KR20200085299A - 수지상 세포 요법을 위한 방법 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 더욱 유리한 치료 결과를 경험할 가능성이 있는 환자를 확인하고 치료하기 위해 면역계 파라미터를 평가하는 방법을 제공한다. 본 발명은 환자 내의 특정 유형의 치료 지표의 수준 및/또는 양의 적어도 하나의 값 또는 측정치를 수득하고, 상기 값 또는 측정치가 이러한 값 또는 측정치에 대한 치료 역치 값을 초과하는지 또는 역치 값 미만인지를 확인하고, 수지상 세포 요법을 환자에게 투여하는 것에 의해 수지상 세포 요법으로 인간 환자를 치료하는 방법을 또한 제공한다.
Description
발명의 분야
본 발명은 수지상 세포의 치료용 용도, 및 수지상 세포 요법으로의 치료가 유효할 가능성에 대한 환자 평가에 관한 것이다.
배경
세포 요법은 변형된 항원 제시 세포 (APC) 또는 면역 이펙터 세포를 이용하여 환자에서 면역 반응을 개시시킨다. 항원 제시 세포가 세포 요법에 중요한데, 이들이 면역 반응을 개시시키기 때문이다; 구체적으로, 이들은 T 림프구로부터 1차 면역 반응을 유도할 수 있다.
수지상 세포 (DC)는 적응 면역에서 수반되는 가장 강력한 APC이다. 이는 나이브 T 세포 및 B 세포에 의한 면역 반응의 개시를 조정하고, 항원-특이적 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 유도한다. DC는 생체 내에서 헬퍼 및 킬러 T 세포를 프라이밍하도록 여러 방식으로 특수화된다. 예를 들어, 말초 조직에 존재하는 미성숙 DC는 항원을 포획하도록, 그리고 면역원성 MHC-펩티드 복합체를 생산하도록 채비된다. 미성숙 DC는 성숙-유도 자극 예컨대 염증성 시토카인에 반응하여 부착 및 공동-자극 분자를 상향조절함으로써 강력한 T 세포 자극제로 발달되고, 2차 림프 기관 내로 이동하여 희귀한 항원-특이적 T 세포를 선택 및 자극한다. T 세포의 강력한 자극은 반응 중인 T-세포의 이펙터 기능을 나타내는 공동-자극 분자에 더하여 세포 표면 상의 MHC/펩티드 복합체의 이용가능성을 증가시키는 프로세스인 DC 성숙 후에만 발생한다.
T 세포가 클론 확장을 유도하기 위한 충분한 시토카인 수준을 생산하기 위해 전형적으로 공동-자극이 필요하다. 수지상 세포를 강력한 항원 제시 세포로 만드는 수지상 세포의 한가지 특징은 면역 반응의 공동-자극 분자, 예컨대 T 림프구 상의 CD28 분자를 활성화시키는 CD80 및 CD86 분자가 풍부하다는 것이다. 다시, T-헬퍼 세포는 DC 상의 CD40에 결찰되는 CD40L (CD40 리간드)를 발현한다. DC와 T 세포 사이의 이러한 상호작용은 DC 성숙 및 T 세포에서의 이펙터 기능의 발달에 이른다. CD54 분자 또는 CD11a/CD18 분자와 같은 부착 분자의 발현은 DC와 T 세포 사이의 협력을 용이하게 한다. DC의 또 다른 특별한 특성은 분화 단계에 따른 상이한 기능의 전개이다. 예를 들어, 미성숙 수지상 세포의 2개의 주요 기능은 항원 포획 및 항원 변환인 반면, 수지상 세포가 조직 및 림프계 내로 이동하여 성숙함에 따라 T 세포를 자극하도록 항원을 제시하는 능력이 증가한다. 따라서, 미성숙 수지상 세포가 성숙 수지상 세포로 이행되는 것이 면역 반응의 개시에서의 기초적인 단계이다.
일부 보고에서, 성숙 프로세스 동안 세포 상의 표면 마커의 변화를 모니터링함으로써 DC 성숙이 추적되었다. DC 성숙의 상이한 단계들에 특징적인 더욱 중요한 세포 표면 마커 중 일부는 조혈 줄기 세포에 대한 CD34+; 단핵구에 대한 CD14++, DR+, CD86+, CD16+/-, CD54+, 및 CD40+; 미성숙 수지상 세포에 대한 CD14+/-, CD16-, CD80+/-, CD83-, CD86+, CD1a+, CD54+, DQ+, 및 DR++; 및 성숙 수지상 세포에 대한 CD14-, CD83++, CD86++, CD80++, DR+++, DQ++, CD40++, CD54++, 및 CD1a+/-를 포함하고, 여기서 "+"는 양성 발현을 가리키고, "++"는 더 높은 발현을 가리키며, "+/-"는 더 약하거나 또는 더 낮은 발현을 가리키고, "-"는 매우 약하거나, 낮거나 또는 검충불가능한 발현을 가리킨다. 관련 분야에 공지된 바와 같이 (예를 들어, 문헌 [Hasan et al. (2015) Clin. Immunol. 157: 261-76] 참조), 표면 마커 및 다른 유전자의 발현은 세포의 성숙 프로세스, 뿐만 아니라 발현을 측정하는 방법에 따라 변할 수 있다.
면역요법의 경우, 현재 성숙 DC가 미성숙 DC보다 선호된다. 완전 성숙 DC 자손만 GM-CSF 수용체 (GM-CSF-R)가 결여되고, GM-CSF의 제거 및/또는 부재 시에 안정적으로 성숙 상태를 유지한다. 성숙 DC는 또한 시험관 내에서, 그리고 생체 내에서 T 세포 반응을 유도하는데 우수한 것으로 나타났고, 시험관 내에서 또는 생체 내에서 항원을 집어올려 T-림프구에 제시할 수 있다. 변형된 항원-제시 DC 및/또는 이러한 변형 DC로부터 교육된 T 세포는 진단, 요법, 백신접종, 연구, 스크리닝 및 유전자 전달을 포함하는 다수의 용도가 있다.
말초혈로부터 성숙 수지상 세포를 단리하는 것이 어려운데, 이는 백혈구 세포의 1% 미만이 이러한 범주에 속하기 때문이고, 성숙 DC는 조직으로부터 추출하기도 어렵다. 이러한 어려움은 연구 및 개발이 대안적인 공급원을 사용하여 성숙 수지상 세포를 생성시키는 새로운 방법을 향하게 하였다. 여러 방법이 미성숙 수지상 세포로부터 성숙 DC를 생산하는 것으로 보고되고, 상이한 방법들이 상이한 성질을 갖는 DC를 생산할 수 있는 것으로 나타났다.
PME-CD40L DC는 표현형적으로 또한 CD83+ 및 CCR7+인 성숙 DC이다. PME-CD40L DC는, 예를 들어, (a) 단리된 미성숙 수지상 세포 (iDC)를 TNF-αR 효능제 및 PGE2의 존재 하에 약 12 내지 30시간 동안 인터페론 감마 수용체 (IFN-γR) 효능제와 함께 배양하여 CD83+ 성숙 수지상 세포를 생산하고; (b) 상기 CD83+ 성숙 수지상 세포 (mDC)에 CD40 효능제를 형질감염시켜 일시적인 CD40 신호를 생산하는 순차적인 단계들을 포함하는 방법에 의해 생산될 수 있다. CD40 효능제는 CD40L 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA로서 제공될 수 있다; 일부 경우에, 이러한 mRNA는 WO2007117682의 서열식별번호(SEQ ID NO): 2의 아미노산 잔기 21-261로 이루어지는 CD40L 폴리펩티드를 코딩한다. CD40L 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA는 항원을 코딩하는 mRNA와 함께 공동형질되어 PME-CD40L DC를 생산할 수 있다.
PME-CD40L DC의 생산을 위한 더욱 상세한 방법은 WO2006042177 (힐리(Healey) 등); WO2007117682 (체레파노바(Tcherepanova) 등); 문헌 [DeBenedette et al. (2008) J. Immunol. 181: 5296-5305]; 및 [Calderhead et al. (2008) J. Immunother. 31: 731-41]에 개시된 것들을 포함한다. 생성된 "PME-CD40L" DC를 암 또는 면역 질환 또는 장애에 걸린 인간 환자를 치료하는데 사용할 수 있고, 또한 유리한 T 세포의 생체내 또는 시험관내 생산을 자극하는데 사용할 수 있다.
PME-CD40L DC는 WO 2015/127190 (드베네데트(DeBenedette) 등) 및 상응하는 미국 공개 번호 20170065690 (드베네데트 등)에 기술된 바와 같이, 생체내 및 시험관내 양쪽 모두에서 "줄기 세포 기억" T 세포 ("TSCM 세포")의 생산을 자극하는 것을 포함하여 유리한 성질이 있다. TSCM 세포는 다능성인 줄기 기억 T 세포이고, 또한 자체가 TSCM 세포인 자손 세포를 일으킬 수 있다. PME-CD40L DC 노출에 의한 TSCM 세포의 생산이 AIDS 또는 HIV 감염을 포함하는 면역 질환 또는 장애에 걸린 인간 환자에서 발생할 수 있고, PME-CD40L DC가 림프구와 함께 공동-배양될 때 시험관 내에서 발생할 수도 있다. 또한 PME-CD40L DC는 장기간의 항원-특이적 CTL 이펙터 기능을 지지하는 것으로, 그리고 급속 확장 고-결합도(Rapidly Expanding High-Avidity) ("REHA") 세포로 지정된 이펙터 기억 CTL의 유형을 유도하는 것으로 나타났다 (문헌 [DeBenedette et al. (2008) J. Immunol. 181: 5296-5305] 참조). 그 후, 이러한 TSCM 및/또는 REHA 세포를 환자 내로 재도입하여, 이들이 유래된 환자의 면역 반응을 자극하는 것을 도울 수 있거나 (즉, 자가 치료), 또는 입양 전달 요법에서 또 다른 환자를 치료할 수 있다 (즉, 이종 치료).
"AGS-003" 또는 "로카풀덴센(Rocapuldencel)-T"로 지정된, 신세포 암종에 대한 아고스 쎄라퓨틱스 인크(Argos Therapeutic, Inc.) ("아고스")의 PME-CD40L DC 요법의 3상 임상 시험이 2013년 1월에 시작되었고, 현재 진행 중이다. 이러한 "ADAPT" 시험은 표준 진료 ("SOC") 단독에 대비하여 SOC와 조합된 로카풀덴셀-T를 받고 있는 전이성 신세포 암종 ("mRCC")이 새롭게 진단된 환자에서 전체 생존 ("OS")을 평가하기 위해 디자인되었다. 2017년 2월에, 독립적인 데이터 모니터링 위원회(Independent Data Monitoring Committee) ("IDMC")가 중간 분석을 수행하였고, 위험비가 1.10인 것으로 발견되었으며, 이는 0.98의 최종 중간 분석에 대한 사전 정의된 무용성 경계보다 더 컸다. 따라서, IDMC는 무용성으로 인해 연구를 중단할 것을 권고하였다. 아고스는 연구로부터의 입수가능한 데이터의 광범위한 분석을 수행하였고, FDA와의 협의 후, 임상 시험을 계속하기로 결정하였다 (2017년 4월 18일자의 문헌 [Argos Press Release] 참조).
