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KR20210025096A - 면역 반응 증강용 복합체의 제조 방법 - Google Patents

면역 반응 증강용 복합체의 제조 방법 Download PDF

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KR20210025096A
KR20210025096A KR1020217002989A KR20217002989A KR20210025096A KR 20210025096 A KR20210025096 A KR 20210025096A KR 1020217002989 A KR1020217002989 A KR 1020217002989A KR 20217002989 A KR20217002989 A KR 20217002989A KR 20210025096 A KR20210025096 A KR 20210025096A
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신푸 (베이징) 메디칼 테크놀로지 코포레이션 리미티드
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Abstract

신규 복합체, 및 제조에 대한 연구, 복합체의 적용 등. 복합체를 제조하는 방법은 폴리이노신-폴리시티딜산, 적어도 1종의 양이온 안정화제, 및 가용성 칼슘염을 액체 반응계 중에서 접촉하는 단계를 포함하고, 양이온 안정화제는 5 kDa 이하의 분자량을 갖는 수용성 비-항생제 아미노 화합물, 또는 수용성 비-항생제 아미노 화합물과 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌이민, 엽산 및 갈락토스 중 1종 이상에 의해 형성된 그래프트이다. 상기 복합체는 적당한 점도 및 분자량을 갖고, 약제학적 용도로 사용하기에 편리하며, 안정한 화학적 특성을 갖고, 장기간 저장 시 쉽게 분해되지 않고, 사용이 안전하다. 복합체는 단독으로 사용시, 체내에서 비-특이적 면역 반응을 유의적으로 증강시키고 질병의 예방 및 치료 목적을 달성할 수 있으며, 다른 약물과 조합하여 사용시, 보다 양호한 항-종양, 항-바이러스 및 항-(슈퍼)박테리아 효능을 달성하고, 환자에게 용이하게 흡수될 수 있다.

Description

면역 반응 증강용 복합체의 제조 방법
관련 출원의 교차 참조
본원은 중국 특허청에 2018년 6월 29일에 출원된 발명의 명칭 "면역 반응 강화용 복합체의 제조 방법"의 중국 특허출원 제201810698033.6호 및 2018년 6월 29일 출원된 발명의 명칭 "면역 반응 강화용 복합체"의 중국 특허출원 제201810700708.6호 및 에 대한 우선권을 주장하며, 이들의 전체 내용은 그 전체로서 본원에 참조로 편입된다.
기술 분야
본원은 생물 의약 분야에 관한 것으로서, 구체적으로 면역 반응 강화용 복합체의 제조 방법에 관한 것이다.
현재 일반적으로 PIC(폴리리보이노신-폴리리보사이토이딜산), PICLC(폴리-L-리신 및 카르복시메틸 셀룰로스를 갖는 PIC), PIC12U(특정 간격으로 우리딜산을 갖는 PIC, 상품명 Ampligen), PICKCa(PIC-카나마이신-CaCl2)를 포함하는 것으로 간주되는 이중 가닥 RNA (dsRNA) 아쥬반트는 다양한 패턴 인식 수용체(PRR)에 대한 리간드이며, 한편으로는 면역 반응을 강화함으로써, 다른 한편으로는 면역 유형을 변화시킴으로써, 예방 백신을 치료 백신으로 만드는 것이 가능하다.
PIC(폴리이노신-폴리시티딜산)는 1960년대에 머크사(미국)에 의해 개발되었다. 마우스에서 PIC는 항바이러스 활성을 갖는 IFN-α 유도제이다. PIC는 비강과 폐의 치명적인 감염으로부터 마우스를 보호할 수 있다. 그러나, 영장류 및 인간의 혈청 뉴클리아제에 의한 PIC의 분해로 인하여, PIC는 구조 안정성이 감소되어, IFN-α 생성 활성이 거의 없고, 항-종양 활성도 없게 된다.
1970년대에 레비 HB(Levy HB)에 의해 개발된 PIC, 폴리리신(폴리 L-리신, 상대 분자량 27,000) 및 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC, 상대 분자량 700,000)의 컨쥬게이트인 PICLC(폴리-L-리신 및 카르복시메틸 셀룰로스를 갖는 폴리이노신-폴리시티딜산)은 보다 큰 상대 분자량, 및 PIC 보다 5-10배 더 큰 뉴클리아제에 의한 가수분해에 대한 저항성을 갖고, 원숭이에서 유의적인 인터페론을 생성한다(15). PICLC에 대한 예비 임상 연구는 열(100%), 근육통(50%), 저혈압(50%)와 같은 중등도 내지 심각한 반응, 백혈구의 유의적인 감소 등이 단지 치료적 용량에서 야기될 수 있음을 보여 주었다. 이는 더 큰 분자량이 더 큰 독성을 일으킨다는 오해로 이어진다.
우라실 뉴클레오티드가 PIC 가닥의 한 위치에 삽입된 PIC12U는 존스 홉킨스 대학에 의해 1970년대 중반에 개발되었고, PIC와 효능이 유사하지만 독성은 더 낮다. 2012년 8월에, 헤미스펙스 바이오파마슈티컬 컴퍼니(Hemispherx Biopharmaceutical Company)는 추가적인 원본 임상 연구 데이터를 제출했으나, 불충분한 안전성 및 효능 데이터로 인해 PIC12U는 미국 식품의약품청(FDA)의 허가를 받지 못하였다.
PICKCa는 항생제, 즉 카나마이신을 포함한다. 카나마이신은 중등도의 내이독성을 갖고, 국가 약전에 의해 규정된 기준을 초과하는 양으로 백신에 존재한다.
PIC 단독으로는 영장류 및 인간을 포함한 영장류보다 고등 동물에 사용할 수 없고, PIC12U는 불량한 효과로 인해 미국 식품의약품청에 의해 승인되지 않았으며, PICLC는 실제로 강력한 부작용을 갖는다.
이를 고려하여, 본 개시내용이 제시된다.
본 개시내용은 신규 복합체에 관한 것으로서, 상기 복합체의 제조, 용도 등이 연구되었다.
본 발명자의 이전 연구에서, PIC, 카나마이신 및 염화칼슘을 사용하여 백신 아쥬반트(상품명: PIKA 아쥬반트)를 제조하였다. 카나마이신은 PIC의 인산기에 결합할 4개의 아미노기를 포함하여 그 구조를 안정화한다는 사실로 인하여 사용된다. 그러나, 백신에 이 제품을 적용하는 것은 항생제의 포함으로 인하여 제한된다.
더욱이, 본 발명자들은 카나마이신을 키토산(염산염)으로 대체하는 것이 또한 양이온 안정화제로서 작용할 수 있음을 발견하였으나, 키토산(염산염)은 분자량이 커서 인체에 쉽게 흡수되지 않으므로 원하는 효능을 얻기가 어렵다.
따라서, 본 개시내용은 면역 반응을 강화하기 위한 복합체를 제공한다. 상기 복합체는 적합한 조건 하에서 적어도 하기 구성요소로 제조된다: 폴리이노신-폴리시티딜산, 적어도 하나의 양이온 안정화제 및 가용성 칼슘염.
상기 복합체는 적합한 조건 하에서 적어도 하기 구성요소로 제조된다: 폴리이노신-폴리시티딜산, 적어도 하나의 양이온 안정화제, 가용성 칼슘염 및/또는 망간염.
여기서, 상기 양이온 안정화제는 5 kDa 이하의 분자량을 갖는 수용성 비-항생제 아미노 화합물, 또는 수용성 비-항생제 아미노 화합물과 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌이민, 엽산 및 갈락토스 중 하나 이상에 의해 형성된 그래프트(graft)이다.
종래 기술과 비교하여, 상기 복합체는 용이하게 약물로 제조되는, 적당한 점도 및 분자량을 갖고, 안정한 화학적 특성을 가짐으로써, 장기간 저장 시 분해되기 어렵고 사용이 안전하다. 상기 복합체는 단독으로 사용시, 체내에서 비-특이적 면역 반응을 유의적으로 증강시키고 질병의 예방 및 치료 목적을 달성할 수 있으며, 다른 약물과 조합하여 사용시, 보다 양호한 항-종양, 항-바이러스 및 항-(슈퍼)박테리아 효능을 달성하고, 환자에게 용이하게 흡수될 수 있다.
본 발명의 실시 태양 또는 종래 기술에 따른 기술적 해결책을 보다 명확히 예시하기 위하여, 실시 태양 또는 종래 기술을 기술하기 위한 첨부 도면이 다음과 같이 간략하게 소개된다. 명백하게, 하기 기재에서 첨부 도면은 단지 본 발명의 일부 실시 태양일 뿐이고, 통상의 기술자는 창의적 노력 없이 첨부 도면으로부터 다른 도면을 도출해낼 수 있다.
도 1은 파미카 복합체 구조의 개략도이다: A는 Poly I:C-COS-Ca2+ 복합체 구조의 개략도이고; B는 항원(Ag)+복합체 입자 구조의 개략도이고; C는 Poly I: C-COS-Ca2++Ag 복합체 구조의 개략도이다.
도 2는 상이한 기간 동안 가열된 후 PIC의 분자량 전기영동도이다.
도 3은 본 개시내용의 실시 태양에 따른 파미카 복합체의 효소 분해 곡선이다.
도 4는 본 개시내용의 실시 태양에 따른 파미카 복합체의 용융 곡선이다.
도 5는 본 개시내용의 실시 태양에 따른 240nm-260nm에서의 개별 물질의 주사 흡수 스펙트럼이다.
도 6은 본 개시내용의 실시 태양에 따른 PIC-COS-CaCl2 복합체의 투과 전자 현미경 이미지이다; 스케일 바 = 500nm.
도 7은 본 개시내용의 실시 태양에 따른 PIC-COS-CaCl2 복합체의 투과 전자 현미경 이미지이다; 스케일 바 = 200nm.
도 8은 본 개시내용의 실시 태양에 따른 PIC-COS-g-MPEG-CaCl2 복합체의 투과 전자 현미경 이미지이다; 스케일 바 = 200nm.
도 9는 본 개시내용의 실시 태양에 따른 PIC-COS-g-MPEG-CaCl2 복합체의 투과 전자 현미경 이미지이다; 스케일 바 = 100nm.
도 10은 본 개시내용의 실시 태양에 따른 PIC-COS-CaCl2 복합체 및 TPP로부터 형성된 나노입자의 투과 전자 현미경 이미지이다; 스케일 바 = 1000nm.
도 11은 본 개시내용의 실시 태양에 따른 PIC-COS-CaCl2 복합체 및 TPP로부터 형성된 나노입자의 투과 전자 현미경 이미지이다; 스케일 바 = 200nm.
도 12는 본 개시내용의 실시 태양에 따라서 알루미늄 아쥬반트/rHBsAg(CHO), ADV20/rHBsAg(CHO) 및 파미카/rHBsAg(CHO) 각각으로 면역화한 후 21일째에 마우스의 혈청에서 ELISA 방법으로 검출된 IgG 항체의 검출도이다.
도 13은 본 개시내용의 실시 태양에 따라서 알루미늄 아쥬반트/rHBsAg(CHO), ADV20/rHBsAg(CHO) 및 파미카/rHBsAg(CHO) 각각으로 면역화한 후 21일째에서 마우스의 체액성 면역이다; 세로 좌표는 발바닥 부종을 나타낸다: mm 증가.
도 14는 본 개시내용의 실시 태양에 따른 MYO 항원에 대한 항체의 제조에 있어서, 파미카 복합체 및 완전 프로인트 아쥬반트의 효과 비교이다.
도 15는 본 개시내용의 실시 태양에 따른 MYO 항원에 대한 항체의 제조에 있어서, 파미카 복합체 및 완전 프로인트 아쥬반트의 효과 비교이다.
도 16은 본 개시내용의 실시 태양에 따라서 파미카 그룹이 대식세포의 포식 기능을 자극하는 실험의 예시적 도면이다.
도 17은 본 개시내용의 실시 태양에 따라서 PBS 대조군이 대식세포의 포식 기능을 자극하지 않는 실험의 예시적 도면이다.
도 18~21은 본 개시내용의 실시 태양에 따른 LL2 폐암 종양 보유 마우스 모델에서 파미카 점막 면역 제형의 항암 효과를 보여주는 실험 결과이다.
도 18: 상이한 약물 치료 하에서 종양 부피 변화곡선
도 19: 상이한 약물 치료 하에서 종양 무게(비히클 대조군은 투여 후 14일째 2201.09mm3 ± 68.01mm3의 종양 부피를 갖고, 실험은 투여 14일째 종료됨)
도 20: A는 대조군, 비강 점적, 2일마다 1회; B는 시스플라틴(5mg/kg), 꼬리 정맥 주사, 1주마다 1회; C는 파미카-1(즉, 파미카), 200μg/마우스, 비강 점적, 2일마다 1회; D는 파미카-1, 200μg/마우스, 비강 점적(접종 후 즉시 투여), 2일마다 1회; E는 파미카-1, 150μg/마우스, 비강 점적, 2일마다 1회; F는 파미카-1, 200μg/마우스, 근육내 주사, 2일마다 1회; G는 파미카-1+시스플라틴, 200μg/마우스+5mg/kg, 비강 점적+꼬리 정맥 주사, 2일마다 1회+1주마다 1회; 스케일 바=1 cm
도 21은 뮤린 PD-1 항체의 종양 억제율
도 22~35는 본 개시내용의 실시 태양에 따른 인 시투 유방암의 4T1-luc 마우스 모델에서 파미카의 생체내 항종양 효과를 보여준다.
도 22: 종양 부피 변화 곡선
도 23: 마우스의 체중 변화 곡선
도 24: 종양 무게에 대한 상이한 약물 치료의 효과
도 25: 상이한 약물의 영향 하에서 종양의 사진
도 26: 비장 무게에 대한 상이한 약물 치료의 효과
도 27: 상이한 약물의 영향 하에서 폐의 앞쪽 사진
도 28: 상이한 약물의 영향 하에서 폐의 뒤쪽 사진
도 29~35는 소동물 이미저에 의해 표시된 종양 부위 및 전이의 생물발광 강도 사진이다.
도 29: 파미카 7일 선행 그룹에서 마우스의 생물발광
도 30: 파미카 0일 그룹에서 마우스의 생물발광
도 31: 비히클 그룹에서 마우스의 생물발광
도 32: 200μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹에서 마우스의 생물발광
도 33: 300μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹에서 마우스의 생물발광
도 34: 200μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹에서 마우스의 생물발광
도 35: 300μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹에서 마우스의 생물발광
본 발명은 하기의 그 일부 실시양태들에 대한 설명과 거기에 포함되어 있는 실시예의 상세한 내용을 보면 보다 명확해질 수 있다.
본 발명을 더 설명하기 전에, 특정 실시양태들은 의당 다양할 수 있기 때문에, 본 발명이 이러한 실시양태들에 한정되지 않는다는 점을 주지하여야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부되는 청구범위로만 정의될 것이므로, 본 명세서에서 사용된 용어들은 한정적인 의미로서 제공된다기보단 특정 실시양태들을 단지 예시하기 위한 것임도 주지하여야 할 것이다.
용어 정의
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용되는 몇 가지 용어들에 대해 이해하여야 한다.
"파미카(Pamica)"라는 용어는 일반적으로 폴리이노신-폴리시티딜산, 양이온성 안정화제 및 가용성 칼슘염 (칼슘 이온)으로부터 제조된 복합체를 그 구체적인 물성과 면역원성에 상관없이 모두 지칭하는 말이다.
"폴리이노신-폴리시티딜산"은 폴리 이노신-시티딘, 폴리이노신산 폴리시티딜산, 폴리이노신산 시토신 뉴클레오타이드, 폴리이노신-폴리시티딜산, PIC 또는 Poly I:C로도 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 "면역반응을 강화하는"이라는 용어는 숙주 내 항원성 물질에 대한 면역 반응을 유도 또는 강화하거나, 면역 세포의 기능을 강화하거나, 면역 세포로부터 염증성 인자 또는 사이토카인의 방출을 촉진하거나, 또는 숙주의 병원성 물질에 대한 내성을 강화하는 것을 가리킨다.
"면역 반응을 유도하는"이라는 용어는 면역 반응을 자극하거나, 개시하거나, 또는 발전시키는 것을 의미한다.
"면역 반응을 강화하는"이라는 용어는 기존 면역 반응을 개선, 발전, 보충, 확대, 증가 및 신장시키는 것을 가리킨다.
"면역 반응을 강화하는"이라는 표현 또는 이와 유사한 표현들은, 이전의 면역 반응 상태에 비해 숙주에게 유익한 면역 반응을 강화하거나, 개선하거나 또는 증가시키는 것을 의미한다. 상기 이전의 면역 반응 상태라는 것은, 예를 들어 본 발명의 면역원성 조성물을 투여하기 전의 이전 면역 반응 상태를 말한다.
본원에서 "개체"라는 용어는 "숙주", "대상체" 및 "동물"과 서로 교환해서 사용하며, 인간과 모든 가축들 (예컨대, 농장 동물과 애완 동물) 및 야생 동물과 새들, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 소, 말, 젖소, 돼지, 양, 염소, 랫트, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 낙타, 당나귀, 사슴, 밍크, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 투계 등을 포함한다.
"항체"라는 용어는 다클론 항체 및 단클론 항체와, Fab, F (ab')2, Fd, Fv, scFv를 비롯한 이러한 항체들의 항원 화합물 결합 단편, 이중특이적 항체 및 항체의 최소 인식 단위 뿐만 아니라 이러한 항체와 단편들의 단쇄 유도체도 포함한다. 항체의 종류는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE 및 IgD에서 선택할 수 있다. 추가로, "항체"라는 용어는, 자연 발생적인 항체들과, 예를 들어 키메라, 이작용성 및 인간화 항체 및 관련 합성 동형(isoforms)을 비롯한 비자연 발생적인 항체들도 포함한다. "항체"라는 용어는 "면역글로불린"과 교환하여 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "항원 화합물"이라는 용어는 적당한 환경 하에 면역계에 의해 인식될 수 있는 (예를 들어, 항체에 결합되거나 세포성 면역 반응을 유도하도록 처리된) 임의의 물질을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "항원"은, 이에 제한되지는 않지만,　세포, 세포 추출물, 단백질, 지질단백질, 당단백질, 핵단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 다당류, 다당류 접합체, 다당류의 펩타이드 모방체, 지방, 당지질, 당류, 바이러스, 바이러스 추출물, 박테리아, 박테리아 추출물, 균류, 균류 추출물, 기생충과 같은 다세포 유기체, 및 알레르겐을 포함한다. 항원은 외인성 (예를 들어, 해당 항원이 투여되는 개체가 아닌 다른 공급원, 예컨대 다른 종에서 기원함) 또는 내인성 (예를 들어, 해당 숙주 몸체로부터 유래한 것, 예컨대 질병 인자, 암 항원, 체내 바이러스에 감염된 세포에 의해 생성된 항원)일 수 있다. 항원은 천연 (예컨대, 자연적 발생) 상태의 것, 합성된 것 또는 재조합된 것일 수 있다. 항원은 세포 추출물, 온전한 세포 및 정제된 항원을 포함하며, 이 경우 "정제된"이라는 용어는 항원이 통상적으로 존재하는 환경에서의 항원 및/또는 미정제 추출물 형태 (예컨대, 항원 배양물의 형태)의 항원과 비교하였을 때 해당 항원이 보다 농축된 형태로 제공되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "백신 조성물"이라는 용어는, 숙주에 투여될 때 면역 반응을 공동으로 자극하게 되는 2종 이상의 물질들 (예컨대, 항원 및 아쥬반트)의 조합을 지칭한다.
