KR20200127168A - Crispr 이펙터 시스템 기반 진단 - Google Patents
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Abstract
본 명세서에 개시된 구현예는 아토몰라 감도로 강건한 CRISPR-기반 진단을 제공하기 위해 RNA 표적화 이펙터를 이용하였다. 본 명세서에 개시된 구현예는 비슷한 수준의 감도로 DNA 및 RNA 둘 모두를 검출할 수 있고 단일 염기쌍 차이를 기반으로 표적을 비-표적과 구별할 수 있으며, 비색 및/또는 형광 이동에 의한 검출을 포함한다. 게다가, 본 명세서에 개시된 구현예는 편리한 유통 및 현장 진단 (POC) 적용을 위해 동결-건조 형태로 제조될 수 있다. 이러한 구현예는 예를 들어, 바이러스 검출, 박테리아 균주 판별, 민감한 유전자형 분석, 및 질환-연관 세포 무함유 DNA의 검출을 포함한 인간 건강의 다수 시나리오에서 유용하다.
Description
관련 출원에 관한 교차 참조
본 출원은 2018년 1월 29일 출원된 미국 가출원 제62/623,531호의 우선권을 청구한다. 상기 확인된 출원의 전체 내용은 완전히 참조로 본 명세서에 편입된다.
전자 서열 목록에 관한 참조
전자 서열 목록의 내용 (BROD_2505WP_ST25.txt"; 2.7 MB 크기, 2019년 1월 28일 생성)은 그 전문이 참조로 본 명세서에 편입된다.
연방 정부 지원 연구에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원에서 수여하는 보조금 번호 MH100706 및 MH110049, 및 비국 국방 위협 감소국에서 수여하는 보조금 번호 HDTRA1-14-1-0006 하의 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명의 일정 권리를 갖는다.
기술 분야
본 명세서에 개시된 주제는 일반적으로 CRISPR 이펙터 시스템의 용도와 관련된 신속한 진단에 관한 것이다.
핵산은 생물학적 정보의 보편적인 특징이다. 휴대용 플랫폼 상에서 높은 감도와 단일-염기 특이도로 핵산을 신속하게 검출하는 능력은 수많은 질환에 대한 진단 및 모니터링을 혁신시키고, 가치있는 역학 정보를 제공하며, 일반화할 수 있는 과학 도구로서 역할을 하게 될 잠재력을 갖는다. 많은 방법들이 핵산을 검출하기 위해 개발되었지만 (Du et al., 2017; Green et al., 2014; Kumar et al., 2014; Pardee et al., 2014; Pardee et al., 2016; Urdea et al., 2006), 그들은 부득이하게 감도, 특이도, 간소함, 및 속도 간에 상호 절충을 겪게된다. 예를 들어, qPCR 접근법은 민감하지만 값비싸고 복잡한 장비에 의존하여, 실험실 상황에서 고도로 숙련된 작업자에게만 사용성이 제한된다. 휴대용 플랫폼과 등온 핵산 증폭을 조합한 신규 방법과 같은 다른 접근법들 (Du et al., 2017; Pardee et al., 2016)은 현장 진단 (POC) 상황에서 높은 검출 특이도를 제공하지만, 어느 정도 낮은 감도로 인해 제한된 적용성을 갖는다. 핵산 진단이 다양한 의료 적용분야와 관련성이 점차로 증가되고 있으므로, 저비용에서 높은 특이도 및 감도를 제공하는 검출 기술은 임상 및 기초 연구 상황 둘 모두에서 상당한 유용성을 가지게 될 것이다.
일 양상에서, 본 발명은 이펙터 단백질 및 해당 표적 분자에 결합하도록 디자인된 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는 검출 CRISPR 시스템; 및 효소 활성을 갖는 사중체를 포함하는 핵산-압타머를 포함하는 핵산 검출 시스템을 제공한다. 일부 구현예에서, 효소 활성은 퍼옥시다제 활성일 수 있다. 일부 구현예에서, 시스템은 핵산 증폭 시약을 더 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 사중체의 효소 활성은 샘플 내에서 색상 신호를 생성시킨다. 일부 구현예에서, 사중체의 효소 활성의 불활성화는 색상 신호의 상실을 일으키고, 색상 신호의 상실은 표적 분자의 존재를 의미한다.
표적 분자는 표적 DNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 시스템은 표적 DNA에 결합하고 RNA 중합효소 프로모터를 포함하는 프라이머를 더 포함할 수 있다. CRISPR 시스템 이펙터 단백질은 RNA-표적화 이펙터 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-표적화 이펙터 단백질은 하나 이상의 HEPN 도메인을 포함할 수 있다. 하나 이상의 HEPN 도메인은 RxxxxH 모티프 서열을 포함할 수 있다. RxxxH 모티프는 R{N/H/K]X1X2X3H 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, X1은 R, S, D, E, Q, N, G, 또는 Y일 수 있고, X2는 독립적으로 I, S, T, V, 또는 L일 수 있으며, X3은 독립적으로 L, F, N, Y, V, I, S, D, E, 또는 A이다.
일부 구현예에서, CRISPR RNA-표적화 이펙터 단백질은 C2c2일 수 있다. 일부 구현예에서, C2c2는 Cas 1 유전자의 20 kb 이내에 존재할 수 있다.
C2c2 이펙터 단백질은 렙토트리키아 (Leptotrichia), 리스테리아 (Listeria), 코리네박터 (Corynebacter), 수테렐라 (Sutterella), 레지오넬라 (Legionella), 트레포네마 (Treponema), 필리팍토르 (Filifactor), 유박테리움 (Eubacterium), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 마이코플라스마 (Mycoplasma), 박테로이데스 (Bacteroides), 플라비이볼라 (Flaviivola), 플라보박테리움 (Flavobacterium), 스파에로카에타 (Sphaerochaeta), 아조스피릴룸 (Azospirillum), 글루콘아세토박터 (Gluconacetobacter), 네이세리아 (Neisseria), 로세부리아 (Roseburia), 파르비바큘럼 (Parvibaculum), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 니트라티프락토르 (Nitratifractor), 마이코플라스마 (Mycoplasma), 캄필로박터 (Campylobacter), 및 라크노스피라 (Lachnospira)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 유기체로부터 유래될 수 있다.
C2c2 또는 Cas13b 이펙터 단백질은 렙토트리키아 샤히이 (Leptotrichia shahii); 렙토트리키아 웨이데이 (Leptotrichia wadei) (Lw2); 리스테리아 실리게리 (Listeria seeligeri); 라크노스피라세애 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MA2020; 라크노스피라세애 박테리움 NK4A179; [클로스트리듐 (Clostridium)] 아미노필럼 (aminophilum) DSM 10710; 카르노박테리움 갈리나럼 (Carnobacterium gallinarum) DSM 4847; 카르노박테리움 갈리나럼 DSM 4847 (제2 CRISPR 유전자좌); 팔루디박터 프로피오니시게네스 (Paludibacter propionicigenes) WB4; 리스테리아 웨이헨스테파넨시스 (Listeria weihenstephanensis) FSL R9-0317; 리스테리아세애 박테리움 (Listeriaceae bacterium) FSL M6-0635; 렙토트리키아 웨이데이 F0279; 로도박터 캡슐라터스 (Rhodobacter capsulatus) SB 1003; 로도박터 캡슐라터스 R121; 로도박터 캡슐라터스 DE442; 렙토트리키아 부칼리스 (Leptotrichia buccalis) C-1013-b; 허비닉스 헤미셀룰로실리티카 (Herbinix hemicellulosilytica); [유박테리움 (Eubacterium)] 렉탈레 (rectale); 유박테리아세애 박테리움 (Eubacteriaceae bacterium) CHKCI004; 블라우티아 (Blautia) sp. 마르세이유-P2398; 렙토트리키아 sp. 경구 분류군 879 str. F0557; 라크노스피라세애 박테리움 NK4A144; 클로로플렉서스 아그레간스 (Chloroflexus aggregans); 데메퀴나 아우란티아카 (Demequina aurantiaca); 탈라소스피라 (Thalassospira) sp. TSL5-1; 슈도부티리비브리오 (Pseudobutyrivibrio) sp. OR37; 부티리비브리오 (Butyrivibrio) sp. YAB3001; 블라우티아 sp. 마르세이유-P2398; 렙토트리키아 sp. 마르세이유-P3007; 박테로이데스 이후아에 (Bacteroides ihuae); 포르피로모나다세애 박테리움 (Porphyromonadaceae bacterium) KH3CP3RA; 리스테리아 리파리아 (Listeria riparia); 및 인솔리티스피릴럼 페레그리넘 (Insolitispirillum peregrinum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기체로부터 유래될 수 있다.
특정 구현예에서, C2c2 이펙터 단백질은 렙토트리키아 웨이데이 F0279 또는 렙토트리키아 웨이데이 F0279 (Lw2) C2c2 이펙터 단백질일 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산-압타머는 오크라톡신 A (OTA)를 인식할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 (합성) 미스매치를 포함하는 해당 표적 분자에 결합하도록 디자인될 수 있다. 미스매치는 상기 표적 분자 내 SNP 또는 다른 단일 뉴클레오티드 변이의 상류 또는 하류에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 표적 RNA 또는 DNA 내 단일 뉴클레오티드 다형성, 또는 RNA 전사물의 스플라이스 변이체를 검출하도록 디자인된다. 하나 이상의 가이드 RNA는 질환 상태에 대한 진단이 되는 하나 이상의 표적 분자에 결합하도록 디자인될 수 있다. 일부 구현예에서, 질환 상태는 암일 수 있다. 일부 구현예에서, 질환 상태는 자가면역 질환일 수 있다. 일부 구현예에서, 질환 상태는 감염일 수 있다. 감염은 바이러스, 박테리아, 진균, 원충 또는 기생충에 의해 초래될 수 있다.
특정 구현예에서, 감염은 바이러스 감염일 수 있다. 바이러스 감염은 DNA 바이러스에 의해 초래된다. DNA 바이러스는 미오바이러스과 (Myoviridae), 포도바이러스과 (Podoviridae), 시포바이러스과 (Siphoviridae), 알로헤르페스바이러스과 (Alloherpesviridae), 헤르페스바이러스과 (Herpesviridae) (인간 헤르페스 바이러스, 및 바리셀라 조스터 바이러스 포함), 말로코헤르페스바이러스과 (Malocoherpesviridae), 리포트릭스바이러스과 (Lipothrixviridae), 루디바이러스과 (Rudiviridae), 아데노바이러스과 (Adenoviridae), 암풀라바이러스과 (Ampullaviridae), 아스코바이러스과 (Ascoviridae), 아스파바이러스과 (Asfarviridae) (아프리카 돼지 열병 바이러스 포함), 배큘로바이러스과 (Baculoviridae), 시카우다바이러스과 (Cicaudaviridae), 클라바바이러스과 (Clavaviridae), 코르티코바이러스과 (Corticoviridae), 푸셀로바이러스과 (Fuselloviridae), 글로불로바이러스과 (Globuloviridae), 구타바이러스과 (Guttaviridae), 히트로사바이러스과 (Hytrosaviridae), 이리도바이러스과 (Iridoviridae), 마세이유바이러스과 (Maseilleviridae), 미미바이러스과 (Mimiviridae), 누디바이러스과 (Nudiviridae), 니마바이러스과 (Nimaviridae), 판도라바이러스과 (Pandoraviridae), 파필로마바이러스과 (Papillomaviridae), 사이코드나바이러스과 (Phycodnaviridae), 플라스마바이러스과 (Plasmaviridae), 폴리드나바이러스 (Polydnavirus), 폴리오마바이러스과 (Polyomaviridae) (원숭이 바이러스 40, JC 바이러스, BK 바이러스 포함), 폭스바이러스과 (Poxviridae) (우두 및 천연두 포함), 스파에롤리포바이러스과 (Sphaerolipoviridae), 텍티바이러스과 (Tectiviridae), 투리바이러스과 (Turriviridae), 디노드나바이러스 (Dinodnavirus), 살터프로바이러스 (Salterprovirus), 리지도바이러스 (Rhizidovirus)일 수 있다.
바이러스 감염은 이중-가닥 RNA 바이러스, 포지티브 센스 RNA 바이러스, 네거티브 센스 RNA 바이러스, 레트로바이러스, 또는 이의 조합에 의해 초래될 수 있다.
바이러스 감염은 코로나바이러스과 (Coronaviridae) 바이러스, 피코르나바이러스과 (Picornaviridae) 바이러스, 칼리시바이러스과 (Caliciviridae) 바이러스, 플라비바이러스과 (Flaviviridae) 바이러스, 토가바이러스과 (Togaviridae) 바이러스, 보르나바이러스과 (Bornaviridae), 필로바이러스과 (Filoviridae), 파라믹소바이러스과 (Paramyxoviridae), 뉴모바이러스과 (Pneumoviridae), 라브도바이러스과 (Rhabdoviridae), 아레나바이러스과 (Arenaviridae,), 부니아바이러스과 (Bunyaviridae), 오르쏘믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae), 또는 델타바이러스 (Deltavirus)에 의해 초래될 수 있다.
바이러스 감염은 코로나바이러스, SARS, 폴리오바이러스, 리노바이러스, A형 간염 바이러스, 노르워크 바이러스, 황열병 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, C형 간염 바이러스, 뎅기열 바이러스, 지카 바이러스, 루벨라 바이러스, 로스 리버 바이러스, 신드비스 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 보르나병 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 니파바이러스, 헨드라 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 공수병 바이러스, 라싸 바이러스, 한타바이러스, 크림-콩고 출혈열 바이러스, 인플루엔자, 또는 D형 간염 바이러스에 의해 초래될 수 있다.
일부 구현예에서, 감염은 박테리아 감염이다. 박테리아 감염을 초래하는 박테리아는 아시네토박터 (Acinetobacter) 종, 악티노바실러스 (Actinobacillus) 종, 악티노마이세테스 (Actinomycetes) 종, 악티노마이세스 (Actinomyces) 종, 애로코커스 (Aerococcus) 종, 애로모나스 (Aeromonas) 종, 아나플라스마 (Anaplasma) 종, 알칼리게네스 (Alcaligenes) 종, 바실러스 (Bacillus) 종, 박테리오데스 (Bacteriodes) 종, 바르토넬라 (Bartonella) 종, 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 종, 보르데텔라 (Bordetella) 종, 보렐리아 (Borrelia) 종, 브루셀라 (Brucella) 종, 버크홀데리아 (Burkholderia) 종, 캄필로박터 (Campylobacter) 종, 카프노사이토파가 (Capnocytophaga) 종, 클라미디아 (Chlamydia) 종, 시트로박터 (Citrobacter) 종, 콕시엘라 (Coxiella) 종, 코린박테리움 (Corynbacterium) 종, 클로스트리듐 (Clostridium) 종, 에이케넬라 (Eikenella) 종, 엔테로박터 (Enterobacter) 종, 에스케리치아 (Escherichia) 종, 엔테로코커스 (Enterococcus) 종, 엘리키아 (Ehlichia) 종, 에피더모피톤 (Epidermophyton) 종, 에리시펠로트릭스 (Erysipelothrix) 종, 유박테리움 (Eubacterium) 종, 프란시셀라 (Francisella) 종, 푸소박테리움 (Fusobacterium) 종, 가드네렐라 (Gardnerella) 종, 제멜라 (Gemella) 종, 헤모필러스 (Haemophilus) 종, 헬리코박터 (Helicobacter) 종, 킨겔라 (Kingella) 종, 클렙시엘라 (Klebsiella) 종, 락토바실러스 (Lactobacillus) 종, 락토코커스 (Lactococcus) 종, 리스테리아 (Listeria) 종, 렙토스피라 (Leptospira) 종, 레지오넬라 (Legionella) 종, 렙토스피라 (Leptospira) 종, 류코노스토크 (Leuconostoc) 종, 만헤이미아 (Mannheimia) 종, 마이코스포럼 (Microsporum) 종, 마이크로코커스 (Micrococcus) 종, 모라셀라 (Moraxella) 종, 모르가넬 (Morganell) 종, 모빌룬커스 (Mobiluncus) 종, 마이크로코커스 (Micrococcus) 종, 마이코박테리움 (Mycobacterium) 종, 마이코플라즘 (Mycoplasm) 종, 노카르디아 (Nocardia) 종, 네이세리아 (Neisseria) 종, 파스퇴렐라 (Pasteurelaa) 종, 페디오코커스 (Pediococcus) 종, 펩토스트렙토코커스 (Peptostreptococcus) 종, 피티로스포럼 (Pityrosporum) 종, 플레시오모나스 (Plesiomonas) 종, 프레보텔라 (Prevotella) 종, 포르피로모나스 (Porphyromonas) 종, 프로테우스 (Proteus) 종, 프로비덴시아 (Providencia) 종, 슈도모나스 (Pseudomonas) 종, 프로피오니박테리움 (Propionibacteriums) 종, 로도코커스 (Rhodococcus) 종, 리케치아 (Rickettsia) 종, 로도코커스 (Rhodococcus) 종, 세라티아 (Serratia) 종, 스테노트로포모나스 (Stenotrophomonas) 종, 살모넬라 (Salmonella) 종, 세라티아 (Serratia) 종, 시겔라 (Shigella) 종, 스타필로코커스 (Staphylococcus) 종, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 종, 스피릴럼 (Spirillum) 종, 스트렙토바실러스 (Streptobacillus) 종, 트레포네마 (Treponema) 종, 트로페리마 (Tropheryma) 종, 트리코피톤 (Trichophyton) 종, 우레아플라즈마 (Ureaplasma) 종, 베일로넬라 (Veillonella) 종, 비브리오 (Vibrio) 종, 여시니아 (Yersinia) 종, 잔토모나스 (Xanthomonas) 종, 또는 이의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 감염은 진균에 의해 초래될 수 있다. 진균은 아스퍼질러스 (Aspergillus), 블라스토마이세스 (Blastomyces), 칸디디아시스 (Candidiasis), 콕시디오도미코시스 (Coccidiodomycosis), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 가티 (Cryptococcus gatti), sp. 히스토플라즈마 (Histoplasma) sp. (예컨대, 히스토플라즈마 캡슐라텀 (Histoplasma capsulatum)), 뉴모시스티스 (Pneumocystis) sp. (예컨대 뉴모시스티스 지로베시 (Pneumocystis jirovecii)), 스타키보트리스 (Stachybotrys) (예컨대 스타키보트리스 카르타럼 (Stachybotrys chartarum)), 무크로임코시스 (Mucroymcosis), 스포로트릭스 (Sporothrix), 진균성 안구 감염 백선 (fungal eye infections ringworm), 엑세로힐럼 (Exserohilum), 클라도스포리움 (Cladosporium), 제오트리컴 (Geotrichum), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 한세눌라 (Hansenula) 종, 칸디다 (Candida) 종, 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 종, 데바리오마이세스 (Debaryomyces) 종, 피키아 (Pichia) 종, 페니실리움 (Penicillium) 종, 클라도스포리움 (Cladosporium) 종, 비쏘클라미스 (Byssochlamys) 종 또는 이의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 감염은 원충에 의해 초래될 수 있다. 원충은 유글레노조아 (Euglenozoa), 헤테롤로보세아 (Heterolobosea), 디플로모나디다 (Diplomonadida), 아메보조아 (Amoebozoa), 블라스토시스틱 (Blastocystic), 아피콤플렉사 (Apicomplexa), 또는 이의 조합일 수 있다.
감염은 기생충에 의해 초래될 수 있다. 기생충은 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi) (샤가스병), 트리파노소마 브루세이 감비엔스 (Trypanosoma brucei gambiense), 트리파노소마 브루세이 로데시엔스 (Trypanosoma brucei rhodesiense), 리슈마니아 브라질리엔시스 (Leishmania braziliensis), 리슈마니아 인판텀 (Leishmania Infantum), 리슈마니아 멕시카나 (Leishmania mexicana), 리슈마니아 마조르 (Leishmania major), 리슈마니아 트로피카 (Leishmania Tropica), 리슈마니아 도노바니 (Leishmania donovani), 내글레리아 파울러리 (Naegleria fowleri), 지아르디아 인테스티날리스 (Giardia intestinalis) (지아르디아 람블리아 (Giardia lamblia), 지아르디아 두오데날리스 (Giardia duodenalis)), 칸타메바 카스텔라니 (Canthamoeba castellanii), 발라무티아 마드릴라리스 (Balamuthia madrillaris), 엔타메바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica), 블라스토시스틱 호미니스 (Blastocystic hominis), 바베시아 미크로티 (Babesia microti), 크립토스포리듐 파르븀 (Cryptosporidium parvum), 시클로스포라 카이에타넨시스 (Cyclospora cayetanensis), 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스 (Plasmodium Vivax), 플라스모듐 오발레 (Plasmodium ovale), 플라스모듐 말라리아 (Plasmodium malariae), 및 톡소플라즈마 곤디 (Toxoplasma gondii) 또는 이의 조합일 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 RNA 분자를 증폭하기 위한 시약은 핵산 서열-기반 증폭 (NASBA), 리콤비나제 중합효소 증폭 (RPA), 루프-매개 등온 증폭 (LAMP), 가닥 전위 증폭 (SDA), 헬리카제-의존적 증폭 (HDA), 닉킹 효소 증폭 반응 (NEAR), PCR, 다중 전위 증폭 (MDA), 롤링 써클 증폭 (RCA), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 또는 세분화 증폭 방법 (RAM)을 포함한다.
시스템은 농축 (농축) CRISPR 시스템을 더 포함하고, 여기서 농축 CRISPR 시스템은 검출 CRISPR 시스템에 의한 검출 이전에 해당 표적 분자에 결합하도록 디자인된다. 농축 CRISPR 시스템은 촉매적 불활성 CRISPR 이펙터 단백질을 포함할 수 있다. 촉매적 불활성 CRISPR 이펙터 단백질은 촉매적 불활성 C2c2일 수 있다.
농축 CRISPR 이펙터 단백질은 태그를 더 포함할 수 있고, 여기서 태그는 농축 CRISPR 이펙터 시스템을 풀다운시키거나, 또는 고형 기재에 농축 CRISPR 시스템을 결합시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, 고형 기재는 플로우 셀일 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 개별 이산 부피를 포함하는 진단 장치를 제공하고, 가가각의 개별 이산 부피는 본 명세서에 기술된 바와 같은 CRISPR 시스템을 포함한다.
일부 구현예에서, 각각의 개별 이산 부피는 핵산 증폭 시약을 더 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 분자는 표적 DNA일 수 있고, 개별 이산 부피는 표적 DNA에 결합하고 RNA 중합효소 프로모터를 포함하는 프라이머를 더 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 개별 이산 부피는 액적일 수 있다. 일부 구현예에서, 개별 이산 부피는 고형 기재 상에 한정된다. 일부 구현예에서, 개별 이산 부피는 마이크로웰이다. 일부 구현예에서, 개별 이산 부피는 기재 상에 한정된 스폿이다. 일부 구현예에서, 기재는 가요성 재료 기재일 수 있다. 일부 구현예에서, 가요성 재료 기재는 종이 기재 또는 가요성 중합체 기반 기재일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 샘플에서 표적 핵산을 검출하기 위한 방법을 제공하고, 샘플 또는 샘플의 세트를 하나 이상의 개별 이산 부피에 분배하는 단계로서, 개별 이산 부피는 본 명세서에 기술된 바와 같은 CRISPR 시스템을 포함하는 것인 단계; 하나 이상의 가이드 RNA와 하나 이상의 표적 분자의 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에서 샘플 또는 샘플의 세트를 인큐베이션시키는 단계; 하나 이상의 가이드 RNA와 하나 이상의 표적 분자의 결합을 통해서 CRISPR 이펙터 단백질을 활성화시키는 단계로서, CRISPR 이펙터 단백질의 활성화는 RNA-압타머 포함 사중체의 변형을 야기시켜서 사중체의 효소 활성이 불활성화되는 것인 단계; 및 효소 활성을 검출하는 단계로서, 한계치 이하의 검출은 샘플 내에 하나 이상의 표적 분자의 존재를 의미하는 것인 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 표적 분자는 표적 DNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 RNA 중합효소 부위를 포함하는 프라이머와 표적 DNA를 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
방법은 샘플 RNA 또는 기폭제 RNA를 증폭시키는 단계를 더 포함할 수 있다. RNA를 증폭시키는 단계는 NASBA에 의한 증폭을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA를 증폭시키는 단계는 RPA에 의한 증폭을 포함할 수 있다.
샘플은 생물학적 샘플 또는 환경 샘플일 수 있다.
생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 객담, 점액, 림프액, 활액, 담즙, 복수, 흉수, 장액종, 타액, 뇌척수액, 안방수 또는 유리체액, 또는 임의의 신체 분비액, 여출액, 삼출액 (예를 들어, 농양 또는 임의의 다른 감염 또는 염증 부위로부터 얻은 체액), 또는 관절 (예를 들어, 정상 관절, 또는 류마티스성 관절염, 골관절염, 통풍성 또는 화농성 관절염과 같은 질환을 앓는 관절)로부터 얻은 체액, 또는 피부 또는 점막 표면의 스왑 (swab)일 수 있다.
환경 샘플은 음식물 샘플, 종이 표면, 패브릭, 금속 표면, 목재 표면, 플라스틱 표면, 토양 샘플, 담수 샘플, 폐수 샘플, 염수 샘플, 또는 이의 조합으로부터 수득될 수 있다.
하나 이상의 가이드 RNA는 표적 RNA 또는 DNA 내 단일 뉴클레오티드 다형성, 또는 RNA 전사물의 스플라이스 변이체를 검출하도록 디자인된다. 하나 이상의 가이드 RNA는 질환 상태에 대한 진단인 하나 이상의 표적 분자에 결합하도록 디자인될 수 있다.
하나 이상의 가이드 RNA는 세포 무함유 핵산에 결합하도록 디자인될 수 있다.
일부 구현예에서, 질환 상태는 감염, 장기 질환, 혈액 질환, 면역계 질환, 암, 뇌 및 신경계 질환, 내분비 질환, 임신 또는 출산 관련 질환, 유전 질환, 또는 환경-획득 질환일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 샘플에서 표적 핵산을 검출하기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같은 핵산 검출 시스템과 샘플을 접촉시키는 단계 및 상기 접촉된 샘플을 측류 면역크로마토그래피 어세이에 적용하는 단계를 포함한다.
도 1 - 예로서 C2c2 기반 CRISPR 이펙터 시스템의 개략도이다.
도 2 - (A) 렙토트리키아 웨이데이 유래 CRISPR/C2c2 유전자좌의 개략도를 제공한다. LwC2c2 및 LshC2c2 시스템 유래의 대표적인 crRNA 구조가 도시되어 있다 (SEQ ID NO. 142 및 143). (B) C2c2 활성에 대한 생체내 박테리아 어세이의 개략도. 프로토스페이서는 앰피실린-내성 플라스미드의 베타-락타마제 유전자의 상류에 클로닝되고, 이 구성체는 표적화 또는 비표적화 스페이서와 함께 C2c2를 발현하는 이. 콜라이를 형질전환시킨다. 성공적인 형질전환체는 활성을 정량하기 위해 계측된다. (C) LwC2c2 및 LshC2c2 생체내 활성의 정량 (n=2 생물학적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (D) LwC2c2의 최종 크기 배제 겔 여과. (E) LwC2c2 단계식 정제의 쿠마시 블루 염색된 아크릴아미드 겔. (F) 상이한 PFS 표적에 대한 LwC2c2의 활성. LwC2c2는 스페이서가 측접된 가변성 3' PFS를 갖는 형광성 RNA에 대해 표적화되었고, 반응 생성물은 변성 겔 상에서 가시화되었다. LwC2c2는 G PFS에 대해 약간의 선호도를 보인다.
도 3 - 3시간 동안 5분 간격으로 측정된, (96+48)*2 = 288회 반응으로, crRNA, crRNA 무함유 조건, 기술적 중복물의 2개 풀로, 4종의 상이한 양의 단백질/crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64)과 1 ㎍, 100 ng, 10 ng, 및 1 ng의 표적을 사용한 상이한 희석물에서 일례의 차폐성 구성체의 검출을 도시한다.
도 4 - 3시간 동안 5분 간격으로 측정된, (96+48)*2= 288 반응에서, 2개 풀의 crRNA, crRNA 부재 조건과, 기술적 복제물로, 4종의 상이한 양의 단백질/crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64)과 1 μg, 100 ng, 10 ng, 및 1 ng의 표적을 사용하여 상이한 희석물에서 예로서 차폐성 구성체의 검출을 도시한다.
도 5 - 3시간 동안 5분 간격으로 측정된, (96+48)*2= 288 반응으로, 2개 풀의 crRNA, crRNA 부재 조건과, 기술적 복제물로, 4종의 상이한 양의 단백질/crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64)과 1 μg, 100 ng, 10 ng, 및 1 ng의 표적을 사용하여 상이한 희석물에서 예로서 차폐성 구성체의 검출을 도시한다.
도 6 - 3시간 동안 5분 간격으로 측정된, (96+48)*2= 288 반응으로, 2개의 crRNA, crRNA 부재 조건과, 기술적 복제물로, 4종의 상이한 양의 단백질/crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64)과 1 μg, 100 ng, 10 ng, 및 1 ng의 표적을 사용하여 상이한 희석물에서 예로서 차폐성 구성체의 검출을 도시한다.
도 7 - 일정한 일례의 구현예에 따라서, 차폐성 구성체 및 CRISPR 이펙터 단백질을 사용한 일례의 검출 계획의 계략도를 제공한다.
도 8 - 상이한 풀의 가이드 RNA를 사용해 표적을 검출할 때 시간 경과에 따른 형광도의 변화를 도시하는 그래프의 세트를 제공한다.
도 9 - CRISPR 이펙터 단백질의 다양한 농도에서 표적 RNA의 상이한 희석에 걸쳐 검출된 정규화된 형광도를 도시하는 그래프를 제공한다.
도 10 - NASBA 증폭 반응의 일반 단계를 도시하는 개략도이다.
도 11 - 3종의 상이한 프라이머 세트를 사용하여 NASBA에서 증폭시키고 나서 소광된 형광성 프로브를 사용한 C2c2 부차적 검출이 수행된 핵산 표적 ssRNA 1의 검출을 도시하는 그래프를 제공한다. (n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄)
도 12 - 부차적 효과가 렌티바이러스 표적 RNA의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다는 것을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 13 - 부차적 효과 및 NASBA가 aM 농도에서 종을 검출할 수 있다는 것을 입증하는 그래프를 제공한다.
도 14 - 부차적 효과 및 NASBA가 저농도 샘플을 신속하게 구별한다는 것을 입증하는 그래프를 제공한다.
도 15 - 특정한 시점에서 정규화된 형광도가 샘플 투입 농도를 예측한다는 것을 도시한다. 증폭없이 Cas13a 검출에 의한 형광도 측정은 투입 RNA 농도와 상관성이 있다. (n=2 생물학적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 16 - 반응에 참여하는 성분을 보여주는 RPA 반응의 개략도를 제공한다.
도 17 - SHERLOCK의 개략도로서, RPA 또는 그에 따라 RT-RPA 단계의 도입을 통해서 DNA 또는 RNA 표적 둘 모두의 검출을 보여주는 개략도를 제공한다. 표적 RNA의 인식 시, 부차적 효과는 C2c2가 절단성 리포터를 절단하게 하여, 형광이 발생된다. RNA 또는 DNA의 단일-분자의 양은 리콤비나제 중합효소 증폭 (RPA)을 통해서 DNA로 증폭될 수 있고 전사되어 RNA를 생성시키고, 그 이후에 C2c2에 의해 검출된다.
도 18 - C2c2 부차적 검출을 통해 검출된 ssRNA 표적의 개략도를 제공한다 (SEQ ID NO. 144 및 145).
도 19 - RPA를 사용한 단일분자 DNA 검출을 입증하는 그래프 세트를 제공한다 (즉, C2c2 첨가의 15분 이내).
도 20 - RPA 반응물에 T7 중합효소의 혼합이 DNA 검출에 부정적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다.
도 21 - RPA 반응물에 중합효소의 혼합이 DNA 검출에 부정적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다.
도 22 - RPA, T7 전사, 및 C2c2 검출 반응은 동시에 인큐베이션했을 때 단일 분자 검출을 달성하고 호환적이라는 것을 입증하는 그래프를 제공한다 (n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 23 - 신속한 RPA-RNA 인큐베이션 시간의 효율을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다.
도 24 - T7 중합효소의 양 증가는 RPA-RNA에 대한 감도를 증대시킨다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다.
도 25 - 1.5x 효소에 의한 원-포트 반응을 사용한 RPA-DNA 검출 어세이의 결과를 도시한 그래프의 세트를 제공한다. 단일 분자 (2aM) 검출이 30분 정도로 조기에 획득되었다.
도 26 - RPA-DNA 원-포트 반응이 투입 농도에 비해 형광도의 정량적 감소를 입증한다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다. 적합화된 그래프는 표적 투입 농도 및 출력 형광도 간 상관성을 밝혀준다.
도 27 - (A) 증폭없이 RNA의 C2c2 검출은 50 fM에 이르는 농도에서 ssRNA 표적을 검출할 수 있고 (n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄), (B) RPA-C2c2 반응이 단일-분자 DNA 검출을 할 수 있다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄)는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다.
도 28 - 일정한 일례의 구현예에 따라서 발생된 C2c2 신호가 종이 기재 상에서 20 pM 표적을 검출할 수 있다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다.
도 29 - 특이적 RNAse 억제제가 종이 상에서 배경 신호를 제거할 수 있다는 것을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 30 - 유리 섬유 기재 상에서 일정한 일례의 구현예에 따른 시스템을 사용한 검출을 보여주는 그래프의 세트이다.
도 31 - (A) 일정한 일례의 구현예에 따른 지카 RNA 검출의 계략도를 제공하는 그래프 세트를 제공한다. 렌티바이러스는 C2c2 부차적 검출에 의해 표적화된 지카 RNA 또는 상동성 뎅기 RNA 단편으로 패키징되었다. 배지는 48시간 후에 회수하여 열 용해, RT-RPA, 및 C2c2 검출을 수행한다. (B) RT-RAP-C2c2 검출은 지카 렌티바이러스 입자의 고도로 민감한 검출을 할 수 있다 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; *****, p<0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (C) 일정한 일례의 구현예에 따른, 종이 상의 동결-건조된 C2c2를 사용한 지카 RNA 검출의 개략도. (D) 종이-기반 어세이는 지카 렌티바이러스 입자의 고도로 민감한 검출을 할 수 있다 (n-4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; ****, p<0.0001; **, p<0.01, 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 32 - (A) 인간 혈청으로부터 단리된 지카 RNA의 C2c2 검출에 대한 개략도를 입증하는 그래프의 세트를 제공한다. 혈청 중 지카 RNA에 대해 역전사, RNA의 RNase H 분해, cDNA의 RPA, 및 C2c2 검출이 수행된다. (B) C2c2는 인간 지카 혈청 샘플의 고도로 민감한 검출을 할 수 있다. 표시된 지카 RNA의 농도는 qPCR로 검증하였다 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 33 - (A) 동결-건조된 C2c2가 낮은 펨토몰라 범위에서 ssRNA 1의 민감한 검출을 할 수 있다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다. C2c2는 액상 형태 (B) 또는 동결 건조 (C)로 종이 상에서 200 pM ssRNA 1 표적의 신속한 검출을 할 수 있다. 반응은 용액 중 (D) (n=3) 및 동결-건조 형태 (E) (n=3)로 합성된 지카 RNA 단편의 민감한 검출을 할 수 있다. (F) 투입 농도 및 검출된 형광도 간 유의한 상관성을 보여주는 인간 지카 cDNA 검출에 대한 정량적 그래프. (G) ssRNA1 1의 C2c2 검출은 다양한 양의 인간 혈청 존재 하에서 수행되었다 (달리 표시하지 않으면 n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 34 - (A) 범용 V3 RPA 프라이머 세트를 사용한 박테리아 게놈 유래의 16S rRNA 유전자의 C2c2 검출의 개략도, 및 일정한 일례의 구현예에 따라 수행된 어세이를 사용한 (B) 이. 콜라이 또는 (C) 피. 애루지노사 gDNA의 민감하고 특이적인 검출을 획득하는 능력을 제공한다 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). Ec, 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli); Kp, 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae); Pa, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa); Mt, 마이코박테리움 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis); Sa, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus).
도 35 - (A) 클렙시엘라 뉴모니아의 4종의 상이한 임상 단리주 유래의 2종의 상이한 카르바페넴-내성 유전자 (KPC 및 NDM-1)의 검출, 및 (B) 카르바페넴-내성 유전자의 검출 (파트 A)이 KPC 및 NDM-1 crRNA 어세이 간 신호의 비율로서 정규화된다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다 (n=2 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 36 - (A) C2c2가 단일 미스매치에 민감하지 않지만, 추가의 미스매치를 갖는 crRNA와 로딩될 때 표적 내 단일 뉴클레오티드 편차를 구별할 수 있다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다. ssRNA 표적 1-3은 crRNA 내 다양한 위치에 합성 미스매치를 함유하는 10종의 스페이서를 갖는 11종의 crRNA로 검출되었다. 미스매치된 스페이서는 표적 1의 감소된 절단을 보이지 않았지만, 미스매치 표적 2 및 3의 억제된 절단을 보였다 (SEQ ID NO. 146 내지 159). (B) 합성 미스매치를 갖는 단일-염기 특이적 스페이서의 합리적 디자인을 위한 과정을 도시한 개략도. 합성 미스매치는 SNP 또는 관심 염기에 근접하여 위치된다 (SEQ ID NO. 160 내지 164). (C) 균주 SNP의 고도로 특이한 검출은 절두된 (23개 뉴클레오티드) crRNA에 의한 C2c2 검출을 사용하여 오직 하나의 뉴클레오티드가 상이한 아메리카 RNA 표적에 대해 지카 아프리카의 구별을 가능하게 한다 (n=2 기술적 복제물, 단측 스튜던트 t-검정; *, p < 0.05; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 37 - (A) 검출에 사용된 지카 균주 표적 영역 및 crRNA 서열의 개략도 (SEQ ID NO. 165 내지 170)를 입증하는 그래프의 세트를 제공한다. 표적 내 SNP는 붉은색 또는 파란색으로 강조되고 가이드 서열 내 합성 미스매치는 붉은색으로 표시된다. (B) 균주 SNP의 고도로 특이적인 검출은 SHERLOCK을 사용하여 아메리카 RNA 표적에 대해 지카 아프리카 표적의 구별을 가능하게 한다 (n=2 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄) (SEQ ID NO. 171 내지 176). (C) 검출에 사용된 뎅기 균주 표적 영역 및 crRNA 서열의 개략도. 표적의 SNP는 붉은색 또는 파란색으로 강조되어 있고 가이드 서열의 합성 미스매치는 붉은색으로 표시된다. (D) 균주 SNP의 고도로 특이적인 검출은 SHERLOCK를 사용하여 균주 3 RNA 표적 대비 뎅기 균주 1의 구별을 가능하게 한다 (n=2 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 38 - (A) C2c2로 검출된 인간 SNP의 위치를 도시한 서코스 그래프를 도시한 그래프의 세트를 제공한다. (B) 일정한 일례의 구현예에 따라서 수행된 어세이는 인간 SNP들을 구별할 수 있다. SHERLOCK은 인간 게놈의 4종의 상이한 SNP 부위에서 4종의 상이한 개체를 정확하게 유전자형분석할 수 있다. 각 개체에 대한 유전자형 및 대립유전자-감지 crRNA의 정체는 각 그래프의 아래에 주석을 달았다 (n=4 기술적 복제물; 양측 스튜던트 t-검정; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (C) 일정한 일례의 구현예에 따른 cfDNA의 검출을 위한 과정의 개략도 (예컨대 암 돌연변이의 세포-무함유 DNA 검출). (D) EGFR L858R 및 BRAF V600E를 검출하기 위한 예로서 crRNA 서열. (SEQ ID NO. 177 내지 182). 세포-무함유 DNA의 암 돌연변이에 대해 어세이된 2종 게놈 유전자좌의 서열. 파란색으로 강조된 SNP를 갖는 표적 게놈 서열 및 붉은색으로 표시된 합성 미스매치를 갖는 돌연변이체/야생형 감지 crRNA 서열이 도시되어 있다.
도 39 - C2c2가 EGFR L858R (A) 또는 BRAF V600E (B) 소수 대립유전자 유래의 모의 세포-무함유 DNA 샘플에서 돌연변이체 소수 대립유전자를 검출할 수 있다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다. (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; *, p<0.05; **, p<0.01, ****, P<0.0001; 막대는 ± s.e.m.를 나타냄)
도 40 - (A) 어세이는 rs5082에서 유전자형을 구별할 수 있다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다 (n=4 기술적 복제물; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (B) 어세이는 원심분리하여, 변성 및 끓인 타액에서 직접 유래된 gDNA의 rs601338에서 유전자형을 구별할 수 있다 (n=3 기술적 복제물; *, p < 0.05; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 41 - (A) 오직 단일 미스매치만이 ssDNA 1과 상이한 표적의 배경에서 ssDNA 1에 대해 수행된 일례의 구현예의 개략도를 제공한다. (B) 어세이는 미스매치된 배경 (ssDNA와 오직 단일 미스매치만 상이한 표적)의 존재 하에서 ssDNA 1의 단일 뉴클레오티드 특이성 검출을 획득한다. 표적 DNA의 다양한 농도를 하나의 미스매치를 갖는 과량의 배경 DNA와 조합하고 어세이로 검출하였다.
도 42 는 상이한 염료 Cy5를 갖는 차폐성 구성체가 또한 효과적인 검출을 가능하게 한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 43 은 금 나노입자 비색 기반 어세이의 개략도이다. AuNP는 DNA 링커 및 RNA 가교의 조합을 사용해 응집된다. RNase 활성의 첨가 시, ssRNA 가교가 절단되고 AuNP가 방출되어, 붉은색 쪽으로의 특징적인 색상 이동이 야기된다.
도 44 는 520 nm에서 분산된 나노입자의 색상 이동을 검출하는 능력을 도시하는 그래프이다. 나노입자는 도 43에 도시된 일례의 구현예를 기반으로 하였고 다양한 농도에서 RNase A의 첨가를 사용해 분산되었다.
도 45 는 RNase 비색 시험이 정량적이라는 것을 도시하는 그래프의 세트이다.
도 46 은 분산된 나노입자에서 색상 이동이 시각적으로 검출가능하다는 것을 도시한 마이크로웰 플레이트의 사진이다.
도 47 은 비색 이동이 종이 기재 상에서 가시적이라는 것을 입증하는 사진이다. 시험은 10분 동안 37℃에서 유리 섬유 934-AH 상에서 수행되었다.
도 48 은 (A) 단백질 또는 소형 분자의 검출을 위한 일정한 일례의 구현예에 따른 입체형태 전환 압타머의 개략도이다. 결찰된 생성물 (B)은 미결찰된 투입 생성물을 검출할 수 없는 RNA-표적화 이펙터에 대한 완벽한 표적으로서 사용된다 (SEQ ID NO. 202 및 424).
도 49 는 압타머-기반 결찰이 RPA-검출가능한 기재를 생성시킬 수 있다는 것을 보여주는 겔의 이미지이다. 압타머는 다양한 수준의 트롬빈과 인큐베이션된 후에 프로브로 결찰되었다. 결찰된 구성체는 3분 RPA 반응을 위한 주형으로서 사용되었다. 500 nM 트롬빈은 배경치보다 유의하게 더 높은 수준의 증폭된 표적을 갖는다.
도 50 은 선택된 C2c2 오솔로그의 HEPN 도메인의 아미노산 서열을 도시한다 (SEQ ID NO. 204-233).
도 51 - RPA 증폭 (SHERLOCK)에 의한 RNA의 Cas13a 검출은 Cas13a 단독보다 훨씬 민감하게, ∼2 aM에 이르는 농도에서 ssRNA를 검출할 수 있다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 52 - Cas13a 검출은 바이러스 및 박테리아 병원체를 감지하는데 사용될 수 있다. (A) 인간 임상 샘플로부터 단리된 ZIKV RNA의 SHERLOCK 검출의 개략도. (B) SHERLOCK은 인간 ZIKV-양성 혈청 (S) 또는 소변 (U) 샘플의 고도로 민감한 검출을 할 수 있다. 도시된 ZIKV RNA의 대략적인 농도는 qPCR에 의해 결정되었다. (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄; n.d., 검출 안됨).
도 53 - SHERLOCK 및 (도 11의) 프라이머 세트 2에 의한 NASBA에 의한 ssRNA 1의 검출의 비교 (n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 54 - RPA 및 단일-반응 SHERLOCK에 의한 핵산 증폭. (A) 도 1C에서 사용된 희석물에 대한 ssRNA 1의 디지털-액적 PCR 정량. ddPCR 결과를 기반으로 희석물에 대해 조정된 농도는 막대 그래프 위에 표시된다. (B) 도 1D에서 사용된 희석물에 대한 ssDNA 1의 디지털-액적 PCR 정량. ddPCR 결과를 기반으로 희석물에 대해 조정된 농도는 막대 그래프 위에 표시된다. (C) RPA, T7 전사, 및 Cas13a 검출 반응은 상용성이고 동시에 인큐베이션 될 때 DNA 1의 단일 분자 검출을 획득한다 (n=3 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; n.s., 유의하지 않음; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 55 - SHERLOCK과 다른 민감한 핵산 검출 도구의 비교. (A) 디지털-액적 PCR에 의한 ssDNA 1 연속 희석물의 검출 분석 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; n.s., 유의하지 않음; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001; 붉은색 선은 평균을 나타내고, 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄. 측정 카피/㎕가 10-1 미만인 샘플은 도시하지 않음). (B) 정량적 PCR에 의한 ssDNA 1 연속 희석물의 검출 분석 (n=16 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; n.s., 유의하지 않음; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001; 붉은색 선은 평균을 나타내고, 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄. 상대적 신호가 10-10 미만인 샘플은 도시하지 않음). (C) SYBR Green II에 의한 RPA로 ssDNA 1 연속 희석물의 검출 분석 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; *, p < 0.05; **, p < 0.01; 붉은색 선은 평균을 나타내고, 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄. 상대적 신호가 100 미만인 샘플은 도시하지 않음). (D) SHERLOCK에 의한 ssDNA 1 연속 희석물의 검출 분석 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001; 붉은색 선은 평균을 나타내고, 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄. 상대적 신호가 100 미만인 샘플은 도시하지 않음). (E) 4개 유형의 검출 방법에서 일련의 ssDNA 1 희석물에 대한 변동 계수 백분율. (F) 4개 유형의 검출 방법에서 6e2, 6e1, 6e0, 및 6e-1의 ssDNA 1 희석물에 대한 변동 계수의 평균 백분율 (막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 56 - 임상적 박테리아 단리주에서 카르바파넴 내성의 검출. 이. 콜라이 대조군 및 클렙시엘라 뉴모니아의 5종의 임상 단리주 유래의 2종의 상이한 카르바페넴-내성 유전자 (KPC 및 NDM-1)의 검출 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄; n.d., 검출 안됨).
도 57 - 표적 서열 내 단일 미스매치 및 절두된 스페이서에 대한 LwCas13a 감도의 특징규명. (A) (B-G)에서 사용된 절두된 스페이서 crRNA의 서열 (SEQ ID NO. 425-436). 또한 붉은색으로 강조된 단일한 염기쌍 편차를 갖는 ssRNA 1 및 2의 서열이 도시되어 있다. 합성 미스매치를 함유하는 crRNA는 붉은색으로 표시된 미스매치 위치를 보여준다. (B) 위치 1-7에 합성 미스매치를 갖는 28 nt 스페이서 crRNA의 경우 ssRNA 1 및 2에 대한 부차적 절단 활성 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (C) (B)에서 시험된 crRNA의 특이성 비율. 특이성 비율은 온-표적 (on-target) RNA (ssRNA 1) 부차적 절단 대 오프-표적 (off-target) RNA (ssRNA 2) 부차적 절단의 비율로서 계산된다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (D) 위치 1-7에 합성 미스매치를 갖는 23 nt 스페이서 crRNA의 경우 ssRNA 1 및 2에 대한 부차적 절단 활성 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (E) (D)에서 시험된 crRNA의 특이성 비율. 특이성 비율은 온-표적 RNA (ssRNA 1) 부차적 절단 대 오프-표적 RNA (ssRNA 2) 부차적 절단의 비율로서 계산된다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (F) 위치 1-7에 합성 미스매치를 갖는 20 nt 스페이서 crRNA의 경우 ssRNA 1 및 2에 대한 부차적 절단 활성 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (G) (F)에서 시험된 crRNA의 특이성 비율. 특이성 비율은 온-표적 RNA (ssRNA 1) 부차적 절단 대 오프-표적 RNA (ssRNA 2) 부차적 절단의 비율로서 계산된다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 58 - 표적 서열 내 돌연변이에 대한 이상적인 합성 미스매치 위치의 동정. (A) ssRNA 1 및 ssRNA 사이의 돌연변이를 검출하기 위한 이상적인 합성 미스매치 위치의 평가를 위한 서열 (SEQ ID NO. 437-462). 각각의 표적 상에서, 색상 (붉은색) 표시된 위치에 합성 미스매치를 갖는 crRNA가 시험된다. 각각의 합성 미스매치 crRNA의 세트는 돌연변이 위치가 스페이서의 서열에 대한 위치로 이동되게 디자인된다. 스페이서는 돌연변이가 스페이서 내 위치 3, 4, 5, 및 6에서 평가되도록 디자인된다. (B) 다양한 위치에 합성 미스매치를 갖는 crRNA의 경우 ssRNA 1 및 2에 대한 부차적 절단 활성. 스페이서:표적 듀플렉스 영역 내 위치 3, 4, 5 또는 6에 돌연변이를 갖는 crRNA의 4개 세트가 존재한다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (C) (B)에서 시험된 crRNA의 특이성 비율. 특이성 비율은 온-표적 RNA (ssRNA 1) 부차적 절단 대 오프-표적 RNA (ssRNA 2) 부차적 절단의 비율로서 계산된다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 59 - 추가 유전자좌에서 SHERLOCK에 의한 유전자형 분석 및 끓인 타액으로부터 직접 유전자형 분석. SHERLOCK은 원심분리되고, 변성된, 끓인 타액으로부터 직접 유래된 게놈 DNA의 rs601338 SNP 부위에서 유전자형들을 구별할 수 있다 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; **, p < 0.01; ****, p < 0.001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 60 - 정확한 유전자형 인간 SNP에 대한 합성 유전자형 표준물의 개발. (A) PCR-증폭된 유전자형 표준물에 대해 비교된 4 개체 각각에 대한 rs601338 SNP 부위에서의 SHERLOCK에 의한 유전자형 분석 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (B) PCR-증폭된 유전자형 표준물에 대해 비교된 4 개체 각각에 대한 rs4363657 SNP 부위에서의 SHERLOCK에 의한 유전자형 분석 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (C) rs601338 SNP 부위에서 각각의 개체 및 합성 표준물에 대한 SHERLOCK 결과 간 산출된 p-값의 히트맵. 히트맵은 각각의 대립유전자-감지 crRNA에 대해 도시된다. 히트맵 색상 맵은 비유의성 (p > 0.05)은 붉은색이고 유의성 (p < 0.05)은 파란색이도록 조정된다 (n=4 기술적 복제물, 일원 ANOVA). (D) rs4363657 SNP 부위에서 각각의 개별 및 합성 표준물에 대한 SHERLOCK 결과 간에 산출된 p-값의 히트맵. 히트맵은 대립유전자-감지 crRNA 각각에 대해 도시되어 있다. 히트맵 색상 맵은 비유의성 (p > 0.05)은 붉은색이고 유의성 (p < 0.05)은 파란색이도록 조정된다 (n=4 기술적 복제물, 일원 ANOVA). (E) SHERLOCK 유전자형 분석의 p-값 히트맵 결과를 이해하기 위한 가이드. 유전자형 분석은 개체 및 대립유전자 합성 표준물 간에 p-값 > 0.05에 상응하는 대립유전자를 선택하여 쉽게 판정될 수 있다. 붉은색 블록은 합성 표준물 및 개체의 SHERLOCK 결과 간 비유의한 편차 및 그에 따라 유전자형-양성 결과에 상응한다. 파란색 블록은 합성 표준물 및 개체의 SHERLOCK 결과 간 유의한 편차 및 그에 따라 유전자형-음성 결과에 상응한다.
도 61 - 미스매치된 배경 표적 중 소분획으로서 ssDNA 1의 검출. 인간 게놈 DNA의 배경 상에서 ssDNA 1의 연속 희석물의 SHERLOCK 검출. 검출하려는 ssDNA 1 표적 및 배경 게놈 DNA 간에 서열 유의성이 없어야 한다는 것을 주의한다 (n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 62A, 62B - 지카 바이러스를 갖는 환자 유래의 소변 (도 62A) 또는 혈청 (도 62B) 샘플을 5분 동안 95℃ (소변) 또는 65℃ (혈청)에서 가열 불활성화시켰다. 일례의 구현예에 따라서 1 마이크로리터의 불활성화된 소변 또는 혈청이 2시간 RPA 반응과 이후 3시간 C2c2/Cas13a 검출 반응을 위한 투입물로서 사용되었다. 오차 막대는 검출 반응에 대한 n=4 기술적 복제물을 기반으로 1 SD를 의미한다.
도 63A, 63B - 지카 바이러스를 갖는 환자 유래 소변 샘플은 5분 동안 95℃에서 열-불활성화되었다. 일례의 구현예에 따라서, 1 마이크로리터의 불활성화된 소변을 30분 RPA 반응과 이후 3시간 (도 63A) 또는 1시간 (도 63B) C2c2/Cas13 검출 반응을 위한 투입물로서 사용하였다. 오차 막대는 검출 반응에 대한 n=4 기술적 복제물을 기반으로 1 SD를 의미한다.
도 64 - 지카 바이러스를 갖는 환자 유래 소변 샘플을 5분 동안 95℃에서 열-불활성화시켰다. 1 마이크로리터의 불활성화된 소변을 20분 RPA 반응과 이후에 1시간의 C2c2/Cas13a 검출 반응을 위한 투입물로서 사용하였다. 건강한 인간 소변은 음성 대조군으로서 사용하였다. 오차 막대는 검출 반응을 위한 n=4 기술적 복제물을 기반으로 1 SD를 의미한다.
도 65A, 65B - 지카 바이러스를 갖는 환자 유래의 소변 샘플은 5분 동안 95℃에서 열-불활성화시켰다. 1 마이크로리터의 불활성화된 소변을 20분 RPA 반응과 이후에 가이드 RNA의 존재 또는 부재 하에서 1시간 C2c2/Cas13a 검출 반응을 위한 투입물로서 사용하였다. 데이타 ((도 65A) 막대 그래프 및 (도 65B) 산점도)는 2종의 상이한 그래프에 도시되어 있으며, 가이드를 함유하는 검출 반응으로부터 가이드 무함유 검출 반응의 평균 형광도 값을 차감하여 정규화된다. 건강한 인간 소변은 음성 대조군으로서 사용되었다. 오차 막대는 검출 반응에 대한 n=4 기술적 복제물을 기반으로 1 SD를 의미한다.
도 66 - 일례의 구현예에 따라서, 4종의 상이한 가이드 RNA 디자인에 의한 2종의 말라리아 특이적 표적의 검출을 도시한다 (SEQ ID NO. 463-474).
도 67 - 상이한 Cas13b 오솔로그의 편집 선호도를 도시하는 그래프를 제공한다. 핵심은 표 3을 참조한다.
도 68 - 상이한 편집 선호도의 상이한 Cas13b 오솔로그를 사용한 다중화 어세이의 개략도 (좌), 및 Cas13b10 및 Cas13b5를 사용한 이러한 어세이의 실행가능성을 입증하는 데이타 (우)를 제공한다.
도 69 - Cas13b5 (프레보텔라 sp. MA2106) 및 Cas13b9 (프레보텔라 인터메디아) 오솔로그에 의한 이중 다중화화를 도시한 그래프를 제공한다. 이펙터 단백질 및 가이드 서열 둘 모두가 동일한 반응에 함유되어 상이한 형광 판독 (폴리 U 530nm 및 폴리 A 485nm)을 사용하는 동일 반응에서 이중 다중화를 가능하게 하였다.
도 70 - 도 69와 동일하지만 이 예에서는 Cas13a (렙토트리키아 웨이데이 LwaCas13a) 오솔로그 및 Cas13b 오솔로그 (프레보텔라 sp. MA2016, Cas13b5)를 사용하는 것을 제공한다.
도 71 - 일정한 일례의 구현예에 따라, 표적화의 강건성을 결정하기 위해 다수 가이드 서열로 표적 서열을 타일링하기 위한 방법을 제공한다 (SEQ ID NO. 475 및 476).
도 72 - Cas13 이펙터 단백질이 하이브리드화 연쇄 반응을 활성화시키도록, 본 명세서에 기술된 바와 같은 예를 들어 차폐성 구성체에 도입되는 개시제로서, 개시제를 해제시키는데 사용될 수 있다는 것을 보여주는 하이브리드 연쇄 반응 (HCR) 겔을 제공한다.
도 73 - 다중화 용해물에서 슈도모나스 애루지노사를 검출하는 능력을 도시한 데이타를 제공한다.
도 74 - 일정한 일례의 구현예에 따라 일정한 Cas13 오솔로그의 이온 선호도를 보여주는 데이타를 제공한다. 모든 표적 농도는 20 nM 투입량이었고 이온 농도는 (1 mM 및 10 mM)였다.
도 75 - Cas13b12가 절단을 위해 1 mM 징크 술페이트 선호도를 갖는 것을 보여주는 데이타를 제공한다.
도 76 - 완충제 최적화가 폴리 A 리포터 상의 Cas13b5의 노이즈에 대해 신호를 증대시킬 수 있다는 것을 보여주는 데이타를 제공한다. 이전 완충제는 40 mM의 Tris-HCL, 60 mM의 NaCl, 6 mM의 MgCl2, pH 7.3을 포함한다. 신규 완충제는 20 mM의 HEPES pH 6.8, 6 mM의 MgCl2 및 60 mM의 NaCl을 포함한다.
도 77 - VI-A/C형 Crispr 시스템 및 VI-B1형 및 B2형 시스템의 개략도를 비롯하여 대표적인 Cas13b 오솔로그의 계통도를 제공한다.
도 78 - 다양한 Cas13b 오솔로그의 상이한 뉴클레오티드 및 LwCas13a에 대한 상대적 절단 활성을 제공한다.
도 79 - 다양한 예의 Cas13 오솔로그의 상대적 감도를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 80 - 일례의 구현예를 사용하여 젭토 몰 (zM) 수준의 검출을 획득하는 능력을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 81 - (A) 상이한 편집 선호도를 갖는 Cas13 오솔로그 및 폴리 N 기반 차폐성 구성체를 사용한 다중화 어세이의 개략도를 제공한다. 결과는 (B, D) 그래프 및 (C) 히트맵 형식으로 도시되어 있다.
도 82 - (A-C) 지카 RNA에 대한 프라이머 최적화 실험의 결과, (D) 지카 RNA 검출, 및 (E, F) 다양한 조건 상에서 슈도모나스의 검출을 도시한 데이타를 제공한다.
도 83 - RNA-가이드된 RNA-표적화 효소의 Cas13b 패밀리의 생화학적 특징규명 및 증가된 감도 및 정량적 SHERLOCK을 예시한다. (A) CRISPR-Cas13 유전자좌 및 crRNA 구조의 개략도. (B) A, C, G, 또는 U 염기의 헥사머 동종중합체로 이루어진 센서 프로브에 의한 15종 Cas13b 오솔로그 표적화 ssRNA 1의 염기 선호도의 히트맵. (C) LwaCas13a 및 PsmCas13b에 대한 절단 모티프 선호도 발굴 스크린 및 바람직한 2-염기 모티프의 개략도. 히트맵에 표시된 값은 모든 감손된 모티프에 걸친 각각의 2-염기의 계측치이다. 모티프는 -log2(표적/무표적) 값이 LwaCas13a 조건 하에서 1.0 이상이거나 또는 PsmCas13b 조건 하에서 0.5 이상이면 감손된 것으로 간주된다. -log2(표적/무표적) 값에서, 표적 및 표적-무함유는 각각 표적 및 표적-무함유 조건에서 모티프의 빈도를 표시한다. (D) U6 또는 A6 센서 프로브에 의한 PsmCas13b 및 LwaCas13a 표적화 ssRNA 1의 오솔로그 염기 선호도. (도 83E) 뎅기 ssRNA 표적을 표적으로 하는 LwaCas13a 및 PsmCas13b에 의한 단일 분자 SHERLOCK 검출. (F) ssRNA 표적 1을 표적화하는 증가된 감도를 위해 대량 반응 부피로 LwaCas13a 및 PsmCas13b에 의한 단일 분자 SHERLOCK 검출. (G) 다양한 RPA 프라이머 농도에서 피. 애루지노사 합성 DNA의 정량. (H) 검출된 형광도로 피. 애루지노사 합성 DNA 농도의 보정.
도 84 - 직교성 Cas13 효소에 의한 샘플-내 다중화 SHERLOCK을 예시한다. (A) 직교성 Cas13 효소를 사용한 샘플-내 다중화화의 개략도. (B) LwaCas13a 및 PsmCas13b 부차적 활성에 의한 20 nM의 지카 및 뎅기 합성 RNA의 샘플-내 다중화 검출. (C) LwaCas13a 및 PsmCas13b에 의한 에스. 아우레우스 써모뉴클레아제 및 피. 애루지노사 아실트랜스퍼라제 합성 표적의 감소 농도에서 샘플-내 다중화 RPA 및 부차적 검출. (D) LwaCas13a 및 CcaCas13b에 의한 rs601338에서 인간 샘플을 사용한 다중화 유전자형 분석. (E) 질환 대립유전자의 검출, REPAIR에 의한 보정, 및 REPAIR 교정의 평가에 대한 테라노스틱 시간표의 개략도. (F) LwaCas13a 및 PsmCas13b에 의한 건강- 및 질환-모의 샘플 유래 APC 대립유전자의 샘플-내 다중화 검출. (G) 표적화된 APC 돌연변이에서 REPAIR 편집 효율의 정량화. (H) LwaCas13a 및 PsmCas13b에 의한 REPAIR 표적화 및 비표적화 샘플 유래 APC 대립유전자의 샘플-내 다중화 검출.
도 85 - 시험관내 부차적 활성을 위해 정제 및 평가된 15종의 Cas13b 오솔로그의 계통도를 제공한다. Cas13b 유전자 (파란색), Csx27/Csx28 유전자 (붉은색/노란색), 및 CRISPR 어레이 (회색)가 도시되어 있다.
도 86 - Cas13 오솔로그의 단백질 정제를 예시한다. (A) 본 연구에서 사용된 Cas13b, LwCas13a 및 LbaCas13a에 대한 크기 배제 크로마토그래피의 크로마토그램. 측정된 UV 흡광도 (mAU)는 용리 부피 (mL)에 대해 표시되어 있다. (B) 정제된 Cas13b 오솔로그의 SDS-PAGE 겔. 14종의 Cas13b 오솔로그를 좌측에서 우측으로 로딩한다. 단백질 래더는 좌측에 표시되어 있다. (C) LbaCas13a 희석물 (우측) 및 BSA 표준물 적정 (좌측)의 최종 SDS-PAGE 겔. BSA의 5개 희석물 및 LbaCas13의 2개가 도시되어 있다.
도 87 - Cas13b 오솔로그 부차적 절단의 염기 선호도를 예시하는 그래프를 도시한다. (A) 동종중합체 아데닌 센서 6개 뉴클레오티드 길이를 사용한 ssRNA 1을 표적화하는 14종의 Cas13b 오솔로그의 절단 활성. (B) 동종중합체 우리딘 센서 6개 뉴클레오티드 길이를 사용한 ssRNA 1을 표적화하는 14종의 Cas13b 오솔로그의 절단 활성. (C) 동종중합체 구아닌 센서 6개 뉴클레오티드 길이를 사용한 ssRNA 1을 표적화하는 14종의 Cas13b 오솔로그의 절단 활성. (D) 동종중합체 시티딘 센서 6개 뉴클레오티드 길이를 사용한 ssRNA 1을 표적화하는 14종의 Cas13b 오솔로그의 절단 활성.
도 88 - Cas13 부차적 절단 후 무작위 모티프-라이브러리의 크기 분석을 도시한다. RNase 활성 이후에 라이브러리 크기의 변화를 보여주는 LwaCas13a-, PsmCas13b-, CcaCas13b-, 및 RNase A-처리된 라이브러리 샘플에 대한 생물분석기 추적. Cas13 오솔로그는 뎅기 ssRNA를 표적으로 하고 부차적 절단에 기인하여 무작위 모티프-라이브러리를 절단한다. 마커 표준물은 제1 레인에 표시되어 있다.
도 89 - RNase에 의한 절단 이후 다양한 모티프의 대표자를 도시한다. (A) 5분 및 60분 시점에 LwaCas13a, PsmCas13b, CcaCas13b, 및 RNase A에 대한 표적 대 표적-무함유 비율의 모티프 분포를 도시하는 상자 그래프. RNase A 비율은 3종의 Cas13 표적-무함유 조건의 평균과 비교하였다. 비율은 또한 2개 절단 반응 복제물의 평균이다. (B) 60분 시점에 LwaCas13a, PsmCas13b, CcaCas13b, 및 RNase A에 대한 농축된 모티프의 수. 농축 모티프는 1 (LwaCas13a, CcaCas13b, 및 RNase A) 또는 0.5 (PsmCas13b)의 -log2(표적/무표적) 한계치 이상인 모티프로서 계산되었다. 1의 한계치는 적어도 50% 감손에 상응하는 산편 0.5의 한계치는 적어도 30% 감손에 해당된다. (C) LwaCas13a, PsmCas13b, 및 CcaCas13b에 대한 농축 모티프로부터 생성된 서열 로고스. LwaCas13a 및 CcaCas13b는 예상한 바와 같이 강력한 U 선호도를 보인데 반해서, PsmCas13b는 동종중합체 부차적 활성 선호도와 일관되게, 모티프에 걸쳐 A 염기에 대한 고유한 선호도를 보인다. (D) LwaCas13a, PsmCas13b, 및 CcaCas13b의 직교성 모티프 선호도를 보여주는 히트맵. 히트맵에 표시된 값은 각각의 도시된 모티프의 -log2(표적/무표적) 값이다. -log2(표적/무표적) 값에서, 표적 및 표적-무함유는 각각 표적 및 표적-무함유 조건에서 모티프의 빈도를 표시한다.
도 90 - 무작위 모티프 라이브러리 스크린에 의해 결정된 RNase의 단일-염기 및 2개-염기 선호도를 도시한다. (A) 무작위 모티프 라이브러리 절단 스크린에 의해 결정된 60분 시점에서 LwaCas13a, PsmCas13b, CcaCas13b, 및 RNase A에 대한 단일 염기 선호도를 도시한 히트맵. 히트맵에 표시된 값은 모든 감소된 모티프에 걸쳐 각 염기의 계측치이다. 모티프는 -log2(표적/무표적) 값이 LwaCas13a, CcaCas13b, 및 RNase A 조건의 경우 1.0 이상이거나 또는 PsmCas13b 조건에서 0.5 이상이면 감손으로 간주된다. -log2(표적/무표적) 값에서, 표적 및 표적-무함유는 각각 표적 및 표적-무함유 조건에서 모티프의 빈도를 의미한다. (B) 무작위 모티프 라이브러리 절단 스크린에 의해 결정된 CcaCas13b에 대한 2개-염기 선호도를 도시한 히트맵. 히트맵에 표시된 값은 모든 감소된 모티프에 걸쳐 각각 2-개-염기의 계측치이다. 모티프는 -log2(표적/무표적) 값이 LwaCas13a, CcaCas13b, 및 RNase A 조건에서 1.0 이상이거나 또는 PsmCas13b 조건에서 0.5 이상이면 감손으로 간주된다. -log2(표적/무표적) 값에서, 표적 및 표적-무함유는 각각 표적 및 표적-무함유 조건에서 모티프의 빈도를 표시한다. (C) 무작의 모티프 라이브러리 절단 스크린에 의해 결정된 RNase A에 대한 2개-염기 선호도를 도시하는 히트맵. 히트맵에 표시된 값은 모든 감소된 모티프에 걸쳐 각각의 2개-염기의 계측치이다. 모티프는 -log2(표적/무표적) 값이 LwaCas13a, CcaCas13b, 및 RNase A 조건에서 1.0 이상이거나 또는 PsmCas13b 조건에서 0.5 이상이면 감손으로 간주된다. log2(표적/무표적) 값에서, 표적 및 표적-무함유는 각각 표적 및 표적-무함유 조건에서 모티프의 빈도를 표시한다.
도 91 - 무작위 모티프 라이브러리 스크린에 의해 결정된 RNase의 3개-염기 선호도를 예시한다. 히트맵은 무작위 모티프 라이브러리 절단 스크린에 의해 결정된 60분 시점에 LwaCas13a, PsmCas13b, CcaCas13b, 및 RNase A에 대한 3개-염기 선호도를 표시한다. 히트맵에 표시된 값은 모든 감소된 모티프에 걸쳐 각각의 3개-염기의 계측치이다. 모티프는 -log2(표적/무표적) 값이 LwaCas13a, CcaCas13b, 및 RNase A 조건에서 1.0 이상이거나 또는 PsmCas13b 조건에서 0.5 이상이면 감손으로 간주된다. -log2(표적/무표적) 값에서, 표적 및 표적-무함유는 각각 표적 및 표적-무함유 조건에서 모티프의 빈도를 표시한다.
도 92 - 무작위 모티프 라이브러리 스크린에 의해 결정된 RNase의 4개-염기 선호도를 예시한다. 히트맵은 무작위 모티프 라이브러리 절단 스크린에 의해 결정된 60분 시점에 (A) CcaCas13b, (B) LwaCas13a, (C) PsmCas13b, 및 (D) RNase A에 대한 4개-염기 선호도를 도시한다. 히트맵에 표시된 값은 모든 감소된 모티프에 걸친 각각의 4개-염기의 계측치이다. 모티프는 -log2(표적/무표적) 값이 LwaCas13a, CcaCas13b, 및 RNase A 조건에서 1.0 이상이거나 또는 PsmCas13b 조건에서 0.5 이상이면 감손으로 간주된다. -log2(표적/무표적) 값에서, 표적 및 표적-무함유는 각각 표적 및 표적-무함유 조건에서 모티프의 빈도를 표시한다.
도 93 - 폴리-X 기질의 시험관 내 절단에 의한 Cas13 오솔로그의 염기 절단 선호도를 시험한 결과를 도시한다. (A) crRNA 존재 및 부재로 인큐베이션된 LwaCas13a에 의한 폴리-U, C, G, 및 A 표적의 시험관내 절단. (B) crRNA의 존재 및 부재로 인큐베이션된 CcaCas13b에 의한 폴리-U, C, G, 및 A 표적의 시험관 내 절단. (C) crRNA의 존재 및 부재로 인큐베이션된 PsmCas13b에 의한 폴리-U, C, G, 및 A 표적의 시험관 내 절단.
도 94 - PsmCas13b 절단 활성의 완충제 최적화 결과를 도시한다. (A) 다양한 완충제가 표적화 ssRNA 1을 표적화한 후 PsmCas13b에 대한 부차적 활성에 대한 그들 효과에 대해 시험된다. (B) 최적화된 완충제는 상이한 PsmCas13b-crRNA 복합체 농도에서 본래 완충제와 비교된다.
도 95 - 부차적 절단을 위한 Cas13 오솔로그의 이온 선호도를 예시한다. (A) 2가 양이온 Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni, 및 Zn에 대해 형광성 폴리 U 센서를 사용한 PsmCas13b의 절단 활성. PsmCas13b는 합성 뎅기 ssRNA를 표적화하는 crRNA와 인큐베이션된다. (B) 2가 양이온 Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni, 및 Zn에 대해 형광성 폴리 A 센서를 사용한 PsmCas13b의 절단 활성. PsmCas13b는 합성 뎅기 ssRNA를 표적화하는 crRNA와 인큐베이션된다. (C) 2가 양이온 Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni, 및 Zn에 대해 형광성 폴리 U 센서를 사용한 Pin2Cas13b의 절단 활성. Pin2Cas13b는 합성 뎅기 ssRNA를 표적화하는 crRNA와 인큐베이션된다. (D) 2가 양이온 Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni, 및 Zn에 대해 형광성 폴리 A 센서를 사용한 Pin2Cas13b의 절단 활성. Pin2Cas13b는 합성 뎅기 ssRNA를 표적화하는 crRNA와 인큐베이션된다. (E) 2가 양이온 Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni, 및 Zn에 대해 형광성 폴리 U 센서를 사용한 CcaCas13b의 절단 활성. CcaCas13b는 합성 뎅기 ssRNA를 표적화하는 crRNA와 인큐베이션된다. (F) 2가 양이온 Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni, 및 Zn에 대해 형광성 폴리 A 센서를 사용한 CcaCas13b의 절단 활성. CcaCas13b는 합성 뎅기 ssRNA를 표적화하는 crRNA와 인큐베이션된다.
도 96 - 아데닌 절단 선호도와 Cas13 오솔로그에 대한 절단 활성의 비교를 도시한다. (A) 상이한 농도에서 합성 지카 표적을 표적화하는 각각의 crRNA와 인큐베이션된 PsmCas13b 및 LbaCas13a의 절단 활성 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; n.s., 유의하지 않음; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p<0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (B) 상이한 농도에서 합성 뎅기 표적을 표적화하는 각각의 crRNA와 인큐베이션된 PsmCas13b 및 LbaCas13a의 절단 활성 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; n.s., 유의하지 않음; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p<0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 97 - LwaCas13a 및 PsmCas13b에 의한 SHERLOCK으로 지카 ssRNA 표적 4의 아토몰라 검출을 예시한다. (A) LwaCas13a 및 폴리 U 센서에 의한 상이한 농도에서 지카 ssRNA의 SHERLOCK 검출. (B) PsmCas13b 및 폴리 A 센서에 의한 상이한 농도에서 지카 ssRNA의 SHERLOCK 검출.
도 98 - CcaCas13b의 상이한 농도에서 SHERLOCK에 의한 뎅기 ssRNA의 아토몰라 검출을 예시한다.
도 99 - ssRNA 1를 타일링하는 crRNA에 의한 Cas13 오솔로그 재프로그램가능성 시험. (A) ssRNA1에 걸쳐 타일링된 crRNA를 사용한 LwaCas13a 및 CcaCas13b의 절단 활성. (B) ssRNA1에 걸쳐 타일링된 crRNA를 사용한 PsmCas13b의 절단 활성.
도 100 - Cas13 오솔로그 절단에 대한 crRNA 스페이서 길이의 효과를 도시한다. (A) 다양한 스페이서 길이의 ssRNA1-표적화 crRNA에 대한 PsmCas13b의 절단 활성. (B) 다양한 스페이서 길이의 ssRNA1-표적화 crRNA에 의한 CcaCas13b의 절단 활성.
도 101 - 정량적 SHERLOCK을 위한 최적화된 프라이머 농도를 예시한다. (A) 상이한 농도의 지카 RNA 표적 및 상보성 crRNA를 480 nM의 RPA 프라이머 농도에서 인큐베이션시킨 LwaCas13a의 SHERLOCK 동역학 그래프. (B) 상이한 농도의 지카 RNA 표적 및 상보성 crRNA를 240 nM의 RPA 프라이머 농도에서 인큐베이션시킨 LwaCas13a의 SHERLOCK 동역학 그래프. (C) 상이한 농도의 지카 RNA 표적 및 상보성 crRNA를 120 nM의 RPA 프라이머 농도에서 인큐베이션시킨 LwaCas13a의 SHERLOCK 동역학 그래프. (D) 상이한 농도의 지카 RNA 표적 및 상보성 crRNA를 24 nM의 RPA 프라이머 농도에서 인큐베이션시킨 LwaCas13a의 SHERLOCK 동역학 그래프. (E) 4가지 상이한 RPA 프라이머 농도: 480 nM, 240 nM, 120 nM, 60 nM 및 24 nM로 상이한 농도의 지카 RNA의 SHERLOCK 검출. (F) 상이한 RPA 프라이머 농도에서 지카 표적 RNA 농도 및 SHERLOCK의 배경치 차감된 형광도 간 평균 R2 상관도. (G) 10-배 연속 희석물 (검은색 점) 및 2-배 연속 희석물 (붉은색 점) 중 상이한 농도의 지카 RNA 표적의 정량적 SHERLOCK 검출. 120 nM의 RPA 프라이머 농도가 사용되었다.
도 102 - 지카 및 뎅기 표적의 다중화 검출을 예시한다. (A) 지카 ssRNA 표적을 표적화하는 LwaCas13a 및 뎅기 ssRNA 표적을 표적화하는 PsmCas13b를 사용한 다중화 2-색상 검출. 양 표적은 20 nM로 투입되었다. 도시된 모든 데이타는 반응의 180분 시점을 나타낸다. (B) 지카 ssRNA 표적을 표적화하는 LwaCas13a 및 뎅기 ssRNA 표적을 표적화하는 PsmCas13b를 사용한 다중화 2-색상 검출. 양 표적은 200 pM로 투입된다. (C) CcaCas13a 및 PsmCas13b 부차적 활성에 의한 20 pM의 지카 및 뎅기 합성 RNA의 샘플-내 다중화 검출.
도 103 - 지카 및 뎅기 ssRNA의 샘플-내 다중화 RNA 검출을 예시한다. PsmCas13b 및 CcaCas13b에 의한 (B) 지카 및 (A) 뎅기 합성 표적의 감소 농도에서 샘플-내 다중화 RPA 및 부차적 검출.
도 104 - 돌연변이 및 REPAIR 편집의 비-다중화 테라노스틱 검출을 예시한다. (A) LwaCas13a에 의한 건강- 및 질환-모의된 샘플 유래 APC 대립유전자의 검출. (B) REPAIR 표적화 및 비표적화 샘플 유래 APC 대립유전자에서 편집 보정의 LwaCas13a에 의한 검출.
도 105 - 금 나노입자 응집체에 의한 RNase 활성의 비색 검출을 예시한다. (A) RNase 활성에 대한 금-나노입자 기반 비색 판독의 개략도. RNase 활성의 부재 하에서, RNA 링커는 금 나노입자를 응집시켜서, 붉은 색상의 상실을 초래한다. RNA 링커의 절단은 나노입자를 방출시키고 그 결과 붉은 색상 변화가 야기된다. (B) RNase A의 다양한 유닛에서 RNase 분해의 120분 이후에 비색 리포터의 이미지. (C) RNase A의 다양한 유닛 농도에서 분해에 의한 AuNP 비색 리포터의 520 nM 흡광도에서의 동역학. (D) RNase A의 다양한 유닛 농도에서 120분의 분해 후 AuNP 비색 리포터의 520 nm 흡광도. (E) RNase A의 다양한 유닛 농도에서 분해에 의한 AuNP 비색 리포터의 절반-A520 최대값까지의 시간.
도 106 - 대두 게놈 DNA 유래 CP4-EPSPS 유전자의 정량적 검출을 예시한다. (A) 상이한 검출 시점에서 SHERLOCK 배경치 차감된 형광도 및 CP4-EPSPS 대두 백분율의 평균 상관 R2. 대두 백분율은 라운드-업 레디 (round-up ready) 및 야생형 대두의 혼합물에서 라운드-업 레디 대두의 양을 의미한다. CP4-EPSPS 유전자는 라운드-업 레디 대두에만 존재한다. (B) 30분의 인큐베이션 시에 SHERLOCK 검출의 정량적 성질을 보여주는 상이한 대두 백분율에서의 CP4-EPSPS 내성 유전자의 SHERLOCK 검출. (C) 상이한 대두 백분율에서 렉틴 유전자의 SHERLOCK 검출. 대두 백분율은 라운드-업 레디 및 야생형 대두의 혼합물 중 라운드-업 레디 대두의 양을 의미한다. 렉틴 유전자는 양쪽 유형이 대두에 존재하고 그러므로 라운드-업 레디 대두 백분율과 상관성을 보이지 않는다.
도 107 - 압타머 색상 발생을 예시한다.
도 108 - 압타머 디자인 및 농도 최적화를 예시한다.
도 109 - 비색 검출에 대한 흡광도 데이타를 예시한다.
도 110 - 비색 변화의 안정성을 예시한다.
도 111 - 지카 ssRNA의 형광 검출과 비색 검출의 비교를 예시한다.
도 112 - 닉카제 증폭을 예시한다.
도 2 - (A) 렙토트리키아 웨이데이 유래 CRISPR/C2c2 유전자좌의 개략도를 제공한다. LwC2c2 및 LshC2c2 시스템 유래의 대표적인 crRNA 구조가 도시되어 있다 (SEQ ID NO. 142 및 143). (B) C2c2 활성에 대한 생체내 박테리아 어세이의 개략도. 프로토스페이서는 앰피실린-내성 플라스미드의 베타-락타마제 유전자의 상류에 클로닝되고, 이 구성체는 표적화 또는 비표적화 스페이서와 함께 C2c2를 발현하는 이. 콜라이를 형질전환시킨다. 성공적인 형질전환체는 활성을 정량하기 위해 계측된다. (C) LwC2c2 및 LshC2c2 생체내 활성의 정량 (n=2 생물학적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (D) LwC2c2의 최종 크기 배제 겔 여과. (E) LwC2c2 단계식 정제의 쿠마시 블루 염색된 아크릴아미드 겔. (F) 상이한 PFS 표적에 대한 LwC2c2의 활성. LwC2c2는 스페이서가 측접된 가변성 3' PFS를 갖는 형광성 RNA에 대해 표적화되었고, 반응 생성물은 변성 겔 상에서 가시화되었다. LwC2c2는 G PFS에 대해 약간의 선호도를 보인다.
도 3 - 3시간 동안 5분 간격으로 측정된, (96+48)*2 = 288회 반응으로, crRNA, crRNA 무함유 조건, 기술적 중복물의 2개 풀로, 4종의 상이한 양의 단백질/crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64)과 1 ㎍, 100 ng, 10 ng, 및 1 ng의 표적을 사용한 상이한 희석물에서 일례의 차폐성 구성체의 검출을 도시한다.
도 4 - 3시간 동안 5분 간격으로 측정된, (96+48)*2= 288 반응에서, 2개 풀의 crRNA, crRNA 부재 조건과, 기술적 복제물로, 4종의 상이한 양의 단백질/crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64)과 1 μg, 100 ng, 10 ng, 및 1 ng의 표적을 사용하여 상이한 희석물에서 예로서 차폐성 구성체의 검출을 도시한다.
도 5 - 3시간 동안 5분 간격으로 측정된, (96+48)*2= 288 반응으로, 2개 풀의 crRNA, crRNA 부재 조건과, 기술적 복제물로, 4종의 상이한 양의 단백질/crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64)과 1 μg, 100 ng, 10 ng, 및 1 ng의 표적을 사용하여 상이한 희석물에서 예로서 차폐성 구성체의 검출을 도시한다.
도 6 - 3시간 동안 5분 간격으로 측정된, (96+48)*2= 288 반응으로, 2개의 crRNA, crRNA 부재 조건과, 기술적 복제물로, 4종의 상이한 양의 단백질/crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64)과 1 μg, 100 ng, 10 ng, 및 1 ng의 표적을 사용하여 상이한 희석물에서 예로서 차폐성 구성체의 검출을 도시한다.
도 7 - 일정한 일례의 구현예에 따라서, 차폐성 구성체 및 CRISPR 이펙터 단백질을 사용한 일례의 검출 계획의 계략도를 제공한다.
도 8 - 상이한 풀의 가이드 RNA를 사용해 표적을 검출할 때 시간 경과에 따른 형광도의 변화를 도시하는 그래프의 세트를 제공한다.
도 9 - CRISPR 이펙터 단백질의 다양한 농도에서 표적 RNA의 상이한 희석에 걸쳐 검출된 정규화된 형광도를 도시하는 그래프를 제공한다.
도 10 - NASBA 증폭 반응의 일반 단계를 도시하는 개략도이다.
도 11 - 3종의 상이한 프라이머 세트를 사용하여 NASBA에서 증폭시키고 나서 소광된 형광성 프로브를 사용한 C2c2 부차적 검출이 수행된 핵산 표적 ssRNA 1의 검출을 도시하는 그래프를 제공한다. (n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄)
도 12 - 부차적 효과가 렌티바이러스 표적 RNA의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다는 것을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 13 - 부차적 효과 및 NASBA가 aM 농도에서 종을 검출할 수 있다는 것을 입증하는 그래프를 제공한다.
도 14 - 부차적 효과 및 NASBA가 저농도 샘플을 신속하게 구별한다는 것을 입증하는 그래프를 제공한다.
도 15 - 특정한 시점에서 정규화된 형광도가 샘플 투입 농도를 예측한다는 것을 도시한다. 증폭없이 Cas13a 검출에 의한 형광도 측정은 투입 RNA 농도와 상관성이 있다. (n=2 생물학적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 16 - 반응에 참여하는 성분을 보여주는 RPA 반응의 개략도를 제공한다.
도 17 - SHERLOCK의 개략도로서, RPA 또는 그에 따라 RT-RPA 단계의 도입을 통해서 DNA 또는 RNA 표적 둘 모두의 검출을 보여주는 개략도를 제공한다. 표적 RNA의 인식 시, 부차적 효과는 C2c2가 절단성 리포터를 절단하게 하여, 형광이 발생된다. RNA 또는 DNA의 단일-분자의 양은 리콤비나제 중합효소 증폭 (RPA)을 통해서 DNA로 증폭될 수 있고 전사되어 RNA를 생성시키고, 그 이후에 C2c2에 의해 검출된다.
도 18 - C2c2 부차적 검출을 통해 검출된 ssRNA 표적의 개략도를 제공한다 (SEQ ID NO. 144 및 145).
도 19 - RPA를 사용한 단일분자 DNA 검출을 입증하는 그래프 세트를 제공한다 (즉, C2c2 첨가의 15분 이내).
도 20 - RPA 반응물에 T7 중합효소의 혼합이 DNA 검출에 부정적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다.
도 21 - RPA 반응물에 중합효소의 혼합이 DNA 검출에 부정적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다.
도 22 - RPA, T7 전사, 및 C2c2 검출 반응은 동시에 인큐베이션했을 때 단일 분자 검출을 달성하고 호환적이라는 것을 입증하는 그래프를 제공한다 (n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 23 - 신속한 RPA-RNA 인큐베이션 시간의 효율을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다.
도 24 - T7 중합효소의 양 증가는 RPA-RNA에 대한 감도를 증대시킨다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다.
도 25 - 1.5x 효소에 의한 원-포트 반응을 사용한 RPA-DNA 검출 어세이의 결과를 도시한 그래프의 세트를 제공한다. 단일 분자 (2aM) 검출이 30분 정도로 조기에 획득되었다.
도 26 - RPA-DNA 원-포트 반응이 투입 농도에 비해 형광도의 정량적 감소를 입증한다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다. 적합화된 그래프는 표적 투입 농도 및 출력 형광도 간 상관성을 밝혀준다.
도 27 - (A) 증폭없이 RNA의 C2c2 검출은 50 fM에 이르는 농도에서 ssRNA 표적을 검출할 수 있고 (n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄), (B) RPA-C2c2 반응이 단일-분자 DNA 검출을 할 수 있다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄)는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다.
도 28 - 일정한 일례의 구현예에 따라서 발생된 C2c2 신호가 종이 기재 상에서 20 pM 표적을 검출할 수 있다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다.
도 29 - 특이적 RNAse 억제제가 종이 상에서 배경 신호를 제거할 수 있다는 것을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 30 - 유리 섬유 기재 상에서 일정한 일례의 구현예에 따른 시스템을 사용한 검출을 보여주는 그래프의 세트이다.
도 31 - (A) 일정한 일례의 구현예에 따른 지카 RNA 검출의 계략도를 제공하는 그래프 세트를 제공한다. 렌티바이러스는 C2c2 부차적 검출에 의해 표적화된 지카 RNA 또는 상동성 뎅기 RNA 단편으로 패키징되었다. 배지는 48시간 후에 회수하여 열 용해, RT-RPA, 및 C2c2 검출을 수행한다. (B) RT-RAP-C2c2 검출은 지카 렌티바이러스 입자의 고도로 민감한 검출을 할 수 있다 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; *****, p<0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (C) 일정한 일례의 구현예에 따른, 종이 상의 동결-건조된 C2c2를 사용한 지카 RNA 검출의 개략도. (D) 종이-기반 어세이는 지카 렌티바이러스 입자의 고도로 민감한 검출을 할 수 있다 (n-4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; ****, p<0.0001; **, p<0.01, 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 32 - (A) 인간 혈청으로부터 단리된 지카 RNA의 C2c2 검출에 대한 개략도를 입증하는 그래프의 세트를 제공한다. 혈청 중 지카 RNA에 대해 역전사, RNA의 RNase H 분해, cDNA의 RPA, 및 C2c2 검출이 수행된다. (B) C2c2는 인간 지카 혈청 샘플의 고도로 민감한 검출을 할 수 있다. 표시된 지카 RNA의 농도는 qPCR로 검증하였다 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 33 - (A) 동결-건조된 C2c2가 낮은 펨토몰라 범위에서 ssRNA 1의 민감한 검출을 할 수 있다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다. C2c2는 액상 형태 (B) 또는 동결 건조 (C)로 종이 상에서 200 pM ssRNA 1 표적의 신속한 검출을 할 수 있다. 반응은 용액 중 (D) (n=3) 및 동결-건조 형태 (E) (n=3)로 합성된 지카 RNA 단편의 민감한 검출을 할 수 있다. (F) 투입 농도 및 검출된 형광도 간 유의한 상관성을 보여주는 인간 지카 cDNA 검출에 대한 정량적 그래프. (G) ssRNA1 1의 C2c2 검출은 다양한 양의 인간 혈청 존재 하에서 수행되었다 (달리 표시하지 않으면 n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 34 - (A) 범용 V3 RPA 프라이머 세트를 사용한 박테리아 게놈 유래의 16S rRNA 유전자의 C2c2 검출의 개략도, 및 일정한 일례의 구현예에 따라 수행된 어세이를 사용한 (B) 이. 콜라이 또는 (C) 피. 애루지노사 gDNA의 민감하고 특이적인 검출을 획득하는 능력을 제공한다 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). Ec, 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli); Kp, 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae); Pa, 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa); Mt, 마이코박테리움 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis); Sa, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus).
도 35 - (A) 클렙시엘라 뉴모니아의 4종의 상이한 임상 단리주 유래의 2종의 상이한 카르바페넴-내성 유전자 (KPC 및 NDM-1)의 검출, 및 (B) 카르바페넴-내성 유전자의 검출 (파트 A)이 KPC 및 NDM-1 crRNA 어세이 간 신호의 비율로서 정규화된다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다 (n=2 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 36 - (A) C2c2가 단일 미스매치에 민감하지 않지만, 추가의 미스매치를 갖는 crRNA와 로딩될 때 표적 내 단일 뉴클레오티드 편차를 구별할 수 있다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다. ssRNA 표적 1-3은 crRNA 내 다양한 위치에 합성 미스매치를 함유하는 10종의 스페이서를 갖는 11종의 crRNA로 검출되었다. 미스매치된 스페이서는 표적 1의 감소된 절단을 보이지 않았지만, 미스매치 표적 2 및 3의 억제된 절단을 보였다 (SEQ ID NO. 146 내지 159). (B) 합성 미스매치를 갖는 단일-염기 특이적 스페이서의 합리적 디자인을 위한 과정을 도시한 개략도. 합성 미스매치는 SNP 또는 관심 염기에 근접하여 위치된다 (SEQ ID NO. 160 내지 164). (C) 균주 SNP의 고도로 특이한 검출은 절두된 (23개 뉴클레오티드) crRNA에 의한 C2c2 검출을 사용하여 오직 하나의 뉴클레오티드가 상이한 아메리카 RNA 표적에 대해 지카 아프리카의 구별을 가능하게 한다 (n=2 기술적 복제물, 단측 스튜던트 t-검정; *, p < 0.05; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 37 - (A) 검출에 사용된 지카 균주 표적 영역 및 crRNA 서열의 개략도 (SEQ ID NO. 165 내지 170)를 입증하는 그래프의 세트를 제공한다. 표적 내 SNP는 붉은색 또는 파란색으로 강조되고 가이드 서열 내 합성 미스매치는 붉은색으로 표시된다. (B) 균주 SNP의 고도로 특이적인 검출은 SHERLOCK을 사용하여 아메리카 RNA 표적에 대해 지카 아프리카 표적의 구별을 가능하게 한다 (n=2 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄) (SEQ ID NO. 171 내지 176). (C) 검출에 사용된 뎅기 균주 표적 영역 및 crRNA 서열의 개략도. 표적의 SNP는 붉은색 또는 파란색으로 강조되어 있고 가이드 서열의 합성 미스매치는 붉은색으로 표시된다. (D) 균주 SNP의 고도로 특이적인 검출은 SHERLOCK를 사용하여 균주 3 RNA 표적 대비 뎅기 균주 1의 구별을 가능하게 한다 (n=2 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 38 - (A) C2c2로 검출된 인간 SNP의 위치를 도시한 서코스 그래프를 도시한 그래프의 세트를 제공한다. (B) 일정한 일례의 구현예에 따라서 수행된 어세이는 인간 SNP들을 구별할 수 있다. SHERLOCK은 인간 게놈의 4종의 상이한 SNP 부위에서 4종의 상이한 개체를 정확하게 유전자형분석할 수 있다. 각 개체에 대한 유전자형 및 대립유전자-감지 crRNA의 정체는 각 그래프의 아래에 주석을 달았다 (n=4 기술적 복제물; 양측 스튜던트 t-검정; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (C) 일정한 일례의 구현예에 따른 cfDNA의 검출을 위한 과정의 개략도 (예컨대 암 돌연변이의 세포-무함유 DNA 검출). (D) EGFR L858R 및 BRAF V600E를 검출하기 위한 예로서 crRNA 서열. (SEQ ID NO. 177 내지 182). 세포-무함유 DNA의 암 돌연변이에 대해 어세이된 2종 게놈 유전자좌의 서열. 파란색으로 강조된 SNP를 갖는 표적 게놈 서열 및 붉은색으로 표시된 합성 미스매치를 갖는 돌연변이체/야생형 감지 crRNA 서열이 도시되어 있다.
도 39 - C2c2가 EGFR L858R (A) 또는 BRAF V600E (B) 소수 대립유전자 유래의 모의 세포-무함유 DNA 샘플에서 돌연변이체 소수 대립유전자를 검출할 수 있다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다. (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; *, p<0.05; **, p<0.01, ****, P<0.0001; 막대는 ± s.e.m.를 나타냄)
도 40 - (A) 어세이는 rs5082에서 유전자형을 구별할 수 있다는 것을 입증하는 그래프의 세트를 제공한다 (n=4 기술적 복제물; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (B) 어세이는 원심분리하여, 변성 및 끓인 타액에서 직접 유래된 gDNA의 rs601338에서 유전자형을 구별할 수 있다 (n=3 기술적 복제물; *, p < 0.05; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 41 - (A) 오직 단일 미스매치만이 ssDNA 1과 상이한 표적의 배경에서 ssDNA 1에 대해 수행된 일례의 구현예의 개략도를 제공한다. (B) 어세이는 미스매치된 배경 (ssDNA와 오직 단일 미스매치만 상이한 표적)의 존재 하에서 ssDNA 1의 단일 뉴클레오티드 특이성 검출을 획득한다. 표적 DNA의 다양한 농도를 하나의 미스매치를 갖는 과량의 배경 DNA와 조합하고 어세이로 검출하였다.
도 42 는 상이한 염료 Cy5를 갖는 차폐성 구성체가 또한 효과적인 검출을 가능하게 한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 43 은 금 나노입자 비색 기반 어세이의 개략도이다. AuNP는 DNA 링커 및 RNA 가교의 조합을 사용해 응집된다. RNase 활성의 첨가 시, ssRNA 가교가 절단되고 AuNP가 방출되어, 붉은색 쪽으로의 특징적인 색상 이동이 야기된다.
도 44 는 520 nm에서 분산된 나노입자의 색상 이동을 검출하는 능력을 도시하는 그래프이다. 나노입자는 도 43에 도시된 일례의 구현예를 기반으로 하였고 다양한 농도에서 RNase A의 첨가를 사용해 분산되었다.
도 45 는 RNase 비색 시험이 정량적이라는 것을 도시하는 그래프의 세트이다.
도 46 은 분산된 나노입자에서 색상 이동이 시각적으로 검출가능하다는 것을 도시한 마이크로웰 플레이트의 사진이다.
도 47 은 비색 이동이 종이 기재 상에서 가시적이라는 것을 입증하는 사진이다. 시험은 10분 동안 37℃에서 유리 섬유 934-AH 상에서 수행되었다.
도 48 은 (A) 단백질 또는 소형 분자의 검출을 위한 일정한 일례의 구현예에 따른 입체형태 전환 압타머의 개략도이다. 결찰된 생성물 (B)은 미결찰된 투입 생성물을 검출할 수 없는 RNA-표적화 이펙터에 대한 완벽한 표적으로서 사용된다 (SEQ ID NO. 202 및 424).
도 49 는 압타머-기반 결찰이 RPA-검출가능한 기재를 생성시킬 수 있다는 것을 보여주는 겔의 이미지이다. 압타머는 다양한 수준의 트롬빈과 인큐베이션된 후에 프로브로 결찰되었다. 결찰된 구성체는 3분 RPA 반응을 위한 주형으로서 사용되었다. 500 nM 트롬빈은 배경치보다 유의하게 더 높은 수준의 증폭된 표적을 갖는다.
도 50 은 선택된 C2c2 오솔로그의 HEPN 도메인의 아미노산 서열을 도시한다 (SEQ ID NO. 204-233).
도 51 - RPA 증폭 (SHERLOCK)에 의한 RNA의 Cas13a 검출은 Cas13a 단독보다 훨씬 민감하게, ∼2 aM에 이르는 농도에서 ssRNA를 검출할 수 있다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 52 - Cas13a 검출은 바이러스 및 박테리아 병원체를 감지하는데 사용될 수 있다. (A) 인간 임상 샘플로부터 단리된 ZIKV RNA의 SHERLOCK 검출의 개략도. (B) SHERLOCK은 인간 ZIKV-양성 혈청 (S) 또는 소변 (U) 샘플의 고도로 민감한 검출을 할 수 있다. 도시된 ZIKV RNA의 대략적인 농도는 qPCR에 의해 결정되었다. (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄; n.d., 검출 안됨).
도 53 - SHERLOCK 및 (도 11의) 프라이머 세트 2에 의한 NASBA에 의한 ssRNA 1의 검출의 비교 (n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 54 - RPA 및 단일-반응 SHERLOCK에 의한 핵산 증폭. (A) 도 1C에서 사용된 희석물에 대한 ssRNA 1의 디지털-액적 PCR 정량. ddPCR 결과를 기반으로 희석물에 대해 조정된 농도는 막대 그래프 위에 표시된다. (B) 도 1D에서 사용된 희석물에 대한 ssDNA 1의 디지털-액적 PCR 정량. ddPCR 결과를 기반으로 희석물에 대해 조정된 농도는 막대 그래프 위에 표시된다. (C) RPA, T7 전사, 및 Cas13a 검출 반응은 상용성이고 동시에 인큐베이션 될 때 DNA 1의 단일 분자 검출을 획득한다 (n=3 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; n.s., 유의하지 않음; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 55 - SHERLOCK과 다른 민감한 핵산 검출 도구의 비교. (A) 디지털-액적 PCR에 의한 ssDNA 1 연속 희석물의 검출 분석 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; n.s., 유의하지 않음; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001; 붉은색 선은 평균을 나타내고, 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄. 측정 카피/㎕가 10-1 미만인 샘플은 도시하지 않음). (B) 정량적 PCR에 의한 ssDNA 1 연속 희석물의 검출 분석 (n=16 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; n.s., 유의하지 않음; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001; 붉은색 선은 평균을 나타내고, 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄. 상대적 신호가 10-10 미만인 샘플은 도시하지 않음). (C) SYBR Green II에 의한 RPA로 ssDNA 1 연속 희석물의 검출 분석 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; *, p < 0.05; **, p < 0.01; 붉은색 선은 평균을 나타내고, 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄. 상대적 신호가 100 미만인 샘플은 도시하지 않음). (D) SHERLOCK에 의한 ssDNA 1 연속 희석물의 검출 분석 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001; 붉은색 선은 평균을 나타내고, 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄. 상대적 신호가 100 미만인 샘플은 도시하지 않음). (E) 4개 유형의 검출 방법에서 일련의 ssDNA 1 희석물에 대한 변동 계수 백분율. (F) 4개 유형의 검출 방법에서 6e2, 6e1, 6e0, 및 6e-1의 ssDNA 1 희석물에 대한 변동 계수의 평균 백분율 (막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 56 - 임상적 박테리아 단리주에서 카르바파넴 내성의 검출. 이. 콜라이 대조군 및 클렙시엘라 뉴모니아의 5종의 임상 단리주 유래의 2종의 상이한 카르바페넴-내성 유전자 (KPC 및 NDM-1)의 검출 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; ****, p < 0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄; n.d., 검출 안됨).
도 57 - 표적 서열 내 단일 미스매치 및 절두된 스페이서에 대한 LwCas13a 감도의 특징규명. (A) (B-G)에서 사용된 절두된 스페이서 crRNA의 서열 (SEQ ID NO. 425-436). 또한 붉은색으로 강조된 단일한 염기쌍 편차를 갖는 ssRNA 1 및 2의 서열이 도시되어 있다. 합성 미스매치를 함유하는 crRNA는 붉은색으로 표시된 미스매치 위치를 보여준다. (B) 위치 1-7에 합성 미스매치를 갖는 28 nt 스페이서 crRNA의 경우 ssRNA 1 및 2에 대한 부차적 절단 활성 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (C) (B)에서 시험된 crRNA의 특이성 비율. 특이성 비율은 온-표적 (on-target) RNA (ssRNA 1) 부차적 절단 대 오프-표적 (off-target) RNA (ssRNA 2) 부차적 절단의 비율로서 계산된다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (D) 위치 1-7에 합성 미스매치를 갖는 23 nt 스페이서 crRNA의 경우 ssRNA 1 및 2에 대한 부차적 절단 활성 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (E) (D)에서 시험된 crRNA의 특이성 비율. 특이성 비율은 온-표적 RNA (ssRNA 1) 부차적 절단 대 오프-표적 RNA (ssRNA 2) 부차적 절단의 비율로서 계산된다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (F) 위치 1-7에 합성 미스매치를 갖는 20 nt 스페이서 crRNA의 경우 ssRNA 1 및 2에 대한 부차적 절단 활성 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (G) (F)에서 시험된 crRNA의 특이성 비율. 특이성 비율은 온-표적 RNA (ssRNA 1) 부차적 절단 대 오프-표적 RNA (ssRNA 2) 부차적 절단의 비율로서 계산된다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 58 - 표적 서열 내 돌연변이에 대한 이상적인 합성 미스매치 위치의 동정. (A) ssRNA 1 및 ssRNA 사이의 돌연변이를 검출하기 위한 이상적인 합성 미스매치 위치의 평가를 위한 서열 (SEQ ID NO. 437-462). 각각의 표적 상에서, 색상 (붉은색) 표시된 위치에 합성 미스매치를 갖는 crRNA가 시험된다. 각각의 합성 미스매치 crRNA의 세트는 돌연변이 위치가 스페이서의 서열에 대한 위치로 이동되게 디자인된다. 스페이서는 돌연변이가 스페이서 내 위치 3, 4, 5, 및 6에서 평가되도록 디자인된다. (B) 다양한 위치에 합성 미스매치를 갖는 crRNA의 경우 ssRNA 1 및 2에 대한 부차적 절단 활성. 스페이서:표적 듀플렉스 영역 내 위치 3, 4, 5 또는 6에 돌연변이를 갖는 crRNA의 4개 세트가 존재한다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (C) (B)에서 시험된 crRNA의 특이성 비율. 특이성 비율은 온-표적 RNA (ssRNA 1) 부차적 절단 대 오프-표적 RNA (ssRNA 2) 부차적 절단의 비율로서 계산된다 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 59 - 추가 유전자좌에서 SHERLOCK에 의한 유전자형 분석 및 끓인 타액으로부터 직접 유전자형 분석. SHERLOCK은 원심분리되고, 변성된, 끓인 타액으로부터 직접 유래된 게놈 DNA의 rs601338 SNP 부위에서 유전자형들을 구별할 수 있다 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; **, p < 0.01; ****, p < 0.001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 60 - 정확한 유전자형 인간 SNP에 대한 합성 유전자형 표준물의 개발. (A) PCR-증폭된 유전자형 표준물에 대해 비교된 4 개체 각각에 대한 rs601338 SNP 부위에서의 SHERLOCK에 의한 유전자형 분석 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (B) PCR-증폭된 유전자형 표준물에 대해 비교된 4 개체 각각에 대한 rs4363657 SNP 부위에서의 SHERLOCK에 의한 유전자형 분석 (n=4 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (C) rs601338 SNP 부위에서 각각의 개체 및 합성 표준물에 대한 SHERLOCK 결과 간 산출된 p-값의 히트맵. 히트맵은 각각의 대립유전자-감지 crRNA에 대해 도시된다. 히트맵 색상 맵은 비유의성 (p > 0.05)은 붉은색이고 유의성 (p < 0.05)은 파란색이도록 조정된다 (n=4 기술적 복제물, 일원 ANOVA). (D) rs4363657 SNP 부위에서 각각의 개별 및 합성 표준물에 대한 SHERLOCK 결과 간에 산출된 p-값의 히트맵. 히트맵은 대립유전자-감지 crRNA 각각에 대해 도시되어 있다. 히트맵 색상 맵은 비유의성 (p > 0.05)은 붉은색이고 유의성 (p < 0.05)은 파란색이도록 조정된다 (n=4 기술적 복제물, 일원 ANOVA). (E) SHERLOCK 유전자형 분석의 p-값 히트맵 결과를 이해하기 위한 가이드. 유전자형 분석은 개체 및 대립유전자 합성 표준물 간에 p-값 > 0.05에 상응하는 대립유전자를 선택하여 쉽게 판정될 수 있다. 붉은색 블록은 합성 표준물 및 개체의 SHERLOCK 결과 간 비유의한 편차 및 그에 따라 유전자형-양성 결과에 상응한다. 파란색 블록은 합성 표준물 및 개체의 SHERLOCK 결과 간 유의한 편차 및 그에 따라 유전자형-음성 결과에 상응한다.
도 61 - 미스매치된 배경 표적 중 소분획으로서 ssDNA 1의 검출. 인간 게놈 DNA의 배경 상에서 ssDNA 1의 연속 희석물의 SHERLOCK 검출. 검출하려는 ssDNA 1 표적 및 배경 게놈 DNA 간에 서열 유의성이 없어야 한다는 것을 주의한다 (n=2 기술적 복제물; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 62A, 62B - 지카 바이러스를 갖는 환자 유래의 소변 (도 62A) 또는 혈청 (도 62B) 샘플을 5분 동안 95℃ (소변) 또는 65℃ (혈청)에서 가열 불활성화시켰다. 일례의 구현예에 따라서 1 마이크로리터의 불활성화된 소변 또는 혈청이 2시간 RPA 반응과 이후 3시간 C2c2/Cas13a 검출 반응을 위한 투입물로서 사용되었다. 오차 막대는 검출 반응에 대한 n=4 기술적 복제물을 기반으로 1 SD를 의미한다.
도 63A, 63B - 지카 바이러스를 갖는 환자 유래 소변 샘플은 5분 동안 95℃에서 열-불활성화되었다. 일례의 구현예에 따라서, 1 마이크로리터의 불활성화된 소변을 30분 RPA 반응과 이후 3시간 (도 63A) 또는 1시간 (도 63B) C2c2/Cas13 검출 반응을 위한 투입물로서 사용하였다. 오차 막대는 검출 반응에 대한 n=4 기술적 복제물을 기반으로 1 SD를 의미한다.
도 64 - 지카 바이러스를 갖는 환자 유래 소변 샘플을 5분 동안 95℃에서 열-불활성화시켰다. 1 마이크로리터의 불활성화된 소변을 20분 RPA 반응과 이후에 1시간의 C2c2/Cas13a 검출 반응을 위한 투입물로서 사용하였다. 건강한 인간 소변은 음성 대조군으로서 사용하였다. 오차 막대는 검출 반응을 위한 n=4 기술적 복제물을 기반으로 1 SD를 의미한다.
도 65A, 65B - 지카 바이러스를 갖는 환자 유래의 소변 샘플은 5분 동안 95℃에서 열-불활성화시켰다. 1 마이크로리터의 불활성화된 소변을 20분 RPA 반응과 이후에 가이드 RNA의 존재 또는 부재 하에서 1시간 C2c2/Cas13a 검출 반응을 위한 투입물로서 사용하였다. 데이타 ((도 65A) 막대 그래프 및 (도 65B) 산점도)는 2종의 상이한 그래프에 도시되어 있으며, 가이드를 함유하는 검출 반응으로부터 가이드 무함유 검출 반응의 평균 형광도 값을 차감하여 정규화된다. 건강한 인간 소변은 음성 대조군으로서 사용되었다. 오차 막대는 검출 반응에 대한 n=4 기술적 복제물을 기반으로 1 SD를 의미한다.
도 66 - 일례의 구현예에 따라서, 4종의 상이한 가이드 RNA 디자인에 의한 2종의 말라리아 특이적 표적의 검출을 도시한다 (SEQ ID NO. 463-474).
도 67 - 상이한 Cas13b 오솔로그의 편집 선호도를 도시하는 그래프를 제공한다. 핵심은 표 3을 참조한다.
도 68 - 상이한 편집 선호도의 상이한 Cas13b 오솔로그를 사용한 다중화 어세이의 개략도 (좌), 및 Cas13b10 및 Cas13b5를 사용한 이러한 어세이의 실행가능성을 입증하는 데이타 (우)를 제공한다.
도 69 - Cas13b5 (프레보텔라 sp. MA2106) 및 Cas13b9 (프레보텔라 인터메디아) 오솔로그에 의한 이중 다중화화를 도시한 그래프를 제공한다. 이펙터 단백질 및 가이드 서열 둘 모두가 동일한 반응에 함유되어 상이한 형광 판독 (폴리 U 530nm 및 폴리 A 485nm)을 사용하는 동일 반응에서 이중 다중화를 가능하게 하였다.
도 70 - 도 69와 동일하지만 이 예에서는 Cas13a (렙토트리키아 웨이데이 LwaCas13a) 오솔로그 및 Cas13b 오솔로그 (프레보텔라 sp. MA2016, Cas13b5)를 사용하는 것을 제공한다.
도 71 - 일정한 일례의 구현예에 따라, 표적화의 강건성을 결정하기 위해 다수 가이드 서열로 표적 서열을 타일링하기 위한 방법을 제공한다 (SEQ ID NO. 475 및 476).
도 72 - Cas13 이펙터 단백질이 하이브리드화 연쇄 반응을 활성화시키도록, 본 명세서에 기술된 바와 같은 예를 들어 차폐성 구성체에 도입되는 개시제로서, 개시제를 해제시키는데 사용될 수 있다는 것을 보여주는 하이브리드 연쇄 반응 (HCR) 겔을 제공한다.
도 73 - 다중화 용해물에서 슈도모나스 애루지노사를 검출하는 능력을 도시한 데이타를 제공한다.
도 74 - 일정한 일례의 구현예에 따라 일정한 Cas13 오솔로그의 이온 선호도를 보여주는 데이타를 제공한다. 모든 표적 농도는 20 nM 투입량이었고 이온 농도는 (1 mM 및 10 mM)였다.
도 75 - Cas13b12가 절단을 위해 1 mM 징크 술페이트 선호도를 갖는 것을 보여주는 데이타를 제공한다.
도 76 - 완충제 최적화가 폴리 A 리포터 상의 Cas13b5의 노이즈에 대해 신호를 증대시킬 수 있다는 것을 보여주는 데이타를 제공한다. 이전 완충제는 40 mM의 Tris-HCL, 60 mM의 NaCl, 6 mM의 MgCl2, pH 7.3을 포함한다. 신규 완충제는 20 mM의 HEPES pH 6.8, 6 mM의 MgCl2 및 60 mM의 NaCl을 포함한다.
도 77 - VI-A/C형 Crispr 시스템 및 VI-B1형 및 B2형 시스템의 개략도를 비롯하여 대표적인 Cas13b 오솔로그의 계통도를 제공한다.
도 78 - 다양한 Cas13b 오솔로그의 상이한 뉴클레오티드 및 LwCas13a에 대한 상대적 절단 활성을 제공한다.
도 79 - 다양한 예의 Cas13 오솔로그의 상대적 감도를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 80 - 일례의 구현예를 사용하여 젭토 몰 (zM) 수준의 검출을 획득하는 능력을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 81 - (A) 상이한 편집 선호도를 갖는 Cas13 오솔로그 및 폴리 N 기반 차폐성 구성체를 사용한 다중화 어세이의 개략도를 제공한다. 결과는 (B, D) 그래프 및 (C) 히트맵 형식으로 도시되어 있다.
도 82 - (A-C) 지카 RNA에 대한 프라이머 최적화 실험의 결과, (D) 지카 RNA 검출, 및 (E, F) 다양한 조건 상에서 슈도모나스의 검출을 도시한 데이타를 제공한다.
도 83 - RNA-가이드된 RNA-표적화 효소의 Cas13b 패밀리의 생화학적 특징규명 및 증가된 감도 및 정량적 SHERLOCK을 예시한다. (A) CRISPR-Cas13 유전자좌 및 crRNA 구조의 개략도. (B) A, C, G, 또는 U 염기의 헥사머 동종중합체로 이루어진 센서 프로브에 의한 15종 Cas13b 오솔로그 표적화 ssRNA 1의 염기 선호도의 히트맵. (C) LwaCas13a 및 PsmCas13b에 대한 절단 모티프 선호도 발굴 스크린 및 바람직한 2-염기 모티프의 개략도. 히트맵에 표시된 값은 모든 감손된 모티프에 걸친 각각의 2-염기의 계측치이다. 모티프는 -log2(표적/무표적) 값이 LwaCas13a 조건 하에서 1.0 이상이거나 또는 PsmCas13b 조건 하에서 0.5 이상이면 감손된 것으로 간주된다. -log2(표적/무표적) 값에서, 표적 및 표적-무함유는 각각 표적 및 표적-무함유 조건에서 모티프의 빈도를 표시한다. (D) U6 또는 A6 센서 프로브에 의한 PsmCas13b 및 LwaCas13a 표적화 ssRNA 1의 오솔로그 염기 선호도. (도 83E) 뎅기 ssRNA 표적을 표적으로 하는 LwaCas13a 및 PsmCas13b에 의한 단일 분자 SHERLOCK 검출. (F) ssRNA 표적 1을 표적화하는 증가된 감도를 위해 대량 반응 부피로 LwaCas13a 및 PsmCas13b에 의한 단일 분자 SHERLOCK 검출. (G) 다양한 RPA 프라이머 농도에서 피. 애루지노사 합성 DNA의 정량. (H) 검출된 형광도로 피. 애루지노사 합성 DNA 농도의 보정.
도 84 - 직교성 Cas13 효소에 의한 샘플-내 다중화 SHERLOCK을 예시한다. (A) 직교성 Cas13 효소를 사용한 샘플-내 다중화화의 개략도. (B) LwaCas13a 및 PsmCas13b 부차적 활성에 의한 20 nM의 지카 및 뎅기 합성 RNA의 샘플-내 다중화 검출. (C) LwaCas13a 및 PsmCas13b에 의한 에스. 아우레우스 써모뉴클레아제 및 피. 애루지노사 아실트랜스퍼라제 합성 표적의 감소 농도에서 샘플-내 다중화 RPA 및 부차적 검출. (D) LwaCas13a 및 CcaCas13b에 의한 rs601338에서 인간 샘플을 사용한 다중화 유전자형 분석. (E) 질환 대립유전자의 검출, REPAIR에 의한 보정, 및 REPAIR 교정의 평가에 대한 테라노스틱 시간표의 개략도. (F) LwaCas13a 및 PsmCas13b에 의한 건강- 및 질환-모의 샘플 유래 APC 대립유전자의 샘플-내 다중화 검출. (G) 표적화된 APC 돌연변이에서 REPAIR 편집 효율의 정량화. (H) LwaCas13a 및 PsmCas13b에 의한 REPAIR 표적화 및 비표적화 샘플 유래 APC 대립유전자의 샘플-내 다중화 검출.
도 85 - 시험관내 부차적 활성을 위해 정제 및 평가된 15종의 Cas13b 오솔로그의 계통도를 제공한다. Cas13b 유전자 (파란색), Csx27/Csx28 유전자 (붉은색/노란색), 및 CRISPR 어레이 (회색)가 도시되어 있다.
도 86 - Cas13 오솔로그의 단백질 정제를 예시한다. (A) 본 연구에서 사용된 Cas13b, LwCas13a 및 LbaCas13a에 대한 크기 배제 크로마토그래피의 크로마토그램. 측정된 UV 흡광도 (mAU)는 용리 부피 (mL)에 대해 표시되어 있다. (B) 정제된 Cas13b 오솔로그의 SDS-PAGE 겔. 14종의 Cas13b 오솔로그를 좌측에서 우측으로 로딩한다. 단백질 래더는 좌측에 표시되어 있다. (C) LbaCas13a 희석물 (우측) 및 BSA 표준물 적정 (좌측)의 최종 SDS-PAGE 겔. BSA의 5개 희석물 및 LbaCas13의 2개가 도시되어 있다.
도 87 - Cas13b 오솔로그 부차적 절단의 염기 선호도를 예시하는 그래프를 도시한다. (A) 동종중합체 아데닌 센서 6개 뉴클레오티드 길이를 사용한 ssRNA 1을 표적화하는 14종의 Cas13b 오솔로그의 절단 활성. (B) 동종중합체 우리딘 센서 6개 뉴클레오티드 길이를 사용한 ssRNA 1을 표적화하는 14종의 Cas13b 오솔로그의 절단 활성. (C) 동종중합체 구아닌 센서 6개 뉴클레오티드 길이를 사용한 ssRNA 1을 표적화하는 14종의 Cas13b 오솔로그의 절단 활성. (D) 동종중합체 시티딘 센서 6개 뉴클레오티드 길이를 사용한 ssRNA 1을 표적화하는 14종의 Cas13b 오솔로그의 절단 활성.
도 88 - Cas13 부차적 절단 후 무작위 모티프-라이브러리의 크기 분석을 도시한다. RNase 활성 이후에 라이브러리 크기의 변화를 보여주는 LwaCas13a-, PsmCas13b-, CcaCas13b-, 및 RNase A-처리된 라이브러리 샘플에 대한 생물분석기 추적. Cas13 오솔로그는 뎅기 ssRNA를 표적으로 하고 부차적 절단에 기인하여 무작위 모티프-라이브러리를 절단한다. 마커 표준물은 제1 레인에 표시되어 있다.
도 89 - RNase에 의한 절단 이후 다양한 모티프의 대표자를 도시한다. (A) 5분 및 60분 시점에 LwaCas13a, PsmCas13b, CcaCas13b, 및 RNase A에 대한 표적 대 표적-무함유 비율의 모티프 분포를 도시하는 상자 그래프. RNase A 비율은 3종의 Cas13 표적-무함유 조건의 평균과 비교하였다. 비율은 또한 2개 절단 반응 복제물의 평균이다. (B) 60분 시점에 LwaCas13a, PsmCas13b, CcaCas13b, 및 RNase A에 대한 농축된 모티프의 수. 농축 모티프는 1 (LwaCas13a, CcaCas13b, 및 RNase A) 또는 0.5 (PsmCas13b)의 -log2(표적/무표적) 한계치 이상인 모티프로서 계산되었다. 1의 한계치는 적어도 50% 감손에 상응하는 산편 0.5의 한계치는 적어도 30% 감손에 해당된다. (C) LwaCas13a, PsmCas13b, 및 CcaCas13b에 대한 농축 모티프로부터 생성된 서열 로고스. LwaCas13a 및 CcaCas13b는 예상한 바와 같이 강력한 U 선호도를 보인데 반해서, PsmCas13b는 동종중합체 부차적 활성 선호도와 일관되게, 모티프에 걸쳐 A 염기에 대한 고유한 선호도를 보인다. (D) LwaCas13a, PsmCas13b, 및 CcaCas13b의 직교성 모티프 선호도를 보여주는 히트맵. 히트맵에 표시된 값은 각각의 도시된 모티프의 -log2(표적/무표적) 값이다. -log2(표적/무표적) 값에서, 표적 및 표적-무함유는 각각 표적 및 표적-무함유 조건에서 모티프의 빈도를 표시한다.
도 90 - 무작위 모티프 라이브러리 스크린에 의해 결정된 RNase의 단일-염기 및 2개-염기 선호도를 도시한다. (A) 무작위 모티프 라이브러리 절단 스크린에 의해 결정된 60분 시점에서 LwaCas13a, PsmCas13b, CcaCas13b, 및 RNase A에 대한 단일 염기 선호도를 도시한 히트맵. 히트맵에 표시된 값은 모든 감소된 모티프에 걸쳐 각 염기의 계측치이다. 모티프는 -log2(표적/무표적) 값이 LwaCas13a, CcaCas13b, 및 RNase A 조건의 경우 1.0 이상이거나 또는 PsmCas13b 조건에서 0.5 이상이면 감손으로 간주된다. -log2(표적/무표적) 값에서, 표적 및 표적-무함유는 각각 표적 및 표적-무함유 조건에서 모티프의 빈도를 의미한다. (B) 무작위 모티프 라이브러리 절단 스크린에 의해 결정된 CcaCas13b에 대한 2개-염기 선호도를 도시한 히트맵. 히트맵에 표시된 값은 모든 감소된 모티프에 걸쳐 각각 2-개-염기의 계측치이다. 모티프는 -log2(표적/무표적) 값이 LwaCas13a, CcaCas13b, 및 RNase A 조건에서 1.0 이상이거나 또는 PsmCas13b 조건에서 0.5 이상이면 감손으로 간주된다. -log2(표적/무표적) 값에서, 표적 및 표적-무함유는 각각 표적 및 표적-무함유 조건에서 모티프의 빈도를 표시한다. (C) 무작의 모티프 라이브러리 절단 스크린에 의해 결정된 RNase A에 대한 2개-염기 선호도를 도시하는 히트맵. 히트맵에 표시된 값은 모든 감소된 모티프에 걸쳐 각각의 2개-염기의 계측치이다. 모티프는 -log2(표적/무표적) 값이 LwaCas13a, CcaCas13b, 및 RNase A 조건에서 1.0 이상이거나 또는 PsmCas13b 조건에서 0.5 이상이면 감손으로 간주된다. log2(표적/무표적) 값에서, 표적 및 표적-무함유는 각각 표적 및 표적-무함유 조건에서 모티프의 빈도를 표시한다.
도 91 - 무작위 모티프 라이브러리 스크린에 의해 결정된 RNase의 3개-염기 선호도를 예시한다. 히트맵은 무작위 모티프 라이브러리 절단 스크린에 의해 결정된 60분 시점에 LwaCas13a, PsmCas13b, CcaCas13b, 및 RNase A에 대한 3개-염기 선호도를 표시한다. 히트맵에 표시된 값은 모든 감소된 모티프에 걸쳐 각각의 3개-염기의 계측치이다. 모티프는 -log2(표적/무표적) 값이 LwaCas13a, CcaCas13b, 및 RNase A 조건에서 1.0 이상이거나 또는 PsmCas13b 조건에서 0.5 이상이면 감손으로 간주된다. -log2(표적/무표적) 값에서, 표적 및 표적-무함유는 각각 표적 및 표적-무함유 조건에서 모티프의 빈도를 표시한다.
도 92 - 무작위 모티프 라이브러리 스크린에 의해 결정된 RNase의 4개-염기 선호도를 예시한다. 히트맵은 무작위 모티프 라이브러리 절단 스크린에 의해 결정된 60분 시점에 (A) CcaCas13b, (B) LwaCas13a, (C) PsmCas13b, 및 (D) RNase A에 대한 4개-염기 선호도를 도시한다. 히트맵에 표시된 값은 모든 감소된 모티프에 걸친 각각의 4개-염기의 계측치이다. 모티프는 -log2(표적/무표적) 값이 LwaCas13a, CcaCas13b, 및 RNase A 조건에서 1.0 이상이거나 또는 PsmCas13b 조건에서 0.5 이상이면 감손으로 간주된다. -log2(표적/무표적) 값에서, 표적 및 표적-무함유는 각각 표적 및 표적-무함유 조건에서 모티프의 빈도를 표시한다.
