EA024701B1

EA024701B1 - Антитела, связывающие cd27 человека, и их применение

Info

Publication number: EA024701B1
Application number: EA201291039A
Authority: EA
Inventors: Тибор Келер; Генри К. Марш; Личжэнь Хе; Лаура А. Витале; Лоренс Дж. Томас
Original assignee: Селлдекс Терапьютикс Инк.
Priority date: 2010-04-13
Filing date: 2011-04-13
Publication date: 2016-10-31
Also published as: JP2013531970A; IL222329B; US20150337047A1; CN103154034B; US20220227877A1; EP2558498A2; US20110274685A1; JP6486300B2; NZ602892A; WO2011130434A9; ES2608475T3; US9169325B2; CA2796571C; EP2558498B1; US11180566B2; BR112012026227A2; JP6002659B2; AU2011239706A1; WO2011130434A3; WO2011130434A2

Abstract

Изобретение относится к выделенному моноклональному антителу, которое связывается с CD27 человека и индуцирует или усиливает иммунный ответ, опосредованный Т-клетками. Изобретение также относится к биспецифической молекуле, включающей указанное антитело, связанное со второй молекулой, специфичность связывания которой отличается от специфичности антитела. Кроме того, изобретение также раскрывает композицию на основе указанных антитела или биспецифической молекулы и способы индукции или усиления иммунного ответа, ингибирования роста клеток, экспрессирующих CD27, лечения рака и детектирования наличия или отсутствия CD27 в биологическом образце с использованием указанных антител.

Description

Изобретение относится к выделенному моноклональному антителу, которое связывается с 027 человека и индуцирует или усиливает иммунный ответ, опосредованный Т-клетками. Изобретение также относится к биспецифической молекуле, включающей указанное антитело, связанное со второй молекулой, специфичность связывания которой отличается от специфичности антитела. Кроме того, изобретение также раскрывает композицию на основе указанных антитела или биспецифической молекулы и способы индукции или усиления иммунного ответа, ингибирования роста клеток, экспрессирующих 027, лечения рака и детектирования наличия или отсутствия 027 в биологическом образце с использованием указанных антител.

024701 Β1

Уровень техники

Во взаимодействии между Т-клетками и антигенпрезентирующими клетками участвуют разнообразные вспомогательные молекулы, облегчающие развитие иммунного ответа. Одной из таких молекул является ΟΌ27, связывающий СЭ70 и принадлежащий к надсемейству рецепторов факторов некроза опухолей (ΤΝΡ-Κ, ФНО-Р) (РапНеим ЕА, е! а1., Βίοοά. 1995 1ипе 15;85(12):3556-65). СЭ27 обычно существует в виде гликозилированного трансмембранного белка типа I, часто в форме гомодимеров с дисульфидным мостиком, связывающим два мономера. Дисульфидный мостик располагается в пределах внеклеточного домена вблизи от мембраны (Сатепш е! а1., 1 1ттипо1. 147:3165-69 (1991). СЭ27 также может экспрессироваться в растворимой форме (см., например, уап 0етк МН, е! а1., Βίοοά. 1993 Эес 1; 82(11):3430-6 и Сцепем \УА. е! а1., Еиг. 1. Iттипο1. 22:447, 1992). Перекрестное связывание антигена С'П27 на поверхности Т-клеток обеспечивает костимулирующий сигнал, который совместно с перекрестным связыванием рецептора Т-клеток может вызывать пролиферацию Т-клеток и активацию клеточного иммунитета.

С'П27 экспрессируется на поверхности зрелых тимоцитов, большинства С'П4 + и С.П8+ Т-клеток периферической крови, ΝΚ-клеток и В-клеток (Κοка!а Τ, е! а1., Ргос. Ν;·ι11. Асаά. δα. υδ А. 1995 Νον 21; 92(24):11249-53). Высокий уровень экспрессии С.П27 также наблюдается при В-клеткочных неходжкинских лимфомах и В-клеточных хронических лимфолейкозах (Капкеш ЕА, е! а1., Βίοοά. 1995 1ип 15; 85 (12):3556-65). Кроме того, повышенный уровень растворимого белка С.П27 обнаружен в сыворотке или в областях, пораженных заболеванием, при паразитарной инфекции, цитомегаловирусной (ЦМВ) инфекции, саркоидозе, рассеянном склерозе и В-клеточном лимфолейкозе (^οеηеη ^А, е! а1., Еиг. 1. Iттипο1. 22:447, 1992).

Показано, что агонистические моноклональные антитела против С.П27 стимулируют Т-клеточный ответ и являются перспективными противораковыми терапевтическими средствами (см., например, δакашкк Τ, е! а1., Вюскет Вюркук. Ке8. Ε’οπιπιιπι. 2010 Рек 18 и \УО 2008/051424). В то же время, хотя, согласно современным данным, С'П27 является пригодной для иммунотерапии мишенью, неизвестно, какие конкретные свойства моноклональных антител против С'П27 являются особенно выгодными для терапевтических целей. В силу этого в данной области техники существует потребность в дополнительной информации о специфических функциональных свойствах, обеспечивающих терапевтическую эффективность антител против СО27, а также в усовершенствованных терапевтических антителах против СО27, более эффективных для лечения и/или предотвращения заболеваний.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение представляет, в числе прочего, выделенные антитела против СО27, обладающие некоторыми функциональными свойствами, которые могут быть связаны с выгодным и желательным терапевтическим действием.

Настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу, которое связывается с СЭ27 человека и индуцирует или усиливает иммунный ответ, опосредованный Т-клетками, где указанное антитело включает:

(ί) СЭР1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий δΞΟ ΙΌ N0:38; СЭР2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий δΞΟ ΙΌ N0:39; СЭК3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий δΞΟ ΙΌ N0:40; СЭР1 вариабельной области легкой цепи, включающий δΞΟ ΙΌ N0:44; СЭР2 вариабельной области легкой цепи, включающий δΞΟ ΙΌ N0:45, и СЭР3 вариабельной области легкой цепи, включающий δΞΟ ΙΌ N0:46; или (ίί) вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, включающие аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотным последовательностям δΞΟ ΙΌ N0:37 и 43, соответственно; или (ίίί) вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, включающие аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотным последовательностям δΞΟ ΙΌ N0:37 и 43, соответственно; или (ίν) вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, кодируемые нуклеотидными последовательностями, по меньшей мере на 90% идентичными нуклеотидным последовательностям δΞΟ ΙΌ N0:35 и 41, соответственно.

В одном из вариантов осуществлени выделенное моноклональное антитело содержит СЭК1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий δΞΟ ΙΌ N0:38; СЭК2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий δΞΟ ΙΌ N0:39; СЭР3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий δΞΟ ΙΌ N0:40; СЭК1 вариабельной области легкой цепи, включающий δΞΟ ΙΌ N0:44; СЭР2 вариабельной области легкой цепи, включающий δΞΟ ΙΌ N0:45, и СЭР3 вариабельной области легкой цепи, включающий δΞΟ ΙΌ N0:46.

В еще одном варианте осуществления выделенное моноклональное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, включающие аминокислотные последовательности δΞΟ ΙΌ N0:37 и 43, соответственно.

В другом варианте осуществления выделенное моноклональное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, кодируемые нуклеотидными последователь- 1 024701 ностями 8ЕЦ ΙΌ N0:35 и 41, соответственно.

В следующем варианте осуществления выделенное моноклональное антитело проявляет по меньшей мере одно из следующих свойств:

a) блокирование связывания δΟΌ70 с ΟΌ27 по меньшей мере на 70% при концентрации антител 10 мкг/мл;

b) связывание с ΟΌ27 человека с равновесной константой диссоциации Кб, равной 10^-9 М или менее, или, альтернативно, с равновесной константой ассоциации Ка, равной 10+⁹ М^-1 или более;

c) индукцию специфической комплемент-опосредованной цитотоксичности (СЭС) по отношению к клеткам, экспрессирующим ΟΌ27, по меньшей мере на 10% при концентрации антител 3 мкг/мл и приблизительно 6% комплемента сыворотки кролика;

б) индукцию срецифического лизиса клеток, экспрессирующих ΟΌ27, вызванного антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (ЛЭСС)· по меньшей мере на 10% при концентрации антител 3 мкг/мл и соотношении эффекторных клеток и клеток-мишеней 75:1;

е) повышение медианы выживаемости по меньшей мере на 20% у мышей с тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью (ТКИН) после инокуляции опухолевых клеток ίη νίνο (5х 10⁵ клеток Раджи или 1х10⁶ клеток Дауди) при введении 0,3 мг (внутрибрюшинно) по меньшей мере дважды в неделю на протяжении 3 недель по сравнению с мышами, которым не вводили антитела;

1) индукцию или усиление антигенспецифического иммунного ответа ίη νίνο в комбинации с вакциной или эндогенным антигеном;

д) индукцию или усиление антигенспецифического иммунного ответа ТН1 ίη νίνο в комбинации с вакциной или эндогенным антигеном;

1ι) индукцию или усиление антигенспецифической пролиферации или активации Т-клеток ίη νίνο в комбинации с вакциной или эндогенным антигеном;

ί) индукцию или усиление активности Т-клеток в комбинации с одновременной, раздельной или последовательной активацией ТСК;

Д уменьшение количества СЭ3+ Т-клеток (не являющихся ΝΚ-клетками) у макак менее чем на 50% при введении в количестве 3 мг/кг (в/в) на протяжении периода 29 суток непосредственно после введения; или

к) уменьшение количества В-клеток памяти у макак менее чем на 50% при введении в количестве 3 мг/кг (в/в) на протяжении периода 29 суток непосредственно после введения.

В другом варианте осуществления антитело выбирается из (ί) антител Ι§Ο1, Ι§Ο2, Ι§Ο3, Ι§Ο4, Ι§Μ, Ι§Ά1, Ι§Λ2, Ι§ϋ и 1§Е; и/или (ίί) антитела человека, гуманизированного или химерного антител.

Настоящее изобретение таже относится к биспецифической молекуле, включающей антитело по любому из предшествующих пунктов, связанное со второй молекулой, специфичность связывания которой отличается от специфичности антитела.

В одном из вариантов осуществления указанная вторая молекула связывается с Рс-рецептором, ΝΚрецептором или Т-клеточным рецептором, выбранным из группы, состоящей из СЭ3, СЭ40 и СЭ25.

Кроме того, настоящее изобретение относится к экспрессирующему вектору, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела по изобретению.

Настоящее изобретение также относится к клетке, трансформированной экспрессирующим вектором.

Дополнительно настоящее изобретение также относится к композиции для индуцирования или усиления иммунного ответа против антигена у субъекта, включающей эффективное количество антитела или биспецифической молекулы по изобретению.

В одном из вариантов осуществления композиция также включает:

(ί) адъювант и/или иммуностимулятор; или (и) по меньшей мере одно второе антитело, которое индуцирует или усиливает иммунный ответ, и/или антиген.

В частности, композиция включает иммуностимулятор, выбранный из группы, состоящей из лиганда СЭ40, лиганда РЬТ 3, цитокинов, колониестимулирующих факторов, ЬР8 (эндотоксина), оцРНК, дцРНК, бациллы Кальметта-Герена (ВСО), левамизола гидрохлорида, иммуноглобулинов для внутривенного введения и агониста Τοΐΐ-подобного рецептора (ТЕК).

В еще одном варианте осуществления агонист Τοΐΐ-подобного рецептора (ТЕК) представляет собой агонист ТЬК3, агонист ТЬК4, агонист ТЬК5, агонист ТЬК7, агонист ТЬК8 или агонист ТЬК9.

В следующем варианте осуществления изобретения антиген включает компонент патогенного организма, аллерген, аутоантиген или опухолевый антиген.

Изобретение также относится к композиции, в которой опухолевый антиген представляет собой ЗйСО, др100 или РшеП7, НЕ^/геи, №Т1, мезотелин, СЕА, §р100, МАКТ1, ТКР-2, шеЫ-А, ΝΥ-Ε8Ο-1, ΝΥ-ВК-Д ΝΥ^Ο-58, ΜΝ (др250), набор идиотипических детерминант, МАОЕ-1, МАОЕ-3, МАОЕ-А3,

- 2 024701 тирозиназа, теломераза, антигены §8X2, антигены МИС-1 или опухолевые антигены эмбрионального происхождения.

В одном из вариантов осуществления композиция включает второе антитело, которое связывает СТЬА-4, ΡΌ-1, 41ВВ или ОХ-40.

Изобретение также относится к способу индукции или усиления иммунного ответа на антиген у субъекта, включающему введение субъекту антитела по изобретению или композиции по изобретению, в количестве, достаточном для индукции или усиления иммунного ответа на антиген.

Кроме того, изобретение также относится к способу ингибирования роста клеток, экспрессирующих СИ27, включающему приведение в контакт клеток с антителом или композицией по изобретению в количестве, эффективном для ингибирования роста клеток, экспрессирующих СИ27.

Изобретение также относится к способу ингибирования связывания СИ70 с СИ27 на клетках, включающему введение антитела по изобретению.

В частности, изобретение относится также к способу лечения рака, включающему введение субъекту антитела по изобретению.

Также в объем изобретения входит способ детектирования наличия или отсутствия СИ27 в биологическом образце, включающий:

a) приведение в контакт биологического образца с антителом по изобретению, где антитело мечено обнаруживаемым веществом, и

b) обнаружение антитела, связанного с СИ27, для детектирования посредством этого наличия или отсутствия СИ27 в биологическом образце.

Другие свойства и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 изображены сродство и кинетические параметры моноклональных антител 105, 1Н8, 3Н12, 3Н8, 209, 1Р5, 3А10, 2С2, тз 1А4, тк 9Р4 и тк М-Т271, определенные с помощью программного обеспечения В1асоте ™ ΒίαΕναΙιιαΙίοη (В1асоте АВ) при использовании рекомбинантного СИ27 человека, иммобилизованного на чипе.

Фиг. 2 представляет собой график, показывающий связывание антител человека против СИ27 (2С2, 3Н8, 1Р5, 105, 1Н8, 209, 3А10 и 3Н12) с рекомбинантным очищенным СИ27 человека при использовании ЕЬ18А.

Фиг. 3 представляет собой график, показывающий связывание в ходе ЕЬ18А 1Р5 с очищенным рекомбинантным СИ27 человека или обезьяны (макака).

Фиг. 4 представляет собой график, изображающий действие антител человека против СИ27 (2С2, 3Н8, 1Р5, 105, 1Н8, 209, 3А10 и 3Н12) и Мз1§0 (1А4, 9Р4 и М-Т271) на связывание растворимого СИ70 (зСИ70) с белком СИ27 (показано как % блокирования) при использовании ЕЬ18А.

Фиг. 5 представляет собой результат проточного цитометрического анализа связывания 1Р5 с клетками лимфобластоидной линии человека и блокирования связывания с 8СИ70.

Фиг. 6А-И представляют собой графики, показывающие связывание антител человека против СИ27 (2С2, 3Н8 и 1Р5) с СИ27 на поверхности клеток Кика! (фиг. 4А), клеток Раджи (фиг. 4В), клеток Каток (фиг. 4С) и клеток Дауди (фиг. 4Ό) согласно оценке с помощью проточной цитометрии.

Фиг. 7 представляет собой график, показывающий связывание антител человека против СИ27 (2С2, 3Н8, 1Р5, 105, 1Н8, 209, 3А10 и 3Н12) с СИ27 на поверхности клеток Дауди согласно оценке с помощью проточной цитометрии.

Фиг. 8 представляет собой гистограмму, показывающую результаты эксперимента на основе ЕЬ18А по перекрестному блокированию антител против СИ27, демонстрирующую, что антитела 1Р5, 1Н8 и 3Н12 способны перекрестно блокировать друг друга и, таким образом, связываются с одним и тем же зпитопом.

Фиг. 9 представляет собой гистограмму, показывающую результаты эксперимента на основе ЕЬ18А по перекрестному блокированию антител против СИ27, демонстрирующую, что антитела 2С2, 3Н8, 105 и 209 способны перекрестно блокировать друг друга и, таким образом, связываются с одним и тем же эпитопом.

Фиг. 10 представляет собой гистограмму, показывающую результаты эксперимента на основе ЕЬ18А по перекрестному блокированию антител против СИ27, демонстрирующую, что связывание антитела 3А10 с СИ27 не полностью перекрестно блокируется любым из других протестированных антител против СИ27, таким образом, указывая на то, что 3А10 связывается с уникальным эпитопом, однако связывание 3А10 частично перекрестно блокируется антителами 1Р5, 1Н8 и 3Н12, что указывает на возможную схожесть эпитопа для 3А10 с эпитопом, связываемым антителами 1Р5, 1Н8 и 3Н12.

Фиг. 11 представляет собой график, иллюстрирующий результаты анализа комплемент-зависимой клеточной цитотоксичности (СИСС) с использованием моноклональных антител 1Р5, 2С2, 3Н8, 105, 1Н8, 209, 3А10 и 3Н12.

Фиг. 12 представляет собой график, иллюстрирующий результаты дальнейшего анализа комплемент-зависимой клеточной цитотоксичности (СИСС) с использованием моноклональных антител 1Р5.

- 3 024701

Фиг. 13 представляет собой график, иллюстрирующий результаты анализа антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЭСС) с использованием моноклональных антител 2С2, 1Р5, 3Н8, 105, 1Н8, 209, 3А10, 3Н12, ритуксан и Ни1§0.

Фиг. 14 представляет собой график, иллюстрирующий результаты дальнейшего анализа антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЭСС) с использованием моноклональных антител 1Р5.

Фиг. 15 представляет собой выравнивание последовательностей У_Н антител человека против СО27 (1Р5, 105, 1Н8, 2С2, 209, 3А10, 3Н12 и 3Н8).

Фиг. 16 представляет собой выравнивание последовательностей У_ъ антител человека против 0027 (1Р5, 105, 1Н8, 2С2, 209, 3А10, 3Н12 и 3Н8).

На фиг. 17 и 18 показаны результаты исследования с использованием моноклональных антител 1Р5 ίη νίνο на нечеловекообразных приматах. В частности, на фиг. 17 показаны 1Р5 на циркулирующих лимфоцитах после введения однократной дозы. На фиг. 18 показано, что 1Р5 не приводят к значительному уменьшению количества циркулирующих лимфоцитов.

На фиг. 19 изображены результаты анализа окрашивания пентамером на клетках периферической крови и спленоцитах мыши.

На фиг. 20 изображены результаты анализа ЕЫЗРОТ анализа и усиленное продуцирование ΙΡΝγ с помощью антител против СЭ27.

На фиг. 21 показано усиливающее действие моноклональных антител против СО27 на Т-клеточный ответ на вакцинный антиген у модели трансгенной мыши с помощью окрашивания пентамером и ЕЬ18РОТ интерферона.

Фиг. 22А-С представляют собой протокол и результаты эксперимента, показывающего, что антитела против СО27 усиливают Т-клеточный ответ на вакцину ((Х-ЭЕС205-ОУА), мишенью которой являются АПК. На фиг. 22А показан протокол эксперимента.

На фиг. 22В показаны результаты эксперимента по измерению антиген-специфических Т-клеток путем окрашивания тетрамерами. На фиг. 22С показаны результаты измерения антиген-специфических Т-клеток путем анализа ЕЫЗРОТ интерферона-гамма.

Фиг. 23А-Э представляют собой результаты эксперимента, показывающего, что антитела против СО27 в комбинации с агонистом ТЬК.3 Ро1у1С (в количестве 25 мкг, 50 мкг или 100 мкг) усиливают Тклеточный ответ на вакцину (а-ЭЕС205-ОУА), мишенью которой являются АПК.

Фиг. 23А представляет собой график, показывающий % интерферон-гамма-положительных клеток среди СЭ8+ Т-клеток у мышей дикого типа, обработанных ро1у 1С и моноклональными антителами 1Р5 против СЭ27. ЬиСО27-трансгенных мышей, обработанных ро1у 1С и контрольными 1§01-антителами человека или ЬиСО27-трансгенных мышей, обработанных ро1у 1С и моноклональными антителами 1Р5 против СЭ27.

На фиг. 24 и 25 показаны результаты исследования введения моноклональных антител против СЭ27 до введения вакцины в присутствии или в отсутствие агониста ТЬК и значение расписания введения антитела относительно вакцины.

На фиг. 26 и 27 показаны результаты от введения моноклональных антител против СЭ27 в комбинации с ТСК-активацией Т-клеток мышей, трансгенных по СЭ27 человека, согласно как пролиферации, так и продукции цитокина.

Фиг. 28А-Э представляют собой протокол и результаты эксперимента, показывающего, что антитела против СЭ27 повышают эффективность вакцины (Х-ЭЕС205-ОУА в МО4 (В16-ОУА) на модели вызванной меланомы. На фиг. 24А показан протокол эксперимента. Фиг. 24В представляет собой график размера опухоли (в мм²) от количества дней после инокуляции опухоли в организмы мышей, не подвергавшихся лечению. Фиг. 24С представляет собой график размера опухоли (в мм²) от количества дней после инокуляции опухоли в организмы мышей, подвергавшихся лечению только вакциной. Фиг. 24Ό представляет собой график размера опухоли (в мм²) от количества дней после инокуляции опухоли в организмы мышей, подвергавшихся лечению вакциной в комбинации с антителом против СЭ27.

Фиг. 29А и В представляют собой графики, показывающие длительное выживание мышей, трансгенных по СЭ27 человека (модели опухоли) после стимуляции сингенной лимфомой и введения различных доз моноклональных антител 1Р5 против СО27.

На фиг. 30-32 показаны результаты эксперимента по проверке эффекта от лечения антителами против СО27 на модели ксенотрансплантата Раджи в организмах ТКИН-мышей.

На фиг. 30А показан график размера опухоли (в мм³) от количества дней после инокуляции опухоли в организмы мышей, не подвергавшихся лечению, подвергавшихся лечению контрольными 1д01антителами человека или антителами 1Р5 и 3Н8 против СЭ27. Стрелками указаны дни лечения антителами путем внутрибрюшинных инъекций.

На фиг. 30В показано выживание на графике Каплана-Мейера.

На фиг. 31А показан график размера опухоли (в мм³) от количества дней после инокуляции опухоли в организмы мышей, не подвергавшихся лечению, подвергавшихся лечению контрольными 1д01- 4 024701 антителами человека или антителами 1Р5 против СЭ27. Стрелками указаны дни лечения антителами путем внутрибрюшинных инъекций. На фиг. 31В показано выживание на графике Каплана-Мейера.

На фиг. 32 показаны результаты дальнейшего эксперимента по проверке эффекта от лечения антителами против СО27 на модели ксенотрансплантата Раджи в организмах ТКИН-мышей на графике Каплана-Мейера.

На фиг. 33 показаны результаты эксперимента по проверке эффекта от лечения антителами против СО27 на модели ксенотрансплантата Дауди в организмах ТКИН-мышей. На фиг. 33А показан график размера опухоли (в мм³) от количества дней после инокуляции опухоли в организмы мышей, подвергавшихся лечению контрольными 1§С1-антителами человека или антителами 1Р5 против СО27 (0,1 мг или 0,3 мг). Стрелками указаны дни лечения антителами путем внутрибрюшинных инъекций. На фиг. 33В показано выживание на графике Каплана-Мейера.

На фиг. 34 показаны результаты анализа ЕЫ8РОТ и невозможность усиленного антигенспецифического продуцирования интерферона-гамма с помощью антитела против СО27 при неспособности Ре-фрагмента 1дС связывать Ре-рецепторы.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение представляет антитела против СО27, обладающие определенными функциональными свойствами, соотносящимися со значительными терапевтическими преимуществами, включая стимуляцию иммунитета (например, иммунного ответа, опосредованного Т-клетками, при вакцинной терапии, активацию ΝΚ-клеток при лечении рака), подавление роста клеток (например, при лечении рака) и подавление иммунных реакций, опосредованных Т-клетками (например, при лечении аутоиммунных заболеваний). Указанные функциональные свойства включают, например: (1) ингибирование (например, полное или частичное блокирование) связывания растворимого СО70 с клетками, экспрессирующими СО27, по меньшей мере, приблизительно на 70%, более того, например, по меньшей мере, на 80% или, по меньшей мере, на 90% (2) связывание с СГО27 человека с КО, равной 1х10^-9 М или менее, (3) индукцию, по меньшей мере, приблизительно 40% комплемент-опосредованной цитотоксичности (СЭС) клеток, экспрессирующих СО27, в концентрации 10 мкг/мл, (4) индукцию, по меньшей мере, приблизительно 40% специфического лизиса клеток, экспрессирующих СО27, за счет АОСС в концентрации 10 мкг/мл, (более того, например, по меньшей мере, приблизительно 50%, по меньшей мере, приблизительно 60% или, по меньшей мере, приблизительно 70% специфического лизиса), (5) индукцию усиления иммунного ответа, особенно ТН1-ответа и/или (6) индукцию усиления активности Т-клеток, особенно количества и/или активности специфических СО8+ Т-клеток. В других вариантах воплощения антитела включают определенные последовательности вариабельных областей и/или СОК тяжелых и легких цепей.

Для облегченного понимания настоящего изобретения сначала приводятся определения некоторых терминов. Дополнительные определения приведены на протяжении подробного описания.

Термин СО27 (также называемый СО27 молекулой, СО27Ь рецептором, 81521, антигеном активации Т-клеток СО27, ΤΝΡΚ8Ρ7, МОС20393, членом 7 надсемейства рецепторов факторов некроза опухолей, антигеном активации Т-клеток 8152, Тр55, членом 7 надсемейства рецепторов факторов некроза опухолей, антигеном СО27 и антигеном активации Т-клеток СО27) относится к рецептору, являющемуся членом надсемейства ΤΝΡ-рецепторов, который связывается с лигандом СО70. СО27 необходим для формирования и долгосрочного поддержания Т-клеточного иммунитета и играет ключевую роль в регуляции активации В-клеток и синтезе иммуноглобулинов. Термин СО27 включает любые варианты или изоформы СО27, экспрессируемые клетками в природных условиях (например, СО27 человека, депонированный в ΟΕΝΒΑΝΚ® под номером доступа ААН12160.1). Соответственно, антитела по изобретению могут перекрестно реагировать с СО27 видов животных, не являющихся человеком. В качестве альтернативы антитела могут быть специфичны к СО27 человека и не проявлять перекрестной активности по отношению к другим видам. СО27 или его любые варианты и изоформы могут быть выделены из клеток или тканей, экспрессирующих их в естественных условиях, или рекомбинантно продуцированы с использованием методик, известных в данной области техники и/или описанных здесь. Предпочтительно мишенью антител является ЙСО27, для которого характерна нормальная картина гликозилирования.

По сообщению СеиВаик® (номер доступа ААН12160.1), аминокислотная последовательность СО27 человека представляет собой (8ЕЦ ГО ΝΟ: 1):

татрйруу1с уЦОудйа фаркксрет йууацдЫсс српсердШу кбсбцЬткаа цсбрс1р§У5 ГзрбЬЫтрй секстйсикд 11угпсШа паесасгпду цсгбкесЮс

121 бр1рпр8Йа г^сщкркр цр1к1руу5е пйеаПадкт ц(1абГгц1р агГООцурр

181 срЧсхХП пкГОдтГ 1уй1ада1Г Пкцгкугщ кдезруерае рсгуксргее

241 е§511р|цеб уткрерасзр

Термин СО70 (также называемый молекулой СО70, СО27Ь, СО27ЬС, ΤΝΡ8Ρ7, членом 7 надсемейства (лигандов) факторов некроза опухолей, лигандом СО27, антигеном СО70, поверхностным антигеном СО70, членом 7 надсемейства лигандов факторов некроза опухолей, антигеном Κί- 5 024701 и СО27-Ь) относится к лиганду СГО27 (см., например, Болтаи МК е! а1., 1. 1ттипо1. 1994 РеЬ 15; 152(4):1756-61). СГО70 является трансмембранным белком II типа, который принадлежит к семейству лигандов факторов некроза опухолей (ΤΝΡ, ФНО). Он представляет собой поверхностный антиген активированных Т- и В-лимфоцитах, индуцирующий пролиферацию костимулированных Т-клеток, усиливает образование цитолитических Т-клеток и вносит вклад в активацию Т-клеток. Кроме того, предполагают, что СЭ70 играет роль в регуляции активации В-клеток, цитотоксической функции ΝΚ-клеток и синтезе иммуноглобулинов (ИшЪгеп Кб е! а1., I. 1ттипо1. 1994 РеЬ 15; 152 (4):1762-73).

По сообщению ОепВаик® (номер доступа ΝΡ_001243), аминокислотная последовательность СЭ70 человека представляет собой (8ЕО ГО N0:2):

треедкдеку гггрудсу1г аакркаЦ уюЬтсаср Гас.]ас]с]с|1р1 е51д\уб\'ае1

с]1п1идрс]С|б ргЬлусщдра 1дг8ЙЬдре 1бкдс]1п11г бщутуЬкр' баю^Па

121 8тЬЬрП1ау дюкракга зПгЕЛкщ с0а8С]г11р 1агдб!1с!и ЬдШркти

181 ШеГГдусру утр

Термин антитело, упоминаемый здесь, включает целые антитела и их антиген-связывающий фрагмент (т.е. антиген-связывающую часть) одиночную цепь. В одном из предпочтительных вариантов воплощения антитело относится к гликопротеину, состоящему, по меньшей мере, из двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (Ь) цепей, соединенных дисульфидными связями, или его антиген-связывающий фрагмент. Каждая тяжелая цепь включает вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно обозначаемую здесь как ν_Η) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи включает три домена - СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь включает вариабельную область легкой цепи (сокращенно обозначаемую здесь как У_ъ) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи включает один домен - СЬ. Области ν_Η и Ун также можно разделить на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (СГОК), перемежающиеся с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (РК). Каждая ν_Η и Ун включает три СГОК и четыре РК, выстроенных от Ν-конца к С-концу в следующем порядке: РК1, СГОКЕ РК2, СГОКЗ, РК3, СЭК3, РК4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, взаимодействующий с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (С1ц) классической системы комплемента.

Термин антиген-связывающий фрагмент антитела (или просто фрагмент антитела), как используется здесь, относится к одному или более фрагментам антитела, сохраняющим способность специфически связываться с антигеном (например, СГО27 человека). Длина таких фрагментов находится в диапазоне, например, приблизительно от 8 до приблизительно 1500 аминокислот, соответственно, приблизительно от 8 до приблизительно 745 аминокислот, соответственно, приблизительно от 8 до приблизительно 300, например, приблизительно от 8 до приблизительно 200 аминокислот или приблизительно от 10 до приблизительно 50 или 100 аминокислот. Показано, что функцию связывания антитела с антигеном могут выполнять фрагменты полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином антиген-связывающий фрагмент антитела, включают (ί) РаЬ-фрагмент - моновалентный фрагмент, состоящий из У_ъ-, ν_Η-, СЬ- и СН1-доменов; (ίί) Р (аЬ')₂-фрагмент бивалентный фрагмент, включающий два РаЬ-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ίίί) Рбфрагмент, состоящий из ν_Η- и СИТ-доменов; (ίν) Ру-фрагмент, состоящий из У_ъ- и Уц-доменов одиночного плеча антитела, (ν) бАЬ-фрагмент (\Уагб е! а1., (1989) №-Ииге 341:544-546), состоящий из Уц-домена; и (νί) выделенную гипервариабельную область (СГОК) или (νίί) комбинацию двух или более выделенных СГОК необязательно объединенных с помощью синтетического линкера. Кроме того, хотя два домена Рν-фрагмента У₉ и ν_Η кодируются отдельными генами, их можно объединить, используя рекомбинантные методики, с помощью синтетического линкера, позволяющего им продуцироваться в виде единой белковой цепи, в которой области Ун и ν_Η соединяются, образуя моновалентные молекулы (известные как одноцепочечные Ру (8сРу); см., например, Βίτά е! а1. (1988) §шеисе 242:423-426; и Ηυδ!οη е! а1. (1988) Ргос. №Й. Асаб. 8сь И8А 85:5879-5883). Подразумевается, что такие одноцепочечные антитела также охватываются термином антиген-связывающий фрагмент антитела. Эти фрагменты антител получают с помощью общепринятых методик, известных специалистам в данной области техники; скрининг фрагментов на пригодность выполняют таким же образом, как и для интактных антител. Антиген-связывающие фрагменты можно получить с помощью методик рекомбинантных ДНК или путем ферментативного или химического гидролиза интактных иммуноглобулинов.

Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, содержащее две различные пары тяжелых/легких цепей и два различных сайта связывания. Биспецифические антитела можно получить с помощью различных способов, включая слияние гибридом или соединение РаЬ'-фрагментов. См., например, Бои^МЫ & ЬасЬтаии, СЬи. Ехр. 1ттиио1. 79:315-321 (1990); Ко§!е1иу е! а1., I. 1ттиио1. 148, 1547-1553 (1992).

Термин моноклональное антитело, как используется здесь, относится к антителу, обладающему единственной специфичностью связывания и сродством к определенному эпитопу. Соответственно, тер- 6 024701 мин моноклональное антитело человека относится к антителу, обладающему единственной специфичностью связывания и содержащему вариабельные и необязательные константные области, происходящие от последовательностей иммуноглобулина человека эмбрионального типа. В одном из вариантов воплощения моноклональные антитела человека продуцируются гибридомой, которая включает В-клетку, полученную из трансгенного животного, не являющегося человеком, например, трансгенной мыши, геном которого содержит трансген тяжелой цепи и трансген легкой цепи человека, объединенную с иммортализированной клеткой.

Термин рекомбинантное антитело человека, как используется здесь, включает все антитела человека, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные рекомбинантными средствами, например, (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), являющегося трансгенным или трансхромосомальным по генам иммуноглобулина человека, или гибридомы, полученной из него, (Ь) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной с целью экспрессии антитела, например, из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека и (б) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любым другим способом, включающим сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека включают вариабельные и константные области, использующие определенные последовательности иммуноглобулинов человека эмбрионального типа, кодируемые эмбриональными генами, однако включают последующие реаранжировки и мутации, которые происходят, например, во время созревания антитела. Как известно в данной области техники (см., например, ЬоиЬегд (2005) №Циге Вю1сс1г 23(9):1117-1125), вариабельная область содержит антиген-связывающий домен, кодируемый различными генами, которые реаранжируются, образуя антитело, специфичное по отношению к чужеродному антигену. Кроме реаранжировки, вариабельная область также может быть модифицирована путем множественных замен одиночных аминокислот (называемых соматическими мутациями или гипермутациями) для увеличения сродства антитела к чужеродному антигену. Константные области изменяются в ходе дальнейшего ответа на антиген (т.е. переключении изотипа). В силу этого подвергшиеся реаранжировке и соматической мутации молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды легких цепей и тяжелых цепей иммуноглобулинов в ответ на антиген, могут не обладать идентичностью последовательности с исходными молекулами нуклеиновых кислот, но вместо этого быть в значительной степени идентичными или аналогичными (т.е. обладать, по меньшей мере, 80% идентичностью).

Термин антитело человека включает антитела, содержащие вариабельные и константные области (при их наличии) с последовательностями иммуноглобулинов человека эмбрионального типа. Антитела человека по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов человека эмбрионального типа (например, мутации, внесенные в ходе случайного или сайт-специфического мутагенеза ίη νίίτο или путем соматической мутации ίη νίνο) (см. ЬоиЬегд, N. е1 а1. (1994) Шине 368(6474): 856-859); ЬоиЬегд, N. (1994) НаибЬоок οί ЕхрептеШа1 РЬагтасо1оду 113:49101; ЬоиЬегд, N. аиб Нщ/аг Ό. (1995) 1н1егп. Кег. 1ттиио1. Уо1. 13: 65-93 и Нагбшд, р. аиб ЬоиЬегд, N. (1995) Аии. ΝΥ. Асаб. δα 764:536-546). В то же время термин антитело человека не включает антитела, в которых последовательности СЭК, происходящие от последовательности эмбрионального типа другого вида млекопитающих, например, мыши, перенесены на каркасные последовательности человека (т.е. гуманизированные антитела).

Как используется здесь, определение термина гетерологичное антитело приведено по отношению к трансгенному организму, не являющемуся человеком и продуцирующему такое антитело. Этот термин относится к антителу, обладающему аминокислотной последовательностью или кодирующей нуклеотидной последовательностью, соответствующей последовательности, присутствующей в организме, не представляющем собой трансгенное животное, не являющееся человеком, и в общем случае принадлежащей виду, отличающемуся от указанного трансгенного животного, не являющегося человеком.

Подразумевается, что термин выделенное антитело, как используется здесь, относится к антителу, практически не содержащему других антител, обладающих отличающейся антигенной специфичностью (например, выделенное антитело, специфически связывающееся с СЭ27 человека, практически не содержит антител, специфически связывающихся с антигенами, не являющимися СЭ27 человека). Выделенное антитело, специфически связывающееся с эпитопом, может, вместе с тем, обладать перекрестной реактивностью по отношению к другим белкам СЭ27 различных видов. В то же время указанное антитело предпочтительно всегда связывается с С.П27 человека. Кроме того, выделенное антитело обычно практически не содержит других клеточных материалов и/или химических соединений. В одном из вариантов воплощения изобретения комбинацию выделенных антител, обладающих различной специфичностью к СЭ27, объединяли в составе четко определенной композиции.

Термин эпитоп или антигенная детерминанта относится к сайту на поверхности антигена, с которым специфически связывается иммуноглобулин или антитело. Эпитоп может быть образован как непрерывной последовательностью аминокислот, так и аминокислотами, не образующими непрерывной последовательности, но расположенными вблизи друг от друга за счет формирования третичной структуры белка. Эпитопы, образованные непрерывной последовательностью аминокислот, как правило, ус- 7 024701 тойчивы к воздействию денатурирующих растворителей, в то время как эпитопы, образованные за счет третичной структуры, как правило, повреждаются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп обычно включает, по меньшей мере, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот, образующих уникальную пространственную конформацию. Способы определения того, какие эпитопы связываются данным антителом (т.е. картирования эпитопов) хорошо известны в данной области техники и включают, например, иммуноблоттинг и иммунопреципитацию, где перекрывающиеся или непрерывные пептиды в составе СО27 тестируют на реакционноспособность с данным антителом против СО27. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают методики, известные в данной области техники и описанные здесь, например, рентгеновскую кристаллографию и 2-мерный ядерный магнитный резонанс (см., например, Ерйоре Марршд Рго!осок ίη Ме!йой8 ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Уо1. 66, С. Е. Могг15, Ей. (1996)).

Кроме того, в объем настоящего изобретения входят антитела, связывающиеся с эпитопом на поверхности СО27, полностью или частично включающим эпитоп, распознаваемый определенным антителом, описанным здесь (например, с одной и той же или перекрывающейся областью, или промежуточной областью, или вокруг области).

Кроме того, в объем настоящего изобретения входят антитела, которые связывают один и тот же эпитоп и/или антитела, которые конкурируют за связывание с СО27 человека с антителами, описанными здесь. Антитела, распознающие один и тот же эпитоп или конкурирующие за связывание, можно идентифицировать с помощью обычных методик. Такие методики включают, например, иммуноанализ, который показывает способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеноммишенью, т.е. конкурентный анализ связывания. Конкурентное связывание определяют в ходе анализа, в котором тестируемый иммуноглобулин ингибирует специфическое связывание эталонного антитела с общим антигеном, например, СО27. Известны различные типы конкурентных анализов связывания, например, твердофазный прямой или непрямой радиоиммуноанализ (Κ1Α), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (ΕΙΑ), конкурентный сэндвич-анализ (см. §1аЬИ е! а1., Ме!йой8 ίη Еп/уто1оду 9:242 (1983)); твердофазный прямой Е1А с биотин-авидином (см. КиЫапй е! а1., 1. 1ттипо1. 137:3614 (1986)); твердофазный анализ с использованием метки, твердофазный сэндвич-анализ с использованием метки (см. Наг1оте апй Ьапе, АпйЬоФек: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1й 8ргшд НагЬог Рге88 (1988)); твердофазный ΚΙΑ с использованием Ι-125 в качестве метки (см. Моге1 е! а1., Мо1. 1ттипо1. 25(1):7(1988)); прямой твердофазный Е1А с использованием биотин-авидина (Сйеипд е! а1., Уио1оду 176:546 (1990)); и ΚΙΑ с использованием метки (МоИепйаиег е! а1., 8сапй. 1. 1ттипо1. 32:77 (1990)). Как правило, такой анализ предполагает использование очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью или клеток, несущих антиген, немеченого тестируемого иммуноглобулина и меченого эталонного иммуноглобулина. Конкурентное ингибирование измеряют путем определения количества метки, связанной с твердой поверхностью или клетками, в присутствии тестируемого иммуноглобулина. Обычно тестируемый иммуноглобулин присутствует в избытке. Обычно, если конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно ингибирует специфическое связывание эталонного антитела с общим антигеном по меньшей мере на 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% или более.

Другие методики включают, например, способы картирования эпитопов, например, рентгеновскую кристаллографию комплексов антиген:антитело, которая обеспечивает атомное разрешение эпитопа. Другие способы отслеживают связывание антитела с фрагментами антигена или мутированными вариантами антигена, причем потеря способности к связыванию вследствие модификации аминокислотного остатка в пределах последовательности антигена часто считается признаком компонента эпитопа. Кроме того, для картирования эпитопа также можно использовать вычислительные комбинаторные методики. Эти методики основываются на способности исследуемого антитела аффинно выделять специфические короткие пептиды из комбинаторной пептидной библиотеки фагового дисплея. Указанные пептиды затем рассматривают в качестве ориентиров для определения эпитопа, соответствующего антителу, используемому для скрининга пептидной библиотеки. Разработаны вычислительные алгоритмы для картирования эпитопа, способные картировать конформационные прерывистые эпитопы.