"폴리펩타이드", "펩타이드", "올리고펩타이드" 및 "단백질" 등의 용어들은 본 명세서에서 서로 교환하여 사용되는 것으로, 임의의 길이를 갖는 중합체 형태의 아미노산을 의미한다. 상기 중합체 형태는 암호화된 아미노산과 암호화되지 않은 아미노산, 화학적 또는 생화학적으로 변형되거나 유래된 아미노산, 및 변형된 펩타이드 골격을 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
"면역 반응"이라는 용어는 척추동물 개체의 면역계의 항원성 또는 면역원성 화합물에 대한 임의의 반응을 지칭한다. 일반적인 면역 반응에는, 이에 제한되지는 않지만, 국소 및 전신 세포성 및 체액성 면역 반응, 예를 들어 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응, 예컨대 CD8+ CTL의 항원 특이적 유도; T 세포 증식 반응과 사이토카인 방출을 비롯한 헬퍼 T 세포 반응; 및 항체 반응을 비롯한 B 세포 면역 반응을 포함한다.
본원에 사용된 "아쥬반트"라는 용어는 숙주에서 항원 화합물에 대한 면역 반응을 증가시키거나 변화시키는 임의의 물질 또는 물질들의 혼합물을 가리킨다.
본 명세서에서 사용된 "치료"라는 용어는 일반적으로 목적한 약리학적 및/또는 생리학적 효능을 달성함을 의미한다. 상기 효능은 질병 또는 그 증상을 완전히 및/또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적 성질의 것일 수 있고/있거나, 상기 효능은 질병 또는 해당 질병으로 유발된 부정적인 영향을 완전히 및/또는 부분적으로 안정화거나 치료하는 관점에서 의료적 성질의 것일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "치료"라는 용어는 개체 (특히, 포유동물 개체, 보다 구체적으로는 인간) 질병의 임의의 치료를 포함하며, 하기를 망라한다: (a) 질병에 취약할 수는 있지만 아직 해당 질병으로 진단되지 않은 개체를 해당 질병 또는 그 증상의 발병으로부터 예방하는 것; (b) 질병의 증상을 억제하는 것, 예를 들어 질병 증상의 발생을 방지하는 것; 또는 해당 질병 또는 증상을 진정시키는 것과 같이 질병의 증상을 완화시키는 것; (c) 질병의 감염성 물질 (예컨대, 독소, 항원 등)에 의해 생산되는 생성물의 수준을 감소시키는 것; (d) 질병의 감염성 물질들에 의한 유해한 생리학적 반응 (예컨대, 열, 조직 부종 등)을 감소시키는 것.
"약제학적으로 허용가능한 염"의 화학 물질은 해당 염이 약제학적으로 허용되고 모 화합물의 목적한 약리학적 활성을 보유하고 있음을 의미한다. 이러한 염에는 하기의 것들이 포함된다: (1) 염을 합성하는 무기산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등으로부터 함께 형성되는 염; 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 카프로산, 사이클로펜타프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄디설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캠퍼설폰산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스 (3-하이드록시-2-엔-1-카복실산), 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 3급 부틸 락트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산 등으로부터 함께 형성되는 염; 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 양성자가 알칼리군의 금속 이온, 알칼리토류군의 금속 이온 또는 알루미늄 이온과 같은 금속 이온으로 대체되거나 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등과 같은 유기 화합물과 배위 결합될 때 형성되는 염.
본 발명의 예시적인 실시양태
본 발명의 한 양태는 폴리이노신-폴리시티딜산, 적어도 양이온성 안정화제 및 가용성 칼슘염을 포함하는 면역 반응을 강화하기 위한 배합 조성물에 관한 것이다.
상기 양이온 안정화제는 분자량이 5 kDa 이하인 수용성 비-항생제 아미노 화합물이거나, 또는 상기 수용성 비-항생제 아미노 화합물, 및 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌이민, 엽산 및 갈락토스 중 1종 이상에 의해 형성된 그래프트(graft)이다.
중요한 장점은, 파미카를 단독으로 사용하게 되면 체내의 비특이적 면역 반응을 크게 강화할 수 있고, 특이적인 체액성 면역 반응 및 세포성 면역 반응을 보다 효과적으로 개시하여 보호 면역성을 강화시킬 수 있으며; 항원 물질과 함께 조합하여 사용하는 경우에는 더 나은 효과를 달성할 수 있다는 점에 있다.
또 중요한 장점은, 파미카가 2015년판 중국 약전 (PHARMACOPOEIA OF THE PEOPLE’S REPUBLIC OF CHINA) 제4권의 "1141가지의 비정상 독성 시험"을 통과하여, 인체에 안전하게 사용할 수 있다는 점에 있다. 가열 처리하지 않은 분자량을 갖는 PIC로 제조된 복합체 (예컨대, PIC-아미노 화합물-CaCl2 아쥬반트 또는 PIC-아미노 화합물-CaCl2 아쥬반트 백신)는 비정상 독성 시험을 통과할 수 없다.
중요한 장점은, 파미카가 더 나은 화학적 및/또는 물리적 안정성을 가지기 때문에, 보관하기가 더 쉽다는 점에 있다.
또 중요한 장점은, 파미카가 신호전달 경로를 통해 종양 세포의 아폽토시스를 촉진할 수 있으며, 또한 면역 세포들을 자극하고 다양한 사이토카인을 발현하여 종양 세포가 존재하고 있는 미시적 환경을 변화시켜서, 면역 세포들이 종양 세포, 바이러스, 박테리아 등과 같은 병원성 물질을 공격할 수 있도록 한다는 점에 있다.
또 중요한 장점은, 파미카가 숙주에 더 쉽게 흡수되거나 숙주 세포에 의해 더 쉽게 삼켜질 수 있어, 결과적으로 더 많은 항원들을 세포로 더 가져옴으로써, 단백질과 펩타이드로 유발된 면역 반응을 강화할 수 있다는 점에 있다.
중요한 장점은 파미카가 암 통증이 있는 환자에게 분명한 진통 효과가 있다는 점에 있다.
또 중요한 장점은 파미카가 HPV에 감염된 사람들의 바이러스 역가를 높은 양성치에서 음성치로 변화시킬 수 있다는 점에 있다.
중요한 장점은 파미카와 박테리움 버게리(Bacterium burgeri) 불활성화 백신이 함께 우수한 보호 효과를 나타낸다는 점에 있다.
본 명세서에서 설명한 바와 같이, 파미카는 단순한 조성물이라기 보다는 완전히 새로운 구조를 갖는 복합체라는 점에 주목할 필요가 있다.
일부 실시양태에서, 상기 양이온성 안정화제의 분자량은 4 kDa, 4.5 kDa, 3 kDa, 3.5 kDa, 2.5 kDa, 2 kDa, 1.5 kDa, 1 kDa, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da으로부터 추가로 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 수용성 비-항생제 아미노 화합물은 키토산 올리고당류(chitosan oligosaccharides), 키토올리고당류, 글루코사민, 양이온성 리포좀, DEAE-덱스트란, 폴리아크릴아미드, 폴리아민, 테트라아미노풀벤 및 폴리에틸렌이민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이다.
일부 실시양태에서, 상기 양이온성 안정화제는 키토산 올리고당류와 메톡시폴리에틸렌 글리콜의 그래프트 (COS-g-MPEG), 키토산 하이드로클로라이드와 폴리에틸렌 글리콜의 그래프트 (PEG-g-CS), 엽산과 키토산 하이드로클로라이드의 그래프트 (FA-g-CS), 갈락토스, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌이민의 그래프트 (GAL-g-PEG-g-PEI), 키토산과 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌이민의 그래프트 (COS-g-MPEG-g-PEI), 키토산, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌이민의 그래프트 (CS-g-PEG-g-PEI), 폴리에틸렌 글리콜과 폴리에틸렌이민의 그래프트 (PEI-g-PEG), 키토산 올리고당류와 폴리에틸렌이민의 그래프트 (PEI-g-COS), 키토산 하이드로클로라이드와 폴리에틸렌이민의 그래프트 (PEI-g-CS), 키토산 올리고당류와 폴리에틸렌 글리콜의 그래프트 (COS-g-PEG), 및 키토산 올리고당류, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌이민의 그래프트 (COS-g-PEG-g-PEI)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 상기 양이온성 안정화제는 키토산 올리고당류 (COS), 키토산 올리고당류와 메톡시폴리에틸렌 글리콜의 그래프트 (COS-g-MPEG), 키토산 올리고당류, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌이민의 그래프트 (COS-g-MPEG-g-PEI)로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 상기 그래프트의 분자량은 50 kDa 이하이다.
일부 실시양태에서, 상기 양이온성 안정화제의 분자량은 45 kDa, 40 kDa, 35 kDa, 30 kDa, 25 kDa, 20 kDa, 15 kDa, 10 kDa, 9 kDa, 8 kDa, 7 kDa, 6 kDa, 5 kDa, 4 kDa, 3 kDa, 2 kDa, 1 kDa, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da으로부터 추가로 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 키토산 올리고당류의 탈아세틸화도는 70% 이상이며; 80%, 85%, 90% 또는 95%도 선택될 수 있으나, 90% 내지 100%가 바람직하다.
일부 실시양태에서, 상기 키토산 올리고당류 단량체는 161의 분자량, 2 내지 20의 중합도 및 322 내지 3220 범위에서 선택된 분자량을 가진다.
일부 실시양태에서, 키토산 올리고당류, 키토올리고당류 및 글루코사민의 분자량은 3200 이하이다.
일부 실시양태에서, 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌이민은 40,000 이하의 분자량을 가지며, 30,000, 20,000, 15,000, 10,000, 8,000, 6,000, 4,000, 2,000, 1,500, 1,000 또는 500도 추가로 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 가용성 칼슘염은 CaCl2 및/또는 CaNO3로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 폴리이노신-폴리시티딜산의 분자량은 100 bp 내지 3000 bp이다.
일부 실시양태에서, 폴리이노신-폴리시티딜산의 분자량은 100 bp 내지 1500 bp이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 배합 조성물은 pH 조절제, 트리폴리인산나트륨(sodium tripolyphosphate), 알긴산나트륨, 페닐보론산, 카테콜, 완충 염/시약 및 물 중에서 1종 이상을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 배합 조성물의 각 성분들은 개별적으로 포장된다.
일부 실시양태에서, 배합 조성물의 적어도 두 성분들을 혼합하여 함께 포장하는데, 예를 들어, 양이온과 물 및/또는 완충염을 함께 포장한다.
일부 실시양태에서, 폴리이노신-폴리시티딜산은 그의 원재료, 예를 들어 폴리이노신산 (PI)과 폴리시티딜산 (PC)의 형태로 포장된다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 기술한 바와 같은 배합 조성물의 시약들로부터 제조되는 면역 반응을 강화하기 위한 복합체에 관한 것이기도 하다.
일부 실시양태에서, 상기 제조는 용액계에서 수행하고, 시약 중에서 상기 폴리이노신-폴리시티딜산의 농도는 0.1 mg/㎖ 내지 10 mg/㎖이다.
상기 폴리이노신-폴리시티딜산의 농도는 가용성을 증가시키기 위해 이론적으로는 그래프팅에 의해 더 높은 농도에 도달할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 상기 제조는 용액계에서 수행되며, 시약 중에서 폴리이노신의 농도는 0.5 mg/㎖ 내지 5 mg/㎖이고, 1 mg/㎖, 2 mg/㎖, 3 mg/㎖, 4 mg/㎖, 5 mg/㎖, 6 mg/㎖, 6.4 mg/㎖, 7 mg/㎖, 8 mg/㎖ 또는 9 mg/㎖가 추가로 선택될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 상기 제조는 용액계에서 수행되며, 시약 중에서 양이온 안정화제의 농도는 0.5 mg/㎖ 내지 51.2 mg/㎖이다.
일부 실시양태에서, 양이온성 안정화제의 농도는 0.8 mg/㎖ 내지 25.6 mg/㎖이며, 1 mg/㎖, 2 mg/㎖, 3 mg/㎖, 4 mg/㎖, 5 mg/㎖, 10 mg/㎖, 15 mg/㎖ 또는 20 mg/㎖가 추가로 선택될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 상기 제조는 용액계에서 수행되고, 시약 중에서 폴리이노신-폴리시티딜산 대 양이온성 안정화제의 질량비는 1:0.8 내지 25.6이고; 1:6.4 또는 1:12.8이 추가로 선택될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 상기 제조는 용액계에서 수행되고, 시약 중에서 가용성 칼슘염의 칼슘 이온의 농도는 0.1 mM 내지 1 mM이며, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM 또는 0.9 mM도 추가로 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 복합체는 용액 중에 저장된다.
상기 용액은 완충 용액인 것이 바람직하다.
일부 실시양태에서, 상기 용액의 pH는 5.0 내지 7.2 범위이다.
일부 실시양태에서, 상기 용액의 pH는 5.9 내지 6.9이고, 6.0, 6.2, 6.4, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6 또는 7.8도 선택될 수 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 바와 같은 복합체의 면역 아쥬반트로서의 비치료적 용도에 관한 것이기도 하다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 바와 같은 복합체의 항체, 백신 제제 또는 백신 조성물을 제조하기 위한 용도, 또는 백신 부형제 또는 백신 아쥬반트를 제조하기 위한 용도에 관한 것이기도 하다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 바와 같은 복합체 및 적어도 하나의 항원을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이기도 하다.
일부 실시양태에서, 상기 항원은 바이러스, 박테리아, 단백질, 폴리펩타이드, 다당류, 핵산 또는 저분자-단백질 접합체이다.
일부 실시양태에서, 상기 백신 조성물은, 예를 들어 약독화 백신 (예를 들어, 바이러스 또는 박테리아의 약독화 백신), 불활성화 백신 (예를 들어, 바이러스 또는 박테리아의 불활성화 백신), 단백질 백신, 다당류 백신, 단백질 서브유닛 백신, 키메라 벡터 백신, DNA 백신, RNA 백신, 폴리펩타이드 백신 또는 저분자-단백질 접합체 백신이다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 생체 내 또는 시험관 내에서 적용되는 상술한 바와 같은 복합체의 면역 세포 활성을 조절하는 데 있어서의 용도에 관한 것이기도 하다.
일부 실시양태에서, 상기 면역 세포 활성의 조절은 구체적으로 면역 세포 활성을 강화하는 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 면역 세포는 대식세포, 림프구 및 수지상 세포로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 상기 면역 세포 활성을 조절하거나 강화하는 것은 면역 세포가 염증성 인자를 방출하도록 촉진시키는 것이다.
일부 실시양태에서, 상기 염증성 인자로는 IL-2, IL-6, IL-12p40, IL-18, IL-22, IFN-α, IFN-γ 및 TNF-α를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 염증성 인자로는 IFN-γ 및 TNF-α를 포함한다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 종양, 바이러스, 박테리아, 균류, 기생충을 치료 및/또는 예방하고, 화학요법의 부작용을 감소시키며, 피로를 회복시키거나 면역성을 개선하고, 숙주의 통증을 완화시키며, 숙주의 항원에 대한 면역 반응을 촉진시키기 위한 약물의 제조에 있어서 상술한 바와 같은 복합체의 용도에 관한 것이기도 하다.
일부 실시양태에서, 상기 약물은 주사 투여 제형, 호흡기 투여 제형, 점비액, 피부 투여 제형, 점막 투여 제형, 또는 공동 (cavitary) 투여 제형이다.
일부 실시양태에서, 상기 주사 투여 제형은, 예를 들어 (정맥내 주사, 근육내 주사, 피하주사 및 피내 주사와 같은 다양한 주사 경로를 포함하는) 주사제들로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 상기 호흡기 투여 제형은, 예를 들어 스프레이, 에어로졸, 파워 에어로졸 등으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 상기 피부 투여 제형은, 예를 들어 용액, 로션, 도찰제 (liniment), 연고, 플라스터 (plaster), 페이스트 및 패치 등으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이들은 외용제로서 투여 후 경피 흡수를 통해 국소적으로 작용하거나 전신적 효과를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 상기 점막 투여 제형은, 예를 들어, 점안액, 점비액, 안용 연고, 가글 및 설하용 정제 등으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 점막 투여는 국소적으로 작용하거나 점막 흡수를 통해 전신적 효과를 나타낼 수 있다. 상기 공동 투여 제형으로는 직장, 질, 요도, 비강, 외이도 등에 사용되는 좌약, 에어로졸 등을 포함한다. 상기 공동 투여는 흡수 후 국소적으로 작용하거나 전신적 효과를 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 항원은 종양, 바이러스, 박테리아, 균류 또는 기생충 항원을 포함한다.
일부 실시양태에서, 숙주는 포유동물이다.
일부 실시양태에서, 숙주는 영장류이다.
일부 실시양태에서, 숙주는 인간이다.
일부 실시양태에서, 항원이 바이러스, 박테리아, 균류 또는 기생충 항원인 경우, 약물의 양은 용량당 1 mg 내지 8 mg이다.
일부 실시양태에서, 항원이 종양 항원인 경우에는, 약물의 양은 용량당 1 mg 내지 10 mg이다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 바와 같은 복합체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이기도 하다. 본 약제학적 조성물은 면역 세포 요법 약물, 항체 요법 약물, 화학 약물, 점막 면역 흡수 또는 점막 부착을 촉진하는 물질, 면역조절제, 병원성 항원, 패턴 인식 수용체-리간드 중 1종 이상 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 면역 세포 요법 약물은 종양 침윤성 림프구 (TIL), 수지상 세포 (DC), 사이토카인 유도형 살해 세포 (CIK), 수지상 세포-사이토카인 유도형 살해 세포 (DC-CIK), 자연 살해 세포 (NK), γδT 세포, CD3AK, CAR-T 및 TCR-T로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이다.
일부 실시양태에서, 상기 항체 요법 약물은 항-PD1 항체, 항-PDL1 항체, 항-CTLA4 항체 및 항-CD 항원 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 상기 화학 약물은 알킬화제, 항대사성물질, 항종양 항생제, 식물성 항종양 약물, 호르몬 약물 및 기타 약물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이다.
