CN112004543A - 包含细菌菌株的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含细菌菌株的组合物，所述组合物用于刺激免疫系统以及治疗和预防疾病。

Description

包含细菌菌株的组合物

技术领域

本发明属于包含从哺乳动物消化道分离的细菌菌株的组合物和所述组合物用于治疗疾病、特别是在治疗疾病时用于刺激免疫系统的用途的领域。

发明背景

人类肠道被认为在子宫中是无菌的，但是在出生之后它立即暴露于各种各样的母体和环境微生物。然后，发生动态时间段的微生物定殖和演替，这受到例如以下因素的影响：分娩方式、环境、饮食和宿主基因型，全部这些都影响肠道微生物群的组成，在早期生命期间尤其如此。随后，微生物群稳定化并且变得类似成人[1]。人类肠道微生物群含有超过500-1000种不同的种系型，它们基本上属于两种主要的细菌分类：拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)[2]。由人类肠道的细菌定殖产生的成功的共生关系已产生各种各样的代谢、结构、保护性和其它有益的功能。所定殖肠道的增强的代谢活动确保以其它方式难以消化的膳食组分被降解并释放副产物，从而为宿主提供重要的营养物来源。类似地，肠道微生物群的免疫学重要性是公认的并且在具有在引入共生细菌后在功能上重构的受损免疫系统的无菌动物中示例[3-5]。

微生物群组成的巨大变化在例如炎症性肠病(IBD)的胃肠病症中已有文献记载。举例来说，梭菌(Clostridium)群XIVa细菌的水平在IBD患者中降低，而大肠杆菌(E.coli)的数目增加，表明肠道内共生有机体与致病有机体的平衡的偏移[6-9]。有趣的是，这种微生物生态失调也与T效应细胞群体中的不平衡相关联。

在某些细菌菌株对动物肠道可能具有的潜在正向作用的识别中，已提议多种菌株用于治疗各种疾病(参见例如[10-13])。此外，已提议主要包括乳杆菌(Lactobacillus)和双歧杆菌(Bifidobacterium)菌株的某些菌株用于治疗与肠无直接关联的各种炎症性和自身免疫性疾病(关于评述，参见[14]和[15])。某些链球菌(Streptococcus)和韦荣氏球菌(Veillonella)菌株以及在较小程度上肠球菌(Enterococcus)和乳杆菌菌株已表明具有免疫调节作用，在体外对不同的细胞因子具有不同的作用，这表明用个别菌株在体外获得的数据不太可能充分代表对体内肠道微生物群群落的混合物[88]。然而，不同疾病与不同细菌菌株之间的关系和特定细菌菌株对肠道和在全身水平下以及对任何特定类型的疾病的确切作用缺乏良好表征。

本领域中需要治疗疾病的新方法。也需要待表征的肠道细菌的潜在作用以便可开发使用肠道细菌的新疗法。

发明内容

本发明人已开发了包含鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)菌种的细菌菌株的新组合物，所述组合物可用于刺激免疫系统以及治疗和预防疾病。本发明人已鉴定，鹑鸡肠球菌菌种的菌株可有效地激活免疫系统并且可治疗癌症，这表明它们还可能够治疗免疫系统激活可能有用的其它疾病。

因此，本发明提供了一种包含鹑鸡肠球菌菌种的细菌菌株的组合物，所述组合物用于刺激受试者的免疫系统。

在其它方面，本发明提供了一种包含鹑鸡肠球菌菌种的细菌菌株的组合物，所述组合物用于治疗、预防或延迟免疫衰老。

在其它方面，本发明提供了一种包含鹑鸡肠球菌菌种的细菌菌株的组合物，所述组合物用作疫苗佐剂。

在其它方面，本发明提供了一种包含鹑鸡肠球菌菌种的细菌菌株的组合物，所述组合物用于增强细胞疗法，例如CAR-T。

优选地，用于本发明的细菌是以登录号42488保藏在NCIMB的菌株。

在其它优选的实施方案中，用于本发明的细菌是以登录号42761保藏在NCIMB的菌株。

附图说明

图1A：乳腺癌小鼠模型–肿瘤诱导后肿瘤体积的变化以及指示在每个时间点各两种处理之间的统计学显著性的表格。

图1B：上图：EMT6肿瘤中的坏死面积(未处理n＝6，媒介物n＝6，MRx0518 n＝8)。下图：EMT6肿瘤中分裂细胞的百分比。P＝0.019(未处理n＝4，计数细胞总数＝37201，媒介物n＝6，计数细胞总数＝64297，MRx0518 n＝6，计数细胞总数＝33539)。

图1C：乳腺癌小鼠模型–浸润免疫细胞。散点图代表来自每个处理组的个体动物的不同免疫标志物的细胞计数。

图1D：乳腺癌小鼠模型–肿瘤裂解物中细胞因子的产生。列代表每个处理组中总蛋白的平均pg/mL。使用单因素ANOVA，接着进行Dunnett多重比较检验，各组之间*p<0.05。

图1E：乳腺癌小鼠模型–血浆中细胞因子的产生。列代表每个处理组的平均pg/mL(+/-SEM)。

图1F：用抗CD8α抗体免疫标记(下图)和用DAPI复染(上图)的媒介物、MRx0518和抗CTLA-4处理的小鼠的回肠冷冻切片的代表性图像。

图1G：定量每个视野中有超过3个CD8α+细胞的动物研究子集的图表，所述细胞取自用媒介物、MRx0518或抗CTLA-4处理的小鼠的回肠隐窝区域。

图2：肺癌小鼠模型–肿瘤诱导后肿瘤体积的变化以及指示在每个时间点各两种处理之间的统计学显著性的表格。

图3A：肝癌小鼠模型–肝脏重量。

图3B：肾癌小鼠模型–肿瘤诱导后肿瘤体积的变化以及指示在每个时间点各两种处理之间的统计学显著性的表格。

图4A：未成熟树突状细胞(无细菌)中的细胞因子水平(pg/mLmL)。

图4B：加入LPS后的未成熟树突状细胞的细胞因子水平(pg/mLmL)。

图4C：加入MRx0518MRx0518后的未成熟树突状细胞的细胞因子水平(pg/mLmL)。

图4D：加入MRx0518MRx0518和LPS后的未成熟树突状细胞的细胞因子水平(pg/mLmL)。

图5A：THP-1细胞(无细菌)中的细胞因子水平。

图5B：加入细菌沉积物后的THP-1细胞中的细胞因子水平。

图5C：加入单独或与LPS组合的MRx0518MRx0518后的THP-1细胞中的细胞因子水平。

图6和图7：免疫刺激反应–TNFα

图8：免疫刺激反应–IL-12p70

图9：免疫调节反应–IL-10

图10：免疫刺激反应–IL-8

图11：免疫刺激反应–IL-23

图12：免疫刺激反应–IL-1β

图13：免疫刺激反应–IL-6

图14：作用机制–激活NFκB

图15：作用机制–激活TLR5

图16A：下文所述的实施例8中使用的不同组的处理时间表的示意图。

图16B：带有由EMT-6细胞形成的肿瘤的小鼠中的平均肿瘤体积。小鼠未处理或用YCFA媒介物(媒介物)、YCFA培养基中的MRx0518细菌(MRx0518)、抗CTLA-4抗体和YCFA培养基(抗CTLA-4)或者MRx0518和抗CTLA-4抗体的组合处理。所提供的表格指示在每个时间点各两种处理之间的统计学显著性。

图17：乳腺癌小鼠模型–肿瘤体积。

图18：MRx0554的API 50 CHL概况。

图19：作用机制–在HEK-Blue^TM hTLR9报告基因细胞系中，由MRx0518(MRx0518_LV)、热灭杀的MRx0518(MRx0518_HK)和MRx0518培养上清液(MRx0518_SN)激活TLR9。ODN2006用作阳性对照并且包括YCFA培养基作为MRx0518_SN的阴性对照。条形图表示至少三个生物学重复的平均值。使用GraphPad Prism(普通的单因素ANOVA分析，接着进行Tukey多重比较检验)进行统计分析。与相关对照的统计学显著差异在图表上显示为****(p<0.0001)。

图20A-B：使用热灭杀的MRx0518(HK 518)、来自MRx0518培养物的上清液或RPMI培养基，在不添加细胞因子(无细胞因子)的情况下，诱导(A)T辅助细胞和(B)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)群体中的T细胞分化。*＝p≤0.05；**＝p≤0.01；***＝p≤0.001；****＝p≤0.0001。

图21A-D：(A)PBMC细胞；(B)脾细胞；或(C)THP-1细胞的体外细胞因子产生；所述细胞用YCFA+培养基(“媒介物”)或MRx0518的无细胞细菌上清液(“MRx0518”)处理。图21D显示了用活细菌(“MRx0518”)处理CaCo-2细胞后，相对于未处理的细胞，细胞因子表达的倍数变化。

图21E：从未处理(“未处理”)、用YCFA空白培养基(“10％YCFA”)处理或用MRx0518无细胞细菌上清液(“10％MRx0518”)处理的细胞中脾细胞(N＝3)的体外细胞因子产生。

图21F：如通过MTT测定法测量的从小鼠(N＝4)中提取的脾细胞的活力。细胞未处理(“未处理”)，用YCFA空白培养基(“10％YCFA”)处理或用MRx0518无细胞细菌上清液(“10％MRx0518”)处理。

图22A-D：(A)HEK-Blue^TM-hNOD2细胞；(B)HEK-Blue^TM-hTLR4细胞；(C)HEK-Blue^TM-hTLR9细胞或(D)HEK-Blue^TM-hTLR5细胞中的NF-κB启动子激活。细胞未处理，用YCFA培养基(“YCFA”)处理，用MRx0518(“MRx0518”)处理或用阳性对照处理。

图23：代表用YCFA媒介物(“媒介物”)或MRx0518(“MRx0518”)处理后EMT6肿瘤微环境的NanoString分析的热图。

具体实施方式

细菌菌株

本发明的组合物包含鹑鸡肠球菌菌种的细菌菌株。实施例表明，该属细菌可用于刺激免疫系统和用于治疗疾病。

鹑鸡肠球菌形成球状细胞，大多数成对或短链。它是能动的并且血琼脂或营养琼脂上的菌落是圆形且光滑的。鹑鸡肠球菌与兰斯菲尔德(Lancefield)D组抗血清反应。鹑鸡肠球菌的类型菌株为F87/276＝PB21＝ATCC 49573＝CCUG 18658＝CIP 103013＝JCM 8728＝LMG 13129＝NBRC 100675＝NCIMB 702313(以前称为NCDO 2313)＝NCTC 12359[16]。鹑鸡肠球菌的16S rRNA基因序列的GenBank登录号为AF039900(在本文公开为SEQ ID NO:1)。示例性鹑鸡肠球菌菌株描述于[16]中。

在实施例中测试了以登录号NCIMB 42488保藏的鹑鸡肠球菌细菌，并且在本文中也称为菌株MRx0518。对MRx0518的引用和MRx0518可互换使用。以SEQ ID NO:2提供了所测试的MRx0518菌株的16S rRNA序列。菌株MRx0518由4D Pharma Research Ltd.(LifeSciences Innovation Building,Aberdeen,AB25 2ZS,Scotland)于2015年11月16日以“肠球菌属”保藏在国际保藏机构NCIMB,Ltd.(Ferguson Building,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland)并被指定登录号NCIMB 42488。

菌株MRx0518的基因组包含染色体和质粒。菌株MRx0518的染色体序列以WO2017/085520的SEQ ID NO:3提供。菌株MRx0518的质粒序列以WO2017/085520的SEQ ID NO:4提供。这些序列是使用PacBio RS II平台生成的。

在实施例中也测试了以登录号NCIMB 42761保藏的鹑鸡肠球菌细菌，并且在本文中也称为菌株MRx0554。对MRx0554的引用和MRx0554可互换使用。菌株MRx0554由4D PharmaResearch Ltd.(Life Sciences Innovation Building,Aberdeen,AB25 2ZS,Scotland)于2017年5月22日以“鹑鸡肠球菌MRx0554”保藏在国际保藏机构NCIMB,Ltd.(FergusonBuilding,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland)并被指定登录号NCIMB 42761。该细菌的基因组序列在本文中公开为WO2018/215782的SEQ ID NO:2。基因组序列由多个重叠群装配。序列中的N代表重叠群之间的缺口。“N”可代表A、G、C或T核苷酸。MRx0554菌株的16S rRNA基因序列以SEQ ID NO:3提供。SEQ ID NO:3代表装配体中存在的全长序列，而不是MRx0554中存在的五个16S基因的共有序列。

与实施例中测试的菌株密切相关的细菌菌株也预期可有效刺激免疫系统。在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与SEQ ID NO:1或2具至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16s rRNA基因序列。优选地，序列同一性是与SEQ ID NO:2的序列同一性。优选地，用于本发明的细菌菌株具有由SEQ ID NO:2表示的16s rRNA基因序列。在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与SEQ ID NO:3具至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16s rRNA基因序列。

预期具有以登录号42488保藏的细菌的生物型的细菌菌株也可有效刺激免疫系统。生物型是具有相同或非常相似的生理和生化特征的密切相关的菌株。

可通过对以登录号NCIMB 42488保藏的细菌的其它核苷酸序列进行测序来鉴定具有以登录号NCIMB 42488保藏的细菌的生物型并且适用于本发明的菌株。例如，可对基本上整个基因组进行测序并且用于本发明的生物型菌株可在其整个基因组的至少80％上(例如，至少85％、90％、95％或99％上，或其整个基因组上)具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性。例如，在一些实施方案中，生物型菌株在其基因组的至少98％上具有至少98％的序列同一性，或在其基因组的99％上具有至少99％的序列同一性。用于鉴定生物型菌株的其它合适的序列可包括hsp60或重复序列，例如BOX、ERIC、(GTG)₅或REP或[17]。生物型菌株可具有与以登录号NCIMB 42488保藏的细菌的相应序列具至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列。在一些实施方案中，生物型菌株具有与以NCIMB 42488保藏的菌株MRx0518的相应序列具至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列，并且包含与SEQ ID NO:2具有至少99％同一性(例如至少99.5％或至少99.9％同一性)的16S rRNA基因序列。在一些实施方案中，生物型菌株具有与以NCIMB 42488保藏的菌株MRx0518的相应序列具至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列，并且具有SEQ ID NO:2的16S rRNA序列。

在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具序列同一性的染色体。在优选的实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的至少60％(例如至少65％、70％、75％、80％、85％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)上与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具至少90％序列同一性(例如至少92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的染色体。例如，用于本发明的细菌菌株可具有这样的染色体，所述染色体在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的70％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQID NO:3的80％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的90％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的100％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的70％上与WO2017/085520的SEQID NO:3具有至少95％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的80％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的90％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的100％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的70％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具有至少98％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的80％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具有至少98％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的90％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具有至少98％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的95％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具有至少98％同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的100％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具有至少98％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的90％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具有至少99.5％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的95％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具有至少99.5％同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的98％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具有至少99.5％同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的100％上与WO2017/085520的SEQID NO:3具有至少99.5％序列同一性。

在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与WO2017/085520的SEQ ID NO:4具序列同一性的质粒。在优选的实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有在WO2017/085520的SEQ ID NO:4的至少60％(例如至少65％、70％、75％、80％、85％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)上与WO2017/085520的SEQ ID NO:4具至少90％序列同一性(例如至少92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的质粒。例如，用于本发明的细菌菌株可具有这样的质粒，所述质粒在WO2017/085520的SEQ ID NO:4的70％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:4的80％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:4的90％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:4的100％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:4具有至少90％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:4的70％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:4具有至少95％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:4的80％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:4具有至少95％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:4的90％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:4具有至少95％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ IDNO:4的100％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:4具有至少95％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:4的70％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:4具有至少98％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:4的80％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:4具有至少98％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:4的90％上与WO2017/085520的SEQ IDNO:4具有至少98％序列同一性，或在WO2017/085520的SEQ ID NO:4的100％上与WO2017/085520的SEQ ID NO:4具有至少98％序列同一性。

在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具序列同一性的染色体和与WO2017/085520的SEQ ID NO:4具序列同一性的质粒。

