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KR20210003096A - 박테리아성 균주를 포함하는 조성물 - Google Patents

박테리아성 균주를 포함하는 조성물 Download PDF

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KR20210003096A
KR20210003096A KR1020207028232A KR20207028232A KR20210003096A KR 20210003096 A KR20210003096 A KR 20210003096A KR 1020207028232 A KR1020207028232 A KR 1020207028232A KR 20207028232 A KR20207028232 A KR 20207028232A KR 20210003096 A KR20210003096 A KR 20210003096A
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South Korea
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present
cells
seq
bacterial strain
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에이미 베스 홀트
수아드 아메드
안나 에토르
임케 엘리자베스 멀더
필립 코위
엠마 라프티스
엠마 엘리자베스 클레어 헤네시
델핀 루이스 클로데트 라우트-캘리
오렐리 파스칼 파트리시아 쿠튀리에-마이야르
마가렛 인크스터 델데이
마실리오 아드리아니
마리아 크리스토피
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4디 파마 리서치 리미티드
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Abstract

본 발명은 면역계를 자극하고 질환을 치료하고 예방하기 위한 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.

Description

박테리아성 균주를 포함하는 조성물
본 발명은 포유류 소화관으로부터 단리된 박테리아 균주를 포함하는 조성물 및 질환의 치료에서의, 특히 질환의 치료에서 면역계를 자극하는 데 있어서의 이러한 조성물의 용도 분야에 대한 것이다.
인간 내장은 자궁내에서는 멸균상태인 것으로 여겨지지만, 출생 직후 매우 다양한 모체 및 환경 미생물에 노출된다. 이후, 미생물 집락 및 갱신의 동적 기간이 진행되며, 이는 출산 방식, 환경, 식이 및 숙주 유전형과 같은 요인에 의해 영향받고, 이들 모두가 장 미생물총의 조성에, 특히 초기 수명 동안 영향을 미친다. 이후, 미생물총이 안정화되고 성인과 유사해진다[1]. 인간 장 미생물총은 본질적으로 2개의 주요 박테리아 문에 속하는 박테로이데테스(Bacteroidetes) 및 퍼미쿠테스(Firmicutes)에 속하는 500~1000개를 초과하는 상이한 계통형을 포함한다[2]. 인간 장의 박테리아 집락으로부터 발생하는 성공적인 공생 관계는 매우 다양한 대사, 구조, 보호 및 다른 유익한 기능을 산출하였다. 집락화된 장의 증강된 대사 활성은 다른 경우 소화 불가능한 식이 성분이 부산물을 방출하며 분해되어 숙주에 대해 중요한 영양원을 제공할 것을 보장한다. 유사하게, 장 미생물총의 면역학적 중요성은 잘 인식되어 있으며 공생 박테리아의 도입 후 기능적으로 재구성되는 손상된 면역계를 갖는 무균 동물에서 예시된다[3-5].
염증성 대장 질환(IBD)과 같은 위장관 장애에서 미생물총 조성의 극적인 변화가 보고되었다. 예를 들어, IBD 환자에서는 클로스트리듐(Clostiridium) 클러스터 XIVa 박테리아의 수준이 감소되는 반면, 대장균의 수가 증가되어, 장 내 공생체 및 유해균 균형의 이동을 제시한다[6-9]. 흥미롭게도, 이러한 미생물 세균조성이상은 또한 T 효과기 세포 집단의 불균형과 연관된다.
특정 박테리아 균주가 동물 장에 대해 가질 수 있는 잠재적인 긍정적 효과를 인식하여, 다양한 균주가 다양한 질환의 치료에서의 사용하기 위해 제안되었다(예를 들어, [10~13] 참고). 또한, 대부분 락토바실러스(Lactobacillus) 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 균주를 포함하는 특정 균주가 내장과 직접 연관되지 않은 다양한 염증성 및 자가면역 질환의 치료에서 사용하기 위해 제안되었다(리뷰를 위해 [14] 및 [15] 참고). 특정 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 베일로넬라(Veillonella) 균주, 그리고 더 적은 정도로, 엔테로코커스 및 박토바실러스 균주가 시험관내에서 상이한 사이토카인에 대해 다양한 효과를 가지며 면역조절 효과를 갖는 것으로 제시되어, 개별 균주로 시험관내 수득되는 데이터는 생체내 장 미생물총 커뮤니티의 혼합물에 대한 면역 반응을 적절히 나타낼 수 없을 것임을 제시하였다[88]. 그러나, 상이한 질환 및 상이한 박테리아 균주 간 상관관계, 및 장에 대한 및 전신 수준에서의 그리고 임의의 특정 유형의 질환에 대한 특정 박테리아 균주의 정확한 효과는 잘 특성규명되어 있지 않다.
새로운 질환 치료 방법에 대한 필요성이 당분야에 존재한다. 또한 장 박테리아를 사용하는 새로운 치료법이 개발될 수 있도록 장 박테리아의 잠재적 효과가 특성규명될 필요성이 존재한다.
발명의 요약
본 발명자들은 면역계를 자극하고 질환을 치료하고 예방하는 데 사용될 수 있는 엔테로코커스 갈리나룸(Enterococcus gallinarum) 종의 박테리아 균주를 포함하는 새로운 조성물을 개발하였다. 본 발명자들은 엔테로코커스 갈리나룸 종 균주가 면역계를 강력히 활성화할 수 있고 암을 치료할 수 있음을 확인하였고, 이는 이들이 또한 면역계의 활성화가 유용할 수 있는 다른 질환을 치료할 수 있음을 시사한다.
따라서 본 발명은 대상체에서 면역계를 자극하는 데 사용하기 위한, 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 면역노화를 치료하거나, 예방하거나, 지연하는 데 사용하기 위한, 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 백신 보조제로 사용하기 위한, 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 CAR-T와 같은 세포 치료법을 증강시키는 데 사용하기 위한, 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 박테리아는 NCIMB에서 접근 번호 42488 하에 기탁된 균주이다.
바람직한 추가 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 박테리아는 NCIMB에서 접근 번호 42761 하에 기탁된 균주이다.
도 1a: 유방암의 마우스 모델 - 종양 유도 후 종양 부피의 변화 및 각각의 시점에 각각의 2개 처리 간 통계적 유의성을 시사하는 표.
도 1b: 상부 패널: EMT6 종양에서의 괴사 면적(미처리 n=6, 비히클 n=6, MRx0518 n=8). 하부 패널: EMT6 종양에서 분열 세포의 백분율. P=0.019(미처리 n=4, 계수된 총 세포수=37201, 비히클 n=6, 계수된 총 세포수=64297, MRx0518 n=6, 계수된 총 세포수=33539).
도 1c: 유방암의 마우스 모델 - 침윤 면역 세포. 산란도는 각각의 처리군의 개별 동물로부터의 상이한 면역 마커의 세포수를 나타낸다.
도 1d: 유방암의 마우스 모델 - 종양 용해액 중 사이토카인 생산. 칼럼은 각각의 처리군으로부터의 총 단백질의 평균 pg/㎖을 나타낸다. * 원-웨이 ANOVA에 이어 Dunnett 다중 비교 평가를 사용하여, 군 간 p < 0.05.
도 1e: 유방암의 마우스 모델 - 혈장 중 사이토카인 생산. 칼럼은 각각의 처리군으로부터의 평균 pg/㎖(+/- SEM)을 나타낸다.
도 1f: CD8α에 대한 항체로 면역-표지된(하부 패널) 및 DAPI로 카운터-염색된 비히클(상부 패널), MRx0518 및 항-CTLA-4-처리 마우스의 회장 냉동섹션의 대표 이미지.
도 1g: 비히클, MRx0518 또는 항-CTLA-4로 처리된 마우스의 회장 움 영역으로부터 취한 시야 당 3개를 초과하는 CD8α+ 세포를 갖는 동물 연구 하위세트를 정량하는 그래프.
도 2: 폐암의 마우스 모델 - 종양 유도 후 종양 부피 변화 및 각각의 시점에 각각의 2개 처리 간 통계적 유의성을 시사하는 표.
도 3a: 간암의 마우스 모델 - 간 중량.
도 3b: 신장암의 마우스 모델 - 종양 유도 후 종양 부피 변화 및 각각의 시점에 각각의 2개 처리 간 통계적 유의성을 시사하는 표.
도 4a: 미성숙 수지상 세포에서의 사이토카인 수준(pg/㎖㎖)(박테리아 비함유).
도 4b: LPS의 첨가 후 미성숙 수지상 세포에서의 사이토카인 수준(pg/㎖㎖).
도 4c: MRx0518MRx0518의 첨가 후 미성숙 수지상 세포에서의 사이토카인 수준(pg/㎖㎖).
도 4d: MRx0518MRx0518 및 LPS의 첨가 후 미성숙 수지상 세포에서의 사이토카인 수준(pg/㎖㎖).
도 5a: THP-1 세포에서의 사이토카인 수준(박테리아 비함유).
도 5b: 박테리아 침강의 첨가 후 THP-1 세포에서의 사이토카인 수준.
도 5c: 단독으로 또는 LPS와 조합된 MRx0518MRx0518의 첨가 후 THP-1 세포에서의 사이토카인 수준.
도 6 및 7: 면역자극 반응 - TNFα
도 8: 면역자극 반응 - IL-12p70
도 9: 면역조절 반응 - IL-10
도 10: 면역자극 반응 - IL-8
도 11: 면역자극 반응 - IL-23
도 12: 면역자극 반응 - IL-1β
도 13: 면역자극 반응 - IL-6
도 14: 작용 기전 - NFκB의 활성화
도 15: 작용 기전 - TLR5의 활성화
도 16a: 본원에서 후술되는 실시예 8에서 사용된 상이한 군의 처리 일정의 모식도.
도 16b: EMT-6 세포에 의해 형성된 종양을 보유하는 마우스에서의 평균 종양 부피. 마우스는 미처리하거나 YCFA 비히클(비히클), YCFA 배지 중 MRx0518 박테리아(MRx0518), 항-CTLA-4 항체 및 YCFA 배지(항-CTLA-4) 또는 MRx0518 및 항-CTLA-4 항체의 조합으로 처리하였다. 제공된 표는 각각의 시점에 각각의 2개 치료 간 통계적 유의성을 시사한다.
도 17: 유방암의 마우스 모델 - 종양 부피.
도 18: MRx0554의 API 50 CHL 프로필.
도 19: 작용 기전 - HEK-Blue™ hTLR9 리포터 세포주에서 MRx0518(MRx0518LV), 열-사멸 MRx0518(MRx0518HK) 및 MRx0518 배양 상청액(MRx0518SN)에 의한 TLR9 활성화. ODN2006이 양성 대조군으로 그리고 YCFA 배지가 MRx0518SN에 대한 음성 대조군으로 포함되었다. 막대 그래프는 적어도 3개의 생물학적 반복물의 평균을 나타낸다. 통계적 분석은 GraphPad Prism(일반 원-웨이 ANOVA 분석에 이어 Tukey의 다중 비교 평가)을 사용하여 수행하였다. 관련 대조군과의 통계적 유의차를 그래프에 ****(p < 0.0001)로 표시한다.
도 20a~b: 열-사멸 MRx0518(HK 518), MRx0518 배양 상청액 또는 RPMI 배지를 사이토카인의 첨가 없이(no cyto) 사용하는, (a) T-헬퍼 세포 및 (b) 세포독성 T 림프구(CTL) 집단에서의 T-세포 분화의 유도. * = p≤ 0.05; ** = p≤ 0.01; *** = p≤0.001; **** = p≤0.0001.
도 21a~d: YCFA+ 배지("비히클") 또는 MRx0518의 무세포 박테리아 상청액("MRx0518")으로 처리된, (a) PBMC 세포; (b) 비장세포; 또는 (c) THP-1 세포에 의한 시험관내 사이토카인 생산. 도 21d는 미처리 세포 대비 살아있는 박테리아("MRx0518")를 이용한 CaCo-2 세포의 처리 후 사이토카인 발현의 변화 배율을 나타낸다.
도 21e: 처리되지 않았거나("미처리"), YCFA 블랭크 배지로 처리되었거나("10% YCFA"), MRx0518 무세포 박테리아 상청액으로 처리된("10% MRx0518") 세포로부터의, 비장세포(N=3)에 의한 시험관내 사이토카인 생산.
도 21f: MTT 검정에 의해 측정된, 마우스(N=4)로부터 추출된 비장세포의 생활성. 세포는 처리되지 않았거나("미처리"), YCFA 블랭크 배지로 처리되었거나("10% YCFA"), MRx0518 무세포 박테리아 상청액으로 처리되었다("10% MRx0518").
도 22a~d: (a) HEK-Blue™-hNOD2 세포; (b) HEK-Blue™-hTLR4 세포; (c) HEK-Blue™-hTLR9 세포 또는 (d) HEK-Blue™-hTLR5 세포에서의 NF-κB 프로모터 활성화. 세포는 처리되지 않았거나("미처리"), YCFA 배지로 처리되었거나("YCFA"), MRx0518로 처리되었거나("MRx0518"), 양성 대조군으로 처리되었다.
도 23: YCFA 비히클("비히클") 또는 MRx0518("MRx0518")로의 처리 후 EMT6 종양 미세환경의 NanoString 분석을 나타내는 열 지도.
박테리아 균주
본 발명의 조성물은 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함한다. 실시예는 상기 속의 박테리아가 면역계를 자극하고 질환을 치료하기 위해 유용함을 실증한다.
엔테로코커스 갈리나룸은 대부분 쌍을 짓거나 단쇄인, 알모양 세포를 형성한다. 이는 운동성이며 혈액 한천 또는 영양 한천 상의 콜로니는 원형이고 매끄럽다. 엔테로코커스 갈리나룸은 랜스필드(Lancefield) D 그룹 항혈청과 반응한다. 엔테로코커스 갈리나룸의 균주 유형은 F87/276 = PB21 = ATCC 49573 = CCUG 18658 = CIP 103013 = JCM 8728 = LMG 13129 = NBRC 100675 = NCIMB 702313(예전 NCDO 2313) = NCTC 12359이다[16]. 엔테로코커스 갈리나룸의 16S rRNA 유전자 서열에 대한 GenBank 접근 번호는 AF039900(본원에서 서열 번호 1로 개시됨)이다. 예시적인 엔테로코커스 갈리나룸 균주는 문헌[16]에 기재되어 있다.
접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 박테리아가 실시예에서 평가되었고 본원에서 균주 MRx0518로도 언급된다. MRx0518 및 MRx0518에 대한 언급은 상호 교환적으로 사용된다. 평가된 MRx0518 균주에 대한 16S rRNA 서열은 서열 번호 2에서 제공된다. 균주 MRx0518은 "엔테로코커스 종"으로 2015년 11월 16일에 4D Pharma Research Ltd.(Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Scotland)에 의해 국제 기탁 당국 NCIMB, Ltd.(Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland)에 기탁되었고 접근 번호 NCIMB 42488을 수여받았다.
균주 MRx0518의 게놈은 염색체 및 플라스미드를 포함한다. 균주 MRx0518에 대한 염색체 서열은 WO2017/085520의 서열 번호 3에서 제공된다. 균주 MRx0518에 대한 플라스미드 서열은 WO2017/085520의 서열 번호 4에서 제공된다. 이들 서열은 PacBio RS II 플랫폼을 사용하여 생성되었다.
접근 번호 NCIMB 42761 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 박테리아가 또한 실시예에서 평가되었고 본원에서 균주 MRx0554로도 언급된다. MRx0554 및 MRx0554에 대한 언급은 상호 교환적으로 사용된다. 균주 MRx0554는 "엔테로코커스 갈리나룸 MRx0554"로 2017년 5월 22일에 4D Pharma Research Ltd.(Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Scotland)에 의해 국제 기탁 당국 NCIMB, Ltd.(Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland)에 기탁되었고 접근 번호 NCIMB 42761을 수여받았다. 상기 박테리아의 게놈 서열은 WO2018/215782의 서열 번호 2로 본원에서 개시된다. 게놈 서열은 여러 인접부(contig)로부터 조립되었다. 서열에서 N은 인접부 간 갭을 나타낸다. "N"은 A, G, C 또는 T 뉴클레오타이드를 나타낼 수 있다. MRx0554 균주에 대한 16S rRNA 유전자 서열은 서열 번호 3에서 제공된다. 서열 번호 3은 MRx0554에 존재하는 5개의 16S 유전자의 공통부가 아닌, 어셈블리에 존재하는 전장 서열을 나타낸다.
실시예에서 평가된 균주와 가깝게 관련된 박테리아 균주가 또한 면역계를 자극하기 위해 효과적일 것으로 예상된다. 특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 서열 번호 1 또는 2와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 유전자 서열을 갖는다. 바람직하게는, 서열 동일성은 서열 번호 2에 대한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 서열 번호 2로 나타내는 16s rRNA 유전자 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 서열 번호 3과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 유전자 서열을 갖는다.
접근 번호 42488 하에 기탁된 박테리아의 생물형인 박테리아 균주도 면역계를 자극하기 위해 효과적일 것으로 예상된다. 생물형은 동일하거나 매우 유사한 생리적 및 생화학적 특징을 갖는, 가깝게 관련된 균주이다.
