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JP2011509095A - 核酸配列決定のための対をなすタグのライブラリーを製造する方法 - Google Patents

核酸配列決定のための対をなすタグのライブラリーを製造する方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、対をなすタグ及び対をなすタグのライブラリーを製造する方法及び組成物に関する。

Description

本願は、２００８年１０月３０日出願の米国仮特許出願第６１／１０９，６３８号及び２００８年１月９日出願の第６１／０２０，１１４号の優先権を主張し、上記出願の全体を参照により本明細書に組み入れる。
（技術分野）
本開示は、配列の対をなすタグおよび対をなすタグのライブラリーを製造し、使用する方法および組成物に関する。
（導入）
「対をなす末端（ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ）」、「対での」または「対をなすタグ」の配列決定の技術は、分子生物学分野において、特に全ゲノムのショットガン配列決定に関連して、一般的に知られている（非特許文献１及び２）。対をなすタグの配列決定によって、単一のポリヌクレオチド二本鎖上の２つの場所からの配列の２つの「読み取り」が可能となる。いくつかの状況において、対をなす末端のアプローチによって、２つの独立した核酸配列のそれぞれからのランダムな様式での「ｎ」塩基の配列決定よりも、より多くの情報が、２つのひと続きの核酸配列、長さにおいてそれぞれ「ｎ」塩基の配列決定から得られるようになる。例えば、配列情報のアセンブリに適切なソフトウェアツールを使用することによって（非特許文献３及び４）、「対をなすタグ」配列は完全にランダムではないが、単一の二本鎖上で生じることが知られており、したがって、ゲノム内で結合しているか、または対をなしている、という知識を利用することが可能である。この情報は、全ゲノム配列のコンセンサス配列へのアセンブリの助けとなり得るものである。
Ｓｉｅｇｅｌ Ａ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０００，６８： ２３７−２４６ Ｒｏａｃｈ Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９５，２６：３４５−３５３ Ｍｉｌｌｉｋｉｎ Ｓ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００３，１３：８１−９０ Ｋｅｎｔ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００１，１１：１５４１−８
いくつかの実施態様において、本技術は、対をなすタグ及び対をなすタグのライブラリーの製造を容易にする方法及び製品を提供する。いくつかの実施態様において、これらを用いて、生産される対をなすタグのサイズを増加させ、コストを減少させることができる。この拡張されたサイズは、配列アセンブリを容易にし、微生物の同定及び遺伝子のバリエーションの発見などの次世代のＤＮＡ配列決定用途における正確さを改善することができる。
いくつかの実施態様において、第１のタグ配列及び第２のタグ配列を含む対をなすタグを形成する方法が提供される。該方法は、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端及び第２の末端をアダプターにライゲーションし、それによって、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端とアダプターとの間の第１のニックと、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端とアダプターとの間の第２のニックとを含む環状の核酸分子であって、第１のニック及び第２のニックが環状の核酸分子の第２のニックとは異なる鎖上にある環状の核酸分子を形成することと、少なくとも１つのニックを関心対象のポリヌクレオチドに翻訳するニックトランスレーション反応を行うことを含む。
いくつかの実施態様において、関心対象のＤＮＡ断片から、放出された対をなすタグを形成する方法が提供される。該方法は、第１のアダプターを関心対象のＤＮＡ断片の第１の末端にライゲーションし、かつ第２のアダプターを関心対象のＤＮＡ断片の第２の末端にライゲーションし、それによって、アダプター修飾断片を生じさせることと、第３のアダプターをアダプター修飾断片に付着させることによって、アダプター修飾断片を環状化し、それによって、第１のニックが第３のアダプターと第１のアダプターとの間に存在し、第２のニックが第２のアダプターと第３のアダプターとの間に存在する、環状の核酸分子であって、ＤＮＡの第１の鎖及び第２の鎖を含み、第１のニック及び第２のニックが環状の核酸分子の同一の鎖上に存在しない、環状の核酸分子を形成することと、環状の核酸分子の各鎖上のニックを関心対象のＤＮＡ断片に翻訳するニックトランスレーション反応を行うことと、環状の核酸分子を翻訳されたニックの位置で切断し、それによって、放出された対をなすタグを形成することとを含む。
いくつかの実施態様において、放出された対をなすタグのライブラリーが提供される。放出された対をなすタグのライブラリーは、第１のアダプターを関心対象のポリヌクレオチドの第１の末端にライゲーションし、第２のアダプターを関心対象のポリヌクレオチドの第２の末端にライゲーションし、それによって、アダプターで修飾された関心対象のポリヌクレオチドを生じさせることと、第３のアダプターをアダプターで修飾された関心対象のポリヌクレオチドに付着させることによって、アダプターで修飾された関心対象のポリヌクレオチドを環状化し、それによって、第１のニックが第３のアダプターと第１のアダプターとの間に存在し、第２のニックが第２のアダプターと第３のアダプターとの間に存在する、環状の核酸分子であって、第１の鎖と第２の鎖とを含み、第１のニック及び第２のニックが環状の核酸分子の同一の鎖上に存在しない、環状の核酸分子を形成することと、環状の核酸分子の鎖上のニックを関心対象のポリヌクレオチドに翻訳するニックトランスレーション反応を行うことと、環状の核酸分子を翻訳されたニックの位置で切断し、それによって、放出された対をなすタグを形成することとを含む方法によって製造される、２又はそれ以上の放出された対をなすタグを含む。
いくつかの実施態様において、放出された対をなすタグが提供される。放出された対をなすタグは、第１のタグ配列であって、関心対象のポリヌクレオチドの第１の末端を含み、長さにおいて２７ヌクレオチドより多い第１のタグ配列と、第１のタグ配列に共有結合した第１のアダプターであって、結合部分を含む第１のアダプターと、第１のアダプターに共有結合した第２のタグ配列であって、関心対象のポリヌクレオチドの第２の末端を含み、長さにおいて２７ヌクレオチドより多い第２のタグ配列とを含む。
いくつかの実施態様において、溶液が提供される。溶液は、環状の核酸分子を含み、環状の核酸分子は、第１の末端及び第２の末端を含む関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドと、少なくとも１つのアダプターとを含む。少なくとも１つのアダプターは、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端及び第２の末端に共有結合でき、それによって、環状化した核酸分子を形成する。環状の核酸分子は、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端とアダプターとの間の第１のニックと、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端とアダプターとの間の第２のニックとを更に含む。第１のニックは、環状の核酸分子の第２のニック又はギャップとは異なる鎖上にある。また、溶液は、ニックトランスレーション酵素を含むこともできる。いくつかの実施態様において、溶液は、第２の環状の核酸分子をさらに含み、第２の環状の核酸分子は、第１の末端及び第２の末端を含む関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドと、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端及び第２の末端に共有結合し、それによって、第２の環状化した核酸分子を形成する、少なくとも１つのアダプターとを含む。第２の環状の核酸分子は、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端とアダプターとの間の位置から２７ヌクレオチドより多く離れている第３のニックと、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端とアダプターとの間の位置から２７ヌクレオチドより多く離れている第４のニックとを含み、第３のニックは、環状の核酸分子の第４のニックとは異なる鎖上にある。
いくつかの実施態様において、対をなすタグを形成する方法が提供される。対をなすタグは、関心対象のポリヌクレオチドの少なくとも一部を共に含む第１のタグ配列と第２のタグ配列とを含む。該方法は、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端を少なくとも１つのアダプターにライゲーションすることと、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端を少なくとも１つのアダプターにライゲーションすることとを含む。該方法は、環状の核酸分子であって、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドと、環状の核酸分子の第１の鎖上に第１の３’末端を含む第１のニックと、環状の核酸分子の第２の鎖上に第２の３’末端を含む第２のニックとを含む、環状の核酸分子を形成することを更に含む。第１のニック及び第２のニックは、環状の核酸分子の異なる鎖上にある。該方法は、環状の核酸分子の第１の鎖の第１の３’末端を関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの配列へ伸長させることと、環状の核酸分子の第２の鎖の第２の３’末端を関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの配列へ伸長させることとを更に含む。
いくつかの実施態様において、ニックの入った連結ポリヌクレオチドが提供される。ニックの入った連結ポリヌクレオチドは、第２のアダプター鎖にハイブリダイズしている第１のアダプター鎖を含む第１のアダプターを含む。第１のアダプター鎖は、その５’末端上のリン酸基を欠く。ニックの入った連結ポリヌクレオチドは、第４のアダプター鎖にハイブリダイズしている第３のアダプター鎖を含む第２のアダプターを更に含む。第３のアダプター鎖は、その５’末端上のリン酸基を欠く。ニックの入ったポリヌクレオチドは、第２の連結鎖にハイブリダイズした第１の連結鎖を含む連結ポリヌクレオチドを更に含む。連結ポリヌクレオチドは、第１の末端と第２の末端とを含む。第１のアダプターは、連結ポリヌクレオチドの第１の末端に、第１のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠くところにニックが存在するように付着している。第２の連結鎖は、第２のアダプター鎖に付着している。第２のアダプターは、連結ポリヌクレオチドの第２の末端に、第２のアダプターの第３のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠くところにニックが存在するように付着している。連結ポリヌクレオチドの第２の鎖は、第４のアダプター鎖に付着している。
いくつかの実施態様において、ニックの入った連結ポリヌクレオチドが提供される。ニックの入った連結ポリヌクレオチドは、第１の二本鎖アダプターと、二本鎖の連結ポリヌクレオチドと、二本鎖の連結ポリヌクレオチドの第２の末端に付着している第２の二本鎖アダプターとを含む。第１の二本鎖アダプターは、二本鎖の連結ポリヌクレオチドの第１の末端に付着している。第１のアダプターの第１の鎖と二本鎖ベクターの第１の鎖を分ける第１のニックと、第２のアダプターの第２の鎖と二本鎖ベクターの第１の鎖を分ける第２のニックがある。第１のニック及び第２のニックは、ニックの入ったベクターの異なる鎖上にある。
いくつかの実施態様において、対をなすタグを製造する方法が提供される。該方法は、第２のアダプター鎖にハイブリダイズしている第１のアダプター鎖を含む第１のアダプターであって、第１のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠く、第１のアダプターと、第４のアダプター鎖にハイブリダイズしている第３のアダプター鎖を含む第２のアダプターであって、第３のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠く、第２のアダプターと、第２の連結鎖にハイブリダイズした第１の連結鎖を含む連結ポリヌクレオチドとを含む、ニックの入った連結ポリヌクレオチドを用意することを含む。連結ポリヌクレオチドは、第１の末端と第２の末端とを含む。第１のアダプターは、連結ポリヌクレオチドの第１の末端に、第１のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠くところにニックが存在するように付着している。第２の連結鎖は、第２のアダプター鎖に付着している。第２のアダプターは、連結ポリヌクレオチドの第２の末端に、第２のアダプターの第３のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠くところにニックが存在するように付着している。連結ポリヌクレオチドの第２の鎖は、第４のアダプター鎖に付着している。前記方法は、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端を第１のアダプターにライゲーションすることと、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端を第２のアダプターにライゲーションすることと、第１の及び第２のニックを関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドに移動させることを更に含む。
いくつかの実施態様において、対をなすタグを製造する方法及び対をなすタグ自体が提供される。いくつかの実施態様において、該方法によって、サイズが制限されない対をなすタグの生産が可能となる。いくつかの実施態様において、本発明は、直線状の対をなすタグを含む。直線状の対をなすタグは、第１のタグ配列を含むことができる。第１のタグ配列は、関心対象のポリヌクレオチドの第１の末端を含む。直線状の対をなすタグは、第１のタグ配列に共有結合している第１のアダプターと第１のアダプターに共有結合した第２のタグ配列とを更に含むことができる。第２のタグ配列は、関心対象のポリヌクレオチドの第２の末端を含む。直線状の対をなすタグは、ＩＩｓ型制限部位を欠き、かつＩＩＩ型制限部位を欠く。
いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドの少なくとも一部を共に含む第１のタグ配列と第２のタグ配列とを含む対をなすタグを形成する方法が提供される。該方法は、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端及び第２の末端をアダプターにライゲーションし、それによって、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端とアダプターとの間の第１のニックと、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端とアダプターとの間の第２のニックとを含み、第１のニック及び第２のニックは第２のニックとは環状の核酸分子の異なる鎖上にある、環状の核酸分子を形成することと、少なくとも１つのニックを関心対象のポリヌクレオチドに翻訳するニックトランスレーション反応を行うこととを含むことができる。いくつかの実施態様において、前記方法は、ニックトランスレーション反応を特定の時間進行させることと、ニックトランスレーション反応を終結させることとを更に含むことができる。いくつかの実施態様において、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端及び第２の末端は５’リン酸残基を欠く。いくつかの実施態様において、前記方法は、第１のニック及び第２のニックが互いを通り過ぎて翻訳される前に、ニックトランスレーション反応を終結させることを更に含む。いくつかの実施態様において、第１のニック及び第２のニックが１０塩基を超えて翻訳される。いくつかの実施態様において、前記方法は、第１のニック及び第２のニックにおいて環状の核酸分子を切断するステップを更に含む。いくつかの実施態様において、第１のニック及び第２のニックが５００塩基未満翻訳される。いくつかの実施態様において、第１のニック及び第２のニックが２００塩基未満翻訳される。いくつかの実施態様において、第１のニック及び第２のニックが１００塩基未満下翻訳される。いくつかの実施態様において、第１のニック及び第２のニックが、約２０塩基〜約５０塩基翻訳される。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのニックが５００塩基未満翻訳される。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのニックが、２７塩基より多く５００塩基未満翻訳される。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのニックが２００塩基未満翻訳される。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのニックが、２８塩基〜約５０塩基翻訳される。いくつかの実施態様において、環状の核酸分子は、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端とアダプターとの間の第１のギャップを含む。いくつかの実施態様において、環状の核酸分子は、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端とアダプターとの間の第２のギャップを含む。いくつかの実施態様において、環状の核酸配列は、ニックトランスレーション反応を行ってニックを生じさせる際にヌクレオチドで埋められるギャップを含む。いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドは、５０〜２５００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、ライゲーションするステップの前に、関心対象のポリヌクレオチドをサイズ選別技術に付して、５０〜２５００ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドについて選別する。いくつかの実施態様において、アダプターは、結合部分を含む。いくつかの実施態様において、ニックトランスレーション反応を、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼＩ、及びｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、並びにそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される酵素を用いて行う。いくつかの実施態様において、ニックトランスレーション反応を、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて行う。いくつかの実施態様において、ニックトランスレーション反応は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によるヌクレオチドの除去を含む。いくつかの実施態様において、ニックトランスレーション反応が、鎖の置換によって発生する。いくつかの実施態様において、前記方法は、第１の翻訳されたニックにおいて環状の核酸分子を切断し、それによって、アダプターによって分けられた第１のタグ配列及び第２のタグ配列であって、関心対象のポリヌクレオチドに由来する第１のタグ配列及び第２のタグ配列を含む、直線状のポリヌクレオチドを形成することを更に含む。いくつかの実施態様において、前記方法は、環状の核酸分子を第２の翻訳されたニックにおいて切断することを更に含む。いくつかの実施態様において、環状の核酸分子を、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＰ１、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される酵素によって切断する。いくつかの実施態様において、前記方法は、直線状のポリヌクレオチドを増幅することを更に含む。いくつかの実施態様において、アダプターは、ビオチンを含む結合部分を含む。いくつかの実施態様において、前記方法は、ストレプトアビジンを用いて、対をなすタグを精製するステップを更に含む。いくつかの実施態様において、前記方法は、ライゲーションの前に関心対象のポリヌクレオチドをアルカリホスファターゼで処理し、関心対象のポリヌクレオチドの第１の末端及び第２の末端の両方から５’−リン酸を除去することを更に含む。いくつかの実施態様において、アルカリホスファターゼは、仔牛腸アルカリホスファターゼ、細菌アルカリホスファターゼ、エビアルカリホスファターゼ、及びそれらの何らかの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施態様において、環状の核酸分子は、第１のアダプターに隣接して位置づけられている第２のアダプターを更に含む。いくつかの実施態様において、第１のアダプターの一つの鎖及び第２のアダプターの一つの鎖は、５’リン酸を欠く。いくつかの実施態様において、各ステップを記載されている順で行う。
いくつかの実施態様において、関心対象のＤＮＡ断片から、放出された対をなすタグを形成する方法が提供される。前記方法は、第１のアダプターを関心対象のＤＮＡ断片の第１の末端にライゲーションし、第２のアダプターを関心対象のＤＮＡ断片の第２の末端にライゲーションし、それによって、アダプター修飾断片を生じさせ、第３のアダプターをアダプター修飾断片に付着させることによって、アダプター修飾断片を環状化し、それによって、環状の核酸分子であって、第１のニックが第３のアダプターと第１のアダプターとの間に存在し、第２のニックが第２のアダプターと第３のアダプターとの間に存在し、ＤＮＡの第１の鎖及び第２の鎖を含み、かつ第１のニック及び第２のニックが環状の核酸分子の同一の鎖上に存在しない、環状の核酸分子を形成することと、各鎖上のニックを関心対象のＤＮＡ断片に翻訳するニックトランスレーション反応を行い、環状の核酸分子を翻訳されたニックの位置で切断し、それによって、放出された対をなすタグを形成することとを含むことができる。いくつかの実施態様において、前記方法は、ニックトランスレーション反応を特定の時間進行させることと、ニックトランスレーション反応を終結させることを更に含む。いくつかの実施態様において、前記方法は、翻訳されたニックにおける各位置でポリヌクレオチド鎖を切断する前に、ニックトランスレーション反応を終結させることを更に含む。いくつかの実施態様において、前記方法は、プライマーアダプターを、対をなすタグの末端に付着させることを更に含む。いくつかの実施態様において、前記方法は、対をなすタグを、プライマーアダプターについてのプライマーで増幅することを更に含む。いくつかの実施態様において、増幅は、クローナルな増幅である。いくつかの実施態様において、クローナルな増幅は、エマルジョン・ポリメラーゼ連鎖反応（エマルジョンＰＣＲ）を含む。いくつかの実施態様において、クローナルな増幅は、ブリッジ・ポリメラーゼ連鎖反応（ブリッジＰＣＲ）を含む。いくつかの実施態様において、第３のアダプターは、結合部分を含み、結合部分を固体の支持体に結合させることを更に含む。いくつかの実施態様において、固体の支持体は、アレイである。いくつかの実施態様において、方法は、対をなすタグの一部を配列決定することを更に含む。
いくつかの実施態様において、方法によって製造された２又はそれ以上の放出された対をなすタグを含む、放出された対をなすタグのライブラリーが提供される。前記方法は、第１のアダプターを関心対象のポリヌクレオチドの第１の末端にライゲーションし、第２のアダプターを関心対象のポリヌクレオチドの第２の末端にライゲーションし、それによって、アダプターで修飾された関心対象のポリヌクレオチドを生じさせ、第３のアダプターをアダプターで修飾された関心対象のポリヌクレオチドに付着させることによって、アダプターで修飾された関心対象のポリヌクレオチドを環状化し、それによって、第１のニックが第３のアダプターと第１のアダプターとの間に存在し、第２のニックが第２のアダプターと第３のアダプターとの間に存在し、第１の鎖と第２の鎖とを含み、第１のニック及び第２のニックが環状の核酸分子の同一の鎖上に存在しない、環状の核酸分子を形成することと、環状の核酸分子の鎖上のニックを関心対象のポリヌクレオチドに翻訳するニックトランスレーション反応を行い、環状の核酸分子を翻訳されたニックの位置で切断し、それによって、放出された対をなすタグを形成することとを含むことができる。いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドは、プラスミド、ウイルス、原核細胞、古細菌細胞、細菌人工染色体、真核細胞、細胞株、原生動物、植物、藻類、細菌、真菌、昆虫、爬虫類、魚類、両生類、鳥類、及び哺乳類からなる群より選択される生物から製造される。いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドをサイズ選別技術に供する。いくつかの実施態様において、ライゲーションするステップの前に、サイズ選別技術を用いて、２０００〜３０００ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドについて選別する。
いくつかの実施態様において、放出された対をなすタグが提供される。放出された対をなすタグは、関心対象のポリヌクレオチドの第１の末端を含み、長さにおいて少なくとも２７ヌクレオチドである第１のタグ配列と、第１のタグ配列に共有結合した第１のアダプターと、第１のアダプターに共有結合した第２のタグ配列であって、関心対象のポリヌクレオチドの第２の末端を含み、長さにおいて少なくとも２７ヌクレオチドである、第２のタグ配列とを含む。いくつかの実施態様において、第１のアダプターは、結合部分を更に含む。いくつかの実施態様において、第１のタグ配列は、長さにおいて少なくとも４０ヌクレオチドである。いくつかの実施態様において、第２のタグ配列は、長さにおいて少なくとも４０ヌクレオチドである。