발명의 개요
놀랍게도, 본 발명가들은 특정한 면역계 성질을 갖는 환자가 수지상 세포 요법으로부터 유리한 치료 결과를 경험할 가능성이 더 높다는 것을 발견하였다. 본 발명은 더욱 유리한 치료 결과를 경험할 가능성이 있는 환자를 확인하고 치료하는 것을 돕는데 사용하기 위한, 면역계 파라미터, 예를 들어, 조절 T 세포 ("Treg") 카운트를 평가하는 방법을 제공한다.
예를 들어, Treg 세포의 수준이 높은 환자는 수지상 세포 요법이 이로울 가능성이 있다. 이러한 환자를 효과적인 수지상 세포 요법으로 치료하는 것은 면역 반응을 일으키고, 이 중 일부는 상기 환자 내의 Treg 세포의 수 및/또는 수준의 감소이다. 이러한 환자는 수지상 세포 요법이 Treg 세포의 수준이 더 낮은 다른 환자보다 더 많이 이로울 수 있다.
일부 실시양태에서, 환자를 치료하는데 사용되는 수지상 세포 요법은 항원이 로딩된 PME-CD40L 성숙 DC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원을 코딩하는 RNA로의 형질감염에 의해 항원이 DC에 로딩된다. 일부 실시양태에서, 항원을 코딩하는 RNA는 환자의 암 세포로부터 제조된다 (즉, 항원은 환자에 대해 "자가"이다).
따라서, 본 발명은 환자 내의 특정 유형의 치료 지표, 예를 들어, 면역 세포 및/또는 혈청 화학 마커의 수준 및/또는 양의 적어도 하나의 값 또는 측정치를 수득하고; 상기 값 또는 측정치가 적절하게는 이러한 값 또는 측정치에 대한 치료 역치 값을 초과하는지 또는 역치 값 미만인지를 확인하고; 수지상 세포 요법을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 수지상 세포 요법으로 인간 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 특정 유형의 치료 지표의 수준 및/또는 양의 적어도 하나의 값 또는 측정치를 수득하고; 상기 값 또는 측정치가 적절하게는 이러한 값 또는 측정치에 대한 치료 역치 값을 초과하는지 또는 역치 값 미만인지를 확인하고; 수지상 세포 요법을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에게 수지상 세포 요법을 투여하는 방법을 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 2개, 3개 또는 4개의 값 또는 측정치를 수득하고, 각각에 대해 치료 역치 값이 충족되었음을 확인하고, 수지상 세포 요법을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 환자 혈액 내의 단위 부피 당 Treg의 카운트를 수득하고; 상기 카운트가 Treg의 치료 역치 값을 초과하는 것을 확인하고; 수지상 세포 백신을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 환자를 수지상 세포 요법으로 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료 역치 값은 적어도 500개의 Treg/환자 전혈 100 마이크로리터, 또는 적어도 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 또는 900 개의 Treg/환자 전혈 100 마이크로리터의 Treg/혈액 단위 부피이다. 일부 실시양태에서, 방법은 Treg 세포인 CD4+ 세포의 백분율을 결정하는 것을 포함하고, 치료 역치 값은 적어도 1%, 1.5%, 1.75%, 또는 2% 또는 이를 초과하는 %이다.
일부 실시양태에서, Treg의 치료 역치 값은 질환 또는 장애 예컨대 암 또는 면역 질환 또는 장애의 임의의 치료적 및/또는 제약적 처치 전에 환자에서 측정된다 (본원에서 "기준선"으로 지칭됨). 일부 실시양태에서, 환자 내의 Treg의 역치 값은 질환 또는 장애에 대한 1회 이상의 치료적 및/또는 제약적 처치 후에 측정된다.
일부 실시양태에서, 수지상 세포 요법으로 환자를 치료하는 것은, 예를 들어, 환자의 혈액 내의 단위 부피 당 Treg의 수의 감소에 의해 측정되는 바와 같이, 면역 반응을 자극한다. 본 발명은 치료 후 환자에서의 면역 반응의 자극을 평가하는 방법, 예를 들어, 하기에 추가로 기술되는 바와 같이 세포 집단 예컨대 Treg/eff 세포의 증가를 검출하는 방법을 또한 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 전혈 내의 T 조절 세포 ("Treg")를 확인하기 위한 다색 세포 유동측정법 게이팅 전략을 나타낸다. 왼쪽 패널은 FoxP3 (y축) 및 CD4 (x축) 발현에 의해 게이팅된 CD3+ T 세포를 나타낸다. FoxP3+ 및 CD4+로서 확인된 세포 (왼쪽 패널, 우상단 사분면)를 오른쪽 패널에 나타난 바와 같이 CD127 (y축) 및 CD25 (x축)발현에 대해 추가로 게이팅하여, FoxP3+/CD4+/CD25+/CD127- Treg 세포가 오른쪽 패널의 우하단 사분면에서 정량된다. 트루카운트(Trucount) 비드 튜브 (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))를 사용하여 T 조절 세포의 수를 결정한다. 왼쪽 및 패널의 각각의 코너에서 제시된 숫자는 내부선에 의해 규정된 이러한 사분면 내의 세포의 백분율을 가리킨다. 오른쪽 패널은 왼쪽 패널에서 FoxP3+ 및 CD4+로서 확인된 세포의 추가 게이팅을 나타내기 때문에, 원래의 세포 집단 내의 FoxP3+/CD4+/CD25+/CD127- Treg 세포의 백분율은 8.44%의 44.1%, 또는 3.72%로서 계산될 수 있다.
도 2는 PD-1 및 CXCR4 발현에 의한 Foxp3+/CD25+ Treg 서브세트의 시험관내 검출을 나타낸다. 세포를 다색 세포 유동측정법을 사용하여 정량한다. 이러한 방법은 혈액 또는 조직 배양 배지의 부피 당 절대 세포수를 결정한다. PBMC를 AGS-003 임상 시험에 등록된 환자로부터 2차 방문 (AGS-003 투여 전) 및 12차 방문 (7차 용량의 AGS-003을 환자에게 투여한 후) 시에 수집하였다. PBMC를 10% AB 혈청을 함유하는 엑스비보(Xvivo) 배지에서 6일 동안 배양하였다; 추가 자극을 배양물에 첨가하지 않았다. 제6일에, PBMC 배양물을 유동 세포측정법을 위해 염색하여, 활성화된 FoxP3+/CD25+/CD4+ T 세포의 수를 결정하였다. 먼저, 도 2의 가장 왼쪽의 패널 내의 상자 영역에 제시된 바와 같이, CD4+ T 세포를 게이팅하여 CD25+/CD45RA- T 세포를 확인하였다. 그 후, 이러한 CD25+/CD45RA- T 세포를 이의 PD-1 발현 및 이의 CD4 발현 수준을 결정하도록 추가로 게이팅하여 (도 2의 두번째 패널 세트를 참조한다), Treg를 Treg/eff 세포로부터 구별하였고, 이때 PD-1-/CD4 저-발현 (Treg) 세포는 이러한 패널의 좌하단 사분면에 제시되고, PD-1+/CD4 고-발현 Treg 이펙터 세포 (Treg/eff)는 우상단 사분면에 제시된다. 그 후, 도 2의 왼쪽에서 세번째 및 네번째 패널에서 각각 제시된 바와 같이, 이러한 Treg/eff 및 Treg 집단 각각을 FoxP3 (y축) 및 CXCR4 (x축)의 발현에 대해 서브게이팅하였다. 세번째 패널 세트는 PD-1+/CD4 고-발현/FoxP3+ 세포가 CXCR4 음성임을 나타낸다 (도 2, 세번째 패널 세트, 좌상단 사분면). 네번째 패널 세트는 PD-1-/CD4 저-발현/FoxP3+ 세포가 CXCR4 양성임을 나타낸다 (도 2, 네번째 패널 세트, 우상단 사분면). 제시된 바와 같이, 이러한 게이팅 전략은 CD4+/CD25+/CD45RA-/FoxP3+ T 조절 세포의 2개의 FoxP3+ 서브세트를 확인하는데 사용될 수 있다: 각각 세번째 및 네번재 패널 세트에서 제시된 T reg/eff (FoxP3+/PD-1+/CXCR4-) 및 Treg (FoxP3+/PD-1-/CXCR4+). 치료-전 PBMC를 7회 용량의 AGS-003 수지상 세포 제품을 투여한 후의 동일한 환자로부터의 PBMC에 비교하는 이러한 데이터에 의해 입증된 바와 같이, AGS-003 치료는 시험관내 배양 확장 후 Treg/eff 세포의 수를 증가시킬 수 있다.
도 3은 PD-1 및 CXCR4의 조합 발현에 의한 고전적 Treg 세포 및 Treg/eff 세포의 분화를 도해한다. 고전적 Treg 세포는 PD-1-/CXCR4+이고, Treg 이펙터 세포는 PD-1+/CXCR4-이다. 도 3은 AGS-003 DC 제품으로 자극되었을 때 시험관 내에서 CD4+/PD-1+/FoxP3+ T 세포가 증식하는 것을 나타낸다. 환자의 1차 방문 (기준선) 시에 수집된 PBMC를 자가 AGS-003 DC 제품과 함께 10:1 비의 10% AB 혈청을 함유하는 엑스비보 배지에서 6일 동안 배양하였다. 도 3은 CD25+/CD4+ T 세포 (첫번째 패널, 상자 영역)를 확인하기 위해 먼저 CD25 및 CD4의 발현에 대해 게이팅된 세포를 나타낸다; 그 후, 이러한 세포를 PD-1의 발현 (두번째 패널)에 의해 PD-1+ (두번재 패널, 우상단 사분면) 및 PD-1- T 세포로 게이팅하였다. 그 후, 세포를 FoxP3 발현 및 세포 주기 마커 Ki67의 발현에 대해 검사하여 증식을 결정하였다 (도 3, 세번째 및 네번째 패널). Treg/eff 세포는 증식 중인 것으로 나타난 한편 (도 3, 세번째 패널, 우상단 사분면, CD4+ 고-발현/CD25+/FoxP3+/PD-1+ 세포가 Ki67+ 세포를 포함하는 것을 나타냄), 대부분의 Treg 세포는 그렇지 않았다 (도 3, 네번째 패널, 좌상단 사분면, CD4+ 저-발현/CD25+/FoxP3+/PD-1- 세포가 대부분 Ki67- 세포를 포함하는 것을 나타냄).