도 93 - 폴리-X 기질의 시험관 내 절단에 의한 Cas13 오솔로그의 염기 절단 선호도를 시험한 결과를 도시한다. (A) crRNA 존재 및 부재로 인큐베이션된 LwaCas13a에 의한 폴리-U, C, G, 및 A 표적의 시험관내 절단. (B) crRNA의 존재 및 부재로 인큐베이션된 CcaCas13b에 의한 폴리-U, C, G, 및 A 표적의 시험관 내 절단. (C) crRNA의 존재 및 부재로 인큐베이션된 PsmCas13b에 의한 폴리-U, C, G, 및 A 표적의 시험관 내 절단.
도 94 - PsmCas13b 절단 활성의 완충제 최적화 결과를 도시한다. (A) 다양한 완충제가 표적화 ssRNA 1을 표적화한 후 PsmCas13b에 대한 부차적 활성에 대한 그들 효과에 대해 시험된다. (B) 최적화된 완충제는 상이한 PsmCas13b-crRNA 복합체 농도에서 본래 완충제와 비교된다.
도 95 - 부차적 절단을 위한 Cas13 오솔로그의 이온 선호도를 예시한다. (A) 2가 양이온 Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni, 및 Zn에 대해 형광성 폴리 U 센서를 사용한 PsmCas13b의 절단 활성. PsmCas13b는 합성 뎅기 ssRNA를 표적화하는 crRNA와 인큐베이션된다. (B) 2가 양이온 Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni, 및 Zn에 대해 형광성 폴리 A 센서를 사용한 PsmCas13b의 절단 활성. PsmCas13b는 합성 뎅기 ssRNA를 표적화하는 crRNA와 인큐베이션된다. (C) 2가 양이온 Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni, 및 Zn에 대해 형광성 폴리 U 센서를 사용한 Pin2Cas13b의 절단 활성. Pin2Cas13b는 합성 뎅기 ssRNA를 표적화하는 crRNA와 인큐베이션된다. (D) 2가 양이온 Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni, 및 Zn에 대해 형광성 폴리 A 센서를 사용한 Pin2Cas13b의 절단 활성. Pin2Cas13b는 합성 뎅기 ssRNA를 표적화하는 crRNA와 인큐베이션된다. (E) 2가 양이온 Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni, 및 Zn에 대해 형광성 폴리 U 센서를 사용한 CcaCas13b의 절단 활성. CcaCas13b는 합성 뎅기 ssRNA를 표적화하는 crRNA와 인큐베이션된다. (F) 2가 양이온 Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni, 및 Zn에 대해 형광성 폴리 A 센서를 사용한 CcaCas13b의 절단 활성. CcaCas13b는 합성 뎅기 ssRNA를 표적화하는 crRNA와 인큐베이션된다.
도 96 - 아데닌 절단 선호도와 Cas13 오솔로그에 대한 절단 활성의 비교를 도시한다. (A) 상이한 농도에서 합성 지카 표적을 표적화하는 각각의 crRNA와 인큐베이션된 PsmCas13b 및 LbaCas13a의 절단 활성 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; n.s., 유의하지 않음; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p<0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄). (B) 상이한 농도에서 합성 뎅기 표적을 표적화하는 각각의 crRNA와 인큐베이션된 PsmCas13b 및 LbaCas13a의 절단 활성 (n=4 기술적 복제물, 양측 스튜던트 t-검정; n.s., 유의하지 않음; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p<0.0001; 막대는 평균 ± s.e.m.을 나타냄).
도 97 - LwaCas13a 및 PsmCas13b에 의한 SHERLOCK으로 지카 ssRNA 표적 4의 아토몰라 검출을 예시한다. (A) LwaCas13a 및 폴리 U 센서에 의한 상이한 농도에서 지카 ssRNA의 SHERLOCK 검출. (B) PsmCas13b 및 폴리 A 센서에 의한 상이한 농도에서 지카 ssRNA의 SHERLOCK 검출.
도 98 - CcaCas13b의 상이한 농도에서 SHERLOCK에 의한 뎅기 ssRNA의 아토몰라 검출을 예시한다.
도 99 - ssRNA 1를 타일링하는 crRNA에 의한 Cas13 오솔로그 재프로그램가능성 시험. (A) ssRNA1에 걸쳐 타일링된 crRNA를 사용한 LwaCas13a 및 CcaCas13b의 절단 활성. (B) ssRNA1에 걸쳐 타일링된 crRNA를 사용한 PsmCas13b의 절단 활성.
도 100 - Cas13 오솔로그 절단에 대한 crRNA 스페이서 길이의 효과를 도시한다. (A) 다양한 스페이서 길이의 ssRNA1-표적화 crRNA에 대한 PsmCas13b의 절단 활성. (B) 다양한 스페이서 길이의 ssRNA1-표적화 crRNA에 의한 CcaCas13b의 절단 활성.
도 101 - 정량적 SHERLOCK을 위한 최적화된 프라이머 농도를 예시한다. (A) 상이한 농도의 지카 RNA 표적 및 상보성 crRNA를 480 nM의 RPA 프라이머 농도에서 인큐베이션시킨 LwaCas13a의 SHERLOCK 동역학 그래프. (B) 상이한 농도의 지카 RNA 표적 및 상보성 crRNA를 240 nM의 RPA 프라이머 농도에서 인큐베이션시킨 LwaCas13a의 SHERLOCK 동역학 그래프. (C) 상이한 농도의 지카 RNA 표적 및 상보성 crRNA를 120 nM의 RPA 프라이머 농도에서 인큐베이션시킨 LwaCas13a의 SHERLOCK 동역학 그래프. (D) 상이한 농도의 지카 RNA 표적 및 상보성 crRNA를 24 nM의 RPA 프라이머 농도에서 인큐베이션시킨 LwaCas13a의 SHERLOCK 동역학 그래프. (E) 4가지 상이한 RPA 프라이머 농도: 480 nM, 240 nM, 120 nM, 60 nM 및 24 nM로 상이한 농도의 지카 RNA의 SHERLOCK 검출. (F) 상이한 RPA 프라이머 농도에서 지카 표적 RNA 농도 및 SHERLOCK의 배경치 차감된 형광도 간 평균 R2 상관도. (G) 10-배 연속 희석물 (검은색 점) 및 2-배 연속 희석물 (붉은색 점) 중 상이한 농도의 지카 RNA 표적의 정량적 SHERLOCK 검출. 120 nM의 RPA 프라이머 농도가 사용되었다.
도 102 - 지카 및 뎅기 표적의 다중화 검출을 예시한다. (A) 지카 ssRNA 표적을 표적화하는 LwaCas13a 및 뎅기 ssRNA 표적을 표적화하는 PsmCas13b를 사용한 다중화 2-색상 검출. 양 표적은 20 nM로 투입되었다. 도시된 모든 데이타는 반응의 180분 시점을 나타낸다. (B) 지카 ssRNA 표적을 표적화하는 LwaCas13a 및 뎅기 ssRNA 표적을 표적화하는 PsmCas13b를 사용한 다중화 2-색상 검출. 양 표적은 200 pM로 투입된다. (C) CcaCas13a 및 PsmCas13b 부차적 활성에 의한 20 pM의 지카 및 뎅기 합성 RNA의 샘플-내 다중화 검출.
도 103 - 지카 및 뎅기 ssRNA의 샘플-내 다중화 RNA 검출을 예시한다. PsmCas13b 및 CcaCas13b에 의한 (B) 지카 및 (A) 뎅기 합성 표적의 감소 농도에서 샘플-내 다중화 RPA 및 부차적 검출.
도 104 - 돌연변이 및 REPAIR 편집의 비-다중화 테라노스틱 검출을 예시한다. (A) LwaCas13a에 의한 건강- 및 질환-모의된 샘플 유래 APC 대립유전자의 검출. (B) REPAIR 표적화 및 비표적화 샘플 유래 APC 대립유전자에서 편집 보정의 LwaCas13a에 의한 검출.
도 105 - 금 나노입자 응집체에 의한 RNase 활성의 비색 검출을 예시한다. (A) RNase 활성에 대한 금-나노입자 기반 비색 판독의 개략도. RNase 활성의 부재 하에서, RNA 링커는 금 나노입자를 응집시켜서, 붉은 색상의 상실을 초래한다. RNA 링커의 절단은 나노입자를 방출시키고 그 결과 붉은 색상 변화가 야기된다. (B) RNase A의 다양한 유닛에서 RNase 분해의 120분 이후에 비색 리포터의 이미지. (C) RNase A의 다양한 유닛 농도에서 분해에 의한 AuNP 비색 리포터의 520 nM 흡광도에서의 동역학. (D) RNase A의 다양한 유닛 농도에서 120분의 분해 후 AuNP 비색 리포터의 520 nm 흡광도. (E) RNase A의 다양한 유닛 농도에서 분해에 의한 AuNP 비색 리포터의 절반-A520 최대값까지의 시간.
도 106 - 대두 게놈 DNA 유래 CP4-EPSPS 유전자의 정량적 검출을 예시한다. (A) 상이한 검출 시점에서 SHERLOCK 배경치 차감된 형광도 및 CP4-EPSPS 대두 백분율의 평균 상관 R2. 대두 백분율은 라운드-업 레디 (round-up ready) 및 야생형 대두의 혼합물에서 라운드-업 레디 대두의 양을 의미한다. CP4-EPSPS 유전자는 라운드-업 레디 대두에만 존재한다. (B) 30분의 인큐베이션 시에 SHERLOCK 검출의 정량적 성질을 보여주는 상이한 대두 백분율에서의 CP4-EPSPS 내성 유전자의 SHERLOCK 검출. (C) 상이한 대두 백분율에서 렉틴 유전자의 SHERLOCK 검출. 대두 백분율은 라운드-업 레디 및 야생형 대두의 혼합물 중 라운드-업 레디 대두의 양을 의미한다. 렉틴 유전자는 양쪽 유형이 대두에 존재하고 그러므로 라운드-업 레디 대두 백분율과 상관성을 보이지 않는다.
도 107 - 압타머 색상 발생을 예시한다.
도 108 - 압타머 디자인 및 농도 최적화를 예시한다.
도 109 - 비색 검출에 대한 흡광도 데이타를 예시한다.
도 110 - 비색 변화의 안정성을 예시한다.
도 111 - 지카 ssRNA의 형광 검출과 비색 검출의 비교를 예시한다.
도 112 - 닉카제 증폭을 예시한다.
일반 정의
달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 개시 내용이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학의 공통 용어 및 기술의 정의는 다음의 문헌들에서 확인할 수 있다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) (Sambrook, Fritsch, and Maniatis); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition (2012) (Green and Sambrook); Current Protocols in Molecular Biology (1987) (F.M. Ausubel et al. eds.); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (1995) (M.J. MacPherson, B.D. Hames, and G.R. Taylor eds.): Antibodies, A Laboratory Manual (1988) (Harlow and Lane, eds.): Antibodies A Laboratory Manual, 2nd edition 2013 (E.A. Greenfield ed.); Animal Cell Culture (1987) (R.I. Freshney, ed.); Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones and Bartlet, 2008 (ISBN 0763752223); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 9780471185710); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992); 및 Marten H. Hofker and Jan van Deursen, Transgenic Mouse Methods and Protocols, 2nd edition (2011).
본 명세서에서 사용되는 단수 형태 "한", "하나", 및 "그"는 문맥에서 달리 명확하게 명시하지 않으면, 단수 및 복수 대상 둘 모두를 포함한다.
용어 "임의의" 또는 "임의로는"은 후술되는 사건, 상황 또는 치환기가 존재하지 않을 수도 있거나 또는 존재할 수도 있고, 그 설명은 사건 또는 상황이 일어나는 예 및 일어나지 않는 예를 포함한다는 것을 의미한다.
종료점에 의한 수치 범위의 설명은 언급된 종료점을 비롯하여, 각 범위 내에 포함된 모든 수 및 분수를 포함한다.
측정가능한 값 예컨대 매개변수, 양, 시간적 지속기간 등을 언급할 때 본 명세서에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 명시된 값과 그로부터의 변동, 예컨대 그러한 변동이 개시된 발명에서 수행하기에 적절하다면, 명시된 값과 그로부터의 +/-10% 이하, +/-5% 이하, +/-1% 이하, 및 +/-0.1% 이하의 변동을 포괄한다는 것을 의미한다. 수식어 "약" 또는 "대략"이 언급되는 값은 그 자체로 또한 특별히, 그리고 바람직하게 개시된다는 것을 이해해야 한다.
본 명세서 전반에서 "하나의 구현예", "일 구현예", "일례의 구현예"에 대한 언급은 구현예와 함께 기술된 특정한 특성, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 구현예에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반의 다양한 위치에서 어구 "하나의 구현예에서", "일 구현예에서", 또는 "일례의 구현예"의 출현은 반드시 모두 동일한 구현예를 언급하지 않지만, 그럴 수도 있다. 더 나아가서, 특정한 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 구현예에서, 본 개시로부터 당업자에게 자명하게 되는 바와 같이, 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. 더 나아가서, 본 명세서에 기술된 일부 구현예가 다른 구현예에 포함된 다른 특성이 아닌 일부 특성을 포함하지만, 상이한 구현예의 특성의 조합은 본 발명의 범주 내에 두고자 한다. 더 나아가서, 본 명세서에 기술된 일부 구현예가 다른 구현예에 포함된 다른 특성이 아닌 일부 특성을 포함하지만, 상이한 구현예의 특성의 조합은 본 발명의 범주 내에 두고자 한다.
"C2c2" 는 이제 "Cas13a" 로 지칭되고, 달리 표시되지 않는 한, 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 인용되는 모든 출판물, 공개 특허 문서, 및 특허 출원은 각각의 개별 출판물, 공개 특허 문서, 또는 특허 출원이 참조로 편입된다고 특별히 개별적으로 표시한 바와 동일한 정도로 참조로 본 명세서에 편입된다.
개요
미생물 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 및 CRISPR-연관 (CRISPR-Cas) 적응 면역 시스템은 프로그램가능한 엔도뉴클레아제, 예컨대 Cas9 및 Cpf1 을 포함한다 (Shmakov et al., 2017; Zetsche et al., 2015). Cas9 및 Cpf1 둘 모두가 DNA를 표적화하지만, 특이적 RNA 감지를 위한 플랫폼을 제공하는, C2c2를 포함하여, 단일 이펙터 RNA-가이드된 RNase가 최근에 발견 (Shmakov et al., 2015)되었고 특징규명되었다 (Abudayyeh et al., 2016; Smargon et al., 2017). RNA-가이드 RNase는 표적 RNA를 절단하기 위해 CRISPR RNA (crRNA)를 사용하여 쉽고 편리하게 재프로그램될 수 있다. 오직 이의 DNA 표적만을 절단하는 DNA 엔도뉴클레아제 Cas9 및 Cpf1과 달리, C2c2와 같은 RNA-가이드된 RNase는 이의 RNA 또는 DNA 표적을 절단한 후에 활성인 채로 남아서, 근접한 비표적화 RNA의 "부차적 (collateral)" 절단을 초래한다 (Abudayyeh et al., 2016). 이러한 crRNA-프로그램된 부차적 RNA 절단 활성은 판독으로서 제공될 수 있는 시험관내 비특이적 RNA 분해 또는 생체내 프로그램된 세포 사멸을 촉발하여 특이적 RNA의 존재를 검출하기 위해 RNA-가이드된 RNase를 사용하는 기회를 제시한다 (Abudayyeh et al., 2016; East-Seletsky et al., 2016). 클래스 2 효소의 부차적 활성은 참조로 본 명세서에 편입시킨 [Gootenberg et al. Science, 2018 Apr 27; 360(6387): 439-444]에 기술된 바와 같은, Cas13b 및 Cas12a 효소를 포함한다.
본 명세서에 개시된 구현예는 아토몰라 (attomolar) 감도로 강건한 CRISPR-기반 진단을 제공하기 위해 RNA 표적화 이펙터를 이용하였다. 본 명세서에서 개시된 구현예는 비슷한 수준의 감도로 DNA 및 RNA 둘 모두를 검출할 수 있고, 단일 염기쌍 편차를 기반으로 비-표적과 표적을 구별할 수 있다. 게다가, 본 명세서에서 개시된 구현예는 편리한 유통 및 현장 (POC) 적용을 위한 동결-건조 형태로 제조될 수 있다. 이러한 구현예는 예를 들어, 바이러스 검출, 박테리아 균주 유형 분석, 민감한 유전자형 분석, 및 질환-연관된 세포-무함유 DNA의 검출을 포함하는, 인간 건강의 다수 시나리오에서 유용하다. 쉬운 참조를 위해, 본 명세서에서 개시된 구현예는 또한 SHERLOCK (Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing)이라고 할 수 있다.
일 양상에서, 본 명세서에서 개시된 구현예는 CRISPR 시스템, 해당 표적 분자에 결합하도록 디자인된 하나 이상의 가이드 RNA, RNA-압타머, 및 임의로 샘플 중 표적 핵산 분자를 증폭하기 위한 증폭 시약을 포함하는 핵산 검출 시스템에 관한 것이다. 하나 이상의 검출 압타머는 하나 이상의 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, RNA 중합효소 부위 또는 프라이머 결합 부위는 오직 표적 펩티드에 검출 압타머의 결합시에만 노출되도록 구성된다. RNA 중합효소 부위의 노출은 주형으로서 압타머 서열을 사용하는 기폭제 RNA 올리고뉴클레오티드의 생성을 용이하게 한다. 따라서, 이러한 구현예에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 기폭제 RNA에 결합하도록 구성된다.
다른 양상에서, 본 명세서에서 개시된 구현예는 다수개의 개별 이산 부피를 포함하는 진단 장치에 관한 것이다. 각각의 개별 이산 부피는 CRISPR 이펙터 단백질, 해당 표적 분자에 결합하도록 디자인된 하나 이상의 가이드 RNA, 및 효소 활성을 갖는 사중체를 포함하는 RNA-압타머를 포함한다. 일정한 일례의 구현예에서, RNA 증폭 시약은 개별 이산 부피에 사전-로딩될 수 있거나 또는 각각의 개별 이산 부피에 샘플의 첨가와 동시발생적으로 또는 후속하여 개별 이산 부피에 첨가될 수 있다. 장치는 미세유체 기반 장치, 착용형 장치, 또는 개별 이산 부피를 한정하는 가요성 재료 기재를 포함하는 장치일 수 있다.
다른 양상에서, 본 명세서에서 개시된 구현예는 샘플 또는 샘플의 세트를 개별 이산 부피의 세트에 분배시키는 단계를 포함하는, 샘플 내에서 표적 핵산을 검출하기 위한 방법에 관한 것으로서, 각각의 개별 이산 부피는 CRISPR 이펙터 단백질, 하나의 표적 올리고뉴클레오티드에 결합하도록 디자인된 하나 이상의 가이드 RNA, 및 효소 활성을 갖는 사중체를 포함하는 RNA-압타머를 포함한다. 이후에 샘플의 세트는 하나 이상의 가이드 RNA의 하나 이상의 표적 분자와의 결합을 허용하는데 충분한 조건 하에서 유지된다. 그 다음으로 하나 이상의 가이드 RNA의 표적 핵산과의 결합은 CRISPR 이펙터 단백질을 활성화시킨다. 활성화되면, CRISPR 이펙터 단백질은 사중체의 효소 활성을 탈활성화시킨다. 한계치 미만에서 효소 활성의 검출은 표적 분자의 존재를 의미한다.
핵산 검출 시스템
일부 구현예에서, 본 발명은 이펙터 단백질 및 해당 표적 분자에 결합하도록 디자인된 하나 이상의 가이드 RNA를 갖는 검출 CRISPR 시스템 및 효소 활성을 갖는 사중체를 포함하는 RNA-압타머를 포함하는 핵산 검출 시스템을 제공한다.
검출 CRISPR 시스템
일반적으로, 본 명세서 및 문헌, 예컨대 WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667)에서 사용되는 CRISPR-Cas 또는 CRISPR 시스템은 Cas 유전자를 코딩하는 서열, tracr (trans-activating CRISPR) 서열 (예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열 ("직접 반복부" 및 내생성 CRISPR 시스템의 경우에 tracrRNA-프로세싱된 부분 직접 반복부를 포괄), 가이드 서열 (또한 내생성 CRISPR 시스템의 경우에 "스페이서"라고 함), 또는 그 용어가 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "RNA(들)" (예를 들어, 가이드 Cas에 대한 RNA(들), 예컨대 Cas9, 예를 들어, CRISPR RNA 및 트랜스활성화 (tracr) RNA 또는 단일 가이드 RNA (sgRNA) (키메라 RNA)) 또는 다른 서열 및 CRISPR 유전자좌 유래의 전사물을 포함하는, CRISPR-연관된 ("Cas") 유전자의 활성을 지정하거나 또는 이의 발현에 관여하는 전사물 및 다른 엘리먼트들을 집합적으로 의미한다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 엘리먼트를 특징으로 한다 (내생성 CRISPR 시스템의 경우에 프로토스페이서라고도 함). CRISPR 단백질이 C2c2 단백질인 경우에, tracrRNA는 필요하지 않다. C2c2는 문헌 [Abudayyeh et al. (2016) "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector"; Science; DOI: 10.1126/science.aaf5573]; 및 [Shmakov et al. (2015) "Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems", Molecular Cell, DOI: dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2015.10.008]에 기술되어 있고, 이들은 그 전문을 참조로 본 명세서에 편입시킨다. Cas13b는 문헌 [Smargon et al. (2017) "Cas13b Is a Type VI-B CRISPR-associated RNA-Guided RNases Differentially Regulated by Accessory Proteins Csx27 and Csx28," Molecular Cell. 65, 1-13; dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.12.023.]에 기술되어 있고, 이의 전문을 참조로 본 명세서에 편입시킨다.
1. 이펙터 단백질
일정 구현예에서, 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM) 또는 PAM-유사 모티프는 관심 표적 유전자좌와 본 명세서에 개시된 바와 같은 이펙터 단백질 복합체의 결합을 지정한다. 일부 구현예에서, PAM은 5' PAM (즉, 프로토스페이서의 5' 말단의 상류에 위치)일 수 있다. 다른 구현예에서, PAM은 3' PAM (즉, 프로토스페이서의 5' 말단의 하류에 위치)일 수 있다. 용어 "PAM"은 용어 "PFS" 또는 "프로토스페이서 측접 부위" 또는 "프로토스페이서 측접 서열"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질은 3' PAM을 인식할 수 있다. 일정 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질은 5' H인 3' PAM을 인식할 수 있고, 여기서 H는 A, C 또는 U이다. 일정 구현예에서, 이펙터 단백질은 렙토트리키아 샤히이 C2c2p, 보다 바람직하게 렙토트리키아 샤히이 DSM 19757 C2c2일 수 있고, 3' PAM은 5' H이다.
CRISPR 복합체의 형성에 있어서, "표적 서열"은 표적 서열과 가이드 서열 간 하이브리드화가 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 경우에, 가이드 서열이 상보성을 갖도록 디자인된 서열을 의미한다. 표적 서열은 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 용어 "표적 RNA"는 표적 서열이거나 또는 그를 포함하는 RNA 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 달리 말해서, 표적 RNA는 gRNA, 즉 가이드 서열의 일부분이 상보성을 갖도로 디자인되고 CRISPR 이펙터 단백질 및 gRNA를 포함하는 복합체에 의해 매개되는 이펙터 기능이 지정되는 RNA 폴리뉴클레오티드일 수 있거나 또는 RNA 폴리뉴클레오티드의 일부분일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치된다.
CRISPR 이펙터 단백질, 특히 C2c2를 코딩하는 핵산 분자는 유리하게 코돈 최적화된 CRISPR 이펙터 단백질이다. 코돈 최적화된 서열의 일례는 이러한 예에서 진핵생물, 예를 들어 인간에서의 발현 (즉, 인간에서 발현을 위해 최적화됨), 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 다른 진핵생물, 동물 또는 포유동물에서의 발현을 위해 최적화된 서열이고, 예를 들어 WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667)의 SaCas9 인간 코돈 최적화된 서열을 참조한다. 이것이 바람직하지만, 다른 예가 가능하고 인간 이외의 다른 숙주 종에 대한 코돈 최적화, 또는 특별한 장기에 대한 코돈 최적화가 공지되어 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질을 코딩하는 효소 코딩 서열은 특정한 세포, 예컨대 진핵생물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 진핵생물 세포는 제한없이 인간, 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 인간이외의 진핵생물 또는 동물 또는 포유동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개, 가축, 또는 인간이외의 포유동물 또는 영장류를 포함하는, 특정한 유기체, 예컨대 식물 또는 포유동물의 것일 수 있거나 또는 그로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 또는 동물에게 임의의 실질적인 의학적 이득없이 그들에게 고통을 야기할 가능성이 있는 인간의 생식선의 유전적 정체성을 변형시키기 위한 방법 및/또는 동물의 유전적 정체성을 변형시키기 위한 방법, 및 그러한 방법으로 초래된 동물은 배제될 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 천연 서열의 적어도 하나의 코돈 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개, 또는 그 이상, 또는 이의 초과 코돈)을 천연 아미노산 서열을 유지시키면서 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 치환시켜 관심 숙주 세포에서의 증강된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 방법에 관한 것이다. 다양한 종은 특정한 아미노산의 일정 코돈에 대해 특정 편향성을 나타낸다. 코돈 편향성 (유기체 간 코돈 용법의 편차)은 종종 이후에 특히 번역하려는 코돈의 특성 및 특정한 전달 RNA (tRNA) 분자의 이용가능성에 의존적이라고 여겨지는, 메신저 RNA (mRNA)의 번역 효율과 상관있다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세성은 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈의 반영이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화를 기반으로 소정 유기체에서 최적 유전자 발현을 위해 재단될 수 있다. 코돈 용법 표는 예를 들어 kazusa.orjp/codon/에서 입수할 수 있는 "코돈 용법 데이타베이스"에서 쉽게 입수할 수 있고, 이들 표를 다양한 방식으로 조정할 수 있다. 문헌 [Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)]을 참조한다. 특정한 숙주 세포에서 발현을 위해 특정한 서열을 코돈 최적화하기 위한 컴퓨터 알고리즘이 또한 이용가능하며, 예컨대 Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA)를 또한 이용할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas를 코딩하는 서열에서 하나 이상의 코돈 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개, 또는 그 이상, 또는 모든 코돈)은 특정한 아미노산에 대해 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 상응한다.
일정 구현예에서, 본 명세서에서 기술되는 방법은 Cas 유전자이식 세포, 특히 C2c2 유전자이식 세포를 제공하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 하나 이상의 관심 유전자의 프로모터를 포함하는 조절 엘리먼트와 세포에서 작동적으로 연결되어 제공되거나 또는 도입된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "Cas 유전자이식 세포"는 Cas 유전자가 게놈에 통합된 세포, 예컨대 진핵생물 세포를 의미한다. 세포의 성질, 유형 또는 기원은 본 발명에 따라서 특별히 제한되지 않는다. 또한 Cas 이식유전자가 세포에 도입되는 방식은 다양할 수 있고 당분야에 공지된 바와 같은 임의의 방법일 수 있다. 일정 구현예에서, Cas 유전자이식 세포는 단리된 세포에 Cas 이식유전자를 도입시켜 수득된다. 일정한 다른 구현예에서, Cas 유전자이식 세포는 Cas 유전자이식 유기체로부터 세포를 단리하여 수득된다. 예로서, 제한없이, 본 명세서에서 언급되는 Cas 유전자이식 세포는 Cas 유전자이식 진핵생물, 예컨대 Cas 녹-인 진핵생물로부터 유래될 수 있다. 참조로 본 명세서에 편입되는 WO 2014/093622 (PCT/US13/74667)를 참조한다. Rosa 유전자좌를 표적화하는 것에 관한 Sangamo BioSciences, Inc.에게 양도된 미국 공개 특허 출원 제20120017290호 및 제20110265198호의 방법은 본 발명의 CRISPR Cas 시스템을 이용하도록 변형될 수 있다. Rosa 유전자좌를 표적화하는 것에 관한 Cellectis에게 양도된 미국 공개 특허 출원 제20130236946호의 방법은 또한 본 발명의 CRISPR Cas 시스템을 이용하도록 변형될 수 있다. 추가 예로서 Cas9 녹-인 마우스를 설명하는 [Platt et. al. (Cell; 159(2):440-455 (2014))]를 참조하고, 이것을 참조로 본 명세서에 편입시킨다. Cas 이식유전자는 Lox-Stop-polyA-Lox(LSL) 카세트를 더 포함할 수 있어서 Cas 발현이 Cre 리콤비나제에 의해 유도될 수 있게 한다. 대안적으로, Cas 유전자이식 세포는 단리된 세포에 Cas 이식유전자를 도입시켜서 수득될 수 있다. 이식유전자의 전달 시스템은 당분야에 충분히 공지되어 있다. 예로서, Cas 이식유전자는 역시 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 벡터 (예를 들어, AAV, 아데노바이러스, 렌티바이러스) 및/또는 입자 및/또는 나노입자 전달을 통해서 예를 들어 진핵생물 세포에 전달될 수 있다.
본 명세서에서 언급하는 바와 같은 세포, 예컨대 Cas 유전자이식 세포는 표적 유전자좌로 Cas를 가이딩할 수 있는 RNA와 복합체 형성시 Cas의 서열 특이적 작용으로 발생된 돌연변이 또는 통합된 Cas 유전자를 갖는 것 이외에도 게놈 변경을 더 포함할 수 있다는 것을 당업자는 이해하게 될 것이다.
일정 양상에서 본 발명은 예를 들어 세포에 Cas 및/또는 Cas를 표적 유전자좌로 가이딩할 수 있는 RNA (즉, 가이드 RNA)를 전달 또는 도입시킬뿐만 아니라, 이들 성분을 증식 (예를 들어, 원핵생물 세포에서)시키기 위한 벡터를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "벡터"는 한 환경에서 다른 환경으로 독립체의 전달을 허용하거나 또는 용이하게 하는 도구이다. 이것은 삽입된 절편의 복제가 일어나게 하기 위해서 다른 DNA 절편이 삽입될 수 있는 레플리콘, 예컨대 플라스미드, 파지 또는 코스미드이다. 일반적으로, 벡터는 적절한 제어 엘리먼트와 회합될 때 복제될 수 있다. 일반적으로, 용어 "벡터"는 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터는 제한없이, 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 부분 이중-가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 자유 말단을 포함하거나, 자유 말단이 없는 (예를 들어, 원형) 핵산 분자; DNA, RNA, 또는 둘 모두를 포함하는 핵산 분자; 및 당분야에 공지된 다른 다양한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 벡터의 한 유형은 예컨대 표준 분자 클로닝 기술에 의해서 추가의 DNA 절편이 삽입될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 의미하는 "플라스미드"이다. 벡터의 다른 유형은 바이러스 벡터로서, 바이러스-유래 DNA 또는 RNA 서열이 바이러스 (예를 들어, 레트로바이러스, 복제 결함성 레트로바이러스, 아데노바이러스, 복제 결합성 아데노바이러스, 및 아데노-연합 바이러스 (AAV)) 내로의 패키징을 위해 벡터에 존재한다. 바이러스 벡터는 또한 숙주 세포로의 형질감염을 위해 바이러스가 운반하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일정 벡터는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제될 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포로 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합되고, 그리하여 숙주 게놈과 함께 복제된다. 게다가, 일정한 벡터는 그들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"라고 한다. 재조합 DNA 기술에서 이용되는 공통 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다.
재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태인 본 발명의 핵산을 포함할 수 있고, 이것은 발현시키려는 핵산 서열에 작동적으로 연결되는, 발현에 사용하려는 숙주 세포를 기반으로 선택될 수 있는 하나 이상의 조절 엘리먼트를 재조합 발현 벡터가 포함한다는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동적으로 연결된"은 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템 또는 벡터가 숙주 세포로 발현될 때 숙주 세포에서) 관심 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 엘리먼트(들)에 연결된 것을 의미하고자 한다. 재조합 및 클로닝 방법과 관련하여, US 2004-0171156 A1으로서 2004년 9월 2일에 공개된 미국 특허 출원 10/815,730을 언급하며, 이의 내용은 그 전문을 참조로 본 명세서에 편입된다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 구현예는 또한 CRISPR 이펙터 시스템을 포함하는 유전자이식 세포를 포함할 수 있다. 일정한 일례의 구현예에서, 유전자이식 세포는 개별 이산 부피로서 기능할 수 있다. 달리 말해서, 차폐성 구성체를 포함하는 샘플은 예를 들어 적합한 전달 소포체로 세포에 전달될 수 있고 표적이 절단 소포체에 존재하면 CRISPR 이펙터가 활성화되고 검출가능한 신호가 발생된다.
벡터 (들)는 조절 엘리먼트(들), 예를 들어, 프로모터(들)를 포함할 수 있다. 벡터(들)는 Cas 코딩 서열을 포함할 수 있고/있거나, 단일하지만, 가능하게는 또한 적어도 3개 또는 8개 또는 16개 또는 32개 또는 48개 또는 50개 가이드 RNA(들) (예를 들어, sgRNA) 코딩 서열, 예컨대 1-2개, 1-3개, 1-4개, 1-5개, 3-6개, 3-7개, 3-8개, 3-9개, 3-10개, 3-8개, 3-16개, 3-30개, 3-32개, 3-48개, 3-50개 RNA(들) (예를 들어, sgRNA)를 포함할 수도 있다. 각각의 RNA (예를 들어, sgRNA)를 위한 프로모터가 존재할 수 있는 단일 벡터에서, 유리하게 약 16개 이하의 RNA(들)가 존재할 때; 및, 단일 벡터가 16개 초과의 RNA(들)를 제공할 때, 하나 이상의 프로모터(들)는 하나를 초과하는 RNA(들)의 발현을 구동시킬 수 있으며, 예를 들어, 32개의 RNA(들)가 존재할 때, 각각의 프로모터는 2개의 RNA(들)의 발현을 구동시킬 수 있고, 48개 RNA(들)가 존재할 때, 각각의 프로모터는 3개의 RNA(들)의 발현을 구동시킬 수 있다. 단순 연산 및 충분히 확립된 클로닝 프로토콜 및 본 개시 내용의 교시에 의해서 당업자는 적합한 예시적인 벡터 예컨대 AAV, 및 적합한 프로모터 예컨대 U6 프로모터를 위한 RNA(들)에 대해 본 발명을 쉽게 실시할 수 있다. 예를 들어, AAV의 패키징 한계는 ∼4.7 kb이다. 단일 U6-gRNA의 길이 (클로닝용 제한효소 부위 포함)는 361 bp이다. 그러므로, 당업자는 약 12-16개, 예를 들어, 13개 U6-gRNA 카세트를 단일 벡터에 쉽게 적합화시킬 수 있다. 이것은 임의의 적합한 수단, 예컨대 TALE 어셈블리에 사용된 골든 게이트 전략 (genome-engineering.org/taleffectors/)에 의해 어셈블리될 수 있다. 당업자는 또한 대략 1.5배 만큼 U6-gRNA의 수를 증가시키기 위해서, 예를 들어 12-16개, 예를 들어, 13개에서 대략 18-24개, 예를 들어, 약 19개 U6-gRNA로 증가시키기 위해서 탠덤 가이드 전략을 사용할 수 있다. 그러므로, 당업자는 단일 벡터, 예를 들어 AAV 벡터에서 대략 18-24개, 예를 들어, 약 19개 프로모터-RNA, 예를 들어, U6-gRNA에 쉽게 도달할 수 있다. 벡터에서 RNA 및 프로모터의 수를 증가시키기 위한 추가 수단은 절단가능한 서열에 의해 이격된 RNA의 어레이를 발현시키기 위해 단일 프로모터 (예를 들어, U6)를 사용하는 것이다. 그리고 벡터에서 프로모터-RNA의 수를 증가시키기 위한 다른 추가 수단은 코딩 서열 또는 유전자의 인트론 내에서 절단가능한 서열에 의해 이격된 프로모터-RNA의 어레이를 발현시키는 것이고, 이러한 예에서 조직 특이적 방식으로 긴 RNA의 전사를 가능하게 하고 발현을 증가시킬 수 있는, 중합효소 II 프로모터를 사용하는 것이 유리하다. (예를 들어, nar.oxfordjournals.org/content/34/7/e53.short 및 nature.com/mt/journal/v16/n9/abs/mt2008144a.html을 참조함). 유리한 구현예에서, AAV는 최대 약 50종 유전자를 표적화하는 U6 탠덤 gRNA를 패키징할 수 있다. 따라서, 당업자의 지식 및 본 개시 내용의 교시로부터 당업자는 특히 임의의 과도한 실험없이, 본 명세서에 기술된 RNA 또는 가이드의 수에 관하여 - 하나 이상의 프로모터에 작동적으로 또는 기능적으로 연결되거나 또는 제어 하에 있는 다수의 RNA 또는 가이드를 발현하는 벡터(들), 예를 들어 단일 벡터를 쉽게 만들고 사용할 수 있다.
가이드 RNA(들) 코딩 서열 및/또는 Cas 코딩 서열은 기능적으로 또는 작동적으로 조절 엘리먼트(들)에 연결될 수 있고 그리하여 조절 엘리먼트(들)는 발현을 구동시킨다. 프로모터(들)는 항상성 프로모터(들) 및/또는 조건적 프로모터(들) 및/또는 유도성 프로모터(들) 및/또는 조직 특이적 프로모터(들)일 수 있다. 프로모터는 RNA 중합효소, pol I, pol II, pol III, T7, U6, H1, 레트로바이러스, 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, 및 EF1α 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 유리한 프로모터는 프로모터 U6이다.
일부 구현예에서, 핵산-표적화 시스템의 하나 이상의 엘리먼트는 내생성 CRISPR RNA-표적화 시스템을 포함하는 특정한 유기체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템 이펙터 단백질은 RNA-표적화 이펙터 단백질이다. 일정한 일례의 구현예에서, 이펙터 단백질 CRISPR RNA-표적화 시스템은 제한없이 본 명세서에 기술된 HEPN 도메인, 당분야에 공지된 HEPN 도메인, 및 공통 서열 모티프와 비교하여 HEPN 도메인으로 인식되는 도메인을 포함하는, 적어도 하나의 HEPN 도메인을 포함한다. 몇몇 이러한 도메인이 본 명세서에 제공된다. 비제한적인 하나의 예에서, 공통 서열은 본 명세서에 제공되는 C2c2 또는 Cas13b 오솔로그의 서열로부터 유래될 수 있다. 일정한 일례의 구현예에서, 이펙터 단백질은 단일 HEPN 도메인을 포함한다. 일정한 다른 일례의 구현예에서, 이펙터 단백질은 2종의 HEPN 도메인을 포함한다.
일례의 구현예에서 이펙터 단백질은 RxxxxH 모티프 서열을 포함하는 하나 이상의 HEPN 도메인을 포함한다. RxxxxH 모티프 서열은 제한없이, 본 명세서에 기술된 HEPN 도메인 또는 당분야에 공지된 HEPN 도메인일 수 있다. RxxxxH 모티프 서열은 둘 이상의 HEPN 도메인의 일부를 조합하여 생성된 모티프 서열을 더 포함한다. 언급된 바와 같이, 공통 서열은 발명의 명칭 "신규 CRISPR 효소 및 시스템"의 U.S. 가출원 제62/432,240호, 2017년 3월 15일에 출원된 발명의 명칭 "신규 VI형 CRISPR 오솔로그 및 시스템"의 U.S. 가출원 제62/471,710호, 및 대리인 서류 번호 47627-05-2133으로 표지되고 2017년 4월 12일 출원된 발명의 명칭 "신규한 VI형 CRISPR 오솔로그 및 시스템"의 U.S. 가출원에 개시된 오솔로그의 서열로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, HEPN 도메인은 R{N/H/K}X1X2X3H의 서열을 포함하는 적어도 하나의 RxxxxH 모티프를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, HEPN 도메인은 R{N/H}X1X2X3H의 서열을 포함하는 RxxxxH 모티프를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, HEPN 도메인은 R{N/K}X1X2X3H의 서열을 포함한다. 일정 구현예에서, X1 은 R, S, D, E, Q, N, G, Y, 또는 H이다. 일정 구현예에서, X2 는 I, S, T, V, 또는 L이다. 일정 구현예에서, X3 은 L, F, N, Y, V, I, S, D, E, 또는 A이다.
본 발명에 따라 사용을 위한 추가의 이펙터는 예를 들어, 제한되는 것은 아니나, cas1 유전자의 시작으로부터 20 kb 및 cas1 유전자의 끝으로부터 20 kb 이내에서, cas1 유전자에 대한 그들의 근접성으로 동정될 수 있다. 일정 구현예에서, 이펙터 단백질은 적어도 하나의 HEPN 도메인 및 적어도 500개 아미노산을 포함하고, C2c2 이펙터 단백질은 천연적으로 Cas 유전자 또는 CRISPR 어레이의 상류 또는 하류의 20 kb 이내로 원핵생물 게놈에 존재한다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12라고도 알려짐), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 이의 상동체, 또는 이의 변형된 형태를 포함한다. 일정한 일례의 구현예에서, C2c2 이펙터 단백질은 천연적으로 Cas 1 유전자의 상류 또는 하류의 20 kb 이내로 원핵생물 게놈에 존재한다. 용어 "오솔로그 (orthologue, 또는 ortholog) 및 "상동체 (homologue, 또는 homolog)는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 추가의 지침에 의해서, 본 명세서에서 사용되는 단백질의 "상동체"는 상동체인 단백질과 동일하거나 또는 유사한 기능을 수행하는 동일한 종의 단백질이다. 그러나 상동성 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 또는 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다. 본 명세서에서 사용되는 단백질의 "오솔로그"는 오솔로그인 단백질과 동일하거나 또는 유사한 기능을 수행하는 상이한 종의 단백질이다. 그러나 오솔로그 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 또는 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다.
특정 구현예에서, VI형 RNA-표적화 Cas 효소는 C2c2이다. 다른 일례의 구현예에서, VI형 RNA-표적화 Cas 효소는 Cas 13b이다. 특정 구현예에서, 본 명세서에서 언급되는 VI형 단백질 예컨대 C2c2의 상동체 또는 오솔로그는 VI형 단백질 예컨대 C2c2와 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 예컨대 예를 들면 적어도 95%의 서열 상동성 또는 동일성 (예를 들어, 렙토트리키아 샤히이 C2c2, 라크노스피라세애 박테리움 MA2020 C2c2, 라크노스피라세애 박테리움 NK4A179 C2c2, 클로스트리듐 아미노필럼 (DSM 10710) C2c2, 카르노박테리움 갈리나럼 (DSM 4847) C2c2, 팔루디박터 프로피오니시게네스 (WB4) C2c2, 리스테리아 웨이헨스테파넨시스 (FSL R9-0317) C2c2, 리스테리아세애 박테리움 (FSL M6-0635) C2c2, 리스테리아 뉴요켄시스 (FSL M6-0635) C2c2, 렙토트리키아 웨이데이 (F0279) C2c2, 로도박터 캡술라터스 (SB 1003) C2c2, 로도박터 캡술라터스 (R121) C2c2, 로도박터 캡술라터스 (DE442) C2c2, 렙토트리키아 웨이데이 (Lw2) C2c2, 또는 리스테리아 실리게리 C2c2 중 임의의 야생형 서열 기반)을 갖는다. 추가 구현예에서, 본 명세서에서 언급되는 VI형 단백질 예컨대 C2c2의 상동체 또는 오르소로그는 야생형 C2c2와 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 예컨대 예를 들면 적어도 95%의 서열 동일성 (예를 들어, 렙토트리키아 샤히이 C2c2, 라크노스피라세애 박테리움 MA2020 C2c2, 라크노스피라세애 박테리움 NK4A179 C2c2, 클로스트리듐 아미노필럼 (DSM 10710) C2c2, 카르노박테리움 갈리나럼 (DSM 4847) C2c2, 팔루디박터 프로피오니시게네스 (WB4) C2c2, 리스테리아 웨이헨스테파넨시스 (FSL R9-0317) C2c2, 리스테리아세애 박테리움 (FSL M6-0635) C2c2, 리스테리아 뉴요켄시스 (FSL M6-0635) C2c2, 렙토트리키아 웨이데이 (F0279) C2c2, 로도박터 캡술라터스 (SB 1003) C2c2, 로도박터 캡술라터스 (R121) C2c2, 로도박터 캡술라터스 (DE442) C2c2, 렙토트리키아 웨이데이 (Lw2) C2c2, 또는 리스테리아 실리게리 C2c2 중 임의의 야생형 서열 기반)을 갖는다.
일정한 다른 일례의 구현예에서, CRISPR 시스템 이펙터 단백질은 C2c2 뉴클레아제이다. C2c2의 활성은 2종 HEPN 도메인의 존재에 의존할 수 있다. 이들은 RNase 도메인, 즉 RNA를 절단하는 뉴클레아제 (특히 엔도뉴클레아제)인 것으로 확인되었다. C2c2 HEPN은 또한 DNA, 또는 잠재적으로 DNA 및/또는 RNA를 표적화할 수 있다. C2c2의 HEPN 도메인이 그들의 야생형 형태로, 적어도 RNA에 결합하여 절단시킬 수 있다는 것을 기초로, C2c2 이펙터 단백질이 RNase 기능을 갖는 것이 바람직하다. C2c2 CRISPR 시스템과 관련하여, 2016년 6월 17일에 출원된 U.S. 가출원 제62/351,662호 및 2016년 8월 17일에 출원된 U.S. 가출원 제62/376,377호를 참조한다. 또한 2016년 6월 17일 출원된 U.S. 가출원 제62/351,803호를 참조한다. 또한, 브로드 연구소 번호 10035.PA4 및 대리인 서류 번호 47627.03.2133을 보유하는 2016년 12월 8일 출원된 발명의 명칭 "신규 Crispr 효소 및 시스템"의 U.S. 가출원을 참조한다. 문헌 [East-Seletsky et al. "Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection" Nature doi:10/1038/nature19802] 및 [Abudayyeh et al. "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA targeting CRISPR effector" bioRxiv doi:10.1101/054742]을 더 참조한다.
CRISPR 시스템에서 RNase 기능은 공지되어 있으며, 예를 들어 mRNA 표적화는 일정 III형 CRISPR-Cas 시스템의 경우에 보고되었고 (Hale et al., 2014, Genes Dev, vol. 28, 2432-2443; Hale et al., 2009, Cell, vol. 139, 945-956; Peng et al., 2015, Nucleic Aids research, vol. 43, 406-417) 상당한 장점을 제공한다. 스타필로코커스 에피더미스 (Staphylococcus epidermis) III-A형 시스템에서, 표적 전역의 전사는 그 결과로 Cas10-Csm 리보뉴클레오단백질 이펙터 단백질 복합체 내의 독립적인 활성 부위에 의해 매개되는, 표적 DNA 및 이의 전사물의 절단을 야기시킨다 (Samai et al., 2015, Cell, vol. 151, 1164-1174). 따라서 본 이펙터 단백질을 통한 CRISPR-Cas 시스템, 조성물 또는 RNA 표적화 방법이 제공된다.
일 구현예에서, Cas 단백질은 제한없이 렙토트리키아, 리스테리아, 코리네박터, 수테렐라, 레지오넬라, 트레포네마, 필리팍토르, 유박테리움, 스트렙토코커스, 락토바실러스, 마이코플라스마, 박테로이데스, 플라비이볼라, 플라보박테리움, 스파에로카에타, 아조스피릴룸, 글루콘아세토박터, 네이세리아, 로세부리아, 파르비바큘럼, 스타필로코커스, 니트라티프락토르, 마이코플라스마 및 캄필로박터를 포함하는 속의 유기체의 C2c2 오솔로그일 수 있다. 이러한 속의 유기체 종이 달리 본 명세서에서 기술될 수 있다.
CRISPR-Cas 시스템 효소의 오솔로그를 동정하는 일부 방법은 관심 게놈에서 tracr 서열을 동정하는 단계를 포함할 수 있다. tracr 서열의 동정은 하기의 단계들과 관련될 수 있다: CRISPR 효소를 포함하는 CRISPR 영역을 동정하기 위해 데이타베이스에서 직접 반복부 또는 tracr 메이트 서열에 대한 검색 단계. 센스 및 안티센스 양쪽 방향으로 CRISPR 효소에 측접하는 CRISPR 영역에서 상동성 서열의 검색 단계. 전사 종결인자 및 2차 구조의 조사 단계. 직접 반복부 또는 tracr 메이트 서열은 아니지만 직접 반복부 또는 tracr 메이트 서열와 50% 초과의 동일성을 갖는 잠재적 tracr 서열로서 임의 서열을 동정하는 단계. 잠재적 tracr 서열을 선택하고 그와 회합되는 전사 종결인자 서열을 분석하는 단계.
본 명세서에 기술된 임의의 기능성이 다수의 오솔로그 유래 단편을 포함하는 키메라 효소를 포함하여, 다른 오솔로그 유래 CRISPR 효소로 조작될 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 이러한 오솔로그의 예는 본 명세서의 다른 부분에 기술되어 있다. 따라서, 키메라 효소는 제한없이 렙토트리키아, 리스테리아, 코리네박터, 수테렐라, 레지오넬라, 트레포네마, 필리팩터, 유박테리움, 스트렙토코커스, 락토바실러스, 마이코플라스마, 박테로이데스, 플라비이볼라, 플라보박테리움, 스파에로카에타, 아조스피릴룸, 글루콘아세토박터, 네이세리아, 로세부리아, 파르비바큘럼, 스타필로코커스, 니트라티프락토르, 마이코플라스마 및 캄필로박터를 포함하는 유기체의 CRISPR 효소 오솔로그의 단편을 포함할 수 있다. 키메라 효소는 제1 단편 및 제2 단편을 포함할 수 있고, 단편은 본 명세서에 언급된 속의 유기체 또는 본 명세서에 언급된 종의 유기체의 CRISPR 효소 오솔로그의 것일 수 있으며, 유리하게 단편은 상이한 종의 CRISPR 효소 오솔로그로부터 유래된다.
구현예에서, 본 명세서에서 언급되는 바와 같은 C2c2 단백질은 또한 C2c2의 기능성 변이체 또는 이의 상동체 또는 오솔로그를 포괄한다. 본 명세서에서 사용 시 단백질의 "기능성 변이체"는 그 단백질의 활성을 적어도 부분적으로 보유하는 그러한 단백질의 변이체를 의미한다. 기능성 변이체는 다형체 등을 포함하여는, 돌연변이체 (삽입, 결실, 또는 치환 돌연변이체일 수 있음)를 포함할 수 있다. 기능성 변이체에는 또한 다른, 일반적으로 미관련된, 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드와 이러한 단백질의 융합 생성물이 포함된다. 기능성 변이체는 천연 발생일 수 있거나 또는 만들어 진 것일 수 있다. 구현예는 조작되거나 또는 비천연 발생된 VI형 RNA-표적화 이펙터 단백질을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, C2c2 또는 이의 오솔로그 또는 상동체를 코딩하는 핵산 분자(들)는 진핵생물 세포에서 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 진핵생물은 본 명세서에서 논의되는 바와 같을 수 있다. 핵산 분자(들)는 조작될 수 있거나 또는 비천연 발생일 수 있다.
일 구현예에서, C2c2 또는 이의 오솔로그 또는 상동체는 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다 (그에 따라 이를 코딩하는 핵산 분자(들)는 돌연변이(들)를 가질 수 있음). 돌연변이는 인공적으로 도입된 돌연변이일 수 있고 제한없이 촉매성 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. Cas9 효소에 대한 촉매성 도메인의 예는 제한없이 RuvC I, RuvC II, RuvC III 및 HNH 도메인을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, C2c2 또는 이의 오솔로그 또는 상동체는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이는 인공적으로 도입된 돌연변이일 수 있고 제한없이 촉매성 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. Cas 효소에 대한 촉매성 도메인의 예는 제한없이 HEPN 도메인을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, C2c2 또는 이의 오솔로그 또는 상동체는 기능성 도메인에 작동적으로 연결되거나 또는 융합된 일반 핵산 결합 단백질로서 사용될 수 있다. 예시적인 기능성 도메인은 제한없이 번역 개시인자, 번역 활성인자, 번역 억제인자, 뉴클레아제, 특히 리보뉴클레아제, 스플라이시오솜, 비드, 광 유도성/제어성 도메인 또는 화학 유도성/제어성 도메인을 포함할 수 있다.
일정한 일례의 구현예에서, C2c2 이펙터 단백질은 렙토트리키아, 리스테리아, 코리네박터, 수테렐라, 레지오넬라, 트레포네마, 필리팩터, 유박테리움, 스트렙토코커스, 락토바실러스, 마이코플라스마, 박테로이데스, 플라비이볼라, 플라보박테리움, 스파에로카에타, 아조스피릴룸, 글루콘아세토박터, 네이세리아, 로세부리아, 파르비바큘럼, 스타필로코커스, 니트라티프락토르, 마이코플라스마, 및 캄필로박터로 이루어진 군으로부터 선택된 유기체로부터 유래될 수 있다.
일정 구현예에서, 이펙터 단백질은 리스테리아 sp. C2c2p, 바람직하게 리스테리아 실리게리아 C2c2p, 보다 바람직하게 리스테리아 실리게리아 혈청형 1/2b str. SLCC3954 C2c2p일 수 있고 crRNA 서열은 5' 29-nt 직접 반복부 (DR) 및 15-nt 내지 18-nt 스페이서를 갖는 44 내지 47개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
일정 구현예에서, 이펙터 단백질은 렙토트리키아 sp. C2c2p, 바람직하게 렙토트리키아 샤히이 C2c2p, 보다 바람직하게 렙토트리키아 샤히이 DSM 19757 C2c2p일 수 있고, crRNA 서열은 적어도 24 nt의 5' 직접 반복부, 예컨대 5' 24-28-nt 직접 반복부 (DR) 및 적어도 14 nt의 스페이서, 예컨대 14-nt 내지 28-nt 스페이서, 또는 적어도 18 nt의 스페이서, 예컨대 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 또는 그 이상의 nt, 예컨대 18-28 nt, 19-28 nt, 20-28 nt, 21-28 nt, 또는 22-28 nt의 스페이서를 갖는, 42 내지 58개 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
일정한 일례의 구현예에서, 이펙터 단백질은 렙토트리키아 sp., 렙토트리키아 웨이데이 F0279, 또는 리스테리아 sp., 바람직하게 리스테리아 뉴요켄시스 FSL M6-0635일 수 있다.
일정한 일례의 구현예에서, 본 발명의 C2c2 이펙터 단백질은 제한없이, 하기의 21개 오솔로그 종 (다수 CRISPR 유전자좌 포함): 렙토트리키아 샤히이; 렙토트리키아 웨이데이 (Lw2); 리스테리아 실리게리 라크노스피라세애 박테리움 MA2020; 라크노스피라세애 박테리움 NK4A179; [클로스트리듐] 아미노필럼 DSM 10710; 카르노박테리움 갈리나럼 DSM 4847; 카르노박테리움 갈리나럼 DSM 4847 (제2 CRISPR 유전자좌); 팔루디박터 프로피오니시게네스 WB4; 리스테리아 웨이헨스테파넨시스 FSL R9-0317; 리스테리아세애 박테리움 FSL M6-0635; 렙토트리키아 웨이데이 F0279; 로도박터 캡술라터스 SB 1003; 로도박터 캡술라터스 R121; 로도박터 캡술라터스 DE442; 렙토트리키아 부칼리스 C-1013-b; 허비닉스 헤미셀룰로실리티카; [유박테리움] 렉탈레; 유박테리아과 박테리아 CHKCI004; 블라우티아 sp. 마르세이유-P2398; 및 렙토트리키아 sp. 경구 분류군 879 str. F0557을 포함한다. 12종의 추가의 비제한적인 예는 라크노스피라세애 박테리움 NK4A144; 클로로플렉서스 아그레간스 (Chloroflexus aggregans); 데메퀴나 아우란티아카 (Demequina aurantiaca); 탈라소스피라 (Thalassospira) sp. TSL5-1; 슈도부티리비브리오 (Pseudobutyrivibrio) sp. OR37; 부티리비브리오 (Butyrivibrio) sp. YAB3001; 블라우티아 (Blautia) sp. 마르세이유-P2398; 렙토트리키아 sp. 마르세이유-P3007; 박테로이데스 이후아에 (Bacteroides ihuae); 폴피로모나다과 (Porphyromonadaceae) 박테리아 KH3CP3RA; 리스테리아 리파리아 (Listeria riparia); 및 인솔리티스피릴럼 페레그리넘 (Insolitispirillum peregrinum)이다.
특별한 구현예에서, C2c2 이펙터 단백질은 렙토트리키아 웨이데이 F0279 또는 렙토트리키아 웨이데이 F0279 (Lw2) C2c2 이펙터 단백질이다.
일정 구현예에서, 본 발명에 따른 C2c2 단백질은 하기 표에 기술된 바와 같은 오솔로그 중 하나이거나 또는 그로부터 유래되거나, 또는 하기 표에 기술된 바와 같은 오솔로그 중 둘 이상의 키메라 단백질이거나, 또는 이종성/기능성 도메인과 융합되거나 또는 융합되지 않고, 본 명세서의 다른 곳에 정의된 바와 같은 사멸 C2c2, 분할 C2c2, 탈안정화 C2c2 등을 포함한, 하기 표에 기술된 바와 같은 오솔로그 중 하나의 돌연변이체 또는 변이체 (또는 키메라 돌연변이체 또는 변이체)이다.
일정 예의 구현예에서, C2c2 이펙터 단백질은 하기 표 1로부터 선택된다.
표 1
상기 종의 야생형 단백질 서열은 하기 표 2에 열거되어 있다. 일정 구현예에서, C2c2 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 제공된다.
표 2
본 발명의 일 구현예에서, 렙토트리키아 샤히이 C2c2, 라크노스피라세애 박테리움 MA2020 C2c2, 라크노스피라세애 박테리움 NK4A179 C2c2, 클로스트리듐 아미노필럼 (DSM 10710) C2c2, 카르노박테리움 갈리나럼 (DSM 4847) C2c2, 팔루디박터 프로피오니시게네스 (WB4) C2c2, 리스테리아 웨이헨스테파넨시스 (FSL R9-0317) C2c2, 리스테리아세애 박테리움 (FSL M6-0635) C2c2, 리스테리아 뉴요켄시스 (FSL M6-0635) C2c2, 렙토트리키아 웨이데이 (F0279) C2c2, 로도박터 캡술라터스 (SB 1003) C2c2, 로도박터 캡술라터스 (R121) C2c2, 로도박터 캡술라터스 (DE442) C2c2, 렙토트리키아 웨이데이 (Lw2) C2c2, 또는 리스테리아 실리게리 C2c2 중 임의의 야생형 서열과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이펙터 단백질이 제공된다.
본 발명의 일 구현예에서, 이펙터 단백질은 제한없이 본 명세서에 기술된 공통 서열을 포함하는 VI형 이펙터 단백질 공통 서열과 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따라서, 공통 서열은 제한없이 C2c2 기능을 매개하는 C2c2 오솔로그의 촉매성 잔기 및 HEPN 모티프를 포함하여, 보존된 아미노산 잔기 및 모티프의 위치를 찾는데 도움이 될 수 있는, 다수의 C2c2 오솔로그로부터 생성될 수 있다. Geneious 정렬을 사용하여 상기에 언급된 33종 오솔로그로부터 생성된, 이러한 공통 서열 하나는 다음과 같다:
다른 비제한적인 예에서, 공통 서열의 생성 및 보존된 잔기의 확인을 보조하기 위한 서열 정렬 도구는 MUSCLE 정렬 도구 (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)이다. 예를 들어, MUSCLE을 사용하여, C2c2 오솔로그들 중에서 보존된 하기 아미노산 위치가 렙토트리키아 웨이데이 C2c2에서 확인될 수 있다: K2; K5; V6; E301; L331; I335; N341; G351; K352; E375; L392; L396; D403; F446; I466; I470; R474 (HEPN); H475; H479 (HEPN), E508; P556; L561; I595; Y596; F600; Y669; I673; F681; L685; Y761; L676; L779; Y782; L836; D847; Y863; L869; I872; K879; I933; L954; I958; R961; Y965; E970; R971; D972; R1046 (HEPN), H1051 (HEPN), Y1075; D1076; K1078; K1080; I1083; I1090.
고도로 보존된 잔기를 보여주는 HEPN 도메인의 예시적인 서열 정렬은 도 50에 도시되어 있다.
일정한 일례의 구현예에서, RNA-표적화 이펙터 단백질은 VI형-B 이펙터 단백질, 예컨대 Cas13b 및 그룹 29 또는 그룹 30 단백질이다. 일정한 일례의 구현예에서, RNA-표적화 이펙터 단백질은 하나 이상의 HEPN 도메인을 포함한다. 일정한 일례의 구현예에서, RNA-표적화 이펙터 단백질은 C-말단 HEPN 도메인, N-말단 HEPN 도메인, 또는 둘 모두를 포함한다. 본 발명의 상황에서 사용될 수 있는 예의 VI-B형 이펙터 단백질의 경우, 발명의 명칭 "신규 CRISPR 효소 및 시스템"으로 2016년 10월 21일 출원된 US 특허 출원 제15/331,792호, 발명의 명칭 "신규 CRISPR 효소 및 시스템"으로 2016년 10월 21일 출원된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/058302, 및 문헌 [Smargon et al. "Cas13b is a Type VI-B CRISPR-associated RNA-Guided RNase differentially regulated by accessory proteins Csx27 and Csx28" Molecular Cell, 65, 1-13 (2017); dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.12.023], 및 2017년 3월 15일에 출원된 발명의 명칭 "신규한 Cas13b 오솔로그 CRISPR 효소 및 시스템"의 양도된 U.S. 가출원을 참조한다. 특정한 구현예에서, Cas13b 효소는 베르게이엘라 주헬컴 (Bergeyella zoohelcum)으로부터 유래된다. 일정한 다른 일례의 구현예에서, 이펙터 단백질은 표 3에 열거된 임의의 서열과 적어도 80%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열이거나 또는 그를 포함한다.
표 3
일정 예의 구현예에서, Cas13b 오솔로그의 야생형 서열은 하기 표 4 또는 5에서 확인한다.
표 4
표 5
일정 예의 구현예에서, RNA-표적화 이펙터 단백질은 2017년 6월 26일 출원된 미국 가출원 제62/525,165호, 및 2017년 8월 16일 출원된 PCT 출원 번호 US 2017/047193에 개시된 바와 같은 Cas13c 이펙터 단백질이다. Cas13c의 예시적인 야생형 오솔로그 서열은 하기 표 6에 제공된다.
표 6
일정 예의 구현예에서, Cas13 단백질은 하기 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다.
표 7
Cas12 단백질
일정 예의 구현예에서, 어세이는 다수의 Cas12, 또는 하나 이상의 Cas13 오솔로그와 조합한 하나 이상의 오솔로그를 포함할 수 있다. 일정 예의 구현예에서, Cas12 오솔로그는 Cpf1 오솔로그이다. 일정한 다른 예의 구현예에서, Cas12 오솔로그는 C2c1 오솔로그이다.
Cpf1 오솔로그
본 발명은 V-A 아형으로서 표시되는 Cpf1 유전자좌에서 유래하는, Cpf1이펙터 단백질의 용도를 포함한다. 여기서 이러한 이펙터 단백질은 또한 "Cpf1p", 예를 들어 Cpf1 단백질로서 지칭된다 (그리고 이러한 이펙터 단백질 또는 Cpf1 단백질 또는 Cpf1 유전자좌에서 유래하는 단백질은 또한 "CRISPR 효소" 로 불린다). 현재, V-A 아형 유전자좌는 cas1, cas2, cpf1 로 표시된 별개 유전자 및 CRISPR 어레이를 포함한다. Cpf1 (CRISPR-연관 단백질 Cpf1, 아형 PREFRAN) 은 Cas9 의 특징적인 아르기닌-풍부 클러스터의 대응부와 함께 Cas9 의 해당하는 도메인에 상동성인 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하는 거대 단백질 (약 1300 개 아미노산) 이다. 그러나, Cpf1 은 모든 Cas9 단백질에 존재하는 HNH 뉴클레아제 도메인이 결핍되어 있고, RuvC-유사 도메인은 HNH 도메인을 포함하는 긴 삽입부를 함유하는 Cas9 와 달리 Cpf1 서열에서 연속적이다. 따라서, 특정 구현예에서, CRISPR-Cas 효소는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인만을 포함한다.
RNA-가이드된 Cpf1의 프로그램 가능성, 특이성 및 부차적 활성은 또한 이것을 핵산의 비특이적 절단을 위한 이상적인 전환가능 뉴클레아제이게 한다. 일 구현예에서, Cpf1 시스템은 RNA의 부차적 비특이적 절단을 제공하고 이용하도록 조작된다. 다른 구현예에서, Cpf1 시스템은 ssDNA 의 부차적 비특이적 절단을 제공하고 이용하도록 조작된다. 따라서, 조작된 Cpf1 시스템은 핵산 검출 및 전사체 조작을 위한 플랫폼을 제공한다. Cpf1 은 포유동물 전사물 녹다운 및 결합 도구로서 사용하기 위해 개발된다. Cpf1 은 서열 특이적 표적화된 DNA 결합에 의해 활성화될 때 RNA 및 ssDNA 의 강건한 부차적 절단을 가능하게 한다.
용어 "오솔로그" ("orthologue" 또는 "ortholog") 및 "상동체" ("homologue" 또는 "homolog")는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 추가 지침으로, 본 명세서에서 사용되는 단백질의 "상동체"는 상동체인 단백질과 동일하거나 또는 유사한 기능을 수행하는 동일 종의 단백질이다. 그러나 상동성 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 또는 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다. 본 명세서에서 사용되는 단백질의 "오솔로그"는 오솔로그인 단백질과 동일하거나 또는 상이한 기능을 수행하는 상이한 종의 단백질이다. 그러나 오솔로그 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 또는 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다. 상동체 및 오솔로그는 상동성 모델링 (예를 들어, [Greer, Science vol. 228 (1985) 1055], 및 [Blundell et al. Eur J Biochem vol 172 (1988), 513] 참조) 또는 "구조적 BLAST" (Dey F, Cliff Zhang Q, Petrey D, Honig B. Toward a "structural BLAST": using structural relationships to infer function. Protein Sci. 2013 Apr;22(4):359-66. doi: 10.1002/pro.2225.)로 동정될 수 있다. 또한 CRISPR-Cas 유전자좌 분야에서 적용을 위해 [Shmakov et al. (2015)]를 참조한다. 그러나 상동성 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 또는 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다.
Cpf1 유전자는 여러 다양한 박테리아 게놈에서, 전형적으로 cas1, cas2 및 cas4 유전자 및 CRISPR 카세트 (예를 들어, 프란시셀라 cf. 노비시다 (Francisella cf. novicida) Fx1 의 FNFX1_1431-FNFX1_1428)에 존재한다. 따라서, 이러한 추정 신규 CRISPR-Cas 시스템의 레이아웃은 II-B형의 경우와 유사한 것으로 나타난다. 또한 Cas9 와 유사하게, Cpf1 단백질은, 트랜스포존 ORF-B 와 상동성인 쉽게 식별가능한 C-말단 영역을 함유하고, 활성 RuvC-유사 뉴클레아제, 아르기닌-풍부 영역, 및 Zn 핑거 (Cas9 에 부재함)를 포함한다. 그러나 Cas9 와 달리, Cpf1 은 또한 CRISPR-Cas 내용 없이 여러 게놈에 존재하며, ORF-B 와의 그의 상대적으로 높은 유사성은 그것이 트랜스포존 성분일 수 있다는 것을 시사한다. 이것이 진정한 CRISPR-Cas 시스템이고 Cpf1이 Cas9의 기능성 유사체라면, 이는 신규한 CRISPR-Cas 유형, 즉, V형이라고 제안되었다 (Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Makarova KS, Koonin EV. Methods Mol Biol. 2015;1311:47-75). 그러나, 본 명세서에 기술된 바와 같이, Cpf1은 동일한 도메인 구조를 갖지 않아서 V-B 아형이라고 표시되는 C2c1p와 구별하기 위해 V-A형이라고 한다.
특정 구현예에서, 이펙터 단백질은 스트렙토코커스 (Streptococcus), 캄필로박터 (Campylobacter), 니트라티프락토르 (Nitratifractor), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 파비바큘럼 (Parvibaculum), 로세부리아 (Roseburia), 네이세리아 (Neisseria), 글루콘아세토박터 (Gluconacetobacter), 아조스피릴룸 (Azospirillum), 스파에로카에타 (Sphaerochaeta), 락토바실러스 (Lactobacillus), 유박테리움 (Eubacterium), 코리네박터 (Corynebacter), 카르노박테리움 (Carnobacterium), 로도박터 (Rhodobacter), 리스테리아 (Listeria), 팔루디박터 (Paludibacter), 클로스트리듐 (Clostridium), 라크노스피라세애 (Lachnospiraceae), 클로스트리디아리듐 (Clostridiaridium), 렙토트리키아 (Leptotrichia), 프란시셀라 (Francisella), 레지오넬라 (Legionella), 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 메타노메티오필러스 (Methanomethyophilus), 포르피로모나스 (Porphyromonas), 프레보텔라 (Prevotella), 박테로이데테스 (Bacteroidetes), 헬코코커스 (Helcococcus), 렙토스피라 (Leptospira), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로눔 (Desulfonatronum), 오피투타세애 (Opitutaceae), 투베리바실러스 (Tuberibacillus), 바실러스 (Bacillus), 브레비바실러스 (Brevibacilus), 메틸로박테리움 (Methylobacterium) 또는 악시다미노코커스 (Acidaminococcus)를 포함하는 속으로부터의 유기체 유래의 Cpf1이펙터 단백질이다.
추가 특정 구현예에서, Cpf1이펙터 단백질은 에스. 뮤탄스 (S. mutans), 에스. 아갈락티아 (S. agalactiae), 에스. 에퀴시밀리스 (S. equisimilis), 에스. 산귀니스 (S. sanguinis), 에스. 뉴모니어 (S. Pneumonia); 씨. 제주니 (C. jejuni), 씨. 콜라이 (C. Coli); 엔. 살수기니스 (N. salsuginis), 엔. 테르가쿠스 (N. Tergarcus); 에스. 아우리쿨라리스 (S. auricularis), 에스. 카르노서스 (S. carnosus); 엔. 메닌지티데스 (N. meningitides), 엔. 고노로에아 (N. Gonorrhoeae); 엘. 모노시토게네스 (L. monocytogenes), 엘. 이바노비이 (L. Ivanovii); 씨. 보툴리눔 (C. botulinum), 씨. 디피실 (C. difficile), 씨. 테타니 (C. tetani), 씨. 소르델리이 (C. sordellii)에서 선택되는 유기체로부터 유래된다.
이펙터 단백질은 제1 이펙터 단백질 (예를 들어, Cpf1) 오솔로그로부터의 제1 단편 및 제2 이펙터 (예를 들어, Cpf1) 단백질 오솔로그로부터의 제2 단편을 포함하는 키메라 이펙터 단백질을 포함할 수 있으며, 이때 제1 이펙터 단백질 오솔로그와 제2 이펙터 단백질 오솔로그는 상이하다. 제1 및 제2 이펙터 단백질 (예를 들어, Cpf1) 오솔로그 중 적어도 하나는 스트렙토코커스 (Streptococcus), 캄필로박터 (Campylobacter), 니트라티프락토르 (Nitratifractor), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 파르비바큘럼 (Parvibaculum), 로세부리아 (Roseburia), 네이세리아 (Neisseria), 글루콘아세토박터 (Gluconacetobacter), 아조스피릴룸 (Azospirillum), 스파에로카에타 (Sphaerochaeta), 락토바실러스 (Lactobacillus), 유박테리움 (Eubacterium), 코리네박터 (Corynebacter), 카르노박테리움 (Carnobacterium), 로도박터 (Rhodobacter), 리스테리아 (Listeria), 팔루디박터 (Paludibacter), 클로스트리듐 (Clostridium), 라크노스피라세애 (Lachnospiraceae), 클로스트리디아리디움 (Clostridiaridium), 렙토트리키아 (Leptotrichia), 프란시셀라 (Francisella), 레지오넬라 (Legionella), 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 메타노메티오필러스 (Methanomethyophilus), 포르피로모나스 (Porphyromonas), 프레보텔라 (Prevotella), 박테로이데테스 (Bacteroidetes), 헬코코커스 (Helcococcus), 렙토스피라 (Letospira), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로눔 (Desulfonatronum), 오피투타세애 (Opitutaceae), 투베리바실러스 (Tuberibacillus), 바실러스 (Bacillus), 브레비바실러스 (Brevibacilus), 메틸로박테리움 (Methylobacterium) 또는 악시다미노코커스 (Acidaminococcus)를 포함하는 유기체로부터의 이펙터 단백질 (예를 들어, Cpf1)을 포함할 수 있는데; 예를 들어, 키메라 이펙터 단백질은 제1 단편 및 제2 단편을 포함하며 각각의 제1 단편 및 제2 단편은 스트렙토코커스 (Streptococcus), 캄필로박터 (Campylobacter), 니트라티프락토르 (Nitratifractor), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 파르비바큘럼 (Parvibaculum), 로세부리아 (Roseburia), 네이세리아 (Neisseria), 글루콘아세토박터 (Gluconacetobacter), 아조스피릴룸 (Azospirillum), 스파에로카에타 (Sphaerochaeta), 락토바실러스 (Lactobacillus), 유박테리움 (Eubacterium), 코리네박터 (Corynebacter), 카르노박테리움 (Carnobacterium), 로도박터 (Rhodobacter), 리스테리아 (Listeria), 팔루디박터 (Paludibacter), 클로스트리듐 (Clostridium), 라크노스피라세애 (Lachnospiraceae), 클로스트리디아리디움 (Clostridiaridium), 렙토트리키아 (Leptotrichia), 프란시셀라 (Francisella), 레지오넬라 (Legionella), 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 메타노메티오필러스 (Methanomethyophilus), 포르피로모나스 (Porphyromonas), 프레보텔라 (Prevotella), 박테로이데테스 (Bacteroidetes), 헬코코커스 (Helcococcus), 렙토스피라 (Letospira), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로눔 (Desulfonatronum), 오피투타세애 (Opitutaceae), 투베리바실러스 (Tuberibacillus), 바실러스 (Bacillus), 브레비바실러스 (Brevibacilus), 메틸로박테리움 (Methylobacterium) 또는 악시다미노코커스 (Acidaminococcus)를 포함하는 유기체의 Cpf1에서 선택되고, 이때 제1 단편 및 제2 단편은 동일한 박테리아로부터의 것이 아니고; 예를 들어, 키메라 이펙터 단백질은 제1 단편 및 제2 단편을 포함하며 각각의 제1 단편 및 제2 단편은 에스. 뮤탄스 (S. mutans), 에스. 아갈락티에 (S. agalactiae), 에스. 에퀴시밀리스 (S. equisimilis), 에스. 산귀니스 (S. sanguinis), 에스. 뉴모니어 (S. pneumonia); 씨. 제주니 (C. jejuni), 씨. 콜리 (C. coli); 엔. 살수기니스 (N. salsuginis), 엔. 테르가쿠스 (N. tergarcus); 에스. 아우리쿨라리스 (S. auricularis), 에스. 카르노서스 (S. carnosus); 엔. 메닝기티데스 (N. meningitides), 엔. 고노로에아 (N. gonorrhoeae); 엘. 모노시토게네스 (L. monocytogenes), 엘. 이바노비이 (L. ivanovii); 씨. 보툴리눔 (C. botulinum), 씨. 디피실 (C. difficile), 씨. 테타니 (C. tetani), 씨. 소르델리이 (C. sordellii); 프란시셀라 투라렌시스 (Francisella tularensis) 1, 프레보텔라 알벤시스 (Prevotella albensis), 라크노스피라세애 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MC2017 1, 부티리비브리오 프로테오클라스티커스 (Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움 (Peregrinibacteria bacterium) GW2011_GWA2_33_10, 파르쿠박테리아 박테리움 (Parcubacteria bacterium) GW2011_GWC2_44_17, 스미텔라 (Smithella) sp. SCADC, 악시다미노코커스 sp. (Acidaminococcus sp.) BV3L6, 라크노스피라세애 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MA2020, 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼 (Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스 (Eubacterium eligens), 모라셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi) 237, 렙토스피라 이나다이 (Leptospira inadai), 라크노스피라세애 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) ND2006, 포르피로모나스 크레비오리카니스 (Porphyromonas crevioricanis) 3, 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens) 및 포르피로모나스 마카케 (Porphyromonas macacae)의 Cpf1 에서 선택되고, 이때 제1 단편 및 제2 단편은 동일한 박테리아 유래의 것이 아니다.
보다 바람직한 구현예에서, Cpf1p 는 프란시셀라 투라렌시스 (Francisella tularensis) 1, 프레보텔라 알벤시스 (Prevotella albensis), 라크노스피라세애 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MC2017 1, 부티리비브리오 프로테오클라스티커스 (Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움 (Peregrinibacteria bacterium) GW2011_GWA2_33_10, 파르쿠박테리아 박테리움 (Parcubacteria bacterium) GW2011_GWC2_44_17, 스미텔라 (Smithella) sp. SCADC, 악시다미노코커스 (Acidaminococcus) sp. BV3L6, 라크노스피라세애 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MA2020, 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼 (Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스 (Eubacterium eligens), 모라셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi) 237, 렙토스피라 이나다이 (Leptospira inadai), 라크노스피라세애 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) ND2006, 포르피로모나스 크레비오리카니스 (Porphyromonas crevioricanis) 3, 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens) 및 포르피로모나스 마카케 (Porphyromonas macacae)에서 선택되는 박테리아 종에서 유래한다. 특정 구현예에서, Cpf1p 는 악시다미노코커스 (Acidaminococcus) sp. BV3L6, 라크노스피라세애 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MA2020 에서 선택되는 박테리아 종에서 유래한다. 특정 구현예에서, 이펙터 단백질은 프란시셀라 투라렌시스 subsp. (Francisella tularensis subsp.) 노비시다 (novicida)를 포함하나 이에 제한되지 않는, 프란시셀라 투라렌시스 (Francisella tularensis) 1 의 아종에서 유래한다.
일부 구현예에서, Cpf1p는 유박테리움 (Eubacterium)의 속으로부터의 유기체에서 유래한다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질은 유박테륨 렉탈레(Eubacterium rectale)의 박테리아 종으로부터의 유기체로부터 유래된 Cpf1 단백질이다. 일부 구현예에서, Cpf1이펙터 단백질의 아미노산 서열은 NCBI 참조 서열 WP_055225123.1, NCBI 참조 서열 WP_055237260.1, NCBI 참조 서열 WP_055272206.1, 또는 GenBank ID OLA16049.1에 상응한다. 일부 구현예에서, Cpf1이펙터 단백질은 NCBI 참조 서열 WP_055225123.1, NCBI 참조 서열 WP_055237260.1, NCBI 참조 서열 WP_055272206.1, 또는 GenBank ID OLA16049.1과 적어도 60%, 보다 특히 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 예컨대 예를 들어 적어도 95%의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 갖는다. 당업자는 이것이 Cpf1 단백질의 절두 형태를 포함하고, 그리하여 서열 동일성은 절두 형태의 길이에 대해 결정된다는 것을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, Cpf1 이펙터는 TTTN 또는 CTTN의 PAM 서열을 인식한다.
특정 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 Cpf1의 상동체 또는 오솔로그는 Cpf1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 Cpf1의 상동체 또는 오솔로그는 야생형 Cpf1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. Cpf1이 하나 이상의 돌연변이를 갖는 경우 (돌연변이됨), 본원에서 나타내는 바와 같은 상기 Cpf1의 상동체 또는 오솔로그는 돌연변이된 Cpf1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다.
한 구현예에서, Cpf1 단백질은 악시다미노코커스 (Acidaminococcus) sp., 라크노스피라세애 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) 또는 모라셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi)를 포함하나 이에 제한되지 않는 속의 유기체의 오솔로그일 수 있고; 특정 구현예에서, V형 Cas 단백질은 악시다미노코커스 sp. (Acidaminococcus sp.) BV3L6; 라크노스피라세애 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) ND2006 (LbCpf1) 또는 모라셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi) 237 을 포함하나 이에 제한되지 않는 종의 유기체의 오솔로그일 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 Cpf1의 상동체 또는 오솔로그는 본원에 개시된 Cpf1 서열 중 하나 이상과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 Cpf 의 상동체 또는 오솔로그는 야생형 FnCpf1, AsCpf1 또는 LbCpf1과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 Cpf1 단백질은 FnCpf1, AsCpf1 또는 LbCpf1 과 적어도 60%, 보다 특히 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 Cpf1 단백질은 야생형 AsCpf1 또는 LbCpf1 과 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 보다 특히 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 Cpf1 단백질은 FnCpf1 과 60% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 당업자는 이것이 Cpf1 단백질의 절두 형태를 포함하고, 이에 의해 서열 동일성은 절두 형태의 길이에 대해 결정된다는 것을 이해할 것이다.
하기에서, Cpf1 아미노산은 핵 국재화 신호 (NLS) (이탤릭체), 글리신-세린 (GS) 링커, 및 3x HA 태그가 후속된다. 1-프란시셀라 투라렌시스 subsp. 노비시다 U112 (FnCpf1) (SEQ ID NO. 281); 3-라크노스피라세애 박테리움 MC2017 (Lb3Cpf1) (SEQ ID NO. 282); 4-부티리비브리오 프로테오클라스티커스 (Butyrivibrio proteoclasticus) (BpCpf1) (SEQ ID NO. 283); 5-페레그리니박테리아 박테리움 (Peregrinibacteria bacterium) GW2011_GWA_33_10 (PeCpf1) (SEQ ID NO. 284); 6-파르쿠박테리아 박테리움 (Parcubacteria bacterium) GWC2011_GWC2_44_17 (PbCpf1) (SEQ ID NO. 285); 7-스미텔라 (Smithella) sp. SC_K08D17 (SsCpf1) (SEQ ID NO. 286); 8-아시다미노코커스 (Acidaminococcus) sp. BV3L6 (AsCpf1) (SEQ ID NO. 287); 9-라크노스피라세애 박테리움 MA2020 (Lb2Cpf1) (SEQ ID NO. 288); 10-칸디다투스 메타노플라스마 터미텀 (Candidatus Methanoplasma termitum) (CMtCpf1) (SEQ ID NO. 289); 11-유박테리움 엘리겐스 (Eubacterium eligens) (EeCpf1) (SEQ ID NO. 290); 12-모라셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi) 237 (MbCpf1) (SEQ ID NO. 291); 13-렙토스피라 이나다이 (LiCpf1) (SEQ ID NO. 292); 14-라크노스피라세애 박테리움 ND2006 (LbCpf1) (SEQ ID NO. 293); 15-포르피로모나스 크레비오리카니스 (Porphyromonas crevioricanis) (PcCpf1) (SEQ ID NO. 294); 16-프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens) (PdCpf1) (SEQ ID NO. 295); 17-포르피로모나스 마카카 (Porphyromonas macacae) (PmCpf1) (SEQ ID NO. 296); 18-티오미크로스피라 (Thiomicrospira) sp. XS5 (TsCpf1) (SEQ ID NO. 297); 19-모라셀라 보보쿨리 AAX08_00205 (Mb2Cpf1) (SEQ ID NO. 298); 20-모라셀라 보보쿨리 AAX11_00205 (Mb3Cpf1) (SEQ ID NO. 299); 및 21-부티리비브리오 sp. NC3005 (BsCpf1) (SEQ ID NO. 300).
추가 Cpf1 오솔로그는 NCBI WP_055225123.1, NCBI WP_055237260.1, NCBI WP_055272206.1, 및 GenBank OLA16049.1을 포함한다.
C2c1 오솔로그
본 발명은 아형 V-A 로서 나타내는 C2c1 유전자좌에서 유래하는, C2c1 이펙터 단백질의 용도를 포함한다. 여기서 이러한 이펙터 단백질은 또한 "C2c1p", 예를 들어 C2c1 단백질로서 지칭된다 (그리고 이러한 이펙터 단백질 또는 C2c1 단백질 또는 C2c1 유전자좌에서 유래하는 단백질은 또한 "CRISPR 효소" 로 불린다). 현재, 아형 V-B 유전자좌는 cas1-Cas4 융합, cas2, C2c1 로 나타낸 별개의 유전자 및 CRISPR 어레이를 포함한다. C2c1 (CRISPR-연관 단백질 C2c1) 은 Cas9 의 특징적인 아르기닌-풍부 클러스터에 대응하는 부분과 함께 Cas9 의 해당하는 도메인에 상동성인 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하는 거대 단백질 (약 1100 - 1300 개 아미노산) 이다. 그러나, C2c1 은 모든 Cas9 단백질에 존재하는 HNH 뉴클레아제 도메인이 결핍되어 있고, RuvC-유사 도메인은 HNH 도메인을 포함하는 긴 삽입물을 함유하는 Cas9 와 달리 C2c1 서열에서 연속적이다. 따라서, 특정 구현예에서, CRISPR-Cas 효소는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인만을 포함한다.
C2c1 (Cas12b 로도 공지됨) 단백질은 RNA 가이드된 뉴클레아제이다. 이의 절단은 tracr RNA 에 의존하여, 가이드 서열 및 직접 반복부를 포함하는 가이드 RNA를 동원하는데, 여기서 가이드 서열은 표적 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화하여 DNA/RNA 헤테로듀플렉스를 형성한다. 현재 연구를 기반으로 하여, C2c1 뉴클레아제 활성은 또한 PAM 서열의 인식에 의존한다. C2c1 PAM 서열은 T-풍부 서열이다. 일부 구현예에서, 일부 구현예에서, PAM 서열은 5' TTN 3' 또는 5' ATTN 3'이며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, PAM 서열은 5' TTC 3'이다. 특정 구현예에서, PAM은 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum)의 서열 내에 있다.
C2c1 은 표적 유전자좌에서, 5' 오버행과 함께, 엇갈림 절단 (staggered cut), 또는 표적 서열의 PAM 원위 측에서 "점착성 말단 (sticky end)" 을 생성한다. 일부 구현예에서, 일부 구현예에서, 5' 오버행은 7 nt이다. [Lewis and Ke, Mol Cell. 2017 Feb 2;65(3):377-379]을 참조한다.
본 발명은 C2c1 (V-B형; Cas12b) 이펙터 단백질 및 오솔로그를 제공한다. 용어 "오솔로그" ("orthologue" 또는 "ortholog") 및 "상동체" ("homologue" 또는 "homolog")는 당분야에 충분히 공지되어 있다. 추가 지침으로, 본 명세서에서 사용되는 단백질의 "상동체"는 상동체인 단백질과 동일하거나 또는 유사한 기능을 수행하는 동일 종의 단백질이다. 그러나 상동성 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 또는 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다. 본 명세서에서 사용되는 단백질의 "오솔로그"는 오솔로그인 단백질과 동일하거나 또는 상이한 기능을 수행하는 상이한 종의 단백질이다. 그러나 오솔로그 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 또는 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다. 상동체 및 오솔로그는 상동성 모델링 ([Greer, Science vol. 228 (1985) 1055], 및 [Blundell et al. Eur J Biochem vol 172 (1988), 513) 또는 "구조적 BLAST" (Dey F, Cliff Zhang Q, Petrey D, Honig B. Toward a "structural BLAST": using structural relationships to infer function. Protein Sci. 2013 Apr;22(4):359-66. doi: 10.1002/pro.2225.)를 통해 동정할 수 있다. 또한, CRISPR-Cas 유전자좌의 분야에서 적용을 위해 [Shmakov et al. (2015)]를 참조한다. 그러나 상동성 단백질은 구조적으로 관련될 필요가 없거나, 또는 오직 부분적으로 구조적으로 관련된다.
C2c1 유전자는 여러 다양한 박테리아 게놈에서, 전형적으로는 cas1, cas2 및 cas4 유전자 및 CRISPR 카세트를 갖는 동일한 유전자좌에서 발견된다. 따라서, 이러한 추정 신규 CRISPR-Cas 시스템의 레이아웃은 II-B형의 경우와 유사한 것으로 나타난다. 또한, Cas9 와 유사하게, C2c1 단백질은 활성 RuvC-유사 뉴클레아제, 아르기닌-풍부 영역, 및 Zn 핑거 (Cas9에 부재함)를 함유한다.
특정 구현예에서, 이펙터 단백질은 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로눔 (Desulfonatronum), 오피투타세애 (Opitutaceae), 투베리바실러스 (Tuberibacillus), 바실러스 (Bacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 칸디다투스 (Candidatus), 데술파티랍디움 (Desulfatirhabdium), 시트로박터 (Citrobacter), 엘루시미크로비아 (Elusimicrobia), 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 옴니트로피카 (Omnitrophica), 피시스파에래 (Phycisphaerae), 플란크토마이세테스 (Planctomycetes), 스피로카에테스 (Spirochaetes), 및 베루코미크로비아세애 (Verrucomicrobiaceae)를 포함하는 속으로부터의 유기체로부터의 C2c1 이펙터 단백질이다.
추가 특정 구현예에서, C2c1 이펙터 단백질은 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) (예를 들어, ATCC 49025), 알리시클로바실러스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans) (예를 들어, DSM 17975), 알리시클로바실러스 마크로스포란지두스 (Alicyclobacillus macrosporangiidus) (예를 들어, DSM 17980), 바실러스 히사시이 (Bacillus hisashii) 균주 C4, 칸디다투스 린도우박테리아 박테리움 (Candidatus Lindowbacteria bacterium) RIFCSPLOWO2, 데술포비브리오 이노피나투스 (Desulfovibrio inopinatus) (예를 들어, DSM 10711), 데술포나트로눔 티오디스무탄스 (Desulfonatronum thiodismutans) (예를 들어, 균주 MLF-1), 엘루시미크로비아 박테리움 (Elusimicrobia bacterium) RIFOXYA12, 옴니트로피카 WOR_2 박테리움 (Omnitrophica WOR_2 bacterium) RIFCSPHIGHO2, 오피투타세애 박테리움 (Opitutaceae bacterium) TAV5, 피시스파에래 박테리움 (Phycisphaerae bacterium) ST-NAGAB-D1, 플란크토마이세테스 박테리움 (Planctomycetes bacterium) RBG_13_46_10, 스피로카에테스 박테리움 (Spirochaetes bacterium) GWB1_27_13, 베루코미크로비아세애 박테리움 (Verrucomicrobiaceae bacterium) UBA2429, 투베리바실러스 칼리두스 (Tuberibacillus calidus) (예를 들어, DSM 17572), 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) (예를 들어, 균주 B4166), 브레비바실러스 sp. (Brevibacillus sp.) CF112, 바실러스 sp. (Bacillus sp.) NSP2.1, 데술파티랍디움 부티라티보란스 (Desulfatirhabdium butyrativorans) (예를 들어, DSM 18734), 알리시클로바실러스 허바리우스 (Alicyclobacillus herbarius) (예를 들어, DSM 13609), 시트로박터 프레운디 (Citrobacter freundii) (예를 들어, ATCC 8090), 브레비바실러스 아그리 (Brevibacillus agri) (예를 들어, BAB-2500), 메틸로박테리움 노둘란스 (Methylobacterium nodulans) (예를 들어, ORS 2060)에서 선택되는 종으로부터의 것이다.
이펙터 단백질은 제1 이펙터 단백질 (예를 들어, C2c1) 오솔로그로부터의 제1 단편 및 제2 이펙터 (예를 들어, C2c1) 단백질 오솔로그로부터의 제2 단편을 포함하는 키메라 이펙터 단백질을 포함할 수 있고, 여기서 제1 이펙터 단백질 오솔로그와 제2 이펙터 단백질 오솔로그는 상이하다. 제1 및 제2 이펙터 단백질 (예를 들어, C2c1) 오솔로그 중 적어도 하나는 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로눔 (Desulfonatronum), 오피투타세애 (Opitutaceae), 투베리바실러스 (Tuberibacillus), 바실러스 (Bacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 칸디다투스 (Candidatus), 데술파티랍디움 (Desulfatirhabdium), 엘루시미크로비아 (Elusimicrobia), 시트로박터 (Citrobacter), 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 옴니트로피카이 (Omnitrophicai), 피시스파에래 (Phycisphaerae), 플란크토마이세테스 (Planctomycetes), 스피로카에테스 (Spirochaetes), 및 베루코미크로비아세애 (Verrucomicrobiaceae)를 포함하는 유기체로부터의 이펙터 단백질 (예를 들어, C2c1)을 포함할 수 있고; 예를 들어, 키메라 이펙터 단백질은 제1 단편 및 제2 단편을 포함하며 여기서 각각의 제1 및 제2 단편은 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로눔 (Desulfonatronum), 오피투타세애 (Opitutaceae), 투베리바실러스 (Tuberibacillus), 바실러스 (Bacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 칸디다투스 (Candidatus), 데술파티랍디움 (Desulfatirhabdium), 엘루시미크로비아 (Elusimicrobia), 시트로박터 (Citrobacter), 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 옴니트로피카이 (Omnitrophicai), 피시스파에래 (Phycisphaerae), 플란크토마이세테스 (Planctomycetes), 스피로카에테스 (Spirochaetes), 및 베루코미크로비아세애 (Verrucomicrobiaceae)를 포함하는 유기체의 C2c1 에서 선택되고, 이때 제1 단편 및 제2 단편은 동일한 박테리아로부터의 것이 아니고; 예를 들어 키메라 이펙터 단백질은 제1 단편 및 제2 단편을 포함하며 여기서 각각의 제1 및 제2 단편은 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) (예를 들어, ATCC 49025), 알리시클로바실러스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans) (예를 들어, DSM 17975), 알리시클로바실러스 마크로스포란지두스 (Alicyclobacillus macrosporangiidus) (예를 들어, DSM 17980), 바실러스 히사시이 (Bacillus hisashii) 균주 C4, 칸디다투스 린도우박테리아 박테리움 (Candidatus Lindowbacteria bacterium) RIFCSPLOWO2, 데술포비브리오 이노피나투스 (Desulfovibrio inopinatus) (예를 들어, DSM 10711), 데술포나트로눔 티오디스무탄스 (Desulfonatronum thiodismutans) (예를 들어, 균주 MLF-1), 엘루시미크로비아 박테리움 (Elusimicrobia bacterium) RIFOXYA12, 옴니트로피카 WOR_2 박테리움 (Omnitrophica WOR_2 bacterium) RIFCSPHIGHO2, 오피투타세애 박테리움 (Opitutaceae bacterium) TAV5, 피시스파에래 박테리움 (Phycisphaerae bacterium) ST-NAGAB-D1, 플란크토마이세테스 박테리움 (Planctomycetes bacterium) RBG_13_46_10, 스피로카에테스 박테리움 (Spirochaetes bacterium) GWB1_27_13, 베루코미크로비아세애 박테리움 (Verrucomicrobiaceae bacterium) UBA2429, 투베리바실러스 칼리두스 (Tuberibacillus calidus) (예를 들어, DSM 17572), 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) (예를 들어, 균주 B4166), 브레비바실러스 sp. (Brevibacillus sp.) CF112, 바실러스 sp. (Bacillus sp.) NSP2.1, 데술파티랍디움 부티라티보란스 (Desulfatirhabdium butyrativorans) (예를 들어, DSM 18734), 알리시클로바실러스 허바리우스 (Alicyclobacillus herbarius) (예를 들어, DSM 13609), 시트로박터 프레운디 (Citrobacter freundii) (예를 들어, ATCC 8090), 브레비바실러스 아그리 (Brevibacillus agri) (예를 들어, BAB-2500), 메틸로박테리움 노둘란스 (Methylobacterium nodulans) (예를 들어, ORS 2060)의 C2c1 에서 선택되고, 이때 제1 및 제2 단편은 동일한 박테리아로부터의 것이 아니다.
보다 바람직한 구현예에서, C2c1p 는 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) (예를 들어, ATCC 49025), 알리시클로바실러스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans) (예를 들어, DSM 17975), 알리시클로바실러스 마크로스포란지두스 (Alicyclobacillus macrosporangiidus) (예를 들어, DSM 17980), 바실러스 히사시이 (Bacillus hisashii) 균주 C4, 칸디다투스 린도우박테리아 박테리움 (Candidatus Lindowbacteria bacterium) RIFCSPLOWO2, 데술포비브리오 이노피나투스 (Desulfovibrio inopinatus) (예를 들어, DSM 10711), 데술포나트로눔 티오디스무탄스 (Desulfonatronum thiodismutans) (예를 들어, 균주 MLF-1), 엘루시미크로비아 박테리움 (Elusimicrobia bacterium) RIFOXYA12, 옴니트로피카 WOR_2 박테리움 (Omnitrophica WOR_2 bacterium) RIFCSPHIGHO2, 오피투타세애 박테리움 (Opitutaceae bacterium) TAV5, 피시스파에래 박테리움 (Phycisphaerae bacterium) ST-NAGAB-D1, 플란크토마이세테스 박테리움 (Planctomycetes bacterium) RBG_13_46_10, 스피로카에테스 박테리움 (Spirochaetes bacterium) GWB1_27_13, 베루코미크로비아세애 박테리움 (Verrucomicrobiaceae bacterium) UBA2429, 투베리바실러스 칼리두스 (Tuberibacillus calidus) (예를 들어, DSM 17572), 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) (예를 들어, 균주 B4166), 브레비바실러스 sp. (Brevibacillus sp.) CF112, 바실러스 sp. (Bacillus sp.) NSP2.1, 데술파티랍디움 부티라티보란스 (Desulfatirhabdium butyrativorans) (예를 들어, DSM 18734), 알리시클로바실러스 허바리우스 (Alicyclobacillus herbarius) (예를 들어, DSM 13609), 시트로박터 프레운디 (Citrobacter freundii) (예를 들어, ATCC 8090), 브레비바실러스 아그리 (Brevibacillus agri) (예를 들어, BAB-2500), 메틸로박테리움 노둘란스 (Methylobacterium nodulans) (예를 들어, ORS 2060)에서 선택되는 박테리아 종에서 유래한다. 특정 구현예에서, C2c1p 는 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) (예를 들어, ATCC 49025), 알리시클로바실러스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans) (예를 들어, DSM 17975)에서 선택되는 박테리아 종에서 유래한다.
특정 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 C2c1 의 상동체 또는 오솔로그는 C2c1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 C2c1 의 상동체 또는 오솔로그는 야생형 C2c1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. C2c1 이 하나 이상의 돌연변이를 갖는 경우 (돌연변이됨), 본원에서 나타내는 바와 같은 상기 C2c1 의 상동체 또는 오솔로그는 돌연변이된 C2c1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다.
한 구현예에서, C2c1 단백질은 알리시클로바실러스 (Alicyclobacillus), 데술포비브리오 (Desulfovibrio), 데술포나트로눔 (Desulfonatronum), 오피투타세애 (Opitutaceae), 투베리바실러스 (Tuberibacillus), 바실러스 (Bacillus), 브레비바실러스 (Brevibacillus), 칸디다투스 (Candidatus), 데술파티랍디움 (Desulfatirhabdium), 엘루시미크로비아 (Elusimicrobia), 시트로박터 (Citrobacter), 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 옴니트로피카이 (Omnitrophicai), 피시스파에래 (Phycisphaerae), 플란크토마이세테스 (Planctomycetes), 스피로카에테스 (Spirochaetes), 및 베루코미크로비아세애 (Verrucomicrobiaceae)를 포함하나 이에 제한되지 않는 속의 유기체의 오솔로그일 수 있고; 특정 구현예에서, V 유형 Cas 단백질은 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) (예를 들어, ATCC 49025), 알리시클로바실러스 콘타미난스 (Alicyclobacillus contaminans) (예를 들어, DSM 17975), 알리시클로바실러스 마크로스포란지이두스 (Alicyclobacillus macrosporangiidus) (예를 들어, DSM 17980), 바실러스 히사시이 (Bacillus hisashii) 균주 C4, 칸디다투스 린도우박테리아 박테리움 (Candidatus Lindowbacteria bacterium) RIFCSPLOWO2, 데술포비브리오 이노피나투스 (Desulfovibrio inopinatus) (예를 들어, DSM 10711), 데술포나트로눔 티오디스무탄스 (Desulfonatronum thiodismutans) (예를 들어, 균주 MLF-1), 엘루시미크로비아 박테리움 (Elusimicrobia bacterium) RIFOXYA12, 옴니트로피카 WOR_2 박테리움 (Omnitrophica WOR_2 bacterium) RIFCSPHIGHO2, 오피투타세애 박테리움 (Opitutaceae bacterium) TAV5, 피시스파에래 박테리움 (Phycisphaerae bacterium) ST-NAGAB-D1, 플란크토마이세테스 박테리움 (Planctomycetes bacterium) RBG_13_46_10, 스피로카에테스 박테리움 (Spirochaetes bacterium) GWB1_27_13, 베루코미크로비아세애 박테리움 (Verrucomicrobiaceae bacterium) UBA2429, 투베리바실러스 칼리두스 (Tuberibacillus calidus) (예를 들어, DSM 17572), 바실러스 써모아밀로보란스 (Bacillus thermoamylovorans) (예를 들어, 균주 B4166), 브레비바실러스 sp. (Brevibacillus sp.) CF112, 바실러스 sp. (Bacillus sp.) NSP2.1, 데술파티랍디움 부티라티보란스 (Desulfatirhabdium butyrativorans) (예를 들어, DSM 18734), 알리시클로바실러스 허바리우스 (Alicyclobacillus herbarius) (예를 들어, DSM 13609), 시트로박터 프레운디 (Citrobacter freundii) (예를 들어, ATCC 8090), 브레비바실러스 아그리 (Brevibacillus agri) (예를 들어, BAB-2500), 메틸로박테리움 노둘란스 (Methylobacterium nodulans) (예를 들어, ORS 2060)를 포함하나 이에 제한되지 않는 종의 유기체의 오솔로그일 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 C2c1의 상동체 또는 오솔로그는 본원에 개시된 C2c1 서열 중 하나 이상과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 C2c1의 상동체 또는 오솔로그는 야생형 AacC2c1 또는 BthC2c1 과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명의 C2c1 단백질은 AacC2c1 또는 BthC2c1 과 적어도 60%, 보다 특히 적어도 70, 예컨대 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가 구현예에서, 본원에서 나타내는 바와 같은 C2c1 단백질은 야생형 AacC2c1 과 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 보다 특히 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 C2c1 단백질은 AacC2c1 과 60% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 당업자는 이것이 C2c1 단백질의 절단된 형태를 포함하고, 이에 의해 서열 동일성은 절단된 형태의 길이에 대해 결정된다는 것을 이해할 것이다.
본 발명에 따른 일정 방법에서, CRISPR-Cas 단백질은 바람직하게는 상응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이되어서 돌연변이된 CRISPR-Cas 단백질이 표적 서열을 함유하는 표적 유전자좌의 한쪽 또는 양쪽 DNA 가닥을 절단하는 능력이 결여된다. 특정 구현예에서, C2c1 단백질의 하나 이상의 촉매 도메인은 표적 서열의 오직 하나의 DNA 가닥을 절단하는 돌연변이된 Cas 단백질을 생성시키도록 돌연변이된다.
특정 구현예에서, CRISPR-Cas 단백질은 상응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이될 수 있어서 돌연변이된 CRISPR-Cas 단백질은 실질적으로 모든 DNA 절단 활성이 결여된다. 일부 구현예에서, CRISPR-Cas 단백질은 돌연변이된 효소의 절단 활성이 효소의 비돌연변이된 형태의 핵산 절단 활성의 약 25%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01% 이하일 때, 모든 DNA 및/또는 RNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 것으로 간주될 수 있고, 예로는 돌연변이된 형태의 핵산 절단 활성이 비돌연변이된 형태와 비교하여 무시할만하거나 또는 전무할 때일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 방법의 일정 구현예에서, CRISPR-Cas 단백질은 오직 하나의 DNA 가닥을 절단하는 돌연변이된 CRISPR-Cas 단백질, 즉 닉카제이다. 보다 특히, 본 발명에서, 닉카제는 비-표적 서열, 즉 표적 서열의 반대쪽 DNA 가닥 상에 있고 PAM 서열의 3'에 있는 서열 내에서 절단을 보장한다. 추가 지침으로서, 제한없이, 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 (Alicyclobacillus acidoterrestris) 유래 C2c1의 Nuc 도메인에서 아르기닌 대 아르기닌 (arginine-to-alanine) 치환 (R911A)은 C2C1을 양쪽 가닥을 절단하는 뉴클레아제에서 (단일 가닥을 절단하는) 닉카제로 전환시킨다. 효소가 AacC2c1이 아닌 경우에, 돌연변이는 상응하는 위치 내 잔기에서 만들어질 수 있다는 것을 당업자는 이해하게 될 것이다.
일부 구현예에서, C2c1 단백질은 RuvC 도메인에 돌연변이를 포함하는 촉매적으로 불활성인 C2c1이다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 불활성인 C2c1 단백질은 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 C2c1 내 아미노산 위치 D570, E848, 또는 D977에 상응하는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 불활성인 C2c1 단백질은 알리시클로바실러스 악시도테레스트리스 C2c1 내 D570A, E848A, 또는 D977A에 상응하는 돌연변이를 포함한다.
RNA-가이드된 C2c1 의 프로그램 가능성, 특이성 및 부차적 활성은 또한 핵산의 비특이적 절단을 위한 이상적인 전환가능 뉴클레아제를 가능하게 한다. 한 구현예에서, C2c1 시스템은 RNA의 부차적인 비특이적 절단을 제공하고 이용하도록 조작된다. 또 다른 구현예에서, C2c1 시스템은 ssDNA 의 부차적인 비특이적 절단을 제공하고 이용하도록 조작된다. 따라서, 조작된 C2c1 시스템은 핵산 검출 및 전사체 조작, 및 세포 사멸 유도를 위한 플랫폼을 제공한다. C2c1 은 포유동물 전사물 녹다운 및 결합 도구로서 사용하기 위해 개발된다. C2c1 은 서열 특이적 표적화된 DNA 결합에 의해 활성화될 때 RNA 및 ssDNA 의 강건한 부차적인 절단을 가능하게 한다.
특정 구현예에서, C2c1은 시험관 내 시스템 또는 세포에서 일시적으로 또는 안정적으로 제공되거나 발현되고, 세포 핵산을 비특이적으로 절단하도록 표적화되거나 또는 촉발된다. 한 구현예에서, C2c1은 ssDNA, 예를 들어 바이러스 ssDNA를 녹다운시키도록 조작된다. 다른 구현예에서, C2c1은 RNA를 녹다운시키도록 조작된다. 시스템은 녹다운이 세포 또는 시험관 내 시스템에 존재하는 표적 DNA에 의존하거나, 시스템 또는 세포로 표적 핵산의 첨가에 의해 촉발되도록 고안될 수 있다.
한 구현예에서, C2c1 시스템은 예를 들어 비정상 DNA의 절단이 불완전할 수 있거나 또는 비효율적일 수 있는 경우에, 비정상 DNA 서열의 존재에 의해 구별될 수 있는 세포의 서브세트에서 RNA를 비-특이적으로 절단하도록 조작된다. 하나의 비-제한적인 예에서, 암 세포에 존재하고 세포 형질전환을 유도하는 DNA 전좌가 표적화된다. 염색체 DNA를 받고 복구되는 세포의 소집단은 생존할 수 있는 반면, 비특이적인 부차적 리보뉴클레아제 활성은 유리하게는 잠재적 생존자의 세포 사멸을 초래한다.
부차적 활성은 최근에 많은 임상 진단에 유용한 SHERLOCK 으로 불리는 매우 민감하고 특이적인 핵산 검출 플랫폼에 영향을 주었다 (Gootenberg, J. S. et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 356, 438-442 (2017)).
본 발명에 따르면, 조작된 C2c1 시스템은 DNA 또는 RNA 엔도뉴클레아제 활성을 위해 최적화되고 포유동물 세포에서 발현될 수 있고 세포에서 리포터 분자 또는 전사물을 효과적으로 녹다운시키는 것을 목표로 한다.
2. 가이드 RNA
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가이드 서열", "crRNA", "가이드 RNA" 또는 "단일 가이드 RNA" 또는 "gRNA" 는 표적 핵산 서열과 하이브리드화하고 표적 핵산 서열에 대한 가이드 서열 및 CRISPR 이펙터 단백질을 포함하는 RNA-표적화 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 표적 핵산 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일부 예시적 구현예에서, 적합한 정렬 알고리즘을 이용하여 최적으로 정렬될 때 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기에 적합한 임의의 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있으며, 그의 비제한적인 예는 스미스-워터만 (Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬 (Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우즈-휠러 트랜스폼 (Burrows-Wheeler Transform) 에 기초한 알고리즘 (예를 들어, 버로우즈 휠러 얼라이너 (Burrows Wheeler Aligner)), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies: www.novocraft.com 에서 이용가능함), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (soap.genomics.org.cn 에서 이용가능) 및 Maq (maq.sourceforge.net 에서 이용가능) 를 포함한다. 표적 핵산 서열에 대한 핵산-표적화 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 (핵산-표적화 가이드 RNA 내의) 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 어세이에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험하려는 가이드 서열을 포함하여, 핵산-표적화 복합체를 형성하는 데 충분한 핵산-표적화 CRISPR 시스템의 성분은 해당 표적 핵산 서열을 갖는 숙주 세포에, 예컨대, 핵산-표적화 복합체 성분을 코딩하는 벡터에 의한 형질감염 이후에, 표적 핵산 서열 내의 우선적인 표적화 (예를 들어, 절단)의 평가, 예컨대, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 Surveyor 어세이에 의해 제공될 수 있다. 유사하게는, 표적 핵산 서열의 절단은 시험될 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 비롯한, 핵산-표적화 복합체 성분인 표적 핵산 서열을 제공함으로써, 그리고 시험 가이드 서열과 대조군 가이드 서열 반응 사이의 표적 서열에서 결합 또는 절단 비율을 비교함으로써 시험 튜브에서 평가될 수 있다. 다른 어세이가 가능하며, 당업자에게 떠오를 것이다. 임의의 표적 핵산 서열을 표적화하기 위해 가이드 서열, 및 그에 따른 핵산-표적화 가이드가 선택될 수 있다. 표적 서열은 DNA 일 수 있다. 표적 서열은 임의의 RNA 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 메신저 RNA(mRNA), 프리-mRNA, 리보솜 RNA(rRNA), 전달 RNA(tRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 소형 핵 RNA (snRNA), 소형 핵소체(small nucleolar RNA:snoRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 비-코딩 RNA (ncRNA), 장형 비-코딩 RNA(lncRNA) 및 소형 세포질 RNA(scRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 mRNA, 프리-mRNA 및 rRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 ncRNA 및 lncRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 더 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 mRNA 분자 또는 프리-mRNA 분자 내의 서열일 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산-표적화 가이드는 핵산-표적화 가이드 내에서 2차 구조 정도를 감소시키도록 선택된다. 일부 구현예에서, 최적으로 폴딩될 때 핵산-표적화 가이드의 뉴클레오티드의 약 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 이하가 자기-상보성 염기 쌍형성에 참여한다. 최적 폴딩은 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 일부 프로그램은 최소 깁스(Gibbs) 자유 에너지 계산에 기반한다. 이러한 알고리즘의 일례는 Zuker 및 Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148)가 기술한 mFold이다. 다른 예의 폴딩 알고리즘은 중심 구조 예측 알고리즘을 사용하여, 유니버시티 오브 비엔나 (University of Vienna)의 이론 화학 연구소 (Institute for Theoretical Chemistry)에서 개발한, 온라인 웹서버 RNAfold이다 (예를 들어, [A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23- 24]; 및 [PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151- 62] 참조).
일정 구현예에서, 가이드 RNA 또는 crRNA는 직접 반복부 (DR) 서열 및 가이드 서열 또는 스페이서 서열을 포함할 수 있거나, 그로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 또는 그로 이루어질 수 있다. 일정 구현예에서, 가이드 RNA 또는 crRNA 는 가이드 서열 또는 스페이서 서열에 융합되거나 연결된 직접 반복 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 그로 이루어질 수 있거나, 그로 이루어질 수 있다. 일정 구현예에서, 직접 반복부 서열은 가이드 서열 또는 스페이서 서열의 상류 (즉, 5') 에 위치될 수 있다. 다른 구현예에서, 직접 반복부 서열은 가이드 서열 또는 스페이서 서열의 하류 (즉, 3') 에 위치될 수 있다.
일정 구현예에서, crRNA 는 스템 루프, 바람직하게 단일 스템 루프를 포함한다. 일정 구현예에서, 직접 반복부 서열은 스템 루프, 바람직하게 단일 스템 루프를 형성한다.
일정 구현예에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 15 내지 35 nt 이다. 일정 구현예에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 적어도 15 개 뉴클레오티드이다. 일정 구현예에서, 스페이서 길이는 15 내지 17 nt, 예를 들어, 15, 16, 또는 17 nt, 17 내지 20 nt, 예를 들어 17, 18, 19, 또는 20 nt, 20 내지 24 nt, 예를 들어, 20, 21, 22, 23, 또는 24 nt, 23 내지 25 nt, 예를 들어, 23, 24, 또는 25 nt, 24 내지 27 nt, 예를 들어, 24, 25, 26, 또는 27 nt, 2730 nt, 예를 들어, 27, 28, 29, 또는 30 nt, 3035 nt, 예를 들어, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35 nt, 또는 35 nt 또는 그 이상의 길이이다.
일반적으로, CRISPR-Cas, CRISPR-Cas9 또는 CRISPR 시스템은 전술한 문헌, 예컨대 WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667)에서 사용된 대로 일 수 있고 Cas 유전자, 특히 CRISPR-Cas9의 경우에 Cas9 유전자를 코딩하는 서열, tracr (trans-activating CRISPR) 서열 (예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열 (내생성 CRISPR 시스템의 경우에 "직접 반복부" 및 tracrRNA-프로세싱된 부분 직접 반복부 포함), 가이드 서열 (내생성 CRISPR 시스템의 경우에 "스페이서"라고도 함), 또는 이 용어가 본 명세서에서 사용되는 대로의 "RNA(들)" (예를 들어, 가이드 Cas9에 대한 RNA(들), 예를 들어, CRISPR RNA 및 트랜스활성화 (tracr) RNA 또는 단일 가이드 RNA (sgRNA) (키메라 RNA)) 또는 CRISPR 유전자좌 유래의 다른 서열 및 전사물을 포함하는, CRISPR-연관 ("Cas") 유전자의 발현 또는 그의 활성 유도에 관여하는 전사물 및 다른 엘리먼트를 집합적으로 의미한다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열 (내생성 CRISPR 시스템의 경우 프로토스페이서라고도 함)의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 엘리먼트를 특징으로 한다. CRISPR 복합체의 형성 상황에서, "표적 서열"은 가이드 서열이 상보성을 갖도록 디자인되는 서열을 의미하고, 여기서 표적 서열과 가이드 서열 사이의 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 표적 서열에 대한 상보성이 절단 활성에 중요한 가이드 서열의 섹션은 본 명세서에서 씨드 서열로서 지칭된다. 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치되고, 미토콘드리아, 세포기관, 소수포, 리포솜 또는 세포 내에 존재하는 입자에서의 또는 이들로부터의 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 특히 비-핵 용도를 위해, NLS 는 바람직하지 않다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템은 하나 이상의 핵 유출 신호 (NES) 를 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템은 하나 이상의 NLS 및 하나 이상의 NES 를 포함한다. 일부 구현예에서, 직접 반복부는 임의의 또는 전체의 하기 기준을 충족하는 반복적 모티프를 검색하여 인 실리코에서 확인될 수 있다: 1. II형 CRISPR 유전자좌에 측접하는 게놈 서열의 2 Kb 창 내에서 발견; 2. 20 내지 50 bp 범위; 및 3. 20 내지 50 bp 간격. 일부 구현예에서, 이들 기준 중 2가지, 예를 들어, 1과 2, 2와 3, 또는 1과 3이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 3 가지 기준 모두가 사용될 수 있다.
본 발명의 구현예에서 용어 가이드 서열 및 가이드 RNA, 즉 Cas를 표적 게놈 유전자좌로 가이드할 수 있는 RNA는 앞서 인용된 문헌 예컨대 WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667)에서 처럼 상호교환적으로 사용된다. 일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 하이브리드화하고 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하도록 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, 적합한 정렬 알고리즘을 사용해 최적으로 정렬시, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 최적 정렬은 서열을 정렬시키기 위한 임의의 적합한 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있고, 이의 비제한적인 예는 스미스-워터만 알고리즘 (Smith-Waterman), 니들만-분치 (Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우즈-휠러 (Burrows-Wheeler) 변환을 기반으로 하는 알고리즘 (예를 들어, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; www.novocraft.com에서 입수가능), ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (soap.genomics.org.cn에서 입수가능), 및 Maq (maq.sourceforge.net에서 입수가능)을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게는, 가이드 서열은 10 내지 30개의 뉴클레오티드 길이이다. 표적 서열과 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 어세이를 통해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험하려는 가이드 서열을 포함하여, CRISPR 복합체를 형성하는데 충분한 CRISPR 시스템의 성분은 예컨대 CRISPR 서열의 성분을 코딩하는 벡터로 형질감염을 통해서 해당 표적 서열을 갖는 숙주 세포에게 제공될 수 있고, 그 이후에 예컨대 본 명세서에 기술된 바와 같은 Surveyor 어세이에 의해 표적 서열 내 우선적인 절단의 평가가 후속될 수 있다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은 표적 서열, 시험되는 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체의 성분을 제공하고, 표적 서열에서 시험 및 대조군 가이드 서열 반응 간의 결합 또는 절단 비율을 비교함으로써 시험관에서 평가될 수 있다. 다른 어세이가 가능하며, 해당 분야의 숙련자에게 일어날 것이다.
CRISPR-Cas 시스템의 일부 구현예에서, 가이드 서열과 이에 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 또는 100% 이상일 수 있고; 가이드 또는 RNA 또는 sgRNA 는 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있거나; 가이드 또는 RNA 또는 sgRNA 는 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 개 이하의 뉴클레오티드 길이일 수 있고; 유리하게는 tracr RNA 는 30 또는 50 개 뉴클레오티드 길이이다. 그러나, 본 발명의 양상은 오프-표적 상호작용을 감소시키는 것이고, 예를 들어 낮은 상보성을 갖는 표적 서열과 상호작용하는 가이드를 감소시키는 것이다. 실제로, 예에서, 80% 내지 약 95% 상보성, 예를 들어, 83%- 84% 또는 88- 89% 또는 94- 95% 초과의 상보성을 갖는 오프-표적 서열과 표적 서열을 구별할 수 있는 CRISPR-Cas 시스템을 생성시키는 돌연변이를 포함한다는 것을 보여준다 (예를 들어, 18 개 뉴클레오티드를 갖는 표적과 1, 2 또는 3 개 미스매치를 갖는 18 개 뉴클레오티드의 오프-표적을 구별함). 따라서, 본 발명의 문맥에서, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 간 상보성의 정도는 94.5% 또는 95% 또는 95.5% 또는 96% 또는 96.5% 또는 97% 또는 97.5% 또는 98% 또는 98.5% 또는 99% 또는 99.5% 또는 99.9%, 또는 100%를 초과한다. 오프 표적은 서열과 가이드 간에 100% 또는 99.9% 또는 99.5% 또는 99% 또는 99% 또는 98.5% 또는 98% 또는 97.5% 또는 97% 또는 96.5% 또는 96% 또는 95.5% 또는 95% 또는 94.5% 또는 94% 또는 93% 또는 92% 또는 91% 또는 90% 또는 89% 또는 88% 또는 87% 또는 86% 또는 85% 또는 84% 또는 83% 또는 82% 또는 81% 또는 80% 미만의 상보성이며, 오프 표적이 서열과 가이드 간에 100% 또는 99.9% 또는 99.5% 또는 99% 또는 99% 또는 98.5% 또는 98% 또는 97.5% 또는 97% 또는 96.5% 또는 96% 또는 95.5% 또는 95% 또는 94.5% 의 상보성인 것이 유리하다.
가이드 변형
일정 구현예에서, 본 발명의 가이드는 비천연 발생 핵산 및/또는 비천연 발생 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체, 및/또는 화학적 변형을 포함한다. 비천연 발생 핵산은 예를 들어 천연 및 비천연 발생 뉴클레오티드의 혼합물을 포함한다. 비천연 발생 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체는 리보스, 포스페이트, 및/또는 염기 모이어티에서 변형될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 가이드 핵산은 리보뉴클레오티드 및 비-리보뉴클레오티드를 포함한다. 하나의 이러한 구현예에서, 가이드는 하나 이상의 리보뉴클레오티드 및 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 가이드는 하나 이상의 비-천연 발생 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 포스포로티오에이트 결합, 보라노포스페이트 결합이 있는 뉴클레오티드, 리보스 고리의 2' 및 4' 탄소 사이에 메틸렌 브릿지를 포함하는 잠금 핵산(LNA) 뉴클레오티드 또는 브릿징된 핵산(BNA)을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드의 다른 예는 2'-O-메틸 유사체, 2'-데옥시 유사체, 2-티오우리딘 유사체, N6-메틸아데노신 유사체, 또는 2'-플루오로 유사체를 포함한다. 변형된 염기의 추가의 예에는 2-아미노퓨린, 5-브로모-우리딘, 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸슈도우리딘 (me1Ψ), 5-메톡시우리딘(5moU), 이노신, 7-메틸구아노신이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 가이드 RNA 화학적 변형의 예는 제한없이, 하나 이상의 말단 뉴클레오티드에 2'-O-메틸 (M), 2'-O-메틸-3'-포스포로티오에이트 (MS), 포스포로티오에이트 (PS), S-구속형 에틸(cEt), 또는 2'-O-메틸-3'-티오PACE (MSP)의 도입을 포함한다. 이러한 화학적으로 변형된 가이드는, 온 (on)-표적 대 오프 (off)-표적 특이성이 예측가능하지 않다고 해도, 비변형 가이드에 비해 증가된 안정성 및 증가된 활성을 포함할 수 있다. (Hendel, 2015, Nat Biotechnol. 33(9):985-9, doi:10.1038/nbt.3290, 2015년 6월 29일자로 온라인 공개; Ragdarm et al., 0215, PNAS, E7110-E7111; Allerson et al., J.Med.Chem.2005, 48:901-904; Bramsen et al., Front.Genet., 2012, 3:154; Deng et al., PNAS, 2015, 112:11870-11875; Sharma et al., MedChemComm., 2014, 5:1454-1471; Hendel et al., Nat.Biotechnol.(2015) 33(9): 985-989; Li et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1, 0066 DOI:10.1038/s41551-017-0066). 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 5' 및/또는 3' 말단은 형광성 염료, 폴리에틸렌 글리콜, 콜레스테롤, 단백질, 또는 검출 태그를 포함한 다양한 기능성 모이어티에 의해 변형된다 (Kelly et al., 2016, J.Biotech.233:74-83). 일정 구현예에서, 가이드는 표적 DNA에 결합하는 영역에 리보뉴클레오티드 및 Cas9, Cpf1, 또는 C2c1에 결합하는 영역에 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 본 발명의 한 구현예에서, 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체는 조작된 가이드 구조, 예컨대, 제한 없이 5' 및/또는 3' 말단, 스템-루프 영역, 및 씨드 영역에 혼입된다. 특정 구현예에서, 변형은 스템-루프 영역의 5'-핸들에 있지 않다. 가이드의 스템-루프 영역의 5'-핸들에서의 화학적 변형은 그 기능을 소멸시킬 수 있다 (참조, Li, et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1:0066). 특정 구현예에서, 가이드의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75개의 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 가이드의 3' 또는 5' 말단에서 35개 뉴클레오티드는 화학적으로 변형된다. 일부 구현예에서, 오직 소수의 변형, 예컨대 2'-F 변형이 씨드 영역에 도입된다. 일부 구현예에서, 2'-F 변형이 가이드의 3' 말단에 도입된다 일정 실시형태에서, 가이드의 5' 및/또는 3' 말단에서 3개 내지 5개 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 (M), 2'-O-메틸 3' 포스포로티오에이트 (MS), S-구속형 에틸 (cEt), 또는 2'-O-메틸 3' 티오PACE (MSP)로 화학적으로 변형된다. 이러한 변형은 게놈 편집 효율을 증강시킬 수 있다 ([Hendel et al., Nat.Biotechnol.(2015) 33(9): 985-989] 참조). 일정 구현예에서, 가이드의 모든 포스포디에스테르 결합은 유전자 파괴 수준을 증강시키기 위해 포스포로티오에이트 (PS)로 치환된다. 일정 구현예에서, 가이드의 5' 및/또는 3' 말단에서 5개 초과의 뉴클레오티드가 2'-O-Me, 2'-F 또는 S-구속형 에틸(cEt)로 화학적으로 치환된다. 이러한 화학적으로 변형된 가이드는 유전자 파괴의 증강된 수준을 매개할 수 있다 ([Ragdarm et al., 0215, PNAS, E7110-E7111] 참조). 본 발명의 일 구현예에서, 가이드는 이의 3' 및/또는 5' 말단에서 화학적 모이어티를 포함하도록 변형된다. 이러한 모이어티는 제한없이, 아민, 아지드, 알킨, 티오, 디벤조시클로옥틴 (DBCO), 또는 로다민을 포함한다. 일정 구현예에서, 화학적 모이어티는 링커, 예컨대 알킬 사슬을 통해서 가이드에 접합된다. 일정 구현예에서, 변형된 가이드의 화학적 모이어티는 다른 분자, 예컨대 DNA, RNA, 단백질, 또는 나노입자에 가이드를 부착시키는데 사용될 수 있다. 이러한 화학적으로 변형된 가이드는 CRISPR 시스템에 의해 유전적으로 편집된 세포를 확인하거나 또는 농축시키는데 사용될 수 있다 ([Lee et al., eLife, 2017, 6:e25312, DOI:10.7554] 참조).