在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与例如如上所述的WO2017/085520的SEQ ID NO:3具序列同一性的染色体，和与例如如上所述的SEQ ID NO:1或2中的任一者具序列同一性的16S rRNA序列，优选地具有与SEQ ID NO:2具至少99％同一性的16srRNA序列，更优选地其包含SEQ ID NO:2的16S rRNA序列，并且任选地包含与如上所述的WO2017/085520的SEQ ID NO:4具序列同一性的质粒。

在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与例如如上所述的WO2017/085520的SEQ ID NO:3具序列同一性的染色体，并且任选地包含与如上所述的WO2017/085520的SEQ ID NO:4具序列同一性的质粒，并且其可有效地刺激免疫系统。

在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与例如如上所述的WO2017/085520的SEQ ID NO:3具序列同一性的染色体，和与例如如上所述的SEQ ID NO:1或2中的任一者具序列同一性的16S rRNA序列，并且任选地包含与如上所述的WO2017/085520的SEQID NO:4具序列同一性的质粒，并且其可有效地刺激免疫系统。

在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与由SEQ ID NO:2表示的16srRNA序列具至少99％、99.5％或99.9％同一性的16s rRNA序列(例如，其包含SEQ ID NO:2的16S rRNA序列)和在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的至少90％上与WO2017/085520的SEQID NO:3具至少95％序列同一性的染色体，并且任选地包含与如上所述的WO2017/085520的SEQ ID NO:4具序列同一性的质粒，并且其可有效地刺激免疫系统。

在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与由SEQ ID NO:2表示的16srRNA基因序列具至少99％、99.5％或99.9％同一性的16s rRNA序列(例如，其包含SEQ IDNO:2的16S rRNA序列)和在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的至少98％上(例如在至少99％或至少99.5％上)与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具至少98％序列同一性(例如至少99％或至少99.5％序列同一性)的染色体，并且任选地包含与如上所述的WO2017/085520的SEQID NO:4具序列同一性的质粒，并且其可有效地刺激免疫系统。

在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株是鹑鸡肠球菌并且具有与由SEQ IDNO:2表示的16s rRNA序列具至少99％、99.5％或99.9％同一性的16s rRNA序列(例如，其包含SEQ ID NO:2的16S rRNA序列)和在WO2017/085520的SEQ ID NO:3的至少98％上(例如在至少99％或至少99.5％上)与WO2017/085520的SEQ ID NO:3具至少98％序列同一性(例如至少99％或至少99.5％序列同一性)的染色体，并且任选地包含与如上所述的WO2017/085520的SEQ ID NO:4具序列同一性的质粒，并且其可有效地刺激免疫系统。

或者，可通过使用登录号NCIMB 42488保藏和限制性片段分析和/或PCR分析，例如通过使用荧光扩增片段长度多态性(FAFLP)和重复性DNA元件(rep)-PCR指纹图谱或蛋白质谱分析，或部分16S或23s rDNA测序，来鉴定具有以登录号NCIMB 42488保藏的细菌的生物型并且适用于本发明的菌株。在优选的实施方案中，这样的技术可用于鉴定其它鹑鸡肠球菌菌株。

在某些实施方案中，当通过扩增核糖体DNA限制性分析(ARDRA)进行分析时，例如当使用Sau3AI限制性酶时(关于示例性方法和指南，参见例如[18])，具有以登录号NCIMB42488保藏的细菌的生物型并且适用于本发明的菌株是提供与以登录号NCIMB 42488保藏的细菌相同的模式的菌株。或者，生物型菌株被鉴定为具有与以登录号NCIMB 42488保藏的细菌相同的碳水化合物发酵模式的菌株。在一些实施方案中，使用API 50 CHL图(bioMérieux)确定碳水化合物发酵模式。在一些实施方案中，本发明中使用的细菌菌株：

(i)对以下中的至少一种(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17种或全部)的发酵呈阳性：L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙酰葡糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、水杨苷、D-纤维二糖、D-麦芽糖、蔗糖、D-海藻糖、龙胆二糖、D-塔格糖和葡萄糖酸钾；和/或

(ii)为以下中的至少一种(例如至少2、3、4种或全部)的发酵的中间体：D-甘露糖醇、甲基-αD-吡喃葡糖苷、D-乳糖、淀粉和L-岩藻糖；

优选地如通过API 50 CHL分析(优选地使用来自bioMérieux的API 50 CHL图)所确定。

可使用任何适当的方法或策略，包括实施例中描述的测定法，来鉴定可用于本发明的组合物和方法中的其它鹑鸡肠球菌菌株，例如以登录号NCIMB 42488保藏的细菌的生物型。例如，如实施例中所进行的，可通过评估它们对细胞因子水平的作用来鉴定用于本发明的菌株。特别地，与以登录号NCIMB 42488保藏的细菌具有相似的生长模式、代谢类型和/或表面抗原的细菌菌株可用于本发明。有用的菌株将具有与NCIMB 42488菌株类似的免疫调节活性。特别地，生物型菌株将在癌症疾病模型上引起与实施例中所示的作用类似的作用，这可通过使用实施例中所述的培养和施用方案来鉴定。根据一些实施方案，可在本发明中使用的生物型菌株是当在本发明的方法中施用时能够引起对实施例中所示的癌症疾病模型的类似作用的菌株。

在一些实施方案中，本发明中使用的细菌菌株：

(i)对以下中的至少一种(例如至少2、3、4、5、6、7种或全部)呈阳性：甘露糖发酵、谷氨酸脱羧酶、精氨酸芳酰胺酶、苯丙氨酸芳酰胺酶、焦谷氨酸芳酰胺酶、酪氨酸芳酰胺酶、组氨酸芳酰胺酶和丝氨酸芳酰胺酶；和/或

(ii)为以下中的至少一种(例如至少2种或全部)的中间体：β-半乳糖苷酶-6-磷酸、β-葡萄糖苷酶和N-乙酰基-β-氨基葡糖苷酶；和/或

(iii)对以下中的至少一种(例如至少2、3、4、5、6种或全部)呈阴性：棉子糖发酵、脯氨酸芳酰胺酶、亮氨酰甘氨酸芳酰胺酶、亮氨酸芳酰胺酶、丙氨酸芳酰胺酶、甘氨酸芳酰胺酶和谷氨酰谷氨酸芳酰胺酶，

优选地如通过碳水化合物、氨基酸和硝酸盐代谢的测定以及任选地碱性磷酸酶活性的测定所确定，更优选地如通过Rapid ID 32A分析(优选地使用来自bioMérieux的RapidID 32A系统)所确定。

在一些实施方案中，本发明中使用的细菌菌株：

(i)对以下中的至少一种(例如至少2、3种或全部4种)呈阴性：甘氨酸芳酰胺酶、棉子糖发酵、脯氨酸芳酰胺酶和亮氨酸芳酰胺酶，例如，如通过碳水化合物、氨基酸和硝酸盐代谢所确定，优选地如通过Rapid ID 32A分析(优选地使用来自bioMérieux的Rapid ID32A系统)所确定；和/或

(ii)对L-岩藻糖的发酵呈阳性的中间体，优选地如通过API 50CHL分析(优选地使用来自bioMérieux的API 50 CHL图)所确定。

在一些实施方案中，用于本发明中的细菌菌株是细胞外ATP产生者，例如如使用ATP测定试剂盒(Sigma-Aldrich,MAK190)所测量产生6-6.7ng/μl(例如6.1-6.6ng/μl或6.2-6.5ng/μl或6.33±0.10ng/μl)的ATP的细菌菌株。细菌细胞外ATP可具有多效性作用，包括激活T细胞受体介导的信号转导(Schenk等,2011)，促进肠道Th17细胞分化(Atarashi等,2008)以及通过激活NLRP3炎性体来诱导促炎性介体IL-1β的分泌(Karmarkar等,2016)。因此，在本发明方法的背景下，作为细胞外ATP产生者的细菌菌株可用于刺激免疫系统。

在一些实施方案中，用于本发明的细菌菌株包含以下三种基因中的一个或多个：移动元件蛋白；木糖ABC转运蛋白，通透酶成分；以及FIG00632333：假设蛋白。例如，在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株包含编码以下的基因：移动元件蛋白和木糖ABC转运蛋白(通透酶成分)；移动元件蛋白和FIG00632333(假设蛋白)；木糖ABC转运蛋白(通透酶成分)和FIG00632333(假设蛋白)；或移动元件蛋白、木糖ABC转运蛋白(通透酶成分)和FIG00632333(假设蛋白)。

本发明的特别优选的菌株是以登录号NCIMB 42488保藏的鹑鸡肠球菌菌株。这是在实施例中测试并显示可有效治疗疾病的示例性MRx0518菌株。根据一些实施方案，本发明提供了作为本发明一部分的细菌组合物，所述细菌组合物包含以登录号NCIMB 42488保藏的鹑鸡肠球菌菌株的细胞或其衍生物。以登录号NCIMB 42488保藏的菌株的衍生物可以是子代菌株(后代)或从原始菌株培养(亚克隆)的菌株。

可例如在遗传水平上修饰本发明中包含的组合物的菌株的衍生物，而不会减弱生物活性。特别地，本发明的衍生菌株具有治疗活性。衍生菌株将具有与原始NCIMB 42488菌株类似的免疫调节活性。特别地，当可通过使用实施例中描述的培养和施用方案来鉴定时，衍生菌株将对癌症疾病模型产生类似的作用。NCIMB 42488菌株的衍生物通常是NCIMB42488菌株的生物型。

对以登录号NCIMB 42488保藏的鹑鸡肠球菌菌株的细胞的引用涵盖具有与以登录号NCIMB 42488保藏的菌株相同的安全性和治疗功效特征的任何细胞，并且此类细胞由本发明所涵盖。因此，在一些实施方案中，对以登录号NCIMB 42488保藏的鹑鸡肠球菌菌株的细胞的引用仅指以NCIMB 42488保藏的MRx0518菌株，而不是指未在NCIMB 42488下保藏的细菌菌株。在一些实施方案中，对以登录号NCIMB 42488保藏的鹑鸡肠球菌菌株的细胞的引用是指具有与以登录号NCIMB 42488保藏的菌株相同的安全性和治疗功效特征的细胞，而不是以NCIMB 42488保藏的菌株。

具有以登录号42761保藏的细菌的生物型的细菌菌株也预期可有效地刺激免疫系统。生物型是具有相同或非常相似的生理和生化特征的密切相关的菌株。

可通过对以登录号NCIMB 42761保藏的细菌的其它核苷酸序列进行测序，来鉴定具有以登录号NCIMB 42761保藏的细菌的生物型并且适用于本发明的菌株。例如，基本上整个基因组可被测序并且用于本发明的生物型菌株可在其整个基因组的至少80％上(例如在至少85％、90％、95％或99％上，或在其整个基因组上)具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性。例如，在一些实施方案中，生物型菌株在其基因组的至少98％上具有至少98％序列同一性，或在其基因组的至少99％上具有至少99％序列同一性。用于鉴定生物型菌株的其它合适的序列可包括hsp60或重复序列，例如BOX、ERIC、(GTG)₅或REP或[19]。生物型菌株可具有与以登录号NCIMB 42761保藏的细菌的相应序列具至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列。在一些实施方案中，生物型菌株具有与以NCIMB 42761保藏的菌株MRx0554的相应序列具至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列。在一些实施方案中，生物型菌株具有与以NCIMB 42761保藏的菌株MRx0554的相应序列具至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列并且具有与SEQ ID NO:3具至少99％同一性(例如至少99.5％或至少99.9％同一性)的16S rRNA基因序列。在一些实施方案中，生物型菌株具有与以NCIMB42761保藏的菌株MRx0554的相应序列具至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列同一性的序列并且具有SEQ ID NO:3的16S rRNA基因序列。

或者，可通过使用登录号NCIMB 42761保藏和限制性片段分析和/或PCR分析，例如通过使用荧光扩增片段长度多态性(FAFLP)和重复DNA元件(rep)-PCR指纹图谱或蛋白质谱分析，或部分16S或23s rDNA测序，来鉴定具有以登录号NCIMB 42761保藏的细菌的生物型并且适用于本发明的菌株。

在某些实施方案中，具有以登录号NCIMB 42761保藏的细菌的生物型并且适用于本发明的菌株是当通过扩增核糖体DNA限制性分析(ARDRA)进行分析时，例如当使用Sau3AI限制性酶时(关于示例性方法和指南，参见例如[20])，提供与以登录号NCIMB 42761保藏的细菌相同的模式的菌株。或者，将生物型菌株鉴定为具有与以登录号NCIMB 42761保藏的细菌相同的碳水化合物发酵模式的菌株。在一些实施方案中，使用API 50 CHL图(bioMérieux)确定碳水化合物发酵模式。在一些实施方案中，本发明中使用的细菌菌株：

(iii)对以下中的至少一种(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17种或全部)的发酵呈阳性：L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙酰葡糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、水杨苷、D-纤维二糖、D-麦芽糖、蔗糖、D-海藻糖、龙胆二糖、D-塔格糖和葡萄糖酸钾；和/或

(iv)为以下中的至少一种(例如至少2、3、4种或全部)的发酵的中间体：D-甘露糖醇、甲基-αD-吡喃葡糖苷、D-乳糖、淀粉和L-岩藻糖；

优选地如通过API 50 CHL分析(优选地使用来自bioMérieux的API 50 CHL图)所确定。

在一些实施方案中，本发明中使用的细菌菌株：

(i)对以下中的至少一种(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18种或全部)的发酵呈阳性：L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙酰葡糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、水杨苷、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-蔗糖(蔗糖)、D-海藻糖、龙胆二糖、D-塔格糖和葡萄糖酸钾；

(ii)为以下中的至少一种(例如至少2、3、4、5种或全部)的发酵的中间体：D-甘露糖醇、甲基-αD-吡喃葡糖苷、D-乳糖、D-棉子糖、淀粉(amidon/starch)和D-松二糖；和/或

(iii)对以下中的至少一种(例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23种或全部)的发酵呈阴性：甘油、赤藓糖醇、D-阿拉伯糖、L-木糖、D-己糖醇、甲基-βD-木糖吡喃糖苷、L-山梨糖、L-鼠李糖、半乳糖醇、肌醇、D-山梨糖醇、甲基-αD-甘露吡喃糖苷、D-蜜二糖、菊粉、D-松三糖、糖原、木糖醇、D-来苏糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、2-酮葡萄糖酸钾和5-酮葡萄糖酸钾；

优选地如通过API 50 CHL分析(优选地使用来自bioMérieux的API 50 CHL图，并且优选地使用实施例10中所述的条件)所确定。

可使用任何适当的方法或策略，包括实施例中描述的测定，来鉴定可用于本发明的组合物和方法中的其它鹑鸡肠球菌菌株，例如以登录号NCIMB 42761保藏的细菌的生物型。例如，可通过在厌氧YCFA中培养和/或将细菌施用于II型胶原诱导的关节炎小鼠模型中，然后评估细胞因子水平来鉴定用于本发明的菌株。特别地，与以登录号NCIMB 42761保藏的细菌具有相似的生长模式、代谢类型和/或表面抗原的细菌菌株可用于本发明。有用的菌株将具有与NCIMB 42761菌株类似的免疫调节活性。特别地，生物型菌株将在癌症疾病模型上引起与实施例中所示的作用类似的作用，这可通过使用实施例中所述的培养和施用方案来鉴定。

本发明的菌株的衍生物可例如在遗传水平上被修饰，而不减弱生物学活性。特别地，本发明的衍生菌株具有治疗活性。衍生菌株将具有与原始NCIMB 42761菌株类似的免疫调节活性。特别地，衍生菌株将在癌症疾病模型上引起与实施例中所示的作用类似的作用，这可通过使用实施例中所述的培养和施用方案来鉴定。NCIMB 42761菌株的衍生物通常是NCIMB 42761菌株的生物型。

对以登录号NCIMB 42761保藏的鹑鸡肠球菌菌株的细胞的引用涵盖具有与以登录号NCIMB 42761保藏的菌株相同的安全性和治疗功效特征的任何细胞，并且此类细胞由本发明所涵盖。因此，在一些实施方案中，对以登录号NCIMB 42761保藏的鹑鸡肠球菌菌株的细胞的引用仅指以NCIMB 42761保藏的MRx0554菌株，而不是指未在NCIMB 42761下保藏的细菌菌株。

