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KR20200135397A - 펩티드-mhc 복합체에 대한 치료 항체를 생성하기 위한 유전적으로 변형된 비인간 동물, 이의 제조 방법 - Google Patents

펩티드-mhc 복합체에 대한 치료 항체를 생성하기 위한 유전적으로 변형된 비인간 동물, 이의 제조 방법 Download PDF

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KR20200135397A
KR20200135397A KR1020207029335A KR20207029335A KR20200135397A KR 20200135397 A KR20200135397 A KR 20200135397A KR 1020207029335 A KR1020207029335 A KR 1020207029335A KR 20207029335 A KR20207029335 A KR 20207029335A KR 20200135397 A KR20200135397 A KR 20200135397A
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KR
South Korea
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human
mhc
humanized
endogenous
molecule
Prior art date
Application number
KR1020207029335A
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English (en)
Inventor
앤드류 제이. 머피
Original Assignee
리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 filed Critical 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

비인간 동물은 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 관련 분자, 예를 들어, β2 마이크로글로불린을 암호화하는 서열로 유전적으로 변형되고, 비인간 동물에 의한 서열의 발현은 인간 또는 인간 MHC 분자가 유래되는 상응하는 인간 HLA에 대한 내성을 유도한다. 이러한 비인간 동물에 의해 나타나는 내성은 인간 HLA가 비인간 동물에 대한 항원성인 펩티드를 제시할 때 이러한 상응하는 인간 HLA에 대한 특이적 항체 반응을 생성할 수 있게 한다. MHC 분자에 결합하지 않고 관심 pMHC 복합체를 특이적으로 표적으로 하는 이러한 항체 반응은 해당 상호 작용의 특이성을 제공하는 면역학적 시냅스의 성분을 표적화하는 면역치료 양식에 유용할 수 있다.

Description

펩티드-MHC 복합체에 대한 치료 항체를 생성하기 위한 유전적으로 변형된 비인간 동물, 이의 제조 방법
기술 분야
인간(화) MHC 분자가 비인간 동물에 대해 이질적인 펩티드(비인간 동물에 대해 이종인 펩티드)를 제시할 때(예를 들어, 펩티드와 복합체화 될 때)(예를 들어, 펩티드/MHC (pMHC) 복합체의 일부분일 때), 인간(화) MHC 분자에 대해 강력한 B 세포 반응을 생성할 수 있도록 유전적으로 변형된 비인간 동물(예를 들어, 랫트, 마우스 등과 같은 설치류)로서, 인간(화) MHC 분자(예를 들어, 공 인간(화) MHC 분자, 이에 한정되지는 않음) 또는 이의 결합 부분(예를 들어, MHC 분자의 펩티드 결합 홈)에 대해 내성을 갖는 비인간 동물이 본원에 개시된다. 이러한 동물은 병원성 pMHC 복합체에 대한 치료 항원 결합 단백질, 예를 들어, 인간 HLA의 맥락에서 제시된 자가면역원성 인간 자체 펩티드를 생성하는 데 유용할 수 있다.
관련 출원
본 출원은, 2018년 3월 24일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/647,720호, 및 2018년 3월 24일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/647,724호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
서열 목록
본 명세서는, 2019년 3월 22일에 생성되고, 38.9 킬로바이트 파일 크기를 갖는 "10116WO01_ST25_AsFiled"라는 이름의 ascii.txt 파일로서 전자 형태로 제출된 서열 목록을 참조하며, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
T 세포는 적응성 항-감염증 또는 항종양 반응에서 중요한 역할을 하지만, 이들은 자가면역 및 이식 거부 반응 같은 부적응성 면역 반응에서도 역할을 한다. 일반적으로, T 세포 매개 면역 반응은 T 세포와 항원 제시 세포(APC) 간의 밀접한 접촉을 수반한다. 여러 분자의 페어링(pairing)은 (a) APC 상의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자의 펩티드 결합 홈에 제시된 펩티드에 특이적으로 결합하는, T 세포 상의 T 세포 수용체(TCR), 및 (b) APC 상의 B7 분자와 쌍을 이루는 (T 세포 상의) CD28을 포함하되 이들로 한정되지 않는 T 세포 활성을 유발하는 면역학적 시냅스를 형성하는 데 관여한다. TCR은 CD3 분자와 함께 TCR 복합체를 형성하며, TCR이 펩티드-MHC(pMHC) 복합체에 페어링될 때, CD3을 통해 신호가 전달한다. T 세포 상의 TCR 복합체와 CD28 모두를 통한 신호 전달은 T 세포를 활성화시킨다.
질환 치료에 대한 면역요법적 접근법은 생체 내에서 T 세포 활성을 조절하는데, 예를 들어, 자가면역 및 이식 거부 반응 등을 하향 조절하는 데 효과가 있다. 그러나, 이러한 방법들에는 일반적으로 특이성이 결여되어 있는데, 이는 많은 면역요법이 CD3과의 결합 및/또는 공동 자극 분자와의 페어링 등에 의한 TCR 복합체의 신호 전달을 표적으로 하기 때문이다. 이러한 접근법은 종종 바람직하지 않은 부작용, 예를 들어, 과활성 면역 반응 또는 일반화된 면역 억제를 야기한다. 따라서, TCR과 pMHC 복합체 사이의 독특한 상호작용을 활용하는 요법은 생체 내에서 특이적 T 세포의 활성을 조절하는 능력을 제공할 수 있고, T 세포 조절에 기초한 새로운 치료제를 제공할 수 있다.
유전적으로 변형되고, 인간 HLA 분자 및/또는 β2 마이크로글로불린에 대해 내성을 가지며, 인간 또는 인간화 항체를 생산할 수도 있는 비인간 동물(예를 들어, 포유류, 예를 들어, 랫트 또는 마우스와 같은 설치류)이 개시된다. (1) 인간 HLA 분자에 대한 이들 비인간 동물에 의한 내성, 및 (2) 인간화 항원 결합 단백질을 제공하는 이들 비인간 동물의 능력 둘 다는 이들 비인간 동물을 생체 내에서, 예를 들어, 동종 반응(allogeneic response)의 연구에 유용한 세포의 단리 및/또는 관심 펩티드-MHC 복합체에 특이적으로 결합하는 인간 또는 인간화 항원 결합 단백질의 생산을 위한 독특한 플랫폼으로서 사용할 수 있게 하며, 항원 결합 단백질은 유일하게 유용한 치료법이 될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 비인간 동물 및 이로부터 단리된 세포, 조직, 핵산 및 항원 결합 단편을 제조하는 방법과 사용하는 방법도 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 (a) 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 (b) (비)재배열된 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하되, 임의로, 여기서 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 면역글로불린 경쇄 유전자좌 중 적어도 하나는 재배열되지 않고; 유전적으로 변형된 비인간 동물은 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분을 발현하고; 유전적으로 변형된 비인간 동물은 인간 또는 인간화 중쇄 가변 도메인 및/또는 인간 또는 인간화 경쇄 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린을 발현하며; 비인간 동물은, 다음을 포함하는 항원 펩티드-MHC(pMHC) 복합체를 이용해 면역화될 때 특정 B 세포 반응을 생성하도록, 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 이의 펩티드 결합 부분에 대해 내성을 갖는다: (i) (ii)와 복합체를 형성한 비인간 동물에 대해 이종인 펩티드; 및 (ii) 인간 또는 인간화 MHC 분자가 유래된 인간 HLC 분자 또는 이의 일부분. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 인간 또는 인간화 MHC 분자가 유래되는 인간 HLA 분자와 연관된 비인간 동물에 대해 이종인 펩티드를 포함하는 항원 펩티드-MHC(pMHC) 복합체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 (c) 다음을 포함하는 항원 펩티드-MHC(pMHC) 복합체: (ii) 인간 또는 인간화 MHC 분자가 유래된 인간 HLA 분자 또는 이의 일부분; 및 (i) (ii)와 연관된 비인간 동물에 대해 이종인 펩티드, 및 (d) 항원 pMHC에 특이적으로 결합하고, 인간 또는 인간화 MHC 분자가 유래된 인간 HLA 분자에는 결합하지 않는 인간 또는 인간화 항원 결합 분자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 MHC 분자는 인간 또는 인간화 MHC 클래스 I 분자, 인간 또는 인간화 MHC 클래스 II 분자, 인간 또는 인간화 MHC 클래스 II β 분자, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 MHC 분자는 인간 또는 인간화 MHC 클래스 I 분자이다. 일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 MHC 분자는 HLA-A 분자, HLA-B 분자, HLA-C 분자, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 HLA 클래스 I 분자로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은, 임의로 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 그의 게놈에 추가로 포함하며, 여기서 비인간 동물은 그 자체가 β2 마이크로글로불린에 내성을 가지거나 인간 또는 인간화 클래스 I 분자와의 조합으로 내성을 가지도록 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 발현한다.
일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 MHC 분자는 인간 또는 인간화 MHC 클래스 II 분자로서, 임의로, 인간 또는 인간화 MHC 분자는 HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR 분자 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 HLA 클래스 II 분자의 α 및/또는 β 사슬 또는 적어도 펩티드 결합 홈으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 MHC 분자는 인간 HLA 분자이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 인간 HLA 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 내인성 MHC 유전자좌에 포함하되, 임의로, 뉴클레오티드 서열은 내인성 MHC 분자를 암호화하는 내인성 핵산 서열을 치환한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 인간 HLA 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 이소성 유전자좌(ectopic locus)에 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 인간 HLA 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 ROSA26 유전자좌에 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 내인성 MHC 유전자좌, 이소성 유전자좌 또는 ROSA26 유전자좌에 있는 뉴클레오티드 서열에 대해 동형접합체이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 내인성 MHC 유전자좌, 이소성 유전자좌 또는 ROSA26 유전자좌에 있는 뉴클레오티드 서열에 대해 이형접합체이다.
일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 MHC 분자는 인간화된, 예를 들어, 키메라 MHC 분자이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 키메라 MHC 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 내인성 MHC 유전자좌에 포함하되, 임의로, 뉴클레오티드 서열은 내인성 MHC 분자를 암호화하는 내인성 핵산 서열을 치환한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 키메라 MHC 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 이소성 유전자좌에 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 키메라 MHC 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 ROSA26 유전자좌에 포함한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 내인성 MHC 유전자좌, 이소성 유전자좌 또는 ROSA26 유전자좌에 있는 키메라 MHC 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대해 동형접합체이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 내인성 MHC 유전자좌, 이소성 유전자좌 또는 ROSA26 유전자좌에 있는 키메라 MHC 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대해 이형접합체이다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 내인성 MHC 분자의 막관통 및 세포질 도메인에 작동 가능하게 연결된 인간 HLA 분자의 세포 외 도메인을 포함하는 키메라 인간/비인간 MHC 분자를 암호화한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 (i) 내인성 쥣과 H-2K 폴리펩티드, 내인성 쥣과 H-2D 폴리펩티드, 또는 내인성 쥣과 H-DL 폴리펩티드와 같은 내인성 비인간 MHC 클래스 분자의 막관통 도메인 및 세포질 도메인에 작동 가능하게 연결된 HLA-A, HLA B 및 HLA-C로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 MHC 클래스 I 분자의 α1, α2 및 α3 도메인을 포함하는 키메라 인간/비인간 MHC 클래스 I 분자, 및/또는 (ii) 내인성 쥣과 H-2A α 폴리펩티드 또는 내인성 쥣과 H-2E α 폴리펩티드와 같은 내인성 비인간 MHC 클래스 II α 분자의 막관통 도메인 및 세포질 도메인에 작동 가능하게 연결된 인간 HLA 클래스 II α 폴리펩티드의 α1 및 α2 도메인, 및/또는 내인성 쥣과 H-2A α 폴리펩티드 또는 내인성 쥣과 H-2E α 폴리펩티드와 같은 내인성 비인간 MHC 클래스 II β 분자의 막관통 도메인 및 세포질 도메인에 작동 가능하게 연결된 인간 HLA 클래스 I β 폴리펩티드의 β1 및 β2 도메인을 포함하는 키메라 인간/비인간 MHC 클래스 II 분자를 암호화한다.
일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 MHC 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 내인성 비인간 MHC 유전자좌를 파괴하지 않는다. 일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 MHC 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 내인성 MHC 유전자좌의 외부에 있는 유전자좌에 통합된다. 일부 구현예에서, 이러한 통합은 임의의 다른 내인성 유전자의 기능을 파괴하지 않는다. 일 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 내인성 ROSA26 유전자좌 내에 배치된다.
일부 구현예에서, 비인간 동물은 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대해 이형접합체이다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된, 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 내인성 중쇄 유전자좌에 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된, 제한된 재배열되지 않은 인간(화) 중쇄 가변 영역을 내인성 중쇄 유전자좌에 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 공통 중쇄 암호화 서열을 내인성 중쇄 유전자좌에 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된, 히스티딘 변형된 재배열되지 않은 인간(화) 중쇄 가변 영역을 내인성 중쇄 유전자좌에 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 중쇄 면역글로불린 암호화 서열만을 내인성 중쇄 유전자좌에 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 혼성 면역글로불린 사슬을 암호화하는 재배열되지 않은 인간(화) 혼성 중쇄 서열을 내인성 중쇄 유전자좌에 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된, 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 내인성 경쇄 유전자좌에 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 공통 경쇄 암호화 서열을 내인성 경쇄 유전자좌에 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된, 제한된 재배열되지 않은 인간(화) 경쇄 가변 영역을 내인성 경쇄 유전자좌에 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된, 히스티딘 변형된 재배열되지 않은 인간(화) 경쇄 가변 영역을 내인성 경쇄 유전자좌에 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된, 히스티딘 변형된 재배열된 인간(화) 경쇄 가변 영역을 내인성 경쇄 유전자좌에 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 기능적 ADAM6 유전자를 포함하되, 임의로 기능성 ADAM6 유전자는 내인성 ADAM6 유전자이다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 외인성 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제(TdT) 유전자를 발현한다.
일부 구현예에서, 전술한 것 중 어느 하나의 유전적으로 변형된 비인간 동물을 제조하는 방법은, (a) 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 (b) 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함시키기 위해 비인간 동물의 게놈을 변형하는 단계를 포함하되, 임의로 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌 중 적어도 하나는 재배열되지 않으며, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 다음을 포함하는 펩티드-MHC 복합체로 면역화할 때 특정 B 세포 반응을 생성하도록 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분에 대해 내성을 가지고, 인간 또는 인간화 중쇄 가변 도메인 및/또는 인간 또는 인간화 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화 항체 결합 단백질을 제공할 수 있다: (i) (ii)와 복합체를 형성한 비인간 동물에 대해 이종인 펩티드; 및 (ii) 인간 또는 인간화 MHC 분자가 유래된 인간 HLA 분자 또는 이의 일부분. 일부 구현예에서, 상기 방법은
(a)
(i) 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제1 이소성 유전자좌에 삽입하거나,
(ii) 내인성 비인간 동물 MHC I 유전자좌에서 비인간 동물 MHC I 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 인간(화) MHC I 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 치환하고/하거나, 내인성 비인간 동물 MHC II 유전자좌에서 비인간 동물 MHC II 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 인간(화) MHC II 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 치환하되,
임의로, 인간(화) MHC I 분자는 인간 MHC I의 α1, α2 및 α3 도메인 및 내인성 비인간 MHC I 폴리펩티드의 적어도 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하고,
임의로, 인간(화) MHC II 분자는 인간 MHC II의 α1, α2, β1 및 β2 도메인 및 내인성 설치류 MHC II 폴리펩티드의 적어도 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는, 단계; 및
(b)
(i) 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 제2 이소성 유전자좌에 삽입하거나,
(ii)
(A) 내인성 비인간 중쇄 유전자좌에서 내인성 비인간 면역글로불린 가변(VH) 유전자 분절을 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 가변(VH) 유전자 분절과 치환하고, 내인성 비인간 면역글로불린 다양성(DH) 및/또는 내인성 비인간 결합(JH) 유전자 분절을 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 다양성(DH) 유전자 분절 및/또는 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 결합 (JH) 유전자 분절과 각각 임의로 치환하되, 재배열되지 않은 인간 VH, 및 임의의 DH 및 JH 유전자 분절은 내인성 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결되고/되거나,
(B) 내인성 비인간 경쇄 유전자좌에서 내인성 비인간 경쇄 가변(VL) 유전자 분절 및 내인성 비인간 경쇄 결합(JL) 유전자 분절을, VL/JL 유전자 서열을 형성하도록 임의로 재배열된 인간 경쇄 가변(VL) 유전자 분절 및 인간 경쇄 결합(JL) 유전자 분절과 치환하되, 인간 VL 및 결합 JL 유전자 분절은 내인성 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결되는 단계를 포함하며,
여기서, (a) 비인간 MHC I 및/또는 비인간 MHC II 분자를 각각 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 (b) VH, DH, JH, VL 및 JL 유전자 분절은
(I) 순차적 상동성 재조합에 의해 단일 비인간 배아 줄기(ES) 세포에 삽입 또는 치환되거나,
(II) 제1 및 제2 비인간 동물을 생성하기 위해 사용되는 제1 및 제2 ES 세포에 각각 삽입되거나 치환되며, 상기 방법은 제1 및 제2 비인간 동물을 교배시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물을 만드는 방법은 인간 또는 인간화 MHC 분자가 유래되는 인간 HLA 분자와 연관된 비인간 동물에 대해 이종인 펩티드를 포함하는 항원 pMHC 복합체를 비인간 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 pMHC 복합체는 보조 T 세포 에피토프에 연결된다. 일부 구현예에서, 보조 T 세포 에피토프는, 예를 들어 서열번호 28로 기재된 PADRE를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 항원 pMHC 복합체 또는 이를 암호화하는 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 생성하는 방법은, 비인간 동물이 관심 항원 pMHC 복합체에 대한 면역 반응을 일으키기에 충분한 조건에서 본원에 기술된 바와 같은 유전적으로 변형된 비인간 동물을 유지하는 단계를 포함하며, 여기서 관심 항원 pMHC 복합체는, 비인간 동물에 대해 이종이고 인간 또는 인간화 MHC 분자가 유래된 인간 HLA의 맥락에서 제시되는 펩티드 또는 이의 일부를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은, 제1 단계(들)로서, 관심 항원 pMHC 복합체로 비인간 동물을 면역화하고, 면역화된 비인간 동물의 면역 반응을 임의로 추가 투여하는 단계를 포함하며, 임의로 여기서 면역화 및/또는 추가 투여는 보조 T 세포 에피토프, 예를 들어 PADRE(서열번호 28)에 연결된 관심 pMHC 복합체를 비인간 동물에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 면역 글로불린 중쇄 가변 도메인 및/또는 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 수득하는 방법은: 비인간 동물의 림프구에 의해 발현된 인간 면역글로불린 가변 도메인, 또는 림프구로부터 생성된 하이브리도마를 암호화하는 재배열된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 핵산을 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물로부터 단리하는 단계를 포함하되, 여기서 림프구에 의해 발현된 인간 면역글로불린 가변 도메인, 또는 이로부터 생성된 하이브리도마는 이의 동족 가변 도메인과 결합하여 항원 pMHC 복합체에 특이적인 항원 결합 도메인을 형성한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 관심 항원 pMHC 복합체로 비인간 동물을 면역화하고, 비인간 동물이 항원에 대한 면역 반응을 일으키게 한 후에 핵산을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 수득된 재배열된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열은 적어도 하나의 체세포 과돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 핵산은 재배열된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 인간 불변 영역 유전자 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 5.5 내지 6.0의 pH 범위에서 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 IgG 중쇄 불변 영역 아미노산 서열의 CH2-CH3 영역의 친화도를 증가시키는 변형을 포함하며, 여기서 변형은 M428L, N434S, V259I, V308F, N434A, M252Y, S254T, T256E, T250Q, H433K, N434Y 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, IgG 중쇄 불변 영역 아미노산 서열에서의 돌연변이이다. 또한, 예를 들어, 항원 pMHC 복합체에 특이적인 인간 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산을 발현하기 위한 포유류 숙주 세포가 본원에 기술된다.
일부 구현예에서, 인간 면역 글로불린 중쇄 가변 도메인 및/또는 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 발현하는 세포를 수득하는 방법은, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물로부터 림프구를 단리하는 단계를 포함하며, 여기서 림프구는 항원 pMHC 복합체에 특이적인 항원 결합 도메인을 형성하는 인간 면역글로불린 가변 도메인을 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 단리된 림프구로부터 하이브리도마를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 단리된 세포, 예를 들어, 생식 세포, 배아 줄기 세포, 체세포(예를 들어, B 세포)는 (a) 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 적어도 펩티드 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 (b) 재배열된 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함한다. 일부 구현예에서, 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌 중 적어도 하나는 재배열되지 않는다. 일부 구현예에서, 단리된 세포는 본원에 기술된 방법에 따라 수득된다.
일부 구현예에서, 시험관 내에서 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 만드는 방법은, 본원에 기술된 바와 같은 비인간 동물의 림프구에 의해 발현된 인간 면역글로불린 가변 도메인 또는 림프구로부터 생성된 하이브리도마를 암호화하는 재배열된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 제1 핵산을 세포에서 발현시키는 단계를 포함하며, 여기서 림프구에 의해 발현된 인간 면역글로불린 가변 도메인, 또는 이로부터 생성된 하이브리도마는 이의 동족 가변 도메인과 결합하여 항원 pMHC 복합체에 특이적인 항원 결합 도메인을 형성한다. 일부 구현예에서, 제1 핵산은 재배열된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 인간 면역글로불린 불변 영역 유전자 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 면역글로불린 불변 영역 유전자 서열은 중쇄 불변 영역 유전자 서열이고, 5.5 내지 6.0의 pH 범위에서 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 IgG 중쇄 불변 영역 아미노산 서열의 CH2-CH3 영역의 친화도를 증가시키는 변형을 포함하며, 여기서 변형은 M428L, N434S, V259I, V308F, N434A, M252Y, S254T, T256E, T250Q, H433K, N434Y 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, IgG 중쇄 불변 영역 아미노산 서열에서의 돌연변이이다.
도 1a 내지 도 1c는 본 발명의 예시적인 구현예로서, 키메라 MHC I 및 MHC II 유전자좌, 예를 들어, 내인성 H-2K 유전자좌에 있는 키메라 HLA-A2/H-2K 유전자좌(도 1a), 예를 들어 내인성 H-2E 유전자좌에 있는 키메라 HLA-DR2/H-2E 유전자좌(도 1b), 및 예를 들어 내인성 2M 유전자좌에 있는 인간화 β2M 유전자좌(도 1c)의 개략도(축척에 비례하지 않음)를 제공한다. 달리 명시되지 않는 한, 인간 서열은 빈 형상으로 도시되고 마우스 서열은 채워진 형상으로 도시된다. 줄무늬 형상은 내인성 유전자좌와 다른 마우스 균주로부터 유래된 H-2E 유전자 서열의 엑손 1 및 이의 하류에 있는 인트론 부분을 나타낸다. Cre-매개 제거 전에 양쪽에 loxP 부위가 부착된 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 카세트(들)를 갖는 유전자좌(도 1c) 및 카세트의 Cre-제거 후의 유전자좌(도 1a 및 도 1b)가 이에 따라 표지된 화살표와 함께 도시되어 있다.
도 2는 ROSA26 (Gt (ROSA)26 Sor) 유전자좌에서 인간 β2 마이크로글로불린(B2m)과 결합된 성숙한 HLA-A2 (A2) 폴리펩티드의 전장(예를 들어, HLA-A2의 아미노산 25~365)을 포함하는 단쇄 MHC 분자(서열번호 23)를 암호화하는 본 발명의 예시적인 이식유전자(서열번호 22)의 개략도(축척에 비례하지 않음)를 제공한다. 달리 명시되지 않는 한, 인간 서열은 빈 형상으로 도시되고, 마우스 서열은 채워진 형상으로 도시되며, 인간 서열도 마우스 서열도 아닌 서열은 다양한 패턴으로 도시된다. 채워진 화살표는 내인성 마우스 ROSA26 유전자좌의 엑손을 나타낸다. 5'HB 및 3'HB: 상동성 재조합에 의해 단쇄 HLA-A2/β2M 복합체(서열번호 23)를 암호화하는 B2m-G4Sx4-HLA-A2 이식유전자(서열번호 22)의 삽입에 사용된 ROSA 26 유전자의 상동성 박스. SA: 공통 스플라이스 수용체(consensus Splice Acceptor). ROR: 마우스 ROR 신호 서열. G4Sx4: GGGS 링커 (서열번호 21), SV40PA: SV40 바이러스로부터의 폴리아데닐화 신호. LoxP-New-LoxP: 카세트의 Cre-매개 제거 전에 양쪽에 loxP 부위가 부착된 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 카세트.
도 3은 인간 β2 마이크로글로불린과 결합된 HLA-A의 펩티드 결합 홈에 제시된 펩티드 B를 포함하는 면역원을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 면역화한 시험 마우스(인간화 MHC I 분자(HLA-A2/H-2K), 인간화 β2 마이크로글로불린, 재배열되지 않은 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌, 및 인간화 공통 경쇄 유전자좌 Vκ1-39/Jκ를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함함; ●) 또는 대조군 마우스(기능성 (예를 들어, 쥣과) ADAM6 유전자 및 인간화 중쇄 및 경쇄 유전자좌를 포함함; ■)에서 유래된 혈청을, 단쇄 pMHC 복합체로서 인간 β2 마이크로글로불린과 결합된 HLA-A의 펩티드 결합 홈에 제시된 무관하거나 연관된 펩티드(펩티드 A(무관), 펩티드 B(관련), 또는 펩티드 C(무관))에 결합하는 항체의 역가(y축)에 대해 시험한, 본 발명의 예시적인 구현예의 결과를 보여준다. 개별 pMHC 복합체에 결합하는 혈청 내 항체의 역가는 배경 대비 결합 신호가 2배인 보간된 혈청 희석 인자로서 계산된다.
도 4는 인간 β2 마이크로글로불린과 결합된 HLA-A의 펩티드 결합 홈에 제시된 펩티드 B를 포함하는 단쇄 pMHC 복합체 면역원으로 면역화한 시험 마우스(인간화 MHC I 분자(HLA-A2/H-2K), 인간화 β2 마이크로글로불린, 재배열되지 않은 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌, 및 인간화 공통 경쇄 유전자좌 Vκ1-39/Jκ를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함함; ●) 또는 대조군 마우스(기능성 (예를 들어, 쥣과) ADAM6 유전자 및 인간화 중쇄 및 경쇄 유전자좌를 포함함; ■)에서 유래된 혈청을, 단쇄 pMHC 복합체로서 인간 β2 마이크로글로불린과 결합된 HLA-A의 펩티드 결합 홈에 제시된 무관하거나 연관된 펩티드(펩티드 A(무관), 펩티드 B(관련), 또는 펩티드 C(무관))에 결합하는 항체의 역가(y축)에 대해 시험한, 본 발명의 예시적인 구현예의 결과를 보여준다. 개별 pMHC 복합체에 결합하는 혈청 내 항체의 역가(y축)는 배경 대비 결합 신호가 2배인 보간된 혈청 희석 인자로서 계산된다.
도 5는 인간 β2 마이크로글로불린과 결합된 HLA-A의 펩티드 결합 홈에 제시된 펩티드 B를 포함하는 단쇄 pMHC 복합체 면역원으로 면역화하고, 인간 β2 마이크로글로불린과 결합된 HLA-A의 펩티드 결합 홈에 제시된 펩티드 B를 포함하는 또 다른 재조합 폴리펩티드 및 보조 T 세포 에피토프(PADRE)를 추가 투여한 시험 마우스(인간화 MHC I 분자(HLA-A2/H-2K), 인간화 β2 마이크로글로불린, 재배열되지 않은 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌, 및 인간화 공통 경쇄 유전자좌 Vκ1-39/Jκ를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함함)에서 유래된 혈청을, 단쇄 pMHC 복합체로서 인간 β2 마이크로글로불린과 결합된 HLA-A의 펩티드 결합 홈에 제시된 무관하거나 연관된 펩티드(펩티드 A(무관), 펩티드 B(관련), 또는 펩티드 C(무관))에 대한 결합에 대해 시험한, 본 발명의 예시적인 구현예의 결과를 보여준다. 개별 pMHC 복합체에 결합하는 혈청 내 항체들의 항체 역가(y축)는 배경 대비 결합 신호가 2배인 보간된 혈청 희석 인자로서 계산된다.
본원에 보여진 것과 같이, 인간 HLA 및 인간 β2 마이크로글로불린 분자에 내성이 없지만 HLA 분자, 즉 관심 pMHC 복합체의 맥락에서 제시된 관심 펩티드로 면역화한 대조군 비인간 동물은 관심 pMHC 복합체에 대한 항체 역가를 이끌어 낸다. 도 3 내지 도 4(사각형 심볼). 그러나, 면역화되었지만 내성이 없는 대조군 동물의 혈청은 비인간 동물을 면역화하지 않은 무관한 pMHC 복합체(예를 들어, 동일한 맥락에서 제시된 무관한 펩티드)에 대해서도 유사한 항체 역가를 포함하였는데, 이는 관심 pMHC 복합체에 대해 생성된 반응이 특이적 반응이 아님을 시사한다. 도 3 내지 도 4(사각형 심볼) 참조.
대조적으로, 인간 HLA 및 인간 β2 마이크로글로불린 분자, 또는 적어도 이들의 펩티드 결합 홈(예를 들어, 이들의 세포 외 부분)에 내성을 갖는 비인간 동물로서, 인간 HLA 분자로부터 유래된 관심 pMHC 복합체로 면역화된 비인간 동물은 무관한 pMHC 복합체보다는 관심 pMHC 복합체에 대해 더 큰 항체 역가를 이끌어 낸다. 도 3 내지 도 5 참조. 따라서, 인간 HLA 및 인간 β2 마이크로글로불린 분자(또는 이들의 적어도 펩티드 결합 홈(예를 들어, 이들의 세포 외 부분))에 내성이 있는 비인간 동물은 관심 pMHC에 대한 특이적 면역 반응을 생성하기 위한 생체 내 플랫폼을 제공하고, 이로부터 리드 화합물/화합물들이 선택될 수 있는 것으로 본원에 나타나 있다. 이러한 플랫폼은 관심 pMHC에 대해 비특이적 면역 반응을 생성하는 내성이 없는 동물을 포함하는 플랫폼에 비해 개선된 것이다. 따라서, 인간 HLA 분자의 맥락에서 제시된 관심 펩티드를 포함하는 관심 pMHC 복합체로 면역화될 때, 비인간 동물이 관심 pMHC 복합체에 대해 특이적 B 세포 반응을 생성할 수 있도록 인간 HLA 분자에 대해 내성을 갖도록 유전적으로 변형된 비인간 동물이 본원에 제공된다.
예시적인 구현예에서, 비인간 동물은 인간 HLA 분자, 이의 일부분, 및/또는 이의 단쇄 유도체에 대해 내성을 갖지만, 비인간 동물이 내성을 갖는 인간 HLA 분자와 연관된 (예를 들어, 이에 의해 제시되는) 항원 펩티드(예를 들어, 유전적으로 변형된 비인간 동물에 대해 이종인 펩티드)를 포함하는 항원 펩티드-MHC(pMHC)에 대해서는 내성을 갖지 않도록 유전적으로 변형된다. 비인간 동물이 이러한 항원 pMHC 복합체에 대해 내성을 갖지 않으므로, 본원에 개시된 바와 같이 유전적으로 변형된 동물은. 예를 들어 시험관 내 연구를 위해, 인간 HLA 분자, 이의 일부분 및/또는 이의 단쇄 유도체에 반응하지 않는 면역 세포를 단리하는 데 유용할 뿐 아니라, 관심 항원 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질, 특히 인간 또는 인간화 항원 결합 단백질을 생성하는 데에도 유용하다. 이러한 특이적 (인간 또는 인간화) 항원 결합 단백질은 인간 질환을 치료하기 위한 요법에서, 예를 들어, (가령, 자가 면역 장애, 이식편-숙주 질환, 이식 거부 등의 예방 및/또는 치료를 위해) 자가 반응성 TCR과 자가 반응성 자기-항원을 포함하는 pMHC 복합체 사이에서 면역학적 시냅스 형성을 방지하고, 병원균(예를 들어, 바이러스)에 감염된 세포를 표적화하며, 세포 표면에서 발현되는 pMHC 복합체를 통해 바이러스 펩티드를 제시하는 것 등에 유용할 수 있다. 비인간 동물 및 인간 또는 인간화 HLA 분자, 이의 일부분, 및/또는 이의 단쇄 유도체에 대해 내성을 가진 이러한 비인간 동물을 만드는 방법에 추가하여; 항-pMHC 항체 반응을 생성하기 위해 비인간 동물에게 항원 pMHC 복합체를 투여하는 방법 뿐만 아니라 이러한 항원 pHMC 복합체를 만드는 방법도 개시된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
단수 형태("a", "an", 및 "the")는 문맥상 명시적으로 달리 언급하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 참조는 하나 이상의 방법 및/또는 본 발명에서 설명 및/또는 본 명세서를 읽으면 당업자에게 명백해질 종류의 단계를 포함한다.　
용어 "약(about)" 또는 "대략(approximately)"은 유의미한 값의 범위 내에 있는 것을 포함한다. 용어 "약" 또는 "대략"에 의해 포함된 허용가능한 편차는 연구 중인 특정 시스템에 따라 달라지며, 당업자에 의해 쉽게 이해될 수 있다.
