KR20210143766A

KR20210143766A - Glp1 수용체에 대한 변이체 핵산 라이브러리

Info

Publication number: KR20210143766A
Application number: KR1020217030050A
Authority: KR
Inventors: 레이 타비비아자르; 아론 사토; 판카이 가그; 치앙 리우; 후미코 악셀로드
Original assignee: 트위스트 바이오사이언스 코포레이션
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2020-02-26
Publication date: 2021-11-29
Also published as: CA3131689A1; CN113766930A; AU2020229349A1; US20230193513A1; WO2020176678A1; EP3930753A1; JP2022521551A; JP2024156678A; SG11202109322TA; EP3930753A4; US11492727B2; US20200325235A1

Abstract

본원에서는 글루카곤 유사 펩티드-1 수용체(GLP1R) 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 갖는 GLP1R 라이브러리에 관한 방법 및 조성물을 제공한다. 본원에 기술된 라이브러리는, 각각의 것이 적어도 하나의 미리 결정된 참조 핵산 서열의 미리 결정된 변이체를 코딩하는 것인 핵산을 포함하는 변이된 라이브러리를 포함한다. 본원에서는 핵산 라이브러리가 번역되었을 때 생성되는 단백질 라이브러리를 추가로 기술한다. 본원에서 본원에 기술된 변이된 핵산 라이브러리를 발현하는 세포 라이브러리를 추가로 기술한다.

Description

GLP1 수용체에 대한 변이체 핵산 라이브러리

상호 참조

본 출원은 2019년 2월 26일 출원된 미국 특허 가출원 제62/810,377호; 2019년 4월 5일 출원된 미국 특허 가출원 제62/830,316호; 2019년 5월 31일 출원된 미국 특허 가출원 제62/855,836호; 2019년 9월 23일 출원된 미국 특허 가출원 제62/904,563호; 2019년 12월 6일 출원된 미국 특허 가출원 제62/945,049호; 및 2020년 1월 14일 출원된 미국 특허 가출원 제62/961,104호의 이익을 주장하며, 상기 출원들은 각각 그 전문이 참조로 포함된다.

배경

G 단백질 커플링된 수용체(GPCR: G protein-coupled receptor)는 매우 다양한 질환에 연루되어 있다. GPCR은 대개 세포에서 낮은 수준으로 발현되고, 정제시 매우 불안정하기 때문에, GPCR에 대한 항체의 생성은 적합한 항원을 얻을 때의 문제로 인해 어려웠다. 따라서, GPCR을 표적화하는 치료적 개입을 위한 개선된 작용제가 요구되고 있다.

참조에 의한 포함

본 명세서에서 언급된 모든 공개문헌들, 특허들 및 특허 출원들은 각각의 개별 공개문헌, 특허 또는 특허 출원이 마치 구체적 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 명시된 것처럼 동일한 정도로 본원에서 참조로 포함된다.

간단한 요약

본원에서는 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하고, (a) 여기서, 면역글로불린 중쇄는 서열 번호 2303, 2304, 2305, 2306, 2307, 2308, 2309, 2317, 2318, 2319, 2320, 또는 2321에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (b) 여기서, 면역글로불린 경쇄는 서열 번호 2310, 2311, 2312, 2313, 2314, 2315, 또는 2316에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 제공한다. 본원에서는 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2303에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2310에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2304에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2311에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2305에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2312에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2306에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2313에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2307에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2314에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2308에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2315에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 서열 번호 2309, 2317, 2318, 2319에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2316에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 항체가 단일클론 항체, 다중클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 그라프팅된 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 낙타화 항체, 단일 쇄 Fv(scFv: single-chain Fv), 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 도메인 항체, 단리된 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region), 디아바디, 오직 단일 단량체 가변 도메인으로만 구성된 단편, 디술피드 연결된 Fv(sdFv), 인트라바디, 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 그의 ab 항원 결합 단편인 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 항체 또는 그의 항체 단편이 키메라 또는 인간화 항체 또는 그의 항체 단편인 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 cAMP 검정법에서 항체의 EC50이 약 25 나노몰 미만인 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 cAMP 검정법에서 항체의 EC50이 약 20 나노몰 미만인 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 cAMP 검정법에서 항체의 EC50이 약 10 나노몰 미만인 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 항체가 GLP1R의 효능제인 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 항체가 GLP1R의 길항제인 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 항체가 GLP1R의 알로스테릭 조정제인 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 GLP1R의 알로스테릭 조정제가 음성 알로스테릭 조정제인 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 서열 번호 2277, 2278, 2281, 2282, 2283, 2284, 2285, 2286, 2289, 2290, 2291, 2292, 2294, 2295, 2296, 2297, 2298, 2299, 2300, 2301, 또는 2302 중 어느 하나의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다.

본원에서는 복수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리로서, 여기서, 각각의 핵산이, 번역시, 면역글로불린 스캐폴드를 코딩하는 서열을 코딩하고, 여기서, 면역글로불린 스캐폴드가 GPCR 결합 도메인을 포함하는 CDR-H3 루프를 포함하고, 여기서, 각각의 핵산이 GPCR 결합 도메인의 서열 변이체를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 제공한다. 본원에서는 CDR-H3 루프의 길이가 약 20 내지 약 80개의 아미노산 길이인 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 CDR-H3 루프의 길이가 약 80 내지 약 230개의 염기쌍 길이인 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 면역글로불린 스캐폴드가 가변 도메인, 경쇄(VL), 가변 도메인, 중쇄(Vh), 불변 도메인, 경쇄(CL), 및 불변 도메인, 중쇄(CH)로부터 선택되는 하나 이상의 도메인을 추가로 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 VH 도메인이 IGHV1-18, IGHV1-69, IGHV1-8 IGHV3-21, IGHV3-23, IGHV3-30/33rn, IGHV3-28, IGHV3-74, IGHV4-39, 또는 IGHV4-59/61인 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 VH 도메인이 IGHV1-69, IGHV3-30, IGHV3-23, IGHV3, IGHV1-46, IGHV3-7, IGHV1, 또는 IGHV1-8인 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 VH 도메인이 IGHV1-69 및 IGHV3-30인 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 VL 도메인이 IGKV1-39, IGKV1-9, IGKV2-28, IGKV3-11, IGKV3-15, IGKV3-20, IGKV4-1, IGLV1-51, IGLV2-14, IGLV1-40, 또는 IGLV3-1인 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 VH 도메인의 길이가 약 90 내지 약 100개의 아미노산 길이인 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 VL 도메인의 길이가 약 90 내지 약 120개의 아미노산 길이인 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 VH 도메인의 길이가 약 280 내지 약 300개의 염기쌍 길이인 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 VL 도메인의 길이가 약 300 내지 약 350개의 염기쌍 길이인 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 라이브러리가 적어도 10⁵개의 비동일 핵산을 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 면역글로불린 스캐폴드가 단일 면역글로불린 도메인을 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 면역글로불린 스캐폴드가 최대 100개의 아미노산으로 이루어진 펩티드를 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다.

본원에서는 복수의 단백질을 포함하는 단백질 라이브러리로서, 여기서, 복수의 단백질의 각각의 단백질이 면역글로불린 스캐폴드를 포함하고, 여기서, 면역글로불린 스캐폴드가 GPCR 결합 도메인의 서열 변이체를 포함하는 CDR-H3 루프를 포함하는 것인 단백질 라이브러리를 제공한다. 본원에서는 CDR-H3 루프의 길이가 약 20 내지 약 80개의 아미노산 길이인 것인 단백질 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 면역글로불린 스캐폴드가 가변 도메인, 경쇄(VL), 가변 도메인, 중쇄(Vh), 불변 도메인, 경쇄(CL), 및 불변 도메인, 중쇄(CH)로부터 선택되는 하나 이상의 도메인을 포함하는 것인 단백질 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 VH 도메인이 IGHV1-18, IGHV1-69, IGHV1-8 IGHV3-21, IGHV3-23, IGHV3-30/33rn, IGHV3-28, IGHV3-74, IGHV4-39, 또는 IGHV4-59/61인 것인 단백질 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 VH 도메인이 IGHV1-69, IGHV3-30, IGHV3-23, IGHV3, IGHV1-46, IGHV3-7, IGHV1, 또는 IGHV1-8인 것인 단백질 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 VH 도메인이 IGHV1-69 및 IGHV3-30인 것인 단백질 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 VL 도메인이 IGKV1-39, IGKV1-9, IGKV2-28, IGKV3-11, IGKV3-15, IGKV3-20, IGKV4-1, IGLV1-51, IGLV2-14, IGLV1-40, 또는 IGLV3-1인 것인 단백질 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 VH 도메인의 길이가 약 90 내지 약 100개의 아미노산 길이인 것인 단백질 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 VL 도메인의 길이가 약 90 내지 약 120개의 아미노산 길이인 것인 단백질 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 복수의 단백질이 펩티드 모방체 라이브러리를 생성하는 데 사용되는 것인 단백질 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 단백질 라이브러리가 항체를 포함하는 것인 단백질 라이브러리를 추가로 제공한다.

본원에서는 복수의 단백질을 포함하는 단백질 라이브러리로서, 여기서, 복수의 단백질은 상이한 GPCR 결합 도메인을 코딩하는 서열을 포함하고, 여기서, 각 GPCR 결합 도메인의 길이는 약 20 내지 약 80개의 아미노산 길이인 것인 단백질 라이브러리를 제공한다. 본원에서는 단백질 라이브러리가 펩티드를 포함하는 것인 단백질 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 단백질 라이브러리가 면역글로불린을 포함하는 것인 단백질 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 단백질 라이브러리가 항체를 포함하는 것인 단백질 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 복수의 단백질이 펩티드 모방체 라이브러리를 생성하는 데 사용되는 것인 단백질 라이브러리를 추가로 제공한다.

본원에서는 본원에 기술된 바와 같은 핵산 라이브러리를 포함하는 벡터 라이브러리를 제공한다.

본원에서는 본원에 기술된 바와 같은 핵산 라이브러리를 포함하는 세포 라이브러리를 제공한다.

본원에서는 본원에 기술된 바와 같은 단백질 라이브러리를 포함하는 세포 라이브러리를 제공한다.

본원에서는 항체가 서열 번호 2277, 2278, 2281, 2282, 2283, 2284, 2285, 2286, 2289, 2290, 2291, 2292, 2294, 2295, 2296, 2297, 2298, 2299, 2300, 2301, 또는 2302 중 어느 하나의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 것인 항체를 제공한다.

본원에서는 항체가 서열 번호 2277, 2278, 2281, 2282, 2283, 2284, 2285, 2286, 2289, 2290, 2291, 2292, 2294, 2295, 2296, 2297, 2298, 2299, 2300, 2301, 또는 2302 중 어느 하나의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하고; 여기서, 항체가 단일클론 항체, 다중클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 그라프팅된 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 낙타화 항체, 단일 쇄 Fv(scFv), 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 도메인 항체, 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 디아바디, 오직 단일 단량체 가변 도메인으로만 구성된 단편, 디술피드 연결된 Fv(sdFv), 인트라바디, 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 그의 ab 항원 결합 단편인 것인 항체를 제공한다.

본원에서는 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함하는, GLP1R 활성을 억제시키는 방법을 제공한다. 본원에서는 항체 또는 항체 단편이 알로스테릭 조정제인 것인, GLP1R 활성을 억제시키는 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 항체 또는 항체 단편이 음성 알로스테릭 조정제인 것인, GLP1R 활성을 억제시키는 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 대사 장애 치료를 필요로 하는 피험체에게 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 대사 장애를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 대사 장애가 II형 당뇨병 또는 비만인 것인, 대사 장애를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.

본원에서는 복수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리로서, 여기서, 각각의 핵산이, 번역시 GLP1R 결합 면역글로불린을 코딩하는 서열을 코딩하고, 여기서, GLP1R 결합 면역글로불린은 GLP1R 결합 도메인의 변이체를 포함하고, 여기서, GLP1R 결합 도메인은 GLP1R에 대한 리간드이고, 여기서, 핵산 라이브러리는 적어도 10,000개의 변이체 면역글로불린 중쇄 및 적어도 10,000개의 변이체 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 제공한다. 본원에서는 핵산 라이브러리가 적어도 50,000개의 변이체 면역글로불린 중쇄 및 적어도 50,000개의 변이체 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 핵산 라이브러리가 적어도 100,000개의 변이체 면역글로불린 중쇄 및 적어도 100,000개의 변이체 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 핵산 라이브러리가 적어도 10⁵개의 비동일 핵산을 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 번역시, 면역글로불린 중쇄의 길이가 약 90 내지 약 100개의 아미노산 길이인 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 번역시, 면역글로불린 중쇄의 길이가 약 100 내지 약 400개의 아미노산인 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 번역시, 변이체 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2303, 2304, 2305, 2306, 2307, 2308, 2309, 2317, 2318, 2319, 2320, 또는 2321과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 번역시, 변이체 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2310, 2311, 2312, 2313, 2314, 2315, 또는 2316과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다.

본원에서는 복수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리로서, 여기서, 각각의 핵산이, 번역시 GLP1R 단일 도메인 항체를 코딩하는 서열을 코딩하고, 여기서, 복수의 서열의 각 서열은 중쇄 상의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 중 적어도 하나를 코딩하는 변이체 서열을 포함하고; 여기서, 라이브러리는 적어도 30,000개의 변이체 서열을 포함하고; 여기서, 항체 또는 항체 단편은 100 nM 미만인 K_D로 그의 항원에 결합하는 것인 핵산 라이브러리를 제공한다. 본원에서는 핵산 라이브러리가 적어도 50,000개의 변이체 면역글로불린 중쇄 및 적어도 50,000개의 변이체 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 핵산 라이브러리가 적어도 100,000개의 변이체 면역글로불린 중쇄 및 적어도 100,000개의 변이체 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 핵산 라이브러리가 적어도 10⁵개의 비동일 핵산을 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 번역시, 면역글로불린 중쇄의 길이가 약 90 내지 약 100개의 아미노산 길이인 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 번역시, 면역글로불린 중쇄의 길이가 약 100 내지 약 400개의 아미노산인 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 번역시, 변이체 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2303, 2304, 2305, 2306, 2307, 2308, 2309, 2317, 2318, 2319, 2320, 또는 2321과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 번역시, 변이체 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2310, 2311, 2312, 2313, 2314, 2315, 또는 2316과 적어도 80%의 서열 동일성을 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다.

본원에서는 서열 번호 2279 또는 2320을 포함하는 GLP1R의 길항제를 제공한다. 본원에서는 길항제가 1.5 nM 이하의 EC50을 포함하는 것인 길항제를 추가로 제공한다. 본원에서는 길항제가 1.0 nM 이하의 EC50을 포함하는 것인 길항제를 추가로 제공한다. 본원에서는 길항제가 0.5 nM 이하의 EC50을 포함하는 것인 길항제를 추가로 제공한다. 본원에서는 길항제가 항체 또는 그의 항체 단편인 것인 길항제를 추가로 제공한다.

본원에서는 복수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리로서, 여기서, 각각의 핵산이, 번역시 GLP1R 결합 면역글로불린을 코딩하는 서열을 코딩하고, 여기서, GLP1R 결합 면역글로불린은 GLP1R 결합 도메인의 변이체를 포함하고, 여기서, GLP1R 결합 도메인은 GLP1R에 대한 리간드이고, 여기서, 핵산 라이브러리는 적어도 10,000개의 변이체 면역글로불린 중쇄 및 적어도 10,000개의 변이체 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 제공한다. 본원에서는 핵산 라이브러리가 적어도 50,000개의 변이체 면역글로불린 중쇄 및 적어도 50,000개의 변이체 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 핵산 라이브러리가 적어도 100,000개의 변이체 면역글로불린 중쇄 및 적어도 100,000개의 변이체 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 핵산 라이브러리가 적어도 10⁵개의 비동일 핵산을 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 번역시, 면역글로불린 중쇄의 길이가 약 90 내지 약 100개의 아미노산 길이인 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 번역시, 면역글로불린 중쇄의 길이가 약 100 내지 약 400개의 아미노산인 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 번역시, 변이체 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2303, 2304, 2305, 2306, 2307, 2308, 2309, 2317, 2318, 2319, 2320, 또는 2321과 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 번역시, 변이체 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2310, 2311, 2312, 2313, 2314, 2315, 또는 2316과 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다.

본원에서는 복수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리로서, 여기서, 각각의 핵산이, 번역시 GLP1R 단일 도메인 항체를 코딩하는 서열을 코딩하고, 여기서, 복수의 서열의 각 서열은 중쇄 상의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 중 적어도 하나를 코딩하는 변이체 서열을 포함하고; 여기서, 라이브러리는 적어도 30,000개의 변이체 서열을 포함하고; 여기서, 항체 또는 항체 단편은 100 nM 미만인 K_D로 그의 항원에 결합하는 것인 핵산 라이브러리를 제공한다. 본원에서는 핵산 라이브러리가 적어도 50,000개의 변이체 면역글로불린 중쇄 및 적어도 50,000개의 변이체 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 핵산 라이브러리가 적어도 100,000개의 변이체 면역글로불린 중쇄 및 적어도 100,000개의 변이체 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 핵산 라이브러리가 적어도 10⁵개의 비동일 핵산을 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 번역시, 면역글로불린 중쇄의 길이가 약 90 내지 약 100개의 아미노산 길이인 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 번역시, 면역글로불린 중쇄의 길이가 약 100 내지 약 400개의 아미노산인 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 번역시, 변이체 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2303, 2304, 2305, 2306, 2307, 2308, 2309, 2317, 2318, 2319, 2320, 또는 2321과 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 번역시, 변이체 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2310, 2311, 2312, 2313, 2314, 2315, 또는 2316과 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 것인 핵산 라이브러리를 추가로 제공한다.

본원에서는 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하고, (a) 여기서, 면역글로불린 중쇄는 서열 번호 2303, 2304, 2305, 2306, 2307, 2308, 2309, 2317, 2318, 2319, 2320, 또는 2321에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; (b) 여기서, 면역글로불린 경쇄는 서열 번호 2310, 2311, 2312, 2313, 2314, 2315, 또는 2316에 기재된 아미노산 서열과 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 제공한다. 본원에서는 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2303에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2310에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2304에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2311에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2305에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2312에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2306에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2313에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2307에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2314에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2308에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2315에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 서열 번호 2309에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2316에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 항체가 단일클론 항체, 다중클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 그라프팅된 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 낙타화 항체, 단일 쇄 Fv(scFv), 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 도메인 항체, 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 디아바디, 오직 단일 단량체 가변 도메인으로만 구성된 단편, 디술피드 연결된 Fv(sdFv), 인트라바디, 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 그의 ab 항원 결합 단편인 것인 항체 또는 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 항체 또는 그의 항체 단편이 키메라 또는 인간화 항체 또는 그의 항체 단편인 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 cAMP 검정법에서 항체의 EC50이 약 25 나노몰인 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 cAMP 검정법에서 항체의 EC50이 약 20 나노몰인 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 cAMP 검정법에서 항체의 EC50이 약 10 나노몰인 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 항체가 GLP1R의 효능제인 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 항체가 GLP1R의 길항제인 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 항체가 GLP1R의 알로스테릭 조정제인 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다. 본원에서는 GLP1R의 알로스테릭 조정제가 음성 알로스테릭 조정제인 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 추가로 제공한다.

본원에서는 항체 또는 항체 단편이 서열 번호 2277, 2278, 2281, 2282, 2283, 2284, 2285, 2286, 2289, 2290, 2291, 2292, 2294, 2295, 2296, 2297, 2298, 2299, 2300, 2301, 또는 2302, 또는 하기 표 27에 기재된 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편을 제공한다.

본원에서는 항체 또는 항체 단편이 서열 번호 2277, 2278, 2281, 2282, 2283, 2284, 2285, 2286, 2289, 2290, 2291, 2292, 2294, 2295, 2296, 2297, 2298, 2299, 2300, 2301, 또는 2302, 또는 하기 표 27에 기재된 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하고; 여기서, 항체가 단일클론 항체, 다중클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 그라프팅된 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 낙타화 항체, 단일 쇄 Fv(scFv), 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 도메인 항체, 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 디아바디, 오직 단일 단량체 가변 도메인으로만 구성된 단편, 디술피드 연결된 Fv(sdFv), 인트라바디, 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 그의 ab 항원 결합 단편인 것인 항체 또는 항체 단편을 제공한다.

본원에서는 서열 번호 2279 또는 2320을 포함하는 GLP1R의 길항제를 제공한다. 본원에서는 길항제가 1.5 nM 이하의 EC50을 포함하는 것인 GLP1R의 길항제를 추가로 제공한다. 본원에서는 길항제가 1.0 nM 이하의 EC50을 포함하는 것인 GLP1R의 길항제를 추가로 제공한다. 본원에서는 길항제가 0.5 nM 이하의 EC50을 포함하는 것인 GLP1R의 길항제를 추가로 제공한다. 본원에서는 길항제가 항체 또는 그의 항체 단편인 것인 GLP1R의 길항제를 추가로 제공한다.

본원에서는 서열 번호 2317을 포함하는 GLP1R의 효능제를 제공한다. 본원에서는 효능제가 1.5 nM 이하의 EC50을 포함하는 것인 GLP1R의 효능제를 추가로 제공한다. 본원에서는 효능제가 1.0 nM 이하의 EC50을 포함하는 것인 GLP1R의 효능제를 추가로 제공한다. 본원에서는 효능제가 0.5 nM 이하의 EC50을 포함하는 것인 GLP1R의 효능제를 추가로 제공한다. 본원에서는 효능제가 항체 또는 항체 단편인 것인 GLP1R의 효능제를 추가로 제공한다.

본원에서는 본원에 기술된 바와 같은 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함하는, GLP1R 활성을 억제시키는 방법을 제공한다. 본원에서는 항체 또는 항체 단편이 알로스테릭 조정제인 것인, GLP1R 활성을 억제시키는 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 항체 또는 항체 단편이 음성 알로스테릭 조정제인 것인, GLP1R 활성을 억제시키는 방법을 추가로 제공한다.

본원에서는 대사 장애 치료를 필요로 하는 피험체에게 본원에 기술된 바와 같은 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 대사 장애를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 본원에서는 대사 장애가 II형 당뇨병 또는 비만인 것인, 대사 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

본원에서는 본원에 기술된 바와 같은 핵산 라이브러리에 의해 코딩된 단백질 라이브러리로서, 여기서, 단백질 라이브러리는 펩티드를 포함하는 것인 단백질 라이브러리를 제공한다. 본원에서는 단백질 라이브러리가 면역글로불린을 포함하는 것인 단백질 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 단백질 라이브러리가 항체를 포함하는 것인 단백질 라이브러리를 추가로 제공한다. 본원에서는 단백질 라이브러리가 펩티드 모방체 라이브러리인 것인 단백질 라이브러리를 추가로 제공한다.

본원에서는 본원에 기술된 바와 같은 핵산 라이브러리를 포함하는 벡터 라이브러리를 제공한다. 본원에서는 본원에 기술된 바와 같은 핵산 라이브러리를 포함하는 세포 라이브러리를 제공한다. 본원에서는 본원에 기술된 바와 같은 단백질 라이브러리를 포함하는 세포 라이브러리를 제공한다.

도면의 간단한 설명
도 1a는 면역글로불린 스캐폴드의 제1 개략도를 도시한 것이다.
도 1b는 면역글로불린 스캐폴드의 제2 개략도를 도시한 것이다.
도 2는 스캐폴드에 배치하기 위한 모티프의 개략도를 도시한 것이다.
도 3은 본원에서 개시되는 바와 같은 유전자 합성을 위한 예시적인 프로세서의 작업 흐름을 나타낸 단계들의 다이어그램을 보여주는 것이다.
도 4는 컴퓨터 시스템의 예를 도시한 것이다.
도 5는 컴퓨터 시스템의 아키텍쳐를 나타내는 블록도이다.
도 6은 복수의 컴퓨터 시스템, 복수의 휴대 전화기 및 개인 휴대용 정보 단말기(개인 휴대용 정보 단말기) 및 네크워크 결합 스토리지(NAS: Network Attached Storage)를 포함하도록 구성된 네트워크를 보여주는 다이어그램이다.
도 7은 공유 가상 어드레스 메모리 공간을 사용하는 멀티프로세서 컴퓨터 시스템의 블록도이다.
도 8a는 링커를 사용하여 VL 도메인에 부착된 VH 도메인을 포함하는 면역글로불린 스캐폴드의 개략도를 도시한 것이다.
도 8b는 링커, 리더 서열 및 pIII 서열을 사용하여 VL 도메인에 부착된 VH 도메인을 포함하는 면역글로불린 스캐폴드의 전체 도메인 아키텍쳐의 개략도를 도시한 것이다.
도 8c는 VL 또는 VH 도메인에 대한 4개의 프레임워크 요소(FW1, FW2, FW3, FW4) 및 가변 3 CDR(L1, L2, L3) 요소의 개략도를 도시한 것이다.
도 9a-9o는 GLP1R-2(도 9a), GLP1R-3(도 9b), GLP1R-8(도 9c), GLP1R-26(도 9d), GLP1R-30(도 9e), GLP1R-56(도 9f), GLP1R-58(도 9g), GLP1R-10(도 9h), GLP1R-25(도 9i), GLP1R-60(도 9j), GLP1R-70(도 9k), GLP1R-72(도 9l), GLP1R-83(도 9m), GLP1R-93(도 9n), 및 GLP1R-98(도 9o)에 대한 세포 결합 데이터를 도시한 것이다.
도 10a-10o는 GLP1-7-36 펩티드 유도 cAMP 활성 억제에 대한 GLP1R-2(도 10a), GLP1R-3(도 10b), GLP1R-8(도 10c), GLP1R-26(도 10d), GLP1R-30(도 10e), GLP1R-56(도 10f), GLP1R-58(도 10g), GLP1R-10(도 10h), GLP1R-25(도 10i), GLP1R-60(도 10j), GLP1R-70(도 10k), GLP1R-72(도 10l), GLP1R-83(도 10m), GLP1R-93(도 10n), 및 GLP1R-98(도 10o) 변이체의 그래프를 도시한 것이다.
도 11a-11g는 GLP1R-2(도 11a), GLP1R-3(도 11b), GLP1R-8(도 11c), GLP1R-26(도 11d), GLP1R-30(도 11e), GLP1R-56(도 11f), 및 GLP1R-58(도 11g)에 대한 세포 기능 데이터를 도시한 것이다.
도 12a-12g는 엑센딘(Exendin)-4 펩티드 유도 cAMP 활성 억제에 대한 GLP1R-2(도 12a), GLP1R-3(도 12b), GLP1R-8(도 12c), GLP1R-26(도 12d), GLP1R-30(도 12e), GLP1R-56(도 12f), 및 GLP1R-58(도 12g) 변이체의 그래프를 도시한 것이다.
도 13은 글루카곤, GLP1-1, 및 GLP-2의 개략도를 도시한 것이다.
도 14a-14c는 정제된 면역글로불린의 세포 결합 친화도를 도시한 것이다.
도 14d는 정제된 면역글로불린의 cAMP 활성을 도시한 것이다.
도 15a-15h는 GLP1R-238(도 15a), GLP1R-240(도 15b), GLP1R-241(도 15c), GLP1R-242(도 15d), GLP1R-243(도 15e), GLP1R-244(도 15f), pGPCR-GLP1R-43(도 15g), 및 pGPCR-GLP1R-44(도 15h)에 대하여 MFI(평균 형광 강도: mean fluorescence intensity) 대비로 IgG 농도(나노몰(nM))를 플롯팅한 결합 곡선을 도시한 것이다.
도 16a-16i는 GLP1R-238(도 16a), GLP1R-240(도 16b), GLP1R-241(도 16c), GLP1R-242(도 16d), GLP1R-243(도 16e), GLP1R-244(도 16f), pGPCR-GLP1R-43(도 16g), pGPCR-GLP1R-44(도 16h), 및 GLP1R-239(도 16i)의 100 nM IgG를 이용하여 도트 플롯으로 제시된 결합 검정법의 유세포 분석 데이터를 도시한 것이다.
도 17a-17b는 y축 상의 상대 발광 단위(RLU: relative luminescence unit) 및 x축 상의 농도(나노물(nM))로 제시된, cAMP 검정법으로부터의 데이터를 도시한 것이다. GLP1 (7-36), GLP1R-238, GLP1R-239, GLP1R-240, GLP1R-241, GLP1R-242, GLP1R-243, GLP1R-244, pGPCR-GLP1R-43, pGPCR-GLP1R-44, 및 완충제에 대해 반응으로 cAMP를 측정하였다.
도 17c는 GLP1R-241의 cAMP 알로스테릭 효과에 대한 그래프를 도시한 것이다.
도 17d는 GLP1R-241의 베타-어레스틴 동원에 대한 그래프를 도시한 것이다.
도 17e는 GLP1R-241 내재화에 대한 그래프를 도시한 것이다.
도 18a-18b는 y축 상의 상대 발광 단위(RLU) 및 x축 상의 GLP1 (7-36)의 농도(나노물(nM))로 제시된, cAMP 검정법으로부터의 데이터를 도시한 것이다. GLP1R-238, GLP1R-239, GLP1R-240, GLP1R-241, GLP1R-242, GLP1R-243, GLP1R-244, pGPCR-GLP1R-43, pGPCR-GLP1R-44, 및 항체 부재의 알로스테릭 효과를 시험하였다.
도 19a-19f는 GLP1R-59-2(도 19a), GLP1R-59-241(도 19b), GLP1R-59-243(도 19c), GLP1R-3(도 19d), GLP1R-241(도 19e), 및 GLP1R-2(도 19f)에 대한 도트 플롯 및 히스토그램으로 제시된 결합 검정법의 유세포 분석 데이터를 도시한 것이다. 도 19a-19f는 또한 GLP1R-59-2(도 19a), GLP1R-59-241(도 19b), GLP1R-59-243(도 19c), GLP1R-3(도 19d), GLP1R-241(도 19e), 및 GLP1R-2(도 19f)에 대하여 MFI(평균 형광 강도) 대비로 IgG 농도(나노몰(nM))를 플롯팅한 결적정 곡선을 도시한 것이다.
도 20a-20f는 GLP1R-59-2(도 20a), GLP1R-59-241(도 20b), GLP1R-59-243(도 20c), GLP1R-3(도 20d), GLP1R-241(도 20e), 및 GLP1R-2(도 20F)에 대한, y축 상의 상대 발광 단위(RLU) 및 x축 상의 GLP1 (7-36)의 농도(나노물(nM))로 제시된, cAMP 검정법으로부터의 데이터 뿐만 아니라, 베타-어레스틴 동원 및 수용체 내재화를 도시한 것이다.
도 21a-21b는 20 내지 4000인 친화도 임계값(도 21a) 또는 20 내지 1000인 친화도 임계값(도 21b)을 도시한, VHH 라이브러리에 대한 TIGIT 친화도 분포 그래프를 도시한 것이다. 140개의 VHH 결합제 중 51개의 변이체가 < 100 nM이었고, 90개의 변이체가 < 200 nM이었다.
도 22a-22b는 GLP1R-43-77의, FACs 분석 그래프(도 22a) 및 용량 곡선 및 특이성(도 22b) 그래프를 도시한 것이다.
도 23a는 중쇄 IGHV3-23 디자인의 설계도를 도시한 것이다.
도 23b는 중쇄 IGHV1-69 디자인의 설계도를 도시한 것이다.
도 23c는 경쇄 IGKV 2-28 및 IGLV 1-51 디자인의 설계도를 도시한 것이다.
도 23d는 GLP1R 라이브러리의 이론상 다양성 및 최종 다양성의 설계도를 도시한 것이다.
도 23e-23f는 GLP1R IgG의 FACS 결합 그래프를 도시한 것이다.
도 23g-23h는 정제된 GLP1R IgG를 이용한 cAMP 검정법 그래프를 도시한 것이다.
도 24a는 항체 부재인 것과 비교한 GLP1R-3 억제 그래프를 도시한 것이다. 상대 발광 단위(RLU)는 y축 상에 도시되어 있고, GLP1 (7-36) 농도(나노몰(nM))는 x축 상에 도시되어 있다.
도 24b는 0.05 nM GLP1 (7-36)로 자극한 후의 고농도에서의 GLP1R-3 억제 그래프를 도시한 것이다. 상대 발광 단위(RLU)는 y축 상에 도시되어 있고, GLP1R-3 농도(나노몰(nM))는 x축 상에 도시되어 있다.
도 24c는 식이 유도 비만의 마우스 모델에서 비히클(삼각형 표시), 리라글루티드(사각형 표시), 및 GLP1R-3(동그라미 표시)으로 처리되었을 때 글루코스 투여 후의 글루코스 수준을 도시한 것이다.
도 24d는 식이 유도 비만의 마우스 모델에서 비히클(개방형 삼각형 표시), 리라글루티드(사각형 표시), 및 GLP1R-59-2(폐쇄형 삼각형 표시)로 처리되었을 때 글루코스 투여 후의 글루코스 수준을 도시한 것이다.
도 25a는 시간 경과((분), x축)에 따른 GLP1R-59-2(효능제), GLP1R-3(길항제), 및 대조군으로 처리된 마우스에서의 혈당 수준(mg/dL; y축) 그래프를 도시한 것이다.
도 25b는 GLP1R-59-2(효능제), GLP1R-3(길항제), 및 대조군으로 처리된 마우스에서의 혈당 수준(mg/dL; y축) 그래프를 도시한 것이다.
도 25c는 대조군과 비교하여 금식 상태의 마우스(p=0.0008) 및 비금식 상태의 마우스(p<0.0001), 둘 모두에서 GLP1R-59-2(효능제)로 처리된 마우스에서의 혈당 수준(mg/dL; y축) 그래프를 도시한 것이다.
도 25d는 투약 전 GLP1R-59-2(효능제), GLP1R-3(길항제), 및 대조군 마우스에서의 혈당 수준(mg/dL/min; y축) 그래프를 도시한 것이다.