Как используется здесь, термины специфическое связывание, селективное связывание, селективно связывается и специфически связывается относятся к связыванию антигена с эпитопом заранее определенного антигена. Как правило, антитело связывается с равновесной константой диссоциации (КО) приблизительно менее 10^-7 М, например, приблизительно менее 10^-8 М, 10^-9 М или 10^-10 М, или менее, согласно определению с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса (8РК) с использованием инструмента В1ЛСОРЕ 2000 и рекомбинантного СО27 человека в качестве анализируемого соединения и антитела в качестве лиганда, и связывается с заранее определенным антигеном со сродством, по меньшей мере, в два раза превышающим его сродство связывания с неспецифическим антигеном (например, БСА, казеином), отличающимся от заранее определенного антигена или близкородственного антигена. Фразы антитело, распознающее антиген и антитело, специфичное к антигену используют здесь на равных основаниях с термином антитело, специфически связывающееся с антигеном.

Предполагается, что термин КО, как используется здесь, относится к равновесной константе диссоциации конкретного взаимодействия антиген-антитело. Как правило, антитела человека по изобрете- 8 024701 нию связываются с СИ27 с равновесной константой диссоциации (ΚΌ) приблизительно 10^-8 М или менее, например, менее 10-9 М или 10-10 М, или менее, согласно определению с помощью технологии поверхностного плазмонного резонанса (§РК) с использованием инструмента В1АСОРЕ 2000 и рекомбинантного СИ27 человека в качестве анализируемого соединения и антитела в качестве лиганда.

Предполагается, что термин кб, как используется здесь, относится к константе скорости диссоциации антитела из комплекса антиген/антитело.

Предполагается, что термин ка, как используется здесь, относится к константе скорости ассоциации антитела с антигеном.

Термин ЕС50, как используется здесь, относится к концентрации антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, индуцирующего ответ в ходе анализа ίη νίΐτο или ίη νίνο, равный 50% от максимального ответа, т.е. находящийся посередине между максимальным ответом и фоновым уровнем.

Как используется здесь, изотип относится к классу антитела (например, 1дМ или 1§О1), кодируемого генами константной области тяжелой цепи. В одном из вариантов воплощения моноклональное антитело человека по изобретению относится к изотипу 1дО1. В еще одном из вариантов воплощения моноклональное антитело человека по изобретению относится к изотипу 1дО2.

Термин связывается с иммобилизованным СИ27 относится к способности антитела человека по изобретению связываться с С.П27. например, экспрессируемым на поверхности клетки или прикрепленным к твердому носителю.

Термин перекрестно реагирует, как используется здесь, относится к способности антитела по изобретению связываться с С.П27 различных видов животных. Например, антитело по настоящему изобретению, связывающее С.П27 человека, также может связывать другие виды СИ27. Как используется здесь, перекрестную реакционную способность измеряют путем обнаружения специфической способности реагировать с очищенным антигеном в ходе анализа связывания (например, 8РК, ЕЬРЗА), или связывания с, или иного типа функционального взаимодействия с клетками, физиологически экспрессирующими СИ27. Способы определения перекрестной реакционноспособности включают стандартные анализы связывания, описанные здесь, например, анализ с использованием поверхностного плазмонного резонанса (8РК) В1асоге™ с помощью §РК-инструмента В1асоге™ 2000 (В1асоге АВ, Уппсала, Швеция), или проточно-цитометрических методик.

Как используется здесь, переключение изотипов относится к феномену, согласно которому класс или изотип антитела меняется с одного класса 1д на один из других классов 1д.

Как используется здесь, непереключенный изотип относится к изотипическому классу тяжелых цепей, продуцируемому при отсутствии переключения изотипа; СН-ген, кодирующий непереключенный изотип, обычно представляет собой первый СН-ген, расположенный непосредственно ниже функционально реаранжированного νθί-гена. Переключение изотипов классифицируют как классическое или неклассическое переключение изотипов. Классическое переключение изотипов происходит за счет рекомбинационных событий, в которых участвует, по меньшей мере один сайт переключающей последовательности трансгена. Неклассическое переключение изотипов может происходить, например, за счет гомологичной рекомбинации между σ_μ человека и Σ_μ человека (δ-асоциированной делеции). В числе прочего, переключение изотипов может осуществляться за счет альтернативных механизмов неклассического переключения, например, межтрансгенной или межхромосомной рекомбинации.

Как используется здесь, термин переключающая последовательность относится к последовательностям ДНК, отвечающим за рекомбинацию на этапе переключения. Донорная переключающая последовательность, обычно μ-переключающая область, располагается в направлении 5'- (т.е. выше) области конструкта, удаляемой во время рекомбинации на этапе переключения. Акцепторная переключающая область располагается между удаляемой областью конструкта и замещающей константной областью (например, γ, ε и т.д.). Поскольку конкретный постоянный сайт рекомбинации отсутствует, окончательную последовательность генов обычно невозможно предсказать на основе конструкта.

Как используется здесь, картина гликозилирования определяется как картина углеводных групп, ковалентно присоединенных к белку, более конкретно - к белку иммуноглобулина. Картину гликозилирования гетерологичного антитела можно описать как в значительной степени аналогичную картине гликозилирования, наблюдаемой в естественных условиях у антител, продуцированных трансгенным животным, не являющимся человеком, если специалист в данной области техники может распознать, что картина гликозилирования гетерологичного антитела более сходна с указанной картиной гликозилирования у трансгенного животного, не являющегося человеком, чем с картиной гликозилирования у вида, от которого происходят СН-гены трансгена.

Термин природный, как используется здесь по отношению к объекту, относится к тому факту, что объект можно найти в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме (включая вирусы), который можно выделить из естественного источника и не являющаяся целенаправленно модифицированной человеком в лаборатории, является природной.

Термин реаранжированный, как используется здесь, относится к конфигурации локуса тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, где сегмент V непосредственно примыкает к сегменту Ό-ί или ί

- 9 024701 в конформации, кодирующей фактически полный Ун- или У[-домен, соответственно. Реаранжированный генный локус иммуноглобулина можно идентифицировать путем сравнения с ДНК эмбрионального типа; реаранжированный локус содержит, по меньшей мере, один рекомбинированный гептамерный/нонамерный гомологичный элемент.

Термин нереаранжированный или конфигурация зародышевого типа, как используется здесь по отношению к сегменту У, относящемуся к конфигурации, в которой сегмент У не подвергался рекомбинации, обеспечивающей его непосредственное примыкание к сегменту Ό или 1.

Предполагается, что термин молекула нуклеиновой кислоты, как используется здесь, включает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двуцепочечной, но предпочтительно представляет собой двуцепочечную ДНК.

Предполагается, что термин выделенная молекула нуклеиновой кислоты, как используется здесь по отношению к нуклеиновым кислотам, кодирующим антитела или фрагменты антител (например, У_н, У_ь, СИКЗ), связывающиеся с СЭ27, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело или фрагмент антитела, не содержат других нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитела или фрагменты антител, связывающие антигены, не являющиеся СИ27, причем эти другие последовательности в естественных условиях могут фланкировать указанную нуклеиновую кислоту в геномной ДНК человека. Например, 8ЕО ГО N0:35 и 41, 47 и 53, 101 и 107, 83 и 89, 83 и 95, 23 и 29, 71 и 77 соответствуют нуклеотидным последовательностям, включающим вариабельные области тяжелой цепи (У_н) и легкой цепи (У_ъ) моноклональных антител 1Р5, 1Н8, 3Н12, 3А10, 2С2, 209, 3Н8 и 105 против СН27.

Настоящее изобретение также включает консервативные модификации последовательностей, представленных в 8Е0 ГО N0:5-112, т.е. модификации нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, не препятствующие связыванию антитела, кодируемого нуклеотидной последовательностью или содержащего аминокислотную последовательность, с антигеном. Такие консервативные модификации последовательностей включают консервативные нуклеотидные и аминокислотные замены, а также добавления и делеции нуклеотидов и аминокислот. Например, модификации можно внедрить в 8Е0 ГО N0:5-112 с помощью стандартных методик, известных в данной области техники, например, сайтспецифического мутагенеза и ПЦР-опосредованного мутагенеза. Консервативные аминокислотные замены включают замены, при которых аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, содержащим аналогичную боковую цепь. В данной области техники существуют определения семейств аминокислотных остатков, содержащих аналогичные боковые цепи. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Так, предсказанный аминокислотный остаток, не являющийся незаменимой аминокислотой, в составе антитела человека против СГО27 предпочтительно замещают другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. Способы идентификации нуклеотидных и аминокислотных консервативных замен, не устраняющих связывания с антигеном, широко известны в данной области техники (см., например, Вгитте11 е! а1., Βίοейет. 32:1180-1187 (1993); КоЬауакЫ е! а1. Рго1еш Епд. 12(10):879-884 (1999); и Виткк е! а1. Ргос. №И. Асай. 8с1. И8А 94:412-417 (1997)).

В качестве альтернативы, в еще одном варианте воплощения можно внедрить случайные мутации на протяжении всей кодирующей последовательности антитела против СГО27 или ее фрагмента, например, путем насыщающего мутагенеза, и выполнить скрининг связывающей активности среди полученных модифицированных антител против СГО27.

По отношению к нуклеиновым кислотам термин значительная гомология означает, что две нуклеиновые кислоты или обозначающие их последовательности при оптимальном выравнивании и сравнении являются идентичными при учете соответствующих нуклеотидных инсерций и делеций, по меньшей мере приблизительно на 80% от общего количества нуклеотидов, обычно, по меньшей мере, приблизительно на 90-95%, а более предпочтительно - по меньшей мере, приблизительно на 98-99,5% от общего количества нуклеотидов. В качестве альтернативы, значительная гомология существует, если сегменты гибридизуются с комплементарной цепью при условиях для селективной гибридизации.

Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию количества идентичных положений, общих для обеих последовательностей (т.е. % гомологии=# идентичных положений/общее # положенийх100), с учетом количества пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо внести для оптимального выравнивания двух указанных последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно выполнить с использованием математического алгоритма, как описано в неограничивающих примерах ниже.

Процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей можно определить с помощью

- 10 024701 программы САР в пакете программного обеспечения ОСО (доступном на 1Шр://\у\у\у.дсд.еот). используя матрицу Ы^Здарбпа.СМР, вес пробела 40, 50, 60, 70 или 80 и вес длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Процент идентичности двух нуклеотидных или аминокислотных последовательностей также можно определить с помощью алгоритма Е. Меуегк апб Мб1ег (САБЮ§, 4:11-17 (1989)), включенного в программу ΑΜΟΝ (версия 2,0), при использовании таблицы весов остатков РАМ120, штрафа за длину пробела 12 и штрафа за пробел 4. Кроме того, процент идентичности двух аминокислотных последовательностей можно определить с помощью алгоритма №еб1ешап апб ^ипксЬ (1. Мо1. Βίο1. (48):444-453 (1970)), включенного в программу САР в пакете программного обеспечения ОСО (доступном на Ьбр://№№№.дсд.сот), используя матрицу В1о88ит 62 или матрицу РАМ250, вес пробела 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и вес длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Последовательности нуклеиновых кислот и белков по настоящему изобретению можно в дальнейшем использовать в качестве запрашиваемой последовательности для выполнения поиска в общедоступных базах данных, например, с целью определения родственных последовательностей. Такой поиск можно выполнить с помощью программ ΝΒΕΑδΤ и ХВЬАЗТ (версии 2,0), описанных в АДксШ, е1 а1. (1990) 1. Мо1. Βίο1. 215:403-10. ВЬА§Т-поиск нуклеотидных последовательностей можно осуществить с помощью программы NΒ^Α§Τ при следующих значениях: параметр = 100, длина слова = 12, получая нуклеотидные последовательности, гомологичные молекулам нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. ВЬА§Т-поиск белков можно осуществить с помощью программы ХВЬАЗТ при следующих значениях: параметр = 50, длина слова = 3, получая аминокислотные последовательности, гомологичные белковым молекулам по изобретению. Для получения выровненных последовательностей, содержащих пробелы, для целей сравнения, можно использовать Оарреб ВЬА§Т, как описано в А11кс1ш1 е1 а1., (1997) №с1ею Ашбк Ке8. 25 (17):3389-3402. При использовании программ ВЬА§Т и Оарреб ВЬА§Т можно использовать параметры по умолчанию соответствующих программ (например, ХВЬАЗТ и NΒ^Α§Τ). См. 1Шр://\\л\лу.псЬгп1т.ш1гдоу.

Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенном или практически чистом виде. Нуклеиновая кислота является выделенной или практически очищенной, если она очищена от других компонентов клетки или других загрязняющих веществ, например, других внутриклеточных нуклеиновых кислот или белков, с помощью стандартных методик, в том числе обработки щелочью/δΌδ, расслоения при центрифугировании в градиенте СкС1, колоночной хроматографии, электрофореза в агарозном геле и других методик, хорошо известных в данной области. См. Р. Аи8иЬе1, е1 а1., еб. Сиггеи! РгоЮсок ш Мо1еси1аг Вю1оду, Огеепе РиЬЬкЫид апб \УПеу 1п1ег5с1епсе,

Уогк (1987).

Композиции нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, часто присутствующие в виде нативной последовательности (за исключением модифицированных сайтов рестрикции и т.п.), либо полученные из кДНК, геномной ДНК или их смесей, можно мутировать в соответствии со стандартными методиками, получая последовательности генов. Для кодирующих последовательностей при желании эти мутации могут влиять на аминокислотную последовательность. В частности, рассматриваются последовательности ДНК, в значительной степени гомологичные или происходящие от нативных последовательностей V, Ό, 1, константных, переключающих и других подобных последовательностей, описанные в данном документе (где происходящие означает, что последовательность идентична другой последовательности или представляет собой ее модифицированный вариант).

Нуклеиновая кислота является функционально связанной, если она вступает в функциональное взаимодействие с другой нуклеотидной последовательностью. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию указанной последовательности. В отношении последовательностей регуляции транскрипции термин функционально связанный означает, что связанные последовательности ДНК являются непрерывными и, при необходимости объединения кодирующих областей двух белков, являются непрерывными и находятся в одной рамке считывания. Для переключающих последовательностей термин функционально связанный указывает, что последовательности способны эффективно переключать рекомбинацию.

Предполагается, что термин вектор, как используется здесь, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой он связан. Одним из типов вектора является плазмида, которая относится к кольцевой двуцепочечной петле ДНК, в которую можно лигировать дополнительные сегменты ДНК. Еще одним типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК можно лигировать в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они внедрены (например, бактериальные векторы, содержащие бактериальный сайт инициации репликации, и эписомальные векторы млекопитающих).

Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина после внедрения в клетку-хозяина и, тем самым, реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы здесь называют рекомбинантными экспрессирующими векторами (или просто экспрессирующими векторами). В общем случае экспрессирующие векторы, использующиеся в методиках рекомбинантных ДНК, часто находятся в форме плазмид. В настоящем па- 11 024701 тентном описании плазмида и вектор могут использоваться на равных основаниях, поскольку плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. В то же время предполагается, что изобретение включает другие формы экспрессирующих векторов, например, вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.

Предполагается, что термин рекомбинантная клетка-хозяин (или просто клетка-хозяин), как используется здесь, относится к клетке, в которую внедрен рекомбинантный экспрессирующий вектор. Следует понимать, что такие термины должны относиться не только к определенной клетке субъекта, но и к потомству такой клетки. Поскольку в последующих поколениях ввиду мутаций или влияния окружающей среды могут возникнуть некоторые модификации, такое потомство фактически может не являться идентичным исходной клетке, но все же оставаться в рамках термина клетка-хозяин, как используют здесь.

Как используется здесь, термин антиген относится к любому природному или синтетическому иммуногенному веществу, например белку, пептиду или гаптену. Антигены, пригодные для использования в настоящем изобретении (например, в составе вакцины в сочетании с антителами против С.ГО27 по изобретению) включают, например, антигены инфекционных заболеваний и опухолевые антигены, против которых желательны защитные или терапевтические иммунные реакции, например, антигены, экспрессируемые опухолевой клеткой или патогенным организмом, или антигены инфекционных заболеваний. Например, подходящие антигены включают опухоле-ассоциированные антигены для профилактики или лечения рака. Примеры опухоле-ассоциированных антигенов включают последовательности, полностью или частично содержащие последовательности рНСС. др100 или Рте117, НЕК2/пеи, ^Т1, мезотелин, СЕА, др100, МАКТ1, ТКР-2, те1ап-А, ΝΥ-Ε8Ο-1, ΝΥ-ΒΚ-1, ΝΥ-ΟΟ-58, ΜΝ (др250), набора идиотипических детерминант, МАОЕ-1, МАОЕ-3, МАОЕ-А3, тирозиназы, теломеразы, антигенов 88X2 и МИС1 и опухолевых антигенов эмбрионального происхождения, но не ограничиваются ими. Опухолеассоциированные антигены также включают антигены группы крови, например, антигены Ье^а, Ье^ь, ЬеХ, БеУ, Н-2, Β-1, В-2. В качестве альтернативы, в конструкты антиген-антитело по изобретению можно включать более одного антигена. Например, антиген МАОЕ можно комбинировать с другими антигенами, например, меланином А, тирозиназой и др100, наряду с такими адъювантами, как ОМ-С8Р и 1Ь-12, и связывать с антителом против АПК.

Другие подходящие антигены включают вирусные антигены для профилактики и лечения вирусных заболеваний. Примеры вирусных антигенов включают антигены Н1У-1 дад, Н1У-1 епу, Н1У-1 пеГ, НВУ (поверхностные или коровью антигены), НРУ, РА8, Н8У-1, Н8У-2, р17, ΟΚΡ2 и ΟΚΡ3, но не ограничиваются ими. Примеры бактериальных антигенов включают Тохор1акта допбн или Тгеропета раШбит, но не ограничиваются ими. Конъюгаты антитело-бактериальный антиген по изобретению можно использовать при лечении и профилактике различных бактериальных заболеваний, например, сибирской язвы, ботулизма, столбняка, хламидиозов, холеры, дифтерии, болезни Лайма, сифилиса и туберкулеза. Другие подходящие антигены возбудителей инфекционных заболеваний, например, вирусов, бактерий, паразитов и грибков, описаны ниже.

Последовательности вышеописанных антигенов хорошо известны в данной области. Например, пример последовательности кДНК МАОЕ-3 представлен в И8 6235525 (ЬцДМд 1пкФи1е Гот Сапсег КекеагсЬ); примеры нуклеотидной и белковой последовательностей ΝΥΈ8Ο-1 представлены в И8 5804381 и и8 6069233 (ЬцДМд 1пкФи1е Гог Сапсег КекеатсЬ); примеры нуклеотидной и белковой последовательностей Ме1ап-А представлены в И8 5620886 и И8 5854203 (ЬцДМд 1пкЬ1и1е Гог Сапсег КекеатсЬ); примеры нуклеотидной и белковой последовательностей ΝΥ-ΒΚ-1 представлены в И8 6774226 и И8 6911529 (ЬцДМд 1и8Йи1е Гог Сапсег КекеатсЬ), а примеры нуклеотидной и белковой последовательностей ΝΥ^Ο58 представлены в νΟ 02090986 (ЬцДдад 1пкФи1е Гог Сапсег КекеатсЬ); пример аминокислотной последовательности белка НЕК-2/пеи доступен в ОЕХВАЫК® под номером доступа ААА58637; а нуклеотидная последовательность (мРНК) ракового эмбрионального антигена-1 человека (СЕА-1) доступна в ОЕХВАЫК® под номером доступа ХМ_020219.

Антиген НРУ, который можно использовать в композициях и способах по изобретению, может включать, например, антиген НРУ-16, антиген НРУ-18, антиген НРУ-31, антиген НРУ-33 и/или антиген НРУ-35, и предпочтительно является антигеном НРУ-16 и/или антигеном НРУ-18. Геном НРУ-16 описан в Уио1оду, 145:181-185 (1985), а последовательности ДНК, кодирующие НРУ-18, описаны в патенте США 5840306, описание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. Антигены НРУ-16 (например, области белков НРУ-16 Е1 и/или Е2, вызывающие серологическую реакцию), описаны в патенте США 6531127, а антигены НРУ-18 (например, области белков НРУ-18 Ь1 и/или Ь2, вызывающие серологическую реакцию), описаны в патенте США 5840306, описания которых включены в настоящий документ посредством ссылки. Аналогично, полный геном НВУ доступен в ОЕХВАМУ®® под номером доступа ΝΟ_θθ3977, описание которого включено в настоящий документ. Геном НСУ описан в европейской патентной заявке № 318216, описание которой включено в настоящий документ. В РСТ/и890/01348, включенном в настоящий документ посредством ссылки, описана информация о кло- 12 024701 нах генома НСУ, аминокислотных последовательностях вирусных белков НСУ и способах изготовления и использования таких композиций в составе НСУ-вакцин, включающих белки НСУ и пептиды, происходящие от них.

Антигенные пептиды, белки (т.е. пептиды и белки, содержащие Т-клеточные эпитопы) можно идентифицировать различными способами, хорошо известными в данной области техники. Например, Тклеточные эпитопы можно предсказать на основе анализа последовательности белка с помощью вебалгоритма для прогнозирования (В1МА§ & 8УРРЕ1ТН1), создавая потенциальные пептиды, связывающие МНС класса I и II, которые соответствуют внутренней базе данных из 10000 хорошо изученных МНСсвязывающих пептидов, определенных ранее с использованием СТЬ. Пептиды с высокими показателями можно классифицировать и выбрать в качестве интересующих на основании высокого сродства к данной молекуле МНС.

Еще один способ идентификации антигенных пептидов, содержащих Т-клеточные эпитопы, заключается в разделении белка на неперекрывающиеся пептиды нужной длины или перекрывающиеся пептиды нужной длины, которые можно получить рекомбинантно, синтетически, или, в некоторых ограниченных случаях, путем химического расщепления белка, и протестировать на иммуногенные свойства, например, способность вызывать Т-клеточный ответ (т.е. пролиферацию или секрецию лимфокинов).

Для определения точных Т-клеточных эпитопов белка, например, с помощью методик точного картирования, пептид, обладающий стимуляторной активностью по отношению к Т-клеткам и, следовательно, содержащий, по меньшей мере, один Т-клеточный эпитоп, согласно методикам Т-клеточной биологии, можно модифицировать путем добавления или удаления аминокислотных остатков на Ν-или Сконце указанного пептида и протестировать на изменение реакционной способности модифицированного пептида по отношению к Т-клеткам. Если установлено, что два или более пептидов, содержащих общую перекрывающуюся область в нативной последовательности белка, обладают стимуляторной активностью по отношению к Т-клеткам человека, согласно методикам Т-клеточной биологии, можно получить дополнительные пептиды, полностью или частично включающие такие пептиды, и протестировать указанные дополнительные пептиды с помощью аналогичной процедуры. Следуя этой методике, осуществляют выбор и получение пептидов рекомбинантным или синтетическим путем. Пептиды выбраны на основании различных факторов, в том числе силы Т-клеточного ответа на пептид (например, индекса стимуляции). Затем можно исследовать физические и химические свойства указанных выбранных пептидов (например, растворимость, стабильность) для определения пригодности этих пептидов для использования в терапевтических композициях, или необходимости модификации этих пептидов.

Термин антигенпрезентирующая клетка или АПК обозначает клетку, на поверхности которой находится чужеродный антиген в комплексе с МНС Т-клетки распознают этот комплекс, используя Тклеточный рецептор (ТСК). Примеры АПК включают дендритные клетки (ДК), мононуклеары периферической крови (МПК), моноциты (например, ТНР-1), В-лимфобластоидные клетки (например, С1К.А2, 1518 В-ЕСЬ) и дендритные клетки моноцитарного происхождения (ДК), но не ограничиваются ими. Некоторые АПК поглощают антигены путем фагоцитоза или рецептор-опосредованного эндоцитоза. Примеры АПК-рецепторов включают лектины С-типа, например, рецептор дендритных и эпителиальных клеток человека 205 (СИ27) и рецептор маннозы макрофагов человека, но не ограничиваются ими.

Термин презентация антигена относится к процессу, посредством которого АПК захватывают антигены и делают возможным их распознавание Т-клетками, например, в качестве компонента конъюгата МНС-Ι и/или МНС-ΙΙ.

Молекулы МНС включают два вида молекул, МНС класса I и МНС класса II. Молекулы МНС класса I, презентируют антиген специфическим СИ8+ Т-клеткам, а молекулы МНС класса II презентируют антиген специфическим СИ4+ Т-клеткам. Внеклеточные антигены обрабатываются АПК в первую очередь путем связывания с МНС класса II. В противоположность этому, внутриклеточные антигены обрабатываются АПК в первую очередь путем связывания с МНС класса I.

Как используется здесь, термин иммуностимулятор включает соединения, способные стимулировать АПК, например, ДК и макрофаги, но не ограничивается ими. Например, подходящие для использования в настоящем изобретении иммуностимуляторы могут стимулировать АПК, ускоряя процесс созревания АПК, усиливая пролиферацию АПК и/или стимулируя рекрутинг или высвобождение костимулирующих молекул (например, СИ80. СИ86. ЮАМ-1, молекул МНС и ССК7) и провоспалительных цитокинов (например, [И-1 β, К-б, ГЕ-12, ГЕ-15 и интерферон-γ). Подходящие иммуностимуляторы также способны усиливать пролиферацию Т-клеток. Такие иммуностимуляторы включают лиганд СИ40; лиганд РЬТ 3; цитокины, например, интерферон-α, интерферон-β, интерферон-γ и !И-2; колониестимулирующие факторы, такие как 0-С8Р (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор) и 0М-С8Р (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор); антитело против СТЬА-4, антитело против ΡΌ1, антитело против 41ВВ или антитело против ОХ-40; ЬР8 (эндотоксин); оцРНК; дцРНК; бациллу Кальмета-Герена (ВС0); левамизола гидрохлорид, а также иммуноглобулины для внутривенного введения, но не ограничиваются ими. В одном из вариантов воплощения иммуностимулятор может представлять собой агонист То11-подобного рецептора (ТЕК). Например, иммуностимулятор может представлять

- 13 024701 собой агонист ТЬК3, например, двуцепочечный полинуклеотид инозин:цитозин (Ροΐγ ЕС, например, доступный как АшрПденТМ от Неш18рЬетх В1рЬагта, штат Пенсильвания, США или Ροΐγ ГОЬС от ΟικονίΓ) или Ροΐγ А:И; агонист ТЬК4, например, монофосфориллипид (МРЬ) или КС-529 (например, доступный от О8К, Великобритания); агонист ТЬК5, например, флагеллин; агонист ТЬК7 или ТЬК8, например, имидазохинолин, агонист ТЬК7 или ТЬК8, например, имиквимод (например, АМатаТМ) или резиквимод и родственные имидазохинолину агенты (например, доступные от 3М Сο^рο^аΐ^οη)· или агонист ТЬК 9, например, дезоксинуклеотид с неметилированными СрО-мотивами (так называемые СрО, например, доступные от СЫеу РЬагшасеийсаД. Предпочтительным иммуностимулятором является агонист ТЬК3, предпочтительно Ρο1у ЕС. Такие иммуностимуляторы можно вводить одновременно, раздельно или последовательно с антителами и конструктами по настоящему изобретению, а также можно физически связывать с указанными антителами и конструктами.

Как используется здесь, термин связанный относится к объединению двух или более молекул. Указанная связь может быть ковалентной или нековалентной. Указанная связь также может быть генетической (т.е. компоненты могут быть объединены рекомбинантным путем). Такую связь можно получить, используя широкий спектр методик, принятых в данной области техники, например, химическое конъюгирование и продуцирование рекомбинантного белка.

Как используется здесь, термин перекрестная презентация антигена относится к презентации экзогенных белковых антигенов Т-клеткам через молекулы МНС класса Ι и класса ΙΙ на АПК.

Как используется здесь, термин ответ, опосредованный Т-клетками относится к любому ответу, опосредованному Т-клетками, в том числе эффекторными Т-клетками (например, СЭ8+-клетками) и Тхелперами (например, СЭ4+-клетками). Ответы, опосредованные Т-клетками, включают, например, Тклеточную цитотоксичность и пролиферацию Т-клеток.

Как используется здесь, термин ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (СТЬ) относится к иммунному ответу, индуцированному цитотоксическими Т-клетками. СТЬ-ответы опосредуются главным образом СЭ8+ Т-клетками.

Как используется здесь, термины ингибирует или блокирует (например, по отношению к ингибированию/блокированию связывания СЭ70 с СЭ27 на поверхности клеток) используются на равных основаниях и охватывают как частичное, так и полное ингибирование/блокирование. Ингибирование/ блокирование СЭ70 предпочтительно снижает или изменяет нормальный уровень или тип активности, имеющий место при связывании с СЭ70 при отсутствии ингибирования или блокирования. Предполагается, что ингибирование и блокирование также включают любое измеримое снижение сродства связывания СЭ70 при контакте с антителом против СЭ27 по сравнению с СО70, не находящимся в контакте с антителом против СО27, например, ингибирование связывания СО70, по меньшей мере, приблизительно на 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%. В предпочтительном варианте воплощения антитело против СЭ27 ингибирует связывание 0070, по меньшей мере, приблизительно на 70%. В еще одном варианте воплощения антитело против СЭ27 ингибирует связывание СЭ70 по меньшей мере приблизительно на 80%.

Как используется здесь, предполагается, что термин подавляет рост (например, по отношению к клеткам) включает любое измеримое снижения роста клеток, например, подавление роста клеток, по меньшей мере, приблизительно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 99 или 100%.

Термины индукция иммунного ответа и повышение иммунного ответа используются на равных основаниях и относятся к стимуляции иммунного ответа (т.е. пассивного или адаптивного) на конкретный антиген. Термин индуцировать, используемый по отношению к индукции СЭС или АЭСС, относится к стимуляции конкретных механизмов прямого уничтожения клеток. Например, в одном из вариантов воплощении, антитело в концентрации 10 мкг/мл индуцирует, по меньшей мере, приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60% лизис клеток, экспрессирующих СО27, за счет СЭС. В предпочтительном варианте воплощения антитело в концентрации 10 мкг/мл индуцирует, по меньшей мере, приблизительно 40% лизис клеток, зкспрессирующих СП27, за счет СЭС. В еще одном варианте воплощения антитело в концентрации 10 мкг/мл индуцирует, по меньшей мере, приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 или 85% лизис клеток, экспрессирующих СО27, за счет АЭСС (т.е. специфический лизис). В предпочтительном варианте воплощения антитело в концентрации 10 мкг/мл индуцирует, по меньшей мере, приблизительно 40% лизис клеток, экспрессирующих СП27, за счет АЭСС.

Термины лечить и лечение, как используются здесь, относятся к терапевтическим или профилактическим мерам, описанным здесь. Способы лечения включают введение в организм субъекта, нуждающегося в таком лечении, антитела человека по настоящему изобретению, например, в организм субъекта, нуждающегося в усиленном иммунном ответе против определенного антигена, или субъекта, у которого в конечном счете может развиться такое расстройство, в целях предотвращения, лечения, задержки, снижения тяжести или улучшения одного или нескольких симптомов расстройства или рецидивирующего расстройства, или для повышения продолжительности жизни субъекта по сравнению с ожидаемой продолжительностью жизни при отсутствии такого лечения.

Термин эффективная доза или эффективная дозировка определяется как количество, достаточное для достижения или, по меньшей мере, частичного достижения желательного эффекта. Термин те- 14 024701 рапевтически эффективная доза определяется как количество, достаточное для лечения или, по меньшей мере, частичного замедления развития заболевания и его осложнений у пациента, уже страдающего этим заболеванием. Количество, эффективное для этой цели, зависит от тяжести расстройства, подвергаемого лечению, и общего состояния иммунной системы пациента.

Термин пациент включает в себя человека и других субъектов-млекопитающих, которые получают профилактическое или терапевтическое лечение.

Как используется здесь, термин субъект включает человека или любое животное, не являющееся человеком. Например, способы и композиции по настоящему изобретению можно использовать для лечения субъекта, страдающего иммунным расстройством. Термин животное, не являющееся человеком включает всех позвоночных, например, млекопитающих и позвоночных, не являющихся млекопитающими, например, приматов, не являющихся человеком, овец, собак, коров, кур, амфибий, рептилий и т.д.

Различные аспекты изобретения более подробно описаны в следующих подразделах.

I. Получение антител к СЭ27.

Настоящее изобретение включает антитела, например, полностью человеческие антитела, связывающиеся с СЭ27. например, СЭ27 человека. Типичные моноклональные антитела, связывающиеся с СЭ27, включают 1Р5, 1Н8, 3Н12, 3А10, 2С2, 209, 3Н8 и 105. Моноклональные антитела по изобретению можно получить с помощью множества известных методик, например, стандартной методики гибридизации соматических клеток, описанной в работе КоЫет апб Мйк!еш, Ыа!иге 256: 495 (1975). Хотя предпочтительными являются процедуры гибридизации соматических клеток, в принципе, также можно использовать другие методики получения моноклональных антител, например, вирусную или онкогенную трансформацию В-лимфоцитов, технологию фагового дисплея с использованием библиотеки генов антител человека.

Соответственно, в одном из вариантов воплощения для получения антитела, связывающего СО27 человека, используют технологию гибридом. Согласно этому способу мышь или другое подходящее животное-носитель можно иммунизировать подходящим антигеном с целью выделения лимфоцитов, продуцирующих или способных продуцировать антитела, специфически связывающиеся с антигеном, использованным для иммунизации. В качестве альтернативы лимфоциты можно иммунизировать ίη νίίτο. Затем лимфоциты можно слить с миеломными клетками с помощью подходящего агента, вызывающего слияние клеток, например, полиэтиленгликоля, получая клетку гибридомы (Οοάίη§, Мопос1опа1 ΛηΙίόοά1ек: Ргтщр1ек апб Ртасйсе, рр. 59-103 (Асабетю Ргекк, 1986)). Культуральную среду, в которой растут клетки гибридомы, анализируют на продукцию моноклональных антител против заданного антигена. После того, как установлено, что клетки гибридомы продуцируют антитела, обладающие желательной специфичностью, сродством и/или активностью, клоны можно субклонировать, используя способ серийных разведений, и вырастить с помощью стандартных способов (0обш§, Мопос1опа1 АпйЬоШек: Ртшшр1ек апб Ртасйсе, рр. 59-103 (Асабетю Ргекк, 1986)). Подходящие для этих целей культуральные среды включают, например, среду Ό-МЕМ или РРМ1-1640. Кроме того, клетки гибридомы можно вырастить ш νί\Ό в организме животного в виде асцитной опухоли. Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно отделить от культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки с помощью стандартных процедур очистки иммуноглобулинов, например, гель-фильтрации на белок А-сефарозе, хроматографии на гидроксиапатите, гель-электрофореза, диализа или аффинной хроматографии.

В еще одном варианте воплощения антитела или фрагменты антител, связывающие СО27 человека, можно выделить из фаговых библиотек антител, полученных с использованием методик, описанных, например, в статье МсСайейу е! а1., Ха!иге, 348:552-554 (1990). С1асккоп е! а1., Ха!иге, 352:624-628 (1991), Магкк е! а1., 1. Мо1. Вю1., 222:581-597 (1991) и Ное! е! а1 (2005) Ха!иге Вю!есйпо1о§у 23, 344-348; патентах США 5223409; 5403484; и 5571698, принадлежащих Ьабпет е! а1.; патентах США 5427908 и 5580717, принадлежащих Эо\уег е! а1.; патентах США 5969108 и 6172197, принадлежащих МсСайеПу е! а1.; и патентах США 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081, принадлежащих ОтШййк е! а1.. Кроме того, можно использовать получение высокоаффинных (в диапазоне нМ) антител человека путем перетасовки цепей (Магкк е! а1., Вю/Тесйпо1о§у, 10:779-783 (1992)), а также комбинаторную инфекцию и рекомбинацию ш νί\Ό в качестве стратегий конструирования очень крупных фаговых библиотек (^а!етйоике е! а1., Ыис. Ашбк. Кек., 21:2265-2266 (1993)).

В конкретном варианте осуществления антитело, связывающее 0027 человека, получают с помощью методики фагового дисплея, описанной Ное! е! а1., кирга. Эта методика включает получение библиотеки РаЬ человека, содержащей уникальную комбинацию последовательностей иммуноглобулинов, выделенных из материала, полученного от доноров-людей и характеризующихся сгенерированным синтетическим разнообразием СОК тяжелых цепей. Затем осуществляют скрининг библиотеки в поисках РаЬ, связывающихся с СЭ27 человека.

Предпочтительная система животного для создания гибридом, продуцирующих антитела по изобретению, представляет собой систему мыши. Получение гибридом мыши хорошо известно в данной области техники, включая протоколы иммунизации и методики выделения и слияния иммунизированных спленоцитов.

В одном из вариантов воплощения антитела против СЭ27 получают с использованием трансгенных

- 15 024701 или трансхромосомальных мышей, несущих фрагменты иммунной системы человека, а не мыши. В одном из вариантов воплощения изобретения используют трансгенных мышей, называемых здесь НиМАЪмышами, несущих мини-локусы генов иммуноглобулинов человека, кодирующих не подвергавшиеся реаранжировке последовательности тяжелых (μ- и γ-) и легких κ-цепей иммуноглобулинов наряду с адресными мутациями, инактивирующими эндогенные локусы μ- и κ-цепей (ЬопЪетд, Ν. е! а1. (1994) №-Цигс 368(6474): 856-859). Соответственно, указанные мыши демонстрируют пониженную экспрессию 1дМ или к мыши и, в ответ на иммунизацию, внедренные трансгены тяжелых и легких цепей подвергаются переключению классов и соматической мутации, что позволяет генерировать высокоаффинные моноклональные 1д0к-антитела человека (ЬопЪетд, Ν. е! а1. (1994), кирга; обзор ЬопЪетд, N. (1994) НапбЪоок оГ Ехрептеп1а1 Рйаттасо1оду 113:49-101; ЬопЪетд, Ν. апб Ни5/аг, Ό. (1995) 1п!егп. Κ£ν. 1ттипо1. Уо1. 13:6593, и Натбшд, Р. апб ЬопЪетд, N. (1995) Апп. Ν.Υ. Асаб. δα 764:536-546). Получение НиМАЪ-мышей подробно описано в разделе II ниже и в работах Тау1ог, Ь. е! а1. (1992) ШсШс Лабк Кекеатсй 20:6287-6295; СНеп, 1. е! а1. (1993) 1п!егпайопа1 1ттипо1оду 5: 647-656; ТиаШоп е! а1. (1993) Ргос. №Ш. Асаб. δα ИЗА 90:3720-3724; С1ю1 е! а1. (1993) ХаПие СепеПск 4:117-123; Сйеп, 1. е! а1. (1993) ЕМВО 1. 12: 821-830; Тиаб1оп е! а1. (1994) 1. 1ттипо1. 152:2912-2920; ЬопЪетд е! а1., (1994) Ха!иге 368(6474): 856-859; ЬопЪетд, Ν. (1994) НапбЪоок оГ Ехрептеп!а1 Рйаттасо1оду 113:49-101; Тау1ог, Ь. е! а1. (1994) 1п!етпабопа1 1ттипо1оду 6: 579-591; ЬопЪетд, Ν. апб Ни5/аг, Ό. (1995) 1п!егп. Кем. 1ттипо1. Уо1. 13:65-93; Натбшд, Р. апб ЬопЪетд, Ν. (1995) Апп. Ν.Υ. Асаб. δα 764:536-546; Икйцбб, Ό. е! а1. (1996) Ν!ωΌ В1о!есйпо1оду 14: 845-851. Кроме того, см. патенты США 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429, принадлежащие ЬопЪетд апб Кау и 0епРЬатт 1п!етпа!юпа1; патент США 5545807, принадлежащий на Зиташ е! а1.; международные публикации \¥О 98/24884, опубликованную 11 июня 1998 г.; \¥О 94/25585, опубликованную 10 ноября 1994 г.; \¥О 93/1227, опубликованную 24 июня 1993 г.; \¥О 92/22645, опубликованную 23 декабря 1992 г.; \¥О 92/03918, опубликованную 19 марта 1992 г.

Иммунизация

Для получения полностью человеческих антител к СЭ27 трансгенных или трансхромосомальных мышей, несущих гены иммуноглобулинов человека (например, мышей НСо12, НСо7 или КМ), можно иммунизировать очищенным или обогащенным препаратом антигена СЭ27 и/или клеток, экспрессирующих ί'.Ό27. как описано, например, в ЬопЪетд е! а1. (1994) №11иге 368(6474): 856-859; Р18йто1б е! а1. (1996) НаЦие В1о!есЬпо1оду 14: 845-851 и \¥О 98/24884. Как описано здесь, НиМАЪ-мышей иммунизировали рекомбинантными белками СЭ27 или клетками линий, экспрессирующих СЭ27, в качестве иммуногенов. В качестве альтернативы, мышей можно иммунизировать ДНК, кодирующей СЭ27 человека. Предпочтительно, для первого вливания использовали мышей возрастом 6-16 недель. Например, для внутрибрюшинной иммунизации НиМАЪ-мышей можно использовать очищенный или обогащенный препарат (5-50 мкг) рекомбинантного антигена СЭ27. В случае, если иммунизация с использованием очищенного или обогащенного препарата антигена СЭ27 не приводит к продукции антител, для стимуляции иммунного ответа мышей также можно иммунизировать клетками, экспрессирующими СЭ27, например, линией клеток. Типичные линии клеток включают СЭ27-сверхэкспрессирующие стабильные линии клеток СНО и Раджи.

