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KR20200131844A - 이중특이적 항체 car 세포 면역요법 - Google Patents

이중특이적 항체 car 세포 면역요법 Download PDF

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Publication number
KR20200131844A
KR20200131844A KR1020207028761A KR20207028761A KR20200131844A KR 20200131844 A KR20200131844 A KR 20200131844A KR 1020207028761 A KR1020207028761 A KR 1020207028761A KR 20207028761 A KR20207028761 A KR 20207028761A KR 20200131844 A KR20200131844 A KR 20200131844A
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KR
South Korea
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cells
cell
car
bsab
antibody
Prior art date
Application number
KR1020207028761A
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English (en)
Inventor
지안화 유
마이클 칼리귀리
Original Assignee
사이토이뮨 테라퓨틱스 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 사이토이뮨 테라퓨틱스 인코퍼레이티드 filed Critical 사이토이뮨 테라퓨틱스 인코퍼레이티드
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Abstract

본원에는 세포용해성 면역 세포에서 발현될 때, (1) CAR 표적화 종양-관련 항원의 발현 및 (2) 한 단부에서 선천성 및 항원 특이적 세포용해성 면역 세포 둘 다에서 발현된 NKG2D를 인식하고 다른 단부에서 종양 관련 항원을 표적으로 하는 이중특이적 항체의 분비 둘 다를 초래하는 단일 벡터가 기술된다. 예상하지 못하게, T 세포에 대한 이들 변형은 생체내에서 향상된 생존 및 증식을 초래한다. 그러므로, 치료적 및 진단적 용도가 개시된다.

Description

이중특이적 항체 CAR 세포 면역요법
관련된 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 3월 16일에 출원된 미국 가출원 번호 62/644,343호에 대한 35 U.S.C. § 119(d) 하의 우선권을 주장하며, 상기 출원의 내용은 본 개시에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 인간 면역학, 구체적으로 암 면역요법 분야에 관한 것이다.
본 발명의 배경에 대한 다음 논의는 단지 본 발명에 대한 기술을 돕기 위해 제공된다.
현재의 암 치료 양생법은 화학요법, 면역조절 약물14, 단클론성 항체15, 및 자가 또는 동종 이식을 포함한다. 이들 치료법은 자주 차도로 이어지지만, 거의 모든 환자가 결국 재발하고 질환의 재발로 인해 사망하게 된다.
그러므로, 재발된 및/또는 난치성 질환에 대한 새로운 조합 면역요법을 포함한, 새로운 치료법에 대한 충족되지 못한 요구가 있다. 본 개시는 이런 한계를 해결하고 관련된 장점을 또한 제공한다.
키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포는 혈액 악성종양 및 고체 종양 둘 다의 치료를 위해 임상에서 성공적으로 사용되어 왔고, 최근에 미국 FDA에 의해 승인을 받았다1-4. 이중특이적 항체 (BsAb)도 또한 암 치료를 위해 FDA에 의해 승인받았고 에 대한 대체 면역치료 접근법으로서 사용되고 있다5. 그러나, CAR- 및 BsAb-기반 암 면역요법은 5가지 중요한 이유로 인해 여전히 개선이 필요하다. 첫째, 일부 경우에, CAR T 세포는 생체내에서 팽창될 수 없고 환자에서 종양 용해를 시작하기에 충분한 시간 동안 생존할 수 없다6. CAR T 세포의 효능은 생체내에서 CAR T 세포 존재의 양 및 기간과 상관이 있다고 보고되었다6-8. 둘째, 종양 세포는 특히 단일 항원만이 표적화될 때, 표적화된 항원을 배출하여 치료를 피할 수 있다. 셋째, 제조하는 데 비용이 들고 시간 소모적인 것 외에, BsAb는 짧은 반감기를 가지며 지금까지 치료적인 것으로 나타나지 않았다9,10. 넷째, 2개의 구별되는 종양 관련 항원을 표적화하는 CAR T 세포의 BsAb와의 병용 요법은 양호한 접근법이 될 수 있을 것이다; 그러나, 각각을 개별적으로 생체외에서 생성하는 것은 노동 집약적이고 비용이 들며; CAR 및 모든 세포용해 이펙터 세포와 연관되는 BsAb 둘 다를 단일 구성물 안에서 발현시키기 위해, 또는 생체내에서 T 세포 생존율을 향상시키기 위해 T 세포를 조작하는 것은 아직 보고된 것이 없거나 부가적이거나 상조적인 것으로 밝혀지지 않았다. 마지막으로, CAR 면역요법에 대한 현재의 접근법은 면역 체계의 선천성 및 적응성 팔의 모든 다른 세포용해 이펙터 세포를 배제하고, 주로 하나의 면역 세포 유형, 즉, T 세포에 집중된다. NKG2D는 면역 체계의 선천성 및 적응성 팔 둘 다에서 실제로 모든 세포용해 이펙터 세포 상에서 발현되는 c-렉틴 유형의 수용체이다.
본 개시는 이들 두 가지 모드의 치료법을 전달하는 단일 벡터로 감염된 T 세포를 조작함으로써, 즉, 그것의 CAR이 하나의 특이적 종양-관련 항원을 표적화하는 T 세포를 생성함으로써, 부분적으로 또는 전체적으로 이들 문제를 해결하는 플랫폼을 제공한다.
그러므로, 한 측면으로, 본원에는 (a) 암 또는 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인; (b) 힌지 도메인; (c) 경막 도메인; 및 (d) 세포내 도메인을 포함하는, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지는, 또는 추가로 이것들로 이루어지는 키메라 항원 수용체 (CAR)가 제공된다. 개시의 추가의 측면은 (a) 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인; (b) CD8 α 힌지 도메인; (c) CD8 α경막 도메인; (d) CD28 동시자극성 신호전달 영역 및/또는 4-1BB 동시자극성 신호전달 영역; 및 (e) CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지는, 또는 추가로 이것들로 이루어지는 키메라 항원 수용체 (CAR)에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인은 링커 펩타이드에 의해 선택적으로 결합된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 일부 구체예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 B-세포 성숙 항원 (BCMA) 및/또는 SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 및/또는 이것들의 각각의 동등물 중 임의의 하나에 대한 항체의 관련된 CDR 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 한 측면으로, 종양 표적화 항체는 BCMA를 표적으로 한다. 일부 구체예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 B-세포 성숙 항원 (BCMA) 및/또는 SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 및/또는 이것들의 각각의 동등물 중 임의의 하나에 대한 항체의 아미노산을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다.
특정 구체예에서, CAR은 추가로 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이에 위치한 링커 폴리펩타이드를 포함하거나, 또는 대안으로 추가로 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 이것으로 이루어진다. 특정 구체예에서, 링커는 글리신-세린 링커이다. 추가의 구체예에서, 링커 폴리펩타이드는 서열 (글리신-세린)n (여기서 n은 1 내지 6의 정수임)을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 추가로 이것으로 이루어진다.
특정 구체예에서, CAR은 CAR에 부착된 검출 가능한 마커 및/또는 정제 마커를 추가로 포함하거나, 또는 대안으로 추가로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 이것들로 이루어진다.
개시의 추가적인 측면은 상기에서 기술된 것과 같은, CAR을 암호화하는 분리된 핵산 서열, 또는 그것의 보체, 또는 이것들의 각각의 동등물에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 분리된 핵산 서열은 암 또는 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 상류에 위치한 Kozak 공통 서열을 추가로 포함하거나, 또는 추가로 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 이것으로 이루어진다.
특정 측면으로, 분리된 핵산은 분리된 핵산에 작동 가능하게 결합된 항생물질 내성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 프로모터 및/또는 인핸서 요소를 추가로 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다.
또한 NKG2D를 인식하고 결합하는 이중특이적 항체를 암호화하는 분리된 핵산이 제공된다. 일부 구체예에서, 핵산은 NKG2D 리간드 및, 선택적으로, 선택적으로 코돈 최적화된 SALMF7 (CD319의 CS1으로도 알려져 있음) 리간드를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어지는 이중특이적 항체를 암호화한다. 특정 구체예에서, 분리된 핵산은 NKG2D 및, 선택적으로, 선택적으로 코돈-최적화된 SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 또는 이것들의 각각의 동등물에 대한 항체의 관련된 CDR 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어지는 이중특이적 항체를 암호화한다. 일부 구체예에서, 핵산은 선택적으로 코돈 최적화된, NKG2D 및, 선택적으로, SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 및/또는 이것들의 각각의 동등물에 대한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어지는 이중특이적 항체를 암호화한다. 일부 구체예에서, 핵산은 선택적으로 코돈 최적화된, NKG2D에 대한 항체로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFV) 및, 선택적으로, SALMF7 (CD319의 CS1으로도 알려져 있음)로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFV) 및/또는 이것들의 각각의 동등물을 포함하는 이중특이적 항체를 암호화한다. 특정 구체예에서, 분리된 핵산은 항생물질 내성 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 이것으로 이루어진다.
추가의 측면으로, 본원에는, 한 구성물에서, 상기에서 개시된 CAR 및 이중특이적 항체를 암호화하는 분리된 핵산이 제공된다 ("BsAb-CAR 구성물"). 한 측면으로, 분리된 핵산은 BCMA 및 이중특이적 항체, 예컨대, 인간 근육 알도스로부터 유래되는 것과 같이 비면역원성 단백질 링커를 암호화하는 핵산에 의해 함께 연결된, 항-CS1 항체로부터의 하나의 scFv 및 항-NKG2D 항체로부터의 하나의 scFv를 표적으로 하는 항원 결합 단편을 암호화한다. 예시의 BsAb-CAR 벡터는 도 3A에 제시된다. 벡터는 선택적으로 프로모터, 인핸서, 및 바이러스 LTR과 같은 조절 서열을 포함한다.
개시의 여러 측면은 상기 기술된 분리된 핵산을 하나 이상 포함하는 벡터에 관련된다. 특정 구체예에서, 벡터는 플라스미드 또는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-관련 바이러스 벡터의 군으로부터 선택된 바이러스 벡터이다. 분리된 핵산 및 그것을 함유하는 벡터는 본원에서 기술된 CAR을 제조하기 위해 유용하다.
개시의 추가의 측면은 상기 기술된 조성물: CAR, CAR 또는 그것의 보체를 암호화하는 분리된 핵산, CAR/BsA 구성물을 암호화하는 분리된 핵산, 또는 분리된 핵산을 함유하는 벡터 중 하나 이상을 포함하는, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지는, 또는 추가로 이것들로 이루어지는 분리된 세포에 관한 것이다. 일부 구체예에서, CAR은 분리된 세포의 표면에서 발현된다.
특정 구체예에서, 분리된 세포는 NKG2D를 선택적으로 인식하고 결합하는 이중특이적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어지는 분리된 핵산을 추가로 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 항-NKG2 항체의 NKG2D 리간드 또는 항-NKG2 항원 결합 단편, 및, 선택적으로, SALMF7 (CD319의 CS1으로도 알려져 있음) 리간드를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 특정 구체예에서, 이중특이적 항체는 선택적으로 코돈-최적화된, NKG2D 및, 선택적으로, SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 또는 이것들의 각각의 동등물에 대한 항체의 관련된 경쇄 및 중쇄 영역 또는 CDR 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 선택적으로 코돈-최적화된, NKG2D 및, 선택적으로, SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 또는 이것들의 각각의 동등물에 대한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 NKG2D에 대한 항체로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 및, 선택적으로, SALMF7 (CD319의 CS1으로도 알려져 있음)로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 및/또는 이것들의 각각의 동등물을 포함한다. 특정 구체예에서, 분리된 핵산은 항생물질 내성 유전자를 암호하하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 이것으로 이루어진다.
분리된 세포의 비제한적인 예는 박테리아 세포, 예컨대 대장균과 같은 원핵 세포, 또는 진핵 세포이다. 일부 구체예에서 분리된 진핵 세포는 동물 세포, 포유류 세포, 소 세포, 고양이 세포, 개 세포, 쥐과 세포, 말 세포 또는 인간 세포로부터 선택된다. 추가의 구체예에서, 분리된 세포는 T-세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 골수성 세포, 단핵세포, 대식세포, 이것들의 임의의 하위세포, 도는 본원에서 개시된 임의의 종으로부터의 임의의 다른 면역 세포이다.
개시의 측면은 상기 기술된 조성물, 예컨대, CAR, 분리된 핵산, 세포, 또는 벡터 및 담체 중 하나 이상을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다.
특정 구체예에서, 조성물은 NKG2D를 선택적으로 인식하고 결합하는 이중특이적 항체, 및/또는 NKG2D를 선택적으로 인식하고 결합하는 이중특이적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산을 추가로 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 이것들로 이루어진다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 NKG2D 리간드 및, 선택적으로, SALMF7 (CD319의 CS1으로도 알려져 있음) 리간드를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 특정 구체예에서, 이중특이적 항체는 NKG2D 및, 선택적으로, SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음)에 대한 항체의 관련된 CDR 영역, 또는 이것들의 각각의 동등물을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 NKG2D 및, 선택적으로, SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 및/또는 이것들의 각각의 동등물에 대한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 NKG2D에 대한 항체로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 및, 선택적으로, SALMF7 (CD319의 CS1으로도 알려져 있음)로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 및/또는 이것들의 각각의 동등물을 포함한다.
개시의 여러 측면은 CAR 또는 암 또는 종양 항원 또는 그것들의 단편에 결합된 CAR을 포함하는 세포, 및/또는 암 또는 종양 항원을 발현하는 세포를 포함하는 분리된 복합체에 관한 것이다. 한 측면으로, 항원 결합 도메인은 세포 표면에서 발현된다. 다른 측면으로, 암 또는 종양 항원은 B-세포 성숙 항원 (BCMA), SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 및/또는 이것들의 각각의 동등물이다. 한 측면으로 CAR을 함유하는 또는 발현하는 세포는 T-세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 골수성 세포, 단핵세포, 대식세포, 이것들의 임의의 하위세트, 또는 임의의 다른 면역 세포이다. 종양 또는 세포는 임의의 동물, 예컨대, 인간 세포와 같은 포유류 세포일 수 있다.
개시의 일부 측면은 CAR 발현 세포 또는 BsA를 분비하는 CAR 발현 세포의 제조 방법에 관한 것이고, 방법은 분리된 세포를 본원에서 기술되는 CAR 및 Bsa를 암호화하는 핵산 서열 또는 BsAb-CAR을 암호화하는 분리된 핵산으로 형질도입시키는 단계를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이 단계로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 이 단계로 이루어진다.
추가의 측면으로, 방법은 CAR 또는 BsAb-CAR을 발현하는 세포를 선택하고 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 측면으로, 세포는 포유류 세포, 예컨대, T-세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 골수성 세포, 단핵세포, 대식세포, 이것들의 임의의 하위세트, 또는 임의의 다른 면역 세포와 같은 인간 세포와 같은 진핵 세포이다. 세포는 본원에 기술된 바이러스 벡터를 사용하여 또는 대안으로 "Nonviral RNA transfection to transiently modify T cell with chimeric antigen receptors for adoptive therapy"라는 제목 하에 Riet et al. (2013) Meth. Mol. Biol. 969:187-201에서 기재된 기술을 사용하여 형질도입될 수 있다.
특정 구체예에서, 방법은 선택적으로 NKG2D를 인식하고 결합하는 이중특이적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어지는 분리된 핵산으로 세포를 형질도입하는 단계를 추가로 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이 단계로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 이 단계로 이루어진다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는, 각각 선택적으로 코돈 최적화된 리간드인 NKG2D 리간드 및, 선택적으로, SALMF7 (CD319의 CS1으로도 알려져 있음)을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 특정 구체예에서, 이중특이적 항체는 선택적으로 코돈 최적화된, NKG2D 및, 선택적으로, SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 또는 이것들의 각각의 동등물에 대한 항체의 관련된 CDR 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 선택적으로 코돈 최적화된, NKG2D 및, 선택적으로, SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음) 및/또는 이것들의 각각의 동등물에 대한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 선택적으로 코돈 최적화된, NKG2D에 대한 항체로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 및, 선택적으로, SALMF7 (CD319의 CS1으로도 알려져 있음)로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 및/또는 이것들의 각각의 동등물을 포함한다. 세포는 본원에 기술된 바이러스 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터를 사용하여 또는 대안으로 "Nonviral RNA transfection to transiently modify T cell with chimeric antigen receptors for adoptive therapy"라는 제목 하에 Riet et al. (2013) Meth. Mol. Biol. 969:187-201에서 기재된 기술을 사용하여 형질도입될 수 있다.
특정 구체예에서, CAR 또는 BsAb-CAR 발현 세포의 제조 방법은 CAR 발현 세포의 집단을 활성화하고 팽창시키는 단계를 추가로 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이 단계로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 이 단계로 이루어진다. 본 개시의 특정 측면은 CAR 또는 BsAb-CAR을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어지는 세포의 분리된, 활성화된 집단에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 세포는 T-세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 골수성 세포, 단핵세포, 대식세포, 이것들의 임의의 하위세트, 또는 임의의 다른 면역 세포 중 하나 이상이다.
개시의 여러 측면은 상기에서 개시된 분리된 세포 또는 조성물의 유효량과 종양을 접촉시킴으로써, 암 또는 종양 항원을 발현하는 종양의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 접촉은 시험관내에서 또는 생체내에서 이루어질 수 있다. 접촉이 시험관내에서 이루어질 때, 방법은 환자의 종양에 대한 맞춤 치료법을 테스트하기 위해 또는 병용 요법에 대해 검정하기 위해 사용될 수 있다. 접촉이 생체내에서 이루어질 때, 방법은 그것을 필요로 하는 대상체, 예컨대 암에 걸린 인간 환자 및 유효량의 세포를 받는 환자에서 종양 또는 암세포의 성장을 억제하는 데 유용하다. 특정 구체예에서, 종양은 고체 종양이다. 유효량은 단독으로 또는 본원에서 기술되는 다른 치료법과 함께 투여된다. 특정 구체예에서, 표적화된 암/종양은 혈액 및/또는 골수에 영향을 주는 고체 종양 또는 암, 예컨대, 다발성 골수종 (MM)이다. 특정 구체예에서 분리된 세포는 치료되는 대상체에 대해 자가이다. 다른 측면으로, 세포는 치료되는 대상체와 동종이계성이다. 또 다른 측면으로, 방법은 대상체에게 유효량의 세포감소 치료법을 투여하는 단계를 추가로 포함하거나, 또는 본질적으로 이 단계로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 이 단계로 이루어진다. 추가의 측면으로, 방법은 대상체에게 투여된 세포를 분리하는 단계, 세포를 본원에 기술된 CAR 또는 BsAb-CAR을 암호화하는 분리된 핵산의 유효량으로 형질도입시키는 단계, CAR 또는 BsAb-CAR 암호화 세포 집단을 얻기 위해 세포를 배양하는 단계, 이 세포는 선택적으로 팽창되고 활성화된 후 환자에게 투여되는 단계를 추가로 포함한다.
또한 본원에는 상기 주지된 조성물 중 하나 이상 및 본원에 개시된 것과 같은 방법에 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 개시된다.
상기 조성물 및 방법은 이것들이 제2 종양 관련-항원을 표적화하는 NKG2D-기반 BsAb를 동시에 분비하는 CAR 세포를 제공한다는 점에서 특유하고 현재 기술 상태의 한계를 극복한다. 개시된 CAR NKGD2D-기반 BsAb는 단지 예시이다. 이 접근법은 기술분야에 알려져 있는 임의의 많은 종양 항원, 예컨대, EGFRVIII; CD70, 메소텔린, CD123, CD19, CEA, CD133, Her2 (Townsend et al. (2018) J. Exp. & Clinical Cancer Res. 37:163 참조)에 대해 변형될 수 있다.
예시의 구성물이 다발성 골수종 모델 (MM)에서 테스트되었다. MM은 클론 형질 세포의 축적을 특징으로 하는 악성종양이다13. 상기에서 주지된 것과 같이, 화학요법, 면역조절 약물14, 단클론성 항체15, 및 자가 또는 동종 이식을 포함한, 현재의 치료 양생법은 자주 차도로 이어지지만, 거의 모든 환자가 결국 재발하고 질환의 재발로 인해 사망하게 된다. 그러므로, 재발된 및/또는 난치성 MM에 대한 새로운 조합 면역요법을 포함한, 새로운 치료법에 대한 충족되지 못한 요구가 있다.
선청성 면역 체계의 구성요소로서, 천연 살해 (NK) 세포는 종양 성장을 방지하는 데 중요한 역할을 하지만16, NK 세포 항-종양 활성은 많은 MM 환자에서 약화되는 것으로 나타났다17. 활성화된 또는 동종이계 NK 세포의 입양 전달(Adoptive transfer)은 MM18,19, 및 고체 종양을 포함한, 많은 혈액 악성종양의 치료에서 효과적인 항-종양 반응을 유발한다. 그러나, 많은 경우에, NK 세포-매개된 항종양 반응은 약한데, 이것은 억제 수용체의 NK 세포 발현, 생존하기에는 빈약한 용량, 또는 이펙터 세포의 종양 부위로의 제한된 이동으로부터 유발될 수 있다20-22. 한편, 적응성 면역의 일부로서, T 세포는 다양한 조직으로 효율적으로 이동할 수 있고, 항원 자극에 반응하여 잘 증식하는 경향이 있다. 그러나, T 세포는 항원-특이적 T-세포 수용체 (TCR)에 의해 지시된 엄격한 특이성을 가진다. 그러므로, T 세포 및 NK 세포 둘 다를 참여시키고, 그로써 자체 한계를 극복하는 방법은 암 면역요법에 대단한 장점이 될 것이다. 본 개시는 이런 장점을 제공한다.
도 1A-1D는 BCMA CAR 및 항-NKG2D-항-CS1 이중-특이적 융합 단백질을 개별적으로 또는 조합하여 발현시키기 위해 T 세포를 조작한 결과를 도시한다. (A) CD28 및 CD3제타(ζ) 엔도도메인(endodomain)에 연결된 BCMA에 대한 scFv를 함유한 BCMA CAR 렌티바이러스 구성물의 개략도. 도입유전자의 발현은 EF1알파(α) 프로모터에 의해 구동된 GFP 발현에 의해 추적되었다. LTR, 긴 말단 반복부; SP, 신호 펩타이드; VH, 가변 H 사슬; L, 링커; VL, 가변 L 사슬. MyC, MyC 태그; 힌지, 힌지 사슬; CD28, T 세포 공동 자극 분자; CD3ζ, CD3 제타 사슬. (B) 항-NKG2D-항-CS1 이중특이적 항체 (BsAb)의 포유류에서의 발현을 위한 렌티바이러스 구성물의 개략도. 항-NKG2D-항-CS1 BsAb는 링커 (L)에 의해 함께 연결된 VH 및 VL로 구성된 항-NKG2D scFv, 및 항-CS1 scFv로 이루어졌다. BsAb의 발현은 렌티바이러스 LTR이 옆에 있는 CMV 프로모터에 의해 구동된다. (C) 건강한 도너로부터의 PBMC (말초혈 단핵 세포)가 CD3 및 CD28 비드로 활성화되었고 pCDH 빈 벡터 (EV), BCMA CAR, 항-NKG2D-항-CS1 BsAb로 형질도입되었다. 활성화된 T 세포는 또한 순차적으로 BsAb 및 BCMA-CAR로 형질도입되었고 이들 형질도입된 세포는 "BsAb-BCMA seq. trans. T"로 명명되었다. GFP-양성 세포가 분류되었고, 세포는 비오틴 표지된 염소 항-마우스 Fab 특이적 또는 아이소타입-매치된 대조군 항체로 염색된 후, 스트렙트아비딘 및 CD3 항체 염색으로 염색되었다. (D) 미변형 T 세포, BsAb T 세포 또는 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포의 상층액이 수집되었고, 개별 세포 용해물에 대해 항-6x His-태그 항체를 사용하여 면역블롯 분석이 실시되었다.
도 2A-2E는 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포가 BCMA-CAR T 세포 또는 BsAb T 세포보다 반응하는 고용량의 세포독성 및 IFN-감마(g) 생성을 가지는 것을 도시한다. (A) MM 세포주의 표면에서 BCMA 및 CS1 발현의 유동 세포분석에 의한 분석. 3개의 MM 세포주 (MM1.S, H929, 및 RPMI-8226) 및 1개의 만성 골수성 백혈병 세포주 (K562)가 항-CS1 mAb 항체 (상부 패널) 또는 항-BCMA mAb (하부 패널)로 염색되었고, 3개의 MM 세포주, MM.1S (녹색), H929 (적색), 및 RPMI-8226 (회색), 뿐만 아니라 K562 세포주 (청색) 또는 아이소타입-매치된 대조군 항체 (검은색 실선 및 개방 구역)를 구별하기 위해 상이한 색이 사용되었다. (B) 51Cr-표지된 MM1.S, H929, RPMI-8226 MM 세포주 및 K562 세포주 (각 세포주에 대해 5 x 103)가 미변형 T 세포 (T, 검은색 실선), 빈 벡터-형질도입된 T 세포 (EV T, 검은색 점선), 항-NKG2D-항-CS1 BsAb를 발현하는 T 세포 (BsAb T, 적색 실선), BCMA CAR (BCMA CAR T, 녹색 실선), 및 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포 (청색 실선)와 함께 표시된 E:T 비율로 4시간 동안 공동 배양되었고, 표적 용해 (51Cr 방출)가 측정되었다. BsAb-BCMA seq. trans. T 대비 BCMA CAR T, * p<0.05, ** p<0.01; seq. trans. T 대비 BsAb T, # p<0.05, ## p<0.01. K562 세포는 BCMA-CS1- 음성 대조군이다. (C) 미변형 T 세포 (흰색 사각형), EV T 세포 (횐색 음영 사각형), BsAb T 세포 (적색 사각형), BCMA CAR T 세포 (녹색 사각형) 또는 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포 (청색 사각형) 2 x 105개가 단독으로 (표적 없음) 배양되거나 또는 동일한 수의 MM.1S, H929, 또는 상이한 수준의 CS1 및 BCMA를 발현하는 RPMI-8226 MM 세포 또는 BCMA-CS1- K562 세포로 24시간 동안 자극되었고, ELISA에 의해 IFN-γ 분비를 측정하기 위해 상층액이 수집되었다. * p<0.05, ** p<0.01, n.s. 유의미한 차이 없음. (D 및 E) 세포는 (C)에서 기술된 것과 같이 처리되었고, 세포-유리 상층액에서의 IL-2 또는 TNF-알파(α) 분비가 각각 ELISA에 의해 측정되었다. ** p<0.01, n.s. 유의미한 차이 없음.
도 3A-3H는 동일한 구성물에 BCMA CAR 및 항-G2D-항-CS1 이중특이적 항체 (BsAb)를 둘 다 함유하는 BsAb-CAR 벡터의 생성 및 이 구성물을 사용하여 형질도입된 T 세포의 기능성 조사를 도시한다. (A) BCMA CAR 및 항-NKG2D-항-CS1 BsAb를 둘 다 발현하는 생성된 렌티바이러스 벡터 (이하 BsAb-CAR로 언급됨)의 개략도. T2A, 자가 절단 2A 유전자. (B) 빈 벡터 (EV)-형질도입된 T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포의 상층액 및 세포 용해물에 대해 항-6x His-태그 항체를 사용하여 면역블롯 분석이 실시되었다. (C) 51Cr-표지된 MM1.S 세포 (5 x 103)가 미변형 T 세포 (T, 검은색 실선), 빈 벡터-형질도입된 T 세포 (EV T, 검은색 점선) 또는 BsAb-CAR T 세포 (자주색 선)와 표시된 E:T 비율에서 4시간 동안 공동 배양되었고, 표적 용해 (51Cr 방출)가 측정되었다. (D) 건강한 도너로부터 분리된 미변형- (검은색 실선), EV- (검은색 점선), BsAb- (적색 선), BCMA CAR- (녹색 실선) 또는 BsAb-CAR (자주색 실선)-형질도입된 CD8 (+) T 세포가 51Cr-표지된 MM1.S MM 세포 (5 x 103)와 표시된 E:T 비율에서 4시간 동안 공동 배양되었고, 표적 용해 (51Cr 방출)가 측정되었다. (E) 10:1의 E:T 비율에서 MM.1S MM 세포로의 4-시간 51Cr 방출 검정. 상이한 양의 정상 (미감염) 인간 PBMC의 존재 하에 이 항-종양 효과를 평가하기 위하여, PBMC가 MM.1S MM 표적 세포의 1배, 10배, 100배, 및 200배의 양으로 첨가되었다. (F) 5:1의 E:T 비율에서 MM.1S MM 표적 세포에 대한 미변형 T 세포 (검은색 사각형), EV T 세포 (패턴 사각형), BsAb T 세포 (적색 사각형), BCMA-CAR T 세포 (녹색 사각형), 또는 BsAb-CAR T 세포 (자주색 사각형)의 51Cr 방출 검정. 이 도면에서 주지되는 것과 같이, 이펙터 세포 및 MM.1S MM 표적 세포에 대한 인큐베이션 시간은 PBMC, NK 및 NKT 세포 (좌측 패널)의 경우 4시간이고, CD3+T 세포, CD8+T 세포, Vγ9Vd2 T 세포 또는 CD4+T 세포의 경우 16시간이다. * p<0.05, ** p<0.01, n.s. 유의미한 차이 없음. (G) 1시간 후의 EV T 세포 (GFP, 녹색) 및 MM.1S MM 세포 (적색)의 공동 배양의 제어, 시냅스의 공초점 현미경 분석이 측정되었다 (규모 10 μL, 상부 패널; 규모 20 μL, 하부 패널); 시냅스는 하부 패널에서 나타낸 고전력에서도 주지되지 않는다. (H) BsAb-CAR T 세포 (E: GFP, 녹색) 및 MM.1S MM 세포 (T: 적색)의 1시간 공동 배양; E/T 시냅스가 관찰되었고 모든 프레임에서 화살표로 표시되었다 (S1은 좌측에서 우측으로 이동하면서 각 프레임에서의 동일한 컨쥬게이션된 E/T 쌍을 나타내고, S2 및 S3도 마찬가지이다). 상부, 좌측의 프레임은 명시야 (Bf, 규모 10 μL)를 나타내고; 상부, 중간 프레임은 BsAb-CAR T 세포 (GFP, 녹색) 및 MM.1S MM 세포 (적색) 공동 배양 (규모 10 μL)의 면역형광 이미지를 나타낸다. 상부, 우측의 프레임은 BsAb를 확인하는 추가적인 항-6x-His-태그를 사용한 병합된 이미지 (청색, 규모 10 μL)이다. 하부의 3개의 열은 3개의 개별적인 E/T 컨쥬게이트 (S1, S2, 및 S3)가 확대된 시야 (규모 20 μL)에서 가시화된 것을 보여준다.
도 4A-4D는 K562 세포에서 BCMA 및 CS1의 과다발현이 BsAb-CAR T 세포에 의한 인식 후에 증강된 세포독성 및 사이토카인 분비를 촉발시키는 것을 도시한다. (A) 세포가 CS1 (좌측 패널) 또는 BCMA (우측 패널) 또는 IgG 아이소타입 대조군 (각 패널에서 검은색 점선) 항체로 염색된 후 CS1 및 BCMA를 과다발현하는 K562 세포 (K562-CS1-BCMA, 회색 음영) 또는 빈 벡터 대조군 (K562-PCDH, 검은색 실선)의 유동 세포분석에 의한 분석. (B) 4시간 51Cr 방출 검정에 의해 측정된, K562-CS1-BCMA 및 K562-PCDH 세포에 대한 빈 벡터 (EV)- 또는 BsAb-CAR-형질도입된 T 세포의 세포독성. K562-CS1-BCMA 또는 K562-PCDH 세포가 EV T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포와 표시된 E:T 비율에서 인큐베이션되었다. ** p<0.01 (K562-CS1-BCMA + BsAb T 세포 대비 K562-PCDH + BsAb T 세포). (C) EV T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포 (1 x 105)가 단독으로 배양되거나 동일한 수의 K562-CS1-BCMA 또는 K562-PCDH 세포로 자극되었다. 배양물로부터의 상층액은 ELISA에 의한 IFN-γ 분비를 측정하는 데 사용되었다. ** p<0.01. (D) 세포는 (C)에서와 같이 처리되었고 세푸-유리 상층액에서의 IL-2 분비가 ELISA에 의해 측정되었다. ** p<0.01.
도 5A-5E는 분비된 항-NKG2D-항-CS1 BsAb가 NKG2D 신호전달을 통해 CAR T 세포 증식을 향상시키는 것을 도시한다. (A) 미변형 T 세포 (1), 2-EV T 세포 (2), BsAb T 세포 (3), BCMA CAR T 세포 (4), BsAb-CAR T 세포 (5) 또는 나이브 T 세포 (6) (비증식성 대조군)의 배양 후의 배지 색이 상부 패널에 나타났다. 막대 그래프는 각 그룹당 6개의 개별 샘플을 포함한 총 세포 수의 통계학적 분석을 제공한다. ** p<0.01 (그룹 5 대비 그룹 1, 2, 4 및 그룹 3 대비 그룹 1, 2, 4). T 세포 증식 또는 그것의 결핍을 증명하기 위하여, 보라색 세포 추적자가 사용되었고 하부 패널에서 막대그래프에 의해 표시되는 V450 희석으로서 도시된다. (B) 각각 1+, 2+, 4+ 또는 1, 2, 4로 표시된, (A)로부터의 BsAb-CAR T 세포의 세포-유리 상층액의 존재 또는 부재 하에 미변형 T 세포, EV T 세포, 및 BCMA CAR T 세포의 5일 된 배양 배지. 세포는 계수되었고, 데이터는 막대 그래프로서 제시되었다 (상부). ** p<0.01 (4+ 대비 4, 2+ 대비 2, 1+ 대비 1). 보라색 세포 추적자는 하부 패널에서 막대그래프에 의해 표시된 V450 희석으로서 나타낸다 (바닥). (C) 2일 된 배양 배지가 도시된다. 1A-미변형 T 세포, 2A-EV T 세포, 3A-BsAb T 세포, 4A-BCMA CAR T 세포, 및 5A-BsAb-CAR T 세포. 0일에, NKG2D 차단 항체 (20 μg/mL)가 1B, 2B, 3B, 4B 및 5B의 배양에 첨가된 한편, 비반응성 아이소타입 대조군 항체 (20 μg/mL)가 1A, 2A, 3A, 4A 및 5A에 첨가되었다). 이들 웰 아래에는 세포 증식을 측정하기 위한 CD3, NKG2D, F(ab)2 (CAR의 발현을 나타내는 "Fab"에 의해 표시됨), 및 Ki67에 대한 유동 세포분석 염색이 도시된다. (D) AKT 단백질, 및 1A---미변형 T, 2A---EV T, 3A---BsAb T, 4A---BCMA-CAR T, 및 5A---BsAb-CAR T와 뿐만 아니라 1B-미변형 T 세포 + NKG2D 차단, 2A---EV T+ NKG2D 차단, 3A---BsAb-T+NKG2D 차단, 4A---BCMA-CAR T+NKG2D 차단, 및 5A---BsAb-CAR T+NKG2D 차단의 총 AKT 단백질의 인산화 (p)를 측정하기 위해 면역블롯 분석이 수행되었다. (E) (C)에서 나타낸 동일한 세포 (1A, 2A, 3A, 4A 및 5A)가 또한 MM.1S MM 세포와 함께 48시간 동안 공동 배양되었다. 세포 증식을 평가하기 위한 유동 세포분석에 의한 분석이 상기 (C)에서 기술된 것과 같이 수행되었다.