접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 박테리아의 생물형이며 본 발명에서 사용하기 위해 적합한 균주는 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 박테리아에 대해 다른 뉴클레오타이드 서열을 서열분석하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 전체 게놈이 서열분석될 수 있고 본 발명에서 사용하기 위한 생물형 균주는 그 전체 게놈의 적어도 80%에 걸쳐(예로 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99%에 걸쳐, 또는 그 전체 게놈에 걸쳐) 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 생물형 균주는 그 게놈의 적어도 98%에 걸쳐 적어도 98% 서열 동일성 또는 그 게놈의 99%에 걸쳐 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 생물형 균주를 확인하는 데 사용하기 적합한 다른 서열에는 hsp60 또는 BOX, ERIC, (GTG)5, 또는 REP 또는 [17]와 같은 반복 서열이 포함될 수 있다. 생물형 균주는 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 박테리아의 대응하는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 생물형 균주는 NCIMB 42488로 기탁된 균주 MRx0518의 대응하는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가지며 서열 번호 2와 적어도 99% 동일한(예로 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9% 동일한) 16S rRNA 유전자 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물형 균주는 NCIMB 42488로 기탁된 균주 MRx0518의 대응하는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가지며 서열 번호 2의 16S rRNA 유전자 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2017/085520의 서열 번호 3과 서열 동일성을 갖는 염색체를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2017/085520의 서열 번호 3의 적어도 60%(예로 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)에 걸쳐 적어도 90% 서열 동일성(예로 적어도 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 염색체를 갖는다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2017/085520의 서열 번호 3의 70%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 3의 80%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 3의 90%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 3의 100%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 3의 70%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 3의 80%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 3의 90%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 3의 100%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 3의 70%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 3의 80%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 3의 90%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 3의 95%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 3의 100%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 3의 90%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 99.5% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 3의 95%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 99.5% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 3의 98%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 99.5% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 3의 100%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 99.5% 서열 동일성을 갖는 염색체를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2017/085520의 서열 번호 4와 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2017/085520의 서열 번호 4의 적어도 60%(예로 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 4와 적어도 90% 서열 동일성(예로 적어도 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 플라스미드를 갖는다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2017/085520의 서열 번호 4의 70%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 4와 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 4의 80%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 4와 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 4의 90%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 4와 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 4의 100%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 4와 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 4의 70%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 4와 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 4의 80%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 4와 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 4의 90%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 4와 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 4의 100%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 4와 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 4의 70%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 4와 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 4의 80%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 4와 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 4의 90%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 4와 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2017/085520의 서열 번호 4의 100%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 4와 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2017/085520의 서열 번호 3과 서열 동일성을 갖는 염색체 및 WO2017/085520의 서열 번호 4와 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 예를 들어 상술된 바와 같은, WO2017/085520의 서열 번호 3과 서열 동일성을 갖는 염색체, 및 예를 들어 상술된 바와 같은, 서열 번호 1 또는 2 중 어느 하나와 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 서열을 갖고, 바람직하게는 서열 번호 2와 적어도 99% 동일한 16s rRNA 서열을 갖고, 보다 바람직하게는 서열 번호 2의 16S rRNA 서열을 포함하고, 선택적으로 상술된 바와 같은, WO2017/085520의 서열 번호 4와 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 예를 들어 상술된 바와 같은, WO2017/085520의 서열 번호 3과 서열 동일성을 갖는 염색체를 가지며, 선택적으로 상술된 바와 같은, WO2017/085520의 서열 번호 4와 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 포함하고, 면역계를 자극하기 위해 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 예를 들어 상술된 바와 같은, WO2017/085520의 서열 번호 3과 서열 동일성을 갖는 염색체, 및 예를 들어 상술된 바와 같은, 서열 번호 1 또는 2 중 어느 하나와 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 서열을 가지며, 선택적으로 상술된 바와 같은, WO2017/085520의 서열 번호 4와 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 포함하고, 면역계를 자극하기 위해 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 서열 번호 2로 나타내는 16s rRNA 서열과 적어도 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열(예를 들어, 서열 번호 2의 16S rRNA 서열을 포함함) 및 WO2017/085520의 서열 번호 3의 적어도 90%에 걸쳐 WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 염색체를 가지며, 선택적으로 상술된 바와 같은, WO2017/085520의 서열 번호 4와 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 포함하고, 면역계를 자극하기 위해 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 서열 번호 2로 나타내는 16s rRNA 유전자 서열과 적어도 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열(예를 들어, 서열 번호 2의 16s rRNA 서열을 포함함) 및 WO2017/085520의 서열 번호 3의 적어도 98%에 걸쳐(예로 적어도 99% 또는 적어도 99.5%에 걸쳐) WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 98% 서열 동일성(예로 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 서열 동일성)을 갖는 염색체를 가지며, 선택적으로 상술된 바와 같은, WO2017/085520의 서열 번호 4와 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 포함하고, 면역계를 자극하기 위해 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 엔테로코커스 갈리나룸이며 서열 번호 2로 나타내는 16s rRNA 서열과 적어도 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열(예를 들어, 서열 번호 2의 16s rRNA 서열을 포함함) 및 WO2017/085520의 서열 번호 3의 적어도 98%에 걸쳐(예로 적어도 99% 또는 적어도 99.5%에 걸쳐) WO2017/085520의 서열 번호 3과 적어도 98% 서열 동일성(예로 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 서열 동일성)을 갖는 염색체를 갖고, 선택적으로 상술된 바와 같은, WO2017/085520의 서열 번호 4와 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 포함하고, 면역계를 자극하기 위해 효과적이다.
대안적으로, 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 박테리아의 생물형이며 본 발명에서 사용하기 위해 적합한 균주는 접근 번호 NCIMB 42488 기탁물 및 제한효소 단편 분석 및/또는 PCR 분석을 사용하여, 예를 들어 형광 증폭된 단편 길이 다형성(FAFLP) 및 반복 DNA 요소(rep)-PCR 핑거프린트 분석, 또는 단백질 프로필 분석, 또는 부분적 16S 또는 23s rDNA 서열분석을 사용하여 확인될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이러한 기법은 다른 엔테로코커스 갈리나룸 균주를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 박테리아의 생물형이며 본 발명에서 사용하기 위해 적합한 균주는 증폭된 리보솜 DNA 제한효소 분석(ARDRA)에 의해 분석되는 경우, 예를 들어 Sau3AI 제한 효소를 사용하는 경우(예를 들어, 예시적인 방법 및 지침에 대해서는, 문헌[18]을 참고한다), 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 박테리아와 동일한 패턴을 제공하는 균주이다. 대안적으로, 생물형 균주는 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 박테리아와 동일한 탄수화물 발효 패턴을 갖는 균주로 확인된다. 일부 구현예에서, 탄수화물 발효 패턴은 API 50 CHL 패널(bioM
Figure pct00001
rieux)을 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 박테리아 균주는 하기와 같다:
바람직하게는 API 50 CHL 분석(바람직하게는 bioM
Figure pct00002
rieux의 API 50 CHL 패널을 사용함)에 의해 결정되는,
(i) L-아라비노스, D-리보스, D-자일로스, D-갈락토스, D-글루코스, D-프룩토스, D-만노스, N-아세틸글루코사민, 아미그달린, 아르부틴, 살리신, D-셀로바이오스, D-말토스, 수크로스, D-트레할로스, 겐티오바이오스, D-타가토스 및 칼륨 글루코네이트 중 적어도 하나(예로 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개 또는 모두)의 발효에 대해 양성이고/이거나;
(ii) D-만니톨, 메틸-αD-글리코피라노시드, D-락토스, 전분, 및 L-푸코스 중 적어도 하나(예로 적어도 2, 3, 4개 또는 모두)의 발효에 대해 중간임.
접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 박테리아의 생물형과 같이, 본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 다른 엔테로코커스 갈리나룸 균주는 실시예에 기재된 검정을 포함하는, 임의의 적절한 방법 또는 전략을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 균주는 실시예에서 수행된 바와 같이, 사이토카인 수준에 대한 이의 효과를 평가하여 확인될 수 있다. 특히, 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 박테리아와 유사한 성장 패턴, 대사 유형 및/또는 표면 항원을 갖는 박테리아 균주가 본 발명에서 유용할 수 있다. 유용한 균주는 NCIMB 42488 균주에 필적하는 면역 조절 활성을 가질 것이다. 특히, 생물형 균주는 암 질환 모델 상에서 실시예에 나타낸 효과와 필적하는 효과를 유발할 것이며, 이는 실시예에 기재된 배양 및 투여 프로토콜을 사용하여 확인될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본 발명에서 사용될 수 있는 생물형 균주는 본 발명의 방법에서 투여되는 경우 실시예에 나타낸 암 질환 모델 상에서 필적하는 효과를 유발할 수 있는 균주이다.
일부 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 박테리아 균주는 하기와 같다:
바람직하게는 탄수화물, 아미노산 및 니트레이트 대사의 검정, 및 선택적으로 알칼리성 포스파타제 활성의 검정에 의해 결정되며, 보다 바람직하게는 Rapid ID 32A 분석에 의해(바람직하게는 bioM
Figure pct00003
rieux의 Rapid ID 32A 시스템을 사용하여) 결정되는,
(i) 만노스 발효, 글루탐산 탈카르복실라제, 아르기닌 아릴아미다제, 페닐알라닌 아릴아미다제, 피로글루탐산 아릴아미다제, 티로신 아릴아미다제, 히스티딘 아릴아미다제 및 세린 아릴아미다제 중 적어도 하나(예로 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 모두)에 대해 양성이고/이거나;
(ii) β-갈락토시다제-6-포스페이트, β-글루코시다제 및 N-아세틸-β-글루코스아미니다제 중 적어도 하나(예로 적어도 2개 또는 모두)에 대해 중간이고/이거나;
(iii) 라피노스 발효, 프롤린 아릴아미다제, 류실 글리신 아릴아미다제, 류신 아릴아미다제, 알라닌 아릴아미다제, 글리신 아릴아미다제 및 글루타밀 글루탐산 아릴아미다제 중 적어도 하나(예로 적어도 2, 3, 4, 5, 6개 또는 모두)에 대해 음성임.
일부 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 박테리아 균주는 하기와 같다:
(i) 예를 들어, 탄수화물, 아미노산 및 니트레이트 대사의 검정에 의해 결정되는, 바람직하게는 Rapid ID 32A 분석에 의해(바람직하게는 bioM
Figure pct00004
rieux의 Rapid ID 32A 시스템을 사용하여) 결정되는, 글리신 아릴아미다제, 라피노스 발효, 프롤린 아릴아미다제, 및 류신 아릴아미다제 중 적어도 하나(예로 적어도 2, 3개, 또는 4개 모두)에 대해 음성이고/이거나;
(ii) 바람직하게는 API 50 CHL 분석에 의해(바람직하게는 bioM
Figure pct00005
rieux의 API 50 CHL 패널을 사용하여) 결정되는, L-푸코스 발효에 대해 중간 양성임.
일부 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 박테리아 균주는 세포외 ATP 생산체, 예를 들어 ATP 검정 키트(Sigma-Aldrich, MAK190)를 사용하여 측정되는, 6~6.7 ng/㎕(예를 들어, 6.1~6.6 ng/㎕ 또는 6.2~6.5 ng/㎕ 또는 6.33 ± 0.10 ng/㎕)의 ATP를 생산하는 생산체이다. 박테리아 세포외 ATP는 T 세포-수용체 매개된 신호전달의 활성화(Schenk et al., 2011), 내장 Th17 세포 분화의 촉진(Atarashi et al., 2008) 및 NLRP3 인플라솜의 활성화에 의한 전염증성 매개체 IL-1β의 분비 유도(Karmarkar et al., 2016)를 포함하는 다면발현 효과를 가질 수 있다. 따라서, 세포외 ATP 생산체인 박테리아 균주는 본 발명의 방법의 맥락에서 면역계를 자극하기 위해 유용하다.
일부 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 하기 3개 유전자: 운동성 요소 단백질; 자일로스 ABC 트랜스포터, 퍼미아제(Permease) 성분; 및 FIG00632333: 가상 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 운동성 요소 단백질 및 자일로스 ABC 트랜스포터, 퍼미아제 성분; 운동성 요소 단백질 및 FIG00632333: 가상 단백질; 자일로스 ABC 트랜스포터, 퍼미아제 성분 및 FIG00632333: 가상 단백질; 또는 운동성 요소 단백질, 자일로스 ABC 트랜스포터, 퍼미아제 성분, 및 FIG00632333: 가상 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함한다.
본 발명의 특히 바람직한 균주는 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 균주이다. 이는 실시예에서 평가된 예시적인 MRx0518 균주이며 질환을 치료하기 위해 효과적인 것으로 나타난다. 본 발명은 일부 구현예에 따르면, 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 균주의 세포, 또는 이의 유도체를 포함하는, 본 발명의 일환으로서의 박테리아 조성물을 제공한다. 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 균주의 유도체는 원래 균주로부터의 딸 균주(자손) 또는 이로부터 배양된(서브클로닝된) 균주일 수 있다.
본 발명에 포함된 조성물의 균주 유도체는, 예를 들어 유전자 수준에서, 생물학적 활성을 제거하지 않고 변형될 수 있다. 특히, 본 발명의 유도체 균주는 치료 활성이 있다. 유도체 균주는 원래 NCIMB 42488 균주와 필적하는 면역 조절 활성을 가질 것이다. 특히, 유도체 균주는 실시예에 기재된 배양 및 투여 프로토콜을 사용하여 확인될 수 있는 경우 암 질환 모델 상에서 필적하는 효과를 유발할 것이다. NCIMB 42488 균주의 유도체는 일반적으로 NCIMB 42488 균주의 생물형일 것이다.
접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 균주의 세포에 대한 언급은 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 균주와 동일한 안전성 및 치료 유효성 특징을 갖는 임의의 세포를 포괄하며, 이러한 세포는 본 발명에 의해 포괄된다. 따라서, 일부 구현예에서, 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 균주의 세포에 대한 언급은 NCIMB 42488 하에 기탁된 MRx0518 균주만을 나타내며 NCIMB 42488 하에 기탁되지 않은 박테리아 균주는 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 균주의 세포에 대한 언급은 접근 번호 NCIMB 42488 하에 기탁된 균주와 동일한 안전성 및 치료 유효성 특징을 갖지만, NCIMB 42488 하에 기탁된 균주가 아닌 세포를 나타낸다.
접근 번호 42761 하에 기탁된 박테리아의 생물형인 박테리아 균주도 면역계를 자극하기 위해 효과적일 것으로 예상된다. 생물형은 동일하거나 매우 유사한 생리적 및 생화학적 특징을 갖는, 가깝게 관련된 균주이다.
접근 번호 NCIMB 42761 하에 기탁된 박테리아의 생물형이며 본 발명에서 사용하기 위해 적합한 균주는 접근 번호 NCIMB 42761 하에 기탁된 박테리아에 대해 다른 뉴클레오타이드 서열을 서열분석하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 전체 게놈이 서열분석될 수 있고 본 발명에서 사용하기 위한 생물형 균주는 그 전체 게놈의 적어도 80%(예로 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99%에 걸쳐, 또는 그 전체 게놈에 걸쳐) 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 생물형 균주는 그 게놈의 적어도 98%에 걸쳐 적어도 98% 서열 동일성 또는 그 게놈의 99%에 걸쳐 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 생물형 균주를 확인하는 데 사용하기 위한 다른 적합한 서열에는 hsp60 또는 반복 서열, 예컨대 BOX, ERIC, (GTG)5, 또는 REP 또는 [19]가 포함될 수 있다. 생물형 균주는 접근 번호 NCIMB 42761 하에 기탁된 박테리아의 대응하는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 생물형 균주는 NCIMB 42761로 기탁된 균주 MRx0554의 대응하는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 생물형 균주는 NCIMB 42761로 기탁된 균주 MRx0554의 대응하는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가지며 서열 번호 3과 적어도 99% 동일한(예로 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9% 동일한) 16S rRNA 유전자 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 생물형 균주는 NCIMB 42761로 기탁된 균주 MRx0554의 대응하는 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가지며 서열 번호 3의 16S rRNA 유전자 서열을 갖는다.
대안적으로, 접근 번호 NCIMB 42761 하에 기탁된 박테리아의 생물형이며 본 발명에서 사용하기 위해 적합한 균주는 접근 번호 NCIMB 42761 기탁물 및 제한효소 단편 분석 및/또는 PCR 분석을 사용하여, 예를 들어 형광 증폭된 단편 길이 다형성(FAFLP) 및 반복 DNA 요소(rep)-PCR 핑거프린트 분석, 또는 단백질 프로필 분석, 또는 부분적 16S 또는 23s rDNA 서열분석을 사용하여 확인될 수 있다.
특정 구현예에서, 접근 번호 NCIMB 42761 하에 기탁된 박테리아의 생물형이며 본 발명에서 사용하기 위해 적합한 균주는 증폭된 리보솜 DNA 제한효소 분석(ARDRA)에 의해 분석되는 경우, 예를 들어 Sau3AI 제한 효소를 사용하는 경우(예시적인 방법 및 지침에 대해서는, 예를 들어 [20]을 참고한다) 접근 번호 NCIMB 42761 하에 기탁된 박테리아와 동일한 패턴을 제공하는 균주이다. 대안적으로, 생물형 균주는 접근 번호 NCIMB 42761 하에 기탁된 박테리아와 동일한 탄수화물 발효 패턴을 갖는 균주로 확인된다. 일부 구현예에서, 탄수화물 발효 패턴은 API 50 CHL 패널(bioM
Figure pct00006
rieux)을 사용하여 결정된다. 일부 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 박테리아 균주는 하기와 같다:
바람직하게는 API 50 CHL 분석에 의해(바람직하게는 bioM
Figure pct00007
rieux의 API 50 CHL 패널을 사용하여) 결정되는,
(iii) L-아라비노스, D-리보스, D-자일로스, D-갈락토스, D-글루코스, D-프룩토스, D-만노스, N-아세틸글루코사민, 아미그달린, 아르부틴, 살리신, D-셀로바이오스, D-말토스, 수크로스, D-트레할로스, 겐티오바이오스, D-타가토스 및 칼륨 글루코네이트 중 적어도 하나(예로 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17개 또는 모두)의 발효에 대해 양성이고/이거나;
(iv) D-만니톨, 메틸-αD-글리코피라노시드, D-락토스, 전분, 및 L-푸코스 중 적어도 하나(예로 적어도 2, 3, 4개 또는 모두)의 발효에 대해 중간임.
일부 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 박테리아 균주는 하기와 같다:
바람직하게는 API 50 CHL 분석에 의해(바람직하게는 bioM
Figure pct00008
rieux의 API 50 CHL 패널을 사용하여, 바람직하게는 실시예 10에 기재된 조건을 사용하여) 결정되는,
(i) L-아라비노스, D-리보스, D-자일로스, D-갈락토스, D-글루코스, D-프룩토스, D-만노스, N-아세틸글루코사민, 아미그달린, 아르부틴, 에스쿨린, 살리신, D-셀로바이오스, D-말토스, D-사카로스(수크로스), D-트레할로스, 겐티오바이오스, D-타가토스 및 칼륨 글루코네이트 중 적어도 하나(예로 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개 또는 모두)의 발효에 대해 양성이고;
(ii) D-만니톨, 메틸-αD-글리코피라노시드, D-락토스, D-라피노스, 아미돈 (전분), 및 D-투라노스 중 적어도 하나(예로 적어도 2, 3, 4, 5개 또는 모두)의 발효에 대해 중간이고/이거나;
(iii) 글리세롤, 에리트리톨, D-아라비노스, L-자일로스, D-아도니톨, 메틸-βD-자일로프리노시드, L-소르보스, L-람노스, 둘시톨, 이노시톨, D-소르비톨, 메틸-αD-만노피라노시드, D-멜리바이오스, 이눌린, D-멜레지토스, 글리코겐, 자일리톨, D-릭소스, D-푸코스, L-푸코스, D-아라비톨, L-아라비톨, 칼륨 2-케토글루코네이트 및 칼륨 5-케토글루코네이트 중 적어도 하나(예로 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23개 또는 모두)의 발효에 대해 음성임.
접근 번호 NCIMB 42761 하에 기탁된 박테리아의 생물형과 같이, 본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 다른 엔테로코커스 갈리나룸 균주는 실시예에 기재된 검정을 포함하는 임의의 적절한 방법 또는 전략을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 균주는 혐기성 YCFA를 배양하고/하거나 박테리아를 II형 콜라겐-유도 관절염 마우스 모델로 투여한 후 사이토카인 수준을 평가하여 확인될 수 있다. 특히, 접근 번호 NCIMB 42761 하에 기탁된 박테리와 유사한 성장 패턴, 대사 유형 및/또는 표면 항원을 갖는 박테리아 균주가 본 발명에서 유용할 수 있다. 유용한 균주는 NCIMB 42761 균주에 필적하는 면역 조절 활성을 가질 것이다. 특히, 생물형 균주는 실시예에 나타낸 효과와 필적하는 효과를 암 질환 모델 상에서 유발할 것이며, 이는 실시예에 기재된 배양 및 투여 프로토콜을 사용하여 확인될 수 있다.
본 발명의 균주 유도체는, 예를 들어 유전자 수준에서, 생물학적 활성을 제거하지 않고 변형될 수 있다. 특히, 본 발명의 유도체 균주는 치료 활성이 있다. 유도체 균주는 원래 NCIMB 42761 균주와 필적하는 면역 조절 활성을 가질 것이다. 특히, 유도체 균주는 실시예에 나타낸 효과와 필적하는 효과를 암 질환 모델 상에서 유발할 것이며, 이는 실시예에 기재된 배양 및 투여 프로토콜을 사용하여 확인될 수 있다. NCIMB 42761 균주 유도체는 일반적으로 NCIMB 42761 균주의 생물형일 것이다.