いくつかの実施態様において、溶液が提供される。該溶液は、第１の末端及び第２の末端を含む関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドと、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端及び第２の末端に共有結合することによって環状化した核酸分子を形成する少なくとも１つのアダプターとを含む、環状の核酸分子であって、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端とアダプターとの間の第１のニックと、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端とアダプターとの間の第２のニックとを更に含み、第１のニックが、環状の核酸分子の第２のニック又はギャップとは異なる鎖上にある、環状の核酸分子と、ニックトランスレーション酵素とを含むことができる。いくつかの実施態様において、ニックトランスレーション酵素は、ＤＮＡポリメラーゼＩを含む。いくつかの実施態様において、前記溶液は、ニック切断酵素を更に含み、ニックトランスレーション酵素が熱で不活性化される。いくつかの実施態様において、前記溶液は、第２の環状の核酸分子を更に含み、第２の環状の核酸分子は、第１の末端と第２の末端とを含む関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドと、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端及び第２の末端に共有結合することによって第２の環状化した核酸分子を形成する少なくとも１つのアダプターとを含み、第２の環状の核酸分子は、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端とアダプターとの間の位置から２７ヌクレオチドを超えて離れている第３のニックと、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端とアダプターとの間の位置から２７ヌクレオチドを超えて離れている第４のニックを含み、第３のニックは、環状の核酸分子の第４のニックとは異なる鎖上にある。いくつかの実施態様において、第３のニックは、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端とアダプターとの間の位置から少なくとも５０ヌクレオチド離れている。いくつかの実施態様において、第４のニックは、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端とアダプターとの間の位置から少なくとも５０ヌクレオチド離れている。いくつかの実施態様において、前記溶液は、ニック切断酵素をさらに含み、ニックトランスレーション酵素が熱で不活性化される。
いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドの少なくとも一部を共に含む第１のタグ配列と第２のタグ配列とを含む対をなすタグを形成する方法が提供される。該方法は、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端を少なくとも１つのアダプターにライゲーションすることと、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端を少なくとも１つのアダプターにライゲーションすることと、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドと、環状の核酸分子の第１の鎖上に第１の３’末端を含む第１のニックと、環状の核酸分子の第２の鎖上に第２の３’末端を含む第２のニックとを含む、環状の核酸分子であって、第１のニック及び第２のニックが環状の核酸分子の異なる鎖上にある、環状の核酸分子を形成することと、環状の核酸分子の第１の鎖の第１の３’末端を関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの配列へ伸長することと、環状の核酸分子の第２の鎖の第２の３’末端を関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの配列へ伸長することとを含むことができる。いくつかの実施態様において、第１の３’末端を伸長させる前に、第１のニックを、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端と少なくとも１つのアダプターとの間に位置付け、第２のニックを、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端と少なくとも１つのアダプターとの間に位置付ける。いくつかの実施態様において、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の及び第２の末端を同一のアダプターに連結する。いくつかの実施態様において、アダプターは、第１の及び第２のアダプターを含み、環状の核酸分子の形成により、第１のアダプターが、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端上に位置付けられ、第２のアダプターが、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端上に位置付けられる。いくつかの実施態様において、第１のアダプターが、連結ポリヌクレオチドを介して第２のアダプターに連結されている。いくつかの実施態様において、環状の核酸分子の形成により、第１のニックが、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドに連結されている第１のアダプターの末端に対して遠位にある第１のアダプターの末端に位置付けられ、第２のニックが、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドに連結されている第２のアダプターの末端に対して遠位にある第２のアダプターの末端に位置付けられている。いくつかの実施態様において、アダプターを関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションする前に、アダプターを連結ポリヌクレオチドにライゲーションする。いくつかの実施態様において、前記方法は、環状の核酸分子の第１の鎖の少なくとも一部を消化することと、環状の核酸分子の第２の鎖の少なくとも一部を消化することとを更に含み、消化によって、関心対象の二本鎖のポリヌクレオチドの少なくとも一部が一本鎖となる結果がもたらされ、消化は、第１の及び第２の３’末端を伸長させる前に起こる。いくつかの実施態様において、５’−３’エキソヌクレアーゼを用いて、前記ニックの入った環状の核酸分子を消化する。いくつかの実施態様において、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの全体が一本鎖となる前に、消化を停止する。いくつかの実施態様において、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチド全体を、関心対象の一本鎖ポリヌクレオチドに消化する。いくつかの実施態様において、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、前記ニックの入った環状の核酸分子を伸長させる。いくつかの実施態様において、前記方法は、環状の核酸分子の第１の鎖の少なくとも一部を消化することと、環状の核酸分子の第２の鎖の少なくとも一部を消化することとを更に含み、消化によって、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一部が一本鎖となる結果がもたらされ、消化は、第１の及び第２の３’末端を伸長させるのと同時に起こる。いくつかの実施態様において、消化及び伸長が、同一の反応チューブで行われる。いくつかの実施態様において、環状の核酸分子の第１の鎖の第１の３’末端を関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの配列に伸長することは、ニックトランスレーションによって達成される。いくつかの実施態様において、環状の核酸分子の第２の鎖の第２の３’末端を関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの配列に伸長することは、ニックトランスレーションによって達成される。いくつかの実施態様において、第１の及び第２のニックを、それぞれ第１のギャップ及び第２のギャップに広げる。いくつかの実施態様において、エキソヌクレアーゼを用いて、第１の及び第２のニックをそれぞれ第１のギャップ及び第２のギャップに広げる。いくつかの実施態様において、エキソヌクレアーゼは、Ｔ７エキソヌクレアーゼを含む。いくつかの実施態様において、前記方法は、一本鎖に依存した消化を行って、対をなすＤＮＡタグを放出すること更に含む。
いくつかの実施態様において、ニックの入った連結ポリヌクレオチドが提供される。ニックの入った連結ポリヌクレオチドは、第２のアダプター鎖にハイブリダイズしている第１のアダプター鎖を含む第１のアダプターであって、第１のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠く、第１のアダプターと、第４のアダプター鎖にハイブリダイズしている第３のアダプター鎖を含む第２のアダプターであって、第３のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠く、第２のアダプターと、第２の連結鎖にハイブリダイズした第１の連結鎖を含む連結ポリヌクレオチドとを含むことができ、連結ポリヌクレオチドが第１の末端と第２の末端とを含み、第１のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠くところにニックが存在しているように、第１のアダプターが連結ポリヌクレオチドの第１の末端に付着し、第２の連結鎖は、第２のアダプター鎖に付着し、第２のアダプターは、連結ポリヌクレオチドの第２の末端に、第２のアダプターの第３のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠くところにニックが存在するように付着し、連結ポリヌクレオチドの第２の鎖が、第４のアダプター鎖に付着している。いくつかの実施態様において、ニックの入った連結ポリヌクレオチドは、第２のアダプター鎖の５’末端上のリン酸基を更に含む。いくつかの実施態様において、ニックの入った連結ポリヌクレオチドは、第４のアダプター鎖の５’末端上のリン酸基を更に含む。いくつかの実施態様において、第２のアダプター鎖の３’末端上のリン酸基を更に含むものの上にリン酸基がない。
いくつかの実施態様において、ニックの入った連結ポリヌクレオチドが提供される。ニックの入った連結ポリヌクレオチドは、第１の二本鎖アダプターと、二本鎖の連結ポリヌクレオチドであって、第１の二本鎖アダプターが該二本鎖の連結ポリヌクレオチドの第１の末端に付着している、二本鎖の連結ポリヌクレオチドと、二本鎖の連結ポリヌクレオチドの第２の末端に付着している第２の二本鎖アダプターとを含むことができ、第１のアダプターの第１の鎖と二本鎖ベクターの第１の鎖を分ける第１のニック及び第２のアダプターの第２の鎖と二本鎖ベクターの第１の鎖を分ける第２のニックがあり、第１のニック及び第２のニックは、ニックの入ったベクターの異なる鎖上にある。
いくつかの実施態様において、対をなすタグを製造する方法が提供される。該方法は、第２のアダプター鎖にハイブリダイズしている第１のアダプター鎖を含む第１のアダプターであって、該第１のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠く、第１のアダプターと、第４のアダプター鎖にハイブリダイズしている第３のアダプター鎖を含む第２のアダプターであって、第３のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠く、第２のアダプターと、第２の連結鎖にハイブリダイズした第１の連結鎖を含む連結ポリヌクレオチドであって、第１の末端と第２の末端とを含み、第１のアダプターが、連結ポリヌクレオチドの第１の末端に、第１のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠くところにニックが存在するように付着し、第２の連結鎖が、第２のアダプター鎖に付着し、第２のアダプターが、連結ポリヌクレオチドの第２の末端に、第２のアダプターの第３のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠くところにニックが存在するように付着し、連結ポリヌクレオチドの第２の鎖が第４のアダプター鎖に付着している、連結ポリヌクレオチドとを含む、ニックの入った連結ポリヌクレオチドを用意することを含むことができる。前記方法は、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端を第１のアダプターにライゲーションすることと、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端を第２のアダプターにライゲーションすることと、第１の及び第２のニックを関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドに移動させることとを更に含むことができる。いくつかの実施態様において、前記方法は、ニックの入った連結ポリヌクレオチドを線状にするために、一本鎖に依存した消化をすることを更に含む。いくつかの実施態様において、前記方法は、内部アダプターを、線状にしたニックの入った連結ポリヌクレオチドにライゲーションすることを更に含む。いくつかの実施態様において、前記方法は、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一本の鎖を増幅することを更に含む。いくつかの実施態様において、増幅は、ＰＣＲベースの増幅である。
いくつかの実施態様において、直線状の対をなすタグが提供される。直線状の対をなすタグは、関心対象のポリヌクレオチドの第１の末端を含む第１のタグ配列と、第１のタグ配列に共有結合した第１のアダプターと、第１のアダプターに共有結合し、関心対象のポリヌクレオチドの第２の末端を含む、第２のタグ配列とを含むことができ、前記直線状の対をなすタグは、ＩＩｓ型制限部位を欠き、かつＩＩＩ型制限部位を欠く。
当業者は、下記の図面が専ら例示を目的とするものであることを理解する。図面は本技術の範囲を何ら制限するものではない。
図１は、ニックの入った環状の核酸分子を形成する実施態様を示す。 図２は、ニックトランスレーションのステップを実施する実施態様を示す。 図３は、ニックの入った環状の核酸を形成する実施態様を示す。 図４は、本発明の実施態様のステップを実施する実施態様を示す。 図５は、環状の核酸分子を線状にする実施態様を示す。 図６は、プライマーアダプターを配列決定のための対をなすタグに付着させる実施態様を示す。 図７は、ギャップの入った環状の核酸分子を形成する実施態様を示す。 図８は、環状の核酸分子を形成する実施態様を示す。 図９は、ニックの入った環状の核酸分子を形成する実施態様を示す。 図１０は、トポイソメラーゼＩ結合部位とニックとを有するアダプターを形成する実施態様を示す。三角は、トポイソメラーゼＩ認識部位の位置を示す。 図１１は、トポイソメラーゼＩ−アダプター複合体を形成する実施態様を示す。 図１２は、ニックの入った環状の核酸分子を形成する実施態様を示す。 図１３は、ニックの入った環状の核酸分子の実施態様を示す。 図１４は、ニックトランスレーションステップを伴う実施態様を示す。 図１５は、ギャップ形成によって対をなすタグを形成するいくつかの実施態様を示す。 図１６は、対をなすタグを形成する別の実施態様を示す。 図１７は、図１６から続く、対をなすタグを形成する別の実施態様を示す。 図１８は、図１７から続く、対をなすタグを形成する別の実施態様を示す。 図１９は、対をなすタグを形成する別の実施態様を示す。 図２０は、図１９から続く、対をなすタグを形成する別の実施態様を示す。 図２１は、図２０から続く、対をなすタグを形成する別の実施態様を示す。 図２２は、ニックの入った連結ポリヌクレオチドの実施態様を示す。 図２３は、アダプターが連結ポリヌクレオチド上にライゲーションされている、ニックの入った連結ポリヌクレオチドの実施態様を示す。 図２４Ａは、アダプターと連結ポリヌクレオチドとの間のニックの構造についての実施態様を示し、図２４Ｂは、アダプターと連結ポリヌクレオチドとの間のニックの構造についての実施態様を示す。 図２５Ａ〜２５Ｃは、アダプターの末端の種々の構造についての３つの実施態様を示す。 図２６は、図２５Ｂにおけるニックの入った連結ポリヌクレオチドを使用する方法の実施態様を示す。 図２７は、図２６中の実施態様の続きを示す。 図２８は、内部アダプターライゲーションの別の実施態様を示す。 図２９Ａは、ニックの入った連結ポリヌクレオチドの実施態様のいくつかが、どのようにすべてのニックの入った連結ポリヌクレオチドが有用であるという結果をもたらすかを示し、図２９Ｂは、あまり好ましくないニックの入った連結ポリヌクレオチドの多数の可能な配置、及びそれらのいくつかがあまり有用でない生産物をもたらすことを示す。
本明細書に開示される種々の実施態様は、概して、対をなすタグ及び対をなすタグのライブラリーを製造するための組成物及び方法に向けられたものである。ＤＮＡの「対をなすタグ」は、関心対象のポリヌクレオチドから生成される２つのタグ（核酸配列）を含む、ある長さの核酸配列である。概して、各タグは、関心対象のポリヌクレオチドの別個の部分であり、別個のタグ上での短鎖読み取り配列決定（短い読み取り配列決定）技術の使用（これに制限されない）を可能にするが、タグは根本的には同じポリヌクレオチド断片に由来することから、後の配列分析において２つのタグの配列を関連づけることを可能にするものである。
現在、対をなすタグ及び対をなすタグのライブラリーを製造するために存在する限られた数の技術がある。種々の技術は、多くの場合、短い配列の読み取り及び高コストを招き得るという問題を有している。今まで、次世代の配列決定戦略は、概して、ＥｃｏＰ１５Ｉ（ＡＢ ＳＯＬｉＤ（商標）配列決定）及びＭｍｅＩ（４５４Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）などのＩＩＩ型制限酵素をＤＮＡの対をなすタグを生成するために利用していた。ＥｃｏＰ１５Ｉ及びＭｍｅＩが２７ｂｐ及び１８ｂｐの配列のタグのみをそれぞれ生成することから、これらの戦略は、タグの長さを制限するものである。本明細書に記載されている実施態様のいくつかは、このような制限及び他の制限を克服するものである。
本実施態様のいくつかは、対をなすタグのクローンを製造する方法を伴う。一のそのような実施態様を、概して、図１及び２に概説する。図１において、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドのＤＮＡ断片（「ＤＮＡ」で示される）を両末端にてアダプターにライゲーションして、環状の核酸分子を形成する。図示した実施態様において、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドのＤＮＡ断片は、５’末端及び３’末端の両方において５’リン酸残基を欠く。生じた環状の核酸分子は、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドＤＮＡ断片の５’末端とアダプターとの間のニックと、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドＤＮＡ断片の第２の末端とアダプターとの間のニックを有する。図１に概略的に示すように、ニックは、環状の核酸分子の異なる鎖上にあることが可能である。次に、図２に示すように、ニックトランスレーション反応を行う。図２に概略的に示すように、ニックを環状の核酸分子の各鎖上の５’から３’の方向で、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドＤＮＡ断片内の位置に移動させる。この点において、図５に概略的に示すように、対をなすタグのクローンを、ニックの反対の位置でポリヌクレオチド鎖を切断することによって放出できる。
ニックトランスレーション反応の生成物の長さ、すなわちニックが移動した距離は、反応時間、反応温度、使用したポリメラーゼなどの反応条件に依存する。当業者に明らかであるように、反応条件を変動させて、ニックトランスレーション生成物の長さを制御することができる。それ故に、いくつかの実施態様において、製造した配列タグの長さを制御できる。さらに、いくつかの実施態様において、結合部分をアダプターに結合させることができ、対をなすタグのクローンを、例えば、固体の支持体に付着させることが可能である。さらに、図６に概略的に示すように、いくつかの実施態様において、プライマーアダプターを、対をなすタグのクローンの末端に付着させることができる。プライマーアダプターを用いて、対をなすタグのクローンを、例えば、クローナルな増幅を用いて増幅できる。プライマーアダプターを、対をなすタグのクローンの一部を配列決定する配列決定反応に使用することもできる。
上記に加えて、３’末端を関心対象のポリヌクレオチドに簡単に伸長させる別の技術も、本明細書に開示される。それ故に、３’の伸長も使用することができ、ニックトランスレーション自体は必要ではない。さらに、関心対象のポリヌクレオチドの外側及び内部へのニックの添加を簡略化する種々のニックの入った連結ポリヌクレオチドも本明細書に開示される。
当業者に明らかであるように、より長い配列タグを有する対をなすタグを作製する能力は、特に、ゲノム配列決定などの大きな配列決定プロジェクトに大きな恩恵をもたらすものである。
本明細書に使用されるいくつかの用語の簡単な説明および定義の後に、上記の及び追加の実施態様を、以下に詳細に説明する。
（定義及び実施態様）
本明細書にて使用するセクションの見出しは、組織の目的のためのものに過ぎず、記載されている対象事項を制限するものと何ら解釈するべきものではない。特許、特許出願、論説、本、論文、及びインターネットのウェブページを含むが、これらに制限されない本願で引用されるすべての文献及び類似の材料を、いずれの目的で、表現的に参照によりその全体を組み込むものとする。組み込まれた参考文献中の用語の定義が、本教示にて提供される定義と異なるように思われる場合は、本教示にて提供される定義がコントロールする。本教示に記載されている温度、濃度、時間等の前には暗示的な「約」があり、わずかでかつ実質的でない逸脱が本明細書における本教示の範囲内にあることが理解される。本願において、単数形の使用は、特に指定がないかぎり、複数のものを含む。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、制限することを意図しているものではない。当然のことながら、上記の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両方が、例示及び説明のためのものに過ぎず、本発明を制限するものではないことが理解されるべきである。
別段の定めがない限り、本明細書に記載されている本発明と関連して使用する科学的な及び技術的な用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。更に、文脈上別段必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。概して、細胞及び組織培養、分子生物学、並びにタンパク質及びオリゴ−又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションの技術と関連して使用される学名及びそれらの技術は、本技術分野において周知のものであり、通常使用されるものである。標準的な技術を、例えば、核酸の精製及び調製、化学的分析、組み換え核酸、及びオリゴヌクレオチド合成に使用する。酵素反応及び精製技術を、製造業者の説明書に従って、又は通常本技術分野にて成し遂げられているように、又は本明細書に記載されているように行う。本明細書に記載されている技術及び手順を、概して、本技術分野において周知の従来の方法に従って、本明細書全体を通して引用され、記載されている種々の一般的な及びより具体的な参考文献に記載されている通りに行う。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｌ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２０００）を参照されたい。本明細書に記載されている、関連して使用される学名及び実験手順及び技術は周知のものであり、本技術分野において通常使用されるものである。
本明細書に記載されている実施態様にしたがって利用されるように、以下の用語は、特に指示がない限り、以下の意味を有するものと理解される。
「ヌクレオチド」は、モノマー単位として又は核酸内のヌクレオシドのリン酸エステルを指す。「ヌクレオチド５’−三リン酸」は、５’位置にて三リン酸エステル基を有するヌクレオチドを指し、時に、特にリボースの糖の構造上の特徴を指摘する「ＮＴＰ」、又は「ｄＮＴＰ」及び「ｄｄＮＴＰ」として示される。三リン酸エステル基は、種々の酸素を硫黄に置換したもの、例えば、α−チオ−ヌクレオチド５’−三リン酸を含むことができる。核酸化学の総説について、Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．及びＢｏｇｄａｎｏｖ，Ａ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，ＶＣＨ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４を参照されたい。
「核酸」という用語は、天然の核酸、人工の核酸、そのアナログ、又はそれらの組み合わせを指す。
本明細書にて使用する、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、ヌクレオチドモノマー（核酸）の一本鎖及び二本鎖のポリマーを意味し、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合の連結、例えば３’−５’及び２’−５’、逆位連結、例えば３’−３’及び５’−５’によって結合した２’−デオキシリボヌクレオチド（核酸）及びリボヌクレオチド（ＲＮＡ）、分岐状構造、又はアナログの核酸が含まれるが、これらに制限されない。ポリヌクレオチドは、Ｈ＋、ＮＨ４ ＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋並びに同種のものなどの結合したカウンターイオンを有する。ポリヌクレオチドは、すべてデオキシリボヌクレオチド、すべてリボヌクレオチド、又はそれらのキメラの混合物から構成されうる。ポリヌクレオチドは、核酸塩基及び糖のアナログから構成されうる。ポリヌクレオチドは、典型的には、サイズにおいて、通常多くの場合、本技術分野においてオリゴヌクレオチドと称される数モノマー単位、例えば５〜４０から、数千のモノマーのヌクレオチド単位までの範囲にある。別段の指定がない限り、ポリヌクレオチド配列が示されるときはいつでも、ヌクレオチドが左から右へ５’から３’の順であり、「Ａ」がデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」がデオキシシチジンを示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」がチミジンを示すことが理解される。
１つのモノヌクレオチドのペントース環の５’リン酸が、１つの方向でのその隣の３’酸素にホスホジエステル結合によって付着しているようにオリゴヌクレオチドを作製するようにモノヌクレオチドが反応していることから、ポリヌクレオチドは、「５’末端」及び「３’末端」を有すると言われている。したがって、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの末端は、５’リン酸がモノヌクレオチドのペントース環の３’酸素に結合していない場合「５’末端」と称され、３’酸素が次のモノヌクレオチドのペントース環の５’リン酸に結合していない場合「３’末端」と称される。本明細書にて使用する、核酸配列は、たとえより大きなオリゴヌクレオチドの内部であっても、５’及び３’末端を有すると言うことができる。
ポリヌクレオチドの「第１の末端」及び「第２の末端」は、ポリヌクレオチドの５’末端又は３’末端を指す。ポリヌクレオチドの第１の末端又は第２の末端は、ポリヌクレオチドの５’末端又は３’末端であってもよく、「第１の」及び「第２の」という用語は、末端が特に５’末端又は３’末端を示すことを意味するものではない。
本明細書にて使用する「末端領域」という用語は、５’末端又は３’末端に位置したポリヌクレオチドの領域を指す。
「関心対象のＤＮＡ断片」、「関心対象のポリヌクレオチド」、「標的ポリヌクレオチド」、「ＤＮＡ鋳型」又は「鋳型ポリヌクレオチド」は、同定すること、特徴付けること又は操作することに関心があるＤＮＡ断片又はポリヌクレオチドを示す。本明細書にて使用する、「鋳型」及び「関心対象のポリヌクレオチド」という用語は、例えば、ポリメラーゼと混合される核酸などの作用を受ける核酸を指す。いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドは関心対象の二本鎖ポリヌクレオチド（「ＤＳＰＩ」）である。
本明細書にて使用する「ポリヌクレオチドの異なる鎖」及び「核酸分子の異なる鎖」という語句は、二本鎖ポリヌクレオチドの別の鎖と同じ側由来ではない、二本鎖ポリヌクレオチドの核酸鎖を指す。