상기 기타 약물은 L-아스파라기나제, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 다카바진, 헥사메틸멜라민 약물 및 상기 언급한 약물들의 유도체들로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 알킬화제는 사이클로포스파미드, 부설판, 다카바진, 시스플라틴, 메클로레타민, 페닐알라닌 머스타드, 니트로소우레아 및 전술한 약물들의 유도체들로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항대사성물질은 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트, 시타라빈, 사이클로시티딘, 하이드록시우레아 및 전술한 약물들의 유도체들로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항종양 항생제는 악티노마이신, 미토마이신, 빌리플라빈(biliflavin), 독소루비신, 다우노마이신, 닥티노마이신, 블레오마이신 및 전술한 약물들의 유도체들로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 호르몬 약물은 성 호르몬, 코르티코스테로이드 호르몬 및 전술한 약물들의 유도체들로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 점막 면역 흡수 또는 점막 부착을 촉진하는 물질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이다: 음이온성 계면활성제 (예컨대, 카복실레이트, 설포네이트, 설페이트, 포스페이트 등), 양이온성 계면활성제 (예컨대, 아민염, 4급 암모늄염, 헤테로사이클, 오늄염 등), 양성이온성 계면활성제 (예컨대, 카복실레이트 유형, 설포네이트 유형, 포스페이트 유형, 베타인 유형, 이미다졸린 유형, 아미노산 유형 등), 비이온성 계면활성제 (예컨대, 알킬 폴리글리코시드 유형, 폴리옥시에틸렌 유형, 폴리올 유형, 알카놀아미드 유형, 블록 폴리에테르 유형), 특수 계면활성제 (예컨대, 불소 함유형, 규소 함유형, 붕소 함유형, 중합체 유형 등), 킬레이트제 (예컨대, 폴리포스페이트, 아미노카복실산, 1,3-디케톤, 하이드록시카복실산, 폴리아민 등), 접착제(adhesives) [수용성 접착제 (예컨대, 전분, 덱스트린, 폴리비닐 알코올, 카르복시메틸셀룰로오스 등), 고온 용융형 접착제 (예컨대, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 등), 용매 접착제 (예컨대, 셸락, 부틸 고무 등), 에멀젼 접착제 (예컨대, 비닐 아세테이트 수지, 아크릴 수지, 염화 처리 고무 등), 무용매 액상 접착제 (예컨대, 에폭시 수지 등)], 폴리락트산-하이드록시 아세트산 공중합체, 덱스트란 및 다당류.
일부 실시양태에서, 면역 조절제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이다: 사이토카인, 케모카인, 줄기 세포 성장 인자, 림프독소, 조혈 인자, 콜로니 자극 인자 (CSF), 인터페론, 에리트로포이에틴, 혈소판 형성소, 종양 괴사 인자 (TNF), 인터루킨 (IL), 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 줄기 세포 성장 인자.
일부 실시양태에서, 병원성 항원은 종양, 바이러스, 박테리아, 균류 또는 기생충 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 종양은 하기를 포함한다: 뼈, 뼈 연결부, 근육, 폐, 기관(trachea), 인두, 코, 심장, 비장, 동맥, 정맥, 혈액, 모세혈관, 림프절, 림프관, 림프액, 구강, 인두, 식도, 위, 십이지장, 소장, 결장, 직장, 항문, 맹장, 간, 담낭, 췌장, 귀밑샘, 설하선, 비뇨기 신장, 수뇨관, 방광, 요도, 난소, 나팔관, 자궁, 질, 외음부, 음낭, 고환, 수정관, 음경, 눈, 귀, 코, 혀, 피부, 뇌, 뇌간, 연수, 척수, 뇌척수액, 신경, 갑상선, 부갑상선, 부신, 뇌하수체, 송과선, 췌장도, 흉선, 생식선, 설하선 및 귀밑샘 중 임의의 병변에서 발생하는 종양.
일부 실시양태에서, 박테리아는 하기 중 1종 이상을 포함한다: 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 리스테리아(Listeria), 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix), 레니박테리움(Renibacterium), 바실러스(Bacillus), 클로스트리듐(Clostridium), 마이코박테리움(Mycobacterium), 악티노마이세스(Actinomyces), 노카르디아(Nocardia), 코리네박테리움(Corynebacterium), 로도코커스(Rhodococcus), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 에리시펠라스 바실러스(erysipelas bacillus), 바실러스 테타니(Bacillus tetani), 리스테리아 모노사이토제네스(listeria monocytogenes), 바실러스 퍼프린젠스(Bacillus perfringens), 바실러스 강라에나에 엠피세마토사에(Bacillus gangraenae emphysematosae), 튜버컬로시스(tuberculosis), 에쉬리키아 콜라이(Escherichia coli), 박테리움 프로테우스(Bacterium proteus), 쉬겔라 디센테리아에(Shigella dysenteriae), 뉴모바실러스(Pneumobacillus), 박테리움 버게리(Bacterium burgeri), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 해모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 해모필러스 파라인플루엔자에(Haemophilus parainfluenzae), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis), 아시네토박터(Acinetobacter), 예르시니아(Yersinia), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 보르데텔라 파라페르투시스(Bordetella parapertussis), 쉬겔라, 파스퇴렐라(Pasteurella), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae) 및 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio Parahemolyticus).
일부 실시양태에서, 기생충은 소화관에 존재하는 기생충 [회충, 십이지장충, 촌충, 엔도아메바 히스톨리티카(endoamoeba histolytica) 및 얄의 편모(Yal’s flagellum) 등], 강내 기생충 [예컨대, 트리코모나스 버지날리스(trichomonas vaginalis)], 간내 기생충 [예컨대, 간디스토마, 에키노코커스(echinococcus)], 폐내 기생충 [예컨대, 파라고니무스 웨스테르마니(paragonimus westermani)], 뇌조직 기생충 [예컨대, 시스티세르쿠스 셀룰로사에(Cysticercus cellulosae), 톡소플라스마 곤디이(toxoplasma gondii)], 혈관내 기생충 (예컨대, 주혈흡충증), 림프내 기생충 (예컨대, 사상충), 근육 조직 기생충 [예컨대, 트리키넬라 라바에(Trichinella larvae)], 세포내 기생충 [예컨대, 말라리아 원충, 리슈마니아eishmania), 뼈 조직 기생충 (예컨대, 포충; 피부 기생충, 예를 들어 사르콥티드(sarcoptid), 모낭 진드기) 및 안구내 기생충 [예컨대, 동양안충(thelazia callipaeda), 시스티세르쿠스 셀룰로사에] 중 1종 이상이다.
일부 실시양태에서, 바이러스는 아데노 바이러스과, 아레나 바이러스과, 아스트로 바이러스과, 버냐 바이러스과, 칼리시 바이러스과, 플라비 바이러스과, 델타 간염 바이러스, 헤페바이러스과, 모노네가 바이러스목, 니도 바이러스목, 피코르나 바이러스과, 오르토믹소 바이러스과, 파필로마 바이러스과, 파르보 바이러스과, 폴리오마 바이러스과, 폭스 바이러스과, 레오 바이러스과, 레트로 바이러스과 또는 토가 바이러스과 중 1종 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 바이러스는 인간 파필로마 바이러스이다.
일부 실시양태에서, 균류는 하기 중 1종 이상을 포함한다: 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 콕시디오이데스 포사다시이(Coccidioides posadasii), 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 히스토플라스마 두보이시이(Histoplasma duboisii), 블라스토마이세스 로보(Blastomyces lobo), 파라콕시디오데스 브라실리엔시스(Paracoccidiodes brasiliensis), 블라스토마이세스 더마티티스(Blastomyces dermatitis), 스포로트릭스 쉔키이(Sporothrix schenckii), 페니실리움 마르네페이(Penicillium marneffei), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 루시타니아에(Candida lusitaniae), 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 아스퍼질러스(Aspergillus), 엑소피알라 진셀메이(Exophiala jeanselmei), 폰세카에아 페드로소이(Fonsecaea Pedrosoi), 폰세카에아 콤팩타(Fonsecaea compacta), 크로모마이세스 베루시포르미스(Chromomyces verruciformis), 피그멘타티온 더마티티스(Pigmentation dermatitis), 게오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum), 슈달레쉐리아 보이디이(Pseudallescheria boydii), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 트리코스포론 쿠타네움(Trichosporon Cutaneum), 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae), 뮤코 인디쿠스(Mucor indicus), 압시디아 코림비페라(Absidia corymbifera), 신세팔라스트룸 라세모숨(Syncephalastrum racemosum), 바시디오볼루스 라나룸(Basidiobolus ranarum), 코니디오볼루스 코로나투스(Conidiobolus coronatus), 코니디오볼루스 인콘그루스(Conidiobolus incongruus), 엔테로사이토준 비엔네우시(Enterocytozoon bieneusi), 엔세팔리토준 인테스티날리스(Encephalitozoon intestinalis), 리노스포리듐 세베리(Rhinosporidium seeberi), 히알로히포마이세트(hyalohyphomycete) 및 파에오히포마이세트(phaeohyphomycete).
일부 실시양태에서, 패턴 인식 수용체-리간드는 TLR 수용체-리간드, RLR 수용체-리간드, CLR 수용체-리간드 및 NLR 수용체-리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 상기 TLR 수용체에 결합하는 리간드는, 예를 들어 펩티도글리칸, 이당류, 만난, 지질펩타이드, 당지질, 비정형 지질다당류, 혈청 아밀로이드 단백질, CPG DNA, dsRNA, ssRNA, LPS, PGN, 포화 지방산, 리포테이코산, 레지스틴, 락토페린, 계면활성제 단백질, 플라젤린(flagellin), 히알루론산, RNA 관련 항원, 프로필린 유사 분자 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 RLR 수용체에 결합하는 리간드는. 예를 들어 RNA, PIC, PICLC, PIC12u 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 CLR 수용체에 결합하는 리간드는, 예를 들어 균류 세포벽 표면 상의 만노스 및 β-글루칸 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 NLR 수용체에 결합하는 리간드는, 예를 들어 MDP, Mesθ DAP 등을 포함한다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 면역 반응을 강화하기 위한 복합체를 제조하는 방법에 관한 것이기도 하다:
액상 반응계 중에서 폴리이노신-폴리시티딜산, 적어도 양이온성 안정화제 및 가용성 칼슘염을 접촉시키는 단계로서;
상기 양이온 안정화제가 분자량이 5 kDa 이하인 수용성 비-항생제 아미노 화합물이거나, 또는 상기 수용성 비-항생제 아미노 화합물, 및 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌이민, 엽산 및 갈락토스 중 1종 이상에 의해 형성된 그래프트인 것인, 단계.
일부 실시양태에서, 폴리이노신-폴리시티딜산은 염기쌍 형성 반응을 통해 폴리시티딜산과 폴리이노신산으로부터 제조된다.
일부 실시양태에서, 폴리시티딜산 및 폴리이노신산의 분자량은 23,000 달톤 초과이다.
일부 실시양태에서, 폴리시티딜산의 분자량은 66,000 달톤 내지 660,000 달톤 범위이다.
일부 실시양태에서, 폴리이노신산의 분자량은 66,000 달톤 내지 660,000 달톤 범위이다.
일부 실시양태에서, 상기 염기쌍 형성 반응은 40℃ 내지 50℃의 온도에서 수행하는데, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃ 또는 49℃도 추가로 선택할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 염기쌍 형성 반응은 6.8 내지 7.6의 pH에서 수행하는데, pH 7.0, 7.2, 7.4도 추가로 선택할 수 있다.
일부 실시양태에서, 접촉 전에, 폴리이노신-폴리시티딜산을 88℃ 내지 92℃에서 70분 내지 120분간 가열한다.
일부 실시양태에서, 상기 온도는 82℃, 84℃, 86℃, 88℃, 90℃, 92℃, 94℃, 96℃ 또는 98℃에서 추가로 선택할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 상기 가열은 80분, 90분, 100분 또는 110분에서 추가로 선택할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 상기 액상 반응계는 40℃ 내지 50℃의 온도로 유지하는데, 41℃, 42℃, 43℃, 44℃, 45℃, 46℃, 47℃, 48℃ 또는 49℃도 추가로 선택할 수 있다.
일부 실시양태에서, 그래프트의 제조 방법은 하기의 단계를 포함한다:
먼저, 카보닐 디이미다졸을 사용하여 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌이민, 엽산 및 갈락토스 중 1종 이상을 활성화시킨 후, 상기 활성화된 생성물을 이온성 액체 [bmim]Cl 중에서 수용성 비-항생제 아미노 화합물로 그래프팅시키는 단계.
일부 실시양태에서, 상기 그래프트는 키토산 올리고당류와 메톡시폴리에틸렌 글리콜의 그래프트로서, 먼저 카보닐 디이미다졸 (CDI)을 사용하여 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (MPEG)을 활성화시킨 후, 상기 활성화된 MPEG를 이온성 액체 [bmim]Cl 중에서 키토산 올리고당류 (COS)로 그래프팅시켜 제조한다.
일부 실시양태에서, 상기 그래프팅은 비산화성 분위기 하에 60℃ 내지 80℃에서 반응시킨다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:
해당 반응계에 틴들(Tyndall) 효과가 나타날 때까지, 수득된 복합체에 가교결합제 용액을 교반하면서 적가한 후, 교반하여 나노입자를 얻는 단계로서;
상기 가교결합제가 트리폴리인산나트륨, 알긴산나트륨, 페닐보론산 및 카테콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 단계.
일부 실시양태에서, 상기 가교결합제는 (병원체) 항원을 함유한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 복합체 또는 나노입자를 항원과 공동 인큐베이션(co-incubation)하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 항원은 단백질 또는 폴리펩타이드 항원이다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 또한 본 발명은 숙주에서 항원에 대한 생체내 면역 반응을 촉진하거나, 숙주에서 면역 세포 활성을 조절 및 강화하거나, 숙주의 피로를 감소시키는데 도움을 주거나, 또는 숙주의 통증을 경감시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 숙주에게 상술한 바와 같은 복합체, 또는 상술한 바와 같은 백신 조성물, 또는 상술한 바와 같은 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 숙주는 감염성 질환을 앓고 있어서, 상기 감염성 질환을 유발하는 병원체에 대한 면역 반응을 자극하기 위하여 항원 화합물이 투여된다.
일부 실시양태에서, 상기 투여는 비경구 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 피하 주사, 국소 투여, 경피 투여 또는 피내 투여로 수행된다.
일부 실시양태에서, 숙주는 수술, 화학요법, 방사선요법 또는 면역요법에 실패했거나 의료 기관에서 치료를 포기했던 종양 환자, 바이러스 감염 환자, 세균 감염 환자, 기생충 감염 환자 또는 비염 환자이다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 수술, 방사선요법, 화학요법 및 다양한 면역요법들과 병용하여 사용될 수 있고, 또한 바이러스 감염 환자, 박테리아 감염 환자 또는 기생충 감염 환자에 대한 통상적인 요법들과 병용하여 사용될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 통증은 미생물 또는 기생충 감염으로 인해 발생하거나, 암이나 신경병증 통증으로 인해 발생하는 것이다.
일부 실시양태에서, 항원이 바이러스, 박테리아, 균류 또는 기생충 항원인 경우, 약물은 매회 1 mg/kg 내지 8 mg/kg으로 투여되고, 다르게는, 바람직하게는 매일, 2일 마다, 3일 마다 또는 4일 마다 1회 투여되며;
항원이 종양 항원인 경우에는, 매회 1 mg/kg 내지 10 mg/kg으로 투여하며, 바람직하게는 적어도 360일, 적어도 180일, 적어도 60일 또는 적어도 30일의 기간 동안 투여한다.
본 개시내용은 본 개시내용의 방법에 따라서 제조된 면역 반응 강화용 복합체를 제공한다.
본 개시내용은 항체, 백신 제제 또는 백신 조성물을 제조하거나, 면역 세포 활성을 강화하거나, 종양, 바이러스, 박테리아, 균류(fungus), 기생충을 치료 및/또는 예방하고, 화학요법의 부작용을 감소시키며, 피로에 저항하거나 면역성을 개선하고, 숙주의 통증을 완화시키며, 숙주의 항원에 대한 면역 반응을 촉진시키기 위한, 본 개시내용의 방법에 따라서 제조된 면역 반응 강화용 복합체의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태들을 실시예들과 함께 아래에서 상세히 설명할 것이지만, 당업자라면 누구나 하기의 실시예들이 본 발명을 단지 예시하기 위한 것일 뿐이고, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다는 점에 대해서는 주지하고 있을 것이다. 구체적인 조건이 적시되지 않은 실시예들은 종래의 조건이나 제조업체가 권장하는 조건에 따라 수행하였다. 제조업체 표시없이 사용된 시약 또는 장비들은 모두 시판중인 기존의 제품들이다.
실시예 1: 파미카(Pamica)의 제조
Ⅰ. 파미카 복합체의 제조
1. PBS 용액(pH 7.2)의 제조:
1.1 염화나트륨 용액(0.85%, 1500ml)의 제조: 12.75g의 염화나트륨을 칭량하고, 2000ml의 측정 실린더에 첨가하고, 물 주입에 의해 1500ml로 고정시키고;
1.2 인산수소이나트륨 용액(0.006 mol/L, 500ml)의 제조: 0.4259g(0.006×0.5×141.96)의 인산수소이나트륨을 칭량하고, 500ml의 용량 플라스크에 첨가하고, 0.85%의 염수로 500ml로 희석하였고;
1.3 인산이수소나트륨 용액(0.006 mol/L, 500ml)의 제조: 0.4140g(0.006×0.5×137.99)의 인산이수소나트륨을 칭량하고, 500ml의 용량 플라스크에 첨가하고, 0.85%의 염수로 500ml로 희석하였고;
1.4 7.2의 pH를 갖는 PBS 용액의 제조: 273.6ml의 "1.2의 용액"을 126.4ml의 "1.3의 용액"과 혼합한다.
2. PIC 용액(2.0mg/ml, 100ml)의 제조:
2.1 114.5mg(2.0mg/ml*100ml*[1.04/(1.04+1)]×/91.5%/(1-2.7%))의 PI를 칭량하고, 250ml의 삼각형 플라스크에 첨가하고, 50ml의 PBS 용액을 첨가하여 용해시키고, 40℃ 내지 60℃의 수조에서 평형화시켰다;
2.2 113.2mg(2.0mg/ml*100ml*[1/(1.04+1)]/90.4%/(1-4.2%))의 PC를 칭량하고, 250ml의 삼각형 플라스크에 첨가하고, 50ml의 PBS 용액을 첨가하여 용해시키고, 40℃ 내지 60℃의 수조에서 평형화시켰다;
2.3 PIC 용액의 제조: 50ml의 PI 용액을 50ml의 PC 용액에 부었고, 혼합물을 30분 동안 45℃의 수조에서 반응시켰다.
2.4 PIC 용액을 15분 내지 300분 동안 80℃ 내지 99℃에서 가열하였다.
3. 염화칼슘 용액(0.16 mol/L, 25ml)의 제조:
0.5881g의 CaCl2.2H2O(MW: 147.02)을 칭량하고, 100ml의 삼각형 플라스크에 첨가하고, 주사용수 약 25ml를 첨가하여 용해시키고, 100ml로 희석하였다.