상세한 설명

본 개시내용은 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 통상의 기술에 속하는 통상적인 분자 생물학 기술을 사용한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

정의

본 개시내용 전반에 걸쳐, 다양한 실시양태가 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식의 설명은 단지 편의 및 간결성을 위한 것이며, 임의의 실시양태의 영역에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되지 않아야 한다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한, 가능한 모든 하위 범위 및 그 범위내의 개별 수치값을 하한 단위의 10분의 1까지 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예컨대, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6등과 같은 하위 범위, 및 그 범위 내의 개별 값, 예컨대, 1.1, 2, 2.3, 5, 및 5.9를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭에 관계없이 적용된다. 상기 사이에 존재하는 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 이 또한 언급된 범위 내의 임의의 구체적으로 제외된 한계에 따라 본 개시내용 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위가 또한 본 개시내용에 포함된다.

본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시양태를 설명하기 위한 것이며, 임의의 실시양태로 제한하려는 것이 아니다. 본원에서 사용되는 바, 단수 형태("a" "an" 및 "the")는 문맥상 명백하게 다르게 나타내지 않는 한, 복수 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 사용될 때 용어 "포함하다" 및/또는 "포함하는"은 언급된 특징, 정수, 단계, 작동, 요소 및/또는 성분의 존재를 명시하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 작동, 요소, 성분 및/또는 그의 군의 존재 또는 추가를 배제하지는 않는다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "및/또는"은 하나 이상의 열거된 관련 항목의 임의의 및 모든 조합을 포함한다.

구체적으로 언급되거나, 또는 문맥상 명백하지 않은 한, 본원에서 사용되는 바, 수치 또는 수치 범위와 관련하여 "약"이라는 용어는 언급된 수치 및 그의 ± 10%, 또는 범위에 대해 열거된 값의 열거된 하한의 10% 미만 및 열거된 상한의 10% 초과를 의미하는 것으로 이해된다.

구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "핵산"은 단일 가닥 분자 뿐만 아니라, 이중 가닥 또는 삼중 가닥 핵산도 포함한다. 이중 또는 삼중 가닥 핵산에서, 핵산 가닥은 동시에 연장될 필요는 없다(즉, 이중 가닥 핵산은 두 가닥의 전체 길이를 따라 이중 가닥일 필요는 없다) 제공된 경우, 핵산 서열은 달리 언급되지 않는 한, 5'에서 3' 방향으로 열거된다. 본원에서 기술되는 방법은 단리된 핵산의 생성을 제공한다. 본원에서 기술되는 방법은 단리 및 정제된 핵산의 생성을 추가로 제공한다. 본원에서 언급되는 바와 같이, "핵산"은 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000개 또는 그 초과의 염기 길이를 포함할 수 있다. 더욱이, 임의의 수의 폴리펩티드 세그먼트 코딩 뉴클레오티드 서열, 예컨대, 비-리보솜 펩티드(NRP: non-ribosomal peptide)를 코딩하는 서열, 비-리보솜 펩티드 합성효소(NRPS: non-ribosomal peptide-synthetase) 모듈 및 합성 변이체, 다른 모듈 단백질, 예컨대, 항체의 폴리펩티드 세그먼트, 다른 단백질 패밀리로부터의 폴리펩티드 세그먼트를 코딩하는 서열, 예컨대, 비-코딩 DNA 또는 RNA, 예컨대, 조절 서열, 예컨대, 프로모터, 전사 인자, 인핸서, siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 마이크로RNA로부터 유래된 작은 핵소체 RNA, 또는 임의의 관심있는 기능적 또는 구조적 DNA 또는 RNA 단위의 합성 방법이 본원에서 제공된다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 유전자 사이의 DNA, 연결 분석으로부터 정의된 유전자좌(들), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA: short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA: short-hairpin RNA), 마이크로-RNA(miRNA: complementary DNA), 작은 핵소체 RNA, 리보자임, 일반적으로 메신저 RNA(mRNA)의 역전사에 의해 또는 증폭에 의해 수득되는 mRNA의 DNA 표시인 상보성 DNA(cDNA: complementary DNA); 합성에 의해 또는 증폭에 의해 생산되는 DNA 분자, 게놈 DNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 본원에서 언급되는 유전자 또는 유전자 단편을 코딩하는 cDNA는 게놈 등가 서열에 개재하는 인트론 서열이 없는 엑손 서열을 코딩하는 적어도 하나의 영역을 포함할 수 있다.

GLP1 수용체에 대한 GPCR 라이브러리

G 단백질-커플링된 수용체(GPCR) 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 글루카곤 유사 펩티드-1 수용체(GLP1R: glucagon-like peptide-1 receptor)에 대한 GPCR 결합 라이브러리와 관련된 방법 및 조성물을 제공한다. 본원에 기술된 바와 같은 스캐폴드는 GPCR 결합 도메인을 안정적으로 지원할 수 있다. GPCR 결합 도메인은 GLP1R 리간드 및 GLP1R의 표면 상호작용에 기초하여 디자인될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 라이브러리는, 각각의 것이 적어도 하나의 미리 결정된 참조 핵산 서열의 미리 결정된 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 변이체 라이브러리를 제공하도록 추가로 변이될 수 있다. 본원에서는 핵산 라이브러리가 번역시 생성될 수 있는 단백질 라이브러리를 추가로 기술한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같은 핵산 라이브러리는 세포 라이브러리를 생성하도록 세포 내로 전달된다. 또한, 본원에서는 본원에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 합성되는 라이브러리에 대한 하류 적용을 제공한다. 하류 적용은 개선된 생물학적 관련 기능, 예컨대, 개선된 안정성, 친화도, 결합, 기능적 활성을 갖는, 및 GPCR 신호전달과 관련된 질환 상태의 치료 또는 예방을 위한 변이체 핵산 또는 단백질 서열의 확인을 포함한다.

스캐폴드 라이브러리

본원에서는 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리로서, 여기서, GPCR 결합 도메인에 대한 서열이 스캐폴드에 위치하는 것인 라이브러리를 제공한다. 본원에 기술된 바와 같은 스캐폴드는 비변형 스캐폴드에 비해, 스캐폴드에 삽입될 때 다양한 GPCR 결합 도메인 코딩 서열에 대한 개선된 안정성을 허용한다. 예시적인 스캐폴드는 단백질, 펩티드, 면역글로불린, 그의 유도체, 또는 그의 조합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 스캐폴드는 면역글로불린이다. 본원에 기술된 바와 같은 스캐폴드는 개선된 기능적 활성, 구조적 안정성, 발현, 특이성 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 스캐폴드는 GPCR 결합 도메인을 지원하기 위한 긴 영역을 포함한다.

본원에서는 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리로서, 여기서, 스캐폴드는 면역글로불린인 것인 라이브러리를 제공한다. 일부 경우에, 면역글로불린은 항체이다. 본원에서 사용되는 바, 항체라는 용어는 전형적인 항체 분자의 특징적인 2개의 아암이 존재하는 Y자 형태를 갖는 단백질 및 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예시적인 항체로는 단일클론 항체, 다중클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 그라프팅된 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 낙타화 항체, 단일 쇄 Fv(scFv)(단일 쇄 Fab 및 scFab를 포함하는, 1가 분자를 형성하도록 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루는 단일 단백질 쇄로서 VL 및 VH가 만들어지도록 할 수 있는 합성 또는 천연 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 VL 및 VH가 연결된 단편 포함), 단일 쇄 항체, Fab 단편(VL, VH, CL, 및 CH1 도메인을 포함하는 1가 단편), F(ab')2 단편(힌지 영역에서 디술피드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편 포함), Fd 단편(VH 및 CH1 단편을 포함하는 단편 포함), Fv 단편(항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 단편 포함), 단일 도메인 항체(dAb 또는 sdAb)(VH 도메인을 포함하는 단편 포함), 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 디아바디(서로 결합된 2가 이량체, 예컨대, 2개의 VL 및 VH 도메인을 포함하고, 2개의 상이한 항원을 인식하는 단편 포함), 오직 단일 단량체 가변 도메인으로만 구성된 단편, 디술피드 연결된 Fv(sdFv), 인트라바디, 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 그의 ab 항원 결합 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 본원에서 개시된 라이브러리는 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서, 스캐폴드는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편으로 이루어진 Fv 항체를 포함하는 Fv 항체이다. 일부 실시양태에서, Fv 항체는 단단한 비공유 회합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어지고, 각각의 가변 도메인의 3개의 초가변 영역은 VH-VL 이량체의 표면 상에 항원 결합 부위를 규정하기 위해 상호작용한다. 일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 6개의 초가변 영역은 항체에게 항원 결합 특이성을 부여한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인(또는 VHH 항체 또는 나노바디와 같이 하나의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 낙타류 동물로부터 단리된 단일 도메인 항체를 비롯하여 항원에 특이적인 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)은 항원을 인식하고, 결합하는 능력을 갖는다. 일부 경우에, 본원에서 개시되는 라이브러리는 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하고, 여기서, 스캐폴드는 VH, VL, 또는 VH과 VL 도메인 둘 모두를 포함하는 항체 단편을 포함하는 단일 쇄 Fv 또는 scFv이고, 여기서, 두 도메인은 모두 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일부 실시양태에서, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 요구되는 구조를 형성하도록 하는, VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. 일부 경우에, scFv는 Fc 단편에 연결되거나, 또는 VHH는 Fc 단편(미니바디 포함)에 연결된다. 일부 경우에, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편, 예컨대, 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예컨대, IgG1, IgG 2, IgG 3, IgG 4, IgA 1 및 IgA 2) 또는 서브클래스이다.

일부 실시양태에서, 라이브러리는 의도된 치료 표적의 종에 맞게 적합화된 면역글로불린을 포함한다. 일반적으로, 이들 방법은 "포유동물화"를 포함하고, 유용한 치료적 처치를 생성하기 위해 면역원성이 더 적은 포유동물 항체 수용자에 공여자 항원 결합 정보를 전달하는 방법을 포함한다. 일부 경우에, 포유동물은 마우스, 래트, 말, 양, 소, 영장류(예컨대, 침팬지, 개코원숭이, 고릴라, 오랑우탄, 원숭이), 개, 고양이, 돼지, 당나귀, 토끼 및 인간이다. 일부 경우에, 본원에서는 항체의 고양이화(felinization) 및 개화(caninization)를 위한 라이브러리 및 방법을 제공한다.

"인간화" 형태의 비인간 항체는 비인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체일 수 있다. 인간화 항체는 일반적으로 하나 이상의 CDR의 잔기가 비인간 항체(공여자 항체)의 하나 이상의 CDR의 잔기로 대체된 인간 항체(수용자 항체)이다. 공여자 항체는 원하는 특이성, 친화성 또는 생물학적 효과를 갖는 마우스, 래트, 토끼, 닭 또는 비인간 영장류 항체와 같은 임의의 적합한 비인간 항체일 수 있다. 일부 경우에, 수용자 항체의 선택된 프레임워크 영역 잔기는 공여자 항체로부터의 상응하는 프레임워크 영역 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 또한 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 수행된다.

"개화"는 개에서 치료제로서 유용한 치료를 생성하기 위해 공여자 항체로부터 면역원성이 더 적은 개 항체 수용자로 개가 아닌 항원 결합 정보를 전달하는 방법을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된, 개화 형태의 개가 아닌 항체는 개가 아닌 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일부 경우에, 개화 항체는 수용자의 초가변 영역 잔기가 예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 염소, 닭, 소, 말, 라마, 낙타, 단봉낙타, 상어, 비인간 영장류, 인간과 같은 개가 아닌 종("공여자" 항체)의 초가변 영역 잔기, 인간화, 재조합 서열, 또는 원하는 특성을 갖는 조작된 서열로 대체된 개 항체 서열("수용자(acceptor)" 또는 "수용자(recipient)" 항체)이다. 일부 경우에, 개 항체의 프레임워크 영역(FR: framework region) 잔기는 상응하는 개가 아닌 FR 잔기로 대체된다. 일부 경우에, 개화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 수행된다. 개화 항체는 또한 개 항체의 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다.

"고양이화"는 고양이에서 치료제로서 유용한 치료법을 생성하기 위해 비고양이 항원 결합 정보를 공여자 항체로부터 면역원성이 더 적은 고양이 항체 수용자로 전달하는 방법을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 제공된 고양이화 형태의 비고양이 항체는 비고양이 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일부 경우에, 고양이화 항체는 수용자의 초가변 영역 잔기가 예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 염소, 닭, 소, 말, 라마, 낙타, 단봉낙타, 상어, 비인간 영장류, 인간과 같은 비고양이 종("공여자" 항체)의 초가변 영역 잔기, 인간화, 재조합 서열, 또는 원하는 특성을 갖는 조작된 서열로 대체된 고양이 항체 서열("수용자" 또는 "수용자" 항체)이다. 일부 경우에, 고양이 항체의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비고양이 FR 잔기로 대체된다. 일부 경우에, 고양이화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 수행된다. 고양이화 항체는 또한 고양이 항체의 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다.

본원에서는 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리로서, 여기서, 스캐폴드는 비면역글로불린인 것인 라이브러리를 제공한다. 일부 경우에, 스캐폴드는 비면역글로불린 결합 도메인이다. 예를 들어, 스캐폴드는 항체 모방체이다. 예시적인 항체 모방체로는 안티칼린, 아필린, 아피바디 분자, 아피머, 아피틴, 알파바디, 아비머, 아트리머, DARPin, 파이노머, 쿠니츠 도메인 기반 단백질, 모노바디, 안티칼린, 노트틴, 아르마딜로 반복 단백질 기반 단백질, 및 비사이클릭 펩티드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

면역글로불린인 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기술된 바와 같은 라이브러리는 면역글로불린의 적어도 하나의 영역에서의 변이를 포함한다. 변이를 위한 항체의 예시적인 영역은 상보성 결정 영역(CDR), 가변 도메인 또는 불변 도메인을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, CDR은 CDR1, CDR2 또는 CDR3이다. 일부 경우에, CDR은 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3을 포함하나, 이에 제한되지 않는 중쇄 도메인이다. 일부 경우에, CDR은 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하나, 이에 제한되지 않는 경쇄 도메인이다. 일부 경우에, 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인(VL) 또는 중쇄 가변 도메인(VH)이다. 일부 경우에, VL 도메인은 카파 또는 람다 쇄를 포함한다. 일부 경우에, 불변 도메인은 경쇄 불변 도메인(CL) 또는 중쇄 불변 도메인(CH)이다.

본원에 기술된 바와 같은 방법은 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리의 합성을 제공하며, 여기서, 각각의 핵산은 적어도 하나의 미리 결정된 참조 핵산 서열의 미리 결정된 변이체를 코딩한다. 일부 경우에, 미리 결정된 참조 서열은 단백질을 코딩하는 핵산 서열이고, 변이체 라이브러리는 합성된 핵산에 의해 코딩되는 후속 단백질에서 단일 잔기의 복수의 상이한 변이체가 표준 번역 프로세스에 의해 생성되도록 하기 위해 적어도 하나의 단일 코돈의 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 스캐폴드 라이브러리는 다수의 위치에서 변이를 집합적으로 코딩하는 변이된 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 라이브러리는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDRL1, CDR-L2, CDR-L3, VL 또는 VH 도메인의 적어도 단일 코돈의 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 라이브러리는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, VL 또는 VH 도메인의 다중 코돈의 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 라이브러리는 프레임워크 요소 1(FW1), 프레임워크 요소 2(FW2), 프레임워크 요소 3(FW3) 또는 프레임워크 요소 4(FW4)의 다중 코돈의 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 변이를 위한 예시적인 코돈의 개수는 적어도 또는 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 225, 250, 275, 300개의 코돈, 또는 300개 초과의 코돈을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

일부 경우에, 변이를 위한 면역글로불린의 적어도 하나의 영역은 중쇄 V 유전자 패밀리, 중쇄 D 유전자 패밀리, 중쇄 J 유전자 패밀리, 경쇄 V 유전자 패밀리 또는 경쇄 J 유전자 패밀리로부터 유래된 것이다. 도 1a-1b를 참조한다. 일부 경우에, 경쇄 V 유전자 패밀리는 면역글로불린 카파(IGK: immunoglobulin kappa) 유전자 또는 면역글로불린 람다(IGL: immunoglobulin lambda)를 포함한다. 예시적인 유전자는 IGHV1-18, IGHV1-69, IGHV1-8, IGHV3-21, IGHV3-23, IGHV3-30/33rn, IGHV3-28, IGHV1-69, IGHV3-74, IGHV4-39, IGHV4-59/61, IGKV1-39, IGKV1-9, IGKV2-28, IGKV3-11, IGKV3-15, IGKV3-20, IGKV4-1, IGLV1-51, IGLV2-14, IGLV1-40, 및 IGLV3-1을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 유전자는 IGHV1-69, IGHV3-30, IGHV3-23, IGHV3, IGHV1-46, IGHV3-7, IGHV1, 또는 IGHV1-8이다. 일부 경우에, 유전자는 IGHV1-69 및 IGHV3-30이다. 일부 경우에, 유전자는 IGHJ3, IGHJ6, IGHJ, IGHJ4, IGHJ5, IGHJ2, 또는 IGH1이다. 일부 경우에, 유전자는 IGHJ3, IGHJ6, IGHJ, 또는 IGHJ4이다.

본원에서는 면역글로불린 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리로서, 여기서, 라이브러리는 다양한 개수의 단편으로 합성되는 것인 라이브러리를 제공한다. 일부 경우에, 단편은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, VL 또는 VH 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 단편은 프레임워크 요소 1(FW1), 프레임워크 요소 2(FW2), 프레임워크 요소 3(FW3) 또는 프레임워크 요소 4(FW4)를 포함한다. 일부 경우에, 스캐폴드 라이브러리는 적어도 또는 약 2개의 단편, 3개의 단편, 4개의 단편, 5개의 단편 또는 5개 초과의 단편으로 합성된다. 각각의 핵산 단편의 길이 또는 합성된 핵산의 평균 길이는 적어도 또는 약 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600개, 또는 600개 초과의 염기쌍 길이일 수 있다. 일부 경우에, 길이는 약 50 내지 600, 75 내지 575, 100 내지 550, 125 내지 525, 150 내지 500, 175 내지 475, 200 내지 450, 225 내지 425, 250 내지 400, 275 내지 375, 또는 300 내지 350개의 염기쌍 길이이다.

본원에 기술된 바와 같은 면역글로불린 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리는 번역시 다양한 길이의 아미노산을 포함한다. 일부 경우에, 합성된 각각의 아미노산 단편의 길이 또는 아미노산의 평균 길이는 적어도 또는 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150개 또는 150개 초과의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 경우에, 아미노산 길이는 약 15 내지 150, 20 내지 145, 25 내지 140, 30 내지 135, 35 내지 130, 40 내지 125, 45 내지 120, 50 내지 115, 55 내지 110, 60 내지 110, 65 내지 105, 70 내지 100, 또는 75 내지 95개의 아미노산 길이이다. 일부 경우에, 아미노산 길이는 약 22개의 아미노산 내지 약 75개의 아미노산 길이이다. 일부 경우에, 면역글로불린 스캐폴드는 적어도 또는 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000개, 또는 5000개 초과의 아미노산을 포함한다.

변이를 위한 면역글로불린의 적어도 하나의 영역에 대한 다수의 변이체 서열은 본원에 기술된 바와 같은 바와 같은 방법을 사용하여 드 노보 합성된다. 일부 경우에, 다수의 변이체 서열은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDRL1, CDR-L2, CDR-L3, VL, VH 또는 그의 조합에 대해 드 노보 합성된다. 일부 경우에, 프레임워크 요소1(FW1), 프레임워크 요소 2(FW2), 프레임워크 요소 3(FW3) 또는 프레임워크 요소 4(FW4)에 대해 다수의 변이체 서열이 드 노보 합성된다. 변이체 서열의 개수는 적어도 또는 약 적어도 또는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500개 또는 500개 초과의 서열일 수 있다. 일부 경우에, 변이체 서열의 개수는 적어도 또는 약 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000개 또는 8000개 초과의 서열이다. 일부 경우에, 변이체 서열의 개수는 약 10 내지 500, 25 내지 475, 50 내지 450, 75 내지 425, 100 내지 400, 125 내지 375, 150 내지 350, 175 내지 325, 200 내지 300, 225 내지 375, 250 내지 350, 또는 275 내지 325개의 서열이다.

일부 경우에, 면역글로불린의 적어도 하나의 영역에 대한 변이체 서열은 길이 또는 서열이 다양하다. 일부 경우에, 드 노보 합성되는 적어도 하나의 영역은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, VL, VH 또는 그의 조합에 대한 것이다. 일부 경우에, 드 노보 합성되는 적어도 하나의 영역은 프레임워크 요소 1(FW1), 프레임워크 요소 2(FW2), 프레임워크 요소 3(FW3) 또는 프레임워크 요소 4(FW4)에 대한 것이다. 일부 경우에, 변이체 서열은 야생형과 비교하여 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 50개 초과의 변이체 뉴클레오티드 또는 아미노산을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 서열은 야생형과 비교하여 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개의 추가의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 서열은 야생형과 비교하여 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 더 적은 뉴클레오티드 또는 아미노산을 포함한다. 일부 경우에, 라이브러리는 적어도 또는 약 10¹, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰개,또는 10¹⁰개 초과의 변이체를 포함한다.

스캐폴드 라이브러리의 합성 후, 스캐폴드 라이브러리는 스크리닝 및 분석을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드 라이브러리는 라이브러리 디스플레이 가능성 및 패닝에 대해 검정된다. 일부 경우에, 선별가능한 태그를 사용하여 디스플레이 가능성이 검정된다. 예시적인 태그는 방사성 표지, 형광 표지, 효소, 화학발광 태그, 비색 태그, 친화도 태그 또는 당업계에 공지된 다른 표지 또는 태그를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 태그는 히스티딘, 폴리히스티딘, myc, 헤마글루티닌(HA) 또는 FLAG이다. 일부 경우에, 스캐폴드 라이브러리는 단일 분자 실시간(SMRT: single-molecule real-time) 시퀀싱, 폴로니(Polony) 시퀀싱, 라이게이션에 의한 시퀀싱, 가역적 종결인자 시퀀싱, 양성자 검출 시퀀싱, 이온 반도체 시퀀싱, 나노포어 시퀀싱, 전자 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 막삼-길버트(Maxam-Gilbert) 시퀀싱, 쇄 종결(예컨대, 생어(Sanger)) 시퀀싱, +S 시퀀싱 또는 합성에 의한 시퀀싱을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 방법을 사용한 시퀀싱에 의해 검정된다.

일부 경우에, 스캐폴드 라이브러리는 기능적 활성, 구조적 안정성(예컨대, 열 안정성 또는 pH 안정성), 발현, 특이성 또는 그의 조합에 대해 검정된다. 일부 경우에, 스캐폴드 라이브러리는 폴딩할 수 있는 스캐폴드에 대해 검정된다. 일부 경우에, 항체의 영역은 기능적 활성, 구조적 안정성, 발현, 특이성, 폴딩 또는 그의 조합에 대해 검정된다. 예를 들어, VH 영역 또는 VL 영역은 기능적 활성, 구조적 안정성, 발현, 특이성, 폴딩 또는 그의 조합에 대해 검정된다.

GLP1R 라이브러리

본원에서는 GLP1R 결합 도메인에 대한 서열을 포함하는 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 GLP1R 결합 라이브러리를 제공한다. 일부 경우에, 스캐폴드는 면역글로불린이다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인에 대한 서열을 포함하는 스캐폴드는 GLP1R 결합 도메인과 GLP1R 사이의 상호작용에 의해 결정된다.

본원에서는 GLP1R 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리로서, 여기서, GLP1R 결합 도메인은 GLP1R 상의 표면 상호작용에 기초하여 디자인된 것인 라이브러리를 제공한다. 일부 경우에, GLP1R은 서열 번호 1에 의해 정의된 서열을 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인은 GLP1R의 아미노- 또는 카복시-말단과 상호작용한다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인은 막횡단 도메인 1(TM1), 막횡단 도메인 2(TM2), 막횡단 도메인 3(TM3), 막횡단 도메인 4(TM4), 막횡단 도메인 5(TM5), 막횡단 도메인 6(TM6) 및 막횡단 도메인 7(TM7)을 포함하나, 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 막횡단 도메인과 상호작용한다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인은 GLP1R의 세포내 표면과 상호작용한다. 예를 들어, GLP1R 결합 도메인은 세포내 루프 1(ICL(intracellular loop)1), 세포내 루프 2(ICL2) 및 세포내 루프 3(ICL3)을 포함하나, 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 세포내 루프와 상호작용한다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인은 GLP1R의 세포외 표면과 상호작용한다. 예를 들어,GLP1R 결합 도메인은 GLP1R의 적어도 하나의 세포외 도메인(ECD: extracellular domain) 또는 세포외 루프(ECL: extracellular loop)와 상호작용한다. 세포외 루프는 세포외 루프 1(ECL1), 세포외 루프 2(ECL2) 및 세포외 루프 3(ECL3)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에서는 GLP1R 결합 도메인이 GLP1R 리간드와 GLP1R 사이의 표면 상호작용에 기초하여 디자인된 것인 GLP1R 결합 도메인을 기술한다. 일부 경우에, 리간드는 펩티드이다. 일부 경우에, 리간드는 글루카곤, 글루카곤 유사 펩티드 1-(7-36) 아미드, 글루카곤 유사 펩티드 1-(7-37), 리라글루티드, 엑센딘-4, 릭시세나티드, T-0632, GLP1R0017, 또는 BETP이다. 일부 경우에, 리간드는 GLP1R 효능제이다. 일부 경우에, 리간드는 GLP1R 길항제이다. 일부 경우에, 리간드는 GLP1R 알로스테릭 조정제이다. 일부 경우에, 알로스테릭 조정제가 음성 알로스테릭 조정제이다. 일부 경우에, 알로스테릭 조정제는 양성 알로스테릭 조정제이다.