Опыт, накопленный при использовании различных антигенов, показал, что наилучший ответ у трансгенных НиМАЪ-мышей развивался при первоначальной внутрибрюшинной (в/б) или подкожной (п/к) иммунизации антигеном в полном адъюванте Фрейнда с последующей в/б/п/к иммунизацией раз в две недели (в общей сложности до 10 раз) антигеном в неполном адъюванте Фрейнда. Иммунный ответ можно отслеживать в течение курса иммунизации, используя образцы плазмы, полученные путем ретроорбитального отбора крови. Скрининг плазмы можно осуществлять с помощью ЕЫЗА (как описано ниже), и мышей с достаточными титрами иммуноглобулина человека против СЭ27 можно использовать для слияния. Мышей можно дополнительно стимулировать внутривенными инъекциями антигена за 3 суток до умерщвления и удаления селезенки.

Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к СИ27

Для создания гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к СЭ27, можно выделить клетки селезенки и лимфатических узлов иммунизированных мышей и слить их с клетками соответствующих иммортализованных линий, например, клетками миеломной линии мыши. Полученные гибридомы можно подвергнуть скринингу на продукцию антиген-специфических антител. Например, суспензии одиночных лимфоцитов селезенки иммунизированных мышей можно слить с клетками несекретирующей миеломной линии мыши ЗР2/0-Ад8,653 (АТСС, СКЬ 1580) с 50% ПЭГ (мас./об). Клетки можно высеять в количестве приблизительно 1х10⁵ на плоскодонные титрационные микропланшеты с последующим инкубированием в течение двух недель в селективной среде, содержащей, помимо обычных реагентов, 10% эмбриональной сыворотки для клонирования, 5-10% фактора для клонирования гибридом Опдеп (10Е№) и IX НАТ (З1дта). Спустя приблизительно две недели клетки можно культивировать в среде, в которой НАТ заменили на НТ. Затем можно выполнить скрининг отдельных лунок с помощью ЕЫЗА на моноклональные 1дМ- и 1д0-антитела человека против СЭ27 или на связывание с поверхностью клеток, экспрессирующих СЭ27, например, клеток линии СНО, экспрессирующих СЭ27, с помощью твердофазного

- 16 024701 флуоресцентного иммуноанализа. После возникновения экстенсивного роста гибридом среду можно наблюдать, как правило, спустя 10-14 суток. Гибридомы, секретирующие антитела, можно пересеять, подвергнуть повторному скринингу и, при подтверждении положительного результата анализа 1дС, по меньшей мере, дважды субклонировать моноклональные антитела против СЭ27 с помощью серийных разведений. Затем можно культивировать стабильные субклоны ш уйго, получая антитела в среде тканевой культуры для оценки их характеристик.

Получение трансфектом, продуцирующих моноклональные антитела к СБ27

Антитела по изобретению также можно продуцировать в трансфектоме клетки-хозяина, используя, например, сочетание технологии рекомбинантных ДНК и методик трансфекции генов, хорошо известных в данной области (Моткои, δ. (1985) δ^ι^ 229:1202).

Например, в одном из вариантов воплощения, ген(ы), интересующие исследователя, например, гены антитела человека, можно лигировать в экспрессирующий вектор, например, в эукариотическую экспрессирующую плазмиду, например, плазмиду, используемую в системе экспрессии генов Οδ, описанную в \νϋ 87/04462, \νϋ 89/01036 и ЕР 338841 или других зкспрессирующих системах, хорошо известных в данной области техники. Очищенную плазмиду с клонированными генами антитела можно внедрить в эукариотические клетки-хозяева, например, СНО-клетки или №О-клетки или, в качестве альтернативы, другие зукариотические клетки типа клеток растительного происхождения, клеток грибов и дрожжей. Способ, используемый для внедрения этих генов, может представлять собой способ, описанный в данной области, например, электропорацию, липофектин, липофектамин или др. После внедрения указанных генов антител в клетки-хозяева можно идентифицировать и выделить клетки, экспрессирующие антитела. Эти клетки представляют собой трансфектомы, в которых затем можно усилить уровень экспрессии и использовать для широкомасштабного продуцирования антител. Затем можно выделить рекомбинантные антитела и очистить их от надостадочной культуральной жидкости и/или клеток.

В качестве альтернативы указанные клонированные гены антител можно экспрессировать в других экспрессирующих системах, например, Е. сой или полных организмах или экспрессировать синтетически.

Использование неполных последовательностей антител для экспрессии интактных антител

Антитела взаимодействуют с антигенами-мишенями преимущественно через аминокислотные остатки, расположенные в шести гипервариабельных областях (СОК) тяжелых и легких цепей. По этой причине аминокислотные последовательности в пределах СОК в большей степени различаются между отдельными антителами, чем последовательности за пределами СОК. Поскольку последовательности СОК отвечают за большинство взаимодействий антитело-антиген, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, имитирующие свойства специфических природных антител, путем конструирования экспрессирующих векторов, включающих последовательности СОК специфических природных антител, пересаженные на каркасные последовательности другого антитела с другими свойствами (см., например, Кзесйтаии, Ь. еί а1., 1998, №Циге 332:323-327; 1оие8, Р. еί а1., 1986, №Шге 321:522-525; и Онееи, С. еί а1., 1989, Ргос. №·ιΐ1. Асаб. δее. υ.δ.Α. 86:10029-10033). Такие каркасные последовательности можно получить из общедоступных баз данных ДНК, которые включают последовательности генов антител эмбрионального типа. Эти последовательности эмбрионального типа отличаются от последовательностей генов зрелых антител, потому что они не содержат полностью собранных вариабельных генов, которые формируются путем объединения во время созревания В-клетки. Последовательности генов эмбрионального типа также равномерно отличаются от последовательностей высокоаффинных антител вторичного иммунного репертуара организма на всем протяжении вариабельной области. Например, соматические мутации сравнительно редко встречаются в ^концевой части каркасной области. Например, соматические мутации сравнительно редко встречаются в ^концевой части каркасной области 1 и Сконцевой части каркасной области 4. Кроме того, многие соматические мутации не приводят к существенным изменениям связывающих свойств антитела. По этой причине нет необходимости получать полную последовательность ДНК конкретного антитела для воссоздания интактного рекомбинантного антитела, обладающего связывающими свойствами, аналогичными свойствам исходного антитела (см. РСТ/υδ 99/05535, поданную 12 марта 1999 г.). Частичная последовательность тяжелой и легкой цепи, перекрывающая области СОК, обычно является достаточной для этой цели. Указанную частичную последовательность используют для определения генов вариабельных и соединительных сегментов эмбрионального типа, присутствующих в составе вариабельных генов рекомбинированного антитела. Затем для восполнения недостающих фрагментов вариабельных областей используют последовательности эмбрионального типа. Лидерные последовательности тяжелых и легких цепей расщепляются во время созревания белка и не вносят вклада в свойства окончательного антитела. Для добавления недостающих последовательностей можно сочетать клонированные кДНК-последовательности с синтетическими олигонуклеотидами путем лигирования или ПЦР-амплификации. В качестве альтернативы, полную вариабельную область можно синтезировать в виде набора коротких перекрывающихся олигонуклеотидов и объединить с помощью ПЦР-амплификации, создавая полный синтетический клон вариабельной области. Этот способ обладает определенными преимуществами, например, возможностью удаления или внедрения определенных сайтов рестрикции или оптимизации определенных кодонов.

- 17 024701

Для формирования набора перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов для создания синтетических У-последовательностей с аминокислотной кодирующей емкостью, аналогичной природным последовательностям, используют нуклеотидные последовательности транскриптов тяжелых и легких цепей гибридомы. Последовательности синтетических последовательностей тяжелой и каппа-цепей могут отличаться от природных последовательностей по трем признакам: последовательности повторяющихся нуклеиновых оснований прерываются для облегчения синтеза олигонуклеотидов и ПЦРамплификации; внедрены оптимальные сайты инициации трансляции в соответствии с правилами Козака (Ко/ак, 1991, 1. ΒίοΙ. Скет. 266:19867-19870), и сконструированы сайты ΗίηάΙΙΙ выше сайтов инициации трансляции.

Для вариабельных областей как тяжелых, так и легких цепей последовательности оптимизированной кодирующей и соответствующей некодирующей цепей разделены на 30-50 нуклеотидов в области середины соответствующего некодирующего олигонуклеотида. Таким образом, для каждой цепи указанные олигонуклеотиды можно собрать в наборы перекрывающихся двуцепочечных последовательностей, охватывающих сегменты из 150-400 нуклеотидов. Затем указанные пулы используют в качестве матриц для получения продуктов ПЦР-амплификации длиной 150-400 нуклеотидов. Как правило, один набор олигонуклеотидов вариабельной области делят на два пула, которые раздельно амплифицируют, получая два перекрывающихся продукта ПЦР. Указанные перекрывающиеся продукты затем объединяют с помощью ПЦР-амплификации, формируя полную вариабельную область. Кроме того, при ПЦРамплификации может быть желательно включить перекрывающийся фрагмент константной области тяжелой или легкой цепи (включая сайт ВЬ§1 легкой каппа-цепи или сайт Аде1, тяжелой гамма-цепи) для создания фрагментов, которые можно легко клонировать в конструктах экспрессирующих векторов.

Реконструированные вариабельные области тяжелых и легких цепей затем объединяют с клонированным промотором, лидерной последовательностью, последовательностью инициации трансляции, лидерной последовательностью, константной областью, З'-нетранслируемой последовательностью, последовательностью полиаденилирования и последовательностью терминации транскрипции, формируя конструкт экспрессирующего вектора. Экспрессирующие конструкты тяжелых и легких цепей можно объединить в единый вектор, совместно трансфицировать, последовательно трансфицировать или раздельно трансфицировать в клетки-хозяева, которые затем сливают, образуя клетки-хозяева, экспрессирующие обе цепи.

Плазмиды для конструирования экспрессирующих векторов сконструированы так, что ПЦРамплифицированные У-последовательности кДНК тяжелых и легких каппа-цепей можно использовать для реконструирования полных минигенов тяжелой и легкой цепи. Указанные плазмиды можно использовать для экспрессии полностью человеческих 1§С1к- или 1§С4к-антител. Полностью человеческие и химерные антитела по настоящему изобретению также включают антитела 1§С2, 1дС3, 1дЕ, 1дА, 1дМ и 1дЭ. Аналогичные плазмиды можно сконструировать для экспрессии других изотипов тзгжелых цепей или для экспрессии антител, содержащих легкие лямбда-цепи.

Так, в еще одном аспекте изобретения, структурные особенности антител против СЭ27 по изобретению использовали для создания близких по структуре антител против СЭ27, сохраняющих, по меньшей мере, одно функциональное свойство антител по изобретению, например, (1) ингибирующих (например, полностью или частично блокирующих) связывание СЭ70 с клетками, экспрессирующими СЭ27, по меньшей мере, приблизительно на 70% (например, по меньшей мере, приблизительно на 70% или, по меньшей мере, на 70% при концентрации антител 10 мкг/мл);

(2) связывающихся с СЭ27 человека с равновесной константой диссоциации Кб, равной 10^-9 М или менее, или, в качестве альтернативы, с равновесной константой ассоциации Ка, равной 10+⁹ М^-1 или более;

(3) индуцирующих, по меньшей мере, приблизительно 30% комплемент-опосредованную цитотоксичность (СЭС) клеток, экспрессирующих СЭ27, в концентрации 10 мкг/мл (или индуцирующих, по меньшей мере, 30% или, по меньшей мере, приблизительно 40% или, по меньшей мере, 40% СЭС клеток, экспрессирующих СЭ27, в концентрации 10 мкг/мл);

(4) индуцирующих, по меньшей мере, приблизительно 30% специфический АЭСС-опосредованный лизис клеток, экспрессирующих СЭ27, в концентрации 10 мкг/мл (или индуцирующих, по меньшей мере, 30% или, по меньшей мере, приблизительно 40% или, по меньшей мере, 4 0% специфический АЭССопосредованный лизис клеток, экспрессирующих СЭ27, в концентрации 10 мкг/мл);

(5) предотвращающих или подавляющих рост опухолевых клеток, экспрессирующих СЭ27, на модели ксенотрансплантата (например, уменьшающих размер опухоли у мышей с тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью (ТКИН), по меньшей мере, приблизительно на 50% через 20 суток после инокуляции опухолевых клеток ίη νίνο при внутрибрюшинном введении 0,5 мг, по меньшей мере, на 6 сутки);

(6) вызывающих или усиливающих антиген-специфические иммунные реакции в сочетании с вакциной или другим антигеном;

(7) вызывающих или усиливающих иммунный ответ, в частности, иммунный ответ ТН1, но, не ограничиваясь им;

- 18 024701 (8) индуцирующих или усиливающих Т-клеточную активность, в частности, количество или функциональную активность специфических С.О8+ Т-клеток, или пролиферацию или активацию Т-клеток, но не ограничиваясь ими; и / или (9) ослабляющих или ингибирующих пролиферацию или активацию Т-клеток.

В одном из вариантов воплощения одну или несколько СЭР-областей антител по изобретению можно рекомбинантно объединить с известными каркасными областями и СОК, создавая дополнительные рекомбинантные антитела против СО27 по изобретению. Вариабельные каркасные области тяжелой и легкой цепи могут происходить от одних и тех же или различных последовательностей антител. Последовательности антител могут представлять собой последовательности природных антител или консенсусные последовательности нескольких антител. См. Ке!!1еЬогоидй е! а1., Рго!еш Епдшеегшд 4:773 (1991); Ко1Ьш§ег е! а1., Рго!еш Епдшеегшд 6:971 (1993) и Сайег е! а1., \7О 92/22653.

Соответственно, в еще одном варианте воплощения настоящее изобретение представляет способ получения антител против СЭ27, включающий: получение антитела, в том числе (1) каркасных областей тяжелых цепей и СОК тяжелых цепей, причем, по меньшей мере, один из СОК тяжелых цепей включает аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей СОК, представленных в 8ЕЦ ГО N0:8, 9, 10, 26, 27, 28, 38, 39, 40, 50, 51, 52, 62, 63, 64, 74, 75, 76, 86, 87, 88, 104, 105, 106; и (2) каркасных областей легких цепей и СОК легких цепей, причем, по меньшей мере, один из СОК легких цепей включает аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей СОК, представленных в 8ЕЦ ГО N0:14, 15, 16, 20, 21, 22, 32, 33, 34, 44, 45, 46, 56, 57, 58, 68, 69, 70, 80, 81, 82, 92, 93, 94, 98, 99, 100, 110, 111, 112; причем указанное антитело сохраняет способность связываться с С.О27. Способность антитела связывать СГО27 можно определить с помощью стандартных анализов связывания, например, изложенных в примерах (например, ЕЬ18А или твердофазного флуоресцентного иммуноанализа).

В данной области техники известно, что СОК3-домены тяжелых и легких цепей антител играют особенно важную роль в специфичности/сродстве связывания антитела с антигеном (см. На11 е! а1., ί. 1типо1., 149:1605-1612 (1992); Ро1утеш8 е! а1., I. 1ттипо1., 152:5318-5329 (1994); .Тайп е! а1., 1ттипоЬю1., 193:400-419 (1995); Кйтка е! а1., Вгй. I. Сапсег, 83:252-260 (2000); ВеЛоег е! а1., I Мо1. Вю1, 296:833-849 (2000); Кабег е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А, 95:8910-8915 (1998); ВагЬак е! а1., I. Ат. Сйет. §ос., 116:2161-2162 (1994); 0Пхе1 е! а1., I. 1ттипо1., 157:739-749 (1996)). Соответственно, рекомбинантные антитела по изобретению, изготовленные, как указано выше, предпочтительно содержат СОК3 тяжелых и/или легких цепей антител 1Р5, 1Н8, 3Н12, 3А10, 2С2, 209, 3Н8 и 105. Кроме того, указанные антитела могут содержать СЭК2 антител 1Р5, 1Н8, 3Н12, 3А10, 2С2, 209, 3Н8 и 105. Кроме того, указанные антитела могут содержать СОК1 антител 1Р5, 1Н8, 3Н12, 3А10, 2С2, 209, 3Н8 и 105. Кроме того, антитела могут содержать любые комбинации указанных СОК.

Соответственно, в еще одном варианте воплощения, изобретение также представляет антитела против 0027, содержащие: (1) каркасные области тяжелых цепей, СОК1-область тяжелой цепи, СОК2область тяжелой цепи и СОК3-область тяжелой цепи, причем СОК3-область тяжелой цепи выбирают из СОК3 1Р5, 1Н8, 3Н12, 3А10, 2С2, 209, 3Н8 и 105, и (2) каркасные области легких цепей, СОК1-область легкой цепи, С0К2-область легкой цепи и С0К3-область легкой цепи, причем С0К3-область легкой цепи выбирают из СОК3 1Р5, 1Н8, 3Н12, 3А10, 2С2, 209, 3Н8 и 105, причем антитело связывает СО27. Антитело может дополнительно включать СОК2 тяжелых цепей и/или СОК2 легких цепей антител 1Р5, 1Н8, 3Н12, 3А10, 2С2, 209, 3Н8 и 105. Антитело может дополнительно содержать СОК1 тяжелых цепей и/или СОК1 легких цепей антител 1Р5, 1Н8, 3Н12, 3А10, 2С2, 209, 3Н8 и 105.

Получение антител с модифицированными последовательностями

В еще одном варианте воплощения последовательности вариабельных областей антител против СО27 или их фрагменты по изобретению модифицируют, создавая близкие по структуре антитела против СО27, которые сохраняют связывающую способность (т.е. с тем же эпитопом, что и немодифицированные антитела) и, таким образом, являются функционально эквивалентными. Способы идентификации остатков, которые можно изменить без потери способности связывать антиген, хорошо известны в данной области техники (см., например, Магкк е! а1. (Вю!есйпо1о§у (1992) 10(7):779-83 (диверсификация моноклональных антител путем перетасовки вариабельных областей легкой цепи, а затем вариабельных областей тяжелой цепи при фиксированных изменениях последовательности СОК3), 1е8рег8 е! а1.(1994) Вю!есйпо1о§у 12(9):899-903 (выбор антител человека из репертуара фагового дисплея к единичному эпитопу антигена), 8йагоп е! а1. (1986) РNА§ И8А 83(8):2628-31 (сайт-направленный мутагенез инвариантного аминокислотного остатка в положении соединения вариабельного и дополнительного сегментов антитела); Са88оп е! а1. (1995) ί. 1ттипо1. 155(12):5647-54 (эволюция утраты и изменения специфичности в результате случайного мутагенеза вариабельной области тяжелой цепи антитела).

Соответственно, в одном из аспектов настоящего изобретения области СОК1, 2 и/или 3 вышеописанных сконструированных антител могут содержать точную(ые) аминокислотную(ые) последовательность(и) антител 1Р5, 1Н8, 3Н12, 3А10, 2С2, 209, 3Н8 и 105, описанных здесь. Вместе с тем, в других аспектах настоящего изобретения антитела содержат производные от точных последовательностей СОК 1Р5, 1Н8, 3Н12, 3А10, 2С2, 209, 3Н8 и 105, сохраняя способность эффективно связывать СО27. Такие

- 19 024701 модификации последовательности могут включать добавление, делецию или замену одной или более аминокислот, например, консервативные модификации последовательности, как описано выше. Модификации последовательностей также могут основываться на консенсусных последовательностях, описанных выше для конкретных последовательностей СОК1, СЭР2 и СЭР3 антител 1Р5, 1Н8, 3Н12, 3А10, 2С2, 2С9, 3Н8 и 1С5.

Соответственно, в еще одном варианте воплощения сконструированное антитело может содержать один или более СОК, являющихся, например, на 90, 95, 98 или 99,5% идентичными одному или более СОК антител 1Р5, 1Н8, 3Н12, 3А10, 2С2, 2С9, 3Н8 и 1С5. Подразумевается, что промежуточные диапазоны вышеуказанных значений, например, СОК, на 90-95%, 95-98%, 90-95% или 98-100% идентичные одной или более из вышеупомянутых последовательностей, также входят в объем настоящего изобретения.

В еще одном варианте воплощения можно изменить один или несколько остатков в составе СОК, модифицируя характеристики связывания с целью получения более благоприятной скорости ассоциации, более благоприятной скорости диссоциации или обеих этих характеристик, так что достигается оптимальная константа связывания. При использовании этой стратегии можно получить антитело со сверхвысоким сродством связывания, равным, например, 10¹⁰ М^-1 или более. Для модификации СОКобласти(ей) можно использовать методики созревания аффинности, хорошо известные в данной области техники и описанные здесь, с последующим скринингом полученных связывающих молекул на желательные изменения характеристик связывания. Соответственно, после модификации СОК можно отслеживать и оценивать изменения сродства связывания, а также иммуногенности, получая антитело, оптимизированное по наилучшему сочетанию связывающей способности и низкой иммуногенности.

В дополнение к или вместо модификаций в пределах СОК, также можно внести модификации в пределах одной или более каркасных областей РК1, РК2, РК3 и РК4 вариабельных областей тяжелой и/или легкой цепи антитела, при условии, что эти модификации не устраняют сродства связывания антитела. Например, один или более аминокислотный остаток неэмбрионального типа в каркасных вариабельных областях тяжелой цепи и/или легкой цепи антитела по изобретению замещают аминокислотным остатком эмбрионального типа, т.е. соответствующим аминокислотным остатком последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи человека эмбрионального типа, которая в значительной степени идентична последовательности указанного антитела. Например, цепь антитела и цепь антитела эмбрионального типа, для которых характерна значительная идентичность последовательностей, можно выровнять друг с другом и заменить аминокислотные остатки, не совпадающие в каркасной последовательности антитела и в каркасной последовательности эмбрионального типа, соответствующими остатками из последовательности эмбрионального типа. Если аминокислота различается в вариабельной каркасной области антитела и эквивалентной вариабельной каркасной области последовательности эмбрионального типа человека, аминокислоту каркаса антитела обычно следует заменить эквивалентной аминокислотой последовательности эмбрионального типа человека, если имеются основания ожидать, что указанная аминокислота относится к одной из следующих категорий:

(1) аминокислотному остатку, непосредственно связывающему антиген нековалентным образом, (2) аминокислотному остатку, примыкающему к СОК-области, (3) аминокислотному остатку, иным образом взаимодействующему с СОК-областью (например, расположенный в пределах 3-6 А от СОК-области, согласно данным компьютерного моделирования), или (4) аминокислотному остатку, участвующему в контакте Уь-У_Н. Остатки, непосредственно связывающие антиген нековалентным образом, включают аминокислоты в положениях каркасных областей, для которых характерна высокая вероятность непосредственного взаимодействия с аминокислотами антигена посредством известных химических сил, например, водородных связей, сил ван-дер-Ваальса, гидрофобных взаимодействий и т.п. Соответственно, в одном из вариантов воплощения аминокислотный остаток в каркасной области антитела по изобретению заменяют соответствующим аминокислотным остатком эмбрионального типа, который непосредственно связывает антиген нековалентным образом.

Остатки, примыкающие к СОК-области, включают аминокислотные остатки в положениях, непосредственно примыкающих к одному или нескольким СОК первичной последовательности антитела, например, в положениях, непосредственно примыкающих к СОК по Кабату или по СЬо!Ыа (см., например, С1ю11па апй Ьекк 1. Мо1. Вю1. 196:901 (1987)). Соответственно, в одном из вариантов воплощения аминокислотный остаток в каркасной области антитела по изобретению заменяют соответствующим аминокислотным остатком эмбрионального типа, который примыкает к СОК-области.

Остатки, иным образом взаимодействующие с СОК-областью, включают остатки, пространственное расположение которых, согласно анализу вторичной структуры, позволяет им влиять на СОКобласть. Такие аминокислоты, как правило, содержат атом боковой цепи, расположенный в пределах 3 ангстрем (А) от какого-либо атома в составе СОК, и должны содержать атом, который может взаимодействовать с атомами СОК посредством известных химических сил, например, перечисленных выше. Соответственно, в одном из вариантов воплощения аминокислотный остаток в каркасной области антитела по изобретению заменяют соответствующим аминокислотным остатком эмбрионального типа, который

- 20 024701 иным образом взаимодействует с СЭК-областью.

Известно, что аминокислоты в нескольких положениях каркаса важны для определения конформации СИК (например, способны взаимодействовать с СИК) многих антител (СЬо!Ыа апй Ьекк, 8ирта, С1юЙиа е! а1., 8ирга, и Тгатойаио е! а1., 1. Мо1. Βίο1. 215:175 (1990), включенные в настоящий документ посредством ссылок). Эти авторы идентифицировали консервативные остатки каркаса, важные для конформации СИК, с помощью анализа структуры нескольких известных антител. Проанализированные антитела относились к ограниченному количеству структурных или канонических классов, основанных на конформации СИК. Консервативные остатки каркаса, общие для членов канонического класса, называют каноническими остатками. Канонические остатки включают остатки 2, 25, 29, 30, 33, 48, 64, 71, 90, 94 и 95 легкой цепи и остатки 24, 26, 29, 34, 54, 55, 71 и 94 тяжелой цепи. Дополнительные остатки (например, остатки, определяющие структуру СИК) можно идентифицировать согласно методологии Майш апй Тйойои (1996) 1. Мо1. Вю1. 263:800. Примечательно, что аминокислоты в положениях 2, 48, 64 и 71 легкой цепи и 26-30, 71 и 94 тяжелой цепи (нумерация по Кабату), как известно, способны взаимодействовать с СИК во многих антителах. Аминокислоты в положениях 35 в легкой цепи и 93 и 103 в тяжелой цепи также, вероятно, взаимодействуют с СИК. Дополнительные остатки, которые могут влиять на конформацию СИК, можно идентифицировать согласно методологии Еоо1е апй ХУиНег (1992) 1. Мо1. Вю1. 224:487. Такие остатки называются верньерными остатками и представляют собой остатки каркасной области, расположенные непосредственно под (т.е. образующие платформу под) СИК.

Остатки, участвующие в контакте Уь-У_н или упаковочные остатки включают остатки, расположенные на поверхности контакта между Уь и У_н, согласно определению, например, №зуо!иу апй наЬег, Ргос. ΝηΚ Асай. 8ск И8А, 82:4592-66 (1985) или СНоЙиа е! а1, 8ирта.

Иногда возникает некоторая неоднозначность в принадлежности конкретной аминокислоты к одной или более вышеупомянутых категорий. В таких случаях продуцируются альтернативные варианты антител, одно из которых содержит данную конкретную замену, а другое - нет. Желательную активность альтернативных вариантов антител, полученных таким образом, можно протестировать с помощью любого из анализов, описанных здесь, и выбрать предпочтительные антитела.

Дополнительными кандидатами на замену в каркасной области являются аминокислоты, которые являются необычными или редкими для антитела в этом положении. Указанные аминокислоты можно заменить аминокислотами из эквивалентного положения последовательности человека эмбрионального типа или из эквивалентных положений более типичных антител. Например, замена может быть желательна, если аминокислота каркасной области антитела редко встречается в этом положении, а соответствующая аминокислота в последовательности эмбрионального типа является распространенной в этом положении в последовательностях иммуноглобулинов; или если аминокислота каркасной области антитела редко встречается в этом положении, а соответствующая аминокислота в последовательности эмбрионального типа также встречается редко по сравнению с другими последовательностями. Предполагается, что за счет замены необычной аминокислоты аминокислотой из последовательности эмбрионального типа, являющейся типичной для антител, антитело можно сделать менее иммуногенным.

Термин редкий, как используется здесь, означает аминокислоту, встречающуюся в данном положении менее чем приблизительно в 20%, предпочтительно менее чем приблизительно в 10%, более предпочтительно - менее чем приблизительно в 5%, еще более предпочтительно - менее чем приблизительно в 3%, еще более предпочтительно - менее чем приблизительно в 2%, и еще более предпочтительно - менее чем приблизительно в 1% последовательностей в репрезентативной выборке последовательностей, а термин распространенный, как используется здесь, означает аминокислоту, встречающуюся более чем приблизительно в 25%, но обычно более чем в приблизительно в 50% последовательностей репрезентативной выборки. Например, все последовательности вариабельных областей легких и тяжелых цепей, соответственно, сгруппированы в подгруппы последовательностей, обладающих повышенной гомологией по отношению друг к другу и содержащих одни и те же аминокислоты в определенных критических положениях (КаЬа! е! а1., 8ирта). При определении того, является ли аминокислота в последовательности антитела редкой или распространенной среди последовательностей, часто бывает предпочтительно рассматривать только последовательности в той же подгруппе, к которой принадлежит последовательность антитела.

В общем случае каркасные области антител, как правило, в значительной степени идентичны и, чаще всего, идентичны каркасным областям последовательностей человека эмбрионального типа, от которых они происходят. Разумеется, многие из аминокислот каркасной области вносят незначительный вклад или не вносят непосредственного вклада в специфичность или сродство антитела. Таким образом, могут быть допустимы многие отдельные консервативные замены остатков каркасов, не приводящие к заметному изменению специфичности или сродства получаемого иммуноглобулина. Так, в одном из вариантов воплощения вариабельная каркасная область антитела обладает по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с последовательностью вариабельной каркасной области человека эмбрионального типа или консенсусной последовательностью, рассчитанной на основе таких последовательностей. В еще одном из вариантов воплощения вариабельная каркасная область антитела обладает по меньшей мере 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью последовательности с последовательностью ва- 21 024701 риабельной каркасной области человека эмбрионального типа или консенсусной последовательностью, рассчитанной на основе таких последовательностей.

В дополнение к простому связыванию С.О27, антитело можно выбрать на основе сохранения ими других функциональных свойств антител по изобретению, например:

(1) ингибирования (например, полного или частичного блокирования) связывания С.О70 с клетками, экспрессирующими С.О27, по меньшей мере, приблизительно на 70%;

(2) связывания с С'О27 человека с равновесной константой диссоциации Кб, равной 10^-9 М или менее, или, в качестве альтернативы, с равновесной константой ассоциации Ка, равной 10+⁹ М^-1 или более;

(3) индукции, по меньшей мере, приблизительно 40% комплемент-опосредованной цитотоксичности (СОС) клеток, экспрессирующих СО27, в концентрации 10 мкг/мл; и/или (4) индукции, по меньшей мере, приблизительно 40% АОСС-опосредованного специфического лизиса клеток, экспрессирующих СО27, в концентрации 10 мкг/мл.

Исследование характеристик моноклональных антител к СИ27

Связывание моноклональных антител по изобретению с СО27 можно охарактеризовать с помощью различных известных методик.

Как правило, характеристики антител вначале оценивают с помощью ЕЫ8А. Кратко, титрационные микропланшеты можно покрыть очищенным СО27 в РВ8, а затем заблокировать неспецифическими белками, например, бычьим сывороточным альбумином (БСА), разбавленным РВ8. В каждую лунку вносили разведения плазмы СО27-иммунизированных мышей и инкубировали в течение 1-2 ч и 37°С. Планшеты промывали РВ8/Туееп 20 и затем инкубировали с Рс-специфическим поликлональным реагентом козы против 1дС человека, конъюгированным со щелочной фосфатазой, в течение 1 ч при 37°С. После промывки планшеты обрабатывали субстратом АВТ8 и анализировали при ОО 405 нм. Предпочтительно мышей, у которых развивались высокие титры, использовали для слияния.

ЕЫ8А, как описано выше, можно использовать для скрининга антител и, таким образом, гибридом, продуцирующих антитела, обладающие положительной способностью реагировать с иммуногеном СО27. Гибридомы, связывающиеся с СО27, желательно с высоким сродством, можно клонировать и исследовать далее. Один клон из каждой гибридомы, сохраняющий реакционную способность родительских клеток (согласно ЕЫ8А), можно выбрать для создания банка клеток, а также для очистки антител.

Для очистки антител против СО27, выбранную гибридому можно вырастить в роллер-флаконах, двухлитровых роллерных колбах или других системах для культивирования. Надосадочную жидкость можно отфильтровать и концентрировать, а затем подвергнуть аффинной хроматографии с сорбентом белок А-сефароза (РЬагтааа, Пискатауэй, штат Нью-Джерси, США) для очистки белка. После замены буфера на РВ8 можно определить концентрацию при ОО₂₈₀, используя коэффициент экстинкции 1,43, или предпочтительно с помощью нефелометрического анализа. 1дС можно проверять с помощью гельэлектрофореза и с помощью антиген-специфического способа.

Для определения того, связываются ли выбранные моноклональные антитела против СО27 с уникальными эпитопами, каждое антитело можно биотинилировать с использованием доступных для приобретения реагентов (Р1етсе, Рокфорд, штат Иллинойс, США). Связывание биотинилированных моноклональных антител можно обнаружить с помощью зонда, меченого стрептавидином. Для определения изотипа очищенных антител можно выполнить ЕЫ8А изотипов с помощью принятых в данной области техники методик. Например, лунки титрационных микропланшетов можно покрыть с 10 мкг/мл антител против 1д в течение ночи при 4°С. После блокирования 5% БСА планшеты подвергали реакции с 10 мкг/мл моноклональных антител или очищенных изотипических контролей при комнатной температуре в течение двух часов. Затем лунки можно подвергнуть реакции с зондом, специфически конъюгированным с 1дС1 или другим изотипом. Планшеты обрабатывали и анализировали, как описано выше.

Для тестирования связывания моноклональных антител с живыми клетками, экспрессирующими СО27, можно использовать проточную цитометрию. Кратко, линии клеток и/или мононуклеары периферической крови человека, экспрессирующие мембраносвязанный СО27 (выращенные в стандартных условиях), смешивают с различными концентрациями моноклональных антител в РВ8, содержащем 0,1% БСА при 4°С в течение 1 ч. После промывки клетки подвергают реакции с антителами против 1дС, мечеными флуоресцеином, в тех же условиях, что и при окрашивании первичных антител. Образцы можно анализировать с помощью инструмента РАС8сап при использовании светорассеяния и бокового светорассеяния, гейтируя одиночные клетки, и определять связывание меченых антител. Можно использовать (в дополнение к или вместо) проточно-цитометрического анализа альтернативный анализ с использованием флуоресцентной микроскопии. Клетки можно окрасить в строгом соответствии с вышеприведенным описанием и оценить с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот способ позволяет визуализировать отдельные клетки, но может обладать пониженной чувствительностью в зависимости от плотности антигена.

1дС против СО27 можно дополнительно протестировать на способность реагировать с антигеном СО27 с помощью вестерн-блоттинга. Кратко, можно получить экстракты клеток, экспрессирующих СО27, и подвергнуть их электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. После электрофореза разделенные антигены переносят на нитроцеллюлозные мембраны, блокируют 20% сыво- 22 024701 роткой мыши и анализируют, используя тестируемые моноклональные антитела. Связывание ЦС можно обнаружить с помощью антител против ЦС, меченых щелочной фосфатазой и проявить с помощью таблеток субстрата ВС'ЧРАВТ (δίβίικι Скет. Οο., Сент-Луис, штат Миссури, США).

Способы анализа аффинности связывания, перекрестной реакционной способности и кинетики связывания различных антител против СЭ27 включают стандартные анализы, известные в данной области техники, например, анализ поверхностного плазменного резонанса (δΡΚ) Вхатоге™ с использованием δΡΚ-анализатора Вхатоге™ 2000 (Βκοπ; АВ, Уппсала, Швеция), как описано здесь в примере 2.

ΙΙ. Иммунотоксины.

В еще одном варианте воплощения антитела по настоящему изобретению связывают с терапевтической группой, например, цитотоксином, лекарственным агентом или радиоактивным изотопом. При конъюгировании с цитотоксином эти конъюгаты антител называются иммунотоксинами. Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который наносит ущерб клеткам (например, уничтожает их). Примеры включают таксол, цитохалазин В, грамицидин Ό, этидий-бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин Ό, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. Терапевтические агенты включают антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5фторурацил, декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (ΒδNυ) и ломустин (ССNυ), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиаминплатину (ΙΙ) (ΌΌΡ), цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)) и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин), но не ограничиваются ими. Антитело по настоящему изобретению можно конъюгировать с радиоактивным изотопом, например, радиоактивным иодом, получая цитотоксические радиофармацевтические средства для лечения расстройства, ассоциированного с дендритными клетками, например, аутоиммунного или воспалительного заболевания или реакции трансплантат против хозяина.

Конъюгаты антител по изобретению можно использовать для модификации данной биологической ответной реакции, а лекарственную группу в составе препарата не следует рассматривать как ограничивающую настоящее изобретение классическими химическими терапевтическими агентами. Например, лекарственная группа в составе препарата может представлять собой белок или полипептид, обладающий желательной биологической активностью. Такие белки могут включать, например, токсин, обладающий ферментативной активностью, или его активный фрагмент, например, абрин, рицин А, экзотоксин Ρδеиάοтοηаδ или дифтерийный токсин; белок, например, фактор некроза опухолей или интерферонγ; или модификаторы биологического ответа, например, лимфокины, интерлейкин-1 (Ш-1), интерлейкин-2 (Ш-2), интерлейкин-6 (Ш-6), гранулоцитарно-макрофагальный колонестимулирующий фактор (СМ-ϋδΡ), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-С'ЪР) или другие факторы роста.

Хорошо известны методики конъюгирования такой терапевтической группы с антителом, см., например, Аптон е! а1., Μο^Πο^Ι Аη!^кοά^еδ Ρογ ΙΗΐΗΗπιοΡπ^Ιίι^ 0£ Игидк Ш Сапсег Ткегару, в ΜοποсПпа1 Апί^кοά^еδ АШ Сапсег Ткегару, РеШеИ е! а1. ^άδ.), рр. 243-56 (А1ап К. Πδδ, кто. 1985); НеШклт е! а1., Ап!^кοά^еδ Ρογ Эгид Иекуегу, ш ^ώτοί^ά Эгид Эекуегу (2πά Еά.), Ροк^пδοп е! а1. ^άδ.), рр. 623-53 (Магсе1 Иеккег, кто. 1987); Т1югре, 'ΆπΗ^ά}· Сатегк 0£ СуГОГОхто Адеп!к Ш Сапсег Ткегару. А Ре\зе\у, в Μοпοс1οпа1 Апккοά^еδ '84: ВюЦдюЦ АШ СИтса1 Арр1^саι^οпδ. Ршскега е! а1. ^άδ.), рр. 475-506 (1985); Апа1у515, Реки1!к, АЫ Ри!иге Ргсторескуе 0£ Тке Ткегареикс Ше 0£ Ρ;·ιάίο1;·^Κά Ап!^кοάу Ш Сапсег Ткегару, в Μοпοс1οпа1 Ап!^кοά^еδ Ρογ Сапсег Ие!ес!юп АгЛ Ткегару, ВаШхут е! а1. ^άδ.), рр. 303-16 (Ас;Летто ΡϊΌδδ 1985) и Ткюгре е! а1., Тке Ргерага1юп АгЛ СуГОГОхто Ргорегкек 0£ Ап!^кοάу-Τοx^п Сοп^ида!еδ, Iтти^1. Рет., 62:119-58 (1982).

ΙΙΙ. Композиции.

В еще одном варианте воплощения настоящее изобретение представляет композицию, например, композицию, содержащую одно моноклональное антитело по настоящему изобретению или их комбинацию, включенное в состав препарата вместе с носителем (например, фармацевтически приемлемым носителем). Кроме того, представлены композиции, содержащие биспецифические молекулы, содержащие антитело по настоящему изобретению. В одном из вариантов воплощения композиции включают комбинацию нескольких (например, двух или более) выделенных антител по изобретению. Предпочтительно каждое из антител композиции связывает отдельный, заранее выбранный эпитоп СИ27.

Кроме того, фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить в рамках комбинированной терапии, т.е. в комбинации с другими агентами. Например, комбинированная терапия может включать композицию по настоящему изобретению, по меньшей мере, с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами, например, противовоспалительными агентами, ИМАРИ (модифицирующими заболевание противоревматическими препаратами), иммунодепрессантами и химиотерапевтическими средствами. Фармацевтическую композицию по изобретения также можно вводить в сочетании с лучевой терапией. Совместное введение с другими антителами также входит в объем изо- 23 024701 бретения.

Как используются здесь, термины носитель и фармацевтически приемлемый носитель включают всевозможные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие всасывание агенты и т.п., являющиеся физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель подходит для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или вливания). В зависимости от пути введения активное соединение, т.е. антитело, биспецифическую и полиспецифическую молекулу, можно покрыть материалом для защиты соединения от действия кислот и других природных условий, которые могут инактивировать соединение.

Примеры адъювантов, которые можно использовать с антителами и конструктами по настоящему изобретению, включают: неполный адъювант и полный адъювант Фрейнда (ИтГсо ЬаЬога!ог1ек, Детройт, штат Мичиган, США); адъювант Мегск Аб]и\'ап1 65 (Мегск апб Сотрапу, 1ис., Роуэй, штат Нью-Джерси, США); АЗ-2 (ЗтййКйпе Веесйат, Филадельфия, штат Пенсильвания, США); соли алюминия, например, гель гидроксида алюминия (квасцы) или фосфат алюминия; соли кальция, железа и цинка; нерастворимую суспензию ацилированного тирозина; ацилированные сахара; полисахариды, модифицированные катионами или анионами; полифосфазены; биоразлагаемые микросферы; цитокины, например, ОМ-СЗР, интерлейкин-2, -7, -12 и другие подобные факторы; 3О-МРЬ; СрО-олигонуклеотид; и монофосфориллипид А, например 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А.