4. COS-g-MPEG의 제조:
COS-g-MPEG 그래프트를 제조하는 방법은 아래와 같다: 키토산 올리고당 그래프팅된 메톡시폴리에틸렌 글리콜(COS-g-MPEG) 그래프트 공중합체를 제조하고 항암 약물의 제조를 위한 부형제로서 사용하였다.
원리: 카보닐 디이미다졸(CDI) 커플링을 COS-g-MPEG의 제조를 위해 사용한다. 먼저, 메톡시폴리에틸렌 글리콜(MPEG)을 카보닐 디이미다졸로 활성화하여 활성화 MPEG를 제조하고, 그 다음 활성화 MPEG를 이온성 액체에서 키토산 올리고당(COS)과 반응시켜 COS-g-MPEG 공중합체를 합성한다. 특정 반응은 다음의 3개의 단계들을 포함한다:
4.1 이온성 액체 1-부틸-3-메틸이미다졸 클로라이드 염([BMIM]Cl)의 제조
1-메틸 이미다졸을 클로로부탄과 반응시켜 이온성 액체 [BMIM]Cl를 제조하고, 합성 반응식은 아래와 같다:.
Figure pct00001
4.2 메톡시폴리에틸렌 글리콜(MPEG, 분자량: 1000)의 활성화
MPEG를 CDI로 활성화하고, 합성 반응식은 아래와 같다:
Figure pct00002
4.3 COS-g-MPEG 공중합체의 합성;
활성화 MPEG를 그래프팅하고, 이온성 액체에서 COS와 중합하고, 합성 반응식은 아래와 같다:
Figure pct00003
4.4 장비 및 시약:
메틸 이미다졸, 클로로부탄, 톨루엔, 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 카보닐 디이미다졸, 무수 에테르, 4Å 분자체(2mm 내지 3mm), 디메틸 설폭사이드, 1,4-디옥산, 키토산 올리고당, 집열식 온도조절 자기 가열 교반기(DF-101S 유형), 전자 저울, 전열 블라스트 건조 오븐, 순환수 진공 펌프, 자동 삼중 순수 증류기, 진공 건조 오븐, 동결 건조기, 유리 기구 기류 건조기, 단일-상 커패시터 시동 모터, 로터리 베인 진공 펌프, 섹스튜플(sextuple) 자기 가열식 교반기, 셀룰로오스 투석용 백, 사용 준비된 투석용 백 45-2000RC 멤브레인, 3-구 플라스크(500ml, 1000ml), 유리 스토퍼, 자석 교반 막대, 일회용 종이컵, 500ml 비이커, 2 L 비이커, 일회용 점적기, 약제용 스푼, 시약 병, 데시케이터, 등.
4.5 제조:
4.5.1 증류수의 제조
Z-97A 자동 삼중 순수 증류기를 사용하여 증류수를 3회 제조하였다.
4.5.2 유리제품의 세척
3-구 플라스크, 유리 스토퍼, 페트리 접시, 및 자석 교반 막대 등을 먼저 수돗물로 세정하고, 그 다음 증류수로 3회 린스하고, 마지막으로 유리 기구 기류 건조기에서 건조시켰다.
4.5.3 용매 건조: 일회용 비이커에 적당한 양의 분자체를 첨가하고, 그 다음 적당한 양의 디메틸 설폭사이드, 1,4-디옥산, 및 무수 에테르를 첨가하고, 물을 제거하였다.
4.5.4 무수 에테르 사전 동결.
4.6. 작동(각 단계에서의 주목점):
4.6.1 이온성 액체의 제조
(1) 500ml의 3-구 플라스크에 100g의 1-메틸이미다졸 및 148.5ml의 클로로부탄을 차례로 첨가하였다. 콘덴서를 플라스크에 설치하고, 아르곤을 30분 동안 도입하였다. 용액을 자기적으로 교반하고, 그 다음 오일욕에서 80℃로 가열하고, 24시간 동안 반응시켰다;
(2) 반응의 완료 후, 플라스크를 꺼내고, 용액을 실온으로 냉각시키고, 2시간 동안 -18℃의 냉장고에서 냉동시켰다. 용액의 층화를 관찰할 수 있고, 그 다음 상청액을 버렸다(주로 클로로부탄 제거를 위해);
(3) 나머지를 80℃의 블라스트 건조 오븐에 넣고, 고체가 완전히 용융된 후, 뜨거울 때 적당한 양의 톨루엔을 첨가하고, 진탕시켜 톨루엔을 용액과 철저하게 혼합하였다. 그 다음, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 냉장고에서 냉동시키고, 그 다음 꺼내고, 상청액을 버렸다(1-메틸이미다졸 및 클로로부탄을 톨루엔에 용해시키고, 톨루엔, 1-메틸이미다졸 및 클로로부탄을 제거하였다);
(4) 미반응된 클로로부탄의 완전한 제거를 위해 단계(3)을 2회 반복하였고;
(5) 샘플을 진공 건조 오븐에 넣고, 90℃로 가열하였다. 완전히 용융된 후, 샘플을 8시간 동안 90℃에서 진공에서 건조시키고(톨루엔 제거를 위해), 그 다음 꺼내고, 실온으로 냉각시키기 위해 방치한 다음, 사용을 위해 데시케이터에 넣었다.
4.6.2 MPEG의 활성화
(1) 10ml의 디메틸 설폭사이드 및 20ml의 1,4-디옥산을 500ml의 3-구 플라스크에 첨가하고, 자기적으로 교반하였다. 20g의 MPEG를 첨가하고, MPEG가 완전히 용융된 후, 3.24g의 CDI를 첨가하였다. 혼합물을 수조에서 37℃로 가열하고, 18시간 동안 반응시켰다;
(2) 반응의 완료 후, 자기적으로 교반하면서 샘플을 빙수욕에서 사전-냉각된 무수 에테르에 첨가하고, 비이커의 개구를 보존 필름으로 덮고, 그 다음 샘플을 30분 동안 냉장고에 넣었다;
(3) 샘플을 30분 후에 꺼내고, 상청 용액을 버렸다. 사전-냉각된 무수 에테르를 침전물에 첨가하고, 30분 동안 자기적으로 교반하고, 그 다음 혼합물을 30분 동안 냉장고에 넣었다.
(4) 단계(3)을 2회 반복하여 미반응된 CDI를 충분히 세정 제거하였고;
(5) 상청 용액을 버리고, 나머지를 6시간 동안 40℃의 블라스트 건조 오븐에 넣어 에테르를 미리 제거하였고;
(6) 잔류물을 40℃의 진공 건조 오븐에 넣었고, 2.5시간 동안 진공에서 건조시켜 에테르를 완전히 제거하고, 그 다음 꺼내고, 실온으로 냉각시키기 위해 방치한 다음, 사용을 위해 데시케이터에 넣었다.
4.6.3 COS-g-MPEG의 제조:
(1) 이온성 액체를 80℃의 블라스트 건조 오븐에서 용융시켰다;
(2) 105g의 이온성 액체를 칭량하고, 3-구 플라스크에 첨가하고, 오일욕에서 70℃로 가열하였다. 아르곤을 도입하고, 9g의 COS를 천천히 첨가하였다. COS가 완전히 용해된 후, 6g의 활성화 MPEG를 첨가하고 혼합물을 자기적으로 교반하였다. 모든 원료를 첨가한 후, 혼합물을 아르곤의 보호 하에 6시간 동안 반응시켰다. 반응의 완료 후, 반응 용기를 실온으로 냉각시켰다;
(3) 먼저, 투석용 백을 클립으로 측면에서 클램핑(clamping)하고, 적당한 양의 증류수를 첨가하여 투석용 백을 3회 세정하고, 투석용 백으로부터 누수 여부를 점검하였다. 그 다음, 반응 용기 내의 샘플을 투석용 백에 넣고(분자량 컷-오프: 2000), 그리고 72시간 동안 투석하였으며, 증류수는 투석용 백을 침지시키기에 적합한 양이다. 물을 첫 날에 2시간 내지 3시간마다, 그 다음 12시간마다 다시 채웠다.
(4) 투석의 완료 후, 용액을 1000ml의 3-구 플라스크에 첨가하고, 수조에 넣었다. 진공 증류 장치를 잘 설치하고, 증류 온도를 실온에서 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃로 구배적으로 상승시켰다. 약 50ml의 용액이 남을 때까지 증류를 계속한 다음, 증류 장치를 제거하였다. 뜨거울 때 샘플을 일회용 비이커에 부었다. 비이커의 개구를 일회용 장갑으로 덮고, 샘플을 냉장고에서 8시간 이상 냉동하였다.
(5) 동결 건조기를 30분 동안 사전냉각하여, 냉동 온도가 -52℃에 도달하도록 하였다. 샘플을 분쇄하고, 페트리 접시에 펴고 평평하게 만들었다. 페트리 접시를 사전냉각된 동결 건조기에 넣고, 30분 동안 -52℃에서 냉동건조하였다. 동결의 완료 후, 동결 건조기를 끄고, 샘플을 꺼내고, 칭량하고, 시약 백에 넣은 다음, 데시케이터에서 보관하였다.
(6) 적외선 분석: 적당한 양의 샘플을 취하고, 브롬화칼륨과 함께 타정하였다. 샘플의 적외선 스펙트럼을 400 cm-1 내지 4000 cm-1의 스캔 면적으로 측정하였다.
5. PBS 중 COS-g-MPEG 용액의 제조:
5.1 5.12%: 0.128g의 COS-g-MPEG를 칭량하고, 5ml의 원심관에 첨가하고, PBS 용액을 첨가하여 용해시키고, 2.5ml로 희석하였다;
5.2 2.56%: 1.2ml의 5.12% 용액 + 1.2ml의 PBS 용액;
5.3 1.28%: 1.2ml의 2.56% 용액 + 1.2ml의 PBS 용액;
5.4 0.64%: 1.2ml의 1.28% 용액 + 1.2ml의 PBS 용액;
5.5 0.32%: 1.2ml의 0.64% 용액 + 1.2ml의 PBS 용액;
5.6 0.16%: 1.2ml의 0.32% 용액 + 1.2ml의 PBS 용액;
6. PIC, COS-g-MPEG 및 염화칼슘 용액의 파미카 용액 제조:
6.1 1.0ml의 PIC 용액을 45℃에서 수조에 넣고, 1.0ml의 5.1을 적가하고, 그 다음 0.005ml의 염화칼슘 용액을 첨가하여 그것의 최종 농도가 0.0004mol/L가 되도록 하였다.
6.2 1.0ml의 PIC 용액을 45℃에서 수조에 넣고, 1.0ml의 5.2를 적가하고, 그 다음 0.005ml의 염화칼슘 용액을 첨가하여 그것의 최종 농도가 0.0004mol/L가 되도록 하였다.
6.3 1.0ml의 PIC 용액을 45℃에서 수조에 넣고, 1.0ml의 5.3을 적가하고, 그 다음 0.005ml의 염화칼슘 용액을 첨가하여 그것의 최종 농도가 0.0004mol/L가 되도록 하였다.
6.4 1.0ml의 PIC 용액을 45℃에서 수조에 넣고, 1.0ml의 5.4를 적가하고, 그 다음 0.005ml의 염화칼슘 용액을 첨가하여 그것의 최종 농도가 0.0004mol/L가 되도록 하였다.
6.5 1.0ml의 PIC 용액을 45℃에서 수조에 넣고, 1.0ml의 5.5를 적가하고, 그 다음 0.005ml의 염화칼슘 용액을 첨가하여 그것의 최종 농도가 0.0004mol/L가 되도록 하였다.
6.6 1.0ml의 PIC 용액을 45℃에서 수조에 넣고, 1.0ml의 5.6을 적가하고, 그 다음 0.005ml의 염화칼슘 용액을 첨가하여 그것의 최종 농도가 0.0004mol/L가 되도록 하였다.
7. 결과
MPEG, PEG, PEI 등 모두는 양호한 수용해도를 가지며, 많은 유기 성분과의 양호한 상용성을 갖는다. 이 실시예에서, MPEG를 예로 들면, MPEG와 양이온성 안정화제(예컨대 키토산 올리고당)와의 그래프트가 PIC로 제조될 때 상용성이 상당히 증가하였다. 이론상, PEG(등)-그래프팅된 양이온성 안정화제, 예컨대 키토산이 PIC로 제조되면, 상용성은 또한 증가할 것이고; 양이온성 안정화제가 PEG로 그래프팅된 후, 그래프트 그 자체는 PEG의 특성도 가질 것이다.
Figure pct00004
시험 결과로부터, 용액은 1: 25.6mg의 PIC: COS-g-MPEG에서 여전히 맑다는 것을 보여주지만, 농색(hyperchromic) 효과에 대한 결과는 더 많은 그래프트가 더 나은 것을 의미하지 않는다는 것을 보여준다. 또한 6.1, 6, 6.3, 6.4, 6.5 및 6.6의 샘플을 2018년 5월 7일에 제조한 후 실온에서 방치하였고, 2018년 5월 14일에 플레이크 침전물이 6.6의 샘플에 나타나서 다시 용해될 수 없다는 것이 관찰되었다. 포괄적인 고려에 기초하여, 파미카 제형 중 PIC 대 COS-g-MPEG의 비는 1mg : 6.4mg의 범위 내에서 제한된다.
Ⅱ. 파미카 나노입자의 제조
의료 표준을 갖는 트리폴리인산나트륨(TPP)를 구매하였다. 적당한 비의 PIC-COS-g-MPEG-CaCl2 복합체를 일정 속도로 항온 자석 교반기로 교반하고, 상이한 농도의 TPP 수용액을 적가하였다. 명백한 유백색이 관찰되는 즉시 적가를 중단하고, 반응을 30분 동안 유지하였다. 1000nm 미만의 입자 크기를 갖는 나노입자를 이온 가교결합을 통한 자가-조립으로 형성하였고, 고속 원심분리로 수득하였다. 나노입자는 다양한 시험에서 적격인 것으로 검증되었다.
Ⅲ. 폴리펩타이드 또는 단백질 항원 나노입자
반응식 1: 폴리펩타이드 또는 단백질 항원을 상기 언급된 나노입자의 형성 동안에 첨가하였다: 각각의 성분을 PEG-COS 그래프트 또는 COS 매트릭스에 혼입하고, 폴리펩타이드 또는 단백질 항원이 TPP를 함유하는 수성상에 들어가서 결합되었다. 각각의 성분은 자기 비드로 교반하면서 적합한 비 및 pH에서 결합되어 복합체 및 나노입자를 형성해야 한다.
반응식 2: 폴리펩타이드 또는 단백질 항원을 상기 언급된 사전-형성된 복합체 및 나노입자와 함께 인큐베이션하여, 폴리펩타이드 또는 단백질 항원을 복합체 및 나노입자의 표면 상에서 결합하거나, 또는 폴리펩타이드 또는 단백질 항원을 일정한 비로 상기 언급된 복합체 및 나노입자와 혼합하였다. 혼합물을 5분 동안 자기적으로 교반하고, 실온에서 1시간 동안 방치하고, 2 시간 동안 4℃에서 20,000 rcf에서 글리세롤 매트릭스 하에 초원심분리하고, 그 다음 폴리펩타이드 또는 단백질 항원 나노입자를 수득하였다.
반응식 1/반응식 2의 복합체 및 나노입자는 다양한 시험에서 적격인 것으로 검증될 필요가 있다.
Ⅳ. 파미카의 제형
상기 언급된 복합체/그래프트를 포함하는 복합체/복합체 나노입자/폴리펩타이드 또는 단백질 항원 나노입자를 적합한/적격 포장재에 무균적으로 포장하여 다양한 투여 형태 예컨대 주사, 스프레이 또는 에어로졸을 제조하고, 다양한 제품 시험에서 적격인 것으로 검증된 후 다양한 제품으로 제조하였다.
상기 언급된 복합체/그래프트를 포함하는 복합체/복합체 나노입자/폴리펩타이드 또는 단백질 항원 나노입자를 적합한/적격 포장재에 무균적으로 포장하고, 연고로 제조하였다.
스프레이 제조의 예: 파미카를 상기 방법에 따라 제조하고, 파미카 용액을 분무 병에 넣었다. 의료 용액의 분무 패턴 검출 및 액적 분포의 데이터 검출을 각각 20 병의 파미카 용액에 대해 수행하였다.
분무 패턴은 하기의 표에 나타낸다:
Figure pct00005
액적 분포는 하기의 표에 나타낸다:
Figure pct00006
실시예 2: 용해도를 증가시키기 위한 PEI와 조합된 파미카의 시험
"PEG와 조합된 파미카"의 제조 방법(즉, 실시예 1)을 참조하여 제조를 수행하였다. 파미카 중 COS의 양을 증가시킨 후, 침전이 나타났는데, 이는 투여의 균일성에 영향을 미쳤다. PEI를 첨가한 후에는 침전을 피할 수 있고, COS의 투여량을 증가시켜 그의 면역 효과를 추가로 향상시켰다.
Figure pct00007
실험은 파미카가 PEI와 조합된 후, PIC 중 COS의 용해도가 1.6mg/ml에서 6.4mg/mL로 증가하였고, 이는 적어도 4배 증가하였다는 것을 명백하게 보여준다.
특허 공개 제CN105396130A호는 "PIC-아미노 화합물-CaCl2 아쥬반트 및 PIC-아미노산 화합물-CaCl2 아쥬반트를 포함하는 백신"을 개시하고, 비-항생제 아미노 화합물이 선택적으로 키토산일 수 있음을 개시한다.
본 비교예에서, 수용성 키토산(키토산 하이드로클로라이드, 약어로 CS)을 사용하여 실시예 1의 키토산 올리고당을 대체하여, 투여 균일성에 대한 수용성 키토산 및 키토산 올리고당의 효과를 비교하였다. 결과는 하기 표에 나타낸다.
Figure pct00008
연구는, 수용성 키토산의 첨가가 제조 동안 진탕에 의해 분산될 수 없는 침전을 유도하여, 투여 균일성에 영향을 미치는 반면, 키토산 올리고당이 상기 문제를 해결하기 위해 사용될 수 있음을 발견하였다. 또한, 키토산 그래프팅된 PEG 또는 수용성 키토산은 모두 인체에 흡수되기 쉽도록 작은 분자량을 갖는 키토산 올리고당으로 분해될 필요가 있지만, 키토산 올리고당은 직접 흡수될 수 있다.
실시예 3: PIC 가열 및 분자량 검출
PIC 용액을 실시예 1의 제조 방법에 따라 제조하였고, 260ml의 PIC 용액을 20 ml/튜브로 총 13개의 튜브로 나누었다. 12개의 샘플 튜브를 그의 온도가 80℃ 내지 99℃(바람직하게는 90℃)로 상승하였을 때 항온 수조에 넣었다. 튜브를 수조에 넣은 후, 타이밍을 시작하고, 1개의 튜브를 10 분(밴드 3), 20 분(밴드 4), 30 분(밴드 5), 40 분(밴드 6), 50 분(밴드 7), 60 분(밴드 9), 70 분(밴드 10), 80 분(밴드 11), 90 분(밴드 12), 100 분(밴드 13), 110 분(밴드 14) 및 120 분(밴드 15) 각각에 꺼내었다. 밴드 2의 샘플은 가열되지 않는다.