일정 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 CRISPR 시스템은 가이드 서열을 포함하는 crRNA 또는 유사한 폴리뉴클레오티드를 사용할 수 있고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA 또는 RNA 및 DNA 의 혼합물이고/이거나, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 서열은 벌지 (bulge), 헤어핀 또는 스템 루프 구조와 같은 천연 crRNA 의 구조를 비제한적으로 포함하는 임의의 구조를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 가이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 서열일 수 있는 제 2 폴리뉴클레오티드 서열과 듀플렉스를 형성한다.
특정 구현예에서, 화학적으로 변형된 가이드 RNA 가 사용된다. 가이드 RNA 화학 변형의 예로는, 이로 제한되지는 않지만, 하나 이상의 말단 뉴클레오티드에서 2'-O-메틸 (M), 2'-O-메틸 3'포스포로티오에이트 (MS), 또는 2'-O-메틸 3'티오PACE (MSP) 의 혼입을 포함한다. 이러한 화학적으로 변형된 가이드 RNA 는, 온-표적 대 오프-표적 특이성이 예측가능하지 않다고 해도, 비변형 가이드 RNA 에 비해 증가된 안정성 및 증가된 활성을 포함할 수 있다. (2015년 6월 29일 자로 온라인 공개된, [Hendel, 2015, Nat Biotechnol. 33(9):985-9, doi: 10.1038/nbt.3290] 참조). 화학적으로 변형된 가이드 RNA 는 포스포로티오에이트 결합 및 리보오스 고리의 2' 및 4' 탄소 사이에 메틸렌 브릿지를 포함하는 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드를 갖는 RNA 를 추가로 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게, 가이드 서열은 10 내지 30 개 뉴클레오티드 길이이다. 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 어세이를 통해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험하려는 가이드 서열을 포함하여, CRISPR 복합체를 형성하는데 충분한 CRISPR 시스템의 성분은 예컨대 CRISPR 서열의 성분을 코딩하는 벡터로 형질감염을 통해서 해당 표적 서열을 갖는 숙주 세포에게 제공될 수 있고, 그 이후에 예컨대 본 명세서에 기술된 바와 같은 Surveyor 어세이에 의해 표적 서열 내 우선적인 절단의 평가가 후속될 수 있다. 유사하게, 표적 RNA의 절단은 표적 서열, 시험하려는 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체의 성분 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 제공하고, 시험 및 대조군 가이드 서열 반응 간에 표적 서열의 결합 또는 절단 속도를 비교하여 시험관에서 평가될 수 있다. 다른 어세이도 가능하고, 당업자에게 자명할 것이다.
일부 구현예에서, 가이드에 대한 변형은 화학적 변형, 삽입, 결실 또는 분할이다. 일부 구현예에서, 화학적 변형은 2'-O-메틸 (M) 유사체, 2'-데옥시 유사체, 2- 티우리딘 유사체, N6-메틸아데노신 유사체, 2'-플루오로 유사체, 2-아미노푸린, 5-브로모-우리딘, 슈도우리딘 (Ψ), N1-메틸슈도우리딘 (me1Ψ), 5-메톡시우리딘 (5moU), 이노신, 7- 메틸구아노신, 2'-O-메틸-3'-포스포로티오에이트 (MS), S-속박된 에틸 (cEt), 포스포로티오에이트 (PS) 또는 2'-O-메틸-3'-티오PACE (MSP)의 혼입을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서 가이드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형을 포함한다. 특정 구현예에서, 가이드의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 25개의 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 일정 구현예에서, 씨드 영역 내의 하나 이상의 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 일정 구현예에서, 3’-말단 내의 하나 이상의 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. 일정 구현예에서, 5'-핸들 내 뉴클레오티드는 화학적으로 변형되지 않는다. 일부 구현예에서, 씨드 영역 내 화학적 변형은 소수의 변형, 예컨대 2'-플루오로 유사체의 도입이다. 특정 구현예에서, 씨드 영역의 하나의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 유사체로 치환된다. 일부 구현예에서, 3’-말단 내의 5 또는 10 개의 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된다. Cpf1 CrRNA의 3'-말단에서 이러한 화학적 변형은 유전자 절단 효율을 개선시킨다 ([Li, et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1:0066] 참조). 특별한 구현예에서, 3'-말단의 5개 뉴클레오티드는 2'-플루오로 유사체로 치환된다. 특별한 구현예에서, 3’-말단 내의 10개의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 유사체로 치환된다. 특별한 구현예에서, 3’-말단 내의 5 개 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 (M) 유사체로 치환된다.
일부 구현예에서, 가이드의 5'-핸들의 루프가 변형된다. 일부 구현예에서, 가이드의 5'-핸들의 루프는 결실, 삽입, 분할 또는 화학적 변형을 갖도록 변형된다. 일정 구현예에서, 루프는 3, 4 또는 5 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일정 구현예에서, 루프는 UCUU, UUUU, UAUU, 또는 UGUU의 서열을 포함한다.
가이드 서열, 및 따라서 핵산-표적화 가이드 RNA는 임의의 표적 핵산 서열 또는 표적 분자를 표적화하도록 선택될 수 있다. CRISPR 복합체의 형성의 맥락에서, "표적 서열" 또는 "표적 분자"는 가이드 서열이 상보성을 갖도록 디자인된 서열 또는 분자를 지칭하며, 여기서, 표적 서열과 가이드 서열 간의 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시킨다. 표적 서열은 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 용어 "표적 RNA"는 표적 서열이거나 또는 그를 포함하는 RNA 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 달리 말해서, 표적 RNA는 gRNA, 즉 가이드 서열의 일부분이 상보성을 갖도록 디자인되고 CRISPR 이펙터 단백질 및 gRNA를 포함하는 복합체에 의해 매개되는 이펙터 기능이 유도되게 하는 RNA 폴리뉴클레오티드 또는 RNA 폴리뉴클레오티드의 일부분일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치된다. 표적 서열은 DNA 일 수 있다. 표적 서열은 임의의 RNA 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 메신저 RNA (mRNA), 프리-mRNA, 리보솜 RNA (rRNA), 전달 RNA (tRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 소형 핵 RNA (snRNA), 소형 핵 RNA (snoRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 비코딩 RNA (ncRNA), 장형 비코딩 RNA (lncRNA), 및 소형 세포질 RNA (scRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 RNA 분자 내 서열일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 mRNA, 프리-mRNA 및 rRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 ncRNA 및 lncRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 더 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 mRNA 분자 또는 프리-mRNA 분자 내의 서열일 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 분자는 표적 DNA이다. 일부 구현예에서, 스템은 표적 DNA에 결합하고 RNA 중합효소 프로모터를 포함하는 프라이머를 더 포함할 수 있다.
일정 구현예에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 28 개 미만의 뉴클레오티드이다. 일정 구현예에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 적어도 18 개 뉴클레오티드 및 28 개 미만의 뉴클레오티드이다. 일정 구현예에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 19 내지 28 개 뉴클레오티드이다. 일정 구현예에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 19 내지 25 개 뉴클레오티드이다. 일정 구현예에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 20 개 뉴클레오티드이다. 일정 구현예에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 23 개 뉴클레오티드이다. 일정 구현예에서, 가이드 RNA 의 스페이서 길이는 25 개 뉴클레오티드이다.
일정 구현예에서, 절단 효율의 조절은 스페이서/표적을 따라 미스매치의 위치를 포함하여, 스페이서 서열 및 표적 서열 간에 미스매치, 예를 들어 하나 이상의 미스매치, 예컨대 1 또는 2개 미스매치의 도입에 의해 활용될 수 있다. 예를 들어 보다 중심 (즉, 3' 또는 5' 가 아님) 에 이중 미스매치가 존재할수록, 절단 효율이 보다 영향받는다. 따라서, 스페이서를 따라서 미스매치 위치를 선택함으로써, 절단 효율이 조절될 수 있다. 예로서, 표적의 100 % 미만의 절단이 바람직하면 (예를 들어, 세포 개체군에서), 스페이서 및 표적 서열 간에 하나 이상, 예컨대 바람직하게는 2 개 미스매치가 스페이서 서열에 도입될 수 있다. 미스매치 위치의 스페이서를 따라서 보다 중심일수록, 절단 비율은 더 낮다.
일정한 예의 구현예에서, 절단 효율은 단일 뉴클레오티드, 예컨대 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP), 변이, 또는 (점) 돌연변이가 다른 둘 이상의 표적을 구별할 수 있는 단일 가이드를 디자인하기 위해 활용될 수 있다. CRISPR 이펙터는 SNP (또는 다른 단일 뉴클레오티드 변이) 에 대한 감도를 감소시킬 수 있고 일정한 수준의 효율로 SNP 표적을 계속 절단할 수 있다. 따라서, 2개 표적, 또는 표적 세트의 경우에, 가이드 RNA는 표적 중 하나와 상보적인 뉴클레오티드 서열, 즉 온-표적 SNP를 갖도록 디자인될 수 있다. 가이드 RNA는 합성 미스매치를 갖도록 더욱 디자인된다. 본 명세서에서 사용되는 "합성 미스매치"는 천연 발생 SNP의 상류 또는 하류에 도입되는 비천연 발생 미스매치, 예컨대 상류 또는 하류에 5개 이하의 뉴클레오티드, 예를 들어 상류 또는 하류에 4, 3, 2, 또는 1개의 뉴클레오티드, 바람직하게 상류 또는 하류에 3개 이하의 뉴클레오티드, 더 바람직하게 상류 또는 하류에 2개 이하의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 상류 또는 하류에 1개 뉴클레오티드 (즉, SNP에 인접)를 의미한다. CRISPR 이펙터가 온-표적 SNP 에 결합할 때, 오직 단일 미스매치가 합성 미스매치와 함께 형성될 것이고, CRISPR 이펙터는 계속 활성화될 것이며 검출가능한 신호가 생성될 것이다. 가이드 RNA 가 오프-표적 SNP 와 하이브리드화될 때, SNP 로부터의 미스매치 및 합성 미스매치의, 2 개 미스매치가 형성될 것이고, 검출가능한 신호는 발생되지 않을 것이다. 따라서, 본원에 개시된 시스템은 개체군 내에서 SNP 를 구별하도록 디자인될 것이다. 예를 들어, 시스템은 단일 SNP 가 상이한 병원성 균주를 구별하거나 또는 일정한 질환 특이적 SNP, 예컨대 비제한적으로, 질환 연관된 SNP, 예컨대 비제한적으로, 암 연관된 SNP 를 검출하는데 사용될 수 있다.
일정 구현예에서, 가이드 RNA 는 SNP 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 에 위치되도록 디자인된다. 일정 구현예에서, 가이드 RNA 는 SNP 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9 에 위치되도록 디자인된다. 일정 구현예에서, 가이드 RNA 는 SNP 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 에 위치되도록 디자인된다. 일정 구현예에서, 가이드 RNA 는 SNP 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 3, 4, 5, 또는 6 에 위치되도록 디자인된다. 일정 구현예에서, 가이드 RNA 는 SNP 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 3 에 위치되도록 디자인된다.
일정한 구현예에서, 가이드 RNA는 미스매치 (예를 들어, 합성 미스매치, 즉 SNP 이외의 추가 돌연변이)가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30에 위치되도록 디자인된다. 일정한 구현예에서, 가이드 RNA는 미스매치가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9에 위치되도록 디자인된다. 일정 구현예에서, 가이드 RNA 는 미스매치가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 4, 5, 6, 또는 7 에 위치되도록 디자인된다. 일정 구현예에서, 가이드 RNA 는 미스매치가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 5 에 위치하도록 디자인된다.
일정 구현예에서, 가이드 RNA 는 미스매치가 SNP 의 상류 2 개 뉴클레오티드 (즉, 하나의 개재 뉴클레오티드) 에 위치되도록 디자인된다.
일정 구현예에서, 가이드 RNA 는 미스매치가 SNP 의 하류 2 개 뉴클레오티드 (즉, 하나의 개재 뉴클레오티드) 에 위치되도록 디자인된다.
일정 구현예에서, 가이드 RNA 는 미스매치가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 5 에 위치되도록, 그리고 SNP 가 스페이서 서열의 (5' 말단에서 시작하여) 위치 3 에 위치되도록 디자인된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 본 명세서에 기술된 바와 같이 표적 RNA 또는 DNA 내 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하도록 디자인될 수 있거나, 또는 RNA 전사물의 스플라이스 변이체를 검출하도록 디자인될 수 있다.
본 명세서에 기술된 구현예는 본 명세서에 기술된 바와 같이 벡터를 세포에 전달하는 단계를 포함하는 본 명세서에 기술된 바와 같은 진핵생물 세포 (시험관내, 즉 단리된 진핵생물 세포)에서 하나 이상의 뉴클레오티드 변형을 유도하는 것을 이해한다. 돌연변이(들)는 가이드(들) RNA(들)를 통해서 세포(들)의 각 표적 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들) 를 통해서 상기 세포(들) 의 각 표적 서열에서 1- 75 개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들) 를 통해서 상기 세포(들) 의 각 표적 서열에서 1, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75 개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들) 를 통해서 상기 세포(들) 의 각 표적 서열에서 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75 개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들) 를 통해서 상기 세포(들) 의 각 표적 서열에 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75 개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함한다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들) 를 통해서 상기 세포(들) 의 각 표적 서열에 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75 개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들) 를 통해서 상기 세포(들) 의 각 표적 서열에 40, 45, 50, 75, 100, 200, 300, 400 또는 500 개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다.
전형적으로, 내생성 CRISPR 시스템의 상황에서, CRISPR 복합체 (표적 서열과 하이브리드화하고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체를 형성하는 가이드 서열 포함) 의 형성은 그 결과로 표적 서열 내 또는 그 근처 (예를 들어, 표적 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 개 이상의 염기쌍 이내) 에서 절단을 일으키지만, 특히 RNA 표적의 경우에, 예를 들어 2차 구조에 의존적일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "차폐성 구성체"는 본 명세서에 기술된 활성화된 CRISPR 시스템 이펙터 단백질에 의해 절단될 수 있거나 또는 달리 탈활성화될 수 있는 분자이다. 용어 "차폐성 구성체"는 또한 "검출 구성체"로서 대체하여 언급될 수있다. 일정 예의 실시형태에서, 차폐성 구성체는 RNA-기반 차폐성 구성체이다. RNA-기반 차폐성 구성체는 CRISPR 이펙터 단백질에 의해 절단될 수 있는 핵산 구성요소를 포함한다. RNA 구성요소의 절단은 작용제를 방출하거나 또는 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있는 입체형태 변화를 일으킨다. RNA 구성요소를 검출가능한 신호의 발생을 방지하거나 또는 차폐시키는데 사용하는 방법을 입증한 예시적인 구성체를 하기에 기술하며 본 발명의 구현예는 이의 별형을 포함한다. 절단 전에, 또는 차폐성 구성체가 ‘활성’ 상태일 때, 차폐성 구성체는 양성 감출가능한 신호의 발생 또는 검출을 차단한다. 일정 예의 구현예에서 최소의 배경치 신호가 활성 RNA 차폐성 구성체의 존재 하에서 생성될 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다. 양성 검출가능한 신호는 광학, 형광, 화학발광, 전기화학 또는 다른 당분야에 공지된 검출 방법을 사용해 검출될 수 있는 임의 신호일 수 있다. 용어 "양성 검출가능한 신호"는 차폐성 구성체의 존재 하에서 검출할 수 있는 다른 검출가능한 신호를 구별하는데 사용된다. 예를 들어, 일정 구현예에서, 제1 신호 (즉, 음성 검출가능한 신호)는 차폐제가 존재할 때 검출될 수 있고, 활성화된 CRISPR 이펙터 단백질에 의한 차폐제의 절단 또는 탈활성화 및 표적 분자의 검출 시에 제2 신호 (예를 들어, 양성 검출가능한 신호)로 전환된다.
일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 유전자 생성물의 발생을 억제할 수 있다. 유전자 생성물은 샘플에 첨가되는 리포터 구성체에 의해 코딩될 수 있다. 차폐성 구성체는 RNA 간섭 경로에 관여하는 간섭 RNA, 예컨대 짧은 헤어핀 RNA (shRHN) 또는 소형 간섭 RNA (siRNA)일 수 있다. 차폐성 구성체는 또한 마이크로RNA (miRNA)를 포함할 수 있다. 존재하면서, 차폐성 구성체는 유전자 생성물의 발현을 억제한다. 유전자 생성물은 형광성 단백질 또는 다른 RNA 전사물 또는 달리 표지된 프로브, 압타머, 또는 항체에 의해 검출가능한 단백질일 수 있지만 차폐성 구성체의 존재를 위한 것일 수 있다. 이펙터 단백질의 활성화 시에 차폐성 구성체는 절단되거나 또는 달리 침묵화되어서 양성 검출가능한 신호로서 유전자 생성물의 발현 및 검출이 가능하게 된다.
일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 차폐성 구성체로부터 하나 이상의 시약의 방출이 검출가능한 양성 신호의 발생을 일으키도록 검출가능한 양성 신호를 발생시키는데 필요한 하나 이상의 시약을 격리시킬 수 있다. 하나 이상의 시약은 비색 신호, 화학발광 신호, 형광 신호 또는 임의의 다른 검출가능한 신호를 생성시키도록 조합될 수 있고 이러한 목적에 적합한 것으로 알려진 임의의 시약을 포함할 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 하나 이상의 시약은 하나 이상의 시약에 결합하는 RNA 압타머에 의해 격리된다. 하나 이상의 시약은 이펙터 단백질이 표적 분자의 검출 시에 활성화되고 RNA 압타머가 분해될 때 방출된다.
일정 구현예에서, 가이드 RNA는 질환 상태의 진단인 하나 이상의 표적 분자에 결합하도록 디자인될 수 있다.
일부 구현예에서, 질환은 암일 수 있다. 암은 제한없이, 액상 종양 예컨대 백혈병 (예를 들어, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수아구성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수단핵구성 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 급성 적백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병), 진성 다혈구증, 림프종 (예를 들어, 호지킨병, 비호지킨병), 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 중쇄병, 또는 다발설 골수종을 포함한다.
암은 제한없이, 고형 종양 예컨대 육종 및 암종을 포함할 수 있다. 고혈 종양의 예에는 제한없이 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두모양 암종, 유두모양 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 상피 암종, 기관지원성 암종, 간세포암, 직결장암 (예를 들어, 결장암, 직장암), 항문암, 췌장암 (예를 들어, 췌장 선암종, 섬세포 암종, 신경내분비 종양), 유방암 (예를 들어, 유관 암종, 소엽 암종, 염증성 유방암, 투명 세포 암종, 점액 암종), 난소 암종 (예를 들어, 장액 종양, 자궁내막모양 종양 및 점액 낭선암종, 성삭-기질 종양을 포함한, 난소 상피 암종 또는 표면 상피-기질 종양), 전립선암, 간 및 담관 암종 (예를 들어, 간세포 암종, 담관암종, 혈관종), 융모암, 정상피종, 배아 암종, 신장 암 (예를 들어, 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 빌름 종양, 신장모세포종), 자궁경부암, 자궁암 (예를 들어, 자궁내막 선암종, 자궁 유두양 장액 암종, 자궁 투명 세포 암종, 자궁 육종 및 평활근육종, 혼합 뮬러 종양), 고환암, 생식 세포 종양, 폐암 (예를 들어, 폐 선암종, 편평 세포 암종, 거대 세포 암종, 기관지폐포 암종, 비소세포 암종, 소세포 암종, 중피종), 방광 암종, 반지 세포 암종, 두경부 암 (예를 들어, 편평 세포 암종), 식도 암종 (예를 들어, 식도 선암종), 뇌 종양 (예를 들어, 신경교종, 교아세포종, 수아세포종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 청신경종, 핍지교종, 신경초종, 뇌수막종), 신경아세포종, 망막아세포종, 신경내분비 종양, 흑색종, 위암 (예를 들어, 위 선암종, 위장 기질 종양), 또는 카시노이드가 포함된다. 림프증식성 질병은 또한 증식성 질환으로 고려된다.
일부 구현예에서, 질환은 자가면역 질환일 수 있고, 류마티스성 관절염, 루푸스, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, I형 당뇨병, 길렝-바레 증후군, 그레이브병, 또는 다른 자가면역 질병을 포함할 수 있지만, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 질환은 감염일 수 있다. 감염은 반드시 이에 제한되는 것은 아니나, 바이러스, 박테리아, 진균, 원충 또는 기생충에 의해 초래되는 감염을 포함할 수 있다.
특정 예시적 구현예에서, 본 명세서에 개시된 시스템, 장치 및 방법은 샘플, 예컨대 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 중 하나 이상의 미생물원의 존재를 검출하는 것에 관한 것이다. 특정 예시적 구현예에서, 미생물은 박테리아, 진균, 효모, 원충, 기생충, 또는 바이러스일 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 미생물 종의 신속한 동정, 미생물 단백질 (항원), 항체, 항체 유전자의 존재의 모니터링, 일정 표현형 (예를 들어, 박테리아 내성) 의 검출, 질환 진행 및/또는 대발생의 모니터링, 및 항생제 스크리닝을 요구하는 다른 방법과 (또는 조합하여) 다른 방법에서 사용을 위해 적합화될 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예의 신속하고 민감한 진단 능력, 단일 뉴클레오티드 편차에 이르는, 기생충 유형의 검출, 및 POC 장치로서 배치되는 능력 때문에, 본 명세서에 개시된 구현예는 치료 계획, 예컨대 적절한 치료 과정의 선택을 가이드하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예는 또한 미생물 오염의 존재에 대해 환경 샘플 (공기, 물, 표면, 식품 등) 을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
미생물 종, 예컨대 박테리아, 바이러스, 진균, 효모 또는 기생충 종 등을 식별하는 방법을 개시한다. 본원에 개시된 특정 구현예는 단일 샘플 내에서, 또는 다수 샘플에 걸쳐 미생물 종을 식별하고 구별하여, 많은 상이한 미생물의 인식을 가능하게 하는 방법 및 시스템을 기재한다. 본 발명은 샘플 중 표적 핵산 서열의 존재를 검출하여, 생물학적 또는 환경적 샘플 중에서 하나 이상의 유기체, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 효모, 원충, 및 진균 또는 이의 조합 중 2종 이상을 구별하고, 병원체의 검출을 가능하게 한다. 샘플로부터 수득된 양성 신호는 미생물의 존재를 의미한다. 다수 미생물은 하나를 초과하는 이펙터 단백질의 사용을 적용하여, 본 발명의 방법 및 시스템을 사용해 동시에 식별될 수 있고, 여기서 각각의 이펙터 단백질은 특이적 미생물 표적 서열을 표적으로 한다. 이러한 방식으로, 임의 수의 미생물을 한번에 검출할 수 있는 다층 분석을 특정한 대상체에 대해 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, 다수 미생물의 동시 검출은 하나 이상의 미생물 종을 식별할 수 있는 프로브의 세트를 사용하여 수행할 수 있다.
샘플의 다중 분석은 샘플의 대규모 검출을 가능하게 하여 분석 시간 및 비용을 절감한다. 그러나, 다중 분석은 종종 생물학적 샘플의 이용가능성에 의해 제한된다. 그러나 본 발명에 따라서, 다중 분석의 대안은 다수 이펙터 단백질을 단일 샘플에 첨가할 수 있고 각각의 차폐성 구성체는 개별 소광제 염료와 조합할 수 있도록 수행될 수 있다. 이러한 경우, 양성 신호는 단일 샘플 중 복합 검출을 위해 개별적으로 각각의 소광제 염료로부터 수득될 수 있다.
본 명세서에서는 샘플 중 하나 이상의 유기체의 둘 이상의 종을 구별하기 위한 방법이 개시된다. 이 방법은 또한 샘플 중 하나 이상의 유기체의 하나 이상의 종을 검출할 수 있게 한다.
일부 구현예에서, 샘플 중 미생물을 검출하기 위한 방법은 샘플 또는 샘플의 세트를 하나 이상의 개별 이산 부피에 분배하는 단계로서, 개별 이산 부피는 본원에 기재된 바와 같은 CRISPR 시스템을 포함하는 것인 단계; 하나 이상의 가이드 RNA 와 하나 이상의 미생물-특이적 표적의 결합을 허용하기 위해 충분한 조건 하에서 샘플 또는 샘플의 세트를 인큐베이션시키는 단계; 하나 이상의 가이드 RNA 와 하나 이상의 표적 분자의 결합을 통해서 CRISPR 이펙터 단백질을 활성화시키는 단계로서, CRISPR 이펙터 단백질의 활성화는 RNA-기반 차폐성 구성체의 변형을 야기하여 검출가능한 양성 신호가 발생되는 것인 단계; 및 검출가능한 양성 신호를 검출하는 단계로서, 검출가능한 양성 신호의 검출은 샘플 중 하나 이상의 표적 분자의 존재를 의미하는 것인 단계를 포함한다. 하나 이상의 표적 분자는 둘 이상의 미생물 종/균주를 서로 구별하는데 사용될 수 있는 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mRNA, gDNA (코딩 또는 비코딩), trRNA, 또는 rRNA 일 수 있다. 가이드 RNA 는 표적 서열을 검출하도록 디자인될 수 있다. 본원에 개시된 구현예는 또한 가이드 RNA 와 표적 RNA 서열 간 하이브리드화를 개선시키는 특정 단계들을 또한 이용할 수 있다. 리보핵산 하이브리드화를 향상시키는 방법은, 본원에 참조로 포함되는 발명의 명칭 "Enhanced Methods of Ribonucleic Acid Hybridization" 의 WO 2015/085194 에 개시되어 있다. 미생물-특이적 표적은 RNA 또는 DNA 또는 단백질일 수 있다. DNA 방법이 본 명세서에 기재된 바와 같은 RNA 중합효소 프로모터를 도입하는 DNA 프라이머의 사용을 더 포함할 수 있다. 표적이 단백질인 경우, 방법은 본 명세서에 기재된 단백질 검출에 특이적인 단계 및 압타머를 이용하게 될 것이다.
i) 바이러스
일정한 예의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 시스템, 장치, 및 방법은 샘플에서 바이러스를 검출하는 것에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 구현예는 (예를 들어, 대상체 또는 식물의) 바이러스 감염을 검출하거나, 단일 뉴클레오티드 다형성이 상이한 바이러스 균주를 포함하여, 바이러스 균주의 결정에 사용될 수 있다. 바이러스는 DNA 바이러스, RNA 바이러스, 또는 레트로바이러스일 수 있다. 본 발명으로 유용한 바이러스의 비제한적인 예는 에볼라, 홍역, SARS, 치쿤구니아, 간염, 마르부르크, 황열, MERS, 뎅기, 라싸, 인플루엔자, 랩도바이러스 또는 HIV 를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 간염 바이러스는 A 형 바이러스, B 형 바이러스 또는 C 형 바이러스를 포함할 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 예를 들어, A 형 인플루엔자 또는 B 형 인플루엔자를 포함할 수 있다. HIV 는 HIV 1 또는 HIV 2 를 포함할 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, 바이러스 서열은 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 수단 에볼라 바이러스, 분디분교 바이러스, 타이 포레스트 에볼라 바이러스, 레스톤 에볼라 바이러스, 아키모타, 애데스 플라비바이러스, 아구아카테 바이러스, 아까바네 바이러스, 알레티노피드 렙타레나바이러스, 알파우아요 맘마레나바이러스, 아마파리 엠마레나 바이러스, 안데스 바이러스, 아포이 바이러스, 아라반 바이러스, 아로아 바이러스, 아룸워트 바이러스, 대서양 연어 파라믹소바이러스, 오스트레일리아 박쥐 릿사바이러스, 조류 보르나바이러스, 조류 메타뉴모바이러스, 조류 파라믹소바이러스, 펭귄 또는 포클랜드섬 바이러스, BK 폴리오마바이러스, 바가자 바이러스, 반나 바이러스, 박쥐 헤페바이러스, 박쥐 사포바이러스, 베어 캐년 맘마레나바이러스, 베일롱 바이러스, 베타코로노아바이러스, 베타파필로마바이러스 1-6, 반자 바이러스, 보켈로 박쥐 릿사바이러스, 보르나병 바이러스, 버번 바이러스, 소 헤파시바이러스, 소 파라인플루엔자 바이러스 3, 소 호흡기 세포융합 바이러스, 브라조란 바이러스, 부니암웨라 바이러스, 칼리시바이러스과 바이러스, 캘리포니아 뇌염 바이러스, 칸디루 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 개 뉴모바이러스, 체다 바이러스, 세포융합제 바이러스, 세타시안 모르빌리바이러스, 찬디푸라 바이러스, 챠오양 바이러스, 차파레 맘마레나바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 콜로버스 원숭이 파필로마바이러스, 콜로라도 진드기열 바이러스, 우두 바이러스, 크림-콩고 출혈열 바이러스, 쿨렉스 플라비바이러스, 쿠픽시 맘마레나바이러스, 뎅기 바이러스, 도브라바-벨그라데 바이러스, 동강 바이러스, 두그베 바이러스, 듀벤헤이즈 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스, 엔테베 박쥐 바이러스, 장바이러스 A-D, 유럽 박쥐 릿사바이러스 1-2, 이야크 바이러스, 고양이 모빌리바이러스, 페르-드-랑스 파라믹소바이러스, 피츠로이 리버 바이러스, 플라비바이러스과 바이러스, 플렉살 맘마레나바이러스, GB 바이러스 C, 가이로 바이러스, 제미서큘러바이러스, 거위 파라믹소바이러스 SF02, 그레이트 아일랜드 바이러스, 구아나리토 맘마레나바이러스, 한탄 바이러스, 한타바이러스 Z10, 하트랜드 바이러스, 헨드라 바이러스, A/B/C/E 형 간염 바이러스, 델타형 간염 바이러스, 인간 보카바이러스, 인간 코로나바이러스, 인간 내인성 레트로바이러스 K, 인간 장 코로나바이러스, 인간 생식기-연관 원형 DNA 바이러스-1, 인간 헤르페스바이러스 1-8, 인간 면역결핍 바이러스 1/2, 인간 마스타데노바이러스 A-G, 인간 파필로마바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1-4, 인간 파라에코바이러스, 인간 피코르나바이러스, 인간 스마코바이러스, 이코마 릿사바이러스, 일헤우스 바이러스, 인플루엔자 A-C, 입피 맘마레나바이러스, 이르쿠트 바이러스, J-바이러스, JC 폴리오마바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 후닌 맘마레나바이러스, KI 폴리오마바이러스, 카디피로 바이러스, 카미티 리버 바이러스, 케두구 바이러스, 후잔트 바이러스, 코코베라 바이러스, 키아사누 삼림병 바이러스, 라고스 박쥐 바이러스, 란가트 바이러스, 라싸 맘마레나바이러스, 라티노 맘마레나바이러스, 레오파즈 힐 바이러스, 랴오닝 바이러스, 류간 바이러스, 로우비 바이러스, 루핑 일 바이러스, 룰요 맘마레나바이러스, 루나 맘마레나바이러스, 렁크 바이러스, 림프구성 맥락수막염 맘마레나바이러스, 릿사바이러스 오제르노에, MSSI2\.225 바이러스, 마츄포 맘마레나바이러스, 마마스트로바이러스 1, 만자닐라 바이러스, 마푸에라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 마야로 바이러스, 홍역 바이러스, 메낭글 바이러스, 메르카데오 바이러스, 메르켈 세포 폴리오마바이러스, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스, 모발라 맘마레나바이러스, 모독 바이러스, 모이장 바이러스, 모콜로 바이러스, 원두증 바이러스, 몬타나 미오티스 류코엔찰리티스 바이러스, 모페이아 라사 바이러스 재편성체 29, 모페이아 맘마레나바이러스, 모로고로 바이러스, 모스만 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 쥐과 폐렴 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 나리바 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 니파 바이러스, 노르워크 바이러스, 노르웨이 박쥐 헤파시바이러스, 은타야 바이러스, 오니옹-니옹 바이러스, 올리베로스 맘마레나바이러스, 옴스크 출혈열 바이러스, 오로퓨스 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 5, 파라나 맘마레나바이러스, 파라마타 리버 바이러스, 가성 우역 바이러스, 피찬드 맘마레나바이러스, 피코르나바이러스과 바이러스, 피리탈 맘마레나바이러스, 피시헤페바이러스 A, 돼지 파라인플루엔자 바이러스 1, 돼지 루불라바이러스, 파와산 바이러스, 영장류 T-림프친화성 바이러스 1-2, 영장류 적혈파보바이러스 1, 푼타 토로 바이러스, 푸울말라 바이러스, 꽝빈 바이러스, 공수병 바이러스, 라즈단 바이러스, 파충류 보르나바이러스 1, 리노바이러스 A-B, 리프트 밸리 발열 바이러스, 우역 바이러스, 리오 브라보 바이러스, 설치류 토크 테노 바이러스, 설치류 헤파시바이러스, 로스 리버 바이러스, 로타바이러스 A-I, 로얄 팜 바이러스, 루벨라 바이러스, 사비아 맘마레나바이러스, 세일럼 바이러스, 모래파리열 나폴리 바이러스, 모래파리열 시칠리아 바이러스, 사포로 바이러스, 사투페리 바이러스, 물개 아넬로바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 센다이 바이러스, 서울 바이러스, 세픽 바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군-관련 코로나바이러스, 혈소판감소증 증후군 수반 중증 발열 바이러스, 샤몬다 바이러스, 시모니 박쥐 바이러스, 슈니 바이러스, 심부 바이러스, 원숭이 토크 테노 바이러스, 시미언 바이러스 40-41, 신 놈브레 바이러스, 신드비스 바이러스, 소형 아넬로바이러스, 소수가 바이러스, 스페인 염소 뇌염 바이러스, 스폰드웨니 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 선샤인 바이러스, TTV-유사 미니 바이러스, 타카리브 맘마레나바이러스, 타일라 바이러스, 타마나 박쥐 바이러스, 타미아미 맘마레나바이러스, 템부수 바이러스, 토고토 바이러스, 토타팔라얌 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 티오만 바이러스, 토가바이러스과 바이러스, 토크 테노 카니스 바이러스, 토크 테노 두루쿨리 바이러스, 토크 테노 펠리스 바이러스, 토크 테노 미디 바이러스, 토크 테노 수스 바이러스, 토크 테노 타마린 바이러스, 토크 테노 바이러스, 토크 테노 잘로퍼스 바이러스, 투호코 바이러스, 툴라 바이러스, 투파이아 파라믹소바이러스, 우수투 바이러스, 유우쿠니에미 바이러스, 백시니아 바이러스, 바리올라 바이러스, 베네수엘라 말 뇌염 바이러스, 수포성 구내염 인디아나 바이러스, WU 폴리오마바이러스, 웨셀스브론 바이러스, 서부 코카시안 박쥐 바이러스, 웨스트나일 바이러스, 서부 말 뇌염 바이러스, 화이트워터 아로요 맘마레나바이러스, 황열병 바이러스, 요코세 바이러스, 유그 보그다노박 바이러스, 자이르 에볼라바이러스, 지카 바이러스, 또는 자이고사카로마이세스 바일리 바이러스 Z 바이러스 서열일 수 있다. 검출할 수 있는 RNA 바이러스의 예는 코로나바이러스과 바이러스, 피코르나바이러스과 바이러스, 칼리시바이러스과 바이러스, 플라비바이러스과 바이러스, 토가바이러스과 바이러스, 보르나바이러스과, 필로바이러스과, 파라믹소바이러스과, 뉴모바이러스과, 랩도바이러스과, 아레나바이러스과, 부니아바이러스과, 오르쏘믹소바이러스과, 또는 델타바이러스 중 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합) 을 포함한다. 특정 예시적 구현예에서, 바이러스는 코로나바이러스, SARS, 폴리오바이러스, 리노바이러스, A 형 간염 바이러스, 노르워크 바이러스, 황열병 바이러스, 웨스트나일 바이러스, C 형 간염 바이러스, 뎅기열 바이러스, 지카 바이러스, 루벨라 바이러스, 로스 리버 바이러스, 신드비스 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 보르나병 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 니파 바이러스, 헨드라 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 공수병 바이러스, 라싸 바이러스, 한타바이러스, 크림-콩고 출혈열 바이러스, 인플루엔자, 또는 D 형 간염 바이러스이다.
특정 예시적 구현예에서, 바이러스는 담배 모자이크 바이러스 (TMV), 토마토 반점 위조 바이러스 (TSWV), 오이 모자이크 바이러스 (CMV), 감자 바이러스 Y (PVY), RT 바이러스 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV), 자두 곰보 바이러스 (PPV), 브롬 모자이크 바이러스 (BMV), 감자 바이러스 X (PVX), 감귤 트리스테자 바이러스 (CTV), 보리 황화 위축 바이러스 (BYDV), 감자 잎말림 바이러스 (PLRV), 토마토 덤불 위축 바이러스 (TBSV), 벼 퉁그로 구형 바이러스 (RTSV), 벼 누렁 얼룩 바이러스 (RYMV), 흰잎 벼 바이러스 (RHBV), 옥수수 라야도 피노 바이러스 (MRFV), 옥수수 난장이 모자이크 바이러스 (MDMV), 사탕수수 모자이크 바이러스 (SCMV), 고구마 모틀 바이러스 (SPFMV), 고구마 선켄 베인 클로스테로바이러스 (SPSVV), 포도 부채잎 바이러스 (GFLV), 포도 바이러스 A (GVA), 포도 바이러스 B (GVB), 포도 잎반점 바이러스 (GFkV), 포도 잎말림-연관 바이러스-1, 포도 잎말림-연관 바이러스-2, 및 포도 잎말림-연관 바이러스-3 (GLRaV-1, GLRaV-2, 및 GLRaV-3), 아라비스 모자이크 바이러스 (ArMV), 또는 루페스트리스 고접병-연관 바이러스 (RSPaV) 를 포함하는 군으로부터 선택되는 식물 바이러스일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 표적 RNA 분자는 상기 병원체의 일부이거나 상기 병원체의 DNA 분자로부터 전사된다. 예를 들어, 표적 서열은 RNA 바이러스의 게놈에 포함될 수 있다. CRISPR 이펙터 단백질은 상기 병원체가 상기 식물을 감염시키거나 감염시켰다면, 상기 식물 중 상기 병원체의 상기 표적 RNA 분자를 가수분해시키는 것이 더 바람직하다. 따라서 CRISPR 시스템 (또는 이의 완료에 필요한 부분) 이 치료적으로, 즉 감염이 일어난 이후에, 또는 예방적으로, 즉 감염이 일어나기 전에 적용되는 경우 둘 모두에서, 식물 병원체 유래 표적 RNA 분자를 절단할 수 있는 것이 바람직하다.
일정한 예의 구현예에서, 바이러스는 레트로바이러스일 수 있다. 본원에 개시된 구현예를 사용하여 검출할 수 있는 예시적인 레트로바이러스는 알파레트로바이러스, 베타레트로바이러스, 감마레트로바이러스, 델타레트로바이러스, 엡실론레트로바이러스, 렌티바이러스, 스푸마바이러스의 바이러스 속, 또는 메타바이러스과, 슈도바이러스과, 및 레트로바이로스과 (HIV 포함), 헤파드나바이러스과 (B 형 간염 바이러스 바이러스 포함), 및 콜리모바이러스과 (콜리플라워 모자이크 바이러스 포함) 의 바이러스과 중 하나 이상 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
특정 예시적 구현예에서, 바이러스는 DNA 바이러스이다. 본원에 개시된 구현예를 사용하여 검출할 수 있는 예시적인 DNA 바이러스는 그 중에서도, 미오바이러스과, 포도바이러스과, 시포바이러스과, 알로헤르페스바이러스과, 헤르페스바이러스과 (인간 헤르페스 바이러스 및 바리셀라 조스터 바이러스 포함), 말로코헤르페스바이러스과, 리포트릭스바이러스과, 루디바이러스과, 아데노바이러스과, 암풀라바이러스과, 아스코바이러스과, 아스파르바이러스과 (아프리카 돼지 열병 바이러스 포함), 배큘로바이러스과, 시카우다바이러스과, 클라바바이러스과, 코르티코바이러스과, 푸셀로바이러스과, 글로불로바이러스과, 굿타바이러스과, 히트로사바이러스과, 이리도바이러스과, 마르세이유바이러스과, 미미바이러스과, 누디바이러스과, 니마바이러스과, 판도라바이러스과, 파필로마바이러스과, 피코드나바이러스과, 플라스마바이러스과, 폴리드나바이러스, 폴리오마바이러스과 (시미언 바이러스 40, JC 바이러스, BK 바이러스 포함), 폭스바이러스과 (우두 및 천연두 포함), 스파에롤리포바이러스과, 텍티바이러스과, 투리바이러스과, 디노드나바이러스, 살터프로바이러스, 리지도바이러스의 바이러스과 중 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합) 을 포함한다. 일부 구현예에서, 박테리아 감염을 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 종-특이적 박테리아 감염을 진단하는 방법은 대상체로부터 박테리아 리보솜 리보핵산을 포함하는 샘플을 수득하는 단계; 샘플을 기재된 하나 이상의 프로브와 접촉시키는 단계, 및 샘플에 존재하는 박테리아 리보솜 리보핵산 서열과 프로브 간 하이브리드화를 검출하는 단계로서 설명되고, 여기서 하이브리드화의 검출은 대상체가 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 엔테로박터 클로아카에 (Enterobacter cloacae), 엔테로코커스 파에칼리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 파에시움 (Enterococcus faecium), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis), 스타필로코커스 아갈락티아 (Staphylococcus agalactiae), 또는 스타필로코커스 말토필리아 (Staphylococcus maltophilia) 또는 이의 조합으로 감염된 것을 의미한다.
특별한 구현예에서, 바이러스 감염은 이중-가닥 RNA 바이러스, 포지티브 센스 RNA 바이러스, 네거티브 센스 RNA 바이러스, 레트로바이러스, 또는 이의 조합에 의해 초래될 수 있다.
ii) 박테리아
다음은 본 명세서에서 개시된 구현예를 사용하여 검출될 수 있는 미생물 유형의 예시적인 목록을 제공한다. 특정 예시적 구현예에서, 미생물은 박테리아이다. (예컨대, 보렐리아 레쿠렌티스 (Borrelia recurrentis), 및 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi)), 브루셀라 (Brucella) sp.(예컨대, 브루셀라 아보르투스 (Brucella abortus), 브루셀라 카니스 (Brucella canis), 브루셀라 멜린텐시스 (Brucella melintensis) 및 브루셀라 수이스 (Brucella suis)), 버크홀데리아 (Burkholderia) sp.(예컨대, 버크홀데리아 슈도말레이 (Burkholderia pseudomallei) 및 버크홀데리아 세파시아 (Burkholderia cepacia)), 캄필로박터 (Campylobacter) sp.(예컨대, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 캄필로박터 콜라이 (Campylobacter coli), 캄필로박터 라리 (Campylobacter lari) 및 캄필로박터 페투스 (Campylobacter fetus)), 카프노시토파가 (Capnocytophaga) sp., 카디오박테리움 호미니스 (Cardiobacterium hominis), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 뉴모니아 (Chlamydophila pneumoniae), 클라미도필라 프시타시 (Chlamydophila psittaci), 시트로박터 (Citrobacter) sp.콕시엘라 부르네티이 (Coxiella burnetii), 코리네박테리움 (Corynebacterium) sp.(예컨대, 코리네박테리움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 제이케움 (Corynebacterium jeikeum) 및 코리네박테리움 (Corynebacterium)), 클로스트리듐 (Clostridium) sp.(예컨대 클로스트리듐 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens), 클로스트리듐 디피실 (Clostridium difficile), 클로스트리듐 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 및 클로스트리듐 테타니 (Clostridium tetani)), 에이케넬라 코로덴스 (Eikenella corrodens), 엔테로박터 (Enterobacter) sp.(예컨대, 엔테로박터 애로제네스 (Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 아글로머란스 (Enterobacter agglomerans), 엔테로박터 클로아카에 (Enterobacter cloacae) 및 기회감염성 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 예컨대 장독소원성 이.콜라이, 장침습성 이.콜라이, 장병원성 이.콜라이, 장출혈성 이.콜라이, 장응집성 이.콜라이 및 요로병원성 이.콜라이를 포함한, 에스케리치아 콜라이), 엔테로코커스 (Enterococcus) sp.(예컨대, 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 및 엔테로코커스 패시움 (Enterococcus faecium)), 엘리키아 (Ehrlichia) sp.(예컨대, 엘리키아 카페엔시아 (Ehrlichia chafeensia) 및 엘리키아 카니스 (Ehrlichia canis)), 에피더모피톤 플로코섬 (Epidermophyton floccosum), 에리시펠로트릭스 루시오파티아 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 유박테리움 (Eubacterium) sp., 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis), 푸소박테리움 뉴클레아텀 (Fusobacterium nucleatum), 가드네렐라 바지날리스 (Gardnerella vaginalis), 게멜라 모빌로럼 (Gemella morbillorum), 해모필러스 (Haemophilus) sp.(예컨대, 해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus Influenzae), 해모필러스 두크레이이 (Haemophilus ducreyi), 해모필러스 애집티우스 (Haemophilus aegyptius), 해모필러스 파라인플루엔자 (Haemophilus Parainfluenzae), 해모필러스 해몰리티커스 (Haemophilus haemolyticus) 및 해모필러스 파라해몰리티커스 (Haemophilus parahaemolyticus), 헬리코박터 (Helicobacter) sp.(예컨대, 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori), 헬리코박터 시나에디 (Helicobacter cinaedi) 및 헬리코박터 펜넬리아 (Helicobacter fennelliae)), 킨겔라 킨기이 (Kingella kingii), 클렙시엘라 (Klebsiella) sp. (예컨대, 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 클렙시엘라 그라눌로마티스 (Klebsiella granulomatis) 및 클렙시엘라 옥시토카 (Klebsiella oxytoca)), 락토바실러스 (Lactobacillus) sp., 리스테리아 모노시토제네스 (Listeria monocytogenes), 렙토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 렙토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans), 펩토스트렙토코커스 (Peptostreptococcus) sp., 만헤이미아 헤몰리티카 (Mannheimia hemolytica), 마이크로스포럼 카니스 (Microsporum canis), 모라셀라 카타랄리스 (Moraxella catarrhalis), 모르가넬라 (Morganella) sp., 모빌룬커스 (Mobiluncus) sp., 마이크로코커스 (Micrococcus) sp., 마이코박테리움 (Mycobacterium) sp.(예컨대, 마이코박테리움 레프라에 (Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 파라튜버큘로시스 (Mycobacterium paratuberculosis), 마이코박테리움 인트라셀룰라레 (Mycobacterium intracellulare), 마이코박테리움 아비움 (Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis), 및 마이코박테리움 마리넘 (Mycobacterium marinum)), 마이코플라즘 (Mycoplasm) sp.(예컨대, 마이코플라스마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae), 마이코플라스마 호미니스 (Mycoplasma hominis) 및 마이코플라스마 제니탈리움 (Mycoplalsma genitalium)), 노카르디아 (Nocardia) sp.(예컨대, 노카르디아 아스테로이데스 (Nocardia asteroides), 노카르디아 시리아시제오르기카 (Nocardia cyriacigeorgica) 및 노카르디아 브라실리엔시스 (Nocardia brasiliensis)), 네이세리아 (Neisseria) sp.(예컨대, 네이세리아 고노레아 (Neisseria gonorrhoeae) 및 네이세리아 메닌지티디스 (Neisseria meningitidis)), 파스퇴렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida), 피티로스포럼 오르비쿨라레 (Pityrosporum orbiculare) (말라세지아 푸르푸르 (Malassezia furfur)), 플레시오모나스 시겔로이데스 (Plesiomonas shigelloides), 프레보텔라 (Prevotella) sp., 포르피로모나스 (Porphyromonas) sp., 프레보텔라 멜라니노제니카 (Prevotella melaninogenica), 프로테우스 (Proteus) sp.(예컨대, 프로테우스 불가리스 (Proteus vulgaris) 및 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis)), 프로비덴시아 (Providencia) sp.(예컨대, 프로비덴시아 알칼리파시엔스 (Providencia alcalifaciens), 프로비덴시아 레트게리 (Providencia rettgeri) 및 프로비덴시아 스투아르티 (Providencia stuartii)), 슈도모나스 애루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes), 로도코커스 에쿠이 (Rhodococcus equi), 리켓치아 (Rickettsia) sp.(예컨대, 리켓치아 리켓치이 (Rickettsia rickettsii), 리켓치아 아카리 (Rickettsia akari) 및 리켓치아 프로와제키이 (Rickettsia prowazekii), 오리엔티아 쯔쯔가무시 (Orientia tsutsugamushi) (이전:리켓치아 쯔쯔가무시 (Rickettsia tsutsugamushi)) 및 리켓치아 티피 (Rickettsia typhi)), 로도코커스 (Rhodococcus) sp., 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 스테노트로포모나스 말토필라 (Stenotrophomonas maltophilia), 살모넬라 (Salmonella) sp.(예컨대, 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica), 살모넬라 티피 (Salmonella typhi), 살모넬라 파라티피 (Salmonella paratyphi), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis), 살모넬라 콜레라수이스 (Salmonella cholerasuis) 및 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium)), 세라티아 (Serratia) sp.(예컨대, 세라티아 마르세산스 (Serratia marcesans) 및 세라티아 리퀴파시엔스 (Serratia liquifaciens)), 시겔라 (Shigella) sp.(예컨대, 시겔라 디센테리아 (Shigella dysenteriae), 시겔라 프렉스네리 (Shigella flexneri), 시겔라 보이디이 (Shigella boydii) 및 시겔라 손네이 (Shigella sonnei)), 스타필로코커스 (Staphylococcus) sp.(예컨대 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 헤몰리티커스 (Staphylococcus hemolyticus), 스타필로코커스 사프로피티커스 (Staphylococcus saprophyticus)), 스트렙토코커스 (Streptococcus) sp.(예컨대, 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae) (예를 들어, 클로람페니콜-내성 혈청형 4 스트렙토코커스 뉴모니아, 스펙티노마이신-내성 혈청형 6B 스트렙토코커스 뉴모니아, 스트렙토마이신-내성 혈청형 9V 스트렙토코커스 뉴모니아, 에리쓰로마이신-내성 혈청형 14 스트렙토코커스 뉴모니아, 옵토킨-내성 혈청형 14 스트렙토코커스 뉴모니아, 리팜피신-내성 혈청형 18C 스트렙토코커스 뉴모니아, 테트라사이클린-내성 혈청형 19F 스트렙토코커스 뉴모니아, 페니실린-내성 혈청형 19F 스트렙토코커스 뉴모니아, 및 트리메토프림-내성 혈청형 23F 스트렙토코커스 뉴모니아, 클로람페니콜-내성 혈청형 4 스트렙토코커스 뉴모니아, 스펙티노마이신-내성 혈청형 6B 스트렙토코커스 뉴모니아, 스트렙토마이신-내성 혈청형 9V 스트렙토코커스 뉴모니아, 옵토킨-내성 혈청형 14 스트렙토코커스 뉴모니아, 리팜피신-내성 혈청형 18C 스트렙토코커스 뉴모니아, 페니실린-내성 혈청형 19F 스트렙토코커스 뉴모니아, 또는 트리메토프림-내성 혈청형 23F 스트렙토코커스 뉴모니아), 스트렙토코커스 아갈락티아 (Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 피로제네스 (Streptococcus pyogenes), 그룹 A 스트렙토코커스, 스트렙토코커스 피로제네스, 그룹 B 스트렙토코커스, 스트렙토코커스 아갈락티아, 그룹 C 스트렙토코커스, 스트렙토코커스 안지노서스 (Streptococcus anginosus), 스트렙토코커스 에퀴스밀리스 (Streptococcus equismilis), 그룹 D 스트렙토코커스, 스트렙토코커스 보비스 (Streptococcus bovis), 그룹 F 스트렙토코커스, 및 스트렙토코커스 안지노서스 그룹 G 스트렙토코커스), 스피릴럼 미너스 (Spirillum minus), 스트렙토바실러스 모닐리포르미 (Streptobacillus moniliformi), 트레포네마 (Treponema) sp.(예컨대, 트레포네마 카라테움 (Treponema carateum), 트레포네마 페테누에 (Treponema petenue), 트레포네마 팔리둠 (Treponema pallidum) 및 트레포네마 엔데미컴 (Treponema endemicum), 트리코피톤 루브럼 (Trichophyton rubrum), 티. 멘타그로피테스 (T. mentagrophytes), 프로테리마 위펠리이 (Tropheryma whippelii), 우레아플라스마 우레아리티컴 (Ureaplasma urealyticum), 베일로넬라 (Veillonella) sp., 비브리오 (Vibrio) sp.(예컨대, 비브리오 콜레라에 (Vibrio cholerae), 비브리오 파라헤몰리티커스 (Vibrio parahemolyticus), 비브리오 벌니피커스 (Vibrio vulnificus), 비브리오 파라해몰리티커스 (Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 벌니피커스 (Vibrio vulnificus), 비브리오 알기놀리티커스 (Vibrio alginolyticus), 비브리오 미미커스 (Vibrio mimicus), 비브리오 홀리사에 (Vibrio hollisae), 비브리오 플루비알리스 (Vibrio fluvialis), 비브리오 멧치니코비이 (Vibrio metchnikovii), 비브리오 담셀라 (Vibrio damsela) 및 비브리오 퍼니시이 (Vibrio furnisii)), 여시니아 (Yersinia) sp.(예컨대, 여시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica), 여시니아 페스티스 (Yersinia pestis), 및 여시니아 슈도튜버큘로시스 (Yersinia pseudotuberculosis)) 및 잔토모나스 말토필리아 (Xanthomonas maltophilia) 중 어느 하나 이상 (또는 이의 임의 조합)을 포함한다.
iii) 진균
일정한 예의 구현예에서, 미생물은 진균 또는 진균 종이다. 개시된 방법에 따라 검출할 수 있는 진균의 예는 아스퍼질러스 (Aspergillus), 블라스토마이세스 (Blastomyces), 칸디디아시스 (Candidiasis), 콕시디오도마이코시스 (Coccidiodomycosis), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 가티 (Cryptococcus gatti), sp., 히스토플라스마 (Histoplasma) sp. (예컨대 히스토플라스마 캡술라텀 (Histoplasma capsulatum)), 뉴모시스티스 (Pneumocystis) sp. (예컨대 뉴모시스티스 지로벡시이 (Pneumocystis jirovecii)), 스타키보트리스 (Stachybotrys) (예컨대 스타키보트리스 카르타럼 (Stachybotrys chartarum)), 무크로임코시스 (Mucroymcosis), 스포로트릭스 (Sporothrix), 진균성 안구 감염 백선, 엑세로힐럼 (Exserohilum), 클라도스포리움 (Cladosporium) 중 임의의 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합)을 비제한적으로 포함한다.
일정한 예의 구현예에서, 진균은 효모이다. 개시된 방법에 따라 검출할 수 있는 효모의 예는 아스퍼질러스 (Aspergillus) 종 (예컨대 아스퍼질러스 푸미가터스 (Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 플라버스 (Aspergillus flavus) 및 아스퍼질러스 클라바터스 (Aspergillus clavatus)), 크립토코커스 sp. (Cryptococcus sp.) (예컨대 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 가티 (Cryptococcus gattii), 크립토코커스 라우렌티이 (Cryptococcus laurentii) 및 크립토코커스 알비더스 (Cryptococcus albidus)), 제오트리컴 (Geotrichum) 종, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 종, 한세눌라 (Hansenula) 종, 칸디다 종 (예컨대 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 종, 데바리오마이세스 (Debaryomyces) 종, 피키아 (Pichia) 종, 또는 이의 조합 중 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합) 을 비제한적으로 포함한다. 특정 예시적 구현예에서, 진균은 곰팡이이다. 곰팡이의 예는 페니실리움 (Penicillium) 종, 클라도스포리움 (Cladosporium) 종, 비소클라미스 (Byssochlamys) 종, 또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
iv) 원충
특정 예시적 구현예에서, 미생물은 원충이다. 개시된 방법 및 장치에 따라 검출할 수 있는 원충의 예는 유글레노조아 (Euglenozoa), 헤테로로보세아 (Heterolobosea), 디플로모나디다 (Diplomonadida), 아메보조아 (Amoebozoa), 블라스토시스틱 (Blastocystic), 및 아피콤플렉사 (Apicomplexa) 중 임의의 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합) 을 비제한적으로 포함한다. 예시적인 유글레노조아 (Euglenoza)는 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi) (샤가스 병), 트리파노소마 브루세이 감비엔스 (Trypanosoma brucei gambiense), 트리파노소마 브루세이 로데시엔스 (Trypanosoma brucei rhodesiense), 리슈마니아 브라질리엔시스 (Leishmania braziliensis), 리슈마니아 인판텀 (Leishmania infantum), 리슈마니아 멕시카나 (Leishmania mexicana), 리슈마니아 마조르 (Leishmania major), 리슈마니아 트로피카 (Leishmania tropica), 및 리슈마니아 도노바니 (Leishmania donovani)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 헤테로로보세아 (Heterolobosea) 는 내글레리아 파울러리 (Naegleria fowleri) 를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 디플로모나디드 (Diplomonadid)는 지아르디아 인테스티날리스 (Giardia intestinalis) (지아르디아 람블리아 (Giardia lamblia), 지아르디아 듀오데날리스 (Giardia duodenalis))를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 아메보조아 (Amoebozoa)는 아칸타메바 카스텔라니이 (Acanthamoeba castellanii), 발라무티아 마드릴라리스 (Balamuthia madrillaris), 엔타메바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 블라스토시스트 (Blastocystis)는 블라스토시스틱 호미니스 (Blastocystic hominis)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 아피콤플렉사는 제한없이, 바베시아 미크로티 (Babesia microti), 크립토스포리듐 파르븀 (Cryptosporidium parvum), 시클로스포라 카이에타넨시스 (Cyclospora cayetanensis), 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스 (Plasmodium vivax), 플라스모듐 오발레 (Plasmodium ovale), 플라스모듐 말라리아에 (Plasmodium malariae), 및 톡소플라스마 곤디 (Toxoplasma gondii)를 포함한다.
v)
기생충
일정한 예의 구현예에서, 미생물은 기생충이다. 개시된 방법에 따라 검출할 수 있는 기생충의 예는 온코세르카 (Onchocerca) 종 및 플라스모듐 (Plasmodium) 종 중 하나 이상 (또는 이의 임의의 조합) 을 비제한적으로 포함한다.
다른 구현예에서, 기생충의 예는 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi) (샤가스병), 트리파노소마 브루세이 감비엔스 (Trypanosoma brucei gambiense), 트리파노소마 브루세이 로데시엔스 (Trypanosoma brucei rhodesiense), 리슈마니아 브라질리엔시스 (Leishmania braziliensis), 리슈마니아 인판텀 (Leishmania infantum), 리슈마니아 멕시카나 (Leishmania mexicana), 리슈마니아 마조르 (Leishmania major), 리슈마니아 트로피카 (Leishmania tropica), 리슈마니아 도노바니 (Leishmania donovani), 내글레리아 파울러리 (Naegleria fowleri), 지아르디아 인테스티날리스 (Giardia intestinalis) (지아르디아 람블리아 (Giardia lamblia), 지아르디아 두오데날리스 (Giardia duodenalis)), 칸타메바 카스텔라니 (Canthamoeba castellanii), 발라무티아 마드릴라리스 (Balamuthia madrillaris), 엔타메바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica), 블라스토시스틱 호미니스 (Blastocystic hominis), 바베시아 미크로티 (Babesia microti), 크립토스포리듐 파르븀 (Cryptosporidium parvum), 시클로스포라 카이에타넨시스 (Cyclospora cayetanensis), 플라스모듐 팔시파럼 (Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스 (Plasmodium vivax), 플라스모듐 오발레 (Plasmodium ovale), 플라스모듐 말라리아에 (Plasmodium malariae), 및 톡소플라즈마 곤디 (Toxoplasma gondii) 또는 이의 조합을 포함하지만, 이에 반드시 제한되는 것은 아니다.
3. RNA 압타머
특정 구현예에서, 가이드는 에스코트된(escorted) 가이드이다. "에스코트된"은 CRISPR-Cas 시스템 또는 복합체 또는 가이드가 세포 내에서 선택된 시간 또는 위치로 전달되어서, CRISPR-Cas 시스템 또는 복합체 또는 가이드의 활성이 공간적으로 또는 시간적으로 제어되는 것을 의미한다. 예를 들어, 3 CRISPR-Cas 시스템 또는 복합체 또는 가이드의 활성 및 목적지는 압타머 리간드, 예컨대 세포 표면 단백질 또는 다른 국재화된 세포 성분에 대해 결합 친화성을 갖는 에스코트 RNA 압타머 서열에 의해 제어될 수 있다. 대안적으로, 에스코트 압타머는 예를 들어 세포 상 또는 세포 내 압타머 이펙터, 예컨대 일시적 이펙터, 예컨대 특정한 시기에 세포에 적용되는 외부 에너지원에 반응성일 수 있다.
에스코트된 CRISPR-Cas 시스템 또는 복합체는 가이드 분자 구조, 아키텍처, 안정성, 유전자 발현, 또는 이의 임의 조합을 개선시키도록 디자인된 기능성 구조를 갖는 가이드 분자를 갖는다. 이러한 구조는 압타머를 포함할 수 있다.
압타머는 예를 들어 기하급수적 농축을 통한 리간드의 체계적 진화 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라고 불리는 기술을 사용하여, 다른 리간드에 단단하게 결합되도록 디자인될 수 있거나 또는 선택될 수 있는 생물분자이다 (SELEX; Tuerk C, Gold L: "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase." Science 1990, 249:505- 510). 핵산 압타머는 예를 들어 생물의학적으로 관련된 광범위한 표적에 대해 높은 결합 친화성 및 특이성을 갖는, 무작위-서열 올리고뉴클레오티드의 풀로부터 선택할 수 있어서, 압타머에 대한 광범위한 치료적 활용성을 시사한다 (Keefe, Anthony D., Supriya Pai, and Andrew Ellington. "Aptamers as therapeutics." Nature Reviews Drug Discovery 9.7 (2010): 537- 550). 이들 특징은 또한 약물 전달 비히클로서 압타머에 대한 광범위한 용도를 시사한다 (Levy-Nissenbaum, Etgar, et al. "Nanotechnology and aptamers: applications in drug delivery." Trends in biotechnology 26.8 (2008): 442-449; and, Hicke BJ, Stephens AW. "Escort aptamers: a delivery service for diagnosis and therapy." J Clin Invest 2000, 106:923-928). 압타머는 또한 녹색 형광 단백질의 활성을 모방하도록 형광단에 결합하는 RNA 압타머와 같이, 속성을 변화시켜 큐 (que)에 반응하는, 분자 스위치로서 기능하게 구축될 수 있다 (Paige, Jeremy S., Karen Y. Wu, and Samie R. Jaffrey. "RNA mimics of green fluorescent protein." Science 333.6042 (2011): 642- 646). 압타머는 예를 들어 세포 표면 단백질을 표적화하는, 표적화된 siRNA 치료제 전달 시스템의 성분으로서 사용될 수 있다는 것이 또한 제안되었다 (Zhou, Jiehua, and John J. Rossi. "Aptamer-targeted cell-specific RNA interference." Silence 1.1 (2010): 4).
따라서, 특정 구현예에서, 가이드 분자는 예를 들어 세포막을 통해서, 세포내 구획, 또는 핵으로의 전달을 포함하여, 가이드 분자 전달을 개선시키도록 디자인된 하나 이상의 압타머(들)를 통해 변형된다. 이러한 구조는 가이드 분자를 선택된 이펙터에 대해 전달가능하거나, 유도가능하거나 또는 반응성이도록 만들기 위해서, 하나 이상의 압타머(들)의 첨가 또는 이러한 하나 이상의 압타머(들), 모이어티(들)없이 포함될 수 있다. 따라서 본 발명은 제한없이 pH, 저산소, O2 농도, 온도, 단백질 농도, 효소 농도, 지질 구조, 광노출, 기계적 파괴 (예를 들어, 초음파), 자기장, 전기장 또는 전자기 방사선을 포함한 정상 또는 병적 생리학적 조건에 반응하는 가이드 분자를 이해한다.
특정한 구현예에서, RNA-압타머는 오크라톡신 A (OTA)를 인식한다. OTA는 아스퍼질러스 오크라세우스 (Aspergillus ochraceus), 에이. 카르보나리우스 (A. carbonarius), 에이. 니거 (A. niger), 및 페니실리움 베루코숨 (Penicillium verrucosum)을 포함한 몇몇 진균 종이 생산하는 진균독이다.
일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 개별 이산 부피 (하기에 더욱 정의됨) 내에 고형 기재 상에 고정화될 수 있고 단일 시약을 격리시킬 수 있다. 예를 들어, 시약은 염료를 포함하는 비드일 수 있다. 고정화 시약에 의해 격리될 때, 개별 비드는 너무 확산되어 검출가능한 신호를 발생시키지 못하지만, 차폐성 구성체로부터 방출 시에 예를 들어 응집에 의해서 또는 용액 농도의 단순 증가에 의해서 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 고정된 차폐제는 표적 분자의 검출 시에 활성화된 이펙터 단백질에 의해 절단될 수 있는 RNA-기반 압타머이다. 다른 구현예에서, 고정된 차폐제는 표적 분자의 검출 시에 활성화된 이펙터 단백질에 의해 절단될 수 있는 ssDNA-기반 압타머이다.
일정한 다른 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 용액 중 고정화 시약에 결합하여서 용액 중에 유리된 별개의 표지된 결합 파트너에 결합하는 시약의 능력을 차단한다. 따라서, 샘플에 세척 단계의 적용 시, 표지된 결합 파트너는 표적 분자의 부재 하에서 샘플을 세척해 낼 수 있다. 그러나, 이펙터 단백질이 활성화되면, 차폐성 구성체는 시약에 결합하는 차폐성 구성체의 능력을 방해하도록 충분한 정도로 절단되어서 표지된 결합 파트너가 고정화된 시약과 결합할 수 있게 한다. 따라서, 표지된 결합 파트너는 세척 단계 후에 남아서 샘플 중에 표적 분자의 존재를 의미한다. 일정한 양상에서, 고정화된 시약에 결합하는 차폐성 구성체는 RNA 압타머이다. 고정화된 시약은 단백질일 수 있고 표지된 결합 파트너는 표지된 항체일 수 있다. 대안적으로, 고정화된 시약은 스트렙타비딘일 수 있고 표지된 결합 파트너는 표지된 바이오틴일 수 있다. 상기 구현예에서 사용되는 결합 파트너 상의 표지는 당분야에 공지된 임의의 검출가능한 표지일 수 있다. 또한, 다른 공지된 결합 파트너는 본 명세서에 기술된 전체 디자인에 따라서 사용될 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 리보자임을 포함할 수 있다. 리보자임은 촉매적 특성을 갖는 RNA 분자이다. 천연 및 조작 리보자임은 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질에 의해 표적화될 수 있는, RNA를 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 리보자임은 음성 검출가능한 신호를 발생시키거나 또는 양성 대조군 신호의 발생을 방지하는 반응을 촉매하도록 선택될 수 있거나 또는 조작될 수 있다. 활성화된 이펙터 단백질 분자에 의한 리보자임의 탈활성화 시에 음성 대조군 신호를 발생시키거나 또는 양성 검출가능한 신호의 발생을 방지하는 반응을 제거하여서, 양성 검출가능한 신호가 발생될 수 있게 한다. 일례의 구현예에서, 리보자임은 용액이 제1 색상을 나타내게 하는 비색 반응을 촉매할 수 있다. 리보자임이 탈활성화될 때 용액은 제2 색상으로 바뀌고, 제2 색상은 검출가능한 양성 신호이다. 리보자임을 비색 반응을 촉매하는데 사용할 수 있는 방법의 예는 [Zhao et al. "Signal amplification of glucosamine-6-phosphate based on ribozyme glmS," Biosens Bioelectron.2014; 16:337-42]에 기술되어 있고, 본 명세서에 개시된 구현예의 문맥에서 이러한 시스템이 작동하도록 변형시킬 수 있는 방법의 예를 제공한다. 대안적으로, 리보자임은 존재하는 경우에, 예를 들어 RNA 전사물의 절단 생성물을 발생시킬 수 있다. 따라서, 양성 검출가능한 신호의 검출은 오직 리보자임의 부재 하에서만 발생되는 비절단된 RNA 전사물의 검출을 포함할 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, 하나 이상의 시약은 단백질이 단백질에 하나 이상의 RNA 압타머의 결합에 의해 검출가능한 신호를 발생시킬 수 없도록 억제되거나 또는 격리되는, 검출가능한 신호, 예컨대 비색, 화학발광 또는 형광발광 신호의 발생을 촉진할 수 있는, 단백질, 예컨대 효소이다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시에, RNA 압타머는 그들이 검출가능한 신호를 발생시키는 단백질의 능력을 더 이상 억제하지 않는 정도로 절단되거나 또는 분해된다. 일정한 예의 구현예에서, 압타머는 트롬빈 억제제 압타머이다. 일정한 예의 실시형태에서, 트롬빈 억제제 압타머는 GGGAACAAAGCUGAAGUACUUACCC (SEQ ID NO: 414)의 서열을 갖는다. 이러한 압타머가 절단될 때, 트롬빈은 활성화될 것이고 펩티드 비색 또는 형광 기질을 절단할 것이다. 일정한 예의 구현예에서, 비색 기질은 트롬빈에 대한 펩티드 기질에 공유적으로 연결된 파라-니트로아닐리드 (pNA)이다. 트롬빈에 의해 절단 시, pNA가 방출되고 노란 색상이 되어 쉽게 육안으로 볼 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 형광 기질은 형광도 검출기를 사용하여 검출할 수 있는 7-아미노-4-메틸쿠마린이다. 억제성 압타머는 또한 홀스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP), 베타-갈락토시다제, 또는 송아지 알칼리 포스파타제 (CAP)에 대해 사용될 수 있고, 상기에 제시된 일반 원리 내이다.
일정한 구현예에서, RNAse 또는 DNAse 활성은 효소-억제성 압타머의 절단을 통해 비색적으로 검출된다. DNAse 또는 RNAse 활성을 비색 신호로 전환시키는 하나의 잠재적인 방식은 비색 출력을 생성시킬 수 있는 효소의 재활성화와 RNA 압타머 또는 ssRNA 압타머의 절단을 커플링시키는 것이다. RNA 또는 DNA 절단의 부재 하에서, 온전한 압타머는 효소 표적에 결합하여 이의 활성을 억제하게 될 것이다. 이러한 판독 시스템의 장점은 효소가 추가 증폭 단계를 제공한다는 것이다: 부차적 활성 (예를 들어, Cpf1 또는 Cas13a 부차적 활성)을 통해서 압타머로부터 유리되면, 비색 효소는 비색 생성물을 계속 생성시켜서, 신호의 배가를 일으키게 될 것이다.
유리하게, 일정한 구현예에서, 비색 판독의 효소를 억제하는 현존 압타머가 사용된다. 비색 판독되는 몇몇 압타머/효소 쌍에는 예컨대 트롬빈, 단백질 C, 호중구 엘라스타제 및 서브스틸리신이 존재한다. 이들 프로테아제는 pNA를 기반으로 비색 기질을 가지며 상업적으로 입수가능하다. 일정한 구현예에서, 일반적인 비색 효소를 표적화하는 신규한 압타머가 사용된다. 일반적인 강건한 효소, 예컨대 베타-갈락토시다제, 홀스래디쉬 퍼옥시다제 또는 송아지 장 알칼리 포스파타제는 선택 전략 예컨대 SELEX에 의해 디자인된 조작된 압타머에 의해 표적화될 수 있다. 이러한 전략은 나노몰 결합 효율로 압타머의 신속한 선택을 가능하게 하고 비색 판독을 위한 추가의 효소/압타머 쌍의 개발에 사용될 수 있다.
일정한 구현예에서, RNAse 활성은 RNA-속박형 억제제의 절단을 통해서 비색으로 검출된다. 많은 일반 비색 효소는 경쟁적, 가역적 억제제를 가지며, 예를 들어 베타-갈락토시다제는 갈락토스에 의해 억제될 수 있다. 많은 이들 억제제는 약하지만, 그들의 효과는 국소 농도를 증가시켜서 증가될 수 있다. 억제제의 국소 농도를 RNAse 활성과 연결시킴으로써, 비색 효소 및 억제제 쌍은 RNAse 센서에 조작될 수 있다. 소형-분자 억제제를 기반으로 하는 비색 RNAse 센서는 3종의 성분을 포함하는데, 비색 효소, 억제제, 및 억제제를 효소에 속박시키는, 억제제와 효소 둘 모두에 공유적으로 연결된 브릿징 RNA이다. 미절단된 구성에서, 효소는 소형 분자의 증가된 국소 농도에 의해 억제되고, RNA가 (예를 들어, Cas13a 부차적 절단에 의해) 절단될 때, 억제제가 방출될 것이고 비색 효소가 활성화될 것이다. 비색 이동을 검출하는 능력은 가시적 파장에서의 사용 편이를 가능하게 하는 검출에 대한 접근성을 제공한다.
일정한 실시형태에서, RNAse 활성은 실시예 8에 기술된 바와 같이, G-사중체의 형성 및/또는 활성화를 통해 비색적으로 검출된다. DNA의 G 사중체는 헴 (heme) (철 (III)-프로토폴피린 IX)과 복합체를 형성하여 퍼옥시다제 활성을 갖는 DNAzyme을 형성할 수 있다. 퍼옥시다제 기질 (예를 들어, ABTS: (2,2'-아지노비스 [3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산]-디암모늄 염))이 공급될 때, 과산화수소의 존재 하에서 G-사중체-헴 복합체가 기질의 산화를 야기하고, 그 다음에 용액 중에서 녹색을 형성시킨다. G-사중체 형성 DNA 서열의 예는 GGGTAGGGCGGGTTGGGA (SEQ ID NO: 415)이다. 이러한 DNA 압타머와 RNA 서열을 하이브리드화시킴으로써, G-사중체 구조의 형성은 제한될 것이다. RNAse 부차적 활성화 (예를 들어, C2c2-복합체 부차적 활성화) 시에, RNA 스테이플은 절단되어서 G 사중체가 형성되고 헴이 결합할 수 있게 될 것이다. 이러한 전략은 RNAse 활성화 이후에 추가 증폭이 존재한다는 것을 의미하는, 색상 형성이 효소적이기 때문에 특히 매력적이다.
일정한 실시형태에서, DNAse 활성은 실시예 8에 기술된 바와 같이, G-사중체의 형성 및/또는 활성화를 통해 비색적으로 검출된다. DNA의 G 사중체는 헴 (heme) (철 (III)-프로토폴피린 IX)과 복합체를 형성하여 퍼옥시다제 활성을 갖는 DNAzyme을 형성할 수 있다. 퍼옥시다제 기질 (예를 들어, ABTS: (2,2'-아지노비스 [3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산]-디암모늄 염))이 공급될 때, 과산화수소의 존재 하에서 G-사중체-헴 복합체가 기질의 산화를 야기하고, 그 다음에 용액 중에서 녹색을 형성시킨다. G-사중체 형성 DNA 서열의 예는 GGGTAGGGCGGGTTGGGA (SEQ ID NO: 415)이다. 이러한 DNA 압타머와 RNA 서열을 하이브리드화시킴으로써, G-사중체 구조의 형성은 제한될 것이다. DNAse 부차적 활성화 (예를 들어, Cpf1-복합체 부차적 활성화) 시에, DNA 스테이플은 절단되어서 G 사중체가 형성되고 헴이 결합할 수 있게 될 것이다. 이러한 전략은 DNAse 활성화 이후에 추가 증폭이 존재한다는 것을 의미하는, 색상 형성이 효소적이기 때문에 특히 매력적이다.
일부 구현예에서, 핵산 검출 시스템은 효소 활성을 갖는 사중체를 포함하는 RNA-압타머 또는 DNA 압타머를 포함한다. 특별한 구현예에서, 효소 활성은 퍼옥시다제 활성이다. 구현예에서, 방법, 시스템, 및 어세이는 하나 이상의 표적 분자의 지시자로서 형광단 및 소광제를 이용할 수 있다. 다른 구현예에서, 방법, 시스템 및 어세이는 하나 이상의 표적 분자의 지시자로서 비색 이동을 이용할 수 있다. 표적 분자는 DNA, RNA, 또는 이의 조합일 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 개별 이산 부피 (하기에 더욱 정의됨) 내에 고형 기재 상에 고정화될 수 있고 단일 시약을 격리시킬 수 있다. 예를 들어, 시약은 염료를 포함하는 비드일 수 있다. 고정화 시약에 의해 격리될 때, 개별 비드는 너무 확산되어 검출가능한 신호를 발생시키지 못하지만, 차폐성 구성체로부터 방출 시에 예를 들어 응집에 의해서 또는 용액 농도의 단순 증가에 의해서 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 고정된 차폐제는 표적 분자의 검출 시에 활성화된 이펙터 단백질에 의해 절단될 수 있는 RNA-기반 압타머 또는 ssDNA-기반 압타머이다.
일례의 구현예에서, 차폐성 구성체는 검출제가 응집되는지 또는 용액에 분산되는지 여부에 따라서 생상을 변화시키는 검출제를 포함한다. 예를 들어, 일정한 나노입자, 예컨대 콜로이드 금은 그들이 응집물로부터 분산된 입자로 이동하면서 가시적인 보라색에서 붉은 색으로 색상 이동을 겪는다. 따라서, 일정한 예의 구현예에서, 이러한 검출제는 하나 이상의 브릿지 분자에 의해 응집물로 유지될 수 있다. 예를 들어, 도43을 참조한다. 브릿지 분자의 적어도 일부분은 RNA를 포함한다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시에, 브릿지 분자의 RNA 일부분은 절단되어서 검출제가 분산될 수 있게 하고 색상의 상응하는 변화를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 도 46을 참조한다. 일정한 예의 구현예에서, 브릿지 분자는 RNA 분자이다. 다른 구현예에서, 브릿지 분자는 부차적 ssDNA 활성을 나타내는 Cas 단백질과 함께 이용될 수 있는 ssDNA 분자이다. 일정한 예의 구현예에서, 검출제는 콜로이드 금속이다. 콜로이드 금속 재료는 액체, 히드로졸 또는 금속 졸에 분산된 수불용성 금속 입자 또는 금속 화합물을 포함할 수 있다. 콜로이드 금속은 주기율표의 그룹 IA, IB, IIB 및 IIIB의 금속을 비롯하여, 전이 금속, 특히 그룹 VIII의 것으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 금속은 금, 은, 알루미늄, 루테늄, 아연, 철, 니켈 및 칼슘을 포함한다. 다른 적합한 금속은 또한 모든 그들의 다양한 산화 상태의 하기의 것들을 포함한다: 리튬, 소듐, 마그네슘, 포타슘, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 크롬, 망간, 코발트, 구리, 갈륨, 스트론튬, 니오븀, 몰리브데늄, 팔라듐, 인듐, 주석, 텅스텐, 레늄, 플래티늄, 및 가돌리늄. 금속은 바람직하게 적절한 금속 화합물로부터 유래된 이온 형태, 예를 들어 A13+, Ru3+, Zn2+, Fe3+, Ni2+ 및 Ca2+ 이온으로 제공된다.
RNA 브릿지 (또는 ssDNA 브릿지)가 활성화된 CRISPR 이펙터에 의해 절단될 때, 앞서 언급된 색상 이동이 관찰된다. 일정한 예의 구현예에서, 입자는 콜로이드 금속이다. 일정한 다른 일례의 구현예에서, 콜로이드 금속은 콜로이드 금이다. 일정한 일례의 구현예에서, 콜로이드 나노입자는 15 nm 금 나노입자 (AuNP)이다. 콜로이드 금 나노입자의 고유한 표면 특성에 기인하여, 최대 흡광도는 용액 중에서 완전하게 분산될 때 520 nm에서 관찰되고 육안으로 붉은 색상으로 나타난다. AuNP의 응집시, 그들은 최대 흡광도에서 적색-이동을 나타내고 색상이 더 진하게 보여서, 결국 진보라색 응집체로서 용액으로부터 침전된다. 일정한 예의 구현예에서, 나노입자는 나노입자의 표면으로부터 연장된 DNA 링커를 포함하도록 변형된다. 개별 입자는 RNA의 각 말단에서 DNA 링커의 적어도 일부분에 하이브리드화되는 단일-가닥 RNA (ssRNA)에 의해 함께 연결된다. 따라서, 나노입자는 연결된 입자 및 응집체의 망을 형성하게 되어 진한 침전물로서 나타나게 될 것이다. 본 명세서에 개시된 CRISPR 이펙터의 활성화 시, ssRNA 브릿지는 절단되어서, 연결된 메쉬로부터 AU NPS를 방출시키고 가시적인 붉은 색상을 생성시키게 된다. 예시적인 DNA 링커 및 RNA 브릿지 서열은 하기에 열거된다. DNA 링커의 말단 상의 티올 링커는 AuNPS와의 표면 접합에 사용될 수 있다. 다른 형태의 접합이 사용될 수도 있다. 일정한 일례의 구현예에서, AuNP의 2개 집단이 생성될 수 있는데, 각각 하나는 각각의 DNA 링커용이다. 이것은 적절한 배향으로 ssRNA 가교의 적절한 결합을 촉진하는 것을 돕게될 것이다. 일정한 일례의 구현예에서, 제1 DNA 링커는 3' 말단에 의해 접합도는 한편 제2 DNA 링커는 5' 말단에 의해 접합된다. ssDNA 부차적 활성을 나타내는 CRISPR-이펙터 단백질에 대한 유사한 시스템이 또한 본 명세서의 개시에 따라 디자인될 수 있다.
표 8
일정한 다른 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 검출가능한 표지 및 그 검출가능한 표지의 차폐제가 부착되는 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 검출가능한 표지/차폐제 쌍의 예는 형광단 및 형광단의 소광제가 있다. 형광단의 소광은 형광단 및 다른 형광단 또는 비형광 분자 간 비형광성 복합체의 형성 결과로서 일어날 수 있다. 이러한 기전은 바닥-상태 복합체 형성, 정적 소광, 또는 접촉 소광으로서 알려져 있다. 따라서, RNA 올리고뉴클레오티드는 형광단 및 소광제가 접촉 소광이 일어나도록 충분히 근접하도록 디자인될 수 있다. 형광단 및 그들의 동족 소광제는 당분야에 공지되어 있고, 당업자에 의해서 이러한 목적을 위해 선택될 수 있다. 특정한 형광단/소광제 쌍은 본 발명의 상황에서 핵심적이지 않고, 오직 형광단/소광제 쌍의 선택이 형광단의 차폐를 보장한다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시에, RNA 올리고뉴클레오티드는 절단되고 그리하여 접촉 소광 효과를 유지하는데 필요한 형광단 및 소광제 간 근접성을 잘라낸다. 따라서, 형광단의 검출은 샘플 중 표적 분자의 존재를 결정하는데 사용될 수 있다.
일정한 다른 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 하나 이상의 금속 나노입자, 예컨대 금 나노입자가 부착되는 하나 이상의 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 차폐성 구성체는 닫힌 루프를 형성하는 다수의 RNA 올리고뉴클레오티드에 의해 가교된 다수의 금속 나노입자를 포함한다. 일 구현예에서, 차폐성 구성체는 닫힌 루프를 형성하는 3개의 RNA 올리고뉴클레오티드에 의해 교차된 3개의 금 나노입자를 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질에 의한 RNA 올리고뉴클레오티드의 절단은 금속 나노입자에 의해 생성되는 검출가능한 신호를 야기시킨다.
일정한 다른 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 하나 이상의 퀀텀 도트가 부착되는 하나 이상의 RNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질에 의한 RNA 올리고뉴클레오티드의 절단은 퀀텀 도트에 의해 생성되는 검출가능한 신호를 야기시킨다.
일례의 구현예에서, 차폐성 구성체는 퀀텀 도트를 포함할 수 있다. 퀀텀 도트는 표면에 부착되는 다수의 링커 분자를 가질 수 있다. 링커 분자의 적어도 일부분은 RNA를 포함한다. 링커 분자는 한쪽 말단에서 퀀텀 도트에 부착되고 링커의 길이를 따라서 또는 말단부에서 하나 이상의 소광제에 부착되어서 소광제가 퀀텀 도트의 소광이 일어나도록 충분히 근접하게 유지된다. 링커는 분지될 수 있다. 상기처럼, 퀀텀 도트/소광제 쌍은 핵심적이지 않고, 오직 퀀텀 도트/소광제 쌍의 선택이 형광단의 차폐를 보장한다. 퀀텀 도트 및 그들의 동족 소광제는 당분야에 공지되어 있고 당업자에 의해서 이러한 목적을 위해 선택될 수 있다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시, 링커 분자의 RNA 부분은 절단되어서 소광 효과를 유지하는데 필요한 하나 이상의 소광제 및 퀀텀 도트 간 근접성을 제거한다. 일정한 예의 구현예에서, 퀀텀 도트는 스트렙타비딘 접합된다. RNA는 바이오틴 링커를 통해서 부착되고 서열 /5Biosg/UCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/ (SEQ ID NO. 416) 또는 /5Biosg/UCUCGUACGUUCUCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/ (SEQ ID NO. 417)을 갖는 소광 분자를 동원하며, 여기서 /5Biosg/는 바이오틴 태그이고 /3lAbRQSp/는 아이오와 블랙 소광제이다. 절단 시, 본 명세서에 개시된 활성화된 이펙터에 의해서 퀀텀 도트는 가시적으로 형광발광할 것이다.
유사한 방식으로, 형광 에너지 전달 (FRET)은 검출가능한 양성 신호를 발생시키기 위해 사용될 수 있다. FRET는 에너지 여기된 형광단 (즉, "도너 형광단")으로부터의 광자가 다른 분자 (즉, "억셉터") 내 전자의 에너지 상태를 더 높은 진동 수준의 여기된 단일항 상태로 상승시키는 비복사 과정이다. 도너 형광단은 그 형광단의 특징적인 형광을 발광하지 않고 바닥 상태로 되돌아간다. 억셉터는 다른 형광단일 수 있거나 또는 비형광성 분자일 수 있다. 억셉터가 형광단이면, 전달된 에너지는 그 형광단의 특징적인 형광으로서 발광된다. 억셉터가 비형광성 분자라면 흡수된 에너지는 열로서 소실된다. 따라서, 본 명세서에 개시된 구현예의 상황에서, 형광단/소광제 쌍은 올리고뉴클레오티드 분자에 부착된 도너 형광단/억셉터 쌍으로 교체된다. 온전할 때, 차폐성 구성체는 억셉터로부터 방출되는 열 또는 형광에 의해 검출되는 제1 신호 (음성 검출가능한 신호)를 발생시킨다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시 RNA 올리고뉴클레오티드는 절단되고 FRET은 파괴되어서 도너 형광단의 형광이 이제 검출된다 (양성 검출가능한 신호).
일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 짧은 뉴클레오티드로 긴 RNA의 절단에 대응하여 그들 흡광도를 변화시키는 인터컬레이팅 염료의 사용을 포함한다. 몇몇 이러한 염료가 존재한다. 예를 들어, 파이로닌-Y는 RNA와 복합체를 형성하게 될 것이고, 572 nm에서 흡광도를 갖는 복합체를 형성하게 될 것이다. RNA의 절단은 그 결과로 흡광도의 소실 및 색상 변화를 일으킨다. 메틸렌 블루는 유사한 방식으로 사용될 수 있고, RNA 절단 시 688 nm에서의 흡광도가 변화한다. 따라서, 일정한 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질에 의한 RNA의 절단 시에 흡광도를 변화시키는 RNA 및 인터컬레이트 염료 복합체를 포함한다.
일정한 일례의 구현예에서, 차폐성 구성체는 HCR 반응을 위한 개시제를 포함할 수 있다. 예를 들어, [Dirks and Pierce. PNAS 101, 15275-15728 (2004)]를 참조한다. HCR 반응은 2개 헤어핀 종에서 위치 에너지를 이용한다. 헤어핀 중 하나에서 상응하는 영역에 대한 상보성 부분을 갖는 단일-가닥 개시제가 이전에 안정한 혼합물에 방출되는 경우, 이것은 한 종의 헤어핀을 개방시킨다. 그 다음으로, 이 과정은 다른 종의 헤어핀을 개방시키는 단일-가닥 영역을 노출시킨다. 그 다음으로, 이러한 과정은 본래 개시제와 동일한 단일 가닥 영역을 노출시킨다. 최종 사슬 반응은 헤어핀 공급이 고갈될 때까지 성장되는 니킹된 이중 헬릭스의 형성을 초래할 수 있다. 최종 생성물의 검출은 겔 상에서 또는 비색적으로 수행될 수 있다. 예시적인 비색성 검출 방법은 예를 들어, 문헌 [Lu et al. "Ultra-sensitive colorimetric assay system based on the hybridization chain reaction-triggered enzyme cascade amplification ACS Appl Mater Interfaces, 2017, 9(1):167-175], [Wang et al."An enzyme-free colorimetric assay using hybridization chain reaction amplification and split aptamers" AnlaystAnalyst 2015, 150, 7657-7662], 및 [Song et al."Non covalent fluorescent labeling of hairpin DNA probe coupled with hybridization chain reaction for sensitive DNA detection."Applied Spectroscopy, 70(4): 686-694 (2016)]에 개시된 것들을 포함한다.
일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 HCR 개시제 서열 및 개시제가 HCR 반응을 개시하는 것을 방지하는 절단성 구조적 구성요소, 예컨대 루프 또는 헤어핀을 포함할 수 있다. 활성화된 CRISPR 이펙터 단백질에 의한 구조적 구성요소의 절단 시에, 개시제가 방출되어 HCR 반응을 촉발시키고, 이의 검출은 샘플 내에 하나 이상의 표적의 존재를 의미한다. 일정 예의 구현예에서, 차폐성 구성체는 RNA 루프를 갖는 헤어핀을 포함한다. 활성화된 CRISPR 이펙터 단백질이 RNA 루프를 절단할 때, 개시제가 방출되어 HCR 반응을 촉발시킬 수 있다.
표적의 증폭
특정 예시적 구현예에서, 표적 RNA 및/또는 DNA 는 CRISPR 이펙터 단백질을 활성화시키기 전에 증폭될 수 있다. 임의의 적합한 RNA 또는 DNA 증폭 기술이 사용될 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, RNA 또는 DNA 증폭은 등온 증폭이다. 특정 예시적 구현예에서, 등온 증폭은 핵산 서열-기반 증폭 (NASBA), 리콤비나아제 중합효소 증폭 (RPA), 루프-매개 등온 증폭 (LAMP), 가닥 전위 증폭 (SDA), 헬리카아제-의존적 증폭 (HDA), 또는 닉킹 효소 증폭 반응 (NEAR) 일 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, 비-등온 증폭 방법은 PCR, 다중 전위 증폭 (MDA), 롤링 써클 증폭 (RCA), 리가아제 연쇄 반응 (LCR), 또는 세분화 증폭 방법 (RAM) 을 비제한적으로 포함하는 것이 사용될 수 있다.
특정 예시적 구현예에서, RNA 또는 DNA 증폭은 RNA/DNA 듀플렉스를 형성하기 위해 서열-특이적 역방향 프라이머에 의한 표적 RNA의 역전사에 의해 개시되는, NASBA 이다. 그 다음으로 RNase H는 RNA 주형을 분해하는데 사용되어서, 프로모터, 예컨대 T7 프로모터를 함유하는 전방향 프라이머가 결합되어 상보성 가닥의 연장을 개시할 수 있고, 이중-가닥 DNA 생성물이 생성된다. DNA 주형의 RNA 중합효소 프로모터-매개 전사가 표적 RNA 서열의 카피를 생성시킨다. 중요한 것은, 신규 표적 RNA 각각이 가이드 RNA 에 의해 검출될 수 있고 그리하여 어세이의 감도를 더 증강시킬 수 있다는 것이다. 그러고 나서, 가이드 RNA에 의한 표적 RNA의 결합이 CRISPR 이펙터 단백질의 활성화를 야기시키고 방법은 상기 약술된 대로 진행된다. NASBA 반응은 예를 들어 대략 41℃ 의 중간 등온 조건 하에서 진행될 수 있다는 추가의 장점을 가져서, 임상 실험실로부터 멀리 떨어진 현장에서 조기 및 직접 검출을 위해 배치된 시스템 및 장치에 적합하다.
일정한 다른 일례의 구현예에서, 리콤비나제 중합효소 증폭 (RPA) 반응은 표적 핵산을 증폭시키는데 사용될 수 있다. RPA 반응은 듀플렉스 DNA 의 상동성 서열과 서열-특이적 프라이머의 쌍을 형성할 수 있는 리콤비나제를 이용한다. 표적 DNA 가 존재하면, DNA 증폭이 개시되고 다른 샘플 조작 예컨대 열 사이클 또는 화학적 용융이 필요하지 않다. 전체 RPA 증폭 시스템은 건조된 제제로서 안정하고 냉동 없이 안전하게 수송될 수 있다. RPA 반응은 또한 37-42℃ 의 최적 반응 온도로 등온 온도에서 실행될 수 있다. 서열 특이적 프라이머는 검출할 표적 핵산 서열을 포함하는 서열이 증폭되도록 디자인된다. 특정 예시적 구현예에서, RNA 중합효소 프로모터, 예컨대 T7 프로모터는 프라이머 중 하나에 첨가된다. 그 결과로 표적 서열 및 RNA 중합효소 프로모터를 포함하는 증폭된 이중-가닥 DNA 생성물이 얻어진다. RPA 반응 이후, 또는 그 동안, RNA 중합효소가 첨가되어 이중-가닥 DNA 주형으로부터 RNA 를 생성시키게 될 것이다. 이어서, 증폭된 표적 RNA 가 그 다음으로 CRISPR 이펙터 시스템에 의해 검출될 수 있다. 이러한 방식으로 표적 DNA 는 본원에 개시된 구현예를 사용하여 검출될 수 있다. RPA 반응은 또한 표적 RNA 를 증폭시키는데 사용될 수 있다. 표적 RNA 는 먼저 역전사효소를 사용해 cDNA 로 전환되고, 그 다음으로 제 2 가닥 DNA 합성이 후속되며, 이 시점에 RPA 반응은 상기 약술된 대로 진행된다.
본 발명의 일 구현예에서, 니킹 효소는 CRISPR 단백질이다. 따라서, dsDNA로 닉의 도입은 프로그램가능할 수 있고 서열-특이적일 수 있다. 도 112는 dsDNA 표적의 반대 가닥을 표적화하도록 디자인된 2개 가이드에서 시작되는 본 발명의 일 구현예를 도시한다. 본 발명에 따라서, 닉카제는 Cpf1, C2c1, Cas9 또는 임의의 오솔로그 또는 DNA 듀플렉스의 단일 가닥을 절단하거나 또는 절단하도록 조작된 CRISPR 단백질일 수 있다. 닉킹된 가닥은 중합효소에 의해 연장될 수 있다. 일 구현예에서, 닉의 위치는 중합효소에 의한 가닥의 연장이 닉 부위 사이의 표적 듀플렉스 DNA의 중심 부분을 향하도록 선택된다. 일정 구현예에서, 연장된 가닥과 하이브리드화할 수 있는 프라이머가 반응에 포함되고 이후에 2개 dsDNA 조각을 재생하도록 프라이머의 추가의 중합효소 연장이 후속된다: Cpf1 가이드 부위 또는 제1 및 제2 가닥 Cpf1 가이드 부위 둘 모두를 포함하는 제1 dsDNA, 및 제2 가닥 Cpf1 가이드 부위 또는 제1 및 제2 가닥 Cprf 가이드 부위 둘 모두를 포함하는 제2 dsDNA. 이들 조각은 닉킹 부위 사이의 표적의 영역을 기하급수적으로 증폭시키는 순환 반응으로 닉킹과 연장을 계속한다.
증폭은 등온적일 수 있고 온도에 대해 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 증폭은 37℃에서 신속하게 진행된다. 다른 구현예에서, 등온 증폭의 온도는 상이한 온도에서 작동가능한 중합효소 (예를 들어, Bsu, Bst, Phi29, klenow 단편 등)를 선택하여 선택될 수 있다.
따라서, 닉킹 등온 증폭 기술은 (예를 들어, 닉킹 효소 증폭 반응 또는 NEAR에서) 고정된 서열 선호도를 갖는 닉킹 효소를 사용하여, 표적의 말단에 닉킹 기질을 첨가하는 프라이머의 어닐링 및 연장을 허용하기 위해 본래 dsDNA 표적의 변성을 필요로 하지만, 닉킹 부위가 가이드 RNA를 통해서 프로그램될 수 있는 것인 CRISPR 닉카제의 사용은 변성 단계를 필요로 하지 않아서, 전체 반응이 진짜로 등온성이게 된다는 것을 의미한다. 이것은 또한 닉킹 기질을 첨가하는 이들 프라이머가 이후 반응에서 사용되는 프라이머와 상이하기 때문에 반응을 단순화시키며, 이것은 NEAR이 2개 프라이머 세트 (즉, 4개 프라이머)를 필요로 하지만 Cpf1 닉킹 증폭은 오직 하나의 프라이머 세트 (즉, 2개 프라이머)를 필요로 한다는 것을 의미한다. 이것은 변성 및 이후 등온 온도로 냉각을 수행하기 위해 복잡한 장비없이 작업하도록 닉킹 Cpf1 증폭을 훨씬 더 단순하고 쉽게 만든다.
따라서, 일정한 예의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 시스템은 증폭 시약을 포함할 수 있다. 핵산의 증폭에 유용한 상이한 성분 또는 시약은 본 명세서에 기술되어 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같은 증폭 시약은 완충제, 예컨대 Tris 완충제를 포함할 수 있다. Tris 완충제는 예를 들어, 제한없이, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM, 1 M 등의 농도를 포함하여, 바람직한 적용 또는 용도에 적절한 임의 농도로 사용될 수 있다. 당업자는 완충제 예컨대 본 발명에서 사용을 위한 Tris의 적절한 농도를 결정할 수 있을 것이다.
염, 예컨대 마그네슘 클로라이드 (MgCl2), 포타슘 클로라이드 (KCl), 또는 소듐 클로라이드 (NaCl) 가 핵산 단편의 증폭을 개선시키기 위해서, 증폭 반응, 예컨대 PCR 에 포함될 수 있다. 염 농도가 특정한 반응 및 적용분야에 의존적일 것이지만, 일부 구현예에서, 특정한 크기의 핵산 단편은 특정한 염 농도에서 최적 결과를 생성시킬 수 있을 것이다. 바람직한 결과를 생성시키기 위해서, 더 큰 생성물은 변경된 염 농도, 전형적으로 더 낮은 염을 요구할 수 있는 한편, 더 작은 생성물의 증폭은 더 높은 염 농도에서 보다 양호한 결과를 생성시킬 수 있다. 당업자는 염 농도의 변경과 함께, 염의 존재 및/또는 농도가 생물학적 또는 화학적 반응의 엄격도를 변경시킬 수 있고, 그러므로 본 명세서에서 기재된 바와 같이 본 발명의 반응을 위해 적절한 조건을 제공하는 임의의 염을 사용할 수 있다는 것을 이해하게 될 것이다.
생물학적 또는 화학적 반응의 다른 성분은 세포 안의 물질의 분석을 위해 세포를 파쇄하거나 용해시키기 위해 세포 용해 성분을 포함할 수 있다. 세포 용해 성분은 세제, 상기 기재된 바와 같은 염, 예컨대 NaCl, KCl, 암모늄 술페이트 [(NH4)2SO4], 또는 다른 것들을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 적절할 수 있는 세제는 Triton X-100, 소듐 도데실 술페이트 (SDS), CHAPS (3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트), 에틸 트리메틸 암모늄 브로마이드, 노닐 페녹시폴리에톡실에탄올 (NP-40) 을 포함할 수 있다. 세제의 농도는 특정 적용분야에 의존적일 수 있고, 일부 경우에서 반응에 특이적일 수 있다. 증폭 반응은 예컨대 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 950 nM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM 등의 농도를 비제한적으로 포함하여, 본 발명에 적절한 임의 농도로 사용되는 dNTP 및 핵산 프라이머를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 본 발명에 따라서 유용한 중합효소는 Taq 중합효소, Q5 중합효소 등을 포함하는, 당분야에 공지되어 있고 본 발명에서 유용한 임의의 특이적이거나 또는 일반적인 중합효소일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 증폭 시약은 핫-스타트 증폭에서 사용에 적절할 수 있다. 핫 스타트 증폭은 어댑터 분자 또는 올리고의 이량체화를 감소시키거나 제거시키기 위해서, 또는 달리 원치않는 증폭 생성물 또는 인공물을 방지하고 바람직한 생성물의 최적 증폭을 수득하기 위해서 일부 구현예에서 유리할 수 있다. 증폭에 사용하기 위한 본원에 기재된 많은 성분이 또한 핫-스타트 증폭에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 핫-스타트 증폭에서 사용하기에 적절한 시약 또는 성분은 적절하다면 조성물 성분 중 하나 이상 대신에 사용될 수 있다. 예를 들어, 중합효소 또는 다른 시약은 특정한 온도 또는 다른 반응 조건에서 바람직한 활성을 나타내는 것이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 시약은 핫-스타트 증폭에서 사용하기 위해 디자인되거나 최적화된 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 중합효소는 전위 이후 또는 특정한 온도에 도달 이후에 활성화될 수 있다. 이러한 중합효소는 항체-기반 또는 압타머-기반일 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 중합효소는 당분야에 공지되어 있다. 이러한 시약의 예는 제한없이, 핫-스타트 중합효소, 핫-스타트 dNTP, 및 광-케이징된 dNTP를 포함할 수 있다. 이러한 시약은 공지되어 있고 당분야에서 입수가능하다. 당업자는 개별 시약에 적절하게 최적 온도를 결정할 수 있을 것이다.
핵산의 증폭은 특별한 열 사이클 기계 또는 장비를 사용하여 수행될 수 있고, 단일 반응으로 또는 대량으로 수행될 수 있어, 임의의 바람직한 횟수의 반응이 동시에 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 증폭은 미세유체 또는 로봇식 장치를 사용해 수행될 수 있거나, 또는 바람직한 증폭을 달성하도록 온도의 수동 변경을 사용해 수행될 수도 있다. 일부 구현예에서, 특정한 적용분야 또는 재료를 위한 최적 반응 조건을 수득하기 위해 최적화가 수행될 수 있다. 당업자는 충분한 증폭을 수득하도록 반응 조건을 이해하게 될 것이고 최적화시킬 수 있을 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법 또는 시스템에 의한 DNA 의 검출은 검출 전에 (증폭된) DNA를 RNA 로 전사시키는 것을 필요로 한다.
본 발명의 검출 방법은 다양하게 조합하여 핵산 증폭 및 검출 절차를 포함할 수 있다는 것은 자명할 것이다. 검출하려는 핵산은 제한없이 검출할 수 있는 중간 생성물을 제공하기 위한 임의의 적합한 방법을 통해 증폭될 수 있는, DNA 및 RNA를 포함하여, 임의의 천연 발생 또는 합성 핵산일 수 있다. 중간 생성물의 검출은 제한없이 직접 또는 부차적 활성을 통해 검출가능한 신호 모이어티를 생성시키는 CRISPR 단백질의 결합 및 활성화를 포함하여, 임의의 적합한 방법을 통할 수 있다.
특정 예시적 구현예에서, 검출가능한 양성 신호를 더 증폭시키는 추가의 변형이 도입될 수 있다. 예를 들어, 활성화된 CRISPR 이펙터 단백질 부차적 활성화는 2차 표적 또는 추가적인 가이드 서열, 또는 돌 모두를 생성시키는데 사용될 수 있다. 한 예시적 구현예에서, 반응 용액은 높은 농도로 스파이크되는 2차 표적을 함유할 것이다. 2차 표적은 1차 표적 (즉, 어세이가 그를 검출하도록 디자인되는 표적) 과 구별될 수 있으며, 특정 경우에는 모든 반응 부피에 걸쳐 공통적일 수 있다. 2차 표적에 대한 2차 가이드 서열은 예를 들어 RNA 루프를 갖는 헤어핀과 같은 2차 구조적 특성에 의해 보호될 수 있으며, 2차 표적 또는 CRISPR 이펙터 단백질에 결합할 수 없다. 활성화된 CRISPR 이펙터 단백질에 의한 보호기의 절단 (즉, 용액 중 1차 표적(들) 과의 복합체 형성에 의한 활성화 후) 및 용액 중 유리 CRISPR 이펙터 단백질과의 복합체 형성 및 2차 표적에 스파이크된 것으로부터의 활성화가 있다. 특정 기타 예시적 구현예에서, 유사한 개념이 2차 표적 서열에 대한 제2 가이드 서열과 함께 사용된다. 2차 표적 서열은 2차 표적 상의 구조적 특성 또는 보호기를 보호할 수 있다. 2차 표적의 보호기 절단은 추가적인 CRISPR 이펙터 단백질, 가이드 서열, 2차 표적 서열이 형성되게 할 것이다. 또 다른 예시적 구현예에서, 1차 표적(들)에 의한 CRISPR 이펙터 단백질의 활성화는 보호되거나 또는 원형화된 프라이머를 절단하는데 사용될 수 있으며, 이어서 2차 가이드 서열, 2차 표적, 또는 둘 모두를 코딩하는 주형 상에서 본원에 개시된 것들과 같은 등온 증폭 반응이 수행되도록 방출될 것이다. 이러한 증폭된 주형의 후속 전사는 더 많은 2차 가이드 서열 및/또는 2차 표적 서열을 생성시켜, 이후 추가적인 CRISPR 이펙터 단백질 부차적 활성화를 생성시킬 것이다.
RNA-가이드된 Cpf1의 프로그램 가능성, 특이성 및 부차적 활성은 또한 이것을 핵산의 비특이적 절단을 위한 이상적인 전환가능 뉴클레아제이게 한다. 한 구현예에서, Cpf1 시스템은 RNA 의 부차적인 비특이적 절단을 제공하고 이용하도록 조작된다. 또 다른 구현예에서, Cpf1 시스템은 ssDNA 의 부차적인 비특이적 절단을 제공하고 이용하도록 조작된다. 따라서, 조작된 Cpf1 시스템은 핵산 검출 및 전사체 조작을 위한 플랫폼을 제공한다. Cpf1 은 포유동물 전사물 녹다운 및 결합 도구로서 사용하기 위해 개발된다. Cpf1 은 서열 특이적 표적화된 DNA 결합에 의해 활성화될 때 RNA 및 ssDNA 의 강건한 부차적인 절단을 가능하게 한다.
RNA-가이드된 C2c1 의 프로그램 가능성, 특이성 및 부차적 활성은 또한 핵산의 비특이적 절단을 위한 이상적인 전환가능 뉴클레아제를 가능하게 한다. 한 구현예에서, C2c1 시스템은 RNA의 부차적인 비특이적 절단을 제공하고 이용하도록 조작된다. 또 다른 구현예에서, C2c1 시스템은 ssDNA 의 부차적인 비특이적 절단을 제공하고 이용하도록 조작된다. 따라서, 조작된 C2c1 시스템은 핵산 검출 및 전사체 조작, 및 세포 사멸 유도를 위한 플랫폼을 제공한다. C2c1 은 포유동물 전사물 녹다운 및 결합 도구로서 사용하기 위해 개발된다. C2c1 은 서열 특이적 표적화된 DNA 결합에 의해 활성화될 때 RNA 및 ssDNA 의 강건한 부차적인 절단을 가능하게 한다.
표적 RNA/DNA 농축
일정한 예의 구현예에서, 표적 RNA 또는 DNA는 먼저 표적 RNA 또는 DNA의 검출 또는 증폭 전에 농축될 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 이러한 농축은 CRISPR 이펙터 시스템에 의한 표적 핵산의 결합에 의해 획득될 수 있다.
현재의 표적-특이적 농축 프로토콜은 프로브와의 하이브리드화 이전에 단일-가닥 핵산을 필요로 한다. 다양한 장점 중에서, 본 발명의 구현예는 이러한 단계를 생략할 수 있고 이중 가닥 (부분 또는 완전 이중 가닥) DNA를 직접 표적화할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 개시된 구현예는 등온 농축을 허용하는 보다 빠른 동역학 및 보다 용이한 작업흐름을 제공하는 효소-구동 표적화 방법이다. 일정 예의 구현예에서, 농축은 20-37℃ 정도로 낮은 온도에서 일어날 수 있다. 일정한 예의 실시형태에서, 상이한 표적 핵산에 대한 가이드 RNA의 세트가 단일 어세이에서 사용되어, 다수의 표적 및/또는 단일 표적의 다수 변이체의 검출을 가능하게 한다.
일정한 예의 구현예에서, 데드 CRISPR 이펙터 단백질은 용액 중에서 표적 핵산에 결합할 수 있고 그 이후에 상기 용액으로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산에 결합된 데드 CRISPR 이펙터 단백질은 데드 CRISPR 이펙터 단백질에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 다른 분자, 예컨대 압타머를 사용해 용액으로부터 단리될 수 있다.
다른 일례의 구현예에서, 데드 CRISPR 이펙터 단백질은 고형 기재에 결합될 수 있다. 고정된 기재는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 부착에 적절하거나 또는 적절하도록 변형될 수 있는 임의 재료를 의미할 수 있다. 가능한 기재는 제한없이, 유리 및 변형된 기능성 유리, 플라스틱 (아크릴, 폴리스티렌 및 스티렌과 다른 재료의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, Teflon™ 등 포함), 다당류, 나일론 또는 니트로셀룰로스, 세라믹, 레진, 규소 및 변형 규소를 포함하는 실리카 또는 실리카-기반 재료, 탄소, 금속, 무기 유리, 플라스틱, 광학 섬유 번들 및 다양한 다른 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 고형 지지체는 규칙적인 패턴으로 분자의 고정에 적합한 패턴화된 표면을 포함한다. 일정한 구현예에서, 패턴화된 표면은 고형 지지체의 노출된 층 내 또는 그 위의 상이한 영역의 배열을 의미한다. 일부 구현예에서, 고형 지지체는 표면에 웰 또는 오목부의 어레이를 포함한다. 고형 지지체의 조성 및 기하학적 구조는 이의 용도에 따라 다양할 수 있다. 일부 구현예에서, 고형 지지체는 평면 구조 예컨대 슬라이드, 칩, 마이크로칩 및/또는 어레이이다. 이와 같이, 기재의 표면은 평면층의 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 고형 지지체는 플로우셀의 하나 이상의 표면을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "플로우 셀"은 하나 이상의 유체 시약이 흐를 수 있는 고형 표면을 포함하는 챔버를 의미한다. 본 개시의 방법에서 쉽게 사용할 수 있는 예시적인 플로우 셀 및 관련 유체 시스템 및 검출 플랫폼은 예를 들어, [Bentley et al. Nature 456:53-59 (2008)], WO 04/0918497, U.S. 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7,329,492; US 7,211,414; US 7,315,019; U.S. 7,405,281, 및 US 2008/0108082에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 고형 지지체 또는 이의 표면은 비평면, 예컨대 튜브 또는 용기의 내부 또는 외부 표면이다. 일부 구현예에서, 고형 지지체는 미세구 또는 비드를 포함한다. 미세구", "비드", "입자"는 제한없이, 플라스틱, 세라믹, 유리 및 폴리스티렌을 포함하는 다양한 재료로 만들어진 소형 개별 입자를 의미하는 것으로 고형 기재의 상황 내에서 의미하고자 한다. 일정 구현예에서, 미세구는 자성 미세구 또는 비드이다. 대안적으로 또는 추가적으로, 비드는 다공성일 수 있다. 비드 크기는 나노미터, 예를 들어 100 nm에서 밀리미터, 예를 들어 1 mm의 범위이다.
다음으로, 표적 핵산을 함유하거나, 또는 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 기재에 노출시켜서 결합된 데드 CRISPR 이펙터 단백질에 표적 핵산이 결합할 수 있게 할 수 있다. 비-표적 분자는 세척해 버릴 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 이후에, 표적 핵산은 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 추가 검출을 위해 CRISPR 이펙터 단백질/가이드 RNA 복합체로부터 방출될 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 표적 핵산은 본 명세서에 기술된 바와 같이 먼저 증폭될 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, CRISPR 이펙터는 결합 태그로 표지될 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, CRISPR 이펙터는 화학적으로 태그화될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 이펙터는 화학적으로 바이오틴화될 수 있다. 다른 일례의 구현예에서 CRISPR 이펙터에 융합체를 코딩하는 추가 서열을 첨가하여 융합체를 생성시킬 수 있다. 이러한 융합체의 일례는 고유한 15개 아미노산 펩티드 태그 상에 단일 바이오틴의 고도로 표적화된 효소 접합을 적용하는 AviTag™ 이다. 일정 구현예에서, CRISPR 이펙터는 포획 태그 예컨대, 제한없이, GST, Myc, 헤마글루티닌 (HA), 녹색 형광성 단백질 (GFP), flag, His 태그, TAP 태그, 및 Fc 태그로 표지될 수 있다. 결합 태그는 융합체, 화학적 태그, 또는 포획 태그인지 여부와 무관하게, 표적 핵산에 결합되면 CRISPR 이펙터 시스템을 풀다운하거나 또는 고형 기재 상에 CRISPR 이펙터 시스템을 고정시키는데 사용될 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, 가이드 RNA는 결합 태그로 표지될 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 전체 가이드 RNA는 하나 이상의 바이오틴화된 뉴클레오티드, 예컨대, 바이오틴화된 우라실을 도입시킨 시험관내 전사 (IVT)를 사용하여 표지될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오틴은 화학적으로 또는 효소적으로 가이드 RNA에 첨가될 수 있고, 예컨대 가이드 RNA의 3' 말단에 하나 이상의 바이오틴 기의 첨가일 수 있다. 결합 태그는 예를 들어, 가이드 RNA/표적 핵산을 스트렙타비딘 코팅된 고형 기재에 노출시켜서, 결합이 발생된 이후 가이드 RNA/표적 핵산 복합체를 풀다운하는데 사용될 수 있다.
특정한 구현예에서, 고형 기재는 플로우 셀일 수 있다. 일정 구현예에서, 플로우 셀은 시험 샘플 중 피분석물의 양 또는 존재를 검출하기 위한 장치일 수 있다. 플로우 셀 장치는 시험 샘플에 함유될 수 있는 피분석물에 대한 전기적 또는 광학적 검출가능한 반응을 생성시키는 고정된 시약 수단을 가질 수 있다.
따라서, 일정한 예의 구현예에서, 조작되거나 또는 비천연 발생된 CRISPR 이펙터는 농축 목적에 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 변형은 이펙터 단백질의 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이를 포함할 수 있다. 하나 이상의 돌연변이는 이펙터 단백질의 하나 이상의 촉매 활성 도메인에 존재할 수 있다. 이펙터 단백질은 상기 하나 이상의 돌연변이를 결여하는 이펙터 단백질과 비교하여 감소되거나 제거된 뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 이펙터 단백질은 대상 표적 유전자좌에서 RNA 가닥의 절단을 유도하지 않을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는 2 개의 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 C2c2 이펙터 단백질, 예를 들어 조작된 또는 비-자연 발생적 이펙터 단백질 또는 C2c2 에서 변형된다. 특정 구현예에서, 돌연변이된 아미노산 잔기의 하나 이상의 변형은 R597, H602, R1278 및 H1283 (Lsh C2c2 아미노산이라고 함)에 상응하는 C2c2의 것들 중 하나 이상, 예컨대 돌연변이 R597A, H602A, R1278A 및 H1283A, 또는 Lsh C2c2 오솔로그 중 해당 아미노산 잔기이다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 변형 또는 돌연변이된 아미노산 잔기는 C2cs 공통 번호매김에 따른, K2, K39, V40, E479, L514, V518, N524, G534, K535, E580, L597, V602, D630, F676, L709, I713, R717 (HEPN), N718, H722 (HEPN), E773, P823, V828, I879, Y880, F884, Y997, L1001, F1009, L1013, Y1093, L1099, L1111, Y1114, L1203, D1222, Y1244, L1250, L1253, K1261, I1334, L1355, L1359, R1362, Y1366, E1371, R1372, D1373, R1509 (HEPN), H1514 (HEPN), Y1543, D1544, K1546, K1548, V1551, I1558에 상응하는 C2c2 내 하나 이상의 것들이다. 일정 구현예에서, 하나 이상의 변형 또는 돌연변이된 아미노산 잔기는 R717 및 R1509에 상응하는 C2c2의 것들 중 하나 이상이다. 일정 구현예에서, 하나 이상의 변형 또는 돌연변이된 아미노산 잔기는 K2, K39, K535, K1261, R1362, R1372, K1546 및 K1548에 상응하는 C2c2의 것 중 하나 이상이다. 일정 구현예에서, 상기 돌연변이는 그 결과로 변경되거나 또는 변형된 활성을 갖는 단백질을 야기시킨다. 일정 구현예에서, 상기 돌연변이는 감소된 활성, 예컨대 감소된 특이성을 갖는 단백질을 야기시킨다. 일정 구현예에서, 상기 돌연변이는 촉매 활성이 없는 단백질 (즉, "데드" C2c2)을 야기시킨다. 일 구현예에서, 상기 아미노산 잔기는 Lsh C2c2 아미노산 잔기에 상응하거나, 또는 상이한 종 유래 C2c2 단백질의 상응하는 아미노산 잔기에 해당된다. 장치는 이들 단계를 용이하게 할 수 있다. 일부 구현예에서, Cas13b 이펙터 및 하나 이상의 기능성 도메인의 융합 단백질의 크기를 축소시키기 위해서, Cas13b 이펙터의 C-말단은 이의 RNA 결합 기능은 여전히 유지하면서 절단될 수 있다. 예를 들어, 적어도 20개 아미노산, 적어도 50개 아미노산, 적어도 80개 아미노산, 또는 적어도 100개 아미노산, 또는 적어도 150개 아미노산, 또는 적어도 200개 아미노산, 또는 적어도 250개 아미노산, 또는 적어도 300개 아미노산, 또는 적어도 350개 아미노산, 또는 최대 120개 아미노산, 또는 최대 140개 아미노산, 또는 최대 160개 아미노산, 또는 최대 180개 아미노산, 또는 최대 200개 아미노산, 또는 최대 250개 아미노산, 또는 최대 300개 아미노산, 또는 최대 350개 아미노산, 또는 최대 400개 아미노산이 Cas13b 이펙터의 C-말단에서 절단될 수 있다. Cas13b 절두형의 특정 예는 C-말단 Δ984-1090, C-말단 Δ1026-1090, 및 C-말단 Δ1053-1090, C-말단 Δ934-1090, C-말단 Δ884-1090, C-말단 Δ834-1090, C-말단 Δ784-1090, 및 C-말단 Δ734-1090을 포함하고, 여기서 아미노산 위치는 프레보텔라 sp. P5-125 Cas13b 단백질의 아미노산 위치에 상응한다.
따라서, 일례의 구현예에서, 농축 CRISPR 시스템은 촉매적 불활성 CRISPR 이펙터 단백질을 포함할 수 있다. 특별한 구현예에서, 촉매적 불활성 CRISPR 이펙터 단백질은 촉매적 불활성 C2c2일 수 있다.
상기 농축 시스템은 또한 일정한 핵산의 샘플을 감손시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 샘플로부터 비-표적 RNA를 제거하기 위해 비-표적 RNA에 결합하도록 디자인될 수 있다. 일례의 구현예에서 가이드 RNA는 특정한 핵산 변이를 보유하는 핵산에 결합하도록 디자인될 수 있다. 예를 들어, 소정 샘플에서 더 높은 카피수의 비-변이체 핵산이 예상될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 구현예는 또한 검출 CRISPR 이펙터 시스템이 소정 샘플에서 표적 변이체 서열을 검출할 수 있는 효율을 증가시키도록, 샘플로부터 비-변이체 핵산을 제거시키는데 사용될 수 있다.
진단 장치
본 명세서에 기술된 장치는 진단 장치 상에서 구현될 수 있다. 다수의 기질 및 구성이 사용될 수 있다. 장치는 장치 내 다수의 개별 이산 부피를 한정할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "개별 이산 부피"는 별개의 공간, 예컨대 용기, 리셉타클, 또는 표적 분자의 이동을 방지 및/또는 억제하는 특성에 의해 한정할 수 있는 다른 임의의 한정된 부피 또는 공간, 예를 들어 물리적 특성 예컨대 불투과성 또는 반투과성일 수 있는, 벽, 예를 들어 웰의 벽, 튜브 또는 액적의 표면에 의해 한정되거나, 또는 다른 수단 예컨대 한정된 공간 내에 샘플을 함유할 수 있는, 화학적, 확산 속도 제한된, 전자기, 또는 광조사, 또는 이의 임의 조합에 의해 한정되는 부피 또는 공간을 의미한다. 개별 이산 부피는 분자 태그, 예컨대 핵산 바코드에 의해 식별할 수 있다. "확산 속도 제한" (확산 한정 부피)이란 확산이 한 스트림에서 다른 스트림으로 표적 분자의 이동을 제한하게 되는 2개의 평행한 층류 스트림의 경우에서 처럼 확산 제한이 효과적으로 공간 또는 부피를 한정하기 때문에 일정한 분자 또는 반응에만 접근가능한 공간을 의미한다. "화학적" 한정된 부피 또는 공간이란 예를 들어 겔 비드가 예컨대 비드의 내부로 진입할 수 있는 종의 선택을 가능하게 할 수 있는 비드의 표면 전하, 매트릭스 크기 또는 다른 물리적 특성에 의해서, 다른 것들은 아니지만, 비드로의 진입에 일정한 종을 배제할 수 있는 경우에, 그들의 화학적 또는 분자적 특성, 예컨대 크기때문에, 오직 일정한 표적 분자가 존재할 수 있는 공간을 의미한다. "전자기적으로" 한정된 부피 또는 공간이란 표적 분자 또는 그들 지지체의 전자기 특성 예컨대 전하 또는 자성이 자기장 내에서 또는 직접적으로 자석 상에서 자성 입자를 포획하는 것과 같이, 공간에서 일정한 영역을 한정하는데 사용될 수 있는 공간을 의미한다. "광학적으로" 한정된 부피란 한정된 공간 또는 부피내 표적 분자만이 표지될 수 있도록 가시광, 자외선, 적외선, 또는 다른 파장의 광으로 조사하여 한정될 수 있는 임의의 공간 영역을 의미한다. 무벽, 또는 반투과성 이산 부피의 사용의 한가지 장점은 일부 시약, 예컨대 완충제, 화학적 활성인자, 또는 다른 작용제가 이산 부피를 통해서 통과할 수 있는 한편, 다른 재료, 예컨대 표적 분자는 이산 부피 또는 공간에 유지될 수 있다는 것이다. 전형적으로, 이산 부피는 표지화를 가능하게 하는 조건 하에서 색인가능한 핵산 식별자로 표적 분자의 표지화에 적합한 유체 매질 (예를 들어, 수용액, 오일, 완충제, 및/또는 세포 성장을 지지할 수 있는 배지)을 포함할 수 있다. 개시된 방법에서 유용한 예시적인 이산 부피 또는 공간은 특히 액적 (예를 들어, 미세유체 액적 및/또는 에멀션 액적), 히드로겔 비드 또는 다른 중합체 구조 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트 비드 또는 아가로스 비드), 조직 슬라이드 (예를 들어, 화학적, 광학적, 또는 물리적 수단으로 한정된 특정한 영역, 부피 또는 공간을 갖는 고정 포르말린 파라핀 포매된 슬라이드), 정돈된 어레이 또는 무작위 패턴으로 시약을 배치하여 한정된 영역을 갖는 현미경 슬라이드, 튜브 (예컨대, 원심분리 튜브, 미세원심분리 튜브, 시험관, 큐벳, 코니칼 튜브 등), 병 (예컨대 유리병, 플라스틱병, 세라믹 병, 엘렌메이어 플라스크, 섬광 바이알 등), 웰 (예컨대 플레이트의 웰), 플레이트, 파이펫, 또는 파이펫 팁을 포함한다. 일정한 구현예에서, 구획은 유중수 에멀션 중 수성 액적이다. 특정한 구현예에서, 정확하고 균일한 부피를 요구하는 본 명세서에 기술된 임의의 적용, 방법, 또는 시스템은 음향 액체 분배기의 사용을 채택할 수 있다.
