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KR20210100224A - 암모니아-산화 니트로소모나스 유트로파 균주 d23 - Google Patents

암모니아-산화 니트로소모나스 유트로파 균주 d23 Download PDF

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KR20210100224A
KR20210100224A KR1020217024983A KR20217024983A KR20210100224A KR 20210100224 A KR20210100224 A KR 20210100224A KR 1020217024983 A KR1020217024983 A KR 1020217024983A KR 20217024983 A KR20217024983 A KR 20217024983A KR 20210100224 A KR20210100224 A KR 20210100224A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
eutropha
gene
bacterium
ammonia
seq
Prior art date
Application number
KR1020217024983A
Other languages
English (en)
Inventor
데이빗 알. 휘틀록
요아니스 그릴로스
스피로스 자마스
래리 바이스
Original Assignee
에이오바이오미 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에이오바이오미 엘엘씨 filed Critical 에이오바이오미 엘엘씨
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Abstract

본 개시내용은, 특히, D23, D23-100, 또는 AOB D23-100로 지정된 니트로소모나스 유트로파 (N. 유트로파)의 최적화된 균주를 제공한다. 본원에서 개시된 N. 유트로파 박테리아는 요망되는 특성, 예를 들면, 최적화된 특성, 예컨대 병원성 박테리아의 성장을 억제하는 능력, 및 산화질소 및 산화질소 전구체를 생산하는 증대된 능력을 갖는다. 본 명세서의 N. 유트로파는, 예를 들면, 낮은 니트라이트 수준과 관련된 질환, 피부 질환, 및 병원성 박테리아에 의해 야기된 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

Description

암모니아-산화 니트로소모나스 유트로파 균주 D23{AMMONIA-OXIDIZING NITROSOMONAS EUTROPHA STRAIN D23}
본원은 그리스 특허 출원 번호 20140100217(2014년 4월 15일 출원), 미국 가출원 번호 62/002084(2014년 5월 22일 출원), 미국 가출원 번호 62/012811(2014년 6월 16일 출원), 미국 가출원 번호 62/053588(2014년 9월 22일 출원), 및 그리스 특허 출원 번호 20150100115(2015년 3월 13일 출원)을 우선권으로 주장하고, 이들의 내용은 그것의 전체가 참고로 본 명세서에 편입되어 있다.
서열목록
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유익한 박테리아는 병원성 박테리아의 성장을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 박테리아 및 다른 미생물은 환경에서 도처에 존재한다. 병원성 박테리아의 발견 및 질환의 세균 이론은 건강 및 질환 상태에 대한 엄청난 영향을 가졌다. 박테리아는 모든 생물의 환경의 정상적인 부분이다. 소화관에서, 이들 박테리아는 정상 조건 하에서 병원성이 아니고, 사실상 질환 야기 유기체에 대해 더 쾌적한 정상 장 내용물이 덜 쾌적하도록 하여 건강을 개선한다. 질환 예방은 수많은 방법으로 달성된다: 영양소는 소비되고, 병원체에 대해 적게 남아 있고; 조건, 예컨대 pH 및 산소 긴장이 생성되고, 이것은 병원체에 대해 쾌적하지 않다; 병원체에 대해 독성있는 화합물이 생산되고; 병원체는 이들 미생물에 의해 음식으로서 소비되고; 더 적은 물리적 공간이 병원체에 대해 이용가능한 채로 남아 있고; 그리고 특정 결합 부위는 병원체에 대해 이용가능한 더 적은 결합 부위를 남겨둔 채로 점거된다. 이들 요망되는 박테리아의 존재는 질환 상태를 예방하는데 유용한 것으로 보여진다.
병원성 박테리아의 성장을 억제할 수 있는 개선된 유익한 박테리아가 당해기술에서 필요하다.
요약
본 개시내용은, 특히, 니트로소모나스 유트로파 (N. 유트로파)의 최적화된 균주 지정된 D23, D23-100 또는 AOB D23-100을 제공하고, 이들 용어들은 본 개시내용 전체를 통해 상호교환적으로 사용될 수 있다.
니트로소모나스 속의 암모니아 산화 박테리아는 에너지를 암모니아의 니트라이트로의 전환으로부터 배타적으로 생성하는 독특한 수용력을 갖는 도처에 존재하는 그램-음성 무조건 화학무기영양 박테리아이다.
본원에서 개시된 N. 유트로파 박테리아는 요망되는, 예를 들면 최적화된, 특성 예컨대 the 병원성 박테리아의 성장을 억제하는 능력, 및 산화질소 (NO) 및 산화질소 (NO2 -) 전구체를 생산하는 증대된 능력을 갖는다. N. 유트로파, 예를 들면, 최적화된 N. 유트로파, 예를 들면, 본 명세서의 최적화된 N. 유트로파의 정제된 제제는 예를 들면, 질환, 예를 들면, 낮은 니트라이트 수준과 관련된 질환, 피부 장애, 및 병원성 박테리아에 의해 야기된 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 개시내용 전체를 통해 N. 유트로파에 대해 언급할 때, N. 유트로파의 최적화된 균주 또는 최적화된 N. 유트로파의 정제된 제제를 언급할 수 있다.
본 개시내용은, 특히, 니트로소모나스 유트로파 (N. 유트로파) 박테리움, 예를 들면, 최적화된 N. 유트로파, 예를 들면, 하기로부터 선택된 적어도 1종의 특성을 갖는 최적화된 N. 유트로파의 정제된 제제를 제공한다:
최적화된 성장률;
최적화된 NH4 + 산화 비율; 및
암모늄 이온 (NH4 +)에 대한 최적화된 내성.
박테리움은 임의로 무균이다.
구현예에서, 최적화된 성장률은 약 1 내지 2일 내에 약 0.5-0.6의 OD600에 도달하도록 약 0.15-0.18의 OD600 (600 nm의 광학 밀도)에서 N. 유트로파의 계속되는 배양을 허용하는 비율이다. 구현예에서, 최적화된 성장률은 회분식 배양 조건 하에서 배양될 때 약 8 시간의 배가 시간이다. 구현예에서, 최적화된 NH4 + 산화 비율은 적어도 약 125 마이크로몰 / NH4 +를 NO2 -의 산화시키는 분의 비율이다. 구현예에서, NH4 +에 대한 최적화된 내성은 적어도 약 48 시간 동안 약 200 mM NH4 +을 포함하는 배지에서 성장하는 능력이다.
일부 구현예에서, 최적화된 N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)의 정제된 제제는 하기로부터 선택된 적어도 2개의 특성을 갖는다: 최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 및 NH4 +에 대한 최적화된 내성. 일부 구현예에서, 최적화된 N. 유트로파의 정제된 제제 박테리움 (이것은 임의로 무균임)은 하기를 갖는다: 최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 및 NH4 +에 대한 최적화된 내성. 일부 구현예에서, 최적화된 N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)의 정제된 제제는 서열식별번호:1에 대한 초고 엄격성 하에서 혼성화되는 염색체를 포함한다.
일부 구현예에서, 최적화된 N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)의 정제된 제제는 하기를 포함한다: 서열식별번호: 6 또는 12에 대한 동일성을 갖는 AmoA 단백질 (상기 동일성은 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 및 100% 동일성으로부터 선택됨), 서열식별번호: 8 또는 14에 대한 동일성을 갖는 AmoB 단백질 (상기 동일성은 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 및 100% 동일성으로부터 선택됨), 서열식별번호: 4, 10, 또는 16에 대한 동일성을 갖는 amoC 유전자 (상기 동일성은 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 및 100% 동일성으로부터 선택됨), 서열식별번호: 18, 20, 또는 22에 대한 동일성을 갖는 하이드록실아민 산화환원효소 단백질 (상기 동일성은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 및 100% 동일성으로부터 선택됨), 서열식별번호: 24, 26, 또는 28에 대한 동일성을 갖는 사이토크롬 c554 단백질 (상기 동일성은 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 및 100% 동일성으로부터 선택됨), 또는 서열식별번호: 30 또는 32에 대한 동일성을 갖는 사이토크롬 cM552 단백질 (상기 동일성은 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 및 100% 동일성으로부터 선택됨).
일부 구현예에서, 최적화된 N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)의 정제된 제제는 표 2의 서열 특성 중 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 또는 모두를 포함한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 AmoA1 또는 AmoA2 단백질을 포함한다: 위치 1에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 1에서 V. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 AmoA1 또는 AmoA2 단백질을 포함한다: 위치 160에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 160에서 L. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 AmoA1 또는 AmoA2 단백질을 포함한다: 위치 167에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 167에서 A. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 AmoB1 또는 AmoB2 단백질을 포함한다: 위치 33에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 33에서 V. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 AmoB1 또는 AmoB2 단백질을 포함한다: 위치 165에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 165에서 I. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 AmoC3 단백질을 포함한다: 위치 79에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 79에서 A. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 AmoC3 단백질을 포함한다: 위치 271에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 271에서 V. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 Hao1, Hao2, 또는 Hao3 단백질을 포함한다: 위치 85에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 85에서 S. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 Hao1, Hao2, 또는 Hao3 단백질을 포함한다: 위치 312에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 312에서 E. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 Hao1 단백질을 포함한다: 위치 1에서 N. 유트로파 균주 C9163, 예를 들면, 위치 163에서 A. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 c554 CycA1, c554 CycA2, 또는 c554 CycA3 단백질을 포함한다: 위치 65에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 65에서 T. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 c554 CycA1 단백질을 포함한다: 위치 186에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 186에서 T. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 cM552 CycB1 또는 cM552 CycB2 단백질을 포함한다: 위치 63에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 63에서 V. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 cM552 CycB1 또는 cM552 CycB2 단백질을 포함한다: 위치 189에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 189에서 P. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 cM552 CycB1 또는 cM552 CycB2 단백질을 포함한다: 위치 206에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 206에서 insE. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 cM552 CycB1 또는 cM552 CycB2 단백질을 포함한다: 위치 207에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 207에서 insE. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 cM552 CycB1 단백질을 포함한다: 위치 195에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 195에서 insD. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 cM552 CycB1 단백질을 포함한다: 위치 196에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 196에서 insD. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 cM552 CycB1 단백질을 포함한다: 위치 197에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 197에서 insD.
표 2의 2 이상의 서열 특성의 조합이 또한 기재된다. 2 이상의 서열 특성은 동일한 유전자 또는 상이한 유전자 내에 있을 수 있다. 2 이상의 서열 특성은 동일한 단백질 또는 상이한 단백질 내에 있을 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 위치 1에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 1에서 V에 대한 돌연변이 및 위치 160에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 160에서 L에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 AmoA1 또는 AmoA2 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 위치 1에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 1에서 V에 대한 돌연변이 및 위치 167에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 167에서 A에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 AmoA1 또는 AmoA2 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 위치 160에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 160에서 L에 대한 돌연변이 및 위치 167에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 167에서 A에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 AmoA1 또는 AmoA2 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 위치 33에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 33에서 V에 대한 돌연변이 및 위치 165에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 165에서 I에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 AmoB1 또는 AmoB2 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 위치 79에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 79에서 A에 대한 돌연변이 및 위치 271에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 271에서 V에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 AmoC3 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 위치 85에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 85에서 S에 대한 돌연변이 및 위치 312에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 312에서 E에 대한 돌연변이(또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 Hao1, Hao2, 또는 Hao3 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 위치 85에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 85에서 S에 대한 돌연변이 및 위치 163에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 163에서 A에 대한 돌연변이(또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 Hao1 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 위치 312에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 312에서 E에 대한 돌연변이 및 위치 163에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 163에서 A에 대한 돌연변이(또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 Hao1 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 위치 65에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 65에서 T에 대한 돌연변이 및 위치 186에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 186에서 T에 대한 돌연변이(또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 c554 CycA1 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기 아미노산 위치 중 임의의 2 이상에서 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 cM552 CycB1 단백질을 포함한다: 63, 189, 194, 195, 196, 197, 206, 및 207. 예를 들면, 2 이상의 아미노산 위치는 하기를 포함할 수 있다: 63 및 189, 63 및 194, 63 및 195, 63 및 196, 63 및 197, 63 및 206, 63 및 207, 189 및 194, 189 및 195, 189 및 196, 189 및 194, 189 및 195, 189 및 196, 189 및 197, 189 및 206, 189 및 207, 194 및 195, 194 및 196, 194 및 197, 194 및 206, 194 및 207, 195 및 196, 195 및 197, 195 및 206, 195 및 207, 196 및 197, 196 및 206, 196 및 207, 197 및 206, 197 및 207, 또는 206 및 207. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 2 이상의 돌연변이를 갖거나 (그것을 인코딩하는 유전자를 갖는cM552 CycB1 단백질을 포함한다: I63V, S189P, D194G, 195insD, 196insD, 197insD, 206insE, 및 207insE. 예를 들면, 2 이상의 돌연변이는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다: I63V 및 S189P, I63V 및 D194G, I63V 및 195insD, I63V 및 196insD, I63V 및 197insD, I63V 및 206insE, I63V 및 207insE, S189P 및 D194G, S189P 및 195insD, S189P 및 196insD, S189P 및 197insD, S189P 및 206insE, S189P 및 207insE, D194G 및 195insD, D194G 및 196insD, D194G 및 197insD, D194G 및 206insE, D194G 및 207insE, 195insD 및 196insD, 195insD 및 197insD, 195insD 및 206insE, 195insD 및 207insE, 196insD 및 197insD, 196insD 및 206insE, 196insD 및 207insE, 197insD 및 206insE, 197insD 및 207insE, 및 206insE 및 207insE.
일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기 아미노산 위치 중 임의의 2 이상에서 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 cM552 CycB2 단백질을 포함한다: 63, 189, 206, 및 207. 예를 들면, 2 이상의 아미노산 위치는 하기를 포함할 수 있다: 63 및 189, 63 및 206, 63 및 207, 189 및 206, 189 및 207, 또는 206 및 207. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 2 이상의 돌연변이를 갖거나 (그것은 인코딩하는 유전자)를 갖는cM552 CycB2 단백질을 포함한다: I63V, S189P, 206insE, 및 207insE. 예를 들면, 2 이상의 돌연변이는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다: I63V 및 S189P, I63V 및 206insE, I63V 및 207insE, S189P 및 206insE, S189P 및 207insE, 및 206insE 및 207insE.
표 2의 3 이상의 서열 특성의 조합이 또한 기재된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 위치 1에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 1에서 V에 대한 돌연변이 및 위치 160에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 160에서 L, 및 N. 유트로파 균주 C91 at 위치 167, 예를 들면, 위치 167에서 A에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 AmoA1 또는 AmoA2 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 위치 85에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 85에서 S에 대한 돌연변이 및 위치 312에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 312에서 E에 대한 돌연변이, 및 위치 163에서 N. 유트로파 균주 C91, 예를 들면, 위치 163에서 A에 대한 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 Hao1 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에서 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자 인코딩)를 갖는 cM552 CycB1 단백질을 포함한다: 하기 아미노산 위치의 임의의 3 이상 (예를 들면, 4, 5, 6, 7, 또는 모두): 63, 189, 194, 195, 196, 197, 206, 및 207. 예를 들면, 3개의 돌연변이는 위치 195, 196, 및 197에서 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기의 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 cM552 CycB1 단백질을 포함한다: 하기로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 3 이상 (예를 들면, 4, 5, 6, 7 개, 또는 모두)의 돌연변이: I63V, S189P, D194G, 195insD, 196insD, 197insD, 206insE, 및 207insE. 예를 들면, 3개의 돌연변이는195insD, 196insD, 및 197insD일 수 있다.
일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기 아미노산 위치 중 임의의 3 이상 (예를 들면, 모두)에서 돌연변이 (또는 그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는 cM552 CycB2 단백질을 포함한다: 63, 189, 206, 및 207. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기로 구성된 군으로부터 임의의 3 이상 (예를 들면, 모든) 돌연변이 또는 (그것을 인코딩하는 유전자)를 갖는cM552 CycB2 단백질을 포함한다: I63V, S189P, 206insE, 및 207insE.
일부 구현예에서, 박테리움 또는 적어도 2개의 유전자, 예를 들면, 표 2에서 열거된 적어도 2개의 유전자에서 제제는 N. 유트로파 균주 C91에 대한 돌연변이를 포함한다. 2개의 유전자는, 예를 들면, 하기일 수 있다: AmoA1 및 AmoA2, AmoA1 및 AmoB1, AmoA1 및 AmoB2, AmoA1 및 AmoC1, AmoA1 및 AmoC2, AmoA1 및 AmoC3, AmoA1 및 Hao1, AmoA1 및 Hao2, AmoA1 및 Hao3, AmoA1 및 c554 CycA1, AmoA1 및 c554 CycA2, AmoA1 및 c554 CycA3, AmoA1 및 cM552 CycB1, AmoA1 및 cM552 CycB2, AmoA2 및 AmoB1, AmoA2 및 AmoB2, AmoA2 및 AmoC1, AmoA2 및 AmoC2, AmoA2 및 AmoC3, AmoA2 및 Hao1, AmoA2 및 Hao2, AmoA2 및 Hao3, AmoA2 및 c554 CycA1, AmoA2 및 c554 CycA2, AmoA2 및 c554 CycA3, AmoA2 및 cM552 CycB1, AmoA2 및 cM552 CycB2, AmoB1 및 AmoB2, AmoB1 및 AmoC1, AmoB1 및 AmoC2, AmoB1 및 AmoC3, AmoB1 및 Hao1, AmoB1 및 Hao2, AmoB1 및 Hao3, AmoB1 및 c554 CycA1, AmoB1 및 c554 CycA2, AmoB1 및 c554 CycA3, AmoB1 및 cM552 CycB1, AmoB1 및 cM552 CycB2, AmoB2 및 AmoC1, AmoB2 및 AmoC2, AmoB2 및 AmoC3, AmoB2 및 Hao1, AmoB2 및 Hao2, AmoB2 및 Hao3, AmoB2 및 c554 CycA1, AmoB2 및 c554 CycA2, AmoB2 및 c554 CycA3, AmoB2 및 cM552 CycB1, AmoB2 및 cM552 CycB2, AmoC1 및 AmoC2, AmoC1 및 AmoC3, AmoC1 및 Hao1, AmoC1 및 Hao2, AmoC1 및 Hao3, AmoC1 및 c554 CycA1, AmoC1 및 c554 CycA2, AmoC1 및 c554 CycA3, AmoC1 및 cM552 CycB1, AmoC1 및 cM552 CycB2, AmoC2 및 AmoC3, AmoC2 및 Hao1, AmoC2 및 Hao2, AmoC2 및 Hao3, AmoC2 및 c554 CycA1, AmoC2 및 c554 CycA2, AmoC2 및 c554 CycA3, AmoC2 및 cM552 CycB1, AmoC2 및 cM552 CycB2, AmoC3 및 Hao1, AmoC3 및 Hao2, AmoC3 및 Hao3, AmoC3 및 c554 CycA1, AmoC3 및 c554 CycA2, AmoC3 및 c554 CycA3, AmoC3 및 cM552 CycB1, AmoC3 및 cM552 CycB2, Hao1 및 Hao2, Hao1 및 Hao3, Hao1 및 c554 CycA1, Hao1 및 c554 CycA2, Hao1 및 c554 CycA3, Hao1 및 cM552 CycB1, Hao1 및 cM552 CycB2, Hao2 및 Hao3, Hao2 및 c554 CycA1, Hao2 및 c554 CycA2, Hao2 및 c554 CycA3, Hao2 및 cM552 CycB1, Hao2 및 cM552 CycB2, Hao3 및 c554 CycA1, Hao3 및 c554 CycA2, Hao3 및 c554 CycA3, Hao3 및 cM552 CycB1, Hao3 및 cM552 CycB2, c554 CycA1 및 c554 CycA2, c554 CycA1 및 c554 CycA3, c554 CycA1 및 cM552 CycB1, c554 CycA1 및 cM552 CycB2, c554 CycA2 및 c554 CycA3, c554 CycA2 및 cM552 CycB1, c554 CycA2 및 cM552 CycB2, c554 CycA3 및 cM552 CycB1, c554 CycA3 및 cM552 CycB2, 또는 cM552 CycB1 및 cM552 CycB2.
일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기에서 N. 유트로파 균주 C91에 대한 돌연변이를 포함한다: 적어도 3 개의 유전자, 예를 들면, 적어도 3 (예를 들면, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개, 또는 모두) 유전자(표 2에서 열거됨). 3 개의 유전자는, 예를 들면 AmoA1 및 AmoA2 및 AmoA3; AmoC1 및 AmoC2 및 AmoC3; 또는 Hao1 및 Hao2 및 Hao3일 수 있다.
일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 야생형 박테리움 예컨대 N. 유트로파 균주 C91에 대한 적어도 1종의 구조적 차이, 예를 들면, 적어도 1종의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 본 명세서에서 기재된 하기 예의 한 쌍의 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있는 핵산을 포함한다: 서열식별번호:64의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열식별번호:65의 서열을 포함하는 프라이머. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 도 6, 7, 또는 8의 유전자와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 단백질 또는 핵산, 또는 도 6, 7, 또는 8의 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 박테리움 또는 제제는 하기를 포함한다: 서열식별번호:64-66 중 임의의 것의 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한 단백질 또는 핵산 또는 서열식별번호:64-66 중 임의의 것의 서열에 의해 인코딩된 단백질.
일부 측면에서, 본 개시내용은 특히, 암모니아 모노옥시게나제 유전자, 하이드록실아민 산화환원효소 유전자, 사이토크롬 c554 유전자, 또는 사이토크롬 cm552 유전자에서의 돌연변이를 포함하는 N. 유트로파 박테리움, 또는 그것의 정제된 제제를 제공한다. 돌연변이는 야생형 박테리움 예컨대 N. 유트로파 균주 C91에 대한 것일 수 있다. 돌연변이는 amoA1 유전자, amoA2 유전자, amoB1 유전자, amoB2 유전자, 및 amoC3 유전자 중 하나 이상 내의 것일 수 있다. N. 유트로파 박테리움, 또는 그것의 정제된 제제는 본 명세서, 예를 들면, 표 2에서 기재된 위치에서 돌연변이를 가질 수 있다. N. 유트로파 박테리움, 또는 그것의 정제된 제제는 돌연변이를 가질 수 있고, 상기 돌연변이는 본 명세서, 예를 들면, 표 2에서 기재된 돌연변이이다.
일부 구현예에서, 돌연변이는 hao1 유전자, hao2 유전자, 또는 hao3 유전자 중 하나 이상 내에 있을 수 있다. N. 유트로파 박테리움, 또는 그것의 정제된 제제는 본 명세서, 예를 들면, 표 2에서 기재된 위치에서 돌연변이를 가질 수 있다. N. 유트로파 박테리움, 또는 그것의 정제된 제제는 돌연변이를 가질 수 있고, 상기 돌연변이는 본 명세서, 예를 들면, 표 2에서 기재된 돌연변이이다.
일부 구현예에서, 돌연변이는 c554 cycA1 유전자, c554 cycA2 유전자, 및 c554 cycA3 유전자 중 하나 이상 내에 있을 수 있다. N. 유트로파 박테리움, 또는 그것의 정제된 제제는 본 명세서, 예를 들면, 표 2에서 기재된 위치에서 돌연변이를 가질 수 있다. N. 유트로파 박테리움, 또는 그것의 정제된 제제는 돌연변이를 가질 수 있고, 상기 돌연변이는 본 명세서, 예를 들면, 표 2에서 기재된 돌연변이이다.
일부 구현예에서, 돌연변이는 c M 552 cycB1 유전자 및 c M 552 cycB2 유전자 중 하나 이상 내에 있을 수 있다. N. 유트로파 박테리움, 또는 그것의 정제된 제제는 본 명세서, 예를 들면, 표 2에서 기재된 위치에서 돌연변이를 가질 수 있다. N. 유트로파 박테리움, 또는 그것의 정제된 제제는 돌연변이를 가질 수 있고, 상기 돌연변이는 본 명세서, 예를 들면, 표 2에서 기재된 돌연변이이다.
어떤 측면에서 이전의 4개의 단락에서 기재된 N. 유트로파 박테리움, 또는 그것의 정제된 제제는 N. 유트로파 박테리움, 예를 들면, 최적화된 N. 유트로파, 예를 들면, 최적화된 N. 유트로파의 정제된 제제를 기반으롤 할 수 있고, 하기로부터 선택된 적어도 1종의 특성을 갖는다:
최적화된 성장률;
최적화된 NH4 + 산화 비율; 및
암모늄 이온 (NH4 +)에 대한 최적화된 내성.
어떤 측면에서, 이전의 5개의 단락에서 기재된 N. 유트로파 박테리움, 또는 그것의 정제된 제제는 amoA1 유전자, amoA2 유전자, amoB1 유전자, amoB2 유전자, amoC3 유전자, hao1 유전자, hao2 유전자, hao3 유전자, c554 cycA1 유전자, c554 cycA2 유전자, c554 cycA3 유전자, c M 552 cycB1 유전자, 및 c554 cycB2 유전자 중 하나 이상의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35 위치에서 돌연변이를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, N. 유트로파 박테리움은 최적화된 성장률, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 최적화된 성장률, 및 구조적 차이 예컨대 돌연변이 (예를 들면, 야생-표준 균주 예컨대 N. 유트로파 균주 C91에 대한 것), 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 돌연변이, 예를 들면, 표 2의 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, N. 유트로파 박테리움은 최적화된 NH4 + 산화 비율, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 최적화된 NH4 + 산화 비율, 및 구조적 차이 예컨대 돌연변이 (예를 들면, 야생-표준 균주 예컨대 N. 유트로파 균주 C91에 대한 것), 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 돌연변이, 예를 들면, 표 2의 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, N. 유트로파 박테리움은 NH4 +에 대한 최적화된 내성, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 NH4 +에 대한 최적화된 내성, 및 구조적 차이 예컨대 돌연변이 (예를 들면, 야생-표준 균주 예컨대 N. 유트로파 균주 C91에 대한 것), 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 돌연변이, 예를 들면, 표 2의 돌연변이를 갖는다.
일부 구현예에서, N. 유트로파 박테리움은 하기를 사용하여 증폭될 수 있는 핵산을 포함한다: 본 명세서에서 기재된 한 쌍의 프라이머, 예를 들면, 서열식별번호:64의 서열을 포함하는 프라이머 및 서열식별번호:65의 서열을 포함하는 프라이머.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 고 엄격성으로 서열식별번호:1에 혼성화되는 염색체를 포함하는 N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)을 제공한다.
구현예에서, 염색체는 매우 고 엄격성으로 하기 서열식별번호:1에 혼성화된다. 구현예에서, N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)는 하기와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 유전자를 포함한다: 도 6-8의 하나 이상의 유전자 (예를 들면, 도 6, 7, 및 8 중 임의의 하나 이상의 10, 20, 30, 40, 50, 100, 또는 모두 유전자).
구현예에서, N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)는 서열식별번호: 2 (pNeut1) 또는 서열식별번호: 3 (pNeut2)와 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 임의의 플라스미드가 없다 (Stein 등 Whole-genome analysis of the ammonia-oxidizing bacterium, 니트로소모나스 유트로파 C91: implications for niche adaptation. Environmental Microbiology (2007) 9(12), 2993-3007에서 기재됨). 구현예에서, N. 유트로파 (이것은 임의로 무균임)는 하기의 플라스미드 상에 존재하는 하나 이상의 유전자가 없다: 서열식별번호: 2 또는 서열식별번호: 3. 예를 들면, N. 유트로파 (이것은 임의로 무균임)는 pNeut1 및 pNeut2 중 하나 또는 둘 모두 상에 존재하는 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 15, 또는 20 유전자가 없을 수 있다. pNeut1은 55 단백질-코딩 서열을 함유하고, 한편 pNeutP2는 52 단백질-코딩 서열을 함유한다. 구현예에서, N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)은 임의의 플라스미드가 없다.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기 중 하나 이상을 포함하는 N. 유트로파 박테리움 (이것은 무균임)을 제공한다: 서열식별번호:7와 적어도 약 98.9% 동일한 amoA1 유전자 및 서열식별번호:13와 적어도 약 98.8% 동일한 amoA2 유전자.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기 중 하나 이상을 포함하는 N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)을 제공한다: 서열식별번호:6과 적어도 약 99.0% 동일한 AmoA1 단백질 및 서열식별번호:12와 적어도 약 99.0% 동일한 AmoA2 단백질.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기 중 하나 이상을 포함하는 N. 유트로파 박테리움 (이것은 무균임)을 제공한다: 서열식별번호:9와 적어도 약 99.2% 동일한 amoB1 유전자 및 서열식별번호:15와 적어도 약 99.2% 동일한 amoB2 유전자.
구현예에서, N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)은 추가로, 하기 중 하나 이상을 포함한다: 서열식별번호:7 또는 13와 적어도 약 98.9% 동일한 amoA1 또는 amoA2 유전자.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기 중 하나 이상을 포함하는 N. 유트로파 박테리움 (이것은 무균임)을 제공한다: 서열식별번호:8와 적어도 약 99.6% 동일한 AmoB1 단백질 및 서열식별번호:14와 적어도 약 99.6% 동일한 AmoB1 단백질.
구현예에서, N. 유트로파 박테리움 (이것은 임으로 무균임)은 추가로, 하기 중 하나 이상을 포함한다: 서열식별번호:6과 적어도 약 99.0% 동일한 AmoA1 단백질 및 서열식별번호:12와 적어도 약 99.0% 동일한 AmoA2 단백질.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기 중 하나 이상을 포함하는 N. 유트로파 박테리움 (이것은 무균임)을 제공한다: 서열식별번호:5와 적어도 약 99.9% 동일한 amoC1 유전자, 서열식별번호:11과 적어도 약 99.9% 동일한 amoC2 유전자, 및 서열식별번호:17와 적어도 약 99.0% 동일한 amoC3 유전자.
구현예에서, N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)은 추가로, 하기 중 하나 이상을 포함한다: 서열식별번호:7와 적어도 약 98.9% 동일한 amoA1 유전자, 서열식별번호:13와 적어도 약 98.9% 동일한 amo2 유전자, 서열식별번호:9와 적어도 약 99.2% 동일한 amoB1 유전자, 및 서열식별번호:15와 적어도 약 99.2% 동일한 amoB2 유전자.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호:16와 적어도 약 99.4% 동일한 AmoC3 단백질을 포함하는 N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)을 제공한다.
구현예에서, N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)은, 추가로 하기 중 하나 이상을 포함한다: 서열식별번호:6과 적어도 약 99.0% 동일한 AmoA1 단백질, 서열식별번호:12와 적어도 약 99.0% 동일한 AmoA2 단백질, 서열식별번호:8와 적어도 약 99.6% 동일한 AmoB1 단백질, 및 서열식별번호:14와 적어도 약 99.6% 동일한 AmoB1 단백질.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기 중 하나 이상을 포함하는 N. 유트로파 박테리움 (이것은 무균임)을 제공한다: 서열식별번호:19와 적어도 약 99.1% 동일한 hao1 유전자, 서열식별번호:21과 적어도 약 99.5% 동일한 hao2 유전자, 및 서열식별번호:23와 적어도 약 99.3% 동일한 hao3 유전자.
구현예에서, N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)은 추가로, 하기 중 하나 이상을 포함한다: 서열식별번호:7와 적어도 약 98.9% 동일한 amoA1 유전자, 서열식별번호:13와 적어도 약 98.9% 동일한 amo2 유전자, 서열식별번호:9와 적어도 약 99.2% 동일한 amoB1 유전자, 서열식별번호:15와 적어도 약 99.2% 동일한 amoB2 유전자, 서열식별번호:5와 적어도 약 99.9% 동일한 amoC1 유전자, 서열식별번호:11과 적어도 약 99.9% 동일한 amoC2 유전자, 및 서열식별번호:17와 적어도 약 99.0% 동일한 amoC3 유전자.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기 중 하나 이상을 포함하는 N. 유트로파 박테리움 (이것은 무균임)을 제공한다: 서열식별번호:18와 적어도 약 99.6% 동일한 Hao1 단백질, 서열식별번호:20와 적어도 약 99.7% 동일한 Hao2 단백질, 및 서열식별번호:22와 적어도 약 99.7% 동일한 Hao3 단백질.
구현예에서, N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)은 추가로, 하기를 포함한다: 서열식별번호:6과 적어도 약 99.0% 동일한 AmoA1 단백질, 서열식별번호:12와 적어도 약 99.0% 동일한 AmoA2 단백질, 서열식별번호:8와 적어도 약 99.6% 동일한 AmoB1 단백질, 서열식별번호:14와 적어도 약 99.6% 동일한 AmoB1 단백질, 또는 서열식별번호:16과 적어도 약 99.4% 동일한 AmoC3 단백질.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기 중 하나 이상을 포함하는 N. 유트로파 박테리움 (이것은 무균임)을 제공한다: 서열식별번호:25와 적어도 약 98.1% 동일한 cycA1 유전자, 서열식별번호:27와 적어도 약 98.8% 동일한 cycA2 유전자, 및 서열식별번호:28와 적어도 약 99.4% 동일한 cycA3 유전자.
구현예에서, N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)은 추가로, 하기 중 하나 이상을 포함한다: 서열식별번호:7와 적어도 약 98.9% 동일한 amoA1 유전자, 서열식별번호:13와 적어도 약 98.9% 동일한 amo2 유전자, 서열식별번호:9와 적어도 약 99.2% 동일한 amoB1 유전자, 서열식별번호:15와 적어도 약 99.2% 동일한 amoB2 유전자, 서열식별번호:5와 적어도 약 99.9% 동일한 amoC1 유전자, 서열식별번호:11과 적어도 약 99.9% 동일한 amoC2 유전자, 서열식별번호:17와 적어도 약 99.0% 동일한 amoC3 유전자, 서열식별번호:19와 적어도 약 99.1% 동일한 hao1 유전자, 서열식별번호:21과 적어도 약 99.5% 동일한 hao2 유전자, 및 서열식별번호:23와 적어도 약 99.3% 동일한 hao3 유전자.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기 중 하나 이상을 포함하는 N. 유트로파 박테리움 (이것은 무균임)을 제공한다: 서열식별번호:24와 적어도 약 99.2% 동일한 CycA1 단백질, 서열식별번호:26과 적어도 약 99.7% 동일한 CycA2 단백질, 및 서열식별번호:28와 적어도 약 99.7% 동일한 CycA3 단백질.
구현예에서, N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)은, 추가로 하기 중 하나 이상을 포함한다: 서열식별번호:6과 적어도 약 99.0% 동일한 AmoA1 단백질, 서열식별번호:12와 적어도 약 99.0% 동일한 AmoA2 단백질, 서열식별번호:8와 적어도 약 99.6% 동일한 AmoB1 단백질, 서열식별번호:14와 적어도 약 99.6% 동일한 AmoB1 단백질, 서열식별번호:16과 적어도 약 99.4% 동일한 AmoC3 단백질, 서열식별번호:18와 적어도 약 99.6% 동일한 Hao1 단백질, 서열식별번호:20와 적어도 약 99.7% 동일한 Hao2 단백질, 및 서열식별번호:22와 적어도 약 99.7% 동일한 Hao3 단백질.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기 중 하나 이상을 포함하는 N. 유트로파 박테리움 (이것은 무균임)을 제공한다: 서열식별번호:31과 적어도 약 96.8% 동일한 cycB1 유전자 및 서열식별번호:33와 적어도 약 97.2% 동일한 cycB2 유전자.
구현예에서, N. 유트로파 박테리움 (이것은 임으로 무균임)은 추가로, 하기 중 하나 이상을 포함한다: 서열식별번호:7와 적어도 약 98.9% 동일한 amoA1 유전자, 서열식별번호:13와 적어도 약 98.9% 동일한 amo2 유전자, 서열식별번호:9와 적어도 약 99.2% 동일한 amoB1 유전자, 서열식별번호:15와 적어도 약 99.2% 동일한 amoB2 유전자, 서열식별번호:5와 적어도 약 99.9% 동일한 amoC1 유전자, 서열식별번호:11과 적어도 약 99.9% 동일한 amoC2 유전자, 서열식별번호:17와 적어도 약 99.0% 동일한 amoC3 유전자, 서열식별번호:19와 적어도 약 99.1% 동일한 hao1 유전자, 서열식별번호:21과 적어도 약 99.5% 동일한 hao2 유전자, 서열식별번호:23와 적어도 약 99.3% 동일한 hao3 유전자, 서열식별번호:25와 적어도 약 98.1% 동일한 cycA1 유전자, 서열식별번호:27와 적어도 약 98.8% 동일한 cycA2 유전자, 및 서열식별번호:28와 적어도 약 99.4% 동일한 cycA3 유전자.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기 중 하나 이상을 포함하는 N. 유트로파 박테리움 (이것은 무균임)을 제공한다: 서열식별번호:30와 적어도 약 97.2% 동일한 CycB1 단백질 또는 서열식별번호:32와 적어도 약 98.8% 동일한 CycB2 단백질.
구현예에서, N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)은, 추가로 하기 중 하나 이상을 포함한다: 서열식별번호:6과 적어도 약 99.0% 동일한 AmoA1 단백질, 서열식별번호:12와 적어도 약 99.0% 동일한 AmoA2 단백질, 서열식별번호:8와 적어도 약 99.6% 동일한 AmoB1 단백질, 서열식별번호:14와 적어도 약 99.6% 동일한 AmoB1 단백질, 서열식별번호:16과 적어도 약 99.4% 동일한 AmoC3 단백질, 서열식별번호:18와 적어도 약 99.6% 동일한 Hao1 단백질, 서열식별번호:20와 적어도 약 99.7% 동일한 Hao2 단백질, 서열식별번호:22와 적어도 약 99.7% 동일한 Hao3 단백질, 서열식별번호:24와 적어도 약 99.2% 동일한 CycA1 단백질, 서열식별번호:26과 적어도 약 99.7% 동일한 CycA2 단백질, 및 서열식별번호:28와 적어도 약 99.7% 동일한 CycA3 단백질.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기에 따른 하나 이상의 유전자를 포함하는 N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)을 포함한다: 서열식별번호: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 및 33.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기에 따른 하나 이상의 단백질을 포함하는 N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)를 제공한다: 서열식별번호: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 및 32.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 표 2에서 열거된 아미노산 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 또는 모두에서 N. 유트로파 균주 C91에 대한 돌연변이체인 단백질을 포함하는 N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)을 제공한다.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 표 2에서 열거된 아미노산 위치 모두에서 N. 유트로파 균주 C91에 대한 돌연변이체인 단백질을 포함하는 N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)을 제공한다.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 균주 D23의 N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)을 제공하고, AOB D23-100로 지정된 상기 박테리움의 25개의 바이알은 ATCC 특허 수탁기관(2014년 4월 8일, ATCC 수탁 번호 PTA-121157 하에서)에 수탁되었다.
구현예에서, N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)은 트랜스제닉이다.
구현예에서, N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)는 하기로부터 선택된 적어도 1종의 특성을 갖는다: 최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 및 NH4 +에 대한 최적화된 내성.
구현예에서, N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)은 하기로부터 선택된 적어도 2개의 특성을 갖는다 최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 및 NH4 +에 대한 최적화된 내성.
구현예에서, N. 유트로파 박테리움 (이것은 임의로 무균임)은 하기를 갖는다: 최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 및 NH4 +에 대한 최적화된 내성.
구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 박테리움 (예를 들면, 균주 D23)은 박테리아, 다른 암모니아 산화 박테리아, 진균, 바이러스, 또는 병원체 (예를 들면, 동물 병원체, 예를 들면, 인간 병원체), 또는 이들의 임의의 조합가 실질적으로 없다.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 박테리움 (예를 들면, 균주 D23)을 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 다른 유기체가 실질적으로 없다.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 박테리움 (예를 들면, 균주 D23)을 포함하고 제2 유기체 (예를 들면, 제2 균주 또는 종)을 추가로 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 다른 유기체 (예를 들면, 균주 또는 종)가 실질적으로 없다. 구현예에서, 제2 유기체는 암모니아 산화 박테리움이다. 구현예에서, 제2 유기체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 니트로소모나스, 니트로소코쿠스, 니트로소프리아, 니트로소사이스티스, 니트로솔로부스, 니트로소비브리오, 락토바실러스, 스트렙토코쿠스, 및 비피도박터, 및 이들의 조합.
본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 박테리움 (예를 들면, 균주 D23)을 포함하고 (예를 들면, 다른 균주 또는 종의) 제2 및 제3 유기체를 추가로 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 다른 유기체 (예를 들면, 균주 또는 종)가 실질적으로 없다. 본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 박테리움 (예를 들면, 균주 D23)을 포함하고 (예를 들면, 다른 균주 또는 종의) 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 다른 유기체를 추가로 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 다른 유기체 (예를 들면, 균주 또는 종)가 실질적으로 없다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 적어도 약 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.6, 0.7, 또는 0.8의 OD600을 갖는 N. 유트로파 박테리아의 활동적 분열 배양물의 세포 현탁액을 포함하는 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 다른 유기체가 실질적으로 없다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 박테리움 (예를 들면, 균주 D23) 및 국소 투여에 적당한 약제학적으로 또는 화장용으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 국소 투여용 조성물을 제공한다. 구현예에서, 본 조성물은 다른 유기체가 실질적으로 없다. 구현예에서, 조성물은 추가로, (예를 들면, 또 다른 균주 또는 종의) 제2 유기체를 포함한다. 구현예에서, 조성물은 추가로, (예를 들면, 다른 균주 또는 종의) 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 다른 유기체를 포함한다. 제2 유기체는, 예들 들면, 암모니아 산화 박테리움일 수 있다. 구현예에서, 제2 유기체는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 니트로소모나스, 니트로소코쿠스, 니트로소프리아, 니트로소사이스티스, 니트로솔로부스, 니트로소비브리오, 락토바실러스, 스트렙토코쿠스, 및 비피도박터, 및 이들의 조합.
구현예에서, 본 조성물은 분말, 화장, 크림, 스틱, 에어로졸, 고약, 와이프, 또는 붕대이다. 구현예에서, 조성물은 추가로, 습윤 제제, 탈취제, 방향제, 착색제, 곤충 퇴치제, 세정제, 또는 UV-차단제를 포함한다. 구현예에서, 부형제는 부착방지제, 결합제, 코팅제, 붕해제, 충전제, 풍미제, 착색제, 윤활제, 활윤제, 흡수제, 보존제, 또는 감미제이다. 구현예에서, 상기 조성물 중 N. 유트로파의 농도는 약 1011 - 1013 CFU/L이다. 구현예에서, 상기 조성물 중 N. 유트로파의 농도는 약 109 CFU/ml이다. 구현예에서, N. 유트로파 대 약제학적 부형제의 질량비는 약 0.1 그램 / 리터 내지 약 100 그램 / 리터일 수 있다. 일부 구현예에서, N. 유트로파 대 약제학적 부형제의 질량비는 1 그램 / 리터이다.
일부 측면에서 본 조성물 및/또는 부형제는 액체, 고체, 또는 겔 중 하나 이상의 형태일 수 있다. 예를 들면, 액체 현탁액은, 비제한적으로, 물, 염수, 포스페이트-완충 염수, 또는 암모니아 산화 보관 완충제를 포함할 수 있다. 겔 제형은, 비제한적으로 한천, 실리카, 폴리아크릴산 (예를 들면 Carbopol®), 카복시메틸 셀룰로오스, 전분, 구아르 검, 알기네이트 또는 키토산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제형은 염화암모늄 또는 암모늄 설페이트를 비제한적으로 포함하는 암모니아 공급원으로 보강될 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 박테리움 (예를 들면, 균주 D23)의 약 1011 CFU/L, 1012 CFU/L, 1013 CFU/L에서 적어도 약 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1,000, 2,000, 또는 10,000 L를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 적어도 약 109 CFU/L, 1010 CFU/L, 1011 CFU/L, 또는 1012 CFU/L의 농도로 존재한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은, 예를 들면, 분말과 같은 건조 제형으로서 적어도 약 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 또는 500g의 본 명세서에 기재된 N. 유트로파 박테리움을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)를 포함하는 의류를 제공한다. 구현예에서, 의류는 포장된다. 구현예에서, 의류 가스 교환에 대해 내성이 있는 또는 물에 대해 내성이 있는 물질 내에 포장된다. 의류는, 예를 들면, 피부 장애의 치료 또는 예방, 낮은 니트라이트 수준과 관련된 질환 또는 병태의 치료 또는 예방, 체취의 치료 또는 예방, 산화질소를 대상체에게 공급하는 치료, 또는 미생물 성장을 억제하는 치료 중 하나 이상을 제공하는 농도로 제공될 수 있다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 옷감을 제공한다: 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23).
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 원사를 제공한다: 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23).
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 실을 제공한다: 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23).
일부 측면에서, 본 개시내용은 최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 또는 NH4 +에 대한 최적화된 내성를 갖는, (임의로 무균) N. 유트로파 박테리움을 얻는, 예를 들면 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
(a) 최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 또는 NH4 +에 대한 최적화된 내성 중 하나 이상을 선택하는 조건 하에서 상기 박테리움을 배양하여, 배양물을 생산하는 단계;
(b) 최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 또는 NH4 +에 대한 최적화된 내성에 대해 상기 배양물로부터의 샘플을 시험하는 단계; 및
(c) 최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 또는 NH4 +에 대한 최적화된 내성을 갖는 박테리움이 수득될 때까지, 상기 배양 및 시험 단계를 반복하는 단계.
구현예에서, 상기 방법은 공급원, 예컨대 토양 또는 개체의 피부로부터N. 유트로파 박테리움을 얻는 단계를 포함한다. 구현예에서, 하기 중 하나 이상 (예를 들면, 2 또는 3개)를 선택되는 조건 하의 박테리움의 배양: 최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 또는 NH4 +에 대한 최적화된 내성은 약 200 mM NH4 +를 포함하는 N. 유로파에아 배지에서 박테리움을 배양하는 것을 포함한다. 구현예에서, 상기 방법은 무균 배양물을 만드는 단계를 포함한다. 구현예에서, 상기 방법은 N. 유트로파를 적어도 1종의 다른 유형의 암모니아 산화 박테리아와 함께 공-배양하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 단계 (a)의 N. 유트로파는 최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 및 NH4 +에 대한 최적화된 내성이 없다. 구현예에서, 단계 (c)는, 최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 및 NH4 +에 대한 최적화된 내성 중 적어도 2개를 갖는박테리움이 수득될 때까지 상기 배양 및 시험 단계를 반복하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 상기에서 기재된 방법에 의해 생산된 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 박테리움 (예를 들면, 균주 D23)을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기의 단계들을 포함하는, (임의로 무균) N. 유트로파의 제제를 시험하는 방법을 제공한다:
최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 또는 NH4 +에 대한 최적화된 내성 중 하나 이상에 대해 N. 유트로파를 검정하는 단계; 및
N. 유트로파가 최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 또는 NH4 +에 대한 최적화된 내성 중 하나 이상을 갖는다면, 허용된 것으로서 N. 유트로파를 분류하는 단계.
구현예에서, 본 방법은 추가로, 오염 유기체에 대한 제제를 시험하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 본 방법은 추가로, 샘플을 상기 제제로부터 제거하고 상기 샘플에 대해 시험을 수행하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 본 방법은 추가로, N. 유트로파가 배양되는 시험 배지를 포함한다. 구현예에서, 본 방법은 추가로, 상기 제제로부터의 N. 유트로파를 패키지로 포장하는 것을 포함한다. 구현예에서, 본 방법은 추가로, 상기 제제로부터의 N. 유트로파를 시판하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 N. 유트로파를 생산하고, 예를 들면 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 N. 유트로파를 배양 배지와 접촉시키고, 적어도 약 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 또는 0.8의 OD600가 도달될 때까지 N. 유트로파를 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 약 0.3-0.4, 0.4-0.5, 0.5-0.6, 0.6-0.7, 또는 0.7-0.8의 OD600가 도달될 때까지 N. 유트로파를 배양하는 것을 포함한다.
구현예에서, 본 방법은 추가로, 오염 유기체에 대해 N. 유트로파 및 배양 배지를 검정하는 것을 포함한다. 구현예에서, 본 방법은 추가로, 하기에 대해 N. 유트로파를 검정하는 것을 포함한다: 하기 중 하나 이상 (예를 들면, 2 또는 3): 최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 또는 NH4 +에 대한 최적화된 내성. 구현예에서, 상기 방법은 예를 들면, 약 1012 CFU/L에서 적어도 약 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1,000, 2,000, 5,000, 또는 10,000 L / 1일의 N. 유트로파를 생산하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, N. 유트로파는 약 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 또는 1014 CFU/L의 농도이다. 일부 구현예에서, N. 유트로파는 적어도 약 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 또는 1014 CFU/L의 농도이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 N. 유트로파를 생산하는, 예를 들면 제조하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 N. 유트로파를 배양 배지와 접촉시키고, 약 적어도 약 1,000 L 약 1012 CFU/L에서 N. 유트로파가 생산될 때까지 N. 유트로파를 배양하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 본 방법은 추가로, 하기에 대한 N. 유트로파를 검정하는 단계를 포함한다: 하기 중 하나 이상 (예를 들면, 2 또는 3): 최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 또는 NH4 +에 대한 최적화된 내성.
구현예에서, 본 방법은 추가로, 오염 유기체에 대해 N. 유트로파 또는 배양 배지를 시험하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 배양 배지와 접촉되는 N. 유트로파는 하기를 갖는 N. 유트로파이다: 하기의 하나 이상 (예를 들면, 2 또는 3): 최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 또는 NH4 +에 대한 최적화된 내성.
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기의 단계들을 포함하는, N. 유트로파를 생산하는, 예를 들면 제조하는 방법을 제공한다:
(a) N. 유트로파를 배양 배지와 접촉시키는 단계; 및
(b) 1 내지 2일 동안 N. 유트로파를 배양하여, 배양물이 약 0.5-0.6의 OD600에 도달할 때까지 배양물을 만드는 단계.
구현예에서, 본 방법은 추가로, 최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 또는 NH4 +에 대한 최적화된 내성 중 하나 이상에 대해 N. 유트로파를 검정하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 본 방법은 추가로, 유기체를 오염시키는 배양물, 예를 들면, 박테리아, 바이러스, 진균, 또는 병원체, 또는 이들의 조합을 시험하는 단계를 포함한다. 구현예에서, 단계 (a)의 N. 유트로파는 하기를 갖는 N. 유트로파이다: 하나 이상 (예를 들면, 2 또는 3): 최적화된 성장률, 최적화된 NH4 + 산화 비율, 또는 NH4 +에 대한 최적화된 내성. 구현예에서, 상기 방법은 약 1012 CFU/L의 N. 유트로파에서 적어도 약 1,000 L / 1일을 생산하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 상기에서 기재된 방법에 의해 생산된 N. 유트로파 박테리움을 제공한다.
구현예에서, N. 유트로파의 제제는 상기에서 기재된 방법에 의해 제조된다. 일부 측면에서, 본 제제는 약 0.1 밀리그램 내지 약 100 밀리그램 (mg)의 N. 유트로파를 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 약 0.5 내지 약 0.6의 광학 밀도에서 N. 유트로파를 포함하는 반응 혼합물이 제공될 수 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 N. 유트로파-보유 의복을 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 의류를 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)와 접촉시키는 것을 포함한다.
구현예에서, 상기 방법은 적어도 10, 100, 또는 1000 종의 의류를 생산하는 것을 포함한다. 구현예에서, 상기 방법은 상기 의류를 적어도 1010 CFU의N. 유트로파와 접촉시키는 것을 포함한다. 구현예에서, 본 방법은 추가로, 의복을 포장하는 것을 포함한다.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 N. 유트로파의 제형을 얻는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 명세서에서 기재된 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)를 약제학적으로 또는 화장용으로 허용가능한 부형제와 접촉시키는 것을 포함한다.
구현예에서, 본 방법은 추가로, N. 유트로파 및 부형제를 포함하는 것을 포함한다. 구현예에서, 본 방법은 오염 유기체, 예를 들면, 박테리아, 바이러스, 진균, 또는 병원체가 실질적으로 없는 조건 하에서 수행된다.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 N. 유트로파를 포장하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 명세서에서 기재된 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)를 패키지에 조합시키는 것을 포함한다.
구현예에서, 패키지는 가스 교환에 대해 내성이 있거나 물에 대해 내성있다. 구현예에서, 패키지는 가스 교환, NH3, NH4 +, 또는 NO2 -에 대해 투과성이 있다.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 대상체의 피부 상에서 미생물 성장을 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 그것이 필요한 대상체에게 효과적인 용량의 본 명세서에 기재된 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)를 국소로 투여하는 것을 포함한다.