도 6A-6C는 분비된 항-NKG2D-항-CS1 BsAb가 시험관내에서 NKG2D 신호전달을 통한 CAR T 세포 생존을 향상시키는 것을 도시한다. (A) 1---Un. (미변형) T + IL-2, 2---EV T + IL-2, 3---BsAb T + IL-2, 4---BCMA-CAR T + IL-2, 5---BsAb-CAR T + IL-2의 5일된 배양 배지가 도시되었다. CD3 (제1 칼럼), F(ab)2 (제2 칼럼), 및 세포 증식을 관찰하기 위한 Ki67 (제3 칼럼), 및 세포 생존을 관찰하기 위한 아넥신 V/시톡스 블루 (제4 칼럼)에 대한 유동 세포분석 염색. (B) 1---미변형 T, 2---EV T, 3---BsAb T, 4---BCMA-CAR T, 및 5---BsAb-CAR T의 5일 된 배양 배지 (IL-2 없음)가 상부 패널에 도시되었다. CD3 (제1 칼럼) 및 세포 증식을 검출하기 위한 Ki67 (제2 칼럼)에 대한 유동 세포분석 염색. 아넥신 V/ 시톡스 블루가 세포 생존 (제3 칼럼)을 검출하기 위해 포함되었다. (C) CD3, Ki67 증식성 세포, 아넥신 V(-)시톡스 블루(-) 생존 세포, 아넥신 V(+) 세포자멸 세포, 및 아넥신 V(+)시톡스 블루(+) 죽은 세포의 백분율의 통계학적 분석이 도시되었다. 다중 t-테스트로 각 그룹이 비교되었다. ** p<0.01.
도 7A-7D는 BsAb-CAR 형질도입된-T 세포가 생체내에서 BCMA-CAR T 세포 및 대조군 T 세포보다 나은 증식 및 생존 능력을 가지는 것을 도시한다. (A) Design of 정맥내 주사 of 미변형 T 세포, EV T 세포, BCMA-CAR T 세포 및 BsAb-CAR T 세포의 면역결핍 NSG 마우스로의 정맥내 주사의 설계 (a, 상부). 3D 막대그래프 (하부 패널, 제1 칼럼)는 주사된 인간 CD3 T 세포의 백분율을 나타낸다. 청색 막대그래프는 -1일에 T 세포 주사를 받지 않은 마우스에 대한 것이고, 오렌지색 막대그래프는 T 세포 주사 후 1일 후를 나타내며, 검은색 막대그래프는 T 세포 주사 후 14일 후를 나타낸다 (적색 화살표는 BsAb-CAR T 그룹을 가리킴). 등고선은 CD69 발현을 나타낸다 (정맥내 주사 후 1일 후의 경우 오렌지색이고, 정맥내 주사 후 14일 후의 경우 검은색임). 자주색 막대그래프 (제4 칼럼)는 정맥내 주사 후 35일 후 주사된 CD3 T 세포의 백분율을 나타냈다. 자주색 등고선은 세포 증식을 나타내기 위한 4개 그룹의 Ki67 및 CD69 염색의 조합이다. 적색 등고선은 세포 세포자멸사 및 세포 사멸을 나타내기 위한 시톡스 블루 및 아넥신 V 염색의 조합이다. S-/A-는 시톡스 블루 (-)/아넥신 V(-)를 나타내고, S-/A+는 시톡스 블루-/아넥신 V+를 나타내며, S+/A+는 시톡스 블루+/아넥신 V+를 나타낸다. (B, C) (A)에 나타낸 인간 CD3+ (B) 및 CD69+ (C) 세포의 통계학적 분석. 미변형 T (빈 직사각형), EV T (패턴으로 채워진 직사각형), BCMA-CAR T (회색 음염 직사각형), 및 BsAb-CAR T (검은색 직사각형). 다중 t-테스트로 각 그룹이 비교되었다. ** p<0.01, n.s. 유의미한 차이 없음, n= 그룹당 5마리 마우스. (D) Ki67+CD69+ 증식성 세포, 아넥신 V(-) 시톡스 블루(-) 살아있는 세포, 아넥신 V(+)시톡스 블루(-) 세포자멸사 세포, 및 아넥신 V(+)시톡스 블루(+) 죽은 세포의 백분율의 통계학적 분석. 다중 t-테스트로 각 그룹이 비교되었다. ** p<0.01, n.s. 유의미한 차이 없음, n=5/ group.
도 8A-8C는 BsAb-CAR T 세포가 생체외에서 CS1 또는/및 BCMA-발현 인간 일차 다발성 골수종 세포를 특이적으로 인식하고 제거하는 것을 도시한다. (A) MM 환자의 골수로부터 분리된 CD138+ 다발성 골수종 종양 세포에서 CS1 및 BCMA 단백질에 대한 유동 세포분석 표면 염색. 8명의 환자로부터의 결과가 도시된다. 8명의 환자의 MM 세포가 PE-컨쥬게이션된 항-CS1 mAb 항체 (좌측 패널)로 또는 비오틴-표지된 항-BCMA mAb와 APC-컨쥬게이션된 스트렙트아비딘 (우측 패널)으로 염색되었다. 8명의 환자 또는 아이소타입-매치된 대조군 항체 (회색 음영)의 각각을 표시하기 위하여 다양한 색이 사용된다. (B) 5 x 103 CD138+ 다발성 골수종 종양 세포가 EV T 세포 (검은색 점선), BsAb T 세포 (적색 선), BCMA-CAR T 세포 (녹색 선), 또는 BsAb-CAR T 세포 (자주색 선)와 함께 표시된 E:T 비율에서 4시간 동안 공동 배양된 후, 특정 용해가 표준 51Cr 방출 검정을 사용하여 측정되었다. 환자 샘플 1 및 환자 샘플 4로부터의 데이터가 표시된다. 8명의 환자의 데이터가 분석되고 각 환자에 대한 개별 값으로서 표시된다 (우측 패널). (C) 표시된 형질도입된 T 세포가 1:1의 E:T 비율에서 CD138+ 다발성 골수종 종양 세포와 함께 공동 배양되었고, IFN-γ 분비가 ELISA를 통해 세포-유리 상층액에서 측정되었다.
도 9A-9C는 BsAb-CAR T 세포가 생체내에서 MM 성장을 억제하고 MM을 포함하는 또는 종양 세포로 재도전되는 마우스의 생존을 연장시키는 데 월등한 것을 도시한다. (A) 각각의 표시된 그룹으로부터 MM.1S 종양을 포함하는 대표적인 5마리 마우스에 대한 생물발광 영상이 도시되었다. NSG 마우스가 루시페라제를 발현하는 8 x 106 MM.1S 세포로 정맥내로 접종되었다 (0일). 종양 이식 후 제10, 17 및 24일에, 각 마우스는 식염수 (대조군 그룹), 또는 10 x 106 EV T 세포, BsAb T 세포, BSMA CAR T 세포, BsAb-BCMA seq. trans. T 세포, 또는 BsAb-CAR T 세포 각각으로의 정맥내 주사를 받았다 (상부 패널, 실험 스케줄). 줄의 이미지는 종양 이식 후 제10일에, 조작된 T 세포 또는 대조군 T 세포의 주입 직전에 채택되었다. 중간 줄의 이미지는 마우스가 이미 2회 (10일, 17일에) 치료를 받은 후이고 제3 치료 직전인 24일에 채택되었다. 맨 아래 줄의 이미지는 3회기의 치료 (10, 17, 및 24일에) 후인 31일의 마우스를 보여준다. (B) 종양 이식 후 80일에, 말초혈 (PBL)이 생존한 마우스 (BCMA CAR T 세포로 치료된 그룹의 3마리 마우스, BCMA seq. trans. T 세포로 치료된 그룹의 4마리 마우스, 및 BsAb-CAR T 세포로 치료된 그룹의 5마리 마우스)로부터 수집되었다. PBL 총 세포 수가 계산되었다 (좌측 패널). FITC-컨쥬게이션된 항-인간 CD45 mAb 항체 및 비오틴-표지된 염소 항-마우스 (Fab)2 다클론성 항체 또는 정상 다클론성 염소 면역글로불린 G (IgG) 항체를 가진 APC-컨쥬게이션된 스트렙트아비딘으로의 유동 세포분석 염색. Fab(+) 세포의 백분율 및 수가 표시된 것과 같이 중간에서 계산되었다. (C) 다양한 형질도입된-T 세포, 식염수 (검은색 실선), EV T 세포 (검은색 점선), BsAb T 세포 (적색 선), BCMA CAR T 세포 (녹색 선), BCMA seq. trans. T 세포 (청색 선), 및 BsAb-CAR T 세포 (자주색 점선)로 처리된 MM.1S-포함 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선. 화살표가 달린 회색 수직 점선은 마우스가 4 x 106 MM.1S 세포로 재도전되었을 때인 제80일을 나타냈다.
도 10A-10D는 BsAb-CAR T 세포가 BCMA-CAR T 세포보다 효과적으로 생체내에서 MM 성장을 억제하고 입양 전달된 인간 PBMC의 존재 하에 MM 종양-포함 마우스의 생존을 연장하는 것을 도시한다. (A) 각각의 표시된 그룹으로부터 MM.1S 종양을 포함하는 3마리의 대표적인 마우스에 대한 생물발광 영상이 도시되었다. NSG 마우스가 루시페라제를 발현하는 8 x 106 MM.1S 세포로 정맥내로 접종되었다 (0일). 종양 이식 후 제10, 17 및 24일에, 각 마우스는 식염수 (대조군 그룹), , BSMA-CAR T 세포, 또는 BsAb-CAR T 세포로의 정맥내 주사를 받았다. 동일한 도너로부터의 골수 세포-고갈된 PBMC가 종양 이식후 10일 후에 마우스에게 정맥내 주사되었다 (상부 패널, 실험 스케줄). 제1열의 이미지는 종양 이식 후 제10일에, 조작된 T 세포 또는 대조군 T 세포의 주입 직전에 채택되었다. 제2열의 이미지는 마우스가 이미 2회 (10일, 17일에) 치료를 받은 후이고 제3 치료가 투여되기 직전인 19일에 채택되었다. 제3열의 이미지는 3회기의 치료 (10, 17, 및 24일에) 후인 28일의 마우스를 보여준다. 제4열의 이미지는 37일의 마우스를 보여준다. (B) 혈액이 생존한 BsAb-CAR T 세포 주입 마우스 (n=5마리), 및 미처리 NSG 마우스 (None, n=5마리)로부터 수집되었다. CD19/20(+) 인간 형질 세포, CD56(+) NK 세포, 및 CD3(+) T 세포에 대한 유동 세포분석 염색. 인간 CD3(+)F(ab)2(+)에 게이트된 등고선의 녹색은 생존한 인간 T 세포 내에서의 CAR 발현의 백분율을 나타낸다. (C) 인간 CD19/20(+) 형질 세포, CD56(+) NK 세포, CD3(+) T 세포, 및 CD3(+)F(ab)2(+) 생존한 CAR T 세포의 백분율의 통계학적 분석. (d) 다양한 형질도입된-T 세포, 식염수 (검은색 실선), BCMA-CAR T 세포 (녹색 선), 또는 BsAb-CAR T 세포 (자주색 점선)로 처리된 MM.1S-포함 마우스의 카플란-마이어 생존 곡선. P < 0.0001, BsAb-CAR T 세포 대비 BCMA-CAR T 세포.
도 11A-11C. (A) 3D 무지개 점 유동 세포분석 지도 (CD3 염색을 기본으로, CD3 양성 세포는 노란색 및 녹색을 나타내고, CD3 음성 세포는 진한 청색 및 자주색을 나타냄)는 CD3(+) T 세포 (검은색 원형, 녹색을 띈 노란색), γδ T 세포 (노란색 단독), NKT 세포 (오렌지색 원형, 녹색을 띈 노란색), 및 NK 세포 (청색 원형, 진한 청색 및 자주색)의 백분율을 나타낸다. 2D 등고선 지도는 3D 지도를 상세하게 보여준다. (B) T 세포, CD8+ T 세포, pan γδ T 세포, Vγ9Vδ2 T 세포, NKT 세포, 및 NK 세포에서 NKG2D 표면 발현의 유동 세포분석 염색. 제공된 데이터는 10명의 건강한 도너로부터의 PBMC를 대표한다. (C) (B)의 NKG2D+ 세포의 백분율의 통계학적 분석. n=10마리.
도 12A-12B. (A) 10:1의 E:T 비율에서 4시간 51Cr 방출 검정 [E, 미변형 T 세포 (검은색 실선) 또는 EV- (검은색 점선), BsAb- (적색 선), BCMA-CAR- (녹색 선), 또는 BsAb-CAR-형질도입된 T 세포 (자주색 선)의 이펙터 세포]. 표적 세포를 넘는 1배, 10배, 100배, 또는 200배의 상이한 양의 인간 PBMC. 3개 중 하나의 대표적인 실험의 특정 용해 곡선이 A에 제시되고 3개 실험의 요약 데이터가 B에 제시된다. (B) (a)의 51Cr 방출 검정의 통계학적 분석, 다중 t-테스트, * p<0.05, ** p<0.01, n.s. 유의미한 차이 없음, 3회 반복.
도 13A-13D. (A) CD3(+) T 세포, CD8(+) 세포독성 T 세포, CD4(+) T 세포, γδ T 세포, NKT 세포, 및 NK 세포가 미국 적십자로부터 주문받은 류코팩(leukopack)으로부터 분리되었다. 프라이밍된 T에 대한 검은색 등고선 지도는 CD3 및 pan αβ TCR의 조합된 염색을 보여준다. 갈색 및 녹색 등고선 지도는 각각 분류된 CD8(+) 및 CD4(+) T 세포를 보여준다. (B) 활성화된 인간 NK 세포가 CD3 및 CD56으로 염색되었다. (C) 분류된 pan γδ Υ 세포가 CD3 및 pan γδ TCR 항체로 염색되었다. 활성화된 Vγ9γδ2 TCR T 세포에 대한 검은색 등고선 지도는 CD3, CD56, Vγ9 및 Vδ2의 조합된 염색에 의해 수행되었다. (D) 새롭게 FACS-분류된 인간 CD3(+)CD56(+) NKT 세포가 CD3 및 CD56으로 염색되었다.
도 14A-14E. (A) 2시간, 4시간, 8시간, 및 16시간을 포함한 상이한 시점에서 5:1의 E:T 비율에서 미변형 T 세포 (검은색 실선), EV T 세포 (검은색 점선), BsAb T 세포 (적색 선), BCMA-CAR T 세포 (녹색 선) 또는 BsAb-CAR T 세포 (자주색 선)의 51Cr 방출 검정. 추가적인 PBMC는 첨가되지 않았다. (B, C, D, E) 상기 기술된 세포독성 검정이 프라이밍된 CD3(+)T 세포, CD8(+)T 세포, CD4(+)T 세포, 및 Vγ9Vd2 T 세포를 포함한 벌크 T 세포 또는 개별 T 세포 하위세트의 존재 또는 부재 하에 반복되었다. 표적 MM.1S 세포에 대한 이펙터 세포의 비율은 모든 실험에 대해 5:1이다.
도 15A-15J는 BsAb-CAR T 세포 (녹색) 또는 EV T 세포 (녹색)와 MM.1S MM 세포 (적색)와의 24시간 공동 배양 후의 공초점 현미경 분석을 도시한다. (A-F) BsAb-CAR T 세포의 MM.1S MM 세포와의 24시간 동안의 공동 배양은 MM.1S MM 세포의 제거를 보여준다. (G-J) EV T 세포의 MM.1S MM 세포와의 24시간 동안의 공동 배양은 MM.1S MM 세포의 지속을 보여준다. Bf = 명시야; 규모, 10 μL.
도 16은 CS1 및 BCMA 유전자를 안정적으로 발현하는 K562 세포의 생성을 도시한다. 좌측 의사 색상 흐름 지도(pseudo color flow map)는 미형질도입 K562 세포의 대조군을 나타낸다. 중간 의사 색상 흐름 지도는 FACS-분류 pCDH-CS1-GFP 렌티바이러스-감염 K562 세포를 나타낸다. 세 번째 의사 색상 흐름 지도는 FACS-분류 CS1(+)BCMA(+) K562 세포를 나타낸다.
도 17A-17D. (A) 48시간 배양. 1A-미변형 T 세포, 2A-EV T 세포, 3A-BsAb T 세포, 4A-BCMA CAR T 세포 및 5A-BsAb-CAR T 세포. CD3(+) 집단 (청색 프레임), CD3(+)NKG2D(+) 집단 (적색 프레임), 및 CD3(+)NKG2D(-) 집단 (녹색 프레임)을 관찰하기 위한 CD3 및 NKG2D에 대한 유동 세포분석 염색. (b) 0일에, NKG2D 차단 항체 (20 μg/mL)가 (A) 배양에 첨가되었고 1B, 2B, 3B, 4B 및 5B로서 명명되었다. 48시간 후에, 세포 집단을 관찰하기 위한 CD3 및 F(ab)2에 대한 유동 세포분석 염색. CD3(+) 집단 (청색 프레임). (C) (A)로부터의 48시간 배양 배지가 도시되었다. 0일에, CS1 차단 항체 (20 μg/mL)가 (A) 배양에 첨가되었고 1C, 2C, 3C, 4C 및 5C로서 명명되었다. 48시간 후, 세포 증식을 관찰하기 위하여 항-CD3, 항-F(ab)2, 항-NKG2D, 및 항-Ki67로 세포를 염색한 후 유동 세포분석 분석이 수행되었다. 세포는 CD3(+) 및 CD3(+)NKG2D(+) 집단 (적색 프레임)에서 게이팅되었고, CD3(+)NKG2D(-) 집단 (녹색 프레임)이 표시되었다. 적색 점 흐름 지도는 NKG2D(+)Fab(+) (상부 3개) 또는 NKG2D(+)Fab(-) (하부 2개) 세포의 증식을 나타냈다. 녹색 점 흐름 지도는 NKG2D(-)Fab(+) (상부 3개) 또는 NKG2D(-)Fab(-) (하부 2개) 세포의 증식을 나타낸다. Fab는 CAR 발현에 대한 항-F(ab)2 염색을 나타낸다. (D) (A)의 1A, 2A, 3A, 4A 및 5A로부터의 세포가 MM.1S 종양 세포와 함께 48시간 동안 공동 배양되었다. 유동 세포분석에 의한 분석이 항-CD3, 항-F(ab)2, 및 항-NKG2D 항체로 세포를 염색한 후에 수행되었다. Fab는 F(ab)2 염색을 나타내고, CAR 발현을 가리킨다.
도 18은 도 7의 데이터에 대한 보충 데이터를 제공한다. 도 7에서, 인간 CD3 T 세포 백분율의 3D 막대그래프 (제1 칼럼)가 도시된다. 이것들은 원래의 의사 색상 흐름 지도이다. 청색 프레임은 -1일에 T 세포 주사가 없는 마우스의 인간 CD3 백분율을 나타낸다 (제1 칼럼). 오렌지색 프레임은 T 세포 주사 후 1일 후의 마우스에서의 항-인간 CD3(+)세포를 나타내고, CAR 발현이 항-F(ab)2로의 염색 후에 유동 세포분석 분석에 의해 검출되었다 (제2, 제3 칼럼). 검은색 프레임은 조작된 또는 대조군 인간 T 세포로의 주입 후 14일 후의 마우스에서의 항-인간 CD3(+) 세포를 보여준다 (제4 칼럼). 자주색 프레임은 조작된 또는 대조군 인간 T 세포로의 주입 후 35일 후의 마우스에서의 항-인간 CD3(+) 세포를 보여준다 (제5 칼럼). CD3(+) 인간 세포에 대한 통계학적 분석이 도 7에 도시된다.
도 19A-19B는 NSG 마우스에 주사될 때 GVHD를 피하기 위한 인간의 건강한 도너의 PBMC에서 골수종 세포의 고갈의 영향을 도시한다. (A) 피콜-파크 (Ficoll-Paque) 플러스 분리된 인간 PBMC가 염색되었다. 번호 1은 림프구 백분율을 나타냈고, 2는 과립구 백분율을 나타냈으며, 3은 단핵세포 백분율을 나타냈다. FACS 분류 전에 건강한 도너의 PBMC의 골수 세포의 백분율을 체크하기 위하여 CD11c, CD14, CD33 및 CD66b가 염색되었다. (B) 분류 후, CD11c, CD14, CD33 및 CD66b가 상기 기술된 것과 같이 염색되었고, 의사 색상 하부 지도가 표시되었다.
도 20은 표준 4h-51Cr 방출 검정에 의한 자가 PBMC, T 세포, NK 세포, 및 형질 세포에 대한 인간 BsAb-CAR T 세포의 세포독성의 평가를 제공한다. PBMC가 피콜 파크 플러스 구배 원심분리에 의해 분리되었다. CD3(+) T 세포, CD56(+) NK 세포, 및 CD19/20(+) 형질 세포가 PBMC로부터 FACS-분류되었다. EV T 세포가 세포독성 검정에서 대조군으로서 사용되었다.
도 21A-21D. (A) BsAb BCMA-CAR (BsAb-CAR T) 렌티바이러스-감염 건강한 도너의 프라이밍된 T 세포의 상이한 시점 (12h, 24h, 48h, 72h, 및 96h). BF (명시야) GFP (녹색)의 동일한 뷰가 보여진다. (B) BsAb-CAR T 세포의 상층액에서 BsAb의 분비를 보여주기 위한 항-His-태그로의 면역블롯팅. (C) BsAb-CAR T 렌티바이러스-감염 프라이밍된 T 세포에 대한 유동 세포분석 염색. GFP-양성 세포가 분류되었고, 세포는 비오틴 표지된 염소 항-마우스 Fab 특이적 또는 아이소타입-매치된 대조군 항체로 염색되고, 이어서 스트렙트아비딘 및 CD3 항체 염색에 의해 염색되었다. (D) 51Cr-표지된 H929, RPMI-8226 및 K562 표적 세포주 (5 x 103)가 미변형 T 세포 (검은색 실선), 빈 벡터-형질도입된 T 세포 (EV T, 검은색 점선), 또는 BsAb-CAR T 세포 (자주색 선)와 함께 표시된 E:T 비율에서 4시간 동안 공동 배양되었다. 표적 용해 (51Cr 방출)가 측정되었다. BsAb-CAR T 대비 미변형 T 또는 EV T, ** P<0.01, 3회 반복됨. BCMA(-)CS1(-) 음성 K562가 음성 대조군 표적 세포로서 사용된다.
본 개시는 기술된 특정 측면이 물론 달라질 수 있기 때문에, 그것들에 제한되지 않는 것이 이해되어야 한다. 또한 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 측면을 기술할 목적을 위한 것이고, 본 개시의 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 제한하려는 의도가 아닌 것이 이해되어야 한다. 본 개시의 전체에서, 다양한 기술적 출판물이 아라비아 숫자로 참조된다. 이들 출판물에 대한 완전한 인용은 청구범위 바로 직전에서 볼 수 있고 본원에 참조로 포함된다.
B-세포 성숙 항원 (BCMA) 및 SLAMF7 (CS1 또는 CD319)은 둘 다 우수한 MM 종양 항원 표적인 것으로 나타난 한편, NKG2D는 최고의 면역 세포 표적이다. 수용체인 NKG2D는 NK 세포, NKT 세포, CD8(+) T 세포, 및 γδ T 세포를 포함한, 실제로 모든 세포용해성 면역 세포에서 발현된다23. BCMA는 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리의 구성원이고 (TNFRSF17 또는 CD269), 형질 세포 분화 중에 선택적으로 유도되며 나이브(naive) 및 메모리 B 세포 상에는 거의 없다24,25. 항-BCMA-CAR-발현 T 세포의 입양 전달은 MM을 치료하기 위한 유망한 새로운 전략으로서 보고되었다26-28. CS1은 MM의 또 다른 매력적인 종양-관련 표적 항원인데, 왜냐하면 CS1이 MM 세포의 표면에서 고도로 편재하여 발현되기 때문이다29,30. CS1은 NK 세포 및 활성화된 CD8(+) T 세포의 하위세트에서 저수준으로 발현되지만, 골수성 세포 및 정상적인 조혈 줄기 세포에서는 거의 검출할 수 없다31. CS1에 대한 치료용 단클론성 항체가 MM의 치료를 위해 FDA에 의해 승인되었다32. 출원인의 공개된 조사는 T 세포 또는 NK 세포의 유전자 변형이 골수종 세포의 CS1 향상된 근절을 재지하였음을 보여주었다29,30. 최근의 전임상 연구는 CS1 CAR T 세포 치료를 받은 환자 MM 세포가 효과적으로 근절되었고, 한편으로 정상적인 NK 및 T 세포는 저수준의 CS1 발현이 영향을 받지 않은 채로 남아 있음을 보여주었다 (Gogishvili, 2017 Blood. 2017 Dec 28;130(26):2838-2847. doi: 10.1182/blood-2017-04-778423. Epub 2017 Oct 31). 활성화 수용체인 NKG2D는 상기에서 언급된 것과 같이 다양한 선천성 및 적응성 세포용해 세포에서 발현된다11,33. NKG2D를 촉발시키면 선천성 및 적응성 세포 면역 둘 다의 활성화로 이어질 수 있다34.
본원에서 개시된 것과 같이, 출원인은 (1) BCMA-특이적 2세대 CAR을 발현하기 위하여, 그리고 (2) 동시에 항-NKG2D-항-CS1 BsAb를 분비하기 위하여 T 세포를 조작하였다. 이들 데이터는 이들 세포 (이하 BsAb-CAR T 세포로 언급됨)가 재발된 및/또는 난치성 MM을 위한 유망한 치료법을 대표하고, 차세대 CAR-기반 암 면역요법을 생성하기에 적합한 플랫폼일 수 있음을 시사한다.
T 세포에 형질도입된 단일 벡터로서의 CAR과 항-NKG2D-기반 이중특이적 항체의 이러한 조합은 아직 문헌에 기술되지 않았다. 출원인은 이러한 접근법이 종양에 대한 강력한 세포용해 이펙터 세포로서 기능하는 T 세포 (BsAb CAR T-세포)를 생성하는 것을 입증하였다. 본원에는 BCMA로 불리는, 다발성 골수종 (MM)에서 잘 얄려져 있는 표적에 대해 T 세포 CAR이 지시되고, 항-NKG2D-기반 이중특이적 항체가 잘 기술된 MM 종양 항원을 이식하고 그것을 NKG2D 항원을 포함한 임의의 선천성 또는 적응성 세포용해 이펙터 세포의 아주 가까운 곳으로 가져가는 대표적인 예가 제공된다. 그러나, 본원에서는 항-종양 효능을 위해 T 및 NK 세포를 나중에 감염시키기 위하여 단일 벡터로 다양한 상보하는 CAR 및 항-NKG2D-기반 이중특이적 항체를 팽창시키는 것이 고려된다. 이런 접근법은 임의의 수의 기술분야에 알려져 있는 것과 같은 종양 항원, 예컨대 EGFRVIII; CD70, 메소텔린, CD123, CD19, CEA, CD133, Her2에 대해 변형될 수 있다, Townsend et al. (2018) J. Exp. & Clinical 암 Res. 37:163 참조.
하기 실시예에서 나타내는 것과 같이, MM 세포 상의 2개의 구별되는 종양 관련 항원에 대해 지시된 2개의 상보하는 모달리티를 전달하는 단일 벡터는 어느 하나의 모달리티 단독보다 월등하고, 하나는 CAR을 암호화하고 다른 하나는 항-NKG2D-기반 이중특이적 항체를 암호화하는 2개의 별도의 구성물로 순차적으로 감염된 T 세포의 사용보다 월등하다. 추가로, T 세포 (CAR 및 항-NKG2D-기반 이중특이적 항체 둘 다를 암호화하는 실험 벡터로 감염됨)가 두 항원을 모두 발현하는 MM 세포를 만날 때, BsAb CAR T 세포는 NKG2D-매개된 활성화를 통해 시험관내 및 생체내에서 증식 및 향상된 생존 둘 다를 진행한다. 이러한 결과는 전혀 예상하지 못한 것이다.
요약하면, 출원인은 또한 항-NKG2D-항-CS1 이중특이적 항체를 분비하는 BCMA CAR T 세포를 구성하였다; 이들 세포는 BCMA(+) 및/또는 CS1(+) 다발성 골수종 (MM) 세포를 효과적으로 표적화한다. BCMA CAR T 세포에 의한 항-NKG2D-항-CS1 이중특이적 항체의 분비는 시험관내에서 CAR T 세포 증식 및 생체내에서 CAR T 세포 생존 및 증식을 NKG2D-매개된 활성화를 통해 향상시킨다. 항-NKG2D-항-CS1 이중특이적 항체를 분비하는 BCMA CAR T 세포는 BCMA CAR T 또는 항-NKG2D-항-CS1 이중특이적 항체를 단독으로 분비하는 T 세포를 사용하는 단일 요법에 비교하여 종양 세포 표적에 대해 상당히 더 나은 시험관내 및 생체내 효능을 나타낸다. 이들 결과는 동일한 방식으로 사용된 다양한 CAR에 일반화될 수 있다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 기술이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 사람에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 기술의 실시 또는 실험에 사용될 수 있긴 하지만, 바람직한 방법, 장치 및 물질이 이제 기술된다. 본원에서 인용됨 모든 기술적 및 특허 출판물은 그 전문이 참조로 본원에 포함된다. 본원의 어떠한 것도 본 기술이 선행 발명에 의해 그러한 공개를 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 기술의 실시는, 다르게 표시되지 않는 한, 기술분야의 숙련도 내에 있는 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 및 재조합 DNA의 종래 기법을 사용할 것이다. 예컨대, Green and Sambrook eds. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th 　edition; the series Ausubel et al. eds. (2015) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (2015) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; McPherson et al. (2006) PCR: The Basics (Garland Science); Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Greenfield ed. (2014) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2010) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 6th　edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; 미국 특허 제 4,683,195호; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Herdewijn ed. (2005) Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Buzdin and Lukyanov ed. (2007) Nucleic Acids Hybridization: Modern Applications; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Grandi ed. (2007) In Vitro Transcription and Translation Protocols, 2nd edition; Guisan ed. (2006) Immobilization of Enzymes and Cells; Perbal (1988) A Practical Guide to Molecular Cloning, 2nd edition; Miller and Calos eds, (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Lundblad and Macdonald eds. (2010) Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 4th edition; 및 Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology, 5th edition; 및 출원 당시 활용 가능한 보다 최근의 편집본을 참조한다.
범위를 포함한 모든 숫자 표시, 예컨대, pH, 온도, 시간, 농도, 및 분자량은 필요에 따라 1.0 또는 0.1의 증분씩, 또는 대안으로 +/- 15%, 또는 대안으로 10%, 또는 대안을 5%, 또는 대안으로 2%의 변이에 의해 (+) 또는 (-)로 달라지는 근사치이다. 비록 언제나 분명하게 개재되는 것은 아니지만, 모든 숫자 표시는 용어 "약"이 선행하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 비록 언제나 분명하게 기재되는 것은 아니지만, 본원에서 기술되는 시약은 단순히 예시적인 것이고 그러한 것의 동등물이 기술분야에 알려져 있다는 것이 이해되어야 한다.
분명한 열거 없이, 그리고 다르게 의도되지 않는 한, 본 기술이 폴리펩타이드, 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체에 관련될 때, 이것들의 동등물 또는 생물학적 동등물이 본 기술의 범주 내에 있는 것으로 의도되는 것으로 추론되어야 한다.
정의
명세서 및 청구범위에서 사용되는 것과 같이, 단일 형태를 나타내는 단어들은 맥락이 명백하게 다른 것을 표시하지 않는 한 복수의 대상물을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 복수의 세포, 및 그것의 혼합물을 포함한다.
본원에서 사용되는 것과 같이, 용어 "동물"은 살아 있는 다세포 척추동물 유기체를 나타내며, 범주로는 예를 들어, 포유류 및 조류를 포함한다. 용어 "포유류"는 인간 및 비인간 포유류를 모두 포함한다.
용어 "대상체", "숙주", "개체", 및 "환자"는 인간 및 척추동물 대상체, 예를 들어 인간, 동물, 비인간 영장류, 개, 고양이, 양, 마우스, 말, 및 소를 나타내기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 일부 구체예에서, 대상체는 인간이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "항체"는 면역글로불린 또는 면역글로불린-유사 분자, 예를 들어, 제한 없이 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 이것들의 조합, 및 임의의 척추동물에서, 예를 들어 인간, 염소, 토끼 및 마우스와 같은 포유류뿐만 아니라 비포유류 종에서의 면역 반응 중에 생성된 유사한 분자, 예컨대 상어 면역글로불린을 포괄적으로 나타낸다. 구체적으로 다르게 주지되지 않는 한, 용어 "항체"는 다른 분자에 대한 결합을 실질적으로 배제하기 위해 관심 있는 분자 (또는 관심 있는 고도로 유사한 분자의 그룹)에 특이적으로 결합하는 온전한 면역글로불린 및 "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"을 포함한다 (예를 들어, 생물학적 샘플 중의 다른 분자에 대한 결합 상수보다 적어도 103 M-1 더 큰, 적어도 104 M-1 더 큰 또는 적어도 105 M-1 더 큰, 관심 있는 분자에 대한 결합 상수를 가지는 항체 및 항체 단편). 용어 "항체"는 또한 일반적으로 키메라 항체 (예를 들어, 쥐과 또는 인간화된 비영장류 항체), 헤테로컨쥬게이트 항체 (예컨대, 이중특이적 항체)와 같은 유전자 조작된 형태를 포함한다. 또한, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.); Owen et al., Kuby Immunology, 7th Ed., W.H. Freeman & Co., 2013; Murphy, Janeway's Immunobiology, 8th Ed., Garland Science, 2014; Male et al., Immunology (Roitt), 8th Ed., Saunders, 2012; Parham, The Immune System, 4th Ed., Garland Science, 2014를 참조한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "단클론성 항체"는 B-림프구의 단일 클론에 의해 또는 단일 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자가 트랜스펙션되어 있는 세포에 의해 생성된 항체를 나타낸다. 단클론성 항체는 기술분야에 숙련된 지식을 가진 사람들에게 알려져 있는 방법에 의해, 예를 들어 골수종 세포와 면역 비장 세포와의 융합으로부터 하이브리드 항체-형성 세포를 만듦으로써 생성된다. 단클론성 항체는 인간화된 단클론성 항체를 포함한다.
항체 구조의 관점에서, 면역글로불린은 이황화 결합에 의해 상호연결된 중쇄 (H) 및 경쇄 (L)를 가진다. 경쇄에는 두 유형, 람다 (λ) 및 카파(κ)가 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 5개의 주요 중쇄 부류 (또는 아이소타입)가 있다: IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE. 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역, (영역은 또한 "도메인"으로서 알려짐)을 함유한다. 조합에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 항원에 특이적으로 결합한다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"로도 불리는 3개의 초가변 영역이 사이에 끼어 있는 "프레임워크" 영역을 함유한다. 프레임워크 영역 및 CDR의 크기는 정해져 있다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991, (본원에 참조로 포함됨) 참조). Kabat 데이터베이스는 이제 온라인으로 유지된다. 상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 종 내에서 상대적으로 보존된다. 항체의 프레임워크, 즉 구성요소 경쇄 및 중쇄의 조합된 프레임워크 영역은 대부분 β-시트 형태를 채택하고 CDR은 β-시트 구조를 연결시키는, 일부 경우에는 그것의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 그러므로, 프레임워크 영역은 사슬간, 비공유 상호작용에 의해 정확한 방향으로 CDR을 위치시키는 것을 제공하는 스캐폴드를 형성하는 작용을 한다.