도 4는 PBMC를 AGS-003 DC 자가 제품과 함께 시험관 내에서 배양한 후의 Treg 이펙터 세포 및 CTL의 동반 확장을 나타낸다. PBMC를 기준선에 15명의 ADAPT 임상 시험 대상체로부터 수집하고, 자가 AGS-003 DC 제품과 함께 6일 동안 배양하였다. 제6일에, CD3+/CD8+/CD25+/CD45RA-/Grb+ CTL의 수 (y축)를 결정하고, CD3+/CD4+/CD25+CD45RA-/PD-1+/Foxp3+ Treg 이펙터 세포의 수 (x축)에 대비하여 플롯팅하였다. 배양물 내의 CTL과 Treg/eff 세포의 수 사이에서 통계적으로 유의한 연관이 검출되었다 (ρ=0.59, p<0.0208).
도 5는 기준선 림프구 카운트가 최고 사분위수에 속한 아고스의 ADAPT 임상 시험에 등록된 환자의 전체 생존의 카플란-마이어 플롯을 나타낸다. 조합 치료 아암의 환자 (AGS-003 + 표준 진료, 윗선)로부터의 데이터 대 표준 진료 아암의 환자로부터의 데이터의 위험비는 0.5999였다.
도 6은 기준선 림프구/단핵구 비가 최고 사분위수에 속한 아고스의 ADAPT 임상 시험에 등록된 환자의 전체 생존의 카플란-마이어 플롯을 나타낸다. 조합 치료 아암의 환자 (AGS-003 + 표준 진료, 그래프의 오른쪽 측면 상의 윗선)로부터의 데이터 대 표준 진료 아암의 환자로부터의 데이터의 위험비는 0.7356이었다.
도 7은 기준선 C-반응성 단백질 값이 최고 사분위수에 속한 아고스의 ADAPT 임상 시험에 등록된 환자의 전체 생존의 카플란-마이어 플롯을 나타낸다. 조합 치료 아암의 환자 (AGS-003 + 표준 진료, 윗선)로부터의 데이터 대 표준 진료 아암의 환자로부터의 데이터의 위험비는 0.7164였다.
도 8은 기준선 % Treg 값에 의해 군으로 나뉜 아고스의 ADAPT 임상 시험에 등록된 환자의 전체 생존의 카플란-마이어 플롯을 나타낸다. 시험의 조합 치료 아암의 환자 (AGS-003 + 표준 진료)로부터의 데이터는 왼쪽 패널에서 제시되고, 표준 진료 아암의 환자로부터의 데이터는 오른쪽 패널에 제시된다. 조합 치료 아암 (왼쪽 패널)에서, 윗선은 기준선 % Treg 값이 상위 3개의 사분위수에 속한 환자로부터의 데이터를 나타내는 한편, 아랫선은 기준선 % Treg 값이 최하 사분위수에 속하는 환자로부터의 데이터를 나타낸다. 표준 진료 아암 (오른쪽 패널)에서, 윗선 (오른쪽으로 확장되었을 때)은 기준선 % Treg 값이 최저 사분위수에 속하는 환자로부터의 데이터를 나타내고, 아랫선은 기준선 % Treg 값이 상위 3개의 사분위수에 속하는 환자로부터의 데이터를 나타낸다.
도 9는 기준선 % Treg 값이 상위 3개의 사분위수에 속하는 아고스의 임상 시험에 등록된 환자의 전체 생존의 카플란-마이어 플롯을 나타낸다. 조합 치료 아암의 환자 (AGS-003 + 표준 진료)로부터의 데이터 대 표준 진료 아암의 환자로부터의 데이터의 위험비는 0.74였다.
도 10은 기준선 단핵구 카운트에 의해 군으로 나뉜 아고스의 임상 시험의 조합 아암에 등록된 환자의 전체 생존의 카플란-마이어 플롯을 나타낸다. 단핵구 카운트가 중앙 값 이하인 환자 (윗선)로부터의 데이터 대 단핵구 카운트가 중앙 값을 초과하는 환자 (아랫선)로부터의 데이터의 위험비는 0.6498이었다.
도 11은 기준선 혈소판 카운트가 최고 사분위수에 속하는 아고스의 임상 시험의 조합 아암에 등록된 환자의 전체 생존의 카플란-마이어 플롯을 나타낸다. 조합 치료 아암의 환자 (AGS-003 + 표준 치료, 윗선)로부터의 데이터 대 표준 치료 아암의 환자로부터의 데이터의 위험비는 0.6954였다.
도 1은 전혈 내의 T 조절 세포 ("Treg")를 확인하기 위한 다색 세포 유동측정법 게이팅 전략을 나타낸다. 왼쪽 패널은 FoxP3 (y축) 및 CD4 (x축) 발현에 의해 게이팅된 CD3+ T 세포를 나타낸다. FoxP3+ 및 CD4+로서 확인된 세포 (왼쪽 패널, 우상단 사분면)를 오른쪽 패널에 나타난 바와 같이 CD127 (y축) 및 CD25 (x축)발현에 대해 추가로 게이팅하여, FoxP3+/CD4+/CD25+/CD127- Treg 세포가 오른쪽 패널의 우하단 사분면에서 정량된다. 트루카운트(Trucount) 비드 튜브 (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))를 사용하여 T 조절 세포의 수를 결정한다. 왼쪽 및 패널의 각각의 코너에서 제시된 숫자는 내부선에 의해 규정된 이러한 사분면 내의 세포의 백분율을 가리킨다. 오른쪽 패널은 왼쪽 패널에서 FoxP3+ 및 CD4+로서 확인된 세포의 추가 게이팅을 나타내기 때문에, 원래의 세포 집단 내의 FoxP3+/CD4+/CD25+/CD127- Treg 세포의 백분율은 8.44%의 44.1%, 또는 3.72%로서 계산될 수 있다.
도 2는 PD-1 및 CXCR4 발현에 의한 Foxp3+/CD25+ Treg 서브세트의 시험관내 검출을 나타낸다. 세포를 다색 세포 유동측정법을 사용하여 정량한다. 이러한 방법은 혈액 또는 조직 배양 배지의 부피 당 절대 세포수를 결정한다. PBMC를 AGS-003 임상 시험에 등록된 환자로부터 2차 방문 (AGS-003 투여 전) 및 12차 방문 (7차 용량의 AGS-003을 환자에게 투여한 후) 시에 수집하였다. PBMC를 10% AB 혈청을 함유하는 엑스비보(Xvivo) 배지에서 6일 동안 배양하였다; 추가 자극을 배양물에 첨가하지 않았다. 제6일에, PBMC 배양물을 유동 세포측정법을 위해 염색하여, 활성화된 FoxP3+/CD25+/CD4+ T 세포의 수를 결정하였다. 먼저, 도 2의 가장 왼쪽의 패널 내의 상자 영역에 제시된 바와 같이, CD4+ T 세포를 게이팅하여 CD25+/CD45RA- T 세포를 확인하였다. 그 후, 이러한 CD25+/CD45RA- T 세포를 이의 PD-1 발현 및 이의 CD4 발현 수준을 결정하도록 추가로 게이팅하여 (도 2의 두번째 패널 세트를 참조한다), Treg를 Treg/eff 세포로부터 구별하였고, 이때 PD-1-/CD4 저-발현 (Treg) 세포는 이러한 패널의 좌하단 사분면에 제시되고, PD-1+/CD4 고-발현 Treg 이펙터 세포 (Treg/eff)는 우상단 사분면에 제시된다. 그 후, 도 2의 왼쪽에서 세번째 및 네번째 패널에서 각각 제시된 바와 같이, 이러한 Treg/eff 및 Treg 집단 각각을 FoxP3 (y축) 및 CXCR4 (x축)의 발현에 대해 서브게이팅하였다. 세번째 패널 세트는 PD-1+/CD4 고-발현/FoxP3+ 세포가 CXCR4 음성임을 나타낸다 (도 2, 세번째 패널 세트, 좌상단 사분면). 네번째 패널 세트는 PD-1-/CD4 저-발현/FoxP3+ 세포가 CXCR4 양성임을 나타낸다 (도 2, 네번째 패널 세트, 우상단 사분면). 제시된 바와 같이, 이러한 게이팅 전략은 CD4+/CD25+/CD45RA-/FoxP3+ T 조절 세포의 2개의 FoxP3+ 서브세트를 확인하는데 사용될 수 있다: 각각 세번째 및 네번재 패널 세트에서 제시된 T reg/eff (FoxP3+/PD-1+/CXCR4-) 및 Treg (FoxP3+/PD-1-/CXCR4+). 치료-전 PBMC를 7회 용량의 AGS-003 수지상 세포 제품을 투여한 후의 동일한 환자로부터의 PBMC에 비교하는 이러한 데이터에 의해 입증된 바와 같이, AGS-003 치료는 시험관내 배양 확장 후 Treg/eff 세포의 수를 증가시킬 수 있다.
도 3은 PD-1 및 CXCR4의 조합 발현에 의한 고전적 Treg 세포 및 Treg/eff 세포의 분화를 도해한다. 고전적 Treg 세포는 PD-1-/CXCR4+이고, Treg 이펙터 세포는 PD-1+/CXCR4-이다. 도 3은 AGS-003 DC 제품으로 자극되었을 때 시험관 내에서 CD4+/PD-1+/FoxP3+ T 세포가 증식하는 것을 나타낸다. 환자의 1차 방문 (기준선) 시에 수집된 PBMC를 자가 AGS-003 DC 제품과 함께 10:1 비의 10% AB 혈청을 함유하는 엑스비보 배지에서 6일 동안 배양하였다. 도 3은 CD25+/CD4+ T 세포 (첫번째 패널, 상자 영역)를 확인하기 위해 먼저 CD25 및 CD4의 발현에 대해 게이팅된 세포를 나타낸다; 그 후, 이러한 세포를 PD-1의 발현 (두번째 패널)에 의해 PD-1+ (두번재 패널, 우상단 사분면) 및 PD-1- T 세포로 게이팅하였다. 그 후, 세포를 FoxP3 발현 및 세포 주기 마커 Ki67의 발현에 대해 검사하여 증식을 결정하였다 (도 3, 세번째 및 네번째 패널). Treg/eff 세포는 증식 중인 것으로 나타난 한편 (도 3, 세번째 패널, 우상단 사분면, CD4+ 고-발현/CD25+/FoxP3+/PD-1+ 세포가 Ki67+ 세포를 포함하는 것을 나타냄), 대부분의 Treg 세포는 그렇지 않았다 (도 3, 네번째 패널, 좌상단 사분면, CD4+ 저-발현/CD25+/FoxP3+/PD-1- 세포가 대부분 Ki67- 세포를 포함하는 것을 나타냄).