在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与WO2018/215782的SEQ ID NO:2具序列同一性的基因组。在一些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的至少60％上(例如在至少65％、70％、75％、80％、85％、95％、96％、97％、98％、99％或100％上)与WO2018/215782的SEQ ID NO:2具至少90％序列同一性(例如至少92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性)的基因组。例如，用于本发明的细菌菌株可具有这样的基因组，所述基因组在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的70％上与WO2018/215782的SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性，或在WO2018/215782的SEQ IDNO:2的80％上与WO2018/215782的SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性，或在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的90％上与WO2018/215782的SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性，或在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的100％上与WO2018/215782的SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性，或在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的70％上与WO2018/215782的SEQID NO:2具有至少95％序列同一性，或在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的80％上与WO2018/215782的SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性，或在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的90％上与WO2018/215782的SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性，或在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的100％上与WO2018/215782的SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性，或在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的70％上与WO2018/215782的SEQ ID NO:2具有至少98％序列同一性，或在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的80％上与WO2018/215782的SEQ ID NO:2具有至少98％序列同一性，或在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的90％上与WO2018/215782的SEQ ID NO:2具有至少98％序列同一性，或在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的95％上具有至少98％同一性，或在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的100％上与WO2018/215782的SEQ IDNO:2具有至少98％序列同一性，或在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的90％上与WO2018/215782的SEQ ID NO:2具有至少99.5％序列同一性，或在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的95％上具有至少99.5％同一性，或在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的98％上具有至少99.5％同一性，或在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的100％上与WO2018/215782的SEQ IDNO:2具有至少99.5％序列同一性。

在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与例如如上所述的WO2018/215782的SEQ ID NO:2具序列同一性的基因组，和与例如如上所述的SEQ ID NO:1或3具序列同一性的16S rRNA基因序列，优选地具有与SEQ ID NO:3具至少99％同一性的16S rRNA基因序列，更优选地其包含SEQ ID NO:3的16S rRNA基因序列。

在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与例如如上所述的WO2018/215782的SEQ ID NO:2具序列同一性的基因组，并且其可有效地刺激免疫系统。

在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与例如如上所述的WO2018/215782的SEQ ID NO:2具序列同一性的基因组，和与例如如上所述的SEQ ID NO:1或3具序列同一性的16S rRNA基因序列，并且其可有效地刺激免疫系统。

在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与由SEQ ID NO:3表示的16SrRNA基因序列具有至少99％、99.5％或99.9％同一性的16S rRNA基因序列(例如，其包含SEQ ID NO:3的16S基因rRNA序列)和在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的至少90％上与WO2018/215782的SEQ ID NO:2具有至少95％序列同一性的基因组，并且其可有效地刺激免疫系统。

在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株是鹑鸡肠球菌并且具有与由SEQ IDNO:3表示的16S rRNA基因序列具有至少99％、99.5％或99.9％同一性的16S rRNA基因序列(例如，其包含SEQ ID NO:3的16S rRNA基因序列)和在WO2018/215782的SEQ ID NO:2的至少98％上(例如在至少99％或至少99.5％上)与WO2018/215782的SEQ ID NO:2具有至少98％序列同一性(例如至少99％或至少99.5％序列同一性)的基因组，并且其可有效地刺激免疫系统。

在优选的实施方案中，本发明组合物中的细菌菌株是活的并且能够部分或全部定殖于肠道。

在本发明的每个实施方案的替代方面，本发明组合物中的细菌菌株是酪黄肠球菌(Enterococcus caselliflavus)菌种。酪黄肠球菌与鹑鸡肠球菌高度相似并且也具有鞭毛。

治疗用途

刺激免疫系统

实施例表明本发明的组合物的施用可导致免疫刺激。由于本发明的组合物的施用显示具有免疫刺激作用，因此本发明的组合物可用于治疗疾病，特别是以降低的免疫激活为特征的疾病和可由增加的免疫反应治疗的疾病。在某些实施方案中，本发明的组合物用于刺激免疫系统。在某些实施方案中，本发明的组合物用于通过刺激免疫系统来治疗疾病。在某些实施方案中，本发明的组合物用于促进免疫反应。

本发明的组合物可用于治疗以细胞群体中Treg的百分比增加为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物可用于治疗或预防以细胞群体中Treg的百分比增加为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物可用于治疗或预防以细胞群体中CD4+CD25+CD127-细胞的百分比增加为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过降低细胞群体中Treg的百分比来治疗或预防疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于减少Treg对免疫反应的抑制。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过Treg的选择性降低来刺激免疫反应。在一个实施方案中，本发明的组合物用于免疫刺激，其中本发明的组合物减少Treg的数目或百分比。

本发明的组合物可用于治疗以CD8/Treg和/或活化的CD8/Treg细胞的比率降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以CD8/Treg细胞的比率降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以活化的CD8/Treg细胞的比率降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加CD8/Treg细胞的比率来刺激免疫反应。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加活化的CD8/Treg细胞的比率来刺激免疫反应。

本发明的组合物可用于治疗以B细胞的数目或百分比减少为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以B细胞的数目或百分比减少为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以CD19⁺CD3-细胞的数目或百分比减少为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加细胞群体中B细胞的数目或百分比来治疗或预防疾病，其中B细胞的数目或百分比的增加引起免疫刺激。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加B细胞的数目或百分比来刺激免疫反应。

本发明的组合物可用于治疗以CD8 T细胞毒性细胞的数目或百分比减少为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以CD8 T细胞毒性细胞的数目或百分比减少为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加细胞群体中CD8 T细胞毒性细胞的数目或百分比来治疗或预防疾病，其中CD8 T细胞毒性细胞的数目或百分比的增加引起免疫刺激。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加CD8 T细胞毒性细胞的数目或百分比来刺激免疫反应。

本发明的组合物可用于治疗以CD8⁺活化细胞的数目或百分比减少为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以CD8⁺活化细胞的数目或百分比减少为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加细胞群体中CD8⁺活化细胞的数目或百分比来治疗或预防疾病，其中CD8⁺活化细胞的数目或百分比的增加引起免疫刺激。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加CD8⁺活化细胞的数目或百分比来刺激免疫反应。

实施例表明本发明的组合物的施用可导致例如促炎性细胞因子的促炎性分子的表达增加。在施用本发明的组合物后显示表达水平增加的促炎性分子的实例包括IL-8、IL-12p70、IL-23、TNF-α、IL-1β和IL-6。由于本发明的组合物的施用显示增加促炎性分子的表达，因此本发明的组合物可用于治疗以例如促炎性细胞因子的促炎性分子的表达降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以促炎性分子的表达和/或活性降低为特征的疾病，特别是以促炎性细胞因子的表达和/或活性降低为特征的疾病。在一个特定的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以IL-8、IL-12p70、IL-23、TNF-α、IL-1β和/或IL-6的表达和/或活性降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加IL-23、TNF-α、IL-1β和/或IL-6的表达和/或活性来治疗或预防疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加IL-8、IL-12p70、IL-23、TNF-α、IL-1β和/或IL-6的表达和/或活性来促进免疫反应。

实施例还表明本发明的组合物的施用可导致IL-1β的表达增加。IL-1β是促炎性细胞因子[21]。IL-1β的产生和分泌由炎性体调控，所述炎性体是与发炎反应的激活相关联的蛋白质复合物[22]。由于本发明的组合物的施用显示增加IL-1β的表达，因此本发明的组合物可用于治疗以IL-1β的表达降低为特征的疾病。在一个特定的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以IL-1β的表达和/或活性降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加IL-1β的表达和/或活性来治疗或预防疾病。

实施例还表明本发明的组合物的施用可导致IL-23的表达增加。IL-23已与炎症相关联[23、24]。所提出的IL-23在免疫反应中的功能包括促进CD4⁺记忆T细胞的增殖和促进由树突状细胞(DC)分泌IFN-γ[25]。由于本发明的组合物的施用显示增加IL-23的表达，因此本发明的组合物可用于治疗以IL-23的表达降低为特征的疾病。在一个特定的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以IL-23的表达和/或活性降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加IL-23的表达和/或活性来治疗或预防疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加IL-23的表达和/或活性来促进免疫反应。

实施例表明本发明的组合物的施用可导致肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达增加。TNF-α是已知涉及于各种信号通路中以促进细胞死亡的促炎性细胞因子。TNF-α通过结合至其同源受体TNFR-1来起始凋亡，这引起凋亡途径中的裂解事件级联[26]。TNF-α也可经由RIP激酶依赖性机制来触发坏死[27]。由于本发明的组合物的施用显示增加TNF-α表达，因此本发明的组合物可用于治疗疾病，特别是用于治疗或预防以TNF-α的表达降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗以降低的TNF-α表达为特征的疾病。在一个特定的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以TNF-α的表达和/或活性降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物可用于通过增加TNF-α的表达和/或活性来治疗或预防疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加TNF-α的表达和/或活性来促进免疫反应。

实施例还表明本发明的组合物的施用可导致IL-6的表达增加。IL-6是一种促炎性细胞因子，其在炎症期间产生，并促进初始CD4⁺T细胞分化和CD8⁺T细胞分化成细胞毒性T细胞[28]。由于本发明的组合物的施用显示增加IL-6的表达，因此本发明的组合物可用于治疗以IL-6的表达降低为特征的疾病。在一个特定的实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防以IL-6的表达和/或活性降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加IL-6的表达和/或活性来治疗或预防疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加IL-6的表达和/或活性来促进免疫反应。

Bettelli等[29]报道IL-6抑制Treg的扩增。由于实施例表明本发明的组合物增加IL-6的表达，因此本发明的组合物可通过增加IL-6的表达来选择性地减少Treg的数目或百分比。在一个实施方案中，本发明的组合物通过增加IL-6的表达用于免疫刺激。在另一个实施方案中，本发明的组合物通过减少Treg的数目或百分比用于免疫刺激。

在一些实施方案中，根据本发明的刺激免疫系统包括TLR5激活或TLR5激活的上调。在一些实施方案中，根据本发明的刺激免疫系统包括TLR9激活或TLR9激活的上调。在一些实施方案中，根据本发明的刺激免疫系统包括TLR5和TLR9的激活或TLR9和TLR5的激活的上调。在一些实施方案中，根据本发明的刺激免疫系统包括诱导和/或上调T细胞(例如但不限于T辅助细胞和T细胞毒性细胞)的分化。

TLR信号通路最终导致转录因子核因子-κB(NF-κB)的激活。NF-κB控制一系列炎性细胞因子基因(包括TNF-α)的表达。免疫刺激会引起例如TLR5的二聚化，其随后招募MyD88并激活蛋白激酶，包括IRAK1、IRAK2、IRAK4和IRAK-M。这些激酶的激活导致NF-κB的核定位，NF-κB是一种促炎性细胞因子[30]。

如实施例中所示，本发明的组合物导致NF-κB表达的增加。由于施用本发明的组合物可增加促炎性细胞因子NF-κB的表达，因此本发明的组合物可用于刺激免疫反应。另外，本发明的组合物可用于治疗疾病，特别是以免疫激活降低为特征的疾病和/或可通过增强的免疫反应治疗的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物通过增加NF-κB的水平和/或活性而用作免疫刺激剂。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加NF-κB的水平和/或活性来治疗以免疫激活降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加NF-κB的水平和/或活性来治疗可通过增加的免疫反应治疗的疾病。

特别地，本发明的组合物可用于治疗以NF-κB的表达和/或激活降低为特征的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗以NF-κB的表达和/或激活降低为特征的疾病。

NF-κB的激活对于引发先天性免疫反应和随后的适应性免疫反应的发展很重要。因此，TLR的激动剂，例如本发明的组合物，可能通过促进先天性和适应性免疫反应而用作治疗感染性疾病、过敏症和肿瘤的佐剂[30]。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗感染性疾病、过敏症和/或肿瘤。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加NF-κB的水平和/或活性来治疗感染性疾病、过敏症和/或肿瘤。

实施例还表明本发明的组合物促进了T辅助细胞和细胞毒性T淋巴细胞的分化。因此，在某些实施方案中，本发明的组合物用于刺激T辅助细胞和/或细胞毒性T淋巴细胞的分化。

在某些实施方案中，用本发明的组合物治疗的疾病并非癌症。

用作疫苗佐剂

实施例表明，施用本发明的组合物可导致肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达增加。已知TNF-α对于疫苗反应很重要。例如，已表明在老年人群的流感疫苗接种中，TNF-α是有效疫苗反应所必需的[31]。由于施用本发明的组合物显示增加TNF-α表达，因此本发明的组合物可用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物通过增加TNF-α的水平和/或活性而用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物用作流感治疗中的疫苗佐剂。在某些实施方案中，本发明的组合物用于增强针对抗原的免疫反应。在某些实施方案中，本发明提供了与抗原组合施用的组合物。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在疫苗接种之前或之后不久施用于患者。

鹑鸡肠球菌并且特别是菌株MRx0518是带鞭毛的，并且鞭毛蛋白可以是TLR5激动剂。TLR激动剂正在开发为多种抗原类型的疫苗佐剂，特别是在老年人群中[32]。而且，实施例中的数据证实MRx0518鞭毛蛋白是TLR5激动剂。因此，本发明的组合物可用作疫苗佐剂，特别是对于施用于免疫系统活性降低的老年患者(例如40、50、60、70或80岁以上)的疫苗。TLR5信号转导在与年龄相关的先天性免疫反应中也起着关键作用[33]。在某些实施方案中，所述组合物用于增强先天性免疫反应。尽管正在开发TLR5激动剂作为疫苗佐剂，但这些物质都来自已知病原体和/或是合成的。相反，本发明的组合物包含共生细菌。

实施例还表明，施用本发明的组合物可导致IL-6表达的增加。IL-6表达增加与许多疾病的疫苗反应相关联。例如，成人被施用流感疫苗后，CD14+CD16-炎性单核细胞产生IL-6[34]，并且实现对流感疫苗的疫苗反应产生更高水平的IL-6[35]。此外，在注射AS03佐剂系统后产生IL-6[36]，并且显示在小鼠中IL-6的下调降低了施用结核病疫苗后的辅助性T细胞反应[37]。由于施用本发明的组合物显示出增加IL-6表达，因此本发明的组合物可用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物通过增加IL-6的水平和/或活性而用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物用作结核病治疗中的疫苗佐剂。

此外，已显示IL-6和TNF-α的表达与治疗性HIV疫苗[Huang等]、结核病疫苗和衣原体疫苗[38]的功效相关。Su等[39]表明，将IL-6或TNF-α与FMDV DNA疫苗共接种会导致CD4⁺和CD8⁺T细胞的IFN-γ表达增加，CD4⁺T细胞中IL-4的表达增加以及抗原特异性细胞毒性反应更高。由于施用本发明的组合物显示可增加IL-6和TNF-α的表达，因此本发明的组合物可用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物可通过增加TNF-α的水平和/或活性而用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物可通过增加IL-6的水平和/或活性而用作疫苗佐剂。在一个特定的实施方案中，本发明的组合物可通过增加TNF-α和IL-6的水平和/或活性而用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物用作HIV治疗中的疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物用作衣原体治疗中的疫苗佐剂。

实施例还表明，施用本发明的组合物可导致IL-1β的表达增加。Li等[40]表明佐剂氢氧化铝激活了IL-1β的分泌，并暗示IL-1β本身可起到佐剂的作用。由于施用本发明的组合物显示可增加IL-1β表达，因此本发明的组合物可用作疫苗佐剂。实施例表明，施用本发明的组合物可增加CD8⁺T细胞与Treg的比率。已显示出佐剂刺激CD8⁺T细胞[41]，并且由于施用本发明的组合物显示增加CD8⁺T细胞与Treg的比率，因此本发明的组合物可用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物用作疫苗佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物通过增加CD8⁺T细胞与Treg的比率而用作疫苗佐剂。