CDR은 주로 항원의 에피토프에 대한 결합에 기여한다. 각 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 차례로 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로서 언급되고, 또한 전형적으로 특정 CDR이 위치한 사슬에 의해 확인된다 (중쇄 영역은 CDHR로 표시되고 경쇄 영역은 CDLR로 표시됨). 그러므로, CDHR3은 그것이 발견되는 항체의 중쇄의 가변 도메인으로부터 CDR3인 반면, CDLR1은 그것이 발견되는 항체의 경쇄의 가변 도메인으로부터의 CDR1이다. 예를 들어, TNT 항체는 TNT 관련 항원에 특유한 특정 VH 영역 및 VL 영역 서열, 따라서 특이적 CDR 서열을 가질 것이다. 상이한 특이성 (즉, 상이한 항원에 대한 상이한 조합 부위)을 가진 항체는 상이한 CDR을 가진다. 비록 CDR이 항체마다 다르긴 하지만, CDR 내의 단지 제한된 수의 아미노산 위치가 항원 결합에 직접적으로 관여한다. CDR 내의 이들 위치는 특이성 결정 잔기 (SDR)로 불린다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "항원"은 특정 체액성 또는 세포성 면역의 생성물, 예컨대 항체 분자 또는 T-세포 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 화합물, 조성물, 또는 물질을 나타낸다. 항원은 예를 들어, 합텐, 간단한 중간 대사물, 당 (예컨대, 올리고당), 지질, 및 복잡한 탄수화물 (예컨대, 다당류), 인지질, 및 단백질과 같은 거대분자뿐만 아니라 호르몬을 포함한 임의의 유형의 분자일 수 있다. 항원의 공통 범주로는, 한정되는 것은 아니지만, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 원생동물 및 기타 기생충 항원, 종양 항원, 자가면역 질환, 알레르기 반응 및 이식 거부반응에 포함된 항원, 독소, 및 기타 여러 종류의 항원을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "항원 결합 도메인"은 항원 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 또는 폴리펩타이드 도메인을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 세포와 관련하여 용어 "자가의"는 분리되고 동일한 대상체 (수령체 또는 숙주)로 다시 주입되는 세포를 나타낸다. "동종이계"는 비자가 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "B 세포"는 적응성 면역 체계의 체액성 면역의 림프구 유형을 나타낸다. B 세포는 주로 항체를 만들고, 항원 제공 세포로서 작용하고, 사이토카인을 방출하고, 항원 상호작용에 의한 활성화 후에 기억 B 세포를 발생시키는 기능을 한다. B 세포는 다른 림프구, 예컨대 T 세포와, 세포 표면에 B-세포 수용체의 존재에 의해 구별된다. B 세포는 상업적으로 이용 가능한 공급원으로부터 분리되거나 얻을 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 B 세포주의 비제한적인 예로는 라인 AHH-1 (ATCC® CRL-8146TM), BC-1 (ATCC® CRL-2230TM), BC-2 (ATCC® CRL-2231TM), BC-3 (ATCC® CRL-2277TM), CA46 (ATCC® CRL-1648TM), DG-75 [D.G.-75] (ATCC® CRL-2625TM), DS-1 (ATCC® CRL-11102TM), EB-3 [EB3] (ATCC® CCL-85TM), Z-138 (ATCC #CRL-3001), DB (ATCC CRL-2289), Toledo (ATCC CRL-2631), Pfiffer (ATCC CRL-2632), SR (ATCC CRL-2262), JM-1 (ATCC CRL-10421), NFS-5 C-1 (ATCC CRL-1693); NFS-70 C10 (ATCC CRL-1694), NFS-25 C-3 (ATCC CRL-1695), 마ㅊ SUP-B15 (ATCC CRL-1929)를 들 수 있다. 추가의 예로는 한정하는 것은 아니지만 신생물 및 큰 세포 림프종으로부터 유래된 세포주, 예컨대, DEL, DL-40, FE-PD, JB6, Karpas 299, Ki-JK, Mac-2A Ply1, SR-786, SU-DHL-1, -2, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, 및 -16, DOHH-2, NU-DHL-1, U-937, Granda 519, USC-DHL-1, RL; 호지킨 림프종, 예컨대, DEV, HD-70, HDLM-2, HD-MyZ, HKB-1, KM-H2, L428, L540, L1236, SBH-1, SUP-HD1, SU/RH-HD-l을 들 수 있다. 이러한 상업적으로 이용 가능한 세포주의 비제한적인 예시의 공급원은 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션, 또는 ATCC (http://www.atcc.org/) 및 독일 미생물 및 세포 배양 센터 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(https://www.dsmz.de/)를 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "암"은 대상체에서 비정상적인 제어되지 않는 복제를 나타내는 세포의 존재를 특징으로 하는 질환 상태이고, 일부 측면으로, 용어는 용어 "종양"과 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 용어 "암 또는 종양 항원"은 암 세포 또는 종양 세포 또는 조직의 표면에 결합되고 그곳에서 발현되는 것으로 알려져 있는 항원을 나타내며, 용어 "암 또는 종양 표적화 항체"는 이러한 항원을 표적으로 하는 항체를 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "키메라 항원 수용체" (CAR)는 항원에 결합할 수 있는 세포외 도메인, 세포외 도메인이 유래되는 폴리펩타이드와 상이한 폴리펩타이드로부터 유래된 경막 도메인, 및 적어도 하나의 세포내 도메인을 포함하는 융합된 단백질을 나타낸다. "키메라 항원 수용체 (CAR)"는 때로 "키메라 수용체", "T-바디", 또는 "키메라 면역 수용체 (CIR)"로도 불린다. "항원에 결합할 수 있는 세포외 도메인"은 특정 항원에 결합할 수 있는 임의의 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. "세포내 도메인" 또는 "세포내 신호전달 도메인"은 세포에서 생물학적 과정의 활성화 또는 억제를 유발하기 위해 신호를 전파하는 도메인으로서 기능하는 것으로 알려져 있는 임의의 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 특정 구체예에서, 세포내 도메인은 주요 신호전달 도메인에 더불어 하나 이상의 동시자극성 신호전달 도메인을 포함하거나, 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것을 포함할 수 있다. "경막 도메인"은 세포막에 걸쳐 있고 세포외 도메인과 신호전달 도메인을 연결시키는 기능을 할 수 있는 것으로 알려져 있는 임의의 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 키메라 항원 수용체는 세포외 도메인과 경막 도메인 사이에서 링커로서 작용하는 "힌지 도메인"을 선택적으로 포함할 수 있다. 이러한 도메인의 비제한적인 예는 본원에 제공되며, 예컨대:
힌지 도메인: IgG1 중쇄 힌지 코딩 서열이다:
CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCG.
추가적인 비제한적인 예는 기술분야에 알려져 있는 것과 같이, IgG4 힌지 영역, IgD 및 CD8 도메인을 들 수 있다.
경막 도메인: CD28 경막 영역 코딩 서열:
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTA태그CTTGC태그TAACAGTGGCCTTTATTAT
TTTCTGGGTG.
세포내 도메인: 4-1BB 동시 자극성 신호전달 영역 코딩 서열:
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAG
AGGAAGATGGCTG태그CTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG.
세포내 도메인: CD28 동시 자극성 신호전달 영역 코딩 서열:
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCG
CAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC.
세포내 도메인: CD3 제타 신호전달 영역 코딩 서열:
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCT
CAATC태그GACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAA
AGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTAC
AGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTAC
AGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA.
각각의 예시의 도메인 구성요소의 추가의 구체예는 상기 개시된 핵산 서열에 의해 암호화된 단백질과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 가지는 다른 단백질을 들 수 있다. 추가로, 이러한 도메인의 비제한적인 예가 본원에 제공된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "CD8 α 힌지 도메인"은 이 명칭과 관련된 특정 단백질 단편 및 본원에서 제시된 CD8 α 힌지 도메인 서열과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 가진 임의의 다른 분자를 나타낸다. 인간, 마우스, 및 다른 종에 대한 CD8 α 힌지 도메인의 예시 서열이 Pinto, R.D. et al. (2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177에 제공된다. CD8 α 힌지 도메인과 관련된 서열은 Pinto, R.D. et al. (2006) Vet. Immunol. Immunopathol. 110:169-177에 제공된다. 이러한 것들의 비제한적인 예로 다음을 들 수 있다:
인간 CD8 알파 힌지 도메인:
PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY
마우스 CD8 알파 힌지 도메인:
KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY
고양이 CD8 알파 힌지 도메인:
PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY.
본원에서 사용되는 바, 용어 "CD8 α 경막 도메인"은 이 명칭과 관련된 특정 단백질 단편 및 본원에서 제시된 CD8 α 경막 도메인 서열과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 가진 임의의 다른 분자를 나타낸다. 인간 T-세포 표면 당단백질 CD8 알파 사슬 (GenBank 수탁 번호: NP_001759.3)의 아미노산 위치 183 내지 203, 또는 마우스 T-세포 표면 당단백질 CD8 알파 사슬 (GenBank 수탁 번호: NP_001074579.1)의 아미노산 위치 197 내지 217, 및 래트 T-세포 표면 당단백질 CD8 알파 사슬(GenBank 수탁 번호: NP_ 113726.1)의 아미노산 위치 190 내지 210과 관련된 단편 서열은 CD8 α 경막 도메인의 추가적인 예시 서열을 제공한다. 열거된 각각의 수탁 번호와 관련된 서열은 다음과 같이 제공된다:
인간 CD8 알파 경막 도메인: IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
마우스 CD8 알파 경막 도메인: IWAPLAGICVALLLSLIITLI
래트 CD8 알파 경막 도메인: IWAPLAGICAVLLLSLVITLI.
본원에서 사용되는 바, 용어 "CD28 경막 도메인"은 이 명칭과 관련된 특정 단백질 단편 및 본원에서 제시된 CD28 경막 도메인 서열과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 가진 임의의 다른 분자를 나타낸다. GenBank 수탁 번호: XM_006712862.2 및 XM_009444056.1과 관련된 단편 서열이 CD28 경막 도메인의 추가적인 비제한적인 예시 서열을 제공한다. 열거된 각각의 수탁 번호와 관련된 서열은 본원에서 제공된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "4-1BB 동시자극성 신호전달 영역"은 이 명칭과 관련된 특정 단백질 단편 및 본원에서 제시된 4-1BB 동시자극성 신호전달 영역 서열과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 가진 임의의 다른 분자를 나타낸다. 4-1BB 동시자극성 신호전달 영역의 비제한적인 예시 서열은 미국 공보 20130266551A1 (미국 출원 번호 13/826,258로 출원됨)에서 제공되고, 예컨대 예시의 서열이 하기에 제공된다:
4-1BB 동시자극성 신호전달 영역:
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL.
본원에서 사용되는 바, 용어 "CD28 동시자극성 신호전달 영역"은 이 명칭과 관련된 특정 단백질 단편 및 본원에서 제시된 CD28 동시자극성 신호전달 영역 서열과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 가진 임의의 다른 분자를 나타낸다. 예시 서열 CD28 동시 자극성 신호전달 도메인은 미국 특허 제 5,686,281호; Geiger, T.L. et al., Blood 98: 2364-2371 (2001); Hombach, A. et al., J Immunol 167: 6123-6131 (2001); Maher, J. et al. Nat Biotechnol 20: 70-75 (2002); Haynes, N.M. et al., J Immunol 169: 5780-5786 (2002); Haynes, N.M. et al., Blood 100: 3155-3163 (2002)에서 제공된다. 비제한적인 예는 하기 CD28 서열의 잔기 114-220: MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS, 및 이것의 동등물을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "ICOS 동시자극성 신호전달 영역"은 이 명칭과 관련된 특정 단백질 단편 및 본원에서 제시된 ICOS 동시자극성 신호전달 영역 서열과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 가진 임의의 다른 분자를 나타낸다. ICOS 동시자극성 신호전달 영역의 비제한적인 예시 서열은 미국 특허 공보 2015/0017141A1에서 제공된다. 예시의 폴리뉴클레오타이드 서열이 하기에 제공된다.
ICOS 동시자극성 신호전달 영역 코딩 서열:
ACAAAAAAGA AGTATTCATC CAGTGTGCAC GACCCTAACG GTGAATACAT GTTCATGAGA
GCAGTGAACA CAGCCAAAAA ATCCAGACTC ACAGATGTGA CCCTA.
본원에서 사용되는 바, 용어 "OX40 동시자극성 신호전달 영역"은 이 명칭과 관련된 특정 단백질 단편 및 본원에서 제시된 OX40 동시자극성 신호전달 영역 서열과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 또는 대안으로 90% 서열 동일성, 또는 대안으로 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 가진 임의의 다른 분자를 나타낸다. OX40 동시자극성 신호전달 영역의 비제한적인 예시 서열은 미국 특허출원 공보 2012/20148552A1에 제공되며, 하기에 제공된 예시의 서열, 및 이것들의 동등물을 예로 들 수 있다.
OX40 동시자극성 신호전달 영역 코딩 서열:
AGGGACCAG AGGCTGCCCC CCGATGCCCA CAAGCCCCCT GGGGGAGGCA GTTTCCGGAC
CCCCATCCAA GAGGAGCAGG CCGACGCCCA CTCCACCCTG GCCAAGATC.
본원에서 사용되는 바, 용어 "CD28 동시자극성 신호전달 영역"은 이 명칭과 관련된 특정 단백질 단편 및 본원에서 제시된 CD28 동시자극성 신호전달 영역 서열과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 또는 대안으로 90% 서열 동일성, 또는 대안으로 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 가진 임의의 다른 분자를 나타낸다. CD28 동시 자극성 신호전달 도메인의 예시 서열은 미국 특허 제 5,686,281호; Geiger, T.L. et al. (2001) Blood 98: 2364-2371; Hombach, A. et al. (2001) J Immunol 167: 6123-6131; Maher, J. et al. (2002) Nat Biotechnol 20: 70-75; Haynes, N.M. et al. (2002) J Immunol 169: 5780-5786 (2002); Haynes, N.M. et al. (2002) Blood 100: 3155-3163에서 제공된다. 비제한적인 예는 하기의 잔기 114-220 및 암호화된 서열을 포함한다:
CD28 서열: MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE
FRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY
FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG
GVLACYSLLVTVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS, 및 이것의 동등물.
본원에서 사용되는 바, 용어 "CD3 제타 신호전달 도메인"은 이 명칭과 관련된 특정 단백질 단편 및 본원에서 제시된 CD3 제타 신호전달 도메인 서열과 적어도 70%, 또는 대안으로 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 바람직하게 90% 서열 동일성, 보다 바람직하게 적어도 95% 서열 동일성을 공유하는 유사한 생물학적 기능을 가진 임의의 다른 분자를 나타낸다. CD3 제타 신호전달 도메인의 비제한적인 예시 서열은 미국 특허출원 번호 13/826,258에 제공되고, 예컨대:
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY
SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 NKG2D는 최근에 상당한 관심을 불러 일으킨 활성화 수용체를 나타낸다. 많은 NKG2D 표적 리간드가 확인되었다. 이것들 중 가장 흥미로운 것은 MICA 및 MICB (주요 조직적합성 복합체 (MHC) 부류 I 사??-관련됨)로 불리는 한 쌍의 밀접하게 관련된 단백질이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 ULBP는 eUL16-결합 단백질 패밀리의 구성원을 나타낸다.
"조성물"은 전형적으로 활성제, 예컨대 화합물 또는 조성물, 및 자연적으로 발생하는 또는 자연적으로 발생하지 않는 담체, 비활성 (예를 들어, 검출 가능한 작용제 또는 표지) 또는 활성제, 예컨대 보조제, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친유성 용매, 보존제, 보조제 등의 조합을 의도하며 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 담체는 또한 단독으로 또는 함께 존재할 수 있고, 단독으로 또는 함께 1 내지 99.99 중량% 또는 부피%를 포함하는 제약학적 부형제 및 첨가 단백질, 펩타이드, 아미노산, 지질, 및 탄수화물 (예컨대, 당, 이를테면 단당, 2-, 3-, 4-올리고당, 및 올리고당류; 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당 등과 같은 유도체화된 당; 및 다당류 또는 당 중합체)을 포함할 수 있다. 예시의 단백질 부형제로는 인간 혈청 알부민 (HSA), 재조합 인간 알부민 (rHA)과 같은 혈청 알부민, 젤라틴, 카제인, 등을 들 수 있다. 또한 완충 능력으로 기능할 수 있는 대표적인 아미노산/항체 구성요소로는 알라닌, 아르기닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스테딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 리신, 류신, 아이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파탐, 등을 들 수 있다. 탄수화물 부형제가 또한 본 기술의 범주 내에 있는 것으로 의도되며, 그 예로, 한정하는 것은 아니지만, 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스, 등과 같은 단당류; 이당류, 예컨대 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스, 등; 다당류, 예컨대 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분, 등; 및 알디톨, 예컨대 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 소르비톨 (글루시톨) 및 미오이노시톨을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 인용된 요소를 포함하지만, 다른 것을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 의도된다. "본질적으로 ~로 이루어지는"은 조성물 및 방법을 규정하기 위해 사용될 때, 의도된 용도에 대한 조합에 대해 임의의 본질적으로 중요한 다른 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. 예를 들어, 본질적으로 본원에서 규정된 요소로 이루어지는 조성물은 분리 및 정제 방법으로부터의 미량의 오염물 및 제약학적으로 허용되는 담체, 예컨대 인산염 완충 식염수, 보존제 등을 배제하지 않을 것이다. "~으로 이루어지는"은 본원에서 개시된 조성물을 투여하기 위한 다른 성분 및 실질적인 방법 단계의 미량 요소 이상을 배제하는 것을 의미할 것이다. 이들 이행 용어의 각각에 의해 규정된 측면은 본 개시의 범주 내에 있다.
본원에서 사용되는 용어 "공통 서열(consensus　sequence)"은 일련의 다중 서열을 배열함으로써 결정되고, 다중 서열의 각각의 상응하는 위치에서 우선적으로 선택된 아미노산 또는 염기를 대표하는 이상적인 서열을 규정하는 아미노산 또는 핵산 서열을 나타낸다. 일련의 다중 서열의 서열에 따라, 일련의 서열에 대한 공통 서열은 0, 1, 몇 개, 또는 그 이상의 치환에 의해 각각의 서열이 상이할 수 있다. 또한, 일련의 다중 서열의 서열에 따라, 시리즈에 대해 하나 이상의 공통 서열이 결정될 수 있다. 공통 서열의 생성은 집중적인 수학적 분석이 시행될 수 있다. 다양한 소프트웨어 프로그램이 공통 서열을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "CRISPR"은 클러스터링된 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회문 반복 경로에 의존하는 서열 특이적 유전자 조작 기법을 나타낸다. CRISPR은 유전자 편집 및/또는 유전자 조절을 수행하기 위하여, 뿐만 아니라 표적 단백질을 특정 게놈 위치로 단순화하기 위하여 사용될 수 있다. 유전자 편집은 표적 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 폴리뉴클레오타이드 서열에의 결실, 삽입, 또는 염기 치환의 도입을 통해 변화된 유전자 조작 유형을 나타낸다. 일부 측면으로, CRISPR-매개된 유전자 편집은 편집을 수행하기 위하여 비상동성 단부-연결 (NHEJ) 또는 상동성 재조합 경로를 활용한다. 유전자 조절은 단백질 또는 RNA와 같은 특정 유전자 생성물의 생성을 증가시키거나 감소시키는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "gRNA" 또는 "가이드 RNA"는 CRISPR 기법을 사용하는 교정을 위해 특이적 유전자를 표적화하기 위해 사용된 가이드 RNA 서열을 나타낸다. 표적 특이성을 위해 gRNA 및 도너 치료용 폴리뉴클레오타이드를 설계하는 기법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Doench, J., et al. Nature biotechnology 2014; 32(12):1262-7, Mohr, S. et al. (2016) FEBS Journal 283: 3232-38, 및　Graham, D., et al. Genome Biol. 2015; 16: 260.　gRNA는 CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 CRIPSPR RNA (tracrRNA)를 포함하는 융합 폴리뉴클레오타이드; 또는 CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스-활성화 CRIPSPR RNA (tracrRNA)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 그것으로 이루어진다. 일부 측면으로, gRNA는 합성이다 (Kelley, M. et al. (2016) J of Biotechnology 233 (2016) 74-83).　본원에서 사용되는 바, gRNA의 생물학적 동등물로는, 한정하는 것은 아니지만, 세포의 게놈의 특정 영역과 같은 특정 뉴클레오타이드 서열로 Cas9 또는 그것의 동등물을 안내할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 표적화 분자를 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "세포감소 치료법"은 한정하는 것은 아니지만, 화학요법, 냉동요법, 및 방사선 요법을 포함한다. 세포의 증식을 감소시키기 위해 작용하는 작용제는 기술분야에 알려져 있고 광범위하게 사용된다. 암 세포가 분할할 때에만 그것들을 사멸시키는 화학요법 약물은 세포-주기 특이적이라고 명명된다. 이들 약물로는 토포이성질화제 억제제 및 항-대사산물을 포함한, S-자형으로 작용하는 작용제를 들 수 있다.
토포이성질화제 억제제는 토포이성질화제 효소 (토포이성질화제 I 및 II)의 작용을 간섭하는 약물이다. 화학 처리 과정 중에, 토포이성질화제 효소는 복제에 필요한 DNA의 구조의 조작을 제어하고, 따라서 세포 주기 특이적이다. 토포이성질화제 I 억제제의 예로는 상기 열거된 캄프토테신 유사체, 이리노테칸 및 토포테칸을 들 수 있다. 토포이성질화제 II 억제제의 예로는 암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 및 테니포시드를 들 수 있다.
항대사산물은 보통 정상적인 대사 기질의 유사체로, 자주 염색체 복제에 관여하는 과정을 간섭한다. 이것은 주기의 매우 특이적인 단계에서 세포를 공격한다. 항대사산물로는 엽산 길항물질, 예컨대, 메토트렉세이트; 피리미딘 길항물질, 예컨대, 5-플루오로우라실, 폭스우리딘, 시타라빈, 카페시타빈, 및 겜시타빈; 푸린 길항물질, 예컨대, 6-메캅토푸린 및 6-티오구아닌; 아데노신 탈아민효소 억제제, 예컨대, 클라드리빈, 플루다라빈, 넬라라빈 및 펜토스타틴; 등을 들 수 있다.
식물 알카로이드는 특정 유형의 식물로부터 유래된다. 빈카 알카로이드는 페리윙클 식물 (카타란투스 로세아(Catharanthus rosea))로부터 만들어진다. 탁산(taxane)은 주목나무 (taxus)의 나무껍질로부터 만들어진다. 빈카 알카로이드 및 탁산은 또한 항미세소관제(antimicrotubule agent)로서 알려져 있다. 포도필로톡신(podophyllotoxin)은 메이 애플 (May apple) 식물로부터 유래된다. 캄프토테칸 유사체는 아시아의 "해피 트리(Happy Tree)"(캄프토테카 아쿠미나타(Camptotheca acuminata))로부터 유래된다. 포도필로톡신 및 캄프토테칸 유사체는 또한 토포이성질화제 억제제로서 분류된다. 식물 알카로이드는 일반적으로 세포-주기 특이적이다.
이들 작용제의 예로는 빈카 알카로이드, 예컨대, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 비노렐빈; 탁산, 예컨대, 파클리탁셀 및 도세탁셀; 포도필로톡신, 예컨대, 에토포시드 및 테니소피드; 및 캄프토테칸 유사체, 예컨대, 이리노테칸 및 토포테칸을 들 수 있다.
냉동요법은, 한정하는 것은 아니지만, 온도를 감소시키는 것을 포함하는 치료법, 예를 들어, 저체온 요법을 포함한다.
방사선 요법은, 한정하는 것은 아니지만, 기술분야에 알려져 있는 것과 같이, 방사선, 예컨대, 이온화 방사선, UV 방사선에 대한 노출을 포함한다. 예시의 투여량은, 한정하는 것은 아니지만, 적어도 약 2 Gy 내지 약 10 Gy 이하의 범위의 이온화 방사선의 용량 및/또는 적어도 약 5 J/m2　내지 약 50 J/m2 이하의 범위, 통사적으로 약 10 J/m2의 자외선 방사선 용량을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "검출 가능한 마커"는 직접 또는 간접적으로 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 적어도 하나의 마커를 나타낸다. 이런 마커의 완전하지 않은 목록은 예를 들어 비색법, 형광, 발광, 예컨대 양고추냉이 과산화효소, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 형광, 발광 염료와 같은 발색단, 전자 현미경에 의해 또는 전도성, 전류 측정, 전압 측정, 임피던스와 같은 전기적 특성에 의해 검출되는 전자 밀도를 가진 기, 검출 가능한 기, 예를 들어 그것의 분자가 그것의 물리적 및/또는 화학적 특성의 검출 가능한 변형을 유도하기에 충분한 크기의 것인 기에 의해 검출 가능한 신호를 생성하는 효소를 포함하며, 이러한 검출은 회절, 표면 플라즈마 공명, 표면 변이, 접촉각 변화와 같은 광학적 방법 또는 원자력 분광법, 터널 효과와, 또는 32P,　35S　또는　125I와 같은 방사능 분자와 같은 물리적 방법에 의해 이루어질 수 있다.
"유효량" 또는 "효과적인 양"은 포유류 또는 다른 대상체의 치료를 위해 투여될 때, 질환에 대한 이러한 치료를 이루기에 충분한 작용제의 양, 또는 둘 이상의 작용제의 조합된 양을 나타낸다. "유효량"은 작용제(들), 질환 및 그것의 중증도 및 치료될 대상체의 연령, 체중 등에 따라 달라질 것이다.
용어 "암호화하는"은 그것이 핵산 서열에 적용될 때와 같이, 만약, 그것의 천연 상태에서 또는 기술분야에 지식을 가진 사람들에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 조작될 때, 폴리펩타이드 및/또는 그것의 단편에 대한 mRNA를 생성하기 위해 전사 및/또는 번역될 수 있다면, 폴리펩타이드를 "암호화하는" 것으로 말할 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 안티센스 가닥은 이러한 핵산의 보체이고, 암호화 서열은 이로부터 추론될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "인핸서"는 발현될 핵산 서열과 관련하여 그것의 위치 및 방향과 무관하게 핵산 서열의 전사를 증대, 개량 또는 개선시키는 서열 요소를 나타낸다. 인핸서는 단일 프로모터로부터 또는 동시에 하나 이상의 프로모터로부터의 전사를 향상시킬 수 있다. 이런 전사 개선 기능성이 보유되거나 또는 실질적으로 보유되는 (예컨대, 야생형 활성의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%, 즉, 전장 서열의 활성)한, 야생형 인핸서 서열의 임의의 절단된, 돌연변이된 또는 그렇지 않으면 변형된 변이체가 또한 상기 정의 내에 있다.
한 측면으로, 용어 항체의 "동등물" 또는 생물학적 동등물"은 ELISA 또는 다른 적합한 방법에 의해 측정되는 바 그것의 에피토프 단백질 또는 그것의 단편에 선택적으로 결합하는 항체의 능력을 의미한다. 생물학적으로 동등한 항체는, 한정하는 것은 아니지만, 참조 항체와 동일한 에티토프에 결합하는 그런 항체, 펩타이드, 항체 단편, 항체 변이체, 항체 유도체 및 항체 모방물을 포함한다.
분명한 설명 없이, 그리고 다르게 의도되지 않는 한, 본 개시가 폴리펩타이드, 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체에 관련될 때, 이것들의 동등물 또는 생물학적으로 동등물이 본 개시의 범주 내에 있는 것으로 의도된다고 추론되어야 한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "그것의 생물학적 동등물"은 참조 단백질, 항체, 폴리펩타이드 또는 핵산을 언급할 때 "그것의 동등물"과 동의적인 것으로 의도되고, 최소한의 상동성을 가지면서 여전히 원하는 구조 또는 기능성을 유지하고 잇는 것들을 의도한다. 본원에서 구체적으로 인용되지 않는 한, 본원에서 언급된 임의의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 또한 그것들의 동등물을 포함하는 것으로 고려된다. 예를 들어, 동등물은 적어도 약 70% 상동성 또는 동일성, 또는 적어도 80% 상동성 또는 동일성 및 대안으로, 또는 적어도 약 85%, 또는 대안으로 적어도 약 90%, 또는 대안으로 적어도 약 95%, 또는 대안으로 98% 퍼센트 상동성 또는 동일성을 의도하며 참조 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산에 대해 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 대안으로, 폴리뉴클레오타이드를 언급할 때, 그것의 동등물은 엄격한 조건 하에서 참조 폴리뉴클레오타이드 또는 그것의 보체에 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드이다.
또 다른 서열에 대해 특정 백분율 (예를 들어 80%, 85%, 90%, 또는 95%)의 "서열 동일성"을 가지는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 (또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역)은, 정렬될 때, 염기 (또는 아미노산)의 그 백분율이 두 서열을 비교할 때 동일한 것을 의미한다. 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 기술분야에 알려져 있는 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1에 기재되어 있는 것들을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게, 디폴트 파라미터가 정렬에 대해 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST이다. 특히, 바람직한 프로그램은 다음의 디폴트 파라미터를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP이다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양 가닥; 컷오프 = 60; 예상 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개 서열; 분류 = 고 점수; 데이터베이스 = 비중복, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세한 설명은 다음의 인터넷 주소에서 알아볼 수 있다: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
본원에서 사용되는 바, 용어 "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 계속해서 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 나타낸다. 만약 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA로부터 유래된다면, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 유전자의 발현 수준은 세포 또는 조직 샘플에서 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 결정될 수 있다. 한 측면으로, 한 샘플로부터의 유전자의 발현 수준은 대조군 또는 참조 샘플로부터의 그 유전자의 발현 수준과 직접 비교될 수 있다. 다른 측면으로, 한 샘플로부터의 유전자의 발현 수준은 화합물의 투여 후 동일한 샘플로부터의 그 유전자의 발현 수준과 직접 비교될 수 있다.
구절 "제1선" 또는 '제2선" 또는 "제3선"은 환자에 의해 수용되는 치료 순서를 나타낸다. 제1선 치료법 양생법은 첫 번째로 주어지는 치료인 반면, 제2선 또는 제3선 치료법은 각각, 제1선 치료법 후에 또는 제2선 치료법 후에 제공된다. 미국 국립 암 연구소는 제1선 치료법을 "질환 또는 장애에 대한 제1 치료"로서 정의한다. 암 환자에서, 일차 치료는 수술, 화학요법, 방사선 요법, 또는 이들 치료법의 조합일 수 있다. 제1선 치료법은 또한 기술분야의 숙련된 사람들에게는 "일차 치료법 및 일차 치료"로서 언급된다. www.cancer.gov의 국립 암 연구소 웹사이트 참조 (마지막 방문 기록, 2008. 5. 1). 전형적으로, 환자는 환자가 제1선 치료법에 대해 또는 제1선 치료법이 중단된 후에 양성 임상 또는 하위임상 반응을 나타내지 않았기 때문에 후속적인 화학요법 양생법이 제공된다.
본원에서 사용되는 바, 둘 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 사용될 때, "상동성" 또는 "동일한", 퍼센트 "동일성" 또는 "유사성"은 동일하거나 명시된 영역 (예컨대, 본원에서 기술된 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 본원에서 기술된 항체의 아미노산 서열)에 걸쳐 동일한, 예컨대, 적어도 60% 동일성, 바람직하게 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 동일성을 가진 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 명시된 백분율을 가진 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 나타낸다. 상동성은 비교를 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 차지된다면, 분자는 그 위치에서 상동성이다. 서열간 상동성 정도는 그 서열에 의해 공유된 매치되는 또는 상동하는 위치의 수의 함수이다. 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 기술분야에 알려져 있는 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1에 기재되어 있는 것들을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게, 디폴트 파라미터가 정렬에 대해 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터를 사용하는 BLAST이다. 특히, 바람직한 프로그램은 다음의 디폴트 파라미터를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP이다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양 가닥; 컷오프 = 60; 예상 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개 서열; 분류 = 고 점수; 데이터베이스 = 비중복, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세한 설명은 다음의 인터넷 주소에서 알아볼 수 있다: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST. 용어 "상동성" 또는 "동일한", 퍼센트 "동일성" 또는 "유사성"은 또한, 테스트 서열의 보체를 나타내거나, 또는 그것에 적용될 수 있다. 용어는 또한 결실 및/또는 첨가를 가진 서열뿐만 아니라, 치환을 가진 서열을 포함한다. 본원에서 기술되는 것과 같이, 바람직한 알고리즘은 갭 등을 설명할 수 있다. 바람직하게, 동일성은 적어도 약 25개 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 길이의 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게 적어도 50 내지 100개 아미노산 또는 뉴클레오타이드 길이의 영역에 걸쳐 존재한다. "미관련" 또는 "비상동성" 서열은 본원에 개시된 서열 중 하나와 40% 미만의 동일성, 또는 대안으로 25% 미만의 동일성을 공유한다.
"혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 반응하여 뉴클레오타이드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화된 복합체를 형성하는 반응을 나타낸다. 수소 결합은 왓슨-크릭 염기쌍 형성, 후그스타인 결합에 의해, 또는 임의의 다른 서열-특이적 방식으로 일어날 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자체-혼성화 가닥, 또는 이것들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 보다 광범위한 과정의 단계, 예컨대 PCR 반응의 개시, 또는 리보자임에 의한 폴리뉴클레오타이드의 효소적 절단으로 구성될 수 있다.
엄격한 혼성화 조건의 예로는 다음을 포함한다: 약 25℃ 내지 약 37℃의 인큐베이션 온도; 약 6x SSC 내지 약 10x SSC의 혼성화 완충제 농도; 약 0% 내지 약 25%의 포름아미드 농도; 및 약 4x SSC 내지 약 8x SSC의 세척 용액. 중간 혼성화 조건의 예는 다음을 포함한다: 약 40℃ 내지 약 50℃의 인큐베이션 온도; 약 9x SSC 내지 약 2x SSC의 완충제 농도; 약 30% 내지 약 50%의 포름아미드 농도; 및 약 5x SSC 내지 약 2x SSC의 세척 용액. 엄격도가 높은 조건의 예는 다음을 포함한다: 약 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도; 약 1x SSC 내지 약 0.1x SSC의 완충제 농도; 약 55% 내지 약 75%의 포름아미드 농도; 및 약 1x SSC, 0.1x SSC의 세척 용액, 또는 탈이온수. 일반적으로, 혼성화 인큐베이션 시간은 5분 내지 24시간이고, 세척 단계는 1, 2회, 또는 그 이상이며, 세척 인큐베이션 시간은 약 1, 2, 또는 15분이다. SSC는 0.15 M NaCl 및 15 mM 시트레이트 완충제이다. 다른 완충 시스템을 사용하는 SSC의 동등물이 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 용어 "분리된"은 다른 물질이 실질적으로 없는 분자 또는 생물학적 물질 또는 세포 물질을 나타낸다. 한 측면으로, 용어 "분리된"은 자연적인 공급원에 존재하는 다른 DNA 또는 RNA, 또는 단백질 또는 폴리펩타이드, 또는 세포 또는 세포 소기관, 또는 조직 또는 장기로부터 각각 분리된 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA, 또는 단백질 또는 폴리펩타이드 (예컨대, 항체 또는 그것의 유도체), 또는 세포 또는 세포 소기관, 또는 조직 또는 장기를 나타낸다. 용어 "분리된"은 또한 재조합 DNA 기법에 의해 제조될 때 실질적으로 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지가 없는, 또는 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 없는 핵산 또는 펩타이드를 나타낸다. 더욱이, "분리된 핵산"은 단편으로서 자연적으로 발생하지 않고 자연적인 상태에서 발견되지 않을 핵산 단편을 포함하는 것을 의미한다. 용어 "분리된"은 또한 본원에서 다른 세포 단백질로부터 분리된 폴리펩타이드를 나타내기 위해 사용되고 정제된 및 재조합 폴리펩타이드를 모두 포함하는 것으로 의미된다. 용어 "분리된"은 또한 본원에서 다른 세포 또는 조직으로부터 분리된 세포 또는 조직을 나타내기 위해 사용되고 배양된 및 조작된 세포 또는 장기를 모두 포함하는 것으로 의미된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "분리된 세포"는 일반적으로 조직의 다른 세포로부터 실질적으로 분리되는 세포를 나타낸다.