도 4는 PBMC를 AGS-003 DC 자가 제품과 함께 시험관 내에서 배양한 후의 Treg 이펙터 세포 및 CTL의 동반 확장을 나타낸다. PBMC를 기준선에 15명의 ADAPT 임상 시험 대상체로부터 수집하고, 자가 AGS-003 DC 제품과 함께 6일 동안 배양하였다. 제6일에, CD3+/CD8+/CD25+/CD45RA-/Grb+ CTL의 수 (y축)를 결정하고, CD3+/CD4+/CD25+CD45RA-/PD-1+/Foxp3+ Treg 이펙터 세포의 수 (x축)에 대비하여 플롯팅하였다. 배양물 내의 CTL과 Treg/eff 세포의 수 사이에서 통계적으로 유의한 연관이 검출되었다 (ρ=0.59, p<0.0208).
도 5는 기준선 림프구 카운트가 최고 사분위수에 속한 아고스의 ADAPT 임상 시험에 등록된 환자의 전체 생존의 카플란-마이어 플롯을 나타낸다. 조합 치료 아암의 환자 (AGS-003 + 표준 진료, 윗선)로부터의 데이터 대 표준 진료 아암의 환자로부터의 데이터의 위험비는 0.5999였다.
도 6은 기준선 림프구/단핵구 비가 최고 사분위수에 속한 아고스의 ADAPT 임상 시험에 등록된 환자의 전체 생존의 카플란-마이어 플롯을 나타낸다. 조합 치료 아암의 환자 (AGS-003 + 표준 진료, 그래프의 오른쪽 측면 상의 윗선)로부터의 데이터 대 표준 진료 아암의 환자로부터의 데이터의 위험비는 0.7356이었다.
도 7은 기준선 C-반응성 단백질 값이 최고 사분위수에 속한 아고스의 ADAPT 임상 시험에 등록된 환자의 전체 생존의 카플란-마이어 플롯을 나타낸다. 조합 치료 아암의 환자 (AGS-003 + 표준 진료, 윗선)로부터의 데이터 대 표준 진료 아암의 환자로부터의 데이터의 위험비는 0.7164였다.
도 8은 기준선 % Treg 값에 의해 군으로 나뉜 아고스의 ADAPT 임상 시험에 등록된 환자의 전체 생존의 카플란-마이어 플롯을 나타낸다. 시험의 조합 치료 아암의 환자 (AGS-003 + 표준 진료)로부터의 데이터는 왼쪽 패널에서 제시되고, 표준 진료 아암의 환자로부터의 데이터는 오른쪽 패널에 제시된다. 조합 치료 아암 (왼쪽 패널)에서, 윗선은 기준선 % Treg 값이 상위 3개의 사분위수에 속한 환자로부터의 데이터를 나타내는 한편, 아랫선은 기준선 % Treg 값이 최하 사분위수에 속하는 환자로부터의 데이터를 나타낸다. 표준 진료 아암 (오른쪽 패널)에서, 윗선 (오른쪽으로 확장되었을 때)은 기준선 % Treg 값이 최저 사분위수에 속하는 환자로부터의 데이터를 나타내고, 아랫선은 기준선 % Treg 값이 상위 3개의 사분위수에 속하는 환자로부터의 데이터를 나타낸다.
도 9는 기준선 % Treg 값이 상위 3개의 사분위수에 속하는 아고스의 임상 시험에 등록된 환자의 전체 생존의 카플란-마이어 플롯을 나타낸다. 조합 치료 아암의 환자 (AGS-003 + 표준 진료)로부터의 데이터 대 표준 진료 아암의 환자로부터의 데이터의 위험비는 0.74였다.
도 10은 기준선 단핵구 카운트에 의해 군으로 나뉜 아고스의 임상 시험의 조합 아암에 등록된 환자의 전체 생존의 카플란-마이어 플롯을 나타낸다. 단핵구 카운트가 중앙 값 이하인 환자 (윗선)로부터의 데이터 대 단핵구 카운트가 중앙 값을 초과하는 환자 (아랫선)로부터의 데이터의 위험비는 0.6498이었다.
도 11은 기준선 혈소판 카운트가 최고 사분위수에 속하는 아고스의 임상 시험의 조합 아암에 등록된 환자의 전체 생존의 카플란-마이어 플롯을 나타낸다. 조합 치료 아암의 환자 (AGS-003 + 표준 치료, 윗선)로부터의 데이터 대 표준 치료 아암의 환자로부터의 데이터의 위험비는 0.6954였다.
발명의 상세한 설명
놀랍게도, 본 발명가들은 특정한 면역계 성질을 갖는 환자가 수지상 세포 요법으로부터 더욱 유리한 치료 결과를 경험할 가능성이 더 높다는 것을 발견하였다. 본 발명은 더욱 유리한 치료 결과를 경험할 가능성이 있는 환자를 확인하고 치료하기 위해 면역계 파라미터, 예를 들어, 조절 T 세포 ("Treg") 카운트를 평가하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 환자 내의 특정 유형의 면역 세포 및/또는 혈청 화학 마커의 수준 및/또는 양의 적어도 하나의 값 또는 측정치를 수득하고; 상기 값 또는 측정치가 적절하게는 이러한 값 또는 측정치에 대한 치료 역치 값을 초과하는지 또는 역치 값 미만인지를 확인하고; 수지상 세포 요법을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 수지상 세포 요법으로 인간 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 특정 유형의 치료 지표의 수준 및/또는 양의 적어도 하나의 값 또는 측정치를 수득하고; 상기 값 또는 측정치가 적절하게는 이러한 값 또는 측정치에 대한 치료 역치 값을 초과하는지 또는 역치 값 미만인지를 확인하고; 수지상 세포 요법을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에게 수지상 세포 요법을 투여하는 방법을 또한 제공한다.
예를 들어, 놀랍게도, 본 발명가들은 Treg 세포의 수준이 높은 환자가 수지상 세포 요법이 이로울 가능성이 있다는 것을 발견하였다. 이러한 환자를 효과적인 수지상 세포 요법으로 치료하는 것은 면역 반응을 일으키고, 이 중 일부는 상기 환자 내의 Treg 세포의 수 및/또는 수준의 감소이다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 시험관 내에서 환자 DC를 이들이 배양물 내에서 T reg/eff 세포를 생산하는 능력에 대해 평가함으로써 측정된다. 따라서, 본 발명이 특정 유형의 치료 지표의 수준 및/또는 양의 적어도 하나의 값 또는 측정치를 수득하고;, 상기 값 또는 측정치가 적절하게는 이러한 값 또는 측정치에 대한 치료 역치 값을 초과하는지 또는 역치 값 미만인지를 확인하고; 수지상 세포 요법을 환자에게 투여하며, 임의적으로, 환자의 면역 반응이 자극되었는지를 결정하거나 확인하는 검정법을 수행하는 것을 포함하는, 환자에서 면역 반응을 자극하는 방법을 또한 제공한다는 것이 이해될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "Treg"는 조절 T 세포를 의미한다. Treg는 특정 세포 표면 마커의 발현, 또는 다른 유전자의 발현, 예를 들어, CD4+, CD25+, 및/또는 FoxP3+에 의해 확인될 수 있다. Treg는 특정 유전자 또는 마커, 예를 들어, CD127의 발현의 결여에 의해 다른 유형의 T 세포와 구별될 수도 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에서 지칭되는 Treg는 CD4+, CD25+, FoxP3+, 및 CD127-인 세포로서 확인된다. 추가적으로, Treg는 CD3+, PD-1-, 및/또는 CXCR4+ 중 하나 이상으로서 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 지칭되는 Treg는 CD3+, CD4+, CD25+, FoxP3+, CD127-, PD-1-, 및 CXCR4+ 중 임의의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개, 또는 이들 모두로서의 표현형에 의해 확인된다.
일반적으로, 본원에서 사용된 바와 같이, "+"는 관련 분야에 공지되어 있는 임의의 적절한 방법에 의해, 예를 들어, 유동 세포측정법을 사용하여 평균 형광 강도 (MFI)를 평가하는 것에 의해 측정된 바와 같은 양성 발현을 가리키고, "++"는 더 높은 발현을 가리키고, "+/-"는 더 약한 발현을 가리키며, "-"는 매우 약하거나 검출불가능한 발현을 가리킨다. 유동 세포측정법에 의해 세포 표면 마커 및 다른 유전자의 발현을 측정하고, 상이한 세포 집단 및/또는 아집단들 사이에서 발현을 비교하기 위한 상세한 방법 및 프로토콜이, 예를 들어, 문헌 [Hasan et al. (2015) Clin. Immunol. 157: 261-76]에 논의된 바와 같이, 관련 분야에 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 억제인자 활성이 있는 Treg가 전사 인자 FoxP3의 세포내 발현과 함께 세포 표면 표현형 마커 CD3, CD4 및 CD25의 양성 발현 및 CD127 발현에 대한 음성의 조합에 대한 다색 세포 유동측정법 염색에 의해 확인된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 환자 혈액 내의 Treg의 초기 (기준선) 수 또는 양을 기초로 요법 (즉, 면역 반응의 유도에 의함)에 반응할 가능성이 가장 높은 암 환자를 확인하기 위해 유동-세포측정법-기반 검정법을 사용하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 적어도 1회의 요법 치료 또는 용량 후의 환자 혈액 내의 Treg의 수의 증가를 검출하는 것을 기초로 요법이 면역 반응을 유도할 가능성이 있는 암 환자를 확인하기 위해 유동-세포측정법-기반 검정법을 사용하는 방법을 제공한다. "암 환자"는 암으로 진단된 환자를 의미하고, 일부 실시양태에서, 암 환자는 전이성 신세포 암종 (RCC)으로 진단되었다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 환자 혈액의 샘플 내에 존재하는 Treg 세포의 수를 정량하여 기준선 판독치를 확립하는 단계; 상기 환자에게 치료를 투여한 후, 상기 환자 혈액의 샘플 내에 존재하는 Treg 세포의 수를 정량하여 치료-후 판독치를 확립하는 단계; 상기 기준선 판독치 및 상기 치료-후 판독치를 비교하여, 환자 혈액의 샘플 내에 존재하는 Treg 세포의 빈도 또는 양이 감소되었는지 여부를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 Treg 세포의 빈도 또는 양의 유의한 감소가 환자에서 면역 반응이 유도되었음을 나타내는 것인, 치료에 의해 환자에서 면역 반응이 유도되었는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 치료는 상기 환자에게 시험관 내에서 제조된 자가 성숙 DC, 예를 들어, 로카풀덴셀-T (AGS-003)를 투여하는 것을 포함한다.