实施例还表明，施用本发明的组合物可导致CXCR3配体CXCL9和CXCL10的表达或水平增加。已知的佐剂如ASO3、CpG、GLA-SE、αGalCer均增加CXCL9和10[42、43]，这表明本发明的组合物将有效用作佐剂。此外，CXCL9和10与IFNγ/Th1反应相关联并促进抗体反应[44]。在某些实施方案中，本发明的组合物用于促进针对抗原、特别是病原性或癌症抗原的抗体反应。此外，在接受研究性疟疾疫苗的志愿者中，CXCL9是比疫苗诱导的T细胞反应的IFN-γ更敏感的量度[45]。在某些实施方案中，本发明的组合物用于促进针对抗原、特别是病原性或癌症抗原的T细胞反应。在一个实施方案中，本发明的组合物通过增加CXCL9和CXCL10的水平和/或活性而用作疫苗佐剂。在某些实施方案中，所述组合物用于保护免受疟疾侵害。

实施例还表明，施用本发明的组合物可导致IL-12p70的表达或水平的增加。该作用与疫苗佐剂效率相关联，并且IL-12已被提议作为佐剂本身[46]，这表明本发明的组合物将有效作为佐剂。在一个实施方案中，本发明的组合物通过增加IL-12p70的水平和/或活性而用作疫苗佐剂。

在一些实施方案中，当用作疫苗佐剂时，本发明的组合物将单独施用以提供对已单独施用于患者的抗原的佐剂作用。在某些实施方案中，本发明的组合物是经口施用的，而抗原是经肠胃外注射的。

本发明的组合物可用于增强对任何有用抗原的免疫反应。用于本发明的示例性抗原包括：病毒抗原，例如病毒表面蛋白；细菌抗原，例如蛋白质和/或糖抗原；真菌抗原；寄生虫抗原；和肿瘤抗原。本发明特别适用于针对以下的疫苗：流感病毒、HIV、钩虫、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、狂犬病、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、衣原体、SARS冠状病毒、水痘带状疱疹病毒、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus)、人类乳头瘤病毒等。用于本发明的其它抗原包括糖蛋白和脂聚糖抗原、古细菌抗原、黑素瘤抗原E(MAGE)、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、HER2、唾液酸-Tn(STn)、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)、威尔姆斯瘤基因(WT1)、CA-125、前列腺特异性抗原(PSA)、爱泼斯坦-巴尔病毒抗原、新抗原、癌蛋白、淀粉样蛋白-β、Tau、PCSK9和习惯形成物质(例如尼古丁、酒精或鸦片)。

用于本发明的优选抗原包括病原体抗原和肿瘤抗原。抗原将引起对所述抗原具有特异性的免疫反应，所述免疫反应将有效地防止病原体感染或攻击肿瘤。抗原可以是例如肽或多糖。

本发明还提供以下用途：(i)抗原的水性制剂；和(ii)在用于提高患者的免疫反应的药物的制造中，包含鹑鸡肠球菌菌种的细菌菌株的组合物。

通过这些方法和用途引起的免疫反应通常包括抗体反应，优选地是保护性抗体反应。

在一些实施方案中，鹑鸡肠球菌菌种的细菌菌株被工程改造以呈递抗原。在本发明的细菌菌株上呈递抗原可最大化免疫刺激活性并进一步增强针对抗原产生的保护性免疫反应。另外，与分别制造和施用抗原和包含细菌菌株的组合物中的每一者时相比，以这种方式制造和递送包含抗原和本发明细菌的治疗剂可能更高效和有效。因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含鹑鸡肠球菌菌种的细菌菌株，所述细菌菌株例如在其细胞表面上呈递抗原。在一些实施方案中，包含呈递抗原的细菌菌株的组合物用作疫苗抗原。在一些实施方案中，所述抗原来源于HIV、钩虫、乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、狂犬病、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌、衣原体、SARS冠状病毒、水痘带状疱疹病毒、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、结核分枝杆菌、炭疽杆菌、爱泼斯坦-巴尔病毒或人类乳头瘤病毒。在一些实施方案中，所述抗原是糖蛋白抗原、脂聚糖抗原、古细菌抗原、黑素瘤抗原E(MAGE)、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、HER2、唾液酸-Tn(STn)、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)、威尔姆斯瘤基因(WT1)、CA-125、前列腺特异性抗原(PSA)、爱泼斯坦-巴尔病毒抗原、新抗原、癌蛋白、淀粉样蛋白-β、Tau、PCSK9或习惯形成物质(例如酒精、鸦片等)。

在一些实施方案中，本发明的细菌表达一种或多种抗原。通常，抗原将重组表达并将与本发明的细菌异源。因此，本发明提供了表达异源抗原的鹑鸡肠球菌菌种的细菌菌株。抗原可以是用一种或多种与细菌同源的多肽表达的融合多肽的一部分。在一些实施方案中，细菌将抗原表达为非融合多肽。在一些实施方案中，本发明提供了包含鹑鸡肠球菌菌种的细菌菌株的细胞的组合物，其中所述细胞表达异源抗原。在一些实施方案中，所述组合物用作疫苗。在一些实施方案中，本发明提供了鹑鸡肠球菌菌种的细菌菌株的细胞，其中所述细胞表达异源抗原。在一些实施方案中，所述细胞用作疫苗。

用于本发明的示例性抗原包括：病毒抗原，例如病毒表面蛋白；细菌抗原，例如蛋白质和/或糖抗原；真菌抗原；寄生虫抗原；和肿瘤抗原。在鹑鸡肠球菌菌种的细菌菌株中表达的其它抗原包括糖蛋白和脂聚糖抗原，古细菌抗原，黑素瘤抗原E(MAGE)，癌胚抗原(CEA)，MUC-1，HER2，唾液酸-Tn(STn)，人类端粒酶逆转录酶(hTERT)，威尔姆斯瘤基因(WT1)，CA-125，前列腺特异性抗原(PSA)，爱泼斯坦-巴尔病毒抗原，新抗原，癌蛋白，淀粉样蛋白-β，Tau，PCSK9和习惯形成物质(例如尼古丁、酒精、鸦片等)。

本发明还可用于增强针对非传染性疾病如胆固醇升高(例如通过PCSK9抗原)的疫苗的反应。

本发明还可用于增强针对习惯形成物质(例如尼古丁、酒精或鸦片)的疫苗的反应。

细胞疗法

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法

实施例还表明，本发明的组合物的施用可导致IL-6的表达增加。增加的IL-6表达已与对慢性淋巴细胞白血病的CD19 CAR-T疗法的反应相关联。血清IL-6的增加与CAR-T细胞扩增相关联，而IL-6的抑制与CAR-T细胞增殖的抑制相关联[47]。由于本发明的组合物的施用显示出增加IL-6表达，因此本发明的组合物可用于细胞疗法，特别是CAR-T细胞疗法。在一个实施方案中，本发明的组合物用于细胞疗法中。在一个实施方案中，本发明的组合物用于CAR-T细胞疗法中。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗慢性淋巴细胞白血病。

已显示Treg的选择性耗尽增强细胞毒性淋巴细胞的功效[48]。CAR-T细胞是细胞毒性淋巴细胞的子组，并且因此认为Treg的选择性耗尽在CAR-T细胞疗法中有效。由于本发明的组合物的施用显示出使Treg耗尽，因此本发明的组合物可用于细胞疗法，特别是CAR-T细胞疗法。

因此，本发明的组合物可用于细胞疗法，特别是增强对细胞疗法的反应。

间充质干细胞(MSC)疗法

已报道间充质干细胞(MSC)疗法具有免疫刺激特性。当MSC用LPS处理时，MSC上调促炎性细胞因子IL-6和IL-8，这引起增加的B细胞增殖[49]。因此，由于本发明的组合物显示出增加IL-6的表达，因此它们可用于与MSC细胞疗法组合。

干细胞移植疗法

已报道，在干细胞移植疗法中替代使用未分化干细胞，在移植之前使干细胞在一定程度上分化可为有益的。举例来说，Heng等[50]报道干细胞的心肌源性分化通过具有较高植入效率、增强的肌细胞再生和增加的心功能恢复可以是有益的。由于本发明的组合物的施用起始了未分化神经母细胞瘤细胞中的神经元分化，因此本发明的组合物可用于干细胞移植疗法中的干细胞分化。

造血干细胞移植

造血干细胞移植是通常来源于骨髓、外周血或脐带血的多能造血干细胞的移植。已显示在同种异体造血干细胞移植之前肠道经肠球菌(鹑鸡肠球菌和酪黄肠球菌)定殖可由于非复发死亡率降低而使患者的2年存活率显著提高[51]。因此，实施例中显示的免疫调节作用可用于造血干细胞移植疗法。在某些实施方案中，本发明的组合物可用于提高造血干细胞移植后和特别是同种异体造血干细胞移植后的存活率。

本发明的组合物可用于与同种异体造血干细胞移植组合。本发明的组合物可有效地加强对同种异体造血干细胞移植的成功患者反应。在某些实施方案中，在造血干细胞移植之前施用本发明的组合物。在某些实施方案中，本发明的组合物用于施用于计划接受造血干细胞移植的患者。在某些实施方案中，在造血干细胞移植之后施用本发明的组合物。在某些实施方案中，本发明的组合物用于施用于已接受造血干细胞移植的患者。

免疫衰老

Fulop等[52]鉴定Treg细胞数目的增加和B细胞数目的减少与适应性免疫系统的老化相关联。因此，本发明的组合物可用于预防或延迟免疫衰老。在一个实施方案中，本发明的组合物用于预防免疫衰老。在另一个实施方案中，本发明的组合物用于延迟以Treg细胞数目的增加为特征的免疫衰老。在另一个实施方案中，本发明的组合物用于延迟以B细胞数目的减少为特征的免疫衰老。在另一个实施方案中，本发明的组合物用于延迟以Treg细胞数目的增加和B细胞数目的减少为特征的免疫衰老。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过减少Treg细胞数目来延迟免疫衰老。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过增加B细胞数目来延迟免疫衰老。在另一个实施方案中，本发明的组合物用于通过减少Treg细胞数目和增加B细胞数目来延迟免疫衰老。在一个实施方案中，本发明的组合物用于治疗由免疫衰老引起的疾病。在一个实施方案中，本发明的组合物用于通过延迟和/或预防免疫衰老来治疗老化相关疾病。

此外，已提议疫苗佐剂可攻克免疫衰老[53]。由于本发明的组合物适合用作疫苗佐剂，因此本发明的组合物可用于预防或延迟免疫衰老。在另一个实施方案中，本发明的组合物作为疫苗佐剂用于延迟和/或预防免疫衰老。在另一个实施方案中，本发明的组合物用作疫苗佐剂，其中组合物延迟和/或预防免疫衰老。

与免疫衰老相关联的疾病包括心血管疾病、癌症、2型糖尿病[54]和自身免疫病症[55]。

施用模式

优选地，将本发明的组合物施用于胃肠道，以便能够将本发明的细菌菌株递送至肠道和/或将本发明的细菌菌株部分或全部定殖在肠道中。通常，本发明的组合物经口(包括舌下)施用，但是它们可经直肠或鼻内施用。

在某些实施方案中，本发明的组合物可作为泡沫剂、作为喷雾剂或凝胶施用。

在某些实施方案中，本发明的组合物可作为栓剂如直肠栓剂施用，例如以可可油(可可脂)、合成硬脂肪(例如苏博瑞(suppocire)、威特索(witepsol))、甘油-明胶、聚乙二醇或皂甘油组合物的形式。

在某些实施方案中，将本发明的组合物经由管，例如鼻胃管、口胃管、胃管、空肠造口管(J管)、经皮内镜胃造瘘(PEG)或端口如可进入胃、空肠的胸壁端口和其它合适的进入端口施用于胃肠道。

本发明的组合物可一次性施用，或者其可作为治疗方案的一部分依序施用。在某些实施方案中，本发明的组合物有待每日施用。

在本发明的某些实施方案中，根据本发明的治疗伴随着对患者肠道微生物群的评估。如果未实现本发明菌株的递送和/或部分或全部定殖，使得未观察到功效，则可重复治疗；或者如果递送和/或部分或全部定殖成功并且观察到功效，则可停止治疗。

在某些实施方案中，可将本发明的组合物施用于怀孕的动物，例如哺乳动物如人类，以减少其孩子在子宫内和/或在出生后发生疾病的可能性。

可将本发明的组合物施用于已被诊断出患有疾病或疾患介导的免疫活性降低的患者，或者已被鉴定为处于具有由免疫活性降低介导的疾病或疾患的风险的患者。所述组合物也可作为预防措施来施用，以预防健康患者中由免疫活性降低介导的疾病或疾患的发展。

可将本发明的组合物施用于已被诊断出免疫活性不足或已被鉴定为具有免疫活性不足风险的患者。例如，患者可具有降低或不存在的肠球菌并且特别是鹑鸡肠球菌定殖。

本发明的组合物可作为食品例如营养补充剂施用。

通常，本发明的组合物用于治疗人类，但它们可用于治疗动物，包括单胃哺乳动物，例如家禽、猪、猫、狗、马或兔。本发明的组合物可用于增强动物的生长和性能。如果施用于动物，则可使用经口管饲法。

组合物

通常，本发明的组合物包含细菌。在本发明的优选实施方案中，将组合物配制成冷冻干燥形式。例如，本发明的组合物可包含颗粒或明胶胶囊，例如硬明胶胶囊，其包含本发明的细菌菌株。

优选地，本发明的组合物包含冻干细菌。细菌的冻干是一个公认的程序，并且相关指南可获自例如参考文献[56、58]。

或者，本发明的组合物可包含活的、活性细菌培养物。

在优选的实施方案中，将本发明的组合物包封以使细菌菌株能够递送至肠。包封保护组合物免于降解直至通过例如用化学或物理刺激(例如压力、酶活性或物理崩解)破裂而在目标位置递送，所述化学或物理刺激可通过pH的变化来触发。可使用任何适当的包封方法。示例性的包封技术包括在多孔基质中的捕获，在固体载体表面上的附着或吸附，通过絮凝或与交联剂的自聚集，以及在微孔膜或微胶囊后的机械容纳。可用于制备本发明的组合物的包封指南可获自例如参考文献[59]和[60]。

所述组合物可经口施用，并且可以是片剂、胶囊剂或散剂的形式。包封产品是优选的，因为肠球菌是厌氧菌。可包括其它成分(例如维生素C)作为除氧剂和益生元底物，以改善体内的递送和/或部分或全部定殖和存活。或者，本发明的益生菌组合物可作为食品或营养产品，例如牛奶或乳清基发酵乳制品，或作为药物产品经口施用。

所述组合物可配制成益生菌。

本发明的组合物包括治疗有效量的本发明的细菌菌株。治疗有效量的细菌菌株足以对患者发挥有益作用。治疗有效量的细菌菌株可能足以导致向患者肠道的递送和/或部分或全部定殖。

例如，对于成年人，所述细菌的合适的日剂量可以是约1x10³至约1x10¹¹菌落形成单位(CFU)；例如，约1x10⁷至约1x10¹⁰CFU；在另一实施例中约1x10⁶至约1x10¹⁰CFU；在另一实施例中约1x10⁷至约1x10¹¹CFU；在另一实施例中约1x10⁸至约1x10¹⁰CFU；在另一实施例中约1x10⁸至约1x10¹¹CFU。

在某些实施方案中，细菌的剂量为每天至少10⁹个细胞，例如每天至少10¹⁰个、至少10¹¹个或至少10¹²个细胞。

在某些实施方案中，相对于组合物的重量，所述组合物包含的细菌菌株的量为约1x10⁶至约1x10¹¹CFU/g；例如，约1x10⁸至约1x10¹⁰CFU/g。剂量可以是例如1g、3g、5g和10g。

在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中细菌菌株的量相对于组合物的重量为每克约1×10³至约1×10¹¹菌落形成单位。

在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中所述组合物以500mg至1000mg、600mg至900mg、700mg至800mg、500mg至750mg或750mg至1000mg之间的剂量施用。在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中所述药物组合物中的冻干细菌以500mg至1000mg、600mg至900mg、700mg至800mg、500mg至750mg或750mg至1000mg之间的剂量施用。

通常，益生菌，例如本发明的组合物，任选地与至少一种合适的益生元化合物组合。益生元化合物通常是不可消化的碳水化合物，例如寡糖或多糖或糖醇，其在上消化道中不会降解或吸收。已知的益生元包括商业产品如菊粉和反式低聚半乳糖。