本明細書にて使用する「タグ」、「配列タグ」又は「タグ配列」は、関心対象のポリヌクレオチドの部分列を指す。
「ＰＴ」、「タグのメイト対」、「メイト対」、「ＭＰ」又は「対をなす末端」としても知られている「対をなすタグ」は、関心対象のポリヌクレオチドの各末端領域由来の２つのタグ（それぞれ核酸配列）を含む。それ故に、対をなすタグは、ポリヌクレオチドの２つの部分からの配列断片情報を含む。いくつかの実施態様において、この情報は、ポリヌクレオチドのサイズに関する情報と合わせることができ、したがって、２つの配列決定した断片の間の分離が少なくとも第１の近似で知られる。この情報を、配列タグが由来するマッピングに使用できる。
対をなすタグが線状である場合、対をなすタグは、「放出されている」か、又は「放出された対をなすタグ」の一部である。この例を図５に示す。当業者に明らかであるように、放出された対をなすタグを、ニックトランスレーション後の一又は両方のニックの切断によって形成することができる、いくつかの実施態様において、ニックトランスレーションを完了まで進行させる（環状の核酸分子上の両方のニックの集合）場合、線状化（すなわち、対をなすタグの放出）が、追加の酵素を必要とすることなく起こりうる。当業者に明らかであるように、「対をなすタグ」は、放出される前には、環状化した核酸分子などのより大きい構造の一部であってもよい。
「対をなすタグのクローン」は、対をなすタグを含有するクローン化したポリヌクレオチドを指す。これは、対をなすタグが、開始ポリヌクレオチドの何らかの操作から得られることを単に示す。いくつかの実施態様において、対をなすタグのクローンは、アダプターによって分けられた第１のタグ配列と第２のタグ配列とを含む。いくつかの実施態様において、クローンは、単一の開始ポリヌクレオチド分子から得られる。
本明細書にて使用する「対をなすタグのライブラリー」という用語は、生物の遺伝子材料のすべて又は一部を含む、対をなすタグのクローンのコレクションを指す。
「環状の核酸分子」は、ループ内にある核酸分子を示す。いくつかの実施態様において、ループは、１又は複数のニック又はギャップを含有することができる。好ましい実施態様において、ループは、二本鎖ポリヌクレオチドの各鎖上のニック又はギャップを含むことができる。
本明細書にて使用する、「開始ポリヌクレオチド」は、関心対象のポリヌクレオチドを得ることができる元のポリヌクレオチドを示す。例えば、開始ポリヌクレオチドが、関心対象のポリヌクレオチドとして機能するのに許容できるサイズに断片化されている、細胞からのサンプルである。当然、開始ポリヌクレオチドの選択肢及びバリエーションは、関心対象のポリヌクレオチドについての選択肢と少なくとも同程度広い。
本明細書にて使用する、「ニック」という用語は、ポリヌクレオチドの片方の鎖の隣接ヌクレオチド間のホスホジエステル結合がない、二本鎖ポリヌクレオチドにおける点を指す。「ニック」という用語は、ニック及びギャップの両方を包含する。ニック及び／又はギャップは、３’及び５’の末端及び／又は側を含むものとして説明することができる。これらの側又は末端は、一のポリヌクレオチドのまさに３’末端上のヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドのまさに５’末端上のヌクレオチドを含む。上述したように、これらの２つのヌクレオチド間のホスホジエステル結合はない。上述した２つのポリヌクレオチドにハイブリダイズしている第２の鎖は、第１の鎖上のホスホジエステルを欠く対応するヌクレオチド間の１又は複数のホスホジエステル結合及び０又は１以上のヌクレオチドを含む。
本明細書にて使用する、「第１の翻訳されたニックにおいて環状の核酸分子を切断する」という語句は、ニックの入った鎖にハイブリダイズしている核酸鎖を、ニックの存在に基づいた位置で切断することを示す。いくつかの実施態様において、ニックの入った鎖にハイブリダイズしている核酸鎖をニックの反対側の位置で切断する。
本明細書にて使用する、「ギャップ」という用語は、片方の鎖が１又は複数のヌクレオチド残基を欠損している、二本鎖ポリヌクレオチドの領域を指す。いくつかの実施態様において、ギャップの３’末端におけるヌクレオチド残基は、５’リン酸残基を欠くことができる。
本明細書にて使用する「ニックトランスレーション」という用語は、協調された５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ活性及び５’−３’エキソヌクレアーゼ活性又は５’−３’鎖置換によって特徴付けられる、重合／分解又は鎖置換の組み合わせプロセスを指す。当業者に明らかであるように、本明細書にて使用する用語としての「ニックトランスレーション」は、ニック上で又はギャップに向かって起こることができる。当業者に明らかであるように、いくつかの実施態様において、ギャップの「ニックトランスレーション」は、次に翻訳される、ホスホジエステル結合を単に欠く従来のニックを形成するために、適切なヌクレオチドの挿入を伴う。
本明細書にて使用する、「ニックを関心対象のＤＮＡ断片に翻訳する」及び「ニックを関心対象のポリヌクレオチドに翻訳する」という語句は、ＤＮＡ断片又は関心対象のポリヌクレオチド内にあるニックを含む鎖における位置へのニックの転位を指す。
本明細書にて使用する、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの配列へ「環状の核酸分子の第１の鎖の第１の３’末端を伸張させること」又は「第１の及び第２のニックを移動させること」という語句は、３’末端を、配列が関心対象のポリヌクレオチドの鎖の１つと相補的である点へ少なくとも伸張することを示す。３’末端の伸長の例を図１４、図１７、及び図２０に示す。作製された配列が関心対象のポリヌクレオチドに相補的である配列を有するように３’末端を配列へ移動させる、又は伸張させる単純なニックトランスレーションも、移動させる、又は伸張させるとみなされる。
本明細書にて使用する、「関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの配列への」又は「関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの配列への」という語句は、伸張した部分が関心対象のポリヌクレオチドの一本鎖の部分に相補的であるように末端又はニックを移動させるか、又は伸張させることを示す。当業者に明らかであるように、関心対象の「二本鎖」ポリヌクレオチドは、３’末端を該ポリヌクレオチドに移動させるか、又は伸張させる前に（「関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの配列への」という語句を使用する際でも）二本鎖である必要はない。いくつかの実施態様において、例えば、ニックトランスレーションを使用する際に、関心対象のポリヌクレオチドは、主として二本鎖のままであるが、ニックは、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドと結合させているところから、アダプターに共有結合している鎖に、ヌクレオチドを効果的に移動させる。
「ニックの入った連結ポリヌクレオチド」は、ニックと少なくとも１つのアダプターとを含む連結ポリヌクレオチドを示す。いくつかの実施態様において、連結ポリヌクレオチドは、ベクター又はプラスミドであるか、又はベクター又はプラスミドに由来するが、これは必要条件ではない。
本明細書にて使用する、「アダプター」という用語は、関心対象のポリヌクレオチドの操作のために使用することができる分子を示す。いくつかの実施態様において、アダプターを、核酸の環状化のために使用することができる。いくつかの実施態様において、アダプターを使用して、ニックを導入することができる。いくつかの実施態様において、アダプターを、対をなすタグのクローンの増幅のために使用することができる。いくつかの実施態様において、アダプターを、対をなすタグのクローンの一部を配列決定するための配列決定反応に使用できる。いくつかの実施態様において、アダプターは、５’リン酸残基を欠く１又は複数の末端を有することができる。いくつかの実施態様において、アダプターは、核酸を含む。いくつかの実施態様において、アダプターは、少なくとも１つのプライミング部位を含むことができるか、該部位からなることができるか、本質的に該部位からなることができる。いくつかの実施態様において、プライミング部位は、ＰＣＲプロセスに有用であり得る。いくつかの実施態様において、アダプターの「Ｐ１」又は「Ｐ２」の命名は、プライミング部位を含むことができるアダプターを示し、さらに、そのようなアダプターを、「プライマー」アダプターと称すことができる。当然、すべてのアダプターがプライミング部位を必要とするわけではない。当業者に明らかであるように、「プライマーアダプター」を含む本明細書に開示される実施態様は、一般的なアダプターを使用して実施することもできる。すなわち、いくつかの実施態様において、プライマーアダプターを、プライミング部位を含む必要がない単純なアダプターと置き換えてもよい。
「バーコード配列」及び「同定するコード配列」は、関心対象のアダプター、遺伝子、又は配列の同定を可能にするのに充分である核酸配列を示す。バーコード配列は、必要ではないが、同定の基となる元の核酸配列の小さな部分であってもよい。いくつかの実施態様において、バーコードは、５〜３０核酸の長さである。いくつかの実施態様において、バーコードは、Ｌ−ＤＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡなどのアナログのヌクレオチドからなる。
「適合性の末端」を有する核酸配列、断片、又は対をなすタグのクローンとは、末端が、本明細書において提供される別の核酸配列、断片又は対をなすタグのクローンに連結するのに適合していることを意味する。適合性末端は、５’及び／又は３’のオーバーハングを有する「粘着末端」であってもよいか、又はもう一つの方法として、適合性の末端は、５’及び／又は３’オーバーハングを有さない「平滑末端」であってもよい。概して、粘着末端は、配列に依存した連結を可能にするが、平滑末端は、配列と独立した連結を可能にする。適合性末端を、本技術分野において標準的ないずれの既知の方法で製造できる。例えば、核酸配列の適合性の末端を、５’及び／又は３’末端の制限エンドヌクレアーゼの消化によって製造できる。
本明細書にて使用する、「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」という用語は、それぞれ二本鎖ＤＮＡを特異的なヌクレオチド配列において又は近くで切断する細菌の酵素を指す。
本明細書にて使用する、「ニック切断酵素」とは、残存する核酸鎖を介してニックにおいて又は近くで切断することができる酵素を指す。そのような酵素の例としては、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＰ１、及びヌクレアーゼＢＡＬ−３１が挙げられるが、これらに制限されない。また、ニックという用語は、ギャップも包含することから、一本鎖のポリヌクレオチドを切断する酵素もニック切断酵素のカテゴリーに入る。例えば、一本鎖に特異的なエンドヌクレアーゼも、このグループに含まれる。さらに、一本鎖に特異的なエキソヌクレアーゼも、関心対象のポリヌクレオチドの末端が一本鎖である実施態様（例えば、図２１）における用語に含まれる。
ＩＩｓ型及びＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼという用語は、それらの認識配列の外側を切断する制限エンドヌクレアーゼを包含する。それ故に、該用語は、ＩＩＩ型又はＩＩｓ型以外のもの、例えば、ＩＶ型酵素（例えば、ＡｃｕＩ）として分類可能な制限エンドヌクレアーゼを包含する。
本明細書にて使用する「３’テーリング」は、１又は複数のヌクレオチドのポリヌクレオチドの３’末端への付加を指す。
「固定化」という用語は、当分野で認識されており、核酸に関して使用する場合、核酸が、表面の使用の意図された環境に存在し、化学種に作用する引力より強い引力で表面に付着している状態を指す。
本明細書にて使用する、「核酸配列」又は「核酸塩基配列」という用語は、核酸塩基含有サブユニットを含むポリマーのいずれの部分である。適したポリマー又はポリマーセグメントの制限されない例としては、オリゴヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ペプチドの核酸並びにそれらのアナログ及びキメラが挙げられる。
「アナログ」の核酸は、添加する宿主または試験するサンプル中で通常見られない核酸である。例えば、標的配列は、アナログの核酸を含まない。このアナログの核酸としては、人工の、合成の、又はそれらの組み合わせの核酸が含まれる。それ故に、例えば、一実施態様において、ＰＮＡは、アナログの核酸であり、Ｌ−ＤＮＡ及びＬＮＡ（ロックド核酸）、イソ−Ｃ／イソ−Ｇ、Ｌ−ＲＮＡ、Ｏ−メチルＲＮＡ、又は他のそのような核酸も同様である。一実施態様において、いずれの修飾された核酸もアナログの核酸という用語内に包含される。別の実施態様において、アナログの核酸は、システム内の天然の核酸に実質的にハイブリダイズしないが、他のアナログの核酸にハイブリダイズする核酸であってもよく；それ故に、ＰＮＡはアナログの核酸ではないが、Ｌ−ＤＮＡは、アナログの核酸である。例えば、Ｌ−ＤＮＡはＰＮＡに有効な様式でハイブリダイズすることができる一方で、Ｌ−ＤＮＡはＤ−ＤＮＡ又はＤ−ＲＮＡに同様の有効な様式でハイブリダイズしない。それ故に、プローブ又は標的配列にハイブリダイズすることができるが、ヌクレアーゼによる分解に対する感受性又はＤ−ＤＮＡ又はＤ−ＲＮＡへの結合などの少なくとも１つの天然のヌクレオチドの特徴を欠くヌクレオチドが、アナログのヌクレオチドである。いくつかの実施態様において、当然、アナログのヌクレオチドは、すべての違いを有する必要がない。
「生物」という用語は、複製可能であり、配列決定に興味のある核酸を含む生存の又は非生存の実体のいずれも示すものとして本明細書にて使用される。該生物としては、プラスミド、ウイルス、原核、古細菌及び真核細胞、細胞株、真菌、原虫、植物、動物などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書にて使用する、「プライマー」という用語は、精製された制限消化のように自然に生じるか、又は合成により製造され、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成を誘導する条件の下に置いた際に（すなわち、でヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導する物質の存在下、並びに適した温度及びｐＨにおいて）合成の開始点として作用することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、増幅における効率が最大であるために、好ましくは一本鎖であるが、その代わりとして二本鎖であってもよい。二本鎖である場合、プライマーは、伸長産物を調製するのに使用する前に、最初に、別個のその鎖に処理される。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導する物質の存在下での伸長産物の合成を刺激するほど充分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源及び方法の使用を含めた多くの要因に依存する。
本明細書にて使用する「核酸配列決定化学」という用語は、ポリヌクレオチドを配列決定して配列決定結果を得るために使用するある種の化学及び関連した方法を指す。幅広い種類の配列決定化学が本技術分野において既知である。本明細書に開示される種々の実施態様に有用な種々のタイプの配列決定化学の例としては、マクサム−ギルバート配列決定、連鎖停止方法、色素標識化ターミネーター法、可逆ターミネーターを用いる配列決定、ピロリン酸検出による核酸の配列決定（「ピロリン酸配列決定」又は「ピロ配列決定」）及びライゲーションによる配列決定が挙げられるが、これらに限定されない。そのような配列決定化学及び対応する配列決定試薬は、例えば、米国特許第７，０５７，０２６号明細書、米国特許第５，７６３，５９４号明細書、米国特許第５，８０８，０４５号明細書、米国特許第６，２３２，４６５号明細書、米国特許第５，９９０，３００号明細書、米国特許第５，８７２，２４４号明細書、米国特許第６，６１３，５２３号明細書、米国特許第６，６６４，０７９号明細書、米国特許第５，３０２，５０９号明細書、米国特許第６，２５５，４７５号明細書、米国特許第６，３０９，８３６号明細書、米国特許第６，６１３，５１３号明細書、米国特許第６，８４１，１２８号明細書、米国特許第６，２１０，８９１号明細書、米国特許第６，２５８，５６８号明細書、米国特許第５，７５０，３４１号明細書、米国特許第６，３０６，５９７号明細書、国際公開第９１／０６６７８号パンフレット、国際公開第９３／０５１８３号パンフレット、国際公開第６００７４３５１号パンフレット、国際公開第０３／０５４１４２号パンフレット、国際公開第０３／００４６９０号パンフレット、国際公開第０７／００２２０４号パンフレット、国際公開第０７／００２２０４号パンフレット、国際公開第０６／０８４１３２号パンフレット及び国際公開第０６／０７３５０４号パンフレットに記載されており、これら文献の全体の内容を参照により組み込むものとする。
本明細書にて使用する、「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）という用語は、参照により本明細書に組み込むＫ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び米国特許第４，６８３，２０２号明細書の方法を指し、該文献には、クローニング又は精製なしで、ゲノムＤＮＡの混合物中の関心対象のポリヌクレオチド配列のセグメントの濃度を増加させる方法が記載されている。関心対象のポリヌクレオチド配列を増幅するためのこのプロセスは、非常に過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、望ましい関心対象のポリヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ混合物に導入し、続いて、ＤＮＡポリメラーゼの存在下での正確な順序のサーマルサイクリングを行うことからなる。２つのプライマーは、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチド配列の各鎖に相補的である。増幅をもたらすために、混合物を変性させ、次に、プライマーを関心対象のポリヌクレオチド分子内のその相補配列とアニーリングする。アニーリングの後、プライマーを、ポリメラーゼを用いて、相補鎖の新しい対を形成するように伸張させる。変性、プライマーのアニーリング及びポリメラーゼの伸長のステップを何度も繰り返して（すなわち、変性、アニーリング及び伸長が１の「サイクル」を構成し；多数の「サイクル」があり得る）、望ましい関心対象のポリヌクレオチドの高濃度の増幅されたセグメントを得ることができる。望ましい関心対象のポリヌクレオチドの増幅されたセグメントの長さを、互いについてのプライマーの相対的な位置によって決定し、したがって、この長さは、制御可能なパラメータである。プロセスの繰り返しの効き目によって、該方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下「ＰＣＲ」）と称される。関心対象のポリヌクレオチド配列の望ましい増幅されたセグメントが混合物中の主な配列（濃度の点で）となることから、それらセグメントは、「ＰＣＲで増幅された」と言われる。
ＰＣＲを用いて、いくつかの異なる方法（例えば、ハイブリダイゼーション標識したプローブ；ビオチン化プライマーの組み込みの後のアビジン−酵素抱合体の検出；３２Ｐで標識した、ｄＣＴＰ又はｄＡＴＰなどのデオキシヌクレオチド三リン酸の増幅されたセグメントへの組み込み）によって検出可能なレベルに、ゲノムＤＮＡ中の特異的な関心対象のポリヌクレオチドの単一のコピーを増幅することが可能である。ゲノムＤＮＡに加えて、いずれのオリゴヌクレオチド配列も、プライマー分子の適切なセットを用いて増幅できる。特に、ＰＣＲのプロセス自体によって作製された増幅されたセグメントは、それ自体、その後のＰＣＲ増幅に有効な関心対象のポリヌクレオチドである。
本明細書にて使用する、「ＰＣＲ産物」、「ＰＣＲ断片」及び「増幅産物」という用語は、変性、アニーリング及び伸長のＰＣＲステップの２又はそれ以上のサイクルが完了した後の化合物の生じた混合物を指す。これらの用語は、１又は複数の標的配列の１又は複数のセグメントの増幅があったケースを包含する。
本明細書にて使用する、「増幅試薬」という用語は、プライマー、関心対象の核酸ポリヌクレオチド及び増幅酵素を除く、増幅に必要とされる試薬（デオキシリボヌクレオチド三リン酸、緩衝液等）を指す。典型的には、増幅試薬は、他の反応成分と共に、反応容器（試験チューブ、マイクロウェル等）に配置されて入れられている。
「クローナルな増幅」は、個々の分子の多くのコピーの生成を指す。本技術分野において既知である種々の方法を、クローナルな増幅のために使用することができる。例えば、エマルジョンＰＣＲが一つの方法であり、油相内の水泡中でプライマーで被覆されたビーズと共に個々のＤＮＡ分子を単離することを伴う。次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、単離したライブラリー分子のクローナルなコピーで各ビーズを被覆し、これらのビーズが、その後、後の配列決定のために固定化される。エマルジョンＰＣＲが、Ｍａｒｇｕｉｌｉｓ ｅｔ ａｌ．ならびにＳｈｅｎｄｕｒｅ及びＰｏｒｒｅｃａ ｅｔ ａｌ．によって公開されている方法（「ポロニー（ｐｏｌｏｎｙ）配列決定」としても知られ、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔによって市販されて、最近、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって入手される）に使用される。Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３７：３７６−３８０；Ｓｈｅｎｄｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９（５７４１）：１７２８−１７３２を参照されたい。クローナルな増幅のための別の方法は、断片が、固体の表面に付着させたプライマーにより増幅される「ブリッジＰＣＲ」である。これらの方法に加えて、クローナルな増幅の他の方法も、単一の分子のポリヌクレオチド断片由来の多くのコピーをそれぞれ含有する多くの物理的に単離した位置を製造する。
「結合部分」は、適切な条件の下で精製する部分に結合することができる分子である。結合部分と精製する部分との間の相互作用は、結合部分及びそれと関連した分子、例えば、対をなすタグのクローンの濃縮及び／又は精製を可能にするほど充分に強い。ビオチンが、結合部分の例である。いくつかの実施態様において、結合部分をアダプターに結合させることによって、結合部分の精製する部分の標的への結合によって、対をなすタグのクローンの精製が可能となる。いくつかの実施態様において、精製する部分は、固体の支持体上に存在することができる。
「精製する部分」は、結合分子に結合する分子である。ビオチンに対する精製する部分の例は、ストレプトアビジンである。
「固体の支持体」という用語は、オリゴヌクレオチドが合成されるか、付着されるか、又は固定化されるいずれの固相材料も指す。固体の支持体は、「樹脂」、「固相」、及び「支持体」などの用語を包含する。固体の支持体は、有機ポリマーなどのポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、及びポリアクリルアミド、並びにそれらのコポリマー及びグラフトから構造することができる。また、固体の支持体は、例えば、ガラス、シリカ、制御された孔径のガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ−ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ））、又は逆相シリカなどの無機のものであってもよい。固体の支持体の構造は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、表面又はそれらの組み合わせの形状であってもよい。表面は、平面状、実質的に平面状、非平面状であってもよい。固体の支持体は、多孔性又は非多孔性であってもよく、膨張又は非膨張の特徴を有することができる。固体の支持体は、ウェル、窪みもしくは他の入れ物、容器、形態又は場所もしくは位置の形状で構成することができる。試薬のロボット送達のために、又はレーザー・イルミネーション及び共焦点のもしくは偏向的な光の集まりによってスキャンすることを含む検出手段によって、アドレス可能な種々の場所、例えば、位置で、複数の固体の支持体をアレイで構成することができる。
「アレイ」又は「マイクロアレイ」は、固体の支持体上又は容器の配置に存在するポリヌクレオチドの配置を包含する。特定のアレイの型式は、「チップ」又は「バイオチップ」と称される（Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ，Ｅｄ．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａｓｓ．（２０００））。アレイは、低密度の数のアドレス可能な場所、例えば１〜約１２、中密度、例えば約百もしくはそれを越える場所、又は高密度の数、例えば千又はそれを超えるものを含むことができる。典型的には、アレイの型式は、製作、取り扱い、設置、スタッキング、試薬導入、検出、及び貯蔵を可能にする幾何的に規則的な形状である。アレイを、行及び列の型式で、各位置の間に規則的に空間を空けて構成することができる。別の方法として、場所を、処理及び／又はサンプリングを同じにするために束ねるか、混合するか、又は均一に混合することができる。アレイは、各場所が、試薬の高処理の取り扱い、ロボット送達、マスキング及び／もしくはサンプリングのために、及び／又はレーザー・イルミネーション及び共焦点の及び／もしくは偏向的な光の集まりによってスキャンすることを含む検出手段によって、空間的にアドレス可能なように構成された複数のアドレス可能な場所を含むことができる。アレイは、１又は複数の「アドレス可能な場所」、例えば、既知のタイプの分子を含む物理的な場所である「アドレス可能な位置」を含むことができる。
以下において、種々の実施態様の異なる実施態様をより詳細に説明する。種々の実施態様の各ステップ又は特徴は、特に明示しない限り、いずれの他のステップ又は特徴と組み合わせることができる。
（実施態様の例）
上述したように、対をなす末端の配列決定のアプローチは、２つの独立した関心対象のポリヌクレオチドのそれぞれからの「ｎ」塩基をランダムな様式で配列決定することによるものより、単一の関心対象のポリヌクレオチドからの２つのひと続きの各「ｎ」塩基を配列決定することによるより多くの情報を提供することができる。しかしながら、今までに、読み取りの長さは、短い配列のタグの長さに限られていた。例えば、ＩＩＩ型制限酵素を用いる対をなすタグを製造するための以前の戦略は、２７ｂｐまでの配列タグを生成するのみであった。所与のメイトの対のクローン上の２つのタグ配列は、異なる長さのもの又は同じ長さのものであってもよい。
いくつかの実施態様において、配列タグの長さを制御するか、かつ／又は増加させるために、対をなすタグのクローンにおいて環状化及びニックトランスレーションを使用することができる。いくつかの実施態様において、開示された方法を使用して、関心対象の核酸分子から対をなすタグのクローンを調製できる。