70 내지 120분 동안 가열된(바람직하게는 120분 동안 가열된) PIC에 의해 제조된 복합체(파미카) 및 이의 백신은 ["1141 Abnormal Toxicity Test", PHARMACOPOEIA OF THE PEOPLE'S REPUBLIC OF CHINA, the 4th vol., 2015]에 따라 마우스 및 기니아 피그(guinea pig)에서 비정상 독성의 검출을 통과할 수 있다. 파미카를 제조하는데 사용되는 PIC는 제품 제조에 사용되기 전에 적어도 70분 동안 90℃에서, 바람직하게는 120분 동안 90℃에서 가열되어야 한다. 미가열 PIC(밴드 2)에 의해 제조되고 60분 동안 가열(밴드 9)함으로써 제조된 선택된 복합체 및 그의 백신은 기니아 피그에서 비정상 독성의 검출을 통과할 수 없다. 결과는 도 2에 도시되어 있다. 최하부로부터 최상부로의 비교 밴드 1: 100 bp, 300 bp, 500 bp, 750 bp, 1000 bp, 1500 bp, 2000 bp, 3000 bp, 5000 bp. 최하부로부터 최상부로의 비교 밴드 8: 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1000 bp.
실시예 4: 파미카 복합체의 효소 분해 시험
방법: 파미카 복합체를 본 개시내용의 실시예 1의 제조 방법에 따라 제조하였다. 제조 완료 후, 파미카 복합체 및 폴리이노신-폴리시티딜산 주사(폴리이노신-폴리시티딜산-카나마이신-염화칼슘)의 각 샘플을 각각 0.04mg/ml로 희석하였다. 5ml의 샘플 희석제를 13개의 튜브(각 10ml) 각각에 첨가한 다음, sigma로부터의 25μg의 RNase(Cat. 번호 R4642)을 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 37℃의 수조에 넣었다. 1개의 튜브를 5분마다 꺼내어서 248 nm에서 OD 값을 측정하고, 곡선을 그렸다.
결과는 도 3에 도시되어 있다.
실시예 5: 본 개시내용의 파미카 복합체는 새로운 구조를 갖는 복합체이다
(1) 용융 곡선 피크의 결정
방법: 본 개시내용의 파미카 복합체 및 폴리이노신-폴리시티딜산 주사의 각 샘플을 0.04mg/ml로 희석한 그 다음, 250ml의 시약 병으로 옮겼다. 시약 병을 수조에 넣고, 수조를 계속 가열하였다. 3ml의 각 샘플을 5℃마다 꺼내고, 석영 큐벳에 넣었다. 248 nm에서의 OD 값을 측정하고, 곡선을 그렸다.
결과는 도 4에 도시되어 있다.
시험 결과는, 본 개시내용의 파미카 복합체(PIC-양이온성 안정화제-염화칼슘)가 85℃에서 용융 곡선 피크를 가지며, 폴리이노신-폴리시티딜산 주사(PIC-카나마이신-염화칼슘)는 80℃에서 용융 곡선 피크를 가짐을 보여주는데, 이는 본 개시내용의 파미카 복합체가 새로운 복합체임을 나타낸다.
(2) 흡수 피크 스캐닝
PI 용액, PC 용액, PIC 용액, PIC-COS 용액, PIC-COS-CaCl2 용액을 각각 실시예 1의 제조 방법에 따라 제조하였다. 상기 샘플을 PBS 완충액으로 0.04mg/ml로 희석하고, 주사 흡수 스펙트럼을 자외선으로 별도로 측정하였다. 도 5는, 높은 것에서 낮은 것까지 240nm 내지 260nm에서 나타나는 피크가 PI, PC, PIC, PIC-COS, PIC-COS-CaCl2의 피크이고, 이들 피크 중, PIC-COS 및 PIC-COS-CaCl2의 피크는 중첩되어 있음을 보여주며, 이는 본 개시내용의 파미카 복합체(PIC-COS-CaCl2)가 새로운 구조를 갖는 복합체임을 나타낸다.
실시예 6: PIC, COS 및 염화칼슘에 의해 형성된 부분 나노입자
양이온성 안정화제로 COS를 선택하고, 금속 양이온으로 염화칼슘을 선택한 실시예 1의 방법에 따라 파미카를 제조하였다. 나노입자가 파미카 용액에서 형성되었음을 투과 전자 현미경사진에서 알 수 있다(도 6 및 도 7). 대부분의 나노입자는 구형이고, 비교적으로 균일하고, 입자 크기는 약 50nm이며, 그리고 일부 나노입자는 100nm 초과의 측면 길이를 갖는 정사각형이다.
실시예 7: PIC, COS-g-MPEG 및 염화칼슘에 의해 형성된 부분 나노입자
양이온성 안정화제로 COS-g-MPEG를 선택하고, 염화칼슘을 금속 양이온으로 선택하는 실시예 1의 방법에 따라 파미카를 제조하였다. 대부분은 100nm 초과의 측면 길이를 갖는 정사각형이고, 몇몇은 구형인 나노입자가 파미카 용액에서 형성되었음을 투과 전자 현미경사진에서 알 수 있다(도 8 및 도 9).
실시예 8: PIC, COS, TPP 및 염화칼슘에 의해 형성된 부분 나노입자
COS를 포스페이트 완충 용액에 용해시키고, TPP 중 PIC의 용액을 실시예 1의 방법에 따라 제조하였다. TPP 중 PIC의 용액을 교반 하에 COS 용액에 천천히 적가하고, 그 다음 염화칼슘 용액을 적가하였다. 형성된 나노입자가 방추형임을 투과 전자 현미경사진에서 알 수 있다(도 10, 도 11).
실시예 5 내지 8을 통해, 놀랍게도, 파미카 복합체 용액은 두 가지 상태의 물질을 동시에 함유하는 것으로 밝혀질 수 있으며, 하나는 나노입자(전자 현미경검사의 결과)이고 다른 하나는 비-나노입자(실시예 3의 전기영동 결과) 용액이다.
나노입자의 이점은, 이들이 세포내이입(endocytosis) 없이 세포막에 직접 침투하여 세포에 들어갈 수 있고, 신속하게 작동할 수 있다는 것이고; 비-나노입자 용액은 세포내 이입을 통해 세포에만 들어갈 수 있으며, 나노입자보다 더 느리게 작동할 수 있다는 것이다. 파미카는 2가지 방식으로 그의 효과를 발휘할 수 있다: 세포내이입 및 세포 내로의 직접 진입. 또한, 더욱 중요하게는, 나노입자는 항바이러스 및 항종양에서 돌파구를 찾기 위해 영장류 및 인간을 포함하는 영장류보다 더 고등동물의 혈청에서 리보뉴클레아제에 의한 PIC의 분해로부터 파미카를 보호할 수 있고 더 큰 효과를 갖는 구조를 갖는다. 이러한 효과는 파미카가 인간 및 마우스의 항암에 대해 현저한 효과를 갖도록 한다.
실험예: 파미카 복합체의 면역 효과의 평가
다음의 실험예에서, 파미카는 달리 언급되지 않는 한 실시예 1에 따라 제조된 PIC, COS 및 염화칼슘 용액의 파미카 용액을 지칭한다.
실험예 1: 재조합 B형 간염 백신[rHBsAg(CHO)]에 대한 파미카 복합체의 면역 효과의 평가
물질: rHBsAg(CHO): 20 ug/ml; 파미카 아쥬반트: 1mg/ml; ADV20 아쥬반트: 400 ug/ml; 수산화알루미늄 아쥬반트: 10mg/ml; 염수.
알루미늄 아쥬반트/rHBsAg(CHO): 알루미늄 아쥬반트 0.07ml + rHBsAg(CHO) 0.5ml + 염수 0.43ml
ADV20(사이토카인 아쥬반트)/rHBsAg(CHO): ADV20 0.25ml + rHBsAg(CHO) 0.5ml + 염수 0.25ml
파미카 아쥬반트/rHBsAg(CHO): 파미카 아쥬반트 0.5ml + rHBsAg(CHO) 0.5ml
방법: 0일 및 14일째에 0.1ml의 알루미늄 아쥬반트/rHBsAg(CHO), ADV20(사이토카인 아쥬반트)/rHBsAg(CHO), 파미카/rHBsAg(CHO) 각각으로 마우스를 근육내 면역화하고, 21일째에 세포성 면역 및 체액성 면역에 대해 검출하였다.
결과: 본 개시내용의 파미카 복합체는 뛰어난 면역 효과를 가지며; 특히, ELISA 항체 및 세포성 면역은 크게 개선되며, 이는 알루미늄 아쥬반트 및 ADV20(사이토카인 아쥬반트)보다 상당히 우수하다. 파미카는 유망한 면역 아쥬반트이고, 세부사항은 도 12 및 도 13를 참조한다.
실험예 2: 파미카 복합체 및 불활성화 박테리움 버게리 ( Bacterium burgeri ) 항원의 면역 효과의 평가
방법: PBS, 폴리이노신-폴리시티딜산 주사 + 불활성화 박테리움 버게리(Bacterium burgeri) 항원, 본 개시내용의 파미카 복합체 + 불활성화 박테리움 버게리 항원 각각으로 마우스를 면역화하였으며, 0일에 1회 면역화하고, 45일 동안 면역화한 후 브루셀라 독성 균주를 사용하여 마우스를 공격하였다. 15일 동안 챌린지(challenge)한 후, 마우스를 치사시켜 마우스의 비장을 분리하고, 비장 내의 박테리움 버게리를 3일 동안 배양하고, 계수한 다음, 본 개시내용의 파미카 복합체 + 불활성화 박테리움 버게리 항원의 보호 효능을 평가하였다.
Figure pct00009
결과: 본 개시내용의 파미카 복합체는 뛰어난 면역 효과를 가지며 불활성화 박테리움 버게리 항원의 개발에 대한 전망을 갖는다. 본 개시내용의 파미카 복합체 + 불활성화 박테리움 버게리 항원을 사용하는 단리된 박테리아의 수는 공시험 대조군을 사용하는 것과 로그값으로 3.03의 차이가 나고 폴리이노신-폴리시티딜산 주사 + 불활성화 박테리움 버게리 항원을 사용하는 것과 1.35의 차이가 난다. 파미카 복합체 및 불활성화 박테리움 버게리는 뛰어난 보호 효과를 갖는다.
실험예 3: 항체의 제조에서 파미카 복합체 및 MYO 항원(인간 미오글로빈)의 용도
물질: 1mg/ml의 농도를 갖는 MYO 항원(인간 미오글로빈),
1mg/ml의 농도를 갖는 본 개시내용의 파미카 복합체,
완전 프로인트(Freund) 아쥬반트(CFA, Sigma)
방법: 2.3 kg 내지 2.5 kg 토끼의 음성 혈액을 수집하고, 면역화 전에 대조군으로 혈청을 분리하였다. 몇 개의 부위의 복부 및 등에 피하로 상이한 샘플을 주사한 후, 혈청을 항체 검출을 위해 분리하였다. 항원 + 아쥬반트를 0.5ml + 0.5ml로 제조하였으며, 각 면역화시 투여량은 1ml였다.
결과:
(1) 토끼를 본 개시내용의 파미카 복합체 + MYO 항원, 완전 프로인트 아쥬반트 + MYO 항원으로 7일마다 1회 면역화하였다. 완전 프로인트 아쥬반트를 2회(10일) 동안 면역화를 위해 13,000의 ELTSA 항체 역가로 첨가하였고; 완전 프로인트 아쥬반트를 3회(18일) 동안 면역화를 위해 39,000의 ELTSA 항체 역가로 첨가하였고; 완전 프로인트 아쥬반트를 6회(3개월) 동안 면역화를 위해 25,000의 ELTSA 항체 역가로 첨가하였고; 본 개시내용의 파미카 복합체를 2회(10일) 동안 면역화를 위해 45,000의 ELTSA 항체 역가로, 3회(18일) 동안 면역화를 위해 51,000의 ELTSA 항체 역가로, 그리고 3회(3개월) 동안 면역화를 위해 36,000의 ELTSA 항체 역가로 첨가하였다. 파미카 아쥬반트는 MYO 항원에 대한 초기 단계에서 비교적 높은 항체 역가 및 더 나은 면역화 지속시간을 갖는데, 이는 본 개시내용의 파미카 복합체가 MYO 항원에 대한 면역 아주반트의 최적 표준으로서 완전 프로인트 아쥬반트보다 상당히 더 우수하다는 것을 나타내며, 상세한 설명은 도 14를 참조한다.
(2) 토끼를 MYO 항원에 대해 완전 프로인트 아쥬반트와 조합된 본 개시내용의 파미카 복합체로 2회 면역화하고(0일에 1회 면역화하고, 14일째에 1회 면역화함), ELISA 항체 역가(면역화 35일 후)는 완전 프로인트 아쥬반트를 사용함으로써 10,000이고, 본 개시내용의 파미카 복합체를 사용함으로써 60,000이며, 그리고 본 개시내용의 파미카 복합체 + 완전 프로인트 아쥬반트를 사용함으로써 160,000이다(도 15).
완전 프로인트 아쥬반트 + 항원, 파미카 아쥬반트 + 완전 프로인트 아쥬반트 + 항원, 및 파미카 아쥬반트 + 항원 각각으로 토끼를 면역화하여 생산된 항체로 키트를 제조하였다. 임상 검증 후, 완전 프로인트 아쥬반트 그룹 또는 완전 프로인트 아쥬반트 + 파미카 아쥬반트 항원 그룹으로 생산된 항체는 임상 샘플과 맞지 않아 임상 검사를 통과할 수 없다. 파미카 아쥬반트 + 항원에 의해 생산된 항체만이 임상 검사를 통과할 수 있으며, 이는 인간 미오글로빈 라텍스 탁도 키트에 사용되는 항체 원료의 공급시 네덜란드 Dako사의 독점을 완전히 파괴할 것이고, 국산 제품을 위한 완전 프로인트 아쥬반트를 사용할 때 일반적인 낮은 면역 역가, 불충분한 에피토프 다양성, 및 비효과적인 임상 샘플 검출의 심각한 상황을 해결할 것이다.
파미카 아쥬반트 + 항원 그룹을 사용하여 생산된 항체로 제조된 키트 및 ㄴ네덜란드 Dako사에 의해 제공된 항체로 제조된 임상적으로 사용되는 키트는 다음의 표에서 비교된다.
Figure pct00010
실험예 4: 광견병 백신 항원에 대한 파미카 복합체의 NIH 효능의 평가
명칭: 광견병 백신 항원에 대한 본 개시내용의 파미카 복합체의 NIH 효능의 평가
방법: 마우스를 본 개시내용의 파미카 복합체(1mg/ml) + 항원, 폴리이노신-폴리시티딜산 주사(1mg/ml) + 항원, PBS + 항원 및 항원으로 0일에 면역화하고, 14일째에 챌린지하였고, 효능을 28일 후에 측정하였다.
결과: 아래의 표를 참조한다.
Figure pct00011
결과는 다음을 보여준다:
a. 본 개시내용의 파미카 복합체 + CTN 균주로부터의 광견병 백신 항원의 보호 효과는 CTN 균주 단독으로부터의 광견병 백신 항원의 3.6 배이고, 항원은 1/5까지 절약되고;
b. 본 개시내용의 파미카 복합체 + CTN 균주로부터의 광견병 백신 항원의 보호 효과는 폴리이노신-폴리시티딜산 주사 + CTN 균주로부터의 광견병 백신 항원의 1.8배로 탁월하다.
실험예 5: 파미카 복합체는 마우스에서 다중 사이토카인의 생산을 유도한다
방법: 마우스를 본 개시내용의 파미카 복합체 및 폴리이노신-폴리시티딜산 주사로 면역화하였다. 면역화 후 1 시간, 2 시간, 5 시간 후에 마우스 안구를 제거하고 혈액을 멸균된 2ml의 원심관(centrifuge tube)에서 수집하였다. 원심관을 실온에서 30분 동안 방치하고, 5분 동안 3500rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 새로운 원심관으로 흡인하고, 혈청을 -20℃에서 냉동시켰다.
결과: 본 개시내용의 파미카 복합체에 의해 유도된 사이토카인 TNF-α 및 IFN-γ의 수율은 폴리이노신-폴리시티딜산 주사의 수율보다 명백하게 우월하다. 수득된 데이터는 모두 기하학적 평균 값이고, 구체적인 결과는 하기 표에 나타낸다.
Figure pct00012
요약: TNF-α는 종양 세포를 살해 및 억제하고, 호중구 포식작용(phagocytosis)을 촉진하고, 감염에 내성이 있고, 종양 세포의 사멸을 직접 유발할 수 있는 사이토카인의 유형이고; IFN-γ는 바이러스 감염에 대한 세포 내성을 유도할 수 있고, 바이러스 유전자의 전사 또는 바이러스 단백질 성분의 번역을 방해함으로써, IFN-γ는 바이러스 감염을 예방하거나 제한할 수 있고 현재 가장 중요한 항-바이러스 감염 및 항-종양 사이토카인이다.
마우스에서 파미카에 의해 유도되어 생성된 TNF-α 및 IFN-γ 사이토카인의 수준은 폴리이노신-폴리시티딜산 주사에 의해 유도되는 것보다 더 높으며, 이는 본 개시내용의 파미카 복합체에 의해 유도되어 생성된 TNF-α 및 IFN-γ가 상승적인 종양 세포의 살해 및 항-감염의 보다 강력한 능력을 가짐을 나타낸다.
실험예 6: 비정상 독성의 검사
1. 마우스에서 본 개시내용의 파미카 복합체의 시험:
1.1 시험:
샘플 주사: 쿤밍(Kunming)의 18g 내지 22g의 건강한 SPF 마우스에게 0.5ml/마우스 및 5마리의 마우스/샘플로 복강내 주사하였고, 공시험 대조군으로서 5마리의 건강한 마우스의 체중은 동시에 18g 내지 22g이었다.
1.2 기준:
각 마우스에게 0.5ml의 시험 물질을 복강내 주사하고, 7일 동안 관찰한다. 관찰 동안에, 모든 마우스는 비정상 반응 없이 생존해야 한다. 시간이 만료될 때, 각 마우스는 체중이 늘어야 하고, 그 다음 시험 물질은 적격인 것으로 간주된다. 상기 요건이 충족되지 않으면, 10마리의 마우스는 한번의 재시험에 사용될 수 있고, 기준은 상기와 동일하다(ip.는 복강내 주사의 약어이다).
1.3. 결과
Figure pct00013
Figure pct00014
2 기니아 피그에서 본 개시내용의 파미카 복합체의 시험:
2.1 시험:
샘플 주사: 250g 내지 350g의 건강한 SPF 등급 하틀리(Hartely) 기니아 피그에게 5ml/기니아 피그 및 2마리의 기니아 피그/샘플로 복강내 주사하였고, 공시험 대조군으로서 2마리의 건강한 기니아 피그의 체중은 동시에 250g 내지 350g이었다.