구현예에서, 효과적인 용량은 대략 1 x 109 CFU, 2 x 109 CFU, 5 x 109 CFU, 1 x 1010 CFU, 1.5 x 1010 CFU, 2 x 1010 CFU, 5 x 1010 CFU, 또는 1 x 1011 CFU이다. 구현예에서, 효과적인 용량은 적어도 약 1 x 109 CFU, 2 x 109 CFU, 5 x 109 CFU, 1 x 1010 CFU, 1.5 x 1010 CFU, 2 x 1010 CFU, 5 x 1010 CFU, 또는 1 x 1011 CFU이다. 구현예에서, 효과적인 용량은 대략 1 x 109 CFU - 2 x 109 CFU, 2 x 109 CFU - 5 x 109 CFU, 5 x 109 CFU - 1 x 1010 CFU, 1 x 1010 CFU - 1.5 x 1010 CFU, 1 x 1010 CFU - 2 x 1010 CFU 1.5 x 1010 CFU - 2 x 1010 CFU, 2 x 1010 CFU - 5 x 1010 CFU, 또는 5 x 1010 CFU - 1 x 1011 CFU이다. 구현예에서, 박테리움은 약 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 5 x 109, 또는 1 x 1010 CFU/ml의 농도로 투여된다. 구현예에서, 박테리움은 적어도 약 1 x 108, 2 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 2 x 109, 5 x 109, 또는 1 x 1010 CFU/ml의 농도로 투여된다. 구현예에서, 박테리움은 약 1 x 108 - 2 x 108, 2 x 108 - 5 x 108, 5 x 108 - 1 x 109, 1 x 109 - 2 x 109, 2 x 109 - 5 x 109, 또는 5 x 109-1 x 1010 CFU/ml의 농도로 투여된다. 구현예에서, 투여는 2회/1일 수행된다. 구현예에서, 대상체는 인간이다. 구현예에서, 저해될 미생물 성장은 슈도모나스 에어루기노사 또는 스타필로코쿠스 아우레스 (S. 아우레스 or SA), 스트렙토코쿠스 파이오제네스 (S. 파이오제네스 또는 SP), 또는 아시네토박터 바우마니 (A. 바우마니 또는 AB)의 성장이다.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 산화질소를 대상체에게 공급하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 효과적인 용량의 본 명세서에 기재된 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)를 상기 대상체에게 아주 근접하여 위치시킨다.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 체취를 감소시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 그것이 필요한 대상체에게 효과적인 용량의 본 명세서에 기재된 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)를 국소로 투여하는 것을 포함한다.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 낮은 니트라이트 수준과 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공한다, 상기 방법은 그것이 필요한 대상체에게 치료적으로 효과적인 용량의 본 명세서에 기재된 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)를 국소로 투여하는 것을 포함한다.
구현예에서, 질환은 HIV 피부염, 당뇨 발 궤양에서의 감염, 아토피 피부염, 여드름, 예를 들면, 심상성 여드름, 습진, 접촉 피부염, 알러지성 반응, 건선, 피부 감염, 혈관 질환, 질 효모 감염, 성 매개성 질환, 심장병, 죽상경화증, 대머리, 당뇨병 또는 병상에 갇힘에 대해 2차적인 다리 궤양, 협심증, 특히 만성적, 안정한 협심증, 허혈성 질환, 울혈성 심장기능상실, 심근경색증, 허혈 재관류 부상, 제엽염, 고혈압, 비대성 기관 변성, 레이노 증후군 현상, 섬유증, 섬유성 기관 변성, 알러지, 자가면역 민감화, 말기 신장 질환, 비만, 발기불능, 또는 암이다.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 피부 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 그것이 필요한 대상체에게 치료적으로 효과적인 용량의 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)를 국소로 투여하는 것을 포함한다. 관련된 측면에서, 본 개시내용은 장애 예컨대 피부 장애를 치료하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)를 제공한다. 관련된 측면에서, 본 개시내용은 약제, 예를 들면, 피부 장애를 치료하는 약제를 제조하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)를 제공한다.
구현예에서, 피부 장애는 여드름, 예를 들면, 심상성 여드름, 주사비, 습진, 또는 건선이다. 일부 구현예에서, 피부 장애는 궤양, 예를 들면, 정맥 궤양, 예를 들면, 다리 궤양, 예를 들면, 정맥 다리 궤양, 예를 들면, 당뇨 발 궤양에서의 감염이다. 일부 구현예에서, 국소 투여는 상기 대상체를 N. 유트로파, 예를 들면, 본원에서 기재된 N. 유트로파로 전-치료하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 국소 투여는 피부 장애의 발생 전에 국소로 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 국소 투여는 피부 장애의 발생 후에 국소로 투여하는 것을 포함한다.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 상처 치유 또는 봉합을 촉진하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상처에, 효과적인 용량의 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)를 투여하는 것을 포함한다. 관련된 측면에서, 본 개시내용은 상처 치유를 촉진하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)을 제공한다. 관련된 측면에서, 본 개시내용은 약제, 예를 들면, 상처 치유를 촉진하는 약제를 제조하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)을 제공한다.
구현예에서, 상처는 하나 이상의 요망되지 않는 박테리아, 예를 들면, 병원성 박테리아를 포함한다. 구현예에서, 상처는 S. 아우레스, P. 에어루기노사, P. 에어로기노사, 또는 A. 바우마니를 포함한다.
구현예에서, N. 유트로파는 상처의 발생 전에 상기 대상체에게 투여된다. 구현예에서, 상기 상처에의 투여는 상처의 발생 전에 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 구현예에서, 본 방법은 추가로, N. 유트로파 (예를 들면, 본원에서 기재된 N. 유트로파, 예를 들면, 균주 D23)을 상처의 발생 후의 상처에 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 개시내용은 병원성 박테리아을 사멸하거나 그것의 성장을 억제하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, 예를 들면, N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 본원에서 기재된 N. 유트로파, 예를 들면, 균주 D23)를 피부와 접촉시키거나 그것에 도포하는 것을 포함한다.
구현예에서, 병원성 박테리아는 하기 병태 중 하나 이상에 기여한다: HIV 피부염, 궤양, 예를 들면, 정맥 궤양, 예를 들면, 다리 궤양, 예를 들면, 정맥 다리 궤양, 예를 들면, 당뇨 발 궤양에서의 감염, 아토피 피부염, 여드름, 예를 들면, 심상성 여드름, 습진, 접촉 피부염, 알러지성 반응, 건선, 두드러기, 주사비, 피부 감염, 혈관 질환, 질 효모 감염, 성 매개성 질환, 심장병, 죽상경화증, 대머리, 당뇨병 또는 병상에 갇힘에 대해 2차적인 다리 궤양, 협심증, 특히 만성적, 안정한 협심증, 허혈성 질환, 울혈성 심장기능상실, 심근경색증, 허혈 재관류 부상, 제엽염, 고혈압, 비대성 기관 변성, 레이노 증후군 현상, 섬유증, 섬유성 기관 변성, 알러지, 자가면역 민감화, 말기 신장 질환, 비만, 발기불능, 폐렴, 일차 면역결핍, 수포성 표피박리증, 또는 암.
구현예에서, 병태는 궤양, 예를 들면, 정맥 궤양, 예를 들면, 다리 궤양, 예를 들면, 정맥 다리 궤양, 예를 들면, 당뇨 발 궤양에서의 감염이다. 구현예에서, 병태는 정맥 다리 궤양이다. 구현예에서, 병태는 여드름, 예를 들면, 심상성 여드름이다. 구현예에서, 병태는 심상성 여드름이다. 구현예에서, 병원성 박테리아는 프로피오니박테리움 아크네스, 슈도모나스 에어루기노사, 스타필로코쿠스 아우레스, 스트렙토코쿠스 파이오제네스, 또는 아시네토박터 바우마니 중 하나 이상이다. 구현예에서, 본 방법은 추가로, 상기 대상체가 병원성 박테리아를 사멸하거나 그것의 성장을 억제하는데 필요한 지를 결정하고, 예를 들면, 상기 대상체가 병원성 박테리아를 사멸하거나 그것의 성장을 억제하는데 필요한 지를 결정하는 것을 포함한다. 구현예에서, 본 방법은 추가로, 병원성 박테리아의 성장을 사멸 또는 억제하는데 필요한 대상체를 선택하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, N. 유트로파는 하기 반응을 촉진한다.
중성 pH에서, 약 중성 pH 조건에서 암모늄으로부터 발생된 암모니아는 초기 반응의 기질이다. 암모니아의 니트라이트로의 전환은 2 단계로 일어나고 하기와 같이 암모니아 모노옥시게나제 (Amo) 및 하이드록실아민 산화환원효소 (Hao)에 의해 각각 촉진된다:
Figure pat00001
일부 예에서, 반응 B는 낮은 pH에서 아질산 (HNO2) 형성을 나타내도록 하기와 같이 보고된다:
Figure pat00002
특정 구현예에서, N. 유트로파는 회분식 배양 조건 하에서 성장될 때 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 시간 미만, 예를 들면 약 8 시간, 예를 들면, 7-9 시간 또는 6-10 시간을 갖는다. 일부 구현예에서, 배가 시간은 회분식 배양 조건 하에서 적어도 3, 4, 5, 또는 6 시간이다. 일부 구현예에서, N. 유트로파는 케모스탯 (즉, 계속되는 배양) 조건 하에서 성장될 때 16, 18, 20, 22, 24, 또는 26 시간 미만, 예를 들면 약 20 시간, 예를 들면, 19-21 시간 또는 18-22 시간의 배가 시간을 갖는다. 일부 구현예에서, 배가 시간은 케모스탯 조건 하에서 적어도 10, 12, 14, 16, 또는 18 시간이다.
특정 구현예에서, 약 0.15-0.18의 OD600에서 N. 유트로파의 계속되는 배양은 약 1 내지 2 일 내에 약 0.5-0.6의 OD600에 도달할 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, N. 유트로파의 계속되는 배양은 약 1 일에 걸쳐 약 0.15에서 적어도 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 또는 0.8의 OD600로 성장할 수 있고; 구현예에서 배양은 약 1 일에 걸쳐 0.4-0.6 또는 0.3-0.7 범위의 OD에 도달할 수 있다. 구현예에서, N. 유트로파의 계속되는 배양은 약 2 일에 걸쳐 약 0.15에서 적어도 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 또는 0.8의 OD600로 성장할 수 있다; 구현예 배양은 약 2 일에 걸쳐 0.4-0.6 또는 0.3-0.7 범위의 OD에 도달할 수 있다. 일부 구현예에서, 계속되는 배양 조건은 약 200 mM NH4 +를 임의로 포함하는 N. 유로파에아 배지에서 생물반응기에서의 성장을 포함한다. 일부 구현예에서, 계속되는 배양 조건은 실시예 2에서 제시된 조건이다.
특정 구현예에서, N. 유트로파는 하기의 속도로 NH4 + (예를 들면, 약 200 mM에서)를 니트라이트 (예를 들면, 최대 약 180 mM에 도달함)로 전환할 수 있다: 적어도 약 50, 75, 125, 또는 150 마이크로몰 NO2 - / 분, 예를 들면, 약 100-150, 75-175, 75-125, 100-125, 125-150, 또는 125-175 마이크로몰/분, 예를 들면, 약 125 마이크로몰 NO2 - / 분. 일부 구현예에서, 반응 속도는 24 시간의 기간에 걸쳐 약 109 CFU/ml의 약 1 L 케모스탯 배양에서 측정된다.
특정 구현예에서, N. 유트로파는 하기를 포함하는 배지에서 성장할 수 있다: 적어도 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM, 175 mM, 200 mM, 225 mM, 250 mM, 275 mM, 또는 300 mM NH4 + (or NH3), 예를 들면, 약 150-200, 175-225, 200-250, 225-275, 250-300 mM, 예를 들면, 약 200 또는 약 250 mM. 특정 구현예에서, N. 유트로파는 암모늄의 이들 농도 하에서 생물반응기에서 성장된다. 일부 구현예에서, N. 유트로파가 암모늄의 이들 농도 하에서 성장될 때, 니트레이트 또는 니트라이트의 농도는 적어도 60, 80, 100, 120, 140, 160, 또는 180 mM, 예를 들면, 약 140-180, 160-200, 또는 140-200 mM, 예를 들면, 약 160 또는 180 mM에 도달할 수 있다.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기의 고밀도 배양물을 제공한다: N. 유트로파, 예를 들면, N. 유트로파 균주 D23. 예를 들면, 고밀도 배양 조성물은 적어도 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 또는 0.7, 예를 들면, 약 0.2-0.6, 0.3-0.6, 0.4-0.6, 0.5-0.6, 또는 0.4-0.7의 OD600를 갖는N. 유트로파 박테리아의 활동적 분열 배양물의 세포 현탁액을 포함할 수 있고, 상기 조성물은 다른 유기체가 실질적으로 없다
일부 구현예에서, N. 유트로파는 4 ℃에서 보관될 때 적어도 2 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 또는 6 개월 동안 안정하다. 일부 구현예에서, 보관 방법은 Na2HPO4 및 MgCl2, 예를 들면 50 mM Na2HPO4 및 2 mM MgCl2 중 하나 이상을 포함하는 버퍼, 예를 들면 실시예 2에서 기재된 보관 버퍼에서 세포를 배현탁시키는 것을 포함한다. 예들 들면, 보관 상태는 실시예 2에서 명시된 것일 수 있다. 일부 구현예에서, N. 유트로파는 4℃에서 보관 전 200 mM NH4 + 에서, 6-8, 예를 들면, 7의 pH 계속해서 배양된다. 안정성은 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 1) 생존력 유지함, 2) 관련된 특성 예컨대 주어진 수준의 니트라이트를 생산하는 능력을 유지함.
특정 구현예에서, NH4 + 및 NH3는 개시내용 전체를 통해 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 개시내용은, 특히, 대상체의 피부 미생물군집의 조성물을 변화시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 암모니아 산화 박테리아를 포함하는 제제를 상기 피부의 표면에 투여하고, 예를 들면 도포하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 양 및 투여 빈도, 예를 들면, 도포는 상기 피부의 표면 상의 병원성 박테리아의 비율을 감소시키기에 충분하다.
암모니아 산화 박테리아는, 일부 구현예에서, 암모니아의 니트라이트로의 전환으로부터 배타적으로 에너지를 생성하기 위해 독특한 수용력을 갖는 도처에 존재하는 그램-음성 무조건 화학무기영양 박테리아이다.
일부 구현예에서, 본 방법은 상기 피부의 표면 상에 병원성 박테리아의 부분에서 감소가 필요한 대상체를 기준으로 대상체를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아를 포함하는 제제는 암모니아, 암모늄 염, 및 우레아 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아를 포함하는 제제는 조절 방출 물질, 예를 들면, 느린 방출 물질을 포함한다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아의 제제는, 부형제, 예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 화장용으로 허용가능한 부형제 중 하나를포함한다. 부형제, 예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 부형제 및 화장용으로 허용가능한 부형제 중 하나는 국소, 코, 폐, 및 위장 투여 중 하나에 적합할 수 있다. 부형제, 예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 부형제 및 화장용으로 허용가능한 부형제 중 하나는 계면활성제일 수 있다. 계면활성제는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다: 코카미도프로필 베타인 (ColaTeric COAB), 폴리에틸렌 소르비톨 에스테르 (예를 들면, Tween 80), 에톡실레이트화된 라우릴 알코올 (RhodaSurf 6 NAT), 나트륨 라우레쓰 설페이트/라우릴 글루코사이드/코카미도프로필 베타인 (Plantapon 611 L UP), 나트륨 라우레쓰 설페이트 (예를 들면, RhodaPex ESB 70 NAT), 알킬 폴리글루코사이드 (예를 들면, Plantaren 2000 N UP), 나트륨 라우레쓰 설페이트 (Plantaren 200), Dr. Bronner's Castile 비누, 라우르아민 옥사이드 (ColaLux Lo), 나트륨 도데실 설페이트 (SDS), 폴리설포네이트 알킬 폴리글루코사이드 (PolySufanate 160 P), 나트륨 라우릴 설페이트 (Stepanol-WA Extra K), 및 이들의 임의의 조합. 닥터 브로너스 캐스틸 비누는 물, 유기 코코넛 오일, 수산화칼륨, 유기 올리브 오일, 유기농 헴프 오일, 유기 요요바 오일, 시트르산, 및 토코페롤을 포함한다. 일부 구현예에서, 부형제는 물, 유기 코코넛 오일, 수산화칼륨, 유기 올리브 오일, 유기농 헴프 오일, 유기 요요바 오일, 시트르산, 및 토코페롤 중 하나 이상, 예들 들면 모두를 포함한다.
일부 구현예에서, 조제물은 다른 유기체가 실질적으로 없을 수 있다.
일부 구현예에서, 본 제제는 분말, 화장, 크림, 스틱, 에어로졸, 고약, 와이프, 또는 붕대 내에 배치될 수 있다. 본 제제는 분말, 화장, 크림, 스틱, 에어로졸, 고약, 와이프, 또는 붕대로서 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 제제는 보습제, 탈취제, 방향제, 착색제, 곤충 퇴치제, 세정제, 또는 UV-차단제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 부형제, 예를 들면, 상기 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 상기 화장용으로 허용가능한 부형제는 부착방지제, 결합제, 코팅제, 붕해제, 충전제, 풍미제, 착색제, 윤활제, 활윤제, 흡수제, 보존제, 또는 감미제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아를 포함하는 제제는 약 108 내지 약 1014 CFU/L를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 본 제제는 약 1 x 109 CFU/L 내지 약 10 x 109 CFU/L를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아를 포함하는 제제는 약 50 밀리그램 (mg) 내지 약 1000 mg의 암모니아 산화 박테리아를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아 대 상기 부형제, 예를 들면, 상기 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 상기 화장용으로 허용가능한 부형제의 질량비는 약 0.1 그램 / 리터 내지 약 1 그램 / 리터의 범위이다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아의 제제는 낮은 니트라이트 수준과 관련된 질환 또는 병태의 치료 또는 예방, 체취의 치료 또는 예방, 산화질소를 대상체에게 공급하는 치료, 또는 미생물 성장을 억제하는 치료, 예를 들면, 병원성 박테리아 성장에서 유용하다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는 니트로소모나스, 니트로소코쿠스, 니트로소프리아, 니트로소사이스티스, 니트로솔로부스, 니트로소비브리오, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 제제는 락토바실러스, 스트렙토코쿠스, 비피도박터, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 유기체를 추가로 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 제제는 암모니아 산화 박테리아 이외의 유기체가 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아를 포함하는 제제는 성장 상태에서 암모니아 산화 박테리아를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아를 포함하는 제제는 보관 상태에서 암모니아 산화 박테리아를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 화장품을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 치료 제품을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 본 제제는 HIV 피부염, 당뇨 발 궤양에서의 감염, 아토피 피부염, 여드름, 예를 들면, 심상성 여드름, 습진, 접촉 피부염, 알러지성 반응, 건선, 두드러기, 주사비, 피부 감염, 혈관 질환, 질 효모 감염, 성 매개성 질환, 심장병, 죽상경화증, 대머리, 당뇨병 또는 병상에 갇힘에 대해 2차적인 다리 궤양, 협심증, 특히 만성적, 안정한 협심증, 허혈성 질환, 울혈성 심장기능상실, 심근경색증, 허혈 재관류 부상, 제엽염, 고혈압, 비대성 기관 변성, 레이노 증후군 현상, 섬유증, 섬유성 기관 변성, 알러지, 자가면역 민감화, 말기 신장 질환, 비만, 발기불능, 폐렴, 일차 면역결핍, 수포성 표피박리증, 또는 암 중 적어도 하나를 치료하는데 유용할 수 있다.
어떤 측면에서, 본 제제는 여드름, 예를 들면, 심상성 여드름, 습진, 건선, 두드러기, 주사비, 및 피부 감염 중 적어도 하나를 치료하는데 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 제제는 용기 내에 제공될 수 있고, 상기 제제 및 용기는 약 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 또는 2000 그램 미만의 중량을 갖는다.
일부 구현예에서, 제제는 약 0.1% 내지 약 10% 미만의 계면활성제를 갖는다. 어떤 측면에서, 본 제제는 계면활성제가 실질적으로 없을 수 있다.
일부 구현예에서, 본 제제는 킬레이터를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 제제는 킬레이터가 실질적으로 없을 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 회 / 1일 제제를 도포하는 것을 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 본 제제는 1회/1일 도포될 수 있다. 어떤 다른 측면에서, 본 제제는 2 회 / 1일 도포될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 제제는 약 1-3, 3-5, 5-7, 7-9, 5-10, 10-14, 12-18, 12-21, 21-28, 28-35, 35-42, 42-49, 49-56, 46-63, 63-70, 70-77, 77-84, 또는 84-91 일 동안 도포될 수 있다. 어떤 측면에서, 조제물은 약 16일 동안 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 상기 피부의 표면으로부터의 샘플을 얻는 것을 추가로 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 본 방법은 샘플 중 박테리아의 DNA를 단리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 본 방법은 샘플 중 박테리아의 DNA를 서열분석하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 암모니아 산화 박테리아의 투여는 상기 표면 상의 비-병원성 박테리아의 비율의 증가를 제공한다. 어떤 측면에서, 비-병원성 박테리아는 공생적 비-병원성 박테리아일 수 있다. 어떤 측면에서, 비-병원성 박테리아는 스타필로코쿠스 속의 공생적 비-병원성 박테리아이다. 어떤 측면에서, 비-병원성 박테리아는 공생적 비-병원성 박테리아 스타필로코쿠스 에피더미디스일 수 있다.
일부 구현예에서, 비-병원성 박테리아 스타필로코쿠스의 비는, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 주 후에 증가되거나 증가되는 것으로 확인된다. 어떤 측면에서, 비-병원성 박테리아 스타필로코쿠스 에피더미디스 스타필로코쿠스의 비는, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 주 후에 증가되거나 증가되는 것으로 확인된다.
일부 구현예에서, 잠재적으로 병원성 또는 질환 관련된 프로피오니박테리아는, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 주 후에 감소되거나 감소되는 것으로 확인된다
일부 구현예에서, 잠재적으로 병원성 또는 질환 관련된 스테노트로포모나스는, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 주 후에 감소되거나 감소되는 것으로 확인된다.
일부 구현예에서, 피부의 표면은 상처를 포함한다.
일부 구현예에서, 여드름 예를 들면, 심상성 여드름을 치료하는 방법은 본 개시내용의 하나 이상의 방법에 의해 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 습진을 치료하는 방법은 본 개시내용의 하나 이상의 방법에 의해 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 건선을 치료하는 방법은 본 개시내용의 하나 이상의 방법에 의해 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 두드러기를 치료하는 방법은 본 개시내용의 하나 이상의 방법에 의해 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 주사비를 치료하는 방법은 본 개시내용의 하나 이상의 방법에 의해 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 피부 감염을 치료하는 방법은 본 개시내용의 하나 이상의 방법에 의해 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체의 표면 상에서 요망되지 않는 박테리아의 양을 감소시키는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 방법 (예를 들면, N. 유트로파 박테리움, 예를 들면, 균주 D23의 박테리움을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법)은 상기 대상체를 항생제로 추가로 처리하는 것은 포함한다. 구현예에서, 항생제는 테트라사이클린, 린코사마이드 예컨대 클린다마이신, 매크롤라이드 예컨대 에리트로마이신, 아미노글리코시드 예컨대 겐타마이신, β-락탐 예컨대 피페라실린, β-락타마제 저해제 예컨대 타조박탐, 또는 이들의 임의의 조합 (예컨대 β-락탐 예컨대 피페라실린 및 β-락타마제 저해제 예컨대 타조박탐의 조합)이다. 일부 구현예에서, 항생제는, 박테리움이 민감한 항생제이다. 구현예에서, 항생제는, 박테리움이 원하는 치료 효과를 달성한 후에 투여된다. 구현예에서, 항생제는, 박테리움이 내성있는 항생제이다. 구현예에서, 항생제는, 박테리움이 그것의 치료 효과를 생성하고 있는 기간 전 또는 동안에 투여된다.
박테리움을 수반하는 본 명세서의 조성물 및 방법이 또한 복수의 박테리아를 수반하는 것으로 이해된다. 예를 들면, N. 유트로파 박테리움을 투여하는 방법은 복수의 N. 유트로파 박테리아를 투여하는 것을 또한 수반할 수 있다.
본 개시내용은 또한, 어떤 측면에서, 하기를 포함하는 핵산을 제공한다: D23 게놈 내의 연속적인 뉴클레오타이드의 서열 (예를 들면, 15-100 개의 뉴클레오타이드), 예를 들면, 본 명세서에서 제공된 유전자의 서열, 예를 들면, 표 1, 도 6-8 또는 보충의 표 1에서 기재된 서열, 또는 서열식별번호: 66, 또는 전술한 임의의 것의 역 보체. 관련된 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 핵산을 제공한다: 하기 내로부터의 연속적인 뉴클레오타이드의 서열 (예를 들면, 15-100 개의 뉴클레오타이드): 서열식별번호: 1 또는 그것의 역 보체. 관련된 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 핵산을 제공한다: 하기 내로부터의 연속적인 뉴클레오타이드의 서열 (예를 들면, 15-100 개의 뉴클레오타이드): 표 1의 유전자 (예를 들면, 서열식별번호: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 또는 33의 서열) 또는 그것의 역 보체.
일부 구현예에서, 핵산은 비-천연 발생 서열 또는 또 다른 변형 예컨대 라벨, 또는 둘 모두를 갖는다. 일부 구현예에서, 연속적인 뉴클레오타이드의 서열은 하기에서 발견되는 서열이 아니다: N. 유트로파 균주 C91. 일부 구현예에서, 핵산은 이종성 서열 5'에서 15-100개의 연속적인 뉴클레오타이드의 서열, 또는 이종성 서열 3'에서 15-100개의 연속적인 뉴클레오타이드의 서열, 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-24, 35-40 개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산은 검출가능한 표지, 예를 들면, 형광성 표지에 결합되고, 예를 들면 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 핵산은 D23 게놈 내로부터의 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-24, 35-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 또는 90-100개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 D23 게놈 내로부터의 적어도 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 DNA이다.
일부 측면에서, 개시내용은 제1 핵산 및 제2 핵산을 포함하는 조성물 또는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 하기를 포함한다: 하기 내로부터의 연속적인 뉴클레오타이드 (예를 들면, 15-100): 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 66, 도 6-8의 유전자, 또는 표 1의 유전자, 또는 그것의 역 보체. 일부 구현예에서, 제2 핵산은 하기를 포함한다: 하기 내로부터의 연속적인 뉴클레오타이드 (예를 들면, 15-100): 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 66, 도 6-8의 유전자, 또는 표 1의 유전자, 또는 그것의 역 보체. 일부 구현예에서, 핵산은 비-천연 발생 서열, 예를 들면, N. 유트로파 균주 C91에서 발견되지 않는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 하기에서 앰플리콘을 마련한다: 표 1의 유전자, 예를 들면, 서열식별번호: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 또는 33의 서열) 또는 그것의 역 보체.
일부 구현예에서, 제1 핵산은 서열식별번호:1의 제1 영역에 상응하는 서열을 가지며, 제2 핵산의 역 보체는 서열식별번호:1의 제2 영역에 상응하는 서열을 가지며, 제1 및 제2 영역은 PCR에 적합한 거리에 의해 분리된다. 일부 구현예에서, 제1 핵산의 역 보체는 서열식별번호:1의 제1 영역에 상응하는 서열을 가지며 제2 핵산은 서열식별번호:1의 제2 영역에 상응하는 서열을 가지며, 제1 및 제2 영역은 PCR에 적합한 거리에 의해 분리된다. 구현예에서, PCR에 적합한 거리는 서열식별번호:1의 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 또는 1000 이하 개의 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 서열식별번호:1에서 앰플리콘을 기술한다. 일부 구현예에서, 제1 핵산 및 제2 핵산 각각은 PCR에 적합한 용융 온도 (Tm), 예를 들면, 약 55-65 ℃ 또는 약 60-65 ℃를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 제1 핵산의 Tm은 상기 제2 핵산의 Tm의 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 ℃ 내이다.
일부 구현예에서, 제1 핵산, 제2 핵산, 또는 각각의 상기 제1 핵산 및 제2 핵산은 추가로, 이종성 서열 5'에서 연속적인 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 대안적으로 또는 함께, 일부 구현예에서, 제1 핵산, 제2 핵산, 또는 각각의 상기 제1 핵산 및 제2 핵산은 추가로, 하기 내의 이종성 서열 3'에서 연속적인 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다: 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 66. 일부 구현예에서, 제1 핵산, 제2 핵산, 또는 각각의 상기 제1 핵산 및 제2 핵산은 15-20, 20-25, 25-30, 30-24, 또는 35-40 개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 핵산, 제2 핵산, 또는 각각의 상기 제1 핵산 및 제2 핵산은 검출가능한 표지, 예를 들면, 형광성 표지에 결합되고, 예를 들면 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 서열식별번호:64의 서열을 포함하거나 그것으로 구성된다. 일부 구현예에서, 제2 핵산은 서열식별번호:65의 서열을 포함하거나 그것으로 구성된다. 일부 구현예에서, 제1 핵산, 제2 핵산, 또는 둘 모두는 DNA이다.
일부 구현예에서, 조성물 또는 키트는 프라이머의 적어도 2 (예를 들면, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의) 쌍을 포함하고, 각 쌍은 하기에서 앰플리콘을 인식한다: 표 1의 유전자 (예를 들면, 서열식별번호: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 또는 33의 서열) 또는 그것의 역 보체. 일부 구현예에서, 프라이머의 제1 쌍은 Amo 유전자 (예를 들면, AmoA1, AmoA2, AmoB1, AmoB2, AmoC1, AmoC2, 또는 AmoC3)에서 앰플리콘을 인식하고 프라이머의 제2 쌍은 하기에서 앰플리콘을 인식한다: Amo 유전자 (예를 들면, AmoA1, AmoA2, AmoB1, AmoB2, AmoC1, AmoC2, 또는 AmoC3). 일부 구현예에서, 프라이머의 제1 쌍은 하기에서 앰플리콘을 인식한다: AmoA 유전자 (예를 들면, AmoA1 또는 AmoA2). 일부 구현예에서, 프라이머의 제2 쌍은 하기에서 앰플리콘을 인식한다: Amob 유전자 (예를 들면, AmoB1 또는 AmoB2). 일부 구현예에서, 프라이머의 제3 쌍은 하기에서 앰플리콘을 인식한다: AmoC 유전자 (예를 들면, AmoC1, AmoC2, 또는 AmoC3).
일부 구현예에서, 본 키트는 제1 핵산이 배치된 제1 용기 및 제2 핵산이 배치된 제2 용기를 포함한다. 본 키트는 추가의 용기, 예를 들면, for 제3, 제 4, 제5, 또는 제6 핵산용 추가의 용기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 앰플리콘을 인식하는 한 쌍의 프라이머은 단일 용기에서 보관된다.
본 개시내용은 또한, 일부 측면에서, 서열식별번호:64의 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 제공한다. 본 개시내용은 또한, 일부 측면에서, 서열식별번호:65의 서열을 포함하거나 그것으로 구성된 핵산을 제공한다. 본 개시내용은 또한, 일부 측면에서, 본 개시내용은 본 명세서에서 기재된 핵산 및 검출가능한 표지, 예를 들면, 형광성 표지를 포함하는 분자를 제공한다. 핵산은 하기로 구성될 수 있다: 예를 들면 서열식별번호: 64 또는 서열식별번호: 65의 서열.
본 개시내용은, 일부 측면에서, 제1 분자 및 제2 분자를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 제1 분자는 본 명세서에서 기재된 핵산, 예를 들면, 서열식별번호의 서열: 64로 구성된 핵산을 포함하고, 그리고 임의로 검출가능한 표지, 예를 들면, 형광성 표지를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 분자는 본 명세서에서 기재된 핵산, 예를 들면, 서열식별번호의 서열: 65로 구성된 핵산을 포함하고, 임의로 검출가능한 표지, 예를 들면, 형광성 표지를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 키트는 제1 분자가 배치된 제1 용기 및 제2 분자가 배치된 제2 용기를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 키트는 버퍼, 효소 (예를 들면, 폴리머라제 예컨대 열안정성 폴리머라제 예컨대 Taq), 뉴클레오타이드 (예를 들면, dNTPs), 및 임의로 염료-표지된 사슬-말단 뉴클레오타이드 (예를 들면, 디데옥시 뉴클레오타이드) 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있고; 이들 성분은 별도로 또는 단일 조성물의 일부로서 제공될 수 있다.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기의 단계들을 포함하는, D23 N. 유트로파 핵산이 샘플에서 존재하는 지를 검출하는 방법을 제공한다: D23 N. 유트로파에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 샘플에 대해 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 수행하는 단계, 및 PCR 생성물이 생산되는 지를 결정하는 단계, 여기서 상기 PCR 생성물의 존재는, D23 N. 유트로파 핵산이 샘플 내에 존재했었다는 것을 나타낸다. 구현예에서, 적어도 2개의 PCR 반응는 예를 들면 하기에서 수행된다: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 PCR 반응. 구현예에서, PCR 반응는 개별의 반응 용적에서 수행된다. 구현예에서, 2 이상의 PCR 반응는 멀티플렉스에서 수행된다.
일부 구현예에서, D23 N. 유트로파에 대해 특이적인 프라이머는 본 명세서에서 기재된 제1 핵산 및 제2 핵산, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 조성물 또는 키트로부터의 제1 및 제2 핵산이다. 일부 구현예에서, 제1 프라이머는 하기를 포함하거나 그것으로 구성되고: 서열식별번호의 서열: 65, 및 제2 프라이머는 하기를 포함하거나 그것으로 구성된다: 서열식별번호의 서열: 66.
일부 구현예에서, PCR 반응은 정량적 또는 실시간 PCR 반응이다. 일부 구현예에서, PCR 반응는 TaqMan 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, PCR 반응은 하기 사이의 반응 혼합물의 온도를 사이클링하는 것을 포함한다: 예를 들면, 분해 온도 (예를 들면, 약 95 ℃), 어닐링 온도 (예를 들면, 45-68, 55-65, 또는 60-65 ℃), 및 연신율 온도 (예를 들면, 약 68 ℃), 검출가능한 PCR 생성물을 생성하는데 충분한 수많은 사이클의 수, 약 10, 15, 20, 25, 또는 30개의 사이클 동안에. 일부 구현예에서, PCR 생성물을 검출하는 것은 PCR 생성물로부터 형광을 검출하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 양성 대조군은, 예를 들면, 공지된 D23 N. 유트로파 핵산을 주형으로서 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 음성 대조군은, 예를 들면, 주형을 사용하지 않거나 또 다른 박테리아 핵산을 주형으로서 사용하여 사용된다.
어떤 측면에서, 개시내용은 D23 N. 유트로파 핵산이 샘플에 존재하는 지를 검출하는 방법을 제공하고, 본 명세서에서 기재된 핵산의 샘플에의 결합을 검출하하는 것을 포함하고, 여기서 상기 결합의 존재는, D23 N. 유트로파 핵산이 샘플 내에 존재했었다는 것을 나타낸다. 일부 구현예에서, 결합은 프라이머 확대 또는 RNase 보호에 의해 검출된다.
본 발명서의 방법의 일부 구현예에서, 상기 샘플은 박테리아의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 대상체, 예를 들면, 인간 대상체의 피부로부터 수득된 것이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 샘플 중 하기 예의 박테리움의 하나 이상의 추가의 유형을 검출하는 것을 포함한다: 슈도모나스 에어루기노사, 스타필로코쿠스 아우레스, 스트렙토코쿠스 파이오제네스, 또는 아시네토박터 바우마니.
본 개시내용은 전술한 측면 및/또는 구현예 중 임의의 하나 이상의 모든 조합, 뿐만 아니라 상세한 설명 및 실시예에서 제시된 구현예 중 임의의 하나 이상과의 조합을 고려한다.
도 1은 N. 유트로파 균주 D23을 포함하는 박테리아의 혼합 배양물의 성장을 나타낸다. 600 nm 파장에서의 광학 밀도가 시간에 대해 플롯팅되어 있다.
도 2a는 N. 유트로파 균주 D23을 포함하는 박테리아의 혼합 배양물의 니트라이트 생산을 나타낸다. 니트라이트 농도가 시간에 대해 플롯팅되어 있다.
도 2b-I는 회분식 배양에서 N. 유트로파 D23에 의한 니트라이트 생산 역학을 나타낸다. 니트라이트 농도가 시간에 대해 플롯팅되어 있다.
도 2b-II는 시험관내에서 N. 유트로파 D23에 의한 니트라이트 생산 역학을 나타낸다. 니트라이트 농도가 시간에 대해 플롯팅되어 있다.
도 2c는 4 ℃에서 보관시 N. 유트로파 D23 안정성을 나타낸다. 니트라이트 농도가 시간에 대해 플롯팅되어 있다.
도 3a는 공동-배양 실험에서 P. 에어루기노사 (좌측 패널) 및 S. 아우레스 (우측 패널)의 성장을 억제하는 N. 유트로파 D23의 능력을 나타낸다. 바람직하지 않은 박테리아의 각 유형의 양 (CFU/ml)이 시간에 대해 플롯팅되어 있다. 이 도면에서, "AOB"는 균주 D23을 지칭한다.
도 3b는 공동-배양 실험에서 스트렙토코쿠스 파이오제네스 (좌측 패널) 및 아시네토박터 바우마니 (우측 패널)의 성장을 억제하는 N. 유트로파 D23의 능력 능력을 나타낸다. 바람직하지 않은 박테리아의 각 유형의 양 (CFU/ml)이 시간에 대해 플롯팅되어 있다. 이 도면에서, "AOB"는 균주 D23을 지칭한다.
도 3c는 공동-배양 실험에서 프로피오니박테리움 아크네스의 성장을 억제하는 N. 유트로파 D23의 능력을 나타낸다. 바람직하지 않은 박테리아의 각 유형의 양 (CFU/ml)이 시간에 대해 플롯팅되어 있다. 이 도면에서, "AOB"는 균주 D23을 지칭한다.
도 4a (상부 패널)는 공동-배양 실험에서 경시적으로 NO2 - 농도를 플롯팅한다. 하부 패널은 공동-배양 실험에서 시간 경과에 따른 pH를 플롯팅한다.
도 4b (상부 패널)는 공동-배양 실험에서 시간 경과에 따른 표시된 박테리아의 CFU/ml을 플롯팅한다. 중앙 패널은 공동-배양 실험에서 시간 경과에 따른 NO2 - 농도를 플롯팅한다. 하부 패널은 공동-배양 실험에서 시간 경과에 따른 pH를 플롯팅한다.
도 4c는 피부 병원체에 대한 D23의 살균 활성을 플롯팅한다.
도 4d는 피부 병원체에 대한 D23의 살균 활성을 플롯팅한다.
도 4e는 피부 병원체에 대한 D23의 살균 활성의 대안적인 플롯을 나타낸다.
도 5a는 상처 치유를 개선하는 D23의 능력을 시험하는 실험에서 시간 경과에 따른 퍼센트 상처 봉합을 플롯팅한다.
도 5b는 다양한 D23 처리에 대한 CT50를 플롯팅한다.
도 5c는 상처 치유를 개선하는 D23의 능력을 시험하는 실험에서 시간 경과에 따른 퍼센트 상처 봉합을 플롯팅한다.
도 5d는 상처 치유를 개선하는 D23의 능력을 시험하는 실험에서 경시적으로 퍼센트 상처 봉합을 플롯팅한다.
도 5e는 다양한 D23 처리에 대한 CT50를 플롯팅한다.
도 5f는 1일, 11일, 및 15일에 당뇨병성 마우스에서 D23 향상된 상처 치유의 이미지를 나타낸다.
도 5g는 다양한 농도의 D23에 대한 혈당 측정을 나타낸다.
도 5h는 시험 과정 동안 시험 대상체의 체중을 나타낸다.
도 5i는 시험 과정 동안 시험 대상체의 체중을 나타낸다.
도 5j는 대상체의 두피 시험에 대한 PCR 스코어를 나타낸다. AOB는 이 도면에서 D23을 지칭한다.
도 5k는 니트로소모나스-함유 국소 현탁액 (AOB-001)의 평가를 위한 인간 지원자 연구의 도식을 나타낸다.
도 5l (좌측 패널)은 연구 동안 수집된 두피 스왑의 PCR 분석을 나타낸다. AOB-특이적 3-유전자 서명 (signature) (amoA, amoB, amoC)에 대한 퍼센트-양성 샘플. 우측 패널은 연구 동안 수집된 두피 스왑의 PCR 분석을 나타낸다. 23명의 지원자 각각으로부터 수집된 총 6개의 샘플에 대한 종합 PCR 스코어. 6개의 샘플링 지점 각각에서 수거된 포지티브 샘플에 대해 사용된 스코어링 도식을 나타낸다.
도 5m은 AOB-001의 국소 적용 전과 후에 수집된 피부 스왑 샘플에서 16S rDNA 서열분석에 의해 결정된 속-수준 박테리아 다양성을 나타낸다. 적용 전(0일) 및 1주 적용 직후(8일) 또는 국소 적용 중지 후 1주 (14일)에 수거된 샘플에서 12개 세균 속 각각을 대표하는 총 서열 판독값의 %를 나타낸다. 아시네토박터, 버크홀데리아, 엔테로박터, 에스케리치아 시겔라, 클렙시엘라, 니트로소모나스, 판토에아, 프로피오니박테리움, 슈도모나스, 세라티아, 스타필로코쿠스, 및 스테노트로포모나스의 비율이 나타나 있다.
도 5n-A는 AOB-001 적용 전과 후에 수집된 피부 샘플에서 니트로소모나스 및 다른 종의 존재도의 변화를 보여준다. 적용전 기준선 (0일째) 및 1주 적용 후 즉시 (8일), 또는 국소 적용을 중지한 후 1주 (14일)에 니트로소모나스를 나타내는 총 16S rDNA 서열 리드의 백분율이 나타나 있다.
도 5n-B는 AOB-001 적용 전과 후에 수집된 피부 샘플에서 니트로소모나스 및 다른 종의 존재량 (abundance) 변화를 나타낸다. 종의 존재량의 변화된 패턴은 AOB 사용자로부터 수집된 0일 샘플 대 8일 샘플에서 16S rDNA 서열분석에 의해 검출하였다.
도 5o는 AOB-001의 사용자 평가를 나타낸다. 두피 및 얼굴에 1주 적용 완료시 23명의 지원자에 의해 제공된 AOB-001의 미용 효과의 평가. 대상체를 종합 PCT 스코어가 증가하는 순서로 플롯팅하였다. (2=강하게 동의함; 0 = 변화 없음; -2 = 강하게 동의하지 않음).
도 6은 서열 분석에 기반하여 배정된 열린 해독틀 (ORF) 수 및 기능 중 어느 하나를 갖는 고유한 D23 유전자, 또는 200 염기쌍 길이를 초과하는 가설 유전자를 나타내는 표이다. 칼럼 머리글은 하기를 의미한다: Feature.ID = 유전자에 대한 고유한 식별자; Type = 유전자의 유형, 여기서 CDS는 단백질-코딩 DNA 서열을 나타냄; Start = 서열번호: 1의 게놈 서열에서 유전자의 시작 위치; Stop = 서열번호: 1의 게놈 서열에서 유전자의 말단; Frame = 해독틀; Length = 유전자의 길이 (염기쌍); Function = 서열 분석에 기반한 유전자 또는 단백질 기능; Subsystem = 유전자 기능의 카테고리; D23GbkId = 유전자 식별자.
도 7은 할당된 ORF 번호를 갖는 200개 미만의 염기쌍의 고유한 D23 유전자들을 보여주는 표이다. 칼럼 머리글은 도 6에 기재된 바와 같다.
도 8은 어떠한 할당된 ORF 번호를 갖지 않는 고유한 D23 유전자들을 보여주는 표이다. 칼럼 머리글은 도 6에 기재된 바와 같다.
도 9는 D23에서 동족체를 갖지 않는 고유한 C91 유전자를 열거한다.
도 10은 N. 유트로파 균주 D23 및 C91에서 AmoA1 및 AmoA2 단백질 간의 서열 정렬이다. 각 단백질의 서열번호가 표 1에 열거되어 있다. 도 10은 나타낸 순서대로 각각 서열번호 6, 12, 36 및 42를 개시한다.
도 11은 N. 유트로파 균주 D23 및 C91에서 AmoB1 및 AmoB2 단백질 간의 서열 정렬이다. 각 단백질의 서열번호가 표 1에 열거되어 있다. 도 11은 나타낸 순서대로 각각 서열번호 8, 14, 38 및 44를 개시한다.
도 12는 N. 유트로파 균주 D23 및 C91에서 AmoC1 및 AmoC2 단백질 간의 서열 정렬이다. 각 단백질의 서열번호가 표 1에 열거되어 있다. 도 12는 나타낸 순서대로 각각 서열번호 34, 40, 10 및 4를 개시한다.
도 13은 N. 유트로파 균주 D23 및 C91에서 AmoC3 단백질 간의 서열 정렬이다. 각 단백질의 서열번호가 표 1에 열거되어 있다. 도 13은 나타낸 순서대로 각각 서열번호 46 및 16을 개시한다.
도 14a 및 도 14b는 N. 유트로파 균주 D23 및 C91에서 Hao1, Hao2, 및 Hao3 단백질 간의 서열 정렬을 보여준다. 각 단백질의 서열번호가 표 1에 열거되어 있다. 도 14는 나타낸 순서대로 각각 서열번호 20, 22, 18, 50, 52 및 48을 개시한다.
도 15는 N. 유트로파 균주 D23 및 C91에서 cycA1, cycA2, 및 cycA3 유전자 간의 서열 정렬이다. 각 단백질의 서열번호가 표 1에 열거되어 있다. 도 15는 나타낸 순서대로 각각 서열번호 26, 28, 24, 58, 56 및 54를 개시한다.
도 16은 N. 유트로파 균주 D23 및 C91에서 cycB1 및 cycB2 유전자 간의 서열 정렬이다. 각 단백질의 서열번호가 표 1에 열거되어 있다. 도 16은 나타낸 순서대로 각각 서열번호 30, 32, 60 및 62를 개시한다.
도 17은 속 (genus) 대 일 (day)에 의한, 박테리아 비율의 막대 그래프를 나타낸다.
도 18은 0일, 1일, 8일, 14일, 및 16일 동안, 속 (genus) 대 일 (day)에 의한, 박테리아 비율의 막대 그래프를 나타낸다.
보조 표 1은 서열 분석을 이용하여 균주 D23에서 확인된 2,777 유전자의 게놈 주석을 나타낸다. 칼럼 머리글은 도 6에 기재된 바와 같다. "C91 Alias"는 균주 C91에서 동족체를 지칭한다. 보조 표 1은 상세한 설명 및 실시예의 끝에 첨부되어 있다.
보조 표 2는 균주 D23에서 확인된 선택된 단백질 유전자들의 서열을 나타낸다. 보조 표 2는 상세한 설명 및 실시예의 끝에 첨부되어 있다.
상세한 설명
니트로소모나스 속의 암모니아-산화 박테리아 (AOB)는 에너지 공급원으로서 암모니아로부터 배타적으로 니트라이트 및 산화질소를 생성하는 독특한 수용력을 갖는 그램-음성 무조건 자가영양 박테리아이다. 토양 및 물 환경 모두에서 존재하고 환경적인 질산화 과정의 필수적인 성분이다. 몇 개의 생리적 기능, 예컨대 혈관확장, 피부 염증 및 상처 치유의 중요한 성분으로서 인간 피부에 대한 니트라이트 및 산화질소의 역할로 인해, 이들 박테리아는 건강한 및 면역병리적 피부 병태 둘 모두에 대한 유익할 특성을 가질 수 있다. 이들 박테리아가 인간에게 사용하기에 안전할 수 있는 것은, 성장이 느리고, 유기 탄소 공급원 상에서 성장할 수 없고, 비누 및 항생제에 민감할 수 있고, 동물 또는 인간에서 임의의 질환 또는 감염관 결코 관련되지 않았기 때문이다.
1. 정의
암모니아 산화 박테리아는 일정한 속도, 예를 들면, 실질적인 속도, 예를 들면, 전-결정된 속도, 예를 들면, 도 2A, 2B, 2C, 4A, 4B, 또는 5 중 어느 하나에 묘사된 적어도 그 속도 또는 상기 속도의 적어도 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 또는 10%로, 암모니아 또는 암모늄을 니트라이트로 산화할 수 있는 박테리아를 지칭한다. 일부 구현예에서, 실질적인 속도는 분당 적어도 50, 75, 125, 또는 150 마이크로몰 NO2 -, 예를 들면, 약 100-150, 75-175, 75-125, 100-125, 125-150, 또는 125-175 마이크로몰/분, 예를 들면, 분당 약 125 마이크로몰 NO2 -의 속도의 암모늄 이온 (NH4 +)(예를 들면, 약 200 mM)의 니트라이트 (NO2 -)로의 전환을 지칭한다. 암모니아 산화 박테리아의 예는 N. 유트로파 균주 D23 및 C91, 및 속 니트로소모나스, 니트로소코쿠스, 니트로소스피라, 니트로소사이스티스, 니트로솔로부스, 및 니트로소비브리오 내의 다른 박테리아를 포함한다. D23 니트로소모나스 유트로파 균주는 수탁 번호 PTA-121157를 갖는, 2014년 4월 8일에 미국 미생물 보존센터 (ATCC)에 수탁된, AOB D23-100으로 지정된 균주를 지칭한다. 수탁 번호 PTA-121157의 D23 니트로소모나스 유트로파는 본원에서 하기 서열번호에 제시된 게놈 서열을 갖는다: 1. 상기 핵산 서열(들), 예컨대 수탁 번호 PTA-121157의 게놈 서열은 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 최적화된 니트로소모나스 유트로파 (N. 유트로파)는 최적화된 성장 속도; 최적화된 NH4 + 산화 속도; 또는 NH4+에 대한 최적화된 내성을 갖는 N. 유트로파를 지칭한다. 일 구현예에서 그것은 적어도 하나의 뉴클레오타이드, 예를 들면, 암모니아 모노옥시게나제, 하이드록실아민 산화환원효소, 사이토크롬 c554, 및 사이토크롬 cM552로부터 선택된 유전자 내의 하나의 뉴클레오타이드가 자연 발생 N. 유트로파와 상이하다. 상기 차이는, 예를 들면, N. 유트로파의 자연적으로 일어나는 돌연변이, 유도 돌연변이, 또는 지향적 유전공학의 선택을 통해 일어날 수 있다. 일 구현예에서 그것은 자연에서 함께 존재하지 않는 대립유전자의 무리 (constellation)를 갖는다는 점에서 자연 발생 N. 유트로파와 상이하다. 이러한 차이는 피부 장애의 치료 또는 예방, 저 니트라이트 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료 또는 예방, 체취의 치료 또는 예방, 산화질소를 대상체에게 공급하는 치료, 및 미생물 성장을 억제하는 치료 중 하나 이상을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "무균"은 다른 유기체가 실질적으로 없는 유기체를 포함하는 조성물을 지칭한다. 예를 들면, 암모니아 산화 박테리아의 무균 배양물은 암모니아 산화 박테리아 이외의 유기체가 실질적으로 없는 배양물이다. 예를 들면, N. 유트로파의 무균 배양물은 N. 유트로파 외의 유기체가 실질적으로 없는 배양물이다. 일부 구현예에서, "실질적으로 없는"은 다른 유기체를 검출하기 위해 사용된 방법, 예를 들면, 배양물을 플레이팅하고 콜로니 형태학을 조사하는 것, 또는 16S RNA와 같은 보존된 유전자에 대한 PCR에 의해 검출불가능함을 의미한다. 무균 조성물은 유기체가 아닌 요소를 포함할 수 있고, 예를 들면, 그것은 영양소 또는 부형제를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 논의된 암모니아 산화 박테리아의 임의의 구현예, 조제물, 조성물, 또는 제형은 임의의 무균 암모니아 산화 박테리아를 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어질 수 있다.
이 개시내용 전반에서, 제형은 조성물 또는 조제물을 가리킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "독립영양", 예를 들면, 독립영양 박테리아는, 영양원으로서 무기 물질을 이용하고 에너지원으로서 광합성 또는 화학합성을 이용함으로써 스스로 양분을 공급할 수 있는 임의의 유기체이다. 독립영양 박테리아는 다른 공급원으로부터 유래된 이산화탄소 및 ATP로부터 유기화합물을 합성하고, 암모니아를 니트라이트로 산화하고, 황화수소를 산화하고, Fe2+를 Fe3+로 산화할 수 있다. 본 개시내용의 독립영양 박테리아는 감염을 야기할 수 없다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "조합" 투여는, 대상체가 장애로 고통받는 과정 동안 2개 (또는 그 이상)의 상이한 치료가 전달되는 것, 예를 들면, 대상체가 장애로 진단받은 이후 및 상기 장애가 치유되거나 제거되기 전에 2 이상의 치료가 전달되는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 한 가지 치료의 전달이 두 번째 치료의 전달이 시작될 때에도 여전히 일어나고 있으므로, 중첩이 있다. 이것은 때때로 본원에서 "동시" 또는 "수반" 또는 "병행 전달"로 지칭된다. 다른 구현예에서, 한 가지 치료의 전달이 끝난 후에 다른 치료의 전달이 시작된다. 이것은 때때로 본원에서 "연속" 또는 "순차 전달"로 지칭된다. 어느 한 경우의 구현예에서, 상기 치료는 병용 투여로 인해 더 효과적이다. 예를 들면, 두 번째 치료는 더 효과적이며, 예를 들면, 적은 두 번째 치료로도 동등한 효과가 관찰되거나 또는 첫 번째 치료의 부재하에 두 번째 치료가 투여되는 경우 관찰될 것보다 두 번째 치료가 더 큰 정도까지 증상을 감소시키거나, 또는 비슷한 상황이 첫 번째 치료로 관찰된다. 일부 구현예에서, 전달은 증상, 또는 장애와 관련된 다른 파라미터의 감소가 다른 치료의 부재하에 전달된 하나의 치료로 관찰될 것보다 더 큰 것이다. 상기 2개의 치료의 효과는 부분적으로 상가적이거나, 완전히 상가적이거나, 상가적인 것보다 더 클 수 있다 (즉, 상승작용). 전달은 두 번째 치료가 전달될 때 전달된 첫 번째 치료의 효과가 여전히 검출가능한 것일 수 있다.