"면역 세포"는, 예컨대, 골수에서 생성된 조혈 줄기 세포 (HSC)로부터 유래되는 백색 혈액 세포 (백혈구), 림프구 (T 세포, B 세포, 천연 살해 (NK) 세포) 및 골수-유래 세포 (호중구, 호산성 세포, 호염기성 세포, 단핵세포, 대식세포, 수지상 세포)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "링커 서열"은 1 내지 10회, 또는 대안으로 1 내지 약 8회, 또는 대안으로 1 내지 약 6회, 또는 대안으로 약 5회, 또는 4회 또는 대안으로 3회, 또는 대안으로 2회 반복될 수 있는, 1 내지 10개, 또는 대안으로, 8개 아미노산, 또는 대안으로 6개 아미노산, 또는 대안으로 5개 아미노산을 포함하는 임의의 아미노산 서열과 관련된다. 예를 들어, 링커는 3회 반복되는 펜타펩타이드로 이루어진 최대 15개 아미노산을 포함할 수 있다. 한 측면으로, 링커 서열은 gly-gly-gly-gly-ser의 3개의 복사물을 포함하는 (글리신4세린)3 가요성폴리펩타이드 링커이다.
"종양 조직 유형에 상응하는 정상 세포"는 종양 조직돠 동일 조직 유형으로부터의 정상 세포를 나타낸다. 비제한적인 예는 폐 종양을 가진 환자로부터의 정상 폐 세포, 또는 결장 종양을 가진 환자로부터의 정상 결장 세포이다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "T 세포"는 흉선에서 성숙하는 림프구 유형을 나타낸다. T 세포는 세포-매개된 면역에서 중요한 역할을 하고 다른 림프구, 예컨대 B 세포와, 세포 표면 상의 T-세포 수용체의 존재에 의해 구별된다. T-세포는 분리되거나 또는 상업적으로 입수 가능한 공급원으로부터 얻어질 수 있다. "T 세포"는 T-헬퍼 세포 (CD4+ 세포), 세포독성 T-세포 (CD8+ 세포), 천연 살해 T-세포, T-조절 세포 (Treg) 및 감마-델타 T 세포를 포함한, CD3을 발현하는 면역 세포의 모든 유형을 포함한다. "세포독성 세포"는 CD8+ T 세포, 천연 살해 (NK) 세포, 및 호중구를 포함하며, 이들 세포는 세포독성 반응을 매개할 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 T-세포주의 비제한적인 예로는 주(line) BCL2 (AAA) Jurkat (ATCC® CRL-2902TM), BCL2 (S70A) Jurkat (ATCC® CRL-2900TM), BCL2 (S87A) Jurkat (ATCC® CRL-2901TM), BCL2 Jurkat (ATCC® CRL-2899TM), Neo Jurkat (ATCC® CRL-2898TM), TALL-104 세포독성 인간 T 세포주 (ATCC # CRL-11386)를 들 수 있다. 추가의 예로는, 한정하는 것은 아니지만 성숙한 T-세포주, 예컨대, Deglis, EBT-8, HPB-MLp-W, HUT 78, HUT 102, Karpas 384, Ki 225, My-La, Se-Ax, SKW-3, SMZ-1 및 T34; 및 미성숙 T-세포주, 예컨대, ALL-SIL, Be13, CCRF-CEM, CML-T1, DND-41, DU.528, EU-9, HD-Mar, HPB-ALL, H-SB2, HT-1, JK-T1, Jurkat, Karpas 45, KE-37, KOPT-K1, K-T1, L-KAW, Loucy, MAT, MOLT-1, MOLT 3, MOLT-4, MOLT 13, MOLT-16, MT-1, MT-ALL, P12/Ichikawa, Peer, PER0117, PER-255, PF-382, PFI-285, RPMI-8402, ST-4, SUP-T1 to T14, TALL-1, TALL-101, TALL-103/2, TALL-104, TALL-105, TALL-106, TALL-107, TALL-197, TK-6, TLBR-1, -2, -3, 및 -4, CCRF-HSB-2 (CCL-120.1), J.RT3-T3.5 (ATCC TIB-153), J45.01 (ATCC CRL-1990), J.CaM1.6 (ATCC CRL-2063), RS4;11 (ATCC CRL-1873), CCRF-CEM (ATCC CRM-CCL-119); 및 피부 T-세포 림프종 주, 예컨대, HuT78 (ATCC CRM-TIB-161), MJ[G11] (ATCC CRL-8294), HuT102 (ATCC TIB-162)를 들 수 있다. 한정하는 것은 아니지만 REH, NALL-1, KM-3, L92-221을 포함한 널(Null) 백혈병 세포주는 면역 세포의 또 다른 상업적으로 입수 가능한 공급원인데, 다른 백혈병 및 림프종으로부터 유래된 세포주, 예컨대 K562 적혈구백혈병, THP-1 단핵세포성 백혈병, U937 림프종, HEL 적혈구백혈병, HL60 백혈병, HMC-1 백혈병, KG-1 백혈병, U266 골수종과 같다. 이러한 상업적으로 입수 가능한 세포주의 비제한적인 예시의 공급원으로는 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션 (American Type Culture Collection), 또는 ATCC (http://www.atcc.org/) 및 독일 미생물 및 세포 배양 센터 (https://www.dsmz.de/)를 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 또한 천연 살해 세포로도 알려져 있는 용어 "NK 세포"는 골수에서 기원하고 선천성 면역 체계에서 중요한 역할을 하는 림프구 유형을 나타낸다. NK 세포는 항체 및 세포 표면 상에 주요 조직적합성 복합체의 부재시에도, 바이러스-감염 세포, 종양 세포 또는 스트레스를 받은 세포에 대한 신속한 면역 반응을 제공한다. NK 세포는 분리되거나 상업적으로 입수 가능한 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 상업적인 NK 세포주의 비제한적인 예로는 주 NK-92 (ATCC® CRL-2407TM), NK-92MI (ATCC® CRL-2408TM)를 들 수 있다. 추가의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, NK 주 HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90, 및 YT를 들 수 있다. 이러한 상업적으로 입수 가능한 세포주의 비제한적인 예시의 공급원은 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션, 또는 ATCC, (http://www.atcc.org/) 및 독일 미생물 및 세포 배양 센터 (https://www.dsmz.de/)를 포함한다.
본원에서 조절 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 사용되는 바, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 조절 폴리뉴클레오타이드와 그것에 연결되는 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 결합이, 특정 단백질이 조절 폴리뉴클레오타이드에 결합될 때, 연결된 폴리뉴클레오타이드가 전사되도록 하는 결합을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 세포, 조직, 또는 장기와 관련하여 용어 "과다발현"은 대조군 세포, 대조군 조직, 또는 장기에서 생성되는 양보다 많은 양으로 단백질을 발현하는 것이다. 과다발현된 단백질은 숙주 세포에 대해 내인성이거나 숙주 세포에 대해 외인성일 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호교환적으로 사용되며 그것이 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이것들의 유사체이든 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고 알려져 있거나 알려져 있지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오타이드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편 (예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보솜 RNA, RNAi, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오타이드 및 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오타이드의 조립 전 또는 후에 이루어질 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 구성요소에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 중합화 후에, 예컨대 표지화 구성요소와의 컨쥬게이션에 의해 추가로 변형될 수 있다. 용어는 또한 이중- 및 단일-가닥 분자 둘 다를 나타낸다. 다르게 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오타이드인 이 기술의 임의의 측면은 이중 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 알려져 있거나 예상되는 2개의 상보하는 단일 가닥 형태의 각각을 전부 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "핵산 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드인, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 나타내기 위하여 상호교환적으로 사용된다. 그러므로, 이 용어는, 한정하는 것은 아니지만, 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 자연적인, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비자연적인, 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "프로모터"는 코딩 서열, 예컨대 유전자의 발현을 조절하는 임의의 서열을 나타낸다. 프로모터는 예를 들어 구성성, 유도성, 억제성, 또는 조직-특이적일 수 있다. "프로모터"는 전사 개시 및 속도가 제어되는 폴리뉴클레오타이드 서열의 영역인 제어 서열이다. 이것은 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전자 요소, 예컨대 RNA 중합효소 및 다른 전사 인자를 함유할 수 있다. 프로모터의 비제한적인 예로는 EF1알파 프로모터 및 CMV 프로모터를 들 수 있다. EF1알파 서열은 기술분야에 알려져 있다 (예컨대, addgene.org/11154/sequences/; ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/J04617 (각각 2019년 3월 13일에 최종 액세스됨), 및 Zheng and Baum (2014) Int'l. J. Med. Sci. 11(5):404-408 참조). CMV 프로모터 서열은 기술분야에 알려져 있다 (예컨대, snapgene.com/resources/plasmid-files/?set=basic_cloning_vectors&plasmid=CMV_promoter (2019년 3월 13일에 최종 액세스됨) 및 Zheng and Baum (2014), 상기동일, 참조).
용어 "단백질", "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 상호교환적으로 사용되고 가장 넓은 의미로 둘 이상의 하위유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티드 모방물의 화합물을 나타낸다. 하위유닛은 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다. 또 다른 측면으로, 하위유닛은 다른 결합, 예컨대 에스테르, 에테르, 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해햐 하고 단백질의 서열 또는 펩타이드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 대한 제한은 없다. 본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 및 L 광학 이성질체, 아미노산 유사체 및 펩티드 모방물을 포함하여, 자연적인 및/또는 비자연적인 또는 합성 아미노산을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "정제된"은 절대 순도를 필요로 하지 않는다; 오히려, 상대적인 용어로서 의도된다. 그러므로, 예를 들어, 정제된 핵산, 펩타이드, 단백질, 생물학적 복합체 또는 다른 활성 화합물은 전체적으로 또는 부분적으로 단백질 또는 다른 오염물질로부터 분리된 것이다. 일반적으로, 본 개시 내에서 사용하기 위한 실질적으로 정제된 펩타이드, 단백질, 생물학적 복합체, 또는 다른 활성 화합물은 치료적 투여를 위한 완전한 제약학적 제제로 제약학적 담체, 부형제, 완충제, 흡수 향상제, 안정화제, 보존제, 보조제 또는 다른 공-성분과 혼합 또는 형성되기 전에 조제물에 존재하는 모든 거대분자 종의 80% 이상을 포함한다. 보다 전형적으로, 펩타이드, 단백질, 생물학적 복합체 또는 다른 활성 화합물은 다른 제제 성분과의 혼합 전에 정제된 조제물에 존재하는 모든 거대분자 종의 90% 이상, 자주 95% 이상을 나타내도록 정제된다. 다른 경우에, 정제된 조제물은 본질적으로 균일하고, 이때 다른 거대분자 종은 종래 기법에 의해 검출될 수 없다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "정제 마커"는 정제 및 확인에 유용한 적어도 하나의 마커를 나타낸다. 이 마커의 완전하지 않은 목록은 His, lacZ, GST, 말토스-결합 단백질, NusA, BCCP, c-myc, CaM, FLAG, GFP, YFP, 체리(cherry), 티로레독신(thioredoxin), 폴리(NANP), V5, Snap, HA, 키틴-결합 단백질, Sof태그 1, Sof태그 3, Strep,　또는　S-단백질을 포함한다. 적합한 직접 또는 간접 형광 마커는 FLAG, GFP, YFP, RFP, dTomato, cherry, Cy3, Cy 5, Cy 5.5, Cy 7, DNP, AMCA, 비오틴, 디곡시게닌, Tamra, 텍사스 레드(Texas red), 로다민, 알렉사 플루오르(Alexa fluors), FITC, TRITC 또는 임의의 다른 형광 염료 또는 합텐을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "재조합 단백질"은 재조합 DNA 기법에 의해 생성되는 폴리펩타이드를 나타내며, 여기서 일반적으로, 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA가 결국 이종성 단백질을 제조하기 위해 숙주 세포를 형질전환하는 데 사용되는 적합한 발현 벡터로 삽입된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "특이적 결합"은 적어도 10-6　M의 결합 친화도를 가지는 항체와 항원 사이의 접촉을 의미한다. 특정 측면으로, 항체는 적어도 약 10-7　M, 바람직하게 10-8　M, 10-9　M, 10-10　M, 10-11　M, 또는 10-12　M의 친화도로 결합한다.
"고체 종양"은 일반적으로 낭포 또는 액체 구역을 함유하지 않는 비정상적인 조직 덩어리이다. 고체 종양은 양성이거나 악성, 전이성이거나 비전이성일 수 있다. 상이한 유형의 고체 종양은 그것을 형성하는 세포의 유형에 대해 명명된다. 고체 종양의 예로는 육종, 암종, 및 림프종을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "자살 유전자"는 세포 세포자멸사를 유도할 수 있는 유전자이고; 비제한적인 예로는 HSV-TK (헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제), 시토신 탈아민효소, 니트로환원효소, 카르복실 에스테라제, 시토크롬 P450 또는 PNP (퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제), 절단된 EGFR, 또는 유도성 카스파제 ("iCasp")를 들 수 있다. 자살 유전자는 다양한 경로를 따라 기능할 수 있고, 일부 경우에, 소분자와 같은 유도제에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어, iCasp 자살 유전자는 유도체에 결합하도록 최적화된 단백질에 작동 가능하게 연결된 카스파제 단백질의 일부를 포함하며; 자살 유전자를 포함하는 세포로의 유도제의 도입은 카스파제의 활성화 및 상기 세포의 후속적인 세포자멸사를 초래한다.
용어 "형질도입되다" 또는 "형질도입"은 그것이 키메라 항원 수용체 세포의 생성에 적용될때 외래 뉴클레오타이드 서열이 세포로 도입되는 과정을 나타낸다. 일부 구체예에서, 이런 형질도입은 벡터를 통해 실시된다.
본원에서 사용되는 바, 대상체에서 질환의 "치료하는" 또는 "치료"는 (1) 질환의 성향이 있거나 아직 질환의 증상을 나타내지 않은 대상체에서 증상 또는 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (2) 질환을 억제하거나 그것의 발생을 막는 것; 또는 (3) 질환 또는 질환의 증상을 개선하거나 퇴행을 유도하는 것을 나타낸다. 기술분야에서 이해되는 것과 같이, "치료"는 임상 결과를 포함하여 유익한 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 기술의 목적을 위해, 유익한 또는 원하는 결과는, 한정하는 것은 아니지만, 검출 가능하거나 검출 가능하지 않거나간에, 하나 이상의 증상의 경감 또는 개선, 상태 (질환을 포함함)의 정도의 감소, 상태 (질환을 포함함)의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태, 상태 (질환을 포함함)의 지연 또는 둔화, 상태 (질환을 포함함)의 개선 또는 완화, (부분적이거나 전체적인) 상태 및 차도 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 개시된 조성물 및 방법을 함유하는 치료는 제1선, 제2선, 제3선, 제4선, 제5선 치료법일 수 있고 단독 치료법으로서 또는 다른 적절한 치료법과 함께 사용되도록 의도된다. 한 측면으로, 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 방지 또는 예방을 배제한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "벡터"는, 한정하는 것은 아니지만 플라스미드, 바이러스, 코스미드, 파지, BAC, YAC, 등을 포함한 상이한 숙주 사이에서의 전달을 위해 설계된 핵산 구성물을 나타낸다. 일부 구체예에서, 플라스미드 벡터는 상업적으로 입수 가능한 벡터로부터 제조될 수 있다. 다른 구체예에서, 바이러스 벡터는 배큘로바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV, 등으로부터 기술분야에 알려져 있는 기법에 따라 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
본원에서 사용되는 용어 "NKG2D"는 C-형 렉틴-유사 수용체의 CD94/NKG2 패밀리에 속하고 NK-유전자 복합체 및/또는 이것의 생물학적 동등물에 위치한 유전자 KLRK1 유전자에 의해 암호화되는 경막 단백질을 나타낸다. 이 단백질 또는 기저의 유전자의 비제한적인 예시의 서열은 유전자 카드 ID: GC12M011728, HGNC: 18788, Entrez Gene: 22914, Ensembl: ENSG00000213809, OMIM: 611817, 및 UniProtKB: P26718 (이들은 본원에 참조로 포함됨) 하에 찾아볼 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "BCMA" 및 "B-세포 성숙 항원"은 B-세포 활성화 인자 (BAFF)를 인식하고 TNFRSF17 유전자에 의해 암호화되는 TNF 수퍼패밀리에 속하는 단백질을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 이 단백질 또는 기저의 유전자의 비제한적인 예시의 서열은 유전자 카드 ID: GC16P012058, HGNC: 11913, Entrez Gene: 608, Ensembl: ENSG00000048462, OMIM: 109545, 및 UniProtKB: Q02223 (이들은 본원에 참조로 포함됨) 하에 찾아볼 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "SLAMF7", "CS1", 및 "CD319"는 다발성 골수종에서 정상 형질 세포 및 악성 형질 세포의 활발한 마커인 것으로 알려져 있고 SLAMF7 유전자에 의해 암호화된 단백질을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 이 단백질 또는 기저의 유전자의 비제한적인 예시의 서열은 유전자 카드 ID: GC01P160709, HGNC: 21394, Entrez Gene: 57823, Ensembl: ENSG00000026751, OMIM: 606625, 및 UniProtKB: Q9NQ25 (이들은 본원에 참조로 포함됨) 하에 찾아볼 수 있다.
상기 열거된 GenBank 수탁 번호 및 참고문헌의 각각과 관련된 서열들은 본원에 참조로 포함된다.
개시를 수행하기 위한 방식
면역조절 분자의 투여는 암 치료법으로서 추구된 것이다. 그러나, 전신성 투여와 관련된 심각한 부작용으로 인해 (Giovarelli, M. et al. (2000) J Immunol. 164:3200-3206; Lasek, W. et al. (2014) Cancer Immunol Immunother. 63:419-435), 효과적인 면역 반응을 이루기 위해 관련된 종양에서 고농도의 이들 면역조절 분자를 얻는 것이 어려웠다.
유전자 조작된 키메라 항원 수용체 (CAR) T-세포로의 자가 치료를 사용한 B-세포 림프종 및 백혈병에서 최근에 얻어진 전례없는 결과로 인해 (Maude, S.L. et al. (2014) New Engl. J. Med. 371:1507-1517; Porter, D.L. et al. (2011) New Engl. J. Med. 365:725-733), 많은 실험실에서 난소암, 전립선암, 및 췌장 종양을 포함한 고체 종양에 이 접근법을 적용하기 시작하였다. CAR 변형된 T-세포는 단클론성 항체의 HLA-무관 표적화 특이성을 활성화되지만 체크포인트 억제에는 반응하지 않는 T-세포의 세포용해성 활성, 증식, 및 호우밍 특성과 조합한다. 항원 발현 표적을 직접적으로 사멸시키는 능력으로 인해, CAR T-세포는 임의의 항원 양성 세포 또는 조직에 대해 고도로 독성이어서 고도로 종양 특이적 항체를 가지는 구성물 CAR가 필요하게 되었다. 지금까지, 인간 고체 종양에 대한 CAR 변형된 T-세포는 α-엽산 수용체, 메소텔린, 및 MUC-CD, PSMA, 및 다른 표적에 대해 구성되어 왔지만 대부분이 정상 조직에서 항원의 일부 표적 외 발현이 있었다. 이들 구성물은 환자에서 동일한 예상 결과를 나타내지 않았고, 따라서 새로운 표적을 확인하기 위한 추가적인 연구 및 고체 종양에 대해 사용될 수 있는 CAR T-세포 구성 방법에 대한 필요성이 강조되었다.
그러므로, 본 개시는 일부 측면으로, 항-BCMA 항체의 항원 결합 도메인인 암 또는 종양 항원에 특이적인 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR), 종양 또는 암 항원을 표적으로 하여 가용성 항체 단편을 분비하는 BsA-CAR 세포를 암호화하는 벡터, 및 그것의 사용 및 제조와 관련된 방법 및 조성물을 제공한다.
키메라 항원 수용체 및 이것의 용도
구성요소
본 개시는 암 또는 종양 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공하며, CAR은 세포외, 경막, 및 세포내 도메인을 포함하는 세포 활성화 모이어티를 포함하거나, 본질적으로 그것을 이루어지거나, 또는 그것으로 이루어진다. 세포외 도메인은 다르게는 항원 결합 도메인으로서 언급되는 표적-특이적 결합 요소를 포함한다. 세포내 도메인 또는 세포질 도메인은 동시자극성 신호전달 영역 및 제타 사슬 부분을 포함한다. CAR은 최대 300개 아미노산, 바람직하게 10 내지 100개 아미노산, 보다 바람직하게 25 내지 50개 아미노산의 스페이서 도메인을 선택적으로 추가로 포함할 수 있다.
스페이서 도메인. CAR은 최대 300개 아미노산, 바람직하게 10 내지 100개 아미노산, 보다 바람직하게 25 내지 50개 아미노산의 스페이서 도메인을 선택적으로 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 아미노산일 수 있다. 스페이서 도메인은, 예를 들어, 인간 Fc 도메인의 일부, CH3 도메인, 임의의 면역글로불린, 예컨대 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM, 또는 이것들의 변이체의 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예는 S228P, L235E, 및/또는 N297Q 돌연변이 (Kabat 넘버링에 따름)가 있거나 없는 IgG4 힌지를 포함할 수 있다. 추가적인 스페이서로는, 한정하는 것은 아니지만, CD4, CD8, 및 CD28 힌지 영역을 들 수 있다.
항원 결합 도메인. 특정 측면에서, 본 개시는 암 또는 종양 항원에 대해 특이적인 항원 결합 도메인을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 그것으로 이루어지는 CAR을 제공한다. 항원 결합 도메인은 임의의 적절한 종, 예컨대, 쥐과, 인간 또는 인간화된 서열로부터 유래될 수 있다.
일부 구체예에서, 항원 결합 도메인은 항-BCMA 항체 또는 BCMA-관련 항원에 결합하는 항체의 항원 결합 도메인을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 그것으로 이루어진다. 이들 항원에 특이적으로 결합하는 단클론성 항체는 상업적으로 입수 가능하다. 항원 결합 도메인은 임의의 적절한 종, 예컨대, 쥐과, 인간 또는 인간화된 서열로부터 유래될 수 있다. 한 측면으로, 항원 결합 도메인은 B-세포 성숙 항원 (BCMA) 및/또는 SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 및/또는 이것들의 각각의 동등물에 대한 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원 결합 도메인은 표적-특이적 항체 (즉, B-세포 성숙 항원 (BCMA) 및/또는 SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 및/또는 이것들의 각각의 동등물에 대한 항체)의 단편, 예를 들어, scFv를 포함하거나, 이것으로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이것으로 이루어진다. scFv 영역은 짧은 링커 펩타이드로 연결된, 면역글로불린의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역을 포함할 수 있다. 링커 펩타이드는 1 내지 50개 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 아미노산으로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, 링커는 글리신이 풍부하지만, 세린 또는 트레오닌을 함유할 수 있다.
본 개시의 다른 측면으로, 암 또는 종양 항체의 항원 결합 도메인은 다음 특성 중 하나 이상을 포함한다:
(a) 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열은 개시된 경쇄 서열 중 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인의 CDR에 대해 적어도 80% 동일한 하나 이상의 CDR을 포함한다;
(b) 중쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열은 개시된 중쇄 서열 중 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인의 CDR에 대해 적어도 80% 동일한 하나 이상의 CDR을 포함한다;
(c) 경쇄 면역글로불린 가변 도메인 서열은 개시된 경쇄 서열 중 임의의 서열의 경쇄 가변 도메인에 대해 적어도 80% 동일하다;
(d) HC 면역글로불린 가변 도메인 서열은 개시된 중쇄 서열 중 임의의 서열의 중쇄 가변 도메인에 대해 적어도 80% 동일하다; 및
(e) 항체는 개시된 서열 중 임의의 서열에 의해 결합된 에피토프와 중복하는 에피토프에 결합한다.
동등한 추가적인 예로는 항원 결합 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 보체에 매우 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대해 적어도 85%, 또는 대안으로 적어도 90%, 또는 대안으로 적어도 95%, 또는 대안으로 적어도 97%의 아미노산 동일성을 가지는 펩타이드를 들 수 있고, 여기서 매우 엄격한 조건은 약 55℃ 내지 약 68℃의 인큐베이션 온도; 약 1x SSC 내지 약 0.1x SSC의 완충제 농도; 약 55% 내지 약 75%의 포름아미드 농도; 및 약 1x SSC, 0.1x SSC의 세척 용액, 또는 탈이온수를 포함한다.
경막 도메인. 경막 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 경막 단백질로부터 유래될 수 있다. 본 개시에서 특히 사용되는 경막 영역은 CD8, CD28, CD3, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154, TCR로부터 유래될 수 있다. 대안으로, 경막 도메인은 합성일 수 있고, 이 경우에 그것은 우선적으로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함할 것이다. 바람직하게 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛이 합성 경막 도메인의 각 단부에서 발견될 것이다. 선택적으로, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 바람직하게 2 내지 10개 아미노산의 길이가 경막 도메인과 CAR의 세포질 신호전달 도메인 사이의 결합을 형성할 수 있다. 글리신-세린 더블렛이 특이 적합한 링커를 제공한다.
세포질 도메인. CAR의 세포질 도메인 또는 세포내 신호전달 도메인은 CAR이 참여한 면역 세포의 전통적인 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화에 기여한다. 세포내 신호전달 도메인은 이펙터 기능 신호를 변환시켜서 그것의 특정 기능을 수행하도록 면역 세포를 지시하는 단백질의 부분을 나타낸다. 전체 신호전달 도메인 또는 그것의 절단된 부분은 절단된 부분이 이펙터 기능 신호를 변환시키기에 충분한 한 사용될 수 있다. TCR 및 공-수용체 및 이것들의 유도체 또는 변이체의 세포질 서열은 CAR에서 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인으로서 기능할 수 있다. 본 개시에서 특히 사용되는 세포내 신호전달 도메인은 FcR, TCR, CD3, CDS, CD22, CD79a, CD79b, CD66d로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, CAR의 신호전달 도메인은 CD3 ζ 신호전달 도메인을 포함한다.
TCR을 통해 생성된 신호가 단독으로는 T 세포의 전체 활성화에 불충분하기 때문에, 이차 또는 동시 자극성 신호가 또한 필요할 수 있다. 그러므로, 동시 자극성 신호전달 분자의 세포내 영역, 이를테면, 한정하는 것은 아니지만, 단백질 CD27, CD28, 4- IBB (CD 137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 또는 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드의 세포내 도메인이 또한 CAR의 세포질 도메인에 포함될 수 있다. 예를 들어, CAR은 신호전달 도메인 (예컨대, CD3 ζ 신호전달 도메인)에 더불어 하나, 둘, 또는 그 이상의 동시 자극성 도메인을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체의 세포 활성화 모이어티는 CD8 단백질, CD28 단백질, 4-1BB 단백질, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, LFA-1, CD2, CD7, CD27, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD3-제타 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 그것의 단편을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어지는 T-세포 신호전달 도메인이다.
일부 구체예에서, 키메라 항원 수용체의 세포 활성화 모이어티는 CD8 단백질, CD28 단백질, 4-1BB 단백질, 및 CD3-제타 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 또는 그것의 단편을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어지는 T-세포 신호전달 도메인이다.
특정 구체예에서, CAR은 암 또는 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인, CD8 α 힌지 도메인, CD8 α 경막 도메인, 동시자극성 신호전달 영역, 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 또한 이것들로 이루어진다. 추가의 구체예에서, 동시자극성 신호전달 영역은 CD28 동시자극성 신호전달 영역 및 4-1BB 동시자극성 신호전달 영역 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다.
일부 구체예에서, CAR은 검출 가능한 마커 또는 정제 마커를 추가로 포함할 수 있다. 다른 측면으로, 본원에서 기술된 CAR은 조성물, 예컨대, 진단 또는 치료를 위한 제약학적으로 허용되는 담체에 함유된다.
스위치 메커니즘. 일부 구체예에서, CAR은 또한 CAR의 발현 및/또는 활성화를 제어하기 위한 스위치 메커니즘을 포함할 수 있다. 예를 들어, CAR은 세포외, 경막, 및 세포내 도메인을 포함하거나, 이것들로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이것들로 이루어질 수 있고, 여기서 세포외 도메인은 표지에 결합하는 표적-특이적 결합 요소, 결합 도메인, 또는 표적 세포상에 또는 표적 세포에 의해 발현되는 표적 항원 이외의 분자에 대해 특이적인 태그를 포함한다. 이러한 구체예에서, CAR의 특이성은 표적 항원 결합 도메인 및 표지, 결합 도메인, 또는 CAR 상의 태그에 의해 인식되거나 그것에 결합하는 도메인을 포함하거나, 이것들로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이것들로 이루어지는 제2 구성물에 의해 제공된다. 예컨대, WO 2013/044225, WO 2016/000304, WO 2015/057834, WO 2015/057852, WO 2016/070061, US 9,233,125, US 2016/0129109 참조. 이런 방식으로, CAR을 발현하는 T-세포는 대상체에게 투여될 수 있지만, BCMA-특이적 binding 도메인을 포함하는 제2 조성물이 투여될 때까지는 그것의 표적 항원 (즉, BCMA)에 결합할 수 없다.
본 개시의 CAR은 마찬가지로 그것의 기능을 활성화하기 위하여 (예컨대, US 2015/0368342, US 2016/0175359, US 2015/0368360 참조) 및/또는 T-세포 반응을 유도하기 위해 외인성 신호, 예컨대 소분자 약물을 활성화하기 위하여 (US 2016/0166613, Yung et al., Science, 2015) 멀티머화를 필요로 할 수 있다.
나아가, 개시된 CAR은 치료 후 CAR 세포의 세포 사멸을 유도하기 위하여 (Buddee et al., PLoS One, 2013) 또는 표적 항원에 대한 결합 후 CAR의 발현을 하향조절하기 위하여 (WO 2016/011210) "자살 스위치" (또한 "자살 유전자"로도 언급됨)를 포함할 수 있다. 비제한적인 예시의 자살 스위치 또는 자살 유전자는 iCasp이다.
일부 구체예에서, CAR은 검출 가능한 마커 또는 정제 마커를 추가로 포함할 수 있다. 다른 측면으로, 본원에서 기술된 CAR은 조성물, 예컨대, 진단 또는 치료를 위한 제약학적으로 허용되는 담체에 함유된다.
특정 구체예에서, CAR의 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인은 링커 펩타이드에 의해 선택적으로 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 일부 구체예에서, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역은 B-세포 성숙 항원 (BCMA) 및/또는 SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 및/또는 이것들의 각각의 동등물 중 어느 하나에 대한 항체의 관련 CDR 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 추가로 이것으로 이루어진다. 한 측면으로, 종양 표적화 항체는 BCMA를 표적으로 한다. 특정 구체예에서, CAR은 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이에 위치한 링커 폴리펩타이드를 추가로 포함하거나, 또는 대안으로 추가로 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 이것으로 이루어진다. 특정 구체예에서, 링커는 글리신-세린 링커이다. 추가의 구체예에서, 링커 폴리펩타이드는 서열 (글리신-세린)n (여기서 n은 1 내지 6의 정수임)을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 추가로 이것으로 이루어진다.
또한 CAR 구성물을 암호화하는 분리된 핵산이 제공된다. 핵산은 필요한 조절 서열, 예컨대, 숙주 세포, 예컨대, T 세포와 같은 포유류 또는 인간 숙주 세포에서의 발현을 위한 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 한 측면으로 프로모터는 CMV, MND, 또는 EF1알파 프로모터이다. 추가의 측면으로, CAR 폴리뉴클레오타이드는 암호화 폴리뉴클레오타이드에 대해 5'에 위치한 제2 프로모터 요소, 예컨대, CMV, MND, 및 EF1A 프로모터로부터 조절될 수 있는 마커 펩타이드 (예컨대, GFP)를 추가로 포함한다. 한 측면으로, 제2 프로모터는 EF1 알파 프로모터를 포함한다. 숙련된 전문가에게 명백한 것과 같이, 프로모터(들)는 숙주 발현 시스템에 대해 선택되고 숙주 및 발현 벡터 및 의도된 용도에 따라 다를 것이다.
분리된 핵산은 발현 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터 (5'와 3' LTR 사이) 또는 아데노바이러스 벡터 또는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 다른 벡터에 삽입될 수 있다. 도 1A는 이런 개시의 예시의 구성물이다. 명백한 바와 같이, 인간 환자에서 임상적으로 사용될 때, 마커 또는 정제 태그는 구성물로부터 생략될 것이다.
항체의 제조 방법
본 개시에서 사용하기 위한 항체는 구매하거나 기술분야에 공지되어 있고 본원에서 간단하게 기술되는 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 만약 새로운 항원이 발견되면, 항체 및 항체의 항원 결합 도메인을 제조하는 것이 필요할 것이다. 이것들의 제조 및 용도는 잘 알려져 있고, 예를 들어, Harlow, E. and Lane, D.,　Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999에서 개시된다. 항체는 기술분야에 알려져 있는 표준 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 항체의 예로는 (한정하는 것은 아니지만) 단클론성, 단일 사슬, 및 항체의 기능성 단편을 들 수 있다.
항체는 다양산 숙주, 예를 들어 염소, 토끼, 래트, 마우스, 인간, 및 기타에서 생성될 수 있다. 이들은 표적 항원 또는 면역원성 특성을 가지는 그것의 단편 또는 올리고펩타이드, 예컨대 암 또는 종양 관련 항원의 C-말단 단편 또는 분리된 폴리펩타이드, 예컨대 BCMA 또는 NKG2D로의 주사에 의해 면역화될 수 있다. 숙주 종에 따라, 다양한 보조제가 면역학적 반응을 증가시키기 위해 첨가되어 사용될 수 있다. 이러한 보조제로는, 한정하는 것은 아니지만, 프로인트, 수산화 알루미늄과 같은 미네랄 겔, 및 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가음이온, 펩타이드, 오일 에멀션, 키호울 림펫 헤모시아닌, 및 다이니트로페놀과 같은 표면 활성 물질을 들 수 있다. 인간에서 사용된 보조제 중에, BCG (Bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)이 특히 유용하다. 본 개시는 또한 분리된 폴리펩타이드 및 보조제를 제공한다.
특정 측면으로, 본 개시의 항체는 다클론성, 즉 상이한 아미노산 서열을 가지는 복수 유형의 항체의 혼합물이다. 한 측면으로, 다클론성 항체는 상이한 CDR을 가지는 복수 유형의 항체의 혼합물을 포함한다. 그로써, 상이한 항체를 생성하는 세포의 혼합물이 배양되고, 그 결과의 배양물로부터 정제된 항체가 사용될 수 있다 (WO 2004/061104 참조).