一のそのような実施態様を図１及び図２に示す。図１に示すように、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの環状化を可能にするように、アダプターが、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドに付着している。重要なことは、環状化後、少なくとも１つのニック又はギャップが環状化した核酸配列に存在し、いくつかの実施態様において、２つのニック又はギャップが存在し、環状化した核酸配列の各鎖上に一つずつある。図１に示すように、１つのニック又はギャップは、最初にアダプターの第１の末端と関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの１つの鎖上の第１の末端との間に位置する一方で、第２のニック又はギャップは、アダプターの第２の末端と関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端との間に位置する。次に、図２に示すように、ニックトランスレーション反応をニックトランスレーション酵素によって実施する。これによって、少なくとも１つのニックを関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドへ移動させる。ニックを移動させる望ましい距離は、使用者の目的に応じて変動でき、しかしながら、いくつかの実施態様において、ニックトランスレーション反応が、ニックが１０、２０又は２７ヌクレオチドを超えて関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドへ移動するまで起こるようにする。この後、環状化した核酸配列を、ニックの位置において又はその近くで、一本鎖に特異的なヌクレアーゼなどのニックにおいて又はその近くで切断する酵素によって、線状にすることができ、放出された対をなすタグを生じることができる。ニックの位置で環状化核酸を線状にするための酵素としては、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＰ１、ヌクレアーゼＢＡＬ３１、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）由来のヌクレアーゼ、トウモロコシ黒穂病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）由来のヌクレアーゼ、及びマングビーンヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施態様を図３、図４、及び図５に示す。この実施態様において、複数のアダプターを使用することができる。第１のステップにおいて、粘着末端（又はいくつかの実施態様において平滑末端）を有する第１のタイプのアダプターを、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の及び第２の末端の両方に付着させることができる。この後、第１のアダプターに存在するオーバーハングにライゲーションすることを可能にする適切なオーバーハングを有し、分子を環状化させるようにも機能する第２のタイプのアダプターを付加することができる。第１の例で述べたように、２つではなくても、少なくとも１つのニック又はギャップが、第２のアダプターによる環状化ライゲーションが起こった後に存在する。前述したように（図４に示すように）、このことは、図５に示すように、ニックを、少なくとも部分的に関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドに、ニックトランスレーション酵素によって翻訳することを可能にする。次に、図５に示すように、この翻訳された環状化核酸配列を、いずれの適した酵素によって線状にすることができ、それによって、対をなすタグを生じる。
別の実施態様を、図１０、図１１、図１２及び図１３に示す。この実施態様において、トポイソメラーゼＩ（Ｔｏｐｏ）結合部位ＣＣＣＴＴを有するアダプターを使用することができる（Ｔｏｐｏ結合アダプター）。第１のステップにおいて、向かい合う鎖上に２〜３ｂｐのギャップと、上の及び下の鎖の両方の３’末端にＴｏｐｏ結合部位とを有するアダプターを形成することができる（図１０）。この後、トポイソメラーゼＩを添加して、トポイソメラーゼＩ−アダプター複合体を形成することができる（図１１）。トポイソメラーゼＩ分子とアダプターとの間に形成されたホスホチロシル結合を、後に、脱リン酸化した関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの５’ヒドロキシル基によって攻撃することができ（図１２）、環状化核酸分子の形成をもたらす（図１３）。環状化後、アダプター及びＤＮＡの接合部でのニックを、Ｔ４リガーゼで封着する。そのような実施態様において、トポイソメラーゼＩベースの環状化アプローチの使用によって、長い対をなすタグの作製のための優れた環状化効率をもたらすことができる。
いくつかの実施態様において、図６に示すように、Ｐ１及びＰ２プライマーアダプターなどの更なるプライマーを、対をなすタグに付加できる。そのような実施態様において、Ｐ１及びＰ２プライマーアダプターの付加は、例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）タイプの配列決定などの種々の配列決定技術に有用である可能性がある。
いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドを、関心対象のポリヌクレオチドを１又は複数のアダプターにライゲーションする（例えば、図３に示すように）ことによって環状化することができる。生じたニックの入った環状のＤＮＡは、ニックトランスレーションすることができる（図１４）。ニックの入った環状のＤＮＡを、例えば、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、ラムダ・エキソヌクレアーゼ、及び／又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩＩＩなどのエキソヌクレアーゼで消化することができる（図１５）。それ故に、ニックが開かれ、一本鎖に特異的なエンドヌクレアーゼによって比較的より容易に消化されるギャップになる。この後、対をなすタグを、ギャップの入った関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドから、一本鎖に特異的なエンドヌクレアーゼ（Ｓ１ヌクレアーゼなど）を用いて、放出できる。そのような一本鎖に特異的なエンドヌクレアーゼとしては、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、Ｐ１ヌクレアーゼ、及び／又はＢＡＬ３１ヌクレアーゼが挙げられる。Ｔ７エキソヌクレアーゼ反応は、部分的であるか（中央のパネルに「ギャップ」として示される）、又は完全なものであってもよい（完全なエキソヌクレアーゼ反応がある場合存在しない破線の部分によって中央パネルにおいて示される）。
いくつかの実施態様において、ニックトランスレーションは、実際に発生する必要がなく、むしろアダプターの３’末端の伸長を使用して、対をなすタグを作製することができる。この例を図１６〜１８に示す。いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドを、１又は複数のアダプターをライゲーションすることによって環状化することができる。いくつかの実施態様において、環状の核酸は、ニックを含む。次に、環状の核酸分子を、Ｔ７エキソヌクレアーゼ及び／又はラムダ・エキソヌクレアーゼなどの５’−３’エキソヌクレアーゼで消化することができる（図１６）。続いて、生じた消化された環状の核酸分子の３’末端を、例えば、ＤＮＡポリメラーゼで伸張させることができる（図１７）。いずれのＤＮＡポリメラーゼもこの目的で働くことができる。効果的には、このステップによって、アダプターを有する配列を関心対象のポリヌクレオチドへ伸張させることが可能となる。この後、伸張した消化された環状の核酸分子を、一本鎖に特異的なエンドヌクレアーゼで消化して、対をなすタグを放出することができる。上述したように、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、Ｐ１ヌクレアーゼ、及び／又はＢＡＬ３１ヌクレアーゼなどのいずれの一本鎖に特異的な酵素及び／又は切断プロセスも使用して、対をなすＤＮＡタグを放出することができる。
図１９〜２１は、ニックトランスレーション自体必要とせずに対をなすタグを形成する別の実施態様を示す。上述したように、いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドを、１又は複数のアダプターにライゲーションすることによって環状化することができる。いくつかの実施態様において、環状の核酸分子は、ニックを含む。次に、環状の核酸分子を、Ｔ７エキソヌクレアーゼ及び／又はラムダ・エキソヌクレアーゼなどの５’−３’エキソヌクレアーゼで消化することができる（図１９）。いくつかの実施態様において、大量の関心対象のポリヌクレオチドの二本鎖部分を消化する。図１６〜１８に概説する例が、消化が部分的である一方で、図１９に示すように、消化を完全に起こしてもよい。当業者に明らかであるように、この結果として、関心対象のポリヌクレオチド全体が一本鎖となる。それ故に、いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドのすべてが５’−３’の消化後に一本鎖である。いくつかの実施態様において、このことによって、消化された「環状の」核酸が線状になったものがもたらされ、しかしながら、簡単にするために、分子を、たとえ線状であっても、「消化された環状の核酸分子」と称すことができる。そのような実施態様の直線の性質を具体的に記載する場合、「直線状の状態に消化されている消化された環状の核酸分子」と称す。上述したように、次に、生じた消化された環状の核酸分子の３’末端を、例えば、ＤＮＡポリメラーゼで伸張させることができる（図２０）。この後、伸張した消化された環状の核酸分子を、一本鎖に特異的なエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼで消化して、対をなすタグを放出することができる。上述したように、いずれの一本鎖に特異的な酵素及び／又は切断プロセスも使用できる。環状の核酸を図２０に示す状態に消化することによって、エキソヌクレアーゼを使用して、関心対象の一本鎖ポリヌクレオチドのいずれの残存する部分を除去することができる。当然、エンドヌクレアーゼを同様に使用することができる。当業者に明らかであるように、上記の技術を、図３の最初の実施態様に関して説明したが、図１４〜２０の実施態様は、そのような開始配置に制限されず、本明細書に記載されているいずれの他の実施態様と適宜組み合わせて使用できる。
いくつかの実施態様は、アダプターと関心対象のポリヌクレオチドとの間のニックを使用するが、ニック及び／又はギャップが、この位置に位置する必要はない。いくつかの実施態様において、ニック及び／又はギャップを他の場所に位置付ける更なる利益がある。いくつかの実施態様において、前記方法は、すでにニックを含む連結ポリヌクレオチドを使用できる。いくつかの実施態様において、連結ポリヌクレオチドは、各アダプターと連結ポリヌクレオチドとの間にニックを有する連結ポリヌクレオチドの各末端上のアダプターを有する。このことによって、最初のコンストラクト自体によって、関心対象のポリヌクレオチドへのニックの組み込みが可能となる。簡単にするために、このコンストラクトを、「ニックの入ったベクター」又は「ニックの入った連結ポリヌクレオチド」と称すことができる。いくつかの実施態様において、ニックの入った連結ポリヌクレオチドによって、現在の対をなすタグのワークフローに含まれる時間及びステップを減少させることができる。いくつかの実施態様において、ニックの入った連結ポリヌクレオチドは、関心対象のポリヌクレオチドを捕捉する線状のベクター（剪断した標的ＤＮＡなどの）を含み、関心対象のポリヌクレオチドのライブラリーの構成を単純化する。
いくつかの実施態様において、ニックの入った関心対象のポリヌクレオチドを伴う方法は、２つのパートを含む。第１のパートは、ニックの入った連結ポリヌクレオチドを該ポリヌクレオチドに結合した適切なアダプターを用いて調製することを伴うことができる。いくつかの実施態様において、このステップを、種々のパーティーによって行うことができ、対をなすタグを製造するためのキットに含めることができる。いくつかの実施態様において、第２のパートは、ニックの入った連結ポリヌクレオチドを使用して、ライブラリーのワークフローを増加させることを伴う。
（連結ポリヌクレオチド）
いくつかの実施態様において、第１のステップ（図２２、ステップ１）は、小さい環状のＤＮＡ２０００を関心対象のポリヌクレオチドについての連結ポリヌクレオチドとして選別することを伴う。一旦、線状にすると、このようなものを連結ポリヌクレオチドとして使用することができる。細菌の形質転換及び／又はそれに伴う増幅が必要ないことから、ベクターの選択が柔軟である。いくつかの実施態様において、いずれのポリヌクレオチドも使用できる。それ故に、連結ポリヌクレオチドは、ベクター自体であるか、又はベクターに由来する必要がない。いくつかの実施態様において、連結ポリヌクレオチドは、調製でき線状にできたいずれの環状のベクターであってもよい。いくつかの実施態様において、ｐＵＣ１９プラスミドを使用する。
いくつかの実施態様において、連結ポリヌクレオチドとして機能することができるベクターを選別するに当たって考慮できる２つの関連したエレメントがある。第１に、いくつかの実施態様において、２００ｂｐ〜１５ｋｂの標的ＤＮＡ挿入物を収容するために、環状のベクターのサイズは小さいものであるべきで、４００ｂｐ〜３ｋｂの範囲が好ましい。第２に、必要ではないが、いくつかの実施態様において、環状のベクターを、その後の精製のために結合部分で修飾できる。例えば、いくつかの実施態様において、結合部分としては、ビオチンを挙げることができ、それによって、ビオチン−ストレプトアビジン・ベースの精製スキームが可能となる。いくつかの実施態様において、対をなすタグの単離を可能にするいずれの受容体−リガンドベースのアフィニティー修飾を使用できる。いくつかの実施態様において、単離は、特異的な連結ポリヌクレオチドに特異的である。
連結ポリヌクレオチドを選択した後、必要であれば、該ポリヌクレオチドを線状にする２０１０（例えば、環状化したベクターを、最初に選択した場合）。いくつかの実施態様において、これは、それぞれが連結ポリヌクレオチド上で独特な切断を行う２つの独特な制限酵素（図２２、ステップ２）によって達成される。生じた２つの断片のより大きい断片２０１０は、２つの別々の粘着末端（２０１１及び２０１５）を含有しており、これを選択し、精製することができる。２つの異なる酵素を用いることによって、生じる産物は、自己のライゲーションを防ぐ不適合性の粘着末端（２０１１及び２０１５）を含有する。不適合性の末端を連結ポリヌクレオチド上に生成する他の技術もこのステップに有効である。図２２に示すように、二重に切断した連結ポリヌクレオチドの２つの末端（２０１１及び２０１５）は、リン酸を欠く２つの３’鎖末端（２０１２及び２０１６）と、リン酸基を含有する２つの５’鎖末端２０１３及び２０１４を有する。
この後、２つの二本鎖アダプター、Ｐ１（２０２０）及びＰ２（２０３０）を、連結ポリヌクレオチド２０１０にハイブリダイズして、アダプターがハイブリダイズした連結ポリヌクレオチド２０３８を形成する。いくつかの実施態様において、Ｐ１（２０２０）及びＰ２（２０３０）の粘着末端は、連結ポリヌクレオチド（２０１１及び２０１５）上のそれぞれの末端に一致し、Ｐ１（２０２０）及びＰ２（２０３０）の適切な方向及び位置を確実にする。
いくつかの実施態様において、Ｐ１及びＰ２プライマーアダプターは、別々の特徴を有する。いくつかの実施態様において、Ｐ１プライマーアダプターの「上の」鎖２０２５（図２２において２つのＰ１鎖の上のものとして示される）及びＰ２プライマーアダプター２０３５（図２２において２つの鎖の下のものとして示される）は、その５’末端にリン酸基を含有しない。いくつかの実施態様において、Ｐ１及びＰ２プライマーアダプターの両方の下の鎖（それぞれ２０２６及び２０３６）は、その５’末端（位置２０２２及び２０３２に示される）にリン酸基を含有する。この構成の結果として、両方のアダプターの「下の」鎖（２０２６及び２０３６）のみ、ニックの入った連結ポリヌクレオチド２０３９（図２３）に示すように、連結ポリヌクレオチドにライゲーションする。「上の」鎖がリン酸基を５’末端において欠くために、２つのニック２０２１及び２０３１が連結ポリヌクレオチド２０１０とアダプター２０２０及び２０３０の間にある（図２２及び２３）。それ故に、いくつかの実施態様において、本発明は、上記連結ポリヌクレオチドを製造するか、かつ／又は用いる方法を含む。
いくつかの実施態様において、本発明は、ニックの入った連結ポリヌクレオチド自体を含む。いくつかの実施態様において、ニックの入った連結ポリヌクレオチド２０３９は、第２のアダプター鎖２０２６にハイブリダイズしている第１のアダプター鎖２０２５を含む第１のアダプター（Ｐ１ ２０２０）を有することができる。第１のアダプター鎖２０２５は、その５’末端上のリン酸基を欠く。ニックの入った連結ポリヌクレオチドは、第４のアダプター鎖２０３６にハイブリダイズしている第３のアダプター鎖２０３５を含む第２のアダプター２０３０を更に有することができる。第３のアダプター鎖２０３５は、その５’末端上のリン酸基を欠く。ニックの入った連結ポリヌクレオチドは、第２の連結鎖２０１８にハイブリダイズしている第１の連結鎖２０１７を含む、連結ポリヌクレオチド２０１０更に含むことができる。連結ポリヌクレオチドは、第１の末端２０１１と第２の末端２０１５とを含む。第１のアダプター（Ｐ１ ２０２０）は、第１のアダプター鎖が５’末端上のリン酸基を欠くところにニック（及び／又はギャップ）２０２１が存在するように、連結ポリヌクレオチド２０１０の第１の末端２０１１に付着している。さらに、第２の連結鎖２０１８は、第２のアダプター鎖２０２６に付着している。第２のアダプター（Ｐ２ ２０３０）は、第２のアダプター２０３０の第３のアダプター鎖２０３５がその５’末端上のリン酸基を欠くところにニック（及び／又はギャップ）２０３１が存在するように、連結ポリヌクレオチドの第２の末端２０１５に付着している。第１の連結鎖２０１７が第４のアダプター鎖２０３６に付着している。この実施態様を、概して、図２２及び２３に示す（アダプター２０２０及び２０３０が、連結ポリヌクレオチド２０１０にライゲーションされて、ニックの入った連結ポリヌクレオチド又はニックの入ったベクター２０３９を形成する）。
いくつかの実施態様において、図２４Ａ及び２４Ｂに示すように、アダプターが連結ポリヌクレオチドと連結されている領域（「連結領域」）に関して、少なくとも２つの可能な配置がある。第１の構成（図２４Ａ）において、連結ポリヌクレオチドのオーバーハングは、アダプター２０２０に完全に相補的な末端を有する。ライゲーション及び上のアダプター鎖のリン酸基の欠如の結果として、上の鎖上の連結ポリヌクレオチドとアダプターとの間にニック２０２１がある。第２の構成（図２４Ｂ）において、アダプターを設置することによって、１又は２塩基のギャップ（いくつかの実施態様においてはより大きいギャップ）がもたらされる。いずれの構成も、プロセスにおけるその後のステップのために実現することができる。ポリメラーゼがニック又はギャップを関心対象のポリヌクレオチドに伸長させることを可能にするために、概して、上の鎖上の切断（２０２０と２０１７の間のニック２０２１、および２０３５と２０１８の間のニック２０３１）を保存するべきである。
いくつかの実施態様において、ニックの入った連結ポリヌクレオチドにおけるニック又はギャップの設置を使用して、特に長い対をなすタグ、又は「長い対をなすタグ」（「ＬＰＴ」）ライブラリーを生成できる。しかしながら、本発明は、ＬＰＴに制限されない。例えば、典型的なＥｃｏＰ１５Ｉベースの規則的なＰＴライブラリーのために、ＥｃｏＰ１５Ｉ部位を有するアダプターの両方の鎖を、いずれの上述した末端の構成なしで、直線状のベクターに完全にライゲーションすることができる。簡単にいうと、上記実施態様によって、規則的な及び長い対をなすタグのライブラリーの両方を、異なる対をなすタグにとって適切な化学及び適切に修飾したアダプターを用いて生成できる。
いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドを捕捉するための連結ポリヌクレオチド上のアダプターの末端（２０２０及び２０３０）の可能な構成が更にあり、その例を、図２５Ａ〜２５Ｃに示す。アダプターの上の鎖の５’末端の長さ及び組成を調節することによって、平滑末端（２０４０及び２０４１、図２５Ａ）、単一のチミンのオーバーハングの粘着末端（２０５０及び２０５１、図２５Ｂ）、又は複数のチミン（又は他の塩基）のオーバーハング（２０６０及び２０６１、図２５Ｃ）を得ることができる。そのようなニックの入った連結ポリヌクレオチドを使用して、平滑末端を有する関心対象のポリヌクレオチド、Ｔａｑポリメラーゼで修飾された関心対象のポリヌクレオチド、又は末端転移酵素で修飾された関心対象のポリヌクレオチドをそれぞれ捕捉することができる。いくつかの実施態様において、これらのニックの入った連結ポリヌクレオチドは、ライブラリーの構築に使用するためのキットの一部である。
（ライブラリー調製のワークフロー）
ニックの入った連結ポリヌクレオチドを調製すると、ゲノムＤＮＡなどの関心対象のポリヌクレオチドを、望ましい長さに剪断することができる。いくつかの実施態様において、Ｓｕｐｐｏｒｔ ＯｌｉｇｏＬｉｇａｔｉｏｎＤｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ（商標））ベースの技術に適切に使用するために、関心対象のポリヌクレオチドの末端を磨く（ｅｎｄ−ｐｏｌｉｓｈｅｄ）。関心対象のポリヌクレオチドとライゲーションするためのニックの入った連結ポリヌクレオチド（図２５Ａ〜２５Ｃに示すもの）の選択に応じて、剪断した関心対象のポリヌクレオチドは、末端における修飾を伴うことができる。平滑末端アダプターを有する直線状のベクター（図２５Ａ）にとって、修飾は必要ではない。図２５Ｂに記載されているニックの入った連結ポリヌクレオチドについて、関心対象のポリヌクレオチドは、例えば、Ｔａｑなどのポリメラーゼによって達成できる３’末端におけるアデニン塩基の付加を必要とする。図２５Ｃに記載されているニックの入った連結ポリヌクレオチドについて、末端転移酵素を使用して、ニックの入った連結ポリヌクレオチド内のオーバーハングに相補的であるように、同じ塩基の短いストレッチを付加できる。
ニックの入った連結ポリヌクレオチド選択すると、ワークフローの後続ステップは、すべての３つのタイプのニックの入った連結ポリヌクレオチドについて同様であってよい。簡単にするために、その後のステップを、概して、図２５Ａにおけるニックの入った連結ポリヌクレオチドについてのみ説明する。図２６に示すように、関心対象のポリヌクレオチドの適切な末端修飾２０８５の後、関心対象のポリヌクレオチドを、ライゲーション２０９５のために、一致するオーバーハングを有するニックの入った連結ポリヌクレオチドとインキュベートする。
ライゲーション２０９５の後、環状化したニックの入った連結ポリヌクレオチド（例えば、環状化した核酸分子）は、構造２１００に示すように、関心対象のポリヌクレオチド２０９０の近くに位置した２つのニック（２０２１及び２０３１）を含有する。次に、ニック２０２１及び２０３１の両方を、関心対象のポリヌクレオチド２０９０に、プロセス２１０５によって伸張させる。上述したように、これは、ニックトランスレーション又は第１の及び第２の連結ポリヌクレオチド２０１７及び２０１８の３’末端を関心対象のポリヌクレオチド２０９０に伸張させるためのいずれの他の記載した実施態様によって生じることができる。いくつかの実施態様において、伸長は、ニックトランスレーションによって達成される。いくつかの実施態様において、伸長の程度を、最終のブレイクポイント（ｂｒｅａｋ ｐｏｉｎｔ）（ニック又は分子が一本鎖のところに位置する）が不変のままであるように制御できる。
いくつかの実施態様において、ライゲーション反応２０９５の後、ライゲーションされていない直線状の関心対象のポリヌクレオチド及び残存する直線状のニックの入った連結ポリヌクレオチドを除去又は除くことができる。いくつかの実施態様において、これは、ＰＬＡＳＭＩＤ−ＳＡＦＥ ＡＴＰ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮａｓｅ キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅから入手可能）内のものなどの、直線状の二本鎖ＤＮＡを消化する酵素によって達成される。
いくつかの実施態様において、上述したクリーニング・プロセスの後、残存する環状の種類のもの２１００を、次に、プロセス２２０５によって、伸張させた３’末端の新しい位置で切断して、対をなすタグを放出することができる。３’末端をニックトランスレーションによって移動させる実施態様において、切断部位は、新しいニックの位置２２２１及び２２３１にある。生じた放出された対をなすタグ２３００は、連結ポリヌクレオチド２０１０、２つのアダプター２０２０及び２０３０を含むことができ、望ましい長さの関心対象のポリヌクレオチドのタグ２０９１及び２０９２によって挟むことができる（図２７）。
いくつかの実施態様において、ＳＯＬｉＤ（商標）内部アダプター２３１０を、プロセス２３０５において、製造された放出された対をなすタグ２３００にライゲーションして（図２７に示すように）、内部アダプターを含有する対をなすタグ２４００を作製することができる。ライゲーション後、生じた内部アダプターを含有する対をなすタグ２４００（又はその集団）は、関心対象のポリヌクレオチドタグ２０９１及び２０９２の両方が適切に方向付けられているライブラリー鋳型となることができる。いくつかの実施態様において、ライブラリーは、図２７中のプロセス２４０５に概して示すように（プライマーは図示せず）、アダプターＰ１ ２０２０及びＰ２ ２０３０の一つの鎖に結合することができるプライマーを用いる大規模のＰＣＲ増幅のための鋳型として機能することができる。生じたＰＣＲ産物２５００は、一本鎖であってもよく、産物の各末端上に位置するＰ１及びＰ２配列を有することができる。いくつかの実施態様において、ＰＣＲ増幅２４０５のためのプライマー配列は、ＳＯＬｉＤ（商標）ライブラリーに使用されるものである。いくつかの実施態様において、生じた増幅された直線状の産物がライブラリーである場合、次に、ライブラリーを、鋳型にしたビーズの調製のためのエマルジョンＰＣＲに使用することができる。
図２７が平滑末端内部アダプター２３１０を示す一方で、いくつかの実施態様において、図２８に示すように、放出された対をなすタグ２３００の末端を修飾して、自己のライゲーションを防ぐか又は減少させることができる。例えば、一本鎖の切断２２０５の後に、Ｔａｑポリメラーゼを使用して、生じた放出された対をなすタグが、Ｔのオーバーハンドを５’末端に含む内部アダプター２３１１にのみライゲーションできるように、３’末端にアデニン塩基を付加することができる（図２８）。