2.2 기준:
각 기니아 피그에게 5ml의 시험 물질을 복강내 주사하고, 7일 동안 관찰한다. 관찰 동안에, 모든 기니아 피그는 비정상 반응 없이 생존해야 한다. 시간이 만료될 때, 각 기니아 피그는 체중이 늘어야 하고, 그 다음 시험 물질은 적격인 것으로 간주된다. 상기 요건이 충족되지 않으면, 4마리의 기니아 피그는 한번의 재시험에 사용될 수 있고, 기준은 상기와 동일하다.
2.3. 시험 결과:
Figure pct00015
Figure pct00016
주석: 재시험은 여전히 비적격이었다.
3 기니아 피그에서 본 개시내용의 파미카 복합체 + 정제된 광견병 백신 항원의 시험:
3.1 시험:
샘플 주사: 250g 내지 350g의 건강한 SPF 등급 하틀리 기니아 피그에게 5ml/기니아 피그 및 2마리의 기니아 피그/샘플로 복강내 주사하였고, 공시험 대조군으로서 2마리의 건강한 기니아 피그의 체중은 동시에 250g 내지 350g이었다.
3.2 기준:
각 기니아 피그에게 5ml의 시험 물질을 복강내 주사하고, 7일 동안 관찰한다. 관찰 동안에, 모든 기니아 피그는 비정상 반응 없이 생존해야 한다. 시간이 만료될 때, 각 기니아 피그는 체중이 늘어야 하고, 그 다음 시험 물질은 적격인 것으로 간주된다. 상기 요건이 충족되지 않으면, 4마리의 기니아 피그는 한번의 재시험에 사용될 수 있고, 기준은 상기와 동일하다.
3.3. 시험 결과:
Figure pct00017
주석: 1) 재시험은 여전히 비적격이었다;
2) 정제된 광견병 백신 항원: 세포: 베로(Vero) 세포; 바이러스 균주: CTN 균주(이것은 베로 세포 및 CTN 균주 바이러스 균주에만 제한되는 것으로 의도되지 않는다).
4 기니아 피그에서 본 개시내용의 파미카 복합체 + B형 간염 백신 항원의 시험:
4.1 시험:
샘플 주사: 250g 내지 350g의 건강한 SPF 등급 하틀리 기니아 피그에게 5ml/기니아 피그 및 2마리의 기니아 피그/샘플로 복강내 주사하였고, 공시험 대조군으로서 2마리의 건강한 기니아 피그의 체중은 동시에 250g 내지 350g이었다.
4.2 기준:
각 기니아 피그에게 5ml의 시험 물질을 복강내 주사하고, 7일 동안 관찰한다. 관찰 동안에, 모든 기니아 피그는 비정상 반응 없이 생존해야 한다. 시간이 만료될 때, 각 기니아 피그는 체중이 늘어야 하고, 그 다음 시험 물질은 적격인 것으로 간주된다. 상기 요건이 충족되지 않으면, 4마리의 기니아 피그는 한번의 재시험에 사용될 수 있고, 기준은 상기와 동일하다.
4.3. 시험 결과:
Figure pct00018
주석: 1) 재시험은 여전히 비적격이었다;
2) B형 간염 백신 항원: 발현된 효모(이것은 발현된 효모에만 제한되는 것으로 의도되지 않고, 재조합 CHO 조작된 세포는 또한 B형 간염 항원을 발현시키기 위해 사용될 수 있다).
요약 및 분석:
PIC(이중-가닥 핵산)는 특정 온도에서 가열된 후 풀리고, 2개의 단일 가닥은 온도가 서서히 감소함에 따라 수소 결합을 통해 페어링(pairing)되어 이중 가닥을 복원한다. 가열은 PIC의 분자량을 감소시키고 이의 독성을 감소시킬 수 있다. PIC가 가열되지 않거나 충분한 시간 동안 가열되지 않고 제조되는 경우, 이 방법에 의해 제조된 복합체는 그 자체로 독성이 매우 높고, 이 복합체에 의해 제조된 백신은 또한 독성이 매우 높아서 사용하기 어렵다.
실험예 7: 일부 진행성 암 환자에서 그리고 감염 치료를 위한 파미카 복합체의 용도
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
진행성 암이 있는 많은 경우로부터, 본 제품은 주사되는 투여 경로에 더하여 비강 스프레이를 통해 투여될 수 있고 전이성 암에 상당한 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.
(1) 양호한 안전성, 명백한 부작용이 없음; 파미카 면역 제제는 비-세포독성 약물이다;
(2) 방사선요법 및 화학요법의 부작용 감소: 백혈구 수 및 혈청 단백질 함량 증가;
(3) 유의적인 임상 효과: 통증 완화, 증가된 식욕, 증가된 체력, 비관에서 낙관으로 정신 변화, 자신감, 몇 개월부터 일부 사례에서 13개월까지 연장된 전체 생존;
(4) 일부 사례에서 1/3 내지 1/2까지 전이성 암의 크기의 유의적인 감소.
실험예 8: 안정성 시험
본 개시내용의 파미카 복합체의 생산이 완료된 후, 어두운 실내에서 보관하였고, 샘플을 6개월마다 시험하였다.
Figure pct00024
결과: 샘플을 6개월 이내에 실온(실온은 베이징에서 8월부터 9월까지 30도를 초과하였음)에서 보관하였고, 제품의 시험 지수는 유의적으로 변화하지 않았으며, 이는 제품이 비교적 안정하였다는 것을 나타내고; 1mg/ml로 제조된 파미카는 적어도 12개월 동안 안정할 수 있고; 3mg/ml으로 제조된 파미카는 적어도 9개월 동안 안정할 수 있다. 제품의 pH는 비교적 안정하며, 3년 이내에 유의적으로 변화하지 않는다. 본 개시내용의 파미카의 세균성 내독소는 10 EU/ml 미만인 반면, 폴리이노신-폴리시티딜산 주사의 세균성 내독소는 100 EU/mL 초과이다. 세균성 내독소가 그람-음성 박테리아의 세포벽 성분이라는 것이 당업계에서 일반적인 기술이므로, 박테리아는 죽거나 자가용해한 후에 내독소를 방출할 것이다. 따라서, 세균성 내독소는 자연에서 널리 발견된다. 예를 들어, 수돗물에 함유된 내독소는 1 EU/ml 내지 100 EU/ ml의 양을 갖는다. 세균성 내독소가 소화관을 통해 인체에 도입된 경우, 무해하지만, 내독소가 주사 또는 다른 방식을 통해 혈액에 들어간 경우, 상이한 질환을 유발할 수 있다. 소량의 내독소가 혈액에 들어간 후, 이는 간의 쿠퍼 세포에 의해 불활성화되고 인체에 무해하다. 다량의 내독소가 혈액에 들어가면 발열 반응, 즉 "발열원 반응(pyrogen reaction)"을 야기할 것이다. 따라서, 생물학적 제품, 주사 약제, 화학물질, 방사선의약품, 항생제, 백신, 투석액 등과 같은 제형뿐만 아니라 의료 장비(예를 들어, 일회용 주사기, 이식가능한 생물학적 물질)는 사용 전에 자격을 갖추기 위해 세균성 내독소 시험을 통해 검증을 통과해야 한다.
실험예 9: 대식세포의 포식 기능을 촉진하는 파미카의 측정
위치: Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences
방법: 대식세포의 수집: 20g 내지 25g의 6마리 SPF 등급 쿤밍 마우스를 각 그룹에 3마리의 마우스를 갖는 2개의 그룹으로 무작위로 나누었다. 마우스를 0일에 파미카 및 PBS로 면역화하고, 각 마우스를 200μL로 비강 점적(nasal drip)하였다. 2시간 후, 각 마우스에게 0.85%의 염수 현탁액 중의 5.0% 닭 적혈구를 주사하였다. 4시간 후, 각 마우스 그룹에서 3마리의 마우스를 탈구로 희생시켰다. 소독 후, 피부를 절단하고, 행크스(Hanks) 완충액을 2.5 mL/마우스로 복막 주사하고, 마우스의 복부를 부드럽게 문질러 행크스 완충액이 복강에서 대식세포를 완전히 세척하게 하였다. 그 다음, 복막의 중간에 작은 구멍을 뚫고, 복강 내의 약 2 mL의 액체를 5 mL의 피펫을 사용하여 흡인하고, 시험관 내에 넣었다.
슬라이드 적하: 복막 로션을 시험관으로부터 무균 흡인하여 유리 슬라이드에 적하하였다. 적하 슬라이드를 젖은 거즈 상에 수평으로 놓았다. 슬라이드를 37°C의 항온 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션하였고, 이때 많은 수의 대식세포가 유리 슬라이드에 부착되었다. 포식되지 않은 유리 슬라이드 상의 닭 적혈구 및 다른 조직 세포를 0.85%의 염수로 세척한 후, 유리 슬라이드를 냉기에서 건조시켰다.
시료의 고정 및 염색: 시료를 메탄올로 5분 동안 고정시키고, Giemsa-Wright 염색 용액으로 염색하였다. 염색을 Giemsa 염색 방법에 따라 수행하였고, 사용된 PBS 완충액을 pH 6.5로 조정하였다. 시료는 냉기 중에서 건조시킨 후 오일 액침 렌즈로 관찰하고 계산하였다.
포식작용의 백분율: 적혈구를 포식하는 대식세포의 총수 ÷ 대식세포의 총 수 × 100%.
포식작용 지수: 대식세포에 의해 포식된 적혈구의 총수 ÷ 적혈구를 포식하는 대식세포의 총수 × 100%(100 대식세포를 오일 액침 렌즈 하에서 관찰하였고, 각 대식세포에 의해 포식된 적혈구 수를 계수하고, 그 수를 합계하고, 그 수득된 합계를 100으로 나눔으로써 수득되는 값이 포식 작용 지수이다).
결과: PBS 대조군에서, 포식작용의 백분율은 12%이고 포식작용 지수는 0.11이었고; 파미카 그룹에서, 포식작용의 백분율은 66%이고, 포식작용 지수는 1.2인데, 이는 파미카가 대식세포의 포식 기능에 대한 강한 자극 효과가 있음을 나타낸다. 도 16은 적혈구가 대식세포에 의해 포식됨을 도시하고, 도 17은 적혈구가 청색 대식세포에 의해 포식되지 않음을 도시한다(화살표).
실험예 10: 마우스에서 인플루엔자에 대한 파미카 점비액 점막 면역 제형 단독의 보호 시험
인플루엔자 바이러스: Institute of Viral Disease Prevention and Control, Chinese Academy of Preventive Medicine에서 구매한 인플루엔자 바이러스 아형 A 마우스-폐 순응성 균주 FM1.
리바비린: Shenyang Yanfeng Pharmaceutical Factory에서 구매한 양성 대조 약물.
마우스: 쿤밍 종, 8g 내지 10g의 마우스를 FM1 바이러스 계대에 사용하고, 14g 내지 20g의 마우스를 다음의 형식적 실험에 사용하였다.
치명적 폐렴은 5 LD50/마우스에서 인플루엔자 바이러스 마우스-폐 순응성 균주 FM1의 현탁액으로 비강 점적하여 유발될 수 있다. 시험에서, 마우스를 먼저 감염시킨 다음, 투여하였다. 시험은 다음 표에 따라 그룹으로 수행되었다.
Figure pct00025
실험 결과는, 마우스의 보호 시험에서, 점막 면역 경로를 통한 본 개시내용의 점비액이 인정된 항바이러스 약물인 리바비린보다 더 나은 비-특이적 항-인플루엔자 효과를 갖고, 통계적인 분석에 의해 나타난 유의적인 항-인플루엔자 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
실험예 11: 완전 프로인트 아쥬반트와 비교하여, 체액성 항체 IgA 및 인플루엔자 바이러스 재생산 역가에 대한 비강 점막 면역화 및 피하 주사 면역화를 통한 인플루엔자 백신과 조합된 파미카 점막 면역 제형(점비액)의 효과
실험 계획은 아래와 같다:
인플루엔자 바이러스: Institute of Viral Disease Prevention and Control, Chinese Academy of Preventive Medicine에서 구매한 인플루엔자 바이러스 마우스-폐 순응성 균주 FM1.
인플루엔자 백신: Hualan Biological Products Co., Ltd.에서 구매한 인플루엔자 바이러스 분할 백신.
완전 프로인트 아쥬반트: Shanghai Via-geneprobio Technologies Co. Ltd.
본 개시내용의 점막 면역 아쥬반트: Xinfu(Beijing) Medical Technology Co., Ltd.
마우스: 쿤밍 종, 8 g 내지 10g의 마우스를 FM1 바이러스 계대에 사용하고, 14 g 내지 20g의 마우스를 다음의 형식적 실험에 사용하였다.
완전 프로인트 아쥬반트 인플루엔자 백신: 원심관에서, 백신 및 완전 프로인트 아쥬반트를 동일한 부피로 첨가하고 와류에서 균질하게 혼합하여 유중수 에멀젼을 형성하였다.
본 개시내용의 인플루엔자 백신과 조합된 점비액: 본 개시내용의 인플루엔자 백신 및 점막 면역 아쥬반트를 동일한 양으로 혼합하여 수성 용매를 형성하였다.
인플루엔자 백신: 인플루엔자 백신을 동일한 양의 PBS와 혼합하여 수성 용매를 형성하였다.
면역화 방법:
피하 주사 면역화: 마우스에게 0일째 및 28일째에 0.1 ml/마우스로 피하 주사하였다. 42일째에, 일부 마우스로부터 혈액을 채취하고, 항체 역가 시험을 위해 혈청을 분리하였다. 다른 마우스를 5 LD50/비강 점적으로 인플루엔자 바이러스 마우스-폐 순응성 균주 FM1의 현탁액으로 감염시켰다. 감염 후 5일째에 폐 조직의 바이러스 역가를 검출하였다.
비강 면역화: 마우스를 0일 및 28일째에 비강 점적에 의해 0.1 ml/마우스로 면역화시켰다. 42일째에, 일부 마우스로부터 혈액을 채취하고, 항체 역가 시험을 위해 혈청을 분리하였다. 다른 마우스를 5 LD50/비강 점적으로 인플루엔자 바이러스 마우스-폐 순응성 균주 FM1의 현탁액으로 감염시켰다. 감염 후 5일째에 폐 조직의 바이러스 역가를 검출하였다.
각 그룹의 실험 결과는 하기의 표에 나타낸다:
비강 점적에 의한 인플루엔자 백신과 조합된 점막 면역 제형의 항-인플루엔자 시험
Figure pct00026
완전 프로인트 아쥬반트는 신체의 세포성 면역을 촉진하는 시험을 위한 최적 표준이다. 시험 결과는 인플루엔자 백신과 조합된 본 개시내용의 점막 면역 제형의 피하 면역화가 완전 프로인트 아쥬반트 인플루엔자 백신보다 10배 더 낮은 항체를 생산하지만, 완전 프로인트 아쥬반트 인플루엔자 백신보다 31.6배만큼 인플루엔자 바이러스의 역가를 감소시킨다는 것을 보여주고; 특히, 마우스에서의 비강 점막 면역화는 항원과 조합되는 본 개시내용의 점막 면역 제형의 점비액이 단순 인플루엔자 백신보다 31.6배 더 높은 항체를 생산하고, 3100배 초과만큼 인플루엔자 바이러스의 역가를 감소시킨다는 것을 보여주어서, 이는 매우 유의적인 효과를 갖는다.
실험예 12: 파미카는 CIK 세포 효과-표적 실험의 예비 시험에 대해 명백한 효과를 갖는다.
Beijing Jingmeng Hi-Tech Stem Cell Technology Co., Ltd.에 의해 수행된 시험에서, 본 개시내용은 CIK 세포 효과-표적 실험의 예비 시험에서 명백한 효과를 갖는다.
샘플 번호: JSCIK2016042614; 시험 날짜: 2016년 4월 26일; 보고 날짜: 2016년 4월 28일.
작동 과정: 종래의 CIK 세포 효과-표적 실험에 따라 배양 및 분석을 수행하였고, 실험 방법은, 예를 들어 (The Immunotherapeutic Antitumor Effect of Dendritic Cells Co-cultured with Cytokine Induced Killer Cells, Jie Zhuang et al., Chinese Journal of Cell Biology, 2007, 29; 237-240)에 나타낸 바와 같다.
표적 세포: A549 효과기 세포: 배양된 JSCIK2016042614
결론: JSCIK2016042614 세포의 살해 능력은 형광 현미경 및 마이크로플레이트 판독기에 의한 검출 뿐만 아니라 실험 자체의 오류와 조합하여 포괄적으로 분석되었고 1:10에서 중간이다(표적-효과 비가 1:10인 경우, 표적 세포 A549에 대한 살해율은 51.4%였다).
실험예 13: 종양 보유 마우스의 LL2 폐암 모델에 대한 파미카 점막 면역 제제의 항암 효과
파미카의 항종양 효과를 LL2 마우스 이식 종양 모델에서 비강 스프레이로 시험하였다. 이 모델에서 종양 세포는 접종후 14일째에 2201.9mm3 ± 68.01mm3의 종양 부피로 빠르게 성장하였고, 실험이 종료되었다. 양성 대조군으로서의 시스플라틴은 종양 수축에 대해 최상의 효과를 가졌고, 파미카 근육내 주사 그룹이 뒤따랐다. 그러나, 0.1mg/마우스로 투여된 그룹을 제외하고는, 파미카 비강 스프레이의 경우, 0.2mg/마우스로 투여된 각각의 비강 스프레이 그룹은 비히클-음성 대조군과 비교하여 P<0.0001을 가지며, 이는 유의적인 차이를 나타낸다. 특히, 이력 데이터에 기록된 동일한 마우스 모델에서, 마우스 유형 PD1은 거의 무효임을 나타낸다. 설명으로서, 시스플라틴 그룹은 매우 신속한 세포 분열로 이 모델에서 효능을 나타낼 가능성이 더 크다. 일반적으로, 파미카는 새로운 항암 메카니즘 하에 이러한 종양 보유 마우스 모델에서 현저한 효과를 갖는다. 또한, 이 마우스 모델에서 부작용은 발견되지 않았다.
실험 그룹은 하기 표에 나타낸다:
Figure pct00027
구체적인 실험 결과는 도 18 내지 21에 도시되어 있다.
이 실험에서, 세포는 높은 종양 형성 속도를 가졌고, 비히클 대조군의 종양은 실험 종료시에 2201.09mm3 ± 68.01mm3의 종양 부피로 빠르게 성장하였다. 양성 대조군에서, 시스플라틴은 명백한 종양 억제 효과를 나타내었으며, 이는 이 실험이 성공적이고 결과가 신뢰할 수 있었음을 나타낸다.
시험 결과는 마우스 폐암 LL2 세포 C57BL/6의 마우스 이식된 종양 모델에 대한 본 연구에서, 150μg/마우스로 투여된 파미카 그룹을 제외한 그룹이 비강 점적 또는 근육내 투여에 관계없이 종양 성장 억제의 유의적인 효과를 나타내고, 통계학적 결정이 P<0.0001로 극히 유의적인 차이가 있음을 나타내고; 동시에, 종양 보유 마우스에서 명백한 독성 및 부작용이 나타나지 않음을 나타낸다.