용어 "주요 조직적합성 복합체" 및 "MHC"는 용어 "인간 백혈구 항원" 또는 "HLA"(이 둘 중 후자는 인간 MHC 분자에 주로 적용됨), 자연 발생 MHC 분자, MHC 분자의 개별 사슬(예: MHC 클래스 I α(중쇄), β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 II α 사슬 및 MHC 클래스 II β 사슬), 이러한 MHC 분자 사슬의 개별적 하위 집합(예: MHC 클래스 I α 사슬의 α1, α2 및/또는 α3 하위 집합, MHC 클래스 II α 사슬의 α1-α2 하위 집합, MHC 클래스 II β 사슬의 β1-β2 하위 집합) 뿐만 아니라 이들의 부분(예: 펩티드 결합 부분, 예: 펩티드 결합 홈), 돌연변이체 및 다양한 유도체(융합 단백질 포함)를 포함하며, 여기서 이러한 부분, 돌연변이체 및 유도체는 T 세포 수용체(TCR), 예를 들어 항원 특이적 TCR이 인식할 수 있도록 항원 펩티드를 디스플레이하는 능력을 보유한다. MHC 클래스 I 분자는 약 8~10개 아미노산의 펩티드를 수용할 수 있는 중쇄 α 쇄의 α1 및 α2 도메인에 의해 형성된 펩티드 결합 홈을 포함한다. MHC의 모든 클래스가 펩티드 내에서 약 9개의 아미노산(예를 들어, 5 내지 17개의 아미노산)의 코어에 결합한다는 사실에도 불구하고, MHC 클래스 II 펩티드 결합 홈(클래스 II MHC β 폴리펩티드의 β1 도메인과 연관된 클래스 II MHC α 폴리펩티드의 α1 도메인)의 개방 단부형 성질은 보다 넓은 범위의 펩티드 길이를 허용한다. MHC 클래스 II에 결합하는 펩티드의 길이는 일반적으로 13개 내지 17개 아미노산이지만, 더 짧거나 더 긴 것도 드물지 않다. 그 결과, 펩티드는 MHC 클래스 II 펩티드 결합 홈 내에서 이동하여, 임의의 주어진 시간에 홈 내에 직접적으로 안착하는 9량체를 변경할 수 있다. 특정 MHC 변이체를 식별하는 종래 방법이 본원에서 사용된다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 적어도 인간 펩티드 결합 홈(예를 들어, 펩티드 결합 부분)을 포함하는 인간(화) MHC 분자를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하고, 다른 구현예에서는, 인간 HLA 클래스 I/인간 β2 마이크로글로불린 분자 및/또는 인간 HLA 클래스 II 분자의 적어도 세포 외 도메인을 포함한다.
용어 "내성을 갖는(tolerized)", "내성(tolerance)", "내성화(tolerization)" 등은 물질에 대한 면역 반응을 일으키는 동물, 예를 들어, 유전적으로 변형된 비인간 동물의 능력이 없거나 감소된 것을 지칭한다. 일반적으로, 동물은 배아 발생 및/또는 출생 도중에 발현된 스스로의 단백질 또는 분자에 대해 내성을 갖고, 내성을 나타내고, 내성화를 거치는데, 예를 들어, 동물은 그의 게놈, 예를 들어, 생식선 게놈으로부터 발현된 스스로의 단백질 또는 분자에 대해 면역 반응을 일으키지 않거나 일으킬 수 없다. 동물이 스스로의 게놈, 예를 들어, 생식선 게놈에 인간(화) MHC 분자를 포함하도록 동물을 유전적으로 변형하면, "공(empty)" 인간(화) MHC 분자가 발현될 때, 동물은 마치 인간(화) MHC 분자가 스스로의 단백질인 것처럼 공 인간(화) MHC 분자에 대해 내성을 갖게 되고, 내성을 발현하고, 내성화를 거친다. HLA 분자, MHC 분자, 인간(화) MHC 분자 등의 맥락에서의 "공(empty)"은 스스로의 펩티드 결합 홈 내에서 펩티드 없이 발현되었거나, HLA 분자, MHC 분자, 인간(화) MHC 분자 등을 발현하는 동물에 대해 내인성인 펩티드와 함께 발현된 HLA 분자, MHC 분자, 인간(화) MHC 분자 등을 포함한다. 예를 들어, 공 MHC 분자는 동물의 게놈, 예를 들어, 생식선 게놈에서 발현되고 내인성 동물 자체 단백질 또는 그 일부를 제시하는 동물 인간(화) MHC 분자를 포함할 수 있다.
비인간 동물의 게놈은 "체세포 게놈"으로 간주될 수 있고, 예를 들어 비인간 동물의 체세포 내에서 발견되는 게놈일 수 있거나, "생식선 게놈"으로 간주될 수 있고, 예를 들어 비인간 동물의 생식 세포에서 발견되고 비인간 동물의 자손에게 전달되는 게놈일 수 있다. 당업자는, 생식선 게놈에서 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 유전자좌가 비인간 동물의 체세포(예: B 세포)에서 재배열되어, 면역글로불린 가변 도메인을 암호화하는 재배열된 면역 글로불린 가변 영역 유전자좌를 형성할 수 있다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 따라서, 예시적인 구현예에서의 재배열되지 않은 중쇄 및/또는 경쇄 유전자좌는 비인간 동물의 생식선 게놈에서 발견될 수 있고, 그로부터 유래된 재배열된 서열은 예를 들어 비인간 동물의 B 세포에서 발견될 수 있다.
용어 "비인간 동물" 등은 인간이 아닌 임의의 척추 동물 유기체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 원구류, 경골어, 연골 어류(예를 들어, 상어 또는 가오리), 양서류, 파충류, 포유동물, 및 새이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 포유류이다. 일부 구현예에서, 비인간 포유류는 영장류, 염소, 양, 돼지, 개, 소, 또는 설치류이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 랫트 또는 마우스와 같은 설치류이다.
용어 "인간화", "키메라", "인간/비인간" 등은, 비인간 기원이고 그 일부가 상응하는 인간 분자의 상응하는 일부와 치환된 분자(예: 핵산, 단백질 등)을 지칭하며, 여기서의 치환은 변형된(예: 인간화, 키메라, 인간/비인간 등) 분자가 그의 생물학적 기능을 보유하고/하거나 보유된 생물학적 기능을 수행하는 구조를 유지하는 방식으로 이루어진다. 인간화 분자는 인간 분자로부터 유래된 것으로 간주될 수 있으며, 여기서 인간화 분자는 인간 분자(또는 그의 일부)를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 대조적으로, "인간" 등은 인간 기원만을 갖는 분자, 예를 들어, 각각 인간 뉴클레오티드 및 아미노산 서열만을 포함하는 인간 뉴클레오티드 또는 단백질을 포함한다. 용어 "인간(화)"는 인간(화) 분자가 (a) 인간 분자 또는 (b) 인간화 분자일 수 있음을 반영하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 인간(화) MHC 분자가 인간 HLA 분자의 적어도 인간 펩티드 결합 홈을 포함하는 인간(화) MHC 분자를 포함하거나, 비인간 동물이 이를 발현하고 이에 대해 내성을 가지며, 여기서 인간(화) MHC 분자는 인간 펩티드 결합 홈에 항원을 제시하는 능력을 보유하고/하거나 인간(화) MHC 분자는 인간 HLA 분자의 인간 펩티드 결합 홈의 구조를 유지한다. 일부 구현예에서, 인간(화) MHC 분자가 인간 HLA 분자의 적어도 인간 세포 외 도메인을 포함하는 인간(화) MHC 분자를 포함하거나, 비인간 동물이 이를 발현하고 이에 대해 내성을 가지며, 여기서 인간(화) MHC 분자는 항원을 제시하는 능력을 보유하고/하거나 인간(화) MHC 분자는 펩티드 결합 홈이 형성되게 하는 인간 HLA 분자의 인간 세포 외 도메인의 구조를 유지한다. 일부 구현예에서, 인간(화) MHC 분자가 인간 HLA 클래스 I 폴리펩티드(예: 인간 HLA 클래스 I 폴리펩티드의 적어도 α1 및 α2 도메인, 예: 인간 HLA 클래스 I 폴리펩티드의 세포 외 부분, 예: 적어도 전장 성숙한 인간 HLA 클래스 I 폴리펩티드)의 인간 펩티드 결합 홈을 포함하는 인간(화) MHC 분자를 포함하거나, 비인간 동물이 이를 발현하고 이에 대해 내성을 가지며, 여기서 인간(화) MHC 클래스 I 폴리펩티드는 인간 펩티드 결합 홈에서 항원을 제시하는 능력 및/또는 항원을 제시하는 데 필요한 구조를 보유한다. 일부 구현예에서, 인간(화) MHC 분자가 인간 HLA 클래스 I 폴리펩티드(예: 인간 HLA 클래스 I 폴리펩티드의 적어도 α1 및 α2 도메인, 예: 인간 HLA 클래스 I 폴리펩티드의 세포 외 부분, 예: 적어도 전장 성숙한 인간 HLA 클래스 I 폴리펩티드)의 인간 펩티드 결합 홈을 포함하는 인간(화) MHC 분자를 포함하거나, 비인간 동물이 이를 발현하고 이에 대해 내성을 가지며, 여기서 인간(화) MHC 클래스 I 분자는 인간 펩티드 결합 홈에서 항원을 제시하는 능력 및/또는 항원을 제시하는 데 필요한 구조를 보유하며, 인간(화) MHC 클래스 I 분자는 MHC 클래스 I 분자를 안정화하는 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 추가로 포함한다.
용어 "항원"은, 면역적격 숙주 내로 도입될 때, 숙주의 면역 체계에 의해 인식되고 숙주에 의한 면역 반응을 이끌어 내는 임의의 제제(예를 들어, 단백질, 펩티드, 다당류, 당단백질, 당지질, 뉴클레오티드, 이들의 일부분, 또는 이들의 조합)를 지칭한다. T 세포 수용체는 주요 조직적합성 복합체(MHC)의 맥락에서 제시된 펩티드를 면역학적 시냅스의 일부로서 인식한다. 펩티드-MHC(pMHC) 복합체는 TCR에 의해 인식되며, 펩티드(항원 결정인자)와 TCR 유전자형은 상호작용의 특이성을 제공한다. 따라서, 용어 "항원"은 MHC, 예를 들어, 펩티드-MHC 복합체, 예를 들어 pMHC 복합체의 맥락에서 제시된 펩티드를 포함한다. MHC 상에 디스플레이되는 펩티드는 "에피토프" 또는 "항원 결정인자"로 지칭될 수도 있다. 용어 "펩티드", "항원 결정인자", "에피토프" 등은 항원 제시 세포(APC)에 의해 자연적으로 제시되는 것들을 포함할 뿐만 아니라, 예를 들어, 면역 체계의 세포에 적절히 제시될 때, 유전적으로 변형된 비인간 동물의 면역 세포에 의해 인식되는 한 임의의 원하는 펩티드일 수 있다. 예를 들어, 인위적으로 제조된 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 에피토프로서 사용될 수도 있다.
"펩티드-MHC 복합체", "pMHC 복합체", "홈 내 펩티드(peptide-in-groove)" 등은
(i) MHC 분자, 예를 들어, 인간 및/또는 인간화(예를 들어, "인간(화)") MHC 분자, 또는 이의 일부(예를 들어, 이의 펩티드 결합 홈, 예를 들어, 이의 세포 외 부분), 및
(ii) 항원 펩티드를 포함하여,
여기서 MHC 분자와 항원 펩티드는 pMHC 복합체가 T 세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 방식으로 복합체화된다. pMHC 복합체는 세포 표면 발현성 pMHC 복합체 및 가용성 pMHC 복합체를 포함한다. 예시적인 구현예에서, 인간(화) MHC 분자 또는 적어도 이의 인간 펩티드 결합 홈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 스스로의 게놈, 예를 들어 생식선 게놈에 포함하는 비인간 동물은 공 인간(화) MHC 분자 또는 이의 공 인간 펩티드 결합 홈에 대해 내성을 갖게 된다. 항원 pMHC 복합체, 예를 들어, pMHC 복합체가 투여되는 숙주 비인간 동물에게 이질적인 펩티드와 복합체화 된 인간(화) MHC 분자를 포함하는 복합체를 비인간 동물에게 투여하면, 비인간 동물은 항원 pMHC 복합체에 대한 항체 반응을 생성할 수 있다. 그런 다음, 이러한 특이적 항원 결합 단백질을 단리하여, 항원 pMHC와의 특이적 T 세포 수용체 상호작용을 특이적으로 조절하는 치료제로서 사용할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 비인간 동물이 내성을 가지게 되는 MHC 분자와 복합체화된 펩티드(pMHC 복합체가 투여되는 숙주 비인간 동물에 대해 이질적인 펩티드)를 포함하는 가용성 pMHC 복합체는, 투여된 pMHC 복합체의 가용성으로 인해 T 세포 면역 반응을 이끌어내지 않을 수 있다. 그러나, 이러한 가용성 pMHC 복합체는, 가용성 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 생성하는 B 세포 매개 면역 반응을 유발할 수 있다는 점에서 여전히 항원성으로 간주될 수 있다.
"유전자 분절" 또는 "분절"이란 말은 가변(V) 유전자 분절(예: 면역글로불린 경쇄 가변(VL) 유전자 분절 또는 면역글로불린 중쇄 가변(VH) 유전자 분절), 면역글로불린 중쇄 다양성(DH) 유전자 분절, 또는 결합(J) 유전자 분절(예: 면역글로불린 경쇄 결합(JL) 유전자 분절 또는 면역글로불린 중쇄 결합(JL) 유전자 분절)에 대한 기준을 포함하는데, 이는 (예를 들어, 내인성 재조합 효소에 의해 매개된) 재배열에 참여하여 재배열된 경쇄 VL/JL 서열 또는 재배열된 중쇄 VH/DH/JH 서열을 형성할 수 있는, 면역글로불린 유전자좌에서의 재배열되지 않은 서열을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 재배열되지 않은 V, D 및 J 분절은 12/23 규칙에 따라 VL/JL 재조합 또는 VH/DH/JH 재조합을 가능하게 하는 재조합 신호 서열(RSS)을 포함한다.
용어 "항체 결합 단백질", "면역글로불린", "항체", "항체들", "결합 단백질" 등은 단클론 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fv(scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화-결합 Fv(sdFv), 인트라바디(intrabody), 미니바디(minibody), 디아바디(diabody) 및 항유전자형(항-Id) 항체(예를 들어, 항원-특이적 TCR에 대한 항-Id 항체를 포함함), 및 전술한 것 중 어느 하나의 에피토프 결합 단편을 지칭한다. 용어 "항체(들)"는 또한 미국 특허 출원 공개 제20070004909호(그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)에 개시된 것들과 같은 공유 디아바디, 및 미국 특허 출원 공개 제20090060910호(그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)에 개시된 것과 같은 Ig-DARTS를 지칭한다. pMHC 결합 단백질은 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질, 면역글로불린, 항체 등을 지칭한다.
용어 "특이적으로 결합하는", "특이적 방식으로 결합하는", "항원 특이적" 등은, 특이적 결합에 관여하는 분자가 (1) 생리학적 조건 하에서 안정적으로 결합, 예를 들어 연결, 예를 들어 분자간 비공유 결합을 형성할 수 있고, (2) 생리학적 조건 하에서, 정해진 결합 쌍 외부의 다른 분자에 대해 안정적 결합을 형성할 수 없다는 것을 나타낸다. 따라서, pMHC 복합체에 특이적인 방식으로 결합하는 항원 결합 단백질(예를 들어, 면역글로불린, 항체 등)은 pMHC 결합 단백질이 pMHC 복합체와 안정한 분자간 비공유 결합을 형성한다는 것을 나타낸다. 따라서, 제1 MHC 분자와 복합체화된 제1 펩티드를 포함하는 특정 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하는, 예를 들어 특이적 방식으로 결합하는 pMHC 결합 단백질은
(i) 생물학적 조건 하에서, 제1 MHC 분자의 맥락에서 제시된 제2 펩티드를 포함하는 pMHC 복합체에 안정적으로 결합하지 않으며, 여기서 제1 및 제2 펩티드는 동일하지 않고, 예를 들어, 제1 MHC 분자의 펩티드 결합 홈과 연결될 때 상이한 유전자형(형태 구조)을 디스플레이하고,
(ii) (a) 제1 MHC 분자의 맥락에서 제시된 제1 펩티드를 특이적으로 인식하는 제1 TCR과 (b) 제1 펩티드 및 제1 MHC 분자를 포함하는 pMHC 복합체 간의 상호작용을 방해(예를 들어, 차단)할 수 있지만,
(iii) (a) 제1 MHC 분자의 맥락에서 제시된 제2 펩티드를 특이적으로 인식하는 제2 TCR과 (b) 제1 MHC 분자의 맥락에서 제시된 제2 펩티드를 포함하는 pMHC 복합체 간의 상호작용을 방해하지 않을 것이며, 여기서 제1 및 제2 펩티드는 상이하고, 예를 들어, 제1 MHC 분자의 펩티드 결합 홈과 연결될 때 상이한 유전자형(형태 구조)을 디스플레이한다. 제1 펩티드 및 제1 MHC 분자를 포함하는 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하는 pMHC 결합 단백질은 제1 MHC 분자의 맥락에서 제1 펩티드를 제시하는 제1 세포에도 결합할 수 있거나 독립적으로 결합할 수 있지만, 제1 MHC 분자의 맥락에서 제2 펩티드를 제시하는 제2 세포에는 결합하지 않을 것이며, 여기서 제1 및 제2 펩티드는 상이하고, MHC 분자의 펩티드 결합 홈과 연결될 때 상이한 유전자형(형태 구조)을 디스플레이한다. 특이적 결합은 낮은 마이크로 몰(micromolar) 내지 피코 몰(picomolar) 범위의 평형 해리 상수(KD)를 특징으로 할 수도 있다. 높은 특이성은 낮은 나노 몰 범위에 있을 수 있고, 매우 높은 특이성은 피코 몰 범위에 있을 수 있다. 2개의 분자가 특이적으로 상호 간에 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 평형 투석(equilibrium dialysis), 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 등을 포함한다.
"개체" 또는 "대상체" 또는 "동물"은 인간, 가축 동물(예를 들어, 고양이, 개, 소, 말, 양, 돼지 등) 및 질환의 실험 동물 모델(예: 마우스, 랫트)을 지칭한다. 일 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본원에서 사용되는 용어 "단백질"은 모든 종류의 자연 발생 및 합성 단백질을 포함하며, 이에는 모든 길이의 단백질 단편, 융합 단백질, 및 당단백질을 비롯하여 모든 유형의 변형된 단백질(예를 들어, 인산화, 아세틸화, 미리스토일화, 팔미토일화, 당질화, 산화, 포르밀화, 아미드화, 폴리글루타밀화, ADP-리보실화, 페길화, 비오티닐화에 의해 생성된 단백질)이 포함되지만 이들로 한정되지는 않는다.
용어 "핵산" 및 "뉴클레오티드"는 달리 명시되지 않는 한 DNA 및 RNA 둘 다를 포함한다.
용어 "역가", "항체 역가", "항체의 역가" 등은 이소형, 특이적 또는 비특이적 방식으로 항원에 결합하는 능력 등과 같은 특성을 공유하는 (예를 들어, 대상체로부터 수득된 혈청 내) 항체 샘플의 능력을 지칭한다. 대상체로부터 수집된 혈청 내 항체의 역가를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 대상체로부터 수집된 혈청 내 항체의 역가는 배경 대비 결합 신호가 2배인 보간된 혈청 희석 인자로서 계산된다. 일부 구현예에서, 인간(화) MHC 분자를 발현하고 이에 대해 내성을 갖는 비인간 동물은 관심 pMHC 복합체(예를 들어, 인간(화) MHC 분자가 유래된 HLA 분자의 맥락에서 제시된 관심 펩티드)로 면역화될 때 특이적 반응(예를 들어, 특이적 면역 반응, 예컨대 특이적 B 세포 반응, 예컨대 특이적 항체 반응)을 생성하거나 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 반응은 "특이적 반응" 등으로 간주되며, 여기서 비인간 동물은, 관심 pMHC 복합체로 면역화될 때, 관심 pMHC 복합체에 대한 항체 역가를 생성하며, 이는 무관한 pMHC 복합체에 대한 항체 역가보다 더 크다. 일부 구현예에서, 반응은 특이적 반응 등으로 간주되며, 여기서, 비인간 동물은, 관심 pMHC 복합체로 면역화될 때, 관심 pMHC 복합체에 대한 항체 역가를 생성하며, 이는 무관한 pMHC 복합체에 대한 항체 역가보다 적어도 2배 더 크다. 일부 구현예에서, 반응은 특이적 반응 등으로 간주되며, 여기서, 비인간 동물은, 관심 pMHC 복합체로 면역화될 때, 관심 pMHC 복합체에 대한 항체 역가를 생성하며, 이는 무관한 pMHC 복합체에 대한 항체 역가보다 적어도 5배 더 크다. 일부 구현예에서, 반응은 특이적 반응 등으로 간주되며, 여기서, 비인간 동물은, 관심 pMHC 복합체로 면역화될 때, 관심 pMHC 복합체에 대한 항체 역가를 생성하며, 이는 무관한 pMHC 복합체에 대한 항체 역가보다 적어도 10배 더 크다. 일부 구현예에서, 반응은 특이적 반응 등으로 간주되며, 여기서, 비인간 동물은, 관심 pMHC 복합체로 면역화될 때, 관심 pMHC 복합체에 대한 항체 역가를 생성하며, 이는 무관한 pMHC 복합체에 대한 항체 역가보다 훨씬 더 크다.
용어 "작동 가능하게 연결된(operably linked)" 등은 기술된 성분이 의도된 방식으로 기능하게 하는 것과 관련하여 병치(juxtaposition)된 상태를 지칭한다. 예를 들어, 재배열되지 않은 가변 영역 유전자 분절이, 항원 결합 단백질의 폴리펩티드 사슬로서 불변 영역 유전자와 함께 발현되는 재배열된 가변 영역 유전자를 형성하도록 재배열 될 수 있는 경우, 재배열되지 않은 가변 영역 유전자 분절은 인접한 불변 영역 유전자에 "작동 가능하게 연결"된다. 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 호환 가능한 조건 하에 달성되도록 연결된다. "작동 가능하게 연결된" 서열은 관심 유전자에 인접한 발현 조절 서열 및 관심 유전자(또는 관심 서열)를 조절하기 위해 일정한 거리에서 또는 인 트랜스(in trans)로 작용하는 발현 조절 서열을 포함한다. 용어 "발현 조절 서열"은 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 이들이 연결되는 암호화 서열의 발현 및 가공에 영향을 미치기 위해 필요하다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"은 다음을 포함한다: 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효율적인 RNA 프로세싱 신호; 세포질 mRNA를 안정화하는 서열; 번역 효율을 증진하는 서열; 폴리펩티드 안정성을 증진하는 서열(코작 공통 서열(Kozak consensus sequence)); 및 필요에 따라, 폴리펩티드 분비를 증진하는 서열. 이러한 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 다르다. 예를 들어, 원핵생물에서, 이러한 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함하는 반면, 진핵생물에서, 통상적으로, 이러한 조절 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. "조절 서열(control sequence)"이라는 용어는 존재하는 것이 발현 및 가공에 필수적인 성분을 포함하는 것으로 의도되고, 존재하는 것이 유리한 추가적인 성분, 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수도 있다.
"투여(administration)" 등의 용어는 조성물을 대상물 또는 시스템(예: 세포, 기관, 조직, 유기체, 또는 이들의 관련 구성 요소나 구성 요소의 집합)에 투여하는 것을 지칭하고 이를 포함한다. 당업자는 투여 경로가, 예를 들어, 조성물이 투여되고 있는 대상물 또는 시스템, 조성물의 성질, 투여 목적 등에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 특정 구현예들에서, 동물 대상체(예를 들어, 사람 또는 설치류)에 대한 투여는 기관지(기관지 점적을 포함함), 협측, 장내, 진피간, 동맥내, 진피내, 위내, 골수내, 근육내, 비강내, 복강내, 척수강내, 정맥내, 뇌실내, 점막, 비강, 경구, 직장, 피하, 설하, 국소, 기관(기관내 점적을 포함함), 경피, 질 및/또는 유리체 투여일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 간헐적 투여를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 투여는 적어도 선택된 기간 동안의 연속 투여(예, 관류)을 포함할 수 있다.
재배열되지 않은 가변 영역 및/또는 재배열되지 않은 가변 영역 유전자 분절로부터 "유래하는" 재배열된 가변 영역 유전자 또는 가변 도메인과 관련하여 사용될 때의 용어 "유래하는(derived from)"은, 재배열된 가변 영역 유전자 또는 가변 도메인의 서열을 한 세트의 재배열되지 않은 가변 영역 유전자 분절까지 다시 추적하는 능력을 지칭하며 (경우에 따라, 스플라이스 차이 및 체세포 돌연변이를 해명함), 여기서 상기 재배열된 가변 영역 유전자는 상기 한 세트의 재배열되지 않은 가변 영역 유전자 분절이 가변 도메인을 발현하도록 재배열됨으로써 형성된 것이다. 예를 들어, 재배열된 가변 영역 유전자가 체세포 돌연변이를 겪었더라도 재배열되지 않은 가변 영역 유전자 분절로부터 유래한다는 사실에는 변화가 없다.
용어 "내인성 유전자좌" 또는 "내인성 유전자"는 본원에 기술된 바와 같은 파괴, 결실, 치환, 변경, 또는 변형의 도입 전에 부모 유기체 또는 기준 유기체에서 발견되는 유전자좌를 지칭한다. 일부 구현예에서, 내인성 유전자좌는 자연계에서 발견되는 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 내인성 유전자좌는 야생형 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 내인성 유전자좌는 조작된 유전자좌이다.
용어 "이종(heterologous)"는 상이한 기원에서 유래된 제제 또는 엔티티를 지칭한다. 예를 들어, 특정 세포 또는 유기체 내에 존재하는 폴리펩티드, 유전자, 또는 유전자 산물을 참조하여 사용될 때, 이 용어는 관련 폴리펩티드, 유전자, 또는 유전자 산물이 1) 사람의 손에 의해 조작되었고; 2) 사람의 손에 의해(예를 들어 유전자 조작을 통해) 세포 또는 유기체 (또는 이의 전구체) 내로 도입되었고/되었거나: 3) 관련 세포 또는 유기체(예를 들어, 관련 세포 유형 또는 유기체 유형)에 존재하거나 이에 의해 자연적으로 생성되지 않음을 분명히 한다. "이종(heterologous)"은 특정 천연 세포나 유기체에 정상적으로 존재하지만, 예를 들어, 비자연적으로 결합된 요소 및, 일부 구현예에서는, 비내인성 조절 요소(예: 프로모터)의 조절 하에 돌연변이나 삽입에 의해 변경되거나 변형된 폴리펩티드, 유전자 또는 유전자 산물을 또한 포함한다.
본원의 개시에 따르면, 당업계의 기술에 속하는 종래의 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 이러한 기술들은 문헌에서 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (본원에서는 "Sambrook 등 1989"로 지칭함); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); Ausubel, F.M. 등 (eds.). Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., 1994를 참조하고, 이들 간행물 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 이러한 기술들은 부위 유도성 돌연변이 유발을 포함한다. 예를 들어, Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488- 492 (1985), 미국 특허 제5,071,743호, Fukuoka 등의 Biochem. Biophys. Res. Commun. 263: 357-360 (1999); Kim 및 Maas, BioTech. 28: 196-198 (2000); Parikh 및 Guengerich, BioTech. 24: 4 28-431 (1998); Ray 및 Nickoloff, BioTech. 13: 342-346 (1992); Wang 등의 BioTech. 19: 556-559 (1995); Wang 및 Malcolm, BioTech. 26: 680-682 (1999); Xu 및 Gong, BioTech. 26: 639-641 (1999), 미국 특허 제5,789,166호 및 제5,932,419호, Hogrefe, Strategies l4. 3: 74-75 (2001), 미국 특허 제5,702,931호, 제5,780,270호 및 제6,242,222호, Angag 및 Schutz, Biotech. 30: 486-488 (2001), Wang 및 Wilkinson, Biotech. 29: 976-978 (2000), Kang 등의 Biotech. 20: 44-46 (1996), Ogel 및 McPherson, Protein Engineer. 5: 467-468 (1992), Kirsch 및 Joly, Nucl. Acids. Res. 26: 1848-1850 (1998), Rhem 및 Hancock, J. Bacteriol. 178: 3346-3349 (1996), Boles 및 Miogsa, Curr. Genet. 28: 197-198 (1995), Barrenttino 등의 Nuc. Acids. Res. 22: 541-542 (1993), Tessier 및 Thomas, Meths. Molec. Biol. 57: 229-237, 및 Pons 등의 Meth. Molec. Biol. 67: 209-218을 참조하며, 간행물 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
인간 또는 인간화 MHC 분자의 내성화
예시적인 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물, 예를 들어, 포유류, 예컨대 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스는 적어도 하나의 공 인간 또는 인간화 MHC 분자, 또는 적어도 이의 공 인간 펩티드 결합 홈을 발현하고 이에 대한 내성을 갖지만, 항원 펩티드, 예를 들어 이종 펩티드와 복합체를 형성하는 경우, 인간(화) MHC 분자에 대한 항원 결합 단백질, 예를 들어, 인간 또는 인간화 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단백질을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 공 인간(화) MHC 분자에 대한 비인간 동물의 내성화는, 비인간 동물이 인간(화) MHC 분자 또는 이의 적어도 인간 펩티드 결합 홈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 그의 게놈에 포함하도록 유전적으로 변형시켜, 비인간 동물이 인간(화) MHC 분자 또는 이의 적어도 인간 펩티드 결합 홈을 공 인간(화) MHC 분자 또는 이의 공 인간 펩티드 결합 홈으로서 발현함으로써 달성된다. 인간(화) MHC 분자를 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하도록 유전적으로 변형된 동일한 동물은 인간 또는 인간화 항원 결합 단백질, 예를 들어 인간 또는 인간화 가변 도메인을 갖는 항원 결합 단백질을 발현하는 인간화 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 유전자좌를 포함하도록 추가로 변형될 수 있다.
MHC 분자는 일반적으로 두 가지 범주, 즉 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자로 분류된다. MHC 클래스 I 분자는, 3개의 세포 외 도메인(즉, α1, α2 및 α3)과 2개의 세포내 도메인(즉, 막관통 도메인(TM) 및 세포질 도메인(CYT))을 갖는, α 사슬로도 지칭되는, 당단백질 중쇄를 포함하는 일체형 막 단백질이다. 중쇄는 β2 마이크로글로불린(β2m 또는 β2M)으로 불리는 가용성 하위 집합과 비공유 결합된다. MHC 클래스 II 분자 또는 MHC 클래스 II 단백질은 비공유 연결에서 하나의 α 사슬 및 하나의 β 사슬을 포함하는 이종이량체 일체형 막 단백질이다. α 사슬은 2개의 세포 외 도메인(α1 및 α2) 및 2개의 세포 내 도메인(TM 도메인 및 CYT 도메인)을 갖는다. β 사슬은 2개의 세포 외 도메인(β1 및 β2) 및 2개의 세포 내 도메인(TM 도메인 및 CYT 도메인)을 갖는다.
클래스 I 및 클래스 II MHC 분자의 도메인 구성은 MHC 분자의 항원 결정인자 결합 부위, 예를 들어 펩티드 결합 부위 또는 펩티드 결합 홈을 형성한다. 펩티드 결합 홈은 펩티드, 예를 들어, 항원 결정 인자가 결합할 수 있는 공동을 형성하는 MHC 단백질의 일부를 지칭한다. 펩티드 결합 홈의 형태는 펩티드가 결합할 때 펩티드-MHC (pMHC) 복합체에 대한 TCR의 결합에 중요한 아미노산 잔기가 적절히 정렬되도록 변경될 수 있다.
일부 구현예에서, MHC 분자는 펩티드 결합 홈을 형성하기에 충분한 MHC 사슬의 단편을 포함한다. 예를 들어, 클래스 I 단백질의 펩티드 결합 홈은 2개의 β-주름 시트와 2개의 α 나선부를 형성할 수 있는 중쇄 α1 및 α2 도메인의 일부를 포함할 수 있다. β2 마이크로글로불린 사슬의 일부를 포함하면 MHC 클래스 I 분자가 안정화된다. 대부분의 MHC 클래스 II 분자의 경우, α 및 β 사슬의 상호작용은 펩티드가 없을 때 일어날 수 있지만, MHC 클래스 I의 2쇄 분자는 결합 홈이 펩티드로 채워질 때까지 불안정하다. 클래스 II 단백질의 펩티드 결합 홈은 2개의 β-주름 시트와 2개의 α 나선부를 형성할 수 있는 α1 및 β1 도메인의 일부를 포함할 수 있다. α1 도메인의 제1 부분은 제1 β-주름 시트를 형성하고 α1 도메인의 제2 부분은 제1 α 나선부를 형성한다. β1 도메인의 제1 부분은 제2 β-주름 시트를 형성하고 β1 도메인의 제2 부분은 제2 α 나선부를 형성한다. 단백질의 결합 홈에 결합된 펩티드를 갖는 클래스 II 단백질의 X-선 결정학적 구조는, 결합된 펩티드의 일 단부 또는 양 단부 모두가 MHC 단백질 너머로 돌출할 수 있음을 보여준다(Brown 등, pp. 33-39, 1993, Nature, Vol. 364 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합됨). 따라서, 클래스 II의 α1 및 β1 α 나선부의 단부는, 결합 홈에 결합된 펩티드의 단부가 공동 내에 매립되지 않도록 개방된 공동을 형성한다. 또한, 클래스 II 단백질의 X-선 결정학적 구조는, MHC β 사슬의 N-말단 단부가 MHC 단백질의 측면에서 비구조화된 방식으로 분명히 돌출함을 보여주는데, 이는 β 사슬의 처음 4개의 아미노산 잔기가 X-선 결정학에 의해 할당될 수 없었기 때문이다.
많은 인간 및 다른 포유류 MHC가 당업계에 잘 알려져 있다.
일부 구현예에서, 비인간 동물은 제1, 제2 및/또는 제3 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 포함하며, 이들 각각은 인간 또는 인간화 MHC II α 폴리펩티드, 인간 또는 인간화 MHC II β 폴리펩티드, 및 인간 또는 인간화 MHC I α 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 상이한 인간 또는 인간화 MHC 폴리펩티드를 암호화하며; 예를 들어, 비인간 동물이 인간 또는 인간화 MHC I α 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 구현예에서, 비인간 동물은 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 포함할 수도 있다. 본원에서 제1, 제2 및 제3의 명칭을 사용하는 것은, 본원에 기술된 비인간 동물이 모든 3개의 뉴클레오티드 서열을 필요로 하거나, 인간 또는 인간화 MHC 폴리펩티드 중 어느 하나가 특정 순서로 존재하는 것을 필요로 하는 것으로 비인간 동물을 한정하는 것으로 간주되지 않아야 한다.