본원에서의 실시예는 AGS-003 수지상 세포와 함께 시험관 내에서 배양하는 것의 결과로서 Foxp3+ Treg 이펙터 세포 ("Treg/eff 세포")가 증식된다는 증거를 제공한다. 이러한 Treg/eff 세포는 PD-1의 양성 발현 및 케모카인 수용체 CXCR4의 음성 발현에 의해 Treg와 상이하다. 이러한 Treg/eff 세포는 활성화된 CD4+/FoxP3+/PD-1+/CXCR4- T 세포의 신규 집단이고, 제공된 실시예에서 입증된 바와 같이 생체 내에서 또는 시험관내 배양에 의해 수지상 세포 요법으로부터 초래되는 면역 자극을 측정하는데 사용될 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 환자 혈액의 샘플 내에 존재하는 Treg/eff 세포의 수를 정량하여 기준선 판독치를 확립하는 단계; 상기 환자에게 치료를 투여한 후, 상기 환자 혈액의 샘플 내에 존재하는 Treg/eff 세포의 수를 정량하여 치료-후 판독치를 확립하는 단계; 및 상기 기준선 판독치 및 상기 치료-후 판독치를 비교하여, 환자 혈액의 샘플 내에 존재하는 Treg/eff 세포의 빈도 또는 양이 증가되었는지 여부를 결정하는 단계를 포함하고, 여기서 Treg/eff 세포의 빈도 또는 양의 유의한 증가가 환자에서 면역 반응이 유도되었음을 나타내는 것인, 치료에 의해 환자에서 면역 반응이 유도되었는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 증식에 대해 Treg/eff 세포를 평가하고, 여기서 치료 후에 환자 내에 증식 중인 Treg/eff 세포의 유의한 집단 또는 유의하게 증가된 집단이 존재하는 것은 환자에서 면역 반응이 유도되었음을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 환자의 신체, 체액 또는 조직 내의 치료 지표, 예를 들어, 특정 유형의 면역 세포 및/또는 혈청 화학 마커의 수준 및/또는 양의 적어도 하나의 값 또는 측정치를 수득하고; 상기 값 또는 측정치가 적절하게는 이러한 값 또는 측정치에 대한 치료 역치 값을 초과하는지 또는 역치 값 미만인지를 확인하고; 수지상 세포 백신을 상기 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 환자를 수지상 세포 요법으로 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 치료 지표 값 또는 측정치는 하기 중 하나 이상에 관련된다: 환자 혈액 또는 혈액 성분 ml 당 Treg 세포 카운트; CD8+ CD28+ CTL 카운트; CD4+ 세포 중 % CD4+ CD25+ CD127- FoxP3+ 세포 (또는 다른 마커 또는 QAMA 검정법을 사용한 % Treg); 하나 이상의 혈청 화학 RISK 마커, 예를 들어, C-반응성 단백질 ("CRP")의 혈액 수준; 및 하나 이상의 DC 결핍 마커의 혈액 수준. 혈청 화학 RISK 마커는 관련 분야에 공지되어 있고, Alb, CRP, ESR, AST/ALT, Ca 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
따라서, 일부 실시양태에서, 수지상 세포 요법으로의 치료 전에 치료 지표의 값 또는 카운트, 예를 들어, 혈장 림프구의 수준; CD8+ CD28+ 세포 카운트; CD8+ CD28+ PD-1+ 세포 카운트; IFN-감마를 분비하는 CD8+ CD28+ PD-1+ 세포의 카운트; Treg인 CD4+ 세포의 백분율; 혈액 혈소판 카운트; C-반응성 단백질 (CRP) 수준; 림프구/단핵구 비; 단핵구 카운트 (일루트라(Elutra)-전); 및 호중구/백혈구 비에 대해 환자가 스크리닝될 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "치료 지표"는 수지상 세포 요법으로 치료되는 환자의 개선 또는 성공적인 치료의 가능성에 관한 정보를 제공할 수 있는, 종양 또는 환자 생물학, 혈액 화학의 파라미터, 또는 환자 세포의 배양 또는 프로세싱 결과의 측정치를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "치료 역치 값"은 치료 지표에 대한 상한 또는 하한 역치로서 확인되는 수치로서, 이러한 수치 미만 또는 이러한 수치 초과 각각에서, 수지상 세포 요법으로의 환자 치료가 권장되고/되거나 환자에게 하나 이상의 이익을 일으킬, 즉 환자 건강 또는 치료 성공의 하나 이상의 측정치에서의 개선을 일으킬 가능성이 있는 것으로 확인되는 수치를 지칭한다.
따라서, 예를 들어, 수지상 세포 백신로의 환자 치료 전 또는 초기 스크리닝 ("기준선") 시의 치료 역치 값은, 예를 들어, 하기 중 임의의 것을 포함할 수 있다: 적어도 1.58%, 또는 적어도 1.60%, 1.65%, 1.70%, 1.75%, 1.80%, 1.85%, 1.90%, 2.00%, 또는 이를 초과하는 퍼센트의 Treg인 CD4+ 세포의 퍼센트; 적어도 500개의 Treg/전혈 100 마이크로리터, 또는 적어도 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 또는 1000개 또는 이를 초과하는 개수의 Treg/전혈 100 마이크로리터의 환자 혈액 ml 당 Treg의 절대수; 적어도 500,000개 또는 적어도 600,000; 650,000; 700,000; 750,000; 800,000; 850,000; 900,000; 또는 1,000,000개의 혈소판/혈액 마이크로리터의 혈소판 카운트; 적어도 약 4, 또는 42, 또는 적어도 40, 42, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75 또는 76 mg/L의 C-반응성 단백질 값 (hs-CRP); 적어도 2.50, 또는 적어도 2.60, 2.70, 2.75, 2.80, 2.85, 2.90, 3.00, 3.10, 3.20, 3.30, 3.33, 또는 3.35 또는 이보다 높은 값의 림프구/단핵구 비; 500, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 또는 150개 또는 이보다 적은 개수 미만의 단핵구/혈액 uL의 단핵구 카운트 (일루트라-전); 7% 이하, 또는 6%, 5.5%, 5%, 4.5%, 4%, 또는 3.5% 또는 이보다 적은 % 미만의 백혈구의 백분율로서의 단핵구; 10.0, 9.0, 8.0, 7.0, 6.0, 5.9, 5.5, 5.0, 4.5, 4.0, 또는 3.0 또는 이보다 낮은 값 미만의 단핵구/백혈구 비; 환자에 대한 중앙 값 이상 또는 환자의 최고 사분위수에 상응하는 혈장 림프구 값; 및 중앙 값 이하이거나 또는 환자의 최저 사분위수에 상응하는 CD8+ CD28+ 세포 카운트 또는 CD8+ CD28+ PD-1+ 세포 카운트 또는 IFN-감마를 분비하는 CD8+ CD28+ PD-1+ 세포의 카운트.
일부 실시양태에서, 치료 지표의 치료 역치 값은 수지상 세포 요법의 생산을 위해 환자 혈액을 프로세싱한 후에 결정된다. 예를 들어, 치료 역치 값은 26% 미만, 또는 35%, 30%, 28%, 24%, 22%, 20%, 18%, 또는 15% 또는 이보다 낮은 % 미만의 백혈구성분채집술 후의 백혈구의 백분율로서의 단핵구를 포함한다.
일부 실시양태에서, 수지상 세포 백신으로의 환자 치료 전 또는 초기 스크리닝 ("기준선") 시의 치료 역치 값은 적어도 2.5%의 Treg인 CD4+ 세포의 퍼센트, 또는 적어도 2.5%, 또는 적어도 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 8%, 또는 9% 또는 이보다 높은 퍼센트의 Treg인 CD4+ 세포를 포함할 수 있다. 이러한 측정치는 직접적인 세포 카운트 (예를 들어, 유동 세포측정법으로 수득됨)일 수 있거나, 또는 관련 분야에 공지된 검정법, 예를 들어, FoxP3-TSDR 영역의 메틸화의 결정을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료 역치 값은 환자 혈액으로부터 생산된 수지상 세포 요법의 측정치를 포함한다. 예를 들어, 치료 역치 값은 적어도 1.3 × 107개의 생존 DC, 또는 적어도 7 × 106; 9 × 106, 1 × 107, 1.5 × 107, 2 × 107; 2.5 × 107; 3 × 107개; 또는 이보다 많은 개수의 생존 DC/용량의 생존 DC 개수/용량을 포함한다. "용량"은 환자에게 투여되는 또는 투여되도록 의도되는 DC의 분취량이다. 일부 실시양태에서, 다중 용량의 DC가 환자 혈액의 단일 채혈로부터 생산된다.
일부 실시양태에서, 수지상 세포 백신으로의 환자 치료가 계속되어야 하는지 여부, 또는 대안 치료가 투여되어야 하는지 여부를 결정하도록 방법이 제공된다. 아고스의 ADAPT 임상 시험으로부터의 데이터는 기준선 측정치로부터 48주까지 % Treg 세포의 최대 감소를 경험한 조합 아암의 환자가 전체 생존의 증가를 또한 나타냈다는 것을 나타냈다. 따라서, % Treg의 변화를 단독으로 고려함으로써 또는 이를 다른 측정치 또는 값과 조합하여 고려함으로써, 환자의 % Treg의 변화를 검출 또는 모니터링하는 것이 수지상 세포 백신의 용량으로의 환자 치료를 계속할지 또는 중단할지 여부를 결정하거나, 추가적인 또는 대안적인 치료를 투여할지 여부를 결정하거나, 또는 이러한 환자의 예후를 결정하는 것에서 정보성일 수 있다.