GLP1R 리간드와 GLP1R 사이의 표면 상호작용에 기초한 GLP1R 결합 도메인의 서열은 다양한 방법을 사용하여 분석된다. 예를 들어, 다종 컴퓨터 분석이 수행된다. 일부 경우에, 구조 분석이 수행된다. 일부 경우에, 서열 분석이 수행된다. 서열 분석은 당업계에 공지된 데이터베이스를 사용하여 수행될 수 있다. 데이터베이스의 비제한적 예는 NCBI BLAST(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), UCSC 게놈 브라우저(UCSC Genome Browser)(genome.ucsc.edu/), UniProt(www.uniprot.org/), 및 (IUPHAR/BPS Guide to PHARMACOLOGY)(guidetopharmacology.org/)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 다양한 유기체 중에서 서열 분석에 기초하여 디자인된 GLP1R 결합 도메인을 기술한다. 예를 들어, 상이한 유기체에서 상동성 서열을 확인하기 위해 서열 분석이 수행된다. 예시적인 유기체는 마우스, 래트, 말, 양, 소, 영장류(예컨대, 침팬지, 개코원숭이, 고릴라, 오랑우탄, 원숭이), 개, 고양이, 돼지, 당나귀, 토끼, 어류, 파리 및 인간을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

GLP1R 결합 도메인의 확인 후, GLP1R 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리가 생성될 수 있다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인의 라이브러리는 입체형태적 리간드 상호작용, 펩티드 리간드 상호작용, 소분자 리간드 상호작용, GLP1R의 세포외 도메인, 또는 GLP1R을 표적화하는 항체에 기초하여 디자인된 GLP1R 결합 도메인의 서열을 포함한다. GLP1R 결합 도메인의 라이브러리는 펩티드 리간드 상호자에 기초하여 디자인된 GLP1R 결합 도메인의 서열을 포함한다. GLP1R 결합 도메인의 라이브러리는 단백질 라이브러리를 생성하도록 번역될 수 있다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인의 라이브러리는 펩티드 라이브러리, 면역글로불린 라이브러리, 그의 유도체 또는 그의 조합물을 생성하도록 번역된다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인의 라이브러리는 펩티드모방체 라이브러리를 생성하도록 추가로 변형된 단백질 라이브러리를 생성하도록 번역된다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인의 라이브러리는 소분자를 생성하기 위해 사용되는 단백질 라이브러리를 생성하도록 번역된다.

본원에 기술된 방법은 각각의 것이 적어도 하나의 미리 결정된 참조 핵산 서열의 미리 결정된 변이체를 코딩하는 것인 핵산을 포함하는 GLP1R 결합 도메인의 라이브러리의 합성을 제공한다. 일부 경우에, 미리 결정된 참조 서열은 단백질을 코딩하는 핵산 서열이고, 변이체 라이브러리는 합성된 핵산에 의해 코딩되는 후속 단백질에서 단일 잔기의 복수의 상이한 변이체가 표준 번역 프로세스에 의해 생성되도록 하기 위해 적어도 하나의 단일 코돈의 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인의 라이브러리는 다수의 위치에서 변이를 집합적으로 코딩하는 변이된 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 라이브러리는 GLP1R 결합 도메인에서 적어도 하나의 단일 코돈의 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 라이브러리는 GLP1R 결합 도메인에서 다중 코돈의 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 변이를 위한 예시적인 코돈의 개수는 적어도 또는 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 225, 250, 275, 300개 또는 300개 초과의 코돈을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에 기술된 방법은 라이브러리가 GLP1R 결합 도메인 길이의 변이를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 GLP1R 결합 도메인을 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리의 합성을 제공한다. 일부 경우에, 라이브러리는 미리 결정된 참조 서열과 비교하여 적어도 또는 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 225, 250, 275, 300개, 또는 300개 초과의 코돈이 더 적은 길이 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 라이브러리는 미리 결정된 참조 서열과 비교하여 적어도 또는 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300개, 또는 300개 초과의 코돈이 더 많은 길이 변이를 코딩하는 서열을 포함한다.

GLP1R 결합 도메인의 확인 후, GLP1R 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같이 스캐폴드에 배치될 수 있다. 일부 경우에, 스캐폴드는 면역글로불린이다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인은 CDR-H3 영역에 배치된다. 스캐폴드에 배치될 수 있는 GLP1R 결합 도메인은 또한 모티프로 지칭될 수 있다. GLP1R 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드는 결합, 특이성, 안정성, 발현, 폴딩 또는 하류 활성에 기초하여 디자인될 수 있다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드는 GLP1R과의 접촉을 가능하게 한다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드는 GLP1R과의 고친화도 결합을 가능하게 한다. GLP1R 결합 도메인의 예시적인 아미노산 서열은 표 1에 제시되어 있다.

본원에서는 GLP1R 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드로서, 여기서, GLP1R 결합 도메인의 서열은 GLP1R과의 상호작용을 지원하는 것인 스캐폴드를 제공한다. 서열은 GLP1R 리간드의 서열과 상동성이거나, 또는 동일할 수 있다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인 서열은 서열 번호 1과 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인 서열은 서열 번호 1과 적어도 또는 약 95%의 상동성을 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인 서열은 서열 번호 1과 적어도 또는 약 97%의 상동성을 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인 서열은 서열 번호 1과 적어도 또는 약 99%의 상동성을 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인 서열은 서열 번호 1과 적어도 또는 약 100%의 상동성을 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인 서열은 서열 번호 1의 적어도 또는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400개, 또는 400개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함한다.

용어 "서열 동일성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 서열이 비교창에 걸쳐 동일하다(즉, 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 기준으로)을 의미한다. "서열 동일성(%)"이라는 용어는 비교창에 걸쳐 최적으로 정렬된 두 서열을 비교하고, 두 서열 모두에 동일한 핵산 염기(예: A, T, C, G, U 또는 I)가 존재하는 위치의 개수를 측정하여 매칭되는 위치의 개수를 수득하고, 매칭되는 위치의 개수를 비교창 중 위치 총 개수(즉, 창 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 시퀀스 동일성(%)을 산출한다.

두 단백질 사이의 "상동성" 또는 "유사성"이라는 용어는 한 단백질 서열의 아미노산 서열 및 그의 보존된 아미노산 치환체를 두 번째 단백질 서열과 비교함으로써 결정된다. 유사성은 당업계에 널리 공지된 절차, 예를 들어, BLAST 프로그램(미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biological Information)의 기본 국부 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool))에 의해 결정될 수 있다.

본원에서는 GLP1R 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 GLP1R 결합 라이브러리로서, 도메인 유형, 도메인 길이의 변이, 또는 잔기 변이를 포함하는 것인 라이브러리를 제공한다. 일부 경우에, 도메인은 GLP1R 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드 내의 영역이다. 예를 들어, 영역은 VH, CDR-H3 또는 VL 도메인이다. 일부 경우에, 도메인은 GLP1R 결합 도메인이다.

본원에 기술된 방법은 각각의 것이 적어도 하나의 미리 결정된 참조 핵산 서열의 미리 결정된 변이체를 코딩하는 것인 핵산의 GLP1R 결합 라이브러리의 합성을 제공한다. 일부 경우에, 미리 결정된 참조 서열은 단백질을 코딩하는 핵산 서열이고, 변이체 라이브러리는 합성된 핵산에 의해 코딩되는 후속 단백질에서 단일 잔기의 복수의 상이한 변이체가 표준 번역 프로세스에 의해 생성되도록 하기 위해 적어도 하나의 단일 코돈의 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 결합 라이브러리는 다수의 위치에서 변이를 집합적으로 코딩하는 변이된 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 라이브러리는 VH, CDR-H3 또는 VL 도메인의 적어도 하나의 단일 코돈의 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 라이브러리는 GLP1R 결합 도메인에서 적어도 하나의 단일 코돈의 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 예를 들어, 표 1에 열거된 GLP1R 결합 도메인의 적어도 하나의 단일 코돈이 변이된다. 일부 경우에, 변이체 라이브러리는 VH, CDR-H3 또는 VL 도메인의 다중 코돈의 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 라이브러리는 GLP1R 결합 도메인에서 다중 코돈의 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 변이를 위한 예시적인 코돈의 개수는 적어도 또는 약 적어도 또는 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 225, 250, 275, 300개, 또는 300개 초과의 코돈을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에 기술된 방법은 각각의 것이 적어도 하나의 미리 결정된 참조 핵산 서열의 미리 결정된 변이체를 코딩하는 것인 핵산의 GLP1R 결합 라이브러리의 합성을 제공하며, 여기서, GLP1R 결합 라이브러리는 도메인의 길이의 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 도메인은 VH, CDR-H3 또는 VL 도메인이다. 일부 경우에, 도메인은 GLP1R 결합 도메인이다. 일부 경우에, 라이브러리는 미리 결정된 참조 서열과 비교하여 적어도 또는 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 225, 250, 275, 300개, 또는 300개 초과의 코돈이 더 적은 길이 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 라이브러리는 미리 결정된 참조 서열과 비교하여 적어도 또는 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 225, 250, 275, 300개, 또는 300개 초과의 코돈이 더 많은 길이 변이를 코딩하는 서열을 포함한다.

본원에서는 GLP1R 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 GLP1R 결합 라이브러리로서, 여기서, GLP1R 결합 라이브러리는 다양한 개수의 단편으로 합성되는 것인 GLP1R 결합 라이브러리를 제공한다. 일부 경우에, 단편은 VH, CDR-H3, 또는 VL 도메인을 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 결합 라이브러리는 적어도 또는 약 2개의 단편, 3개의 단편, 4개의 단편, 5개의 단편 또는 5개 초과의 단편으로 합성된다. 각각의 핵산 단편의 길이 또는 합성된 핵산의 평균 길이는 적어도 또는 약 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600,개 또는 600개 초과의 염기쌍일 수 있다. 일부 경우에, 길이는 약 50 내지 600, 75 내지 575, 100 내지 550, 125 내지 525, 150 내지 500, 175 내지 475, 200 내지 450, 225 내지 425, 250 내지 400, 275 내지 375, 또는 300 내지 350개의 염기쌍 길이다.

본원에 기술된 바와 같은 GLP1R 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 GLP1R 결합 라이브러리는 번역시 다양한 길이의 아미노산을 포함한다. 일부 경우에, 각각의 아미노산 단편의 길이 또는 합성된 아미노산의 평균 길이는 적어도 또는 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150개, 또는 150개 초과의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 경우에, 아미노산 길이는 약 15 내지 150, 20 내지 145, 25 내지 140, 30 내지 135, 35 내지 130, 40 내지 125, 45 내지 120, 50 내지 115, 55 내지 110, 60 내지 110, 65 내지 105, 70 내지 100, 또는 75 내지 95개의 아미노산 길이이다. 일부 경우에, 아미노산 길이는 약 22 내지 약 75개의 아미노산 길이이다.

GLP1R 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드를 코딩하는 드 노보 합성된 변이체 서열을 포함하는 GLP1R 결합 라이브러리는 다수의 변이체 서열을 포함한다. 일부 경우에, 다수의 변이체 서열은 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, VL, VH 또는 그의 조합에 대해 드 노보 합성된다. 일부 경우에, 프레임워크 요소 1(FW1), 프레임워크 요소 2(FW2), 프레임워크 요소 3(FW3) 또는 프레임워크 요소 4(FW4)에 대해 다수의 변이체 서열이 드 노보 합성된다. 일부 경우에, GLP1R 결합 도메인에 대해 다수의 변이체 서열이 드 노보 합성된다. 예를 들어, 변이체 서열의 개수는 VH 도메인에 대해 약 1 내지 약 10개의 서열, GLP1R 결합 도메인에 대해 약 10⁸개의 서열, 및 VK 도메인에 대해 약 1 내지 약 44개의 서열이다. 변이체 서열의 개수는 적어도 또는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500개 또는 500개 초과의 서열일 수 있다. 일부 경우에, 변이체 서열의 개수는 약 10 내지 300, 25 내지 275, 50 내지 250, 75 내지 225, 100 내지 200, 또는 125 내지 150개의 서열이다.

GLP1R 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드를 코딩하는 드 노보 합성된 변이체 서열을 포함하는 GLP1R 결합 라이브러리는 개선된 다양성을 포함한다. 예를 들어, 변이체는 GLP1R 결합 도메인 변이체를 N-말단 CDR-H3 변이 및 C-말단 CDR-H3 변이를 포함하는 면역글로불린 스캐폴드 변이체에 배치함으로써 생성된다. 일부 경우에, 변이체는 친화도 성숙 변이체를 포함한다. 대안적으로 또는 조합하여, 변이체는 CDR-H1, CDR-H2, CDR-L1, CDR-L2 및 CDRL3을 포함하나, 이에 제한되지 않는 면역글로불린의 다른 영역에서의 변이체를 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 결합 라이브러리의 변이체의 개수는 적어도 또는 약 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵, 10¹⁶, 10¹⁷, 10¹⁸, 10¹⁹, 10²⁰개, 또는 10²⁰개 초과의 비동일한 서열이다. 예를 들어, VH 영역에 대한 약 10개의 변이체 서열, CDR-H3 영역에 대한 약 237개의 변이체 서열, 및 VL 및 CDR-L3 영역에 대한 약 43개의 변이체 서열을 포함하는 라이브러리는 10⁵개의 비동일한 서열(10 x 237 x 43)을 포함한다.

본원에서는 항체의 적어도 한 영역 중 변이를 포함하는 GLP1R 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리로서, 여기서, 영역은 CDR 영역인 것인 라이브러리를 제공한다. 일부 경우에, GLP1R 항체는 한 중쇄 가변 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체, 예컨대, VHH 항체이다. 일부 경우에, VHH 항체는 하나 이상의 CDR 영역에 변이를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 라이브러리는 CDR1, CDR2, 또는 CDR3의 적어도 또는 약 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2400, 2600, 2800, 3000개, 또는 3000개 초과의 서열을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 라이브러리는 CDR1, CDR2, 또는 CDR3의 적어도 또는 약 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵, 10¹⁶, 10¹⁷, 10¹⁸, 10¹⁹, 10²⁰개, 또는 10²⁰개 초과의 서열을 포함한다. 예를 들어, 라이브러리는 CDR1에 대한 적어도 2000개의 서열, CDR2에 대한 적어도 1200개의 서열, 및 CDR3에 대한 적어도 1600개의 서열을 포함한다. 일부 경우에, 각 서열은 비동일한 것이다.

일부 경우에, CDR1, CDR2, 또는 CDR3은 가변 도메인, 경쇄(VL)의 것이다. 가변 도메인, 경쇄(VL)의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3은 각각 CDR-L1, CDR-L2, 또는 CDR-L3으로 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 라이브러리는 VL의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3의 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2400, 2600, 2800, 3000개, 또는 3000개 초과의 서열을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 라이브러리는 VL의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3의 적어도 또는 약 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵, 10¹⁶, 10¹⁷, 10¹⁸, 10¹⁹, 10²⁰개, 또는 10²⁰개 초과의 서열을 포함한다. 예를 들어, 라이브러리는 VL의 CDR1에 대한 적어도 20개의 서열, VL의 CDR2에 대한 적어도 4개의 서열, 및 VL의 CDR3에 대한 적어도 140개의 서열을 포함한다. 일부 경우에, 라이브러리는 VL의 CDR1에 대한 적어도 2개의 서열, VL의 CDR2에 대한 적어도 1개의 서열, 및 VL의 CDR3에 대한 적어도 3000개의 서열을 포함한다. 일부 경우에, VL은 IGKV1-39, IGKV1-9, IGKV2-28, IGKV3-11, IGKV3-15, IGKV3-20, IGKV4-1, IGLV1-51, IGLV2-14, IGLV1-40, 또는 IGLV3-1이다. 일부 경우에, VL은 IGKV2-28이다. 일부 경우에, VL은 IGLV1-51이다.

일부 경우에, CDR1, CDR2, 또는 CDR3은 가변 도메인, 중쇄(VH)의 것이다. 가변 도메인, 중쇄(VH)의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3은 각각 CDR-H1, CDR-H2, 또는 CDR-H3으로 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 라이브러리는 VH의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3의 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2400, 2600, 2800, 3000개, 또는 3000개 초과의 서열을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 라이브러리는 VH의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3의 적어도 또는 약 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵, 10¹⁶, 10¹⁷, 10¹⁸, 10¹⁹, 10²⁰개, 또는 10²⁰개 초과의 서열을 포함한다. 예를 들어, 라이브러리는 VH의 CDR1에 대한 적어도 30개의 서열, VH의 CDR2에 대한 적어도 570개의 서열, 및 VH의 CDR3에 대한 적어도 10⁸개의 서열을 포함한다. 일부 경우에, 라이브러리는 VH의 CDR1에 대한 적어도 30개의 서열, VH의 CDR2에 대한 적어도 860개의 서열, 및 VH의 CDR3에 대한 적어도 10⁷개의 서열을 포함한다. 일부 경우에, VH는 IGHV1-18, IGHV1-69, IGHV1-8 IGHV3-21, IGHV3-23, IGHV3-30/33rn, IGHV3-28, IGHV3-74, IGHV4-39, 또는 IGHV4-59/61이다. 일부 경우에, VH는 IGHV1-69, IGHV3-30, IGHV3-23, IGHV3, IGHV1-46, IGHV3-7, IGHV1, 또는 IGHV1-8이다. 일부 경우에, VH는 IGHV1-69 및 IGHV3-30이다. 일부 경우에, VH는 IGHV3-23이다.

일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 라이브러리는 다양한 길이의 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 또는 CDR-H3을 포함한다. 일부 경우에, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 또는 CDR-H3의 길이는 적어도 또는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90개, 또는 90개 초과의 아미노산 길이를 포함한다. 예를 들어, CDR-H3 길이는 적어도 또는 약 12, 15, 16, 17, 20, 21, 또는 23개의 아미노산 길이를 포함한다. 일부 경우에, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 또는 CDR-H3 길이는 약 1 내지 약 10, 약 5 내지 약 15, 약 10 내지 약 20, 또는 약 15 내지 약 30개의 아미노산 범위를 포함한다.

본원에 기술된 바와 같은 변이체 CDR 서열을 갖는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리는 번역시 다양한 길이의 아미노산을 포함한다. 일부 경우에, 각각의 아미노산 단편의 길이 또는 합성된 아미노산의 평균 길이는 적어도 또는 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150개, 또는 150개 초과의 아미노산 길이일 수 있다. 일부 경우에, 아미노산 길이는 약 15 내지 150, 20 내지 145, 25 내지 140, 30 내지 135, 35 내지 130, 40 내지 125, 45 내지 120, 50 내지 115, 55 내지 110, 60 내지 110, 65 내지 105, 70 내지 100, 또는 75 내지 95개의 아미노산 길이이다. 일부 경우에, 아미노산 길이는 약 22 아미노산 내지 약 75개의 아미노산 길이이다. 일부 경우에, 항체는 적어도 또는 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000개, 또는 5000개 초과의 아미노산을 포함한다.

CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 또는 CDR-H3의 길이 비는 본원에 기술된 라이브러리에서 다양할 수 있다. 일부 경우에, 적어도 또는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90개, 또는 90개 초과의 아미노산 길이를 포함하는 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 또는 CDR-H3은 라이브러리의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 90% 초과를 차지한다. 예를 들어, 약 23개의 아미노산 길이를 포함하는 CDR-H3은 라이브러리에서 40%로 존재하고, 약 21개의 아미노산 길이를 포함하는 CDR-H3은 라이브러리에서 30%로 존재하고, 약 17개의 아미노산 길이를 포함하는 CDR-H3은 라이브러리에서 20%로 존재하고, 약 12개의 아미노산 길이를 포함하는 CDR-H3은 라이브러리에서 10%로 존재한다. 일부 경우에, 약 20개의 아미노산 길이를 포함하는 CDR-H3은 라이브러리에서 40%로 존재하고, 약 16개의 아미노산 길이를 포함하는 CDR-H3은 라이브러리에서 30%로 존재하고, 약 15개의 아미노산 길이를 포함하는 CDR-H3은 라이브러리에서 20%로 존재하고, 약 12개의 아미노산 길이를 포함하는 CDR-H3은 라이브러리에서 10%로 존재한다.

VHH 항체를 코딩하는 본원에 기술된 바와 같은 라이브러리는 적어도 또는 약 10^7,10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³,10¹⁴, 10¹⁵, 10¹⁶, 10¹⁷, 10¹⁸, 10¹⁹, 10²⁰개, 또는 10²⁰개 초과의 서열의 이론상 다양성을 갖는 라이브러리를 생성하기 위핸 셔플링된 변이체 CDR 서열을 포함한다. 일부 경우에, 라이브러리는 적어도 또는 약 10^7,10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³,10¹⁴, 10¹⁵, 10¹⁶, 10¹⁷, 10¹⁸, 10¹⁹, 10²⁰개, 또는 10²⁰개 초과의 서열의 최종 라이브러리 다양성을 갖는다.

본원에서는 면역글로불린을 코딩하는 GLP1R 결합 라이브러리를 제공한다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 항체이다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 VHH 항체이다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 1 nM 미만, 1.2 nM 미만, 2 nM 미만, 5 nM 미만, 10 nM 미만, 11 nm, 13.5 nM 미만, 15 nM 미만, 20 nM 미만, 25 nM 미만, 또는 30 nM 미만의, GLP1R에 대한 결합 친화도(예컨대, kD)를 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 1 nM 미만의 kD를 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 1.2 nM 미만의 kD를 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 2 nM 미만의 kD를 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 5 nM 미만의 kD를 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 10 nM 미만의 kD를 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 13.5 nM 미만의 kD를 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 15 nM 미만의 kD를 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 20 nM 미만의 kD를 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 25 nM 미만의 kD를 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 30 nM 미만의 kD를 포함한다.

일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 GLP1R 효능제이다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 GLP1R 길항제이다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 GLP1R 알로스테릭 조정제이다. 일부 경우에, 알로스테릭 조정제가 음성 알로스테릭 조정제이다. 일부 경우에, 알로스테릭 조정제는 양성 알로스테릭 조정제이다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 적어도 또는 약 1 nM, 2 nM, 4 nM, 6 nM, 8 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 120 nM, 140 nM, 160 nM, 180 nM, 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM, 900 nM, 1000 nM, 또는 1000 nM 초과의 농도에서 효능작용성, 길항성, 또는 알로스테릭 효과를 발휘한다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 음성 알로스테릭 조정제이다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 적어도 또는 약 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1 nM, 2 nM, 4 nM, 6 nM, 8 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM, 또는 100 nM 초과의 농도에서 음성 알로스테릭 조정제이다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 약 0.001 내지 약 100, 0.01 내지 약 90, 약 0.1 내지 약 80, 1 내지 약 50, 약 10 내지 약 40 nM, 또는 약 1 내지 약 10 nM 범위의 농도에서 음성 알로스테릭 조정제이다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 적어도 또는 약 0.001, 0.0025, 0.005, 0.01, 0.025, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.9, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 nM, 또는 6 nM 초과의 EC50 또는 IC50을 포함한다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 적어도 또는 약 1 nM, 2 nM, 4 nM, 6 nM, 8 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, 100 nM 또는 100 nM 초과의 EC50 또는 IC50을 포함한다.

본원에서는 면역글로불린을 코딩하는 GLP1R 결합 라이브러리로서, 여기서, 면역글로불린가 긴 반감기를 포함하는 것인 GLP1R 결합 라이브러리를 제공한다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린의 반감기는 적어도 또는 약 12시간, 24시간 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간, 96시간, 108시간, 120시간, 140시간, 160시간, 180시간, 200시간, 또는 200시간 초과이다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린의 반감기는 약 12시간 내지 약 300시간, 약 20시간 내지 약 280시간, 약 40시간 내지 약 240시간, 또는 약 60시간 내지 약 200시간 범위이다.

본원에 기술된 바와 같은 GLP1R 면역글로불린은 개선된 특성을 포함할 수 있다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 단량체이다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 응집되는 경향은 없다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린 중 적어도 또는 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%는 단량체이다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 열안정적이다. 일부 경우에, GLP1R 면역글로불린은 비특이적 결합을 감소시킨다.

GLP1R 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 GLP1R 결합 라이브러리의 합성 후, 라이브러리는 스크리닝 및 분석을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 라이브러리는 라이브러리 디스플레이 가능성 및 패닝에 대해 검정된다. 일부 경우에, 선별가능한 태그를 사용하여 디스플레이 가능성이 검정된다. 예시적인 태그는 방사성 표지, 형광 표지, 효소, 화학발광 태그, 비색 태그, 친화도 태그 또는 당업계에 공지된 다른 표지 또는 태그를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 태그는 히스티딘, 폴리히스티딘, myc, 헤마글루티닌(HA) 또는 FLAG이다. 일부 경우에, GLP1R 결합 라이브러리는 다수의 태그, 예컨대, GFP, FLAG 및 Lucy 뿐만 아니라, DNA 바코드를 갖는 GPCR 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 라이브러리는 단일 분자 실시간(SMRT) 시퀀싱, 폴로니 시퀀싱, 라이게이션에 의한 시퀀싱, 가역적 종결인자 시퀀싱, 양성자 검출 시퀀싱, 이온 반도체 시퀀싱, 나노포어 시퀀싱, 전자 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 막삼-길버트 시퀀싱, 쇄 종결(예컨대, 생어) 시퀀싱, +S 시퀀싱 또는 합성에 의한 시퀀싱을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다양한 방법을 사용한 시퀀싱에 의해 검정된다.

발현 시스템

본원에서는 GLP1R 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리로서, 여기서, 라이브러리는 개선된 특이성, 안정성, 발현, 폴딩 또는 하류 활성을 갖는 것인 라이브러리를 제공한다. 일부 경우에, 본원에 기술된 라이브러리는 스크리닝 및 분석을 위해 사용된다.

본원에서는 GLP1R 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리로서, 여기서, 핵산 라이브러리는 스크리닝 및 분석을 위해 사용되는 것인 라이브러리를 제공한다. 일부 경우에, 스크리닝 및 분석은 시험관내, 생체내 또는 생체외 검정을 포함한다. 스크리닝을 위한 세포는 살아있는 피험체 또는 세포주로부터 채취된 1차 세포를 포함한다. 세포는 원핵 생물(예컨대, 박테리아 및 진균) 또는 진핵 생물(예를 들어, 동물 및 식물)로부터 유래될 수 있다. 예시적인 동물 세포는 제한 없이, 마우스, 토끼, 영장류 및 곤충으로부터의 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 스크리닝을 위한 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese Hamster Ovary) 세포주, 인간 배아 신장(HEK: human embryonic kidney) 세포주 또는 새끼 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포주를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 본원에 기술된 바와 같은 핵산 라이브러리는 또한 다세포 유기체로 전달될 수 있다. 예시적인 다세포 유기체로는 제한 없이, 식물, 마우스, 토끼, 영장류 및 곤충을 포함한다.

본원에 기술된 바와 같은 핵산 라이브러리 또는 그를 코딩하는 단백질 라이브러리는 다양한 약리학적 또는 약동학적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 일부 경우에, 라이브러리는 시험관내 검정, 생체내 검정 또는 생체외 검정을 사용하여 스크리닝된다. 예를 들어, 스크리닝되는 시험관내 약리학적 또는 약동학적 특성은 결합 친화도, 결합 특이성 및 결합력을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 스크리닝되는 본원에 기술된 바와 같은 라이브러리의 예시적인 생체내 약리학적 또는 약동학적 특성은 치료 효능, 활성, 임상전 독성 특성, 임상 효능 특성, 임상 독성 특성, 면역원성, 효력 및 임상 안전성 특성을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

스크리닝될 수 있는 약리학적 또는 약동학적 특성은 세포 결합 친화도 및 세포 활성을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 세포 결합 친화도 검정법 또는 세포 활성 검정법은 본원에 기술된 라이브러리의 효능작용성, 길항성, 또는 알로스테릭 효과를 측정하기 위해 수행된다. 일부 경우에, 세포 활성 검정법은 cAMP 검정법이다. 일부 경우에, 본원에서 기술된 바와 같은 라이브러리는 GLP1R의 리간드의 세포 결합 또는 세포 활성과 비교된다.

