KR20210136002A

KR20210136002A - 단세포 홍조류의 산업적 이용을 위한 최적화된 방법

Info

Publication number: KR20210136002A
Application number: KR1020217026267A
Authority: KR
Inventors: 올리비에 카냑; 악셀 아타네; 줄리앙 드몰; 산드라 브로세-뱅상
Original assignee: 페르망탈그
Priority date: 2019-02-08
Filing date: 2020-02-07
Publication date: 2021-11-16
Also published as: CN113423719A; FR3092586A1; US20220145237A1; BR112021015614A2; AU2020219417A1; WO2020161280A1; JP2022519630A; MX2021009517A; JP7550773B2; CA3128866A1; EP3921333A1

Abstract

본 발명은 배양 산물; 획득된 바이오매스, 이로부터 추출된 피코시아닌 둘 모두 또는 다른 배양 산물, 예컨대 포르피린 또는 단백질 추출물의 가치증대화를 위한 최적화된 단세포 홍조류(URA)의 배양 방법에 관한 것이다.

Description

단세포 홍조류의 산업적 이용을 위한 최적화된 방법

본 발명은 배양 산물, 획득된 바이오매스(biomass), 이로부터 추출된 피코시아닌(phycocyanin) 둘 모두 또는 다른 배양 산물 예컨대 포르피린(porphyrin) 또는 단백질 추출물의 가치증대화(valorization)에 최적화된 단세포 홍조류(unicellular red algae; URA)의 배양 공정(process)에 관한 것이다.

산업 또는 식품용의 다양한 산물을 제조하기 위해 미세조류, 특히 단세포 홍조류(URA)를 배양하는 다양한 방법이 공지되어 있다.

특히, 단백질이 풍부한 식품 보충제의 제조 또는 식품 착색제로 유용한 피코시아닌의 제조를 위한 스피룰리나(spirulina)의 배양 및 처리 공정이 언급될 수 있다.

유사한 산물을 획득하기 위해 URA를 배양 및 처리하는 공정, 특히 특허 출원 WO 2017/050917, WO 2017/093345 및 WO 2018/178334에 기재된 갈디에리아 술푸라리아(Galdieria sulphuraria)를 배양 및 처리하는 공정이 또한 언급될 수 있다.

갈디에리아 술푸라리아와 같은 URA의 배양 및 처리를 위한 산업적 공정이 도 1에 도시되어 있다.

그러나, 이러한 상이한 공정은 URA의 생성 및 처리의 각 단계에서 더욱 개선될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 특히, 갈디에리아 술푸라리아와 같은 URA가 일반적인 배양 조건 하에서 배양될 때 많은 양의 글리코겐, 특히 바이오매스의 처리 조건, 특정 세포 용해, 바이오매스로부터 산물의 단리 조건 및 이러한 단리된 산물, 특히 피코시아닌의 특질(quality)에 영향을 미치는 글리코겐의 양을 축적한다는 사실의 관점에서 이러한 공정을 개선할 수 있다.

특히, 획득된 산물의 더 우수한 가치증대화를 위해 이러한 다양한 단계를 최적화할 수 있는 것이 중요하다.

본 발명은 URA, 특히 갈디에리아 술푸라리아의 배양 및 가치증대화를 위한 최적화된 공정으로서, URA를 발효 배양하는 단계 (a), 발효액(fermentation juice)으로부터 바이오매스를 분리하는 단계 (b), 필요한 경우 세포를 용해하는 단계 (c) 및 필요한 경우 용해된 바이오매스로부터의 가치증대화 가능한 산물을 추출하는 단계 (d)를 포함하고, 다음 단계

분쇄하는 동안 바이오매스를 50℃ 미만의 온도에서 유지하면서 분쇄시킴으로써 용해하는 단계 (c1) 및/또는

배양 배지로 유입되는 탄소 공급원이 제한된 숙성 상(maturation phase)에 발효 배양하는 단계 (a1), 및/또는

발효액으로부터 포르피린을 추출하는 단계 (b1), 및/또는

용해된 바이오매스의 총 부피의 총 4배 미만을 나타내는 물의 양으로 적어도 2회의 연속 세척에 의한 용해된 바이오매스로부터 피코시아닌을 추출하는 단계 (d1)

중 적어도 하나를 포함하는 공정에 관한 것이다.

본 발명은 또한 공정에 의해 획득된 산물, 특히 발효액으로부터 추출된 포르피린, 바이오매스, 용해된 바이오매스, 단리된 단백질 및/또는 피코시아닌에 관한 것이다.

도 1은 갈디에리아 술푸라리아 배양물로부터 상이한 산물을 제조하기 위한 공정의 단순화된 다이어그램을 나타낸다.
도 2는 숙성 상을 갖는 글리세롤 상에 유가식(fed-batch) 방식의 갈디에리아 술푸라리아 균주의 성장을 나타낸다.
도 3은 숙성 상을 갖는 글리세롤 상에 유가식 배양 동안 바이오매스 조성의 모니터링을 나타낸다.
도 4는 숙성 상을 갖는 우유 투과액 상에 유가식 방식의 갈디에리아 술푸라리아 균주의 성장을 나타낸다.
도 5는 숙성 상을 갖는 유가식 방식의 우유 투과액 상에서 배양 동안 바이오매스 조성의 모니터링을 나타낸다.
도 6은 포르피린 생성 없이 글리세롤 상에서 연속적으로 성장한 갈디에리아 술푸라리아 균주의 성장 모니터링을 나타낸다.
도 7은 글리세롤 상에서 연속적으로 성장한 갈디에리아 술푸라리아의 배양 동안 바이오매스 조성의 모니터링을 나타낸다.
도 8은 글루코스 상에서 연속 방식의 갈디에리아 술푸라리아 균주의 성장 모니터링을 나타낸다.
도 9는 글루코스 상에서 연속적으로 성장한 갈디에리아 술푸라리아의 배양 동안 바이오매스 조성의 모니터링을 나타낸다.
도 10은 우유 투과액 상에서 연속 방식의 갈디에리아 술푸라리아 균주의 성장 모니터링을 나타낸다.
도 11은 우유 투과액 상에서 연속적으로 성장한 갈디에리아 술푸라리아의 배양 동안 바이오매스 조성의 모니터링을 나타낸다.
도 12는 냉각 부재 하의 Bertoli HHP 분쇄 데이터(1200 bar)를 보여준다.
도 13은 냉각 하의 Bertoli HHP 분쇄 데이터(1200 bar)를 보여준다.
도 14는 다른 pH로 조정된 용해물에 대한 50℃에서의 피코시아닌의 내성을 나타낸다.
도 15는 볼 밀(ball mill)에 의한 세포 용해율에 대한 비드 직경의 영향을 나타낸다.
도 16은 상이한 부피의 물에 대한 단일 세척과 비교하여 연속 세척으로 추출된 피코시아닌의 양을 나타낸다.

본 발명에 따른 공정의 다양한 단계는 하기 및 실시예에 보다 상세하게 기재되어 있다.

본 발명에 따르면, "가치증대화"는 산업에서 사용하기 위한 유용한 산물의 단리를 가능하게 하는 기술적 단계를 의미한다.

특히, 본 발명에 따른 공정은 다음의 연속 단계

배양 배지에서 탄소 공급원을 제한함을 포함하는 숙성 상에 발효 배양하는 단계 (a1),

필요한 경우, 발효액으로부터 포르피린을 추출하는 단계 (b1),

필요한 경우, 분쇄 동안 바이오매스를 50℃ 미만의 온도에서 유지하면서 분쇄시킴으로써 용해하는 단계 (c1), 및

필요한 경우, 용해된 바이오매스의 총 부피의 4배 미만의 총 물의 양으로 적어도 2회의 연속 세척에 의한 용해된 바이오매스로부터의 피코시아닌을 추출하는 단계 (d1)

을 포함한다.

더욱 구체적으로, 본 발명에 따른 공정은 다음의 연속 단계

발효액으로부터 포르피린을 추출하는 단계 (b1),

용해된 바이오매스의 총 부피의 3배 미만의 총 물의 양으로 연속 세척에 의한 용해된 바이오매스로부터의 피코시아닌을 추출하는 단계 (d1)

을 포함한다.