上述した実施態様において多くの様々な利益があるが、いくつかの実施態様において、ニックの入った連結ポリヌクレオチドの使用によって、種々の対をなすタグのライブラリーワークフローにおいて必要とされるステップの数を回避するか、又は減少させることができる。例えば、いくつかの現在のＳＯＬｉＤ（商標）の対をなすタグのライブラリーワークフローは、ＳＯＬｉＤ（商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ上で配列決定するのに適切なライブラリーを作製するにあたって、１４の重要なステップを伴う。いくつかの実施態様において、ニックの入った連結ポリヌクレオチドの使用によって、対をなすタグのライブラリーのワークフローを調製することから１又は複数のステップを除去することが可能となる。いくつかの状況において、典型的なワークフローは、以下のプロセス：１）ＤＮＡの剪断、２）ＤＮＡの末端の修復、３）ＥｃｏＰ１５Ｉ部位におけるｇＤＮＡのメチル化、４）アダプターにおけるライゲーション、５）サイズ分画、６）内部アダプターによる環状化、７）ＥｃｏＰ１５Ｉの消化、８）末端修復、９）アダプターライゲーション、１０）結合部分の結合、１１）ニックトランスレーション、１２）大規模のＰＣＲ、１３）ゲル精製及びサイズ選別、並びに１４）ライブラリーの最終の定量化を含むことができる。いくつかの実施態様において、１又は複数の本明細書に記載されている実施態様を用いることによって、プロセス４〜６を、ニックの入った連結ポリヌクレオチドにおいて単にライゲーションするように圧縮することができる。さらに、プロセス９〜１１の１又は複数を除去することもできる。それ故に、いくつかの実施態様において、プロセス４〜６及び９〜１１の１又は複数を除去するか、かつ／又は本明細書に記載されている実施態様の一つに交換する。いくつかの実施態様において、標準的なワークフローは、以下のプロセス：１）ＤＮＡの剪断、２）ＤＮＡの末端の修復、３）ＥｃｏＰ１５Ｉ部位におけるｇＤＮＡのメチル化、４）アダプター（例えば、ＣＡＰアダプター）におけるライゲーション、５）サイズ選別、６）内部アダプターによるＤＮＡの環状化、７）Ｐｌａｓｍｉｄ−ｓａｆｅ（商標）ＤＮａｓｅ処理、８）ＥｃｏＰ１５Ｉの消化、９）Ｋｌｅｎｏｗ媒介の末端修復、１０）アダプターのライゲーション、１１）結合部分の結合、１２）ニックトランスレーション、１３）大規模のＰＣＲ（例えば、ライブラリー増幅）、並びに１４）ライブラリーのゲル精製及びサイズ選別及び定量化を含むことができる。しかしながら、１又は複数の本明細書に開示される実施態様を用いることによって、ワークフローは、単に、以下のプロセス：１）ＤＮＡの剪断、２）サイズ選別、３）末端修復、４）ゲノムのＥｃｏＰ１５Ｉ部位メチル化、５）ＬＶＡライゲーション、６）ＰＬＡＳＭＩＤ−ＳＡＦＥ（商標）ＤＮａｓｅ処理、７）ＥｃｏＰ１５Ｉの消化、８）末端修復、９）内部アダプターのライゲーション、１０）ライブラリーの増幅、及び１１）ライブラリーの純度（ｐｕｒｉｔｙ）ＱＣ及び定量化を含むことができる。それ故に、いくつかの実施態様において、ワークフローを１４から１１のプロセスに減少させることができる。当然、本明細書に開示される利益は、ＳＯＬｉＤ（商標）システム上での配列決定に制限されない。
いくつかの他の対をなすタグのライブラリーは、構築するのに約４日かかり、ＳＯＬｉＤ（商標）に関連したワークフローにとっての障害を生じるものである。いくつかの実施態様において、ニックの入った連結ポリヌクレオチドを用いることによって対をなすタグのライブラリーを作製するのに必要とされる時間は、４日より短く、例えば、３日、２日、１日であり、２０時間未満、１５時間未満、又は１０時間である。さらに、複数のステップによって、実験の誤りの機会及び各ステップの間におけるサンプルの損失が増加する。ニックの入った連結ポリヌクレオチドの使用によって、ワークフローを促進することができる一方で、サンプル回収率を向上させることができる。いくつかの実施態様において、ニックの入った連結ポリヌクレオチドのベースのワークフローの方法は、対をなすタグのライブラリーのワークフローにおけるステップの数を６ステップに減少させるか、かつ／又は全体の手順に必要とされる時間を約１０〜１２時間に減少させる。いくつかの実施態様において、実験の手順は、１４ステップから、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、又は６ステップに減少する。
いくつかの実施態様において、アダプターにライゲーションされている標的ＤＮＡ断片の５０％が無益な産物である他のＰＴスキームに対して、直線状のベクターにライゲーションされている標的断片のすべてが、後の処理について生産的なものである（例えば、図２９Ａ対図２９Ｂ参照）。いくつかのＰＴ方法において、内部アダプターによる環状化プロセスは、乏しい自己環状化効率のために重大なサンプルの損失を出す可能性があるが、いくつかの開示された実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドは、適切な長さを有する連結ポリヌクレオチドに既に結合しており、したがって、既に捕捉されている。それ故に、より内部のアダプターを使用して、いくつかの実施態様において最大のライゲーション効率を出すことができる。さらに、Ｔ／Ａオーバーハング（例えば、図２８）を用いて、連結ポリヌクレオチド及びアダプターの自己ライゲーションを減少させることができる。
いくつかの実施態様において、ニックの入った連結ポリヌクレオチドは、より小さい挿入物サイズ、約１００ｂｐまで小さいものを取り扱うことができるが、既存のＰＴライブラリーワークフローは、６００ｂｐより小さい挿入物サイズで機能しない。例えば、連結ポリヌクレオチドの存在によって、長さがより短いために容易に環状化しない関心対象のポリヌクレオチドが環状化できるように、関心対象のポリヌクレオチドの長さを効果的に増加させる。いくつかの実施態様において、これは、５０ｂｐの配列決定化学などのより長い読み取りのための配列決定化学と合わせた場合に特に有利であり、それによって、約１００ｂｐのサイズのポリヌクレオチドの全体を配列決定することが可能になる。それ故に、種々の本明細書に記載されている実施態様は、配列決定化学を更に変化させることなく、１００ｂｐ読み取り（各タグについて５０ｂｐ）の能力をもたらすことができる。いくつかの実施態様において、より長い読み取りによって、新規の配列決定が可能となる。
上記で概説した多数の態様に照らして、開示された実施態様が、既存のＰＴライブラリー作製における重大な障害であるステップに取り組むことができる一方で、同時に、より高い効率及び優れたサンプル回収率をもたらすことができることは明らかである。図２９Ａ及び２９Ｂは、他の技術を用いて対をなすタグのライブラリーを製造するための種々の技術（図２９Ｂに示す）を超えるいくつかの本明細書において開示された実施態様（図２９Ａ）のいくつかの利益を更に表す。いくつかの本明細書に記載されている実施態様が、すべてのライゲーション反応から有用な産物をもたらすが（図２９Ａ）、対をなすタグのライブラリーを製造するための他のアプローチは、ライゲーション産物の５０％のみに有用な産物をもたらす（図２９Ｂ）。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されている種々の方法及び部分を、対をなすタグのライブラリーを製造するのに使用できるＳｕｐｐｏｒｔ Ｏｌｉｇｏ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ（商標））キットに関して使用することができる。
多くの上記図面中の実施態様は、Ｐ１及び／又はＰ２プライマーアダプターを含むものとして描写されているが、いくつかの実施態様において、これらの実施態様におけるアダプターは、プライミング部位を含まない。それ故に、Ｐ１及びＰ２プライマーアダプターが一般的なアダプターに置き換えられている別の実施態様も考慮され、本明細書に開示される。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されている方法によって、サイズが制限されない対をなすタグの生産が可能になる。いくつかの実施態様において、前記方法によって、ＩＩｓ型又はＩＩＩ型制限酵素によって処理されない対をなすタグの生産が可能になる。それ故に、いくつかの実施態様において、方法及び／又はキットは、ＩＩｓ型又はＩＩＩ型制限酵素を含まない。いくつかの実施態様において、このことによって、ＩＩｓ型又はＩＩＩ型制限酵素によって処理されていない末端を含む対をなすタグの生産が可能になる。それ故に、いくつかの実施態様において、対をなすタグの末端上の１又は複数の配列は、ＩＩｓ型又はＩＩＩ型制限酵素による切断から生じる配列ではない。これには、後に平滑にされるか又は他の方法で操作されるＩＩｓ又はＩＩＩ型切断部位が含まれる。いくつかの実施態様において、対をなすタグは、ＩＩｓ型及び／又はＩＩＩ型制限部位を欠く。
上述したものは、対をなすタグの生産のための種々の実施態様に含まれるコンセプトを設定するが、以下のセクションにて、種々の具体的な実施態様を説明し、技術を更に説明するために具体的な例を提案する。
（関心対象の二本鎖ポリヌクレオチド）
関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドは、細胞の又は組織の核酸サンプル、予めクローン化した断片のサブクローン、ｍＲＮＡ、化学合成された核酸、ゲノムの核酸サンプル、核酸ライブラリーから得られた核酸分子、特異的な核酸分子、及び核酸分子の混合物などのいずれの供給源に由来することができる。開示された方法のいくつかの実施態様は、特に、ライブラリーにて示される核酸分子の複合混合物から開始した核酸分子のライブラリーを生産するのに適している。例えば、ｃＤＮＡを、細胞のサンプル中のｍＲＮＡのすべてから生産することができ、該ｃＤＮＡを使用して、ｃＤＮＡライブラリーを製造できるか、又はゲノムＤＮＡのライブラリーをゲノムの核酸サンプルから製造できる。
いくつかの実施態様において、特徴付けられる核酸配列は、ゲノムであってもよい。ゲノムは、細胞又は生物のゲノムＤＮＡである。いくつかの実施態様において、ゲノムは、原核生物、真核生物、植物、ウイルス、真菌、又はその単離した細胞のものであってもよい。他の実施態様において、ゲノムは、既知の（予め特徴付けられたか、又は配列決定された）ゲノムであってもよい。他の実施態様において、ゲノムは、未知の（予め特徴付けられていないか、又は配列決定されていない）ゲノムであってもよい。いくつかの実施態様において、ゲノムを特徴付けることは、ゲノムの核型分析を含むことができる。核型分析は、細胞又は生物のゲノムの分析である。他の実施態様において、ゲノムを特徴付けることは、異なる供給源由来の２又はそれ以上の核酸配列間の違いを同定する多型の発見又は遺伝子型同定を含む。
関心対象のポリヌクレオチド、核酸又はＤＮＡは、基本的に、既知の又は未知の配列のいずれの核酸であってもよい。例えば、関心対象のポリヌクレオチド、核酸又はＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡの断片であってもよい。配列決定によって、関心対象の分子の全体の又は一部の配列が決定される。関心対象の分子を、ランダムに断片化された一次の核酸サンプルから得ることができる。関心対象の分子を、増幅に適した関心対象のポリヌクレオチド断片に、例えば、関心対象の各断片末端に普遍的な増幅配列を設置することによって、加工することができる。また、関心対象の分子を、ｃＤＮＡへの逆転写によって、一次のＲＮＡサンプルから得ることもできる。
いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の形態（例えばゲノムＤＮＡ断片、ＰＣＲ及び増幅産物など）で生じることができる。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドは、一本鎖の形態で、ＤＮＡ又はＲＮＡとして生じ、ｄｓＤＮＡの形態に変換できる。一例として、ｍＲＮＡ分子を、本発明の方法での使用に適した二本鎖ｃＤＮＡに、本技術分野において周知の標準的な技術を用いてコピーすることができる。一次のポリヌクレオチド分子の正確な配列は、概して、本発明の材料ではなく、既知であっても、未知であってもよい。
対をなすタグ又は対をなす読み取りを、いずれの長さの断片、例えば２〜１０ＫｂのＰＣＲ増幅産物又は細菌もしくは他の生物学的供給源から単離したＤＮＡクローン上で得ることができる。標的は、約４０ｋＢのフォスミド（ｐｈｏｓｍｉｄ）分子の末端又は約１００〜２００ｋＢの細菌人工染色体（ＢＡＣ）の末端であってもよい。そのような供給源由来のポリヌクレオチドの末端は、各々の断片化されていないポリヌクレオチドの末端から読み取りを得るために、断片化することなく配列決定できるか、又はポリヌクレオチドを断片化することができる。断片化されているポリヌクレオチドを、例えばゲル電気泳動によって、標的断片サイズ上での狭いサイズ分布を得るために、選択することができる。サンプル全体にわたって空間が空けられた対をなす読み取りを、予め配列決定していないサンプルの新規のアセンブリのために加えて、参照ゲノムが利用可能である場合にサンプルを再び配列決定するためのツールとして使用できる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されている方法は、分子の末端における配列の知識が望ましい場合に、いずれの供給源から得られた核酸分子と共に使用するのに適している。
いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子であってもよい。いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドは、生物の全遺伝子の補完を表すことができ、イントロン及びエキソン配列（コード配列）の両方に加えて、プロモーター及びエンハンサー配列などの非コード制御配列を含むゲノムＤＮＡ分子であってもよい。ゲノムＤＮＡ分子を使用する実施態様において、ゲノムの幅広い分析又は全ゲノムの分析を達成できる。しかしながら、例えば、特定の染色体などのポリヌクレオチド配列又はゲノムＤＮＡの特定のサブセットも使用できることが予想される。いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドの配列は既知でなくてもよい。いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドは、ヒトゲノムＤＮＡ分子であってもよい。関心対象のＤＮＡ分子を、いずれのランダムな断片化プロセスの前又は後に、アダプター配列のライゲーションの前又は後に、化学的に又は酵素的に処理することができる。ランダムな断片化とは、順序付けられていない様式での酵素的な、化学的な又は機械的な手段によるポリヌクレオチド分子の断片化を指す。そのような断片化方法は、本技術分野において既知であり、標準的な方法を利用するものである（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）。ランダムな断片化を、切断を含むか、かつ／又は囲むヌクレオチドの配列同一性又は位置に無関係の断片を生産するように設計する。ランダムな断片化を、噴霧又は超音波処理などの機械的な手段によって達成でき、例えば、約５０塩基対の長さ〜約３０００塩基対の長さ、特に５０〜２０００塩基対の長さ、特に５０〜１５００塩基対の長さ、特に５０〜１０００塩基対の長さ、特に５０〜７００塩基対の長さの断片を生じることができる。いくつかの実施態様において、前記方法を使用して、約１０００〜２０００塩基対の長さの断片を生成することができる。いくつかの実施態様において、前記方法を用いて、約５００〜１０００塩基対の長さの断片を生成することができる。いくつかの実施態様において、方法を用いて、約５０〜１５０塩基対の長さの断片を生成することができる。
いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドを、特定のサイズのポリヌクレオチド断片について選別するサイズ選別方法に付すことができる。サイズ選別方法は、本技術分野において既知であるいずれの種々のサイズ選別方法であってもよく、ゲル電気泳動などの電気泳動、並びにＨＰＬＣ及びサイズ排除クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、例えば、約５０塩基対の長さ〜約３０００塩基対の長さ、特に５０〜２０００塩基対の長さ、特に５０〜１５００塩基対の長さ、特に５０〜１０００塩基対の長さ、及び特に５０〜７００塩基対長さの断片をサイズ選別方法によって選別する。いくつかの実施態様において、前記方法を用いて、約１０００〜２０００塩基対の長さの断片を選別することができる。いくつかの実施態様において、前記方法を用いて、約１００〜１０００塩基対の長さの断片を選別することができる。いくつかの実施態様において、サイズ選別方法を用いて、約５０〜１５０塩基対の長さの断片を選別することができる。
本明細書に記載されている種々の実施態様において、核酸配列を断片化して、５’末端及び３’末端を有する複数の核酸配列断片を生産することを含む、核酸配列を特徴付ける方法が提供される。機械的な手段（例えば噴霧、超音波処理及びハイドロシヤー（Ｈｙｄｒｏｓｈｅａｒ））によるポリヌクレオチド分子の断片化によって、平滑並びに３’及び５’オーバーハング末端の異種の混合物を有する断片が生じる。断片の末端を、本技術分野において既知である方法又はキット（Ｌｕｃｉｇｅｎ ＤＮＡ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｅｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｋｉｔなど）を用いて修復して、例えば、平滑末端を有するアダプターにライゲーションするのに最適な末端を生成することができる。例えば、ＳｍａＩなどの種々の制限エンドヌクレアーゼを使用して、平滑末端を生じることができる。いくつかの実施態様において、核酸の集団の断片の末端は平滑末端化されている。
図１に示すものなどのいくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドは、５’リン酸残基を５’及び３’末端の両方にて欠く。図１に示す関心対象のポリヌクレオチドは、平滑末端を有すると思われ、他の実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドは、１つの粘着末端及び１つの平滑末端、２つの粘着末端、又は２つの平滑末端を有することができる。いくつかの実施態様において、アダプターは、１つの粘着末端及び１つの平滑末端、２つの粘着末端、又は２つの平滑末端を有することができる。
いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドを、５’リン酸残基を欠く少なくとも１つの末端を備えて調製する。例えば、５’リン酸残基を、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボ−及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸からの５’リン酸基の除去を触媒するアルカリホスファターゼの活性によって除去できる。アルカリホスファターゼによるポリヌクレオチド断片の処理は、
Figure 2011509095
 の通りである。それ故に、５’リン酸残基を関心対象のポリヌクレオチドの５’末端から除去できる。適したアルカリホスファターゼの例としては、仔牛腸アルカリホスファターゼ、細菌アルカリホスファターゼ、エビアルカリホスファターゼ、南極ホスファターゼ、及び胎盤アルカリホスファターゼが挙げられる。当業者に明らかであるように、ニックを導入できるか、又は関心対象のポリヌクレオチドの環状化から生じさせることができる種々の方法がある。そのような技術から必要とされていることは、ニックが環状化した核酸配列に存在することである。
いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドの末端を修飾できる。例えば、関心対象のポリヌクレオチドに結合するアダプターが１又は複数のチミンを含む場合、１又は複数のアデニンを付加することができる。いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドは、そのリン酸残基を保持する。
（アダプター、環状化及びニック導入）
いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドを、１又は複数のアダプターをポリヌクレオチドの末端に付着させることによって、曝された末端から５’リン酸を効果的に除去するように修飾する。例えば、１つの鎖において５’リン酸残基を欠くアダプターを、関心対象のＤＮＡ断片の末端にライゲーションすることができる。いくつかの実施態様において、アダプターは、関心対象のポリヌクレオチドの末端に対して少なくとも１つの適合性の末端を有する。いくつかの実施態様において、アダプターは、１つの平滑末端、２つの平滑末端、２つの粘着末端、又は２つの平滑末端を有することができる。いくつかの実施態様において、アダプターの１つの末端が粘着性であってもよく、５’リン酸残基を欠くことができ、アダプターの他の末端が平滑であってもよい。他の実施態様において、第１のアダプターを、関心対象のポリヌクレオチドの１つの末端に付着させることができ、第１のアダプターとは異なる配列を有する第２のアダプターを、関心対象のポリヌクレオチドの他の末端に付着させることができる。第１のもしくは第２のアダプターのいずれか、又は第１の及び第２のアダプターの両方が、１つの鎖において５’リン酸残基を欠くことができる。いくつかの実施態様において、アダプターを、関心対象のポリヌクレオチドに、例えば、ライゲーションによって付着させることができる。
当業者に明らかであるように、いくつかの実施態様において、アダプターは、いずれの長さのいずれのヌクレオチド配列も含むことができる。いくつかの実施態様において、アダプターを、関心対象のポリヌクレオチド又は別のアダプターにライゲーションする際にニック又はギャップを生じるように構成する。いくつかの実施態様において、アダプターを関心対象のポリヌクレオチドに付加する際に、アダプターの濃度が関心対象のポリヌクレオチドよりもはるかに大きい。いくつかの実施態様において、アダプターは、関心対象のポリヌクレオチドよりも短い。いくつかの実施態様において、アダプターは、５００塩基未満、例えば、４００、３００、２００、１００、５０、又はそれよりも少ない塩基の長さである。
いくつかの実施態様において、アダプターは、バーコード配列を含む。アダプターのバーコード配列を、例えば、配列決定又はハイブリダイゼーションなどの方法によって検出できる。いくつかの実施態様において、バーコード配列によって、単一の配列決定の実行下に共に置かれている異なるサンプルの同定が可能となる。例えば、独特なバーコード配列を有する２、３、４、５、６、７〜１０、１０〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜５００、５００〜１０００、又はそれより多い異なるサンプルを共に単一の配列決定の実行下に置くことができる。対をなすタグのメンバーを、対をなすタグの特定のアダプターと関連した独特なバーコード配列を用いて、同定することができる。いくつかの実施態様において、バーコードは、アダプターと分離されているが、対をなすタグに含まれる。いくつかの実施態様において、バーコードは、２つのアダプターの間に位置する。いくつかの実施態様において、バーコードは、１つよりも多いアダプター中にある。
いくつかの実施態様において、アダプターは、結合部分と連結している。
いくつかの実施態様において、アダプター（１、２、３、又はすべてのアダプター）は、制限酵素結合部位を含まない。例えば、いくつかの実施態様において、アダプター（環状化した核酸分子中の１又は複数のアダプター）は、ＥｃｏＰ１５Ｉ及びＭｍｅＩ制限部位を欠く。それ故に、いくつかの実施態様において、特異的な配列に結合する制限酵素を添加することによって、環状化した核酸分子の切断が生じない。
いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドのアダプターへの付着は、例えば、ライゲーション又はアニーリングによって生じることができる。図１において、環状の核酸分子は、環状の核酸分子の異なる鎖のそれぞれの上に１つのニックを有する。例示した実施態様において、ニックは、最初に、アダプターと関心対象のポリヌクレオチドの間に位置する。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドの末端及びアダプターの配列が、関心対象のポリヌクレオチドのアダプターへの付着により、図７に示すように、少なくとも１つのギャップが関心対象のポリヌクレオチドとアダプターとの間に形成できるようなものであってもよい。ギャップが関心対象のポリヌクレオチドとアダプターとの間にあるいくつかの実施態様において、ギャップを挟むポリヌクレオチド鎖の５’末端が、依然として、５’リン酸残基を有することができる。これは、ギャップを導入する場合、５’リン酸残基の存在が、ニックトランスレーション反応に影響しないからである。ギャップが関心対象のポリヌクレオチドとアダプターとの間にあるいくつかの実施態様において、ギャップを挟むポリヌクレオチドの鎖の５’末端が、５’リン酸残基を欠くことができる。換言すれば、図７に示すように、ギャップの３’末端におけるポリヌクレオチド鎖が５’リン酸残基を欠くことができる。ギャップの３’末端におけるポリヌクレオチド鎖が５’リン酸残基を欠く必要はない。いくつかの実施態様において、ギャップの３’末端におけるポリヌクレオチド鎖は、５’リン酸残基を欠いていない。いくつかの実施態様において、環状の核酸分子は、１つのニック、１つのギャップ、向かい合う鎖上の２つのニック、１つの鎖上のニック及び向かい合う鎖上のギャップ、又は向かい合う鎖上の２つのギャップを有することができる。
いくつかの実施態様において、対をなすタグのクローンの調製において、アダプター配列の第１のセットを、図３に示すように、関心対象のポリヌクレオチド断片に付着させることができる。関心対象のポリヌクレオチドのアダプターへの付着は、例えば、ライゲーション又はアニーリングによって生じることができる。図に示される実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドは、アダプター１の平滑末端にライゲーションされている平滑末端を有する。他の実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドの一つの末端を第１のアダプター１にライゲーションすることができ、関心対象のポリヌクレオチドの他の末端を第２のアダプター１にライゲーションすることができ、第１の及び第２のアダプター１は、同じ又は異なる配列を有することができる。図３において、アダプター１は、その粘着５’末端において５’リン酸残基を欠く。生じた分子は、５’末端のリン酸残基を欠く粘着末端を有する。次に、この分子の両方の粘着末端を、アダプター２の末端にライゲーションし、それによって、図３に示すように、向かい合う鎖上にニックを有する環状の核酸分子を形成する。ニックが、第１のアダプターの末端と第２のアダプターとの間に存在する。いくつかの実施態様において、アダプター１及びアダプター２の配列は、アダプター２がアダプター１にライゲーションされたときに、少なくとも１つのギャップがアダプター１とアダプター２の間に形成されるようなものである。ギャップがアダプター１とアダプター２の間にあるいくつかの実施態様において、ギャップを挟むポリヌクレオチド鎖の５’末端は、必要ではないが、５’リン酸残基を有することができる。換言すれば、ギャップの３’末端におけるポリヌクレオチド鎖は、必要ではないが、５’リン酸残基を有することができる。いくつかの実施態様において、環状の核酸は、１つのニック、１つのギャップ、向かい合う鎖上の２つのニック、１つの鎖上のニック及び向かい合う鎖上のギャップ、又は向かい合う鎖上の２つのギャップを有することができる。いくつかの実施態様において、アダプター１は、１つの粘着末端及び１つの平滑末端、２つの粘着末端、又は２つの平滑末端を有することができる。アダプター２は、１つの粘着末端及び１つの平滑末端、２つの粘着末端、又は２つの平滑末端を有することができる。第１のアダプター１及び第２のアダプター１は、両方とも、少なくとも１つの５’リン酸残基を欠くことができる。
いくつかの実施態様において、ニックを環状の核酸分子に導入する。いくつかの実施態様において、環状の核酸分子に導入したニックの位置は、ランダムであってもよい。いくつかの実施態様において、環状の核酸分子を、ニッキング制限酵素のための認識部位を有するように設計することができる。いくつかの実施態様において、ニッキング制限酵素の制限部位を含有するアダプターを、関心対象のポリヌクレオチドの１つの又は両末端にライゲーションして、アダプターで修飾された関心対象のポリヌクレオチドを作製することができる（図８）。次に、図８に示すように、アダプターで修飾された関心対象のポリヌクレオチドを、別のアダプターを用いて、環状化することができる。他の実施態様において、ニッキング制限酵素部位を両末端に有するアダプターを、関心対象のポリヌクレオチドの両末端にライゲーションして、環状の核酸分子を形成することができる。環状の核酸分子に導入された部位に特異的なニッキング制限酵素を使用して、一つの鎖において、各ニッキング制限酵素部位の下流で、ニックを生じさせることができる（図９）。