다양한 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물, 예컨대 포유 동물, 예컨대 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트)이 본원에 제공되며, 상기 비인간 동물은 인간 또는 인간화 MHC I 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 인간 또는 인간화 MHC II 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 이들의 적어도 인간 펩티드 결합 홈을 게놈에 포함한다. MHC I 뉴클레오티드 서열은 완전한 인간인 MHC I 폴리펩티드(예를 들어, 인간 HLA 클래스 I 분자), 또는 부분적으로 인간이면서 부분적으로 비인간인 인간화 MHC I 폴리펩티드(예를 들어, 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩티드)를 암호화할 수 있고, MHC II 뉴크레오티드 서열은 완전한 인간인 MHC II 단백질(예를 들어, 인간 HLA 클래스 II 분자) 또는 부분적으로 인간이면서 부분적으로 비인간인 인간화 MHC 클래스 II 단백질(예를 들어, 키메라 인간/비인간 MHC II α 및 β 폴리펩티드를 포함하는, 예를 들어, 키메라 인간/비인간 MHC II 단백질)을 암호화할 수 있다.
본원의 실시예들에서, 비인간 MHC I 분자의 막관통 및 세포막 도메인에 작동 가능하게 연결된 인간 HLA 클래스 I 분자의 인간 세포 외 부분(인간 펩티드 결합 도메인을 포함함)을 포함하는 키메라 인간/비인간 MHC I 분자를 내인성 유전자좌에서 발현하는 유전적으로 변형된 동물은, 인간 HLA 클래스 I 분자의 인간 세포 외 부분(예를 들어, 인간 펩티드 결합 도메인)이 비어 있을 때 이에 대해 내성을 갖고, 인간 펩티드 결합 도메인이 비인간 동물에 대해 이종인 항원(예: 펩티드)과 복합체화 될 때 이에 대해 특이적 면역 반응을 생성할 수 있는 것으로 나타난다. 예를 들어, 실시예 참조. 이와 같이, 일부 구현예에서, 비인간 동물, 예컨대 설치류, 예컨대 랫트, 또는 마우스는
(1) (b) 비인간 MHC I 분자의 비인간 막관통 및 세포질 도메인에 작동 가능하게 연결된 (a) 인간 HLA 분자의 적어도 인간 펩티드 결합 홈(예: 인간 세포 외 부분)을 포함하는 키메라 인간/비인간 MHC 분자를 내인성 MHC 유전자좌에서 발현하고,
(2) 인간 HLA 분자의 적어도 세포 외 부분에 대해 내성을 갖는다.
키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 게놈(예: 내인성 유전자좌)에 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물은 미국 특허 제9,591,835호 및 제9,615,550호에 개시되어 있으며, 이들 문헌 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 인간화, 예를 들어, 키메라 인간/비인간 MHC II 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 게놈(예: 내인성 유전자좌)에 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물은 미국 특허 제8,847,005호 및 제9,043,996호에 개시되어 있으며, 이들 문헌 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 인간화, 예를 들어, 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 게놈(예: 내인성 유전자좌)에 포함하고, 인간화, 예를 들어, 키메라 인간/비인간 MHC II 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 게놈(예: 내인성 유전자좌)에 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물은 미국 특허 제10,154,658호에 개시되어 있으며, 이 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
본원에 제공된 다양한 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물이 본원에 제공되며, 상기 비인간 동물은 그의 게놈에, 예를 들어, 그의 생식선 게놈에, 예를 들어, 하나 이상의 내인성 MHC 유전자좌에:
(i) 비인간 MHC I 폴리펩티드(예: 내인성 MHC I 폴리펩티드)의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 비인간 부분에 작동 가능하게 연결된 인간 MHC I 폴리펩티드의 세포 외 부분(또는 그의 일부분, 예를 들어, 하나 이상의 세포 외 도메인, 예를 들어, 펩티드 결합 홈)을 포함하는 인간 부분을 포함하는 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩티드를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및/또는
(ii) 비인간 부분에 작동 가능하게 연결된 인간 부분을 포함하는 키메라 인간/비인간 MHC II α 폴리펩티드를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열로서, 키메라 MHC II α 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 MHC 클래스 II 분자의 α 폴리펩티드의 세포 외 부분(또는 이의 일부, 예를 들어, 하나 이상의 세포 외 도메인, 예를 들어, α1 도메인)을 포함하는, 제2 뉴클레오티드 서열, 및 비인간 부분에 작동 가능하게 연결된 인간 부분을 포함하는 키메라 인간/비인간 MHC II β폴리펩티드를 암호화하는 제3 뉴클레오티드 서열로서, 키메라 MHC II β 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 MHC 클래스 II 분자의 β 폴리펩티드의 세포 외 부분(또는 이의 일부, 예를 들어, 하나 이상의 세포 외 도메인, 예를 들어, 적어도 β1 도메인)을 포함하는, 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하며,
여기서, 비인간 동물은 키메라 인간/비인간 MHC I 및/또는 MHC II 단백질을 발현하고, 키메라 인간/비인간 MHC I 및/또는 MHC II 단백질에 내성을 갖는다. 일 구현예에서, 제1, 제2 및/또는 제3 뉴클레오티드 서열은 각각 내인성 비인간 MHC I, MHC II α 및 MHC II β 유전자좌에 위치한다. 일 구현예에서, 비인간 동물은 마우스이고, 제1, 제2 및/또는 제3 뉴클레오티드 서열은 마우스 염색체 17상의 내인성 마우스 MHC 유전자좌에 위치한다. 일 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 내인성 비인간 MHC I 유전자좌에 위치한다. 일 구현예에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 내인성 비인간 MHC II α 유전자좌에 위치한다. 일 구현예에서, 제3 뉴클레오티드 서열은 내인성 비인간 MHC II β 유전자좌에 위치한다.
일 구현예에서, 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩티드는 비인간 부분에 작동 가능하게 연결된 인간 부분을 포함하며, 인간 부분은 인간 MHC I 폴리펩티드의 적어도 펩티드 결합 홈을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 MHC I 분자의 세포 외 부분을 포함한다. 본 구현예에서, 키메라 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 MHC I 분자의 α 사슬의 세포 외 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 MHC I 분자의 α1 및 α2 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 MHC I 분자의 α1, α2 및 α3 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 키메라 MHC II α 폴리펩티드의 인간 부분 및/또는 키메라 MHC II β 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 MHC II α 폴리펩티드 및/또는 인간 MHC II β 폴리펩티드(예를 들어, 인간 MHC II 단백질의 MHC II α 및 β 폴리펩티드)의 펩티드 결합 도메인을 각각 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 MHC II α 및/또는 β 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 MHC II 단백질의 인간 MHC II α 및/또는 β 폴리펩티드(예를 들어, MHC II α 및 β 폴리펩티드)의 세포 외 부분을 각각 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 MHC II α 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 MHC II α 폴리펩티드의 α1 도메인을 포함하고; 또 다른 구현예에서, 키메라 MHC II α 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 MHC II α 폴리펩티드의 α1 및 α2 도메인을 포함한다. 추가의 구현예에서, 키메라 MHC II β 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 MHC II β 폴리펩티드의 β1 도메인을 포함하고; 또 다른 구현예에서, 키메라 MHC II β 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 MHC II β 폴리펩티드의 β1 및 β2 도메인을 포함한다.
예시적인 구현예에서의 비인간 동물은 키메라 인간/비인간 MHC 분자를 포함하고, 발현하고, 이에 대해 내성을 갖는다. 일 구현예에서, 인간 부분이 인간 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 분자의 세포 외 부분을 각각 포함하는 일 구현예에서, 인간 부분은 비인간 부분에 작동 가능하게 연결되며, 여기서 키메라 인간/비인간 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩티드(들)는 내인성 비인간(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스, 랫트 등) MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩티드(들)를 각각 포함한다. 따라서, 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩티드의 비인간 부분은 내인성 비인간 MHC I 폴리펩티드의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 키메라 MHC II α 폴리펩티드의 비인간 부분은 내인성 비인간 MHC II α 폴리펩티드의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 키메라 비인간 MHC II β 폴리펩티드의 비인간 부분은 내인성 비인간 MHC II β 폴리펩티드의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 비인간 동물은 마우스이며, 키메라 MHC I 폴리펩티드의 비인간 부분은 마우스 H-2K 단백질로부터 유래된다. 일 구현예에서, 비인간 동물은 마우스이며, 키메라 MHC II α 및 β 폴리펩티드의 비인간 부분은 마우스 H-2E 단백질로부터 유래된다. 따라서, 키메라 MHC I 폴리펩티드의 비인간 부분은 마우스 H-2K로부터 유래된 막관통 및 세포질 도메인을 포함할 수 있으며, 키메라 MHC II α 및 β 폴리펩티드의 비인간 부분은 마우스 H-2E 단백질로부터 유래된 막관통 및 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 특정 H-2K 및 H-2E 서열이 실시예에서 고려되지만, 임의의 적절한 서열, 예를 들어, 다형성 변이체, 보존적/비보존적 아미노산 치환 등이 본원에 포함된다.
일 구현예에서, 키메라 인간/마우스 MHC I 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 MHC I(예를 들어, 인간 HLA-A, 예컨대 인간 HLA-A2, 예컨대 인간 HLA-A2.1)의 세포 외 도메인을 포함한다. 인간 MHC I의 펩티드 결합 홈은 α1 및 α2 도메인을 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 MHC I의 펩티드 결합 홈은 α1, α2 및 α3 도메인을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 인간 MHC I의 세포 외 도메인은 인간 MHC I α 사슬의 세포 외 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 내인성 마우스 MHC I 유전자좌는 H-2K(예를 들어, H-2Kb) 유전자좌이고, 키메라 MHC I 폴리펩티드의 마우스 부분은 마우스 H-2K(예를 들어, H-2Kb) 폴리펩티드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 마우스는 키메라 인간/마우스 MHC I을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 그의 내인성 마우스 MHC I 유전자좌에서 포함하되, 키메라 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 HLA-A2 (예를 들어, HLA-A2.1) 폴리펩티드의 세포 외 도메인을 포함하고, 마우스 부분은 마우스 H-2K(예를 들어, H-2Kb) 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 24 참조)의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며, 마우스는 키메라 인간/마우스 HLA-A2/H-2K 단백질을 발현한다. 다른 구현예에서, 키메라 MHC I 폴리펩티드의 마우스 부분은 다른 마우스 MHC I, 예를 들어, H-2D, H-2L 등으로부터 유래될 수 있고; 키메라 MHC I 폴리펩티드의 인간 부분은 다른 인간 MHC I, 예를 들어 HLA-B, HLA-C 등으로부터 유래될 수 있다.
일 구현예에서, 키메라 인간/마우스 MHC II α 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 MHC II α 펩티드 결합 또는 세포 외 도메인을 포함하고, 키메라 인간/마우스 MHC II β 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 MHC II β 펩티드 결합 또는 세포 외 도메인을 포함한다. 인간 MHC II α 폴리펩티드의 펩티드 결합 도메인은 α1 도메인을 포함할 수 있고, 인간 MHC II β 폴리펩티드의 펩티드 결합 도메인은 β1 도메인을 포함할 수 있으므로; 키메라 MHC II 분자의 펩티드 결합 도메인은 인간 α1 및 β1 도메인을 포함할 수 있다. 인간 MHC II α 폴리펩티드의 세포 외 도메인은 α1 및 α2 도메인을 포함할 수 있고, 인간 MHC II β 폴리펩티드의 세포 외 도메인은 β1 및 β2 도메인을 포함할 수 있으므로; 키메라 MHC II 분자의 세포 외 도메인은 인간 α1, α2, β1 및 β2 도메인을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 키메라 MHC II 분자의 마우스 부분은 마우스 MHC II, 예를 들어 마우스 H-2E의 막관통 및 시토졸 도메인(예를 들어 마우스 H-2E α 및 β 사슬의 막관통 및 시토졸 도메인)을 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 마우스는 키메라 인간/마우스 MHC II α를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 그의 내인성 마우스 MHC II 유전자좌에 포함하며, 여기서 키메라 MHC II α 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 MHC II의 α 사슬(예를 들어, HLA-DR2의 α 사슬)로부터 유래된 세포 외 도메인을 포함하고, 마우스 부분은 마우스 MHC II(예: H-2E)의 α 사슬로부터 유래된 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며; 마우스는 키메라 인간/마우스 MHC II β를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 그의 내인성 마우스 MHC II 유전자좌에 포함하며, 여기서 키메라 MHC II β 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 MHC II의 β 사슬(예: HLA-DR2의 β 사슬)을 포함하고, 마우스 부분은 마우스 MHC II(예: H-2E)의 β 사슬로부터 유래된 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며; 예를 들어, 마우스는 키메라 인간/마우스 HLA-DR2/H-2E 단백질을 발현한다. 다른 구현예에서, 키메라 MHC II 단백질의 마우스 부분은 다른 마우스 MHC II, 예를 들어, H-2A 등으로부터 유래될 수 있고; 키메라 MHC II 단백질의 인간 부분은 다른 인간 MHC II, 예를 들어 HLA-DQ 등으로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 키메라 인간/비인간 폴리펩티드는 인간 또는 비인간 리더(신호) 서열을 포함하도록 된 것일 수 있다. 일 구현예에서, 키메라 MHC I 폴리펩티드는 내인성 MHC I 폴리펩티드의 비인간 리더 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 MHC II α 폴리펩티드는 내인성 MHC II α 폴리펩티드의 비인간 리더 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 키메라 MHC II β 폴리펩티드는 내인성 MHC II β 폴리펩티드의 비인간 리더 서열을 포함한다. 대안적인 구현예에서, 키메라 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩티드(들)는 또 다른 비인간 동물, 예를 들어, 또 다른 설치류, 또는 또 다른 마우스 계통에서 유래된 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩티드(들)의 비인간 리더 서열을 각각 포함한다. 따라서, 키메라 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비인간 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 리더 서열에 작동 가능하게 각각 연결될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 키메라 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩티드(들)는 인간 MHC I, 인간 MHC II α 및/또는 인간 MHC II β 폴리펩티드의 인간 리더 서열을 각각(인간 HLA-A2, 인간 HLA-DRα 및/또는 인간 HLA-DRβ1*1501의 리더 서열을 각각) 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라 인간/비인간 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩티드는 인간 MHC I, 인간 MHC II α 및/또는 인간 MHC II β 폴리펩티드의 완전한 또는 실질적으로 완전한 세포 외 도메인을 그의 인간 부분에 각각 포함할 수 있다. 따라서, 인간 부분은 인간 MHC I, 인간 MHC II α 및/또는 인간 MHC II β 폴리펩티드(예를 들어, 인간 HLA-A2, 인간 HLA-DRα 및/또는 인간 HLA-DRβ1*1501)의 세포 외 도메인을 암호화하는 아미노산산의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 예를 들어, 95% 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 일 예에서, 인간 MHC I, 인간 MHC II α 및/또는 인간 MHC II β 폴리펩티드의 실질적으로 완전한 세포 외 도메인은 인간 리더 서열이 결여되어 있다. 또 다른 예에서, 키메라 인간/비인간 MHC I, 키메라 인간/비인간 MHC II α 및/또는 키메라 인간/비인간 MHC II β 폴리펩티드는 인간 리더 서열을 포함한다.
또한, 일부 구현예에서, 키메라 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩티드는 내인성 비인간 프로모터 및 조절 요소, 예를 들어 마우스 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 조절 요소 각각에 작동 가능하게 연결될 수 있다(예를 들어, 내인성 비인간 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현될 수 있다). 이러한 배열은 비인간 동물에서, 예를 들어, 비인간 동물에서의 면역 반응 도중에, 키메라 MHC I 및/또는 MHC II 폴리펩티드의 적절한 발현을 용이하게 할 것이다.
본원에 제공된 실시예는 내인성 MHC 유전자좌로부터 발현된 키메라 인간/비인간 MHC 분자의 인간 펩티드 결합 도메인에 대한 내성화를 보여주지만, 이러한 내성화는 이소성 유전자좌(데이터 미도시)에서 인간 MHC 분자(또는 이의 기능적 펩티드 결합 도메인)를 발현하는 비인간 동물에서도 발생한다. 또한, 이소성 유전자좌로부터 공 인간 MHC 분자(또는 이의 공 펩티드 결합 도메인)를 발현하고 이에 대해 내성을 갖는 비인간 동물은 항원 펩티드, 예를 들어, 비인간 동물에 대해 이종인 펩티드(데이터 미도시)와 복합체를 형성한 인간 HLA 분자(또는 이의 펩티드 결합 도메인 및/또는 이의 유도체)로 비인간 동물이 면역화될 때, 발현된 인간 MHC 분자가 유래된 인간 MHC 분자(또는 이의 펩티드 결합 도메인 또는 이의 유도체)에 대해 특이적 면역 반응을 생성할 수 있다.
이론에 구속되고자 함이 없이, 비인간 동물의 내성화는 인간 또는 인간화 MHC 분자의 발현 시 발생하는 것으로 여겨진다. 이와 같이, 인간 또는 인간화 MHC 분자가 내인성 유전자좌로부터 발현될 필요는 없다. 따라서, 본원에서 제공되는 다양한 구현예에서, 인간(화) MHC I 폴리펩티드(또는 이의 일부분 및/또는 유도체)를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열, 인간(화) MHC II α 폴리펩티드(또는 이의 일부분 및/또는 유도체)를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열, 및/또는 인간(화) MHC II β 폴리펩티드(또는 이의 일부분 및/또는 유도체)를 암호화하는 제3 뉴클레오티드 서열을 그의 게놈에 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물이 제공되며, 비인간 동물은 인간(화) MHC I, MHC II α, 및/또는 MHC II β 폴리펩티드(또는 이들의 일부분 및/또는 유도체)를 발현하고, 인간(화) 폴리펩티드 또는 이의 일부분 및/또는 유도체에 내성을 갖는다. 일 구현예에서, 제1, 제2 및/또는 제3 뉴클레오티드 서열(들)은 각각 내인성 비인간 MHC I, MHC II α 및 MHC II β 유전자좌를 파괴하지 않고, 예를 들어, 이소성 유전자좌, 예를 들어, ROSA26 유전자좌에 위치한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 이소성 유전자좌, 예를 들어, ROSA26 유전자좌에서, 키메라 인간/마우스 MHC I을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 키메라 폴리펩티드의 인간 부분은 인간 HLA-A2 (예를 들어, HLA-A2.1) 폴리펩티드의 세포 외 도메인을 포함하고, 마우스 부분은 마우스 H-2K (예를 들어, H-2Kb) 폴리펩티드(예를 들어, 서열번호 24 참조)의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며, 마우스는 키메라 인간/마우스 HLA-A2/H-2K 단백질을 발현하고 이에 대해 내성을 갖는다.
또한, 완전한 인간 MHC 분자 또는 이의 완전한 인간 부분 및/또는 유도체가 이소성 유전자좌로부터 발현될 수 있다. 따라서, 본원의 다양한 구현예에서, 완전한 인간 MHC I 폴리펩티드(또는 이의 완전한 인간 부분 및/또는 유도체)를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열, 완전한 인간 MHC II 폴리펩티드(또는 이의 완전한 인간 부분 및/또는 유도체)를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열, 및/또는 완전한 인간 MHC II 폴리펩티드(또는 이의 완전한 인간 부분 및/또는 유도체)를 암호화하는 제3 뉴클레오티드 서열을 그의 게놈에 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물이 제공되며, 비인간 동물은 완전한 인간 MHC I, MHC II α, 및/또는 MHC II β 폴리펩티드(또는 이들의 완전한 인간 부분 및/또는 유도체)를 발현하고, 완전한 인간 폴리펩티드 또는 이의 완전한 인간 부분 및/또는 유도체에 내성을 갖는다. 일 구현예에서, 제1, 제2 및/또는 제3 뉴클레오티드 서열(들)은 각각 내인성 비인간 MHC I, MHC II α 및 MHC II β 유전자좌를 파괴하지 않고, 임의로, 임의의 내인성 유전자좌를 파괴하지 않으며, 예를 들어, 이소성 유전자좌, 예를 들어, ROSA26 유전자좌에 위치한다.
일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 MHC I 폴리펩티드는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 기능적 인간 HLA 분자로부터 유래될 수 있으며, 예를 들어, 인간 또는 인간화 MHC I 폴리펩티드는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 기능적 인간 HLA 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부를 암호화하거나 포함하는 핵산에 의해 암호화된다. 인간 또는 인간화 MHC II α 또는 β 폴리펩티드는 HLA-DP, -DQ 및 -DR 유전자좌에 의해 암호화된 기능적 인간 HLA 분자의 α 또는 β 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 흔히 사용되는 HLA 항원 및 대립유전자의 목록은 Shankarkumar 등의 문헌[(2004) The Human Leukocyte Antigen (HLA) System, Int. J. Hum. Genet. 4(2):91-103]에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. Shankarkumar 등은 당업계에서 사용되는 HLA 명명법에 대한 간단한 설명도 제시한다. HLA 명명법 및 다양한 HLA 대립유전자에 관한 추가 정보는 Holdsworth 등의 문헌[(2009) The HLA dictionary 2008: a summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, and DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, -DR, and -DQ antigens, Tissue Antigens 73:95-170], 및 최근에 개정된 Marsh 등의 문헌[(2010) Nomenclature for factors of the HLA system, 2010, Tissue Antigens 75:291-455]에서 확인할 수 있으며, 이들 간행물 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 일부 구현예에서, MHC I 또는 MHC II 폴리펩티드는 임의의 기능적 인간 HLA-A, B, C, DR, 또는 DQ 분자로부터 유래될 수 있다. 따라서, 인간 또는 인간화 MHC I 및/또는 II 폴리펩티드는 예시적인 구현예에서의 임의의 기능적 인간 HLA 분자로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 표면에 발현되는 모든 MHC I 및 MHC II 폴리펩티드는 인간 HLA 분자로부터 유래된 부분을 포함한다.
특히 흥미로운 것은 다수의 인간 질환, 예를 들어 인간 자가면역 질환과 연관된 것으로 알려진 다형성 인간 HLA 대립유전자이다. 실제로, HLA 유전자좌에서의 특정 다형성은 류마티스성 관절염, I형 당뇨병, 하시모토 갑상선염, 다발성 경화증, 중증근무력증, 그레이브스 병, 전신성 홍반성 루푸스, 소아 지방병증, 크론병, 궤양성 대장염, 및 기타 자가면역 질환의 발병과 상관이 있는 것으로 확인되었다. 예를 들어, Wong 및 Wen (2004) What can the HLA transgenic mouse tell us about autoimmune diabetes?, Diabetologia 47:1476-87; Taneja 및 David (1998) HLA Transgenic Mice as Humanized Mouse Models of Disease and Immunity, J. Clin. Invest. 101:921-26; Bakker 등의 (2006), A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC, Nature Genetics 38:1166-72 및 Supplementary Information; 및 International MHC and Autoimmunity Genetics Network (2009) Mapping of multiple susceptibility variants within the MHC region for 7 immune-mediated diseases, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:18680-85를 참조하며, 간행물 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 따라서, 일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 MHC I 및/또는 II 폴리펩티드는 특정 질환, 예를 들어 자가면역 질환과 연관된 것으로 알려진 인간 HLA 분자로부터 유래될 수 있다.
하나의 특정 구현예에서, 인간 또는 인간화 MHC I 폴리펩티드는 인간 HLA-A로부터 유래된다. 특정 구현예에서, HLA-A 폴리펩티드는 HLA-A2 폴리펩티드(및, 예를 들어, HLA-A2.1 폴리펩티드)이다. 일 구현예에서, HLA-A 폴리펩티드는 HLA-A*0201 대립유전자, 예를 들어, HLA-A*02:01:01:01 대립유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드이다. HLA-A*0201 대립유전자는 일반적으로 북미 모집단에서 흔히 사용된다. 본 실시예는 이러한 특정 HLA 서열을 기술하지만, 임의의 적절한 HLA-A 서열, 예를 들어, 인간 모집단에서 나타나는 HLA-A2의 다형성 변이체, 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산 변형을 갖는 서열, 유전자 코드의 퇴화로 인해 본원의 예시적인 구현예에서의 서열과 상이한 뉴클레오티드 서열 등이 본원에 포함된다.
또 다른 특정 구현예에서, 인간 또는 인간화 MHC I 폴리펩티드는 HLA-B 및 HLA-C로부터 선택된 인간 MHC I로부터 유래된다. 일 구현예에서, 이는 HLA-B, 예컨대 HLA-B27로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 이는 HLA-A3, -B7, -Cw6 등으로부터 유래된다.
하나의 특정 구현예에서, 인간 또는 인간화 MHC II α 및 β 폴리펩티드는 인간 HLA-DR, 예를 들어, HLA-DR2로부터 유래된다. 일반적으로, HLA-DR α 사슬은 단형성(monomorphic)이며, 예를 들어, HLA-DR 단백질의 α 사슬은 HLA-DRA 유전자(예: HLA-DRα*01 유전자)에 의해 암호화된다. 한편, HLA-DR β 사슬은 다형성(polymorphic)이다. 따라서, HLA-DR2는 HLA-DRA 유전자에 의해 암호화된 β 사슬 및 HLA-DR1β*1501 유전자에 의해 암호화된 β 사슬을 포함한다. 임의의 적절한 HLA-DR 서열, 예를 들어, 인간 모집단에서 나타나는 다형성 변이체, 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산 변형을 갖는 서열 등이 본원에 포함된다.
일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 MHC II α 및/또는 β 폴리펩티드는 일반적인 인간 질환과 연관된 것으로 알려진 HLA 대립유전자의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부분에 의해 암호화될 수 있다. 이러한 HLA 대립유전자는 HLA-DRB1*0401, -DRB1*0301, -DQA1*0501, -DQB1*0201, DRB1*1501, -DRB1*1502, -DQB1*0602, -DQA1*0102, -DQA1*0201, -DQB1*0202, -DQA1*0501 및 이들의 조합을 포함하나 이들로 한정되지는 않는다. HLA 대립유전자/질환 연관성의 요약에 대해서는, 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 Bakker 등의 전술한 문헌[(2006)]을 참조한다.
추가 구현예에서, 본 발명의 비인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예컨대 랫트 또는 마우스는 (내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서) 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. MHC 클래스 I 단백질의 β2 마이크로글로불린 또는 경쇄("β2M"으로도 약칭됨)는 클리코실화되지 않은 작은(12 kDa) 단백질로서, 주로 MHC I α 사슬을 안정화하도록 작용한다. 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 동물의 생성은 미국 특허 제9,615,550호에 상세히 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 단지 일부분, 예를 들어 인간(화) MHC I 분자를 안정화하는 데 도움이 되는 적어도 일부분에 상응하는 뉴클레오티드 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 전체 인간 β2 마이크로글로불린 유전자를 포함한다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 인간 β2 마이크로글로불린 단백질의 아미노산 21~119로 제시된 아미노산 서열(즉, 성숙한 인간 β2 마이크로글로불린에 상응하는 아미노산 잔기)을 암호화하는 뉴클레오티 잔기를 포함할 수 있다. 대안적인 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 인간 β2 마이크로글로불린 단백질의 아미노산 23~115로 제시된 아미노산 서열, 예를 들어, 인간 β2 마이크로글로불린 단백질의 아미노산 23~119로 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티 잔기를 포함할 수 있다. 인간 β2 마이크로글로불린의 핵산 서열 및 아미노산 서열은 Gussow 등의 문헌[(1987) β2-Microglobulin Gene. Primary Structure and Definition of the Transcriptional Unit, J. Immunol. 139:3131-38]에 기술되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
따라서, 일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드는 인간 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드의 아미노산 23~115에 제시된 아미노산 서열, 예를 들어, 인간 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드의 아미노산 23~119로 제시된 아미노산 서열, 예를 들어, 인간 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드의 아미노산 21~119로 제시된 아미노산아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 β2 마이크로글로불린은 인간 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드의 아미노산 1~119를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 대안적으로, 뉴클레오티드 서열은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 구현예에서, 엑손 2, 3 및 4로 제시된 뉴클레오티드 서열은 작동 가능하게 연결되어 유전자의 정상적인 전사 및 번역을 가능하게 한다. 따라서, 일 구현예에서, 인간 서열은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 서열은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4 이후 약 267 bp에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 서열은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 약 2.8 kb를 포함한다.
따라서, 일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드는 인간 β2 마이크로글로불린의 엑손 2 내지 4로 제시된 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 폴리펩티드는 인간 2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 특정 구현예에서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드는 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4 이후 약 267 bp에 상응하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 또 다른 특정 구현예에서, 인간 또는 인간화 폴리펩티드는 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 약 2.8 kb를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 4는 5' 비번역 부위를 함유하므로, 인간 또는 인간화 폴리펩티드는 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 및 3을 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다.
또한, 일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 비인간 동물은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 1로 제시된 뉴클레오티드 서열도 포함한다. 따라서, 특정 구현예에서, 비인간 동물은 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 그의 게놈에 포함하되, 뉴클레오티드 서열은 비인간 β2 마이크로글로불린의 엑손 1 및 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 포함한다. 따라서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드는 비인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 1 및 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4(예를 들어, 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 및 3)에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 내인성 비인간 동물 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 있다. 일부 구현예에서, 인간 β2 마이크로글로불린의 뉴클레오티드 서열은 내인성 비인간 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서 내인성 비인간 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 상응하는 뉴클레오티드 서열을 치환한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4에 상응하는 뉴클레오티드 서열은 내인성 마우스 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서 마우스 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4에 상응하는 내인성 마우스 서열을 치환한다(도 1c 참조). 일부 구현예에서, 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열은 마우스 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4로 제시된 뉴클레오티드 서열을 치환한다.
일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 내인성 비인간 동물 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 파괴하지 않으며, 예를 들어, 이소성 유전자좌, 예를 들어, ROSA26 유전자좌에 위치한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 이소성 유전자좌, 예를 들어, ROSA26 유전자좌에 있는 그의 게놈에, 제1 뉴클레오티드 서열 및/또는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 제1 뉴클레오티드 서열은 HLA 클래스 I 분자의 기능적 펩티드 결합 부분(예를 들어, 인간 MHC 클래스 I 분자의 적어도 α1 및 α2 도메인)을 포함하고 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린(또는 이의 일부분)에 작동 가능하게 연결된, 예를 들어 이와 융합된 단쇄 폴리펩티드를 암호화하며, 제2 뉴클레오티드 서열은 HLA 클래스 II 분자의 기능적 펩티드 결합 부분(예를 들어, 인간 MHC 클래스 II 분자의 적어도 α1 및 β1 도메인)을 포함하는 단쇄 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은, 예를 들어, 이소성 유전자좌에서 인간 β2 마이크로글로불린과 융합된 인간 HLA-A2 폴리펩티드(예를 들어, 전장 성숙한 HLA-A2 폴리펩티드)의 적어도 기능적 펩티드 결합 부분을 포함하는 단쇄 폴리펩티드를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함한다(예를 들어, 도 2 참조). 일부 구현예에서, 인간 β2 마이크로글로불린과 융합된 인간 HLA-A2 폴리펩티드(예를 들어, 전장 성숙한 HLA-A2 폴리펩티드)의 적어도 기능적 펩티드 결합 부분을 포함하는 단쇄 폴리펩티드는 서열번호 18, 서열번호 20, 또는 서열번호 23으로 제시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 유전적으로 변형된 비인간 동물은 이소성 유전자좌, 예를 들어 ROSA26 유전자좌에서, 인간(화) β2 마이크로글로불린과 융합된 인간 HLA-A2 분자의 적어도 기능적 펩티드 결합 부분을 포함하는 인간(화) MHC 클래스 I 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 서열번호 17, 서열번호 19, 서열번호 22, 또는 이들의 퇴행성 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 유전적으로 변형된 비인간 동물은 이소성 유전자좌, 예를 들어, ROSA26 유전자좌에서, 키메라 MHC 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 서열번호 24로 제시된 HLA-A2/H2-K 폴리펩티드를 포함한다.
당업자는, 일부 구현예가 유전적으로 조작된 동물을 생성하기 위한 특정 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 포함하지만, 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환으로 이루어진 서열, 또는 유전자 코드의 퇴화로 인해 본원의 구현예와는 다른 서열도 본 발명의 범주에 포함되는 것 간주된다는 것을 이해할 것이다.
따라서, 일부 구현예에서, 인간(화) MHC 클래스 I α 폴리펩티드 핵산 서열을 발현하는 비인간 동물이 제공되며, 여기서 인간(화) MHC 클래스 I α 폴리펩티드 핵산 서열 또는 이의 일부분은 유전자 코드의 퇴화로 인해 인간 MHC 클래스 I α 폴리펩티드 핵산 서열과 동일하지 않지만, 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 특정 구현예에서, 인간(화) MHC 클래스 I α 폴리펩티드 핵산 서열은 본원에 예시된 구현예의 인간 MHC 클래스 I α 폴리펩티드 핵산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 일 구현예에서, 발현된 인간(화) MHC 클래스 I α 폴리펩티드 서열은 하나 이상의 보존적 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 인간(화) MHC 클래스 I α 폴리펩티드 서열은 하나 이상의 비보존적 치환을 포함한다.
