KR20200138346A - Cex 크로마토그래피 매질 및 생물제약 공급물로부터의 표적 단백질의 저염 용출 - Google Patents

Abstract

응집체 및 다른 불순물의 혼합물로부터의 표적 단백질의 낮은 염/낮은 용액 전도도 분리를 위한 결합/용출 크로마토그래피 방법 및 조성물.

Description

CEX 크로마토그래피 매질 및 생물제약 공급물로부터의 표적 단백질의 저염 용출

<관련 출원에 대한 상호 참조>

본 출원은 2018 년 4 월 3 일 출원된 미국 특허 출원 번호 62/651,878로부터 우선권을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

<발명의 분야>

본원은 결합/용출 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 생물제약 공급물로부터 표적 단백질, 예컨대 치료용 단백질 및 항체 분자 항체를 정제하는 방법을 기재한다.

관심 대상의 생물제약 생성물은 배양에서 성장된 세포에 의해 생산된다. 관심 대상의 생성물은 수확되어 일련의 분리 기술을 사용하여 불순물을 제거하기 위해 정제된다. 불순물의 예에는 응집체, 숙주 세포 단백질 (HCP), 및 핵산, 내독소, 바이러스 등이 포함된다 (예를 들어, 문헌[State-of-the-Art in Downstream Processing of Monoclonal Antibodies: Process Trends in Design and Validation Biotechnol. Prog., 2012, 899-916] 참조). 생성물이 진단용, 치료용 또는 다른 적용분야에서 사용되기 전에, 단백질 응집체 및 다른 오염물은 관심 대상의 생성물을 함유하는 생물제약 공급물로부터 제거되어야 한다. 단백질 응집체는 하이브리도마 세포주로부터 수확된 항체 제제에서 종종 발견되고, 그의 의도된 목적을 위해 항체 제제를 사용하기 전에 제거될 필요가 있다. 이는 치료 용도 및 식품의약품안전처와 같은 규제 기관에 대한 준수를 위해 특히 중요하다.

단백질 응집체의 제거는 생물제약 제제에서 단백질 응집체 및 종종 단량체 분자인 관심 대상의 생성물의 물리적 특성과 화학적 특성 사이의 많은 유사성 때문에 도전적일 수 있다. 당업계에는 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 혼합 방식, 히드록시아파타이트, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하여 생물제약 제제로부터 단백질 응집체를 제거하기 위한 다양한 방법이 존재한다.

관심 대상의 생성물로부터 단백질 응집체의 분리를 위한 결합 및 용출 크로마토그래피 방법이 공지되어 있지만, 이들은 불완전한 방법이다. 예를 들어, 히드록시아파타이트는 단백질, 핵산, 뿐만 아니라 항체의 크로마토그래피 분리에 사용되어 왔다. 히드록시아파타이트 크로마토그래피에서, 칼럼이 먼저 평형화되고, 이어서 샘플을 낮은 농도의 포스페이트 완충제와 적용한다. 흡착된 단백질을 용출시키기 위해, 포스페이트 완충제의 높은 농도 구배를 적용한다 (예를 들어, 문헌[Giovannini, Biotechnology and Bioengineering 73:522-529 (2000)] 참조). 그러나, 몇몇 경우에, 연구자들은 히드록시아파타이트로부터 항체를 선택적으로 용출시킬 수 없거나 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피가 충분히 순수한 생성물을 생성하지 않는다는 것을 발견하였다 (예를 들어, 문헌[Jungbauer, J. Chromatography 476:257-268 (1989)]; 문헌[Giovannini, Biotechnology and Bioengineering 73:522-529 (2000)] 참조).

상업적으로 입수 가능한 크로마토그래피 수지인 세라믹 히드록시아파타이트 (CHT)가 수지 포맷으로 사용되어 (바이오라드 코포레이션 (BIORAD CORP), 또한 예를 들어, PCT 출원 WO 2005/044856 참조) 단백질 응집체의 제거에 일부 성공이 있었지만, 그러나 일반적으로 고가이고 단백질 응집체에 대한 낮은 결합능을 나타낸다. 결과적으로, 샘플은 여전히 응집체 불순물로 오염된다.

상기 기재된 것과 같은 공지된 양이온 결합/용출 크로마토그래피 방법이 있지만, 종래의 강한 양이온 교환 크로마토그래피 매질은 관심 대상의 단백질을 용출하기 위해 용출을 위한 높은 농도의 염을 필요로 한다.

본원에는 생물제약 조성물에서, 관심 대상의 생성물, 예를 들어, 치료용 항체 또는 단량체 단백질을 단백질 응집체를 포함하여 불순물로부터 분리하는 방법이 기재되어 있다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 관심 대상의 생성물, 예를 들어 모노클로날 항체 (mAb)의 용출을 표준의, 상업적으로 입수 가능한 양이온 교환 (CEX) 수지로 가능한 것보다 결합/용출 크로마토그래피 동안 낮은 농도의 염을 갖는 완충제로 달성하는 신규의 강한 CEX 매질의 사용을 기재한다.

본원에는 샘플 내의 관심 대상의 단백질 응집체를 포함하는 혼합물로부터 관심 대상의 단량체 단백질을 분리하는 방법이 기재되어 있다. 방법은 샘플을 하나 이상의 부착된 양이온 교환 결합기를 포함하는 고체 지지체와 접촉시키는 것을 포함한다. 관심 대상의 단량체 단백질은 20 mS/cm 미만의 용액 전도도를 갖는 완충제로 선택적으로 용출된다. 다양한 실시양태에서, 관심 대상의 단량체 단백질은 약 10 분의 체류 시간 또는 그 미만, 예를 들어, 5 분, 4 분, 3 분, 2 분, 1 분, 0.5 분의 체류 시간을 제공하기 위한 유속의 완충제로 용출된다.