ニッキング制限酵素は、本技術分野において既知であり、該ニッキング酵素としては、例えば、ＥｃｏＰ１５Ｉ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩが挙げられるが、これらに制限されない。ＥｃｏＰ１５Ｉ及びＭｍｅＩなどの制限酵素を、ニッキング酵素に既存の戦略を用いて設計することができる。（Ｈｅｉｔｅｒ，ＤＦ．ｅｔ ａｌ，２００５，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，３４８，６３１−６４０；Ｓａｍｕｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ ＮＡＲ，３２：３６６１−３６７１；Ｚｈｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．２００４，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３３７：５７３−５８３）。
いくつかの実施態様において、対をなすタグのクローンの調製において、トポイソメラーゼ（Ｔｏｐｏ）を使用して、環状化効率を改善することができる。ＩＡ型、ＩＢ型、ＩＩ型等を含めた種々のトポイソメラーゼを使用できる。いくつかの実施態様において、トポイソメラーゼは、トポイソメラーゼＩであってもよい。いくつかの実施態様において、Ｔｏｐｏ結合部位を有するアダプターを使用することができる（「Ｔｏｐｏ結合アダプター」）。Ｔｏｐｏ結合部位配列は、使用する特定のトポイソメラーゼに依存する。いくつかの実施態様において、Ｔｏｐｏ結合部位は、ＹＣＣＴＴであるか、又はＹＣＣＴＴを含み、Ｙは、Ｃ又はＴでありうる。いくつかの実施態様において、アダプターは、１つの又は両方の鎖の３’末端にＴｏｐｏ結合部位を有することができる。他の実施態様において、Ｔｏｐｏ結合アダプターは、アダプターの各鎖の３’末端にＴｏｐｏ結合部位を有することができる。いくつかの実施態様において、Ｔｏｐｏ結合アダプターは、１つの又は両方の鎖の３’末端のＴｏｐｏ結合部位を超えて伸長する１又は複数の余分な塩基を有する。Ｔｏｐｏ結合アダプターは、平滑末端、粘着末端、又は１つの平滑末端及び１つの粘着末端を有することができる。
いくつかの実施態様において、Ｔｏｐｏ結合アダプターは、１つの又は両方の鎖上にギャップ又はニックを有する。Ｔｏｐｏ結合アダプターの例を、図１０に示す。図１０に示すように、向かい合う鎖上にギャップ又はニックを有するＴｏｐｏ結合アダプターは、４つのオリゴヌクレオチド、Ｔｏｐｏ−ＩＡ−Ａ−１、Ｔｏｐｏ−ＩＡ−Ｂ−１、Ｔｏｐｏ−ＩＡ−Ａ−２及びＴｏｐｏ−ＩＡ−Ｂ−２を合わせることによって形成される。オリゴヌクレオチドＴｏｐｏ−ＩＡ−Ｂ−１及びＴｏｐｏ−ＩＡ−Ａ−２は、それぞれ、３’末端にＴｏｐｏ結合部位を有し、５’リン酸を欠く。図示した実施態様において、Ｔｏｐｏ−ＩＡ−Ａ−１は、結合部分であるビオチンに連結している。生じたＴｏｐｏ結合アダプター（図１０の下部に示される）は、両方の鎖の３’末端にＴｏｐｏ結合部位、向かい合う鎖上にニック、ギャップ／ニックを有し、ビオチンに連結している。
トポイソメラーゼのＴｏｐｏ結合アダプターへの添加によって、図１１に示すように、トポイソメラーゼ−アダプター複合体を生成できる。当業者に明らかであるように、複合体形成の間に、トポイソメラーゼＩは、Ｔｏｐｏ結合部位においてアダプターに共有結合する（例えば、Ｓｈｕｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８８，ｐｐ．１０１０４−１０１０８，１９９１参照）。アダプターの鎖における５’ＹＣＣＴＴ部位の後のホスホジエステル骨格が壊れ、ホスホチロシル結合が、切断した鎖の３’リン酸とトポイソメラーゼＩのＴｙｒ２７４残基との間に生じる（図１１）。ホスホチロシル結合を、後に、脱リン酸化したポリヌクレオチドの５’ヒドロキシル基によって攻撃できる（図１２）。いくつかの実施態様において、ＤＮＡ挿入断片（いくつかの実施態様においてライブラリー構成のために使用することができる）を脱リン酸化し、Ｔａｑ又はオーバーハングを生成するためのいずれの他の適切な方法を用いて、関連したヌクレオチドで３’テーリングをすることができる。当業者に明らかであるように、トポイソメラーゼとアダプターとの間の特異的な結合反応は、使用した特定のトポイソメラーゼに応じて変化する。
いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドを脱リン酸化することができる。関心対象のポリヌクレオチドの脱リン酸化の例は上記で説明している。いくつかの実施態様において、脱リン酸化した関心対象のポリヌクレオチドを望ましいヌクレオチドで３’テーリングする。３’テーリングは、オーバーハングを生成するための種々の方法を用いて行うことができる。いくつかの実施態様において、Ｔａｑを使用して、脱リン酸化した関心対象のポリヌクレオチドを３’テーリングして、オーバーハングを生成する。いくつかの実施態様において、１又は複数のヌクレオチドを、関心対象のポリヌクレオチドの１つの又は両方の鎖の３’末端に付加できる。いくつかの実施態様において、単一のヌクレオチドを、関心対象のポリヌクレオチドの各鎖の３’末端に付加できる。図１２に示す実施態様において、脱リン酸化した関心対象のポリヌクレオチドは、各鎖の３’末端に単一のＡオーバーハングを有する。
いくつかの実施態様において、トポイソメラーゼ−アダプター複合体を、脱リン酸化した関心対象のポリヌクレオチドと結合させる。脱リン酸化した関心対象のポリヌクレオチドの５’ヒドロキシル基は、図１２に示すように、トポイソメラーゼ−アダプター複合体のホスホチロシル結合を攻撃できる。アダプターと関心対象のポリヌクレオチドとを含む環状の核酸分子を、図１３に示すように形成する。いくつかの実施態様において、環状の核酸は、アダプター内の向かい合う鎖上にニックを有することができる。
上述したように、いくつかの実施態様において、１つを超えるアダプターを使用できる。さらに、いくつかの実施態様において、連結ポリヌクレオチドを使用して、第１の及び第２のアダプターを連結し、それによって、ニックの入った連結ポリヌクレオチドを形成することができる。いくつかの実施態様において、環状化を、少なくとも２つのアダプターによって達成する。いくつかの実施態様において、内部アダプターも、プロセス中の後のポイントで使用する（例えば、図２７及び２８）。
上述したように、いくつかの実施態様において、ニックは、アダプターと関心対象のポリヌクレオチドとの間に存在する。いくつかの実施態様において、ニックは、ニックの入ったベクターに存在する。いくつかの実施態様において、ニックは、アダプターと関心対象のポリヌクレオチドとの間に位置しないが、アダプターと連結ポリヌクレオチドとの間に位置する。いくつかの実施態様において、ニックを、ギャップに広げて、一本鎖に特異的なエンドヌクレアーゼ（又はエキソヌクレアーゼ）による消化効率を増加させることができる。
いくつかの実施態様において、アダプターを、リン酸基を欠くように修飾し、したがって、アダプターが連結ポリヌクレオチドに連結されると、ニック及び／又はギャップが形成される。いくつかの実施態様において、ニック及び／又はギャップは、関心対象のポリヌクレオチドとアダプターとの間にある。いくつかの実施態様において、ニック及び／又はギャップは、連結ポリヌクレオチドとアダプターとの間にある。いくつかの実施態様において、ニック及び／又はギャップは、関心対象のポリヌクレオチド内にある。いくつかの実施態様において、ニック及び／又はギャップは、連結ポリヌクレオチド内にある。
いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドの環状化は、関心対象のポリヌクレオチドの末端及び／又はアダプターを修飾することを伴うことができる。いくつかの実施態様において、修飾によって、ニックの入った連結ポリヌクレオチドが自己ライゲーションする可能性を減少させる。いくつかの実施態様において、修飾は、１又は複数のヌクレオチド（例えば、チミン）の、ニックの入った連結ポリヌクレオチドのアダプター部分の末端への付加である。追加のヌクレオチドを、自己ライゲーションの可能性を減少させるように選択する（例えば、末端が互いにハイブリダイズしない）。当然、関心対象のポリヌクレオチドを、修飾したアダプターの末端にハイブリダイズするように修飾する。いくつかの実施態様において、放出された対をなすタグの末端も、修飾できる（内部アダプターの末端が適切に同様に修飾されている）。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されているように、ニックをギャップに転換し、次に、プロセスを、より小さいニックの代わりにギャップを用いて続ける。いくつかの実施態様において、これによって、一本鎖部分においてより有効に切断して、対をなすタグを放出することが可能になる。
（ニックトランスレーション及び／又はニックの３’側の伸長）
少なくとも１つのニック又はギャップを有する環状の核酸分子の形成後の種々の実施態様において、図２及び図４に示すように、ニックトランスレーション反応を行うことができる。ニックトランスレーション反応は、環状の核酸分子に存在する少なくとも１つのニックを、関心対象のポリヌクレオチド内の位置に転位させる。図４は、図３に示す環状の核酸分子上で行われたニックトランスレーション反応の結果を概略的に示す。ニックトランスレーション反応は、図４に示すように、環状の核酸分子中のニックのそれぞれを、アダプター１を介して、関心対象のポリヌクレオチド内の位置に転位させることができる。
いくつかの実施態様において、ニックトランスレーションを、直線状の核酸分子上で行うことができる。このように、分子は、ニックトランスレーション反応中に環状である必要がない。
ニックトランスレーション反応を行う方法は、当業者に既知である（Ｒｉｇｂｙ，Ｐ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９７７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１３，２３７）。種々の適したポリメラーゼを使用して、ニックトランスレーション反応を行うことができ、該ポリメラーゼとしては、例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼＩ、及びｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。使用する酵素に応じて、ニックトランスレーションが、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性又は５’−３’鎖置換によって起こることができる。ギャップが、環状の核酸分子に存在する場合、ギャップが、最初に、５’−３’ポリメラーゼ活性によってヌクレオチドで埋められ、それによって、ニックを生じる。いくつかの実施態様において、活性の低い変異体酵素を、ニックトランスレーション反応に使用する。変異体酵素は、例えば、伸長の低い割合、低い５’−３’エキソヌクレアーゼ活性、低い５’−３’ポリメラーゼ活性、低い５’−３’鎖置換活性、又はそれらの組み合わせを有することができる。いくつかの実施態様において、変異体酵素は、例えば、温度又はｐＨなどの反応条件に対し感受性である。
当業者に明らかであるように、反応条件を変化させて、ニックトランスレーション生成物の長さを制御することができる。例えば、ニックトランスレーション反応の生成物の長さ、すなわち、ニックを移動させる距離は、反応時間、反応温度、使用するポリメラーゼ、ｐＨ、存在するイオン、塩の条件等の反応条件に依存し得る。上述したように、変異体のポリメラーゼを使用でき、該変異体のポリメラーゼとしては、温度感受性ポリメラーゼが含まれる。それ故に、前記方法によって、生成される配列タグの長さを制御することが可能となる。いくつかの実施態様において、ニックトランスレーションを、切断ステップの前に停止させる。当業者に明らかであるように、ニックトランスレーションを、温度を上昇させる、温度を低下させる、ｐＨを変化させる、存在するイオンを変化させる、塩の条件を変化させる、キレート剤を添加する等によって停止させるか、又は遅くすることができる。
いくつかの実施態様において、ニックトランスレーション反応を、５分間、０℃で大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ１を用いて行う。いくつかの実施態様において、ニックトランスレーション反応を、約１〜約２０分間進行させる。いくつかの実施態様において、ニックトランスレーション反応を、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０分間、反応を進行させた後、加熱することによって終結させる。いくつかの実施態様において、ニックトランスレーション反応を、約０℃〜約４０℃の温度で行う。いくつかの実施態様において、ニックトランスレーション反応を、約０℃、４℃、３０℃、室温又は３７℃で行う。
いくつかの実施態様において、ニックトランスレーション反応を、環状化した核酸周辺の望ましい長さの間で継続させることができ、次に、反応を終結させることができる。終結は、例えば、加熱することによるもの又は適切な停止溶液もしくは緩衝液の添加によるものを含めたいずれの多くの適した手段によって行うことができる。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのニックを、少なくとも１塩基、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、８００、１０００、１５００、及び２０００又はそれより多い塩基について翻訳することができる。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのニックを、１０〜２０００塩基の間で翻訳することができる。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのニックを１０〜５００塩基の間で翻訳することができる。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのニックを１０〜２００塩基の間で翻訳することができる。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのニックを１０〜１００塩基の間で翻訳することができる。いくつかの実施態様において、少なくとも１つのニックを２０〜５０塩基の間で翻訳することができる。いくつかの実施態様において、いずれの上記範囲の下の方の境界が２８塩基である。いくつかの実施態様において、いずれの上記範囲の上の方の境界が２０００塩基である。他の実施態様において、ニックトランスレーション反応を、２つの対向するニックが１つの点で出会い、環状の核酸分子において中断を形成するまで継続することができる。
いくつかの実施態様において、ニック及び／又はギャップの一部を含むポリヌクレオチドの末端を、単に移動させるか又は伸張させ、ニックトランスレーション酵素によって翻訳する必要がない。いくつかの実施態様において、アダプターの３’末端を、移動させるか、かつ／又は該末端から伸張させる（例えば、図１６及び１７に示すように）。いくつかの実施態様において、１又は複数のアダプターを除去し、次に、残存するアダプターの１つから伸長を生じさせる（例えば、図２０）。
いくつかの実施態様において、ニック及び／又はギャップの入った環状化した核酸を、エキソヌクレアーゼ消化（５’−３’エキソヌクレアーゼ消化など）に曝すことができる（図１６）。このことによって、いくつかの又はすべての関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドが一本鎖となる（それに加えて、任意選択的に、１又は複数のアダプターの鎖を除去する）。この後、生じた産物を、残存する３’末端又はニックの側から伸張させることができる（例えばＤＮＡポリメラーゼによって、図１７に示すように）。効果的には、このことによって、たとえ以前にニックを含んでいた５’末端を更に離れたところへ移動させるか（図１７）、又は実際に除去した（図２０）としても、ニックの３’末端を伸張させるか又は移動させることが可能となる。いくつかの実施態様において、このプロセスは、非常に大きなギャップ構造を伴うと考えることができる。また、このプロセスは、ニックの３’末端又は一部を単に伸長させるか又は移動させると説明することもできる、いくつかの実施態様において、ニックの５’側を含む鎖の一部を、伸長前に消化する。いくつかの実施態様において、消化を、ニックの５’側を含む鎖の一部にて開始する。いくつかの実施態様において、５’末端を含む鎖を、Ｔ７エキソヌクレアーゼ又はラムダ・エキソヌクレアーゼなどの５’−３’エキソヌクレアーゼによって消化する。いくつかの実施態様において、エキソヌクレアーゼを必要としない。いくつかの実施態様において、例えば、ヘリカーゼを使用して、ニック及び／又はギャップにてＤＮＡを巻き戻すことができる。いくつかの実施態様において、ヘリカーゼの巻き戻し及びポリメラーゼの３’の伸長を、同じ反応チューブ内で、同時に起こすことができる。５’末端を置換できる他の適切な酵素又はプロセスも使用できる。
「ニックトランスレーション」に関連する本明細書に記載した態様のいずれも、必要に応じて、上述した伸長プロセス（例えば、移動させる塩基の数等）に適用できる。
（ニックの切断及び一本鎖の切断）
上述したように、ニックの関心対象のポリヌクレオチド内への転位によって、関心対象のポリヌクレオチド内の位置での切断が可能になり、それ故に、アダプターとニックとの間のポリヌクレオチド配列の塩基配列の操作が可能になる。いくつかの実施態様において、ニックトランスレーション反応を、切断前に終結させることができる。図５に示すように、ニックトランスレーション反応を終結させた後の環状の核酸分子におけるニックの反対側のポリヌクレオチド鎖の切断によって、２つのタグを含む対をなすタグのクローンを、各関心対象のポリヌクレオチドの末端から「放出する」ことができる。いくつかの実施態様において、放出された対をなすタグを含有する溶液は、対をなすタグ、及び対をなすタグの一部である２つのタグ配列を引いた関心対象のポリヌクレオチドの部分である残存する関心対象のポリヌクレオチドの部分を含むことができる。
いくつかの実施態様において、対をなすタグのクローンは、関心対象のポリヌクレオチドの向かい合う末端からのタグ（第１の及び第２のタグ）によって挟まれた少なくとも１つのアダプターを含む。図５に示す対をなすタグは、両側でアダプター１によって挟まれたアダプター２を含む。図５中の対をなすタグの末端領域は、関心対象のポリヌクレオチドの向かい合う末端からの配列タグを含む。ニックの反対側の鎖の切断は、種々の適したヌクレアーゼによって行うことができ、該ヌクレアーゼとしては、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＰ１、及びヌクレアーゼＢＡＬ−３１が挙げられるが、これらに制限されない。いくつかの実施態様において、ニックの反対側のポリヌクレオチド鎖を切断できる。
鎖置換酵素を使用して、ニックを関心対象のポリヌクレオチドに移動させる場合、置換した鎖も、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＰ１又はヌクレアーゼＢＡＬ−３１によって消化できる。
いくつかの実施態様において、環状化した核酸分子を、他のニックに遭遇するまで核酸分子の周囲にニックトランスレーションを生じさせることによって切断し、それによって、自己切断した分子をもたらす。そのようなものとして、いくつかの実施態様において、全体の関心対象のポリヌクレオチドが、約半分が第１のタグであり残りの半分が第２のタグである対をなすタグ上にあってもよい。当業者に明らかであるように、そのような対をなすタグは、関心対象のポリヌクレオチドの最初のサイズに応じて、比較的大きいものであってもよい。それ故に、いくつかの実施態様において、ニックトランスレーションステップにて放出された対をなすタグを生じさせるのが望ましい場合、適切なサイズにした関心対象のポリヌクレオチドから始めることができる。例えば、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、又は１００塩基未満の長さである関心対象のポリヌクレオチドから始めることができ、それによって、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、又は５０塩基未満の長さであるタグを生じさせることができる。
本明細書に記載されているように、いくつかの実施態様において、単一のホスホジエステル結合がニックにおいて欠損するよりもむしろ、ギャップが存在する。いくつかの実施態様において、このことによって、放出された対をなすタグを作製するより有効な処理及び切断が可能となる。いくつかの実施態様において、ギャップを、鎖の末端に効果的に伸長させ、それ故に、全体の関心対象のポリヌクレオチドが一本鎖である。そのような実施態様において、末端が一本鎖であることから、エキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼを使用して、対をなすタグを放出することができる。
いくつかの実施態様において、関心対象のポリヌクレオチドを切断して、放出された対をなすタグを形成することは、別個の切断する酵素を必要としない。例えば、図１９〜２１中の実施態様に示すように、いくつかの実施態様において、５’−３’エキソヌクレアーゼが、環状の分子を線状にするまで、環状化した分子を消化できるようにすることができる。いくつかの実施態様において、一本鎖の関心対象のポリヌクレオチドを、依然として、一本鎖に特異的なエキソヌクレアーゼによって除去することができる（例えば、図２１に示すように）。
（対をなすタグの更なる処理）
いくつかの実施態様において、対をなすタグのクローンを、本技術分野において既知である種々の方法によって精製して、不必要な分子を除去することができる。いくつかの実施態様において、対をなすタグのクローン中のアダプターを、結合部分に連結させることができる。結合部分は、例えば、ビオチンなどの、アダプターに結合させることができるいずれの結合部分であってもよい。結合部分を、例えば、対をなすタグのクローンを固体の支持体に付着させるために使用することができる。固体の支持体は、例えば、アレイ又はマイクロアレイであるが、これらに制限されない。いくつかの実施態様において、固体の支持体は、マイクロアレイ上のビーズである。結合部分を組み込む核酸分子を、例えば、ストレプトアビジンといった、結合部分に特異的に結合する精製する部分の使用などの、本技術分野において既知である多くの方法を用いるアフィニティー捕捉によって、精製することができる。アフィニティー捕捉方法は、典型的には、固体表面、磁性ビーズ、又は半固体ビーズ又は樹脂などの基材に付着させた捕捉試薬の使用を伴う。
いくつかの実施態様において、１又は複数のプライマーアダプターを、対をなすタグのクローンの１又は複数の末端に付着させることができる。図６において、プライマーアダプターＰ１及びＰ２が、対をなすタグのクローンの末端に付着している。プライマーアダプターを種々の目的のために使用することができる。例えば、対をなすタグを、プライマーアダプターを用いて増幅することができる。いくつかの実施態様において、増幅は、例えば、エマルジョン・ポリメラーゼ連鎖反応（エマルジョンＰＣＲ）、ブリッジ・ポリメラーゼ連鎖反応（ブリッジＰＣＲ）、又はそれらの組み合わせなどのクローナルな増幅であってもよい。いくつかの実施態様において、プライマーアダプターを、図６に示すように、対をなすタグのクローンの少なくともの一部を配列決定するために使用することができる。
いくつかの実施態様において、後の又は追加のニックトランスレーション反応を、対をなすタグのクローン上で行うことができる。例えば、プライマーアダプターがリン酸化されていない場合、追加のニックトランスレーションを、対をなすタグのクローンの末端にプライマーアダプターを付着させて、例えば、次のＰＣＲ増幅を容易にした後に行うことができる。
当業者に明らかであるように、関心対象のポリヌクレオチドからの対をなすタグのクローンの生産は、多くの用途を有する。例えば、関心対象のポリヌクレオチドの迅速な特徴付けを可能にする。いくつかの実施態様において、核酸配列を特徴付けることは、核酸配列から生産された対をなすタグを配列決定することを含む。配列決定方法は、本技術分野において標準的なものであり、例えば、マクサム及びギルバート技術又はサンガー方法を用いる従来の配列決定、又は例えばチップ上の既知のオリゴヌクレオチドのアレイ又はマイクロアレイへのハイブリダイゼーションによるものがある。別のアプローチは、プライマー−関心対象のポリヌクレオチド複合体を、例えば、ポリマー、磁性ビーズ、又は固体表面などの基材に固定化し、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼを用いて、添加生成物を特徴付けてＤＮＡ配列を決定することができるような標識した基質の存在下で、伸張させる合成方法によって配列決定することを含む。いくつかの実施態様において、対をなすタグを製造するための種々の実施態様は、関心対象のポリヌクレオチド又はその一部を、Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｏｌｉｇｏ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ （ＳＯＬｉＤ（商標））配列決定又は他の大規模平行配列決定技術のために調製するのに有益であり得る。
（更なる実施態様）
対をなすタグのライブラリーを調製する方法及びライブラリー自体を検討する。いくつかの実施態様において、前記方法は、核酸配列を断片化して、５’末端及び３’末端を有する複数のポリヌクレオチド断片を製造することを含む。１又は複数のアダプターを、各ポリヌクレオチド断片の末端に連結して、ニック又はギャップがアダプターとポリヌクレオチド断片との間に導入されている複数の環状の核酸分子を製造することができる。いくつかの実施態様において、ニック又はギャップが、ポリヌクレオチド断片の各末端とアダプターとの間に存在する。対をなすタグのライブラリーのために環状の核酸分子を調製するに当たって、上述したいずれの方法も使用できる。ニックトランスレーション反応を、環状の核酸分子上で行って、対応するポリヌクレオチド断片内に存在する少なくとも１つのニックをそれぞれ有する複数の環状の核酸分子を製造することができる。生じた環状の核酸分子を、ニックの反対側の地点で切断して、対をなすタグのクローンを放出し、それによって、対をなすタグのライブラリーを製造することができる。
いくつかの実施態様において、ライブラリーは、内部アダプターを使用する。
（キット）
いくつかの実施態様において、対をなすタグを作製するためのキットが提供される。キットは、関心対象のポリヌクレオチドをアダプターにライゲーションして、関心対象のポリヌクレオチドの第１の末端とアダプターとの間の第１のニック又はギャップと、関心対象のポリヌクレオチドの第２の末端とアダプターとの間の第２のニック又はギャップとを有する環状の核酸分子を形成するための試薬と、ニックトランスレーション反応を行う試薬を含むことができる。いくつかの実施態様において、増幅試薬は含まれない。さらに、説明書及びゲノムアセンブリの案内書のセットを含むことができる。そのような材料は、例えば、印刷された形態又はデジタルの形態であってもよい。いくつかの実施態様において、環状化した核酸分子に関連したニックを含めるように、関心対象のポリヌクレオチドの５’又は３’末端又はアダプターを調節する酵素又は成分が含まれる。
いくつかの実施態様において、キットは、連結ポリヌクレオチド及び該ポリヌクレオチドにライゲーションされている２つのアダプターを含むニックの入った連結ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、キットは、これらの３つの部分を含むが、これらの部分は、共にライゲーションされていない。いくつかの実施態様において、キットは、図２２〜２８に示すような、ポリヌクレオチドの迅速な操作を可能にする、ビオチン／ストレプトアビジン部分などの結合部分（又はいずれの他の連結する組み合わせ）を含む。いくつかの実施態様において、キットは、ＳＯＬｉＤ（商標）ベースのプロセスのためのプライマーを含む。いくつかの実施態様において、図２２〜２８に示すように、ＳＯＬｉＤ（商標）プライマーは、Ｐ１及び／又はＰ２における鎖の１つの少なくとも一部に相補的である。いくつかの実施態様において、キットは、１又は複数の内部アダプターを含む。いくつかの実施態様において、キットは、ライゲーション、ニックトランスレーション、３’末端の伸長、粘着末端の付加、一本鎖切断酵素（エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼを含む）、ＰＣＲ増幅のための１又は複数の酵素、エマルジョンＰＣＲのための成分、及びＳＯＬｉＤ（商標）配列決定のための成分を含む。いくつかの実施態様において、キットは、いずれの１又は複数の本明細書に記載されている酵素及び／又はポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施態様において、本明細書に開示される方法によって製造された対をなすタグのクローンの配列決定の結果を比較するコンピュータープログラムが含まれる（又は別個に提供できる）。いくつかの実施態様において、プログラムは、対をなすタグのライブラリー由来の対をなすタグのクローンからの配列情報を同定し、構築する。このように、単一の完全な、非常に正確な配列をプログラムによって提供できる。いくつかの実施態様において、プログラムは、本明細書に記載されている方法のいずれも実施する。