추가적으로, 일부 구현예에서, 인간(화) β2 마이크로글로불린 서열을 발현하는 비인간 동물이 제공되며, 여기서 인간(화) β2 마이크로글로불린 서열 또는 이의 일부분은 유전자 코드의 퇴화로 인해 인간 β2 마이크로글로불린 서열과 동일하지 않지만, 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 특정 구현예에서, 인간(화) β2 마이크로글로불린 서열은 본원에서 예시된 구현예의 인간 β2 마이크로글로불린 서열과 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 일 구현예에서, 인간(화) β2 마이크로글로불린 서열은 하나 이상의 보존적 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 인간(화) β2 마이크로글로불린 서열은 하나 이상의 비보존적 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간(화) MHC 클래스 II α 폴리펩티드 핵산 서열을 발현하는 비인간 동물이 제공되며, 여기서 인간(화) MHC 클래스 II α 폴리펩티드 핵산 서열 또는 이의 일부분은 유전자 코드의 퇴화로 인해 인간 MHC 클래스 I α 폴리펩티드 핵산 서열과 동일하지 않지만, 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 일 구현예에서, 발현된 인간(화) MHC 클래스 II α 폴리펩티드 서열은 하나 이상의 보존적 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 인간(화) MHC 클래스 II α 폴리펩티드 서열은 하나 이상의 비보존적 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간(화) MHC 클래스 II β 폴리펩티드 핵산 서열을 발현하는 비인간 동물이 제공되며, 여기서 인간(화) MHC 클래스 II β 폴리펩티드 핵산 서열 또는 이의 일부분은 유전자 코드의 퇴화로 인해 인간 MHC 클래스 I α 폴리펩티드 핵산 서열과 동일하지 않지만, 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 일 구현예에서, 발현된 인간(화) MHC 클래스 II α 폴리펩티드 서열은 하나 이상의 보존적 치환을 포함한다. 일 구현예에서, 인간(화) MHC 클래스 II α 폴리펩티드 서열은 하나 이상의 비보존적 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 비인간 동물은 제1, 제2, 및/또는 제3 뉴클레오티드 서열에 대해 이형접합체이며, 이들 각각은 인간 또는 인간화 MHC II α 폴리펩티드, 인간 또는 인간화 MHC II β 폴리펩티드, 및 인간 또는 인간화 MHC I α 폴리펩티드, 또는 이들의 일부로 이루어진 군으로부터 선택된 상이한 인간 또는 인간화 MHC 폴리펩티드를 암호화한다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 인간 또는 인간화 MHC II α 폴리펩티드, 인간 또는 인간화 MHC II β 폴리펩티드, 및 인간 또는 인간화 MHC I α 폴리펩티드, 또는 이들의 일부로 이루어진 군으로부터 선택된 상이한 인간 또는 인간화 MHC 폴리펩티드를 각각 암호화하는 제1, 제2, 및/또는 제3 뉴클레오티드 서열에 대해 동형접합체이다.
인간 또는 인간화 B 세포 면역 반응
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은, 인간 또는 인간화 MHC II α 폴리펩티드, 인간 또는 인간화 MHC II β 폴리펩티드, 및 인간 또는 인간화 MHC I α 폴리펩티드 또는 이들의 일부로 이루어진 군으로부터 선택된 상이한 인간 또는 인간화 MHC 폴리펩티드를 각각 암호화하는 제1, 제2, 및/또는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것에 추가하여, 예를 들어, 비인간 동물이 인간 또는 인간화 항원 결합 도메인(예: 인간 또는 인간화 가변 도메인)을 포함하는 인간 또는 인간화 항원 결합 단백질을 제공할 수 있도록, 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 유전자좌를 또한 포함한다.
인간 가변 영역 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 유전자좌는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제5,633,425호; 제5,770,429호; 제5,814,318호; 제6,075,181호; 제6,114,598호; 제6,150,584호; 제6,998,514호; 제7,795,494호; 제7,910,798호; 제8,232,449호; 제8,502,018호; 제8,697,940호; 제8,703,485호; 제8,754,287호; 제8,791,323호; 제8,809,051호; 제8,907,157호; 제9,035,128호; 제9,145,588호; 제9,206,263호; 제9,447,177호; 제9,551,124호; 제9,580,491호 및 제9,475,559호(이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨) 뿐만 아니라 미국 특허 공개 제20100146647호, 제20110195454호, 제20130167256호, 제20130219535호, 제20130326647호, 제20130096287호 및 제2015/0113668호(이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨) 및 PCT 공개 번호 WO2007117410, WO2008151081, WO2009157771, WO2010039900, WO2011004192, WO2011123708 및 WO2014093908(이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)에서 확인할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 비인간 동물은, 인간 또는 인간화 MHC 분자에 추가하여, 외인적으로 도입된 완전한 인간 면역글로불린 이식유전자를 포함하는데, 상기 이식 유전자는 마우스 내의 전구체 B 세포에 재배열될 수 있다(Alt 등의 문헌[1985, Immunoglobulin genes in transgenic mice, Trends Genet 1:231-236]을 참조하고, 상기 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 이들 구현예에서, 완전한 인간 면역글로불린 이식유전자는 (무작위로) 삽입될 수 있고, 내인성 면역글로불린 유전자가 또한 녹아웃될 수도 있으며(Green 등의 문헌[1994, Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs, Nat Genet 7:13-21]; Lonberg 등의 문헌[1994, Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications, Nature 368:856-859]; Jakobovits 등의 문헌[2007, From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice, Nat Biotechnol 25:1134-1143]을 참조하고, 이들 간행물 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨), 예를 들어, 여기서 내인성 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 유전자좌는, 예를 들어, 각 내인성 유전자좌의 작지만 중요한 부분의 표적화 결실에 이어 무작위로 통합된 큰 이식 유전자 또는 소염색체로서 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입함으로써 불활성화된다(Tomizuka 등의 문헌[2000, Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies, PNAS USA 97:722-727]을 참조하고, 그 전체는 참조로서 통합됨).
일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌에 각각 위치한다. 자손을 생성하는 마우스의 능력을 유지하면서 마우스 생식선 면역글로불린 가변 유전자좌를 인간 생식선 면역글로불린 가변 유전자좌와 대규모로 인 시튜 유전자 치환하는 방법이 이전에 기술된 적이 있다. (예를 들어, 미국 특허 제6,596,541호 및 제8,697,940호를 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 구체적으로, 마우스 불변 영역은 온전하게 남기면서 마우스 중쇄 및 κ 경쇄 면역글로불린 가변 유전자좌 둘 다의 6메가염을 이의 인간 상대와 정밀하게 치환하는 것이 기술되어 있다. 그 결과, 마우스 불변 영역은 유지하면서, 동등한 인간 생식선 면역글로불린 가변 서열과 마우스의 전체 생식선 면역글로불린 가변 레파토리가 정확하게 치환된 마우스가 생성되었다. 인간 가변 영역은 마우스 불변 영역에 연결되어 생리학적으로 적절한 수준으로 재배열되고 발현되는 키메라 인간-마우스 면역글로불린 유전자좌를 형성한다. 발현된 항체는 "역 키메라"이고, 인간 가변 영역 서열 및 마우스 불변 영역 서열을 포함한다. 인간 또는 인간화 가변 영역을 갖는 항체를 발현하는 인간화 면역글로불린 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 이들 마우스는 VELOCIMMUNE® 마우스라 불린다.
VELOCIMMUNE® 인간화 마우스는 야생형 마우스와는 본질적으로 구별 불가능한 완전한 기능적 체액 면역 시스템을 나타낸다. 이들은 B 세포 발달의 모든 단계에서 정상 세포 모집단을 나타낸다. 이들은 정상적인 림프 기관 형태를 나타낸다. VELOCIMMUNE® 마우스의 항체 서열은 정상적인 V(D)J 재배열 및 정상적인 체세포 과돌연변이 빈도를 나타낸다. 이러한 마우스의 항체 모집단은 정상 클래스 스위칭(예를 들어, 정상 이소형 시스-스위칭)으로 인한 이소형 분포를 반영한다. VELOCIMMUNE® 마우스를 면역화하면, 후보 치료제로서 사용하기에 적합한 인간 면역글로불린 가변 도메인을 갖는 크고 다양한 항체 레퍼토리를 생성하는 강력한 체액 면역 반응이 생성된다. 이러한 플랫폼은 약학적으로 허용 가능한 항체 및 다른 항원 결합 단백질을 제조하기 위한 자연적으로 친화도 성숙된 인간 면역글로불린 가변 영역 서열의 풍부한 공급원을 제공한다. 또한, 인간 VH 유전자 분절과 단일 내인성 VH 유전자 분절의 치환조차도 인간화 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 면역 반응을 생성할 수 있는 것으로 나타났다. 예를 들어, Tien 등의 문헌[(2016) Cell 166:1471-84]을 참조하며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 이는, VELOCIMMUNE® 마우스의 제조를 가능하게 하는 역 키메라 방식으로 내인성 비인간 불변 영역 유전자 서열(들)과 인간 면역글로불린 가변 서열이 작동 가능하게 연결되도록, 마우스 면역글로불린 가변 서열을 인간 면역글로불린 가변 서열과 정확하게 치환하는 것이다.
역 키메라 방식으로 변형된 마우스에는, 내인성 면역글로불린 유전자좌에서, 내인성 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 인간(화) 가변 영역(예를 들어, (D), J 및 하나 이상의 인간 V 유전자 분절을 포함함)을 포함하도록 변형된 마우스가 포함되며, 예를 들어,
(a) 내인성 중쇄 유전자좌에서:
(i) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (여기서, 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 복수의 재배열되지 않은 인간 중쇄 가변 영역 VH 유전자 분절(예: 완전한 기능적 인간인 재배열되지 않은 인간 VH 유전자 분절), 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 JH 유전자 분절을 포함하고;
임의로, 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 HJ 유전자 분절은 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 중쇄 DH 유전자 분절(예: 완전한 기능적 인간 DH 유전자 분절) 및/또는 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 중쇄 JH 유전자 분절임(예: 완전한 기능적 인간 JH 유전자 분절임));
(ii) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 제한된 재배열된 인간(화) 중쇄 가변 영역 (여기서, 제한된 재배열되지 않은 인간(화) 중쇄 가변 영역은 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 JH 유전자 분절과 작동 가능하게 연결된 하나의 재배열되지 않은 인간 중쇄 가변 영역 VH 유전자 분절로 이루어지고; 임의로, 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 DH 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 JH 유전자 분절은 각각 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 중쇄 DH 유전자 분절 및/또는 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 중쇄 JH 유전자 분절임);
(iii) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간(화) 중쇄 가변 영역 서열을 포함하는 공통 중쇄 암호화 서열 (여기서, 재배열된 인간(화) 중쇄 가변 영역 서열은, 면역글로불린 중쇄 JH 유전자 분절과 재배열되는 면역글로불린 중쇄 DH 유전자 분절과 재배열된 인간 중쇄 가변 영역 VH 유전자 분절을 포함하고;
임의로, 면역글로불린 중쇄 JH 유전자 분절 또는 면역글로불린 중쇄 DH 유전자 분절은 각각 인간 면역글로불린 중쇄 DH 유전자 분절 및/또는 인간 면역글로불린 중쇄 JH 유전자 분절임);
(iv) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열되지 않은 인간(화) 중쇄 가변 영역 (여기서, 히스티딘 변형된 인간(화) 중쇄 가변 영역은, 히스티딘 코돈과 적어도 하나의 비히스티딘 코돈의 치환 또는 적어도 하나의 히스티딘 코돈의 삽입을 상보성 결정 영역 3(CDR3) 암호화 서열에 포함하는 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 서열을 포함함);
(v) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간(화) 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 단독 면역글로불린 암호화 서열 (여기서, 내인성 중쇄 불변 영역은 (1) 경쇄와 결합되는 IgM 이소형을 암호화하는 온전한 내인성 IgM 유전자 및 (2) 기능적 CH1 도메인을 암호화하는 서열이 결여된 비-IgM 유전자, 예를 들어, IgG 유전자를 포함하고; 비-IgM 유전자는 경쇄 불변 영역과 공유 결합될 수 있는 CH1 도메인이 결여된 비-IgM 이소형을 암호화함); 또는
(vi) 하이브리드 면역글로불린 사슬을 암호화하는 재배열되지 않은 인간(화) 하이브리드 중쇄 서열 (여기서, 재배열되지 않은 인간(화) 하이브리드 중쇄 서열은 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 경쇄 가변(VL) 및 재배열되지 않은 결합(JL) 유전자 분절을 포함하고;
임의로, 내인성 중쇄 불변 영역은 (1) 경쇄와 결합되는 IgM 이소형을 암호화하는 온전한 내인성 IgM 유전자 및 (2) 기능적 CH1 도메인을 암호화하는 서열이 결여된 비-IgM 유전자, 예를 들어, IgG 유전자를 포함하고; 비-IgM 유전자는 경쇄 불변 도메인과 공유 결합될 수 있는 CH1 도메인이 결여된 비-IgM 이소형을 암호화함);
및/또는
(b) 내인성 경쇄 유전자좌에서:
(i) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 영역 (여기서, 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 복수의 재배열되지 않은 인간 경쇄 가변 영역 VL 유전자 분절(예: 완전한 기능적 인간인 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 분절) 및 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 JL 유전자 분절을 포함하고;
임의로, 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 JL 유전자 분절은 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 JL 유전자 분절(예: 완전한 기능적 인간 JHL 유전자 분절)이고;
임의로, 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 경쇄 카파 (κ) 유전자좌이고, 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 인간 가변 κ(Vκ) 및 결합 κ(Jκ) 유전자좌이고; 내인성 경쇄 불변 영역은 내인성 κ 사슬 불변 영역 서열이고/이거나; 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 내인성 면역글로불린 경쇄 람다(λ)이고, 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 인간 가변 λ(Vλ) 및 결합 λ(Jλ) 유전자 분절을 포함하고, 내인성 경쇄 불변 영역은 내인성 λ 사슬 불변 영역 서열이고; 임의로, 내인성 면역글로불린 경쇄 λ 유전자좌는 (a) 하나 이상의 인간 Vλ 유전자 분절, (b) 하나 이상의 인간 Jλ 유전자 분절, 및 (c) 하나 이상의 인간 Cλ 유전자 분절을 포함하되, (a)와 (b)는 (c) 및 설치류 면역글로불린 경쇄 불변 (Cλ) 유전자 분절에 작동 가능하게 연결되며; 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌는 하나 이상의 설치류 면역글로불린 λ 경쇄 인핸서(Eλ) 및 하나 이상의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 인핸서(Eλ)를 포함하고, 임의로는 3개의 인간 Eλ를 포함함);
(ii) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간(화) 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 공통 경쇄 암호화 서열 (여기서, 재배열된 인간(화) 경쇄 가변 영역 서열은 면역글로불린 경쇄 JL 유전자 분절과 재배열된 인간 경쇄 가변 영역 VL을 포함함);
(iii) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 제한된 재배열된 인간(화) 경쇄 가변 영역 (여기서, 제한된 재배열된 인간(화) 경쇄 가변 영역은 하나 이상의 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 결합(JL) 유전자 분절에 작동 가능하게 연결된 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 가변(VL) 유전자 분절을 포함함);
(iv) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열된 인간(화) 경쇄 가변 영역 (여기서, 히스티딘 변형된 재배열되지 않은 인간(화) 경쇄 가변 영역은, 히스티딘 코돈과 적어도 하나의 비히스티딘 코돈의 치환 또는 적어도 하나의 히스티딘 코돈의 삽입을 상보성 결정 영역 3(CDR3) 암호화 서열에 포함하는 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함함); 또는
(v) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열된 인간(화) 경쇄 가변 영역 (여기서, 히스티딘 변형된 재배열된 인간(하) 경쇄 가변 영역은, 히스티딘 코돈과 적어도 하나의 비히스티딘 코돈의 치환 또는 적어도 하나의 히스티딘 코돈의 삽입을 상보성 결정 영역 3(CDR3) 암호화 서열에 포함하는 재배열된 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함함)을 포함하는 마우스로서,
임의로, 마우스는
(i) 마우스가 비인간 동물의 야생형 생식능력을 나타내도록 기능적 ADAM6 유전자좌를 포함하는 인간(화) 면역글로불린 중쇄 유전자좌; 및/또는
(ii) 임의로, 재배열된 가변 영역 유전자의 적어도 10%가 비템플릿 첨가를 포함하도록 항원 수용체의 다양성을 증가시키기 위해 외인성 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제(TdT) 유전자를 추가로 포함하는 마우스가
이전에 기술되었다. 예를 들어, 미국 특허 제8,697,940호; 제8,754,287호; 제9,204,624호; 제9,334,334호; 제9,801,362호; 제9,332,742호; 및 제9,516,868호; 미국 특허 공개 20110195454, 20120021409, 20120192300, 20130045492; 20150289489; 20180125043; 20180244804; PCT 공개 번호 WO2017210586 및 WO2011163314; Lee 등의 문헌[(2014) Nature Biotechnology 32:356]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 게놈, 예를 들어, 생식선 게놈을 갖는 유전적으로 변형된 비인간 동물을 포함한다:
인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절, 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하되, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 불변 영역에 작동 가능하게 연결되는, 내인성 면역글로불린 유전자좌, 및/또는
인간 VL 유전자 분절 및 인간 JL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하되, 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 불변 영역에 작동 가능하게 연결되는, 내인성 사슬 유전자좌.
일부 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 게놈, 예를 들어, 생식선 게놈을 갖는 유전적으로 변형된 비인간 동물을 포함한다:
인간 VH 유전자 분절, 인간 DH 유전자 분절, 및 인간 JH 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하되, 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 불변 영역에 작동 가능하게 연결되는, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌, 및/또는
인간 VL 유전자 분절 및 인간 JL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 포함하되, 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 불변 영역에 작동 가능하게 연결되는, 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌.
일부 구현예에서, 비인간 동물, 예를 들어, 랫트 또는 마우스와 같은 설치류는, 인간 또는 인간화 MHC를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 추가하여 그의 게놈에서, 하나 이상의 인간 VH, DH 및 JH 분절과 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 있는 하나 이상의 내인성 VH, DH 및 JH 분절의 치환을 포함하되, 하나 이상의 VH, DH 및 JH 분절은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자에 작동 가능하게 연결되고; 임의로, 재배열되지 않았거나 재배열된 인간 VL 및 인간 JL 분절은 비인간 동물이 인간 또는 인간화 MHC 분자에 대해 대성을 갖고 면역원(예: 항원 pMHC 복합체)에 반응하여 역 키메라 항체를 생성하도록, 예를 들어, 내인성 비인간 경쇄 유전자좌에서 비인간(예를 들어, 마우스 또는 랫트와 같은 설치류) 또는 인간 면역글로불린 경쇄 불변(CL) 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된다.
특정 구현예에서, 인간 또는 인간화 MHC 분자를 발현하고 이에 대해 내성을 갖는 유전적으로 변형된 비인간 동물은 그의 게놈(예: 생식선 게놈)에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 가변 영역 및 면역글로불린 불변 영역 유전자를 포함하는 면역글로불린 불변 영역을 함유하는 (외인성 또는 내인성) 면역글로불린 유전자좌를 또한 포함하며, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 분절은 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 MHC 분자를 발현하고 이에 대해 내성을 갖는 비인간 동물은 그의 게놈(예: 생식선 게놈)에서, 다수의 이러한 면역글로불린 유전자좌를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 마우스가 인간 항체, 인간화 항체, 부분적으로 인간 항체 및/또는 역 키메라(인간 가변 영역 및 비인간 불변 영역) 항체를 만들도록, 그의 게놈(예: 생식선 게놈)에서, 인간 또는 인간화 MHC 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 (유전적으로 변형된 재배열되거나 재배열되지 않은 면역글로불린 유전자좌를 포함하는) 하나 이상의 면역글로불린 유전자좌를 포함한다.
일반적으로, 유전적으로 변형된 면역글로불린 유전자좌는 면역글로불린 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 (면역 글로불린 가변 영역 유전자 분절을 포함하는) 면역글로불린 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 유전자좌는 중쇄 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 인간 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 유전자좌는 중쇄 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 인간 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 (예를 들어 κ) 유전자 분절을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제9,516,868호를 참조하고, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 유전자좌는 κ 사슬 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 인간 재배열되지 않은 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 유전자좌는 κ 사슬 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 인간 재배열되지 않은 면역글로불린 가변 영역 κ 유전자 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 유전자좌는 κ 사슬 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 인간 재배열되지 않은 면역글로불린 가변 영역 λ 유전자 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 면역글로불린 유전자좌는 λ 사슬 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 연결된 인간 재배열되지 않은 면역글로불린 가변 영역 λ 유전자 분절을 포함한다.
특정 구현예에서, 비인간 동물은 내인성 중쇄 유전자좌에서, 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하되, 면역글로불린 가변 영역은 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Ig 중쇄 가변 영역 유전자 분절을 함유한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 Ig 가변 영역 유전자 분절은 적어도 하나의 인간 면역글로불린 중쇄 가변 (VH) 분절, 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 다양성 (DH) 분절(임의로 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 분절), 및 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 결합 (JH) 분절(임의로 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 분절)을 포함한다. 일부 구현예에서, 재배열되지 않은 인간 Ig 가변 영역 유전자 분절은 복수의 재배열되지 않은 인간 VH 분절, 하나 이상의 재배열되지 않은 (인간) DH 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 (인간) JH 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 재배열되지 않은 인간 Ig 가변 영역 유전자 분절은 적어도 3개의 VH 유전자 분절, 적어도 18개의 VH 유전자 분절, 적어도 20개의 VH 유전자 분절, 적어도 30개의 VH 유전자 분절, 적어도 40개의 VH 유전자 분절, 적어도 50개의 VH 유전자 분절, 적어도 60개의 VH 유전자 분절, 적어도 70개의 VH 유전자 분절 또는 적어도 80개의 VH 유전자 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 재배열되지 않은 인간 Ig 유전자 분절은 모든 기능적 인간 DH 유전자 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 재배열되지 않은 인간 Ig 유전자 분절은 모든 기능적 인간 JH 유전자 분절을 포함한다. Ig 중쇄 유전자 분절을 포함하는 예시적인 가변 영역은 예를 들어, Macdonald 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111 :5147-52 및 supplemental information에 제공되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물은 내인성 중쇄 유전자좌에서, 적어도 비인간 IgM 유전자를 포함하는 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 제한된 재배열되지 않은 인간(화) 중쇄 가변 영역을 포함하되, 제한된 재배열되지 않은 인간(화) 중쇄 가변 영역은 하나의 인간 VH 유전자 분절, 복수의 DH 유전자 분절 (예를 들어, 인간 DH 유전자 분절) 및 복수의 JH 유전자 분절 (예: 인간 JH 유전자 분절)을 특징으로 하며, 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 재배열이 가능하고 복수의 구별되는 재배열을 형성할 수 있으며, 각각의 재배열은 하나의 인간 VH 유전자 분절, DH 분절 중 하나 및 JH 분절 중 하나로부터 유래되고, 각각의 재배열은 상이한 중쇄 가변 도메인을 암호화한다(예를 들어, 미국 특허 공개 제20130096287호에 기술된 바를 참조하고, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 일부 구현예에서, 하나의 인간 VH 유전자 분절은 VH1~2 또는 VH1~69이다.
특정 구현예에서, 비인간 동물은 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된, 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 내인성 경쇄 유전자좌에 포함한다. 일부 구현예에서, 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 재배열되지 않은 인간 Ig κ 가변 영역 유전자 분절을 함유한다. 일부 구현예에서, 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 가변 영역은 복수의 재배열되지 않은 인간 Vκ 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JK 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 분절은 모든 인간 Jκ 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 가변 영역 유전자 분절은 4개의 기능적 Vκ 분절 및 모든 인간 Jκ 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 가변 영역 유전자 분절은 16개의 기능적 Vκ 분절 및 모든 인간 Jκ 분절(예를 들어, 모든 기능적 인간 Vκ 분절 및 Jκ 분절)을 포함한다. 일부 구현예에서, 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 분절은 모든 인간 Vκ 분절 및 모든 인간 Jκ 분절을 포함한다. Ig κ 유전자 분절을 포함하는 예시적인 가변 영역은 예를 들어, Macdonald 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1 11 :5147-52 및 supplemental information에 제공되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 제한된 재배열되지 않은 인간(화) 경쇄 가변 영역은, 재배열되지 않은 인간(화) 경쇄 가변 영역이 2개 이하의 인간 VL 유전자 분절 및 복수의 JL 유전자 분절(예를 들어, 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 미국 특허 제9,796,788호에 기술된 것과 같은 이중 경쇄 마우스, 또는 DLC)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, VL 유전자 분절은 Vκ 유전자 분절이다. 일부 구현예에서, VL 유전자 분절은 Vλ 유전자 분절이다. 일부 구현예에서, Vκ 유전자 분절은 IGKV3-20 및 IGKV1-39이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 마우스이 내인성 κ 경쇄 유전자좌에서 마우스 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 정확히 2개의 재배열되지 않은 인간 Vκ 유전자 분절 및 5개의 재배열되지 않은 인간 Jκ 유전자 분절을 포함하되, 임의로 2개의 재배열되지 않은 인간 Vκ 유전자 분절은 인간 Vκ1-39 유전자 분절 및 인간 Vκ3-20 유전자 분절이고, 5개의 재배열되지 않은 인간 Jκ 유전자 분절은 인간 Jκ1 유전자 분절, 인간 Jκ2 유전자 분절, 인간 Jκ3 유전자 분절, 인간 Jκ4 유전자 분절, 및 인간 Jκ5 유전자 분절이고, 재배열되지 않은 인간 카파 경쇄 유전자 분절은 재배열되어 항체의 인간 가변 도메인을 암호화할 수 있으며, 추가로, 비인간 동물은 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 형성하기 위해 재배열될 수 있는 내인성 내인성 Vκ 유전자 분절을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 재배열되지 않은 인간 Igλ 가변 영역 유전자 분절을 함유한다. 일부 구현예에서, 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 분절은 복수의 인간 Vλ 분절 및 하나 이상의 인간 Jλ 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 분절은 하나 이상의 인간 Vλ 분절 및 하나 이상의 인간 Jλ 분절 및 하나 이상의 인간 Cλ 불변 영역 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 분절은 모든 인간 Vλ 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 분절은 모든 인간 Jλ 분절을 포함한다. Ig λ 유전자 분절을 포함하는 예시적인 가변 영역은 예를 들어, 미국 특허 제9,035,128호 및 제6,998,514호에 제공되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 일부 구현예에서, 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 (a) 하나 이상의 인간 Vλ 유전자 분절, (b) 하나 이상의 인간 Jλ 유전자 분절, 및 (c) 하나 이상의 인간 Cλ 유전자 분절을 포함하되, (a)와 (b)는 (c) 및 내인성 (예를 들어, 설치류) Cλ 유전자 분절에 작동 가능하게 연결되고, 내인성 면역글로불린 λ 경쇄 유전자좌는 하나 이상의 설치류 면역글로불린 λ 경쇄 인핸서(Eλ), 및 하나 이상의 인간 면역글로불린 λ 경쇄 인핸서(Eλ)를 추가로 포함하고, 임의로는 3개의 인간 Eλ를 포함한다.
특정 구현예에서, 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 영역은, 비인간 동물이 내인성 κ 불변 도메인과 융합된 Vλ 및 Jλ 유전자 분절로부터 유래된 인간 λ 가변 도메인 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 발현하도록, 내인성(예를 들어, 랫트 또는 마우스와 같은 설치류) Cκ 유전자에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 Igλ 가변 영역 유전자 분절을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제9,226,484호를 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합됨).
일부 구현예에서, 재배열되지 않은 인간 면역 글로불린 가변 영역 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 가변 영역은 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자간 서열(intergenic sequence)을 또한 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 가변 영역은 비인간(예를 들어, 설치류, 랫트, 마우스) Ig 가변 영역 유전자간 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자간 서열은 내인성 종 기원이다.
일부 구현예에서, 면역글로불린 가변 영역은 재배열된 중쇄 가변 영역(범용 중쇄 가변 영역 또는 공통 중쇄 암호화 서열)이다. 일부 구현예에서, 재배열된 Ig 중쇄 가변 영역 유전자는 인간 재배열된 Ig 중쇄 가변 영역 유전자이다. 예시적인 재배열된 Ig 중쇄 가변 영역은 미국 특허 공개 제20140245468호 및 미국 특허 제9,204,624호 및 제9,930,871호에 제공되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 일부 구현예에서, 범용 중쇄 가변 영역을 포함하는 비인간 유기체는 이중특이적 항체를 생산하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서,공통 중쇄 암호화 서열, 예를 들어, 내인성 면역글로불린 불변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 내인성 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열을 포함하되, 재배열된 중쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열은 VH3-23/X1X2/JH의 서열을 암호화하고(여기서 X1은 임의의 아미노산이고, X2는 임의의 아미노산임); 비인간 동물은 내인성 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결되고, 임의로 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인과 동족인, 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, VH3-23/X1X2/JH 유전자로부터 유래되는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 발현한다.
일부 구현예에서, 면역글로불린 가변 영역은 재배열된 경쇄 가변 영역(범용 경쇄 가변 영역)이다. 일부 구현예에서, 재배열된 Ig 경쇄 가변 영역 유전자는 인간 재배열된 Ig 경쇄 가변 영역 유전자이다. 예시적인 재배열된 Ig 경쇄 가변 영역은, 예를 들어, 미국 특허 제9,969,814호; 제10,130,181호, 및 제10,143,186호 및 미국 특허 공개 제20120021409호, 제20120192300호, 제20130045492호, 제20130185821호, 제20130302836호, 및 제20150313193호에 제공되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 일부 구현예에서, 범용 경쇄 가변 영역을 포함하는 비인간 유기체("범용 경쇄" 유기체)는 이중특이적 항체를 생산하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 공통 경쇄 암호화 서열은 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 하나의 재배열된 인간 면역 글로불린 경쇄 Vκ/Jκ 서열을 포함하되, 하나의 재배열된 인간 면역 글로불린 경쇄 Vκ/Jκ 서열은 (i) 인간 Jκ5 유전자 분절에 융합된 인간 Vκ1-39 유전자 분절을 포함하는 인간 Vκ1-39/Jκ5 서열이거나, (ii) 인간 Jκ1 유전자 분절에 융합된 인간 Vκ3-20 유전자 분절을 포함하는 인간 Vκ3-20/Jκ1 서열이다.
일부 구현예에서, 면역글로불린 가변 영역은 이러한 비인간 유기체에서 생성된 항체에 pH 의존적 결합 특성을 도입하도록 설계된 히스티딘 코돈의 삽입 및/또는 치환을 포함하는 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 가변 영역이다. 일부 이러한 구현예에서, 히스티딘 코돈은 CDR3을 암호화하는 핵산 서열에 삽입되고/되거나 치환된다. 다양한 이러한 경쇄 및/또는 중쇄 면역글로불린 유전자좌는 미국 특허 제9,301,510호; 제 9,334,334호; 및 제9,801,362호 및 미국 특허 출원 공개 제20140013456호에 제공되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 일부 구현예에서, 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열된 인간(화) 경쇄 가변 영역은, 인간 Vκ 및 Jκ 분절 서열을 포함하는 하나의 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하되, 임의로 Vκ 분절 서열은 인간 Vκ1-39 또는 Vκ3-20 유전자 분절로부터 유래되며, 임의로 하나의 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 (IMGT 넘버링에 따른) 105, 106, 107, 108, 109, 111 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 발현되는 히스티딘 코돈과 Vκ 분절 서열의 적어도 하나의 비히스티딘 코돈의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열되지 않은 인간(화) 중쇄 가변 영역은, 히스티딘 코돈과 적어도 하나의 비히스티딘 코돈의 치환 또는 적어도 하나의 히스티딘 코돈의 삽입을 상보성 결정 영역 3(CDR3) 암호화 서열에 포함하는 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 서열은 재배열되지 않은 인간 VH, 재배열되지 않은 인간 DH 또는 합성 DH, 및 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절을 포함하되, 임의로 재배열되지 않은 인간 DH 또는 합성 DH 유전자 분절은 히스티딘 코돈과 적어도 하나의 비히스티딘 코돈의 치환 또는 적어도 하나의 히스티딘 코돈의 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 중쇄 불변 영역에 대한 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열되지 않은 인간(화) 경쇄 가변 영역은 재배열되지 않은 VL 및 재배열되지 않은 JL 유전자 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 히스티딘 변형된 재배열되지 않은 인간(화) 경쇄 가변 영역은 2개 이하의 재배열되지 않은 인간 VL(예: 2개 이하의 Vκ 유전자 분절) 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JL(예를 들어, Jκ) 유전자 분절(들)을 포함하되, 2개 이하의 인간 VL 유전자 분절 각각은 히스티딘 코돈과 적어도 하나의 비히스티딘 코돈의 치환 및 적어도 하나의 히스티딘 코돈의 삽입을 CDR3 암호화 서열에 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이하의 인간 Vκ 유전자 분절은 인간 Vκ1-39 및 Vκ3-20 유전자 분절이고, 이들 각각은 히스티딘 코돈과 비히스티딘 코돈의 하나 이상의 치환을 포함하되, 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절은 재배열될 수 있고, 인간 Vκ 및 Jκ 유전자 분절은 (IGMT 넘버링에 따른) 105, 106, 107, 108, 109, 111로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 하나 이상의 히스티딘을 포함하는 인간 경쇄 가변 도메인을 암호화하며, 하나 이상의 히스티딘은 하나 이상의 치환으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 면역 글로불린 불변 영역은 중쇄 불변 영역 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 인간 중쇄 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원이다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 마우스 불변 영역 유전자이거나 랫트 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 불변 영역 유전자는 인간 서열과 비인간 서열의 혼합물이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 불변 영역 유전자는 인간 CH1 영역 및 비인간(예를 들어, 내인성 종 기원, 마우스, 랫트) CH2 및/또는 CH3 영역을 암호화한다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역 유전자는 Cμ, Cδ, Cγ (Cγl, Cγ2, Cγ3, Cγ4), Cα 또는 Cε 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 불변 영역 유전자는 내인성 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 불변 영역 유전자는, 비인간 동물이 중쇄 단독 항체를 발현하도록 돌연변이된 CH1 영역을 암호화한다(예를 들어, 미국 특허 제8,754,287호, 미국 특허 출원 공개 제2015/0289489호를 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 예를 들어, (범용 또는 이중 경쇄 유기체에서) 이중 특이적 항체를 만들기 위한 중쇄를 생성하는 것이 목표인 일부 구현예에서, 중쇄의 Fc 도메인은 중쇄 이종이량체 형성을 용이하게 하고/하거나 중쇄 동종이량체 형성을 억제하기 위한 변형을 포함한다. 이러한 변형은, 예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호; 제5,807,706호; 제5,821,333호; 제7,642,228호 및 제8,679,785호, 및 미국 특허 공개 제2013/0195849호에 제공되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본문에 통합된다.
일부 구현예에서, 면역 글로불린 불변 영역은 경쇄 불변 영역 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄 불변 영역 유전자는 κ 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 경쇄 불변 영역 유전자는 λ 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 경쇄 불변 영역 유전자는 내인성 종 기원이다. 일부 구현예에서, 경쇄 불변 영역 유전자는 마우스 불변 영역 유전자이거나 랫트 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 경쇄 불변 영역 유전자는 인간 서열과 비인간 서열의 혼합물이다.