접근 번호 NCIMB 42761 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 균주의 세포에 대한 언급은 접근 번호 NCIMB 42761 하에 기탁된 균주와 동일한 안전성 및 치료 유효성 특징을 갖는 임의의 세포를 포괄하며, 이러한 세포는 본 발명에 의해 포괄된다. 따라서, 일부 구현예에서, 접근 번호 NCIMB 42761 하에 기탁된 엔테로코커스 갈리나룸 균주의 세포에 대한 언급은 접근 번호 NCIMB 42761 하에 기탁된 MRx0554 균주만을 나타내며 NCIMB 42761 하에 기탁되지 않은 박테리아 균주는 나타내지 않는다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2018/215782의 서열 번호 2와 서열 동일성을 갖는 게놈을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2018/215782의 서열 번호 2의 적어도 60%에 걸쳐(예로 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%에 걸쳐) WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 90% 서열 동일성(예로 적어도 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 게놈을 갖는다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 WO2018/215782의 서열 번호 2의 70%에 걸쳐 WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2018/215782의 서열 번호 2의 80%에 걸쳐 WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2018/215782의 서열 번호 2의 90%에 걸쳐 WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2018/215782의 서열 번호 2의 100%에 걸쳐 WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 90% 서열 동일성, 또는 WO2018/215782의 서열 번호 2의 70%에 걸쳐 WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2018/215782의 서열 번호 2의 80%에 걸쳐 WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2018/215782의 서열 번호 2의 90%에 걸쳐 WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2018/215782의 서열 번호 2의 100%에 걸쳐 WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 95% 서열 동일성, 또는 WO2018/215782의 서열 번호 2의 70%에 걸쳐 WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2018/215782의 서열 번호 2의 80%에 걸쳐 WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2018/215782의 서열 번호 2의 90%에 걸쳐 WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2018/215782의 서열 번호 2의 95%에 걸쳐 WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2018/215782의 서열 번호 2의 100%에 걸쳐 WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 98% 서열 동일성, 또는 WO2018/215782의 서열 번호 2의 90%에 걸쳐 WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 99.5% 서열 동일성, 또는 WO2018/215782의 서열 번호 2의 95%에 걸쳐 WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 99.5% 서열 동일성, 또는 WO2018/215782의 서열 번호 2의 98%에 걸쳐 WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 99.5% 서열 동일성, 또는 WO2018/215782의 서열 번호 2의 100%에 걸쳐 WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 99.5% 서열 동일성을 갖는 게놈을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 예를 들어 상술된 바와 같은, WO2018/215782의 서열 번호 2와 서열 동일성을 갖는 게놈, 및 예를 들어 상술된 바와 같은, 서열 번호 1 또는 3과 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 유전자 서열, 바람직하게는 서열 번호 3과 적어도 99% 동일한 16S rRNA 유전자 서열을 가지며, 보다 바람직하게는 서열 번호 3의 16S rRNA 유전자 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 예를 들어 상술된 바와 같은, WO2018/215782의 서열 번호 2와 서열 동일성을 갖는 게놈을 가지며, 면역계를 자극하기 위해 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 예를 들어 상술된 바와 같은, WO2018/215782의 서열 번호 2와 서열 동일성을 갖는 게놈, 및 예를 들어 상술된 바와 같은, 서열 번호 1 또는 3과 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 유전자 서열을 갖고, 면역계를 자극하기 위해 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 서열 번호 3으로 나타내는 16S rRNA 유전자 서열과 적어도 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한(예를 들어, 서열 번호 3의 16S 유전자 rRNA 서열을 포함하는) 16S rRNA 유전자 서열 및 WO2018/215782의 서열 번호 2의 적어도 90%에 걸쳐 WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 게놈을 가지며, 면역계를 자극하기 위해 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는 엔테로코커스 갈리나룸이며 서열 번호 3으로 나타내는 16S rRNA 유전자 서열과 적어도 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16S rRNA 유전자 서열(예를 들어, 서열 번호 3의 16S 유전자 rRNA 서열을 포함함) 및 WO2018/215782의 서열 번호 2의 적어도 98%에 걸쳐(예로 적어도 99% 또는 적어도 99.5%에 걸쳐) WO2018/215782의 서열 번호 2와 적어도 98% 서열 동일성(예로 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 서열 동일성)을 갖는 게놈을 가지며, 면역계를 자극하기 위해 효과적이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 박테리아 균주는 생활성이며 내장에 부분적으로 또는 전체적으로 집락할 수 있다.
본 발명의 모든 구현예의 대안적 양태에서, 본 발명의 조성물 중 박테리아 균주는 엔테로코커스 카셀리플라부스(Enterococcus caselliflavus) 종이다. 엔테로코커스 카셀리플라부스는 엔테로코커스 갈리나룸과 매우 유사하며 역시 편모를 갖는다.
치료적 용도
면역계 자극
본 실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 면역 자극을 야기할 수 있음을 보여준다. 본 발명의 조성물의 투여가 면역자극 효과를 보여주므로, 본 발명의 조성물은 질환, 특히 감소된 면역 활성화를 특징으로 하는 질환 및 증가된 면역 반응에 의해 치료 가능한 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역계를 자극하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역계를 자극하여 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물은 세포 집단에서 Treg의 백분율 증가를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세포 집단에서 Treg의 백분율 증가를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세포 집단에서 CD4+CD25+CD127- 세포의 백분율 증가를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세포 집단에서 Treg의 백분율을 감소시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Treg에 의해 면역 반응의 억제를 감소시키는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Treg의 선택적 감소에 의해 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역자극에서 사용하기 위한 것이며, 여기서 본 발명의 조성물은 Treg의 수 또는 백분율을 감소시킨다.
본 발명의 조성물은 CD8/Treg의 비 및/또는 활성화된 CD8/Treg 세포의 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8/Treg 세포의 비 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 활성화된 CD8/Treg 세포의 비 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8/Treg 세포의 비를 증가시켜 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 활성화된 CD8/Treg 세포의 비를 증가시켜 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물은 B 세포의 수 또는 백분율 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포의 수 또는 백분율 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD19+CD3- 세포의 수 또는 백분율 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세포 집단에서 B 세포의 수 또는 백분율을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이며, 여기서 B 세포의 수 또는 백분율 증가는 면역 자극을 유도한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포의 수 또는 백분율을 증가시켜 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물은 CD8 T-세포독성 세포의 수 또는 백분율 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8 T-세포독성 세포의 수 또는 백분율 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세포 집단에서 CD8 T-세포독성 세포의 수 또는 백분율을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이며, 여기서 CD8 T-세포독성 세포의 수 또는 백분율 증가는 면역 자극을 유도한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8 T-세포독성 세포의 수 또는 백분율을 증가시켜 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 조성물은 CD8+ 활성화된 세포의 수 또는 백분율 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8+ 활성화된 세포의 수 또는 백분율 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세포 집단에서 CD8+ 활성화된 세포의 수 또는 백분율을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이며, 여기서 CD8+ 활성화된 세포의 수 및 백분율의 증가는 면역 자극을 유도한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8+ 활성화된 세포의 수 또는 백분율을 증가시켜 면역 반응을 자극하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 전염증성 분자, 예컨대 전염증성 사이토카인의 발현 증가를 야기할 수 있음을 보여준다. 본 발명의 조성물의 투여 시 발현 수준의 증가를 나타낸 전염증성 분자의 예에는 IL-8, IL-12p70, IL-23, TNF-α, IL-1β, 및 IL-6이 포함된다. 본 발명의 조성물의 투여는 전염증성 분자의 발현을 증가를 보여주므로, 본 발명의 조성물은 전염증성 분자, 예컨대 전염증성 사이토카인의 발현 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 전염증성 분자의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환, 특히 전염증성 사이토카인의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-8, IL-12p70, IL-23, TNF-α, IL-1β,- 및/또는 IL-6의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-23, TNF-α, IL-1β, 및/또는 IL-6의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-8, IL-12p70, IL-23, TNF-α, IL-1β, 및/또는 IL-6의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 면역 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 실시예는 또한 본 발명의 조성물의 투여가 IL-1β의 발현 증가를 야기할 수 있음을 보여준다. IL-1β는 전염증성 사이토카인이다[21]. IL-1β의 생산 및 분비는 염증성 반응의 활성화와 연관되는 단백질 복합체인 인플라좀에 의해 조절된다[22]. 본 발명의 조성물의 투여는 IL-1β의 발현을 증가시키는 것으로 보이므로, 본 발명의 조성물은 IL-1β의 발현 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-1β의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-1β의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 실시예는 또한 본 발명의 조성물의 투여가 IL-23의 발현 증가를 야기할 수 있다. IL-23은 염증과 연관되었다[23,24]. 면역 반응에서 IL-23의 제안된 기능에는 CD4+ 메모리 T 세포의 증식 촉진 및 수지상 세포(DC)에 의한 IFN-γ의 분비 촉진이 포함된다[25]. 본 발명의 조성물의 투여는 IL-23의 발현을 증가하는 것으로 보이므로, 본 발명의 조성물은 IL-23의 발현 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-23의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-23의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-23의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 면역 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 발현 증가를 야기할 수 있음을 보여준다. TNF-α는 세포사를 촉진하는 다양한 신호전달 경로에 관여되는 것으로 알려져 있는 전염증성 사이토카인이다. TNF-α는 그 인지체 수용체, TNFR-1에 결합하여 아폽토시스를 개시하고, 이는 아폽토시스 경로에서 절단 이벤트 캐스케이드를 야기한다[26]. TNF-α는 또한 RIP 키나제-의존적 기전을 통해 괴사를 유발할 수 있다[27]. 본 발명의 조성물의 투여는 TNF-α 발현을 증가시키는 것이 보이므로, 본 발명의 조성물은 질환의 치료에서 유용할 수 있고, 특히 TNF-α에 의한 발현 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 감소된 TNF-α 발현을 특징으로 하는 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 면역 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 실시예는 또한 본 발명의 조성물의 투여가 IL-6의 발현 증가를 야기할 수 있음을 보여준다. IL-6은 염증 동안 생산되고, 나이브 CD4+ T 세포의 분화 및 CD8+ T 세포의 세포독성 T 세포로의 분화를 촉진하는 전염증성 사이토카인이다[28]. 본 발명의 조성물의 투여는 IL-6의 발현을 증가시키는 것으로 보이므로, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현 및/또는 활성 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현 및/또는 활성을 증가시켜 면역 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다.
Bettelli 등[29]은 IL-6이 Treg의 확장을 억제함을 보고하였다. 본 실시예는 본 발명의 조성물이 IL-6의 발현을 증가시키는 것을 나타내므로, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현을 증가시켜 Treg의 수 또는 백분율을 선택적으로 감소시킬 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현을 증가시켜 면역자극에서 사용하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Treg의 수 또는 백분율을 감소시켜 면역자극에서 사용하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 면역계의 자극은 TLR5 활성화 또는 TLR5 활성화의 상향조절을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 면역계의 자극은 TLR9 활성화 또는 TLR9 활성화의 상향조절을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 면역계의 자극은 TLR5 및 TLR9의 활성화 또는 TLR9 및 TLR5 활성화의 상향조절을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 면역계의 자극은 비제한적으로 T 헬퍼 세포 및 T 세포독성 세포와 같은 T 세포의 분화 유도 및/또는 상향조절을 포함한다.
TLR 신호전달 경로는 전사 인자인 핵 인자-카파B(NF-κB)의 활성화로 완결된다. NF-κB는 TNF-α를 포함하는 염증성 사이토카인 유전자 어레이의 발현을 제어한다. 면역 자극은, 예를 들어, TLR5의 이량체화를 유도하며, 이후 MyD88을 모집하고 IRAK1, IRAK2, IRAK4 및 IRAK-M을 포함하는 단백질 키나제를 활성화한다. 이들 키나제의 활성화는 NF-κB의 핵 편재를 야기하며, 이는 전염증성 사이토카인이다[30].
실시예에 실증된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 NF-κB의 발현 증가를 야기한다. 본 발명의 조성물의 투여가 전염증성 사이토카인 NF-κB의 발현을 증가시키므로, 본 발명의 조성물은 면역 반응을 자극하는 데 유용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 질환, 특히 감소된 면역 활성화를 특징으로 하는 질환 및/또는 증가된 면역 반응에 의해 치료 가능한 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 NF-κB의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 면역 자극제로서 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 NF-κB의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 감소된 면역 활성화를 특징으로 하는 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 NF-κB의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 증가된 면역 반응에 의해 치료 가능한 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.
특히, 본 발명의 조성물은 NF-κB의 발현 및/또는 활성화 감소를 특징으로 하는 질환의 치료에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 NF-κB의 발현 및/또는 활성화 감소를 특징으로 하는 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.
NF-κB의 활성화는 선천성 면역 반응의 유발 및 적응 면역 반응의 후속 발생을 위해 중요하다. 따라서, 본 발명의 조성물과 같은 TLR의 작용제는 선천성 및 적응 면역 반응을 둘 다 촉진하여 감염성 질환, 알러지 및 종양을 치료하기 위한 보조제로 유용할 수 있다[30]. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 감염성 질환, 알러지 및/또는 종양을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 NF-κB의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 감염성 질환, 알러지 및/또는 종양을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.
실시예는 또한 본 발명의 조성물이 T-헬퍼 세포 및 세포독성 T 림프구의 분화를 촉진함을 실증한다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 T-헬퍼 세포 및/또는 세포독성 T 림프구의 분화를 자극하는 데 사용하기 위한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물에 의해 치료받을 질환은 암이 아니다.
백신 보조제로서의 용도
실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 발현 증가를 야기할 수 있음을 나타낸다. TNF-α는 백신 반응을 위해 중요한 것으로 알려져 있다. 예를 들어, TNF-α는 고령 집단에서 독감 백신접종에서의 효율적 백신 반응을 위해 요구되는 것으로 나타났다[31]. 본 발명의 조성물의 투여가 TNF-α 발현을 증가시키는 것으로 나타났으므로, 본 발명의 조성물은 백신 보조제로 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 백신 보조제로 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 백신 보조제로 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 인플루엔자 치료법에서 백신 보조제로 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 데 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 항원과 조합되어 투여될 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 백신접종 직전 또는 직후 환자에게 투여하기 위한 것이다.
엔테로코커스 갈리나룸, 특히 균주 MRx0518은 편모를 가지며 플라겔린은 TLR5 작용제일 수 있다. TLR 작용제는 다양한 항원 유형에 걸쳐, 특히 고령 집단에서 백신 보조제로 개발 중이다[32]. 또한, 실시예에서의 데이터는 MRx0518 플라겔린이 TLR5 작용제임을 확인시켜 준다. 따라서, 본 발명의 조성물은 백신 보조제로서, 특히 감소된 면역계 활성을 가질 수 있는 고령 환자(예로 40, 50, 60, 70 또는 80세 초과)에 투여될 백신을 위해 유용할 수 있다. TLR5 신호전달은 또한 연령-연관 선천성 면역 반응에서 핵심 역할을 담당한다[33]. 특정 구현예에서, 조성물은 선천성 면역 반응을 증강시키는 데 사용하기 위한 것이다. TLR5 작용제는 백신 보조제로 개발 중이지만, 이들은 모두 알려진 병원체 및/또는 합성 유래이다. 대조적으로, 본 발명의 조성물은 공생 박테리아를 포함한다.
실시예는 또한 본 발명의 조성물의 투여는 IL-6의 발현 증가를 야기할 수 있음을 나타낸다. 증가된 IL-6 발현은 여러 질환에 있어서 백신 반응과 연관되었다. 예를 들어, IL-6은 성인에 인플루엔자 백신이 투여된 후 CD14+CD16- 염증성 단핵구에 의해 생성되었고[34], 더 높은 수준의 IL-6은 인플루엔자 백신에 대한 백신 반응의 달성에 연관되었다[35]. 또한, IL-6은 AS03 보조제 시스템의 주사 후 생성되었고[36] 마우스에서 IL-6의 하향조절은 결핵 백신의 투여 후 헬퍼 T 세포 반응을 감소시키는 것으로 나타났다[37]. 본 발명의 조성물의 투여는 IL-6 발현을 증가시키는 것으로 나타났으므로, 본 발명의 조성물은 백신 보조제로 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 백신 보조제로 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 백신 보조제로 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 결핵 치료법에서 백신 보조제로 사용하기 위한 것이다.
또한, IL-6 및 TNF-α 발현은 치료용 HIV 백신[Huang 등] 결핵 백신 및 클라미디아 백신[38]의 유효성과 관련된 것으로 나타났다. Su 등[39]은 FMDV DNA 백신과 함께 IL-6 또는 TNF-α의 공동-접종이 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의해 증가된 IFN-γ 발현, CD4+ T 세포에서 IL-4의 더 높은 발현 및 더 높은 항원-특이적 세포독성 반응을 일으킴을 나타내었다. 본 발명의 조성물의 투여는 IL-6 및 TNF-α 발현을 증가시키는 것으로 나타났으므로, 본 발명의 조성물은 백신 보조제로 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 백신 보조제로 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 백신 보조제로 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α 및 IL-6의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 백신 보조제로 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 HIV 치료법에서 백신 보조제로 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 클라미디아 치료법에서 백신 보조제로 사용하기 위한 것이다.
실시예는 또한 본 발명의 조성물의 투여가 IL-1β의 발현 증가를 야기할 수 있음을 나타낸다. Li 등[40]은 보조제 알루미늄 하이드록사이드가 IL-1β의 분비를 활성화함을 나타내었고, IL-1β 자체가 보조제로 작용할 수 있음을 제시하였다. 본 발명의 조성물의 투여는 IL-1β 발현을 증가시키는 것으로 나타났으므로, 본 발명의 조성물은 백신 보조제로 유용할 수 있다. 실시예는 본 발명의 조성물의 투여가 CD8+ T 세포 대 Treg의 비를 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 보조제는 CD8+ T 세포를 자극하는 것으로 나타났고[41] 본 발명의 조성물의 투여는 CD8+ T 세포 대 Treg의 비를 증가시키는 것으로 나타났으므로, 본 발명의 조성물은 백신 보조제로 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 백신 보조제로 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CD8+ T 세포 대 Treg의 비를 증가시켜 백신 보조제로 사용하기 위한 것이다.
실시예는 또한 본 발명의 조성물의 투여가 CXCR3 리간드 CXCL9 및 CXCL10의 발현 또는 수준 증가를 야기할 수 있음을 나타낸다. ASO3, CpG, GLA-SE, αGalCer와 같은 알려진 보조제는 모두 CXCL9 및 10을 증가시키며[42,43], 이는 본 발명의 조성물이 보조제로 효과적일 것임을 제시한다. 또한, CXCL9 및 10은 IFNγ/Th1 반응과 연관되며 항체 반응을 촉진한다[44]. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항원, 특히 병원성 또는 암 항원에 대해 항체 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다. 또한, CXCL9는 연구되는 말라리아 백신을 수여받는 자원자에서 백신 유도된 T-세포 반응의 IFN-γ보다 민감한 척도이다[45]. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항원, 특히 병원성 또는 암 항원에 대해 T-세포 반응을 촉진하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CXCL9 및 CXCL10의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 백신 보조제로 사용하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 조성물은 말라리아에 대해 보호하는 데 사용하기 위한 것이다.
실시예는 또한 본 발명의 조성물의 투여가 IL-12p70의 발현 또는 수준 증가를 야기할 수 있음을 나타낸다. 상기 효과는 백신 보조제 효율과 연관되었고 IL-12 자체가 보조제로 제안되었으며[46], 이는 본 발명의 조성물이 보조제로 효과적일 것임을 제시한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-12p70의 수준 및/또는 활성을 증가시켜 백신 보조제로 사용하기 위한 것이다.
일부 구현예에서, 백신 보조제로 사용되는 경우, 본 발명의 조성물은 이들 자체가 환자에게 별도 투여된 항원에 대해 보조제 효과를 제공하기 위해 투여될 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 경구 투여되는 반면, 항원은 비경구 주사된다.