본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 본 공정은 적어도 다음 단계

배양 배지에서 탄소 공급원을 공급 제한함으로써 숙성 상에 발효 배양하는 단계 (a1), 및

발효액으로부터 포르피린을 추출하는 단계 (b1)

을 포함한다.

본 발명의 또 다른 특정 실시형태에 따르면, 본 공정은 적어도 다음 단계

분쇄 동안 바이오매스를 50℃ 미만의 온도에서 유지시키면서 분쇄시킴으로써용해하는 단계 (c1) 및 필요한 경우

용해된 바이오매스의 총 부피의 3배 미만의 총 물의 양으로 연속 세척에 의한 용해된 바이오매스로부터 피코시아닌을 추출하는 단계 (d1)

을 포함한다.

URA, 특히 바이오매스 및 그 부산물, 단백질 또는 피코시아닌의 생성을 위해 산업적으로 배양될 수 있는 URA는 당업자에게 잘 알려져 있다. 시아니디알레스(Cyanidiales) 목의 조류(또는 미세조류)가 특히 언급될 수 있다. 시아니디알레스 목은 시아니디아세아(Cyanidiaceae) 및 갈디에리아세아(Galdieriaceae) 과를 포함하고, 그 자체는 시아니디오쉬존(Cyanidioschyzon), 시아니듐(Cyanidium) 및 갈디에리아 속(genus)으로 세분되며, 특히 시아니디오쉬존 메롤라에 10D(Cyanidioschyzon merolae 10D), 시아니디오쉬존 메롤라에 DBV201(Cyanidioschyzon merolae DBV201), 시아니듐 칼다룸(Cyanidium caldarum), 시아니듐 다에달룸(Cyanidium daedalum), 시아니듐 막시뭄(Cyanidium maximum), 시아니듐 파르티툼(Cyanidium partitum), 시아니듐 룸펜스(Cyanidium rumpens), 갈디에리아 다에달라(Galdieria daedala), 갈디에리아 막시마(Galdieria maxima), 갈디에리아 파르티타(Galdieria partita) 및 갈디에리아 술푸라리아(Galdieria sulphuraria) 종(species)에 속한다. 갈디에리아 술푸라리아(시아니듐 칼다륨 (Cyanidium caldarium)라고도 함) UTEX 2919 균주가 특히 언급될 수 있다.

또한 스피룰리나라는 일반 명칭으로 산업적으로 배양되는 아르트로스피라(Arthrospira) 속의 사상 시아노박테리아와 같은 피코시아닌의 공지된 생성자가 언급될 수 있다.

글리코겐 함량이 높은 피코시아닌을 생성하는 미생물은 특히 위에서 언급한 미생물, 특히 아르트로스피라, 스피룰리나, 시네코코쿠스(Synechococcus), 시아니디오쉬존, 시아니듐 또는 갈디에리아, 특히 갈디에리아 술푸라리아 종 중에서 확인된다.

본 발명은 또한 공정에 의해 획득된 산물, 특히 바이오매스, 발효액으로부터 단리된 포르피린, 용해된 바이오매스, 용해된 바이오매스로부터 단리된 단백질 및 피코시아닌에 관한 것이다.

미생물에 의해 생성되는 피코시아닌(PC)은 c-피코시아닌(C-PC) 및 알로피코시아닌을 포함한다. 본 발명에 따르면, 피코시아닌은 단리된 C-PC 및 알로피코시아닌, 또는 임의의 비율의 이의 혼합물, 특히 C-PC로 규정된다.

URA를 배양하는 단계 (a1).

URA, 특히 갈디에리아 술푸라리아의 발효기 배양은 종속영양 또는 혼합영양 방식, 유가식 또는 연속식 방식으로 과학 문헌에 널리 기재되어 있다.

생성된 바이오매스는 피코시아닌과 단백질뿐만 아니라 글리코겐과 같은 예비 당을 또한 포함한다. 바이오매스의 글리코겐 함량은 건조물의 총 질량 대비 20 내지 50 질량% 정도이다. 최종 바이오매스의 글리코겐 함량이 높을수록 피코시아닌(PC)과 단백질의 농도가 낮아진다. 특히 갈디에리아에서 URA에 의해 생성된 글리코겐은 냉각 수에 용해되기 때문에 PC 추출 중 수상에 존재하며, 이는 점도 증가, 여과막 막힘, 압력 상승, 피코시아닌을 포함하는 분량에의 글리코겐 축적, 이에 따라 순도가 더 낮은 피코시아닌 획득과 같은 여과 중 기술적인 문제를 야기한다. 본 발명은 발효의 "조정"에 의해 글리코겐 수준을 20% (질량/DM) 미만의 값으로 감소시키는 것을 가능하게 한다.

따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 바이오매스의 생성 공정으로서, 배양 배지에서 탄소 공급원을 공급 제한함을 포함하는 숙성 상에 의한 상기 규정된 바와 같은 URA의 발효 배양을 포함하는 공정에 관한 것이다.

발효에 의한 배양은 세포 성장을 가능하게 하는 다양한 영양소를 포함하는 배양 배지에서 수행한다. 당업자에게 잘 알려진 이러한 배양 배지는 탄소 공급원, 질소 공급원, 인 공급원, 거대원소, 미량원소를 세포 성장을 가능하게 하는 적절한 농도로 포함한다.

숙성 단계는 특히 유가식 또는 연속 배양(continuous culture) 방식으로 수행한다.

탄소 공급원은 당업자에게 공지되고 URA 및 특히 갈디에리아 술푸라리아의 배양에 사용될 수 있는 임의의 탄소 공급원, 예컨대 폴리올, 특히 글리세롤, 당, 예컨대 글루코스 또는 수크로스 또는 또한 락토스 또는 락토스를 포함하는 복합 배지, 예컨대 우유 투과물(milk permeate), 혈청 투과물, 버터밀크(buttermilk) 및 이의 혼합물, 특히 우유 투과물일 수 있다.

글루코스과 같은 일부 탄소질 기질은 PC 합성을 강력하게 억제하나 그 외의 기질들은 더 낮은 정도로 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러나 산업용 PC 생성 공정의 수행 가능성을 위해 많은 경제적 매개변수, 특히 원자재 비용을 고려해야 한다. 따라서 락토스를 포함하는 우유 투과물과 같은 탄소 공급원을 사용하면 글리세롤만큼 높은 PC 수율을 획득할 수 없지만, 우유 투과물을 사용하는 공정의 전반적인 경제성은 재활용이 어려운 유제품의 부산물이므로 여전히 유리하다. 본 발명에 따른 공정의 수행에 의해 낮은 글리코겐 함량으로 높은 세포 밀도를 획득할 수 있고, 이는 공정의 마지막에 PC의 추출을 용이하게 하기 때문에 더욱 유리하다.

숙성 후에 획득된 바이오매스는 하기 조성을 갖는다:

이러한 두 가지 배양 방법의 경우 탄소 공급원을 제한함으로써 숙성 단계를 수행하기 위한 특정 조건은 아래에 명시되어 있다.

배치/유가식 배양.

유가식 배양에서, 본 발명에 따른 발효 배양 공정은 배양 배지에 적어도 30 g/L DM의 세포 밀도를 획득할 수 있는 상기 규정된 바와 같은 탄소 공급원을 포함하는 배양 배지에서 세포 성장의 제1 단계를 포함한다. 당업자는 특히 특허 출원 WO 2017/050917, WO 2017/093345 및 WO 2018/178334에 기재된 선행 기술의 공정과 관련하여 이러한 세포 밀도 및 특히 탄소 공급원 함량을 획득하기에 적합한 배양 배지의 조성을 규정하는 방법을 알고 있을 것이다.

적절한 세포 밀도가 획득되면, "숙성" 단계가 수행되며, 이는 유기 탄소 기질에서 균주를 제거(weaning)하는 단계로 구성된다.