일정 구현예에서 개별 이산 부피는 고형 기재 상에 한정된다. 일정 구현예에서 개별 이산 부피는 마이크로웰이다.
일정한 예의 구현예에서, 장치는 많은 스폿이 한정될 수 있는 가요성 재료 기재를 포함한다. 진단 및 바이오센싱에서 사용이 적합한 가요성 기재 재료는 당분야에 공지되어 있다. 가요성 기재 재료는 식물 유래 섬유, 예컨대 셀룰로스계 섬유로 만들어질 수 있거나, 또는 가요성 중합체 예컨대 가요성 폴리에스테르 필름 및 다른 중합체 유형으로 제조될 수 있다. 각각의 한정된 스폿 내에서, 본 명세서에 기술된 시스템의 시약은 개별 스폿에 적용된다. 각각의 스폿은 상이한 가이드 RNA 또는 가이드 RNA의 세트를 제외하고, 동일한 시약을 함유할 수 있거나, 또는 적용가능한 경우에, 한번에 다수의 표적을 스크리닝하기 위한 상이한 검출 압타머를 함유할 수 있다. 따라서, 본 명세서의 시스템 및 장치는 동일 표적의 존재에 대해서 다수의 공급원 (예를 들어, 상이한 개체 유래의 다수 임상 샘플) 유래 샘플을 스크리닝할 수 있거나, 또는 샘플 중 다수의 상이한 표적의 존재에 대해서 제한된 수의 표적, 또는 단일 샘플의 분취액 (또는 동일 공급원 유래 다수의 샘플)에 대해 스크리닝할 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 본 명세서에 기술된 시스템의 구성요소는 종이 또는 직물 기재 상에서 동결 건조된다. 일정 예의 장치에서 사용할 수 있는 에시적인 가요성 재료 기반 기재는 [Pardee et al.Cell.2016, 165(5):1255-66] 및 [Pardee et al.Cell.2014, 159(4):950-54]에 개시되어 있다. 혈액을 포함한, 생물학적 유체에 사용을 위한 적합한 가요성 재료-기반 기재는 Shevkoplyas 등의 발명의 명칭 "Paper based diagnostic test"의 국제 공개 특허 출원 WO/2013/071301, Siegel 등의 발명의 명칭 "Paper-based microfluidic systems"의 미국 공개 특허 출원 번호 2011/0111517, 및 문헌 [Shafiee et al. "Paper and Flexible Substrates as Materials for Biosensing Platforms to Detect Multiple Biotargets" Scientific Reports 5:8719 (2015)]에 개시되어 있다. 착용형 진단 장치에서 사용에 적합한 것들을 포함하여, 추가의 가요성 기반 재료는 문헌 [Wang et al."Flexible Substrate-Based Devices for Point-of-Care Diagnostics" Cell 34(11):909-21 (2016)]에 개시되어 있다. 추가의 가요성 기반 재료는 니트로셀룰로스, 폴리카보네이트, 메틸에틸 셀룰로스, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF), 폴리스티렌, 또는 유리 (예를 들어, US20120238008 참조)를 포함할 수 있다. 일정한 구현예에서, 이산 부피는 소수성 표면, 예컨대 제한없이, 왁스, 포토레지스트, 또는 고형 잉크에 의해 이격된다.
특정 구현예에서, 가요성 재료 기재는 종이 기재일 수 있거나 또는 가요성 중합체 기반 기재일 수 있다.
일부 구현예에서, 선량계 또는 뱃지는 사용자가 일정한 미생물 또는 다른 작용제에 노출을 통지하게 하는 센서 또는 지시자로서 제공하는 것이 제공될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 시스템은 특정한 병원체를 검출하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 상기 개시된 압타머 기반 구현예는 폴리펩티드를 비롯하여, 특이적 압타머가 결합할 수 있는, 다른 작용제, 예컨대 화학제 둘 모두를 검출하는데 사용될 수 있다. 이러한 장치는 예를 들어, 생물전 또는 화학전 작용제 검출을 위해, 가능한 신속하게 잠재적으로 위험한 미생물에 노출에 관한 정보를 제공하기 위해서, 군인 또는 다른 병사를 비롯하여, 임상의, 연구자, 병원 의료진 등의 감시에 유용할 수 있다. 다른 구현예에서, 이러한 감시 뱃지는 면역약화 환자, 화상 환자, 화학요법을 겪은 환자, 어린이, 또는 노령 개체에서 위험한 미생물 또는 병원체에 노출을 방지하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 기술된 시스템 및 장치를 사용하여 분석할 수 있는 샘플 공급원은 대상체의 생물학적 샘플 또는 환경적 샘플을 포함한다. 환경 샘플은 표면 또는 유체를 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 제한없이, 타액, 혈액, 혈장, 혈청, 대변, 소변, 객담, 점액질, 림프, 활액, 척수액, 뇌척수액, 피부 또는 점막의 스왑, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 일례의 구현예에서, 환경 샘플은 식품 또는 다른 민감한 조성물 및 재료의 제조에서 사용되는 표면과 같은, 고형 표면으로부터 채취된다.
다른 일례의 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 시스템의 구성요소는 일회용 기재, 예컨대 표면 또는 샘플 유체를 면봉으로 닦는데 사용되는 면봉 또는 직물 상에 위치될 수 있다. 예를 들어, 시스템은 식품, 예컨대 과일 또는 야채의 표면을 면봉으로 닦아서 식품 상에 병원체의 존재에 대해 시험하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 일회용 기재는 일정한 미생물 또는 작용제의 검출을 위해서, 예컨대 검색 스크리닝에서 사용을 위해서 다른 표면을 면봉으로 닦는데 사용될 수 있다. 일회용 기재는 또한 포렌식에서 적용성을 가질 수 있고, 여기서 CRISPR 시스템은 샘플에 존재하는 생물학적 물질의 유형을 결정하기 위해서 의심되거나, 또는 일정한 조직 또는 세포 마커를 식별하는데 사용할 수 있는, 예를 들어 식별 DNA SNP를 검출하도록 디자인된다. 유사하게, 일회용 기재는 환자 유래 샘플 - 예컨대 구강 유래 타액 샘플 - 또는 피부의 스왑을 수집하는데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 샘플 또는 스왑은 육류 제품 상에 또는 그 내에 오염물의 존재 또는 부재를 검출하기 위해서 육류 제품에서 채취될 수 있다.
식품, 임상, 산업, 및 다른 환경 상황의 경우 근실시간 미생물 진단이 필요하다 (예를 들어, [Lu TK, Bowers J, and Koeris MS., Trends Biotechnol. 2013 Jun;31(6):325-7] 참조). 일정 구현예에서, 본 발명은 병원체 (예를 들어, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 클로스트리듐 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens), 살모넬라 (Salmonella) spp., 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes), 시겔라 (Shigella) spp., 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcal aureus), 스타필로코커스 엔테리티스 (Staphylococcal enteritis), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 비브리오 파라해몰리티커스 (Vibrio parahaemolyticus), 비브리오 벌니피커스 (Vibrio vulnificus), 여시니아 엔테로콜리티카 (Yersinia enterocolitica) 및 여시니아 슈도튜버큘로시스 (Yersinia pseudotuberculosis), 브루셀라 (Brucella) spp., 코리네박테리움 울세란스 (Corynebacterium ulcerans), 콕시엘라 부르네티이 (Coxiella burnetii), 또는 플레시오모나스 시겔로이데스 (Plesiomonas shigelloides))에 특이적인 가이드 RNA를 사용하는 식품유래 병원체의 신속한 검출을 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 각각의 개별 이산 부피는 본 명세서에 기술된 바와 같은 핵산 증폭 시약을 포함할 수 있다. 이와 같이, 표적 분자는 표적 DNA일 수 있고 개별 이산 부피는 표적 DNA에 결합하고 RNA 중합효소 프로모터를 포함하는 프라이머를 더 포함할 수 있다.
일정 구현예에서, 장치는 플로우 스트립이거나 또는 그를 포함한다. 예를 들면, 측류 스트립은 색상을 통해 RNAse (예를 들어, C2c2) 검출을 가능하게 한다. RNA 리포터는 5' 말단에 부착된 제1 분자 (예컨대 예를 들면 FITC) 및 3' 말단에 부착된 제2 분자 (예컨대 예를 들면 바이오틴)를 갖도록 변형된다 (또는 반대도 같음). 측류 스트립은 항-제1 분자 (예를 들어, 항-FITC) 항체가 제1 라인에서 하이브리드화되고 항-제2 분자 (예를 들어, 항-바이오틴) 항체는 제2 하류 라인에서 하이브리드화되는 2개 포획 라인을 갖도록 디자인된다. 반응물이 스트립 아래로 흐르면서, 미절단된 리포터는 제1 포획 라인에서 항-제1 분자 항체에 결합하게 되는 한편, 절단된 리포터는 제2 분자를 방출하게 되고 제2 포획 라인에서 제2 분자 결합을 가능하게 한다. 예를 들면 나노입자, 예컨대 금 나노입자에 접합된, 제2 분자 샌드위치 항체는 제1 또는 제2 라인에서 임의의 제2 분자에 결합하게 될 것이고 그 결과 강력한 판독치/신호 (예를 들어, 색상)를 야기시키게 될 것이다. 리포터가 더 절단되면서, 더 많은 신호가 제2 포획 라인에서 축적되어지고 적은 신호가 제1 라인에서 나타나게 될 것이다. 일정한 양상에서, 본 발명은 핵산 또는 폴리펩티드를 검출하기 위해서 본 명세서에 기술된 바와 같은 플로우 스트립의 사용에 관한 것이다. 일정한 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 플로우 스트립으로 핵산 또는 폴리펩티드를 검출하기 위한 방법, 예를 들어 (측면) 흐름 시험법 또는 (측면) 흐름 면역크로마토그래피 어세이에 관한 것이다.
일정한 예의 구현예에서, 장치는 상이한 액적 (즉, 개별 이산 부피)을 생성시키고/시키거나 병합시키는 미세유체 장치이다. 예를 들어, 액적의 제1 세트는 스크리닝하려는 샘플을 함유하게 형성될 수 있고 액적의 제2 세트는 본 명세서에 기술된 시스템의 구성요소를 함유하게 형성된다. 그 다음으로, 액적의 제1 및 제2 세트를 병합시키고 나서 본 명세서에 기술된 바와 같은 진단 방법은 병합된 액적 세트 상에서 수행된다. 본 명세서에 개시된 미세유체 장치는 실리콘-기반 칩일 수 있고 제한없이, 핫 엠보싱, 엘라스토머의 성형, 사출 성형, LIGA, 소프트 리쏘그라피, 규소 제작 및 관련 박막 프로세싱 기술을 포함한, 다양한 기술을 사용하여 제작될 수 있다. 미세유체 장치를 제작하기 위한 적합한 재료는 제한없이, 환형 올레핀 공중합체 (COC), 폴리카보네이트, 폴리(디메틸실록산) (PDMS), 및 폴리(메틸아크릴레이트) (PMMA)를 포함한다. 일 구현예에서, PDMS의 소프트 리쏘그라피는 미세유체 장치를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 몰드는 기재 내에서 흐름 채널, 밸브 및 필터의 위치를 한정하는 포토리쏘그라피를 사용해 제조될 수 있다. 기재 재료를 몰드에 붓고 경화되게 하여 스탬프를 생성시킨다. 그 다음으로, 스탬프는 고형 지지체, 예컨대 제한없이, 유리에 밀봉된다. 일부 단백질을 흡착하고 일정한 생물학적 프로세스를 억제할 수 있는, 일부 중합체, 예컨대 PDMS의 소수성 성질에 기인하여, 부동태화제가 필요할 수 있다 (Schoffner et al. Nucleic Acids Research, 1996, 24:375-379). 적합한 부동태화제는 당분야에 공지되어 있고, 제한없이, 실란, 파릴렌, n-도데실-b-D-마토시드 (DDM), 플루론산, Tween-20, 다른 유사한 계면활성제, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 알부민, 콜라겐, 및 다른 유사한 단백질 및 펩티드를 포함한다.
일정한 예의 구현예에서, 시스템 및/또는 장치는 유세포측정 판독으로의 전환 또는 단일 실험에서 수백만 세포의 민감하고 정량적인 측정의 허용 및 현행 흐름-기반 방법, 예컨대 PrimeFlow 어세이에 비해 개선되도록 적합화된다. 일정한 예의 구현예에서, 세포는 이후에 유세포측정에 의한 분석에 적합한 단일-세포 액적으로 캐스팅될 수 있는, 미중합된 겔 단량체를 함유하는 액적에 캐스팅될 수 있다. 형광성 검출가능한 표적을 포함하는 검출 구성체는 미중합된 겔 단량체로 캐스팅될 수 있다. 겔 단량체의 중합시 액적 내에 비드가 형성된다. 겔 중합은 자유-라디칼 형성을 통하기 때문에, 형광성 리포터는 겔에 공유 결합된다. 검출 구성체는 링커, 예컨대 아민을 포함하도록 더욱 변형될 수 있다. 소광제는 겔 형성 후에 첨가될 수 있고 링커를 통해서 리포터 구성체에 결합하게 될 것이다. 따라서, 소광제는 겔에 결합되지 않고, CRISPR 이펙터 단백질에 의해서 리포터가 절단될 때 자유롭게 확산된다. 액적에서 신호의 증폭은 하이브리드화 연쇄 반응 (HCR 개시제) 증폭과 검출 구성체를 커플링하여 획득될 수 있다. DNA/RNA 하이브리드 헤어핀은 RNase 민감성 도메인을 갖는 헤어핀 루프를 포함할 수 있는 겔에 도입될 수 있다. RNase 민감성 도메인을 갖는 헤어핀 루프 내에서 가닥 치환 토우홀드를 보호함으로써, HCR 개시제는 CRISPR 이펙터 단백질에 의한 헤어핀 루프의 절단 이후에 선택적으로 탈보호될 수 있다. 토우홀드 매개된 가닥 치환을 통해서 HCR 개시제의 탈보호 이후, 형광성 HCR 단량체는 겔로 세척되어서 개시제가 탈보호되는 경우에 신호를 증폭시킬 수 있게 한다.
본 발명이 상황에서 사용할 수 있는 미세유체 장치의 예는 문헌 [Hou et al. "Direct Dectection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics" Lap Chip.15(10):2297-2307 (2016)]에 기술되어 있다.
본 명세서에 기술된 시스템은 대상체의 생물학적 샘플, 예컨대 생물학적 유체를 클리닉 환경 외부에서 평가하고 의료 전문가가 접속할 수 있는 중심 서버에 원격으로 어세이의 결과를 보고하는 착용형 의료 장치에 더 도입될 수 있다. 장치는 Peeters 등의 발명의 명칭 "Needle-free Blood Draw"의 미국 공개 특허 출원 번호2015/0342509, Andrew Conrad의 발명의 명칭 "Nanoparticle Phoresis"의 미국 공개 특허 출원 번호 2015/0065821에 개시된 장치와 같은, 혈액을 자가-샘플채취하는 능력을 포함할 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, 장치는 개별 웰, 예컨대 마이크로플레이트 웰을 포함할 수 있다. 마이크로플레이트 웰의 크기는 표준 6, 24, 96, 384, 1536, 3456, 또는 9600 크기 웰의 크기일 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 본 명세서에 기술된 시스템의 구성요소는 동결 건조될 수 있고 유통 및 사용 전에 웰의 표면 상에 적용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 장치는 입구 및 출구 포트를 더 포함할 수 있고, 이들은 차례로 밸브, 튜브, 채널, 챔버, 및 시린지 및/또는 장치 내부 및 외부로 유체의 유입 및 추출을 위한 펌프에 이후에 연결될 수 있다. 장치는 미세유체 장치 내에서 유체의 지향성 움직임을 가능하게 하는 유체 흐름 액츄에이터에 연결될 수 있다. 예시적인 액츄에이터는 제한없이, 시린지 펌프, 기계 작동식 재순환 펌프, 전기삼투 펌프, 벌브, 벨로우, 다이어프램, 또는 유체를 움직이게 하려는 버블을 포함한다. 일정한 예의 구현예에서, 장치는 장치를 통해서 유체를 움직이게 함께 작동하는 프로그램가능한 밸브를 갖는 제어기에 연결된다. 일정한 예의 구현예에서, 장치는 하기에 더욱 상세하게 기술되는 제어기에 연결된다. 장치는 장치 상의 입구 포트에 삽입을 위한 금속 핀으로 종결되는 튜빙에 의해서 흐름 액츄에이터, 제어기, 및 샘플 로딩 장치에 연결될 수 있다.
본 명세서에 도시된 바와 같이, 시스템의 엘리먼트는 동결건조될 때 안정하고, 그러므로, 지지 장치를 필요로 하지 않는 구현예가 또한 고려되며, 즉, 시스템은 본 명세서에 개시된 반응을 지지하게 되는 임의의 표면 또는 유체에 적용될 수 있고, 그 표면 또는 용액으로부터 양성 검출가능한 신호의 검출을 가능하게 한다. 동결-건조 이외에도, 시스템은 또한 펠렛화된 형태로 안정하게 저장되고 이용될 수 있다. 적합한 펠렛화 형태를 형성하는데 유용한 중합체는 당분야에 공지되어 있다.
일정 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질은 장치에서 각각의 이산 부피에 결합된다. 각각의 이산 부피는 상이한 표적 분자에 특이적인 상이한 가이드 RNA를 포함할 수 있다. 일정 구현예에서, 샘플은 각각이 표적 분자에 특이적인 가이드 RNA를 포함하는 하나를 초과하는 이산 부피를 포함하는 고형 기재에 노출된다. 이론에 국한하지 않으나, 각각의 가이드 RNA는 샘플 유래의 이의 표적 분자를 포획하게 될 것이고 샘플은 개별 어세이로 나뉘어질 필요가 없다. 따라서, 중요한 샘플을 보존할 수 있다. 이펙터 단백질은 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 친화성 태그는 당분야에 충분히 공지되어 있다 (예를 들어, HA 태그, Myc 태그, Flag 태그, His 태그, 바이오틴). 이펙터 단백질은 바이오틴 분자에 연결될 수 있고 이산 부피는 스트렙타비딘을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질은 이펙터 단백질에 특이적인 항체에 의해 결합된다. CRISPR 효소에 결합하는 방법은 이전에 기술된 바 있다 (예를 들어, US20140356867A1 참조).
본 명세서에 개시된 장치는 또한 다른 방법에 의해 샘플을 분석하기 위해 당분야에 공지된 현장진단 (POC) 장치의 엘리먼트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [St John and Price, "Existing and Emerging Technologies for Point-of-Care Testing" (Clin Biochem Rev. 2014 Aug; 35(3): 155167)]을 참조한다.
본 발명은 무선 랩-온-칩 (LOC) 진단 센서 시스템에 의해 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 9,470,699 "Diagnostic radio frequency identification sensors and applications thereof" 참조). 일정한 구현예에서, 본 발명은 무선 장치 (예를 들어, 휴대폰, 개인 정보용 단말기 (PDA), 타블렛)에 의해 제어되는 LOC에서 수행되고 결과가 상기 장치에 보고된다.
RFID (Radio frequency identification) 태그 시스템은 RFID 판독기 (인터로게이트라고도 함)에 의한 수신을 위해 데이터를 전송하는 RFID 태그를 포함한다. 전형적인 RFID 시스템에서, 개별 객체 (예를 들어, 상점 상품)는 트랜스폰더를 함유하는 상대적으로 소형의 태그가 장착된다. 트랜스폰더는 고유한 전자 제품 코드가 제공되는 메모리 칩을 갖는다. RFID 판독기는 통신 프로토콜의 사용을 통해서 태그 내 트랜스폰더를 활성화시키는 신호를 방출한다. 따라서, RFID 판독기는 태그에 대한 데이타를 읽고 쓸 수 있다. 추가적으로, RFID 태그 판독기는 RFID 태그 시스템 어플리케이션에 따라서 데이타를 처리한다. 현재, 수동형 및 능동형 RFID 태그가 존재한다. 수동형 RFID 태그 내부 전력원을 함유하지 않지만, FRID 판독기로부터 수신된 라디오 주파수 신호에 의해 작동된다. 대안적으로, 능동형 RFID 태그는 이 활성형 RFID 태그가 더 큰 전파 범위 및 메모리 용량을 보유할 수 있게 하는 내부 전력원을 함유한다. 수동형 대 능동형 태그의 사용은 특정한 적용 분야에 따라 좌우된다.
랩-온-더 칩 기술은 과학 문헌에 충분히 설명되어 있고, 다수의 미세유체 채널, 투입 또는 화학적 웰로 이루어진다. 웰 내에서의 반응은 RFID 전자 칩으로부터의 전도성 리드가 시험 웰 각각에 직접 연결될 수 있으므로 RFID 태그 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 안테나는 장치의 후면 상에 직접적으로 또는 전자 칩의 다른 층에 장착되거나 또는 인쇄될 수 있다. 더 나아가서, 리드, 안테나 및 전자 칩은 LOC 칩에 내장될 수 있고, 그리하여 전극 또는 전자 장치의 단락을 방지한다. LOC가 복합체 샘플 분리 및 분석을 가능하게 하므로, 이러한 기술은 LOC 시험을 복잡하거나 또는 값비싼 판독기와 독립적으로 수행하는 것을 가능하게 한다. 대신 단순 무선 장치 예컨대 휴대폰 또는 PDA를 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 무선 장치는 또한 보다 복잡한 LOC 분석을 위한 미세유체 채널의 분리 및 제어를 통제한다. 일 구현예에서, LED 및 다른 전자 측정 또는 감지 장치는 LOC-RFID 칩에 포함된다. 이론에 국한하려는 것이 아니나, 이러한 기술은 일회성이어서 분리 및 혼합을 요구하는 복잡한 시험을 실험실 밖에서 수행하는 것을 가능하게 한다.
바람직한 구현예에서, LOC는 미세유체 장치일 수 있다. LOC는 수동형 칩일 수 있고, 여기서 칩은 무선 장치를 통해서 작동되고 제어된다. 일정 구현예에서, LOC는 시약을 수용하기 위한 미세유체 채널 및 샘플을 도입시키기 위한 채널을 포함한다. 일정 구현예에서, 무선 장치로부터의 신호는 전력을 LOC에 전달하여 샘플 및 어세이 시약의 혼합을 활성화시킨다. 특히, 본 발명의 경우에서, 시스템은 차폐제, CRISPR 이펙터 단백질, 및 표적 분자에 특이적인 가이드 RNA를 포함할 수 있다. LOC의 활성화 시, 미세유체 장치는 샘플 및 어세이 시약을 혼합할 수 있다. 혼합 시, 센서는 신호를 검출하고 결과를 무선 장치로 전송한다. 일정 구현예에서, 비차폐제는 전도성 RNA 분자이다. 전도성 RNA 분자는 전도성 재료에 부착될 수 있다. 전도성 분자는 전도성 나노입자, 전도성 단백질, 단백질 또는 라텍스에 부착되는 금속 입자 또는 전도성인 다른 비드일 수 있다. 일정 구현예에서, DNA 또는 RNA가 사용되면 전도성 분자는 부응하는 DNA 또는 RNA 가닥에 직접 부착될 수 있다. 전도성 분자의 방출은 센서에 걸쳐 검출될 수 있다. 어세이는 단일 단계 과정일 수 있다.
표면 면적의 전기 전도성은 측정할 수 있으므로 정밀하게 정량된 결과가 일회용 무선 RFID 전기-어세이에서 가능하다. 더 나아가서, 시험 면적은 매우 작아서 소정 면적에서 더 많은 시험을 수행할 수 있게 하여 그 결과로 비용이 절감될 수 있다. 일정 구현예에서, 각각이 센서에 고정된 상이한 CRISPR 이펙터 단백질 및 가이드 RNA와 연합된 별개의 센서가 다수의 표적 분사를 검출하는데 사용된다. 이론에 국한하려는 것은 아니나, 상이한 센서의 활성화는 무선 장치에 의해 구별될 수 있다.
본 명세서에 기술된 전도성 방법 이외에도, 일회용 RFID 어세이를 위한 기본적인 저비용 통신 및 전력 플랫폼 때문에 RFID 또는 블루투스에 의존하는 다른 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 광학 수단을 사용하여 소정 표적 분자의 존재 및 수준을 평가할 수 있다. 일정 구현예에서, 광학 센서는 형광성 차폐제의 탈차폐를 검출한다.
일정 구현예에서, 본 발명의 장치는 어세이의 진단 판독을 위한 소형 휴대용 장치를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Vashist et al., Commercial Smartphone-Based Devices and Smart Applications for Personalized Healthcare Monitoring and Management, Diagnostics 2014, 4(3), 104128]; mReader from Mobile Assay; 및 Holomic Rapid Diagnostic Test Reader 참조).
본 명세서에 언급된 바와 같이, 일정한 구현예는 구현예가 신호를 판독하기 위해 보다 복잡한 검출 장비로의 접근이 제한될 수 있는 자원 부족 환경 및/또는 POC 상황에서 이용될 때 일부 부차적인 이득을 갖는 비색성 변화를 통한 검출을 가능하게 한다. 그러나, 본 명세서에 개시된 휴대용 구현예는 또한 가시 범위 밖의 신호의 검출할 수 있게 하는 소형 분광광도계와 커플링될 수 있다. 본 발명과 조합하여 사용할 수 있는 휴대용 분광광도계 장치의 예는 [Das et al."Ultra-portable, wireless smartphone spectrophotometer for rapid, non-destructive testing of fruit ripeness."Nature Scientific Reports.2016, 6:32504, DOI:10.1038/srep32504]에 기술되어 있다. 마지막으로, 퀀텀 도트-기반 차폐성 구성체를 이용하는 일정한 구현예에서, 소형 UV 광, 또는 다른 적합한 장치는 퀀텀 도트에 의해 제공되는 거의 완전한 퀀텀 수율 덕분에 신호를 검출하는데 성공적으로 사용될 수 있다.
샘플에서 표적 핵산의 검출을 위한 방법
또한 본 명세서는 샘플에서 표적 핵산을 검출하기 위한 방법을 제공하고, 방법은 샘플 또는 샘플의 세트를 하나 이상의 개별 이산 부피에 분배시키는 단계로서, 개별 이산 부피는 본 명세서에 기술된 바와 같은 CRISPR 시스템을 포함하는 것인 단계; 하나 이상의 가이드 RNA와 하나 이상의 표적 분자의 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에서 샘플 또는 샘플의 세트를 인큐베이션시키는 단계; 하나 이상의 가이드 RNA와 하나 이상의 표적 분자의 결합을 통해서 CRISPR 이펙터 단백질을 활성화시키는 단계로서, CRISPR 이펙터 단백질의 활성화는 사중체를 포함하는 RNA-압타머의 변형을 야기시켜서 사중체의 효소 활성이 불활성화되는 것인 단계; 및 효소 활성을 검출하는 단계로서, 한계치 미만에서의 검출은 샘플 내에 하나 이상의 표적 분자의 존재를 의미하는 것인 단계를 포함한다.
일정 예의 구현예에서, 표적 분자는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은 표적 DNA일 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 표적 분자는 표적 DNA일 수 있고 방법은 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이 RNA 중합효소 부위를 포함하는 프라이머와 표적 DNA를 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
일정 예의 구현예에서, 방법은 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이 샘플 RNA 또는 기폭제 RNA를 증폭시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA의 증폭은 본 명세서에 기술된 바와 같은 NASBA에 의한 증폭을 포함한다. 일부 구현예에서, RNA의 증폭은 본 명세서에 기술된 바와 같은 RPA에 의한 증폭을 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플은 생물학적 샘플 또는 환경 샘플일 수 있다. 환경 샘플은 음식물 샘플 (신선 과일 또는 채소, 육류), 음료 샘플, 종이 표면, 패브릭 표면, 금속 표면, 목재 표면, 플라스틱 표면, 토양 샘플, 담수 샘플, 폐수 샘플, 염수 샘플, 대기 공기 또는 다른 가스 샘플에의 노출, 또는 이의 조합을 포함할 수 있으나, 반드시 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 금속, 목재, 플라스틱, 고무 등을 비제한적으로 포함하는 임의의 재료로 만들어진 가정용/상업적/산업적 표면을 면봉으로 닦아서 오염을 시험할 수 있다. 토양 샘플은 환경적 목적 및/또는 인간, 동물 또는 식물 질환 검사를 위해, 병원성 박테리아 또는 기생충, 또는 다른 미생물의 존재에 대해 시험될 수 있다. 물 샘플 예컨대 담수 샘플, 폐수 샘플, 또는 염수 샘플은 예를 들어, 크립토스포리듐 파르븀 (Cryptosporidium parvum), 지아르디아 람블리아 (Giardia lamblia), 또는 다른 미생물 오염의 존재를 검출하기 위해, 청정도 및 안정성, 및/또는 휴대성에 대해 평가될 수 있다. 추가 구현예에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플, 타액, 혈액, 혈장, 혈청, 대변, 소변, 객담, 점액질, 림프, 활액, 뇌척수액, 복수, 흉수, 혈청종, 고름, 또는 피부 또는 점막 표면의 스왑을 비제한적으로 포함하는 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 특정한 구현예에서, 환경 샘플 또는 생물학적 샘플은 미가공 샘플일 수 있고/있거나 하나 이상의 표적 분자는 방법의 적용 이전에 샘플로부터 정제되지 않을 수 있거나 증폭되지 않을 수 있다. 미생물의 식별은 임의의 많은 적용분야에서 유용하고/하거나 필요할 수 있고, 따라서 당업자가 적절하다고 여기는 임의 출처 유래의 임의 유형의 샘플이 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.
생물학적 샘플은 단일 세포 유기체, 예컨대 박테리아, 효모, 원충, 및 아메바 등, 다세포 유기체 (예컨대 식물 또는 동물로서, 건강하거나 또는 외관상 건강한 인간 대상체 또는 진단 또는 검사해야 하는 병태 또는 질환, 예컨대 병원성 미생물, 예컨대 병원성 박테리아 또는 바이러스에 의한 감염에 걸린 인간 환자 유래 샘플 포함)를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 살아있는 유기체로부터 수득되거나, 그로부터 배출되거나, 그에 의해 분비되는 임의의 고형 또는 유체 샘플이다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 객담, 점액질, 림프액, 활액, 담즙, 복수, 흉수, 혈청종, 타액, 뇌척수액, 수양액 또는 유리체액, 또는 임의의 신체 분비물, 여출액, 삼출액 (예를 들어, 농양 또는 감염 또는 염증의 임의의 다른 부위로부터 수득된 유체), 또는 관절로부터 수득된 유체 (예를 들어, 정상 관절 또는 질환, 예컨대 류마티스성 관절염, 골관절염, 통풍성 또는 화농성 관절염에 걸린 관절), 또는 피부 또는 점막 표면의 스왑으로부터 수득된 생물학적 유체일 수 있다.
샘플은 또한 임의의 장기 또는 조직으로부터 수득된 샘플 (생검 또는 부검 표본, 예컨대 종양 생검 포함) 일 수 있거나 세포 (1차 세포 또는 배양 세포이건 무관) 또는 임의 세포, 조직 또는 장기에 의해 조건화된 배지를 포함할 수 있다. 예시적인 샘플은 세포, 세포 용해물, 혈액 도말 샘플, 세포원심분리 제조물, 세포학 도말 샘플, 체액 (예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 객담, 소변, 기관지폐포 세척액, 정액 등), 조직 생검 (예를 들어, 종양 생검), 세침 흡인물, 및/또는 조직 절편 (예를 들어, 크라이오스태트 조직 절편 및/또는 파라핀-포매 조직 절편)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 예에서, 샘플은 순환성 종양 세포 (세포 표면 마커에 의해 식별할 수 있음) 를 포함한다. 특정 예에서, 샘플은 직접적으로 (예를 들어, 신선 또는 냉동) 사용되거나, 사용 전에, 예를 들어 고정 (예를 들어, 포르말린 사용) 및/또는 왁스 포매 (예컨대 포르말린-고정 파라핀-포매 (FFPE) 조직 샘플)에 의해 조작될 수 있다. 대상체로부터 조직을 수득하는 임의의 방법이 이용될 수 있고, 사용되는 방법의 선택은 다양한 인자들 예컨대 조직의 유형, 대상체의 연령, 또는 의사가 이용가능한 절차에 따라 좌우될 것임을 이해하게 될 것이다. 이러한 샘플의 획득을 위한 표준 기술은 당분야에서 입수가능하다. 예를 들어, 문헌 [Schluger et al., J.Exp.Med.176:1327-33 (1992)]; [Bigby et al., Am.Rev.Respir.Dis.133:515-18 (1986)]; [Kovacs et al., NEJM 318:589-93 (1988)]; 및 [Ognibene et al., Am.Rev.Respir.Dis.129:929-32 (1984)]을 포함하는 수많은 간행물에 기술되어 있다.
특별한 구현예에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 객담, 점액, 림프액, 활액, 담즙, 복수, 흉수, 장액종, 타액, 뇌척수액, 안방수 또는 유리체액, 또는 임의의 신체 분비액, 여출액, 삼출액 (예를 들어, 농양 또는 임의의 다른 감염 또는 염증 부위로부터 얻은 체액), 또는 관절 (예를 들어, 정상 관절, 또는 류마티스성 관절염, 골관절염, 통풍성 또는 화농성 관절염과 같은 질환을 앓는 관절)로부터 얻은 체액, 또는 피부 또는 점막 표면의 스왑일 수 있다.
특별한 구현예에서, 환경 샘플은 음식물 샘플, 종이 표면, 패브릭, 금속 표면, 목재 표면, 플라스틱 표면, 토양 샘플, 담수 샘플, 폐수 샘플, 염수 샘플, 또는 이의 조합로부터 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 식별된 표적 서열은 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 서열에 특이적이고 그에 결합하는 가이드 RNA를 사용해 검출될 수 있다. 본 발명의 시스템 및 방법은 상이한 미생물 종에 존재하는 단일 뉴클레오티드 다형성을 구별할 수 있고, 그러므로, 본 발명에 따른 다수 가이드 RNA 의 사용은 종 간 구별에 사용될 수 있는 표적 서열의 수를 더 확장시키거나 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하나 이상의 가이드 RNA 는 종, 속, 과, 목, 강, 문, 계, 또는 표현형, 또는 이의 조합으로 미생물을 구별할 수 있다.
일정 구현예에서 하나 이상의 가이드 RNA는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 표적 RNA 또는 DNA 내 단일 뉴클레오티드 다형성, 또는 RNA 전사물의 스플라이스 변이체를 검출하도록 디자인된다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA는 질환 상태에 대한 진단인 하나 이상의 표적 분자에 결합하도록 디자인될 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 질환 상태는 감염, 장기 질환, 혈액 질환, 면역계 질환, 암, 뇌 및 신경계 질환, 내분비 질환, 임신 또는 출산 관련 질환, 유전 질환, 또는 환경-획득 질환일 수 있다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA는 세포 무함유 핵산에 결합하도록 디자인될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 샘플에서 표적 핵산을 검출하기 위한 방법을 제공하고, 방법은 샘플을 본 명세서에 기술된 바와 같은 핵산 검출 시스템과 접촉시키는 단계; 및 접촉된 샘플을 본 명세서에 기술된 바와 같은 측류 면역크로마토그래피 어세이에 적용하는 단계를 포함한다.
단백질의 검출
본 명세서에 개시된 시스템, 장치, 및 방법은 또한 특이적으로 구성된 폴리펩티드 검출 압타머의 도입을 통해서 핵산의 검출 이외에도 폴리펩티드 (또는 다른 분자)의 검출에 적합화될 수 있다. 폴리펩티드 검출 압타머는 상기 기술된 차폐성 구성체 압타머와 별개이다. 첫번째로, 압타머는 하나 이상의 표적 분자에 특이적으로 결합하도록 디자인된다. 일례의 구현예에서 표적 분자는 표적 폴리펩티드이다. 다른 일례의 구현예에서, 표적 분자는 표적 화학적 화합물, 예컨대 표적 치료 분자이다. 소정 표적에 대한 특이성을 갖는 압타머를 디자인하고 선택하기 위한 방법, 예컨대 SELEX는 당분야에 공지되어 있다. 소정 표적에 대한 특이성 이외에도, 압타머는 RNA 중합효소 프로모터 결합 부위를 도입시키도록 더욱 디자인된다. 일정한 예의 구현예에서, RNA 중합효소 프로모터는 T7 프로모터이다. 표적에 압타머의 결합 전에, RNA 중합효소 부위는 RNA 중합효소가 접근가능하거나, 또는 달리 인식가능하지 않다. 그러나, 압타머는 표적의 결합 시 압타머의 구조가 입체형태 변화를 겪어서 RNA 중합효소 프로모터가 노출되도록 구성된다. RNA 중합효소 프로모터의 하류의 압타머 서열은 RNA 중합효소에 의한 기폭제 RNA 올리고뉴클레오티드의 생성을 위한 주형으로서 작용한다. 따라서, 압타머의 주형 부분은 소정 압타머 및 이의 표적을 식별하는 바코드 또는 다른 식별 서열을 더 도입시킬 수 있다. 상기 기술된 바와 같은 가이드 RNA는 이들 특이적 기폭제 올리고뉴클레오티드 서열을 인식하도록 디자인될 수 있다. 기폭제 올리고뉴클레오티드에 가이드 RNA의 결합은 CRISPR 이펙터 단백질을 활성화시키고, 이전에 기술된 바와 같이 차폐성 구성체를 탈활성화시켜서 양성 검출가능한 신호를 발생시키도록 진행된다.
따라서, 일정한 예의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 샘플 또는 샘플의 세트를 개별 이산 부피의 세트에 분배시키는 단계로서, 각각의 개별 이산 부피는 펩티드 검출 압타머, CRISPR 이펙터 단백질, 하나 이상의 가이드 RNA, 차폐성 구성체를 포함하는 것인 단계, 및 샘플 또는 샘플의 세트를 하나 이상의 표적 분자와 펩티드 검출 압타머의 결합을 허용하기 위해 충분한 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계로서, 상응하는 표적에 대한 압타머의 결합은 RNA 중합효소 프로모터 결합 부위를 노출시켜서 RNA 중합효소 프로모터 결합 부위에 RNA 중합효소의 결합을 통해 기폭제 RNA의 합성이 개시되는 것인 단계의 추가 단계를 포함한다.
다른 일례의 구현예에서 압타머의 결합은 표적 폴리펩티드에 압타머의 결합 시 프라이머 결합 부위를 노출시킬 수 있다. 예를 들어, 압타머는 RPA 프라이머 결합 부위를 노출시킬 수 있다. 따라서, 프라이머의 첨가 또는 포함은 증폭 반응, 예컨대 상기 약술된 바와 같은 RPA 반응에 공급되어 질 것이다.
일정 예의 구현예에서, 압타머는 관심 표적에 결합 시, 2차 구조를 변화시켜서 단일-가닥 DNA의 새로운 영역을 노출시킬 수 있는, 입체형태-전환 압타머일 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 이들 단일-가닥 DNA의 새로운 영역은 결찰을 위한 기질로서 사용될 수 있어서, 압타머를 연장하고 더 긴 ssDNA 분자를 생성시켜서 이것이 본 명세서에 개시된 구현예를 사용해 특이적으로 검출될 수 있다. 압타머 디자인은 글루코스와 같은, 저-에피토프 표적의 검출을 위한 3원 복합체와 더 조합될 수 있다 (Yang et al.2015:http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.analchem.5b01634). 예시적인 입체형태 이동 압타머 및 상응하는 가이드 RNA (crRNA)는 하기 표에 표시되어 있다.
표 9
예시적인 방법 및 어세이
어세이 플랫폼의 저비용 및 적응성은 그 자체로 (i) 일반적인 RNA/DNA/단백질 정량, (ii) 신속한, 복합 RNA/DNA 및 단백질 발현 검출, 및 (iii) 임상 및 환경 샘플 둘 모두에서 표적 핵산, 펩티드 및 단백질의 민감한 검출을 포함하는 수많은 적용성을 부여한다. 추가적으로, 본 명세서에 개시된 시스템은 생물학적 환경, 예컨대 세포 내에서 전사물의 검출을 위해 개조될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 CRISPR 이펙터의 고도로 특이적인 성질을 고려하면, 살아있는 세포에서 전사물 또는 질환-연관 돌연변이의 대립유전자 특이적 발현을 추적하는 것이 가능할 수 있다.
일정 예의 구현예에서, 단일 표적에 특어적인 단일 가이드 서열이 개별 부피에 위치된다. 그 후에 각각의 부피는 상이한 샘플 또는 동일 샘플의 분취액을 수용할 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 개별 표적 각각에 대한 다수 가이드 서열은 다수 표적이 상이한 웰에서 스크리닝될 수 있도록 단일 웰에 위치될 수 있다. 단일 부피에서 다수 가이드 RNA를 검출하기 위해서, 일정 예의 구현예에서, 상이한 특이성을 갖는 다수의 이펙터 단백질이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상이한 서열 특이성을 갖는 상이한 오솔로그가 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 오솔로그는 A를 우선적으로 절단할 수 있는 한편, 나머지는 C, G, U/ T를 우선적으로 절단한다. 따라서, 그 각각이 상이한 파장에서 검출될 수 있는 상이한 형광단을 갖는, 단일 뉴클레오티드의 실질적인 부분을 완전히 포함하거나, 또는 그를 포함하는 차폐성 구성체를 생성시킬 수 있다. 이러한 방식으로 최대 4종의 상이한 표적이 단일 개별 이산 부피에서 스크리닝될 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 동일 클래스의 CRISPR 이펙터 단백질 유래의 상이한 오솔로그, 예컨대 2종의 Cas13a 오솔로그, 2종의 Cas13b 오솔로그, 또는 2종의 Cas13c 오솔로그가 사용될 수 있다. 다양한 Cas13 단백질의 뉴클레오티드 선호도는 도 67에 도시되어 있다. 일정한 다른 예의 구현예에서, 상이한 뉴클레오티드 편집 선호도를 갖는 상이한 오솔로그, 예컨대 Cas13a 및 Cas13b 오솔로그, 또는 Cas13a 및 Cas13c 오솔로그, 또는 Cas13b 오솔로그 및 Cas13c 오솔로그 등이 사용될 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 폴리U 선호도를 갖는 Cas13 단백질 및 폴리A 선호도를 갖는 Cas13 단백질이 사용된다. 일정 예의 구현예에서, 폴리U 선호도를 갖는 Cas13 단백질은 프레보텔라 인터메디아 (Prevotella intermedia) Cas13b이다. 그리고 폴리A 선호도를 갖는 Cas13 단백질은 프레보텔라 sp. MA2106 Cas13b 단백질 (PsmCas13b)이다. 일정 예의 구현예에서, 폴리U 선호도를 갖는 Cas13 단백질은 렙토트리키아 웨이데이 (Leptotrichia wadei) Cas13a (LwaCas13a) 단백질이고, 폴리A 선호도를 갖는 Cas13 단백질은 프레보텔라 sp. MA2106 Cas13b 단백질이다. 일정 예의 구현예에서, 폴리U 선호도를 갖는 Cas13 단백질은 카프토사이토파가 카니몰서스 (Capnocytophaga canimorsus) Cas13b 단백질 (CcaCas13b)이다.
단일 염기 편집 선호도 이외에도, 추가의 검출 구성체가 Cas13 오솔로그의 다른 모티프 절단 선호도를 기반으로 디자인될 수 있다. 예를 들어, Cas13 오솔로그는 디뉴클레오티드 서열, 트리뉴클레오티드 서열, 또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 뉴클레오티드 모티프를 포함하는 보다 복잡하나 모티프를 우선적으로 절단할 수 있다. 따라서 본 명세서에 개시된 구현예를 사용하는 다중 어세이에 대한 상한은 구별가능한 검출가능 표지의 개수에 의해 주로 제한된다. 이러한 모티프를 동정하기 위한 예시적인 방법은 하기 작업예에 더욱 개시된다.
본 명세서에서 입증하는 바와 같이, CRISPR 이펙터 시스템은 표적 분자의 아토몰라 농도에 이르기 까지 검출할 수 있다. 예를 들어 도 13, 14, 19, 22 및 하기 기술된 작업예를 참조한다. 상기 시스템의 감도에 기인하여, 신속하고 민감한 검출을 필요로 하는 많은 적용분야들은 본 명세서에 개시된 구현예로부터 이득을 얻을 수 있고, 본 발명의 범주 내인 것으로 고려된다. 예시적인 어세이 및 적용분야는 하기에서 더욱 상세히 기술된다.
rRNA 서열 기반 검출
일정 예시적 구현예에서, 본 명세서에 개시된 장치, 시스템, 및 방법은 샘플 중 다수 미생물 종을 구별하는데 사용될 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, 식별은 16S, 23S, 및 5S 서브유닛을 포함하는, 리보솜 RNA 서열을 기반으로 할 수 있다. 관련 rRNA 서열을 식별하기 위한 방법은 미국 공개 특허 출원 번호 2017/0029872 에 개시되어 있다. 일정 예시적 구현예에서, 가이드 RNA의 세트는 각각의 종 또는 균주에 고유한 가변 영역에 의해 각각의 종을 구별하도록 디자인될 수 있다. 가이드 RNA는 또한 속, 과, 목, 강, 문, 계 수준, 또는 이의 조합으로 미생물을 구별하는 RNA 유전자를 표적화하도록 디자인될 수 있다. 증폭이 사용되는 특정 예시적 구현예에서, 증폭 프라이머의 세트는 리보솜 RNA 서열의 측접하는 불변 영역에 대해 디자인될 수 있고 가이드 RNA는 가변 내부 영역에 의해 각각의 종을 구별하도록 디자인될 수 있다. 일정 예시적 구현예에서, 프라이머 및 가이드 RNA는 각각 16S 서브유닛 내 보존 및 가변 영역에 대해 디자인될 수 있다. 종 또는 종의 서브세트에 걸쳐 고유하게 가변적인 다른 유전자 또는 게놈 영역 예컨대 RecA 유전자 패밀리, RNA 중합효소 β 서브유닛이 또한 사용될 수 있다. 다른 적합한 계통 마커, 및 이를 식별하기 위한 방법은 예를 들어, [Wu et al. arXiv:1307.8690 [q-bio.GN]] 에서 논의된다.
특정 예시적 구현예에서, 방법 또는 진단은 동시에 다수의 계통 및/또는 표현형 수준에 걸쳐 미생물을 스크리닝하도록 디자인된다. 예를 들어, 방법 또는 진단은 상이한 가이드 RNA 와 다수의 CRISPR 시스템의 사용을 포함할 수 있다. 가이드 RNA의 제1 세트는 예를 들어 마이코박테리아, 그람 양성, 및 그람 음성 박테리아를 구별할 수 있다. 이들 일반 부류는 더욱 세분화될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 그람 음성 박테리아 내에서 장내 및 비-장내 박테리아를 구별하는 방법 또는 진단에서 디자인되어 사용될 수 있다. 가이드 RNA의 제2 세트는 속 또는 종 수준에서 미생물을 구별하도록 디자인될 수 있다. 따라서, 그들 부류 중 하나 내에 속하는 소정 샘플 중에서 식별되는 박테리아 종의 각 속에 대해 모든 마이코박테리아, 그람 양성, 그람 음성 (장내 및 비-장내로 더 분류됨)을 식별하는 매트릭스가 생성될 수 있다. 전술한 내용은 단지 예시의 목적이다. 다른 미생물 유형을 분류하기 위한 다른 수단이 또한 고려되고 상기 기재된 일반 구조를 따르게 될 것이다.
약제 내성에 대한 스크리닝
특정 예시적 구현예에서, 본 명세서에 개시된 장치, 시스템 및 방법은 관심 미생물 유전자, 예를 들어 항생제 및/또는 항바이러스 내성 유전자에 대해 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 가이드 RNA는 기지의 관심 유전자를 구별하도록 디자인될 수 있다. 이후에, 임상 샘플을 포함하는 샘플은 이러한 유전자의 검출을 위해 본 명세서에 개시된 구현예를 사용하여 스크리닝될 수 있다. POC 에서 약제 내성에 대해 스크리닝하는 능력은 적절한 치료 계획을 선택하는데 있어 대단한 이득을 가지게 된다. 특정 예시적 구현예에서, 항생제 내성 유전자는 KPC, NDM1, CTX-M15, OXA-48 을 포함하는, 카르바페네마아제이다. 다른 항생제 내성 유전자가 공지되어 있고 예를 들어 종합 항생제 내성 데이터베이스 (Comprehensive Antibiotic Resistance Database)에서 확인할 수 있다 (Jia et al. "CARD 2017: expansion and model-centric curation of the Comprehensive Antibiotic Resistance Database." Nucleic Acids Research, 45, D566-573).
리바비린은 수많은 RNA 바이러스를 공격하는 효과적인 항바이러스제이다. 수족구병 바이러스 (doi:10.1128/JVI.03594-13); 폴리오 바이러스 (Pfeifer and Kirkegaard. PNAS, 100(12):7289-7294, 2003); 및 C형 간염 바이러스 (Pfeiffer and Kirkegaard, J. Virol. 79(4):2346-2355, 2005)를 포함하여, 몇몇 임상적으로 중요한 바이러스가 리바비린 내성을 진화시켜왔다. 많은 다른 지속성 RNA 바이러스, 예컨대 간염 바이러스 및 HIV는 현존하는 항바이러스 약제에 대한 내성을 진화시켜왔다: B형 간염 바이러스 (라미부딘, 테노포비어, 엔테카비어) (doi:10/1002/hep22900); C형 간염 바이러스 (텔라프레비어, BILN2061, ITMN-191, SCh6, 보세프레비어, AG-021541, ACH-806) (doi:10.1002/hep.22549); 및 HIV (다제 내성 돌연변이) (hivb.standford.edu). 본 명세서에서 개시된 구현예는 특히 이러한 변이체를 검출하는데 사용될 수 있다.
약제 내성 이외에도, LCMV의 지속성 대 급성 감염 (doi:10.1073/pnas.1019304108), 및 에볼라의 증가된 감염성 (Diehl et al. Cell. 2016, 167(4):1088-1098)과 같은, 본 명세서에 개시된 구현예로 검출할 수 있는 수많은 임상적으로 관련된 돌연변이가 존재한다.
본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 밀접하게 관련된 미생물 종 (예를 들어, 소정 표적 서열에 오직 단일 뉴클레오티드 편차만 가짐)은 gRNA 내 합성 미스매치의 도입에 의해 구별될 수 있다.
세트 커버 접근법
특정 구현예에서, 예를 들어, 미생물의 정의된 세트 내의 모든 미생물 종을 식별할 수 있는 가이드 RNA의 세트가 디자인된다. 일정 예의 구현예에서 이러한 방법이 기재되며; 본 명세서에 기재된 바와 같은 가이드 RNA를 생성시키기 위한 방법은 본 명세서에 참조로 포함되는 WO 2017/040316 에 개시된 방법과 비교할 수 있다. WO 2017040316 에 기재된 바와 같이, 세트 커버 해법은 전체 표적 서열 또는 표적 서열의 세트, 예를 들어 게놈 서열의 세트를 커버하는데 필요한 최소 수의 표적 서열 프로브 또는 가이드 RNA를 식별할 수 있다. 세트 커버 접근법은 전형적으로 20 내지 50개 염기쌍 범위에서, 프라이머 및/또는 마이크로어레이 프로브를 식별하기 위해 이전에 사용되어왔다. 예를 들어, 하기 문헌들을 참조한다: Pearson et al., cs.virginia.edu/∼robins/papers/primers_dam11_final.pdf., Jabado et al. Nucleic Acids Res. 2006 34(22):6605-11, Jabado et al. Nucleic Acids Res. 2008, 36(1):e3 doi10.1093/nar/gkm1106, Duitama et al. Nucleic Acids Res. 2009, 37(8):2483-2492, Phillippy et al. BMC Bioinformatics. 2009, 10:293 doi:10.1186/1471-2105-10-293. 그러나, 이러한 접근법은 일반적으로 각각의 프라이머/프로브를 k-량체로서 처리하는 단계 및 정확한 매치를 검색하는 단계 또는 서픽스 (suffix) 어레이를 사용하여 부정확한 매치를 허용하는 단계를 포함하였다. 또한, 방법은 일반적으로 각각의 투입 서열이 오직 하나의 프라이머 또는 프로브에 의해 결합되는 것을 필요로 하고, 서열을 따라서 이러한 결합의 위치가 비관련적이도록 프라이머 또는 프로브를 선택하여 하이브리드화를 검출하는 2원 접근법을 취한다. 대안적인 방법은 표적 게놈을 사전-정의된 윈도우로 나누고 효과적으로 각각의 윈도우를 2원 접근법 하에서 개별 투입 서열로서 처리할 수 있으며, 즉, 이들은 소정 프로브 또는 가이드 RNA 가 각각의 윈도우 내에서 결합하는지 여부를 결정하고 모든 윈도우가 일부 프로브 또는 가이드 RNA의 상태에 의해 결합되는 것을 요구한다. 효과적으로, 이들 접근법은 전체 투입 서열 또는 투입 서열의 사전-정의된 윈도우로서 세트 커버 문제 내 "유니버스" 의 각 요소를 처리하고, 각각의 요소는 요소 내에서 프로브 또는 가이드 RNA의 시작이 결합된다면 "커버됨"으로 간주된다. 이들 접근법은 상이한 프로브 또는 가이드 RNA 디자인이 소정 표적 서열을 커버하도록 허용되는 유동성을 제한한다.
대조적으로, 본 명세서에 개시된 구현예는 더 긴 프로브 또는 가이드 RNA 길이, 예를 들어, 하이브리드 선택 시퀀싱에 적합한 70 bp 내지 200 bp 의 범위의 길이를 검출하는 것에 관한 것이다. 또한, 본 명세서의 WO 2017/040316에 개시된 방법은 대량 및/또는 가변적 표적 서열 세트에서 모든 종 및/또는 균주 서열의 검출 시퀀싱을 식별하고 용이하게 할 수 있는 프로브 또는 가이드 RNA 세트를 한정할 수 있는 범-표적 서열 접근법을 취하도록 적용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 방법은 단일 어세이에서 다수의 상이한 바이러스, 또는 소정 바이러스의 모든 변이체를 식별하는데 사용될 수 있다. 더 나아가, 본 명세서에 개시된 방법은 세트 커버 문제에서 "유니버스" 의 각각의 요소를 표적 서열의 뉴클레오티드인 것으로서 처리하고, 각각의 요소는 요소를 포함하는 표적 게놈의 일부 분절에 프로브 또는 가이드 RNA 가 결합하는 한, "커버됨" 으로 간주된다. 이들 유형의 세트 커버 방법은 이전 방법의 2원 접근법 대신에 사용될 수 있고, 본 명세서에 개시된 방법은 어떻게 프로브 또는 가이드 RNA 가 표적 서열과 하이브리드화할 수 있는지에 대한 더 양호한 모델이 된다. 단지 소정 가이드 RNA 서열이 소정 윈도우에 결합하는지 또는 결합하지 않는지를 질문하기보다는, 이러한 접근법은 하이브리드화 패턴을 검출하는데 사용될 수 있으며, 즉, 소정 프로브 또는 가이드 RNA 가 표적 서열 또는 표적 서열들에 결합하는 경우, 샘플로부터의 농축 및 임의의 그리고 모든 표적 서열의 시퀀싱을 가능하게 하기에 충분한 정도로 표적 서열의 세트를 커버하기 위해 필요한 프로브 또는 가이드 RNA의 최소 개수를 그들 하이브리드화 패턴으로부터 결정한다. 이들 하이브리드화 패턴은 기능 상실을 최분해하는 특정 매개변수를 한정하고, 그리하여 예를 들어, 각각의 종의 다양성을 반영하기 위해서, 매개변수를 각각의 종에 대해 다양화시킬 수 있는 방식을 비롯하여, 프로브 또는 가이드 RNA 디자인 상황에서 이전에 적용된 것과 같은, 세트 커버 해법의 간단한 적용을 사용해 획득할 수 없는 계산적으로 효율적인 방식으로 최소의 프로브 또는 가이드 RNA의 식별을 가능하게 한다.
다수 전사물 존재도를 검출하는 능력은 특정한 표현형을 의미하는 고유한 미생물 서명의 생성을 가능하게 할 수 있다. 다양한 기계 학습 기술은 유전자 서명을 유래시키는데 사용될 수 있다. 따라서, CRISPR 시스템의 가이드 RNA는 특정 표현형을 검출하기 위해 유전자 서명에 의해 한정되는 바이오마커의 상대적 수준을 식별 및/또는 정량하는데 사용될 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, 유전자 서명은 항생제에 대한 감수성, 항생제에 대한 내성, 또는 이의 조합을 의미한다.
본 발명의 한 양상에서, 방법은 하나 이상의 병원체를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 방식으로, 개별 미생물에 의한 대상체의 감염 간 구별이 얻어질 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 구별은 특별한 질환, 예를 들어, 질환의 상이한 변이형의 임상의에 의한 검출 또는 진단을 가능하게 할 수 있다. 바람직하게 병원체 서열은 병원체의 게놈 또는 이의 단편이다. 방법은 병원체의 진화를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 병원체의 진화를 결정하는 단계는 병원체 돌연변이, 예를 들어 뉴클레오티드 결실, 뉴클레오티드 삽입, 뉴클레오티드 치환의 식별을 포함할 수 있다. 후자 중에서, 비-동의성, 동의성, 및 비-코딩 치환이 존재한다. 돌연변이는 대발생 동안 보다 빈번하게 비-동의성이다. 방법은 상기 기재된 바와 같이 분석된 2개 병원체 서열 간 치환율을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 돌연변이가 유해하거나 심지어 적응성인지 여부는 기능적 분석을 필요로 하지만, 비-동의성 돌연변이의 속도는 이러한 유행병의 계속적인 진행이 병원체 적응의 기회를 제공할 수 있다는 것을 시사하므로, 신속한 격리의 필요성을 강조한다. 따라서, 방법은 바이러스 적응의 위험성을 평가하는 단계를 더 포함할 수 있고, 여기서 비-동의성 돌연변이의 수가 결정한다 (Gire, et al., Science 345, 1369, 2014).
미생물 대발생의 모니터링
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CRISPR 시스템 또는 이의 사용 방법은 병원체 대발생의 진화를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 방법은 하나 이상의 대상체 유래의 다수 개의 샘플로부터 하나 이상의 표적 서열을 검출하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서 표적 서열은 대발생을 야기하는 미생물 유래의 서열이다. 이러한 방법은 병원체 전파의 패턴, 또는 병원체에 의해 야기되는 질환 대발생에 관여하는 기전을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
병원체 전파의 패턴은 병원체의 천연 병원소로부터의 계속적인 신규 전파 또는 천연 병원소로부터의 단일 전파 후 대상체 대 대상체 전파 (예를 들어, 인간 대 인간 전파) 또는 이 둘의 혼합을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 병원체 전파는 박테리아 또는 바이러스 전파일 수 있고, 이러한 경우, 표적 서열은 바람직하게는 미생물 게놈 또는 이의 단편이다. 한 구현예에서, 병원체 전파의 패턴은 병원체 전파의 조기 패턴, 즉 병원체 대발생의 시작 시의 패턴이다. 대발생의 시작 시 병원체 전파의 패턴 결정은 가능한 가장 빠른 시점에 대발생을 중단시킬 가능성을 증가시키고, 그리하여 지역 및 국가간 전파 확률을 감소시킨다.
병원체 전파의 패턴을 결정하는 단계는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 병원체 서열을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 병원체 전파의 패턴을 결정하는 단계는 대상체 간 병원체 서열의 공유된 숙주내 변이를 검출하는 단계 및 공유된 숙주내 변이가 시간적 패턴을 보이는지 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 관찰된 숙주내 및 숙주간 변이의 패턴은 전파 및 역학에 관한 중요한 통찰을 제공한다 (Gire, et al., 2014).
시간적 패턴을 보이는 대상체 간 공유된 숙주내 변이의 검출은, 다수 공급원으로부터의 대상체 감염 (중복감염), 샘플 오염 재발성 돌연변이 (돌연변이의 강화를 위한 균형 선택의 존재 또는 부재 하), 또는 전파 사슬의 초기에 돌연변이에 의해 발생된 약간의 발산된 바이러스의 동시-전파에 의해 설명될 수 있기 때문에, 대상체 간 (특히 인간 사이)의 전파 관련성을 나타낸다 (Park, et al., Cell 161(7):15161526, 2015). 대상체 간 공유된 숙주내 변이의 검출은 공통 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 위치에 위치하는 숙주내 변이체의 검출을 포함할 수 있다. 공통 (SNP) 위치에 위치된 숙주내 변이체의 양성 검출은 숙주내 변이체에 대한 주요 설명으로서 중복감염 및 오염을 의미한다. 중복감염 및 오염은 숙주간 변이체로서 나타나는 SNP 빈도를 기반으로 구별될 수 있다 (Park, et al., 2015). 그렇지 않으면 중복감염 및 오염은 배제시킬 수 있다. 이 후자의 경우에, 대상체 간 공유된 숙주내 변이의 검출은 동의성 및 비-동의성 변이체의 빈도를 평가하는 단계 및 동의성 및 비-동의성 변이체의 빈도를 서로 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 비동의성 돌연변이는 단백질의 아미노산을 변경시키는 돌연변이이고, 아마도 그 결과로 자연 선택을 겪은 미생물에서 생물학적 변화를 야기시킬 듯 하다. 동의성 치환은 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 동의성 및 비-동의성 변이체의 동일한 빈도는 중성적으로 진화하는 숙주내 변이체를 의미한다. 동의성 및 비-동의성 변이체의 빈도가 다른 경우, 숙주내 변이체는 균형 선택에 의해 유지될 가능성이 있다. 동의성 및 비-동의성 변이체의 빈도가 낮은 경우, 이것은 재발성 돌연변이를 의미한다. 동의성 및 비-동의성 변이체의 빈도가 높은 경우, 이것은 동시-전파를 의미한다 (Park, et al., 2015).
에볼라 바이러스처럼, 라싸 바이러스 (LASV)는 사망률이 높은 출혈열을 야기시킬 수 있다. Andersen 등은 임상 및 설치류 병원소 샘플로부터 거의 200 종의 LASV 서열의 게놈 카탈로그를 생성시켰다 (Andersen, et al., Cell Volume 162, Issue 4, p 738750, 13 August 2015). Andersen 등은 2013-2015년 EVD 유행병이 인간-대-인간 전파에 의해 자극된데 반해, LASV 감염은 주로 병원소-대-인간 감염에 의한다는 것을 보여준다. Andersen 등은 서아프리카 전역에서 LASV 의 확산을 밝혀주었으며 이러한 이동은 LASV 게놈 존재비, 사망률, 코돈 적응, 및 번역 효율의 변화가 수반되었다는 것을 보여준다. 방법은 제1 병원체 서열을 제2 병원체 서열과 계통발생적으로 비교하는 단계, 및 제1 및 제2 병원체 서열 간 계통발생적 연결성이 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 제2 병원체 서열은 초기 참조 서열일 수 있다. 계통발생적 연결성이 존재한다면, 방법은 제1 병원체 서열의 계통발생을 제2 병원체 서열에 기원시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 따라서, 제1 병원체 서열의 계통을 구축하는 것이 가능하다 (Park, et al., 2015).
방법은 돌연변이가 유해성 또는 적응성인지 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 유해성 돌연변이는 전파-손상 바이러스 및 종말 감염 (dead-end infection)을 의미하고, 따라서 정상적으로 오직 개별 대상체에만 존재한다. 하나의 개별 대상체에 고유한 돌연변이는 계통수의 외부 분지에서 발생되는 것들인데 반해, 내부 분지 돌연변이는 다수 샘플 (즉, 다수 대상체)에 존재하는 것들이다. 더 높은 비율의 비-동의성 치환은 계통수의 외부 분지를 특징으로 한다 (Park, et al., 2015).
계통수의 내부 분지에서, 선택은 유해성 돌연변이를 여과시켜 버릴 더 많은 기회를 가졌었다. 정의에 의해, 내부 분지는 다수의 후손 계통을 생성시켰고, 따라서 적응 비용으로 돌연변이를 포함시킬 가능성이 덜 할 수 있다. 따라서, 더 낮은 비율의 비-동의성 치환은 내부 분지를 의미한다 (Park, et al., 2015).
적응도에 대한 영향이 덜 할 가능성이 있는, 동의성 돌연변이는 내부 및 외부 분지 상에서 보다 비슷한 빈도로 발생하였다 (Park, et al., 2015).
시퀀싱된 표적 서열, 예컨대 바이러스 게놈을 분석하여, 2014 년 에볼라 대발생 동안과 같은 유행병 에피소드의 중증도에 대한 원인이 되는 기전을 발견하는 것이 가능하다. 예를 들어, 이전 대발생 유래의 모든 20 종 게놈에 대해서 2014 년 대발생의 게놈의 계통발생적 비교를 만든 Gire 등은 2014 년 서아프리카 바이러스가 지난 십여년 내에 중앙 아프리카로부터 확산된 가능성이 있다는 것을 제안한다. 다른 에볼라 바이러스 게놈으로부터의 분기를 이용하여 계통발생을 기원시키는 것은 문제가 있었다 (6, 13). 그러나, 가장 오래된 대발생에 대해 계통수를 기원시키는 것은 샘플 날짜와 뿌리부터 첨단까지의 거리 사이에 강력한 상관성을 밝혀주었고, 치환율은 연간 부위 당 8 × 104 였다 (13). 이것은 가장 최근의 대발생 3 건의 계통이 모두 대략 2004 년 경에, 대체로 동일한 시점에 공통 조상으로부터 분기되었다는 것을 시사하며, 이는 각각의 대발생이 이의 천연 병원소의 동일한 유전적으로 다양한 바이러스 개체군으로부터의 독립적인 동물원성 감염 사건을 나타낸다는 가설을 뒷받침한다. 이들은 또한 2014 년 EBOV 대발생이 천연 병원소로부터의 단일 전파와 그 이후 대발생 동안 인간 대 인간 전파에 의해 야기되었을 것임을 발견하였다. 그들 결과는 또한 시에라리온에서의 유행병 에피소드가 대략 동일 시점에 기니로부터의 2 종의 유전적으로 별개인 바이러스의 유입에 기인하였을 것임을 시사한다 (Gire, et al., 2014).
특히 인간 대 인간 전파 덕분에, 라싸 바이러스가 이의 원점으로부터 어떻게 확산되었는가를 결정하고 심지어 이러한 확산 400년의 역사를 역추적하는 것이 또한 가능하였다 (Andersen, et al., Cell 162(4):73850, 2015).
2013-2015 년 EBOV 대발생 동안 필요했던 작업 및 대발생 현장에서 의료진이 직면했던 어려움과 관련하여, 보다 일반적으로, 본 발명의 방법은 소수의 선택된 프로브를 사용하여 시퀀싱을 수행하는 것을 가능하게 만들어서 시퀀싱을 가속화시킬 수 있고, 따라서 샘플 채취부터 결과 입수까지 필요한 시간을 단축시킬 수 있다. 또한, 키트 및 시스템은 현장에서 사용가능하게 디자인될 수 있어서 환자의 진단이 샘플을 국가 또는 세계의 다른 부분으로 수송하거나 또는 발송할 필요없이 쉽게 수행될 수 있다.
상기 기재된 임의의 방법에서, 표적 서열 또는 이의 단편의 시퀀싱은 상기 기재된 임의의 시퀀싱 방법을 사용할 수 있다. 또한, 표적 서열 또는 이의 단편의 시퀀싱은 근실시간 시퀀싱일 수 있다. 표적 서열 또는 이의 단편의 시퀀싱은 이전에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다 (실험 절차: [Matranga et al., 2014]; 및 [Gire, et al., 2014]). 표적 서열 또는 이의 단편의 시퀀싱은 다수 개의 표적 서열의 병행 시퀀싱을 포함할 수 있다. 표적 서열 또는 이의 단편의 시퀀싱은 Illumina 시퀀싱을 포함할 수 있다.
선택된 프로브 중 하나 이상과 하이브리드화하는 표적 서열 또는 이의 단편의 분석은 식별 분석일 수 있는데, 표적 서열 또는 이의 단편과 선택된 프로브의 하이브리드화는 샘플 내의 표적 서열의 존재를 의미한다.
현재, 1차 진단은 환자가 갖고 있는 증상을 기반으로 한다. 그러나, 다양한 질환은 동일한 증상을 공유할 수 있어, 진단은 통계에 많이 의존한다. 예를 들어, 말라리아는 감기-유사 증상: 두통, 발열, 오한, 관절통, 구토, 용혈성 빈혈, 황달, 소변 중 헤모글로빈, 망막 손상, 및 경련을 촉발시킨다. 이들 증상은 또한 패혈증, 위장염, 및 바이러스 질환에서 공통이다. 그들 중에서, 에볼라 출혈열은 하기의 증상: 발열, 인후염, 근육통, 두통, 구토, 설사, 발진, 간 및 신장 기능 감소, 내부 및 외부 출혈을 갖는다.
환자가 예를 들어 열대 아프리카의 의료단에 출석했을 때, 기초 진단은 통계적으로 아프리카의 지역 내에서 말라리아가 가장 개연성있는 질환이기 때문에 말라리아로 결론내릴 것이다. 그러한 결과로 환자가 실제로 그 질환에 걸리지 않았을지라도 말라리아에 대해 치료받게 되어 결국 환자는 올바르게 치료되지 않게 된다. 이러한 올바른 치료의 부족은 특히 환자가 걸린 질환이 빠른 진화를 나타낼 때 생명 위협적일 수 있다. 환자에게 제공된 치료가 비효과적이고, 올바른 진단을 해서 환자에게 적절한 치료를 투여하는 것을 의료진이 깨닫기 전에 너무 늦을 수도 있다.
본 발명의 방법은 이러한 상황에 대한 해결책을 제공한다. 실제로, 가이드 RNA의 개수는 극적으로 감소될 수 있기 때문에, 이는 다수의 질환, 예를 들어 바이러스 감염을 동시에 진단할 수 있도록, 단일 칩 상에, 각각의 군이 하나의 질환에 대해 특이적인 것인 군들로 나뉘는 선택된 프로브를 제공하는 것을 가능하게 만든다. 본 발명 덕분에, 3 종이 넘는 질환을 단일 칩 상에서 진단할 수 있고, 바람직하게는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 종을 초과하는 질환을 동시에, 바람직하게는 소정 지리적 영역의 개체군 내에서 가장 일반적으로 발병되는 것인 질환을 진단할 수 있다. 선택된 프로브의 각 그룹이 진단된 질환 중 하나에 대해 특이적이므로, 보다 정확한 진단을 수행할 수 있고, 따라서 환자에게 부적절한 치료를 투여할 위험성이 감소된다.
다른 경우에서, 바이러스 감염과 같은 질환은 임의의 증상없이 발병될 수 있거나, 또는 증상을 야기하지만 환자가 의료진에게 나타나기 전에 소멸되었다. 이러한 경우, 환자는 임의의 의료 지원을 찾지 않거나 출석날 증상의 부재로 인해 진단이 복잡해진다.
본 발명은 또한 핵산, 예컨대 미가공, 비정제 샘플 중 mRNA 와 같은 핵산의 검출을 기반으로 질환의 진단, 병원체의 식별 및 치료의 최적화를 위한 다른 방법과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 이러한 상황을 해결하기 위한 강력한 도구를 제공한다. 실제로, 각각의 군이 소정 지역의 개체군 내에서 발병된 가장 일반적인 질환 중 하나에 특이적인, 선택된 가이드 RNA의 다수 군이 단일 진단 내에 포함되므로, 의료진은 오직 환자로부터 채취된 생물학적 샘플을 칩과 접촉시키는 것만을 필요로 한다. 칩의 판독은 환자가 걸린 질환을 밝혀준다.
일부 경우, 환자는 특정 증상의 진단을 위해 의료진에게 출석한다. 본 발명의 방법은 어떠한 질환이 이들 증상을 야기시켰는지를 식별할뿐만 아니라 동시에 환자가 자각하지 못한 또 다른 질환을 앓고 있는지 여부를 결정하는 것을 가능하게 만든다.
이러한 정보는 대발생의 기전을 찾을 때 최고로 중요할 것이다. 실제로, 동일한 바이러스를 갖는 환자 군은 또한 대상체 대 대상체 전파 연결성을 시사하는 시간적 패턴을 보인다.
미생물 유전자 교란 스크리닝
특정 예시적 구현예에서, 본 명세서에 개시된 CRISPR 시스템은 미생물 유전적 교란을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 미생물 경로 및 기능적 네트워크를 설계하기 위해 유용할 수 있다. 미생물 세포는 유전자 변형될 수 있고 그런 후에 상이한 실험 조건 하에서 스크리닝될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 본 명세서에서 개시된 구현예는 복합적 방식으로 단일 개별 이산 부피에서 단일 표적, 또는 단일 샘플에서 다수 표적 분자에 대해 스크리닝할 수 있다. 유전자 변형된 미생물은 특정한 미생물 세포 또는 미생물 세포의 개체군에 의해 운반되는 특정한 유전자 변형을 식별하는 핵산 바코드 서열을 포함하도록 변형될 수 있다. 바코드는 식별자로서 사용되는 뉴클레오티드의 짧은 서열 (예를 들어, DNA, RNA, 또는 이의 조합) 이다. 핵산 바코드는 4-100 개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있고 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 바코드로 세포를 식별하기 위한 방법은 당분야에 공지되어 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 CRISPR 이펙터 시스템의 가이드 RNA는 바코드를 검출하는데 사용될 수 있다. 양성 검출가능 신호의 검출은 샘플에서 특정한 유전자 변형의 존재를 의미한다. 본 명세서에 개시된 방법은 시험되는 실험 조건 하에서 유전자 변형의 효과를 의미하는 상보성 유전자형 또는 표현형 판독을 검출하는 다른 방법과 조합될 수 있다. 스크리닝하려는 유전자 변형은 유전자 녹-인, 유전자 녹-아웃, 역위, 유전자좌, 전이, 또는 하나 이상의 뉴클레오티드 삽입, 결실, 치환, 돌연변이, 또는 기능적 결과 예컨대 변경된 단백질 안정성 또는 검출을 갖는 에피토프를 인코딩하는 핵산의 첨가를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 유사한 방식으로, 본 명세서에 기재된 방법은 유전자 조절 요소 및 유전자 발현 모듈의 특별한 배열의 기능성을 스크리닝하기 위해 합성 생물학 적용분야에서 사용될 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, 방법은 하이포모프를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 하이포모프의 생성 및 핵심 박테리아 기능성 유전자의 식별에서 그들의 용도 및 신규 항생제 치료제의 식별은 참조로 본 명세서에 편입시킨, 2016년 11월 4일 출원된 발명의 명칭 "Multiplex High-Resolution Detection of Micro-organism Strains, Related Kits, Diagnostic Methods and Screening Assays"의 PCT/US2016/060730에 개시된 바와 같다.
상이한 실험 조건은 상이한 화학제, 화학제의 조합, 상이한 농도의 화학제 또는 화학제의 조합에 대한 미생물의 노출, 화학제 또는 화학제의 조합에 대한 상이한 노출 기간, 상이한 물리적 변수, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 일정 예의 구현예에서, 화학제는 항생제 또는 항바이러스제이다. 스크리닝하려는 상이한 물리적 매개변수는 상이한 온도, 대기압, 상이한 대기 및 비-대기 가스 농도, 상이한 pH 수준, 상이한 배양 배지 조성, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
환경 샘플의 스크리닝
본 명세서에 개시된 방법은 또한 표적 핵산 또는 폴리펩티드의 존재를 검출하여 오염에 대해 환경 샘플을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명은 미생물을 검출하는 방법을 제공하고, 이 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 CRISPR 시스템을 샘플에 노출시키는 단계; 하나 이상의 가이드 RNA 와 하나 이상의 미생물-특이적 표적 RNA 또는 하나 이상의 기폭제 RNA의 결합을 통해 RNA 이펙터 단백질을 활성화시켜, 검출가능한 양성 신호를 생성시키는 단계를 포함한다. 양성 신호가 검출될 수 있고 샘플 중 하나 이상의 미생물의 존재를 의미한다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템은 본 명세서에 기재된 바와 같이 기재 상에 존재할 수 있고, 기재는 샘플에 노출될 수 있다. 다른 구현예에서, 동일한 CRISPR 시스템, 및/또는 상이한 CRISPR 시스템이 기재 상의 다수의 별개 위치에 적용될 수 있다. 추가 구현예에서, 상이한 CRISPR 시스템은 각각의 위치에서 상이한 미생물을 검출할 수 있다. 상기 더욱 상술한 바와 같이, 기재는 예를 들어 종이 기재, 패브릭 기재, 또는 가요성 중합체-기반 기재를 비제한적으로 포함하는, 가요성 재료 기재일 수 있다.
본 발명에 따라서, 기재는 샘플채취하려는 유체 중에 기재를 일시적으로 함침시키거나, 기재에 시험하려는 유체를 도포하거나, 시험하려는 표면을 기재와 접촉시켜서, 수동적으로 샘플에 노출될 수 있다. 기재에 샘플을 도입하는 임의의 수단이 적절하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 본 발명에서 사용을 위한 샘플은 생물학적 또는 환경 샘플, 예컨대 음식물 샘플 (신선 과일 또는 채소, 육류), 음료 샘플, 종이 표면, 패브릭 표면, 금속 표면, 목재 표면, 플라스틱 표면, 토양 샘플, 담수 샘플, 폐수 샘플, 염수 샘플, 대기 공기 또는 다른 가스 샘플에의 노출, 또는 이의 조합일 수 있다. 예를 들어, 금속, 목재, 플라스틱, 고무 등을 비제한적으로 포함하는 임의의 재료로 만들어진 가정용/상업용/산업용 표면을 면봉으로 닦아서 오염을 시험할 수 있다. 토양 샘플은 환경적 목적 및/또는 인간, 동물 또는 식물 질환 검사를 위해, 병원성 박테리아 또는 기생충, 또는 다른 미생물의 존재에 대해 시험될 수 있다. 물 샘플 예컨대 담수 샘플, 폐수 샘플, 또는 염수 샘플은 예를 들어, 크립토스포리듐 파르븀 (Cryptosporidium parvum), 지아르디아 람블리아 (Giardia lamblia), 또는 다른 미생물 오염의 존재를 검출하기 위해, 청정도 및 안정성, 및/또는 휴대성에 대해 평가될 수 있다. 추가 구현예에서, 생물학적 샘플은 조직 샘플, 타액, 혈액, 혈장, 혈청, 대변, 소변, 객담, 점액질, 림프, 활액, 뇌척수액, 복수, 흉수, 혈청종, 고름, 또는 피부 또는 점막 표면의 스왑을 비제한적으로 포함하는 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 특정한 구현예에서, 환경 샘플 또는 생물학적 샘플은 미가공 샘플일 수 있고/있거나 하나 이상의 표적 분자는 방법의 적용 이전에 샘플로부터 정제되지 않을 수 있거나 증폭되지 않을 수 있다. 미생물의 식별은 임의의 많은 적용분야에서 유용하고/하거나 필요할 수 있고, 따라서 당업자가 적절하다고 여기는 임의 출처 유래의 임의 유형의 샘플이 본 발명에 따라서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 레스토랑 또는 다른 식품 제공처에서 박테리아, 예컨대 이. 콜라이 (E. coli)에 의한 식품 오염의 점검; 식품 표면; 살모넬라 (Salmonella), 캄필로박터 (Campylobacter), 또는 이. 콜라이와 같은 병원체에 대한 물 검사; 또한 제조사 및 규제 기관이 육류원의 순도를 결정하기 위한 식품 품질 점검; 병원체 예컨대 레지오넬라 (Legionella)에 의한 공기 오염의 확인; 페디오코커스 (Pediococcus) 및 락토바실러스 (Lactobacillus)와 같은 병원체에 의한 맥주의 오염 또는 부패 여부 점검; 제조 동안 박테리아 또는 진균에 의한 살균 또는 미살균 치즈의 오염이 있다.
본 발명에 따른 미생물은 식품 또는 소모성 제품 부패를 초래하는 미생물 또는 병원성 미생물일 수 있다. 병원성 미생물은 병원성일 수 있거나 아니면 인간, 동물 또는 식물에게 바람직하지 않을 수 있다. 인간 또는 동물 목적을 위해, 미생물은 질환을 야기할 수 있거나 또는 질병을 일으킬 수 있다. 본 발명의 동물 또는 수의학적 적용은 미생물에 감염된 동물을 식별할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 시스템은 켄넬 코프, 공수병 바이러스, 및 심장사상충을 포함하나 이에 제한되지 않는 병원체를 갖는 반려동물을 식별할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법 및 시스템은 육종 목적으로 친자 감별에 사용될 수 있다. 식물 미생물은 식물에 유해하거나 또는 질환을 초래할 수 있고, 수확량을 감소시킬 수 있거나 또는 색상, 맛, 견실성, 냄새와 같은 특성을 변경시킬 수 있고, 식품 또는 소비성 오염 목적의 경우, 미생물은 식품 또는 소모성 제품의 맛, 냄새, 색상, 견실성 또는 다른 상업적 특성에 부정적으로 영향을 미칠 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, 미생물은 박테리아 종이다. 박테리아는 정신친화성 (psychotroph), 대장균형, 락트산 박테리아, 또는 포자-형성 박테리아일 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 박테리아는 질환 또는 질병을 야기하는 임의의 박테리아 종일 수 있거나, 또는 아니면 원치않는 생성물 또는 특성을 일으킨다. 본 발명에 따라서 박테리아는 인간, 동물 또는 식물에 병원성일 수 있다.
샘플 유형
본 명세서에서 개시된 방법에서 사용하기에 적절한 샘플은 유기체 또는 이의 일부분, 예컨대 식물, 동물, 박테리아 등으로부터 수득된 임의의 통상적인 생물학적 샘플을 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 동물 대상체, 예컨대 인간 대상체로부터 수득된다. 생물학적 샘플은 단일 세포 유기체, 예컨대 박테리아, 효모, 원충, 및 아메바 등, 다세포 유기체 (예컨대 식물 또는 동물로서, 건강하거나 또는 외관상 건강한 인간 대상체 또는 진단 또는 검사해야 하는 병태 또는 질환, 예컨대 병원성 미생물, 예컨대 병원성 박테리아 또는 바이러스에 의한 감염에 걸린 인간 환자 유래 샘플 포함)를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 살아있는 유기체로부터 수득되거나, 그로부터 배출되거나, 그에 의해 분비되는 임의의 고형 또는 유체 샘플이다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 객담, 점액질, 림프액, 활액, 담즙, 복수, 흉수, 혈청종, 타액, 뇌척수액, 수양액 또는 유리체액, 또는 임의의 신체 분비물, 여출액, 삼출액 (예를 들어, 농양 또는 감염 또는 염증의 임의의 다른 부위로부터 수득된 유체), 또는 관절로부터 수득된 유체 (예를 들어, 정상 관절 또는 질환, 예컨대 류마티스성 관절염, 골관절염, 통풍성 또는 화농성 관절염에 걸린 관절), 또는 피부 또는 점막 표면의 스왑으로부터 수득된 생물학적 유체일 수 있다.
샘플은 또한 임의의 장기 또는 조직으로부터 수득된 샘플 (생검 또는 부검 표본, 예컨대 종양 생검 포함) 일 수 있거나 세포 (1차 세포 또는 배양 세포이건 무관) 또는 임의 세포, 조직 또는 장기에 의해 조건화된 배지를 포함할 수 있다. 예시적인 샘플은 세포, 세포 용해물, 혈액 도말 샘플, 세포원심분리 제조물, 세포학 도말 샘플, 체액 (예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 객담, 소변, 기관지폐포 세척액, 정액 등), 조직 생검 (예를 들어, 종양 생검), 세침 흡인물, 및/또는 조직 절편 (예를 들어, 크라이오스태트 조직 절편 및/또는 파라핀-포매 조직 절편)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 예에서, 샘플은 순환성 종양 세포 (세포 표면 마커에 의해 식별할 수 있음)를 포함한다. 특정 예에서, 샘플은 직접적으로 (예를 들어, 신선 또는 냉동) 사용되거나, 사용 전에, 예를 들어 고정 (예를 들어, 포르말린 사용) 및/또는 왁스 포매 (예컨대 포르말린-고정 파라핀-포매 (FFPE) 조직 샘플)에 의해 조작될 수 있다. 대상체로부터 조직을 수득하는 임의의 방법이 이용될 수 있고, 사용되는 방법의 선택은 다양한 인자들 예컨대 조직의 유형, 대상체의 연령, 또는 의사가 이용가능한 절차에 따라 좌우될 것임을 이해하게 될 것이다. 이러한 샘플의 획득을 위한 표준 기술은 당분야에서 입수가능하다. 예를 들어, 문헌 [Schluger et al., J. Exp. Med. 176:1327-33 (1992)]; [Bigby et al., Am. Rev. Respir. Dis. 133:515-18 (1986)]; [Kovacs et al., NEJM 318:589-93 (1988)]; 및 [Ognibene et al., Am. Rev. Respir. Dis. 129:929-32 (1984)]을 포함하는 수많은 간행물에 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 샘플은 환경 샘플, 예컨대 물, 토양, 또는 표면 예컨대 산업적 또는 의학적 표면일 수 있다. 일부 구현예에서, 미국 공개 특허 출원 번호 2013/0190196 에 개시된 바와 같은 방법은 고도의 감도 및 특이도로 미가공 세포 샘플로부터 직접적으로 유래된, 핵산 서명, 특히 RNA 수준의 검출에 적용될 수 있다. 각각의 관심 병원체에 특이적인 서열은 BLAST 소프트웨어에 의해 다른 유기체의 모든 코딩 서열과 관심 병원체 유래 코딩 서열을 비교하여 식별되거나 선택될 수 있다.
본 개시 내용의 몇몇 구현예는 임상적 혈액 샘플을 성공적으로 분획화하기 위해 당분야에 공지된 절차 및 접근법의 사용을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 그의 개시물 전체가 참조로 포함되는, [Han Wei Hou et al., Microfluidic Devices for Blood Fractionation, Micromachines 2011, 2, 319343]; [Ali Asgar S. Bhagat et al., Dean Flow Fractionation (DFF) Isolation of Circulating Tumor Cells (CTCs) from Blood, 15th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, October 26, 2011, Seattle, WA]; 및 국제 공개 특허 출원 번호 WO2011109762 에 기재된 절차를 참조한다. 혈액 샘플은 검사 목적을 위해 샘플 크기를 증가시키도록 일반적으로 배양으로 확장된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 혈액 또는 다른 생물학적 샘플은 배양에 의한 확장 필요없이 본 명세서에서 기재된 바와 같은 방법에서 사용될 수 있다.
또한, 본 개시물의 몇몇 구현예는 본 명세서에 그의 개시물 전체가 참조로 포함되는, [Han Wei Hou et al., Pathogen Isolation from Whole Blood Using Spiral Microchannel, Case No. 15995JR, Massachusetts Institute of Technology, manuscript in preparation] 에 기재된 바와 같이, 나선형 마이크로채널을 사용하여 전혈로부터 병원체를 성공적으로 단리하기 위해 당분야에 공지된 절차 및 접근법의 사용을 포함한다.
본 명세서에서 개시된 구현예의 증가된 감도로 인해, 특정 예시적 구현예에서, 어세이 및 방법은 검출하려는 표적 분자를 샘플로부터 더 분획화시키거나 또는 정제시키지 않는 샘플 또는 미가공 샘플에 대해 수행될 수 있다.
말라리아 검출 및 모니터링
말라리아는 플라스모듐 (Plasmodium) 기생충에 의해 야기되는 모기-매개 병상이다. 이 기생충은 감염된 암컷 아노펠레스 (Anopheles) 모기에게 물리는 것을 통해 사람에게 확산된다. 5 종의 플라스모듐 종이 인간에서 말라리아를 야기시킨다: 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스 (Plasmodium vivax), 플라스모듐 오발 (Plasmodium ovale), 플라스모듐 말라리아 (Plasmodium malariae), 및 플라스모듐 크노우레시 (Plasmodium knowlesi). 그들 중에서, 세계 보건 기구 (WHO)에 따르면, 플라스모듐 팔시파룸 및 플라스모듐 비박스가 가장 큰 위협의 원인이다. 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum) 은 아프리카 대륙에서 가장 우세한 말라리아 기생충이고 전세계적으로 대부분의 말라리아-관련 사망의 원인이다. 플라스모듐 비박스 (Plasmodium vivax)는 사하라 사막 남부 아프리카 외부의 대부분의 국가에서 우세한 말라리아 기생충이다.
2015 년에, 91 개 국가 및 지역에서 말라리아 전파가 계속 진행되었었다. 최근 WHO 가 추산한 바에 따르면, 2015 년에 2 억 1,200 만 건의 말라리아가 발생하였고, 429 000명이 사망하였다. 말라리아 전파가 높은 지역에서, 5 세 이하의 어린이가 특히 감염, 질병 및 사망에 걸리기 쉽고, 전체 말라리아 사망 중 2/3 (70%) 이상이 이 연령군에서 발생한다. 2010 년 내지 2015 년 사이에, 5 세 이하 말라리아 사망률은 전세계적으로 29% 로 감소되었다. 그러나, 말라리아는 2 분마다 어린이의 생명을 앗아가서, 여전히 5 세 이하 어린이의 주요 사망인자로 남아있다.
WHO 가 설명하는 바와 같이, 말라리아는 급성 열병이다. 비면역 개체에서, 증상은 감염성 모기 물림 이후 7 일 또는 그 이후에 나타난다. 최초 증상 - 발열, 두통, 오한 및 구토 - 은 약할 수 있어서 말라리아로 인식하는 것이 어려울 수 있지만, 24 시간 이내에 치료하지 않으면, 피. 팔시파룸 말라리아는 중증 질병으로 진행될 수 있고, 종종 사망을 초래할 수 있다.
중증 말라리아에 걸린 어린이에게는 빈번하게 하기 증상 중 하나 이상이 발생된다: 중증 빈혈증, 대사성 산증과 관련된 호흡 곤란, 또는 뇌 말라리아. 성인에서, 다기관 관여가 또한 빈번하다. 말라리아 풍토병 지역에서, 사람들은 부분 면역성이 생겨서, 무증상성 감염이 발생될 수 있다.
신속하고 효율적인 진단 검사의 개발은 공중 위생과 높은 관련성이 있다. 실제로, 말라리아의 조기 진단 및 치료는 질환을 감소시키고 사망을 방지할 뿐만 아니라 말라리아 전파를 감소시키는데 기여한다. WHO 권고에 따라서, 의심되는 말라리아의 모든 사례는 치료 투여 전에 기생충-기반 진단 검사 (특히 신속한 진단 검사 사용)를 사용하여 확진되어야만 한다 (["WHO Guidelines for the treatment of malaria", 제 3 판, 2015 년 4 월 출간] 참조).
항말라리아 요법에 대한 내성은 치료 전략을 대폭적으로 감소시키는 중대한 건강 문제를 의미한다. 실제로, WHO 웹사이트에 보고된 바와 같이, 이전 세대 약물, 예컨대 클로로퀸 및 술파독신/피리메타민 (SP)에 대한 피. 팔시파룸의 내성은 1950 년대 및 1960 년대에 널리 퍼지게 되었고, 말라리아 방제 노력을 약화시키고 어린이 생존 획득을 후퇴시켰다. 따라서, WHO 는 항말라리아 약제 내성의 일상적인 모니터링을 권고한다. 실제로, 정확한 진단은 부적절한 치료를 피할 수 있고 항말라리아 약물에 대한 내성 확대를 제한할 수 있다.
이러한 맥락에서, 2015 년 5 월에 세계 보건 총회가 채택한 - 말라리아 20162030 에 대한 WHO 세계 기술 전략 (WHO Global Technical Strategy for Malaria 2016-2030) 은 모든 말라리아-풍토병 국가에 기술적 체계를 제공한다. 이것은 그들이 말라리아 방제 및 박멸에 대한 작업을 하면서 지역 및 국가 프로그램을 안내 및 지원하고자 하는 것이다. 전략은 다음을 포함하여, 야심적이지만 달성가능한 세계적 목표를 설정한다:
. 2030년까지 적어도 90% 까지 말라리아 사례 발병률 감소.
. 2030년까지 적어도 90% 까지 말라리아 사망률 감소.
. 2030년까지 적어도 35 개 국가에서 말라리아 박멸.
. 모든 말라리아 청정 국가에서 말라리아의 부활 방지.
이러한 전략은 2 년에 걸친 광범위한 협의 과정의 결과였으며 70 개 회원국의 400 명이 넘는 기술 전문가의 참여가 수반되었다. 이것은 3 가지 핵심 축을 기반으로 한다:
. 말라리아, 예방, 진단 및 치료에 대한 보편적 접근 보장;
. 말라리아-청정 상태의 달성 및 박멸에 대한 노력 가속화; 및
. 말라리아 감시를 핵심 개입으로 전환.
플라스모듐에 대한 치료는 아릴-아미노 알코올 예컨대 퀴닌 또는 퀴닌 유도체 예컨대 클로로퀸, 아모디아퀸, 메플로퀸, 피페라퀸, 루메판트린, 프리마퀸; 친유성 히드록시나프토퀴논 유사체, 예컨대 아토바퀀; 항엽산 약제, 예컨대 술파 약제 술파독신, 답손 및 피리메타민; 프로구아닐; 아토바퀀/프로구아닐 병용; 아테미신 약제; 및 이의 조합을 포함한다.
모기-매개 병원체의 존재에 대해 진단하는 표적 서열은 그 게놈 유래 서열을 포함하여, 플라스모듐 (Plasmodium), 특히 인간에 영향을 미치는 플라스모디아 (Plasmodia) 종 예컨대 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스 (Plasmodium vivax), 플라스모듐 오발 (Plasmodium ovale), 플라스모듐 말라리아 (Plasmodium malariae), 및 플라스모듐 크노우레시 (Plasmodium knowlesi)의 존재에 대해 진단하는 서열을 포함한다.
플라스모듐, 특히 인간에 영향을 미치는 플라스모디아 종, 예컨대 플라스모듐 팔시파룸, 플라스모듐 비박스, 플라스모듐 오발, 플라스모듐 말라리아, 및 플라스모듐 크노우레시에 대한 치료에 대한 약제 내성을 모니터링하기 위한 진단하는 표적 서열.
추가 표적 서열은 플라스모듐 기생충에게 필수적인 생물학적 과정에 관여되는 단백질 및 특히 수송체 단백질, 예컨대 약제/대사산물 수송체 패밀리 유래 단백질, 기질 전좌에 관여되는 ATP-결합 카세트 (ABC) 단백질, 예컨대 ABC 수송체 C 서브패밀리 또는 Na+/H+ 교환체, 막 글루타티온 S-트랜스퍼라아제; 폴레이트 경로에 관여되는 단백질, 예컨대 디히드로프테로에이트 신타아제, 디히드로폴레이트 리덕타아제 활성 또는 디히드로폴레이트 리덕타아제-티미딜레이트 신타아제; 및 내부 미토콘트리아 막에 걸친 양자의 전좌에 관여되는 단백질 및 특히 시토크롬 b 복합체를 코딩하는 표적 분자/핵산 분자를 포함하는 서열을 포함한다. 추가의 표적은 또한 헴 중합효소를 코딩하는 유전자(들)를 포함할 수 있다.
추가 표적 서열은 피. 팔시파룸 클로로퀸 내성 수송체 유전자 (pfcrt), 피. 팔시파룸 다제 내성 수송체 1 (pfmdr1), 피. 팔시파룸 다제 내성-연관된 단백질 유전자 (Pfmrp), 피. 팔시파룸 Na+/H+ 교환체 유전자 (pfnhe), 피. 팔시파룸 이출 단백질 1 을 코딩하는 유전자, 피. 팔시파룸 Ca2+ 수송 6 (pfatp6); 피. 팔시파룸 디히드로프테로에이트 신타아제 (pfdhps), 디히드로폴레이트 리덕타아제 활성 (pfdhpr) 및 디히드로폴레이트 리덕타아제-티미딜레이트 신타아제 (pfdhfr) 유전자, 시토크롬 b 유전자, gtp 시클로히드롤라아제 및 Kelch13 (K13) 유전자를 비롯하여 다른 플라스모듐 종에서 그들의 기능적 이종성 유전자로부터 선택될 수 있는, 필수적인 생물학적 과정에 관여되는 단백질을 코딩하는 표적 분자/핵산 분자를 포함한다.
수많은 돌연변이, 특히 단일 점 돌연변이는 현행 치료의 표적이며 특별한 내성 표현형과 연관된 단백질에서 식별되었다. 따라서, 본 발명은 모기-매개 기생충, 예컨대 플라스모듐의 다양한 내성 표현형의 검출을 가능하게 한다.
본 발명은 표적 핵산/분자에서 하나 이상의 돌연변이(들) 및 특히 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 하기의 돌연변이 중 임의의 하나 또는 그들의 조합은 약제 내성 마커로서 사용될 수 있으며 본 발명에 따라 검출될 수 있다.
피. 팔시파룸 K13 의 단일 점 돌연변이는 위치 252, 441, 446, 449, 458, 493, 539, 543, 553, 561, 568, 574, 578, 580, 675, 476, 469, 481, 522, 537, 538, 579, 584 및 719 에서 하기의 단일 점 돌연변이, 및 특히 돌연변이 E252Q, P441L, F446I, G449A, N458Y, Y493H, R539T, I543T, P553L, R561H, V568G, P574L, A578S, C580Y, A675V, M476I; C469Y; A481V; S522C; N537I; N537D; G538V; M579I; D584V; 및 H719N 을 포함한다. 이들 돌연변이는 일반적으로 아르테미신 약제 내성 표현형과 연관된다 (Artemisinin and artemisinin-based combination therapy resistance, April 2016 WHO/HTM/GMP/2016.5).
피. 팔시파룸 디히드로폴레이트 리덕타아제 (DHFR) (PfDHFR-TS, PFD0830w)에서, 중요한 다형성은 위치 108, 51, 59 및 164 에 돌연변이, 특히 피리메타민에 대한 내성을 조정하는 108D, 164L, 51I 및 59R 을 포함한다. 다른 다형성은 또한 술파독신에 대한 내성과 연관된 437G, 581G, 540E, 436A 및 613S 를 포함한다. 추가적인 관찰된 돌연변이는 Ser108Asn, Asn51Ile, Cys59Arg, Ile164Leu, Cys50Arg, Ile164Leu, Asn188Lys, Ser189Arg 및 Val213Ala, Ser108Thr 및 Ala16Val 을 포함한다. 돌연변이 Ser108Asn, Asn51Ile, Cys59Arg, Ile164Leu, Cys50Arg, Ile164Leu 는 특히 피리메타민 기반 요법 및/또는 클로로구아닌-답손 병용 요법 내성과 연관된다. 시클로구아닐 내성은 이중 돌연변이 Ser108Thr 및 Ala16Val 과 연관되는 것으로 보인다. dhfr 의 증폭은 또한 내성, 특히 피리메타민 내성과 높은 관련성이 있을 수 있다.
피. 팔시파룸 디히드로프테로에이트 신타아제 (DHPS) (PfDHPS, PF08_0095)에서, 중요한 다형성은 위치 436, 437, 581 및 613 에서의 돌연변이 Ser436Ala/Phe, Ala437Gly, Lys540Glu, Ala581Gly 및 Ala613Thr/Ser 을 포함한다. 위치 581 및/또는 613 의 다형성은 또한 술파독신-피리메타민 기반 요법에 대한 내성과 연관되었다.
피. 팔시파룸 클로로퀸-내성 수송체 (PfCRT)에서, 위치 76 의 다형성, 특히 돌연변이 Lys76Thr 은 클로로퀸에 대한 내성과 연관된다. 추가 다형성은 클로로퀸 내성과 연관될 수 있는 Cys72Ser, Met74Ile, Asn75Glu, Ala220Ser, Gln271Glu, Asn326Ser, Ile356Thr 및 Arg371Ile를 포함한다. PfCRT 는 또한 잔기 S33, S411 및 T416 에서 인산화되고, 이것은 단백질의 특이성 또는 수송 활성을 조절할 수 있다.
피. 팔시파룸 다제-내성 수송체 1 (PfMDR1) (PFE1150w)에서, 위치 86, 184, 1034, 1042 에서의 다형성, 특히 Asn86Tyr, Tyr184-Phe, Ser1034Cys, Asn1042Asp 및 Asp1246Tyr이 확인되었고 루메판트린, 아르테미시닌, 퀴닌, 메플로퀸, 할로판트린 및 클로로퀸에 대한 감수성에 영향을 미친다고 보고되었다. 추가적으로, PfMDR1의 증폭은 루메판트린, 아르테미시닌, 퀴닌, 메플로퀸 및 할로판트린에 대한 감소된 감수성과 연관되고, PfMDR1 의 탈증폭은 클로로퀸 내성의 증가를 초래한다. pfmdr1의 증폭이 또한 검출될 수 있다. PfMDR1의 인산화 상태가 또한 높은 관련성이 있다.
피. 팔시파룸 다제-내성 연관 단백질 (PfMRP) (유전자 참조 PFA0590w)에서, 위치 191 및/또는 437 에서의 다형성, 예컨대 Y191H 및 A437S가 확인되었고 클로로퀸 내성 표현형과 연관되었다.
피. 팔시파룸 NA+/H+ 교환체 (PfNHE) (ref PF13_0019)에서, 미세부수체 ms4670 에서 DNNND의 증가된 반복성은 퀴닌 내성에 대한 마커일 수 있다.
시토크롬 be 유전자 (cytb, mal_mito_3)에 의해 코딩되는 시토크롬 b 단백질의 유비퀴놀 결합 부위를 변경시키는 돌연변이는 아토바퀀 내성과 연관된다. 위치 26, 268, 276, 133 및 280 의 돌연변이, 특히 Tyr26Asn, Tyr268Ser, M1331 및 G280D 는 아토바퀀 내성과 연관될 수 있다.
예를 들어 플라스모듐 비박스에서, Pf MDR1의 상동체인 PvMDR1 의 돌연변이는 클로로퀸 내성와 연관되는데, 특히 위치 976의 다형성 예컨대 돌연변이 Y976F이다.
상기 돌연변이는 단백질 서열과 관련하여 정의된다. 그러나, 당업자는 또한 핵산 표적 서열로서 식별되는, SNPS 를 포함하는, 상응하는 돌연변이를 결정할 수 있다.
다른 식별된 약제-내성 마커는 예를 들어, 그 내용이 본 명세서에 참조로 포함되는, 문헌 ["Susceptibility of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs (1996- 2004)"; WHO; Artemisinin and artemisinin-based combination therapy resistance (April 2016 WHO/HTM/GMP/2016.5); "Drug-resistant malaria: molecular mechanisms and implications for public health" FEBS Lett. 2011 Jun 6;585(11):1551- 62. doi:10.1016/j.febslet.2011.04.042. Epub 2011 Apr 23. Review. PubMed PMID: 21530510] 에 기재된 바와 같이 당분야에 공지되어 있다.
본 발명에 따라 검출할 수 있는 폴리펩티드와 관련하여, 본 명세서에 언급된 모든 유전자의 유전자 생성물은 표적으로서 사용될 수 있다. 상응하게, 이러한 폴리펩티드는 종 식별, 유형분석 및/또는 약제 내성의 검출에 사용될 수 있다는 것이 고려된다.
특정 예시적 구현예에서, 본 명세서에 개시된 시스템, 장치 및 방법은 샘플, 예컨대 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 모기-매개 기생충의 존재를 검출하는 것에 관한 것이다. 특정 예시적 구현예에서, 기생충은 종 플라스모듐 팔시파룸, 플라스모듐 비박스, 플라스모듐 오발, 플라스모듐 말라리아 또는 플라스모듐 크노우레시로부터 선택될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 방법은 기생충 종의 신속 식별, 기생충의 존재 및 기생충 형태 (예를 들어 다양한 단계의 감염 및 기생충 생활-주기, 예컨대 적혈구-외부 주기, 적혈구내 주기, 포자생식 주기에 상응; 기생충 형태는 메로조이트, 스포로조이트, 스키존트, 가메토사이트를 포함)의 모니터링; 특정 표현형 (예를 들어, 병원체 약제 내성)의 검출, 질환 진행 및/또는 대발생의 모니터링, 및 치료 (약제) 스크리닝을 필요로 하는 다른 방법과 함께 다른 방법에서 (또는 조합으로) 사용을 위해 적합화될 수 있다. 또한, 말라리아의 경우, 감염성 물림 이후에 장시간이 지나갈 수 있는데, 즉 환자가 증상을 보이지 않는 긴 인큐베이션 기간이 지날 수 있다. 유사하게, 예방적 치료는 증상의 출현을 지연시킬 수 있고, 장기간의 무증상 기간이 또한 재발 전에 관찰될 수 있다. 이러한 지연은 오진단 또는 지연 진단을 쉽게 초래할 수 있고, 따라서 치료의 유효성을 손상시킬 수 있다.
본 명세서에 개시된 구현예의 신속하고 민감한 진단 능력, 단일 뉴클레오티드 편차에 이르는, 기생충 유형의 검출, 및 POC 장치로서 배치되는 능력으로 인해, 본 명세서에 개시된 구현예는 치료 계획, 예컨대 적절한 치료 과정의 선택을 가이드하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예는 또한 기생충의 존재 및 유형분석을 위해 환경 샘플 (모기 개체군 등)을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 구현예는 또한 모기-매개 기생충 및 다른 모기-매개 병원체를 동시에 검출하도록 변형시킬 수 있다. 일부 예에서, 말라리아 및 다른 모기-매개 병원체는 초기에 유사한 증상으로 존재할 수 있다. 따라서, 신속하게 감염 유형을 구별하는 능력은 중요한 치료 결정을 가이드할 수 있다. 말라리아와 함께 검출될 수 있는 다른 모기-매개 병원체는 뎅기, 웨스트나일 바이러스, 치쿤구니아, 황열, 필라리아증, 일본 뇌염, 세인트 루이스 뇌염, 서부 말 뇌염, 동부 말 뇌염, 베네수엘라 말 뇌염, 라크로스 뇌염, 및 지카를 포함한다.
특정 예시적 구현예에서, 본 명세서에 개시된 장치, 시스템 및 방법은 샘플 중의 다수의 모기-매개 기생충 종을 구별하는데 사용될 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, 식별은 18S, 16S, 23S, 및 5S 서브유닛을 포함하는, 리보솜 RNA 서열을 기반으로 할 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, 식별은 게놈에 다수 카피로 존재하는 유전자, 예컨대 CYTB 와 같은 미토콘트리아 유전자의 서열을 기반으로 할 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, 식별은 고도로 발현되고/되거나 고도로 보존된 유전자 예컨대 GAPDH, 히스톤 H2B, 에놀라아제, 또는 LDH 의 서열을 기반으로 할 수 있다. 관련 rRNA 서열을 식별하기 위한 방법은 미국 공개 특허 출원 번호 2017/0029872 에 개시되어 있다. 특정 예시적 구현예에서, 가이드 RNA의 세트는 각각의 종 또는 균주에 고유한 가변 영역에 의해 각각의 종을 구별하도록 디자인될 수 있다. 가이드 RNA는 또한 속, 과, 목, 강, 문, 계 수준, 또는 이의 조합으로 미생물을 구별하는 RNA 유전자를 표적화하도록 디자인될 수 있다. 증폭이 사용되는 특정 예시적 구현예에서, 증폭 프라이머의 세트는 리보솜 RNA 서열의 측접하는 불변 영역에 대해 디자인될 수 있고 가이드 RNA는 가변 내부 영역에 의해 각각의 종을 구별하도록 디자인될 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, 프라이머 및 가이드 RNA는 각각 16S 서브유닛 내 보존 및 가변 영역에 대해 디자인될 수 있다. 종 또는 종의 서브세트에 걸쳐 고유하게 가변적인 다른 유전자 또는 게놈 영역 예컨대 RecA 유전자 패밀리, RNA 중합효소 β 서브유닛이 또한 사용될 수 있다. 다른 적합한 계통 마커, 및 이를 식별하기 위한 방법은 예를 들어, [Wu et al. arXiv:1307.8690 [q-bio.GN]] 에서 토의된다.
특정 예시적 구현예에서, 종 식별은 게놈에 다수 카피로 존재하는 유전자, 예컨대 CYTB 와 같은 미토콘드리아 유전자를 기반으로 수행될 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, 종 식별은 고도로 발현되고/되거나 고도로 보존된 유전자 예컨대 GAPDH, 히스톤 H2B, 에놀라아제, 또는 LDH 를 기반으로 수행될 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, 방법 또는 진단은 다수의 계통발생 및/또는 표현형 수준에 걸쳐서 동시에 모기-매개 기생충을 스크리닝하도록 디자인된다. 예를 들어, 방법 또는 진단은 상이한 가이드 RNA와 다수의 CRISPR 시스템의 사용을 포함할 수 있다. 가이드 RNA의 제1 세트는 예를 들어 플라스모듐 팔시파룸 또는 플라스모듐 비박스를 구별할 수 있다. 이들 일반 부류는 더욱 세분화될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 일반적으로 또는 특별한 약제 또는 약제의 조합에 대해서, 약제-내성 균주를 구별하는 방법 또는 진단으로 디자인되어 사용될 수 있다. 가이드 RNA의 제2 세트는 종 수준에서 미생물을 구별하도록 디자인될 수 있다. 따라서, 매트릭스는 약제 내성에 따라서 더욱 분류되는, 모든 모기-매개 기생충 종 또는 아종을 식별하도록 생성될 수 있다. 전술한 내용은 단지 예시의 목적이다. 모기-매개 기생충의 다른 유형을 분류하기 위한 다른 수단이 또한 고려되며, 상기 기재된 일반 구조를 따를 수 있다.
특정 예시적 구현예에서, 본 명세서에 개시된 장치, 시스템 및 방법은 관심 모기-매개 기생충 유전자, 예를 들어 약제 내성 유전자에 대해서 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 가이드 RNA는 기지의 관심 유전자들을 구별하도록 디자인될 수 있다. 임상 샘플을 포함하는, 샘플들은 이후에 하나 이상의 이러한 유전자의 검출을 위해 본 명세서에 개시된 구현예를 사용하여 스크리닝될 수 있다. POC에서 약제 내성에 대해 스크리닝하는 능력은 적절한 치료 계획을 선택하는데 있어 대단한 이득을 가지게 된다. 일정한 예의 구현예에서, 약제 내성 유전자는 단백질 예컨대 수송체 단백질, 예컨대 약제/대사산물 수송체 패밀리 유래 단백질, 기질 전좌에 관여하는 ATP-결합 카세트 (ABC) 단백질, 예컨대 ABC 수송체 C 서브패밀리 또는 Na+/H+ 교환체; 폴레이트 경로에 관여하는 단백질, 예컨대 디히드롭테로에이트 신타제, 디히드로폴레이트 리덕타제 활성 또는 디히드로폴레이트 리덕타제-티미딜레이트 신타제; 및 내부 미토콘트리아 막에 걸쳐 양자의 유전자좌에 관여하는 단백질, 특히 시토크롬 b 복합체를 코딩하는 유전자이다. 추가의 표적은 또한 헴 중합효소를 코딩하는 유전자(들)를 포함할 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, 약제 내성 유전자는 피. 팔시파룸 클로로퀸 내성 수송체 유전자 (pfcrt), 피. 팔시파룸 다제 내성 수송체 1 (pfmdr1), 피. 팔시파룸 다제 내성-연관된 단백질 유전자 (Pfmrp), 피. 팔시파룸 Na+/H+ 교환체 유전자 (pfnhe), 피. 팔시파룸 Ca2+ 수송 ATPase 6 (pfatp6), 피. 팔시파룸 디히드로프테로에이트 신타아제 (pfdhps), 디히드로폴레이트 리덕타아제 활성 (pfdhpr) 및 디히드로폴레이트 리덕타아제-티미딜레이트 신타아제 (pfdhfr) 유전자, 시토크롬 b 유전자, GTP 시클로히드롤라아제 및 Kelch13 (K13) 유전자를 비롯하여 다른 플라스모듐 종의 그들의 기능적 이종성 유전자로부터 선택된다. 다른 식별된 약제-내성 마커는 예를 들어, 그 내용이 본원에 참조로 포함되는, ["Susceptibility of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs (1996- 2004)"; WHO; Artemisinin and artemisinin-based combination therapy resistance (April 2016 WHO/HTM/GMP/2016.5); "Drug-resistant malaria: molecular mechanisms and implications for public health" FEBS Lett. 2011 Jun 6;585(11):1551- 62. doi:10.1016/j.febslet.2011.04.042. Epub 2011 Apr 23. Review. PubMed PMID: 21530510] 에 기재된 바와 같이 당분야에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CRISPR 시스템, 검출 시스템 또는 이의 사용 방법은 모기-매개 기생충 대발생의 진화를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 방법은 하나 이상의 대상체 유래의 다수 개 샘플로부터 하나 이상의 표적 서열을 검출하는 단계로서, 표적 서열은 모기-매개 기생충 확산 또는 대발생으로부터의 서열인 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 모기-매개 기생충 전파의 패턴, 또는 모기-매개 기생충에 의해 야기된 질환 대발생에 관여하는 기전을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 샘플은 하나 이상의 인간으로부터 유래될 수 있고/있거나, 하나 이상의 모기로부터 유래될 수 있다.
병원체 전파의 패턴은 모기-매개 기생충의 천연 병원소로부터 계속되는 신
규 전파 또는 천연 병원소로부터 단일 전파 이후 다른 전파 (예를 들어, 모기에 교차로) 또는 이 둘의 혼합을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 표적 서열은 바람직하게는 모기-매개 기생충 게놈 내 서열 또는 이의 단편이다. 한 구현예에서, 모기-매개 기생충 전파의 패턴은 모기-매개 기생충 전파의 초기 패턴, 즉 모기-매개 기생충 대발생의 시작시의 것이다. 대발생의 시작시에 모기-매개 기생충 전파의 패턴 결정은 가능한 가장 빠른 시간에 대발생을 중단시킬 가능성을 증가시키고 그리하여 지역 및 국가간 전파 확률을 감소시킨다.
모기-매개 기생충 전파의 패턴 결정은 본 명세서에 기술된 방법에 따라서 모기-매개 기생충 서열을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 병원체 전파의 패턴을 결정하는 단계는 대상체 내에서 모기-매개 기생충 서열의 공유된 숙주내 변이를 검출하는 단계 및 공유된 숙주내 변이가 시간적 패턴을 보이는지 여부를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 관찰된 숙주내 및 숙주간 변이의 패턴은 전파 및 역학에 관한 중요한 통찰을 제공한다 (Gire, et al., 2014).
본 명세서에 개시된 다른 샘플 유형에 추가로, 샘플은 하나 이상의 모기로부터 유래될 수 있고, 예를 들어 샘플은 모기 타액을 포함할 수 있다.
바이오마커 검출
일정한 예의 구현예에서, 본 명세서에 개시된 시스템, 장치 및 방법은 바이오마커 검출에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 시스템, 장치 및 방법은 SNP 검출 및/또는 유전자형 분석에 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 시스템, 장치 및 방법은 또한 이상 유전자 발현을 특징으로 하는 임의의 질환 상태 또는 장애의 검출에 사용될 수 있다. 이상 유전자 발현은 발현된 유전자, 발현의 위치 및 발현도에서의 이상성을 포함한다. 다른 질환 중에서도 심혈관, 면역 장애, 및 암과 관련된 다수의 전사물 또는 단백질 마커가 검출될 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 구현예는 용해를 포함하는 질환, 예컨대 간 섬유증 및 억제성/폐색성 폐 질환의 무세포 DNA 검출에 사용될 수 있다. 일정한 예의 구현예에서, 구현예는 무세포 DNA 의 태아기 검사를 위한 보다 빠르고 보다 휴대가능한 검출에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 구현예는 특히 심혈관 건강, 지질/대사성 서명, 인종성 식별, 친부 매칭, 인간 ID (예를 들어, SNP 서명의 범죄 데이터베이스에 용의자 대조)와 연관된 상이한 SNP 의 패널을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 구현예는 또한 암 종양과 관련되고 그로부터 방출되는 돌연변이의 무세포 DNA 검출에 사용될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 구현예는 또한 예를 들어, 소정 육류 제품에서 상이한 동물원의 신속한 검출을 제공하여, 육류 품질의 검출에도 사용될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 구현예는 DNA 와 관련된 유전자 편집 또는 GMO 의 검출을 위해 사용될 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 밀접하게 관련된 유전자형/대립 유전자 또는 바이오마커 (예를 들어, 소정 표적 서열에 오직 단일 뉴클레오티드 편차를 가짐)는 gRNA 에 합성 미스매치의 도입에 의해 구별될 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 샘플에서 표적 핵산을 검출하기 위한 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 하기 단계들을 포함한다:
a. 샘플 또는 샘플의 세트를 하나 이상의 개별 이산 부피에 분배하는 단계로서, 개별 이산 부피는 본 명세서에 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 CRISPR 시스템을 포함하는 것인 단계;
b. 샘플 또는 샘플의 세트를 하나 이상의 가이드 RNA 와 하나 이상의 표적 분자의 결합을 허용하기 위해 충분한 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계;
c. 하나 이상의 가이드 RNA 와 하나 이상의 표적 분자의 결합을 통해서 CRISPR 이펙터 단백질을 활성화시키는 단계로서, CRISPR 이펙터 단백질의 활성화는 그 결과로 RNA-기반 차폐성 구성체의 변형을 야기시켜 검출가능한 양성 신호가 발생되는 것인 단계; 및
d. 검출가능한 양성 신호를 검출하는 단계로서, 검출가능한 양성 신호의 검출은 샘플 중 하나 이상의 표적 분자의 존재를 의미하는 것인 단계.
바이오마커 샘플 유형
본 명세서에 기술된 어세이의 민감도는 표적 핵산이 희석되거나 샘플 재료가 제한적인 샘플을 포함하여, 광범위하게 다양한 생물학적 샘플 중 표적 핵산의 검출에 충분히 적합하다. 바이오마커 스크리닝은 제한없이, 타액, 소변, 혈액, 대변, 객담, 및 뇌척수 유체를 포함하는, 수많은 샘플 유형에 대해 수행될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 구현예는 또한 유전자의 상향조절 및/또는 하향조절을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 오직 과발현된 유전자만 어세이의 검출 한계값 이상으로 남도록 연속 희석될 수 있다.
일정 구현예에서, 본 발명은 생물학적 유체 (예를 들어, 소변, 혈액 혈청 또는 혈청, 객담, 뇌척수 유체)의 샘플을 수득하는 단계, 및 DNA를 추출하는 단계를 제공한다. 검출하려는 돌연변이체 뉴클레오티드 서열은 거대 분자의 분획일 수 있거나, 또는 초기에 별개 분자로서 존재할 수 있다.
일정 구현예에서, DNA는 암 환자의 혈장/혈청으로부터 단리된다. 비교를 위해서, DNA 샘플은 신생물 조직으로부터 단리되고 제2 샘플은 동일 환자 유래 비신생물성 조직 (대조군), 예를 들어 림프구로부터 단리될 수 있다. 비신생물성 조직은 상이한 장기 출처로부터 유래될 수 있거나 또는 신생물성 조직과 동일한 유형일 수 있다. 일정 구현예에서, 혈액 샘플을 채혈하고 혈장은 원심분리를 통해서 혈액 세포로부터 즉시 분리시킨다. 혈청은 여과될 수 있고 DNA 추출 전에 동결 저장될 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, 표적 핵산은 미가공 또는 미처리된 샘플, 예컨대 혈청, 혈청, 타액, 뇌척수액, 객담, 또는 소변으로부터 직접 검출된다. 일정한 예의 구현예에서, 표적 핵산은 세포-무함유 DNA이다.
순환성 종양 세포
일 구현예에서, 순환성 세포 (예를 들어, 순환성 종양 세포 (CTC))는 본 발명으로 어세이될 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의 방법에서 사용을 위한 순환성 종양 세포 (CTC)의 단리가 수행될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 순환 세포의 특이적이고 민감한 검출 및 포획을 달성하는 예시적인 기술은 기술되어 있다 (Mostert B, et al., Circulating tumor cells (CTCs): detection methods and their clinical relevance in breast cancer. Cancer Treat Rev. 2009;35:463-474; 및 Talasaz AH, et al., Isolating highly enriched populations of circulating epithelial cells and other rare cells from blood using a magnetic sweeper device. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009; 106:3970-3975). 105-106 말초 혈액 단핵 세포의 배경에서 하나 정도로 적은 CTC 가 존재할 수 있다 (Ross A A, et al., Detection and viability of tumor cells in peripheral blood stem cell collections from breast cancer patients using immunocytochemical and clonogenic assay techniques. Blood. 1993,82:2605- 2610). CellSearch® 플랫폼은 EPCAM-발현 상피 세포를 농축하기 위해 상피 세포 부착 분자 (EpCAM)에 대한 항체로 코팅된 면역자성 비드를 사용하고, 그 이후에 면역 염색하여 사이토케라틴 염색의 존재 및 백혈구 마커 CD45의 부재를 확인하여 포획 세포가 상피 종양 세포인 것을 확인한다 (Momburg F, et al., Immunohistochemical study of the expression of a Mr 34,000 human epithelium-specific surface glycoprotein in normal and malignant tissues. Cancer Res. 1987;47:2883- 2891; 및 Allard WJ, et al., Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin Cancer Res. 2004; 10:6897-6904). 포획된 세포의 개수는 진행된 질환을 갖는 유방, 직결장 및 전립선 암 환자에 대한 예후 유의성을 갖는다는 것이 유망하게 입증되었다 (Cohen SJ, et al., J Clin Oncol. 2008;26:3213-3221; Cristofanilli M, et al. N Engl J Med. 2004;351:781-791; Cristofanilli M, et al., J Clin Oncol. 2005;23: 1420-1430; and de Bono JS, et al. Clin Cancer Res. 2008; 14:6302-6309).
본 발명은 또한 CTC-칩 기술로 CTC 를 단리하기 위해 제공된다. CTC-칩은 CTC 가 결합하는 항-EpCAM 항체가 코팅된 수천개의 마이크로포스트를 함유하는 챔버를 통해서 혈액이 흐르는 미세유체 기반 CTC 포획 장치이다 (Nagrath S, et al. Isolation of rare circulating tumor cells in Cancer patients by microchip technology. Nature. 2007;450: 1235- 1239). CTC-칩은 CellSearch® 시스템과 비교하여 CTC 계수 및 순도의 유의한 증가를 제공하고 (Maheswaran S, et al. Detection of mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells, N Engl J Med. 2008;359:366-377), 양쪽 플랫폼은 후속 분자 분석에 사용될 수 있다.