在某些实施方案中，本发明的益生菌组合物包含相对于组合物总重量为约1重量％至约30重量％(例如5重量％至20重量％)的量的益生元化合物。碳水化合物可选自由以下组成的组：低聚果糖(或FOS)，短链低聚果糖，菊粉，低聚异麦芽糖，果胶，低聚木糖(或XOS)，低聚壳聚糖(或COS)，β-葡聚糖，阿拉伯胶改性和抗性淀粉，聚右旋糖，D-塔格糖，阿拉伯胶纤维，角豆，燕麦和柑橘纤维。在一个方面，益生元是短链低聚果糖(为简单起见，在下文中显示为FOSs-c.c)；所述FOSs-c.c.是不可消化的碳水化合物，通常通过甜菜糖的转化而获得，并且包括与三个葡萄糖分子结合的蔗糖分子。

本发明的组合物可包含药学上可接受的赋形剂或载体。这种合适的赋形剂的实例可见于参考文献[61]。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在药学领域是众所周知的，并且例如描述于参考文献[62]中。合适的载体的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露糖醇、山梨糖醇等。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。可根据预期的施用途径和标准药学实践来选择药物载体、赋形剂或稀释剂。所述药物组合物可包含以下作为载体、赋形剂或稀释剂或除此以外还包含以下：任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、涂布剂、增溶剂。合适的粘合剂的实例包括淀粉；明胶；天然糖，例如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂；天然和合成胶，例如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠；羧甲基纤维素；和聚乙二醇。合适的润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。防腐剂、稳定剂、染料和甚至调味剂可在药物组合物中提供。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。也可使用抗氧化剂和悬浮剂。

本发明的组合物可配制成食品。例如，除了本发明的治疗作用外，食品还可提供营养益处，例如在营养补充剂中。类似地，可配制食品以增强本发明组合物的味道或通过更类似于普通食品而不是药物组合物来使组合物更具消费吸引力。在某些实施方案中，本发明的组合物被配制成乳基产品。术语“乳基产品”是指具有变化的脂肪含量的任何液体或半固体乳基或乳清基产品。乳基产品可以是例如牛奶，山羊奶，绵羊奶，脱脂奶，全脂奶，由奶粉和乳清复合而成的未经任何加工的奶，或经过加工的产品，例如酸乳、凝结乳、凝乳、酸奶、酸全脂奶、酪乳和其它酸奶产品。另一个重要的组包括乳饮料，例如乳清饮料、发酵乳、炼乳、幼儿或婴儿乳；调味奶，冰淇淋；含乳食物，例如糖果。

在某些实施方案中，本发明的组合物包含单个细菌菌株或菌种，并且不包含任何其它细菌菌株或菌种。这样的组合物可仅包含极少量或生物学上不相关量的其它细菌菌株或菌种。这样的组合物可以是基本上不含其它生物物种的培养物。

根据本发明使用的组合物可能需要或可能不需要销售许可。

在一些情况下，在施用前将冻干的细菌菌株重构。在一些情况下，通过使用本文所述的稀释剂进行重构。

本发明的组合物可包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

在某些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含：本发明的细菌菌株；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中所述细菌菌株的量足以在施用于有需要的受试者时治疗病症。

在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含：本发明的细菌菌株；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中所述细菌菌株的量足以治疗或预防疾病或疾患。

在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含：本发明的细菌菌株；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中所述细菌菌株的量足以治疗或预防疾病或疾患。

在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含：本发明的细菌菌株；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中所述细菌菌株的量足以治疗或预防疾病或疾患。

在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含：本发明的细菌菌株；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中所述细菌菌株的量足以治疗或预防由促炎性细胞因子例如IL-1β、TNF-α、MIP-3α、IL-23或IL-6介导的疾病或疾患。在一个优选的实施方案中，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含：本发明的细菌菌株；和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；其中所述细菌菌株的量足以治疗或预防由TNF-α介导的疾病或疾患。

在某些实施方案中，本发明提供了上述药物组合物，其中细菌菌株的量相对于组合物的重量为每克约1×10³至约1×10¹¹菌落形成单位。

在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中所述组合物以1g、3g、5g或10g的剂量施用。

在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中所述组合物是通过选自由经口、经直肠、皮下、经鼻、经颊和舌下组成的组的方法施用的。

在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，所述药物组合物包含选自由乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露糖醇和山梨糖醇组成的组的载体。

在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，所述药物组合物包含选自由乙醇、甘油和水组成的组的稀释剂。

在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，所述药物组合物包含选自由以下组成的组的赋形剂：淀粉、明胶、葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂、阿拉伯胶、黄蓍胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠。

在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，所述药物组合物还包含防腐剂、抗氧化剂和稳定剂中的至少一者。

在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，所述药物组合物包含选自由苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯组成的组的防腐剂。

在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中所述细菌菌株是冻干的。

在某些实施方案中，本发明提供上述药物组合物，其中当组合物在约4℃或约25℃下储存于密封容器中并且所述容器置于具有50％相对湿度的气氛中时，如以菌落形成单位测量的至少80％的细菌菌株在至少约1个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年的时段后仍存在。

培养方法

用于本发明的细菌菌株可使用例如参考文献[63、65]中详述的标准微生物学技术进行培养。

用于培养的固体或液体培养基可以是YCFA琼脂或YCFA培养基。YCFA培养基可包括(每100mL，近似值)：酪胨(1.0g)、酵母提取物(0.25g)、NaHCO₃(0.4g)、半胱氨酸(0.1g)、K₂HPO₄(0.045g)、KH₂PO₄(0.045g)、NaCl(0.09g)、(NH₄)₂SO₄(0.09g)、MgSO₄·7H₂O(0.009g)、CaCl₂(0.009g)、刃天青(0.1mg)、血红素(1mg)、生物素(1μg)、钴胺素(1μg)、对氨基苯甲酸(3μg)、叶酸(5μg)和吡哆胺(15μg)。

用于疫苗组合物中的细菌菌株

本发明人已鉴定，本发明的细菌菌株可用于治疗或预防与免疫活性降低相关的疾病或疾患。这可能是本发明的细菌菌株对宿主免疫系统产生作用的结果。因此，当作为疫苗组合物施用时，本发明的组合物还可用于预防疾病或疾患。在某些这样的实施方案中，本发明的细菌菌株可被杀灭、灭活或减毒。在某些这样的实施方案中，所述组合物可包含疫苗佐剂。在某些实施方案中，所述组合物用于通过注射施用，例如通过皮下注射施用。

通则

除非另有指示，否则本发明的实践将采用在本领域的技能范围内的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法。这些技术在文献中全面解释。参见例如参考文献[66]和[67、73]等。

术语“包含”涵盖“包括”以及“组成”，例如“包含”X的组合物可排他性地由X组成或者可包括额外事物，例如X+Y。

关于数值x的术语“约”是任选的并且是指例如x±10％。

词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可完全不含Y。必要时，词语“基本上”可从本发明的定义中省略。

对两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比的引用是指当比对时，所述百分比的核苷酸在比较两个序列时是相同的。这种比对和同源性或序列同一性百分比可使用本领域中已知的软件程序确定，例如参考文献[74]的章节7.7.18中所述的那些。优选的比对是通过史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜寻算法使用空位开放罚分12和空位扩展罚分2、BLOSUM矩阵62进行仿射空位搜寻来确定。史密斯-沃特曼同源性搜寻算法在参考文献[75]中公开。

除非另有规定，否则包含众多步骤的工艺或方法可在方法开始或结束时包括额外步骤，或者可包括额外中间步骤。此外，适当时，步骤可组合、省略或以替代性次序进行。

本文描述本发明的各种实施方案。应了解，各实施方案中指定的特征可与其它指定特征组合，以提供另外的实施方案。特别是，本文中突出强调为合适、典型或优选的实施方案可彼此组合(除非所述实施方案相互排斥)。

本发明的实施方式

实施例1–细菌接种物在小鼠癌症模型中的功效

概述

这项研究测试了包含根据本发明的细菌菌株的组合物在四个肿瘤模型中的功效。

材料

测试物质-细菌菌株#MRx0518。

参考物质-抗CTLA-4抗体(克隆：9H10，目录：BE0131，同种型：Syrian HamsterIgG1,Bioxcell)。

测试和参考物质媒介物-细菌培养基(酵母提取物，酪胨，脂肪酸培养基(YCFA))。每天注射给小鼠，抗体用PBS(参考：BE14-516F，Lonza,France)稀释。

处理剂量-细菌：2x10⁸个于200μL中。抗CTLA-4以每次注射10mg/kg的量注射。根据小鼠的最新体重，以每次施用10mL/kg的剂量体积施用抗CTLA-4(即对于体重20g的一只小鼠，将施用200μL的测试物质)。

施用途径-细菌接种物经由插管通过经口管饲法(口服，PO)施用。插管每天进行消毒。将抗CTLA-4注射到小鼠的腹膜腔内(腹膜内，IP)。

细菌菌株的培养条件-细菌菌株的培养条件如下：

·将10mL的YCFA(从准备好的10mL E&O实验室瓶中)吸移到Hungate管中

·密封管并使用注射器输入和排气系统用CO₂冲洗

·对Hungate管进行高压灭菌

·当冷却时，用1mL甘油储备液对Hungate管接种

·将管放在37℃静态温育器中约16小时。

·第二天，取1mL该亚培养物并接种10mL YCFA(再次预热冲洗过的Hungate管，都是一式两份)

·将其放入37℃静态温育器中持续5至6小时

癌细胞系和培养条件-

下表详述了使用的细胞系：

细胞系	类型	小鼠品系	来源
				EMT-6	乳腺癌	BALB/c	ATCC
LL/2(LLC1)	肺癌	C57BL/6	ATCC CRL1642
				Hepa1-6	肝细胞癌	C57BL/6	IPSEN INNOVATION
RENCA	肾腺癌	BALB/c	ATCC

EMT-6细胞系是由可移植的鼠类乳腺癌建立的，所述鼠类乳腺癌在增生性乳腺泡结节植入后出现在BALB/cCRGL小鼠中[76]。

LL/2(LLC1)细胞系是从C57BL/6小鼠的肺中建立的，所述小鼠带有因原发性Lewis肺癌植入而产生的肿瘤[77]。

Hepa 1-6细胞系是在C57/L小鼠中出现的BW7756小鼠肝细胞瘤的衍生物[78]。

细胞培养条件-所有细胞系均在37℃下在潮湿气氛(5％CO₂、95％空气)中以单层生长。下表中列出了培养基和补充物：

对于实验用途，通过在无钙或镁的汉克斯培养基(参考：BE10-543F，Lonza)中，用胰蛋白酶-维尔烯(versene)(参考：BE17-161E，Lonza)处理5分钟，并通过加入完全培养基中和，将附着的肿瘤细胞从培养瓶分离。在血细胞计数器中对细胞进行计数，并通过0.25％台盼蓝排除测定法评估其活力。

动物的使用-

从CHARLES RIVER获得体重和年龄匹配的健康雌性BALB/C(BALB/cByJ)小鼠，用于EMT6和RENCA模型实验。

从CHARLES RIVER(L'Arbresles)获得体重和年龄匹配的健康雌性C57BL/6(C57BLl6J)小鼠，用于LL/2(LLC1)和Hepa1-6模型实验。

根据FELASA指南，动物维持在SPF健康状态，并根据法国和欧洲法规以及实验动物的护理和使用的NRC指南进行动物饲养和实验程序[79、80]。在以下受控的环境条件下将动物饲养在饲养室中：温度：22±2℃，湿度55±10％，光周期(光照12小时/黑暗12小时)，HEPA过滤空气，每小时15次空气交换，无再循环。为动物围栏提供无菌和足够的空间，并提供衬垫材料、食物和水，环境和社会性丰富(集体住宅)，如下所述：通风架中的900cm²笼子(参考：绿色，Tecniplast)，Epicea衬垫(SAFE)，10kGy辐照饮食(A04-10，SAFE)，具有免疫能力的啮齿动物的全食品-R/M-H挤出物，瓶装水。

实验设计和处理

抗肿瘤活性，EMT6模型

处理时间表-首次给药的开始时间被视为D0。在D0，使用Vivo

软件(Biosystemes,Couternon,France)根据未移植小鼠的个体体重将它们随机分组，每组9/8只。在D0，小鼠接受媒介物(培养基)或细菌菌株。在D14，如下所述向所有小鼠植入EMT-6肿瘤细胞。在D24，来自阳性对照组的小鼠接受抗CTLA-4抗体处理。

下表中总结了处理时间表：

如下所述进行动物的监测。

在动物中诱导EMT6肿瘤-在D14，通过将200μL RPMI 1640中的1x10⁶个EMT-6细胞皮下注射到小鼠右侧腹来诱导肿瘤。

安乐死-每只小鼠在其达到如下所述的人道终点时或在开始给药后最多6周后被安乐死。

抗肿瘤活性，LL/2(LLC1)模型

处理时间表-首次给药的开始时间被视为D0。在D0，使用Vivo

软件(Biosystemes,Couternon,France)根据未移植小鼠的个体体重将它们随机分为7组，每组9/8只。在D0，小鼠接受媒介物(培养基)或细菌菌株。在D14，如下所述，向所有小鼠植入LL/2肿瘤细胞。在D27，来自阳性对照组的小鼠接受抗CTLA-4抗体处理。

下表中总结了处理时间表：

如下所述进行动物的监测。

在动物中诱导LL/2(LLC1)肿瘤-在D14，通过将200μL RPMI1640中的1x10⁶个LL/2(LLC1)细胞皮下注射到小鼠右侧腹来诱导肿瘤。

安乐死-每只小鼠在其达到如下所述的人道终点时或在开始给药后最多6周后被安乐死。

抗肿瘤活性，Hepa1-6模型

处理时间表-首次给药的开始时间被视为D0。在D0，使用Vivo

软件(Biosystemes,Couternon,France)根据未移植小鼠的个体体重将它们随机分成7组，每组9只。在D0，小鼠接受媒介物(培养基)或细菌菌株。在D14，如下所述向所有小鼠植入Hepa 1-6肿瘤细胞。在D16，来自阳性对照组的小鼠接受抗CTLA-4抗体处理。

下表中总结了处理时间表：

如下所述进行动物的监测。

通过脾内注射在动物中原位诱导Hepa 1-6肿瘤细胞-在D0，通过脾内注射将50μLRPMI 1640培养基中的一百万(1x10⁶)个Hepa 1-6肿瘤细胞移植到小鼠体内。简言之，做了一个小的左肋下侧腹切口并将脾脏从腹中取出。将脾脏暴露在无菌纱布垫上，并在目视控制下用27号针头注射细胞悬液。细胞接种后，切除脾脏。

安乐死-当每只小鼠达到如下文部分中所述的人道终点时或在开始给药后最多6周后，对每只小鼠实施安乐死。

安乐死时肿瘤负荷的评估-终止时，收集肝脏并称重。

抗肿瘤活性，RENCA模型

处理时间表-首次给药的开始时间被视为D0。在D0，未移植小鼠根据它们的个体体重随机分组，每组12只小鼠。在D0，小鼠接受媒介物(培养基)或细菌菌株(2x10⁸个于100μL中，PO)。在D14，如下所述，向所有小鼠植入RENCA肿瘤细胞，将其SC注射到左后侧腹。从D17开始使用抗CTLA-4(克隆9D9，10mg/kg，IP)和抗PDL1(克隆10F.9G2，10mg/kg，IP)进行处理。

下表中总结了处理时间表：

如下所述进行动物的监测。

在D14(细菌给药/预处理2周后)，将100μL PBS中的5x10⁵个活细胞皮下注射到每只小鼠的左后侧腹中(用外科用酒精消毒)，每只小鼠1个注射器和针头。在细胞植入前一天将植入部位剃毛。