본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 성장 단계의 배양물이 적어도 30 g/L DM, 바람직하게는 적어도 80 g/L DM, 더욱 바람직하게는 적어도 100 g/L 건조물에 도달하면 숙성 단계가 진행된다.

유가식 단계 동안, 유가식 단계에서 글리코겐 축적을 제한하기 위해 배양물에는 적어도 100 g/L의 탄소 기질, 바람직하게는 적어도 200 g/L의 탄소 기질, 더욱 바람직하게는 적어도 500 g/L의 탄소 기질을 포함하는 공급 배지가 공급된다. 당업자는 발효에서 탄소질 기질 함량이 5 g/L 미만, 바람직하게는 1 g/L 미만, 더욱 바람직하게는 0.1 g/L 미만일 수 있게 하는 공급율을 규정하는 방법을 알고 있을 것이다.

성장 단계 후 숙성 단계가 이루어진다. 이 숙성 단계에서 성장 중 축적된 예비 당, 특히 글리코겐의 소모로 인해 필수 물질 1 리터당 건조 질량의 감소가 관찰된다. 동시에 건조물 그램당 피코시아닌의 양의 증가가 관찰될 수 있다. 단백질 함량도 동일하다. 이 숙성 공정을 통해 글리코겐 함량이 낮은 바이오매스를 획득할 수 있다.

본 발명의 제1 실시형태에 따르면, 배양물에는 탄소 공급원을 포함하지 않는 숙성 공급 배지가 공급된다. 숙성 공급 배지가 검출 가능한 미량의 탄소 공급원을 포함하는 경우에도 탄소 공급원의 부재가 관찰되는 것으로 이해된다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 제거는 전체적이며, 즉 세포에 더 이상 배양 배지가 공급되지 않고, 발효의 잔여 요소 및 이의 세포 보유물을 공급함으로써 세포의 숙성을 개시하는 세포가 필요하다.

유리하게는, 획득된 바이오매스는 건조물의 질량 (% DM)과 관련하여 질량 기준으로 글리코겐 20% 미만, 바람직하게는 15% 미만 DM, 더욱 바람직하게는 10% 미만 DM을 포함한다.

숙성 시간은 배양 온도에 따라 다소 길어질 수 있다. 온도가 최적 성장 온도에 가까울수록 숙성 단계가 짧아진다.

성장 및 숙성 단계를 동시에 수행하고 탄소 공급원 공급을 통해 더 낮은 성장율을 부과하여 균주에서 글리코겐의 축적을 제한함으로써 유가 방식으로 배양을 수행하는 것이 또한 가능하다. 이 숙성을 위한 성장율은 균주의 최대 성장 속도에 따라 결정되며, 이는 당업자가 결정할 수 있다. 이 성장율은 균주의 최대 성장율의 80% 미만, 바람직하게는 균주의 최대 성장율의 70% 미만, 보다 바람직하게는 균주의 최대 성장율의 50% 미만이어야 한다.

유가식 방식의 본 발명에 따른 공정에 의해 적어도 70 g/L DM (도 4), 및 적어도 10 mg/g DM (도 5)의 PC 함량의 바이오매스, 특히 C-PC 및 DM 중 적어도 40%의 단백질 함량을 포함하는 발효 필수 물질을 획득할 수 있다 (도 5).

연속 배양.

0.05 g/L 미만의 검출 수준의 기질 제한 하의 연속 성장은 문헌[Sloth et al., 2006]에 이미 기재되었으며, 저자는 이를 분석적 검출 한계로 고려한다. 이 경우 공급 배지는 배양물에 지속적으로 공급되지만 세포에 의해 거의 순간적으로 소모되므로 정량화할 수 없다. 이 문헌에서 저자의 목적은 배지의 유의한 글루코스 농도와 연결된 PC 합성의 억제를 제한하는 것이며 글루코스는 PC 합성을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이러한 조건에서 PC 함량은 약 28 mg/g 건조물로 매우 낮고 바이오매스 함량은 약 5 g/L 건조물이다.

본 발명의 목적은 유가식 배양과 비교하여 바이오매스 및 PC 생성성을 증가시키기 위해 연속 배양을 수행하는 것이다. 본 발명에 따른 공정에 의해, 65 내지 70 g/L 이상의 건조 질량 및 25 내지 90 mg/g DM 이상을 포함하는 PC 함량에 도달하는 것이 가능하다.

본 발명의 제1 실시형태에 따르면, 숙성 단계는 영양 공급 없이 연속 배양물로부터 탱크(tank)로 필수 물질의 일부를 이동시킴으로써 수행한다. 위에서 설명한 유가식 배양 방식과 마찬가지로 글리코겐 함량이 감소하고 피코시아닌 및 단백질 함량이 증가한다.

당업자는 적절한 목적에 따라 바이오매스가 공급 없이 유지되는 온도와 같은 공지된 매개변수에 따라 숙성에 필요한 시간을 결정하는 방법을 알 것이다. 이 숙성 시간은 적어도 12시간, 바람직하게는 적어도 48시간, 더욱 바람직하게는 적어도 72시간이다.

성장 및 숙성 단계는 또한 공급 배지의 유속을 통해 감소된 성장율을 부과함으로써 동시에 수행될 수 있다. 유리하게는, 성장율은 0.06 h-1 미만, 바람직하게는 0.03 h-1 미만, 더욱 바람직하게는 0.015 h-1 미만이다.

유리하게는, 성장율은 균주의 최대 성장율의 80% 미만, 바람직하게는 균주의 최대 성장율의 60% 미만, 더욱 바람직하게는 균주의 최대 성장율의 40% 미만이다. 도 7에서는 400시간 배양 후 성장율이 최대 성장율의 80% 미만 값으로 감소하여 초기에 부과된 성장율과 비교하여 바이오매스 내 PC 및 단백질 함량이 증가하고 글리코겐 함량이 감소하였다.

탄소 공급원 함량은 적어도 65 g/L, 또는 심지어 적어도 70 g/L, 보다 특히 적어도 80 g/L의 건조물 함량이 획득되는 것을 보장한다.

이와 같이 개별적 또는 동시적 숙성으로 획득된 바이오매스는 20% 미만, 유리하게는 15% 미만 또는 심지어 10% 미만의 글리코겐 함량을 갖는다. 획득된 바이오매스는 DM 중 적어도 45%, 유리하게는 적어도 50%의 단백질 함량을 갖는다.

피코시아닌 함량, 특히 C-PC는 적어도 20 mg/g DM, 유리하게는 25 내지 50 mg/g DM일 것이다. 폴리올과 같은 특정 탄소 공급원을 사용하면 50 mg/g DM 초과의 C-PC 함량을 달성할 수 있다.

발효 필수 물질에서 포르피린을 생성하는 단계 (b1).

여러 연구에 따르면 피코시아닌과 엽록소 합성 경로의 다수의 주요 단계는 빛에 의해 유도되고 다른 단계는 배지의 유기 기질의 존재 하에 억제되는 것으로 나타났다 (문헌[Foley et al., 1982; Brown et al., 1982; Troxler et al., 1989; Rhie and Beale, 1994; Stadnichuck et al., 1998]). 문헌에 따르면 종속영양 배양은 성장 배지 중 코프로포르피린(coproporphyrin)의 배출을 유도하고 코프로포르피리노겐 III에서 프로토포르피리노겐 IX로의 전환 동안 세포의 색소 함량(피코시아노빌린 및 클로로필)을 감소시킨다. 혼합영양 조건에서 빛은 광합성 색소의 생합성과 환경으로의 포르피린 배출을 모두 유도한다. 한 형태의 포르피린에서 다른 형태로의 전환은 때때로 자발적 반응에 의해 이루어지므로 성장 배지에 다수의 형태의 포르피린이 존재할 수 있다 (문헌[Brown et al., 1982; Stadnichuck et al., 1998]).