무세포 염색질
일정 구현예에서, 무세포 크로마틴 단편을 본 발명에 따라서 단리하고 분석한다. 뉴클레오솜은 건강한 개체를 비롯하여 질환 상태에 의해 영향받은 개체의 혈청에서 검출될 수 있다 (Stroun et al., Annals of the New York Academy of Sciences 906: 161168 (2000)). 게다가, 뉴클레오솜의 혈청 농도는 양성 및 악성 질환, 예컨대 암 및 자가면역 질환을 앓는 환자에서 상당히 더 높다 (Holdenrieder et al (2001) Int J Cancer 95, 1 14120, Trejo-Becerril et al (2003) Int J Cancer 104, 663668; Kuroi et al 1999 Breast Cancer 6, 361364; Kuroi et al (2001) Int j Oncology 19, 143148; Amoura et al (1997) Arth Rheum 40, 22172225; Williams et al (2001) J Rheumatol 28, 8194). 이론에 국한하려는 것은 아니나, 종양 보유 환자에서 뉴클레오솜의 고농도는 증식하는 종양에서 자발적으로 발생되는, 아폽토시스로부터 유래된다. 혈액에서 순환하는 뉴클레오솜은 고유하게 변형된 히스톤을 함유한다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 번호 2005/0069931 (2005년 3월 31일) 은 질환의 진단 지시자로서 특이적 히스톤 N-말단 변형에 대해 유도된 항체의 사용에 관한 것으로서, 진단/스크리닝 목적을 위해 수반된 DNA 의 정제 및 분석을 촉진하기 위해 환자의 혈액 또는 혈청 샘플로부터 뉴클레오솜을 단리하기 위해 이러한 히스톤-특이적 항체를 적용한다. 따라서, 본 발명은 예를 들어, 종양 돌연변이를 검출하고 모니터링하기 위해서 염색질 결합된 DNA를 사용할 수 있다. 변형된 히스톤과 회합된 DNA 의 식별은 질환 및 선천적 결함의 진단 마커로서 제공될 수 있다.
따라서, 다른 구현예에서, 단리된 염색질 단편은 순환성 염색질, 바람직하게 순환성 모노 및 올리고뉴클레오솜으로부터 유래된다. 단리된 염색질 단편은 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있다. 생물학적 샘플은 이를 필요로 하는 대상체 또는 환자로부터 유래될 수 있다. 생물학적 샘플은 혈청, 혈장, 림프, 혈액, 혈액 분획, 소변, 활액, 척추액, 타액, 순환성 종양 세포 또는 점액일 수 있다.
무세포 DNA (cfDNA)
일정 구현예에서, 본 발명은 무세포 DNA (cfDNA)를 검출하는데 사용될 수 있다. 혈장 또는 혈청 중 무세포 DNA는 비침습성 진단 도구로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 무세포 태아 DNA를 연구했고 비호환성 RhD 인자의 검사, X-연결된 유전자 질병에 대한 성별 결정, 단일 유전자 질병에 대한 검사, 자간전증의 식별에 대해 최적화되었다. 예를 들어, 모계 혈장에서 cfDNA 의 태아 세포 분획의 시퀀싱은 태아 염색체 이수성과 연관된 카피수 변화를 검출하기 위한 신뢰할 만한 접근법이다. 다른 예의 경우, 암 환자로부터 단리된 cfDNA 는 치료 결정과 관련된 핵심 유전자에서 돌연변이를 검출하는데 사용되었다.
일정한 예의 구현예에서, 본 개시 내용은 환자 샘플로부터 직접적으로 cfDNA 를 검출하는 것을 제공한다. 일정한 다른 예의 구현예에서, 본 개시 내용은 표적 cfDNA 를 검출하기 전에 상기 개시된 농축 구현예를 사용하여 cfDNA 를 농축시키는 것을 제공한다.
엑소솜
일 구현예에서, 엑소솜은 본 발명에 의해 어세이될 수 있다. 엑소솜은 RNA를 함유하는 것으로 확인된 소형 세포외 소포체이다. 초원심분리, 여과, 화학적 침전, 크기 배제 크로마토그래피, 및 미세유체학에 의한 엑소솜의 단리는 당분야에 공지되어 있다. 일 구현예에서 엑소솜은 엑소솜 바이오마커를 사용해 정제된다. 생물학적 샘플로부터 엑소솜의 단리 및 정제는 임의의 공지 방법으로 수행될 수 있다 (예를 들어, WO2016172598A1 참조).
SNP 검출 및 유전자형 분석
일정 구현예에서, 본 발명은 생물학적 샘플 중에 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. SNP는 출산 검사 (예를 들어, 성별 결정, 태아 결함)에 관한 것일 수 있다. 그들은 범죄 수사에 관한 것일 수 있다. 일 구현예에서, 범죄 수사의 용의자는 본 발명에 의해 식별될 수 있다. 이론에 국한하려는 것은 아니나, 핵산 기반 법의학 증거는 검사되는 샘플이 제한적일 수 있으므로 용의자 또는 피해자의 유전 물질을 검출하는데 이용할 수 있는 가장 민감한 어세이를 요구할 수 있다.
다른 구현예에서, 질환과 연관된 SNP는 본 발명에 의해 포괄된다. 질환과 연관된 SNP는 당분야에서 충분히 공지되어 있고 당업자가 적합한 가이드 RNA를 설계하기 위해 본 발명의 방법을 적용할 수 있다 (예를 들어, www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar?term=human%5Borgn%5D 참조).
일 양상에서, 본 발명은 유전자형 분석, 예컨대 SNP 유전자형 분석을 위한 방법에 관한 것으로서, 이 방법은
a) 샘플 또는 샘플의 세트를 하나 이상의 개별 이산 부피에 분배하는 단계로서, 개별 이산 부피는 본 명세서에 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 CRISPR 시스템을 포함하는 것인 단계;
b) 샘플 또는 샘플의 세트를 하나 이상의 가이드 RNA 와 하나 이상의 표적 분자의 결합을 허용하기 위해 충분한 조건 하에서 인큐베이션시키는 단계;
c) 하나 이상의 가이드 RNA 와 하나 이상의 표적 분자의 결합을 통해서 CRISPR 이펙터 단백질을 활성화시키는 단계로서, CRISPR 이펙터 단백질의 활성화는 그 결과로 RNA-기반 차폐성 구성체의 변형을 야기시켜 검출가능한 양성 신호가 발생되는 것인 단계; 및
d) 검출가능한 양성 신호를 검출하는 단계로서, 검출가능한 양성 신호의 검출은 샘플 중에 특정한 유전자형을 특징으로 하는 하나 이상의 표적 분자의 존재를 의미하는 것인 단계를 포함한다.
일정 실시형태에서, 검출가능한 신호는 예컨대 예를 들면 도 60의 일례의 구현예에 예시된 바와 같은, 하나 이상의 표준 신호, 바람직하게 합성 표준 신호와 (예를 들어, 신호 강도의 비교에 의해) 비교된다. 일정 구현예에서, 표준은 특정한 유전자형이거나 또는 그에 상응한다. 일정 구현예에서, 표준은 특정한 SNP 또는 다른 (단일) 뉴클레오티드 변이를 포함한다. 일정 구현예에서, 표준은 (PCR-증폭된) 유전자형 표준이다. 일정 구현예에서, 표준은 DNA 이거나 또는 그를 포함한다. 일정 구현예에서, 표준은 RNA 이거나 또는 그를 포함한다. 일정 구현예에서, 표준은 DNA 로부터 전사된 RNA이거나 또는 그를 포함한다. 일정 구현예에서, 표준은 RNA 로부터 역전사된 DNA이거나 또는 그를 포함한다. 일정 구현예에서, 검출가능한 신호는 하나 이상의 표준과 비교되고, 그 각각은 기지의 유전자형, 예컨대 SNP 또는 다른 (단일) 뉴클레오티드 변이에 상응한다. 일정 구현예에서, 검출가능한 신호는 하나 이상의 표준 신호와 비교되고 비교는 통계 분석, 예컨대 모수 또는 비모수 통계 분석, 예컨대 일원 또는 이원 ANOVA 등을 포함한다. 일정 구현예에서, 검출가능한 신호는 하나 이상의 표준 신호와 비교되고 검출가능한 신호가 (통계적으로) 유의하게 표준을 벗어나지 않을 경우에, 유전자형은 상기 표준에 상응하는 유전자형으로 결정된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 응급 약물유전체학에 대한 신속한 유전자형 분석을 가능하게 한다. 일 구현예에서, 단일 의료 현장 (point-of-care) 어세이가 응급실로 옮겨온 환자를 유전자분석하는데 사용될 수 있다. 환자는 혈액 응고를 갖는 것으로 의심될 수 있고 응급의는 투여하기 위한 혈액 희석제의 용량을 결정하는 것이 필요하다. 예시적인 구현예에서, 본 발명은 마커 예컨대 VKORC1, CYP2C9, 및 CYP2C19 의 유전자분석을 기반으로 심근경색 또는 졸중 치료 동안 혈액 희석제의 투여를 위한 지침을 제공할 수 있다. 일 구현예에서, 혈액 희석제는 항응고제 와파린이다 (Holford, NH (December 1986). "Clinical Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Warfarin Understanding the Dose-Effect Relationship". Clinical Pharmacokinetics. Springer International Publishing. 11 (6): 483-504). 혈액 응고와 연관된 유전자는 당분야에 공지되어 있다 (US20060166239A1; Litin SC, Gastineau DA (1995) "Current concepts in anticoagulant therapy". Mayo Clin. Proc. 70 (3): 266-72; 및 Rusdiana et al., Responsiveness to low-dose warfarin associated with genetic variants of VKORC1, CYP2C9, CYP2C19, and CYP4F2 in an Indonesian population. Eur J Clin Pharmacol. 2013 Mar;69(3):395-405). 특히, VKORC1 1639 (또는 3673) 단일-뉴클레오티드 다형성에서, 공통 ("야생형") G 대립 유전자는 A 대립 유전자로 치환된다. A 대립 유전자 (또는 "A 일배체형")를 갖는 사람은 G 대립 유전자 (또는 "비-A 일배체형")를 갖는 사람보다 VKORC1 을 덜 생성시킨다. 이들 변이체의 출현율은 또한 인종에 따라 다양하며, 백인 중 37% 및 아프리카인의 14% 가 A 대립 유전자를 보유한다. 최종 결과는 응고 인자의 감소된 수이고, 그에 따라 응고 능력의 감소이다.
일정한 예의 구현예에서, 환자에서 SNP 를 검출하기 위한 유전 물질의 이용가능성은 DNA 또는 RNA 샘플의 증폭없이 SNP 를 검출하는 것을 가능하게 한다. 유전자형 분석의 경우에서, 시험되는 생물학적 샘플은 쉽게 수득된다. 일정한 예의 구현예에서, 본 발명의 인큐베이션 시간은 단축될 수 있다. 어세이는 효소 반응이 발생되는데 필요한 시간 기간에 수행될 수 있다. 당업자는 5분 동안 생물학적 반응 (예를 들어, 5분 결찰)을 수행할 수 있다. 본 발명은 혈액으로부터 DNA를 수득하기 위해서 자동화 DNA 추출 장치를 사용할 수 있다. 다음으로 DNA는 이펙터 단백질에 대한 표적 분자를 생성시키는 반응에 첨가될 수 있다. 표적 분자가 생성되면 즉시, 차폐제가 절단되어 신호가 검출될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 본 발명은 약제 (예를 들어, 혈액 희석제)를 투여하기 전에 유전자형을 결정하기 위해 PCR 신속 진단을 가능하게 한다. 증폭 단계가 사용되는 경우에서, 모든 반응은 한 단계 과정으로 동일 반응에서 일어난다. 바람직한 구현예에서, POC 어세이는 한 시간 미만, 바람직하게 10분, 20분, 30분, 40분, 또는 50분으로 수행될 수 있다.
일정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 시스템, 장치 및 방법은 장형 비코딩 RNA (lncRNA)의 존재 또는 발현도를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 일정한 lncRNA의 발현은 질환 상태 및/또는 약제 내성과 연관된다. 특히 일정한 lncRNA (예를 들어, TCONS_00011252, NR_034078, TCONS_00010506, TCONS_00026344, TCONS_00015940, TCONS_00028298, TCONS_00026380, TCONS_0009861, TCONS_00026521, TCONS_00016127, NR_125939, NR_033834, TCONS_00021026, TCONS_00006579, NR_109890, 및 NR_026873)는 암 치료에 대한 내성, 예컨대 흑색종 (예를 들어, 결절성 흑색종, 악성 흑색점, 악성 흑색점 흑색종, 말단 흑자 흑색종, 표재 확산 흑색종, 점막 흑색종, 용종양 흑색종, 섬유조직형성 흑색종, 무멜라닌성 흑색종, 및 연조직 흑색종)을 치료하기 위한 하나 이상의 BRAF 억제제 (예를 들어, 베무라페닙, 다브라페닙, 소라페닙, GDC-0879, PLX-4720, 및 LGX818)에 대한 내성과 연관된다. 본 명세서에 기술된 다양한 구현예를 사용하는 lncRNA의 검출은 질환 진단 및/또는 치료 옵션의 선택을 용이하게 할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 특히 요법의 신속한 투여가 치료 결과에 중요한 상황에서, 가이드 DNA- 또는 RNA-표적화 요법 (예를 들어, CRISPR, TALE, 징크 핑커 단백질, RNAi)을 가이드할 수 있다.
LOH 검출
암 세포는 정상 세포와 비교했을 때 유전 물질 (DNA)의 상실을 겪는다. 전부는 아니지만, 거의 전부의 암이 겪는 유전자 물질의 이러한 결실은 "이형접합성의 상실" (LOH) 이라고 한다. 이형접합성의 상실 (LOH) 은 전체 유전자 및 주변 염색체 영역의 상실을 일으키는 총 염색체 사건이다. 이형접합성의 상실은 암에서의 일반적인 발생이고, 이것은 상실된 영역의 기능적 종양 억제인자 유전자의 부재를 의미할 수 있다. 그러나, 상실은 여전히 염색체 쌍의 나머지 염색체 상에 남은 하나의 기능성 유전자가 존재하기 때문에 침묵될 수 있다. 종양 억제인자 유전자의 나머지 카피는 점 돌연변이에 의해 불활성화될 수 있어서, 종양 억제인자 유전자의 상실을 초래할 수 있다. 암 세포 유래 유전 물질의 상실은 그 결과로 염색체 상의 특정한 유전자좌에서 세포 생존능 또는 세포 성장에 필수적인 유전자의 둘 이상의 대립 유전자 중 하나의 선택적 상실을 야기시킬 수 있다.
"LOH 마커" 는 정상 세포와 비교했을 때, 암 또는 다른 질환과 연관된 결실, 변경, 또는 증폭의, 미세부수체 유전자좌로부터의 DNA 이다. LOH 마커는 종종 종양 억제인자 유전자 또는 다른, 일반적으로 종양 관련 유전자의 상실과 연관된다.
용어 "미세부수체" 는 인간 게놈에 광범위하게 분포된 DNA 의 짧은 반복 서열을 의미한다. 미세부수체는 2 내지 5개 뉴클레오티드 길이의 범위인 직렬로 반복되는 (즉, 인접한) DNA 모티프의 부분이고, 전형적으로 5-50회 반복된다. 예를 들어, 서열 TATATATATA (SEQ. I.D. No. 333)은 디뉴클레오티드 미세부수체이고, GTCGTCGTCGTCGTC (SEQ. I.D. No. 334)는 트리뉴클레오티드 미세부수체이다 (A는 아데닌, G는 구아닌, C는 시토신, T는 티민임). 이러한 미세부수체의 반복 길이에서 체세포 변경은 종양의 특징적인 특성을 대표하는 것으로 확인되었다. 가이드 RNA는 이러한 미세부수체를 검출하도록 설계될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명은 검출가능한 신호의 정량을 기반으로 증폭 및 결실뿐만 아니라, 반복 길이에서의 변경을 검출하는데 사용될 수 있다. 일정한 미세부수체는 유전자의 조절 측접 또는 인트론 영역에, 또는 직접적으로 유전자의 코돈에 위치된다. 이러한 경우에서 미세부수체 돌연변이는 표현형 변화 및 질환, 특히 트리플렛 확장 질환, 예컨대 취약 X 증후군 및 헌팅톤 질환을 초래할 수 있다.
특별한 염색체 영역 상의 빈번한 이형접합성의 상실 (LOH)은 많은 종류의 악성종에서 보고되었다. 특별한 염색체 영역 상의 대립 유전자 상실은 다양한 악성종에서 관찰되는 가장 일반적인 유전자 변형이며, 따라서 미세부수체 분석은 체액 유래 시료, 예컨대 폐암의 경우 객담 및 방광암의 경우 소변에서 암 세포의 DNA를 검출하기 위해 적용되었다 (Rouleau, et al. Nature 363, 515- 521 (1993); 및 Latif, et al. Science 260, 1317- 1320 (1993)). 더욱이, 가용성 DNA 의 두드러지게 증가된 농도가 암 및 일부 다른 질환을 갖는 개체의 혈장에 존재하고, 이것은 무세포 혈청 또는 혈장이 미세부수체 비정상성을 갖는 암 DNA를 검출하는데 사용될 수 있다는 것이 확고해졌다 (Kamp, et al. Science 264, 436-440 (1994); 및 Steck, et al. Nat Genet. 15(4), 356- 362 (1997)). 2개 그룹이 소세포 폐암 또는 두경부암을 갖는 제한된 수의 환자의 혈장 또는 혈청에서 미세부수체 변형을 보고하였다 (Hahn, et al. Science 271, 350-353 (1996); 및 Miozzo, et al. Cancer Res. 56, 2285-2288 (1996)). 흑색종 환자의 혈청 및 종양에서 이형접합성의 상실의 검출이 또한 이전에 확인되었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 US6465177B1 참조).
따라서, 암을 앓고 있거나 또는 암의 위험성이 있는 대상체에서 LOH 마커를 검출하는 것이 유리하다. 본 발명은 종양 세포에서 LOH 를 검출하는데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 순환성 종양 세포는 생물학적 샘플로서 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 혈청 또는 혈장으로부터 수득된 무세포 DNA는 LOH 를 비침습적으로 검출 및/또는 모니터링하는데 사용된다. 다른 구현예에서, 생물학적 샘플은 본 명세서에 기술된 임의 샘플 (예를 들어, 방광암에 대한 소변 샘플) 일 수 있다. 이론에 국한하려는 것은 아니나, 본 발명은 임의의 종래 방법과 비교하여 개선된 민감도로 LOH 마커를 검출하는데 사용될 수 있고, 따라서, 돌연변이 사건의 조기 검출을 제공한다. 일 구현예에서, LOH 는 생물학적 유체에서 검출되는 반면, LOH 의 존재는 암의 발생과 연관된다. 본 명세서에 기술된 방법 및 시스템은 암과 연관된 특별한 대립 유전자의 LOH 를 검출하기 위한 비침습성의 신속하고 정확한 방법을 제공함으로써, 종래 기술, 예컨대 PCR 또는 조직 생검에 비해 상당한 진보를 나타낸다. 따라서, 본 발명은 화학예방, 화학요법, 면역요법 또는 다른 치료를 겪은 고위험 환자를 모니터링하고 고위험 집단을 스크리닝하기 위해 사용할 수 있는 방법 및 시스템을 제공한다.
본 발명의 방법은 오직 체액 예컨대 혈액으로부터의 DNA 추출만을 필요로 하기 때문에, 임의 시점에 반복적으로 한 환자에 대해 수행될 수 있다. 혈액은 수술 이전 또는 이후; 치료, 예컨대 화학요법, 방사선 요법, 유전자 요법 또는 면역요법 이전, 그 동안, 및 이후; 또는 질환 진행, 안정, 또는 재발에 대한 치료 후 추적 조사 동안 채혈되어 LOH 에 대해 모니터링된다. 이론에 국한하려는 것은 아니지만, 본 발명의 방법은 또한 LOH 마커가 개별 환자의 종양에 특이적이므로 그 환자에게 특이적인 LOH 마커에 의해 준임상 질환 존재 또는 재발을 검출하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 다수 전이가 존재한다면 종양 특이적 LOH 마커를 사용해 검출될 수 있다.
후성적 변형의 검출
암 또는 암 진행을 의미하는 히스톤 변이, DNA 변형, 및 히스톤 변형이 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 20140206014는 암 샘플이 건강한 대상체와 비교하여 상승된 뉴클레오솜 H2AZ, 마크로H2A1.1, 5-메틸시토신, P-H2AX(Ser139) 수준을 갖는다고 기술하고 있다. 개체에 암 세포의 존재는 암 세포의 증가된 아폽토시스의 결과로서 혈중 무세포 뉴클레오솜의 더 높은 수준을 생성시킬 수 있다. 일 구현예에서, 아폽토시스와 연관된 마커에 대해 유도된 항체, 예컨대 H2B Ser 14(P)가 아폽토시스된 신생물 세포로부터 방출된 단일 뉴클레오솜을 확인하는데 사용될 수 있다. 따라서, 종양 세포로부터 발생된 DNA는 높은 감도 및 정확도로 본 발명에 따라 유리하게 분석될 수 있다.
태아기 스크리닝
일정 구현예에서, 본 발명의 방법 및 시스템은 태아기 스크리닝에서 사용될 수 있다. 일정 구현예에서, 무세포 DNA는 태아기 스크리닝의 방법에서 사용된다. 일정 구현예에서, 단일 뉴클레오솜 또는 올리고뉴클레오솜과 연관된 DNA는 본 발명으로 검출될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 단일 뉴클레오솜 또는 올리고뉴클레오솜과 연관된 DNA 의 검출은 태아기 스크리닝을 위해 사용된다. 일정 구현예에서, 무세포 염색질 단편은 태아기 스크리닝의 방법에서 사용된다.
태아기 진단 또는 태아기 스크리닝은 태어나기 전 태아 또는 배아에서 질환 또는 병태의 검사를 의미한다. 목적은 선천성 결손증 예컨대 신경관 결손, 다운 증후군, 염색체 이상, 유전적 장애 및 다른 병태, 예컨대 이분 척추, 구개열, 테이 삭스 병, 겸상 적혈구 빈혈증, 탈라세미아, 낭포성 섬유증, 근이영양증, 및 취약 X 증후군을 검출하는 것이다. 스크리닝은 또한 태아 성별 판별에 사용될 수도 있다. 공통 검사 절차는 양수천자, 목덜미 투명대 초음파를 포함한 초음파검사, 혈청 마커 검사, 또는 유전자 스크리닝을 포함한다. 일부 경우에서, 검사는 태아가 유산될 것인지 여부를 결정하도록 투여되지만, 의사 및 환자는 이것이 또한 고위험 임신을 조기에 진단하는데 유용하다는 것을 확인하여 신생아가 적절한 관리를 받을 수 있는 3차 요양 병원에서 출산 일정을 잡을 수 있다.
산모의 혈액에 존재하는 태아 세포가 있고, 이들 세포는 태아 DNA-기반 진단을 위한 태아 염색체의 잠재적인 공급원이 존재한다는 것은 알려져 있었다. 추가적으로, 태아 DNA는 산모 혈액 중 총 DNA 의 약 2 내지 10% 범위이다. 현재 이용가능한 태아 유전자 검사는 일반적으로 침습성 시술이 관여된다. 예를 들어, 임신 대략 10 내지 12주인 임산부에게 수행된 융모막 채취법 (CVS) 및 대략 14-16주에 수행된 양수천자는 모두 태아에서 염색체 이상성을 검사하기 위한 샘플을 수득하기 위해 침습성 시술을 포함한다. 이들 채취 시술을 통해 수득된 태아 세포는 일반적으로 세포유전 또는 형광성 제자리 하이브리드화 (FISH) 분석을 사용해 염색체 이상성에 대해 검사된다. 무세포 태아 DNA는 임신 6주 정도로 조기에 임산부의 혈장 및 혈청에 존재하는 것으로 확인되었고, 농도는 임신 동안 상승하여 출산전에 최고이다. 이들 세포는 임신 초기에 나타나므로, 그들은 정확하고, 비침습적인, 제1 삼분기 검사의 기초를 형성할 수 있다. 이론에 국한하려는 것은 아니나, 본 발명은 소량의 태아 DNA를 검출하는데 전례없는 민감도를 제공한다. 이록에 국한하려는 것은 아니나, 풍부한 양의 산모 DNA가 일반적으로 관심 태아 DNA와 함께 부차적으로 회수되므로, 태아 DNA 정량 및 돌연변이 검출에서 민감도가 감소된다. 본 발명은 예상치않게 높은 민감도의 어세이를 통해서 이러한 문제를 극복한다.
히스톤의 H3 부류는 4종의 상이한 단백질 유형으로 이루어진다: 주요 유형, H3.1 및 H3.2; 대체 유형, H3.3; 및 고환 특이적 변이, H3t. H3.1 및 H3.2 은 밀접하게 관련되지만, 오직 Ser96 에서만 상이하고, H3.1 은 적어도 5개 아미노산 위치에서 H3.3 과 상이하다. 또한, H3.1 은 간, 신장 및 심장을 포함한 성인 조직에서 이의 존재와 비교하여, 태아 간에 고도로 농축되어 있다. 성인 인간 조직에서, H3.3 변이체는 H3.1 변이체보다 더 풍부한데 반해, 태아 간의 경우 그 반대가 사실이다. 본 발명은 태아 및 산모 세포 및/또는 태아 핵산을 모두 포함하는 산모의 생물학적 샘플에서 태아 뉴클레오솜 및 태아 핵산을 검출하기 위해 이들 차이를 이용할 수 있다.
일 구현예에서, 태아 뉴클레오솜은 혈액으로부터 수득될 수 있다. 다른 구현예에서, 태아 뉴클레오솜은 자궁경관 점액성 샘플로부터 수득된다. 일정 구현예에서, 자궁경관 점액성 샘플은 임신의 제2 삼분기의 초기 또는 임신의 제1 삼분기의 후기에 임산부로부터의 세척액 또는 면봉으로 닦아서 수득된다. 샘플은 점액에 포획된 DNA를 방출시키기 위해 인큐베이터에 놓여질 수 있다. 인큐베이터는 37℃로 설정될 수 있다. 샘플은 대략 15분 내지 30분 동안 교반될 수 있다. 점액은 DNA를 방출시키는 목적을 위해 뮤시나제로 더 용해될 수 있다. 샘플은 또한 태아 뉴클레오솜을 방출시키도록 아폽토시스를 유도하기 위해서, 당분야에 충분히 공지된 바와 같이, 화학적 처리와 같은 조건이 가해질 수 있다. 따라서, 자궁경관 점액성 샘플은 아폽토시스를 유도하는 작용제로 처리될 수 있고, 그리하여 태아 뉴클레오솜이 방출된다. 순환성 태아 DNA 의 농축과 관련하여, 미국 공개 특허 출원 번호 20070243549 및 20100240054 를 참조한다. 본 발명은 오직 소량의 뉴클레오솜 또는 DNA가 태아로부터 기원할 수 있는 경우에 태아기 스크리닝에 방법 및 시스템을 적용할 때 특히 유리하다.
본 발명에 따른 태아기 스크리닝은 제한없이, 세염색체증 13, 세염색체증 16, 세염색체증 18, 클라인펠터 증후군 (47, XXY), (47, XYY) 및 (47, XXX), 터너 증후군, 다운 증후군 (세염색체증 21), 낭포성 섬유증, 헌팅톤 질환, 베타 탈라세미아, 근긴장성 이영양증, 겸상 적혈구 빈혈증, 포르피린증, 취약-X 염색체-증후군, 로버트슨 전좌증, 안젤만 증후군, 디조지 증후군 및 울프-허쉬호른 증후군을 포함하는 질환을 위한 것일 수 있다.
본 발명의 몇몇 추가 양상은 미국 국립 보건원의 웹사이트 상에 주제 세부 항목 유전적 장애 (health.nih.gov/topic/Genetic Disorders 의 웹사이트)에 기술된 광범위한 유전 질환과 연관된 결손을 진단, 예후 및/또는 치료하는 것에 관한 것이다.
암 및 암 약제 내성 검출
일정 구현예에서, 본 발명은 암과 연관된 유전자 및 돌연변이를 검출하는데 사용될 수 있다. 일정 구현예에서, 내성과 연관된 돌연변이가 검출된다. 종양 세포의 클론 개체군에서 내성 종양 세포의 증폭 또는 내성 돌연변이의 출현이 치료 동안 발생될 수 있다 (Burger JA, et al., Clonal evolution in patients with chronic lymphocytic leukaemia developing resistance to BTK inhibition. Nat Commun. 2016 May 20;7:11589; Landau DA, et al., Mutations driving CLL and their evolution in progression and relapse. Nature. 2015 Oct 22;526(7574):525-30; Landau DA, et al., Clonal evolution in hematological malignancies and therapeutic implications. Leukemia. 2014 Jan;28(1):34-43; 및 Landau DA, et al., Evolution and impact of subclonal mutations in chronic lymphocytic leukemia. Cell. 2013 Feb 14;152(4):714-26). 따라서, 이러한 돌연변이의 검출은 고도로 민감한 어세이를 요구하고 모니터링은 반복적인 생검을 필요로 한다. 반복적인 생검은 불편하고, 침습적이며 값비싸다. 내성 돌연변이는 당분야에 공지된 종래 방법을 사용하여 혈액 샘플 또는 다른 비침습적으로 채취된 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액, 타액, 소변)에서 검출하는 것이 어려울 수 있다. 내성 돌연변이는 화학요법, 표적화 요법, 또는 면역요법에 대한 내성과 연관된 돌연변이를 의미할 수 있다.
일정 구현예에서, 돌연변이는 암 진행을 검출하는데 사용될 수 있는 개별 암에서 발생된다. 일 실시형태에서, 종양에 대항하는 T-세포 세포용해성 활성과 관련된 돌연변이가 특성분석되었고 본 발명에 의해 검출될 수 있다 (예를 들어, Rooney et al., Molecular and genetic properties of tumors associated with local immune cytolytic activity, Cell. 2015 January 15; 160(1- 2): 48-61 참조). 개별 맞춤 요법이 이들 돌연변이의 검출을 기반으로 환자를 위해 개발될 수 있다 (예를 들어, WO2016100975A1 참조). 일정 구현예에서, 세포용해성 활성과 연관된 암 특이적 돌연변이는 CASP8, B2M, PIK3CA, SMC1A, ARID5B, TET2, ALPK2, COL5A1, TP53, DNER, NCOR1, MORC4, CIC, IRF6, MYOCD, ANKLE1, CNKSR1, NF1, SOS1, ARID2, CUL4B, DDX3X, FUBP1, TCP11L2, HLA-A, B 또는 C, CSNK2A1, MET, ASXL1, PD-L1, PD-L2, IDO1, IDO2, ALOX12B 및 ALOX15B로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 내 돌연변이, 또는 카피수 획득일 수 있고, 임의의 하기 염색체 밴드에 영향을 미치는 전체-염색체 사건은 배제시킨다: 6q16.1q21, 6q22.31q24.1, 6q25.1q26, 7p11.2q11.1, 8p23.1, 8p11.23p11.21 (IDO1, IDO2 함유), 9p24.2p23 (PDL1, PDL2 함유), 10p15.3, 10p15.1p13, 11p14.1, 12p13.32p13.2, 17p13.1 (ALOX12B, ALOX15B 함유), 및 22q11.1q11.21.
일정 구현예에서, 본 발명은 치료 과정 동안 및 치료가 완료된 후 암 돌연변이 (예를 들어, 내성 돌연변이)를 검출하기 위해 사용된다. 본 발명의 민감도는 치료 동안 발생된 클론 돌연변이의 비침습성 검출을 가능하게 할 수 있고 질환의 재발을 검출하는데 사용될 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, 마이크로RNA (miRNA) 및/또는 차등적으로 발현된 miRNA의 miRNA 서명의 검출은 암의 진행을 검출하거나 또는 모니터링하고/하거나 암 요법에 대한 약제 내성을 검출하는데 사용될 수 있다. 예로서, Nadal 등 (Nature Scientific Reports, (2015) doi:10.1038/srep12464)은 비소세포 폐암 (NSCLC)을 검출하는데 사용할 수 있는 mRNA 서명을 기술하고 있다.
일정한 예의 구현예에서, 세포의 클론 하위개체군 내 내성 돌연변이의 존재는 치료 계획을 결정하는데 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 환자를 치료하기 위한 개별 맞춤 요법은 공통 종양 돌연변이를 기반으로 투여될 수 있다. 일정 구현예에서, 공통 돌연변이는 치료에 대응하여 발생되고 약제 내성을 초래한다. 일정 구현예에서, 본 발명은 돌연변이를 획득한 세포 또는 이러한 약제 내성 돌연변이를 보유하는 세포의 증폭에 대해 환자를 모니터링하는데 사용될 수 있다.
다양한 화학요법제, 특히 표적화 요법 예컨대 티로신 키나제 억제제에 의한 치료는 빈번하게 치료제의 활성에 저항하는 표적 분자 내 신규 돌연변이를 초래한다. 이러한 내성을 극복하기 위한 다중 전략은 이들 돌연변이에 의해 영향받지 않는 2세대 요법의 개발 및 내성 돌연변이의 하류에서 작용하는 것들을 포함하는 다중 작용제에 의한 치료를 포함하는 것들이 평가 중에 있다. 일례의 구현예에서, 브루톤 티로신 키나제 (BTK)를 표적화하고 CLL 및 특정 림프종에 사용되는 분자인, 이브루티닙에 대한 공통 돌연변이는 위치 481 (BTK/C481S)에서 시스테인의 세린으로의 변화이다. 상피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 티로신 키나제 도메인을 표적으로 하는 엘로티닙은 폐암의 치료에서 일반적으로 사용되며, 내성 종양이 요법 이후에 변함없이 발생된다. 내성 클론에서 발견되는 공통 돌연변이는 위치 790 에서 트레오닌의 메티오닌으로의 돌연변이이다.
본 발명으로 검출될 수 있는 공통 내성 돌연변이 및 암 환자의 개체군 간에 공유되는 비침묵 돌연변이는 당분야에 공지되어 있다 (예를 들어, WO/2016/187508 참조). 일정 구현예에서, 약제 내성 돌연변이는 이브루티닙, 엘로티닙, 이마티닙, 제피티닙, 크리조티닙, 트라스투주맙, 베무라페닙, RAF/MEK, 체크 포인트 차단 요법, 또는 항에스트로겐 요법을 사용한 치료에 의해 유도될 수 있다. 일정 구현예에서, 암 특이적 돌연변이는 프로그램된 사멸-리간드 1 (PD-L1), 안드로겐 수용체 (AR), 브루톤 티로신 키나제 (BTK), 상피 성장 인자 수용체 (EGFR), BCR-Abl, c-kit, PIK3CA, HER2, EML4-ALK, KRAS, ALK, ROS1, AKT1, BRAF, MEK1, MEK2, NRAS, RAC1, 및 ESR1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자에 존재한다.
면역 체크포인트는 면역 반응을 둔화시키거나 또는 중지시키고 면역 세포의 비제어 활성에 의한 과도한 조직 손상을 방지하는 억제성 경로이다. 일정 구현예에서, 표적화된 면역 체크포인트는 프로그램된 사멸-1 (PD-1 또는 CD279) 유전자 (PDCD1)이다. 다른 구현예에서, 표적화된 면역 체크포인트는 세포독성 T-림프구-연관 항원 (CTLA-4)이다.. 추가의 구현예에서, 표적화된 면역 체크포인트는 CD28 및 CTLA4 Ig 수퍼패밀리의 다른 구성원 예컨대 BTLA, LAG3, ICOS, PDL1 또는 KIR 이다. 더욱 추가의 구현예에서, 표적화된 면역 체크포인트는 TNFR 수퍼패밀리의 구성원 예컨대 CD40, OX40, CD137, GITR, CD27 또는 TIM-3 이다.
최근에, 종양 및 그들 미세환경에서 유전자 발현이 단일 세포 수준에서 특징규명되었다 (Tirosh, et al. Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single cell RNA-seq. Science 352, 189-196, doi:10.1126/science.aad0501 (2016)); Tirosh et al., Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 2016 Nov 10;539(7628):309-313. doi: 10.1038/nature20123. Epub 2016 Nov 2; 및 국제 공개 특허 출원 번호 WO 2017004153 A1 참조). 일정 구현예에서, 유전자 서명은 본 발명을 사용해 검출될 수 있다. 일 구현예에서, 보체 유전자가 종양 미세환경에서 모니터링되거나 또는 검출된다. 일 구현예에서 MITF 및 AXL 프로그램이 모니터링되거나 또는 검출된다. 일 구현예에서, 종양 특이적 줄기 세포 또는 전구체 세포 서명이 검출된다. 이러한 서명은 면역 반응의 상태 및 종양의 상태를 의미한다. 일정 구현예에서, 증식, 치료에 대한 내성 및 면역 세포의 존재비 관점에서 종양의 상태를 검출할 수 있다.
따라서, 일정 구현예에서, 본 발명은 특히 질환 재발 또는 공통 내성 돌 연변이의 발생을 모니터링하기 위해, 순환성 DNA, 예컨대 종양 DNA 에 대한 저비용의 신속한, 복합 암 검출 패널을 제공한다.
면역요법 적용분야
본 명세서에서 개시된 구현예는 또한 추가 면역요법 상황에서 유용할 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 대상체에서 면역 반응을 진단, 예후화 및/또는 병기구분하는 방법은 하나 이상의 바이오마커의 발현, 활성 및/또는 기능의 제1 수준을 검출하는 단계 및 검출된 수준을 대조군 수준과 비교하는 단계를 포함하고 여기서 검출된 수준과 대조군 수준의 차이는 대상체에서 면역 반응의 존재를 의미한다.
일정 구현예에서, 본 발명은 종양 침윤성 림프구 (TIL)의 기능이상 또는 활성화를 결정하는데 사용될 수 있다. TIL 은 기지 방법을 사용하여 종양으로부터 단리될 수 있다. TIL 은 양자 세포 전달 요법에서 그들을 사용할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 분석될 수 있다. 추가적으로, 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR T 세포)는 그들을 대상체에게 투여하기 전에 기능이상 또는 활성화의 서명에 대해 분석될 수 있다. 기능이상 및 활성화된 T 세포에 대한 예시적인 서명은 기술되어 있다 (예를 들어, Singer M, et al., A Distinct Gene Module for Dysfunction Uncoupled from Activation in Tumor-Infiltrating T Cells. Cell. 2016 Sep 8;166(6):1500- 1511.e9. doi: 10.1016/j.cell.2016.08.052 참조).
일부 구현예에서, C2c2는 면역 세포, 예컨대 T 세포 (예를 들어, CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포)의 상태를 평가하는데 사용된다. 특히, T 세포 활성화 및/또는 기능이상은 예를 들어 T 세포 상태 중 하나 이상과 연관된 유전자 또는 유전자 서명을 기반으로 결정될 수 있다. 이러한 방식으로, c2c2 는 T 세포의 하나 이상의 하위개체군의 존재를 결정하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, C2c2 는 진단 어세이에서 사용될 수 있거나 또는 환자가 면역요법 또는 다른 유형의 요법을 투여하기에 적합한지 여부를 결정하는 방법으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자 또는 바이오마커 서명의 검출은 환자가 소정 치료에 반응하는지 여부, 또는 환자가 반응하지 않으면, 이것이 T 세포 기능이상에 기인하는 것인지 여부를 결정하기 위해 c2c2 를 통해서 수행할 수 있다. 이러한 검출은 환자가 수용하기에 최고로 적합한 유형의 요법에 관해 유용한 정보를 준다. 예를 들어, 환자가 면역요법을 수용하는지 여부.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 시스템 및 어세이는 임상의가 요법 (예를 들어, 양자 세포 전달 (ACT) 요법)에 대한 환자의 반응이 세포 기능이상에 기인하는지 여부, 및 그렇다면 바이오마커 서명에 걸친 상향조절 및 하향조절의 수준이 문제를 해결할 수 있게 할 것인지 여부를 확인할 수 있게 한다. 예를 들어, ACT 를 받은 환자가 비반응성이면, ACT 의 일부로서 투여된 세포는 세포 활성화 및/또는 기능이상 상태와 연관된 것으로 알려진 바이오마커 서명의 상대적 발현도를 결정하기 위해 본 명세서에 개시된 어세이를 통해 어세이될 수 있다. 특정한 억제성 수용체 또는 분자가 ACT 세포에서 상향조절되면, 환자는 그 수용체 또는 분자의 억제제로 처치될 수 있다. 특정한 자극성 수용체 또는 분자가 ACT 세포에서 하향 조절되면, 환자는 그 수용체 또는 분자의 효현제로 처치될 수 있다.
일정한 예의 구현예에서, 본 명세서에 기술된 시스템, 방법 및 장치는 특정한 세포 유형, 세포 표현형, 또는 세포 상태를 식별하는 유전자 서명을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 압축적 감지와 같은 방법의 사용을 통해서, 본 명세서에서 개시된 구현예는 전사체를 검출하는데 사용될 수 있다. 유전자 발현 데이터는 고도로 구조화되어서, 일부 유전자의 발현도는 다른 것들의 발현도를 예측한다. 유전자 발현 데이터가 고도로 구조적이라는 지식은 시스템에서 자유도의 수가 적다는 가정을 가능하게 하고, 이것은 상대적 유전자 존재비의 계산을 위한 기초가 희박하다고 가정하는 것을 가능케 한다. 어떠한 유전자가 상호작용할 것인가에 대한 임의의 특별한 지식없이 출원인이 언더샘플링하면서 비선형 상호작용 조건을 회복할 수 있게 하는 몇몇 생물학적 동기 부여 가설을 만드는 것이 가능하다. 특히, 출원인이 유전자 상호작용을 저순위, 희박, 또는 이들의 조합이라고 가정한다면, 자유도의 진짜 수가 완전한 조합적 확장에 비해 작고, 이것은 출원인이 상대적으로 작은 수의 교란으로 지표를 추론할 수 있게 한다. 이들 가정으로 작업하여, 압축 감지 및 매트릭스 완성의 분석 이론을 사용하여 언더샘플링된 조합적 교란 실험을 설계할 수 있다. 또한, 커널 학습 프레임워크 (kernel-learning framework)를 사용하여 임의의 개별 상호작용 계수의 직접적인 학습없이 조합적 교란의 예측 함수를 구축하여 언더샘플링을 적용할 수 있다. 압축 감지는 종합적인 유전자-발현 프로파일을 수득하기 위해 검출하려는 표적 전사물의 최소 수를 식별하는 방식을 제공한다. 압축 감지를 위한 방법은 참조로 본 명세서에 편입시킨, 2016년 10월 27일 출원된 PCT/US2016/059230 "Systems and Methods for Determining Relative Abundances of Biomolecules" 에 개시되어 있다. 최소 전사물 표적 세트를 식별하기 위해 압축 감지와 같은 방법을 사용하게 되는 경우라면, 상응하는 가이드 RNA의 세트는 상기 전사물을 검출하도록 설계될 수 있다. 따라서, 일정한 예의 구현예에서, 세포의 유전자-발현 프로파일을 수득하기 위한 방법은 본 명세서에 개시된 구현예를 사용하여, 세포 또는 세포 개체군의 유전자-발현 프로파일을 제공하는 최소 전사물 세트를 검출하는 단계를 포함한다.
유전자 편집 및/또는 오프-표적 효과의 검출
본 명세서에 개시된 구현예는 바람직한 유전자 편집 또는 편집들이 성공적이었음을 확인하고/하거나 임의의 오프-표적 효과의 존재를 검출하기 위해 다른 유전자 편집 도구와 조합하여 사용될 수 있다. 편집된 세포는 하나 이상의 표적 유전자좌에 대한 하나 이상의 가이드를 사용하여 스크리닝될 수 있다. 본 명세서에 개시된 구현예가 CRISPR 시스템을 이용하듯이, 테라노스틱 적용분야가 또한 고려된다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 유전자형 분석 구현예를 사용하여 적절한 표적 유전자좌를 선택하거나 또는 표적 편집을 필요로 하는 세포 또는 세포 개체군을 식별할 수 있다. 동일 또는 별개 시스템이 편집 효율을 결정하는데 사용될 수 있다. 하기 작업예에 기술하는 바와 같이, 본 명세서에 개시된 구현예는 1주일 내에 능률적인 테라노스틱 파이프라인을 디자인하는데 사용될 수 있다.
핵산 태그화된 항목 검출
대안적으로, 본 명세서에 기술된 구현예는 핵산 식별자를 검출하는데 사용될 수 있다. 핵산 식별자는 특정한 물품을 식별하는데 사용될 수 있는 비코딩 핵산이다. 일례의 핵산 식별자, 예컨대 DNA 워터마크는 [Heider and Barnekow. "DNA watermarks: A proof of concept" BMC Molecular Biology 9:40 (2008)]에 기술되어 있다. 핵산 식별자는 또한 핵산 바코드일 수 있다. 핵산 기반 바코드는 회합된 분자, 예컨대 표적 분자 및/또는 표적 핵산에 대한 식별자로서 사용되는 짧은 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, DNA, RNA, 또는 이의 조합) 이다. 핵산 바코드는 적어도, 예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있고, 단일-가닥 형태일 수 있거나 또는 이중-가닥 형태일 수 있다. 하나 이상의 핵산 바코드는 표적 분자 및/또는 표적 핵산에 부착, 또는 "태그화" 될 수 있다. 이러한 부착은 직접적 (예를 들어, 표적 분자에 바코드의 공유 또는 비공유 결합) 일 수 있거나 또는 간접적 (예를 들어, 추가 분자, 예를 들어, 특이적 결합제, 예컨대 항체 (또는 다른 단백질) 또는 바코드 수용 어댑터 (또는 다른 핵산 분자)를 통해서) 일 수 있다. 표적 분자 및/또는 표적 핵산은 조합적인 방식으로 다수 핵산 바코드, 예컨대 핵산 바코드 콘카테머로 표지될 수 있다. 전형적으로, 핵산 바코드는 특정한 구획 (예를 들어, 이산 부피)으로부터, 특정한 물리적 특성 (예를 들어, 친화성, 길이, 서열 등)을 갖는 것으로, 또는 일정한 치료 조건을 겪은 것으로, 표적 분자 및/또는 표적 핵산을 식별하는데 사용된다. 표적 분자 및/또는 표적 핵산은 모든 이들 특성 (및 그 이상)에 관한 정보를 제공하도록 다수의 핵산 바코드와 회합될 수 있다. 핵산-바코드를 생성시키는 방법은 예를 들어, 국제 공개 특허 출원 번호 WO/2014/047561 에 개시되어 있다.
효소
본 출원은 RNA 절단 및 검출의 상이한 적용분야에 특히 적합하게 만드는 강건한 활성을 입증한 C2c2 의 오솔로그를 더 제공한다. 이들 적용분야는 제한없이 본 명세서에 기술된 것들을 포함한다. 보다 특히, 시험된 다른 것들보다 강력한 활성을 갖는 것으로 입증된 오솔로그는 유기체 렙토트리키아 웨이데이로부터 동정된 C2c2 오솔로그 (LwC2c2) 이다. 따라서 본 출원은 관심 표적 유전자좌를 변형시키기 위한 방법을 제공하고, 이 방법은 C2c2 이펙터 단백질, 보다 특히 본 명세서에 기술된 바와 같이 증가된 활성을 갖는 C2c2 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 비천연 발생되거나 또는 조작된 조성물을 상기 유전자좌에 전달하는 단계를 포함하고, 여기서 적어도 하나 이상의 핵산 성분은 조작되고, 하나 이상의 핵산 성분은 복합체를 관심 표적으로 유도시키고 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵산 성분과 복합체를 형성하며 복합체는 관심 표적 유전자좌에 결합한다. 특정한 구현예에서, 관심 표적 유전자좌는 RNA를 포함한다. 본 출원은 RNA 서열 특이적 간섭, RNA 서열 특이적 유전자 조절, RNA 또는 RNA 생성물 또는 lincRNA 또는 비코딩 RNA, 또는 핵 RNA, 또는 mRNA의 스크리닝, 돌연변이유발법, 형광 제자리 하이브리드화, 또는 브리딩에서 증가된 활성을 갖는 Cc2 이펙터 단백질의 용도를 더 제공한다.
본 발명은 하기 실시예에서 더욱 설명되지만, 이것이 청구항에 기술된 본 발명의 범주를 제한하지는 않는다.
작업예
실시예 1: 일반 프로토콜
DNA 및 RNA 에 대한 C2c2 진단 시험을 수행하는 두 가지 방법이 있다. 이 프로토콜은 또한 검출 앱타머의 전달 후 단백질 검출 변이체와 함께 사용될 수 있다. 첫번째는 증폭과 C2c2 검출이 별도로 수행되는 2 단계 반응이다. 두번째에서는 모든 것이 하나의 반응으로 조합되며, 이것을 2-단계 반응이라고 한다. 더 높은 농도의 샘플에는 증폭이 필요하지 않을 수 있으므로 증폭 기능이 내장되어 있지 않은 별도의 C2c2 프로토콜을 사용하는 것이 좋다는 점이 중요하다.
표 10. CRISPR 이펙터 단독 - 비증폭:
반응 완충액: 40 mM Tris-HCl, 60 mM NaCl, pH 7.3
이 반응을 37℃에서 20 분 내지 3 시간 동안 수행한다. 여기: 485 nm/20 nm, 방출: 528 nm/20 nm로 판독한다. 단일 분자 민감도에 대한 신호는 20분에 시작될 수 있지만 물론 반응 시간이 길수록 민감도는 더 높다.
2 단계 반응:
표 11. RPA 증폭 믹스
이 반응물을 함께 혼합한 다음 동결 건조 효소 믹스의 2 내지 3 개 튜브를 재현탁한다. 믹스에 5 ㎕의 280 mM MgAc 를 첨가하여 반응을 시작한다. 반응은 10-20분 동안 수행한다. 각 반응은 20 ㎕이므로 최대 5회의 반응에 충분하다.
표 12. C2c2 검출 믹스
반응 완충액: 40 mM Tris-HCl, 60 mM NaCl, pH 7.3
이를 20분 내지 3시간 동안 수행한다. 단일 분자 민감도를 보기 위한 최소 검출 시간은 약 20분이다. 더 오래 동안 반응을 수행하는 것만으로도 민감도가 향상된다.
표 13. 1 포트 반응:
언급된 NEB 키트는 HighScribe T7 고수율 키트이다. 완충액을 재현탁시키기 위해서, 1.5x 농도를 사용한다: 동결 건조된 기질의 세 개의 튜브를 59 ㎕의 완충액에 재현탁시키고, 상기 믹스에 사용한다. 각각의 반응은 20 ㎕이며, 이는 5회의 반응에 충분하다. 이 반응에 관하여 단일 분자 민감도가 30-40분만에 관찰되었다.
실시예 2 - 렙토트리키아 웨이데이 유래 C2c2는 DNA 및 RNA의 고도로 민감하고 특이적인 검출을 매개한다
신속하고, 저렴하고 민감한 핵산 검출은 의료 현장 병원체 검출, 유전형분석, 및 질환 모니터링을 보조할 수 있다. RNA-가이드된, RNA-표적화 CRISPR 이펙터 Cas13a (이전에 C2c2 로서 알려짐)는 표적 인지시에 난잡한 RNAse 활성의 "부차적 효과 (collateral effect)" 를 나타낸다. 출원인은 Cas13a의 부차적 효과와 등온 증폭을 조합하여 CRISPR-기반 진단 (CRISPR-Dx)을 확립하여, 신속한 DNA 또는 RNA 검출에 아토몰라 (attomolar) 감도 및 단일-염기 미스매치 특이도를 제공한다. 출원인은 SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)으로 명명되는, 이러한 Cas13a-기반 분자 검출 플랫폼을 사용하여 지카 (Zika) 및 뎅기 (Dengue) 바이러스의 특이적 균주를 검출하고, 병원성 박테리아를 구별하고, 인간 DNA를 유전자형분석하고, 무세포 종양 DNA 돌연변이를 식별한다. 또한, SHERLOCK 반응 시약은 저온 유통 독립성 및 장기간 저장을 위해 동결건조될 수 있고, 현장 적용을 위해 종이 상에서 용이하게 재구성될 수 있다.
휴대용 플랫폼에서 높은 감도 및 단일-염기 미스매치 특이성을 갖는 핵산을 신속하게 검출하는 능력은 질병 진단 및 모니터링, 역학 및 일반적인 실험실 작업에 도움이 될 수 있다. 핵산 (1-6)을 검출하기 위한 방법이 존재하지만, 그들은 감도, 특이성, 단순성, 비용 및 속도간에 상충성이 있다. 미생물 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) (CRISPR) 및 CRISPR-연관 (CRISPR-Cas) 적응 면역 시스템은 CRISPR-기반 진단 (CRISPR-Dx)에 활용할 수 있는 프로그램가능한 엔도뉴클레아제를 포함한다. 일부 Cas 효소는 DNA (7, 8)를 표적화하지만, 단일 이펙터 RNA-가이드된 RNases, 예컨대 Cas13a (이전에 C2c2 로서 알려짐) (8)는, CRISPR RNA (crRNA) (9-11)로 재프로그래밍되어 특이적 RNA 감지를 위한 플랫폼을 제공한다. 이의 RNA 표적의 인지시에, 활성화된 Cas13a 는 인근의 비-표적화 RNA의 "부차적" 절단 (10)에 참여한다. 상기 crRNA-프로그램된 부차적 절단 활성은 생체 내에서 프로그램된 세포 사멸 (10)을 유발하거나 시험관 내에서 표지된 RNA (10, 12)의 비특이적 분해에 의해 Cas13a 가 특정 RNA의 존재를 검출할 수 있게 한다. 여기에서 출원인은 표적의 실시간 검출을 가능하게 하는, 상업적 리포트 RNA (12)의 3 Cas13a-매개 부차적 절단 및 핵산 증폭을 기반으로 하는 아토몰라 감도의 시험관내 핵산 검출 플랫폼인, SHERLOCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)을 기재한다 (도 17).
방법
발현을 위한 C2c2 유전자좌 및 단백질의 클로닝
박테리아 생체내 효율 어세이를 위해, 렙토트리키아 웨이데이 (Leptotrichia wadei) F0279 및 렙토트리키아 샤히이 (Leptotrichia shahii)로부터의 C2c2 단백질을 포유동물 발현을 위한 코돈-최적화된 유전자로서 주문하였고 (Genscript, Jiangsu, China), 베타-락타마제 표적화 또는 비-표적화 스페이서 측접의 상응하는 직접 반복부와 함께 pACYC184 골격에 클로닝하였다. 스페이서 발현은 J23119 프로모터로 구동시켰다.
단백질 정제를 위해서, 포유동물 코돈-최적화된 C2c2 단백질은 단백질 정제를 위해 박테리아 발현 벡터 (Ilya Finkelstein에게서 선물로 받은 6x His/Twin Strep SUMO, pET-기반 발현 벡터)에 클로닝되었다.
박테리아 생체내 C2c2 효율 어세이
LwC2c2 및 LshC2c2 생체내 효율 플라스미드 및 이전에 기술된 베타-락타마제 플라스미드 (Abudayyeh 2016)는 NovaBlue Singles 컴피턴트 세포 (Millipore)에 각각 90 ng 및 25 ng으로 공동 형질전환시켰다. 형질전환 이후에, 세포 희석물은 암피실린 및 클로람페니콜 LB-한천 플레이트 상에 플레이팅시켰고 밤새 37℃에서 인큐베이션시켰다. 다음 날에 콜로니를 계수하였다.
핵산 표적 및 crRNA 제조
핵산 표적은 KAPA Hifi Hot Start (Kapa Biosystems)를 사용하여 PCR 증폭시켰고, MinElute 겔 추출 키트 (Qiagen)를 사용하여 겔 추출 및 정제하였다. 정제된 dsDNA는 HiScribe T7 Quick High Yield RNA 합성 키트 (New England Biolabs)를 사용하여 T7 중합효소와 밤새 30℃에서 인큐베이션시켰고 RNA는 MEGAclear 전사 클린-업 키트 (Thermo Fisher)에 의해 정제하였다.
crRNA의 제조를 위해서, 구성체는 첨부된 T7 프로모터 서열을 갖는 DNA (Integrated DNA Technologies)로서 주문하였다. crRNA DNA는 짧은 T7 프라이머 (최종 농도 10 μM)에 어닐링시켰고 HiScribe T7 Quick High Yield RNA 합성 키트 (New England Biolabs)를 사용하여 T7 중합효소와 밤새 37℃에서 인큐베이션시켰다. crRNA는 RNAXP 클린 비드 (Beckman Coulter)를 사용하여, 반응 부피에 대해 2x 비율의 비드로, 추가의 1.8x 이소프로판올 (Sigma)을 보충하여 정제하였다.
NASBA 등온 증폭
NASBA 반응의 세부사항은 [Pardee 2016] 에 기재되어 있다. 20 ㎕의 총 반응 부피를 위해서, 6.7 ㎕의 반응 완충액 (Life Sciences, NECB-24), 3.3 ㎕의 뉴클레오티드 믹스 (Life Sciences, NECN-24), 0.5 ㎕의 뉴클레아제-무함유 물, 0.4 ㎕의 12.5 μM NASBA 프라이머, 0.1 ㎕의 RNase 억제제 (Roche, 03335402001) 및 4 ㎕의 RNA 앰플리콘 (또는 음성 대조군의 경우 물)을 4℃에서 어셈블링하였고 65℃에서 2분 및 그 다음으로 41℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 사용된 NASBA 프라이머는 5'-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGGATCCTCTAGAAATATGGATT-3' (SEQ ID NO. 16) 및 5'-CTCGTATGTTGTGTGGAATTGT-3' (SEQ ID NO. 17) 였고, 밑줄친 부분은 T7 프로모터 서열을 나타낸다.
리콤비나제 중합효소 증폭
RPA를 위한 프라이머는 앰플리콘 크기 (100 내지 140 nt), 프라이머 용융 온도 (54℃ 내지 67℃) 및 프라이머 크기 (30 내지 35 nt)를 제외하고, 디폴트 매개변수를 사용하는 NCBI 프라이머 blast (Ye et al., BMC Bioinformaics 13, 134 (2012))를 사용해 디자인하였다. 그 다음으로 프라이머는 DNA (Integrated DNA Technologies)로 주문하였다.
RPA 및 RT-RPA 반응 수행은 280 mM MgAc 를 주형 투입 이전에 첨가한 것을 제외하고, 각각 TwistAmp® Basic 또는 TwistAmp® Basic RT (TwistDx)에서 지시한 바와 같이 하였다. 반응은 달리 설명하지 않으면, 1 ㎕의 투입량으로 2시간 동안 37℃에서 수행하였다.
LwC2c2 단백질 정제
C2c2 박테리아 발현 벡터는 Rosetta™ 2(DE3) pLysS Singles 컴피턴트 세포 (Millipore)를 형질전환시켰다. 16 mL 출발 배양물을 Terrific Broth 4 성장 배지 (12 g/L 트립톤, 24 g/L 효소 추출물, 9.4 g/L K2HPO, 2.2 g/L KH2PO4, Sigma) (TB)에서 성장시켰고, 이것을 사용하여 4 L의 TB를 접종하였으며, 이를 37℃, 300 RPM 에서 0.6의 OD600 까지 인큐베이션하였다. 이 시점에, 단백질 발현은 500 μM 의 최종 농도로 IPTG (Sigma)를 보충하여 유도시켰고, 세포를 단백질 발현을 위해서 16시간 동안 18℃로 냉각시켰다. 그 다음으로 세포는 5200 g, 15분, 4℃로 원심분리시켰다. 세포 펠렛을 회수하였고 이후의 정제를 위해서 -80℃에 저장하였다.
단백질 정제의 모든 후속 단계는 4℃에서 수행하였다. 세포 펠렛을 파쇄하였고, 프로테아제 억제제 (Complete Ultra EDTA-비함유 정제), 리소자임, 및 벤조나아제를 보충한 용해 완충액 (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 8.0)에 재현탁시키고, 그에 뒤이어 초음파처리 (Sonifier 450, Branson, Danbury, CT)를 하기 조건으로 수행했다: 1초 온 (on) 및 2 초 오프 (off) 동안 진폭 100 및 총 초음파처리 시간 10 분. 용해물을 1 시간 동안 4℃에서 10,000g 에서 원심분리에 의해 맑게 하고, 상청액을 Stericup 0.22 마이크론 필터 (EMD Millipore)를 통해 여과하였다. 여과된 상청액을 StrepTactin Sepharose (GE)에 도포했고 1시간 동안 회전하면서 인큐베이션시킨 후에 용해 완충액으로 3회 단백질-결합된 StrepTactin 수지를 세척하였다. 수지는 250 유닛의 SUMO 프로테아제 (ThermoFisher)와 함께 SUMO 분해 완충액 (30 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl 1 mM DTT, 0.15% Igepal (NP-40), pH 8.0)에 재현탁시켰고 밤새 4℃에서 회전시키면서 인큐베이션하였다. 분해는 SDS-PAGE 및 Commassie Blue 염색에 의해 확인하였고, 단백질 용리액을 수지를 스핀 다운시켜 단리하였다. 단백질을 5 mL HiTrap SP HP 양이온 교환 컬럼 (GE Healthcare Life Sciences) 상에 FPLC (AKTA PURE, GE Healthcare Life Sciences)를 통해 로딩했고, 용리 완충액 (20mM Tris-HCl, 1mM DTT, 5% 글리세롤, pH 8.0) 중 130 mM 내지 2M NaCl 의 염 농도구배로 용리하였다. 최종 분획은 SDS-PAGE 를 통해서 LwC2c2 의 존재에 대해 시험되었고, 단백질을 함유하는 분획을 풀링하여 원심분리용 필터 유닛을 통해 1 mL 까지 S200 완충액 (10mM HEPES, 1M NaCl, 5mM MgCl2, 2mM DTT, pH 7.0) 중에서 농축시켰다. 농축된 단백질은 겔 여과 컬럼 (Superdex® 200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare Life Sciences) 상에 FPLC 를 통해 로딩하였다. 겔 여과로부터 생성된 분획을 SDS-PAGE 에 의해 분석했고, LwC2c2 를 함유하는 분획을 풀링하고 저장 완충액 (600 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 5% 글리세롤, 2 mM DTT)으로 완충액 교환하고, 저장을 위해 -80℃에서 동결시켰다.
LwC2c2 부차적 검출
검출 어세이를, 다르게 명시되지 않으면, 뉴클레아제 어세이 완충액 (40mM Tris-HCl, 60 mM NaCl, 6 mM MgCl2, pH 7.3) 중에서 45 nM 정제된 LwC2c2, 22.5 nM crRNA, 125 nM 기질 리포터 (Thermo Scientific RNAse Alert v2), 2 ㎕ 쥐과 RNase 억제제, 100ng의 배경 전체 RNA 및 다양한 투입량의 핵산 표적으로 수행하였다. 투입물이 RPA 반응으로부터의 T7 프로모터를 포함하는 증폭된 DNA인 경우에, 상기 C2c2 반응은 1 mM ATP, 1 mM GTP, 1 mM UTP, 1 mM CTP 및 0.6 ㎕ T7 중합효소 믹스 (NEB)를 포함하도록 변형시켰다. 반응은 형광 동역학을 5분마다 측정하면서 형광 플레이트 판독기 (BioTek) 상에서 1-3시간 동안 (달리 표시하지 않으면) 37℃에서 진행되도록 하였다.
상기 반응 조건과 RPA 증폭 믹스를 통합시킴으로써, RPA-DNA 증폭, DNA 에서 RNA로의 T7 중합효소 전환 및 C2c2 검출을 조합하는, 1-포트 반응을 수행하였다. 간략하게, 50 ㎕의 원-포트 어세이는 0.48 μM 전방향 프라이머, 0.48 μM 역방향 프라이머, 1x RPA 재수화 완충액, 다양한 양의 DNA 투입물, 45 nM LwC2c2 재조합 단백질, 22.5 nM crRNA, 250 ng 배경 전체 RNA, 200 nM 기질 리포터 (RNase alert v2), 4 ㎕ RNase 억제제, 2 mM ATP, 2 mM GTP, 2 mM UTP, 2 mM CTP, 1 ㎕ T7 중합효소 믹스, 5 mM MgCl2, 및 14 mM MgAc로 이루어졌다.
TaqMan 프로브를 사용하는 정량적 PCR (qPCR) 분석
SHERLOCK 정량을 다른 확립된 방법과 비교하기 위해서, ssDNA 1의 연속 희석물에 대해 qPCR을 수행하였다. TaqMan 프로브 및 프라이머 세트 (하기 서열)는 ssDNA 1에 대해서 디자인되었고 IDT에 의해 합성되었다. 어세이는 TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher)를 사용해 수행되었고 Roche LightCycler 480에서 측정되었다.
표 14. qPCR 프라이머/프로브 서열.
SYBR Green II 를 사용하는 실시간 RPA
SHERLOCK 정량을 다른 확립된 방법과 비교하기 위해서, 출원인은 ssDNA 1의 연속 희석물에 대해 RPA를 수행하였다. DNA의 축적을 실시간으로 정량화하기 위해서, 출원인은 1x SYBR Green II (Thermo Fisher)를 위에 기재된 전형적 RPA 반응 혼합물에 첨가했으며, 이는 핵산의 양과 상관관계가 있는 형광 신호를 제공한다. 형광 동역학을 5분 마다 측정하면서 1시간 동안 37℃에서 형광 플레이트 판독기 (BioTek) 상에서 반응이 진행되도록 하였다.
렌티바이러스 제조 및 가공
렌티바이러스 제조 및 가공은 이전에 알려진 방법에 기초하였다. 간략히, HeBS-CaCl2 방법을 사용하여 10 ㎍ 지카 또는 뎅기 RNA 단편을 포함하는 pSB700 유도체, 7.5 ㎍ psPAX2, 및 2.5 ㎍ pMD2.G 로 HEK293FT 세포 (Life Technologies, R7007)를 형질감염시켰다. 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 4 mM GlutaMAX (ThermoFisher Scientific) 이 보충된 DMEM 로 배지를 교환한 후 28시간에, 상청액을 0.45 ㎛의 시린지 필터를 사용하여 여과하였다. ViralBind Lentivirus Purification Kit (Cell Biolabs, VPK-104) 및 Lenti-X Concentrator (Clontech, 631231)를 사용하여 상청액으로부터 렌티바이러스를 정제 및 제조하였다. QuickTiter Lentivirus Kit (Cell Biolabs, VPK-112)를 사용하여 바이러스 농도를 정량하였다. 바이러스 샘플을 7% 인간 혈청 (Sigma, H4522)에 혼합하였고, 95 ℃ 로 2분 동안 가열하고, RPA의 투입물로서 사용하였다.
지카 인간 혈청 샘플의 단리 및 cDNA 정제
의심되는 지카 양성 인간 혈청 또는 소변 샘플을 AVL 완충액 (Qiagen)으로 불활성화시키고, RNA의 단리는 QIAamp Viral RNA 미니키트 (Qiagen)로 수행하였다. 단리된 RNA는 무작위 프라이머, dNTP, 및 샘플 RNA를 혼합하여 cDNA로 전환된 후에 7분 동안 70℃에서 열 변성시켰다. 다음으로 변성된 RNA는 22-25℃에서 10분, 50℃에서 45분, 55℃에서 15분, 및 80℃에서 10분 동안 인큐베이션시키는 Superscript III (Invitrogen)에 의해 역전사시켰다. 이어서 cDNA는 20분 동안 37℃에서 RNAse H (New England Biolabs)와 인큐베이션시켜서 RNA:cDNA 하이브리드의 RNA를 파괴시켰다.
인간 타액으로부터 게놈 DNA 추출
2 mL의 타액은 채취 전 30분간 음식 또는 음료 섭취가 제한된, 지원자로부터 채취되었다. 그 다음으로 샘플은 키트 프로토콜이 추천하는 대로 QIAamp® DNA 혈액 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 처리되었다. 끓인 타액 샘플의 경우, 400 ㎕의 포스페이트 완충 염수 (Sigma)가 100 ㎕의 지원자 타액에 첨가되었고 5분 동안 1800 g에서 원심분리되었다. 상청액을 폐기하였고 펠렛은 95℃에서 5분 동안 인큐베이션하기 전에 0.2% Triton X-100 (Sigma)이 존재하는 포스페이트 완충 염수에 재현탁시켰다. 1 ㎕의 샘플은 RPA 반응에 직접 투입물로서 사용되었다.
동결-건조 및 종이 침적
유리 섬유 필터 종이 (Whatman, 1827021)를 90분 동안 오토클레이브하고 (Consolidated Stills and Sterilizers, MKII), 5% 뉴클레아제-비함유 BSA (EMD Millipore, 126609-10GM)에서 하룻밤 차단하였다. 종이를 뉴클레아제-비함유 물 (Life technologies, AM9932)로 1회 헹군 후에, 4 % RNAsecureTM (Life technologies, AM7006)와 함께 60℃에서 20분 동안 인큐베이션하고, 뉴클레아제-비함유 물로 3회 더 헹궜다. 처리된 종이를 사용 전에 핫 플레이트 (Cole-Parmer, IKA C-Mag HS7) 상에서 20분 동안 80℃에서 건조시켰다. 1.8 ㎕의 이전에 명시된 C2c2 반응 혼합물을 검은색, 투명 바닥 384-웰 플레이트 (Corning, 3544)에 배치된 디스크 (2 mm) 상에 놓았다. 동결-건조된 시험을 위해서, 반응 혼합물 디스크를 함유하는 플레이트를 액체 질소에서 급속 동결시키고, Pardee 등 (2)이 기재한 바와 같이 하룻밤 동결-건조시켰다. RPA 샘플을 뉴클레아제-비함유 물에 1:10 희석하고, 1.8 ㎕의 혼합물을 종이 디스크 상에 로딩하고, 37℃에서 플레이트 판독기 (BioTek Neo)를 사용하여 인큐베이션하였다.
박테리아 게놈 DNA 추출
CRE 검출을 포함하는 실험의 경우, 박테리아 배양물은 용원성 액체배지 (lysogeny broth; LB)에서 중간 대수기까지 성장시켰고, 그 다음에 펠렛화시키고, 적절하게 그람 음성 또는 그람 양성 박테리아에 대한 제조사의 프로토콜을 사용하여 Qiagen DNeasy 혈액 및 조직 키트를 사용해 gDNA 추출 및 정제를 수행하였다. gDNA는 Quant-It dsDNA 어세이를 통해서 Qubit 형광계에서 정량하였고 이의 품질은 200-300 nm 흡광도 스펙트럼을 통해 Nanodrop 분광광도계에서 평가하였다.
이. 콜라이와 슈도모나스 에루지노사 (Pseudomonas aeruginosa)를 구별하는 실험을 위해, 박테리아 배양물을 LB (Luria-Bertani) 액체 배지에서 초기 정지기까지 성장시켰다. 1.0 mL의 이. 콜라이 및 슈도모나스 에루지노사 둘 모두를 휴대용 PureLyse 박테리아 gDNA 추출 키트 (Claremont BioSolutions)를 사용하여 처리하였다. 1X 결합 완충액을 박테리아 배양물에 첨가하고, 그 후 배터리 구동 용해 카트리지에 3 분 동안 통과시켰다. 물 중 0.5X 결합 완충액을 세정 용액으로서 사용했고, 그 후 150 ㎕의 물로 용출하였다.
디지털 액적 PCR 정량
도 1C 에서 사용되는 ssDNA 1 및 ssRNA 1 표준 희석물의 농도를 확인하기 위해서, 출원인은 디지털 액적 PCR (ddPCR)을 수행하였다. DNA 정량을 위해, ssDNA 1 서열을 표적화하도록 디자인된 PrimeTime qPCR 프로브/프라이머 어세이와 프로브용 ddPCR Supermix (dUTP 없음)를 사용하여 액적을 만들었다. RNA 정량을 위해서, ssRNA 1 서열을 표적화하도록 디자인된 PrimeTime qPCR 프로브/프라이머 어세이와 프로브용 원-스텝 RT-ddPCR 키트를 사용하여 액적을 만들었다. 액적은 두 경우 모두 QX200 액적 생성기 (BioRad)를 사용하여 생성하고, PCR 플레이트로 옮겼다. 액적-기반 증폭을 키트의 프로토콜에 기술된 대로 열순환기에서 수행했고, 핵산 농도를 이후에 QX200 액적 판독기 상에서 측정을 통해 확인하였다.
인간 유전형분석을 위한 합성 표준
인간 샘플 유전자형의 정확한 호출을 위한 표준을 생성하기 위해서, 출원인은 SNP 표적 근처의 프라이머를 디자인하여 두 개의 동형접합체 유전자형 각각을 나타내는 인간 게놈 DNA 로부터 ∼200 bp 영역을 증폭시켰다. 그 후 동형접합체 표준을 1:1 비로 혼합함으로써 이형접합체 표준을 만들었다. 그 후 이들 표준을 등가의 게놈 농도 (∼0.56 fg/㎕) 까지 희석했고, 실제 인간 샘플과 함께 SHERLOCK 을 위한 투입물로서 사용하였다.
종양 돌연변이체 무세포-DNA (cfDNA)의 검출
실제 환자 cfDNA 샘플을 모의하는 모의 cfDNA 표준을 상업적 판매회사 (Horizon Discovery Group)로부터 구입했다. 이들 표준은 BRAF V600E 및 EGFR L858R 돌연변이체 둘 모두의 경우에 4 개의 대립유전자 분획 (100% WT 및 0.1%, 1%, 및 5% 돌연변이체)으로서 제공되었다. 3 ㎕의 이들 표준은 SHERLOCK 을 위한 투입물로서 제공되었다.
형광도 데이터의 분석
배경치 차감 형광도 데이터를 계산하기 위해서, 샘플의 초기 형광도를 차감하여 상이한 조건 간 비교를 가능하게 하였다. 배경 조건 (투입물 부재 또는 crRNA 부재 조건)에 대한 형광도를 샘플에서 차감하여 배경치 차감 형광도를 생성시켰다.
SNP 또는 균주 구별을 위한 가이드 비율은 샘플-대-샘플 전체 변이에 대해 조정하기 위해서, 가이드 값의 총합으로 각 가이드를 나누어서 계산하였다. SNP 또는 균주 구별을 위한 crRNA 비율은 다음과 같이 샘플-대-샘플 전체 변동성에 대해 조정하도록 계산되었다:
식에서 Ai 및 Bi 는 소정 개체에서, 각각 대립 유전자 A 또는 대립 유전자 B 를 감지하는 crRNA의 기술적 복제물 i에 대한 SHERLOCK 강도 값을 의미한다. 전형적으로 어세이는 crRNA 당 4개의 기술적 복제물을 가지므로, m 및 n 은 4 와 동등하고 분모는 소정 SNP 유전자좌 및 개체에 대한 모든 8개의 crRNA SHERLOCK 강도 값의 총합과 동등하다. 2개의 crRNA 가 존재하기 때문에, 개체에 대한 각각의 crRNA 전반에서 crRNA 비율 평균은 항상 총합이 2 일 것이다. 그러므로, 이상적인 동형접합 경우에, 양성 대립 유전자 crRNA에 대한 평균 crRNA 비율은 2 일 것이고 음성 대립 유전자 crRNA에 대한 평균 crRNA 비율은 0일 것이다. 이상적인 이형접합 경우에, 2개 crRNA 각각에 대한 평균 crRNA 비율은 1일 것이다.
LwCas13a 절단 요건의 특징규명
프로토스페이서 측접 부위 (PFS)는 Cas13a에 의한 강건한 리보뉴클레아제 활성에 필요한 표적 부위 근처에 존재하는 특이적 모티프이다. PFS는 표적 부위의 3'에 위치되고 H (G가 아님)로서 우리 그룹에 의해 LshCas13a에 대해 이전에 특징규명되었다 (1). 이러한 모티프는 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM), 클래스 2 시스템을 표적화하는 DNA에 대한 서열 제한과 유사하지만, 내생성 시스템의 CRISPR 유전자좌의 자기 표적화를 방지하는데 관여되지 않으므로 기능적으로 상이하다. Cas13a의 향후 구조 연구는 아마도 Cas13a:crRNA 표적 복합체 형성 및 절단 활성을 위한 PFS의 중요성을 밝혀줄 것이다.
출원인은 이. 콜라이로부터 재조합 LwCas13a 단백질을 정제하였고 (도 2D-E) 각각의 가능한 프로토스페이서 측접 부위 (PFS) 뉴클레오티드 (A, U, C 또는 G)를 갖는 173-nt ssRNA를 절단하는 이의 능력을 어세이하였다 (도 2F). LshCas13a 와 유사하게, LwCas13a는 A, U, 또는 C PFS 가 있는 표적을 강력하게 절단할 수 있으며, G PFS 가 있는 ssRNA에 대한 활성은 더 낮다. G PFS가 있는 ssRNA 1 에 대해 더 약한 활성을 보지만, 출원인은 G PFS 모티프가 있는 두 개의 표적 부위에 대해 강건한 검출을 여전히 확인하였다 (표 3; rs601338 crRNA 및 지카 표적화 crRNA 2). 아마도 H PFS 가 모든 상황 하에서 요구되지 않고, 많은 경우에 G PFS 로 강한 절단 또는 부차적 활성이 달성될 수 있을 것이다.
리콤비나제 중합효소 증폭 (RPA) 및 다른 등온 증폭 전략의 고찰.
리콤비나제 중합효소 증폭 (RPA)은 3종의 필수적인 효소: 리콤비나제, 단일-가닥 DNA-결합 단백질 (SSB), 및 가닥 치환 중합효소로 이루어진 등온 증폭 기술이다. RPA는 효소가 모두 대략 37℃의 일정한 온도에서 작동되므로 온도 조절을 요구하지 않으므로써, 다른 증폭 전략, 특히 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 존재하는 많은 기술적 어려움을 극복한다. RPA는 이중 가닥 주형의 전반적인 용융 및 프라이머 어닐링을 위한 온도 사이클링을 생체내 DNA 복제 및 복구에 의해 영감받은 효소적 접근법으로 교체시킨다. 리콤비나제-프라이머 복합체는 이중 가닥 DNA를 스캐닝하고 상보적 부위에서 가닥 교환을 촉진한다. 가닥 교환은 SSB에 의해 안정화되어, 프라이머가 계속 결합 상태로 유지될 수 있게 한다. 리콤비나제의 자발적인 탈조립은 이의 ADP-결합 상태로 발생되어, 가닥-치환 중합효소가 침입하여 프라이머를 확장시킬 수 있게 하고, 현장현시 및 필드 상황에서 이용불가능한 복잡한 장비없이 증폭될 수 있게 한다. 37℃ 내지 42℃의 온도 범위에서 이러한 과정의 주기적 반복은 기하급수적 DNA 증폭을 일으킨다. 공개된 본래 배합물은 가닥-치환 중합효소로서 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) Pol I (Bsu), 리콤비나제로서 T4 uvsX, 및 단일-가닥 DNA 결합 단백질로서 T4 gp32를 사용하지만 (2), 본 연구에서 사용된 TwistDx가 판매하는 현행 배합물에 어떠한 성분이 존재하는가는 불명확하다.
추가적으로, RPA는 많은 제한을 갖는다:
1) Cas13a 검출은 정량적이지만 (도 15), 실시간 RPA 정량은 리콤비나제가 모든 이용가능한 ATP를 이용할 때 이의 신속한 포화때문에 어려울 수 있다. 실시간 PCR은 증폭을 순환시키는 능력때문에 정량적인 한편, RPA는 증폭의 속도를 강력하게 제어하는 기전을 갖지 않는다. 증폭 속도를 감소시키기 위해서, 예컨대 이용가능한 마그네슘 또는 프라이머 농도를 감소시키기 위해, 반응 온도를 저하시키기 위해, 또는 비효율적인 프라이머를 디자인하기 위해서 일정한 조절을 할 수 있다. 우리는 정량적 SHERLOCK의 일부 예를, 예컨대 도 31, 32, 및 52에서 확인하지만, 이것이 항상 그러한 경우는 아니고 주형에 의존하게 된다.
2) RPA 효율성은 프라이머 디자인에 민감할 수 있다. 제조사는 전형적으로 평균 GC 함량 (40-60%)으로 효율적인 리콤비나제 결합을 보장하도록 보다 긴 프라이머를 디자인하고 고도로 민감한 프라이머 쌍을 찾기 위해 최대 100개 프라이머 쌍을 스크리닝하는 것을 추천한다. 출원인은 단일 분자 감도로 아토몰라 시험을 달성하기 위해서 오직 2개 프라이머 쌍을 디자인해야 한다는 것을 SHERLOCK으로 확인하였다. 이러한 강건성은 앰플리콘 증폭에서 임의의 비효율성을 오프셋시키는 항상적으로 활성인 Cas13a 부차적 활성에 의한 신호의 추가적 증폭에 기인하는 듯 하다. 이러한 품질은 도 34에서의 우리의 박테리아 병원체 식별을 위해 특히 중요하다. RPA에 관여되는 용융 단계가 존재하지 않기 때문에 고도로 구조적인 영역 예컨대 16S rRNA 유전자 부위를 박테리아 게놈에서 증폭시켜서 이슈들을 실험하였다. 따라서, 프라이머의 2차 구조가 증폭 효율 및 그에 따라 감도를 제한하는 이슈가 된다. 본 명세서에서 개시된 실시형태는 Cas13a로부터의 추가적인 신호 증폭 때문에 이들 RPA-특이적 이슈에도 불구하고 성공적이라고 여겨졌다.
3) 증폭 서열 길이는 효율적인 RPA를 위해 짧아야 한다 (100-200 bp). 대부분의 적용을 위해서, 이것은 중요한 이슈는 아니며 아마도 장점이다 (예를 들어, 평균 단편 길이가 160 bp인 cfDNA 검출). 예컨대 범용 프라이머가 박테리아 검출에 바람직하고 구별을 위한 SNP가 거대 영역 상에 확산된 경우에, 때때로 큰 앰플리콘 길이가 중요하다.
SHERLOCK의 모듈성은 임의의 증폭 기술, 심지어 비등온성 접근법을 T7 전사 및 Cas13a 검출 이전에 사용하는 것을 가능하게 한다. 이러한 모듈성은 T7 프로모터를 임의의 증폭된 DNA 투입물에 대해 검출을 수행할 수 있게 하는 단일 반응으로 T7 및 Cas13a 단계의 상용성에 의해 가능하게 된다. RPA를 사용하기 전에, 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA) (3, 4)은 우리의 검출 어세이를 위해 시도되었다 (도 10). 그러나, NASBA는 Cas13a의 감도를 극적으로 개선시키지는 않았다 (도 11 및 53). 검출 전에 적용될 수 있는 다른 증폭 기술은 PCR, 루프 매개된 등온성 증폭 (LAMP) (5), 가닥 치환 증폭 (SDA) (6), 헬리카제-의존적 증폭 (HDA) (7), 및 닉킹 효소 증폭 반응 (NEAR) (8)을 포함한다. 임의의 등온 기술을 교환하는 능력은 SHERLOCK이 임의의 한 증폭 기술의 특별한 한계를 극복할 수 있게 한다.
조작된 미스매치의 디자인.
출원인은 LshCas13a 표적 절단이 표적:crRNA 듀플렉스에 둘 이상의 미스매치가 존재할 때 감소되었지만 단일 미스매치에 의해 비교적 영향을 받지 않는다는, 우리가 LwCas13a 부차적 절단에 대해 확인한 관찰을 이전에 보여주었다 (도 36A). 출원인은 crRNA 스페이서 서열에 추가적인 돌연변이를 도입함으로써, 오직 단일 미스매치만이 존재하므로, 우리는 표적-적중 부차적 절단을 유지하면서 추가의 미스매치 (총 2개 미스매치)에 의해 표적에 대해 부차적 절단을 탈안정화시키게 되었다고 가정하였다. 증가된 특이성을 조작하는 가능성을 시험하기 위해서, 출원인은 ssRNA 1 을 표적화하는 다수의 crRNA를 디자인하였고, crRNA의 길이를 따라 미스매치를 포함시켜서 (도 36A) 온-표적 부차적 절단을 최적화하고 단일 미스매치 만큼 상이한 표적의 부차적 절단을 최분해하였다. 출원인은 이들 미스매치가 ssRNA 1 의 부차적 절단을 감소시키지 않았으나, 부가적 미스매치를 포함하는 표적 (ssRNA 2)에 대한 신호를 유의하게 감소시켰다는 것을 관찰하였다. ssRNA 1 과 ssRNA 2를 최고로 구별하게 디자인된 crRNA는 ssRNA 2 미스매치 가까이에 합성 미스매치를 포함했으며, 사실상 "버블 (bubble)", 또는 왜곡을 하이브리드된 RNA 에서 생성하였다. 표적에 존재하는 합성 미스매치 및 추가의 미스매치의 조화 (즉, 이중 미스매치)에 의해 야기된 감도의 손실은 연속하거나 또는 근접한 이중 미스매치에 대한 LshCas13a 및 LwCas13a의 감도와 일치되고 단일-뉴클레오티드 구별을 할 수 있는 crRNA의 합리적 디자인의 기초를 제시한다 (도 36B).
ZIKV 및 DENV 균주의 미스매치 검출을 위해, 우리의 전장 crRNA는 두 개의 미스매치를 함유했다 (도 37A,B). 균주 사이의 높은 서열 분기로 인해, 출원인은 2개 게놈 사이에 오직 단일 뉴클레오티드 차이를 갖는 28 nt 의 연속 스트레치를 찾을 수 없었다. 그러나, 출원인은 더 짧은 crRNA가 여전히 기능적일 수 있다고 예측하여, 스페이서 서열에 합성 미스매치 및 표적 서열에 오직 하나의 미스매티를 포함하는 2종 ZIKV 균주의 표적에 대한 더 짧은 23nt crRNA를 디자인하였다. 이들 crRNA는 여전히 ZIKV 의 아프리카 및 아메리카 균주를 구별할 수 있었다 (도 36C). 23 nt 및 20 nt crRNA의 후속적 시험은 스페이서 길이의 감소가 활성은 감소시키나 단일 미스매치를 구별하는 능력은 유지 또는 향상시킨다는 것을 보여준다 (도 57A-G). 단일-뉴클레오티드 돌연변이 구별을 촉진하기 위해 어떻게 합성 미스매치를 도입시킬 수 있는가를 더욱 이해하기 위해서, 우리는 3종의 상이한 스페이서 길이: 28, 23, 및 20 nt에서 스페이서의 처음 7개 위치에 걸쳐 합성 미스매치를 타일링시켰다 (도 57A). 제3 위치에 돌연변이를 갖는 표적 상에서, LwCas13a는 표적-적중 활성의 더 낮은 수준에도 불구하고, 보다 짧은 스페이서 길이에서 개선된 감도로, 스페이서의 위치 5에 합성 미스매치가 존재할 때 최고 특이도를 보인다 (도 57B-G). 출원인은 또한 위치 3-6에 걸쳐 표적 돌연변이를 이동시켰고 돌연변이 주변 스페이서에서 합성 미스매치를 타일링시켰다 (도 58).
합성 표준을 사용하는 SHERLOCK 에 의한 유전형분석.
SNP 유전자좌의 PCR 증폭으로 생성된 합성 표준물의 평가는 유전자형의 정확한 식별을 가능하게 한다 (도 60A,B). 개체의 샘플 및 합성 표준물의 SHERLOCK 결과 간 모든 비교를 계산함으로써 (ANOVA), 가장 유사한 SHERLOCK 검출 강도를 갖는 합성 표준물을 찾아서 각각의 개체의 유전자형을 식별할 수 있다 (도 60C, D). 이러한 SHERLOCK 유전자형 분석 접근법은 임의의 SNP 유전자좌에 대해 일반화가능하다 (도 60E).
SHERLOCK은 입수가능하고, 적합화가능한 CRISPR-Dx 플랫폼이다.
HERLOCK의 비용 분석을 위해서, crRNA의 합성을 위한 DNA 주형, RPA에서 사용되는 프라이머, 공통 완충액 (MgCl2, Tris HCl, 글리세롤, NaCl, DTT), 유리 미세섬유 필터지, 및 RNAsecure 시약을 포함한, 무시할만한 비용으로 결정된 시약은 생략하였다. DNA 주형의 경우, IDT로부터의 울트라머 합성은 40회 시험관내 전사 반응 (각각 ∼10,000 반응에 충분함)을 위한 재료는 ∼$70로 제공되어, crRNA 합성에 무시할만한 비용을 첨가하였다. RPA 프라이머의 경우, 30 nt DNA 프라이머의 25 nmole IDT 합성은 ∼$10로 구매할 수 있어서, 5000 SHERLOCK 반응에 적합한 재료를 제공하였다. 유리 미세섬유 종이는 $0.50/시트에 입수가능하며, 이는 수백 회의 SHERLOCK 반응에 충분하다. 4% RNAsecure 시약은 비용이 $7.20/mL 이며, 이는 500 회 시험에 충분하다.
또한, 종이-기반 어세이를 제외한, 모든 실험에서, 384-웰 플레이트 (Corning 3544)를, $0.036/반응의 비용으로 사용하였다. 무시할만한 비용 때문에, 이는 전체 비용 분석에 포함되지 않았다. 추가적으로, SHERLOCK-POC는 플라스틱 용기의 사용을 필요로 하지 않는데, 종이 상에서 쉽게 수행될 수 있기 때문이다. 본 명세서에서 사용되는 SHERLOCK 에 관한 판독 방법은 필터 세트 또는 단색광분석기가 구비된 플레이트 판독기였다. 자본 투자로서, 판독기의 비용은 계산에 포함되지 않았는데, 더 많은 반응이 장비 상에서 실시되므로 비용이 급격하게 감소되어 무시할만하기 때문이다. POC 적용을 위해서, 더 싸고 휴대가능한 대안이 사용될 수 있는데, 예컨대 휴대용 분광광도계 (9) 또는 휴대용 전자 판독기 (4)는 < $200로 장비의 비용을 절감시킨다. 이들 보다 휴대가능한 해법은 대량 장비와 비교하여 판독의 속도 및 용이함을 줄이게 되는 한편, 그들은 보다 광범위한 사용을 가능하게 한다.
결과
본 명세서에 기술된 어세이 및 시스템은 일반적으로 증폭 및 검출의 2-단계 과정을 포함할 수 있다. 제1 단계 동안, RNA 또는 DNA인 핵산 샘플은 예를 들어 등온성 증폭에 의해 증폭된다. 제2 단계에서, 증폭된 DNA는 RNA로 전사되고 그 이후에 표적 핵산 서열의 존재를 검출하기 위해서 프로그램된 CRISPR 이펙터, 예컨대 C2c2, 및 crRNA와 인큐베이션시킨다. 검출할 수 있기 위해서, 소광된 형광단으로 표지된 리포터 RNA가 반응에 첨가된다. 리포터 RNA의 부차적 절단은 그 결과로 형광단이 탈소광을 야기시키고 핵산 표적의 실시한 검출을 가능하게 한다 (도 17A).
강건한 신호 검출을 획득하기 위해서, C2c2의 오솔로그는 유기체 렙토트리키아 웨이데이 (LwC2c2)로부터 동정되었고 평가되었다. LwC2c2 단백질의 활성은 이것을 이. 콜라이에서 합성 CRISPR 어레이와 함께 발현시키고, 암피실린 선별 하에서 박테리아의 사멸을 초래하는, 베타-락타마제 mRNA 내 표적 부위를 절단하도록 프로그래밍하여 평가하였다 (도 2B). LwC2c2 유전자좌에서 LshC2c2 유전자좌에 비해 적은 생존 이. 콜라이 콜로니가 관찰되어서, LwC2c2 오솔로그의 더 높은 절단 활성이 입증되었다 (도 2C). 다음으로 인간-코돈 최적화된 LwC2c2 단백질을 이. 콜라이로부터 정제하였고 (도 2D-E) 173-nt ssRNA를 절단하는 이의 능력은 상이한 프로토스페이서 측접 부위 (PFS) 뉴클레오티드에 의해 어세이하였다 (도 2F). LwC2c2는 가능한 4종의 PFS 표적 각각을 절단할 수 있었고, G PFS를 갖는 ssRNA에 대해 약간 적은 활성을 가졌다.
LwC2c2 RNase 부차적 활성의 실시간 측정은 상업적으로 입수가능한 RNA형광 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다 (도 17A). LwC2c2 활성의 기준치 감도를 결정하기 위해서, LwC2c2는 ssRNA 표적 1 (ssRNA 1) 및 ssRNA 표적 내 부위에 상보성인 crRNA와, RNA 센서 프로브와 함께 인큐베이션시켰다 (도 18). 이것은 다른 최신 핵산 검출 기술 (Pardee et al., 2014) 보다 더 민감하지만, 펨토몰라 이하의 검출 성능을 요구하는 많은 진단 적용분야에 충분히 민감하지 않은 ∼50 fM의 감도를 산출하였다 (도 27A) (Barletta et al., 2004; Emmadi et al., 2011; Rissin et al., 2010; Song et al., 2013).
감도를 증가시키기 위해서, 등온성 증폭 단계가 LwC2c2와의 인큐베이션 이전에 첨가되었다. LwC2c2-매개 검출과 이전에 사용된 등온성 증폭 접근법 예컨대 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA)(Compton, 1991; Pardee et al., 2016)과의 커플링은 일정한 정도로 감도를 개선시켰다 (도 11). 대안적인 등온성 증폭 접근법, 리콤비나제 중합효소 증폭 (RPA) (Piepenburg et al., 2006)은 2시간 내에 기하급수적으로 DNA를 증폭시키기 위해 사용될 수 있는 것을 시험하였다. RPA 프라이머 상에 T7 RNA 중합효소 프로모터를 첨가함으로써, 증폭된 DNA는 LwC2c2에 의한 후속 검출을 위해 RNA로 전환될 수 있다 (도 17). 따라서, 일정한 예의 구현예에서, 어세이는 RPA에 의한 증폭, DAN에서 RNA로의 T7 RNA 중합효소 전환, 및 소광된 리포터로부터 형광의 후속 검출, C2c2 노출에 의한 RNA의 후속 검출의 조합을 포함한다.
ssRNA 1의 합성된 DNA형태에 대해 예시적인 방법을 사용하여, 반응 당 1-10 분자 범위에서 아토몰라 감도를 획득하는 것이 가능하였다 (도 27B, 좌측). 검출의 정확도를 검증하기 위해서, 투입 DNA의 농도는 디지털-액적 PCR에 의해 정량하였고 최저 검출가능한 표적 농도 (2 aM)가 마이크로리터 당 단일 분자의 농도에서 였다는 것을 확인하였다. 역전사 단계의 첨가로, RPA는 또한 RNA를 dsDNA형태로 증폭시킬 수 있어서, 우리가 ssRNA 1에 대해 아토몰라 감도를 획득할 수 있게 한다 (27B, 우측). 유사하게, RNA 표적의 농도를 디지털-액적 PCR 에 의해 확인하였다. 실시예 방법이 POC 진단 시험으로서 기능할 실행가능성을 평가하기 위해서, 모든 성분 - RPA, T7 중합효소 증폭, 및 LwC2c2 검출 - 이 단일 반응에서 기능하는 능력을 시험했고, 어세이의 원-포트 버전으로 아토몰 민감도로 밝혀졌다 (도 22).
어세이는 액체에서 또는 종이 상에서 민감한 바이러스 검출을 할 수 있다
다음으로 어세이가 높은 민감도를 요구하는 감염성 질환 응용에서 효과적일지 여부 및 휴대용 진단으로부터 유익을 얻을 수 있는지 여부를 확인하였다. 모델 시스템에서 검출을 시험하기 위해서, 지카 바이러스 게놈의 RNA 단편을 보유하는 렌티바이러스 및 관련되는 플라비바이러스 뎅기 (Dejnirattisai et al., 2016)를 생산했고, 바이러스 입자의 수를 정량했다 (도 31A). 모의군 바이러스의 수준은 2 aM 까지 검출되었다. 동시에, 지카 및 뎅기 RNA 단편을 함유하는 이들 대용 바이러스 간 분명한 구별을 보여주는 것이 또한 가능하였다 (도 31B). 유통을 위한 저온 유통 의존성을 제거하기 위해 어세이가 동결-건조와 상용성인지 여부를 결정하기 위해서, 반응 성분을 동결-건조시켰다. 샘플을 사용하여 동결건조된 성분을 재수화시킨 후에, 20 fM 의 ssRNA 1이 검출되었다 (도 33A). 자원-부족 및 POC 상황은 유용성의 용이함을 위한 종이 시험으로부터 유익을 얻을 것이기 때문에, 유리 섬유 종이 상에서 C2c2 검출의 활성을 또한 평가했고 종이-점적된 C2c2 반응이 표적 검출 능력이 있다는 것을 발견했다 (도 33B). 동결-건조 및 종이-점적 조합으로, C2c2 검출 반응은 ssRNA 1의 민감한 검출을 초래했다 (도 33C). 용액 중 LwC2c2 와 동결-건조된 LwC2c2 사이의 합성 지카 바이러스 RNA 단편의 검출에 관해 유사한 수준의 감도가 또한 관찰되었으며, 동결-건조된 SHERLOCK 의 강력함 및 신속한, POC 지카 바이러스 진단의 잠재성을 입증했다 (도 33D-E). 이를 위해서, 어세이의 POC 변형의 능력을 시험하여 지카 RNA를 뎅기 RNA와 구별하는 능력을 확인했다 (도 31C). 종이-점적 및 동결건조는 판독의 절대 신호를 약간 감소시켰지만, 어세이는 20 aM 만큼 낮은 농도의 모의 지카 바이러스를 여전히 유의하게 검출했으며 (도 31D), 이는 뎅기 제어 서열을 갖는 모의 바이러스의 검출과 비교된다.
인간에서 지카 바이러스 RNA 수준은 인간 타액에서 3 x 106 카피수/mL (4.9 fM) 및 환자 혈청에서 7.2 x 105 카피수/mL (1.2 fM) 정도로 낮은 것으로 보고되었다 (Barzon et al., 2016; Gourinat et al., 2015; Lanciotti et al., 2008). 수득된 환자 샘플로부터 1.25 x 103 카피수/mL (2.1 aM) 정도로 낮은 농도가 관찰되었다. 어세이가 저-역가 임상 단리주의 지카 바이러스 검출을 할 수 있는지 여부를 평가하기 위해서, 바이러스 RNA를 환자로부터 추출하였고 역전사시켰고 최종 cDNA를 어세이를 위한 투입물로서 사용하였다 (도 32A). 지카 인간 혈청 샘플에 대한 유의한 검출은 1.25 카피수/㎕에 이르는 농도 (2.1 aM)에서 관찰되었다 (도 32B). 뿐만 아니라, 환자 샘플 유래의 신호는 지카 바이러스 RNA 카피수를 예측하였고 바이러스 존재량을 예측하는데 사용될 수 있었다 (도 31F). 핵산 정제가 이용불가능한 질환 상황의 경우에 광범위한 적용가능성을 시험하기 위해서, 인간 혈청에 섞인 ssRNA 1의 검출을 시험하였고, 어세이가 2% 이하의 혈청 수준에서 활성화되었다는 것을 결정하였다 (도 33G).
박테리아 병원체 구별 및 유전자 구별
어세이가 박테리아 병원체를 구별하는데 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위해서, 보존된 측접 영역이 박테리아 종에 걸쳐 범용 RNA 프라이머를 사용가능하게 하고, 가변 내부 영역이 종을 구별할 수 있게 하므로, 16S V3 영역이 초기 표적으로서 선택되었다. 5종의 가능한 표적화 crRNA의 패널이 병원성 균주 및 단리된 이. 콜라이 및 슈도모나스 애루지노사 gDNA에 대해 디자인되었다 (도 34A). 이 어세이는 이. 콜라이 또는 피. 애루지노사 gDNA를 구별할 수 있었고 다른 종의 crRNA에 대한 낮은 배경치 신호를 확인하였다 (도 34 A, B).
어세이는 또한 관심의 박테리아 유전자, 예컨대 항생제-내성 유전자를 신속하게 검출 및 구별하기 위해 적합화될 수 있다. 카르바페넴-내성 엔테로박테리아 (CRE)는 중요한 신흥 공중 보건 도전이다 (Gupta et al., 2011). 시험이 카르바페넴-내성 유전자를 구별할 수 있는지, 카르바페넴-내성 유전자를 검출하는 어세이의 능력을 평가하였다. 클렙시엘라 뉴모니아는 클렙시엘라 뉴모니아 카르바페나마제 (KPC) 또는 뉴델리 메탈로-베타-락타마제1 (NDM-1) 내성 유전자를 보유하는 임상 단리주로부터 수득하였고 유전자를 구별하기 위해 crRNA를 디자인하였다. 모든 CRE는 이들 내성 유전자가 결여된 박테리아에 대해 유의한 신호를 가졌고 (도 35A) 우리는 내성의 KPC 및 NDM-1 균주를 유의하게 구별할 수 있었다 (도 35B).
CRISPR RNA-가이드된 RNase 의 단일-염기 미스매치 특이성
일정한 CRISPR RNA-가이드된 RNase 오솔로그, 예컨대 LshC2c2는 단일-염기 미스매치를 쉽게 구별하지 못한다는 것이 확인되었다 (Abudayyeh et al., 2016). 본 명세서에서 입증하는 바와 같이, LwC2c2는 또한 이러한 특성을 공유한다 (도 37A). LwC2c2 절단의 특이성을 증가시키기 위해서, crRNA:표적 듀플렉스에 합성 미스매치를 도입하기 위한 시스템을 개발했으며, 이것은 미스매치에 대한 총 민감도를 증가시키고 단일-염기 미스매치 감도를 가능하게 한다. 표적 1 에 대한 다수의 crRNA를 설계했고, crRNA의 길이를 따라 미스매치를 포함시켜서 (도 37A) 온-표적 부차적 절단을 최적화하고 단일 미스매치 만큼 상이한 표적의 절단을 최분해하였다. 이들 미스매치는 ssRNA 표적 1 의 절단 효율을 감소시키지 않았으나, 부가적 미스매치를 포함하는 표적 (ssRNA 표적 2)에 대한 신호를 유의하게 감소시켰다. 표적 1 과 표적 2를 최적으로구별하게 디자인된 crRNA는 표적 2 미스매치 가까이에 합성 미스매치를 포함했으며, 사실상 "버블 (bubble)" 을 생성하였다. 표적에 존재하는 합성 미스매치 및 추가 미스매치의 합동 (즉, 이중 미스매치)에 의해 야기된 감도의 손실은 연속되거나 또는 가까운 이중 미스매치에 대한 LshC2c2의 감도와 일치되고 (Abudayyeh et al., 2016) 단일-뉴클레오티드 구별을 할 수 있는 crRNA의 합리적 디자인을 위한 형태를 제시한다 (도 37B).
C2c2 가 단일-염기 미스매치를 인지하도록 조작될 수 있음을 입증한 후, 이 조작된 특이성이 밀접하게 관련된 바이러스 병원체 사이를 구별하는데 사용될 수 있는지 여부를 확인하였다. 다수의 crRNA는 지카 바이러스의 아프리카 또는 아메리카 균주 (도 37A) 및 뎅기 바이러스의 균주 1 또는 3 (도 37C)을 검출하도록 디자인되었다. 이들 crRNA는 스페이서 서열에 합성 미스매치를 포함했으며, 합성 미스 매치로 인해 온-표적 균주에 듀플렉스화될 때 단일 버블이 야기된다. 그러나, 합성 미스매치 스페이서가 오프-표적 균주에 듀플렉스화될 때, 합성 미스매치 및 SNP 미스매치로 인해 2 개의 버블이 형성된다. 합성 미스매치 crRNA는 상응하는 균주를 오프-표적 균주보다 현저히 더 높은 신호로 검출하여 강력한 균주 구별을 가능하게 했다 (도 37B, 37D). 균주 사이의 상당한 서열 유사성으로 인해, 단일-뉴클레오티드 균주 구별을 보여주기 위해서 두 개의 게놈 사이에 오직 단일 뉴클레오티드 차이가 있는 28 nt 의 연속 스트레치를 찾을 수 없었다. 그러나, 그들이 LshC2c2를 갖고 (Abudayyeh et al., 2016), 따라서 보다 짧은 23-nt crRNA는 스페이서 서열에 합성 미스매치 및 표적 서열에 오직 하나의 미스매치를 포함하는 2종의 지카 균주의 표적에 대해 디자인되었으므로, 보다 짧은 crRNA가 여전히 기능성일 것으로 예측되었다. 이들 crRNA는 고감도로 지카의 아프리카 및 아메리카 균주를 여전히 구별할 수 있었다 (도 36C).
타액에서 정제된 DNA를 사용하는 신속한 유전자형 분석
인간 타액으로부터 신속한 유전자형 분석은 응급 약물유전체 상황 또는 재택 진단에서 유용할 수 있다. 유전자형분석을 위한 본 명세서에 개시된 구현예의 가능성을 입증하기 위해서, 5개 유전자좌가 금본위제로서 23andMe 유전자형 데이터를 사용해 C2c2 검출을 벤치마킹하기 위해 선택되었다 (Eriksson et al., 2010) (도 38A). 5개 유전자좌는 약제, 예컨대 스타틴 또는 아세타미노펜에 대한 감도, 노로바이러스 감수성, 및 심장 질환의 위험성을 포함하여, 광범위한 기능적 연관성을 포괄한다 (표 15).
표 15: 시험된 SNP 변이체
4명 인간 대상체 유래의 타액을 채취하였고 1시간 이내에 간단한 상업적 키트를 사용해 게놈 DNA를 정제하였다. 4명 대상체는 5개 유전자좌에 걸쳐 유전자형의 다양한 세트를 가졌고, 유전자형 분석을 위한 어세이를 벤치마킹하기 위해 충분히 넓은 샘플 공간을 제공한다. 5개의 SNP 유전자좌 각각의 경우, 대상체의 게놈 DNA는 적절한 프라이머에 의한 RPA를 사용해 증폭하였고 그 이후에 2종의 가능한 대립유전자 중 하나를 특이적으로 검출하도록 디자인된 crRNA의 쌍 및 LwC2c2로 검출하였다 (도 38B). 어세이는 대립 유전자를 높은 유의성으로 구별하고 동형접합 및 이형접합 유전자형 둘 모두를 추론하기에 충분히 특이적이었다. DNA 추출 프로토콜이 검출 전에 타액에 대해 수행되었기 때문에, 어세이가 추가 추출없이 5 분 동안 95℃ 로 가열된 타액을 사용하여 POC 유전자형분석에 더 적합하게 만들어질 수 있는지 여부를 확인하기 위해 어세이를 시험하였다. 어세이는 타액이 5분 동안 가열된 후 후속 증폭 및 C2c2 검출을 받은 2명의 환자를 정확하게 유전자형분석할 수 있었다 (도 40B).
저-대립유전자 분획에서 cfDNA 의 암성 돌연변이의 검출
어세이가 표적 중 단일 뉴클레오티드 편차에 고도로 특이적이기 때문에, 시험은 어세이가 세포-무함유 DNA (cfDNA)에서 암 돌연변이를 검출하기에 충분히 민감한지 여부를 결정하기 위해 고안되었다. cfDNA 단편은 야생형 cfDNA 단편의 적은 비율 (0.1% 내지 5%)이었다 (Bettegowda et al., 2014; Newman et al., 2014; Olmedillas Lopez et al., 2016; Qin et al., 2016). cfDNA 분야에서 상당한 도전은 이들 돌연변이를 검출하는 것인데 그들이 전형적으로 혈액 중 배경으로 발견되는 높은 수준의 비-돌연변이된 DNA를 고려하면 발견되는 것이 어렵기 때문이다 (Bettegowda et al., 2014; Newman et al., 2014; Qin et al., 2016). POC cfDNA 암 검사는 또한 특히 관해에 대해 위험성이 있는 환자에 대해, 암 존재의 정기적 스크리닝을 위해 유용할 수 있다.
야생형 배경에서 돌연변이체 DNA를 검출하는 어세이의 능력은 crRNA 표적 부위에 단일 돌연변이를 갖는 ssDNA1의 배경에서 dsDNA 표적 1을 희석하여 결정하였다 (도 41A-B). LwC2c2는 배경 dsDNA의 0.1% 정도로 낮은 수준까지 그리고 dsDNA 1의 아토몰라 농도 내에서 dsDNA 1을 감지할 수 있다. 이러한 결과는 배경 돌연변이체 dsDNA 1의 LwC2c2 절단이 0.1% 대립유전자 분획에서 표적-적중 dsDNA의 강건한 검출을 가능하게 하도록 충분히 낮다는 것을 보여준다. 0.1% 미만의 수준에서, 배경 활성은 아마도 올바른 표적의 임의의 추가의 유의한 검출을 막게 되는 문제일 것이다.
어세이가 임상적으로 관련된 범위에서 대립유전자 분획을 갖는 합성 표적을 감지할 수 있기 때문에, 어세이가 cfDNA에서 암 돌연변이를 검출할 수 있는지 여부를 평가하였다. 2종의 상이한 암 돌연변이, EGFR L858R 및 BRAF V600E에 대한 RPA 프라이머를 디자인하였고, 상업적 cfDNA 표준은 시험하려는 실제 인간 cfDNA 샘플을 닮은 5%, 1%, 및 0.1%의 대립유전자 분획으로 사용하였다. 야생형 대립유전자와 돌연변이체 대립유전자를 구별할 수 있는 crRNA의 쌍을 사용하여 (도 38C), 돌연변이체 유전자좌 둘 모두에 대한 0.1% 대립유전자 분획의 검출을 달성하였다 (도 39 A-B).
고찰
등온성 증폭 및 소광된 형광 프로브와 C2c2의 천연 특성을 조합함으로써, 본 명세서에 개시된 어세이 및 시스템은 RNA 및 DNA를 검출하기 위한 다재다능하고, 강건한 방법으로서, 감염성 질환 적용 및 신속한 유전자형 분석을 포함한 다양한 신속 진단에 적합하다는 것이 입증되었다. 본 명세서에 개시된 어세이 및 시스템의 주요 장점은 새로운 POC 시험이 $0.6/시험 정도로 낮은 비용으로 수일 내에 재디자인되고 합성될 수 있다는 것이다.
많은 인간 질환 적용이 단일 미스매치를 검출하는 능력을 필요로 하므로 crRNA의 스페이서 서열에 합성 미스매치를 도입시켜 표적 서열 내 단일 미스매치에 고도로 특이적이도록 crRNA를 조작하여 합리적인 접근법을 개발하였다. CRISPR 이펙터에 의해 특이도를 획득하기 위한 다른 접근법은 수십여개의 가이드 디자인에 대한 스크리닝-기반 방법에 의존적이다 (Chavez et al., 2016). 디자인된 미스매치 crRNA를 사용하여, 단일 미스매치가 상이한 부위에서 지카 및 뎅기 바이러스 균주의 구별, 인간 타액 gDNA로부터 SNP의 신속한 유전자형 분석, 및 cfDNA 샘플에서 암 돌연변이의 검출을 입증하였다.
어세이 플랫폼의 저비용 및 적용성은 그 자체로 (i) 특이적 qPCR 어세이, 예컨대 Taqman을 대신하여 일반적인 RNA/DNA 정량 경험, (ii) 마이크로어레이와 유사한 신속한, 다중 RNA 발현 검출, 및 (iii) 다른 민감한 검출 적용, 예컨대 식품 중 다른 공급원 유래 핵산 오염의 검출을 포함하는, 추가 적용에 제공된다. 추가적으로, C2c2는 잠재적으로 생물학적 환경, 예컨대, 세포에서 전사물의 검출을 위해 사용될 수 있고, C2c2 검출의 고도로 특이적인 성질을 고려하면, 살아있는 세포에서 질환-연관된 돌연변이 또는 전사물의 대립유전자 특이적 발현을 추적하는 것이 가능할 수 있다. 압타머의 광범위한 이용가능성에 의해, 압타머에 의한 단백질 검출을 RPA 를 위한 암호화된 증폭 부위의 노출 및 이어서 C2c2 검출과 결합함으로써 단백질을 감지하는 것이 또한 가능할 수 있다.
CRISPR-Cas13a/C2c2에 의한 핵산 검출: 아토몰라 감도 및 단일 뉴클레오티드 특이도
강건한 신호 검출을 획득하기 위해서, 출원인은 렙토트리키아 샤히이 (LshCas13a)에 비해 더 큰 RNA-가이드된 RNase 활성을 나타내는, 렙토트리키아 웨이데이 (LwCas13a) 유래 Cas13a의 오솔로그를 동정하였다 (10) (도 2, 또한 상기 "LwCas13a 요건의 특징규명" 참조). ssRNA 표적 1 (ssRNA 1), crRNA, 및 리포터 (소광된 형광 RNA)와 인큐베이션된 LwCas13a (도 18) (13)는 ∼50 fM의 검출 감도를 산출하였고 (도 51, 15), 이것은 많은 진단 적용에 충분하게 민감하지 않다 (12, 14-16). 그러므로 출원인은 Cas13a-based 검출과 상이한 등온성 증폭 단계의 조합을 조사하였다 (도 10, 11, 53, 16) (17, 18). 조사된 방법 중에서, 리콤비나제 중합효소 증폭 (RPA) (18)은 최대 감도를 제공하였고 LwCas13a에 의한 후속 검출을 위해 증폭된 DNA를 RNA로 전환시키기 위한 T7 전사와 커플링될 수 있다 (역시 상기 "리콤비나제 중합효소 증폭 (RPA) 및 다른 등온성 증폭 전략의 설명" 참조). 출원인은 RPA 에 의한 증폭, 증폭된 DNA 의 RNA 로의 T7 RNA 중합효소 전사, 및 리포터 신호의 Cas13a 부차적 RNA 절단-매개 방출에 의한 표적 RNA의 검출의 이러한 조합을 SHERLOCK 으로서 언급한다.
출원인은 먼저 RNA (역전사와 커플링될 때) 또는 DNA 표적의 검출에 대한 SHERLOCK 의 감도를 확인하였다. 출원인은 디지털-액적 PCR (ddPCR)에 의해 검증된 바와 같이 RNA 와 DNA 에 대한 단일 분자 감도를 획득했다 (도 27, 51, 54A, B). 모든 SHERLOCK 성분을 단일 반응으로 조합했을 때 아토몰라 감도가 유지되어, 이 플랫폼의 POC (point-of-care) 진단으로서의 실행가능성을 입증했다 (도 54C). SHERLOCK은 2종의 확립된 민감한 핵산 검출 접근법, ddPCR 및 정량적 PCR (qPCR) 과 유사한 수준의 감도를 가지고 있는 반면, RPA 단독은 낮은 수준의 표적을 검출하기에 충분히 민감하지 않았다 (도 55A-D). 또한, SHERLOCK 은 반복 실험에 걸친 변동 계수에 의해 측정될 때 ddPCR, qPCR 및 RPA 보다 적은 변동을 보인다 (도 55E-F).
다음으로 출원인은 SHERLOCK이 높은 감도를 요구하는 전염성 질환 적용분야에서 효과적인지 여부를 조사하였다. 출원인은 지카 바이러스 (ZIKV) 또는 관련 플라비바이러스 뎅기 (DENV)의 게놈 단편을 보유하는 렌티바이러스를 생산하였다 (19) (도 31A). SHERLOCK은 바이러스 입자를 2 aM 까지 검출했으며 ZIKV 와 DENV 를 구별할 수 있었다 (도 31B). 현장에서 SHERLOCK의 잠재적인 사용을 조사하기 위해, 출원인은 먼저 동결 건조 후 재수화된 Cas13acrRNA 복합체 (20)가 20 fM 의 비증폭 ssRNA 1을 검출할 수 있고 (도 33A) 또한 유리 섬유 종이에서 표적 검출이 가능함을 입증했다 (도 33B). SHERLOCK 의 다른 성분들도 동결 건조가 가능하다: RPA는 상온에서 동결 건조된 시약으로 제공되며, 출원인은 이전에 T7 중합효소가 동결 건조를 견딜 수 있음을 입증했다 (2). 동결-건조 및 종이-점적 조합에서, Cas13a 검출 반응은 수성 반응으로서 ssRNA 1의 비슷한 수준의 민감한 검출을 초래하였다 (도 33C-E). 종이-점적 및 동결 건조는 판독의 절대 신호를 약간 감소시켰지만, SHERLOCK (도 31C) 은 20 aM 의 낮은 농도에서 모의 ZIKV 바이러스를 쉽게 검출할 수 있었다 (도 31D). SHERLOCK 은 또한 역가가 2 x 103 카피수/mL (3.2 aM) 만큼 낮을 수 있는 임상 단리물 (혈청, 소변 또는 타액)에서 ZIKV 를 검출할 수 있다 (21). 환자 혈청 또는 소변 샘플에서 추출하여 cDNA 로 역전사된 ZIKV RNA (도 32E 및 52A)는 qPCR 에 의해 검증된 바와 같이 1.25 x 103 카피수/mL (2.1 aM) 까지의 농도에서 검출될 수 있었다 (도 32F 및 52B). 게다가, 환자 샘플로부터의 신호는 ZIKV RNA 카피 개수를 예측했고, 바이러스 존재량을 예측하는데 사용될 수 있었다 (도 33F). 핵산 정제 없이 샘플 검출을 모의시험하기 위해, 출원인은 인간 혈청에 혼합된 ssRNA 1 의 검출을 측정했고, Cas13a가 2% 혈청을 함유하는 반응에서 RNA를 검출할 수 있음을 발견했다 (도 33G). 본 명세서에 개시된 구현예에 대한 다른 중요한 역학 적용분야는 박테리아 병원체의 동정 및 특별한 박테리아 유전자의 검출이다. 출원인은 보존된 측접 영역이 범용 RPA 프라이머가 박테리아 종 전반에서 사용될 수 있고 가변 내부 영역이 종의 분화를 허용하는, 16S rRNA 유전자 V3 영역을 표적으로 삼았다. 이. 콜라이 및 슈도모나스 애루지노사로부터 단리된 gDNA 및 상이한 병원성 균주에 대한 5종의 가능한 표적화 crRNA의 패널에서 (도 34A), SHERLOCK 은 균주를 올바르게 유전자형분석했으며 낮은 교차 반응성을 보였다 (도 34B). 추가로, 출원인은 SHERLOCK 을 사용하여 2종의 상이한 내성 유전자: 클렙시엘라 뉴모니아 카르바페나마제 (KPC)와 뉴델리 메탈로-베타-락타마제1 (NDM-1)로 클렙시엘리 뉴모니아의 임상 단리주를 구별할 수 있었다 (도 56).
SHERLOCK 의 특이도를 증가시키기 위해서, 출원인은 LwCas13a가 단일-염기 미스매치가 상이한 표적을 구별할 수 있게 하는, crRNA:표적 듀플렉스에 합성 미스매치를 도입했다 (도 36A, B; 상기 "조작된 미스매치의 디자인" 참조). 출원인은 ZIKV 의 아프리카 또는 아메리카 균주 (도 37A) 및 DENV 의 균주 1 또는 3 을 검출하기 위해 스페이서 서열에 합성 미스매치를 갖는 다수의 crRNA를 디자인하였다 (도 37C). 합성 미스매치 crRNA는 오프-표적 균주보다 유의하게 더 높은 신호 (양측 스튜던트 t-검정; p < 0.01)로 상응하는 균주를 검출하여, 단일 미스매치에 기반한 강력한 균주 구별을 가능하게 한다 (도 37B, D, 36C). 추가의 특징규명은 Cas13a 검출이 돌연변이가 스페이서의 위치 3 에 있고 합성 미스매치가 위치 5 에 있을 때 온-표적 민감도를 유지하면서 최대 특이도를 달성한다는 것을 밝혀냈다 (도 57 및 58). 단일-염기 차이를 검출하는 능력은 신속한 인간 유전자형 분석을 위해 SHERLOCK 을 사용할 수 있는 기회를 열어준다. 출원인은 광범위한 건강-관련 단일-뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 포괄하는 5개 유전자좌를 선택하였고 (표 1) 이들 SNP에서 금본위 표준으로서 23andMe 유전자형분석 데이터를 사용하여 SHERLOCK 검출을 벤치마킹하였다 (23) (도 38A). 출원인은 관심 유전자좌에 걸쳐 다양한 유전자형을 갖는 4명 인간 대상체로부터 타액을 채취하였고, 상업적 컬럼 정제 또는 5분간 직접 가열을 통해서 게놈 DNA를 추출하였다 (20). SHERLOCK은 동형접합 및 이형접합 유전자형 둘 모두를 추론하기에 충분한 특이도 및 높은 유의성으로 대립유전자를 구별하였다 (도 38B, 40, 59, 60; 또한 "합성 표준물을 사용한 SHERLOCK에 의한 유전자형 분석" 참조). 마지막으로, 출원인은 환자 혈액 중 높은 야생형 DNA의 수준 때문에 도전이 되는, 세포 무함유 (cf) DNA 단편에서 낮은 빈도의 암 돌연변이를 SHERLOCK이 검출할 수 있는지 여부를 결정하고자 하였다 (24-26). 출원인은 먼저 SHERLOCK이 게놈 DNA의 배경에서 희석된 아토몰라 농도에서 ssDNA 1을 검출할 수 있다는 것을 확인하였다 (도 61). 다음으로, 출원인은 SHERLOCK이 또한 임상적으로 관련있는 범위인, 0.1% 정도로 낮은 배경 DNA 수준에서 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)-함유 대립유전자를 검출할 수 있다는 것을 확인하였다 (도 41A, B). 출원인은 0.1% 만큼 낮은 대립유전자 분획을 갖는 모의군 cfDNA 샘플에서, 2종의 상이한 암 돌연변이, EGFR L858R 및 BRAF V600E를 검출할 수 있다는 것을 입증하였다 (도 38,39) (20).
SHERLOCK 플랫폼은 그 자체로 (i) 특이적 qPCR 어세이, 예컨대 TaqMan 대신 일반적인 RNA/DNA 정량, (ii) 신속한, 복합 RNA 발현 검출, 및 (iii) 다른 민감한 검출 적용분야, 예컨대 핵산 오염의 검출을 포함하는 추가 적용분야에 적합하다. 추가적으로, Cas13a는 잠재적으로 생물학적 환경 내에서 전사물을 검출할 수 있었고 살아있는 세포 내 질환-연관 돌연변이 또는 전사물의 대립유전자-특이적 발현을 추적할 수 있었다. SHERLOCK이 감염성 질환 적용분야 및 민감한 유전자형 분석을 포함하는 신속한 진단에 적합한, RNA 및 DNA를 검출하기 위한 다재다능하고, 강건한 방법이라는 것을 보여주었다. SHERLOCK 종이 검사는, 거의 모든 시험된 crRNA가 높은 감도 및 특이성을 야기시켰으므로, 신뢰를 갖고, 수일 내에 $0.61/시험 정도로 낮은 비용으로 재디자인 및 합성될 수 있다 (상기 "SHERLOCK는 입수가능하고, 적합화가능한 CRISPR-Dx 플랫폼이다" 참조). 이들 품질은 CRISPR-Dx의 능력을 강조하고 생물학적 분자의 신속하고, 강건하며 민감한 검출을 위한 새로운 길을 열어준다.
표 16: 사용된 RPA 프라이머
표 17: 사용된 crRNA 서열
표 18: 본 실시예에서 사용된 RNA 및 DNA 표적
표 19: 본 실시예에서 사용된 플라스미드
실시예 3 - 직교성 염기 선호도를 갖는 Cas13b 오솔로그의 특징규명
출원인은 SHERLOCK 검출 기술을 개선시키기 위한 새로운 후보를 찾기 위해 최근에 규명된 RNA-가이드된 RNA-표적화 효소의 VI형 CRISPR-Cas13b 패밀리의 14종 오솔로그를 생화학적으로 특징규명하였다 (도 83A 및 85). 출원인은 이. 콜라이에서 14종 Cas13b 오솔로그를 이종성으로 발현시킬 수 있었고 시험관내 RNase 활성 어세이를 위해 단백질을 정제할 수 있었다 (도 86). 상이한 Cas13 오솔로그가 최적 절단 활성을 위한 다양한 염기 선호도를 가질 수 있기 때문에, 출원인은 직교성 절단 선호도를 평가하기 위해서, 5 As, Gs, Cs, 또는 Us로 이루어진 형광성 RNase 동종중합체 센서를 생성시켰다. 출원인은 각각의 오솔로그를 합성 173 nt ssRNA 1을 표적화하는 이의 동족 crRNA와 인큐베이션시켰고 동종중합체 형광 센서를 사용해 부차적 절단 활성을 측정하였다 (도 83B 및 87).