완전한 N. 유로파에아 배지는 하기에 기재된 N. 유로파에아 성장 배지를 지칭한다: Ensign 등, "In vitro activation of ammonia monooxygenase from Nitrosomonas europaea by copper." J Bacteriol. 1993 Apr;175(7):1971-80.
"배양하는" 것은 원하는 박테리아의 양을 그의 성장을 촉진하는, 즉, 세포 분열을 촉진하는 조건 하에 두는 과정을 지칭한다. 상기 조건은 특정한 배양 배지, 설정 온도 범위, 및/또는 진탕 속도를 포함할 수 있다. 박테리아는 액체 배양으로 또는 플레이트, 예를 들면, 우무평판 상에서 배양될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 그의 본래의 또는 원상태 환경 (예를 들면, 만약 그것이 자연 발생하면, 자연 환경)으로부터 제거된 물질을 지칭한다. 예를 들면, 살아있는 동물 내에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리되지 않지만, 자연계에서의 공존하는 물질 중 일부 또는 모두로부터 인간의 개입에 의해 분리된, 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리된다. 그러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부일 수 있고/거나 그러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 조성물의 일부일 수 있으며, 그러한 벡터 또는 조성물이 그것이 자연에서 발견되는 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리될 수 있다.
용어들 "핵산," "핵산 서열," "뉴클레오타이드 서열," 또는 "폴리뉴클레오타이드 서열," 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호교환적으로 사용된다. 이들은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 폴리머 형태, 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 그것의 유사체를 지칭한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 단일가닥 또는 이중가닥 중 하나일 수 있으며, 만약 단일가닥인 경우, 코딩 가닥 또는 비-코딩 (안티센스) 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 단절될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는, 표지화 성분과의 접합에 의해서와 같이, 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 핵산은 재조합 폴리뉴클레오타이드, 또는 게놈, cDNA, 반합성, 또는 자연상에서 존재하지 않거나 비천연 배열로 또 다른 폴리뉴클레오타이드에 연결된 합성 기원의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "최적화된 성장 속도"는 하기 중 하나 이상을 지칭한다: 실시예 2에서 본원에 기재된 바와 같은 회분 조건 하에 배양될 때 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10시간 미만의 배가 시간 (doubling time); 실시예 2에서 본원에 기재된 바와 같은 케모스탯 조건 하에 성장될 때 약 16, 18, 20, 22, 24, 또는 26시간 미만의 배가 시간; 또는 약 1 또는 2일간 약 0.15의 OD600 내지 적어도 약 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 또는 0.8로 성장하는 것. 일 구현예에서, 최적화된 성장 속도는 자연 발생 N. 유트로파보다 적어도 10, 20, 30, 40, 또는 50% 더 짧은 배가 시간을 갖는 속도이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "최적화된 NH4 + 산화 속도"는 NH3 또는 NH4 +를 NO2 -로 전환시키는 분당 적어도 약 50, 75, 125, 또는 150 마이크로몰의 속도를 지칭한다. 예를 들면, 상기 속도는 NH4 + (예를 들면, 약 200 mM)를 NO2 -로 전환시키는 분당 적어도 약 50, 75, 125, 또는 150 마이크로몰일 수 있다. 일 구현예에서, 최적화된 NH4 + 산화 속도는 NH3 또는 NH4 +가 자연 발생 N. 유트로파에서 관찰된 것보다 적어도 10, 20, 30, 40, 또는 50% 더 빠르게 NO2 -로 전환되는 것이다.
본원에서 아미노산 서열 (예를 들면, N. 유트로파 D23에 의해 발현된 단백질)에 대한 퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성은, 서열들을 정렬하고 필요하면 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하고, 서열 동일성의 일부로서 어떤 보존적 치환도 고려하지 않은 후, 자연 발생 N. 유트로파 서열 또는 N. 유트로파 D23 서열일 수 있는 참조 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당해분야의 숙련가의 수단 내에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공중이 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당해분야의 숙련가는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 예를 들면, WU-BLAST-2 소프트웨어가 아미노산 서열 동일성을 결정하는데 사용될 수 있다 (Altschul 등, Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html). WU-BLAST-2는 몇 가지 탐색 파라미터를 이용하며, 이들 대부분은 디폴트 값으로 설정된다. 조정가능한 파라미터는 하기 값으로 설정된다: 오버랩 범위=l, 오버랩 분획=0.125, 월드 역치 (T)=I 1. HSP 스코어 (S) 및 HSP S2 파라미터는 동적 값이며, 특정 서열의 조성에 따라, 프로그램 자체에 의해 확립되지만, 최소 값은 적절하게 조절될 수 있다.
아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환하는 것, 예컨대 류신을 세린으로 치환하는 것, 즉, 보존적 아미노산 치환의 결과일 수 있다. 전형적이나 비제한적인 보존적 치환은 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile 중에서 서로에 대한 치환; 하이드록시 잔기를 함유하는 Ser 및 Thr의 교환, 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환, 아미드-함유 잔기 Asn 및 Gln 간의 교환, 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환, 방향성 잔기 Phe 및 Tyr의 교환, 및 작은 크기의 아미노산 Ala, Ser, Thr, Met 및 Gly의 교환이다. 부가적인 보존적 치환은 하나의 아미노산을 유사한 공간적 또는 입체 배열의 또 다른 아미노산에 의해 치환하는 것, 예를 들면 Asp의 Asn으로의 교환, 또는 Glu의 Gln으로의 교환을 포함한다. 아미노산 치환은 또한 하나의 아미노산을 유사하지 않은 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체하는 것, 즉, 비-보존적 아미노산 대체의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 1 내지 5 아미노산 범위일 수 있다. 허용된 변이는 서열 내의 아미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환하고, 수득한 변이체를 예를 들면, 우레아 또는 암모니아를 대사하는 것에 대해 생체내 또는 시험관내 분석에서 활성을 시험함으로써 결정될 수 있다.
본원에서의 핵산 서열 (예를 들면, N. 유트로파 D23 게놈 및 이의 일부)에 대한 퍼센트 (%) 서열 동일성은, 서열들을 정렬하고, 필요하면 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후, 자연 발생 N. 유트로파 서열 또는 N. 유트로파 D23 서열일 수 있는 참조 서열 내의 뉴클레오타이드와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오타이드의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 뉴클레오타이드 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당해분야의 숙련가의 수단에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공중이 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST를 이용하여 달성될 수 있다. 당해분야의 숙련가는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
용어들 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질" (단일 사슬인 경우)은 아미노산 폴리머를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 폴리머는 선형 또는 분지형일 수 있고, 그것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 그것은 비-아미노산에 의해 단절될 수 있다. 상기 용어들은 또한 변형된 아미노산 폴리머; 예를 들면, 디설파이드 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작, 예컨대 표지화 성분과의 접합을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 진핵 또는 원핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생산될 수 있거나, 또는 합성 절차의 생성물일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "NH4 +에 대한 최적화된 내성"은 적어도 약 24 또는 48시간 동안 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 또는 300 mM을 초과하는 NH3 또는 NH4 +의 조건으로 성장할 수 있는 능력을 지칭한다. 일 구현예에서, NH4 +에 대한 최적화된 내성은 선택된 농도의 NH3 또는 NH4 +의 존재시에, 자연 발생 N. 유트로파보다 적어도 10, 20, 30, 40, 또는 50% 더 빠르게, 또는 적어도 10, 20, 30, 40, 또는 50% 더 길게 성장하는 능력을 지칭한다.
핵산 또는 단백질 서열 간의 비교에 대해 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "유사한"은 상동성을 갖는 것을 의미한다. 유사한 유전자 또는 단백질은, 예를 들면, 치환 (예컨대 보존적 또는 비-보존적 치환), 삽입 (예를 들면, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30개의 아미노산, 및 예를 들면 최대 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 또는 50개의 아미노산, 또는 이들의 임의의 양성 조합, 또는 상기 아미노산을 인코딩하는데 필요한 뉴클레오타이드의 수), 또는 결실 (예를 들면, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30개의 아미노산, 및 예를 들면 최대 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 또는 50개의 아미노산, 또는 이들의 임의의 양성 조합, 또는 상기 아미노산을 인코딩하는데 필요한 뉴클레오타이드의 수), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 치환, 삽입, 및 결실 각각은 단백질 또는 유전자의 N-말단, C-말단, 또는 중앙 영역에 위치할 수 있다. 구현예에서, 보존적 치환은 상기 치환된 위치에서 전하 및/또는 극성 및/또는 대략적인 크기 및/또는 기하학을 변경하지 않는 치환이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "형질전환"은 DNA의 하나 이상의 외인성 부분을 포함하는 것을 의미한다. 외인성 DNA는 또 다른 유기체, 예를 들면, 또 다른 박테리아, 박테리오파아지, 동물, 또는 식물로부터 유래된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 질환 또는 병태의 치료는, 유사하나 치료받지 않은 환자와 비교하여, 상기 질환 또는 병태의 적어도 하나의 증상의 중증도 또는 빈도를 감소시키는 것을 지칭한다. 치료는 또한 유사하나 치료받지 않은 환자와 비교하여, 질환 또는 병태의 진행을 정지시키거나, 늦추거나, 또는 역전시키는 것을 지칭할 수 있다. 치료는 질환 및/또는 하나 이상의 증상의 근본 원인을 다루는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 치료적 유효량은 질환 또는 병태의 진전을 예방하거나, 또는 퇴행을 야기하는데 충분한 용량, 또는 질환 또는 병태의 증상을 경감할 수 있거나, 또는 원하는 결과를 달성할 수 있는 용량을 지칭한다. 치료적 유효량은, 예를 들면, 박테리아의 수 또는 살아있는 박테리아의 수 (예를 들면, CFU) 또는 박테리아의 질량 (예를 들면, 밀리그램, 그램, 또는 킬로그램), 또는 박테리아의 부피 (예를 들면, mm3)로서 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "생존력 (viability)"은 암모니아, 암모늄, 또는 우레아를 전-결정된 속도로 니트라이트로 산화하는 독립영양 박테리아의, 예를 들면, 암모니아 산화 박테리아의 능력을 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 속도는 분당 적어도 50, 75, 125, 또는 150 마이크로몰 NO2 -, 예를 들면, 약 100-150, 75-175, 75-125, 100-125, 125-150, 또는 125-175 마이크로몰/분, 예를 들면, 분당 약 125 마이크로몰 NO2 -의 속도로, 암모늄 이온 (NH4 +) (예를 들면, 약 200 mM)을 니트라이트 (NO2 -)로 전환하는 것을 지칭한다.
본원에서 언급된 바와 같은 "성장 배지" 또는 "AOB 배지"는 본원 표 3 또는 표 4의 하기 성분을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용과 가장 관련된 상태는 성장 상태, 예를 들면, 적어도 약 7.6의 pH, 암모니아, 미량 미네랄, 산소 및 이산화탄소를 특징으로 하는 최대 성장이다. 또 다른 상태는 약 7.4 이하의 pH를 특징으로 할 수 있고 이산화탄소의 부재를 특징으로 할 수 있다. 낮은 이산화탄소 조건하에, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, 니트로소모나스는 계속 암모니아를 니트라이트로 산화하고 ATP를 생성하지만, 이산화탄소가 결여되고, 예를 들면, 충분한 이산화탄소가 결여되면, 단백질을 고정시키고 생성하기 위해, 그것은 대신에 폴리포스페이트를 생성하고, 그것은 에너지 저장 배지로서 사용한다. 이것은 일정 기간, 예를 들면, 전-결정된 기간, 예를 들면, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일, 1, 2, 3, 4주, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월, 1, 2, 3, 4, 또는 5년의 기간 동안 암모니아 산화 박테리아를 "보관 상태 (storage state)"로 유지시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는 적어도 약 6개월 내지 약 1년 동안 보관 상태에 유지될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "성장 상태"는 상태 또는 환경, 예컨대, 배지, 예를 들면, 배양 배지, 예를 들면, 적어도 약 7.6의 pH를 가질 수 있는, 성장 배지 내의 독립영양 박테리아, 예를 들면, 암모니아 산화 박테리아를 지칭한다. 암모니아, 암모늄 이온, 및 우레아 중 적어도 하나의 수준은 약 1 마이크로몰 내지 1000 밀리몰이다. 미량 물질의 수준은 약 0.01 마이크로몰 철 내지 200 마이크로몰 철이다. 산소의 수준은 약 5% 내지 100% 산소 포화 (예를 들면, 배지의)이다. 이산화탄소의 수준은 약 20 ppm 내지 10% 포화 (예를 들면, 배지의)이다. 어떤 측면에서, 암모니아, 암모늄 이온, 및 우레아 중 적어도 하나의 수준은 약 10 마이크로몰 내지 100 밀리몰일 수 있다. 미량 물질의 수준은 약 0.1 마이크로몰 철 내지 20 마이크로몰 철이다. 산소의 수준은 약 5% 내지 100% 산소 포화 사이이다. 이산화탄소의 수준은 약 200 ppm 내지 5% 포화 (예를 들면, 배지의)이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "폴리포스페이트 로딩 상태"는 상태 또는 환경, 예컨대, 배지, 예를 들면, 배양 배지, 예를 들면, 약 7.4 이하의 pH를 가질 수 있는, 성장 배지 내의 독립영양 박테리아, 예를 들면, 암모니아 산화 박테리아를 지칭한다. 암모니아, 암모늄 이온, 및 우레아 중 적어도 하나의 수준은 약 1 마이크로몰 내지 2000 밀리몰이다. 미량 물질의 수준은 0.01 마이크로몰 철 내지 200 마이크로몰 철이다. 산소의 수준은 약 0% 내지 100% O2 포화 (예를 들면, 배지의)이다. 이산화탄소의 수준은 약 0 및 400 ppm 사이/미만이고, 포스페이트 수준은 약 1 마이크로몰 초과이다. 어떤 측면에서, 암모니아, 암모늄 이온, 및 우레아 중 적어도 하나의 수준은 약 10 마이크로몰 내지 200 밀리몰이다. 미량 물질의 수준은 0.1 마이크로몰 철 내지 20 마이크로몰 철이다. 산소의 수준은 약 5% 내지 100% O2 포화이다. 이산화탄소는 약 0 및 200 ppm 사이/미만이고, 포스페이트 수준은 약 10 마이크로몰 초과이다.
폴리포스페이트 로딩 상태는 일정 기간, 예를 들면, 전-결정된 기간 동안 유도될 수 있다. 전-결정된 기간은 암모니아 산화 박테리아 내에 충분한 폴리포스페이트 축적을 가능하게 하는 기간일 수 있다. 이 전-결정된 기간은 암모니아 산화 박테리아가 연장된 기간 동안 보관되도록 하기 위해 충분한 폴리포스페이트 로딩을 제공하는데 적합한 기간이다. 전-결정된 기간은 암모니아 산화 박테리아에 대한 배가 시간의 약 0.2-10배, 0.3-5배, 0.5-3배, 0.5-1.5배, 또는 0.5 내지 1배의 기간에 적어도 일부 기초할 수 있다. 전-결정된 기간은 암모니아 산화 박테리아에 대한 약 1 배가 시간의 기간에 적어도 일부 기초할 수 있다. 일부 구현예에서, 전-결정된 기간은 약 8시간 내지 12시간이다. 일부 구현예에서, 전-결정된 기간은 약 10시간이다. 일부 구현예에서, 전-결정된 기간은 약 24시간이다.
폴리포스페이트 로딩 상태의 목적은 충분한 암모니아, 암모늄 이온, 및/또는 우레아, 및 O2를 갖는 AOB를 제공하여 ATP가 생산될 수 있게 하기 위한 것일 수 있지만, CO2 및 카보네이트를 거부함으로써 이들이 상기 ATP를 사용하여 CO2를 고정화시킬 수 없게 하고 대신에 상기 ATP를 사용하여 박테리아에 의해 보관될 수 있는 폴리포스페이트를 생성할 수 있게 하기 위한 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "보관 상태"는 상태 또는 환경, 예컨대, 배지, 예를 들면, 배양 배지, 예를 들면, 약 7.4 이하의 pH (일부 구현예에서, pH는 7.6 또는 그 미만일 수 있음)를 갖는, 성장 배지 내의 독립영양 박테리아, 예를 들면, 암모니아 산화 박테리아를 지칭한다. 암모니아, 암모늄 이온, 및 우레아 중 적어도 하나의 수준은 약 _1 내지 1000 마이크로몰이다. 미량 물질의 수준은 약 0.1 내지 100 마이크로몰이다. 산소의 수준은 약 0 내지 100% 포화 (예를 들면, 배지의)이다. 이산화탄소의 수준은 약 0 내지 800 ppm이다. 어떤 측면에서, 암모니아, 암모늄 이온, 및 우레아 중 적어도 하나의 수준은 약 _10 내지 100 마이크로몰이다. 미량 물질의 수준은 약 1 내지 10 마이크로몰이다. 산소의 수준은 약 0 내지 100% 포화 (예를 들면, 배지의)이다. 이산화탄소의 수준은 약 0 내지 400 ppm이다.
AOB는 성장 상태 동안 AOB 바이오매스를 생성한 다음, 상기 AOB를 폴리포스페이트 로딩 상태에 노출시키고, 이후 배지를 제거하고 상기 AOB를 완충제, 예를 들면, 보관 완충제에 재현탁시킴으로써 (즉, 보관 상태), 본 개시내용의 일부 구현예에 따라 생산된다.
암모니아 산화 박테리아는 일정 기간, 예를 들면, 전-결정된 기간, 예를 들면, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일, 1, 2, 3, 4주, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월, 1, 2, 3, 4, 또는 5년 동안 "보관 상태"로 유지될 수 있다. 일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는 적어도 약 6개월 내지 약 1년 동안 보관 상태에 유지될 수 있다. 회복시, 암모니아 산화 박테리아의 생존력은 보관 전 (예를 들면, 성장 상태) 암모니아 산화 박테리아의 생존력의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%이다. 일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아의 조제물은 NH4 +를 산화하는 능력의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 70% 이하가 선택된 조건에서 보관시 소실되도록, 제조될 수 있다.
암모니아 산화 박테리아를 보관 상태 (또는 폴리포스페이트 로딩 상태)로부터 회복하는데 걸리는 시간은 전-결정된 기간일 수 있다. 예를 들면, 전-결정된 기간은 약 75시간 미만, 또는 약 72시간 미만일 수 있다. 전-결정된 기간은 암모니아 산화 박테리아에 대한 배가 시간의 약 0.2-10배, 0.3-5배, 0.5-3배, 0.5-1.5배, 또는 0.5 내지 1배의 기간에 적어도 일부 기초할 수 있다. 전-결정된 기간은 암모니아 산화 박테리아에 대한 약 1 배가 시간의 기간에 적어도 일부 기초할 수 있다. 전-결정된 기간은 약 8 시간 내지 12시간일 수 있다. 전-결정된 기간은 약 10시간일 수 있다. 전-결정된 시간은 약 75시간, 72시간, 70시간, 68시간, 65시간, 60시간, 55시간, 50시간, 45시간, 40시간, 35시간, 30시간, 25시간, 20시간, 15시간, 10시간, 5시간, 4시간, 3시간, 2시간, 또는 1시간 미만일 수 있다. 전-결정된 기간은 약 5분 내지 5시간일 수 있다. 전-결정된 기간은 약 5-10분, 10-15분, 15-20분, 20-25분, 25-30분, 30-45분, 45-60분, 60분 - 1.5시간, 1.5시간 - 2시간, 2시간 - 2.5시간, 2.5시간 - 3시간, 3시간 - 3.5시간, 3.5시간 - 4시간, 4시간 - 4.5시간, 4.5시간 - 5시간일 수 있다. 일부 구현예에서, 전-결정된 기간은 약 2시간일 수 있다. 전-결정된 기간은, 예를 들면 암모니아 산화 박테리아의 회복을 달성하는데, 예를 들면, 보관 전 박테리아(예를 들면, 성장 상태임)의 생존력과 비교하여, 예를 들면, 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 생존력을 달성하는데 걸릴 수 있는 시간일 수 있다.
2. 암모니아 산화 박테리아 (AOBs), N. 유트로파 균주 D23 및 유사한 박테리아
본 명세서에서 AOBs 또는 AOB로 지칭될 수 있는 독립영양 암모니아 산화 박테리아는 하기에 의해 언급된 바와 같은 절대 독립영양 박테리아이다: Alan B. Hooper and A. Krummel at al. Alan B. Hooper, Biochemical Basis of Obligate Autotrophy in Nitrosomonas europaea, Journal of Bacteriology, Feb 1969, p. 776-779. Antje Krummel et al., Effect of Organic Matter on Growth and Cell Yield of Ammonia-Oxidizing Bacteria, Arch Microbiol (1982) 133: 50-54. 이들 박테리아는 이들의 호흡 사슬에서 중간 생성물로서 산화질소 (NO)와 함께 오직 암모니아의 니트라이트로의 산화로부터 모든 대사성 에너지를 얻고 이산화탄소를 고정화시킴으로써 거의 모든 탄소를 얻는다. 이들은 몇 가지 간단한 분자 이외의 탄소 공급원을 이용할 수 없다.
암모니아 산화 박테리아 (AOB)는 환경에서 널리 발견되며, 암모니아의 존재시, 산소 및 미량의 금속이 이산화탄소를 고정시키고 증식할 것이다. AOB는 느리게 성장할 수 있으며, 암모니아의 독성 수준이 AOB가 증식하여 암모니아를 비독성 수준으로 감소시키기 전에 물고기 및 다른 유기체를 사멸시킬 수 있다. AOB의 느린 성장은 또한 피부에 적용될 때 AOB가 생산하는 NO 및 니트라이트의 건강상의 이점을 지연시킬 수 있다.
상기 목적을 위해 아쿠아리움, 피부, 또는 공정을 성장되고 보관된 충분한 살아있는 AOB로 보충하는 것이 요구된다. AOB는 포자를 형성하지 않으므로, 높은 생존력으로 건조 상태로 보관하는 것이어렵고 습식 상태에서의 보관이 이들을 대사적으로 활성 상태로 만든다.
예를 들면, 폐수 처리를 위해 AOB의 보관 동안 질화 능력의 붕괴가 연구되어 왔다 (Munz G, Lubello C, Oleszkiewicz JA. Modeling the decay of ammonium oxidizing bacteria. Water Res. 2011 Jan; 45(2): 557-64. Oi: 10.1016/j.watres.2010.09.022.)
니트로소모나스의 성장, 장기 보관, 및 활성의 회복이 하기에 의해 논의되며: Cassidy et al. (미국 5,314,542), 여기서 저자들은 니트로소모나스를 성장시키고, 독성 폐기물을 제거하고, 최대 1년의 기간 동안 적절한 염분의 멸균수에 보관한 다음, 버퍼 (CaCO3) 및 200 ppm의 암모늄을 부가하는 것 (상기 회복은 72시간이 걸림)을 개시한다.
절대 독립영양생물로서, AOB는 암모니아의 니트라이트로의 산화에 의해 생성된 에너지 및 환원 등가물을 이용한 CO2의 고정화를 통해 단백질을 합성한다. 성장은 암모니아, 산소, 미네랄 및 이산화탄소를 필요로 한다.
하기 문헌에 의한 "Polyphosphate and Orthophosphate Content of Nitrosomonas europaea as a Function of Growth"에 따르면, 니트로소모나스는 몇 가지 대사성 상태로 존재할 수 있다: K.R. Terry and A.B. Hooper, Journal of Bacteriology, July 1970, p. 199-206, Vol. 103, No. I.
개시내용의 특정 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는 무균일 수 있다. 암모니아 산화 박테리아의 조제물 (제형 또는 조성물)은 무균 암모니아 산화 박테리아를 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어질 수 있다. 암모니아 산화 박테리아는 니트로소모나스, 니트로소코쿠스, 니트로소프리아, 니트로소사이스티스, 니트로솔로부스, 니트로소비브리오, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 속으로부터일 수 있다.
본 개시내용은 대상체, 예를 들면, 인간 대상체의 표면 상의 산화질소 및 산화질소 전구체의 생산을 증가시킬 수 있는 암모니아 산화 박테리아의 독특한, 예를 들면, 최적화된 균주, 특히, N. 유트로파 균주 D23을 제공한다. 본 개시내용은 또한, 상기 박테리아 및 상기 박테리아를 포함하는 물품을 이용하는 방법을 제공한다.
구현예에서, N. 유트로파는 비-자연 발생이다. 예를 들면, 그것은 선택된 기간 동안 바람직한 돌연변이를 축적할 수 있다. 다른 구현예에서, 바람직한 돌연변이가 실험자에 의해 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, N. 유트로파는 정제된 제제일 수 있고, 이는 최적화된 N. 유트로파 일 수 있다.
바람직한 구현예에서, N. 유트로파 균주는 독립영양이고 따라서 감염을 야기할 수 없다. 바람직한 균주는 우레아 뿐만 아니라 암모니아를 이용하며, 따라서 땀에서 우레아의 가수분해가 박테리아에 의한 흡수 및 이용 전에 필요하지 않을 것이다. 또한, 낮은 pH에서 성장하기 위해, 상기 박테리아는 NH4 + 이온 또는 우레아 중 어느 하나를 흡수할 수 있다. 상기 선택된 균주는 또한 대상체, 예를 들면, 인간의 외부 피부 상에서 살아갈 수 있어야 하며, 그 곳에서의 조건을 견딜 수 있어야 한다.
본 개시내용이 N. 유트로파 균주 D23을 상세히 언급하고 있음에도 불구하고, 상기 조제물, 방법, 조성물, 치료, 착용가능한 물품, 및 의류는 하기 중 하나 이상과 함께 사용될 수 있다: N. 유트로파의 하나 이상의 다른 균주, 니트로소모나스의 하나 이상의 다른 종, 및 하나 이상의 다른 암모니아 산화 박테리아. 독립영양 AOBs는 하기에 의해 언급된 바와 같이 절대 독립영양 박테리아이다: Alan B. Hooper and A. Krummel at al. Alan B. Hooper, Biochemical Basis of Obligate Autotrophy in Nitrosomonas europaea, Journal of Bacteriology, Feb 1969, p. 776-779. Antje Krummel et al., Effect of Organic Matter on Growth and Cell Yield of Ammonia-Oxidizing Bacteria, Arch Microbiol (1982) 133: 50-54. 이들 박테리아는 이들의 호흡 사슬에서 중간 생성물로서 산화질소 (NO)와 함께 오직 암모니아의 니트라이트로의 산화로부터 모든 대사성 에너지를 얻고 이산화탄소를 고정화시킴으로써 거의 모든 탄소를 얻는다. 이들은 몇 가지 간단한 분자 이외의 탄소 공급원을 이용할 수 없다.
특정 구현예에서, N. 유트로파는 수탁 번호 PTA-121157 하에 AOB D23-100 (25 바이알)로 지정된, 2014년 4월 8일에 미국 미생물 보존센터 (ATCC)에 수탁된 균주이다.
특정 구현예에서, N. 유트로파는 서열번호:1에 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한 서열을 갖는 염색체를 포함한다 (균주 D23 전체 게놈 서열).
특정 구현예에서, 상기-언급된 서열 특성을 갖는 박테리움은 하기 중 하나 이상을 갖는다: (1) 배가 시간에 의해 측정된 최적화된 성장률, (2) OD600에 의해 측정된 최적화된 성장률, (3) 최적화된 NH4 + 산화 비율, (4) NH4 +에 대한 최적화된 내성, 및 (4) NO2 -에 대한 최적화된 내성. 이들 특성의 특정한 하위-조합은 하기 단락에서 명시되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 하기 중 하나 이상을 갖는다: (1) 배가 시간에 의해 측정된 최적화된 성장률, (2) OD600에 의해 측정된 최적화된 성장률, (3) 최적화된 NH4 + 산화 비율, (4) NH4 +에 대한 최적화된 내성, 및 (4) NO2 -에 대한 최적화된 내성. 예를 들면, 상기 박테리움은 이 단락의 시작부에 있는 목록으로부터의 특성 (1) 및 (2); (2) 및 (3); (3) 및 (4); 또는 (4) 및 (5)를 가질 수 있다. 또 다른 예로서, 박테리움은 이 단락의 시작부에 있는 목록으로부터의 특성 (1), (2), 및 (3); (1), (2), 및 (4); (1), (2), 및 (5); (1), (3), 및 (4); (1), (3), 및 (5); (1), (4), 및 (5); (2), (3), 및 (4); (2), (3), 및 (5), 또는 (3), (4), 및 (5)를 가질 수 있다. 추가 예로서, 박테리움은 이 단락의 시작부에 있는 목록으로부터의 특성 (1), (2), (3), 및 (4); (1), (2), (3), 및 (5); (1), (2), (4), 및 (5); (1), (3), (4), 및 (5); 또는 (2), (3), (4), 및 (5)를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 박테리움은 이 단락의 시작부에 있는 목록으로부터의 특성 (1), (2), (3), (4), 및 (5)를 갖는다.
본 개시내용은 또한, 하기 중 하나 이상을 갖는 N. 유트로파의 무균 조성물을 제공한다: (1) 배가 시간에 의해 측정된 최적화된 성장률, (2) OD600에 의해 측정된 최적화된 성장률, (3) 최적화된 NH4 + 산화 비율, (4) NH4 +에 대한 최적화된 내성, 및 (4) NO2 -에 대한 최적화된 내성. 예를 들면, 상기 무균 N. 유트로파 조성물은 이 단락의 시작부에 있는 목록으로부터의 특성 (1) 및 (2); (2) 및 (3); (3) 및 (4); 또는 (4) 및 (5)를 가질 수 있다. 또 다른 예로서, 무균 N. 유트로파 조성물은 이 단락의 시작부에 있는 목록으로부터 특성 (1), (2), 및 (3); (1), (2), 및 (4); (1), (2), 및 (5); (1), (3), 및 (4); (1), (3), 및 (5); (1), (4), 및 (5); (2), (3), 및 (4); (2), (3), 및 (5), 또는 (3), (4), 및 (5)를 가질 수 있다. 추가 예로서, 무균 N. 유트로파 조성물은 이 단락의 시작부에 있는 목록으로부터의 특성 (1), (2), (3), 및 (4); (1), (2), (3), 및 (5); (1), (2), (4), 및 (5); (1), (3), (4), 및 (5); 또는 (2), (3), (4), 및 (5)를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 무균 N. 유트로파 조성물은 이 단락의 시작부에 있는 목록으로부터 특성 (1), (2), (3), (4), 및 (5)를 가질 수 있다.
N. 유트로파 균주 D23(25 바이알의 형태로 수탁됨, 2014년 4월 8일, ATCC 특허 수탁기관, AOB D23-100로 지정됨, 수탁 번호 PTA-121157)는 서열식별번호:1 또는 그것의 보체를 갖는 원형 게놈을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 N. 유트로파 균주는 하기를 포함한다: 핵산 서열, 예를 들면, 서열식별번호:1와 유사한 게놈 또는 그것의 보체.
예를 들면, N. 유트로파는 하기에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 1,000개의 염기쌍 부분을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다: 서열식별번호:1의 1,000개의 염기쌍 부분 또는 그것의 보체. 1,000개의 염기쌍 부분은, 예를 들면, 뉴클레오타이드 (n*1,000)+1 내지 (n+1)*1,000를 포괄할 수 있고, 여기서 n = 0, 1, 2, 3… 2538, 예를 들면, 뉴클레오타이드 1-1,000, 1,001-2,000, 등(서열식별번호:1의 말단을 통해).
구현예에서, N. 유트로파는 하기에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 2,000개의 염기쌍 부분을 갖는 핵산 서열을 포함한다: 서열식별번호:1의 2,000개의 염기쌍 부분 또는 그것의 보체. 2,000개의 염기쌍 부분은, 예를 들면, 뉴클레오타이드 (n*2,000)+1 내지 (n+1)*2,000를 포괄할 수 있고, 여기서 n = 0, 1, 2, 3 …1269, 예를 들면, 뉴클레오타이드 1-2,000, 2,001-4,000, 등(서열식별번호:1의 말단을 통해).
구현예에서, N. 유트로파는 하기에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 5,000개의 염기쌍 부분을 갖는 핵산 서열을 포함한다: 서열식별번호:1의 5,000개의 염기쌍 부분 또는 그것의 보체. 5,000개의 염기쌍 부분은, 예를 들면, 뉴클레오타이드 (n*5,000)+1 내지 (n+1)*5,000를 포괄할 수 있고, 여기서 n = 0, 1, 2, 3 …508, 예를 들면, 뉴클레오타이드 1-5,000, 5,001-10,000, 등(서열식별번호:1의 말단을 통해).
구현예에서, N. 유트로파는 하기에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 10,000개의 염기쌍 부분을 갖는 핵산 서열을 포함한다: 서열식별번호:1의 10,000개의 염기쌍 부분 또는 그것의 보체. 10,000개의 염기쌍 부분은, 예를 들면, 뉴클레오타이드 (n*10,000)+1 내지 (n+1)*10,000를 포괄할 수 있고, 여기서 n = 0, 1, 2, 3 …254, 예를 들면, 뉴클레오타이드 1-10,000, 10,001-20,000, 등(서열식별번호:1의 말단을 통해).
구현예에서, N. 유트로파는 하기에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 20,000개의 염기쌍 부분을 갖는 핵산 서열을 포함한다: 서열식별번호:1의 20,000개의 염기쌍 부분 또는 그것의 보체. 20,000개의 염기쌍 부분은, 예를 들면, 뉴클레오타이드 (n*20,000)+1 내지 (n+1)*20,000를 포과할 수 있고, 여기서 n = 0, 1, 2, 3 …127, 예를 들면, 뉴클레오타이드 1-20,000, 20,001-40,000, 등(서열식별번호:1의 말단을 통해).
구현예에서, N. 유트로파는 하기에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 50,000개의 염기쌍 부분을 갖는 핵산 서열을 포함한다: 서열식별번호:1의 50,000개의 염기쌍 부분 또는 그것의 보체. 50,000개의 염기쌍 부분은, 예를 들면, 뉴클레오타이드 (n*50,000)+1 내지 (n+1)*50,000를 포괄할 수 있고, 여기서 n = 0, 1, 2, 3 …51, 예를 들면, 뉴클레오타이드 1-50,000, 50,001-100,000, 등(서열식별번호:1의 말단을 통해).
구현예에서, N. 유트로파는 하기에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성을 갖는 100,000개의 염기쌍 부분을 갖는 핵산 서열을 포함한다: 서열식별번호:1의 100,000개의 염기쌍 부분 또는 그것의 보체. 100,000개 염기쌍 부분은, 예를 들면, 뉴클레오타이드 (n*100,000)+1 내지 (n+1)*100,000를 포괄할 수 있고, 여기서 n = 0, 1, 2, 3 …26, 예를 들면, 뉴클레오타이드 1-100,000, 100,001-20,000, 등 (서열식별번호:1의 말단을 통해).
일부 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 N. 유트로파의 조성물을 제공한다: 서열식별번호:1와 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한 염색체. 일부 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 N. 유트로파의 무균 조성물을 제공한다: 서열식별번호:1와 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한 염색체.
특정 구현예에서, N. 유트로파 균주는 하기를 포함한다: 핵산 서열, 예를 들면, 게놈, 서열식별번호: 1과 혼성화된 게놈, 또는 D23 균주(25 바이알의 형태로 수탁됨, ATCC 특허 수탁기관, 2014년 4월 8일, AOB D23-100로 지정, 수탁 번호: PTA-121157)의 게놈, 또는 그것의 보체, 낮은 엄중, 배지 엄중, 높은 엄중, 또는 매우 높은 엄중, 또는 본 명세서에서 기재된 다른 하이브리드화 조건 하에서. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "낮은 엄중, 배지 엄중, 높은 엄중, 또는 매우 고 엄격성 조건 하에서 혼성화하다"는 하이브리드화 및 세정의 조건을 기재한다. 하이브리드화 반응을 수행하기 위한 안내는 하기에서 발견될 수 있다: Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 (이것은 참고로 편입된다). 수성 및 비수성 방법은 상기 참조에서 기재되고 사용될 수 있다. 본 명세서에서 언급된 특정 하이브리드화 조건은 하기와 같다: 1) 6X 염화나트륨/나트륨 시트레이트 (SSC)에서 약 45℃에서 낮은 엄격성 하이브리드화 조건, 그 다음 0.2X SSC에서 2 회 세정물, 적어도 50°C에서0.1% SDS (세정물의 온도는 낮은 엄격성 조건 동안에 55°C로 증가될 수 있음); 2) 6X SSC에서 약 45℃에서 배지 엄격성 하이브리드화 조건, 그 다음 0.2X SSC에서 하나 이상의 세정물, 60°C에서 0.1% SDS; 3) 6X SSC에서 약 45℃에서 고 엄격성 하이브리드화 조건, 그 다음 0.2X SSC에서 하나 이상의 세정물, 65°C에서 0.1% SDS; 4) 매우 고 엄격성 하이브리드화 조건은 0.5M 나트륨 포스페이트, 65°C에서7% SDS, 그 다음 0.2X SSC에서 하나 이상의 세정물, 65°C에서 1% SDS이다. 매우 고 엄격성 조건 (4)는 적당한 조건 및 다르게 구체화되지 않으면 사용되어야 하는 것이다.
균주 D23의 게놈 (서열식별번호: 1)은 N. 유트로파 C91의 게놈과 비교된다. D23 게놈의 주석은 보충의 표 1에서 보여지고, 이것은 서열식별번호:1에서 2,777개의 유전자의 위치를 열거한다 (서열 분석에 의해 확인됨). 특정 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 보충의 표 1에서 열거된 하나 이상의 유전자 또는 단백질, 또는 유전자 또는 상기 유전자 또는 단백질 중 하나와 유사한 단백질을 포함한다.
따라서, 일부 구현예에서, N. 유트로파는 보충의 표 1의 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, N. 유트로파는 보충의 표 1의 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질과 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 유사한 유전자를 포함한다. 구현예에서, N. 유트로파는 보충의 표 1의 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 또는 모두와 동일 또는 유사한 유전자 또는 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)는 균주 C91, 또는 유전자 또는 상기 유전자 또는 단백질 중 하나와 유사한 단백질로부터 부재한 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 포함한다. 이들 유전자의 예는 도 6-8에서 제시되어 있고, 본 명세서의 실시예 4에서 더 상세히 기재되어 있다.
따라서, 도 6에 대해, 일부 구현예에서, N. 유트로파는 도 6의 유전자의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 또는 모두와 동일한 또는 유사한 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, N. 유트로파는 도 6에서 열거된 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 또는 모두와 동일한 또는 유사한 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 단백질을 포함한다.
도 7에 대해, 일부 구현예에서, N. 유트로파는 도 7의 유전자의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 또는 모두와 동일한 또는 유사한 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, N. 유트로파는 도 7에서 열거된 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 또는 모두와 동일한 또는 유사한 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 단백질을 포함한다.
With respect to 도 8, 일부 구현예에서, N. 유트로파는도 8의 유전자의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 또는 모두와 동일한 또는 유사한 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, N. 유트로파는 도 8에서 열거된 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 또는 모두 와 동일한 또는 유사한 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 단백질을 포함한다.
종합적으로 도 6-8에 대해, 일부 구현예에서, N. 유트로파는 도 6 내지 8의 유전자의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 또는 모두와 동일한 또는 유사한 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, N. 유트로파는 도 6 내지 8에서 열거된 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 또는 모두와 동일한 또는 유사한 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)는 균주 C91, 또는 유전자 또는 상기 유전자 또는 단백질 중 하나와 유사한 단백질에 대해 특이적인 하나 이상의 유전자 또는 단백질이 없다. 이들 유전자의 예는 도 9에서 제시되고 본 명세서의 실시예 4에서 더 상세히 기재된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 도 9의 유전자의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 또는 모두가 없다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 도 9의 유전자의 최대 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 또는 모두가 없다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 도 9의 유전자의 약 1 내지 5, 5-10, 10-20, 20-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 또는 250-모두가 없다.
D23 게놈의 서열분석은 암모니아 대사에 관여된 유전자 (예를 들면, 암모니아 모노옥시게나제, 하이드록실아민 산화환원효소, 사이토크롬 c554, 및 사이토크롬 cM552)를 포함하는 잠재적인 관심의 몇 개의 유전자를 드러냈다. 모든 이들 유전자는 다중 복제물 내에 존재하고, 일반적으로 복제물은 서로 동일하지 않다. 한 세트의 관심 유전자는 amoC의 제3 복제물과 함께 2개의 복제물에서 존재하는 암모니아 모노옥시게나제 합성 오페론 amoCAB이다. 오페론은 C91 중 동족체를 갖는다: 즉, Neut_2078/7/6 및 Neut_2319/8/7. 관심 유전자의 또 다른 세트는3개의 복제물에 존재하는 하이드록실아민 산화환원효소 (hao)이다. C91 중 hao 동족체는 Neut_1672, 1793, 및 2335로 지정된다. 관심 유전자의 제3 세토는 3개의 복제물에 존재하는 cycA에 의해 인코딩된 사이토크롬 c554 유전자이다. 상응하는 C91 유전자는 Neut_1670, 1791, 및 2333로 지정된다. 관심 유전자의 제4 세트는 2개의 복제물에 존재하는 cycB에 의해 인코딩된 사이토크롬 cM552 유전자이다. 상동성 C91 유전자는 Neut_1790 및 2332로 지정된다. 유전자의 각 그룹은 표 1에서 요약되고 하기에서 더 상세히 논의된다.
표 1. N. 유트로파 균주 D23에서 암모니아대사 유전자의 서열.
Figure pat00003
일부 측면에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 표 1의 단백질 또는 유전자와 동일 또는 유사한 유전자를 포함한다.
더 상세하게는, 어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기 예의 N. 유트로파의 조성물을 제공한다: 표 1의 암모니아 모노옥시게나제 서열과 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한 핵산 서열을 포함하는N. 유트로파의 정제된 제제. 어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 N. 유트로파의 조성물을 제공한다: 표 1의 하이드록실아민 산화환원효소 서열와 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한 핵산 서열. 어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 N. 유트로파의 조성물을 제공한다: 표 1의 사이토크롬 c554 서열과 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한 핵산 서열. 어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 N. 유트로파의 조성물을 제공한다: 표 1의 사이토크롬 c M 552 서열에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한 핵산 서열.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 N. 유트로파의 조성물을 제공한다: 표 1의 암모니아 모노옥시게나제 서열에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 또는 99.6% 동일한 아미노산 서열. 어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 N. 유트로파의 조성물을 제공한다: 표 1의 하이드록실아민 산화환원효소 서열에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 또는 99.7% 동일한 아미노산 서열. 어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 N. 유트로파의 조성물을 제공한다: 표 1의 사이토크롬 c554 서열에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.5%, 99.6%, 또는 99.7% 동일한 아미노산 서열. 어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 N. 유트로파의 조성물을 제공한다: 표 1의 사이토크롬 cM552 서열에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 97.1%, 97.2%, 97.5%, 98%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 99%, 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열.
일부 구현예에서, N. 유트로파는 무균 조성물 내에, 예를 들면, 최적화된 N. 유트로파의 정제된 제제의 형태로 존재한다.
더 상세하게는, 어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 N. 유트로파의 무균 조성물을 제공한다: 표 1의 암모니아 모노옥시게나제 서열에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.5%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 또는 99.6% 동일한 핵산 서열. 어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 N. 유트로파의 무균 조성물을 제공한다: 표 1의 하이드록실아민 산화환원효소 서열에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한 핵산 서열. 어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 N. 유트로파의 무균 조성물을 제공한다: 표 1의 사이토크롬 c554 서열에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한 핵산 서열. 어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 N. 유트로파의 무균 조성물을 제공한다: 표 1의 사이토크롬 c M 552 서열에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한 핵산 서열.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 N. 유트로파의 무균 조성물을 제공한다: 표 1의 암모니아 모노옥시게나제 서열에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98.5%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 또는 99.6% 동일한 아미노산 서열. 어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 N. 유트로파의 무균 조성물을 제공한다: 표 1의 하이드록실아민 산화환원효소 서열에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 또는 99.7% 동일한 아미노산 서열. 어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 N. 유트로파의 무균 조성물을 제공한다: 표 1의 사이토크롬 c554 서열에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.5%, 99.6%, 또는 99.7% 동일한 아미노산 서열. 어떤 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는 N. 유트로파의 무균 조성물을 제공한다: 표 1의 사이토크롬 cM552 서열에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 97.1%, 97.2%, 97.5%, 98%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 99%, 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열.
일부 구현예에서, N. 유트로파는 하기를 포함하는 유전자 또는 단백질을 포함한다: 표 1의 균주 D23 서열, 예를 들면, 서열식별번호 4-33 중 임의 것에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한 서열. 치환은 보존적 또는 비-보존적일 수 있고; 또한, 삽입 및 결실이 고려된다. 일부 구현예에서, N. 유트로파는 표 1의 서열, 예를 들면, 서열식별번호 4-33 중 임의의 것을 포함하는 유전자 또는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 최대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 또는 100의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단 확대 또는 결실을 갖는다.
표 1의 핵산 서열의 정렬은 C91과 D23에서의 동족체들 간의 % 동일성을 보여준다. 하기 단락은 이러한 퍼센트 동일성을 논의하고 표 1의 D23 유전자에 대한 상동성을 갖는 다양한 유전자를 기재한다.
더 구체적으로, amoA1 유전자는 (즉, 821/831 위치에서) 약 98.8% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 D23 amoA1 유전자와 적어도 약 98.8%, 98.9%, 99.0%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 유전자를 포함한다.
amoA2 유전자는 (즉, 821/831 위치에서) 약 98.8% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 D23 amoA2 유전자와 적어도 약 98.8%, 98.9%, 99.0%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 유전자를 포함한다.
amoB1 유전자는 (즉, 1255/1266 위치에서) 약 99.1% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 D23 amoB1 유전자 와 적어도 약 99.1%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 유전자를 포함한다.
amoB2 유전자는 (즉, 1254/1266 위치에서) 약 99.1% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 D23 amoB2 유전자와 적어도 약 99.1%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 유전자를 포함한다.
amoC1 유전자는 (즉, 814/816 위치에서) 약 99.8% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 D23 amoC1 유전자와 적어도 약 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 유전자를 포함한다.
amoC2 유전자는 (즉, 814/816 위치에서) 약 99.8% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 D23 amoC2 유전자와 적어도 약 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 유전자를 포함한다.
amoC3 유전자는 (즉, 816/825 위치에서) 약 98.9% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 D23 amoC3 유전자 와 적어도 약 98.9%, 99.0%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 유전자를 포함한다.
hao1 유전자는 (즉, 1696/1713 위치에서) 약 99.0% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 D23 hao1 유전자와 적어도 약 99.0%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 유전자를 포함한다.
hao2 유전자는 (즉, 1702/1713 위치에서) 약 99.4% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 D23 hao2 유전자와 적어도 약 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 유전자를 포함한다.
hao3 유전자는 (즉, 1700/1713 위치에서) 약 99.2% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 D23 hao3 유전자와 적어도 약 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 유전자를 포함한다.
cycA1 유전자는 (즉, 694/708 위치에서) 약 98.0% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 D23 cycA1 유전자 와 적어도 약 98.0%, 98.2%, 98.4%, 98.6%, 98.8%, 99.0%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 유전자를 포함한다.
cycA2 유전자는 (즉, 699/708 위치에서) 약 98.7% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 D23 cycA2 유전자와 적어도 약 98.7%, 98.8%, 99.0%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 유전자를 포함한다.
cycA3 유전자는 (즉, 703/708 위치에서) 약 99.3% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 D23 cycA3 유전자와 적어도 약 99.3%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 유전자를 포함한다.
cycB1 유전자는 (즉, 696/720 위치에서) 약 96.7% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 D23 cycB1 유전자 와 적어도 약 96.7%, 96.8%, 97.0%, 97.2%, 97.4%, 97.6%, 97.8%, 98.0%, 98.2%, 98.4%, 98.4%, 98.6%, 98.8%, 99.0%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 유전자를 포함한다.
cycB2 유전자는 (즉, 702/723 위치에서) 약 97.1% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 D23 cycB2 유전자와 적어도 약 97.1%, 97.2%, 97.4%, 97.6%, 97.8%, 98.0%, 98.2%, 98.4%, 98.4%, 98.6%, 98.8%, 99.0%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 유전자를 포함한다.
하기 4개의 단락은 표 1의 유전자 및 단백질을 더 상세히 기재한다.
암모니아 모노옥시게나제는 반응 NH3 + O2 + 2e- + 2H+ ↔ NH2OH + H2O을 촉진하는 암모니아 산화에 관여된 효소이다 (Ensign 등, 1993). N. 유트로파 균주 D23에서, the 암모니아 모노옥시게나제 오페론은 3 개의 유전자 지정된 amoA, amoB, 및 amoC을 포함한다. 균주 D23은 전체 오페론의 2개의 복제물, 및 amoC의 제3개의 복제물을 포함한다. 이들 유전자 및 상응하는 단백질은 상기의 표 1에서 열거되어 있다. 특정 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 표 1의 1 또는 2 개의 암모니아 모노옥시게나제 서브유닛 A 유전자 및/또는 단백질 (예를 들면, 표 1의 D23 서열), 또는 유전자 및/또는 그것과 유사한 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 표 1의 1 또는 2 개의 암모니아 모노옥시게나제 서브유닛 B 유전자 및/또는 단백질 (예를 들면, 표 1의 D23 서열), 또는 유전자 및/또는 그것과 유사한 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 표 1의 1, 2, 또는 3 개의 암모니아 모노옥시게나제 서브유닛 C 유전자 및/또는 단백질 (예를 들면, 표 1의 D23 서열), 또는 유전자 및/또는 그것과 유사한 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 하기 중 적어도 2 개 각각을 포함한다: (a) 표 1의 암모니아 모노옥시게나제 서브유닛 A 유전자 및/또는 단백질 (예를 들면, 표 1의 D23 서열), (b) 표 1의 암모니아 모노옥시게나제 서브유닛 B 유전자 및/또는 단백질 (예를 들면, 표 1의 D23 서열), 및 (c) 표 1의 암모니아 모노옥시게나제 서브유닛 C 유전자 및/또는 단백질 (예를 들면, 표 1의 D23 서열). 예를 들면, N. 유트로파는 하기 중 모두를 포함할 수 있다: 표 1의 암모니아 모노옥시게나제 유전자 및/또는 단백질 (예를 들면, 표 1의 D23 서열), 또는 유전자 및/또는 그것과 유사한 단백질. 더욱더 구체적으로, 일부 구현예에서, N. 유트로파는 하기 중 모두를 포함한다: 표 1의 D23 암모니아 모노옥시게나제 유전자. 일부 구현예에서, N. 유트로파는 하기 중 모두를 포함한다: 표 1의 D23 암모니아 모노옥시게나제 단백질. 하이드록실아민 산화환원효소는 일반적인 반응 NH2OH + O2
Figure pat00004
NO2 - + H2O을 촉진한다. 전형적으로 보조인자로서 헴(heme)를 사용한다. N. 유트로파 균주 D23은, hao1, hao2, 및 hao3로 지정된 3개의 하이드록실아민 산화환원효소을 포함한다. 이들 유전자 및 상응하는 단백질은 상기의 표 1에서 열거되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 하기를 포함한다: 표 1의 1, 2, 또는 3개의 하이드록실아민 산화환원효소 유전자 및/또는 단백질 (예를 들면, 표 1의 D23 서열), 또는 유전자 및/또는 그것과 유사한 단백질. 예를 들면, N. 유트로파는 하기 중 모두를 포함할 수 있다: 표 1의 하이드록실아민 산화환원효소 유전자 및/또는 단백질 (예를 들면, 표 1의 D23 서열), 또는 유전자 및/또는 그것과 유사한 단백질. 더욱더 구체적으로, 일부 구현예에서, N. 유트로파는 하기 중 모두를 포함한다: 표 1의 D23 하이드록실아민 산화환원효소 유전자. 일부 구현예에서, N. 유트로파는 하기 중 모두를 포함한다: 표 1의 D23 하이드록실아민 산화환원효소 단백질.
에너지 및 환원제의 유일한 공급원으로서 암모니아를 호기성으로 이화하는 D23의 수용력은 2 종의 특화된 단백질 복합체, Amo 및 Hao 뿐만 아니라, 전자를 퀴논 풀(pool)에 전달하는 사이토크롬 c554 및 cm552을 필요로 한다. c554의 NO 환원효소 활성은 낮은 산소 농도에서 암모니아 산화 동안에 중요하다. N. 유트로파 균주 D23은 cycA1, cycA2, 및 cycA3로 지정된 3 종의 사이토크롬 c554 유전자를 포함한다. 이들 유전자 및 상응하는 단백질은 상기의 표 1에서 열거되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 하기를 포함한다: 표 1의 1, 2, 또는 3개의 사이토크롬 c554 유전자 및/또는 단백질 (예를 들면, 표 1의 D23 서열), 또는 유전자 및/또는 그것과 유사한 단백질. 예를 들면, N. 유트로파는 하기 중 모두를 포함할 수 있다: 표 1의 사이토크롬 c554 유전자 및/또는 단백질 (예를 들면, 표 1의 D23 서열), 또는 유전자 및/또는 그것과 유사한 단백질. 더욱더 구체적으로, 일부 구현예에서, N. 유트로파는 하기 중 모두를 포함한다: 표 1의 D23 사이토크롬 c554 유전자. 일부 구현예에서, N. 유트로파는 하기 중 모두를 포함한다: 표 1의 D23 사이토크롬 c554 단백질.