МРЬ-адъюванты доступны от Соп.ха Сотротайоп (Сиэтл, штат Вашингтон, США; см., например, патенты США 4436727; 4877611; 4866034 и 4912094). СрО-содержащие олигонуклеотиды (в которых динуклеотид СрО неметилирован) хорошо известны и описаны, например, в \С0 96/02555, \С0 99/33488 и патентах США 6008200 и 5856462. Иммуностимулирующие последовательности ДНК также описаны, например, 8а!о е! а1., Заепсе 273:352, 1996.

Другие альтернативные адъюванты включают, например, сапонины, например, Оиб А или его производные, включая 0821 и 087 (Ацийа Вюрйагтасеи!юа1к 1пс., Фремингейм, штат Массачусетс, США); эсцин; дигитонин; или сапонины Оуркорййа или СНепоробшт сципоа; монтанид 18А 720 (Зеррю, Франция); ЗАР (СЫтоп, штат Калифорния, США); иммуностимулирующие комплексы (СЗЬ), МР-59 (СНиоп); серию адъювантов ЗВАЗ (например, ЗВАЗ-2 или ЗВАЗ-4, доступные от ЗтййКйпе ВеесНат, Риксансар, Бельгия); детокс (ЕпНап/упТМ) (Соп.ха, Гамильтон, штат Монтана, США); КС-529 (Соп.ха, Гамильтон, штат Монтана, США) и другие аминоалкилглюкозаминид-4-фосфаты (АОР); адъюванты на основе эфиров полиоксиэтилена, например, описанные в \С0 99/52549А1; синтетические имидазохинолины, например, имиквимод [З-26308, К-837], Шаткоц е! а1., Уисс^ 19: 1820-1826, 2001; и резиквимод [З-28463, К848] ^акИакок, е! а1., Се11и1аг 1ттипо1оду 204: 64-74, 2000; шиффовы основания карбонилов и аминов, конститутивно экспрессирующиеся на поверхности антигенпрезентирующих клеток и Т-клеток, например, тукарезол (КНобек, I. е! а1., №Ииге 377: 71-75, 1995); цитокины, хемокины и костимуляторные молекулы, являющиеся пептидами или белками, включая, например, провоспалительные цитокины, например, интерферон, ОМ-СЗР, Ш-1 альфа, Ш-1 бета, ТОР-альфа и ТОР-бета, индукторы ТН1, например, интерферон-гамма, Ш-2, Ш-12, Ш-15, Ш-18 и Ш-21, индукторы ТН2, например, Ш-4, Ш-5, Ш-6, Ш-10 и ГО13 и гены других хемокинов и костимуляторов, например, МСР-1, М1Р-1 альфа, М1Р-1 бета, КАЭТЕЗ, ТСА-3, СГО80, СГО86 и СО40Ь; иммуностимуляторы, мишенями которых являются лиганды, например, СТЬА-4 и Ь-селектин, белки и пептиды, стимулирующие апоптоз, например, Рак; адъюванты на основе синтетических липидов, например, ваксфектин, (Кеуек е! а1., УиссС^ 19: 3778-3786, 2001) сквален, альфатокоферол, полисорбат 80, диолеилфосфатидилхолин и холестерин; эндотоксин, [ЬРЗ], (Веи!1ег, В., Сиггеп! 0рЫюп ш МютоЬю1оду 3: 23-30, 2000); лиганды, переключающие То11-рецепторы на продукцию ТН1-индуцирующих цитокинов, например, синтетические микобактериальные липопротеины, микобактериальный белок р19, пептидогликан, тейхоевые кислоты и липид А; СТ (холерный токсин, субъединицы А и В) и ЬТ (термолабильный энтеротоксин Е. сой, субъединицы А и В), семейство белков теплового шока ШЗР) и ЬЬ0 (листериолизин О; \С0 01/72329). Эти и различные другие агонисты То11-подобного рецептора (ТЬК) описаны, например, в Кап/1ег е! а1, №!ите Мебюше, Мау 2007, Уо1 13, № 5.

Предпочтительным иммуностимулятором для использования в комбинации с антителом против СГО27 по изобретению является агонист ТЬК3, например, Ро1у 1С.

Фармацевтически приемлемая соль относится к соли, сохраняющей желательную биологическую активность исходного соединения и не обладающей нежелательным токсикологическим действием (см., например, Вегде, З.М., е! а1. (1977) I. Рйагт. Зсг 66:1-19). Примеры таких солей включают соли добавления кислот и соли добавления оснований. Соли добавления кислот включают соли, происходящие от нетоксичных неорганических кислот, например, соляной, азотной, фосфорной, серной, бромистоводородной, йодоводородной, фосфористой и т.п., а также от нетоксичных органических кислот, например, алифатических моно - и дикарбоновых кислот, фенилзамещенных карбоновых кислот, гидроксикарбоновых кислот, ароматических кислот, алифатических и ароматических сульфоновых кислот и т.п. Соли добавления оснований включают соли, происходящие от щелочноземельных металлов, например, натрия, калия, магния, кальция и т.д., а также от нетоксичных органических аминов, например Ν,Ν'дибензилэтилендиамина, Ν-метилглюкамина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина,

- 24 024701 прокаина и т.п.

Композиции по настоящему изобретению можно вводить с помощью разнообразных способов, известных в данной области техники. Специалист должен принимать во внимание, что путь и/или режим введения варьируется в зависимости от желательных результатов. Активные соединения можно изготовить в комбинации с носителями, защищающими соединение от быстрого высвобождения, например, препараты контролируемого высвобождения, включая импланты, трансдермальные пластыри и микрокапсулированные системы доставки. Можно использовать биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, например, этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевую кислоту, коллаген, полиортоэфиры и полимолочную кислоту. Многие способы изготовления таких составов запатентованы или известны специалистам в данной области техники. См., например, 8ик1атеб апб СойгоПеб Ке1еаке Эгид Эейуегу §ук1етк, ЕК. КоЬткоп, еб., Магсе1 Иеккег, 1пс., Νον Уогк, 1978.

Для введения соединения по изобретению посредством определенного пути введения может быть необходимо покрыть соединение или совместно вводить соединение с материалом для предотвращения его инактивации. Например, соединение можно ввести в организм субъекта в подходящем носителе, например, липосомах или разбавителе. Приемлемые разбавители включают физиологический раствор и водные буферные растворы. Липосомы включают СОР-эмульсии типа вода в масле в воде, а также традиционные липосомы ^^ап е! а1. (1984) ί. №игоппшипо1. 7:27).

Носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приема или стерильные растворы или дисперсии для инъекций. Использование таких сред и агентов в комбинации с фармацевтически активными веществами хорошо известно в данной области техники. Кроме того, поскольку любая обычная среда или агент несовместима с активным соединением, рассматривается их использование в фармацевтической композиции по изобретению. В композиции можно также включать дополнительные активные соединения.

Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композицию можно составить в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного агента. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытий, например, лецитина, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования ПАВ. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например, сахара, многоатомные спирты, например, маннит, сорбит или хлорид натрия. Длительное поглощение композиций, вводимых путем инъекции, можно осуществить путем включения в композицию агента, замедляющего поглощение, например, солей моностеарата и желатина.

Стерильные растворы для инъекций можно изготовить путем включения активного соединения в необходимом количестве в соответствующий растворитель с одним из ингредиентов, перечисленных выше, или их комбинацией, при необходимости, с последующей стерилизацией микрофильтрацией. Как правило, дисперсии изготавливают путем включения активного соединения в стерильную средуноситель, содержащую основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из числа вышеперечисленных. В случае стерильного порошка для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами изготовления являются вакуумная сушка и сублимационная сушка (лиофилизация), которые позволяют получить порошок активного ингредиента в сочетании с любым дополнительным желательным ингредиентом из его раствора, ранее стерилизованного фильтрацией.

Схемы приема корректируют для обеспечения оптимального желательного ответа (например, терапевтического ответа). Например, можно ввести однократный болюс, можно ввести несколько разделенных доз за период времени, или дозу можно пропорционально уменьшать или увеличивать в зависимости от потребностей, определяемых терапевтической ситуацией. Например, антитела по изобретению можно вводить один или два раза в неделю подкожно или внутримышечно, или один или два раза в месяц подкожно или внутримышечно.

Особенно выгодно составление парентеральных композиций в виде дозированной лекарственной формы для удобства введения и единообразия дозировки. Дозированная лекарственная форма, как используется здесь, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичной дозировки для введения субъектам, подвергаемым лечению; каждая единица лекарственной формы содержит заранее определенное количество активного соединения, рассчитанное на получение желательного терапевтического эффекта, в комбинации с необходимым фармацевтическим носителем. Требования к дозированным лекарственным формам по изобретению определяются и напрямую зависят от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного планируемого терапевтического эффекта и (Ь) ограничений, существующих в области составления рецептуры такого активного соединения для лечения чувствительности у людей.

Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают:

(1) водорастворимые антиоксиданты, например, аскорбиновую кислоту, цистеина гидрохлорид, бисульфат натрия, метабисульфит натрия, сульфит натрия и т.п.;

- 25 024701 (2) жирорастворимые антиоксиданты, например, аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и т.п.; и (3) металл-хелатирующие агенты, например, лимонную кислоту, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЕОТА), сорбит, винную кислоту, фосфорную кислоту и т.п.

Для терапевтических композиций составы по настоящему изобретению включают составы, пригодные для перорального, назального, местного (включая буккальное и подъязычное), ректального, вагинального и/или парентерального введения. Составы может быть удобно представлять в дозированной лекарственной форме и можно готовить любым способом, известным в области фармации. Количество активного ингредиента, которое можно смешать с материалом носителя для получения дозированного лекарственного средства, будет меняться в зависимости от субъекта, подвергающегося лечению, и конкретного способа введения. Количество активного ингредиента, которое можно объединить с материалом носителя для получения одной дозированной формы, в общем случае представляет собой количество композиции, производящее терапевтический эффект. Как правило, это количество находится в диапазоне от 0,001% до приблизительно девяноста процентов активного ингредиента из ста, предпочтительно приблизительно от 0,005% до приблизительно 70%, наиболее предпочтительно приблизительно от 0,01 до 30%.

Составы по настоящему изобретению, подходящие для вагинального введения, также включают составы в форме вагинальных суппозиториев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или аэрозолей, содержащие подходящие носители, известные в данной области техники. Дозированные формы для местного или трансдермального введения композиций по настоящему изобретению включают порошки, аэрозоли, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и ингаляторы. Активное соединение можно смешать в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми необходимыми консервантами, буферами или пропеллентами.

Фразы парентеральное введение и вводили парентерально, как используются здесь, означают способы введения, не являющиеся энтеральным и местным введением, обычно выполняемые путем инъекции и включающие, но без ограничения, внутривенные, внутримышечные, внутриартериальные, интратекальные, внутрисуставные, внутриглазничные, внутрисердечные, внутрикожные, внутрибрюшинные, транстрахеальные, подкожные, подкутикулярные, внутрисуставные, субкапсулярные, субарахноидальные, интраспинальные, эпидуральные и внутригрудинные инъекции и вливания.

Примеры подходящих водных и неводных перевозчиков, которые можно использовать в фармацевтической композиции по изобретению, включают воду, этанол, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, например, оливковое масло, и органические эфиры для инъекций, например, этилолеат. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покровных материалов, например, лецитина, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования ПАВ.

Указанные композиции также могут содержать адъюванты, например, консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергаторы. Предотвращение присутствия микроорганизмов можно обеспечить как за счет процедур стерилизации, описанных выше, так и включения различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Также может быть целесообразно включение в композицию изотонических агентов, например, сахаров, хлорида натрия и т.п. Кроме того, длительное поглощение фармацевтической формы, вводимой путем инъекции, можно обеспечить за счет включения агентов, замедляющих поглощение, например, моностеарата алюминия и желатина.

Если соединения по настоящему изобретению вводят людям и животным в качестве фармацевтических препаратов, они могут быть предоставлены в чистом виде или в виде фармацевтической композиции, содержащей, например, от 0,001 до 90% (более предпочтительно, от 0,005 до 70%, например, от 0,01 до 30%) активного ингредиента в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

Независимо от выбранного пути введения, соединения по настоящему изобретению, которые можно использовать в подходящей гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции по настоящему изобретению, составляют в виде фармацевтически приемлемых дозируемых форм с использованием обычных способов, известных специалистам.

Фактическую дозировку активного ингредиента в фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением можно изменять с тем, чтобы получить количество активного ингредиента, являющееся эффективным с точки зрения достижения желательного терапевтического ответа у конкретного пациента при данной композиции и режиме введения, и не являющееся токсичным для пациента. Выбранная дозировка зависит от различных фармакокинетических факторов, включая активность конкретных используемых композиций по настоящему изобретению или их эфиров, солей или амидов, способа употребления, времени употребления, скорости выведения конкретного используемого соединения, продолжительности лечения, других лекарств, соединений и/или материалов, используемых в комбинации с конкретными используемыми композициями, возраста, половой принадлежности, общего состояния здоровья и предыдущей истории болезни пациента, подвергаемого лечению, и т.п. факторов, общеизвестных в области медицины. Врач или ветеринар-специалист может легко определить и назначить

- 26 024701 необходимое эффективное количество фармацевтической композиции. Например, врач или ветеринар может начать с дозировок соединения по изобретению, использованных в фармацевтической композиции, на несколько уровней меньших, чем требуется для достижения желательного терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозировку до достижения желательного эффекта. В общем случае подходящая суточная доза композиции по изобретению равна количеству соединения, которое представляет собой наименьшую дозу, позволяющую получить терапевтический эффект. Обычно такая эффективная доза зависит от факторов, описанных выше. Предпочтительным является внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное или подкожное введение, предпочтительно, введение вблизи от местоположения мишени. При желании, эффективную суточную дозу терапевтической композиции можно вводить в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более меньших доз, вводимых раздельно через соответствующие интервалы в течение суток, при необходимости, в виде дозированных лекарственных форм. Хотя возможно введение соединения по настоящему изобретению в чистом виде, желательно вводить соединение в виде фармацевтического состава (композиции).

Терапевтические композиции можно вводить с помощью медицинских устройств, известных в данной области техники. Например, в предпочтительном варианте воплощения, терапевтическую композицию можно вводить с помощью устройства для безыгольных подкожных инъекций, например, устройства, описанного в патентах США 5399163, 5383851, 5312335, 5064413, 4941880, 4790824 или 4596556. Примеры известных имплантов и модулей, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают: патент США 4487603, в котором описан имплантируемый насос для микровливаний, позволяющий подавать лекарство с контролируемой скоростью; патент США 4486194, в котором описано терапевтическое устройство для введения медикаментов через кожу; патент США 4447233, в котором описан насос для вливания лекарств с точно заданной скоростью; патент США 4447224, в котором описан имплантируемый аппарат для вливания с переменной скоростью потока, позволяющий осуществлять непрерывную доставку лекарства; патент США 4439196, в котором описана система осмотической доставки лекарств, содержащая многокамерные отсеки; и патент США 4475196, в котором описана система осмотической доставки лекарств. Специалистам известны многие другие импланты, системы доставки и модули такого рода.

В некоторых вариантах воплощения антитела по изобретению можно включать в состав препарата, обеспечивая надлежащее распределение ίη У1уо. Например, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) задерживает многие высокогидрофильные соединения. Чтобы обеспечить прохождение ГЭБ терапевтическими соединениями по изобретению (при необходимости), их можно включать в состав препарата, например, на основе липосом. Способы изготовления липосом см., например, в патентах США 4522811; 5374548 и 5399331. Липосомы могут содержать одну или несколько групп, которые избирательно транспортируются в специфические клетки или органы, тем самым улучшая адресную доставку лекарств (см., например, У.У. Капабе (1989) ί. СБп. РБагтасо1. 29:685). Типичные молекулы, обеспечивающие адресную доставку лекарства, включают фолат или биотин (см., например, патент США 5416016, принадлежащий Ьоте е! а1.); маннозиды Ште/а\уа е! а1., (1988) ВюсБет. ВюрБуз. Кез. Соттип. 153:1038); антитела (Р.0. В1оетап е! а1. (1995) РЕВ8 Ьей. 357:140; М. 0\уа1з е! а1. (1995) АпйтюгоЬ. АдеШз СБето1Бег. 39:180); рецептор белка А сурфактанта (Впзсое е! а1. (1995) Ат. I. РБузю1. 1233:134), различные типы которого могут входить в состав препаратов по изобретению, а также компоненты молекул по изобретению; р120 (8сБге1ег е! а1. (1994) I. Вю1. СБега. 269:9090); см. также К. Кеюапеп; М.Ь. Ьаиккапеп (1994) РЕВ8 Бей. 346:123; И КПБоп; Ы. РМ1ег (1994) IттиηотеΐБоάз 4:273. В одном из вариантов воплощения изобретения терапевтические соединения по изобретению составлены в виде липосом; в более предпочтительном варианте воплощения липосомы включают группу для адресной доставки. В наиболее предпочтительном варианте воплощения терапевтические соединения в составе липосом доставляют болюсной инъекцией в область, расположенную вблизи от опухоли или инфекции. Композиция должна быть в достаточной степени жидкой, чтобы ее можно было легко ввести с помощью шприца. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, например, бактерий и грибов.

Способность соединения подавлять рак можно оценить в системе животной модели, позволяющей прогнозировать эффективность по отношению к опухолям человека. Кроме того, это свойство композиции можно оценивать путем проверки способности соединения осуществлять такое ингибирование ш уйго с помощью анализов, известных специалистам в данной области техники. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может уменьшить размер опухоли или иным образом облегчить симптомы рака у субъекта. Специалист в данной области техники может определить такое количество на основе таких факторов, как размер субъекта, тяжесть симптомов у субъекта и конкретная выбранная композиция или путь введения.

Композиция должна быть стерильной и в достаточной степени жидкой для возможности ее доставки с помощью шприца. Кроме воды, носитель может представлять собой изотонический забуференный физиологический раствор, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, путем использования покровных материалов, например, лецитина, путем поддержания требуемого размера

- 27 024701 частиц в случае дисперсии и путем использования ПАВ. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например, сахара, многоатомные спирты, например, маннит или сорбит, и хлорид натрия. Длительное поглощение композиций, вводимых путем инъекции, можно осуществить путем включения в композицию агента, замедляющего поглощение, например, моностеарата алюминия и желатина.

Если активное соединение надлежащим образом защищено, как описано выше, это соединение можно вводить перорально, например, с инертным разбавителем или усваиваемым съедобным носителем.

Ιν. Варианты применения и способы согласно изобретению.

В одном из вариантов воплощения антитела биспецифические молекулы и композиции по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или предотвращения (например, иммунизации против) разнообразных заболеваний и состояний.

Одним из основных заболеваний, которые можно лечить, является рак. В частности, антитело против СО27, индуцирующее или усиливающее иммунный ответ, может использоваться при лечении рака. Типы рака включают лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз, миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный лейкоз, эритролейкоз, хроническый лейкоз, хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфому из клеток мантии, первичную лимфому центральной нервной системы, лимфому Беркитта и Вклеточную лимфому пограничной зоны, истинную полицитемию, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей, солидные опухоли, саркомы и карциномы, фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеогенную саркому, остеосаркому, хордому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, саркому Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, саркому толстой кишки, карциному ободочной и прямой кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичников, рак предстательной железы, плоскоклеточную карциному, базальноклеточную карциному, аденокарциному, карциному потовой железы, карциному сальной железы, папиллярную карциному, папиллярные аденокарциномы, цистаденокарциному, медуллярный рак, бронхогенную карциному, почечноклеточную карциному, гепатому, карциному желчного протока, хориокарциному, семиному, эмбриональную карциному, нефробластому, рак шейки матки, рак матки, опухоли яичка, рак легких, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, карциному мочевого пузыря, эпителиальную карциному, глиому, астроцитому, медуллобластому, краниофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, нейрому слухового нерва, олигодендроглиому, менингиому, меланому, нейробластому, ретинобластому, носоглоточную карциному, рак пищевода, базальноклеточную карциному, рак желчных путей, рак мочевого пузыря, рак костей, рак головного мозга и центральной нервной системы (ЦНС), рак шейки матки, хориокарциному, рак ободочной и прямой кишки, рак соединительной ткани, рак пищеварительной системы, рак эндометрия, рак пищевода, рак глаза, рак головы и шеи, рак ЖКТ, внутриэпителиальное новообразование, рак почек, рак гортани, рак печени, рак легких (мелкоклеточный, крупноклеточный), меланому, нейробластому; рак ротовой полости (например, губ, языка, ротовой полости и глотки), рак яичников, рак поджелудочной железы, ретинобластому, рабдомиосаркому, рак прямой кишки; рак дыхательной системы, саркому, рак кожи, рак желудка, рак яичек, рак щитовидной железы, рак матки и рак мочевыделительной системы, но не ограничиваются ими. Предпочтительные виды рака включают опухоли, экспрессирующие СО27, выбранные из группы, состоящей из хронического лимфоцитарного лейкоза, лимфомы из клеток мантии, первичной лимфомы центральной нервной системы, лимфомы Беркитта и В-клеточной лимфомы пограничной зоны.

Другие заболевания, являющиеся показаниями к применению антитела против СО27, индуцирующего или усиливающего иммунный ответ, включают бактериальные, грибковые, вирусные и паразитарные инфекционные заболевания. Другие заболевания, являющиеся показаниями к применению антитела против СО27, ингибирующего или блокирующего иммунный ответ, включают отторжение трансплантата, аллергию и аутоиммунные заболевания.

Типичные аутоиммунные заболевания включают рассеянный склероз, ревматоидный артрит, диабет типа 1, псориаз, болезнь Крона и другие воспалительные заболевания кишечника, например, язвенный колит, системную красную волчанку (СКВ), аутоиммунный энцефаломиелит, миастению гравис (МГ), тиреоидит Хашимото, синдром Гудпасчера, пузырчатку, болезнь Грейвса, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру, склеродермию с антителами против коллагена, смешанное заболевание соединительной ткани, полимиозит, пернициозную анемию, идиопатическую болезнь Аддисона, бесплодие, связанное с аутоиммунными факторами, гломерулонефрит, серповидный гломерулонефрит, пролиферативный гломерулонефрит, буллезный пемфигоид, синдром Шегрена, псориатический артрит, инсулинорезистентность, аутоиммунный сахарный диабет, аутоиммунный гепатит, аутоиммунную гемофилию, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (АЬР8), аутоиммунный гепатит, аутоиммунную гемофилию, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, аутоиммунный увеоретинит, синдром Гийена-Барре, артериосклероз и болезнь Альцгеймера, но не ограничиваются ими. Типичные аллергические расстройства включают аллергический конъюнктивит, весенний

- 28 024701 конъюнктивит, весенний кератоконъюнктивит и гигантский папиллярный конъюнктивит; назальные аллергические расстройства, включая аллергический ринит и синусит; аллергические расстройства уха, включая зуд евстахиевой трубы; аллергические расстройства верхних и нижних дыхательных путей, включая врожденную и приобретенную бронхиальную астму; аллергические заболевания кожи, включая дерматит, экзему и крапивницу; и аллергические заболевания желудочно-кишечного тракта, но не ограничиваются ими.

В еще одном аспекте антитело по изобретению вводят в комбинации с вакциной для усиления иммунного ответа против антигена вакцины, например, опухолевого антигена (с целью усиления иммунного ответа против опухоли за счет этого) или антигена возбудителя инфекционного заболевания (с целью усиления иммунного ответа против возбудителя инфекционного заболевания за счет этого). Соответственно, в этом варианте воплощения антиген вакцины может включать, например, антиген или композицию антигенов, способную вызвать иммунный ответ против опухоли или против возбудителя инфекционного заболевания, например, вируса, бактерии, паразита или грибка. Антиген или антигены могут представлять собой, например, пептиды/белки, полисахариды и/или липиды. Антиген или антигены могут иметь опухолевое происхождение, например, различные опухолевые антигены, описанные выше. Альтернативно, антиген или антигены могут происходить от патогенных организмов, например, вирусов, бактерий, паразитов или грибков, например, различные антигены патогенных организмов, описанные выше. Дополнительные примеры подходящих антигенов патогенных организмов включают, но не ограничиваются ими, следующие: вирусные антигены или антигенные детерминанты могут происходить, например, от: цитомегаловируса (особенно человека, например, дВ или его производных); вируса Эпштейна-Барр (например, др350); флавивирусов (например, вируса желтой лихорадки, вируса денге, вируса клещевого энцефалита, вируса японского энцефалита); вируса гепатита, например, вируса гепатита В (например, поверхностный антиген вируса гепатита В, например, антигены ΓΐΐδΕ Р^еδ2 и δ, описанные в ЕР-А-414374; ЕР-А-0304578 и ЕР-А-198474), вируса гепатита А, вируса гепатита С и вируса гепатита Е; ВИЧ-1 (например, ίаί, иеГ, др120 или др160); вирусов герпеса человека, например, дИ или его производных, или предраннего белка, например, 1СР27 Ηδν1 или Ηδν2; вирусов папилломы человека (например, НРУ6, 11, 16, 18); вируса гриппа (интактного или инактивированного вируса, сплит-вируса гриппа, выращенного в яйцах или клетках МИСК, или клетках Vе^ο, или полных виросом гриппа (как описано в О1иск, νηαίικ, 1992, 10, 915-920) или их очищенных или рекомбинантных белков, например, белков ИР, NΑ, НА или М); вируса кори; вируса эпидемического паротита; вируса парагриппа; вируса бешенства; респираторно-синцитиального вируса (например, белки р и Ο); ротавируса (в том числе живого ослабленного вируса); вируса натуральной оспы; вируса ветряной оспы (например, др1, II и 1Е63); и ΗΓν, ответственных за рак шейки матки (например, ранние белки Е6 и Е7, гибридизованные с переносчиком белка И, образующие гибридные белки И-Е6 или Е7 НРV 16, или их комбинации; или комбинации Е6 или Е7 с Ь2 (см., например, νθ 96/26277).

Бактериальные антигены или антигенные детерминанты могут происходить, например, от: ВасШик крр., включая В. Аййгасщ (например, ботулинический токсин); Вогбе1е11а крр, включая В. рег1нкк1к (например, пертактин, коклюшный токсин, фимбриальный гемагглютинин, аденилатциклазу, фимбрии); Воггейа крр., включая В. ЬигдбогГег1 (например, ОкрА, ОкрС, ИЬрА, ИЬрВ), В. далии (например, ОкрА, ОкрС, ИЬрА, ИЬрВ), В. АГ/е1н (например, ОкрА, ОкрС, ИЬрА, ИЬрВ), В. аибегкоии (например, ОкрА, ОкрС, ИЬрА, ИЬрВ), В. йегткп; Сатру1оЬас1ег крр, включая С. .ίςριπί (например, токсины, адгезины и инвазины) и С. сой; Сй1агауб1а крр., включая С. (гасйотаЛк (например, МОМР, гепарин-связывающие белки), С. риеитоте (например, МОМР, гепарин-связывающие белки), С. ркЮаск С1окйтбшт крр., включая С. 1е1аш (например, столбнячный токсин), С. ВоШйиит (например, ботулинический токсин), С. бТПсПе (например, клостридиальные токсины А или В); СогуиеЬасегшт крр., включая С. б|рй1йег!ае (например, дифтерийный токсин); ЕйгйсИа крр., включая Е. есцн и возбудителя гранулоцитарного эрлихиоза человека; Кюкейыа крр, включая К.г1ске11к11; Етегососснк крр., включая Е. Гаесайк, Е. Гаесшт; Ексйепсййа крр, включая энтеротоксические штаммы Е. сой (например, факторы колонизации, термолабильный токсин или его производные, или термостабильный токсин), энтерогеморрагические штаммы Е. сой, энтеропатогенные штаммы Е. сой (например, токсин, подобный шига-токсину); НаеторйНик крр., включая Н. шЛиеи/ае типа В (например, РКР), нетипируемые штаммы Н. тЛиеи/ае, например, ОМР26, высокомолекулярные адгезины, Р5, Р6, белок Ό и липопротеин Ό, и фимбрин и белки-производные фимбрина (см., например, υδ 5843464); НейсоЬас1ег крр, включая Н. ру1оп (например, уреазу, каталазу, вакуолизированный токсин); Ркеиботоиак крр, включая Р. аегидшока; ЬедюиеПа крр, включая Ь. риеиторййа; БерЮкрпа крр., включая Ь. Шеггодаик; Ык1ег1а крр., включая Ь. тоиосуЮдеиек; Могахе11а крр, включая М. саШггйаНк, также известную как Вгаийате11а са1аггйаПк (например, высоко- и низкомолекулярные адгезины и инвазины); Могехе11а са1аггйайк (включая везикулы ее наружной мембраны и ОМР106 (см., например, ^О 97/41731)); МусоЬасЮгшт крр., включая М. 1нЬегсн1ок1к (например, ЕδΑТ6, антиген 85А, -В или -С), М. Ьоу1к, М. 1ергае, М. аушт, М. рагаШЬегсЫокк, М. ктедтайк; №1ккепа крр, включая N. доиоггйеа и N. теишдШбщ (например, полисахариды капсулы и их конъюгаты, трансферрин-связывающие белки, лактоферрин-связывающие белки, РИС, адгезины); №1ккепа теидййбщ В (включая везикулы ее наружной мембраны и №рА (см., например, ^О 96/29412); δа1тοие11а крр, включая δ. ίурй^, δ. рага1урйк δ. сйо1егаекшк,

- 29 024701

δ. еп!егШЙ18; δ1ιί^113 8рр, включая δ. 8оппек δ. йу8еп!епае, δ. ЛехпегН; δίарЬу1ососси8 8рр., включая δ. аигеиз, δ. ер1йегт1Й18; δί^ер!ососси8 8рр, включая δ. Рпеитоте (например, полисахариды капсулы и их конъюгаты, Р8аΑ, Р8рΑ, стрептолизин, холин-связывающие белки) и белковый антиген пневмолизин (ΒίосНет ВюрЬу8 Α^, 1989, 67, 1007; КиЬш8 е! а1., М1сгоЫа1 Ра!Нодепе818, 25, 337-342), и их мутантные производные, не обладающие токсическим действием (см., например, \¥О 90/06951; \¥О 99/03884); Тгеропета 8рр., включая Т. раШйит (например, белки наружной мембраны), Т. йейюо1а, Т. НуофъеШепае; УФпо 8рр, включая У. сНо1ега (например, холерный токсин); и Уегеииа 8рр, включая Υ. Еп!егосо1Шса (например, белок Υор), Υ. ре8Й8, Υ. р8еийо!иЬегси1о818.

Паразитарные/грибковые антигены или антигенные детерминанты могут происходить, например, от: ВаЬе81а 8рр., включая В. тюгой; СапйМа 8рр., включая С. а1Ысап8; Сгур!ососси8 8рр., включая С. пеоГогтап8; Еп!атоеЬа 8рр., включая Е. 1п81о1уЛса; С1агФа 8рр., включая С. 1атЬПа; Ье8Нтата 8рр., включая Ь. та]ог; Р1а8тойшт Гаарагит (МδР1, ΑΙ^ΑΕ МδР3, ΕΒΑ, СЬИКР, КΛР1, КΑР2, секвестрин, РГЕМР1, РГ332, Ε8Α1, ΡδΑ3, δТЛКР, δΑΣδΑ, РГЕХР1, РГ825, РГ828, РΡδ27/25, РГ816, РГ848/45, РГ8230 и их аналоги у Р1а8тойшт 8рр.); Рпеитосу8Й8 8рр., включая Р. саппп; δсЬ^8Ο8!ота 8рр., включая δ. тап8от; ТпсНотопа8 8рр., включая Т. уащпа^; Тохор1а8та 8рр., включая Т. допйп (например, δΑС2, δΑС3, Тд34); ТгураЫОота 8рр., включая Т. сги/к

Следует иметь в виду, что в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения можно использовать антигены и антигенные детерминанты в самых различных формах. Например, антигены или антигенные детерминанты могут быть представлены как отдельные белки или пептиды (например, в так называемых субъединичных вакцинах) или, например, как антигены или антигенные детерминанты, связанные с клеткой или вирусом (например, в живых или убитых патогенных штаммах). Предпочтительно живые патогенные организмы должны быть ослаблены известным способом. Кроме того, антигены или антигенные детерминанты можно получить ш 8ίΙιι в организме субъекта за счет использования полинуклеотида, кодирующего антиген или антигенную детерминанту (например, при так называемой ДНКвакцинации), хотя следует иметь в виду, что полинуклеотиды, которые можно использовать при таком подходе, не ограничиваются ДНК и могут также включать РНК и модифицированные полинуклеотиды, как обсуждалось выше.

В одном из вариантов воплощения вакцинный антиген также может обладать специфичностью, например, к клеткам определенного типа или определенным тканям. Например, можно обеспечить специфичность вакцинного антигена по отношению к антигенпрезентирующим клеткам (АПК), например, путем использования таких агентов, как антитела, мишенью которых являются рецепторы поверхности АПК, например, ЭЕС-205, например, как обсуждается в \¥О 2009/061996 (Се11йех ТЬегареи1ю8, 1пс), или рецептор маннозы (СЭ206), например, как обсуждается в \¥О 03040169 (Мейагех, 1пс.)

Для терапевтического использования антитела по изобретению можно вводить непосредственно в организм субъекта (т.е. ш У1уо) в чистом виде либо в комбинации с другими вариантами терапии, например, иммуностимулятором, вакциной, химиотерапией или лучевой терапией. Во всех случаях антитела, биспецифические молекулы, композиции и иммуностимуляторы и другие варианты терапии вводят в количестве, эффективном для получения желательного терапевтического эффекта. Термин эффективное количество относится к количеству, необходимому или достаточному для получения желательного биологического эффекта. Например, эффективное количество может представлять собой количество, необходимое для устранения опухоли, рака или бактериальной, вирусной или грибковой инфекции. Эффективное количество для каждого конкретного варианта применения может меняться в зависимости от таких факторов, как заболевание или состояние, подвергаемое лечению, конкретное вводимое антитело, размер субъекта или тяжесть заболевания или состояния. Специалист в данной области техники может эмпирически определить эффективное количество конкретной молекулы, не требуя излишних экспериментов.

Предпочтительные пути введения вакцин включают, например, инъекцию (например, подкожную, внутривенную, парентеральную, внутрибрюшинную, интратекальную). Инъекция может быть в виде болюса или непрерывного вливания. Другие пути введения включают пероральное введение.

Антитела и биспецифические молекулы по изобретению также можно вводить совместно с адъювантами и другими терапевтическими агентами. Следует иметь в виду, что термин совместно введенные, как используется здесь, включает всевозможные варианты одновременного, раздельного или последовательного введения антител и конъюгатов по настоящему изобретению с адъювантами и другими агентами, в том числе введение в рамках режима дозирования. Антитела, как правило, включают в препарат в носителе отдельно или в комбинации с такими агентами. Примеры таких носителей включают растворы, растворители, дисперсионные среды, замедлители, эмульсии и т.п. Использование таких сред в комбинации с фармацевтически активными веществами хорошо известно в данной области техники. Любой другой общепринятый носитель, подходящий для использования с указанными молекулами, входят в объем настоящего изобретения.

Агенты, подходящие для совместного введения с антителами, конъюгатами, биспецифическими молекулами и композициями, включают другие антитела, цитотоксины и/или лекарственные агенты, а также адъюванты, иммуностимуляторы и/или иммунодепрессанты. В одном из вариантов воплощения

- 30 024701 агент представляет собой химиотерапевтический агент. Антитела, биспецифические молекулы и композиции можно вводить в сочетании с лучевой терапией.

Химиотерапевтические агенты, подходящие для совместного введения с антителами и конъюгатами по настоящему изобретению при лечении опухолей включают, например: таксол, цитохалазин В, грамицидин Ό, этидий-бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин Ό, 1дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. Дополнительные агенты включают, например, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил, декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (ΒδΝυ) и ломустин (ССХи), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиаминплатину (II) (ΌΌΡ), цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)) и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин) и темозоломид.

Агенты, устраняющие или ингибирующие иммуносупрессивную активность, например, за счет клеток иммунной системы (например, регуляторных Т-клеток, ΝΚΤ-клеток, макрофагов, супрессоров миелоидного происхождения, незрелых или супрессивных дендритных клеток) или супрессорных факторов, продуцируемых опухолью или клетками-хозяевами в локальное микроокружение опухоли (например, ТСР-бета, индоламин-2,3-диоксигеназы - ГОО), также можно вводить с антителами и конъюгатами по настоящему изобретению. Такие агенты включают антитела и низкомолекулярные лекарственные агенты, например, ингибиторы ГОО, например, 1-метилтриптофан или его производные. Подходящие агенты для совместного введения с антителами и биспецифическими молекулами по настоящему изобретению при лечении таких иммунных расстройств включают, например, иммунодепрессанты, например, рапамицин, циклоспорин и РК506; анти-ФНО агенты, например, этанерцепт, адалимумаб и инфликсимаб; и стероиды. Примеры специфических природных и синтетических стероидов включают, например: альдостерон, беклометазон, бетаметазон, будесонид, клопреднол, кортизон, кортивазол, дезоксикортон, десонид, дезоксиметазон, дексаметазон, дифторкортолон, флуклоролон, флуметазон, флунизолид, флуоцинолон, флуоцинонид, флуокортинбутил, фторкортизон, фторкортолон, фторметолон, флурандренолон, флутиказон, галцинонид, гидрокортизон, икометазон, мепреднизон, метилпреднизолон, параметазон, преднизолон, преднизон, тиксокортол и триамцинолон.

Подходящие агенты для совместного введения с антителами и биспецифическими молекулами по настоящему изобретению для индукции или усиления иммунного ответа включают, например, адьюванты и/или иммуностимуляторы, неограничивающие примеры которых описаны выше. Предпочтительным иммуностимулятором является агонист ТЬК3, например, Ро1у 1С.

Кроме того, настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами, которые не следует рассматривать в качестве ограничивающих. Содержание списка последовательностей, фигуры и все ссылки, патенты и опубликованные патентные заявки, цитируемые в настоящей заявке, в явной форме включены в настоящий документ посредством ссылки.

Примеры

Пример 1. Получение СГО27-специфически.\ моноклональных антител человека.

Моноклональные антитела человека против СГО27 получали за счет иммунизации линии НС2/КСо7 трансгенных мышей НиМАЬк (НиМАЬ является торговой маркой компании Мебагех, 1пс, Принстон, Нью-Джерси, США) растворимым антигеном СГО27 человека. НС2/КСо7 НиМАЬ-мышей получали, как описано в патентах США 5770429 и 5545806, содержание которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

Антиген и иммунизация: антиген представлял собой растворимый гибридный белок, содержавший внеклеточный домен СГО27, объединенный с Рс-доменом антитела (рекомбинантный химерный белок СГО27-РС человека (Κ&Ό §у81ет8). Для первой иммунизации антиген смешивали с полным адъювантом Фрейнда (81дта). Затем антиген смешивали с неполным адъювантом Фрейнда (81дта). Дополнительных мышей иммунизировали растворимым белком СГО27 в системе адьюванта ΚΙΒΙ МРЬ плюс ТОМ (§1§та). 5-25 микрограммов растворимого рекомбинантного антигена СГО27 в ΡΒδ или 5х10⁶ клеток СНО, трансфицированных для поверхностной экспрессии СГО27 человека, в ΡΒδ, смешивали с адъювантом в соотношении 1:1. Мышам вводили 100 микролитров подготовленного антигена в брюшную полость каждые 14 дней. Животным, у которых развивались титры антител против СГО27, внутривенно вводили 10 мкг растворимого рекомбинантного антигена СГО27 за три-четыре дня до слияния. Собирали селезенки мышей, и выделенные спленоциты использовали для получения гибридом.

Получение гибридом: для слияния использовали миеломную линию клеток мыши Р3х63Ад8,653 (АТСС СКЬ 1580). КΡМI 1640 ОпуПгодеп), содержащую 10% ΡΒδ, использовали для культивирования миеломных клеток. В среду для роста гибридом вносили дополнительные добавки, включавшие: 3% фактор клонирования гибридом Опдеп Одеп), 10% ΡΒδ ^дта), Ь-глутамин (ОФсо), 0,1% гентамицин (СтЬсо), 2-меркаптоэтанол (СтЬсо), среды НАТ ^дта, 1,0х10^-4 М гипоксантина, 4,0х10^-7 М аминоптери- 31 024701 на, 1,6х10^-5 М тимидина) или НТ (81дта, 1,0х10^-4 М гипоксантина, 1,6х10^-5 М тимидина).

Клетки селезенки смешивали с миеломными клетками Р3х63Ад8,653 в соотношении 6:1 и осаждали центрифугированием. Для облегчения слияния по каплям добавляли полиэтиленгликоль при тщательном перемешивании. Гибридомам позволяли расти в течение одной-двух недель до появления видимых колоний. Надосадочную жидкость собирали и использовали для первоначального скрининга на 1дС человека с помощью ЕЫ8А с использованием специфических иммобилизованных каппа-цепей человека и специфического детекторного Рс человека. 1дС-положительные образцы надосадочной жидкости затем исследовали на специфичность к С.О27 путем проточной цитометрии или с помощью ЕЫ8А, обнаруживая антитела против СЭ27.