실시예 4 - 라이브러리를 사용한 모티프 발굴 스크린
다양한 Cas13a 및 Cas13b 오솔로그의 절단 선호도의 다양성을 더욱 조사하기 위해서, 출원인은 부차적 활성에 대응하여 엔도뉴클레아제 활성에 대해 바람직한 모티프를 특징규명하기 위한 라이브러리-기반 접근법을 개발하였다. 출원인은 미절단 서열의 증폭 및 판독을 허용하는, 불변 DNA 핸들이 측접된 축퇴성 6-량체 RNA 리포터를 사용하였다 (도 83C). 이러한 라이브러리와 부차적 활성화된 Cas13 효소의 인큐베이션은 검출가능한 절단을 야기시켰고 표적 RNA의 첨가에 의존적이었다 (도 88). 감손된 모티프의 시퀀싱은 염기-선호도를 의미하는, 분해 시간 전반에서 라이브러리의 왜곡 증가를 밝혀주었고 (도 89A), 한계 비율 이상의 서열 선택은 효소의 절단에 해당하는 수의 농축된 서열을 생성시켰다 (도 89B). 농축된 모티프로부터의 서열 로고는 LwaCas13a 및 CcaCas13b에 대해 관찰된 U-선호도 및 PsmCas13b에 대해 관찰된 A-선호도를 재현하였다 (도 89C). 출원인은 또한 독립적 판독을 허용하기 위해서, 다른 것들은 아니고, 오직 하나의 오솔로그에 대해 절단을 보인 다수의 서열을 결정하였다 (도 89D). 효소 선호도의 특별한 하위-모티프를 이해하기 위해서, 출원인은 단일-염기 선호도에 대해 감소된 모티프를 분석하였고 (도 90A), 이것은 시험된 동종중합체 모티프뿐만 아니라 2-염기 모티프와 일치하였다 (도 83C 및 90B). 이들 2 염기 모티프는 TA, GA 및 AT 2염기 서열을 선호하는, 특히 LwaCas13a 및 PsmCas13b 경우에 보다 복잡한 선호도를 밝혀준다. 고차원 모티프는 또한 추가 선호도를 밝혀주었다 (도 91 및 92).
출원인은 표적의 시험관내 분해로 LwaCas13a, PsmCas13b, 및 CcaCas13b의 부차적 선호도를 확인하였다 (도 93). PsmCas13b의 약한 분해를 개선시키기 위해서, 출원인은 완충액 조성 및 효소 농도를 최적화시켰다 (도 94A, B). PsmCas13b 및 Cas13b 오솔로그에 대해 시험된 다른 2가 양이온은 큰 효과를 갖지 않았다 (도 95A-F). 출원인은 또한 2개 RNA 표적에 대해 이전에 특징규명된 A-선호도 Cas13 패밀리와 PsmCas13b를 비교하였고, 비슷하거나 또는 개선된 감소를 확인하였다 (도 96A, B). 이들 결과로부터, 출원인은 독립 리포터를 사용하는 개별 반응으로, LwaCas13a 및 PsmCas13b의 동역학을 비교하였고, 2개 채널 간에 낮은 수준의 누화를 확인하였다 (도 83D).
실시예 5 - LwaCas13a, PsmCas13b, AND CcaCas13b에 의한 단일 분자 검출
SHERLOCK 기술의 핵심 특성은 LwaCas13a 부차적 RNase 활성에 의한 단일 분자 검출 (2 aM 또는 1 분자/㎕)을 가능하게 한다는 것이다. Cas13b 효소의 감도를 특징규명하기 위해서, 출원인은 PsmCas13b 및 CcaCas13b, 우리딘 선호도를 갖는 다른 고도의 활성 Cas13b 효소로 SHERLOCK을 수행하였다 (도 83E). 출원인은 LwaCas13a, PsmCas13b, 및 CcaCas13b가 2종의 상이한 RNA 표적, ssRNA 1 및 합성 지카 ssRNA의 2 aM 검출을 달성할 수 있다는 것을 확인하였다 (도 83E; 97, 및 98). 이들 3종 효소에 의한 표적화의 강건성을 조사하기 위해서, 출원인은 ssRNA 1에 걸쳐 고르게 간격을 차지하는 11종의 상이한 crRNA를 디자인하였고 LwaCas13a가 가장 일관적으로 신호 검출을 수행하는데 반해, CcaCas13b 및 Psmcas13b 둘 모두는 crRNA 마다 검출에서 더 많은 가변성을 보였다는 것을 확인하였다 (도 99). 검출을 위한 최적 crRNA를 동정하기 위해서, 출원인은 PsmCas13b 및 CcaCas13b의 스페이서 길이를 34 내지 12 nt로 다양화시켰고 PsmCas13b가 30의 스페이서 길이에서 최고 감도를 가졌고 그에 반해 CcaCas13b는 28 nt 이상의 스페이서 길이에서 동등한 감도를 가졌다 (도 100). 출원인은 또한 SHERLOCK으로의 더 큰 샘플 투입 부피를 허용하게, 검출 한계가 2 aM을 초과할 수 있는가를 시험하였다. 사전-증폭 RPA 단계의 규모 확대를 통해서, 출원인은 LwaCas13a 및 PsmCas13b 둘 모두가 200, 20, 및 2 zM 투입 샘플에 대해 유의한 검출 신호를 제공할 수 있고 250 ㎕ 및 540 ㎕의 투입 부피를 허용한다는 것을 확인하였다.
실시예 6 - RPA에 의한 정량적 SHERLOCK
SHERLOCK이 기하급수적 증폭에 의존하므로, 핵산의 정확한 정량이 어려울 수 있다. 출원인은 RPA 단계의 효율 감소가 투입량 및 SHERLOCK 반응의 신호 간 상관성을 개선시킬 수 있다고 가정하였다. 출원인은 SHERLOCK 검출의 동역학이 광범위한 샘플 농도에 걸쳐 프라이머 농도에 매우 민감하였다는 것을 관찰하였다 (도 101A-D). 출원인은 프라이머 농도를 희석하여, 신호와 정량적 정확도 둘 모두를 증가시켰다 (도 83G 및 101E). 이러한 관찰은 프라이머-이량체 형성의 감소에 기인할 수 있고, 포화를 방지하면서 보다 효과적인 증폭을 허용할 수 있다. 120 nM의 프라이머 농도가 신호와 투입물 간 최대 상관성을 나타냈다 (도 101F). 이러한 정확도는 아토콜라 범위에 이르기까지 큰 범위의 농도에 걸쳐 지속가능하였다 (도 83H 및 101G).
실시예 7 - 직교성 Cas13 오솔로그에 의한 2색상 다중화
핵산 진단의 유리한 특성은 다중화 검출 패널 또는 샘플 대조군에서 허용되는, 다수 샘플 투입물을 동시에 검출하는 능력이다. Cas13 효소의 직교성 염기 선호도는 다중화 SHERLOCK을 가질 기회를 제공한다. 출원인은 상이한 염기 정체 및 형광단 색상의 형광성 동종중합체 센서를 통해 동일 반응에서 상이한 Cas13 효소의 부차적 활성을 검정할 수 있어서, 다수 표적을 동시에 측정할 수 있게 한다 (도 84A). 이러한 개념을 입증하기 위해서, 출원인은 지카 바이러스 ssRNA에 대한 LwaCas13a crRNA 및 뎅기 바이러스 ssRNA에 대한 PsmCas13b crRNA를 디자인하였다. 출원인은 동일 반응에서 Cas13-crRNA 복합체의 양쪽 세트를 사용한 어세이가 지카 또는 뎅기 RNA, 또는 둘 모두가 반응에 존재하는가를 확인할 수 있다는 것을 확인하였다 (도 84B). 출원인은 또한 CcaCas13b 및 PsmCas13b 간 직교성 선호도 때문에, 이들 2개 효소가 또한 지카 및 뎅기 표적의 다중 검출에 활용될 수 있다는 것을 확인하였다 (도 102). 출원인은 다중 RPA 프라이머 및 Cas13-crRNA 복합체 둘 모두를 함유하는, 전체 SHERLOCK 반응에 대해 이러한 개념을 성공적으로 확대시킬 수 있었다. 출원인은 피. 애루지노사에 대한 LwaCas13a crRNA 및 S. 아우레우스에 대한 PsmCas13b crRNA를 디자인하였고 아토몰라 범위에 이르기까지 양쪽 DNA 표적을 검출할 수 있었다 (도 84C). 유사하게, PsmCas13b 및 LwaCas13a를 사용하여, 출원인은 SHERLOCK을 사용한 지카 및 뎅기 RNA의 아토폴라 다중화 검출을 달성할 수 있었다 (도 103).
출원인은 LwaCas13a가 단일 뉴클레오티드 변이체 검출을 할 수 있었고 이것을 인간 타액에 대한 신속한 유전자형 분석에 적용할 수 있다는 것을 확인하였지만, 검출은 각각의 대립유전자-감지 crRNA에 대해 하나씩, 2개의 개별 반응을 요구하였다. 단일-반응 SHERLOCK 유전자형 분석을 가능하게 하기 위해서, 출원인은 노로바이러스 내성과 연 관된 알파(1,2)-푸코실트랜스퍼라제 FUT2 유전자의 변이체, rs601338 SNP의 G-대립유전자에 대한 LwaCas13a crRNA 및 A-대립유전자에 대한 PsmCas13b crRNA를 디자인하였다. 이러한 단일-샘플 다중화 접근법을 사용하여, 출원인은 그들의 타액을 사용해 4명의 다른 인간 대상체를 성공적으로 유전자형분석할 수 있었고 그들이 동형접합 또는 이형접합인지를 정확하게 확인할 수 있었다.
Cas13 효소 패밀리의 다재다능성을 더욱 보여주기 위해서, 출원인은 동반 진단 및 요법 그 자체로 제공되는 Cas13을 포함하는 치료 접근법을 모의시험하였다. 출원인은 최근에 REPAIR (RNA Editing for Programmable A to I Replacement)라고 불리는 시스템을 사용하여, 유전 질환의 돌연변이를 교정하는데 사용할 수 있는, 전사물의 프로그램가능한 RNA 편집을 위한 PspCas13b를 개발하였다. 치료 판단을 안내하거나 또는 치료 결과를 모니터링하기 위해서 요법과 결합했을 때 진단이 매우 유용할 수 있으므로, 출원인은 SHERLOCK을 REPAIR 치료를 가이드하기 위한 유전자형 분석을 위해서, 그리고 또한 요법의 편집 효율을 추적하기 위해 편집된 RNA에 대한 판독으로서 사용할 수 있다고 생각하였다 (도 84E). 출원인은 대장 및 직장에 암을 포함하는 유전 질병인, 가족성 선종성 용종증 1의 APC 돌연변이 (APC:c.1262G>A)를 교정하기 위해 이러한 테라노스틱 개념을 입증하는 것을 선택하였다. 출원인은 APC 유전자의 건강 및 돌연변이체 cDNA를 디자인하였고 이들로 HEK293FT 세포를 형질감염시켰다. 출원인은 이들 세포로부터 DNA를 회수할 수 있었고 LwaCas13a 및 Psmas13b에 의한 단일-샘플 다중화 SHERLOCK을 사용해 올바른 샘플을 성공적으로 유전자형 분석할 수 있었다 (도 84F). 동시에, 출원인은 REPAIR 시스템을 위한 가이드 RNA를 디자인하고 클로닝하였으며 가이드 RNA 및 dPspCas13b-ADAR2dd(E488Q) REPAIR 시스템으로 질환 유전자형을 갖는 세포를 형질감염시켰다. 48시간 후에, 출원인은 RNA를 회수하였고, 출원인은 이것을 편집 결과를 검출하기 위한 SHERLOCK 용 투입물 및 편집율을 확인하기 위한 차세대 시퀀싱 (NGS) 용 투입물로 분할하였다. 시퀀싱은 출원인이 REPAIR 시스템을 사용해 43% 편집율을 획득하였고 (도 84G) 건강-감지 crRNA가 비표적화 가이드 대조 조건에 비해 높은 신호를 보였고 질환-감지 crRNA가 신호 감소를 보였으므로 SHERLOCK을 통해 이를 검출할 수 있다는 것을 밝혀주었다 (도 84H 및 104). 전체적으로 이 어세이를 위한 시약의 디자인 및 합성은 3일이 걸렸고, 유전자 분석은 1일이 걸렸으며, REPAIR에 의한 교정 및 편집율 감지는 3일이 걸려서, 오직 7일간 지속되는 전체 테라노스틱 파이프라인을 산출하였다.
출원인은 렙토트리키아 웨이데이 유래 VI형 RNA-가이드된 RNA-표적화 CRISPR-Cas13a 오솔로그를 사용한 핵산의 고도로 민감하고 특이적인 검출을 입증하였다. 출원인은 Cas13b 효소 패밀리가 생화학적으로 활성이고 SHERLOCK에 의한 핵산의 다중 검출을 처리할 수 있는 독특한 성질을 갖는다는 것을 더욱 확인하였다. Cas13b 효소의 직교성 염기 선호도를 특징규명하여, 출원인은 LwaCas13a가 인지하지 못하는 PsmCas13b가 인지하는 형광성 RNA 센서의 특이적 서열을 확인하였다. 출원인은 2종의 상이한 표적의 샘플 내 다중화 검출을 가능하게 만드는 이들 염기 선호도를 활용할 수 있었고 바이러스 균주의 구별 및 개체의 유전자형 분석을 위한 이러한 특성의 유용성을 확인할 수 있었다. 추가로, 사전-증폭 단계의 조작을 통해서, SHERLOCK을 정량적으로 만들어서, 투입 핵산 농도의 개산 또는 정량을 가능하게 할 수 있다. 출원인은 추가로 직교성 PsmCas13b가 단일 분자 검출을 할 수 있고, 규모 확대를 통해서 출원인이 ∼0.5 mL 이하 및 2 zM 농도까지 샘플의 검출을 수행할 수 있다는 것을 확인하였다.
SHERLOCK에 의한 다중화 검출은 다수 반응을 공간적으로 수행하여 가능하지만, 직교성 염기 선호도를 통한 샘플 내 다중화는 보다 저렴한 비용으로 규모에 맞게 많은 표적을 검출할 수 있게 한다. 출원인이 여기서 2-투입물 다중화를 보여주었지만, 절단 모티프 스크린은 추가의 직교성 절단 센서의 디자인을 가능하게 한다 (도 90). LwaCas13a 및 CcaCas13b는 둘 모두 동일한 우리딘 동종중합체를 절단하고 따라서 동중중합체 센서를 통해 측정시에 직교성이 아니며 (도 83B), 모티프 스크린을 통해 매우 독특한 절단 선호도를 보여주었다 (도 90). 추가의 Cas13a, Cas13b, 및 Cas13c 오솔로그를 스크리닝함으로써, 아마도 많은 오솔로그는 독특한 6-량체 모티프 선호도를 밝혀줄 것이고, 이것은 이론적으로 스펙트럼이 독특한 형광성 센서의 개수에 의해서만 고도의-다중화 SHERLOCK을 제한하게 할 것이다. 고도의 다중화 SHERLOCK은 특히 복합 투입물 감지 논리적 계산을 포함하여, 많은 기술적 적용을 가능하게 한다.
가시적이고, 보다 민감하며, 다중화된 판독을 위한 Cas13-기반 검출의 이들 추가의 개량은 특히 휴대가능하고 장비-부재 분석이 필요한 상황에서, 핵산 검출을 위한 증가된 적용을 가능하게 한다. 신속한 다중 유전자형 분석은 약리유전체학 판단에 정보를 제공할 수 있거나, 현장에서 다수 작물 형질을 시험할 수 있거나, 또는 동발생 병원체 존재를 평가할 수 있다. 신속한, 등온 판독은 순환성 DNA와 같은 희귀종의 경우더라도, 전력 또는 휴대용 판독기를 이용할 수 없는 상황에서 이러한 검출의 접근가능성을 증가시킨다. 개선된 CRISPR-기반 핵산 검사는 농업에서 핵산의 존재, 병원체 검출, 및 만성 질환을 이해하는 것을 더 쉽게 만든다.
실시예 8 - SHERLOCK 비색 검출
DNA 사중체가 생물분자 피분석물 검출에 사용될 수 있다 (도 107). 한 경우에, OTA-압타머 (파란색)는 OTA를 인식하여, 입체형태 변화를 초래해 사중체 (빨간색)를 노출시켜 헤민에 결합되게 한다. 헤민-사중체 복합체는 퍼옥시다제 활성을 가져서, TMB 기질을 유색 형태 (일반적으로 용액 중에서 파란색)로 산화시킬 수 있다. 출원인은 본 명세서에 기술된 부차적 활성의 일부로서 Cas13이 분해할 수 있는 이들 사중체의 RNA형태를 생성시켰다. 분해는 RNA 압타머의 손실을 초래하여서, 핵산 표적 ?事? 하에서 색상 신호의 손실을 초래한다. 예시적인 2개 디자인을 하기에 예시한다.
구아닌은 사중체 구조를 생성하는 핵심 염기쌍을 형성하고 이것이 헤민 분자에 결합한다. 출원인은 디-뉴클레오티드 데이터가 구아닌이 불충분하게 분해한다는 것을 보여주므로 Cas13이 사중체를 분해할 수 있도록 우리딘 (굵은체로 표시)과 구아닌의 세트를 배치하였다.
출원인은 2가지 상이한 농도에서 2종 암타머 디자인을 시험하였다 (도 108). 낮은 100 nM 농도는 색상 형성에 충분하지 않았다. 400 nM 조건은 색상을 형성하였다. 이 분석에 대응하는 흡광도 데이터가 또한 정량화되었다 (도 109). 특히, 디자인 1은 B9의 경우에 최적 결과를 가졌고 디자인 2는 Lwa의 경우에 최적 결과를 가졌다.
출원인은 비색 변화의 안정성을 더욱 시험하였다 (도 110). Cas13 비색 변화는 1시간 후에 안정하다. LwaCas13a 비색 신호는 1시간에 걸쳐 안정한 반면Cas13b9 색상 편차는 덜 안정하다. 출원인은 100 nM 압타머 농도에서도 Cas13b9에 대해 작동한다는 것을 관찰하였는데 1시간 후에 색상이 기질 산화로 인해 생성될 수 있어서 색산 차이를 관찰할 수 있기 때문이다.
출원인은 비색 검출과 형광 검출을 비교하였다 (도 111). 양쪽 시스템으로 2 aM 농도를 검출할 수 있었지만, 배경치 대비 형광도 증가가 배경치 대비 비색 검출의 감소에 비해 낮았다. 이것은 비색 어세이가 더 민감한 결과를 제공할 수 있다는 것을 의미한다.
비색 어세이는 본 명세서에 기술된 바와 같은 진단 어세이에서 사용을 위해 적용가능하다. 일 구현예에서, 사중체를 시험 샘플 및 Cas13 SHERLOCK 시스템과 인큐베이션시킨다. 표적 서열의 Cas13 식별을 허용하고 부차적 활성에 의한 압타머의 분해를 위한 인큐베이션 기간 이후에, 기질을 첨가할 수 있다. 그러고 나서 흡광도를 측정할 수 있다. 다른 구현예에서, 기질을 Cas13 SHERLOCK 시스템과 함께 어세이에 포함시킨다.
***
본 발명의 기술된 방법, 약학 조성물 및 키트의 다양한 변형 및 이형은 본 발명의 범주 및 사조를 벗어나지 않고 당업자에게 분명해질 것이다. 본 발명이 특별한 구현예와 함께 기술되어 있지만, 더욱 변형될 수 있고 청구되는 본 발명이 이러한 특별한 구현예에 과도하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해하게 될 것이다. 실제로, 당업자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위해 기술된 방식의 다양한 변형은 본 발명의 범주 내에 포함하고자 한다. 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리에 따른 본 발명의 임의의 이형, 용도, 또는 개조를 포괄하고자 하고 본 개시내용으로부터의 이러한 이탈의 포함은 본 발명이 속하는 분야 내에서 공지의 통상적인 관례 내이고 이전에 기재된 본 명세서의 본질적인 특성에 적용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> The BROAD Institute, Inc.
Massachusetts Institute of Technology
The President and Fellows of Harvard College
Abudayyeh, Omar
Gootenberg, Jonathan
Zhang, Feng
<120> CRISPR Effector System Based Diagnostics
<130> BROD-2505WP
<150> US 62/623,531
<151> 2018-01-29
<160> 622
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1440
<212> PRT
<213> Leptotrichia shahii
<400> 1
Met Gly Asn Leu Phe Gly His Lys Arg Trp Tyr Glu Val Arg Asp Lys
1 5 10 15
Lys Asp Phe Lys Ile Lys Arg Lys Val Lys Val Lys Arg Asn Tyr Asp
20 25 30
Gly Asn Lys Tyr Ile Leu Asn Ile Asn Glu Asn Asn Asn Lys Glu Lys
35 40 45
Ile Asp Asn Asn Lys Phe Ile Arg Lys Tyr Ile Asn Tyr Lys Lys Asn
50 55 60
Asp Asn Ile Leu Lys Glu Phe Thr Arg Lys Phe His Ala Gly Asn Ile
65 70 75 80
Leu Phe Lys Leu Lys Gly Lys Glu Gly Ile Ile Arg Ile Glu Asn Asn
85 90 95
Asp Asp Phe Leu Glu Thr Glu Glu Val Val Leu Tyr Ile Glu Ala Tyr
100 105 110
Gly Lys Ser Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ile Thr Lys Lys Lys Ile
115 120 125
Ile Asp Glu Ala Ile Arg Gln Gly Ile Thr Lys Asp Asp Lys Lys Ile
130 135 140
Glu Ile Lys Arg Gln Glu Asn Glu Glu Glu Ile Glu Ile Asp Ile Arg
145 150 155 160
Asp Glu Tyr Thr Asn Lys Thr Leu Asn Asp Cys Ser Ile Ile Leu Arg
165 170 175
Ile Ile Glu Asn Asp Glu Leu Glu Thr Lys Lys Ser Ile Tyr Glu Ile
180 185 190
Phe Lys Asn Ile Asn Met Ser Leu Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Ile Ile
195 200 205
Glu Asn Glu Thr Glu Lys Val Phe Glu Asn Arg Tyr Tyr Glu Glu His
210 215 220
Leu Arg Glu Lys Leu Leu Lys Asp Asp Lys Ile Asp Val Ile Leu Thr
225 230 235 240
Asn Phe Met Glu Ile Arg Glu Lys Ile Lys Ser Asn Leu Glu Ile Leu
245 250 255
Gly Phe Val Lys Phe Tyr Leu Asn Val Gly Gly Asp Lys Lys Lys Ser
260 265 270
Lys Asn Lys Lys Met Leu Val Glu Lys Ile Leu Asn Ile Asn Val Asp
275 280 285
Leu Thr Val Glu Asp Ile Ala Asp Phe Val Ile Lys Glu Leu Glu Phe
290 295 300
Trp Asn Ile Thr Lys Arg Ile Glu Lys Val Lys Lys Val Asn Asn Glu
305 310 315 320
Phe Leu Glu Lys Arg Arg Asn Arg Thr Tyr Ile Lys Ser Tyr Val Leu
325 330 335
Leu Asp Lys His Glu Lys Phe Lys Ile Glu Arg Glu Asn Lys Lys Asp
340 345 350
Lys Ile Val Lys Phe Phe Val Glu Asn Ile Lys Asn Asn Ser Ile Lys
355 360 365
Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Ala Glu Phe Lys Ile Asp Glu Leu Ile
370 375 380
Lys Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys Gly Asn Cys Asp Thr Glu Ile
385 390 395 400
Phe Gly Ile Phe Lys Lys His Tyr Lys Val Asn Phe Asp Ser Lys Lys
405 410 415
Phe Ser Lys Lys Ser Asp Glu Glu Lys Glu Leu Tyr Lys Ile Ile Tyr
420 425 430
Arg Tyr Leu Lys Gly Arg Ile Glu Lys Ile Leu Val Asn Glu Gln Lys
435 440 445
Val Arg Leu Lys Lys Met Glu Lys Ile Glu Ile Glu Lys Ile Leu Asn
450 455 460
Glu Ser Ile Leu Ser Glu Lys Ile Leu Lys Arg Val Lys Gln Tyr Thr
465 470 475 480
Leu Glu His Ile Met Tyr Leu Gly Lys Leu Arg His Asn Asp Ile Asp
485 490 495
Met Thr Thr Val Asn Thr Asp Asp Phe Ser Arg Leu His Ala Lys Glu
500 505 510
Glu Leu Asp Leu Glu Leu Ile Thr Phe Phe Ala Ser Thr Asn Met Glu
515 520 525
Leu Asn Lys Ile Phe Ser Arg Glu Asn Ile Asn Asn Asp Glu Asn Ile
530 535 540
Asp Phe Phe Gly Gly Asp Arg Glu Lys Asn Tyr Val Leu Asp Lys Lys
545 550 555 560
Ile Leu Asn Ser Lys Ile Lys Ile Ile Arg Asp Leu Asp Phe Ile Asp
565 570 575
Asn Lys Asn Asn Ile Thr Asn Asn Phe Ile Arg Lys Phe Thr Lys Ile
580 585 590
Gly Thr Asn Glu Arg Asn Arg Ile Leu His Ala Ile Ser Lys Glu Arg
595 600 605
Asp Leu Gln Gly Thr Gln Asp Asp Tyr Asn Lys Val Ile Asn Ile Ile
610 615 620
Gln Asn Leu Lys Ile Ser Asp Glu Glu Val Ser Lys Ala Leu Asn Leu
625 630 635 640
Asp Val Val Phe Lys Asp Lys Lys Asn Ile Ile Thr Lys Ile Asn Asp
645 650 655
Ile Lys Ile Ser Glu Glu Asn Asn Asn Asp Ile Lys Tyr Leu Pro Ser
660 665 670
Phe Ser Lys Val Leu Pro Glu Ile Leu Asn Leu Tyr Arg Asn Asn Pro
675 680 685
Lys Asn Glu Pro Phe Asp Thr Ile Glu Thr Glu Lys Ile Val Leu Asn
690 695 700
Ala Leu Ile Tyr Val Asn Lys Glu Leu Tyr Lys Lys Leu Ile Leu Glu
705 710 715 720
Asp Asp Leu Glu Glu Asn Glu Ser Lys Asn Ile Phe Leu Gln Glu Leu
725 730 735
Lys Lys Thr Leu Gly Asn Ile Asp Glu Ile Asp Glu Asn Ile Ile Glu
740 745 750
Asn Tyr Tyr Lys Asn Ala Gln Ile Ser Ala Ser Lys Gly Asn Asn Lys
755 760 765
Ala Ile Lys Lys Tyr Gln Lys Lys Val Ile Glu Cys Tyr Ile Gly Tyr
770 775 780
Leu Arg Lys Asn Tyr Glu Glu Leu Phe Asp Phe Ser Asp Phe Lys Met
785 790 795 800
Asn Ile Gln Glu Ile Lys Lys Gln Ile Lys Asp Ile Asn Asp Asn Lys
805 810 815
Thr Tyr Glu Arg Ile Thr Val Lys Thr Ser Asp Lys Thr Ile Val Ile
820 825 830
Asn Asp Asp Phe Glu Tyr Ile Ile Ser Ile Phe Ala Leu Leu Asn Ser
835 840 845
Asn Ala Val Ile Asn Lys Ile Arg Asn Arg Phe Phe Ala Thr Ser Val
850 855 860
Trp Leu Asn Thr Ser Glu Tyr Gln Asn Ile Ile Asp Ile Leu Asp Glu
865 870 875 880
Ile Met Gln Leu Asn Thr Leu Arg Asn Glu Cys Ile Thr Glu Asn Trp
885 890 895
Asn Leu Asn Leu Glu Glu Phe Ile Gln Lys Met Lys Glu Ile Glu Lys
900 905 910
Asp Phe Asp Asp Phe Lys Ile Gln Thr Lys Lys Glu Ile Phe Asn Asn
915 920 925
Tyr Tyr Glu Asp Ile Lys Asn Asn Ile Leu Thr Glu Phe Lys Asp Asp
930 935 940
Ile Asn Gly Cys Asp Val Leu Glu Lys Lys Leu Glu Lys Ile Val Ile
945 950 955 960
Phe Asp Asp Glu Thr Lys Phe Glu Ile Asp Lys Lys Ser Asn Ile Leu
965 970 975
Gln Asp Glu Gln Arg Lys Leu Ser Asn Ile Asn Lys Lys Asp Leu Lys
980 985 990
Lys Lys Val Asp Gln Tyr Ile Lys Asp Lys Asp Gln Glu Ile Lys Ser
995 1000 1005
Lys Ile Leu Cys Arg Ile Ile Phe Asn Ser Asp Phe Leu Lys Lys
1010 1015 1020
Tyr Lys Lys Glu Ile Asp Asn Leu Ile Glu Asp Met Glu Ser Glu
1025 1030 1035
Asn Glu Asn Lys Phe Gln Glu Ile Tyr Tyr Pro Lys Glu Arg Lys
1040 1045 1050
Asn Glu Leu Tyr Ile Tyr Lys Lys Asn Leu Phe Leu Asn Ile Gly
1055 1060 1065
Asn Pro Asn Phe Asp Lys Ile Tyr Gly Leu Ile Ser Asn Asp Ile
1070 1075 1080
Lys Met Ala Asp Ala Lys Phe Leu Phe Asn Ile Asp Gly Lys Asn
1085 1090 1095
Ile Arg Lys Asn Lys Ile Ser Glu Ile Asp Ala Ile Leu Lys Asn
1100 1105 1110
Leu Asn Asp Lys Leu Asn Gly Tyr Ser Lys Glu Tyr Lys Glu Lys
1115 1120 1125
Tyr Ile Lys Lys Leu Lys Glu Asn Asp Asp Phe Phe Ala Lys Asn
1130 1135 1140
Ile Gln Asn Lys Asn Tyr Lys Ser Phe Glu Lys Asp Tyr Asn Arg
1145 1150 1155
Val Ser Glu Tyr Lys Lys Ile Arg Asp Leu Val Glu Phe Asn Tyr
1160 1165 1170
Leu Asn Lys Ile Glu Ser Tyr Leu Ile Asp Ile Asn Trp Lys Leu
1175 1180 1185
Ala Ile Gln Met Ala Arg Phe Glu Arg Asp Met His Tyr Ile Val
1190 1195 1200
Asn Gly Leu Arg Glu Leu Gly Ile Ile Lys Leu Ser Gly Tyr Asn
1205 1210 1215
Thr Gly Ile Ser Arg Ala Tyr Pro Lys Arg Asn Gly Ser Asp Gly
1220 1225 1230
Phe Tyr Thr Thr Thr Ala Tyr Tyr Lys Phe Phe Asp Glu Glu Ser
1235 1240 1245
Tyr Lys Lys Phe Glu Lys Ile Cys Tyr Gly Phe Gly Ile Asp Leu
1250 1255 1260
Ser Glu Asn Ser Glu Ile Asn Lys Pro Glu Asn Glu Ser Ile Arg
1265 1270 1275
Asn Tyr Ile Ser His Phe Tyr Ile Val Arg Asn Pro Phe Ala Asp
1280 1285 1290
Tyr Ser Ile Ala Glu Gln Ile Asp Arg Val Ser Asn Leu Leu Ser
1295 1300 1305
Tyr Ser Thr Arg Tyr Asn Asn Ser Thr Tyr Ala Ser Val Phe Glu
1310 1315 1320
Val Phe Lys Lys Asp Val Asn Leu Asp Tyr Asp Glu Leu Lys Lys
1325 1330 1335
Lys Phe Lys Leu Ile Gly Asn Asn Asp Ile Leu Glu Arg Leu Met
1340 1345 1350
Lys Pro Lys Lys Val Ser Val Leu Glu Leu Glu Ser Tyr Asn Ser
1355 1360 1365
Asp Tyr Ile Lys Asn Leu Ile Ile Glu Leu Leu Thr Lys Ile Glu
1370 1375 1380
Asn Thr Asn Asp Thr Leu Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala
1385 1390 1395
Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro
1400 1405 1410
Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr
1415 1420 1425
Asp Val Pro Asp Tyr Ala Glu Lys Ile Ile Glu Asn
1430 1435 1440
<210> 2
<211> 1197
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei
<400> 2
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1 5 10 15
Glu Gly Lys Leu Val Lys Ser Thr Ser Glu Glu Asn Arg Thr Ser Glu
20 25 30
Arg Leu Ser Glu Leu Leu Ser Ile Arg Leu Asp Ile Tyr Ile Lys Asn
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Pro Asp Asn Ala Ser Glu Glu Glu Asn Arg Ile Arg Arg Glu Asn Leu
50 55 60
Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Val Leu His Leu Lys Asp Ser Val Leu
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Tyr Leu Lys Asn Arg Lys Glu Lys Asn Ala Val Gln Asp Lys Asn Tyr
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Ser Val Leu Lys Lys Ile Leu Leu Asn Glu Asp Val Asn Ser Glu Glu
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130 135 140
Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile
145 150 155 160
Asn Glu Asn Asn Val Glu Lys Val Gly Gly Lys Ser Lys Arg Asn Ile
165 170 175
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Asn Val Gln Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Lys Glu Asp Ile Glu
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210 215 220
Ile Arg Glu Tyr Tyr His Lys Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu
225 230 235 240
Asn Phe Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Ile
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Lys Glu Leu Ile Glu Lys Ile Pro Asp Met Ser Glu Leu Lys Lys Ser
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Gln Val Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys Glu Glu Leu Asn Asp Lys
275 280 285
Asn Ile Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Gln
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Lys Ile Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu
325 330 335
Asn Lys Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys
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Tyr Asn Tyr Tyr Leu Gln Val Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile
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Ala Arg Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val
370 375 380
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<211> 1120
<212> PRT
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515 520 525
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885 890 895
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900 905 910
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<212> PRT
<213> Lachnospiraceae bacterium MA2020
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50 55 60
Ser Asp Lys Ser Glu Lys Asp Lys Glu Ile Ile Ser Lys Gly Ala Lys
65 70 75 80
Phe Val Ala Lys Ser Phe Asn Ser Ala Ile Thr Ile Leu Lys Lys Gln
85 90 95
Asn Lys Ile Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Gln Gln Val Ile Lys Glu Leu
100 105 110
Lys Asp Lys Phe Gly Gly Ala Arg Ile Tyr Asp Asp Asp Ile Glu Glu
115 120 125
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Asn Ser Ile Lys Val Leu Ile Glu Asn Ala Ala Gly Ile Arg Ser Ser
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His Ile Thr Lys Ile Gly Lys Asn Gly Lys Glu Gln Lys Val Leu Asp
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355 360 365
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450 455 460
Asn Tyr Leu Ala Cys Ala Thr Val Asp Thr Asp Lys Asp Phe Leu Leu
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Phe Ser Lys Glu Asp Ile Arg Ser Cys Thr Lys Lys Asp Gly Asn Leu
485 490 495
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1175 1180 1185
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1340
<210> 5
<211> 1437
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae bacterium NK4A179
<400> 5
Met Lys Ile Ser Lys Val Arg Glu Glu Asn Arg Gly Ala Lys Leu Thr
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Arg Ile Lys Asn Asn Ile Asp Asn Lys Val Ser Glu Asp Ile Ile Asp
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Arg Ile Ile Ala Lys Tyr Leu Lys Lys Ser Leu Cys Arg Glu Arg Val
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Lys Asn Met Asn Met Pro Val Gln Pro Glu Gly Asp Gly Lys Phe Ala
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Ile Thr Val Ser Lys Gly Gly Thr Glu Ser Gly Asn Lys Arg Ser Ala
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Glu Lys Glu Ala Phe Lys Lys Phe Leu Ser Asp Tyr Ala Ser Leu Asp
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Glu Arg Val Arg Asp Asp Met Leu Arg Arg Met Arg Arg Leu Val Val
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1175
<210> 8
<211> 1164
<212> PRT
<213> Carnobacterium gallinarum DSM4847
<400> 8
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<212> PRT
<213> Paludibacter propionicigenes WB4
<400> 9
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Leu Tyr Leu Ser Glu Arg Leu Arg Glu Ile Phe Lys Tyr Asp Arg Lys
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Gly Met Ser Val Val Phe Ala Asn Leu Lys Glu Asn Lys His Arg Leu
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Cys Gly Ile Val Lys Arg Leu Leu Glu Ile
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<211> 1051
<212> PRT
<213> Listeriaceae bacterium FSLM6-0645
<400> 11
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Gln Lys Ser Ile Glu Gln Asn Lys Ile Gln Ser Pro Asp Ser Pro Arg
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Lys Leu Val Leu Gln Lys Tyr Val Thr Ala Phe Leu Asn Gly Glu Pro
195 200 205
Leu Gly Leu Asp Leu Val Ala Lys Lys Tyr Lys Leu Ala Asp Leu Ala
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Glu Ser Phe Lys Leu Val Asp Leu Asn Glu Asp Lys Ser Ala Asn Tyr
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Lys Ile Lys Ala Cys Leu Gln Gln His Gln Arg Asn Ile Leu Asp Glu
245 250 255
Leu Lys Glu Asp Pro Glu Leu Asn Gln Tyr Gly Ile Glu Val Lys Lys
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385 390 395 400
Glu Leu Gln Asn Val Asn Phe Asp Glu Ala Ile Trp Ala Ile Arg Gly
405 410 415
Ser Ile Gln Gln Ile Arg Asn Glu Val Tyr His Cys Lys Lys His Ser
420 425 430
Trp Lys Ser Ile Leu Lys Ile Lys Gly Phe Glu Phe Glu Pro Asn Asn
435 440 445
Met Lys Tyr Ala Asp Ser Asp Met Gln Lys Leu Met Asp Lys Asp Ile
450 455 460
Ala Lys Ile Pro Glu Phe Ile Glu Glu Lys Leu Lys Ser Ser Gly Val
465 470 475 480
Val Arg Phe Tyr Arg His Asp Glu Leu Gln Ser Ile Trp Glu Met Lys
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Ala Phe Ile Asn Ile Arg Glu Val Glu Glu Gly Glu Met Pro Arg Asp
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Tyr Met Gly Tyr Val Gln Gly Gln Ile Ala Ile His Glu Asp Ser Ile
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Glu Asp Thr Pro Asn His Phe Glu Lys Phe Ile Ser Gln Val Phe Ile
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Lys Gly Phe Asp Arg His Met Arg Ser Ala Asn Leu Lys Phe Ile Lys
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Asn Pro Arg Asn Gln Gly Leu Glu Gln Ser Glu Ile Glu Glu Met Ser
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<211> 1152
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei F0279
<400> 12
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885 890 895
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<213> Rhodobacter capsulatus R121
<400> 14
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Gln Pro Lys Arg Asn Pro Lys Thr Asp Lys Phe Ala Pro Gly Leu Val
180 185 190
Val Ala Arg Ala Leu Gly Ile Glu Ser Ser Val Leu Pro Arg Gly Met
195 200 205
Ala Arg Leu Ala Arg Asn Trp Gly Glu Glu Glu Ile Gln Thr Tyr Phe
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Val Val Asp Val Ala Ala Ser Val Lys Glu Val Ala Lys Ala Ala Val
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770 775 780
Asn Leu Leu His Gln Leu Arg Lys Trp Glu Ala Leu Gln Gly Lys Tyr
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Glu Leu Val Gln Asp Gly Asp Ala Thr Asp Gln Ala Asp Ala Arg Arg
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Leu Lys Thr Gly Glu Ala Arg Phe Glu Gly Arg Ala Ala Pro Phe Asp
835 840 845
Leu Lys Pro Phe Arg Ala Leu Phe Ala Asn Pro Ala Thr Phe Asp Arg
850 855 860
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Glu Gly Asp Gly Ala Ser Glu Pro Glu Leu Arg Val Ala Arg Thr Leu
885 890 895
Arg Gly Leu Arg Gln Ile Ala Arg Tyr Asn His Met Ala Val Leu Ser
900 905 910
Asp Leu Phe Ala Lys His Lys Val Arg Asp Glu Glu Val Ala Arg Leu
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Ala Glu Ile Glu Asp Glu Thr Gln Glu Lys Ser Gln Ile Val Ala Ala
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Gln Glu Leu Arg Thr Asp Leu His Asp Lys Val Met Lys Cys His Pro
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Lys Thr Ile Ser Pro Glu Glu Arg Gln Ser Tyr Ala Ala Ala Ile Lys
965 970 975
Thr Ile Glu Glu His Arg Phe Leu Val Gly Arg Val Tyr Leu Gly Asp
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His Leu Arg Leu His Arg Leu Met Met Asp Val Ile Gly Arg Leu Ile
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Asp Tyr Ala Gly Ala Tyr Glu Arg Asp Thr Gly Thr Phe Leu Ile
1010 1015 1020
Asn Ala Ser Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ala Asp Trp Ala Val Thr
1025 1030 1035
Ile Ala Gly Ala Ala Asn Thr Asp Ala Arg Thr Gln Thr Arg Lys
1040 1045 1050
Asp Leu Ala His Phe Asn Val Leu Asp Arg Ala Asp Gly Thr Pro
1055 1060 1065
Asp Leu Thr Ala Leu Val Asn Arg Ala Arg Glu Met Met Ala Tyr
1070 1075 1080
Asp Arg Lys Arg Lys Asn Ala Val Pro Arg Ser Ile Leu Asp Met
1085 1090 1095
Leu Ala Arg Leu Gly Leu Thr Leu Lys Trp Gln Met Lys Asp His
1100 1105 1110
Leu Leu Gln Asp Ala Thr Ile Thr Gln Ala Ala Ile Lys His Leu
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Asp Lys Val Arg Leu Thr Val Gly Gly Pro Ala Ala Val Thr Glu
1130 1135 1140
Ala Arg Phe Ser Gln Asp Tyr Leu Gln Met Val Ala Ala Val Phe
1145 1150 1155
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1160 1165 1170
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Leu Pro Pro Pro Gln Val Gly Glu Val Tyr Glu Gly Val Val Val
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1220 1225 1230
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Lys Ser Asp Gly Lys Ala Ile His Ser Pro Thr Pro Ser Lys Met Gln
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Phe Asp Ala Arg Asp Asp Leu Gly Glu Ala Phe Trp Lys Leu Val Ser
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100 105 110
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115 120 125
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Gly Leu Pro Arg Leu Lys Leu Leu Leu Lys Arg Ala Asp Gly Val Arg
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<220>
<223> Synthetic
<400> 69
cugccagaca uucggugcga gcuggcgg 28
<210> 70
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 70
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca agauugcugu ucuaccaagu 60
aauccau 67
<210> 71
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 71
aagauugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 72
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 72
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu ugauugcugu ucuaccaagu 60
aauccau 67
<210> 73
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 73
uugauugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 74
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 74
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu acauugcugu ucuaccaagu 60
aauccau 67
<210> 75
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 75
uacauugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 76
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 76
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu aguuugcugu ucuaccaagu 60
aauccau 67
<210> 77
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 77
uaguuugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 78
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 78
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agaaugcugu ucuaccaagu 60
aauccau 67
<210> 79
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 79
uagaaugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 80
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 80
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauagcugu ucuaccaagu 60
aauccau 67
<210> 81
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 81
uagauagcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 82
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 82
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauuccugu ucuaccaagu 60
aauccau 67
<210> 83
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 83
uagauuccug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 84
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 84
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauuggugu ucuaccaagu 60
aauccau 67
<210> 85
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 85
uagauuggug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 86
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 86
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauugcagu ucuaccaagu 60
aauccau 67
<210> 87
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 87
uagauugcag uucuaccaag uaauccau 28
<210> 88
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 88
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauugcucu ucuaccaagu 60
aauccau 67
<210> 89
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 89
uagauugcuc uucuaccaag uaauccau 28
<210> 90
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 90
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gauacuucau gaugccagcu 60
gcuguuc 67
<210> 91
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 91
ggauacuuca ugaugccagc ugcuguuc 28
<210> 92
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 92
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gauuguucau gaugccagcu 60
gcuguuc 67
<210> 93
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 93
ggauuguuca ugaugccagc ugcuguuc 28
<210> 94
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 94
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gguacuucau gaugccagcu 60
gccguuc 67
<210> 95
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 95
ggguacuuca ugaugccagc ugccguuc 28
<210> 96
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 96
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gguuguucau gaugccagcu 60
gccguuc 67
<210> 97
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 97
ggguuguuca ugaugccagc ugccguuc 28
<210> 98
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 98
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg guuuaauccc uucuggugug 60
uugaugu 67
<210> 99
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 99
gguuuaaucc cuucuggugu guugaugu 28
<210> 100
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 100
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg guaaaauccc uucuggugug 60
uugaugu 67
<210> 101
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 101
gguaaaaucc cuucuggugu guugaugu 28
<210> 102
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 102
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gguuaauccc uucuggugug 60
uuuaugu 67
<210> 103
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 103
ggguuaaucc cuucuggugu guuuaugu 28
<210> 104
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 104
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg ggaaaauccc uucuggugug 60
uuuaugu 67
<210> 105
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 105
gggaaaaucc cuucuggugu guuuaugu 28
<210> 106
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 106
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gauacuucau gaugccagcu 60
gc 62
<210> 107
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 107
ggauacuuca ugaugccagc ugc 23
<210> 108
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 108
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gauuguucau gaugccagcu 60
gc 62
<210> 109
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 109
ggauuguuca ugaugccagc ugc 23
<210> 110
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 110
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gguacuucau gaugccagcu 60
gc 62
<210> 111
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 111
ggguacuuca ugaugccagc ugc 23
<210> 112
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 112
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg gguuguucau gaugccagcu 60
gc 62
<210> 113
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 113
ggguuguuca ugaugccagc ugc 23
<210> 114
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 114
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu acuacgcuuc agccuacugc 60
aaaucca 67
<210> 115
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 115
uacuacgcuu cagccuacug caaaucca 28
<210> 116
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 116
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu auuacgcuuc agccuacugc 60
aaaucca 67
<210> 117
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 117
uauuacgcuu cagccuacug caaaucca 28
<210> 118
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 118
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg acagaaaugu ccuuuuccca 60
auccuau 67
<210> 119
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 119
gacagaaaug uccuuuuccc aauccuau 28
<210> 120
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 120
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg auagaaaugu ccuuuuccca 60
auccuau 67
<210> 121
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 121
gauagaaaug uccuuuuccc aauccuau 28
<210> 122
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 122
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca ccgacucuuu uuuguauuuc 60
caguaga 67
<210> 123
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 123
accgacucuu uuuuguauuu ccaguaga 28
<210> 124
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 124
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca cugacucuuu uuuguauuuc 60
caguaga 67
<210> 125
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 125
acugacucuu uuuuguauuu ccaguaga 28
<210> 126
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 126
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc uacaccuucu accaccaccu 60
ccgccag 67
<210> 127
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 127
cuacaccuuc uaccaccacc uccgccag 28
<210> 128
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 128
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc ugcaccuucu accaccaccu 60
ccgccag 67
<210> 129
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 129
cugcaccuuc uaccaccacc uccgccag 28
<210> 130
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 130
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg agagcaacag gaagcaggau 60
uccaagu 67
<210> 131
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 131
gagagcaaca ggaagcagga uuccaagu 28
<210> 132
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 132
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aaagcaacag gaagcaggau 60
uccaagu 67
<210> 133
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 133
gaaagcaaca ggaagcagga uuccaagu 28
<210> 134
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 134
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc caggccaaaa ucugugaucu 60
ugacaug 67
<210> 135
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 135
ccaggccaaa aucugugauc uugacaug 28
<210> 136
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 136
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc ccggccaaaa ucugugaucu 60
ugacaug 67
<210> 137
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 137
cccggccaaa aucugugauc uugacaug 28
<210> 138
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 138
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu caguguagcu agaccaaaau 60
caccuau 67
<210> 139
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 139
ucaguguagc uagaccaaaa ucaccuau 28
<210> 140
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 140
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu cuguguagcu agaccaaaau 60
caccuau 67
<210> 141
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 141
ucuguguagc uagaccaaaa ucaccuau 28
<210> 142
<211> 44
<212> RNA
<213> Leptotrichia wadei
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(44)
<223> N represents any nucleotide
<400> 142
gcaaggggac uaaaacnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 44
<210> 143
<211> 44
<212> RNA
<213> Leptotrichia wadei
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(44)
<223> "n" represents any nucleotide
<400> 143
cgaaggggac uaaaacnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 44
<210> 144
<211> 70
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 144
uacccgggga uccucuagaa auauggauua cuugguagaa cagcaaucua cucgaccugc 60
aggcaugcaa 70
<210> 145
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> "n" represents any nucleotide
<400> 145
gcaaggggac naaaacuaga uugcuguucu accaaguaau ccau 44
<210> 146
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 146
tagattgctg 10
<210> 147
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 147
aagattgctg 10
<210> 148
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 148
ttgattgctg 10
<210> 149
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 149
tacattgctg 10
<210> 150
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 150
tagtttgctg 10
<210> 151
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 151
tagaatgctg 10
<210> 152
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 152
tagatagctg 10
<210> 153
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 153
tagattcctg 10
<210> 154
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 154
tagattggtg 10
<210> 155
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 155
tagattgcag 10
<210> 156
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 156
tagattgctc 10
<210> 157
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 157
cagcaatcta 10
<210> 158
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 158
cagcaatgta 10
<210> 159
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 159
cagctatgta 10
<210> 160
<211> 58
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 160
gugcugccca gaagagaaca gcagcuggca ucaugaagaa ucccguugug gauggaau 58
<210> 161
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 161
gcaaggggac uaaaacggau acuucaugau gccagcugcu guuc 44
<210> 162
<211> 58
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 162
gugcugccca gaagagaaca gcagcuggca ucaugaagaa ucccguugug gauggaau 58
<210> 163
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 163
gcaaggggac uaaaacggau acuucaugau gccagcugcu guuc 44
<210> 164
<211> 58
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 164
gugcugccca gaagagaacg gcagcuggca ucaugaagaa ccccguugug gauggaau 58
<210> 165
<211> 58
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 165
gugcugccca gaagagaaca gcagcuggca ucaugaagaa ucccguugug gauggaau 58
<210> 166
<211> 28
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 166
ggauuguuca ugaugccagc ugcuguuc 28
<210> 167
<211> 28
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 167
ggauacuuca ugaugccagc ugcuguuc 28
<210> 168
<211> 58
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 168
gugcugccca gaagagaacg gcagcuggca ucaugaagaa cccuguugug gauggaau 58
<210> 169
<211> 28
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 169
ggguacuuca ugaugccagc ugccguuc 28
<210> 170
<211> 28
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 170
ggguuguuca ugaugccagc ugccguuc 28
<210> 171
<211> 58
<212> RNA
<213> Flavivirus sp.
<400> 171
aaaugcugcu ggacaacauc aacacaccag aagggauuau accagcucuc uuugaacc 58
<210> 172
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 172
gguaaaaucc cuucuggugu guugaugu 28
<210> 173
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 173
gguuuaaucc cuucuggugu guugaugu 28
<210> 174
<211> 58
<212> RNA
<213> Flavivirus sp
<400> 174
aaaugcuccu ugacaacaua aacacaccag aagggauuau cccagcccuc uuugagcc 58
<210> 175
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 175
ggguuaaucc cuucuggugu guuuaugu 28
<210> 176
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 176
gggaaaaucc cuucuggugu guuuaugu 28
<210> 177
<211> 39
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 177
caccgcagca ugucaagauc acagauuuug ggcgggcca 39
<210> 178
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 178
cccggccaaa aucugugauc uugacaug 28
<210> 179
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 179
ccaggccaaa aucugugauc uugacaug 28
<210> 180
<211> 39
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 180
caguaaaaau aggugauuuu ggucuagcua cagagaaau 39
<210> 181
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 181
ucuguguagc uagaccaaaa ucaccuau 28
<210> 182
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 182
ucaguguagc uagaccaaaa ucaccuau 28
<210> 183
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..()
<223> 3ThioM3-D
<400> 183
ttataactat tcctaaaaaa aaaaa 25
<210> 184
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5ThioMC6-D
<400> 184
aaaaaaaaaa ctcccctaat aacaat 26
<210> 185
<211> 45
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 185
ggguaggaau aguuauaauu ucccuuuccc auuguuauua gggag 45
<210> 186
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 186
tgtggttggt gtggttggtt catggtcata ttggtttttt tttttttttc caaccacagt 60
ctctgt 66
<210> 187
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 187
ggttggtagt ctcgaattgc tctctttcac tggcc 35
<210> 188
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 188
gaaattaata cgactcacta tagggggttg gttcatggtc atattggt 48
<210> 189
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 189
gaaattaata cgactcacta tagggggttg gtgtggttgg ttcatggtca tattggt 57
<210> 190
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 190
ggccagtgaa agagagcaat tcgagactac c 31
<210> 191
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 191
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacccag ugaaagagag caauucgaga 60
cuac 64
<210> 192
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 192
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacaaag agagcaauuc gagacuacca 60
acca 64
<210> 193
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 193
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacagac uaccaaccac agagacugug 60
guug 64
<210> 194
<211> 106
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 194
gttagatcgc aagcatatca ttgcgcttgc gatctaactg ctgcgccgcc gggaaaatac 60
tgtacggtta gatcgcatag tctcgaattg ctctctttca ctggcc 106
<210> 195
<211> 71
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 195
gttagatcgc aagcatatca ttgcgcttgc gatctaactg ctgcgccgcc gggaaaatac 60
tgtacggtta g 71
<210> 196
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 196
atcgcatagt ctcgaattgc tctctttcac tggcc 35
<210> 197
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 197
gaaattaata cgactcacta tagggatcgc aagcatatca ttgcgcttgc 50
<210> 198
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 198
ggccagtgaa agagagcaat tcgagactat g 31
<210> 199
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 199
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacccag ugaaagagag caauucgaga 60
cuau 64
<210> 200
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 200
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacagag caauucgaga cuaugcgauc 60
uaac 64
<210> 201
<211> 64
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 201
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacacua ugcgaucuaa ccguacagua 60
uuuu 64
<210> 202
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 202
tgtggttggt gtggttggtt catggtcata ttggtttttt tttttttttc caaccacagt 60
ctctgt 66
<210> 203
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 203
ggttggtagt ctcgaattgc tctct 25
<210> 204
<211> 18
<212> PRT
<213> Leptotrichia shahii
<400> 204
Ile Arg Lys Phe Thr Lys Ile Gly Thr Asn Glu Arg Asn Arg Ile Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 205
<211> 15
<212> PRT
<213> Leptotrichia shahii
<400> 205
Ser Ile Arg Asn Tyr Ile Ser His Phe Tyr Ile Val Arg Asn Pro
1 5 10 15
<210> 206
<211> 18
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae bacterium MA2020
<400> 206
Leu Tyr Ser Leu Lys Ser Met Leu Tyr Ser Met Arg Asn Ser Ser Phe
1 5 10 15
His Phe
<210> 207
<211> 15
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae bacterium MA2020
<400> 207
Ile Phe Arg Asn Glu Ile Asp His Phe His Tyr Phe Tyr Asp Arg
1 5 10 15
<210> 208
<211> 18
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae
<400> 208
Leu Thr Asp Leu Lys Asp Val Ile Tyr Ser Met Arg Asn Asp Ser Phe
1 5 10 15
His Tyr
<210> 209
<211> 15
<212> PRT
<213> Lachnospiraceae
<400> 209
Glu Leu Arg Asn Tyr Ile Glu His Phe Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe
1 5 10 15
<210> 210
<211> 18
<212> PRT
<213> Clostridium aminophilum DSM 10710
<400> 210
Ala Asp Asp Leu Arg Lys Ala Ile Tyr Ser Leu Arg Asn Glu Thr Phe
1 5 10 15
His Phe
<210> 211
<211> 15
<212> PRT
<213> Clostridium aminophilum DSM 10710
<400> 211
Asp Val Arg Lys Tyr Val Asp His Phe Lys Tyr Tyr Ala Thr Ser
1 5 10 15
<210> 212
<211> 18
<212> PRT
<213> Carnobacterium gallinarum DSM 4847
<400> 212
Ile Trp Ala Leu Arg Gly Ser Val Gln Gln Ile Arg Asn Glu Ile Phe
1 5 10 15
His Ser
<210> 213
<211> 15
<212> PRT
<213> Carnobacterium gallinarum
<400> 213
Lys Ile Arg Asn Gln Thr Ala His Leu Ser Val Leu Gln Leu Glu
1 5 10 15
<210> 214
<211> 18
<212> PRT
<213> Carnobacterium gallinarum DSM 4847
<400> 214
Leu Trp Ala Ile Arg Gly Ala Val Gln Arg Val Arg Asn Gln Ile Phe
1 5 10 15
His Gln
<210> 215
<211> 15
<212> PRT
<213> Carnobacterium gallinarum DSM 4847
<400> 215
Glu Ile Arg Asn Asn Ile Ala His Leu His Val Leu Arg Asn Asp
1 5 10 15
<210> 216
<211> 18
<212> PRT
<213> Paludibacter propionicigenes WB4
<400> 216
Leu Trp Gly Ile Arg Gly Ala Val Gln Gln Ile Arg Asn Asn Val Asn
1 5 10 15
His Tyr
<210> 217
<211> 15
<212> PRT
<213> Paludibacter propionicigenes WB4
<400> 217
Asp Ile Arg Asn His Ile Ala His Phe Asn Tyr Leu Thr Lys Asp
1 5 10 15
<210> 218
<211> 18
<212> PRT
<213> Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317
<400> 218
Ile Trp Ala Ile Arg Gly Ser Ile Gln Gln Ile Arg Asn Glu Val Tyr
1 5 10 15
His Cys
<210> 219
<211> 15
<212> PRT
<213> Listeria weihenstephanensis FSL R9-0317
<400> 219
Asn Ala Arg Asn His Ile Ala His Leu Asn Tyr Leu Ser Leu Lys
1 5 10 15
<210> 220
<211> 18
<212> PRT
<213> Listeriaceae bacterium FSL M6-0635
<400> 220
Ile Trp Ala Ile Arg Gly Ser Ile Gln Gln Ile Arg Asn Glu Val Tyr
1 5 10 15
His Cys
<210> 221
<211> 15
<212> PRT
<213> Listeriaceae bacterium FSL M6-0635
<400> 221
Asn Ala Arg Asn His Ile Ala His Leu Asn Tyr Leu Ser Leu Lys
1 5 10 15
<210> 222
<211> 18
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei F0279
<400> 222
Val Phe Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gly Cys Arg Asn Gln Thr Phe
1 5 10 15
His Leu
<210> 223
<211> 15
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei F0279
<400> 223
Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn Tyr Ile Pro His Ala
1 5 10 15
<210> 224
<211> 18
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus SB 1003
<400> 224
Val Phe Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gly Cys Arg Asn Gln Thr Phe
1 5 10 15
His Leu
<210> 225
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 225
Gln Thr Arg Lys Asp Leu Ala His Phe Asn Val Leu Asp Arg Ala
1 5 10 15
<210> 226
<211> 18
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus R12
<400> 226
Val Phe Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gly Cys Arg Asn Gln Thr Phe
1 5 10 15
His Leu
<210> 227
<211> 15
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus R121
<400> 227
Gln Thr Arg Lys Asp Leu Ala His Phe Asn Val Leu Asp Arg Ala
1 5 10 15
<210> 228
<211> 18
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus DE442
<400> 228
Val Phe Ala Leu Leu Arg Tyr Leu Arg Gly Cys Arg Asn Gln Thr Phe
1 5 10 15
His Leu
<210> 229
<211> 15
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus DE-442
<400> 229
Gln Thr Arg Lys Asp Leu Ala His Phe Asn Val Leu Asp Arg Ala
1 5 10 15
<210> 230
<211> 18
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei (Lw2)
<400> 230
Phe Ala Asn Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val
1 5 10 15
His Phe
<210> 231
<211> 15
<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei (Lw2)
<400> 231
Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn Tyr Ile Pro His Ala
1 5 10 15
<210> 232
<211> 18
<212> PRT
<213> Listeria seeligen
<400> 232
Ser Trp Gly Leu Arg Gly Ala Ile Ala Pro Ile Arg Asn Glu Ile Ile
1 5 10 15
His Leu
<210> 233
<211> 15
<212> PRT
<213> Listeria seeligen
<400> 233
Glu Lys Arg Asn Asn Ile Ser His Phe Asn Tyr Leu Asn Gly Gln
1 5 10 15
<210> 234
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 234
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agaaugcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 235
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 235
uagaaugcug uucuaccaag uaa 23
<210> 236
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUAGAUAGCUGUUCUACCAAGUAA
<400> 236
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauagcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 237
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 237
uagauagcug uucuaccaag uaa 23
<210> 238
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 238
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauuccugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 239
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 239
uagauuccug uucuaccaag uaa 23
<210> 240
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 240
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca agauugcugu ucuaccaag 59
<210> 241
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 241
aagauugcug uucuaccaag 20
<210> 242
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 242
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu ugauugcugu ucuaccaag 59
<210> 243
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 243
uugauugcug uucuaccaag 20
<210> 244
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 244
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu aguuugcugu ucuaccaag 59
<210> 245
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 245
uaguuugcug uucuaccaag 20
<210> 246
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 246
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agaaugcugu ucuaccaag 59
<210> 247
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 247
uagaaugcug uucuaccaag 20
<210> 248
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 248
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauagcugu ucuaccaag 59
<210> 249
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 249
uagauagcug uucuaccaag 20
<210> 250
<211> 59
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 250
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu agauuccugu ucuaccaag 59
<210> 251
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UAGAUUCCUGUUCUACCAAG
<400> 251
uagauuccug uucuaccaag 20
<210> 252
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 252
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacc uagauugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 253
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 253
cuagauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 254
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 254
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aagauugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 255
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Seqeunce
<220>
<223> Synthetic
<400> 255
gaagauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 256
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 256
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg uugauugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 257
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 257
guugauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 258
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 258
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg uaguuugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 259
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 259
guaguuugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 260
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 260
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg uagaaugcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 261
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 261
guagaaugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 262
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 262
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg uagauagcug uucuaccaag 60
uaaucca 67
<210> 263
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 263
guagauagcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 264
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 264
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca cuagauugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 265
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 265
acuagauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 266
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 266
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca gaagauugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 267
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 267
agaagauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 268
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 268
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca guugauugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 269
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 269
aguugauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 270
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 270
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca guaguuugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 271
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 271
aguaguuugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 272
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 272
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca guagaaugcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 273
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 273
aguagaaugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 274
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 274
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca guagauagcu guucuaccaa 60
guaaucc 67
<210> 275
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 275
aguagauagc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 276
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 276
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg acuagauugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 277
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 277
gacuagauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 278
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 278
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg agaagauugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 279
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 279
gagaagauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 280
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 280
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aguugauugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 281
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 281
gaguugauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 282
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 282
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aguaguuugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 283
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 283
gaguaguuug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 284
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 284
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aguagaaugc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 285
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 285
gaguagaaug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 286
<211> 67
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 286
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacg aguagauagc uguucuacca 60
aguaauc 67
<210> 287
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 287
gaguagauag cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 288
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 288
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa ucuacucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 289
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 289
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa ucuagucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 290
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 290
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa ucuaaucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 291
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 291
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa ucuauucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 292
<211> 173
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 292
ggccagtgaa ttcgagctcg gtacccgggg atcctctaga aatatggatt acttggtaga 60
acagcaatct actcgacctg caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 120
cctgtgttta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aag 173
<210> 293
<211> 189
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 293
gagtacgtcc gcttcaccgg ctacccctgc tcctggacct tctaccacca cctccgccag 60
gagatcctcc aggagttcac cctgcacgac cacgtgcggg aggaggccca gaagttcctg 120
cggggcctgc aggtgaacgg gagccggccg ggcacctttg taggggtcca tgttcgccga 180
ggggactat 189
<210> 294
<211> 334
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 294
agcuggagug uuguuuggua ugggcaaagg gaugccauuc uacgcauggg acuuuggagu 60
cccgcugcua augauagguu gcuacucaca auuaacaccc cugacccuaa uaguggccau 120
cauuuugcuc guggcgcacu acauguacuu gaucccaggg cugcaggcag cagcugcgcg 180
ugcugcccag aagagaacgg cagcuggcau caugaagaac ccuguugugg auggaauagu 240
ggugacugac auugacacaa ugacaauuga cccccaagug gagaaaaaga ugggacaggu 300
gcuacucaua gcaguagccg ucuccagcgc caua 334
<210> 295
<211> 334
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 295
ggcagcuaua uugaugggac uugacaaggg auggccaaua ucgaagaugg acauaggagu 60
uccacuucuc gccuuagggu gcuauuccca ggugaaccca uugacacuga cagcggcggu 120
guugauguua guggcucauu augccauaau uggaccagga cugcaagcaa aggccacuag 180
agaagcucaa aaaaggacag cggccggaau aaugaaaaau ccaaccguag acgggauugu 240
ugcaauagac uuggauccug ugguuuauga uacaaaauuu gaaaaacagc uaggccaaau 300
aauguuacug auacuuugua caucacagau ccuc 334
<210> 296
<211> 337
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 296
gggagcugga guguuguuug guaugggcaa agggaugcca uucuacgcau gggacuuugg 60
agucccgcug cuaaugauag guugcuacuc acaauuaaca ccccugaccc uaauaguggc 120
caucauuuug cucguggcgc acuacaugua cuugauccca gggcugcagg cagcagcugc 180
gcgugcugcc cagaagagaa cggcagcugg caucaugaag aacccuguug uggauggaau 240
aguggugacu gacauugaca caaugacaau ugacccccaa guggagaaaa agaugggaca 300
ggugcuacuc auagcaguag ccgucuccag cgccaua 337
<210> 297
<211> 173
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 297
gggaaccuug auaguggcua ucauucugcu uguggcacac uauauguacu ugaucccagg 60
ccuacaggca gcagcagcgc gugcugccca gaagagaaca gcagcuggca ucaugaagaa 120
ucccguugug gauggaauag ugguaacuga cauugacaca augacaauug acc 173
<210> 298
<211> 173
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 298
ggggacccua auaguggcca ucauuuugcu cguggcgcac uacauguacu ugaucccagg 60
gcugcaggca gcagcugcgc gugcugccca gaagagaacg gcagcuggca ucaugaagaa 120
cccuguugug gauggaauag uggugacuga cauugacaca augacaauug acc 173
<210> 299
<211> 173
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 299
gggaguacau auucaggggc caaccucuca acaaugacga agaccaugcu cacuggacag 60
aagcaaaaau gcugcuggac aacaucaaca caccagaagg gauuauacca gcucucuuug 120
aaccagaaag ggagaaguca gccgccauag acggugaaua ccgccugaag ggu 173
<210> 300
<211> 173
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 300
gggaguacau uuacauggga cagccuucaa acaacgauga ggaucacgcu cauuggacag 60
aagcaaaaau gcuccuugac aacauaaaca caccagaagg gauuauccca gcccucuuug 120
agccggagag aggaaaaagu gcagcaauag acggggaaua cagacugcgg ggu 173
<210> 301
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 301
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcaa uguacucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 302
<211> 176
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 302
gggggccagu gaauucgagc ucgguacccg gggauccucu agaaauaugg auuacuuggu 60
agaacagcua uguacucgac cugcaggcau gcaagcuugg cguaaucaug gucauagcug 120
uuuccugugu uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg agccggaagc auaaag 176
<210> 303
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 303
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaaca agauugcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 304
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 304
aagauugcug uucuaccaag uaa 23
<210> 305
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 305
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu ugauugcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 306
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 306
uugauugcug uucuaccaag uaa 23
<210> 307
<211> 62
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 307
ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu aguuugcugu ucuaccaagu 60
aa 62
<210> 308
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 308
uaguuugcug uucuaccaag uaa 23
<210> 309
<211> 1159
<212> PRT
<213> Leptorichia buccalis C-1013-b
<400> 309
Met Lys Val Thr Lys Val Gly Gly Ile Ser His Lys Lys Tyr Thr Ser
1 5 10 15
Glu Gly Arg Leu Val Lys Ser Glu Ser Glu Glu Asn Arg Thr Asp Glu
20 25 30
Arg Leu Ser Ala Leu Leu Asn Met Arg Leu Asp Met Tyr Ile Lys Asn
35 40 45
Pro Ser Ser Thr Glu Thr Lys Glu Asn Gln Lys Arg Ile Gly Lys Leu
50 55 60
Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Met Val Tyr Leu Lys Asp Asn Thr Leu
65 70 75 80
Ser Leu Lys Asn Gly Lys Lys Glu Asn Ile Asp Arg Glu Tyr Ser Glu
85 90 95
Thr Asp Ile Leu Glu Ser Asp Val Arg Asp Lys Lys Asn Phe Ala Val
100 105 110
Leu Lys Lys Ile Tyr Leu Asn Glu Asn Val Asn Ser Glu Glu Leu Glu
115 120 125
Val Phe Arg Asn Asp Ile Lys Lys Lys Leu Asn Lys Ile Asn Ser Leu
130 135 140
Lys Tyr Ser Phe Glu Lys Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile Asn Glu
145 150 155 160
Asn Asn Ile Glu Lys Val Glu Gly Lys Ser Lys Arg Asn Ile Ile Tyr
165 170 175
Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys Arg Asp Ala Tyr Val Ser Asn Val
180 185 190
Lys Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Glu Glu Asp Ile Ala Lys Leu
195 200 205
Val Leu Glu Ile Glu Asn Leu Thr Lys Leu Glu Lys Tyr Lys Ile Arg
210 215 220
Glu Phe Tyr His Glu Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu Asn Phe
225 230 235 240
Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Met Lys Glu
245 250 255
Leu Ile Glu Lys Val Pro Asp Met Ser Glu Leu Lys Lys Ser Gln Val
260 265 270
Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys Glu Glu Leu Asn Asp Lys Asn Ile
275 280 285
Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Gln Leu Leu
290 295 300
Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Ile Ser Asn Asp Lys Ile
305 310 315 320
Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu Asn Lys
325 330 335
Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys Tyr Asn
340 345 350
Tyr Tyr Leu Gln Asp Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile Ala Arg
355 360 365
Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val Ser Ser
370 375 380
Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn Glu Asn
385 390 395 400
Asp Ile Thr Gly Arg Met Arg Gly Lys Thr Val Lys Asn Asn Lys Gly
405 410 415
Glu Glu Lys Tyr Val Ser Gly Glu Val Asp Lys Ile Tyr Asn Glu Asn
420 425 430
Lys Lys Asn Glu Val Lys Glu Asn Leu Lys Met Phe Tyr Ser Tyr Asp
435 440 445
Phe Asn Met Asp Asn Lys Asn Glu Ile Glu Asp Phe Phe Ala Asn Ile
450 455 460
Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val His Phe Asn Leu
465 470 475 480
Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Phe Ala Phe Lys Asn Ile Ala Pro Ser
485 490 495
Glu Ile Ser Lys Lys Met Phe Gln Asn Glu Ile Asn Glu Lys Lys Leu
500 505 510
Lys Leu Lys Ile Phe Arg Gln Leu Asn Ser Ala Asn Val Phe Arg Tyr
515 520 525
Leu Glu Lys Tyr Lys Ile Leu Asn Tyr Leu Lys Arg Thr Arg Phe Glu
530 535 540
Phe Val Asn Lys Asn Ile Pro Phe Val Pro Ser Phe Thr Lys Leu Tyr
545 550 555 560
Ser Arg Ile Asp Asp Leu Lys Asn Ser Leu Gly Ile Tyr Trp Lys Thr
565 570 575
Pro Lys Thr Asn Asp Asp Asn Lys Thr Lys Glu Ile Ile Asp Ala Gln
580 585 590
Ile Tyr Leu Leu Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn Tyr Phe
595 600 605
Met Ser Asn Asn Gly Asn Phe Phe Glu Ile Ser Lys Glu Ile Ile Glu
610 615 620
Leu Asn Lys Asn Asp Lys Arg Asn Leu Lys Thr Gly Phe Tyr Lys Leu
625 630 635 640
Gln Lys Phe Glu Asp Ile Gln Glu Lys Ile Pro Lys Glu Tyr Leu Ala
645 650 655
Asn Ile Gln Ser Leu Tyr Met Ile Asn Ala Gly Asn Gln Asp Glu Glu
660 665 670
Glu Lys Asp Thr Tyr Ile Asp Phe Ile Gln Lys Ile Phe Leu Lys Gly
675 680 685
Phe Met Thr Tyr Leu Ala Asn Asn Gly Arg Leu Ser Leu Ile Tyr Ile
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Gly Ser Asp Glu Glu Thr Asn Thr Ser Leu Ala Glu Lys Lys Gln Glu
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Phe Asp Lys Phe Leu Lys Lys Tyr Glu Gln Asn Asn Asn Ile Lys Ile
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Pro Tyr Glu Ile Asn Glu Phe Leu Arg Glu Ile Lys Leu Gly Asn Ile
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Leu Lys Tyr Thr Glu Arg Leu Asn Met Phe Tyr Leu Ile Leu Lys Leu
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Leu Asn His Lys Glu Leu Thr Asn Leu Lys Gly Ser Leu Glu Lys Tyr
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Asn
<210> 310
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<212> PRT
<213> Herbinix hemicellulosilytica
<400> 310
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<213> Eubacterium rectale
<400> 311
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Lys Phe Leu Asn Ala Arg Ser Leu Asn Leu Met Val Gly Ser Met Arg
835 840 845
Ser Tyr Ile Gln Tyr Val Thr Asp Ile Lys Arg Arg Ala Ala Ser Ile
850 855 860
Gly Asn Glu Leu His Val Ser Val His Asp Val Glu Lys Val Glu Lys
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885 890 895
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915 920 925
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Phe Ala Ala Asp His Ile Leu Arg Asp Ile Val Glu Pro Val Ser Lys
965 970 975
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980 985 990
Lys Ile Lys Gly Lys Glu Ile Thr Ala Glu Glu Gln Lys Ala Val Leu
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Lys Tyr Gln Lys Leu Lys Asn Arg Val Glu Leu Arg Asp Ile Val
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Glu Tyr Gly Glu Ile Ile Asn Glu Leu Leu Gly Gln Leu Ile Asn
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Trp Ser Phe Met Arg Glu Arg Asp Leu Leu Tyr Phe Gln Leu Gly
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Phe His Tyr Asp Cys Leu Arg Asn Asp Ser Lys Lys Pro Glu Gly
1055 1060 1065
Tyr Lys Asn Ile Lys Val Asp Glu Asn Ser Ile Lys Asp Ala Ile
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Leu Tyr Gln Ile Ile Gly Met Tyr Val Asn Gly Val Thr Val Tyr
1085 1090 1095
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Asp Ile Lys Tyr Gln Lys Asn Val Leu Asn Leu Leu Gln Asn Ile
1190 1195 1200
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Phe Lys Thr Ile Gly Glu Gln Thr Lys Pro Gly Ala Lys Leu Ser
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Asn Phe Lys Leu Ser Asn
1340
<210> 312
<211> 1373
<212> PRT
<213> Eubacteriaceae bacterium CHKCI004
<400> 312
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Lys Lys Gln Arg Leu Ser Lys Phe Lys Gly Arg Met Glu Asp Phe Val
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Leu Ile Ala Leu Arg Lys Ser Leu Val Val Ser Thr Tyr Asn Gln Glu
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Val Phe Asp Ser Arg Lys Ala Ala Thr Val Phe Leu Lys Asn Ile Gly
165 170 175
Lys Lys Asn Ile Ser Ala Asp Asp Glu Arg Gln Ile Lys Gln Leu Met
180 185 190
Ala Leu Ile Arg Glu Asp Tyr Asp Lys Trp Asn Pro Asp Lys Asp Ser
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Ser Asp Lys Lys Glu Ser Ser Gly Thr Lys Val Ile Arg Ser Ile Glu
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Asn Gln Gln Asn Asn Lys Glu Arg Lys Val Arg Ser Ala Asn Asp Gly
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Ala Leu Lys Met Ala Phe Ala Ser Tyr Ile Lys Asn Asp Lys Glu Leu
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Asn Phe Leu Pro Asn Trp Asn Ser Glu Lys Tyr Asn Thr Leu Ile Ser
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Trp Val Tyr Ile Arg Glu Arg Asp Met Met Tyr Leu Gln Leu Gly
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Leu His Tyr Ile Lys Leu Tyr Phe Thr Asp Ser Val Ala Glu Asp
1040 1045 1050
Ser Tyr Leu Arg Thr Leu Asp Leu Glu Glu Gly Ser Ile Ala Asp
1055 1060 1065
Gly Ala Val Leu Tyr Gln Ile Ala Ser Leu Tyr Ser Phe Asn Leu
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Pro Met Tyr Val Lys Pro Asn Lys Ser Ser Val Tyr Cys Lys Lys
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<211> 1168
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<213> Leptotrichia sp. Marseille-P3007
<400> 320
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Leu Val Leu Lys Lys Ile Leu Leu Asn Glu Asp Ile Asn Ser Glu Glu
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<213> Bacterioides ihuae
<400> 321
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Ile Cys Arg Arg Leu Leu Glu Met Lys Lys
1130 1135
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<212> PRT
<213> Porphyromonadaceae bacterium KH3CP3RA
<400> 322
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Val Trp Lys Glu Leu Lys Lys Asp Ile Glu Glu Lys Ile Lys Leu Arg
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Asn Leu Asp Asn Lys Leu His Phe Val His Leu Lys Arg Met His Ser
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Leu Leu Ile Glu Leu Leu Gly Arg Phe Val Gly Phe Thr Tyr Leu Phe
485 490 495
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580 585 590
Glu Leu Ile Asn Glu Leu Arg Glu Val Met Ser Tyr Asp Arg Lys Leu
595 600 605
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Asn Lys His His Leu Glu Leu Asp Asp Ile Val Pro Lys Lys Ile Met
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Ile Gln Thr Asp Ser Val Asp Pro Leu Tyr Cys Arg Met Trp Lys Lys
675 680 685
Leu Leu Asp Leu Lys Pro Thr Pro Phe
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<210> 323
<211> 204
<212> PRT
<213> Listeria riparia
<400> 323
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<210> 324
<211> 1082
<212> PRT
<213> Insolitispirillum peregrinum
<400> 324
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245 250 255
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260 265 270
Leu Glu Arg Leu Leu Pro Arg Thr Gly Glu Ala Leu Arg His Ala Val
275 280 285
Thr Val Gln His Gly Asn Arg Ser Leu Ala Asp Ala Val Arg Ile Gly
290 295 300
Lys Ile Leu His Tyr Gly Trp Leu Gln Asn Gly Glu Pro Asp Pro Trp
305 310 315 320
Pro Asp Asp Ala Ala Leu Tyr Ser Ser Arg Tyr Trp Gly Ser Asp Gly
325 330 335
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340 345 350
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1 5 10 15
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50 55 60
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Arg Ile Leu Leu Xaa Xaa Gly Lys Val Xaa Tyr Lys Leu Gln Xaa Gly
275 280 285
Tyr Leu Ala Glu Leu Trp Lys Ile Arg Ile Asn Glu Ile Phe Ile Lys
290 295 300
Tyr Ile Xaa Val Gly Lys Ala Val Ala Xaa Phe Ala Leu Arg Asn Xaa
305 310 315 320
Xaa Lys Asx Glu Asn Asp Ile Leu Gly Gly Lys Ile Xaa Lys Lys Leu
325 330 335
Asn Gly Ile Thr Ser Phe Xaa Tyr Glu Lys Ile Lys Ala Glu Glu Ile
340 345 350
Leu Gln Arg Glu Xaa Ala Val Glu Val Ala Phe Ala Ala Asn Xaa Leu
355 360 365
Tyr Ala Xaa Asp Leu Xaa Xaa Ile Arg Xaa Ser Ile Leu Gln Phe Phe
370 375 380
Gly Gly Ala Ser Asn Trp Asp Xaa Phe Leu Phe Phe His Phe Ala Thr
385 390 395 400
Ser Xaa Ile Ser Asp Lys Lys Trp Asn Ala Glu Leu Ile Xaa Xaa Lys
405 410 415
Lys Xaa Gly Leu Val Ile Arg Glu Lys Leu Tyr Ser Asn Asn Val Ala
420 425 430
Met Phe Tyr Ser Lys Asp Asp Leu Glu Lys Leu Leu Asn Xaa Leu Xaa
435 440 445
Xaa Phe Xaa Leu Arg Ala Ser Gln Val Pro Ser Phe Lys Lys Val Tyr
450 455 460
Val Arg Xaa Asx Phe Pro Gln Asn Leu Leu Lys Lys Phe Asn Asp Glu
465 470 475 480
Lys Asp Asp Glu Ala Tyr Ser Ala Xaa Tyr Tyr Leu Leu Lys Glu Ile
485 490 495
Tyr Tyr Asn Xaa Phe Leu Pro Tyr Phe Ser Ala Asn Asn Xaa Phe Phe
500 505 510
Phe Xaa Val Lys Asn Leu Val Leu Lys Ala Asn Lys Asp Lys Phe Xaa
515 520 525
Xaa Ala Phe Xaa Asp Ile Arg Glu Met Asn Xaa Gly Ser Pro Ile Glu
530 535 540
Tyr Leu Xaa Xaa Thr Gln Xaa Asn Xaa Xaa Asn Glu Gly Arg Lys Lys
545 550 555 560
Glu Glu Lys Glu Xaa Asp Phe Ile Lys Phe Leu Leu Gln Ile Phe Xaa
565 570 575
Lys Gly Phe Asp Asp Tyr Leu Lys Asn Asn Xaa Xaa Phe Ile Leu Lys
580 585 590
Phe Ile Pro Glu Pro Thr Glu Xaa Ile Glu Ile Xaa Xaa Glu Leu Gln
595 600 605
Ala Trp Tyr Ile Val Gly Lys Phe Leu Asn Ala Arg Lys Xaa Asn Leu
610 615 620
Leu Gly Xaa Phe Xaa Ser Tyr Leu Lys Leu Leu Asp Asp Ile Glu Leu
625 630 635 640
Arg Ala Leu Arg Asn Glu Asn Ile Lys Tyr Gln Ser Ser Asn Xaa Glu
645 650 655
Lys Glu Val Leu Glu Xaa Cys Leu Glu Leu Ile Gly Leu Leu Ser Leu
660 665 670
Asp Leu Asn Asp Tyr Phe Asx Asp Glu Xaa Asp Phe Ala Xaa Tyr Xaa
675 680 685
Gly Lys Xaa Leu Asp Phe Glu Lys Lys Xaa Met Lys Asp Leu Ala Glu
690 695 700
Leu Xaa Pro Tyr Asp Gln Asn Asp Gly Glu Asn Pro Ile Val Asn Arg
705 710 715 720
Asn Ile Xaa Leu Ala Lys Lys Tyr Gly Thr Leu Asn Leu Leu Glu Lys
725 730 735
Xaa Xaa Asp Lys Val Ser Glu Lys Glu Ile Lys Glu Tyr Tyr Glu Leu
740 745 750
Lys Lys Glu Ile Glu Glu Tyr Xaa Xaa Lys Gly Glu Glu Leu His Glu
755 760 765
Glu Trp Xaa Gln Xaa Lys Asn Arg Val Glu Xaa Arg Asp Ile Leu Glu
770 775 780
Tyr Xaa Glu Glu Leu Xaa Gly Gln Ile Ile Asn Tyr Asn Xaa Leu Xaa
785 790 795 800
Asn Lys Val Leu Leu Tyr Phe Gln Leu Gly Leu His Tyr Leu Leu Leu
805 810 815
Asp Ile Leu Gly Arg Leu Val Gly Tyr Thr Gly Ile Trp Glu Arg Asp
820 825 830
Ala Xaa Leu Tyr Gln Ile Ala Ala Met Tyr Xaa Asn Gly Leu Pro Glu
835 840 845
Tyr Ile Xaa Xaa Lys Lys Asn Asp Lys Tyr Lys Asp Gly Gln Ile Val
850 855 860
Gly Xaa Lys Ile Asn Xaa Phe Lys Xaa Asp Lys Lys Xaa Leu Tyr Asn
865 870 875 880
Ala Gly Leu Glu Leu Phe Glu Asn Xaa Asn Glu His Lys Asn Ile Xaa
885 890 895
Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn Tyr Leu Ser Lys Ala Glu Ser
900 905 910
Ser Leu Leu Xaa Tyr Ser Glu Asn Leu Arg Xaa Leu Phe Ser Tyr Asp
915 920 925
Arg Lys Leu Lys Asn Ala Val Xaa Lys Ser Leu Ile Asn Ile Leu Leu
930 935 940
Arg His Gly Met Val Leu Lys Phe Lys Phe Gly Thr Asp Lys Lys Ser
945 950 955 960
Val Xaa Ile Arg Ser Xaa Lys Lys Ile Xaa His Leu Lys Ser Ile Ala
965 970 975
Lys Lys Leu Tyr Tyr Pro Glu Val Xaa Val Ser Lys Glu Tyr Cys Lys
980 985 990
Leu Val Lys Xaa Leu Leu Lys Tyr Lys
995 1000
<210> 326
<211> 1224
<212> PRT
<213> Bergeyella zoohelcum
<400> 326
Met Glu Asn Lys Thr Ser Leu Gly Asn Asn Ile Tyr Tyr Asn Pro Phe
1 5 10 15
Lys Pro Gln Asp Lys Ser Tyr Phe Ala Gly Tyr Phe Asn Ala Ala Met
20 25 30
Glu Asn Thr Asp Ser Val Phe Arg Glu Leu Gly Lys Arg Leu Lys Gly
35 40 45
Lys Glu Tyr Thr Ser Glu Asn Phe Phe Asp Ala Ile Phe Lys Glu Asn
50 55 60
Ile Ser Leu Val Glu Tyr Glu Arg Tyr Val Lys Leu Leu Ser Asp Tyr
65 70 75 80
Phe Pro Met Ala Arg Leu Leu Asp Lys Lys Glu Val Pro Ile Lys Glu
85 90 95
Arg Lys Glu Asn Phe Lys Lys Asn Phe Lys Gly Ile Ile Lys Ala Val
100 105 110
Arg Asp Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Lys Glu His Gly Glu Val Glu
115 120 125
Ile Thr Asp Glu Ile Phe Gly Val Leu Asp Glu Met Leu Lys Ser Thr
130 135 140
Val Leu Thr Val Lys Lys Lys Lys Val Lys Thr Asp Lys Thr Lys Glu
145 150 155 160
Ile Leu Lys Lys Ser Ile Glu Lys Gln Leu Asp Ile Leu Cys Gln Lys
165 170 175
Lys Leu Glu Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Arg Lys Ile Glu Glu Lys Arg
180 185 190
Arg Asn Gln Arg Glu Arg Gly Glu Lys Glu Leu Val Ala Pro Phe Lys
195 200 205
Tyr Ser Asp Lys Arg Asp Asp Leu Ile Ala Ala Ile Tyr Asn Asp Ala
210 215 220
Phe Asp Val Tyr Ile Asp Lys Lys Lys Asp Ser Leu Lys Glu Ser Ser
225 230 235 240
Lys Ala Lys Tyr Asn Thr Lys Ser Asp Pro Gln Gln Glu Glu Gly Asp
245 250 255
Leu Lys Ile Pro Ile Ser Lys Asn Gly Val Val Phe Leu Leu Ser Leu
260 265 270
Phe Leu Thr Lys Gln Glu Ile His Ala Phe Lys Ser Lys Ile Ala Gly
275 280 285
Phe Lys Ala Thr Val Ile Asp Glu Ala Thr Val Ser Glu Ala Thr Val
290 295 300
Ser His Gly Lys Asn Ser Ile Cys Phe Met Ala Thr His Glu Ile Phe
305 310 315 320
Ser His Leu Ala Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Lys Val Arg Thr Ala Glu
325 330 335
Ile Asn Tyr Gly Glu Ala Glu Asn Ala Glu Gln Leu Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Lys Glu Thr Leu Met Met Gln Met Leu Asp Glu Leu Ser Lys Val Pro
355 360 365
Asp Val Val Tyr Gln Asn Leu Ser Glu Asp Val Gln Lys Thr Phe Ile
370 375 380
Glu Asp Trp Asn Glu Tyr Leu Lys Glu Asn Asn Gly Asp Val Gly Thr
385 390 395 400
Met Glu Glu Glu Gln Val Ile His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu
405 410 415
Asp Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Ala Gln
420 425 430
Phe Pro Thr Leu Arg Phe Gln Val His Leu Gly Asn Tyr Leu His Asp
435 440 445
Ser Arg Pro Lys Glu Asn Leu Ile Ser Asp Arg Arg Ile Lys Glu Lys
450 455 460
Ile Thr Val Phe Gly Arg Leu Ser Glu Leu Glu His Lys Lys Ala Leu
465 470 475 480
Phe Ile Lys Asn Thr Glu Thr Asn Glu Asp Arg Glu His Tyr Trp Glu
485 490 495
Ile Phe Pro Asn Pro Asn Tyr Asp Phe Pro Lys Glu Asn Ile Ser Val
500 505 510
Asn Asp Lys Asp Phe Pro Ile Ala Gly Ser Ile Leu Asp Arg Glu Lys
515 520 525
Gln Pro Val Ala Gly Lys Ile Gly Ile Lys Val Lys Leu Leu Asn Gln
530 535 540
Gln Tyr Val Ser Glu Val Asp Lys Ala Val Lys Ala His Gln Leu Lys
545 550 555 560
Gln Arg Lys Ala Ser Lys Pro Ser Ile Gln Asn Ile Ile Glu Glu Ile
565 570 575
Val Pro Ile Asn Glu Ser Asn Pro Lys Glu Ala Ile Val Phe Gly Gly
580 585 590
Gln Pro Thr Ala Tyr Leu Ser Met Asn Asp Ile His Ser Ile Leu Tyr
595 600 605
Glu Phe Phe Asp Lys Trp Glu Lys Lys Lys Glu Lys Leu Glu Lys Lys
610 615 620
Gly Glu Lys Glu Leu Arg Lys Glu Ile Gly Lys Glu Leu Glu Lys Lys
625 630 635 640
Ile Val Gly Lys Ile Gln Ala Gln Ile Gln Gln Ile Ile Asp Lys Asp
645 650 655
Thr Asn Ala Lys Ile Leu Lys Pro Tyr Gln Asp Gly Asn Ser Thr Ala
660 665 670
Ile Asp Lys Glu Lys Leu Ile Lys Asp Leu Lys Gln Glu Gln Asn Ile
675 680 685
Leu Gln Lys Leu Lys Asp Glu Gln Thr Val Arg Glu Lys Glu Tyr Asn
690 695 700
Asp Phe Ile Ala Tyr Gln Asp Lys Asn Arg Glu Ile Asn Lys Val Arg
705 710 715 720
Asp Arg Asn His Lys Gln Tyr Leu Lys Asp Asn Leu Lys Arg Lys Tyr
725 730 735
Pro Glu Ala Pro Ala Arg Lys Glu Val Leu Tyr Tyr Arg Glu Lys Gly
740 745 750
Lys Val Ala Val Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg Phe Met Pro Thr
755 760 765
Asp Phe Lys Asn Glu Trp Lys Gly Glu Gln His Ser Leu Leu Gln Lys
770 775 780
Ser Leu Ala Tyr Tyr Glu Gln Cys Lys Glu Glu Leu Lys Asn Leu Leu
785 790 795 800
Pro Glu Lys Val Phe Gln His Leu Pro Phe Lys Leu Gly Gly Tyr Phe
805 810 815
Gln Gln Lys Tyr Leu Tyr Gln Phe Tyr Thr Cys Tyr Leu Asp Lys Arg
820 825 830
Leu Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Val Gln Gln Ala Glu Asn Phe Lys Ser
835 840 845
Glu Asn Lys Val Phe Lys Lys Val Glu Asn Glu Cys Phe Lys Phe Leu
850 855 860
Lys Lys Gln Asn Tyr Thr His Lys Glu Leu Asp Ala Arg Val Gln Ser
865 870 875 880
Ile Leu Gly Tyr Pro Ile Phe Leu Glu Arg Gly Phe Met Asp Glu Lys
885 890 895
Pro Thr Ile Ile Lys Gly Lys Thr Phe Lys Gly Asn Glu Ala Leu Phe
900 905 910
Ala Asp Trp Phe Arg Tyr Tyr Lys Glu Tyr Gln Asn Phe Gln Thr Phe
915 920 925
Tyr Asp Thr Glu Asn Tyr Pro Leu Val Glu Leu Glu Lys Lys Gln Ala
930 935 940
Asp Arg Lys Arg Lys Thr Lys Ile Tyr Gln Gln Lys Lys Asn Asp Val
945 950 955 960
Phe Thr Leu Leu Met Ala Lys His Ile Phe Lys Ser Val Phe Lys Gln
965 970 975
Asp Ser Ile Asp Gln Phe Ser Leu Glu Asp Leu Tyr Gln Ser Arg Glu
980 985 990
Glu Arg Leu Gly Asn Gln Glu Arg Ala Arg Gln Thr Gly Glu Arg Asn
995 1000 1005
Thr Asn Tyr Ile Trp Asn Lys Thr Val Asp Leu Lys Leu Cys Asp
1010 1015 1020
Gly Lys Ile Thr Val Glu Asn Val Lys Leu Lys Asn Val Gly Asp
1025 1030 1035
Phe Ile Lys Tyr Glu Tyr Asp Gln Arg Val Gln Ala Phe Leu Lys
1040 1045 1050
Tyr Glu Glu Asn Ile Glu Trp Gln Ala Phe Leu Ile Lys Glu Ser
1055 1060 1065
Lys Glu Glu Glu Asn Tyr Pro Tyr Val Val Glu Arg Glu Ile Glu
1070 1075 1080
Gln Tyr Glu Lys Val Arg Arg Glu Glu Leu Leu Lys Glu Val His
1085 1090 1095
Leu Ile Glu Glu Tyr Ile Leu Glu Lys Val Lys Asp Lys Glu Ile
1100 1105 1110
Leu Lys Lys Gly Asp Asn Gln Asn Phe Lys Tyr Tyr Ile Leu Asn
1115 1120 1125
Gly Leu Leu Lys Gln Leu Lys Asn Glu Asp Val Glu Ser Tyr Lys
1130 1135 1140
Val Phe Asn Leu Asn Thr Glu Pro Glu Asp Val Asn Ile Asn Gln
1145 1150 1155
Leu Lys Gln Glu Ala Thr Asp Leu Glu Gln Lys Ala Phe Val Leu
1160 1165 1170
Thr Tyr Ile Arg Asn Lys Phe Ala His Asn Gln Leu Pro Lys Lys
1175 1180 1185
Glu Phe Trp Asp Tyr Cys Gln Glu Lys Tyr Gly Lys Ile Glu Lys
1190 1195 1200
Glu Lys Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Ala Glu Val Phe Lys Lys Glu
1205 1210 1215
Lys Glu Ala Leu Ile Lys
1220
<210> 327
<211> 1126
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 327
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Thr Asp Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val
20 25 30
Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Ile Leu Glu Glu Gly Glu Ile
35 40 45
Asn Arg Asp Gly Tyr Glu Thr Thr Leu Lys Asn Thr Trp Asn Glu Ile
50 55 60
Lys Asp Ile Asn Lys Lys Asp Arg Leu Ser Lys Leu Ile Ile Lys His
65 70 75 80
Phe Pro Phe Leu Glu Ala Ala Thr Tyr Arg Leu Asn Pro Thr Asp Thr
85 90 95
Thr Lys Gln Lys Glu Glu Lys Gln Ala Glu Ala Gln Ser Leu Glu Ser
100 105 110
Leu Arg Lys Ser Phe Phe Val Phe Ile Tyr Lys Leu Arg Asp Leu Arg
115 120 125
Asn His Tyr Ser His Tyr Lys His Ser Lys Ser Leu Glu Arg Pro Lys
130 135 140
Phe Glu Glu Gly Leu Leu Glu Lys Met Tyr Asn Ile Phe Asn Ala Ser
145 150 155 160
Ile Arg Leu Val Lys Glu Asp Tyr Gln Tyr Asn Lys Asp Ile Asn Pro
165 170 175
Asp Glu Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Thr Glu Glu Glu Phe Asn Tyr
180 185 190
Tyr Phe Thr Lys Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu
195 200 205
Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln
210 215 220
Gln Lys Leu Arg Gly Phe Lys Asp Asn Arg Glu Asn Lys Lys Lys Met
225 230 235 240
Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
245 250 255
Leu Gln Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn
260 265 270
Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Arg Glu Glu
275 280 285
Asp Arg Glu Lys Phe Arg Val Pro Ile Glu Ile Ala Asp Glu Asp Tyr
290 295 300
Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp
305 310 315 320
Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe
325 330 335
Thr Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile
340 345 350
Tyr Lys Lys Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Glu Ser His His Leu Thr His
355 360 365
Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln Glu Phe Thr Lys Gln Asn Arg
370 375 380
Pro Asp Glu Trp Arg Lys Phe Val Lys Thr Phe Asn Ser Phe Glu Thr
385 390 395 400
Ser Lys Glu Pro Tyr Ile Pro Glu Thr Thr Pro His Tyr His Leu Glu
405 410 415
Asn Gln Lys Ile Gly Ile Arg Phe Arg Asn Asp Asn Asp Lys Ile Trp
420 425 430
Pro Ser Leu Lys Thr Asn Ser Glu Lys Asn Glu Lys Ser Lys Tyr Lys
435 440 445
Leu Asp Lys Ser Phe Gln Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu
450 455 460
Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Asp
465 470 475 480
Asn Asp Asn Glu Ile Glu Thr Lys Lys Lys Glu Asn Lys Asn Asp Lys
485 490 495
Gln Glu Lys His Lys Ile Glu Glu Ile Ile Glu Asn Lys Ile Thr Glu
500 505 510
Ile Tyr Ala Leu Tyr Asp Thr Phe Ala Asn Gly Glu Ile Lys Ser Ile
515 520 525
Asp Glu Leu Glu Glu Tyr Cys Lys Gly Lys Asp Ile Glu Ile Gly His
530 535 540
Leu Pro Lys Gln Met Ile Ala Ile Leu Lys Asp Glu His Lys Val Met
545 550 555 560
Ala Thr Glu Ala Glu Arg Lys Gln Glu Glu Met Leu Val Asp Val Gln
565 570 575
Lys Ser Leu Glu Ser Leu Asp Asn Gln Ile Asn Glu Glu Ile Glu Asn
580 585 590
Val Glu Arg Lys Asn Ser Ser Leu Lys Ser Gly Lys Ile Ala Ser Trp
595 600 605
Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Gln Lys Asp Asn Glu
610 615 620
Gly Lys Pro Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Gln Leu
625 630 635 640
Leu Gln Arg Thr Leu Ala Phe Phe Gly Ser Glu His Glu Arg Leu Ala
645 650 655
Pro Tyr Phe Lys Gln Thr Lys Leu Ile Glu Ser Ser Asn Pro His Pro
660 665 670
Phe Leu Lys Asp Thr Glu Trp Glu Lys Cys Asn Asn Ile Leu Ser Phe
675 680 685
Tyr Arg Ser Tyr Leu Glu Ala Lys Lys Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys
690 695 700
Pro Glu Asp Trp Glu Lys Asn Gln Tyr Phe Leu Lys Leu Lys Glu Pro
705 710 715 720
Lys Thr Lys Pro Lys Thr Leu Val Gln Gly Trp Lys Asn Gly Phe Asn
725 730 735
Leu Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Pro Ile Arg Lys Trp Phe Met Lys
740 745 750
His Arg Glu Asn Ile Thr Val Ala Glu Leu Lys Arg Val Gly Leu Val
755 760 765
Ala Lys Val Ile Pro Leu Phe Phe Ser Glu Glu Tyr Lys Asp Ser Val
770 775 780
Gln Pro Phe Tyr Asn Tyr His Phe Asn Val Gly Asn Ile Asn Lys Pro
785 790 795 800
Asp Glu Lys Asn Phe Leu Asn Cys Glu Glu Arg Arg Glu Leu Leu Arg
805 810 815
Lys Lys Lys Asp Glu Phe Lys Lys Met Thr Asp Lys Glu Lys Glu Glu
820 825 830
Asn Pro Ser Tyr Leu Glu Phe Lys Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu
835 840 845
Leu Arg Leu Val Arg Asn Gln Asp Ile Val Thr Trp Leu Leu Cys Met
850 855 860
Glu Leu Phe Asn Lys Lys Lys Ile Lys Glu Leu Asn Val Glu Lys Ile
865 870 875 880
Tyr Leu Lys Asn Ile Asn Thr Asn Thr Thr Lys Lys Glu Lys Asn Thr
885 890 895
Glu Glu Lys Asn Gly Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Lys Asn Asn Ile
900 905 910
Leu Asn Arg Ile Met Pro Met Arg Leu Pro Ile Lys Val Tyr Gly Arg
915 920 925
Glu Asn Phe Ser Lys Asn Lys Lys Lys Lys Ile Arg Arg Asn Thr Phe
930 935 940
Phe Thr Val Tyr Ile Glu Glu Lys Gly Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly
945 950 955 960
Asn Phe Lys Ala Leu Glu Arg Asp Arg Arg Leu Gly Gly Leu Phe Ser
965 970 975
Phe Val Lys Thr Pro Ser Lys Ala Glu Ser Lys Ser Asn Thr Ile Ser
980 985 990
Lys Leu Arg Val Glu Tyr Glu Leu Gly Glu Tyr Gln Lys Ala Arg Ile
995 1000 1005
Glu Ile Ile Lys Asp Met Leu Ala Leu Glu Lys Thr Leu Ile Asp
1010 1015 1020
Lys Tyr Asn Ser Leu Asp Thr Asp Asn Phe Asn Lys Met Leu Thr
1025 1030 1035
Asp Trp Leu Glu Leu Lys Gly Glu Pro Asp Lys Ala Ser Phe Gln
1040 1045 1050
Asn Asp Val Asp Leu Leu Ile Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His
1055 1060 1065
Asn Gln Tyr Pro Met Arg Asn Arg Ile Ala Phe Ala Asn Ile Asn
1070 1075 1080
Pro Phe Ser Leu Ser Ser Ala Asn Thr Ser Glu Glu Lys Gly Leu
1085 1090 1095
Gly Ile Ala Asn Gln Leu Lys Asp Lys Thr His Lys Thr Ile Glu
1100 1105 1110
Lys Ile Ile Glu Ile Glu Lys Pro Ile Glu Thr Lys Glu
1115 1120 1125
<210> 328
<211> 1127
<212> PRT
<213> Prevotella buccae
<400> 328
Met Gln Lys Gln Asp Lys Leu Phe Val Asp Arg Lys Lys Asn Ala Ile
1 5 10 15
Phe Ala Phe Pro Lys Tyr Ile Thr Ile Met Glu Asn Lys Glu Lys Pro
20 25 30
Glu Pro Ile Tyr Tyr Glu Leu Thr Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe
35 40 45
Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val Tyr Thr Thr Ile Asn His Ile Asn
50 55 60
Arg Arg Leu Glu Ile Ala Glu Leu Lys Asp Asp Gly Tyr Met Met Gly
65 70 75 80
Ile Lys Gly Ser Trp Asn Glu Gln Ala Lys Lys Leu Asp Lys Lys Val
85 90 95
Arg Leu Arg Asp Leu Ile Met Lys His Phe Pro Phe Leu Glu Ala Ala
100 105 110
Ala Tyr Glu Met Thr Asn Ser Lys Ser Pro Asn Asn Lys Glu Gln Arg
115 120 125
Glu Lys Glu Gln Ser Glu Ala Leu Ser Leu Asn Asn Leu Lys Asn Val
130 135 140
Leu Phe Ile Phe Leu Glu Lys Leu Gln Val Leu Arg Asn Tyr Tyr Ser
145 150 155 160
His Tyr Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Pro Lys Pro Ile Phe Glu Thr Ser
165 170 175
Leu Leu Lys Asn Met Tyr Lys Val Phe Asp Ala Asn Val Arg Leu Val
180 185 190
Lys Arg Asp Tyr Met His His Glu Asn Ile Asp Met Gln Arg Asp Phe
195 200 205
Thr His Leu Asn Arg Lys Lys Gln Val Gly Arg Thr Lys Asn Ile Ile
210 215 220
Asp Ser Pro Asn Phe His Tyr His Phe Ala Asp Lys Glu Gly Asn Met
225 230 235 240
Thr Ile Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Asp Lys Lys
245 250 255
Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Leu Lys Gly Phe Lys Asp Gly Arg
260 265 270
Asn Leu Arg Glu Gln Met Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Ile
275 280 285
Ser Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Asn Val Gln Thr Lys Asp Trp Met
290 295 300
Gln Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Val Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr
305 310 315 320
Glu Arg Leu Arg Glu Lys Asp Arg Glu Ser Phe Lys Val Pro Phe Asp
325 330 335
Ile Phe Ser Asp Asp Tyr Asn Ala Glu Glu Glu Pro Phe Lys Asn Thr
340 345 350
Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr Phe Val Leu Arg Tyr Phe
355 360 365
Asp Leu Asn Glu Ile Phe Glu Gln Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly
370 375 380
Thr Tyr His Phe Ser Ile Tyr Asn Lys Arg Ile Gly Asp Glu Asp Glu
385 390 395 400
Val Arg His Leu Thr His His Leu Tyr Gly Phe Ala Arg Ile Gln Asp
405 410 415
Phe Ala Pro Gln Asn Gln Pro Glu Glu Trp Arg Lys Leu Val Lys Asp
420 425 430
Leu Asp His Phe Glu Thr Ser Gln Glu Pro Tyr Ile Ser Lys Thr Ala
435 440 445
Pro His Tyr His Leu Glu Asn Glu Lys Ile Gly Ile Lys Phe Cys Ser
450 455 460
Ala His Asn Asn Leu Phe Pro Ser Leu Gln Thr Asp Lys Thr Cys Asn
465 470 475 480
Gly Arg Ser Lys Phe Asn Leu Gly Thr Gln Phe Thr Ala Glu Ala Phe
485 490 495
Leu Ser Val His Glu Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu
500 505 510
Thr Lys Asp Tyr Ser Arg Lys Glu Ser Ala Asp Lys Val Glu Gly Ile
515 520 525
Ile Arg Lys Glu Ile Ser Asn Ile Tyr Ala Ile Tyr Asp Ala Phe Ala
530 535 540
Asn Asn Glu Ile Asn Ser Ile Ala Asp Leu Thr Arg Arg Leu Gln Asn
545 550 555 560
Thr Asn Ile Leu Gln Gly His Leu Pro Lys Gln Met Ile Ser Ile Leu
565 570 575
Lys Gly Arg Gln Lys Asp Met Gly Lys Glu Ala Glu Arg Lys Ile Gly
580 585 590
Glu Met Ile Asp Asp Thr Gln Arg Arg Leu Asp Leu Leu Cys Lys Gln
595 600 605
Thr Asn Gln Lys Ile Arg Ile Gly Lys Arg Asn Ala Gly Leu Leu Lys
610 615 620
Ser Gly Lys Ile Ala Asp Trp Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln
625 630 635 640
Pro Val Gln Lys Asp Gln Asn Asn Ile Pro Ile Asn Asn Ser Lys Ala
645 650 655
Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Met Leu Gln Arg Ala Leu Ala Leu Phe Gly
660 665 670
Ser Glu Asn Phe Arg Leu Lys Ala Tyr Phe Asn Gln Met Asn Leu Val
675 680 685
Gly Asn Asp Asn Pro His Pro Phe Leu Ala Glu Thr Gln Trp Glu His
690 695 700
Gln Thr Asn Ile Leu Ser Phe Tyr Arg Asn Tyr Leu Glu Ala Arg Lys
705 710 715 720
Lys Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Pro Gln Asn Trp Lys Gln Tyr Gln His
725 730 735
Phe Leu Ile Leu Lys Val Gln Lys Thr Asn Arg Asn Thr Leu Val Thr
740 745 750
Gly Trp Lys Asn Ser Phe Asn Leu Pro Arg Gly Ile Phe Thr Gln Pro
755 760 765
Ile Arg Glu Trp Phe Glu Lys His Asn Asn Ser Lys Arg Ile Tyr Asp
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290 295 300
Pro Tyr Ala Lys Leu Phe Ile Asp Glu Val Arg Leu Phe Glu Tyr Ser
305 310 315 320
Pro Phe Asp Asp Lys Glu Asn Met Ile Met Ser Glu Met Leu Ser Ile
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Tyr Arg Ile Arg Thr Pro Arg Leu His Lys Ile Asp Ser His Asp Ser
340 345 350
Lys Ala Thr Leu Ala Met Asp Ile Phe Gly Glu Leu Arg Arg Cys Pro
355 360 365
Met Glu Leu Tyr Asn Leu Leu Asp Lys Asn Ala Gly Gln Pro Phe Phe
370 375 380
His Asp Glu Val Lys His Pro Asn Ser His Thr Pro Asp Val Ser Lys
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Asp Glu Thr Glu Leu Phe Lys Arg Ile Arg Phe Gln Leu Gln Leu Gly
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Ser Phe Arg Tyr Lys Phe Tyr Asp Lys Glu Asn Cys Ile Asp Gly Arg
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Val Arg Val Arg Arg Ile Gln Lys Glu Ile Asn Gly Tyr Gly Arg Met
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Lys Arg Glu Glu Arg Ser Val Lys Leu Glu His Glu Glu Leu Tyr Ile
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Asn Gly Met Tyr Ile Pro Glu Leu Val Val Thr Glu Asp Lys Lys Ala
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Pro Ile Lys Met Pro Ala Pro Arg Cys Ala Leu Ser Val Tyr Asp Leu
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325 330 335
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340 345 350
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1295 1300 1305
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1310 1315 1320
<210> 334
<211> 1095
<212> PRT
<213> Riemeralla anatipesifer
<400> 334
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Tyr Arg Phe Glu Lys Asp Gly Phe Phe Thr Glu Ser Gly Leu Leu Phe
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Phe Thr Asn Leu Phe Leu Asp Lys Arg Asp Ala Tyr Trp Met Leu Lys
225 230 235 240
Lys Val Ser Gly Phe Lys Ala Ser His Lys Gln Arg Glu Lys Met Thr
245 250 255
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260 265 270
Glu Ser Arg Tyr Asp His Asn Gln Met Leu Leu Asp Met Leu Ser Glu
275 280 285
Leu Ser Arg Cys Pro Lys Leu Leu Tyr Glu Lys Leu Ser Glu Glu Asn
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565 570 575
Ser Pro Lys Leu Gly Lys Arg Arg Glu Lys Leu Ile Lys Thr Gly Val
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595 600 605
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740 745 750
Ile Lys Lys His Gly Arg Val Gly Phe Ile Ser Arg Ala Ile Thr Leu
755 760 765
Tyr Phe Lys Glu Lys Tyr Gln Asp Lys His Gln Ser Phe Tyr Asn Leu
770 775 780
Ser Tyr Lys Leu Glu Ala Lys Ala Pro Leu Leu Lys Arg Glu Glu His
785 790 795 800
Tyr Glu Tyr Trp Gln Gln Asn Lys Pro Gln Ser Pro Thr Glu Ser Gln
805 810 815
Arg Leu Glu Leu His Thr Ser Asp Arg Trp Lys Asp Tyr Leu Leu Tyr
820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
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885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Ile Lys Glu Glu Asn Asp
945 950 955 960
Thr Gln Lys His Pro Ile Ser Gln Leu Arg Leu Arg Arg Glu Leu Glu
965 970 975
Ile Tyr Gln Ser Leu Arg Val Asp Ala Phe Lys Glu Thr Leu Ser Leu
980 985 990
Glu Glu Lys Leu Leu Asn Lys His Thr Ser Leu Ser Ser Leu Glu Asn
995 1000 1005
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1010 1015 1020
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1070 1075 1080
Leu Arg Glu Tyr Cys Glu Ile Val Lys Ser Gln Ile
1085 1090 1095
<210> 335
<211> 1124
<212> PRT
<213> Prevotella aurantiaca
<400> 335
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Thr Gly Ser Ile Ser Tyr Glu Leu Lys
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Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val
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145 150 155 160
Asn Ile Gln Leu Val Ile Asn Asp Tyr Gln His Asn Lys Asp Ile Asn
165 170 175
Pro Asp Glu Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Lys Gly Gln Phe Lys Tyr
180 185 190
Ser Phe Ala Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu Phe
195 200 205
Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln Gln
210 215 220
Lys Leu Asn Gly Phe Lys Asp Asn Leu Glu Asn Lys Lys Lys Met Thr
225 230 235 240
His Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Ile Leu Met Pro Lys Leu Arg Leu
245 250 255
Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu
260 265 270
Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Asp Asp
275 280 285
Arg Glu Lys Phe Lys Val Pro Phe Asp Pro Ala Asp Glu Asp Tyr Asn
290 295 300
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305 310 315 320
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385 390 395 400
Asn Lys Arg Tyr Ile Ser Glu Thr Thr Pro His Tyr His Leu Glu Asn
405 410 415
Gln Lys Ile Gly Ile Arg Phe Arg Asn Gly Asn Lys Glu Ile Trp Pro
420 425 430
Ser Leu Lys Thr Asn Asp Glu Asn Asn Glu Lys Ser Lys Tyr Lys Leu
435 440 445
Asp Lys Gln Tyr Gln Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu Leu
450 455 460
Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu Lys Lys Glu Lys Pro Asn Asn
465 470 475 480
Asp Glu Ile Asn Ala Ser Ile Val Glu Gly Phe Ile Lys Arg Glu Ile
485 490 495
Arg Asn Ile Phe Lys Leu Tyr Asp Ala Phe Ala Asn Gly Glu Ile Asn
500 505 510
Asn Ile Asp Asp Leu Glu Lys Tyr Cys Ala Asp Lys Gly Ile Pro Lys
515 520 525
Arg His Leu Pro Lys Gln Met Val Ala Ile Leu Tyr Asp Glu His Lys
530 535 540
Asp Met Val Lys Glu Ala Lys Arg Lys Gln Lys Glu Met Val Lys Asp
545 550 555 560
Thr Lys Lys Leu Leu Ala Thr Leu Glu Lys Gln Thr Gln Lys Glu Lys
565 570 575
Glu Asp Asp Gly Arg Asn Val Lys Leu Leu Lys Ser Gly Glu Ile Ala
580 585 590
Arg Trp Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Gln Lys Asp
595 600 605
Asn Glu Gly Lys Pro Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr
610 615 620
Gln Met Leu Gln Arg Ser Leu Ala Leu Tyr Asn Asn Glu Glu Lys Pro
625 630 635 640
Thr Arg Tyr Phe Arg Gln Val Asn Leu Ile Glu Ser Asn Asn Pro His
645 650 655
Pro Phe Leu Lys Trp Thr Lys Trp Glu Glu Cys Asn Asn Ile Leu Thr
660 665 670
Phe Tyr Tyr Ser Tyr Leu Thr Lys Lys Ile Glu Phe Leu Asn Lys Leu
675 680 685
Lys Pro Glu Asp Trp Lys Lys Asn Gln Tyr Phe Leu Lys Leu Lys Glu
690 695 700
Pro Lys Thr Asn Arg Glu Thr Leu Val Gln Gly Trp Lys Asn Gly Phe
705 710 715 720
Asn Leu Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Pro Ile Arg Glu Trp Phe Lys
725 730 735
Arg His Gln Asn Asn Ser Lys Glu Tyr Glu Lys Val Glu Ala Leu Asp
740 745 750
Arg Val Gly Leu Val Thr Lys Val Ile Pro Leu Phe Phe Lys Glu Glu
755 760 765
Tyr Phe Lys Asp Lys Glu Glu Asn Phe Lys Glu Asp Thr Gln Lys Glu
770 775 780
Ile Asn Asp Cys Val Gln Pro Phe Tyr Asn Phe Pro Tyr Asn Val Gly
785 790 795 800
Asn Ile His Lys Pro Lys Glu Lys Asp Phe Leu His Arg Glu Glu Arg
805 810 815
Ile Glu Leu Trp Asp Lys Lys Lys Asp Lys Phe Lys Gly Tyr Lys Glu
820 825 830
Lys Ile Lys Ser Lys Lys Leu Thr Glu Lys Asp Lys Glu Glu Phe Arg
835 840 845
Ser Tyr Leu Glu Phe Gln Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg
850 855 860
Leu Val Arg Asn Gln Asp Ile Val Thr Trp Leu Leu Cys Lys Glu Leu
865 870 875 880
Ile Asp Lys Leu Lys Ile Asp Glu Leu Asn Ile Glu Glu Leu Lys Lys
885 890 895
Leu Arg Leu Asn Asn Ile Asp Thr Asp Thr Ala Lys Lys Glu Lys Asn
900 905 910
Asn Ile Leu Asn Arg Val Met Pro Met Glu Leu Pro Val Thr Val Tyr
915 920 925
Glu Ile Asp Asp Ser His Lys Ile Val Lys Asp Lys Pro Leu His Thr
930 935 940
Ile Tyr Ile Lys Glu Ala Glu Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe
945 950 955 960
Lys Ala Leu Val Lys Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val
965 970 975
Lys Thr Asn Ser Glu Ala Glu Ser Lys Arg Asn Pro Ile Ser Lys Leu
980 985 990
Arg Val Glu Tyr Glu Leu Gly Glu Tyr Gln Glu Ala Arg Ile Glu Ile
995 1000 1005
Ile Gln Asp Met Leu Ala Leu Glu Glu Lys Leu Ile Asn Lys Tyr
1010 1015 1020
Lys Asp Leu Pro Thr Asn Lys Phe Ser Glu Met Leu Asn Ser Trp
1025 1030 1035
Leu Glu Gly Lys Asp Glu Ala Asp Lys Ala Arg Phe Gln Asn Asp
1040 1045 1050
Val Asp Phe Leu Ile Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln
1055 1060 1065
Tyr Pro Met His Asn Lys Ile Glu Phe Ala Asn Ile Lys Pro Phe
1070 1075 1080
Ser Leu Tyr Thr Ala Asn Asn Ser Glu Glu Lys Gly Leu Gly Ile
1085 1090 1095
Ala Asn Gln Leu Lys Asp Lys Thr Lys Glu Thr Thr Asp Lys Ile
1100 1105 1110
Lys Lys Ile Glu Lys Pro Ile Glu Thr Lys Glu
1115 1120
<210> 336
<211> 1151
<212> PRT
<213> Prevotella saccharolytica
<400> 336
Met Glu Asp Lys Pro Phe Trp Ala Ala Phe Phe Asn Leu Ala Arg His
1 5 10 15
Asn Val Tyr Leu Thr Val Asn His Ile Asn Lys Leu Leu Asp Leu Glu
20 25 30
Lys Leu Tyr Asp Glu Gly Lys His Lys Glu Ile Phe Glu Arg Glu Asp
35 40 45
Ile Phe Asn Ile Ser Asp Asp Val Met Asn Asp Ala Asn Ser Asn Gly
50 55 60
Lys Lys Arg Lys Leu Asp Ile Lys Lys Ile Trp Asp Asp Leu Asp Thr
65 70 75 80
Asp Leu Thr Arg Lys Tyr Gln Leu Arg Glu Leu Ile Leu Lys His Phe
85 90 95
Pro Phe Ile Gln Pro Ala Ile Ile Gly Ala Gln Thr Lys Glu Arg Thr
100 105 110
Thr Ile Asp Lys Asp Lys Arg Ser Thr Ser Thr Ser Asn Asp Ser Leu
115 120 125
Lys Gln Thr Gly Glu Gly Asp Ile Asn Asp Leu Leu Ser Leu Ser Asn
130 135 140
Val Lys Ser Met Phe Phe Arg Leu Leu Gln Ile Leu Glu Gln Leu Arg
145 150 155 160
Asn Tyr Tyr Ser His Val Lys His Ser Lys Ser Ala Thr Met Pro Asn
165 170 175
Phe Asp Glu Asp Leu Leu Asn Trp Met Arg Tyr Ile Phe Ile Asp Ser
180 185 190
Val Asn Lys Val Lys Glu Asp Tyr Ser Ser Asn Ser Val Ile Asp Pro
195 200 205
Asn Thr Ser Phe Ser His Leu Ile Tyr Lys Asp Glu Gln Gly Lys Ile
210 215 220
Lys Pro Cys Arg Tyr Pro Phe Thr Ser Lys Asp Gly Ser Ile Asn Ala
225 230 235 240
Phe Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Gln Asp Ser
245 250 255
Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Pro Gly Phe Lys Lys Ala Ser Glu Asn
260 265 270
Tyr Met Lys Met Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Asn His Ile Leu Leu
275 280 285
Pro Lys Ile Arg Leu Glu Thr Val Tyr Asp Lys Asp Trp Met Leu Leu
290 295 300
Asp Met Leu Asn Glu Val Val Arg Cys Pro Leu Ser Leu Tyr Lys Arg
305 310 315 320
Leu Thr Pro Ala Ala Gln Asn Lys Phe Lys Val Pro Glu Lys Ser Ser
325 330 335
Asp Asn Ala Asn Arg Gln Glu Asp Asp Asn Pro Phe Ser Arg Ile Leu
340 345 350
Val Arg His Gln Asn Arg Phe Pro Tyr Phe Val Leu Arg Phe Phe Asp
355 360 365
Leu Asn Glu Val Phe Thr Thr Leu Arg Phe Gln Ile Asn Leu Gly Cys
370 375 380
Tyr His Phe Ala Ile Cys Lys Lys Gln Ile Gly Asp Lys Lys Glu Val
385 390 395 400
His His Leu Ile Arg Thr Leu Tyr Gly Phe Ser Arg Leu Gln Asn Phe
405 410 415
Thr Gln Asn Thr Arg Pro Glu Glu Trp Asn Thr Leu Val Lys Thr Thr
420 425 430
Glu Pro Ser Ser Gly Asn Asp Gly Lys Thr Val Gln Gly Val Pro Leu
435 440 445
Pro Tyr Ile Ser Tyr Thr Ile Pro His Tyr Gln Ile Glu Asn Glu Lys
450 455 460
Ile Gly Ile Lys Ile Phe Asp Gly Asp Thr Ala Val Asp Thr Asp Ile
465 470 475 480
Trp Pro Ser Val Ser Thr Glu Lys Gln Leu Asn Lys Pro Asp Lys Tyr
485 490 495
Thr Leu Thr Pro Gly Phe Lys Ala Asp Val Phe Leu Ser Val His Glu
500 505 510
Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Gln Leu Leu Leu Cys Glu Gly Met
515 520 525
Leu Lys Thr Asp Ala Gly Asn Ala Val Glu Lys Val Leu Ile Asp Thr
530 535 540
Arg Asn Ala Ile Phe Asn Leu Tyr Asp Ala Phe Val Gln Glu Lys Ile
545 550 555 560
Asn Thr Ile Thr Asp Leu Glu Asn Tyr Leu Gln Asp Lys Pro Ile Leu
565 570 575
Ile Gly His Leu Pro Lys Gln Met Ile Asp Leu Leu Lys Gly His Gln
580 585 590
Arg Asp Met Leu Lys Ala Val Glu Gln Lys Lys Ala Met Leu Ile Lys
595 600 605
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610 615 620
Thr Asp Val Ala Ala Lys Asn Thr Gly Thr Leu Leu Lys Asn Gly Gln
625 630 635 640
Ile Ala Asp Trp Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Lys
645 650 655
Arg Asp Lys Glu Gly Asn Pro Ile Asn Cys Ser Lys Ala Asn Ser Thr
660 665 670
Glu Tyr Gln Met Leu Gln Arg Ala Phe Ala Phe Tyr Ala Thr Asp Ser
675 680 685
Cys Arg Leu Ser Arg Tyr Phe Thr Gln Leu His Leu Ile His Ser Asp
690 695 700
Asn Ser His Leu Phe Leu Ser Arg Phe Glu Tyr Asp Lys Gln Pro Asn
705 710 715 720
Leu Ile Ala Phe Tyr Ala Ala Tyr Leu Lys Ala Lys Leu Glu Phe Leu
725 730 735
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740 745 750
Leu Arg Ala Pro Lys Asn Asp Arg Gln Lys Leu Ala Glu Gly Trp Lys
755 760 765
Asn Gly Phe Asn Leu Pro Arg Gly Leu Phe Thr Glu Lys Ile Lys Thr
770 775 780
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785 790 795 800