단클론성 항체 생성. 암 또는 종양 항원에 대한 단클론성 항체는 배양 중인 연속 세포주에 의해 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 기법으로는, 한정하는 것은 아니지만, 하이브리도마 기법 (예컨대, Kohler & Milstein, Nature 256: 495-497 (1975) 참조); 트리오마(trioma) 기법; 인간 B-세포 하이브리도마 기법 (예컨대, Kozbor et al., Immunol. Today 4: 72 (1983) 참조) 및 인간 단클론성 항체를 생성하기 위한 EBV 하이브리도마 기법 (예컨대, Cole et al., in: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985) 참조)을 들 수 있다. 인간 단클론성 항체는 이 기술의 실시에 이용될 수 있고 인간 하이브리도마를 사용함으로써 (예컨대, Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030 (1983) 참조) 또는 인간 B-세포를 시험관내에서 엡스타인 바 바이러스로 형질전환함으로써 (예컨대, Cole et al., in: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985) 참조) 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 영역을 암호화하는 핵산 집단이 분리될 수 있다. 항체의 보존된 영역을 암호화하는 서열로부터 유래된 프라이머를 이용하는 PCR이 집단으로부터 항체의 부분을 암호화하는 서열을 증폭시킨 후 항체 또는 그것의 단편, 예컨대 가변 도메인을 암호화하는 DNA를 증폭된 서열로부터 재구성하기 위해 사용된다. 이러한 증폭된 서열은 또한 파지 또는 박테리아 상의 융합 폴리펩타이드의 발현 및 디스플레이를 위한 다른 단백질-예컨대, 박테리오파지 코트, 또는 박테리아 세포 표면 단백질을 암호화하는 DNA에 융합될 수 있다. 증폭된 서열은 그런 후 발현될 수 잇고 추가로, 예컨대, 발현된 항체 또는 그것의 단편의 항원 또는 BCMA 관련 항원 폴리펩타이드 상에 존재하는 에피토프에 대한 친화도를 바탕으로 선택되거나 분리될 수 있다. 대안으로, 단클론성 항체를 발현하는 하이브리도마는 대상체를, 예컨대, 관련 항원 또는 그것의 단편의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 추가로 이것으로 이루어지는 분리된 폴리펩타이드로 면역화한 후, 대상체의 비장으로부터 일상적인 방법을 사용하여 분리함으로써 제조될 수 있다. 예컨대, Milstein et al., (Galfre and Milstein, Methods Enzymol　73: 3-46 (1981)) 참조. 표준 방법을 사용하여 하이브리도마를 스크리닝함으로써 다양한 특이성 (즉, 상이한 에피토프에 대한) 및 친화도를 가진 단클론성 항체가 생성될 것이다. 원하는 특성, 예컨대, 관련 항원 결합을 가진 선택된 단클론성 항체는 (i) 하이브리도마에 의해 발현된 채로 사용될 수 있거나, (ii) 그것의 특성을 변경하기 위하여 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)와 같은 분자에 결합될 수 있거나, 또는 (iii) 다양한 방법으로 분리되고, 서열분석되며 조작될 수 있는 단클론성 항체를 암호화하는 cDNA일 수 있다. 한 측면으로, 단클론성 항체는 불멸화된 세포에 융합된 인간 중쇄 도입유전자 및 경쇄 도입유전자를 포함하는 게놈을 가지는 형질도입 비인간 동물, 예컨대 형질도입 마우스로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다. 하이브리도마 기법은 기술분야에 알려져 있고 Harlow et al.,　Antibodies: A Laboratory Manual　Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 349 (1988); Hammerling et al.,　Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas,　563-681 (1981)에서 교시된 것들을 포함한다.
파지 디스플레이 기법. 상기에서 주지된 것과 같이, 본 개시의 항체는 재조합 DNA 및 파지 디스플레이 기술의 적용을 통해 생성될 수 있다. 예를 들어, BCMA 항체는 기술분야에 알려져 있는 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 기능성 항체 도메인은 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 운반하는 파지 입자의 표면에 드러난다. 원하는 결합 특성을 가진 파지는 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리 (예컨대, 인간 또는 쥐과)로부터 직접적으로 항원, 전형적으로 고체 표면 또는 비드에 결합된 또는 포획되어 있는 항원으로 선택함으로써 선택된다. 이들 방법에 사용된 파지는 전형적으로 fd를 포함하는 사상형 파지이고 Fab, Fv 또는 이황화 안정화된 Fv 항체 도메인을 가진 M13은 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질 중 어느 하나에 재조합에 의해 융합된다. 더불어, 방법은 관련 항원 풀리펩타이드, 예컨대, 폴리펩타이드 또는 그것의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대한 원하는 특이성을 가진 단클론성 Fab 단편의 신속하고 효과적인 확인을 허용하기 위해 Fab 발현 라이브러리의 구성을 위해 채택될 수 있다 (예컨대, Huse et al., Science 246: 1275-1281, 1989 참조). 본 개시의 분리된 항체를 만들기 위해 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 다른 예로는 Huston et al.,　Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,　85: 5879-5883 (1988); Chaudhary et al.,　Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,　87: 1066-1070 (1990); Brinkman et al.,　J. Immunol. Methods 182: 41-50 (1995); Ames et al.,　J. Immunol. Methods　184: 177-186 (1995); Kettleborough et al.,　Eur. J. Immunol.　24: 952-958 (1994); Persic et al.,　Gene　187: 9-18 (1997); Burton et al.,　Advances in Immunology　57: 191-280 (1994); PCT/GB91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; WO 96/06213; WO 92/01047 (Medical Research Council et al.); WO 97/08320 (Morphosys); WO 92/01047 (CAT/MRC); WO 91/17271 (Affymax); 미국 특허 제 5,698,426호, 5,223,409호, 5,403,484호, 5,580,717호, 5,427,908호, 5,750,753호, 5,821,047호, 5,571,698호, 5,427,908호, 5,516,637호, 5,780,225호, 5,658,727호 및 5,733,743호에서 개시된 것들을 들 수 있다.
이황화 결합을 통해 폴리펩타이드를 부착시킴으로써 박테리오파지 입자의 표면에서 폴리펩타이드를 드러내는 데 유용한 방법은 Lohning에 의해 미국 특허 제 6,753,136호에서 기술된 바 있다. 상기 참고문헌에서 기술된 것과 같이, 파지 선택 후에, 파지로부터의 항체 코딩 영역이 분리될 수 있고, 인간 항체, 또는 임의의 다른 원하는 항원 결합 단편을 포함한 전체 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있으며, 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 및 박테리아를 포함하는 임의의 원하는 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2　단편을 재조합에 의해 생성하기 위한 기법은 또한 WO 92/22324; Mullinax et al.,　BioTechniques　12: 864-869 (1992); Sawai et al.,　AJRI　34: 26-34 (1995); 및 Better et al.,　Science　240: 1041-1043 (1988)에서 개시된 것들과 같이 기술분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 사용될 수 있다.
일반적으로, 디스플레이 벡터에 클로닝된 하이브리드 항체 또는 하이브리드 항체 단편은, 항체 또는 항체 단편이 파지 또는 파지미드 입자의 표면에 존재할 것이기 때문에, 양호한 결합 활성을 유지한 변이체를 확인하기 위하여 적절한 항원에 대해 선택될 수 있다. 예컨대, Barbas III et al.,　Phage Display, A Laboratory Manual　(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001) 참조. 그러나, 다른 벡터 포맷이 이 과정, 예컨대 선택 및/또는 스크리닝을 위해 항체 단편 라이브러리를 용해성 파지 벡터 (변형된 T7 또는 람다 Zap 시스템)에 클로닝하는 데 사용될 수 있다.
항체 제조의 대체 방법. 항체는 또한 림프구 집단에서 생체내 생성을 유도함으로써 또는 고도로 특이적인 결합 시약의 재조합 면역글로불린 라이브러리 또는 패널을 스크리닝함으로써 제조될 수 있다 (Orlandi et al., PNAS 86: 3833-3837 (1989); Winter, G. et al., Nature, 349: 293-299 (1991)).
대안으로, 단일 사슬 항체의 제조를 위한 기법이 사용될 수 있다. 단일 사슬 항체 (scFv)는 링커 펩타이드 (전형적으로 약 5 내지 25개 아미노산의 길이)와 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. scFv에서, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 동일한 항체 또는 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. scFv는 재조합 기법을 사용하여, 예를 들어 대장균과 같은 숙주 유기체에서 scFv를 암호화하는 벡터의 발현에 의해 합성될 수 있다. scFv를 암호화하는 DNA는 상기 언급된 항체의 중쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA로부터 선택된 DNA의 전체 또는 원하는 아미노산 서열을 암호화하는 부분 DNA 및 주형으로서 그것의 경쇄 또는 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA를 사용하여 증폭을 수행함으로써, 그것의 양 단부를 규정하는 프라이머 쌍을 사용하는 PCR에 의하여, 그리고 링커의 양 단부를 각각 중쇄 및 경쇄에 결찰시키기 위하여, 추가로 폴리펩타이드 링커를 암호화하는 DNA 및 그것의 양 단부를 규정하는 프라이머 쌍을 조합하여 증폭을 수행함으로써 얻을 수 있다. scFv를 암호화하는 DNA를 함유하는 발현 벡터 및 그 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주는 기술분야에 알려져 있는 종래 방법에 따라 얻어질 수 있다.
항원 결합 단편, 예를 들어 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2　단편 및 F(ab')2　단편의 이황화 가교를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편이 또한 생성될 수 있다. 대안으로, 원하는 특이성을 가진 단클론성 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인을 허용하기 위해 Fab 발현 라이브러리가 구성될 수 있다 (Huse et al., Science, 256: 1275-1281 (1989)).
항체 변형. 본 개시의 항체는 항원에 대한 친화도를 증가시키기 위하여 멀티머화될 수 있다. 멀티머화될 항체는 한 유형의 항체 또는 동일한 항원의 복수의 에피토프를 인식하는 복수의 항체일 수 있다. 항체의 멀티머화 방법으로서, IgG CH3 도메인을 2개의 분자에 결합시키는 것, 스트렙트아비딘에 결합시키는 것, 나선-턴-나선 모티프의 도입 등을 예로 들 수 있다.
본원에서 개시된 항체 조성물은 이들 항체 중 임의의 것과 또 다른 작용제 (면역컨쥬게이트) 사이에 형성된 컨쥬게이트의 형태로 있을 수 있다. 한 측면으로, 본원에서 개시된 항체는 방사성 물질에 컨쥬게이션된다. 다른 측면으로, 본원에서 개시된 항체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 분자의 다양한 유형에 결합될 수 있다.
항체 스크리닝. 원하는 특이성을 가지는 항체를 확인하기 위한 스크리닝에 다양한 면역검정이 사용될 수 있다. 확립된 특이성을 가진 다클론성 또는 단클론성 항체를 사용하는 경합 결합 또는 면역방사계측 검정을 위한 수많은 프로토콜이 기술분아야 잘 알려져 있다. 이러한 면역검정은 전형적으로 관련 항원 사이, 또는 그것의 임의의 단편 또는 올리고펩타이드와 그것의 특정 항체 사이의 복합체 형성의 측정을 포함한다. 2개의 비-간섭 관련 항원 에피토프에 대해 특이적인 단클론성 항체를 활용하는 2-부위, 단클론성-기반 면역검정이 사용될 수 있지만, 경합 결합 검정이 또한 사용될 수 있다 (Maddox et al., J. Exp. Med., 158: 1211-1216 (1983)).
항체 정제. 본원에서 개시된 항체는 균질성으로 정제될 수 있다. 항체의 분리 및 정제는 종래의 단백질 분리 및 정제 방법을 사용함으로써 수행될 수 있다.
단지 예를 들면, 항체는 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염 침전, 투석, 제조용 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 초점 전기영동, 등을 적절하게 선택하고 조합하여 사용함으로써 분리 및 정제될 수 있다. Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988).
크로마토그래피의 예로는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 및 흡착 크로마토그래피를 들 수 있다. 한 측면으로, 크로마토그래피는 HPLC 또는 FPLC와 같은 액체 크로마토그래피를 사용함으로써 수행될 수 있다.
한 측면으로, 단백질 A 칼럼 또는 단백질 G 칼럼이 친화성 크로마토그래피에 사용될 수 있다. 다른 예시의 칼럼으론로는 단백질 A 칼럼, Hyper D, POROS, 세파로스 F. F. (Pharmacia) 등을 들 수 있다.
이중특이적 항체
또한 본원에는 NKG2D의 또는 종양 항원의 임의의 항체, 예컨대, 항-NKG2D 항체의 항원 결합 도메인 및 항체의 종양 표적화 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체 구성물이 제공된다. 항원 결합 도메인은 임의의 적절한 종, 예컨대, 쥐과, 인간 또는 인간화된 서열로부터 유래될 수 있다. 한 측면으로, 종양 표적화 항체는 항-CS1 또는 항-BCMA를 포함한다. 그것은 또한 이들 두 단백질에 결합하는 임의의 분자를 포함한다. 예를 들어, MICA, MICB, 및 ULBP. 한 측면으로, CAR은 CS1 CAR일 수 있고 이중특이적 부분은 항-BCMA scFv로 대체될 수 있다. 한 측면으로, 종양 표적화 항체는 항-CS1 또는 항-BCMA를 포함한다. 이러한 것의 예는 구체적으로 이것의 폴리뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 포함하여 2016년 2월 22일에 출원된 PCT/US2016/018955 (본원에 참조로 포함됨)에서 기술된다.
한 측면으로, 두 항원 결합 도메인 중 적어도 하나는 예정된 제1 항원과 공동 발현되는 항원에 대해 특이적이다. 예를 들어, MM의 경우에, BCMA 및 CS1이 MM에서 공동 발현되며, CS1이 CAR 구성물의 BCMA 항원 결합 도메인을 보충하기 위하여 선택되었다. 대안으로, BCMA가 항-CS1 CAR을 보충할 수 있다.
추가의 측면으로, 항원 결합 도메인은 선택적으로 코돈-최적화된 scFv 단편을 포함하거나, 또는 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 이것으로 이루어진다. 추가의 측면으로, 이중특이적 항원 결합 도메인은 펩타이드 링커에 의해 연합된 가변 중쇄 및 경쇄이다. 일반적으로, 항원 결합 도메인은 펩타이드 링커, 예컨대 인간 근율 알도스로부터 유래된 비면역원성 단백질 링커에 의해 함께 연합될 수 있다35.
또한 이중특이적 항체를 암호화하는 분리된 핵산이 제공된다. 핵산은 필요한 조절 서열, 예컨대 숙주 세포, 예컨대 T 세포와 같은 포유류 또는 인간 숙주 세포에서의 발현을 위한 프로모터 및/또는 인핸서를 추가로 포함할 수 있다. 한 측면으로 프로모터는 CMV 또는 EF1 알파 프로모터이다. 분리된 핵산은 BsAb 암호화 폴리뉴클레오타이드로부터 하류에 위치할 수 있고 별도의 프로모터 요소, 예컨대 , EF1알파 프로모터로부터 조절될 수 있는 GFP와 같은 검출 가능한 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 숙련된 전문가에게 명백한 것과 같이, 프로모터(들)는 숙주 발현 시스템에 대해 선택된다.
분리된 핵산은 발현 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터에, 5'와 3' LTR 사이에 삽입될 수 있다. 도 1B는 이런 개시의 예시의 렌티바이러스 벡터 구성물이다. 숙련된 전문가에게 명백한 것과 같이, 구성물은 마커 펩타이드 또는 정제 마커를 포함하지 않을 수 있다.
BsAb-CAR 구성물
추가의 측면으로, 본원에는 한 구성물에서, 상기에서 개시된 CAR 구성물 및 이중특이적 항체를 암호화하는 분리된 핵산 ("BsAb-CAR 구성물")이 제공된다. 항원 결합 도메인은 임의의 적절한 종, 예컨대, 쥐과, 인간 또는 인간화된 서열로부터 유래될 수 있다. 한 측면으로, 분리된 핵산은 BCMA 및 이중특이적 항체, 예컨대, 인간 근육 알도스로부터 유래되는 것과 같이 비면역원성 단백질 링커를 암호화하는 핵산에 의해 함께 연합된, 항-CS1 항체로부터의 하나의 scFv 및 항-NKG2D 항체로부터의 하나의 scFv를 표적으로 하는 항원 결합 단편을 암호화한다. 한 측면으로, CAR 구성물을 암호화하는 핵산은 BsAb를 암호화하는 핵산에 대해 5'에 위치한다. 한 측면으로, T2A 요소는 5' 위치한 CAR 폴리뉴클레오타이드와 3' 위치한 BsAb 사이에 위치한다. 핵산은 필요한 조절 서열, 예컨대, 숙주 세포, 예컨대 T 세포와 같은 포유류 또는 인간 숙주 세포에서의 발현을 위한 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 한 측면으로 프로모터는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 대해 5'로 위치한 EF1a 또는 CMV 프로모터이다. 추가의 측면으로, 분리된 핵산은 BsAb 폴리뉴클레오타이드로부터 하류에 있을 수 있고 별도의 프로모터 요소, 예컨대, EF1알파 프로모터의 제어 하에 있는 GFP와 같은 검출 가능한 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 숙련된 전문가에게 명백한 것과 같이, 프로모터(들)는 숙주 발현 시스템에 대해 선택된다.
분리된 핵산은 발현 벡터, 예컨대, 렌티바이러스 벡터에, 5'와 3' LTR 사이에 삽입될 수 있다. 도 3A는 이런 개시의 예시의 렌티바이러스 벡터 구성물이다. 숙련된 전문가에게 명백한 것과 같이, 구성물은 마커 펩타이드 또는 정제 마커를 포함하지 않을 수 있다.
숙주 세포 및 CAR의 제조 방법
본 개시의 여러 측면은 CAR, BsAb, 및 BsAb CAR을 포함하는 분리된 세포, 및 이러한 세포의 제조 방법에 관한 것이다. 세포는 원핵 또는 진핵 세포이다. 한 측면으로, 세포는 T-세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 골수성 세포, 단핵세포, 대식세포, 이것들의 임의의 하위세트, 또는 임의의 다른 면역 세포면역 세포이다. 진핵 세포는 임의의 바람직한 종, 예컨대, 동물 세포, 포유류 세포, 예컨대 인간, 고양이 또는 개과 세포로부터 유래될 수 있다. 세포는 환자, 도너, 또는 세포주, 예컨대 이용 가능한 기성품으로부터 유래될 수 있다. 세포는 치료되는 대상체에 대해 자가 또는 동종성일 수 있다.
특정 구체예에서, 분리된 세포는 암 또는 종양 항체의 항원 결합 도메인, CD8 α 힌지 도메인, CD8 α 경막 도메인, CD28 동시자극성 신호전달 영역 및/또는 a 4-1BB 동시자극성 신호전달 영역, 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어지는 외인성 CAR 또는 BsAb CAR을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 이것으로 이루어진다. 또한 추가의 측면으로, 세포는 본원에 개시된 BsAb를 포함한다. 특정 구체예에서, 분리된 세포는 T-세포, 예컨대, 동물 T-세포, 포유류 T-세포, 고양이 T-세포, 개과 T-세포 또는 인간 T-세포이다. 특정 구체예에서, 분리된 세포는 NK-세포, 예컨대, 동물 NK-세포, 포유류 NK-세포, 고양이 NK-세포, 개과 NK-세포 또는 인간 NK-세포이다. 특정 구체예에서, 분리된 세포는 B-세포, 예컨대, 동물 B-세포, 포유류 B-세포, 고양이 B-세포, 개과 B-세포 또는 인간 B-세포이다. 각각의 종에 대한 동일하거나 유사한 구체예가 수지상 세포, 골수 세포, 단핵세포, 대식세포, 이들의 임의의 하위세트 또는 기술된 T-세포, NK-세포, 및 B-세포, 및/또는 임의의 다른 면역 세포와 관련하여 적용되는 것이 인지된다. 한 측면으로, 세포는 유전자 편집 기술, 예컨대, CRISPR 또는 TALEN을 사용하여 CD52 발현을 제거하도록 변형된 T 세포이다.
특정 구체예에서, BsAb, CAR, 및/또는 BsAb CAR 발현 세포의 제조 방법이 개시되는데, 방법은 분리된 세포 집단을 BsAb, CAR, BsAb 및 CAR, 및/또는 BsAb CAR을 암호화하는 핵산 서열로 형질도입하는 단계를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이 단계로 이루어지거나 또는 또한 추가로 이 단계로 이루어진다. 추가의 측면으로, 핵산 서열로 성공적으로 형질도입된 세포의 하위집단이 선택된다. 일부 구체예에서, 분리된 세포는 T-세포, 동물 T-세포, 포유류 T-세포, 고양이 T-세포, 개과 T-세포 또는 인간 T-세포이고, 그로써 BsAb, CAR, BsAb 및 CAR, 및/또는 BsAb CAR T-세포가 생성된다. 특정 구체예에서, 분리된 세포는 NK-세포, 예컨대, 동물 NK-세포, 포유류 NK-세포, 고양이 NK-세포, 개과 NK-세포 또는 인간 NK-세포이고, 그로써 BsAb, CAR, BsAb 및 CAR, 및/또는 BsAb CAR NK-세포가 생성된다. 일부 구체예에서, 분리된 세포는 B-세포, 동물 B-세포, 포유류 B-세포, 고양이 B-세포, 개과 B-세포 또는 인간 B-세포이고, 그로써 BsAb, CAR, BsAb 및 CAR, 및/또는 BsAb CAR B-세포가 생성된다. 각각의 종에 대한 동일하거나 유사한 구체예가 수지상 세포, 골수 세포, 단핵세포, 대식세포, 이들의 임의의 하위세트 또는 기술된 T-세포, NK-세포, 및 B-세포, 및/또는 임의의 다른 면역 세포와 관련하여 적용되는 것이 인지된다. 한 측면으로, 세포는 유전자 편집 기술, 예컨대, CRISPR 또는 TALEN을 사용하여 CD52 발현을 제거하도록 변형된 T 세포이다. 한 측면으로, 세포는 치료되는 대상체에 대해 자가이거나 동종이다.
분리된 세포의 공급원. 본원에서 개시된 세포의 팽창 및 유전자 변형 전에, 세포는 대상체 - 예를 들어, 자가 요법을 포함하는 구체예에서 - 또는 상업적으로 입수 가능한 세포주 또는 배양, 또는 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)와 같은 줄기 세포로부터 얻어질 수 있다.
세포는 말초혈 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직, 및 종양을 포함한, 대상체의 많은 공급원으로부터 얻어질 수 있다.
관련 세포의 분리 방법은 기술분야에 잘 알려져 있고 본 출원에 대해 쉽게 조정될 수 있다; 예시의 방법은 하기 실시예에서 기술된다. 본 개시와 관련하여 사용하기 위한 분리 방법은, 한정하는 것은 아니지만 Life Technologies Dynabeads® 시스템; STEMcell Technologies EasySepTM, RoboSepTM, RosetteSepTM, SepMateTM; Miltenyi Biotec MACSTM 세포 상층액 키트, 및 기타 상업적으로 입수 가능한 세포 분리 및 격리 키트를 포함한다. 면역 세포의 특정 하위집단은 특유한 세포 표면 마커에 특이적인 이러한 키트에서 이용 가능한 비드 또는 다른 결합제의 사용을 통해 분리될 수 있다. 예를 들어, MACSTM CD4+ 및 CD8+ 마이크로비드가 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 분리하기 위해 사용될 수 있다. 공지된 기법에 따라 분리될 수 있는 세포의 대체하는 비제한적은 예는 벌크해진 T-세포, NK T-세포, 및 감마 델타 T-세포를 포함한다.
대안으로, 세포는, 한정하는 것은 아니지만, T-세포의 경우, 주 BCL2 (AAA) Jurkat (ATCC® CRL-2902TM), BCL2 (S70A) Jurkat (ATCC® CRL-2900TM), BCL2 (S87A) Jurkat (ATCC® CRL-2901TM), BCL2 Jurkat (ATCC® CRL-2899TM), Neo Jurkat (ATCC® CRL-2898TM); B 세포의 경우, 주 AHH-1 (ATCC® CRL-8146TM), BC-1 (ATCC® CRL-2230TM), BC-2 (ATCC® CRL-2231TM), BC-3 (ATCC® CRL-2277TM), CA46 (ATCC® CRL-1648TM), DG-75 [D.G.-75] (ATCC® CRL-2625TM), DS-1 (ATCC® CRL-11102TM), EB-3 [EB3] (ATCC® CCL-85TM), Z-138 (ATCC #CRL-3001), DB (ATCC CRL-2289), Toledo (ATCC CRL-2631), Pfiffer (ATCC CRL-2632), SR (ATCC CRL-2262), JM-1 (ATCC CRL-10421), NFS-5 C-1 (ATCC CRL-1693); NFS-70 C10 (ATCC CRL-1694), NFS-25 C-3 (ATCC CRL-1695), 및 SUP-B15 (ATCC CRL-1929); 그리고, NK 세포의 경우, 주 NK-92 (ATCC® CRL-2407TM), NK-92MI (ATCC® CRL-2408TM)를 포함한, 상업적으로 입수 가능한 세포 배양을 통해 얻어질 수 있다. 추가의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 성숙한 T-세포주, 예컨대, Deglis, EBT-8, HPB-MLp-W, HUT 78, HUT 102, Karpas 384, Ki 225, My-La, Se-Ax, SKW-3, SMZ-1 및 T34; 미성숙한 T- 세포주, 예컨대, ALL-SIL, Be13, CCRF-CEM, CML-T1, DND-41, DU.528, EU-9, HD-Mar, HPB-ALL, H-SB2, HT-1, JK-T1, Jurkat, Karpas 45, KE-37, KOPT-K1, K-T1, L-KAW, Loucy, MAT, MOLT-1, MOLT 3, MOLT-4, MOLT 13, MOLT-16, MT-1, MT-ALL, P12/Ichikawa, Peer, PER0117, PER-255, PF-382, PFI-285, RPMI-8402, ST-4, SUP-T1 to T14, TALL-1, TALL-101, TALL-103/2, TALL-104, TALL-105, TALL-106, TALL-107, TALL-197, TK-6, TLBR-1, -2, -3, 및 -4, CCRF-HSB-2 (CCL-120.1), J.RT3-T3.5 (ATCC TIB-153), J45.01 (ATCC CRL-1990), J.CaM1.6 (ATCC CRL-2063), RS4;11 (ATCC CRL-1873), CCRF-CEM (ATCC CRM-CCL-119); 피부 T-세포 림프종 주, 예컨대, HuT78 (ATCC CRM-TIB-161), MJ[G11] (ATCC CRL-8294), HuT102 (ATCC TIB-162); 신생 및 거대 세포 림프종으로부터 유래된 B-세포주, 예컨대, DEL, DL-40, FE-PD, JB6, Karpas 299, Ki-JK, Mac-2A Ply1, SR-786, SU-DHL-1, -2, -4,-5,-6,-7,-8,-9,-10, 및 -16, DOHH-2, NU-DHL-1, U-937, Granda 519, USC-DHL-1, RL; 호지킨 림프종, 예컨대, DEV, HD-70, HDLM-2, HD-MyZ, HKB-1, KM-H2, L 428, L 540, L1236, SBH-1, SUP-HD1, 및 SU/RH-HD-l; 및 HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90, 및 YT와 같은 NK 주를 들 수 있다. 한정하는 것은 아니지만, REH, NALL-1, KM-3, L92-221을 포함한 Null 백혈병 세포주는, 세포주가 K562 적혈구백혈병, THP-1 단핵세포성 백혈병, U937 림프종, HEL 적혈구백혈병, HL60 백혈병, HMC-1 백혈병, KG-1 백혈병, U266 골수종과 같은 다른 백혈병 및 림프종으로부터 유래되기 때문에, 면역 세포의 또 다른 상업적으로 입수 가능한 공급원이다. 이러한 상업적으로 입수 가능한 세포주에 대한 비제한적인 예시의 공급원으로는 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션, 또는 ATCC (atcc.org/) 및 독일 미생물 및 세포 배양 센터 (dsmz.de/)를 포함한다.
일부 구체예에서, 개시된 CAR을 발현하는 T-세포는 내인성 TCR의 발현을 감소 또는 제거하기 위하여 추가로 변형될 수 있다. 내인성 TCR의 감소 또는 제거는 표적 외 효과를 감소시킬 수 있고 T 세포의 유효성을 증가시킬 수 있다. 기능성 TCR의 발현이 안정적으로 결핍된 T 세포는 다양한 접근법을 사용하여 제조될 수 있다. T 세포는 전체 T 세포 수용체를 휴지기 T 세포에서 약 10시간 및 자극된 T 세포에서 3시간의 반감기를 가지는 (von Essen, M. et al. 2004. J. Immunol. 173:384-393) 복합체로서 내부화하고, 분류하고, 분해한다. TCR 복합체의 적절한 기능화는 TCR 복합체를 분해하는 단백질의 적절한 화학양론학적 비율을 필요로 한다. TCR 기능은 또한 ITAM 모티프를 가지는 2개의 기능화 TCR 제타 단백질을 필요로 한다. TCR이 그것의 MHC-펩타이드 리간드와 맞물릴 때 TCR의 활성화는 모두 적절하게 신호를 내야 하는 동일한 T 세포 상의 여러 TCR의 맞물림을 필요로 한다. 그러므로, 만약 TCR 복합체가 적절하게 회합되지 않는 또는 최적으로 신호를 낼 수 없는 단백질로 탈안정화된다면, T 세포는 세포 반응을 시작할만큼 충분하게 활성화되지 않을 것이다.
따라서, 일부 구체예에서, TCR 발현은 RNA 간섭 (예컨대, shRNA, siRNA, miRNA, 등), CRISPR, 또는 특정 TCR (예컨대, TCR-α및 TCR-β) 및/또는 일차 T 세포의 CD3 사슬을 암호화하는 핵산을 표적으로 하는 다른 방법을 사용하여 제거될 수 있다. 이들 단백질 중 하나 이상의 발현을 차단함으로써, T 세포는 TCR 복합체의 하나 이상의 핵심 구성요소를 더 이상 생성하지 않을 것이고, 그로써 TCR 복합체를 탈안정화시키고 기능성 TCR의 세포 표면 발현을 방지한다. 일부 TCR 복합체가 RNA 간섭이 사용될 때 세포 표면으로 재순환될 수 있긴 하지만, RNA (예컨대, shRNA, siRNA, miRNA, 등)는 TCR 단백질의 새로운 생성을 방해하여 전체 TCR 복합체의 분해 및 제거를 초래하고, 기능성 TCR 발현의 안정적인 결핍을 갖는 T 세포의 생성을 초래할 것이다.
일차 T 세포에서 억제 RNA (예컨대, shRNA, siRNA, miRNA, 등)의 발현은 임의의 종래의 발현 시스템, 예컨대, 렌티바이러스 발현 시스템을 사용하여 이루어질 수 있다. 비록 렌티바이러스가 휴지기 일차 T 세포를 표적화하는 데 유용하긴 하지만, 모든 T 세포가 shRNA를 발현하지는 않을 것이다. 이들 T 세포의 일부는 T 세포의 기능적 활성을 변경하기 위해 TCR 발현의 충분한 억제를 허용할 정도의 RNA의 충분한 양을 발현할 수 없다. 그러므로, 바이러스 형질도입 후 중간 내지 높은 TCR 발현을 보유하는 T 세포는, 예컨대 세포 분류 또는 분리 기법에 의해 제거될 수 있어서, 나머지 T 세포는 세포 표면 TCR 또는 CD3에서 결핍되어, 기능성 TCR 또는 CD3의 별현이 결핍된 T 세포의 분리된 집단의 팽창을 가능하게 한다.
일차 T 세포에서 CRISPR의 발현은 종래의 CRISPR/Cas 시스템 및 표적 TCR에 대해 특이적인 가이드 RNA를 사용하여 이루어질 수 있다. 적합한 발현 시스템, 예컨대 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 발현 시스템이 기술분야에 알려져 있다. 억제자 RNA의 전달과 유사하게, CRISPR 시스템은 CAR 세포 요법을 위해 휴지기 일차 T 세포 또는 다른 적합한 면역 세포를 특이적으로 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, CRISPR 편집이 성공적이지 못한 정도까지, 세포는 상기 개시된 방법에 따르는 성공을 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기에서 주지된 것과 같이, 바이러스 형질도입 후 중간 내지 높은 TCR 발현을 보유하는 T 세포는, 예컨대, 세포 분류 또는 분리 기법에 의해 제거될 수 있어서, 나머지 T 세포는 세포 표면 TCR 또는 CD3에서 결핍되어, 기능성 TCR 또는 CD3의 별현이 결핍된 T 세포의 분리된 집단의 팽창을 가능하게 한다. CRISPR 편집 구성물이 내인성 TCR의 녹킹 아웃 및 본원에 개시된 CAR 구성물에서의 녹킹에 유용할 수 있음이 추가로 인지된다. 따라서, CRISPR 시스템은 이들 목적 중 하나 또는 둘 다를 이루기 위해 설계될 수 있는 것이 인지된다.
벡터. CAR 세포는 벡터를 사용하여 제조될 수 있다. 본 개시의 여러 측면은 (i) CAR 또는 (ii) 면역조절 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 분리된 핵산 서열 및 이들 핵산 중 어느 하나 또는 둘 다 및/또는 이것들의 각각의 보체 및/또는 동등물을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어지는 벡터에 관한 것이다.
일부 구체예에서, 분리된 핵산 서열은 , CD8 α 힌지 도메인, CD8 α 경막 도메인, CD28 동시자극성 신호전달 영역 및/또는 4-1BB 동시자극성 신호전달 영역, 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어지는 CAR을 암호화한다. 특정 구체예에서, 분리된 핵산 서열은 (a) 암 또는 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인과 이어서 (b) CD8 α 힌지 도메인, (c) CD8 α 경막 도메인과 이어서 (d) CD28 동시자극성 신호전달 영역 및/또는 4-1BB 동시자극성 신호전달 영역과 이어서 (e) CD3 제타 신호전달 도메인을 암호화하는 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 이것들로 이루어진다.
일부 구체예에서, 분리된 핵산 서열은 CAR을 암호화하고 암 또는 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인을 암호화하는 서열의 상류의 코작 공통 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 이것으로 이루어진다.
한 측면으로, 항원 결합 도메인은 BCMA를 표적으로 한다.
일부 구체예에서, 분리된 핵산은 이중특이적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 이것으로 이루어진다. 특정 구체예에서, 이중특이적 항체는 선택적으로 코돈 최적화된 NKG2D, 및 선택적으로, SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 또는 이것들의 각각의 동등물에 대한 항체의 관련 CDR 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 특정 구체예에서, 이중특이적 항체는 NKG2D 및, 선택적으로, SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음) (선택적으로 코돈 최적화됨) 또는 이것들의 각각의 동등물에 대한 항체의 관련 CDR 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 NKG2D 및, 선택적으로, SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음) (선택적으로 코돈 최적화됨) 및/또는 이것들의 각각의 동등물에 대한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 NKG2D에 대한 항체로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFV) 및, 선택적으로, SALMF7 (CD319의 CS1으로도 알려져 있음) (선택적으로 코돈 최적화됨)로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFV) 및/또는 이것들의 각각의 동등물을 포함한다. 일부 구체예에서, 분리된 핵산은 상기 개시된 방법에 따라 생성될 수 있는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 이중특이적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 추가로 이것으로 이루어진다.
일부 구체예에서, 분리된 핵산은 검출 가능한 표지 및/또는 항생물질 내성을 부여하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 한 측면으로, 표지 또는 폴리뉴클레오타이드는 분리된 핵산으로 성공적으로 형질도입된 세포를 선택하는 데 유용하다.