본 발명의 조성물은 임의의 유용한 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 예시적인 항원에는 바이러스 표면 단백질과 같은 바이러스 항원; 단백질 및/또는 당류 항원과 같은 박테리아 항원; 진균 항원; 기생충 항원; 및 종양 항원이 포함된다. 본 발명은 특히 인플루엔자 바이러스, HIV, 십이지장충, B형 간염 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 광견병, 호흡기 융합 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 스타필로코커스 아우레우스, 클라미디아, SARS 코로나바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스, 스트렙토코커스 뉴모니애, 나이세리아 메닌지티디스, 미코박테리움 투베르쿨로시스, 바실러스 안트라시스, 엡스타인 바 바이러스, 인간 유두종바이러스 등에 대한 백신을 위해 특히 유용하다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 추가 항원에는 당단백질 및 리포글리칸 항원, 고세균 항원, 흑색종 항원 E(MAGE), 암배아 항원(CEA), MUC-1, HER2, 시알릴-Tn(STn), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), 윌름 종양 유전자(WT1), CA-125, 전립샘-특이적 항원(PSA), 엡스타인-바 바이러스 항원, 신생물항원, 종양단백질, 아밀로이드-베타, 타우, PCSK9 및 습관성 성분, 예를 들어 니코틴, 알코올 또는 오피에이트가 포함된다.
본 발명과 함께 사용하기 위한 바람직한 항원에는 병원체 항원 및 종양 항원이 포함된다. 항원은 병원체로의 감염에 대한 보호 또는 종양을 공격하기 위해 효과적일 항원에 대해 특이적인 면역 반응을 유발할 것이다. 항원은, 예를 들어, 펩타이드 또는 다당류일 수 있다.
본 발명은 또한 환자에서 면역 반응을 상승시키기 위한 약제의 제조에서 (i) 항원의 수성 제조물; 및 (ii) 엔테로코커스 갈리나룸 종으로부터의 박테리아 균주를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
이들 방법 및 용도에 의해 일어난 면역 반응에는 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 보호 항체 반응이 포함될 것이다.
일부 구현예에서, 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주는 항원을 제시하도록 조작된다. 본 발명의 박테리아 균주 상의 항원 제시는 면역자극 활성을 최대화하고 항원에 대해 생성된 보호 면역 반응을 추가로 증강시킬 수 있다. 또한, 항원 및 본 발명의 박테리아를 포함하는 치료제의 제조 및 전달은 각각의 항원 및 박테리아 균주를 포함하는 조성물이 별도로 제조되고 투여되는 경우보다 이러한 방식으로 더 효율적이고 효과적일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은, 예를 들어 그 세포 표면 상에, 항원을 제시하는 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 항원을 제시하는 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 백신 항원으로 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 항원은 HIV, 십이지장충, B형 간염 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 광견병, 호흡기 융합 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 스타필로코커스 아우레우스, 클라미디아, SARS 코로나바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스, 스트렙토코커스 뉴모니애, 나이세리아 메닌지티디스, 미코박테리움 투베르쿨로시스, 바실러스 안트라시스, 엡스타인 바 바이러스 또는 인간 유두종바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 항원은 당단백질 항원, 리포글리칸 항원, 고세균 항원, 흑색종 항원 E(MAGE), 암배아 항원(CEA), MUC-1, HER2, 시알릴-Tn(STn), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), 윌름 종양 유전자(WT1), CA-125, 전립샘-특이적 항원(PSA), 엡스타인-바 바이러스 항원, 신생물항원, 종양단백질, 아밀로이드-베타, 타우, PCSK9 또는 알코올, 오피에이트 등과 같은 습관성 성분이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 박테리아는 하나 이상의 항원을 발현한다. 일반적으로 항원은 재조합적으로 발현될 것이고 본 발명의 박테리아에 대해 이종성일 것이다. 따라서, 본 발명은 이종성 항원을 발현하는 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 제공한다. 항원은 박테리아와 상동성인 하나 이상의 폴리펩타이드와 함께 발현되는 융합 폴리펩타이드의 일부일 수 있다. 일부 구현예에서, 박테리아는 비-융합 폴리펩타이드로서 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주 세포를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 세포는 이종성 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 조성물은 백신으로 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 이종성 항원을 발현한다. 일부 구현예에서, 세포는 백신으로 사용하기 위한 것이다.
본 발명과 함께 사용하기 위한 예시적인 항원에는 바이러스 표면 단백질과 같은 바이러스 항원; 단백질 및/또는 당류 항원과 같은 박테리아 항원; 진균 항원; 기생충 항원; 및 종양 항원이 포함된다. 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주에서 발현하기 위한 추가 항원에는 당단백질 및 리포글리칸 항원, 고세균 항원, 흑색종 항원 E(MAGE), 암배아 항원(CEA), MUC-1, HER2, 시알릴-Tn(STn), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), 윌름 종양 유전자(WT1), CA-125, 전립샘-특이적 항원(PSA), 엡스타인-바 바이러스 항원, 신생물항원, 종양단백질, 아밀로이드-베타, 타우, PCSK9 및 습관성 성분, 예를 들어 니코틴, 알코올, 오피에이트 등이 포함된다.
본 발명은 또한 상승된 콜레스테롤과 같은 비-전염성 질환에 대한 백신에 대해 (예로 PCSK9 항원을 통해) 반응을 증강시키기 위해 유용할 수 있다.
본 발명은 또한 습관성 성분, 예를 들어 니코틴, 알코올, 또는 오피에이트에 대한 백신에 대해 반응을 증강시키기 위해 유용할 수 있다.
세포 치료법
키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T) 치료법
본 실시예는 또한 본 발명의 조성물의 투여가 IL-6의 발현 증가를 야기할 수 있음을 나타낸다. 증가된 IL-6 발현은 만성 림프구 백혈병의 CD19 CAR-T 치료법에 대한 반응과 관련되었다. 혈청 IL-6의 증가는 CAR-T 세포 증식과 연관된 반면, IL-6의 억제는 CAR-T 세포 증식의 억제와 연관되었다[47]. 본 발명의 조성물의 투여는 IL-6 발현을 증가시키는 것을 나타내므로, 본 발명의 조성물은 세포 치료법, 특히 CAR-T 세포 치료법에서 유용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세포 치료법에서 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CAR-T 세포 치료법에서 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 만성 림프구 백혈병의 치료에서 사용하기 위한 것이다.
Treg의 선택적 고갈은 세포독성 림프구의 유효성을 증강시키는 것으로 나타났다[48]. CAR-T 세포는 세포독성 림프구의 하위세트이며, 이에 따라 Treg의 선택적 고갈은 CAR-T 세포 치료법에서 효과적인 것으로 여겨진다. 본 발명의 조성물의 투여는 Treg를 고갈시키는 것을 나타내므로, 본 발명의 조성물은 세포 치료법, 특히 CAR-T 세포 치료법에서 유용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 조성물은 세포 치료법에서, 특히 세포 치료법에 대한 반응을 증강시키는 데 유용할 수 있다.
중간엽 줄기 세포(MSC) 치료법
중간엽 줄기 세포(MSC) 치료법은 면역자극 특성을 갖는 것으로 보고되었다. MSC가 LPS로 처리되는 경우, 이들은 증가된 B 세포 증식을 유도하는 전염증성 사이토카인 IL-6 및 IL-8을 상향조절한다[49]. 따라서, 본 발명의 조성물은 IL-6의 발현을 증가시키는 것을 나타냈으므로, 이들은 MSC 세포 치료법과 조합되어 유용할 수 있다.
줄기 세포 이식 치료법
줄기 세포 이식 치료법에서 분화되지 않은 줄기 세포를 사용하는 대신, 이식 전에 어느 정도 줄기 세포를 분화시키는 것이 유익할 수 있음이 보고되었다. 예를 들어, Heng 등[50]은 줄기 세포의 심근 분화가 더 높은 그래프팅 효율, 근육세포의 증강된 재생 및 심장 기능의 증가된 복원을 가져서 유익할 수 있음을 보고하였다. 본 발명의 조성물의 투여는 분화되지 않은 신경모세포종 세포에서 신경 분화를 개시했으므로, 본 발명의 조성물은 줄기 세포 이식 치료법에서 줄기 세포 분화를 위해 유용할 수 있다.
조혈 줄기 세포 이식
조혈 줄기 세포 이식은 보통 골수, 말초혈, 또는 제대혈로부터 유래되는, 다능성 조혈 줄기 세포의 이식이다. 동종이형 조혈 줄기 세포 이식 전 엔테로코커스(엔테로코커스 갈리나룸 및 엔테로코커스 카셀리플라부스)로의 장 집락은 감소된 비재발 사망율로 인해 유의미하게 개선된 환자의 2년 생존율을 야기하는 것으로 나타났다[51]. 따라서, 실시예에서 나타난 면역조절 효과는 조혈 줄기 세포 이식 치료법에서 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 조혈 줄기 세포 이식 후, 특히 동종이형 조혈 줄기 세포 이식 후 생존을 개선하는 데 유용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 동종이형 조혈 줄기 세포 이식과 조합되어 유용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 동종이형 조혈 줄기 세포 이식에 대해 성공적인 환자 반응을 부양하는 데 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 조혈 줄기 세포 이식 전에 투여된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 조혈 줄기 세포 이식을 수여받을 일정이 잡힌 환자에 투여하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 조혈 줄기 세포 이식 후에 투여된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 조혈 줄기 세포 이식을 수여받은 환자에 투여하기 위한 것이다.
면역노화
Fulop 등[52]은 Treg 세포수 증가 및 B 세포수 감소가 적응 면역계에서 노화와 연관됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 조성물은 면역노화를 예방하거나 지연하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역노화를 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Treg 세포수 증가를 특징으로 하는 면역노화를 지연하는 데 사용하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포수 감소를 특징으로 하는 면역노화를 지연하는 데 사용하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Treg 세포수 증가 및 B 세포수 감소를 특징으로 하는 면역노화를 지연하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Treg 세포를 감소시켜 면역노화를 지연하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 B 세포수를 증가시켜 면역노화를 지연하는 데 사용하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Treg 세포수를 감소시키고 B 세포수를 증가시켜 면역노화를 지연하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역노화에 의해 유도되는 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역노화를 지연하고/하거나 예방하여 노화-관련 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다.
또한, 백신 아주반트가 면역노화를 극복할 수 있음이 제안되었다[53]. 본 발명의 조성물은 백신 아주반트로 사용하기 위해 적합하므로, 본 발명의 조성물은 면역노화를 예방하거나 지연하기 위해 유용할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 백신 아주반트로서 면역노화를 지연하고/하거나 예방하는 데 사용하기 위한 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 백신 아주반트로서 사용하기 위한 것이며, 여기서 조성물은 면역노화를 지연하고/하거나 예방한다.
면역노화와 연관된 질환에는 심혈관 질환, 암, 2형 진성 당뇨병[54] 및 자가면역 장애[55]가 포함된다.
투여 방식
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 본 발명의 박테리아 균주로 장내의 전달 및/또는 부분 또는 전체 콜로니화를 가능하게 하기 위해 위장관에 투여되어야 한다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은 경구(설하 포함)로 투여되지만 직장 또는 비강 내로 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 폼, 스프레이 또는 겔로 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 좌약, 예컨대 직장 좌약으로, 예를 들어 테오브로마 오일(코코아 버터), 합성 경질 지방(예로 서포시르, 휘테폴), 글리세로-젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 비누 글리세린 조성물 형태로 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 코위 튜브, 입위 튜브, 위 튜브, 공장조루술 튜브(J 튜브), 경피 내시경 위절개술(PEG)과 같은 튜브, 또는 위, 공장에 대한 접근을 제공하는 흉벽 포트 및 다른 적합한 접근 포트와 같은 포트를 통해 위장관에 투여된다.
본 발명의 조성물은 1회 투여될 수도 있고, 또는 치료 요법의 일환으로 순차적으로 투여될 수도 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 매일 투여되기 위한 것이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 치료에는 환자의 장 미생물총의 평가가 수반된다. 본 발명의 균주 전달 및/또는 부분적이거나 전체적인 집락이 달성되지 않고 유효성이 관찰되지 않는 경우 치료가 반복될 수 있거나, 전달 및/또는 부분적 또는 전체적 집락이 성공적이고 유효성이 관찰되는 경우 치료가 종료될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 자궁내 및/또는 출생 후 자녀에서 질환의 발생 가능성을 감소시키기 위해 임신한 동물, 예를 들어 인간과 같은 포유류에 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 감소된 면역 활성으로 매개된 질환 또는 병태를 갖는 것으로 진단받은, 또는 감소된 면역 활성에 의해 매개되는 질환 또는 병태의 위험에 처한 것으로 확인된 환자에게 투여될 수 있다. 조성물은 또한 건강한 환자에서 감소된 면역 활성에 의해 매개된 질환 또는 병태의 발생을 예방하기 위한 예방적 조치로서 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 결핍 면역 활성을 갖는 것으로 진단받은, 또는 결핍 면역 활성의 위험에 처한 것으로 확인된 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 환자는 엔테로코커스, 특히 엔테로코커스 갈리나룸에 의한 집락이 감소되었거나 부재할 수 있다.
본 발명의 조성물은 영양 보충제와 같은 식품으로 투여될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 조성물은 인간의 치료를 위한 것이지만, 이들은 가금, 돼지, 고양이, 개, 말 또는 토끼와 같은 단위 포유류를 포함하는 동물을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 동물의 성장 및 수행능력을 증강시키기 위해 유용할 수 있다. 동물에 투여되는 경우, 경구 급식이 사용될 수 있다.
조성물
일반적으로, 본 발명의 조성물은 박테리아를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 조성물은 냉동-건조 형태로 제형화된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 본 발명의 박테리아 균주를 포함하는 과립 또는 젤라틴 캡슐, 예를 들어 경질 젤라틴 캡슐을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 동결건조된 박테리아를 포함한다. 박테리아의 동결건조는 잘 확립된 절차이며 관련 지침은, 예를 들어, 참고문헌[56,58]에서 이용 가능하다.
대안적으로, 본 발명의 조성물은 살아있는, 활성 박테리아 배양을 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 캡슐화되어 박테리아 균주의 내장으로의 전달을 가능하게 한다. 캡슐화는, 예를 들어, 압력, 효소 활성과 같은 화학적 또는 물리적 자극으로의 파열, 또는 pH 변화에 의해 유발될 수 있는 물리적 붕해를 통해, 표적 위치에서의 전달 시까지 조성물을 분해로부터 보호한다. 임의의 적절한 캡슐화 방법이 사용될 수 있다. 예시적인 캡슐화 기법에는 다공성 매트릭스 내의 포획, 고형 담체 표면 상의 부착 또는 흡착, 응결에 의한 또는 가교제를 이용한 자가-응집, 및 미세다공성 막 또는 마이크로캡슐 내로의 기계적 봉쇄가 포함된다. 본 발명의 조성물을 제조하기 위해 유용할 수 있는 캡슐화에 대한 지침은, 예를 들어, 참고문헌[59] 및 [60]에서 이용 가능하다.
조성물은 경구 투여될 수 있고 정제, 캡슐 또는 분말의 형태일 수 있다. 엔테로코커스는 혐기체이므로 캡슐화된 제품이 바람직하다. 다른 성분(예컨대 비타민 C)이 전달 및/또는 생체내 부분적 또는 전체적 집락 및 생존을 개선하기 위해 프리바이오틱 기질 및 산소 스캐빈저로서 포함될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 프로바이오틱 조성물은 우유 또는 유장 기재 발효된 유제품과 같은 음식 또는 영양 제품으로, 또는 약학 제품으로 경구 투여될 수 있다.
조성물은 프로바이오틱으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물에는 치료 유효량의 본 발명의 박테리아 균주가 포함된다. 치료 유효량의 박테리아 균주는 환자 상에서 유익한 효과를 발휘하는 데 충분하다. 치료 유효량의 박테리아 균주는 환자의 내장으로의 전달 및/또는 이의 부분적 또는 전체적 집락을 일으키는 데 충분할 수 있다.
예를 들어 성인 인간에 대한, 박테리아의 적합한 1일 용량은 약 1 x 103 내지 약 1 x 1011 콜로니 형성 단위(CFU); 예를 들어, 약 1 x 107 내지 약 1 x 1010 CFU; 또 다른 예에서는 약 1 x 106 내지 약 1 x 1010 CFU; 또 다른 예에서는 약 1 x 107 내지 약 1 x 1011 CFU; 또 다른 예에서는 약 1 x 108 내지 약 1 x 1010 CFU; 또 다른 예에서는 약 1 x 108 내지 약 1 x 1011 CFU일 수 있다.
특정 구현예에서, 박테리아의 용량은 1일 당 적어도 1010, 적어도 1011, 또는 적어도 1012 세포와 같이, 1일 당 적어도 109 세포이다.
특정 구현예에서, 조성물은 조성물의 중량에 대해 약 1 x 106 내지 약 1 x 1011 CFU/g의 양으로; 예를 들어, 약 1 x 108 내지 약 1 x 1010 CFU/g의 양으로 박테리아 균주를 함유한다. 용량은, 예를 들어, 1 g, 3 g, 5 g, 및 10 g일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 박테리아 균주의 양은 조성물의 중량에 대해 그램 당 약 1 x 103 내지 약 1 x 1011 콜로니 형성 단위이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 500 ㎎ 내지 1000 ㎎, 600 ㎎ 내지 900 ㎎, 700 ㎎ 내지 800 ㎎, 500 ㎎ 내지 750 ㎎ 또는 750 ㎎ 내지 1000 mg의 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 약학 조성물 중 동결건조된 박테리아는 500 ㎎ 내지 1000 ㎎, 600 ㎎ 내지 900 ㎎, 700 ㎎ 내지 800 ㎎, 500 ㎎ 내지 750 ㎎ 또는 750 ㎎ 내지 1000 mg의 용량으로 투여된다.