Гибридомы, продуцировавшие специфические моноклональные антитела человека (мАт человека; 1дС), субклонировали и размножали. Затем продуцированные моноклональные антитела человека очищали с помощью колоночной хроматографии с белком А в соответствии со стандартными условиями, которые приводили к выделению ряда антител, представлявших особый интерес, которые были обозначены как 4В7-1В3 (также называемые здесь 4В7), 3Н12-1С8 (также называемые здесь 3Н12), 1Р5-1Н5 (также называемые здесь 1Р5), 2С2-1А10 (также называемые здесь 2С2), 2С9-ГО11 (также называемые здесь 2С9), 1Н8-В4 (также называемые здесь 1Н8), 3Н12-1Е12 (также называемые здесь 3Н12), 3С1-1А11 (также называемые здесь 3С1) (1В10), 4А2-В11 (также называемые здесь 4А2), 3А10-С10 (также называется здесь 3А10), 2С11-В5 (также называемые здесь 2С11), 4Н11-С11 (также называемые здесь 4Н11), 2Н3-Е8 (также называемые здесь 2Н3), 4А7-В3 (также называемые здесь 4А7), ЗН8-1В11 (также называемые здесь 3Н8) и 1С5-1В9 (также называемые здесь 1С5). Кроме того, выполняли скрининг гибридом на перекрестную реакционноспособность с СЭ27 макака-резус, и все они демонстрировали положительный результат связывания.

Пример 2. Определение сродства и констант скорости моноклональных антител человека с помощью поверхностного плазменного резонанса (8РК).

Сродство связывания и кинетику связывания различных антител человека против С'О27 из примера 1 оценивали с помощью анализа поверхностного плазменного резонанса (8РК) В1асоге™ с использованием 8РК-анализатора В1асоге™ 2000 (В1асоге АВ, Уппсала, Швеция) в соответствии с рекомендациями изготовителя.

Очищенный рекомбинантный химерный белок С'О27 человека/Т№К8Р7/Рс (Κ&Ό 8у51ет5, № по каталогу 382-СЭ) ковалентно связывали с сенсорным чипом В1асоге ТМ СМ5 (карбоксиметилированный декстран, ковалентно присоединенный к поверхности золота; № продукта В1асоге ВК-1000-14), используя стандартные химические методики аминного связывания, с помощью набора Атте Соир1шд, предоставленного В1асоге, в соответствии с рекомендациями изготовителя (№ продукта В1Асоге ВК-100050, содержащего связующие реагенты Ν-гидроксисукцинимид (ΝΉ8) и гидрохлорид 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимида (ЕЭС)). Низкий уровень иммобилизованного лиганда позволял ограничить действие переноса масс на кинетические параметры, так что наблюдаемая К МАХ составляла величину порядка 100-400 КИ.

Связывание измеряли с помощью потока антител над сенсорным чипом в НВ8-ЕР буфере (НВ8-ЕР буфер, № продукта В1асоге ВК-1001-88: 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (НЕРЕ8) 0,01 М, хлорид натрия 0,15 М, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЕЭТА) 3 мМ, ПАВ Р20 0,005%) в диапазоне концентраций от 1,56 до 50 нм и при скорости потока 30 мкл/мин в течение 180 с. Кинетику ассоциации и диссоциации антиген-антитело отслеживали в течение 480 с или 1200 с для антител с более медленной скоростью диссоциации.

В каждом случае выполняли соответствующие контроли с помощью чистой проточной ячейки, не содержавшей иммобилизованного белка, для вычитания фона. Последовательные введения 10 мМ НС1 в течение 10 с при 50 мкл/мин, а затем 10 мм глицина (рН 2,0) в течение 30 с при 50 мкл/мин использовали в качестве регенерирующих условий на протяжении всего исследования.

В каждом случае для определения кинетических параметров на основании набора концентраций анализируемого соединения, разведенного НВ8-ЕР буфером для анализа, использовали программное обеспечение В1Аеуа1иабоп В1асоге версии 3,2 (В1асоге АВ, Уппсала, Швеция). Кривые ассоциации и диссоциации строили согласно ленгмюровской модели связывания при соотношении 1:1, используя программное обеспечение В1асоге ТМ В1Аеуа1иабоп (В1асоге АВ) в соответствии с рекомендациями изготовителя.

Результаты определения сродства и кинетических параметров (при вычитании фона) показаны на фиг. 1.

Для каждого антитела на фигурах показаны средние значения по двум отдельным сериям экспериментов, с использованием отдельно подготовленной проточной ячейки в каждом конкретном случае (где ка = константа скорости ассоциации, кб = константа скорости диссоциации, КО = равновесная константа диссоциации (мера сродства), КА = равновесная константа ассоциации, Ктах = максимальный ответный сигнал 8РК).

Пример 3. ЕЬ18А для определения связывающих характеристик моноклональных антител человека

- 32 024701 по отношению к СЭ27.

Титрационные микропланшеты покрывали растворимым или рекомбинантным СЭ27 человека или макака в РВ§, а затем блокировали 5% бычьим сывороточным альбумином в РВ§. Моноклональные антитела человека, очищенные белком А, и изотипические контрольные антитела вносили в насыщающих концентрациях и инкубировали при 37°С. Планшеты промывали РВ8/Т\уееп и затем инкубировали с Рсспецифическим поликлональным реагентом козы против 1д0 человека, конъюгированным с щелочной фосфатазой, при 37°С. После промывки планшеты обрабатывали субстратом рМРР (1 мг/мл) и анализировали при ΘΌ 405-650 с помощью ридера для титрационных микропланшетов. Типичные кривые связывания показаны на фигуре 2. Результаты также использованы для оценки 50% насыщающей концентрации (значение С 4-параметрической кривой), как показано в табл. 1 ниже.

Для определения того, является ли яванский макак релевантной моделью для тестирования моноклональных антител против СО27, на планшетах для ЕЫ8А иммобилизовали различные концентрации очищенного СЭ27 макака или СЭ27 человека с помощью антител против Р1ад с последующим инкубированием с моноклональными антителами против СЭ27 человека. Для обнаружения использовали антитела Рс-НКР против 1д0 человека и субстрат §ирет В1ие ТМВ. Результаты представлены в табл. 1, которая показывает сходство связывания с СЭ27 макака и человека. Типичные кривые связывания для антитела 1Р5 также показаны на фиг. 3.

Таблица 1. Оценка характеристик выбранных моноклональных антител против СО27

тАЬ	Полумаксимальное	Полумаксимальное связывание С СО27 человека (мкг/мл) * *	Полумаксимальное связывание с СР27 обезьяны (мкг/мл) *★
связывание с человека СМ)	СН27 * *
1С5	4,9Е-10	0,074	0,065
1Н8	4,ЗЕ-10	0,064	0,105
ЗН12	5,7Е-10	0,085	0,123
ЗН8	4,6Е-10	0,069	0,065
209	4,ЗЕ-10	0,064	0,069
1Р5	3,9Е-10	0,059	0,12
ЗА10	6,ЗЕ-10	0,094	связывание отсутствует
2С2	3,ОЕ-10	0,045	0,034

** согласно связыванию с планшетами с иммобилизованным СЭ27 в формате ЕЫ8А

В дальнейшем эксперименте, для определения аналогичного распределения связывания 1Р5 с клетками периферической крови, из цельной крови 3 людей и 3 яванских макак выделили МПК. Клетки обрабатывали моноклональными антителами 1Р5 вместе с маркерами для определения размеров основных популяций Т- и В-клеток, экспрессирующих СО27. В следующей таблице (табл. 2) приведены средние значения±стандартная ошибка результатов для клеток человека и макака по отношению к проценту клеток, экспрессирующих СЭ27, и интенсивности экспрессии (МР1). Эти данные определяют аналогичное распределение связывания 1Р5 с клетками периферической крови человека и обезьяны.

Таблица 2

Анализ	С04+Т клетки	1 Сй8+Т клетки	В клетки (СО20+)	ΝΚ клетки
	человек	обезьян.	. человек	обезьяна	человек обезьяна	человек	обезьяна
% С027+	84 + 5	81 ± 1	70 + 12	90 ±1	37 + 4 15 + 1	11+4	88 + 6
МЙ	1517+123	416+ 14	1415+ 153	519+11	893± 101 491+ 113	667± 28	1050+ 42

Пример 4. 4А: блокирование связывания кСЭ70 с помощью ЕЫ8А.

Действие моноклональных антител человека из примера 1 на связывание растворимого СЭ70 (кСЭ70) с белком СЭ27 измеряли с помощью ЕЫ8А. Титровальные микропланшеты покрывали 1 мкг/мл растворимого рекомбинантного химерного белка СЭ27 человека/Рс от Κ&Ό §ук!етк при 1 мкг/мл, а затем блокировали 5% РВА. Антитела против СЭ27 ([конечная концентрация] = 25 мкг/мл) смешивали с растворимым рекомбинантным СЭ70 человека-биотин от И8 Вю1одюа1к ([конечная концентрация]=0,5 мкг/мл) и вносили на планшет. тСО70, захваченные СЭ27, обнаруживали с помощью стрептавидин-НКР и субстрата 8ирет В1ие ТМВ. Результаты (в виде % блокирования) показаны на фиг. 4 с контрольными значениями, как указано. Эти результаты показывают, что некоторые из антител (в том числе 1Р5, 1Н8, 3Н12 и 1А4) обладали способностью блокировать или, по меньшей мере, существенно ингибировать связывание кСЭ70.

4В: моноклональные антитела СО27 связываются с СО27 на клетках лимфобластоидных линий человека и блокируют связывание лиганда (СЭ70).

Связывание моноклональных антител человека 1Р5 против СЭ27 с клетками лимфобластоидных

- 33 024701 линий человека и блокирование связывания кСИ70 анализировали с помощью проточной цитометрии, используя проточный цитометр Вес!оп Эюкткоп РАС8Сап!о II. Результаты показаны на фиг. 5, и показывают, что 1Р5 эффективно связывались с клетками различных линий и конкурентно ингибировали связывание кСИ70.

Пример 5. Связывание моноклональных антител человека с клетками, экспрессирующими СЭ27 человека.

Способность моноклональных антител человека против СЭ27 связываться с СЭ27 на клетках, экспрессирующих СЭ27 человека на своей поверхности, исследовали проточной цитометрией следующим образом.

Антитела тестировали на связывание с линиями клеток человека, экспрессирующих Ό27 человека на своей поверхности. Моноклональные антитела человека 2С2, 3Н8 и 1Р5, очищенные с помощью белка А, инкубировали с клетками 1игка!, Раджи, Каток и Дауди, экспрессирующими СЭ27 человека, а также контрольными клетками при 4°С. Все антитела использовали при насыщающих концентрациях. Через 1 ч клетки промывали РВ§, содержащим 0,1% БСА и 0,05% №ιΝ₃ (РВА) и обнаруживали связанные антитела путем инкубирования клеток с Рс-специфическим зондом козы, меченным РЕ, против 1д0 человека при 4°С. Избыток зонда удаляли из клеток путем промывки РВА и определяли флуоресценцию, связанную с клетками, в ходе анализа с использованием инструмента Ь§КТМ (ВИ Вюкшепсек, штат Нью-Джерси, США) в соответствии с указаниями производителя.

Как показано на фиг. 6 и 7, моноклональные антитела человека демонстрировали высокий уровень связывания с клетками, экспрессирующими СИ27 человека. Эти данные демонстрируют, что указанные антитела эффективно и специфически связывались с СИ27 человека, экспрессирующимся на живых клетках, по сравнению с контрольными клетками.

Пример 6. Перекрестное блокирование/конкуренция моноклональных антител человека, определяемое с помощью ЕЬРЗА.

Титрационный микропланшет покрывали химерным гибридным белком рекомбинантный СИ27 человека-Рс, а затем блокировали 5% БСА в РВ§. Неконъюгированные моноклональные антитела человека (20 мкг/мл) смешивали с вторичными антителами, мечеными пероксидазой хрена (0,5 мкг/мл), затем вносили на планшет и инкубировали при 37°С. Планшеты промывали РВ8/Т\уееп, обрабатывали субстратом ТМВ и анализировали при ОИ 450 с помощью ридера титрационных микропланшетов. Результаты, показанные на фиг. 8-10, означают, что моноклональные антитела человека первого набора (включающего моноклональные антитела 1Р5, 1Н8 и 3Н12) перекрестно конкурировали друг с другом (см. фиг. 8), что моноклональные антитела человека другого набора (включающего моноклональные антитела 2С2, 3Н8, 105 и 209) также перекрестно конкурировали друг с другом (см. фиг. 9), и что моноклональное антитело человека 3А10 связывалось с уникальным эпитопом, но могло связываться с сайтом, не совпадающим, но, возможно, расположенным вблизи от сайтов связывания моноклональных антител 1Р5, 1Н8 и 3Н12, поскольку эти антитела были способны к частичному перекрестному блокированию связывания 3А10 с СИ27 (см. фиг. 10).

Пример 7. Комплемент-зависимая клеточная цитотоксичность (СИСС или СЭС).

Клетки-мишени (клетки лимфомы Раджи) культивировали (в среде АБМ-ν) в течение 1-2 ч при температуре 37°С, 5% СО₂ в присутствии антител против СИ27 и комплемента кролика (конечное разведение 1:15) в конечном объеме 150 мкл. Кроме того, в исследование включали соответствующие контроли со слабым сигналом (только мишени) и максимальным сигналом (мишени с детергентом Ьуко1™ при 12% и конечной концентрации 4%). Количество клеток доводили до 1х10⁶/мл и вносили по 50 мкл в каждую лунку (внося 50000 клеток/лунка). Затем ресуспендировали лунки и 100 мкл клеточной суспензии переносили в непрозрачный, белый планшет. В каждую из указанных лунок вносили 100 мкл реагента Рготеда СеИТйег 01о и перемешивали планшет в течение 2 мин при комнатной температуре. Планшет инкубировали в течение 10 минут для стабилизации люминесцентного сигнала. Люминесценцию регистрировали на планшет-ридере Регкш Е1тег ^с!ог Х4. Цитотоксичность определяли по следующей формуле: (100-((образец-максимальный сигнал)/(слабый сигнал-максимальный сигнал)))х100. Результаты (в виде % лизиса) показаны на фиг. 11, из которой видно, что ряд антител против СИ27 демонстрировал значительную СИСС-активность.

В дальнейшем эксперименте клетки-мишени (клетки Каток) промывали и нагружали красителем Са1сет АМ (Мо1еси1аг РгоЬек). Затем нагруженные клетки повторно промывали и ресуспендировали до 1х10⁶/мл в культуральной среде (КРМ1+10% РВ§). Клетки-мишени культивировали в течение 2 ч при 37°С, 5% СО₂ в присутствии антител против СИ27 и комплемента кролика (конечное разведение 1:15) в конечном объеме 150 мкл. Кроме того, в исследование включали соответствующие контроли со слабым сигналом (только мишени) и максимальным сигналом (мишени с ТгПоп Х-100 при 20% и конечной концентрации 2%). После инкубирования 75 мкл надосадочной жидкости переносили в непрозрачный, черный планшет. Флуоресценцию (возб. 485; эм. 535) регистрировали на планшет-ридере Регкш Е1тег ^с!ог Х4. Специфическую цитотоксичность определяли по следующей формуле: (экспериментальное значение-спонтанный лизис)/(максимальный лизис-спонтанный лизис)х 100. Результаты, показанные на фиг.

- 34 024701

12, означают, что моноклональные антитела против СГО27 (1Р5) демонстрировали, по меньшей мере, 10% СЭС-активность в клетках Каток при концентрации антител 3 мкг/мл.

Пример 8. Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (АЭСС).

Клетки-мишени (клетки лимфомы Раджи) промывали и нагружали реагентом ВАТЭА (Реткш Е1тег). Затем нагруженные клетки повторно промывали и ресуспендировали до 2х10⁵/мл в культуральной среде (КРМ1+10% РВЗ). Эффекторные клетки подготавливали и доводили до соответствующей концентрации в культуральной среде, получая желательные соотношения эффектор:мишень (100:1-50:1). В круглодонный планшет вносили клетки-мишени, эффекторные клетки и антитела в конечном объеме 150 мкл. Использовали соответствующие контроли, включая слабый сигнал (только мишени), сигнал спонтанного лизиса (мишени+эффекторы) и сигнал максимального лизиса (мишени+детергент ЛизолТМ при 12% и конечной концентрации 4%). Клетки осаждали в планшете и инкубировали в течение 2 ч при 37°С, 5% СО₂. После инкубирования 20 мкл надосадочной жидкости переносили в непрозрачный, белый планшет. В каждую из указанных лунок вносили 200 мкл раствора европия (Реткш Е1тег) и перемешивали планшет в течение 15 мин. Флуоресценцию с разрешением по времени регистрировали на планшетридере Реткш Е1тег Ую!от Х4. Специфическую цитотоксичность определяли по следующей формуле: (экспериментальное значение-спонтанный лизис)/(максимальный лизис-спонтанный лизис)х100. Результаты (в виде % лизиса) показаны на фиг. 13, из которой видно, что ряд антител против СО27 демонстрировал значительную АЭСС-активность.

В дальнейшем эксперименте клетки-мишени (клетки лимфомы Каток и Дауди) промывали и нагружали красителем Са1сеш АМ (Мо1еси1аг РгоЬек). Затем нагруженные клетки повторно промывали и ресуспендировали до 1х10⁵/мл в культуральной среде (КРМ1+10% РВЗ). Нагруженные клетки подготавливали и доводили до соответствующей концентрации в культуральной среде, получая желательные соотношения эффектор:мишень (75:1). В круглодонный планшет вносили клетки-мишени, эффекторные клетки и антитела в конечном объеме 150 мкл. Использовали соответствующие контроли, включая слабый сигнал (только мишени), сигнал спонтанного лизиса (мишени+эффекторы) и сигнал максимального лизиса (мишени+Тгйои Х-100 при 20% и конечной концентрации 2%). Клетки осаждали в планшете и инкубировали в течение 4 ч при 37°С, 5% СО2. После инкубирования 75 мкл надосадочной жидкости переносили в непрозрачный, черный планшет. Флуоресценцию (возб. 485; эм. 535) регистрировали на планшет-ридере Реткш Е1тег Ую!ог Х4. Специфическую цитотоксичность определяли по следующей формуле: (экспериментальное значение-спонтанный лизис)/(максимальный лизис-спонтанный лизис)х100. Результаты, показанные на фиг. 14, показывают, что моноклональные антитела против СО27 (1Р5) демонстрировали по меньшей мере 10% АЭСС-активность (измеренную как специфическая цитотоксичность) в клетках Дауди и Каток при концентрации антител 3 мкг/мл и отношении эффектор: клетки-мишени 75:1.

Пример 9. Секвенирование антител.

Как описано выше в примере 1, моноклональные антитела человека из гибридом, продуцирующих специфические моноклональные 1д0-антитела человека, очищали колоночной хроматографией с белком А, что приводило к выделению панели антител (мАт человека), представляющих особый интерес. Кодирующие области У_н и У_ь моноклональных антител человека 4В7, 3Н12, 1Р5, 2С2, 209, 1Н8, 3Н12, 301 (1В10), 4А2, 3А10, 2011, 4Н11, 2Н3, 4А7, 3Н8 и 105 определили, используя РНК из соответствующих гибридом. РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК, кодирующие области У-доменов амплифицировали с помощью ПЦР и секвенировали продукт ПЦР. Ниже приведены нуклеотидные и аминокислотные последовательности У_н и У_ъ-областей моноклональных антител человека (в случае аминокислотной последовательности гипервариабельные области (СОК) подчеркнуты).

3Н8 У_н (Ун 3-7; Б7-27; .1112)

Нуклеотидная последовательность У_н (ЗЕО ГО N0:5):

аСддадкеддддсСдадсЬдддееьессРРдккдсРаСкСеадааддЪдкссадкдкд аддкдсадскддСддадксЬдддддаддсССддСссадсскддддддксссСдадасЬсйсск дрдсадссксйддаСРсассЬРРадЬадкЬаСйддакддсскдддРссдссаддсСссаддда аадддсРддадйддсСдддсааСайааадсаадаСддаадЬдадааайасСаЬдСддасЬсСд

РдаадддссдайЬсассаСсЬссададасаасдссаадаасСсасйдйаСсСасаааСдааса дсскдададссдаддасасддсСдСдкаСкасСдкдкдадддааскддддакддаскддкасС

СсдайсСсСддддссдСддсасссйддйсасСдСсСссСса

Аминокислотная последовательность У_н (ЗЕО ГО N0:6) (включая сигнальный пептид, выделенный подчеркнутым курсивом):

- 35 024701

М£ЬСЬЗ№УГЬУА1£,ЕСУССЕУ0ЬУЕЗС<ЗаЬУрраоЗЬЕЬ5СААЗОРТР53УТО4АВДУЕ0

АРОКОЬЕКЬОЫЬКОРаЗЕКУУУРЗУКСКРТГЗКРЫАКЫЗЬУЬОМЫБЬПАЕРТАУУУСУПЕЬдМ рнуррьисеотьутузз

Зрелая аминокислотная последовательность У_Н (8ЕО ГО ΝΟ:7), за исключением сигнального пептида:

ЕУОЬУЕ БСССЬУОРССБЬЕЬБ САА5СРТР5 5УТОМАИУЕОАРОКОЬЕМЬОЫ I КОРОБ ΕΚ УΥУРБУКОЕРТI 3ΕΡΝΑΚΝ3ΡΥΡ0ΜΝ3 ЬКАЕРТАУУУСУЕЕЬСМРИУРРШОЕСТЬУТУБ Б

СРЕ1	ν_Η	(ЗЕО	ΙΡ	N0:8):	ΟΡΤΡ33ΥΝ
СРЕ2	ν_Η	(5ΕΏ	ΙΡ	N0:9);	1КОРОЗЕК
СРЕЗ	Ун	(8Е<2	ТР	N0:10)	: УЕЕЬСМРНУРРЬ

3Н8 УК #2 (УК 3-11; Ж1)

Нуклеотидная последовательность У_ъ (8Е0 ГО ΝΟ:11):

АЬддаадссссадсЬсадсЬЬсЬсЬЬссЬссЬдсЬасЕсЬддсЬсссадаЬассассд дадаааЬЕдЬдЪЪдасасадЬсСссадссасссЕдСсЬЕЪдЪскссаддддааададссассс

ЬсЬссЬдсадддссадЬсададСдЬЬдасадсЬасЬЬадссиддЬассаасадааассЬддсс аддсЪсссаддсЪссксаЬсЪаЪда^дсагссаасадддссаскддсаЬсссадссаддЬЬса дЬддсадЪдддЬсСдддасадасЬСсасЪсЪсассаЬсадсаассЪададссЬдаадакЪЫед садЪЬБаЪЬасЬдЬсадсадсдЬадсаасЬддссЬссдасдЪЬсддссаадддассааддЬдд аааЬсааа

Аминокислотная последовательность У_ъ (8Е0 ГО ΝΟ:12) (включая сигнальный пептид, выделенный подчеркнутым курсивом):

№АРА0®ЬГЬЬТТтаР0ГГОЕ1УЬТ05РАТЬЗЬ5РСЕКАТЬЗСКА503\ГОЗУЬАИУ20

КРаОАРКЬЫУрАЗЫЕАТС1РАЕРЗОЗОЗОТРРТЬТ13МЬЕРЕРРАУУУСООЕ31ТМ№ТРООО

ТКУЕ1К

Аминокислотная последовательность У_ъ (8Е0 ГО ΝΟ:13), за исключением сигнального пептида:

ЕIУЬТОБ РАТЬБЬЗ РСЕЕАТЬЗСЕАЗОЗУРЗУЬАМУООКРООАРЕЬЫΥΡΑ3ΝΕΑΤΟΙ

РАЕРБСЗОЗОТРРТЬТ13ЫЬЕРЕРРАУУУС00Е5ЫИРРТРС0СТКУЕ1К

СРЕ1	У_ь	(5Е0	ΙΏ	N0:14):	ОЗУРЗУ
СРЕ2	Уь	(5Е<2	ΙΡ	N0:15):	РАЗ
СРЕЗ	Уь	(ЗЕ<2	ΙΡ	N0:16):	00Ε3ΝΗΡΡΤ

3Н8 УК #3 (УК 3-11; Ж1)

Обнаружили, что следующая легкая цепь также являлась активной (хотя в вышеприведенных примерах использовали только вышеописанные легкие цепи (3Н8-1В11 УК #2)):

Нуклеотидная последовательность У_ъ (8Е0 ГО ΝΟ:17):

АЬддаадссссадс1:садсЫ:сс.сЫ;ссЬссЬдсСасЬс1:ддсс.сссада(;ассассд дадааакЪдЪдьЬдасасадьсьссадссассс'СдЪсЫ.с.дЪсьссаддддааададссассс

ЪсЬссидсадддссадЪсададЬдЬЬадсадсиасЬЪадссЬддЬассаасадааассЪддсс аддсСсссаддсессСсаЪсГаЪдаЬдсаЬссадсадддссасГддсаЬсссадасаддЪЪса дЬддсадЬдддЬсЬдддасадасЬЬсасксЬсассаСсадсадасЬддадссЬдаадаЬЬЬЬд садЪдЬаСЬасЪдЬсадсадсдЪадсаасЬддссЬссдасдкЪсддссаадддассааддЪдд ааагсааа

Аминокислотная последовательность У_ъ (8Е0 ГО ΝΟ:18) (включая сигнальный пептид, выделенный подчеркнутым курсивом):

МЗАРАСААГАЬАЫУАРРГГеЕ I УЬТ<2 Б РАТЬ 3 ЬЗ РОЕКАТЬ 5 СКАЗОЗУЗЗУЬАИ У<2<2 КРО0АРЕЬЫУРА53ЕАТО1РРЕР5ОБО5ОТРРТЬТ13ЕЬЕРЕРРАУУУС00ЕЗКИРРТРС0О ТКУЕ1К

Аминокислотная последовательность У_ъ (8Е0 ГО ΝΟ:19), за исключением сигнального пептида:

- 36 024701

Е1УЬТ2£РАТЬЗЬ5Р0ЕЕАТЬЗСКА32еуЗЗУ1АМУ00КРС0АРК.ЬЫУрАЗЗКАТ(31

РРЕРЗОЗСЗОТРРТЬТ13ЕЬЕРЕРРАУУУС00ЕЗЫИРРТРО05ТКУЕ1К

СРЕ1	Уь	(ЗЕО	ΙΡ	N0:20):	ОЗУЗЗУ
СРЕ2	Уь	(5Е0	ΙΡ	N0:21}:	РАЗ
СРЕЗ	Уь	(БЕ£>	ΙΡ	N0:22}:	00Ε3ΝΝΡΡΤ

2С2 Ун (Ун 3-33; Б1-7; .1114)

Нуклеотидная последовательность Ун (БЕЦ ГО N0:23):

АЕддадОЬЕдддсЬдадсЕдддЕЕЕЕссЕсдЬЬдсЬсРЕЕЕаададдЬдЕссадЕдЕс аддЕдсаасЕддЕддадЬсЬдддддаддсдРддЕссадссЕдддаддЕсссЕдсдасЕсЬссЕ дЕдсадсдЬсЕддаЬЬсассЕЕсадЕадсЕаЬдасаЕасасЕдддЕссдссаддсЬссаддса аддддсЬддадЬдддЬддсадЕЬаЪаЕддааЬдаЬддаадеааЪаааЬасСаедсадасЕссд

ЕдаадддссдаЕЕсассаЬсЕссададасааЕЕссасдаасЬсдсЕдЕЕЕсЕдсаааЕдааса дссЬдададссдаддасасддсЬдЬдеаЫгаЬЬдЬдЬдддаддаасЕдсЬдассЬЬдаасасЁ дддассадддаасссЬддГсассдЕсЬссЬса

Аминокислотная последовательность ν_Η (БЕЦ ГО N0:24) (включая сигнальный пептид, выделенный подчеркнутым курсивом):

МЕГСЬ51УУР£УА1АВ6У£>С2УОЬУЕЗОССУУОРОЕ5ЬЕЬЗСАА5СРТРБЗУР1НИУЕО

ΑΡσΚ0ΡΕΝνΑνΐΜΝΡ53ΝΚΥΥΑΡ3νΚΘΕΡΤΙ3ΕΡΝ3ΤΝ3ΡΡΡ2ΜΝ3ΡΕΑΕΡΤΑνγΥ0ν0ΟΤΑΡ

ЬЕНИРООТЬУТУЗЗ

Аминокислотная последовательность ν_Η (8ЕЦ ГО N0:25), за исключением сигнального пептида:

ОУОРУЕЗОССУУОРОЕЗРЕРЗСААЗСРТРЗЗУРТНИУЕОАРСКСЬЕИУАУРИЫРОЗЫК

УУАРЗУКСЕРТТЗЕРЫЗТЫЗРРЬРМЫЗЬЕАЕРТАУУУСУССТАРРЕНМРОСТЬУТУЗЗ

СРЕ1 У_н	(ЗЕ<2 ΙΡ N0:26) :	0ΡΤΡ35ΥΡ
СРЕ2 У_н	(ЗЕО ΙΌ N0:27):	ΙΝΝΡ05ΝΚ
СРЕЗ У_н	(ЗЕ2 ΙΡ N0:28):	УСОТАРЬЕНГСРО

2С2 УК (УК 1ϋ-16; .ΙΚ4)

Нуклеотидная последовательность V (8ЕЦ ГО N0:29):

АЪдадддЪссЕсдсЬсадсЪссЕддддсЕссЪдсЕдсЬсЬдЪЕЕсссаддСдссада!:

дЬдасаЬссадаЕдасссадЕсЪссаСссесасОдЬсЬдсаЬсЪдОаддадасададЕсасса

ЬсасЕОдОсдддсдадЕсадддЬаЪЕадсадсЕддЬЬадссЬддЬаЪсадсадааассадада аадссссЬаадЕсссОдаЬсЕаЕдсОдсаЬссадЬЬЬдсааадОддддЬсссаЕсааддЕЬса дсддсадЕддаЪсЕдддасадаЬЕЕсасРсс.сассаЬсадсадссРдсадсс1:даадаЕЬЕЬд саасгеаЬЬасЕдссаасадЕаЕааСадЪЕасссЬсЬсасРЬЕсддсддадддассааддРдд адаЕсааа

Аминокислотная последовательность V (8ЕЦ ГО N0:30) (включая сигнальный пептид, выделенный подчеркнутым курсивом):

ИЕУЬА2ЬАСААЬЬСГРСАКСР1(2МТОЗРЗЗРЗАЗУСРЕУТ1ТСЕАЗОС133ИЬАМУОО

КРЕКАРКЗЫУААЗЗРОЗОУРЗЕРдОЗОЗСТРРТЬТ133ЬОРЕРЕАТУУСООУЫЗУРЬТГООО

ТКУЕ1К

Аминокислотная последовательность νΗ (8ЕЦ ГО N0:31), за исключением сигнального пептида:

Р1СМТСЗРЗЗЬЗАЗУеРЕУТ1ТСЕАЗОС133МЬАИУОСКРЕКАРКЗЫУААЗЗЬСЗОУ

РЗЕРЗСЗОЗОТРРТЬТI3ЗЬОРЕРРАТУУСООУНЗУРЬТРООСТКУЕIК СРЕ1 У_ь (ЗЕ<2 Ю N0:32): 0ΟΙ33Η СРЕ2 У,, (ЗЕО Ю N0:33): ААВ 0ΏΚ3 У_ь (ЗЕО Ю N0:34); 00ΥΝ3ΥΡΙ/Γ

- 37 024701

1Р5 ν_Η (У_н 3-33; Ώ7-27; .1114)

Нуклеотидная последовательность ν_Η (БЕЦ ГО N0:35):

АбддадбббдддсбдадсЬдддббЪСссесдббдсЕсббЕбаададдЕдбссадбдЕс аддбдсадсбддЬддадбсбдддддаддсдбддбссадссбдддаддбсссбдадасбсбссб дбдсадсдбсбддаббсассббсадбадббабдасабдсасбдддбссдссаддсбссаддса аддддсЬддадбдддбддсадббабабддбаЬдабддаадЬааЬааабасбабдсадасбссд

Ьдаадддссдаббсассабебссададасааббссаадаасасдсбдбабсбссааабдааса дссбдададссдаддасасддсбдбдбаббасбдбдсдададдбадбддбаасбддддбббсб

Ьбдасбасбддддссадддаасссбддбсассдбсбссбса Аминокислотная последовательность У_Н (ЗЕО ГО NО:36) (включая сигнальный пептид, выделенный подчеркнутым курсивом):

АГЕР(?£3<УУГЬтаЬ£ДОУ0О0У0ЬУЕЗ<Зд<ЗУУ0Р5ЕЗЬКЪЗСААЗСРТРЗЗУРМН№УК0 АРОКСЬЕУ^УАУТМУРОЗЫКУУАРдУКОЕРТТЗКРНЗКЫТЬУЪОМНаЬКАБРТАУУУСАКОВОМ когрруксостьутузз

Аминокислотная последовательность У_Н (ЗЕО ГО NО:37), за исключением сигнального пептида:

ОУОРУЕЗОООУУОРСЕЗРЕЬЗСААЗОРТРЗЗУРМНИУЕОАРаКОЬЕМУАУ1ИУРСЗЫК

УУАРЗУКСЕРТТЗЕРМЗ^ТРУЬОММЗЬЕАЕРТАУУУСАЕОЗСОТЮРРРУИООСТЬУТУЗЗ

СРЕ1	Ун	(ЗЕО	ΙΌ	N0:38):	СРТРЗЗУР
СРЕ2	Ун	(ЗЕО	ΙΡ	N0:39):	ΙΝΥΡ03ΝΚ
СРЕЗ	Ун	(ЗЕО	ΙΡ	N0:40):	АЕСЗСГЖСРРРУ

1Р5 νΚ #2 (νΚ 1ϋ-16; .ΙΚ1)

Нуклеотидная последовательность У_ь (ЗЕО ГО NО:41):

АЬдадддбссбсдсбсадсбссбддддсбссбдсбдсбсбдбЕСсссаддбдссадаЕ дЬдасаЕссадаЬдасссадЬсбссаЪссбсасбдбсЬдсабсЬдйаддадасададйсасса бсасббдЬсдддсдадбсадддбаЕбадсаддбддббадссбддЪабсадсадааассадада аадссссЬаадСсссбдабсЕабдсбдсаЕссадббХдсааадЕддддЪсссаЕсааддЕЕса дсддсадбддабсЬдддасадабЫ:сасЪс1:сассаЬсадсадссбдсадссб.даадаЪббЪд саасббаббасбдссаасадЕабаабасббасссбсддасдЕЕсддссаадддассааддбдд ааабсааа

Аминокислотная последовательность У_ъ (ЗЕО ГО NО:42) (включая сигнальный пептид, выделенный подчеркнутым курсивом):

МЕУААОААОЫАЬСГРОАЕСР10МТ03Р5 5 ЬЗ АЗ У0РЕУТ1 ТСЕАЗОСРЗЕМЬАИУОО КРЕКАРКЗЫУАА35Ь03аУРЗЕРЗСЗСЗСТЕРТЬТ133Ь0РЕРРАТУУС00таТУРЕТРО0О ТКУЕ1К

Аминокислотная последовательность У_ъ (ЗЕО ГО NО:43), за исключением сигнального пептида: РЮМТОЗРЗЗЬЗАЗУОРЕУТ1ТСЕАЗОС13ЕИЬАМУООКРЕКАРКЗЫУААЗЗЬ050У

РЗЕРЗОЗаЗОТРРТЬТ153ЬОРЕРРАТУУСООУЫТУРЕТРООеТКУЕ1К

СРЕ1 У_ь (ЗЕО 1Г> N0:44) :	0ΘΙ3ΕΝ
СРЕ2 У_ь (ЗЕО Ιϋ N0:45):	ААЗ
СРЕЗ У_ь (ЗЕО Ю N0:46) :	ΟΟΥΝΤΥΡΕΤ

1Н8 νΗ (νΗ 3-33; Р7-27; .1114)

Нуклеотидная последовательность У_Н (ЗЕО ГО NО:47):

- 38 024701

АЬддадЬЬЬдддсЬдадсЬдддЬЬЪЬссЬсдЫдсЬсЪЬЬЬаададдЪдЬссадЬдЪс аддЬдсадсЪддьддад1;сС.дддддаддсд1;ддЬссадссЬдддаддЬсссЁдадасЪс1:сси дЬдсадсдЬсЬддаЬЬсасс'ЬЪсааЬа'исЬаЬдасаСдсасЬдддЬссдссаддсЬссаддса аддддседдадЪдддЬддсадЬЬаЬаЬддЬаЬдаЬддаадЬааЪсааЬасЬаЬдсадасЬссд

ЪдаадддссдаЫссассаЬсбссададасааЬЬссаадаасасдсЬдЬаЬсЪдсаааЪдааса

ЬЬ1:ЬдададссдаддасасддсЬдЕдЕ.аЦС.ас1;дЬдсдададдЬ.асЬсас(;дддддЬасЫ;Ьд асСасЬддддссадддаасссЬддЬсассдЬсЬссЪса

Аминокислотная последовательность ν_Η (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:48) (включая сигнальный пептид, выделенный подчеркнутым курсивом):

МЕТОАЗ^УГРУЛАХДдУСеОУОЬУЕЗСССУУОРСЕЗЬКЬЗСААЗСРТРНГУРМНКУЕО АРСКаЬБИУАУТИУрдЗЫОУУАРЗУКОЕРТТЗЕРЫЗКНТЬУЬОММЬЬЕАЕРТАУУУСАЕОТНИ СУРрУМОООТЬУТУ 5 3

Аминокислотная последовательность ν_Η (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:49), за исключением сигнального пептида: (2У0ЬУЕЗСОСУУ0РаР.ЗЬНЬЗСАА32ГТГД1УРМНМУКСАРОК13ЬЕ№7АУ1ИУРОЗЫ<

УУАРЗУКСЕРТ15ЕРПЗИЯТРУЬ0МЫ1ЬЕАЕРТАУУУСАЕОТНИСУРрУИССОТЬУТУЗЗ

СРЕ1 Ун	(5Е<2 ΙΡ N0:50):	ΟΡΤΡΝΙΥΡ
СРЕ2	ν_Η	(5Е<Э	ΙΏ	N0:51):	ΙΝΥΡΟΞΝζ)
СРЕЗ	У_н	(ЗЕО	ΙΡ	N0:52):	ΑΕΟΤΗΝΟΥΡΡΥ

1Н8 νκ (νκ 1Ό-16; ίΚ1)

Нуклеотидная последовательность ν (8Е0 ΙΌ ΝΟ:53):

АЬдадддЬссСсдсЪсадсЬссЬддддсЪссбдсЬдсЬсЬдЬЪЬсссаддЪдссадаЪ дЬдасаЬссадаЬдасссадЪсЬссаЬссЬсасЬдЬсЬдсаЬсЬдЬаддадасададЬсасса

СсасЬЬдЦсдддсдадЬсадддЬаЬЬадсадсЬддЬЬадссЬддЬаЬсадсадааассадада аадссссЬаадессседаЬсЪаЪдсЬдсасссааЫХдсааадЬддддьсссаЬсааддЬЬса дсддсадЬддаЪсЬдддасадаЬЬЬсасЬсЬсассаЬсадсадссЪдсадссСдаадаЬЫЪд саасЫаЫасСдссаасадЬаСааСадЫасссЬсддасдССсддссаадддассааддСдд ааабсааа

Аминокислотная последовательность ν (8Е0 ΙΌ ΝΟ:54) (включая сигнальный пептид, выделенный подчеркнутым курсивом):

МКУЬАОЬЪаЪЬЪЬСГРвАКСР 1<2МТ<Э5 РЗ 3 ЬЗАЗУСРЕУТIТСЕАЗОСЯЗЗИЬАМУОО КРЕКАРКЗЫУААЗЫЬСЗеУРЗЕРЗСЗОЗСТРРТЬТРЗЗЬОРЕРРАТУУСООУЫЗХРЕТРСОа ТКУЕ1К

Аминокислотная последовательность ν (8ЕО ΙΌ ΝΟ:55), за исключением сигнального пептида:

Р1ОМТОЗРЗЗЬЗАЗУСРЕУТ1ТСЕАЗОС133МЬАМУООКРЕКАРКЗЫУААЗНЬОЗСУ РЗЕРЗСБОЗСТРРТЬТI33ЪОРЕРΡΑΤΥΥ000ΥΝ3ΥΡΕΤРСОСТКУΕΙК

СРЕ1	Уь	(ЗЕО	ΙΏ	N0:56):	0ΟΙ33Ν
СРЕ2	Уг,	(ЗЕО	Ιϋ	N0:57):	АА5
СРЕЗ	Уь	(ЗЕО	ΙΡ	N0:58):	00ΥΝ3ΥΡΚΤ

1С5 УН (УН 3-33; Бб-19; .1112)

Нуклеотидная последовательность ν_Η (8ЕО ΙΌ ΝΟ:59):

АЬддадЬЪСдддсЬдадсЬдддСЬЬЬссЬсдЬСдсЬсЬЬЬЬаададдЬдЬссадЬдЬс аддЬдсаасЪддЬддадЬсЬдддддаддсдСддЪссадссЪдддаддЬсссЪдадасГсессС дЬдсадсдЬсЬддаЕЬсадсЬ'ЬсадЬадсЬаЬддсаЬдсасЬдддЬссдссаддсЬссаддса адддасЬддадЬдддСддсасЬЬсЬаЬддЬаЬдаЬддСадссаЬааадасЬССдсадасСссд