문헌에 기재된 것과는 달리, 본 발명에 따른 공정의 수행은 유기 탄소 공급원, 특히 글루코스, 글리세롤, 락토스 또는 수크로스가 배지에 존재하는 한 포르피린 배출을 야기하지 않는다. 포르피린은 유가식 및 연속 배양 모두에서 숙성 단계 (배지에 유기 탄소 없음) 동안에만 검출된다. 숙성 단계 후에 유기 기질이 배지에 첨가되면 세포에 의한 포르피린의 재사용이 관찰될 수 있으며 발효액에 이러한 포르피린이 검출할 수 없는 수준으로 되돌아간다.

본 발명에 따른 숙성 단계 후에, 상기 규정된 바와 같이 글리코겐 함량이 낮고 단백질 및 PC가 다량 존재하는 바이오매스, 및 포르피린을 포함하는 액체를 포함하는 발효가 획득되어야 한다.

URA, 특히 갈디에리아 술푸라리아에 의해 생성된 이러한 포르피린은 예를 들어 선충류에 대한 치료에 사용될 수 있는 천연 킬레이터(chelator)이다 (US 2006/0206946). 프로토포르피린 IX와 같은 일부 분자는 광선요법에 의한 암 치료를 위한 의료 분야에서도 관심을 가질 수 있다 (문헌[Huang et al., 2015])

따라서, 본 발명은 발효액를 회수하고 이 액체로부터 포르피린을 추출하는 단계를 포함하는 공정에 관한 것이다.

발효액은 모든 통상적인 바이오매스 분리 방법, 특히 당업자에게 잘 알려진 원심분리 (플레이트 원심분리기 또는 침전기) 또는 여과 (플레이트 필터(plate filter), 필터 프레스(filter press), 세라믹 또는 유기 접선 여과)에 의해 회수된다.

포르피린은 크로마토그래피(친화성 또는 크기 배제 크로마토그래피)와 같은 통상적인 방법에 의해 추출될 수 있다.

추출된 포르피린은 정제된 다음, 특히 요법에서 추가 사용을 위해 패키징될 수 있다.

바이오매스를 분쇄하는 단계 (c1).

바이오매스에서 피코시아닌 및/또는 단백질을 추출하려면 적절한 산물을 방출하는 세포 용해를 수행할 필요가 있다. URA와 특히 갈디에리아 술푸라리아는 적절한 피코시아닌을 분해하는 것과 같은 작동 조건이 아닌 한 일반적인 방법으로는 용해가 어려운 매우 저항성인 세포벽을 가지고 있다.

회수된 산물, 피코시아닌 및/또는 단백질의 수율은 바이오매스의 산물 함량뿐만 아니라 이 바이오매스로부터 최대량을 추출하는 용량에 좌우된다. 이 추출 용량은 세포 용해의 효율성뿐만 아니라 피코시아닌의 실질적인 분해로 이어지지 않는 조건에서의 수행에 달려 있다.

분쇄는 분쇄율과 기계적 마찰에 의해 발생하는 열의 두 가지 주요 문제를 기반으로 한다. 피코시아닌의 경우 열에 민감한 분자이기 때문에 이러한 열 제어는 훨씬 더 중요하다. 실시예 7에 기재된 조건 하에서 Bertoli 유형 고압 균질기로 시험을 수행하였다. 고압 균질기로 분쇄하려면 일관된 용해율을 달성하기 위해 다회 통과해야 한다. 갈디에리아 술푸라리아 바이오매스의 통과는 3회의 연속 통과에도 불구하고 40% 초과의 용해율을 획득하지 못했다. 약 70℃의 온도에서 바이오매스가 녹갈색으로 도달하여 대부분의 피코시아닌이 분해될 때까지 각 통과에서 온도의 증가를 관찰할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 URA 세포, 특히 갈디에리아 술푸라리아를 용해시키는 공정으로서, 분쇄 동안 URA 바이오매스를 50℃ 미만의 온도에서 유지하면서 볼 밀로 분쇄함으로써 용해를 수행하는 것을 특징으로 하는 공정에 관한 것이다.

본 발명은 50℃, 바람직하게는 47℃, 더욱 바람직하게는 40℃ 이하를 초과하지 않도록 분쇄 챔버 내부에서 분쇄 동안 바이오매스의 온도를 조절하는 것으로 이루어진다. 이 온도 제어는 밀 재킷(mill jacket)의 수냉식 시스템을 사용하거나 이전에 20℃ 미만의 온도로 냉각된 바이오매스를 밀에 주입하여 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 분쇄 공정은 획득 방식 (발효 방식 및 단리)에 관계없이 바이오매스에 적용될 수 있다. 이는 글리코겐 함량이 감소되는 상기 기재된 본 발명에 따른 배양 공정에 의해 획득된 바이오매스에 특히 적합하고 바람직하다.

본 발명은 또한 이렇게 획득된 용해된 바이오매스에 관한 것이다.

본 발명자들은 본 발명에 따라 분쇄된 바이오매스가 분쇄되지 않은 바이오매스보다 더 우수한 단백질 분해율을 제공한다는 것을 발견하였다. 분해율의 이러한 개선은 시험관내 분해율 시험에 의해 입증되었다 (문헌[Boisen and Fernandez, 1995]).

따라서, 본 발명은 분쇄된 URA 바이오매스, 특히 본 발명에 따른 분쇄 공정에 의해 획득가능한 갈디에리아 술푸라리아 바이오매스에 관한 것이다.

본 발명은 특히 후술하는 조성의 갈디에리아 술푸라리아의 분쇄 바이오매스(ground biomass)에 관한 것이다.

아미노산 조성은 하기 표에 제공된다.

지질 조성은 다음과 같다:

본 발명은 또한 인간 또는 동물 소비를 위한 식품 보충제 또는 식품으로서 이러한 분쇄된 바이오매스의 용도에 관한 것이다.

피코시아닌을 추출하는 단계 (d1).

본 발명은 또한 용해된 URA 세포, 특히 갈디에리아 술푸라리아의 바이오매스로부터 피코시아닌을 추출하는 공정으로, 용해된 바이오매스의 총 부피의 총 4배 미만, 바람직하게는 2 내지 3배, 더욱 바람직하게는 약 3배를 나타내는 물의 양으로 연속 세척을 포함하는 것을 특징으로 하는 공정에 관한 것이다.

이 용해된 바이오매스는 피코시아닌을 포함하여 세포 용해 후 가용화된 다양한 세포 추출물을 포함하는 수용액 중 불용성 세포 잔류물(insoluble cell residue)의 현탁액을 포함한다. 용해된 바이오매스는 유리하게는 적어도 2%, 바람직하게는 적어도 5%, 더욱 바람직하게는 적어도 7%의 건조물을 포함한다.

추출에 필요한 총 물의 부피 (Vw)는 처리될 용해된 바이오매스의 부피 (Vb)의 함수로 계산되며 이 부피의 최대 4배를 나타낼 것이다 (Vw/Vb는 4 이하이다). 물론, 더 많은 총 물의 부피로 본 발명을 수행하는 것이 가능하지만, 피코시아닌을 회수하기 위해 나중에 처리해야 하는 물의 부피 때문에 공정의 경제성 면에서 유리하지 않다.

그런 다음 이 총 물의 부피는 바이오매스 상의 연속 통과에 의해 피코시아닌을 추출하는데 사용될 다수의 분량으로 나뉘며, 분량의 수 (n)는 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3이다. 당업자는 장비 고정 비용 및 바이오매스의 반복적인 처리와 같은 공정 수행의 모든 경제적 매개변수를 고려하여 3개 초과의 물 분량으로 추출을 수행할 계획을 세울 수 있다. 바람직하게는, 분량의 수는 3이다.

본 발명의 제1 실시형태에 따르면, 분량은 서로 다른 각각의 부피를 갖는다. 본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, 모든 분량은 Vw/n과 동일한 부피를 갖는다.

당업자는 수행할 피코시아닌 제조 공정을 최적화하기 위해 분량의 수 및 각 분량의 각각의 부피를 결정하는 방법을 알고 있을 것이다.