다양한 실시양태에서, 관심 대상의 단량체 단백질은 모노클로날 항체 또는 재조합 단백질이다.

다양한 실시양태에서, 샘플은 관심 대상의 단량체 단백질 및 관심 대상의 단량체 단백질 응집체의 혼합물을 포함하며, 여기서 샘플은 1 % 이상의 (예를 들어, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 % 또는 그 초과의) 응집체를 포함한다. 이러한 응집체는 이량체, 삼량체, 사량체 또는 보다 고차의 응집체, 또는 이러한 응집체의 조합일 수 있다.

다양한 실시양태에서, 고체 지지체는 비드 또는 막이다. 일반적으로, 고체 지지체는 관심 대상의 단량체 단백질 및 관심 대상의 단백질 응집체 둘 다에 결합할 수 있다. 단량체 및 응집체는 양으로 하전된 단백질과 음으로 하전된 CEX 매질 사이의 정전기 상호작용을 감소시키는 더 높은 농도의 염 및 더 높은 전도도를 갖는 완충제로 용출시 분리된다.

도면은 하나 이상의 본 발명의 버전을 예시하기 위해 제공되며, 특허청구범위의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
도 1A-1D는 본 발명에 포함되는 다양한 조성물의 대표적인 화학 구조를 도시한다. 도 1A-1D는 고체 지지체에 공유 결합된 그라프팅된 중합체 구조를 도시한다. R¹은 양이온-교환기, 예컨대 예를 들어, 술폰산기, 황산기, 인산기, 포스폰산기 또는 카르복실산기이고; R²는 하전된 기를 함유하지 않는 임의의 지방족 또는 방향족 유기 잔기이고; x, y 및 z는 중합체 내의 각각의 단량체의 평균 몰 분획이고; y > x이고; 기호 m은 링커의 다른 말단에 유사한 중합체 쇄가 부착되어 있는 것을 나타내고; R⁴는 NH 또는 O이고; R⁵는 선형 또는 분지형 지방족 또는 방향족 기, 예컨대 -CH₂-, -C₂H₄-, -C₃H₆-, -C(CH₃)₂-CH₂-, -C₆H₄-이고; R⁶은 중합체 쇄에 대한 NH, O 또는 S 링커를 함유하는 선형 또는 분지형 지방족 또는 방향족 비하전 기이고; R⁷ 및 R⁸은 하나 이상의 중성 지방족 및 방향족 유기 잔기를 함유하는 기로부터 독립적으로 선택되고, O, N, S, P, F, Cl 등과 같은 헤테로 원자를 함유할 수 있다.

본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 정의된다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.

용어 "크로마토그래피"는 관심 대상의 생성물 (예를 들어, 치료용 단백질 또는 항체)을 생물제약 공급물 또는 제제와 같은 샘플 내의 다른 성분들의 혼합물로부터 분리하는 임의의 종류의 기술을 지칭한다.

용어 "친화성 크로마토그래피"는 분리가 고정된 리간드와 그의 결합 파트너 사이의 특이적 결합 상호작용을 기초로 하는 단백질 분리 기술을 지칭한다. 그 예는 항체-항원, Fc 도메인-단백질 A, 효소-기질 및 효소-억제제 상호작용을 포함한다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "이온-교환" 및 "이온-교환 크로마토그래피"는 샘플 내의 단백질과 크로마토그래피 매질 사이의 전하-전하 상호작용을 기초로 하는 분리 기술을 지칭한다.

이온 교환 크로마토그래피는 양으로 하전된 이온이 음으로 하전된 크로마토그래피 매질에 결합하는 "양이온 교환 크로마토그래피" 및 음으로 하전된 이온이 양으로 하전된 크로마토그래피 매질에 결합하는 "음이온 교환 크로마토그래피"로 세분될 수 있다.

용어 "이온 교환 매트릭스"는 음으로 하전된 (즉, 양이온 교환 수지) 또는 양으로 (즉, 음이온 교환 수지) 하전된 크로마토그래피 매트릭스를 지칭한다. 전하는 하나 이상의 하전된 리간드를 매트릭스에, 예를 들어, 공유 연결에 의해 부착시킴으로써 제공될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 전하는 매트릭스의 고유한 특성일 수 있다 (예를 들어, 전체 음전하를 갖는 실리카의 경우와 같음).

"양이온 교환 매트릭스" ("CEX")는 음으로 하전되고 매트릭스와 접촉된 수용액 중 양이온과의 교환을 위한 유리 양이온을 갖는 크로마토그래피 매트릭스를 지칭한다. 고체상에 부착되어 양이온 교환 매트릭스를 형성하는 음으로 하전된 리간드는 예를 들어 카르복실레이트 또는 술포네이트일 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 양이온 교환 수지는 카르복시-메틸-셀룰로스, 아가로스 상에 고정된 술포프로필 (SP) (예를 들어, 지이 헬쓰케어 (GE Healthcare)의 SP-세파로스 패스트 플로우 (SP-SEPHAROSE FAST FLOW)™ 또는 SP-세파로스 하이 퍼포먼스 (SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE)™) 및 아가로스 상에 고정된 술포닐 (예를 들어, 지이 헬쓰케어의 S-세파로스 패스트 플로우 (S-SEPHAROSE FAST FLOW)™)를 포함한다. 추가의 예는 친수성 중합체 베이스 비드 상의 프락토겔 (Fractogel)®EMD SO3, 프락토겔® EMD SE 하이캡 (EMD SE Highcap), 에쉬무노 (Eshmuno)® S 및 프락토겔® EMD COO (EMD 밀리포어 (EMD Millipore))를 포함한다.