安乐死-当每只小鼠达到如下文部分中所述的人道终点时或在开始给药后最多6周后，对每只小鼠实施安乐死。

安乐死时肿瘤负荷的评估-终止时，收集肿瘤并评估其体积。

动物监测

临床监测-每周用卡尺测量肿瘤的长度和宽度2-3次，并通过此公式估算肿瘤的体积[81]：

人道终点[82]：疼痛、受难或痛苦的迹象：疼痛姿势、疼痛面罩、行为；肿瘤超过正常体重的10％，但不超过2000mm³；肿瘤干扰步行或营养；溃疡性肿瘤或组织糜烂；连续3天剩余体重减轻20％；身体状况不佳，消瘦，恶病质，脱水；长期缺乏对外部刺激的自主反应；快速呼吸困难，贫血，大量出血；神经系统征象：环行，抽搐，瘫痪；体温持续下降；腹胀。

麻醉-异氟烷气体麻醉用于所有程序：外科手术或肿瘤接种、静脉内注射、采血。氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉用于立体定位手术程序。

镇痛-卡洛芬或多模式卡洛芬/丁丙诺啡镇痛方案适应于外科手术的严重程度。对于所有痛苦过程提供非药理护理。另外，应主治兽医的建议，提供不干扰研究(局部处理)的药理护理。

安乐死-动物的安乐死通过以下进行：气体麻醉过量(异氟烷)，然后进行颈脱位或放血。

结果

抗肿瘤活性，EMT6模型

结果如图1A所示。相对于两个阴性对照，用本发明的细菌菌株进行的处理导致肿瘤体积明显减小。如预期的那样，阳性对照也导致肿瘤体积减小。

为了进一步阐明MRx0518在同源肿瘤模型中传达其治疗作用的机制，对同源EMT6肿瘤模型研究进行离体分析。虽然肿瘤体积是临床前肿瘤学研究中的主要测量结果，但肿瘤常常由活跃分裂的肿瘤细胞与坏死核心组成。为了研究MRx0518处理是否对EMT6肿瘤中发现的坏死程度有影响，用苏木精和曙红对肿瘤中腹区域的石蜡切片进行染色。对鼠类EMT6乳腺癌模型的MRx0518处理显示出增加肿瘤内坏死横截面积的趋势(图1B，上图)。为了研究MRx0518处理是否对肿瘤内的分裂细胞有影响，将来自肿瘤中腹区域的石蜡切片用增殖蛋白Ki67染色以及DAPI复染，以估算EMT6肿瘤内分裂的细胞百分比。对鼠类EMT6乳腺癌模型的MRx0518处理显著降低了肿瘤内可见的分裂细胞百分比(图1B，下图，P＝0.019)。

免疫细胞群体

通过肿瘤的流式细胞术对肿瘤微环境进行进一步的研究，以研究以下假设：MRx0518细菌菌株具有调节免疫系统以诱导抗肿瘤作用的能力。从不同处理组切下的肿瘤被切成片。对一个片进行流式细胞术分析。为了评估肿瘤内存在的T淋巴细胞的相对百分比，使用以下标志物：CD45、CD3、CD4、CD8、CD25和FoxP3。

图1C中提供的初步流式细胞术数据(并得到图23中提供的下述数据进一步支持)显示，MRx0518和抗CTLA-4处理组中的肿瘤中淋巴细胞的相对百分比当分别与媒介物或对照动物进行比较时略有降低。同样，在MRx0518和抗CTLA-4处理的动物中，CD4⁺细胞的相对百分比似乎有所降低，而CD8⁺细胞的相对百分比在两组中遵循相反的趋势，尽管幅度不同。与MRx0518治疗的动物中的轻微减少相比，抗CTLA-4处理组中的CD4⁺FoxP3⁺细胞的相对百分比较低；然而，仅在抗CTLA-4处理组中，CD4⁺CD25⁺细胞相对百分比的降低是明显的。与MRx0518动物相比，抗CTLA-4处理组中的CD8+/FoxP3+比率显示出更大的增加。本文提供的这些数据支持以下假设：抗CTLA-4抗体可通过减少调节性T细胞(Treg)的细胞数量或减弱其在肿瘤组织中的抑制活性来靶向调节性T细胞(Treg)，同时表明MRx0518的作用方式不同。

使用对肿瘤组织的NanoString分析，进行肿瘤微环境的额外研究，以研究MRx0518细菌菌株是否具有调节免疫系统以在EMT6模型中诱导抗肿瘤作用的能力。收集从媒介物和MRx0518处理组切除的肿瘤。使用TRIzol试剂(ThermoFisher)从肿瘤组织中提取RNA，然后使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)进行清洁，包括DNA酶I处理(Qiagen)。然后将RNA用于使用PanCancer Mouse IO 360图的Nanostring分析。先前显示出具有各种细胞群体特征的基因被用来测量这些群体的丰度：

使用由NanoString分析提供的线性细胞类型评分(图23，热图)计算每个细胞群体的Z评分。

NanoString数据显示，与媒介物处理的动物相比，MRx0518处理组的肿瘤组织中B细胞、CD45、T细胞、细胞毒性和NK细胞的丰度增加(图23)。此处提供的数据支持以下假设：MRx0518通过增加肿瘤微环境中的白细胞，特别是NK细胞、T细胞和细胞毒性细胞而具有免疫刺激作用。

细胞因子产生

将另一个肿瘤片与血浆样品一起用于总蛋白提取和随后的细胞因子分析。通过MagPix技术分析了肿瘤微环境中IL-10、CXCL1、CXCL2、CXCL10、IL-1β、IL-17A、GM-CSF、TNF-α、IL-12p70和IFN-γ的蛋白质水平。尽管IL-17A和GM-CSF低于检测水平，但所有其它标志物均以合理水平表达(图1D)。在媒介物与抗CTLA-4组之间观察到IFN-γ的显著差异。与对照处理相比，MRx0518处理后IL-10和IL-12p70免疫标志物的产生似乎减少。

还对相同动物的血浆中的细胞因子水平进行了评估。通过MagPix技术分析了IL-23、IL-6、IL-10、VEGF、CXCL1、CXCL2、CXCL10、IL-2、IL-1β、IL-17A、GM-CSF、TNF-α、IL-12p70和IFN-γ的蛋白质水平。总体而言，在肿瘤诱导之前或在研究结束时，在动物血浆中几乎未检测到细胞因子的产生(图1E)。检测到大量水平的VEGF和CXCL10，而检测到较低水平的IL-23、IL-6、IL-10、CXCL1和CXCL2。在样品中未检测到IL-2、IL-1b、IL-17A、GM-CSF、TNF-α、IL-12p70和IFN-γ。在第0天，MRx0518显著增加了IL-6的产生。MRx0518似乎也增加了IL-23的产生。在第22天，抗CLTA-4组中的VEGF和CXCL10显著下调。与免疫细胞群体显示的结果相似，MRx0518与抗CTLA-4在肿瘤和血浆中细胞因子产生之间的差异表明：它们中的每一者都作用于不同且可能互补的机制。

CD8α阳性细胞局限在回肠中

在低温恒温器(CM 1950Leica)中切开回肠的10μm冷冻切片，拾取到聚L赖氨酸载玻片上。然后将切片风干1小时，在冰冷的甲醇中固定10分钟，在PBS中洗涤，在PBS pH 7.2中的10％BSA中封闭，然后与初级抗体(大鼠抗小鼠CD8α抗体，Sigma-Aldrich，Millipore)一起温育过夜。

第二天早晨，将载玻片在PBS中洗涤，并用二级抗体山羊抗大鼠抗体Alexa488(Molecular Probe,Invitrogen)在室温下染色1小时。在另一个洗涤步骤后，将载玻片用4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)(Sigma-Aldrich,Millipore)复染，并安装在Vectashield(Vector Laboratories)中。使用配备有汞蒸气灯、适当的滤光片和x20复消色差物镜的Zeiss Axioscope显微镜对载玻片进行观察和成像。显示了从载玻片从媒介物、MRx0518和抗CTLA4动物获得的图像示例(图1F–上图：DAPI染色，下图：CD8α染色)。

检查了来自20只动物的视野，并使用手动曝光时间对其成像。下表中显示了动物数量和分析视野数量：

组	分析视野数量	小鼠数量
			媒介物	53	5
MRx0518	70	7
			抗CTLA4	71	8

图像评分如下：具有≤3个阳性细胞的视野评分为0，而具有更多≥3个细胞的视野评分为1。该分析结果如所示(图1G)。

与媒介物组相比，用抗CD8α染色的回肠冷冻切片显示，局限在用MRx0518和抗CTLA-4处理的动物的隐窝区域组织中的CD8α阳性细胞数量更高。

该观察结果与在感染或炎性微环境中作为免疫反应一部分在肠道中存在的CD8⁺T细胞一致。

抗肿瘤活性，LL/2(LLC1)模型

结果如图2所示。相对于两个阴性对照，用本发明的细菌菌株进行的处理导致肿瘤体积明显减小。

抗肿瘤活性，Hepa1-6模型

结果显示在图3A中。未处理的阴性对照未出现预期情况，因为该组的肝脏重量低于其它组。然而，媒介物阴性对照组和阳性对照组均出现预期情况，因为单独用媒介物处理的小鼠的肝脏大于用抗CTLA4抗体处理的小鼠的肝脏，这反映出在媒介物阴性对照组中更大的肿瘤负荷。相对于媒介物阴性对照组中的小鼠，用本发明的细菌菌株进行的处理导致肝脏重量(以及因此肿瘤负荷)明显减小。

抗肿瘤活性，RENCA模型

结果显示在图3B中。与媒介物处理组相比，用MRx0518单一疗法进行治疗使测试/对照的肿瘤体积减少51％(第18天)。与未处理组和媒介物组相比，太平洋紫杉醇和抗CTLA-4+抗PDL-1在D18和D22显示(几乎)完全缩小的肿瘤大小。

这些数据表明，菌株MRx0518可用于治疗或预防与免疫系统活性降低相关的其它疾病。

实施例2–PCR基因分析

在PCR基因分析中研究了细菌MRx0518的纯培养物。实验有两个方面：1)将MRx0518与人类结肠细胞(CaCo2)共培养以研究细菌对宿主的影响，以及2)将MRx0518在用IL1刺激的CaCo2细胞上共培养以模拟细菌在炎性环境中的作用。通过基因表达分析评估了两种情形下的作用。结果如下所示：

这些数据似乎显示出两个基因表达签名，即与促炎性细胞迁移相关的CXCR1/2配体(CXCL3、CXCL2、CXCL1、IL-8)，和CXCR3配体(CXCL9、CXCL10)，其更具体地指示IFN-γ型反应也由IL-32支持，其为IFN-γ诱导型。这些数据表明，本发明的组合物可用于刺激免疫系统。

实施例3–稳定性测试

将包含至少一个本文所述的细菌菌株的本文所述的组合物储存在25℃或4℃的密封容器中，并将所述容器置于具有30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％相对湿度的气氛中。在1个月、2个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年后，至少50％、60％、70％、80％或90％的细菌菌株仍存在，如通过标准方案确定的菌落形成单位所测量。

实施例4–MRx0518相比于MRx0518+LPS诱导的未成熟树突状细胞中的细胞因子产生

概述

这项研究测试了单独和与脂聚糖(LPS)组合的细菌菌株MRx0518对未成熟树突状细胞中的细胞因子产生的影响。

从外周血单核细胞(PBMC)中分离出单核细胞群体。单核细胞随后被分化为未成熟的树突状细胞。将未成熟的树突状细胞以200,000个细胞/孔铺板，并与最终浓度为10⁷/mL的MRx0518一起温育，其中任选地添加最终浓度为100ng/mL的LPS。阴性对照涉及将细胞与仅RPMI培养基一起温育，而阳性对照是将细胞与最终浓度为100ng/mL的LPS一起温育。然后分析细胞的细胞因子含量。

结果

这些实验的结果可见于图4a-d。与阴性对照相比，单独添加MRx0518会导致细胞因子IL-6和TNF-α的水平大幅增加(图4a和图4c)。与阴性对照相比，添加LPS(阳性对照)导致IL-6和TNF-α的水平增加，但IL-1β没有增加(图4b)。MRx0518和LPS的组合导致产生的IL-1β水平协同增加(图4d)。

结论

MRx0518具有诱导未成熟树突状细胞中更高的IL-6和TNF-α细胞因子产生的能力。LPS和MRx0518的组合可增加未成熟树突状细胞中细胞因子IL-1β的水平。这些数据表明，单独或与LPS组合的MRx0518可增加炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α，从而促进炎症。

实施例5–MRx0518相比于MRx0518+LPS诱导的THP-1细胞中的细胞因子产生

概述

这项研究测试了单独和与LPS组合的细菌菌株MRx0518对THP-1细胞(一种用于单核细胞和巨噬细胞的模型细胞系)中细胞因子产生的影响。

用5ng/mL佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)将THF-1细胞分化至M0培养基中持续48小时。随后将这些细胞与最终浓度为10⁸/mL的MRx0518一起温育，添加或不添加最终浓度为100ng/mL的LPS。然后洗去细菌并且使细胞在正常生长条件下温育24小时。然后将细胞快速离心，并分析所得上清液的细胞因子含量。

结果

这些实验的结果可见于图5a-c。与无细菌和细菌沉积物的对照相比，没有LPS的MRx0518的添加导致IL-1β、IL-6和TNF-α的细胞因子水平增加。LPS和MRx0518的添加导致细胞因子产生的协同增加。

结论

MRx0518具有在THP-1细胞中诱导细胞因子产生的能力，其可通过添加LPS来协同增加。这些数据表明，单独或与LPS组合的MRx0518可增加炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α，从而促进炎症。

实施例6–细胞因子分析

引言

本发明人试图进一步分析本发明的组合物的免疫刺激作用。本发明人分析了用MRx0518处理后来自THP-1巨噬细胞和源自单核细胞的树突状细胞的特定细胞因子的表达。巨噬细胞和树突状细胞是先天性免疫系统的关键组成部分，在先天性免疫系统和适应性免疫系统之间充当信使，并定居在肠道中，它们在其中释放各种细胞因子来调节免疫反应。

分析了参与先天性免疫反应的细胞因子(TNF-α、IL-12和IL-10)，并且还分析了参与募集和激活适应性免疫细胞的细胞因子(IL-8、IL-23、IL-1β和IL-6)。

方法

细菌菌株

MRx0518

LPS用作阳性对照

结果

结果如图6-13所示。MRx0518在THP-1衍生的巨噬细胞和衍生自单核细胞的DC中诱导出强烈且特征性的免疫刺激概况。MRx0518在DC和巨噬细胞中均显著诱导参与先天性免疫反应的细胞因子(TNF-α、IL-12和IL-10)。MRx0518在巨噬细胞和DC中均诱导非常强烈且显著的IL-8诱导。MRX0581诱导强烈且显著的IL-23和IL-6诱导。MRx0518也诱导IL-1β。

讨论

这些数据表明，MRx0518具有免疫刺激特性，并且可能是有效的免疫刺激组合物。

实施例7–作用机制

进行了进一步的实验以表征MRx0518刺激免疫系统的作用机制。选择了TLR5信号报告基因测定，并且数据提供于图14和图15中。MRx0518上清液是最有效的TLR5和NF-κB激活剂。此外，用各种裂解酶处理上清液，并且发现胰蛋白酶消除了大部分活性。

实施例8–MRx0518与CTLA-4抑制剂的治疗性组合的辅助免疫刺激活性

概述

这项研究比较了MRx0518、CTLA-4抑制剂以及MRx0518与CTLA-4抑制剂的治疗性组合在带有EMT-6肿瘤细胞的小鼠中的抗肿瘤活性。

材料

测试和参考物质–细菌菌株#MRx0518；抗CTLA4抗体(参考：BE0131，Bioxcell；克隆：9H10；反应性：小鼠；同种型：Hamster IgG1；储存条件：+4℃)。

测试和参考物质媒介物–MRx0518细菌在细菌培养基(酵母提取物，酪胨，脂肪酸培养基(YCFA))中生长，并在-80℃下作为甘油储备液保存。根据研究方案向动物施用细菌。在向小鼠注射的每一天，将抗CTLA-4抗体用PBS(参考：BE14-516F，Lonza,France)稀释。

处理剂量–细菌：2x10⁸个于200μL中。根据小鼠的最新体重，以10mg/kg体重施用抗CTLA4抗体。

施用途径–细菌组合物经由管饲管通过经口管饲法(口服，PO)施用，每次注射体积为200μL。将抗CTLA-4抗体以根据小鼠的最新个体体重调整的10mL/kg的体积注射到小鼠的腹膜腔中(腹膜内，IP)。