바이오매스로부터 적절한 양의 피코시아닌을 추출하기 위해서는 펠릿화된 불용성 요소의 연속 세척이 필요하다. 다회 세척 후 펠릿의 C-PC와 APC의 비율이 바뀐다. 도 16에서 알 수 있듯이 동일한 양의 물을 사용하는 것보다 소량의 물을 연속적으로 사용하여 피코시아닌을 추출하는 것이 바람직하다 (도 16).

y축에는 다이어그램의 왼쪽부터 시작하여 동일한 부피의 3개의 물 분량으로 이루어진 3회의 연속 추출에 해당하는 3개의 블록 S1, S2 및 S3이 있으며, 총 물의 부피 Vw는 1배이고, 제1 블록 (1/2 연속 희석)의 경우 바이오매스 Vb의 부피이고, 제2 블록 (1/3 연속 희석)의 경우 2배이고, 제3 블록 (1/4 연속 희석)의 경우 3배이다. Bar S1은 제1 추출에서 추출한 PC 값을 제공한다. Bar S2는 제1 및 제2 추출로 추출한 PC의 누적 값을 제공한다. 막대 S3는 연속적으로 사용된 3개의 분량에 대한 누적 값을 제공한다. 그런 다음 5X 내지 12X까지 다양한 양의 물을 사용하여 5회의 단일 추출을 수행하였다.

도 16으로부터, 제1 추출에서 더 큰 초기 부피의 물이 특정 한계 (5X 내지 12X)까지 더 바람직한 결과를 제공함을 알 수 있다. 연속 추출 방식을 사용하면 추출 효율과 물 사용량 감소 측면에서 실질적인 이득을 볼 수 있다. 예를 들어, 3회의 추출은 단일 추출보다 더 바람직한 결과를 제공하고 사용되는 총 물의 양을 적어도 2배 감소시킨다.

피코시아닌을 포함하는 각각의 연속 추출로부터 회수된 세척수는 이 회수 전에 피코시아닌을 회수하기 위해 별도로 처리되거나 조립될 수 있다.

본 발명에 따른 추출 공정은 바이오매스 생성에 사용되는 배양 방법 및 세포 용해에 사용되는 방법에 관계없이 URA, 특히 갈디에리아 술푸라리아의 임의의 용해된 바이오매스에 적합하다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 추출 방법은 상기 기재된 본 발명에 따른 공정에 의해 획득된 글리코겐 함량이 낮은 바이오매스 및/또는 상기 규정된 본 발명에 따른 분쇄 방법에 의해 용해된 바이오매스에 특히 적합하다.

생성된 피코시아닌 용액은 일반적으로 피코시아닌을 단리하기 위해 처리된다. 수용액에서 피코시아닌을 회수하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 특허 출원 WO 2018/178334에 기재된 산 침전(acid precipitation)이 특히 언급될 수 있다.

이는 또한 초기 용액의 pH를 피코시아닌이 덜 용해되는 pH 값 범위 (불안정 범위라고도 함)에서 선택된 값으로 조정하고 침전을 용이하게 하기 위해 용액 중 피코시아닌을 농축하고 그 다음 침전된 피코시아닌을 회수하는 단계로 구성된 선택적 침전에 의해 단리될 수 있다. 이러한 불안정 범위는 특히 갈디에리아 술푸라리아에 의해 생성되는 내산성 피코시아닌(acid-resistant phycocyanin)의 경우 pH 4.4 내지 5.5이다. 물론, 당업자는 간단한 실험을 통해 다른 URA에 의해 생성된 다른 피코시아닌에 대한 이러한 불안정 범위를 결정하는 방법을 알 것이다. 이러한 방법은 특히 2019년 1월 11일에 출원된 특허 출원 FR 1900278에 기재되어 있다.

또한 피코시아닌을 회수하기 전에 수용액을 처리하여 글리코겐의 효소적 분해에 의해 글리코겐 함량을 낮출 수 있다. 이미 낮은 피코시아닌의 침전으로 제거될 수 있는 이러한 미량의 다당류는 다당류가 훨씬 더욱 가용성인 저분자량 다당류로 용해될 때 훨씬 더 감소한다. 더욱이, 농축 단계가 접선 여과에 의해 수행될 때, 저분자량 다당류는 용액의 다른 작은 분자와 함께 제거되어 훨씬 더 높은 피코시아닌 함량을 갖는 용액을 획득하는데 유리하다. 특히, 글리코겐의 효소적 용해는 실온에서 pH 5 이하, 바람직하게는 약 4.5에서 수행한다. 이러한 온도 및 pH 조건은 효소 반응 동안 피코시아닌을 보존하는데 특히 적합하다. 산성 pH 및 실온 조건에서 활성인 효소는 α1-4 글루쿠로니다제, α1-4 글루코시다제 (또는 알파-글루코시다제) 활성을 갖는 것으로 알려진 효소로부터 선택된다. 펙틴을 분해하는 것으로 알려진 펙티나제, 특히 아스퍼길루스(Aspergillus)와 같은 사상 진균으로부터 추출된 펙티나제, 더욱 구체적으로 아스퍼길루스 아쿨레아투스로부터 추출된 펙티나제, 예를 들어 Novozymes 사에서 제품명 Pectinex®로 시판되는 효소가 언급될 수 있다. 또한 글리코겐의 효소적 용해는 α1-4 글루쿠로니다제 또는 α1-4 글루코시다제 외에 α1-6 글루코시다제를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 제시된 pH 및 온도 조건하에서 활성인 α1-6 글루코시다아제는 또한 당업자에게 공지되어 있다. 특히, 여기에는 풀루란의 α1-6 글리코시드 결합을 가수분해하고, 특히 전분 분지(starch branch)를 제거하는 것으로 알려진 풀루라나제가 있다. 이는 일반적으로 박테리아, 특히 바실루스(Bacillus) 속으로부터 추출한 효소이다. US 6,074,854, US 5,817,498 및 WO 2009/075682는 바실루스 데라미피칸스(Bacillus deramificans) 또는 바실루스 애시도풀룰리티쿠스(Bacillus acidopullulyticus)로부터 추출된 이러한 풀루라나제를 기재하고 있다. 상업적으로 이용 가능한 풀루라나제는 특히 제품명 "Promozyme D2"(Novozymes), "Novozym 26062"(Novozymes) 및 "Optimax L 1000"(DuPont-Genencor)으로 공지되어 있다. 풀루라나제/알파-아밀라제 혼합물이 선행 기술에 기재되어 있지만, 특히 전분으로부터 글루코스 액을 생성하는 것에 주목해야 한다 (US 2017/159090). 당업자는 처리될 용액의 초기 글리코겐 함량, 사용되는 효소의 양 및 생성된 피코시아닌의 목표 순도에 따라 글리코겐의 양을 가장 적절하게 감소시키기 위해 적절한 반응 조건을 결정하는 방법을 알고 있을 것이다. 이러한 방법은 특히 2019년 1월 11일에 출원된 특허 출원 FR 1900278에 기재되어 있다.

회수된 피코시아닌은 정용여과(diafiltration)와 같은 당업자에게 공지된 방법으로 정제할 수 있다.

본 발명에 따른 추출 공정에 의해 획득된 피코시아닌은 순도 지수가 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3, 또는 4 초과이다. 이 순도 지수는 문헌[Moon et al. (2014)]에 기재된 방법에 의한 흡광도 측정에 의해 측정된다.

유리하게는, 획득된 피코시아닌은 글리코겐/피코시아닌 비율 (건조 중량 기준)이 6 미만, 유리하게는 4 미만, 바람직하게는 3 미만, 더욱 바람직하게는 2.5 미만, 훨씬 더욱 바람직하게는 1 미만인 피코시아닌이다.

본 발명은 또한 착색제, 특히 식품 착색제로서 획득된 피코시아닌의 용도에 관한 것이다. 이는 또한 본 발명에 따른 추출 공정에 의해 획득된 피코시아닌을 포함하는 고체 또는 액체의 식품, 특히 음료에 관한 것이다.

세척 후 남은 고체 잔류물 또한 회수된다. 이는 단백질이 풍부한 바이오매스 잔류물로서 인간 또는 동물 소비용 식품 보충제 또는 식품의 제조에도 사용할 수 있다.