ЪдаадддссдаЬЬсассаЬсЬссададасааЫссаадаасасдсЬадаЬсЪдсааакдааса дссЬдададссдаддасасддсХдЬдЬаСЬасСдЬдсдадададддЬЬЬадсадЬассЬддЬс асЬддЬас(:(:сдаЬс1:с1;ддддссдЬддсассс1:ддЬсасС.дЬсЬссЪса Аминокислотная последовательность ν_Η (8ЕО ΙΌ ΝΟ:60) (включая сигнальный пептид, выделен- 39 024701 ный подчеркнутым курсивом):

мкгеьг^угьУАЬьксУссоУОЬУвздооууорокз реьз саазсрзрззуомнутуео АРдкдЬЕМУАЪЬИУРСЗНКРРАРЗУКСКРТЬЗЕРНдКЫТЬРЫЗМНЗЬЕАЕРТАУУУСАЕЕСЬА УРСНМУРРЬМСЕСТЬУТУЗ3

Аминокислотная последовательность У_Н (8ЕО ГО N0:61), за исключением сигнального пептида:

ОУОЬУЕЗОООУУОРОКЗЬЕЬЗСААЗОРЗРЗЗУОМНИУЕОАРдКОЬЕИУАЬЬМУРОЗНК Ρ РАР 3УКОР, РТ 13ΕΡΝ3 ИДТЬРЬОМЫЗЬЕАЕРТАУУУСАЕЕОЬАуРОНМУРРЬМОЕСТЬУТУЗ

СРЕ1 Ун (5Е<2 ΙΏ N0:62) : ОРЗГЗЗУО

СРЕ2 У_н (5Е<2 ΙΌ N0:63) : ЬМУРОЗНК СРЕЗ У_н (5Е<2 ΙΡ N0:64): АЕЕСЬАУРОНКУРРЬ

1С5 УК (УК 1-13; .ΙΚ1)

Нуклеотидная последовательность У_ъ (8Е0 ГО N0:65):

АЕдадддЕссссдсЕсадсЕссЕддддсЕЕсЕдсЕдсЕсЕддсЕсссаддЕдссадаЕ дЕдссаЕссадЕСдасссадЕсЕссаЬссЕсссЕдЕсЕдсаЕсЕдЕаддадасададЕсасса

ЬсасЕЕдссдддсаадЕсадддсаЕЕадсадЕдсЕЕЕадссЬддЕаЕсадсадааассаддда аадсЕссЕаадсЕссЬдаЕсЕаЬдаЪдссЕссадЕЕЕддааадЕддддЕсссаЕсааддЪЕса дсддсадБддаСсЬдддасадаСССсасСсЪсассаЕсадсадссЕдсадссЕдаадаЕЕЕЕд саасЪйаСЛасЬдЪсаасадЬеЬааЪасЪЪасссЕсддасдеесддссаадддассааддЬдд аааБсааа

Аминокислотная последовательность У_ъ (8Е0 ГО N0:66) (включая сигнальный пептид, выделенный подчеркнутым курсивом):

ЯДУРАОРЬОРЫ-ЫУРРОАКСАЮЬТОЗРЗЗЪЗАЗУОРЕУТТТСЕАЗООТЗЗАЬАИУОО

КРСКАРКЬЫУРА35ЬЕ5СУРЗЕР5СЗС5СТРРТЬТ155Ь0РЕРРАТУУС00гаТУРЕТР»ЗЙ

ТКУЕ1К

Аминокислотная последовательность У_ъ (8Е0 ГО N0:67), за исключением сигнального пептида:

А1СРТОЗР35РЗАЗУеРЕУТ1ТСЕАЗОС153АРАИУСЗОКРСКАРКРЫУРАЗЗЬЕЗеУ РЗ Е РЗ С5С5СТР РТЬТ! 3 3 Ь<2РЕР РАТУУСООРЫТУРЕТРСОСТКУЕ IК

СРЕ1 У_ь	(ЗЕО ΙΡ N0:68):	0С133А
СРЕ2 У_ь	(3Εζ) ΙΡ N0:69) :	РАЗ
СРЕЗ У_ь	(ЗЕО ΙΡ N0:70):	ΟΟΡΝΤΥΡΕΤ

2С9 УН (УН 3-33; Б1-7; .1114)

Нуклеотидная последовательность У_Н (8Е0 ГО N0:71):

АЕддадЕЕЕдддсЕдадсЕдддЕЕЕЕссЕсдЕЬдсЕсЕЕЕЕаададдЕдЕссадЕдЕс аддЬдсадСЬддЬддадъссдддддаддсдЕддЕссадссСдддаддЕсссБдсдасЕсЕссЕ дЕдсадсдгсЕддаЪЕсасссЬсадЕадссаЕдасаЬасасЬдддЕссдссаддсЕссаддса аддддсЕддадСдддСддсадЕЕаЕаЕддааЬдаЕддаадЕааЕаааЕасЕаЕдсадасЕссд

ЕдаадддссдаЕЕсассаЕсЕссададасааЕЕссасдаасЕсдсЕдЬЕЕсЕдсаааЕдааса дссЕдададссдаддасасддсЕдЕдЕаЕЕаСЕдгдЕдададдаасЕдсЕдассЕЕдаасасЕ дддассадддаасссЕддЕсассдЕсЕссЬса

Аминокислотная последовательность У_Н (8Е0 ГО N0:72) (включая сигнальный пептид, выделенный подчеркнутым курсивом):

МЕГС£3№УГЬУЛР£ДОУСС0У0ЬУВЗСССУУОРОЕЗЬЕЬЗСААЗОРТЬЗЗНРIНИУЕО

АРОКСЬЕИУАУ1ТОГОдЗЖУУАРЗУКОЕРТ13ЕР№ТН5ЬРЬ0Ж5ЬЕАЕРТАУУУСУЕ5ТАР ЬЕНМРООТЬУТУЗ3

Аминокислотная последовательность У_Н (8Е0 ГО N0:73), за исключением сигнального пептида:

- 40 024701

ОУрЬУЕ5СССУУОРОЕЗРЕЬЗ САА5О ЕТЬ.55 НРIНМУЕОАРОКОРЕЧУАУIΝΝΡΟ3 ΝΚ УУАРЗУКОЕРТТЗЕРЫЗТПЗЬРРОМНЗРЕАЕРТАУУУСуЕОТАРЬЕНМРОСТРУТУЗЗ

СРЕ1	Ун	(ЗЕО	ΙΡ	N0:74):	ОРТР55НР
СРЕ2	Ун	(ЗЕО	ΙΡ	N0:75):	ΙΗΝΡ05ΝΚ
СРЕЗ	Ун	(ЗЕО	ΙΡ	N0:76):	УКОТАРЬЕНИРО

2С9 УК (УК 1Р-16; .ΙΚ4)

Нуклеотидная последовательность У_ъ (δερ ΙΌ N0:77):

АЬдадддЬссЪсдсЪсадсЬссЬддддс^ссЪдскдсрсъдкЬЬсссадд^дссадае дЬдасаРссадакдасссадкскссаЬссЬсасЬдРсРдсаЪсЬдЬаддадасададЪсасса

ЬсасЫдЬсдддсдад'ЬсадддЬаЫадсадсРдд'ЬЬадссЬддЬаЬсадсадааассадада аадссссРаадкссскдаксЪакдсСдсаСссадИЪдсааадРддддЬсссаксааддСЪса дсддсадЪддаЬсЬдддасадаЬЬЬсасЬсЪсассаЪсадсадссЦдсадссЪдаадаЬЬЬЬд саасрЪаСЬасЬдссаасадСаНааЬадЪБасссксксассеесддсддадддассааддСдд адаксааа

Аминокислотная последовательность У_ъ (δερ ΙΌ N0:78) (включая сигнальный пептид, выделенный подчеркнутым курсивом):

МДУЬА{?ЫС1,£ЬЬСГРСДКС3310МТ05Р65Ь5А5УОРКУТ1ТСКАВСУ3153ИЬАУГГ00

КРЕКАРКЗЫУААЗЗЬОЗСУРЗЕРЗОЗазаТРРТЬТ153РОРЕРРАТУУСООУНЗУРЬТРООа

ТКУЕ1К

Аминокислотная последовательность У_ъ (ЪЕР ΙΌ N0:79), за исключением сигнального пептида:

Р ЮМТ03Р5 Б ЬЗАЗУОРЕУТ1ТСЕА30О135ИРАИУ00КРЕКАРКЗЫУААЗЗРрЗСУ

Р5РР353СЗСТРРТЬТ135ЬСРЕРРАТУУСООУ115УРЬТРСССТКУЕ1К

СРЕ1 У_ь	(ЗЕО ΙΡ N0:80):	0ΟΙ33Ν
СРЕ2 У_ь	(ЗЕО ΙΌ N0:81):	ААЗ
СРЕЗ У_ь	(5Е<2 ΙΡ N0:82):	00ΥΝ3ΥΡΣΤ

3А10 УН (УН 3-33; Р3-10; .1113)

Нуклеотидная последовательность У_Н (δερ ΙΌ N0:83):

АСддад11С.дддс1;дадс1дддЫИ;сс1;сдЫдс1;с1.таададд1д1ссад1;дес аддЪдсадсЪддкддадЬсЪдддддаддсдеддЬссадссЪдддаддСсссЪдадасЪсЪссЬ дЪдсадсдЕсЕддаЕЬсассЬЬсадЕсаЬЬаЬддсаЬдсасЬдддЬссдссаддсЕссаддса аддддссддадЪдддЕддсааС.ЪаЪаЪддсаЦдаЕддаадСааьаааЦас'ЬаЦдсадасСссд

СдаадддссдаЪЕсассаЕсЕссададасааЬЬссаадаасасдсЬддаЦсЬдсаааЬдааса дссЕдададссдаддасасддсЬд'ЬдЕаЕЕасЕдЕдсдададаЕддаЕддасЪасЪаЬддЕЪс ддддасЬЬааРдСЬЬЬкдаРакскддддссаадддасаакддРсассдСсксЬСса

Аминокислотная последовательность У_Н (δερ ΙΌ N0:84) (включая сигнальный пептид, выделенный подчеркнутым курсивом):

УДЫ-ДСУСОЭ УфЬ УЕЗСОСУУО РОЕЗ РЕЬЗ СААЗОРТРЗНУОМНИУЕр

АРеКСРЕЗДУА11ИУРО5ККУУАРЗУКОНРТ13КРЫ5К1ДТЫ>Ь0МИ5ЬЕАЕРТАУУУСАКРОИТ

ТМУР.ОЬРУРР1МОООТМУТУ5 3

Аминокислотная последовательность У_Н (δερ ΙΌ N0:85), за исключением сигнального пептида:

ОУОЬУЕЗСбеУУОРСКЗЬКЬЗСААЗСРТРЗНУОМНИУКОАРОКОРЕИУАИВДУРОЭМК УУАРЗУКаКРТГЗЕРЫЗКМТЬРЬйМИЗРЕАЕРТАУУУСАЕРОИТТМУЕОЬЫУРРТИдйОТМУТ УЗ 5

СРЕ1 У_н	(ЗЕ<2 ΙΌ N0:86) :	СРТРЗНУО
СРЕ2 У_н	(ЗЕ<2 ΙΡ N0:87) :	ΙΝΥΡΟεΝΚ
СРЕЗ У_н	(ЗЕ<2 ΙΡ N0:88):	АЕРС»ТТМУЕ0РЫУРР1

- 41 024701

3А10 УК #1 (УК 1ϋ-16; Ж5)

Нуклеотидная последовательность У_ь (ЗЕО ΙΌ N0:89):

АЬдадддсссЬсдсЕсадсЕссЬддддсЬссйдсЪдсЪсЕдЬЬЬсссаддЕдссадаЬ дЬдасаЕссадаЕдасссадЕсЕссаЕссЪсасЕдЕсЕдсаЬсЕдЬаддадасададЬсасса

ЕсасшдисдддсдадЕсаддаСаШадсадсСддЕгадссЕддЕаЕсадсадааассадада аадссссЕаадЕсссЕдаЬсЬаЕдсЬдсаЬссадЕЕЕдсааадЕддддЕсссаЕсааддЕЕса дсддсадЕддаЬсЬдддасадаЬЕЬсасЬсЬсассаЕсадсадссЕдсадссЕдаадаСЫЛд саасЕЕаЕЕасЕдссаасадЕаЕааЕадЕЕасссЕсссассЕЬсддссаадддасасдасЬдд адаЬЬааа

Аминокислотная последовательность У₉ (ЗЕО ГО N0:90) (включая сигнальный пептид, выделенный подчеркнутым курсивом):

МЕУЬА0Ь£СЫЬЬСРРОАЕСР10МТ05Р55ЬЗАЗУОРЕУТ1ТСЕА30Р133ИРАМУ00

КРЕКАРКЗЫУААЗЗЬОЗСУРЗЕГЗСБОЗОТРРТЬТТЗЗЬОРЕРРАТУУСООтаЗУРРТРСОО

ТЕЬЕ1К

Аминокислотная последовательность У_ъ (ЗЕО ГО N0:91), за исключением сигнального пептида:

Р К2МТОЗР53ЕЗАЗУОРЕУТIТСЕАЗОРТЗЗИЬΑΝΥ00ΚΡΕΚΑΡΚ3ЬIУААЗЗЬОЗОУ РЗЕРЗОЗОЗОТРРТЬТТЗЗЬОРЕРРАТУУСООУНЗУРРТРОООТЕЬЕТК

СРЕ1 Уь	(ЗЕО ΙΡ N0:92):	0Р133Ю
СРЕЗ У_ь	(ЗЕО ΙΌ N0:93):	ААЗ
СРЕЗ У_ь	(ЗЕО ΙΡ N0:94):	00ΥΝ3ΥΡΡΤ

3А10 УК #4 (УК 1-13; Ж5)

Обнаружили, что следующая легкая цепь также являлась активной (хотя в вышеприведенных примерах использовали только вышеописанные легкие цепи (3Н8-1В11 УК #1)):

Нуклеотидная последовательность У_ъ (ЗЕО ГО N0:95):

АЕдадддЕссЬ.сдсЕсадс1:ссЬддддсЬЕсЕдсЕдсЬсйддс1:сссаддЕдссадаЬ дЬдссаЬссадШдасссадЪсЕссаЕссЕсссЕдЬсЕдсаЕсЪдЪаддадасададЬсасса

ЬсасЕЬдссдддсаадЬсадддсаЬЬадсадйдсЬЬЬадссйддЬаЬсадсадааассадада аадссссЕаадЬсссЕдаЕсЕаЕдсЕдсаЕссадЬЕЕдсааадЬддддЬсссаЕсааддЕЕса дсддсадЕддагсЕдддасадаЕЕЕсасЕсЕсассаЕсадсадссГдсадссЕдаадаШЬЕд саасЕЕаЕЕасЕдссаасадЕаЕааЕадЕЕасссЕсссассЕЕсддссаадддасасдасЕдд адаЕЕааа

Аминокислотная последовательность У_ъ (ЗЕО ГО N0:96) (включая сигнальный пептид, выделенный подчеркнутым курсивом):

МДУ1А0ААС1АЕЬ^ЬРСАЕСА10ЬТ03РЗЗЬБАЗУОРЕУТ1ТСЕА50О1БЗАЬАИУ00

КРЕКАРК5ЫУАА55Ь05ОУР5ЕГ5ОЗ(35ОТРРТЬТ155Ь0РЕРРАТУУС00УН5УРРТРО0О

ТЕЬЕЬК

Аминокислотная последовательность У_ъ (ЗЕО ГО N0:97), за исключением сигнального пептида: АКЗЬТОЗРЗЗРЗАЗУОРЕУТГТСЕАЗОСТЗЗАЬАИУООКРЕКАРКЗЫУААЗБЬфБОТ

Р5ЕРЗ ОЗСЗОТРРТЬТ!ЗЗРрРЕРРАТΥΥ000ΫΝ3УРРТРОООТЕЬЕΙΚ СРЕ1 У_ь (ЗЕО Ιϋ N0:98): 0С13БА СРЕ2 V,, (ЗЕО Ιϋ N0:99): ААЗ СРЕЗ У_ь (ЗЕО ΙΡ N0:100): 00ΥΝ3ΥΡΡΤ

3Н12 УН (УН 3-33; Б7-27; .1114)

Нуклеотидная последовательность ν_Η (ЗЕО ГО N0:101):

- 42 024701 аЬддадЕЪСдддсЕдадсЬдддССЕСссЕсдЬЕдсЕсЕЕЬЕаададдЬдессадЕдЬс аддЬдсадсЬддЬддадЬсЕдддддаддсдЕддЕссадссЕдддаддРсссЕдадасЬсЕссЬ дЕдсаасдЕсЕддаЕЪсассЕЪсадЕадсЕаЕдасаЕдсасЕдддЕссдссаддсЬссаддса аддддсъддадЬдддЪддсадЪЪаЪЪЬддЬаЪдаЬддаадЪааЕаааЪасСаЬдсадасЪссд

ЬдаадддссдаЫзсассаСсЬссададасааЪЪссаадаасасдсЬдЬаЬсЬссаааЬдааса дссЕдддадасдаддасасддсГдЪдЬаЬГасГдЬдсдададдЪадСддЬаасЬддддЪЪЪсЬ

ЬЕдасЕасЕддддссадддаасссЕддЕсассдЕсЕссЕса

Аминокислотная последовательность У_Н (δΕΟ ΙΌ N0:102) (включая сигнальный пептид, выделенный подчеркнутым курсивом):

ядгаР5№УГ£УЛРРЕСУССОУОЬУЕ5ао<5УУОР5Е5ЬЕЬ5САтз<5гтрд5УРМНиУЕО

АРОКСЬЕИУАУ1МУРОЗЫКУУАРЗУК0ЕРТ13ЕРНЗИ4ТБУЬ0МЫЗРОРЕРТАУУУСАЕд5ОЫ исррруиооотрутузз

Аминокислотная последовательность У_Н (δΕΟ ΙΌ N0:103), за исключением сигнального пептида:

ОУОЬУЕЗООСУУОРОЕЗЬКБЗСАТЗСРТРЗЗУРМНИУЕОАРОКОЬЕИУАУТКУРСЗЖ ¥УАВ£УК5ЕРТ15ЕРРЗКРТР¥Ь0МП5Ь0РЕРТАУУУСАЕ0501'ТИ<ЗГРРУИО0ОТБУТУ53

СРЕ1 У_н	(ЗЕО ΙΡ N0:104):	ΟΡΤΡ55ΥΡ
СРЕ2	Ун	(ЗЕО	ΙΡ	N0:105) :	ΙΝΥΡΟ3ΝΚ
СРЕЗ	Ук	(ЗЕО	ΙΡ	ΝΟ:106):	ΑΕΟ3ΟΝ№3ΡΡΡΥ

3Н12 УК #2 (УК 1ϋ-16; .ΙΚ1)

Нуклеотидная последовательность У_ь (δΕΟ ΙΌ N0:107):

АЕдадддЕссЕсдсЬсадсЕссЕддддсЕссЕдсЕдсЕсЕдЕЕЕсссаддЕдссадаЕ дЕдасаессадаедасссадЬсЕссаЕссЕсасЕдЬсЕдсаЬсЬдЕаддадасададЕсасса

ЕсасЕЬдЕсдддсдадЕсадддЕаЕЕадсаддЕддЕЕадссЬддЬаЕсадсадааассадада аадссссЬаадЬсссЕдаЕсЬаЬдсЕдсаЬссадсЪЕдсааадЬддддЬсссаЕсааддЕЪса дсддсадЕддаЕсЕдддасадаЕЕСсасЕсЕсассаЕсадсадссЕдсадссЕдаадаЬЕССд саасЕЕаЕХасЬдссаасадЬаЕааЪасЪЕасссЕсддасдСЬсддссаадддассааддЕдд аааЕсааа

Аминокислотная последовательность У_ъ (δΕΟ ΙΌ N0:108) (включая сигнальный пептид, выделенный подчеркнутым курсивом):

МКуЬАОЬЪОЫ^ЪСЕРаЛКСО I0МТ03РЗ3Ь3 АЗ УОРЕУТIТСЕАЗ ОСХЗЕМЬАМ У О О КРЕКАРКЗЫУААЗЗЬОЗОУРЗЕРБОЗОЗОТРРТРТТЗЗРОРЕРРАТУУСООУКТУРЕТРООС ТКУЕ1К

Аминокислотная последовательность У_ъ (δΕΟ ΙΌ N0:109), за исключением сигнального пептида:

Р10МТ03РЗЗЬЗАЗУСРЕУТ1ТСЕА30О15ЕМЬАИУ00КРЕКАРКЗЫУАА35Ь03СУ

РЗЕРБСЗСЗСТРРТЪТТЗЗЬСРЕРРАТУУСООтаТУРЕТРООСТКУЕГК

СРЕ1 У_ь	(ЗЕО Ιϋ N0:110)	: 0ΟΙ3ΕΝ
СРЕ2 У_ь	(ЗЕО ΙΡ N0:111)	: ААЗ
СРЕЗ Уь	(ЗЕО ΙΡ N0:112)	; ΟΟΥΝΤΥΡΕΤ

выравнивания показаны на фиг. 15 и 16.

Пример 10. Исследование ίη νί\Ό на приматах, не являющихся человеком.

Для оценки переносимости моноклональных антител человека 1Р5 против СО27 у приматов, не являющихся человеком, 3 яванских макак обрабатывали однократной внутривенной дозой 1Р5 1, 3 или 10 мг/кг. Животных наблюдали в течение 29 дней. Общее количество лимфоцитов (на основе прямого и бокового светорассеяния), В-клетки памяти (светлые СО20+ и СО95) и моноциты (на основе прямого и бокового светорассеяния) обрабатывали антителами против !дС человека (полужирная линия) и сравнивали с необработанными контролями (затемненная гистограмма). Результаты показаны на фиг. 17. Эти результаты показывают, что моноклональное антитело 1Р5 связывалось с поверхностью циркулирующих

- 43 024701 лимфоцитов, заведомо экспрессирующих СЭ27 в течение всего периода исследования. Моноциты, клетки, не экспрессирующие СЭ27. не связывались с 1Р5.

Кроме того, для определения влияния 1Р5 на популяцию циркулирующих лимфоцитов, лимфоциты окрашивали маркерами субпопуляций и строили график зависимости % положительных клеток от времени на фиг. 17 для каждого животного, обработанного различными дозами (квадратные точки = 1 мг/кг; круглые точки = 3 мг/кг; треугольные точки = 10 мг/кг). Результаты показаны на фиг. 18.

В совокупности результаты этих исследований, показанные на фиг. 17 и 18, демонстрируют, что 1Р5 хорошо переносилось и не приводило к значительному уменьшению популяции циркулирующих лимфоцитов (кроме некоторого временного снижения количества ΝΚ-клеток) после однократной дозы 110 мг/кг. Кроме того, отсутствовало повышение температуры тела и обнаруживаемые уровни ФНО-α, 1Ь6 или ГО-1 β.

Пример 11. Моноклональные антитела против СЭ27 усиливают антиген-специфическую пролиферацию и активацию СЭ8+ Т-клеток. Окрашивание пентамером клеток периферической крови и спленоцитов мыши.

Мышам, трансгенным по С.П27 человека (1шСО27-Тд), внутривенно вводили 5 мг куриного овальбумина и панель полностью человеческих антител, распознающих С.П27 человека, полученных, как в примере 1 (моноклональные антитела человека С.П27). Клон антител крысы АТ124 против С.П27 мыши и неспецифический 1дС1 человека были включены в качестве положительного и отрицательного контролей, соответственно. Каждое антитело (250 мкг) вводили совместно с овальбумином в день 0, а дополнительные 250 мкг чистого антитела - на 1 день. Клетки периферической крови и селезенки собирали на 7 день. Спленоциты (1х 10⁶) или цельную кровь (100 мкл) использовали для окрашивания. После блокирования Рс-рецептора клетки окрашивали 10 мкл Η-2ΚΡ/δΙΙΝΡΕΚΤ, тетрамерного комплекса МНС мыши с пептидным Т-клеточным эпитопом овальбумина (Весктап СоиПег), или аналогичного пентамерного комплекса (Рго1ттипе), антител против СЭ8 (еВюваепсе) и моноклональных антител против йиСП27 или против твСЭ27 (ΒΌ Вюваепсев) при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем в препаратах клеток лизировали эритроциты, препараты промывали и фиксировали, и регистрировали, по меньшей мере, 100000 событий на проточном цитометре Р1о\у Су1оте1ег Ь8К (ΒΌ Вюваепсев). Определяли фракцию тетрамер- или пентамер-положительных клеток в СЭ8'- или СЭ27+-гейтированной популяции. Результаты показаны на фиг. 19 и 21, из которых видно, что антитела против СЭ27 существенно усиливали иммунный ответ.

Пример 12. Анализ ЕЫ8РОТ.

Спленоциты (2,5х 10⁵ и 0,5х 10⁵) из препарата, окрашенного пентамером в вышеприведенном примере 8, после лизиса эритроцитов помещали в лунки планшета, покрытого моноклональными антителами против интерферона γ, в трех повторах. Пептид 8ΙΙΝΡΕΚΤ вносили в конечной концентрации 2 мкг/мл. Для каждого образца ставили фоновый контроль в отсутствие пептида в трех повторах. Стимуляцию поддерживали при 37°С в инкубаторе для культивирования тканей в течение ночи. Обнаружение ЕЫЗРОТ выполняли, используя набор ЕЫЗРОТ (ΒΌ Вюваепсев), в соответствии с протоколом производителя. Подсчитывали количество пятен интерферона γ. Результаты показаны на фиг. 20 и 21, из которых видно, что моноклональные антитела против СЭ27 существенно усиливали активность Т-клеток.

Пример 13. Моноклональное антитело против СЭ27 усиливает Т-клеточный ответ на вакцинный антиген.

Трансгенных мышей НиСЭ27 иммунизировали 5 мкг (подкожно) вакцины, мишенью которой являются АПК, содержащей 1§С-антитела против ЭЕС-205 мыши, объединенные с овальбумином (ОУА) (называемые а-МОЕС-205-ОУА), в комбинации с моноклональными антителами человека 1Р5 против СЭ27 (внутрибрюшинно) в различных дозах (25, 50, 100, 200 или 400 мкг). Спустя неделю спленоциты анализировали на реакционную способность СЭ8+ Т-клеток по отношению к пептиду ОУА 8ΙΙΝΡΕΚΤ (пептид ОУА 257-264) путем окрашивания тетрамером (показан % тетрамер-положительных клеток от общего количества С.П8+) и ГОН.'-ЕЫЗРОТ в соответствии с процедурами, в общих чертах описанными в примерах 8 и 9, соответственно. Результаты показаны на фиг. 22А-С, причем на фиг. 22А показан используемый протокол, на фиг. 22В показаны результаты эксперимента по окрашиванию тетрамером, а на фиг. 22С показаны результаты эксперимента ГО^-ЕЫЗРОТ. Эти результаты показывают, что совместно вводимые моноклональные антитела человека 1Р5 существенно усиливали Т-клеточный ответ на введенный компонент вакцины.

Пример 14. Синергическое действие моноклональных антител против СЭ27 (1Р5) и агониста ТЬК (Ро1у ГО) на ответ Т-клеток на вакцину (против ЭЕС205-ОУА)

Детенышам одного помета 1шСЭ27-Тд (трансгенных) мышей и мышей дикого типа (^Т) внутрибрюшинно вводили моноклональные антитела 1Р5 против СЭ27 (50 мкг) на -3 день, а затем подкожно вводили в 4 лапы антитела против тЭес205-ОУА (5 мкг) плюс 0, 25, 50 или 100 мкг Ро1у ГО в день 0. Селезенки собирали на 7 день и оценивали путем окрашивания тетрамером, ГО^-ЕЫЗРОТ и ГР^-Ю8 (внутриклеточное окрашивание интерферона-гамма). Рассчитывали среднее±8Э положительных ГРЕГОВ среди гейтированных СЭ8 Т-клеток 3 мышей каждой группы и собирали панель репрезентативных

- 44 024701 точечных диаграмм. Результаты, показанные на фиг. 23Ά-Ό, показывают, что моноклональные антитела человека против ί'Ό27 действовали синергически с агонистом ТЬК3 Ро1у 1С, усиливая ответ Т-клеток на введенный компонент вакцины.

Пример 15. Введение моноклональных антител против ί'Ό27 до введения вакцины, мишень которой Оес205, при отсутствии или в присутствии агониста ТЬК.

Детенышам одного помета 1шСО27-Тд мышей и мышей дикого типа (^Т) внутрибрюшинно вводили моноклональные антитела против ί'Ό27 (50 мкг) в различные дни по отношению к введению вакцины, как показано на фиг. 28, и подкожно вводили в 4 лапы антитела против шЭес205-ОУА (5 мкг) плюс или минус агонист ТЬК Ро1у 1С (20 мкг) в день 0. Селезенки собирали на 7 день и оценивали путем окрашивания тетрамером и 1Р№/-ЕЫ8РОТ. Репрезентативная панель окрашивания тетрамером среди гейтированных СЭ8 Т-клеток показана на фиг. 24 и 25. 1Р№/-ЕЫ8РОТ показал аналогичную картину.

Эти результаты показывают, что, как ни странно, при введении антитела против ί'Ό27 в комбинации с вакциной в присутствии или в отсутствие агониста ТЬК более выраженная активация Т-клеток наблюдалась при введении антитела до вакцины, например, за день или более до введения вакцины (антигена).

Пример 16. Моноклональное антитело против ί'Ό27 в комбинации с активацией ТСК активирует Тклетки мышей, трансгенных по СЭ27 человека.

Чтобы оценить способность моноклональных антител 1Р5 активировать Т-клетки, Т-клетки выделяли из селезенки мышей НСО27-Тд путем негативного отбора с помощью гранул. Клетки метили СР8Е и инкубировали с 0,2 мкг/мл моноклональных антител человека 1Р5 против ί'Ό27 или изотипическими контрольными антителами в течение 3 дней. Перекрестно связывающие антитела против 1дС человека перед использованием пропускали через колонку для удаления эндотоксинов. 1Р№/-1С8 и разведение С8РЕ среди ί'Ό8 и СЭ4 Т-клеток показаны на фиг. 26 и 27. Т№а-1С8 (внутриклеточное окрашивание ТМР-альфа) показало такую же картину, как и ΙΡΝ§. Как показано на фиг. 26 и 27, моноклональное антитело 1Р5 в комбинации с активацией ТСК эффективно индуцировало пролиферацию и продукцию цитокинов в Т-клетках ш νίΙΐΌ. Данные показывают, что перекрестное связывание с антителами против 1дС человека и активация рецептора Т-клеток моноклональными антителами против ί'Ό3 были необходимы для 1Р5-индуцированной пролиферации и продукции цитокинов.

Пример 17. Моноклональное антитело против ί'Ό27 повышает эффективность вакцины на модели вызванной меланомы МО4.

Для оценки противоопухолевой активности ш У1уо мышам НиСЭ27-Тд и контрольным \УТ-мышам (по 8 мышей на группу) подкожно имплантировали 0,3 х10⁵ клеток М04 в день 0. В день 5 и 12 указанным мышам внутрибрюшинно вводили моноклональные антитела 1Р5 против ί'Ό27 (50 мкг); в день 8 и 15 вводили дополнительные дозы НиМаЪ СЭ27 (50 мкг) и вакцинировали антителами против шЭес205ОУА (5 мкг). Рост опухоли измеряли штангенциркулем 2 раза в неделю. Результаты показаны на фиг. 24.

В дальнейшем исследовании мышам 1шСО27-Тд и контрольным \УТ-мышам (по 5 мышей на группу) подкожно имплантировали 1 х 10⁵ клеток МО4 в день 0. В день 5 и 12 указанных мышей внутрибрюшинно вакцинировали антителами против шЭес205-ОУА (5 мкг) плюс агонист ТЬК Ро1у 1С-ЬС (10 мкг). В дни 6 и 13 мышам вводили моноклональные антитела 1Р5 против ί'Ό27 (50 мкг). Рост опухоли измеряли штангенциркулем 2 раза в неделю, как указано в протоколе, проиллюстрированном на фиг. 285А. Результаты, показанные на фиг. 28В, С и Ό, показывают эффект при отсутствии лечения (фиг. 28В), при лечении только вакциной (фиг. 28С) или при лечении вакциной в комбинации с лечением антителами против ί'Ό27 (фиг. 28Ό) по отношению к размеру опухоли у мышей в зависимости от количества дней после имплантации опухоли. Результаты показывают, что комбинированное лечение моноклональными антителами против ί'Ό27 (1Р5) значительно продлевало продолжительность жизни мышей с вызванными опухолями.

Пример 18. 1Р5 проявляет мощную противоопухолевую активность на модели вызванной ВСЦ Влимфомы на основе сингенной трансгенной мыши.

Для оценки противоопухолевой активности 1Р5 ш У1уо группы из 9-10 НСЭ27 трансгенных мышей (на основе Ва1Ъ/с) стимулировали 10⁷ клетками ВСЫ В-лимфомы, внутривенно введенными в день 0. Затем животных лечили 5 дозами моноклонального антитела 1Р5 против ί'Ό27 человека, как указано. Как показано на фиг. 29А и 29В, 1Р5 значительно продлевали продолжительность жизни мышей с вызванными опухолями в степени, зависимой от дозы.

Пример 19. Уничтожение опухоли на модели ксенотрансплантата клеток Раджи у ТКИН-мышей.

ТКИН-мышей СВ,17 (приобретенных в Тасотс) содержали в стерильном помещении для мышей. ТКИН-мышам (по 4 мыши на группу) подкожно вводили лимфоидные клетки Раджи (1 х 10⁵). На 6 день этих мышей лечили моноклональными антителами против ί'Ό27 человека путем внутрибрюшинного введения в количестве 0,5 мг на дозу и в дальнейшем вводили эту дозу дважды в неделю в течение 3 недель. Рост опухоли измеряли штангенциркулем 3 раза в неделю. Результаты роста опухоли и анализ Каплана-Мейера показаны на фиг. 30А и 30В, из которой видно, что моноклональные антитела против ί'Ό27 значительно продлевали продолжительность жизни мышей с вызванными опухолями.

- 45 024701

В ходе дальнейшего эксперимента ТКИН-мышей СВ.17 (приобретенных в Тасотс) содержали в стерильном помещении для мышей. ТКИН-мышам (по 6 мышей на группу) подкожно вводили клетки лимфомы человека Раджи (5х 10⁵) в день 0. На 5 день этих мышей лечили моноклональными антителами 1Р5 против СЭ27 путем внутрибрюшинного введения в количестве 0,033, 0,1 или 0,3 на дозу и в дальнейшем вводили эту дозу дважды в неделю в течение 3 недель. Рост опухоли измеряли штангенциркулем 2 раза в неделю.

Результаты, показанные на фиг. 31А, указывают, что моноклональное антитело против СЭ27 (1Р5) в значительной степени подавляло рост опухоли и, таким образом, значительно продлевало продолжительность жизни мышей с вызванными опухолями. На фиг. 31В также представлен график выживания Каплана-Мейера на основании полученных данных, показывающий, что медиана выживаемости у мышей группы, получавшей лечение, увеличилась по меньшей мере на 10 суток по сравнению с контрольной группой. Дополнительный эксперимент с ксенотрансплантатом выполняли с использованием 105; его результаты показаны на фиг. 32.

Пример 20. Уничтожение опухоли на модели ксенотрансплантата клеток Дауди у ТКИН-мышей.

ТКИН-мышей СВ,17 (приобретенных в Тасотс) содержали в стерильном помещении для мышей. ТКИН-мышам (по 6 мышей на группу) подкожно вводили клетки лимфомы человека Дауди (1 х 10⁶) в день 0. На 5 день этих мышей лечили моноклональными антителами человека 1Р5 против СЭ27 путем внутрибрюшинного введения в количестве 0,033, 0,1 или 0,3 на дозу и в дальнейшем вводили эту дозу дважды в неделю в течение 3 недель. Рост опухоли измеряли штангенциркулем 2 раза в неделю.

Результаты, показанные на фиг. 33, указывают, что моноклональное антитело против СЭ27 (1Р5) в значительной степени подавляло рост опухоли (фиг. 33А) и, таким образом, значительно продлевало продолжительность жизни мышей с вызванными опухолями (график Каплана-Мейера на фиг. 33В).

Пример 21. Сконструированные моноклональные антитела против СЭ27, не связывающие рецепторы Рс, не усиливают ответ Т-клеток на вакцинный антиген.

Трансгенных мышей НиСЭ27 иммунизировали 5 мкг (подкожно) вакцины, мишенью которой являются АПК, содержащей 1д0-антитела против ЭЕС-205 мыши, объединенные с овальбумином (ОVА) (называемые (/.-МОЕС-205-θνΛ), в комбинации с моноклональными антителами человека 1Р5 против СЭ27 (внутрибрюшинно) или мутантными моноклональными антителами 1Р5 (содержащими Рсфрагмент, мутированный с целью предотвращения связывания с рецептором Рс) или контрольными моноклональными 1д0-антителами. Спустя неделю спленоциты анализировали на реакционную способность СЭ8+ Т-клеток по отношению к пептиду ОVА δΙΙΝΡΈΚΕ (пептид ОVА 257-264) с помощью ΙΡΝγЕЫ§РОТ в соответствии с процедурами, описанными в общих чертах.

Результаты, показанные на фиг. 34, демонстрируют, что модифицированное моноклональное антитело человека 1Р5 не усиливало ответ Т-клеток на вакцину и, таким образом, могло являться эффективным агентом для блокирования пути СЭ70/СЭ27.

Эквиваленты

Специалисту в данной области техники будет очевидно или он сможет выявить с помощью стандартных экспериментов большое количество эквивалентов конкретных вариантов воплощения настоящего изобретения, описанных здесь. Подразумевается, что такие эквиваленты входят в объем следующей формулы изобретения.