일부 구체예에서, 분리된 핵산서열은 벡터 내에 포함된다. 특정 구체예에서, 벡터는 플라스미드이다. 다른 구체예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 이러한 것의 비제한적인 예로는 제한 없이 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-관련 바이러스 벡터를 들 수 있다. 특정 구체예에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
예시의 벡터의 제조 및 상기 벡터를 사용하여 CAR 발현 세포의 생성은 하기 실시예에서 상세하게 논의된다. 요약하면, CAR 또는 면역조절 분자를 암호화하는 천연 또는 합성 핵산의 발현은 전형적으로 CAR 폴리펩타이드 또는 그것의 일부를 암호화하는 핵산을 프로모터에 작동 가능하게 연결하고, 그 구성물을 발현 벡터에 통합시킴으로써 이루어진다. 면역조절 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 서열을 구성하기 위해 유사한 방법이 사용될 수 있다. 벡터는 진핵세포의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 제조한 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)을 참조한다.
한 측면으로, 용어 "벡터"는 비분할 및/또는 서서히 분할하는 세포를 감염시키고 형질도입하며 표적 세포의 게놈에 통합시키는 능력을 보유하는 재조합 벡터를 의도한다. 여러 측면으로, 벡터는 야생형 바이러스로부터 또는 그것을 바탕으로 유래된다. 추가의 측면으로, 벡터는 야생형 렌티바이러스로부터 또는 그것을 바탕으로 유래된다. 이러한 것의 예로는 제한 없이, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 말 감염성 빈혈 바이러스 (EIVA), 유인원 면역결핍 바이러스 (SIV) 및 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV)를 들 수 있다. 대안으로, 다른 레트로바이러스가 이러한 쥐과 백혈병 바이러스 (MLV)의 벡터 골격에 대한 기초로서 사용될 수 있는 것으로 여겨진다. 개시에 따르는 바이러스 벡터는 특정 바이러스의 구성요소에 국한될 필요는 없는 것이 명백할 것이다. 바이러스 벡터는 둘 이상의 상이한 바이러스로부터 유래된 구성요소를 포함할 수 있고, 또한 합성 구성요소를 포함할 수 있다. 벡터 구성요소는 원하는 특성, 예컨대 표적 세포 특이성을 얻기 위해 조작될 수 있다.
본 개시의 재조합 벡터는 영장류 및 비영장류로부터 유래된다. 영장류 렌티바이러스의 예로는 인간 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS)의 원인 물질, 및 유인원 면역결핍 바이러스 (SIV)를 들 수 있다. 비영장류 렌티바이러스 그룹은 프로토타입 "느린 바이러스" 비스나/매디(visna/maedi) 바이러스 (VMV), 뿐만 아니라 관련된 카프린 관절염-뇌염 바이러스 (CAEV), 말 감염성 빈혈 바이러스 (EIAV) 및 보다 최근에 기재된 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV) 및 소 면역결핍 바이러스 (BIV)를 들 수 있다. 선행 기술 재조합 렌티바이러스 벡터는 기술분야에 알려져 있고, 예컨대, 미국 특허 제 6,924,123호; 7,056,699호; 7,419,829호 및 7,443,551호 (본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
미국 특허 제 6,924,123호는 특정 레트로바이러스 서열이 표적 세포 게놈으로의 통합을 용이하게 하는 것을 개시한다. 이 특허는 각각의 레트로바이러스 게놈이 비리온 단백질 및 효소를 암호화하는 gag, pol 및 env로 불리는 유전자를 포함하는 것을 교시한다. 이들 유전자는 긴 말단 반복부 (LTR)로 불리는 영역에 의해 양 단부에서 플랭킹된다. LTR은 프로바이러스 통합, 및 전사에 기여한다. 이것들은 또한 인핸서-프로모터 서열로서 작용한다. 달리 말하면, LTR은 바이러스 유전자의 발현을 제어할 수 있다. 레트로바이러스 RNA의 캡시드화는 바이러스 게놈의 5' 단부에 위치한 psi 서열에 의해 일어난다. LTR 자체는 U3, R 및 U5로 불리는 3개의 요소로 나누어질 수 있는 동일한 서열이다. U3은 RNA의 3' 단부에 특유한 서열로부터 유래된다. R은 RNA의 양 단부에서 반복되는 서열로부터 유래되고, U5는 RNA의 5' 단부에 특유한 서열로부터 유래된다. 3개의 요소의 크기는 상이한 레트로바이러스 중에서 상당히 다를 수 있다. 바이러스 게놈에 대해. 그리고 폴리 (A) 첨가 (종결)의 부위는 우측 LTR의 R과 U5 사이의 경계에 있다. U3은 세포에 대해 및 일부 경우에 바이러스 전사 활성자 단백질에 대한 반응으로 프로모터 및 다중 인핸서 서열을 포함하는 프로바이러스의 전사 제어 요소의 대부분을 함유한다.
구조적인 유전자 gag, pol 및 env 자체와 관련하여, gag는 바이러스의 내부 구조 단백질을 암호화한다. Gag 단백질은 성숙한 단백질 MA (매트릭스), CA (캡시드) 및 NC (뉴클레오캡시드)로 단백질 가수분해에 의해 프로세싱된다. pol 유전자는 DNA 중합효소, 게놈의 복제를 매개하는 회합된 RNase H 및 인테그라제 (IN)를 함유하는 역전사효소 (RT)를 암호화한다.
바이러스 벡터 입자의 생성을 위해, 벡터 RNA 게놈은 숙주 세포에서 그것을 암호화하는 DNA 구성물로부터 발현된다. 벡터 게놈에 의해 암호화되지 않은 입자의 구성요소는 숙주 세포에서 발현된 추가적인 핵산 서열 (보통 gag/pol 및 env 유전자 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함하는 "포장 시스템")에 의해 트랜스로 제공된다. 바이러스 벡터 입자의 생성에 필요한 서열 세트는 일시적인 트랜스펙션에 의해 숙주 세포에 도입되거나, 또는 그것들은 숙주 세포 게놈에 통합되거나, 또는 그것들은 혼합된 방식으로 제공될 수 있다. 포함된 기법은 기술분야의 숙련된 사람들에게 알려져 있다.
본 개시에서 사용하기 위한 레트로바이러스 벡터로는, 한정하는 것은 아니지만, Lentigen Corp.에 의해 제조된 Invitrogen's pLenti 시리즈 버전 4, 6, 및 6.2 "ViraPower" 시스템; 실험실에서 생성되고 City of Hope Research Institute에 의해 사용된 pHIV-7-GFP; Clontech에 의해 제조된 "렌티-X" 렌티바이러스 벡터, pLVX; Sigma-Aldrich에 의해 제조된 pLKO.1-puro; Open Biosystems에 의해 제조된 pLemiR; 및 실험실에서 생성되고 독일 베를린 Charite Medical School, Institute of Virology (CBF)에 의해 사용되는 pLV를 들 수 있다.
외인성 핵산을 도입시키는 추가의 방법은 기술분야에 알려져 있고 한정하는 것은 아니지만, RNA 전기천공, 나노기술, 슬리핑 뷰티 벡터, 레트로바이러스, 및/또는 아데노바이러스 중 하나 이상을 사용하는 유전자 전달을 포함한다.
외인성 핵산을 숙주 세포에 도입하기 위해 또는 다르게는 세포를 본 개시의 억제자에 노출시키기 위해 사용된 방법에도 불구하고, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위하여, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정으로는, 예를 들어, 기술분야의 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있는 "분자 생물학적" 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯틴, RT-PCR 및 PCR; "생화학적" 검정, 예컨대 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 또는 개시의 범주 내에 속하는 인자들을 확인하기 위해 본원에서 기술된 검정에 의해 특정 펩타이드의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 들 수 있다.
포장 벡터 및 세포주.　분리된 핵산은 포장 벡터 및 세포주를 사용함으로써 레트로바이러스 포장 시스템에 포장될 수 있다. 포장 벡터로는, 한정하는 것은 아니지만, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-관련 바이러스 벡터를 들 수 있다.　포장 벡터는 세포로의 유전자 물질의 전달을 용이하게 하는 요소 및 서열을 함유한다. 예를 들어, 레트로바이러스 구성물은 복제 무능한 레트로바이러스 벡터를 포장하기 위해, 그리고 복제-가능 헬퍼 바이러스의 생성 없이 복제-무능한 레트로바이러스를 포장할 수 있는 비리온 단백질을 고역가로 생성하기 위해, 필요한 모든 비리온 단백질을 트랜스로 암호화하는 복제-무능 레트로바이러스 게놈으로부터 유래된 적어도 하나의 레트로바이러스 헬퍼 DNA 서열을 포함하는 포장 벡터이다. 레트로바이러스 DNA 서열은 바이러스의 바이러스　5' LTR의 천연 인핸서 및/또는 프로모터를 암호화하는 영역이 결핍되고, 포장 헬퍼 게놈에 기여하는 psi 기능 서열 및 3' LTR이 둘 다 결핍되지만, 외래 폴리아데닐화 부위, 예를 들어 SV40 폴리아데닐화 부위, 및 바이러스 생성이 바람직한 세포 유형에서 효율적이도록 지시하는 외래 인핸서 및/또는 프로모터를 암호화한다. 레트로바이러스는 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 (MMLV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 또는 긴팔 원숭이(Gibbon Ape) 백혈병 바이러스 (GALV)같은 백혈병 바이러스이다. 외래 인핸서 및 프로모터는 인간 사이토메갈로바이러스 (HCMV) 즉시 (IE) 인핸서 및 프로모터, 및 몰로니 쥐과 육종 바이러스 (MMSV)의 인핸서 및 프로모터 (U3 영역), 라우스 육종 바이러스 (RSV)의 U3 영역, 비장 초점 형성 바이러스 (SFFV)의 U3 영역, 또는 천연 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 (MMLV) 프로모터에 연합된 HCMV IE 인핸서일 수 있다. 레트로바이러스　포장 벡터는 예를 들어 제1 헬퍼 서열이 자기지향성(ecotropic) MMLV 또는 GALV의 gag 및 pol 단백질을 암호화하는 cDNA를 함유하고 제2 헬퍼 서열이 단백질을 암호화하는 cDNA를 함유하는 경우에, 플라스미드 기반 발현 벡터에 의해 암호화된 2개의 레트로바이러스 헬퍼 DNA로 이루어질 수 있다. 숙주 범위를 결정하는 Env 유전자는 이종향성(xenotropic), 양종향성(amphotropic), 자기지향성, 다중지향성(polytropic) (밍크(mink) 초점 형성) 또는 10A1 쥐과 백혈병 바이러스 env 단백질, 또는 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 (GALV env 단백질, 인간 면역결핍 바이러스 env (gp160) 단백질, 수포성 구내염 바이러스 (VSV) G 단백질, 인간 T 세포 (HTLV) 유형 I 및 II env 유전자 생성물, 상기 언급된 env 유전자 또는 상기 언급된 env 유전자 생성물의 세포질 및 경막을 암호화하는 키메라 엔벨로프 유전자 중 하나 이상의 조합으로부터 유래된 키메라 엔벨로프 유전자 및 원하는 표적 세포 상의 특정 표면 분자에 대해 지시된 단클론성 항체를 암호화하는 유전자로부터 유래될 수 있다.
포장 과정에서, 포장 벡터 및 레트로바이러스 벡터는 고역가 재조합 레트로바이러스-함유 상층액을 생성하기 위하여, 바이러스를 생성할 수 있는 포유류 세포, 예컨대 인간 배아 신장 세포, 예를 들어 293 세포 (ATCC No. CRL1573, ATCC, Rockville, Md.)의 제1 집단에 일시적으로 공동트랜스펙션될 수 있다. 개시의 다른 방법에서 이런 일시적으로 트랜스펙션된 세포의 제1 집단은 그런 후, 표적 세포를 외래 유전자로 고효율로 형질도입시키기 위하여, 포유류 표적 세포, 예를 들어 인간 림프구와 공동 배양된다. 발명의 또 다른 방법에서 상기 기술된 일시적으로 트랜스펙션된 세포의 제1 집단으로부터의 상층액은, 표적 세포를 외래 유전자로 고효율로 형질도입시키기 위하여, 포유류 표적 세포, 예를 들어 인간 림프구 또는 조혈 줄기 세포와 함께 인큐베이션된다.
또 다른 측면으로, 포장 벡터는 바이러스를 생성할 수 있는 포유류 세포, 예컨대 인간 배아 신장 세포, 예를 들어 293 세포에서 안정적으로 발현된다. 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터는 선택 가능한 마커로의 공동 트랜스펙션 또는 위형(pseudotyped) 바이러스로의 감염에 의해 세포로 도입된다. 두 경우에 모두, 벡터가 통합된다. 대안으로, 벡터는 에피솜성으로 유지된 플라스미드에 도입될 수 있다. 고역가 재조합 레트로바이러스-함유 상층액이 생성된다.
CAR 세포의 활성화 및 팽창. 원하는 CAR을 발현하기 위한 세포의 유전자 변형 전이나 후에, 세포는 미국 특허 제 6,352,694호; 6,534,055호; 6,905,680호; 6,692,964호; 5,858,358호; 6,887,466호; 6,905,681호; 7, 144,575호; 7,067,318호; 7, 172,869호; 7,232,566호; 7, 175,843호; 5,883,223호; 6,905,874호; 6,797,514호; 6,867,041호 및 Lapateva et al. (2014) Crit Rev Oncog 19(1-2):121-32; Tam et al. (2003) Cytotherapy 5(3):259-72; Garcia-Marquez et al. (2014) Cytotherapy 16(11):1537-44와 같은 참고문헌에서 기술된 것들과 같은 일반적으로 알려져 있는 방법을 사용하여 활성화되고 팽창될 수 있다. 생체외에서 종양 관련 항원으로의 자극은 선택된 CAR 발현 세포 하위집단을 활성화하고 팽창시킬 수 있다. 대안으로, 세포는 생체내에서 종양 관련 항원과의 상호작용에 의해 활성화될 수 있다.
특정 면역 세포의 경우에, 추가적인 세포 집단, 가용성 리간드 및/또는 사이토카인, 또는 자극제가 세포를 활성화하고 팽창시키기 위해 필요할 수 있다. 관련 시약은 기술분야에 잘 알려져 있고 공지된 면역학적 원리에 따라 선택된다. 예를 들어, 가용성 CD-40 리간드가 특정 B-세포 집단을 활성화하고 팽창시키는 데 도움이 될 수 있다; 유사하게, 방사선 조사된 공급기 세포가 NK 세포의 활성화 및 팽창을 위한 과정에 사용될 수 있다.
관련 세포를 활성화하는 방법은 기술분야에 잘 알려져 있고 본 출원에 쉽게 적응될 수 있다; 예시의 방법은 하기 실시예에서 기술된다. 본 개시와 관련하여 사용하기 위한 분리 방법은, 한정하는 것은 아니지만 Life Technologies Dynabeads® 시스템 활성화 및 팽창 키트; BD Biosciences PhosflowTM 활성화 키트, Miltenyi Biotec MACSTM 활성화/팽창 키트, 및 관련 세포의 활성화 모이어티에 특이적인 다른 상업적으로 이용 가능한 세포 키트를 포함한다. 면역 세포의 특정 하위집단은 이러한 키트에서 이용할 수 있는 비드 또는 다른 작용제의 사용을 통해 활성화되거나 팽창될 수 있다. 예를 들어, α-CD3/α-CD28 Dynabeads®가 분리된 T-세포의 집단을 활성화하고 팽창시키기 위해 사용될 수 있다.
사용 방법
치료적 적용. 본 개시의 방법 측면은 시험관내 또는 생체내에서 종양 또는 암 세포 (예컨대, MM 세포)의 성장을 억제하기 위한 및/또는 그것을 필요로 하는 암 환자를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 종양은 고체 종양이다. 일부 구체예에서, 암은 혈액 및/또는 골수에 영향을 미치는 암, 예컨대, MM이다. 일부 구체예에서, 암 또는 종양 세포는 암 또는 종양 항원, 예컨대, BCMA 및/또는 CS1을 발현 또는 과다발현한다. 시험관내에서 실시될 때, 방법은 정확한 의학 적용을 위한 시험관내 검정 및 새로운 조합 및 치료법을 테스트하기 위한 유용한 검정을 제공한다.
특정 구체예에서, 이들 방밥은 CAR을 포함하는 분리된 세포의 유효량을 대상체 또는 환자에게 투여하는 단계를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 추가의 구체예에서, 이 분리된 세포는 CAR 및/또는 이중특이적 항체를 포함하거나 발현한다. 일부 구체예에서, CAR의 항원 결합 도메인은 B-세포 성숙 항원 (BCMA) 및/또는 SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 및/또는 이것들의 각각의 동등물 중 어느 하나에 대한 항체의 관련 CDR 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 일부 구체예에서, CAR의 항원 결합 도메인은 B-세포 성숙 항원 (BCMA) 및/또는 SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 및/또는 이것들의 각각의 동등물 중 어느 하나에 대한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 또한 추가의 구체예에서, 분리된 세포는 T-세포 또는 NK 세포이다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 NKG2D 리간드 및, 선택적으로, SALMF7 (CD319의 CS1으로도 알려져 있음) 리간드를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 특정 구체예에서, 이중특이적 항체는 NKG2D 및, 선택적으로, SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 또는 이것들의 각각의 동등물에 대한 항체의 관련 CDR 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 NKG2D 및, 선택적으로, SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 및/또는 이것들의 각각의 동등물에 대한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 NKG2D에 대한 항체로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFV) 및, 선택적으로, SALMF7 (CD319의 CS1으로도 알려져 있음)로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFV), 및/또는 이것들의 각각의 동등물을 포함한다. 일부 구체예에서, 분리된 세포는 치료되는 대상체 또는 환자에 대해 자가이다. 추가의 측면으로, 종양은 암 또는 종양 항원을 발현하고 대상체는 진단, 예컨대 CAR에 의해 표적화된 종양 또는 암 관련 항원을 인식하고 결합하는 항체의 사용에 의해 치료법에 대해 선택되었다. 대상체는 동물, 포유류, 개과, 고양이, 소, 말, 쥐과 또는 인간 환자이다.
본원에서 개시된 CAR 세포는 단독으로 또는 본원에 개시된 이중특이적 항체, 희석제, 공지된 항암 치료제, 및/또는 사이토카인 또는 면역조절성인 다른 세포집단과 같은 다른 구성요소와 함께 투여될 수 있다. 이것들은 제1선 치료법, 제2선 치료법, 제3선 치료법, 또는 제4선 치료법으로서 투여될 수 있다. 추가적인 치료법의 비제한적인 예로는 세포감소 치료법, 예컨대 방사선 요법, 한랭요법, 또는 화학요법, 또는 생물학적 제제를 들 수 있다. 추가의 비제한적인 예로는 다른 관련 세포 유형, 예컨대 미변형 면역 세포, 하나 이상의 면역조절 분자를 발현하는 벡터를 포함하는 변형된 면역 세포, 또는 본원에 개시된 것과 상이한 항원에 대해 특이적인 CAR 세포를 들 수 있다. 본 개시의 CAR 세포를 사용할 때와 같이, 일부 구체예에서, 이들 세포는 자가이거나 동종의 것일 수 있다. 적절한 치료 양생법은 치료하는 의자 또는 수의사에 의해 결정될 것이다.
본 개시의 제약학적 조성물은 치료되거나 예방될 질환에 대해 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 양 및 빈도는 환자의 상태, 및 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자들에 의해 결정되겠지만, 적절한 투여량은 임상 실험에 의해 결정될 수 있다. 한 측면으로 그것은 직접 주사에 의해 직접적으로 또는 정맥내 주사와 같은 전신적으로 투여된다.
개시의 여러 측면은 만약 환자가 CAR 요법에 대해 반응할 가능성이 있는지, 또는 CAR 요법에 대해 반응할 가능성이 없는지를 결정하기 위한 예시의 방법을 제공한다. 그 방법은 환자로부터 분리된 종양 샘플에서 괴사의 존재 또는 부재를 결정하는 단계 및 암 또는 종양 항원을 발현하는 암 또는 종양 세포의 양을 정량화하는 단계를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어진다. 특정 구체예에서, 방법은 CAR 요법에 대해 반응할 가능성이 있는 것으로 결정된 환자에 대해 유효량의 CAR 요법을 투여하는 단계를 추가로 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 이것으로 이루어진다. CAR 요법은 환자에 대해 자가이거나 동종일 수 있고 환자는 고체 종양에 걸린 대상체, 동물 또는 인간일 수 있다.
괴사에 대한 조직학적 염색 기법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, "H&E 염색"으로서도 언급되는 헤마톡실린 및 에오신 염색은 조직, 특히 종양발생 또는 암성 성장에서 괴사의 존재를 확인하기 위한 공통 기법이다. 세포질의 H&E 염색은 증가된 호산구 증가증이 세포질 RNA의 손실에 부분적으로 기여하고 변성된 세포질 단백질에 부분적으로 기여할 수 있음을 입증한다. 괴사 조직 염색에서, 세포질은 종종 세포질 소기관의 효소 소화로 인해 "좀 먹은(moth eaten)"것으로 나타난다. 미엘린 수치, 석회화 및 다른 세포로의 식균 작용의 증거는 또한 조직학적 염색에 의해 검출될 수 있는 괴사 조직의 특징이다. 괴사 조직은 또한 세포 사멸의 결과로서 핵용해, 핵농축 및 핵붕괴를 보여주는 핵 염색의 특정 특징을 가진다. 이러한 괴사 특징의 현미경 및 수동 또는 자동 정량화를 사용하여, CAR 요법의 관련성이 결정될 수 있다. 종양발생 또는 암성 성장 또는 괴사 조직을 검출하는 대체 수단은 일반적으로, 한정하는 것은 아니지만 생체마커-기반 또는 영상화-기반 진단을 포함하며, 또한 환자가 특정 유형의 CAR 요법에 반응할 것인지를 결정하는 것과 동등하게 관련되며, 그에 따라 사용될 수 있다.
담체
개시의 추가적인 측면은 담체 및 생성물 - 예컨대, CAR, CAR을 포함하는 분리된 세포, CAR을 함유하는 분리된 핵산, 벡터, 분리된 세포 및 본원에 개시된 이중특이적 항체 및/또는 이러한 것을 암호화하는 핵산 - 본원에 개시된 구체예에서 기술됨 - 중 하나 이상을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 추가로 이것들로 이루어지는 조성물에 관한 것이다. 추가의 측면으로, 조성물은 추가적으로 면역조절 분자 및/또는 이중특이적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 이중특이적 항체는 BCMA 및/또는 NKG2D, 선택적으로, SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 또는 이것들의 각각의 동등물에 대한 항체의 관련 CDR 영역을 포함하거나 또는 대안으로 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 추가로 이것으로 이루어진다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 NKG2D, 선택적으로, SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음) (선택적으로 코돈 최적화됨) 및/또는 이것들의 각각의 동등물에 대한 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 또는 추가로 이것으로 이루어진다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 NKG2D에 대한 항체로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 선택적으로, SALMF7 (CD319의 CS1으로도 알려져 있음)로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFv) (선택적으로 코돈 최적화됨) 및/또는 이것들의 각각의 동등물을 포함한다.
간단히 설명하면, 본 개시의 제약학적 조성물은 한정하는 것은 아니지만, 본원에서 기술된 청구된 조성물 중 어느 하나를, 하나 이상의 제약학적으로 또는 생리적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함한다. 이러한 조성물은 중성 완충된 식염수, 인산염 완충된 식염수 등과 같은 완충제; 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩타이드 또는 글리신과 같은 아미노산; 항산화제; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트화제; 보조제 (예컨대, 수산화 알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 개시의 조성물은 경구, 정맥내, 국소, 장내, 및/또는 비경구 투여를 위해 제제화될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 개시의 조성물은 정맥내 투여를 위해 제제화된다.
세포 또는 조성물의 투여는 치료 과정 내내 연속적으로 또는 간헐적으로 한 용량으로 이루어질 수 있고 원하는 치료적 이익을 이루기 위한 유효량이 제공된다. 가장 효과적인 투여 수단 및 투여량을 결정하는 방법은 기술분야의 숙련된 사람들에게 알려져 있고 치료법에 사용된 조성물, 치료법의 목적 및 치료되는 대상체에 따라 달라질 것이다. 단일 또는 다중 투여는 치료하는 의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴에 다라 수행될 수 있다. 적합한 투여 제제 및 작용제의 투여 방법은 기술분야에 알려져 있다. 추가의 측면으로, 개시의 세포 및 조성물은 다른 치료와 함께 투여될 수 있다.
세포 및 세포 집단은 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어, PCT/US2011/064191에서 기술된 방법을 사용하여 숙주에 투여된다. 이런 개시의 세포 또는 조성물의 투여는 실험 및 스크리닝 검정을 위해 원하는 질환, 장애, 또는 상태의 동물 모델을 생성하기 위해 이루어질 수 있다.
병용 요법
본원에서 기술된 조성물은 제1선, 제2선, 제3선, 제4선, 또는 다른 치료법으로서 투여될 수 있고 세포감소성 개입과 조합될 수 있다. 그것은 치료하는 의사에 의해 결정된 대로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 한 측면으로, 그것은 CAR 및/또는 BsAb가 결합하게 되는 종양 또는 다른 항원의 발현을 상향조절할 수 있는 치료법과 조합될 수 있다. 한 측면으로, 일부 임상 약물은 표적화된 항원을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, CS1 표면 발현은 FDA-승인된, 다발성 골수종에 대한 면역 조절제 약물인 레날리도마이드(Lenalidomide)에 의해 증가될 수 있다. Wang et al. (2018) Clin. Cancer Res. Jan 1;24(1):106-119를 참조한다. 다른 예는 CAR-BsAb가 FLT3 항원을 표적으로 할 때 FLT3 발현을 증가시키는 FDA-승인된 약물 미도스타우린이다.
키트
본원에서 제시된 것과 같이, 본 개시는 CAR 및/또는 BsAb CAR 세포를 제조 및 투여하는 방법을 제공한다. 한 특정 측면으로, 본 개시는 세포 및/또는 조직을 수집하고, 및/또는 스크린/형질도입/등을 수행하며, 및/또는 그 결과를 분석하는 것과 같은, 본 개시의 방법을 수행하기 위한 설명서뿐만 아니라 이들 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다.
한 측면으로 키트는 본원에 개시된 분리된 핵산 중 어느 하나 및/또는 상기 핵산 및/또는 분리된 동종 세포, 바람직하게 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 벡터, 및/또는 환자로부터 자가 세포를 입수하는 것에 대한 설명서를 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 이러한 키트는 또한 본원에 개시된 것들과 같은, CAR 및/또는 BsAb CAR 발현 세포의 형질도입 및/또는 선택 및/또는 활성화 및/또는 팽창에 적절한 배지 및 기타 시약을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 포함할 수 있다.
한 측면으로 키트는 분리된 CAR 및/또는 BsAb CAR 발현 세포 또는 그것의 집단을 포함하거나, 또는 대안으로 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 또는 또한 추가로 그것으로 이루어진다. 일부 구체예에서, 이 키트의 세포는 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여되기 전에 활성화 및/또는 팽창을 필요로 할 수 있다. 추가의 구체예에서, 키트는 분리된 CAR 및/또는 BsAb CAR 발현 세포를 활성화 및/또는 팽창시키기 위한 배지 및 시약, 예컨대 상기 개시에서 포함된 것들을 추가로 포함하거나, 또는 본질적으로 그것들로 이루어질 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 CAR 요법에 대해 사용될 것이다. 추가의 구체예에서, 키트는 CAR 요법을 필요로 하는 환자에게 분리된 세포를 투여하는 데 대한 설명서를 포함한다.
본 개시의 키트는 또한, 예컨대, 완충제, 보존제 또는 단백질-안정화제를 포함할 수 있다. 키트는 검출 가능한-표지를 검출하기 위해 필요한 구성요소, 예컨대 효소 또는 기질을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한 검정되고 테스트 샘플과 비교될 수 있는 대조군 샘플 또는 대조군 샘플의 시리즈를 함유할 수 있다. 키트의 각각의 구성요소는 개별 용기 내에 동봉될 수 있고 다양한 용기는 모두 단일 포장 내에, 키트를 사용하여 수행된 검정의 결과를 해석하기 위한 설명서와 함께 있을 수 있다. 본 개시의 키트는 서면 제품을 키트 용기 상에 또는 키트 용기 내에 함유할 수 있다. 서면 제품은 키트에 함유된 시약을 사용하는 방법을 기술한다.
순응할 수 있게, 이들 제안된 키트 구성요소는 기술분야에 숙련된 사람들에 의해 사용하기 위해 통상적인 방식으로 포장될 수 있다. 예를 들어, 이들 제안된 키트 구성요소는 용액으로 또는 액체 분산액 등으로서 제공될 수 있다.
다음의 실시예는 개시를 실시하는 데 있어 다양한 경우에 사용될 수 있는 과정의 예시이다.
실시예 1 - BsAb CAR T-세포 생성 및 효능
키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 및 이중특이적 항체 (BsAb)는 FDA-승인 요법이고 암에 대해 인상적인 치료 잠재력을 보여준다. 그러나, 대부분의 경우에, 아직은 어느 것도 치료적인 것으로 나타나지 않았다. 이것은 부분적으로는 치료법의 기간으로 인한 것일 수 있는데, 즉, CAR T 세포는 생체내에서 오랫동안 충분하게 생존할 수 없고, BsAb는 매우 짧은 반감기를 가지면서 비싸고 시간 소모적인 제조 과정을 가짐으로써, 이것들의 효능 및 광범위한 적용을 제한한다. 여기서, 출원인은 CAR T 세포 요법을 BsAb 요법과 조합하기 위한 플랫폼을 성공적으로 생성하였고, 이들 둘 다 장기간 지속되는 효과에 대한 잠재력을 가진다. 출원인은 이 플랫폼을, 현재 FDA-승인 치료법 후에 고속으로 재발되는 치요 가능한 암인, 다발성 골수종 (MM)의 환경에서 테스트하였다. 출원인은 2개의 MM 표적 항원, CS1 및 BCMA를 이용하는 개념을 입증하였고, CS1(+) MM에 대한 세포독성 활성을 촉진할 목적으로 BCMA CAR을 발현할뿐만 아니라 가용성 항-NKG2D-항-CS1 BsAb를 분비하는 신규하고 효과적인 단일 렌티바이러스 구성물을 생성하였고, 이때 전자는 BCMA(+) MM 종양 세포를 공격하고 후자는 CD8(+) T 세포, γδT 세포, 천연 살해 (NK) T 세포, 및 NK 세포를 포함한 모든 NKG2D(+) 세포용해성 세포를 끌어당긴다. 이런 올인원(all-in-one), 다각적인 면역 양상은 동일한 악성 집단에 대해 상이한 표적 항원에서 지시된 선천성 및 적응성 면역 이펙터 세포 둘 다를 포획하는, 2개의 "살아있는 약물", 즉, CAR T 세포 및 BsAb를 동시에 제공한다. 출원인은, BCMA CAR T 세포 또는 BsAb 형질도입된 T 세포와 비교하여, BsAb-CAR T 세포는 더 많은 IFN-γ를 분비하였고 과립화에 대한 더 높은 능력을 보인 한편, 시험관내에서 MM 세포주 및 일차 MM 종양 세포를 포함한, MM 종양 세포를 표적화하는 것을 통해 시험관내에서 향상된 세포독성을 나타내는 것을 발견하였다. 이들 두 항원의 내인성 발현이 없는 표적 세포에서 BCMA 및 CS1의 이소적으로 강요된 발현은 표적 세포 용해를 향상시켰다. 중요하게, BCMA CAR T 세포로부터 분비된 항-NKG2D-항-CS1 BsAb는 NKG2D 신호전달의 활성화를 통해, 각각, 시험관내에서 BCMA CAR T 세포 증식 및 생체내에서 그것들의 향상된 증식 및 생존을 촉발시키는 자가분비 방식으로 작용한다. 포괄적으로, 본원에는 선천성 및 적응성 세포용해 이펙터 세포 둘 다의 특이적 항종양 활성을 포획하는 능력뿐만 아니라 증가된 기간 및 향상된 효능에 대해 CAR T 세포 요법 및 항-NKG2D 이중특이적 항체 요법을 단일 플랫폼으로 조합하는 능력을 가진 차세대 암 면역요법을 생성하기 위한 증거가 제공된다.
세포 배양: 세포주, MM.1S, H929, RPMI-8226 (인간 다중 골수종 세포주), 및 K562 (인간 적혈구백혈병 세포주)를 ATCC (Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. 이들 세포를 10% 우태아 혈청 (FBS)(Invitrogen, CA, USA) 및 1% 항생물질-항진균제 (Invitrogen)를 함유한 RPMI 1640 배지 (Sigma, St. Louis, USA)와 함께 배양하였다. ATCC로부터 구입하였고 렌티바이러스 생성을 위해 사용한 293T 세포주를 RPMI 1640에서와 동일한 상층액이 플러스된 DMEM (Sigma)에서 배양하였다. 건강한 도너 및 MM 환자로부터의 인간 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 피콜-파크 플러스 (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA) 밀도 구배 원심분리에 의해, 제조사의 설명서를 따라 분리하였다. 인간 CD56+ NK 세포, CD3+CD56+ NKT 세포, 및 CD3+γoTCR+ T 세포를 각각 인간 NK, NKT 및 γoT 세포 분리 키트 (MACS, Miltenyi Biotech, Auburn, CA, USA)를 제조사의 설명서를 따라 사용하여 분리하였다. 일차 MM 환자 샘플을 OSU 종합 암 센터 및 제임스 암 병원의 백혈병 조직 은행 공유 자원에 의해 제공받았다. 인간 대상체와의 모든 작업을 오하이오 주립대학 기관 검토 위원회에 의해 승인받은 프로토콜을 따라 수행하였다.
마우스: 생후 6- 내지 8-주령의 NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) 마우스를 잭슨 실험실 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA)로부터 구입하여 모든 생체내 연구에 사용하였다. 모든 동물 작업을 오하이오 주립대학 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인받은 프로토콜을 따라 수행하였다. MM 질환의 진행을 면밀하게 모니터링하고, 생존 데이터를 기록하였다. 마우스를 뒷다리 마비, 무기력, 및 분명한 체중 손실이 관찰될 때 희생시켰다.
BCMA-CAR, 항-NKG2D-항-CS1 BsAb, 및 BsAb-BCMA CAR- 렌티바이러스 구성물의 생성: BCMA CAR의 경우, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 사슬의 가변 영역에 대한 BCMA 코딩 도메인 서열을 하이브리도마로부터 얻어서 링커를 사용하여 재조합하였다. VH-링커-VL 단편을 CD28-CD3제타 부분과 프레임에 통합시켰다. 항-BCMA-scFv-CD28-CD3제타 단편을 렌티바이러스 벡터 pCDH에 하위클로닝하여 2세대 pCDH-BCMA CAR 구성물을 생성하였다. 항-NKG2D-항-CS1 BsAb 렌티바이러스 구성물을 만들기 위하여, 항-CS1 단클론성 항체로부터의 2개의 코돈-최적화된 단일 사슬 가변 단편 (scFv)29 및 인간 근육 알도스로부터 유래된 비면역원성 단백질 링커에 의해 함께 연합된 항-NKG2D 항체35를 pCDH 렌티바이러스 벡터에 클로닝하였다. "올인원" BsAb-BCMA CAR의 경우에, 항-BCMA-scFv-CD28-CD3ξ-T2A 카세트를 pCDH 항-CS1-NKG2D BsAb-EF1a-GFP에 통합시켜서 완전한 pCDH-BCMA CAR-T2A-BsAb-EF1a-GFP 렌티바이러스 구성물을 구성하였다.