본원에 기술된 바와 같은 라이브러리는 세포 기반 검정법에서, 또는 비세포 기반 검정법에서 스크리닝될 수 있다. 비세포 기반 검정법의 예로는 바이러스 입자 사용, 시험관내 번역 단백질 사용, 및 GLP1R을 포함하는 프로테오리포솜 사용을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원에 기술된 바와 같은 핵산 라이브러리는 시퀀싱에 의해 스크리닝될 수 있다. 일부 경우에, 차세대 서열은 GLP1R 결합 변이체의 서열 농축을 결정하는 데 사용된다. 일부 경우에, V 유전자 분포, J 유전자 분포, V 유전자 패밀리, 길이당 CDR3 계수, 또는 그의 조합이 결정된다. 일부 경우에, 클론 빈도, 클론 축적, 계통 축적 또는 그의 조합이 결정된다. 일부 경우에, 서열 개수, VH 클론을 갖는 서열, 클론, 1보다 큰 클론타입, 클론형, 1보다 큰 클론타입, 계통, 심슨, 또는 그의 조합이 결정된다. 예를 들어, 비동일한 CDR3의 비율(%)은 샘플 중 비동일한 CDR3의 개수를 샘플 중 CDR3을 갖는 서열의 총 개수로 나눈 값으로 산출된다.

본원에서는 벡터에서 발현될 수 있는 핵산 라이브러리가를 제공한다. 본원에 개시된 핵산 라이브러리를 삽입하기 위한 발현 벡터는 진핵 또는 원핵 발현 벡터를 포함할 수 있다. 예시적인 발현 벡터는 제한 없이, 포유동물 발현 벡터: pSF-CMV-NEO-NH2-PPT-3XFLAG, pSF-CMV-NEO-COOH-3XFLAG, pSF-CMV-PURO-NH2-GST-TEV, pSF-OXB20-COOH-TEV-FLAG(R)-6His, pCEP4 pDEST27, pSF-CMV-Ub-KrYFP, pSF-CMV-FMDV-daGFP, pEF1a-mCherry-N1 벡터, pEF1a-tdTomato 벡터, pSF-CMV-FMDV-Hygro, pSF-CMV-PGK-Puro, pMCP-태그(m), 및 pSF-CMV-PURO-NH2-CMYC; 박테리아 발현 벡터: pSF-OXB20-베타Gal,pSF-OXB20-Fluc, pSF-OXB20, 및 pSF-Tac; 식물 발현 벡터: pRI 101-AN DNA 및 pCambia2301; 및 효모 발현 벡터: pTYB21 및 pKLAC2, 및 곤충 벡터: pAc5.1/V5-His A 및 pDEST8을 포함한다. 일부 경우에, 벡터는 pcDNA3 또는 pcDNA3.1이다.

본원에서는 벡터에서 발현되어 GLP1R 결합 도메인의 서열을 포함하는 스캐폴드를 포함하는 구성물을 생성하는 핵산 라이브러리를 기술한다. 일부 경우에, 구성물의 크기가 달라진다. 일부 경우에, 구성물은 적어도 또는 약 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 2000, 2400, 2600, 2800, 3000, 3200, 3400, 3600, 3800, 4000, 4200,4400, 4600, 4800, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000개, 또는 10000개 초과의 염기를 포함한다. 일부 경우에, 구성물은 약 300 내지 1,000, 300 내지 2,000, 300 내지 3,000, 300 내지 4,000, 300 내지 5,000, 300 내지 6,000, 300 내지 7,000, 300 내지 8,000, 300 내지 9,000, 300 내지 10,000, 1,000 내지 2,000, 1,000 내지 3,000, 1,000 내지 4,000, 1,000 내지 5,000, 1,000 내지 6,000, 1,000 내지 7,000, 1,000 내지 8,000, 1,000 내지 9,000, 1,000 내지 10,000, 2,000 내지 3,000, 2,000 내지 4,000, 2,000 내지 5,000, 2,000 내지 6,000, 2,000 내지 7,000, 2,000 내지 8,000, 2,000 내지 9,000, 2,000 내지 10,000, 3,000 내지 4,000, 3,000 내지 5,000, 3,000 내지 6,000, 3,000 내지 7,000, 3,000 내지 8,000, 3,000 내지 9,000, 3,000 내지 10,000, 4,000 내지 5,000, 4,000 내지 6,000, 4,000 내지 7,000, 4,000 내지 8,000, 4,000 내지 9,000, 4,000 내지 10,000, 5,000 내지 6,000, 5,000 내지 7,000, 5,000 내지 8,000, 5,000 내지 9,000, 5,000 내지 10,000, 6,000 내지 7,000, 6,000 내지 8,000, 6,000 내지 9,000, 6,000 내지 10,000, 7,000 내지 8,000, 7,000 내지 9,000, 7,000 내지 10,000, 8,000 내지 9,000, 8,000 내지 10,000, 또는 9,000 내지 10,000개 범위의 염기를 포함한다.

본원에서는 GLP1R 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리로서, 여기서, 핵산 라이브러리는 세포에서 발현되는 것인 라이브러리를 제공한다. 일부 경우에, 라이브러리는 리포터 유전자를 발현하도록 합성된다. 예시적인 리포터 유전자는 아세토하이드록시산 신타제(AHAS: acetohydroxyacid synthase), 알칼리성 포스파타제(AP: alkaline phosphatase), 베타 갈락토시다제(LacZ), 베타 글루코로니다제(GUS), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT: chloramphenicol acetyltransferase), 녹색 형광 단백질(GFP: green fluorescent protein), 적색 형광 단백질(RFP: red fluorescent protein), 황색 형광 단백질(YFP: yellow fluorescent protein), 시안 형광 단백질(CFP: cyan fluorescent protein), 진청색 형광 단백질, 담황색 형광 단백질, 주황색 형광 단백질, 선홍색 형광 단백질, 청록색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP: horseradish peroxidase), 루시퍼라제(Luc), 노팔린 신타제(NOS: nopaline synthase), 옥토핀 신타제(OCS: octopine synthase), 루시페라제 및 그의 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 리포터 유전자의 조정을 결정하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 형광 측정 방법(예컨대, 형광 분광법, 형광 활성화 세포 분류(FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting), 형광 현미경법) 및 항생제 내성 측정을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

질환 및 장애

본원에서는 치료 효과를 가질 수 있는 GLP1R 결합 도메인을 포함하는 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 GLP1R 결합 라이브러리를 제공한다. 일부 경우에, GLP1R 결합 라이브러리는 번역시 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용되는 단백질을 생성한다. 일부 경우에, 단백질은 면역글로불린이다. 일부 경우에, 단백질은 펩티드 모방체이다.

본원에 기술된 바와 같은 GLP1R 라이브러리는 GLP1R의 조정제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, GLP1R의 조정제는 억제제이다. 일부 경우에, GLP1R의 조정제는 활성제이다. 일부 경우에, GLP1R 억제제는 GLP1R 길항제이다. 일부 경우에, GLP1R 길항제는 GLP1R-3이다. 일부 경우에, GLP1R-3은 서열 번호 2279를 포함한다. 일부 경우에, GLP1R-3은 서열 번호 2320을 포함한다. 일부 경우에, GLP1R의 조정제는 다양한 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용된다.

예시적인 질환은 암, 염증성 질환 또는 장애, 대사성 질환 또는 장애, 심혈관 질환 또는 장애, 호흡기 질환 또는 장애, 통증, 소화계 질환 또는 장애, 생식계 질환 또는 장애, 내분비계 질환 또는 장애, 또는 신경계 질환 또는 장애를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 암은 고형암 또는 혈액암이다. 일부 경우에, 본원에서 기술된 바와 같은 GLP1R의 조정제는 체중 증가의 치료를 위해(또는 체중 감소의 유도를 위해), 비만의 치료를 위해, 또는 II형 당뇨병의 치료를 위해 사용된다. 일부 경우에, GLP1R 조정제는 저혈당증을 치료하는 데 사용된다. 일부 경우에, GLP1R 조정제는 비만 후 저혈당증증을 치료하는 데 사용된다. 일부 경우에, GLP1R 조정제는 중증 저혈당증을 치료하는 데 사용된다. 일부 경우에, GLP1R 조정제는 고인슐린증을 치료하는 데 사용된다. 일부 경우에, GLP1R 조정제는 선천성 고인슐린증을 치료하는 데 사용된다.

일부 경우에, 피험체는 포유동물이다. 일부 경우에, 피험체는 마우스, 토끼, 개 또는 인간이다. 본원에 기술된 방법에 의해 치료되는 피험체는 유아, 성인 또는 아동일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 바와 같은 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물은 정맥내로 또는 피하로 투여될 수 있다.

본원에서 GLP1R에 결합하는 항체 또는 그의 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 기술한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하고: 여기서, 면역글로불린 중쇄는 서열 번호 2303, 2304, 2305, 2306, 2307, 2308, 2309, 2317, 2318, 2319, 2320, 또는 2321에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 면역글로불린 경쇄는 서열 번호 2310, 2311, 2312, 2313, 2314, 2315, 또는 2316에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하고: 여기서, 면역글로불린 중쇄는 서열 번호 2303, 2304, 2305, 2306, 2307, 2308, 2309, 2317, 2318, 2319, 2320, 또는 2321에 기재된 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 면역글로불린 경쇄는 서열 번호 2310, 2311, 2312, 2313, 2314, 2315, 또는 2316에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하고: 여기서, 면역글로불린 중쇄는 서열 번호 2303에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 면역글로불린 경쇄는 서열 번호 2310에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하고: 여기서, 면역글로불린 중쇄는 서열 번호 2304에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 면역글로불린 경쇄는 서열 번호 2311에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하고: 여기서, 면역글로불린 중쇄는 서열 번호 2305에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 면역글로불린 경쇄는 서열 번호 2312에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하고: 여기서, 면역글로불린 중쇄는 서열 번호 2306에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 면역글로불린 경쇄는 서열 번호 2313에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하고: 여기서, 면역글로불린 중쇄는 서열 번호 2307에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 면역글로불린 경쇄는 서열 번호 2314에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하고: 여기서, 면역글로불린 중쇄는 서열 번호 2308에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 면역글로불린 경쇄는 서열 번호 2315에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항체 단편은 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하고: 여기서, 면역글로불린 중쇄는 서열 번호 2309에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 면역글로불린 경쇄는 서열 번호 2316에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 95%, 97%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

일부 경우에, 약제학적 조성물은 서열 번호 2260-2276 중 어느 하나의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 본원에 기술된 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 서열 번호 2277-2295 중 어느 하나의 서열을 포함하는, 본원에 기술된 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일부 경우에, 약제학적 조성물은 서열 번호 2277, 2278, 2281, 2282, 2283, 2284, 2285, 2286, 2289, 2290, 2291, 2292, 2294, 또는 2295 중 어느 하나의 서열을 포함하는, 본원에 기술된 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 추가의 경우에, 약제학적 조성물은 대사 장애의 치료를 위해 사용된다.

변이체 라이브러리

코돈 변이

본원에 기술된 변이체 핵산 라이브러리는 복수의 핵산을 포함할 수 있으며, 여기서, 각각의 핵산은 참조 핵산 서열과 비교하여 변이체 코돈 서열을 코딩한다. 일부 경우에, 제1 핵산 집단의 각각의 핵산은 단일 변이체 부위에 변이체를 함유한다. 일부 경우에, 제1 핵산 집단은 제1 핵산 집단이 동일한 변이체 부위에 하나 초과의 변이체를 함유하도록 단일 변이체 부위에 복수의 변이체를 함유한다. 제1 핵산 집단은 동일한 변이체 부위에 다중 코돈 변이체를 집합적으로 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 제1 핵산 집단은 동일한 위치에 최대 19개 이상의 코돈을 집합적으로 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 제1 핵산 집단은 동일한 위치에 최대 60개의 변이체 삼중체를 집합적으로 코딩하는 핵산을 포함할 수 있거나, 또는 제1 핵산 집단은 동일한 위치에 최대 61개의 상이한 코돈 삼중체를 집합적으로 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 각각의 변이체는 번역 동안 상이한 아미노산을 생성하는 코돈을 코딩할 수 있다. 표 3은 변이체 부위에 대해 가능한 각각의 코돈(및 대표적인 아미노산)의 목록을 제공한다.

핵산 집단은 다중 20개 이하의 코돈 변이를 집합적으로 코딩하는 변이된 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 집단 내의 각각의 핵산은 동일한 핵산 내의 하나 초과의 위치에서 코돈에 대한 변이를 포함한다. 일부 경우에, 집단 내의 각각의 핵산은 단일 핵산 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 코돈에서 코돈에 대한 변이를 포함한다. 일부 경우에, 각각의 변이체의 긴 핵산은 하나의 긴 핵산 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 초과의 코돈에서 코돈에 대한 변이를 포함한다. 일부 경우에, 변이체 핵산 집단은 단일 핵산 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 초과의 코돈에서 코돈에 대한 변이를 포함한다. 일부 경우에, 변이체 핵산 집단은 하나의 긴 핵산 내의 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 초과의 코돈에서 코돈에 대한 변이를 포함한다.

고도로 병렬화된 핵산 합성

본원에서 혁신적인 합성 플랫폼을 생성하기 위해 뉴클레오티드 합성으로부터 실리콘 상의 나노웰 내에서의 유전자 어셈블리까지의 종단간 프로세스의 소형화, 병렬화 및 수직 통합을 이용하는 플랫폼 접근법이 제공된다. 본원에서 기술되는 장치는 96웰 플레이트와 동일한 풋프린트를 제공하며, 실리콘 합성 플랫폼은 전통적인 합성 방법과 비교하여 최대 1,000개 이상의 수준으로 처리량을 증가시킬 수 있고, 최대 약 1,000,000개 이상의 뉴클레오티드, 또는 10,000개 이상의 유전자를 하나의 고도로 병렬화된 실행으로 생성할 수 있다.

차세대 시퀀싱의 출현으로, 고해상도 게놈 데이터는 정상적인 생물학 및 질환 발병 기전 둘 모두에서 다양한 유전자의 생물학적 역할을 탐구하는 연구에 중요한 요소가 되었다. 이 연구의 핵심은 분자 생물학의 중심 원리 및 "순차적 정보의 잔기간 이동" 개념이다. DNA에 코딩된 게놈 정보는 메시지로 전사된 후, 주어진 생물학적 경로 내에서 활성 생성물인 단백질로 번역된다.

또 다른 흥미로운 연구 영역은 고특이적 세포 표적에 초점을 맞춘 치료 분자의 발견, 개발 및 제조에 관한 것이다. 높은 다양성의 DNA 서열 라이브러리는 표적 치료제 개발을 위한 파이프라인의 핵심이다. 유전자 돌연변이체는 그의 치료 표적에 대한 높은 친화도를 갖는 단백질의 높은 발현을 위해 최적화된 유전자에서 이상적으로 최고조에 달하는 단백질 조작 사이클을 설계, 구축 및 시험할 때 단백질을 발현하기 위해 사용된다. 예를 들어, 수용체의 결합 포켓을 고려한다. 결합 포켓 내의 모든 잔기의 모든 서열 순열을 동시에 시험할 수 있는 능력은 철저한 조사를 가능하게 하여 성공 가능성을 증가시킨다. 연구자가 수용체 내의 특정 부위에서 가능한 모든 돌연변이를 생성하려고, 시도하는 포화 돌연변이 유발이 상기 개발 시도에 대한 하나의 접근 방식을 나타낸다. 이는 비싸고, 시간도 많이 걸리고, 노동 집약적이기는 하지만, 각각의 변이체를 각각의 위치에 도입할 수 있다. 이와 대조적으로, DNA의 몇몇의 선택된 위치 또는 짧은 스트레치가 광범위하게 변형될 수 있는 조합 돌연변이 유발은 편향되어 제시된 변이체의 불완전한 레퍼토리를 생성한다.

약물 개발 파이프라인을 가속화하기 위해, 시험을 위해 이용 가능한 올바른 위치에서 의도된 빈도로 이용 가능한 원하는 변이체를 갖는 라이브러리, 즉, 정밀 라이브러리는 스크리닝을 위한 소요 시간 뿐만 아니라, 비용 감소를 가능하게 한다. 원하는 빈도로 각각의 의도된 변이체의 정확한 도입을 제공하는 핵산 합성 변이체 라이브러리를 합성하는 방법이 본원에서 제공된다. 최종 사용자에게, 이것은 서열 공간을 철저히 샘플링할 수 있을 뿐만 아니라, 효율적인 방법으로 이러한 가설을 검사하여 비용 및 스크리닝 시간을 감소시킬 수 있는 능력으로 제시된다. 게놈 와이드 편집에 의해, 중요한 경로, 각각의 변이체 및 서열 순열을 최적의 기능성에 대해 시험할 수 있는 라이브러리, 및 약물 발견을 위한 생물 시스템을 재조작하기 위한 전체 경로 및 게놈을 재구성하기 위해 사용될 수 있는 수천 개의 유전자를 규명할 수 있다.

제1 예에서, 약물 자체는 본원에서 기술되는 방법을 사용하여 최적화될 수 있다. 예를 들어, 항체의 특정 기능을 개선하기 위해, 항체의 일부를 코딩하는 변이체 뉴클레오티드 라이브러리가 디자인되고, 합성된다. 이어서, 항체에 대한 변이체 핵산 라이브러리는 본원에서 기술되는 프로세스(예를 들어, PCR 돌연변이 유발, 이어서 벡터 내로의 삽입)에 의해 생성될 수 있다. 이어서 항체를 생산 세포주에서 발현시키고, 향상된 활성에 대해 스크리닝한다. 예시적인 스크리닝은 항원에 대한 결합 친화도, 안정성, 또는 이펙터 기능(예를 들어, ADCC, 보체 또는 아폽토시스)의 조정을 조사하는 것을 포함한다. 항체를 최적화하기 위한 예시적인 영역은 제한 없이, Fc 영역, Fab 영역, Fab 영역의 가변 영역, Fab 영역의 불변 영역, 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인(V_H 또는 V_L) 및 V_H 또는 V_L의 특정 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.

본원에서 기술되는 방법에 의해 합성된 핵산 라이브러리는 질환 상태와 관련된 다양한 세포에서 발현될 수 있다. 질환 상태와 관련된 세포에는 세포주, 조직 샘플, 피험체의 1차 세포, 피험체에서 확장된 배양 세포, 또는 모델 시스템의 세포가 포함된다. 예시적인 모델 시스템은 제한 없이, 질환 상태의 식물 및 동물 모델을 포함한다.

질환 상태의 예방, 감소 또는 치료와 관련된 변이체 분자를 확인하기 위해, 본원에서 기술되는 변이체 핵산 라이브러리는 질환 상태와 관련된 세포에서 발현되거나, 질환 상태가 유도될 수 있는 세포에서 발현된다. 일부 경우에, 세포에서 질환 상태를 유도하기 위해 작용제가 사용된다. 질환 상태 유도를 위한 예시적인 도구는 제한 없이, Cre/Lox 재조합 시스템, LPS 염증 유도 및 저혈당증을 유도하는 스트렙토조토신을 포함한다. 질환 상태와 관련된 세포는 특정 질환 병태를 갖는 피험체로부터의 세포 뿐만 아니라, 모델 시스템 또는 배양된 세포로부터의 세포일 수 있다. 예시적인 질환 상태는 박테리아성, 진균성, 바이러스성, 자가면역 또는 증식성 장애(예컨대, 암)를 포함한다. 일부 경우에, 변이체 핵산 라이브러리는 모델 시스템, 세포주, 또는 피험체로부터 유래된 1차 세포에서 발현되고, 적어도 하나의 세포 활성의 변화에 대해 스크리닝된다. 예시적인 세포 활성은 제한 없이, 증식, 주기 진행, 세포 사멸, 부착, 이동, 재생, 세포 신호전달, 에너지 생성, 산소 이용, 대사 활성 및 노화, 자유 라디칼 손상에 대한 반응, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.

기판

폴리뉴클레오티드 합성을 위한 표면으로서 사용되는 장치는 제한 없이, 균질한 어레이 표면, 패턴화된 어레이 표면, 채널, 비드, 겔 등을 포함하는 기판의 형태일 수 있다. 본원에서는 각각의 클러스터가 폴리뉴클레오티드의 부착 및 합성을 지원하는 복수의 로커스를 포함하는 것인 복수의 클러스터를 포함하는 것인 기판을 제공한다. 일부 경우에, 기판은 균질한 어레이 표면을 포함한다. 예를 들어, 균질한 어레이 표면은 균질한 플레이트이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "로커스"라는 용어는 미리 결정된 단일 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 표면으로부터 연장되는 것을 지원하는 구조 상의 별개의 영역을 지칭한다. 일부 경우에, 로커스는 2차원 표면, 예컨대, 실질적으로 평평한 표면 상에 위치한다. 일부 경우에, 로커스는 3차원 표면, 예를 들어, 웰, 마이크로웰, 채널, 또는 포스트 상에 위치한다. 일부 경우에, 로커스의 표면은 폴리뉴클레오티드 합성을 위해 적어도 하나의 뉴클레오티드에, 또는 바람직하게, 폴리뉴클레오티드 집단의 합성을 위해 동일한 뉴클레오티드로 이루어진 집단에 부착되도록 능동적으로 작용화된 물질을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 동일한 핵산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 집단을 지칭한다. 일부 경우에, 기판의 표면은 기판의 하나의 표면 또는 복수의 표면을 포함한다. 제공된 시스템 및 방법을 사용하여 본원에서 기술되는 라이브러리 내에서 합성된 폴리뉴클레오티드에 대한 평균 오류율은 종종 오류 보정이 없이, 종종 1000개 중 1개 미만, 2000개 중 약 1개 미만, 3000개 중 약 1개 미만이거나, 이보다 적다.

본원에서는 통상의 지지체 상의 주소 지정 가능한 위치에 상이한 미리 결정된 서열을 갖는, 복수의 폴리뉴클레오티드의 병렬 합성을 지원하는 표면을 제공한다. 일부 경우에, 기판은 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2,000; 5,000; 10,000; 20,000; 50,000; 100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000; 1,200,000; 1,400,000; 1,600,000; 1,800,000; 2,000,000; 2,500,000; 3,000,000; 3,500,000; 4,000,000; 4,500,000; 5,000,000; 10,000,000개 초과, 또는 이보다 많은 비동일한 폴리뉴클레오티드의 합성을 위한 지지체를 제공한다. 일부 경우에, 표면은 상이한 서열을 코딩하는, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2,000; 5,000; 10,000; 20,000; 50,000; 100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000; 1,200,000; 1,400,000; 1,600,000; 1,800,000; 2,000,000; 2,500,000; 3,000,000; 3,500,000; 4,000,000; 4,500,000; 5,000,000; 10,000,000개 초과, 또는 이보다 많은 폴리뉴클레오티드의 합성을 위한 지지체를 제공한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드 중 적어도 일부는 동일한 서열을 갖거나, 또는 동일한 서열로 합성되도록 구성된다. 일부 경우에, 기판은 적어도 적어도 80, 90, 100, 120, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500개 또는 그 초과의 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드의 성장을 위한 표면 환경을 제공한다.

본원에서는 기판의 별개의 로커스에서 폴리뉴클레오티드를 합성하는 방법으로서, 여기서, 각각의 로커스는 폴리뉴클레오티드 집단의 합성을 지원하는 것인 방법을 제공한다. 일부 경우에, 각각의 로커스는 또 다른 로커스에서 성장한 폴리뉴클레오티드 집단과 상이한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 집단의 합성을 지원한다. 일부 경우에, 각각의 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 합성을 위한 표면 상의 로커스의 동일한 클러스터 내의 상이한 로커스에 걸쳐 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 초과의 중복도로 합성된다. 일부 경우에, 기판의 로커스는 복수의 클러스터 내에 위치한다. 일부 경우에, 기판은 적어도 10, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 20000, 30000, 40000, 50000개, 또는 그 초과의 클러스터를 포함한다. 일부 경우에, 기판은 2,000; 5,000; 10,000; 100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000; 1,100,000; 1,200,000; 1,300,000; 1,400,000; 1,500,000; 1,600,000; 1,700,000; 1,800,000; 1,900,000; 2,000,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000; 1,200,000; 1,400,000; 1,600,000; 1,800,000; 2,000,000; 2,500,000; 3,000,000; 3,500,000; 4,000,000; 4,500,000; 5,000,000; 또는 10,000,000개 초과, 또는 이보다 많은 별개의 로커스를 포함한다. 일부 경우에, 기판은 약 10,000개의 별개의 로커스를 포함한다. 단일 클러스터 내의 로커스의 양은 상이한 경우마다 다르다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 150, 200, 300, 400, 500개 또는 그 초과의 로커스를 포함한다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 약 50-500개의 로커스를 포함한다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 약 100-200개의 로커스를 포함한다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 약 100-150개의 로커스를 포함한다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 약 109, 121, 130 또는 137개의 로커스를 포함한다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 약 19, 20, 61, 64개 또는 그 초과의 로커스를 포함한다. 대안적으로 또는 조합하여, 폴리뉴클레오티드 합성은 균질한 어레이 표면에서 발생한다.

일부 경우에, 기판 상에서 합성된 별개의 폴리뉴클레오티드의 개수는 기판에서 이용가능한 별개의 로커스의 개수에 의존한다. 일부 경우에, 기판의 클러스터 또는 표면 내의 로커스의 밀도는 ㎟당 적어도 또는 약 1, 10, 25, 50, 65, 75, 100, 130, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 1,000개 또는 그 초과의 로커스이다. 일부 경우에, 기판은 10-500, 25-400, 50-500, 100-500, 150-500, 10-250, 50-250, 10-200, 또는 50-200 ㎟를 포함한다^. 일부 경우에, 클러스터 또는 표면 내에서 2개의 인접한 로커스의 중심 사이의 거리는 약 10-500, 약 10-200 또는 약 10-100 um이다. 일부 경우에, 인접한 로커스의 두 중심 사이의 거리는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 um 초과이다. 일부 경우에, 2개의 인접한 로커스의 중심 사이의 거리는 약 200, 150, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 um 미만이다. 일부 경우에, 각각의 로커스는 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 um의 폭을 갖는다. 일부 경우에, 각각의 로커스는 약 0.5-100, 0.5-50, 10-75, 또는 0.5-50 um의 폭을 갖는다.

일부 경우에, 기판 내의 클러스터 밀도는 적어도 또는 약 100 ㎟당 1개의 클러스터, 10 ㎟당 1개의 클러스터, 5 ㎟당 1개의 클러스터, 4 ㎟당 1개의 클러스터, 3 ㎟당 1개의 클러스터, 2 ㎟당 1개의 클러스터, 1 ㎟당 1개의 클러스터, 1 ㎟당 2개의 클러스터, 1 ㎟당 3개의 클러스터, 1 ㎟당 4개의 클러스터, 1 ㎟당 5개의 클러스터, 1 ㎟당 10개의 클러스터, 1 ㎟당 50개의 클러스터 또는 그 초과이다. 일부 경우에, 기판은 10 ㎟당 약 1개의 클러스터 내지 1 ㎟당 약 10개의 클러스터를 포함한다. 일부 경우에, 2개의 인접한 클러스터의 중심 사이의 거리는 적어도 또는 약 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 또는 5000 um이다. 일부 경우에, 2개의 인접한 클러스터의 중심 사이의 거리는 약 50-100, 50-200, 50-300, 50-500, 및 100-2000 um이다. 일부 경우에, 2개의 인접한 클러스터의 중심 사이의 거리는 약 0.05-50, 0.05-10, 0.05-5, 0.05-4, 0.05-3, 0.05-2, 0.1-10, 0.2-10, 0.3-10, 0.4-10, 0.5-10, 0.5-5, 또는 0.5-2 mm이다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 약 0.5 내지 약 2, 약 0.5 내지 약 1, 또는 약 1 내지 약 2 mm의 단면을 갖는다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2 mm의 단면을 갖는다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.15, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2 mm의 내부 단면을 갖는다.

일부 경우에, 기판은 대략 표준 96웰 플레이트의 크기, 예를 들어, 약 100 내지 약 200 mm x 약 50 내지 약 150 mm이다. 일부 경우에, 기판은 약 1000, 500, 450, 400, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 mm 이하의 직경을 갖는다. 일부 경우에, 기판의 직경은 약 25-1000, 25-800, 25-600, 25-500, 25-400, 25-300, 또는 25-200 mm이다. 일부 경우에, 기판은 적어도 약 100; 200; 500; 1,000; 2,000; 5,000; 10,000; 12,000; 15,000; 20,000; 30,000; 40,000; 50,000 ㎟ 또는 그 초과의 평면 표면적을 갖는다. 일부 경우에, 기판의 두께는 약 50-2000, 50-1000, 100-1000, 200-1000, 또는 250-1000 mm이다.