- 46 024701

СВОДКА ПО СПИСКУ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

ЗЕО ГО N0:	ОПИСАНИЕ
1	СЭ27 человека (№ доступа СепВапк: ААН12160.1)
2	СЭ70 человека (№ доступа СепВапк: ΝΡ 001243)
3	Представлена последовательность У_н 3-33 эмбрионального типа (№ доступа СепЬапк ΑΆΡ44382)
4	Представлена последовательность У_н 3-7 эмбрионального типа (№ доступа СепЬапк ААР44389)
5	ЗН8-1В11 УН Нуклеотидная
6	ЗН8-1В11 УН аминокислотная, включая сигнальный пептид
7	ЗН8-1В11 УН зрелая аминокислотная, за исключением сигнального пептида
3	ЗНЗ-1В11 УН СОЕ1 Аминокислотная
9	ЗНЗ-1ВИ та сое2 Аминокислотная
10	ЗН8-1В11 та СЬЕЗ Аминокислотная
11	ЗНЗ-1В11 УЬ #2 Нуклеотидная
12	ЗН8-1В11 УЬ #2 аминокислотная, включая сигнальный пептид
13	ЗН8-1В11 УЬ #2 зрелая аминокислотная, за исключением сигнального пептида
14	ЗН8-1В11 УЬ #2 ΟΌΕ1 Аминокислотная
15	ЗН8-1В11 УЬ #2 СОК2 Аминокислотная
16	ЗН8-1В11 УЬ #2 СЬЕЗ Аминокислотная

- 47 024701

17	ЗН8-1В11 УЬ #3 Нуклеотидная
18	ЗН8-1В11 УЬ #3 аминокислотная, включая сигнальный пептид
19	ЗН8-1В11 УЬ #3 зрелая аминокислотная, за исключением сигнального пептида
20	ЗН8-1В11 УЬ #3 СОЕ1 Аминокислотная
21	ЗН8-1В11 УЬ #3 СЬЕ2 Аминокислотная
22	ЗН8-1В11 УЬ #3 СБЕЗ Аминокислотная
23	2С2-1А10 УН Нуклеотидная
24	2С2-1А10 УН аминокислотная, включая сигнальный пептид
25	2С2-1А10 УН зрелая аминокислотная, за исключением сигнального пептида
26	2С2-1А10 УН СЬЕ1 аминокислотная
27	2С2-1А10 УН СОЕ2 аминокислотная
28	2С2-1А10 УН СЬЕЗ аминокислотная
29	2С2-1А10 УЬ нуклеотидная
30	2С2-1А10 УЬ аминокислотная, включая сигнальный пептид
31	2С2-1А10 УЬ зрелая аминокислотная, за исключением сигнального пептида
32	2С2-1А10 УЬ СЬЕ1 аминокислотная

- 48 024701

33	2С2-1А10 УЬ СОЕ2 аминокислотная
34	2С2-1А10 УЬ СОЕЗ аминокислотная
35	1Р5-1Н5 УН нуклеотидная
36	1Р5-1Н5 УН аминокислотная, включая сигнальный пептид
37	1Р5-1Н5 УН зрелая аминокислотная, за исключением сигнального пептида
38	1Р5-1Н5 УН СОЕ1 аминокислотная
39	1Р5-1Н5 УН СБЕ2 аминокислотная
40	1Р5-1Н5 УН СОЕЗ аминокислотная
41	1Р5-1Н5 УЬ #2 нуклеотидна я
42	1Р5-1Н5 УЬ #2 аминокислотная, включая сигнальный пептид
43	1Р5-1Н5 УЬ #2 зрелая аминокислотная, за исключением сигнального пептида
44	1Р5-1Н5 УЬ #1 СОЕ1 аминокислотная
45	1Р5-1Н5 УЬ #2 СОЕ2 аминокислотная
46	1Р5-1Н5 УЬ #2 СОЕЗ аминокислотная
47	1Н8-В4 УН нуклеотидная
48	1Н8-В4 УН аминокислотная, включая сигнальный пептид

- 49 024701

49	1Н8-В4 УН
зрелая аминокислотная, за пептида	исключением	сигнального
50	1Н8-В4 УН СЬЕ1 аминокислотная
51	1Н8-В4 УН СЬЕ2 аминокислотная
52	1Н8-В4 УН СЬЕЗ аминокислотная
53	1Н8-В4 УЬ нуклеотидная
54	1Н8-В4 УЬ аминокислотная, включая сигнальный пептид
	1Н8-В4 УЬ
55	зрелая аминокислотная, за	исключением	сигнального
	пептида
56	1Н8-В4 УЬ СЬЕ1 аминокислотная
57	1Н8-В4 УЬ СЬЕ2 аминокислотная
58	1Н8-В4 УЬ СЬЕЗ аминокислотная
59	105-1В9 УН нуклеотидная
60	1О5-1В9 УН аминокислотная, включая сигнальный пептид
	1О5-1В9 УН
61	зрелая аминокислотная, за	исключением	сигнального
	пептида
62	1О5-1В9 УН СЬЕ1 аминокислотная
63	105-1В9 УН СЬЕ2 аминокислотная
64	1О5-1В9 УН СЬЕЗ аминокислотная

- 50 024701

65	1О5-1В9 УЬ нуклеотидная
66	1С5-1В9 УЬ аминокислотная, включая сигнальный пептид
67	1С5-1В9 УЬ зрелая аминокислотная, за исключением сигнального пептида
68	1О5-1В9 УЬ СПЕ1 аминокислотная
69	1О5-1В9 УЬ ΟΌΕ2 аминокислотная
70	1С5-1В9 УЬ СВЕЗ аминокислотная
71	2С9-Ю11 УН нуклеотидная
72	2О9-Ю11 УН аминокислотная, включая сигнальный пептид
73	2О9-Ю11 УН зрелая аминокислотная, за исключением сигнального пептида
74	2О9-Ю11 УН ΟΌΕ1 аминокислотная
75	2О9-Ю11 УН 0ΌΕ2 аминокислотная
76	2О9-Ю11 УН СВЕЗ аминокислотная
77	2О9-Ю11 УЬ нуклеотидная
78	2С9-Ю11 УЬ аминокислотная, включая сигнальный пептид
79	2С9-Ю11 УЬ зрелая аминокислотная, за исключением сигнального пептида
80	209-ЮН УЬ ΟϋΕΙ аминокислотная

- 51 024701

81	2(39-ЮН УЬ СЬЕ2 аминокислотная
82	2Ο9-1Ό11 УЬ ΟΌΕ3 аминокислотная
83	ЗА10-Ю10 УН нуклеотидная
84	ЗА10-1(310 УН аминокислотная, включая сигнальный пептид
85	ЗА10-1(310 УН зрелая аминокислотная, за исключением сигнального пептида
86	ЗА10-1(310 УН СЬЕ1 аминокислотная
87	ЗА10-1(310 УН СЬЕ2 аминокислотная
88	ЗА10-1(310 УН СЬКЗ аминокислотная
89	ЗА10-1С10 УЬ #1 нуклеотидная
90	ЗА10-1С10 УЬ #1 аминокислотная, включая сигнальный пептид
91	ЗА10-1С10 УЬ #1 зрелая аминокислотная, за исключением сигнального пептида
92	ЗА10-1С10 УЬ #1 СЬЕ1 аминокислотная
93	ЗА10-1С10 УЬ #1 СЬЕ2 аминокислотная
94	ЗА10-1(310 УЬ #1 СОЕЗ аминокислотная
95	ЗА10-1С10 УЬ #4 нуклеотидная
96	ЗА10-1(310 УЬ #4 аминокислотная, включая сигнальный пептид

- 52 024701

97	ЗА10-1С10 УЬ #4 зрелая аминокислотная, за исключением сигнального пептида
98	ЗА10-1С10 УЬ #4 СОЕ1 аминокислотная
99	ЗА10-1С10 УЬ #4 СВЕ2 аминокислотная
100	ЗА10-Ю10 УЬ #4 СВЕЗ аминокислотная
101	ЗН12-1Е12 УН нуклеотидная
102	ЗН12-1Е12 УН аминокислотная_г включая сигнальный пептид
103	ЗН12-1Е12 УН зрелая аминокислотная, за исключением сигнального пептида
104	ЗН12-1Е12 УН СВЕ1 аминокислотная
105	ЗН12-1Е12 УН СВЕ2 аминокислотная
106	ЗН12-1Е12 УН СВЕЗ аминокислотная
107	ЗН12-1Е12 УЬ #2 нуклеотидная
108	ЗН12-1Е12 УЬ #2 аминокислотная, включая сигнальный пептид
109	ЗН12-1Е12 УЬ #2 зрелая аминокислотная, за исключением сигнального пептида
110	ЗН12-1Е12 УЬ #2 СВЕ1 аминокислотная
111	ЗН12-1Е12 УЬ #2 СЬЕ2 аминокислотная
112	ЗН12-1Е12 УЬ #2 СВЕЗ аминокислотная
113	Консенсусная УН СЬКЗ
114	Консенсусная УЬ СЬКЗ
115	Консенсусная УН СЬК2
116	Консенсусная УЬ СЬЕ2
117	Консенсусная УН СЬЕ1
118	Консенсусная УЬ СЬК1

- 53 024701

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> КЕЬЕК, ΤΙΒΟΗ

МАКЗН, ΗΕΝΕΥ С.

НЕ, Ι,ΙΖΗΕΝ У1ТАЬЕ, ЬАиКА А.

ТНОМАЗ, ЬАМКЕЫСЕ И.

<120> АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕ СО27 ЧЕЛОВЕКА, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ <1зо> ουσ-367ρο <140> РСТ/и32011/032355 <141> 2011-04-13 <150> 61/471,459 <151> 2011-04-04 <150> 61/323,720 <151> 2010-04-13 <160> 120 <170> РабепЫп νβΓδίοη 3.5 <210> 1 <211> 260 <212> белок <213> Ното заргепз <400> 1

Мей А1а Агд Рго Ηίβ Рго Тгр Тгр Ьеи Суз Уа1 Ьеи С31у ТЬг Ьеи Уа1 15 10 15

О1у Ьеи Зег А1а ТЬг Рго А1а Рго Ьуз Зег Суз Рго С1и Агд Ηίδ Туг 20 25 30

Тгр А1а О1п С1у Ьуз Ьеи Суз Суз С1п МеЬ Суз О1и Рго О1у ТЬг РЬе 35 40 45

Ьеи Уа1 Ьуз Азр Суз Азр Οίη Ηί3 Агд Ьуз А1а А1а О1п Суз Азр Рго 50 55 60

Суз Не Рго О1у Уа1 Зег РЬе Зег Рго Азр НЬз НЬз ТЬг Агд Рго НЬз 65 70 75 80

Суз <31и Зег Суз Агд Нхз Суз Азп Зег <31у Ьеи Ьеи Уа1 Агд Азп Суз 85 90 95

ТЬг 11е ТЬг А1а Азп А1а С1и Суз А1а Суз Агд Азп С1у Тгр О1п Суз 100 105 110

Агд Азр Ьуз С1и Суз ТЬг О1и Суз Азр Рго Ьеи Рго Азп Рго Зег Ьеи

- 54 024701

115

120

125

ТЬг А1а Агд Зег Зег О1п А1а Ьеи Зег Рго Шз Рго <31п Рго ТЬг Низ 130 135 140

Ьеи Рго Туг Уа1 Зег О1и Мер Ьеи О1и А1а Агд ТЬг А1а С1у Низ Мер 145 150 155 160 <31п ТЬг Ьеи А1а Азр РЬе Агд Οίη Ьеи Рго А1а Агд ТЬг Ьеи Зег ТЬг 165 170 175

Низ Тгр Рго Рго Θΐη Агд Зег Ьеи Суз Зег Зег Азр РЬе Не Агд 11е 180 185 190

Ьеи Уа1 Не РЬе Зег <31у Мер РЬе Ьеи Уа1 РЬе ТЬг Ьеи А1а С1у А1а 195 200 205

Ьеи РЬе Ьеи Низ О1п Агд Агд Ьуз Туг Агд Зег Азп Ьуз С1у С1и Зег 210 215 220

Рго Уа1 <31и Рго А1а С1и Рго Суз Агд Туг Зег Суз Рго Агд С1и С1и 225 230 235 240

О1и С1у Зег ТЬг Не Рго Не С1п О1и Азр Туг Агд Ьуз Рго С1и Рго 245 250 255

А1а Суз Зег Рго 260 <210> 2 <211> 193 <212> белок <213> Ното зариепз <400> 2

МеЬ Рго О1и С1и С1у Зег О1у Суз Зег Уа1 Агд Агд Агд Рго Туг С1у 15 10 15

Суз Уа1 Ьеи Агд А1а А1а Ьеи Уа1 Рго Ьеи Уа1 А1а С1у Ьеи Уа1 Не 20 25 30

Суз Ьеи Уа1 Уа1 Суз Не <31п Агд РЬе А1а С1п А1а <31п <31п С1п Ьеи 35 40 45

Рго Ьеи С1и Зег Ьеи О1у Тгр Азр Уа1 А1а С1и Ьеи С1п Ьеи Азп Низ 50 55 60

- 55 024701

ТЬг СЬу Рго СЬп С1п Азр Рго Агд Ьеи Туг Тгр СЬп СЬу СЬу Рго АЬа 65 70 75 80

Ьеи СЬу Агд Зег РЬе Ьеи Низ СЬу Рго СЬи Ьеи Азр Ьуз СЬу СЬп Ьеи 85 90 95

Агд Не НЬз Агд Азр СЬу Не Туг МеЬ УаЬ НЬз Не СЬп УаЬ ТЬг Ьеи 100 105 110

АЬа Не Суз Зег Зег ТЬг ТЬг АЬа Зег Агд НЬз НЬз Рго ТЬг ТЬг Ьеи 115 120 125

АЬа УаЬ СЬу Не Суз Зег Рго АЬа Зег Агд Зег Не Зег Ьеи Ьеи Агд 130 135 140

Ьеи Зег РЬе НЬз СЬп СЬу Суз ТЬг Не АЬа Зег СЬп Агд Ьеи ТЬг Рго 145 150 155 160

Ьеи АЬа Агд СЬу Азр ТЬг Ьеи Суз ТЬг Азп Ьеи ТЬг СЬу ТЬг Ьеи Ьеи 165 170 175

Рго Зег Агд Азп ТЬг Азр СЬи ТЬг РЬе РЬе СЬу УаЬ СЬп Тгр УаЬ Агд 180 185 190

Рго <210> 3 <211> 97 <212> белок <213> Ното зарЬепз <400> 3

УаЬ СЬп Ьеи УаЬ СЬи Зег СЬу СЬу СЬу УаЬ УаЬ СЬп Рго СЬу Агд Зег 15 10 15

Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе Зег ТЬг Туг СЬу 20 25 30

Меб НЬз Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ АЬа 35 40 45

Не Не Тгр РЬе Азр СЬу Зег Азп ТЬг Туг Туг АЬа Азр Зег УаЬ Агд 50 55 60

СЬу Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Зег Зег Агд Ьуз ТЬг Ьеи Туг Ьеи

- 56 024701

70 75 80

61и МеЛ Ьуз

Ьуз

Зег Ьеи Агд 85

Уа1

С1и Азр Ткг А1а Уа1 90

Туг Туг

Суз 95

А1а

<210> 4

<211> 97 <212> белок

<213> Ното :

зарЬепз

<400> 4 Уа1 О1п

Ьеи

Уа1

О1и

Зег

О1у

61у

С1у

Ьеи

Уа1

О1п

Рго

О1у

Зег

1

5

10

15

Ьеи Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Зег

С1у

Рке

Ткг

Рке

Зег

Азп

Зег

Туг

20

25

30

МеЛ Ткг

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

О1у

Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Уа1

А1а

35

40

45

Азп Не

Ьуз

Рго

Азр

О1у

Зег

Азр

Ьуз

Азп

Туг

Не

Азп

Зег

Уа1

Агд

50

55

60

С1у Агд

Рке

Ткг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

С1и

Ьуз

Зег

Туг

Ьеи

65

70

75

80

<31п МеЛ

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

Ткг

А1а

Не

Туг

Суз

Уа1

85

90

95

Ткг

<210> 5 <211> 414 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 5 аЛддадЛЛдд ддсЛдадсЛд ддЛЛЛЛссЛЛ дЛЛдсЛаЛЛЛ ЛадааддЛдЛ ссадЛдЛдад 60 дЛдсадсЛдд ЛддадЛсЛдд дддаддсЛЛд дЛссадссЛд дддддЛсссЛ дадасЛсЛсс 120

- 57 024701 бдбдсадссб сбддаббсас сбббадбадб баббддабдд ссбдддбссд ссаддсбсса 180 дддааадддс бддадбддсб дддсаабаба аадсаадабд даадбдадаа абасбабдбд 240 дасбсбдбда адддссдабб сассабсбсс ададасаасд ссаадаасбс асбдбабсба 300 сааабдааса дссбдададс сдаддасасд дсбдбдбабб асбдбдбдад ддаасбдддд 360 абддасбддб асббсдабсб сбддддссдб ддсасссбдд бсасбдбсбс сбса 414 <210> 6 <211> 138 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 6

Меб О1и Ьеи СЯу Ьеи Зег Тгр Уа1 РЬе Ьеи Уа1 А1а 11е Ьеи б1и О1у 15 10 15

Уа1 О1п Суз О1и Уа1 <31п Ьеи Уа1 С1и Зег О1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п 20 25 30

Рго <31у <31у Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе 35 40 45

Зег Зег Туг Тгр Меб А1а Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго О1у Ьуз С1у Ьеи 50 55 60

С1и Тгр Ьеи С1у Азп 11е Ьуз О1п Азр <31у Зег О1и Ьуз Туг Туг Уа1 65 70 75 80

Азр Зег Уа1 Ьуз <31у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп 85 90 95

Зег Ьеи Туг Ьеи С1п Меб Азп Зег Ьеи Агд А1а <31и Азр ТЬг А1а Уа1 100 105 110

Туг Туг Суз Уа1 Агд <31и Ьеи С1у Меб Азр Тгр Туг РЬе Азр Ьеи Тгр 115 120 125

С1у Агд С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

- 58 024701

130

135 <210> 7 <211> 119 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 7

С1и Уа1 Θΐη Ьеи Уа1 б1и Зег О1у <31у О1у Ьеи Уа1 О1п Рго О1у С1у 15 10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РЬе Зег Зег Туг 20 25 30

Тгр Мер А1а Тгр Уа1 Агд О1п А1а Рго <31у Ьуз О1у Ьеи С1и Тгр Ьеи 35 40 45

С1у Азп 11е Ьуз О1п Азр <31у Зег О1и Ьуз Туг Туг Уа1 Азр Зег Уа1 50 55 60

Ьуз (31у Агд РНе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг 65 70 75 80

Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95

Уа1 Агд С1и Ьеи С1у Мер Азр Тгр Туг РНе Азр Ьеи Тгр С1у Агд С1у 100 105 110

ТНг Ьеи Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег 115 <210> 8 <211> 8 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 8

О1у РНе ТНг РНе Зег Зег Туг Тгр

5 <210> 9

- 59 024701 <211> 8 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 9

Не Ьуз С1п Азр С1у Зег С1и Ьуз

5 <210> 10 <211> 12 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 10

Уа1 Агд <31и Ьеи С1у Мер Азр Тгр Туг РЪе Азр Ьеи

10 <210> 11 <211> 381 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<400> 11 арддаадссс 60	садсРсадсР	РсРсРРссРс	сРдсРасРсР	ддсРсссада	Рассассдда
даааРРдРдР 120	РдасасадРс	Рссадссасс	срдрсрррдр	сРссадддда	аададссасс
сРсРссРдса 180	дддссадРса	дадРдРРдас	адсРасРРад	ссРддРасса	асадааассР
ддссаддсРс 240	ссаддсРссР	саРсРаРдаР	дсаРссааса	дддссасрдд	саРсссадсс
аддРРсадРд 300	дсадРдддРс	Рдддасадас	РРсасРсРса	ссаРсадсаа	ссРададссР
даадаРРРРд 360	садРРРаРРа	сРдРсадсад	сдРадсаасР	ддссРссдас	дРРсддссаа
дддассаадд 381	РддаааРсаа	а

<210> 12 <2Ы> 127 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 12

Меб СЬи АЬа Рго АЬа СЬп Ьеи Ьеи РЬе Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Тгр Ьеи Рго 15 10 15

Азр ТЬг ТЬг СЬу СЬи Не УаЬ Ьеи ТЬг СЬп Зег Рго АЬа ТЬг Ьеи Зег 20 25 30

Ьеи Зег Рго СЬу СЬи Агд АЬа ТЬг Ьеи Зег Суз Агд АЬа Зег СЬп Зег 35 40 45

УаЬ Азр Зег Туг Ьеи АЬа Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу СЬп АЬа Рго 50 55 60

Агд Ьеи Ьеи Не Туг Азр АЬа Зег Азп Агд АЬа ТЬг СЬу Не Рго АЬа 65 70 75 80

Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег 85 90 95

Азп Ьеи СЬи Рго СЬи Азр РЬе АЬа УаЬ Туг Туг Суз СЬп СЬп Агд Зег 100 105 110

Азп Тгр Рго Рго ТЬг РЬе СЬу СЬп СЬу ТЬг Ьуз УаЬ СЬи Не Ьуз 115 120 125 <210> 13 <211> 107 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 13

СЬи Не νβΐ Ьеи ТЬг СЬп Зег Рго АЬа ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго СЬу 15 10 15

СЬи Агд АЬа ТЬг Ьеи Зег Суз Агд АЬа Зег СЬп Зег А/аЬ Азр Зег Туг 20 25 30

Ьеи АЬа Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬу СЬп АЬа Рго Агд Ьеи Ьеи Не

- 61 024701

	35	40	45
Туг	Азр А1а Зег Азп	Агд А1а ТЬг <31у 11е Рго	А1а Агд РЬе Зег С1у
	50	55	60
Зег	С1у Зег О1у ТЬг	Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е	Зег Азп Ьеи <31и Рго
65		70 75	80
О1и	Азр РЬе А1а Уа1	Туг Туг Суз О1п С1п Агд	Зег Азп Тгр Рго Рго
	85	90	95
ТЬг	РЬе С1у <31п О1у	ТЬг Ьуз \7а1 С1и 11е Ьуз
	100	105
<210> 14
<211> 6
<212> белок
<213> искусственная	последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 14

С1п Зег Уа1 Авр Зег Туг

5 <210> 15 <211> 3 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 15

Азр А1а Зег <210> 16 <211> 9 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 16

С1п <31п Агд Зег Азп Тгр Рго Рго ТЬг

5

- 62 024701 <210> 17 <211> 381 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 17 абддаадссс садсбсадсб бсбсббссбс сбдсбасбсб ддсбсссада бассассдда 60 даааббдбдб бдасасадбс бссадссасс сбдбсбббдб сбссадддда аададссасс 120 сбсбссбдса дддссадбса дадбдббадс адсбасббад ссбддбасса асадааассб 180 ддссаддсбс ссаддсбссб сабсбабдаб дсабссадса дддссасбдд сабсссадас 240 аддббсадбд дсадбдддбс бдддасадас ббсасбсбса ссабсадсад асбддадссб 300 даадаббббд садбдбабба сбдбсадсад сдбадсаасб ддссбссдас дббсддссаа 360 дддассаадд бддааабсаа а

381
<210>	18
<211>	127
<212>	белок
<213>	искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности:	Синтетический
полипептид	РНе	Ьеи 10	Ьеи	Ьеи	Ьеи	Тгр	Ьеи 15	Рго
<400> 18	Рго А1а С1п Ьеи Ьеи 5
Меб 1	<31и А1а
Азр	ТНг ТНг	С1у С1и Не Уа1 Ьеи 20	ТНг 25	С1п	Зег	Рго	А1а	ТНг 30	Ьеи	Зег
Ьеи	Зег Рго 35	О1у С1и Агд А1а ТНг 40	Ьеи	Зег	Суз	Агд	А1а 45	Зег	С1п	Зег
Уа1	Зег Зег 50	Туг Ьеи А1а Тгр Туг 55	О1п	С1п	Ьуз	Рго 60	С1у	С1п	А1а	Рго
Агд	Ьеи Ьеи	11е Туг Азр А1а Зег	Зег	Агд	А1а	ТНг	О1у	11е	Рго	Азр

- 63 024701

Агд РЬе Зег О1у Зег С1у Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег 85 90 95

Агд Ьеи О1и Рго С1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз Θΐη Θΐη Агд Зег 100 105 110

Азп Тгр Рго Рго ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 <31и Не Ьуз 115 120 125 <210> 19 <211> 107 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 19

О1и Не Уа1 Ьеи ТЬг <31п Зег Рго А1а ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго О1у 15 10 15

О1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег О1п Зег νδΐ Зег Зег Туг 20 25 30

Ьеи А1а Тгр Туг 61п О1п Ьуз Рго <31у О1п А1а Рго Агд Ьеи Ьеи Не 35 40 45

Туг Азр А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг С1у Не Рго Азр Агд РЬе Зег С1у 50 55 60

Зег <31у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Агд Ьеи О1и Рго 65 70 75 80

О1и Азр РЬе А1а Уа1 Туг Туг Суз <31п <31п Агд Зег Азп Тгр Рго Рго 85 90 95

ТЬг РЬе <31у О1п О1у ТЬг Ьуз Уа1 <31и Не Ьуз 100 105 <210> 20 <211> 6 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

- 64 024701 пептид <400> 20

С1п Зег Уа1 Зег Зег Туг 1 5 <210> 21 <211> 3 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 21

Азр А1а Зег <210> 22 <211> 9 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 22 <31п С1п Агд Зег Азп Тгр Рго Рго ТЬг

5 <210> 23 <211> 405 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<400> 23 абддадЬЬбд 60	ддсбдадсбд	ддбЬЬбссбс	дббдсЬсЬЬЬ	ЬаададдЬдЬ	ссадбдбсад
дбдсаасбдд 120	Ьддадбсбдд	дддаддсдбд	дбссадссЬд	ддаддбсссб	дсдасбсбсс
ДдбдсадсдЬ 180	сЕддаббсас	сббсадбадс	Иакдасабас	асДдддкссд	ссаддсбсса
ддсааддддс 240	бддадбдддб	ддсадббаба	Ьддаабдабд	даадбаабаа	абасЬаЬдса
дасбссдбда 300	адддссдабб	сассабсбсс	ададасаабб	ссасдаасбс	дсЬдЬЬЬсбд

сааабдааса дссбдададс сдаддасасд дсбдбдбабб аббдбдбддд аддаасбдсб 360 дассббдаас асбдддасса дддаасссбд дбсассдбсб ссбса

405 <210> 24 <211> 135 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 24

Меб 1

О1и

РЬе

О1у

Ьеи 5

Зег Тгр Уа1

РЬе

Ьеи 10

Уа1

А1а

Ьеи

Агд 15

О1у

Уа1

О1п

Суз

О1п

Уа1

О1п Ьеи Уа1

С1и

Зег

О1у

<31у

Уа1

С1п

20

25

30

Рго

О1у

Агд

Зег

Ьеи

Агд Ьеи Зег

Суз

А1а

Зег

СЯу

РЬе

ТЬг

РЬе

35

40

45

Зег

Туг

Азр

Не

Ηί3 Тгр Уа1

Агд

О1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

О1у

Ьеи

50

55

60

О1и

Тгр

Уа1

А1а

Уа1

Не Тгр Азп

Азр

С1у

Зег

Азп

Ьуз

Туг

А1а

65

70

75

80

Азр

Зег

Уа1

Ьуз

О1у

Агд РЬе ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

ТЬг

Азп

85

90

95

Зег

Ьеи

РЬе

Ьеи

С1п

Меб Азп Зег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

100

105

110

Туг

Суз

Уа1

О1у

О1у ТЬг А1а

Азр

Ьеи

<31и

ΗΪ3

Тгр

Азр

О1п

<31у

115

120

125

ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 130 135 <210> 25 <211> 116 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

- 66 024701 полипептид <400> 25

01п Уа1 01п Ьеи Уа1 С1и Зег О1у 01у 01у Уа1 Уа1 С1п Рго 01у Агд 15 10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег О1у РНе ТНг РНе Зег Зег Туг 20 25 30

Азр 11е Нтз Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго О1у Ьуз О1у Ьеи О1и Тгр Уа1 35 40 45

А1а Уа1 11е Тгр Азп Азр О1у Зег Азп Ьуз Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60

Ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп Зег ТНг Азп Зег Ьеи РНе 65 70 75 80

Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а О1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95

Уа1 С1у С1у ТНг А1а Азр Ьеи С1и Шз Тгр Азр С1п С1у ТНг Ьеи 17а1 100 105 110

ТНг Уа1 Зег Зег 115 <210> 26 <211> 8 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 26

С1у РНе ТНг РНе Зег Зег Туг Азр

5 <210> 27 <211> 8 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 27

Не Тгр Азп Азр С1у Зег Азп Ьуз

- 67 024701 <210> 28 <211> 12 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 28

Уа1 С1у С1у ТЬг А1а Азр Ьеи С1и Низ Тгр Азр О1п

10 <210> 29 <211> 381 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<400> 29 абдадддбсс 60	бсдсбсадсб	ссбддддсбс	сбдсбдсбсб	дбббсссадд	бдссадабдб
дасабссада 120	бдасссадбс	бссабссбса	сбдбсбдсаб	сбдбаддада	сададбсасс
абсасббдбс 180	дддсдадбса	дддбаббадс	адсбддббад	ссбддбабса	дсадааасса
дадааадссс 240	сбаадбсссб	дабсбабдсб	дсабссадбб	бдсааадбдд	ддбсссабса
аддббсадсд 300	дсадбддабс	бдддасадаб	ббсасбсбса	ссабсадсад	ссбдсадссб
даадаббббд 360	саасббабба	сбдссаасад	бабаабадбб	асссбсбсас	бббсддсдда
дддассаадд 381	бддадабсаа	а

<210> 30 <211> 127 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 30

Меб Агд Уа1 Ьеи А1а О1п Ьеи Ьеи С1у Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Суз РЬе Рго

- 68 024701

С1у А1а Агд Суз Азр Не <31п Мер ТНг Θΐη Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег 20 25 30

А1а Зег Уа1 О1у Азр Агд Уа1 ТНг Не ТНг Суз Агд А1а Зег <31п О1у 35 40 45

11е Зег Зег Тгр Ьеи А1а Тгр Туг О1п С1п Ьуз Рго О1и Ьуз А1а Рго 50 55 60

Ьуз Зег Ьеи 11е Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи О1п Зег С1у Уа1 Рго Зег 65 70 75 80

Агд РНе Зег <31у Зег С1у Зег О1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг Не Зег 85 90 95

Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз (31п <31п Туг Азп 100 105 110

Зег Туг Рго Ьеи ТНг РНе <31у О1у (31у ТНг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз 115 120 125 <210> 31 <211> 107 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 31

Азр Не О1п Мер ТНг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 О1у 15 10 15

Азр Агд Уа1 ТНг Не ТНг Суз Агд А1а Зег С1п <31у Не Зег Зег Тгр 20 25 30

Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго (31и Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи Не 35 40 45

Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи Θΐη Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег С1у 50 55 60

Зег С1у Зег О1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг Не Зег Зег Ьеи (31п Рго 65 70 75 80

- 69 024701 б1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз 01п 01п Туг Азп Зег Туг Рго Ьеи 85 90 95

ТЬг РЬе О1у О1у О1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и Не Ьуз 100 105 <210> 32 <211> 6 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 32

О1п О1у Не Зег Зег Тгр

5 <210> 33 <211> 3 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 33

А1а А1а Зег <210> 34 <211> 9 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 34

О1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Ьеи ТЬг

5 <210> 35 <211> 414 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

- 70 024701 <400> 35 аРддадРРРд 60 дрдсадсрдд

120 рдрдсадсдр

180 ддсааддддс

240 дасРссдРда

300 саааРдааса

360 аасрддддрр

414 ддсРдадсРд

РддадРсРдд сРддаРРсас

РддадРдддР адддссдаРР дссРдададс

РсРРРдасРа ддРРРРссРс дддаддсдрд сРРсадРадР ддсадРРаРа сассаРсРсс сдаддасасд срддддссад дРРдсРсРРР дРссадссРд

РаРдасаРдс

РддРаРдаРд ададасааРР дсРдРдРаРР ддаасссРдд

РаададдРдР ддаддрссср асРдддРссд даадРааРаа ссаадаасас асРдРдсдад

РсассдРсРс ссадРдРсад дадасРсРсс ссаддсРсса аРасРаРдса дсРдРаРсРс аддРадРддР сРса <210> 36 <211> 138 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 36

Мер СБи РЪе СБу Ьеи Зег Тгр УаБ 1 5

РЪе Ьеи УаБ АБа Ьеи Ьеи Агд СБу 10 15

УаБ СБп Суз СБп УаБ СБп Ьеи УаБ 20

СБи Зег СБу СБу СБу УаБ УаБ СБп 25 30

Рго СБу Агд Зег Ьеи Агд Ьеи Зег 35 40

Суз АБа АБа Зег СБу РЪе ТЪг РЪе 45

Зег Зег Туг Азр Мер НБз Тгр УаБ 50 55

Агд СБп АБа Рго СБу Ьуз СБу Ьеи 60

СБи Тгр УаБ АБа УаБ 11е Тгр Туг 65 70

Азр СБу Зег Азп Ьуз Туг Туг АБа 75 80

Азр Зег УаБ Ьуз СБу Агд РЪе ТЪг 85

ББе Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп 90 95

ТЪг Ьеи Туг Ьеи СБп Мер Азп Зег 100

Ьеи Агд АБа СБи Азр ТЪг АБа УаБ 105 110

- 71 024701

Туг Туг Суз А1а Агд 115 <31у Зег С1у Азп Тгр <31у РЬе 120

РЬе Азр Туг Тгр 125

О1у О1п О1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 130 135 <210> 37 <211> 119 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 37

С1п 1

Уа1

О1п

Ьеи

Уа1 5

<31и

Зег О1у С1у

О1у 10

Уа1

О1п

Рго

С1у 15

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Зег

О1у

РЬе

ТЬг

РЬе

Зег

Туг

20

25

30

Азр

Мер

Низ

Тгр

Уа1

Агд

<31п

А1а

Рго

<31у

Ьуз

<31у

Ьеи

<31и

Тгр

Уа1

35

40

45

А1а

Уа1

Не

Тгр

Туг

Азр

С1у

Зег

Азп

Ьуз

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

С1п

МеР

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

А1а

Агд

С1у

Зег

О1у

Азп

Тгр

С1у

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

<31п

С1у

100

105

110

ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210> 38 <211> 8 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

- 72 024701 <400> 38

С1у Рке Ткг Рке Зег Зег Туг Азр 1 5 <210> 39 <211> 8 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 39

Не Тгр Туг Азр О1у Зег Азп Ьуз

5 <210> 40 <211> 12 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 40

А1а Агд С1у Зег С1у Азп Тгр С1у Рке Рке Азр Туг

10 <210> 41 <211> 381 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 41 аЛдадддЛсс ЛсдсЛсадсЛ ссЛддддсЛс сЛдсЛдсЛсЛ дЛЛЛсссадд ЛдссадаЛдЛ 60 дасаЛссада ЛдасссадЛс ЛссаЛссЛса сЛдЛсЛдсаЛ сЛдЛаддада сададЛсасс 120 аЛсасЛЛдЛс дддсдадЛса дддЛаЛЛадс аддЛддЛЛад ссЛддЛаЛса дсадааасса 180 дадааадссс сЛаадЛсссЛ даЛсЛаЛдсЛ дсаЛссадЛЛ ЛдсааадЛдд ддЛсссаЛса 240 аддЛЛсадсд дсадЛддаЛс ЛдддасадаЛ ЛЛсасЛсЛса ссаЛсадсад ссЛдсадссЛ 300 даадаЛЛЛЛд саасЛЛаЛЛа сЛдссаасад ЛаЛааЛасЛЛ асссЛсддас дЛЛсддссаа 360 дддассаадд рддаааРсаа а 381 <210> 42 <211> 127 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 42

Мер Агд Уа1 Беи А1а О1п Беи Беи 61у Беи Беи Беи Беи Суз РЬе Рго 15 10 15

О1у А1а Агд Суз Азр Не <31п Мер ТЬг Θΐη Зег Рго Зег Зег Беи Зег 20 25 30

А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег О1п С1у 35 40 45

11е Зег Агд Тгр Беи А1а Тгр Туг 61η С1п Буз Рго О1и Буз А1а Рго 50 55 60

Буз Зег Беи 11е Туг А1а А1а Зег Зег Беи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег 65 70 75 80

Агд РЬе Зег О1у Зег О1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Беи ТЬг 11е Зег 85 90 95

Зег Беи С1п Рго О1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз 01η О1п Туг Азп 100 105 110

ТЬг Туг Рго Агд ТЬг РЬе С1у О1п О1у ТЬг Буз Уа1 О1и 11е Буз 115 120 125 <210> 43 <211> 107 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 43

Азр 11е О1п МеР ТЬг Θΐη Зег Рго Зег Зег Беи Зег А1а Зег Уа1 С1у 15 10 15

- 74 024701

Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п С1у Не Зег Агд Тгр 20 25 30

Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи 11е 35 40 45

Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у 50 55 60

Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго 65 70 75 80

С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п <31п Туг Азп ТЬг Туг Рго Агд 85 90 95

ТЬг РЬе С1у О1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и Не Ьуз 100 105 <210> 44 <211> 6 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 44

С1п С1у Не Зег Агд Тгр

5 <210> 45 <211> 3 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 45

А1а А1а Зег <210> 46 <211> 9 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

- 75 024701 пептид <400> 46 (31η 01п Туг Азп ТЬг Туг Рго Агд ТЬг 1 5 <210> 47 <211> 411 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 47 аДддадДДДд ддсДдадсДд ддДДДДссДс дДДдсДсДДД ДаададдДдД ссадДдДсад 60 дДдсадсДдд ДддадДсДдд дддаддсдДд дДссадссДд ддаддДсссД дадасДсДсс 120

ДдДдсадсдД сДддаДДсас сДДсааДаДс ДаДдасаДдс асДдддДссд ссаддсДсса 180 ддсааддддс ДддадДдддД ддсадДДаДа ДддДаДдаДд даадДааДса аДасДаДдса 240 дасДссдДда адддссдаДД сассаДсДсс ададасааДД ссаадаасас дсДдДаДсДд 300 саааДдааса ДДДДдададс сдаддасасд дсДдДдДаДД асДдДдсдад аддДасДсас 360

ДдддддДасД ДДдасДасДд дддссаддда асссДддДса ссдДсДссДс а

411 <210> 48 <211> 137 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 48

МеД О1и РЬе О1у Ьеи Зег Тгр Уа1 РЬе Ьеи Уа1 А1а Ьеи Ьеи Агд О1у 15 10 15

Уа1 С1п Суз О1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 О1и Зег О1у О1у О1у Уа1 Уа1 О1п 20 25 30

Рго О1у Агд Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег <31у РЬе ТЬг РЬе 35 40 45

- 76 024701

Азп Не Туг Азр Мер Нхз Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи 50 55 60

С1и Тгр Уа1 А1а 17а1 Не Тгр Туг Азр С1у Зег Азп С1п Туг Туг А1а 65 70 75 80

Азр Зег Уа1 Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп 85 90 95

ТЬг Ьеи Туг Ьеи С1п Мер Азп Не Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 100 105 110

Туг Туг Суз А1а Агд С1у ТЬг Шз Тгр С1у Туг РЬе Азр Туг Тгр С1у 115 120 125

С1п 01у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 130 135 <210> 49 <211> 118 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 49

С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Уа1 Уа1 С1п Рго С1у Агд 15 10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг РЬе Азп Не Туг 20 25 30

Азр Мер ΗΪ8 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр 1/а1 35 40 45

А1а Уа1 Не Тгр Туг Азр С1у Зег Азп С1п Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60

Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80

Ьеи С1п Мер Азп Не Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а иа1 Туг Туг Суз 85 90 95

А1а Агд С1у ТЬг Ηίδ Тгр С1у Туг РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг

- 77 024701

100 105 110

Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210> 50 <211> 8 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 50

С1у РЬе ТЬг РЬе Азп Не Туг Азр

5 <210> 51 <211> 8 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 51

Не Тгр Туг Азр <31у Зег Азп О1п

5 <210> 52 <211> 11 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 52

А1а Агд С1у ТЬг Шз Тгр С1у Туг РЬе Азр Туг

10 <210> 53 <211> 381 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 53

- 78 024701

абдадддбсс 60	бсдсбсадсб	ссбддддсбс	сбдсбдсбсб	дбббсссадд	бдссадабдб
дасабссада 120	бдасссадбс	бссабссбса	сбдбсбдсаб	сбдбаддада	сададбсасс
абсасббдбс 180	дддсдадбса	дддбаббадс	адсбддббад	ссбддбабса	дсадааасса
дадааадссс 240	сбаадбсссб	дабсбабдсб	дсабссаабб	бдсааадбдд	ддбсссабса
аддббсадсд 300	дсадбддабс	бдддасадаб	ббсасбсбса	ссабсадсад	ссбдсадссб
даадаббббд 360	саасббабба	сбдссаасад	бабаабадбб	асссбсддас	дббсддссаа
дддассаадд 381	бддааабсаа	а

<210> 54 <211> 127 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 54

Меб Агд Уа1 Ьеи А1а <31п Ьеи Ьеи 1 5

О1у Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Суз РЬе Рго 10 15

01у А1а Агд Суз Азр Не О1п Меб 20

ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег 25 30

А1а Зег А/а1 О1у Азр Агд Уа1 ТЬг 35 40

11е ТЬг Суз Агд А1а Зег Θΐη С1у 45

11е Зег Зег Тгр Ьеи А1а Тгр Туг 50 55

С1п С1п Ьуз Рго О1и Ьуз А1а Рго 60

Ьуз Зег Ьеи 11е Туг А1а А1а Зег 65 70

Азп Ьеи С1п Зег О1у Уа1 Рго Зег 75 80

Агд РЬе Зег С1у Зег О1у Зег <31у 85

ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег 90 95

Зег Ьеи С1п Рго О1и Азр РЬе А1а 100

ТЬг Туг Туг Суз О1п <31п Туг Азп 105 110

- 79 024701

Зег Туг Рго Агд ТЬг РЬе С1у βΐη С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз 115 120 125 <210> 55 <211> 107 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<400> 55

ТЬг 5

<31п

Зег

Рго

Зег

Зег 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

<31у

Азр 1

Не

<31п

Меб

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Агд

А1а

Зег

<31п

С1у

Не

Зег

Тгр

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

О1п

С1п

Ьуз

Рго

С1и

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Зег

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

А1а

Зег

Азп

Ьеи

О1п

Зег

О1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

О1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Ьеи

С1п

Рго

65

70

75

80

О1и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Суз

О1п

Туг

Азп

Зег

Туг

Рго

Агд

85

90

95

ТЬг

РЬе

С1у

О1п

О1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

О1и

Не

Ьуз

100

105

<210> 56

<211> 6

<212> белок

<213> искусственная

последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 56

О1п С1у Не Зег Зег Тгр .