특정 실시형태에 따르면, 용해된 바이오매스를 세척하는 단계는 바이오매스 현탁액을 5 이하의 pH로 산성화하는 단계를 포함한다. 피코시아닌 추출 후에 획득된 잔류 바이오매스는 건조물을 기준으로 적어도 60% 단백질 및 적어도 건조물을 기준으로 20% 미만의 총 당 함량 및/또는 건조물을 기준으로 10% 미만의 글리코겐 함량 및/또는 건조물을 기준으로 적어도 5%의 지방 함량을 포함한다. 단백질이 풍부한 바이오매스를 회수하는 이러한 방법은 특히 2018년 9월 5일에 출원된 특허 출원 FR 1857950에 기재되어 있다.

실시예.

재료 및 방법.

균주.

갈디에리아 술푸라리아 UTEX#2919, 또한 시아니듐 칼다륨으로도 불린다.

유가식 방식에서의 성장 조건.

전용 액체 핸들러 및 컴퓨터 스테이션에 의한 관리 하에 유용한 부피 1 내지 2 L의 생물반응기에서 배양을 수행한다. 배양물의 pH를 염기 (암모니아 용액 14% NH3 w/w) 및/또는 산 (4N 황산 용액)을 첨가하여 조절한다. 배양 온도를 37℃로 설정한다. 2개의 교반 스핀들(spindle)에 의해 교반을 수행한다: 1개의 Rushton 터빈에는 6개의 직선 블레이드가 스파저(sparger) 위의 교반 샤프트(shaft) 하부에 위치하고 1개의 HTPG2 3날 프로펠러는 교반 샤프트 상에 배치된다. 교반 샤프트의 회전 속도 (250 내지 1800 rpm), 공기 및/또는 산소의 흐름에 의해 배양 전반에 걸쳐 배지 중 액상의 용존 산소 압력을 조절한다. 관리 자동화 장치에 혼입된 조절 매개변수를 통해 동일한 온도, 압력 및 배지 조성 조건에서 공기에 의한 포화 값의 5 내지 30%로 구성된 액상의 용존 산소 부분 압력을 유지할 수 있다. 배양 시간은 50 내지 300시간으로 구성하였다.

연속 방식 배양 조건.

전용 액체 핸들러 및 컴퓨터 스테이션에 의한 관리 하에 유용한 부피 1 내지 2 L의 반응기에서 배양을 수행한다. 배양물의 pH를 염기 (암모니아 용액 14% (w NH3/w) 및/또는 산 (4N 황산 용액)을 첨가하여 조절한다. 배양 온도를 37℃로 설정한다. 2개의 교반 스핀들에 의해 교반을 수행한다: 1개의 Rushton 터빈에는 6개의 직선 블레이드가 스파저 위의 교반 샤프트 하부에 위치하고 1개의 HTPG2 3날 프로펠러는 교반 샤프트 상에 배치된다. 교반 샤프트의 회전 속도 (250 내지 1800 rpm), 공기 및/또는 산소의 흐름에 의해 배양 전반에 걸쳐 배지 중 액상의 용존 산소 압력을 조절한다. 관리 자동화 장치에 혼입된 조절 매개변수를 통해 동일한 온도, 압력 및 배지 조성 조건에서 공기에 의한 포화 값의 5 내지 30%로 구성된 액상의 용존 산소 부분 압력을 유지할 수 있다. 배양 시간은 50 내지 300시간으로 구성하였다. 연속발효기의 공급율을 조절하여 배양 배지 중 탄소 공급원이 검출되는 시간이 없도록 하였다.

공급 배지

유가식 또는 연속식 공급 배지의 경우, 탄소 공급원의 양을 유가식 종료 시 목표 건조 중량 또는 연속 배양의 경우 100 g/L 건조 중량으로 조정한다. 배지의 다른 모든 요소는 실시예에서 규정된 출발 물질 배지에 사용된 비율로 첨가한다.

배양 모니터링.

건조 질량을 측정함으로써 성장을 모니터링한다 (GF/F 필터, Whatman 상에서 여과한 후, 최소 24시간 동안 105℃에서 오븐에서 건조한 후 중량 측정함).

포르피린의 측정.

H₂SO₄ 등용매 방식 (5 mM) 및 RI (굴절률) 검출에서 HPLC (Shimatsu)에 의해 유기산 측정을 수행하였다.

PC의 측정.

건조물 그램당 피코시아닌 함량의 추정을 Moon 및 동료들에 의한 문헌[Moon et al., Korean J. Chem. Eng., 2014, 1-6]에 기재된 공정을 사용하여 상이한 배양 시간에 수행하였다.

글리코겐의 측정.

건조물 그램당 글리코겐 함량의 추정을 Martinez-Garcia 및 동료들에 의한 문헌[Martinez-Garcia et al., Int J Biol Macromol. 2016; 89:12-8]에 기재된 추출 공정을 사용하여 상이한 배양 시간에 수행하였다.

실시예 1: 숙성 상을 갖는 글리세롤 상에 유가식 발효.

배양 배지.

출발 물질: 30 g/L 글리세롤, 8 g/L (NH₄)₂SO₄, 250 mg/L KH₂PO₄, 716 mg/L MgSO₄, 44 mg/L CaCl₂, 2H₂O, 0.2843849 g/L K₂SO₄, 0.07 g/L FeSO₄, 7H₂O, 0.01236 g/L Na₂EDTA, 0.00657 g/L ZnSO₄, 7H₂O, 0.0004385 g/L CoCl₂, 6H₂O, 0.00728 g/L MnCl₂, 4H₂O, 0.005976 g/L (NH₄)6Mo₇O₂₄, 4H₂O, 0.005976 g/L CuSO₄, 5H₂O, 0.00016 g/L NaVO₃, 0.01144 g/L H₃BO₃, 0.00068 g/L Na₂SeO₃.

결과는 도 2 및 3에 제시되어 있다.

실시예 2: 숙성 상을 갖는 글루코스 상에 유가식 발효.

배양 배지.

출발 물질: 30 g/L 글루코스, 8 g/L (NH₄)₂SO₄, 250 mg/L KH₂PO₄, 716 mg/L MgSO₄, 44 mg/L CaCl₂, 2H₂O, 0.2843849 g/L K₂SO₄, 0.07 g/L FeSO₄, 7H₂O, 0.01236 g/L Na₂EDTA, 0.00657 g/L ZnSO₄, 7H₂O, 0.0004385 g/L CoCl₂, 6H₂O, 0.00728 g/L MnCl₂, 4H₂O, 0.005976 g/L (NH₄)6Mo₇O₂₄, 4H₂O, 0.005976 g/L CuSO₄,5H₂O, 0.00016 g/L NaVO₃, 0.01144 g/L H₃BO₃, 0.00068 g/L Na₂SeO₃.

결과는 도 4 및 5에 제시되어 있다.

실시예 3: 숙성 상을 갖는 수크로스 상에 유가식 발효.

배양 배지.

출발 물질: 30 g/L 수크로스, 8 g/L (NH₄)₂SO₄, 250 mg/L KH₂PO4, 716 mg/L MgSO₄, 44 mg/L CaCl₂, 2H₂O, 0.2843849 g/L K₂SO₄, 0.07 g/L FeSO₄, 7H₂O, 0.01236 g/L Na₂EDTA, 0.00657 g/L ZnSO₄, 7H₂O, 0.0004385 g/L CoCl₂, 6H₂O, 0.00728 g/L MnCl₂, 4H₂O, 0.005976 g/L (NH₄)6Mo₇O₂₄, 4H₂O, 0.005976 g/L CuSO₄, 5H₂O, 0.00016 g/L NaVO₃, 0.01144 g/L H₃BO₃, 0.00068 g/L Na₂SeO₃.

결과는 도 6 및 7에 제시되어 있다.

실시예 4: 숙성 상을 갖는 우유 투과물 상에 유가식 발효.

배양 배지.