용어 "음이온 교환 매트릭스" ("AEX")는 양으로 하전된 크로마토그래피 매질, 예를 들어 하나 이상의 양으로 하전된 리간드, 예컨대 4 차 아미노기가 부착된 크로마토그래피 매트릭스를 지칭한다. 상업적으로 입수 가능한 음이온 교환 수지는 DEAE 셀룰로스, QAE 세파덱스 (QAE SEPHADEX)™ 및 패스트 Q 세파로스 (FAST Q SEPHAROSE)™ (지이 헬스케어)를 포함한다. 추가의 예는 친수성 중합체 베이스 비드 상의 프락토겔® EMD TMAE, 프락토겔® EMD TMAE 하이캡, 에쉬무노® Q 및 프락토겔® EMD DEAE (EMD 밀리포어)를 포함한다.

용어 "결합 및 용출 공정," "결합 및 용출 방식," 및 "결합 및 용출 크로마토그래피"는 본원에서 상호교환적으로 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 불순물과 함께 생물제약 조성물에 함유된 관심 대상의 하나 이상의 생성물이, 고체 지지체에 대한 관심 대상의 생성물의 결합을 용이하게 하는 조건 하에 고체 지지체에 접촉되는 생성물 분리 기술을 지칭한다. 관심 대상의 생성물은 후속적으로 고체 지지체로부터 용출된다.

대조적으로, 본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "유통 (flow-through) 공정," "유통 방식" 및 "유통 크로마토그래피"는 하나 이상의 불순물과 함께 생물제약 조성물 내에 함유된 하나 이상의 관심 대상의 생성물이 통상적으로 하나 이상의 불순물에 결합하고 크로마토그래피 매트릭스를 통해 유동하도록 의도되는 생성물 분리 기술을 지칭하고, 여기서 관심 대상의 생성물은 결합하지 않고, 대신 유통한다.

용어 "오염물," "불순물" 및 "잔해"는 하나 이상의 외래 또는 바람직하지 않은 분자로부터 분리되는 관심 대상의 생성물을 함유하는 샘플에 존재할 수 있는 생물학적 거대분자, 예컨대 DNA, RNA, 하나 이상의 숙주 세포 단백질 (HCP), 내독소, 지질, 단백질 응집체, 및 하나 이상의 첨가제를 포함하는 임의의 외래 또는 원치 않는 분자를 지칭한다. 또한, 이러한 오염물은 분리 공정 전에 발생하는 생물공정 단계에서 사용되는 임의의 시약을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 관심 대상의 생성물을 함유하는 샘플로부터 단백질 응집체를 선택적으로 제거하도록 의도된다.

용어 "단백질 응집체" 또는 "단백질 응집체들"은 관심 대상의 생성물, 예를 들어, 치료용 단백질 또는 항체의 2 개 이상의 분자의 회합 (예를 들어, 이량체, 삼량체, 사량체, 고분자량 응집체)을 지칭한다. 단백질 응집은 공유, 비-공유, 디술피드, 또는 비-환원성 가교를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 수단에 의해 발생할 수 있다.

용어 "이량체," "이량체들," "단백질 이량체" 또는 "단백질 이량체들"은 우세하게 2 개의 단량체 분자를 함유하는 응집체로 구성되지만 일부 양의 삼량체 및 사량체를 또한 함유할 수 있는, 보다 낮은 차수 분획의 단백질 응집체를 지칭한다. 이 분획은 통상적으로 SEC 크로마토그램에서의 주요 단량체 피크 직전의 첫번째 분해 가능한 피크로서 관찰된다.

용어 "고분자량 응집체" 또는 "HMW"는 단백질 응집체의 보다 높은 차수의 분획, 즉, 오량체 및 그 이상을 지칭한다. 이 분획은 통상적으로 SEC 크로마토그램에서 이량체 피크 이전의 1 개 이상의 피크로서 관찰된다. 응집체 양 또는 농도는 당업계에서 널리 공지되고 널리 허용되는 방법인 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여 단백질 샘플에서 측정될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Gabrielson et al., J. Pharm. Sci., 96, (2007), 268-279] 참조). UV 흡광도를 사용하여 용출액 중에서 다양한 분자량의 종의 상대 농도를 측정하고, 칼럼 제조업자의 지시에 따라 시스템 보정을 수행함으로써 분획의 분자량을 결정하였다.

표준 모노클로날 항체 (mAb) 정제 계획에서 mAb를 포획하고, 특정 양의 숙주 세포 단백질, DNA 및 비-Fc-함유 항체 단편을 제거하기 위해 정화된 세포 배양물을 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 적용한다. mAb를 포획하는 것 이외에, 단백질 A는 또한 mAb 응집체 및 Fc-함유 항체 단편을 포획할 것이다. 이 혼합물을 단백질 A로부터 용출시키고, 불순물을 추가로 감소시키기 위해 연마되는데, 이에 가장 통상적인 방법은 양이온 교환 (CEX) 결합/용출 크로마토그래피이다. CEX 매질로부터의 용출은 pH 변화와 함께 또는 변화 없이 염 농도를 증가시킴으로써 적정화된다. 완충제 중 염의 농도를 증가시키는 것은 또한 완충제의 용액 전도도를 증가시킨다. 염의 농도 및 용액 완충제의 전도도가 증가하면서 음으로 하전된 술포네이트 CEX 수지와 양으로 하전된 단백질 사이의 정전기력이 감소된다. CEX 단계는 응집체 및 침출된 단백질 A를 제거하는 것을 표적으로 한다. 추가의 연마는 전형적으로 숙주 세포 단백질 (HCP) 및 DNA를 제거하는데 필요하고, 음이온 교환 (AEX) 유통 크로마토그래피에 의해 달성된다.