일부 구현예에서, 가변 영역 유전자 분절이 작동 가능하게 연결된 면역글로불린 불변 영역 유전자 및 인간 가변 영역 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 가변 영역은 내인성 면역글로불린 유전자좌에 위치한다. 일부 구현예에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 중쇄 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 κ 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 내인성 λ 유전자좌이다. 일부 구현예에서, 인간 가변 영역 유전자 분절이 작동 가능하게 연결된 불변 영역 유전자는 내인성 불변 영역 유전자이다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 비인간 동물의 게놈 내의 하나 이상의 내인성 면역글로불린 유전자좌 또는 하나 이상의 내인성 유전자좌의 일부분(예를 들어, 가변 영역 및/또는 불변 영역)은 불활성화된다. 내인성 면역글로불린 가변 영역 유전자좌 및 이의 일부분은, 유기체의 게놈으로부터 유전자좌 또는 이의 일부분을 결실시키는 것, 상이한 핵산 서열과 유전자좌 또는 이의 일부분을 치환하는 것, 비인간 유기체의 게놈 내 또 다른 위치로 유전자 또는 이의 일부분을 역위 또는 변위시키는 것을 포함하되 이들로 한정되지 않는, 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용해 불활성화될 수 있다. 일부 구현예에서, 유전자좌의 불활성화는 단지 부분적 불활성화이다. 일부 구현예에서, 유전자좌의 가변 영역은 불활성화되지만 불변 영역은 (예를 들어, 불변 영역이 비내인성 가변 영역 유전자 분절에 작동 가능하게 연결되어 있기 때문에) 기능적인 상태로 유지된다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 불활성화된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌 또는 이의 일부는 내인성 중쇄 유전자좌의 내인성 가변 영역의 적어도 일부의 결실, 치환, 변위 및/또는 역위에 의해 불활성화된다. 일부 구현예에서, 결실되고, 치환되고, 변위되고/되거나 역위되는 내인성 중쇄 유전자좌의 가변 영역의 적어도 일부는 가변 영역의 J 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌 또는 이의 일부는 내인성 중쇄 유전자좌의 내인성 불변 영역의 적어도 일부의 결실, 치환, 변위 및/또는 역위에 의해 불활성화된다. 일부 구현예에서, 결실되고, 치환되고, 변위되고/되거나 역위되는 내인성 중쇄 유전자좌의 불변 영역의 적어도 일부는 내인성 불변 영역의 Ομ 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 불활성화된 내인성 면역글로불린 κ 사슬 유전자좌를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 면역글로불린 κ 사슬 유전자좌 또는 이의 일부는 내인성 κ 사슬 유전자좌의 내인성 가변 영역의 적어도 일부의 결실, 치환, 변위 및/또는 역위에 의해 불활성화된다. 일부 구현예에서, 결실되고, 치환되고, 변위되고/되거나 역위되는 내인성 κ 사슬 유전자좌의 가변 영역의 적어도 일부는 가변 영역의 J 분절을 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 면역글로불린 κ 사슬 유전자좌 또는 이의 일부는 내인성 κ 사슬 유전자좌의 내인성 불변 영역의 적어도 일부의 결실, 치환, 변위 및/또는 역위에 의해 불활성화된다. 일부 구현예에서, 결실되고, 치환되고, 변위되고/되거나 역위되는 내인성 κ 사슬 유전자좌의 불변 영역의 적어도 일부는 내인성 불변 영역의 Cκ 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 불활성화된 내인성 면역글로불린 λ 사슬 유전자좌를 포함한다. 일부 구현예에서, 내인성 면역글로불린 λ 사슬 유전자좌 또는 이의 일부는 내인성 λ 사슬 유전자좌의 내인성 가변 영역의 적어도 일부의 결실, 치환, 변위 및/또는 역위에 의해 불활성화된다. 일부 구현예에서, 내인성 λ 사슬 유전자좌 내의 적어도 하나의 V-J-C 유전자 클러스터의 적어도 일부는 결실되고, 치환되고, 변위되고/되거나 역위된다. 일부 구현예에서, 내인성 면역글로불린 λ 사슬 유전자좌 또는 이의 일부는 내인성 λ 사슬 유전자좌의 내인성 불변 영역의 적어도 일부의 결실, 치환, 변위 및/또는 역위에 의해 불활성화된다. 일부 구현예에서, 결실되고, 치환되고, 변위되고/되거나 역위되는 내인성 λ 사슬 유전자좌의 불변 영역의 적어도 일부는 내인성 불변 영역의 C 유전자를 포함한다.
다양한 구현예에서, 면역글로불린 유전자좌의 변형은 비인간 동물의 생식능력에 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예에서, 중쇄 유전자좌는 기능적 유전자, 예를 들어, 내인성 ADAM6a 유전자, ADAM6b 유전자, 또는 둘 다를 포함하고, 유전적 변형은 내인성 ADAM6a 유전자, ADAM6b 유전자, 또는 둘 다의 발현 및/또는 기능에 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물의 게놈은 이소적으로(ectopically) 위치된 기능적 유전자, 예를 들어 내인성 ADAM6a 유전자, ADAM6b 유전자, 또는 둘 다를 추가로 포함한다. 외인성 ADAM6a 및/또는 ADAM6b를 발현하는 예시적인 비인간 동물은 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 항원 수용체 다양성을 증가시키기 위해 외인성 말단 데옥시티뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제(TdT)를 추가로 포함하고 이를 발현한다. 외인성 TdT를 발현하는 예시적인 비인간 동물은 PCT 공개 WO 2017210586에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물은 인간 또는 인간화 MHC 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 이를 발현하고, 인간 가변 도메인(예를 들어, 재배열된 인간 가변 영역 유전자 분절로부터 유래된 (예를 들어, 이에 의해 암호화된) 인간 가변 도메인)을 갖는 항체를 발현하지만, 공 인간 또는 인간화 MHC에 특이적으로 결합하는 항체는 결여된다. 일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 가변 도메인은 인간 또는 인간화 중쇄 가변 도메인이다. 일부 구현예에서, 항체는 중쇄 단독 항체이다. 일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 가변 도메인은 인간 또는 인간화 경쇄 가변 도메인이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물에 의해 생성된 항체는 인간 또는 인간화 중쇄 가변 도메인, 및 인간 또는 인간화 경쇄 가변 도메인을 둘 다를 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 또는 인간화 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 항체는 인간 또는 인간화 경쇄 불변 도메인을 갖는다. 일부 구현예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 불변 도메인은 비인간 기원이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 중쇄 불변 도메인은 내인성 종 기원이다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 도메인은 마우스 또는 랫트 기원이다. 일부 구현예에서, 경쇄 불변 도메인은 내인성 종 기원이다. 일부 구현예에서, 경쇄 불변 도메인은 마우스 또는 랫트 기원이다.
비인간 동물, 조직 및 세포
일부 구현예에서, 본 발명의 유전적으로 변형된 비인간 동물은 마우스, 랫트, 토끼, 돼지, 소(예를 들어, 암소, 숫소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 페릿, 영장류(예: 마모셋, 붉은털 원숭이)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 적절한 유전자 변형이 가능한 ES 세포를 쉽게 구할 수 없는 비인간 동물의 경우, 유전자 변형을 포함하여 비인간 동물을 만들기 위한 다른 방법이 사용된다. 이러한 방법은, 예를 들어, 비-ES 세포 게놈(예를 들어, 섬유아세포 또는 유도된 다능성 세포)의 변형 및 적합한 세포, 예를 들어, 난모세포로 변형된 게놈을 이식하기 위한 핵 이식의 채용, 및 배아를 형성하기에 적합한 조건 하에 비-인간 동물에서 변형된 세포(예를 들어, 변형된 난모세포)의 잉태를 포함한다.
일 구현예에서, 비인간 동물은 마모셋이다. 일 구현예에서, 비인간 동물은, 예를 들어, 뛰는 쥐상과(Dipodoidea 또는 Muroidea) 아목의 작은 포유동물이다. 일 구현예에서, 유전적으로 변형된 동물은 설치류이다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스, 랫트 및 햄스터로부터 선택된다. 일 구현예에서, 설치류는 쥐상과 아목으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 유전적으로 변형된 동물은 칼로미스쿠스과(Calomyscidae)(예를 들어, 마우스와 같은 햄스터), 비단털쥐과(Cricetidae)(예: 햄스터, 미국 랫트 및 마우스, 들쥐), 쥐과(Muridae)(진짜 마우스 및 랫트, 사막쥐, 가시쥐, 갈기쥐), 네소미스과(Nesomyidae)(클라이밍 마우스, 락 마우스(rock mice), 흰꼬리 랫트, 말라가시 랫트 및 마우스), 가시겨울잠쥐과(Platacanthomyidae)(예: 가시겨울잠쥐), 및 소경쥐과(Spalacidae)(예: 두더쥐, 대나무쥐, 및 동북)로부터 선택된 과(family)로부터 유래한다. 특정 구현예에서, 유전적으로 변형된 설치류는 진짜 마우스 또는 랫트(쥐상과), 사막쥐(gerbil), 가시쥐(spiny 마우스), 갈기쥐(crested rat)로부터 선택된다. 일 구현예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 쥐상과의 구성원으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 비인간 동물은 설치류이다. 일 구현예에서, 설치류는 마우스 및 랫트로부터 선택된다. 일 구현예에서, 비인간 동물은 랫트이다. 일 구현예에서, 비인간 동물은 마우스이다.
특정 구현예에서, 비인간 동물은 C57BL/A, C57BL/An,C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10,C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola로부터 선택된 C57BL 계통의 마우스인 설치류이다. 또 다른 구현예에서, 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들어, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 계통으로 이루어진 군으로부터 선택된 129 계통이다(예를 들어, Festing 등의 문헌[(1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836] 및 Auerbach 등의 문헌[(2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines] 참조). 일 구현예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 전술한 129 계통 및 전술한 C57BL/6 계통의 혼합체이다. 또 다른 구체적인 구현예에서, 마우스는 전술한 129 계통의 혼합체, 또는 전술한 BL/6 계통의 혼합체이다. 구체적인 일 구현예에서, 혼합체의 129 계통은 129S6(129/SvEvTac) 계통이다. 또 다른 구현예에서, 마우스는 BALB 계통, 예를 들어, BALB/c 계통이다. 또 다른 구현예에서, 마우스는 BALB 계통 및 전술한 다른 계통의 혼합체이다. 본원에 제공된 바와 같은 비인간 동물은 전술한 계통의 임의의 조합으로부터 유래된 마우스일 수 있다.
랫트 ES 세포에서 표적화된 변형된 대립유전자의 생식선 전이(germline transmission)는 10년 전에 확립되었다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제20140235933호 및 제20140310828호; Tong 등의 문헌[(2010) Nature 467:211-215], Tong 등의 문헌[(2011) Nat Protoc. 6(6): doi:10.1038/nprot.2011.338]을 참조하며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 이와 같이, 일 구현예에서, 랫트는 위스타 랫트(Wistar rat), LEA 계통, 스프래그 다울리(Sprague Dawley) 계통, 피셔(Fischer) 계통, F344, F6, 및 다크 아구티(Dark Agouti)로부터 선택된다. 일 구현예에서, 랫트 계통은 위스타, LEA, 스프래그 다울리, 피셔, F344, F6, 및 아크 아구티로 이루어진 군으로부터 선택된 2가지 이상 계통의 혼합체이다.
따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되되, 마우스는 예를 들어 그의 게놈에서, 예를 들어, 그의 생식선 게놈에서
(a) 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및
(b) 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하되, 임의로 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌 중 적어도 하나는 재배열되지 않고,
상기 유전적으로 변형된 비인간 동물은 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 적어도 이의 펩티드 결합 부분을 발현하고,
상기 유전적으로 변형된 비인간 동물은 인간 또는 인간화 중쇄 가변 도메인 및/또는 인간 또는 인간화 경쇄 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린을 발현하고,
비인간 동물은, 다음을 포함하는 항원 펩티드-MHC(pMHC) 복합체로 면역화할 때 특이적 B 세포 반응을 생성하도록 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분에 대해 내성을 갖는다: (i) (ii)와 복합체를 형성한 비인간 동물에 대해 이종인 펩티드를; 및 (ii) 인간 또는 인간화 MHC 분자가 유래된 인간 HLA 분자 또는 이의 일부분.
일부 구현예에서, 마우스는 제1 완전한 인간 또는 키메라 인간/쥣과 MHC 폴리펩티드(예: MHC II α)를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열, 제2 완전한 인간 또는 키메라 인간/쥣과 MHC 폴리펩티드(예: MHC II β)를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열, 및/또는 제3 완전한 인간 또는 키메라 인간/쥣과 MHC 폴리펩티드(예: MHC I)를 암호화하는 제3 뉴클레오티드 서열 및 임의로 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 포함하며,
(a) 내인성 중쇄 유전자좌에서:
(i) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 중쇄 가변 영역;
(ii) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 제한된 재배열되지 않은 인간(화) 중쇄 가변 영역;
(iii) 공통 중쇄 암호화 서열;
(iv) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열되지 않은 인간(화) 중쇄 가변 영역;
(v) 중쇄 단독 면역글로불린 암호화 서열; 또는
(vi) 하이브리드 면역글로불린 사슬을 암호화하는 재배열되지 않은 인간(화) 하이브리드 중쇄 서열을 포함하고/하거나 　
(b) 내인성 경쇄 유전자좌에서:
(i) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 영역;
(ii) 공통 경쇄 암호화 서열;
(iii) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 제한된 재배열되지 않은 인간(화) 경쇄 가변 영역;
(iv) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열되지 않은 인간(화) 경쇄 가변 영역;
(v) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열된 인간(화) 경쇄 가변 영역을 포함하고,
임의로, 마우스는
(i) 마우스가 야생형 생식능력을 나타내도록 기능적 ADAM6 유전자좌를 포함하는 인간(화) 면역글로불린 중쇄 유전자좌; 및/또는
(ii) 임의로, 재배열된 가변 영역 유전자의 적어도 10%가 비템플릿 첨가를 포함하도록 항원 수용체의 다양성을 증가시키기 위해 외인성 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제(TdT) 유전자를 추가로 포함한다.
유전적으로 변형된 동물(예를 들어, 마우스 또는 랫트와 같은 설치류)에 추가로, 조직 또는 세포가 또한 제공되며, 여기서 조직 또는 세포는 일부 구현예의 비인간 동물로부터 유래되는데, 예를 들어, 조직 또는 세포는 (a) 완전한 인간 또는 키메라 인간/쥣과 MHC 폴리펩티드(예: MHC II α)를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열, 완전한 인간 또는 키메라 인간/쥣과 MHC 폴리펩티드(예: MHC II β)를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열 및/또는 완전한 인간 또는 키메라 인간/쥣과 MHC 폴리펩티드(예: MHC I)를 암호화하는 제3 뉴클레오티드 서열 및 임의로 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 β2 마이크로글로불린 유전자를 포함하되, (b) 세포가 B 세포가 아닌 경우, 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌, 임의로, 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화화 면역글로불린 경쇄 유전자좌는 재배열되지 않는다.
일부 구현예에서, 조직 또는 세포는 인간 또는 인간화 MHC 분자 및 인간 또는 인간화 항원 결합 단백질 및/또는 인간 또는 인간화 항원 결합 단백질의 하나 이상의 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 발현하며, 여기서 항원 결합 단백질은, 조직 또는 세포가 유래되는 비인간 동물에 대해 항원성인 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하고, 예를 들어, pMHC 복합체는 인간 MHC(또는 이의 일부분)와 복합체를 형성한 항원 펩티드를 포함하고, 비인간 동물은 복합체 중 인간 MHC에 대해 일반적으로 내성을 갖는다. 일부 구현예에서, 세포는 CHO 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 일부 구현예의 비인간 동물로부터 단리된 B 세포와 골수종 세포의 융합물로부터 유래된 하이브리도마 또는 쿼드로마이다. 일부 구현예에서, 조직 또는 세포는 항원 결합 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 서열이며, 여기서 항원 결합 단백질은, 항원 결합 단백질이 유래되는 비인간 동물에 대해 항원성인 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하고, 예를 들어, pMHC 복합체는 인간 MHC(또는 이의 일부분)와 복합체를 형성한 항원 펩티드를 포함하고, 비인간 동물은 복합체 중 인간 MHC에 대해 일반적으로 내성을 갖는다.
유전적으로 조작된 비인간 동물에 추가하여, 비인간 배아(예를 들어, 마우스 또는 랫트와 같은 설치류 배아)가 또한 제공되며, 여기서 비인간 배아는 예시적 구현예에서 비인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 랫트와 같은 설치류)를 생성하는 데 사용될 수 있는 공여자 ES 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 비인간 배아는, 인간 또는 인간화 MHC I(예를 들어, MHC I α) 뉴클레오티드 서열, 인간 또는 인간화 MHC II (예를 들어, MHC II α 및/또는 MHC II β) 뉴클레오티드 서열, 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 유전자좌(예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 유전자좌), 및/또는 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 유전자 서열 및 숙주 배아 세포를 포함하는 공여자자 ES 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 비-인간 동물(예를 들어, 랫트 또는 마우스와 같은 설치류) 세포 또는 게놈은 비인간 동물 세포, 예를 들어, 다능성 세포, 배아 줄기(ES) 세포, 생식 세포 등을 생성하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 세포 또는 게놈은
(a) 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및
(b) 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하되, 임의로 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌 중 적어도 하나는 재배열되지 않고,
생성된 유전적으로 변형된 비인간 동물은 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 적어도 이의 펩티드 결합 부분을 발현하므로,
생성된 유전적으로 변형된 비인간 동물은 인간 또는 인간화 중쇄 가변 도메인 및/또는 인간 또는 인간화 경쇄 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린을 발현하고,
생성된 비인간 동물은, 다음을 포함하는 항원 펩티드-MHC(pMHC) 복합체로 면역화할 때 특이적 B 세포 반응을 생성하도록 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분에 대해 내성을 갖는다: (i) (ii)와 복합체를 형성한 비인간 동물에 대해 이종인 펩티드; 및 (ii) 인간 또는 인간화 MHC 분자가 유래된 인간 HLA 분자 또는 이의 일부분.
일부 예시적인 구현예에서, 세포 또는 게놈은 제1 완전한 인간 또는 키메라 인간/쥣과 MHC 폴리펩티드(예: MHC II α)를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열, 제2 완전한 인간 또는 키메라 인간/쥣과 MHC 폴리펩티드(예: MHC II β)를 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열, 및/또는 제3 완전한 인간 또는 키메라 인간/쥣과 MHC 폴리펩티드(예: MHC I)를 암호화하는 제3 뉴클레오티드 서열 및 임의로 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 포함하며,
(a) 내인성 중쇄 유전자좌에서:
(i) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 중쇄 가변 영역;
(ii) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 제한된 재배열되지 않은 인간(화) 중쇄 가변 영역;
(iii) 공통 중쇄 암호화 서열;
(iv) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열되지 않은 인간(화) 중쇄 가변 영역;
(v) 중쇄 단독 면역글로불린 암호화 서열; 또는
(vi) 하이브리드 면역글로불린 사슬을 암호화하는 재배열되지 않은 인간(화) 하이브리드 중쇄 서열을 포함하고/하거나
및/또는
(b) 내인성 경쇄 유전자좌에서:
(i) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 영역;
(ii) 공통 경쇄 암호화 서열;
(iii) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 제한된 재배열되지 않은 인간(화) 경쇄 가변 영역;
(iv) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열되지 않은 인간(화) 경쇄 가변 영역;
(v) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열된 인간(화) 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며
임의로, 세포 또는 게놈은
(i) 마우스가 야생형 생식능력을 나타내도록 기능적 ADAM6 유전자좌를 포함하는 인간(화) 면역글로불린 중쇄 유전자좌; 및/또는
(ii) 임의로, 재배열된 가변 영역 유전자의 적어도 10%가 비템플릿 첨가를 포함하도록 항원 수용체의 다양성을 증가시키기 위해 외인성 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제(TdT) 유전자를 추가로 포함한다.
후속하는 실시예는, 키메라 인간/마우스 HLA-A2/H-2K를 암호화하는 핵산 서열과 마우스 H-2K 단백질을 암호화하는 핵산의 치환을 포함하는 게놈을 가진 유전적으로 조작된 동물을 기술하지만, 당업자는 다른 인간(화) MHC I 및 II 유전자(예를 들어, ROSA26 유전자좌와 같은 내인성 유전자좌 또는 이소성 유전자좌에서, 다른 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C; 및 다른 HLA-DR, HLA-DP 및 HLA-DQ 유전자)를 도입하는데 유사한 전략이 사용될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 내인성 MHC 유전자좌에서 다수의 키메라 인간/비인간(예를 들어, 인간/설치류, 예컨대 인간/마우스) MHC I 및 MHC II 유전자를 포함하는 이러한 동물이 또한 제공된다. 이러한 키메라 MHC I 및 MHC II 단백질의 예는 미국 특허 공개 제20130111617호, 제20130185819호, 제20130185820호 및 제20140245467호 및 미국 특허 제8,847,005호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
또한, 본 발명의 구현예의 비인간 동물의 염색체 또는 이의 단편을 포함하는 비인간 세포가 제공된다. 일 구현예에서, 비인간 세포는 본 발명의 구현예의 비인간 동물의 세포핵(nucleus)을 포함한다. 일 구현예에서, 비인간 세포는 핵 전달의 결과로서 염색체 또는 이의 단편을 포함한다.
유전적으로 변형된 비인간 동물의 제조
유전자 조작된 비인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 랫트와 같은 유전자 조작된 설치류)을 제조하는 방법이 또한 제공된다. 일반적으로, 상기 방법은 (a) 제1 키메라 인간/비인간 MHC 폴리펩티드를 암호화하는 제1 핵산 서열, 제2 키메라 인간/비인간 MHC 폴리펩티드를 암호화하는 제2 핵산 서열, 제3 키메라 인간/비인간 MHC 폴리펩티드를 암호화하는 제3 핵산 서열 및/또는 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드를 암호화하는 β2 마이크로글로불린 유전자좌, 및 (b) 인간 또는 인간화 항체를 암호화하는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌를 포함하도록 비인간 동물의 게놈, 예를 들어, 생식선 게놈을 변형하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형하는 단계는 내인성 MHC 폴리펩티드 세포 외 도메인을 암호화하는 표적화 서열, β2 마이크로글로불린의 전부 또는 일부, 및 면역글로불린 가변 영역을 표적화하는 단계, 및 이들을 인간 MHC 세포 외 도메인(들), 인간 β2 마이크로글로불린의 전부 또는 일부, 및 인간 면역글로불린 가변 영역과 각각 치환하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형하는 단계는 동일한 종의 동물과 번식시키는 단계, 예를 들어, 교배시키는 단계를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 변형하는 단계는 하나 이상의 ES 세포에서의 순차적 상동성 재조합을 포함한다. 일부 구현예에서, ES 세포는 원하는 유전적 변형의 전부는 아니지만 하나 이상을 포함하도록 유전적으로 변형된 비인간 동물로부터 유래되며, 이러한 ES 세포에서의 상동성 재조합을 통해 유전자 변형이 완성된다. 다른 구현예에서, 변형하는 단계는 번식시키는 단계와 ES 세포에서의 상동성 재조합의 조합을 포함할 수 있고, 예를 들어, 동물을 동일한 종의 또 다른 (또는 더 많은) 동물과 교배시키되, 비인간 동물의 일부 또는 전부는 단일 상동성 재조합 또는 순차적 상동성 재조합 이벤트를 통해 유전적으로 변형된 ES 세포로부터 생성될 수 있고, 일부 ES 세포는 본원에 개시된 유전적 변형 중 하나 이상을 포함하는 비인간 동물로부터 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형하는 단계는 하나의 ES 세포에서의 순차적 상동성 재조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 VELOCIGENE® 기술을 사용해 만들어진 작제물을 표적화하는 단계, 작제물을 ES 세포에 도입하는 단계, 및 표적화된 ES 세포 클론을 VELOCIMOUSE® 기술을 사용해 마우스 배아에 도입하는 단계를 활용한다(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 Poueymirou 등의 문헌[(2007) Nature Biotech 25:91-99]을 참조하고, 이들 참조 문헌 각각은 그 전체가 참조로써 본원에 통합됨). 작제물을 표적화하는 단계는 치환 대상 내인성 서열을 표적화하는 5' 및/또는 3' 상동성 아암, (내인성 서열을 치환하는) 삽입 서열, 및 하나 이상의 선택 카세트를 포함할 수 있다. 선택 카세트는 표적 작제물 내에 삽입되어, 관심 작제물이 통합된 세포(예를 들어, ES 세포)의 선택을 용이하게 하는 뉴클레오티드 서열이다. 다수의 적절한 선택 카세트가 당업계에 알려져 있다. 일반적으로, 선택 카세트는 특정 항생제(예: Neo, Hyg, Pur, CM, SPEC 등)의 존재 하에 양성 선택을 가능하게 한다. 또한, 선택 카세트의 측면에는 재조합 부위가 위치할 수 있는데, 이는 재조합 효소(recombinase enzyme)로 치료할 때 선택 카세트가 결실되도록 한다. 흔히 사용되는 재조합 부위는 Cre 및 Flp 효소에 의해 각각 인식되는 loxP 및 Frt이지만, 다른 것들도 당업계에 공지되어 있다. 선택 카세트는 작제물 내에서 코딩 영역 밖의 어디든지 위치할 수 있다. 일 구현예에서, 선택 카세트는 인간 DNA 단편의 5' 말단에 위치한다. 또 다른 구현예에서, 선택 카세트는 인간 DNA 단편의 3' 말단에 위치한다. 또 다른 구현예에서, 선택 카세트는 인간 DNA 단편 내에 위치한다. 또 다른 구현예에서, 선택 카세트는 인간 DNA 단편의 인트론 내에 위치한다. 또 다른 구현예에서, 선택 카세트는 인간과 마우스 DNA 단편의 접합부(junction)에 위치한다. 본질적으로 공여자 유전자-표적화 ES 세포로부터 완전히 유래된 F0 세대 마우스는 즉각적인 표현형 분석을 가능하게 한다. 인간 또는 인간화 MHC 클래스 I 유전자, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 유전자, 및/또는 인간 또는 인간화 MHC 클래스 II 유전자를 비롯하여 인간화 면역글로불린 유전자도 독립적으로 보유하는 VELOCIMICE®(완전히 공여자 ES 세포로부터 유래된 F0 마우스)는 이들 고유한 유전자 서열의 존재를 검출하는 변형된 대립유전자 검정(Valenzuela 등의 문헌[(2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659]을 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합됨)을 사용하는 유전자형 분석에 의해 식별된다. 이 방법에 의해 생성된 이형접합성 마우스를 동형접합체와 교배시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 인간 또는 인간화 MHC I, β2 마이크로글로불린, MHC II 분자를 포함하는 비인간 동물을 동일한 종의 제2 비인간 동물과 교배시키는데, 여기서 제2 비인간 동물은 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함한다. 예를 들어, 인간 또는 인간화 MHC I, β2 마이크로글로불린, MHC II 분자를 포함하는 마우스는
(a) 내인성 중쇄 유전자좌에서:
(i) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 중쇄 가변 영역;
(ii) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 제한된 재배열되지 않은 인간(화) 중쇄 가변 영역;
(iii) 공통 중쇄 암호화 서열;
(iv) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열되지 않은 인간(화) 중쇄 가변 영역;
(v) 중쇄 단독 면역글로불린 암호화 서열; 또는
(vi) 하이브리드 면역글로불린 사슬을 암호화하는 재배열되지 않은 인간(화) 하이브리드 중쇄 서열을 포함하고/하거나
　
(b) 내인성 경쇄 유전자좌에서:
(i) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 영역;
(ii) 공통 경쇄 암호화 서열;
(iii) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 제한된 재배열되지 않은 인간(화) 경쇄 가변 영역;
(iv) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열되지 않은 인간(화) 경쇄 가변 영역;
(v) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열된 인간(화) 경쇄 가변 영역을 포함하는 제2 마우스와 교배시킬 수 있고,
임의로, 제2 마우스는
(i) 마우스가 야생형 생식능력을 나타내도록 기능적 ADAM6 유전자좌를 포함하는 인간(화) 면역글로불린 중쇄 유전자좌; 및/또는
(ii) 임의로, 재배열된 가변 영역 유전자의 적어도 10%가 비템플릿 첨가를 포함하도록 항원 수용체의 다양성을 증가시키기 위해 외인성 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제(TdT) 유전자를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 인간 또는 인간화 MHC I, MHC II 및/또는 β2 마이크로글로불린을 삽입하는 작제물은 (내인성 MHC I, MHC II 및/또는 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서 또는 이소성 유전자좌에서), 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하도록 유전적으로 변형된 비인간 동물 ES 세포에서의 상동성 재조합에 참여한다. 대안적으로, 삽입을 위한 작제물은 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하며, 인간 또는 인간화 MHC I, MHC II 및/또는 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 유전적으로 변형된 비인간 동물 ES 세포에서의 상동성 재조합에 참여한다. 일 구현예에서, 내인성 MHC I, MHC II, 및/또는 β2 마이크로글로불린 서열을 표적화하여 키메라 인간/마우스 MHC I, MHC II 및/또는 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 핵산 서열로 치환하기 위한 작제물; 또는 단쇄 MHC I/β2 마이크로글로불린 및/또는 단쇄 MHC II 단백질을 삽입하기 위한 작제물은 ES 세포에서의 상동성 재조합에 참여하며, 이는 또한
(a) 내인성 중쇄 유전자좌에서:
(i) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 중쇄 가변 영역;
(ii) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 제한된 재배열되지 않은 인간(화) 중쇄 가변 영역;
(iii) 공통 중쇄 암호화 서열;
(iv) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열되지 않은 인간(화) 중쇄 가변 영역;
(v) 중쇄 단독 면역글로불린 암호화 서열; 또는
(vi) 하이브리드 면역글로불린 사슬을 암호화하는 재배열되지 않은 인간(화) 하이브리드 중쇄 서열을 포함하고/하거나
　
(b) 내인성 경쇄 유전자좌에서:
(i) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 영역;
(ii) 공통 경쇄 암호화 서열;
(iii) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 제한된 재배열되지 않은 인간(화) 경쇄 가변 영역;
(iv) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열되지 않은 인간(화) 경쇄 가변 영역;
(v) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열된 인간(화) 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며
임의로, ES 세포는
(i) 기능적 ADAM6 유전자좌를 포함하는 인간(화) 면역글로불린 중쇄 유전자좌; 및/또는
(ii) 항원 수용체의 다양성을 증가시키기 위한 외인성 말단 데옥시티뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제(TdT) 유전자를 추가로 포함한다.
본 발명의 다양한 구현예에서, 키메라 인간/비인간 MHC I 및 MHC II 폴리펩티드를 암호화하는 서열(들)은 내인성 비인간 MHC 유전자좌(예를 들어, 마우스 H-2K 및/또는 H-2E 유전자좌)에 위치한다. 일 구현예에서, 이는 내인성 MHC 유전자(들) 또는 그의 일부분의 배치, 예를 들어, 인간 또는 인간화 MHC I 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열(들)과의 치환을 야기한다. MHC I, MHC II α 및 MHC II β 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 염색체 상에서 서로 근접하여 위치하므로, 하나의 동물에서 MHC I 및 MHC II 모두의 인간화를 성공적으로 달성하기 위해서는 필요에 따라 MHC I 및 MHC II 유전자좌를 순차적으로 표적화해야 한다. 따라서, 키메라 인간/비인간 MHC I, MHC II α 및 MHC II β 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 비인간 동물을 생성하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
따라서, 일부 구현예에서, 키메라 인간/비인간 MHC를 포함하는 유전적으로 변형된 동물을 생성하기 위한 뉴클레오티드 작제물이 제공된다. 일 구현예에서, 핵산 작제물은 5' 및 3' 비인간 상동성 아암, 인간 MHC 유전자 서열(예를 들어, 인간 HLA-A2 또는 인간 HLA-DR2 유전자 서열)을 포함하는 인간 DNA 단편, 및 재조합 부위가 측면에 위치한 선택 카세트를 포함한다. 일 구현예에서, 인간 DNA 단편은 인간 MHC 유전자(예를 들어, 인간 HLA-A2 또는 HLA-DR2 유전자)의 인트론과 엑손 둘 다를 포함하는 게놈 단편이다. 일 구현예에서, 비인간 상동성 아암은 비인간 MHC 유전자좌(예를 들어, MHC I 또는 MHC II 유전자좌)와 상동이다.
일 구현예에서, 5' 및 3' 비인간 상동성 아암은 내인성 비인간(예를 들어, 쥣과) MHC 클래스 I 또는 클래스 II 유전자좌의 5' 및 3' 위치에서 (예를 들어, 제1 리더 서열의 5' 및 마우스 MHC I 유전자의 α3 엑손, 또는 마우스 H-2Ab1 유전자의 상류 및 마우스 H-2Ea 유전자의 상류에서) 게놈 서열을 각각 포함한다. 일 구현예에서, 내인성 MHC 클래스 I 유전자좌는 마우스 H-2K, H-2D 및 H-2L로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 내인성 MHC 클래스 I 유전자좌는 마우스 H-2K이다. 일 구현예에서, 내인성 MHC 클래스 II 유전자좌는 마우스 H-2E 및 H-2A로부터 선택된다. 일 구현예에서, 조작된 MHC II 작제물은 마우스 H-2E 및 H-2A 유전자 둘 다를 치환될 수 있게 한다. 일 구현예에서, 마우스는 그의 H-2D 유전자좌로부터 기능적 내인성 MHC 폴리펩티드를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, 마우스는 내인성 H-2D 유전자좌의 전부 또는 일부가 결여되도록 조작된다. 또 다른 구현예에서, 마우스는 세포 표면 상에서 임의의 기능적 내인성 MHC I 및 MHC II 폴리펩티드를 발현하지 않는다. 일 구현예에서, 세포 표면 상에서 마우스에 의해 발현되는 유일한 MHC I 및 MHC II는 키메라 인간/마우스 MHC I 및 MHC II이다.