癌症细胞系和培养条件–这项研究中使用的细胞系是从ATCC(美国典型培养物保藏中心，Manassas,Virginia,USA)获得的EMT-6细胞系。所述EMT-6细胞系是由可移植的鼠类乳腺癌建立的，所述鼠类乳腺癌是在增生性乳腺泡结节植入后在BALB/cCRGL小鼠中产生的。

肿瘤细胞在潮湿气氛(5％CO2、95％空气)中在37℃下以单层生长。培养基是RPMI1640，其含有2mM L-谷氨酰胺(参考：BE12-702F，Lonza,Verviers,Belgium)并补充有10％胎牛血清(参考：3302，Lonza)。EMT-6肿瘤细胞粘附至塑料瓶。对于实验用途，通过在不含钙或镁的汉克斯培养基(参考：BE10-543F，Lonza)中用胰蛋白酶-维尔烯(参考：BE02-007E，Lonza)处理5分钟并通过加入完全培养基中和，从培养瓶分离肿瘤细胞。对细胞进行计数，并通过0.25％台盼蓝排除测定法评估其活力。

动物的使用-5-7周龄的健康雌性BALB/C(BALB/cByJ)小鼠获自CHARLES RIVER(L'Arbresles)并根据FELASA指南保持SPF健康状态。根据法国和欧洲法规以及关于实验动物的护理和使用的NRC指南，实现动物饲养和实验程序。在以下受控的环境条件下将每个笼子3-4只动物饲养在饲养室中：温度：22±2℃，湿度55±10％，光周期(光照12小时/黑暗12小时)，HEPA过滤空气，每小时15次空气交换，无再循环。为动物围栏提供无菌和足够的空间，并提供衬垫材料、食物和水，环境和社会性丰富(集体住宅)，如下所述：顶部过滤聚碳酸酯欧洲标准III型或IV型笼子，玉米芯衬垫(参考：LAB COB 12，SERLAB,France)，25kGy辐照饮食(

Soest,Germany)，用于有免疫能力的啮齿类动物的全食品-R/M-H挤出物，无菌，以0.2μm水过滤和环境丰富(SIZZLE-dri kraft-D20004 SERLAB,France)。用RFID应答器单独地识别动物，并为每个笼子装上特定的代码。第2批和第3批适应一周后，或第1批适应三周后，开始对动物进行处理。

实验设计和处理

在第-14天(D-14)，使用Vivo

软件(Biosystemes,Couternon,France)根据未移植小鼠的个体体重将它们随机分为3个30只动物组和2个10只动物组。每个处理组将小鼠分成3批，每批10只动物(第1批：第1、2和3组的10只动物；第2批：第1、2和3组的10只动物；和第3批，第1至5组的10只动物)，其中从D-14或D0开始研究有不同的终止点。

终止时，由于终止和FACS分析计划，将第3批分为2组，这些动物被错开1天：D24/D25。因此，每个处理组中每组动物有5只动物(来自笼1的4只动物和来自笼2的1只动物)。根据伦理标准，如果肿瘤体积高于1500mm³，则选择在D24和D25处死动物是基于肿瘤体积而不是笼子。实验设计描绘于图16A中并且总结于下：

1)第1批(第1、2和3组)在D0开始治疗并且在D14淘汰(第1至3组的10只动物)。这些动物未接受肿瘤细胞并构成基线组。

2)第2批(第1、2和3组)在D-14开始治疗并且在D7淘汰(第1至3组的10只动物)。

3)第3批(第1至5组)在D-14上开始治疗并且在D24/25淘汰(第1至5组的10只动物)。抗CTLA-4的治疗开始于D10。

在第0天(D0)，通过皮下注射200μL RPMI 1640中的1x10⁶个EMT-6细胞到右侧腹，向第2批和第3批的所有小鼠(分别在第7天和第24/25天终止)植入EMT-6肿瘤细胞(第1批的30只小鼠在D14处死，未接受肿瘤注射)。根据以下处理时间表组对小鼠进行处理(TWx2＝每周两次)：

动物监测

每天记录动物的活力和行为。每周两次测量体重。每周两次用卡尺测量肿瘤的长度和宽度，并通过以下公式估算肿瘤的体积：

根据测试物质对所处理动物(相对于对照动物)的肿瘤体积的作用来评估治疗功效。使用Vivo

软件(Biosystemes,Couternon,France)确定以下抗肿瘤功效的评估标准。第1至5组的平均肿瘤体积描绘于图16B。在整个研究过程中，除MRx0518+抗CTLA-4处理组外，所有组均观察到肿瘤生长的进展，其中MRx0518+抗CTLA-4处理组从肿瘤诱导后第14天开始出现肿瘤生长消退。在肿瘤诱导后第21天和第24天，与媒介物处理组相比，MRx0518+抗CTLA-4治疗显著降低了肿瘤生长。MRx0518与抗CTLA-4的组合治疗对于减少带有皮下移植EMT6肿瘤的BALB/c小鼠的肿瘤生长最有效。这些数据表明MRx0518具有免疫刺激作用。

实施例9–细菌接种物在癌症小鼠模型中的功效

概述

这项研究测试了根据本发明的包含细菌菌株的组合物在肿瘤模型中的功效。

材料

测试物质-细菌菌株#MRx0554。

参考物质-抗CTLA-4抗体(克隆：9H10，目录：BE0131，同种型：Syrian HamsterIgG1,Bioxcell)。

测试和参考物质媒介物-细菌培养基(酵母提取物，酪胨，脂肪酸培养基(YCFA))。每天注射给小鼠，抗体用PBS(参考：BE14-516F，Lonza,France)稀释。

治疗剂量-细菌：2x10⁸个于200μL YCFA中。抗CTLA-4以每次注射10mg/kg的量注射。根据小鼠的最新体重，以每次施用10mL/kg的剂量体积施用抗CTLA-4(即对于体重20g的一只小鼠，将施用200μL的测试物质)。

施用途径-细菌接种物经由插管通过经口管饲法(口服，PO)施用。插管每天进行消毒。将抗CTLA-4注射到小鼠的腹膜腔内(腹膜内，IP)。

细菌菌株的培养条件-细菌菌株的培养条件如下：

·将10mL的YCFA(从准备好的10mL E&O实验室瓶中)吸移到Hungate管中

·密封管并使用注射器输入和排气系统用CO₂冲洗

·对Hungate管进行高压灭菌

·当冷却时，用1mL甘油储备液对Hungate管接种

·将管放在37℃静态温育器中约16小时。

·第二天，取1mL该亚培养物并接种10mL YCFA(再次预热冲洗过的Hungate管，都是一式两份)

·将其放入37℃静态温育器中持续5至6小时

癌细胞系和培养条件-

下表详述了使用的细胞系：

细胞系	类型	小鼠品系	来源
				EMT-6	乳腺癌	BALB/c	ATCC

EMT-6细胞系是由可移植的鼠类乳腺癌建立的，所述鼠类乳腺癌在增生性乳腺泡结节植入后出现在BALB/cCRGL小鼠中[83]。

细胞培养条件-所有细胞系均在37℃下在潮湿气氛(5％CO₂、95％空气)中以单层生长。下表中列出了培养基和补充物：

对于实验用途，通过在无钙或镁的汉克斯培养基(参考：BE10-543F，Lonza)中用胰蛋白酶-维尔烯(参考：BE17-161E，Lonza)处理5分钟并通过加入完全培养基中和，将附着的肿瘤细胞从培养瓶分离。在血细胞计数器中对细胞进行计数，并通过0.25％台盼蓝排除测定法评估其活力。

动物的使用-

从CHARLES RIVER(L'Arbresles)获得体重和年龄匹配的健康雌性BALB/C(BALB/cByJ)小鼠，用于EMT6模型实验。

根据FELASA指南，动物维持在SPF健康状态，并根据法国和欧洲法规以及实验动物的护理和使用的NRC指南进行动物饲养和实验程序[84、85]。在以下受控的环境条件下将动物饲养在饲养室中：温度：22±2℃，湿度55±10％，光周期(光照12小时/黑暗12小时)，HEPA过滤空气，每小时15次空气交换，无再循环。为动物围栏提供无菌和足够的空间，并提供衬垫材料、食物和水，环境和社会性丰富(集体住宅)，如下所述：通风架中的900cm²笼子(参考：绿色，Tecniplast)，Epicea衬垫(SAFE)，10kGy辐照饮食(A04-10，SAFE)，具有免疫能力的啮齿动物的全食品-R/M-H挤出物，瓶装水。

实验设计和处理

抗肿瘤活性，EMT6模型

处理时间表-首次给药的开始时间被视为D0。在D0，使用Vivo

软件(Biosystemes,Couternon,France)根据未移植小鼠的个体体重将它们随机分组，每组8-9只。在D0，小鼠接受媒介物(培养基)或细菌菌株。在D14，如下所述向所有小鼠植入EMT-6肿瘤细胞。在D24，来自阳性对照组的小鼠接受抗CTLA-4抗体处理。

下表中总结了处理时间表：

如下所述进行动物的监测。

在动物中诱导EMT6肿瘤-在D14，通过将200μL RPMI 1640中的1x10⁶个EMT-6细胞皮下注射到小鼠右侧腹来诱导肿瘤。

安乐死-每只小鼠在达到如下所述的人道终点时或在开始给药后最多6周后被安乐死。

动物监测

临床监测-每周两次用卡尺测量肿瘤的长度和宽度并通过此公式估算肿瘤的体积[86]：

人道终点[87]：疼痛、受难或痛苦的迹象：疼痛姿势、疼痛面罩、行为；肿瘤超过正常体重的10％，但不超过2000mm³；肿瘤干扰步行或营养；溃疡性肿瘤或组织糜烂；连续3天剩余体重减轻20％；身体状况不佳，消瘦，恶病质，脱水；长期缺乏对外部刺激的自主反应；快速呼吸困难，贫血，大量出血；神经系统征象：环行，抽搐，瘫痪；体温持续下降；腹胀。

麻醉-异氟烷气体麻醉用于所有程序：外科手术或肿瘤接种、静脉内注射、采血。氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉用于立体定位手术程序。

镇痛-卡洛芬或多模式卡洛芬/丁丙诺啡镇痛方案适应于外科手术的严重程度。对于所有痛苦过程提供非药理护理。另外，应主治兽医的建议，提供不干扰研究(局部处理)的药理护理。

安乐死-动物的安乐死通过以下进行：气体麻醉过量(异氟烷)，然后进行颈脱位或放血。

结果

抗肿瘤活性，EMT6模型

结果如图17所示。相对于两个阴性对照，用本发明的细菌菌株进行处理导致肿瘤体积的明显减小。如预期的那样，阳性对照也导致肿瘤体积减小。

这些数据表明，菌株MRx0554可用于治疗或预防与免疫系统活性降低相关的其它疾病。

实施例10–碳水化合物代谢的分析-MRx0554的API 50 CHL分析

分析概况指数(API)测试系统由包含微型生化检验的试条组成，所述检验测定细菌菌种中的酶活性。这些检验通常用于表征新菌株。进行API 50 CHL测试以检查MRx0554中的碳水化合物代谢。按照制造商的说明，将细菌在10mL YCFA肉汤中于37℃下在厌氧工作站中培养16-18小时。将该培养物稀释在10mL API CHL培养基中，使其密度大致相当于McFarland 2号标准，并使用110μl的该混合物在一套API 50 CH试条上接种每个吸盘。将试条在37℃下在加湿温育箱中于厌氧工作站中温育48小时，然后记录每个吸盘的颜色，并指定负值、中间阳性值、阳性值或可疑值。

使用API 50 CHL分析，MRx0554对L-阿拉伯糖、D-核糖、D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙酰葡糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、水杨苷、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-蔗糖(蔗糖)、D-海藻糖、龙胆二糖、D-塔格糖和葡萄糖酸钾的发酵测试呈阳性(图18)。观察到D-甘露糖醇、甲基α-D-吡喃葡糖苷、D-乳糖、D-棉子糖，淀粉(amidon/starch)和D-松二糖的中间反应。

实施例11–TLR9激活

为了进一步阐明MRx0518刺激免疫系统的机制，使用HEK-Blue^TM人类TLR9报告细胞(InvivoGen，San Diego,CA,USA)来测试MRx0518对TLR9激活的作用。

细胞系和细菌菌株的维持

HEK-Blue^TM人类TLR9报告细胞(InvivoGen，San Diego,CA,USA)在DMEM中生长，该DMEM补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、4mM L-谷氨酰胺、4.5mg/mL葡萄糖、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、100μg/mL Normocin^TM(InvivoGen)、10μg/mL杀稻瘟素(InvivoGen)和100μg/mL zeocin(InvivoGen)达到90％的密度。将细胞维持在37℃和5％CO2下。为了进行测定，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Sigma-Aldrich，Gillingham,England,UK)洗涤一次，并以450,000个细胞/毫升的密度重悬于无抗生素的生长培养基中。除非另有说明，否则所有试剂均由Sigma Aldrich提供。鹑鸡肠球菌MRx0518通常在37℃下在厌氧箱(Don WhitleyScientific，Shipley,England,UK)中于酵母提取物、酪胨、脂肪酸培养基(YCFA，E&OLaboratories，Bonnybridge,Scotland,UK)中培养。

TLR9报告基因测定

研究以下组合物诱导TLR9激活的能力：

1.MRx0518的活级分(MRx0518LV)-对数后期细菌培养物在室温下以5,000x g离心5分钟以产生细菌级分。将沉淀的细菌在PBS中洗涤一次并重悬于无抗生素的细胞培养基中至适当的稀释度。

2.MRx0518上清液级分(MRx0518SN)-收集培养上清液，并通过0.22μm孔径的过滤器过滤并在水中稀释。

3.MRx0518的热灭杀级分(MRx0518HK)-将细菌培养物在80℃下热灭活40分钟，并按上文对于活级分所述制备。

MRx0518LV和MRx0518HK以100:1的感染复数(MOI)使用。MRx0518SN使用100:1MOI等效体积。将合成的CpG寡核苷酸ODN2006(InvivoGen)用作浓度为5μM的测定阳性对照。YCFA用作阴性对照。通过铺板确定活细胞计数。

将HEK-Blue^TM人类TLR9报告细胞与上述处理液一起在37℃下在5％CO2气氛中温育22小时。根据制造商的建议，使用QUANTI-Blue^TM(InvivoGen)对测定显影2小时。图19中描绘的结果是至少三个独立实验的平均值。统计学显著性是使用普通的单因素ANOVA和Tukey多重比较检验确定的。

结果表明，活级分和上清液级分能够激活TLR9。

实施例12–T细胞分化

在外周血单核细胞(PBMC，Stemcell，目录：70025)上体外探索MRx0518诱导T细胞分化的能力。简言之，将PBMC以每孔400,000个接种于涂有抗CD3(Ebioscience，抗CD3单克隆抗体(OKT3克隆)，功能等级，目录号16-0037-81)的96孔板中的每孔50μl cRPMI培养基中(cRPMI含有RPMI 1640(+L-谷氨酰胺，21875-034)2mM最终浓度，储备液200mM；10％HI FBS(Gibco life technologies，10082-147)；50μm巯基乙醇(Gibco life technologies，21985-023)；和1％青霉素/链霉素(P4333，10mg/mL)。然后将热灭杀的MRx0518(通过在80℃下温育30分钟制备，此后将培养物用PBS洗涤并重悬于适当的细胞培养基中，并通过铺板确认活菌计数)添加到每个孔中，100μl/孔中4,000,000个。

在37℃温育器中3天后，将细胞移出并重悬于含有PMA-(Sigma，目录号P8139)、离子霉素(Sigma，目录号I3909)和GolgiSTOP(BD，目录号554724)的培养基中持续5小时。PMA储备液为DMSO中1mg/mL，然后进一步稀释为100ug/mL(每个样品需要cRPMI中50ng/mL)，离子霉素储备液为DMSO中1mM(使用cRPMI中1μM)，并且使用4μl/6mL的GolgiStop浓度。将上清液通过0.22μm过滤器并在共培养基中适当稀释。