이 방법의 도전적 측면은 고농도의 염 및 높은 용액 전도도를 갖는 완충제를 사용하는 결합/용출 CEX 크로마토그래피 칼럼으로부터 mAb 단백질이 용출된다는 것이다. 당업계에 공지된 바와 같이, 표준 결합/용출 크로마토그래피에 대한 용액 전도도 범위는 약 20 mS/cm 내지 약 50 mS/cm 사이의 범위이다. 결과적으로, CEX 크로마토그래피로부터 생성된 용출은 후속 유통 크로마토그래피 단계에서 AEX 매질과 불순물의 정전기 결합에 대해 너무 높은 염 농도를 갖는다. 상기 문제는 종래에는 AEX 크로마토그래피에 적용하기 전에 CEX mAb 용출을 희석함으로써 해결되었다. 그러나 이는, mAb 단백질 CEX 용출의 희석이 mAb 단백질 용액의 부피를 현저하게 증가시키고, 따라서 AEX 크로마토그래피, 바이러스 제거 막 및 한외여과를 비롯한 후속 단계를 처리하는데 필요한 시간을 유의하게 연장시키기 때문에 또 다른 문제를 도입한다. 더 긴 공정 시간은 생산을 방해하고, 생산 비용을 증가시키고, 장비 고장에 대한 잠재성을 증가시키고, 따라서 제품을 장비 고장으로 인한 잠재적 오염에 노출시킨다.

이러한 공정의 용출 측면의 또 다른 도전적 측면은 mAb 단백질이 mAb가 CEX 매질과 강하게 상호작용하는 경우, mAb가 몇몇 상이한 분획에 걸쳐 보다 낮은 농도에서 칼럼으로부터 단지 서서히 용출될 수 있다는 것이다. 따라서, 결과적으로 낮은 농도를 갖는 더 큰 용출 부피가 얻어진다. mAb 단백질 용액의 부피 증가는, AEX 크로마토그래피, 바이러스 제거 막 및 한외여과를 비롯한 후속 단계를 처리하는데 필요한 시간을 연장시키는 것을 필요로 한다. 더 긴 공정 시간은 생산을 방해하고, 생산 비용을 증가시키고, 장비 고장에 대한 잠재성을 증가시키고, 따라서 제품을 장비 고장으로 인한 잠재적 오염에 노출시킨다.

이와 대조적으로, 본원에 기재된 바와 같이, 응집체의 유통 제거를 위해 설계된 강한 CEX 크로마토그래피 매질 (본원에서 "유통 CEX 크로마토그래피 매질" 또는 "유통 CEX 매질"로서 지칭됨)은 놀랍게도 결합/용출 방식의 크로마토그래피에서 응집체의 제거에 유용한 것으로 밝혀졌다. 본원에서 입증되는 바와 같이, 결합/용출 크로마토그래피에 사용되는 현재 상업적으로 입수 가능한 강한 CEX 크로마토그래피 매질로 가능한 것보다 mAb 단백질은 더 높은 단백질 농도 및 더 낮은 용액 전도도에서 상기 유통 CEX 매질로부터 용출될 수 있다.

본원에 기재된 바와 같이, 결합/용출 용출은 낮은 염 농도를 갖는 용출 완충제로 유통 CEX 매질 상에서 수행될 수 있고, 이 완충제는 낮은 용액 전도도를 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 낮은 용액 전도도 용출 완충제는 약 10 mS/cm 내지 약 20 mS/cm 범위의 전도도를 갖는다. 다양한 실시양태에서, 낮은 전도도 용출 완충제는 약 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17 mS/cm, 18 mS/cm, 19 mS/cm, 20 mS/cm 또는 그의 임의의 범위의 전도도를 갖는다. 보다 낮은 염 농도에서 이러한 유통 CEX 크로마토그래피 매질로부터 표적 단백질을 용출시키는 것이 유리한데, 그 이유는 이후의 AEX 유통 크로마토그래피 단계 전에 요구되는 희석의 양을 감소시키기 때문이며, 그 이유는 그렇지 않으면 높은 염 농도가 AEX에 대한 불순물의 정전기 결합을 억제할 것이기 때문이다.

뜻밖에도, 유통 CEX 크로마토그래피 매질을 사용한 결합/용출 방식의 크로마토그래피가 더 높은 농도의 표적 단백질 (예를 들어, 재조합 단백질 또는 항체, 예컨대 mAb)을 함유하는 보다 작은 분획 부피를 초래한다는 것이 또한 발견되었다. 따라서, 나머지 하류 정제 단계에서의 보다 높은 농도에서 표적 단백질을 가공하는 것은, 용출액의 유의한 희석이 필요하지 않기 때문에 후속 가공 단계 (예를 들어, AEX 유통, 바이러스 막, 한외여과/정용여과 (UF/DF) 막 단계) 및 비용을 감소시키는 것을 용이하게 하는데, 이는 달리 용출액 부피를 현저하게 증가시켜, 필요한 매질의 양 및 각각의 후속 공정 단계에서 요구되는 시간의 길이를 증가시킨다.

보다 특히, 강한 촉수형 양이온 교환 매질이 용출을 위해 드물게 낮은 염 농도가 사용된 결합/용출 크로마토그래피 방식에서 단백질 응집체, 예컨대 항체 응집체를 제거하는 것으로 발견되는 놀라운 발견이 이루어졌다. 예시적 양이온 교환 크로마토그래피 매질은 US 2013/0245139에 기재되어 있고, 그의 교시내용은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 예를 들어, 고체 지지체는 다공성 또는 비다공성일 수 있고, 또는 예컨대 모노리스 또는 막의 형태로 연속적일 수 있다. 고체 지지체는 또한 예컨대 입자, 비드 또는 섬유의 형태로 불연속적일 수 있다. 어느 경우에서든 (연속적 또는 불연속적), 고체 지지체의 중요한 특징은 이들이 높은 표면적, 기계적 완전성, 수성 환경에서의 완전성, 및 결합기의 접근성을 보장하는 유동 분포를 제공하는 능력을 갖는다는 것이다. 다양한 실시양태에서, 유통 CEX 매질은 폴리비닐에테르 수지를 포함한다. 전형적으로, 비드 수지는 약 50 ㎛의 대략적인 직경을 갖는다.