일부 실시양태에서, 수지상 세포 요법으로의 환자 치료 또는 환자 평가는 1가지를 초과하는 치료 역치 값이 고려되는 단계를 포함할 것이다. 따라서, 예를 들어, 일부 실시양태에서, 환자의 치료 방법은 관련 분야의 통상의 기술자가 적합한 것으로 생각하고/하거나 유용한 것으로 간주하는 임의의 조합으로 혈장 림프구 값; CD8+ CD28+ 세포 카운트; CD8+ CD28+ PD-1+ 세포 카운트; IFN-감마를 분비하는 CD8+ CD28+ PD-1+ 세포의 카운트; Treg인 CD4+ 세포의 퍼센트; 혈액 또는 혈액 성분의 단위 부피 당 Treg의 카운트; 혈소판 카운트; C-반응성 단백질 (CRP) 값; 림프구/단핵구 비; 단핵구 카운트 (일루트라-전); 및 호중구/백혈구 비로 이루어진 군으로부터 선택된 치료 지표의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 또는 7개 이상의 카운트 또는 값을 측정하거나 결정하거나 고려하는 단계를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 환자의 치료 방법은 CRP 및 %Treg에 대한 치료 역치 값이 충족되거나 또는 초과되도록 42 이상인 상기 환자에 대한 C-반응성 단백질의 측정치 및 1.75% 초과인 (CD4+ 세포의 백분율로서의) % Treg 세포의 측정치를 수득하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 환자를 치료하는 방법 또는 치료 지표 또는 역치 값을 고려하는 단계는 다변수 통계 분석 또는 2개 이상의 치료 지표 값이 입력되는 통계 모델로부터 가능한 치료 성공의 예측을 수득하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다변수 통계 분석이 환자에게 수지상 세포 요법으로의 치료가 이로울 가능성이 있는지 여부를 평가하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 통계 모델은 환자의 C-반응성 단백질 수준, 림프구/단핵구 비, 단핵구/백혈구 비, % Treg, 또는 이들 중 2개 이상에 대한 입력 값을 취한다. 일부 실시양태에서, 통계 모델은 C-반응성 단백질 및 퍼센트 T-reg에 대한 입력 값을 취한다. 본 발명의 방법에서, 임의의 적절한 통계 모델이 환자에게 DC 요법으로의 치료가 이로울지 여부에 대한 예측 값을 나타내는 치료 지표 및 치료 역치 값 중 임의의 것과 함께 사용될 수 있고, 적절한 통계 모델, 방법 및 기술이 관련 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, SAS® 인스티튜트 인크(SAS® Institute, Inc.) (노스 캐롤라이나주 캐리)로부터, 적절한 소프트웨어 패키지가 쉽게 상업적으로 입수가능하다.
성숙 DC를 생산하기 위해 관련 분야에 방법들이 공지되어 있다. 성숙 DC를 생산하는 일부 방법이 WO2006042177 (힐리 등); WO2007117682 (체레파노바 등); 문헌 [DeBenedette et al. (2008) J. Immunol. 181: 5296-5305]; 및 [Calderhead et al. (2008) J. Immunother. 31: 731-41]에 상세하게 기술되어 있다. 이러한 방법 중 일부에서, 미성숙 DC에 순차적으로 제1 신호 (IFN-γ 수용체 효능제 및 임의적으로 TNF-α 수용체 효능제)가 신호전달되어 CD83+ CCR7- 성숙 DC가 생산된 후, CD83+ CCR7+ 성숙 DC가 생산되는데 효과적인 양으로 제2 신호 (CD40 효능제)가 신호전달된다; 다양한 IFN-γ 수용체 효능제 및/또는 TNF-α 수용체 효능제가 사용될 수 있다. "PME-CD40L 프로세스" (CD40L로의 성숙 후 전기천공(Post Maturation Electroporation with CD40L))로 칭해지는 방법에서, IFN-γ 및 TNF-α를 배양 배지에 첨가함으로써 미성숙 DC가 먼저 표현형적으로 성숙된다; 임의적으로, PGE2가 또한 첨가된다. 그 후, 약 12-30시간 후 (일부 실시양태에서는 약 18시간 후), 세포에 CD40L mRNA 및 임의적인 항원-코딩 mRNA가 전기천공된다. 이러한 PME-CD40L 프로세스로 CD83+ CCR7+ 성숙 DC가 생산된다. 전기천공 후 (예를 들어, 전기천공 4시간 후) 이러한 프로세스로부터 수확되고 백신으로서 제형화된 세포는 시험관내 검정법에서 최대 면역효능을 매개하는 것으로 나타났다.
PME-CD40L 프로세스에 의해 제조된 수지상 세포 (본원에서, "PME-CD40L DC")는 기존에 공지된 수지상 세포와 상이한데, 이들이 장기간의 항원-특이적 CTL 이펙터 기능을 지지할 수 있고, 급속 확장 고-결합도 ("REHA") 세포로 지정된 이펙터 기억 CTL의 유형을 유도할 수 있기 때문이다 (문헌 [DeBenedette et al. (2008) J. Immunol. 181: 5296-5305] 참조). REHA 세포는 확장되고, 시토카인을 생산하며, 표적 세포를 사망시키는 능력을 유지하고, 따라서 강건한 장기간의 CTL 이펙터 기능을 제공한다. 따라서, PME-CD40L DC는 항원-특이적 T 세포의 집단으로부터 CD28+ CD45RA- 기억/이펙터 T 세포의 집단을 우선적으로 유도한다. PME-CD40L DC는 또한 TSCM 세포를 생산하는 것으로 나타났다 (WO 2015/127190 (드베네데트 등) 및 상응하는 미국 공개 번호 20170065690 (드베네데트 등)). 일부 경우에, CD83+ CCR7+ 성숙 DC는 일시적으로 CD40L 폴리펩티드를 발현한다; 일부 경우에, CD40L은 세포 표면보다는 세포 내에 우세하게 국소화된다.
PME-CD40L DC는 (a) 공동-자극제 분자 CD80, CD83, 및 CD86의 세포 표면 발현 상승을 나타내고; (b) CCR7+이며; (c) IL-12 p70 폴리펩티드 또는 단백질을 분비하고/하거나, 유의하게 감소된 수준 (0 내지 500 pg/ml/백만개의 DC)의 IL-10을 분비하는 것을 포함하여, 몇가지의 독특한 특성을 나타낸다 (예를 들어, WO2006042177 (힐리 등) 및 WO2007117682 (체레파노바 등)에서 제시된 데이터 및 실험을 참조한다). 이러한 성숙 CD83+ CCR7+ DC는 적어도 1000 pg의 IL-12/106개의 DC를 생산한다; IL-10 및 IL-12 수준은 미성숙 DC로부터 DC 성숙을 유도하고 나서 36시간 후까지 수집된 배양 상청액의 ELISA에 의해 결정될 수 있다 (Wierda et al. (2000) Blood 96: 2917; Ajdary et al. (2000) Infection and Immunity 68: 1760). 관련 분야의 통상의 기술자는 CD40L mRNA 및/또는 CD40L 폴리펩티드를 발현하거나 또는 인터루킨 12 (IL-12) p35 단백질을 발현하는 성숙 DC의 존재에 대해 세포 또는 세포 집단으로부터의 DC의 하위집단을 샘플링함으로써 PME-CD40L가 언제 생산되었는지를 결정할 수도 있다. 이러한 세포의 다른 특성이, 예를 들어, WO2006042177 (힐리 등); WO2007117682 (체레파노바 등); 문헌 [DeBenedette et al. ((2008) J. Immunol. 181: 5296-5305)]; 및 [Calderhead et al. ((2008) J. Immunother. 31: 731-41)]에 논의되어 있다.
PME-CD40L DC를 생산하는데 사용되는 미성숙 DC는 DC 전구체 세포를 함유하고 미성숙 DC를 생산하도록 시험관 내에서 분화되는 적절한 조직 공급원으로부터 단리 또는 제조될 수 있다. 말초혈 단핵 세포 (PBMC)가 미성숙 DC로 분화되도록 인터루킨 4 (IL-4) 및/또는 IL-13의 존재 또는 부재 하에 유효량의 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)로 임의적으로 처리된 PBMC로부터 미성숙 DC가 단리될 수도 있다. 일부 실시양태에서, PBMC를 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에 약 4-7일, 바람직하게는 약 5-6일 동안 배양하여 미성숙 DC가 생산된다. 일부 실시양태에서, 제4일, 제5일, 제6일 또는 제7일, 가장 바람직하게는 제5일 또는 제6일에 제1 신호가 제공된다. 추가적으로, GM-CSF, 뿐만 아니라 IL-4 및/또는 IL-13이 제1 및/또는 제2 신호전달의 시기에 배지 내에 존재할 수 있다. 대안적으로, 미성숙 수지상 세포에 유효량의 TNF-α 수용체 효능제로 신호를 전달한 후, CD40 효능제로 신호를 전달할 수 있다. 미성숙 DC를 IFN-γR 효능제 및 TNF-αR 효능제의 제1 신호를 수신할 때와 대략적으로 같은 시간에 PGE2와 접촉시킬 수 있다. 일부 방법에서, 유효량의 IL-1β 및/또는 IL-6의 부재 하에 신호가 전달된다. 수지상 세포가 제1 및 제2 신호를 수신할 때 GM-CSF, 및 IL-4 또는 IL-13 중 적어도 하나가 배지 내에 존재할 수 있다.
IFN-γ 수용체 효능제, TNF-α 수용체 효능제, 및/또는 CD40 효능제로의 신호전달은 세포를 직접적으로 IFN-γ 폴리펩티드 및/또는 단백질 및/또는 TNF-α 폴리펩티드 또는 단백질 및/또는 CD40 효능제 각각과 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 유사하게, IFN-γ 및 TNF-α 수용체 효능제는 IFN-γ 및 TNF-α와 유사한 생물학적 활성을 갖는 앱타머, 항체 등일 수 있다. 대안적으로, 세포에 IFN-γR 효능제, TNF-αR 효능제 및/또는 CD40 효능제로 신호를 전달하는 것은 이러한 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 mRNA가 수지상 세포 내에서 번역될 때 발생할 수 있다. 이러한 mRNA는 형질감염 또는 다른 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있고, 그 후 IFN-γR 효능제, TNF-αR 효능제 및 CD40 효능제 폴리펩티드 및/또는 단백질의 발현 시에 신호전달이 발생한다. 따라서, 신호전달 효능제를 배양 배지에 제공함으로써, 효능제를 세포 내로 도입하는 것에 의해, 및/또는 효능작용 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 수지상 세포 내에서의 번역 시에 신호전달이 개시될 수 있다. 방법은 생체 내에서 또는 생체 외에서 실행될 수 있다. 그 후, DC와 함께 공동-배양함으로써 생산된 TSCM과 함께 면역 반응을 유도하거나 강화하도록, 생체 외 성숙 수지상 세포를 대상체에게 투여할 수 있다.