에너지 및 환원제의 유일한 공급원으로서 암모니아를 호기성으로 이화하는 D23의 수용력은 2 종의 특화된 단백질 복합체, Amo 및 Hao 뿐만 아니라, 전자를 퀴논 풀(pool)에 전달하는 사이토크롬 c554 및 cm552을 필요로 한다. 사이토크롬 cm552는 Hao로부터 유래하는 전자로 퀴논을 환원시킨다. N. 유트로파 균주 D23은 cycB1 및 cycB2로 지정된 2 종의 사이토크롬 cM552 유전자를 포함한다. 이들 유전자 및 상응하는 단백질은 상기의 표 1에서 열거되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 표 1의 1 또는 2개의 사이토크롬 c M 552 유전자 및/또는 단백질 (예를 들면, 표 1의 D23 서열), 또는 유전자 및/또는 그것과 유사한 단백질를 포함한다. 예를 들면, N. 유트로파는 표 1의 사이토크롬 c M 552 유전자 및/또는 단백질 (예를 들면, 표 1의 D23 서열), 또는 유전자 및/또는 그것과 유사한 단백질 둘 모두를 포함할 수 있다. 더욱더 구체적으로, 일부 구현예에서, N. 유트로파는 표 1의 D23 사이토크롬 c M 552 유전자 둘 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, N. 유트로파는 표 1의 D23 사이토크롬 cM552 단백질 둘 모두를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 표 1로부터 선택된 유전자 및/또는 단백질의 조합을 포함한다. 이러한 조합은, 예를 들면, 이전의 4개의 단락에서 열거된 유전자 및/또는 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 조합은 표 1 내의 2 종의 클래스로부터 유전자 및/또는 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, N. 유트로파는 표 1에서 기재되거나 이전의 4개의 단락에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암모니아 모노옥시게나제 유전자 및/또는 단백질 및 하나 이상의 하이드록실아민 산화환원효소 유전자 및/또는 단백질을 포함한다. 구현예에서, N. 유트로파는 표 1에서 기재되거나 이전의 4개의 단락에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암모니아 모노옥시게나제 유전자 및/또는 단백질 및 하나 이상의 사이토크롬 c554 유전자 및/또는 단백질을 포함한다. 구현예에서, N. 유트로파는 표 1에서 기재되거나 이전의 4개의 단락에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암모니아 모노옥시게나제 유전자 및/또는 단백질 및 하나 이상의 사이토크롬 c M 552 유전자 및/또는 단백질을 포함한다. 구현예에서, N. 유트로파는 표 1에서 기재되거나 이전의 4개의 단락에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 하이드록실아민 산화환원효소 유전자 및/또는 단백질 및 하나 이상의 사이토크롬 c554 유전자 및/또는 단백질을 포함한다. 구현예에서, N. 유트로파는 표 1에서 기재되거나 이전의 4개의 단락에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 하이드록실아민 산화환원효소 유전자 및/또는 단백질 및 하나 이상의 사이토크롬 cM552 유전자 및/또는 단백질을 포함한다.
상기 조합은 또한 표 1 내의 3종의 클래스 유전자 및/또는 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, N. 유트로파는 표 1에서 기재되거나 상기 언급된 4개의 단락에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암모니아 모노옥시게나제 유전자 및/또는 단백질 및 하나 이상의 하이드록실아민 산화환원효소 유전자 및/또는 단백질 및 하나 이상의 사이토크롬 c554 유전자 및/또는 단백질을 포함한다. 구현예에서, N. 유트로파는 표 1에서 기재되거나 상기 언급된 4개의 단락에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암모니아 모노옥시게나제 유전자 및/또는 단백질 및 하나 이상의 하이드록실아민 산화환원효소 유전자 및/또는 단백질 및 하나 이상의 사이토크롬 c M 552 유전자 및/또는 단백질을 포함한다. 구현예에서, N. 유트로파는 표 1에서 기재되거나 상기 언급된 4개의 단락에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 하나 이상의 암모니아 모노옥시게나제 유전자 및/또는 단백질 및 하나 이상의 사이토크롬 c554 유전자 및/또는 단백질 및/또는 하나 이상의 사이토크롬 c M 552 유전자 및/또는 단백질을 포함한다. 구현예에서, N. 유트로파는 표 1에서 기재되거나 상기 언급된 4개의 단락에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 하나 이상의 하이드록실아민 산화환원효소 유전자 및/또는 단백질 및 하나 이상의 사이토크롬 c554 유전자 및/또는 단백질 및/또는 하나 이상의 사이토크롬 c M 552 유전자 및/또는 단백질을 포함한다.
상기 조합은 표 1 내의 모두 4 종의 클래스로부터 유전자 및/또는 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, N. 유트로파는 표 1에서 기재되거나 상기 언급된 4개의 단락에서 기재된 바와 같이 하나 이상의 암모니아 모노옥시게나제 유전자 및/또는 단백질 및 하나 이상의 하이드록실아민 산화환원효소 유전자 및/또는 단백질 및 하나 이상의 사이토크롬 c554 유전자 및/또는 단백질 및/또는 하나 이상의 사이토크롬 c M 552 유전자를 포함한다.
표 2 (아래)는 표 1의 D23과 C91 단백질 사이의 서열 차이를 열거한다. 예들 들면, AmoA1은 C91 중 위치 1에서 M을 갖지만, D23 중 위치 1에서 V를 가지며, 이러한 차이는 표 2에서 약칭 M1V이다. 또 다른 예로서, D23 CycB1은 C91 단백질의 잔기 194과 195 사이의 DDD의 삽입을 가지며, 이로써 상기 부가된 잔기는 D23 단백질의 잔기 번호 195, 196, 및 197이고 이러한 차이는 표 2에서 약칭 195insD, 196insD, 및 197insD 각각이다. 표 2에 대한 기준을 형성하는 서열 정렬은 도 10-16에서 보여진다.
표 2. N. 유트로파 균주 D23과 C91 사이의 아미노산 서열 차이
Figure pat00005
따라서, 본원에서 기재된 N. 유트로파는 표 2에서 열거된 서열 특성 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들면, N. 유트로파는 표 2의 서열 특성 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30개, 또는 모두를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, N. 유트로파는 표 2의 서열 특성 중 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30 이하, 또는 모두를 포함할 수 있다. 구현예에서, N. 유트로파는 표 2의 서열 특성 중 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30개, 또는 모두를 포함할 수 있다. N. 유트로파는 상기 단백질의 단편을 또한 포함할 수 있다.
유전자 또는 단백질의 개별적인 카테고리에 대해, 일부 구현예에서, N. 유트로파는 표 2, 섹션 1의 서열 특성 (암모니아 모노옥시게나제를 기재함) 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 모두를 포함한다. 구현예에서, N. 유트로파는 표 2, 섹션 1의 서열 특성 중 1-5, 3-7, 4-8, 또는 5-10개를 포함한다. 예를 들면, 일부 구현예에서, N. 유트로파는 표 2에서 열거된 amoA 유전자 또는 단백질의 적어도 1, 2, 또는 3개의 서열 특성, 및/또는 이들 특성 중 2 또는 3개 이하를 포함한다. N. 유트로파는 표 2에서 열거된 amoB 유전자 또는 단백질의 적어도 1 또는 2개의 서열 특성을 또한 포함할 수 있다. 또한, N. 유트로파는 표 2에서 열거된 amoC3 유전자의 적어도 1 또는 2개의 서열 특성을 포함할 수 있다. N. 유트로파는 상기 단백질의 단편을 또한 포함할 수 있다.
hao 유전자 및 단백질에 대해, N. 유트로파는 표 2, 섹션 2 (하이드록실아민 산화환원효소를 기재함)의 서열 특성 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개, 또는 모두를 포함할 수 있다. 구현예에서, N. 유트로파는 표 2, 섹션 2의 서열 특성 중 1-4, 2-5, 3-6, 또는 4-8를 포함한다. N. 유트로파는 표 1에서 열거된 Hao1의 적어도 1, 2 또는 3 개의 서열 특성, 및/또는 이들 특성 중 2 또는 3개 이하를 또한 포함할 수 있다. N. 유트로파는 표 2에서 열거된 Hao2 또는 Hao3의 적어도 1 또는 2개의 서열 특성을 또한 포함할 수 있다. N. 유트로파는 상기 단백질의 단편을 또한 포함할 수 있다.
이제 사이토크롬 c554로 돌아가서, N. 유트로파는 표 2, 섹션 3 (사이토크롬 c554를 기재함)의 서열 특성 중 적어도 1, 2, 3, 4개, 또는 모두를 포함할 수 있다. 구현예에서, N. 유트로파는 표 2 섹션 3의 서열 특성 중 많아야 2, 3, 4개, 또는 모두를 포함할 수 있다. 구현예에서, N. 유트로파는 표 2에서 열거된 사이토크롬 c554 CycA1의 적어도 1 또는 2개의 서열 특성을 포함한다. N. 유트로파는 표 2에서 열거된 c554 CycA2 또는 c554 CycA3의 적어도 하나의 서열 특징을 또한 포함할 수 있다. N. 유트로파는 상기 단백질의 단편을 또한 포함할 수 있다.
c M 552 유전자 및 단백질에 대해, N. 유트로파는 표 2, 섹션 4 (사이토크롬 cM552를 기재함)의 서열 특성 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 모두를 포함할 수 있다. 구현예에서, N. 유트로파는 표 2, 섹션 4의 서열 특성 중 많아야 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 모두르르 포함한다. 예를 들면, 구현예에서, N. 유트로파는 표 2, 섹션 4의 서열 특성 중 1-5, 2-7, 3-8, 또는 5-10개를 포함한다. 구현예에서, 표 2에서 열거된 cM552 CycB1 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 서열 특성, 및/또는 이들 특성 중2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 개 이하. N. 유트로파는 표 2에서 열거된 cM552 CycB2 중 적어도 1, 2, 또는 3 개의 서열 특성, 및/또는 이들 특성 중 2 또는 3개 이하를 또한 포함할 수 있다. N. 유트로파는 상기 단백질의 단편을 또한 포함할 수 있다.
다양한 N. 유트로파 단백질의 서열 특성을 언급하는 상기 단락은, 또한 이들 단백질을 인코딩하는 핵산의 서열을 기재하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 기재된 서열분석 분석은, 균주 D23이 플라스미드가 없다는 것을 나타낸다. 결과적으로, 일부 구현예에서, N. 유트로파 박테리움은 플라스미드가 없고, 즉, 모든 그것의 DNA는 염색체 내에 함유된다. 일부 구현예에서, N. 유트로파 박테리움은 내인성 플라스미드가 없지만, 하나 이상의 트랜스제닉 플라스미드를 보유한다.
이러한 D23 균주는 자연 생성물인 것으로 믿어지지 않고, 오히려 실험실에서 배양 및 선택의 확장된 기간 동안에 어떤 돌연변이 및 특성을 획득했다. 예를 들면, D23는 24 시간 초과 동안에 약 200 또는 250 mM 초과의 NH4 +의 존건에서 성장하는 능력을 갖는다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 N. 유트로파은 담철세포의 존재도에서 천연 발생 박테리아와 상이하다. 예를 들면, N. 유트로파는 N. 유트로파 C91과 비교하여 상승된 또는 감소된 수준의 담철세포를 가질 수 있다. 일반적으로, 담철세포는, 박테리아가 그것의 환경으로부터 철을 포함하는 분비된 철-킬레이트화 화합물이다. 일부 담철세포는 펩타이드, 및 기타는 작은 유기 분자이다.
AOB, 예들 들면, 본 개시내용에서 고려된 N. 유트로파는 본 명세서에서 개시된 야생형 N. 유트로파 및/또는 N. 유트로파 서열에 대한 돌연변이를 포함할 수 있다. 이들 돌연변이는, 예를 들면, 동시에 생길 수 있고, 랜덤 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있거나, 또는 표적화된 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 예를 들면, N. 유트로파는, 야생형 N. 유트로파가 전형적으로 포함하는 하나 이상의 유전자 또는 조절 DNA 서열이 없을 수 있다. N. 유트로파는 서열분석된 균주 또는 야생-표준 균주에 대한 점 돌연변이, 치환, 삽입, 결실, 및/또는 재배열을 또한 포함할 수 있다. N. 유트로파는 최적화된 N. 유트로파의 정제된 제제일 수 있다.
특정 구현예에서, N. 유트로파는 트랜스제닉이다. 예를 들면, 야생형 N. 유트로파 D23가 없는 하나 이상의 유전자 또는 조절 DNA 서열을 포함할 수 있다. 더 상세하게는, N. 유트로파는, 예를 들면, 리포터 유전자, 선택적 마커, 효소를 인코딩하는 유전자, 또는 프로모터 (유도성 또는 억제성 프로모터를 포함함)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 추가의 유전자 또는 조절 DNA 서열은 박테리아 염색체에 통합되고; 일부 구현예에서 추가의 유전자 또는 조절 DNA 서열은 플라스미드, 예를 들면 N. 유트로파 N91에서 발견된 플라스미드에 관련된 플라스미드 상에 위치한다.
일부 바람직한 구현예에서, N. 유트로파는 천연 발생 박테리아로부터 적어도 1종의 뉴클레오타이드가 다르다. 예를 들면, N. 유트로파는 관련된 경로, 예를 들면, 암모니아 대사 경로, 우레아 대사 경로, 또는 산화질소 또는 산화질소 전구체를 생성ㅎ가는 경로의 일부인 유전자 또는 단백질에서 천연 발생 박테리아가 다를 수 있다. 더 상세하게는, N. 유트로파는, 예를 들면, 상기 경로의 요소의 수준 또는 활성을 증가시켜서 경로의 활성을 상승시키는 돌연변이를 포함할 수 있다.
상기-언급된 돌연변이는 임의의 적합한 기술을 사용하여 도입될 수 있다. 수많은 방법은 돌연변이를 주어진 위치에 도입하기 위해 공지된다. 예를 들면, 부위 지향적 돌연변이유발, 올리고뉴클레오타이드-지향된 돌연변이유발, 또는 부위-특이적인 돌연변이유발을 사용할 수 있다. 특이적 돌연변이유발 프로토콜의 비-제한적인 예는 예를 들면 하기에서 기재되어 있다: 돌연변이유발, pp. 13.1-13.105 (Sambrook 및 Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory, Manual Vol. 3, 3.sup.rd ed. 2001). 또한, 상업적 판매인으로부터 이용가능한 잘 특성화된 돌연변이유발 프로토콜의 비-제한적인 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 변경된 부위.RTM. II 시험관내 돌연변이유발 시스템 (Promega Corp., Madison, Wis.); Erase-a-Base.RTM. 시스템 (Promega, Madison, Wis.); GeneTailor.TM. 부위 지향적 돌연변이유발 시스템 (Invitrogen, Inc., Carlsbad, Calif.); QuikChange.RTM. II 부위 지향적 돌연변이유발 키트 (Stratagene, La Jolla, Calif.); 및 Transformer.TM. 부위 지향적 돌연변이유발 키트 (BD-Clontech, Mountain View, Calif.).
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아의 제제는 병태 또는 질환을 적어도 부분적으로 치료하기 위해 암모니아 산화 박테리아의 농도 또는 양을 포함할 수 있다. 암모니아 산화 박테리아의 제제는 표면, 예를 들면, 피부 표면 상에서 박테리움, 또는 박테리아의 속의 양, 농도 또는 비를 변경, 예를 들면, 감소 또는 증가시키기 위해 암모니아 산화 박테리아의 농도 또는 양을 포함할 수 있다. 박테리아는 비-병원성 또는 병원성, 또는 잠재적으로 병원성일 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아의 제제는 약 108 내지 약 1014 CFU/L를 포함할 수 있다. 본 제제는 적어도 108, 109, 1010, 1011, 2 x 1011, 5 x 1011, 1012, 2 x 1012, 5 x 1012, 1013, 2 x 1013, 5 x 1013, 또는 1014; 또는 약 108-109, 109-1010,1010-1011, 1011-1012, 1012-1013, 또는 1013-1014 CFU/L를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 본 제제는 약 1 x 109 CFU/L 내지 약 10 x 109 CFU/L를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 본 제제는 약 1 x 109 CFU 내지 약 10 x 109 CFU를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아의 조제물은 약 0.1 밀리그램 (mg) 내지 약 1000 mg의 암모니아 산화 박테리아를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 조제물은 약 50 mg 내지 약 1000 mg의 암모니아 산화 박테리아를 포함할 수 있다. 조제물은 하기를 포함할 수 있다: 약 0.1-0.5 mg, 0.2-0.7 mg, 0.5-1.0 mg, 0.5-2 mg, 0.5-5 mg, 2.5-5 mg, 2.5-7.0 mg, 5.0-10 mg, 7.5-15 mg, 10-15 mg, 15-20 mg, 15-25 mg, 20-30 mg, 25-50 mg, 25-75 mg, 50-75 mg, 50-100 mg, 75-100 mg, 100-200 mg, 200-300 mg, 300-400 mg, 400-500 mg, 500-600 mg, 600-700 mg, 700-800 mg, 800-900 mg, 900-1000 mg, 100-250 mg, 250-500 mg, 100-500 mg, 500-750 mg, 750-1000 mg, 또는 500-1000 mg.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아의 제제는 암모니아 산화 박테리아 대 부형제, 예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 화장용으로 허용가능한 부형제의 질량비를 약 0.1 그램 / 리터 내지 약 1 그램 / 리터의 범위로 포함할 수 있다. 조제물은 리터당 약 0.1-0.2, 0.2-0.3, 0.1-0.5, 0.2-0.7, 0.5-1.0, 또는 0.7-1.0 그램 범위의 암모니아 산화 박테리아 대 부형제의 질량비를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아의 제제는 성장 상태일 수 있다. 성장 상태는 암모니아 산화 박테리아를 성장을 촉진할 수 있는 환경에 노출시킴으로써 제공될 수 있다. 성장 상태는 한 가지 상태, 예를 들면, 암모늄 이온 (NH4 +)을 니트라이트 (NO2 -)로 전환시키는 암모니아 산화 박테리아의 즉각적인 이용가능성을 가능하게 하는 환경에서 있는 암모니아 산화 박테리아일 수 있다. 성장 상태는 약 7.6보다 더 큰 pH를 갖는 환경에서 암모니아 산화 박테리아를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 성장 상태는 또한 상기 섹션 1에 기재된 바와 같이, 암모니아, 암모늄 염, 및/또는 우레아, 미량 미네랄 및 충분한 산소 및 이산화탄소를 갖는 환경에서 암모니아 산화 박테리아를 제공하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아의 조제물은 폴리포스페이트 로딩 상태일 수 있고, 상기 상태 또는 환경, 예컨대, 배지, 예를 들면, 배양 배지, 예를 들면, 성장 배지는 약 7.4 미만의 pH를 가질 수 있다. 암모니아, 암모늄 이온, 및 우레아의 수준 중 적어도 하나는 약 10 마이크로몰 내지 200 밀리몰일 수 있다. 미량 물질의 수준은 0.1 마이크로몰 철 내지 20 마이크로몰 철일 수 있다. 산소의 수준은 약 5% 내지 100% 산소 포화일 수 있다. 이산화탄소의 수준은 약 0 및 200 ppm 사이/미만일 수 있고, 포스페이트 수준은 약 10 마이크로몰을 초과할 수 있다. 폴리포스페이트 로딩 상태의 목적은 AOB에게 암모니아 및 산소를 제공하여 ATP가 생산될 수 있게 하기 위한 것일 수 있지만, 이산화탄소 및 카보네이트를 거부함으로써 이들이 상기 ATP를 사용하여 이산화탄소를 고정화시킬 수 없게 하고 대신에 상기 ATP를 사용하여 보관될 수 있는 폴리포스페이트를 생성할 수 있게 하기 위한 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아의 조제물은 보관 상태일 수 있다. 보관 상태는 암모니아 산화 박테리아가 이후에 회복되도록 보관될 수 있는 환경에서의 암모니아 산화 박테리아로서 정의될 수 있다. 보관 상태는 한 가지 상태, 예를 들면, 회복된 후에, 예를 들면, 전-결정된 기간 동안 성장 상태를 촉진하는 환경에 있은 후에, 암모니아 산화 박테리아의 이용가능성을 허용하는 환경에서의 암모니아 산화 박테리아일 수 있다.
보관 상태는 약 7.4 미만의 pH를 갖는 환경에서 암모니아 산화 박테리아를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 보관 상태는 또한, 상기 섹션 1에서 기재된 바와 같이, 암모니아, 암모니아 염, 및/또는 우레아, 미량 미네랄, 산소, 및 저농도의 이산화탄소를 갖는 환경에서 암모니아 산화 박테리아를 제공하는 것을 포함할 수 있다.
보관은 또한 최대 몇 개월 동안 4 ℃에서 보관함으로써 달성될 수 있다. 일부 구현예에서 보관 버퍼는 50 mM Na2HPO4 - 2 mM MgCl2 (pH 7.6)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는 동결보존될 수 있다. 1.25 mL의 암모니아 산화 박테리아 중간-로그 배양물이 2 ml 동결튜브 및 0.75 mL의 멸균된 80% 글리세롤에 부가될 수 있다. 튜브는 서서히 진탕되고, 실온에서 15분 동안 배양되어 동결보호제가 세포에 의해 흡수될 수 있게 할 수 있다. 튜브는 동결 및 보관을 위해 -80 ℃ 냉동고에서 직접 보관될 수 있다.
배양물의 소생을 위해, 냉동된 스톡은 얼음 상에서 10 - 20분 동안 해동된 다음, 4 ℃에서 3분간 8,000 x g에서 원심분리될 수 있다. 펠렛은 동결보호제의 잠재적인 독성을 감소시키기 위해 이를 2 ml AOB 배지에 현탁시킨 다음 4 ℃에서 3분간 8,000 x g에서 더 원심분리함으로써 세정될 수 있다. 펠렛은 2 mL의 AOB 배지에서 재현탁되고, 50 mM NH4 +를 함유하는 50 mL의 AOB 배지에서 예방접종되고, 200 rpm에서 교반하면서 30 ℃에서 암실에서 배양될 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아의 조제물은 보관 상태의 암모니아 산화 박테리아 및/또는 폴리포스페이트 로딩 상태의 암모니아 산화 박테리아 및/또는 성장 상태의 암모니아 산화 박테리아를 포함할 수 있다.
이론에 구속되기를 바라지 않지만, 암모니아 산화 박테리아를 충분한 산소 및 암모니아와 함께, 낮은 이산화탄소의 조건 하에 또는 환경에서 유지시킴으로써, 이들은 전-결정된 기간 동안, 예를 들면, 약 1 배가 시간의 기간 동안, 예를 들면, 약 8-12시간 동안, 예를 들면, 약 10시간 동안 폴리포스페이트를 축적할 수 있다. 암모니아 산화 박테리아는 그의 보관 생존력, 보관 시간을 연장하고, 그의 회복을 가속화하기 위해 충분한 폴리포스페이트를 축적할 수 있다. 이것은 버퍼 및 암모니아의 부가와 함께 또는 부가없이 일어날 수 있다.
충분한 보관된 폴리포스페이트의 존재는 암모니아 산화 박테리아 ATP 자원이 암모니아 및 산소의 부재시에도 대사성 활성을 유지하고, 치명적인 손상에 살아남도록 할 수 있다.
ATP를 생성하는 암모니아의 산화 과정은 2단계를 갖는다. 제1 단계는 암모니아 모노옥시게나아제 (Amo)에 의한 암모니아의 하이드록실아민으로의 산화이며, 이후 하이드록실아민 산화환원효소 (Hao)에 의한 하이드록실아민의 니트라이트로의 전환이 일어난다. 제2 단계 (하이드록실아민의 니트라이트로의 전환)로부터의 전자는 제1 단계 (암모니아의 하이드록실아민으로의 산화)에 작동시키는데 사용된다.
만약 암모니아 산화 박테리아가 Amo를 위한 전자를 생성하는 하이드록실아민을 갖지 않으면, 하이드록실아민은 Hao를 위해 이용불가능하다. 예를 들면, 아세틸렌은 비가역적으로 암모니아의 니트라이트로의 산화, 암모니아의 하이드록실아민으로의 산화에서 제1 단계에 결정적인 효소를 비가역적으로 억제한다. AOB가 아세틸렌에 노출되면, Amo는 비가역적으로 저해되고 새로운 효소가 하이드록실아민이 생성될 수 있기 전에 합성되어야 한다. 정상적인 컨소시엄 생물막 (biofilm) 서식지에서, AOB는 다른 AOB (저해제에 대해 상이한 감수성을 갖는 매우 상이한 균주)로부터 하이드록실아민을 공유하고 받을 수 있으며, 따라서 상기 생물막은개별적인 유기체보다 아세틸렌과 같은 저해제에 더 내성인 경향이 있다. AOB는 하이드록실아민의 부재시에도, 새로운 Amo를 합성하기 위해 보관된 폴리포스페이트를 사용할 수 있다.
본 명세서에서 논의된 암모니아 산화 박테리아의 임의의 구현예, 조제물, 조성물, 또는 제형은 임의의 무균 암모니아 산화 박테리아를 포함하거나, 이들로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어질 수 있다.
3. N. 유트로파 를 생산하는 방법
다양한 니트로소모나스 종을 배양하는 방법은 당해기술에 공지되어 있다. N. 유트로파는, 예를 들면, 하기 실시예 2에 기재된 바와 같은, N. 유로파에아 배지를 이용하여 배양될 수 있다. 암모니아 산화 박테리아는, 예를 들면, 상기 표 3 또는 표 4에 기재된 배지를 이용하여 배양될 수 있다.
N. 유트로파는, 예를 들면, 액체 배양으로 또는 플레이트 상에서 성장될 수 있다. 적합한 플레이트는 1.2% R2A 한천, 1.2% 한천, 1.2% 아가로스, 및 0.3 g/L 피루베이트를 갖는 1.2% 아가로스를 포함한다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예컨대 N. 유트로파는 유기물이 없는 배지에서 배양된다. 유기물이 없는 배지를 사용하는 하나의 이점은 그것이 독립영양 박테리아에 의해 생산된 것을 제외하고 종속영양 박테리아가 대사하기 위한 기질이 결여되어 있다는 점이다. 성장된 배양물을 이용하는 또 다른 이점은 실질적인 니트라이트가 배양 배지에서 축적되고, 이 니트라이트가 또한 종속영양 박테리아을 저해하고 따라서 보관 동안 보존제로서 작용한다는 점이다.
일부 구현예에서, 개선된, 예를 들면 최적화된, 특성을 갖는 암모니아 산화 박테리아, 예컨대 N. 유트로파 균주는 반복적인 증식 과정 및 원하는 특성에 대해 선택함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, 선택 및 증식은 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, 선택은 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM, 175 mM, 200 mM, 225 mM, 250 mM, 275 mM, 또는 300 mM NH4 +, 예를 들면, 적어도 200 mM NH4 +를 포함하는 반응 매질 (예를 들면, 완전한 N. 유로파에아 배지)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 증식 및/또는 선택의 기간은 적어도 1, 2, 3, 또는 6개월이다. 구현예에서, 증식 및/또는 선택의 기간은 적어도 1, 2, 4, 6, 8, 또는 10년이다.
일부 측면에서, 암모니아 산화 박테리아, 예컨대 N. 유트로파는 상업적규모로 제조된다. 일부 구현예에서, 상업적 규모는 적어도 10,000, 20,000, 30,000, 50,000, 또는 100,000 리터 (L)의 배양 배지 용적을 갖는 액체 배양 방법을 지칭한다. 일부 구현예에서, 박테리아는 생물반응기에서 생산된다. 생물반응기는, 예를 들면 절연을 위한 열 재킷, 온도 센서, 및 가열 또는 냉각 요소를 이용하여, 박테리아를 일정한 온도, 예를 들면, 약 26-30 섭씨 온도로 유지시킬 수 있다. 생물반응기는 암모니아, 우레아, 산소, 이산화탄소, 및 다양한 미네랄과 같은 영양소의 분포를 개선하기 위해 배양물을 교반하기 위한 장치를 가질 수 있다. 생물반응기는 또한 새로운 배지의 부가를 위한 유입구 튜브, 및 세포의 수집을 위한 유출구 튜브를 가질 수 있다. 생물반응기는 또한 산소 및/또는 이산화탄소를 배양물에 분배시키기 위한 급기장치 (aerator)를 가질 수 있다. 생물반응기는, 예를 들면, 회분식 (batch) 반응기, 유가식 (fed batch) 반응기, 또는 연속식 반응기일 수 있다. 일부 구현예에서, N. 유트로파의 상업적 규모 생산은 리터 당 약 1012 CFU로 1일당 1,000 내지 100,000 L의 배치 및 1,000 내지 100,000를 생산한다. 상업적 규모 생산은 예를 들면, 1,000-5,000, 5,000-10,000, 10,000-50,000, 또는 50,000-100,000 L/1일의 배치를 생산할 수 있다. 상업적 규모 생산은 예를 들면, 배치당 1,000-5,000, 5,000-10,000, 10,000-50,000, 또는 50,000-100,000 L의 배치를 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 수율은 적어도 1010, 1011, 2 x 1011, 5 x 1011, 또는 1012, 또는 약 1010-1011, 1011-1012, 1012-1013, 또는 1013-1014 CFU/L의 농도이다
일부 구현예에서, 전형적으로 상업적 규모 생산을 포함하여, 품질관리 (QC) 시험 단게가 수행된다. QC의 일반적인 단계는 전형적으로, 1) N. 유트로파를 배양하는 것, 2) 상기 배양물 또는 이의 분취량에 대해 시험 단계를 수행하는 것, 및 3) 상기 시험 단계로부터 값을 수득하는 것, 및 임의로: 4) 상기 수득된 값을 참조 값 또는 허용가능한 값의 범위와 비교하는 것, 및 5) 만약 수득된 값이 허용가능한 참조 값 또는 범위를 만족하면, 상기 배양물을 허용가능한 것으로 분류하고, 만약 수득된 값이 허용가능한 참조 값 또는 범위를 만족하지 않으면, 상기 배양물을 허용될 수 없는 것으로 분류하는 것을 포함한다. 만약 상기 배양물이 허용가능한 것으로 분류되면, 상기 배양물은 예를 들면, 계속해서 성장하게 되고/거나 수확되어 상품에 부가될 수 있다. 만약 상기 배양물이 허용될 수 없는 것으로 분류되면, 상기 배양물은, 예를 들면, 안전하게 처리되거나 또는 결함이 치유될 수 있다.
상기 시험 단계는 배양물의 광학 밀도 (OD)를 측정하는 것을 포함할 수 있다. OD가 분광측정기에서 측정되고, 이는 흡수되거나 산란된 빛을 구별하여, 샘플을 통해 투과된 빛의 양에 관한 정보를 제공한다. 일부 구현예에서, OD600 (예를 들면, 600 nm의 파장을 갖는 빛의 광학 밀도)이 결정될 수 있다. 이러한 측정은 전형적으로 배지 내의 세포의 농도를 가리키며, 여기서 더 높은 광학 밀도는 더 높은 세포 밀도에 상응한다.
상기 시험 단계는 배양물의 pH를 측정하는 것을 포함할 수 있다. N. 유트로파 배양물의 pH는 질소 산화 속도를 나타내며, 이는 또한 배양물이 오염 유기체를 포함하는지 여부를 나타낼 수 있다. pH는, 예를 들면, 전극 (예컨대 수소 전극, 퀸하이드론-전극, 안티몬 전극, 유리 전극)을 포함하는 pH-감지 장치, 반도체, 또는 발색 시약, 예컨대 pH 종이를 포함하는 pH-감지 장치를 이용하여 측정될 수 있다.
특정 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예컨대 N. 유트로파를 생산하는 것은 다양한 품질관리 단계를 수행하는 것을 포함한다. 예를 들면, N. 유트로파가 성장된 배지를 시험하여, 예를 들면, 배지가 적절한 pH를 갖는지, 배지가 충분히 낮은 수준의 폐기물을 갖는지, 및/또는 배지가 충분히 높은 수준 또는 영양소를 갖는지 결정할 수 있다. 또한 오염 유기체의 존재를 시험할 수 있다. 오염 유기체는 전형적으로 암모니아 산화 박테리아 이외의 유기체, 예컨대 N. 유트로파, 예를 들면 마이크로박테리움 종, 알칼리제나세애 박테리움, 카울로박터 sp., 버코델리아 멀티보란스, 에스케리치아 콜리, 클렙시엘라 뉴모니아에, 및 스타필로코쿠스 아우레스으로부터 선택된 유기체이다. 예를 들면, DNA를 추출하고, 이를 증폭시키고, 16S rRNA와 같은 보존된 유전자를 서열분석함으로써 오염물질에 대해 시험할 수 있다. 또한 우무평판 상에 배양물을 플레이팅하고 콜로니 형태학을 관찰함으로써 오염물질에 대해 시험할 수 있다. N. 유트로파는 전형적으로 적색 콜로니를 형성하므로, 비-적색 콜로니는 종종 오염 유기체를 나타낸다.
4. 암모니아 산화 박테리아를 포함하는 조성물; N. 유트로파 를 포함하는 조성물
본 개시내용은, 특히, 암모니아 산화 박테리아를 포함하는 조성물, 예를 들면, 암모니아 산화 박테리아의 조제물, 또는 암모니아 산화 박테리아의 정제된 조제물 예를 들면, 천연 생성물, 또는 강화된 천연 생성물을 제공한다. 암모니아 산화 박테리아를 포함하는 조성물, 예를 들면, 암모니아 산화 박테리아의 조제물, 또는 암모니아 산화 박테리아의 정제된 조제물은 화장품 또는 치료 제품으로 제공될 수 있다. 상기 조제물은, 특히, 암모니아, 암모늄 염, 및 우레아 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
본 개시내용은, 특히, N. 유트로파를 포함하는 조성물, 예를 들면, 최적화된 N. 유트로파의 정제된 조제물을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물 내의 N. 유트로파는 최적화된 성장 속도, 최적화된 NH4 + 산화 속도, 및 NH4 +에 대한 최적화된 내성으로부터 선택된 적어도 하나의 특성을 갖는다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 정의된 수의 종을 갖는 조성물을 제공한다. 예를 들면, 본 개시내용은 N. 유트로파 및 한 가지 다른 유형의 유기체를 가지나, 다른 유형의 유기체를 갖지 않는 조성물을 제공한다. 다른 예에서, 조성물은 N. 유트로파 및 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 다른 유형의 유기체를 가지나, 다른 유형의 유기체를 갖지 않는다. 이러한 조성물 내의 다른 유형의 유기체는, 예를 들면, 박테리움, 예컨대 암모니아-산화 박테리움일 수 있다. 이러한 목적을 위한 적합한 암모니아-산화 박테리아는 속 니트로소모나스, 니트로소코쿠스, 니트로소스피라, 니트로소사이스티스, 니트로솔로부스, 또는 니트로소비브리오 내의 것을 포함한다.
일부 구현예에서, N. 유트로파를 포함하는 조성물은 N. 유트로파 생존력을 지원하는 조건을 제공한다. 예를 들면, 본 조성물은 N. 유트로파 성장 및 대사를 촉진할 수 있거나 또는 생존가능한 N. 유트로파가 회수될 수 있는 휴면기 상태 (예를 들면, 동결)를 촉진할 수 있다. 조성물이 성장 또는 대사를 촉진할 때, 그것은 N. 유트로파가, 예를 들면, 암모늄, 암모니아, 우레아, 산소, 이산화탄소, 또는 미량 미네랄로서 소비하는 물 및/또는 영양소를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아를 포함하는 조성물은 암모니아 산화 박테리아 생존력을 지원하는 조건을 제공한다. 예를 들면, 조성물은 암모니아 산화 박테리아 성장 및 대사를 촉진할 수 있거나 또는 생존가능 암모니아 산화 박테리아가 회수될 수 있는, 본원에 기재된 바와 같은 휴면기 상태 (예를 들면, 동결) 또는 보관 상태를 촉진할 수 있다. 조성물이 성장 또는 대사를 촉진할 때, 그것은 암모니아 산화 박테리아가, 예를 들면, 암모늄 이온, 암모니아, 우레아, 산소, 이산화탄소, 또는 미량 미네랄로서 소비하는 물 및/또는 영양소를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아 외에 하나 이상의 다른 유기체가 암모니아 산화 박테리아의 조제물 내에 포함될 수 있다. 예를 들면, 락토바실러스, 스트렙토코쿠스, 비피도박터, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 속의 유기체는 암모니아 산화 박테리아의 조제물로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 조제물은 다른 유기체가 실질적으로 없을 수 있다.
암모니아 산화 박테리아의 제제는 약 108 내지 약 1014 CFU/L를 포함할 수 있다. 조제물은 적어도 약 108, 109, 1010, 1011, 2 x 1011, 5 x 1011, 1012, 2 x 1012, 5 x 1012, 1013, 2 x 1013, 5 x 1013, 또는 1014; 또는 약 108-109, 109-1010,1010-1011, 1011-1012, 1012-1013, 또는 1013-1014 CFU/L를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 조제물은 적어도 108, 109, 1010, 1011, 2 x 1011, 5 x 1011, 1012, 2 x 1012, 5 x 1012, 1013, 2 x 1013, 5 x 1013, 또는 1014; 또는 약 108-109, 109-1010, 1010-1011, 1011-1012, 1012-1013, 또는 1013-1014 CFU/ml를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 조제물은 약 1 x 109 내지 약 10 x 109 CFU/L를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조제물은 하기를 포함할 수 있다: 1일당 약 3 x 1010 CFU, 예를 들면, 3 x 1010 CFU. 일부 구현예에서, 조제물은 하기를 포함할 수 있다: 1일당 약 1 x 109 내지 약 10 x 109 CFU, 예를 들면, 약 1 x 109 내지 약 10 x 109 CFU.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아의 조제물은 약 0.1 밀리그램 (mg) 내지 약 1000 mg의 암모니아 산화 박테리아를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 조제물은 약 50 mg 내지 약 1000 mg의 암모니아 산화 박테리아를 포함할 수 있다. 조제물은 하기를 포함할 수 있다: 약 0.1-0.5 mg, 0.2-0.7 mg, 0.5-1.0 mg, 0.5-2 mg, 0.5-5 mg, 2.5-5 mg, 2.5-7.0 mg, 5.0-10 mg, 7.5-15 mg, 10-15 mg, 15-20 mg, 15-25 mg, 20-30 mg, 25-50 mg, 25-75 mg, 50-75 mg, 50-100 mg, 75-100 mg, 100-200 mg, 200-300 mg, 300-400 mg, 400-500 mg, 500-600 mg, 600-700 mg, 700-800 mg, 800-900 mg, 900-1000 mg, 100-250 mg, 250-500 mg, 100-500 mg, 500-750 mg, 750-1000 mg, 또는 500-1000 mg.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아의 조제물은 리터당 약 0.1 그램 내지 리터당 내지 약 1 그램 범위의 암모니아 산화 박테리아 대 부형제, 예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 화장용으로 허용가능한 부형제의 질량비를 포함할 수 있다. 조제물은 리터당 약 0.1-0.2, 0.2-0.3, 0.1-0.5, 0.2-0.7, 0.5-1.0, 또는 0.7-1.0 그램 범위의 암모니아 산화 박테리아 대 부형제의 질량비를 포함할 수 있다.
유익하게는, 제형은 AOB, 예를 들면, N. 유트로파 생존력, 예를 들면, 대사성 활성을 촉진하는 pH를 가질 수 있다. 우레아는 암모니아로 가수분해되고 pH를 7 내지 8로 상승시킬 것이다. AOB는 이 pH 범위에서 매우 활성이며 상기 pH를 NH3이 암모늄으로 전환되고 이용될 수 없는 약 6으로 낮출 것이다. 더 낮은 pH 수준, 예를 들면 약 pH 4가 또한 허용가능하다. 질환 및 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있는 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 하나 이상의 약제학적으로 또는 화장용으로 허용가능한 부형제와 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 약제학적으로-허용가능한 물질, 조성물, 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고형 충전제, 희석제, 용매, 또는 캡슐화 물질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 각 부형제는 약제학적 제형의 다른 성분과 양립가능하고, 과도한 독성, 자극, 알러지성 반응, 면역원성, 또는 합리적인 유익/유해 비율과 비례하는 다른 문제나 합병증 없이 인간 및 동물의 조직 또는 장기와 접촉하여 사용하는데 적합하다는 의미에서 "약제학적으로 허용가능"하다. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed.; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, Pa., 2005; Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6th ed.; Rowe et al., Eds.; The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association: 2009; Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd ed.; Ash and Ash Eds.; Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation, 2nd ed.; Gibson Ed.; CRC Press LLC: Boca Raton, Fla., 2009를 참고한다.
일부 구현예에서, 화장용으로 허용가능한 부형제는 화장용으로 허용가능한 물질, 조성물, 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고형 충전제, 희석제, 용매, 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 일부 구현예에서, 각 부형제는 화장품 제형의 다른 성분과 양립가능하고, 과도한 독성, 자극, 알러지성 반응, 면역원성, 또는 합리적인 유익/유해 비율과 비례하는 다른 문제나 합병증 없이 인간 및 동물의 조직 또는 장기와 접촉하여 사용하는데 적합하다는 의미에서 화장용으로 허용가능하다.
활성 성분, 예를 들면, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파가 단독으로 투여될 수 있음에도 불구하고, 많은 구현예에서 그것은 약제학적 제형 또는 조성물로 제공된다. 따라서, 본 개시내용은 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 약제학적 조성물은 아래에서 기재된 바와 같은 약제학적 제형의 형태를 취할 수 있다.
본원에 기재된 약제학적 제형은, 가장 적합한 경로가, 예를 들면, 수령체의 병태태 및 장애에 좌우될 수 있음에도 불구하고, 경구, 비경구 (피하, 진피내, 근육내, 정맥내, 및 관절내 포함), 흡입 (정량, 가압된 에어로졸, 분무기 또는 취입기의 다양한 유형의 수단에 의해 생성될 수 있는 미세 입자 분진 또는 미스트를 포함하고, 비강내로 또는 폐를 통한 것을 포함함), 직장 및 국소 (진피, 경피, 경점막, 구강, 설하, 및 안구내 포함) 투여에 적합한 것을 포함한다.
제형은 단위 투여량 형태로 간편하게 제공될 수 있고 조제실의 당해분야에서 공지된 방법 중 어느 것에 의해 제조될 수 있다. 전형적으로, 방법은 활성 성분 (예를 들면, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파)을 하나 이상의 부속 성분을 구성하는 약제학적 담체와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미분된 고형 담체 또는 둘 모두와 균일하고 단단하게 회합시킨 다음, 필요하면, 상기 생성물을 원하는 제형으로 성형함으로써 제조된다.
제형은 캡슐, 카셰 또는 정제와 같은 별개의 단위로서 (각각은 예를 들면, N. 유트로파의 미리 결정된 양을 함유함); 분말 또는 과립으로서; 수성 액체 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액으로서; 또는 수중유 액체 유화액 또는 유중수 액체 유화액으로서 제공될 수있다. 활성 성분은 또한 볼러스, 연약 또는 페이스트로서 제공될 수 있다. 다양한 약제학적으로 허용가능한 담체 및 이의 제형은 표준 제형 논문, 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin에 기재되어 있다. 또한 하기를 참조한다: Wang, Y. J. 및 Hanson, M. A., Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report 번호 10, Supp. 42:2 S, 1988.
질환 및 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있는 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파 조성물은, 예를 들면, 즉시 방출 또는 연장 방출에 적합한 형태로 투여될 수 있다. 지속-방출 시스템의 적합한 예는 적합한 폴리머성 물질, 예를 들면 성형품 형태의 반-투과성 폴리머 매트릭스, 예를 들면, 필름, 또는 마이크로캡슐; 예를 들면 허용가능한 오일 중의 유화액으로서, 적합한 소수성 물질; 또는 이온교환수지를 포함한다. 지속-방출 시스템은 경구로; 직장으로; 비경구로; 낭내로; 질내로; 복강내로; 국소로, 예를 들면 분말, 연고, 겔, 점적제 또는 경피 패치로서; 구강으로; 또는 분무로서 투여될 수 있다.
투여용 조제물은 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파를 이용한 질환 및 병태를 치료하는 다양한 방법을 제공한다. 예를 들면, 약제학적 조성물은 생분해성 폴리머, 다당류 젤리화 및/또는 생접착성 폴리머, 또는 양친매성 폴리머 중 하나 이상을 포함하는 입자의 형태일 수 있다. 이들 조성물은 활성 물질의 제어 방출을 가능하게 하는 어떤 생체적합성 특징을 나타낸다. 미국 특허 번호 5,700,486호를 참고한다.
예시적인 조성물은, 예를 들면, 부피를 부여하기 위한 미세결정성 셀룰로오스, 현탁화제로서 알긴산 또는 소디움 알기네이트, 점도 증강제로서 메틸셀룰로오스, 디칼슘 포스페이트, 전분, 마그네슘 스테아레이트 및/또는 락토오스 및/또는 다른 부형제, 결합제, 증량제, 붕해제, 희석제 및 윤활제, 만니톨, 락토오스, 수크로오스 및/또는 사이클로덱스트린을 함유할 수 있는 현탁액을 포함한다. 또한 고분자량 부형제, 예컨대 셀룰로오스 (avicel) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 상기 제형 내에 포함될 수 있다. 상기 제형은 또한 점막 부착을 돕는 부형제, 예컨대 하이드록시 프로필 셀룰로오스 (HPC), 하이드록시 프로필 메틸 셀룰로오스 (HPMC), 나트륨 카복시 메틸 셀룰로오스 (SCMC), 말레산 무수물 코폴리머 (예를 들면, Gantrez), 및 방출을 제어하는 제제, 예컨대 폴리아크릴산 코폴리머 (예를 들면 카보폴 934)를 포함할 수 있다. 윤활제, 활윤제, 풍미제, 착색제 및 안정제가 또한 제조 및 사용의 편의를 위해 부가될 수 있다. 계면활성제는 쯔비터이온 계면활성제, 비-이온성 계면활성제, 또는 음이온성 계면활성제일 수 있다.
본 개시내용의 구현예와 함께 사용될 수 있는 부형제, 예컨대 계면활성제는 코카미도프로필 베타인 (ColaTeric COAB), 폴리에틸렌 소르비톨 에스테르 (예를 들면, Tween 80), 에톡실레이트화된 라우릴 알코올 (RhodaSurf 6 NAT), 나트륨 라우레쓰 설페이트/라우릴 글루코사이드/코카미도프로필 베타인 (Plantapon 611 L UP), 나트륨 라우레쓰 설페이트 (예를 들면, RhodaPex ESB 70 NAT), 알킬 폴리글루코사이드 (예를 들면, Plantaren 2000 N UP), 나트륨 라우레쓰 설페이트 (Plantaren 200), Dr. 브로너스 캐스틸 비누, 닥터 브로너스 캐스틸 베이비 비누, 라우르아민 옥사이드 (ColaLux Lo), 나트륨 도데실 설페이트 (SDS), 폴리설포네이트 알킬 폴리글루코사이드 (PolySufanate 160 P), 나트륨 라우릴 설페이트 (Stepanol-WA Extra K). 및 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 닥터 브로너스 캐스틸 비누 및 닥터 브로너스 베이비 비누는 물, 유기 코코넛 오일, 수산화칼륨, 유기 올리브 오일, 유기 페어 딜 헴프 오일 "(organic fair deal hemp oil), 유기 요요바 오일 (organic jojoba oil), 시트르산, 및 토코페롤을 포함한다.
일부 구현예에서, 계면활성제는 니트라이트가 생산되게 하는 양으로 암모니아 산화 박테리아와 함께 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 조제물은 약 0.0001 % 미만 내지 약 10% 미만의 계면활성제를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 조제물은 약 0.1 % 내지 약 10 % 계면활성제를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 사용되는 계면활성제의 농도는 약 0.0001% 내지 약 10%일 수 있다. 일부 구현예에서, 조제물은 계면활성제가 실질적으로 없을 수 있다.
일부 구현예에서, 제형, 예를 들면, 조제물은 암모니아 산화 박테리아의 효과를 향상시킬 수 있거나, 또는 치료 또는 증상을 향상시킬 수 있는 다른 성분을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 킬레이터가 조제물 내에 포함될 수 있다. 킬레이터는 또 다른 화합물, 예를 들면, 금속과 결합할 수 있는 화합물일 수 있다. 킬레이터는 환경으로부터 원치않는 화합물을 제거하는데 도움을 제공할 수 있거나, 또는 특정한 화합물이 환경, 예를 들면, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면 암모니아 산화 박테리아의 제제, 예를 들면, 부형제와 접촉하는 것을 감소시키거나 제거하는 보호 방식으로 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 조제물은 킬레이터가 실질적으로 없을 수 있다.
제형은 또한 항산화제, 완충제, 원하지 않는 박테리아의 성장을 방지하는 정균제, 용질, 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균된 현탁액을 함유할 수 있다. 제형은 단위-용량 또는 다중-용량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰풀 및 바이알로 제공될 수 있고, 사용 바로 전에 멸균된 액체 담체, 예를 들면 염수 또는 주사용 증류수의 부가만을 필요로 하는 동결건조된 (동결건조된) 조건에서 보관될 수 있다. 즉석 용액 및 현탁액은 이전에 기재된 유형의 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다. 예시적인 조성물은, 예를 들면, 적합한 비독성, 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 용매, 예컨대 만니톨, 1,3-부탄디올, 물, 링거액, 등장의 염화나트륨 용액, 또는 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함하는, 다른 적합한 분산 또는 습윤 및 현탁화제, 및 올레산, 또는 크레모포어를 포함하는 지방산을 함유할 수 있는 용액 또는 현탁액을 포함한다. 수성 담체는, 예를 들면, 약 3.0 내지 약 8.0의 pH, 약 3.5 내지 약 7.4, 예를 들면 3.5 내지 6.0, 예를 들면 3.5 내지 약 5.0의 pH의 등장성 완충 용액일 수 있다. 유용한 완충제는 나트륨 시트레이트-시트르산 및 나트륨 포스페이트-인산, 및 아세트산나트륨/아세트산 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서 조성물은 산화제를 포함하지 않는다.
포함될 수 있는 부형제는, 예를 들면, 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민 또는 혈장 조제물일 수 있다. 원한다면, 약제학적 조성물은 또한 소량의 비독성 보조 물질, 예컨대 습윤 또는 유화제, 보존제, 및 pH 완충제 등, 예를 들면 아세트산나트륨 또는 소르비탄 모노라우레이트를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 부형제, 예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 화장용으로 허용가능한 부형제는 부착방지제, 결합제, 코팅제, 붕해제, 충전제, 풍미제, 착색제, 윤활제, 활윤제, 흡수제, 보존제, 또는 감미제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조제물은 부형제가 실질적으로 없을 수 있다.
일부 구현예에서, 조제물은 개시내용에서 열거된 화합물 또는 물질 중 하나 이상이 실질적으로 없을 수 있다.
에어로졸 투여를 위한 예시적인 조성물은 염수 중의 용액을 포함하고, 이는, 예를 들면, 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 생체이용률을 향상시키는 흡수 촉진제, 및/또는 다른 가용화 또는 분산제를 함유할 수 있다. 편리하게 에어로졸 투여를 위한 조성물에서 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로디플루오로-메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 제시의 형태로 전달된다. 가압된 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 N. 유트로파 및 적합한 분말 기재, 예를 들면 락토오스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, N. 유트로파는 구동기 (actuator)로도 공지된 에어로졸 어댑터를 통해, 정량 밸브로부터 에어로졸로서 투여된다. 임의로, 안정제가 또한 포함되고/거나 깊은 폐 전달을 위한 다공성 입자가 포함된다 (예를 들면, 미국 특허 번호 6,447,743호 참고).
제형은 담체, 예컨대 코코아 버터, 합성 글리세라이드 에스테르 또는 폴리에틸렌 글리콜과 함께 제공될 수 있다. 그러한 담체는 전형적으로 상온에서 고체이지만, 체온에서 액화되고/거나 용해되어 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파를 이용한 질환 및 병태를 치료하는 다양한 방법을 제공한다.
국소 투여를 위한 예시적인 조성물은 국소 담체, 예컨대 플라스티베이스 (Plastibase) (폴리에틸렌으로 겔화된 광유)를 포함한다. 일부 측면에서, 조성물 및/또는 부형제는 액체, 고체, 또는 겔 중 하나 이상의 형태일 수 있다. 예를 들면, 액체 현탁액은, 비제한적으로, 물, 염수, 포스페이트-완충 염수, 또는 암모니아 산화 보관 완충제를 포함할 수 있다. 겔 제형은, 비제한적으로 한천, 실리카, 폴리아크릴산 (예를 들면 Carbopol®), 카복시메틸 셀룰로오스, 전분, 구아르 검, 알기네이트 또는 키토산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제형은 염화암모늄 또는 암모늄 설페이트를 비제한적으로 포함하는 암모니아 공급원으로 보강될 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파 조성물은 피부 내로의 NO 침투를 개선하도록 제형화된다. 겔-형성 물질, 예컨대 KY 젤리 또는 다양한 모발 겔은 주위 공기로의 NO 손실에 대한 확산 배리어를 제공할 것이며, 따라서 피부의 NO 흡수를 개선할 것이다. 피부에서의 NO 수준은 일반적으로 20 nM/L을 크게 초과하지 않을 것인데, 상기 수준이 GC를 활성화시키고 국소 혈관확장 및 과잉의 NO의 산화적 파괴를 야기하지 않을 것이기 때문이다.