본 개시는 또한 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드를 암호화하는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 포함하는 게놈을 가진 유전자 조작된 비인간 동물(예를 들어, 유전자 조작된 마우스 또는 랫트와 같은 설치류)을 만드는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법에 의해 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 게놈을 가진 유전자 조작된 설치류, 예를 들어, 마우스가 생성된다. 일부 경우에, 마우스는 내인성 마우스 β2 마이크로글로불린 유전자좌로부터 기능적 마우스 β2 마이크로글로불린을 발현하지 않는다.
또한, 유전자 조작된 비인간 동물을 생성하는 데 사용되는 뉴클레오티드 작제물이 제공된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 작제물은: 5' 및 3' 비인간 상동성 아암, 인간 β2 마이크로글로불린 서열을 포함하는 인간 DNA 단편, 및 재조합 부위가 측면에 위치한 선택 카세트를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 인간 DNA 단편은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 인트론과 엑손 둘 다를 포함하는 게놈 단편이다. 일 구현예에서, 비인간 상동성 아암은 비인간 β2 마이크로글로불린 유전자좌와 상동이다. 게놈 단편은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 포함할 수 있다. 한 경우에, 게놈 단편은 5'에서 3' 방향으로: 모두 인간 β2 마이크로글로불린 서열인 엑손 2, 인트론, 엑손 3, 인트론 및 엑손 4를 포함한다. 선택 카세트는 β2 마이크로글로불린 코딩 영역 외부의 작제물의 어디에든 위치할 수 있고, 예를 들어, 인간 β2 마이크로글로불린의 엑손 4의 3'에 위치할 수 있다. 5' 및 3' 비인간 상동성 아암은 내인성 비인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 5' 및 3'에서 게놈 서열을 각각 포함한다. 또 다른 구현예에서, 5' 및 3' 비인간 상동성 아암은 내인성 비인간 유전자의 엑손 2의 5' 및 엑손 4의 3'에서 게놈 서열을 각각 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예는, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드를 발현하도록 비인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 랫트와 같은 설치류류)의 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 변형하는 방법에 관한 것이다. 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드를 발현하도록 비인간 동물(예: 마우스)의 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 변형하는 한 가지 방법은 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서, 마우스 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 치환하는 단계를 포함한다. 이러한 방법의 일 구현예에서, 비인간 동물(예: 마우스)은 내인성 비인간(예: 마우스) β2 마이크로글로불린 유전자좌로부터 기능적 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드를 발현하지 않는다. 일부 특정 구현예에서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4로 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 개시는 또한, 인간(화) β2 마이크로글로불린 및 인간(화) MHC 클래스 I α 폴리펩티드 및/또는 인간(화) β2 마이크로글로불린을 포함하는 단쇄 β2 마이크로글로불린/MHC 복합체를 암호화하는 서열을 이소성 유전자좌에서 (예를 들어, ROSA26 유전자좌에서) 포함하는 게놈을 가진 유전자 조작된 비인간 동물(예를 들어, 유전자 조작된 마우스 또는 랫트와 같은 설치류)를 만드는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법에 의해 인간(화) β2 마이크로글로불린 및 인간(화) MHC 복합체, 인간(화) MHC 클래스 I α 폴리펩티드 및/또는 인간(화) β2 마이크로글로불린을 포함하는 단쇄 β2 마이크로글로불린/MHC 복합체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 내인성 MHC I 또는 β2 마이크로글로불린 유전자좌가 아닌 내인성 유전자좌, 예를 들어, ROSA26 유전자좌에 포함하는 게놈을 가진 유전자 조작된 설치류(예를 들어, 랫트 또는 마우스)가 생성된다. ROSA 유전자좌를 표적화하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Stefano Casola의 문헌[Mouse Models for miRNA expression: the ROSA26 Locus, in Methods in Molecular Biology vol. 667:145-163 (S. Monticelli ed. 2010)]을 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다.
또한, 유전자 조작된 비인간 동물을 생성하는 데 사용되는 뉴클레오티드 작제물이 제공된다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 작제물은: 5' 및 3' 비인간 상동성 아암; 인간(화) β2 마이크로글로불린 및 인간(화) MHC 클래스 I α 폴리펩티드를 포함하는 단쇄 β2 마이크로글로불린/MHC 복합체(예를 들어, 서열번호 23으로 제시된 단쇄 β2 마이크로글로불린/HLA-A2 복합체); 및 재조합 부위가 측면에 위치한 선택 카세트를 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 작제물은: 5' 및 3' 비인간 상동성 아암; 인간(화) MHC 클래스 I α 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 재조합 부위가 측면에 위치한 선택 카세트를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 작제물은: 5' 및 3' 비인간 상동성 아암; 인간(화) β2 마이크로글로불린을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 및 재조합 부위가 측면에 위치한 선택 카세트를 포함할 수 있다. 5' 및 3' 비인간 상동성 아암은 내인성 ROSA26 인트론의 측면에 위치하는 게놈 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 유전적으로 변형된 비인간 동물(예를 들어, 마우스)은, 인간 또는 인간화 MHC I; 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린; 인간 또는 인간화 MHC II (예: MHC IIα 및/또는 MHC IIβ); 및 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자의 1개 또는 2개의 사본을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 비인간 동물은 이들 유전자의 전부에 대해 이형접합체이거나 동형접합체일 수 있다. 인간 또는 인간 MHC I, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린; 인간 또는 인간화 MHC II(예: MHC IIα 및/또는 MHC IIβ)를 포함하도록 비인간 동물을 변형하는 것의 비한정적인 목적은 인간 또는 인간화 MHC II 분자에 대해 비인간 동물이 내성을 갖게 하는 것이므로, 이들 유전자의 동형접합성은 요구되지 않는다. 따라서, 일부 구현예에서, 비인간 동물은 인간 또는 인간화 MHC 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대해 이형접합체일 수 있다. 대조적으로, 비인간 동물의 면역글로불린 유전자좌를 변형시키는 비한정적인 목적은 관심 항원 pMHC 복합체에 대한 인간 또는 인간화 항체를 생성하기 위한 것이므로, 일부 구현예에서, 비인간 동물은 변형된 면역글로불린 유전자좌에 대해 동형접합체일 수 있다.
유전자 표적화가 완료되면, ES 세포 또는 유전적으로 변형된 비인간 동물을 스크리닝하여 관심 외인성 뉴클레오티드 서열의 통합 또는 외인성 폴리펩티드의 발현이 성공적인지를 확인한다. 많은 기술이 당업자에게 공지되어 있고, 이에는 서던 블롯팅, 장 PCR(long PCR), 정량적 PCR(예를 들어, TAQMAN®을 사용하는 실시간 PCR), 형광 인 시튜 혼성화, 노던 블롯팅, 유세포 계측법, 웨스턴 분석, 면역 세포 화학, 면역 조직 화학 등이 포함되지만 이들로 한정되지는 않는다. 일 예에서, 관심 유전적 변형을 가진 비인간 동물(예를 들어, 마우스)은 Valenzuela 등의 전술한 (2003) 문헌에 기술된 대립유전자 분석법을 변형하여 사용해 마우스 대립유전자의 상실 및/또는 인간 대립유전자의 획득에 대해 스크리닝함으로써 식별될 수 있다. 유전적으로 변형된 동물에서 특이적 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 식별하는 다른 분석법은 당업자에게 공지되어 있다.
관심 항원 펩티드-MHC 복합체
본원에 기술된 MHC 단백질에 대해 내성을 갖는 마우스는 pMHC-특이적 항원 결합 단백질을 생성하도록 항원 펩티드-MHC 복합체로 면역화된다. 일부 구현예에서, 항원 펩티드-MHC(pMHC) 복합체의 일부로서 유용한 MHC는 자연 발생 전장 MHC를 비롯하여 MHC의 개별 사슬(예를 들어, MHC 클래스 I α(중쇄), β2 마이크로글로불린, MHC 클래스 II α 사슬, 및 MHC 클래스 II β 사슬), 이러한 MHC 사슬의 개별 하위 집합(예를 들어, MHC 클래스 I α 사슬의 α1-α3 하위 집합, MHC 클래스 II α 사슬의 α1-α2 하위 집합, MHC 클래스 II β 사슬의 β1-β2 하위 집합) 뿐만 아니라, 이들의 돌연변이체 및 다양한 유도체를 포함하며, 여기서 이러한 단편, 돌연변이체 및 유도체는 항원-특이적 TCR에 의한 인식될 수 있도록 항원 결정 인자를 디스플레이하는 능력을 보유한다.
자연 발생 MHC는 인간 염색체 6 상에서 유전자 클러스터에 의해 암호화된다. MHC는 A(예를 들어, A1-A74), B(예를 들어, B1-B77), C(예를 들어, C1-C11), D(예를 들어, D1-D26), DR(예를 들어, DR1-DR-8), DQ(예를 들어, DQ1-DQ9) 및 DP(예를 들어, DP1-DP6)와 같은 HLA 특이성을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. HLA 특이성은 A1, A2, A3, A11, A23, A24, A28, A30, A33, B7, B8, B35, B44, B53, B60, B62, DR1, DR2, DR3, DR4, DR7, DR8 및 DR 11을 포함한다.
자연 발생 MHC 클래스 I 분자는 세포에 의해 단백질 분해된 단백질, 특히 내생적으로 합성된 단백질로부터 유래된 펩티드에 결합한다. 이렇게 수득된 작은 펩티드는 소포체 내로 운반되어 발생 단계의(nascent) MHC 클래스 I 분자와 결합된 후, 골지 장치를 통과하고, 세포독성 T 림프구에 의해 인식되도록 세포 표면에 디스플레이된다.
자연 발생 MHC 클래스 I 분자는 β2 마이크로글로불린과 결합된 α 중쇄로 구성된다. 중쇄는 하위 집합 α1-α3으로 구성된다. β2 마이크로글로불린 단백질과 중쇄의 α3 하위 집합이 결합된다. 특정 구현예에서, β2 마이크로글로불린과 α3 하위 집합은 공유 결합에 의해 결합된다. 특정 구현예에서, β2 마이크로글로불린과 α3 하위 집합은 비공유 결합된다. 중쇄의 α1 및 α2 하위 집합은 접혀서 펩티드, 예를 들어, 항원 결정 인자가 디스플레이되고 TCR에 의해 인식될 수 있는 위한 홈을 형성한다.
클래스 I 분자는 일반적으로 길이가 약 8~9개 아미노산(예를 들어, 7~11개 아미노산)인 펩티드에 연결, 예를 들어, 결합된다. 모든 인간은 3개 내지 6개의 상이한 클래스 I 분자를 가지는데, 이들 각각은 많은 상이한 유형의 펩티드에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, pMHC 복합체는 (i) 클래스 I MHC 폴리펩티드 또는 이의 단편, 돌연변이체 또는 유도체, 및 임의로 (ii) β2 마이크로글로불린 폴리펩티드 또는 이의 단편, 돌연변이체 또는 유도체를 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, 클래스 I MHC 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드에 결합, 예를 들어, 연결된다.
하나의 특정 구현예에서, 클래스 I MHC 폴리펩티드는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 클래스 I MHC 폴리펩티드이다. 또 다른 특정 구현예에서, 클래스 I MHC 폴리펩티드는 H-2K, H-2D, H-2L, H2-IA, H2-IB, H2-IJ, H2-IE 및 H2-IC로 이루어진 군으로부터 선택된 쥣과 클래스 I MHC 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 항원 pMHC 복합체의 MHC 클래스 I α 중쇄는 완전한 인간이다. 일부 구현예에서, 항원 pMHC 복합체의 MHC 클래스 I α 중쇄는 인간화된 것이다. 인간화 MHC 클래스 I α 중쇄는, 예를 들어, 미국 특허 공개 제2013/0111617호, 제2013/0185819호 및 제2014/0245467호에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I α 중쇄는 인간 세포 외 도메인(인간 α1, α2 및/또는 α3 도메인) 및 다른 종의 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 클래스 I α 중쇄 폴리펩티드는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-K 또는 HLA-L이다. 일부 구현예에서, HLA-A 서열은 HLA-A*0201 서열일 수 있다. 다양한 구현예에서, 펩티드-MHC는 MHC 클래스 I 중쇄의 모든 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원 pMHC 복합체는 β2 마이크로글로불린을 포함한다. 일부 구현예에서, β2 마이크로글로불린은 완전한 인간이다. 일부 구현예에서, β2 마이크로글로불린은 인간화된 것이다. 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩티드는, 예를 들어, 미국 특허 공개 제2013/0111617호 및 제2013/0185819호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 항원 pMHC 복합체의 MHC 클래스 I 분자는 인간(화) B2M과 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 사이에 이황화 결합이 형성될 수 있도록 인간(화) β2 마이크로글로불린(β2m 또는 B2M) 폴리펩티드와 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄에서 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 이황화 결합은 다음의 잔기 쌍 중 하나를 연결한다: 인간(화) B2M 잔기 12, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 236; 인간(화) B2M 잔기 12, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 237; 인간(화) B2M 잔기 8, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 234; 인간(화) B2M 잔기 10, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 235; 인간(화) B2M 잔기 24, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 236; 인간(화) B2M 잔기 28, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 232; 인간(화) B2M 잔기 98, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 192; 인간(화) B2M 잔기 99, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 234; 인간(화) B2M 잔기 3, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 120; 인간(화) B2M 잔기 31, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 96; 인간(화) B2M 잔기 53, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 35; 인간(화) B2M 잔기 60, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 96; 인간(화) B2M 잔기 60, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 122; 인간(화) B2M 잔기 63, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 27; 인간(화) B2M 잔기 Arg3, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 Gly 120; 인간(화) B2M 잔기 His31, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 Gln96; 인간(화) B2M 잔기 Asp53, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 Arg35; 인간(화) B2M 잔기 Trp60, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 Gln96; 인간(화) B2M 잔기 Trp60, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 Asp 122; 인간(화) B2M 잔기 Tyr63, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 Tyr27; 인간(화) B2M 잔기 Lys6, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 Glu232; 인간(화) B2M 잔기 Gln8, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 Arg234; 인간(화) B2M 잔기 Tyr 10, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 Pro235; 인간(화) B2M 잔기 Serl l, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 Gln242; 인간(화) B2M 잔기 Asn24, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 Ala236; 인간(화) B2M 잔기 Ser28, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 Glu232; 인간(화) B2M 잔기 Asp98, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 His 192; 인간(화) B2M 잔기 Met99, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 Arg234 및/또는 인간(화) B2M 잔기 Arg 12, 인간(화) MHC 클래스 I α 중쇄 잔기 Gly237. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO/2015195531를 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다.
일부 구현예에서, 항원 결정 인자 아미노산 서열은 MHC 클래스 I 분자와 결합할 수 있는, 예를 들어 이에 의해 제시될 수 있는 펩티드의 아미노산 서열일 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 서열은 6 내지 20개의 연속 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 펩티드 서열은 단백질 단편의 서열일 수 있으며, 여기서 단백질은, 예를 들어, 자가면역 장애와 관련된 단백질과 같은 세포 단백질로부터, 예를 들어, 그의 일부로부터 유도되며, 펩티드는 MHC 클래스 I 중쇄에 결합될 수 있다.
일부 구현예에서, MHC의 적어도 하나의 사슬과 펩티드는 융합 단백질로서 결합된다. 일 구현예에서, MHC와 펩티드는 링커 서열에 의해 결합된다. 예를 들어, 단쇄 분자는 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 항원 결정 인자, β2 마이크로글로불린 서열, 및 클래스 I α (중쇄) 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단쇄 분자는 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 항원 결정 인자, 클래스 I α (중쇄) 서열 및 β2 마이크로글로불린 서열을 포함할 수 있다. pMHC 복합체를 생성하고 단쇄 삼량체로서 사용하는 것에 대해서는 이전에 기술된 적이 있다. 예를 들어, 미국 특허 제8,895,020호; 미국 특허 제8,992,937호; Hansen 등의 (2010) Trends Immunol. 31:363-69; Truscott 등의 (2007) J. Immunol. 178:6280-89; Mitaksov 등의 (2007) Chem Biol 14:909-22를 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 단쇄 pMHC 복합체는 아미노 단말에서 신호 펩티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 펩티드 서열과 β2 마이크로글로불린 서열 사이에 링커 서열이 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, β2 마이크로글로불린 서열과 클래스 I α (중쇄) 서열 사이에 링커 서열이 존재할 수 있다. 단쇄 분자는 아미노 말단에서, 신호 펩티드 서열을 비롯하여, 펩티드 서열과 β2 마이크로글로불린 서열 사이에서 연장되는 제1 링커 서열 및/또는 β2 마이크로글로불린 서열과 클래스 I 중쇄 서열 사이에서 연장되는 제2 링커 서열을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 단쇄 pMHC 복합체는 펩티드 리간드 분절과 β2 마이크로글로불린 분절 사이에서 제1 가요성 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커는 펩티드 리간드 분절의 카르복시 말단에서 β2 마이크로글로불린 분절의 아미노 말단까지 연장될 수 있고, 이들을 연결할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 연결된 펩티드 리간드를 결합 홈 내로 접어서 기능적 MHC-항원 펩티드를 생성하는 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, 이러한 링커는 적어도 3개의 아미노산, 최대 약 15개의 아미노산(예를 들어, 20개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단쇄 분자는 β2 마이크로글로불린과 MHC I 중쇄 분절 사이에 삽입된 제2 가요성 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커는 β2 마이크로글로불린 분절의 카르복시 말단에서 MHC I 중쇄 분절의 아미노 말단까지 연장될 수 있고, 이들을 연결할 수 있다. 특정 구현예에서, β2 마이크로글로불린과 MHC I 중쇄는 결합 홈 내로 접혀서 T 세포 증식을 촉진시키는 기능을 할 수 있는 분자를 생성할 수 있다.
pMHC 복합체에 사용된 적합한 링커의 길이는 4 내지 10개 아미노산, 5 내지 9개 아미노산, 6 내지 8개 아미노산 또는 7 내지 8개 아미노산을 포함하여 임의의 적절한 수의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 예컨대, 1개(예: Gly) 내지 20개 아미노산, 2개 내지 15개 아미노산, 3개 내지 12개 아미노산일 수 있고, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 아미노산일 수 있다. 예시적인 링커는 글리신 중합체 (G)n, 글리신-세린 중합체 (예를 들어, (GS)n, (GSGGS) (서열번호 1) 및 (GGGS) (서열번호:2)를 포함하며, 여기서 n은 적어도 1의 정수임), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 당업계에 알려진 다른 가요성 링커를 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체가 사용될 수 있는데, Gly 및 Ser 둘 다는 비교적 구조화되어 있지 않으므로, 성분들 간의 중립적인 연결자(neutral tether) 역할을 할 수 있다. 글리신 중합체가 사용될 수 있는데, 글리신은 심지어 알라닌보다 훨씬 더 phi-psi 공간에 접근할 수 있고, 측쇄가 더 긴 잔기보다 훨씬 덜 제한적이다(Scheraga, Rev. Computational Chem. 1 1173-142 (1992)를 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합됨). 예시적인 링커는 GGSG (서열번호 3), GGSGG (서열번호 4), GSGSG (서열번호 5), GSGGG (서열번호 6), GGGSG (서열번호 7), GSSSG (서열번호 8), GCGASGGGGSGGGGS (서열번호 9), GCGASGGGGSGGGGS (서열번호 10), GGGGSGGGGS (서열번호 11), GGGASGGGGSGGGGS (서열번호 12), GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 13), 또는 GGGASGGGGS (서열번호 14), GGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 15), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 16), GCGGS (서열번호 21) 등을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 링커 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 존재하는 시스테인 잔기에 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 포함한다.
특정 구현예에서, 단쇄 pMHC 복합체는 이황화 브릿지(즉, 2개의 시스테인 사이의 이황화 결합)를 통해 MHC 클래스 I α (중쇄)에 공유 부착된 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제8,992,937호 및 제8,895,020호를 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 특정 구현예에서, 이황화 결합은: 항원 펩티드의 카르복시 단말으로부터 연장되는 링커 내에 위치한 제1 시스테인; 및 MHC 클래스 I 중쇄 (예를 들어, 항원 펩티드를 위한 비공유 결합 부위를 갖는 MHC 클래스 I α 중쇄) 내에 위치한 제2 시스테인을 포함한다. 특정 구현예에서, 제2 시스테인은 MHC 클래스 I α (중쇄)에서의 돌연변이(첨가 또는 치환)일 수 있다. 특정 구현예에서, 단쇄 분자는 하나의 연속 폴리펩티드 사슬 뿐만 아니라 이황화 브릿지도 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 단쇄 분자는 유일한 공유 연결로서의 이황화 브리지를 통해 부착되는 2개의 연속 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 서열은 시스테인에 추가하여 적어도 하나의 아미노산을 포함할 수 있고, 이에는 하나 이상의 글리신, 하나 이상의 알라닌 및/또는 하나 이상의 세린이 포함된다. 일부 구현예에서, 단쇄 분자는 N-말단에서 C-말단까지, MHC 클래스 I 펩티드(예를 들어, 항원 펩티드), 제1 시스테인을 포함하는 제1 링커, 인간(화) β2-마이크로글로불린 서열, 제2 링커, 및 제2 시스테인을 포함하는 인간(화) MHC 클래스 I 중쇄 서열을 포함하며, 여기서 제1 시스테인과 제2 시스테인은 이황화 브릿지를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 시스테인은 T80C, Y84C 및 N86C로 이루어진 군으로부터 선택된 인간(화) MHC 클래스 I 중쇄의 아미노산의 치환이다(Y84C는 성숙한 단백질 내 위치 108에서의 돌연변이를 지칭하며, 여기서 성숙한 단백질은 신호 서열이 결여되어 있다. 대안적으로, 단백질이 24량체 신호 서열을 여전히 포함하는 경우, 위치는 Y108C로 대신 지칭된다).
특정 구현예에서, pMHC 복합체가 펩티드의 C-말단과 β2 마이크로글로불린 사이에서 연장되는 Gly-Ser 링커에서 제1 시스테인을 포함하는 경우, 이황화 브리지는 pMHC 복합체의 클래스 I 홈에 있는 항원 펩티드를 가까운 중쇄 위치에 있는 제2 시스테인에 연결할 수 있다.
일부 구현예에서, β2 마이크로글로불린 서열은 전장 (인간 또는 비인간) β2 마이크로글로불린 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, β2 마이크로글로불린 서열은 리더 펩티드 서열이 결여되어 있다. 이와 같이, β2 마이크로글로불린 서열은 약 99개의 아미노산을 포함할 수 있고, 인간 β2 마이크로글로불린 서열(Genebank AF072097.1)일 수 있다.
일부 구현예에서, pMHC 복합체는 인간 β2 마이크로글로불린과 융합된 인간 HLA 클래스 I 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 β2 마이크로글로불린과 융합된 인간 HLA 클래스 I 분자는 하나 이상의 링커, 예를 들어, HLA 분자와 β2 마이크로글로불린을 연결하는 링커 및/또는 인간 β2 마이크로글로불린과 융합된 인간 HLA 클래스 I 분자에 인간 HLA 클래스 I 분자를 연결시키는 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, pMHC 복합체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인간 HLA 및 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, pMHC 복합체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인간 HLA 및 β2 마이크로글로불린 및 하나 이상의 링커를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, pMHC 복합체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인간 HLA 및 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 서열, 및 표지(예를 들어, 녹색 형광 단백질) 또는 태그(예를 들어, c-myc, 히스티딘 태그 등)를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, pMHC 복합체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인간 HLA 및 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 서열, 링커를 암호화하는 서열, 및 표지 또는 태그를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 인간 HLA 및 β2 마이크로글로불린 및 하나 이상의 링커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 비제한적인 예는 서열번호 17 및 서열번호 19로 제시된다. 이로부터 암호화되는 아미노산 서열은 서열번호 18 및 서열번호 20으로 각각 제시된다.
관심 펩티드는 서열번호 18 및 서열번호 20의 N-말단 GCGGS 링커 서열(서열번호 21)에 부착될 수 있으며, 여기서 링커의 시스테인은 인간 HLA-A2 폴리펩티드의 Y108C 아미노산과 이황화 브릿지를 형성한다. 따라서, 일부 구현예에서, 비인간 동물은 서열번호 18 또는 서열번호 20으로 제시된 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 pMHC 복합체로 면역화되고/되거나 추가로 면역화된다. 일부 구현예에서, 비인간 동물은 서열번호 18 또는 서열번호 20으로 제시된 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 pMHC 복합체를 암호화하는 DNA로 면역화된다.
일부 구현예에서, 보조 T 세포 에피토프, 예를 들어, PADRE는 단쇄 pMHC 복합체의 C-말단에 연결될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,413,935호, 및 Alexander J. 등의 (1994) Immunity 1:751-61을 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 일부 구현예에서, PADRE는 단쇄 pMHC 복합체의 C-말단에 직접 연결된다. 구현예에서, PADRE는 링커를 통해 단쇄 pMHC 복합체의 C-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 면역화 프로토콜은 C-말단에서 PADRE에 연결된 단쇄 pMHC 복합체를 비인간 동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, C-말단에서 PADRE에 연결된 단쇄 pMHC 복합체는 서열번호 25로 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, pMHC 복합체는 미국 특허 제4,478,82호; 제6,011,146호; 제8,895,020호; 제8,992,937호; WO 96/04314; Mottez 등의 J. Exp Med. 181: 493-502, 1995; Madden 등의 Cell 70: 1035-1048, 1992; Matsumura 등의 Science 257: 927-934, 1992; Mage 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10658-10662, 1992; Toshitani 등의 Proc. Nat'l Acad. Sci. 93: 236-240, 1996; Chung 등의 J. Immunol. 163:3699-3708, 1999; Uger 및 Barber의 J. Immunol. 160: 1598-1605, 1998; Uger 등의 J. Immunol. 162, pp. 6024-6028, 1999; White 등의 J. Immunol. 162: 2671-2676, 1999(이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)에 개신된 바와 같은 것일 수 있다.
일부 구현예에서, pMHC 복합체는 클래스 II MHC 폴리펩티드 또는 이의 단편, 돌연변이체 또는 유도체를 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, MHC는 클래스 II MHC 분자 또는 이의 단편, 돌연변이체 또는 유도체의 α 및 β 폴리펩티드를 포함한다. 하나의 특정 구현예에서, α 및 β 폴리펩티드는 펩티드 링커에 의해 연결된다. 하나의 특이적 구현예에서, MHC는 HLA-DP, HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DM 및 HLA-DO로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 클래스 II MHC 분자의 α 및 β 폴리펩티드를 포함한다.
MHC 클래스 II 분자는 일반적으로 2개의 폴리펩티드 사슬인 α 및 β로 구성된다. 사슬은 DP, DQ, 또는 DR 유전자군으로부터 유래될 수 있다. 약 40개의 상이한 인간 MHC 클래스 II 분자가 알려져 있다. 이들 모두는 동일한 기본 구조를 갖지만, 이들의 분자 구조는 미묘하게 다르다. MHC 클래스 II 분자는 13~18개 아미노산의 길이의 펩티드에 결합한다.
일부 구현예에서, 항원 pMHC 복합체는 하나 이상의 MHC 클래스 II α 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 II α 사슬은 완전한 인간이다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 II α 사슬은 인간화된 것이다. 인간화 MHC 클래스 II α 사슬은, 예를 들어, 미국 특허 제8,847,005호 및 제9,043,996호 및 미국 특허 공개 제2014/0245467호에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 인간화 MHC 클래스 II α 사슬 폴리펩티드는 인간 세포 외 도메인 및 다른 종의 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 클래스 II α 사슬은 HLA-DMA, HLA-DOA, HLA-DPA, HLA-DQA 또는 HLA-DRA이다. 일부 구현예에서, 클래스 II α 사슬 폴리펩티드는 HLA-DMA, HLA-DOA, HLA-DPA, HLA-DQA 및/또는 HLA-DRA이다.
일부 구현예에서, 바이러스 입자는 하나 이상의 MHC 클래스 II β 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 II β 사슬은 완전한 인간이다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 II β 사슬 폴리펩티드는 인간화된 것이다. 인간화 MHC 클래스 II β 사슬 폴리펩티드는, 예를 들어, 미국 특허 제8,847,005호 및 제9,043,996호 및 미국 특허 공개 제2014/0245467호에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 인간화 MHC 클래스 II β 사슬은 인간 세포 외 도메인 및 다른 종의 세포질 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 클래스 II β 사슬은 HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB, HLA-DQB 또는 HLA-DRB이다. 일부 구현예에서, 클래스 II β 사슬은 인간화 HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB, HLA-DQB 및/또는 HLA-DRB이다.
일부 구현예에서, 항원 결정인자, 예를 들어, 항원 pMHC 복합체에 포함된 펩티드는, pMHC 복합체가 TCR에 결합할 수 있는 방식으로, 예를 들어 특이적 방식으로, MHC 단백질에 결합할 수 있는 임의의 펩티드를 포함할 수 있다.
실시예에는 가수분해에 의해 생성된 펩티드, 가장 일반적으로는 합성에 의해 생성된 펩티드가 포함되어 있으며, 이에는 무작위로 생성된 펩티드, 특이적으로 설계된 펩티드, 및 아미노산 위치의 적어도 일부가 여러 펩티드 사이에서 보존되고 나머지 위치는 무작위로 배정되는 펩티드가 포함된다.
자연에서, 가수분해에 의해 생산된 펩티드는 항원이 MHC 단백질에 결합하기 전에 가수분해를 거친다. 클래스 I MHC는 일반적으로 세포의 세포질에서 능동적으로 합성된 단백질로부터 유래된 펩티드를 제시한다. 대조적으로, 클래스 II MHC는 일반적으로 세포의 식균 경로(endocytic pathway)에 들어가는 외인성 단백질 또는 ER에서 합성된 단백질로부터 유래된 펩티드를 제시한다. 세포 내 수송은 펩티드가 MHC 단백질과 결합될 수 있게 한다.
펩티드가 MHC 펩티드 결합 홈에 결합하면, MHC 및/또는 TCR에 의해 인식되는 펩티드 아미노산의 공간 배열, 또는 본원에 기술된 바와 같이 유전적으로 변형된 동물에 의해 생성된 pMHC 결합 단백질의 공간 배열을 조절할 수 있다. 이러한 공간적 조절은 펩티드와 MHC 단백질 사이에서 형성된 수소 결합에 부분적으로 기인한다. 펩티드가 다양한 MHC에 결합하는 방법에 대한 지식을 기반으로, 변하는 주요 MHC 앵커 아미노산 및 상이한 펩티드 사이에서 변화하는 다양한 표면 노출 아미노산을 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, MHC 결합 펩티드의 길이는 5 내지 40개 아미노산 잔기, 예를 들어, 6 내지 30개 아미노산 잔기, 예를 들어, 8 내지 20개 아미노산 잔기, 예를 들어, 9 내지 11개 아미노산 잔기이며, 길이가 5개와 40개 아미노산 잔기 사이의 모든 정수 증분(즉, 5, 6, 7, 8, 9 . . . 40)을 포함하는 임의 크기의 펩티드를 포함한다. 자연적으로 MHC 클래스 II-결합 펩티드는 약 9~40개의 아미노산으로 다양하지만, 거의 모든 경우에 있어서 펩티드는 MHC 결합 활성 또는 T 세포 인식의 손실 없이 9~11개 아미노산 코어로 절단될 수 있다.
펩티드에는 자가면역 장애와 관련된 인간 자기 단백질, 감염원 단백질 (예를 들어, 박테리아, 바이러스 또는 기생충 유기체), 알레르겐, 및 종양 관련 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 적어도 일부, 예를 들어 항원 결정 인자를 포함하는 펩티드가 포함된다. 일 구현예에서, pMHC 복합체는 자가 면역 장애와 관련된 인간 자기 단백질의 항원 결정인자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, pMHC 복합체는 알레르겐의 항원 결정인자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, pMHC 복합체는 박테리아의 항원 결정인자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, pMHC 복합체는 바이러스의 항원 결정인자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, pMHC 복합체는 기생충의 항원 결정인자를 포함한다.
가요성 링커를 통해 펩티드를 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 분자에 부착하는 것은 생합성, 운송 및 디스플레이 도중에 펩티드가 자리를 차지하고 MHC와 결합된 상태를 유지하게 하는 데 유리하다. 대안적인 접근법으로서, 일부 구현예에서, MHC와 펩티드는 개별적으로 발현된다.
관심 항원 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질, 핵산 작제물, 세포 및 이의 제조 방법
일 구현예에서, 항원성 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인의 가변 도메인을 암호화하는 핵산, 및 핵산을 발현하는 세포가 제공된다.
일 구현예에서, 인간 치료제의 제조를 위한 세포주를 제조하기 위한, 비인간 동물에서 유래된 핵산 서열의 용도가 제공된다. 일 구현예에서, 인간 치료제는 인간 항원 결합 도메인 및 인간 Fc 영역을 포함하는 결합 단백질이다.
일 구현예에서, 발현 시스템이 제공되며, 상기 시스템은: 인간 CH 영역과 융합된 체세포 돌연변이된 인간 중쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 포유류 숙주 세포; 및/또는 인간 CL 영역과 융합된 체세포 돌연변이된 인간 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하며, 여기서 VH 및 VL 도메인은 동족체이다.
일 구현예에서, 적절한 숙주 세포는 B 세포, 하이브리도마, 쿼드로마, CHO 세포, COS 세포, 293 세포, HeLa 세포, 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 인간 망막 세포(예를 들어, PERC.6?? 세포 (Creative Biolabs))로부터 선택된다.
일 구현예에서, 결합 단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본원에 개시된 바와 같은 비인간 동물로부터 세포 또는 핵산을 단리하는 단계를 포함하며, 여기서 세포 또는 핵산은 관심 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 포함하거나 암호화한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 인간 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(히스티딘 변형된 인간 중쇄 가변 도메인 및/또는 히스티딘 변형된 인간 경쇄 가변 도메인을 암호화할 수 있는 서열로서, 범용 경쇄 가변 도메인일 수도 있거나 독립적으로 범용 경쇄 가변 도메인일 수 있음)을 인간 CH 또는 CL 영역을 암호화하는 유전자와 함께 프레임 내에서 클로닝하여 인간 결합 단백질 서열을 형성하는 단계; 및 인간 결합 단백질 서열을 적절한 세포에서 발현시키는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 비인간 동물은 관심 pMHC 복합체로 면역화되었으며, 인간 항원 결합 도메인은 관심 pMHC 복합체의 에피토프에 (예를 들어, 마이크로 몰, 나노 몰, 또는 피코 몰 범위의 KD로) 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, VH 및/또는 VL 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비인간 동물에서 체세포 돌연변이된다.