전형적으로, 본 발명의 조성물과 같은 프로바이오틱은 선택적으로 적어도 하나의 적합한 프리바이오틱 화합물과 조합된다. 프리바이오틱 화합물은 보통 상부 소화관에서 분해되거나 흡수되지 않는, 올리고당류 또는 다당류와 같은 소화-불가능한 탄수화물, 또는 당 알코올이다. 알려진 프리바이오틱에는 이눌린 및 트랜스갈락토-올리고당류와 같은 상업적 제품이 포함된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 프로바이오틱 조성물에는 조성물의 총 중량 대비 약 1 내지 약 30중량%(예로 5 내지 20중량%)의 양으로 프리바이오틱 화합물이 포함된다. 탄수화물은 프룩토-올리고당류(또는 FOS), 단쇄 프룩토-올리고당류, 이눌린, 이소말트-올리고당류, 펙틴, 자일로-올리고당류(또는 XOS), 키토산-올리고당류(또는 COS), 베타-글루칸, 변형된 아라블(arable) 검 및 내성 전분, 폴리덱스트로스, D-타가토스, 아카시아 섬유, 구주콩나무, 귀리, 및 시트러스 섬유로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 하나의 양태에서, 프리바이오틱은 단쇄 프룩토-올리고당류이다(단순성을 위해 아래에서 FOSs-c.c로 나타냄); 상기 FOSs-c.c.는 일반적으로 첨채당의 전환에 의해 수득되며 3개의 글루코스 분자가 결합되는 당류 분자를 포함하는, 소화 불가능한 탄수화물이다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다. 이러한 적합한 부형제의 예는 참고문헌[61]에서 확인될 수 있다. 치료 용도를 위해 허용 가능한 담체 또는 희석제는 약학 분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들어, 참고문헌[62]에 기재되어 있다. 적합한 담체의 예에는 락토스, 전분, 글루코스, 메틸 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 만니톨, 소르비톨 등이 포함된다. 적합한 희석제의 예에는 에탄올, 글리세롤 및 물이 포함된다. 약학 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도되는 투여 경로 및 표준 약학 관습에 관해 선택될 수 있다. 약학 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서 또는 이에 부가하여, 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁화제(들), 코팅제(들), 가용화제(들)를 포함할 수 있다. 적합한 결합제의 예에는 전분, 젤라틴, 글루코스, 무수 락토스, 자유-유동 락토스, 베타-락토스, 옥수수 감미제와 같은 천연당, 아카시아, 트래거캔스 또는 나트륨 알기네이트와 같은 천연 및 합성 검, 카복시메틸 셀룰로스 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 적합한 윤활제의 예에는 나트륨 올레에이트, 나트륨 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트, 나트륨 클로라이드 등이 포함된다. 보존제, 안정화제, 염료 그리고 심지어 풍미제가 약학 조성물에 제공될 수 있다. 보존제의 예에는 나트륨 벤조에이트, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르가 포함된다. 항산화제 및 현탁화제도 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 식품은 영양 보충제에서와 같이, 본 발명의 치료 효과에 부가하여 영양적 이점을 제공할 수 있다. 유사하게, 식품은 본 발명의 조성물의 맛을 증강시키거나 조성물을 약학 조성물보다는 일반 음식 품목과 더 유사하게 하여 소비자에게 더 매력적으로 만들도록 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 우유-기재 제품으로 제형화된다. 용어 "우유-기재 제품"은 다양한 지방 함량을 갖는 임의의 액체 또는 반고체 우유- 또는 유장-기재 제품을 의미한다. 우유-기재 제품은, 예로, 우유, 염소유, 양유, 탈지유, 전유, 임의의 가공 없이 분유 및 유장으로부터 재조합된 우유, 또는 요거트, 커들링화 우유, 커드, 사워 밀크, 사워 전유, 버터 밀크 및 다른 사워 밀크 제품과 같이 가공된 제품일 수 있다. 또 다른 중요한 그룹에는 유장 음료, 발효유, 농축유, 영아용 또는 유아용 우유와 같은 우유 음료; 풍미유, 아이스크림; 단 음식(sweets)과 같은 우유-함유 음식이 포함된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 단일 박테리아 균주 또는 종을 함유하며 임의의 다른 박테리아 균주 또는 종은 함유하지 않는다. 이러한 조성물은 최소의 또는 생물학적으로 무관한 양의 다른 박테리아 균주 또는 종만을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 실질적으로 다른 유기체종이 없는 배양일 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 시판 승인을 필요로 할 수도 있고 필요로 하지 않을 수도 있다.
일부 경우에서, 동결건조된 박테리아 균주는 투여 전에 재구성된다. 일부 경우에서, 재구성은 본원에서 기재된 희석제의 사용에 의한다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 박테리아 균주는 이를 필요로 하는 대상체에 투여되는 경우 장애를 치료하기 충분한 양이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 박테리아 균주는 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 충분한 양이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 박테리아 균주는 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 충분한 양이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 박테리아 균주는 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 충분한 양이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 박테리아 균주는 IL-1β, TNF-α, MIP-3α, IL-23 또는 IL-6과 같은 전염증성 사이토카인에 의해 매개되는 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 충분한 양이다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 박테리아 균주; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공하며; 여기서 박테리아 균주는 TNF-α에 의해 매개되는 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 충분한 양이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 박테리아 균주의 양은 조성물의 중량에 대해 그램 당 약 1 × 103 내지 약 1 × 1011 콜로니 형성 단위이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 1 g, 3 g, 5 g 또는 10 g의 용량으로 투여된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 경구, 직장, 피하, 비강, 협측, 및 설하로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법에 의해 투여된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 락토스, 전분, 글루코스, 메틸 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 만니톨 및 소르비톨로 구성되는 군으로부터 선택되는 담체를 포함하는, 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 에탄올, 글리세롤 및 물로 구성되는 군으로부터 선택되는 희석제를 포함하는, 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 전분, 젤라틴, 글루코스, 무수 락토스, 자유-유동 락토스, 베타-락토스, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래거캔스, 나트륨 알기네이트, 카복시메틸 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 올레에이트, 나트륨 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트 및 나트륨 클로라이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 부형제를 포함하는, 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 보존제, 항산화제 및 안정화제 중 적어도 하나를 추가로 포함하는, 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 나트륨 벤조에이트, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르로 구성되는 군으로부터 선택되는 보존제를 포함하는, 상기 약학 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 상기 박테리아 균주는 동결건조된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 제공하며, 여기서 조성물이 약 4℃ 또는 약 25℃에서 밀봉 용기에 보관되고 용기가 50% 상대 습도를 갖는 분위기에 배치되는 경우, 적어도 약 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 1.5년, 2년, 2.5년 또는 3년의 기간 후 콜로니 형성 단위로 측정되는 적어도 80%의 박테리아 균주가 유지된다.
배양 방법
본 발명에서 사용하기 위한 박테리아 균주는, 예를 들어, 참고문헌[63,,65]에 상세히 기재된 바와 같은 표준 미생물학 기법을 사용하여 배양될 수 있다.
배양을 위해 사용되는 고체 또는 액체 배지는 YCFA 한천 또는 YCFA 배지일 수 있다. YCFA 배지에는 (100 ㎖ 당, 근사값): 카시톤(1.0 g), 효모 추출물(0.25 g), NaHCO3(0.4 g), 시스테인(0.1 g), K2HPO4(0.045 g), KH2PO4(0.045 g), NaCl(0.09 g), (NH4)2SO4(0.09 g), MgSO4·7H2O(0.009 g), CaCl2(0.009 g), 레사주린(0.1 ㎎), 헤민(1 ㎎), 바이오틴(1 ㎍), 코발라민(1 ㎍), p-아미노벤조산(3 ㎍), 엽산(5 ㎍), 및 피리독사민(15 ㎍)이 포함될 수 있다.
백신 조성물에서 사용하기 위한 박테리아 균주
본 발명자들은 본 발명의 박테리아 균주가 면역 활성의 감소와 연관된 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위해 유용함을 확인하였다. 이는 본 발명의 박테리아 균주가 숙주 면역계 상에서 가지는 효과의 결과일 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 백신 조성물로 투여되는 경우, 질환 또는 병태를 예방하기 위해 유용할 수 있다. 이러한 특정 구현예에서, 본 발명의 박테리아 균주는 사멸되거나, 불활성화되거나 약독화될 수 있다. 이러한 특정 구현예에서, 조성물은 백신 보조제를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 피하 주사를 통해서와 같이, 주사를 통해 투여하기 위한 것이다.
일반사항
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당분야의 기술 수준 내의 화학, 생화학, 분자 생물학, 면역학 및 약리학의 통상적 방법을 채택할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예로, 참고문헌[66] 및 [67,73] 등을 참고한다.
용어 "포함하는"은 "포함되는"뿐만 아니라 "구성되는"을 포괄하며, 예로 X를 "포함하는" 조성물은 X만으로 구성될 수도 있고 일부 추가부분, 예로 X + Y가 포함될 수도 있다.
수치값 x에 관해 용어 "약"이란 선택적이며, 예를 들어, x±10%를 의미한다.
용어 "실질적으로"에는 "완전히"가 배제되지 않으며, 예로 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의에서 생략될 수 있다.
2개의 뉴클레오타이드 서열 간 서열 동일성 백분율에 대한 언급은, 정렬되는 경우, 해당 백분율의 뉴클레오타이드가 2개 서열의 비교에서 동일함을 의미한다. 상기 정렬 및 상동성% 또는 서열 동일성%는 당분야에 알려진 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 참고문헌[74]의 섹션 7.7.18에 기재된 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직한 정렬은 갭 개방 페널티 12 및 갭 연장 페널티 2, BLOSUM 매트릭스 62로 아핀(affine) 갭 검색을 사용하여 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘에 의해 결정된다. Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘은 참고문헌[75]에 개시되어 있다.
구체적으로 언급되지 않는 한, 여러 단계를 포함하는 공정 또는 방법은 방법의 시작 또는 종료 시 추가 단계를 포함할 수도 있고, 또는 추가적인 개재 단계를 포함할 수도 있다. 또한, 단계는 적절한 경우 조합되거나, 생략되거나, 대안적인 순서로 수행될 수 있다.
본 발명의 다양한 구현예가 본원에 기재된다. 각각의 구현예에서 명시되는 특징이 다른 특정된 특징과 조합되어 추가 구현예를 제공할 수 있음이 이해될 것이다. 특히, 본원에서 적합하거나, 전형적이거나, 바람직한 것으로 강조되는 구현예는 (서로 상호 배타적인 경우를 제외하고) 서로 조합될 수 있다.
본 발명을 수행하기 위한 양태
실시예 1 - 암의 마우스 모델에서 박테리아 접종물의 유효성
요약
본 연구에서는 4개의 종양 모델에서 본 발명에 따른 박테리아 균주를 포함하는 조성물의 유효성을 평가하였다.
물질
평가 성분 - 박테리아 균주 #MRx0518.
참조 성분 - 항-CTLA-4 항체(클론: 9H10, 카탈로그: BE0131, 이소형: 시리아 햄스터 IgG1, Bioxcell).
평가 및 참조 성분 비히클 - 박테리아 배양 배지(효모 추출물, 카시톤, 지방산 배지(YCFA)). 마우스로의 주사일마다, 항체를 PBS(ref: BE14-516F, Lonza, France)로 희석하였다.
치료 용량 - 박테리아: 200 ㎕ 중 2x108. 항-CTLA-4를 10 ㎎/㎏/inj로 주사하였다. 항-CTLA-4를 마우스의 가장 최근 체중에 따라 10 ㎖/㎏/adm의 투여 부피로 투여하였다(즉, 20 g 체중의 한 마리 마우스에 있어서, 200 ㎕의 평가 성분을 투여할 것임).
투여 경로 - 박테리아 접종물을 캐뉼라를 통해 경구 급식(입으로(per os), PO)에 의해 투여하였다. 매일 캐뉼라의 오염을 제거하였다. 항-CTLA-4를 마우스의 복강 내로 주사하였다(복강내, IP).
박테리아 균주의 배양 조건 - 박테리아 균주에 대한 배양 조건은 하기와 같았다:
· 10 ㎖의 YCFA(10 ㎖ E&O 랩 보틀에 제조됨)를 Hungate 튜브 내로 피펫팅함
· 튜브를 밀봉하고 시린지 입구 및 배출 시스템을 사용해서 CO2로 플러싱함
· Hungate 튜브를 오토클레이브함
· 냉각되면, 1 ㎖의 글리세롤 스톡을 Hungate 튜브에 접종함
· 약 16시간 동안 정적 37℃ 인큐베이터에 튜브를 배치함.
· 다음 날, 상기 하위배양액 1 ㎖을 취해 10 ㎖의 YCFA에(모두 2개씩, 다시 사전-가온되고 플러싱된 Hungate 튜브에) 접종함
· 이를 5~6 h 동안 정적 37℃ 인큐베이터에 배치함
암 세포주 및 배양 조건 -
사용한 세포주를 아래 표에 상세히 나타낸다:
Figure pct00009
과다형성 유방 치조 결절의 임플란트 후 BALB/cCRGL 마우스에서 생긴 이식 가능한 쥣과 유방암종으로부터 EMT-6 세포주를 확립하였다[76].
원발성 루이스 폐암종의 임플란트로 생성된 종양을 보유하는 C57BL/6 마우스 폐로부터 LL/2(LLC1) 세포주를 확립하였다[77].
Hepa 1-6 세포주는 C57/L 마우스에서 생긴 BW7756 마우스 간암종의 유도체이다[78].
세포 배양 조건 - 모든 세포주를 가습 분위기(5% CO2, 95% 공기)에서 37℃에서 단층으로 성장시켰다. 배양 배지 및 보충물을 아래 표에 나타낸다:
Figure pct00010
실험적 용도를 위해, 부착성 종양 세포를 칼슘 또는 마그네슘을 함유하지 않는 Hank 배지(ref: BE10-543F, Lonza) 중 트립신-베르센(ref: BE17-161E, Lonza)으로의 5분 처리에 의해 배양 플라스크로부터 탈착하고, 완전 배양 배지를 첨가하여 중화했다. 세포를 혈구계에서 계수하고 이의 생활성을 0.25% 트립판 블루 배제 검정에 의해 평가하였다.
동물의 사용 -
EMT6 및 RENCA 모델 실험을 위해 매칭되는 체중 및 연령을 갖는 건강한 암컷 BALB/C(BALB/cByJ) 마우스를 CHARLES RIVER로부터 입수하였다.
LL/2(LLC1) 및 Hepa1-6 모델 실험을 위해 매칭되는 체중 및 연령을 갖는 건강한 암컷 C57BL/6(C57BLl6J) 마우스를 CHARLES RIVER(L'Arbresles)로부터 입수하였다.
동물을 FELASA 가이드라인에 따라 SPF 건강 상태로 유지하고 실험실 동물의 케어 및 사용에 대한 프랑스 및 유럽 규제 및 NRC 지침에 따른 동물 수용 및 실험 절차를 따랐다[79,80]. 동물은 제어되는 환경 조건 하에 수용실에서 유지하였다: 온도: 22±2℃, 습도 55±10%, 광주기(12 h 명주기/12 h 암주기), HEPA 여과된 공기, 재순환 없이 시간 당 15회 공기 교환. 기재된 바와 같은 침구재, 음식 및 물, 환경 및 풍부한 사회조건(군 수용)과 함께 멸균된 적절한 공간으로 동물 봉쇄를 제공하였다: 통기되는 랙에 있는 900 ㎠ 우리(참조: 녹색, Tecniplast), Epicea 침구(SAFE), 10 kGy 조사된 식이(A04-10, SAFE), 면역-적격 설치류에 대한 완전식 - R/M-H 압출물, 물병으로부터의 물.
실험 설계 및 처리
항종양 활성, EMT6 모델
처리 일정 - 최초 투여의 시작을 D0으로 간주하였다. D0에, Vivo manager® 소프트웨어(Biosystems, Couternon, France)를 사용하여 그래프팅되지 않은 마우스를 이의 개별 체중에 따라 9/8마리의 군으로 무작위화하였다. D0에, 마우스는 비히클(배양 배지) 또는 박테리아 균주를 수여받았다. D14에, 모든 마우스에 후술된 바와 같이 EMT-6 종양 세포를 그래프팅하였다. D24에, 양성 대조군으로부터의 마우스는 항-CTLA-4 항체 처리를 수여받았다.
처리 일정을 아래의 표에 요약한다:
Figure pct00011
동물의 모니터링을 후술된 바와 같이 수행하였다.
동물에서 EMT6 종양의 유도 - D14에, 마우스의 우측 넙다리 내로 200　㎕ RPMI 1640 중 1x106 EMT-6 세포의 피하 주사에 의해 종양을 유도하였다.
안락사 - 후술된 바와 같이 인도적 종결점에 도달했을 때 또는 투여 시작 후 최대 6주 후, 각각의 마우스를 안락사시켰다.
항종양 활성, LL/2(LLC1) 모델
처리 일정 - 최초 투여의 시작을 D0으로 간주하였다. D0에, Vivo manager® 소프트웨어(Biosystems, Couternon, France)를 사용하여 그래프팅되지 않은 마우스를 이의 개별 체중에 따라 9/8마리의 7개 군으로 무작위화하였다. D0에, 마우스는 비히클(배양 배지) 또는 박테리아 균주를 수여받았다. D14에, 모든 마우스에 후술된 바와 같이 LL/2 종양 세포를 그래프팅하였다. D27에, 양성 대조군으로부터의 마우스는 항-CTLA-4 항체 처리를 수여받았다.
처리 일정을 아래의 표에 요약한다:
Figure pct00012
동물의 모니터링을 후술된 바와 같이 수행하였다.
동물에서 LL/2(LLC1) 종양 종양의 유도 - D14에, 마우스의 우측 넙다리 내로 200　㎕ RPMI 1640 중 1x106 LL/2(LLC1) 세포의 피하 주사에 의해 종양을 유도하였다.
안락사 - 후술된 바와 같이 인도적 종결점에 도달했을 때 또는 투여 시작 후 최대 6주 후, 각각의 마우스를 안락사시켰다.
항종양 활성, Hepa1-6 모델
처리 일정 - 최초 투여의 시작을 D0으로 간주하였다. D0에, Vivo manager® 소프트웨어(Biosystems, Couternon, France)를 사용하여 그래프팅되지 않은 마우스를 이의 개별 체중에 따라 9마리의 7개 군으로 무작위화하였다. D0에, 마우스는 비히클(배양 배지) 또는 박테리아 균주를 수여받았다. D14에, 모든 마우스에 후술된 바와 같이 Hepa 1-6 종양 세포를 그래프팅하였다. D16에, 양성 대조군으로부터의 마우스는 항-CTLA-4 항체 처리를 수여받았다.
처리 일정을 아래의 표에 요약한다:
Figure pct00013
동물의 모니터링을 후술된 바와 같이 수행하였다.
비장내 주사에 의한 동물에서 Hepa 1-6 종양 세포의 직교이방성 유도 - D0에, 50 ㎕ RPMI 1640 배지 중 백만 개(1x106) Hepa 1-6 종양 세포를 마우스 내로 비장내 주사를 통해 이식하였다. 간략하게, 소형 좌측 갈비밑 넙다리 절개를 수행하고 비장을 노출시켰다. 비장을 멸균 거즈 패드 상에서 노출시키고, 시각적 제어 하에 27-게이지 바늘로 세포 현탁액을 주사하였다. 세포 접종 후, 비장을 절제하였다.
안락사 - 후술된 바와 같이 인도적 종결점에 도달했을 때 또는 투여 시작 후 최대 6주 후, 각각의 마우스를 안락사시켰다.
안락사 시 종양 부담의 평가 - 종료 시, 간을 수집하고 칭량하였다.
항종양 활성, RENCA 모델
처리 일정 - 최초 투여의 시작을 D0으로 간주하였다. D0에, 그래프팅되지 않은 마우스를 이의 개별 체중에 따라 12마리의 군으로 무작위화하였다. D0에, 마우스는 비히클(배양 배지) 또는 박테리아 균주를 수여받았다(100 ㎕ 중 2x108, PO). D14에, 모든 마우스에 후술된 바와 같이 좌측 뒷넙다리 내로 RENCA 종양 세포를 SC 주사하여 그래프팅하였다. D17부터 항-CTLA-4(클론 9D9, 10 ㎎/㎏, IP) 및 항-PDL1(클론 10F.9G2, 10 ㎎/㎏, IP)로의 처리를 개시하였다.
처리 일정을 아래의 표에 요약한다:
Figure pct00014
동물의 모니터링을 후술된 바와 같이 수행하였다.
D14에(박테리아 투여/전-처리 2주 후), 100 ㎕의 PBS 중 5x105 생활성 세포를 마우스 당 1개 주사기 및 바늘로, 각각의 마우스(수술용 주정으로 멸균화함)의 좌측 뒷다리 넙다리 내로 피하 주사하였다. 세포 임플란트 전날 임플란트 부위를 면도하였다.
안락사 - 아래 섹션에 기재된 바와 같이 인도적 종결점에 도달했을 때 또는 투여 시작 후 최대 6주 후, 각각의 마우스를 안락사시켰다.
안락사 시 종양 부담의 평가 - 종료 시, 종양을 수집하고 이의 부피를 평가하였다.