5 <210> 57 <211> 3 <212> белок <213> искусственная последовательность

- 80 024701 <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 57

А1а А1а Зег <210> 58 <211> 9 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 58

Οίη Οίη Туг Азп Зег Туг Рго Агд ТЬг

5 <210> 59 <211> 423 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<400> 59 абддадбббд 60	ддсбдадсбд	ддббббссбс	дббдсбсббб	баададдбдб	ссадбдбсад
дбдсаасбдд 120	бддадбсбдд	дддаддсдбд	дбссадссбд	ддаддбсссб	дадасбсбсс
бдбдсадсдб 180	сбддаббсад	сббсадбадс	бабддсабдс	асбдддбссд	ссаддсбсса
ддсаадддас 240	бддадбдддб	ддсасббсба	бддбабдабд	дбадссабаа	адасбббдса
дасбссдбда 300	адддссдабб	сассабсбсс	ададасаабб	ссаадаасас	дсбадабсбд
сааабдааса 360	дссбдададс	сдаддасасд	дсбдбдбабб	асбдбдсдад	ададддббба
дсадбассбд 420	дбсасбддба	сббсдабсбс	бддддссдбд	дсасссбддб	сасбдбсбсс
бса
423
<210> 60

<211> 141 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<400> 60

Уа1

РЬе

Ьеи Уа1 10

А1а

Ьеи

Агд 15

<31у

Меб 1

С1и

РЬе

О1у

Ьеи 5

Зег

Тгр

Уа1

С1п

Суз

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1

С1и

Зег

С1у

<31у

Уа1

О1п

20

25

30

Рго

О1у

Агд

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

Зег

С1у

РЬе

Зег

РЬе

35

40

45

Зег

Туг

С1у

Меб

Нхз

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго

С1у

Ьуз

С1у

Ьеи

50

55

60

С1и

Тгр

Уа1

А1а

Ьеи

Тгр

Туг

Азр

С1у

Зег

Нхз

Ьуз

Азр

РЬе

А1а

65

70

75

80

Азр

Зег

Уа1

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

85

90

95

ТЬг

Ьеи

Азр

Ьеи

О1п

Меб

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

О1и

Азр

ТЬг

А1а

Уа1

100

105

110

Туг

Суз

А1а

Агд

С1и

О1у

Ьеи

А1а

Уа1

Рго

С1у

Нхз

Тгр

Туг

РЬе

115

120

125

Азр

Ьеи

Тгр

С1у

Агд

С1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

130

135

140

<210> 61 <211> 122 <212> белок

<213> искусственная

последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 61

Θΐη Уа1 О1п Ьеи Уа1 С1и Зег О1у О1у С1у Уа1 Уа1 Θΐη Рго О1у Агд 15 10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе Зег РЬе Зег Зег Туг

- 82 024701

ОЬу МеР НЬз Тгр А7аЬ Агд ОЬп А1а Рго ОЬу Ьуз ОЬу Ьеи ОЬи Тгр УаЬ 35 40 45

АЬа Ьеи Ьеи Тгр Туг Азр ОЬу Зег НЬз Ьуз Азр РЬе АЬа Азр Зег УаЬ 50 55 60

Ьуз ОЬу Агд РЬе ТЬг 1Ье Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Азр 65 70 75 80

Ьеи ОЬп Мер Азп Зег Ьеи Агд АЬа ОЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг Туг Суз 85 90 95

АЬа Агд ОЬи ОЬу Ьеи АЬа УаЬ Рго ОЬу НЬз Тгр Туг РЬе Азр Ьеи Тгр 100 105 110

ОЬу Агд ОЬу ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег 115 120 <210> 62 <211> 8 <2Ь2> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 62

ОЬу РЬе Зег РЬе Зег Зег Туг ОЬу

5 <210> 63 <211> 8 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 63

Ьеи Тгр Туг Азр ОЬу Зег НЬз Ьуз <210> 64 <211> 15 <212> белок <2ЬЗ> искусственная последовательность

- 83 024701 <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 64

А1а Агд С1и <31у Ьеи А1а Уа1 Рго С31у НЬз Тгр Туг Рке Азр Ьеи 15 10 15 <210> 65 <211> 381 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<400> 65 аЛдадддЛсс 60	ссдсЛсадсЛ	ссЛддддсЛЛ	сЛдсЛдсЛсЛ	ддсЛсссадд	ЛдссадаЛдЛ
дссаЛссадЛ 120	ЛдасссадЛс	ЛссаЛссЛсс	сЛдЛсЛдсаЛ	сЛдЛаддада	сададЛсасс
аЛсасЛЛдсс 180	дддсаадЛса	дддсаЛЛадс	адЛдсЛЛЛад	ссЛддЛаЛса	дсадааасса
дддааадсЛс 240	сЛаадсЛссЛ	даЛсЛаЛдаЛ	дссЛссадЛЛ	ЛддааадЛдд	ддЛсссаЛса
аддЛЛсадсд 300	дсадЛддаЛс	ЛдддасадаЛ	ЛЛсасЛсЛса	ссаЛсадсад	ссЛдсадссЛ
даадаЛЛЛЛд 360	саасЛЛаЛЛа	сЛдЛсаасад	ЛЛЛааЛасЛЛ	асссЛсддас	дЛЛсддссаа
дддассаадд 381	ЛддаааЛсаа	а

<210> 66 <211> 127 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 66

МеЛ Агд Уа1 Рго А1а С1п Ьеи Ьеи О1у Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Тгр Ьеи Рго 15 10 15

С1у А1а Агд Суз А1а Не <31п Ьеи Ткг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег 20 25 30

А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд Уа1 Ткг Не Ткг Суз Агд А1а Зег Οίη С1у

- 84 024701

11е Зег Зег АБа Ьеи А1а Тгр Туг СБп СБп Ьуз Рго СБу Ьуз А1а Рго 50 55 60

Ьуз Ьеи Ьеи 11е Туг Азр А1а Зег Зег Ьеи СБи Зег <31у УаБ Рго Зег 65 70 75 80

Агд РЪе Зег СБу Зег СБу Зег СБу ТЪг Азр РЪе ТЪг Ьеи ТЪг 11е Зег 85 90 95

Зег Ьеи СБп Рго СБи Азр РЪе АБа ТЪг Туг Туг Суз СБп СБп РЪе Азп 100 105 110

ТЪг Туг Рго Агд ТЪг РЪе СБу СБп СБу ТЪг Ьуз УаБ СБи 11е Ьуз 115 120 125 <210> 67 <211> 107 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 67

АБа 11е СБп Ьеи ТЪг СБп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег АБа Зег УаБ СБу 15 10 15

Азр Агд УаБ ТЪг 11е ТЪг Суз Агд АБа Зег СБп СБу 11е Зег Зег АБа 20 25 30

Ьеи АБа Тгр Туг СБп СБп Ьуз Рго СБу Ьуз АБа Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е 35 40 45

Туг Азр АБа Зег Зег Ьеи СБи Зег СБу УаБ Рго Зег Агд РЪе Зег СБу 50 55 60

Зег СБу Зег СБу ТЪг Азр РЪе ТЪг Ьеи ТЪг 11е Зег Зег Ьеи СБп Рго 65 70 75 80

СБи Азр РЪе АБа ТЪг Туг Туг Суз СБп СБп РЪе Азп ТЪг Туг Рго Агд 85 90 95

ТЪг РЪе СБу СБп СБу ТЪг Ьуз УаБ СБи 11е Ьуз 100 105

- 85 024701 <210> 68 <211> 6 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 68

О1п 01у Не Зег Зег А1а

5 <210> 69 <211> 3 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 69

Азр А1а Зег <210> 70 <211> 9 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 70

С1п О1п РЬе Азп ТЬг Туг Рго Агд ТЬг

5 <210> 71 <211> 405 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 71 абддадбббд ддсбдадсбд ддббббссбс дббдсбсббб баададдбдб ссадбдбсад 60 дбдсадббдд бддадбсбдд дддаддсдбд дбссадссбд ддаддбсссб дсдасбсбсс 120

- 86 024701 кдкдсадсдк скддакксас ссксадкадс сакдасакас аскдддкссд ссаддсксса 180 ддсааддддс кддадкдддк ддсадккака кддаакдакд даадкаакаа акаскакдса 240 даскссдкда адддссдакк сассаксксс ададасаакк ссасдааскс дскдкккскд 300 сааакдааса дсскдададс сдаддасасд дскдкдкакк аккдкдкдад аддааскдск 360 дассккдаас аскдддасса дддаассскд дксассдкск секса

405 <210> 72 <211> 135 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 72

Мек О1и РЬе С1у Ьеи Зег Тгр Уа1 РЬе Ьеи Уа1 А1а Ьеи Ьеи Агд С1у 15 10 15

Уа1 С1п Суз Θΐη Уа1 С1п Ьеи Уа1 О1и Зег О1у С1у С1у Уа1 Уа1 <31п 20 25 30

Рго С1у Агд Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЬе ТЬг Ьеи 35 40 45

Зег Зег НЬз Азр Не НЬз Тгр Уа1 Агд 61п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи 50 55 60

СЬи Тгр Уа1 АЬа УаЬ 11е Тгр Азп Азр ОЬу Зег Азп Ьуз Туг Туг А1а 65 70 75 80

Азр Зег УаЬ Ьуз ОЬу Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег ТЬг Азп 85 90 95

Зег Ьеи РЬе Ьеи ОЬп Мек Азп Зег Ьеи Агд АЬа ОЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ 100 105 110

Туг Туг Суз УаЬ Агд С1у ТЬг АЬа Азр Ьеи <31и НЬз Тгр Азр С1п С1у 115 120 125

ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег 130 135

- 87 024701 <210> 73 <211> 116 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<400> 73

Ьеи

Уа1 5

О1и

Зег

С1у СЯу

О1у Уа1 10

Уа1

О1п

Рго

О1у 15

Агд

С1п 1

Уа1

О1п

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а Зег

О1у РЬе

ТЬг

Ьеи

Зег

Низ

20

25

30

Азр

Не

Низ

Тгр

Уа1

Агд

О1п

А1а Рго

О1у Ьуз

О1у

Ьеи

О1и

Тгр

Уа1

35

40

45

А1а

Уа1

Не

Тгр

Азп

Азр

С1у

Зег Азп

Ьуз Туг

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

О1у

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд Азр

Азп Зег

ТЬг

Азп

Зег

Ьеи

РЬе

65

70

75

80

Ьеи

Θΐη

Меб

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а С1и

Азр ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Суз

85

90

95

Уа1

Агд

О1у

ТЬг

А1а

Азр

Ьеи

61и Низ

Тгр Азр

<31п

О1у

ТЬг

Ьеи

Уа1

100

105

110

ТЬг

Уа1

Зег

115

<210> 74

<211> 8

<212> белок

<213> искусственная

последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 74

О1у РЬе ТЬг Ьеи Зег Зег Низ Азр

5 <210> 75 <211> 8

- 88 024701 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 75

Не Тгр Азп Азр С1у Зег Азп Буз

5 <210> 76 <211> 12 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 76

Уа1 Агд С1у ТЬг А1а Азр Беи С1и Шз Тгр Азр <31п

10 <210> 77 <211> 381 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<400> 77 аРдадддРсс 60	РсдсРсадсР	ссРддддсРс	сРдсРдсРсР	дРРРсссадд	РдссадаРдР
дасаРссада 120	РдасссадРс	РссаРссРса	сРдРсРдсаР	сРдРаддада	сададРсасс
аРсасРРдРс 180	дддсдадРса	дддРаРРадс	адсРддРРад	ссРддРаРса	дсадааасса
дадааадссс 240	сРаадРсссР	даРсРаРдсР	дсаРссадРР	РдсааадРдд	ддРсссаРса
аддРРсадсд 300	дсадРддаРс	РдддасадаР	РРсасРсРса	ссаРсадсад	ссРдсадссР
даадаРРРРд 360	саасРРаРРа	сРдссаасад	РаРааРадРР	асссРсРсас	РРРсддсдда
дддассаадд 381	РддадаРсаа	а

<210> 78 <211> 127 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности полипептид <400> 78

МеД Агд Уа1 Ьеи А1а СЬп Ьеи Ьеи О1у Ьеи Ьеи Ьеи 15 10

Синтетический

Ьеи Суз РЬе Рго 15

СЬу АЬа Агд Суз Азр ХЬе СЬп МеД ТЬг СЬп Зег Рго 20 25

Зег Зег Ьеи Зег 30

АЬа Зег УаЬ СЬу Азр Агд УаЬ ТЬг 1Ье ТЬг Суз Агд 35 40

АЬа Зег СЬп СЬу 45

Не Зег Зег Тгр Ьеи АЬа Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго 50 55 60

СЬи Ьуз АЬа Рго

Ьуз Зег Ьеи 1Ье Туг АЬа АЬа Зег Зег Ьеи СЬп Зег 65 70 75

СЬу УаЬ Рго Зег 80

Агд РЬе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг 85 90

Ьеи ТЬг Не Зег 95

Зег Ьеи СЬп Рго СЬи Азр РЬе АЬа ТЬг Туг Туг Суз 100 105

СЬп СЬп Туг Азп 110

Зег Туг Рго Ьеи ТЬг РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ 115 120

СЬи Не Ьуз 125 <210> 79 <211> 107 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности полипептид <400> 79

Азр Не СЬп МеД ТЬг СЬп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег 15 10

Синтетический

АЬа Зег УаЬ СЬу 15

Азр Агд УаЬ ТЬг Не ТЬг Суз Агд АЬа Зег СЬп СЬу 20 25

Не Зег Зег Тгр 30

Ьеи АЬа Тгр Туг СЬп СЬп Ьуз Рго СЬи Ьуз АЬа Рго 35 40

Ьуз Зег Ьеи Не 45

- 90 024701

Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи 01п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РНе Зег О1у 50 55 60

Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи ТНг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго 65 70 75 80

О1и Азр РНе А1а ТНг Туг Туг Суз (31п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Ьеи 85 90 95

ТНг РНе <31у С1у С1у ТНг Ьуз Уа1 <31и Не Ьуз 100 105 <210> 80 <211> 6 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 80

С1п <31у Не Зег Зег Тгр <210> 81 <211> 3 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 81

А1а А1а Зег <210> 82 <211> 9 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 82

С1п О1п Туг Азп Зег Туг Рго Ьеи ТНг 1 5

- 91 024701 <210> 83 <211> 429 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 83 аРддадРРРд ддсРдадсРд ддРРРРссРс дРРдсРсРРР РаададдРдР ссадРдРсад 60 дрдсадсрдд РддадРсРдд дддаддсдРд дРссадссРд ддаддРсссР дадасРсРсс 120

РдРдсадсдР сРддаРРсас сРРсадРсаР РаРддсаРдс асРдддРссд ссаддсРсса 180 ддсааддддс сддадРдддР ддсааРРаРа РддРаРдаРд даадРааРаа аРасРаРдса 240 дасРссдРда адддссдаРР сассаРсРсс ададасааРР ссаадаасас дсРддаРсРд 300 саааРдааса дссРдададс сдаддасасд дсРдРдРаРР асРдРдсдад адаРддаРдд 360 асРасРаРдд РРсддддасР РааРдРРРРР даРаРсРддд дссаадддас ааРддРсасс 420 дРсРсРРса

429
<210>	84
<211>	143
<212>	белок
<213>	искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности:	: Синтетический
полипептид	Зег Тгр УаЬ	РНе	Ьеи УаЬ 10	АЬа	Ьеи	Ьеи Агд СЬу 15
<400> 84	РНе	О1у Ьеи 5
Мер 1	ОЬи
УаЬ	СЬп	Суз	СЬп УаЬ	СЬп Ьеи УаЬ	СЬи	Зег СЬу	СЬу	СЬу	УаЬ УаЬ СЬп
			20		25				30
Рго	ОЬу	Агд	Зег Ьеи	Агд Ьеи Зег	Суз	АЬа АЬа	Зег	СЬу	РНе ТНг РНе
		35		40				45
Зег	ΗΪ8	Туг	СЬу Мер	НЬз Тгр УаЬ	Агд	СЬп АЬа	Рго	СЬу	Ьуз СЬу Рго
	50			55			60

- 92 024701

С1и Тгр Уа1 А1а Не 11е Тгр Туг Азр С1у Зег Азп Ьуз Туг Туг А1а 65 70 75 80

ТЬг Ьеи Азр Ьеи С1п Меб Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 100 105 110

Туг Туг Суз А1а Агд Азр С1у Тгр ТЬг ТЬг Меб Уа1 Агд С1у Ьеи Азп 115 120 125

Уа1 РЬе Азр Не Тгр О1у О1п С1у ТЬг Меб Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 130 135 140 <210> 85 <211> 124 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 85

О1п Уа1 <31п Ьеи Уа1 <31и Зег С1у О1у О1у Уа1 Уа1 О1п Рго О1у Агд 15 10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег О1у РЬе ТЬг РЬе Зег Нтз Туг 20 25 30

О1у Меб ΗΪ3 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз О1у Рго С1и Тгр Уа1 35 40 45

А1а Не Не Тгр Туг Азр О1у Зег Азп Ьуз Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60

Ьуз О1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Азр 65 70 75 80

Ьеи О1п Меб Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95

А1а Агд Азр С1у Тгр ТЬг ТЬг Меб Уа1 Агд О1у Ьеи Азп Уа1 РЬе Азр 100 105 110

Не Тгр О1у О1п С1у ТЬг Меб Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег

- 93 024701

115 120 <210> 86 <211> 8 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 86

СБу РЪе ТЪг РЪе Зег НБз Туг СБу

5 <210> 87 <211> 8 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 87

Не Тгр Туг Азр СБу Зег Азп Ьуз

5 <210> 88 <211> 17 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 88

АБа Агд Азр СБу Тгр ТЪг ТЪг Меб УаБ Агд СБу Ьеи Азп УаБ РЪе Азр 15 10 15

Не <210> 89 <211> 381 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 89

- 94 024701 абдадддбсс бсдсбсадсб ссбддддсбс сбдсбдсбсб дбббсссадд бдссадабдб 60 дасабссада бдасссадбс бссабссбса сбдбсбдсаб сбдбаддада сададбсасс 120 абсасббдбс дддсдадбса ддабаббадс адсбддббад ссбддбабса дсадааасса 180 дадааадссс сбаадбсссб дабсбабдсб дсабссадбб бдсааадбдд ддбсссабса 240 аддббсадсд дсадбддабс бдддасадаб ббсасбсбса ссабсадсад ссбдсадссб 300 даадаббббд саасббабба сбдссаасад бабаабадбб асссбсссас сббсддссаа 360 дддасасдас бддадаббаа а

381

<210> 90

<211> 127

<212> белок

<213> искусственная последовательность

<220>

полипептид

<400> 90

Меб Агд Уа1 Ьеи А1а С1п Ьеи Ьеи <31у Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Суз РЬе Рго

15 10 15

С1у А1а Агд Суз Азр 11е (31п Меб ТЬг С1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег

20 25 30

А1а Зег Уа1 О1у Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег О1п Азр

35 40 45

Не Зег Зег Тгр Ьеи А1а Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1и Ьуз А1а Рго

50 55 60

Ьуз Зег Ьеи Не Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи О1п Зег <31у Уа1 Рго Зег

65 70 75 80

Агд РЬе Зег С1у Зег О1у Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег

85 90 95

Зег Ьеи О1п Рго <31и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп

100 105 110

- 95 024701

Зег Туг Рго Рго ТЬг РЬе О1у 61п <31у ТЬг Агд Ьеи <31и Не Ьуз 115 120 125 <210> 91 <211> 107 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<400> 91

Азр 1

Не

О1п

Меб

ТЬг 5

О1п

Зег

Рго

Зег

Зег 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

С1у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

Азр

Не

Зег

Тгр

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

Θΐη

С1п

Ьуз

Рго

О1и

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Зег

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

А1а

Зег

Ьеи

Θΐη

Зег

О1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

С1у

50

55

60

Зег

С1у

Зег

О1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Ьеи

С1п

Рго

65

70

75

80

С1и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Суз

С1п

Θΐη

Туг

Азп

Зег

Туг

Рго

85

90

95

ТЬг

РЬе

О1у

σΐη

<31у

ТЬг

Агд

Ьеи

О1и

Не

Ьуз

100

105

<210> 92

<211> 6

<212> белок

<213> искусственная

последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 92

С1п Азр Не Зег Зег Тгр

5 <210> 93 <211> 3 <212> белок <213> искусственная последовательность

- 96 024701 <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 93

А1а А1а Зег <210> 94 <211> 9 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 94

С1п 61п Туг Азп Зег Туг Рго Рго Ткг

5 <210> 95 <211> 381 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 95 аЛдадддЛсс ЛсдсЛсадсЛ ссЛддддсЛЛ сЛдсЛдсЛсЛ ддсЛсссадд ЛдссадаЛдЛ 60 дссаЛссадЛ ЛдасссадЛс ЛссаЛссЛсс сЛдЛсЛдсаЛ сЛдЛаддада сададЛсасс 120 аЛсасЛЛдсс дддсаадЛса дддсаЛЛадс адЛдсЛЛЛад ссЛддЛаЛса дсадааасса 180 дадааадссс сЛаадЛсссЛ даЛсЛаЛдсЛ дсаЛссадЛЛ ЛдсааадЛдд ддЛсссаЛса 240 аддЛЛсадсд дсадЛддаЛс ЛдддасадаЛ ЛЛсасЛсЛса ссаЛсадсад ссЛдсадссЛ 300 даадаЛЛЛЛд саасЛЛаЛЛа сЛдссаасад ЛаЛааЛадЛЛ асссЛсссас сЛЛсддссаа 360 дддасасдас ЛддадаЛЛаа а

381 <210> 96 <211> 127 <212> белок <213> искусственная последовательность

- 97 024701 <220>

<223> Описание искусственной последовательности полипептид <400> 96

Меб Агд Уай Ьеи Айа Ойп Ьеи Ьеи Сйу Ьеи Ьеи Ьеи 15 10

Синтетический

Ьеи Тгр Ьеи Рго 15

Ойу А1а Агд Суз А1а Не Οίη Ьеи ТЬг Οίη Зег Рго 20 25

Зег Зег Ьеи Зег 30

Айа Зег Уай О1у Азр Агд Уай ТЬг Не ТЬг Суз Агд 35 40

Айа Зег Сйп Ойу 45

Не Зег Зег Айа Ьеи Айа Тгр Туг Οίη Οίη Ьуз Рго 50 55 60

Сйи Ьуз Айа Рго

Ьуз Зег Ьеи Не Туг Айа Айа Зег Зег Ьеи Ойп Зег 65 70 75

Ойу Уай Рго Зег 80

Агд РЬе Зег Сйу Зег Сйу Зег Сйу ТЬг Азр РЬе ТЬг 85 90

Ьеи ТЬг Не Зег 95

Зег Ьеи Ойп Рго Ойи Азр РЬе Айа ТЬг Туг Туг Суз 100 105

Ойп Ойп Туг Азп 110

Зег Туг Рго Рго ТЬг РЬе О1у Ойп Ойу ТЬг Агд Ьеи 115 120

Ойи Не Ьуз 125 <210> 97 <211> 107 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности полипептид <400> 97

Айа Не Ойп Ьеи ТЬг Ойп Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег 15 10

Синтетический

А1а Зег Уай Ойу 15

Азр Агд Уай ТЬг Не ТЬг Суз Агд Айа Зег Ойп Ойу 20 25

Не Зег Зег Айа 30

Ьеи Айа Тгр Туг Ойп Ойп Ьуз Рго Ойи Ьуз Айа Рго 35 40

Ьуз Зег Ьеи Не 45

- 98 024701

Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи <31п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег 01у 50 55 60

Зег <31у Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго 65 70 75 80

С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз <31п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Рго 85 90 95

ТЬг РЬе О1у С1п О1у ТЬг Агд Ьеи С1и Не Ьуз 100 105 <210> 98 <211> 6 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 98

С1п О1у Не Зег Зег А1а

5 <210> 99 <211> 3 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 99

А1а А1а Зег <210> 100 <211> 9 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 100 <31п Θΐη Туг Азп Зег Туг Рго Рго ТЬг

5 <210> 101 <211> 414

- 99 024701 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 101 абддадбббд ддсбдадсбд ддббббссбс дббдсбсббб баададдбдб ссадбдбсад 60 дбдсадсбдд бддадбсбдд дддаддсдбд дбссадссбд ддаддбсссб дадасбсбсс 120 бдбдсаасдб сбддаббсас сббсадбадс бабдасабдс асбдддбссд ссаддсбсса 180 ддсааддддс бддадбдддб ддсадббабб бддбабдабд даадбаабаа абасбабдса 240 дасбссдбда адддссдабб сассабсбсс ададасаабб ссаадаасас дсбдбабсбс 300 сааабдааса дссбдддада сдаддасасд дсбдбдбабб асбдбдсдад аддбадбддб 360 аасбддддбб бсбббдасба сбддддссад ддаасссбдд бсассдбсбс сбса 414 <210> 102 <211> 138 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 102

Меб СБи РЪе СБу Ьеи Зег Тгр УаБ РЪе Ьеи УаБ А1а Ьеи Ьеи Агд СБу 15 10 15

УаБ СБп Суз СБп УаБ СБп Ьеи УаБ СБи Зег СБу СБу СБу УаБ УаБ СБп 20 25 30

Рго СБу Агд Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АБа ТЪг Зег СБу РЪе ТЪг РЪе 35 40 45

Зег Зег Туг Азр Меб НБз Тгр УаБ Агд СБп АБа Рго СБу Ьуз СБу Ьеи 50 55 60

СБи Тгр УаБ АБа УаБ 11е Тгр Туг Азр СБу Зег Азп Ьуз Туг Туг АБа 65 70 75 80

- 100 024701

Азр Зег λ/аЬ

Ьуз

СЬу

Агд

РЬе

ТЬг

Не

Зег

Агд

Азр

Азп

Зег

Ьуз

Азп

85

90

95

ТЬг Ьеи Туг

Ьеи

СЬп

МеД

Азп

Зег

Ьеи

СЬу

Азр

СЬи

Азр

ТЬг

АЬа

УаЬ

100

105

110

Туг Туг Суз

АЬа

Агд

ОЬу

Зег

СЬу

Азп

Тгр

СЬу

РЬе

Азр

Туг

Тгр

115

120

125

СЬу СЬп СЬу

ТЬг

Ьеи

УаЬ

ТЬг

УаЬ

Зег

130

135

<210> 103

<211> 119

<212> белок

<213> искусственная

последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 103

СЬп \7а1 СЬп Ьеи УаЬ <31и Зег О1у О1у О1у УаЬ λ/аЬ СЬп Рго ОЬу Агд 15 10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа ТЬг Зег СЬу РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг 20 25 30

Азр МеД НЬз Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго ОЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр УаЬ 35 40 45

АЬа УаЬ 1Ье Тгр Туг Азр СЬу Зег Азп Ьуз Туг Туг АЬа Азр Зег УаЬ 50 55 60

Ьуз СЬу Агд РЬе ТЬг 1Ье Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг 65 70 75 80

Ьеи СЬп МеД Азп Зег Ьеи СЬу Азр СЬи Азр ТЬг АЬа УаЬ Туг Туг Суз 85 90 95

АЬа Агд СЬу Зег СЬу Азп Тгр ОЬу РЬе РЬе Азр Туг Тгр СЬу СЬп СЬу 100 105 110

ТЬг Ьеи УаЬ ТЬг λ/аЬ Зег Зег 115 <210> 104 <211> 8

- 101 024701 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 104

С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг Азр

5 <210> 105 <211> 8 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 105

Не Тгр Туг Азр О1у Зег Азп Буз

5 <210> 106 <211> 12 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 106

А1а Агд <31у Зег С1у Азп Тгр С1у РЬе РЬе Азр Туг

10 <210> 107 <211> 381 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <400> 107 аРдадддРсс РсдсРсадсР ссРддддсРс сРдсРдсРсР дРРРсссадд РдссадаРдР 60 дасаРссада РдасссадРс РссаРссРса сРдРсРдсаР сРдРаддада сададРсасс 120 аРсасРРдРс дддсдадРса дддРаРРадс аддРддРРад ссРддРаРса дсадааасса 180

- 102 дадааадссс сРаадРсссР даРсРаРдсР дсаРссадРР РдсааадРдд ддРсссаРса 240 аддРРсадсд дсадРддаРс РдддасадаР РРсасРсРса ссаРсадсад ссрдсадсср 300 даадаРРРРд саасРРаРРа сРдссаасад РаРааРасРР асссРсддас дРРсддссаа 360 дддассаадд РддаааРсаа а

381 <210> 108 <211> 127 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 108

Мер Агд Уа1 Ьеи А1а <31п Ьеи Ьеи С1у Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи Суз РЬе Рго 15 10 15

С1у А1а Агд Суз Азр 11е О1п Мер ТЬг О1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег 20 25 30

А1а Зег Уа1 (31у Азр Агд \7а1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п <31у 35 40 45

Не Зег Агд Тгр Ьеи А1а Тгр Туг О1п С1п Ьуз Рго <31и Ьуз А1а Рго 50 55 60

Ьуз Зег Ьеи Не Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег 65 70 75 80

Агд РЬе Зег <31у Зег С1у Зег <31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег 85 90 95

Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп 100 105 110

ТЬг Туг Рго Агд ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 (31и Не Ьуз 115 120 125 <210> 109 <211> 107 <212> белок <213> искусственная последовательность

- 103 024701 <220>

<400> 109

Азр 1

Не

О1п

Мер

ТЬг 5

С1п

Зег

Рго

Зег

Зег 10

Ьеи

Зег

А1а

Зег

Уа1 15

О1у

Азр

Агд

Уа1

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Агд

А1а

Зег

С1п

О1у

Не

Зег

Агд

Тгр

20

25

30

Ьеи

А1а

Тгр

Туг

О1п

С1п

Ьуз

Рго

С1и

Ьуз

А1а

Рго

Ьуз

Зег

Ьеи

Не

35

40

45

Туг

А1а

Зег

Ьеи

О1п

Зег

С1у

Уа1

Рго

Зег

Агд

РЬе

Зег

О1у

50

55

60

Зег

<31у

Зег

01у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

Ьеи

С1п

Рго

65

70

75

80

О1и

Азр

РЬе

А1а

ТЬг

Туг

Суз

О1п

С1п

Туг

Азп

ТЬг

Туг

Рго

Агд

85

90

95

ТЬг

РЬе

<31у

<31п

<31у

ТЬг

Ьуз

Уа1

<31и

Не

Ьуз

100

105

<210> 110

<211> 6

<212> белок

<213> искусственная

последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 110

О1п О1у 11е Зег Агд Тгр

5 <210> 111 <211> 3 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 111

А1а А1а Зег

- 104 024701 <210> 112 <211> 9 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 112

СЬп ОЬп Туг Азп ТНг Туг Рго Агд ТНг

5 <210> 113 <211> 16 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая консенсусная последовательнрость <220>

<221> модифицированный остаток <222> (2) . . (2) <223> СЬу, СЬи, или Азр <220>

<221> модифицированный остаток <222> (3) . . (3) <223> Зег, Ьеи, СЬу или отсутствует <220>

<221> модифицированный остаток <222> (4) . . (4) <223> СЬу, Ьеи, ТНг, Тгр, или отсутствует <220>

<22Ь> модифицированный остаток <222> (5)..(5) <223> Азп, АЬа, ТНг, НЬз или отсутствует <220>

<221> модифицированный остаток <222> (6)..(6) <223> УаЬ, ТНг или отсутствует <220>

<22Ь> модифицированный остаток <222> (7)..(7) <223> МеР, Рго или отсутствует <220>

<221> модифицированный остаток <222> (8) . . (8) <223> СЬу, Х/аЬ или отсутствует

- 105 024701 <220>

<221> модифицированный остаток <222> (9)..(9) <223> Мау или может присутствовать <220>

<221> модифицированный остаток <222> (10) . . (10) <223> С1у, Меб или отсутствует <220>

<221> модифицированный остаток <222> (11)..(11) <223> Азр, ΗΪ3, Ъеи, ТЬг или Тгр <220>

<221> модифицированный остаток <222> (12)..(12) <223> А1а, С1у, Азп или Тгр <220>

<221> модифицированный остаток <222> (13) . . (13) <223> Азр, РЬе, Уа1 или Туг <220>

<221> модифицированный остаток <222> (14)..(14) <223> РЬе или Ъеи <220>

<221> модифицированный остаток <222> (15) . . (15) <223> Азр или С1и <220>

<221> модифицированный остаток <222> (16)..(16) <223> ΗΪ3, 11е, Ъеи или Туг <400> 113

Агд Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Агд Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа 15 10 15 <210> 114 <211> 8 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<221> модифицированный остаток <222> (2) . . (2) <223> РЬе, Агд или Туг

- 106 024701 <220>

<221> модифицированный остаток <222> (3)..(3) <223> Азп или Зег <220>

<221> модифицированный остаток <222> (4) . . (4) <223> Азп, Ткг или Зег <220>

<221> модифицированный остаток <222> (5)..(5) <223> Туг или Тгр <220>

<221> модифицированный остаток <222> (7)..(7) <223> Рке, Ьеи, Рго или Агд <400> 114

С1п Хаа Хаа Хаа Хаа Рго Хаа Ткг <210> 115 <211> 8 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<221> модифицированный остаток <222> (2)..(2) <223> Ьуз или Тгр <220>

<221> модифицированный остаток <222> (3)..(3) <223> Туг, Азп или С1п <220>

<221> модифицированный остаток <222> (7)..(7) <223> С1и или Азп <220>

<221> модифицированный остаток <222> (8)..(8) <223> Ьуз или С1п <400> 115

Не Хаа Хаа Азр О1у Зег Хаа Хаа 1 5

- 107 024701 <210> 116 <211> 3 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<221> модифицированный остаток <222> (1)..(1) <223> АЬа или Азр <400> 116

Хаа АЬа Зег <210> 117 <211> 7 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<221> модифицированный остаток <222> (3)..(3) <223> ТЬг или Зег <220>

<221> модифицированный остаток <222> (4)..(4) <223> РЬе или Ьеи <220>

<221> модифицированный остаток <222> (5)..(5) <223> Зег или Азп <220>

<221> модифицированный остаток <222> (6)..(6) <223> Не, Зег или НЬз <220>

<221> модифицированный остаток <222> (7) . . (7) <223> Туг или НЬз <400> 117

ОЬу РЬе Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа 1 5

- 108 024701 <210> 118 <211> 6 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<221> модифицированный остаток <222> (2)..(2) <223> Авр, С1у или Зег <220>

<221> модифицированный остаток <222> (3) . . (3) <223> Не или Уа1 <220>

<221> модифицированный остаток <222> (4) . . (4) <223> Азр или Зег <220>

<221> модифицированный остаток <222> (5)..(5) <223> Агд или Зег <220>

<221> модифицированный остаток <222> (6) . . (6) <223> А1а, Тгр или Туг <400> 118

С1п Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа 1 5 <210> 119 <211> 8 <212> белок <213> Са11из зр.

<400> 119

Зег 11е 11е Азп РЬе О1и Ьуз Ьеи <210> 120 <211> 127 <212> белок <213> искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: полипептид

Синтетический <400> 120

- 109 024701

Меб 1

Агд

Уай

Рго

Айа 5

Сйп

Ьеи

Сйу

Ьеи 10

Ьеи

Тгр

Ьеи 15

Рго

Ойу

А1а

Агд

Суз

Айа

Не

Ойп

Ьеи

ТЬг

Ойп

Зег

Рго

Зег

Ьеи

Зег

20

25

30

Айа

Зег

Уай

Ойу

Азр

Агд

Уай

ТЬг

Не

ТЬг

Суз

Агд

Айа

Зег

Ойп

Ойу

35

40

45

Не

Зег

Айа

Ьеи

Айа

Тгр

Туг

Ойп

Ьуз

Рго

Ойу

Ьуз

Айа

Рго

50

55

60

Ьуз

Ьеи

Не

Туг

Азр

Айа

Зег

Ьеи

Ойи

Зег

Ойу

Уай

Рго

Зег

65

70

75

80

Агд

РЬе

Зег

Ойу

Зег

Ойу

Зег

Сйу

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Не

Зег

85

90

95

Зег

Ьеи

Οίη

Рго

Ойи

Азр

РЬе

Айа

ТЬг

Туг

Суз

Οίη

Сйп

РЬе

Азп

100

105

110

Зег

Туг

Рго

РЬе

ТЬг

РЬе

Ойу

Рго

Ойу

ТЬг

Ьуз

Уай

Азр

Не

Ьуз

115

120

125

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

1. Выделенное моноклональное антитело, которое связывается с СГО27 человека и индуцирует или усиливает иммунный ответ, опосредованный Т-клетками, где указанное антитело включает:

(ί) СЭК1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е0 ΙΌ ΝΟ:38; СГОК2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е0 ГО ΝΟ:39; СГОК3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е0 ГО ΝΟ:40; СГОК1 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ГО ΝΟ:44; СГОК2 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ГО ΝΟ:45, и СГОК3 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ГО ΝΟ:46; или (ίί) вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, включающие аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотным последовательностям 8Е0 ГО ΝΟ:37 и 43 соответственно; или (ίίί) вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, включающие аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотным последовательностям 8Е0 ГО ΝΟ:37 и 43 соответственно; или (ίν) вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, кодируемые нуклеотидными последовательностями, по меньшей мере на 90% идентичными нуклеотидным последовательностям 8Е0 ГО ΝΟ:35 и 41 соответственно.

2. Выделенное моноклональное антитело по п.1, где указанное антитело содержит СГОК1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е0 ГО ΝΟ:38; СГОК2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е0 ГО ΝΟ:39; СГОК3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий 8Е0 ГО ΝΟ:40; СГОК1 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ГО ΝΟ:44; СГОК2 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ГО ΝΟ:45, и СГОК3 вариабельной области легкой цепи, включающий 8Е0 ГО ΝΟ:46.

3. Выделенное моноклональное антитело по п.1 или 2, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, включающие аминокислотные последовательности 8Е0 ГО ΝΟ:37 и 43 соответственно.

4. Выделенное моноклональное антитело по п.1 или п.2, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, кодируемые нуклеотидными последовательно- 110 024701 стями 8ЕЦ ΙΌ ЫО:35 и 41 соответственно.

5. Выделенное моноклональное антитело по любому из предшествующих пунктов, проявляющее по меньшей мере одно из следующих свойств:

a) блокирование связывания δί'Ό70 с СЭ27 по меньшей мере на 70% при концентрации антител 10 мкг/мл;

b) связывание с ί'Ό27 человека с равновесной константой диссоциации Кб, равной 10⁹ М или менее, или, альтернативно, с равновесной константой ассоциации Ка, равной 10+⁹ М^-1 или более;

c) индукцию специфической комплемент-опосредованной цитотоксичности (СОС) по отношению к клеткам, экспрессирующим СЭ27, по меньшей мере на 10% при концентрации антител 3 мкг/мл и приблизительно 6% комплемента сыворотки кролика;

б) индукцию срецифического лизиса клеток, экспрессирующих СЭ27, вызванного антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (АОСС), по меньшей мере на 10% при концентрации антител 3 мкг/мл и соотношении эффекторных клеток и клеток-мишеней 75:1;

е) повышение медианы выживаемости по меньшей мере на 20% у мышей с тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью (ТКИН) после инокуляции опухолевых клеток ш У1уо (5х 10⁵ клеток Раджи или 1х 10⁶ клеток Дауди) при введении 0,3 мг (внутрибрюшинно) по меньшей мере дважды в неделю на протяжении 3 недель по сравнению с мышами, которым не вводили антитела;

ί) индукцию или усиление антигенспецифического иммунного ответа ш У1уо в комбинации с вакциной или эндогенным антигеном;

д) индукцию или усиление антигенспецифического иммунного ответа ТН1 ш У1уо в комбинации с вакциной или эндогенным антигеном;

1) индукцию или усиление антигенспецифической пролиферации или активации Т-клеток ш У1уо в комбинации с вакциной или эндогенным антигеном;

_() уменьшение количества СЭ3+ Т-клеток (не являющихся МК-клетками) у макак менее чем на 50% при введении в количестве 3 мг/кг (в/в) на протяжении периода 29 суток непосредственно после введения; или

6. Антитело по любому из предшествующих пунктов, где антитело выбрано из:

(ί) антител 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дМ, 1дА1, 1дА2, 1др и 1дЕ; и/или (ίί) антитела человека, гуманизированного или химерного антитела.

7. Биспецифическая молекула, включающая антитело по любому из предшествующих пунктов, связанное со второй молекулой, специфичность связывания которой отличается от специфичности антитела.

8. Биспецифическая молекула по п.7, где вторая молекула связывается с Рс-рецептором, ΝΙ<рецептором или Т-клеточным рецептором, выбранным из группы, состоящей из СЭ3, СЭ40 и СЭ25.

9. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела по любому из пп.1-6.

10. Клетка, трансформированная экспрессирующим вектором по п.9.

11. Композиция для индуцирования или усиления иммунного ответа против антигена у субъекта, включающая эффективное количество антитела по любому из пп.1-6 или биспецифической молекулы по п.7 или 8.

12. Композиция по п.11, дополнительно включающая:

(ί) адъювант и/или иммуностимулятор; или (ίί) по меньшей мере одно второе антитело, которое индуцирует или усиливает иммунный ответ, и/или антиген.

13. Композиция по п.12, где иммуностимулятор выбран из группы, состоящей из лиганда ί'Ό40, лиганда РЬТ 3, цитокинов, колониестимулирующих факторов, ЬР8 (эндотоксина), оцРНК, дцРНК, бациллы Кальметта-Герена (ВСС), левамизола гидрохлорида, иммуноглобулинов для внутривенного введения и агониста То11-подобного рецептора (ТЬК).

14. Композиция по п.13, где агонист То11-подобного рецептора (ТЬК) представляет собой агонист ТЬК3, агонист ТЬК4, агонист ТЬК5, агонист ТЬК7, агонист ТЬК8 или агонист ТЬК9.

15. Композиция по п.12, где антиген включает компонент патогенного организма, аллерген, аутоантиген или опухолевый антиген.

16. Композиция по п.15, где опухолевый антиген представляет собой βΙιί'Ό, др100 или Рте117, НЕК2/пеи, №Т1, мезотелин, СЕА, др100, МАКТ1, ТКР-2, те1ап-А, ЯУ-Е8О-1, ЯУ-ВК-1, ЯУ-СО-58, ММ (др250), набор идиотипических детерминант, МАСЕ-1, МАСЕ-3, МАСЕ-А3, тирозиназа, теломераза, антигены 88X2, антигены МИС-1 или опухолевые антигены эмбрионального происхождения.

17. Композиция по п.12, где второе антитело связывает СТЬА-4, РЭ-1, 41ВВ или ОХ-40.

18. Способ индукции или услления иммунного ответа на антиген у субъекта, включающий введение

- 111 024701 субъекту антитела по любому из пп.1-6 или композиции по п.11 или 12 в количестве, достаточном для индукции или усиления иммунного ответа на антиген.

19. Способ ингибирования роста клеток, экспрессирующих СО27, включающий приведение в контакт клеток с антителом по любому из пп.1-6, или композицией по п.11 или 12 в количестве, эффективном для ингибирования роста клеток, экспрессирующих СЭ27.

20. Способ ингибирования связывания ί.Ό70 с СЭ27 на клетках, включающий введение антитела по любому из пп.1-6.

21. Способ лечения рака, включающий введение субъекту антитела по любому из пп.1-6.

22. Способ детектирования СЭ27 в биологическом образце, включающий приведение в контакт биологического образца с антителом по любому из пп.1-6, где антитело мечено обнаруживаемым веществом, и обнаружение антитела, связанного с СЭ27, что свидетельствует о наличии СЭ27 в биологическом образце.