예시적인 불연속 고체 지지체는 다공성 크로마토그래피 비드를 포함한다. 당업자에 의해 용이하게 인식되는 바와 같이, 크로마토그래피 비드는 매우 다양한 중합체 및 무기 물질, 예컨대 다당류, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 폴리스티렌, 비닐 에테르, 제어된 공극 유리, 세라믹 등으로부터 제조될 수 있다. 예시적인 상업적으로 입수 가능한 크로마토그래피 비드는 EMD 밀리포어 코포레이션 (EMD Millipore Corp.)으로부터의 CPG; GE 헬스케어 라이프 사이언시스 AB로부터의 세파로스®; 토소 바이오사이언스 (Tosoh Bioscience)로부터의 토요펄 (TOYOPEARL)® 및 라이프 테크놀로지스 (Life Technologies)로부터의 포로스 (POROS)®이다. 다양한 실시양태에서, 비드는 폴리비닐에테르 수지이다.

다른 고체 지지체는 당업계에 공지된 바와 같은 막, 모노리스, 직조 및 부직 섬유상 지지체를 포함한다.

일부 실시양태에서, 바람직한 결합기는 이온성 기이다. 특정 실시양태에서, 결합기는 음으로 하전된 술포네이트 기이다. 일반적으로, 음으로 하전된 술포네이트 기는 몇몇 이점을 갖는다. 예를 들어, 이들은 용액 중에서 양으로 하전된 단백질에 결합하는 광범위한 적용 가능성을 나타내고; 화학 물질은 용이하게 이용 가능한 많은 합성 제조 방법을 이용하여 저렴하고 간단하고; 결합기와 단백질 사이의 상호작용은 잘 이해되어 있고 (예를 들어, 문헌[Stein et al., J. Chrom. B, 848 (2007) 151-158] 참조), 상호작용은 용액 조건을 변경함으로써 용이하게 조작될 수 있고, 이러한 상호작용은 다른 상호작용으로부터 단리될 수 있다.

다양한 실시양태에서, 본 발명에 따른 중합체는 중합체가 고체 지지체 상에 공유 결합을 통해 그라프팅되는 하기 화학 구조를 포함한다:

여기서, R¹은 양이온-교환기이고; R²는 하전된 기를 함유하지 않는 임의의 지방족 또는 방향족 유기 잔기이고; x 및 y는 중합체 내의 각각의 단량체의 평균 몰 분획이고, 여기서 y > x이다. 다양한 실시양태에서, y는 적어도 1.5x, 적어도 2x, 적어도 2.5x, 적어도 3x, 적어도 4x, 또는 그 초과이다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 중합체는 하기 화학 구조를 포함한다:

여기서, x 및 y는 중합체에서 각각의 단량체의 평균 몰 분획이고, 여기서 y > x이고, 중합체는 크로마토그래피 수지 상으로의 결합을 통해 그라프팅된다. 다양한 실시양태에서, y는 적어도 1.5x, 적어도 2x, 적어도 2.5x, 적어도 3x, 적어도 4x, 또는 그 초과이다.

고체 지지체에 그라프팅된 결합기 함유 중합체의 또 다른 대표적인 화학 구조가 도 1A에 도시되어 있다. 고체 지지체는 직사각형으로 도시되어 있다. 도 1A에서, R¹은 양이온-교환기 예컨대, 술폰산기, 황산기, 인산기, 포스폰산기 또는 카르복실산기를 함유하는 임의의 지방족 또는 방향족 유기 잔기이고; R²는 하전된 기를 함유하지 않는 임의의 지방족 또는 방향족 유기 잔기인 중합체 구조가 제시된다. 도 1A에 도시된 중합체 구조에서 y > x이고, 이는 중성 기 ("R²"로 표시됨)가 하전된 기 ("R¹"으로 표시됨)보다 더 큰 수로 존재하는 것을 의미한다.

일부 실시양태에서, 결합기를 함유하는 그라프트 중합체는 블록 공중합체이고, 이는 한 종류의 단량체의 긴 스트링 또는 블록 (예를 들어, 중성 또는 하전된 결합기를 함유하는)에 이어서 다른 종류의 (예를 들어, 첫번째 블록이 중성이면 하전된, 및 첫번째 블록이 하전되었다면 중성인) 단량체의 긴 스트링 또는 블록을 포함하는 것을 의미한다.

다른 실시양태에서, 결합기를 함유하는 중합체는 랜덤 순서로 단량체를 함유한다.

다른 실시양태에서, 결합기를 함유하는 중합체는 교호 공중합체인 반면, 각각의 단량체는 항상 상이한 종류의 2 개 단량체에 인접한다.

일부 실시양태에서, 결합기 함유 중합체의 대표적인 화학 구조는 도 1B에 도시되어 있고, 여기서 R⁴는 NH 또는 O이고; R⁵는 선형 또는 분지형 지방족 또는 방향족 기, 예컨대 -CH₂-, -C₂H₄-, -C₃H₆-, -C(CH₃)₂-CH₂-, -C₆H₄-이고; R⁶은 중합체 쇄에 대한 NH, O, 또는 S 링커를 함유하는 선형 또는 분지형 지방족 또는 방향족 비하전 기이다.