표면 물질

본원에서 제공되는 기판, 장치 및 반응기는 본원에서 기술되는 방법, 조성물 및 시스템에 적합한 임의의 다양한 물질로 제조된다. 특정 경우에, 기판 물질은 낮은 수준의 뉴클레오티드 결합을 나타내도록 제조된다. 일부 경우에, 기판 물질은 높은 수준의 뉴클레오티드 결합을 나타내는 별개의 표면을 생성하도록 변형된다. 일부 경우에, 기판 물질은 가시광 및/또는 UV 광에 대해 투과성이다. 일부 경우에, 기판 물질은 충분히 전도성이며, 예를 들어, 기판의 전체 또는 일부에 걸쳐 균일한 전기장을 형성할 수 있다. 일부 경우에, 전도성 물질은 전기 접지에 연결된다. 일부 경우에, 기판은 열 전도성이거나, 또는 절연된다. 일부 경우에, 상기 물질은 화학적 또는 생화학적 반응물, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 합성 반응 프로세스를 지원하기 위해 내화학성 및 내열성이다. 일부 경우에, 기판은 가요성 물질을 포함한다. 가요성 물질의 경우, 물질은 제한 없이, 나일론, 개질 및 비개질 니트로셀룰로스, 폴리프로필렌 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 기판은 강성 물질을 포함한다. 강성 물질의 경우, 재료는 제한 없이, 유리; 퓨즈 실리카; 실리콘, 플라스틱(예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리카보네이트 및 그의 블렌드 등); 금속(예를 들어, 금, 백금 등)을 포함할 수 있다. 기판, 고체 지지체 또는 반응기는 실리콘, 폴리스티렌, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스 중합체, 폴리아크릴아미드, 폴리디메틸실록산(PDMS) 및 유리로 이루어지는 군으로부터 선택되는 물질로 제조될 수 있다. 기판/고체 지지체 또는 미세 구조체, 반응기는 본원에서 열거되는 물질의 조합물 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 물질로 제조될 수 있다.

표면 아키텍쳐

본원에서는 본원에 기술된 방법, 조성물 및 시스템에 대한 기판으로서, 여기서 기판은 본원에 기술된 방법, 조성물 및 시스템에 적합한 표면 아키텍쳐를 갖는 것인 기판을 제공한다. 일부 경우에, 기판은 상승 및/또는 하강된 특징부를 포함한다. 이러한 특징부를 갖는 것의 하나의 이점은 폴리뉴클레오티드 합성을 지원하기 위한 표면적의 증가이다. 일부 경우에, 상승 및/또는 하강된 특징부를 갖는 기판은 3차원 기판으로 지칭된다. 일부 경우에, 3차원 기판은 하나 이상의 채널을 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 로커스는 채널을 포함한다. 일부 경우에, 채널은 물질 침착 장치와 같은 침착 장치를 통해 시약 침착에 접근할 수 있다. 일부 경우에, 시약 및/또는 유체는 하나 이상의 채널과 유체 연통하여 더 큰 웰에 수집된다. 예를 들어, 기판은 클러스터와 복수의 로커스에 대응하는 복수의 채널을 포함하고, 복수의 채널은 클러스터의 하나의 웰과 유체 연통된다. 일부 방법에서, 폴리뉴클레오티드의 라이브러리는 클러스터의 복수의 로커스에서 합성된다.

본원에서는 본원에 기술된 방법, 조성물 및 시스템에 대한 기판으로서, 여기서 기판은 폴리뉴클레오티드 합성을 위해 구성된 것인 기판을 제공한다. 일부 경우에, 구조는 표면에서의 폴리뉴클레오티드 합성을 위한 제어된 유동 및 물질 전달 경로를 허용하도록 구성된다. 일부 경우에, 기판의 구성은 폴리뉴클레오티드 합성 동안 물질 전달 경로, 화학 물질 노출 시간 및/또는 세척 효능의 제어된 균일한 분포를 허용한다. 일부 경우에, 기판의 구성은 예를 들어, 성장하는 폴리뉴클레오티드에 의해 배제되는 부피가, 폴리뉴클레오티드 성장을 위해 이용 가능하거나, 또는 적합한 초기 이용 가능 부피의 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1%를 초과하여, 또는 이보다 작은 값을 초과하여 차지하지 않도록 성장하는 폴리뉴클레오티드에 충분한 부피를 제공함으로써 증가된 스윕 효율을 허용한다. 일부 경우에, 3차원 구조는 화학 물질 노출의 신속한 교환을 허용하기 위해 유체의 관리된 유동을 허용한다.

본원에서는 본원에 기술된 방법, 조성물 및 시스템에 대한 기판으로서, 여기서 기판은 본원에 기술된 방법, 조성물 및 시스템에 적합한 구조를 포함하는 것인 기판을 제공한다. 일부 경우에, 물리적 구조에 의해 분리가 이루어진다. 일부 경우에, 분리는 폴리뉴클레오티드 합성을 위한 표면 생성 능동 및 수동 영역의 차등 관능화에 의해 달성된다. 일부 경우에, 기판 표면을 가로질러 소수성을 교대시킴으로써 차등 관능화가 달성되고, 이에 의해 침착된 시약의 비딩 또는 습윤을 야기하는 물 접촉각 효과가 생성된다. 더 큰 구조를 사용하면, 인접한 스폿의 시약을 사용한 별개의 폴리뉴클레오티드 합성 위치의 스플래싱 및 교차 오염을 줄일 수 있다. 일부 경우에, 물질 침착 장치와 같은 장치가 시약을 별개의 폴리뉴클레오티드 합성 위치에 침착시키기 위해 사용된다. 3차원 특징부를 갖는 기판은 낮은 오류율(예컨대, 약 1:500, 1:1000, 1:1500, 1:2,000, 1:3,000, 1:5,000 또는 1:10,000 미만)로 매우 많은 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 약 10,000개 초과)의 합성을 허용하는 방식으로 구성된다. 일부 경우에, 기판은 ㎟당 약 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400 또는 500개의 특징부의 밀도 또는 이를 초과하는 밀도로 특징부를 포함한다.

기판의 웰은 기판의 또 다른 웰과 동일하거나, 또는 상이한 폭, 높이 및/또는 부피를 가질 수 있다. 기판의 채널은 기판의 또 다른 채널과 동일하거나, 또는 상이한 폭, 높이 및/또는 부피를 가질 수 있다. 일부 경우에, 클러스터의 직경 또는 클러스터를 이루는 웰의 직경, 또는 둘 모두는 약 0.05-50, 0.05-10, 0.05-5, 0.05-4, 0.05-3, 0.05-2, 0.05-1, 0.05-0.5, 0.05-0.1, 0.1-10, 0.2-10, 0.3-10, 0.4-10, 0.5-10, 0.5-5, 또는 0.5-2 mm이다. 일부 경우에, 클러스터 또는 웰 또는 둘 모두의 직경은 약 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 또는 0.05 mm이거나, 이보다 작다. 일부 경우에, 클러스터 또는 웰 또는 둘 모두의 직경은 약 1.0 내지 1.3 mm이다. 일부 경우에, 클러스터 또는 웰 또는 둘 모두의 직경은 약 1.150 mm이다. 일부 경우에, 클러스터 또는 웰 또는 둘 모두의 직경은 약 0.08 mm이다. 클러스터의 직경은 2차원 또는 3차원 기판 내의 클러스터를 지칭한다.

일부 경우에, 웰의 높이는 약 20-1000, 50-1000, 100- 1000, 200-1000, 300-1000, 400-1000, 또는 500-1000 um이다. 일부 경우에, 웰의 높이는 약 1000, 900, 800, 700, 또는 600 um 미만이다.

일부 경우에, 기판은 클러스터 내에서 복수의 로커스에 상응하는 복수의 채널을 포함하고, 여기서, 채널의 높이 또는 깊이는 5-500, 5-400, 5-300, 5-200, 5-100, 5-50, 또는 10-50 um이다. 일부 경우에, 채널의 높이는 100, 80, 60, 40, 또는 20 um 미만이다.

일부 경우에, 채널, 로커스(예컨대, 실질적으로 평면인 기판에서) 또는 채널과 로커스 둘 모두(예컨대, 로커스가 채널에 상응하는 3차원 기판에서)의 직경은 약 1-1000, 1-500, 1-200, 1-100, 5-100, 또는 10-100 um, 예를 들어, 약 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 um이다. 일부 경우에, 채널, 로커스, 또는 채널과 로커스 둘 모두의 직경은 약 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 um 미만이다. 일부 경우에, 2개의 인접 채널, 로커스, 또는 채널과 로커스의 중심 사이의 거리는 약 1-500, 1-200, 1-100, 5-200, 5-100, 5-50, 또는 5-30, 예를 들어, 약 20 um이다.

표면 변형

본원에서는 표면이 다양한 표면 변형을 포함하는 것인, 표면에서의 폴리뉴클레오티드 합성 방법을 제공한다. 일부 경우에, 표면 변형은 기판 표면 또는 기판 표면의 선택된 부위 또는 영역의 하나 이상의 화학적 및/또는 물리적 특성을 변화시키기 위한 부가 또는 공제 프로세스에 의한 표면의 화학적 및/또는 물리적 변경을 위해 사용된다. 예를 들어, 표면 변형은 제한 없이, (1) 표면의 습윤 특성 변화, (2) 표면의 관능화, 즉, 표면 작용기의 제공, 변형 또는 치환, (3) 표면의 탈관능화, 즉, 표면 작용기의 제거, (4) 다르게는 예컨대, 에칭을 통한 표면의 화학적 조성의 변경, (5) 표면 거칠기의 증가 또는 감소, (6) 표면에 코팅, 예를 들어, 표면의 습윤 특성과 상이한 습윤 특성을 보이는 코팅의 제공, 및/또는 (7) 표면 상의 미립자의 침착을 포함한다.

일부 경우에, 표면의 상부에 화학물질층(접착 증진제로 언급됨)을 부가하는 것은 기판의 표면 상에 로커스의 구조화된 패턴화를 용이하게 한다. 접착 촉진의 적용을 위한 예시적인 표면은 제한 없이, 유리, 실리콘, 이산화규소 및 질화규소를 포함한다. 일부 예에서, 접착 증진제는 높은 표면 에너지를 갖는 화학물질이다. 일부 경우에, 제2 화학물질층이 기판의 표면 상에 침착된다. 일부 경우에, 제2 화학물질층은 낮은 표면 에너지를 갖는다. 일부 경우에, 표면 상에 코팅된 화학물질층의 표면 에너지가 표면 상의 소적의 국재화를 지지한다. 선택된 패턴화 배열에 따라, 로커스의 근접 및/또는 로커스에서의 유체 접촉 영역이 변경될 수 있다.

일부 경우에, 핵산 또는 다른 모이어티가 예를 들어, 뉴클레오티드 합성을 위해 그 위에 침착되는 기판 표면 또는 분해된 로커스는 평탄하거나, 실질적으로 평면(예를 들어, 2차원)이거나, 또는 불규칙성, 예를 들어, 상승 또는 하강된 특징부(예를 들어, 3차원 특징부)를 갖는다. 일부 경우에, 기판 표면은 화합물의 하나 이상의 상이한 층으로 변형된다. 이러한 관심 있는 변형 층은 제한 없이, 무기 및 유기 층, 예를 들어, 금속, 금속 산화물, 중합체, 유기 소분자 등을 포함한다.

일부 경우에, 기판의 분해된 로커스는 표면 에너지를 증가 및/또는 감소시키는 하나 이상의 모이어티로 관능화된다. 일부 경우에, 모이어티는 화학적으로 비활성이다. 일부 경우에, 모이어티는 원하는 화학 반응, 예를 들어, 뉴클레오티드 합성 반응에서 하나 이상의 프로세스를 지지하도록 구성된다. 표면의 표면 에너지 또는 소수성은 뉴클레오티드가 표면에 부착하는 친화도를 결정하는 인자이다. 일부 경우에, 기판 관능화를 위한 방법은 (a) 이산화규소를 포함하는 표면을 갖는 기판을 제공하는 단계; 및 (b) 본원에 기술되거나, 또는 다르게는 당업계에 공지된 적합한 실란화제, 예를 들어, 유기 작용성 알콕시실란 분자를 사용하여 표면을 실란화하는 단계를 포함한다. 방법 및 관능화제는 미국 특허 제5474796호(상기 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다.

일부 경우에, 기판 표면은 실란을 기판 표면에 커플링하는 데 효과적인 반응 조건하에, 전형적으로 기판 표면 상에 존재하는 반응성 친수성 모이어티를 통해 실란 혼합물을 함유하는 유도체화 조성물과의 접촉에 의해 관능화된다. 실란화는 일반적으로 유기 작용성 알콕시실란 분자를 사용한 자가 어셈블리를 통해 표면을 커버한다. 다양한 실록산 관능화 시약이 예를 들어, 표면 에너지를 낮추거나, 증가시키기 위해 당업계에 현재 알려진 바와 같이 추가로 사용될 수 있다. 유기 작용성 알콕시 실란은 그들의 유기 작용기에 따라 분류된다.

폴리뉴클레오티드 합성

폴리뉴클레오티드 합성에 대한 본 개시내용의 방법은 포스포르아미다이트 화학을 포함하는 프로세스를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드 합성은 염기를 포스포르아미다이트와 커플링시키는 것을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 합성은 커플링 조건하에서 포스포르아미다이트의 침착에 의해 염기를 커플링하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서, 동일한 염기는 임의적으로 포스포르아미다이트로 1회 초과로 침착, 즉, 이중 커플링된다. 폴리뉴클레오티드 합성은 미반응 부위의 캡핑을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 캡핑은 임의적이다. 폴리뉴클레오티드 합성은 또한 산화 또는 산화 단계 또는 산화 단계들을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 합성은 차단해제, 탈트리틸화 및 황화를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드 합성은 산화 또는 황화를 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드 합성 반응 동안 하나 또는 각각의 단계 사이에서, 예를 들어, 테트라졸 또는 아세토니트릴을 사용하여 장치를 세척한다. 포스포르아미다이트 합성 방법에서 임의의 한 단계에 대한 시간 프레임은 약 2 min, 1 min, 50 sec, 40 sec, 30 sec, 20 sec 및 10 sec 미만일 수 있다.

포스포르아미다이트 방법을 사용하는 폴리뉴클레오티드 합성은 포스파이트 트리에스테르 연결의 형성을 위해 성장하는 폴리뉴클레오티드 쇄에 포스포르아미다이트 빌딩 블록(예컨대, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트)의 후속적인 부가를 포함할 수 있다. 포스포르아미다이트 폴리뉴클레오티드 합성은 3'에서 5' 방향으로 진행된다. 포스포르아미다이트 폴리뉴클레오티드 합성은 합성 사이클당 성장하는 핵산 쇄에 대한 하나의 뉴클레오티드의 제어된 부가를 허용한다. 일부 경우에, 각각의 합성 사이클은 커플링 단계를 포함한다. 포스포르아미다이트 커플링은 활성화된 뉴클레오시드 포스포르아미다이트와, 예를 들어, 링커를 통해 기판에 결합된 뉴클레오시드 사이에 포스파이트 트리에스테르 연결을 형성하는 것을 포함한다. 일부 경우에, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트가 활성화된 장치에 제공된다. 일부 경우에, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트가 활성제와 함께 장치에 제공된다. 일부 경우에, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트는 기판에 결합된 뉴클레오시드보다 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100배 과량 또는 그 초과의 양으로 장치에 제공된다. 일부 경우에, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트의 부가는 무수 환경, 예를 들어, 무수 아세토니트릴에서 수행된다. 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 부가한 후, 장치를 임의적으로 세척한다. 일부 경우에, 커플링 단계는 임의적으로 기판에 대한 뉴클레오시드 포스포르아미다이트의 부가 사이의 세척 단계와 함께, 1회 이상 추가로 반복된다. 일부 경우에, 본원에서 사용되는 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 1, 2, 3개 또는 그 초과의 순차적 커플링 단계를 포함한다. 커플링 전에, 많은 경우에, 장치에 결합된 뉴클레오시드는 보호기의 제거에 의해 탈보호화되고, 여기서, 보호기는 중합화를 막기 위해 관능화된다. 일반적인 보호기는 4,4'-디메톡시트리틸(DMT)이다.

커플링 후, 포스포르아미다이트 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 임의적으로 캡핑 단계를 포함한다. 캡핑 단계에서, 성장하는 폴리뉴클레오티드는 캡핑제로 처리된다. 캡핑 단계는 추가의 쇄 연장으로부터 커플링 후 미반응 기판 결합 5'-OH 기를 차단하여 내부 염기가 결실된 폴리뉴클레오티드의 형성을 방지하는 데 유용하다. 또한, 1H-테트라졸로 활성화된 포스포르아미다이트는 구아노신의 O6 위치와 작은 정도로 반응할 수 있다. 이론에 제한되지 않으면서, I₂/물을 사용한 산화시에, 상기 부산물은 아마도 O6-N7 이동을 통해 탈퓨린화를 거칠 수 있다. 탈퓨린 부위는 폴리뉴클레오티드의 최종 탈보호 과정에서 결국 절단되어 전장 생성물의 수율을 감소시킬 수 있다. I₂/물을 사용한 산화 전에 캡핑 시약으로 처리함으로써 O6 변형은 제거될 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드 합성 동안 캡핑 단계를 포함시키면, 캡핑이 없는 합성에 비해 오류율이 감소한다. 예로서, 캡핑 단계는 기판 결합 폴리뉴클레오티드를 무수 아세트산과 1-메틸이미다졸의 혼합물로 처리하는 단계를 포함한다. 캡핑 단계 후에, 장치는 임의적으로 세척된다.

일부 경우에, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트의 부가 후, 및 임의적으로 캡핑 및 1회 이상의 세척 단계 후에, 장치 결합된 성장하는 핵산이 산화된다. 산화 단계는 포스파이트 트리에스테르를 4배위 결합된 포스파이트 트리에스테르, 즉, 자연 발생 포스페이트 디에스테르 뉴클레오시드간 연결의 보호된 전구체로 산화시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 성장하는 폴리뉴클레오티드의 산화는 임의적으로 약 염기(예를 들어, 피리딘, 루티딘, 콜리딘)의 존재하에 요오드 및 물로 처리함으로써 달성된다. 산화는 예를 들어, tert-부틸 하이드로퍼옥시드 또는 (1S)-(+)-(10-캄포르술포닐)-옥사지리딘(CSO)을 사용하여 무수 조건하에서 수행될 수 있다. 일부 방법에서, 캡핑 단계는 산화 후에 수행된다. 계속 존재할 수 있는, 산화로부터 잔류하는 물이 후속 커플링을 억제할 수 있기 때문에, 제2 캡핑 단계는 장치의 건조를 허용한다. 산화 후에, 장치 및 성장하는 폴리뉴클레오티드는 임의적으로 세척된다. 일부 경우에, 산화 단계는 황화 단계로 대체되어 폴리뉴클레오티드 포스포로티오에이트를 수득하고, 여기서, 임의의 캡핑 단계는 황화 후에 수행될 수 있다. 3-(디메틸아미노메틸리덴)아미노)-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온, DDTT, 보카주(Beaucage) 시약으로도 알려진 3H-1,2-벤조디티올-3-온 1,1-디옥시드, 및 N,N,N'N'-테트라에틸티우람 디술피드(TETD)를 포함하나, 이에 제한되지 않는 많은 시약이 효율적인 황 전달을 수행할 수 있다.

커플링을 통해 뉴클레오시드 혼입의 후속 사이클을 수행하기 위해, 1차 하이드록실 기가 다음 뉴클레오시드 포스포르아미다이트와 반응성이 되도록 장치 결합된 성장하는 폴리뉴클레오티드의 보호된 5' 말단을 제거한다. 일부 경우에, 보호기는 DMT이고, 디클로로메탄 중 트리클로로아세트산에 의해 차단 해제가 일어난다. 연장된 시간 동안 또는 권장된 것보다 더 강한 산 용액을 사용하여 탈트리틸화를 수행하면, 고체 지지체 결합 폴리뉴클레오티드의 탈퓨린화가 증가될 수 있고, 따라서, 원하는 전장 생성물의 수율이 감소될 수 있다. 본원에 기술된 개시내용의 방법 및 조성물은 바람직하지 않은 탈퓨린화 반응을 제한하는 제어된 차단 해제 조건을 제공한다. 일부 경우에, 장치 결합된 폴리뉴클레오티드는 차단 해제 후에 세척된다. 일부 경우에, 차단 해제 후의 효율적인 세척은 합성된 폴리뉴클레오티드의 낮은 오류율에 기여한다.

폴리뉴클레오티드의 합성 방법은 전형적으로 다음 단계의 반복하는 순서를 포함한다: 활성화된 표면, 링커 또는 이전에 탈보호된 단량체와 연결하기 위해 능동적으로 관능화된 표면(예를 들어, 로커스)에 보호된 단량체를 적용하는 단계; 적용된 단량체를 탈보호하여 후속적으로 적용되는 보호된 단량체와 반응성이 되도록 하는 단계; 및 연결을 위한 또 다른 보호된 단량체를 적용하는 단계. 하나 이상의 중간 단계는 산화 또는 황화를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 세척 단계가 단계 중의 하나 또는 전부에 선행하거나, 후행한다.

포스포르아미다이트 기반 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 일련의 화학적 단계를 포함한다. 일부 경우에, 합성 방법의 하나 이상의 단계는 시약 사이클링을 포함하며, 이 방법의 하나 이상의 단계는 단계에 유용한 시약을 장치에 적용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 시약은 일련의 액체 침착 및 진공 건조 단계에 의해 순환된다. 웰, 마이크로웰, 채널 등과 같은 3차원 특징부를 포함하는 기판에 대해, 시약은 웰 및/또는 채널을 통해 장치의 하나 이상의 영역을 임의적으로 통과한다.

본원에 기술된 방법 및 시스템은 폴리뉴클레오티드의 합성을 위한 폴리뉴클레오티드 합성 장치에 관한 것이다. 합성은 동시에 수행될 수 있다. 예를 들어, 적어도 또는 약 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 10000, 50000, 75000, 100000개 또는 그 초과의 폴리뉴클레오티드를 동시에 합성할 수 있다. 동시에 합성될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 총 개수는 2-100000, 3-50000, 4-10000, 5-1000, 6-900, 7-850, 8-800, 9-750, 10-700, 11-650, 12-600, 13-550, 14-500, 15-450, 16-400, 17-350, 18-300, 19-250, 20-200, 21-150,22-100, 23-50, 24-45, 25-40, 30-35개일 수 있다. 당업자는 동시에 합성된 폴리뉴클레오티드의 총 개수가 이들 값 중 임의의 값에 의해 규정된 범위 내, 예를 들어, 25-100에 있을 수 있음을 인식할 것이다. 동시에 합성된 폴리뉴클레오티드의 총 개수는 범위의 종점으로 사용되는 임의의 값에 의해 정의된 임의의 범위 내에 있을 수 있다. 장치 내에서 합성된 폴리뉴클레오티드의 총 몰 질량 또는 각각의 폴리뉴클레오티드의 몰 질량은 적어도 또는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 25000, 50000, 75000, 100000 피코몰, 또는 그 초과일 수 있다. 장치 내의 각각의 폴리뉴클레오티드의 길이 또는 폴리뉴클레오티드의 평균 길이는 적어도 또는 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500개 뉴클레오티드 또는 그 초과일 수 있다. 장치 내의 각각의 폴리뉴클레오티드의 길이 또는 폴리뉴클레오티드의 평균 길이는 최대 또는 최대 약 500, 400, 300, 200, 150, 100, 50, 45, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10개 뉴클레오티드 또는 그 미만일 수 있다. 장치 내의 각각의 폴리뉴클레오티드의 길이 또는 폴리뉴클레오티드의 평균 길이는 10-500, 9-400, 11-300, 12-200, 13-150, 14-100, 15-50, 16-45, 17-40, 18-35, 19-25개일 수 있다. 당업자는 장치 내의 각각의 폴리뉴클레오티드의 길이 또는 폴리뉴클레오티드의 평균 길이가 이들 값 중 임의의 값에 의해 규정된 임의의 범위 내, 예를 들어, 100-300일 수 있음을 인식할 것이다. 장치 내의 각각의 폴리뉴클레오티드의 길이 또는 폴리뉴클레오티드의 평균 길이는 범위의 종점으로 사용되는 임의의 값에 의해 정의된 임의의 범위 내에 있을 수 있다.

본원에 제공된 표면 상의 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 빠른 속도의 합성을 가능하게 한다. 예로서, 시간당 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200개 또는 그 초과의 뉴클레오티드가 합성된다. 뉴클레오티드는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 우리딘 빌딩 블록 또는 그의 유사체/변형된 버전을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드의 라이브러리는 기판 상에서 동시에 합성된다. 예를 들어, 약 또는 적어도 약 100; 1,000; 10,000; 30,000; 75,000; 100,000; 1,000,000; 2,000,000; 3,000,000; 4,000,000; 또는 5,000,000개의 분해된 로커스를 포함하는 장치는 적어도 동일한 수의 별개의 폴리뉴클레오티드의 합성을 지지할 수 있고, 여기서, 별개의 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 분해된 로커스 상에서 합성된다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드의 라이브러리는 약 3개월, 2개월, 1개월, 3주, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2일, 24시간 미만 또는 이보다 짧은 시간 미만에 본원에 기술된 낮은 오류율로 장치 상에서 합성된다. 일부 경우에, 본원에 기술된 기판 및 방법을 사용하여 낮은 오류율로 합성된 폴리뉴클레오티드 라이브러리로부터 어셈블리된 보다 큰 폴리뉴클레오티드는 약 3개월, 2개월, 1개월, 3주, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2일, 24시간 미만 또는 이보다 짧은 시간 미만에 제조된다.

일부 경우에, 본원에 기술된 방법은 다수의 코돈 부위가 상이한 변이체 핵산을 포함하는 핵산의 라이브러리 생성을 제공한다. 일부 경우에, 핵산은 1개의 부위, 2개의 부위, 3개의 부위, 4개의 부위, 5개의 부위, 6개의 부위, 7개의 부위, 8개의 부위, 9개의 부위, 10개의 부위, 11개의 부위, 12개의 부위, 13개의 부위, 14개의 부위, 15개의 부위, 16개의 부위, 17개의 부위, 18개의 부위, 19개의 부위, 20개의 부위, 30개의 부위, 40개의 부위, 50개의 부위, 또는 그 초과의 변이체 코돈 부위를 가질 수 있다.

일부 경우에, 변이체 코돈 부위의 하나 이상의 부위는 인접할 수 있다. 일부 경우에, 변이체 코돈 부위의 하나 이상의 부위는 인접하지 않을 수 있고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 코돈으로 분리될 수 있다.

일부 경우에, 핵산은 변이체 코돈 부위의 다수의 부위를 포함할 수 있으며, 모든 변이체 코돈 부위는 서로 인접하여 변이체 코돈 부위의 스트레치를 형성한다. 일부 경우에, 핵산은 변이체 코돈 부위의 다수의 부위를 포함할 수 있으며, 변이체 코돈 부위는 서로 인접하지 않는다. 일부 경우에, 핵산은 변이체 코돈 부위의 다수의 부위를 포함할 수 있으며, 일부 변이체 코돈 부위는 서로 인접하여 변이체 코돈 부위의 스트레치를 형성하고, 변이체 코돈 부위의 일부는 서로 인접하지 않는다.

도면을 참조하면, 도 3은 더 짧은 핵산으로부터 핵산(예컨대, 유전자)의 합성을 위한 예시적인 프로세스 작업 흐름을 도시한 것이다. 작업 흐름은 일반적으로 다음 단계로 분리된다: (1) 단일 가닥 핵산 라이브러리의 드 노보 합성, (2) 더 큰 단편을 형성하기 위한 핵산의 결합, (3) 오류 정정, (4) 품질 관리, 및 (5) 발송. 드 노보 전에, 의도된 핵산 서열 또는 핵산 서열의 군이 미리 선택된다. 예를 들어, 유전자의 군이 생성을 위해 미리 선택된다.

생성을 위한 큰 핵산이 선택되면, 핵산의 미리 결정된 라이브러리가 드 노보 합성을 위해 디자인된다. 고밀도 폴리뉴클레오티드 어레이를 생성하기 위한 다양한 적합한 방법이 공지되어 있다. 작업 흐름의 예에서, 장치 표면 층이 제공된다. 이 예에서, 폴리뉴클레오티드 합성 프로세스를 개선하기 위해 표면의 화학적 성질이 변경된다. 표면 에너지가 낮은 영역은 액체를 밀어내기 위해 생성되며, 표면 에너지가 높은 영역은 액체를 끌어당기도록 생성된다. 표면 그 자체는 평면인 표면의 형태일 수 있거나, 또는 표면적을 증가시키는 돌출부 또는 마이크로웰과 같은 형태의 변형을 포함한다. 작업 흐름의 예에서, 선택된 높은 표면 에너지 분자는 국제 특허 출원 공개 WO/2015/021080(상기 출원은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시된 바와 같이 DNA 화학을 지지하는 이중 기능을 제공한다.

폴리뉴클레오티드 어레이의 계내 제조는 고체 지지체 상에 생성되고, 단일 뉴클레오티드 연장 프로세스를 이용하여 다수의 올리고머를 동시에 연장한다. 물질 침착 장치와 같은 침착 장치는 다수의 폴리뉴클레오티드가 미리 결정된 핵산 서열을 갖는 올리고머를 생성하기 위해 한 번에 하나의 잔기를 동시에 연장하는 단계적 방식으로 시약을 방출하도록 디자인된다(302). 일부 경우에, 핵산은 이 단계에서 표면으로부터 절단된다. 절단은 예컨대, 암모니아 또는 메틸아민을 사용한 기체 절단을 포함한다.