동물 모니터링
임상적 모니터링 - 캘리퍼로 1주 2~3회 종양의 길이 및 폭을 측정하고 종양의 부피를 상기 식에 의해 추정하였다[81]:
Figure pct00015
인도적 종결점[82]: 통증, 고통 또는 곤란의 징후; 통증 자세, 통증 안면 표정, 행동; 정상 체중의 10%를 초과하지만 2000 ㎣ 이하의 종양; 보행 또는 영양을 방해하는 종양; 궤양화된 종양 또는 조직 미란; 연속 3일 동안 20% 체중 손실; 불량한 신체 상태, 쇠약, 악액질, 탈수; 외부 자극에 대한 자발적 반응의 연장된 부재; 빠르고 힘든 호흡, 빈혈, 상당한 출혈; 신경학적 징후; 회선, 경련, 마비; 체온의 지속된 감소; 복부 팽창.
마취 - 모든 절차: 수술 또는 종양 접종, i.v. 주사, 혈액 수집을 위해 이소플루란 기체 마취를 사용하였다. 정위 수술 절차를 위해 케타민 및 자일라진 마취를 사용하였다.
진통 - 카프로펜 또는 다중양상 카프로펜/부프레노르핀 진통 프로토콜을 수술 절차의 중증도에 대해 적응시켰다. 모든 고통스러운 절차에 대해 비-약리학적 케어를 제공하였다. 추가적으로, 주치 수의사의 권고 시 연구(국소 처리)를 방해하지 않는 약리학적 케어를 제공하였다.
안락사 - 기체 마취 과-투여량(이소플루란)에 이어 경추 탈골 또는 사혈에 의해 동물의 안락사를 수행하였다.
결과
항종양 활성, EMT6 모델
결과를 도 1a에 나타낸다. 본 발명의 박테리아 균주로의 처리는 두 음성 대조군 모두에 대해 종양 부피의 뚜렷한 감소를 야기하였다. 양성 대조군도 예상될 바와 같이, 종양 부피의 감소를 야기하였다.
MRx0518이 동계 종양 모델에서 그 치료 효과를 전달하는 기전을 추가 규명하기 위해, 동계 EMT6 종양 모델 연구 상에서 생체외 분석을 수행하였다. 종양 부피는 전임상 종양학 연구에서의 일차 척도지만, 종양은 종종 괴사 코어와 함께 활발히 분열하는 종양 세포로 구성된다. MRx0518 처리가 EMT6 종양 내에서 확인되는 괴사 정도에 영향을 미쳤는지를 조사하기 위해, 종양의 중간-부푼 영역으로부터의 파라핀 섹션을 해마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 쥣과 EMT6 유방암종 모델의 MRx0518 처리는 종양 내 괴사 단면적을 증가시키는 경향을 나타내었다(도 1b, 상부 패널). MRx0518 처리가 종양 내의 분열 세포에 영향을 미쳤는지를 조사하기 위해, 종양의 중간-부푼 영역으로부터의 파라핀 섹션을 DAPI 카운터염색과 함께 증식 단백질 Ki67로 염색하여, EMT6 종양 내에서 분열 세포의 백분율을 추정하였다. 쥣과 EMT6 유방암종 모델의 MRx0518 처리는 종양 내에서 나타난 분열 세포의 백분율을 유의미하게 감소시켰다(도　1b, 하부 패널, P=0.019).
면역 세포 집단
종양의 유세포측정을 통해 종양 미세환경의 추가 조사를 수행하여, MRx0518 박테리아 균주가 면역계가 항-종양 효과를 유도하도록 조절하는 능력을 갖는다는 가설을 조사하였다. 상이한 처리군으로부터 절제된 종양을 절편으로 절단하였다. 한 절편으로 유세포측정 분석을 거쳤다. 종양 내에 존재하는 T 림프구의 상대 백분율을 평가하기 위해, 하기 마커: CD45, CD3, CD4, CD8, CD25 및 FoxP3을 사용하였다.
도 1c에 제시된(및 도 23에 제시되는, 후술되는 데이터에 의해 추가로 뒷받침되는) 예비 유세포측정 데이터는 종양 내 림프구의 상대 백분율이 각각 비히클 또는 대조군 동물과 비교되는 경우, MRx0518 및 항-CTLA-4 처리군 모두에서 약간 감소되었음을 나타낸다. 마찬가지로, CD4+ 세포의 상대 백분율은 MRx0518 및 항-CTLA-4 처리된 동물에서 감소되는 것으로 드러난 반면, CD8+ 세포의 상대 백분율은 상이한 크기기는 해도, 두 군에서 모두 반대 경향을 따랐다. CD4+FoxP3+ 세포의 상대 백분율은 MRx0518 처리된 동물에서의 약한 감소와 비교되는 경우 항-CTLA-4 처리군에서 더 낮았다; 그러나, CD4+CD25+ 세포의 상대 백분율 감소는 항-CTLA-4 처리군에서만 주지 가능하였다. CD8+/FoxP3+ 비는 MRx0518 동물에서보다 항-CTLA-4 처리군에서 더 큰 증가를 나타내었다. 여기에 나타낸 이들 데이터는 MRx0518에 대한 상이한 작용 방식을 제시하며, 항-CTLA-4 항체가 조절 T 세포(Treg)를 이의 세포수를 감소시켜 또는 종양 조직에서 이의 억제 활성을 약화시켜 표적화한다는 가설을 뒷받침한다.
종양 미세환경의 추가 조사를 종양 조직의 NanoString 분석을 사용해서 수행하여 MRx0518 박테리아 균주가 면역계가 EMT6 모델에서 항-종양 효과 유도를 조절하는 능력을 갖는지를 조사하였다. 비히클 및 MRx0518-처리군으로부터 절제된 종양을 수집하였다. TRIzol 시약(ThermoFisher)을 사용하여 종양 조직으로부터 RNA를 추출한 후 DNase I 처리(Qiagen)를 포함하여 RNeasy Mini 키트(Qiagen)를 사용하여 클린-업하였다. 이어서 PanCancer Mouse IO 360 패널을 사용하여 Nanostring 분석을 위해 RNA를 사용하였다. 이전에 다양한 세포 집단의 특징으로 나타난 유전자를 사용하여 이들 집단의 존재비를 측정하였다:
Figure pct00016
NanoString 분석에 의해 제공되는 선형 세포 유형 스코어를 사용해서 각각의 세포 집단에 대한 Z-스코어를 계산하였다(도 23, 열 지도).
NanoString 데이터는 비히클-처리 동물과 비교되는 경우, MRx0518-처리군의 종양 조직에서 B 세포, CD45, T 세포, 세포독성 및 NK 세포의 존재비가 증가했음을 나타낸다(도 23). 여기 나타낸 데이터는 MRx0518이 종양 미세환경에서 백혈구, 특히 NK 세포, T 세포 및 세포독성 세포를 증가시켜 면역자극 효과를 갖는다는 가설을 뒷받침한다.
사이토카인 생산
혈장 샘플과 함께, 전체 단백질 추출 및 후속 사이토카인 분석을 위해 추가 종양 절편을 사용하였다. 종양 미세환경에서 IL-10, CXCL1, CXCL2, CXCL10, IL-1β, IL-17A, GM-CSF, TNF-α, IL-12p70 및 IFN-γ의 단백질 수준을 MagPix 기술을 사용해서 분석하였다. IL-17A 및 GM-CSF는 검출 수준 미만이었지만, 모든 다른 마커는 합리적인 수준으로 발현되었다(도　1d). IFN-γ에 있어서 비히클 및 항-CTLA-4군 간 유의차가 관찰되었다. IL-10 및 IL-12p70 면역 마커의 생산은 대조군 처리 대비 MRx0518 처리 후 감소된 것으로 나타났다.
사이토카인 수준을 또한 동일한 동물의 혈장 중에서 평가하였다. IL-23, IL-6, IL-10, VEGF, CXCL1, CXCL2, CXCL10, IL-2, IL-1β, IL-17A, GM-CSF, TNF-α, IL-12p70 및 IFN-γ의 단백질 수준을 MagPix 기술을 사용해서 분석하였다. 전반적으로 종양 유도 전에 또는 연구 말기에 동물의 혈장 중에서 사이토카인은 거의 검출되지 않았다(도 1e). VEGF 및 CXCL10은 상당한 수준으로 검출된 반면, IL-23, IL-6, IL-10, CXCL1 및 CXCL2는 저수준으로 검출되었다. IL-2, IL-1b, IL-17A, GM-CSF, TNF-α, IL-12p70 및 IFN-γ는 샘플에서 검출되지 않았다. MRx0518은 0일째에 IL-6의 생산을 유의미하게 증가시켰다. MRx0518은 또한 IL-23 생산을 증가시키는 것으로 나타났다. VEGF 및 CXCL10은 22일째에 항-CLTA-4군에서 유의미하게 하향조절되었다. 면역 세포 집단에 대해 나타난 결과와 유사하게, MRx0518 및 항-CTLA-4 간에, 종양 및 혈장 중 사이토카인 생산의 차이는 이들 각각이 구별되고 잠재적으로 상보적인 기전으로 작용함을 제시한다.
회장에서 CD8α 양성 세포의 편재
회장의 10 ㎛ 냉동-섹션을 크리오스타트(CM 1950 Leica)에서 절단하고, 폴리-L 라이신 슬라이드 상에 픽업하였다. 이어서 섹션을 1시간 동안 공기-건조하고, 빙냉 메탄올 중 10분 동안 고정하고, PBS 중에 세척하고, PBS pH 7.2 중 10% BSA에서 차단한 후, 일차 항체(래트-항-마우스-CD8α 항체, Sigma-Aldrich, Millipore)와 함께 하룻밤 동안 인큐베이션하였다.
다음날 아침에 슬라이드를 PBS 중에 세척하고 실온에서 1시간 동안 이차 항체: 염소-항-래트-항체-Alexa488(Molecular Probe, Invitrogen)로 염색하였다. 다시 세척 단계 후, 슬라이드를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 디하이드로클로라이드(DAPI)(Sigma-Aldrich, Millipore)로 카운터염색하고 Vectashield(Vector Laboratories)에 실장하였다. 슬라이드를 확인하고 수은 증기 램프, 적절한 필터 및 x20 세색지움 대물렌즈가 장착된 Zeiss Axioscope 현미경을 사용하여 이미지화하였다. 비히클, MRx0518, 및 항-CTLA4 동물로부터의 슬라이드에서 수득한 이미지의 예를 나타낸다(도 1f - 상부 패널: DAPI 염색, 하부 패널: CD8α 염색).
20마리 동물로부터의 뷰 시야를 검사하고 수동 노출 시간을 사용해서 이미지화하였다. 동물의 수 및 분석된 시야를 하기 표에 나타낸다:
Figure pct00017
이미지는 하기와 같이 스코어링하였다: 3개 이하의 양성 세포를 갖는 시야는 0으로 스코어링한 반면, 3개 초과의 세포를 갖는 시야는 1로 스코어링하였다. 상기 분석의 결과를 나타낸다(도 1g).
항-CD8α로 염색된 회장 냉동섹션은 비히클군 대비 MRx0518 및 항-CTLA-4로 처리된 동물로부터의 움 영역 조직에 편재된 더 많은 수의 CD8α 양성 세포를 나타내었다.
상기 관찰은 면역 반응의 일환으로, 감염 또는 염증성 미세환경의 경우 내장에 존재하는 CD8+ T 세포와 일치한다.
항종양 활성, LL/2(LLC1) 모델
결과를 도 2에 나타낸다. 본 발명의 박테리아 균주로의 처리는 두 음성 대조군 대비 종양 부피의 뚜렷한 감소를 야기하였다.
항종양 활성, Hepa1-6 모델
결과를 도 3a에 나타낸다. 미처리 음성 대조군에서는 다른 군에 비해 상기 군에서의 간 중량이 더 낮았으므로, 예상된 바와 같이 나타나지 않는다. 그러나, 비히클 음성 대조군 및 양성 대조군은 비히클 단독으로 처리된 마우스가 항-CTLA4 항체로 처리된 마우스에서보다 큰 간을 가졌으므로, 예상된 바와 같이 둘 다 나타나서, 비히클 음성 대조군에서의 더 큰 종양 부담을 반영한다. 본 발명의 박테리아 균주로의 처리는 비히클 음성 대조군에서의 마우스 대비 간 중량(그리고 이에 따라 종양 부담)의 뚜렷한 감소를 야기하였다.
항종양 활성, RENCA 모델
결과를 도 3b에 나타낸다. MRx0518 단독치료법으로의 처리는 비히클-처리군 대비 평가군/대조군으로 종양 부피를 51% 감소시켰다(18일째). 파클리탁셀 및 항-CTLA-4 + 항-PDL-1은 미처리군 및 비히클군 둘 다에 비해 D18 및 D22에 종양 크기의 (거의) 완전한 감소를 나타내었다.
이들 데이터는 균주 MRx0518이 감소된 면역계 활성과 연관된 다른 질환을 치료하거나 예방하기 위해 유용할 수 있음을 시사한다.
실시예 2 - PCR 유전자 분석
박테리아 MRx0518의 순수한 배양을 PCR 유전자 분석에서 연구하였다. 실험에는 2 부문(arm)이 존재했다: 1) MRx0518을 인간 결장 세포(CaCo2)와 공동-배양하여 숙주에 대한 박테리아의 효과를 조사하였고, 2) MRx0518을 IL1로 자극된 CaCo2 세포 상에서 공동-배양하여 염증성 환경에서 박테리아의 효과를 모사하였다. 두 시나리오에서의 효과를 유전자 발현 분석을 통해 평가하였다. 결과를 아래에 나타낸다:
Figure pct00018
Figure pct00019
이들 데이터는 2개의 유전자 발현 특징부 - 전염증성 세포 이동과 연관되는 CXCR1/2 리간드(CXCL3, CXCL2, CXCL1, IL-8), 및 IFN-γ-유도성인 IL-32에 의해서도 뒷받침되는, IFN-γ-유형 반응을 보다 구체적으로 시사하는 CXCR3 리간드(CXCL9, CXCL10)를 나타내는 것으로 드러난다. 이들 데이터는 본 발명의 조성물이 면역계를 자극하기 위해 유용함을 제시한다.
실시예 3 - 안정성 평가
본원에서 기재되는 적어도 하나의 박테리아 균주를 함유하는 본원에 기재된 조성물을 25℃ 또는 4℃에서 밀봉된 용기에 보관하고 용기를 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% 또는 95% 상대 습도를 갖는 분위기에 배치한다. 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 1년, 1.5년, 2년, 2.5년 또는 3년 후, 표준 프로토콜에 의해 결정되는 콜로니 형성 단위로 측정되는 박테리아 균주의 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%가 유지될 것이다.
실시예 4 - MRx0518 + LPS 대비 MRx0518에 의해 유도되는 미성숙 수지상 세포에서의 사이토카인 생산
요약
본 연구는 미성숙 수지상 세포에서의 사이토카인 생산에 대한 박테리아 균주 MRx0518 단독 및 지질다당류(LPS)와의 조합 효과를 평가하였다.
단핵구 집단을 말초혈 단핵 세포(PBMC)로부터 단리하였다. 단핵구 세포는 이후 미성숙 수지상 세포로 분화되었다. 미성숙 수지상 세포를 200,000 세포/웰로 플레이트 접종하고 107/㎖의 최종 농도로 MRx0518과 인큐베이션하였고, 선택적으로 100 ng/㎖의 최종 농도로 LPS를 첨가하였다. 음성 대조군에는 세포와 RPMI 배지만의 인큐베이션이 관여되었고 양성 대조군은 세포를 최종 농도 100 ng/㎖의 LPS와 인큐베이션하였다. 이어서 세포의 사이토카인 함량을 분석하였다.
결과
이들 실험 결과는 도 4a~d에서 알 수 있다. MRx0518 단독 첨가는 음성 대조군 대비 사이토카인 IL-6 및 TNF-α 수준의 실질적 증가를 야기한다(도 4a 및 c). LPS의 첨가(양성 대조군)는 음성 대조군 대비 IL-1β가 아닌 IL-6 및 TNF-α의 수준 증가를 야기한다(도 4b). MRx0518 및 LPS의 조합은 생산된 IL-1β 수준의 상승적 증가를 야기하였다(도 4d).
결론
MRx0518은 미성숙 수지상 세포에서 더 높은 IL-6 및 TNF-α 사이토카인 생산을 유도하는 능력을 갖는다. LPS 및 MRx0518 조합은 미성숙 수지상 세포에서 사이토카인 IL-1β의 수준을 증가시킬 수 있다. 이들 데이터는 MRx0518 단독 또는 LPS와의 조합이 염증을 촉진하는 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 증가시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 5 - MRx0518 + LPS 대비 MRx0518에 의해 유도된 THP-1 세포에서의 사이토카인 생산
요약
본 연구는 단핵구 및 대식구에 대한 모델 세포주인 THP-1 세포에서의 사이토카인 생산에 대한 박테리아 균주 MRx0518 단독 및 LPS와의 조합 효과를 평가하였다.
THF-1 세포를 5 ng/㎖ 포볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)와 48 h 동안 M0 배지 내에서 분화시켰다. 이들 세포를 이후 최종 농도 100 ng/㎖의 LPS를 첨가하거나 첨가하지 않고, 108/㎖의 최종 농도로 MRx0518과 인큐베이션하였다. 이어서 박테리아를 세척 제거하고 세포를 24 h 동안 일반 성장 조건 하에 인큐베이션하며 두었다. 그 후 세포를 회전 침강시키고 생성 상청액을 사이토카인 함량에 대해 분석하였다.
결과
이들 실험의 결과는 도 5a~c에서 알 수 있다. LPS 없는 MRx0518 첨가는 박테리아 비함유 및 박테리아 침강 대조군 대비 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 사이토카인 수준의 증가를 야기한다. LPS 및 MRx0518의 첨가는 사이토카인 생산의 상승적 증가를 야기한다.
결론
MRx0518은 THP-1 세포에서 사이토카인 생산을 유도하는 능력을 갖고, 이는 LPS의 첨가로 상승적으로 증가될 수 있다. 이들 데이터는 MRx0518 단독 또는 LPS와의 조합이 염증을 촉진하는 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6 및 TNF-α를 증가시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 6 - 사이토카인 분석
개요
본 발명자들은 본 발명의 조성물의 면역자극 효과를 추가 분석하고자 했다. 본 발명자들은 MRx0518의 처리 시 단핵구로부터 유도된 수지상 세포 및 THP-1 대식구로부터 특정 사이토카인의 발현을 분석하였다. 대식구 및 수지상 세포는 선천성 면역계의 핵심 성분으로, 선천성 및 적응 면역계 간 메신저로 작용하며, 이들이 다양한 사이토카인을 방출하여 면역 반응을 조절하는 장에서 촉발한다.
선천성 면역 반응(TNF-α, IL-12 및 IL-10)에 관여되는 사이토카인 그리고 또한 적응 면역 세포의 모집 및 활성화에 관여되는 사이토카인(IL-8, IL-23, IL-1β 및 IL-6)을 분석하였다.
방법
박테리아 균주
MRx0518
LPS를 양성 대조군으로 사용함
결과
결과를 도 6~13에 나타낸다. MRx0518은 단핵구로부터 유래된 DC 및 THP-1-유래 대식구에서 강력하고 특징적인 면역-자극 프로필을 유도한다. 선천성 면역 반응에 관여된 사이토카인(TNF-α, IL-12 및 IL-10)은 DC 및 대식구 모두에서 MRx0518에 의해 유의미하게 유도된다. MRx0518은 대식구 및 DC 모두에서 IL-8의 매우 강력하고 유의미한 유도를 일으킨다. MRX0581은 IL-23 및 IL-6의 강력하고 유의미한 유도를 일으킨다. MRx0518도 IL-1β를 유도하였다.