다른 실시양태에서, 결합기 함유 중합체의 대표적인 화학 구조는 도 1C에 도시되어 있다. R⁷ 및 R⁸은 하나 이상의 중성 지방족 및 방향족 유기 잔기를 함유하는 기로부터 독립적으로 선택되고, 헤테로원자, 예컨대 O, N, S, P, F, Cl 등을 함유할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 결합기 함유 중합체의 대표적인 구조는 도 1D에 도시되어 있다.

도 1B 내지 1D의 술폰산 기는 도시된 바와 같은 양성자화된 형태, 뿐만 아니라 적합한 반대이온, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄 등을 함유하는 염 형태일 수 있다.

다양한 실시양태에서, 고체 지지체는 2-아크릴아미도-2-메틸프로판 술폰산 (AMPS) 및 N,N-디메틸아크릴아미드 (DMMA)로 관능화된 폴리비닐 에테르 수지를 포함한다. 다양한 실시양태에서, DMMA 대 AMPS의 몰비는 2.0 초과이다. 예를 들어, DMMA 대 AMPS의 몰비는 적어도 또는 약 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0 또는 그 이상이다.

크로마토그래피 칼럼은 다수의 적합한 물질, 예컨대 유리, 금속, 세라믹 및 플라스틱으로부터 생산될 수 있다. 이들 칼럼은 최종 사용자에 의해 고체 지지체로 패킹될 수 있거나, 또는 제조자에 의해 사전 패킹되고, 최종 사용자에게 패킹된 상태로 운송될 수 있다.

다양한 실시양태에서, 용출 완충제는 10 mS/cm 내지 20 mS/cm 사이의 용액 전도도를 갖는 저염 완충제를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어진다. 다양한 실시양태에서, 용출 완충제는 약 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17 mS/cm, 18 mS/cm, 19 mS/cm, 20 mS/cm 또는 그의 임의의 범위의 전도도를 갖는다.

다양한 실시양태에서, 관심 대상의 생성물을 함유하는 용출액은 본원에 기재된 하나 이상의 분리 방법에 적용되며, 여기서 용출액은 20 % 미만, 또는 15 % 미만, 또는 10 % 미만, 또는 5 % 미만, 또는 2 % 미만, 또는 1 % 미만의 단백질 응집체를 함유한다.

본 발명에 따른 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및/또는 조성물은 단백질 A 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정된 금속 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 정용여과, 한외여과, 바이러스 제거 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피 중 하나 이상과 조합되어 사용될 수 있다.

실시예

실시예 1. 0.5 분의 체류 시간으로 용출하는 결합/용출 크로마토그래피

결합/용출 크로마토그래피 실험을 수행하여 0.5 분의 체류 시간으로 용출될 때 모노클로날 항체 공급물로부터의 응집체 제거를 비교하였다. 종래의 결합/용출 CEX 크로마토그래피 매질 (에쉬무노® CPX로 대표됨) 및 유통 CEX 크로마토그래피 매질의 상대적인 능력을 결정하기 위해 2 개의 CEX 크로마토그래피 매질이 시험되었고, 여기서 유통 CEX 크로마토그래피 매질은 유통 방식보다는 결합/용출 방식으로 사용되었다. CEX 크로마토그래피 매질 둘 다는 미국 매사추세츠주 벌링턴 소재의 EMD 밀리포어 코포레이션으로부터 입수 가능한 친수성 폴리비닐에테르 CEX 비드 매질이다.

실험을 위해 사용된 공급물은 mAb05 모노클로날 항체 공급물이었고, pH 4.9의 100 mM 아세트산나트륨 중 18 mg/mL의 농도시 7 % 응집체이었다. 1.0 M 아세트산을 적가함으로써 공급물을 pH 4.5로 조정하고, 이어서 0.45 μm 막 (스테리플립 (STERIFLIP)®-HV, 0.45 ㎛, PVDF, 방사성-멸균, 파트 번호: SE1M003M00, EMD 밀리포어 코포레이션, 미국 매사추세츠주 벌링턴)을 통해 여과하였다.

지이 헬쓰케어 라이프 사이언시스 (GE Healthcare Life Sciences)로부터의 AKTA 아반트 (AKTA Avant) 25 크로마토그래피 시스템 상에서의 280 nm의 파장에서 UV 흡광도 검출기를 사용하여 실험을 수행하였다. 크로마토그래피 수지를 수퍼포먼스 (Superformance)® 5 mm 내부 직경에 20.0 cm의 베드 높이 (칼럼 부피 = 3.93 mL)에 12 %의 압축 인자로 패킹하였다. 칼럼을 pH 4.5의 100 mM 아세트산나트륨을 사용하여 5 칼럼 부피 동안 유속 1.0 mL/분으로 평형화시킨 후, 1.0 M 수산화나트륨으로 10 칼럼 부피 동안 1.0 mL/분의 유속으로 세정한 후, pH 4.5의 100 mM 아세트산나트륨으로 10 칼럼 부피 동안 1.0 mL/분의 유속으로 평형화시킴으로써 예비세정하였다.

결합/용출 크로마토그래피 실험은 구배 용출을 사용하였고, 표 1에 기재된 순서에 따라 수행하였다. 본 실험에서, "완충제 A"는 pH 4.5의 100 mM 아세트산나트륨으로 구성되었고, "완충제 B"는 pH4.5의 100 mM 아세트산나트륨, 0.5 M 염화나트륨으로 구성되었다. 3.93 mL 크로마토그래피 칼럼에 18 mg/mL의 농도를 갖는 8.8 mL의 mAb05 공급물을 로딩하여 40 mg/mL의 로딩을 제공하였다.