Huiyuan Biotech로부터의 이전 데이터는 뮤린 PD-1 항체가 LL2 모델에서 비교적 덜 효과적임을 나타내었다(종양 억제율이 10% 미만임). 면역계에 또한 작용하는 파미카는 PD-1 항체보다 더 나은 효과를 나타낸다. 일반적으로, PD-1 항체의 항종양 효능이 종양 세포에서 PD-L1의 발현 수준에 의존하거나, 돌연변이 부하, 고빈도 미소부수체 불안정형(MSI-H) 또는 미스매치 복원에서의 결함(dMMR)과 관련되며, 이는 결국 그의 약물 효과에 영향을 미친다고 여겨진다. 면역 아쥬반트로서, 파미카는 면역 관문보다 넓은 범위에서 종양 억제 효과를 가지며, 이는 큰 개발 전망을 나타낸다.
실험예 14: 인-시투(in-situ) 유방암의 4T1-luc 마우스 모델에서 파미카의 생체내 항종양 효과 연구
이 약력학적 실험을 9개의 그룹에 대해 수행하였다: 비히클 그룹, PD1 그룹, 6개의 파미카 처리 그룹, 및 PD1 투여 그룹과 조합된 파미카. 비히클 그룹은 접종후 16일째, 2일마다 1회 66.7μL/마우스로 PBS 용액을 비강 점적 투여하였고; PD1 그룹은 접종후 16일째, 1주에 1회 100μg/마우스로 PD1 용액을 복강내 주사하였고; 6개의 파미카 처리 그룹을 각각 다음과 같이 투여하였다: 하나의 그룹은 접종전 7일째, 2일마다 1회 200μg/마우스로 파미카를 비강 점적 투여하였고; 하나의 그룹은 접종일, 2일마다 1회 200μg/마우스로 파미카를 비강 점적 투여하였고; 하나의 그룹은 접종후 16일째, 2일마다 1회 200μg/마우스로 파미카를 비강 점적 투여하였고; 하나의 그룹은 접종후 16일째, 2일마다 1회 300μg/마우스로 파미카를 비강 점적 투여하였고; 하나의 그룹은 접종후 16일째, 2일마다 1회 200μg/마우스로 파미카를 근육내 투여하였고; 하나의 그룹은 접종후 16일째, 2일마다 1회 300μg/마우스로 파미카를 근육내 투여하였고; PD1과 조합된 파미카 투여 그룹은 접종후 16일째, 2일마다 1회 200μg/마우스로 파미카를 비강 점적 투여하였고, 접종후 16일째, 1주에 1회 100μg/마우스로 PD1 용액을 복강내 주사하였다. 암컷 Balb/c 마우스를 실험에 사용하고, 3일마다 종양 부피를 측정하고, 2일마다 체중을 칭량하였다. 비히클 대조군의 평균 종양 부피가 2000mm3를 초과하는 경우 실험을 종료하고, 종양의 생물발광을 소동물 생체내 이미저(imager)에 의해 측정하였다. 마지막으로, 각 그룹의 마우스의 기관을 HE 염색을 위해 취하였다.
약력학 시험의 결과는, 7-일 진행 그룹 및 0-일 그룹이 종양의 성장 및 전이를 억제하는 비교적 약한 능력을 가졌고, 2개의 파미카 근육내 주사 그룹이 2개의 파미카 비강 점적 그룹보다 종양의 증식 및 전이에 대해 더 강한 억제 효과를 가졌다는 것을 나타내었다. 200μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹을 제외하고, 300μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹, 200μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹 및 300μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹은 모두 종양의 성장 및 전이를 유의적으로 억제할 수 있다. 실험 종료시, 200μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹 및 300μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹의 종양 억제율은 각각 25% 및 35%였다. 200μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹 및 300μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹의 종양 억제율은 각각 56% 및 61%였다.
상기 결과는, 파미카가 4T1 유방암에서 종양의 성장 및 전이를 억제하는 데 양호한 효과가 있음을 나타낸다.
실험 방법 및 실험 결과는 하기에 상세히 기재된다.
1. 실험 방법
1.1 인-시투 유방암의 4T1-luc 마우스 모델의 구축
암컷 BALB/c 마우스를 취하고; 대수 성장기의 4T1-luc 유방암 세포를 선택하고, BALB/c 마우스의 네 번째 유선 하에 1×105 세포/0.2mL/마우스의 양으로 접종하여 인 시투 종양 보유 마우스 모델을 구축하였다. 종양 덩어리의 부피를 버니어 캘리퍼로 동적으로 측정하였다. 종양 부피를 다음의 공식에 따라 계산한다: V=0.5×L×D2(상기 식에서, V는 종양 부피이고, L은 종양의 긴 직경이고, D는 종양의 짧은 직경이다).
1.2 투여 시간의 설정
접종 7일 전 비강 점적 투여된 파미카 그룹(7-일 선행 그룹으로 지칭함)의 경우, 10마리의 마우스를 종양 접종 7일 전에 무작위로 선택하고 표 1에 따라 투여하였고;
접종 0일 비강 점적 투여된 파미카 그룹(0-일 그룹으로 지칭함)의 경우, 10마리의 마우스를 종양 접종일에 무작위로 선택하고, 표 1에 따라 투여하였고;
비히클 그룹의 경우, 종양 부피가 약 80mm3까지 성장했을 때, 즉, 종양 접종후 16일째에, 표 1에 따라 투여를 시작하였다.
PD1 그룹의 경우, 종양 부피가 약 80mm3까지 성장했을 때, 즉, 종양 접종후 16일째에, 표 1에 따라 투여를 시작하였다.
200μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹의 경우, 종양 부피가 약 80mm3까지 성장했을 때, 즉, 종양 접종후 16일째에, 표 1에 따라 투여를 시작하였다.
300μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹의 경우, 종양 부피가 약 80mm3까지 성장했을 때, 즉, 종양 접종후 16일째에, 표 1에 따라 투여를 시작하였다.
200μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹의 경우, 종양 부피가 약 80mm3까지 성장했을 때, 즉, 종양 접종후 16일째에, 표 1에 따라 투여를 시작하였다.
300μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹의 경우, 종양 부피가 약 80mm3까지 성장했을 때, 즉, 종양 접종후 16일째에, 표 1에 따라 투여를 시작하였다.
Figure pct00028
1.3 실험 종료
종양 부피가 2000mm3을 초과했기 때문에 전체 실험을 투여후 30일째에 종료하였다.
1.4 지수 관찰
종양 부피를 3일마다 부피로 측정하고 마우스를 2일마다 칭량하였다. 실험의 종료시, 심장, 간, 비장, 폐, 신장 및 종양을 분리하였다. 심장, 간, 비장 및 신장을 4% 중성 포름알데하이드로 고정한 다음, 파라핀 섹션하고, HE 염색으로 분석하고; 종양을 사진촬영하고, 칭량하고; 폐를 16시간 동안 보우인(Bouin) 고정제로 고정시키고, 2시간 동안 50% 알코올에 액침시키고, 사진촬영하고, 4% 중성 포름알데하이드로 고정시키고, 파라핀 섹션하고, HE 염색으로 분석하였다.
1.5 소동물 생체내 이미저
투여 종료시, 플루오레세인 기질로서 30mg/mL의 농도로 100μL의 루시페린을 마우스에게 복강내로 투여하고, 이소플루란으로 마취시켰다. 17분 후, 마우스를 소동물 생체내 이미저에서 고정하여 생물발광을 관찰하였다. 이미지 획득 파라미터는 아래와 같다: 획득 시간: 0.2 초; 빈(Bin) 값: 4; 및 F 값: 2. 이미지 처리 소프트웨어: Living Image® 소프트웨어(버전 4.3.1; Caliper Life Sciences Inc.).
2. 통계적 분석
실험 데이터 모두는 "평균 ± 표준 편차"로 표현되고, SPSS 통계 19(버전 4.0.100.1124; SPSS Inc., IBM Company, USA) 소프트웨어를 데이터 분석에 사용하였다. 분산 ANOVA의 1-인자 분석을 데이터 비교에 사용하고, 그룹 간의 유의차에 t-시험을 사용하였다: * p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001.
3. 실험 결과 및 논의
3.1 종양 부피
종양 부피 변화의 곡선은 도 22에 도시되어 있다.
표 2: 종양 부피의 t-시험 결과
Figure pct00029
주석: 오차 막대는 SD를 나타내고; ―는 데이터 없음을 나타내고 *은 비히클 그룹과 비교하여 p<0.05를 나타내고; **은 비히클 그룹과 비교하여 p<0.01을 나타내고; ***은 비히클 그룹과 비교하여 p<0.001을 나타낸다.
도 22 및 표 2로부터, 7-일 선행 그룹 및 0-일 그룹의 종양 억제 효과가 비교적 약하고, 2개의 근육내 주사 그룹이 2개의 비강 점적 그룹보다 더 나은 종양 억제 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다. 구체적인 결과는 다음과 같다.
파미카 7-일 선행 그룹 및 0-일 그룹은 후기 단계에서 특정 종양 억제 효과를 갖고, 기본적으로 초기 단계에서 종양 억제 효과가 없으며, 이는 선행된 투여 또는 즉시 투여가 명백한 종양 사멸 효과를 갖지 않음을 나타내고, 파미카가 예방 백신이 아닌 종양 치료 백신임을 측면으로 증명한다. 실험 종료시, 7-일 선행 그룹 및 0-일 그룹의 종양 억제율은 각각 36% 및 26%였다.
12일째의 PD1 그룹의 종양 부피는 비히클 그룹과 유의적으로 상이하였으며(**p<0.01), 이는 PD1이 4T1 마우스 유방암에서 특정 억제 효과가 있음을 나타낸다.
파미카와 PD1의 조합 투여 그룹의 각 처리 그룹에서, 대부분의 마우스는 투여후 20일째에 사망하였고, 따라서 2개의 그룹에 대한 이후의 측정으로부터 데이터는 없었다. 이들 중에서, 6일째, 12일째 및 18일째의 조합 투여 그룹의 종양 부피는 비히클 그룹과 유의적으로 상이하였다(각각, *p<0.05, **p<0.01 및 ***p<0.001).
200μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹은 투여 초기 단계에서 유의적인 억제 효과를 가졌고, 투여 후기 단계에서 점진적으로 약화된 종양 억제 효과를 가졌다. 6일째 및 12일째의 종양 부피는 비히클 그룹의 종양 부피와 유의적으로 상이하였다(**p<0.01). 18일째를 제외하고, 300μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹의 종양 부피는 다른 시점에서 비히클 그룹과 유의적으로 상이하였다. 이는 비강 점적 투여가 효과적이며 종양 억제 효과가 투여량-의존적임을 보여준다. 실험의 종료시, 200μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹 및 300μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹의 종양 억제율은 각각 25% 및 35%였다.
2개의 파미카 근육내 주사 투여량 그룹의 종양 억제 효과는 전체 투여 과정 동안 유사하였고, 비히클 그룹과 유의적으로 상이하였으며, 2개의 근육내 주사 그룹의 종양 억제 효과는 2개의 비강 점적 그룹보다 양호하였다. 실험 종료시, 200μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹 및 300μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹의 종양 억제율은 각각 56% 및 61%였다.
3.2 체중
마우스의 체중 변화 곡선은 도 23에 도시되어 있다.
표 3: 각 그룹 및 비히클 그룹의 마우스 체중의 통계적 t-시험 결과
Figure pct00030
Figure pct00031
주석: 오차 막대는 SD를 나타내고; ―는 데이터 없음을 나타내고 *은 비히클 그룹과 비교하여 p<0.05를 나타내고; **은 비히클 그룹과 비교하여 p<0.01을 나타내고; ***은 비히클 그룹과 비교하여 p<0.001을 나타낸다.
도 23 및 표 3으로부터, PD1 및 조합 투여 그룹에서의 마우스의 체중이 유효 측정 시간 동안에 비히클 그룹과 유의적으로 상이하지 않음을 알 수 있고, 이는 부작용이 적음을 나타낸다. 투여 후기 단계를 제외하고는, 7-일 선행 그룹, 0-일 그룹, 200μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹, 및 300μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹의 체중은 다른 시점에서 비히클 그룹보다 유의적으로 낮았다. 전체 투여 기간 동안 200μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹과 비히클 그룹 사이에 유의적인 차이는 없었다. 300μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹의 체중은 투여 중기에 비히클 그룹보다 낮고, 투여 초기 단계 및 후기 단계에 비히클 그룹과 유의적으로 상이하지 않았다.
상기 결과는 근육내 주사가 마우스의 체중에 거의 효과가 없고 부작용이 적고, 비강내 투여가 마우스에서 특정 부작용을 갖는다는 것을 나타낸다.
3.3 종양 중량, 비장 중량 및 종양 사진
도 24 및 도 25로부터, 대조군과 비교된 7-일 선행 그룹 또는 0-일 그룹 사이에 종양 중량의 유의적인 차이가 없었고, 2개의 파미카 근육내 주사 그룹은 2개의 파미카 비강 점적 그룹보다 종양 성장에 대해 더 강한 억제 효과를 가졌다는 것을 알 수 있다. 200μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹을 제외하고, 300μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹, 200μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹 및 300μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹은 모두 비히클 그룹과 비교시 통계적 차이(각각 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)로 종양의 성장을 유의적으로 억제할 수 있다.
비장은 신체의 최대 면역 기관이고, 신체의 전체 림프 조직의 25%를 차지하며, 다수의 림프구 및 대식세포를 함유하고, 신체의 세포성 면역 및 체액성 면역의 중심이다. 도 26으로부터, 200μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹 및 300μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹의 비장 중량이 통계적 차이(각각 **p<0.01, *p<0.05)로 비히클 그룹보다 유의적으로 더 높았다는 것을 알 수 있고, 이는 근육내 주사 그룹의 면역 반응이 더 강할 수 있음을 나타낸다.
3.4 폐 사진
도 27 및 도 28로부터, 비히클 그룹, 7-일 선행 그룹, 및 0-일 그룹에서 폐 조직의 표면에서의 많은 백색 종양 결절이 있음을 알 수 있고, 이는 7-일 선행 그룹과 0-일 그룹이 기본적으로 4T1의 폐 전이의 억제에 효과 없음을 나타낸다. 200μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹 및 300μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹의 폐 조직의 표면에서는 더 적은 결절이 존재하며, 200μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹 및 300μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹은 폐 조직의 표면에서 최소의 결절을 가지며, 이는 2개의 비강 점적 그룹 및 2개의 근육내 주사 그룹이 4T1의 폐 전이를 효과적으로 억제할 수 있고, 근육내 주사 그룹이 비강 점적 그룹보다 4T1의 폐 전이를 억제하는 더 강한 능력을 갖는다는 것을 나타낸다.
3.5 소동물 이미저
도 29 내지 도 35로부터, 비히클 그룹, 7-일 선행 그룹 및 0-일 그룹의 종양 부위 및 전이의 생물발광 강도가 더 강하다는 것을 알 수 있다. 200μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹 및 300μg/마우스 파미카에서 종양 부위 및 전이의 생물발광 강도는 약해졌고, 200μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹 및 300μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹에서 종양 부위 및 전이의 생물발광 강도는 가장 약하여, 이는 근육내 주사 그룹이 비강 점적 그룹보다 4T1 유방암의 성장 및 전이를 억제하는 능력이 더 강하다는 것을 나타내며, 이는 상기 결과와 일치한다.
4. 결론
이 실험에서, 우리는 인-시투 유방암의 4T1-luc 마우스 모델을 성공적으로 확립하였다. 종양은 빠르게 성장하고, 종양 부피는 실험 종료시 2000mm3를 초과하였다.
시험 결과는, 마우스 유방암 4T1-luc 세포 Balb/c 마우스 동소성 종양 모델에 대한 본 연구에서, PD1 및 조합 투여 그룹에서 다수의 마우스가 PD1로 인해 사망하여 실험 데이터의 일부만이 수득된 것을 제외하고는, 다른 각각의 그룹은 모두 특정 기간 내에 특정 종양 억제 효과를 가졌다는 것을 보여준다. 7-일 선행 그룹, 0-일 그룹 및 200μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹은 명백한 종양 억제 효과가 없었고, 200μg/마우스 파미카 비강 점적 그룹, 200μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹 및 300μg/마우스 파미카 근육내 주사 그룹은 모두 명백한 종양 억제 효과를 나타내었다.
실험예 15: 인간 유두종 바이러스(HPV)로 감염된 환자의 치료에서의 파미카의 용도
Figure pct00032
실험예 16: 유방암의 치료에서의 파미카의 용도
1. 양성 대조 약물:
PD1, 파클리탁셀 주사
2. 4T1 보유 마우스의 동소성 유방암 동물 모델의 구축
암컷 BALB/c 마우스를 취하고; 대수 성장기의 4T1-luc 유방암 세포를 선택하고, BALB/c 마우스의 네 번째 유선 하에 1×105 세포/0.2mL/마우스의 양으로 접종하여 동소성 종양 보유 마우스 모델을 구축하였다. 종양 덩어리의 부피를 버니어 캘리퍼로 동적으로 측정하였다. 종양 부피를 다음의 공식에 따라 계산한다: V=0.5×L×D2(상기 식에서, V는 종양 부피이고, L은 종양의 긴 직경이고, D는 종양의 짧은 직경이다).
3. 인 시투 4T1 유방암의 성장 및 자발적인 전이에 대한 영향
3.1 그룹 설정 및 투여량 레지멘
① PBS 그룹의 경우, 종양 접종 수일 후, PBS를 100μL/마우스로 격일에 1회 비강 점적으로 투여하였고;
② PD1 그룹의 경우, 종양 접종 수일 후, PD1을 100μg/마우스로, 1주에 1회 복강내로 투여하였고;
③ 파클리탁셀 그룹의 경우, 종양 접종 수일 후, 파클리탁셀을 10mg/kg으로, 1주에 1회 꼬리 정맥 주사로 투여하였고;
④ 파미카 비강 점적 그룹의 경우, 종양 접종 수일 후, 파미카를 투여일 아침에 50μL의 비강 점적 및 오후에 50μL의 비강 점적으로, 100μL(0.3mg)/마우스 격일 1회로 비강 점적 투여하였고;
⑤ 파미카 근육내 주사 그룹의 경우, 종양 접종 수일 후, 파미카를 근육내로 주사하고, 100μL(0.3mg)/마우스로, 격일에 1회 투여하였고;
⑥ 조합 투여 그룹의 경우, 종양 접종 수일 후, PD1 복강내(100μg/마우스, 1주에 1회 투여) + 파미카 비강 점적(100μL/마우스, 격일에 1회 투여);
⑦ 조합 투여 그룹의 경우, 종양 접종 수일 후, 파클리탁셀 꼬리 정맥 주사(10mg/kg, 1주에 1회 투여) + 파미카 비강 점적(100μL/마우스, 격일에 1회 투여).