Phe Lys Asn Arg Val Gly Gln Val Ala Arg Leu Ile Pro Val Phe Phe
805 810 815
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820 825 830
Asn Val Gly Asn Val Ser Lys Pro Thr Glu Ala Asn Tyr Leu Ser Lys
835 840 845
Gly Lys Arg Glu Glu Leu Phe Lys Ser Tyr Gln Asn Lys Phe Lys Asn
850 855 860
Asn Ile Pro Ala Glu Lys Thr Lys Glu Tyr Arg Glu Tyr Lys Asn Phe
865 870 875 880
Ser Leu Trp Lys Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Ile Lys Asn Gln
885 890 895
Asp Ile Leu Ile Trp Leu Met Cys Lys Asn Leu Phe Asp Glu Lys Ile
900 905 910
Lys Pro Lys Lys Asp Ile Leu Glu Pro Arg Ile Ala Val Ser Tyr Ile
915 920 925
Lys Leu Asp Ser Leu Gln Thr Asn Thr Ser Thr Ala Gly Ser Leu Asn
930 935 940
Ala Leu Ala Lys Val Val Pro Met Thr Leu Ala Ile His Ile Asp Ser
945 950 955 960
Pro Lys Pro Lys Gly Lys Ala Gly Asn Asn Glu Lys Glu Asn Lys Glu
965 970 975
Phe Thr Val Tyr Ile Lys Glu Glu Gly Thr Lys Leu Leu Lys Trp Gly
980 985 990
Asn Phe Lys Thr Leu Leu Ala Asp Arg Arg Ile Lys Gly Leu Phe Ser
995 1000 1005
Tyr Ile Glu His Asp Asp Ile Asp Leu Lys Gln His Pro Leu Thr
1010 1015 1020
Lys Arg Arg Val Asp Leu Glu Leu Asp Leu Tyr Gln Thr Cys Arg
1025 1030 1035
Ile Asp Ile Phe Gln Gln Thr Leu Gly Leu Glu Ala Gln Leu Leu
1040 1045 1050
Asp Lys Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Asp Asn Phe Tyr Gln Met Leu
1055 1060 1065
Ile Gly Trp Arg Lys Lys Glu Gly Ile Pro Arg Asn Ile Lys Glu
1070 1075 1080
Asp Thr Asp Phe Leu Lys Asp Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn
1085 1090 1095
Gln Tyr Pro Asp Ser Lys Lys Ile Ala Phe Arg Arg Ile Arg Lys
1100 1105 1110
Phe Asn Pro Lys Glu Leu Ile Leu Glu Glu Glu Glu Gly Leu Gly
1115 1120 1125
Ile Ala Thr Gln Met Tyr Lys Glu Val Glu Lys Val Val Asn Arg
1130 1135 1140
Ile Lys Arg Ile Glu Leu Phe Asp
1145 1150
<210> 337
<211> 1159
<212> PRT
<213> Myroides odoratimimus
<400> 337
Met Lys Asp Ile Leu Thr Thr Asp Thr Thr Glu Lys Gln Asn Arg Phe
1 5 10 15
Tyr Ser His Lys Ile Ala Asp Lys Tyr Phe Phe Gly Gly Tyr Phe Asn
20 25 30
Leu Ala Ser Asn Asn Ile Tyr Glu Val Phe Glu Glu Val Asn Lys Arg
35 40 45
Asn Thr Phe Gly Lys Leu Ala Lys Arg Asp Asn Gly Asn Leu Lys Asn
50 55 60
Tyr Ile Ile His Val Phe Lys Asp Glu Leu Ser Ile Ser Asp Phe Glu
65 70 75 80
Lys Arg Val Ala Ile Phe Ala Ser Tyr Phe Pro Ile Leu Glu Thr Val
85 90 95
Asp Lys Lys Ser Ile Lys Glu Arg Asn Arg Thr Ile Asp Leu Thr Leu
100 105 110
Ser Gln Arg Ile Arg Gln Phe Arg Glu Met Leu Ile Ser Leu Val Thr
115 120 125
Ala Val Asp Gln Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Tyr His His Ser Asp
130 135 140
Ile Val Ile Glu Asn Lys Val Leu Asp Phe Leu Asn Ser Ser Phe Val
145 150 155 160
Ser Thr Ala Leu His Val Lys Asp Lys Tyr Leu Lys Thr Asp Lys Thr
165 170 175
Lys Glu Phe Leu Lys Glu Thr Ile Ala Ala Glu Leu Asp Ile Leu Ile
180 185 190
Glu Ala Tyr Lys Lys Lys Gln Ile Glu Lys Lys Asn Thr Arg Phe Lys
195 200 205
Ala Asn Lys Arg Glu Asp Ile Leu Asn Ala Ile Tyr Asn Glu Ala Phe
210 215 220
Trp Ser Phe Ile Asn Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Glu Thr Val
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Asp Ala Tyr Phe Glu Lys Asn His His Lys Ser
245 250 255
Asn Asp Pro Asp Phe Ala Leu Asn Ile Ser Glu Lys Gly Ile Val Tyr
260 265 270
Leu Leu Ser Phe Phe Leu Thr Asn Lys Glu Met Asp Ser Leu Lys Ala
275 280 285
Asn Leu Thr Gly Phe Lys Gly Lys Val Asp Arg Glu Ser Gly Asn Ser
290 295 300
Ile Lys Tyr Met Ala Thr Gln Arg Ile Tyr Ser Phe His Thr Tyr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Lys Gln Lys Ile Arg Thr Ser Glu Glu Gly Val Lys Glu Thr
325 330 335
Leu Leu Met Gln Met Ile Asp Glu Leu Ser Lys Val Pro Asn Val Val
340 345 350
Tyr Gln His Leu Ser Thr Thr Gln Gln Asn Ser Phe Ile Glu Asp Trp
355 360 365
Asn Glu Tyr Tyr Lys Asp Tyr Glu Asp Asp Val Glu Thr Asp Asp Leu
370 375 380
Ser Arg Val Ile His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Arg Phe
385 390 395 400
Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Phe Asp Phe Pro Thr
405 410 415
Leu Arg Phe Gln Val His Leu Gly Asp Tyr Val His Asp Arg Arg Thr
420 425 430
Lys Gln Leu Gly Lys Val Glu Ser Asp Arg Ile Ile Lys Glu Lys Val
435 440 445
Thr Val Phe Ala Arg Leu Lys Asp Ile Asn Ser Ala Lys Ala Ser Tyr
450 455 460
Phe His Ser Leu Glu Glu Gln Asp Lys Glu Glu Leu Asp Asn Lys Trp
465 470 475 480
Thr Leu Phe Pro Asn Pro Ser Tyr Asp Phe Pro Lys Glu His Thr Leu
485 490 495
Gln His Gln Gly Glu Gln Lys Asn Ala Gly Lys Ile Gly Ile Tyr Val
500 505 510
Lys Leu Arg Asp Thr Gln Tyr Lys Glu Lys Ala Ala Leu Glu Glu Ala
515 520 525
Arg Lys Ser Leu Asn Pro Lys Glu Arg Ser Ala Thr Lys Ala Ser Lys
530 535 540
Tyr Asp Ile Ile Thr Gln Ile Ile Glu Ala Asn Asp Asn Val Lys Ser
545 550 555 560
Glu Lys Pro Leu Val Phe Thr Gly Gln Pro Ile Ala Tyr Leu Ser Met
565 570 575
Asn Asp Ile His Ser Met Leu Phe Ser Leu Leu Thr Asp Asn Ala Glu
580 585 590
Leu Lys Lys Thr Pro Glu Glu Val Glu Ala Lys Leu Ile Asp Gln Ile
595 600 605
Gly Lys Gln Ile Asn Glu Ile Leu Ser Lys Asp Thr Asp Thr Lys Ile
610 615 620
Leu Lys Lys Tyr Lys Asp Asn Asp Leu Lys Glu Thr Asp Thr Asp Lys
625 630 635 640
Ile Thr Arg Asp Leu Ala Arg Asp Lys Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ile
645 650 655
Leu Glu Gln Lys Gln Arg Ala Asp Asp Tyr Asn Tyr Thr Ser Ser Thr
660 665 670
Lys Phe Asn Ile Asp Lys Ser Arg Lys Arg Lys His Leu Leu Phe Asn
675 680 685
Ala Glu Lys Gly Lys Ile Gly Val Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg
690 695 700
Phe Met Phe Lys Glu Ser Lys Ser Lys Trp Lys Gly Tyr Gln His Thr
705 710 715 720
Glu Leu Gln Lys Leu Phe Ala Tyr Phe Asp Thr Ser Lys Ser Asp Leu
725 730 735
Glu Leu Ile Leu Ser Asn Met Val Met Val Lys Asp Tyr Pro Ile Glu
740 745 750
Leu Ile Asp Leu Val Lys Lys Ser Arg Thr Leu Val Asp Phe Leu Asn
755 760 765
Lys Tyr Leu Glu Ala Arg Leu Glu Tyr Ile Glu Asn Val Ile Thr Arg
770 775 780
Val Lys Asn Ser Ile Gly Thr Pro Gln Phe Lys Thr Val Arg Lys Glu
785 790 795 800
Cys Phe Thr Phe Leu Lys Lys Ser Asn Tyr Thr Val Val Ser Leu Asp
805 810 815
Lys Gln Val Glu Arg Ile Leu Ser Met Pro Leu Phe Ile Glu Arg Gly
820 825 830
Phe Met Asp Asp Lys Pro Thr Met Leu Glu Gly Lys Ser Tyr Lys Gln
835 840 845
His Lys Glu Lys Phe Ala Asp Trp Phe Val His Tyr Lys Glu Asn Ser
850 855 860
Asn Tyr Gln Asn Phe Tyr Asp Thr Glu Val Tyr Glu Ile Thr Thr Glu
865 870 875 880
Asp Lys Arg Glu Lys Ala Lys Val Thr Lys Lys Ile Lys Gln Gln Gln
885 890 895
Lys Asn Asp Val Phe Thr Leu Met Met Val Asn Tyr Met Leu Glu Glu
900 905 910
Val Leu Lys Leu Ser Ser Asn Asp Arg Leu Ser Leu Asn Glu Leu Tyr
915 920 925
Gln Thr Lys Glu Glu Arg Ile Val Asn Lys Gln Val Ala Lys Asp Thr
930 935 940
Gln Glu Arg Asn Lys Asn Tyr Ile Trp Asn Lys Val Val Asp Leu Gln
945 950 955 960
Leu Cys Asp Gly Leu Val His Ile Asp Asn Val Lys Leu Lys Asp Ile
965 970 975
Gly Asn Phe Arg Lys Tyr Glu Asn Asp Ser Arg Val Lys Glu Phe Leu
980 985 990
Thr Tyr Gln Ser Asp Ile Val Trp Ser Ala Tyr Leu Ser Asn Glu Val
995 1000 1005
Asp Ser Asn Lys Leu Tyr Val Ile Glu Arg Gln Leu Asp Asn Tyr
1010 1015 1020
Glu Ser Ile Arg Ser Lys Glu Leu Leu Lys Glu Val Gln Glu Ile
1025 1030 1035
Glu Cys Ser Val Tyr Asn Gln Val Ala Asn Lys Glu Ser Leu Lys
1040 1045 1050
Gln Ser Gly Asn Glu Asn Phe Lys Gln Tyr Val Leu Gln Gly Leu
1055 1060 1065
Leu Pro Ile Gly Met Asp Val Arg Glu Met Leu Ile Leu Ser Thr
1070 1075 1080
Asp Val Lys Phe Lys Lys Glu Glu Ile Ile Gln Leu Gly Gln Ala
1085 1090 1095
Gly Glu Val Glu Gln Asp Leu Tyr Ser Leu Ile Tyr Ile Arg Asn
1100 1105 1110
Lys Phe Ala His Asn Gln Leu Pro Ile Lys Glu Phe Phe Asp Phe
1115 1120 1125
Cys Glu Asn Asn Tyr Arg Ser Ile Ser Asp Asn Glu Tyr Tyr Ala
1130 1135 1140
Glu Tyr Tyr Met Glu Ile Phe Arg Ser Ile Lys Glu Lys Tyr Ala
1145 1150 1155
Asn
<210> 338
<211> 1120
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 338
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Thr Asp Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val
20 25 30
Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Ile Leu Glu Glu Asp Glu Ile
35 40 45
Asn Arg Asp Gly Tyr Glu Asn Thr Leu Glu Asn Ser Trp Asn Glu Ile
50 55 60
Lys Asp Ile Asn Lys Lys Asp Arg Leu Ser Lys Leu Ile Ile Lys His
65 70 75 80
Phe Pro Phe Leu Glu Ala Thr Thr Tyr Arg Gln Asn Pro Thr Asp Thr
85 90 95
Thr Lys Gln Lys Glu Glu Lys Gln Ala Glu Ala Gln Ser Leu Glu Ser
100 105 110
Leu Lys Lys Ser Phe Phe Val Phe Ile Tyr Lys Leu Arg Asp Leu Arg
115 120 125
Asn His Tyr Ser His Tyr Lys His Ser Lys Ser Leu Glu Arg Pro Lys
130 135 140
Phe Glu Glu Asp Leu Gln Asn Lys Met Tyr Asn Ile Phe Asp Val Ser
145 150 155 160
Ile Gln Phe Val Lys Glu Asp Tyr Lys His Asn Thr Asp Ile Asn Pro
165 170 175
Lys Lys Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Lys Arg Lys Gly Lys Phe His
180 185 190
Tyr Ser Phe Ala Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu
195 200 205
Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Val Gln
210 215 220
Lys Lys Leu Glu Gly Phe Lys Cys Ser Asn Lys Ser Tyr Gln Lys Met
225 230 235 240
Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
245 250 255
Leu Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn
260 265 270
Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Val
275 280 285
Asn Arg Lys Lys Phe Tyr Val Ser Phe Asp Pro Ala Asp Glu Asp Tyr
290 295 300
Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp
305 310 315 320
Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Val Phe
325 330 335
Ala Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile
340 345 350
Tyr Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln Lys Glu Asp Arg His Leu Thr His
355 360 365
Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln Glu Phe Asp Lys Gln Asn Arg
370 375 380
Pro Asp Glu Trp Lys Ala Ile Val Lys Asp Ser Asp Thr Phe Lys Lys
385 390 395 400
Lys Glu Glu Lys Glu Glu Glu Lys Pro Tyr Ile Ser Glu Thr Thr Pro
405 410 415
His Tyr His Leu Glu Asn Lys Lys Ile Gly Ile Ala Phe Lys Asn His
420 425 430
Asn Ile Trp Pro Ser Thr Gln Thr Glu Leu Thr Asn Asn Lys Arg Lys
435 440 445
Lys Tyr Asn Leu Gly Thr Ser Ile Lys Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val
450 455 460
His Glu Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu Lys Thr Glu
465 470 475 480
Asn Thr Lys Asn Asp Asn Lys Val Gly Gly Lys Lys Glu Thr Lys Lys
485 490 495
Gln Gly Lys His Lys Ile Glu Ala Ile Ile Glu Ser Lys Ile Lys Asp
500 505 510
Ile Tyr Ala Leu Tyr Asp Ala Phe Ala Asn Gly Glu Ile Asn Ser Glu
515 520 525
Asp Glu Leu Lys Glu Tyr Leu Lys Gly Lys Asp Ile Lys Ile Val His
530 535 540
Leu Pro Lys Gln Met Ile Ala Ile Leu Lys Asn Glu His Lys Asp Met
545 550 555 560
Ala Glu Lys Ala Glu Ala Lys Gln Glu Lys Met Lys Leu Ala Thr Glu
565 570 575
Asn Arg Leu Lys Thr Leu Asp Lys Gln Leu Lys Gly Lys Ile Gln Asn
580 585 590
Gly Lys Arg Tyr Asn Ser Ala Pro Lys Ser Gly Glu Ile Ala Ser Trp
595 600 605
Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Gln Lys Asp Glu Asn
610 615 620
Gly Glu Ser Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Gln Leu
625 630 635 640
Leu Gln Arg Thr Leu Ala Phe Phe Gly Ser Glu His Glu Arg Leu Ala
645 650 655
Pro Tyr Phe Lys Gln Thr Lys Leu Ile Glu Ser Ser Asn Pro His Pro
660 665 670
Phe Leu Asn Asp Thr Glu Trp Glu Lys Cys Ser Asn Ile Leu Ser Phe
675 680 685
Tyr Arg Ser Tyr Leu Lys Ala Arg Lys Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys
690 695 700
Pro Glu Asp Trp Glu Lys Asn Gln Tyr Phe Leu Met Leu Lys Glu Pro
705 710 715 720
Lys Thr Asn Arg Glu Thr Leu Val Gln Gly Trp Lys Asn Gly Phe Asn
725 730 735
Leu Pro Arg Gly Phe Phe Thr Glu Pro Ile Arg Lys Trp Phe Met Glu
740 745 750
His Trp Lys Ser Ile Lys Val Asp Asp Leu Lys Arg Val Gly Leu Val
755 760 765
Ala Lys Val Thr Pro Leu Phe Phe Ser Glu Lys Tyr Lys Asp Ser Val
770 775 780
Gln Pro Phe Tyr Asn Tyr Pro Phe Asn Val Gly Asp Val Asn Lys Pro
785 790 795 800
Lys Glu Glu Asp Phe Leu His Arg Glu Glu Arg Ile Glu Leu Trp Asp
805 810 815
Lys Lys Lys Asp Lys Phe Lys Gly Tyr Lys Ala Lys Lys Lys Phe Lys
820 825 830
Glu Met Thr Asp Lys Glu Lys Glu Glu His Arg Ser Tyr Leu Glu Phe
835 840 845
Gln Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Arg Asn Gln
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Lys Ser Trp Gln Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Lys Asn Gln
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<213> Flavobacterium branchiphilum
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100 105 110
Asn His Tyr Val His Asn Phe Asn Asp Ile Asn Leu Asn Lys Ile Asp
115 120 125
Ser Asn Val Phe His Phe Leu Lys Glu Ser Phe Glu Leu Ala Ile Ile
130 135 140
Glu Lys Tyr Tyr Lys Val Asn Lys Lys Tyr Pro Leu Asp Asn Glu Ile
145 150 155 160
Val Leu Phe Leu Lys Glu Leu Phe Ile Lys Asp Glu Asn Thr Ala Leu
165 170 175
Leu Asn Tyr Phe Thr Asn Leu Ser Lys Asp Glu Ala Ile Glu Tyr Ile
180 185 190
Leu Thr Phe Thr Ile Thr Glu Asn Lys Ile Trp Asn Ile Asn Asn Glu
195 200 205
His Asn Ile Leu Asn Ile Glu Lys Gly Lys Tyr Leu Thr Phe Glu Ala
210 215 220
Met Leu Phe Leu Ile Thr Ile Phe Leu Tyr Lys Asn Glu Ala Asn His
225 230 235 240
Leu Leu Pro Lys Leu Tyr Asp Phe Lys Asn Asn Lys Ser Lys Gln Glu
245 250 255
Leu Phe Thr Phe Phe Ser Lys Lys Phe Thr Ser Gln Asp Ile Asp Ala
260 265 270
Glu Glu Gly His Leu Ile Lys Phe Arg Asp Met Ile Gln Tyr Leu Asn
275 280 285
His Tyr Pro Thr Ala Trp Asn Asn Asp Leu Lys Leu Glu Ser Glu Asn
290 295 300
Lys Asn Lys Ile Met Thr Thr Lys Leu Ile Asp Ser Ile Ile Glu Phe
305 310 315 320
Glu Leu Asn Ser Asn Tyr Pro Ser Phe Ala Thr Asp Ile Gln Phe Lys
325 330 335
Lys Glu Ala Lys Ala Phe Leu Phe Ala Ser Asn Lys Lys Arg Asn Gln
340 345 350
Thr Ser Phe Ser Asn Lys Ser Tyr Asn Glu Glu Ile Arg His Asn Pro
355 360 365
His Ile Lys Gln Tyr Arg Asp Glu Ile Ala Ser Ala Leu Thr Pro Ile
370 375 380
Ser Phe Asn Val Lys Glu Asp Lys Phe Lys Ile Phe Val Lys Lys His
385 390 395 400
Val Leu Glu Glu Tyr Phe Pro Asn Ser Ile Gly Tyr Glu Lys Phe Leu
405 410 415
Glu Tyr Asn Asp Phe Thr Glu Lys Glu Lys Glu Asp Phe Gly Leu Lys
420 425 430
Leu Tyr Ser Asn Pro Lys Thr Asn Lys Leu Ile Glu Arg Ile Asp Asn
435 440 445
His Lys Leu Val Lys Ser His Gly Arg Asn Gln Asp Arg Phe Met Asp
450 455 460
Phe Ser Met Arg Phe Leu Ala Glu Asn Asn Tyr Phe Gly Lys Asp Ala
465 470 475 480
Phe Phe Lys Cys Tyr Lys Phe Tyr Asp Thr Gln Glu Gln Asp Glu Phe
485 490 495
Leu Gln Ser Asn Glu Asn Asn Asp Asp Val Lys Phe His Lys Gly Lys
500 505 510
Val Thr Thr Tyr Ile Lys Tyr Glu Glu His Leu Lys Asn Tyr Ser Tyr
515 520 525
Trp Asp Cys Pro Phe Val Glu Glu Asn Asn Ser Met Ser Val Lys Ile
530 535 540
Ser Ile Gly Ser Glu Glu Lys Ile Leu Lys Ile Gln Arg Asn Leu Met
545 550 555 560
Ile Tyr Phe Leu Glu Asn Ala Leu Tyr Asn Glu Asn Val Glu Asn Gln
565 570 575
Gly Tyr Lys Leu Val Asn Asn Tyr Tyr Arg Glu Leu Lys Lys Asp Val
580 585 590
Glu Glu Ser Ile Ala Ser Leu Asp Leu Ile Lys Ser Asn Pro Asp Phe
595 600 605
Lys Ser Lys Tyr Lys Lys Ile Leu Pro Lys Arg Leu Leu His Asn Tyr
610 615 620
Ala Pro Ala Lys Gln Asp Lys Ala Pro Glu Asn Ala Phe Glu Thr Leu
625 630 635 640
Leu Lys Lys Ala Asp Phe Arg Glu Glu Gln Tyr Lys Lys Leu Leu Lys
645 650 655
Lys Ala Glu His Glu Lys Asn Lys Glu Asp Phe Val Lys Arg Asn Lys
660 665 670
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675 680 685
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Glu Lys Lys Asp Pro Val Ile Glu Lys Arg Lys Asn Lys Glu His Glu
705 710 715 720
Phe Gly His His Lys Asn Leu Asn Ile Thr Arg Glu Glu Phe Asn Asp
725 730 735
Tyr Cys Lys Trp Met Phe Ala Phe Asn Gly Asn Asp Ser Tyr Lys Lys
740 745 750
Tyr Leu Arg Asp Leu Phe Ser Glu Lys His Phe Phe Asp Asn Gln Glu
755 760 765
Tyr Lys Asn Leu Phe Glu Ser Ser Val Asn Leu Glu Ala Phe Tyr Ala
770 775 780
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785 790 795 800
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835 840 845
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850 855 860
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865 870 875 880
Lys Ser Asn Lys Leu Glu Asp Cys Leu Leu Tyr Glu Ile Ala Tyr Asn
885 890 895
Tyr Ile Asp Lys Lys Asn Val His Lys Ile Asp Ile Gln Lys Ile Leu
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915 920 925
Ile Ser Val Pro Phe Asn Lys Leu Glu Arg Tyr Thr Glu Met Ile Ala
930 935 940
Ile Lys Asn Gln Asn Asn Leu Lys Ala Arg Phe Leu Ile Asp Leu Pro
945 950 955 960
Leu Tyr Leu Ser Lys Asn Lys Ile Lys Lys Gly Lys Asp Ser Ala Gly
965 970 975
Tyr Glu Ile Ile Ile Lys Asn Asp Leu Glu Ile Glu Asp Ile Asn Thr
980 985 990
Ile Asn Asn Lys Ile Ile Asn Asp Ser Val Lys Phe Thr Glu Val Leu
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Glu Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Ile Lys Phe Lys His Asn Asn Phe
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Tyr Leu Asn Leu Phe Asn Lys Asn Glu Ser Lys Thr Ile Lys Asn
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Asp Lys Glu Val Lys Lys Asn Arg Val Leu Gln Lys Phe Ile Asn
1130 1135 1140
Gln Val Ile Leu Lys Lys Lys
1145 1150
<210> 343
<211> 1159
<212> PRT
<213> Myroides odoratimimus
<400> 343
Met Lys Asp Ile Leu Thr Thr Asp Thr Thr Glu Lys Gln Asn Arg Phe
1 5 10 15
Tyr Ser His Lys Ile Ala Asp Lys Tyr Phe Phe Gly Gly Tyr Phe Asn
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Leu Ala Ser Asn Asn Ile Tyr Glu Val Phe Glu Glu Val Asn Lys Arg
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Asn Thr Phe Gly Lys Leu Ala Lys Arg Asp Asn Gly Asn Leu Lys Asn
50 55 60
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65 70 75 80
Lys Arg Val Ala Ile Phe Ala Ser Tyr Phe Pro Ile Leu Glu Thr Val
85 90 95
Asp Lys Lys Ser Ile Lys Glu Arg Asn Arg Thr Ile Asp Leu Thr Leu
100 105 110
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115 120 125
Ala Val Asp Gln Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Tyr His His Ser Asp
130 135 140
Ile Val Ile Glu Asn Lys Val Leu Asp Phe Leu Asn Ser Ser Phe Val
145 150 155 160
Ser Thr Ala Leu His Val Lys Asp Lys Tyr Leu Lys Thr Asp Lys Thr
165 170 175
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Glu Ala Tyr Lys Lys Lys Gln Ile Glu Lys Lys Asn Thr Arg Phe Lys
195 200 205
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210 215 220
Trp Ser Phe Ile Asn Asp Lys Asp Lys Asp Lys Asp Lys Glu Thr Val
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Asp Ala Tyr Phe Glu Lys Asn His His Lys Ser
245 250 255
Asn Asp Pro Asp Phe Ala Leu Asn Ile Ser Glu Lys Gly Ile Val Tyr
260 265 270
Leu Leu Ser Phe Phe Leu Thr Asn Lys Glu Met Asp Ser Leu Lys Ala
275 280 285
Asn Leu Thr Gly Phe Lys Gly Lys Val Asp Arg Glu Ser Gly Asn Ser
290 295 300
Ile Lys Tyr Met Ala Thr Gln Arg Ile Tyr Ser Phe His Thr Tyr Arg
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Gly Leu Lys Gln Lys Ile Arg Thr Ser Glu Glu Gly Val Lys Glu Thr
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Leu Leu Met Gln Met Ile Asp Glu Leu Ser Lys Val Pro Asn Val Val
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Ser Arg Val Thr His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Arg Phe
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Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Phe Asp Phe Pro Thr
405 410 415
Leu Arg Phe Gln Val His Leu Gly Asp Tyr Val His Asp Arg Arg Thr
420 425 430
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435 440 445
Thr Val Phe Ala Arg Leu Lys Asp Ile Asn Ser Ala Lys Ala Ser Tyr
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Gln His Gln Gly Glu Gln Lys Asn Ala Gly Lys Ile Gly Ile Tyr Val
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Glu Lys Pro Leu Val Phe Thr Gly Gln Pro Ile Ala Tyr Leu Ser Met
565 570 575
Asn Asp Ile His Ser Met Leu Phe Ser Leu Leu Thr Asp Asn Ala Glu
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Ile Thr Arg Asp Leu Ala Arg Asp Lys Glu Glu Ile Glu Lys Leu Ile
645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
Phe Met Phe Lys Glu Ser Lys Ser Lys Trp Lys Gly Tyr Gln His Ile
705 710 715 720
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725 730 735
Glu Leu Ile Leu Ser Asn Met Val Met Val Lys Asp Tyr Pro Ile Glu
740 745 750
Leu Ile Asp Leu Val Lys Lys Ser Arg Thr Leu Val Asp Phe Leu Asn
755 760 765
Lys Tyr Leu Glu Ala Arg Leu Glu Tyr Ile Glu Asn Val Ile Thr Arg
770 775 780
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785 790 795 800
Cys Phe Thr Phe Leu Lys Lys Ser Asn Tyr Thr Val Val Ser Leu Asp
805 810 815
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820 825 830
Phe Met Asp Asp Lys Pro Thr Met Leu Glu Gly Lys Ser Tyr Lys Gln
835 840 845
His Lys Glu Lys Phe Ala Asp Trp Phe Val His Tyr Lys Glu Asn Ser
850 855 860
Asn Tyr Gln Asn Phe Tyr Asp Thr Glu Val Tyr Glu Ile Thr Thr Glu
865 870 875 880
Asp Lys Arg Glu Lys Ala Lys Val Thr Lys Lys Ile Lys Gln Gln Gln
885 890 895
Lys Asn Asp Val Phe Thr Leu Met Met Val Asn Tyr Met Leu Glu Glu
900 905 910
Val Leu Lys Leu Ser Ser Asn Asp Arg Leu Ser Leu Asn Glu Leu Tyr
915 920 925
Gln Thr Lys Glu Glu Arg Ile Val Asn Lys Gln Val Ala Lys Asp Thr
930 935 940
Gln Glu Arg Asn Lys Asn Tyr Ile Trp Asn Lys Val Val Asp Leu Gln
945 950 955 960
Leu Cys Asp Gly Leu Val His Ile Asp Asn Val Lys Leu Lys Asp Ile
965 970 975
Gly Asn Phe Arg Lys Tyr Glu Asn Asp Ser Arg Val Lys Glu Phe Leu
980 985 990
Thr Tyr Gln Ser Asp Ile Val Trp Ser Ala Tyr Leu Ser Asn Glu Val
995 1000 1005
Asp Ser Asn Lys Leu Tyr Val Ile Glu Arg Gln Leu Asp Asn Tyr
1010 1015 1020
Glu Ser Ile Arg Ser Lys Glu Leu Leu Lys Glu Val Gln Glu Ile
1025 1030 1035
Glu Cys Ser Val Tyr Asn Gln Val Ala Asn Lys Glu Ser Leu Lys
1040 1045 1050
Gln Ser Gly Asn Glu Asn Phe Lys Gln Tyr Val Leu Gln Gly Leu
1055 1060 1065
Leu Pro Ile Gly Met Asp Val Arg Glu Met Leu Ile Leu Ser Thr
1070 1075 1080
Asp Val Lys Phe Lys Lys Glu Glu Ile Ile Gln Leu Gly Gln Ala
1085 1090 1095
Gly Glu Val Glu Gln Asp Leu Tyr Ser Leu Ile Tyr Ile Arg Asn
1100 1105 1110
Lys Phe Ala His Asn Gln Leu Pro Ile Lys Glu Phe Phe Asp Phe
1115 1120 1125
Cys Glu Asn Asn Tyr Arg Ser Ile Ser Asp Asn Glu Tyr Tyr Ala
1130 1135 1140
Glu Tyr Tyr Met Glu Ile Phe Arg Ser Ile Lys Glu Lys Tyr Ala
1145 1150 1155
Asn
<210> 344
<211> 1214
<212> PRT
<213> Flavobacterium columnare
<400> 344
Met Ser Ser Lys Asn Glu Ser Tyr Asn Lys Gln Lys Thr Phe Asn His
1 5 10 15
Tyr Lys Gln Glu Asp Lys Tyr Phe Phe Gly Gly Phe Leu Asn Asn Ala
20 25 30
Asp Asp Asn Leu Arg Gln Val Gly Lys Glu Phe Lys Thr Arg Ile Asn
35 40 45
Phe Asn His Asn Asn Asn Glu Leu Ala Ser Val Phe Lys Asp Tyr Phe
50 55 60
Asn Lys Glu Lys Ser Val Ala Lys Arg Glu His Ala Leu Asn Leu Leu
65 70 75 80
Ser Asn Tyr Phe Pro Val Leu Glu Arg Ile Gln Lys His Thr Asn His
85 90 95
Asn Phe Glu Gln Thr Arg Glu Ile Phe Glu Leu Leu Leu Asp Thr Ile
100 105 110
Lys Lys Leu Arg Asp Tyr Tyr Thr His His Tyr His Lys Pro Ile Thr
115 120 125
Ile Asn Pro Lys Ile Tyr Asp Phe Leu Asp Asp Thr Leu Leu Asp Val
130 135 140
Leu Ile Thr Ile Lys Lys Lys Lys Val Lys Asn Asp Thr Ser Arg Glu
145 150 155 160
Leu Leu Lys Glu Lys Leu Arg Pro Glu Leu Thr Gln Leu Lys Asn Gln
165 170 175
Lys Arg Glu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Lys Lys Leu Leu Glu Glu Asn
180 185 190
Leu Glu Asn Ala Val Phe Asn His Cys Leu Ile Pro Phe Leu Glu Glu
195 200 205
Asn Lys Thr Asp Asp Lys Gln Asn Lys Thr Val Ser Leu Arg Lys Tyr
210 215 220
Arg Lys Ser Lys Pro Asn Glu Glu Thr Ser Ile Thr Leu Thr Gln Ser
225 230 235 240
Gly Leu Val Phe Leu Met Ser Phe Phe Leu His Arg Lys Glu Phe Gln
245 250 255
Val Phe Thr Ser Gly Leu Glu Arg Phe Lys Ala Lys Val Asn Thr Ile
260 265 270
Lys Glu Glu Glu Ile Ser Leu Asn Lys Asn Asn Ile Val Tyr Met Ile
275 280 285
Thr His Trp Ser Tyr Ser Tyr Tyr Asn Phe Lys Gly Leu Lys His Arg
290 295 300
Ile Lys Thr Asp Gln Gly Val Ser Thr Leu Glu Gln Asn Asn Thr Thr
305 310 315 320
His Ser Leu Thr Asn Thr Asn Thr Lys Glu Ala Leu Leu Thr Gln Ile
325 330 335
Val Asp Tyr Leu Ser Lys Val Pro Asn Glu Ile Tyr Glu Thr Leu Ser
340 345 350
Glu Lys Gln Gln Lys Glu Phe Glu Glu Asp Ile Asn Glu Tyr Met Arg
355 360 365
Glu Asn Pro Glu Asn Glu Asp Ser Thr Phe Ser Ser Ile Val Ser His
370 375 380
Lys Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu Asn Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Met
385 390 395 400
Arg Phe Leu Asp Glu Tyr Ala Glu Leu Pro Thr Leu Arg Phe Met Val
405 410 415
Asn Phe Gly Asp Tyr Ile Lys Asp Arg Gln Lys Lys Ile Leu Glu Ser
420 425 430
Ile Gln Phe Asp Ser Glu Arg Ile Ile Lys Lys Glu Ile His Leu Phe
435 440 445
Glu Lys Leu Ser Leu Val Thr Glu Tyr Lys Lys Asn Val Tyr Leu Lys
450 455 460
Glu Thr Ser Asn Ile Asp Leu Ser Arg Phe Pro Leu Phe Pro Asn Pro
465 470 475 480
Ser Tyr Val Met Ala Asn Asn Asn Ile Pro Phe Tyr Ile Asp Ser Arg
485 490 495
Ser Asn Asn Leu Asp Glu Tyr Leu Asn Gln Lys Lys Lys Ala Gln Ser
500 505 510
Gln Asn Lys Lys Arg Asn Leu Thr Phe Glu Lys Tyr Asn Lys Glu Gln
515 520 525
Ser Lys Asp Ala Ile Ile Ala Met Leu Gln Lys Glu Ile Gly Val Lys
530 535 540
Asp Leu Gln Gln Arg Ser Thr Ile Gly Leu Leu Ser Cys Asn Glu Leu
545 550 555 560
Pro Ser Met Leu Tyr Glu Val Ile Val Lys Asp Ile Lys Gly Ala Glu
565 570 575
Leu Glu Asn Lys Ile Ala Gln Lys Ile Arg Glu Gln Tyr Gln Ser Ile
580 585 590
Arg Asp Phe Thr Leu Asp Ser Pro Gln Lys Asp Asn Ile Pro Thr Thr
595 600 605
Leu Ile Lys Thr Ile Asn Thr Asp Ser Ser Val Thr Phe Glu Asn Gln
610 615 620
Pro Ile Asp Ile Pro Arg Leu Lys Asn Ala Leu Gln Lys Glu Leu Thr
625 630 635 640
Leu Thr Gln Glu Lys Leu Leu Asn Val Lys Glu His Glu Ile Glu Val
645 650 655
Asp Asn Tyr Asn Arg Asn Lys Asn Thr Tyr Lys Phe Lys Asn Gln Pro
660 665 670
Lys Asn Lys Val Asp Asp Lys Lys Leu Gln Arg Lys Tyr Val Phe Tyr
675 680 685
Arg Asn Glu Ile Arg Gln Glu Ala Asn Trp Leu Ala Ser Asp Leu Ile
690 695 700
His Phe Met Lys Asn Lys Ser Leu Trp Lys Gly Tyr Met His Asn Glu
705 710 715 720
Leu Gln Ser Phe Leu Ala Phe Phe Glu Asp Lys Lys Asn Asp Cys Ile
725 730 735
Ala Leu Leu Glu Thr Val Phe Asn Leu Lys Glu Asp Cys Ile Leu Thr
740 745 750
Lys Gly Leu Lys Asn Leu Phe Leu Lys His Gly Asn Phe Ile Asp Phe
755 760 765
Tyr Lys Glu Tyr Leu Lys Leu Lys Glu Asp Phe Leu Ser Thr Glu Ser
770 775 780
Thr Phe Leu Glu Asn Gly Phe Ile Gly Leu Pro Pro Lys Ile Leu Lys
785 790 795 800
Lys Glu Leu Ser Lys Arg Leu Lys Tyr Ile Phe Ile Val Phe Gln Lys
805 810 815
Arg Gln Phe Ile Ile Lys Glu Leu Glu Glu Lys Lys Asn Asn Leu Tyr
820 825 830
Ala Asp Ala Ile Asn Leu Ser Arg Gly Ile Phe Asp Glu Lys Pro Thr
835 840 845
Met Ile Pro Phe Lys Lys Pro Asn Pro Asp Glu Phe Ala Ser Trp Phe
850 855 860
Val Ala Ser Tyr Gln Tyr Asn Asn Tyr Gln Ser Phe Tyr Glu Leu Thr
865 870 875 880
Pro Asp Ile Val Glu Arg Asp Lys Lys Lys Lys Tyr Lys Asn Leu Arg
885 890 895
Ala Ile Asn Lys Val Lys Ile Gln Asp Tyr Tyr Leu Lys Leu Met Val
900 905 910
Asp Thr Leu Tyr Gln Asp Leu Phe Asn Gln Pro Leu Asp Lys Ser Leu
915 920 925
Ser Asp Phe Tyr Val Ser Lys Ala Glu Arg Glu Lys Ile Lys Ala Asp
930 935 940
Ala Lys Ala Tyr Gln Lys Leu Asn Asp Ser Ser Leu Trp Asn Lys Val
945 950 955 960
Ile His Leu Ser Leu Gln Asn Asn Arg Ile Thr Ala Asn Pro Lys Leu
965 970 975
Lys Asp Ile Gly Lys Tyr Lys Arg Ala Leu Gln Asp Glu Lys Ile Ala
980 985 990
Thr Leu Leu Thr Tyr Asp Ala Arg Thr Trp Thr Tyr Ala Leu Gln Lys
995 1000 1005
Pro Glu Lys Glu Asn Glu Asn Asp Tyr Lys Glu Leu His Tyr Thr
1010 1015 1020
Ala Leu Asn Met Glu Leu Gln Glu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Lys
1025 1030 1035
Glu Leu Leu Lys Gln Val Gln Glu Leu Glu Lys Lys Ile Leu Asp
1040 1045 1050
Lys Phe Tyr Asp Phe Ser Asn Asn Ala Ser His Pro Glu Asp Leu
1055 1060 1065
Glu Ile Glu Asp Lys Lys Gly Lys Arg His Pro Asn Phe Lys Leu
1070 1075 1080
Tyr Ile Thr Lys Ala Leu Leu Lys Asn Glu Ser Glu Ile Ile Asn
1085 1090 1095
Leu Glu Asn Ile Asp Ile Glu Ile Leu Leu Lys Tyr Tyr Asp Tyr
1100 1105 1110
Asn Thr Glu Glu Leu Lys Glu Lys Ile Lys Asn Met Asp Glu Asp
1115 1120 1125
Glu Lys Ala Lys Ile Ile Asn Thr Lys Glu Asn Tyr Asn Lys Ile
1130 1135 1140
Thr Asn Val Leu Ile Lys Lys Ala Leu Val Leu Ile Ile Ile Arg
1145 1150 1155
Asn Lys Met Ala His Asn Gln Tyr Pro Pro Lys Phe Ile Tyr Asp
1160 1165 1170
Leu Ala Asn Arg Phe Val Pro Lys Lys Glu Glu Glu Tyr Phe Ala
1175 1180 1185
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1190 1195 1200
Glu Asn Lys Glu Lys Lys Asp Lys Thr Gln Val
1205 1210
<210> 345
<211> 1119
<212> PRT
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 345
Met Thr Glu Gln Asn Glu Lys Pro Tyr Asn Gly Thr Tyr Tyr Thr Leu
1 5 10 15
Glu Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn
20 25 30
Ala Tyr Ile Thr Leu Ala His Ile Asp Arg Gln Leu Ala Tyr Ser Lys
35 40 45
Ala Asp Ile Thr Asn Asp Glu Asp Ile Leu Phe Phe Lys Gly Gln Trp
50 55 60
Lys Asn Leu Asp Asn Asp Leu Glu Arg Lys Ala Arg Leu Arg Ser Leu
65 70 75 80
Ile Leu Lys His Phe Ser Phe Leu Glu Gly Ala Ala Tyr Gly Lys Lys
85 90 95
Leu Phe Glu Ser Gln Ser Ser Gly Asn Lys Ser Ser Lys Lys Lys Glu
100 105 110
Leu Ser Lys Lys Glu Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Ala Leu Ser Leu
115 120 125
Asp Asn Leu Lys Ser Ile Leu Phe Asp Phe Leu Gln Lys Leu Lys Asp
130 135 140
Phe Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Arg His Pro Glu Ser Ser Glu Leu
145 150 155 160
Pro Leu Phe Asp Gly Asn Met Leu Gln Arg Leu Tyr Asn Val Phe Asp
165 170 175
Val Ser Val Gln Arg Val Lys Arg Asp His Glu His Asn Asp Lys Val
180 185 190
Asp Pro His Arg His Phe Asn His Leu Val Arg Lys Gly Lys Lys Asp
195 200 205
Lys Tyr Gly Asn Asn Asp Asn Pro Phe Phe Lys His His Phe Val Asp
210 215 220
Arg Glu Gly Thr Val Thr Glu Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu
225 230 235 240
Phe Leu Glu Lys Arg Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Arg Gly
245 250 255
Phe Lys Gly Gly Thr Glu Ala Tyr Gln Gln Met Thr Asn Glu Val Phe
260 265 270
Cys Arg Ser Arg Ile Ser Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Ser Leu Arg
275 280 285
Thr Asp Asp Trp Met Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Val Arg Cys
290 295 300
Pro Lys Ser Leu Tyr Asp Arg Leu Arg Glu Glu Asp Arg Ala Arg Phe
305 310 315 320
Arg Val Pro Val Asp Ile Leu Ser Asp Glu Asp Asp Thr Asp Gly Thr
325 330 335
Glu Glu Asp Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe
340 345 350
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355 360 365
Leu Arg Phe His Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ala Ile Tyr Lys
370 375 380
Lys Asn Ile Gly Glu Gln Pro Glu Asp Arg His Leu Thr Arg Asn Leu
385 390 395 400
Tyr Gly Phe Gly Arg Ile Gln Asp Phe Ala Glu Glu His Arg Pro Glu
405 410 415
Glu Trp Lys Arg Leu Val Arg Asp Leu Asp Tyr Phe Glu Thr Gly Asp
420 425 430
Lys Pro Tyr Ile Thr Gln Thr Thr Pro His Tyr His Ile Glu Lys Gly
435 440 445
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Lys Arg Leu Thr Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu Met Pro
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Met Met Phe Tyr Tyr Phe Leu Leu Arg Glu Lys Tyr Ser Glu Glu Val
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Ser Ala Glu Lys Val Gln Gly Arg Ile Lys Arg Val Ile Glu Asp Val
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Tyr Ala Val Tyr Asp Ala Phe Ala Arg Asp Glu Ile Asn Thr Arg Asp
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Glu Lys Val Arg Lys Lys Leu Gln Glu Met Ile Ala Asp Thr Asp His
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Arg Leu Asp Met Leu Asp Arg Gln Thr Asp Arg Lys Ile Arg Ile Gly
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530 535 540
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Glu Gly Leu Asn Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu Arg Leu Lys Asp Ile
900 905 910
Asp Thr Asp Thr Ala Lys Gln Glu Lys Asn Asn Ile Leu Asn Arg Val
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Met Pro Met Gln Leu Pro Val Thr Val Tyr Glu Ile Asp Asp Ser His
930 935 940
Asn Ile Val Lys Asp Arg Pro Leu His Thr Val Tyr Ile Glu Glu Thr
945 950 955 960
Lys Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys Asp
965 970 975
Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val Asp Thr Ser Ser Glu Thr
980 985 990
Glu Leu Lys Ser Asn Pro Ile Ser Lys Ser Leu Val Glu Tyr Glu Leu
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1040 1045 1050
Glu Ala Asp Lys Ala Arg Phe Gln Asn Asp Val Lys Leu Leu Val
1055 1060 1065
Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr Pro Met Arg Asn
1070 1075 1080
Arg Ile Ala Phe Ala Asn Ile Asn Pro Phe Ser Leu Ser Ser Ala
1085 1090 1095
Asp Thr Ser Glu Glu Lys Lys Leu Asp Ile Ala Asn Gln Leu Lys
1100 1105 1110
Asp Lys Thr His Lys Ile Ile Lys Arg Ile Ile Glu Ile Glu Lys
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Pro Ile Glu Thr Lys Glu
1130
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<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 349
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1 5 10 15
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Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Val Leu Glu Leu Lys Asn Lys
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65 70 75 80
Leu Arg Glu Leu Met Thr Lys His Phe Pro Phe Leu Glu Thr Ala Ile
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100 105 110
Ala Lys Ala Gln Ser Phe Asp Ser Leu Lys His Cys Leu Phe Leu Phe
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Gln His Asn Lys Asp Ile Asn Pro Asp Glu Asp Phe Lys His Leu Asp
180 185 190
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195 200 205
Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu
210 215 220
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225 230 235 240
Asn Arg Glu Ser Lys Lys Lys Met Thr His Glu Val Phe Cys Arg Ser
245 250 255
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260 265 270
Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser
275 280 285
Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Glu Asp Arg Glu Lys Phe Lys Val Pro
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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370 375 380
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405 410 415
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485 490 495
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515 520 525
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915 920 925
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<400> 350
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595 600 605
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645 650 655
Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Met Leu Gln Arg Ala Leu Ala Leu Phe Gly
660 665 670
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675 680 685
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885 890 895
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915 920 925
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995 1000 1005
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<213> Prevotella pallens
<400> 351
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Lys Lys Leu Glu Gly Phe Lys Cys Ser Asn Glu Ser Tyr Gln Lys Met
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980 985 990
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995 1000 1005
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1010 1015 1020
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1025 1030 1035
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1040 1045 1050
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1055 1060 1065
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1070 1075 1080
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1085 1090 1095
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1100 1105 1110
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1115 1120 1125
<210> 352
<211> 1157
<212> PRT
<213> Myroides odoratimim
<400> 352
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1 5 10 15
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50 55 60
Tyr Ile Ile His Val Phe Lys Asp Glu Leu Ser Ile Ser Asp Phe Glu
65 70 75 80
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85 90 95
Asp Lys Lys Ser Ile Lys Glu Arg Asn Arg Thr Ile Asp Leu Thr Leu
100 105 110
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115 120 125
Ala Val Asp Gln Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Tyr His His Ser Glu
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Lys Glu Phe Leu Lys Glu Thr Ile Ala Ala Glu Leu Asp Ile Leu Ile
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Trp Ser Phe Ile Asn Asp Lys Asp Lys Asp Lys Glu Thr Val Val Ala
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Lys Gly Ala Asp Ala Tyr Phe Glu Lys Asn His His Lys Ser Asn Asp
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Pro Asp Phe Ala Leu Asn Ile Ser Glu Lys Gly Ile Val Tyr Leu Leu
260 265 270
Ser Phe Phe Leu Thr Asn Lys Glu Met Asp Ser Leu Lys Ala Asn Leu
275 280 285
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<212> PRT
<213> Myoides odoratimim
<400> 353
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<213> Bergeyella zoohelcum
<400> 354
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1220
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<211> 1150
<212> PRT
<213> Prevotella saccharolytica
<400> 355
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405 410 415
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Asp Glu Val Lys Thr Leu Leu Gly Glu Tyr Asp Arg Cys Arg Ile Lys
980 985 990
Ile Phe Asp Trp Ala Phe Ala Leu Glu Gly Ala Ile Met Ser Asp Arg
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Asp Leu Lys Pro Tyr Leu His Glu Ser Ser Ser Arg Glu Gly Lys
1010 1015 1020
Ser Gly Glu His Ser Thr Leu Val Lys Met Leu Val Glu Lys Lys
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Gly Cys Leu Thr Pro Asp Glu Ser Gln Tyr Leu Ile Leu Ile Arg
1040 1045 1050
Asn Lys Ala Ala His Asn Gln Phe Pro Cys Ala Ala Glu Met Pro
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Leu Ile Tyr Arg Asp Val Ser Ala Lys Val Gly Ser Ile Glu Gly
1070 1075 1080
Ser Ser Ala Lys Asp Leu Pro Glu Gly Ser Ser Leu Val Asp Ser
1085 1090 1095
Leu Trp Lys Lys Tyr Glu Met Ile Ile Arg Lys Ile Leu Pro Ile
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Leu Asp Pro Glu Asn Arg Phe Phe Gly Lys Leu Leu Asn Asn Met
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<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 359
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1 5 10 15
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Asn Leu Ile Glu Val Glu Ser His Val Arg Ile Lys Phe Gly Lys Lys
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50 55 60
Leu Ser Val Asp Arg Trp Thr Lys Val Tyr Gly His Ser Arg Arg Tyr
65 70 75 80
Leu Pro Phe Leu His Tyr Phe Asp Pro Asp Ser Gln Ile Glu Lys Asp
85 90 95
His Asp Ser Lys Thr Gly Val Asp Pro Asp Ser Ala Gln Arg Leu Ile
100 105 110
Arg Glu Leu Tyr Ser Leu Leu Asp Phe Leu Arg Asn Asp Phe Ser His
115 120 125
Asn Arg Leu Asp Gly Thr Thr Phe Glu His Leu Glu Val Ser Pro Asp
130 135 140
Ile Ser Ser Phe Ile Thr Gly Thr Tyr Ser Leu Ala Cys Gly Arg Ala
145 150 155 160
Gln Ser Arg Phe Ala Asp Phe Phe Lys Pro Asp Asp Phe Val Leu Ala
165 170 175
Lys Asn Arg Lys Glu Gln Leu Ile Ser Val Ala Asp Gly Lys Glu Cys
180 185 190
Leu Thr Val Ser Gly Leu Ala Phe Phe Ile Cys Leu Phe Leu Asp Arg
195 200 205
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210 215 220
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Ile Arg His Pro His Asp Arg Leu Glu Ser Ser Asn Thr Lys Glu Ala
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Leu Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Asn Arg Cys Pro Arg Ile Leu
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Tyr Asp Met Leu Pro Glu Glu Glu Arg Ala Gln Phe Leu Pro Ala Leu
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355 360 365
Glu Tyr Asp Arg Thr Ile Thr Asp His Ala Leu Ala Phe Gly Lys Leu
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Ile Phe Asp Trp Ala Phe Ala Leu Glu Gly Ala Ile Met Ser Asp Arg
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<212> PRT
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 360
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485 490 495
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595 600 605
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Ser Ser Ala Lys Asp Leu Pro Glu Gly Ser Ser Leu Val Asp Ser
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Tyr Gln His Asn Lys Asp Ile Asn Pro Asp Glu Asp Phe Lys His Leu
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Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln Gln Lys Leu Thr Gly Phe Lys Asp Asn
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Arg Glu Ser Lys Lys Lys Met Thr His Glu Val Phe Cys Arg Arg Arg
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340 345 350
Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile Tyr Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln Lys
355 360 365
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435 440 445
Asn Glu Lys Ser Lys Tyr Lys Leu Asp Lys Pro Tyr Gln Ala Glu Ala
450 455 460
Phe Leu Ser Val His Glu Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu
465 470 475 480
Leu Lys Lys Glu Glu Pro Asn Asn Asp Lys Lys Asn Ala Ser Ile Val
485 490 495
Glu Gly Phe Ile Lys Arg Glu Ile Arg Asp Met Tyr Lys Leu Tyr Asp
500 505 510
Ala Phe Ala Asn Gly Glu Ile Asn Asn Ile Gly Asp Leu Glu Lys Tyr
515 520 525
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530 535 540
Ala Ile Leu Tyr Asp Glu Pro Lys Asp Met Val Lys Glu Ala Lys Arg
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Lys Gln Lys Glu Met Val Lys Asp Thr Lys Lys Leu Leu Ala Thr Leu
565 570 575
Glu Lys Gln Thr Gln Glu Glu Ile Glu Asp Gly Gly Arg Asn Ile Arg
580 585 590
Leu Leu Lys Ser Gly Glu Ile Ala Arg Trp Leu Val Asn Asp Met Met
595 600 605
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Lys Ile Glu Phe Leu Asn Lys Leu Lys Pro Glu Asp Trp Glu Lys Asn
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Leu Ile Asp Lys Met Lys Val Glu Gly Leu Asn Val Glu Glu Leu Gln
885 890 895
Lys Leu Arg Leu Lys Asp Ile Asp Thr Asp Thr Ala Lys Gln Glu Lys
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945 950 955 960
Phe Lys Ala Leu Val Lys Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe
965 970 975
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Ser Val Val Glu Tyr Glu Leu Gly Glu Tyr Gln Asn Ala Arg Ile Glu
995 1000 1005
Thr Ile Lys Asp Met Leu Leu Leu Glu Lys Thr Leu Ile Lys Lys
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1025 1030 1035
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1040 1045 1050
Asp Val Lys Leu Leu Val Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn
1055 1060 1065
Gln Tyr Pro Met Arg Asn Arg Ile Ala Phe Ala Asn Ile Asn Pro
1070 1075 1080
Phe Ser Leu Ser Ser Ala Asp Ile Ser Glu Glu Lys Lys Leu Asp
1085 1090 1095
Ile Ala Asn Gln Leu Lys Asp Lys Thr His Lys Ile Ile Lys Lys
1100 1105 1110
Ile Ile Glu Ile Glu Lys Pro Ile Glu Thr Lys Glu
1115 1120 1125
<210> 362
<211> 1161
<212> PRT
<213> Bacterioides bacterium
<400> 362
Met Glu Asn Gln Thr Gln Lys Gly Lys Gly Ile Tyr Tyr Tyr Tyr Thr
1 5 10 15
Lys Asn Glu Asp Lys His Tyr Phe Gly Ser Phe Leu Asn Leu Ala Asn
20 25 30
Asn Asn Ile Glu Gln Ile Ile Glu Glu Phe Arg Ile Arg Leu Ser Leu
35 40 45
Lys Asp Glu Lys Asn Ile Lys Glu Ile Ile Asn Asn Tyr Phe Thr Asp
50 55 60
Lys Lys Ser Tyr Thr Asp Trp Glu Arg Gly Ile Asn Ile Leu Lys Glu
65 70 75 80
Tyr Leu Pro Val Ile Asp Tyr Leu Asp Leu Ala Ile Thr Asp Lys Glu
85 90 95
Phe Glu Lys Ile Asp Leu Lys Gln Lys Glu Thr Ala Lys Arg Lys Tyr
100 105 110
Phe Arg Thr Asn Phe Ser Leu Leu Ile Asp Thr Ile Ile Asp Leu Arg
115 120 125
Asn Phe Tyr Thr His Tyr Phe His Lys Pro Ile Ser Ile Asn Pro Asp
130 135 140
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145 150 155 160
Lys Lys Gln Lys Met Lys Thr Asp Lys Thr Lys Gln Ala Leu Lys Asp
165 170 175
Gly Leu Asp Lys Glu Leu Lys Lys Leu Ile Glu Leu Lys Lys Ala Glu
180 185 190
Leu Lys Glu Lys Lys Ile Lys Thr Trp Asn Ile Thr Glu Asn Val Glu
195 200 205
Gly Ala Val Tyr Asn Asp Ala Phe Asn His Met Val Tyr Lys Asn Asn
210 215 220
Ala Gly Val Thr Ile Leu Lys Asp Tyr His Lys Ser Ile Leu Pro Asp
225 230 235 240
Asp Lys Ile Asp Ser Glu Leu Lys Leu Asn Phe Ser Ile Ser Gly Leu
245 250 255
Val Phe Leu Leu Ser Met Phe Leu Ser Lys Lys Glu Ile Glu Gln Phe
260 265 270
Lys Ser Asn Leu Glu Gly Phe Lys Gly Lys Val Ile Gly Glu Asn Gly
275 280 285
Glu Tyr Glu Ile Ser Lys Phe Asn Asn Ser Leu Lys Tyr Met Ala Thr
290 295 300
His Trp Ile Phe Ser Tyr Leu Thr Phe Lys Gly Leu Lys Gln Arg Val
305 310 315 320
Lys Asn Thr Phe Asp Lys Glu Thr Leu Leu Met Gln Met Ile Asp Glu
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Leu Asn Lys Val Pro His Glu Val Tyr Gln Thr Leu Ser Lys Glu Gln
340 345 350
Gln Asn Glu Phe Leu Glu Asp Ile Asn Glu Tyr Val Gln Asp Asn Glu
355 360 365
Glu Asn Lys Lys Ser Met Glu Asn Ser Ile Val Val His Pro Val Ile
370 375 380
Arg Lys Arg Tyr Asp Asp Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu
385 390 395 400
Asp Glu Phe Ala Asn Phe Pro Thr Leu Lys Phe Phe Val Thr Ala Gly
405 410 415
Asn Phe Val His Asp Lys Arg Glu Lys Gln Ile Gln Gly Ser Met Leu
420 425 430
Thr Ser Asp Arg Met Ile Lys Glu Lys Ile Asn Val Phe Gly Lys Leu
435 440 445
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450 455 460
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Leu Ser Asn Ser Leu Ile Thr Lys Lys Leu Lys Lys Ser Glu Pro Asn
595 600 605
Glu Asp Lys Ile Asn Ala Glu Lys Ile Ile Leu Ala Ile Asn Arg Glu
610 615 620
Leu Glu Ile Thr Glu Asn Lys Leu Asn Ile Ile Lys Asn Asn Arg Ala
625 630 635 640
Glu Phe Arg Thr Gly Ala Lys Arg Lys His Ile Phe Tyr Ser Lys Glu
645 650 655
Leu Gly Gln Glu Ala Thr Trp Ile Ala Tyr Asp Leu Lys Arg Phe Met
660 665 670
Pro Glu Ala Ser Arg Lys Glu Trp Lys Gly Phe His His Ser Glu Leu
675 680 685
Gln Lys Phe Leu Ala Phe Tyr Asp Arg Asn Lys Asn Asp Ala Lys Ala
690 695 700
Leu Leu Asn Met Phe Trp Asn Phe Asp Asn Asp Gln Leu Ile Gly Asn
705 710 715 720
Asp Leu Asn Ser Ala Phe Arg Glu Phe His Phe Asp Lys Phe Tyr Glu
725 730 735
Lys Tyr Leu Ile Lys Arg Asp Glu Ile Leu Glu Gly Phe Lys Ser Phe
740 745 750
Ile Ser Asn Phe Lys Asp Glu Pro Lys Leu Leu Lys Lys Gly Ile Lys
755 760 765
Asp Ile Tyr Arg Val Phe Asp Lys Arg Tyr Tyr Ile Ile Lys Ser Thr
770 775 780
Asn Ala Gln Lys Glu Gln Leu Leu Ser Lys Pro Ile Cys Leu Pro Arg
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Lys Asn Leu Asn Lys Ser Asp Lys Phe Ile Tyr Phe Arg Tyr Lys Gln
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Asn Leu Lys Lys Leu Tyr Gln Thr Ser Asp Glu Arg Phe Lys Asn Gln
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Leu Ile Ala Asp Val Gln Lys Asn Arg Glu Lys Gly Asp Thr Ser Asp
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945 950 955 960
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1025 1030 1035
Glu Lys Phe Asp Gly Ile Asn His Pro Lys His Phe Glu Gln Asp
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Trp Val Phe Ser Tyr Leu Cys Phe Lys Gly Ile Lys Gln Lys Leu Ser
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305 310 315 320
Ser Lys Val Pro Asp Glu Val Tyr Ser Ala Phe Asp Ser Lys Thr Lys
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Glu Lys Phe Leu Glu Asp Ile Asn Glu Tyr Met Lys Glu Gly Asn Ala
340 345 350
Asp Leu Ser Leu Glu Asp Ser Lys Val Ile His Pro Val Ile Arg Lys
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Arg Tyr Glu Asn Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu
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850 855 860
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Val Leu Asp Asp Glu Glu Ser Lys Ala Ser Lys Leu Leu Ser Tyr Asp
980 985 990
Lys Asn Lys Ile Trp Asn Lys Glu Gln Leu Glu Arg Glu Leu Ser Ile
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Gly Glu Asn Ser Tyr Glu Val Ile Arg Arg Glu Lys Leu Phe Lys
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1055 1060 1065
Leu Arg Lys Asn Ile Asn Leu Tyr Lys Glu Asp Glu Asp Phe Trp
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Leu Glu Ser Leu Lys Glu Asn Asp Phe Lys Thr Leu Pro Ser Glu
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Ile Arg Asn Gly Val Leu Asn Ala Ala Phe Asn His Leu Ile Tyr Lys
195 200 205
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Gly Ala Asp Ser Ala Glu Asn Gly Ile Thr Ile Ser Gln Ser Gly Leu
225 230 235 240
Leu Phe Leu Leu Ser Met Phe Leu Gly Lys Lys Glu Ile Glu Asp Leu
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260 265 270
Glu Asn Ile Ser Gly Leu Lys Phe Met Ala Thr His Trp Ile Phe Ser
275 280 285
Tyr Leu Ser Phe Lys Gly Met Lys Gln Arg Leu Ser Thr Asp Phe His
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340 345 350
Gly Asp Ser Thr Ile Ile His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu Asn
355 360 365
Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Val Arg Phe Leu Asp Glu Phe Ile Lys Phe
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Lys Asp Arg Ile Lys Val Phe Gly Lys Leu Ser Glu Ile Ser Ser Leu
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Lys Thr Glu Tyr Ile Glu Lys Glu Leu Asp Leu Asp Ser Asp Thr Gly
435 440 445
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450 455 460
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Asn Ile Lys Asn Tyr Asp Pro Glu Lys Pro Leu Pro Ala Ser Gln Ile
565 570 575
Ser Lys Arg Leu Arg Asn Asn Thr Thr Asp Lys Gly Lys Lys Val Ile
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Asn Pro Glu Lys Leu Ile His Leu Ile Asn Lys Glu Ile Asp Ala Thr
595 600 605
Glu Ala Lys Phe Ala Leu Leu Ala Lys Asn Arg Lys Glu Leu Lys Glu
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Lys Phe Arg Gly Lys Pro Leu Arg Gln Thr Ile Phe Ser Asn Met Glu
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Leu Gly Arg Glu Ala Thr Trp Leu Ala Asp Asp Ile Lys Arg Phe Met
645 650 655
Pro Asp Ile Leu Arg Lys Asn Trp Lys Gly Tyr Gln His Asn Gln Leu
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Gln Gln Ser Leu Ala Phe Phe Asn Ser Arg Pro Lys Glu Ala Phe Thr
675 680 685
Ile Leu Gln Asp Gly Trp Asp Phe Ala Asp Gly Ser Ser Phe Trp Asn
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Gly Trp Ile Ile Asn Ser Phe Val Lys Asn Arg Ser Phe Glu Tyr Phe
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Tyr Glu Ala Tyr Phe Glu Gly Arg Lys Glu Tyr Phe Ser Ser Leu Ala
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Glu Asn Ile Lys Gln His Thr Ser Asn His Arg Asn Leu Arg Arg Phe
740 745 750
Ile Asp Gln Gln Met Pro Lys Gly Leu Phe Glu Asn Arg His Tyr Leu
755 760 765
Leu Glu Asn Leu Glu Thr Glu Lys Asn Lys Ile Leu Ser Lys Pro Leu
770 775 780
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Gly Tyr Ser Thr Glu His Val Phe Gln Asn Phe Tyr Gly Trp Glu Arg
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Asp Tyr Asn Asp Leu Leu Glu Ser Glu Leu Glu Lys Asp Asn Asp Phe
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Ser Lys Asn Ser Ile His Tyr Ser Arg Thr Ser Gln Leu Glu Leu Ile
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Lys Leu Lys Gln Asp Leu Lys Ile Lys Lys Ile Lys Ile Gln Asp Leu
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Phe Leu Lys Leu Ile Ala Gly His Ile Phe Glu Asn Ile Phe Lys Tyr
885 890 895
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Leu Asn Lys Glu Gln Glu Ala Leu Ile Gln Ser Gln Arg Lys Glu Gly
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Val Thr Tyr Glu Ser Lys Gln Ile Ser Glu Pro Asn Val Lys Leu Lys
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Asp Ile Gly Lys Phe Asn Arg Phe Leu Leu Asp Asp Lys Val Lys Thr
965 970 975
Leu Leu Ser Tyr Asn Glu Asp Lys Val Trp Asn Lys Asn Asp Leu Asp
980 985 990
Leu Glu Leu Ser Ile Gly Glu Asn Ser Tyr Glu Val Ile Arg Arg Glu
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Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gln Asn Phe Glu Leu Gln Thr Leu Thr
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Asn Leu Ala Val Val Glu Leu Leu Glu Leu Leu Glu Lys
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<211> 1036
<212> PRT
<213> Chryseobacterium ureilyticum
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Asn Leu Ser Glu Glu Leu Asp Phe Arg Tyr Gln Glu Gln Leu Glu Arg
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Leu Arg Lys Leu Lys Ser Glu Gly Lys Lys Val Asp Leu Arg Asp Thr
180 185 190
Glu Ala Ile Arg Asn Gly Val Leu Asn Ala Ala Phe Asn His Leu Ile
195 200 205
Phe Lys Asp Ala Glu Asp Phe Lys Pro Thr Val Ser Tyr Ser Ser Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Asp Ser Asp Thr Ala Glu Asn Gly Ile Ser Ile Ser Gln Ser
225 230 235 240
Gly Leu Leu Phe Leu Leu Ser Met Phe Leu Gly Arg Arg Glu Met Glu
245 250 255
Asp Leu Lys Ser Arg Val Arg Gly Phe Lys Ala Arg Ile Ile Lys His
260 265 270
Glu Glu Gln His Val Ser Gly Leu Lys Phe Met Ala Thr His Trp Val
275 280 285
Phe Ser Glu Phe Cys Phe Lys Gly Ile Lys Thr Arg Leu Asn Ala Asp
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Tyr His Glu Glu Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ile Asp Glu Leu Ser Lys
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Phe Ile Glu Asp Ile Asn Glu Tyr Ile Arg Asp Gly Lys Glu Asp Lys
340 345 350
Ser Leu Ile Glu Ser Lys Ile Val His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr
355 360 365
Glu Ser Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Val
370 375 380
Asn Phe Pro Thr Leu Arg Phe Gln Val His Ala Gly Asn Tyr Val His
385 390 395 400
Asp Arg Arg Ile Lys Ser Ile Glu Gly Thr Gly Phe Lys Thr Glu Arg
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Leu Val Lys Asp Arg Ile Lys Val Phe Gly Lys Leu Ser Thr Ile Ser
420 425 430
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435 440 445
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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980 985 990
Arg Val Glu Tyr Glu Leu Ala Lys Tyr Gln Thr Ala Arg Val Cys Ala
995 1000 1005
Phe Glu Gln Thr Leu Glu Leu Glu Glu Ser Leu Leu Thr Arg Cys
1010 1015 1020
Pro His Leu Pro Asp Lys Asn Phe Arg Lys Met Leu Glu Ser Trp
1025 1030 1035
Ser Asp Pro Leu Leu Asp Lys Trp Pro Asp Leu His Arg Lys Val
1040 1045 1050
Arg Leu Leu Ile Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr
1055 1060 1065
Pro Met Tyr Asp Glu Ala Val Phe Ser Ser Ile Arg Lys Tyr Asp
1070 1075 1080
Pro Ser Phe Pro Asp Ala Ile Glu Glu Arg Met Gly Leu Asn Ile
1085 1090 1095
Ala His Arg Leu Ser Glu Glu Val Lys Gln Ala Lys Glu Thr Val
1100 1105 1110
Glu Arg Ile Ile Gln Ala
1115
<210> 376
<211> 1179
<212> PRT
<213> Flavobacterium columnare
<400> 376
Met Ser Ser Lys Asn Glu Ser Tyr Asn Lys Gln Lys Thr Phe Asn His
1 5 10 15
Tyr Lys Gln Glu Asp Lys Tyr Phe Phe Gly Gly Phe Leu Asn Asn Ala
20 25 30
Asp Asp Asn Leu Arg Gln Val Gly Lys Glu Phe Lys Thr Arg Ile Asn
35 40 45
Phe Asn His Asn Asn Asn Glu Leu Ala Ser Val Phe Lys Asp Tyr Phe
50 55 60
Asn Lys Glu Lys Ser Val Ala Lys Arg Glu His Ala Leu Asn Leu Leu
65 70 75 80
Ser Asn Tyr Phe Pro Val Leu Glu Arg Ile Gln Lys His Thr Asn His
85 90 95
Asn Phe Glu Gln Thr Arg Glu Ile Phe Glu Leu Leu Leu Asp Thr Ile
100 105 110
Lys Lys Leu Arg Asp Tyr Tyr Thr His His Tyr His Lys Pro Ile Thr
115 120 125
Ile Asn Pro Lys Ile Tyr Asp Phe Leu Asp Asp Thr Leu Leu Asp Val
130 135 140
Leu Ile Thr Ile Lys Lys Lys Lys Val Lys Asn Asp Thr Ser Arg Glu
145 150 155 160
Leu Leu Lys Glu Lys Leu Arg Pro Glu Leu Thr Gln Leu Lys Asn Gln
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Arg Lys Ser Lys Pro Asn Glu Glu Thr Ser Ile Thr Leu Thr Gln Ser
225 230 235 240
Gly Leu Val Phe Leu Met Ser Phe Phe Leu His Arg Lys Glu Phe Gln
245 250 255
Val Phe Thr Ser Gly Leu Glu Gly Phe Lys Ala Lys Val Asn Thr Ile
260 265 270
Lys Glu Glu Glu Ile Ser Leu Asn Lys Asn Asn Ile Val Tyr Met Ile
275 280 285
Thr His Trp Ser Tyr Ser Tyr Tyr Asn Phe Lys Gly Leu Lys His Arg
290 295 300
Ile Lys Thr Asp Gln Gly Val Ser Thr Leu Glu Gln Asn Asn Thr Thr
305 310 315 320
His Ser Leu Thr Asn Thr Asn Thr Lys Glu Ala Leu Leu Thr Gln Ile
325 330 335
Val Asp Tyr Leu Ser Lys Val Pro Asn Glu Ile Tyr Glu Thr Leu Ser
340 345 350
Glu Lys Gln Gln Lys Glu Phe Glu Glu Asp Ile Asn Glu Tyr Met Arg
355 360 365
Glu Asn Pro Glu Asn Glu Asp Ser Thr Phe Ser Ser Ile Val Ser His
370 375 380
Lys Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu Asn Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Met
385 390 395 400
Arg Phe Leu Asp Glu Tyr Ala Glu Leu Pro Thr Leu Arg Phe Met Val
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
Ser Asn Asn Leu Asp Glu Tyr Leu Asn Gln Lys Lys Lys Ala Gln Ser
500 505 510
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515 520 525
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Pro Ile Asp Ile Pro Arg Leu Lys Asn Ala Ile Gln Lys Glu Leu Thr
625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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Lys Glu Leu Ser Lys Arg Phe Lys Tyr Ile Phe Ile Val Phe Gln Lys
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Ala Asp Ala Ile Asn Leu Ser Arg Gly Ile Phe Asp Glu Lys Pro Thr
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965 970 975
Lys Asp Ile Gly Lys Tyr Lys Arg Ala Leu Gln Asp Glu Lys Ile Ala
980 985 990
Thr Leu Leu Thr Tyr Asp Asp Arg Thr Trp Thr Tyr Ala Leu Gln Lys
995 1000 1005
Pro Glu Lys Glu Asn Glu Asn Asp Tyr Lys Glu Leu His Tyr Thr
1010 1015 1020
Ala Leu Asn Met Glu Leu Gln Glu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Lys
1025 1030 1035
Glu Leu Leu Lys Gln Val Gln Glu Leu Glu Lys Gln Ile Leu Glu
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Glu Ala Met Arg Glu Leu Asp Glu Thr Ile Thr Asn Pro Ile Ile
1100 1105 1110
Lys Lys Ala Ile Val Leu Ile Ile Ile Arg Asn Lys Met Ala His
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Val Phe Glu Thr Ile Thr Lys Glu Leu Trp Glu Asn Lys Glu Lys
1160 1165 1170
Lys Asp Lys Thr Gln Val
1175
<210> 377
<211> 1145
<212> PRT
<213> Psychroflexus torquis
<400> 377
Met Glu Ser Ile Ile Gly Leu Gly Leu Ser Phe Asn Pro Tyr Lys Thr
1 5 10 15
Ala Asp Lys His Tyr Phe Gly Ser Phe Leu Asn Leu Val Glu Asn Asn
20 25 30
Leu Asn Ala Val Phe Ala Glu Phe Lys Glu Arg Ile Ser Tyr Lys Ala
35 40 45
Lys Asp Glu Asn Ile Ser Ser Leu Ile Glu Lys His Phe Ile Asp Asn
50 55 60
Met Ser Ile Val Asp Tyr Glu Lys Lys Ile Ser Ile Leu Asn Gly Tyr
65 70 75 80
Leu Pro Ile Ile Asp Phe Leu Asp Asp Glu Leu Glu Asn Asn Leu Asn
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Thr Arg Val Lys Asn Phe Lys Lys Asn Phe Ile Ile Leu Ala Glu Ala
100 105 110
Ile Glu Lys Leu Arg Asp Tyr Tyr Thr His Phe Tyr His Asp Pro Ile
115 120 125
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130 135 140
Leu Leu Lys Thr Ile Leu Asp Val Lys Lys Lys Tyr Leu Lys Thr Asp
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Val Ile Arg Lys Thr Asp Glu Leu Arg Glu Lys Lys Lys Thr Asn
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195 200 205
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245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Asn Leu Lys Lys His Phe Phe Ser Gln Leu Ser Asp Asp Glu Asn Thr
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Lys Ile Glu Lys Gln Phe Lys Ala Ile Asn His Pro Ser Lys Asn Asn
580 585 590
Lys Gly Ile Pro Lys Ser Leu Phe Ala Asp Thr Asn Val Arg Val Asn
595 600 605
Ala Ile Lys Leu Lys Lys Asp Leu Glu Ala Glu Leu Asp Met Leu Asn
610 615 620
Lys Lys His Ile Ala Phe Lys Glu Asn Gln Lys Ala Ser Ser Asn Tyr
625 630 635 640
Asp Lys Leu Leu Lys Glu His Gln Phe Thr Pro Lys Asn Lys Arg Pro
645 650 655
Glu Leu Arg Lys Tyr Val Phe Tyr Lys Ser Glu Lys Gly Glu Glu Ala
660 665 670
Thr Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg Phe Met Pro Lys Asp Phe Lys
675 680 685
Thr Lys Trp Lys Gly Cys Gln His Ser Glu Leu Gln Arg Lys Leu Ala
690 695 700
Phe Tyr Asp Arg His Thr Lys Gln Asp Ile Lys Glu Leu Leu Ser Gly
705 710 715 720
Cys Glu Phe Asp His Ser Leu Leu Asp Ile Asn Ala Tyr Phe Gln Lys
725 730 735
Asp Asn Phe Glu Asp Phe Phe Ser Lys Tyr Leu Glu Asn Arg Ile Glu
740 745 750
Thr Leu Glu Gly Val Leu Lys Lys Leu His Asp Phe Lys Asn Glu Pro
755 760 765
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785 790 795 800
Ala Lys Pro Thr Phe Leu Pro Arg Gly Val Phe Asp Glu Arg Pro Thr
805 810 815
Met Lys Lys Gly Lys Asn Pro Leu Lys Asp Lys Asn Glu Phe Ala Glu
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Trp Phe Val Glu Tyr Leu Glu Asn Lys Asp Tyr Gln Lys Phe Tyr Asn
835 840 845
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850 855 860
Ile Lys Lys Gln Lys Leu Lys Asp Phe Tyr Thr Leu Gln Met Val Asn
865 870 875 880
Tyr Leu Leu Lys Glu Val Phe Gly Lys Asp Glu Met Asn Leu Gln Leu
885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
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945 950 955 960
Tyr Lys Arg Tyr Glu Arg Asp Glu Arg Val Lys Thr Phe Ile Gly Tyr
965 970 975
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980 985 990
Arg Tyr Ser Val Lys Pro Ile Asn Val Ile Asp Leu Gln Ile Gln Glu
995 1000 1005
Tyr Glu Glu Ile Arg Ser His Glu Leu Leu Lys Glu Ile Gln Asn
1010 1015 1020
Leu Glu Gln Tyr Ile Tyr Asp His Thr Thr Asp Lys Asn Ile Leu
1025 1030 1035
Leu Gln Asp Gly Asn Pro Asn Phe Lys Met Tyr Val Leu Asn Gly
1040 1045 1050
Leu Leu Ile Gly Ile Lys Gln Val Asn Ile Pro Asp Phe Ile Val
1055 1060 1065
Leu Lys Gln Asn Thr Asn Phe Asp Lys Ile Asp Phe Thr Gly Ile
1070 1075 1080
Ala Ser Cys Ser Glu Leu Glu Lys Lys Thr Ile Ile Leu Ile Ala
1085 1090 1095
Ile Arg Asn Lys Phe Ala His Asn Gln Leu Pro Asn Lys Met Ile
1100 1105 1110
Tyr Asp Leu Ala Asn Glu Phe Leu Lys Ile Glu Lys Asn Glu Thr
1115 1120 1125
Tyr Ala Asn Tyr Tyr Leu Lys Val Leu Lys Lys Met Ile Ser Asp
1130 1135 1140
Leu Ala
1145
<210> 378
<211> 948
<212> PRT
<213> Riemerella anatispestifer
<400> 378
Met Phe Phe Ser Phe His Asn Ala Gln Arg Val Ile Phe Lys His Leu
1 5 10 15
Tyr Lys Ala Phe Asp Ala Ser Leu Arg Met Val Lys Glu Asp Tyr Lys
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Ala His Phe Thr Val Asn Leu Thr Arg Asp Phe Ala His Leu Asn Arg
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65 70 75 80
Leu Phe Leu Asp Lys Arg Asp Ala Tyr Trp Met Leu Lys Lys Val Ser
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Gly Phe Lys Ala Ser His Lys Gln Arg Glu Lys Met Thr Thr Glu Val
100 105 110
Phe Cys Arg Ser Arg Ile Leu Leu Pro Lys Leu Arg Leu Glu Ser Arg
115 120 125
Tyr Asp His Asn Gln Met Leu Leu Asp Met Leu Ser Glu Leu Ser Arg
130 135 140
Cys Pro Lys Leu Leu Tyr Glu Lys Leu Ser Glu Glu Asn Lys Lys His
145 150 155 160
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Phe Ala Leu Arg Tyr Leu Asp Leu Asn Glu Ser Phe Lys Ser Ile Arg
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275 280 285
Gly Phe Arg Leu Gly Thr Ser Lys Glu Leu Tyr Pro Ser Leu Glu Ile
290 295 300
Lys Asp Gly Ala Asn Arg Ile Ala Lys Tyr Pro Tyr Asn Ser Gly Phe
305 310 315 320
Val Ala His Ala Phe Ile Ser Val His Glu Leu Leu Pro Leu Met Phe
325 330 335
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385 390 395 400
Leu Ser Glu Lys Ala Lys Ile Lys Ile Glu Lys Leu Ile Ala Glu Thr
405 410 415
Lys Leu Leu Ser His Arg Leu Asn Thr Lys Leu Lys Ser Ser Pro Lys
420 425 430
Leu Gly Lys Arg Arg Glu Lys Leu Ile Lys Thr Gly Val Leu Ala Asp
435 440 445
Trp Leu Val Lys Asp Phe Met Arg Phe Gln Pro Val Ala Tyr Asp Ala
450 455 460
Gln Asn Gln Pro Ile Lys Ser Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Phe Trp
465 470 475 480
Phe Ile Arg Arg Ala Leu Ala Leu Tyr Gly Gly Glu Lys Asn Arg Leu
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Lys His Gln Pro Trp Glu Pro Tyr Gln Tyr Cys Leu Leu Leu Lys Val
545 550 555 560
Pro Lys Glu Asn Arg Lys Asn Leu Val Lys Gly Trp Glu Gln Gly Gly
565 570 575
Ile Ser Leu Pro Arg Gly Leu Phe Thr Glu Ala Ile Arg Glu Thr Leu
580 585 590
Ser Lys Asp Leu Thr Leu Ser Lys Pro Ile Arg Lys Glu Ile Lys Lys
595 600 605
His Gly Arg Val Gly Phe Ile Ser Arg Ala Ile Thr Leu Tyr Phe Lys
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Glu Lys Tyr Gln Asp Lys His Gln Ser Phe Tyr Asn Leu Ser Tyr Lys
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Leu Glu Ala Lys Ala Pro Leu Leu Lys Lys Glu Glu His Tyr Glu Tyr
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Trp Gln Gln Asn Lys Pro Gln Ser Pro Thr Glu Ser Gln Arg Leu Glu
660 665 670
Leu His Thr Ser Asp Arg Trp Lys Asp Tyr Leu Leu Tyr Lys Arg Trp
675 680 685
Gln His Leu Glu Lys Lys Leu Arg Leu Tyr Arg Asn Gln Asp Ile Met
690 695 700
Leu Trp Leu Met Thr Leu Glu Leu Thr Lys Asn His Phe Lys Glu Leu
705 710 715 720
Asn Leu Asn Tyr His Gln Leu Lys Leu Glu Asn Leu Ala Val Asn Val
725 730 735
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740 745 750
Val Leu Pro Val Lys Val Tyr Pro Thr Thr Ala Phe Gly Glu Val Gln
755 760 765
Tyr His Glu Thr Pro Ile Arg Thr Val Tyr Ile Arg Glu Glu Gln Thr
770 775 780
Lys Ala Leu Lys Met Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys Asp Arg Arg
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Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Ile Lys Glu Glu Asn Asp Thr Gln Lys
805 810 815
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Ser Leu Arg Val Asp Ala Phe Lys Glu Thr Leu Ser Leu Glu Glu Lys
835 840 845
Leu Leu Asn Lys His Ala Ser Leu Ser Ser Leu Glu Asn Glu Phe Arg
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Thr Leu Leu Glu Glu Trp Lys Lys Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Met Val
865 870 875 880
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885 890 895
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900 905 910
Leu Phe Thr Val Ala Gln Pro Thr Thr Glu Glu Lys Asp Gly Leu Gly
915 920 925
Ile Ala Glu Ala Leu Leu Lys Val Leu Arg Glu Tyr Cys Glu Ile Val
930 935 940
Lys Ser Gln Ile
945
<210> 379
<211> 1139
<212> PRT
<213> Prevotella pleuritidis
<400> 379
Met Glu Asn Asp Lys Arg Leu Glu Glu Ser Ala Cys Tyr Thr Leu Asn
1 5 10 15
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Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Thr Leu Glu Leu Lys Asn Lys
35 40 45
Lys Asn Gln Glu Ile Ile Ile Asp Asn Asp Gln Asp Ile Leu Ala Ile
50 55 60
Lys Thr His Trp Ala Lys Val Asn Gly Asp Leu Asn Lys Thr Asp Arg
65 70 75 80
Leu Arg Glu Leu Met Ile Lys His Phe Pro Phe Leu Glu Ala Ala Ile
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Ala Lys Ala Gln Ser Phe Lys Ser Leu Lys Asp Cys Leu Phe Leu Phe
115 120 125
Leu Glu Lys Leu Gln Glu Ala Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Lys Tyr
130 135 140
Ser Glu Ser Ser Lys Glu Pro Glu Phe Glu Glu Gly Leu Leu Glu Lys
145 150 155 160
Met Tyr Asn Thr Phe Asp Ala Ser Ile Arg Leu Val Lys Glu Asp Tyr
165 170 175
Gln Tyr Asn Lys Asp Ile Asp Pro Glu Lys Asp Phe Lys His Leu Glu
180 185 190
Arg Lys Glu Asp Phe Asn Tyr Leu Phe Thr Asp Lys Asp Asn Lys Gly
195 200 205
Lys Ile Thr Lys Asn Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu
210 215 220
Lys Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln Gln Lys Phe Arg Gly Phe Lys Asp
225 230 235 240
Asn Arg Gly Asn Lys Glu Lys Met Thr His Glu Val Phe Cys Arg Ser
245 250 255
Arg Met Leu Leu Pro Lys Ile Arg Leu Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp
260 265 270
Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser
275 280 285
Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Ala Tyr Arg Glu Lys Phe Lys Val Pro
290 295 300
Phe Asp Ser Ile Asp Glu Asp Tyr Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Arg
305 310 315 320
Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg
325 330 335
Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe Lys Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp
340 345 350
Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile Tyr Lys Lys Leu Ile Gly Gly Lys
355 360 365
Lys Glu Asp Arg His Leu Thr His Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile
370 375 380
Gln Glu Phe Thr Lys Gln Asn Arg Pro Asp Lys Trp Gln Ala Ile Ile
385 390 395 400
Lys Asp Leu Asp Thr Tyr Glu Thr Ser Asn Glu Arg Tyr Ile Ser Glu
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Thr Thr Pro His Tyr His Leu Glu Asn Gln Lys Ile Gly Ile Arg Phe
420 425 430
Arg Asn Asp Asn Asn Asp Ile Trp Pro Ser Leu Lys Thr Asn Gly Glu
435 440 445
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Pro Glu Lys Asp Phe Lys His Leu Glu Arg Lys Glu Asp Phe Asn Tyr
180 185 190
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1115
<210> 393
<211> 1174
<212> PRT
<213> Porphyromonas gulae
<400> 393
Met Thr Glu Gln Ser Glu Arg Pro Tyr Asn Gly Thr Tyr Tyr Thr Leu
1 5 10 15
Glu Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn
20 25 30
Ala Tyr Ile Thr Leu Thr His Ile Asp Arg Gln Leu Ala Tyr Ser Lys
35 40 45
Ala Asp Ile Thr Asn Asp Gln Asp Val Leu Ser Phe Lys Ala Leu Trp
50 55 60
Lys Asn Leu Asp Asn Asp Leu Glu Arg Lys Ser Arg Leu Arg Ser Leu
65 70 75 80
Ile Leu Lys His Phe Ser Phe Leu Glu Gly Ala Ala Tyr Gly Lys Lys
85 90 95
Leu Phe Glu Ser Lys Ser Ser Gly Asn Lys Ser Ser Lys Asn Lys Glu
100 105 110
Leu Thr Lys Lys Glu Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Ala Leu Ser Leu
115 120 125
Asp Asn Leu Lys Ser Ile Leu Phe Asp Phe Leu Gln Lys Leu Lys Asp
130 135 140
Phe Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Arg His Ser Gly Ser Ser Glu Leu
145 150 155 160
Pro Leu Phe Asp Gly Asn Met Leu Gln Arg Leu Tyr Asn Val Phe Asp
165 170 175
Val Ser Val Gln Arg Val Lys Arg Asp His Glu His Asn Asp Lys Val
180 185 190
Asp Pro His Tyr His Phe Asn His Leu Val Arg Lys Gly Lys Lys Asp
195 200 205
Arg Tyr Gly His Asn Asp Asn Pro Ser Phe Lys His His Phe Val Asp
210 215 220
Ser Glu Gly Met Val Thr Glu Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu
225 230 235 240
Phe Leu Glu Lys Arg Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Arg Gly
245 250 255
Phe Lys Gly Gly Thr Gly Pro Tyr Glu Gln Met Thr Asn Glu Val Phe
260 265 270
Cys Arg Ser Arg Ile Ser Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Ser Leu Arg
275 280 285
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290 295 300
Pro Lys Pro Leu Tyr Asp Arg Leu Arg Glu Lys Asp Arg Ala Cys Phe
305 310 315 320
Arg Val Pro Val Asp Ile Leu Pro Asp Glu Asp Asp Thr Asp Gly Gly
325 330 335
Gly Glu Asp Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe
340 345 350
Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Leu Lys Lys Val Phe Thr Ser
355 360 365
Leu Arg Phe His Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ala Ile Tyr Lys
370 375 380
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385 390 395 400
Tyr Gly Phe Gly Arg Ile Gln Asp Phe Ala Glu Glu His Arg Pro Glu
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Lys Ile Gly Leu Arg Phe Val Pro Glu Gly Gln His Leu Trp Pro Ser
450 455 460
Pro Glu Val Gly Thr Thr Arg Thr Gly Arg Ser Lys Cys Ala Gln Asp
465 470 475 480
Lys Arg Leu Thr Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu Met Pro
485 490 495
Met Met Phe Tyr Tyr Phe Leu Leu Arg Glu Lys Tyr Ser Glu Glu Val
500 505 510
Ser Ala Glu Lys Val Gln Gly Arg Ile Lys Arg Val Ile Glu Asp Val
515 520 525
Tyr Ala Ile Tyr Asp Ala Phe Ala Arg Asp Glu Ile Asn Thr Leu Lys
530 535 540
Glu Leu Asp Thr Cys Leu Ala Asp Lys Gly Ile Arg Arg Gly His Leu
545 550 555 560
Pro Lys Gln Met Ile Thr Ile Leu Ser Gln Glu Arg Lys Asp Met Lys
565 570 575
Glu Lys Ile Arg Lys Lys Leu Gln Glu Met Ile Ala Asp Thr Asp His
580 585 590
Arg Leu Asp Met Leu Asp Arg Gln Thr Asp Arg Lys Ile Arg Ile Gly
595 600 605
Arg Lys Asn Ala Gly Leu Pro Lys Ser Gly Val Ile Ala Asp Trp Leu
610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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740 745 750
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755 760 765
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835 840 845
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850 855 860
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Met Glu Gln Tyr Pro Ile Ser Lys Leu Arg Val Glu Tyr Glu Leu
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Ala Ile Glu Glu Arg Met Gly Leu Asn Ile Ala His Arg Leu Ser
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1160 1165 1170
Ala
<210> 394
<211> 1135
<212> PRT
<213> Porphyromonas gulae
<400> 394
Met Asn Thr Val Pro Ala Thr Glu Asn Lys Gly Gln Ser Arg Thr Val
1 5 10 15
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20 25 30
Asn Leu Ile Glu Val Glu Ser His Val Arg Ile Lys Phe Gly Lys Lys
35 40 45
Lys Leu Asn Glu Glu Ser Leu Lys Gln Ser Leu Leu Cys Asp His Leu
50 55 60
Leu Ser Ile Asp Arg Trp Thr Lys Val Tyr Gly His Ser Arg Arg Tyr
65 70 75 80
Leu Pro Phe Leu His Cys Phe Asp Pro Asp Ser Gly Ile Glu Lys Asp
85 90 95
His Asp Ser Lys Thr Gly Val Asp Pro Asp Ser Ala Gln Arg Leu Ile
100 105 110
Arg Glu Leu Tyr Ser Leu Leu Asp Phe Leu Arg Asn Asp Phe Ser His
115 120 125
Asn Arg Leu Asp Gly Thr Thr Phe Glu His Leu Lys Val Ser Pro Asp
130 135 140
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Gln Ser Arg Phe Ala Asp Phe Phe Lys Pro Asp Asp Phe Leu Leu Ala
165 170 175
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340 345 350
Gly Glu Ile Glu Leu Asp Ser Tyr Ser Lys Lys Val Gly Arg Asn Gly
355 360 365
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370 375 380
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435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Tyr Val Lys Gln Leu Asn Glu Asp Cys Arg Leu Arg Leu Arg Lys Phe
580 585 590
Arg Lys Asp Gly Asp Gly Lys Ala Arg Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
Ile Val Ala Glu Leu His Leu Leu Asp Pro Ser Ser Gly His Pro Phe
660 665 670
Leu Ser Ala Thr Met Glu Thr Ala His Arg Tyr Thr Glu Asp Phe Tyr
675 680 685
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705 710 715 720
Val Pro Asp Gly Glu Ala Arg Lys Leu Leu Pro Leu Leu Ile Arg Arg
725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
Glu Leu Leu Lys Val Lys Asp Gly Lys Lys Lys Trp Asn Glu Ala Phe
770 775 780
Lys Asp Trp Trp Ser Thr Lys Tyr Pro Asp Gly Met Gln Pro Phe Tyr
785 790 795 800
Gly Leu Arg Arg Glu Leu Asn Ile His Gly Lys Ser Val Ser Tyr Ile
805 810 815
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820 825 830
Lys Thr Val Arg Asp Lys Lys Arg Glu Leu Arg Thr Ala Gly Lys Pro
835 840 845
Val Pro Pro Asp Leu Ala Ala Tyr Ile Lys Arg Ser Phe His Arg Ala
850 855 860
Val Asn Glu Arg Glu Phe Met Leu Arg Leu Val Gln Glu Asp Asp Arg
865 870 875 880
Leu Met Leu Met Ala Ile Asn Lys Met Met Thr Asp Arg Glu Glu Asp
885 890 895
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900 905 910
Gln Phe Ser Leu Ala Val His Ala Lys Val Leu Glu Lys Glu Gly Glu
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Gly Gly Asp Asn Ser Leu Ser Leu Val Pro Ala Thr Ile Glu Ile Lys
930 935 940
Ser Lys Arg Lys Asp Trp Ser Lys Tyr Ile Arg Tyr Arg Tyr Asp Arg
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Arg Val Pro Gly Leu Met Ser His Phe Pro Glu His Lys Ala Thr Leu
965 970 975
Asp Glu Val Lys Thr Leu Leu Gly Glu Tyr Asp Arg Cys Arg Ile Lys
980 985 990
Ile Phe Asp Trp Ala Phe Ala Leu Glu Gly Ala Ile Met Ser Asp Arg
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Leu Ile Tyr Arg Asp Val Ser Ala Lys Val Gly Ser Ile Glu Gly
1070 1075 1080
Ser Ser Ala Lys Asp Leu Pro Glu Gly Ser Ser Leu Val Asp Ser
1085 1090 1095
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1100 1105 1110
Leu Asp His Glu Asn Arg Phe Phe Gly Lys Leu Leu Asn Asn Met
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Ser Gln Pro Ile Asn Asp Leu
1130 1135
<210> 395
<211> 1218
<212> PRT
<213> Capnocytophaga cynodegmi
<400> 395
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1 5 10 15
Lys Pro Gln Asp Lys Ser Tyr Phe Ala Gly Tyr Leu Asn Ala Ala Met
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Glu Asn Ile Asp Ser Val Phe Arg Glu Leu Gly Lys Arg Leu Lys Gly
35 40 45
Lys Glu Tyr Thr Ser Glu Asn Phe Phe Asp Ala Ile Phe Lys Glu Asn
50 55 60
Ile Ser Leu Val Glu Tyr Glu Arg Tyr Val Lys Leu Leu Ser Asp Tyr
65 70 75 80
Phe Pro Met Ala Arg Leu Leu Asp Lys Lys Glu Val Pro Ile Lys Glu
85 90 95
Arg Lys Glu Asn Phe Lys Lys Asn Phe Arg Gly Ile Ile Lys Ala Val
100 105 110
Arg Asp Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Lys Glu His Gly Glu Val Glu
115 120 125
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130 135 140
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Ile Leu Lys Lys Ser Ile Glu Lys Gln Leu Asp Ile Leu Cys Gln Lys
165 170 175
Lys Leu Glu Tyr Leu Lys Asp Thr Ala Arg Lys Ile Glu Glu Lys Arg
180 185 190
Arg Asn Gln Arg Glu Arg Gly Glu Lys Lys Leu Val Pro Arg Phe Glu
195 200 205
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Phe Asp Val Tyr Ile Asp Lys Lys Lys Asp Ser Leu Lys Glu Ser Ser
225 230 235 240
Lys Thr Lys Tyr Asn Thr Glu Ser Tyr Pro Gln Gln Glu Glu Gly Asp
245 250 255
Leu Lys Ile Pro Ile Ser Lys Asn Gly Val Val Phe Leu Leu Ser Leu
260 265 270
Phe Leu Ser Lys Gln Glu Val His Ala Phe Lys Ser Lys Ile Ala Gly
275 280 285
Phe Lys Ala Thr Val Ile Asp Glu Ala Thr Val Ser His Arg Lys Asn
290 295 300
Ser Ile Cys Phe Met Ala Thr His Glu Ile Phe Ser His Leu Ala Tyr
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Lys Lys Leu Lys Arg Lys Val Arg Thr Ala Glu Ile Asn Tyr Ser Glu
325 330 335
Ala Glu Asn Ala Glu Gln Leu Ser Ile Tyr Ala Lys Glu Thr Leu Met
340 345 350
Met Gln Met Leu Asp Glu Leu Ser Lys Val Pro Asp Val Val Tyr Gln
355 360 365
Asn Leu Ser Glu Asp Val Gln Lys Thr Phe Ile Glu Asp Trp Asn Glu
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Tyr Leu Lys Glu Asn Asn Gly Asp Val Gly Thr Met Glu Glu Glu Gln
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Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Ala Gln Phe Pro Thr Leu Arg
420 425 430
Phe Gln Val His Leu Gly Asn Tyr Leu His Asp Ser Arg Pro Lys Glu
435 440 445
His Leu Ile Ser Asp Arg Arg Ile Lys Glu Lys Ile Thr Val Phe Gly
450 455 460
Arg Leu Ser Glu Leu Glu His Lys Lys Ala Leu Phe Ile Lys Asn Thr
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Glu Thr Asn Glu Asp Arg Lys His Tyr Trp Glu Val Phe Pro Asn Pro
485 490 495
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500 505 510
Pro Ile Ala Gly Ser Ile Leu Asp Arg Glu Lys Gln Pro Thr Ala Gly
515 520 525
Lys Ile Gly Ile Lys Val Asn Leu Leu Asn Gln Lys Tyr Ile Ser Glu
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Pro Ser Ile Gln Asn Ile Ile Glu Glu Ile Val Pro Ile Asn Gly Ser
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Asn Pro Lys Glu Ile Ile Val Phe Gly Gly Gln Pro Thr Ala Tyr Leu
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595 600 605
Glu Lys Lys Lys Glu Lys Leu Glu Lys Lys Gly Glu Lys Glu Leu Arg
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Lys Glu Ile Gly Lys Glu Leu Glu Glu Lys Ile Val Gly Lys Ile Gln
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Ile Lys Asp Leu Lys Gln Glu Gln Lys Ile Leu Gln Lys Leu Lys Asn
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Glu Gln Thr Ala Arg Glu Lys Glu Tyr Gln Glu Cys Ile Ala Tyr Gln
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Leu Arg Asn Gln Leu Lys Arg Lys Tyr Pro Glu Val Pro Thr Arg Lys
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Glu Ile Leu Tyr Tyr Gln Glu Lys Gly Lys Val Ala Val Trp Leu Ala
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945 950 955 960
Lys His Ile Phe Lys Ser Val Phe Lys Gln Asp Ser Ile Asp Arg Phe
965 970 975
Ser Leu Glu Asp Leu Tyr Gln Ser Arg Glu Glu Arg Leu Glu Asn Gln
980 985 990
Glu Lys Ala Lys Gln Thr Gly Glu Arg Asn Thr Asn Tyr Ile Trp Asn
995 1000 1005
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1040 1045 1050
Trp Gln Ala Phe Leu Ile Lys Glu Ser Lys Glu Glu Glu Asn Tyr
1055 1060 1065
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1070 1075 1080
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1085 1090 1095
Leu Glu Lys Val Lys Asp Lys Glu Ile Leu Lys Lys Gly Asp Asn
1100 1105 1110
Gln Asn Phe Lys Tyr Tyr Ile Leu Asn Gly Leu Leu Lys Gln Leu
1115 1120 1125
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1130 1135 1140
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1145 1150 1155
Asp Leu Glu Gln Lys Ala Phe Val Leu Thr Tyr Ile Arg Asn Lys
1160 1165 1170
Phe Ala His Asn Gln Leu Pro Lys Lys Glu Phe Trp Asp Tyr Cys
1175 1180 1185
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1190 1195 1200
Tyr Phe Ala Glu Val Phe Lys Arg Glu Lys Glu Ala Leu Met Lys
1205 1210 1215
<210> 396
<211> 1090
<212> PRT
<213> Prevotella sp. P5-119
<400> 396
Met Asn Ile Pro Ala Leu Val Glu Asn Gln Lys Lys Tyr Phe Gly Thr
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50 55 60
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65 70 75 80
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Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gln Asn Arg Val Glu Val Asn Ser Asn Asp
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Leu Ser Leu Gln Asp Tyr Asn Gly Asp Thr Gln Lys Lys Leu His Leu
210 215 220
Ser Gly Val Gly Ile Ala Leu Leu Ile Cys Leu Phe Leu Asp Lys Gln
225 230 235 240
Tyr Ile Asn Ile Phe Leu Ser Arg Leu Pro Ile Phe Ser Ser Tyr Asn
245 250 255
Ala Gln Ser Glu Glu Arg Arg Ile Ile Ile Arg Ser Phe Gly Ile Asn
260 265 270
Ser Ile Lys Leu Pro Lys Asp Arg Ile His Ser Glu Lys Ser Asn Lys
275 280 285
Ser Val Ala Met Asp Met Leu Asn Glu Val Lys Arg Cys Pro Asp Glu
290 295 300
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305 310 315 320
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945 950 955 960
Ile Pro Asp Thr Lys Val Asp Ile Thr Asp Lys Leu Pro Leu Arg Arg
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Tyr Gly Asp Leu Arg Arg Val Ala Lys Asp Arg Arg Leu Val Asn Leu
980 985 990
Ala Ser Tyr Tyr His Val Ala Gly Leu Ser Glu Ile Pro Tyr Asp Leu
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Val Lys Lys Glu Leu Glu Glu Tyr Asp Arg Arg Arg Val Ala Phe
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Ala Ala Glu Leu Arg Asn Glu Asn Pro Lys Gly Glu Ser Thr Tyr
1040 1045 1050
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1100 1105 1110
Val Phe Asp Val Ala Glu Gly Tyr Tyr Gln Lys Met Arg Lys Leu
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1130
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<213> Flavobacterium sp. 316
<400> 400
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115 120 125
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165 170 175
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180 185 190
Ile Asp Glu Asn Ile Lys Gly Ala Val Leu Asn Arg Ala Phe Ser His
195 200 205
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Phe Leu Leu Ser Phe Phe Leu Asn Lys Lys Glu Gln Glu Gln Leu Lys
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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1040 1045 1050
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1055 1060 1065
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<400> 402
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Asn Ile Lys Ala Val Leu Lys Ala Phe Ser Glu Lys Phe Asn Val Gly
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Leu Phe Leu Leu Ser Met Phe Leu Lys Arg Lys Glu Ile Glu Asp Leu
245 250 255
Lys Asn Arg Asn Lys Gly Phe Lys Ala Lys Val Val Ile Asp Glu Asp
260 265 270
Gly Lys Val Asn Gly Leu Lys Phe Met Ala Thr His Trp Val Phe Ser
275 280 285
Tyr Leu Cys Phe Lys Gly Leu Lys Ser Lys Leu Ser Thr Glu Phe His
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Glu Glu Thr Leu Leu Ile Gln Ile Ile Asp Glu Leu Ser Lys Val Pro
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Asp Glu Leu Tyr Cys Ala Phe Asp Lys Glu Thr Arg Asp Lys Phe Ile
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355 360 365
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885 890 895
Leu Pro Leu Ser Asp Phe Tyr Leu Thr Gln Glu Glu Arg Met Glu Lys
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915 920 925
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Lys Lys Gly Gln Ile Ile Glu Asn Ala Val Lys Leu Lys Asp Ile Gly
945 950 955 960
Lys Leu Asn Val Leu Ser Leu Asp Asp Lys Val Gln Thr Leu Leu Ser
965 970 975
Tyr Asp Asp Ala Lys Pro Trp Ser Lys Ile Ala Leu Glu Asn Glu Phe
980 985 990
Ser Ile Gly Glu Asn Ser Tyr Glu Val Ile Arg Arg Glu Lys Leu Phe
995 1000 1005
Lys Glu Ile Gln Gln Phe Glu Ser Glu Ile Leu Phe Arg Ser Gly
1010 1015 1020
Trp Asp Gly Ile Asn His Pro Ala Gln Leu Glu Asp Asn Arg Asn
1025 1030 1035
Pro Lys Phe Lys Met Tyr Ile Val Asn Gly Ile Leu Arg Lys Ser
1040 1045 1050
Ala Gly Leu Tyr Ser Gln Gly Glu Asp Ile Trp Phe Glu Tyr Asn
1055 1060 1065
Ala Asp Phe Asn Asn Leu Asp Ala Asp Val Leu Glu Thr Lys Ser
1070 1075 1080
Glu Leu Val Gln Leu Ala Phe Leu Val Thr Ala Ile Arg Asn Lys
1085 1090 1095
Phe Ala His Asn Gln Leu Pro Ala Lys Glu Phe Tyr Phe Tyr Ile
1100 1105 1110
Arg Ala Lys Tyr Gly Phe Ala Asp Glu Pro Ser Val Ala Leu Val
1115 1120 1125
Tyr Leu Asn Phe Thr Lys Tyr Ala Ile Asn Glu Phe Lys Lys Val
1130 1135 1140
Met Ile
1145
<210> 403
<211> 948
<212> PRT
<213> Riemerella anatipestifer
<400> 403
Met Phe Phe Ser Phe His Asn Ala Gln Arg Val Ile Phe Lys His Leu
1 5 10 15
Tyr Lys Ala Phe Asp Ala Ser Leu Arg Met Val Lys Glu Asp Tyr Lys
20 25 30
Ala His Phe Thr Val Asn Leu Thr Arg Asp Phe Ala His Leu Asn Arg
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100 105 110
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130 135 140
Cys Pro Lys Leu Leu Tyr Glu Lys Leu Ser Glu Glu Asn Lys Lys His
145 150 155 160
Phe Gln Val Glu Ala Asp Gly Phe Leu Asp Glu Ile Glu Glu Glu Gln
165 170 175
Asn Pro Phe Lys Asp Thr Leu Ile Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr
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Phe Ala Leu Arg Tyr Leu Asp Leu Asn Glu Ser Phe Lys Ser Ile Arg
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Ile Gly Asp Glu Gln Glu Lys Arg His Leu Thr Arg Thr Leu Leu Ser
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Lys Ala Leu Thr Lys Asp Leu Asp Tyr Lys Glu Thr Ser Asn Gln Pro
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Phe Ile Ser Lys Thr Thr Pro His Tyr His Ile Thr Asp Asn Lys Ile
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Lys Asp Gly Ala Asn Arg Ile Ala Lys Tyr Pro Tyr Asn Ser Gly Phe
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Lys Glu Leu Ser Lys Arg Leu Asn Tyr Ile Phe Ile Val Phe Gln Lys
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Ala Asp Ala Ile Asn Leu Ser Arg Gly Ile Phe Asp Glu Lys Pro Thr
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<400> 407
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<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 408
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<212> PRT
<213> Flavobacterium columnare
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Leu Ile Thr Ile Lys Lys Lys Lys Val Lys Asn Asp Thr Ser Arg Glu
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Leu Leu Lys Glu Lys Leu Arg Pro Glu Leu Thr Gln Leu Lys Asn Gln
165 170 175
Lys Arg Glu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Lys Lys Leu Leu Glu Glu Asn
180 185 190
Leu Glu Asn Ala Val Phe Asn His Cys Leu Arg Pro Phe Leu Glu Glu
195 200 205
Asn Lys Thr Asp Asp Lys Gln Asn Lys Thr Val Ser Leu Arg Lys Tyr
210 215 220
Arg Lys Ser Lys Pro Asn Glu Glu Thr Ser Ile Thr Leu Thr Gln Ser
225 230 235 240
Gly Leu Val Phe Leu Met Ser Phe Phe Leu His Arg Lys Glu Phe Gln
245 250 255
Val Phe Thr Ser Gly Leu Glu Gly Phe Lys Ala Lys Val Asn Thr Ile
260 265 270
Lys Glu Glu Lys Ile Ser Leu Asn Lys Asn Asn Ile Val Tyr Met Ile
275 280 285
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Ile Lys Thr Asp Gln Gly Val Ser Thr Leu Glu Gln Asn Asn Thr Thr
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Val Asp Tyr Leu Ser Lys Val Pro Asn Glu Ile Tyr Glu Thr Leu Ser
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Lys Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu Asn Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Met
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Arg Phe Leu Asp Glu Tyr Ala Glu Leu Pro Thr Leu Arg Phe Met Val
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420 425 430
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Ser Asn Asn Leu Asp Glu Tyr Leu Asn Gln Lys Lys Lys Ala Gln Ser
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Pro Ile Asp Ile Pro Arg Leu Lys Asn Ala Ile Gln Lys Glu Leu Ala
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645 650 655
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<210> 411
<211> 1095
<212> PRT
<213> Riemerella anatispestifer
<400> 411
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Leu Asn Arg Lys Gly Lys Asn Lys Gln Asp Asn Pro Asp Phe Asp Arg
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Phe Thr Asn Leu Phe Leu Asp Lys Arg Asp Ala Tyr Trp Met Leu Lys
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Lys Val Ser Gly Phe Lys Ala Ser His Lys Gln Ser Glu Lys Met Thr
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Ser Ser Met Val Thr Asp Glu His Ile Ala Phe Ile Ala Ser Val
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1085 1090 1095
<210> 412
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<212> PRT
<213> Sinomicrobium oceani
<400> 412
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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Ser Ala Ser Ser Lys Gly Lys Glu Leu Tyr Arg Asp Leu Met Lys Ile
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Lys Ser Glu Lys Lys Lys Lys Ser Arg Glu Glu Gly Ile Pro Met Glu
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500 505 510
Arg Asn Ile Lys Asp Asn Asn Phe Lys Asp Ile Tyr Pro Gly Glu Pro
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Glu Lys Leu Tyr Glu Arg Phe Gln Ile Ile Arg Asp Tyr Lys Pro Gly
565 570 575
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595 600 605
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Ser Asp Ile Ile Gly Phe Leu Glu Glu His Lys Val Leu Lys Arg Tyr
740 745 750
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885 890 895
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1145
<210> 413
<211> 1133
<212> PRT
<213> Richenbachiella agariperforans
<400> 413
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225 230 235 240
Phe His Ala Cys Leu Phe Leu Leu Ser Leu Phe Leu Tyr Lys Ser Glu
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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435 440 445
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Glu Gln Arg Asp His Leu Lys Glu Gln Lys Lys Glu Leu Pro Lys Lys
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Glu Asp Ala Leu Tyr Ser Glu Lys Arg Glu Asn Ala Gly Lys Gly Leu
580 585 590
Ile Ser Gly Tyr Phe Val His His Gln Lys Glu Leu Lys Asp Gln Leu
595 600 605
Asp Ile Leu Glu Lys Glu Thr Glu Ile Ser Arg Glu Gln Lys Arg Glu
610 615 620
Phe Lys Lys Leu Leu Pro Lys Arg Leu Leu His Arg Tyr Ser Pro Ala
625 630 635 640
Gln Ile Asn Asp Thr Thr Glu Trp Asn Pro Met Glu Val Ile Leu Glu
645 650 655
Glu Ala Lys Ala Gln Glu Gln Arg Tyr Gln Leu Leu Leu Glu Lys Ala
660 665 670
Ile Leu His Gln Thr Glu Glu Asp Phe Leu Lys Arg Asn Lys Gly Lys
675 680 685
Gln Phe Lys Leu Arg Phe Val Arg Lys Ala Trp His Leu Met Tyr Leu
690 695 700
Lys Glu Leu Tyr Met Asn Lys Val Ala Glu His Gly His His Lys Ser
705 710 715 720
Phe His Ile Thr Lys Glu Glu Phe Asn Asp Phe Cys Arg Trp Met Phe
725 730 735
Ala Phe Asp Glu Val Pro Lys Tyr Lys Glu Tyr Leu Cys Asp Tyr Phe
740 745 750
Ser Gln Lys Gly Phe Phe Asn Asn Ala Glu Phe Lys Asp Leu Ile Glu
755 760 765
Ser Ser Thr Ser Leu Asn Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Lys Gln Arg Phe
770 775 780
Glu Gly Trp Ser Lys Asp Leu Thr Lys Gln Ser Asp Glu Asn Lys Tyr
785 790 795 800
Leu Leu Ala Asn Tyr Glu Ser Met Leu Lys Asp Asp Met Leu Tyr Val
805 810 815
Asn Ile Ser His Phe Ile Ser Tyr Leu Glu Ser Lys Gly Lys Ile Asn
820 825 830
Arg Asn Ala His Gly His Ile Ala Tyr Lys Ala Leu Asn Asn Val Pro
835 840 845
His Leu Ile Glu Glu Tyr Tyr Tyr Lys Asp Arg Leu Ala Pro Glu Glu
850 855 860
Tyr Lys Ser His Gly Lys Leu Tyr Asn Lys Leu Lys Thr Val Lys Leu
865 870 875 880
Glu Asp Ala Leu Leu Tyr Glu Met Ala Met His Tyr Leu Ser Leu Glu
885 890 895
Pro Ala Leu Val Pro Lys Val Lys Thr Lys Val Lys Asp Ile Leu Ser
900 905 910
Ser Asn Ile Ala Phe Asp Ile Lys Asp Ala Ala Gly His His Leu Tyr
915 920 925
His Leu Leu Ile Pro Phe His Lys Ile Asp Ser Phe Val Ala Leu Ile
930 935 940
Asn His Gln Ser Gln Gln Glu Lys Asp Pro Asp Lys Thr Ser Phe Leu
945 950 955 960
Ala Lys Ile Gln Pro Tyr Leu Glu Lys Val Lys Asn Ser Lys Asp Leu
965 970 975
Lys Ala Val Tyr His Tyr Tyr Lys Asp Thr Pro His Thr Leu Arg Tyr
980 985 990
Glu Asp Leu Asn Met Ile His Ser His Ile Val Ser Gln Ser Val Gln
995 1000 1005
Phe Thr Lys Val Ala Leu Lys Leu Glu Glu Tyr Phe Ile Ala Lys
1010 1015 1020
Lys Ser Ile Thr Leu Gln Ile Ala Arg Gln Ile Ser Tyr Ser Glu
1025 1030 1035
Ile Ala Asp Leu Ser Asn Tyr Phe Thr Asp Glu Val Arg Asn Thr
1040 1045 1050
Ala Phe His Phe Asp Val Pro Glu Thr Ala Tyr Ser Met Ile Leu
1055 1060 1065
Gln Gly Ile Glu Ser Glu Phe Leu Asp Arg Glu Ile Lys Pro Gln
1070 1075 1080
Lys Pro Lys Ser Leu Ser Glu Leu Ser Thr Gln Gln Val Ser Val
1085 1090 1095
Cys Thr Ala Phe Leu Glu Thr Leu His Asn Asn Leu Phe Asp Arg
1100 1105 1110
Lys Asp Asp Lys Lys Glu Arg Leu Ser Lys Ala Arg Glu Arg Tyr
1115 1120 1125
Phe Glu Gln Ile Asn
1130
<210> 414
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> RNA aptamer
<400> 414
gggaacaaag cugaaguacu uaccc 25
<210> 415
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic G-quadraplex
<400> 415
gggtagggcg ggttggga 18
<210> 416
<211> 12
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> synthetic linker
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5Biosg
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> 3IAbRQSp
<400> 416
ucucguacgu uc 12
<210> 417
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic tag
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5Biosg
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> 3IAbRQSp
<400> 417
ucucguacgu ucucucguac guuc 24
<210> 418
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 418
tatatatata 10
<210> 419
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 419
gtcgtcgtcg tcgtc 15
<210> 420
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 420
gtggaattgt gagcggataa ac 22
<210> 421
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<400> 421
aacagcaatc tactcgacct g 21
<210> 422
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 56-FAM fluorophore
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> internal ZEN quencher
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> 3IABkFQ quencher
<400> 422
aggaaacagc tatgaccatg attacgcc 28
<210> 423
<400> 423
000
<210> 424
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 424
ggttggtagt ctcgaattgc tctct 25
<210> 425
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 425
gcaaggggac uaaaacuaga uugcuguucu accaaguaau ccau 44
<210> 426
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 426
uagauugcug uucuaccaag uaa 23
<210> 427
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 427
uagauugcug uucuaccaag 20
<210> 428
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 428
auggauuacu ugguagaaca gcaaucua 28
<210> 429
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sytthetic
<400> 429
auggauuacu ugguagaaca gcaaugua 28
<210> 430
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 430
uagauugcug uucuacc 17
<210> 431
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 431
aagauugcug uucuacc 17
<210> 432
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 432
uugauugcug uucuacc 17
<210> 433
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 433
uaguuugcug uucuacc 17
<210> 434
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 434
uagaaugcug uucuacc 17
<210> 435
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 435
uagauagcug uucuacc 17
<210> 436
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 436
uagauuccug uucuacc 17
<210> 437
<211> 30
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 437
auggauuacu ugguagaaca gaaucuacuc 30
<210> 438
<211> 30
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 438
auggauuacu ugguagaaca gaauguacuc 30
<210> 439
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 439
aagauugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 440
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 440
uugauugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 441
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 441
uaguuugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 442
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 442
uagaaugcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 443
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 443
uagauagcug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 444
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 444
uagauuccug uucuaccaag uaauccau 28
<210> 445
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 445
cuagauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 446
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 446
gaagauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 447
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 447
guugauugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 448
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 448
guaguuugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 449
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 449
guagaaugcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 450
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 450
guagauagcu guucuaccaa guaaucca 28
<210> 451
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 451
acuagauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 452
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 452
agaagauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 453
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 453
aguugauugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 454
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 454
aguaguuugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 455
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 455
aguagaaugc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 456
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 456
aguagauagc uguucuacca aguaaucc 28
<210> 457
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 457
gacuagauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 458
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 458
gagaagauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 459
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 459
gaguugauug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 460
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 460
gaguaguuug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 461
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 461
gaguagaaug cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 462
<211> 28
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 462
gaguagauag cuguucuacc aaguaauc 28
<210> 463
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum target
<400> 463
gaaattaata cgactcacta tagggttatt gcaattatta atcttgaacg aggaatg 57
<210> 464
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 464
gaaattaata cgactcacta taggggattg acagattaat agctctttct tgatttc 57
<210> 465
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 465
atttttcttg tccaaacaat tcatcatatc tt 32
<210> 466
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 466
ttcaatttca aataagaata tagtgtactc gc 32
<210> 467
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 467
gaaattaata cgactcacta tagggttctt attagcagaa caaagaagtt taacaac 57
<210> 468
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 468
gaaattaata cgactcacta tagggatttt atgcaatgtt aaaaactgtt ccaagta 57
<210> 469
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 469
taattgacat ccaatccata ataaagcata ga 32
<210> 470
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 470
gaattatagt tgttaaactt ctttgttctg ct 32
<210> 471
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 471
cctagtaagc atgattcatc agattgtggt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89
<210> 472
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 472
ggatggtgat gcatggccgt ttttagttgt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89
<210> 473
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P falciparum
<400> 473
caatttaaaa tgatttttgg tgctagaggt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89
<210> 474
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P. falciparum
<400> 474
gctggtttag taattgtatt attatcatgt tttagtcccc ttcgtttttg gggtagtcta 60
aatcccctat agtgagtcgt attaatttc 89
<210> 475
<211> 124
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 475
tacttggtag aacagcaatc tactcgacct gcaggcatgc aagcttggcg taatcatggt 60
catagctgtt tcctgtgttt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 120
aaag 124
<210> 476
<211> 124
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 476
atgaaccatc ttgtcgttag atgagctgga cgtccgtacg ttcgaaccgc attagtacca 60
gtatcgacaa aggacacaaa taggcgagtg ttaaggtgtg ttgtatgctc ggccttcgta 120
ttta 124
<210> 477
<211> 1389
<212> PRT
<213> Leptotrichia shahii
<400> 477
Met Gly Asn Leu Phe Gly His Lys Arg Trp Tyr Glu Val Arg Asp Lys
1 5 10 15
Lys Asp Phe Lys Ile Lys Arg Lys Val Lys Val Lys Arg Asn Tyr Asp
20 25 30
Gly Asn Lys Tyr Ile Leu Asn Ile Asn Glu Asn Asn Asn Lys Glu Lys
35 40 45
Ile Asp Asn Asn Lys Phe Ile Arg Lys Tyr Ile Asn Tyr Lys Lys Asn
50 55 60
Asp Asn Ile Leu Lys Glu Phe Thr Arg Lys Phe His Ala Gly Asn Ile
65 70 75 80
Leu Phe Lys Leu Lys Gly Lys Glu Gly Ile Ile Arg Ile Glu Asn Asn
85 90 95
Asp Asp Phe Leu Glu Thr Glu Glu Val Val Leu Tyr Ile Glu Ala Tyr
100 105 110
Gly Lys Ser Glu Lys Leu Lys Ala Leu Gly Ile Thr Lys Lys Lys Ile
115 120 125
Ile Asp Glu Ala Ile Arg Gln Gly Ile Thr Lys Asp Asp Lys Lys Ile
130 135 140
Glu Ile Lys Arg Gln Glu Asn Glu Glu Glu Ile Glu Ile Asp Ile Arg
145 150 155 160
Asp Glu Tyr Thr Asn Lys Thr Leu Asn Asp Cys Ser Ile Ile Leu Arg
165 170 175
Ile Ile Glu Asn Asp Glu Leu Glu Thr Lys Lys Ser Ile Tyr Glu Ile
180 185 190
Phe Lys Asn Ile Asn Met Ser Leu Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Ile Ile
195 200 205
Glu Asn Glu Thr Glu Lys Val Phe Glu Asn Arg Tyr Tyr Glu Glu His
210 215 220
Leu Arg Glu Lys Leu Leu Lys Asp Asp Lys Ile Asp Val Ile Leu Thr
225 230 235 240
Asn Phe Met Glu Ile Arg Glu Lys Ile Lys Ser Asn Leu Glu Ile Leu
245 250 255
Gly Phe Val Lys Phe Tyr Leu Asn Val Gly Gly Asp Lys Lys Lys Ser
260 265 270
Lys Asn Lys Lys Met Leu Val Glu Lys Ile Leu Asn Ile Asn Val Asp
275 280 285
Leu Thr Val Glu Asp Ile Ala Asp Phe Val Ile Lys Glu Leu Glu Phe
290 295 300
Trp Asn Ile Thr Lys Arg Ile Glu Lys Val Lys Lys Val Asn Asn Glu
305 310 315 320
Phe Leu Glu Lys Arg Arg Asn Arg Thr Tyr Ile Lys Ser Tyr Val Leu
325 330 335
Leu Asp Lys His Glu Lys Phe Lys Ile Glu Arg Glu Asn Lys Lys Asp
340 345 350
Lys Ile Val Lys Phe Phe Val Glu Asn Ile Lys Asn Asn Ser Ile Lys
355 360 365
Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Ala Glu Phe Lys Ile Asp Glu Leu Ile
370 375 380
Lys Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys Gly Asn Cys Asp Thr Glu Ile
385 390 395 400
Phe Gly Ile Phe Lys Lys His Tyr Lys Val Asn Phe Asp Ser Lys Lys
405 410 415
Phe Ser Lys Lys Ser Asp Glu Glu Lys Glu Leu Tyr Lys Ile Ile Tyr
420 425 430
Arg Tyr Leu Lys Gly Arg Ile Glu Lys Ile Leu Val Asn Glu Gln Lys
435 440 445
Val Arg Leu Lys Lys Met Glu Lys Ile Glu Ile Glu Lys Ile Leu Asn
450 455 460
Glu Ser Ile Leu Ser Glu Lys Ile Leu Lys Arg Val Lys Gln Tyr Thr
465 470 475 480
Leu Glu His Ile Met Tyr Leu Gly Lys Leu Arg His Asn Asp Ile Asp
485 490 495
Met Thr Thr Val Asn Thr Asp Asp Phe Ser Arg Leu His Ala Lys Glu
500 505 510
Glu Leu Asp Leu Glu Leu Ile Thr Phe Phe Ala Ser Thr Asn Met Glu
515 520 525
Leu Asn Lys Ile Phe Ser Arg Glu Asn Ile Asn Asn Asp Glu Asn Ile
530 535 540
Asp Phe Phe Gly Gly Asp Arg Glu Lys Asn Tyr Val Leu Asp Lys Lys
545 550 555 560
Ile Leu Asn Ser Lys Ile Lys Ile Ile Arg Asp Leu Asp Phe Ile Asp
565 570 575
Asn Lys Asn Asn Ile Thr Asn Asn Phe Ile Arg Lys Phe Thr Lys Ile
580 585 590
Gly Thr Asn Glu Arg Asn Arg Ile Leu His Ala Ile Ser Lys Glu Arg
595 600 605
Asp Leu Gln Gly Thr Gln Asp Asp Tyr Asn Lys Val Ile Asn Ile Ile
610 615 620
Gln Asn Leu Lys Ile Ser Asp Glu Glu Val Ser Lys Ala Leu Asn Leu
625 630 635 640
Asp Val Val Phe Lys Asp Lys Lys Asn Ile Ile Thr Lys Ile Asn Asp
645 650 655
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<220>
<223> Prevotella sp.