특히 상기 언급된 성분 외에도, 본원에 기재된 바와 같은 제형은 문제가 되는 제형의 유형을 고려하여 당해기술에서 통상적인 다른 제제를 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
제형, 예를 들면, 조제물, 예를 들면, 조성물은 용기의 내용물을 포함하거나 포함하지 않고, 약 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 또는 2000 그램 미만일 수 있는 중량을 갖는, 용기, 전달 시스템, 또는 전달 장치 내에 제공될 수 있다.
적합한 단위 투여량 제형은 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파를 이용한 질환 및 병태를 치료하는 다양한 방법을 제공한다.
치료적 유효량의 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 단일 펄스 용량으로서, 볼러스 용량으로서, 또는 시간 경과에 따라 투여된 펄스 용량으로서 투여될 수 있다. 따라서, 펄스 용량에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파의 볼러스 투여가 제공된 다음, 일정 기간 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파가 상기 대상체에게 투여된 다음, 제2 볼러스 투여가 제공된다. 특정한 비-제한적인 예에서, 펄스 용량은 1일의 과정 동안, 1주의 과정 동안, 또는 1개월의 과정 동안 투여된다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아의 제제, 예를 들면, 제형, 예를 들면, 조성물은 전-결정된 일수 동안 적용될 수 있다. 이것은, 예를 들면, 병태 또는 질환의 중증도, 치료에 대한 반응, 적용된 복용량 및 투여 빈도에 적어도 일부 기초할 수 있다. 예를 들면, 조제물은 1-3, 3-5, 5-7, 7-9, 5-10, 10-14, 12-18, 12-21, 21-28, 28-35, 35-42, 42-49, 49-56, 46-63, 63-70, 70-77, 77-84, 84-91일., 약 1개월 동안, 약 2개월 동안, 약 3개월 동안 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는 규정되지 않은 기간 동안, 예를 들면, 1년 초과, 5년 초과, 10년 초과, 15년 초과, 30년 초과, 50년 초과, 75년 초과 동안 투여된다. 어떤 측면에서, 조제물은 약 16일 동안 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아의 제제, 예를 들면, 제형, 예를 들면, 조성물은 1일당 미리 결정된 회수로 투여될 수 있다. 이것은, 예를 들면, 병태 또는 질환의 중증도, 치료에 대한 반응, 적용된 복용량 및 투여 빈도에 적어도 일부 기초할 수 있다. 예를 들면, 조제물은 1일당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24회 적용될 수 있다.
일부 구현예에서, 조제물은 1일당 1회 적용될 수 있다. 다른 구현예에서, 조제물은 1일당 2회 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 조제물은 어떤 일수 동안 제1 전-결정된 양으로 적용되고 어떤 차후의 일수 동안 제2 전-결정된 양으로 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 조제물은 약 16일 동안 적용될 수 있다.
소비자 제품
암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 다양한 소비자 제품과 연관될 수 있으며, 상기 제품의 예는 하기에 제시되어 있다. 일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 제품과 혼합되며, 예를 들면 제품에 균일하게 퍼져 있으며, 일부 구현예에서, 제품과 연관된 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면 , N. 유트로파는 제품 위에 쌓여 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 분말과 연관된다. 분말은 전형적으로 서로 부착되지 않고 기울였을 때 자유롭게 흐를 수 있는 작은 미립자 고체이다. 소비자 사용을 위한 예시적인 분말은 활석 분말 및 일부 화장품 (예를 들면, 분말 파운데이션)을 포함한다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는 화장품과 연관된다. 화장품은 사람의 외관을 바꾸고자 의도된 국소 적용을 위한 물질, 예를 들면, 액체 파운데이션, 분말 파운데이션, 블러쉬, 또는 립스틱일 수 있다. 화장품은, 예를 들면, 하기 하에 식품의약품안전청 규정에 언급된 임의의 물질일 수 있다: 21 C.F.R.§720.4.
화장품은 유아용품, 예를 들면, 베이비 샴푸, 베이비 로션, 베이비 오일, 베이비 파우더, 베이비 크림; 입욕제, 예를 들면, 목욕 오일, 태블릿, 소금, 버블 배쓰, 배쓰 캡슐; 눈 메이크업 제제, 예를 들면, 눈썹 연필, 아이라이너, 눈 쉐도우, 눈 로션, 눈 메이크업 제거제, 마스카라; 방향 제제, 예를 들면, 콜로뉴 (cologne), 화장수, 향수, 분말 (dusting and talcum), 샤세트; 모발 제제, 예를 들면, 모발 컨디셔너, 모발 스프레이, 모발 스트레이트너, 영구적 웨이브, 린스, 샴푸, 토닉, 드레싱, 모발 그루밍 보조제, 웨이브 세트; 모발 염색 제제, 예를 들면, 모발 염료 및 색상, 모발 염색약, 착색 모발 린스, 착색 모발 샴푸, 색상이 있는 모발 탈색제, 모발 블리치; 메이크업 제제, 예를 들면, 얼굴 화장 분, 파운데이션, 다리 및 신체 페인트, 립스틱, 메이크업 베이스, 루즈, 메이크업 정착액; 매니큐어 제제, 예를 들면, 베이스코트 및 언터코트, 각피 연화제, 네일 크림 및 로션, 손톱 연장제, 매니큐어 및 에나멜, 매니큐어 및 에나멜 제거제; 경구 위생 생성물, 예를 들면, 치약, 구강청결제 및 호흡 청정제; 목욕용 비누 및 세제, 방취제, 질 세척제, 여성 위생 방취제; 면도 제제, 예를 들면, 애프터쉐이브 로션, 수염 연화제, 활석, 프리쉐이브 로션, 면도 크림, 면도 비누; 피부 케어 제제, 예를 들면, 크렌징, 제모제, 얼굴 및 목, 신체 및 손, 발 분말 및 스프레이, 보습제, 야간 제제, 페이스트 마스크, 피부 청정제; 및 썬텐 제제, 예를 들면, 겔, 크림, 및 액체, 및 실내 태닝 제제 중 적어도 하나일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 제형, 조성물, 또는 제제는 유아 용품, 예를 들면, 베이비 샴푸, 베이비 로션, 베이비 오일, 베이비 파우더, 베이비 크림; 입욕제, 예를 들면, 목욕 오일, 태블릿, 소금, 버블 배쓰, 배쓰 캡슐; 분말 (dusting and talcum), 샤세트; 모발 제제, 예를 들면, 모발 컨디셔너, 린스, 샴푸, 토닉, 얼굴 화장 분, 각피 연화제, 네일 크림 및 로션, 경구 위생 생성물, 구강청결제, 목욕용 비누, 질 세척제, 여성 위생 방취제; 면도 제제, 예를 들면, 애프터쉐이브 로션, 피부 케어 제제, 예를 들면, 크렌징, 얼굴 및 목, 신체 및 손, 발 분말 및 스프레이, 보습제, 야간 제제, 페이스트 마스크, 피부 청정제; 및 썬텐 제제, 예를 들면, 겔, 크림, 및 액체 중 적어도 하나를 포함하거나, 적어도 하나로서 제공되거나, 또는 적어도 하나에 분산될 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 화장품과 연관된다. 화장품은 사람의 외관을 바꾸고자 의도된 국소 적용을 위한 물질, 예를 들면, 액체 파운데이션, 분말 파운데이션, 블러쉬, 또는 립스틱일 수 있다. 예를 들면, 물, 광유, 착색제, 향수, 알로에, 글리세린, 염화나트륨, 중탄산나트륨, pH 버퍼, UV 차단제, 실리콘 오일, 천연 오일, 비타민 E, 허브 농축물, 락트산, 시트르산, 탈크, 점토, 칼슘 카보네이트, 탄산마그네슘, 아연 옥사이드, 전분, 우레아, 및 에리소르브산, 또는 본 명세서에서 개시된 것들을 포함하는, 당해분야의 숙련가에 의해 공지된 임의의 다른 부형제와 같은 다른 성분들이 화장품 제형의 기술분야의 숙련가에 의해 선택된 이들 화장품 제제에 부가될 수 있다.
일부 구현예에서, 조제물은 분말, 화장, 크림, 스틱, 에어로졸, 고약, 와이프, 또는 붕대 내에 배치되거나, 또는 이들로서 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 크림과 연관된다. 크림은 증점제를 포함하는 유체일 수 있으며, 일반적으로 그것이 피부에 고르게 퍼지게 하는 농도를 갖는다. 예시적인 크림은 보습 로션, 얼굴 크림, 및 바디 로션을 포함한다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 스틱과 연관된다. 스틱은 전형적으로 표면과 접촉할 때, 스틱 내용물 중 일부를 상기 표면에 전달하는 고체이다. 예시적인 스틱은 방취제 스틱, 립스틱, 스틱 형태의 립밤, 및 자외선차단제 도포기 스틱을 포함한다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 에어로졸과 연관된다. 에어로졸은 전형적으로 기체, 예컨대 공기 중의 미세한 고체 입자 또는 미세한 액적의 콜로이드이다. 에어로졸은 N. 유트로파 (및 임의로 담체)를 압력하의 용기에 둔 다음, 밸브를 열어 내용물을 방출시킴으로써 생성될 수 있다. 상기 용기는 N. 유트로파 생존력과 양립가능한 압력의 수준만을 가하도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 고압은 짧은 시간 동안만 가해질 수 있고/거나, 압력은 생존력을 손상시키지 않을 정도로 충분히 낮을 수 있다. 에어로졸의 소비자 사용의 예는 자외선차단제, 방취제, 향수, 헤어스프레이, 및 곤충 퇴치제를 포함한다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 고약과 연관된다. 고약은 피부를 보호하고 치유를 촉진하고자 의도된, 액체 또는 크림-유사 밀도를 갖는 국소 적용된 제제일 수 있다. 고약의 예는 화상 연고 및 피부 보습제를 포함한다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 와이프 (wipe)와 연관된다. 와이프는 액체 또는 크림을 피부에 국소 적용하는데 적합한 가요성 물질일 수 있다. 와이프는, 예를 들면, 종이-기반 또는 옷감 기반일 수 있다. 예시적인 와이프는 티슈 및 습식 와이프를 포함한다
암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파를 포함하는 조성물은 또한 보습제, 탈취제, 방향제, 착색제, 곤충 퇴치제, 세정제, 또는 UV-차단제 중 하나 이상이거나 이를 포함할 수 있다.
예를 들면, 보습제는 피부 건조를 감소시키거나 예방하는 제제일 수 있다. 예시적인 보습제는 습윤제 (예를 들면, 우레아, 글리세린, 알파 하이드록시 산 및 디메티콘) 및 완화제 (예를 들면, 라놀린, 광유 및 바셀린)를 포함한다. 보습제는, 예를 들면, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파-함유 크림, 향유, 로션, 또는 자외선차단제에 포함될 수 있다.
탈취제는 원치않는 악취를 감소시키는 제제일 수 있다. 탈취제는 악취를 직접 중화시키거나, 발한을 예방하거나, 또는 악취-생성 박테리아의 성장을 예방함으로써 작용할 수 있다. 예시적인 탈취제는 알루미늄 염 (예를 들면, 알루미늄 클로라이드 또는 알루미늄 클로로수화물), 사이클로메티콘, 탈크, 베이킹 소다, 에센셜 오일, 미네랄 염, 홉, 및 하마멜리스를 포함한다. 탈취제는 전형적으로 분무 또는 스틱 방취제에 존재하며, 이는 또한 일부 비누 및 의복에서 발견될 수 있다
곤충 퇴치제는 곤충 및 다른 절지동물이 표면을 발견하지 못하게 하는 표면 (예를 들면, 피부)에 적용될 수 있는 제제일 수 있다. 곤충 퇴치제는 DEET (N,N-디에틸-m-톨루아미드), p-멘탄-3,8-디올 (PMD), 이카리딘, 네페타락톤, 시트로넬라 오일, 멀구슬 오일, 들버드나무 (bog myrtle), 디메틸 카베이트, 트리사이클로데세닐 알릴 에테르, 및 IR3535 (3-[N-부틸-N-아세틸]-아미노프로피온 산, 에틸 에스테르)를 포함한다.
세정제는 피부와 같은 표면으로부터 먼지 또는 원치않는 박테리아를 제거하는 제제일 수 있다. 예시적인 세정제는 막대 비누, 액체 비누, 및 샴푸를 포함한다.
UV-차단제는 표면이 받는 자외선의 양을 감소시키기 위해 표면에 적용될 수 있는 제제일 수 있다. UV-차단제는 UV-A 및/또는 UV-B 선을 차단한다. UV 차단제는 UV를 흡수하거나, 반사하거나, 또는 산란시킴으로써 기능할 수 있다. 예시적인 UV-차단제는 흡수제, 예를 들면, 호모살레이트, 옥티살레이트 (또한 소위 옥틸 살리실레이트), 옥티녹세이트 (또한 소위 옥틸 메톡시신나메이트 또는 OMC), 옥토크릴렌, 옥시벤존, 및 아보벤존, 및 반사제 (예를 들면, 이산화티타늄 및 아연 옥사이드)를 포함한다. UV-차단제는 전형적으로 자외선차단제에 존재하며, 이는 또한 피부 크림 및 일부 화장품에서 발견될 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 컨디셔너와 연관된다. 컨디셔너는 일반적으로 모발의 외관, 강도, 또는 관리를 개선하기 위해 모발에 적용될 수 있는 크림-유사 밀도를 갖는 물질을 가리킨다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 옷감과 연관된다. 옷감은 일반적으로, 예를 들면, 착용자에 의해 매일의 움직임을 견디는데 충분한 물질 강도를 갖는, 의복으로 만들어지는데 적합한 가요성 물질을 지칭한다. 옷감은 섬유질, 방직포, 또는 편물일 수 있고; 그것은 자연 발생 물질 또는 합성 물질로 구성될 수 있다. 예시적인 옷감 물질은 면, 아마, 양모, 모시, 비단, 데님, 가죽, 나일론, 폴리에스테르, 및 스판덱스, 및 그의 혼방을 포함한다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 방적사 (yarn)와 연관된다. 방적사는 일반적으로 뜨개질 또는 위이빙(weaving)에 적합한 길고 얇은 실로 자은 가요성 물질을 지칭한다. 방적사는, 예를 들면, 양모, 면, 폴리에스테르, 및 그의 혼방으로 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 실과 연관된다. 실은 일반적으로 바느질에 적합한 길고 얇은 실로 자은 가요성 물질을 지칭한다. 실은 일반적으로 방적사보다 더 얇은 직경을 갖는다. 실은, 예를 들면, 면, 폴리에스테르, 나일론, 실크, 및 그의 혼방으로 구성될 수 있다.
의류, 예를 들면, 신발, 신발 깔창, 파자마, 스니커즈, 벨트, 모자, 셔츠, 속옷, 운동복, 헬멧, 수건, 글러브, 양말, 붕대, 등이 또한 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파를 이용한 질환 및 병태를 치료하는 다양한 방법을 제공한다. 시트, 베개, 베개 주머니, 및 담요를 포함하는 침구가 또한 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파를 이용한 질환 및 병태를 치료하는 다양한 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 일정 기간 동안 세정될 수 없는 피부의 영역이 또한 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파를 이용한 질환 및 병태를 치료하는 다양한 방법을 제공한다. 예를 들면, 치유 과정 동안 손상된 사지를 고정화하는 정형외과 주형에 봉입된 피부, 및 꿰맨 상처와 같이 적절한 치유를 위해 건조한 상태를 유지해야 하는 손상 인접 영역이 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파를 이용한 질환 및 병태를 치료하는 다양한 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 균주를 포함하는 착용가능한 물품을 제공한다. 착용가능한 물품은 보행을 방해하지 않는 방식으로, 사용자의 몸과 밀접히 연관될 수 있는 가벼운 물품일 수 있다. 착용가능한 물품의 예는 손목시계, 손목밴드, 헤드밴드, 헤어 고무, 헤어망, 샤워 캡, 모자, 부분 가발, 및 보석을 포함한다. 본원에 기재된 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파 균주를 포함하는 착용가능한 물품은, 예를 들면, 피부 장애의 치료 또는 예방, 낮은 니트라이트 수준과 관련된 질환 또는 병태의 치료 또는 예방, 체취의 치료 또는 예방, 산화질소를 대상체에게 공급하는 치료, 또는 미생물 성장을 억제하는 치료 중 하나 이상을 제공하는 농도로 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 모발에 접촉하고자 하는 제품, 예를 들면, 브러쉬, 빗, 샴푸, 컨디셔너, 머리밴드, 헤어 고무, 헤어망, 샤워 캡, 모자, 및 부분 가발과 연관된다. 피부 표면으로부터 떨어져, 모발 상에 형성된 산화질소는 모자, 스카프 또는 안면 마스크에 포획될 수 있고 흡입 공기로 향할 수 있다.
인간 대상체의 표면에 접촉하는 물품, 예컨대 기저귀는 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파를 이용한 질환 및 병태를 치료하는 다양한 방법을 제공한다. 기저귀는 실금의 개인에 의해 생산된 소변 및 대변을 보유하고 함유하도록 설계되기 때문에, 소변 및 대변 내의 우레아는 피부 및 대변 박테리아에 의해 가수분해되어 자극시키고 기저귀 발진을 유발할 수 있는 자유 암모니아를 형성할 수 있다. 우레아를 니트라이트 또는 니트레이트로 대사시키는 박테리아, 예컨대 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파의 혼입은 자유 암모니아의 방출을 회피할 수 있으며 소아 및 실금의 성인 모두에게 건강한 피부를 유지하는데 도움을 줄 수 있는 니트라이트 및 궁극적으로 NO를 방출할 수 있다. 기저귀에서 산화질소의 방출은 인간 대변에 존재하는 질환 유발 유기체에게 항-미생물 효과를 미칠 수 있다. 이러한 효과는 일회용 기저귀가 폐기물로서 처리된 후에도 게속될 수 있으며, 더러운 일회용 기저귀과의 접촉을 통한 질환의 전염의 발생을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파를 포함하는 제품은 포장된다. 상기 포장은 제품을 소형화하고 제품을 손상, 먼지, 또는 분해로부터 보호하는 역할을 할 수 있다. 포장은, 예를 들면, 플라스틱, 종이, 판지, 또는 목재를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 포장은 박테리아에 대해 불투과성이다. 일부 구현예에서 포장은 산소 및/또는 이산화탄소에 대해 투과성이다.
5. N. 유트로파 를 이용한 치료 방법
본 개시내용은 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파를 이용한 질환 및 병태를 치료하는 다양한 방법을 제공한다. 질환 및 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있는 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 모든 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, 본원에서 기재된 N. 유트로파 조성물, 예를 들면최적화된 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파의 정제된 조제물, 예를 들면 상기 섹션 2에서의 것, 예를 들면 균주 D23을 포함한다.
예를 들면, 본 개시내용은 병태 또는 질환을 치료하기 위한 (예를 들면, 대상체의 피부 상의 미생물 성장을 억제하기 위한), 서열번호: 1에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한 핵산 서열을 포함하는 N. 유트로파의 임의의 무균 조성물; 표 1의 균주 D23 핵산 중 어느 하나에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한 핵산 서열을 포함하는 임의의 N. 유트로파의 무균 조성물의 용도를 제공한다. 구현예에서, N. 유트로파는 표 1의 균주 D23 핵산 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 모두를 포함할 수 있다. 구현예에서, N. 유트로파는 도 6-8의 하나 이상의 핵산을 포함한다. 추가 예로서, 본 개시내용은, 병태 또는 질환을 치료하기 위한, 표 1의 균주 D23 단백질 서열 중 어느 하나에 대해 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 임의의 N. 유트로파의 무균 조성물의 용도를 제공한다. 구현예에서, N. 유트로파는 표 1의 서열의 균주 D23 단백질 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 모두를 포함할 수 있다. 구현예에서, N. 유트로파는 도 6-8의 핵산에 의해 인코딩된 하나 이상의 단백질을 포함한다. 이 단락의 N. 유트로파는, 예를 들면, 당뇨병성 궤양, 예를 들면, 당뇨 발 궤양, 만성 상처, 여드름, 주사비, 습진, 또는 건선을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 개시내용은, 병태 또는 질환을 치료하기 위한 (예컨대, 대상체의 피부 상에서 미생물 성장을 억제하기 위한), 하기 중 하나 이상을 갖는 N. 유트로파의 임의로 무균 조성물의 용도를 제공한다: (1) 최적화된 성장 속도, (2) 최적화된 NH4 + 산화 속도, (3) NH3에 대해 최적화된 내성, (4) NH4 +에 대한 최적화된 내성, 및 (5) NO2 -에 대한 최적화된 내성. 예를 들면, 무균 N. 유트로파 조성물은 이 단락의 시작부에 있는 목록으로부터 특성 (1) 및 (2); (2) 및 (3); (3) 및 (4); 또는 (4) 및 (5)를 가질 수 있다. 또 다른 예로서, 무균 N. 유트로파 조성물은 이 단락의 시작부에 있는 목록으로부터 특성 (1), (2), 및 (3); (1), (2), 및 (4); (1), (2), 및 (5); (1), (3), 및 (4); (1), (3), 및 (5); (1), (4), 및 (5); (2), (3), 및 (4); (2), (3), 및 (5), 또는 (3), (4), 및 (5)를 가질 수 있다. 추가 예로서, 임의의 무균 N. 유트로파 조성물은 이 단락의 시작부에 있는 목록으로부터 특성 (1), (2), (3), 및 (4); (1), (2), (3), 및 (5); (1), (2), (4), 및 (5); (1), (3), (4), 및 (5); 또는 (2), (3), (4), 및 (5)를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 무균 N. 유트로파 조성물은 이 단락의 시작부에 있는 목록으로부터 특성 (1), (2), (3), (4), 및 (5)를 가질 수 있다. 이 단락의 N. 유트로파는, 예를 들면, 당뇨병성 궤양, 예를 들면, 당뇨 발 궤양, 만성 상처, 여드름, 주사비, 습진, 또는 건선을 치료하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 임의의 무균 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)는 대상체를 치료하는데 사용된다. 대상체는 동물, 포유동물, 인간, 비-인간 동물, 가축 동물, 또는 반려 동물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 무균 N. 유트로파 (예를 들면, 이 섹션 및 상기 섹션 2에 기재된 N. 유트로파, 예를 들면, 균주 D23)는 다른 유기체의 성장을 억제하는데 사용된다. 예를 들면, N. 유트로파 D23은 인간 피부의 장기 군집화를 위해 잘 적응되며, 일부 구현예에서 그것은 피부에 바람직하지 않은 다른 박테리아보다 더 우월하다. 바람직하지 않은 피부 박테리아는, 예를 들면, 상처를 감염시키거나, 질환의 위험 또는 중증도를 높이거나, 또는 악취를 생산할 수 있는 박테리아를 포함한다. 어떤 바람직하지 않은 피부 박테리아는 S. 아우레스, P. 에어루기노사, S. 파이오제네스, 및 A. 바우마니를 포함한다. 본원에서 기재된 N. 유트로파는, 예를 들면, 부족한 영양소를 소비하거나, 또는 다른 유기체에게 유해한 부산물을 생성함으로써, 예를 들면, 피부의 pH를 바람직하지 않는 유기체의 성장에 도움이 되지 않는 수준으로 변화시킴으로써 다른 유기체보다 더 우월할 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)의 유효량을 이를 필요로 하는 인간에게 국소 투여하는 것을 포함하는, 특히, 대상체의 피부 상에서 미생물 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 유사하게, 본 개시내용은 대상체의 피부 상에서 미생물의 성장을 억제하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)를 제공한다. 마찬가지로, 본 개시내용은 대상체의 피부 상의 미생물의 성장을 억제하기 위한 약제의 제조에 있어서 임의의 무균 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 임의의 무균 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)의 유효량을 대상체에게 근접하여 위치시키는 것을 포함하는, 산화질소를 대상체에게 공급하는 방법을 제공한다. 유사하게, 본 개시내용은 산화질소를 대상체에게 공급하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)를 제공한다. 마찬가지로, 본 개시내용은 대상에게 근접한 위치에 적합한 약제 또는 조성물의 제조에 있어서 임의의 무균 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 임의의 무균 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 국소 투여하는 것을 포함하는, 체취를 감소시키는 방법을 제공한다. 유사하게, 본 개시내용은 대상체에서 체취를 감소시키는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)를 제공한다. 마찬가지로, 본 개시내용은 체취를 감소시키기 위한 약제 또는 조성물의 제조에 있어서 본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 임의의 무균 N. 유트로파 박테리아 ( 예를 들면, 균주 D23)의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 국소 투여하는 것을 포함하는, 낮은 니트라이트 수준과 관련된 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 유사하게, 본 개시내용은 낮은 니트라이트 수준과 관련된 질환을 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)의 국소 제형을 제공한다. 마찬가지로, 본 개시내용은 낮은 니트라이트 수준과 관련된 질환을 치료하기 위한 국소 약제의 제조에 있어서 본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 피부 장애 또는 피부 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 유사하게, 본 개시내용은 대상체에서의 피부 장애를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)를 제공한다. 마찬가지로, 본 개시내용은 피부 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)의 용도를 제공한다. 구현예에서, 피부 장애는 여드름, 주사비, 습진, 건선, 또는 두드러기이며; 피부 감염은 농가진이다.
이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)의 치료적 유효량을 이용한 여드름의 치료는 NO 생성으로 인한 염증의 하향조절; 및/또는 산성화된 니트라이트 및 NO 생산을 통한 심상성 여드름과 연관된 프로피오니박테리움 아크네스의 확산 및 증식을 제한하고/거나 억제하는 것을 수반할 수 있는 것으로 제안된다.
예를 들면, 본 개시내용은 병태 또는 질환을 치료하기 위한 (예를 들면, 대상체의 피부 상의 미생물 성장을 억제하기 위한), 암모니아 산화 박테리아의 조성물의 용도를 제공한다. 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는, 예를 들면, 만성 상처, 여드름, 주사비, 습진, 건선, 두드러기, 피부 감염, 또는 당뇨병성 궤양, 예를 들면, 당뇨 발 궤양을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 시스템 및 방법은 피부 장애를 치료하거나 예방하는데, 낮은 니트라이트 수준과 연관된 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하는데, 체취를 치료하거나 예방하는데, 산화질소를 대상체에게 공급하기 위해 치료하는데, 또는 미생물 성장을 억제하기 위해 치료하는데 유용할 내용물을 제공하거나, 이를 함유할 수 있다.
본 개시내용의 시스템 및 방법은 환경, 예를 들면, 대상체의 표면으로부터 바람직하지 않은 박테리아의 양을 감소시키는 것을 제공할 수 있다.
본 개시내용의 시스템 및 방법은 HIV 피부염, 당뇨 발 궤양에서의 감염, 아토피 피부염, 여드름, 습진, 접촉 피부염, 알러지성 반응, 건선, 두드러기, 주사비, 피부 감염, 혈관 질환, 질 효모 감염, 성 매개성 질환, 심장병, 죽상경화증, 대머리, 당뇨병 또는 병상에 있는 것에 대해 부수적인 다리 궤양, 협심증, 특히 만성적, 안정한 협심증, 허혈성 질환, 울혈성 심장기능상실, 심근경색증, 허혈 재관류 부상, 제엽염, 고혈압, 비대성 기관 변성, 레이노 증후군 현상, 섬유증, 섬유성 기관 변성, 알러지, 자가면역 민감화, 말기 신장 질환, 비만, 발기불능, 폐렴, 일차 면역결핍, 수포성 표피박리증, 또는 암 중 적어도 하나의 치료에 유용할 내용물을 제공하거나 함유할 수 있다.
본 개시내용의 시스템 및 방법은 여드름, 습진, 건선, 두드러기, 주사비, 피부 감염 및 상처 중 적어도 하나, 예를 들면, 감염된 상처의 치료에 유용할 내용물을 제공하거나 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는 대상체를 치료하는데 사용될 수 있다. 대상체는 동물, 포유동물, 인간, 비-인간 동물, 가축 동물, 또는 반려 동물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 암모니아 산화 박테리아는 다른 유기체의 성장을 억제하는데 사용된다. 예를 들면, 암모니아 산화 박테리아는 인간 피부의 장기 군집을 위해 잘 적응될 수 있고, 일부 구현예에서 피부 상의 바람직하지 않은 다른 박테리아보다 우월하다. 바람직하지 않은 피부 박테리아는, 예를 들면, 상처를 감염시키거나, 질환의 위험 또는 중증도를 상승시키거나, 악취를 생산할 수 있는 것을 포함한다. 바람직하지 않은 박테리아는 병원성 박테리아로 지칭될 수 있다. 어떤 바람직하지 않은 박테리아는 스타필로코쿠스 아우레스 (S. 아우레스), 예를 들면, 메티실린 내성있는 스타필로코쿠스 아우레스 슈도모나스 에어루기노사 (P. 에어루기노사), 스트렙토코쿠스 파이오제네스 (S. 파이오제네스), 아시네토박터 바우마니 (A. 바우마니), 프로피오니박테리아, 및 스테노트로포모나스를 포함한다. 본원에 기재된 암모니아 산화 박테리아는, 예를 들면, 부족한 영양소를 소비하거나, 또는 다른 유기체에게 유해한 부산물을 생성함으로써, 예를 들면, 피부의 pH를 바람직하지 않은 유기체의 성장에 도움이 되지 않은 수준으로 변화시킴으로써 다른 유기체보다 더 우월할 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 그 중에서도, 본원에 기재된 바와 같은 암모니아 산화 박테리아의 유효 용량을 이를 필요로 하는 인간에게 국소 투여하는 것을 포함하는 대상체의 피부 상에서 미생물 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 유사하게, 본 개시내용은 대상체의 피부 상의 미생물 성장을 억제하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 암모니아 산화 박테리아를 제공한다. 마찬가지로, 본 개시내용은 대상체의 피부 상의 미생물 성장을 억제하기 위한 약제의 제조에 있어서 암모니아 산화 박테리아의 용도를 제공한다.
본 개시내용은, 그 중에서도, 환경, 예를 들면, 표면, 예를 들면, 대상체의 표면에서, 피부 미생물군집의 조성을 변화시키는 방법, 예를 들면, 피부 미생물군집의 조성을 조절하는 방법, 예를 들면, 피부 미생물군집의 비율을 조절하거나 변화시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 투여하는 것, 예를 들면, 암모니아 산화 박테리아를 포함하는 조제물을 환경, 예를 들면, 표면, 예를 들면, 대상체의 표면에 적용하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 투여, 예를 들면, 적용의 양 및 빈도는 피부의 표면 상의 병원성 박테리아의 비율을 감소시키는데 충분할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 피부의 표면 상의 병원성 박테리아의 비율의 감소를 필요로 하는 대상체에 기초하여 선택될 수 있다.
본 개시내용은 피부의 표면으로부터의 샘플을 수득하는 것, 및 상기 샘플에서 박테리아의 DNA를 단리시키는 것을 추가로 제공할 수 있다. 샘플 내의 박테리아의 DNA의 서열분석은 또한 대상체의 샘플 내의 박테리아의 양 또는 비율을 결정하거나 모니터링하기 위해 수행될 수 있다.
본 개시내용은 표면 상의 비-병원성 박테리아의 비율을 증가시키는 것을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 비-병원성 박테리아는 공생적 비-병원성 박테리아일 수 있다. 일부 구현예에서, 비-병원성 박테리아는 스타필로코쿠스 속일 수 있다. 일부 구현예에서, 비-병원성 박테리아는 스타필로코쿠스 에피더미디스일 수 있다. 일부 구현예에서, 비율이 증가된 비-병원성 박테리아는 적어도 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 스타필로코쿠스 에피더미디스를 포함하는, 스타필로코쿠스 속일 수 있다.
비-병원성 박테리아의 비율 증가는 미리 결정된 기간으로, 예를 들면, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 1주, 2주, 3주, 또는 4주, 또는 1-3, 3-5, 5-7, 7-9, 5-10, 10-14, 12-18, 12-21, 21-28, 28-35, 35-42, 42-49, 49-56, 46-63, 63-70, 70-77, 77-84, 84-91일 미만에 일어날 수 있다.
스타필로코쿠스 박테리아, 예를 들면, 스타필로코쿠스 에피더미디스의 비율 증가는 약 3주, 예를 들면, 약 16일, 예를 들면, 약 2주 미만 내에 관찰될 수 있다.
본 개시내용은 표면 상의 병원성 박테리아, 예를 들면, 잠재적 병원성 박테리아, 예를 들면, 질환-연관된 박테리아의 비율을 감소시키는 것을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 병원성 박테리아는 프로피오니박테리아 일 수 있다. 일부 구현예에서, 병원성 박테리아는 스테노트로포모나스일 수 있다.
병원성 박테리아의 비율 감소는 미리 결정된 기간으로, 예를 들면, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 1주, 2주, 3주, 또는 4주 미만, 또는 1-3, 3-5, 5-7, 7-9, 5-10, 10-14, 12-18, 12-21, 21-28, 28-35, 35-42, 42-49, 49-56, 46-63, 63-70, 70-77, 77-84, 84-91일 미만 내에 일어날 수 있다.
프로피오니박테리아 박테리아 및/또는 스테노트로포모나스의 비율 감소는 약 3주, 예를 들면, 약 16일, 예를 들면, 약 2주 미만 내에 관찰될 수 있다.
본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 암모니아 산화 박테리아의 유효량을 대상체에게 근접하여 위치시키는 것을 포함하는, 산화질소를 대상체에게 공급하는 방법을 제공한다. 유사하게, 본 개시내용은 산화질소를 대상체에게 공급하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 암모니아 산화 박테리아를 제공한다. 마찬가지로, 본 개시내용은 대상체에게 근접한 위치에 적합한 약제 또는 조성물의 제조에 있어서 용도를 제공한다.
본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 암모니아 산화 박테리아의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체를 국소 투여하는 것을 포함하는, 체취를 감소시키는 방법을 제공한다. 유사하게, 본 개시내용은 대상체에서 체취를 감소시키는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 암모니아 산화 박테리아를 제공한다. 마찬가지로, 본 개시내용은 체취를 감소시키기 위한 약제 또는 조성물의 제조에 있어서 본원에 기재된 바와 같은 암모니아 산화 박테리아의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 암모니아 산화 박테리아의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 국소 투여하는 것을 포함하는, 낮은 니트라이트 수준과 연관된 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 유사하게, 본 개시내용은 낮은 니트라이트 수준과 연관된 질환을 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 암모니아 산화 박테리아의 국소 제형을 제공한다. 마찬가지로, 본 개시내용은 낮은 니트라이트 수준과 연관된 질환을 치료하기 위한 국소 약제의 제조에 있어서 본원에 기재된 바와 같은 암모니아 산화 박테리아의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 바와 같은 암모니아 산화 박테리아의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 국소 투여하는 것을 포함하는, 피부 장애 또는 피부 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 유사하게, 본 개시내용은 대상체에서 피부 장애를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 암모니아 산화 박테리아를 제공한다. 마찬가지로, 본 개시내용은 피부 장애를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 본원에 기재된 바와 같은 암모니아 산화 박테리아의 용도를 제공한다. 구현예에서, 피부 장애는 여드름, 주사비, 습진, 건선, 또는 두드러기이며; 피부 감염은 농가진이다.
이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)의 치료적 유효량을 이용한 주사비의 치료는 NO 생성으로 인한 하향조절을 수반할 수 있는 것으로 제안된다. 이것은 전구체 프로펩타이드 hCAP18로부터 인간 카텔리시딘 펩타이드 LL-37의 형성을 감소시킬 수 있는 카잘-유형 KLK5/KLK7 저해제(들)의 발현 때문일 수 있다.
이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)의 치료적 유효량을 이용한 습진 및/또는 아토피 피부염의 치료는 NO 생성으로 인한 염증의 하향조절; 및/또는 S. 아우레스 및 산성화된 니트라이트 및 NO 생산을 통한 아토피 피부염에서 매우 높은 군집 비율 및 피부 로드와 종종 연관된 다른 피부 병원체의 확산 및 증식을 제한하고/거나 억제하는 것을 수반할 수 있는 것으로 제안된다.
이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)의 치료적 유효량을 이용한 건선의 치료는 NO 생성으로 인한 염증의 하향조절 및 인간 카텔리시딘 펩타이드 LL-37의 형성 감소를 수반할 수 있는 것으로 제안된다.
이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)의 치료적 유효량을 이용한 건선의 치료는 NO 생성으로 인한 염증의 하향조절을 수반할 수 있는 것으로 제안된다.
이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, 본원에 기재된 바와 같은 임의로 무균 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)의 치료적 유효량을 이용한 농가진 또는 다른 피부 및 연조직 감염의 치료는 S. 아우레스 및 S. 파이오제네스의 확산 및 증식을 제한하고/거나 억제하는 것을 수반할 수 있는 것으로 제안된다.
본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 바와 같은 임의로 무균 N. 유트로파 박테리아 (예를 들면, 균주 D23)의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상처 치유를 촉진하는 방법을 제공한다. 유사하게, 본 개시내용은 상처를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)를 제공한다. 마찬가지로, 본 개시내용은 상처를 치료하기 위한 약제 또는 조성물의 제조에 있어서 본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)의 용도를 제공한다.
본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)는 손상된 치유 능력을 갖는 환자, 예를 들면, 당뇨 환자에서 상처 치유를 촉진하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 질환 또는 장애, 예를 들면, 피부 장애를 예방하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 임의의 무균 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23)를 사용하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 예방은 유사한 치료되지 않은 대상체와 비교하여, 질환을 발전시키는 대상체의 위험을 감소시키는 것을 의미한다. 상기 위험은 0으로 감소될 필요는 없다.
목욕 빈도가 감소된 개인, 예컨대 우주 비행사, 잠수함 승무원, 군사 작전 중인 군인력, 원격지에 있는 노무자, 난민, 아파서 누워 있는 개인 및 기타 다수는 피부 상에 N. 유트로파를 유지함으로써 더 건강한 피부를 유지할 수 있다. 아파서 누워 있는 개인에 대해, 일부 구현예에서N. 유트로파는 불충분한 순환을 증가시킴으로써 욕창의 빈도 또는 중증도를 감소시킨다.
많은 현대 사회의 퇴행성 질환은 NO 종의 부족에 의해 야기될 수 있으며, 외부 피부상의 AOB는 확산에 의해 상기 종을 공급할 수 있고, 피부에의 AOB의 적용은 장기간의 의학적 병태를 해결하는 것으로 인식된다. 특정 구현예에서, AOB는 현대의 목욕 관행을 보완하기 위해 대상체에게 적용되며, 특히 음이온성 세제는 외부 피부로부터 AOB를 제거한다.
국소 적용의 한 가지 적합한 방법은 충분한 N. 유트로파를 적용한 다음 땀흘리기를 유도하기 위해 충분한 의복을 입는 것이다. 그러나, 많은 사람은 그들의 현재의 목욕 습관을 유지하면서 AOB의 이점을 얻기를 원할 것이며, 이 경우, 상기 박테리아의 배양물이 이들이 NO를 생산하기 위한 충분한 기질과 함께 적용될 수 있다. 인간 땀의 무기 조성과 비슷한 영양액이 이 목적을 위해 사용될 수 있다. 인간 땀과 비슷한 배지에 적응된 박테리아를 이용하는 것은 이들이 적용될 때 적응하는 시간을 최소화한다. 땀은 일단 피부 표면 상으로 배출되면 증발하므로, 더 높은 이온 강도를 갖는 배양 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 인간 땀의 약 2배의 농도가 적합하지만, 다른 조건이 또한 고려된다. AOB의 영양적 요구는 전형적으로 NH3 또는 우레아, O2, CO2, 및 미네랄로 충족된다. 일부 구현예에서, 기질은 철, 구리, 아연, 코발트, 몰리브데늄, 망간, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 클로라이드, 포스페이트, 설페이트, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 미량 미네랄을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 N. 유트로파를 포함하는 붕대를 상처에 적용함으로써 상처를 치료하는 방법을 제공한다. 또한 그와 같은 붕대를 생산하는 방법이 제공된다. 상기 붕대는, 예를 들면, 붕대를 손상되지 않은 상처 주위 피부에 접착하기 위한 접착제 부분 및 상처를 덮거나 덮어씌우는 부드러운 가요성 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 붕대는 다른 유기체를 함유하지 않지만 N. 유트로파를 함유한다. 붕대는 붕대가 상처에 적용될 때 산소 및 이산화탄소와 같은 기체가 N. 유트로파에 도달하게 하는 투과성 물질로 구성될 수 있다. 특정 구현예에서, 붕대는 N. 유트로파를 위한 영양소, 예컨대 암모늄, 암모니아, 우레아, 또는 미량 미네랄을 포함한다. 특정 구현예에서, 붕대는 N. 유트로파가 내성인 항생제를 포함한다. 항생제 내성은 하나 이상의 내인성 내성 유전자로부터 또는 하나 이상의 이식유전자로부터 발생할 수 있다.
일부 구현예에서, N. 유트로파는 적용 당 약 108 - 109 CFU, 109 - 1010 CFU, 1010 - 1011 CFU, 또는 1011-1012 CFU의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, N. 유트로파는 약 1010-1011 CFU, 예를 들면, 약 1 x 1010 - 5 x 1010, 1 x 1010 - 3 x 1010, 또는 1 x 1010 - 2 x 1010 CFU의 용량으로 국소 투여된다.
일부 구현예에서, N. 유트로파는 용량 당 약 1 내지 2, 2-5, 5-10, 10-15, 12-18, 15-20, 20-25, 또는 25-50 ml의 부피로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 용액은 약 108-109, 109-1010, 또는 1010-1011 CFU/ml의 농도이다. 일부 구현예에서, N. 유트로파는 1일당 2개의 15 ml 용량으로서 투여되며, 여기서 각각의 용량은 109 CFU/ml의 농도이다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 1일당 1회, 2회, 3회, 또는 4회 투여된다. 일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 1주당 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 또는 6회 투여된다. 일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 목욕 직후에 투여된다. 일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파는 수면 직전에 투여된다.
어떤 측면에서, 본 개시내용은 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파 및 제2 치료제를 포함하는 조합 요법을 제공한다. 예를 들면, 본 개시내용은 2가지 (또는 그 이상의) 요법이 물리적으로 혼합된 물리적 혼합물을 제공한다. 다른 구현예에서, 2가지 (또는 그 이상의) 요법은 별도의 제형으로서 조합하여 투여된다. 제2 요법은, 예를 들면, 관련 질환 또는 장애를 치료하는 약제, 수술, 또는 임의의 다른 의료 접근법일 수 있다. 하기 단락은 당뇨병성 궤양, 만성 상처, 여드름, 주사비, 습진, 및 건선을 치료할 수 있는 조합 요법을 기술한다.
예를 들면, 당뇨병성 궤양을 치료할 수 있는 조합 요법에서, 제2 요법은, 예를 들면, 상처 드레싱 (예를 들면, 흡수성 충전제, 하이드로겔 드레싱, 또는 하이드로콜로이드), 안지오텐신, 안지오텐신 유사체, 혈소판-풍부 피브린 요법, 고압 산소 요법, 음성 압력 상처 요법, 죽은조직제거술, 배액, 동맥 혈관재생, 고압 산소 요법, 낮은 수준 레이저 요법, 및 비복근 축퇴술을 포함할 수 있다. 상기 조합 요법은 상기-언급된 치료 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
만성 상처를 치료할 수 있는 조합 요법에서, 제2 요법은, 예를 들면, 항생제 (예를 들면, 국소 또는 전신, 및 살균 또는 정균), 예컨대 페니실린, 세팔로스포린, 폴리믹신, 리파마이신, 리피아마이신, 퀴놀론, 설폰아미드, 매크롤라이드, 린코사마이드, 테트라사이클린, 사이클릭 리포펩타이드, 글라이실사이클린, 옥사졸리디논, 및 리피아마이신; 안지오텐신, 안지오텐신 유사체; 죽은조직제거술; 배액; 상처 세척 (wound irrigation); 음압 상처 요법; 열의 적용; 동맥 혈관재생; 고압 산소 요법; 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 글루타티온, 리포산, 카로텐, α-토코페롤, 또는 유비퀴놀; 낮은 수준 레이저 요법; 비복근 축퇴술; 성장 인자 예컨대 혈관 내피 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 1-2, 혈소판 유도된 성장 인자, 형질전환 성장 인자-β, 또는 표피 성장 인자; 자가조직 혈소판, 예컨대 하나 이상의 성장 인자, 예컨대 혈관 내피 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 1-2, 혈소판 유도된 성장 인자, 형질전환 성장 인자-β, 또는 표피 성장 인자를 분비하는 것의 적용; 배양된 케라틴생성세포의 이식; 동종이식편; 콜라겐, 예를 들면 콜라겐을 포함하는 드레싱; 또는 프로테아제 저해제, 예컨대 SLPI을 포함할 수 있다. 상기 조합 요법은 상기-언급된 치료 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
여드름을 치료할 수 있는 조합 요법에서, 제2 요법은, 예를 들면, 약물 (예를 들면, 전신 또는 국소), 예컨대 벤조일 퍼옥사이드, 항생제 (예컨대 에리트로마이신, 클린다마이신, 또는 테트라사이클린), 살리실산, 호르몬 (예를 들면, 프로게스틴, 예컨대 데소게스트렐, 노르게스티메이트 또는 드로스피레논을 포함함), 레티노이드, 예컨대 트레티노인, 아다팔렌, 타자로텐, 또는 이소트레티노인을 포함할 수 있다. 제2 요법은 또한 여드름 추출, 코르티코스테로이드 주사, 또는 수술 랜싱과 같은 절차일 수 있다. 상기 조합 요법은 상기-언급된 치료 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
주사비를 치료할 수 있는 조합 요법에서, 제2 요법은, 예를 들면, 항생제, 예를 들면, 경구 테트라사이클린 항생제, 예컨대 테트라사이클린, 독시사이클린, 또는 미노사이클린, 또는 국소 항생제, 예컨대 메트로니다졸; 아젤라산; 알파-하이드록시 산; 이소트레티노인이 처방될 수 있음; 백단유 오일; 클로니딘; 베타-차단제 예컨대 나돌롤 및 프로프라놀롤; 항히스타민제 (예컨대 로라타딘); 미타자핀; 임의로 서로 조합된, 메틸설포닐메탄 또는 실리마린; 레이저, 예컨대 피부과 혈관 레이저 또는 CO2 레이저; 또는 광 요법, 예컨대 강렬한 펄스 광, 낮은-수준 광 요법 또는 광회춘을 포함할 수 있다. 상기 조합 요법은 상기-언급된 치료 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
습진을 치료할 수 있는 조합 요법에서, 제2 요법은, 예를 들면, 코르티코스테로이드, 예컨대 하이드로코르티손 또는 클로베타솔 프로피오네이트, 면역억제제 (국소 또는 전신) 예컨대 피메크롤리무스, 타크롤리무스, 사이클로스포린, 아자티오프린 또는 메토트렉세이트, 또는 광 요법, 예컨대 자외선을 이용한 광 요법을 포함할 수 있다. 상기 조합 요법은 상기-언급된 치료 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
건선을 치료할 수 있는 조합 요법에서, 제2 요법은, 예를 들면, 코르티코스테로이드 예컨대 데속시메타손; 레티노이드; 콜 타르; 비타민 D 또는 이의 유사체, 예컨대 파리칼시톨 또는 칼시포트리올; 보습제 및 완화제, 예컨대 광유, 바셀린, 칼시포트리올, 데쿠발, 또는 코코넛 오일; 디트라놀; 또는 플루오시노나이드를 포함할 수 있다. 상기 조합 요법은 상기-언급된 치료 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, 본원에 기재된 암모니아 산화 박테리아의 치료적 유효량을 이용한 건선의 치료는 NO 생성으로 인한 염증의 하향조절 및 인간 카텔리시딘 펩타이드 LL-37의 형성 감소를 수반할 수 있는 것으로 제안된다.
이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, 본원에 기재된 암모니아 산화 박테리아의 치료적 유효량을 이용한 건선의 치료는 NO 생성으로 인한 염증의 하향조절을 수반할 수 있는 것으로 제안된다.
이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, 본원에 기재된 바와 같은 암모니아 산화 박테리아의 치료적 유효량을 이용한 농가진 또는 다른 피부 및 연조직 감염의 치료는 스타필로코쿠스 아우레스 (S. 아우레스), 예를 들면, 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레스, 슈도모나스 에어루기노사 (P. 에어루기노사), 스트렙토코쿠스 파이오제네스 (S. 파이오제네스), 아시네토박터 바우마니 (A. 바우마니), 프로피오니박테리아, 및 스테노트로포모나스의 확산 및 증식을 제한하고/거나 억제하는 것을 수반할 수 있는 것으로 제안된다.
본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 바와 같은 암모니아 산화 박테리아의 유효량을 상처에 투여하는 것을 포함하는, 상처 치유를 촉진하는 방법을 제공한다. 유사하게, 본 개시내용은 상처를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 암모니아 산화 박테리아를 제공한다. 마찬가지로, 본 개시내용은 상처를 치료하기 위한 약제 또는 조성물의 제조에 있어서 본원에 기재된 바와 같은 암모니아 산화 박테리아의 용도를 제공한다.
본원에 기재된 바와 같은 암모니아 산화 박테리아는 손상된 치유 능력을 갖는 환자, 예를 들면, 당뇨 환자에서 상처 치유를 촉진하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 질환 또는 장애, 예를 들면, 피부 장애를 예방하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 암모니아 산화 박테리아를 사용하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 예방은 유사한 치료되지 않은 대상체와 비교하여, 질환을 발전시키는 대상체의 위험을 감소시키는 것을 의미한다. 상기 위험은 0으로 감소될 필요는 없다.
목욕 빈도가 감소된 개인, 예컨대 우주 비행사, 잠수함 승무원, 군사 작전 중인 군인력, 원격지에 있는 노무자, 난민, 아파서 누워 있는 개인 및 기타 다수는 피부 상에 암모니아 산화 박테리아를 유지함으로써 더 건강한 피부를 유지할 수 있다. 아파서 누워 있는 개인과 관련하여, 일부 구현예에서 암모니아 산화 박테리아는 불충분한 순환을 증가시킴으로써 욕창의 빈도 또는 중증도를 감소시킨다.
많은 현대 사회의 퇴행성 질환은 NO 종의 부족에 의해 야기될 수 있으며, 외부 피부상의 AOB는 확산에 의해 상기 종을 공급할 수 있고, 피부에의 AOB의 적용은 장기간의 의학적 병태를 해결하는 것으로 인식된다. 특정 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는 현대의 목욕 관행을 보완하기 위해, 특히 음이온성 세제는 외부 피부로부터 암모니아 산화 박테리아를 제거한다.
국소 적용의 한 가지 적합한 방법은 충분한 암모니아 산화 박테리아를 적용한 다음 땀흘리기를 유도하기 위해 충분한 의복을 입는 것이다. 그러나, 많은 사람은 그들의 현재의 목욕 습관을 유지하면서 암모니아 산화 박테리아의 이점을 얻기 원할 것이며, 이 경우, 박테리아의 배양물이 이들이 NO를 생산하기 위한 충분한 기질과 함께 적용될 수 있다. 인간 땀의 무기 조성과 비슷한 영양액이 이 목적을 위해 사용될 수 있다. 인간 땀과 비슷한 배지에 적응된 박테리아를 이용하는 것은 이들이 적용될 때 적응하는 시간을 최소화한다. 땀은 일단 피부 표면 상으로 배출되면 증발하므로, 더 높은 이온 강도를 갖는 배양 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 인간 땀의 약 2배의 농도가 적합하지만, 다른 조건이 또한 고려된다. 암모니아 산화 박테리아의 영양적 요구는 전형적으로 NH3 또는 우레아, O2, CO2, 및 미네랄로 충족된다. 일부 구현예에서, 기질은 철, 구리, 아연, 코발트, 몰리브데늄, 망간, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 클로라이드, 포스페이트, 설페이트, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 미량 미네랄을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 암모니아 산화 박테리아를 포함하는 붕대를 상처에 적용함으로써 상처를 치료하는 방법을 제공한다. 또한 그와 같은 붕대를 생산하는 방법이 제공된다. 상기 붕대는, 예를 들면, 붕대를 손상되지 않은 상처 주위 피부에 접착하기 위한 접착제 부분 및 상처를 덮거나 덮어씌우는 부드러운 가요성 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 붕대는 암모니아 산화 박테리아를 제외한 다른 유기체를 함유하지 않는다. 붕대는 붕대가 상처에 적용될 때 산소 및 이산화탄소와 같은 기체가 암모니아 산화 박테리아에 도달하게 하는 투과성 물질로 구성될 수 있다. 특정 구현예에서, 붕대는 암모니아 산화 박테리아의 영양소, 예컨대 암모늄, 암모니아, 우레아, 또는 미량 미네랄을 포함한다. 특정 구현예에서, 붕대는 암모니아 산화 박테리아가 내성인 항생제를 포함한다. 항생제 내성은 하나 이상의 내인성 내성 유전자로부터 또는 하나 이상의 이식유전자로부터 발생할 수 있다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, 암모니아 산화 박테리아의 조제물은, 적용당 또는 1일당 약 108 - 109 CFU, 109 - 1010 CFU, 1010 - 1011 CFU, 또는 1011-1012 CFU의 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는 약 109-1010 CFU, 예를 들면, 약 1 x 109 - 5 x 109, 1 x 109 - 3 x 109, 또는 1 x 109 - 10 x 109 CFU의 용량으로 국소로 투여된다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는 용량당 약 1 내지 2, 2-5, 5-10, 10-15, 12-18, 15-20, 20-25, 또는 25-50 ml의 부피로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 용액은 약 108-109, 109-1010, 또는 1010-1011 CFU/ml의 농도이다. 일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는 1일당 2개의 15 ml 용량으로서 투여되고, 여기서 각각의 용량은 109 CFU/ml의 농도이다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는 1일당 1회, 2회, 3회, 또는 4회 투여된다. 일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는 1주당 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 또는 6회 투여된다. 일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는 목욕 직후에 투여된다. 일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는 수면 직전에 투여된다.