생성된 폴리뉴클레오티드 라이브러리는 반응 챔버에 배치된다. 이 예시적인 작업 흐름에서, 반응 챔버("나노 반응기"로도 지칭됨)는 PCR 시약을 함유하고, 폴리뉴클레오티드 라이브러리 상으로 하강된 규소 코팅된 웰이다(303). 폴리뉴클레오티드의 실링(304) 전 또는 후에, 시약은 기판으로부터 폴리뉴클레오티드를 방출하기 위해 첨가된다. 예시적인 작업 흐름에서, 폴리뉴클레오티드는 나노 반응기의 실링 후에 방출된다(305). 일단 방출되면, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드의 단편은 DNA의 전체 길이 범위의 서열에 걸치기 위해 하이브리드화된다. 부분적 하이브리드화(305)는 각각의 합성된 폴리뉴클레오티드가 풀 내의 적어도 하나의 다른 폴리뉴클레오티드와 중첩되는 작은 부분을 갖도록 디자인되기 때문에 가능하다.

하이브리드화 후, PCA 반응이 개시된다. 폴리머라제 사이클 동안, 폴리뉴클레오티드는 상보성 단편에 어닐링되고, 갭은 폴리머라제에 의해 채워진다. 각각의 사이클은 어느 폴리뉴클레오티드들이 서로를 발견하는지에 따라 다양한 단편의 길이를 무작위로 증가시킨다. 단편 사이의 상보성은 이중 가닥 DNA의 완전한 큰 스팬을 형성하게 한다(306).

PCA가 완료된 후, 나노 반응기는 장치로부터 분리되고(307), PCR을 위한 프라이머를 갖는 장치와의 상호작용을 위해 배치된다(308). 실링 후, 나노 반응기는 PCR에 적용되고(309), 더 큰 핵산이 증폭된다. PCR 후에(310), 나노 챔버가 오픈되고(311), 오류 정정 시약이 첨가되고(312), 챔버가 실링되고(313), 오류 정정 반응이 발생하여 이중 가닥 PCR 증폭 산물로부터 불량한 상보성을 갖는 미스매치된 염기쌍 및/또는 가닥을 제거한다(314). 나노 반응기는 오픈되고, 분리된다(315). 오류 정정된 생성물은 다음에 PCR 및 분자 바 코딩과 같은 추가의 프로세싱 단계를 거친 후, 발송(323)을 위해 패키징된다(322).

일부 경우에, 품질 관리 조치가 취해진다. 오류 정정 후에, 품질 관리 단계는 예를 들어, 오류 정정된 생성물의 증폭(316)을 위한 시퀀싱 프라이머를 갖는 웨이퍼와의 상호작용, 오류 정정된 증폭 생성물을 포함하는 챔버로의 웨이퍼의 실링(317) 및 추가의 증폭 라운드의 수행(318)을 포함한다. 나노 반응기가 오픈되고(319), 생성물은 풀링되고(320), 시퀀싱된다(321). 허용가능한 품질 관리 결정이 내려지면, 패키징된 생성물(322)은 발송(323)을 위해 승인된다.

일부 경우에, 도 3에서와 같이 작업 흐름에 의해 생성되는 핵산은 본원에 개시된 중첩 프라이머를 사용한 돌연변이 유발에 적용된다. 일부 경우에, 프라이머의 라이브러리는 고체 지지체 상의 계내 제조에 의해 생성되고, 단일 올리고뉴클레오티드 연장 프로세스를 이용하여 다수의 올리고머를 동시에 연장한다. 물질 침착 장치와 같은 침착 장치는 다수의 폴리뉴클레오티드가 미리 결정된 핵산 서열을 갖는 올리고머를 생성하기 위해 한 번에 하나의 잔기를 동시에 연장하는 단계적 방식으로 시약을 방출하도록 디자인된다(302).

컴퓨터 시스템

본원에 기술된 임의의 시스템은 컴퓨터에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 컴퓨터를 통해 근거리에서 또는 원격으로 자동화될 수 있다. 다양한 경우에 있어서, 본 개시내용의 방법 및 시스템은 컴퓨터 시스템 상의 소프트웨어 프로그램 및 그의 사용을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 물질 침착 장치 이동, 분배 동작 및 진공 작동을 조율하고, 동기화하는 것과 같은 분배/진공/리필 기능의 동기화를 위한 컴퓨터 제어는 본 개시내용의 범위 내에 있다. 컴퓨터 시스템은 기판의 특정 영역에 정확한 시약을 전달하기 위해 사용자 지정 염기 서열과 물질 침착 장치의 위치 사이를 인터페이스로 연결하도록 프로그래밍될 수 있다.

도 4에 도시된 컴퓨터 시스템(400)은 고정 매체(412)를 갖는 서버(409)에 임의적으로 접속될 수 있는 매체(411) 및/또는 네트워크 포트(405)로부터의 명령을 판독할 수 있는 논리 장치로서 이해될 수 있다. 도 4에 도시된 것과 같은 시스템은 CPU(401), 디스크 드라이브(403), 임의적인 입력 장치, 예컨대 키보드(415) 및/또는 마우스(416) 및 임의적인 모니터(407)를 포함할 수 있다. 데이터 통신은 근거리 또는 원격 위치의 서버에 대한 표시된 통신 매체를 통해 달성될 수 있다. 통신 매체는 데이터를 전송신 및/또는 수신하는 임의의 수단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 통신 매체는 네트워크 접속, 무선 접속 또는 인터넷 접속일 수 있다. 이러한 접속은 월드 와이드 웹(World Wide Web)을 통한 통신을 제공할 수 있다. 본 개시내용과 관련된 데이터는 도 4에 도시된 바와 같은 파티(422)에 의한 수신 및/또는 검토를 위해 이러한 네트워크 또는 접속을 통해 전송될 수 있다는 것이 구상된다.

도 5는 본 개시내용의 예시적인 실시예와 관련하여 사용될 수 있는 컴퓨터 시스템(500)의 예시적인 제1 아키텍쳐를 보여주는 블록도이다. 도 5에 도시된 바와 같이, 예시적인 컴퓨터 시스템은 명령을 처리하기 위한 프로세서(502)를 포함할 수 있다. 프로세서의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 인텔(Intel) 제온(Xeon)™ 프로세서, AMD 옵테론(Opteron)™ 프로세서, 삼성(Samsung) 32-비트 RISC ARM 1176JZ(F)-S v10™ 프로세서, ARM 코텍스(Cortex)-A8 삼성 S5PC100™ 프로세서, ARM 코텍스-A8 애플(Apple) A4™ 프로세서, 마벨(Marvell) PXA 930™ 프로세서, 또는 기능적으로 등가인 프로세서. 다수의 실행 쓰레드(thread of execution)가 병렬식 프로세싱을 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 다수의 프로세서, 또는 다수의 코어를 가진 프로세서가 또한, 단일 컴퓨터 시스템에서, 클러스터에서, 또는 다수의 컴퓨터, 휴대 전화기 및/또는 개인 휴대용 정보 단말기를 포함하는 네트워크 상에 걸쳐 분산된 시스템에서 사용될 수 있다.

도 5에 도시된 바와 같이, 고속 캐시(504)를 프로세서(502)에 연결하거나, 도입하여, 프로세서(502)에 의해 최근에 사용되었거나 빈번하게 사용되는 명령 또는 데이터를 위한 고속 메모리를 제공할 수 있다. 프로세서(502)는 프로세서 버스(508)에 의해 노쓰 브릿지(506)에 연결된다. 노쓰 브릿지(506)는 메모리 버스(512)에 의해 랜덤 접근 메모리(RAM: random access memory)에 연결되고, 프로세서(502)에 의해 RAM(510)으로의 접근을 관리한다. 노쓰 브릿지(506)는 칩셋 버스(516)에 의해 사우쓰 브릿지(514)에도 연결된다. 이어서, 사우쓰 브릿지(514)는 주변 버스(518)에 연결된다. 주변 버스는 예를 들어, PCI, PCI-X, PCI 익스프레스(Express) 또는 다른 주변 버스일 수 있다. 노쓰 브릿지 및 사우쓰 브릿지는 종종 프로세서 칩셋으로서 지칭되고, 프로세서, RAM, 및 주변 버스(518) 상의 주변 구성요소 사이의 데이터 전달을 관리한다. 일부 대안적 아키텍쳐에서, 별개의 노쓰 브릿지 칩을 사용하는 대신에 노쓰 브릿지의 기능을 프로세서 내로 도입할 수 있다. 일부 경우에, 시스템(500)은 주변 버스(518)에 부착된 가속기 카드(522)를 포함할 수 있다. 가속기는 필드 프로그래밍 가능 게이트 어레이(FPGA: field programmable gate array), 또는 특정 프로세싱을 가속화하기 위한 다른 하드웨어를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가속기는 적응 데이터 재구조화를 위해, 또는 연장된 세트 프로세싱에서 사용된 대수적 표현의 평가를 위해 사용될 수 있다.

소프트웨어 및 데이터는 외부 저장장치(524)에 저장되고, 프로세서에 의한 사용을 위해 RAM(510) 및/또는 캐시(504)에 로딩될 수 있다. 시스템(500)은 시스템 자원을 관리하기 위한 운영 체계를 포함하고; 운영 체계의 비제한적인 예는 본 개시내용의 예시적인 실시양태에 따라 데이터 저장 및 최적화를 관리하기 위한 운영 체계의 상부 상에서 실행되는 응용 소프트웨어 뿐만 아니라, 리눅스(Linux), 윈도우™, 마코스(MACOS)™, 블랙베리(BlackBerry) OS™, iOS™ 및 다른 기능적으로 동등한 운영 체계도 포함한다. 이 예에서, 시스템(500)은 또한 외부 저장 장치, 예컨대, 네크워크 결합 스토리지(NAS)에 대한 네트워크 인터페이스를 제공하기 위해 주변 버스에 연결된 네트워크 인터페이스 카드(NIC: network interface card)(520 및 521), 및 분산된 병렬식 프로세싱을 위해 사용될 수 있는 다른 컴퓨터 시스템도 포함한다.

도 6은 다수의 컴퓨터 시스템(602a 및 602b), 다수의 휴대 전화기 및 개인 휴대용 정보 단말기(602c) 및 네크워크 결합 스토리지(NAS)(604a 및 604b)를 갖는 네트워크(600)를 보여주는 다이어그램이다. 예시적 실시양태에서, 시스템(602a, 602b 및 602c)은 데이터 저장을 관리할 수 있고, 네크워크 결합 스토리지(NAS)(604a 및 604b)에 저장된 데이터에 대한 데이터 접근을 최적화할 수 있다. 데이터를 위해 수학적 모델을 이용할 수 있고, 컴퓨터 시스템(602a 및 602b), 및 휴대 전화기 및 개인 휴대용 정보 단말기 시스템(602c)에 걸쳐 분산된 병렬식 프로세싱을 이용하여 이러한 모델을 평가할 수 있다. 컴퓨터 시스템(602a 및 602b), 및 휴대전화 및 개인 휴대용 정보 단말기 시스템(602c)도 네크워크 결합 스토리지(NAS)(604a 및 604b)에 저장된 데이터의 적응 데이터 재구조화를 위한 병렬식 프로세싱을 제공할 수 있다. 도 6은 단지 한 예만을 보여주지만, 매우 다양한 다른 컴퓨터 아키텍쳐 및 시스템이 본 개시내용의 다양한 예와 함께 이용될 수 있다. 예를 들어, 블레이드 서버를 이용하여 병렬식 프로세싱을 제공할 수 있다. 백플레인을 통해 프로세서 블레이드를 연결하여 병렬식 프로세싱을 제공할 수 있다. 저장 장치도 백플레인에 연결될 수 있거나, 또는 별개의 네트워크 인터페이스를 통해 네크워크 결합 스토리지(NAS)로서 연결될 수 있다. 일부 예시적인 실시양태에서, 프로세서는 별개의 메모리 공간을 유지할 수 있고, 다른 프로세서에 의한 병렬식 프로세싱을 위해 네트워크 인터페이스, 백플레인 또는 다른 연결기를 통해 데이터를 전송할 수 있다. 다른 예에서, 프로세서의 일부 또는 전부가 공유된 가상 주소 메모리 공간을 이용할 수 있다.

도 7은 예시적인 실시양태에 따라 공유된 가상 어드레스 메모리 공간을 이용하는 멀티프로세서 컴퓨터 시스템(700)의 블록 다이어그램이다. 상기 시스템은 공유된 메모리 서브시스템(704)에 접근할 수 있는 다수의 프로세서(702a-f)를 포함한다. 상기 시스템은 다수의 프로그래밍 가능한 하드웨어 메모리 알고리즘 프로세서(MAP: memory algorithm processor)(706a-706f)을 메모리 서브시스템(704) 내로 도입한다. 각각의 MAP(706a-f)는 메모리(708a-f) 및 하나 이상의 필드 프로그래밍 가능한 게이트 어레이(FPGA)(710a-f)를 포함할 수 있다. MAP는 구성 가능한 기능적 유닛을 제공하고, 특정 알고리즘 또는 알고리즘의 일부는 각각의 프로세서와 긴밀히 협력된 프로세싱을 위해 FPGA(710a-f)에게 제공될 수 있다. 예를 들면, 예시적인 경우에서 MAP를 이용하여 데이터 모델에 대한 대수적 표현을 평가하고, 적응 데이터 재구조화를 수행할 수 있다. 이 예에서, 각각의 MAP는 상기 목적을 위해 모든 프로세서들에 의해 전체적으로 접근될 수 있다. 한 구성에서, 각각의 MAP는 직접 메모리 접근(DMA: Direct Memory Access)을 이용하여 관련된 메모리(708a-f)에 접근함으로써, 상기 메모리가 각각의 마이크로프로세서(702a-f)로부터 독립적으로 및 비동기적으로 과제를 실행할 수 있다. 이 구성에서, MAP는 알고리즘의 파이프라이닝 및 병렬식 실행을 위해 결과를 또 다른 MAP에게 직접 공급할 수 있다.

상기 컴퓨터 아키텍쳐 및 시스템은 단지 예일 뿐이고, 일반적인 프로세서, 보조 프로세서, FPGA 및 다른 프로그래밍 가능한 논리 디바이스의 임의의 조합을 이용하는 시스템, 시스템 온 칩(SOC: system on chip), 특정 용도 집적 회로(ASIC: application specific integrated circuit), 및 다른 프로세싱 및 논리 요소를 비롯한 매우 다양한 다른 컴퓨터, 휴대 전화기 및 개인 휴대용 정보 단말기 아키텍쳐 및 시스템이 예시적 실시양태와 관련하여 사용될 수 있다. 일부 경우에, 컴퓨터 시스템 모두 또는 일부가 소프트웨어 또는 하드웨어에서 실행될 수 있다. 랜덤 접근 메모리, 하드 드라이브, 플래시 메모리, 테이프 드라이브, 디스크 어레이, 네크워크 결합 스토리지(NAS), 및 다른 근거리 또는 분산된 데이터 저장 디바이스 및 시스템을 비롯한 임의의 다양한 데이터 저장 매체가 예시적 경우와 관련하여 사용될 수 있다.

예시적 경우에서, 상기 또는 다른 컴퓨터 아키텍쳐 및 시스템 중 임의의 것에서 실행되는 소프트웨어 모듈을 이용하여 컴퓨터 시스템을 실행할 수 있다. 다른 경우에서, 펌웨어, 프로그래밍 가능한 논리 디바이스, 예컨대, 도 5에서 언급된 필드 프로그래밍 가능한 게이트 어레이(FPGA), 시스템 온 칩(SOC), 특정 용도 집적 회로(ASIC), 또는 다른 프로세싱 및 논리 요소에서 시스템의 기능을 부분적으로 또는 완전히 실행할 수 있다. 예를 들어, 하드웨어 가속기 카드, 예컨대, 도 5에 제시된 가속기 카드(522)의 사용을 통한 하드웨어 가속으로 세트 프로세서 및 옵티마이저(Optimizer)를 실행할 수 있다.

하기 실시예는 당업자에게 본원에 개시된 실시양태의 원리 및 실시를 더욱 명확하게 예시하기 위해 제시되는 것으로, 임의의 청구된 실시양태의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 달리 언급하지 않는 한, 모든 부 및 백분율은 중량 기준이다.

실시예

하기 실시예는 본 개시내용의 다양한 실시양태를 설명하기 위해 제공되는 것이며, 어느 방식으로든 본 개시내용을 제한하려는 것이 아니다. 본원에 기술된 방법과 함께, 본 실시예는 현재 바람직한 실시양태를 나타내고 있으며, 예시적이고, 본 개시내용의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 청구범위의 범주에 의해 정의되는 본 개시내용의 정신 내에 포함되는 변경 및 다른 용도는 당업자에게 구상될 수 있을 것이다.

실시예 1: 장치 표면의 관능화

폴리뉴클레오티드의 라이브러리의 부착 및 합성을 지지하도록 하기 위해 장치를 관능화시켰다. 장치 표면을 먼저 90% H₂SO₄ 및 10% H₂O₂를 포함하는 피라냐 용액을 사용하여 20분 동안 습식 세정하였다. 장치를 여러 비이커에서 DI 수로 세정하고, 5 min 동안 DI 수 거위목형 꼭지 아래에 놓고, N₂로 건조시켰다. 이어서, 장치를 5 min 동안 NH₄OH(1:100; 3 mL:300 mL)에 침지시키고, 핸드건을 사용하여 DI 수로 세정하고, DI 수가 있는 3개의 연속적인 비이커에 각각 1 min 동안 침지시킨 후, 핸드건을 사용하여 DI 수로 다시 세정하였다. 이어서, 장치 표면을 O₂에 노출시켜 장치를 플라스마로 세정하였다. SAMCO PC-300 기기를 사용하여 하류 모드에서 1 min 동안 250 와트에서 O₂ 플라즈마 에칭을 수행하였다.

세정된 장치 표면을 다음 파라미터를 갖는 YES-1224P 기상 증착 오븐 시스템을 사용하여 N-(3-트리에톡시실릴프로필)-4-하이드록시부티르아미드를 포함하는 용액으로 능동적으로 관능화시켰다: 0.5 내지 1 torr, 60 min, 70℃, 135℃ 기화기. 장치 표면은 브루어 사이언스(Brewer Science) 200X 스핀 코터를 사용하여 레지스트 코팅하였다. SPR™ 3612 포토레지스트를 2500 rpm에서 40 sec 동안 장치에 스핀 코팅하였다. 이 장치는 브루어 고온 플레이트에서 90℃에서 30min 동안 예비 베이킹하였다. 장치를 칼 수스(Karl Suss) MA6 마스크 정렬 장치를 사용하여 리소그래피하였다. 장치를 2.2 sec 동안 노출시키고, MSF 26A에서 1 min 동안 현상시켰다. 남아있는 현상액을 핸드건으로 세정하고, 장치를 5 min 동안 물에 침지시켰다. 장치는 오븐에서 100℃에서 30 min 동안 베이킹한 후, 니콘(Nikon) L200을 사용하여 리소그래피 결함을 육안으로 검사하였다. 데스 컴(descum) 프로세스를 사용하여 250 와트에서 1 min 동안 O₂ 플라즈마 에칭을 수행하는 SAMCO PC-300 장비를 사용하여 잔류 레지스트를 제거하였다.

장치 표면을 10 ㎕의 경질 광유와 혼합된 퍼플루오로옥틸트리클로로실란 용액 100 ㎕로 수동적으로 관능화시켰다. 장치를 챔버에 넣고, 10 min 동안 펌핑한 후, 펌프로 가는 밸브를 닫고, 10 min 동안 방치하였다. 챔버로부터 공기를 배출하였다. 장치는 최대 출력(크레스트 시스템(Crest system)에서 9)의 초음파 처리와 함께 70℃에서 500 mL NMP에서 5 min 동안 2회의 침지를 수행하여 레지스트를 제거하였다. 이어서, 장치를 최대 출력의 초음파 처리와 함께 실온에서 500 mL의 이소프로판올에 5 min 동안 침지시켰다. 장치를 300 mL의 200 도수(proof) 에탄올에 침지시키고, N₂를 송풍하여 건조시켰다. 관능화된 표면은 활성화되어 폴리뉴클레오티드 합성을 위한 지지체로서의 역할을 하였다.

실시예 2: 올리고뉴클레오티드 합성 장치 상의 50-mer 서열의 합성

2차원 올리고뉴클레오티드 합성 장치를 유동셀(Applied Biosystems)(ABI394 DNA Synthesizer"))에 연결된 유동셀로 어셈블리하였다. 2차원 올리고뉴클레오티드 합성 장치를 N-(3-트리에톡시실릴프로필)-4-하이드록시부티르아미드(Gelest)로 균일하게 관능화하고, 이를 이용하여 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 합성 방법을 이용하여 50 bp의 예시적인 폴리뉴클레오티드("50-mer 폴리뉴클레오티드")를 합성하였다.

50-mer의 서열은 다음 서열 번호 2에 기술된 바와 같았다: 5'AGACAATCAACCATTTGGGGTGGACAGCCTTGACCTCTAGACTTCGGCAT##TTTTTTTTTT3' (서열 번호 2), 여기서, #은 탈보호 동안 표면으로부터 올리고머를 방출할 수 있게 하는 절단 가능한 링커인 티미딘-숙시닐 헥사마이드 CED 포스포르아미다이트(ChemGenes로부터의 CLP-2244)를 나타낸다.

표 3의 프로토콜에 따른 표준 DNA 합성 화학 반응(커플링, 캡핑, 산화 및 차단 해제) 및 ABI 합성기를 이용하여 합성을 수행하였다.

포스포르아미다이트/활성제 조합을 유동셀을 통한 벌크 시약의 전달과 유사하게 전달하였다. 환경이 전체 시간 동안 시약에 의해 "습한" 상태로 유지되기 때문에 건조 단계를 수행하지 않았다.

유동 제한제를 ABI 394 합성기로부터 제거하여, 더 빨리 유동할 수 있도록 하였다. 보다 빠른 유동을 가능하게 하였다. 유동 제한제를 이용하지 않았을 때, 아미다이트(ACN 중의 0.1 M), 활성제(ACN 중의 0.25 M 벤조일티오테트라졸("BTT"; GlenResearch로부터의 30-3070-xx) 및 Ox(20% 피리딘, 10% 물 및 70% THF 중의 0.02 M I₂)에 대한 유속은 대략 ~100 uL/sec였고, 아세토니트릴("ACN") 및 캡핑 시약(CapA와 CapB의 1:1 혼합물, 여기서, CapA는 THF/피리딘 중의 아세트산 무수물이고, CapB는 THF 중의 16% 1-메틸이미디졸)에 대한 유속은 대략 ~200 uL/sec였고, 차단 해제제(톨루엔 중의 3% 디클로로아세트산)에 대한 유속은 대략 ~300 uL/sec였다(유속 제한제를 사용하였을 때 모든 시약에 대한 ~50 uL/sec의 유속과 비교). 산화제를 완전히 밀어내기 위한 시간을 관찰하였고, 이에 따라 화학적 유동 시간에 대한 타이밍을 조절하였고, 여분의 ACN 세척을 상이한 화합물들 사이에 수행하였다. 폴리뉴클레오티드 합성 후, 칩을 75 psi에서 암모니아 기체로 밤새도록 탈보호화하였다. 5개의 물방울을 표면에 적용하여 폴리뉴클레오티드를 회수하였다. 이어서, 회수된 폴리뉴클레오티드를 바이오애널라이저 작은 RNA 칩 상에서 분석하였다.

실시예 3: 올리고뉴클레오티드 합성 장치 상의 100-mer 서열의 합성

50-mer 서열의 합성을 위해 실시예 2에서 설명된 프로세스와 동일한 프로세스를, 2개의 상이한 실리콘 칩(N-(3-트리에톡시실릴프로필)-4-하이드록시부티르아미드로 균일하게 관능화된 제1 칩, 및 11-아세톡시운데실트리에톡시실란 및 n-데실트리에톡시실란의 5/95 믹스로 관능화된 제2 칩) 상에서 100-mer 폴리뉴클레오티드(100-mer 폴리뉴클레오티드("100-mer 폴리뉴클레오티드"; 5' CGGGATCCTTATCGTCATCGTCGTACAGATCCCGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATACCATGATGATGATGATGATGAGAACCCCGCAT##TTTTTTTTTT3', 여기서, #은 티미딘-숙시닐 헥사마이드 CED 포스포르아미다이트(ChemGenes로부터의 CLP-2244); 서열 번호 3)의 합성을 위해 사용하였고, 표면으로부터 추출된 폴리뉴클레오티드를 바이오애널라이저 기기 상에서 분석하였다.

50 uL PCR 믹스(25 uL NEB Q5 마스터믹스, 2.5 uL 10 uM 정방향 프라이머, 2.5 uL 10 uM 역방향 프라이머, 표면으로부터 추출된 1 uL 폴리뉴클레오티드, 및 50 uL가 될 때까지 물로 채움) 중의 정방향 프라이머(5'ATGCGGGGTTCTCATCATC3'; 서열 번호 4) 및 역방향 프라이머(5'CGGGATCCTTATCGTCATCG3'; 서열 번호 5)를 사용하고, 하기 열순환 프로그램을 이용하여 상기 2개의 칩으로부터의 10개의 모든 샘플을 PCR에 의해 추가로 증폭시켰다:

98℃, 30 sec

98℃, 10 sec; 63℃, 10 sec; 72℃, 10 sec; 12사이클 반복

72℃, 2 min.

또한, PCR 생성물을 바이오애널라이저 상에서 분석하였고, 100-mer 위치에서 날카로운 피크를 제시하였다. 이어서, PCR에 의해 증폭된 샘플을 클로닝하고, 생어 시퀀싱을 수행하였다. 표 4는 칩 1로부터의 스폿 1-5로부터 채취된 샘플 및 칩 2로부터의 스폿 6-10으로부터 채취된 샘플에 대한 생어 시퀀싱으로부터의 결과를 요약한 것이다.

따라서, 합성된 폴리뉴클레오티드의 고품질 및 균일성은 상이한 표면 화학을 갖는 2개의 칩 상에서 반복하였다. 종합적으로, 시퀀싱된 262개의 100-mer 중 233개에 상응하는 89%가 오류가 없는 완벽한 서열이었다.

표 5는 스폿 1-10으로부터의 폴리뉴클레오티드 샘플로부터 수득된 서열에 대한 오류 특징을 요약한 것이다.

실시예 4: 펩티드 리간드 상호작용에 기반한 GLP1R 결합 도메인 디자인

GLP1R 결합 도메인은 GLP1R과 상호작용하는 펩티드 리간드 사이의 상호작용 표면을 기반으로 디자인하였다. 모티프 변이체는 N-말단 GLP1R 리간드 상호작용 표면 뿐만 아니라, ECD와의 펩티드 상호작용 표면을 기반으로 생성되었다. 이는 구조 모델링을 사용하여 수행되었다. 예시적인 모티프 변이체는 표 6에 나타난 바와 같이 글루카곤 유사 펩티드와 GLP1R의 상호작용을 기반으로 하여 생성되다. 모티프 변이체 서열은 글루카곤 유사 펩티드로부터의 하기 서열을 사용하여 생성되었다: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (서열 번호 6).

실시예 5: 항체 스캐폴드의 디자인

스캐폴드를 생성하기 위해, 구조 분석, 중쇄의 레퍼토리 시퀀싱 분석 및 이종이량체 고속 시퀀싱 데이터세트에 대한 특정 분석을 수행하였다. 각각의 중쇄는 각각의 경쇄 스캐폴드와 관련되었다. 각각의 중쇄 스캐폴드에는 5개의 상이한 긴 CDR-H3 루프 옵션이 할당되었다. 각각의 경쇄 스캐폴드에는 5개의 상이한 L3 스캐폴드가 할당되었다. 중쇄 CDR-H3 줄기는 개체 및 V-유전자 세그먼트 둘 모두에 걸쳐서 발견되는 빈번하게 관찰된 긴 H3 루프 줄기(N-말단 및 C-말단의 10개의 아미노산)로부터 선택되었다. 경쇄 스캐폴드 L3은 긴 H3을 포함하는 이종이량체로부터 선택되었다. CDR H1, H2, L1, L2, L3 및 CDR-H3 줄기가 고정된, 단백질 데이터 뱅크(PDB: Protein Data Bank) 및 딥 시퀀싱 데이터세트로부터의 정보에 기초한 직접적인 이종이량체가 사용되었다. 이어서, 다양한 스캐폴드는 발현을 평가하기 위해 파지 상의 디스플레이를 위해 포맷하였다.

구조 분석

그로부터 적어도 25개 아미노산 길이의 긴 CDR-H3을 갖는 22개의 구조가 관찰된 약 2,017개의 항체 구조를 분석하였다. 중쇄는 다음을 포함하였다: IIGHV1-69, IGHV3-30, IGHV4-49, 및 IGHV3-21. 확인된 경쇄는 다음을 포함하였다: IGLV3-21, IGKV3-11, IGKV2-28, IGKV1-5, IGLV1-51, IGLV1-44, 및 IGKV1-13. 분석에서, IGHV4-59/61-IGLV3-21, IGHV3-21-IGKV2-28, IGHV1-69-IGKV3-11, 및 IGHV1-69-IGKV1-5를 포함하는 4개의 이종이량체 조합이 다회 관찰되었다. 서열 및 구조에 대한 분석을 통해, 긴 H3 안정성에 대한 지지를 제공하는 줄기에 벌키한 측쇄, 예컨대, 티로신을 패킹함으로써 몇몇 구조에서 CDR-H3 내 디술파이드 결합을 확인하였다. 베타-턴-베타 시트 및 "해머헤드" 서브도메인을 포함하는 2차 구조가 또한 관찰되었다.