일 구현예에서, 관심 pMHC 복합체에 결합하는 항원 결합 단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은
(1) 비인간 동물을 관심 pMHC 복합체로 면역화하는 단계로서, 비인간 동물은 그의 게놈에서
(i) 인간(화) MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및
(ii) 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하되, 비인간 동물은 인간 또는 인간화 항원 결합 도메인, 예를 들어, 인간 또는 인간화 가변 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화 항원 결합 단백질을 제공할 수 있고,
임의로, 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌 중 적어도 하나는 재배열되지 않는, 단계;
(2) 비인간 동물이 관심 pMHC 복합체 또는 담체에 연결된 관심 pMHC 복합체에 대한 면역 반응을 이끌어내도록 하는 단계;
(3) 면역화된 비인간 동물로부터 세포(예를 들어, 림프구)를 단리하는 단계로서, 세포는 관심 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(이들 각각은 독립적으로 히스티딘 변형될 수 있고, 이들 중 경쇄 가변 도메인은 공통 경쇄 가변 도메인일 수 있음)을 암호화하는 제1 및 제2 면역글로불린 가변 영역 핵산 서열을 포함하는, 단계;
(4) 관심 pMHC 복합체 또는 담체에 연결된 관심 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하는 (쌍을 이룰 때 특이적으로 결합하는) 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 식별하는 단계; 및
(5) 관심 pMHC 복합체에 결합하는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 이량체를 포함하는 항원 결합 단백질을 형성하기 위해, 항원 결합 단백질을 발현하기에 적절한 발현 시스템에서 (4) 단계의 핵산 서열을 발현시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 pMHC 복합체에 결합하는 항원 결합 단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은
(1) 비인간 동물을 관심 pMHC 복합체로 면역화하는 단계로서, 비인간 동물은 그의 게놈에서
(i) 인간(화) MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및
(ii) 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하되, 비인간 동물은 인간 또는 인간화 항원 결합 도메인, 예를 들어, 인간 또는 인간화 가변 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화 항원 결합 단백질을 제공할 수 있고,
임의로, 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌 중 적어도 하나는 재배열되지 않는, 단계;
(2) 관심 pMHC에 특이적으로 결합하는 항체의 인간(화) 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및/또는 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 인간(화) 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 각각 수득하는 단계; 및
(c) 인간(화) 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 인간(화) 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 사용하여 pMHC에 결합하는 항체를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포(예컨대 B 세포)는 비인간 동물로부터 (예를 들어, 비장 또는 림프절로부터) 회수된다. 세포를 골수종 세포주와 융합하여 불멸성 하이브리도마 세포주를 제조할 수 있고, 이러한 하이브리도마 세포주를 스크리닝하고 선택하여 면역화에 사용된 항원에 대해 특이적인 하이브리드 중쇄를 함유하는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 식별할 수 있다.
일 구현예에서, 면역화는 관심 pMHC 복합체로 비인간 동물을 프라이밍(예를 들어, 투여)하는 단계, 비인간 동물이 일정 기간 동안 휴식을 취할 수 있게 하는 단계, 및 관심 pMHC 복합체로 비인간 동물을 재면역화하는 (예를 들어, 비인간 동물의 면역 반응 일으키는) 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 보조 T 세포 에피토프, 예를 들어 범 DR T 보조 에피토프(PADRE)로 동시에 비인간 동물을 면역화 및/또는 추가 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제6,413,935호, 및 Alexander J. 등의 (1994) Immunity 1:751-61을 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 관심 pMHC 복합체로 비인간 동물을 프라이밍하는 단계, 및 면역화된 동물을 보조 T 세포 에피토프, 예를 들어 PADRE에 연결된 관심 pMHC 복합체를 추가 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 보조 T 세포 에피토프에 연결된 관심 pMHC 복합체로 비인간 동물을 프라이밍하는 단계, 및 상기 복합체를 추가 투여하는 단계 둘 다를 포함한다. PADRE로 프라이밍하는 단계 및/또는 PADRE를 추가 투여하는 단계를 포함하는 구현예에서, 비인간 동물은 C57/Bl6 유전적 배경을 포함하며, 예를 들어, C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10C, 및 C57BL/Ola로부터 선택된 C57BL 계통의 마우스이거나, 전술한 C57BL/6 계통과 다른 계통(예: 129, BALB 등)의 잡종이다. 일부 구현예에서, 비인간 동물을 프라이밍하는 단계와 비인간 동물에게 추가 접종하는 단계 사이의 기간은 수 일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 또는 적어도 1개월이다.
일 구현예에서, 비인간 동물에서 만들어진 면역글로불린 가변 영역(VR)이 제공되며, 상기 면역글로불린 가변 영역은, 예를 들어, 재배열된 인간 VH/DH/JH 유전자 서열 또는 재배열된 인간 VL/JL 유전자 서열을 포함하며, 이들 유전자 서열은 각각 독립적으로 히스티딘 변형된 재배열된 인간 VH/DH/JH 유전자 서열 또는 재배열된 인간 VL/JL 유전자 서열일 수 있으며, 이들 중 후자는 독립적으로 공통 재배열된 인간 VL/JL 유전자 서열일 수 있다. 일 구현예에서, 재배열된 VH/DH/JH 유전자 서열은 (예를 들어, 인간 또는 마우스 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택된) 하나 이상의 인간 중쇄 불변 영역 서열을 포함하거나, 재배열된 VL/JL 유전자 서열은 인간 경쇄 불변 영역 서열에 융합된다. 본 발명의 구현예의 비인간 동물로 만들어지고/만들어지거나 이로부터 단리된 핵산 서열에 의해 암호화된 결합 단백질의 면역글로불린 가변 도메인 아미노산 서열이 또한 본원에 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명의 구현예의 비인간 동물에서 만들어지거나, 본 발명의 구현예의 마우스에서 만들어진 서열로부터 유래된 결합 단백질 또는 이의 항원 결합 단편(예: Fab, F(ab)2, scFv)이 제공된다.
이중특이적 결합 단백질
관심 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하는 인간 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 유사 결합 단백질이 제공된다. 이러한 결합 단백질을 발현하는 세포, 그 세포를 만드는 마우스, 및 관련 방법 및 조성물이 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 결합 단백질 및 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 다중특이적 결합 단백질, 예를 들어, 이중특이적 결합 단백질을 만드는 데 사용될 수 있다. 본 구현예에서, 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드는 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드와 결합될 수 있다. 제1 중쇄 가변 도메인과 제2 중쇄 가변 도메인이 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 경우, 이들 2개의 중쇄 가변 도메인을 사용해 이중특이적 결합 분자를 만들 수 있다. CH 영역은 동일하거나 상이할 수 있다. 일 구현예에서, 예를 들어, CH 영역 중 하나는 단백질 A 결합 결정인자를 제거하도록 변형될 수 있는 반면, 다른 하나의 중쇄 불변 영역은 그렇게 변형되지 않는다(미국 특허 제8,586,713 B2호를 참조하고, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨). 이러한 특정한 배열은, 예를 들어, 동종이량체(예를 들어, 제1 또는 제2 폴리펩티드의 동종이량체)로부터 이중특이적 결합 단백질의 단리를 간단하게 만든다. 일부 구현예에서, 이중특이적 pMHC 결합 단백질은 단백질 A 결합에 대해 이종이량체일 수 있고,
a. N-말단에서 C-말단까지, 제1 에피토프에 선택적으로 결합하는 제1 에피토프 결합 영역, IgG1, IgG2 및 IgG4로부터 선택된 인간 IgG의 제1 CH3 영역을 포함하는 면역 글로불린 불변 영역을 포함하는, 제1 폴리펩티드(여기서 제1 CH3 영역은 단백질 A에 결합함); 및
b. N-말단에서 C-말단까지, 제2 에피토프에 선택적으로 결합하는 제2 에피토프 결합 영역, IgG1, IgG2 및 IgG4로부터 선택된 인간 IgG의 제2 CH3 영역을 포함하는, 면역글로불린 불변 영역을 포함할 수 있다(여기서 제2 CH3 영역은 단백질 A에 대한 제2 CH3 영역의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형을 포함함). 일부 구현예에서, 변형은 IMGT 엑손 넘버링 시스템에서의 (a) 95R, 및 (b) 95R 및 96F; 또는 EU 넘버링 시스템에서의 (a') 435R, 및 (b') 435R 및 436F로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 CH3 영역은 IMGT 엑손 넘버링 시스템에서의 16E, 18M, 44S, 52N, 57M 및 82I 또는 EU 넘버링 시스템에서의 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 및 422I로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 5개의 변형을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 상기 방법 및 조성물은 이중특이적 결합 단백질을 만드는 데 사용된다. 본 구현예에서, CH 영역에 융합되는 제1 VH 및 CH 영역에 융합되는 제2 VH는 동일한 이소형 인간 IgG 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4)과 함께 프레임 내에서 각각 독립적으로 클로닝된다. 제1 VH는 제1 pMHC 복합체에 특이적으로 결합하고, 제2 VH는 제2 pMHC 복합체에 특이적으로 결합한다. 제1 및 제2 에피토프는 상이한 pMHC 상에 있거나, 동일한 pMHC 복합체 상에 있을 수 있다.
일 구현예에서, 제1 VH에 융합된 CH 영역의 IgG 이소형 및 제2 VH에 융합된 CH 영역의 IgG 이소형은 동일한 이소형이지만, 하나의 IgG 이소형이 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다는 점에서 다르다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은, 치환이 결여된 중쇄와 비교했을 때, 치환을 가진 중쇄가 단백질 A에 결합할 수 없게 하거나 실질적으로 결합할 수 없게 한다.
일 구현예에서, 제1 C는H 영역은 IgG1, IgG2 및 IgG4로부터 선택된 인간 IgG의 제1 CH3 도메인을 포함하고; 제2 CH 영역은 IgG1, IgG2 및 IgG4로부터 선택된 인간 IgG의 제2 CH3 도메인을 포함하며, 여기서 제2 CH3 도메인은 단백질 A에 대한 제2 CH3 도메인의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형을 포함한다(미국 특허 제8,586,713 B2호를 참조하고, 동 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
일 구현예에서, 제2 CH3 도메인은 EU 넘버링 시스템에 따라 번호가 매겨진 435R 변형을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제2 CH3 도메인은 EU 넘버링 시스템에 따라 번호가 매겨진 436F 변형을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 제2 CH3 도메인은 EU 넘버링 시스템에 따라 번호가 매겨진 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M 및 V422I로 이루어진 군으로부터 선택된 변형을 포함하는 인간 IgG1의 CH3 도메인이다.
일 구현예에서, 제2 CH3 도메인은 EU 넘버링 시스템에 따라 번호가 매겨진 N384S, K392N 및 V422I로 이루어진 군으로부터 선택된 변형을 포함하는 인간 IgG2의 CH3 도메인이다.
일 구현예에서, 제2 CH3 도메인은 EU 넘버링 시스템에 따라 번호가 매겨진 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q 및 V422I로 이루어진 군으로부터 선택된 변형을 포함하는 인간 IgG4의 CH3 도메인이다.
일 구현예에서, 결합 단백질은 본원에 인용된 바와 같은 하나 이상의 변형을 갖는 CH 영역을 포함하며, 여기서 결합 단백질의 불변 영역은 인간에서 비면역원성이거나 실질적으로 비면역원성이다. 특정 구현예에서, CH 영역은 인간에서 면역원성 에피토프를 제시하지 않는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 결합 단백질은 야생형 인간 중쇄에서는 발견되지 않는 CH 영역을 포함하며, CH 영역은 T 세포 에피토프를 생성하는 서열을 포함하지 않는다.
일 구현예에서, Fc 도메인은 변경된 Fc 수용체 결합을 갖도록 변형될 수 있고, 이는 결국 작동자 기능에 영향을 미친다. Fc 도메인을 포함하는 조작된 중쇄 불변 영역(CH)은 키메라일 수 있다. 이와 같이, 키메라 CH 영역은 둘 이상의 면역글로불린 이소형으로부터 유래된 CH 도메인들을 조합한다. 예를 들어, 키메라 CH 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자에서 유래된 CH3 도메인의 일부 또는 전부와 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 분자에서 유래된 CH2 도메인의 일부 또는 전부를 포함한다. 키메라 CH 영역은 키메라 힌지 영역을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 키메라 힌지는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역 유래의 "하부 힌지" 서열(EU 넘버링에 따른 위치 228 내지 236에서의 아미노산 잔기)과 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역 유래의 "상부 힌지" 아미노산 서열(EU 넘버링에 따른 위치 216 내지 227에서의 아미노산 잔기)을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 키메라 힌지 영역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 상부 힌지 유래의 아미노산 잔기, 및 인간 IgG2 하부 힌지 유래의 아미노산 잔기를 포함한다.
특정 요법의 경우, Fc 도메인은 Fc-함유 단백질(예컨대 항체)의 원하는 약동학적 특성에 영향을 미치지 않으면서, 정상적인 Fc 작동자 기능 중 전부 또는 일부를 활성화시키거나 전혀 활성화시키지 않도록 조작될 수 있다. 키메라 CH 영역을 포함하고 변경된 작동자 기능을 갖는 단백질의 예에 대해서는 미국 특허 제9,359,437호를 참조하며, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다. 일부 구현예에서, pMHC-결합 단백질은 N-말단에서 C-말단까지, CH1 도메인, 키메라 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변(CH) 영역을 포함하는 재조합 폴리펩티드를 포함하며, 여기서: (a) CH1 도메인은 (EU 넘버링) 위치 212에서 215까지 아미노산 서열 DKKV 또는 DKRV를 포함하고; (b) 키메라 힌지는 (EU 넘버링) 위치 216에서 227까지 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 상부 힌지 아미노산 서열을 포함하고, (EU 넘버링) 위치 228에서 236까지 인간 IgG2 하부 힌지 아미노산 서열 PCPAPPVA (서열번호 29)를 포함하고; (c) CH2 도메인은 (EU 넘버링) 위치 237에서 340까지 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 인간 IgG4 CH2 도메인 아미노산 서열을 포함하며; (d) CH3 도메인은 (EU 넘버링) 위치 341에서 447까지 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 CH3 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중특이적 항체는, 각각 공통 경쇄를 동족 VL 도메인으로서 갖는 제1 VH 및 제2 VH를 가질 수 있다.
내인성 펩티드에 대한 내성의 파괴
특이적 pMHC 결합 단백질을 얻기 위해 항원 pMHC로 비인간 동물(예를 들어, 마우스 또는 랫트와 같은 설치류)을 면역화하는 것은 비인간 동물 내 내인성 단백질과 비인간 동물의 면역 체계가 pMHC 복합체를 비-자기(즉, 이물)로서 인식하게 하기 위해 제시되는 이종 단백질 간의 서열 차이에 따라 달라진다. 자가-pMHC와의 높은 상동성을 갖는 pMHC에 대한 항체를 생성하는 것은 자가-pMHC 에 대한 면역학적 내성으로 인해 어려울 수 있다. 관심 펩티드에 상동인 자가-펩티드에 대한 내성을 파괴하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제20170332610호를 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합된다. 일부 구현예에서, 내인성 펩티드에 대한 내성을 파괴하는 방법은, 관심 펩티드와 높은 상동성을 갖는 자가-펩티드의 결실, 예를 들어, 녹아웃 돌연변이를 포함하도록 본원의 비인간 동물을 변형시키는 단계를 포함한다.
약학적 조성물
특정 구현예에서, 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된 적어도 하나의 pMHC 결합 단백질을 함유하는 조성물, 예를 들어, 약학적 조성물이 본원에 제공된다.
본원에서 제공된 약학적 조성물은 다음에 적합한 것을 포함하여, 고체 또는 액체 형태로 투여되도록 특별히 제형화될 수 있다: (1) 경구 투여, 예를 들어, 드렌치(수성 또는 비수성 용액 또는 현탁액), 정제, 예를 들어, 구강, 설하, 및 전신 흡수, 볼루스, 분말, 과립, 혀에 도포하기 위한 연고; 또는 (2) 비경구 투여, 예를 들어, 멸균 용액 또는 현탁액 또는 서방성 제형으로서 피하, 근육 내, 정맥 내 또는 경막외 주사에 의한 비경구 투여.
일부 구현예에서, 비경구 투여에 적합한 본원에서 제공된 약학적 조성물은 본 발명의 특정 구현예의 하나 이상의 치료제를 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 유화액 또는 멸균 분말과 조합하여 포함하는데, 이들 용액 또는 분말은 사용 직전에 멸균 주사액 또는 분산액으로 재구성될 수 있으며, 당, 알코올, 항산화제, 완충제, 세균 발육 저지제, 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장화시키는 용질, 또는 현탁제 또는 농조화제를 함유할 수 있다.
본원에서 제공되는 약학적 조성물에 사용될 수 있는 적절한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등, 이들로 한정되지는 않음), 및 이들의 적절한 혼합물, 식물성 오일(예: 올리브 오일), 및 주사식 유기 에스테르(예: 올레산에틸)를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제를 사용함으로써, 분산액의 경우 요구되는 입자의 크기를 유지함으로써, 및 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다.
특정 구현예에서, 조성물은 원하는 투여량에 적절한 w/v를 만드는 농도로 pMHC 결합 단백질을 포함한다. pMHC 결합 단백질은 적어도 1 mg/mL, 적어도 5 mg/mL, 적어도 10 mg/mL, 적어도 15 mg/mL, 적어도 20 mg/mL, 적어도 25 mg/mL, 적어도 30 mg/mL, 적어도 35 mg/mL, 적어도 40 mg/mL, 적어도 45 mg/mL, 적어도 50 mg/mL, 적어도 55 mg/mL, 적어도 60 mg/mL, 적어도 65 mg/mL, 적어도 70 mg/mL, 적어도 75 mg/mL, 적어도 80 mg/mL, 적어도 85 mg/mL, 적어도 90 mg/mL, 적어도 95 mg/mL, 적어도 100 mg/mL, 적어도 105 mg/mL, 적어도 110 mg/mL, 적어도 115 mg/mL, 적어도 120 mg/mL, 적어도 125 mg/mL, 적어도 130 mg/mL, 적어도 135 mg/mL, 적어도 140 mg/mL, 적어도 150 mg/mL, 적어도 200 mg/mL, 적어도 250 mg/mL, 또는 적어도 300 mg/mL의 농도로 조성물 중에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, pMHC 결합 단백질은 1 mg/mL 내지 300 mg/mL의 농도로 조성물 중에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, pMHC 결합 단백질은 5 mg/mL 내지 250 mg/mL의 농도로 조성물 중에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, pMHC 결합 단백질은 10 mg/mL 내지 200 mg/mL의 농도로 조성물 중에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, pMHC 결합 단백질은 15 mg/mL 내지 150 mg/mL의 농도로 조성물 중에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, pMHC 결합 단백질은 20 mg/mL 내지 140 mg/mL의 농도로 조성물 중에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, pMHC 결합 단백질은 25 mg/mL 내지 135 mg/mL의 농도로 조성물 중에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, pMHC 결합 단백질은 30 mg/mL 내지 130 mg/mL의 농도로 조성물 중에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, pMHC 결합 단백질은 35 mg/mL 내지 125 mg/mL의 농도로 조성물 중에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, pMHC 결합 단백질은 40 mg/mL 내지 120 mg/mL의 농도로 조성물 중에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, pMHC 결합 단백질은 45 mg/mL 내지 115 mg/mL의 농도로 조성물 중에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, pMHC 결합 단백질은 50 mg/mL 내지 110 mg/mL의 농도로 조성물 중에 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 치료되는 특정 적응증에 대해 필요에 따라 하나 이상의 활성 화합물을 포함하며, 이들은 일반적으로 서로에게 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물들이다. 이러한 추가의 활성 화합물은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적절히 존재한다.
일부 구현예에서, 조성물은 원하는 최종 농도의 동결 건조된 조성물 또는 수용액의 형태로, pMHC 결합 단백질을 임의의 생리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(완충제, 당류, 염, 계면활성제, 가용화제, 폴리올, 희석제, 결합제, 안정화제, 염, 친유성 용매, 아미노산, 킬레이트제, 보존제 등을 포함하되 이들로 한정되지는 않음)와 혼합함으로써 제조된다(Goodman 및 Gilman의 문헌[The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th edition], L. Brunton 등의 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1999)] 참조). 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 독성이 없으며, 히스티딘, 인산염, 구연산염, 글리신, 아세테이트 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조리시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (10 내지 15잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 트레할로스, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염형성 상대 이온; 금속 착물(예: 아연-단백질 착물); 및/또는 TWEEN, 폴리소르베이트 80, PLURONICS® 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
일부 구현예에서, 완충제는 히스티딘, 구연산염, 인산염, 글리신, 또는 아세테이트이다. 당류 부형제는 트레할로스, 수크로오스, 만니톨, 말토오스 또는 라피노오스일 수 있다. 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 80, 또는 플루로닉 F68일 수 있다. 염은 NaCl, KC1, MgC12 또는 CaC12일 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 pH 조절을 개선하기 위한 완충제 또는 pH 조절제를 포함한다. 이러한 조성물은 약 3.0 내지 약 9.0, 약 4.0 내지 약 8.0, 약 5.0 내지 약 8.0, 약 5.0 내지 약 7.0, 약 5.0 내지 약 6.5, 약 5.5 내지 약 8.0, 약 5.5 내지 약 7.0 또는 약 5.5 내지 약 6.5의 pH를 가질 수 있다. 추가 구현예에서, 이러한 조성물은 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5 또는 약 9.0의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 조성물은 약 6.0의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 조성물은 pH 조절을 개선하기 위한 완충제 또는 pH 조절제를 포함한다. 이러한 조성물은 3.0 내지 9.0, 4.0 내지 8.0, 5.0 내지 8.0, 5.0 내지 7.0, 5.0 내지 6.5, 5.5 내지 8.0, 5.5 내지 7.0, 또는 5.5 내지 6.5의 pH를 가질 수 있다. 추가의 구현예에서, 이러한 조성물은 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 또는 9.0의 pH를 갖는다. 특정 구현예에서, 조성물은 6.0의 pH를 갖는다.
당업자는 조성물의 pH가 일반적으로 조성물에 사용될 특정 pMHC 결합 단백질의 등전점과 동일해서는 안된다는 것을 이해할 것이다. 통상적으로, 완충제는 유기 또는 무기 산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 완충제는, 구연산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 타르타르산, 숙신산, 아세트산, 또는 프탈산의 염과 같은 유기산 염; 트리스, 트로메타아민 하이드로클로라이드, 또는 인산 완충제를 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 또한, 아미노산 성분이 완충 작용을 할 수도 있다. 완충제로서 조성물에 사용될 수 있는 대표적인 아미노산 성분은 글리신 및 히스티딘을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 특정 구현예에서, 완충제는 히스티딘, 구연산염, 인산염, 글리신 및 아세테이트로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 완충제는 히스티딘이다. 또 다른 특정 구현예에서, 완충제는 구연산염이다. 또 다른 특정 구현예에서, 완충제는 글리신이다. 완충제의 순도는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%이어야 한다. 본원에 사용된 바와 같이, 히스티딘 및 글리신의 맥락에서 "순도(purity)"라는 용어는 당업계에서 이해되는 것과 같은 히스티딘 또는 글리신의 화학적 순도를 지칭하며, 예를 들어, The Merck Index, 13th ed., O'Neil 등 ed. (Merck & Co., 2001)에 기술된 바와 같다(상기 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨).
특정 구현예에서, 조성물은 완충제로서 히스티딘을 포함한다. 특정 구현예에서, 히스티딘은 적어도 약 1 mM, 적어도 약 5 mM, 적어도 약 10 mM, 적어도 약 20 mM, 적어도 약 30 mM, 적어도 약 40 mM, 적어도 약 50 mM, 적어도 약 75 mM, 적어도 약 100 mM, 적어도 약 150 mM 또는 적어도 약 200 mM 히스티딘의 농도로 조성물 중에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 1 mM 내지 약 200 mM, 약 1 mM 내지 약 150 mM, 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 75 mM, 약 10 mM 내지 약 200 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 10 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 75 mM, 약 10 mM 내지 약 50 mM, 약 10 mM 내지 약 40 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 75 mM, 약 20 mM 내지 약 50 mM, 약 20 mM 내지 약 40 mM 또는 약 20 mM 내지 약 30 mM의 히스티딘을 포함한다. 추가 구현예에서, 조성물은 약 1 mM, 약 5 mM, 약 10 mM, 약 20 mM, 약 25 mM, 약 30 mM, 약 35 mM, 약 40 mM, 약 45 mM, 약 50 mM, 약 60 mM, 약 70 mM, 약 80 mM, 약 90 mM, 약 100 mM, 약 150 mM 또는 약 200 mM의 히스티딘을 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 약 10 mM, 약 25 mM의 히스티딘을 포함하거나 히스티딘을 포함하지 않을 수 있다.
특정 구현예에서, 조성물은 완충제로서 히스티딘을 포함한다. 특정 구현예에서, 히스티딘은 적어도 1 mM, 적어도 5 mM, 적어도 10 mM, 적어도 20 mM, 적어도 30 mM, 적어도 40 mM, 적어도 50 mM, 적어도 75 mM, 적어도 100 mM, 적어도 150 mM 또는 적어도 200 mM 히스티딘의 농도로 조성물 중에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 1 mM 내지 200 mM, 1 mM 내지 150 mM, 1 mM 내지 100 mM, 1 mM 내지 75 mM, 10 mM 내지 200 mM, 10 mM 내지 150 mM, 10 mM 내지 100 mM, 10 mM 내지 75 mM, 10 mM 내지 50 mM, 10 mM 내지 40 mM, 10 mM 내지 30 mM, 20 mM 내지 75 mM, 20 mM 내지 50 mM, 20 mM 내지 40 mM 또는 20 mM 내지 30 mM의 히스티딘을 포함한다. 추가 구현예에서, 조성물은 1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 150 mM 또는 200 mM의 히스티딘을 포함한다. 특정, 조성물은 10 mM, 약 25 mM의 히스티딘을 포함하거나 히스티딘을 포함하지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 탄수화물 부형제를 포함한다. 탄수화물 부형제는, 예컨대 점도 증강제, 안정화제, 벌크화제, 가용화제 등으로서 작용할 수 있다. 탄수화물 부형제는 중량 또는 부피 기준으로 일반적으로 약 1% 내지 약 99%, 예를 들어, 약 0.1% 내지 약 20%, 약 0.1% 내지 약 15%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 약 8% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 20%, 0.1% 내지 20%, 5% 내지 15%, 8% 내지 10%, 10% 내지 15%, 15% 내지 20%, 약 0.1% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 10%, 또는 약 15% 내지 약 20%로 존재한다. 또 다른 특정 구현예에서, 탄수화물 부형제는 1%, 또는 1.5%, 또는 2%, 또는 2.5%, 또는 3%, 또는 4%, 또는 5%, 또는 10%, 또는 15%, 또는 20%로 존재한다.
일부 구현예에서, 조성물은 탄수화물 부형제를 포함한다. 탄수화물 부형제는, 예컨대 점도 증강제, 안정화제, 벌크화제, 가용화제 등으로서 작용할 수 있다. 탄수화물 부형제는 중량 또는 부피 기준으로 일반적으로 약 1% 내지 약 99%, 예를 들어, 0.1% 내지 20%, 0.1% 내지 15%, 0.1% 내지 5%, 1% 내지 20%, 5% 내지 15%, 8% 내지 10%, 10% 내지 15%, 15% 내지 20%, 0.1% 내지 20%, 5% 내지 15%, 8% 내지 10%, 10% 내지 15%, 15% 내지 20%, 0.1% 내지 5%, 5% 내지 10%, 또는 15% 내지 20%로 존재한다. 또 다른 특정 구현예에서, 탄수화물 부형제는 1%, 또는 1.5%, 또는 2%, 또는 2.5%, 또는 3%, 또는 4%, 또는 5%, 또는 10%, 또는 15%, 또는 20%로 존재한다.
일부 구현예에서, 조성물은 탄수화물 부형제를 포함한다. 조성물에 사용하기에 적합한 탄수화물 부형제는 단당류, 예컨대 프룩토오스, 말토오스, 갈락토오스, 글루코오스, D-만노오스, 소르보오스 등; 이당류, 예컨대 락토오스, 수크로오스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 다당류, 예컨대 라피노오스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예컨대 만니톨, 크실리톨, 말티톨, 락티톨, 크실리톨 소르비톨(글루시톨) 등을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 특정 구현예에서, 본원에서 제공된 조성물에 사용하기 위한 탄수화물 부형제는 수크로오스, 트레할로스, 락토오스, 만니톨 및 라피노오스로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 탄수화물 부형제는 트레할로스이다. 또 다른 특정 구현예에서, 탄수화물 부형제는 만니톨이다. 또 다른 특정 구현예에서, 탄수화물 부형제는 수크로오스이다. 또 다른 특정 구현예에서, 탄수화물 부형제는 라피노오스이다. 탄수화물 부형제의 순도는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%이어야 한다.
일부 구현예에서, 조성물은 트레할로스를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 4%, 적어도 약 8%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%의 트레할로스를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 1% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 40%, 약 2% 내지 약 30%, 약 2% 내지 약 20%, 약 4% 내지 약 40%, 약 4% 내지 약 30%, 또는 약 4% 내지 약 20%의 트레할로스를 포함한다. 추가 구현예에서, 조성물은 약 1%, 약 2%, 약 4%, 약 6%, 약 8%, 약 15%, 약 20%, 약 30%, 또는 약 40%의 트레할로스를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 약 4%, 약 6% 또는 약 15%의 트레할로스를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 트레할로스를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 적어도 1%, 적어도 2%, 적어도 4%, 적어도 8%, 적어도 20%, 적어도 30%, 또는 적어도 40%의 트레할로스를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 1% 내지 40%, 1% 내지 30%, 1% 내지 20%, 2% 내지 40%, 2% 내지 30%, 2% 내지 20%, 4% 내지 40%, 4% 내지 30%, 또는 4% 내지 20%의 트레할로스를 포함한다. 추가 구현예에서, 조성물은 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 15%, 20%, 30%, 또는 40%의 트레할로스를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 4%, 6% 또는 15%의 트레할로스를 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 부형제를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 당, 염, 계면활성제, 아미노산, 폴리올, 킬레이트제, 유화제 및 보존제로부터 선택된 적어도 하나의 부형제를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 염, 예를 들어, NaCl, KC1, CaC12 및 MgC12로부터 선택된 염을 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 NaCl을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 아미노산, 예를 들어, 리신, 아르기닌, 글리신, 히스티딘 또는 아미노산 염을 포함한다. 조성물은 적어도 약 1 mM, 적어도 약 10 mM, 적어도 약 25 mM, 적어도 약 50 mM, 적어도 약 100 mM, 적어도 약 150 mM, 적어도 약 200 mM, 적어도 약 250 mM, 적어도 약 300 mM, 적어도 약 350 mM 또는 적어도 약 400 mM의 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 약 1 mM 내지 약 100 mM, 약 10 mM 내지 약 150 mM, 약 25 mM 내지 약 250 mM, 약 25 mM 내지 약 300 mM, 약 25 mM 내지 약 350 mM, 약 25 mM 내지 약 400 mM, 약 50 mM 내지 약 250 mM, 약 50 mM 내지 약 300 mM, 약 50 mM 내지 약 350 mM, 약 50 mM 내지 약 400 mM, 약 100 mM 내지 약 250 mM, 약 100 mM 내지 약 300 mM, 약 100 mM 내지 약 400 mM, 약 150 mM 내지 약 250 mM, 약 150 mM 내지 약 300 mM, 또는 약 150 mM 내지 약 400 mM의 아미노산을 포함할 수 있다. 추가 구현예에서, 조성물은 약 1 mM, 1.6 mM, 25 mM, 약 50 mM, 약 100 mM, 약 150 mM, 약 200 mM, 약 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM 또는 약 400 mM의 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 아미노산, 예를 들어, 리신, 아르기닌, 글리신, 히스티딘 또는 아미노산 염을 포함한다. 조성물은 적어도 1 mM, 적어도 10 mM, 적어도 25 mM, 적어도 50 mM, 적어도 100 mM, 적어도 150 mM, 적어도 200 mM, 적어도 250 mM, 적어도 300 mM, 적어도 350 mM 또는 적어도 400 mM의 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 1 mM 내지 100 mM, 10 mM 내지 150 mM, 25 mM 내지 250 mM, 25 mM 내지 300 mM, 25 mM 내지 350 mM, 25 mM 내지 400 mM, 50 mM 내지 250 mM, 50 mM 내지 300 mM, 50 mM 내지 350 mM, 50 mM 내지 400 mM, 100 mM 내지 250 mM, 100 mM 내지 300 mM, 100 mM 내지 400 mM, 150 mM 내지 250 mM, 150 mM 내지 300 mM, 또는 150 mM 내지 400 mM의 아미노산을 포함할 수 있다. 추가 구현예에서, 조성물은 1 mM, 1.6 mM, 25 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM 또는 400 mM의 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 계면활성제를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "계면활성제(surfactant)"는 양친매성 구조를 갖는 유기 물질을 지칭한다; 즉, 이들은 반대되는 용해 경향을 갖는 군, 일반적으로는 유용성 탄화수소 사슬 및 수용성 이온 군으로 이루어진다. 계면활성제는 표면 활성 모이어티의 전하에 따라 음이온성, 양이온성 및 비이온성 계면활성제로 분류될 수 있다. 계면활성제는 종종 다양한 약학적 조성물 및 생물학적 물질의 제조를 위한 습윤제, 유화제, 가용해화, 및 분산제로서 사용된다. 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 80); 폴리옥사머(예를 들어, 폴록사머 188); 트리톤; 소듐 옥틸 글리코시드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-술포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스타미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테르아미도프로필-베타인(예: 라우로아미도프로필); 미리스타미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 소듐 메틸 코코일-, 또는 디소듐 메틸 올레일-타우레이트; 및 MONAQUA® 시리즈(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), 폴리 에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체(예: PLURONICS® PF68, 등)와 같이 약학적으로 허용 가능한 계면활성제가 응집을 줄이기 위해 조성물에 임의로 첨가될 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 또는 폴리소르베이트 80을 포함한다. 계면활성제는, 펌프 또는 플라스틱 용기가 조성물을 투여하는데 사용되는 경우에 특히 유용하다. 약학적으로 허용 가능한 계면활성제의 존재는 단백질이 응집하려는 성향을 감소시킨다. 조성물은 약 0.001% 내지 약 1%, 또는 약 0.001% 내지 약 0.1%, 또는 약 0.01% 내지 약 0.1% 범위의 농도로 폴리소프베이트를 포함할 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 조성물은 0.001%, 또는 0.002%, 또는 0.003%, 또는 0.004%, 또는 0.005%, 또는 0.006%, 또는 0.007%, 또는 0.008%, 또는 0.009%, 또는 0.01%, 또는 0.015%, 또는 0.02%의 농도로 폴리소르베이트를 포함한다. 조성물은 0.001% 내지 1%, 또는 0.001% 내지 0.1%, 또는 0.01% 내지 0.1% 범위의 농도로 폴리소프베이트를 포함할 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 조성물은 0.001%, 또는 0.002%, 또는 0.003%, 또는 0.004%, 또는 0.005%, 또는 0.006%, 또는 0.007%, 또는 0.008%, 또는 0.009%, 또는 0.01%, 또는 0.015%, 또는 0.02%의 농도로 폴리소르베이트를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 희석제, 결합제, 안정화제, 친유성 용매, 보존제, 보조제 등을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 다른 부형제 및/또는 첨가제를 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 첨가제는 본원에서 제공된 조성물에 사용될 수 있다. 응집을 줄이기 위해, 약학적으로 허용 가능한 킬레이트제(예를 들어, EDTA, DTPA 또는 EGTA, 이들로 한정되지는 않음)와 같은 일반적으로 사용되는 부형제/첨가제가 조성물에 임의로 첨가될 수 있다. 이들 첨가제는, 펌프 또는 플라스틱 용기가 조성물을 투여하는데 사용되는 경우에 특히 유용하다.