논의
이들 데이터는 MRx0518이 면역자극 특성을 가지며, 면역자극을 위한 효과적인 조성물일 수 있음을 나타낸다.
실시예 7 - 작용 기전
MRx0518이 면역계를 자극하는 작용 기전을 특성규명하기 위해 추가 실험을 수행하였다. TLR5 신호전달 리포터 검정을 선택하였고, 데이터를 도 14 및 15에 제시한다. MRx0518 상청액은 TLR5 및 NF-κB의 가장 강력한 활성화제였다. 또한, 상청액을 다양한 용해 효소로 처리하였고 트립신은 대부분의 활성을 폐지하는 것으로 확인되었다.
실시예 8 - CTLA-4 억제제와의 치료 조합에서 MRx0518의 보조제 면역자극 활성
요약
본 연구는 EMT-6 종양 세포를 보유하는 마우스에서 MRx0518, CTLA-4 억제제, 및 MRx0518과 CTLA-4 억제제의 치료 조합의 항-종양 활성을 비교하였다.
물질
평가 및 참조 성분 - 박테리아 균주 #MRx0518; 항-CTLA4 항체(ref: BE0131, Bioxcell; 클론: 9H10; 반응성: 마우스; 이소형: 햄스터 IgG1; 보관 조건: +4℃).
평가 및 참조 성분 비히클 - MRx0518 박테리아를 박테리아 배양 배지(효모 추출물, 카시톤, 지방산 배지(YCFA)) 중에 성장시키고 -80℃에서 글리세롤 스톡으로 유지하였다. 연구 프로토콜에 따라 동물에 박테리아를 투여하였다. 항-CTLA-4 항체를 마우스로의 주사 당일에 PBS(ref: BE14-516F, Lonza, France)로 희석하였다.
처리 용량 - 박테리아: 200 ㎕ 중 2x108. 항 CTLA4 항체를 마우스의 가장 최근 체중에 따라 10 ㎎/체중㎏으로 투여하였다.
투여 경로 - 박테리아 조성물을 200 ㎕/inj의 부피로 급식 튜브를 통해 경구 급식(입으로(per os), PO)에 의해 투여하였다. 항 CTLA-4 항체를 마우스의 가장 최근 개별 체중에 대해 조정된 10 ㎖/㎏의 부피로 마우스의 복강 내로(복강내, IP) 주사하였다.
암 세포주 및 배양 조건 - 본 연구에서 사용한 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA)로부터 입수한 EMT-6 세포주이다. EMT-6 세포주를 과다형성 유방 치조 결절의 임플란트 후 BALB/cCRGL 마우스에서 생긴 이식 가능한 쥣과 유방암종으로부터 확립하였다.
종양 세포를 가습된 분위기(5% CO2, 95% 공기)에서 37℃에서 단층으로 성장시켰다. 배양 배지는 10% 우태 혈청(ref: 3302, Lonza)이 보충된 2 mM L-글루타민 함유 RPMI 1640(ref: BE12-702F, Lonza, Verviers, Belgium)이었다. EMT-6 종양 세포는 플라스틱 플라스크에 부착한다. 실험적 용도를 위해, 종양 세포를 칼슘 또는 마그네슘 비함유 Hanks 배지(ref: BE10-543F, Lonza) 중 트립신-베르센(ref: BE02-007E, Lonza)으로의 5분 처리에 의해 배양 플라스크로부터 탈착하고 완전 배양 배지를 첨가하여 중화하였다. 세포를 계수하고 이의 생활성을 0.25% 트립판 블루 배제 검정에 의해 평가하였다.
동물의 사용 - 5~7주령 건강한 암컷 BALB/C(BALB/cByJ) 마우스를 CHARLES RIVER(L'Arbresles)로부터 입수하고 FELASA 가이드라인에 따라 SPF 건강 상태로 유지하였다. 실험실 동물의 케어 및 사용에 대한 프랑스 및 유럽 규제 및 NRC 지침에 따라 동물 수용 및 실험 절차를 구현하였다. 동물은 제어되는 환경 조건 하에 수용실에서 우리 당 3~4마리씩 유지하였다: 온도: 22±2℃, 습도 55±10%, 광주기(12 h 명주기/12 h 암주기), HEPA 여과된 공기, 재순환 없이 시간 당 15회 공기 교환. 기재된 바와 같은 침구재, 음식 및 물, 환경 및 풍부한 사회조건(군 수용)과 함께 멸균된 적절한 공간으로 동물 봉쇄를 제공하였다: 상부 필터 폴리카보네이트 유로표준 유형 III 또는 IV 우리, 옥수수 속대 침구재(ref: LAB COB 12, SERLAB, France), 25 ㎏y 조사된 식이(Ssniff® Soest, Germany), 면역적격 설치류에 대한 완전식 - R/M-H 압출물, 멸균, 0.2 ㎛ 여과수 및 풍부한 사회조건(SIZZLE-dri kraft - D20004 SERLAB, France). 동물은 RFID 응답기로 개별 식별하며 각각의 우리는 특정 코드로 표지하였다. 동물의 처리는 배치 2 및 3에 대해서는 순응 1주 후, 또는 배치 1에 대해서는 순응 3주 후 시작하였다.
실험 설계 및 처리
-14일째(D-14)에, 그래프팅되지 않은 마우스를 Vivo Manager® 소프트웨어(Biosystemes, Couternon, France)를 사용하여 30마리 동물의 3 군 및 10마리 동물의 2 군으로 이의 개별 체중에 따라 무작위화하였다. 마우스를 연구 시작: D-14 또는 D0으로부터 상이한 종료 지점을 갖는 처리군 당 10마리 동물의 3개 배치로 구분하였다(배치 1: 군 1, 2 및 3의 10마리 동물, 배치 2: 군 1, 2 및 3의 10마리 동물 및 배치 3: 군 1 내지 5의 10마리 동물).
종료 시, 배치 3을 종료 및 FACS 분석 일정으로 인해 2개 코호트로 분할하였다; 이들은 1일: D24/D25에 걸쳐 엇갈렸다. 따라서, 동물의 모든 코호트는 처리군 당 5마리 동물을 가졌다(우리 1로부터의 4마리 동물 및 우리 2로부터의 1마리 동물). 윤리적 기준에 근거하여, 종양 부피가 1500 ㎣ 초과인 경우, D24 및 D25에 희생시킬 동물의 선택은 우리 대신 종양 부피에 근거한다. 실험 설계를 도 16a에 도시하고 아래에 요약한다:
1) 배치 1(군 1, 2 및 3)은 D0에 처리를 시작하였고 D14에 추려냈다(군 1 내지 3으로부터 10마리 동물). 이들은 종양 세포를 수여받지 않았고 기준선 군을 이뤘다.
2) 배치 2(군 1, 2 및 3)는 D-14에 처리를 시작하였고 D7에 추려냈다(군 1 내지 3으로부터 10마리 동물).
3) 배치 3(군 1 내지 5)은 D-14에 처리를 시작하였고 D24/25에 추려냈다(군 1 내지 5로부터 10마리 동물). 항 CTLA-4의 처리를 D10에 시작하였다.
0일째(D0)에 배치 2 및 3으로부터의 모든 동물(각각 7일 및 24/25일에 종료)에 우측 넙다리 내로 200 ㎕ RPMI 1640 중 1x106 EMT-6 세포의 피하 주사에 의해 EMT-6 종양 세포를 그래프팅하였다(D14에 희생시킨 배치 1로부터의 30마리 마우스는 종양 주사를 수여받지 않았음). 마우스는 하기 처리 일정 군에 따라 처리하였다(TWx2 = 주 2회):
Figure pct00020
동물 모니터링
동물의 생활성 및 행동을 매일 기록하였다. 체중을 주 2회 측정하였다. 캘리퍼로 1주 2회 종양의 길이 및 폭을 측정하고 종양의 부피를 하기 식에 의해 추정하였다:
Figure pct00021
처리 유효성을 대조군 동물 대비 처리받은 동물의 종양 부피에 대한 평가 성분의 효과의 관점에서 평가하였다. 항종양 유효성의 하기 평가 기준을 Vivo Manager® 소프트웨어(Biosystemes, Couternon, France)를 사용하여 결정하였다. 군 1 내지 5의 평균 종양 부피를 도 16b에 도시한다. 연구 과정을 통해, 종양 유도 후 14일부터 종양 성장의 퇴행이 일어난 MRx0518 + 항-CTLA-4-처리군을 제외하고, 종양 성장의 진행이 모든 군에서 관찰되었다. MRx0518 + 항-CTLA-4 처리는 종양 유도 후 21일 및 24일째에 비히클-처리군 대비 종양 성장을 유의미하게 감소시켰다. MRx0518과 항-CTLA-4의 조합 처리는 피하 그래프팅된 EMT6 종양을 보유하는 BALB/c 마우스에서 종양 성장을 감소시키기 위해 가장 유효하였다. 이들 데이터는 MRx0518이 면역자극 효과를 가짐을 실증한다.
실시예 9 - 암의 마우스 모델에서 박테리아 접종물의 유효성
요약
본 연구에서는 종양 모델에서 본 발명에 따른 박테리아 균주를 포함하는 조성물의 유효성을 평가하였다.
물질
평가 성분 - 박테리아 균주 #MRx0554.
참조 성분 - 항-CTLA-4 항체(클론: 9H10, 카탈로그: BE0131, 이소형: 시리아 햄스터 IgG1, Bioxcell).
평가 및 참조 성분 비히클 - 박테리아 배양 배지(효모 추출물, 카시톤, 지방산 배지(YCFA)). 마우스로의 주사일에 항체를 PBS(ref: BE14-516F, Lonza, France)로 희석하였다.
처리 용량 - 박테리아: 200 ㎕ 중 2x108. 항-CTLA4-항체를 10 ㎎/㎏/inj으로 주사하였다. 항-CTLA-4를 마우스의 가장 최근 체중에 따라 10 ㎖/㎏/adm의 투여 부피로 투여하였다(즉, 20 g 체중의 한 마리 마우스에 대해, 200 ㎕의 평가 성분이 투여될 것임).
투여 경로 - 박테리아 접종물을 캐뉼라를 통해 경구 급식(입으로, PO)에 의해 투여하였다. 매일 캐뉼라의 오염을 제거하였다. 항-CTLA-4를 마우스의 복강 내로(복강내, IP) 주사하였다.
박테리아 균주의 배양 조건 - 박테리아 균주에 대한 배양 조건은 하기와 같았다:
· 10 ㎖의 YCFA(10 ㎖ E&O 랩 보틀에 제조됨)를 Hungate 튜브 내로 피펫팅함
· 튜브를 밀봉하고 시린지 입구 및 배출 시스템을 사용해서 CO2로 플러싱함
· Hungate 튜브를 오토클레이브함
· 냉각되면, 1 ㎖의 글리세롤 스톡을 Hungate 튜브에 접종함
· 약 16시간 동안 정적 37℃ 인큐베이터에 튜브를 배치함.
· 다음 날, 상기 하위배양액 1 ㎖을 취해 10 ㎖의 YCFA에(모두 2개씩, 다시 사전-가온되고 플러싱된 Hungate 튜브에) 접종함
· 이를 5 내지 6 h 동안 정적 37℃ 인큐베이터에 배치함
암 세포주 및 배양 조건 -
사용한 세포주를 아래의 표에 상세히 나타낸다:
Figure pct00022
EMT-6 세포주를 과다형성 유방 치조 결절의 임플란트 후 BALB/cCRGL 마우스에서 생긴 이식 가능한 쥣과 유방암종으로부터 확립하였다[83].
세포 배양 조건 - 모든 세포주를 가습된 분위기(5% CO2, 95% 공기)에서 37℃에서 단층으로 성장시켰다. 배양 배지 및 보충물을 아래 표에 나타낸다:
Figure pct00023
실험 용도를 위해, 부착성 종양 세포를 칼슘 또는 마그네슘을 함유하지 않는 Hank 배지(ref: BE10-543F, Lonza) 중 트립신-베르센(ref: BE17-161E, Lonza)으로의 5분 처리에 의해 배양 플라스크로부터 탈착하고, 완전 배양 배지를 첨가하여 중화했다. 세포를 혈구계에서 계수하고 이의 생활성을 0.25% 트립판 블루 배제 검정에 의해 평가하였다.
동물의 사용 -
EMT6 모델 실험을 위해 매칭되는 체중 및 연령을 갖는 건강한 암컷 BALB/C(BALB/cByJ) 마우스를 CHARLES RIVER(L'Arbresles)로부터 입수하였다.
동물을 FELASA 가이드라인에 따라 SPF 건강 상태로 유지하고, 실험실 동물의 케어 및 사용에 대한 프랑스 및 유럽 규제 및 NRC 지침에 따른 동물 수용 및 실험 절차를 따랐다[84,85]. 동물은 제어되는 환경 조건 하에 수용실에서 유지하였다: 온도: 22±2℃, 습도 55±10%, 광주기(12 h 명주기/12 h 암주기), HEPA 여과된 공기, 재순환 없이 시간 당 15회 공기 교환. 기재된 바와 같은 침구재, 음식 및 물, 환경 및 풍부한 사회조건(군 수용)과 함께 멸균된 적절한 공간으로 동물 봉쇄를 제공하였다: 통기된 랙에 있는 900 ㎠ 우리(참조: 녹색, Tecniplast), Epicea 침구재(SAFE), 10 ㎏y 조사된 식이(A04-10, SAFE), 면역적격 설치류에 대한 완전식 - R/M-H 압출물, 물병으로부터의 물.
실험 설계 및 처리
항종양 활성, EMT6 모델
처리 일정 - 최초 투여의 시작을 D0으로 간주하였다. D0에, Vivo manager® 소프트웨어(Biosystems, Couternon, France)를 사용하여 그래프팅되지 않은 마우스를 이의 개별 체중에 따라 8~9마리의 군으로 무작위화하였다. D0에, 마우스는 비히클(배양 배지) 또는 박테리아 균주를 수여받았다. D14에, 모든 마우스에 후술된 바와 같이 EMT-6 종양 세포를 그래프팅하였다. D24에, 양성 대조군으로부터의 마우스는 항-CTLA-4 항체 처리를 수여받았다.
처리 일정을 아래의 표에 요약한다:
Figure pct00024
동물의 모니터링을 후술된 바와 같이 수행하였다.
동물에서 EMT6 종양의 유도 - D14에, 마우스의 우측 넙다리 내로 200　㎕ RPMI 1640 중 1x106 EMT6 세포의 피하 주사에 의해 종양을 유도하였다.
안락사 - 후술된 바와 같이 인도적 종결점에 도달했을 때 또는 투여 시작 후 최대 6주 후, 각각의 마우스를 안락사시켰다.
동물 모니터링
임상적 모니터링 - 캘리퍼로 1주 2회 종양의 길이 및 폭을 측정하고 종양의 부피를 하기 식에 의해 추정하였다[86]:
Figure pct00025
인도적 종결점[87]: 통증, 고통 또는 곤란의 징후; 통증 자세, 통증 안면 표정, 행동; 정상 체중의 10%를 초과하지만 2000 ㎣ 이하의 종양; 보행 또는 영양을 방해하는 종양; 궤양화된 종양 또는 조직 미란; 연속 3일 동안 20% 체중 손실; 불량한 신체 상태, 쇠약, 악액질, 탈수; 외부 자극에 대한 자발적 반응의 연장된 부재; 빠르고 힘든 호흡, 빈혈, 상당한 출혈; 신경학적 징후; 회선, 경련, 마비; 체온의 지속된 감소; 복부 팽창.
마취 - 모든 절차: 수술 또는 종양 접종, i.v. 주사, 혈액 수집을 위해 이소플루란 기체 마취를 사용하였다. 정위 수술 절차를 위해 케타민 및 자일라진 마취를 사용하였다.
진통 - 카프로펜 또는 다중양상 카프로펜/부프레노르핀 진통 프로토콜을 수술 절차의 중증도에 대해 적응시켰다. 모든 고통스러운 절차에 대해 비-약리학적 케어를 제공하였다. 추가적으로, 주치 수의사의 권고 시 연구를 방해하지 않는 약리학적 케어(국소 치료)를 제공하였다.
안락사 - 기체 마취 과-투여량(이소플루란)에 이어 경추 탈골 또는 사혈에 의해 동물의 안락사를 수행하였다.
결과
항종양 활성, EMT6 모델
결과를 도 17에 나타낸다. 본 발명의 박테리아 균주로의 처리는 두 음성 대조군 모두에 대해 종양 부피의 뚜렷한 감소를 야기하였다. 양성 대조군도 예상될 바와 같이, 종양 부피의 감소를 야기하였다.
이들 데이터는 균주 MRx0554가 감소된 면역계 활성과 연관된 다른 질환을 치료하거나 예방하기 위해 유용할 수 있음을 시사한다.
실시예 10 - 탄수화물 대사의 분석 - MRx0554의 API 50 CHL 분석
분석 프로필 지수(API) 평가 시스템은 박테리아종에서 효소 활성에 대해 검정하는 미니 생화학 평가를 포함하는 스트립으로 구성된다. 이들 평가는 신규한 균주의 특성규명에서 일상적으로 사용된다. API 50 CHL 평가를 수행하여 MRx0554에서의 탄수화물 대사를 검사하였다. 제조업체의 지침에 따라, 박테리아를 혐기성 워크스테이션에서 37℃에서 16~18시간 동안 10 ㎖ YCFA 배양액 중에 배양하였다. McFarland 표준 번호 2와 대략 균등한 밀도를 달성하기 위해 상기 배양을 10 ㎖ API CHL 배지 중에 희석하고, 110 ㎕의 상기 혼합물을 사용하여 API 50 CH 평가 스트립 세트 상에 각각의 흡반(cupule)을 접종하였다. 평가 스트립을 48시간 동안 혐기성 워크스테이션에서 37℃에서 가습된 인큐베이션 상자에서 인큐베이션한 후, 각각의 흡반의 색상을 기록하고, 음성, 중간 양성, 양성 또는 불확실의 값을 할당하였다.
API 50 CHL 분석을 사용하여, MRx0554는 L-아라비노스, D-리보스, D-자일로스, D-갈락토스, D-글루코스, D-프룩토스, D-만노스, N-아세틸글루코사민, 아미그달린, 아르부틴, 에스쿨린, 살리신, D-셀로바이오스, D-말토스, D-사카로스(수크로스), D-트레할로스, 겐티오바이오스, D-타가토스, 및 칼륨 글루코네이트의 발효에 대해 양성으로 평가되었다(도 18). D-만니톨, 메틸 α-D-글루코피라노시드, D-락토스, D-라피노스, 아미돈(전분), 및 D-투라노스에 대해서는 중간 반응이 관찰되었다.
실시예 11 - TLR9 활성화
MRx0518이 면역계를 자극하는 기전을 추가 규명하기 위해, HEK-Blue™ 인간 TLR9 리포터 세포(InvivoGen, San Diego, CA, USA)를 사용하여 TLR9 활성화에 대한 MRx0518의 효과를 평가하였다.
세포주 및 박테리아 균주의 유지
HEK-Blue™ 인간 TLR9 리포터 세포(InvivoGen, San Diego, CA, USA)를 10%(v/v) 우태 혈청(FBS), 4 mM L-글루타민, 4.5 ㎎/㎖ 글루코스, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100 ㎍/㎖ Normocin™(InvivoGen), 10 ㎍/㎖ 블라스토시딘(InvivoGen) 및 100 ㎍/㎖ 제오신(InvivoGen)이 보충된 DMEM 중에 90% 밀도까지 성장시켰다. 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 유지하였다. 검정을 위해, 세포를 인산염-완충 식염수(PBS)(Sigma-Aldrich, Gillingham, England, UK)로 1회 세척하고 450,000 세포/㎖의 밀도로 항생제-비함유 성장 배지 중에 재현탁하였다. 달리 언급되지 않는 한 모든 시약은 Sigma Aldrich에서 공급받았다. E. 갈리나룸 MRx0518은 혐기성 캐비넷(Don Whitley Scientific, Shipley, England, UK)에서 37℃에서 효모 추출물, 카시톤, 지방산 배지(YCFA, E&O Laboratories, Bonnybridge, Scotland, UK) 중에서 일상적으로 배양하였다.