3.2 각 그룹의 동물의 수: 각 그룹에서 15마리의 동물(각 그룹에서 5마리의 잉여 동물이 있음).
3.3 실험 종료 시간: 실제 상황(마우스가 사망하였거나 투여 그룹과 대조군 간의 차이가 명백함)에 따라, 실험은 조기에 끝날 수 있다.
3.4 실험 프로토콜
인시투 4T1-luc 유방암 모델을 확립하였고, 소동물 생체내 이미저를 조기 검출 및 그룹화에 사용하였다. 투여를 항목 6.1 하의 그룹 설정 및 투여 요법에 따라 수행하였다. 종양 부피(3일마다 1회 측정), 체중 변화(3일마다 1 회 측정), 종양 중량(마지막에 검출됨) 및 비장 중량(마지막에 검출됨), TUNEL 염색(마지막에 검출됨)을 측정하였다. 폐를 보우인 고정제로 고정시킨 다음, 사진 촬영하였다. 각각의 조직 및 기관을 중성 포름알데히드로 고정시킨 후, H&E로 염색하고(마지막에 검출됨), 상이한 시점 및 최종 시점에서 인시투 종양 및 전이의 생물발광 강도를 소동물 생체내 이미저에 의해 관찰하였다. 각 그룹 사이의 인시투 종양의 성장 및 전이 억제 효과를 포괄적으로 비교하였다.
실험은, 파미카가 유방암의 종양 부피를 감소시키고, 종양 중량 및 비장 중량을 제어하고, 종양 세포 아폽토시스를 촉진하는 것, 및 다른 측면에서 명백한 효과를 갖는다는 것을 증명하였다.
마지막으로, 상기 구현예는 단지 예시를 위한 것이고, 본 개시내용의 기술적 해결책을 제한하고자 하는 것이 아님에 유의해야 하고; 본 개시내용이 전술한 실시예와 관련하여 상세히 설명되었지만, 당업자는 전술한 실시예에 인용된 기술적 해결책에 대한 수정을 하거나, 기술적 특징의 일부 또는 전부에 대한 동등한 대체를 하는 것이 여전히 가능하다는 것을 이해해야 하며; 이러한 수정 또는 대체는 대응하는 기술적 해결책의 본질이 본 개시내용의 실시예의 기술적 해결책들의 범위로부터 벗어나게 하지 않는다.
산업 유용성
본 개시내용의 복합체는 적당한 점도 및 분자량을 가지며, 약제학적 적용에 사용하기에 편리하며; 이는 안정한 화학적 특성을 가지며, 장기간 보관시 거의 분해되지 않고 사용하기에 안전하다. 단독으로 사용되는 경우, 복합체는 신체의 비특이적 면역 반응을 유의적으로 강화시킬 수 있고 질환의 예방 및 치료 목적을 달성할 수 있고, 다른 약물과 조합하여 사용되는 경우 더 나은 항종양, 항바이러스 및 항(수퍼) 박테리아 효능을 가지며 환자에 의해 쉽게 흡수된다.

Claims (20)

  1. 액체 반응계 중에 폴리이노신-폴리시티딜산, 적어도 하나의 양이온 안정화제 및 가용성 칼슘염을 접촉시키는 단계를 포함하고,
    상기 양이온 안정화제는 5 kDa 이하의 분자량을 갖는 수용성 비-항생제 아미노 화합물, 또는 수용성 비-항생제 아미노 화합물과 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌이민, 엽산 및 갈락토스 중 1종 이상에 의해 형성된 그래프트인,
    면역 반응 강화용 복합체의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 수용성 비-항생제 아미노 화합물은 키토산 올리고당류, 키토올리고당류, 글루코사민, 양이온성 리포좀, DEAE-덱스트란, 폴리아크릴아미드, 폴리아민, 테트라아미노풀벤(tetraaminofulvene) 및 폴리에틸렌이민으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 양이온 안정화제는 키토산 올리고당류, 키토산 올리고당류와 메톡시폴리에틸렌 글리콜의 그래프트, 및 키토산 올리고당류, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌이민의 그래프트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그래프트는 50 kDa 이하의 분자량을 갖는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 반응계에서 폴리이노신-폴리시티딜산의 농도는 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml이고;
    선택적으로, 액체 반응계에서 폴리이노신-폴리시티딜산의 농도는 0.5 mg/ml 내지 5 mg/ml인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 반응계에서 양이온 안정화제의 농도는 0.5 mg/ml 내지 51.2 mg/ml이고;
    선택적으로, 액체 반응계에서 양이온 안정화제의 농도는 0.8 mg/ml 내지 25.6 mg/ml인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 반응계에서 가용성 칼슘염 중의 칼슘 이온의 농도는 0.1 mM 내지 1 mM인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키토산 올리고당류가 70% 이상의 탈아세틸화도를 갖는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가용성 칼슘염이 CaCl2 및/또는 CaNO3인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,폴리이노신-폴리시티딜산은 염기쌍 형성 반응을 통하여 폴리시티딜산 및 폴리이노신산으로 제조되는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 폴리시티딜산 및 폴리이노신산은 23,000 달톤 초과의 분자량을 갖고;
    선택적으로, 폴리시티딜산의 분자량은 66,000 달톤 내지 660,000 달톤의 범위이고;
    선택적으로, 폴리이노신산의 분자량은 66,000 달톤 내지 660,000 달톤의 범위인, 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 염기쌍 형성 반응이 40℃ 내지 50℃의 온도에서 수행되는, 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 염기쌍 형성 반응이 pH 6.8 내지 7.6에서 수행되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 전에 폴리이노신-폴리시티딜산이 80℃ 내지 99℃에서 70분 내지 120분 동안 가열되고;
    선택적으로, 접촉 전에 폴리이노신-폴리시티딜산이 88℃ 내지 92℃에서 70분 내지 120분 동안 가열되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 액체 반응계가 40℃ 내지 50℃의 온도인, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 그래프트의 제조 방법은 먼저 카보닐 디이미다졸을 사용하여 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌이민, 엽산 및 갈락토스 중 1종 이상을 활성화시킨 후, 상기 활성화된 생성물을 이온성 액체 [bmim]Cl 중에서 수용성 비-항생제 아미노 화합물로 그래프팅시키는 단계;
    선택적으로, 상기 그래프트는 키토산 올리고당류와 메톡시폴리에틸렌 글리콜의 그래프트로서, 먼저 카보닐 디이미다졸 (CDI)을 사용하여 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (MPEG)을 활성화시킨 후, 상기 활성화된 MPEG를 이온성 액체 [bmim]Cl 중에서 키토산 올리고당류 (COS)로 그래프팅시키는 단계를 포함하고,
    선택적으로, 상기 그래프팅은 비산화성 분위기 하에 60℃ 내지 80℃에서 수행되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로
    반응계에서 틴들(Tyndall) 효과가 나타날 때까지, 수득된 복합체에 가교결합제 용액을 교반하면서 적가한 후, 교반하여 나노입자를 얻는 단계를 포함하되,
    상기 가교결합제가 트리폴리인산나트륨, 알긴산나트륨, 페닐보론산 및 카테콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 방법으로서,
    선택적으로, 상기 가교결합제 용액은 면역 세포 요법 약물, 항체 요법 약물, 화학 약물, 점막 면역 흡수 또는 점막 부착을 촉진하는 물질, 면역조절제, 항원, 패턴 인식 수용체-리간드 중 1종 이상, 및 약제학적으로 허용가능한 염 또는 부형제를 추가로 포함하고;
    선택적으로, 상기 방법은 상기 복합제 또는 나노 입자를 면역 세포 요법 약물, 항체 요법 약물, 화학 약물, 점막 면역 흡수 또는 점막 부착을 촉진하는 물질, 면역조절제, 항원, 패턴 인식 수용체-리간드 중 1종 이상, 및 약제학적으로 허용가능한 염 또는 부형제와 공동-인큐베이션시키는 단계를 추가로 포함하고;
    선택적으로, 상기 항원은 단백질 또는 폴리펩타이드 항원이고;
    선택적으로, 상기 항원은 종양, 바이러스, 박테리아, 균류 또는 기생충 항원을 포함하고;
    선택적으로, 상기 종양이 뼈, 뼈 연결부, 근육, 폐, 기관, 인두, 코, 심장, 비장, 동맥, 정맥, 혈액, 모세혈관, 림프절, 림프관, 림프액, 구강, 인두, 식도, 위, 십이지장, 소장, 결장, 직장, 항문, 맹장, 간, 담낭, 췌장, 귀밑샘, 설하선, 비뇨기 신장, 수뇨관, 방광, 요도, 난소, 나팔관, 자궁, 질, 외음부, 음낭, 고환, 수정관, 음경, 눈, 귀, 코, 혀, 피부, 뇌, 뇌간, 연수, 척수, 뇌척수액, 신경, 갑상선, 부갑상선, 부신, 뇌하수체, 송과선, 췌장도, 흉선, 생식선, 설하선 및 귀밑샘 중 임의의 병변에서 발생하는 종양을 포함하고;
    선택적으로, 상기 박테리아가 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 리스테리아(Listeria), 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix), 레니박테리움(Renibacterium), 바실러스(Bacillus), 클로스트리듐(Clostridium), 마이코박테리움(Mycobacterium), 악티노마이세스(Actinomyces), 노카르디아(Nocardia), 코리네박테리움(Corynebacterium), 로도코커스(Rhodococcus), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 에리시펠라스 바실러스(erysipelas bacillus), 바실러스 테타니(Bacillus tetani), 리스테리아 모노사이토제네스(listeria monocytogenes), 바실러스 퍼프린젠스(Bacillus perfringens), 바실러스 강라에나에 엠피세마토사에(Bacillus gangraenae emphysematosae), 튜버컬로시스(tuberculosis), 에쉬리키아 콜라이(Escherichia coli), 박테리움 프로테우스(Bacterium proteus), 쉬겔라 디센테리아에(Shigella dysenteriae), 뉴모바실러스(Pneumobacillus), 박테리움 버게리(Bacterium burgeri), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 해모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 해모필러스 파라인플루엔자에(Haemophilus parainfluenzae), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis), 아시네토박터(Acinetobacter), 예르시니아(Yersinia), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 보르데텔라 파라페르투시스(Bordetella parapertussis), 쉬겔라, 파스퇴렐라(Pasteurella), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae) 및 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio Parahemolyticus) 중의 1종 이상을 포함하고;
    선택적으로, 상기 기생충은 소화관 기생충, 강내(intraluminal) 기생충, 간내 기생충, 폐내 기생충, 뇌조직 기생충, 혈관내 기생충, 림프내 기생충, 근육 조직 기생충, 세포내 기생충, 뼈 조직 기생충 및 안구내 기생충 중 1 종 이상을 포함하고;
    선택적으로, 상기 바이러스는 아데노 바이러스과, 아레나 바이러스과, 아스트로 바이러스과, 버냐 바이러스과, 칼리시 바이러스과, 플라비 바이러스과, 델타 간염 바이러스, 헤페바이러스과, 모노네가 바이러스목, 니도 바이러스목, 피코르나 바이러스과, 오르토믹소 바이러스과, 파필로마 바이러스과, 파르보 바이러스과, 폴리오마 바이러스과, 폭스 바이러스과, 레오 바이러스과, 레트로 바이러스과 또는 토가 바이러스과 중 1종 이상을 포함하고;
    선택적으로, 상기 균류는 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 콕시디오이데스 포사다시이(Coccidioides posadasii), 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 히스토플라스마 두보이시이(Histoplasma duboisii), 블라스토마이세스 로보(Blastomyces lobo), 파라콕시디오데스 브라실리엔시스(Paracoccidiodes brasiliensis), 블라스토마이세스 더마티티스(Blastomyces dermatitis), 스포로트릭스 쉔키이(Sporothrix schenckii), 페니실리움 마르네페이(Penicillium marneffei), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 루시타니아에(Candida lusitaniae), 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 아스퍼질러스(Aspergillus), 엑소피알라 진셀메이(Exophiala jeanselmei), 폰세카에아 페드로소이(Fonsecaea Pedrosoi), 폰세카에아 콤팩타(Fonsecaea compacta), 크로모마이세스 베루시포르미스(Chromomyces verruciformis), 피그멘타티온 더마티티스(Pigmentation dermatitis), 게오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum), 슈달레쉐리아 보이디이(Pseudallescheria boydii), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 트리코스포론 쿠타네움(Trichosporon Cutaneum), 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae), 뮤코 인디쿠스(Mucor indicus), 압시디아 코림비페라(Absidia corymbifera), 신세팔라스트룸 라세모숨(Syncephalastrum racemosum), 바시디오볼루스 라나룸(Basidiobolus ranarum), 코니디오볼루스 코로나투스(Conidiobolus coronatus), 코니디오볼루스 인콘그루스(Conidiobolus incongruus), 엔테로사이토준 비엔네우시(Enterocytozoon bieneusi), 엔세팔리토준 인테스티날리스(Encephalitozoon intestinalis), 리노스포리듐 세베리(Rhinosporidium seeberi), 히알로히포마이세트(hyalohyphomycete) 및 파에오히포마이세트(phaeohyphomycete) 중 1종 이상을 포함하고;
    선택적으로, 상기 면역 세포 요법 약물은 종양 침윤성 림프구, 수지상 세포, 사이토카인 유도형 살해 세포, 수지상 세포-사이토카인 유도형 살해 세포, 자연 살해 세포, γδT 세포, CD3AK, CAR-T 및 TCR-T로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이고;
    선택적으로, 상기 항체 요법 약물은 항-PD1 항체, 항-PDL1 항체, 항-CTLA4 항체 및 항-CD 항원 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    선택적으로, 상기 화학 약물은 알킬화제, 항대사성물질, 항종양 항생제, 식물성 항종양 약물, 호르몬 약물 및 기타 약물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이고;
    상기 기타 약물은 L-아스파라기나제, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 다카바진, 헥사메틸멜라민 약물 및 이의 유도체들로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    선택적으로, 점막 면역 흡수 또는 점막 부착을 촉진하는 물질은 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 양성이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 특수 계면활성제, 킬레이트제, 접착제(adhesives), 폴리락트산-글리콜산 공중합체, 덱스트란 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이고;
    선택적으로, 면역 조절제가 사이토카인, 케모카인, 줄기 세포 성장 인자, 림프독소, 조혈 인자, 콜로니 자극 인자 (CSF), 인터페론, 에리트로포이에틴, 혈소판 형성소(thrombopoietin), 종양 괴사 인자 (TNF), 인터루킨 (IL), 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 줄기 세포 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이고;
    선택적으로, 상기 패턴 인식 수용체-리간드는 TLR 수용체-리간드, RLR 수용체-리간드, CLR 수용체-리간드 및 NLR 수용체-리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 제조된 면역 반응 강화용 복합체.
  19. 항체, 백신 제제 또는 백신 조성물을 제조하거나, 면역 세포 활성을 강화하거나, 종양, 바이러스, 박테리아, 균류, 기생충을 치료 및/또는 예방하고, 화학요법의 부작용을 감소시키며, 피로에 저항하거나 면역성을 개선하고, 숙주의 통증을 완화시키며, 숙주의 항원에 대한 면역 반응을 촉진시키기 위한, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 제조된 면역 반응 강화용 복합체의 용도.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 제조된 면역 반응 강화용 복합체, 또는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 제조된 면역 반응 강화용 복합체 및 적어도 하나의 항원을 포함하는 백신 조성물, 또는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 제조된 면역 반응 강화용 복합체를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 약제학적 조성물은 면역 세포 요법 약물, 항체 요법 약물, 화학 약물, 점막 면역 흡수 또는 점막 부착을 촉진하는 물질, 면역조절제, 병원성 항원, 패턴 인식 수용체 리간드 중 1종 이상, 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는,
    숙주에서 항원에 대한 생체내 면역 반응을 촉진하거나, 숙주에서 면역 세포 활성을 조절 및 강화하거나, 숙주의 피로를 감소시키는데 도움을 주거나, 또는 숙주의 통증을 경감시키는 방법.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103599071A (zh) * 2013-11-08 2014-02-26 杭州美亚药业有限公司 一种双链聚肌胞干粉的制备方法
CN105396130A (zh) * 2015-11-10 2016-03-16 林海祥 皮氨钙佐剂及含有皮氨钙佐剂的疫苗
CN109078180A (zh) * 2018-06-29 2018-12-25 信福(北京)医药科技有限公司 用于增强免疫响应的复合物

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2380481T3 (es) * 2005-06-08 2012-05-14 Yisheng Biopharma (Singapore) Pte. Ltd. Sustancias inmunogénicas que comprenden un adyuvante a base de ácido poliinosínico y ácido policitidílico
CN103405762A (zh) * 2005-06-08 2013-11-27 依生生物制药(新加坡)私人有限公司 以聚肌苷酸-聚胞苷酸为主的佐剂
US20070166800A1 (en) * 2006-01-13 2007-07-19 Haixiang Lin Immunogenic substances comprising a polyinosinic acid-polycytidilic acid based adjuvant
CN101134014A (zh) * 2007-09-19 2008-03-05 天津大学 带有表面涂层的硫酸钙串珠植入型局部释药体系及制备方法
CN102318740B (zh) * 2011-07-15 2012-11-21 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 复合氨基酸多维液体微乳及其制备方法
CN104394846B (zh) * 2012-05-03 2018-10-19 爱尔兰詹森科学公司 用于治疗上呼吸道感染的聚肌苷酸-聚胞苷酸（聚(i:c)）配制品
US10023871B2 (en) * 2013-12-16 2018-07-17 Riboxx Gmbh Double-stranded polyC:poly(G/I) RNA for immunostimulation and cancer treatment
CN104434784B (zh) * 2014-11-15 2017-07-04 成都天台山制药有限公司 聚肌胞注射液药物组合物和制法
CN107188932B (zh) 2016-03-15 2020-02-11 中国医学科学院基础医学研究所 截短型人乳头瘤病毒16型l1蛋白及其应用
WO2017173371A1 (en) * 2016-04-01 2017-10-05 Colorado State University Research Foundation Compositions and methods for enhanced innate immunity
CN107875168B (zh) * 2016-09-30 2022-03-04 广州百吉生物制药有限公司 一种免疫调节组合物在治疗恶性积液中的用途
CN108743938B (zh) * 2018-06-29 2019-04-09 信福(北京)医药科技有限公司 用于增强免疫响应的复合物的制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103599071A (zh) * 2013-11-08 2014-02-26 杭州美亚药业有限公司 一种双链聚肌胞干粉的制备方法
CN105396130A (zh) * 2015-11-10 2016-03-16 林海祥 皮氨钙佐剂及含有皮氨钙佐剂的疫苗
CN109078180A (zh) * 2018-06-29 2018-12-25 信福(北京)医药科技有限公司 用于增强免疫响应的复合物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Adv. Drug Deliv. Rev. (2013)* *
Mar. Drugs (2017)* *

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Publication number Publication date
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