일부 구현예에서, 조성물은 보존제를 포함한다. 보존제, 예컨대 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 질산 페닐 수은, 페녹시에탄올, 포름알데히드, 클로로부탄올, 염화 마그네슘(예: 6수화물, 이에 한정되지는 않음), 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 소듐 데하이드로아세테이트 및 티메로살, 또는 이들의 혼합물은 임의의 적합한 농도로, 예컨대 0.001% 내지 5% 또는 그 사이의 임의의 범위 또는 값의 농도로 조성물에 임의로 첨가될 수 있다. 조성물에 사용된 보존제의 농도는 미생물 효과를 수득하기에 충분한 농도이다. 이러한 농도는, 선택된 보존제에 따라 달라지고 당업자에 의해 쉽게 결정된다.
일부 구현예에서, 조성물은 인간 혈액과 등장성이며, 여기서 조성물은 인간 혈액과 본질적으로 동일한 삼투압을 갖는다. 이러한 등장성 조성물은 일반적으로 250 mOSm 내지 350 mOSm의 삼투압을 가지게 된다. 등장성(isotonicity)은, 예를 들어, 증기압 또는 결빙형(ice-freezing) 삼투압계를 사용해 측정할 수 있다. 조성물의 긴장성(tonicity)은 긴장성 조절제를 사용해 조절된다. "긴장성 조절제(tonicity modifier)"는 조성물에 등장성을 제공하기 위해 조성물에 첨가될 수 있는 약학적으로 허용 가능한 불활성 물질들이다. 본원에 제공된 조성물에 적합한 긴장성 조절제는 당류, 염 및 아미노산을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
특정 구현예에서, 조성물은 발열물질이 없는 조성물로서, 내독소(endotoxin) 및/또는 관련 발열 물질이 실질적으로 없다. 내독소는 미생물 내부에 구속되어 있으면서 미생물이 분해되거나 사멸할 때만 방출되는 독소이다. 발열 물질에는 박테리아 및 다른 미생물의 막 외부로부터 발열을 유도하는 내열성 물질도 포함된다. 이러한 물질 모두는 인체에 투여되는 경우 발열, 저혈압 및 쇼크를 유발할 수 있다. 잠재적 유해 효과 때문에, 비록 소량이더라도 내독소는 정맥 주사식 약학적 약물 용액으로부터 반드시 제거되어야 한다. 미국 식품의약국("FDA")은 정맥 내 약물 적용에 대해 1시간 동안 체중 1킬로그램 당 투여량 당 5 내독소 단위(EU)로 상한을 설정하였다(The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000) 참조). 관심 단백질(예: 항체)의 경우처럼, 치료 단백질이 체중 1킬로그램당 수백 또는 수천 밀리그램의 양으로 투여되는 경우, 미량일지라도 유해하고 위험한 내독소는 제거해야만 한다. 일부 구현예에서, 조성물 중의 내독소 및 발열원 수준은 10 EU/mg 미만, 또는 5 EU/mg 미만, 또는 1 EU/mg 미만, 또는 0.1 EU/mg 미만, 또는 0.01 EU/mg 미만, 또는 0.001 EU/mg 미만이다.
일부 구현예에서, 생체 내 투여에 사용될 때, 약학적 조성물은 멸균 상태여야 한다. 조성물은 멸균 여과, 방사선 등을 포함하는 다양한 멸균 방법에 의해 멸균될 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 미리 살균된 0.22미크론 필터로 여과-멸균된다. 주사용 멸균 조성물은 "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005)(그 전체는 참조로서 본원에 통합됨)에 기술된 바와 같이 종래의 약학적 관행에 따라 제형화될 수 있다.
본원에 개시된 것과 같은 pMHC 결합 단백질을 포함하는 조성물은 일반적으로 동결 건조된 형태 또는 용액으로 보관되게 된다. pMHC 결합 단백질을 포함하는 멸균 조성물은 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼(stopper)와 같은, 조성물을 꺼내어 쓸 수 있는 어댑터를 갖는 정맥 내 용액 백 또는 바이알에 담기는 것으로 고려된다. 특정 구현예에서, 조성물은 사전 충진된 주사기로 제공된다.
특정 구현예에서, 조성물은 동결 건조된 제형이다. 용어 "동결 건조된" 또는 "냉동 건조된"은 적어도 50%의 수분이 제거된, 동결건조와 같은 건조 과정을 거친 물질의 상태를 포함한다.
선택된 투여 경로에 관계없이, 적절한 수화 형태로 사용될 수 있는 본원에 제공된 제제 및/또는 본원에 제공된 약학적 조성물은 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용 가능한 투여 형태로 제형화된다.
본 발명은 다수의 실시예를 참조하여 특히 도시되고 기술되었지만, 당업자는 본 명세서에 개시된 다양한 실시예들의 형태 및 세부 사항에 있어서의 변경이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있고, 본원에 개시된 다양한 구현예들이 청구범위의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시를 위해 제공되며 본 발명의 범위를 한정하도록 의도되지 않는다.
실시예 1
(1) 인간 또는 인간화 MHC I 유전자좌, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 유전자좌 및/또는 인간 또는 인간화 MHC II 유전자좌(예를 들어, 이러한 인간화 유전자좌의 비한정적 예에 대해서는 도 1 및 도 2 참조) 및 (2) 인간화 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 유전자좌(예를 들어, Macdonald 등의 문헌[(2014) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111 :5147-52]을 참조하고, 그 전체는 참조로서 본원에 통합됨)를 포함하는 마우스를, 교배 기술 및 ES 세포에서의 순차적인 상동성 재조합 중 하나 또는 둘 모두를 사용하여 생성한다. 이들 마우스는 인간 또는 인간화 MHC I/β2 마이크로글로불린 분자 및/또는 인간 또는 인간화 MHC II 분자를 발현되고 이에 대해 내성을 갖는다. 마우스에 대해 항원성인 펩티드 및 마우스가 내성을 갖는 인간 또는 인간화 MHC를 포함하는 관심 펩티드-MHC(pHHC) 복합체로 마우스를 면역화한다. 관심 pMHC 복합체를 마우스에게 추가적으로 및 임의로 추가 투여하는데, 추가 투여는 보조 T 세포 에피토프에도 임의로 연결된다. 인간화 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄 유전자좌로부터 발현된 인간 또는 인간화 항체를 pMHC 복합체에 대한 결합 특이성에 대해 시험한 면역화된 마우스의 혈청으로부터 단리한다.
C57BL 배경을 갖고, 인간화 β2 마이크로글로불린과 결합된 인간화 MHC I 분자(HLA-A2/H-2K)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 도 1a 및 도 1c를 참조하고; 각각 전체가 참조로서 본원에 통합된 미국 특허 제9,591,835호 및 제9,615,550호 또한 참조함), 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌(Macdonald의 전술한 문헌[(2014)] 참조), 및 인간화 공통 경쇄 유전자좌(예를 들어, 미국 특허 제10,143,186호; 제10,130,081호 및 제9,969,814호; 미국 특허 공개 제20120021409호, 제20120192300호, 제20130045492호, 제20130185821호, 제20130302836호, 및 제20150313193호를 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)를 갖는 시험 마우스를 생성하였다. 이들 시험 마우스, 및 기능적(예를 들어, 쥣과) ADAM6 유전자(예를 들어, 미국 특허 제8,642,835호 및 제8,697,940호 참조; 간행물 각각은 그 전체가 참조로서 통합됨) 및 인간화 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌를 포함하는 대조군 마우스를 HLA-A2/β2m 분자의 맥락에서 제시된 이종 펩티드(펩티드 B)를 포함하는 단쇄 pMHC 복합체로 면역화하였으며, 여기서 면역원은 서열번호 26으로 제시된 단백질 면역원(도 4) 또는 서열번호 27로 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단쇄 pMHC 복합체를 암호화하는 DNA(도 3)로 투여하였다. 상이한 경로를 통해 시간 간격을 달리하면서 표준 보조제와 함께 pMHC 복합체 면역원(도 3 내지 도 4) 또는 T 보조 펩티드(PADRE; 도 5)에 연결된 pMHC 복합체 면역원을 마우스에게 추가 투여하였다. 면역화 개시 전에 마우스로부터 면역 전 혈청을 채취하였다. 주기적으로 마우스에서 채혈을 하고 항-혈청 역가를 각각의 항원에 대해 분석하였다.
HLA-A2의 맥락에서 제시된 무관한 (펩티드 A 또는 펩티드 C) 항원 및 관련 항원에 대한 혈청 내 항체 역가를 ELISA를 사용하여 결정하였다. 96-웰 마이크로역가 플레이트(Thermo Scientific)를 5 μg/ml의 인산염 완충 식염수(PBS, Irvine Scientific) 중 항-myc 항체로 밤새 코팅하였다. 0.05% Tween 20이 포함된 인산염 완충 식염수(PBS-T, Sigma-Aldrich)로 플레이트를 세척하고, PBS 중 0.5% 소 혈청 알부민(BSA, Sigma-Aldrich) 250 μl으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 플레이트를 PBS-T로 세척하고, HLA-A2의 맥락에서 제시된 관련 펩티드 B 또는 무관한 항원 펩티드 A 또는 펩티드 C를 포함하는 2 μg/ml c-myc-태그된 단쇄 pMHC 복합체로 코팅하였다.
면역 전 및 면역 항혈청을 0.5% BSA-PBS에서 3배 연속 희석하고, 실온에서 1시간 동안 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 세척하고 염소 항-마우스 IgG-Fc- 서양 고추냉이 과산화효소(HRP) 접합된 이차 항체(Jackson Immunoresearch)를 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)/H2O2를 제조업자의 권장 절차에 따라 기질로서 사용해 전개하고, 450 nm에서의 흡광도를 분광광도계(Victor, Perkin Elmer)를 사용해 기록하였다. 항체 역가는 Graphpad PRISM 소프트웨어를 사용하여 연산하였다. 항체 역가는, 결합 신호가 배경 대비 2배인 보간된 혈청 희석 인자로서 계산하였다.
단쇄 pMHC를 함유하는 펩티드 B에 결합하는 항체 역가는 HLA-A의 맥락에서 펩티드 B를 암호화하는 DNA 면역원 또는 이를 포함하는 단백질 면역원으로 면역화할 때 대조군 마우스에서 유도하였고(도 3~4), 대조군 마우스는 키메라 HLA-A2/H-2K 폴리펩티드 및/또는 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린에 대해 내성이 없는 코호트를 포함하였다. 그러나, 이들 대조군 마우스의 혈청은 단쇄 pMHC를 함유하는 펩티드 B에 대한 항체 역가와 유사한 HLA-A의 맥락에서 제시된 무관한 펩티드(펩티드 A 또는 펩티드 C)에 대한 항체 역가도 포함하였다(도 3~4). 이와 같이, 내성이 없는 동물이 관심 pMHC 복합체에 대한 면역 반응을 생성할 수 있지만, 이러한 면역 반응은 항체 역가가 단쇄 pMHC를 함유하는 펩티드 B 및 단쇄 pMHC를 함유하는 무관한 펩티드에 대한 항체 역가와 비슷하기 때문에 비특이적 면역 반응으로 간주될 수 있다.
대조적으로, 인간(화) HLA-A 및 β2 마이크로글로불린 분자에 내성을 가진 시험 마우스의 혈청을, 단쇄 pMHC를 함유하는 펩티드 B에 대한 항체 역가를 유도한 단쇄 펩티드 B/ HLA-A/β2M 복합체로 면역화하였다. (도 4) 펩티드 B를 포함하는 pMHC 복합체에 대한 항체 역가는 무관한 펩티드 A 또는 C를 포함하는 HLA-A/β2M 복합체에 대한 항체 역가보다 높았다(도 4). 유사하게, 펩티드 B/HLA-A/β2M 복합체를 암호화하는 DNA가 면역원으로서 사용된 경우, (무관한 pMHC 복합체와 비교했을 때) 관련 펩티드 B 단쇄 단백질에 대해 더 높은 항체 역가가 관찰되었다(도 3). 무관한 pMHC 복합체에 대한 항체 역가와 비교했을 때, 시험 마우스에게 펩티드 B를 포함하는 단쇄 pMHC 복합체를 초회 주사로 투여하고 이어서 PADRE 보조 T 세포에 연결된 펩티드 B를 포함하는 단쇄 pMHC 복합체를 추가 투여한 제3 코호트에서도 면역원에 대해 더 높은 역가가 유도되었다(도 5). 추가로, ROSA26 유전자좌에서 단쇄 HLA-A2/β2M 폴리펩티드(서열번호 23)를 발현하는 마우스(예를 들어, 도 2 참조)를 공 HLA-A2/β2M 분자에 대해 유사하게 내성화하였는데, 이들 마우스는, (PADRE가 존재하는 가운데) pMHC/펩티드 B 복합체 단백질로 면역화하고 추가 투여한 경우, 무관한 펩티드를 제시하는 pMHC 복합체에 대한 항체 역가와 비교했을 때 펩티드 B를 제시하는 pMHC 복합체에 대해 더 높은 항체 역가를 생성하였다.(데이터 미도시)
실시예 2
상응하는 내인성 유전자좌, 예를 들어 ROSA26 유전자좌가 아닌 유전자좌로부터 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, 및/또는 β2M 분자를 발현하는 마우스를 공 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, 및/또는 β2M 분자에 대해 내성화시키면, 이들 마우스는, 공 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, 및/또는 β2M 분자에 내성이 없는 마우스와 비교했을 때, 면역원, 예를 들어, 단쇄 pMHC 복합체를 암호화하는 DNA에 대해 더 높은 항체 역가를 생성한다.
본원의 데이터는 인간 HLA 클래스 I 및 인간 β2 마이크로글로불린 분자 또는 이들의 일부에 대해 비인간 동물을 내성화하면, 인간 HLA 클래스 I 및 인간 β2 마이크로글로불린 분자에 내성이 없는 대조군 비인간 동물과 비교했을 때, 변형된 비인간 동물이 관심 pMHC에 대해 특이적 항체 반응을 생성하는 능력을 향상시킨다는 것을 입증한다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Murphy, Andrew J. <120> GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMALS FOR GENERATING THERAPEUTIC ANTIBODIES AGAINST PEPTIDE-MHC COMPLEXES, METHODS OF MAKING AND USES THEREOF <130> 009108.116WO1/10116WO01 <150> 62/647,720 <151> 2018-03-24 <150> 62/647,724 <151> 2018-03-24 <160> 29 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 1 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 2 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 3 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 4 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 5 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker sequence <400> 6 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> 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Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu 180 185 190 Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His 195 200 205 Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala 210 215 220 Gly Ser His Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp 225 230 235 240 Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp 245 250 255 Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met 260 265 270 Ala Ala Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu 275 280 285 Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg 290 295 300 Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys 305 310 315 320 Thr His Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg 325 330 335 Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln 340 345 350 Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg 355 360 365 Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro 370 375 380 Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu 385 390 395 400 Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser 405 410 415 Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 420 425 430 His His His His His His 435 <210> 27 <211> 733 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GCGGS-G4Sx2-hB2m-G4Sx4-HLA-A*02:01 full length (Y108C)-G4Sx4-eGFP <400> 27 Gly Cys Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile 1 5 10 15 Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn 20 25 30 Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser 35 40 45 Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val 50 55 60 Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu 65 70 75 80 Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg 85 90 95 Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg 100 105 110 Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr 130 135 140 Ser Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly 145 150 155 160 Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser 165 170 175 Gln Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu 180 185 190 Tyr Trp Asp Gly Glu Thr Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His 195 200 205 Arg Val Asp Leu Gly Thr Leu Arg Gly Cys Tyr Asn Gln Ser Glu Ala 210 215 220 Gly Ser His Thr Val Gln Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp 225 230 235 240 Trp Arg Phe Leu Arg Gly Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp 245 250 255 Tyr Ile Ala Leu Lys Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met 260 265 270 Ala Ala Gln Thr Thr Lys His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu 275 280 285 Gln Leu Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg 290 295 300 Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys 305 310 315 320 Thr His Met Thr His His Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg 325 330 335 Cys Trp Ala Leu Ser Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln 340 345 350 Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg 355 360 365 Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro 370 375 380 Ser Gly Gln Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu 385 390 395 400 Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Ser Gln Pro Thr Ile 405 410 415 Pro Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Phe Gly Ala Val Ile 420 425 430 Thr Gly Ala Val Val Ala Ala Val Met Trp Arg Arg Lys Ser Ser Asp 435 440 445 Arg Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln 450 455 460 Gly Ser Asp Val Ser Leu Thr Ala Cys Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser 465 470 475 480 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val 485 490 495 Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu 500 505 510 Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly 515 520 525 Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr 530 535 540 Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr 545 550 555 560 Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His 565 570 575 Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr 580 585 590 Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys 595 600 605 Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp 610 615 620 Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr 625 630 635 640 Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile 645 650 655 Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln 660 665 670 Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val 675 680 685 Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys 690 695 700 Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr 705 710 715 720 Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 725 730 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PADRE <400> 28 Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 29 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala 1 5

Claims (33)

  1. 유전적으로 변형된 비인간 동물로서, 이의 게놈은
    (a) 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및
    (b) 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하되, 임의로 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌 중 적어도 하나는 재배열되지 않고,
    상기 유전적으로 변형된 비인간 동물은 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 적어도 이의 펩티드 결합 부분을 발현하고,
    상기 유전적으로 변형된 비인간 동물은 인간 또는 인간화 중쇄 가변 도메인 및/또는 인간 또는 인간화 경쇄 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린을 발현하고,
    비인간 동물은, 다음을 포함하는 항원 펩티드-MHC(pMHC) 복합체로 면역화할 때 특이적 B 세포 반응을 생성하도록 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분에 대해 내성을 가지는, 유전적으로 변형된 비인간 동물: (i) (ii)와 복합체를 형성한 비인간 동물에 대해 이종인 펩티드; 및 (ii) 인간 또는 인간화 MHC 분자가 유래된 인간 HLA 분자 또는 이의 일부분.
  2. 제1항에 있어서, 인간 또는 인간화 MHC 분자는 인간 또는 인간화 MHC 클래스 I 분자, 인간 또는 인간화 MHC 클래스 II α 분자, 인간 또는 인간화 MHC 클래스 II β 분자, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고/되거나,
    상기 유전적으로 변형된 비인간 동물은
    (a) 내인성 중쇄 유전자좌에서:
    (i) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 가변 영역;
    (ii) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 제한된 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 중쇄 가변 영역;
    (iii) 공통 중쇄 암호화 서열;
    (iv) 내인성 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 중쇄 가변 영역;
    (v) 중쇄 단독 면역글로불린 암호화 서열; 또는
    (vi) 하이브리드 면역글로불린 사슬을 암호화하는 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 하이브리드 중쇄 서열을 포함하고/하거나
    (b) 내인성 경쇄 유전자좌에서:
    (i) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 가변 영역;
    (ii) 공통 경쇄 암호화 서열;
    (iii) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 제한된 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 경쇄 가변 영역;
    (iv) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 경쇄 가변 영역;
    (v) 내인성 경쇄 불변 영역에 작동 가능하게 연결된 히스티딘 변형된 재배열된 인간 또는 인간화 경쇄 가변 영역을 포함하는, 유전적으로 변형된 비인간 동물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 비인간 동물은 기능적 ADAM6 유전자를 추가로 포함하고, 임의로 기능적 ADAM6 유전자는 내인성 ADAM6 유전자인, 유전적으로 변형된 비인간 동물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 외인성 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제(TdT) 유전자를 추가로 발현하는, 유전적으로 변형된 비인간 동물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 인간화 MHC 분자는 인간 또는 인간화 MHC 클래스 I 분자이고, 임의로 인간 또는 인간화 MHC 분자는 HLA-A 분자, HLA-B 분자, HLA-C 분자, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 HLA 클래스 I 분자로부터 유래되는, 유전적으로 변형된 비인간 동물.
  6. 제5항에 있어서, 임의로 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 그의 게놈 내에 추가로 포함하되,
    비인간 동물은 비인간 동물이 β2 마이크로글로불린에 대해 자체로서 내성을 갖거나 인간 또는 인간화 MHC 클래스 I 분자와 연관됨으로써 내성을 갖도록 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 발현하는, 유전적으로 변형된 비인간 동물.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 인간화 MHC 분자는 인간 또는 인간화 MHC 클래스 II 분자이고, 임의로, 인간 또는 인간화 MHC 분자는 HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR 분자 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 HLA 클래스 II 분자의 α 및/또는 β 사슬 또는 적어도 펩티드 결합 홈으로부터 유래되는, 유전적으로 변형된 비인간 동물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 완전한 인간 HLA 분자를 암호화하고,
    임의로, 뉴클레오티드 서열은 내인성 비인간 MHC 유전자좌를 파괴하지 않고, 임의로, 뉴클레오티드 서열은 내인성 ROSA26 유전자좌에 삽입되는, 유전적으로 변형된 비인간 동물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 내인성 MHC 분자의 막관통 및 세포질 도메인에 작동 가능하게 연결된 인간 HLA 분자의 세포 외 도메인을 포함하는 키메라 인간/비인간 MHC 분자를 암호화하고, 임의로, 뉴클레오티드 서열은
    (i) 내인성 비인간 MHC 클래스 I 분자, 예컨대 내인성 쥣과 H-2K 폴리펩티드, 내인성 쥣과 H-2D 폴리펩티드 또는 내인성 쥣과 H-DL 폴리펩티드의 막관통 및 세포질 도메인에 작동 가능하게 연결된 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 MHC 클래스 I 분자의 α1, α2 및 α3 도메인을 포함하는 키메라 인간/비인간 MHC 클래스 I 분자, 및/또는
    (ii) 내인성 비인간 MHC 클래스 II α 분자, 예컨대 내인성 쥣과 H-2A α 폴리펩티드 또는 내인성 쥣과 H-2E α 폴리펩티드의 막관통 및 세포질 도메인에 작동 가능하게 연결된 인간 HLA 클래스 II α 폴리펩티드의 α1 및 α2 도메인, 및/또는 내인성 비인간 MHC 클래스 II β 분자, 예컨대 내인성 쥣과 H-2A α 폴리펩티드 또는 내인성 쥣과 H-2E α 폴리펩티드의 막관통 및 세포질 도메인에 작동 가능하게 연결된 인간 HLA 클래스 II β 폴리펩티드의 β1 및 β2 도메인을 포함하는 키메라 인간/비인간 MHC 클래스 II 분자를 암호화하는, 유전적으로 변형된 비인간 동물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 또는 인간화 MHC 분자가 유래되는 인간 HLA 분자와 연관된 비인간 동물에 대해 이종인 펩티드를 포함하는 항원 펩티드-MHC(pMHC) 복합체를 추가로 포함하는, 유전적으로 변형된 비인간 동물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    (c) 다음을 포함하는 항원 펩티드-MHC(pMHC) 복합체: (i) (ii)와 연관된 비인간 동물에 대해 이종인 펩티드; 및 (ii) 인간 또는 인간화 MHC 분자가 유래되는 인간 HLA 분자 또는 이의 일부분, 및
    (d) 항원 펩티드-MHC에 특이적으로 결합하고, 인간 또는 인간화 MHC 분자가 유래되는 인간 HLA 분자에는 결합하지 않는 인간 또는 인간화 항원 결합 단백질을 추가로 포함하는, 유전적으로 변형된 비인간 동물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 대해 이형접합체인, 유전적으로 변형된 비인간 동물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 설치류, 예컨대 마우스 또는 랫트인, 유전적으로 변형된 비인간 동물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물은 마우스인, 유전적으로 변형된 비인간 동물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 유전적으로 변형된 비인간 동물을 만드는 방법으로서, 상기 방법은 비인간 동물의 게놈이
    (a) 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및
    (b) 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하도록 게놈을 변형시키는 단계를 포함하되, 임의로, 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌 중 적어도 하나는 재배열되지 않고,
    유전적으로 변형된 비인간 동물은
    A. (ii) 인간 또는 인간화 MHC 분자가 유래된 인간 HLA 분자 또는 이의 일부분, 및 (i) (ii)와 복합체를 형성한 비인간 동물에 대해 이종인 펩티드를 포함하는 펩티드-MHC(pMHC) 복합체로 면역화될 때 특이적 B 세포 반응을 생성하도록 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분에 대해 내성을 가지고,
    B. 인간 또는 인간화 중쇄 가변 도메인 및/또는 인간 또는 인간화 경쇄 가변 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화 항원 결합 단백질을 제공할 수 있는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 방법은
    (a)
    (i) 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제1 이소성 유전자좌에 삽입하거나,
    (ii) 내인성 비인간 동물 MHC I 유전자좌에서, 비인간 동물 MHC I 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 치환하고/하거나, 내인성 비인간 동물 MHC II 유전자좌에서, 비인간 동물 MHC II 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 키메라 인간/비인간 MHC II 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 치환하되,
    키메라 인간/비인간 MHC I 분자는 인간 MHC I의 α1, α2 및 α3 도메인 및 내인성 비인간 MHC I 폴리펩티드의 적어도 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하고,
    키메라 인간/비인간 MHC II 분자는 인간 MHC II의 α1, α2, β1 및 β2 도메인 및 내인성 설치류 MHC II 폴리펩티드의 적어도 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는, 단계; 및
    (b)
    (i) 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 제2 이소성 유전자좌에 삽입하거나,
    (ii)
    (A) 내인성 비인간 중쇄 유전자좌에서 내인성 비인간 면역글로불린 가변(VH) 유전자 분절을 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 가변(VH) 유전자 분절과 치환하고, 내인성 비인간 면역글로불린 다양성(DH) 및/또는 내인성 비인간 결합(JH) 유전자 분절을 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 다양성(DH) 유전자 분절 및/또는 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 결합 (JH) 유전자 분절과 각각 임의로 치환하되, 재배열되지 않은 인간 VH, 및 임의의 DH 및 JH 유전자 분절은 내인성 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결되고/되거나,
    (B) 내인성 비인간 경쇄 유전자좌에서 내인성 비인간 경쇄 가변(VL) 유전자 분절 및 내인성 비인간 경쇄 결합(JL) 유전자 분절을, VL/JL 유전자 서열을 형성하도록 임의로 재배열된 인간 경쇄 가변(VL) 유전자 분절 및 인간 경쇄 결합(JL) 유전자 분절과 치환하되, 인간 VL 및 결합 JL 유전자 분절은 내인성 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결되는 단계를 포함하며,
    여기서, (a) 비인간 MHC I 및/또는 비인간 MHC II 분자를 각각 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 (b) VH, DH, JH, VL 및 JL 유전자 분절은
    (I) 순차적 상동성 재조합에 의해 단일 비인간 배아 줄기(ES) 세포에 삽입 또는 치환되거나,
    (II) 제1 및 제2 비인간 동물을 생성하기 위해 사용되는 제1 및 제2 ES 세포에 각각 삽입되거나 치환되며, 상기 방법은 제1 및 제2 비인간 동물을 교배시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 인간 또는 인간화 MHC 분자가 유래되는 인간 HLA 분자와 연관된 비인간 동물에 대해 이종인 펩티드를 포함하는 항원 pMHC 복합체를 비인간 동물에게 투여하는 단계를 추가로 포함하되, 임의로, 항원 pMHC 복합체는 보조 T 세포 에피토프에 연결되고, 임의로, 보조 T 세포 에피토프는 PADRE인, 방법.
  18. 관심 항원 pMHC 복합체 또는 이를 암호화하는 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 생성하는 방법으로서, 상기 방법은, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 비인간 동물 또는 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항의 방법에 따라 만들어진 비인간 동물이 관심 항원 pMHC 복합체에 대한 면역 반응을 일으키기에 충분한 조건에서 상기 비인간 동물을 유지시키는 단계를 포함하되, 관심 항원 pMHC 복합체는 비인간 동물에 대해 이종이고, 인간 또는 인간화 MHC 분자가 유래되는 인간 HLA의 맥락에서 제시되는 펩티드 또는 이의 일부를 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 제1 단계(들)로서, 관심 항원 pMHC 복합체로 비인간 동물을 면역화하는 단계, 및 면역화된 비인간 동물의 면역 반응을 임의로 추가 투여하는 단계를 포함하되, 임의로, 면역화하는 단계 및/또는 추가 투여하는 단계는 보조 T 세포 에피토프에 연결된 관심 pMHC 복합체를 비인간 동물에게 투여하는 단계를 포함하고, 임의로 보조 T 세포 에피토프는 서열번호 28로 제시된 PADRE를 포함하는, 방법.
  20. 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및/또는 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 핵산을 수득하는 방법으로서, 상기 방법은:
    제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 비인간 동물로부터, 비인간 동물의 림프구 또는 림프구로부터 생성된 하이브리도마에 의해 발현된 인간 면역글로불린 가변 도메인을 암호화하는 재배열된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 핵산을 단리하는 단계를 포함하되,
    림프구 또는 이로부터 생성된 하이브리도마에 의해 발현된 인간 면역글로불린 가변 도메인은 그의 동족 가변 도메인과 결합하여 항원 pMHC 복합체에 특이적인 항원 결합 도메인을 형성하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 관심 항원 pMHC 복합체로 비인간 동물을 면역화하는 단계 및, 비인간 동물이 항원에 대한 면역 반응을 일으키게 한 후에 핵산을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 수득된 재배열된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열은 적어도 하나의 체세포 과돌연변이를 포함하는, 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 재배열된 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 핵산.
  24. 제23항에 있어서, 핵산은 재배열된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 인간 불변 영역 유전자 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
  25. 제22항 또는 제24항에 있어서, 인간 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 5.5 내지 6.0의 pH 범위에서 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 IgG 중쇄 불변 영역 아미노산 서열의 CH2-CH3 영역의 친화도를 증가시키는 변형을 포함하며, 상기 변형은 M428L, N434S, V259I, V308F, N434A, M252Y, S254T, T256E, T250Q, H433K, N434Y 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, IgG 중쇄 불변 영역 아미노산 서열에서의 돌연변이인, 핵산.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  27. 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 및/또는 인간 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 발현하는 세포를 수득하는 방법으로서, 상기 방법은:
    제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 비인간 동물로부터 림프구를 단리하는 단계를 포함하되, 상기 림프구는 항원 pMHC 복합체에 특이적인 항원 결합 도메인을 형성하는 인간 면역글로불린 가변 도메인을 발현하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 단리된 림프구로부터 하이브리도마를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  29. 단리된 세포, 예를 들어, 생식 세포, 배아 줄기 세포, 체세포 (예컨대, B 세포)로서,
    (a) 인간 또는 인간화 MHC 분자 또는 이의 적어도 펩티드 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및
    (b) 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함하되, 비인간 동물은 인간 또는 인간화 항원 결합 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화 항원 결합 단백질을 제공할 수 있고, 임의로, 인간 또는 인간화 항원 결합 도메인은 인간 또는 인간화 가변 도메인을 포함하고,
    임의로, 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 중쇄 유전자좌 및/또는 재배열된(재배열되지 않은) 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 유전자좌 중 적어도 하나는 재배열되지 않으며,
    임의로, 단리된 세포는 제27항 또는 제28항의 방법에 따라 수득된 것인, 단리된 세포.
  30. 인간 면역글로불린 가변 도메인을 만드는 시험관 내 방법으로서, 상기 방법은:
    세포에서, 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 비인간 동물의 림프구 또는 림프구로부터 생성된 하이브리도마에 의해 발현된 인간 면역글로불린 가변 도메인을 암호화하는 재배열된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열을 포함하는 제1 핵산을 발현시키는 단계를 포함하되,
    림프구 또는 이로부터 생성된 하이브리도마에 의해 발현된 인간 면역글로불린 가변 도메인은 그의 동족 가변 도메인과 결합하여 항원 pMHC 복합체에 특이적인 항원 결합 도메인을 형성하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 제1 핵산은 재배열된 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 연결된 인간 면역글로불린 불변 영역 유전자 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 인간 면역글로불린 불변 영역 유전자 서열은 중쇄 불변 영역 유전자 서열이고, 5.5 내지 6.0의 pH 범위에서 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 IgG 중쇄 불변 영역 아미노산 서열의 CH2-CH3 영역의 친화도를 증가시키는 변형을 포함하며, 상기 변형은 M428L, N434S, V259I, V308F, N434A, M252Y, S254T, T256E, T250Q, H433K, N434Y 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, IgG 중쇄 불변 영역 아미노산 서열에서의 돌연변이인, 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법에 따라 만들어진 인간 면역글로불린 중쇄 가변 도메인.
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