일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는 약 1-3, 3-5, 5-7, 7-9, 5-10, 10-14, 12-18, 12-21, 21-28, 28-35, 35-42, 42-49, 49-56, 46-63, 63-70, 70-77, 77-84, 84-91일 동안, 예를 들면, 약 1개월 동안, 약 2개월 동안, 약 3개월 동안 투여된다. 일부 구현예에서, 암모니아 산화 박테리아는 규정되지 않은 기간 동안, 예를 들면, 1년 초과, 5년 초과, 10년 초과, 15년 초과, 30년 초과, 50년 초과, 75년 초과 동안 투여된다.
6. D23 치료를 개선하기 위한 실험 모델
본원에 기재된 바와 같은 암모니아 산화 박테리아를 포함하는 치료 (임의로 또 다른 요법과 조합됨)는 수많은 모델 시스템을 이용하여 개선될 수 있다. 이들 모델 시스템은 적합한 용량 및 투여 시기를 결정하는데 사용될 수 있다.
예를 들면, 만성 상처 및 당뇨병성 궤양과 관련하여, 마우스 피부 천자 모델을 사용할 수 있다. 이들 장애를 위한 다른 모델은 기니아 피그 모델에서의 제어된 피부 허혈, 토끼 귀 궤양 모델, 상처에 칼슘의 적용, 또는 독소루비신의 국소 적용을 포함한다.
여드름과 관련하여 (예를 들면) 멕시칸 헤어리스 개 모델, 라이노 (Rhino) 마우스 모델, 또는 토끼 귀 분석을 사용할 수 있다. 주사비와 관련하여, (예를 들면) 마우스 피부 내로 LL-37의 진피내 주사 또는 시리아 햄스터 모델을 사용할 수 있다. 습진과 관련하여, (예를 들면) 집먼지 진드기의 조 추출물의 적용, 민감화된 기니아 피그의 귀에 디나이트로클로로벤젠의 적용, 또는 NC/Nga 마우스를 사용할 수 있다. 건선과 관련하여, (예를 들면) 관여되고 관여되지 않은 건선성 피부가 면역결핍 마우스 상에 이식된 이종이식 모델, SCID 마우스의 피부에 인터루킨 15에 대한 항체의 적용, 및 Sharpincpdm/Sharpincpdm 마우스 모델을 사용할 수 있다.
암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 N. 유트로파 (예를 들면, 균주 D23) (임의로 또 다른 요법과 조합됨)를 포함하는 치료는 수많은 모델 시스템을 이용하여 개선될 수 있다. 이들 모델 시스템은 적합한 용량 및 투여 시기를 결정하는데 사용될 수 있다.
예를 들면, 만성 상처 및 당뇨병성 궤양과 관련하여, 실시예 6에서 본원에 기재된 마우스 피부 천자 모델을 사용할 수 있다. 이들 장애를 위한 다른 모델은 기니아 피그 모델에서의 제어된 피부 허혈, 토끼 귀 궤양 모델, 상처에 칼슘의 적용, 또는 독소루비신의 국소 적용을 포함한다.
여드름과 관련하여 (예를 들면) 멕시칸 헤어리스 개 모델, 라이노 (Rhino) 마우스 모델, 또는 토끼 귀 분석을 사용할 수 있다. 주사비와 관련하여, (예를 들면) 마우스 피부 내로 LL-37의 진피내 주사 또는 시리아 햄스터 모델을 사용할 수 있다. 습진과 관련하여, (예를 들면) 집먼지 진드기의 조 추출물의 적용, 민감화된 기니아 피그의 귀에 디나이트로클로로벤젠의 적용, 또는 NC/Nga 마우스를 사용할 수 있다. 건선과 관련하여, (예를 들면) 관여되고 관여되지 않은 건선성 피부가 면역결핍 마우스 상에 이식된 이종이식 모델, SCID 마우스의 피부에 인터루킨 15에 대한 항체의 적용, 및 Sharpincpdm/Sharpincpdm 마우스 모델을 사용할 수 있다.
7. 치료적 이점의 기전
이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, 하기 기전 중 하나 이상이 본 명세서에서 논의된 질환 및 병태를 치료하는데 있어서 암모니아 산화 박테리아, 예를 들면, N. 유트로파의 유익한 효과에 기여하는 것으로 여겨진다. 부가적인 기계론적 세부사항은 그 전체가 참고로 본원에 편입된 국제 출원 제WO/2005/030147호에서 발견된다.
이들 박테리아의 유익한 측면을 이해하기 위해, 혈관신생을 이해하는 것이 도움이 된다. 몇백 마이크론의 외부 공기 내에 있는 세포를 제외한, 모든 신체 세포는 혈액 공급으로부터 모든 대사성 산소를 받는다. 산소는 폐 안의 혈액에 의해 흡수되고, 산소화된 헤모글로빈으로서 적혈구에 의해 말초 조직으로 운반되고, 이 곳에서 그것은 이산화탄소로 교환되고, 이는 다시 운반되어 폐로 발산된다. 산소는 산소가 이를 소비하는 세포 내의 미토콘드리아에 도달할 때까지, 혈장을 통해, 내피를 통해, 그리고 다양한 조직을 통해, 적혈구로부터 확산되어야 한다. 인간의 몸은 약 5 리터의 혈액을 함유하므로, 순환계의 부피는 신체의 부피에 비해 작다. 산소는 활발하게 수송되지 않는다. 산소는 공기에서 적혈구로, 적혈구에서 세포로, 그리소 세포에서 사이토크롬 옥시다제로, 농도 구배로 수동적으로 확산되며, 그곳에서 산소가 소비된다. 소비 부위에서의 산소의 농도는 신체에서 가장 낮으며, O2 fluX는 확산저항 및 농도 구배에 의해 결정된다. 모든 말초 조직에 충분한 산소 공급을 달성하는 것은 모세관 크기 및 위치의 매우 정교한 제어를 필요로 한다. 만약 모세관 사이의 간격이 증가되면, 산소의 동일한 유동을 달성하는 것은 더 큰 농도 차이 및 이에 따라 사이토크롬 옥시다제에서 더 낮은 O2 농도를 필요로 할 것이다. 모세관 사이에 더 많은 세포가 있으면, O2 요구량은 더 클 것이다. 만약 모세관 사이의 간격이 감소되면, 장기의 대사 기능을 수행하는 세포가 이용가능한 공간이 적을 것이다.
어떤 측면에서, 암모니아 산화 박테리아로부터의 NO는 외부 피부에 의해 쉽게 흡수되고 상기 외부 피부가 헤모글로빈이 없으므로 S-니트로소티올로 전환되는 것으로 인식된다. M. Stucker 등은 외부 피부가 외부 공기로부터 그의 산소 모두를 받는다는 것을 보여왔다: "The cutaneous uptake of atmospheric oxygen contributes significantly to the oxygen supply of human dermis and epidermis. (Journal of Physiology (2002), 538.3, pp. 985-994.) 외부 피부가 본질적으로 적혈구가 없는 것으로 보여질 수 있기 때문에, 이것은 매우 분명하다. 이들은 살아있고 산소가 아닌, 혈액 내의 다른 영양소를 필요로 하기 때문에, 이들 층을 통한 혈장의 순환이 있다. 형성된 S-니트로소티올은 안정하며, 신체 전반에 확산될 수 있고, 단백질 티올을 트랜스니트로소화하는 진짜 NO의 용적 공급원 및 NO의 공급원을 구성한다.
일부 측면에서, 모세관 희박화 (capillary rarefaction)가 NO의 불충분한 수준의 첫 징후 중 하나일 수 있는 것으로 인식된다. F. T. Tarek 등은 부족한 모세관, 또는 모세관 희박화가 본태성 고혈압을 갖는 사람에게 통상적으로 관찰된다는 것을 보여왔다. (Structural Skin Capillary Rarefaction in Essential Hypertension. Hypertension. 1999;33:998-1001
상당히 많은 병태는 모세관 밀도가 더 부족하게 되는 것과 연관된다. 고혈압은 하나이며, 연구자들은 부족한 모세관이 또한 본태성 고혈압을 가진 사람들의 아이에서, 그리고 또한 당뇨병을 가진 사람에서 관찰된다고 보고하였다. 당뇨병의 유의미한 합병증은 고혈압, 당뇨병성 신병증, 당뇨 망막병증, 및 당뇨병성 신경병증이다. R. Candido 등은 마지막 2개의 병태가 관찰된 증상 전에 환부로의 혈류의 감소를 특징으로 한다는 것을 발견하였다. (Haemodynamics in microvascular complications in type 1 diabetes. Diabetes Metab Res Rev 2002; 18: 286-304.) 감소된 모세관 밀도는 비만과 연관되며, 단순한 체중 감소는 하기에 의해 나타난 바와 같이 모세관 밀도를 증가시킨다: A Philip et al. in "Effect of Weight Loss on Muscle Fiber Type, Fiber Size, Capilarity, and Succinate Dehydrogenase Activity in Humans. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism Vol. 84, No. 11 4185-4190, 1999.
연구자들은 일차 레이노 증후군 현상 (PRP)에서, 손톱주름 (nailfold) 모세관이 정상 대조군보다 더 부족하며 (약간), 전신 경화증 (SSc)으로 진행된 환자보다 더 풍부하다는 것을 보여왔다. M. Bukhari, Increased Nailfold Capillary Dimensions In Primary Raynaud's Phenomenon And Systemic Sclerosis. British Journal of Rheumatology, Vol. 24 No 35: 1127-1131, 1996. 이들은 모세관 밀도가 35 루프/mm2 (정상 대조군)로부터 33 (PRP), 17 (SSc)로 감소하였음을 확인하였다. 모세관 사지 간의 평균 거리는 대조군, PRP 및 SSc의 경우 각각 18μ, 18μ, 및 30μ였다.
어떤 측면에서, 신체가 "저산소증"을 감지하기 위해 일반적으로 사용하는 기전이 모세관 밀도를 조절하는 신체의 시스템에 영향을 미칠 수 있는 것으로 인식된다. 본 발명의 이러한 측면에 따르면, "저산소증"의 유의미한 요소는, O2 수준 감소에 의해서가 아니라, 오히려 NO 수준 증가에 의해 감지된다. 기저 NO 수준의 저하는 이러한 "저산소증" 감지를 방해하여, "저산소증"을 통해 조절된 많은 신체 기능에 영향을 미친다. 예를 들면, 빈혈은 "충분하지 않은 헤모글로빈"으로서 통상적으로 정의되고 충분하지 않은 헤모글로빈의 한 가지 결과는 "충분하지 않은 산소"로서 정의된 "저산소증"이다. 일부 측면에 따르면, 이러한 공통적인 정의는 일반적인 정의는 두 병태의 산화질소 매개된 측면을 설명하지 못한다.
휴식시, 급성 동량성 (isovolemic) 빈혈이 잘 용인된다. 적혈구용적률 (hematocrit)의 2/3 감소는 정맥 환류 (venous return) PvO2에게 최소한의 영향을 미치며, 신체 전반에 O2 긴장 또는 전달 중 어느 하나의 감소를 나타내지 않는다. Weiskopf et al. Human cardiovascular and metabolic response to acute, severe isovolemic anemia. JAMA 1998, vol 279, No. 3, 217-221. 50% 감소시 (140에서 70g Hb/L로), 평균 PvO2 (32 대상체에 대해)는 약 77%에서 약 74% (포화의)로 감소하였다. 혈액의 O2 수용력 감소는 63에서 85 bpm로 증가하는 심박수를 갖는 혈관확장 및 빈맥에 의해 보상된다. 상기 보상이 효과적이라는 점은 매우 명확하지만, 기전은 명확하지 않다. 전형적인 설명은 "저산소증" 센서가 "저산소증"을 검출하고 혈관확장 및 빈맥으로 보상되었다는 것이다. 그러나, 검출할 "저산소증"이 없었다. 적은 혐기성 호흡 및 적은 "저산소증"을 나타내는 0.77에서 0.62 mM/L로의 혈액 락테이트 (혐기성 호흡을 위한 마커)의 약간의 감소가 있었다. 정맥 환류 PvO2에서의 3% 감소는 300미터 고도를 올라감으로써 얻을 동일한 수준의 "저산소증"이다 (전형적으로 빈맥을 야기하지 않음). 그대로 유지하는 정맥 환류에서의 O2 농도, 및 그대로 유지하는 O2 소비로 인해, O2 농도의 감소가 존재하는 신체 내의 장소는 없다. 동량성 빈혈 중의 보상은 O2 감지 때문에 일어나지 않을 수 있다.
따라서 급성 동량성 빈혈에서 관찰되는 혈관확장은 혈관 벽에서 증가된 NO 농도때문일 수 있다. NO는 전단 응력 및 다른 인자에 대한 반응으로 혈관의 확장을 매개한다. NO 대사물의 수준 변화가 관찰되지 않을 것인데, 왜냐하면 NO의 생산 속도가 변화가 없고 계속 붕괴 속도와 동일하기 때문이다. metHb가 Hb와 마찬가지로 NO에 결합할 수 있기 때문에 metHb 치환을 이용한 "저산소" 보상이 없다는 관찰은 이해될 수 있으며, 따라서 Hb 회수와 같이, metHb 치환으로 NO 농도 증가가 없다.
산화질소는 많은 대사성 경로에서 역할을 한다. NO의 기전 수준이 긴장성 (tonal) 저해 반응을 발휘하고, 이러한 기저 수준의 감소가 상기 경로의 탈억제를 야기한다고 제안되어 왔다. Zanzinger 등은 NO가 기저 교감신경 긴장성을 억제하고 흥분성 반사를 약화시키는 것으로 나타났음을 보고하였다. (Inhibition of basal and reflex-mediated sympathetic activity in the RVLM by nitric oxide. Am. J. Physiol. 268 (Regulatory Integrative Comp. Physiol. 37): R958-R962, 1995.)
일부 측면에서, NO의 용적 공급원의 하나의 성분은 암모니아 산화 박테리아에 의해 외부 피부 상에서 생산된 NO로부터 적혈구가 없는 피부에서 생산된 저분자량 S-니트로소티올임이 인식된다. 이들 저분자량 S-니트로소티올은 장기간 안정하며, 혈장에서 자유롭게 확산하고순환할 수 있다. 다양한 효소는 다양한 S-니트로소티올로부터 NO를 절단하여 효소 부위에서 NO를 유리시킬 수 있다. 정상적인 생리학에서 파괴를 야기하는 것은 피부 상의 AOB로부터 NO의 이러한 용적 공급원의 손실이다. 모세관으로부터 멀리 떨어져 NO를 생성하기 위해 S-니트로소티올을 이용하는 신체의 이점은 O2가 S-니트로소티올로부터 NO 생산에 필요하지 않다는 것이다. 산화질소 합성효소 (NOS)로부터 NO의 생산은 O2를 필요로 하지 않는다. S-니트로소티올의 충분한 배경으로, NO는 무산소성 영역에서도 생성될 수 있다. NO는 또 다른 분자, 예컨대 시스테인 잔기의 티올 또는 헴의 철에 부착될 때에만 효과를 발휘하므로 자유 NO가 필요하지 않고, 따라서 NO의 효과는 S-니트로소티올 및 트랜스니트로소화 효소가 존재하면 자유 NO의 부재시에도 트랜스니트로소화 반응에 의해 매개될 수 있다.
Frank 등은 정상적인 상처 치유를 동반하는 혈관신생이 증가된 산화질소에 의해 유도된 상승된 VEGF에 의해 부분적으로 초래된다는 것을 보여왔다. (Nitric oxide triggers enhanced induction of vascular endothelial growth factor expression in cultured keratinocytes (HaCaT) and during cutaneous wound repair. FASEB J. 13, 2002-2014 (1999).)
NO는 암 발달에서 역할을 하며, 이는 본원에 기재된 박테리아가 암 치료 및 예방 방법에서 사용될 수 있음을 보여준다. 어떤 측면에 따르면, 저산소증 동안 NO의 존재는, 세포가 DNA를 복제하는데 있어 오류의 위험성이 더 클 때, 저산소 스트레스 하에 세포가 분열하는 것을 방지할 수 있다. 한 가지 관련된 세포 기능은 세포 주기의 조절이다. 이것은 세포가 DNA를 복제하고, 이를 염색체로 조립하고, 분열하는 방법 및 시기를 제어하는 조절 프로그램이다. 세포 주기의 조절은 매우 복잡하며, 완전히 이해되지 않고 있다. 그러나, 주기가 정지되고 분열이 멈추기 위한 조건이 개선될 때까지 주기가 정지되고 분열이 멈출 수 있는 세포 주기의 경로에 많은 포인트가 있음이 알려져 있다. p53 종양 억제제 단백질은 세포 주기의 조절에서 핵심 단백질이며, 그것은 DNA 손상을 포함하는 다양한 세포 스트레스 신호로부터 세포 정지 및 세포자멸사 모두를 개시하는 역할을 하고 p53은 하기에 의해 보고된 바와 같이 절반이 넘는 인감 암에서 돌연변이된다: Ashcroft et al. in "Stress Signals Utilize Multiple Pathways To Stabilize p53." (Molecular And Cellular Biology, May 2000, p. 3224-3233.) 저산소증은 p53의 축적을 개시하며, 하며, 저산소증이 세포 주기를 조절하는데 중요한 반면, 저산소증 단독은 p53 mRNA 효과기 단백질의 다운스트림 발현을 유도하지 못하며 따라서 세포 주기의 정지를 야기하지 못한다. Goda 등은 세포 정지의 저산소 유도가 저산소증-유도 인자-1 (HIF-1α)을 필요로 한다고 보고하였다. (Hypoxia-Inducible Factor 1α Is Essential for Cell Cycle Arrest during Hypoxia. Molecular And Cellular Biology, Jan. 2003, p. 359-369.) Britta 등은 NO가 HIF-1α에 대한 주요 자극 중 하나라고 보고하였다. ( Accumulation of HIF-1a under the influence of nitric oxide. Blood, 15 February 2001, Volume 97, Number 4.) 그에 반해, NO는 전사 활성 p53의 축적을 야기하며 세포 주기의 정지를 야기하고 세포자멸사를 야기한다. Wang et al., P53 Activation By Nitric Oxide Involves Down-Regulation Of Mdm2. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 277, No. 18, Issue Of May 3, Pp. 15697-15702, 2002.
본 발명의 어떤 측면에서, 세포의 저산소 사망을 야기하는 모세관 희박화를 예방함으로써 세포의 괴저성 사망을 예방하는 것이 자가면역 장애를 예방할 수 있는 것으로 인식된다. 세포가 만성적 저산소증에 노출될 때, 반응성 산소 종 (ROS)의 생산이 증가되고, 세포 대사성 기계에 그리고 궁극적으로 세포의 DNA에 대한 손상이 증가한다. 감소된 대사 능력은 수용력은 ROS로 인한 손상 및 외인성 발암원 노출로 인한 손상의 회복 능력을 감소시킬 것이다. 시간 경과에 따라, 손상은 축적되고 세 가지 사건의 가능성을 증가시킨다: 세포는 암의 암-예방 유전자의 결실을 겪을 것이고 세포는 암이 될 것이며, 세포는 괴사를 통해 사멸할 것이고, 또는 세포는 세포자멸사를 통해 사멸할 것이다. 세포가 괴사 또는 세포자멸사 중 어느 하나를 통해 사멸할 때, 세포 잔해는 상기 부위로부터 제거되어야 한다. 사멸 세포는 수지상 세포 및 대식세포를 포함하는 면역 세포에 의해 식균된다. 이들 세포가 신체를 식균할 때, 그것은 다양한 단백분해 효소에 의해 항원 단편으로 소화된 다음, 이들 항원은 주 조직적합 복합체 (MHC1, MHC2)에 부착되고 항원-MHC 복합체가 세포의 표면으로 이동하고, 여기서 그것은 T 세포와 상호작용하고 T 세포를 다양한 방식으로 활성화시킬 수 있다. 임의의 세포 손상은 다양한 방식으로 면역계를 자극하는 아쥬반트를 방출한다. 일반적으로, 괴사를 겪는 세포는 세포자멸사를 겪는 세포보다 더 큰 면역 반응을 자극한다. 따라서, 면역 세포가 사멸 세포 및 사멸하고 있는 세포에 만성적으로 노출되는 것은 자가면역 장애를 야기할 가능성이 있다.
어떤 측면에서, 낮은 기저 NO가 섬유성 비대를 야기하는 것으로 인식된다. 사멸 세포가 제거되면, 새로운 세포가 그 위치를 쉽게 차지할 수 없는데, 왜냐하면 상기 세포를 지원하는 O2가 충분하지 않기 때문이다. 임의의 그러한 새로운 세포는 동일한 운명을 당할 것이다. 상기 공간은 빈 상태를 유지할 수 있고, 이 경우에 장기는 수축하고, 모세관은 서로 가까워지며, 새로운 세포는 지금 사라지는 세포에 의해 예전에 생산된 VEGF를 박탈당하고, 따라서 모세관은 제거되고 저산소 구역이 개선된다. 이것은 환부 조직의 일반적인 수축을 야기할 수 있다. 섬유증을 지지하는 조직에서, 상대적으로 불활성인 콜라겐 섬유가 상기 공간을 채울 수 있다. 문제되는 특정한 장기에 대한 신체의 대사성 요구는 감소되지 않으므로, 장기는 더 크게, 하지만, 지금은 유의미한 섬유질 함량으로 성장하려고 시도할 수 있다. 이것은 섬유성 비대, 예컨대 심장 및 간의 섬유성 비대를 야기할 수 있다. 뇌와 같은 일부 장기는 신경 및 혈관의 3차원적 연결성이 중요하기 때문에 더 크게 또는 더 작게 성장할 수 없고, 계속해서 그리고 동시에 비대칭으로 수축하는 뇌에 연관될 수 없다. 상기 공간은 어떤 것으로 채워져야 하며, β-아밀로이드가 (그렇게 불활성이지 않음) 공간 충전제일수도 있다. 신장은 신장 캡슐 때문에 더 크게 성장할 수 없어서, 살아 있는 세포의 수가 더 적어지고 이들은 섬유성 조직으로 대체된다. 만약 사멸 세포가 제거되면, 조직은 수축하고, NO/O2의 비는 다시 낮아지며, 모세관은 다시 부족해진다. 이것은 말기 신장 질환, 울혈성 심장기능상실/심장 비대증, 원발성 담도성 간경변증, 알츠하이머병, 죽상경화증, 염증성 장 질환, 비대성 반흔 형성, 및 레이노 증후군 현상으로 시작하여 모세관 희박화가 또한 관찰되는 전신 경화증 및 일차 쇼그렌 증후군으로 끝나는 다중 결합 조직 질환의 악순환을 촉발시킬 수 있다. Ferrini 등은 L-NAME을 이용한 NOS의 만성적 저해를 통한 기저 NO 수준의 감소가 심장 및 신장의 일반화된 섬유증을 야기한다는 것을 보여왔다. (Antifibrotic Role of Inducible Nitric Oxide Synthase. Nitirc Oxide: Biology and Chemistry Vol. 6, No. 3, pp. 283-294 (2002).) 낮은 기저 NO가 섬유성 비대를 야기할지도 모른다.
어떤 측면에서, 모세관 희박화는 식욕을 제어하는 대상체의 능력에 영향을 미치는 것으로 인식된다. 모세관 희박화는 노인 및 동물의 뇌에서 관찰된다. 모세관 희박화는 성장 인자-1과 같은 인슐린을 포함하는 순환하는 성장 인자의 감소와 연관된다. 성인 뇌에서의 신경발생은 혈관신생과 조화를 이룬다. 뇌는 많은 항상성 기능을 조절하므로, 뇌의 요소를 조절하는 모세관 사이의 확산 길이 증가는 상기 종의 불충분한 혈액 농도로서 "해석될" 수 있을 것이다. 뇌에서 글루코오스의 유동은 정상적인 대사성 요구와 상당히 가까우며, 여기서 글루코오스 유동은 글루코오스 소비보다 단지 50 내지 75% 더 크고 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 글루코오스 수송체는 포화가능하고, 입체특이적이며, 에너지 또는 이온 구배에 독립적이다. 식욕 조절의 큰 부분은 뇌를 통해 매개되고, 모세관 희박화는 "영양소" (또는 "영양소"에 비례하는 마커 화합물)의 충분한 혈액 농도가 불충분한 것으로 해석되게 할 수 있다. 이것이 비만의 한 가지 원인일 수 있다.
어떤 측면에 따르면, 모세관 희박화는 비-인슐린 의존적 당뇨병의 원인일 수 있는 것으로 인식된다. 비-인슐린 의존적 당뇨병 (NIDDM)은 대사성 증후군 또는 2형 당뇨병으로도 공지되어 있으며, 인슐린 내성을 특징으로 한다. 인슐린에 대한 신체의 민감성은 감소되며, 인슐린 수준은 증가하고, NIDDM를 가진 사람은 높은 혈당, 높은 혈액 트리글리세라이드를 가지고, 전형적으로 비만이며, 고혈압이고, 전형적으로는 심각한 내장 지방을 갖는다.
다른 증상은 NIDDM을 동반하며, 이는 모세관 희박화를 원인으로서 지적할 수 있다. NIDDM를 갖는 그리고 갖지 않는, 비만인 (BMI 29) 및 마른 (BMI 24) 40명의 연구에서 (각각 10명), Konrad 등은 휴식시 혈액 락테이트 수준이 NIDDM이 없는 마른 남자, NIDDM이 없는 비만인 남자, NIDDM를 갖는 마른 남자, NIDDM를 갖는 비만인 남자의 경우 각각 1.78, 2.26, 2.42, 및 2.76 (mM/L)이었음을 보고한다. (A-Lipoic acid treatment decreases serum lactate and pyruvate concentrations and improves glucose effectiveness in lean and obese patients with type 2 diabetes. Diabetes Care 22:280-287, 1999.) 락테이트는 혐기성 당분해의 척도이다. O2가 산화적 인산화를 통해 ATP를 생성하는데 불충분한 경우, 세포는 혐기성 당분해를 통해 ATP를 생산할 수 있다. 혐기성 당분해의 생성물 중 하나는 락테이트이며, 이는 세포로부터 배출되어야 하며, 그렇지 않으면 pH가 내려가고 기능이 저하된다. 혈액 락테이트는 운동 연구에서 통상적으로 측정되며, 여기서 증가는 최대 산화적 작업이 수행될 수 있는 작업 부하를 가리킨다. 휴식시 락테이트의 더 높은 수준은 휴식시 증가된 혐기성 당분해를 가리킬 것이며, 이는 모세관 희박화와 일치한다.
원발성 담도성 간경변증은 레이노 증후군 현상, 가려움증, 시카 증후군, 골다공증, 관문 고혈압, 신경병증, 및 췌장 결손과 연관되고, 간 비정상은 류마티스성 질환과 연관된다. 상승된 간 효소는 간 염증의 증상이며, 상승된 간 효소는 "무증상" 원발성 담도성 간경변증의 조기 증상으로서 관찰된다. 따라서, 본원에 기재된 박테리아는 간 염증을 치료하는데 사용될 수 있다.
Torre 등은 알츠하이머병 (AD)가 불충분한 산화질소로부터 일부 비롯되는, 저관류에 부수적인 신경적 변성을 갖는 미세혈관 장애라고 보고하였다. (검토: Evidence that Alzheimer's disease is a microvascular disorder: the role of constitutive nitric oxide, Brain Research Reviews 34 (2000) 119-136.) 따라서, 본원에 기재된 박테리아는 AD를 치료하는데 사용될 수 있다.
고혈압과 연관된 부정적인 건강 효과는 또한 낮은 기저 NO의 결과일 수 있다. 혈관확장에 대한 감소된 반응은 또한 낮은 기저 NO와 일치한다. NO는 공급원으로부터 그것이 신호전달 효과를 갖는 센서 부위로 확산하는 확산형 분자이다. 낮은 NO 수준에서, 모든 NO 공급원은 어떤 거리로 떨어져 어떤 세기의 동등한 NO 신호를 생성하기 위해 더 NO를 생산해야 한다. NO는 3차원으로 확산하고 상기 확산 범위 내의 전체 용적은 센서 위치에서 적절한 신호를 제공할 수준으로 상승되어야 한다. 이것은 공급원에서 그리고 상기 공급원 및 상기 센서 사이에서 더 높은 NO 수준을 야기할 수 있다. 그리고 나서, 공급원 근처에서 상승된 NO의 부정적인 국소 효과가 너무 낮은 NO 배경으로부터 일어날 수 있다. 이러한 시나리오 실제 일어난다는 증거가 있다. 랫트 췌장 소도에서, Henningsson 등은 L-NAME을 이용한 NOS의 저해가 iNOS의 유도를 통해 총 NO 생산을 증가시킨다고 보고하였다 (Chronic blockade of NO synthase paradoxically increases islet NO production and modulates islet hormone release. Am J Physiol Endocrinol Metab 279: E95-E107, 2000.) NOS 활성을 증가시킴으로써 NO를 증가시키는 것은 일부 제한적으로만 작동할 것이다. NOS는 활성화되지만 충분한 비스테트라하이드로바이오프테린 (BH4) 또는 L-아르기닌이 공급되지 않는 경우, 그것은 "미커플링"되고 NO 대신에 수퍼옥사이드 (O2-)를 생성한다. 이후에 이 O2 -는 NO를 파괴할 수 있다. BH4 또는 L-아르기닌의 공급을 초과하는 수준으로 NO를 생산하고자 하는 시도는 대신에 NO 수준을 감소시킬 수 있다. 이것은 낮은 NO 수준이 NOS의 자극에 의해 더 악화되는 경우 양성 피드백을 야기할 수 있고, 미커플링된 NOS는 유의미한 O2 -를 생성하고, 이는 죽상경화증, 말기 신장 질환, 알츠하이머병, 및 당뇨병에서 관찰되는 것과 같은, 국소적인 반응성 산소 종 (ROS) 손상을 야기한다.
본원에 기재된 박테리아는 또한 노화의 징후를 지연시키는데 사용될 수 있다. 칼로리 제한은 수명을 연장시키며, Holloszy는 음식 섭취를 무제한 제어의 70%까지 제한하는 것이 주로 앉아 지내는 랫트의 수명을 858 내지 1,051 일, 거의 25% 연장시킨다고 보고하였다. (Mortality rate and longevity of food restricted exercising male rats: a reevaluation. J. Appl. Physiol. 82(2): 399-403, 1997.) 칼로리 제한과 연장된 수명 간의 연관성은 잘 확립되어 있지만, 인과관계 기전은 그렇지 못하다. Lopez-Torres 등은 랫트에서 간 미토콘드리아 효소의 조사가 칼로리 제한과 연관된 감소된 복합체 I 활성으로 인한 H2O2 생산의 감소를 보여준다고 보고하였다. (Influence Of Aging And Long-Term Caloric Restriction On Oxygen Radical Generation And Oxidative DNA Damage In Rat Liver Mitochondria. Free Radical Biology & Medicine Vol. 32 No 9 pp882-8899, 2002.) H2O2는 호흡 동안 미토콘드리아에 의해 생산된 주요 ROS인 O2 -의 불변화 (dismutation)에 의해 생산된다. O2 -의 주요 공급원이 석시네이트 환원 부위인 복합체 III로부터의 전자의 역 유동에 의해 NAD/NADH 산화환원 쌍을 촉매하는 복합체 I이라는 것이 Kushareva 등에 의해 제안되었다. Beckman에 의해 제안된 노화의 자유 라디칼 이론은 세포 DNA, 항산화제 시스템 및 DNA 치유 시스템에 대한 자유 라디칼 손상이 나이가 들어감에 따라 축적되고 중요 시스템이 회복할 수 없을 정도로 손상되는 경우, 사망이 뛰다른다고 주장한다. (The Free Radical Theory of Aging Matures. Physiol. Rev. 78: 547- 581, 1998.)
추가 기전으로서, NO는 텔로머라제를 활성화시키고 내피 세포의 노화를 지연시킨다는 것이 Vasa 등에 의해 입증되었다. (Nitric Oxide Activates Telomerase and Delays Endothelial Cell Senescence. Circ Res. 2000;87:540-542.) 낮은 기저 NO는 사이토크롬 옥시다제의 탈억제에 의해 기초대사율을 증가시킬 것이다. 증가된 기초 대사는 또한 세포 회전주기 및 성장 속도를 증가시킬 것이다. 만성적 저산소증의 유도에 의한 모세관 희박화는 자유 라디칼 손상을 증가시킬 수 있고 또한 세포 회전주기를 증가시켜, 두 가지 기전에 의해 노화를 가속화할 수 있다.
일부 측면에서, 독립영양 암모니아-산화 박테리아는 알러지 및 자가면역 장애에 대해 보호 양상을 야기할 수 있는 것으로 인식된다. 가장 잘 공지된 자가면역 질환은 아마 1형 당뇨병이며, 이는 면역계에 의한 췌장내 인슐린 생산 세포의 파괴로부터 비롯된다. 습관성 유산은 또한 자가면역 장애와 연관되며, 여기서 양성 자가면역 항체의 수는 습관성 유산의 수와 양의 상관관계가 있었다. 전신 경화증, 원발성 담도성 간경변증, 자가면역 간염, 및 다양한 류마티스성 장애는 자가면역 장애의 다른 예이다. AOB의 적용은 WO/2005/030147호에 기재된 바와 같이, 알러지, 고초열을 감소시키는 것으로 관찰되었다.
AOB가 알러지 및 자가면역 장애에 대해 그의 보호 효과를 발휘할 수 있는 한 가지 기전은 산화질소의 생산을 통해, 주로 NF-κB의 조절 저해 및 면역 세포의 활성화 및 염증성 반응의 유도의 예방을 통해서이다. NF-κB는 유전자 발현을 상향조절하는 전사 인자이며 많은 이들 유전자는 사이토카인, 케모카인, 및 다양한 부착 인자의 방출을 야기하는 유전자를 포함하는 염증 및 면역 반응과 연관된다. 이들 다양한 면역 인자는 면역 세포를 그의 방출 부위로 이동시켜 염증 반응을 야기한다. 항시적 NO 생산은 IκBα 분해를 방지하여 IκBα (NF-κB의 저해제)를 안정화시킴으로써 NF-κB를 억제하는 것으로 나타났다.
NO 공여체의 투여는 랫트에서 실험적인 알러지성 뇌척수염의 발달을 예방하는 것으로 Xu 등에 의해 나타났다. (SIN-1, a Nitric Oxide Donor, Ameliorates Experimental Allergic Encephalomyelitis in Lewis Rats in the Incipient Phase: The Importance of the Time Window. The Journal of Immunology, 2001, 166: 5810-5816.) 이러한 연구에서, NO 공여체의 투여가 대식세포의 중추신경계 내로의 침윤을 감소시켰고, 혈액 단핵 세포의 증식을 감소시켰으며, 혈액 단핵 세포의 세포자멸사를 증가시켰음이 입증되었다. 이들 결과 모두는 유도된 자가면역 반응의 정도 및 중증도를 감소시킬 것으로 기대된다.
낮은 기저 NO는 뇌 내의 새로운 연결이 불충분한 기저 산화질소의 결과로서 불충분하게 형성된다는 기전을 통해 자폐증을 야기할 수 있다. 이론에 구속되기를 바라진 않지만, 일부 구현예에서, 신경 연결의 형성은 NO에 의해 조절된다. 이들 경우에, NO 확산 범위를 낮추는 임의의 조건은 연결을 겪을 수 있는 뇌 요소의 용적 크기를 감소시킬 수 있다. 낮은 기저 NO 수준의 조건 하에 발달된 뇌는 NO의 감소된 효과적인 범위 때문에 더 작은 용적으로 준비될 수 있다.
자폐성 개인에서 나타난 추가의 증상은 또한 낮은 NO를 원인으로서 지적할 수 있으며, 이는 증가된 음조 식별, 소화관 장애, 면역계 기능이상, 감소된 뇌 혈류, 뇌의 증가된 글루코오스 소비, 증가된 혈장 락테이트, 부착 장애, 및 콧노래 (humming)를 포함한다. 이들 각각의 증상은 낮은 기저 NO 수준에 기인할 수 있다.
Takashi Onnishi 등은 자폐성 개인이 감소된 혈류를 나타낸다고 보고하였다. Takashi Ohnishi et al., Abnormal regional cerebral blood flow in childhood autism. Brain (2000), 123, 1838-1844. J.M. Rumsey 등은 자폐성 개인이 증가된 글루코스 소비를 갖는다고 보고하였다. Rumsey JM, Duara R, Grady C, Rapoport JL, Margolin RA, Rapoport SI, Cutler NR. Brain metabolism in autism. Resting cerebral glucose utilization rates as measured with positron emission tomography. Arch Gen Psychiatry, 1985 May;42(5):448-55 (abstract). D.C. Chugani는 자폐성 개인이 증가된 혈장 락테이트 수준을 갖는다고 보고하였다. Chugani DC, et al., Evidence of altered energy metabolism in autistic children. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 1999 May;23(4):635-41. 이들 효과의 발생은 뇌에서의 모세관 희박화의 결과일 수 있으며, 이는 혈류 및 O2 공급을 감소시킬 수 있고, 이로써, 뇌의 대사성 부하의 일부가 산화적 인산화 대신에 당분해를 통해 생산될 수 있다.
산화질소는 B. A. Klyachko 등에 의해 이온 통로의 cGMP 변형을 통해 초분극화 후 증가함으로써 뉴런의 흥분성을 증가시키는 것으로 입증되었다. Vitaly A. Klyachko et al., cGMP-mediated facilitation in nerve terminals by enhancement of the spike after hyperpolarization. Neuron, Vol. 31, 1015-1025, September 27, 2001. C. Sandie 등는 NOS의 저해가 놀라는 것을 감소시킨다는 것을 보여왔다. Carmen Sandi et al., Decreased spontaneous motor activity and startle response in nitric oxide synthase inhibitor-treated rats. European journal of pharmacology 277 (1995) 89-97. 주의력 결핍 과잉행동 장애 (ADHD)는 자발적 고혈압 랫트 (SHR) 및 나폴리 고-흥분성 (NHE) 랫트를 이용하여 모델화되었다. 이들 모델 모두는 급성 NOS 저해의 기간 동안 증가된 주의력 결핍을 나타내는 것으로 Raffaele Aspide 등에 의해 나타났다. Raffaele Aspide et al., Non-selective attention and nitric oxide in putative animal models of attention-deficit hyperactivity disorder. Behavioral Brain Research 95 (1998) 123-133. 따라서, 본원의 박테리아는 ADHD의 치료에 사용될 수 있다.
NOS의 저해는 또한 하기에 의해 나타났다: M. R. Dzoljic to inhibit sleep. M. R. Dzoljic, R. de Vries, R. van Leeuwen. Sleep and nitric oxide: effects of 7-nitro indazole, inhibitor of brain nitric oxide synthase. Brain Research 718 (1996) 145-150. G. Zoccoli는 급속한 안구 운동 및 뇌 순환에서의 수면 각성 차이를 포함하는, 수면 중에 관찰된 많은 생리적 효과가 NOS가 저해될 때 변경된다고 보고하였다. G. Zoccoli, et al., Nitric oxide inhibition abolishes sleep-wake differences in cerebral circulation. Am. J. Physiol. Heart Circ Physiol 280: H2598-2606, 2001. NO 공여체는 L. Kapas 등에 의해 비-REM 수면을 촉진하나, 이들은 NO 공여체의 지속시간보다 훨씬 더 길게 지속적으로 증가하며, 이는 아마도 반동 효과를 제안한다는 것을 보여왔다. Levente Kapas et al.. Nitric oxide donors SIN-1 and SNAP promote nonrapid-eye-movement sleep in rats. Brain Research Bullitin, vol 41, No 5, pp. 293-298, 1996. M. Rosaria et al., Central NO facilitates both penile erection and yawning. Maria Rosaria Melis and Antonio Argiolas. Role of central nitric oxide in the control of penile erection and yawning. Prog Neuro-Psychopharmacol & Biol. Phychiat. 1997, vol 21, pp 899-922. P. Tani 등은 불면증이 아스퍼거 (Asperger)를 갖는 성인에서 빈번하게 발견된다고 보고하였다. Pekka Tani et al., Insomnia is a frequent finding in adults with Asperger's syndrome. BMC Psychiatry 2003, 3:12. Y. Hoshino는 또한 자폐성 소아에서 수면 장애를 관찰하였다. Hoshino Y, Watanabe H, Yashima Y, Kaneko M, Kumashiro H. An investigation on sleep disturbance of autistic children. Folia Psychiatr Neurol Jpn. 1984;38(1):45-51. (요약) K.A. Schreck 등은 수면 장애의 중증도가 자폐성 증상의 중증도와 상관관계가 있음을 관찰하였다. Schreck KA, et al., Sleep problems as possible predictors of intensified symptoms of autism. Res Dev Disabil. 2004 Jan-Feb;25(1):57-66. (요약). 따라서, 본원의 박테리아는 불면증의 치료에서 사용될 수 있다.
W. D. Ratnasooriya 등은 수컷 랫트에서 NOS의 저해가 성교전 활동을 감소시키고, 성욕을 감소시키고, 생식능력을 감소시킨다고 보고하였다. W. D. Ratnasooriya et al., Reduction in libido and fertility of male rats by administration of the nitric oxide (NO) synthase inhibitor N-nitro-L-arginine methyl ester. International journal of andrology, 23: 187-191 (2000).
ATP 고갈 및 최종적인 장기 부전을 특징으로 하는, 수많은 외견상의 디스파테이트 장애는 실제로는 기저 산화질소에서의 전면적인 결핍에 의해 야기된, 니트로감소증 (nitropenia)에 의해 야기될지도 모른다. 이것이 심장에서 일어나는 경우, 결과는 확장성 심근병증이다. 이것이 뇌에서 일어나는 경우, 결과는 백질 과집중 (white matter hyperintensity), 알츠하이머, 혈관 우울증, 혈관 치매, 파킨슨, 및 루이체 치매이다. 이것이 신장에서 일어나는 경우, 결과는 말기 신장 질환이며, 이것이 간에서 일어나는 경우, 결과는 원발성 담도성 간경변증이다. 이것이 근육에서 일어나는 경우, 결과는 섬유근통증후군, 걸프전 증후군, 또는 만성적 피로 증후군이다. 이것이 창자에서 일어나는 경우, 결과는 허혈성 장 질환이다. 이것이 췌장에서 일어나는 경우, 결과는 먼저 2형 당뇨병 다음으로, 췌장의 만성적 염증 다음으로, 췌장의 자가면역 공격 (또는 췌장암) 다음으로, 1형 당뇨병이다. 이것이 결합 조직에서 일어나는 경우, 결과는 전신 경화증이다.
말기 신장 질환의 나머지 신장 모델에서, 신장의 일부가 제거되며, (수술로 또는 독소로), 이는 나머지에 대해 대사성 부하를 증가시킨다. 수퍼옥사이드가 생성되어 NO를 감소시키고 신장 미토콘드리아로의 O2 확산을 증가시킨다. 만성적 과부하는 진행성 신장 모세관 희박화 및 진행성 신부전을 야기한다. 급성 신부전에서, 사람을 투석시키는 것은 신장에게 "휴식"을 제공할 수 있고, 그것이 회복되게 한다. 횡문근변성 (미오글로빈을 혈류 내로 방출하는 근육 손상)에 의해 유도된 급성 신부전에서, 신장 손상은 허혈성 손상을 특징으로 한다. 미오글로빈은 헤모글로빈과 마찬가지로 NO를 제거하며, 신장에서 혈관수축을 유발하여 허혈을 야기할 것이다. 미오글로빈은 또한 국소적인 니트로감소증 및 추가적인 ATP 고갈을 야기하는 사건의 캐스케이드를 유도할 것이다.
일부 측면에서, 낮은 NO 수준은 감소된 미토콘드리아 생체내 합성을 야기한다. 감소된 미토콘드리아 밀도에서 동일한 ATP를 생산하는 것은 O2 소비, 또는 가속화된 기초대사율의 증가를 야기할 것이다. 가속화된 기초대사율은 하기를 포함하는 수많은 조건에서 관찰된다: 겸상 적혈구 빈혈, 울혈성 심장기능상실, 당뇨병, 간경변증, 크론병, 근위축 측삭 경화증, 비만, 말기 신장 질환, 알츠하이머, 및 만성적 폐쇄성 폐 질환.
일부 증가된 O2 소비가 생산적으로 사용될 수도 있음에도 불구하고, 많은 이들 조건에서 미커플링 단백질은 또한 상향조절되며, 이는 증가된 대사율 중 적어도 일부가 비효율 때문이라는 것을 보여준다. 미커플링 단백질이 상향조절되는 것으로 공지된 병태는 비만 및 당뇨병을 포함한다.
더 적은 O2 농도까지 O2를 소비하는 더 적은 미토콘드리아로 인해, O2 확산을 구동시키는 O2 구배는 더 커서, O2 확산 경로 길이는 증가하여 모세관 희박화를 야기할 수 있고, 이는 확장성 심근병증, 고혈압, 2형 당뇨병, 및 신장 고혈압에서 관찰된다.
Cu2+로서 또는 세룰로플라스민 (CP)으로서 구리 (성인 혈청에서 0.38 g/L으로 존재하며 0.32% Cu이고 94%의 혈청 구리를 함유하는 주요 Cu 함유 혈청 단백질)는 NO 및 티올 함유 그룹 (RSH)으로부터 S-NO-티올의 형성을 촉매한다. 혈장의 Cu 함량은 가변적이며 감염의 조건하에 증가된다. Berger 등은 화상 삼출물의 Cu 및 Zn 함량이 1/3의 이들의 화상된 피부를 가진환자와 대등하며, 7일 내에 정상적인 신체 Cu의 20 내지 40% 및 Zn 함량의 5 내지 10%를 잃는다고 보고하였다. (Cutaneous copper and zinc losses in burns. Burns. 1992 Oct;18(5):373-80.) 만약 환자 피부에 AOB가 대량서식하면, AOB가 필요로 하는 우레아 및 Fe, Cu, 및 Zn을 함유하는 상처 삼출물은 NO 및 니트라이트로 전환되어, 대사작용으로 장애가 있는 상처에서 자원 (예컨대 O2 및 L-아르기닌)을 소비하지 않고, iNOS에 의해 NO의 국소 생산을 크게 보충할 것이다. 상처의 표면 상에서 AOB에 의한 NO 및 니트라이트의 높은 생산은, 특히 테타누스독소증, 가스 괴저병, 및 보툴리눔독소증을 야기하는 클로스트리듐과 같은 혐기성 박테리아에 의해 감염을 억제할 것으로 기대될 것이다.
본 발명의 실시는, 달리 명시되지 않는 한, 본 기술분야에 속하는 면역학, 분자 생물학, 및 재조합 DNA 기법의 종래의 방법을 이용할 수 있다. 그러한 기술은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들면, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Current Edition); and Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., current edition)을 참고한다.
8. N. 유트로파 로부터의 핵산 및 단백질
본 개시내용은, 다른 것들 중에서, 균주 D23에서 발견된 것과 동일 또는 유사한 단백질 및 핵산 (임의로, 단리된 단백질 및 핵산)을 제공한다. 이론에 의해 구속되기를 바라지 않지만, D23의 서열분석된 균주는 실험실에서 배양 및 선택의 확장된 기간으로 인한 비-천연 발생 단백질 및 핵산 서열을 갖는 것으로 믿는다.
이들 핵산 및 단백질은 수많은 용도를 갖는다. 예를 들면, 단백질은 균주 D23 또는 관련된 균주를 검출하는 항체 또는 다른 결합 분자를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 단백질이 높은-NH4 + 조건 하에서 반응을 수행하기 위해 또한 사용될 수 있는 것은, D23이 이들 조건 하에서 성장 및 대사에 적응되기 때문이다. 또 다른 예로서, 핵산은 항체를 생성하거나 상기에서 기재된 바와 같은 반응을 수행하기 위해 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 핵산은 마이크로어레이 또는 또 다른 하이브리드화-기반 검정을 사용하여 균주 D23 또는 관련된 균주, 예를 들면를 검출하기 위해 또한 사용될 수 있다.
균주 D23의 게놈은 서열식별번호:1로서 제공된다. 게놈 주석 (서열식별번호:1 내의 유전자의 위치 및 방향 포함)은 보충의 표 1에서 제공된다. 따라서, 본 개시내용은 유전자, 및 보충의 표 1에서 열거된 유전자와 동일 또는 유사한 단백질을 제공한다.
따라서, 본 개시내용은 보충의 표 1의 유전자의 서열을 포함하는 핵산 (예를 들면, 단리된 핵산), 뿐만 아니라 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 제공한다. 특정 구현예에서, 핵산은 보충의 표 1의 유전자, 또는 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질과 유사한 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 포함한다. 본 개시내용은 또한, 보충의 표1의 서열 , 그것과 유사한 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 또는 서열의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 100, 200, 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 또는 모두인 핵산, 또는 상기 핵산에 의해 인코딩된 하나 이상의 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 핵산 및 단백질의 단편이 또한 제공된다.
본 개시내용은 또한, 특히, 균주 D23에서 존재하고 균주 C91, 또는 유전자 또는 상기 유전자 또는 단백질 중 하나와 유사한 단백질에 부재한 하나 이상의 유전자 또는 단백질을 제공한다. 이들 유전자의 예는 도 6 내지 8에서 준비되어 있고 본 명세서의실시예 4에서 더 상세히 기재되어 있다. 이들 유전자 및 단백질, 뿐만 아니라 그것과 유사한 유전자 및 단백질의 예는 아래에 기재되어 있다.
따라서, 도 6에 대해, 본원은 도 6의 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 또는 모두와 동일한 또는 유사한 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 핵산을 개시한다. 본원은 또한 도 6에서 열거된 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 또는 모두와 동일한 또는 유사한 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 단백질을 개시한다. 더욱이, 본원은 이들 유전자 및 단백질의 단편, 예를 들면, 0-20, 20-50, 50-100, 100-200, 200-500, 500-1000, 또는 1000 초과 개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 단편을 개시한다. 일부 구현예에서, 복수의 상기-언급된 유전자 또는 단백질은 고형 지지체, 예를 들면,에 부착되어 마이크로어레이를 형성한다.
도 7에 대해, 본원은 도 7의 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 또는 모두와 동일한 또는 유사한 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 핵산을 개시한다. 본원은 또한 도 7에서 열거된 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 또는 모두와 동일한 또는 유사한 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 단백질을 개시한다. 더욱이, 본원은 이들 유전자 및 단백질의 단편, 예를 들면, 0-20, 20-50, 50-100, 100-200, 200-500, 500-1000, 또는 1000 초과 개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 단편을 개시한다. 일부 구현예에서, 복수의 상기-언급된 유전자 또는 단백질은 고형 지지체, 예를 들면,에 부착되어 마이크로어레이를 형성한다.
도 8에 대해, 본원은 도 8의 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 또는 모두와 동일한 또는 유사한 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 핵산을 개시한다. 본원은 또한 도 8에서 열거된 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 또는 모두와 동일한 또는 유사한 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 단백질을 개시한다. 더욱이, 본원은 이들 유전자 및 단백질의 단편, 예를 들면, 0-20, 20-50, 50-100, 100-200, 200-500, 500-1000, 또는 1000 초과 개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 단편을 개시한다. 일부 구현예에서, 복수의 상기-언급된 유전자 또는 단백질은 고형 지지체, 예를 들면,에 부착되어 마이크로어레이를 형성한다.
종합적으로 도 6 내지 8에 대해, 본원은 도 6 내지 8의 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 또는 모두와 동일한 또는 유사한 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 핵산을 개시한다. 본원은 도 6 내지 8에서 열거된 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 또는 모두와 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 동일 또는 유사한 단백질을 개시한다. 더욱이, 본원은 이들 유전자 및 단백질의 단편, 예를 들면, 1-20, 20-50, 50-100, 100-200, 200-500, 500-1000, 또는 1000 초과 개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의단편을 개시한다. 일부 구현예에서, 복수의 상기-언급된 유전자 또는 단백질은 고형 지지체, 예를 들면,에 부착되어 마이크로어레이를 형성한다.
본 개시내용은 또한, 서열식별번호:1의 단편인 핵산 서열을 제공한다. 단편은, 예를 들면, 그 길이가 1-20, 20-50, 50-100, 100-200, 200-500, 500-1000, 1,000-2,000, 2,000-5,000, 또는 10,000개 이상의 뉴클레오타이드일 수 있다. 단편은 또한 서열식별번호: 1 또는 그것의 보체의 상응하는 부분에 대해 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.5% 동일성일 수 있다. 단편은 또한 서열식별번호: 1와 혼성화될 단편일 수 있거나, 또는 ATCC 특허 수탁기관에 수탁된 D23 균주의 게놈 (2014년 4월 8일, 수탁 번호 PTA-121157 하에서 ATCC에 의해 AOB D23-100로 지정됨), 또는 그것의 보체 하에서, 낮은 엄중, 배지 엄중, 높은 엄중, 또는 매우 높은 엄중, 또는 본 명세서에서 기재된 다른 하이브리드화 조건 하에서.