本技術の実施態様は、以下の実施例に照らして更に理解されるものであるが、これらの実施例は、本技術の範囲を制限するものとして何ら解釈すべきではない。
（実施例１）
本実施例は、対をなすタグのクローンを製造する１つの方法を例示する。
プラスミドＤＮＡ ｐＵＣ１９を制限酵素ＳｍａＩで線状にし、関心対象のポリヌクレオチドのモデルＤＮＡとして使用した。アダプター１を、関心対象のＤＮＡポリヌクレオチドの末端にライゲーションした。生じたコンストラクトを、アダプター２とライゲーションすることによって環状化した。アダプター２を、ビオチンで標識して、下流の精製を容易にした。環状ＤＮＡの半分を、５分間０℃で大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーション反応に使用した。環状ＤＮＡの残りの半分を、ニックトランスレーションをしていないコントロールとして保存した。ニックトランスレーションしたＤＮＡ及びニックトランスレーションしなかったコントロールを、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて、３７℃で１５分間消化した。Ｓ１で消化されたＤＮＡを、末端修復し、次いで、ストレプトアビジン磁性ビーズに結合させることによって精製し、Ｐ１及びＰ２プライマーアダプターとライゲーションした。生じたＤＮＡをＰ１及びＰ２プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
ＰＣＲ産物を、アガロースゲルで分析した。予想通り、ニックトランスレーション反応の生成物のＰＣＲ産物は、コントロールの反応のＰＣＲ産物より長かった。さらに、ニックトランスレーション反応のＰＣＲ産物は、約１００ｂｐから２００ｂｐを超えるところまでの産物の長さの範囲を示すスメアを示した。
（実施例２）
本実施例は、ｐＵＣ１９を用いる対をなすタグのクローンの作製方法を例示する。
ｐＵＣ１９ＤＮＡを、ＳｍａＩで消化し、線状にしたＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ（商標） ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔで精製した。
アダプター１を、ＮＥＢ Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、線状にしたｐＵＣ１９ＤＮＡにライゲーションした。続いて、反応物を、ＱＩＡＧＥＮ（商標） ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔで精製した。ライゲーション産物を、ＱＩＡＧＥＮ（商標） ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてアガロースゲルで精製した。
上記のライゲーション産物を、ＮＥＢ Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いるアダプター２とのライゲーションによって環状化した。次に、反応物を、ＱＩＡＧＥＮ（商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔで精製した。
上記反応産物を、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ ｓａｆｅ ＤＮａｓｅで消化して、いずれの直線状のＤＮＡも除去し、次に、ＱＩＡＧＥＮ（商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔで精製した。
上記のものからの環状のＤＮＡを、５、１０、又は１５分間０℃でＥ ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて、ニックトランスレーションした。反応を、ＱＩＡＧＥＮ（商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔ由来のＥＲＣ緩衝液を添加することによって、停止させた。次に、反応物を、ＱＩＡＧＥＮ（商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔで精製した。
上記のものからのニックトランスレーションしたＤＮＡを、３７℃で１５分間、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓ１ヌクレアーゼで消化して、対をなすタグＤＮＡを放出した。次に、反応物を、ＱＩＡＧＥＮ（商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔで精製した。
上記ステップからのＤＮＡを、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ ＥｎｄＩｔ ｋｉｔを用いて末端修復した。
対をなすタグＤＮＡを、ストレプトアビジンビーズへの結合によって精製した。
Ｐ１及びＰ２プライマーアダプターを、対をなすタグＤＮＡにライゲーションした。
ｐＵＣ１９の対をなすタグのクローンのＰＣＲ増幅を、Ｐ１プライマー及びＰ２プライマーを用いて行って、ｐＵＣ１９の対をなすタグを増幅した。
０℃で５、１０及び１５分間のニックトランスレーションによって生成した対をなすタグのＰＣＲ産物を、アガロースゲルで別個のレーンで分析した。それぞれ、約１００ｂｐから２００ｂｐを超えるまでの産物長さの範囲を示すスメアを示した。０℃、１５分間で生成した対をなすタグのＰＣＲ産物は、０℃、１０分間で生成した対をなすタグのＰＣＲ産物より平均して長く、０℃、１０分間で生成した対をなすタグのＰＣＲ産物は、０℃、５分間で生成した対をなすタグのＰＣＲ産物より平均して長かった。
（実施例３）
本実施例は、ＤＨ１０ＢゲノムＤＮＡを用いる対をなすタグのクローンのライブラリーの作製方法を例示する。本実施例において、３０μｇのＤＨ１０ＢゲノムＤＮＡを、ハイドロシヤー（ｈｙｄｒｏｓｈｅａｒ）して、関心対象のポリヌクレオチドを製造した。ハイドロシヤーによって製造した関心対象のポリヌクレオチドの末端を、ＥＮＤＩＴ（商標）キットを用いて修復した。次に、関心対象のポリヌクレオチドを、ＱＩＡＧＥＮ（商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔを用いて精製した。
アダプター１を、上記のステップからの関心対象のポリヌクレオチドの末端に、ＮＥＢ Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてライゲーションした。
反応物を、ＱＩＡＧＥＮ（商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔを用いて精製した。アダプターで修飾された２ｋｂ〜３ｋｂの長さの関心対象のポリヌクレオチドを、アガロースゲル上のＤＮＡを用いて選別した。ゲルで選別したアダプターで修飾された関心対象のポリヌクレオチドを、ＱＩＡＧＥＮ（商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて精製した。
ゲルで選別したアダプターで修飾された関心対象のポリヌクレオチドを、アダプター２とのライゲーションによって環状化した。アダプター２は、ビオチン結合部分を含有していた。
次に、反応物を、ＱＩＡＧＥＮ（商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔを用いて精製した。
上記反応産物を、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ ｓａｆｅ ＤＮａｓｅで消化して、いずれの直線状のＤＮＡも除去し、次に、ＱＩＡＧＥＮ（商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔで精製した。
上記のステップからの環状のＤＮＡを、０℃で１５分間、Ｅ ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて、ニックの入った翻訳をした。反応を、ＱＩＡＧＥＮ（商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｋｉｔ由来のＥＲＣ緩衝液を添加することによって停止させた。反応物を、ＱＩＡＧＥＮ（商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔを用いて精製した。
対をなすタグのクローンを、３７℃で１５分間のＳ１ヌクレアーゼ消化によって放出した。反応物を、ＱＩＡＧＥＮ（商標）ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔを用いて精製した。
上記のステップからのＤＮＡを、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ ＥｎｄＩｔ ｋｉｔで末端修復した。生じた対をなすタグのクローンを、ストレプトアビジンビーズに結合させることによって精製した。
Ｐ１及びＰ２プライマーアダプターを、対をなすタグのクローンにライゲーションした。
試験的なＰＣＲ増幅を、Ｐ１プライマー及びＰ２プライマーを用いて行って、適切なサイクル数を決定した。続いて、大規模のＰＣＲを行って、対をなすタグのクローンライブラリーを増幅した。最終の対をなすタグのクローンライブラリーを、アガロースゲル電気泳動を用いて選別した。
ＰＣＲ産物を、図１０に示すように、アガロースゲルで分析した。レーン１は、２５ｂｐのＤＮＡラダーを含有する。レーン２〜９は、２倍段階希釈の鋳型からのＰＣＲ産物を含有する。
（実施例４）
本実施例は、他の対をなすタグのクローンの作製方法を例示する。
本実施例において、平滑末端化した関心対象のポリヌクレオチドを、アルカリホスファターゼで処理して、５’リン酸残基を末端から除去することができる。次に、図１に示すように、ポリヌクレオチドを、ライゲーションによってアダプターを用いて環状化する。アダプターを、ビオチンで標識して、下流の精製を容易にすることができる。環状の核酸分子は、ポリヌクレオチド二本鎖の片方の鎖上の関心対象のポリヌクレオチドとアダプターとの間の第１のニックと、ポリヌクレオチド二本鎖の異なる鎖上の関心対象のポリヌクレオチドとアダプターとの間の第２のニックとを有する。図２に概略的に示すように、ニックトランスレーション反応を行う。例えば、約５分間約０℃で、例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて、ニックトランスレーション反応を行うことができる。ニックトランスレーション反応を、加熱することによって終結させる。ニックトランスレーションしたポリヌクレオチドを、例えば、３７℃で約１５分間、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて消化する。Ｓ１で消化されたＤＮＡを、ストレプトアビジン磁性ビーズに結合させることによって精製する。プライマーアダプターＰ１及びＰ２を、アダプターによって磁性ビーズに結合している対をなすタグのクローンの末端に付着させる。対をなすタグを、Ｐ１及びＰ２プライマーでクローナルに増幅する。増幅された対をなすタグのクローンを、後に、配列決定することができる。
（実施例５）
本実施例は、他の対をなすタグのクローンの作製方法を例示する。
本実施例において、図３に概略的に示すように、アダプター１を、関心対象のポリヌクレオチドの両末端にライゲーションする。アダプター１の５’末端は、５’リン酸残基を欠く。次に、図３に示すように、生じたコンストラクトを、ライゲーションによってアダプター２を用いて環状化する。アダプター２をビオチンで標識して、下流の精製を容易にすることができる。環状の核酸分子は、ポリヌクレオチド二本鎖の片方の鎖上のアダプター１とアダプター２との間の第１のニックと、ポリヌクレオチド二本鎖の異なる鎖上のアダプター１とアダプター２との間の第２のニックとを有する。図４に概略的に示すように、ニックトランスレーション反応を行う。例えば、約５分間約０℃で、例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて、ニックトランスレーション反応を行うことができる。ニックトランスレーション反応を、加熱することによって終結させる。ニックトランスレーションしたポリヌクレオチドを、例えば、３７℃で約１５分間、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて消化する。Ｓ１で消化されたＤＮＡを、ストレプトアビジン磁性ビーズに結合させることによって精製する。図６に示すように、プライマーアダプターＰ１及びＰ２を、アダプターによって磁性ビーズに結合している対をなすタグのクローンの末端に付着させる。対をなすタグを、Ｐ１及びＰ２プライマーでクローナルに増幅する。増幅された対をなすタグのクローンを、後に、配列決定することができる。
（実施例６）
本実施例は、他の対をなすタグのクローンの作製方法を例示する。
本実施例において、アダプター１を、図３に概略的に示すように、関心対象のポリヌクレオチドの両末端にライゲーションする。アダプター１の５’末端は、５’リン酸残基を有してもよいし、有さなくてもよい。次に、図７に示すように、生じたコンストラクトを、アダプター２を用いてアニーリングによって環状化する。アダプター２をビオチンで標識して、下流の精製を容易にすることができる。環状の核酸分子は、ポリヌクレオチドの二本鎖の片方の鎖上のアダプター１とアダプター２との間の第１のギャップと、ポリヌクレオチド二本鎖の異なる鎖上のアダプター１とアダプター２との間の第２のギャップとを有する。図４に概略的に示すように、ニックトランスレーション反応を行う。例えば、約５分間約０℃で、例えば、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて、ニックトランスレーション反応を行うことができる。ニックトランスレーション反応を、加熱することによって終結させる。ニックトランスレーションしたポリヌクレオチドを、例えば、３７℃で約１５分間、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて消化する。Ｓ１で消化されたＤＮＡを、ストレプトアビジン磁性ビーズに結合させることによって精製する。図６に示すように、プライマーアダプターＰ１及びＰ２を、アダプターによって磁性ビーズに結合している対をなすタグのクローンの末端に付着させる。対をなすタグを、Ｐ１及びＰ２プライマーでクローナルに増幅する。増幅された対をなすタグのクローンを、後に、配列決定することができる。
（実施例７）
本実施例は、対をなすタグのライブラリーを作製する他の方法を例示する。
本実施例において、核酸配列を断片化して、５’末端及び３’末端を有する複数のポリヌクレオチド断片を製造する。ポリヌクレオチド断片をサイズ選別方法に供して、約２ｋｂ〜約３ｋｂの断片を選別する。ポリヌクレオチド断片の末端を平滑末端化し、次に、アルカリホスファターゼで処理して、５’リン酸残基を末端から除去する。アダプターを各ポリヌクレオチド断片の末端に連結して、ニックがアダプターとポリヌクレオチド断片との間に導入されている複数の環状の核酸分子を製造する。ニックトランスレーション反応を環状の核酸分子上で行って、対応するポリヌクレオチド断片内に存在する少なくとも１つのニックをそれぞれ有する複数の環状の核酸分子を製造する。生じた環状の核酸分子をニックの反対側の地点で切断して、対をなすタグのクローンを放出し、それによって、対をなすタグのライブラリーを製造する。対をなすタグのライブラリーの対をなすタグのクローンを、マイクロアレイなどの固体の支持体に付着させることができる。
（実施例８）
本実施例は、対をなすタグのライブラリーを製造する他の方法を例示する。
本実施例において、核酸配列を剪断して、約２ｋｂ〜約３ｋｂの長さの複数の関心対象のポリヌクレオチドを製造する。関心対象のポリヌクレオチドの末端を平滑末端化する。アダプター１を、関心対象のポリヌクレオチドの各末端に付着させ、それによって、アダプターで修飾された複数の関心対象のポリヌクレオチドを形成する。アダプターで修飾された関心対象のポリヌクレオチドの両末端を、アダプター２にライゲーションして、ニックがアダプター２とアダプター１との間に導入されている複数の環状の核酸分子を製造する。ニックトランスレーション反応を環状の核酸分子上で行って、対応するポリヌクレオチド断片内に存在する少なくとも１つのニックをそれぞれ有する複数の環状の核酸分子を製造する。生じた環状の核酸分子を、ニックの反対側の地点で切断して、対をなすタグのクローンを放出し、それによって、対をなすタグのライブラリーを製造する。対をなすタグのライブラリーの対をなすタグのクローンを、マイクロアレイなどの固体の支持体に付着させることができる。
（実施例９）
本実施例は、対をなすタグのライブラリーを配列決定する他の方法を例示する。
本実施例において、核酸配列を断片化して、５’末端及び３’末端を有する複数の関心対象のポリヌクレオチドを製造する。ポリヌクレオチド断片を、サイズ選別方法に供して、約２ｋｂ〜約３ｋｂの関心対象のポリヌクレオチドを選別する。関心対象のポリヌクレオチドの末端を平滑末端化し、次に、アルカリホスファターゼで処理して、５’リン酸残基を末端から除去する。アダプターを、各関心対象のポリヌクレオチドの末端に連結して、ニックがアダプターと関心対象のポリヌクレオチドとの間に導入されている複数の環状の核酸分子を製造する。ニックトランスレーション反応を環状の核酸分子上で行って、対応するポリヌクレオチド断片内に存在する少なくとも１つのニックをそれぞれ有する複数の環状の核酸分子を製造する。生じた環状の核酸分子を、ニックの反対側の地点で切断して、対をなすタグのクローンを放出し、それによって、対をなすタグのライブラリーを製造する。対をなすタグのライブラリーの対をなすタグのクローンを、マイクロアレイなどの固体の支持体に付着させる。
対をなすタグのライブラリーを配列決定するために、プライマーアダプターを、固体の支持体に付着させた対をなすタグのクローンの末端に付着させる。対をなすタグのクローンを、例えば、エマルジョンＰＣＲによってクローナルに増幅し、後に、例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）配列決定によって配列決定する。
（実施例１０）
本実施例は、対をなすタグのクローンを作製する他の方法を例示する。
図８に示すように、ＥｃｏＰ１５Ｉ認識部位を有するＤＮＡアダプター１を、関心対象のポリヌクレオチドの両末端にライゲーションして、アダプターで修飾された関心対象のポリヌクレオチドを形成することができる。次に、アダプターで修飾された関心対象のポリヌクレオチドを環状化することができる（図８）。図９に示すように、ニッキング制限酵素を使用して、ＥｃｏＰ１５Ｉ部位の下流で片方の鎖にニックを作製できる。ニックトランスレーション反応を行うことができ、ニックを、５’から３’の方向で関心対象のポリヌクレオチドに転位させることができる（図９）。
（実施例１１）
本実施例は、ニックの入った環状の核酸を作製する１つの方法を例示する。
本実施例において、トポイソメラーゼＩ結合部位を有するアダプターを使用して、環状の核酸の調製を容易にする。４つのオリゴヌクレオチド、Ｔｏｐｏ−ＩＡ−Ａ−１、Ｔｏｐｏ−ＩＡ−Ｂ−１、Ｔｏｐｏ−ＩＡ−Ａ−２及びＴｏｐｏ−ＩＡ−Ｂ−２をアニーリングすることによって、向かい合う鎖上にニックを有するＴｏｐｏ結合アダプターを形成する（図１０）。オリゴヌクレオチドＴｏｐｏ−ＩＡ−Ｂ−１及びＴｏｐｏ−ＩＡ−Ａ−２は、それぞれ、３’末端にＴｏｐｏ結合部位を有し、５’リン酸を欠く。図１０に示すように、Ｔｏｐｏ−ＩＡ−Ａ−１を、結合部分であるビオチンに結合させる。生じたＴｏｐｏ結合アダプターは、両方の鎖の３’末端にＴｏｐｏ結合部位を、向かい合う鎖上にニックを有し、ビオチンに結合している（図１０）。
図１１に示すように、トポイソメラーゼＩを、Ｔｏｐｏ結合アダプターに添加して、トポイソメラーゼＩ−アダプター複合体を生成する。トポイソメラーゼＩはアダプターに共有結合し、切断された鎖の３’リン酸とトポイソメラーゼＩのＴｙｒ２７４残基との間にホスホチロシル結合を形成し、トポイソメラーゼＩ−アダプター複合体を形成する（図１１）。
トポイソメラーゼＩ−アダプター複合体を、脱リン酸化した関心対象のポリヌクレオチドと結合させる（図１２）。図１２に示すように、脱リン酸化した関心対象のポリヌクレオチドの５’ヒドロキシル基が、トポイソメラーゼＩ−アダプター複合体のホスホチロシル結合を攻撃する。アダプターと関心対象のポリヌクレオチドとを含む環状の核酸分子が、図１３に示すように、形成される。
（実施例１２）
本実施例は、対をなすタグを作製する他の方法を例示する。
本実施例において、関心対象のポリヌクレオチドを、関心対象のポリヌクレオチドを１又は複数のアダプターにライゲーションすることによって環状化する。生じたニックの入った環状のＤＮＡ分子をニックトランスレーションする。ニックトランスレーション反応は、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて行うことができる。環状の核酸分子は、関心対象のポリヌクレオチド内に２つのニックを有する。環状のＤＮＡ上の一本鎖ギャップを、図１５に示すように形成する。ギャップを、ニックの入った環状のＤＮＡ分子をＴ７エキソヌクレアーゼで消化することによって形成する。生じたギャップを有する環状のＤＮＡ分子をＳ１ヌクレアーゼで消化して、対をなすＤＮＡタグを放出する。
（実施例１３）
本実施例は、ニックトランスレーションなしで対をなすタグを製造する方法を例示する。
本実施例において、関心対象のポリヌクレオチドを、最初に、アダプターを関心対象のポリヌクレオチドの両末端にライゲーションすることによって環状化する。生じた環状の核酸分子は、ポリヌクレオチド二本鎖の片方の鎖上の関心対象のポリヌクレオチドとアダプターとの間の第１のニックと、ポリヌクレオチド二本鎖の異なる鎖上の関心対象のポリヌクレオチドとアダプターとの間の第２のニックとを有する。ニックの入った環状ＤＮＡ分子を５’−３’エキソヌクレアーゼで消化することによって、関心対象のポリヌクレオチドの一本鎖領域を形成する。次に、生じた分子において、その３’末端をＤＮＡポリメラーゼで伸張させる。次に、生じた分子をＳ１ヌクレアーゼで消化して、対をなすＤＮＡタグを放出する。
（実施例１４）
本実施例は、ニックトランスレーションなしで対をなすタグを製造する方法を例示する。本実施例において、少なくとも１つのアダプターにライゲーションされている関心対象の二本鎖のポリヌクレオチドを含むニックの入った環状のＤＮＡ分子を、５’−３’エキソヌクレアーゼで消化する。この反応を、二本鎖の関心対象のポリヌクレオチドがすべて一本鎖になって完了するまで継続する。次に、図２０に示すように、生じたコンストラクトにおいて、その３’末端をＤＮＡポリメラーゼで伸張させる。次に、生じたコンストラクトを一本鎖に特異的なエキソヌクレアーゼで消化して、対をなすタグを放出する。
（実施例１５）
本実施例は、対をなすタグのライブラリーを構築するのに使用するベクターの調製を例示する。本実施例において、２ｋｂ〜３ｋｂの範囲の小さい環状のＤＮＡを、関心対象のポリヌクレオチドの集団のためのベクターとして選択する。ベクターを、その後の受容体−リガンドベースのアフィニティー精製のためにビオチンで修飾する。ベクターの自己ライゲーションを防ぐために、線状にしたベクター上で不適合の粘着末端を生成する方法によって、ベクターを線状にする。続いて、図２３に示すように、２つの二本鎖アダプターを、線状にしたベクターにライゲーションする。両方のアダプターの上の鎖は、リン酸基をその５’末端にて含有しないのに対して、両方のアダプターの下の鎖は、リン酸基をその５’末端にて含有する。そのような構成の結果として、両方のアダプターの下の鎖のみ、直線状のベクターにライゲーションされ、直線状のベクターとアダプターとの間にニックがある。
（実施例１６）
本実施例は、対をなすタグのライブラリーの調製のワークフローを例示する。本実施例において、関心対象のポリヌクレオチドを、第１に、適切な末端構造を有するように修飾して、ニックの入った連結ポリヌクレオチドの修飾されたセットの末端に一致させる。次に、関心対象のポリヌクレオチドを、ニックの入った連結ポリヌクレオチドとインキュベートし、ライゲーション反応を行う。ライゲーション後、環状化したニックの入った連結ポリヌクレオチドは、関心対象のポリヌクレオチドの近くに位置した２つのニックを含有する。次に、ニックを、関心対象のポリヌクレオチドに、ニックトランスレーションによって伸張させる。ライゲーション反応後、ライゲーションしていないコンストラクトを、直線状のポリヌクレオチドを消化することによって取り除く。精製及びニックの翻訳後、次に、環状の集団をニックの位置で切断し、それによって、対をなすタグを放出する。
（実施例１７）
本実施例は、放出された対をなすタグで行うことができる更なる操作の１つのセットを例示する。実施例１６の放出された対をなすタグを、対をなすタグの２つの末端の間の内部アダプターをライゲーションすることによって再び環状化する。この後、ＰＣＲ増幅を、２つのアダプター末端における配列をハイブリダイズするプライマーを用いて行うことができる。ＰＣＲ増幅された産物は、最終の対をなすタグのライブラリーであり得る。
本技術を、これらの例示の実施態様にて説明したが、当業者であれば、過度に実験することなく、これらの例示の実施態様の多数のバリエーションおよび改変が可能であることが容易に理解できる。そのようなバリエーション及び改変のすべては、本教示の範囲内である。
開示された教示を、種々の用途、方法、キット、及び組成物を参照して説明したが、本明細書中の教示及び特許請求の範囲に記載の発明から逸脱することなく様々な変形及び改変をなすことができることは明らかである。上記の例は、開示された教示をより例示するために記載されたものであって、本明細書中の教示の範囲を制限することを意図したものではない。
本願において、単数形の使用は、特に指定がないかぎり、又は当業者が本開示に照らして理解できるように、単数形のみが機能的な実施態様でないかぎり、複数形を含むことができる。それ故に、例えば、「ａ」は、１以上を意味し、「一実施態様」は、記載が複数の実施態様に適用されることを意味することができる。さらに、本願において、「及び／又は」は、「及び」の包含の意味と、これとは別に、「又は」の除外の意味の両方がリストに適用されることを示す。それ故に、一覧は、一覧の項目のすべての可能な組み合わせを含み、他の項目を除外してそれぞれの項目も含むと読みとるべきである。この用語の追加は、「及び」又は「又は」の用語の単独の使用を特に意味することを示すものとして何ら意図されたものではない。そのような用語の意味は、特定の開示を読み取ることにより、当業者に明らかである。
（参照による組み込み）
特許、特許出願、文書、本などを含めた本明細書において引用したすべての参考文献及びそれらで引用された参考文献は、それらが前もってなされたものではない範囲で、参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。１又は複数の組み込まれた文献及び類似のものが、制限するものではないが、定義された用語、用語の使用、記載された技術等を含め本願と異なり、矛盾する場合には、本願を優先する。
（均等物）
上記の説明及び実施例は、本発明の特定の具体的な実施態様を詳述したものであり、発明者らによって考慮された最良の形態を説明するものである。しかしながら、どんなに上記にて詳述していたとしても、本発明は、多くの方法で実施でき、本発明は、特許請求の範囲及びそれらのいずれの均等物にしたがって解釈すべきである。