표 1: 결합/용출 크로마토그래피 공정

구배 용출의 분획을 수집하였다. 280 nm에서의 용액의 흡광도를 측정함으로써 각각의 분획에서 mAb05의 농도를 측정하였다. 각각의 분획 내의 응집체의 퍼센트를 VWR 시스템으로부터의 라크롬 엘리트 (LaChrom Elite)® L-2200 HPLC를 사용하는 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정하였다. HPLC 시스템은 페노메넥스 주식회사 (Phenomenex Inc.)로부터의 프리-칼럼 (3.2 내지 8.0 mm 내부 직경을 갖는 HPLC GFC 3000 칼럼의 시큐리티가드 (SecurityGuard)™ 카트리지, 파트 번호: AJ0-4488) 및 분석적 크기 배제 크로마토그래피 칼럼 (바이오셉 (BioSep)™ 5 μm SEC-s3000 400 Å, LC 칼럼 300 x 7.8 mm, 파트 번호: 00H-2146-K0) 둘 다를 사용하였다. 이어서, 하기 표 2 및 표 3에 제시된 바와 같이, 응집체 퍼센트, mAb 회수율, 전도도, 및 mAb 농도의 누적 풀 (cumulative pool)을 계산하였다.

표 2: 에쉬무노® CPX에서의 0.5 분 체류 시간

표 3: 유통 CEX 크로마토그래피 매질에서의 0.5 분 체류 시간

표 2 및 표 3은 에쉬무노® CPX로 대표되는 종래의 CEX 크로마토그래피 매질 또는 유통 CEX 크로마토그래피 매질에 대한 칼럼 로딩의 함수로 나타낸 0.5 분의 체류 시간에서의 계산된 누적 풀을 보여준다 (하기 참조). 칼럼 상에 로딩된 mAb05 공급물은 7 %의 응집체를 가졌고, 구배 용출을 사용하여 pH 4.5의 100 mM 아세테이트로부터 출발하여 20 칼럼 부피에 걸쳐 pH 4.5의 0.5 M NaCl로 용출하여 100 mM 아세테이트로 증가하는 칼럼으로부터 용출되었다.

0.5 분의 체류 시간에서 mAb05가 에쉬무노® CPX로부터 서서히 용출되는 것으로 밝혀졌다 (표 4). 분획 1-10을 합하여 누적 응집체 0.15 %, 누적 mAb 회수율 85 %, 누적 전도도 35.87 mS/cm, 및 누적 농도 2.89 mg/mL를 수득하였다. 대조적으로, mAb05는 유통 CEX 크로마토그래피 매질로부터 보다 빠르게 용출되었다. 분획 1-3을 합하여 누적 응집체 0.72 %, 누적 mAb 회수율 93 %, 누적 전도도 15.28 mS/cm, 및 누적 농도 10.58 mg/mL를 수득하였다. 응집체 제거 및 mAb 회수율은 두 크로마토그래피 매질에 대해 매우 유사하였음에 주목한다. 그러나, 유통 CEX 크로마토그래피 매질로부터의 용출은 에쉬무노® CPX로부터 용출하기 위해 요구되는 용액 전도도의 절반 미만의 용액 전도도에서 달성되었고, 용출은 3 배 초과로 더 농축되었다.

표 4: 에쉬무노® CPX 및 유통 CEX 크로마토그래피 매질에서의 0.5 분 체류 시간에서 결합/용출 응집체 제거

실시예 2. 3 분의 체류 시간으로 용출하는 결합/용출 크로마토그래피

실시예 1과 유사하게, 결합/용출 크로마토그래피 실험을 수행하였지만 대신 3 분의 체류 시간으로 용출하였다.

실험을 위해 사용된 공급물은 mAb05 모노클로날 항체 공급물로 pH 4.9의 100 mM 아세트산나트륨 중 18 mg/mL의 농도의 7 % 응집체이었다. 1.0 M 아세트산을 적가함으로써 공급물을 pH 4.5로 조정하고, 이어서 EMD 밀리포어 코포레이션으로부터 0.45 ㎛ 막 (스테리플립®-HV, 0.45 ㎛, PVDF, 방사성-멸균, 파트 번호: SE1M003M00)을 통해 여과하였다.

지이 헬쓰케어 라이프 사이언시스로부터의 AKTA 아반트 25 크로마토그래피 시스템 상에서의 280 nm의 파장에서 UV 흡광도 검출기를 사용하여 실험을 수행하였다. 크로마토그래피 수지를 수퍼포먼스® 내부 직경 5 mm에 20.0 cm의 베드 높이 (칼럼 부피 = 3.93 mL)에 12 %의 압축 인자로 패킹하였다. 칼럼을 pH 4.5에서의 100 mM 아세트산나트륨을 사용하여 5 칼럼 부피 동안 유속 1.0 mL/분으로 평형화시킨 후, 1.0 M 수산화나트륨으로 1.0 mL/분의 유속으로 10 칼럼 부피 동안 세정한 후, pH 4.5의 100 mM 아세트산나트륨으로 1.0 mL/분의 유속으로 10 칼럼 부피 동안 평형화시킴으로써 예비세정하였다.

결합/용출 크로마토그래피 실험은 구배 용출을 사용하였고, 표 5에 기재된 순서에 따라 수행하였다. 본 실험에서, "완충제 A"는 pH 4.5의 100 mM 아세트산나트륨으로 구성되었고, "완충제 B"는 pH 4.5의 100 mM 아세트산나트륨, 0.5 M 염화나트륨으로 구성되었다. 3.93 mL 크로마토그래피 칼럼에 18 mg/mL의 농도를 갖는 8.8 mL의 mAb05 공급물을 로딩하여 40 mg/mL의 로딩을 제공하였다.