면역원 (예를 들어, 항원)을 DC에 투여함으로써 수지상 세포가 추가로 변형될 수 있다. 면역원은 생체 내에서 또는 생체 외에서 전달될 수 있다. 면역원은 관련 분야에 공지된 방법을 사용하여 세포에 전달될 수 있고, 폴리펩티드 또는 단백질로서 (예를 들어, "펄싱(pulsing)"에 의해) 또는 면역원을 코딩하는 핵산으로서 (예를 들어, 형질감염 또는 전기천공에 의해) 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 mRNA이다. PME-CD40L DC를 생산하는 일부 방법에서, CD40 효능제를 코딩하는 mRNA와 함께 또는 CD40 효능제 신호전달과 실질적으로 동반적되어 항원-코딩 mRNA가 전기천공된다.
PME-CD40L DC는 임의의 관심 병원체 또는 질환으로부터의 항원을 코딩하는 RNA로 형질감염될 수도 있다; 이러한 항원은 1명의 개별적인 대상체 또는 다수의 대상체로부터의 것일 수 있고, 항원이 단리된 대상체의 병원체 감염으로부터의 것 또는 또 다른 대상체로부터의 것일 수 있다. 컨센서스 항원 및 병원체-특이적 항원이 관련 분야에 공지되어 있고, PME-CD40L DC를 제조하는 방법에서 또한 사용될 수 있다. DC가 항원을 프로세싱하여 자신의 세포 표면에 항원을 디스플레이할 것이다; 이러한 성숙 DC는 나이브 면역 이펙터 세포를 교육하는데 사용될 수 있다. 대상체로부터 제거된 암 및/또는 종양 샘플로부터의 항원을 코딩하는 RNA를 이러한 방식으로 DC를 형질감염시키는데 사용할 수 있다. 대상체로부터 제거된 샘플로부터의 HIV 항원을 코딩하는 RNA 또한 DC를 형질감염시키는데 사용할 수 있다. 예를 들어, WO2006042177 (힐리 등) 및 WO2007117682 (체레파노바 등)에 기술된 바와 같이, 예를 들어, MART-코딩 mRNA로 형질감염된 PME-CD40L DC가 자가 CD8+ T 세포를 자극하여 반응자 CD8+ T 세포를 생산하였다. 또한, 전체적인 증폭된 신세포 암종 ("RCC") 종양 RNA가 로딩된 PME-CD40L 성숙 DC가 완전 자가 CTL 반응을 유도하였다 (WO2006042177 (힐리 등) 참조).
일부 실시양태에서, WO2006031870 및 미국 공개 번호 20080311155 (니콜레트(Nicolette) 등)에 기술된 바와 같이, HIV 단백질 Gag, Nef, Tat, 및 Rev의 일부 또는 전부를 코딩하는 RNA로 PME-CD40L DC가 형질감염된다. 간략하게, DC가 개별적인 대상체 내에 존재하는 다중 HIV 균주로부터의 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 RNA로 형질감염된다; RNA는 병원체 폴리뉴클레오티드의 핵산 증폭으로부터 유래된다. WO2006031870 및 미국 공개 번호 20080311155에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 병원체가 HIV인 경우에, 병원체의 다중 균주 사이의 서열 가변성을 보상하도록 이러한 병원체 폴리뉴클레오티드를 증폭시키기 위한 프라이머가 디자인될 수 있다. 예를 들어, 이러한 프라이머는 Gag, Nef, Tat, 및 Rev에 대한 전방향 및 역방향 프라이머를 포함하여, WO2006031870에 개시된 프라이머를 포함할 수 있다. 이러한 프로세스로부터 초래된 DC는 HIV 환자에서 HIV에 대한 면역 반응을 자극할 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 방식으로, 환자에 대해 자가성인 DC 요법이 생산될 수 있고, 이러한 환자에서 발견되는 HIV 균주에 대한 면역 반응을 자극하는데 사용될 수 있다.
또한 PME-CD40L DC는 강화된 수지상 세포 집단을 적절한 조건 하에 적절한 냉동보존제와 접촉시킴으로써 저장될 수 있고, 동결될 수 있다 (예를 들어, WO 2002016560 및 미국 특허 번호 8,574,901 (슐러(Schuler) 등) 참조).
CD34+ 줄기 세포를 포함하여, 수지상 세포로의 시험관내 확장 및 분화를 위한 다양한 세포의 단리 및 확장을 위한 다수의 방법이 관련 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,199,942 참조). 관련 분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 줄기 세포 및 단핵구를 수지상 세포로 분화시키기 위한 용량 범위는 대략적이다. 상이한 공급원, 및 동일한 공급원으로부터의 상이한 시토카인 롯트는 시토카인의 활성이 다르다. 기술자는 임의의 특정 시토카인에 대해 최적 용량을 결정하는데 사용되는 각각의 시토카인을 쉽게 적정할 수 있다. 관련 분야에 공지된 바와 같이, 특정 세포 유형이 다른 세포 유형과의 공동-배양에 의해 유도되거나 또는 성숙될 수 있다. 용어 "공동-배양"은 적어도 2개의 상이한 유형의 세포를 함유하는 것으로 공지된 세포 배양물을 지칭한다.
GM-CSF 및 IL-4 또는 GM-CSF 및 IL-13을 함유하는 배지에서 배양함으로써 말초 혈액 내의 증식 중이지 않은 CD14+ 전구체 (단핵구)로부터 DC가 생성될 수 있다 (예를 들어, WO 97/29182; 문헌 [Sallusto and Lanzavecchia (1994) J. Exp. Med. 179: 1109] 및 [Romani et al. (1994) J. Exp. Med. 180:83] 참조). 일부 실시양태에서, DC는 환자 또는 대상체에 대해 자가성이다; 즉, DC 또는 이의 전구체 세포는 이들이 투여되는 환자 또는 대상체와 동일한 환자 또는 대상체로부터 수득된다. 다른 실시양태에서, DC 또는 이의 전구체는 이들이 투여되는 환자와 상이한 환자로부터 수득된다 (즉, 이들은 동종이형 또는 이종성이다).
세포가 HIV 환자로부터 단리되는 경우, 시약, 예를 들어, CD4-PE40 (예를 들어, 25 nM)을 사용하여 집단으로부터 HIV-감염 세포를 우선적으로 제거할 수 있다. CD4-PE40은 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A의 전위 및 ADP-리보실화 도메인에 연결된 HIV-1-결합 CD4 도메인으로 이루어진 재조합 단백질이다; 이는 HIV-감염 세포 배양물에서 p24 생산을 억제하고 HIV-1-감염 세포를 선택적으로 사망시키는 것으로 나타났다. 세포 증식을 자극하기 위해, OKT3 모노클로날 항체 (오르토 디아그노스틱스™ 인크(Ortho Diagnostics™, Inc.))를 첨가할 수 있다.
환자 자신의 암 세포로부터 항원이 제조되어 DC 내로 로딩될 수 있고, 그 후 DC가 다시 환자 내로 주입된다. HIV/AIDS의 치료를 위해, 항원이 HIV 환자 (즉, HIV에 감염된 환자)로부터 제조되어 DC 내로 로딩되고, DC가 다시 환자 내로 주입된다. 예를 들어, WO2006031870 (니콜레트 등)에 기술된 바와 같이, HIV 환자로부터 항원을 제조하고, 이를 제시하는 DC를 제조하는 방법이 관련 분야에 공지되어 있다.
Treg는 또한 다양한 시토카인, 예를 들어 IL-10 및/또는 TGF-β를 생산할 수 있다. 이러한 시토카인을 검출 및 측정하는 방법이 관련 분야에 공지되어 있다. 특정한 기능적 속성 예컨대 특이적인 시토카인의 발현을 기초로 세포를 분리하는 방법이 관련 분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kammula et al. (1999) J. Immunol. 12: 6867-75] 및 [Kammula et al. (2008) J. Transl. Med. 2008: 60]에 논의된 바와 같음), 시토카인 포착 시약을 사용하여 시토카인 발현을 기초로 세포를 선별할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Brosterhus et al. (1999) Eur. J. Immunol. 12: 4053-59]에 논의된 바와 같음).
또 다른 측면에서, 세포를 특정 유전자의 발현을 기초로 확인 및/또는 단리할 수 있다. 세포 표면 마커가 이러한 방식에서 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, DC는 MHC 분자 및 공동자극 분자 (예를 들어, B7-1 및 B7-2)를 발현하고, 과립구, NK 세포, B 세포, 및 T 세포에 대해 특이적인 마커가 결여되기 때문에, DC를 다른 세포로부터 구별할 수 있다. Treg는 CD4, CD25, 및 FoxP3를 발현하지만, CD127 발현은 거의 없거나 없고, 예를 들어, 유동 세포측정법을 사용하여, 이들을 활성화된 T 세포로부터 구별하는데 이를 사용할 수 있다. 마커의 발현은 적어도 하나의 상이한 마커를 발현하는 다른 세포로부터의 이러한 세포의 확인, 정제 및 분리를 용이하게 한다; 마커의 임의의 적절한 조합이 사용될 수 있고, 관련 분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 음성 마커 또는 세포 선별을 또한 사용할 수 있다. 이러한 방식에서, CD4, CD25, FoxP3, CD127, PD-1, 및 CXCR4 중 하나 이상의 발현을 기초로 Treg 세포 및/또는 Treg/eff 세포가 다른 세포로부터 확인, 분리, 단리 또는 강화될 수 있다. 유동 세포측정법 방법 예컨대 FACS 분석, 뿐만 아니라 관련 분야에 공지되어 있는 임의의 적절한 방법에 의해 세포를 단리 및/또는 특성화할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Lowther et al. (2016) JCI Insight 1(5): e85935]; [Raimondi et al. (2006) J. Immunol. 176: 2808-16]을 참조한다. 따라서, 예를 들어, Treg가 마커 CD4, CD25, 및 FoxP3에 대해 양성이지만 (즉, 이들을 검출가능한 수준으로 발현함), 낮은 또는 검출불가능한 수준의 CD127 발현을 나타내는 세포로서 다색 세포 유동측정법에 의해 확인될 수 있다. 생체내 또는 시험관내에서의 후속 용도를 위해, 특정 세포 유형 예컨대 Treg 또는 Treg/eff가 이러한 마커 중 하나 이상을 갖는 세포의 자기 비드 단리를 사용하여 다른 세포로부터 강화, 단리 또는 정제될 수도 있거나, 일부 경우에, 적합한 마커를 사용하여 혼합 세포 집단으로부터 다른 세포 유형을 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원의 다른 곳에서 더욱 상세하게 논의된 바와 같은 QAMA 검정법 ("메틸화 대립유전자의 정량적 분석")을 사용하여 Treg를 측정할 수 있다.