출발 물질: 30 g/L 우유 투과물, 8 g/L (NH₄)2SO₄, 716 mg/L MgSO₄, 0.07 g/L FeSO₄, 7H₂0, 0.01236 g/L Na₂EDTA, 0.00657 g/L ZnSO₄, 7H₂O, 0.0004385 g/L CoCl₂, 6H₂O, 0.00728 g/L MnCl₂, 4H₂O, 0.005976 g/L (NH₄)6Mo₇O₂₄, 4H₂O, 0.005976 g/L CuSO₄, 5H₂O, 0.00016 g/L NaVO₃, 0.01144 g/L H₃BO₃, 0.00068 g/L Na₂SeO₃.

결과는 도 8 및 9에 제시되어 있다.

실시예 5: 글리세롤 상의 갈디에리아 균주의 연속 배양.

배양 배지.

출발 물질: 30 g/L 글리세롤, 8 g/L (NH₄)₂SO₄, 250 mg/L KH₂PO_4, 716 mg/L MgSO₄, 44 mg/L CaCl_2,2H₂O, 0.2843849 g/L K₂SO4, 0.07 g/L FeSO₄, 7H₂0, 0.01236 g/L Na₂EDTA, 0.00657 g/L ZnSO₄, 7H₂O, 0.0004385 g/L CoCl₂, 6H₂O, 0.00728 g/L MnCl₂, 4H₂O, 0.005976 g/L (NH₄)6Mo₇O₂₄, 4H₂O, 0.005976 g/L CuSO₄, 5H₂O, 0.00016 g/L NaVO₃, 0.01144 g/L H₃BO₃, 0.00068 g/L Na₂SeO_3.

결과는 도 10 및 11에 제시되어 있다.

실시예 6: 우유 투과물 상의 갈디에리아 균주의 연속 배양.

배양 배지.

출발 물질: 출발 물질: 30 g/L 우유 투과물, 8 g/L (NH₄)₂SO₄, 716 mg/L MgSO₄, 0.2843849 g/L K₂SO₄, 0.07 g/L FeSO₄, 7H₂O, 0.01236 g/L Na₂EDTA, 0.00657 g/L ZnSO₄, 7H₂O, 0.0004385 g/L CoCl₂, 6H₂O, 0.00728 g/L MnCl₂, 4H₂O, 0.005976 g/L (NH₄)6Mo₇O₂₄, 4H₂O, 0.005976 g/L CuSO₄, 5H₂O, 0.00016 g/L NaVO₃, 0.01144 g/L H₃BO₃, 0.00068 g/L Na₂SeO₃.

결과는 도 12 및 13에 제시되어 있다.

실시예 7: 바이오매스 냉각의 부재 하의 HHP 분쇄

절차

연속 배양물로부터의 바이오매스를 연속 원심분리에 의해 세척한 다음 1.4.10¹⁰ 세포/mL의 농도로 농축한다. 그런 다음 1L의 바이오매스를 16℃로 냉각한 다음 각 시리즈 사이에 냉각 없이 Bertoli Atomo 균질화기에서 1200 bar에서 3회의 연속 균질화를 수행한다. 각각에 대해 바이오매스의 온도, Malassez 세포에 의한 계수에 의한 세포 용해 및 바이오매스 내 피코시아닌 농도를 모니터링한다.

3회의 연속 균질화에 대해 측정된 분쇄 온도는 각각 46.7℃, 57.6℃ 및 67℃이다.

용해되지 않은 세포의 백분율과 피코시아닌 함량은 도 12에 나와 있다.

실시예 8: 바이오매스 냉각의 존재 하의 HHP 분쇄.

절차

연속 배양물로부터의 바이오매스를 연속 원심분리에 의해 세척한 다음 2.10¹⁰ 세포/mL의 농도로 농축한다. 그런 다음 1L의 바이오매스를 16℃로 냉각한 다음 Bertoli Atomo 균질화기에서 1200 bar에서 3회 연속 균질화한다. 각 균질화 사이에 바이오매스의 온도를 다시 16℃로 복귀시킨다. 같은 방식으로 바이오매스의 온도, Malassez 세포 계수에 의한 세포 용해 및 바이오매스 내 피코시아닌 농도를 모니터링한다.

분쇄 공정의 시작과 끝에서 측정된 바이오매스 온도는 다음과 같다.

용해되지 않은 세포의 백분율과 피코시아닌 함량은 도 13에 나와 있다.

또한 분쇄된 바이오매스의 pH가 산성일수록 피코시아닌이 열에 의한 분해에 더 민감하다는 것이 발견되었다. 따라서 분쇄 방법에 열 방출이 수반되는지 관계없이 세포를 분쇄하기 전에 세포의 pH를 5 내지 7로 조정하는 것이 바람직하다.

실시예 9: 바이오매스 내 피코시아닌의 열민감성.

절차.

연속 배양으로부터의 바이오매스를 연속 원심분리에 의해 세척하고 150 mg/g의 건조물로 농축한 후 안료의 보존 및 90%의 용해율을 가능하게 하는 조건 하에 볼 밀 (WAB, multilab)에 의해 분쇄한다. 용해물 샘플을 pH 2.4 내지 6으로 조정하고 0 내지 120분의 동역학을 50 내지 70℃ 범위의 다양한 온도에서 수행한다. 각 시간에 피코시아닌의 정량화를 수행한다.

결과는 도 14에 제시되어 있다.

실시예 10: 분쇄 및 온도 제어에 대한 비드 크기의 영향.

절차.

갈디에리아 술푸라리아 세포를 20,000 g에서 5분 동안 원심분리한 다음 10 mM Tris-Cl 완충액 pH 7에 재현탁한다. 2 mL Safelock Eppendorf 튜브의 부피의 1/3의 세포 분취량에 이 현탁액을 충전하고, 나머지 1/3은 시험 작경의 세라믹 비드로 충전한다 (Netzsch 0.8 mm; 0.6 mm; 0.3 mm; 플러스 0.2 mm; 나노 0.2 mm; 플러스 0.1 mm; 및 0.05 mm). 튜브를 TissueLyser II 장치 (Qiagen)에 넣고 30 Hz에서 2분 동안 교반한다. 용해율을 비드가 포함되지 않은 대조군 튜브와 비교하여 Malassez 세포 수로 계산한다.

결과는 도 15에 제시되어 있다.

비드의 직경이 분쇄 효율에 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있다. 비드 직경이 감소함에 따라 0.2 mm 직경의 비드에서 최적에 도달할 때까지 용해율이 증가한다. 이 직경 아래에서 용해 효율은 0.05 mm의 직경의 비드의 최저 비율에 도달할 때까지 다시 감소한다.

분쇄 시간이 증가하면 더 큰 비드를 사용하여 100%에 가까운 분쇄율을 달성할 수 있다. 그러나 분쇄 시간을 늘리면 볼 밀 공급율이 부과되어 분쇄 챔버의 온도가 상승한다. 이 온도 상승은 용해된 바이오매스의 피코시아닌 함량을 감소시킨다.

실시예 11: 분쇄율에 대한 챔버 충전율의 영향.

절차.

세포를 WAB의 Multilab 모델 볼 밀에서 분쇄한다. 분쇄 챔버의 50% 및 65%를 직경 0.8 mm의 세라믹 비드로 충전한다. 65% 충전율이 최대 충전율이다. 분쇄 모듈 속도와 유속은 두 경우 모두 동일하다. 분쇄 출구에서의 용해율을 분쇄되지 않은 유입 바이오매스와 비교하여 Malassez 세포에서 계수하여 계산한다.

챔버가 제조사가 권장하는 최대 충전율, 즉 65%일 때 최고의 용해율이 획득됨을 알 수 있다. 충전율이 65% 미만이면 용해율이 감소한다.

실시예 12: 분쇄율 및 온도 제어에 대한 세포 농도의 영향.

절차.

세포를 WAB의 Multilab 모델 볼 밀에서 분쇄한다. 분쇄 챔버를 65%의 비율로 0.8 mm 직경의 세라믹 비드로 충전한다. 분쇄 모듈 속도와 유속은 모든 경우에 동일하다. 분쇄 출구에서의 용해율을 분쇄되지 않은 유입 바이오매스와 비교하여 Malassez 세포 수에 의해 계산한다.