２０００ 小さい環状のＤＮＡ
２０１０ 連結ポリヌクレオチド
２０１１ 粘着末端
２０１２ ３’鎖末端
２０１３ ５’鎖末端
２０１４ ５’鎖末端
２０１５ 粘着末端
２０１６ ３’鎖末端
２０１７ 第１の連結鎖
２０１８ 第２の連結鎖
２０２０ アダプターＰ１
２０２１ ニック
２０２２ Ｐ１プライマーアダプターの５’末端
２０２５ Ｐ１プライマーアダプターの上の鎖
２０２６ Ｐ１プライマーアダプターの下の鎖
２０３０ アダプターＰ２
２０３１ ニック
２０３２ Ｐ２プライマーアダプターの５’末端
２０３５ 第３のアダプター鎖
２０３６ Ｐ２プライマーアダプターの下の鎖
２０３８ アダプターがハイブリダイズした連結ポリヌクレオチド
２０３９ ニックの入った連結ポリヌクレオチド
２０４０ 平滑末端
２０４１ 平滑末端
２０５０ 単一のチミンのオーバーハングの粘着末端
２０５１ 単一のチミンのオーバーハングの粘着末端
２０６０ 複数のチミン（又は他の塩基）のオーバーハング
２０６１ 複数のチミン（又は他の塩基）のオーバーハング
２０８５ 関心対象のポリヌクレオチドの適切な末端修飾
２０９０ 関心対象のポリヌクレオチド
２０９１ 関心対象のポリヌクレオチドのタグ
２０９２ 関心対象のポリヌクレオチドのタグ
２０９５ ライゲーション
２１００ 構造
２１０５ プロセス
２２０５ 一本鎖の切断
２２２１ ニックの位置
２２３１ ニックの位置
２３００ 放出された対をなすタグ
２３０５ プロセス
２３１０ アダプター
２３１１ 内部アダプター
２４００ 内部アダプターを含有する対をなすタグ
２４０５ ＰＣＲ増幅
２５００ ＰＣＲ産物

Claims (91)

  1. 関心対象のポリヌクレオチドの少なくとも一部を共に含む第１のタグ配列と第２のタグ配列とを含む対をなすタグを形成する方法であって、
    関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端及び第２の末端をアダプターにライゲーションし、それによって、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端とアダプターとの間の第１のニックと、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端とアダプターとの間の第２のニックとを含む環状の核酸分子であって、第１のニック及び第２のニックが環状の核酸分子の第２のニックとは異なる鎖上にある、環状の核酸分子を形成することと、
    少なくとも１つのニックを関心対象のポリヌクレオチドに翻訳するニックトランスレーション反応を行うことを含む、
    前記対をなすタグを形成する方法。
  2. ニックトランスレーション反応を特定の時間進行させることと、ニックトランスレーション反応を終結させることを更に含む、請求項１記載の方法。
  3. 関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端及び第２の末端が５’リン酸残基を欠く、請求項１記載の方法。
  4. 第１のニック及び第２のニックが互いを通り過ぎて翻訳される前に、ニックトランスレーション反応を終結させることを更に含む、請求項１記載の方法。
  5. 第１のニック及び第２のニックが１０塩基を超えて翻訳され、第１のニック及び第２のニックにおいて環状の核酸分子を切断するステップを更に含む、請求項１記載の方法。
  6. 第１のニック及び第２のニックが５００塩基未満翻訳される、請求項５記載の方法。
  7. 第１のニック及び第２のニックが２００塩基未満翻訳される、請求項６記載の方法。
  8. 第１のニック及び第２のニックが１００塩基未満翻訳される、請求項７記載の方法。
  9. 第１のニック及び第２のニックが約２０塩基〜約５０塩基翻訳される、請求項５記載の方法。
  10. 少なくとも１つのニックが５００塩基未満翻訳される、請求項１記載の方法。
  11. 少なくとも１つのニックが、２７塩基を超えて５００塩基未満翻訳される、請求項１０記載の方法。
  12. 少なくとも１つのニックが２００塩基未満翻訳される、請求項１１記載の方法。
  13. 少なくとも１つのニックが２８塩基〜約５０塩基翻訳される、請求項１記載の方法。
  14. 環状の核酸分子が、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端とアダプターとの間の第１のギャップを含む、請求項１記載の方法。
  15. 環状の核酸分子が、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端とアダプターとの間の第２のギャップを含む、請求項１４記載の方法。
  16. 環状の核酸配列が、ニックトランスレーション反応を行ってニックを生じさせる際にヌクレオチドで埋められるギャップを含む、請求項１４記載の方法。
  17. 関心対象のポリヌクレオチドが、５０〜２５００ヌクレオチドを含む、請求項１記載の方法。
  18. ライゲーションするステップの前に、関心対象のポリヌクレオチドをサイズ選別技術に供して、５０〜２５００ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドについて選別する、請求項１７記載の方法。
  19. アダプターが結合部分を含む、請求項１記載の方法。
  20. ニックトランスレーション反応を、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼＩ、及びｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、並びにそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される酵素を用いて行う、請求項１記載の方法。
  21. ニックトランスレーション反応を、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて行う、請求項１記載の方法。
  22. ニックトランスレーション反応が、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性によるヌクレオチドの除去を含む、請求項１記載の方法。
  23. ニックトランスレーション反応が、鎖の置換によって発生する、請求項１記載の方法。
  24. 第１の翻訳されたニックにおいて環状の核酸分子を切断し、それによって、アダプターによって分けられた第１のタグ配列及び第２のタグ配列であって、関心対象のポリヌクレオチドに由来する第１のタグ配列及び第２のタグ配列を含む直線状のポリヌクレオチドを形成することを更に含む、請求項１記載の方法。
  25. 環状の核酸分子を第２の翻訳されたニックにおいて切断することを更に含む、請求項２４記載の方法。
  26. 環状の核酸分子を、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＰ１、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される酵素によって切断する、請求項２４記載の方法。
  27. 直線状のポリヌクレオチドを増幅することを更に含む、請求項２４記載の方法。
  28. アダプターが、ビオチンを含む結合部分を含む、請求項１記載の方法。
  29. ストレプトアビジンを用いて、対をなすタグを精製するステップを更に含む、請求項２８記載の方法。
  30. ライゲーション前に、関心対象のポリヌクレオチドをアルカリホスファターゼで処理し、５’リン酸を、関心対象のポリヌクレオチドの第１の末端及び第２の末端の両方から除去することを更に含む、請求項１記載の方法。
  31. アルカリホスファターゼが、仔牛腸アルカリホスファターゼ、細菌アルカリホスファターゼ、エビアルカリホスファターゼ、及びそれらの何らかの組み合わせからなる群より選択される、請求項３０記載の方法。
  32. 環状の核酸分子が第２のアダプターを更に含み、第２のアダプターが第１のアダプターに隣接して位置づけられている、請求項１記載の方法。
  33. 第１のアダプターの一つの鎖及び第２のアダプターの一つの鎖が５’リン酸を欠く、請求項３２記載の方法。
  34. 各ステップを請求項１に記載されている順で行う、請求項１記載の方法。
  35. 関心対象のＤＮＡ断片から、放出された対をなすタグを形成する方法であって、
    第１のアダプターを関心対象のＤＮＡ断片の第１の末端にライゲーションし、かつ第２のアダプターを関心対象のＤＮＡ断片の第２の末端にライゲーションし、それによって、アダプター修飾断片を生じさせることと、
    第３のアダプターをアダプター修飾断片に付着させることによってアダプター修飾断片を環状化し、それによって、第１のニックが第３のアダプターと第１のアダプターとの間に存在し、第２のニックが第２のアダプターと第３のアダプターとの間に存在する、環状の核酸分子であって、ＤＮＡの第１の鎖及び第２の鎖を含み、第１のニック及び第２のニックが環状の核酸分子の同一の鎖上に存在しない、環状の核酸分子を形成することと、
    環状の核酸分子の各鎖上のニックを関心対象のＤＮＡ断片に翻訳する、ニックトランスレーション反応を行うことと、
    環状の核酸分子を翻訳されたニックの位置で切断し、それによって、放出された対をなすタグを形成することとを含む、
    前記放出された対をなすタグを形成する方法。
  36. ニックトランスレーション反応を特定の時間進行させることと、ニックトランスレーション反応を終結させることとを更に含む、請求項３５記載の方法。
  37. 翻訳されたニックにおける各位置でポリヌクレオチド鎖を切断する前に、ニックトランスレーション反応を終結させることを更に含む、請求項３６記載の方法。
  38. プライマーアダプターを、対をなすタグの末端に付着させることを更に含む、請求項３５記載の方法。
  39. 対をなすタグを、プライマーアダプターについてのプライマーで増幅することを更に含む、請求項３８記載の方法。
  40. 増幅がクローナルな増幅である、請求項３９記載の方法。
  41. クローナルな増幅が、エマルジョン・ポリメラーゼ連鎖反応（エマルジョンＰＣＲ）を含む、請求項４０記載の方法。
  42. クローナルな増幅が、ブリッジ・ポリメラーゼ連鎖反応（ブリッジＰＣＲ）を含む、請求項４０記載の方法。
  43. 第３のアダプターが結合部分を含み、結合部分を固体の支持体に結合させることを更に含む、請求項３５記載の方法。
  44. 固体の支持体がアレイである、請求項４２記載の方法。
  45. 対をなすタグの一部を配列決定することを更に含む、請求項３５記載の方法。
  46. ２又はそれ以上の放出された対をなすタグを含む放出された対をなすタグのライブラリーであって、
    第１のアダプターを関心対象のポリヌクレオチドの第１の末端にライゲーションし、第２のアダプターを関心対象のポリヌクレオチドの第２の末端にライゲーションし、それによって、アダプターで修飾された関心対象のポリヌクレオチドを生じさせることと、
    第３のアダプターをアダプターで修飾された関心対象のポリヌクレオチドに付着させることによって、アダプターで修飾された関心対象のポリヌクレオチドを環状化し、それによって、第１のニックが第３のアダプターと第１のアダプターとの間に存在し、第２のニックが第２のアダプターと第３のアダプターとの間に存在する、環状の核酸分子であって、第１の鎖と第２の鎖とを含み、第１のニック及び第２のニックが環状の核酸分子の同一の鎖上に存在しない、環状の核酸分子を形成することと、
    環状の核酸分子の鎖上のニックを関心対象のポリヌクレオチドに翻訳するニックトランスレーション反応を行うことと、
    環状の核酸分子を翻訳されたニックの位置で切断し、それによって、放出された対をなすタグを形成することと
    を含む方法によって、対をなすタグのそれぞれが製造される、前記放出された対をなすタグのライブラリー。
  47. 関心対象のポリヌクレオチドが、プラスミド、ウイルス、原核細胞、古細菌細胞、細菌人工染色体、真核細胞、細胞株、原生動物、植物、藻類、細菌、真菌、昆虫、爬虫類、魚類、両生類、鳥類、及び哺乳類からなる群より選択される生物から製造される、請求項４６記載の放出された対をなすタグのライブラリー。
  48. 関心対象のポリヌクレオチドをサイズ選別技術に供する、請求項４６記載の放出された対をなすタグのライブラリー。
  49. ライゲーションするステップの前に、サイズ選別技術を用いて、２０００〜３０００ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドについて選別する、請求項４８記載の放出された対をなすタグのライブラリー。
  50. 以下を含む、放出された対をなすタグ：
    第１のタグ配列であって、関心対象のポリヌクレオチドの第１の末端を含み、長さにおいて少なくとも２７ヌクレオチドである、第１のタグ配列と、
    第１のタグ配列に共有結合した第１のアダプターと、
    第１のアダプターに共有結合した第２のタグ配列であって、関心対象のポリヌクレオチドの第２の末端を含み、長さにおいて少なくとも２７ヌクレオチドである、第２のタグ配列。
  51. 第１のアダプターが結合部分を更に含む、請求項５０記載の放出された対をなすタグ。
  52. 第１のタグ配列が、長さにおいて少なくとも４０ヌクレオチドである、請求項５０記載の放出された対をなすタグ。
  53. 第２のタグ配列が、長さにおいて少なくとも４０ヌクレオチドである、請求項５２記載の放出された対をなすタグ。
  54. 以下を含む、溶液：
    環状の核酸分子であって、
    第１の末端及び第２の末端を含む関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドと、
    関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端及び第２の末端に共有結合し、それによって、環状化した核酸分子を形成する、少なくとも１つのアダプターと
    を含む、環状の核酸分子であって、環状の核酸分子が、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端とアダプターとの間の第１のニックと、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端とアダプターとの間の第２のニックとを更に含み、第１のニックが、環状の核酸分子の第２のニック又はギャップとは異なる鎖上にある、環状の核酸分子と、
    ニックトランスレーション酵素。
  55. ニックトランスレーション酵素がＤＮＡポリメラーゼＩを含む、請求項５４記載の溶液。
  56. 溶液がニック切断酵素をさらに含み、ニックトランスレーション酵素が熱で不活性化される、請求項５４記載の溶液。
  57. 溶液が、第２の環状の核酸分子を更に含み、第２の環状の核酸分子が、
    第１の末端と第２の末端とを含む関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドと、
    関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端及び第２の末端に共有結合し、それによって、第２の環状化した核酸分子を形成する、少なくとも１つのアダプターと
    を含み、第２の環状の核酸分子が、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端とアダプターとの間の位置から２７ヌクレオチドを超えて離れている第３のニックと、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端とアダプターとの間の位置から２７ヌクレオチドを超えて離れている第４のニックとを含み、第３のニックは、環状の核酸分子の第４のニックとは異なる鎖上にある、
    請求項５４記載の溶液。
  58. 第３のニックが、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端とアダプターとの間の位置から少なくとも５０ヌクレオチド離れている、請求項５７記載の溶液。
  59. 第４のニックが、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端とアダプターとの間の位置から少なくとも５０ヌクレオチド離れている、請求項５８記載の溶液。
  60. 溶液がニック切断酵素をさらに含み、ニックトランスレーション酵素が熱で不活性化される、請求項５９記載の溶液。
  61. 関心対象のポリヌクレオチドの少なくとも一部を共に含む第１のタグ配列と第２のタグ配列とを含む対をなすタグを形成する方法であって、
    関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端を少なくとも１つのアダプターにライゲーションすることと、
    関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端を少なくとも１つのアダプターにライゲーションすることと、
    環状の核酸分子であって、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドと、環状の核酸分子の第１の鎖上に第１の３’末端を含む第１のニックと、環状の核酸分子の第２の鎖上に第２の３’末端を含む第２のニックとを含み、第１のニック及び第２のニックが環状の核酸分子の異なる鎖上にある、環状の核酸分子を形成することと、
    環状の核酸分子の第１の鎖の第１の３’末端を関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの配列へ伸長させることと、
    環状の核酸分子の第２の鎖の第２の３’末端を関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの配列へ伸長させることとを含む、
    前記対をなすタグを形成する方法。
  62. 第１の３’末端を伸長させる前に、第１のニックを、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端と少なくとも１つのアダプターとの間に位置付け、第２のニックを、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端と少なくとも１つのアダプターとの間に位置付ける、請求項６１記載の方法。
  63. 関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の及び第２の末端を、同一のアダプターに連結する、請求項６２記載の方法。
  64. アダプターが、第１の及び第２のアダプターを含み、環状の核酸分子の形成により、第１のアダプターが、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端上に位置付けられ、第２のアダプターが、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端上に位置付けられる、請求項６１記載の方法。
  65. 第１のアダプターが、第２のアダプターに連結ポリヌクレオチドを介して連結されている、請求項６４記載の方法。
  66. 環状の核酸分子の形成により、第１のニックが、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドに連結されている第１のアダプターの末端の遠位にある第１のアダプターの末端に位置付けられ、第２のニックが、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドに連結されている第２のアダプターの末端の遠位にある第２のアダプターの末端に位置付けられる、請求項６５記載の方法。
  67. アダプターを関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションする前に、アダプターを連結ポリヌクレオチドにライゲーションする、請求項６６記載の方法。
  68. 環状の核酸分子の第１の鎖の少なくとも一部を消化し、かつ環状の核酸分子の第２の鎖の少なくとも一部を消化することを更に含み、消化によって、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一部が一本鎖となる結果がもたらされ、消化が、第１の及び第２の３’末端を伸長させる前に起こる、請求項６１記載の方法。
  69. ５’−３’エキソヌクレアーゼを用いて、前記ニックの入った環状の核酸分子を消化する、請求項６８記載の方法。
  70. 関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの全体が一本鎖となる前に、消化を停止する、請求項６８記載の方法。
  71. 関心対象の二本鎖ポリヌクレオチド全体を、関心対象の一本鎖ポリヌクレオチドに消化する、請求項６８記載の方法。
  72. ＤＮＡポリメラーゼを用いて、前記ニックの入った環状の核酸分子を伸長させる、請求項６８記載の方法。
  73. 環状の核酸分子の第１の鎖の少なくとも一部を消化し、かつ環状の核酸分子の第２の鎖の少なくとも一部を消化することを更に含み、消化によって、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一部が一本鎖となる結果がもたらされ、消化が、第１の及び第２の３’末端を伸長させることと同時に起こる、請求項６１記載の方法。
  74. 消化及び伸長が、同一の反応チューブで行われる、請求項７３記載の方法。
  75. 環状の核酸分子の第１の鎖の第１の３’末端を、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの配列に伸長させることが、ニックトランスレーションによって達成される、請求項６１記載の方法。
  76. 環状の核酸分子の第２の鎖の第２の３’末端を、関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの配列に伸長させることが、ニックトランスレーションによって達成される、請求項７５記載の方法。
  77. 第１の及び第２のニックを、それぞれ第１のギャップ及び第２のギャップに広げる、請求項７６記載の方法。
  78. エキソヌクレアーゼを用いて、第１の及び第２のニックをそれぞれ第１のギャップ及び第２のギャップに広げる、請求項７７記載の方法。
  79. エキソヌクレアーゼが、Ｔ７エキソヌクレアーゼを含む、請求項７８記載の方法。
  80. 一本鎖に依存した消化を行って、対をなすＤＮＡタグを放出することを更に含む、請求項６１記載の方法。
  81. ニックの入った連結ポリヌクレオチドであって、
    第２のアダプター鎖にハイブリダイズしている第１のアダプター鎖を含み、第１のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠く、第１のアダプターと、
    第４のアダプター鎖にハイブリダイズしている第３のアダプター鎖を含み、第３のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠く、第２のアダプターと、
    第２の連結鎖にハイブリダイズした第１の連結鎖を含み、第１の末端と第２の末端とを含む、連結ポリヌクレオチドとを含み、
    第１のアダプターが、連結ポリヌクレオチドの第１の末端に、第１のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠くところにニックが存在するように付着しており、第２の連結鎖が、第２のアダプター鎖に付着しており、第２のアダプターが、連結ポリヌクレオチドの第２の末端に、第２のアダプターの第３のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠くところにニックが存在するように付着しており、連結ポリヌクレオチドの第２の鎖が、第４のアダプター鎖に付着している、
    前記ニックの入った連結ポリヌクレオチド。
  82. 第２のアダプター鎖の５’末端上のリン酸基を更に含む、請求項８１記載のニックの入った連結ポリヌクレオチド。
  83. 第４のアダプター鎖の５’末端上のリン酸基を更に含む、請求項８２記載のニックの入った連結ポリヌクレオチド。
  84. 第２のアダプター鎖の３’末端上のリン酸基を更に含むものの上にリン酸基がない、請求項８３記載のニックの入った連結ポリヌクレオチド。
  85. ニックの入った連結ポリヌクレオチドであって、
    第１の二本鎖アダプターと、
    第１の二本鎖アダプターが二本鎖の連結ポリヌクレオチドの第１の末端に付着している、二本鎖の連結ポリヌクレオチドと、
    二本鎖の連結ポリヌクレオチドの第２の末端に付着している第２の二本鎖アダプターとを含み、
    第１のアダプターの第１の鎖と二本鎖ベクターの第１の鎖を分ける第１のニック及び第２のアダプターの第２の鎖と二本鎖ベクターの第１の鎖を分ける第２のニックがあり、第１のニック及び第２のニックは、ニックの入ったベクターの異なる鎖上にある、
    前記ニックの入った連結ポリヌクレオチド。
  86. 対をなすタグを製造する方法であって、
    第２のアダプター鎖にハイブリダイズしている第１のアダプター鎖を含む第１のアダプターであって、第１のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠く、第１のアダプターと、
    第４のアダプター鎖にハイブリダイズしている第３のアダプター鎖を含む第２のアダプターであって、第３のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠く、第２のアダプターと、
    第２の連結鎖にハイブリダイズした第１の連結鎖を含む連結ポリヌクレオチドであって、該連結ポリヌクレオチドが第１の末端と第２の末端とを含み、第１のアダプターが、連結ポリヌクレオチドの第１の末端に、第１のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠くところにニックが存在するように付着し、第２の連結鎖が、第２のアダプター鎖に付着し、第２のアダプターが、連結ポリヌクレオチドの第２の末端に、第２のアダプターの第３のアダプター鎖がその５’末端上のリン酸基を欠くところにニックが存在するように付着し、連結ポリヌクレオチドの第２の鎖が第４のアダプター鎖に付着している、連結ポリヌクレオチドとを含む、
    ニックの入った連結ポリヌクレオチドを用意することと、
    関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第１の末端を第１のアダプターにライゲーションし、かつ関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの第２の末端を第２のアダプターにライゲーションすることと、
    第１の及び第２のニックを関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドに移動させることとを含む、
    前記対をなすタグを製造する方法。
  87. ニックの入った連結ポリヌクレオチドを線状にするために、一本鎖に依存した消化をすることを更に含む、請求項８６記載の方法。
  88. 内部アダプターを、線状にしたニックの入った連結ポリヌクレオチドにライゲーションすることを更に含む、請求項８７記載の方法。
  89. 関心対象の二本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一本の鎖を増幅することを更に含む、請求項８８記載の方法。
  90. 増幅がＰＣＲベースの増幅である、請求項８９記載の方法。
  91. 直線状の対をなすタグであって、
    関心対象のポリヌクレオチドの第１の末端を含む第１のタグ配列と、
    第１のタグ配列に共有結合した第１のアダプターと、
    第１のアダプターに共有結合し、関心対象のポリヌクレオチドの第２の末端を含む、第２のタグ配列とを含み、
    前記直線状の対をなすタグが、ＩＩｓ型制限部位を欠き、かつＩＩＩ型制限部位を欠く、
    前記直線状の対をなすタグ。
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