然后对细胞进行流式细胞术染色：

洗涤后，将细胞与活力染料(来自Miltenyi biotec的Viobility 405/520FixableDye，1μl/样品)和人类Fc封闭液(目录564219)(1μl/样品)一起在室温下于黑暗中于PBS中温育10分钟。然后将表面抗体(各2μl)在室温下于黑暗中直接添加至孔中持续10分钟，即CD3-APC-Vio 770(Miltenyi，目录号130-113-136)、CD4-VioBlue(Miltenyi，目录号130-114-534)和CD25-VioBright FITC(Miltenyi，目录号130-113-283)。然后将细胞在PBS中洗涤两次并以300g/5min/RT快速离心。

然后使用eBioscience FoxP3转录因子染色缓冲液固定并透化细胞(目录号00-5523)。按照eBioscience方案，使用1份浓缩物溶液和3份稀释剂制备透化/固定缓冲液。将细胞在室温下固定1小时，然后在1x透化洗涤液中洗涤2次，并以300g/5min/RT快速离心。将以下细胞内染色或转录因子抗体添加至透化洗涤液(1x)中的样品中，在黑暗中在室温下持续45分钟或在冰箱中过夜(最多18小时)，然后使用透化洗涤液(300μl)将抗体洗涤2次并重悬于PBS(250μl)中以在血细胞计数器上采集：

细胞内标志物	转录因子
		2ul抗IL10-PE	5.5ul抗FoxP3-PE-Cy7
2ul抗IFNγ-PE Vio770	9ul抗Tbet-APC
		10ul抗IL17a-APC	9ul抗RoRyt-PE

·抗IFNγ-PE Vio770人类抗体(Miltenyi，目录号130-114-025)

·抗IL10-PE人类抗体(Miltenyi，目录号130-112-728)

·抗IL17a-APC人类抗体(Miltenyi，目录号130-099-202)

·抗RORyt-PE人类抗体(Miltenyi，目录号130-103-837)

·抗Tbet-APC人类抗体(Miltenyi，目录号130-098-655

·抗Foxp3单克隆抗体(236A/E7)、PE-Cy7(ebioscience)目录号25-4777-41

如图20A-B可见，即使不存在细胞因子来诱导分化(无细胞因子)，MRx0518的上清液(SP 518)和热灭杀的MRx0518(HK 518)也都能够分别诱导T辅助细胞和细胞毒性T细胞的分化。

实施例13–MRx0518诱导的细胞因子签名

从C57BL/6小鼠中分离出脾细胞，并以900,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中的RPMI1640中，所述RPMI1640补充有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素/链霉素(Sigma-Aldrich)和55μMβ-巯基乙醇(Gibco)。用来自固定相的不同浓度的空白培养基(YCFA⁺)或细菌上清液处理细胞72小时。在每个时间点后收集无细胞上清液，并储存在-80℃下用于细胞因子分析。使用多重procartaplex MO Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/Treg17plex试剂盒(Invitrogen)测量细胞因子。使用MTT测定法(Millipore)测量未处理的脾细胞或通过10％YCFA培养基或10％MRx0518细菌上清液处理的脾细胞的细胞增殖，如图21F所描绘。

将生长中的活MRx0518细菌与人类肠上皮细胞系CaCo-2和人类单核细胞/巨噬细胞细胞系THP-1一起温育长达2小时。立即(CaCo-2)或在进一步24小时温育后(THP-1)分析宿主反应。

冷冻的健康人类PBMC购自Stem Cells Technologies(Cambridge UK)。将细胞解冻，使其在37℃下在CO₂温育器中在完全生长培养基(RPMI 1640，含10％FBS、55μMβ-巯基乙醇、2mM L谷氨酰胺和100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)中静置过夜。对于实验，将细胞以750,000个细胞/孔的密度接种在48孔板中，并在存在或不存在1ng/mL LPS的情况下在含有10％细菌上清液的完全生长培养基中进行处理。将细胞培养基添加至未处理的孔中。使细胞静置72小时，其后收集无细胞上清液并在4℃下以10,000g快速离心3分钟。将样品储存在-80℃以用于细胞因子分析。根据制造商建议(Thermo Fischer Scientific)，使用ProcartaPlex多重免疫测定法进行细胞因子定量。简言之，使用带有xPONENT软件(Luminex,Austin,TX,USA)的

系统(Merck)，将50μl无细胞共培养上清液用于细胞因子定量。使用

分析软件(Merck)使用5参数逻辑曲线和背景减除来分析数据，以将平均荧光强度转换为pg/mL值。

数据在图21A-D中表示为10个生物学重复(PBMC)或3个生物学重复(脾细胞)的两个技术重复的平均值，并且显示以下中的细胞因子的产生：(A)PBMC；(B)脾细胞；(C)THP-1细胞；和(D)Caco-2细胞，在用YCFA空白培养基(“媒介物”)或MRx0518细菌/MRx0518无细胞细菌上清液(“MRx0518”)处理后。图21E描绘了与来自脾细胞(N＝3)、来自未处理(“未处理”)、用YCFA空白培养基(“10％YCFA”)处理或用MRx0518无细胞细菌上清液(“10％MRx0518”)处理的细胞的细胞因子分泌有关的额外数据。

从图21A-D中可见，用MRx0518细菌的上清液处理不同的细胞导致免疫刺激，如细胞因子产生的增加所证明。

实施例14–NF-κB激活

在与人类NOD2基因、TLR4、TLR9或TLR5基因(分别为HEK-Blue^TM-hNOD2、HEK-Blue^TM-hTLR5、HEK-Blue^TM-hTLR9和HEK-Blue^TM-hTLR4细胞，InvivoGen，San Diego,CA,USA)一起共表达NF-κB诱导型分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因的HEK293细胞中测试了NF-κB启动子的激活。

简言之，将HEK-TLR4细胞维持在补充有10％(v/v)热灭活的FBS、4mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、100μg/ml离子霉素、1x HEK-Blue选择培养基的DMEM4.5g/L D-葡萄糖中；对于HEK-TLR5和HEK-TLR9，使用相同的培养基，不同之处在于使用2mML-谷氨酰胺。对于两种细胞系，使用分别30μg/ml和10μg/ml的杀稻瘟素和100μg/ml zeocin培养基将HEK-TLR5和HEK-TLR9选择到培养物中。

对于实验，用PBS洗涤细胞，在PBS中解离并收集在生长培养基中。将细胞以25,000个细胞/孔(对于HEK-TLR4和HEK-TLR5)、80,000个细胞/孔(对于HEK-TLR9)和50,000个细胞/孔(对于HEK-NOD2)的密度接种在96孔板中。

为了评估细胞对其配体的反应性，将细胞用1ng/ml LPS(HEK-TLR4)、1ng/μl来自鼠伤寒沙门氏菌的超纯鞭毛蛋白(HEK-TLR5)、1μM ODN2006 CPG(HEK-TLR9阳性对照)或1μMODN2006 GPC(HEK-TLR9阴性对照)、1ng/ml的L18-MDP处理，并在37℃下在CO₂温育箱中温育。处理在37℃和5％CO₂下进行22小时，然后根据制造商的说明使用QUANTI-blue溶液检测细胞培养上清液中分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)活性。简言之，收集20μl细胞培养基并通过与200μl QUANTI-Blue检测培养基混合来分析SEAP的存在。在37℃下温育2小时(HEK-TLR4和HEK-TLR5)或4小时(HEK-TLR9和HEK-NOD2)后，在酶标仪(iMark microplate，Bio-Rad)上于655nm测量光密度。

如图22A-D(显示三个独立实验的平均技术重复的结果)中可见，在未处理(“未处理”)、用YCFA+培养基(“YCFA”)处理或用MRx0518(“MRx0518”)处理的细胞中测量NF-κB启动子激活。使用以下阳性对照(1ng)：L18-MDP(对于HEK-Blue^TM-hNOD2细胞，图22A)，脂聚糖，LPS(对于HEK-Blue^TM-hTLR4，图22B)，CPG或negC(对于HEK-Blue^TM-hTLR9，图22C)或来自鼠伤寒沙门氏菌的重组鞭毛蛋白FLA(对于HEK-Blue^TM-hTLR5，图22D)。将细胞与各种处理液一起在37℃下在5％CO₂气氛中温育22小时。为了测量NF-κB启动子激活(N＝3)，将QUANTI-Blue^TM(InvivoGen)与细胞上清液混合，将板温育2小时并于655nm测量光密度。

序列

SEQ ID NO:1(鹑鸡肠球菌16S rRNA基因-AF039900)

SEQ ID NO:2(鹑鸡肠球菌菌株MRx0518的共有16S rRNA序列)

SEQ ID NO:3(鹑鸡肠球菌菌株MRx0554的16S rRNA基因)

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[88]Van den Bogert et al.(2014)，PLOS One；9(12)：1-20.

序列表

<110> 4D制药研究有限公司(4D PHARMA RESEARCH LIMITED)

<120> 包含细菌菌株的组合物

<130> P075147WO

<140> 2019-03-19

<160> 3

<170> SeqWin2010, version 1.0

<210> 1

<211> 1506

<212> DNA

<213> 鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)

<400> 1

taatacatgc aagtcgaacg ctttttcttt caccggagct tgctccaccg aaagaaaaag 60

agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccat cagaagggga taacacttgg 120

aaacaggtgc taataccgta taacactatt ttccgcatgg aagaaagttg aaaggcgctt 180

ttgcgtcact gatggatgga cccgcggtgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240

aaggccacga tgcatagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300

cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttcggc aatggacgaa agtctgaccg 360

agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggttttc ggatcgtaaa actctgttgt tagagaagaa 420

caaggatgag agtagaacgt tcatcccttg acggtatcta accagaaagc cacggctaac 480

tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt 540

aaagcgagcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg 600

gtcattggaa actgggagac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca tgtgtagcgg 660

tgaaatgcgt agatatatgg aggaacacca gtggcgaagg cggctctctg gtctgtaact 720

gacgctgagg ctcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780

gtaaacgatg agtgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca gcaaacgcat 840

taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900

ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 960

ttgacatcct ttgaccactc tagagataga gcttcccctt cgggggcaaa gtgacaggtg 1020

gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080

acccttattg ttagttgcca tcatttagtt gggcactcta gcgagactgc cggtgacaaa 1140

ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200

tgctacaatg ggaagtacaa cgagttgcga agtcgcgagg ctaagctaat ctcttaaagc 1260

ttctctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagccggaat cgctagtaat 1320

cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380

cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt tttggagcca gccgcctaag 1440

gtgggataga tgattggggt gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag gtgcggctgg 1500

atcacc 1506

<210> 2

<211> 1444

<212> DNA

<213> 鹑鸡肠球菌菌株MRX518 (Enterococcus gallinarum strain MRX518)

<400> 2

tgctatacat gcagtcgaac gctttttctt tcaccggagc ttgctccacc gaaagaaaaa 60

gagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggt aacctgccca tcagaagggg ataacacttg 120

gaaacaggtg ctaataccgt ataacactat tttccgcatg gaagaaagtt gaaaggcgct 180

tttgcgtcac tgatggatgg acccgcggtg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac 240

caaggccacg atgcatagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300

gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcgg caatggacga aagtctgacc 360

gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggtttt cggatcgtaa aactctgttg ttagagaaga 420

acaaggatga gagtagaacg ttcatccctt gacggtatct aaccagaaag ccacggctaa 480

ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg 540

taaagcgagc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600

ggtcattgga aactgggaga cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc atgtgtagcg 660

gtgaaatgcg tagatatatg gaggaacacc agtggcgaag gcggctctct ggtctgtaac 720

tgacgctgag gctcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780

cgtaaacgat gagtgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc agcaaacgca 840

ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900

cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960

cttgacatcc tttgaccact ctagagatag agcttcccct tcgggggcaa agtgacaggt 1020

ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080

aacccttatt gttagttgcc atcatttagt tgggcactct agcgagactg ccggtgacaa 1140

accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200

gtgctacaat gggaagtaca acgagttgcg aagtcgcgag gctaagctaa tctcttaaag 1260

cttctctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagccggaa tcgctagtaa 1320

tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380

ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttttggagcc agccgcctaa 1440

ggtg 1444

<210> 3

<211> 1506

<212> DNA

<213> 鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)

<400> 3

taatacatgc aagtcgaacg ctttttcttt caccggagct tgctccaccg aaagaaaaag 60

agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccat cagaagggga taacacttgg 120

aaacaggtgc taataccgta taacactatt ttccgcatgg aagaaagttg aaaggcgctt 180

ttgcgtcact gatggatgga cccgcggtgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240

aaggccacga tgcatagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300

cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttcggc aatggacgaa agtctgaccg 360

agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggttttc ggatcgtaaa actctgttgt tagagaagaa 420

caaggatgag agtagaacgt tcatcccttg acggtatcta accagaaagc cacggctaac 480

tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt 540

aaagcgagcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg 600

gtcattggaa actgggagac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca tgtgtagcgg 660

tgaaatgcgt agatatatgg aggaacacca gtggcgaagg cggctctctg gtctgtaact 720

gacgctgagg ctcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780

gtaaacgatg agtgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca gcaaacgcat 840

taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900

ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 960

ttgacatcct ttgaccactc tagagataga gcttcccctt cgggggcaaa gtgacaggtg 1020

gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080

acccttattg ttagttgcca tcatttagtt gggcactcta gcgagactgc cggtgacaaa 1140

ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200

tgctacaatg ggaagtacaa cgagttgcga agtcgcgagg ctaagctaat ctcttaaagc 1260

ttctctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagccggaat cgctagtaat 1320

cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380

cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt tttggagcca gccgcctaag 1440

gtgggataga tgattggggt gaagtcgtaa caaggtagcc gtatcggaag gtgcggctgg 1500

atcacc 1506

Claims (21)

1.一种包含鹑鸡肠球菌菌种的细菌菌株的组合物，所述组合物用于刺激受试者的免疫系统。

2.如权利要求1所述使用的组合物，所述组合物用于治疗、预防或延迟免疫衰老。

3.如权利要求1所述使用的组合物，所述组合物用作疫苗佐剂。

4.如权利要求1所述使用的组合物，所述组合物用于增强细胞疗法，例如CAR-T。

5.如前述权利要求中任一项所述使用的组合物，所述组合物用于增加IL-12p70、IL-8、IL-1β、IL-6IL-23和/或TNF-α的表达水平和/或活性。

6.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物用于增加NF-κB的水平和/或活性。

7.如前述权利要求中任一项所述使用的组合物，其中所述细菌菌株具有与SEQ ID NO:2具至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16s rRNA基因序列，或者其中所述细菌菌株具有由SEQ ID NO:2表示的16s rRNA基因序列。

8.如前述权利要求中任一项所述使用的组合物，其中所述细菌菌株具有与SEQ ID NO:3具至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性的16s rRNA基因序列，或者其中所述细菌菌株具有由SEQ ID NO:3表示的16s rRNA基因序列。

9.如前述权利要求中任一项所述使用的组合物，其中所述细菌菌株是以登录号42488保藏于NCIMB的菌株。

10.如前述权利要求中任一项所述使用的组合物，其中所述细菌菌株是以登录号42761保藏于NCIMB的菌株。

11.如前述权利要求中任一项所述使用的组合物，其中所述组合物用于经口施用。

12.如前述权利要求中任一项所述使用的组合物，其中所述组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。

13.如前述权利要求中任一项所述使用的组合物，其中所述细菌菌株是冻干的。

14.一种食品，所述食品包含如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述食品用于前述权利要求中任一项的用途。

15.一种治疗或预防与免疫刺激降低相关的疾病或疾患的方法，所述方法包括向有需要的患者施用包含鹑鸡肠球菌菌种的细菌菌株的组合物。

16.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1至14中任一项所述的细菌菌株的细胞，其中所述细胞表达一种或多种异源抗原。

17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述细胞呈递所述一种或多种异源抗原。

18.根据权利要求16或权利要求17所述的组合物，所述组合物用作疫苗。

19.如权利要求1至14中任一项所述的细菌菌株的细胞，其中所述细胞表达一种或多种异源抗原。

20.根据权利要求19所述的细胞，其中所述细胞呈递所述一种或多种异源抗原。

21.根据权利要求19或权利要求20所述的细胞，所述细胞用作疫苗。

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