레퍼토리 분석

레퍼토리 분석은 1,083,875개의 IgM+/CD27-나이브 B 세포 수용체(BCR: B cell receptor) 서열 및 12명의 건강한 대조군으로부터 비편향된 5' RACE에 의해 수득된 1,433,011개의 CD27+ 서열에 대해 수행되었다. 12명의 건강한 대조군은 같은 수의 남성과 여성으로 구성되었으며, 4명의 백인, 4명의 아시아인 및 4명의 히스패닉계 개인으로 구성되었다. 레퍼토리 분석은 인간 레퍼토리의 1% 미만이, 21개 아미노산보다 더 긴 CDR-H3을 갖는 BCR을 포함함을 입증하였다. IGHV1-69, IGHV4-34, IGHV1-18 및 IGHV1-8을 갖는 긴 CDR3 서브레퍼토리에서 V-유전자 편향이 관찰되었는데, 이는 긴 H3 루프를 갖는 BCR에서의 우선적인 농축을 나타낸다. 긴 루프에 대한 편향은 IGHV3-23, IGHV4-59/61, IGHV5-51, IGHV3-48, IGHV3-53/66, IGHV3-15, IGHV3-74, IGHV3-73, IGHV3-72, 및 IGHV2-70에 대해 관찰되었다. IGHV4-34 스캐폴드는 자가 반응성이고, 짧은 반감기를 갖는 것으로 입증되었다.

긴 루프에 대한 생존 가능한 N-말단 및 C-말단 CDR-H3 스캐폴드 변이가 또한 5' RACE 참조 레퍼토리에 기초하여 디자인되었다. 길이가 22개 아미노산 이상인 약 81,065개의 CDR-H3이 관찰되었다. V-유전자 스캐폴드를 비교함으로써, 스캐폴드 다양성이 다수의 스캐폴드 참조 내에 클로닝될 수 있도록 하는 스캐폴드 특이적 H3 줄기 변이가 회피되었다.

이종이량체 분석

이형이량체 분석은 스캐폴드에 대해 수행되었고, 스캐폴드의 변이체 서열 및 길이를 검정하였다.

구조 분석

변이체 서열의 GPCR 스캐폴드를 사용하여 구조 분석을 수행하고, 길이를 검정하였다.

실시예 6: GPCR 항체 라이브러리의 생성

GPCR-리간드 상호작용 표면 및 스캐폴드 배열에 기초하여, 라이브러리를 디자인하고, 드 노보 합성하였다. 실시예 4를 참조한다. 10개의 변이체 서열은 중쇄 가변 도메인에 대해 디자인되었고, 237개의 변이체 서열은 중쇄 상보성 결정 영역 3에 대해 디자인되었고, 44개의 변이체 서열은 경쇄 가변 도메인에 대해 디자인되었다. 단편은 실시예 1-3에서 설명된 바와 유사한 방법에 따라 3개의 단편으로서 합성되었다.

드 노보 합성 후, 중쇄 가변 도메인에 대해 10개의 변이체 서열이 생성되었고, 중쇄 상보성 결정 영역 3에 대해 236개의 변이체 서열이 생성되었고, 경쇄 가변 도메인 및 CDR-L3을 포함하는 영역에 대해 43개의 변이체 서열이 디자인되었고, 이 중 경쇄 가변 도메인에 대한 9개의 변이체가 디자인되었다. 이에 의해, 약 10⁵ 다양성 의 라이브러리가 생성되었다. 이것은 1600만개의 리드(read)와 차세대 시퀀싱(NGS: next generation sequencing)을 사용하여 확인되었다. 중쇄 가변 도메인에 대한 10개의 변이체 각각에 대한 정규화된 시퀀싱 리드는 약 1이었다(데이터는 제시되지 않음). 경쇄 가변 도메인에 대한 43개의 변이체 각각에 대한 정규화된 시퀀싱 리드는 약 1이었다(데이터는 제시되지 않음). 중쇄 상보성 결정 영역 3에 대한 236개의 변이체 서열에 대한 정규화된 시퀀싱 리드는 약 1이었다(데이터는 제시되지 않음).

이어서, 다양한 경쇄 및 중쇄를 발현 및 단백질 폴딩에 대해 시험하였다. 중쇄 가변 도메인에 대한 10개의 변이체 서열은 하기를 포함하였다: IGHV1-18, IGHV1-69, IGHV1-8 IGHV3-21, IGHV3-23, IGHV3-30/33rn, IGHV3-28, IGHV3-74, IGHV4-39, 및 IGHV4-59/61. 10개의 변이체 서열 중에서, IGHV1-18, IGHV1-69, 및 IGHV3-30/33rn은 개선된 열 안정성과 같은 개선된 특성을 나타냈다. 경쇄 가변 도메인에 대한 9개의 변이체 서열은 하기를 포함하였다: IGKV1-39, IGKV1-9, IGKV2-28, IGKV3-11, IGKV3-15, IGKV3-20, IGKV4-1, IGLV1-51, 및 IGLV2-14. 9개의 변이체 서열 중에서, IGKV1-39, IGKV3-15, IGLV1-51, 및 IGLV2-14는 개선된 열 안정성과 같은 개선된 특성을 나타냈다.

실시예 7: HEK293 세포에서의 GPCR 항체 라이브러리의 발현

GPCR 항체 라이브러리의 생성 후, 약 47개의 GPCR이 스크리닝을 위해 선택되었다. 약 1.8 kb 내지 약 4.5 kb 크기의 GPCR 구성물을 pCDNA3.1 벡터에 디자인하였다. 이어서, GPCR 구성물은 계층적 어셈블리를 포함하는 실시예 2-4에 설명된 바와 유사한 방법에 따라 합성되었다. 47개의 GPCR 구성물 중에서, 46개의 GPCR 구성물이 합성되었다.

합성된 GPCR 구성물을 HEK293에서 형질감염시키고, 면역형광을 사용하여 발현에 대해 검정하였다. HEK293 세포를 N-말단에 헤마글루티닌(HA) 태그부착된 인간 Y₁ 수용체를 포함하는 GPCR 구성물로 형질감염시켰다. 형질감염 24-48시간 후, 세포를 포스페이트 완충처리된 염수(PBS: phosphate buffered saline)로 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 핵을 청색으로 시각화하기 위해 형광단 및 DAPI를 포함하는, HA 태그 또는 2차 항체를 향해 유도되는 형광 1차 항체를 사용하여 세포를 염색하였다. 인간 Y₁ 수용체는 투과되지 않은 세포의 세포 표면에서 및 투과된 세포의 세포 표면에서 및 세포 내에서 시각화되었다.

자가 형광 단백질을 포함하는 GPCR 구성물을 디자인함으로써 GPCR 구성물을 또한 시각화하였다. 인간 Y₁ 수용체는 그의 C-말단에 융합된 EYFP를 포함하고, 인간 Y₅ 수용체는 그의 C-말단에 융합된 ECFP를 포함하였다. HEK293 세포는 인간 Y₁ 수용체로 형질감염되거나, 또는 인간 Y₁ 수용체 및 인간 Y₅ 수용체와 함께 공동 형질감염되었다. 형질감염 후에, 세포를 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 세포를 DAPI로 염색하였다. 인간 Y₁ 수용체 및 인간 Y₅ 수용체의 위치는 형광 현미경법에 의해 시각화되었다.

실시예 8: 면역글로불린 라이브러리의 디자인

면역글로불린 스캐폴드 라이브러리는 GPCR 결합 도메인의 배치 및 다양한 GPCR 결합 도메인 코딩 서열에 대한 안정성을 개선시키도록 디자인되었다. 면역글로불린 스캐폴드는 링커에 의해 VL 도메인에 부착된 VH 도메인을 포함하였다. VH 도메인 및 VL 도메인의 프레임워크 요소 및 CDR 요소에 대한 변이체 핵산 서열이 생성되었다. 디자인된 구조는 도 8a에 도시되어 있다. 전체 도메인 아키텍쳐는 도 8b에 도시되어 있다. 리더, 링커 및 pIII의 서열이 표 7에 열거되어 있다.

디자인된 VL 도메인은 IGKV1-39, IGKV3-15, IGLV1-51, 및 IGLV2-14를 포함한다. 4개의 VL 도메인 각각은 그 각각의 4개의 불변 프레임워크 요소(FW1, FW2, FW3, FW4) 및 가변적인 3개의 CDR(L1, L2, L3) 요소로 어셈블리되었다. IGKV1-39의 경우, L1에 대해 디자인된 490개의 변이체가 존재하고, L2에 대해 디자인된 420개의 변이체가 존재하고, L3에 대해 디자인된 824개의 변이체가 존재하여, 1.7 x 10⁸(490 * 420 * 824)의 다양성이 유도되었다. IGKV3-15의 경우, L1에 대해 디자인된 490개의 변이체가 존재하고, L2에 대해 디자인된 265개의 변이체가 존재하고, L3에 대해 디자인된 907개의 변이체가 존재하여, 1.2 x 10⁸(490*265*907)의 다양성이 유도되었다. IGLV1-51의 경우, L1에 대해 디자인된 184개의 변이체가 존재하고, L2에 대해 디자인된 151개의 변이체가 존재하고, L3에 대해 디자인된 824개의 변이체가 존재하여, 2.3 x 10⁷(184*151*824)의 다양성이 유도되었다. IGLV2-14의 경우, L1에 대해 디자인된 967개의 변이체가 존재하고, L2에 대해 디자인된 535개의 변이체가 존재하고, L3에 대해 922개의 변이체가 존재하여 4.8 10⁸(967*535*922)의 다양성이 유도되었다. 표 8은 IGLV1-51에 대한 4개의 프레임워크 요소(FW1, FW2, FW3, FW4)에 대한 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열을 열거한다. 표 9는 IGLV1-51에 대한 가변적인 3개의 CDR(L1, L2, L3) 요소를 열거한다. 4개의 프레임워크 요소(FW1, FW2, FW3, FW4) 및 가변적인 3개의 CDR(L1, L2, L3) 요소에 대한 변이체 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열 또한 IGKV1-39, IGKV3-15, 및 IGLV2-14에 대해 디자인되었다.

CDR은 아미노산 장애, 잠재 스플라이스 부위 또는 뉴클레오티드 제한 부위를 함유하지 않도록 예비 스크리닝되었다. CDR 변이는 적어도 2명의 개체에서 관찰되었고, 단일, 이중 및 삼중 돌연변이의 생식계열 근처 공간을 포함한다. 어셈블리 순서는 도 8c에 도시되어 있다.

디자인된 VH 도메인은 IGHV1-69 및 IGHV3-30을 포함한다. 2개의 중쇄 VH 도메인은 각각 그 각각의 4개의 불변 프레임워크 요소(FW1, FW2, FW3, FW4) 및 가변적인 3개의 CDR(H1, H2, H3) 요소로 어셈블리된다. IGHV1-69의 경우, 417개의 변이체가 H1에 대해 디자인되었고, 258개의 변이체가 H2에 대해 디자인되었다. IGHV3-30의 경우, 535개의 변이체가 H1에 대해 디자인되었고, 165개의 변이체가 H2에 대해 디자인되었다. CDR H3의 경우, 동일한 카세트가 IGHV1-69 및 IGHV-30 둘 모두에 사용되었으며, 이는 디자인된 둘 모두가 동일한 FW4를 사용하고 FW3의 가장자리도 IGHV1-69 및 IGHV3-30 둘 모두에 대해 동일하기 때문이다. CDR H3은 1 x 10¹⁰의 다양성을 생성하기 위해 중앙의 중간 요소에 조합 결합된 N-말단 및 C-말단 요소를 포함한다. N-말단 및 중간 요소는 "GGG" 글리신 코돈과 중첩된다. 중간 및 C-말단 요소는 "GGT" 글리신 코돈과 중첩된다. CDR H3은 개별적으로 어셈블리된 5개의 서브풀을 포함한다. 다양한 N-말단 및 C-말단 요소는 표 10에 제시된 서열을 포함한다.

실시예 9. GPCR GLP1R 결합 단백질의 농축

GPCR 결합 단백질의 변이체 단편을 갖는 CDR-H3 영역을 갖는 항체를 본원에 기술된 방법에 의해 생성하고, 실시예 4에 기술된 바와 같이, 세포 기반 방법을 사용하여 패닝하여 특정 GPCR에의 결합에 대해 농축된 변이체를 확인하였다.

GLP C-말단 펩티드의 변이체는 항체의 CDR-H3 영역에 매립될 때, GPCR GLP1R에 결합하기 위해 반복적으로 및 선택적으로 농축된다는 것이 확인되었다(표 11에 열거)

실시예 10. GLP1R 결합 단백질 변이체 분석

GLP1R 결합 단백질의 변이체 단편을 갖는 CDR-H3 영역을 갖는 항체는 본원에 기술된 방법에 의해 생성하고, 실시예 4에 기술된 바와 같이, 세포 기반 방법을 사용하여 패닝하여 GLP1R에의 결합에 대해 농축된 변이체를 확인하였다.

GLP1R 펩티드의 변이체에 대한 차세대 서열(NGS: next generation sequence) 농축을 수행하였다(데이터는 제시되지 않음). 간략하면, 각 라운드의 선별에서 딥 시퀀싱한 후 파지 집단을 딥 시퀀싱한 후에 농축하고, 교차 샘플 클론을 확인하였다. NGS 데이터에서 CHO 배경 클론을 필터링한 후, 표적 특이적 클론을 선택하였다. GLP1R 펩티드의 경우, 약 2000개의 VH 및 VL 쌍을 박테리아 콜로니로부터 직접 바코딩하고, 시퀀싱하여 비동일한 클론을 확인하였다.

GLP1R-1 변이체를 V 유전자 분포, J 유전자 분포, V 유전자 패밀리, 및 길이당 CDR3 계수에 대해 분석하였다. V 유전자 IGHV1-69, IGHV3-30, IGHV3-23, IGHV3, IGHV3-53, IGHV3-NL1, IGHV3-d, IGHV1-46, IGHV3-h, IGHV1, IGHV3-38, IGHV3-48, IGHV1-18, IGHV1-3, 및 IGHV3-15의 빈도를 측정하였다(데이터는 제시되지 않음). IGHV1-69 및 IGHV3-30은 고빈도로 관찰되었다. J 유전자 IGHJ3, IGHJ6, IGHJ, IGHJ4, IGHJ5, mIGHJ, IGHJ2, 및 IGH1의 빈도 또한 측정하였다(데이터는 제시되지 않음). IGHJ3 및 IGHJ6은 고빈도로 관찰되었고, IGHJ 및 IGHJ4는 더 낮은 빈도로 관찰되었다. V 유전자 IGHV1-69, IGHV3-30, IGHV3-23, IGHV3, IGHV1-46, IGHV3-7, IGHV1, 및 IGHV1-8의 빈도를 측정하였다(데이터는 제시되지 않음). IGHV1-69 및 IGHV3-30은 고빈도로 관찰되었다. J 유전자 IGHJ3, IGHJ6, IGHJ, IGHJ4, IGHJ5, IGHJ2, 및 IGH1의 빈도를 측정하였다(데이터는 제시되지 않음). IGHJ3 및 IGHJ6은 고빈도로 관찰되었고, IGHJ 및 IGHJ4는 더 낮은 빈도로 관찰되었다.

GLP1R-1, GLP1R-2, GLP1R-3, GLP1R-4, 및 GLP1R-5에 대한 H 축적 및 빈도를 측정하였다(데이터는 제시되지 않음).

GLP1R-1, GLP1R-2, GLP1R-3, GLP1R-4, 및 GLP1R-5 변이체에 대한 서열 분석을 수행하였다(데이터는 제시되지 않음).

GLP1R 변이체에 대한 세포 결합을 측정하였다. 도 9a-9o는 GLP1R-2(도 9a), GLP1R-3(도 9b), GLP1R-8(도 9c), GLP1R-26(도 9d), GLP1R-30(도 9e), GLP1R-56(도 9f), GLP1R-58(도 9g), GLP1R-10(도 9h), GLP1R-25(도 9i), GLP1R-60(도 9j), GLP1R-70(도 9k), GLP1R-72(도 9l), GLP1R-83(도 9m), GLP1R-93(도 9n), 및 GLP1R-98(도 9o)에 대한 세포 결합 데이터를 보여주는 것이다.

이어서, cAMP 검정법에서 GLP1R-3, GLP1R-8, GLP1R-26, GLP1R-56, GLP1R-58 및 GLP1R-10이 GLP1-7-36 펩티드에 대해 미치는 알로스테릭 효과에 대하여 분석하였다. 도 10a-10o는 GLP1-7-36 펩티드 유도 cAMP 활성 억제에 대한 GLP1R 변이체의 그래프를 보여주는 것이다. GLP1R-3(도 10b), GLP1R-8(도 10c), GLP1R-26(도 10d), GLP1R-30(도 10e), GLP1R-56(도 10f), GLP1R-58(도 10g), GLP1R-10(도 10h, 우측 그래프), GLP1R-25(도 10i), 및 GLP1R-60(도 10j)은 GLP1-7-36 펩티드 유도 cAMP 활성의 알로스테릭 억제를 보여주는 것이다. 도 10h는 추가로 엑센딘-4와 비교하여 cAMP 신호에 대해 GLPR-10이 미치는 효과를 보여주는 것이다(도 10h, 좌측 그래프).

cAMP 검정법에서 GLP1R 변이체를 시험하여 변이체가 엑센딘-4 유도 cAMP 활성을 차단하는 데 있어 길항제인지 여부를 결정하였다. 도 11a-11g는 GLP1R-2(도 11a), GLP1R-3(도 11b), GLP1R-8(도 11c), GLP1R-26(도 11d), GLP1R-30(도 11e), GLP1R-56(도 11f), 및 GLP1R-58(도 11g)에 대한 세포 기능 데이터를 도시한 것이다.

이어서, cAMP 검정법에서 GLP1R-2, GLP1R-3, GLP1R-8, GLP1R-26, GLP1R-30, GLP1R-56, 및 GLP1R-58이 엑센딘-4에 대해 미치는 알로스테릭 효과에 대해 분석하였다. 도 12a-12g는 엑센딘-4 펩티드 유도 cAMP 활성 억제에 대한 GLP1R-2(도 12a), GLP1R-3(도 12b), GLP1R-8(도 12c), GLP1R-26(도 12d), GLP1R-30(도 12e), GLP1R-56(도 12f), 및 GLP1R-58(도 12g) 변이체의 그래프를 도시한 것이다. 표 12는 엑센딘-4 단독, 또는 GLP1R-2, GLP1R-3, GLP1R-8, GLP1R-26, GLP1R-30, GLP1R-56, 및 GLP1R-58과의 그에 대한 EC50(nM) 데이터를 보여주는 것이다.

GLP1R 변이체에 대해 FACS 스크리닝을 수행하였다. 표 13에 제시된 바와 같이 GLP1R-2, GLP1R-3, GLP1R-8, GLP1R-10, GLP1R-25, GLP1R-26, GLP1R-30, GLP1R-56, GLP1R-58, GLP1R-60, GLP1R-70, GLP1R-72, GLP1R-83, GLP1R-93, 및 GLP1R-98이 확인되었다. GLP1R-3, GLP1R-8, GLP1R-56, GLP1R-58, GLP1R-60, GLP1R-72, 및 GLP1R-83은 GLP1 모티프를 포함한다. 도 13을 참조한다. GLP1R-25, GLP1R-30, GLP1R-70, GLP1R-93, 및 GLP1R-98은 GLP2 모티프를 포함한다. 도 13을 참조한다. GLP1R-50 및 GLP1R-71은 CC 케모카인 28 모티프를 포함한다.

GLP1R 변이체를 응집에 대하여 검정하였다. GLP1R-30 및 GLP1R-56 변이체에 대해 크기 배제 크로마토그래피(SEC: size exclusion chromatography)를 수행하였다. GLP1R-30 중 82.64%가 단량체(~150 Kd)였다. GLP1R-56 중 97.4%가 단량체(~150 Kd)였다.

실시예 11. GPCR 결합 단백질 관능성

GPCR 결합 단백질에 대해, 파지 선별로부터 상위 100 - 200 scFv를 전장 면역글로불린으로 전환시켰다. 면역글로불린 전환 후, 클론을 ExpiCHO에서 일시적으로 형질감염시켜 면역글로불린을 생성하였다. 배치 IgG 정제를 위해 킹피셔 앤드 해밀턴(Kingfisher and Hamilton)을 사용한 후, 랩-칩에 의해 정제된 모든 면역글로불린에 대한 순도 데이터를 수집하였다. 표 14에 제시된 바와 같이 10 mL 배양물로부터 고수율 및 순도를 수득하였다.

이어서, GPCR 표적을 발현하는 안정한 세포주를 생성하고, FACS에 의해 확인하였다(데이터는 제시되지 않음). 이어서, 표적의 > 80%를 발현하는 세포를 세포 기반 선별에 직접 사용하였다. 관심 표적을 과다발현하는 세포에 대해 5 라운드의 선별을 수행하였다. 10⁸개의 세포를 각 선별 라운드에 사용하였다. 표적 발현 세포에 대한 선별 이전에, 각 라운드의 파지를 먼저 10⁸개의 CHO 배경 세포에서 고갈시켰다. 후속 선별 라운드에서 세척 횟수를 증가시켜 선별 엄격성을 증가시켰다. 각 선별 라운드에 대해 농축비를 모니터링하였다.

FACS(도 14a-14c) 및 cAMP 활성(도 14d)을 이용하여 세포 결합 친화도에 대해 정제된 IgG를 시험하였다. 알로스테릭 억제가 관찰되었다.

BVP ELISA를 이용하여 정제된 IgG를 시험하였다. BVP ELISA는 비교물질 항체에 필적하는 BVP 점수를 포함하는 일부 클론을 보여주었다(데이터는 제시되지 않음).

실시예 12. GLP1R scFv 조정제

본 실시예는 GLP1R 조정제 확인을 예시하는 것이다.

라이브러리 패닝

GPCR1.0/2.0 scFv-파지 라이브러리를 CHO 세포와 함께 실온(RT: room temperature)에서 1시간 동안 인큐베이션시켜 CHO 세포 결합제를 고갈시켰다. 인큐베이션 후, 1,200 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화함으로써 비특이적 CHO 세포 결합제를 제거하였다. 이어서, CHO 세포 결합제가 고갈된 파지 상청액을 GLP1R 발현 CHO 세포로 옮겨 놓았다. 파지 상청액 및 GLP1R 발현 CHO 세포를 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켜 GLP1R 결합제에 대해 선별하였다. 인큐베이션 후, PBS로 수회 세척하여 비결합 클론을 세척하였다. 마지막으로, 효능제 클론을 선택적으로 용출하기 위해, GLP1R 세포에 결합된 파지를 1 μM의, GLP1R의 천연 리간드인 GLP1 펩티드(잔기 7 내지 36)와 경쟁시켰다. 세포에서 용출된 클론은 GLP1R 상의 GLP1 리간드 결합 에피토프에 결합할 가능성이 있었다. 1,200 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화함으로써 세포 상의 GLP1R에 여전히 결합하고, 내인성 GLP1 리간드 결합 부위(오르토스테릭 부위)에 결합하지 않은 클론을 제거였다. 다음 라운드의 선별을 위해 상청액을 TG1 E. 콜라이(E. coli) 세포에서 증폭시켰다. 5 라운드 동안 상기 선별 전략법을 반복하였다. 한 라운드로부터 얻은 증폭된 파지를 후속 라운드를 위한 입력 파지로서 사용하였고, 각각의 후속 선별 라운드에서 세척 엄격성을 증가시켰다. 5 라운드의 선별 후, 4 라운드 및 5 라운드, 각각으로부터 얻은 500개의 클론을 생어 시퀀싱하여 GLP1R 조정제 클론을 확인하였다. 7개의 고유한 클론을 IgG2로 재포맷하고, 정제하고, FACS 및 기능적 검정법에 의해 결합을 시험하였다.

결합 검정법

7개의 GLP1R scFv 클론(GLP1R-238, GLP1R-239, GLP1R-240, GLP1R-241, GLP1R-242, GLP1R-243, 및 GLP1R-244), 및 대조군으로서 사용된 2개의 GLP1R IgG(pGPCR-GLP1R-43 및 pGPCR-GLP1R-44, Janssen Biotech, J&J)를 유세포 분석법에 의한 분석과 커플링된 결합 검정법에서 시험하였다. GLP1R-238, GLP1R-239, GLP1R-240, GLP1R-241, GLP1R-242, GLP1R-243, 및 GLP1R-244에 대한 CDR3 서열(표 15), 중쇄 서열(표 16), 및 경쇄 서열(표 17)은 하기 제시되어 있다.

간략하면, flag-GLP1R-GFP 발현 CHO 세포(CHO-GLP1R) 및 CHO-모체 세포를 얼음 위에서 1시간 동안 100 nM IgG와 함께 인큐베이션시키고, 3회 세척하고, 알렉사(Alexa) 647 접합된 염소-항-인간 항체(1:200)와 함께 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 3회 세척하였다. 모든 인큐베이션과 세척은 PBS 및 0.5% BSA를 함유하는 완충제 중에서 수행하였다. 적정을 위해, IgG를 100 nM을 시작으로 1:3으로 연속하여 희석하였다. 세포를 유세포 분석법에 의해 분석하고, 알렉사 647 신호 대비 GFP 신호를 측정함으로써 IgG가 CHO-GLP1R에 결합하는 것으로 관찰된 히트를 확인하였다. GLP1R-238, GLP1R-240, GLP1R-241, GLP1R-242, GLP1R-243, 및 GLP1R-244가 CHO-GLP1R에 결합하는 것으로 관찰되었다. GLP1R-238은 CHO-GLP1R 및 CHO-모체 세포에 동등하게 결합하였고, 따라서, 이는 비특이적 결합제인 것으로 보인다. MFI(평균 형광 강도) 대비 IgG 농도를 플롯팅한 결합 곡선으로서 나타낸 IgG 적정을 이용한 결합 검정 분석이 도 15a-15h에 제시되어 있다. 100 nM IgG를 이용하여 도트 플롯으로 나타낸 결합 검정의 유세포 분석 데이터는 도 16a-16i에 제시되어 있다.

기능적 검정법

모든 GLP1R scFv 클론 뿐만 아니라, pGPCR-GLP1R-43 및 pGPCR-GLP1R-44를 cAMP 검정법(Eurofins DiscoverX Corporation)을 수행함으로써 그가 GLP1R 신호전달에 미치는 잠재적인 효과에 대해 검정법하였다. 상기 검정법은 Ga_s커플링된 야생형 GLP1R을 자연적으로 과다발현하도록 조작되고, 수용체의 효능제 자극에 대한 반응으로 세포내 cAMP 수준의 변화를 감지하도록 디자인된 CHO 세포를 포함한다. cAMP 수준 검출에 관여하는 기술은 효소 단편 보완 기술을 기반으로 하는 무세척 신호 획득 경쟁 면역검정법이며, 이는 세포의 cAMP 양에 정비례하는 발광 신호를 생성하였다. 실험은 IgG의 효능제 또는 알로스테릭 활성을 측정하도록 디자인되었다. IgG의 효능제 활성을 시험하기 위해, 세포를 37℃에서 30분 동안 IgG로(100 nM을 시작으로 1:3으로 적정) 또는 공지된 효능제 GLP1 (7-36) 펩티드로(12.5 nM을 시작으로 1:6으로 적정) 자극시켰다. IgG의 알로스테릭 활성을 시험하기 위해, 세포를 실온에서 1시간 동안 100 nM 고정 농도의 IgG와 함께 인큐베이션시켜 결합시킨 후, 이어서, 37℃에서 30분 동안 GLP1 (7-36) 펩티드(12.5 nM을 시작으로 1:6으로 적정) 자극시켰다. 검정용 키트 설명서에 따라 세포내 cAMP 수준을 검출하였다.

도 17a-17b에 제시된 바와 같이, IgG 중 어느 것도 효능제 신호를 개시하지 않았다. GLP1R-241을 또한 cAMP 알로스테릭 효과(도 17c), 베타-어레스틴 동원(도 17d), 및 내재화(도 17e)에 대해 시험하였다. IgG 중 수개의 IgG는 도 18a-18b에 제시된 바와 같이, 억제 방식으로 GLP1 (7-36)에 대한 상기 세포의 신호전달 반응을 변경시킴으로써 음성 알로스테릭 조정제로서 작용하였다. 표 18은 도 18a에 상응하는 EC50(nM) 값을 보여주는 것이고, 표 19는 도 18b에 상응하는 EC50을 보여주는 것이다.

본 데이터는 GLP1R 조정제의 약리학적 및 기능적 효과를 보여준다.

실시예 13: GLP1R 효능제 및 길항제

본 실시예는 GLP1R 효능제 및 길항제 확인을 예시하는 것이다.

실시예 12와 유사하게 실험을 수행하였다. 6개의 GLP1R 면역글로불린(IgG)을 결합 및 기능적 검정법에 대해 검정하여 어느 클론이 효능제인지 또는 길항제인지를 결정하였다. 시험된 GLP1R IgG로 GLP1R-59-2, GLP1R-59-241, GLP1R-59-243, GLP1R-3, GLP1R-241, 및 GLP1R-2를 포함하였다. GLP1R-241, GLP1R-3, 및 GLP1R-2는 앞서 실시예 10 및 12에서 기술되었다. GLP1R-59-2, GLP1R-59-241, GLP1R-59-243, GLP1R-43-8, 및 GLP1R-3에 대한 중쇄 서열은 표 20에 제시되어 있다.