표 5: 결합/용출 크로마토그래피 공정

구배 용출의 분획을 수집하였다. 280 nm에서의 용액의 흡광도를 측정함으로써 각각의 분획에서 mAb05의 농도를 측정하였다. 각각의 분획 내의 응집체 퍼센트를, VWR로부터의 라크롬 엘리트® L-2200 HPLC 시스템을 사용하는 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정하였다. HPLC 시스템은 페노메넥스 주식회사로부터의 프리-칼럼 (3.2 내지 8.0 mm 내부 직경을 갖는 HPLC GFC 3000 칼럼의 시큐리티가드™ 카트리지, 파트 번호: AJ0-4488) 및 분석적 크기 배제 크로마토그래피 칼럼 (바이오셉™ 5 ㎛ SEC-s 3000 400 Å, LC 칼럼 300 x 7.8 mm, 파트 번호: 00H-2146-K0) 둘 다를 사용하였다. 하기 표 6 및 표 7에 나타낸 바와 같이, 응집체 퍼센트, mAb 회수율, 전도도, 및 mAb 농도의 누적 풀을 계산하였다.

표 6: 에쉬무노® CPX에서의 3.0 분 체류 시간

표 7: 유통 CEX 크로마토그래피 매질에서의 3.0 분 체류 시간

표 6 및 표 7은 에쉬무노® CPX로 대표되는 종래의 CEX 크로마토그래피 매질 또는 유통 CEX 크로마토그래피 매질에 대한 칼럼 로딩의 함수로 나타낸 3.0 분의 체류 시간에서의 계산된 누적 풀을 보여준다 (하기 참조). 칼럼 상에 로딩된 mAb05 공급물은 7 %의 응집체를 가졌고, 구배 용출을 사용하여 pH 4.5의 100 mM 아세테이트로부터 출발하여 20 칼럼 부피에 걸쳐 pH 4.5의 0.5 M NaCl로 용출하여 100 mM 아세테이트로 증가하는 칼럼으로부터 용출되었다.

3.0 분의 체류 시간에서 mAb05가 에쉬무노® CPX로부터 서서히 용출되는 것으로 밝혀졌다 (표 8). 분획 1-11을 합하여 누적 응집체 0.45 %, 누적 mAb 회수율92 %, 누적 전도도 35.44 mS/cm 및 누적 농도 2.86 mg/mL를 제공하였다. 대조적으로, mAb05는 유통 CEX 크로마토그래피 매질로부터 보다 빠르게 용출되었다. 분획 1-4를 합하여 누적 응집체 0.57 %, 누적 mAb 회수율 90 %, 누적 전도도 14.99 mS/cm, 및 누적 농도 7.66 mg/mL를 제공하였다. 응집체 제거 및 mAb 회수율은 두 크로마토그래피 매질에 대해 매우 유사하였음에 주목한다. 그러나, 유통 CEX 크로마토그래피 매질로부터의 용출은 유통 CEX 크로마토그래피 매질로부터 용출되는데 필요한 용액 전도도의 절반 미만의 용액 전도도에서 달성되었고, 용출은 2 배 초과로 농축되었다.

표 8: 에쉬무노® CPX 및 유통 CEX 크로마토그래피 매질에서의 3.0 분 체류 시간에서 결합/용출 응집체 제거

본 명세서는 본원에 참고로 포함된 명세서 내에서 인용된 참고문헌의 교시내용에 비추어 가장 완전히 이해된다. 본 명세서 내의 실시양태는 본 발명의 실시양태의 예시를 제공하고, 그의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 당업자는 많은 다른 실시양태가 본 발명에 포함됨을 쉽게 인식한다. 모든 간행물 및 발명은 그 전문이 참고로 포함된다. 참고로 포함된 자료가 본 명세서와 모순되거나 또는 일치하지 않는 경우 본 명세서가 임의의 이러한 자료를 대체할 것이다. 본원에서 임의의 참고문헌의 인용은 이러한 참고문헌이 본 발명에 대한 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.

달리 나타내지 않는 한, 특허청구범위를 포함한 명세서에서 사용된 성분의 양, 세포 배양물, 치료 조건 등을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 달리 지시되지 않는 한, 수치 파라미터는 근사치이고, 본 발명에 의해 얻어지는 목적하는 특성에 따라 변할 수 있다. 달리 나타내지 않는 한, 일련의 요소 앞의 용어 "적어도"는 시리즈 내의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 특허청구범위에 포함되도록 의도된다.

본 발명의 변형 및 변이는 당업자에게 명백할 바와 같이 그의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 구체적 실시양태는 단지 예로서 제공되며, 어떠한 방식으로도 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로 간주되고, 본 발명의 진정한 범주 및 취지는 하기 특허청구범위에 의해 지시되는 것으로 의도된다.

Claims (6)

1. 샘플을 고체 지지체와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 고체 지지체는 2-아크릴아미도-2-메틸프로판 술폰산 (AMPS) 및 N,N-디메틸아크릴아미드 (DMMA)로 관능화된 폴리비닐 에테르 수지를 포함하고, 여기서 DMMA 대 AMPS의 몰비는 2.0 초과이고, 관심 대상의 단량체 단백질을 약 10 mS/cm 내지 20 mS/cm 사이의 용액 전도도를 갖는 완충제로 고체 지지체로부터 용출시키는 것을 포함하는, 샘플 중 관심 대상의 단백질의 응집체를 포함하는 혼합물로부터 관심 대상의 단량체 단백질을 분리하는 방법.
2. 제1항 또는 제2항에 있어서, 관심 대상의 단량체 단백질이 모노클로날 항체인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 관심 대상의 단백질이 재조합 단백질인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물이 1 % 이상의 관심 단백질의 응집체를 포함하는 것인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체가 비드인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 고체 지지체가 막인 방법.
   

Images