렌티바이러스 생성 및 T 세포의 형질도입: 렌티바이러스 트랜스펙션 및 감염을 앞서 보고된 프로토콜에서 기술된 대로 수행하였다36,37.
안정적으로 CS1 및 BCMA 유전자를 발현하는 K562 세포의 생성: 인간 CS1 코딩 서열을 함유하는 전장 pCDH-CMV-CS1-EF1α-GFP 구성물은 이전에 보고되었다 30. 렌티바이러스를 생성하기 위하여, 293T 세포를 pCDH-CS1 플라스미드 또는 pCDH 빈 벡터 플라스미드 플러스 포장 플라스미드 pCMV-VSVG 및 pCMV-δr9로 리포펙타민® 2000 (Invitrogen)을 사용하여 공-트랜스펙션시켰다. 그런 후 렌티바이러스 상층액을 수득하고 이전에 공개된 프로토콜을 사용하여 K562 세포를 감염시키는 데 사용하였다36,38. 그런 후 GFP-양성 세포를 FACS Aria II 세포 분류기 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 분류하였다. BCMA-K562는 전장 BCMA cDNA를 운반하는 벡터로 형질도입된 K562 세포이다. 렌티바이러스 생성, 감염 및 분류를 상기 기술된 방법을 사용하여 수행하였다. CS1+BCMA+K562 세포를, pCDH-CMV-BCMA-EF1α-GFP 렌티바이러스 구성물을 상기 기술된 CS1-K562 세포로 형질도입함으로써 생성하였다. 이중-형질도입된 세포를 APC-항-BCMA mAb로 염색한 후 GFP+BCMA+ 집단에 대해 분류하였다. 실험에 사용하기 전에, 이들 GFP+BCMA+ 이중 양성 세포를 여러 번 배양 중에 계대하여 항-BCMA mAb-결합 세포의 손실을 확실하게 하였다.
유세포 분석 분석: 세포 표면에서 CAR 발현의 검출을 이전에 보고된 것과 같이 수행하였다30. 이 연구에서 사용한 항체는 다음을 포함하였다: FITC 및 비오틴-표지된 염소 항-마우스 (Fab)2 다클론성 항체 또는 정상 다클론성 염소 면역글로불린 G (IgG) 항체 (Jackson ImmunoResearch), 알로파이코시아닌 (APC)-컨쥬게이션된 스트렙트아비딘 (Jackson ImmunoResearch), PerCP/Cy5.5-컨쥬게이션된 스트렙트아비딘 (Biolegend), PE, PerCP/Cy5.5 및 BV421 항-인간 CD3 (hCD3, 클론 UCHT1 및 SK7, BD Biosciences), APC 및 PE 항-hCD56 (클론 TULY56 및 CMSSB, eBioscience), FITC 및 PC5.5 항-TCR pan γ/δ (클론 IMMU510, Beckman Coulter, Inc. CA, USA), PC5 항-TCR pan α/β (클론 IP26A, Beckman), FITC 항-TCR Vγ9 (클론 IMMU 360, Beckman) 및 퍼시픽 청색 항-TCR Vδ2 (클론 IMMU 389, Beckman), 컨쥬게이션되지 않은 및 APC-항 hNKG2D (클론 1D11BD Biosciences), PE-Cy7 항-hCD8 (클론 SK1, BD Biosciences), APC-Cy7 항-hCD4 (클론 SK3, BD Biosciences), BV421 항-인간 CD1d (클론 CD1d42, BD OptiBuild), V450 항-hCD11c (클론 B-ly6, BD Horizon), APC-H7 항-hCD19 (클론 HIB19, BD Pharmingen), APC-H7 항-hCD20 (클론 2H7, BD Biosciences), FITC 항-hCD45 (클론 J.33, Beckman), 비오틴 및 FITC 항-hCD14 (클론 63D3 및 M5E2, Biolegend), 비오틴 및 PE 항-hCD33 (클론 P67.6, Biolegend, 및 WM53, BD Pharmingen), 비오틴 항-hCD66b (클론 G10F5, Biolegend), 컨쥬게이션되지 않은 및 PE-항 hCS1 (클론 162, eBioscience), APC-항 hBCMA (클론 19F2, Biolegend), PE-항 Ki67 (클론 SolA15, BD Biosciences), PE-hCD69 (클론 FN50, BD Biosciences). 세포를 4% 소 혈청 알부민을 함유한 PBS로 1회 세척하고, 20분 동안 실온에서 항체로 염색하고, LSRII 유세포 분석기 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)로 분석하였다.
면역블롯팅: 세포내 발현 및 이중특이적 항체의 분비를 검출하기 위하여, BsAb-형질도입된 T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포 및 이들 세포의 배양으로부터의 세포-유리 상층액을 6x-his-태그 mAb (클론 4A12E4, Invitrogen)를 사용하는 면역블롯팅을 위해 수집하였다. 면역블롯팅을 출원인이 이전에 보고한 표준 면역블롯팅 프로토콜에 따라 수행하였다30,37. CAR 발현의 검출을 위해, CAR-형질도입된 T 세포를 용해하고 단백질을 면역블롯팅을 위해 추출하고, 이전에 보고한 것과 같이 마우스 항-인간 CD3ξ mAb (BD Pharmingen)로 프로빙하였다30,37.
세포독성 검정: 세포를 51Cr로 표지하고 96-웰 V-자형 바닥 플레이트의 웰에서 다양한 이펙터: 표적 비율 (E:T)의 형질도입된 T 세포와 37℃에서 4시간 동안 공동 배양한 후, 상층액을 수득하여 TopCount 카운터 (Canberra Packard)를 사용하여 표적 세포로부터의 51Cr의 방출을 측정하였다. PBMC에 맞물리는 BsAb의 능력을 연구할 때, CD3+T 세포, CD8+세포독성 T 세포, γδ T 세포, NKT 세포, 및 NK 세포를 미국 적십자로부터 주문받은 류코팩으로부터 분리하였다. T 세포를 IL-2 (500 U/mL) 및 IL-15 (500 U/mL)를 가진 DynabeadsTM 인간 T-활성자 CD3/CD28 (4 x 104/ μL, Beads:T=1:1)로 5 내지 14일 동안 프라이밍한 후 상기에서 기술한 표준 4시간 51Cr 방출 검정을 하였다. 인간 NK 세포를 IL-2 (500 U/mL)로 활성화한 후에 세포독성 검정을 하였다. 분리한 인간 CD3+CD56+ NKT 세포를 IL-2 (100U/mL)를 가진 α-GalCer (α-Galactosylceramide, KRN7000, Enzo Biochem Inc. NY, USA. 100ng/mL)39로 7 내지 10일 동안 활성화하였다. CD3+ γδTCR+ T 세포 활성화의 경우, IL-2 (100 U/mL)를 가진 HMBPP ((E)-1-하이드록시-2-메틸-2-부테닐 4-피로포스페이트, Sigma. 10nM)40,41를 사용하였고 14일 동안 배양하였다. 류코팩으로부터 이들 세포의 분리를 위한 프로토콜은 오하이오 주립대학 기관 검토 위원회에 의해 승인받았다.
ELISA: 배양 상층액 중의 인간 IFN-γ의 존재를 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)로부터의 키트를 사용하여 제조사의 프로토콜을 따라 검정하였다. 배양 상층액 중의 인간 IL-2 및 TNF-α의 수준을 또한 ELISA 키트 (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)에 의해 검정하였다. 이들 ELISA 분석을 위해, 환자로부터의 2.5 x 105개의 세포의 골수종 세포주 또는 일차 MM 세포를 96-웰 V자형 바닥 플레이트에서 24시간 동안 2.5 x 105개의 조작된 또는 대조군 T 세포와 인큐베이션하였다. 데이터를 450 nm에서 Synergy HT 마이크로플레이트 판독기 (Biotek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 판독하였다.
MM-포함 마우스의 생체내 치료 및 생물발광 영상화: 반딧불이 루시페라제 유전자, MM.1S-GL3을 발현하는 MM.1S 골수종 세포는 이전에 기술되었다30. 이종이식 동소(orthotopic) MM 모델을 구성하기 위하여, NSG 마우스 (수컷)를 200 μL의 식염수 중의 8 x 106개의 MM.1S-GL3 세포로 꼬리 정맥 i.v.를 통해 0일에 주사하였다. 10, 17 및 24일에, 마우스에게 (1) 비히클 대조군 (식염수) 또는 (2) 빈-벡터 형질도입된 T 세포, (3) BsAb-형질도입된 T 세포, (4) BCMA-CAR-형질도입된 T 세포, (5) BsAb 및 BCMA-CAR로 순차적으로 형질도입된 T 세포, 또는 (6) BsAb-CAR-형질도입된 T 세포를 포함한, 10 x 106개의 이펙터 세포를, 꼬리 정맥 정맥내 주사에 의해, 각각 200 μL 식염수에 담아 투여하였다. MM.1S-GL3 세포로의 접종 후 10일, 24일, 31일 후에, D-루시페린 (150 mg/kg 체중; Gold Biotechnology)을 모든 마우스에게 복강내로 주사하였다. 영상화를 리빙 이미지 소프트웨어를 포함한 생체내 영상화 시스템 (IVIS) (PerkinElmer)을 사용하여 수행하였다. 80일에, 본 발명자들은 생존 마우스를 200 μl 식염수 중의 마우스당 4 x 106개의 MM1.S 세포의 꼬리 정맥 i.v. 주사에 의해 도전하였고, 생존 데이터를 수집하고 140일에 종료하였다. BsAb의 효과를 조사하기 위하여, 상기 실험을 인간 골수 세포의 고갈을 포함한 PBMC의 존재 하에 반복하였다. 이 목적을 위해, NSG 마우스를 0일에 200 mL의 식염수 중의 8 x 106개의 MM.1S-GL3 세포로 i.v. 주사하였다. 10일에, 마우스에게 3 x 106개의 다양한 형질도입된-T 세포와, 이어서 3 x 106개의 CD33-CD14-CD66b-인간 PBMC를 모두 i.v.로 투여하였다. 17일 및 24일에, 마우스에게 동일한 도너로부터 생성한 3 x 106개의 조작된 T 세포를 i.v.로 주었다. 10일, 19일, 28일, 및 37일에, 마우스에게 D-루시페린을 주입하고 상기에서 기술한 것과 같이 영상화하였다.
면역형광 현미경에 의해 검출된 면역-시냅스: 주로 분비된 항-NKG2D-항-CS1 BsAb를 표지하기 위하여, supernatant from BsAb CAR T 세포로부터의 상층액을 수집하고 6x-His 태그 mAb (클론 4E3D10H2/E3, Invitrogen)로 1:500의 희석률로 1시간 동안 37℃ 인큐베이션으로 염색한 후 Alexa Fluor®350 (청색, Thermo Fisher Scientific, MA, USA)으로 표지하였다. MM.1S 세포를 수득하고 45분 동안 성장 조건 하에서 세포TrackerTM 진한 적색 염료 (20μM, Thermo Fisher Scientific)와 인큐베이션하였다. 면역-시냅스를 보기 위하여, BsAb-CAR T 세포 (GFP, 녹색) 또는 빈 벡터-형질도입된 대조군 T 세포 (GFP, 녹색)를 MM.1S 세포 (적색) 및 His 태그 표지된 상층액과 1시간 또는 24시간 동안 공동 배양하였다. 생-세포 형광 영상화를 자이스 현미경 시스템 (Zeiss Axio Observer Z1, Carl Zeiss Inc., NY, USA)에 의해 관찰하였다. 비디오 촬영을 위해, BsAb-CAR T 세포 (GFP, 녹색) 또는 빈 벡터-형질도입된 T 세포 (GFP, 녹색)를 MM.1S 세포 (적색)와 1시간 동안 공동 배양하고, 현미경을 2시간의 기간 동안 면역-시냅스를 관찰하기 위해 사용하였다.
결과: BCMA-특이적 CAR 및/또는 항-NKG2D-항-CS1 이중특이적 항체를 발현하는 일차 T 세포의 생성: 출원인은 순차적으로 신호 펩타이드 (SP), 중쇄 가변 영역 (VH), 글리신-세린 (GS) 링커, 경쇄 가변 영역 (VL), Myc 태그, 힌지, CD28, CD3ξ로 이루어진, 렌티바이러스 벡터 골격을 가진 특이적 BCMA-CAR 구성물을 생성하였다 (도 1A). 다음으로, 출원인은 렌티바이러스 벡터 골격을 가진 항-NKG2D-항-CS1 이중특이적 항체 ("BsAb"로 언급됨) 구성물을 설계하였다. 이것은 인간 근육 알도스로부터 유래된 비면역원성 단백질 링커에 의해 함께 연합된, 항-NKG2D 항체 및 항-CS1 단클론성 항체로부터의 2개의 코돈-최적화된 단일 사슬 가변 단편 (scFv)으로 이루어졌다. 각각의 scFv는 글리신-세린 (GS) 링커에 의해 연결된 상응하는 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)를 함유한다(도 1B). 건강한 도너로부터 분리되고 항-인간 CD3/CD28 항체 비드에 의해 활성화된 동일한 도너 T 세포를 빈 벡터 (EV), the BsAb 구성물, BCMA-CAR 구성물로 형질도입하거나, 또는 먼저 BsAb 구성물로 형질도입한 후 순차적으로 BCMA-CAR 구성물로 형질도입하였다 (이하 BsAb-BCMA seq. trans. T 구성물로 언급함). 세포 표면에서 BCMA CAR의 발현을 항-Fab로 형질도입된 T 세포를 염색함으로써 입증하였는데, 이것은 BCMA CAR 구성물 또는 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포 구성물 중 어느 하나로 형질도입된 FACS-풍부 T 세포의 80% 이상에서 scFv의 발현을 검출한 반면, 발현은 미변형 T 세포에서, EV-형질도입된 T 세포에서, 및 BsAb T 세포에서 거의 검출 가능하지 않았다 (도 1C). BsAb T 세포 및 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포가 성공적으로 형질도입되었는지를 측정하기 위하여, 4-일 배양으로부터의 세포-유리 상층액을 수득하고 4-일 배양으로부터의 세포 펠릿을 용해시켰다. 그런 후 상층액과 세포 용해물을 전부 6x-his 태그 Ab를 사용하여 면역블롯팅을 수행하였다. 결과는 BsAb-T 세포 및 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포가 둘 다 세포 및 분비된 BsAb를 생성한 한편, 미변형 T 세포 상층액 및 용해물로부터의 대조군은 BsAb를 생성하지 못하였다 (도 1D).
BsAb-BCMA seq. trans. T 세포는 시험관내에서 각 벡터 단독으로 형질도입된 T 세포보다 MM의 보다 효과적인 킬러이다: BsAb가 항-NKG2D 수용체 부분 및 항-CS1 부분을 함유하였기 때문에, 출원인은 NKG2D+ 세포용해성 면역 세포에서의 NKG2D 활성화를 촉발시키기 위해 시도하였고 그것이 MM-관련 항원, CS1을 통해 동시에 MM 세포와 맞물리는 지를 테스트하였다. 출원인은 먼저 3개의 공통적으로 사용된 MM 세포주 MM.1S, H929, RPMI-8226 및 인간 적혈구 백혈병 세포주, K562에서 CS1 및 BCMA의 표면 발현을 유동 세포분석 분석에 의해 평가하였다. 결과는 4개의 MM 세포주에서의 BCMA 및 CS1 발현의 다양한 수준을 보여주었다. MM1.S MM 세포주는 BCMA 및 CS1 둘 다의 고수준의 발현을 가지고; H929 MM 세포주는 고수준의 BCMA 및 중간 (int) 수준의 CS1 발현을 가지며; RPMI-8226 MM 세포주는 중간 수준의 BCMA 발현을 가지는 한편, 이것의 CS1 발현은 매우 낮다. 음성 대조군으로서, K562 적혈구백혈병 세포주는 세포 표면에서 CS1이나 BCMA를 발현하지 못하였다 (도 2A). 상기 언급한 BSAb-BCMA seq. trans. T 세포 (순차적으로 형질도입된 BCMA CAR 및 항-NKG2D-항-CS1 BsAb를 가짐)가 MM 세포주의 보다 효율적인 종양 세포 용해로 이어질 수 있을지의 여부를 결정하기 위하여, 표준 4시간 51Cr-방출 검정을 수행하였고, K562 적혈구백혈병 세포주를 음성 표적 대조군으로서 사용하였다. 단일 구성물-조작된 BsAb-CAR T 세포를 생성하기 전에, 출원인은 MM 종양 세포 살해를 5개의 T 세포 그룹에서 비교하였다: (1) 미변형 T 세포, (2) 빈 벡터 (EV)-형질도입된 T 세포 (EV T), (3) 항-NKG2D-항-CS1-BsAb-형질도입된 T 세포 (이하 BsAb T로서 언급함), (4) BCMA-CAR-형질도입된 T 세포 (이하 BCMA-CAR T로서 언급함), 및 (5) 항-NKG2D-항-CS1 BsAb 및 BCMA-CAR 순차적으로 형질도입된 T 세포 (BsAb-BCMA seq. trans. T로도 언급함). 표적 MM 세포주 BCMAhighCS1high MM.1S 및 BCMAhighCS1int H929의 경우, BsAb-BCMA seq. trans. T 세포가 BsAb T 세포 또는 BCMA-CAR T 세포보다 상당히 더 나은 살해를 유발하였다. 표적 MM 세포주 BCMAintCS1low RPMI-8226의 경우, BsAb-BCMA seq. trans. T 세포는 BsAb T 세포보다는 낫게 수행하였지만 BCMA-CAR T 세포보다 낫지는 않았다; 중요하게, 단일 또는 조합 항원 표적화는 음성 대조군 K562 적혈구백혈병 표적 세포주에 대한 활성을 나타내지 않았다 (도 2B). 특히, BCMA-CAR T 세포는 BsAb T 세포, EV T 세포, 및 미변형 T 세포의 효과와 비교할 때 MM 표적 세포를 용해하는 데 더 효과적이었다. 통계학적 분석은 표적 MM 세포주가 중간 내지 고수준의 CS1 및 BCMA (즉, MM1.S 및 H929)를 발현할 때 이펙터 세포의 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포 집단으로 수행된 세포독성 검정에 대해 상조 효과가 관찰되었음을 나타낸 한편, 이런 효과는 표적 세포가 낮은 또는 중간 수준의 두 항원을 발현할 때에는 (즉, RPMI-8226) 관찰되지 않았다 (도 2B).
CS1 및 BCMA를 내재적으로 발현하는 MM 세포를 인식할 때 상기 형질도입된-T 세포의 활성화를 추가로 측정하기 위하여, 출원인은 미변형 T 세포, EV T 세포, BCMA-CAR T 세포, BsAb T 세포, 및 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포로부터의 상층액에서 ELISA를 통한 IFN-γ, IL-2 및 TNF-α 분비를 측정하였다. BsAb-BCMA seq. trans. T 세포로부터의 IFN-γ 분비는 BCMAhighCS1high MM.1S 또는 BCMAhighCS1int H929 MM 세포주와 공동 배양될 때 BsAb T 세포 또는 BCMA CAR T 세포 단독보다 상당히 더 높았다. BCMAintCS1low RPMI-8226 MM 세포주와의 공동 배양 조건에서, BsAb-BCMA seq. trans. T 세포로부터의 IFN-γ 분비는 BsAb T 세포보다 상당히 더 높았지만 BCMA T 세포와 비교하여 상당히 더 높지는 않았다. CS1*BCMA* K562 적혈구백혈병 세포주와의 공동 배양 조건에서 또는 종양 표적 세포 없이, BsAb-BCMA seq. trans. T 세포는 BsAb T 세포 또는 BCMA-CAR T 세포로의 단일 항원 표적화보다 월등하지 않았다 (도 2C). BsAb T 세포, BCMA-CAR T 세포 또는 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포에서 IL-2 생성은 MM.1S, H929 또는 RPMI-8226 MM 세포주와 공동 배양될 때 미변형 T 세포 또는 EV T 세포보다 극적으로 더 높았다 (도 2D). 흥미롭게, 음성 대조군 K562 적혈구백혈병 세포주와의 공동 배양에서 또는 표적 세포가 없을 때에도, BsAb T 세포 및 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포는 BCMA CAR T 세포에서 볼 수 있는 IL-2 분비보다 상당히 더 높은 고수준의 IL-2를 분비하였고 (도 2D), 이것은 적어도 이 경우에, 효과가 MM 표적 세포로부터 유발하기보다는 오히려 분비된 BsAb 자체의 존재로부터 유발하는 것으로 나타났음을 시사한다. TNF-α 분비는 IFN-γ 분비와 일관되었다 (도 2E). 전체적으로, 이들 결과는 BsAb T 세포 또는 BCMA-CAR T 세포와 비교하여, BsAb-BCMA seq. trans. T 세포가 MM 표적 세포를 더 특이적으로 인식할 수 있고, 이들 MM 세포의 인식 후에 더 활성화되는 것을 나타냈다. 더욱이, 다른 조건과 비교하여, 출원인은 또한 BsAb T 세포 또는 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포로부터 분비된 BsAb가 BsAb 구성물을 발현하지 않은 T 세포와 비교하여 고도로 풍부한 IL-2 생성에 의해 증명된 것과 같이, MM 세포의 존재로 또는 부재와 관계 없이 T 세포 활성화를 촉발하는 것으로 나타난 것을 주지하였다 (도 2D). 이것은 세포독성 CD8(+) T 세포에서 발현된 NKG2D 수용체가 분비된 BsAb의 존재에 의해 활성화되었음을 시사하였다.
GMM에서 BCMA 및 CS1을 둘 다 표적화하기 위한 단일 구성물-조작된 BsAb-CAR T 세포의 생성 : 출원인은 2개의 별도의 구성물에 의해 전달된 BCMA-CAR 및 항-NKG2D-항-CS1 BsAb를 공동 발현하는 T 세포 (즉, BsAb-BCMA seq. trans. T 세포)가 BCMA-CAR 또는 BsAb 중 어느 하나를 발현하는 T 세포와 비교할 때 MM 세포를 살해하는 데 월등한 것을 주지하였다. BsAb 및 CAR을 둘 다 발현하는 단일 구성물 (이하 BsAb-CAR로 언급함)은 (1) 단일 T 세포에서 두 구성물의 효과적인 발현을 생성하고; (2) 제조 비용을 감소시키며; (3) 시간을 절약하는 데 있어서 더 실제적일 수 있을 것이다. 그러므로 출원인은 T2A에 의해 연결된 렌티바이러스 벡터 골격에서 두 부분을 모두 함유하는 단일 BsAb-CAR 구성물을 생성하였다 (도 3A). BsAb-CAR을 발현하는 일차 T 세포를 생성하기 위하여, 출원인은 상기 기술된 것과 동일한 방법을 사용한 후 BsAb-CAR-형질도입된 T 세포가 성공적으로 형질도입되었는지를 결정하였다. CAR의 표면 발현을 유동 세포분석 분석에 의해 확인하였다 (도 21C). BsAb 융합 단백질을 두 세포 용해물 및 혈청-유리 배지에서 4일에 6x-his-태그 Ab를 사용하여 성공적으로 검출하였다 (도 3B). 추가적으로, BsAb 분비를 동역학적으로 측정하기 위하여, 출원인은 BsAb-CAR T 세포를 혈청-유리 배지에 5일에 재시딩한 후, 세포-유리 상층액을 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 수집하였다. 그 결과는 발현이 12시간 전에 시작하여 시간 의존 방식으로 계속 증가하였기 때문에, BsAb 분비가 강력하였음을 보여주었다 (도 21A-B). 출원인은 그런 후 분획화되지 않은 BsAb-CAR T 세포가 EV T 세포 및 미변형 T 세포에 의한 살해와 비교하여 BCMAhighCS1high MM 세포주 MM.1S의 상당히 월등한 살해를 보여준 것을 입증하였다 (도 3C). 유사한 결과를 BCMAhighCS1int H929 및 BCMAintCS1low RPMI-8226 MM 표적 세포주에 대해 얻은 한편, 음성 대조군 K562 적혈구백혈병 세포주에 대한 살해는 없었다 (도 21D). 대략 80%의 CD8+ T 세포가 NKG2D의 고표면 밀도 발현을 나타내기 때문에 (분획화되지 않은 T 세포의 30% 대비; 도 11A), 출원인은 고도로 풍부한 CD8+ T 세포를 BsAb-CAR 구성물로 형질도입하였다. 아마도 예측 가능하게, 출원인은 이들 세포가 CD8+ BsAb T 세포 및 CD8+ BCMA-CAR T 세포보다 높을뿐만 아니라 에 대해, 2개의 음성 대조군, 미변형 T 세포 및 EV T 세포보다 더 높은 세포독성을 가지는 것을 발견하였다 (도 3D).
CAR T 세포에 의해 분비된 BsAb는 두 항원이 기능성일 것을 필요로 한다: 종양 세포에서 발현된 CS1, 및 면역 세포에서 발현된 NKG2D. 출원인은 먼저 PBMC 중에서 TCR pan α/β CD3+T, TCR pan γ/δ CD3+T, CD3+CD56+NKT, 및 CD3-CD56+NK 세포의 백분율을 평가하였는데, 이것들은 각각 PBMC의 대략 50%, 1%, 8%, 및 15%를 나타낸다 (도 11A). 나아가, 출원인은 NKG2D가 T 세포의 대략 30%, CD8+T 세포의 대략 80%, γ/δ T 세포의 대략 70%, NKT 세포의 대략 60%, 및 90%의 NK 세포에서 발현되는 것을 확인하였다. 특히, γδ T 세포의 하위세트인, 거의 90%의 Vγ9Vδ2 T 세포가 NKG2D를 발현하였다 (도 11B 및 11C). 항-NKG2D-항-CS1 BsAb가 NKG2D+ 면역 세포를 촉발하는지를 결정하기 위하여, 출원인은 상기에서 기술된 것과 같은 4시간 크로뮴-51 방출 검정을 10개의 이펙터 (형질도입된 또는 미변형 T 세포) 대 1개의 표적 세포 (MM.1S)의 비율에서, 그러나 상이한 양, 즉, 종양 세포의 1-, 10-, 100-, 또는 200배의 인간 PBMC를 첨가하여 수행하였다. 출원인은 BsAb T 세포 및/또는 BsAb-CAR T 세포 중 어느 하나로부터 분비된 BsAb가 비-형질도입 NKG2D+ 세포용해성 이펙터 세포를 CS1+ MM 세포주 표적에 충원하였다면, 표적의 살해는 비-형질도입 PBMC의 첨가로부터 더 큰 희석으로 증가될 수 있을 것으로 가설을 세웠다. 이들의 가설을 지지하여, 비-형질도입 PBMC가 증가되었기 때문에, BsAb를 분비한 형질도입된 T 세포 (즉, BsAb T 세포 및 BsAb-CAR T 세포)를 함유한 배양만이 BCMAhighCS1high MM.1S MM 세포주에 대한 증가하는 세포독성을 보여주었다 (도 3E). 예측 가능하게, 효과는 MM.1S MM 세포주보다 낮은 CS1의 발현을 가진 BCMAhighCS1int H929 세포주에 대해 더 소소하였고, BCMAintCS1low RPMI-8226 MM 표적 세포주에 대해서는 없었다 (도 12A, 12B).
출원인은 다음에 PBMC의 각 하위세트, 즉, NK 세포, NKT 세포, CD8+ T 세포, 및 γ9Vδ2 T 세포를 거의 98% 순도로 풍부화하였고 (도 13), 그것들을 IL-2, CalCer 플러스 IL-2, CD3/CD28 다이나비드 플러스 IL-2, 및 HMBPP 플러스 IL-2로 각각 프라이밍하였고, 각각을 대조군 또는 실험 벡터 중 하나로 형질도입한 후, BCMAhighCS1high MM.1S MM 세포주에 대해 5:1의 E:T 비율로 4시간 (도 3F, 좌측) 또는 16시간 (도 3F, 우측) 51Cr-방출 세포독성 검정을 하였다. 4시간 이상의 인큐베이션 때, 결과는 BsAb CAR T 세포가, T 세포 하위세트 또는 활성화 방법과 관계없이, 다른 구성물로 형질도입된 동일한 세포보다 상당히 더 높은 세포독성을 가지는 것을 보여주었다 (도 3F 및 14). 중요하게, 조사한 BsAb CAR T 세포 집단 중에서, 대조군 세포와 비교하여, 활성화된 CD4+ BsAb CAR T 세포가, 아마도 적어도 부분적으로는 이 집단에서 NKG2D의 상대적으로 낮은 표면 밀도 발현으로 인하여 세포독성 활성에서 가장 적은 증가를 나타냈다 (도 3F, 우측 및 도 14).
BsAb-CAR T 세포에 의해 분비된 BsAb가 BsAb-CAR T 세포와 MM.1S MM 세포 사이의 시냅스 형성을 유도할 수 있는지를 결정하기 위하여, 한 시간의 공-인큐베이션 후에 공초점 현미경 분석을 수행하였다. EV T 세포 및 MM.1S MM 세포의 공동 배양의 대조군을 관찰했을 때, 시냅스는 볼 수 없었다 (도 3G). 대조적으로, 시냅스를 BsAb-CAR T 세포 및 MM.1S MM 세포의 공동 배양 중에 관찰하였다 (도 3H).
추가로, BsAb CAR-T 세포 (녹색)의 표적 MM.1S MM 세포 (적색)와의 24시간 공동 배양을 관찰했을 때, 출원인은 단지 BsAb CAR-T 집단 (녹색)만이 존재하였고 (도 15A-F); 여전히 EV T 세포 및 MM.1S MM 세포의 공동 배양에서, 표적 MM.1S MM 세포 및 이펙터 EV T 세포 (녹색)가 둘 다 여전히 존재한 것 (도 15G-M)을 주지하였다.
BsAb-CAR T 세포의 기능적으로 향상된 인식 및 활성화는 CS1 및 BCMA-의존적이다: BsAb-CAR T 세포의 증강된 세포독성 효과가 표적화 종양 항원에 의존적인 것을 증명하기 위하여, 출원인은 다음으로 BsAb-CAR T 세포-내성 K562 세포주에서 CS1 및 BCMA의 강요된 과다발현이 이 이펙터 집단에 대한 용해에 대해 그것의 한계값을 강하시킬 수 있었는지를 탐색하였다. 이 목적을 위해, 출원인은 CS1 및 BCMA를 이소성으로 발현하는 K562 세포주를 생성하기 위하여 인간 CS1 및 BCMA를 암호화하는 렌티바이러스 (또는 대조군으로서 빈 벡터 PCDH)로 K562 세포를 순차적으로 형질도입하였다 (도 16). 표적 세포주의 생성의 성공을 확인한 후 (도 4A), 출원인은 51Cr 방출 검정을 수행하였고 그 결과는 K562 적혈구백혈병 세포주에서 CS1 및 BCMA의 과다발현이 EV T 세포를 사용하는 세포독성과 비교하여 이 K562 세포주에 대한 BsAb-CAR T 세포의 세포독성 활성의 상당한 증가를 초래한 것을 나타냈다 (도 4B, 자주색 선). 출원인은 다음으로 ELISA 검정을 수행하였고, 이것은 EV T 세포의 K562-CS1-BCMA 세포와의 공동 배양과 비교하여, BsAb-CAR T 세포 및 K562-CS1-BCMA 세포의 공동 배양에서 IFN-γ 및 IL-2 분비의 증가를 보여주었다 (도 4C, 4D). 그러나, K562-PCDH와 인큐베이션했을 때 BsAb-CAR T 세포와 EV T 세포 사이에서 세포독성, IFN-γ 및 IL-2 생성의 차이는 없었다 (도 4-D). 종합적으로, 이들 데이터는 BsAb-CAR T 세포에 의한 표적 세포의 증가된 인식, 살해, 및 사이토카인 분비가 CS1 및 BCMA-의존 방식으로 일어났음을 시사하였다.
분비된 항-NKG2D-항-CS1 BsAb는 시험관내에서 CAR T 세포 증식을 향상시키고 생체내에서 NKG2D 신호전달을 통해 생존 및 증식을 둘 다 향상시킨다: 일부 환자에서, CAR T 세포는 제한된 팽창 및 생존 능력으로 인해 매우 길게 생존하지 못하고, 이것은 이들 세포의 효능을 제한할 수 있다42. 유감스럽게도, 출원인은 BsAb-형질도입된 T 세포 및 BsAb-CAR T 세포의 배양 배지가 유사한 시점에서 BsAb가 없는 다른 조건과 비교하여 더 산성이었음을 발견하였고, 이것은 세포 대사의 더 높은 속도를 시사한다 (도 5A, 상부). 이런 관찰은 이들 BsAb-형질도입된 세포가 표적 세포가 없거나 BCMA*CS1* 표적 세포로도 더 많은 사이토카인을 분비할 수 있다는 상기 기술된 데이터와 일치한다 (도 2D). 출원인은 BsAb의 발현 및 분비가 T 세포 증식, 생존, 및/또는 그것의 활성화를 유도할 수 있다고 추측하였다. 세포 열거는, 다른 배양 조건과 비교하여, BsAb 또는 BsAb-CAR 구성물로 형질도입된 T 세포를 함유한 것들이 실제로 상당히 더 많은 양의 세포를 함유하였고 (도 5A, 막대 그래프), 이것은 보라색 세포 추적자에 의해 입증되고 하부 패널에서 막대그래프에서 나타낸 V450 희석으로서 도시된 것과 같이 (도 5A, 막대그래프) T 세포 증식으로부터 비롯된 것임을 확인시켜주었다.
이들 예상하지 못했던 결과를 확인하기 위하여, 출원인은 도 5A에 도시된 BsAb-CAR T 세포 배양으로부터의 상층액을 BsAb가 없는 세포 배양 조건, 즉, BCMA CAR T 세포, EV T 세포, 및 미변형 T 세포에 첨가하였다. 실제로, BsAb-CAR T 세포 배양으로부터의 상층액을 첨가하는 것은, 세포 회전율에서 일어나는 것과 같이 배지의 황색에 의해 증명되는 바, BsAb-CAR T 세포 배지로부터의 상층액이 보충되지 않은 BCMA CAR T 세포, EV T 세포, 및 미변형 T 세포의 배양과 비교하여, 5일 인큐베이션 후에 상당히 더 큰 세포 대사 정도를 초래하였다 (데이터 미도시). 세포 열거는, 다른 배양 조건과 비교하여, BsAb-CAR T 세포 배양으로부터의 배지가 보충된 것들이 실제로 상당히 더 많은 양의 세포를 함유하였고 (도 5B, 상부), 이것은 보라색 세포 추적자에 의해 입증되고 하부 패널에서 막대그래프에서 나타낸 V450 희석으로서 도시된 것과 같이 (도 5B, 바닥) T 세포 증식으로부터 비롯된 것임을 확인시켜주었다. Ki67 염색은, BsAb T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포 중 어느 하나를 함유한 배양에서, 대부분의 NKG2D+ 세포가 증식하였을뿐만 아니라, 거의 절반의 NKG2D- 세포가 증식하였으며 (도 5C, 및 도 17A), 이것은 BsAb-활성화된 NKG2D+ 세포가, 더 적은 정도이긴 하지만, 계속해서 NKG2D- 세포를 활성화할 수 있음을 나타냈다. 더욱이, NKG2D 차단 항체는 분비된 BsAb의 증식 효과를 경감시켰다 (도 5C 청색 프레임, 도 17B). 면역블롯 분석을 수행하여 AKT 단백질의 인산화 (p)를 결정하였고, 이것으로 분비된 BsAb가 BsAb T 및 BsAb-CAR T 세포 배양 조건 하에서, 이들 조건이 더 높은 수준의 p-AKT를 가지기 때문에 NKG2D+ 세포 증식 및 활성화를 촉발시킬 수 있음을 확인하였다 (도 5D).