본 개시내용은 또한, (암모니아 대사에 관여된 유전자를 기재하는) 표 1에서 제시된 핵산 서열을 제공한다. 따라서, 일부 측면에서, 본원은 표 1의 유전자의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 모두와 동일한 또는 유사한 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 97.5%, 98%, 98.2%, 98.4%, 98.6%, 98.8%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한) 유전자를 개시한다. 구현예에서, 본원은 표 1에서의 단백질의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 모두에 대해 동일 또는 유사한 단백질을 개시한다 (예를 들면, 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 97.5%, 98%, 98.2%, 98.4%, 98.6%, 98.8%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일함).
표 1의 핵산 서열의 정렬은 C91과 D23에서의 동족체들 간의 % 동일성을 보여준다. 하기 단락은 이러한 퍼센트 동일성을 논의하고 표 1의 D23 유전자에 대한 상동성을 갖는 다양한 핵산을 기재한다.
더 구체적으로, amoA1 유전자는 (즉, 821/831 위치에서) 약 98.8% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, amoA1 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, amoA1 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, amoA1 핵산은 D23 amoA1 유전자 와 적어도 약 98.8%, 98.9%, 99.0%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
amoA2 유전자는 (즉, 821/831 위치에서) 약 98.8% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, amoA2 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, amoA2 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, amoA2 핵산은 D23 amoA2 유전자 와 적어도 약 98.8%, 98.9%, 99.0%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
amoB1 유전자는 (즉, 1255/1266 위치에서) 약 99.1% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, amoB1 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, amoB1 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, amoB1 핵산은 D23 amoB1 유전자 와 적어도 약 99.1%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
amoB2 유전자는 (즉, 1254/1266 위치에서) 약 99.1% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, amoB2 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, amoB2 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, amoB2 핵산은 D23 amoB2 유전자와 적어도 약 99.1%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
amoC1 유전자는 (즉, 814/816 위치에서) 약 99.8% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, amoC1 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, amoC1 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, amoC1 핵산은 D23 amoC1 유전자 와 적어도 약 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
amoC2 유전자는 (즉, 814/816 위치에서) 약 99.8% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, amoC2 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, amoC2 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, amoC2 핵산은 D23 amoC2 유전자 와 적어도 약 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
amoC3 유전자는 (즉, 816/825 위치에서) 약 98.9% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, amoC3 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, amoC3 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, amoC3 핵산은 D23 amoC3 유전자 와 적어도 약 98.9%, 99.0%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
hao1 유전자는 (즉, 1696/1713 위치에서) 약 99.0% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, hao1 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, hao1 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, hao1 핵산은 D23 hao1 유전자 와 적어도 약 99.0%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
hao2 유전자는 (즉, 1702/1713 위치에서) 약 99.4% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, hao2 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, hao2 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, hao2 핵산은 D23 hao2 유전자 와 적어도 약 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
hao3 유전자는 (즉, 1700/1713 위치에서) 약 99.2% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, hao3 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, hao3 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, hao3 핵산은 D23 hao3 유전자와 적어도 약 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
cycA1 유전자는 (즉, 694/708 위치에서) 약 98.0% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, cycA1 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, cycA1 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, cycA1 핵산은 D23 cycA1 유전자 와 적어도 약 98.0%, 98.2%, 98.4%, 98.6%, 98.8%, 99.0%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
cycA2 유전자는 (즉, 699/708 위치에서) 약 98.7% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, cycA2 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, cycA2 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, cycA2 핵산은 D23 cycA2 유전자 와 적어도 약 98.7%, 98.8%, 99.0%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
cycA3 유전자는 (즉, 703/708 위치에서) 약 99.3% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, cycA3 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, cycA3 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, cycA3 핵산은 D23 cycA3 유전자와 적어도 약 99.3%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
cycB1 유전자는 (즉, 696/720 위치에서) 약 96.7% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, cycB1 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, cycB1 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, cycB1 핵산은 D23 cycB1 유전자와 적어도 약 96.7%, 96.8%, 97.0%, 97.2%, 97.4%, 97.6%, 97.8%, 98.0%, 98.2%, 98.4%, 98.4%, 98.6%, 98.8%, 99.0%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
cycB2 유전자는 (즉, 702/723 위치에서) 약 97.1% 동일하다. 따라서, 일부 구현예에서, cycB2 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, cycB2 핵산은 균주 C91과 D23 사이의 이러한 유전자가 다른 위치의 많아야 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 모두에서 D23 뉴클레오타이드를 포함한다. 구현예에서, cycB2 핵산은 D23 cycB2 유전자와 적어도 약 97.1%, 97.2%, 97.4%, 97.6%, 97.8%, 98.0%, 98.2%, 98.4%, 98.4%, 98.6%, 98.8%, 99.0%, 99.2%, 99.4%, 99.6%, 99.8%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
본 명세서에서 기재된 뉴클레오타이드 서열를 포함하는 벡터가 본 명세서에서 추가로 제공된다. 일부 구현예에서, 본 벡터는 본 명세서에서 기재된 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함한다. 벡터는, 비제한적으로, 바이러스, 플라스미드, 코스미드, 람다 파아지 또는 효모 인공 염색체 (YAC)을 포함한다. 그와 같은 벡터는 프로모터, 인트론이 있거나 없는 열린 해독틀, 및 종료 신호를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 바와 같은 핵산, 또는 본원에 기재된 바와 같은 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주세포를 제공한다.
특정 구현예에서, 숙주세포는 발현 카세트을 사용하여 유전적으로 조작된다. 어구 "발현 카세트"는 그와 같은 서열과 양립가능한 숙주에서 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 그와 같은 카세트는 프로모터, 인트론이 있거나 없는 열린 해독틀, 및 종료 신호를 포함할 수 있다. 발현을 가져오는데 필요하거나 도움이 되는 추가의 인자가 또한 사용될 수 있고,그 예는 유도성 프로모터이다.
본 개시내용은 또한, 본 명세서에서 기재된 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다
세포는, 비제한적으로, 진핵 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포, 또는 인간 세포일 수 있다. 세포가 박테리아 세포이면, 예를 들면 하기일 수 있다: E. 콜리 또는 암모니아-산화 박테리움 예컨대 니트로소모나스 (예를 들면, N. 유트로파 또는 N. 유로파에아), 니트로소코쿠스, 니트로소스피라, 니트로소사이스티스, 니트로솔로부스, 및 니트로소비브리오.
9. 암모니아 산화 박테리아에 의한 피부 미생물군집의 조정
본 개시내용은 피부 미생물군집, 예를 들면, 인간 피부 미생물군집을 변화시키는 시스템 및 방법을 제공한다. 상기 시스템 및 방법은 e.g 피부와 관련된 감염 또는 병태, 예를 들면, 피부 감염 및/또는 피부 병태의 치료를 제공한다.
니트로소모나스 속의 암모니아-산화 박테리아 (AOB)는 에너지 공급원으로서 암모니아로부터 배타적으로 니트라이트 및 산화질소를 생성하는 독특한 수용력을 갖는 그램-음성 무조건 자가영양 박테리아이다. 토양 및 물 환경 모두에서 존재하고 환경적인 질산화 과정의 필수적인 성분이다. 몇 개의 생리적 기능, 예컨대 혈관확장, 피부 염증 및 상처 치유의 중요한 성분으로서 인간 피부에 대한 니트라이트 및 산화질소의 역할로 인해, 이들 박테리아는 건강한 및 면역병리적 피부 병태 둘 모두에 대한 유익할 특성을 가질 수 있다. 이들 박테리아가 인간에게 사용하기에 안전할 수 있는 것은, 성장이 느리고, 유기 탄소 공급원 상에서 성장할 수 없고, 비누 및 항생제에 민감할 수 있고, 동물 또는 인간에서 임의의 질환 또는 감염관 결코 관련되지 않았기 때문이다.
암모니아 산화 박테리아의 대상체, 예를 들면, 인간 대상체에의 국소 적용은 피부 미생물군집의 예기치 못한 변화로 이어질 수 있고, 더 구체적으로 정상 공생적 비-병원성 종의 비의 증가 및 잠재적으로 병원성, 병원성, 또는 질환 야기 유기체의 비의 감소로 이어질 수 있다.
실시예
실시예 1. 엔. 유트로파(N. eutropha) 의 초기 배양
다양한 암모니아 산화 세균이 풍부한 토양-유래된 배양물은 WO/2003/057380에 기재된 바와 같이 성숙 수컷 대상체의 피부에 적용하였다. 인간 신체 상의 성장 기간은 연장된 기간 동안 인간 피부에 군집하는 능력을 갖는 균주에 대해 선택하였다. 몇 개월 후, 상기 균주는 개체의 피부로부터 다시 단리하고 후속 실험에 기재된 바와 같이 연장기간 동안 실험실 조건에서 배양하였다. 이론에 국한되는 것 없이, 연장된 실험실 배양물은 균주 성질을 개선시키는, 예를 들어, 높은-암모니아 조건에 대한 개선된 내성을 갖는 새로운 돌연변이에 대해 선택되는 것으로 사용된다.
실시예 2. D23, 또는 D23을 포함하는 혼합 균주의 성장 및 모니터링
배양 조건
D23은 배치에서, 또는 생물반응기에서 연속 배양에 의해 성장시킬 수 있다. 배치 제조는 표 3의 배지를 사용한다.
표 3. 배치 배양을 위한 성장 배지:
Figure pat00006
표 3의 배지에 D23의 3일된 배양물 ~ 15 ml을 접종하였다(즉, 1% 용적)을 접종한다. 상기 배양물은 암실에서 200rpm으로 진탕시킴에 의해 30 ℃에서 배양한다.
흔히, 엔. 유트로파(N. eutropha) D23 혼합 배양물은 완전한 엔, 유로파에아(N. europaea) 배지상에서 성장시킨다. 상기 배양 배지는 하기에 기재되어 있고 암모니아-산화 세균을 배양하는 것에 대한 추가의 세부사항은 월드 와이드 웹 (nitrificationnetwork.org/Nerecipe.php, Ensign et al., 1993, and Stein & Arp, 1998)상에서 가용하다.
단계 1.
900 ml의 탈이온수를 2-리터 삼각 플라스크에 첨가한다.
하기의 순서로 첨가한다:
3.3 g (NH4)2SO4 (50 mM);
0.41 g KH2PO4
0.75 ml의 1 M MgSO4 스톡 용액
0.2 ml의 1 M CaCl2 스톡 용액
0.33 ml의 30 mM FeSO4 /50 mM EDTA 스톡 용액
0.01 ml의 50 mM CuSO4 스톡 용액
상기 용액을 오토클레이빙함에 의해 멸균시킨다.
단계 2.
400 ml의 탈이온수를 비이커에 첨가한다. 하기를 첨가한다:
27.22 g의 KH2PO4
2.4 g의 NaH2PO4
10 N NaOH를 사용하여 pH를 8.0으로 조정하고, 탈이온수를 사용하여 최종 용적이 500ml이 되게한다.
상기 용액의 분획물 100ml을 250-500 ml 삼각 플라스크에서 오토클레이빙함에 의해 멸균시킨다.
단계 3
500 ml의 5% (w/v) Na2CO3 (무수물)을 제조한다.
상기 용액을 오토클레이빙함에 의해 멸균시킨다.
단계 4
단계 2에서 제조된 용액의 1 x 100 ml 적정액을 단계 1에서 제조된 플라스크에 첨가한다.
단계 5
단계 3에서 제조된 8 ml의 용액을 단계 1에 제조된 플라스크에 첨가한다.
상기 D23은 또한 생물반응기에서 연속적으로 배양할 수 있다. 표 4는 적당한 배지를 기재한다.
표 4. 연속 배양을 위한 성장 배지:
Figure pat00007
생물반응기 용기에서 배치 배지에 ~ 10 ml의 3일된 엔. 유트로파 D23 배양물 (즉, 1% 용적)을 접종한다. 상기 pH는 7.5% Na2CO3을 사용하여 7.6으로 조정한다. 상기 생물반응기는 배치 모드로 하기 파라미터로 작동한다: pH: 7.6 (하한치: 7.45 및 상한치: 7.8), 온도: 28 ℃ (하한치: 25 ℃ 및 상한치: 32 ℃), DO (용존 산소): 45% (하한치: 10%, 상한치: 100%), 교반기: 550 rpm.
생물반응기에서 배양물의 OD600nm은 3 내지 4일 후 0.15 내지 0.18에 도달한다. 이 시점에서, 상기 배양은 AOB 성장 배지에 존재하는 대부분의 50 mM NH4+을 소비하고 사용자는 0.59 ml/분 (~10%)으로 영양 공급 용액을 상기 생물 반응기에 공급하기 시작해야 한다. 유출 펌프는 또한 0.59 ml/분 (~10%)으로 가동시켜야 한다. 상기 생물반응기의 OD600nm은 1 내지 2일의 연속 배향 후 0.5 - 0.6에 도달한다. 상기 생물 반응기에서 배양물은 1ml의 생물반응기 유출물을 LB 플레이트상에 플레이팅함에 의해종속영양 오염물에 대해 시험한다.
엔. 유트로파 D23 성장의 모니터링
엔. 유트로파 D23 세포의 성장은 상기 배양물의 OD600nm를 측정함에 의해 모니터링한다. OD600nm에 의한 측정시 배치 배양물에서 전형적인 성장은 0.06 내지 0.08이다.
상기 AOB 성장 배지는 엔. 유트로파 D23에 의해 NO2 -로 화학양론적으로 전환되는 NH4 +를 함유한다. 엔. 유트로파의 성장을 모니터링하기 위한 또 다른 방법은 성장 배지내 니트라이트 (NO2-)의 방출에 따른 것이다. NO2- 농도는 그리스(Griess) 시약, 설파닐아미드 및 N-나프틸에틸렌디아민 (또한 NNEQ로 불리움)으로 결정한다. 간략하게, 설파닐아미드 및 NNEQ는 샘플에 첨가하고 표준 곡선을 구성하는 공지된 농도의 아질산나트륨에 첨가한다. 샘플은 30분 동안 암실에서 항온처리한다. 흡광도는 540 nm에서 판독한다.
니트라이트 생산을 수행하기 위한 또 다른 방법은 352nm와 400nm 사이의 광학 밀도(OD) 차이를모니터링함에 의해 분광측정기를 사용하는 것이다. 니트라이트 농도는 0.0225 mM-1의 밀리몰 흡광 계수를 사용하여 결정한다. 상기 검정은 세포와 함께 상기 배지를 샘플링함에 의해 직접적으로 수행할 수 있다.
NO2- 농도 (mM) = (OD352 - OD400)/0.0225
D23을 포함하는 혼합 배양물의 성장은 600nm (OD600 nm)에서 광학 밀도를 측정하고 니트라이트 (NO2 -)을 측정함에 의해 모니터링하고, 성장 속도는 도 1 및 2에 나타낸다. 도 1은 600nm파장에서 광학 밀도가 3 내지 4일 후 약간의 0.1 미만으로 정체기에 있음을 보여준다. 도 2a는 생성된 니트라이트의 양이 3 내지 4일 후 약간의 25mM 미만으로 정체기에 있음을 보여준다. 상기 배양물에서 NO2 - 농도는 그리스 시약(Griess reagent) (Hageman & Hucklesby, 1971)에 의해 비색계로 결정하였고 NO2 -의 축적이 일정하게 성장 동안에 세포 매쓰의 증가에 비례하기 때문에 성장 속도 및 성장 단계에 대한 제2 지표로서 사용한다.
도 2b-i에서, 연속 배양으로부터 수거된 증가하는 밀도의 D23은 50mM의 NH4 +이 보충된 배지에 현탁시키고 48시간 동안 30 ℃에서 진탕시키면서 성장시킨다. 니트라이트 생산은 지정된 시점에서 그리스 검정을 사용하여 상등액 샘플에서 측정하였다. 보여지는 결과는 3개의 독립적 실험으로부터의 평균 값 ± SD이다.
도 2b-ii에서. 엔. 유트로파(N. eutropha)D23에 의한 시험관내 니트라이트 생산을 나타낸다. 증가하는 밀도의 D23은 50 mM의 NH4 +이 보충된 무기물 염 배지에 현탁시키고 24시간 동안 30 ℃에서 진탕시켜 성장시킨다. 니트라이트 생산은 지정된 시점에서 그리스 검정을 사용하여 상등액 샘플에서 측정하였다.
저장 조건
연속 배양 시스템으로부터 수득된 엔. 유트로파(N. eutropha) 현탁액은 배치 성장 조건하에 계대배양시 생성된 높은 일정 니트라이트 농도에 의해 지적된 바와 같이 수개월 동안 4 ℃에서 저장시 현저한 안정성을 보여주었다. 엔. 유트로파(N. eutropha)를 저장하고 회수하기 위한 프로토콜은 하기에 제시된다.
후기-대수 증식기 (연속 배양에서 OD600 = 0.5 - 0.6)까지 성장한 500 ml의 엔. 유트로파(N. eutropha) D23 배양물을 수득한다. 20 ℃에서 15분 동안 10,000 x g에서 원심분리한다. 상등액을 제거하고 펠렛을 50 ml의 AOB 저장 완충액에 재현탁시킨다. 상기와 같이 회전시킨다. 상등액을 제거하고 총 50ml의 저장 완충액 중에 완전히 재현탁시킨다. 이것은 10x AOB 스톡이 될 것이다. 50 ml의 폴리프로필렌 튜브에서 4 ℃에서 바로 세워 저장한다.
AOB 저장 완충액 (4 ℃에서 AOB 저장 동안): 50 mM Na2HPO4 - 2 mM MgCl2 (pH 7.6)은 다음과 같이 제조될 수 있다.
1 리터의 ddH2O에서: Na2HPO4 - 7.098 g
MgCl2 - 0.1904 g
pH를 7.6으로 조정한다. 여과-멸균한다.
엔. 유트로파(N. eutropha)는 다음과 같이 동결보존될 수 있다. 1.25 ml의 엔. 유트로파(N. eutropha) D23 중기-로그 배양물을 2 ml의 동결튜브 및 0.75 ml의 멸균 80% 글리세롤로 이전시킨다. 튜브를 약하게 진탕시키고 15분 동안 실온에서 항온처리하여 세포가 동결보호제를 흡수할 수 있게한다. 이어서, 튜브를 동결 및 저장을 위해 -80oC 동결기에 직접 넣는다. 배양물의 소생을 위해, 10 내지 20분 동안 빙상에서 동결된 스톡을 해동시킨다. 4 ℃에서 3분 동안 8,000 x g에서 원심분리한다. 상등액을 버리고 이를 2ml의 AOB 배지에 현탁시킴에 의해 펠렛을 세척함에 이어서 4 ℃에서 3분 동안 8,000 x g에서 다시 원심분리하여 후속 성장 실험에서 냉동보호제의 잠재적 독성을 감소시킨다. 상기 상등액을 버리고 펠렛을 2ml의 AOB 배지에 재현탁시키고, 50 mM NH4 +를 함유하는 50ml의 AOB 배지에 접종하고, 200rpm에서 진탕시킴에 의해 30 ℃에서 암실에서 배양한다.
도 2c에서, 4 ℃에서 저장시 안정성을 연구하였다. 연속 배양물로부터 이전에 수거되고 4 ℃에서 저장된 엔. 유트로파(N. eutropha) D23은 50 mM NH4+이 보충된 무기물 염 배지에 109 CFU/ml로 접종하고 30 ℃에서 진탕시키면서 성장시킨다. 니트라이트 생산은 24시간 및 48시간 후-항온처리(각각 좌측 및 우측 패널)에서 결정하였다. 나타낸 데이터는 6개월 기간 동안 반복적으로 샘플링된 D23 현탁액을 나타낸다.
실시예 3. 무균 D23 배양물의 생성
순수 배양으로 엔. 유트로파(N. eutropha) D23을 단리시키기 위해, 4개 유형의 배지(하기된)를 제조하고 오토클레이빙하고 플레이트 분주하였다. 멸균된 나일론 막을 상기 플레이트 상에 위치시켰다.
엔. 유로파에아(N. europaea) 배지 + 1.2% R2A 한천
엔. 유로파에아(N. europaea) 배지 + 1.2% 한천
엔. 유로파에아(N. europaea) 배지 + 1.2% 아가로스
엔. 유로파에아(N. europaea) 배지 + 1.2% 아가로스 + 0.3g/L 피루베이트
3일된 엔. 유트로파(N. eutropha) D23 배양물을 나일론막 상으로 스트리킹하고 상기 플레이트를 30 ℃에서 배양하였다. 상기 플레이트는 적색의 엔. 유트로파(N. eutropha) 세포의 성장을 위해 매일 모니터링하였다. 나일론 막은 1주에 1회 새로운 플레이트로 이전시켰다.
불그스름한 콜로니는 1주 말기까지 R2A 한천 또는 한천을 갖는 플레이트상에 나타났다. 단일 콜로니를 RA2 한천을 갖는 플레이트로부터 집어내고 엔. 유로파에아(N. europaea) 배지에서 성장시킨다. 상기 배양물은 6일 후 0.08 OD600nm까지 잘 성장하였다. 타가영양원성 콜로니는 상기 배양물이 LB-한천 플레이트상에 도말되는 경우 나타났다.
R2A 한천, 한천, 아가로스, 또는 아가로스 + 피루베이트를 갖는 플레이트상의 불그스름한 콜로니는 2주말까지 나타났다. 단일 콜로니는 한천 또는 아가로스를 갖는 플레이트로부터 집어내고 엔. 유로파에아(N. europaea) 배지에서 성장시킨다. 상기 배양물은 6 - 8일 후 0.08 OD600nm까지 잘 성장하였다. 타가영양원성 콜로니는 상기 배양물이 LB-한천 플레이트상에 도말되는 경우 나타났다.
R2A 한천, 한천, 아가로스, 또는 + 피루베이트를 갖는 플레이트상의 밝은 불그스름한 콜로니는 4주말까지 나타났다. 단일 콜로니는 아가로스를 갖는 플레이트로부터 집어내고 엔. 유로파에아(N. europaea) 배지에서 성장시킨다. 상기 배양물은 6 - 8일 후 0.08 OD600nm까지 잘 성장하였다. 백색 콜로니는 상기 배양물이 LB-한천 플레이트상에 도말되는 경우 나타났다.
오염 세균 (예를 들어, 혼합 배양물에 존재하는 비-엔. 유트로파(N. eutropha) 세균)은 배양하고, PCR에 의해 16S rRNA를 증폭시키고 PCR 생성물의 서열 분석에 의해 종정하였다. 오염물은 마이크로박테리움 종(Microbacterium sp.) 및 알칼리게나세아에 세균으로서 동정되었다.
D23의 무균 배양물 (즉, 오염 세균이 없는)을 생성하기 위해, 연속 희석을 사용하였다. 8개의 단일 콜로니 (A-H로 지정함)를 집어내고 각각을 10 ml의 엔. 유로파에(N. europae) 배양물 배지에 위치시켰다. 각각의 배양을 위해, 5개의 연속 1:10 희석물을 생성시켰다. 각각의 배양물 A-H에 대해 성장은 2개 또는 3개의 가장 농축된 희석물에서 관찰하였다.
제2 연속 희석을 수행하였다. 50 ml의 배지에 대략 2 x 108 엔. 유트로파(N. eutropha) 세포를 접종하고, 1:50의 연속 희석물은 제5 희석 후 플라스크가 대략 1개의 세포를 갖는 것으로 예상되도록 제조하였다. 세균 성장을 나타나는 플라스크는 LB-한천상에 도말하여 오염 세균에 대해 분석하였고 어떠한 오염 세균이 관찰되지 않았다. 추가로. 어떠한 오염 그람 양성 세균도 현미경하에 관찰되지 않았다.
따라서, 연속 희석 과정은 엔. 유트로파(N. eutropha)의 무균 또는 실질적으로 무균 배양물을 생성시켰다.
실시예 4. D23 게놈의 서열분석
균주 D23은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득하였고 실시예 3에 기재된 바와 같이 무균성이 되게 하였다.
10 ml의 분액으로, 상기 세균 샘플을 실시예 2에 기재된 대략 1L의 엔. 유로파에아(N. europaea) 성장 배지에 접종하였다. 상기 배양물은 3일 후 배치 배양으로 600nm에서 0.08의 광학 밀도까지 잘 성장하였다.
상기 배양물의 총 DNA를 제조하였고 Illumina® 기술 및/또는 SMRT® DNA 서열분석 시스템 기술(Pacific Biosciences)을 사용하여 서열분석하였다. 상기 균주는 니트로소모나스 유트로파(Nitrosomonas eutropha)로서 동정되었고 D23으로 지정하였다.
D23의 게놈 서열은 엔. 유트로파(N. eutropha)의 단지 다른 서열분석된 균주인 것으로 사료되는, 엔. 유트로파(N. eutropha) C91의 서열과 비교하였다.
D23 염색체의 길이는 2,537,572 염기 쌍이고, 이는 엔. 유트로파(N. eutropha) 균주 C91 염색체의 2,661,057 염기 쌍 염색체 보다 짧다. 16S-23S 오페론을 기준으로, 균주 D23은 C91과 99.46%의 동일성을 갖고 엔. 유로파에아(N. europaea)과 95.38%의 동일성을 갖는다. 엔. 유트로파(N. eutropha) D23의 DNA 서열분석은 상기 균주에 플라스미드가 없음을 지적하였다. 이것은 2개의 플라스미드를 갖는 균주 C91의 서열과 대조적이다.
단백질-암호화 영역 및 RNA-암호화 서열은 서열 분석에 의해 동정하였다. 보충적 표 1은 D23 게놈 (서열번호 1)에서 2,777 유전자들의 위치들을 열거하는 주석의 표이다.
개별 유전자들의 수준상에서, 여러 유전자들이 C91에서는 부재인 D23에 존재한다. 이들 유전자들은 도 6-8에 요약되어 있다. 도 6은 서열 분석에 기초한 할당된 ORF 번호 및 기능과 함께 유일한 D23 유전자, 또는 길이가 200개 염기쌍 초과인 가상적 유전자를 보여주는 표이다. 상기 카테고리에는 162개 유전자들이 있다. 도 7은 할당된 ORF 번호를 갖는 200개 미만의 염기쌍의 고유한 D23 유전자들을 보여주는 표이다. 164개 유전자들이 있다. 도 8은 어떠한 할당된 ORF 번호를 갖지 않는 고유한 D23 유전자들을 보여주는 표이다. 219개 유전자들(이중에 180개가 200bp 미만의 길이이다)이 있다.
균주 D23에는 균주 C91에 존재하는 다수의 유전자들이 부재이다 (또는 가까운 동족체들이 부재이다). 이들 유전자들은 때로는 고유한 C91 유전자들로서 언급된다. 이들 유전자들은 도 9에 열거된 약 300개 유전자들을 포함한다.
D23은 C91에서 이들의 동족체와는 상이한 여러 암모니아 대사 유전자들을 포함한다. 특정 이들 유전자들은 상세한 설명의 표 1에 열거되어 있다. 서열 정렬은 균주 C91에서 D23 단백질과 이들의 동족체 간에 수행하였다. 상기 서열 정렬은 도 10 내지 16에 나타내고 2개의 균주간의 서열 차이는 상세한 설명의 표 2에나타낸다.
상기 서열 비교는 각각의 단백질의 C91과 D23 동족체들 간의 % 서열 동일성을 밝혔다. 보다 구체적으로, 도 10은 균주 C91 및 D23의 AmoA1과 AmoA2 간의 정렬이다. 각각의 단백질은 273/276 잔기들에서 동일하고, 따라서 각각은 균주 간에 약 98.9% 동일하다. 도 11은 균주 C91 및 D23의 AmoB1과 AmoB2 간의 정렬이다. 단백질 둘다는 419/421 위치들에서 동일하고, 따라서 균주 간에 약 99.5% 동일하다. 도 12는 균주 C91 및 D23의 AmoC1과 AmoC2 간의 정렬이다. 2개의 단백질은 전반적으로 동일하다. 도 13은 균주 C91 및 D23의 AmoC3 간의 정렬이다. 상기 단백질은 272/274 위치들에서 동일하고, 따라서 균주들 간에는 약 99.3% 동일하다.
Hao 단백질에 관하여, 도 14 (A 및 B)는 균주 C91 및 D23의 Hao1, Hao2와 Hao3 간의 정렬이다. Hao1은 567/570 위치들에서 동일하고, 따라서 각각은 균주들 간에 약 99.5% 동일하다. Hao2 및 Hao3은 각각 568/570 위치들에서 동일하고, 따라서 균주들 간에 약 99.6% 동일하다.
지금 시토크롬 c554 단백질로 돌아가면, 도 15는 균주 C91 및 D23의 CycA1, CycA2와 CycA3 간의 정렬이다. CycA1은 233/235 위치들에서 동일하고, 따라서 균주들 간에 약 99.1% 동일하다. CycA2 및 CycA3은 각각 234/235 위치들에서 동일하고, 따라서, 각각은 균주들 간에 약 99.6% 동일하다.
시토크롬 cM552 단백질에 관하여, 도 16은 균주들 C91 및 D23의 CycB1과 CycB2 간의 정렬이다. CycB1은 232/239 위치들에서 동일하고, 따라서 균주들 간에 약 97.1% 동일하다. CycB2는 236/239 위치들에서 동일하고, 따라서 균주들 간에 약 98.7% 동일하다. 여기서, 단백질의 길이는 이것이 균주 D23에서의 길이이기 때문에 239개 아미노산인 것으로 고려된다.
표 1의 핵산 서열의 정렬은 C91과 D23에서의 동족체들 간의 % 동일성을 보여준다. amoA1 유전자는 약 98.8% 동일하고 (즉, 821/831 위치들에서), amoA2 유전자들은 약 98.8% 동일하고(즉, 821/831 위치들에서, amoB1 유전자들은 약 99.1% 동일하고 (즉, 1255/1266 위치들에서), amoB2 유전자들은 약 99.1% 동일하고 (즉, 1254/1266 위치들에서), amoC1 유전자들은 약 99.8% 동일하고 (즉, 814/816 위치들에서), amoC2 유전자들은 약 99.8% 동일하고(즉, 814/816 위치들에서), amoC3 유전자들은 약 98.9% 동일하다 (즉, 816/825 위치들에서). hao1 유전자들은 약 99.0% 동일하고 (즉, 1696/1713 위치들에서), hao2 유전자들은 약 99.4% 동일하고 (즉, 1702/1713 위치들에서), hao3 유전자들은 약 99.2% 동일하다 (즉, 1700/1713 위치들에서). 시토크롬 c554 유전자들 중에서, cycA1 유전자들은 약 98.0% 동일하고 (즉, 694/708 위치들에서), cycA2 유전자들은 약 98.7% 동일하고 (즉, 699/708 위치들에서), cycA3 유전자들은 약 99.3% 동일하다 (즉, 703/708 위치들에서). 시토크롬 cM552 유전자들 중에서, cycB1 유전자들은 약 96.7% 동일하고 (즉, 696/720 위치들에서), cycB2 유전자들은 약 97.1% 동일하다(즉, 702/723 위치들에서).
실시예 5. 경쟁 성장 연구
엔. 유트로파(N. eutropha) 균주 D23이 목적하지 않은 세균, 예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) (피. 아에루기노사(P. aeruginosa) 또는 PA), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) (에스. 아우레우스(S. aureus) 또는 SA), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) (에스. 피오게네스(S. pyogenes) 또는 SP), 악시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii) (에이. 바우마니(A. baumannii) 또는 AB), 및프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)(이 모두는 흔히 감염된 피부 및 상처 부위로부터 흔히 단리되는 중요한 병원성 제제이다)의 성장을 억제할 수 있는지를 결정하기 위한 연구를 디자인하였다. 상기 프로토콜은 또한 목적하지 않은 세균의 성장을 억제하는 능력에 대해 다른 엔. 유트로파(N. eutropha) 균주들을 시험하기 위해 사용될 수 있다.
간략하게, 적합한 프로토콜은 하기의 단계들을 포함할 수 있다. t=0에서, 배양물에 엔. 유트로파(N. eutropha)를 접종하고, 이어서 엔. 유트로파(N. eutropha)는 24시간 동안 배양한다. 배양물 특성 (예를 들어, pH 및 니트라이트 수준)을 분석한다. t=24 시간에서, 목적하지 않은 세균을 배양물에 첨가한다. 첨가 즉시, 샘플은 목적하지 않은 세균의 CFU/ml 및 임의로 엔. 유트로파(N. eutropha)의 CFU/ml, pH, 및 니트라이트 수준을 결정하기 위해 수득한다. 배양은 추가로 24시간 동안 진행하도록 방치한다. 후속적 시점에서, 예를 들어, t=30 및 t=48에서, t=24에서와 같이 동일한 측정을 취할 수 있다. CFU/ml을 결정하기 위해, 순수 /-1/-2/-3/-4/-5 (또는 이 보다 높은)을 도말하여 정확한 카운트를 수득할 수 있다.
보다 상세한 프로토콜은 하기에 설정한다.
1일
1. 균질한 현탁액이 수득될 때까지 수회 역위함에 의해 4 ℃에서 저장된 10x AOB 스톡 현탁액을 혼합한다.
2. 8 x 1.5 ml의 폴리프로필렌 튜브에서 10ml의 현탁액을 분취한다.
3. 실온에서 3분 동안 17,000 x g에서 원심분리한다.
4. 각각의 펠렛으로부터 상등액 및 임의의 잔류 완충액을 제거하고 모든 펠렛을 50ml의 폴리프로필렌 튜브내 총 10ml의 완전 AOB 배지에 고루 재현탁시킨다.
5. 2개의 50 ml 폴리프로필렌 튜브(튜브 1-2)의 각각에서 5ml의 10 x AOB 현탁액을 피펫팅한다.
6. 완전한 AOB 배지/ 0.5 x 포스페이트 완충액 중 10x AOB 현탁액을 함유하는 5개의 추가의 튜브(튜브 4-8)를 제조한다. 16 x 1.5 ml 폴리프로필렌 튜브 중 26ml의 10x AOB 스톡 현탁액을 분취한다. 상기와 같이 펠렛을 수득하고 50ml의 폴리프로필렌 튜브 중 총 26ml 완전 AOB 배지/0.5 x 포스페이트 완충액 중에 재현탁시킨다.
7. 5개의 50 ml 폴리프로필렌 튜브 (튜브 4-8)의 각각에서 5ml의 10x AOB 현탁액을 피펫팅한다.
8. 또한, 완전한 AOB 배지(튜브 3) 또는 완전한 AOB 배지/0.5 x 포스페이트 완충액 (튜브 9) 중 10x 열-사멸된 AOB 현탁액으로 2개의 튜브를 제조한다. 4 ℃ in 8 x 1.5 ml 폴리프로필렌튜브 중 4 ℃에서 저장된 10ml의 열-사멸된 현탁액을 분취한다. 생존 AOB에 대해 상기된 바와 같이 실온에서 3분 동안 17,000 x g에서 원심분리하고 상등액을 제거한다. 하나의 50ml의 폴리프로필렌 튜브(튜브 3) 중 총 5ml의 완전 AOB 배지에 4개의 펠렛 및 2번째50ml의 폴리프로필렌 튜브 (튜브 9) 중 총 5ml의 완전 AOB 배지/0.5 x 포스페이트 완충액내에 나머지 4개의 펠렛을 재현탁시킨다.
9. 141 μl의 1 M 황산암모늄을 첨가하여 25 mM의 최종 농도 (튜브 1, 3, 4, 5, 9)를 수득한다. 균등한 용적의 dH2O를 상응하는 대조군 튜브(튜브 2, 6, 7)에 첨가한다.
10. 튜브 8에, 141 μl의 신선한 1 M NaNO2를 첨가한다.
11. 모든 튜브를 약하게 그러나 완전하게 돌려서 혼합한다.
12. 각각의 현탁액을 혼합한 후 즉시, 각각의 튜브로부터 0.5ml을 제거하고 17,000 x g, 3분, RT에서 모든 샘플을 원심분리한다. 단계 13을 완료한 후 새로운 튜브로 현탁액을 이전시키고 그리스 시약을 사용하여 pH 및 니트라이트 수준 둘다를 측정하여 T0 값을 수득한다.
13. 24시간 동안 150rpm (바로 선 위치)에서 회전 진탕기 상에서 혼합하면서 모든 50ml의 튜브를 30 ℃에서 항온처리한다.
표 5.
Figure pat00008
2일
14. 24시간에, 현탁액에 첨가할 SA, PA, SP 또는 AB 접종물을 제조한다.
15. 뇌 심장 주입물(BHI) 한천 상에서 제조한 트립틱 소이 한천 (TSA), 또는 SP 또는 AB 배양물 상에서 성장한 밤새 (20-24시간) SA 또는 PA 배양물로부터, ~ 2 x 108 CFU / ml에서 트립틱 소이 브로쓰 (Tryptic Soy Broth(TSB)) 또는 BHI 브로쓰(BHIB) 중 세균 현탁액을 제조한다.
16. 9.95 ml 식염수 중 50 μl의 SA/PA/SP/AB 현탁액을 피펫팅하여 ~ 106 CFU / ml을 수득한다. 필요한 바와 같이 빙상에 유지시킨다.
17. SA/PA/SP/AB 현탁액을 와류시키고 0.5 ml을 튜브 1 - 9에 첨가한다.
18. 모든 튜브를 약하게 그러나 완전하게 돌려서 혼합한다.
19. 각각의 현탁액을 혼합한 후 즉시, 각각의 튜브로부터 100 μl를 0.9 ml TSB 또는 BHIB (10-1 희석물)로 이전시켜 CFU 결정을 위한 샘플을 중화시킨다. 추가로, 각각의 튜브로부터 0.5 ml을 제거하고 17,000 x g, 3분, RT에서 원심분리한다. 단계 20을 완료한 후 새로운 튜브 중 상등액을 회수하고 단계 21 후 그리스 시약을 사용하여 pH 및 니트라이트 수준 둘다를 측정하여 T24 값을 수득한다.
20. 추가로 24시간 동안 회전 진탕기(150rpm) 상에서 혼합함과 함께 30 ℃에서 모든 50ml의 튜브를 항온처리한다.
21. T24 샘플을 TSB 또는 BHIB 중에 추가로 희석하고 -2/-3/-4 희석물을 TSA 또는 BHI 한천 상에 도말한다. 플레이트를 24시간 동안 37 ℃에서 항온처리하여 SA, PA, SP, 또는 AB 생존 카운트를 수득한다.
22. SA/PA/SP/AB과 AOB의 혼합 후 6 및 24시간에, 튜브를 와류시키고 100 μl의 샘플을 0.9 ml TSB에 피펫팅한다. TSB 또는 BHIB에 추가로 희석하고 순수하거나 -5 희석물을 TSA 또는 BHI 한천 상에 도말한다. 각각의 시점에서, 각각의 튜브로부터 0.5 ml을 제거하고 상기된 바와 같이 각각의 상등액 샘플에서 pH 및 니트라이트 수준 둘다를 측정한다.
23. TSA 또는 BHI 한천 플레이트를 37 ℃에서 24시간 동안 배양하여 T30 (6시간) 및 T48 (24시간) 생존 카운트를 수득한다.
24. CFU를 카운팅하여 각각의 시점에 대한 % 사멸 속도를 결정한다.
니트라이트 정량을 위한 그리스 시약 검정
1. 0, 2, 6, 및 24시간에서 pH 측정을 위해 수득된 0.5ml의 상등액 샘플을 사용한다.
2. 56 μl의 상등액을 0.5 ml dH2O 중에 연속으로 희석시켜 필요한 만큼 10- 100- 및 1000-배 희석물을 수득한다. T0 샘플에 대해, 튜브 1-6, 8, 9에서는 1/10을 사용하고, 튜브 7에 대해서는 1/1000을 사용한다. T24 / T30 / T48 샘플에 대해, 모든 튜브에서 1/10, 1/100, 1/1000을 사용한다,
3. 아질산나트륨 표준물을 제조하기 위해, 10 μl의 새로운 1 M 스톡을 990 μl의 완전한 AOB 배지-10% 식염수를 희석시켜 10mM 용액을 수득한다.
4. 990 μl dH2O 중에 10 μl의 10 mM 스톡을 희석시켜 100 μM 작동 용액을 수득한다.
5. 하기된 바와 같이 dH2O 중에 표준물을 제조한다. 표준물을 단지 T0 샘플로만 수행한다.
표 6.
Figure pat00009
6. 각각의 0.5 ml 샘플 (또는 아질산나트륨 표준물)에 0.25 ml의 시약 A (1.5 N HCl 중 58 mM 설파닐아미드) 및 시약 B (H2O 중 0.77 mM n-(1-나프틸) 에틸렌 디아민-2HCl (약민감성; 암실에 저장) 각각을 첨가한다.
7. 암실(또는 포일로 덮어진)에서 30분 동안 실온에서 혼합하고 방치한다. 색상은 비비드 핑크/바이올렛으로 변해야 한다.
8. 540 nm에서 흡광도를 판독하고 표준 곡선으로부터 니트라이트 농도를 결정한다.
상기 프로토콜을 사용하여 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) (PA), 에스. 아우레우스(S. aureus) (SA), 에스. 피오게네스(S. pyogenes) (SP), 에이. 바우마니(A. baumannii) (AB), 또는 피. 아크네스(P. acnes)의 성장을 억제하는 엔. 유트로파(N. eutropha) D23의 능력을 시험하였다. 이러한 실험 결과는 도 3a, 3b 및 3c에 나타낸다.
도 3a의 좌측 패널은 PA가 생존 엔. 유트로파(N. eutropha) 및 암모늄과 함께 동시 배양되는 경우(사각형), 암모늄 없이 생존 엔. 유트로파(N. eutropha)와 동시 배양되는 경우(원형), 사멸된 엔. 유트로파(N. eutropha) 및 암모늄과 함께 동시 배양되는 경우 (삼각형), 또는 NaNO2와 함께 생존 엔. 유트로파(N. eutropha)와 동시 배양되는 경우(역전된 삼각형) 시간에 대한 PA의 CFU/ml를 플롯팅한다. 도 3a의 우측 패널은 동일한 조건하에 시간에 대한 SA의 CFU/ml을 플롯팅한다. 도 3b의 좌측 패널은 동일한 조건하에서 시간에 대한 SP의 CFU/ml을 플롯팅한다. 도 3b의 우측 패널은 동일한 조건하에서 시간에 대한 CFU/ml AB를 플롯팅한다. 도 3c는 피. 아크네스(P. acnes)가 생존 엔. 유트로파(N. eutropha) 및 암모늄과 동시 배양되는 경우 (사각형), 암모늄 없이 생존 엔. 유트로파(N. eutropha)과 동시 배양되는 경우(원형), 사멸된 엔. 유트로파(N. eutropha) 및 암모늄과 동시 배양되는 경우 (삼각형), 또는 NaNO2과 함께 생존 엔. 유트로파(N. eutropha)과 동시 배양되는 경우(역전된 삼각형) 시간에 대한 피. 아크네스(P. acnes)의 CFU/ml을 플롯팅한다. 모든 경우에, 암모늄과 함께 생존 엔. 유트로파(N. eutropha)는 PA, SA, SP, AB, 또는 피. 아크네스(P. acnes)의 수를 감소시키는 반면, 다른 배양 조건은 목적하지 않은 세균이 성장하도록 한다. 이론적으로 국한되는 것 없이, 이들 실험은 D23에 의한 배지 산성화와 동시에 암모니아로부터의니트라이트 생성이 강한 항세균 효과, 예를 들어, 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 또는 피. 아크네스(P. acnes)의 생존 카운트에서 대략 100배 감소를 유도함을 시사한다. 대조적으로, 암모니아가 보충된 열-사멸된 D23과, 또는 암모니아 없이 생존 D23과 병원성 세균의 대조군 동시 배양물은 상응하는 항세균 효과를 나타내지 않았다. 암모늄 없이 생존 엔. 유트로파(N. eutropha) 배양물을 포함하는 대조군은 엔. 유트로파(N. eutropha)의 암모니아 산화 활성이 이의 항세균 효과에 기여한다는 모델과 일치한다. 사멸된 엔. 유트로파(N. eutropha) 및 암모늄을 포함하는 대조군은 엔. 유트로파(N. eutropha)의 일부 생물학적 활성 (예를 들어,, 이의 암모니아 산화 활성)이 항세균 활성에 기여함을 지적한다. NaNO2와 함께 생존 엔. 유트로파(N. eutropha)를 포함하는 대조군은 중성 pH(세균이 암모니아를 사용하는 경우의 낮은 pH에 대한)에서 상응하는 니트라이트 수준이 강한 항세균 효과를 갖지 않고 단독의 니트라이트 보다는 차라리 엔. 유트로파(N. eutropha)의 암모니아 산화가 항세균 활성에 기여한다는 모델과 일치함을 지적한다.
도 4a의 상부 패널은 상기 문단에 기재된 동시 배양물에서 시간 경과에 따른 NO2 - 농도를 플롯팅한다. NO2 - 농도는 배양물에서 NH3 대사 속도를 지적한다. 상기와 같이, PA는 엔. 유트로파(N. eutropha) 및 암모늄과 동시 배양 (사각형)되거나, 암모늄 없이 엔. 유트로파(N. eutropha)와 동시 배양 (원형)되거나, 사멸된 엔. 유트로파(N. eutropha) 및 암모늄과 동시 배양(삼각형)된다. 암모늄과 함께 생존 엔. 유트로파(N. eutropha)는 2개의 대조군 배양물 보다 높은 NO2 - 수준을 급격히 생성시키고, 이는 생존 엔. 유트로파(N. eutropha)가 배양 조건하에서 암모늄을 NO2 -로 전환시킴을 지적한다.
도 4a의 하부 패널은 동일한 동시 배양 조건에서 시간에 대한 pH를 플롯팅한다. pH는 암모니아의 니트라이트로의 전환이 수소 이온을 생성하기 때문에 엔. 유트로파(N. eutropha)의 대사 활성을 지적한다. PA는 엔. 유트로파(N. eutropha) 및 암모늄과 동시 배양 (사각형)하거나, 암모늄 없이 엔. 유트로파(N. eutropha)와 동시 배양 (원형), 사멸된 엔. 유트로파(N. eutropha) 및 암모늄과 동시 배양 (삼각형)하거나, NaNO2와 함께 생존 엔. 유트로파(N. eutropha)와 동시 배양 (역전된 삼각형)한다. 암모늄과 함께 생존 엔. 유트로파(N. eutropha)는 3개의 대조군 배양물과 대조적으로배지를 산성화시키고, 이는 생존 엔. 유트로파(N. eutropha)가 배양 조건하에서 암모늄을 대사시킴을 지적한다.
도 4b의 상부 패널은 상기된 동시 배양물에서 시간에 대한 NO2 - 농도를 플롯팅한다. NO2 - 농도는 배양물에서 NH3 대사 속도를 지적한다. 상기와 같이, 에스. 피오게네스(S. pyogenes) (SP) 및 에이. 바우마니(A. baumannii) (AB)는 엔. 유트로파(N. eutropha) 및 암모늄과 동시 배양 (사각형)하거나, 암모늄 없이 엔. 유트로파(N. eutropha)와 동시 배양 (원형)하거나, 사멸된 엔. 유트로파(N. eutropha) 및 암모늄과 동시 배양 (삼각형)배양한다. 암모늄과 함께 생존 엔. 유트로파(N. eutropha)는 2개의 대조군 배양물 보다 높은 NO2 - 수준을 급격히 생성시키고, 이는 생존 엔. 유트로파(N. eutropha)가 배양 조건하에서 암모늄을 NO2 -로 전환시킴을 지적한다.
도 4b의 하부 패널은 동일한 동시 배양 조건에서 시간에 대한 pH를 플롯팅한다. pH는 암모니아의 니트라이트로의 전환이 수소 이온을 생성하기 때문에 엔. 유트로파(N. eutropha)의 대사 활성을 지적한다. SP 및 AB는 엔. 유트로파(N. eutropha) 및 암모늄과 동시 배양(사각형)하거나, 암모늄 없이 엔. 유트로파(N. eutropha)와 동시 배양 (원형)하거나, 사멸된 엔. 유트로파(N. eutropha) 및 암모늄과 동시 배양 (삼각형)하거나, NaNO2과 함께 생존 엔. 유트로파(N. eutropha) 와 동시 배양(역전된 삼각형)와 동시 배양한다. 암모늄과 함께 생존 엔. 유트로파(N. eutropha)는 3개의 대조군 배양물과 대조적으로배지를 산성화시키고, 이는 생존 엔. 유트로파(N. eutropha)가 배양 조건하에서 암모늄을 대사시킴을 지적한다.
도 4e는 도 4a 및 4b의 데이터의 대안적 가시화를 보여준다.
산성화와 동시에 니트라이트 생성(산성화된 니트라이트)으로 인한 병원성 세균의 증식을 억제하는 니트로소모나스 유트로파(Nitrosomonas eutropha) D23의 능력은 D23 시험관내 D23과의 동시 배양 연구에서 5개 병원성 세균 균주의 생존을 시험함에 의해 평가하였다. 병원성 세균의 5개 균주는 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 메티실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) (MRSA), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 및 다중약물-내성 악시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)를 포함했다. 암모늄의 존재하에 엔. 유트로파(N. eutropha)D23 (1010 세포/ml)의 배양은 10mM 이상의 니트라이트 농도 및 pH6 이하로의 산성화를 유도하였다 (도 4b). 증가된 니트라이트 농도 및 pH의 저하의 조합은 살균 또는 세균증식 억제 효과 및 시험된 병원성세균 종의 생존 카운트에서 현저한 감소(965배까지)를 유도하였다. 이들 연구 결과는 하기 도 4d 및 표 7에서 요약한다. 암모늄의 존재하에 배양된 D23 동시 배양물과는 대조적으로, 암모늄 없이 D23과 5개의 병원성 제제의 대조군 동시 배양물 또는 암모늄이 보충된 열-사멸된 D23 (B244)과 5개의 병원성 제제의 대조군 동시 배양물은 어떠한 억제 또는 항미생물 효과를 유도하지 않았다.
표 7 시험관내 병원성 세균의 상대적 생존에 대한 엔. 유트로파(N. eutropha) D23 (D23)의 효과
Figure pat00010
실시예 6. 상처 치유.
당뇨병 마우스에서 상처 봉합에 대한 니트로소모나스 유트로파(Nitrosomonas eutropha) D23 (때로는 또한 B244로 호칭됨)의 효과는 2개의 별도의 연구에서 평가하였다. 연구 1에서, db/db 마우스 (8마리 마우스/그룹)는 염화암모늄이 보충된D23의 3개의 농도 (107, 108 또는 109 세포 /ml) 또는 비히클 대조군 현탁액만을 사용한 1주 동안 하루 신체 이머젼(immersion)에 의해 전처리하였다. 후속적으로, 각각의 동물의 등 상에 생성된 완전 두께의 상처는 전형적으로 14일 동안 단독의 비히클 또는 PBS 보충된 염화암모늄 중 동등한 용적의 3개 농도의 D23 (107, 108 또는 109 세포 /ml)를 사용하여 하루에 1회 처리하였다. 3개의 D23 처리된 그룹 중에서, 최고 용량을 투여된 그룹은 5일 내지 15일에 상처 봉합에서상당한 개선을 보여주었고, 83%의 가장 현저한 개선은 상처 후 9일째에 관찰되었다. 50% 상처 봉합에 대한 메디안 시간은 단독의 비히클 처리를 받은 동물 그룹과 비교하여, 109 세포/ml의 D23으로 처리된 동물에 대해 상당히 감소(P < 0.05)하였다.
연구 완료시 15일째 수거된 상처 조직 샘플의 초기 조직병리 분석은 비히클과 D23-처리된 동물간의 어떠한 그로스(gross) 차이를 밝히지 못했다. 후속적으로, 조직 섹션의 보다 면밀한 검사는 스코어링 시스템 및 파라미터 채택되고 변형된 형태 Altavilla, 등 (2001)에 따라 수행하였다. 이러한 분석은 109 세포/ml의 D23 대 비히클 대조군 그룹을 사용하여 처리된 동물에서 피부 염증의 감소된 수준과 함께 혈관형성의 증가된 수준 및 과립화 조직의 성숙도 경향을 시사하였고 이는 D23-처리된 동물의 상처 치유 속도에서의 관찰된 개선과 일치하였다.
엔. 유트로파(N. eutropha) 균주 D23은 C57BLKS/J Iar- +Leprdb / +Leprdb 수컷 마우스(비-GLP)를 사용하여, 당뇨병 마우스 모델에서 상처 치유를 가속화하는 능력에 대해 시험하였다. 세부적인 프로토콜은 하기에 나타낸다.
-6일 내지 1일: 시험 유기체를 사용한 마우스의 전신 이머젼 전처리
1. 균일한 현탁액이 수득될 때까지 수회 역전시킴에 의해 4 ℃에서 저장된 10x D23 스톡 현탁액을 혼합한다.
2. 2 x 29 ml의 10x 스톡 현탁액을 2개의 50ml의 폴리프로필렌 원심분리 튜브로 피펫팅한다.