GLP1R IgG를 열 램프 안정성(T_m 및 T_agg)에 대해 특징화하였다. UNcle 플랫폼을 이용하여 IgG를 특징화하고, 데이터는 표 21에 제시되어 있다.

이어서, GLP1R IgG를 실시예 12에 기술된 바와 같은 유사한 방법을 사용하여 유세포 분석법에 의한 분석에 커플링된 결합 검정법에서 검정하였다. 간략하면, 안정적으로 Flag-GLP1R-GFP를 발현하는 CHO 세포 또는 CHO-모체 세포를 1차 IgG(100 nM 또는 1:3 적정)와 함께 인큐베이션시켰다. 2차 항체 인큐베이션은 알렉사 647 접합된 염소-항-인간 IgG를 포함하였다. 유세포 분석법은 알렉사 647 신호 대비 GFP 신호를 측정하여 표적 (GLP1R)에 특이적으로 결합하는 IgG를 확인하였다. 리간드 경쟁 검정법은 1차 IgG와 1 μM GLP1 (7-36)의 공동 인큐베이션을 포함하였다. GLP1R-59-2, GLP1R-59-241, GLP1R-59-243, GLP1R-3, GLP1R-241, 및 GLP1R-2에 대한 데이터는 도 19a-19f에 제시되어 있다.

실시예 12에 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 GLP1R IgG를 사용하여 기능적 검정법 또한 수행하였다. 간략하면, cAMP, 베타-어레스틴 동원 및 활성화된 수용체 내재화 검정은 유로핀즈 디스커버X(Eurofins DiscoverX)로부터 입수하였고, 태그가 부착되지 않은 GLP-1R 과다발현 CHO-K1 또는 U2OS 세포를 이용하였다. 세포를 IgG와 미리 인큐베이션시키고, 그가 GLP1 (7-36) 유도 신호전달에 미치는 효과를 조사함으로써 이를 이용하여 GLP1 (7-36)과의 비교로서 IgG의 효능제 활성에 대해, 또는 IgG의 길항성 활성에 대하여 시험하였다. cAMP 검정을 위해, GLP1 (7-36) 또는 IgG 자극 후, 세포 cAMP 수준은 효소 단편 보완(EFC: Enzyme Fragment Complementation) 기술을 기반으로 하는 균질한, 비세척, 신호 획득 경쟁 면역 분석을 사용하여 측정한다. 기능적 검정법으로부터의 GLP1R-59-2, GLP1R-59-241, GLP1R-59-243, GLP1R-3, GLP1R-241, 및 GLP1R-2에 대한 데이터는 도 20a-20f에 제시되어 있다. GLP1R-59-2, GLP1R-59-241, GLP1R-59-243, GLP1R-3, GLP1R-241, 및 GLP1R-2에 대한 EC50(nM) 데이터는 표 22-23에 제시되어 있다. 표 23에 제시된 바와 같이, GLP1R-3에 대한 EC50 데이터는 2.2배 차이를 보였다. GLP1-241에 대한 EC50 데이터는 1.7배 차이를 보였다. GLP1R-2에 대한 EC50 데이터는 0.8배 차이를 보였다.

GLP1R-3 또한 검정하여 GLP1R 대 GL1P2R 결합의 특이성을 측정하고, GLP2R에 비해 GLP1R에 대해 특이적인 것으로 결정되었다(데이터는 제시되지 않음). 마우스, 마카카, 및 인간 GLP1R에서의 GLP1R-3, GLP1R-59-242, 및 GLP1R-43-8의 결합을 측정하였다. 100 nM에서의 GLP1R-3, 100 nM에서의 GLP1R-59-242, 및 100 nM에서의 GLP1R-43-8은 마우스, 마카카, 및 인간 GLP1R에 결합하는 것으로 나타났다(데이터는 제시되지 않음). GLP1R-3 또한 내인성 GLP1R을 발현하는 인간 췌장 전구체 세포에 결합하는 것으로 나타났다.

마우스, 마카카, 및 인간 GLP1R 상의 GLP1R-59-2, GLP1R-59-241, 및 GLP1R-59-243의 결합을 측정하였다. 100 nM에서의 GLP1R-59-2, 100 nM에서의 GLP1R-59-241, 및 50 nM에서의 GLP1R-59-243은 마우스, 마카카, 및 인간 GLP1R에 결합하는 것으로 나타났다(데이터는 제시되지 않음). GLP1R-59-2 또한 내인성 GLP1R을 발현하는 인간 췌장 전구체 세포에 결합하는 것으로 나타났다.

본 실시예는 효능작용성 및 길항제 특성을 갖는 GLP1R IgG를 보여준다. IgG 중 수개의 IgG는 GLP1 (7-36)과 유사한 cAMP 신호전달, 베타-어레스틴 동원, 및 수용체 내재화를 유도하였다.

실시예 14: VHH 라이브러리

합성 VHH 라이브러리를 개발하였다. CDR 다양성이 적합화된 'VHH 비' 라이브러리의 경우, 클러스터 오메가(Clustal Omega)를 이용하여 2391개의 VHH 서열(iCAN 데이터베이스)을 정렬하여 각 위치의 컨센서스를 결정하였고, 프레임워크는 각 위치에서의 컨센서스로부터 유래되었다. 2391개의 서열 모두의 CDR을 위치 특이적 변이에 대해 분석하고, 상기 다양성을 라이브러리 디자인에 도입하였다. 셔플링된 CDR 다양성을 갖는 'VHH 셔플' 라이브러리의 경우, iCAN 데이터베이스를 나노바디 서열 중 고유한 CDR에 대해 스캐닝하였다. 1239개의 고유한 CDR1, 1600개의 고유한 CDR2, 및 1608개의 고유한 CDR3을 확인하였고, iCAN 데이터베이스의 2391개의 서열 중 각 프레임워크 위치에서의 컨센서스로부터 유래되었다. 각각의 고유한 CDR을 개별적으로 합성하고, 컨센서스 프레임워크에서 셔플링하여 3.2 x 10^9의 이론적 다양성을 갖는 라이브러리를 생성하였다. 이어서, 제한 효소 분해를 이용하여 파지미드 벡터에서 라이브러리를 클로닝하였다. 'VHH h셔플' 라이브러리(셔플링된 CDR 다양성을 갖는 합성 "인간" VHH 라이브러리)의 경우, iCAN 데이터베이스를 나노바디 서열 중 고유한 CDR에 대해 스캐닝하였다. 1239개의 고유한 CDR1, 1600개의 고유한 CDR2, 및 1608개의 고유한 CDR3을 확인하였고, 프레임워크 1, 3, 및 4는 인간 생식계열 DP-47 프레임워크로부터 유래되었다. 프레임워크 2는 iCAN 데이터베이스의 2391개의 서열 중 각 프레임워크 위치에서의 컨센서스로부터 유래되었다. 각각의 고유한 CDR을 개별적으로 합성하고, NUGE 도구를 이용하여 부분적 인간화 프레임워크에서 셔플링하여 3.2 x 10^9의 이론적 다양성을 갖는 라이브러리를 생성하였다. 이어서, NUGE 도구를 이용하여 파지미드 벡터에서 라이브러리를 클로닝하였다.

카테라(Carterra) SPR 시스템을 이용하여 VHH-Fc 변이체에 대한 결합 친화도 및 친화도 분포를 평가하였다. VHH-Fc는 12 nM K_D의 하한 값과 1685 nM K_D의 상한 값을 갖는, TIGIT에 대한 다양한 친화도를 나타낸다(데이터는 표시되지 않음). 표 23a는 VHH-Fc 클론에 대한 ELISA, 단백질 A(mg/ml) 및 K_D(nM)에 대한 특정 값을 제공한다. 도 21a 및 도 21b는 20 - 4000인 친화도 임계값(도 21a; 1가 K_D) 및 20 - 1000인 친화도 임계값(도 21b; 1가 K_D)에 걸친 VHH 라이브러리에 대한 TIGIT 친화도 분포를 도시한 것이다. 시험된 140개의 VHH 결합제 중 51개의 변이체는 < 100 nM인 친화도를 가졌고, 90개의 변이체는 < 200 nM인 친화도를 가졌다.

<표 23A>

실시예 15: GLP1R에 대한 VHH 라이브러리

실시예 14에 기술된 방법과 유사하게 GLP1R에 대한 VHH 라이브러리를 개발하였다. 간략하면, GLP1R을 발현하는 안정한 세포주가 생성하고, FACS에 의해 표적 발현을 확인하였다. 이어서, 표적의 > 80%를 발현하는 세포를 세포 기반 선별에 사용하였다. 관심 표적을 안정적으로 과다발현하는 세포에 대해 5 라운드의 세포 기반 선별을 수행하였다. 10⁸개의 세포를 각 선별 라운드에 사용하였다. 표적 발현 세포에 대한 선별 이전에, 각 라운드의 파지를 먼저 10⁸개의 CHO 배경 세포에서 고갈시켰다. 후속 선별 라운드에서 세척 횟수를 증가시켜 선별 엄격성을 증가시켰다. 이어서, 트립신을 이용하여 세포를 파지로부터 용출시키고, 다음 라운드의 패닐을 위해 파지를 증폭시켰다. 4 라운드 및 5 라운드로부터 총 1000개의 클론을 NGS에 의해 시퀀싱하여 VHH-Fc로서 재포맷하기 위한 고유한 클론을 확인한다.

156개의 고유한 GLP1R VHH Fc 결합제 중 53개가 모체 세포 대비 2배인 표적 세포 평균 형광 강도(MFI) 값을 가졌다. 변이체 GLP1R-43-77에 대한 데이터는 도 22a-22b 및 표 23b-24에 제시되어 있다.

<표 23B>

실시예 16. CDR이 변이된 GLP1R 라이브러리

CDR 무작위화 방식을 이용하여 GLP1R 라이브러리를 생성하였다.

간략하면, GPCR 항체 서열에 기초하여 GLP1R 라이브러리를 디자인하였다. 60개 초과의 상이한 GPCR 항체를 분석하고, CDR 무작위화 방식을 이용하여 상기 GPCR로부터의 서열을 변형시켰다.

중쇄 IGHV3-23 디자인은 도 23a에 제시되어 있다. 도 23a에 제시되어 있는 바와 같이, IGHV3-23 CDRH3은 23개의 아미노산 길이, 21개의 아미노산 길이, 17개의 아미노산 길이, 및 12개의 아미노산 길이로 4개의 상이한 길이를 갖고, 여기서, 각 길이는 그의 잔기 다양성을 갖는다. 상기 4개 길이에 대한 비는 하기와 같았다: 길이가 23개의 아미노산 길이인 CDRH3의 경우, 40%, 길이가 21개의 아미노산 길이인 CDRH3의 경우, 30%, 길이가 17개의 아미노산 길이인 CDRH3의 경우, 20%, 및 길이가 12개의 아미노산 길이인 CDRH3의 경우, 10%. CDRH3 다양성은 9.3 x 10⁸인 것으로 결정되었고, 전체 중쇄 IGHV3-23 다양성은 1.9 x 10¹³이었다.

중쇄 IGHV1-69 디자인은 도 23b에 제시되어 있다. 도 23b에 제시되어 있는 바와 같이, IGHV1-69 CDRH3은 20개의 아미노산 길이, 16개의 아미노산 길이, 15개의 아미노산 길이, 및 12개의 아미노산 길이로 4개의 상이한 길이를 갖고, 여기서, 각 길이는 그의 잔기 다양성을 갖는다. 상기 4개 길이에 대한 비는 하기와 같았다: 길이가 20개의 아미노산 길이인 CDRH3의 경우, 40%, 길이가 16개의 아미노산 길이인 CDRH3의 경우, 30%, 길이가 15개의 아미노산 길이인 CDRH3의 경우, 20%, 및 길이가 12개의 아미노산 길이인 CDRH3의 경우, 10%. CDRH3 다양성은 9 x 10⁷인 것으로 결정되었고, 전체 중쇄 IGHV-69 다양성은 4.1 x 10¹²였다.

경쇄 IGKV 2-28 및 IGLV 1-51 디자인은 도 23c에 제시되어 있다. 항체 경쇄 CDR 서열을 위치 특이적 변이에 대해 분석하였다. 고정된 CDR 길이를 갖는 2개의 경쇄 프레임워크를 선택하였다. 카파 및 경쇄에 대한 이론상 다양성은 각각 13800 및 5180인 것으로 결정되었다.

최종 이론상 다양성은 4.7 x 10¹⁷인 것으로 결정되었고, 최종의 생성된 Fab 라이브러리의 다양성은 6 x 10⁹였다. 도 23d를 참조한다.

세포 기반 친화도 측정 및 기능 분석을 위해 정제된 GLP1R IgG를 검정하였다. 정제된 GLP1R IgG를 이용하여 FACS 결합을 측정하였다. 도 23e에 제시된 바와 같이, GLP1R IgG는 낮은 나노몰 범위의 친화도로 GLP1R 발현 세포에 선택적으로 결합하였고, 이는 표적 발현 세포에 1.1 nM의 친화도로 선택적으로 결합하는 IgG를 입증한다. 실시예 4-10에 기술된 방법을 이용하여 생성된 GLP1R IgG에서 FACS 결합 또한 측정하였다. 도 23f에 제시된 바와 같이, GLP1R IgG는 낮은 나노몰 범위의 친화도로 GLP1R 발현 세포에 선택적으로 결합한다.

정제된 GLP1R IgG를 이용한 cAMP 검정법 수행 결과, 도 23g에 제시된 바와 같이, GLP1R 발현 CHO 세포에서의 GLP1 효능제 유도 cAMP 반응의 용량 반응 곡선이 GLP1R IgG의 존재로 좌측으로 이동되었다는 것이 입증되었다. 실시예 4-10에 기술된 방법을 이용하여 생성된 GLP1R IgG는 또한 GLP1R 발현 CHO 세포에서의 수용체 효능제 유도 cAMP 반응의 용량 반응 곡선을 좌측으로 이동시켰다(도 23h).

본 데이터는 효력 및 기능이 개선된 GLP1R IgG의 디자인 및 생성을 보여준다.

실시예 17. 경구 당 부하 마우스 모델

본 연구의 목적은 C57BL/6J DIO 마우스에서 식이 유도 비만의 마우스 모델에서 혈당 조절에 대한 키메라 항체 GLP1R 효능제 및 길항제의 급성 효과를 평가하는 것이었다. 시험 물품은 하기 표 25에 제시되어 있다.

표 25. 시험 물품 식별
	GLP1R 효능제 Ab	GLP1R 길항제 Ab	Ab 대조군	양성 대조군
식별	GLP1R-59-2	GLP1R-3	GLP1R-2	리라글루티드
물리적 설명	투명 액체	투명 액체	투명 액체
순도	95%	95%	TBD
농도	2.7 mg/ml	3.7 mg/ml	TBD
보관 조건	4℃를 유지하도록 온도 설정	4℃를 유지하도록 온도 설정	4℃를 유지하도록 온도 설정	4℃를 유지하도록 온도 설정
제공자	스폰서	스폰서	스폰서	스폰서
- = 해당없음

각 시험 물품에 대해, 하기 표 26에 요약된 바와 같이 군당 8마리의 동물을 사용하여, 7개의 상이한 시험 물품 군을 생성하였다.

3일째(모든 동물) 및 1일째(1-7군), 꼬리 스닙(tail snip)에 의해 비-공복 혈당을 측정하였다. 대략 5-10 ㎕의 혈액을 수집하였다. 동물의 두 번째 혈액 한 방울을 혈당 테스트 스트립에 놓고, 휴대용 혈당계(Abbott Alpha Trak)를 사용하여 분석하였다.

절차 당일 비-공복 혈당 측정 후, 동물의 체중을 측정하고, 꼬리에 표시를 하고, 동물을 먹이가 없는 깨끗한 우리에 넣었다. 동물을 4시간 동안 금식시키고, 공복 혈당 측정치를 측정하였다. 이어서, 표 26에 제시된 같이 동물을 명시된 시험 물품(들)으로 처리하였다.

60분 후 각 동물에 대해 경구 당 부하 검사(OGTT: Oral Glucose Tolerance Test)를 수행하였다. 동물에게 2 g/kg 글루코스(10 mL/kg)을 경구 위관영양법을 통해 투약하였다. 혈당은 글루코스 용량 대비 하기 시간: 0분(글루코스 투약 직전), 15, 30, 60, 90, 및 120분째에 휴대용 혈당계(Abbott Alpha Trak)에 놓인 동물의 두 번째 혈액 방울을 사용하여 꼬리 스닙을 통해 측정하였다. 혈청 인슐린의 추정을 위해 OGTT의 15분 및 60분 시점에서 추가 혈액 샘플을 수득하였다.

도 24a-24b는 GLP1R-3이 GLP1:GLP1R 신호전달을 억제하고(도 24a), 더 높은 고농도에서 완전히 억제한다는 것을 나타낸다(도 24b). 도 24c에 제시된 바와 같이, GLP1R-3을 투약받은 동물은 글루코스 투여 후 높은 글루코스 수준을 지속적으로 유지하였고, 이는 GLP1:GLP1R 신호 차단을 시사하는 것이다. 도 24d에 제시된 바와 같이, 10 mg/kg의 GLP1R-59-2 용량은 리라글루타이드 대조군과 유사한 지속적으로 낮은 글루코스 수준을 나타내었다.

본 데이터는 생성된 GLP1R 항체가 마우스 모델에서 내당능에 대한 기능적 효과를 갖는다는 것을 보여준다.

실시예 18. 야생형 마우스에서의 효능제 및 길항제 효과

본 실시예에서는 야생형 마우스에서의 GLP1R-59-2(효능제) 및 GLP1R-3(길항제)의 효과를 측정하였다.

15마리의 C57BL/6NHsd 사용하여 당 부하 검사(GTT: Glucose Tolerance Test)를 수행하였다. 3개 군의 마우스에 대하여 생체내 GTT 검사를 수행하였고, 여기서, 각 군으로 마우스 5마리로 이루어졌다. 3개 군 모두 체중 측정 전 13.5시간 동안 금식시키고, 시점 0에서 혈당을 측정한 후, 10 uL/g(체중) 용량으로 30% 덱스트로스 용액과 함께 i.p.로 주사하였다. 덱스트로스 주사 후 15, 30, 60, 120, 및 180분째에 각 마우스에 대해 혈당 측정치를 기록하였다. 제1 군의 마우스는 2개 용량의 GLP1R-59-2로 처리하였다: 공복시(GTT 전 -13.5 hr) 10 mg/kg의 GLP1R-59-2, 및 다시 GTT 시작 2시간 전 10 mg/kg의 GLP1R-59-2. 제2 군의 마우스는 2개 용량의 GLP1R-3으로 처리하였다: 공복시(GTT 전 -13.5 hr) 10 mg/kg의 GLP1R-3, 및 다시 GTT 시작 2시간 전 10 mg/kg의 GLP1R-3. 제3 마우스 군은 대조군 마우스였고, 처리하지 않았다. 도 25a-25d에는 GLP1R-59-2(효능제), GLP1R-3(길항제), 및 대조군에 대한 데이터가 제시되어 있다. 도 25a는 시간 경과((분), x축)에 따른 GLP1R-59-2(효능제), GLP1R-3(길항제), 및 대조군으로 처리된 마우스에서의 혈당 수준(y축)을 보여주는 것이다. 도 25b는 GLP1R-59-2(효능제), GLP1R-3(길항제), 및 대조군으로 처리된 마우스에서의 혈당 수준(y축)을 보여주는 것이다. 도 25c에 제시된 바와 같이, 대조군과 비교하여 금식 상태의 마우스(p=0.0008) 및 비금식 상태의 마우스(p<0.0001), 둘 모두에서 GLP1R-59-2(효능제)로 처리된 마우스에서 혈당이 유이적으로 감소된 것이 관찰되었다. 도 25d에 제시된 바와 같이, GLP1R-3(길항제) 투약 이전의 동물은 6시간 공복시 어떤 당 감소도 보이지 않은 반면, 대조군 마우스는 감소를 보였다.

실시예 19. 예시적인 서열

GLP1R의 예시적인 서열은 표 27에 제시되어 있다.

본 개시내용의 바람직한 실시양태가 본원에서 제시되고, 설명되어 있지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 자명할 것이다. 본 개시내용을 벗어나지 않으면서 다수의 변형, 변화 및 치환이 당업자에게 인식될 것이다. 본원에 기술된 개시내용의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 개시내용을 실시할 때 사용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 하기 청구범위가 본 개시내용의 범주를 정의하고, 이들 청구범위 의 범주 내의 방법 및 구조 및 그의 등가물은 그에 의해 커버되는 것으로 의도된다.

Claims

복수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리로서, 여기서, 각각의 핵산이, 번역시 GLP1R 결합 면역글로불린을 코딩하는 서열을 코딩하고, 여기서, GLP1R 결합 면역글로불린은 GLP1R 결합 도메인의 변이체를 포함하고, 여기서, GLP1R 결합 도메인은 GLP1R에 대한 리간드이고, 여기서, 핵산 라이브러리는 적어도 10,000개의 변이체 면역글로불린 중쇄 및 적어도 10,000개의 변이체 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
제1항에 있어서, 핵산 라이브러리가 적어도 50,000개의 변이체 면역글로불린 중쇄 및 적어도 50,000개의 변이체 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
제1항에 있어서, 핵산 라이브러리가 적어도 100,000개의 변이체 면역글로불린 중쇄 및 적어도 100,000개의 변이체 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
제1항에 있어서, 핵산 라이브러리가 적어도 10⁵개의 비동일 핵산을 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
제1항에 있어서, 번역시, 면역글로불린 중쇄의 길이가 약 90 내지 약 100개의 아미노산 길이인 것인 핵산 라이브러리.
제1항에 있어서, 번역시, 면역글로불린 중쇄의 길이가 약 100 내지 약 400개의 아미노산 길이인 것인 핵산 라이브러리.
제1항에 있어서, 번역시, 변이체 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2303, 2304, 2305, 2306, 2307, 2308, 2309, 2317, 2318, 2319, 2320, 또는 2321과 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
제1항에 있어서, 번역시, 변이체 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2310, 2311, 2312, 2313, 2314, 2315, 또는 2316과 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
복수의 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리로서, 여기서, 각각의 핵산이, 번역시 GLP1R 단일 도메인 항체를 코딩하는 서열을 코딩하고, 여기서, 복수의 서열의 각 서열은 중쇄 상의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 중 적어도 하나를 코딩하는 변이체 서열을 포함하고; 여기서, 라이브러리는 적어도 30,000개의 변이체 서열을 포함하고; 여기서, 항체 또는 항체 단편은 100 nM 미만인 K_D로 그의 항원에 결합하는 것인 핵산 라이브러리.
제9항에 있어서, 핵산 라이브러리가 적어도 50,000개의 변이체 면역글로불린 중쇄 및 적어도 50,000개의 변이체 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
제9항에 있어서, 핵산 라이브러리가 적어도 100,000개의 변이체 면역글로불린 중쇄 및 적어도 100,000개의 변이체 면역글로불린 경쇄를 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
제9항에 있어서, 핵산 라이브러리가 적어도 10⁵개의 비동일 핵산을 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
제9항에 있어서, 번역시, 면역글로불린 중쇄의 길이가 약 90 내지 약 100개의 아미노산 길이인 것인 핵산 라이브러리.
제9항에 있어서, 번역시, 면역글로불린 중쇄의 길이가 약 100 내지 약 400개의 아미노산 길이인 것인 핵산 라이브러리
제9항에 있어서, 번역시, 변이체 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2303, 2304, 2305, 2306, 2307, 2308, 2309, 2317, 2318, 2319, 2320, 또는 2321과 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
제9항에 있어서, 번역시, 변이체 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2310, 2311, 2312, 2313, 2314, 2315, 또는 2316과 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄를 포함하고,
(a) 여기서, 면역글로불린 중쇄는 서열 번호 2303, 2304, 2305, 2306, 2307, 2308, 2309, 2317, 2318, 2319, 2320, 또는 2321에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
(b) 여기서, 면역글로불린 경쇄는 서열 번호 2310, 2311, 2312, 2313, 2314, 2315, 또는 2316에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, GLP1R에 결합하는 항체 또는 항체 단편.
제17항에 있어서, 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2303에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2310에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편.
제17항에 있어서, 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2304에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2311에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편.
제17항에 있어서, 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2305에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2312에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편.
제17항에 있어서, 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2306에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2313에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편.
제17항에 있어서, 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2307에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2314에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편.
제17항에 있어서, 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2308에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2315에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편.
제17항에 있어서, 면역글로불린 중쇄가 서열 번호 2309에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 여기서, 면역글로불린 경쇄가 서열 번호 2316에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편.
제17항에 있어서, 항체가 단일클론 항체, 다중클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 그라프팅된 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 낙타화 항체, 단일 쇄 Fv(scFv), 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 도메인 항체, 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 디아바디, 오직 단일 단량체 가변 도메인으로만 구성된 단편, 디술피드 연결된 Fv(sdFv), 인트라바디, 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 그의 ab 항원 결합 단편인 것인 항체 또는 항체 단편.
제17항에 있어서, 항체 또는 그의 항체 단편이 키메라 또는 인간화 항체 또는 그의 항체 단편인 것인 항체 또는 항체 단편.
제17항에 있어서, cAMP 검정법에서 항체의 EC50이 약 25 나노몰 미만인 것인 항체 또는 항체 단편.
제17항에 있어서, cAMP 검정법에서 항체의 EC50이 약 20 나노몰 미만인 것인 항체 또는 항체 단편.
제17항에 있어서, cAMP 검정법에서 항체의 EC50이 약 10 나노몰 미만인 것인 항체 또는 항체 단편.
제17항에 있어서, 항체가 GLP1R의 효능제인 것인 항체 또는 항체 단편.
제17항에 있어서, 항체가 GLP1R의 길항제인 것인 항체 또는 항체 단편.
제17항에 있어서, 항체가 GLP1R의 알로스테릭 조정제인 것인 항체 또는 항체 단편.
제32항에 있어서, GLP1R의 알로스테릭 조정제가 음성 알로스테릭 조정제인 것인 항체 또는 항체 단편.
제32항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 서열 번호 2277, 2278, 2281, 2282, 2283, 2284, 2285, 2286, 2289, 2290, 2291, 2292, 2294, 2295, 2296, 2297, 2298, 2299, 2300, 2301, 또는 2302, 또는 표 27에 기재된 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항체 단편.
항체 또는 항체 단편이 서열 번호 2277, 2278, 2281, 2282, 2283, 2284, 2285, 2286, 2289, 2290, 2291, 2292, 2294, 2295, 2296, 2297, 2298, 2299, 2300, 2301, 또는 2302, 또는 표 27에 기재된 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하고; 여기서, 항체는 단일클론 항체, 다중클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 그라프팅된 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 낙타화 항체, 단일 쇄 Fv(scFv), 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 도메인 항체, 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 디아바디, 오직 단일 단량체 가변 도메인으로만 구성된 단편, 디술피드 연결된 Fv(sdFv), 인트라바디, 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 그의 ab 항원 결합 단편인 것인 항체 또는 항체 단편.
서열 번호 2279 또는 2320을 포함하는 GLP1R의 길항제.
제36항에 있어서, 길항제가 1.5 nM 이하의 EC50을 포함하는 것인 길항제.
제36항에 있어서, 길항제가 1.0 nM 이하의 EC50을 포함하는 것인 길항제.
제36항에 있어서, 길항제가 0.5 nM 이하의 EC50을 포함하는 것인 길항제.
제36항에 있어서, 길항제가 항체 또는 항체 단편인 것인 길항제.
서열 번호 2317을 포함하는 GLP1R의 효능제.
제41항에 있어서, 효능제가 1.5 nM 이하의 EC50을 포함하는 것인 효능제.
제41항에 있어서, 효능제가 1.0 nM 이하의 EC50을 포함하는 것인 효능제.
제41항에 있어서, 효능제가 0.5 nM 이하의 EC50을 포함하는 것인 효능제.
제41항에 있어서, 효능제가 항체 또는 항체 단편인 것인 효능제.
제17항 내지 제35항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함하는, GLP1R 활성을 억제시키는 방법.
제46항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 알로스테릭 조정제인 것인 방법.
제46항에 있어서, 항체 또는 항체 단편이 음성 알로스테릭 조정제인 것인 방법.
대사 장애 치료를 필요로 하는 피험체에게 제17항 내지 제35항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 대사 장애를 치료하는 방법.
제49항에 있어서, 대사 장애가 II형 당뇨병 또는 비만인 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 핵산 라이브러리에 의해 코딩되는 단백질 라이브러리로서, 여기서, 단백질 라이브러리는 펩티드를 포함하는 것인 단백질 라이브러리.
제51항에 있어서, 단백질 라이브러리가 면역글로불린을 포함하는 것인 단백질 라이브러리.
제51항에 있어서, 단백질 라이브러리가 항체를 포함하는 것인 단백질 라이브러리.
제51항에 있어서, 단백질 라이브러리가 펩티드 모방체 라이브러리인 것인 단백질 라이브러리.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 핵산 라이브러리를 포함하는 벡터 라이브러리.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 핵산 라이브러리를 포함하는 세포 라이브러리.
제51항 내지 제54항 중 어느 한 항의 단백질 라이브러리를 포함하는 세포 라이브러리.