그러므로 제시된 데이터는 지금까지 BsAb에 의한 NKG2D+ 면역 세포의 활성화가 NKG2D 경로를 통해 일어났다는 개념을 지지하였다. 출원인은 다음으로 활성화가 MM 세포상에서 발현될뿐만 아니라 NK, NKT, CD8+ T, 및 B 세포 또는 이것들의 하위세트에서도 발현되는 CS1을 통해 일어났는지에 대해 의문을 가졌다. (Veillette and Guo Crit Rev Oncol Hematol. 2013 Oct;88(1):168-77. doi: 10.1016/j.critrevonc.2013.04.003. Epub 2013 Jun 2; Gogishvili et al. Blood. 2017 Dec 28;130(26):2838-2847. doi: 10.1182/blood-2017-04-778423. Epub 2017 Oct 31.) 분비된 BsAb가 또한 그것들의 CS1의 발현을 통해, 그리고 CS1+ 신호전달 경로를 통해 NKG2D+ 면역 세포를 자극하였는지를 결정하기 위하여, 출원인은 다음으로 이 경로를 항-CS1 차단 항체를 사용하여 차단하였다. 출원인은 CS1 차단이 면역 세포의 활성화 상태에 영향을 미치지 못한 것을 발견하였다 (도 17C). 더욱이, 출원인은 NKG2D 및 CS1 이중 차단을 수행하였고, 그 결과는 NKG2D 단일 차단과 비교하여 차이가 없었음을 입증하였다 (데이터 미도시). 종합적으로, 이들 데이터는 BsAb를 분비하는 면역 세포의 활성화가 NKG2D 신호전달 경로를 통해서만 일어나는 것을 시사한다.
상기 발견을 토대로, 출원인은 T 세포와 표적 집단, MM.1S MM 세포와의 공동 배양에서 면역 활성화가 NKG2D에 엄격하게 의존적이지 않으며, 또한 T 세포의 NKG2D+ 하위세트로 제한되지 않을 것이라고 예상하였다. 예를 들어, BsAb T 및 BsAb-CAR T 세포가 MM.1S MM 세포와 공동 배양될 때, CD3+ T 세포의 NKG2D+ (도 5E에서 적색; 83% 내지 94%) 및 NKG2D- (도 5E에서 녹색; 79% 내지 87%) 분획은 둘 다 Ki67 염색에 의해 측정되는 바 광범위한 증식을 보였다. 마찬가지로, BCMA CAR만을 발현하는 CD3+ T 세포의 경우 (도 5E에서 Fab+로서 표시됨) CD3+ T 세포의 NKG2D+ (red; 90.4%) 및 NKG2D- (녹색; 85.8%) 분획이 둘 다, 두 NKG2D+ 및 NKG2D- BsAb-CAR T 세포로 볼 수 있었던 것보다 약간 더 적긴 했지만, Ki67 염색에 의해 측정되는 바 광범위한 증식을 보였다.
형질도입된 T 세포가 시험관내에서 생존하는 능력을 조사하기 위하여, 출원인은 IL-2의 존재 또는 부재 하에 다양한 형질도입된 T 세포를 배양하였다. IL-2 조건 하에서, 모든 세포는 높은 Ki67 발현 및 낮은 아넥신 V 및/또는 시톡스 블루 발현을 보였다 (도 6a). 흥미롭게도, IL-2 결핍 조건에서 (도 6b), BsAb T 세포 및 BsAb-CAR T 세포 (BsAb를 분비하고 NKG2D를 통해 T 세포를 활성화함)만이 약 80% Ki67 발현 정도의 더 나은 증식 능력을 보였고, 이것은 도 2D에서 제공한 데이터와 일치하며, 아넥신 V의 낮은 발현 및/또는 시톡스 블루 염색에 의해 예시된 감소된 세포 세포자멸사 및 사망과 일치한다 (도 6b). 이들 결과는 또한 도 6c에서 다른 3개의 그룹 (미변형 T 세포, EV T 세포, 및 BCMA-CAR T 세포)과 비교된다. 그러므로, BsAb-CAR T는 대부분 NKG2D 신호전달 경로를 통해 세포 증식을 향상시키고 세포 생존을 증대시켰다.
미변형 T 세포, EV T 세포, BCMA CAR T 세포, 및 BsAb-CAR T 세포의 생체내에서의 생존 및 증식을 비교하기 위하여, 출원인은 이들 인간 세포를 면역결핍 NSG 마우스에 주사하였다 (i.v.) (도 7A, 상부). 인간 세포의 정맥내 주사 전 바탕 염색을 또한 -1일에 평가하였다 (도 7A, 및 도 18). +1일에 각각의 인간 T 세포 주사를 받은 마우스는 동등한 인간 CD3 발현을 보였고, 두 CAR T 세포 집단을 또한 그들의 F(ab)2 발현에 의해 확인하였다. 더욱이, 활성화 마커 CD69를 NSG 마우스로부터 분리한 전부 4개의 T 세포 집단의 97%에서 검출하였다 (도 7A, 및 도 18). 흥미롭게도, T 세포 주입 후 14일 후에, BsAb-CAR T 세포 그룹만이 그들의 CD3 및 CD69의 높은 공동 발현을 보유한 한편, 다른 3개의 그룹에서는 CD69 발현의 실질적인 감소가 있었다 (도 7A, 및 도 18). 통계학적 분석은 BsAb-CAR T 세포 그룹에서 CD3 및 CD3+CD69+ T 세포 둘 다의 +14일 백분율이 다른 3개의 그룹보다 상당히 더 높았음을 나타냈다 (도 7B 및 7C). 다양한 형질도입된 T 세포 주입 후 35일 후에, 막대그래프는 BsAb-CAR T 세포로 주입된 마우스만이 여전히 높은 백분율의 hCD3 T 세포를 가진 것을 보여주었다 (도 7B). 생체내 증식 데이터는 Ki67+CD69+ 백분율이 약 61.1%였고, 이것은 비-형질도입 또는 형질도입된 T 세포를 받은 3개의 다른 그룹보다 상당히 더 높은 것이었다 (도 7a 자주색 코트 패널, 도 7c). 더욱이, 출원인은 또한 생체내에서 BsAb-CAR T 세포의 생존율을 측정하였고 살아있는 (아넥신 V-시톡스 블루-) BsAb-CAR T 세포의 백분율이 대략 87%였으며, 죽은 (아넥신 V+시톡스 블루+) BsAb-CAR T 세포의 백분율이 대략 5%였음을 관찰하였다. 통계학적 분석은 BsAb-CAR T 세포가 다른 3개의 그룹에 비교하여 더 높은 분획의 살아있는 세포 및 더 낮은 분획의 죽은 세포를 가졌음을 나타냈다 (도 7D). 이것들을 함께 고려하면, BsAb-CAR T 세포는, 주사된 세포 (BCMA CAR T 세포 포함)의 다른 그룹과 비교하여, 시험관내에서 NKG2D 신호전달 경로를 통해 세포 증식을 향상시킬뿐만 아니라, 생체내에서 향상된 증식 및 생존을 증명하였다.
생체외에서 BsAb-CAR T 세포에 의한 일차 골수종 세포의 개선된 인식 및 살해: BsAb-CAR T 세포의 임상적 관련성을 평가하기 위하여, 출원인은 그것들이 환자로부터 분리된 MM 세포를 효율적으로 인식하고 살해하며 생체외에서 IFN-γ 생성을 향상시킬 수 있는지를 조사하였다. 8명의 환자 골수로부터 얻은 일차 CD138+ MM 세포를 양성 자성 선택을 사용하여 분리하였고, 유세포 분석을 사용하여 그것들의 BCMA 및 CS1의 표면 발현을 평가하였다 (도 8A). 자가 PBMC의 부재 하에 수행한 51Cr 방출 검정을 사용하여, 출원인은 환자로부터의 MM 세포가 전부 8명의 환자에서 EV-형질도입된 T 세포 매개된 용해에 대해 매우 내성이었음을 관찰하였다. BCMA CAR T 세포 또는 BsAb T 세포와 비교하여, BsAb-CAR T 세포는 종양 세포가 CS1의 매우 낮은 표면 밀도 발현을 가진 환자 1을 포함한, 테스트한 8명의 환자 전부에서 상당히 더 높은 세포독성을 보였다. BsAb-CAR T 세포와 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포 사이의 세포용해성 활성에 상당한 차이는 없다 (도 8B). 출원인은 또한 24시간 후에 유사한 공동 배양 검정으로 IFN-γ를 측정하였다; BsAb-CAR T 세포는 또한 EV-형질도입된 T 세포, BsAb T 세포, 또는 BCMA-CAR T 세포보다 상당히 더 높은 수준의 IFN-γ를 분비하였다 (도 8C). 이들 발견은 BsAb-CAR T 세포가 생체외에서 환자 MM 세포를 근절하는 아주 좋은 능력을 가진 것을 입증한다.
BsAb-CAR T 세포는 동소 이종이식 MM 모델에서 MM 종양 성장을 억제하고 종양-포함 마우스의 생존을 연장시킨다: BsAb-CAR T 세포의 잠재적 치료적 적용을 추가로 해명하기 위하여, 출원인은 MM.1S MM-생착 NSG 마우스 모델에서 그것의 항종양 활성을 조사하였다. MM.1S MM 세포의 정맥내 주사를 광범위하게 사용하여 MM의 마우스 이종이식 모델을 확립하였는데, 이것이 다초점 골용해성 병변의 확립과 일치할뿐만 아니라 골수 생착으로 이어질 수 있어서, 인간 MM을 면밀하게 개괄하기 때문이다43,44. 종양 성장을 용이하게 모니터링하기 위하여, 출원인은 GFP 및 반딧불이 루시페라제를 둘 다 발현하도록 레트로바이러스 감염에 의해 MM.1S MM 세포를 조작하였고, 8 x 106개의 이들 MM 세포의 정맥내 주사를 사용하여 이전에 보고된 것과 같이 0일에 NSG 마우스를 생착시켰다30. 그런 후 이들 마우스를 3가지 기회 (10일, 17일, 및 24일)에 식염수 또는 1 x 107개의 EV T 세포, 1 x 107개의 BsAb T 세포, 1 x 107개의 BCMA CAR T 세포, 1 x 107개의 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포, 또는 1 x 107개의 BsAb-CAR T 세포로 i.v.로 주입하였다. 최대 80일까지 생존한 마우스에 대해, 출원인은 말초혈 림프구를 수집하였고 마우스를 1 x 104개의 MM.1S MM 세포로 재도전하였다. 생물발광 영상화를 사용하여 MM.1S MM 성장을 모니터링하였고 전부 6개의 처리 그룹에서 최대 31일까지 초기 질환 진행을 보였다 (도 9A). BCMA CAR T 세포를 확인하기 위해 항-F(ab)2 항체를 사용하여, 출원인은 80일에 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포 및 BsAb-CAR T 세포의 백분율이 BCMA CAR T인 것보다 MM.1S MM 마우스의 혈액에서 상당히 더 높았고 (도 9B), 한편 각 마우스에서 총 림프구 수는 유사하였음 (데이터 미도시)에 주목하였다. 면역블롯팅은 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포로 처리된 80일 MM.1S MM 마우스로부터의 혈청이 여전히 분비된 BsAb를 함유하였음을 나타냈다 (데이터 미도시). 80일 째에, BsAb-BCMA seq. trans. T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포로 처리된 MM.1S MM 마우스는 식염수 대조군, EV T 세포 또는 BsAb T 세포로 처리된 유사한 마우스와 비교하여 상당히 연장된 생존을 나타냈다. BCMA CAR T 세포로 처리된 MM.1S MM 마우스는 BsAb-BCMA seq. trans. T 세포 또는 BsAb-CAR T 세포로 처리된 MM.1S MM 마우스보다 약간 더 악회되었다 (도 9D). 140일 (제1 종양 재도전 후 60일 후)에, BsAb-CAR T로 처리된 MM.1S MM 마우스 그룹의 모두 5마리는 생존하였다 (도 9D). 종양 재도전 후의 이들 생존 데이터는 도 7에서 상기 주지된 BsAb-CAR T 세포의 향상된 생체내 생존 및 향상된 생체내 증식을 말할 가능성이 있다. 전체적으로, 이들 결과는 BsAb-CAR T 세포가 동소 이종이식 MM 모델에서 MM 종양 성장을 억제하고 종양-포함 마우스의 생존을 연장시키는 능력에 있어서 다른 비-형질도입 또는 형질도입된 T 세포 집단보다 월등한 것을 나타냈다.
동소 이종이식 MM 모델 (즉, 도 3E에 도시된 시험관내 실험에 대한 생체내 대응물)에서 인간 비-형질도입 NKG2D+ 림프구의 관련성을 결정하기 위하여, 출원인은 다음으로 MM.1S MM-포함 NSG 마우스에서 식염수 대조군, EV T 세포, BCMA CAR T 세포, 또는 BsAb-CAR T 세포의 항-종양 효능을 조사하는 한편, 동일한 도너로부터 분리한 골수 세포-고갈된 PBMC를 동시 주입하였다. 분류에 의한 골수 세포의 고갈을 수행하여 GVHD를 피하였다 (도 10A, 10B). MM.1S MM 세포, 정상 인간 림프구, 및 다양한 형질도입된 T 세포의 주입 도식은, 37일을 통해 MM 진행을 입증하는 영상화로서, 도 10A에 도시한다. 도 10B 및 10C는 이들 마우스의 혈액에서 검출된 백분율 인간 림프구를 예시한다. 이들 조건 하에서 시간을 추가함으로써, 출원인은 BCMA CAR T 세포로 처리된 마우스 (BsAb를 분비하지 않음; 100일 째에 0% 생존)와 BsAb-CAR T 세포로 처리된 마우스 (BsAb를 분비하지 않음; 140일 째에 100% 생존; 도 10D) 사이에 극적인 차이를 발견하였다. 이들 데이터는 포함된 NKG2D+ 면역 세포가 많을수록, 종양 근절을 위한 BsAb-CAR T 세포의 효능은 더 나아질 것임을 시사한다.
동등물
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부분 서열 목록
예시의 BCMA scFv:
항 - BCMA 서열 1 scFv 중쇄
ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACCAGATTCAGCTGGTGCA
GAGCGGCCCTGAGCTGAAGAAACCCGGCGAGACAGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCC
GGCACTACAGCATGAACTGGGTGAAACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGAAGTGGATGGGCCGGATCAACACC
GAGAGCGGCGTGCCCATCTACGCCGACGACTTCAAGGGCAGATTCGCCTTCAGCGTGGAAACCAGCGCCAG
CACCGCCTACCTGGTGATCAACAACCTGAAGGACGAGGATACCGCCAGCTACTTCTGCAGCAACGACTACC
TGTACAGCCTGGACTTCTGGGGCCAGGGCACCGCCCTGACCGTGTCCAGC
항-BCMA 서열 1 scFv 경쇄
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCCCCAGCCTGGCCATGTCTCTGGGCAAGAGAGCCACCATCAGCTGCCG
GGCCAGCGAGAGCGTGACCATCCTGGGCAGCCACCTGATCTACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGCCCC
CCACCCTGCTGATCCAGCTGGCTAGCAATGTGCAGACCGGCGTGCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGC
AGAACCGACTTCACCCTGACCATCGACCCCGTGGAAGAGGACGACGTGGCCGTGTACTACTGCCTGCAGAG
CCGGACCATCCCCCGGACCTTTGGCGGAGGAACAAAGCTGGAAATCAAG
항 - BCMA 서열 2 scFv 중쇄
ATGGGATGGAGCTCTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACCAGATTCAGCTGGTGCA
GAGCGGCCCTGAGCTGAAGAAACCCGGCGAGACAGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTCA
CCGACTACAGCATCAACTGGGTGAAAAGAGCCCCTGGCAAGGGCCTGAAGTGGATGGGCTGGATCAACACC
GAGACAAGAGAGCCCGCCTACGCCTACGACTTCCGGGGCAGATTCGCCTTCAGCCTGGAAACCAGCGCCAG
CACCGCCTACCTGCAGATCAACAACCTGAAGTACGAGGACACCGCCACCTACTTTTGCGCCCTGGACTACA
GCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCCAGC
항-BCMA 서열 2 scFv 경쇄
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCCCCAGCCTGGCCATGTCTCTGGGCAAGAGAGCCACCATCAGCTGCCG
GGCCAGCGAGAGCGTGACCATCCTGGGCAGCCACCTGATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCC
CCACCCTGCTGATCCAGCTCGCCAGCAATGTGCAGACCGGCGTGCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGC
AGAACCGACTTCACCCTGACCATCGACCCCGTGGAAGAGGACGACGTGGCCGTGTACTACTGCCTGCAGAG
CCGGACCATCCCCCGGACCTTTGGCGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAG
항-CS-1 scFv 중쇄 DNA 서열
AGCGTTACCG TGAGTACAGG CCAGGGCTGG TATGACATGG CACGTACAGC CATCATGACC
TCGCGCGCAT GTTACTACGT CGCGTCAGAT GAATCGACGC CTTCCTCGCT GCAAATGTAT
GCAACCTCCA GCAGCAAAGA TGTTACCCTG ACCGCAAAGG ACAAGTTTAA ACAGAATTTG
CGTACGGAGA GTGACTCCCC GCACATCATG GGAATCTGGG AGTTGGGTCA GGGGCCTCGT
CAGAAGGTAT GGAACATGTG GTATACAACT TTTTCGTACG GCTCAGCAAA ATGCAGCTTG
AAAGTGTCGG CAGGTCCGCG CGTGCTGGAG GCCGGTCCGC AGCAGCTGCA AGTCCAGTCT
항-CS-1 scFv 경쇄 DNA 서열
AAACTTGAGT TGAAGACCGG TGCCGGCTTC ACCTTACCGA CCAGTTATCA TCAACAATGC
TATTACGTGG CCCTGGACGA AGCACAGGTG AATTCAATTA CGTTTACGTT TGATACCGGC
TCTGGCAGCG GTACATTTCG TGATCCCGTG GGCACTTACC GCTATTCGGC GAGTTATATC
TTGCTGAAAC CTTCCCAAGG TCCGAAACAG CAGTACTGGG CGGTTGGCAC CATTGTAGAC
CAATCAGCCA AATGTACAAT CTCGGTTCGC GATGGTGTCA GTACGTCGAT GTCTAAGCAG
TCACAGACAA TGGTTATCGA T
항-NKG2D 중쇄 DNA 서열
CAAGTGCAGC TGGTTGAATC CGGTGGCGGT CTGGTCAAGC CGGGCGGCTC TTTGCGTCTG
AGCTGTGCCG CGTCGGGTTT TACCTTCAGC TCTTATGGTA TGCATTGGGT GCGTCAGGCG
CCTGGCAAAG GTCTGGAGTG GGTTGCGTTC ATCCGCTACG ATGGGTCTAA CAAATATTAT
GCCGACTCAG TAAAAGGACG CTTCACTATT AGCCGCGACA ATAGCAAAAA TACCCTGTAC
CTGCAAATGA ATAGCCTGCG CGCCGAAGAT ACCGCCGTTT ACTATTGCGC TAAAGATCGT
GGCCTGGGTG ATGGTACGTA CTTCGATTAC TGGGGTCAGG GCACCACCGT TACCGTTAGT TCA
항-NKG2D 경쇄 DNA 서열
CAGTCAGCGC TTACGCAGCC GGCGTCGGTG TCGGGTTCCC CGGGTCAGTC GATCACGATC
AGCTGTAGTG GGAGCAGCTC CAACATCGGT AACAACGCAG TGAACTGGTA TCAGCAACTG
CCGGGAAAAG CGCCGAAACT GCTGATTTAC TATGATGATT TGCTGCCAAG TGGAGTTAGT
GACCGCTTTT CCGGCAGTAA ATCGGGTACC TCGGCTTTTC TGGCTATTTC GGGTCTCCAG
AGCGAGGATG AAGCTGATTA TTATTGCGCC GCATGGGATG ATAGCTTAAA TGGCCCAGTT
TTTGGCGGCG GTACTAAACT GACCGTGCTG
링커
GGCGGTGGCGGTTCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCT
항-NKG2D 중쇄
CAAGTGCAGCTGGTTGAATCCGGTGGCGGTCTGGTCAAGCCGGGCGGCTCTTTGCGTCTGAGCTGTGCCGC
GTCGGGTTTTACCTTCAGCTCTTATGGTATGCATTGGGTGCGTCAGGCGCCTGGCAAAGGTCTGGAGTGGG
TTGCGTTCATCCGCTACGATGGGTCTAACAAATATTATGCCGACTCAGTAAAAGGACGCTTCACTATTAGC
CGCGACAATAGCAAAAATACCCTGTACCTGCAAATGAATAGCCTGCGCGCCGAAGATACCGCCGTTTACTA
TTGCGCTAAAGATCGTGGCCTGGGTGATGGTACGTACTTCGATTACTGGGGTCAGGGCACCACCGTTACCG
TTAGTTCAGGTGGGGGCGGCTCT
항-NKG2D 경쇄
CAGCGCTTACGCAGCCGGCGTCGGTGTCGGGTTCCCCGGGTCAGTCGATCACGATCAGCTGTAGTGGGAG
CAGCTCCAACATCGGTAACAACGCAGTGAACTGGTATCAGCAACTGCCGGGAAAAGCGCCGAAACTGCTGA
TTTACTATGATGATTTGCTGCCAAGTGGAGTTAGTGACCGCTTTTCCGGCAGTAAATCGGGTACCTCGGC
TTTTCTGGCTATTTCGGGTCTCCAGAGCGAGGATGAAGCTGATTATTATTGCGCCGCATGGGATGATAGCT
TAAATGGCCCAGTTTTTGGCGGCGGTACTAAACTGACCGTGCTG
HMA 서열
CCGAGCGGCCAGGCGGGCGCGGCGGCATCGGAGTCCCTGTTTGTGTCAAATCACGCCTAC
항 - CS1 중쇄
CTCCGTGACGGTGTCGACGGGCCAAGGATGGTACGATATGGCACGGACCGCGATTATGACATCGCGGGCGT
GCTATTACGTGGCCAGCGATGAGTCGACCCCTTCCTCTCTGCAAATGTATGCCACCTCCTCTTCAAAAGAC
GTGACTCTGACTGCGAAAGACAAATTTAAACAGAATCTGCGCACCGAAAGCGATAGCCCACATATCATGG
GCATCTGGGAACTGGGCCAGGGCCCCCGCCAGAAAGTGTGGAACATGTGGTACACCACCTTCAGCTATGGT
TCGGCCAAATGTTCCCTGAAGGTATCAGCCGGCCCGCGCGTTCTTGAGGCGGGTCCGCAGCAGCTGCAGGT
ACAGAGC
항-CS1 경쇄
AAACTGGAACTCAAGACGGGTGCGGGATTTACCCTCCCTACGAGCTATCACCAGCAGTGCTATTACGTGGC
GCTTGACGAAGCGCAGGTGAACTCTATTACCTTTACCTTTGATACAGGATCAGGCAGCGGTACGTTCCGTG
ATCCGGTAGGTACGTACCGGTATAGTGCAAGCTATATCCTTCTGAAACCTTCTCAGGGTCCGAAACAGC
AGTACTGGGCGGTGGGAACGATCGTGGACCAGTCTGCCAAATGTACAATTTCAGTTCGCGACGGAGTTAGC
ACCTCCATGAGCAAGCAGTCCCAAACCATGGTGATTGACTCT
항 - BCMA 중쇄 서열 2
CAGATTCAGCTGGTGCAGAGCGGCCCTGAGCTGAAGAAACCCGGCGAGACAGTGAAGATCAGCTGCAAGGC
CTCCGGCTACACCTTCACCGACTACAGCATCAACTGGGTGAAAAGAGCCCCTGGCAAGGGCCTGAAGTGGA
TGGGCTGGATCAACACCGAGACAAGAGAGCCCGCCTACGCCTACGACTTCCGGGGCAGATTCGCCTTCAGC
CTGGAAACCAGCGCCAGCACCGCCTACCTGCAGATCAACAACCTGAAGTACGAGGACACCGCCACCTACTT
TTGCGCCCTGGACTACAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCCAGC
항-BCMA 경쇄 서열 2
GACATCGTGCTGACCCAGAGCCCCCCCAGCCTGGCCATGTCTCTGGGCAAGAGAGCCACCATCAGCTGCCG
GGCCAGCGAGAGCGTGACCATCCTGGGCAGCCACCTGATCCACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCC
CCACCCTGCTGATCCAGCTCGCCAGCAATGTGCAGACCGGCGTGCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGC
AGAACCGACTTCACCCTGACCATCGACCCCGTGGAAGAGGACGACGTGGCCGTGTACTACTGCCTGCAGAG
CCGGACCATCCCCCGGACCTTTGGCGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAG
SEQUENCE LISTING <110> CYTOIMMUNE THERAPEUTICS, LLC <120> BISPECIFIC ANTIBODY CAR CELL IMMUNOTHERAPY <130> 113086-0120 <140> PCT/US2019/022639 <141> 2019-03-15 <150> 62/644,343 <151> 2018-03-16 <160> 34 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(12) <223> This sequence may encompass 1-6 "Gly Ser" repeating units <400> 1 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 2 His His His His His His 1 5 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 ctcgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccg 48 <210> 4 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 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cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339 <210> 8 <211> 51 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala 1 5 10 15 Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg 20 25 30 Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys 35 40 45 Asp Ile Tyr 50 <210> 9 <211> 49 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Lys Val Asn Ser Thr Thr Thr Lys Pro Val Leu Arg Thr Pro Ser Pro 1 5 10 15 Val His Pro Thr Gly Thr Ser Gln Pro Gln Arg Pro Glu Asp Cys Arg 20 25 30 Pro Arg Gly Ser Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 35 40 45 Tyr <210> 10 <211> 51 <212> PRT <213> Felis catus <400> 10 Pro Val Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Gln Ala 1 5 10 15 Pro Ile Thr Thr Ser Gln Arg Val Ser Leu Arg Pro Gly Thr Cys Gln 20 25 30 Pro Ser Ala Gly Ser Thr Val Glu Ala Ser Gly Leu Asp Leu Ser Cys 35 40 45 Asp Ile Tyr 50 <210> 11 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr 20 <210> 12 <211> 21 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Ile Ile Thr Leu Ile 20 <210> 13 <211> 21 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 13 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Ala Val Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Val Ile Thr Leu Ile 20 <210> 14 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 14 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 15 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val 1 5 10 15 Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr 20 25 30 Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser 35 40 45 Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu 50 55 60 Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser 65 70 75 80 Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr 85 90 95 Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys 100 105 110 Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 115 120 125 Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 130 135 140 Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 145 150 155 160 Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 165 170 175 Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 180 185 190 Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 195 200 205 Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 21 atgggatgga gctctatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccaccagatt 60 cagctggtgc agagcggccc tgagctgaag aaacccggcg agacagtgaa gatcagctgc 120 aaggcctccg gctacacctt ccggcactac agcatgaact gggtgaaaca ggcccctggc 180 aagggcctga agtggatggg ccggatcaac accgagagcg gcgtgcccat ctacgccgac 240 gacttcaagg gcagattcgc cttcagcgtg gaaaccagcg ccagcaccgc ctacctggtg 300 atcaacaacc tgaaggacga ggataccgcc agctacttct gcagcaacga ctacctgtac 360 agcctggact tctggggcca gggcaccgcc ctgaccgtgt ccagc 405 <210> 22 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 22 gacatcgtgc tgacccagag cccccccagc ctggccatgt ctctgggcaa gagagccacc 60 atcagctgcc gggccagcga gagcgtgacc atcctgggca gccacctgat ctactggtat 120 cagcagaagc ctggccagcc ccccaccctg ctgatccagc tggctagcaa tgtgcagacc 180 ggcgtgcccg ccagattcag cggcagcggc agcagaaccg acttcaccct gaccatcgac 240 cccgtggaag aggacgacgt ggccgtgtac tactgcctgc agagccggac catcccccgg 300 acctttggcg gaggaacaaa gctggaaatc aag 333 <210> 23 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 23 atgggatgga gctctatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccaccagatt 60 cagctggtgc agagcggccc tgagctgaag aaacccggcg agacagtgaa gatcagctgc 120 aaggcctccg gctacacctt caccgactac agcatcaact gggtgaaaag agcccctggc 180 aagggcctga agtggatggg ctggatcaac accgagacaa gagagcccgc ctacgcctac 240 gacttccggg gcagattcgc cttcagcctg gaaaccagcg ccagcaccgc ctacctgcag 300 atcaacaacc tgaagtacga ggacaccgcc acctactttt gcgccctgga ctacagctac 360 gccatggact actggggcca gggcaccagc gtgaccgtgt ccagc 405 <210> 24 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 24 gacatcgtgc tgacccagag cccccccagc ctggccatgt ctctgggcaa gagagccacc 60 atcagctgcc gggccagcga gagcgtgacc atcctgggca gccacctgat ccactggtat 120 cagcagaagc ccggccagcc ccccaccctg ctgatccagc tcgccagcaa tgtgcagacc 180 ggcgtgcccg ccagattcag cggcagcggc agcagaaccg acttcaccct gaccatcgac 240 cccgtggaag aggacgacgt ggccgtgtac tactgcctgc agagccggac catcccccgg 300 acctttggcg gaggcaccaa actggaaatc aag 333 <210> 25 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 25 agcgttaccg tgagtacagg ccagggctgg tatgacatgg cacgtacagc catcatgacc 60 tcgcgcgcat gttactacgt cgcgtcagat gaatcgacgc cttcctcgct gcaaatgtat 120 gcaacctcca gcagcaaaga tgttaccctg accgcaaagg acaagtttaa acagaatttg 180 cgtacggaga gtgactcccc gcacatcatg ggaatctggg agttgggtca ggggcctcgt 240 cagaaggtat ggaacatgtg gtatacaact ttttcgtacg gctcagcaaa atgcagcttg 300 aaagtgtcgg caggtccgcg cgtgctggag gccggtccgc agcagctgca agtccagtct 360 <210> 26 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 26 aaacttgagt tgaagaccgg tgccggcttc accttaccga ccagttatca tcaacaatgc 60 tattacgtgg ccctggacga agcacaggtg aattcaatta cgtttacgtt tgataccggc 120 tctggcagcg gtacatttcg tgatcccgtg ggcacttacc gctattcggc gagttatatc 180 ttgctgaaac cttcccaagg tccgaaacag cagtactggg cggttggcac cattgtagac 240 caatcagcca aatgtacaat ctcggttcgc gatggtgtca gtacgtcgat gtctaagcag 300 tcacagacaa tggttatcga t 321 <210> 27 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 27 caagtgcagc tggttgaatc cggtggcggt ctggtcaagc cgggcggctc tttgcgtctg 60 agctgtgccg cgtcgggttt taccttcagc tcttatggta tgcattgggt gcgtcaggcg 120 cctggcaaag gtctggagtg ggttgcgttc atccgctacg atgggtctaa caaatattat 180 gccgactcag taaaaggacg cttcactatt agccgcgaca atagcaaaaa taccctgtac 240 ctgcaaatga atagcctgcg cgccgaagat accgccgttt actattgcgc taaagatcgt 300 ggcctgggtg atggtacgta cttcgattac tggggtcagg gcaccaccgt taccgttagt 360 tca 363 <210> 28 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Claims (28)

  1. (a) 암 또는 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인; (b) 힌지 도메인; (c) 경막 도메인; (d) 및 세포내 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및
    NKG2D를 인식하고 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드
    를 포함하는 벡터.
  2. 제1항에 있어서, CAR은 (a) 암 또는 종양 표적화 항체의 항원 결합 도메인; (b) CD8 α 힌지 도메인; (c) CD8 α 경막 도메인; (d) CD28 동시자극성 신호전달 영역 및/또는 4-1BB 동시자극성 신호전달 영역; 및 (e) CD3 제타 신호전달 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 암 또는 종양 표적화 항체는 B-세포 성숙 항원 (BCMA) 및/또는 SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 및/또는 이것들의 각각의 동등물을 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체는 NKG2D의 리간드 또는 항-NKG2D scFv 및 항-SLAMF7 항체 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음)의 항원 결합 도메인, 및/또는 이것들의 각각의 동등물을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체는 NKG2D에 대한 항체 및 항-SLAMF7 항체 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음)의 항원 결합 도메인, 및/또는 이것들의 각각의 동등물의 CDR 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 이중특이적 항체는 NKG2D에 대한 항체 및 항-SLAMF7 항체 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음)의 항원 결합 도메인, 및/또는 이것들의 각각의 동등물의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 이중특이적 항체는 NKG2D에 대한 항체로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFV), 선택적으로, 항-SALMF7 항체 (CD319의 CS1으로도 알려져 있음)로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편 (scFv), 및/또는 이것들의 각각의 동등물을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 플라스미드, 선택적으로 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하기 위한 프로모터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-관련 바이러스 벡터, 및 선택적으로 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하기 위한 프로모터의 군으로부터 선탤되는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 분리된 세포.
  11. 제10항에 있어서, 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  12. 제11항에 있어서, 세포는 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  13. 제12항에 있어서, 진핵 세포는 동물 세포, 포유류 세포, 소 세포, 고양이 세포, 개과 세포, 쥐과 세포, 말 세포 또는 인간 세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 진핵 세포는 면역 세포, 선택적으로 T-세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 골수 세포, 단핵세포, 또는 대식세포인 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 세포는 CAR을 발현하고 이중특이적 항체를 분비하는 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 벡터 및/또는 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 분리된 세포, 및, 선택적으로, 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  17. 암 또는 종양 항원을 발현하는 세포에 결합된 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항을 포함하는 분리된 세포를 포함하는 분리된 복합체로서, 선택적으로, 암 또는 종양 항원은 NKG2D 및/또는 SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 및/또는 이것들의 각각의 동등물인 것인 분리된 복합체.
  18. 암 또는 종양 항원 또는 그것의 단편에 결합된 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 분리된 세포를 포함하는 분리된 복합체로서, 선택적으로, 암 또는 종양 항원은 BCMA 또는 SLAMF7 (CS1 또는 CD319로도 알려져 있음), 및/또는 이것들의 각각의 동등물인 것인 분리된 복합체.
  19. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 벡터로 분리된 세포를 형질도입시키는 단계를 포함하는, CAR 발현 세포의 제조 방법.
  20. 제18항에 있어서, 분리된 세포는 T-세포, B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 골수 세포, 단핵세포, 또는 대식세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 암 세포 또는 암 또는 종양 항원을 발현하는 종양의 성장을 억제하는 방법으로서, 암 세포 또는 종양을 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항의 분리된 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 접촉 단계는 시험관내에서 또는 생체내에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 접촉 단계는 생체내에서 이루어지고 분리된 세포는 치료되는 대상체에 대해 자가 또는 동종성인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제21항에 있어서, 접촉 단계는 생체내에서 이루어지고 분리된 세포는 치료되는 대상체에 대해 자가 또는 동종성인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 세포감소 치료법 또는 화학요법 또는 표적 항원의 발현을 상향조절하는 치료법의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 세포감소 치료법은 화학요법, 냉동요법, 고열증, 표적화된 치료법, 및/또는 방사선 요법을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 포유류, 개과, 고양이, 말, 쥐과 또는 인간 환자인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 본원에서 기술된 조성물 및 선택적으로, 사용 설명서를 포함하는 키트.
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