3. 20 ℃에서 15분 동안 8,000 x g에서 원심분리한다.
4. 펠렛으로부터 상등액 및 임의의 잔류 완충액을 제거하고 약하지만 완전하게 2개의 펠렛을 총58ml의 실온 포스페이트 완충 식염수(pH 7.4 (PBS))에 재현탁시킨다. 이것은 하기의 단계 동안 사용하기 위한 10x D23 (시험 유기체) 현탁액이다.
5. 하기에 나타낸 바와 같이 2 mM NH4Cl, 또는 비히클 대조군 욕조가 보충된 30 ℃에서 가온된 PBS에서 1x, 0.1x 및 0.01x 강도에서 시험 유기체를 함유하는 500ml의 욕조를 제조한다. 한 시점에서 10x D23 현탁액으로부터 하나의 욕조를 제조하고 이를 사용하고 다음 욕조로 계속하기 전에 현탁액을 실온에서 유지시켰다. 이것은 암모늄 없이 장기간 동안 30 ℃에서 시험 물질을 유지시킴을 방지한다. 상기 시험 물질을 사용하여 비히클 대조군 그룹의 오염을 예방하기 위해 D23 욕조로 진행하기 전에 비히클 대조군 그룹으로 개시한다.
6. 7일 동안 하루 60초 동안 상응하는 욕조에서 마우스의 각각의 그룹을 침지시킨다.
7. 시험 유기체 또는 비히클 대조군으로의 각각의 하루 이머젼을 위해 새로운 500ml의 욕조를 사용한다.
표 8.
Figure pat00011
1일: 피부 천공에 의한 마우스의 상처내기
1. 등 및 어깨의 제모 후 피부 천공에 의한 각각의 마우스의 등 상에 피부 상처를 생성한다.
2. 연구의 나머지 기간동안 각각의 마우스를 별도로 하우징한다.
1일 내지 15일: 피부 상처의 시험 유기체로의 국소 처리
1. 균일한 현탁액이 수득될 때까지 수회 역전시킴에 의해 4 ℃에서 저장된 10x D23 스톡 현탁액을 혼합한다.
2. 1 ml의 10x 스톡 현탁액을 1.5 ml 폴리프로필렌 튜브로 피펫팅한다.
3. 실온에서 3분 동안 17,000 x g에서 원심분리한다.
4. 펠렛으로부터 상등액 및 임의의 잔류 완충액을 제거하고 약하지만 완전하게 펠렛을 30 ℃에서 총 10ml의 가온된 포스페이트 완충 식염수(pH 7.4(PBS))에 재현탁시킨다. 이것은 하기의 단계에 사용하기 위한 1x D23 (시험 유기체) 현탁액이다.
5. 하기에 나타낸 바와 같이 50ml의 폴리프로필렌 튜브에서 2 mM NH4Cl이 보충된 가온된 PBS, 또는 비히클 대조군 용액에서 시험 유기체의 1x, 0.1x 및 0.01x 현탁액을 제조한다.
6. 반복적인 피펫을 사용하여 각각의 현탁액 2.0ml을 인출한다.
7. 0.2 ml의 시험 유기체 (1x, 0.1x, 0.01x 그룹), 또는 동등한 용적의 비히클 대조군을 각각의 상처 및 주변의 제모된 피부 영역상으로 서서히 적가한다. 피펫 팁을 사용하여 상처 및 전체 제모된 피부 영역상으로 적용된 현탁액을 약하게 분주한다.
8. 총 14일 동안 하루 시험 유기체 또는 비히클 대조군의 적용을 반복한다.
9. 상처 면적 측정에 의한 상처 크기를 측정하고 이미지 분석기 (이미지-프로 플러스 버젼 4.5, Media Cybernetics Inc)를 사용하여 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15일째 각각의 상처의 사진 이미지를 수득한다.
10. 각각의 그룹에 대해 % 상처 봉합 및 상처 절반-봉합 시간 (CT50)을 계산한다.
표 9.
Figure pat00012
15일 (연구 완료시): 상처 조직 샘플의 수거 및 조직병리학적 분석
1. 조직의 교차-오염을 피하기 위해 무균 기술을 사용하여 그룹 당 4마리의 마우스로부터 절반-상처조직 샘플을 수득한다.
2. 조직병리학적 분석을 진행한다 s.
3. - 70 ℃에서 일시적으로 추가의 평가를 위해 각각의 그룹으로부터의 나머지 절반-상처 샘플 및 추가의 4개의 전체 크기 상처 조직을 저장한다.
도 5a에 나타낸 바와 같이, 109 CFU/ml의 균주 D23의 국소적 적용은 상처 치유를 상당히 (*p<0.05) 가속화시켰다. 상기 샘플 크기는 N= 8 동물/gp이었다. 최고 용량을 투여된 그룹은 5일 내지 15일 후 상처 봉합에서 상당한 개선을 보여주었고 83%의 가장 현저한 개선은 상처 후 9일째에 관찰되었다. 상기 연구는 당뇨족궤양, 만성 상처 및 다른 관련 징후에 대한 암모니아 산화 세균, 예를 들어, D23의 잠재적 치료학적 이득을 입증한다.
도 5b는 대조군 (비히클) 및 109 CFU/ml D23에 대한 CT50을 보여주는 플롯이다. CT50은 50% 상처 봉합을 성취하기 위해 요구되는 시간이다. 플롯에 나타낸 바와 같이, D23 적용된 상처들은 하한 CT50 값에 대해 제공하였다.
도 5c는 상기 프로토콜이 시간에 대한 상처 봉합 측정을 수득하기 위해 수행되는 또 다른 실험의 플롯이다. 대조군 (비히클) 상처를 시험하고 109 CFU/ml 상처에서 D23과 비교하였다. 상기 플롯은 이머젼 전처리 및 국소 적용이 수행되는 경우의 D23의 효과를 보여준다.
도 5d는 상기 프로토콜이 어머젼 전처리 없이 시간에 대한 상처 봉합 측정을 수득하기 위해 수행되는 또 다른 실험의 플롯이다 대조군 (비히클) 상처를 시험하고 상처에 대한 109 CFU/ml 및 1010 CFU/ml에서 D23의 적용과 비교하였다. 상기 플롯은 국소 적용이 수행되는 경우 D23의 효과를 보여준다.
도 5e는 이머젼 전처리 부재 또는 존재하에 대조군 (비히클) 및 109 CFU/ml D23, 및 전-처리 부재하의 109 CFU/ml D23에 대한 CT50을 보여주는 플롯이다. 플롯에 보여주는 바와 같이, D23이 적용된 상처는 하한 CT50 값에 대해 제공하였다.
도 5f는 1일, 11일 및 15일째에 상처 치유 실험의 이미지이다. AOB는 D23을 나타낸다.
D23의 항감염 작용과 커플링된 염증 반응의 가능한 조절은 당뇨병 및 다른 임상적 상처에 대한효과적인 국소 치료를 입증할 수 있다.
도 5g는 대조군(비히클) 및 다양한 농도의 D23에 대해 시험된 마우스에서 혈당 수준의 플롯이다. 우측 배향 패널 플롯의 x-축에 나타낸 "IM"은 D23의 이머젼 전처리로 하강된 상기 시험들을 나타낸다. 도 5h는 연구 시간 경과에 따른 이머젼 전처리를 포함하는 연구 동안 시험에 사용된 동물의 체중의 플롯이다. 도 5i는 연구 시간 경과에 따른 이머젼 전처리 연구 및 이머젼 전처리 없이 수행된 연구를 포함하는 연구동안 시험에 사용된 동물의 체중의 플롯이다.
연구 2에서, 상처 봉합에 대한 109 세포 /ml의 B244를 사용한 db/db 마우스의 전처리 효과를 조사하였다. 7마리의 마우스 그룹은 사전의 신체 이머젼의 존재 및 부재하에 109 세포/ml의 B244를 사용하여 국소적으로 처리하였다. 7마리의 마우스의 하나의 추가 그룹은 1010 세포/ml의 D23 (B244)을 사용하여 국소적으로 처리하였다. 상응하는 비히클 그룹 (7마리의 마우스)은 음성 대조군으로서 신체 이머젼의 존재 및 부재하에 병행하여 수행하였다. 각각의 상처의 상처 표면적 및 사진 이미지는 이전과 같이 수득하였다. 이들 연구는 대략 109 세포/ml의 B244 용량을 사용한 상처 봉합의 개선을 시사하는 연구 1의 발견을 재현하였다. 더욱이, 109 세포/ml을 사용한 단독의 국소 치료는 이머젼과 함께 국소 치료를 받는 동물과 유사한 상처 봉합 속도를 개선시켰다. 5일째 회수된 H & E - 염색된 상처 조직 섹션에 의한 추가의 조직병리학적 분석은 비히클과 D23 (B244)-처리된 상처 간의 임의의 차이를 밝히지 않았다.
D23 처리된 당뇨병 동물에서 시토킨 및 성장 인자 발현은 Luminex 기술을 사용하여 조사하였다. 구체적으로, 성장-조절된 발암유전자/각질형성 세포 화학유인 인자 (Gro/KC), 인터류킨-1 (IL-1), 인터류킨-6 (IL-6), 마크로파아지 염증 단백질-2 (MIP-2), 종양 괴사 인자 (TNF), 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 발현은 사전 신체 이머젼의 존재 또는 부재하에 처리된 그룹당 4마리의 마우스로부터 5일째 및 15일째 수득된 혈청 샘플에서 D23-처리된 및 대조군 당뇨병 동물 간에 비교하였다. 유사한 Luminex 분석에서, 연구의 완료(15일)시 수득된 D23-처리되거나 비히클 대조군 동물 기원의 조직의 용해물을 또한 분석하였다. MIP-2, TNFα 및 IL-1β를 포함하는 염증 마커의 비정상적으로 높고 지연된 발현은 db/db 마우스 (Wetzler, 2000)에서 탈조절된 염증 반응 및 손상된 상처 치유 과정과 이전에 연관되어 있었다. 5일 및 15일 혈청 샘플의 분석은 D23-처리되고 비히클 대조군 동물 둘다에서 모든 6개의 시토킨의 매우 낮은 시그날을 생성시켰고 이 결과는 높은 D23 용량을 사용한 상처 치료 후 전신 효과의 부재를 지적한다. 15일째 수득된 상처 조직 용해물에서, MIP-2 수준 (1155 - 1516 pg / 100 g 총 단백질)은 나머지 5개의 시토킨 보다 상당히 높았고, IL-6 및 Gro/KC는 매우 낮은 수준으로 측정되었고 (44 - 48 pg / 100 g 총 단백질) IL-1 및 VEGF는 거의 검출가능하지 않았다 (≤ 3.8 pg / 100 g 총 단백질). 총체적으로, D23 현탁액에서 전신 이머젼의 존재 또는 부재하에 D23-처리된 동물과 비히클 대조군 동물간에 어떠한 차이가 관찰되지 않았다. 조사된 마우의 모든 4개의 그룹의 조직 용해물에서 측정된 모든 6개의 시토킨 또는 성장 인자들의 수준은 하기 표 10에 요약되어 있다.
표 10 D23-처리된 및 비히클 대조군-처리된 db/db 마우스에서 측정된 시토킨 수준
Figure pat00013
설치류에서 D23(B244)의 약리역학적 평가는 하기 섹션에서 기재된 바와 같은 28일 반복 용량 독성학 연구 동안에 수행하였다. 어떠한 별도의 단일 용량 약리역학적 연구는 D23(B244)에 대해 수행되지 않았다.
실시예 7: 독성학
스트렙토조토신-유도된 당뇨 스프라그-돌리 랫트의 전체 두께 상처에 대한 니트로소모나스 유트로파(Nitrosomonas eutropha) D23 (B244) 적용의 28일 안정성 연구
상기 연구의 목적은 최소 28일 동안 상처된 피부 상에 피부로 주어지는 경우 랫트에서 니트로소모나스 유트로파 D23(B244)의 잠재적 독성을 결정하고 임의의 발견의 잠재적 가역성을 평가하는 것이다. 추가로, D23(B244)의 독성역학적 특성을 결정하였다.
연구 디자인 및 방법
상기 디자인은 연구 목적, 시험 제품에 대한 전체 생성물 개발 전략 및 하기의 연구 디자인 가이드라인을 기반으로 하였다: OECD Guidelines 407 and 417, Committee for Human Medicinal Products (CHMP), and ICH Harmonised Tripartite Guidelines M3 (R2), S3a, and S6 (R1). 상기 연구 디자인은 본원에 명시되고 결과는 표 11에 나타낸다.
표 11 28-하루 안정성 연구 디자인
Figure pat00014
당뇨병의 유도를 위해, 스트렙토조토신은 -4일째에 복강내 주사를 통해 스프라그 돌리 랫트에 투여하였다. >200 mg/dL의 혈당 수준을 갖는 동물은 스트렙토조토신 치료에 대한 응답자로서 간주되었고 연구의 투여 용량 단계를 위해 사용하였다. 2개의 완전한 두께의 피부 상처는 8-mm 피부 생검 펀치를 사용하여 동물 당(각각 마취된 동물의등의 각 측면상에 1개) 생성시켰다. 상처들은 대조군 및 시험 제품의 투여 동안 및 또한 연구의 지속 기간 동안 덮지 않은 상태로 방치하였다. 시험 및 대조군 제품은 1일 내지 28일에 하루 1회 (24시간 ± 1 시간 동안) 피부로 적당한 동물에 투여하였다. 상기 연구에서 평가된 종점은 하기와 같다: 임상적 징후, 피부 발견, 체중, 체중 변화, 식품 소비, 안과, 당 분석, 임상적 병리학적 파라미터 (혈액학, 응고, 임상적 화학, 뇨분석, 헤모글로빈 A1c, 및 메테모글로불린), C-반응성 단백질 및 혈청 페리틴 분석, 독성역학적 파라미터, 그로스 부검 소견, 기관 무게 및 상처 조직병리학.
결과
28-일 GLP 독성학 연구에서 평가된 종점에 대한 결과는 표 12에 하기에 명시되어 있다.
표 12 28일 안정성 연구-결과
Figure pat00015
Figure pat00016
Figure pat00017
Figure pat00018
결론
ㆍ 랫트 상처상에서 D23(B244)의 하루 1회 적용은 6 x 107, 6 x 108, 및 6 x 109 CFU/kg/일의 수준에서 양호하게 관용성이었다.
ㆍ 어떠한 D23 (B244)-관련된 사망율이 연구 동안에 관찰되지 않았다
ㆍ 완전한 조직 두께의 절개의 치유가 모든 그룹에서 유사하였다
ㆍ 어떠한 D23 (B244)-관련 임상 징후 또는 피부 자극이 관찰되지 않았다
ㆍ 체중, 음식 소비, 임상적 병리 파라미터, c-반응성 단백질 또는 혈청 페리틴에 대한 연구 동안에 어떠한 효과도 관찰되지 않았다
ㆍ 시험 제품-관련된 그로스 검시 발견 또는 조직병리학적 발견 부재
ㆍ 관찰된 부작용 부재 수준 (no-observed-adverse-effect level (NOAEL))은 6 x 109 CFU/kg/일 (8 x 109 세포/ml)인 것으로 결정되었다
ㆍ 어떠한 특이적 표적 기관이 동정되지 않았다
연구 동안에 발생되는 D23 관련 사망률 부재. D23-관련된 임상 징후 또는 피부 자극이 없었고, 연구동안에 체중, 체중 변화, 음식 소비, 임상적 병리 파라미터, C-반응성 단백질 또는 혈청 페리틴에 대해 어떠한 효과도 없었다. 어떠한 시험 제품 관련 그로스 검시 발견 또는 조직병리학적 병리가 없었다. 아드레날 중량의 증가는 29일째 > 6 x 108 CFU/kg/일에서 주지되었지만; D23과의 연합은 수컷에서 유사 효과의 부재, 상응하는 그로스 발견의 부재 및 상기 조직의 미시적 평가의 부재를 기반으로 모호한 것으로 고려되었다.
모든 상처 부위는 상피에 의해 완전하게 커버되었고 리모델링/해소 단계에 있는 것으로 나타났고이는 각질화 및 피부 콜라겐의 제련 (합성, 빌딩 및 분해) 및 상피 및 피부의 정상적 구조를 복구시키는 모세관과 함께 상피의 계층화를 특징으로 하였다. 상기 빈도 및 중증도는 대조군을 포함하는 모든 그룹에서 유사하였다.
실시예 8: 항생제 민감성
각각 상이한 항생제 부류를 나타내는 5개 항생제의 활성은 니트로소모나스 유트로파 (Nitrosomonas eutropha) D23에 대해 시험하였다. 시험된 항생제는 클린다마이신, 에리트로마이신, 젠타마이신, β-락타마제 억제제 타조박탐의 존재 또는 부재하의 피페리딘 및 테트라사이클린을 포함했다. 이들은 CLSI 24th Informational Supplement (M100-S24)에서 비-파스티디우스 유기체 및 비-엔테로박테리아세애 하에 열거된 계통발생적으로 관련된 프로테오박테리아(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa))의 통상적인 시험 및 보고에 대한 임상 및 연구 표준 연구소(CLSI) 추천을 기준으로 선택하고, 또한 클린다마이신 또는 테트라사이클린에 대해 통상적으로 사용되는 국소 또는 전신 항미생물 제제를 포함했다. 클린다마이신을 사용한 연구가 포함되었지만 상기 항생제는 호기성 그람-음성 세균에 대한 경우에서와 같이 니트로소모나스을 억제하는데 매우 효과적일 것인 것으로 예상되지 않았다.
최소 억제 농도 (MIC)는 5개 항생제 각각의 감소하는 농도에서 엔. 유트로파(N. eutropha) D23을 배양함에 의해 결정하였다. 30 ℃에서 세균 성장은 24시간 간격으로 수거된 샘플에서 광학 밀도 (OD600) 값을 결정함에 의해 48 내지 72 시간 동안 모니터링하였다. MIC 값은 2 또는 3일 배양 기간 동안 OD600 측정시 증가를 유도하지 않는 2배 연속 희석물로부터의 최저 항생제 농도로서 확인되었다. 각각의 항생제 시험에서 엔. 유트로파(N. eutropha) D23 표현형은 CLSI에 의해 제공된MIC 자료 표준에 따라 민감성, 중간 또는 내성으로서 결정하였다. 표 13에 요약된 바와 같이, 이들 연구는 에리트로마이신 및 젠타마이신에 대한 엔. 유트로파(N. eutropha) D23의 민감성 및 테트라사이클린 및 피페라실린의 중간 내성을 입증하였고 이는 약물에 의한 강한 항생제 내성 잠재력의 부재를 시사한다. 엔, 유트로파(N. eutropha) D23에 대해 관찰된 클린다마이신 내성은 호기성 그람-음성세균의 상기 항생제에 대한 천연 내성에 대한 이전의 보고와 일치한다. 단독의 β-락탐 항생제 피페라실린을 시험하는 것 뿐만 아니라, 광범위의 β-락타마제 억제제 타조막탐은 또한 피페라실린과 병용 시험하여 엔. 유트로파(N. eutropha) D23에 의한 β-락타마제(들)의 가능한 발현을 평가하였다. 상기 비교 결과는 엔. 유트로파(N. eutropha) D23 민감성에서의 증가를 나타내지 않았고, 이는 적어도 시험된 조건하에서 엔. 유트로파(N. eutropha) D23에 의한 β-락타마제 발현의 부재를 지적한다.
표 13. 시험관내 엔. 유트로파(N. eutropha) D23 배양물에 대해 시험된 5개 항생제에 대한 MIC 값
Figure pat00019
결론
이들 연구는 마크롤리드 및 아미노글리코사이드 항생제에 대한 D23(B244)의 민감성 및 린코사이미드에 대한 내성을 입증하고, 이 결과는 약물에 의한 강한 항생제-내성 잠재력의 부재를 지적한다.
실시예 9: 엔. 유트로파 구조의 설명
엔. 유트로파(N. eutropha)는 PCR 유전자 서열 분석 방법을 사용하여 종 및 균주 수준에서 한정되었다. 종 수준은 16S rRNA 유전자의 V1-V5 가변 영역의 서열분석에 의해 엔. 유트로파로서 한정되었다. 엔. 유트로파(N. eutropha)는 전체 게놈 서열 분석으로부터 고유한 유전자의 동정에 의해 신규한 엔. 유트로파 균주 D23으로서 한정되었다. 엔. 유트로파(N. eutropha)는 MicroSeq 500 rDNA 세균성 동정 PCL 및 서열분석 키트를 사용한 16S rRNA 유전자 서열분석에 의해 종 수준에서 엔. 유트로파로서 한정되었다.
균주 실체는 하기의 서열의 밑줄친 부분 및 하기 표 14의 D23 1c1355 서열 및 프라이머에 상응하는 커스텀 프라이머를 사용하여 결정될 수 있다. 특정 이론에 국한되지 않으면서, 유전자 D23 1c1355은 엔. 유트로파(N. eutropha) D23에 고유하고 따라서, 유전자 D23 1c1355내 PCR 증폭 반응의 수행은 엔. 유트로파(N. eutropha) D23이 소정의 샘플에 존재하는지를 지적하는 것으로 사료된다.
표 14. D23_1c1355 서열 및 프라이머
Figure pat00020
D23_1c1355 외막 자동수송체 배럴 도메인-함유 단백질
Figure pat00021
Figure pat00022
Figure pat00023
GCGGAGAACAATATCATTTCTGGTGGGATTCGTATGAATTTCTAA (서열번호 66)
실시예 10: 피부 마이크로바이옴을 변화시키기 위한 암모니아 산화 세균의 두부 뒤쪽으로의 투여
암모니아 산화 세균 (엔. 유트로파(N. eutropha) D23)은 2주 이상 동안 대상체의 두부 뒤쪽으로 국소적으로 적용하였다. 용량은 하루 당 3 x 1010 CFU로 적용하였다. 상기 생성물 농도는 염화마그네슘을 갖는 포스페이트 완충액 중에서 1 x 109 CFU/ml (15 ml, 하루 2회)이었다. 각각의 날에, 당업계에 공지된 단리 및 서열분석 프로토콜을 사용하여 존재하는 모든 세균 DNA를 단리하고 서열분석하기 위해 피부 스왑을 취하였다.
니트로소모나스(Nitrosomonas) 속의 암모니아 산화 세균은 0일 샘플에 존재하지 않았고 7일, 14일, 및 16일 피부 스왑에서 검출되고 존재하였다.
0일, 1일, 8일, 14일 및 16일에 대해 비율 대 세균 속을 플롯팅하는 도 17 및 18에서 보여지는 바와 같이, 암모니아 산화 세균의 적용은 공생 비-병원성 스타필로코커스(Staphylococcus) (이것은 적어도 98% 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)였다)이고 이는 0일째 거의 0%이고. 16일째 대략 50% 였다. 추가로, 암모니아 산화 세균의 적용은 시험되는 기간 동안 (0일째 75% 이상 내지 16일째50% 미만) 잠재적 병원성 또는 질환 관련된 프로피오니박테리아(Propionibacteria)의 비율적 감소를 유도하였다. 암모니아 산화 세균의 적용은 또한 시험되는 기간 동안 (0일째 0.1% 내지 16일째 0.01% 미만) 잠재적 병원성 또는 질환 관련 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas)를 감소시켰다
도 1 및 2에 나타낸 데이터의 일부는 또한 하기 표 15에 나타낸다.
표 15. 기일까지의 속(Genera by Day)
Figure pat00024
표 15에 나타낸 바와 같이, 프로피오니박테리아(Propionibacteria)의 비율은 약 14일 후 감소하였다 (표 15에서 0일, 1일 및 8일째 데이터를 14일 및 16일째와 비교한다). 스타필로코씨(Staphylococci)의 비율은 약 2주 후 증가하였다 (표 15에서 0일, 1일 및 8일째에 대한 데이터를 14일 및 16일째 데이터와 비교한다). 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas)의 비율은 약 1일 후 감소하였다 (표 15에서 0일째에 대한 데이터를 1일, 8일, 14일 및 16일째와 비교한다).
피부 마이크로바이옴 조성물에서 보다 적은 병원성 상태로의 변화는 암모니아 산화 박테리아의 적용이 여드름, 습진, 피부 감염 및 주사비를 포함하지만 이에 제한되지 않는 피부학적 질환의 치료에 유용할 것임을 지적한다.
실시예 11: 인간 피부에 대한 암모니아-산화 세균을 사용한 연구: 화장 효과, 안전성, 검출 및 피부 메타게놈
4:1의 AOB 대 위약으로 무작위화된 맹검 위약 제어된 24명의 인간 지원자 연구를 수행하였다. 대상체는 니트로소모나스(Nitrosomonas) 현탁액 (109 CFU/ml, 하루 2회, 하루 총 3 x 1010 CFU)을 1주동안 하루 2회 이들의 얼굴 및 두피에 적용하였고 적용 후 추가로 2주 동안 수행되었다. 지원자들은 1주 AOB 적용 동안에 및 적용 후 주 동안에 모발 제품을 사용하지 않도록 지시 받고 이어서 3번째 주 동안 통상의 샴프로 다시 복귀한다. 두피 스왑은 기준선 대조군으로서 0일째 및 PCR 및 16S rRNA 서열분석에 의한 AOB의 존재/부재를 평가하기 위해 1일, 3일, 8일, 14일 및 21일째에 수득하였다.
어떠한 심각한 부작용은 1주동안 AOB 적용과 관련되지 않았고 상기 생성물은 안전한 것으로 간주되었다. AOB 사용자는 피부 상태 및 질에서 명백한 개선을 보고하였고 이는 7일 적용 기간 후 완성된 자가 평가 보고서에 의해 지적된 바와 같다. 피부 샘플의 AOB-특이적 PCR 분석을 사용하여, 본원 발명자는 적용 기간동안에 AOB 사용자의 83 내지 100%에서 세균의 존재를 입증할 수 있는 반면 어떠한 AOB도 위약 대조군 샘플에서 검출되지 않았다. 모든 대상체는 연구 개시전에 수득된 기준선 스왑으로부터 AOB가 부재였고 이는 비누 및 다른상업 제품에 대한 이들 세균의 예측된 민감성에 일치한다. 16S rRNA 유전자의 증폭 및 샘플 서브세트의 서열분석은 상응하는 샘플에서 AOB의 존재를 확인시켜주었고 국소 AOB 적용에 의한 피부 마이크로바이옴을 조절하는데 잠재적인 경향을 시사하였다. 요약하면, 생존 AOB-기반 생성물은 안전하고 니트라이트 및 산화질소의 인간 피부로의 신규 자가조절 국소 전달 제제로서 큰 전망을 가질 수 있다.
하기 표 16에 나타낸 바와 같이, 니트로소모나스(Nitrosomonas) (AOB)의 비율은 0일째와 8일째를 비교하는 경우 상승하였다. 다른 세균, 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 엔테로박터(Enterobacter), 및 시트로박터(Citrobacter)의 비율은 0일째와 8일째를 비교하는 경우 상승하였다. 표 16에 지적된 p-값은 0일째와 8일째 사이에 가장 중요한 변화가 니트로소모나스(Nitrosomonas) (AOB)에 이어서 프로피오니박테리움(Propionibacterium)과 함께 관찰되었다. 엔테로박터(Enterobacter) 및 시트로박터(Citrobacter)는 또한 보다 적은 정도로 0일째와 8일째 사이의 변화를 보여주었다.
표 16. AOB 적용 후 (0일째 대 8일째) 마이크로바이옴 조성물에서의 경향
Figure pat00025
니트라이트 및 산화질소는 중요한 생리학적 기능, 예를 들어, 혈관확장, 피부 염증 및 상처 치유에 연루되어 있기 때문에, 본원 발명자는 AOB가 땀으로부터 암모니아를 대사하고 피부 산성화를 동시에 구동시킴에 의해 건강하고 면역병리학적 피부 상태 둘다에 대해 이로운 효과를 가질 수 있는 것으로 추정하였다. 본원 발명자는 니트로소모나스(Nitrosomonas)가 인간 용도로 안전할 것으로 합리화하였는데 그 이유는 이들이 느리게 성장하고 유기 탄소원을 활용할 수 없고 이들이 항생제에 민감하고 이들이 결코 동물 또는 인간 질환에 연관되어 있지 않기 때문이다. 여기서, 본원 발명자는 맹검의 위약 제어된 24명의 인간 지원자 연구를 기재하고, 여기서, 대상체는 생존 니트로소모나스(Nitrosomonas) 현탁액을 이들의 얼굴 및 두피에 하루 2회 1주동안 적용하고 후속적으로 추가로 2주 동안 수행하였다. 지원자는 제1 및 제2 주 동안에 모발 제품을 사용하지 않았고 이어서 이들은 제3 주 동안 통상적인으로 것으로 복귀한다. 두피 스왑은 기준선 대조군으로서 0일째 및 니트로소모나스(Nitrosomonas)의 존재/부재를 평가하고 미생물 다양성을 조사하기 위해 1일, 3일, 8일, 14일 및 21일째에 수득하였다. 중요하게, 어떠한 부작용도 국소 적용과 관련되지 않았다. PCR 분석은 1주 적용 기간(1일, 3일 또는 8일) 동안에 또는 직후에 AOB 사용자로부터 수득된 피부 스왑의 83% 내지 100%에서 및 14일째 사용자의 60%에서 세균의 존재를 입증하였지만 임의의 위약 대조군 샘플에서는 아니었다. 모든 대상체는 연구 개시 전에 수득된 기준선 스왑으로부터 AOB가 부재였다. 1주 적용 기간 동안에 AOB의 증가된 수준은 피부 상태에서 질적인 개선과 상호 관련되고 대조적으로 위약 대조군 대상체에 의해 보고된 개선이 없었다. 대상체 서브세트로부터 수득된 16S rRNA 유전자 증폭 생성물의 서열 분석은 상응하는 샘플에서AOB의 존재를 입증하였고 피부 마이크로바이옴 조성물의 잠재적 조절을 시사하였다. 요약컨대, 생존 니트로소모나스(Nitrosomonas)는 양호하게 관용성이고 니트라이트 및 산화질소의 인간 피부로의 자가 조절 국소 전달 제제로서의 전망을 가질 수 있다.
여기서, 본원 발명자는 인간에서 예비 연구로부터의 결과를 제공하고, 여기서, 본원 발명자는 니트로소모나스(Nitrosomonas) 현탁액의 인간 피부로의 국소 적용 및 생체내 NO/NO2 -의 천연 전달 시스템으로서 AOB를 사용하는 잠재력의 평가를 개시하였다. 본원 발명자는 본원 발명자의 국소 화장의 조기 어답터로부터 수거된 중요한 사용자 피드백 뿐만 아니라 피부 표본에서 AOB 검출 및 피부 미생물 군집에서 AOB의 가능한 효과를 위한 방법을 개발하였다.
방법
배양 조건. 엔. 유트로파(N. eutropha) D23은 20 - 50 mM NH4 + 및 탄소원으로서 탄산나트륨이 보충된 무기물 염 배지에서 28-30 ℃에서 배치 배양물에서 증식시켰다 [Ensign 등, 1993]. 연속 배양을 위해, D23은 pH 중성화 및 탄소원 둘다를 위해 탄산나트륨을 사용하여 28 ℃에서 1리터 소형-생물반응기(Applikon Biotechnology)에서 ~109 세포/ml로 증식시켰다.
니트라이트 정량. 배양 상등액 중 니트라이트 농도는 그리스 비색측정 검정 [Hageman and Kucklesby, 1971] 및 표준물로서 아질산나트륨을 사용하여 결정하였다.
피부 스왑으로부터 DNA 추출. 샘플은 PBS 중에 희석된 1 ml의 10% AssayAssure Bioservative (Thermo Scientific)에서 유지시켰다. 바이오매쓰를 원심분리하고 세포는 긴 DNA 통합성을 유지하도록 디자인된 완충액에 대해 변형을 갖는 피부 표본 [Grice, 2009]을 위해 개발된 방법을 사용하여 용해시켰다. 이어서 DNA는 PowerLyzer UltraClean 미생물 DNA 단리 키트를 사용하여 정제하였다 (Mo Bio Laboratories). 엔. 유트로파(N. eutropha) D23은 암모니아 모노옥시게나제 암호화 유전자좌 amoCAB를 증폭시키는 3-유전자 PCR 시그네이쳐를 사용하여 동정하였다.
PCR 및 라이브러리 제조. 전장 16S rRNA 유전자들은 프라이머 칵테일 및 AccuPrime DNA 폴리머라제 SuperMix 키트 (Life Technologies)를 사용하는 2회 반응으로 증폭시켰다. 모든 PCR 생성물은 SMRTbell 템플레이트 프렙 키트에 이어서 DNA/폴리머라제 결합 키트 P4로 직접 처리하였다(Pacific Biosciences).
16S rDNA 서열분석 및 분석. PCR 생성물은 Pacific Biosciences RS 장치를 사용하여 서열분석하였다 [Eid, 2009]. 본래의 베이스 콜을 Pacific Biosciences 컨센서스 툴 팩키지를 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 전환시키고 이어서 전체 바이옴 마이크로바이옴 프로파일링 플랫폼으로 프로세싱하여 각각의 샘플에 대해 필럼-속 및 균주-수준 빈도 측정을 수득하였다.
인간 지원자 연구. 총 24명의 수컷 지원자들은 기관[Allendale Institutional Review Board (Old Lyme, Connecticut)]에 의해 승인된 국소 AOB-001 사용에 대한 프로토콜에 따라 총 3주 동안 각각의 맹검 위약 제어된 연구에 포함되었다. 서식 통지 동의서는 각각의 연구 참여자로부터 수득하였다. 대상체는 ~109 세포/ml을 함유하는 엔. 유트로파 (AOB-001) 또는 위약(비히클)의 15ml의 수성 현탁액 of을 하루 2회 적용하였다.
니트로소모나스(Nitrosomonas)-함유 국소 현탁액 (AOB-001)의 예비 평가를 위한 인간 지원자 연구 디자인은 도 5k에 나타낸다. AOB의 검출은 두피 스왑 샘플에서 PCR에 의해 수행하였다. 도 5l은 연구 동안에 수거된 두피 스왑의 PCR 분석을 보여준다. 좌측 패널은 AOB-특이적 3개 -유전자 시그네이쳐 (amoA, amoB, amoC)에 대한 퍼센트-포지티브 샘플을 지적한다. 우측 패널은 23명의 지원자들 각각으로부터 수거된 총 6개 샘플에 대해 혼성 PCR 스코어를 지적한다. 6개의 샘플링 지점 각각에서 수거된 포지티브 샘플에 대해 사용된 스코어링 도식을 나타낸다.
AOB-001 적용 전 및 적용 동안에 피부 마이크로바이옴 조성물은 16S rDNA 서열분석에 의해 수득하였다. 도 5m은 AOB-001의 국소 적용 전 및 적용 후 수거된 피부 스왑 샘플에서 16S rDNA 서열분석에의한 측정시 속 수준 세균 다양성을 지적한다.
적용 전(0일) 및 1주 적용 직후(8일) 또는 국소 적용 중지 후 1주 (14일)에 수거된 샘플에서 12개 세균 속 각각을 대표하는 총 서열 판독값의 %를 나타낸다.
도 5n은 AOB-001 적용 전 및 후에 수거된 피부 샘플에서 니트로소모나스(Nitrosomonas) 및 다른 종의 풍부함의 변화를 지적한다. 패널 A는 적용 전(0일), 1주 적용 직후 (8일) 또는 적용 종결 후 1주(14일)에 니트로소모나스(Nitrosomonas)를 나타내는 총 16S rDNA 서열 판독값의 %를 보여준다. 패널 B는 AOB 사용자로부터 수거된 0일째 대 8일째 샘플에서 16S rDNA 서열분석에 의해 검출된 종의 풍부함의 패턴 변화를 보여준다.
AOB-001 사용자는 피부 상태의 개선을 보고한다. 도 5o는 AOB-001의 사용자 평가를 보여준다. AOB-001 화장 효과의 평가는 이들의 두피 및 얼굴에 1주 적용의 종료 즉시 23명의 지원자들에 의해 제공되었다. 대상체는 혼성 PCR 스코어를 증가시키는 순서로 플롯팅하였다. (상기 응답은 2=강하게 동의; 0=변화 없음; -2=강하에 비동의)로서 분류하였다. 요약하면, AOB-001은 양호하게 관용성이다. 맹검 연구에서 사용자 응답은 개선된 피부/두피 상태를 지적한다. AOB (니트로소모나스(Nitrosomonas))는 PCR 및 16S rRNA 유전자 서열분석에 의해 피부 마이크로바이옴 샘플 중에서 용이하게 검출가능하다. 예비 마이크로바이옴 분석은 AOB에 의한 피부 마이크로바이오타의 조절을 지적한다.
보충 표 1: 서열번호 1에서 유전자의 주석.
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보충 표 2: 선택된 D23 서열
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인용된 참조문헌
본원에 언급된 모든 공보 및 특허 문헌은 이들의 전문이 각각의 개별 공보 또는 특허 문헌이 구체적으로 및 개별적으로 참조 문헌으로 인용되는 바와 같이 인용된다.
본 발명의 특정 양태가 논의되었지만 상기 명세서는 설명을 위한 것이고 제한적이지 않다. 본 발명의 많은 변형은 명세서 및 하기의 청구항의 검토시 당업자에게 자명해질 것이다. 본 발명의 완전한 범위는 완전한 범위의 등가물, 및 명세서, 상기 변형과 함께 청구항을 참조로 결정되어야만 한다.
특정 양태는 하기의 특허청구범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> AOBIOME LLC <120> AMMONIA-OXIDIZING NITROSOMONAS EUTROPHA STRAIN D23 <130> N2060-7001WO <140> <141> <150> GR 20150100115 <151> 2015-03-13 <150> 62/053,588 <151> 2014-09-22 <150> 62/012,811 <151> 2014-06-16 <150> 62/002,084 <151> 2014-05-22 <150> GR 20140100217 <151> 2014-04-15 <160> 66 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2537572 <212> DNA <213> Nitrosomonas eutropha <400> 1 ttttctaaat ccgggttaat ttcttctact tgtcatgcag aaaatagaga ctttctggta 60 tttctgtctt aagcatttca aacaggaatt gaatggacag cagtttaata cctggatcaa 120 gccgctcaag ctggaaatct gtccggatgt ggaaaatacc ctggttttaa ttgctcccaa 180 tcgttttgta ttgcaatgga tcaaggataa ttttgtcaac cgcatcgacg aaatggcaca 240 aggtcatttc aatgaaaaaa tccatttcaa actggagctg aaagatccag ccgagatcga 300 aacagcaaca atcaaggcac ctgaaccgaa aaacaaggaa gacaagaaac cacctacaga 360 taaagcgcat ggcaccaccg ccagaaaaac caatcccagc cggctcaatc ctgcttttac 420 ctttgacgcc tttgttaccg ggaaggccaa tcagctggca cgtgccgggg ccattcaggt 480 agcagaacga ccaggtattg cctataaccc 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aaccgatagc gcttagtatc 240 tacatggacc cgagcacctt ttacaaacca ccggtttccc cgaaagaaat tgctgagcgc 300 aaagactgcg ttgaatgcca ctctgatgaa acgccggttt gggtaagagc atggaaacgc 360 agcacccacg ccaacctgga caaaatacgc aacctcaagc cggaagatcc gcttttttac 420 aaaaaaggca agctggaaga agttgagaac aacctgcgct ccatgggcaa acttggagag 480 aaggaagcgc tcaaggaagt aggctgtatt gactgtcacg ttgacatcaa cgccaaaaag 540 aaagcagatc acaccaaaga cgtacgcatg cctacagctg acgtttgcgg aacctgtcac 600 ctgagagaat ttgccgagcg tgaatccgag cgtgacacca tgatctggcc gaatggccag 660 tggcctgacg gacgtccatc ccacgcactg gactacacag ccaacattga aaccaccgtt 720 tgggcagcca tgccgcaacg tgaagtggca gaaggttgca ccatgtgcca caccaaccag 780 aacaaatgcg acaactgcca tacccgccat gaattttcgg cggcagaatc ccgcaaaccg 840 gaagcctgtg ccacctgtca cagcggcgtg gatcataata actatgaagc ctacattatg 900 tccaagcacg gcaaactggc tgaaatgaac cgggagaact ggaactggaa tgttcgtctg 960 aaagacgcct tctccaaagg aggtcagacc gcaccgacct gtgcagcctg ccacatggaa 1020 tacgaagggg aatataccca taacatcacc cgtaagaccc gctgggcaaa ctacccgttt 1080 gttccgggga ttgcagaaaa catcaccagc gactggtcag aagctcgtct ggattcctgg 1140 gttgtgacct gtacccaatg tcactcggaa cggtttgccc gctcctacct ggatctcatg 1200 gacaaaggta ccctggaagg gttggctaaa taccaggaag ccaatgccat tgttcacaaa 1260 atgtatgaag acggcaccct gactggtcaa aaaaccaatc gtccgaatcc accggcgcca 1320 gagaaaccgg gttttggtat cttcacccaa ctgttctggt ccaagggtaa caacccggcc 1380 tcacttgaac tgaaagtgct ggaaatggca gaaaacaacc tggccaaaat gcacgtagga 1440 ctggcacacg ttaatccagg tggctggaca tataccgaag gttggggccc gatgaaccgt 1500 gcctatgttg aaatccagga tgaatacacc aagatgcagg aaatgacagc tctgcaagcg 1560 cgtgttaaca aactggaagg taaaaaaacc agcctgcttg acctcaaggg agcgggagaa 1620 aagatctcgc tgggaggact gggaggtggc atgttgctgg cgggagcgat tgctctgatt 1680 ggctggcgta aacgtaagca aacgcaagct tga 1713 <210> 24 <211> 235 <212> PRT <213> Nitrosomonas eutropha <400> 24 Met Lys Ile Ile Ile Ala Cys Gly Leu Val Ala Ala Ala Leu Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ser Gly Gln Ser Leu Ala Ala Asp Ala Pro Phe Glu Gly Arg 20 25 30 Lys Lys Cys Ser Ser 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PRT <213> Nitrosomonas eutropha <400> 30 Met Thr Arg Leu Gln Lys Gly Ser Ile Gly Thr Leu Leu Thr Gly Ala 1 5 10 15 Leu Leu Gly Ile Ala Leu Val Ala Val Val Phe Gly Gly Glu Ala Ala 20 25 30 Leu Ser Thr Glu Glu Phe Cys Thr Ser Cys His Ser Met Ser Tyr Pro 35 40 45 Gln Ser Glu Leu Lys Glu Ser Thr His Tyr Gly Ala Leu Gly Val Asn 50 55 60 Pro Thr Cys Lys Asp Cys His Ile Pro Gln Gly Ile Glu Asn Phe His 65 70 75 80 Leu Ala Val Ala Thr His Val Val Asp Gly Ala Arg Glu Leu Trp Leu 85 90 95 Glu Met Val Asn Asp Tyr Ser Thr Leu Glu Lys Phe Asn Glu Arg Arg 100 105 110 Leu Glu Met Ala His Asp Ala Arg Met Asn Leu Lys Lys Trp Asp Ser 115 120 125 Ile Thr Cys Arg Thr Cys His Val Lys Pro Ala Pro Pro Gly Glu Ser 130 135 140 Ala Gln Ala Glu His Lys Lys Met Glu Thr Glu Gly Ala Thr Cys Ile 145 150 155 160 Asp Cys His Gln Asn Leu Val His Glu Glu Ala Pro Met Thr Asp Leu 165 170 175 Asn Ala Ser Leu Ala Ala Gly Lys Leu Val Leu Lys Pro Glu Glu Gly 180 185 190 Asp Gly Asp Asp Asp Asp Asp Val Asp Val Asp Asp Glu Glu 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gctgggtgta 360 tacatttttg gtgtttactg gggtggtagc ttctttacgg agcaagatgc ctcctggcac 420 caggtgatta ttcgtgacac cagctttaca ccaagtcacg tagtcgtgtt ttatggatca 480 tttccgatgt acatcgtctg cggagttgca acctatctgt atgcaatgac ccgtctgccg 540 ctgtttcatc gtggaatttc tttcccgctg gtgatggcga ttgcaggtcc tctgatgatt 600 ctgccaaacg ttggtctgaa tgaatggggt catgctttct ggttcatgga agagctgttc 660 agcgcaccgc tgcattgggg ttttgtagtg ctcggttggg ctggattatt ccagggtgga 720 gttgctgccc aaatcattac ccgttattcc aacctgactg acgtggtctg gaataatcaa 780 agcaaagaaa ttctgaataa ccgggttgta gcttag 816 <210> 36 <211> 276 <212> PRT <213> Nitrosomonas eutropha <400> 36 Met Ser Ile Phe Arg Thr Glu Glu Ile Leu Lys Ala Ala Lys Met Pro 1 5 10 15 Pro Glu Ala Val His Met Ser Arg Leu Ile Asp Ala Val Tyr Phe Pro 20 25 30 Ile Leu Val Val Leu Leu Val Gly Thr Tyr His Met His Phe Met Leu 35 40 45 Leu Ala Gly Asp Trp Asp Phe Trp Met Asp Trp Lys Asp Arg Gln Trp 50 55 60 Trp Pro Val Val Thr Pro Ile Val Gly Ile Thr Tyr Cys Ser Ala Ile 65 70 75 80 Met Tyr Tyr Leu 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ttagaacaga agagatcctg aaagcggcca agatgccgcc ggaagcggtc 60 catatgtcac gcctgattga tgcggtttat tttccgattc tggttgttct gttggtaggt 120 acctaccata tgcatttcat gttgttggca ggtgactggg atttctggat ggactggaaa 180 gatcgtcaat ggtggcctgt agtaacacct attgtgggca ttacctattg ctcggcaatt 240 atgtattacc tgtgggtcaa ctaccgtcaa ccatttggtg cgactctgtg cgtagtgtgt 300 ttgctgatag gtgagtggct gacacgttac tggggtttct actggtggtc acactatcca 360 ctcaattttg taaccccagg tatcatgctc ccgggtgcat tgatgttgga tttcacaatg 420 tatctgacac gtaactggtt ggtgactgca ttggttggag gtggattctt tggcctgatg 480 ttttacccgg gtaactggcc aatctttggc ccgacccatc tgccaatcgt tgtagaagga 540 acactgttgt cgatggctga ctacatgggt catctgtatg ttcgtacggg tacacctgag 600 tatgttcgtc atattgaaca aggttcatta cgtacctttg gtggtcacac cacagttatt 660 gcagcattct tcgctgcgtt tgtatccatg ctgatgtttg cagtctggtg gtatcttgga 720 aaagtttact gcacagcctt cttctacgtt aaaggtaaaa gaggacgtat cgtacagcgc 780 aatgatgtta cggcatttgg tgaagaaggg tttccagagg ggatcaaata a 831 <210> 38 <211> 421 <212> PRT <213> Nitrosomonas eutropha <400> 38 Met Gly Ile Lys Asn Leu Tyr Lys Arg Gly Met Met Gly Leu Cys Gly 1 5 10 15 Val Ala Val Tyr Ala Met Ala Ala Leu Thr Met Thr Val Thr Leu Asp 20 25 30 Ile Ser Thr Val Ala Ala His Gly Glu Arg Ser Gln Glu Pro Phe Leu 35 40 45 Arg Met Arg Thr Val Gln Trp Tyr Asp Val Lys Trp Gly Pro Glu Val 50 55 60 Thr Lys Val Asn Glu Asn Ala Gln Ile Thr Gly Lys Phe His Leu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Trp Pro Arg Ala Ala Ala Arg Pro Asp Phe Ala Phe Phe Asn 85 90 95 Val Gly Ser Pro Ser Ser Val Tyr Val Arg Leu Ser Thr Lys Ile Asn 100 105 110 Gly His Pro Trp Phe Ile Ser Gly Pro Leu Gln Ile Gly Arg Asp Tyr 115 120 125 Ala Phe Glu Val Gln Leu Arg Ala Arg Ile Pro Gly Arg His His Met 130 135 140 His Ala Met Leu Asn Val Lys Asp Ala Gly Pro Ile Ala Gly Pro Gly 145 150 155 160 Ala Trp Met Asn Val Thr Gly Ser Trp Asp Asp Phe Thr Asn Pro Leu 165 170 175 Lys Leu Leu Thr Gly Glu Thr Ile Asp Ser Glu Thr Phe Asn Leu Ser 180 185 190 Asn Gly Ile Phe Trp His Ile Leu Trp Met Ser Ile Gly Ile Phe Trp 195 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ccgctataca 780 gaaaccaagc atccatacac agtacctatc caggctggtc aatccaaagt tgcaccatta 840 ccggtagcac caaatccggt agcaatcaaa attacagatg ctaactatga cgtaccggga 900 cgtgcactgc gtgtatcaat ggaagtaacc aacaacggtg atacaccagt tacatttggt 960 gaatttacca cagcaggtat tcgtttcgtt aacagtaccg gccgcaagta cctggatcca 1020 cagtatcctc gtgaactggt tgcagtaggc ttgaattttg atgatgatgg tgcaattcag 1080 ccaggcgaga ccaagcaatt gaggatggaa gccaaagatg ctctgtggga aatccaacgt 1140 ctgatggcgt tgctgggtga cccggaaagc cgttttggcg gactgttaat gtcttgggat 1200 tcagaaggta atcgccatat caacagtatt gctggtccgg tgattccagt ctttaccaag 1260 ctctaa 1266 <210> 40 <211> 271 <212> PRT <213> Nitrosomonas eutropha <400> 40 Met Ala Thr Thr Leu Gly Thr Ser Ser Ala Ser Ser Val Ser Ser Arg 1 5 10 15 Gly Tyr Asp Met Ser Leu Trp Tyr Asp Ser Lys Phe Tyr Lys Phe Gly 20 25 30 Leu Ile Thr Met Leu Leu Val Ala Ile Phe Trp Val Trp Tyr Gln Arg 35 40 45 Tyr Phe Ala Tyr Ser His Gly Met Asp Ser Met Glu Pro Glu Phe Asp 50 55 60 Arg Val Trp Met Gly Leu Trp Arg Val His Met Ala 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<400> 41 atggcaacta cgttaggaac gagcagtgcc tcatcagtct catcaagagg ctatgacatg 60 tcactgtggt atgactccaa attttataaa tttggtttaa taaccatgtt gttggtagcg 120 atattctggg tatggtatca acgttacttt gcctattcac acggaatgga ttcaatggaa 180 ccagagtttg accgtgtatg gatgggcctg tggcgtgtgc acatggccat tatgccgctg 240 tttgcactgg taacctgggg ctggatctgg aaaacacgtg atacagaaga gcaattgaat 300 aacctggatc cgaaactgga aatcaaacgc tacttctact acatgatgtg gctgggtgta 360 tacatttttg gtgtttactg gggtggtagc ttctttacgg agcaagatgc ctcctggcac 420 caggtgatta ttcgtgacac cagctttaca ccaagtcacg tagtcgtgtt ttatggatca 480 tttccgatgt acatcgtctg cggagttgca acctatctgt atgcaatgac ccgtctgccg 540 ctgtttcatc gtggaatttc tttcccgctg gtgatggcga ttgcaggtcc tctgatgatt 600 ctgccaaacg ttggtctgaa tgaatggggt catgctttct ggttcatgga agagctgttc 660 agcgcaccgc tgcattgggg ttttgtagtg ctcggttggg ctggattatt ccagggtgga 720 gttgctgccc aaatcattac ccgttattcc aacctgactg acgtggtctg gaataatcaa 780 agcaaagaaa ttctgaataa ccgggttgta gcttag 816 <210> 42 <211> 276 <212> PRT <213> Nitrosomonas eutropha <400> 42 Met Ser Ile Phe Arg Thr Glu Glu Ile Leu Lys Ala Ala Lys Met Pro 1 5 10 15 Pro Glu Ala Val His Met Ser Arg Leu Ile Asp Ala Val Tyr Phe Pro 20 25 30 Ile Leu Val Val Leu Leu Val Gly Thr Tyr His Met His Phe Met Leu 35 40 45 Leu Ala Gly Asp Trp Asp Phe Trp Met Asp Trp Lys Asp Arg Gln Trp 50 55 60 Trp Pro Val Val Thr Pro Ile Val Gly Ile Thr Tyr Cys Ser Ala Ile 65 70 75 80 Met Tyr Tyr Leu Trp Val Asn Tyr Arg Gln Pro Phe Gly Ala Thr Leu 85 90 95 Cys Val Val Cys Leu Leu Ile Gly Glu Trp Leu Thr Arg Tyr Trp Gly 100 105 110 Phe Tyr Trp Trp Ser His Tyr Pro Leu Asn Phe Val Thr Pro Gly Ile 115 120 125 Met Leu Pro Gly Ala Leu Met Leu Asp Phe Thr Met Tyr Leu Thr Arg 130 135 140 Asn Trp Leu Val Thr Ala Leu Val Gly Gly Gly Phe Phe Gly Leu Met 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Gly Asn Trp Pro Ile Phe Gly Pro Thr His Leu Pro Ile 165 170 175 Val Val Glu Gly Thr Leu Leu Ser Met Ala Asp Tyr Met Gly His Leu 180 185 190 Tyr Val Arg Thr Gly Thr Pro Glu Tyr Val Arg His Ile Glu Gln Gly 195 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Claims (1)

  1. 본원에 기재된 바와 같은 최적화된 니트로소모나스 유트로파 (N. 유트로파) 박테리움의 용도.
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