동일한 분쇄 매개변수 (분쇄 모듈 속도, 공급율, 챔버 충전율, 비드 직경)에 대해 획득된 용해율은 분쇄될 산물 (바이오매스 10%, 20% 또는 30% 건조물)의 세포 농도와 상관없이 동일하였음을 알 수 있다. 그러나 유입 산물의 건조 질량이 높을수록 밀에서 배출되는 용해물의 온도가 높아진다는 점에 유의해야 한다. 유입 건조 질량을 증가시켜 분쇄 단계의 생성성을 높이려면 용해물 온도를 45℃ 미만으로 유지하는데 적합한 냉각 용량이 제공되어야 한다.

실시예 13: 산업용 볼 밀에서 유속의 추정.

재료 및 방법.

균주: 갈디에리아 술푸라리아 (시아니듐 칼다륨이라고도 불림) UTEX#2919

절차.

세포를 WAB의 Multilab 모델 볼 밀에서 분쇄한다. 분쇄 챔버 (600mL)를 65%의 비율로 0.8 mm 직경의 세라믹 비드로 충전한다. 분쇄 모듈의 속도와 공급율은 두 경우 모두 동일하다. 밀 출구에서의 용해율을 분쇄되지 않은 바이오매스 입구와 비교하여 Malassez 세포 수에 의해 계산한다. 95 내지 100%의 분쇄율에 대해 이러한 조건에서 적용되는 유량은 시간당 1 내지 2리터이다. 이러한 유속의 추정은 실시예 10에서 획득된 결과를 사용하여 이루어졌다.

참조문헌

Claims

단세포 홍조류(unicellular red algae; URA)의 배양 및 가치증대화(valorization)를 위한 최적화된 공정으로서, URA를 발효 배양하는 단계 (a), 바이오매스(biomass)를 회수하는 단계 (b) 및 세포를 용해하는 단계 (c) 및 필요한 경우, 용해된 바이오매스로부터의 가치증대화 가능한 산물을 추출하는 단계 (d)를 포함하고, 분쇄 동안 바이오매스를 50℃ 미만의 온도에서 유지시키면서 분쇄시킴으로써 용해하는 단계 (c1)을 포함하는 것을 특징으로 하는 최적화된 공정.
제1항에 있어서, 용해된 바이오매스의 총 부피의 총 3배 미만의 총 물의 양으로 연속 세척에 의한 용해된 바이오매스로부터의 피코시아닌 (phycocyanin)을 추출하는 단계 (d1)을 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
제1항 또는 제2항에 있어서, 다음 단계
배양 배지로의 탄소 공급원 유입이 제한된 숙성 상(maturation phase)에 발효 배양하는 단계 (a1), 및/또는
발효액(fermentation juice)으로부터의 포르피린(porphyrin)을 추출하는 단계 (b1)
중 하나를 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 공정.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, URA는 시아니디오쉬존(Cyanidioschyzon), 시아니듐(Cyanidium) 또는 갈디에리아(Galdieria) 속(genus)에 속하는 것을 특징으로 하는 공정.
제4항에 있어서, URA는 갈디에리아 속 및 술푸라리아(sulphuraria) 종(species)에 속하는 것을 특징으로 하는 공정.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, URA는 유가식(fed-batch) 또는 연속식 방식의 발효에 의해 성장되는 것을 특징으로 하는 공정.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 분쇄 온도는 47℃를 초과하지 않는 것을 특징으로 하는 공정.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 분쇄 온도는 40℃를 초과하지 않는 것을 특징으로 하는 공정.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 온도는 밀 재킷(mill jacket)의 수냉 시스템에 의해 유지되는 것을 특징으로 하는 공정.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 온도는 20℃ 미만의 온도로 미리 냉각된 바이오매스를 밀에 주입함으로써 유지되는 것을 특징으로 하는 공정.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 피코시아닌이 용해된 바이오매스의 세척 용액으로부터 회수되는 것을 특징으로 하는 공정.
단세포 홍조류(URA)의 배양 및 가치증대화를 위한 최적화된 공정으로서, URA를 발효 배양하는 단계 (a), 바이오매스를 회수하는 단계 (b) 및 세포를 용해하는 단계 (c) 및 필요한 경우, 용해된 바이오매스로부터의 가치증대화 가능한 산물을 추출하는 단계 (d)를 포함하고, 다음 단계
배양 배지 중 탄소 공급원을 제한함을 포함하는 숙성 상에 발효 배양하는 단계 (a1),
및 필요한 경우, 다음 단계
발효액으로부터의 포르피린을 추출하는 단계 (b1), 및/또는
분쇄 동안 바이오매스를 50℃ 미만의 온도에서 유지시키면서 분쇄시킴으로써 용해하는 단계 (c1), 및/또는
필요한 경우, 용해된 바이오매스의 총 부피의 4배 미만의 총 물의 양으로 적어도 2회의 연속 세척에 의한 용해된 바이오매스로부터의 피코시아닌을 추출하는 단계 (d1)
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 최적화된 공정.
단세포 홍조류(URA)의 배양 및 가치증대화를 위한 최적화된 공정으로서, URA를 발효 배양하는 단계 (a), 바이오매스를 회수하는 단계 (b) 및 세포를 용해하는 단계 (c) 및 필요한 경우, 용해된 바이오매스로부터의 가치증대화 가능한 산물을 추출하는 단계 (d)를 포함하고, 다음 단계
발효액으로부터의 포르피린을 추출하는 단계 (b1),
및 필요한 경우, 다음 단계
배양 배지로의 탄소 공급원 유입을 제한함을 포함하는 숙성 상에 발효 배양하는 단계 (a1), 및/또는
분쇄 동안 바이오매스를 50℃ 미만의 온도에서 유지시키면서 분쇄시킴으로써 용해하는 단계 (c1), 및/또는
용해된 바이오매스의 총 부피의 총 4배 미만을 나타내는 물의 양으로 적어도 2회의 연속 세척에 의한 용해된 바이오매스로부터의 피코시아닌을 추출하는 단계 (d1)
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 최적화된 공정.
단세포 홍조류(URA)의 배양 및 가치증대화를 위한 최적화된 공정으로서, URA를 발효 배양하는 단계 (a), 바이오매스를 회수하는 단계 (b), 세포를 용해하는 단계 (c), 및 필요한 경우, 용해된 바이오매스로부터의 가치증대화 가능한 산물을 추출하는 단계 (d)를 포함하고, 다음 단계
용해된 바이오매스의 총 부피의 총 4배 미만을 나타내는 물의 양으로 적어도 2회의 연속 세척에 의한 용해된 바이오매스로부터 피코시아닌을 추출하는 단계 (d1),
및 필요한 경우, 다음 단계
배양 배지로의 탄소 공급원 유입을 제한함을 포함하는 숙성 상에 발효 배양하는 단계 (a1), 및/또는
발효액으로부터의 포르피린을 추출하는 단계 (b1), 및/또는
분쇄 동안 바이오매스를 50℃ 미만의 온도에서 유지시키면서 분쇄시킴으로써 용해하는 단계 (c1),
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 최적화된 공정.
제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, URA는 시아니디오쉬존, 시아니듐 또는 갈디에리아 속에 속하는 것을 특징으로 하는 공정.
제15항에 있어서, URA는 갈디에리아 속 및 술푸라리아 종에 속하는 것을 특징으로 하는 공정.
제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, URA는 유가식 또는 연속식 방식의 발효에 의해 성장되는 것을 특징으로 하는 공정.
제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 피코시아닌이 용해된 바이오매스의 세척 용액으로부터 회수되는 것을 특징으로 하는 공정.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 공정에 의해 획득된 용해된 바이오매스.
제3항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 공정에 의해 획득된 포르피린.
제2항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 공정에 의해 획득된 피코시아닌.
제19항에 따른 용해된 바이오매스 또는 제21항에 따른 피코시아닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 또는 식품 보충제.