TLR9 리포터 검정
하기 조성물을 TLR9 활성화를 유도하는 이의 능력에 대해 검사하였다:
1. MRx0518의 살아있는 분획(MRx0518LV) - 후기 로그상 박테리아 배양을 실온에서 5분 동안 5,000 x g에서 원심분리하여 박테리아 분획을 생성하였다. 펠렛화된 박테리아를 PBS 중에 1회 세척하고 적절한 희석도로 항생제-비함유 세포 배양 배지 중에 재현탁하였다.
2. MRx0518 상청액 분획(MRx0518SN) - 배양 상청액을 수확하고 0.22 ㎛ 포어 크기 필터를 통해 여과하고 수중 희석하였다.
3. MRx0518의 열-사멸 분획(MRx0518HK) - 박테리아 배양을 80℃에서 40분 동안 열-불활성화하고 살아있는 분획에 대해 상술된 바와 같이 제조하였다.
MRx0518LV 및 MRx0518HK을 100:1의 감염 다중도(MOI)로 사용하였다. 100:1 MOI와 동등 부피를 MRx0518SN에 대해 사용하였다. 합성 CpG 올리고뉴클레오타이드 ODN2006(InvivoGen)을 5 μM의 농도로 검정 양성 대조군으로 사용하였다. YCFA를 음성 대조군으로 사용하였다. 생활성 세포수를 플레이트 접종에 의해 결정하였다.
HEK-Blue™ 인간 TLR9 리포터 세포를 5% CO2 분위기로 37℃에서 22시간 동안 상기 처리와 함께 인큐베이션하였다. 검정을 2 h 동안 제조업체의 권장사항에 따라 QUANTI-Blue™(InvivoGen)를 사용하여 발색시켰다. 도 19에 도시된 결과는 적어도 3회 독립 실험으로부터의 평균이다. 일반 원-웨이 ANOVA 및 Tukey의 다중 비교 평가를 사용하여 통계적 유의성을 결정하였다.
결과는 살아있는 및 상청액 분획이 TLR9를 활성화할 수 있었음을 실증한다.
실시예 12 - T 세포 분화
MRx0518이 T-세포 분화를 유도하는 능력을 말초혈 단핵 세포(PBMC, Stemcell, Cat:70025) 상에서 시험관내 탐색하였다. 간략하게, PBMC를 웰 당 50 ㎕ cRPMI 배지(cRPMI는 RPMI 1640(+L-Glut, 21875-034) 2 mM 최종 농도 스톡 200 mM; 10% HI FBS(Gibco life technologies, 10082-147); 50 μM 메르캅토에탄올(Gibco life technologies, 21985-023); 및 1% pen/strep(P4333, 10 ㎎/㎖)을 함유함) 중 400,000/웰로 항-CD3(Ebioscience, 항-CD3 모노클로날 항체(OKT3 클론), 기능적 등급, cat. No. 16-0037-81)과 함께 96-웰 플레이트에 플레이트접종하였다. 이어서 열-사멸 MRx0518(30분 동안 80℃에서 인큐베이션에 의해 제조한 후, 배양을 PBS로 세척하고 적절한 세포 배양 배지 중에 재현탁하고, 생활성 세포수를 플레이트접종에 의해 확인함)을 100 ㎕/웰로, 각 웰에 4,000,000개 첨가하였다.
37℃ 인큐베이터에서 3일 후, 세포를 제거하고, 5시간 동안 PMA-(Sigma, Cat no. P8139), 이오노마이신(Sigma, Cat no. I3909) 및 GolgiSTOP(BD, Cat no 554724)을 함유하는 배지 중에 재현탁하였다. PMA 스톡은 DMSO 중 1 ㎎/㎖이었고 이를 100 ㎍/㎖(각 샘플은 cRPMI 중 50 ng/㎖로 요구됨)로 추가 희석하였고, 이오노마이신 스톡은 DMSO 중 1 mM이었고(cRPMI 중 1 μM을 사용함) GolgiStop 농도는 4 ㎕/6 ㎖로 사용하였다. 상청액을 0.22 ㎛ 필터를 통해 통과시켰고 공동-배양 배지 중에 적절히 희석하였다.
이어서 세포로 유세포측정 염색을 거쳤다:
세척 후, 세포를 실온에서 암소에서 10분 동안 PBS 중 생활성 염료(Viobility 405/520 Miltenyi biotec의 고정형 염료 1 ㎕/샘플) + 인간 Fc 블록, cat. 564219(1 ㎕/샘플)와 함께 인큐베이션하였다. 이어서 표면 항체(각각 2 ㎕) - CD3-APC-Vio 770(Miltenyi, cat. No. 130-113-136), CD4-VioBlue(Miltenyi, cat. No. 130-114-534) 및 CD25-VioBright FITC(Miltenyi, cat. No. 130-113-283)를 실온에서 암소에서 10분 동안 웰에 직접 첨가하였다. 그 후 세포를 PBS 중에 2회 세척하고 300 g/5분/RT에서 회전 침강시켰다.
이어서 eBioscience FoxP3 전사 인자 염색 완충액(cat. No. 00-5523)을 사용하여 세포를 고정하고 투과화하였다. eBioscience 프로토콜에 따라, 1부의 농축 용액 및 3부의 희석제를 사용하여 perm/fix 완충액을 제조하였다. 세포를 RT에서 1 h 동안 고정한 후 1x Perm 세척액 중 2x 세척하고 300 g/5분/RT로 회전 침강시켰다. 하기 세포내 염색 또는 전사 인자 항체를 45분 동안/암소/실온에서 또는 하룻밤 동안(최대 18 h) 냉장고에서 perm 세척액(1x) 중 샘플에 첨가한 후, Perm 세척액(300 ㎕)을 사용하여 항체를 2x 세척하고, PBS(250 ㎕) 중에 재현탁하여 세포측정기 상에서 획득하였다:
Figure pct00026
· 항 IFNγ-PE Vio770 인간 항체(Miltenyi, cat. No. 130-114-025)
· 항 IL10-PE 인간 항체(Miltenyi, cat. No. 130-112-728)
· 항 IL17a-APC 인간 항체(Miltenyi, cat. No. 130-099-202)
· 항 RORyt-PE 인간 항체(Miltenyi, cat. No. 130-103-837)
· 항 Tbet-APC 인간 항체(Miltenyi, cat. No. 130-098-655
· 항-Foxp3 모노클로날 항체(236A/E7), PE-Cy7(ebioscience) cat. No. 25-4777-41
도 20a~b에서 알 수 있듯이, MRx0518의 상청액(SP 518) 및 열-사멸 MRx0518(HK 518)은 모두 분화를 유도하기 위한 사이토카인의 부재 하에서도(no cyto), T 헬퍼 세포 및 세포독성 T 세포 각각의 분화를 유도할 수 있었다.
실시예 13 - MRx0518이 사이토카인 특징부를 유도함
비장세포를 C57BL/6 마우스로부터 단리하고 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 U/㎖ Pen/Strep(Sigma-Aldrich) 및 55 μM β-메르캅토에탄올(Gibco)이 보충된 RPMI1640 중 900,000 세포/웰의 밀도로 96웰 플레이트에 플레이트접종하였다. 세포를 72 hr 동안 상이한 농도의 블랭크 배지(YCFA+) 또는 정지상으로부터의 박테리아 상청액으로 처리하였다. 무세포 상청액을 각각의 시점 후 수집하여 사이토카인 분석을 위해 -80℃에 보관하였다. 사이토카인을 멀티플렉스 procartaplex MO Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/Treg 17plex 키트(Invitrogen)를 사용하여 측정하였다. 미처리 비장세포 또는 10% YCFA 배지 또는 10% MRx0518 박테리아 상청액에 의해 처리된 비장세포의 세포 증식을 도 21f에 도시된 바와 같이, MTT 검정(Millipore)을 사용하여 측정하였다.
살아있는, 성장 중인 MRx0518 박테리아를 인간 내장 상피 세포주 CaCo-2 및 인간 단핵구/대식구 세포주 THP-1과 최대 2 h 동안 인큐베이션하였다. 숙주 반응을 즉시 분석하거나(CaCo-2) 또는 추가 24 h 인큐베이션 후 분석하였다(THP-1).
냉동된 건강한 인간 PBMC를 Stem Cells Technologies(Cambridge UK)로부터 구매하였다. 세포를 해동하고 37℃에서 CO2 인큐베이터에서 전체 성장 배지(10% FBS, 55 μM β-메르캅토에탄올, 2 mM L. 글루타민 및 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 함유 RPMI 1640) 중 하룻밤 동안 휴지하도록 두었다. 실험을 위해, 세포를 48웰 플레이트에 750,000 세포/웰의 밀도로 플레이트접종하고 1 ng/㎖ LPS의 존재 또는 부재 하에 10% 박테리아 상청액 함유 전체 성장 배지 중에 처리하였다. 미처리 웰에는 세포 배양 배지를 첨가하였다. 세포를 72 h 동안 휴지하도록 둔 후, 무세포 상청액을 수집하고 4℃에서 10,000 g로 3분 동안 회전 침강시켰다. 샘플을 사이토카인 분석을 위해 -80℃에 보관하였다. 사이토카인 정량을 제조업체의 권장사항에 따라 ProcartaPlex 멀티플렉스 면역검정(Thermo Fischer Scientific)을 사용하여 수행하였다. 간략하게, 50 ㎕의 무세포 공동-배양 상청액을 xPONENT 소프트웨어(Luminex, Austin, TX, USA)로 MAGPIX® MILLIPLEX® 시스템(Merck)을 사용하여 사이토카인 정량을 위해 사용하였다. 데이터를 5-파라미터 로지스틱 곡선을 사용하여 MILLIPLEX® 애널리스트 소프트웨어(Merck)를 사용해서 분석하고 배경 감산하여 평균 형광 세기를 pg/㎖ 값으로 전환하였다.
데이터를 도 21a~d에 10개의 생물학적 반복물(PBMC) 또는 3개의 생물학적 반복물(비장세포)의 2개의 기술적 대표물의 평균으로 표시하고 YCFA 블랭크 배지("비히클") 또는 MRx0518 박테리아/MRx0518 무세포 박테리아 상청액("MRx0518")으로의 처리 후, (a) PBMC; (b) 비장세포; (c) THP-1 세포; 및 (d) Caco-2 세포에서 사이토카인의 생산을 나타낸다. 도 21e는 비장세포 (N=3)로부터, 미처리("미처리"), YCFA 블랭크 배지로 처리된("10% YCFA") 또는 MRx0518 무세포 박테리아 상청액으로 처리된("10% MRx0518") 세포로부터, 사이토카인 분비에 관한 추가 데이터를 도시한다.
도 21a~d에서 알 수 있듯이, 상이한 세포의 MRx0518 박테리아 상청액으로의 처리로 사이토카인 생산 증가에 의해 자명하듯 면역자극을 일으켰다.
실시예 14 - NF-κB 활성화
NF-κB 유도성 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP) 리포터 유전자를 인간 NOD2 유전자, TLR4, TLR9 또는 TLR5 유전자와 공동 발현하는 HEK293 세포(각각 HEK-Blue™-hNOD2, HEK-Blue™-hTLR5, HEK-Blue™-hTLR9 및 HEK-Blue™-hTLR4 세포, InvivoGen, San Diego, CA, USA)에서 NF-κB 프로모터의 활성화를 평가하였다.
간략하게, HEK-TLR4 세포를 10%(v/v) 열-불활성화 FBS, 4mM L-글루타민, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100 ㎍/㎖ 노르모신, 1x HEK-Blue 분비 배지가 보충된 DMEM 4.5 g/ℓ D-글루코스 중에 유지하였다; HEK-TLR5 및 HEK-TLR9에 있어서는 2 mM L-글루타민의 사용을 제외하고, 동일한 배지를 사용하였다. HEK-TLR5 및 HEK-TLR9를 두 세포주에 대해 각각 30 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖ 블라스티시딘 및 100 ㎍/㎖ 제오신 배지를 사용하여 선택하였다.
실험을 위해, 세포를 PBS로 세척하고, PBS 중에 해리하고, 성장 배지 중에 수집하였다. 세포를 HEK-TLR4 및 HEK-TLR5에 대해 25,000 세포/웰, HEK-TLR9에 대해 80,000 세포/웰 및 HEK-NOD2에 대해 50,000 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 플레이트접종하였다.
이의 리간드에 대한 세포의 반응성을 평가하기 위해, 세포를 1 ng/㎖ LPS(HEK-TLR4), 살모넬라 타이피무리움으로부터의 1 ng/㎕ 초순수 플라겔린(HEK-TLR5), 1 μM ODN2006 CPG(HEK-TLR9 양성 대조군) 또는 1 μM ODN2006 GPC(HEK-TLR9 음성 대조군), 1 ng/㎖의 L18-MDP로 처리하고 37℃에서 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 처리를 37℃ 및 5% CO2에서 22 h 동안 진행한 후, 세포 배양 상청액으로부터의 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP) 활성의 검출을 제조업체의 지침에 따라 QUANTI-blue 용액을 사용하여 수행하였다. 간략하게, 20 ㎕의 세포 배양 배지를 수집하고 200 ㎕의 QUANTI-Blue 검출 배지와 혼합하여 SEAP의 존재에 대해 분석하였다. 37℃에서 2 h(HEK-TLR4 및 HEK-TLR5) 또는 4 h(HEK-TLR9 및 HEK-NOD2) 인큐베이션 후, 광학 밀도를 마이크로플레이트 판독장치(iMark microplate, Bio-Rad) 상에서 655 nm에서 측정하였다.
도 22a~d(3회 독립 실험에 대해 평균낸 기술적 반복물로부터의 데이터를 나타냄)에서 알 수 있듯이, NF-κB 프로모터 활성화를 미처리("미처리"), YCFA+ 배지로 처리된("YCFA") 또는 MRx0518로 처리된("MRx0518") 세포에서 측정하였다. 하기 양성 대조군(1 ng)을 사용하였다 - L18-MDP(HEK-Blue™-hNOD2 세포에 대해, 도 22a), 지질다당류, LPS(HEK-Blue™-hTLR4에 대해, 도 22b), CPG 또는 negC(HEK-Blue™-hTLR9에 대해, 도 22c) 또는 살모넬라 타이피무리움으로부터의 재조합 플라겔린, FLA(HEK-Blue™-hTLR5에 대해, 도 22d). 세포를 22 h 동안 5% CO2 분위기에서 37℃에서 다양한 처리와 함께 인큐베이션하였다. NF-κB 프로모터 활성화를 측정하기 위해(N=3), QUANTI-Blue™(InvivoGen)를 세포 상청액과 혼합하고, 플레이트를 2 h 동안 인큐베이션하고 광학 밀도를 655 nm에서 측정하였다.
서열
서열 번호 1(엔테로코커스 갈리나룸 16S rRNA 유전자-AF039900)
Figure pct00027
Figure pct00028
서열 번호 2(엔테로코커스 갈리나룸 균주 MRx0518에 대한 공통 16S rRNA 서열)
Figure pct00029
서열 번호 3(엔테로코커스 갈리나룸 균주 MRx0554에 대한 16S rRNA 유전자
Figure pct00030
Figure pct00031
참고문헌
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
SEQUENCE LISTING <110> 4D PHARMA RESEARCH LIMITED <120> COMPOSITIONS COMPRISING BACTERIAL STRAINS <130> P075147WO <140> 2019-03-19 <160> 3 <170> SeqWin2010, version 1.0 <210> 1 <211> 1506 <212> DNA <213> Enterococcus gallinarum <400> 1 taatacatgc aagtcgaacg ctttttcttt caccggagct tgctccaccg aaagaaaaag 60 agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccat cagaagggga taacacttgg 120 aaacaggtgc taataccgta taacactatt ttccgcatgg aagaaagttg aaaggcgctt 180 ttgcgtcact gatggatgga cccgcggtgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240 aaggccacga tgcatagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300 cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttcggc aatggacgaa agtctgaccg 360 agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggttttc ggatcgtaaa actctgttgt tagagaagaa 420 caaggatgag agtagaacgt tcatcccttg acggtatcta accagaaagc cacggctaac 480 tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt 540 aaagcgagcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg 600 gtcattggaa actgggagac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca tgtgtagcgg 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1506 <210> 2 <211> 1444 <212> DNA <213> Enterococcus gallinarum strain MRX518 <400> 2 tgctatacat gcagtcgaac gctttttctt tcaccggagc ttgctccacc gaaagaaaaa 60 gagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggt aacctgccca tcagaagggg ataacacttg 120 gaaacaggtg ctaataccgt ataacactat tttccgcatg gaagaaagtt gaaaggcgct 180 tttgcgtcac tgatggatgg acccgcggtg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac 240 caaggccacg atgcatagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300 gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcgg caatggacga aagtctgacc 360 gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggtttt cggatcgtaa aactctgttg ttagagaaga 420 acaaggatga gagtagaacg ttcatccctt gacggtatct aaccagaaag ccacggctaa 480 ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg 540 taaagcgagc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600 ggtcattgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc atgtgtagcg 660 gtgaaatgcg tagatatatg gaggaacacc agtggcgaag gcggctctct ggtctgtaac 720 tgacgctgag gctcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780 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Claims (21)

  1. 대상체에서 면역계를 자극하는 데 사용하기 위한, 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 면역노화를 치료하거나, 예방하거나, 지연하는 데 사용하기 위한 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 백신 보조제로 사용하기 위한 조성물.
  4. 제1항에 있어서, CAR-T와 같은 세포 치료법을 증강시키는 데 사용하기 위한 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12p70, IL-8, IL-1β, IL-6 IL-23 및/또는 TNF-α의 발현 수준 및/또는 활성을 증가시키는 데 사용하기 위한 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, NF-κB의 수준 및/또는 활성을 증가시키는 데 사용하기 위한 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주가 서열번호 2와 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 유전자 서열을 갖거나 상기 박테리아 균주가 서열 번호 2로 나타내는 16s rRNA 유전자 서열을 갖는, 사용하기 위한 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주가 서열번호 3과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 유전자 서열을 갖거나 상기 박테리아 균주가 서열 번호 3으로 나타내는 16s rRNA 유전자 서열을 갖는, 사용하기 위한 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주가 NCIMB에서 접근 번호 42488 하에 기탁된 균주인, 사용하기 위한 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주가 NCIMB에서 접근 번호 42761 하에 기탁된 균주인, 사용하기 위한 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 경구 투여를 위한, 사용하기 위한 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함하는, 사용하기 위한 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 균주가 동결건조된, 사용하기 위한 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 식품.
  15. 엔테로코커스 갈리나룸 종의 박테리아 균주를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 감소된 면역자극과 연관된 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 박테리아 균주 세포를 포함하는 조성물로서, 상기 세포가 하나 이상의 이종성 항원을 발현하는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 세포가 하나 이상의 이종성 항원을 제시하는 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 백신으로 사용하기 위한 조성물.
  19. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 박테리아 균주 세포로서, 상기 세포가 하나 이상의 이종성 항원을 발현하는 세포.
  20. 제19항에 있어서, 상기 세포가 하나 이상의 이종성 항원을 제시하는 세포.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 백신으로 사용하기 위한 세포.
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