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Ser Ile Lys Leu Pro Lys Asp Arg Ile His Ser Glu Lys Ser Asn Lys
275 280 285
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Glu Arg Tyr Leu Ile Glu Arg Lys Phe Tyr Leu Thr Gly Leu Ser Asn
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Glu Ile Lys Lys Gly Asn Arg Val Asp Val Pro Phe Ile Arg Arg Asp
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Leu Asp Asp Asp Phe Gln Thr Phe Tyr Gln Trp Asn Arg Asn Tyr Arg
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740 745 750
Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Ala Val Arg Asp Cys Leu Ile Glu Met
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Ala Val Pro Leu Tyr Phe Glu Arg Ala Cys Lys Asp Arg Val Gln Pro
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Phe Tyr Asp Ser Pro Phe Asn Val Gly Asn Ser Leu Lys Pro Lys Lys
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Lys Glu Arg Phe Arg Leu Ala Lys Leu Lys Lys Glu Ile Leu Glu Ala
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245 250 255
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Cys Arg Ser Arg Ile Ser Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Ser Leu Arg
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Phe Tyr Asp Tyr Pro Phe Asn Val Gly Asn Ser Leu Lys Pro Lys Lys
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Gly Arg Phe Leu Ser Lys Glu Lys Arg Ala Glu Glu Trp Glu Ser Gly
820 825 830
Lys Glu Arg Phe Arg Leu Ala Lys Leu Lys Lys Glu Ile Leu Glu Ala
835 840 845
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Tyr Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln Lys Glu Asp Arg His Leu Thr His
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Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln Glu Phe Asp Lys Gln Asn Arg
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Gln Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Arg Asn Gln
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885 890 895
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900 905 910
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965 970 975
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1040 1045 1050
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Glu Asn Leu Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ser Leu Ser Ser Ser
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1100 1105 1110
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<211> 1124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Prevotella aurantiaca
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Ser Leu Lys Asp Cys Leu Phe Leu Phe Leu Asp Lys Leu Gln Glu Ala
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Glu Phe Glu Glu Gly Leu Leu Glu Lys Met Tyr Asn Ile Phe Gly Asn
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Asn Ile Gln Leu Val Ile Asn Asp Tyr Gln His Asn Lys Asp Ile Asn
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Pro Asp Glu Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Lys Gly Gln Phe Lys Tyr
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Ser Phe Ala Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu Phe
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1130
<210> 515
<211> 1133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reichenbachiella agariperforans
<400> 515
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195 200 205
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<210> 562
<211> 1218
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Capnocytophaga cynodegmi
<400> 562
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225 230 235 240
Lys Gln Ser Ile Glu Asn Lys Ile Glu Lys Asn Thr Asn Lys Ile Lys
245 250 255
Glu Ile Glu Gln Lys Leu Lys Lys Glu Lys Tyr Lys Lys Glu Ile Asn
260 265 270
Arg Leu Lys Lys Gln Leu Ile Glu Leu Asn Arg Glu Asn Asp Leu Leu
275 280 285
Glu Lys Asp Lys Ile Glu Leu Ser Asp Glu Glu Ile Arg Glu Asp Ile
290 295 300
Glu Lys Ile Leu Lys Ile Tyr Ser Asp Leu Arg His Lys Leu Met His
305 310 315 320
Tyr Asn Tyr Gln Tyr Phe Glu Asn Leu Phe Glu Asn Lys Lys Ile Ser
325 330 335
Lys Glu Lys Asn Glu Asp Val Asn Leu Thr Glu Leu Leu Asp Leu Asn
340 345 350
Leu Phe Arg Tyr Leu Pro Leu Val Arg Gln Leu Lys Leu Glu Asn Lys
355 360 365
Thr Asn Tyr Leu Glu Lys Glu Asp Lys Ile Thr Val Leu Gly Val Ser
370 375 380
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Lys Asn Gly Phe Asn Asn Phe Ile Asn Ser Phe Phe Ser Asn Asp Gly
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420 425 430
Glu Ile Glu Ile Met Glu Lys Glu Thr Asn Glu Lys Ile Lys Glu Ile
435 440 445
Asn Lys Asn Glu Leu Gln Leu Met Lys Glu Gln Lys Glu Leu Gly Thr
450 455 460
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Asn Arg Asp Lys Asn Ala Leu Asp Lys Ile Asn Lys Lys Leu Val Glu
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Leu Lys Ile Lys Met Asp Lys Ile Thr Lys Arg Asn Ser Ile Leu Arg
515 520 525
Leu Lys Tyr Lys Leu Gln Val Ala Tyr Gly Phe Leu Met Glu Glu Tyr
530 535 540
Lys Gly Asn Ile Lys Lys Phe Lys Asp Glu Phe Asp Ile Ser Lys Glu
545 550 555 560
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565 570 575
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595 600 605
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Tyr Lys Lys Glu Val Ile Met Ala Ile Lys Arg Ser Ile Val Ser Lys
995 1000 1005
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<220>
<223> Fusobacterium necrophorum
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fusobacterium varium
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Ile Lys Ile Ile Lys Ile Phe Ser Asp Leu Arg His Ser Leu Met His
305 310 315 320
Tyr Glu Tyr Lys Tyr Phe Glu Asn Leu Phe Glu Asn Lys Lys Asn Glu
325 330 335
Glu Leu Ala Glu Leu Leu Asn Leu Asn Leu Phe Lys Asn Leu Thr Leu
340 345 350
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355 360 365
Glu Lys Phe Asn Ile Leu Gly Lys Asp Val Arg Ala Lys Asn Ala Leu
370 375 380
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385 390 395 400
Ile Asn Ser Phe Phe Val Gln Asp Gly Thr Glu Asn Leu Glu Phe Lys
405 410 415
Lys Phe Ile Asp Glu Asn Phe Ile Lys Ala Gln Lys Glu Leu Glu Glu
420 425 430
Asp Ile Lys Asn Cys Lys Glu Ser Val Lys Lys Leu Glu Lys Lys Leu
435 440 445
Lys Glu Asn Pro Lys Lys Ser Glu Asp Leu Glu Lys Lys Leu Glu Lys
450 455 460
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Thr Lys Ser Asn Ser Leu Phe Arg Leu Lys Tyr Lys Met Gln Ile Ala
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Tyr Ala Phe Leu Glu Met Glu Tyr Glu Gly Asn Ile Ala Lys Phe Lys
565 570 575
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580 585 590
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Phe Thr Asp Glu Ser Glu Lys Glu Leu Ser Gln Glu Gln Ile Asp Lys
675 680 685
Met Ile Gly Asp Ser Phe Phe His Lys Ile Arg Leu Phe Glu Lys Asn
690 695 700
Thr Lys Arg Tyr Glu Ile Ile Lys Tyr Ser Ile Leu Thr Ser Asp Glu
705 710 715 720
Ile Lys Lys Tyr Phe Glu Leu Leu Glu Leu Lys Val Pro Tyr Leu Glu
725 730 735
Tyr Lys Gly Ile Asp Glu Ile Gly Ile Phe Asn Lys Asn Ile Ile Leu
740 745 750
Pro Ile Phe Lys Tyr Tyr Gln Ile Ile Phe Arg Leu Tyr Asn Asp Leu
755 760 765
Glu Ile His Gly Leu Phe Asn Val Ser Phe Asp Ile Asn Lys Ile Leu
770 775 780
Ser Asp Leu Lys Ser Tyr Gly Asn Glu Asn Ile Asn Phe Arg Glu Phe
785 790 795 800
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820 825 830
Leu Thr Pro Glu Lys Lys Glu Ile Asn Lys Lys Thr Glu Lys Glu Leu
835 840 845
Lys Lys Leu Asp Gly Ile Ser Phe Leu Arg Asn Lys Ile Ser His Leu
850 855 860
Glu Tyr Glu Lys Ile Ile Glu Gly Val Leu Lys Thr Ala Val Asn Gly
865 870 875 880
Glu Asn Lys Lys Thr Ser Glu Thr Asn Ala Asp Lys Val Phe Leu Asn
885 890 895
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900 905 910
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Leu Lys Ile Thr Tyr Gly Leu Asn Tyr Asn Asn Leu Ser Lys Ile Tyr
965 970 975
Glu Phe Ser Asn Thr Leu Arg Glu Ile Val Asn Ser Pro Leu Phe Leu
980 985 990
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1130 1135 1140
Leu Met Leu Asn Asn His Tyr Cys Phe Asn Val Lys Ile Ile Tyr
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<210> 579
<211> 1385
<212> PRT
<213> Leptotrichia sp oral taxon
<400> 579
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Glu Ile Lys Arg Gln Glu Asn Glu Glu Glu Ile Glu Ile Asp Ile Arg
145 150 155 160
Asp Glu Tyr Thr Asn Lys Thr Leu Asn Asp Cys Ser Ile Ile Leu Arg
165 170 175
Ile Ile Glu Asn Asp Glu Leu Glu Thr Lys Lys Ser Ile Tyr Glu Ile
180 185 190
Phe Lys Asn Ile Asn Met Ser Leu Tyr Lys Ile Ile Glu Lys Ile Ile
195 200 205
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Lys Ile Val Lys Phe Phe Val Glu Asn Ile Lys Asn Asn Ser Ile Lys
355 360 365
Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Ala Glu Phe Lys Ile Asn Glu Leu Ile
370 375 380
Lys Lys Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys Gly Asn Cys Asp Thr Glu Ile
385 390 395 400
Phe Gly Ile Phe Lys Lys His Tyr Lys Val Asn Phe Asp Ser Lys Lys
405 410 415
Phe Ser Asn Lys Ser Asp Glu Glu Lys Glu Leu Tyr Lys Ile Ile Tyr
420 425 430
Arg Tyr Leu Lys Gly Arg Ile Glu Lys Ile Leu Val Asn Glu Gln Lys
435 440 445
Val Arg Leu Lys Lys Met Glu Lys Ile Glu Ile Glu Lys Ile Leu Asn
450 455 460
Glu Ser Ile Leu Ser Glu Lys Ile Leu Lys Arg Val Lys Gln Tyr Thr
465 470 475 480
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485 490 495
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530 535 540
Phe Asn Leu Asn Gly Gln Lys Ile Thr Leu Lys Glu Lys Val Pro Ser
545 550 555 560
Phe Lys Leu Asn Ile Leu Lys Lys Leu Asn Phe Ile Asn Asn Glu Asn
565 570 575
Asn Ile Asp Glu Lys Leu Ser His Phe Tyr Ser Phe Gln Lys Glu Gly
580 585 590
Tyr Leu Leu Arg Asn Lys Ile Leu His Asn Ser Tyr Gly Asn Ile Gln
595 600 605
Glu Thr Lys Asn Leu Lys Gly Glu Tyr Glu Asn Val Glu Lys Leu Ile
610 615 620
Lys Glu Leu Lys Val Ser Asp Glu Glu Ile Ser Lys Ser Leu Ser Leu
625 630 635 640
Asp Val Ile Phe Glu Gly Lys Val Asp Ile Ile Asn Lys Ile Asn Ser
645 650 655
Leu Lys Ile Gly Glu Tyr Lys Asp Lys Lys Tyr Leu Pro Ser Phe Ser
660 665 670
Lys Ile Val Leu Glu Ile Thr Arg Lys Phe Arg Glu Ile Asn Lys Asp
675 680 685
Lys Leu Phe Asp Ile Glu Ser Glu Lys Ile Ile Leu Asn Ala Val Lys
690 695 700
Tyr Val Asn Lys Ile Leu Tyr Glu Lys Ile Thr Ser Asn Glu Glu Asn
705 710 715 720
Glu Phe Leu Lys Thr Leu Pro Asp Lys Leu Val Lys Lys Ser Asn Asn
725 730 735
Lys Lys Glu Asn Lys Asn Leu Leu Ser Ile Glu Glu Tyr Tyr Lys Asn
740 745 750
Ala Gln Val Ser Ser Ser Lys Gly Asp Lys Lys Ala Ile Lys Lys Tyr
755 760 765
Gln Asn Lys Val Thr Asn Ala Tyr Leu Glu Tyr Leu Glu Asn Thr Phe
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820 825 830
Ile Ser Ile Phe Ala Leu Leu Asn Ser Asn Thr Tyr Ile Asn Lys Ile
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Arg Asn Arg Phe Phe Ala Thr Ser Val Trp Leu Glu Lys Gln Asn Gly
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Leu Leu Ile Asn Leu Leu Arg Glu Asn Asn Ile Thr Asp Ile Leu Asp
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<212> PRT
<213> Leptotrichia shahii
<400> 580
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Ile Asp Asn Asn Lys Phe Ile Arg Lys Tyr Ile Asn Tyr Lys Lys Asn
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Asn Thr Asn Asp Thr Leu
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<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei
<400> 581
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Asn Lys Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys
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Tyr Asn Tyr Tyr Leu Gln Val Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile
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405 410 415
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435 440 445
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485 490 495
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Ser Val Pro Lys Asp Lys Glu Glu Lys Asp Ala Gln Ile Tyr Leu Leu
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595 600 605
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980 985 990
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<211> 1120
<212> PRT
<213> Listeria seeligeri
<400> 582
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Thr Ile Pro Asn Phe Glu Leu Ser Leu Leu Thr Ser Ala Val Pro Phe
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<212> PRT
<213> Lachnospiraceae bacterium
<400> 584
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Ile Ser Ser Phe Asp Tyr Glu Leu Ile Lys Ala Glu Glu Met Leu Gln
485 490 495
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595 600 605
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1265 1270 1275
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1280 1285 1290
Val Asn Val Arg Phe Glu Phe Val Ser Gly Lys Lys Met Ile Gly
1295 1300 1305
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<213> Clostridium aminophilum
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450 455 460
Val Ala Phe Ala Ala Asn Asn Leu Phe Arg Ala Val Val Gly Gln Thr
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Gly Lys Lys Ile Glu Gln Ser Lys Ser Glu Glu Asn Glu Glu Asp Phe
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Leu Leu Trp Lys Ala Glu Lys Ile Ala Glu Ser Ile Lys Lys Glu Gly
500 505 510
Glu Gly Asn Thr Leu Lys Ser Ile Leu Gln Phe Phe Gly Gly Ala Ser
515 520 525
Ser Trp Asp Leu Asn His Phe Cys Ala Ala Tyr Gly Asn Glu Ser Ser
530 535 540
Ala Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Phe Ala Asp Asp Leu Arg Lys Ala Ile
545 550 555 560
Tyr Ser Leu Arg Asn Glu Thr Phe His Phe Thr Thr Leu Asn Lys Gly
565 570 575
Ser Phe Asp Trp Asn Ala Lys Leu Ile Gly Asp Met Phe Ser His Glu
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Ser Val Phe Val Arg Lys Asn Phe Arg Leu Phe Leu Ser Asn Thr Leu
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Gly Val Tyr Tyr Leu Phe Lys Glu Ile Tyr Tyr Asn Ser Phe Leu Pro
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Ser Gly Asp Ala His His Leu Phe Phe Glu Gly Leu Arg Arg Ile Arg
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Asn Asn Gly Asn Arg Lys Val Lys Ser Thr Arg Glu Asp Lys Arg Lys
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<213> Paludibacter propionicigenes
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Lys Ala Phe Ala Asp Ser Val Gly Phe Val Gln Met Gln Asn Lys Lys
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Val Ala Glu Glu Thr Arg Ile Asn Phe Glu Lys Phe Val Leu Gln Val
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Phe Ile Lys Gly Phe Asp Ser Phe Leu Arg Ala Lys Glu Phe Asp Phe
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Val Gln Met Pro Gln Pro Gln Leu Thr Ala Thr Ala Ser Asn Gln Gln
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Lys Ala Asp Lys Leu Asn Gln Leu Glu Ala Ser Ile Thr Ala Asp Cys
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770 775 780
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Ser Asp Leu Phe Val Gln Ser Asp Lys His Ser Pro Val Ile His Ala
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<212> PRT
<213> Leptotrichia wadei
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Arg Lys Glu Leu Lys Lys Phe Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Phe Asp Gly
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850 855 860
Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala Lys Tyr Lys Ile
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Ser Leu Lys Glu Leu Lys Glu Tyr Ser Asn Lys Lys Asn Glu Ile Glu
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900 905 910
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1100 1105 1110
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Leu Met Thr Asp Arg Asn Ser Glu Glu Leu Cys Glu Leu Val Lys
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Val Met Phe Glu Tyr Lys Ala Leu Glu
1145 1150
<210> 592
<211> 1285
<212> PRT
<213> Rhodobacter capsulatus
<400> 592
Met Gln Ile Gly Lys Val Gln Gly Arg Thr Ile Ser Glu Phe Gly Asp
1 5 10 15
Pro Ala Gly Gly Leu Lys Arg Lys Ile Ser Thr Asp Gly Lys Asn Arg
20 25 30
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Val Val Asp Val Ala Ala Ser Val Lys Glu Val Ala Lys Ala Ala Val
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<211> 1159
<212> PRT
<213> Leptotrichia buccalis
<400> 595
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Thr Asp Ile Leu Glu Ser Asp Val Arg Asp Lys Lys Asn Phe Ala Val
100 105 110
Leu Lys Lys Ile Tyr Leu Asn Glu Asn Val Asn Ser Glu Glu Leu Glu
115 120 125
Val Phe Arg Asn Asp Ile Lys Lys Lys Leu Asn Lys Ile Asn Ser Leu
130 135 140
Lys Tyr Ser Phe Glu Lys Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile Asn Glu
145 150 155 160
Asn Asn Ile Glu Lys Val Glu Gly Lys Ser Lys Arg Asn Ile Ile Tyr
165 170 175
Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys Arg Asp Ala Tyr Val Ser Asn Val
180 185 190
Lys Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Glu Glu Asp Ile Ala Lys Leu
195 200 205
Val Leu Glu Ile Glu Asn Leu Thr Lys Leu Glu Lys Tyr Lys Ile Arg
210 215 220
Glu Phe Tyr His Glu Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu Asn Phe
225 230 235 240
Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Met Lys Glu
245 250 255
Leu Ile Glu Lys Val Pro Asp Met Ser Glu Leu Lys Lys Ser Gln Val
260 265 270
Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys Glu Glu Leu Asn Asp Lys Asn Ile
275 280 285
Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Gln Leu Leu
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Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Ile Ser Asn Asp Lys Ile
305 310 315 320
Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu Asn Lys
325 330 335
Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys Tyr Asn
340 345 350
Tyr Tyr Leu Gln Asp Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile Ala Arg
355 360 365
Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val Ser Ser
370 375 380
Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn Glu Asn
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515 520 525
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545 550 555 560
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Ile Tyr Leu Leu Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn Tyr Phe
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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Asn
<210> 596
<211> 1285
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<213> Herbinix hemicellulosilytica
<400> 596
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Leu Leu Asp Glu Asn Glu Ile Cys Lys Leu Gln His Gln Phe Ile Lys
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850 855 860
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Leu Val Arg Phe Thr Met Pro Ser Ile Pro Glu Ile Ser Ala Lys Ala
885 890 895
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900 905 910
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Leu Asp Lys Lys Asp Phe Tyr Lys Val Lys Glu Tyr Val Glu Asn
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Arg Ile Val Lys Lys Ile Gln Asn Asn Leu Asn Asn Lys Asn Arg
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Glu Leu Val Ser Met Leu Cys Trp Asn Lys Lys Leu Asn Lys Asn
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Ile Gly Asn Leu Phe Lys Phe Asp Tyr Glu Asp Lys Asn Lys Ser
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Ser Ala Asn Pro Lys His Thr
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<210> 597
<211> 1344
<212> PRT
<213> Eubacterium rectale
<400> 597
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1 5 10 15
Gln Ile Gln Val Gly Thr Lys Pro Lys Lys Trp Asn Asn Asp Glu Lys
20 25 30
Leu Ser Pro Glu Glu Asn Glu Arg Arg Ala Gln Gln Lys Asn Ile Lys
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Met Lys Asn Tyr Lys Trp Arg Glu Ala Cys Ser Lys Tyr Val Glu Ser
50 55 60
Ser Gln Arg Ile Ile Asn Asp Val Ile Phe Tyr Ser Tyr Arg Lys Ala
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Lys Leu Leu Glu Leu Ile Arg Lys Asp Phe Ser Lys Leu Asp Pro Asn
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Asn Ile Glu Lys Glu Lys Phe Asn Val Trp Glu Lys His Glu Cys Gly
275 280 285
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340 345 350
Phe Phe Glu Asn Asn Ala Ile Asn Gln Tyr Trp Ile His His Ile Glu
355 360 365
Asn Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Asn Cys Lys Ala Gly Lys Leu Phe
370 375 380
Lys Leu Arg Lys Gly Tyr Leu Ala Glu Lys Val Trp Lys Asp Ala Ile
385 390 395 400
Asn Leu Ile Ser Ile Lys Tyr Ile Ala Leu Gly Lys Ala Val Tyr Asn
405 410 415
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885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
Ser Ala Leu Val Asp Phe Ser Asn Glu Glu Gln Ser Asp Leu Tyr Val
930 935 940
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945 950 955 960
Phe Ala Ala Asp His Ile Leu Arg Asp Ile Val Glu Pro Val Ser Lys
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980 985 990
Lys Ile Lys Gly Lys Glu Ile Thr Ala Glu Glu Gln Lys Ala Val Leu
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Lys Tyr Gln Lys Leu Lys Asn Arg Val Glu Leu Arg Asp Ile Val
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Glu Tyr Gly Glu Ile Ile Asn Glu Leu Leu Gly Gln Leu Ile Asn
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Tyr Lys Asn Ile Lys Val Asp Glu Asn Ser Ile Lys Asp Ala Ile
1070 1075 1080
Leu Tyr Gln Ile Ile Gly Met Tyr Val Asn Gly Val Thr Val Tyr
1085 1090 1095
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1100 1105 1110
Gly Gly Val Gly Val Lys Val Ser Ala Phe His Arg Tyr Ser Lys
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Asn Gly Ile Asp His Phe Lys Tyr Tyr Leu Gly Asp Tyr Arg Ser
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1175 1180 1185
Asp Ile Lys Tyr Gln Lys Asn Val Leu Asn Leu Leu Gln Asn Ile
1190 1195 1200
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1205 1210 1215
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1220 1225 1230
Ile Arg Ser Ile Lys Ser Asp Thr Phe Gln Tyr Lys Val Lys Gly
1235 1240 1245
Gly Thr Leu Ile Thr Asp Ala Lys Asp Glu Arg Tyr Leu Glu Thr
1250 1255 1260
Ile Arg Lys Ile Leu Tyr Tyr Ala Glu Asn Glu Glu Asp Asn Leu
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1325 1330 1335
Asn Phe Lys Leu Ser Asn
1340
<210> 598
<211> 1373
<212> PRT
<213> Eubacteriaceae bacterium
<400> 598
Met Lys Ile Ser Lys Glu Ser His Lys Arg Thr Ala Val Ala Val Met
1 5 10 15
Glu Asp Arg Val Gly Gly Val Val Tyr Val Pro Gly Gly Ser Gly Ile
20 25 30
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Lys Lys Gln Arg Leu Ser Lys Phe Lys Gly Arg Met Glu Asp Phe Val
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Leu Ile Ala Leu Arg Lys Ser Leu Val Val Ser Thr Tyr Asn Gln Glu
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Val Phe Asp Ser Arg Lys Ala Ala Thr Val Phe Leu Lys Asn Ile Gly
165 170 175
Lys Lys Asn Ile Ser Ala Asp Asp Glu Arg Gln Ile Lys Gln Leu Met
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Ala Leu Ile Arg Glu Asp Tyr Asp Lys Trp Asn Pro Asp Lys Asp Ser
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Ser Asp Lys Lys Glu Ser Ser Gly Thr Lys Val Ile Arg Ser Ile Glu
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Lys Ile Ser Asn Val Gly Lys Lys Thr Lys Thr Lys Gln Lys Glu Lys
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Ala Gly Leu Asp Ala Phe Leu Lys Glu Tyr Ala Gln Ile Asp Glu Asn
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Leu Asn Leu Leu Ser Ile Lys Tyr Ile Ala Leu Gly Lys Ala Val Tyr
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Ser Asp Lys Asn Ser Gly Lys Ile Asn Asp Leu Thr Leu Lys Gly Ile
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Tyr Leu Ala His Phe Lys Tyr Phe Ala Lys Leu Asp Glu Ser Ile
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1145 1150 1155
Lys Lys Ile Arg Asp Leu Val Glu Phe Asn Tyr Leu Asn Lys Ile
1160 1165 1170
Glu Ser Tyr Leu Ile Asp Ile Asn Trp Lys Leu Ala Ile Gln Met
1175 1180 1185
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1190 1195 1200
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Asp Val Asn Leu Asp Tyr Asp Glu Leu Lys Lys Lys Phe Arg Leu
1325 1330 1335
Ile Gly Asn Asn Asp Ile Leu Glu Arg Leu Met Lys Pro Lys Lys
1340 1345 1350
Val Ser Val Leu Glu Leu Glu Ser Tyr Asn Ser Asp Tyr Ile Lys
1355 1360 1365
Asn Leu Ile Ile Glu Leu Leu Thr Lys Ile Glu Asn Thr Asn Asp
1370 1375 1380
Thr Leu
1385
<210> 601
<211> 1224
<212> PRT
<213> Bergeyella zoohelcum
<400> 601
Met Glu Asn Lys Thr Ser Leu Gly Asn Asn Ile Tyr Tyr Asn Pro Phe
1 5 10 15
Lys Pro Gln Asp Lys Ser Tyr Phe Ala Gly Tyr Phe Asn Ala Ala Met
20 25 30
Glu Asn Thr Asp Ser Val Phe Arg Glu Leu Gly Lys Arg Leu Lys Gly
35 40 45
Lys Glu Tyr Thr Ser Glu Asn Phe Phe Asp Ala Ile Phe Lys Glu Asn
50 55 60
Ile Ser Leu Val Glu Tyr Glu Arg Tyr Val Lys Leu Leu Ser Asp Tyr
65 70 75 80
Phe Pro Met Ala Arg Leu Leu Asp Lys Lys Glu Val Pro Ile Lys Glu
85 90 95
Arg Lys Glu Asn Phe Lys Lys Asn Phe Lys Gly Ile Ile Lys Ala Val
100 105 110
Arg Asp Leu Arg Asn Phe Tyr Thr His Lys Glu His Gly Glu Val Glu
115 120 125
Ile Thr Asp Glu Ile Phe Gly Val Leu Asp Glu Met Leu Lys Ser Thr
130 135 140
Val Leu Thr Val Lys Lys Lys Lys Val Lys Thr Asp Lys Thr Lys Glu
145 150 155 160
Ile Leu Lys Lys Ser Ile Glu Lys Gln Leu Asp Ile Leu Cys Gln Lys
165 170 175
Lys Leu Glu Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Arg Lys Ile Glu Glu Lys Arg
180 185 190
Arg Asn Gln Arg Glu Arg Gly Glu Lys Glu Leu Val Ala Pro Phe Lys
195 200 205
Tyr Ser Asp Lys Arg Asp Asp Leu Ile Ala Ala Ile Tyr Asn Asp Ala
210 215 220
Phe Asp Val Tyr Ile Asp Lys Lys Lys Asp Ser Leu Lys Glu Ser Ser
225 230 235 240
Lys Ala Lys Tyr Asn Thr Lys Ser Asp Pro Gln Gln Glu Glu Gly Asp
245 250 255
Leu Lys Ile Pro Ile Ser Lys Asn Gly Val Val Phe Leu Leu Ser Leu
260 265 270
Phe Leu Thr Lys Gln Glu Ile His Ala Phe Lys Ser Lys Ile Ala Gly
275 280 285
Phe Lys Ala Thr Val Ile Asp Glu Ala Thr Val Ser Glu Ala Thr Val
290 295 300
Ser His Gly Lys Asn Ser Ile Cys Phe Met Ala Thr His Glu Ile Phe
305 310 315 320
Ser His Leu Ala Tyr Lys Lys Leu Lys Arg Lys Val Arg Thr Ala Glu
325 330 335
Ile Asn Tyr Gly Glu Ala Glu Asn Ala Glu Gln Leu Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Lys Glu Thr Leu Met Met Gln Met Leu Asp Glu Leu Ser Lys Val Pro
355 360 365
Asp Val Val Tyr Gln Asn Leu Ser Glu Asp Val Gln Lys Thr Phe Ile
370 375 380
Glu Asp Trp Asn Glu Tyr Leu Lys Glu Asn Asn Gly Asp Val Gly Thr
385 390 395 400
Met Glu Glu Glu Gln Val Ile His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu
405 410 415
Asp Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Ala Gln
420 425 430
Phe Pro Thr Leu Arg Phe Gln Val His Leu Gly Asn Tyr Leu His Asp
435 440 445
Ser Arg Pro Lys Glu Asn Leu Ile Ser Asp Arg Arg Ile Lys Glu Lys
450 455 460
Ile Thr Val Phe Gly Arg Leu Ser Glu Leu Glu His Lys Lys Ala Leu
465 470 475 480
Phe Ile Lys Asn Thr Glu Thr Asn Glu Asp Arg Glu His Tyr Trp Glu
485 490 495
Ile Phe Pro Asn Pro Asn Tyr Asp Phe Pro Lys Glu Asn Ile Ser Val
500 505 510
Asn Asp Lys Asp Phe Pro Ile Ala Gly Ser Ile Leu Asp Arg Glu Lys
515 520 525
Gln Pro Val Ala Gly Lys Ile Gly Ile Lys Val Lys Leu Leu Asn Gln
530 535 540
Gln Tyr Val Ser Glu Val Asp Lys Ala Val Lys Ala His Gln Leu Lys
545 550 555 560
Gln Arg Lys Ala Ser Lys Pro Ser Ile Gln Asn Ile Ile Glu Glu Ile
565 570 575
Val Pro Ile Asn Glu Ser Asn Pro Lys Glu Ala Ile Val Phe Gly Gly
580 585 590
Gln Pro Thr Ala Tyr Leu Ser Met Asn Asp Ile His Ser Ile Leu Tyr
595 600 605
Glu Phe Phe Asp Lys Trp Glu Lys Lys Lys Glu Lys Leu Glu Lys Lys
610 615 620
Gly Glu Lys Glu Leu Arg Lys Glu Ile Gly Lys Glu Leu Glu Lys Lys
625 630 635 640
Ile Val Gly Lys Ile Gln Ala Gln Ile Gln Gln Ile Ile Asp Lys Asp
645 650 655
Thr Asn Ala Lys Ile Leu Lys Pro Tyr Gln Asp Gly Asn Ser Thr Ala
660 665 670
Ile Asp Lys Glu Lys Leu Ile Lys Asp Leu Lys Gln Glu Gln Asn Ile
675 680 685
Leu Gln Lys Leu Lys Asp Glu Gln Thr Val Arg Glu Lys Glu Tyr Asn
690 695 700
Asp Phe Ile Ala Tyr Gln Asp Lys Asn Arg Glu Ile Asn Lys Val Arg
705 710 715 720
Asp Arg Asn His Lys Gln Tyr Leu Lys Asp Asn Leu Lys Arg Lys Tyr
725 730 735
Pro Glu Ala Pro Ala Arg Lys Glu Val Leu Tyr Tyr Arg Glu Lys Gly
740 745 750
Lys Val Ala Val Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg Phe Met Pro Thr
755 760 765
Asp Phe Lys Asn Glu Trp Lys Gly Glu Gln His Ser Leu Leu Gln Lys
770 775 780
Ser Leu Ala Tyr Tyr Glu Gln Cys Lys Glu Glu Leu Lys Asn Leu Leu
785 790 795 800
Pro Glu Lys Val Phe Gln His Leu Pro Phe Lys Leu Gly Gly Tyr Phe
805 810 815
Gln Gln Lys Tyr Leu Tyr Gln Phe Tyr Thr Cys Tyr Leu Asp Lys Arg
820 825 830
Leu Glu Tyr Ile Ser Gly Leu Val Gln Gln Ala Glu Asn Phe Lys Ser
835 840 845
Glu Asn Lys Val Phe Lys Lys Val Glu Asn Glu Cys Phe Lys Phe Leu
850 855 860
Lys Lys Gln Asn Tyr Thr His Lys Glu Leu Asp Ala Arg Val Gln Ser
865 870 875 880
Ile Leu Gly Tyr Pro Ile Phe Leu Glu Arg Gly Phe Met Asp Glu Lys
885 890 895
Pro Thr Ile Ile Lys Gly Lys Thr Phe Lys Gly Asn Glu Ala Leu Phe
900 905 910
Ala Asp Trp Phe Arg Tyr Tyr Lys Glu Tyr Gln Asn Phe Gln Thr Phe
915 920 925
Tyr Asp Thr Glu Asn Tyr Pro Leu Val Glu Leu Glu Lys Lys Gln Ala
930 935 940
Asp Arg Lys Arg Lys Thr Lys Ile Tyr Gln Gln Lys Lys Asn Asp Val
945 950 955 960
Phe Thr Leu Leu Met Ala Lys His Ile Phe Lys Ser Val Phe Lys Gln
965 970 975
Asp Ser Ile Asp Gln Phe Ser Leu Glu Asp Leu Tyr Gln Ser Arg Glu
980 985 990
Glu Arg Leu Gly Asn Gln Glu Arg Ala Arg Gln Thr Gly Glu Arg Asn
995 1000 1005
Thr Asn Tyr Ile Trp Asn Lys Thr Val Asp Leu Lys Leu Cys Asp
1010 1015 1020
Gly Lys Ile Thr Val Glu Asn Val Lys Leu Lys Asn Val Gly Asp
1025 1030 1035
Phe Ile Lys Tyr Glu Tyr Asp Gln Arg Val Gln Ala Phe Leu Lys
1040 1045 1050
Tyr Glu Glu Asn Ile Glu Trp Gln Ala Phe Leu Ile Lys Glu Ser
1055 1060 1065
Lys Glu Glu Glu Asn Tyr Pro Tyr Val Val Glu Arg Glu Ile Glu
1070 1075 1080
Gln Tyr Glu Lys Val Arg Arg Glu Glu Leu Leu Lys Glu Val His
1085 1090 1095
Leu Ile Glu Glu Tyr Ile Leu Glu Lys Val Lys Asp Lys Glu Ile
1100 1105 1110
Leu Lys Lys Gly Asp Asn Gln Asn Phe Lys Tyr Tyr Ile Leu Asn
1115 1120 1125
Gly Leu Leu Lys Gln Leu Lys Asn Glu Asp Val Glu Ser Tyr Lys
1130 1135 1140
Val Phe Asn Leu Asn Thr Glu Pro Glu Asp Val Asn Ile Asn Gln
1145 1150 1155
Leu Lys Gln Glu Ala Thr Asp Leu Glu Gln Lys Ala Phe Val Leu
1160 1165 1170
Thr Tyr Ile Arg Asn Lys Phe Ala His Asn Gln Leu Pro Lys Lys
1175 1180 1185
Glu Phe Trp Asp Tyr Cys Gln Glu Lys Tyr Gly Lys Ile Glu Lys
1190 1195 1200
Glu Lys Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Ala Glu Val Phe Lys Lys Glu
1205 1210 1215
Lys Glu Ala Leu Ile Lys
1220
<210> 602
<211> 1126
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 602
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Thr Asp Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val
20 25 30
Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Ile Leu Glu Glu Gly Glu Ile
35 40 45
Asn Arg Asp Gly Tyr Glu Thr Thr Leu Lys Asn Thr Trp Asn Glu Ile
50 55 60
Lys Asp Ile Asn Lys Lys Asp Arg Leu Ser Lys Leu Ile Ile Lys His
65 70 75 80
Phe Pro Phe Leu Glu Ala Ala Thr Tyr Arg Leu Asn Pro Thr Asp Thr
85 90 95
Thr Lys Gln Lys Glu Glu Lys Gln Ala Glu Ala Gln Ser Leu Glu Ser
100 105 110
Leu Arg Lys Ser Phe Phe Val Phe Ile Tyr Lys Leu Arg Asp Leu Arg
115 120 125
Asn His Tyr Ser His Tyr Lys His Ser Lys Ser Leu Glu Arg Pro Lys
130 135 140
Phe Glu Glu Gly Leu Leu Glu Lys Met Tyr Asn Ile Phe Asn Ala Ser
145 150 155 160
Ile Arg Leu Val Lys Glu Asp Tyr Gln Tyr Asn Lys Asp Ile Asn Pro
165 170 175
Asp Glu Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Thr Glu Glu Glu Phe Asn Tyr
180 185 190
Tyr Phe Thr Lys Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu
195 200 205
Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Met Gln
210 215 220
Gln Lys Leu Arg Gly Phe Lys Asp Asn Arg Glu Asn Lys Lys Lys Met
225 230 235 240
Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
245 250 255
Leu Gln Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn
260 265 270
Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Arg Glu Glu
275 280 285
Asp Arg Glu Lys Phe Arg Val Pro Ile Glu Ile Ala Asp Glu Asp Tyr
290 295 300
Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp
305 310 315 320
Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Ile Phe
325 330 335
Thr Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile
340 345 350
Tyr Lys Lys Gln Ile Gly Asp Tyr Lys Glu Ser His His Leu Thr His
355 360 365
Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln Glu Phe Thr Lys Gln Asn Arg
370 375 380
Pro Asp Glu Trp Arg Lys Phe Val Lys Thr Phe Asn Ser Phe Glu Thr
385 390 395 400
Ser Lys Glu Pro Tyr Ile Pro Glu Thr Thr Pro His Tyr His Leu Glu
405 410 415
Asn Gln Lys Ile Gly Ile Arg Phe Arg Asn Asp Asn Asp Lys Ile Trp
420 425 430
Pro Ser Leu Lys Thr Asn Ser Glu Lys Asn Glu Lys Ser Lys Tyr Lys
435 440 445
Leu Asp Lys Ser Phe Gln Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val His Glu Leu
450 455 460
Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu Lys Thr Glu Asn Thr Asp
465 470 475 480
Asn Asp Asn Glu Ile Glu Thr Lys Lys Lys Glu Asn Lys Asn Asp Lys
485 490 495
Gln Glu Lys His Lys Ile Glu Glu Ile Ile Glu Asn Lys Ile Thr Glu
500 505 510
Ile Tyr Ala Leu Tyr Asp Thr Phe Ala Asn Gly Glu Ile Lys Ser Ile
515 520 525
Asp Glu Leu Glu Glu Tyr Cys Lys Gly Lys Asp Ile Glu Ile Gly His
530 535 540
Leu Pro Lys Gln Met Ile Ala Ile Leu Lys Asp Glu His Lys Val Met
545 550 555 560
Ala Thr Glu Ala Glu Arg Lys Gln Glu Glu Met Leu Val Asp Val Gln
565 570 575
Lys Ser Leu Glu Ser Leu Asp Asn Gln Ile Asn Glu Glu Ile Glu Asn
580 585 590
Val Glu Arg Lys Asn Ser Ser Leu Lys Ser Gly Lys Ile Ala Ser Trp
595 600 605
Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Gln Lys Asp Asn Glu
610 615 620
Gly Lys Pro Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Gln Leu
625 630 635 640
Leu Gln Arg Thr Leu Ala Phe Phe Gly Ser Glu His Glu Arg Leu Ala
645 650 655
Pro Tyr Phe Lys Gln Thr Lys Leu Ile Glu Ser Ser Asn Pro His Pro
660 665 670
Phe Leu Lys Asp Thr Glu Trp Glu Lys Cys Asn Asn Ile Leu Ser Phe
675 680 685
Tyr Arg Ser Tyr Leu Glu Ala Lys Lys Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys
690 695 700
Pro Glu Asp Trp Glu Lys Asn Gln Tyr Phe Leu Lys Leu Lys Glu Pro
705 710 715 720
Lys Thr Lys Pro Lys Thr Leu Val Gln Gly Trp Lys Asn Gly Phe Asn
725 730 735
Leu Pro Arg Gly Ile Phe Thr Glu Pro Ile Arg Lys Trp Phe Met Lys
740 745 750
His Arg Glu Asn Ile Thr Val Ala Glu Leu Lys Arg Val Gly Leu Val
755 760 765
Ala Lys Val Ile Pro Leu Phe Phe Ser Glu Glu Tyr Lys Asp Ser Val
770 775 780
Gln Pro Phe Tyr Asn Tyr His Phe Asn Val Gly Asn Ile Asn Lys Pro
785 790 795 800
Asp Glu Lys Asn Phe Leu Asn Cys Glu Glu Arg Arg Glu Leu Leu Arg
805 810 815
Lys Lys Lys Asp Glu Phe Lys Lys Met Thr Asp Lys Glu Lys Glu Glu
820 825 830
Asn Pro Ser Tyr Leu Glu Phe Lys Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu
835 840 845
Leu Arg Leu Val Arg Asn Gln Asp Ile Val Thr Trp Leu Leu Cys Met
850 855 860
Glu Leu Phe Asn Lys Lys Lys Ile Lys Glu Leu Asn Val Glu Lys Ile
865 870 875 880
Tyr Leu Lys Asn Ile Asn Thr Asn Thr Thr Lys Lys Glu Lys Asn Thr
885 890 895
Glu Glu Lys Asn Gly Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Lys Asn Asn Ile
900 905 910
Leu Asn Arg Ile Met Pro Met Arg Leu Pro Ile Lys Val Tyr Gly Arg
915 920 925
Glu Asn Phe Ser Lys Asn Lys Lys Lys Lys Ile Arg Arg Asn Thr Phe
930 935 940
Phe Thr Val Tyr Ile Glu Glu Lys Gly Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly
945 950 955 960
Asn Phe Lys Ala Leu Glu Arg Asp Arg Arg Leu Gly Gly Leu Phe Ser
965 970 975
Phe Val Lys Thr Pro Ser Lys Ala Glu Ser Lys Ser Asn Thr Ile Ser
980 985 990
Lys Leu Arg Val Glu Tyr Glu Leu Gly Glu Tyr Gln Lys Ala Arg Ile
995 1000 1005
Glu Ile Ile Lys Asp Met Leu Ala Leu Glu Lys Thr Leu Ile Asp
1010 1015 1020
Lys Tyr Asn Ser Leu Asp Thr Asp Asn Phe Asn Lys Met Leu Thr
1025 1030 1035
Asp Trp Leu Glu Leu Lys Gly Glu Pro Asp Lys Ala Ser Phe Gln
1040 1045 1050
Asn Asp Val Asp Leu Leu Ile Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His
1055 1060 1065
Asn Gln Tyr Pro Met Arg Asn Arg Ile Ala Phe Ala Asn Ile Asn
1070 1075 1080
Pro Phe Ser Leu Ser Ser Ala Asn Thr Ser Glu Glu Lys Gly Leu
1085 1090 1095
Gly Ile Ala Asn Gln Leu Lys Asp Lys Thr His Lys Thr Ile Glu
1100 1105 1110
Lys Ile Ile Glu Ile Glu Lys Pro Ile Glu Thr Lys Glu
1115 1120 1125
<210> 603
<211> 1127
<212> PRT
<213> Prevotella buccae
<400> 603
Met Gln Lys Gln Asp Lys Leu Phe Val Asp Arg Lys Lys Asn Ala Ile
1 5 10 15
Phe Ala Phe Pro Lys Tyr Ile Thr Ile Met Glu Asn Lys Glu Lys Pro
20 25 30
Glu Pro Ile Tyr Tyr Glu Leu Thr Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe
35 40 45
Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val Tyr Thr Thr Ile Asn His Ile Asn
50 55 60
Arg Arg Leu Glu Ile Ala Glu Leu Lys Asp Asp Gly Tyr Met Met Gly
65 70 75 80
Ile Lys Gly Ser Trp Asn Glu Gln Ala Lys Lys Leu Asp Lys Lys Val
85 90 95
Arg Leu Arg Asp Leu Ile Met Lys His Phe Pro Phe Leu Glu Ala Ala
100 105 110
Ala Tyr Glu Met Thr Asn Ser Lys Ser Pro Asn Asn Lys Glu Gln Arg
115 120 125
Glu Lys Glu Gln Ser Glu Ala Leu Ser Leu Asn Asn Leu Lys Asn Val
130 135 140
Leu Phe Ile Phe Leu Glu Lys Leu Gln Val Leu Arg Asn Tyr Tyr Ser
145 150 155 160
His Tyr Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Pro Lys Pro Ile Phe Glu Thr Ser
165 170 175
Leu Leu Lys Asn Met Tyr Lys Val Phe Asp Ala Asn Val Arg Leu Val
180 185 190
Lys Arg Asp Tyr Met His His Glu Asn Ile Asp Met Gln Arg Asp Phe
195 200 205
Thr His Leu Asn Arg Lys Lys Gln Val Gly Arg Thr Lys Asn Ile Ile
210 215 220
Asp Ser Pro Asn Phe His Tyr His Phe Ala Asp Lys Glu Gly Asn Met
225 230 235 240
Thr Ile Ala Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Asp Lys Lys
245 250 255
Asp Ala Ile Trp Met Gln Lys Lys Leu Lys Gly Phe Lys Asp Gly Arg
260 265 270
Asn Leu Arg Glu Gln Met Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Ile
275 280 285
Ser Leu Pro Lys Leu Lys Leu Glu Asn Val Gln Thr Lys Asp Trp Met
290 295 300
Gln Leu Asp Met Leu Asn Glu Leu Val Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr
305 310 315 320
Glu Arg Leu Arg Glu Lys Asp Arg Glu Ser Phe Lys Val Pro Phe Asp
325 330 335
Ile Phe Ser Asp Asp Tyr Asn Ala Glu Glu Glu Pro Phe Lys Asn Thr
340 345 350
Leu Val Arg His Gln Asp Arg Phe Pro Tyr Phe Val Leu Arg Tyr Phe
355 360 365
Asp Leu Asn Glu Ile Phe Glu Gln Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly
370 375 380
Thr Tyr His Phe Ser Ile Tyr Asn Lys Arg Ile Gly Asp Glu Asp Glu
385 390 395 400
Val Arg His Leu Thr His His Leu Tyr Gly Phe Ala Arg Ile Gln Asp
405 410 415
Phe Ala Pro Gln Asn Gln Pro Glu Glu Trp Arg Lys Leu Val Lys Asp
420 425 430
Leu Asp His Phe Glu Thr Ser Gln Glu Pro Tyr Ile Ser Lys Thr Ala
435 440 445
Pro His Tyr His Leu Glu Asn Glu Lys Ile Gly Ile Lys Phe Cys Ser
450 455 460
Ala His Asn Asn Leu Phe Pro Ser Leu Gln Thr Asp Lys Thr Cys Asn
465 470 475 480
Gly Arg Ser Lys Phe Asn Leu Gly Thr Gln Phe Thr Ala Glu Ala Phe
485 490 495
Leu Ser Val His Glu Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu
500 505 510
Thr Lys Asp Tyr Ser Arg Lys Glu Ser Ala Asp Lys Val Glu Gly Ile
515 520 525
Ile Arg Lys Glu Ile Ser Asn Ile Tyr Ala Ile Tyr Asp Ala Phe Ala
530 535 540
Asn Asn Glu Ile Asn Ser Ile Ala Asp Leu Thr Arg Arg Leu Gln Asn
545 550 555 560
Thr Asn Ile Leu Gln Gly His Leu Pro Lys Gln Met Ile Ser Ile Leu
565 570 575
Lys Gly Arg Gln Lys Asp Met Gly Lys Glu Ala Glu Arg Lys Ile Gly
580 585 590
Glu Met Ile Asp Asp Thr Gln Arg Arg Leu Asp Leu Leu Cys Lys Gln
595 600 605
Thr Asn Gln Lys Ile Arg Ile Gly Lys Arg Asn Ala Gly Leu Leu Lys
610 615 620
Ser Gly Lys Ile Ala Asp Trp Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln
625 630 635 640
Pro Val Gln Lys Asp Gln Asn Asn Ile Pro Ile Asn Asn Ser Lys Ala
645 650 655
Asn Ser Thr Glu Tyr Arg Met Leu Gln Arg Ala Leu Ala Leu Phe Gly
660 665 670
Ser Glu Asn Phe Arg Leu Lys Ala Tyr Phe Asn Gln Met Asn Leu Val
675 680 685
Gly Asn Asp Asn Pro His Pro Phe Leu Ala Glu Thr Gln Trp Glu His
690 695 700
Gln Thr Asn Ile Leu Ser Phe Tyr Arg Asn Tyr Leu Glu Ala Arg Lys
705 710 715 720
Lys Tyr Leu Lys Gly Leu Lys Pro Gln Asn Trp Lys Gln Tyr Gln His
725 730 735
Phe Leu Ile Leu Lys Val Gln Lys Thr Asn Arg Asn Thr Leu Val Thr
740 745 750
Gly Trp Lys Asn Ser Phe Asn Leu Pro Arg Gly Ile Phe Thr Gln Pro
755 760 765
Ile Arg Glu Trp Phe Glu Lys His Asn Asn Ser Lys Arg Ile Tyr Asp
770 775 780
Gln Ile Leu Ser Phe Asp Arg Val Gly Phe Val Ala Lys Ala Ile Pro
785 790 795 800
Leu Tyr Phe Ala Glu Glu Tyr Lys Asp Asn Val Gln Pro Phe Tyr Asp
805 810 815
Tyr Pro Phe Asn Ile Gly Asn Arg Leu Lys Pro Lys Lys Arg Gln Phe
820 825 830
Leu Asp Lys Lys Glu Arg Val Glu Leu Trp Gln Lys Asn Lys Glu Leu
835 840 845
Phe Lys Asn Tyr Pro Ser Glu Lys Lys Lys Thr Asp Leu Ala Tyr Leu
850 855 860
Asp Phe Leu Ser Trp Lys Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Ile Lys
865 870 875 880
Asn Gln Asp Ile Val Thr Trp Leu Met Phe Lys Glu Leu Phe Asn Met
885 890 895
Ala Thr Val Glu Gly Leu Lys Ile Gly Glu Ile His Leu Arg Asp Ile
900 905 910
Asp Thr Asn Thr Ala Asn Glu Glu Ser Asn Asn Ile Leu Asn Arg Ile
915 920 925
Met Pro Met Lys Leu Pro Val Lys Thr Tyr Glu Thr Asp Asn Lys Gly
930 935 940
Asn Ile Leu Lys Glu Arg Pro Leu Ala Thr Phe Tyr Ile Glu Glu Thr
945 950 955 960
Glu Thr Lys Val Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys Asp
965 970 975
Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Ala Glu Thr Thr Asp Leu Asn
980 985 990
Leu Glu Glu His Pro Ile Ser Lys Leu Ser Val Asp Leu Glu Leu Ile
995 1000 1005
Lys Tyr Gln Thr Thr Arg Ile Ser Ile Phe Glu Met Thr Leu Gly
1010 1015 1020
Leu Glu Lys Lys Leu Ile Asp Lys Tyr Ser Thr Leu Pro Thr Asp
1025 1030 1035
Ser Phe Arg Asn Met Leu Glu Arg Trp Leu Gln Cys Lys Ala Asn
1040 1045 1050
Arg Pro Glu Leu Lys Asn Tyr Val Asn Ser Leu Ile Ala Val Arg
1055 1060 1065
Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr Pro Met Tyr Asp Ala Thr Leu
1070 1075 1080
Phe Ala Glu Val Lys Lys Phe Thr Leu Phe Pro Ser Val Asp Thr
1085 1090 1095
Lys Lys Ile Glu Leu Asn Ile Ala Pro Gln Leu Leu Glu Ile Val
1100 1105 1110
Gly Lys Ala Ile Lys Glu Ile Glu Lys Ser Glu Asn Lys Asn
1115 1120 1125
<210> 604
<211> 953
<212> PRT
<213> Alistipes sp.
<400> 604
Met Ser Asn Glu Ile Gly Ala Phe Arg Glu His Gln Phe Ala Tyr Ala
1 5 10 15
Pro Gly Asn Glu Lys Gln Glu Glu Ala Thr Phe Ala Thr Tyr Phe Asn
20 25 30
Leu Ala Leu Ser Asn Val Glu Gly Met Met Phe Gly Glu Val Glu Ser
35 40 45
Asn Pro Asp Lys Ile Glu Lys Ser Leu Asp Thr Leu Pro Pro Ala Ile
50 55 60
Leu Arg Gln Ile Ala Ser Phe Ile Trp Leu Ser Lys Glu Asp His Pro
65 70 75 80
Asp Lys Ala Tyr Ser Thr Glu Glu Val Lys Val Ile Val Thr Asp Leu
85 90 95
Val Arg Arg Leu Cys Phe Tyr Arg Asn Tyr Phe Ser His Cys Phe Tyr
100 105 110
Leu Asp Thr Gln Tyr Phe Tyr Ser Asp Glu Leu Val Asp Thr Thr Ala
115 120 125
Ile Gly Glu Lys Leu Pro Tyr Asn Phe His His Phe Ile Thr Asn Arg
130 135 140
Leu Phe Arg Tyr Ser Leu Pro Glu Ile Thr Leu Phe Arg Trp Asn Glu
145 150 155 160
Gly Glu Arg Lys Tyr Glu Ile Leu Arg Asp Gly Leu Ile Phe Phe Cys
165 170 175
Cys Leu Phe Leu Lys Arg Gly Gln Ala Glu Arg Phe Leu Asn Glu Leu
180 185 190
Arg Phe Phe Lys Arg Thr Asp Glu Glu Gly Arg Ile Lys Arg Thr Ile
195 200 205
Phe Thr Lys Tyr Cys Thr Arg Glu Ser His Lys His Ile Gly Ile Glu
210 215 220
Glu Gln Asp Phe Leu Ile Phe Gln Asp Ile Ile Gly Asp Leu Asn Arg
225 230 235 240
Val Pro Lys Val Cys Asp Gly Val Val Asp Leu Ser Lys Glu Asn Glu
245 250 255
Arg Tyr Ile Lys Asn Arg Glu Thr Ser Asn Glu Ser Asp Glu Asn Lys
260 265 270
Ala Arg Tyr Arg Leu Leu Ile Arg Glu Lys Asp Lys Phe Pro Tyr Tyr
275 280 285
Leu Met Arg Tyr Ile Val Asp Phe Gly Val Leu Pro Cys Ile Thr Phe
290 295 300
Lys Gln Asn Asp Tyr Ser Thr Lys Glu Gly Arg Gly Gln Phe His Tyr
305 310 315 320
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Val Arg Ile Ser Glu Leu Gln Gly Thr Ile Ser Val Glu Glu Leu Arg
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Asn Met Val Tyr Ala Ser Ile Asn Gly Lys Asp Val Asn Lys Ser Val
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Ile Ser Gly Gln Thr Ile Lys Glu Gly Arg Val Asp Val Glu Asp Tyr
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Leu Leu Ser Asn Arg Phe Asp Cys Ser Glu Gly Val Ser Ala Val Glu
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Lys Arg Leu Lys Ala Ile Leu Leu Arg His Glu Gln Leu Leu Leu Ser
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Glu Trp Cys Arg Lys Gln Leu Met Ser Ile Gly Lys Gly Thr Ala Lys
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645 650 655
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705 710 715 720
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740 745 750
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<211> 1322
<212> PRT
<213> Prevotella sp.
<400> 605
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<400> 606
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1085 1090 1095
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<211> 1124
<212> PRT
<213> Prevotella aurantiaca
<400> 607
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195 200 205
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210 215 220
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245 250 255
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Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Asp Asp
275 280 285
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785 790 795 800
Asn Ile His Lys Pro Lys Glu Lys Asp Phe Leu His Arg Glu Glu Arg
805 810 815
Ile Glu Leu Trp Asp Lys Lys Lys Asp Lys Phe Lys Gly Tyr Lys Glu
820 825 830
Lys Ile Lys Ser Lys Lys Leu Thr Glu Lys Asp Lys Glu Glu Phe Arg
835 840 845
Ser Tyr Leu Glu Phe Gln Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg
850 855 860
Leu Val Arg Asn Gln Asp Ile Val Thr Trp Leu Leu Cys Lys Glu Leu
865 870 875 880
Ile Asp Lys Leu Lys Ile Asp Glu Leu Asn Ile Glu Glu Leu Lys Lys
885 890 895
Leu Arg Leu Asn Asn Ile Asp Thr Asp Thr Ala Lys Lys Glu Lys Asn
900 905 910
Asn Ile Leu Asn Arg Val Met Pro Met Glu Leu Pro Val Thr Val Tyr
915 920 925
Glu Ile Asp Asp Ser His Lys Ile Val Lys Asp Lys Pro Leu His Thr
930 935 940
Ile Tyr Ile Lys Glu Ala Glu Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe
945 950 955 960
Lys Ala Leu Val Lys Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val
965 970 975
Lys Thr Asn Ser Glu Ala Glu Ser Lys Arg Asn Pro Ile Ser Lys Leu
980 985 990
Arg Val Glu Tyr Glu Leu Gly Glu Tyr Gln Glu Ala Arg Ile Glu Ile
995 1000 1005
Ile Gln Asp Met Leu Ala Leu Glu Glu Lys Leu Ile Asn Lys Tyr
1010 1015 1020
Lys Asp Leu Pro Thr Asn Lys Phe Ser Glu Met Leu Asn Ser Trp
1025 1030 1035
Leu Glu Gly Lys Asp Glu Ala Asp Lys Ala Arg Phe Gln Asn Asp
1040 1045 1050
Val Asp Phe Leu Ile Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln
1055 1060 1065
Tyr Pro Met His Asn Lys Ile Glu Phe Ala Asn Ile Lys Pro Phe
1070 1075 1080
Ser Leu Tyr Thr Ala Asn Asn Ser Glu Glu Lys Gly Leu Gly Ile
1085 1090 1095
Ala Asn Gln Leu Lys Asp Lys Thr Lys Glu Thr Thr Asp Lys Ile
1100 1105 1110
Lys Lys Ile Glu Lys Pro Ile Glu Thr Lys Glu
1115 1120
<210> 608
<211> 1151
<212> PRT
<213> Prevotella saccharolytica
<400> 608
Met Glu Asp Lys Pro Phe Trp Ala Ala Phe Phe Asn Leu Ala Arg His
1 5 10 15
Asn Val Tyr Leu Thr Val Asn His Ile Asn Lys Leu Leu Asp Leu Glu
20 25 30
Lys Leu Tyr Asp Glu Gly Lys His Lys Glu Ile Phe Glu Arg Glu Asp
35 40 45
Ile Phe Asn Ile Ser Asp Asp Val Met Asn Asp Ala Asn Ser Asn Gly
50 55 60
Lys Lys Arg Lys Leu Asp Ile Lys Lys Ile Trp Asp Asp Leu Asp Thr
65 70 75 80
Asp Leu Thr Arg Lys Tyr Gln Leu Arg Glu Leu Ile Leu Lys His Phe
85 90 95
Pro Phe Ile Gln Pro Ala Ile Ile Gly Ala Gln Thr Lys Glu Arg Thr
100 105 110
Thr Ile Asp Lys Asp Lys Arg Ser Thr Ser Thr Ser Asn Asp Ser Leu
115 120 125
Lys Gln Thr Gly Glu Gly Asp Ile Asn Asp Leu Leu Ser Leu Ser Asn
130 135 140
Val Lys Ser Met Phe Phe Arg Leu Leu Gln Ile Leu Glu Gln Leu Arg
145 150 155 160
Asn Tyr Tyr Ser His Val Lys His Ser Lys Ser Ala Thr Met Pro Asn
165 170 175
Phe Asp Glu Asp Leu Leu Asn Trp Met Arg Tyr Ile Phe Ile Asp Ser
180 185 190
Val Asn Lys Val Lys Glu Asp Tyr Ser Ser Asn Ser Val Ile Asp Pro
195 200 205
Asn Thr Ser Phe Ser His Leu Ile Tyr Lys Asp Glu Gln Gly Lys Ile
210 215 220
Lys Pro Cys Arg Tyr Pro Phe Thr Ser Lys Asp Gly Ser Ile Asn Ala
225 230 235 240
Phe Gly Leu Leu Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Gln Asp Ser
245 250 255
Ile Trp Met Gln Lys Lys Ile Pro Gly Phe Lys Lys Ala Ser Glu Asn
260 265 270
Tyr Met Lys Met Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Asn His Ile Leu Leu
275 280 285
Pro Lys Ile Arg Leu Glu Thr Val Tyr Asp Lys Asp Trp Met Leu Leu
290 295 300
Asp Met Leu Asn Glu Val Val Arg Cys Pro Leu Ser Leu Tyr Lys Arg
305 310 315 320
Leu Thr Pro Ala Ala Gln Asn Lys Phe Lys Val Pro Glu Lys Ser Ser
325 330 335
Asp Asn Ala Asn Arg Gln Glu Asp Asp Asn Pro Phe Ser Arg Ile Leu
340 345 350
Val Arg His Gln Asn Arg Phe Pro Tyr Phe Val Leu Arg Phe Phe Asp
355 360 365
Leu Asn Glu Val Phe Thr Thr Leu Arg Phe Gln Ile Asn Leu Gly Cys
370 375 380
Tyr His Phe Ala Ile Cys Lys Lys Gln Ile Gly Asp Lys Lys Glu Val
385 390 395 400
His His Leu Ile Arg Thr Leu Tyr Gly Phe Ser Arg Leu Gln Asn Phe
405 410 415
Thr Gln Asn Thr Arg Pro Glu Glu Trp Asn Thr Leu Val Lys Thr Thr
420 425 430
Glu Pro Ser Ser Gly Asn Asp Gly Lys Thr Val Gln Gly Val Pro Leu
435 440 445
Pro Tyr Ile Ser Tyr Thr Ile Pro His Tyr Gln Ile Glu Asn Glu Lys
450 455 460
Ile Gly Ile Lys Ile Phe Asp Gly Asp Thr Ala Val Asp Thr Asp Ile
465 470 475 480
Trp Pro Ser Val Ser Thr Glu Lys Gln Leu Asn Lys Pro Asp Lys Tyr
485 490 495
Thr Leu Thr Pro Gly Phe Lys Ala Asp Val Phe Leu Ser Val His Glu
500 505 510
Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Gln Leu Leu Leu Cys Glu Gly Met
515 520 525
Leu Lys Thr Asp Ala Gly Asn Ala Val Glu Lys Val Leu Ile Asp Thr
530 535 540
Arg Asn Ala Ile Phe Asn Leu Tyr Asp Ala Phe Val Gln Glu Lys Ile
545 550 555 560
Asn Thr Ile Thr Asp Leu Glu Asn Tyr Leu Gln Asp Lys Pro Ile Leu
565 570 575
Ile Gly His Leu Pro Lys Gln Met Ile Asp Leu Leu Lys Gly His Gln
580 585 590
Arg Asp Met Leu Lys Ala Val Glu Gln Lys Lys Ala Met Leu Ile Lys
595 600 605
Asp Thr Glu Arg Arg Leu Lys Leu Leu Asp Lys Gln Leu Lys Gln Glu
610 615 620
Thr Asp Val Ala Ala Lys Asn Thr Gly Thr Leu Leu Lys Asn Gly Gln
625 630 635 640
Ile Ala Asp Trp Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Lys
645 650 655
Arg Asp Lys Glu Gly Asn Pro Ile Asn Cys Ser Lys Ala Asn Ser Thr
660 665 670
Glu Tyr Gln Met Leu Gln Arg Ala Phe Ala Phe Tyr Ala Thr Asp Ser
675 680 685
Cys Arg Leu Ser Arg Tyr Phe Thr Gln Leu His Leu Ile His Ser Asp
690 695 700
Asn Ser His Leu Phe Leu Ser Arg Phe Glu Tyr Asp Lys Gln Pro Asn
705 710 715 720
Leu Ile Ala Phe Tyr Ala Ala Tyr Leu Lys Ala Lys Leu Glu Phe Leu
725 730 735
Asn Glu Leu Gln Pro Gln Asn Trp Ala Ser Asp Asn Tyr Phe Leu Leu
740 745 750
Leu Arg Ala Pro Lys Asn Asp Arg Gln Lys Leu Ala Glu Gly Trp Lys
755 760 765
Asn Gly Phe Asn Leu Pro Arg Gly Leu Phe Thr Glu Lys Ile Lys Thr
770 775 780
Trp Phe Asn Glu His Lys Thr Ile Val Asp Ile Ser Asp Cys Asp Ile
785 790 795 800
Phe Lys Asn Arg Val Gly Gln Val Ala Arg Leu Ile Pro Val Phe Phe
805 810 815
Asp Lys Lys Phe Lys Asp His Ser Gln Pro Phe Tyr Arg Tyr Asp Phe
820 825 830
Asn Val Gly Asn Val Ser Lys Pro Thr Glu Ala Asn Tyr Leu Ser Lys
835 840 845
Gly Lys Arg Glu Glu Leu Phe Lys Ser Tyr Gln Asn Lys Phe Lys Asn
850 855 860
Asn Ile Pro Ala Glu Lys Thr Lys Glu Tyr Arg Glu Tyr Lys Asn Phe
865 870 875 880
Ser Leu Trp Lys Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Ile Lys Asn Gln
885 890 895
Asp Ile Leu Ile Trp Leu Met Cys Lys Asn Leu Phe Asp Glu Lys Ile
900 905 910
Lys Pro Lys Lys Asp Ile Leu Glu Pro Arg Ile Ala Val Ser Tyr Ile
915 920 925
Lys Leu Asp Ser Leu Gln Thr Asn Thr Ser Thr Ala Gly Ser Leu Asn
930 935 940
Ala Leu Ala Lys Val Val Pro Met Thr Leu Ala Ile His Ile Asp Ser
945 950 955 960
Pro Lys Pro Lys Gly Lys Ala Gly Asn Asn Glu Lys Glu Asn Lys Glu
965 970 975
Phe Thr Val Tyr Ile Lys Glu Glu Gly Thr Lys Leu Leu Lys Trp Gly
980 985 990
Asn Phe Lys Thr Leu Leu Ala Asp Arg Arg Ile Lys Gly Leu Phe Ser
995 1000 1005
Tyr Ile Glu His Asp Asp Ile Asp Leu Lys Gln His Pro Leu Thr
1010 1015 1020
Lys Arg Arg Val Asp Leu Glu Leu Asp Leu Tyr Gln Thr Cys Arg
1025 1030 1035
Ile Asp Ile Phe Gln Gln Thr Leu Gly Leu Glu Ala Gln Leu Leu
1040 1045 1050
Asp Lys Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Asp Asn Phe Tyr Gln Met Leu
1055 1060 1065
Ile Gly Trp Arg Lys Lys Glu Gly Ile Pro Arg Asn Ile Lys Glu
1070 1075 1080
Asp Thr Asp Phe Leu Lys Asp Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn
1085 1090 1095
Gln Tyr Pro Asp Ser Lys Lys Ile Ala Phe Arg Arg Ile Arg Lys
1100 1105 1110
Phe Asn Pro Lys Glu Leu Ile Leu Glu Glu Glu Glu Gly Leu Gly
1115 1120 1125
Ile Ala Thr Gln Met Tyr Lys Glu Val Glu Lys Val Val Asn Arg
1130 1135 1140
Ile Lys Arg Ile Glu Leu Phe Asp
1145 1150
<210> 609
<211> 1120
<212> PRT
<213> Prevotella intermedia
<400> 609
Met Glu Asp Asp Lys Lys Thr Thr Asp Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Lys
1 5 10 15
Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn Val
20 25 30
Tyr Ile Thr Val Asn His Ile Asn Lys Ile Leu Glu Glu Asp Glu Ile
35 40 45
Asn Arg Asp Gly Tyr Glu Asn Thr Leu Glu Asn Ser Trp Asn Glu Ile
50 55 60
Lys Asp Ile Asn Lys Lys Asp Arg Leu Ser Lys Leu Ile Ile Lys His
65 70 75 80
Phe Pro Phe Leu Glu Ala Thr Thr Tyr Arg Gln Asn Pro Thr Asp Thr
85 90 95
Thr Lys Gln Lys Glu Glu Lys Gln Ala Glu Ala Gln Ser Leu Glu Ser
100 105 110
Leu Lys Lys Ser Phe Phe Val Phe Ile Tyr Lys Leu Arg Asp Leu Arg
115 120 125
Asn His Tyr Ser His Tyr Lys His Ser Lys Ser Leu Glu Arg Pro Lys
130 135 140
Phe Glu Glu Asp Leu Gln Asn Lys Met Tyr Asn Ile Phe Asp Val Ser
145 150 155 160
Ile Gln Phe Val Lys Glu Asp Tyr Lys His Asn Thr Asp Ile Asn Pro
165 170 175
Lys Lys Asp Phe Lys His Leu Asp Arg Lys Arg Lys Gly Lys Phe His
180 185 190
Tyr Ser Phe Ala Asp Asn Glu Gly Asn Ile Thr Glu Ser Gly Leu Leu
195 200 205
Phe Phe Val Ser Leu Phe Leu Glu Lys Lys Asp Ala Ile Trp Val Gln
210 215 220
Lys Lys Leu Glu Gly Phe Lys Cys Ser Asn Lys Ser Tyr Gln Lys Met
225 230 235 240
Thr Asn Glu Val Phe Cys Arg Ser Arg Met Leu Leu Pro Lys Leu Arg
245 250 255
Leu Glu Ser Thr Gln Thr Gln Asp Trp Ile Leu Leu Asp Met Leu Asn
260 265 270
Glu Leu Ile Arg Cys Pro Lys Ser Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Gly Val
275 280 285
Asn Arg Lys Lys Phe Tyr Val Ser Phe Asp Pro Ala Asp Glu Asp Tyr
290 295 300
Asp Ala Glu Gln Glu Pro Phe Lys Asn Thr Leu Val Arg His Gln Asp
305 310 315 320
Arg Phe Pro Tyr Phe Ala Leu Arg Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Val Phe
325 330 335
Ala Asn Leu Arg Phe Gln Ile Asp Leu Gly Thr Tyr His Phe Ser Ile
340 345 350
Tyr Lys Lys Leu Ile Gly Gly Gln Lys Glu Asp Arg His Leu Thr His
355 360 365
Lys Leu Tyr Gly Phe Glu Arg Ile Gln Glu Phe Asp Lys Gln Asn Arg
370 375 380
Pro Asp Glu Trp Lys Ala Ile Val Lys Asp Ser Asp Thr Phe Lys Lys
385 390 395 400
Lys Glu Glu Lys Glu Glu Glu Lys Pro Tyr Ile Ser Glu Thr Thr Pro
405 410 415
His Tyr His Leu Glu Asn Lys Lys Ile Gly Ile Ala Phe Lys Asn His
420 425 430
Asn Ile Trp Pro Ser Thr Gln Thr Glu Leu Thr Asn Asn Lys Arg Lys
435 440 445
Lys Tyr Asn Leu Gly Thr Ser Ile Lys Ala Glu Ala Phe Leu Ser Val
450 455 460
His Glu Leu Leu Pro Met Met Phe Tyr Tyr Leu Leu Leu Lys Thr Glu
465 470 475 480
Asn Thr Lys Asn Asp Asn Lys Val Gly Gly Lys Lys Glu Thr Lys Lys
485 490 495
Gln Gly Lys His Lys Ile Glu Ala Ile Ile Glu Ser Lys Ile Lys Asp
500 505 510
Ile Tyr Ala Leu Tyr Asp Ala Phe Ala Asn Gly Glu Ile Asn Ser Glu
515 520 525
Asp Glu Leu Lys Glu Tyr Leu Lys Gly Lys Asp Ile Lys Ile Val His
530 535 540
Leu Pro Lys Gln Met Ile Ala Ile Leu Lys Asn Glu His Lys Asp Met
545 550 555 560
Ala Glu Lys Ala Glu Ala Lys Gln Glu Lys Met Lys Leu Ala Thr Glu
565 570 575
Asn Arg Leu Lys Thr Leu Asp Lys Gln Leu Lys Gly Lys Ile Gln Asn
580 585 590
Gly Lys Arg Tyr Asn Ser Ala Pro Lys Ser Gly Glu Ile Ala Ser Trp
595 600 605
Leu Val Asn Asp Met Met Arg Phe Gln Pro Val Gln Lys Asp Glu Asn
610 615 620
Gly Glu Ser Leu Asn Asn Ser Lys Ala Asn Ser Thr Glu Tyr Gln Leu
625 630 635 640
Leu Gln Arg Thr Leu Ala Phe Phe Gly Ser Glu His Glu Arg Leu Ala
645 650 655
Pro Tyr Phe Lys Gln Thr Lys Leu Ile Glu Ser Ser Asn Pro His Pro
660 665 670
Phe Leu Asn Asp Thr Glu Trp Glu Lys Cys Ser Asn Ile Leu Ser Phe
675 680 685
Tyr Arg Ser Tyr Leu Lys Ala Arg Lys Asn Phe Leu Glu Ser Leu Lys
690 695 700
Pro Glu Asp Trp Glu Lys Asn Gln Tyr Phe Leu Met Leu Lys Glu Pro
705 710 715 720
Lys Thr Asn Arg Glu Thr Leu Val Gln Gly Trp Lys Asn Gly Phe Asn
725 730 735
Leu Pro Arg Gly Phe Phe Thr Glu Pro Ile Arg Lys Trp Phe Met Glu
740 745 750
His Trp Lys Ser Ile Lys Val Asp Asp Leu Lys Arg Val Gly Leu Val
755 760 765
Ala Lys Val Thr Pro Leu Phe Phe Ser Glu Lys Tyr Lys Asp Ser Val
770 775 780
Gln Pro Phe Tyr Asn Tyr Pro Phe Asn Val Gly Asp Val Asn Lys Pro
785 790 795 800
Lys Glu Glu Asp Phe Leu His Arg Glu Glu Arg Ile Glu Leu Trp Asp
805 810 815
Lys Lys Lys Asp Lys Phe Lys Gly Tyr Lys Ala Lys Lys Lys Phe Lys
820 825 830
Glu Met Thr Asp Lys Glu Lys Glu Glu His Arg Ser Tyr Leu Glu Phe
835 840 845
Gln Ser Trp Asn Lys Phe Glu Arg Glu Leu Arg Leu Val Arg Asn Gln
850 855 860
Asp Ile Val Thr Trp Leu Leu Cys Thr Glu Leu Ile Asp Lys Leu Lys
865 870 875 880
Ile Asp Glu Leu Asn Ile Lys Glu Leu Lys Lys Leu Arg Leu Lys Asp
885 890 895
Ile Asn Thr Asp Thr Ala Lys Lys Glu Lys Asn Asn Ile Leu Asn Arg
900 905 910
Val Met Pro Met Glu Leu Pro Val Thr Val Tyr Lys Val Asn Lys Gly
915 920 925
Gly Tyr Ile Ile Lys Asn Lys Pro Leu His Thr Ile Tyr Ile Lys Glu
930 935 940
Ala Glu Thr Lys Leu Leu Lys Gln Gly Asn Phe Lys Ala Leu Val Lys
945 950 955 960
Asp Arg Arg Leu Asn Gly Leu Phe Ser Phe Val Lys Thr Pro Ser Glu
965 970 975
Ala Glu Ser Glu Ser Asn Pro Ile Ser Lys Leu Arg Val Glu Tyr Glu
980 985 990
Leu Gly Lys Tyr Gln Asn Ala Arg Leu Asp Ile Ile Glu Asp Met Leu
995 1000 1005
Ala Leu Glu Lys Lys Leu Ile Asp Lys Tyr Asn Ser Leu Asp Thr
1010 1015 1020
Asp Asn Phe His Asn Met Leu Thr Gly Trp Leu Glu Leu Lys Gly
1025 1030 1035
Glu Ala Lys Lys Ala Arg Phe Gln Asn Asp Val Lys Leu Leu Thr
1040 1045 1050
Ala Val Arg Asn Ala Phe Ser His Asn Gln Tyr Pro Met Tyr Asp
1055 1060 1065
Glu Asn Leu Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ser Leu Ser Ser Ser
1070 1075 1080
Asn Ile Ile Glu Ser Lys Gly Leu Asp Ile Ala Ala Lys Leu Lys
1085 1090 1095
Glu Glu Val Ser Lys Ala Ala Lys Lys Ile Gln Asn Glu Glu Asp
1100 1105 1110
Asn Lys Lys Glu Lys Glu Thr
1115 1120
<210> 610
<211> 1199
<212> PRT
<213> Capnocytophaga canimorsus
<400> 610
Met Lys Asn Ile Gln Arg Leu Gly Lys Gly Asn Glu Phe Ser Pro Phe
1 5 10 15
Lys Lys Glu Asp Lys Phe Tyr Phe Gly Gly Phe Leu Asn Leu Ala Asn
20 25 30
Asn Asn Ile Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ile Ile Thr Arg Phe Gly Ile
35 40 45
Val Ile Thr Asp Glu Asn Lys Lys Pro Lys Glu Thr Phe Gly Glu Lys
50 55 60
Ile Leu Asn Glu Ile Phe Lys Lys Asp Ile Ser Ile Val Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys Trp Val Asn Ile Phe Ala Asp Tyr Phe Pro Phe Thr Lys Tyr Leu
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Glu Glu Met Gln Phe Lys Asn Arg Val Ile Cys Phe
100 105 110
Arg Asp Val Met Lys Glu Leu Leu Lys Thr Val Glu Ala Leu Arg Asn
115 120 125
Phe Tyr Thr His Tyr Asp His Glu Pro Ile Lys Ile Glu Asp Arg Val
130 135 140
Phe Tyr Phe Leu Asp Lys Val Leu Leu Asp Val Ser Leu Thr Val Lys
145 150 155 160
Asn Lys Tyr Leu Lys Thr Asp Lys Thr Lys Glu Phe Leu Asn Gln His
165 170 175
Ile Gly Glu Glu Leu Lys Glu Leu Cys Lys Gln Arg Lys Asp Tyr Leu
180 185 190
Val Gly Lys Gly Lys Arg Ile Asp Lys Glu Ser Glu Ile Ile Asn Gly
195 200 205
Ile Tyr Asn Asn Ala Phe Lys Asp Phe Ile Cys Lys Arg Glu Lys Gln
210 215 220
Asp Asp Lys Glu Asn His Asn Ser Val Glu Lys Ile Leu Cys Asn Lys
225 230 235 240
Glu Pro Gln Asn Lys Lys Gln Lys Ser Ser Ala Thr Val Trp Glu Leu
245 250 255
Cys Ser Lys Ser Ser Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Ser Phe Pro Asn Arg
260 265 270
Glu Asn Asp Lys His Cys Leu Glu Val Pro Ile Ser Gln Lys Gly Ile
275 280 285
Val Phe Leu Leu Ser Phe Phe Leu Asn Lys Gly Glu Ile Tyr Ala Leu
290 295 300
Thr Ser Asn Ile Lys Gly Phe Lys Ala Lys Ile Thr Lys Glu Glu Pro
305 310 315 320
Val Thr Tyr Asp Lys Asn Ser Ile Arg Tyr Met Ala Thr His Arg Met
325 330 335
Phe Ser Phe Leu Ala Tyr Lys Gly Leu Lys Arg Lys Ile Arg Thr Ser
340 345 350
Glu Ile Asn Tyr Asn Glu Asp Gly Gln Ala Ser Ser Thr Tyr Glu Lys
355 360 365
Glu Thr Leu Met Leu Gln Met Leu Asp Glu Leu Asn Lys Val Pro Asp
370 375 380
Val Val Tyr Gln Asn Leu Ser Glu Asp Val Gln Lys Thr Phe Ile Glu
385 390 395 400
Asp Trp Asn Glu Tyr Leu Lys Glu Asn Asn Gly Asp Val Gly Thr Met
405 410 415
Glu Glu Glu Gln Val Ile His Pro Val Ile Arg Lys Arg Tyr Glu Asp
420 425 430
Lys Phe Asn Tyr Phe Ala Ile Arg Phe Leu Asp Glu Phe Ala Gln Phe
435 440 445
Pro Thr Leu Arg Phe Gln Val His Leu Gly Asn Tyr Leu Cys Asp Lys
450 455 460
Arg Thr Lys Gln Ile Cys Asp Thr Thr Thr Glu Arg Glu Val Lys Lys
465 470 475 480
Lys Ile Thr Val Phe Gly Arg Leu Ser Glu Leu Glu Asn Lys Lys Ala
485 490 495
Ile Phe Leu Asn Glu Arg Glu Glu Ile Lys Gly Trp Glu Val Phe Pro
500 505 510
Asn Pro Ser Tyr Asp Phe Pro Lys Glu Asn Ile Ser Val Asn Tyr Lys
515 520 525
Asp Phe Pro Ile Val Gly Ser Ile Leu Asp Arg Glu Lys Gln Pro Val
530 535 540
Ser Asn Lys Ile Gly Ile Arg Val Lys Ile Ala Asp Glu Leu Gln Arg
545 550 555 560
Glu Ile Asp Lys Ala Ile Lys Glu Lys Lys Leu Arg Asn Pro Lys Asn
565 570 575
Arg Lys Ala Asn Gln Asp Glu Lys Gln Lys Glu Arg Leu Val Asn Glu
580 585 590
Ile Val Ser Thr Asn Ser Asn Glu Gln Gly Glu Pro Val Val Phe Ile
595 600 605
Gly Gln Pro Thr Ala Tyr Leu Ser Met Asn Asp Ile His Ser Val Leu
610 615 620
Tyr Glu Phe Leu Ile Asn Lys Ile Ser Gly Glu Ala Leu Glu Thr Lys
625 630 635 640
Ile Val Glu Lys Ile Glu Thr Gln Ile Lys Gln Ile Ile Gly Lys Asp
645 650 655
Ala Thr Thr Lys Ile Leu Lys Pro Tyr Thr Asn Ala Asn Ser Asn Ser
660 665 670
Ile Asn Arg Glu Lys Leu Leu Arg Asp Leu Glu Gln Glu Gln Gln Ile
675 680 685
Leu Lys Thr Leu Leu Glu Glu Gln Gln Gln Arg Glu Lys Asp Lys Lys
690 695 700
Asp Lys Lys Ser Lys Arg Lys His Glu Leu Tyr Pro Ser Glu Lys Gly
705 710 715 720
Lys Val Ala Val Trp Leu Ala Asn Asp Ile Lys Arg Phe Met Pro Lys
725 730 735
Ala Phe Lys Glu Gln Trp Arg Gly Tyr His His Ser Leu Leu Gln Lys
740 745 750
Tyr Leu Ala Tyr Tyr Glu Gln Ser Lys Glu Glu Leu Lys Asn Leu Leu
755 760 765
Pro Lys Glu Val Phe Lys His Phe Pro Phe Lys Leu Lys Gly Tyr Phe
770 775 780
Gln Gln Gln Tyr Leu Asn Gln Phe Tyr Thr Asp Tyr Leu Lys Arg Arg
785 790 795 800
Leu Ser Tyr Val Asn Glu Leu Leu Leu Asn Ile Gln Asn Phe Lys Asn
805 810 815
Asp Lys Asp Ala Leu Lys Ala Thr Glu Lys Glu Cys Phe Lys Phe Phe
820 825 830
Arg Lys Gln Asn Tyr Ile Ile Asn Pro Ile Asn Ile Gln Ile Gln Ser
835 840 845
Ile Leu Val Tyr Pro Ile Phe Leu Lys Arg Gly Phe Leu Asp Glu Lys
850 855 860
Pro Thr Met Ile Asp Arg Glu Lys Phe Lys Glu Asn Lys Asp Thr Glu
865 870 875 880
Leu Ala Asp Trp Phe Met His Tyr Lys Asn Tyr Lys Glu Asp Asn Tyr
885 890 895
Gln Lys Phe Tyr Ala Tyr Pro Leu Glu Lys Val Glu Glu Lys Glu Lys
900 905 910
Phe Lys Arg Asn Lys Gln Ile Asn Lys Gln Lys Lys Asn Asp Val Tyr
915 920 925
Thr Leu Met Met Val Glu Tyr Ile Ile Gln Lys Ile Phe Gly Asp Lys
930 935 940
Phe Val Glu Glu Asn Pro Leu Val Leu Lys Gly Ile Phe Gln Ser Lys
945 950 955 960
Ala Glu Arg Gln Gln Asn Asn Thr His Ala Ala Thr Thr Gln Glu Arg
965 970 975
Asn Leu Asn Gly Ile Leu Asn Gln Pro Lys Asp Ile Lys Ile Gln Gly
980 985 990
Lys Ile Thr Val Lys Gly Val Lys Leu Lys Asp Ile Gly Asn Phe Arg
995 1000 1005
Lys Tyr Glu Ile Asp Gln Arg Val Asn Thr Phe Leu Asp Tyr Glu
1010 1015 1020
Pro Arg Lys Glu Trp Met Ala Tyr Leu Pro Asn Asp Trp Lys Glu
1025 1030 1035
Lys Glu Lys Gln Gly Gln Leu Pro Pro Asn Asn Val Ile Asp Arg
1040 1045 1050
Gln Ile Ser Lys Tyr Glu Thr Val Arg Ser Lys Ile Leu Leu Lys
1055 1060 1065
Asp Val Gln Glu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Asp Glu Ile Lys Glu
1070 1075 1080
Glu His Arg His Asp Leu Lys Gln Gly Lys Tyr Tyr Asn Phe Lys
1085 1090 1095
Tyr Tyr Ile Leu Asn Gly Leu Leu Arg Gln Leu Lys Asn Glu Asn
1100 1105 1110
Val Glu Asn Tyr Lys Val Phe Lys Leu Asn Thr Asn Pro Glu Lys
1115 1120 1125
Val Asn Ile Thr Gln Leu Lys Gln Glu Ala Thr Asp Leu Glu Gln
1130 1135 1140
Lys Ala Phe Val Leu Thr Tyr Ile Arg Asn Lys Phe Ala His Asn
1145 1150 1155
Gln Leu Pro Lys Lys Glu Phe Trp Asp Tyr Cys Gln Glu Lys Tyr
1160 1165 1170
Gly Lys Ile Glu Lys Glu Lys Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Ala Glu
1175 1180 1185
Val Phe Lys Arg Glu Lys Glu Ala Leu Ile Lys
1190 1195
<210> 611
<211> 1175
<212> PRT
<213> Porphyromonas gulae
<400> 611
Met Thr Glu Gln Ser Glu Arg Pro Tyr Asn Gly Thr Tyr Tyr Thr Leu
1 5 10 15
Glu Asp Lys His Phe Trp Ala Ala Phe Leu Asn Leu Ala Arg His Asn
20 25 30
Ala Tyr Ile Thr Leu Thr His Ile Asp Arg Gln Leu Ala Tyr Ser Lys
35 40 45
Ala Asp Ile Thr Asn Asp Gln Asp Val Leu Ser Phe Lys Ala Leu Trp
50 55 60
Lys Asn Phe Asp Asn Asp Leu Glu Arg Lys Ser Arg Leu Arg Ser Leu
65 70 75 80
Ile Leu Lys His Phe Ser Phe Leu Glu Gly Ala Ala Tyr Gly Lys Lys
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Leu Phe Glu Ser Lys Ser Ser Gly Asn Lys Ser Ser Lys Asn Lys Glu
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Leu Thr Lys Lys Glu Lys Glu Glu Leu Gln Ala Asn Ala Leu Ser Leu
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Asp Asn Leu Lys Ser Ile Leu Phe Asp Phe Leu Gln Lys Leu Lys Asp
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Phe Arg Asn Tyr Tyr Ser His Tyr Arg His Ser Gly Ser Ser Glu Leu
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Pro Leu Phe Asp Gly Asn Met Leu Gln Arg Leu Tyr Asn Val Phe Asp
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Val Ser Val Gln Arg Val Lys Ile Asp His Glu His Asn Asp Glu Val
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Asp Pro His Tyr His Phe Asn His Leu Val Arg Lys Gly Lys Lys Asp
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Arg Tyr Gly His Asn Asp Asn Pro Ser Phe Lys His His Phe Val Asp
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465 470 475 480
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Met Met Phe Tyr Tyr Phe Leu Leu Arg Glu Lys Tyr Ser Glu Glu Val
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545 550 555 560
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Leu Asp Lys Arg Leu Ser Asn Ser Arg Asn Glu Tyr Gln Lys Ser Glu
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Leu Ser Ile Asp Gln Tyr Lys Thr Cys Gly Lys Leu Phe Asn Lys Leu
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Tyr Ile Asp Lys Lys Asn Val His Lys Ile Asp Ile Gln Lys Ile Leu
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<212> PRT
<213> Porphyromonas gingivalis
<400> 614
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355 360 365
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370 375 380
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420 425 430
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Met Met Phe Tyr Tyr Phe Leu Leu Arg Glu Lys Tyr Ser Glu Glu Val
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Ser Ala Glu Lys Val Gln Gly Arg Ile Lys Arg Val Ile Glu Asp Val
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<213> Fusobacterium necrophorum
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<212> PRT
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<400> 619
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<212> PRT
<213> Fusobacterium perfoetens
<400> 620
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<210> 621
<211> 897
<212> PRT
<213> Fusobacterium ulcerans
<400> 621
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Glu Asn Leu Glu Phe Lys Lys Leu Ile Asp Glu His Phe Val Asn Ala
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Lys Lys Arg Leu Glu Arg Asn Ile Lys Lys Ser Lys Lys Leu Glu Lys
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Arg Lys Ser Leu Ile Glu Glu Tyr Asn Lys Gln Ile Asn Glu Ile Lys
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Lys Thr Glu Ile Ser Glu Lys Asn Lys Glu Ala Thr Leu Asn Glu Lys
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675 680 685
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Ser Asn Asn Leu Arg Glu Arg Ala Asn Ser Ser Ser Leu Leu Glu Asp
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Ser Ala Phe Leu Lys Lys Ile Gly Leu Tyr Lys Val Lys Asn Asn Lys
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755 760 765
Arg Lys Leu Leu Lys Asp Ser Ser Asp Ile Met Gly Met Tyr Lys Ala
770 775 780
Glu Val Val Lys Lys Leu Lys Glu Lys Leu Ile Leu Ile Phe Lys His
785 790 795 800
Asp Glu Glu Lys Arg Ile Tyr Val Thr Val Tyr Asp Thr Ser Lys Ala
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Tyr
<210> 622
<211> 1111
<212> PRT
<213> Anaerosalibacter sp.
<400> 622
Met Lys Ser Gly Arg Arg Glu Lys Ala Lys Ser Asn Lys Ser Ser Ile
1 5 10 15
Val Arg Val Ile Ile Ser Asn Phe Asp Asp Lys Gln Val Lys Glu Ile
20 25 30
Lys Val Leu Tyr Thr Lys Gln Gly Gly Ile Asp Val Ile Lys Phe Lys
35 40 45
Ser Thr Glu Lys Asp Glu Lys Gly Arg Met Lys Phe Asn Phe Asp Cys
50 55 60
Ala Tyr Asn Arg Leu Glu Glu Glu Glu Phe Asn Ser Phe Gly Gly Lys
65 70 75 80
Gly Lys Gln Ser Phe Phe Val Thr Thr Asn Glu Asp Leu Thr Glu Leu
85 90 95
His Val Thr Lys Arg His Lys Thr Thr Gly Glu Ile Ile Lys Asp Tyr
100 105 110
Thr Ile Gln Gly Lys Tyr Thr Pro Ile Lys Gln Asp Arg Thr Lys Val
115 120 125
Thr Val Ser Ile Thr Asp Asn Lys Asp His Phe Asp Ser Asn Asp Leu
130 135 140
Gly Asp Lys Ile Arg Leu Ser Arg Ser Leu Thr Gln Tyr Thr Asn Arg
145 150 155 160
Ile Leu Leu Asp Ala Asp Val Met Lys Asn Tyr Arg Glu Ile Val Cys
165 170 175
Ser Asp Ser Glu Lys Val Asp Glu Thr Ile Asn Ile Asp Ser Gln Glu
180 185 190
Ile Tyr Lys Ile Asn Arg Phe Leu Ser Tyr Arg Ser Asn Met Ile Ile
195 200 205
Tyr Tyr Gln Met Ile Asn Asn Phe Leu Leu His Tyr Asp Gly Glu Glu
210 215 220
Asp Lys Gly Gly Asn Asp Ser Ile Asn Leu Ile Asn Glu Ile Trp Lys
225 230 235 240
Tyr Glu Asn Lys Lys Asn Asp Glu Lys Glu Lys Ile Ile Glu Arg Ser
245 250 255
Tyr Lys Ser Ile Glu Lys Ser Ile Asn Gln Tyr Ile Leu Asn His Asn
260 265 270
Thr Glu Val Glu Ser Gly Asp Lys Glu Lys Lys Ile Asp Ile Ser Glu
275 280 285
Glu Arg Ile Lys Glu Asp Leu Lys Lys Thr Phe Ile Leu Phe Ser Arg
290 295 300
Leu Arg His Tyr Met Val His Tyr Asn Tyr Lys Phe Tyr Glu Asn Leu
305 310 315 320
Tyr Ser Gly Lys Asn Phe Ile Ile Tyr Asn Lys Asp Lys Ser Lys Ser
325 330 335
Arg Arg Phe Ser Glu Leu Leu Asp Leu Asn Ile Phe Lys Glu Leu Ser
340 345 350
Lys Ile Lys Leu Val Lys Asn Arg Ala Val Ser Asn Tyr Leu Asp Lys
355 360 365
Lys Thr Thr Ile His Val Leu Asn Lys Asn Ile Asn Ala Ile Lys Leu
370 375 380
Leu Asp Ile Tyr Arg Asp Ile Cys Glu Thr Lys Asn Gly Phe Asn Asn
385 390 395 400
Phe Ile Asn Asn Met Met Thr Ile Ser Gly Glu Glu Asp Lys Glu Tyr
405 410 415
Lys Glu Met Val Thr Lys His Phe Asn Glu Asn Met Asn Lys Leu Ser
420 425 430
Ile Tyr Leu Glu Asn Phe Lys Lys His Ser Asp Phe Lys Thr Asn Asn
435 440 445
Lys Lys Lys Glu Thr Tyr Asn Leu Leu Lys Gln Glu Leu Asp Glu Gln
450 455 460
Lys Lys Leu Arg Leu Trp Phe Asn Ala Pro Tyr Val Tyr Asp Ile His
465 470 475 480
Ser Ser Lys Lys Tyr Lys Glu Leu Tyr Val Glu Arg Lys Lys Tyr Val
485 490 495
Asp Ile His Ser Lys Leu Ile Glu Ala Gly Ile Asn Asn Asp Asn Lys
500 505 510
Lys Lys Leu Asn Glu Ile Asn Val Lys Leu Cys Glu Leu Asn Thr Glu
515 520 525
Met Lys Glu Met Thr Lys Leu Asn Ser Lys Tyr Arg Leu Gln Tyr Lys
530 535 540
Leu Gln Leu Ala Phe Gly Phe Ile Leu Glu Glu Phe Asn Leu Asp Ile
545 550 555 560
Asp Lys Phe Val Ser Ala Phe Asp Lys Asp Asn Asn Leu Thr Ile Ser
565 570 575
Lys Phe Met Glu Lys Arg Glu Thr Tyr Leu Ser Lys Ser Leu Asp Arg
580 585 590
Arg Asp Asn Arg Phe Lys Lys Leu Ile Lys Asp Tyr Lys Phe Arg Asp
595 600 605
Thr Glu Asp Ile Phe Cys Ser Asp Arg Glu Asn Asn Leu Val Lys Leu
610 615 620
Tyr Ile Leu Met Tyr Ile Leu Leu Pro Val Glu Ile Arg Gly Asp Phe
625 630 635 640
Leu Gly Phe Val Lys Lys Asn Tyr Tyr Asp Leu Lys His Val Asp Phe
645 650 655
Ile Asp Lys Arg Asn Asn Asp Asn Lys Asp Thr Phe Phe His Asp Leu
660 665 670
Arg Leu Phe Glu Lys Asn Val Lys Arg Leu Glu Val Thr Ser Tyr Ser
675 680 685
Leu Ser Asp Gly Phe Leu Gly Lys Lys Ser Arg Glu Lys Phe Gly Lys
690 695 700
Glu Leu Glu Lys Phe Ile Tyr Lys Asn Val Ser Ile Ala Leu Pro Thr
705 710 715 720
Asn Ile Asp Ile Lys Glu Phe Asn Lys Ser Leu Val Leu Pro Met Met
725 730 735
Lys Asn Tyr Gln Ile Ile Phe Lys Leu Leu Asn Asp Ile Glu Ile Ser
740 745 750
Ala Leu Phe Leu Ile Ala Lys Lys Glu Gly Asn Glu Gly Ser Ile Thr
755 760 765
Phe Lys Lys Val Ile Asp Lys Val Arg Lys Glu Asp Met Asn Gly Asn
770 775 780
Ile Asn Phe Ser Gln Val Met Lys Met Ala Leu Asn Glu Lys Val Asn
785 790 795 800
Cys Gln Ile Arg Asn Ser Ile Ala His Ile Asn Met Lys Gln Leu Tyr
805 810 815
Ile Glu Pro Leu Asn Ile Tyr Ile Asn Asn Asn Gln Asn Lys Lys Thr
820 825 830
Ile Ser Glu Gln Met Glu Glu Ile Ile Asp Ile Cys Ile Thr Lys Gly
835 840 845
Leu Thr Gly Lys Glu Leu Asn Lys Asn Ile Ile Asn Asp Tyr Tyr Met
850 855 860
Lys Lys Glu Lys Leu Val Phe Asn Leu Lys Leu Arg Lys Arg Asn Asn
865 870 875 880
Leu Val Ser Ile Asp Ala Gln Gln Lys Asn Met Lys Glu Lys Ser Ile
885 890 895
Leu Asn Lys Tyr Asp Leu Asn Tyr Lys Asp Glu Asn Leu Asn Ile Lys
900 905 910
Glu Ile Ile Leu Lys Val Asn Asp Leu Asn Asn Lys Gln Lys Leu Leu
915 920 925
Lys Glu Thr Thr Glu Gly Glu Ser Asn Tyr Lys Asn Ala Leu Ser Lys
930 935 940
Asp Ile Leu Leu Leu Asn Gly Ile Ile Arg Lys Asn Ile Asn Phe Lys
945 950 955 960
Ile Lys Glu Met Ile Leu Gly Ile Ile Gln Gln Asn Glu Tyr Arg Tyr
965 970 975
Val Asn Ile Asn Ile Tyr Asp Lys Ile Arg Lys Glu Asp His Asn Ile
980 985 990
Asp Leu Lys Ile Asn Asn Lys Tyr Ile Glu Ile Ser Cys Tyr Glu Asn
995 1000 1005
Lys Ser Asn Glu Ser Thr Asp Glu Arg Ile Asn Phe Lys Ile Lys
1010 1015 1020
Tyr Met Asp Leu Lys Val Lys Asn Glu Leu Leu Val Pro Ser Cys
1025 1030 1035
Tyr Glu Asp Ile Tyr Ile Lys Lys Lys Ile Asp Leu Glu Ile Arg
1040 1045 1050
Tyr Ile Glu Asn Cys Lys Val Val Tyr Ile Asp Ile Tyr Tyr Lys
1055 1060 1065
Lys Tyr Asn Ile Asn Leu Glu Phe Asp Gly Lys Thr Leu Phe Val
1070 1075 1080
Lys Phe Asn Lys Asp Val Lys Lys Asn Asn Gln Lys Val Asn Leu
1085 1090 1095
Glu Ser Asn Tyr Ile Gln Asn Ile Lys Phe Ile Val Ser
1100 1105 1110
Claims (68)
- 핵산 검출 시스템으로서,
이펙터 단백질 및 해당 표적 분자에 결합하도록 디자인된 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는 검출 CRISPR 시스템; 및
효소 활성을 갖는 사중체를 포함하는 핵산-압타머
를 포함하는 것인, 핵산 검출 시스템. - 제1항에 있어서, 효소 활성은 퍼옥시다제 활성인 시스템.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵산 증폭 시약을 더 포함하는 것인 시스템.
- 제1항에 있어서, 표적 분자는 표적 DNA이고 시스템은 표적 DNA에 결합하고 RNA 중합효소 프로모터를 포함하는 프라이머를 더 포함하는 것인 시스템.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR 시스템 이펙터 단백질은 RNA-표적화 이펙터 단백질인 시스템.
- 제5항에 있어서, RNA-표적화 이펙터 단백질은 하나 이상의 HEPN 도메인을 포함하는 것인 시스템.
- 제6항에 있어서, 하나 이상의 HEPN 도메인은 RxxxxH 모티프 서열을 포함하는 것인 시스템.
- 제7항에 있어서, RxxxH 모티프는 R{N/H/K]X1X2X3H 서열을 포함하는 것인 시스템.
- 제8항에 있어서, X1 은 R, S, D, E, Q, N, G, 또는 Y이고, X2 는 독립적으로 I, S, T, V, 또는 L이고, X3 은 독립적으로 L, F, N, Y, V, I, S, D, E, 또는 A인 시스템.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, CRISPR RNA-표적화 이펙터 단백질은 C2c2인 시스템.
- 제6항에 있어서, CRISPR RNA-표적화 이펙터 단백질은 C2c2인 시스템.
- 제11항에 있어서, C2c2는 Cas1 유전자의 20 kb 이내에 존재하는 것인 시스템.
- 제12항에 있어서, C2c2 이펙터 단백질은 렙토트리키아 (Leptotrichia), 리스테리아 (Listeria), 코리네박터 (Corynebacter), 수테렐라 (Sutterella), 레지오넬라 (Legionella), 트레포네마 (Treponema), 필리팍토르 (Filifactor), 유박테리움 (Eubacterium), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus), 마이코플라스마 (Mycoplasma), 박테로이데스 (Bacteroides), 플라비이볼라 (Flaviivola), 플라보박테리움 (Flavobacterium), 스파에로카에타 (Sphaerochaeta), 아조스피릴룸 (Azospirillum), 글루콘아세토박터 (Gluconacetobacter), 네이세리아 (Neisseria), 로세부리아 (Roseburia), 파르비바큘럼 (Parvibaculum), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 니트라티프락토르 (Nitratifractor), 마이코플라스마 (Mycoplasma), 캄필로박터 (Campylobacter), 및 라크노스피라 (Lachnospira)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 유기체로부터 유래되는 것인 시스템.
- 제13항에 있어서, C2c2 또는 Cas13b 이펙터 단백질은 렙토트리키아 샤히이 (Leptotrichia shahii); 렙토트리키아 웨이데이 (Leptotrichia wadei) (Lw2); 리스테리아 실리게리 (Listeria seeligeri); 라크노스피라세애 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) MA2020; 라크노스피라세애 박테리움 NK4A179; [클로스트리듐 (Clostridium)] 아미노필럼 (aminophilum) DSM 10710; 카르노박테리움 갈리나럼 (Carnobacterium gallinarum) DSM 4847; 카르노박테리움 갈리나럼 DSM 4847 (제2 CRISPR 유전자좌); 팔루디박터 프로피오니시게네스 (Paludibacter propionicigenes) WB4; 리스테리아 웨이헨스테파넨시스 (Listeria weihenstephanensis) FSL R9-0317; 리스테리아세애 박테리움 (Listeriaceae bacterium) FSL M6-0635; 렙토트리키아 웨이데이 F0279; 로도박터 캡슐라터스 (Rhodobacter capsulatus) SB 1003; 로도박터 캡슐라터스 R121; 로도박터 캡슐라터스 DE442; 렙토트리키아 부칼리스 (Leptotrichia buccalis) C-1013-b; 허비닉스 헤미셀룰로실리티카 (Herbinix hemicellulosilytica); [유박테리움 (Eubacterium)] 렉탈레 (rectale); 유박테리아세애 박테리움 (Eubacteriaceae bacterium) CHKCI004; 블라우티아 (Blautia) sp. 마르세이유-P2398; 렙토트리키아 sp. 경구 분류군 879 str. F0557; 라크노스피라세애 박테리움 NK4A144; 클로로플렉서스 아그레간스 (Chloroflexus aggregans); 데메퀴나 아우란티아카 (Demequina aurantiaca); 탈라소스피라 (Thalassospira) sp. TSL5-1; 슈도부티리비브리오 (Pseudobutyrivibrio) sp. OR37; 부티리비브리오 (Butyrivibrio) sp. YAB3001; 블라우티아 sp. 마르세이유-P2398; 렙토트리키아 sp. 마르세이유-P3007; 박테로이데스 이후아에 (Bacteroides ihuae); 포르피로모나다세애 박테리움 (Porphyromonadaceae bacterium) KH3CP3RA; 리스테리아 리파리아 (Listeria riparia); 및 인솔리티스피릴럼 페레그리넘 (Insolitispirillum peregrinum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기체로부터 유래되는 것인 시스템.
- 제14항에 있어서, C2c2 이펙터 단백질은 렙토트리키아 웨이데이 F0279 또는 렙토트리키아 웨이데이 F0279 (Lw2) C2c2 이펙터 단백질인 시스템.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, RNA-압타머는 오크라톡신 A (OTA)을 인식하는 것인 시스템.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 해당 표적 분자에 결합하도록 디자인되는 하나 이상의 가이드 RNA는 (합성) 미스매치를 포함하는 것인 시스템.
- 제17항에 있어서, 상기 미스매치는 상기 표적 분자 내 SNP 또는 다른 단일 뉴클레오티드 변이의 상류 또는 하류에 존재하는 것인 시스템.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA는 표적 RNA 또는 DNA 내 단일 뉴클레오티드 다형성, 또는 RNA 전사물의 스플라이스 변이체를 검출하도록 디자인되는 것인 시스템.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA는 질환 상태에 대한 진단이 되는 하나 이상의 표적 분자에 결합하도록 디자인되는 것인 시스템.
- 제20항에 있어서, 질환 상태는 암인 시스템.
- 제21항에 있어서, 질환 상태는 자가면역 질환인 시스템.
- 제20항에 있어서, 질환 상태는 감염인 시스템.
- 제23항에 있어서, 감염은 바이러스, 박테리아, 진균, 원충 또는 기생충에 의해 초래되는 것인 시스템.
- 제24항에 있어서, 감염은 바이러스 감염인 시스템.
- 제25항에 있어서, 바이러스 감염은 DNA 바이러스에 의해 초래되는 것인 시스템.
- 제26항에 있어서, DNA 바이러스는 미오바이러스과 (Myoviridae), 포도바이러스과 (Podoviridae), 시포바이러스과 (Siphoviridae), 알로헤르페스바이러스과 (Alloherpesviridae), 헤르페스바이러스과 (Herpesviridae) (인간 헤르페스 바이러스, 및 바리셀라 조스터 바이러스 포함), 말로코헤르페스바이러스과 (Malocoherpesviridae), 리포트릭스바이러스과 (Lipothrixviridae), 루디바이러스과 (Rudiviridae), 아데노바이러스과 (Adenoviridae), 암풀라바이러스과 (Ampullaviridae), 아스코바이러스과 (Ascoviridae), 아스파바이러스과 (Asfarviridae) (아프리카 돼지 열병 바이러스 포함), 배큘로바이러스과 (Baculoviridae), 시카우다바이러스과 (Cicaudaviridae), 클라바바이러스과 (Clavaviridae), 코르티코바이러스과 (Corticoviridae), 푸셀로바이러스과 (Fuselloviridae), 글로불로바이러스과 (Globuloviridae), 구타바이러스과 (Guttaviridae), 히트로사바이러스과 (Hytrosaviridae), 이리도바이러스과 (Iridoviridae), 마세이유바이러스과 (Maseilleviridae), 미미바이러스과 (Mimiviridae), 누디바이러스과 (Nudiviridae), 니마바이러스과 (Nimaviridae), 판도라바이러스과 (Pandoraviridae), 파필로마바이러스과 (Papillomaviridae), 사이코드나바이러스과 (Phycodnaviridae), 플라스마바이러스과 (Plasmaviridae), 폴리드나바이러스 (Polydnavirus), 폴리오마바이러스과 (Polyomaviridae) (원숭이 바이러스 40, JC 바이러스, BK 바이러스 포함), 폭스바이러스과 (Poxviridae) (우두 및 천연두 포함), 스파에롤리포바이러스과 (Sphaerolipoviridae), 텍티바이러스과 (Tectiviridae), 투리바이러스과 (Turriviridae), 디노드나바이러스 (Dinodnavirus), 살터프로바이러스 (Salterprovirus), 리지도바이러스 (Rhizidovirus)인 시스템.
- 제25항에 있어서, 바이러스 감염은 이중-가닥 RNA 바이러스, 포지티브 센스 RNA 바이러스, 네거티브 센스 RNA 바이러스, 레트로바이러스, 또는 이의 조합에 의해 초래되는 것인 시스템.
- 제28항에 있어서, 바이러스 감염은 코로나바이러스과 (Coronaviridae) 바이러스, 피코르나바이러스과 (Picornaviridae) 바이러스, 칼리시바이러스과 (Caliciviridae) 바이러스, 플라비바이러스과 (Flaviviridae) 바이러스, 토가바이러스과 (Togaviridae) 바이러스, 보르나바이러스과 (Bornaviridae), 필로바이러스과 (Filoviridae), 파라믹소바이러스과 (Paramyxoviridae), 뉴모바이러스과 (Pneumoviridae), 라브도바이러스과 (Rhabdoviridae), 아레나바이러스과 (Arenaviridae,), 부니아바이러스과 (Bunyaviridae), 오르쏘믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae), 또는 델타바이러스 (Deltavirus)에 의해 초래되는 것인 시스템.
- 제29항에 있어서, 바이러스 감염은 코로나바이러스, SARS, 폴리오바이러스, 리노바이러스, A형 간염 바이러스, 노르워크 바이러스, 황열병 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, C형 간염 바이러스, 뎅기열 바이러스, 지카 바이러스, 루벨라 바이러스, 로스 리버 바이러스, 신드비스 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 보르나병 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 니파바이러스, 헨드라 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 공수병 바이러스, 라싸 바이러스, 한타바이러스, 크림-콩고 출혈열 바이러스, 인플루엔자, 또는 D형 간염 바이러스에 의해 초래되는 것인 시스템.
- 제24항에 있어서, 감염은 박테리아 감염인 시스템.
- 제31항에 있어서, 박테리아 감염을 초래하는 박테리아는 아시네토박터 (Acinetobacter) 종, 악티노바실러스 (Actinobacillus) 종, 악티노마이세테스 (Actinomycetes) 종, 악티노마이세스 (Actinomyces) 종, 애로코커스 (Aerococcus) 종, 애로모나스 (Aeromonas) 종, 아나플라스마 (Anaplasma) 종, 알칼리게네스 (Alcaligenes) 종, 바실러스 (Bacillus) 종, 박테리오데스 (Bacteriodes) 종, 바르토넬라 (Bartonella) 종, 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 종, 보르데텔라 (Bordetella) 종, 보렐리아 (Borrelia) 종, 브루셀라 (Brucella) 종, 버크홀데리아 (Burkholderia) 종, 캄필로박터 (Campylobacter) 종, 카프노사이토파가 (Capnocytophaga) 종, 클라미디아 (Chlamydia) 종, 시트로박터 (Citrobacter) 종, 콕시엘라 (Coxiella) 종, 코린박테리움 (Corynbacterium) 종, 클로스트리듐 (Clostridium) 종, 에이케넬라 (Eikenella) 종, 엔테로박터 (Enterobacter) 종, 에스케리치아 (Escherichia) 종, 엔테로코커스 (Enterococcus) 종, 엘리키아 (Ehlichia) 종, 에피더모피톤 (Epidermophyton) 종, 에리시펠로트릭스 (Erysipelothrix) 종, 유박테리움 (Eubacterium) 종, 프란시셀라 (Francisella) 종, 푸소박테리움 (Fusobacterium) 종, 가드네렐라 (Gardnerella) 종, 제멜라 (Gemella) 종, 헤모필러스 (Haemophilus) 종, 헬리코박터 (Helicobacter) 종, 킨겔라 (Kingella) 종, 클렙시엘라 (Klebsiella) 종, 락토바실러스 (Lactobacillus) 종, 락토코커스 (Lactococcus) 종, 리스테리아 (Listeria) 종, 렙토스피라 (Leptospira) 종, 레지오넬라 (Legionella) 종, 렙토스피라 (Leptospira) 종, 류코노스토크 (Leuconostoc) 종, 만헤이미아 (Mannheimia) 종, 마이코스포럼 (Microsporum) 종, 마이크로코커스 (Micrococcus) 종, 모라셀라 (Moraxella) 종, 모르가넬 (Morganell) 종, 모빌룬커스 (Mobiluncus) 종, 마이크로코커스 (Micrococcus) 종, 마이코박테리움 (Mycobacterium) 종, 마이코플라즘 (Mycoplasm) 종, 노카르디아 (Nocardia) 종, 네이세리아 (Neisseria) 종, 파스퇴렐라 (Pasteurelaa) 종, 페디오코커스 (Pediococcus) 종, 펩토스트렙토코커스 (Peptostreptococcus) 종, 피티로스포럼 (Pityrosporum) 종, 플레시오모나스 (Plesiomonas) 종, 프레보텔라 (Prevotella) 종, 포르피로모나스 (Porphyromonas) 종, 프로테우스 (Proteus) 종, 프로비덴시아 (Providencia) 종, 슈도모나스 (Pseudomonas) 종, 프로피오니박테리움 (Propionibacteriums) 종, 로도코커스 (Rhodococcus) 종, 리케치아 (Rickettsia) 종, 로도코커스 (Rhodococcus) 종, 세라티아 (Serratia) 종, 스테노트로포모나스 (Stenotrophomonas) 종, 살모넬라 (Salmonella) 종, 세라티아 (Serratia) 종, 시겔라 (Shigella) 종, 스타필로코커스 (Staphylococcus) 종, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 종, 스피릴럼 (Spirillum) 종, 스트렙토바실러스 (Streptobacillus) 종, 트레포네마 (Treponema) 종, 트로페리마 (Tropheryma) 종, 트리코피톤 (Trichophyton) 종, 우레아플라즈마 (Ureaplasma) 종, 베일로넬라 (Veillonella) 종, 비브리오 (Vibrio) 종, 여시니아 (Yersinia) 종, 잔토모나스 (Xanthomonas) 종, 또는 이의 조합인 시스템.
- 제24항에 있어서, 감염은 진균에 의해 초래되는 것인 시스템.
- 제33항에 있어서, 진균은 아스퍼질러스 (Aspergillus), 블라스토마이세스 (Blastomyces), 칸디디아시스 (Candidiasis), 콕시디오도미코시스 (Coccidiodomycosis), 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 크립토코커스 가티 (Cryptococcus gatti), sp. 히스토플라즈마 (Histoplasma) sp. (예컨대, 히스토플라즈마 캡슐라텀 (Histoplasma capsulatum)), 뉴모시스티스 (Pneumocystis) sp. (예컨대, 뉴모시스티스 지로베시 (Pneumocystis jirovecii)), 스타키보트리스 (Stachybotrys) (예컨대, 스타키보트리스 카르타럼 (Stachybotrys chartarum)), 무크로임코시스 (Mucroymcosis), 스포로트릭스 (Sporothrix), 진균성 안구 감염 백선 (fungal eye infections ringworm), 엑세로힐럼 (Exserohilum), 클라도스포리움 (Cladosporium), 제오트리컴 (Geotrichum), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 한세눌라 (Hansenula) 종, 칸디다 (Candida) 종, 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 종, 데바리오마이세스 (Debaryomyces) 종, 피키아 (Pichia) 종, 페니실리움 (Penicillium) 종, 클라도스포리움 (Cladosporium) 종, 비쏘클라미스 (Byssochlamys) 종 또는 이의 조합인 시스템.
- 제24항에 있어서, 감염은 원충에 의해 초래되는 것인 시스템.
- 제35항에 있어서, 원충은 유글레노조아 (Euglenozoa), 헤테롤로보세아 (Heterolobosea), 디플로모나디다 (Diplomonadida), 아메보조아 (Amoebozoa), 블라스토시스틱 (Blastocystic), 아피콤플렉사 (Apicomplexa), 또는 이의 조합인 시스템.
- 제24항에 있어서, 감염은 기생충에 의해 초래되는 것인 시스템.
- 제37항에 있어서, 기생충은 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi) (샤가스병), 트리파노소마 브루세이 감비엔스 (Trypanosoma brucei gambiense), 트리파노소마 브루세이 로데시엔스 (Trypanosoma bruceii rhodesiense), 리슈마니아 브라질리엔시스 (Leishmania braziliensis), 리슈마니아 인판텀 (Leishmania infantum), 리슈마니아 멕시카나 (Leishmania mexicana), 리슈마니아 마조르 (Leishmania major), 리슈마니아 트로피카 (Leishmania tropica), 리슈마니아 도노바니 (Leishmania donovani), 내글레리아 파울러리 (Naegleria fowleri), 지아르디아 인테스티날리스 (Giardia intestinalis) (지아르디아 람블리아 (Giardia lamblia), 지아르디아 두오데날리스 (Giardia duodenalis)), 칸타메바 카스텔라니 (canthamoeba castellanii), 발라무티아 마드릴라리스 (Balamuthia madrillaris), 엔타메바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica), 블라스토시스틱 호미니스 (Blastocystic hominis), 바베시아 미크로티 (Babesia microti), 크립토스포리듐 파르븀 (Cryptosporidium parvum), 시클로스포라 카이에타넨시스 (Cyclospora cayetanensis), 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스 (Plasmodium vivax), 플라스모듐 오발레 (Plasmodium ovale), 플라스모듐 말라리아 (Plasmodium malariae), 및 톡소플라즈마 곤디 (Toxoplasma gondii) 또는 이의 조합인 시스템.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 RNA 분자를 증폭시키기 위한 시약은 핵산 서열-기반 증폭 (NASBA), 리콤비나제 중합효소 증폭 (RPA), 루프-매개 등온 증폭 (LAMP), 가닥 전위 증폭 (SDA), 헬리카제-의존적 증폭 (HDA), 닉킹 효소 증폭 반응 (NEAR), PCR, 다중 전위 증폭 (MDA), 롤링 써클 증폭 (RCA), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 또는 세분화 증폭 방법 (RAM)을 포함하는 것인 시스템.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 농축 CRISPR 시스템을 더 포함하고, 농축 CRISPR 시스템은 검출 CRISPR 시스템에 의한 검출 이전에 해당 표적 분자에 결합하도록 디자인되는 것인 시스템.
- 제40항에 있어서, 농축 CRISPR 시스템은 촉매적 불활성 CRISPR 이펙터 단백질을 포함하는 것인 시스템.
- 제41항에 있어서, 촉매적 불활성 CRISPR 이펙터 단백질은 촉매적 불활성 C2c2인 시스템.
- 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 농축 CRISPR 이펙터 단백질은 태그를 더 포함하고, 태그는 농축 CRISPR 이펙터 시스템을 풀 다운시키거나, 또는농축 CRISPR 시스템을 고형 기재에 결합시키는데 사용되는 것인 시스템.
- 제43항에 있어서, 고형 기재는 플로우 셀인 시스템.
- 하나 이상의 개별 이산 부피를 포함하는 진단 장치로서, 각각의 개별 이산 부피는 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 CRISPR 시스템을 포함하는 것인 진단 장치.
- 제45항에 있어서, 각각의 개별 이산 부피는 핵산 증폭 시약을 더 포함하는 것인 진단 장치.
- 제45항에 있어서, 표적 분자는 표적 DNA이고, 개별 이산 부피는 표적 DNA에 결합하고 RNA 중합효소 프로모터를 포함하는 프라이머를 더 포함하는 것인 진단 장치.
- 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 개별 이산 부피는 액적인 진단 장치.
- 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 개별 이산 부피는 고형 기재 상에 한정되는 것인 진단 장치.
- 제49항에 있어서, 개별 이산 부피는 마이크로웰인 진단 장치.
- 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 개별 이산 부피는 기재 상에 한정된 스폿 (spot)인 진단 장치.
- 제51항에 있어서, 기재는 가요성 재료 기재인 진단 장치.
- 제52항에 있어서, 가요성 재료 기재는 종이 기재 또는 가요성 중합체 기반 기재인 진단 장치.
- 샘플에서 표적 핵산을 검출하기 위한 방법으로서,
샘플 또는 샘플의 세트를 하나 이상의 개별 이산 부피에 분배시키는 단계로서, 개별 이산 부피는 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 CRISPR 시스템을 포함하는 것인 단계;
하나 이상의 가이드 RNA와 하나 이상의 표적 분자의 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에서 샘플 또는 샘플의 세트를 인큐베이션시키는 단계;
하나 이상의 가이드 RNA와 하나 이상의 표적 분자의 결합을 통해 CRISPR 이펙터 단백질을 활성화시키는 단계로서, CRISPR 이펙터 단백질의 활성화는 사중체를 포함하는 RNA-압타머의 변형을 야기시켜서 사중체의 효소 활성을 불활성화시키는 것인 단계; 및
효소 활성을 검출하는 단계로서, 한계치 미만의 검출은 샘플에 하나 이상의 표적 분자의 존재를 의미하는 것인 단계
를 포함하는 것인, 검출 방법. - 제54항에 있어서, 표적 분자는 표적 DNA이고 방법은 RNA 중합효소 부위를 포함하는 프라이머와 표적 DNA를 결합시키는 단계를 더 포함하는 것인 검출 방법.
- 제54항 또는 제55항에 있어서, 샘플 RNA 또는 기폭제 RNA를 증폭시키는 단계를 더 포함하는 것인 검출 방법.
- 제56항에 있어서, RNA를 증폭시키는 단계는 NASBA에 의한 증폭을 포함하는 것인 검출 방법.
- 제56항에 있어서, RNA를 증폭시키는 단계는 RPA에 의한 증폭을 포함하는 것인 검출 방법.
- 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 생물학적 샘플 또는 환경 샘플인 검출 방법.
- 제59항에 있어서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 대변, 객담, 점액, 림프액, 활액, 담즙, 복수, 흉수, 장액종, 타액, 뇌척수액, 안방수 또는 유리체액, 또는 임의의 신체 분비액, 여출액, 삼출액 (예를 들어, 농양 또는 임의의 다른 감염 또는 염증 부위로부터 얻은 체액), 또는 관절 (예를 들어, 정상 관절, 또는 류마티스성 관절염, 골관절염, 통풍성 또는 화농성 관절염과 같은 질환을 앓는 관절)로부터 얻은 체액, 또는 피부 또는 점막 표면의 스왑인 검출 방법.
- 제59항에 있어서, 환경 샘플은 음식물 샘플, 종이 표면, 패브릭, 금속 표면, 목재 표면, 플라스틱 표면, 토양 샘플, 담수 샘플, 폐수 샘플, 염수 샘플, 또는 이의 조합으로부터 수득되는 것인 검출 방법.
- 제54항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA는 표적 RNA 또는 DNA 내 단일 뉴클레오티드 다형성, 또는 RNA 전사물의 스플라이스 변이체를 검출하도록 디자인되는 것인 검출 방법.
- 제54항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA는 질환 상태에 대한 진단이 되는 하나 이상의 표적 분자에 결합하도록 디자인되는 것인 검출 방법.
- 제54항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA는 세포 무함유 핵산에 결합하도록 디자인되는 것인 검출 방법.
- 제63항에 있어서, 질환 상태는 감염, 장기 질환, 혈액 질환, 면역계 질환, 암, 뇌 및 신경계 질환, 내분비 질환, 임신 또는 출산 관련 질환, 유전 질환, 또는 환경-획득 질환인 검출 방법.
- 샘플에서 표적 핵산을 검출하기 위한 방법으로서,
샘플을 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 핵산 검출 시스템과 접촉시키는 단계; 및
상기 접촉된 샘플을 측류 면역크로마토그래피 어세이에 적용하는 단계
를 포함하는 것인, 검출 방법. - 제54항에 있어서, 사중체의 효소 활성은 샘플에서 색상 신호를 생성시키는 것인 검출 방법.
- 제67항에 있어서, 사중체의 효소 활성의 불활성화는 색상 신호의 상실을 일으키고, 색상 신호의 상실은 표적 분자의 존재를 의미하는 것인 검출 방법.
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