세포, 세포 군 또는 세포 유형에 의한 세포 표면 마커 또는 또 다른 유전자의 발현의 "낮은" 또는 "음성" 발현은 발현이 또 다른 세포, 세포 군 또는 세포 유형에서보다 낮거나 또는 발현이 관련 분야에 공지된 방법을 사용하여 간신히 검출가능하거나 또는 검출가능하지 않다는 것을 의미한다 (예를 들어, 문헌 [Hasan et al. (2015) Clin. Immunol. 157: 261-76] 참조).
세포 항원 (세포 표면 마커 포함)을 확인, 검출 및/또는 모니터링하는데 사용될 수 있는 표지제가 관련 분야에 공지되어 있고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 단백질, 또는 다른 중합체 예컨대 친화성 매트릭스, 탄수화물 또는 지질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 임의의 공지된 방법, 예컨대 면역블롯팅, 웨스턴 블롯 분석, 방사성 또는 생물발광 마커의 추적, 모세관 전기영동, 또는 크기, 전하 또는 친화성을 기초로 분자를 추적하는 다른 방법에 의해 검출이 진행된다.
표면 마커의 발현을 기초로 하는 세포 분리 방법이 관련 분야에 공지되어 있고, 자기 비드 단리, 다색 세포 유동측정법 또는 FACS 분류 (예를 들어, 문헌 [Basu et al. (2010) J. Vis. Exp. 41]에 논의된 바와 같음), 및 미세전자기계 시스템 칩 ("MEMS" 칩)-기반 분류 (예를 들어, 문헌 [Shoji and Kawai (2011) Top. Curr. Chem. 2011: 1-25]에 논의된 바와 같음)를 사용하는 것을 포함한다. FACS 기계 및 세포 분류기가 상업적으로 입수가능하고 (예를 들어, BD 바이오사이언스 LSRII 및 BD FACSAria), 제조사의 설명서에 따라 사용될 수 있다.
적합한 경우의 양성 또는 음성 선별에 의해, 또는 양성 및 음성 선별 양쪽 모두에 의해 다른 세포로부터 세포를 단리 또는 분리할 수 있다. 예를 들어, CD4, CD25, CXCR4 및/또는 FoxP3에 대한 양성 선별이 임의적으로 이어지는, 다른 세포 유형을 고갈시키는 음성 선별을 사용하여 다른 세포 예컨대 PBMC 또는 림프구를 포함하는 집단으로부터 Treg 세포를 강화할 수 있다. 다양한 정제 단계를 위한 키트 및 시약이 관련 분야에 공지되어 있어, 관련 분야의 통상의 기술자가 공지된 세포 유형을 단리 또는 정제하게 허용한다; 예를 들어, 인비트로젠(Invitrogen)의 다이나비즈® 언터치드™(Dynabeads® Untouched™) 인간 T 세포 키트는 비-T 세포에 대한 마우스 IgG 항체를 포함하는 항체를 사용하여 인간 B 세포, NK 세포, 단핵구, 대식세포, 혈소판, 수지상 세포, 과립구, 및 적혈구를 고갈시키도록 디자인된다: 인간 CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CDw123, 및 CD235a. 관련 분야의 통상의 기술자가 세포 집단으로부터 공지된 세포 유형을 강화 및/또는 고갈시키기 위해 특정한 (종종 상업적으로 입수가능한) 항체 및 선별 도구를 선택할 수 있다는 것이 이러한 예로부터 이해될 것이다.
특정 마커를 보유하는 세포의 선별 또는 검출은 한번에 하나의 마커에 대해 또는 한번에 1개를 초과하는 마커에 대해 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Stemberger et al. (2012) PLoS One 4:e35798]에 논의된 바와 같음). 선별 또는 검출은 또한 단계적으로 수행될 수 있고, 상이한 유형의 선별 또는 검출이 후속 단계에서 특정 세포 군 또는 집단 상에서 수행되어 원하는 하위집단을 수득하거나 검출하거나 모니터링할 수 있다. HLA-펩티드 복합체에 반응성인 T 세포를 단리함으로써 직접적으로 이의 항원 특이성을 기초로 세포를 선별 또는 확인할 수도 있다 (예를 들어, 문헌 [Keenan et al. (2001) Br. J. Haematol. 2: 428-34]에 논의된 바와 같음). 확인, 스크리닝 및/또는 선별에 유용한 세포 마커는 CD4, CD8, CD25, CD27, CD28, CD38, CD57, CD95, CD127, FoxP3, PD-1, HLA-DR, 및 CD45RA를 포함한다.
아고스 3상 ADAPT 임상 시험은 표준 진료 치료 ("SOC")와 조합된 로카풀덴셀-T (본원에서 AGS-003으로도 지칭됨) 대 SOC 단독을 받는 전이성 신세포 암종 ("RCC")이 새롭게 진단된 환자에서 전체 생존을 평가하기 위해 디자인되었다. SOC 아암의 환자에게는 수니티닙 (SUTENT®) 또는 또 다른 티로신 키나제 억제제 ("TKI")가 제공되었고, AGS-003 아암의 환자에게는 수니티닙 또는 또 다른 티로신 키나제 억제제 ("TKI")에 더하여 시험 프토토콜에 따라 다중 용량의 AGS-003이 제공되었다. 표준 진료에 부합하는 치료에 적절한 티로신 키나제 억제제는, 예를 들어, 문헌 [Broekman et al. (2011) World J. Clin. Oncol. 2: 80-93]에 논의된 바와 같이, 관련 분야에 공지되어 있다. "AGS-003"은 환자 자신의 종양 물질로부터 유래되는 RNA 항원 페이로드를 함유하는 PME-CD40L DC를 지칭한다. 연구의 양쪽 아암에서의 환자의 면역 반응을 치료 전 및 후에 평가하였다. SOC 환자의 경우, 환자에서의 더 높은 초기 Treg 세포 카운트 또는 수준과 이러한 환자에 대한 상대적으로 더 불량한 치료 진행 및/또는 결과 사이에 양의 상관관계가 있었다. 그러나, 놀랍게도, AGS-003으로 치료된 환자의 경우, 환자에서의 더 높은 초기 Treg 카운트 또는 수준과 이러한 환자에 대한 상대적으로 더 양호한 치료 진행 및/또는 결과 (전체 생존 포함) 사이에 양의 상관관계가 있었다. 이는 시험의 SOC 아암의 환자에 관한 발견으로 인해, 그리고 또한 Treg 수준이 높은 환자는 전형적으로 더 불량한 치료 진행 및/또는 결과를 겪는다는 기존의 보고로 인해 놀라운 것이다 (예를 들어, 문헌 [Afzali and Lombardi (2013) BJU International 112: 538-9]; [Schwarzer et al. (2012) PLOS One 7:e46600]; [Griffiths et al. (2007) Cancer Immunol. Immunother. 56: 1743-53]; [Cesana et al. (2006) J. Clin. Oncol. 24: 1169-77] 참조). 아고스 ADAPT 임상 시험에서, SOC 아암의 환자는 수니티닙으로 치료된 1차 시험 방문과 2차 방문 사이에 Treg 세포의 감소를 나타냈지만, AGS-003으로 치료된 환자는 후속 방문에서 Treg의 감소를 계속 나타냈다.
이러한 방식으로, 본 발명은 환자 혈액의 샘플 내에 존재하는 Treg 세포의 수를 정량하여 기준선 판독치를 확립하는 단계; Treg 카운트 또는 값을 평가하여 역치 값을 초과하는지 여부를 결정하는 단계; 및 그렇다면, 상기 환자에게 시험관 내에서 제조된 자가 성숙 DC를 투여하는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
인간 전혈 내의 전형적인 Treg 카운트 또는 수준은 약 200 내지 1000개의 Treg/전혈 100 마이크로리터 범위이고, 중앙 값은 약 500개의 Treg/전혈 100 마이크로리터이다. 임상 시험 결과의 분석은 시험에서 결과가 더 양호한 AGS-003 환자에 대한 Treg의 카운트 또는 수준이 AGS-003으로의 치료를 시작하기 전에 전형적으로 적어도 650개의 Treg/전혈 100 마이크로리터였음을 나타냈다. 일부 실시양태에서, 정제, 배양 또는 자극 (예를 들어, 배양 중 시토카인 또는 다른 세포에 의함) 없이 전혈로부터 세포를 측정하고, 카운트 또는 값은 전혈 100 마이크로리터 당 Treg 세포의 절대수이다. 혈액 분획 내의 다른 등가의 측정치 또는 다른 부피 단위를 사용하는 것이 환자 (즉, 환자의 전혈) 내의 Treg의 동일한 카운트, 수준 또는 빈도를 나타내는 것으로 관련 분야의 통상의 기술자에게 이해된다. 일부 실시양태에서, Treg 대 다른 세포 유형의 세포, 예를 들어 T 이펙터 세포의 비가 사용될 수 있다; 그러나, 이러한 비는 때대로 환자 내의 염증 또는 질환의 존재에 의해 영향을 받는다.
Treg 세포는 때때로 이의 CD4, CD25, 및 FoxP3 발현을 특징으로 하지만, 활성화된 인간 비-조절 T 세포가 비록 억제 기능을 갖지는 않지만 일시적으로 FoxP3을 발현한다는 것이 보고되었다. FoxP3-TSDR ("Treg 특이적 탈메틸화 영역(Treg Specific Demethylated Region)")로 공지된 영역의 탈메틸화를 나타낸다는 점에서 Treg가 이러한 세포와 상이하다는 것과 Treg 세포와 다른 세포 사이의 메틸화 차이를 평가하고 혈액 샘플 내의 Treg 세포의 척도를 제공하기 위해 정량적 PCR 검정법 (QAMA)을 사용할 수 있다는 것이 또한 나타났다. 따라서, 일부 실시양태에서, 환자 내의 Treg의 카운트, 수준 또는 빈도가 FoxP3-TSDR 영역의 메틸화를 결정하는 정량적 PCR 검정법을 사용하여 간접적으로 평가된다. 예를 들어, 문헌 [Tatura et al. (2012) PLoS ONE 7: e49962, "Quantification of Regulatory T Cells in Septic Patients by Real-Time PCR-Based Methylation Assay 및 Flow Cytometry"]에 교시된 바와 같이, 이러한 검정법이 관련 분야에 공지되어 있다.
본 명세서로부터 이해될 바와 같이, 본 발명은 적어도 하나의 기준선 치료 지표 값 또는 카운트가 적절하게는 이러한 지표에 대한 치료 역치 값의 초과 또는 미만인 환자를 치료하는데 사용하기 위한 수지상 세포 요법인 의약을 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 기준선 치료 지표 값 또는 카운트가 적절하게는 이러한 지표에 대한 치료 역치 값의 초과 또는 미만인 환자를 치료하는데 사용하기 위한 수지상 세포 요법인 의약을 제공한다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 본 발명은 초기 Treg 카운트 또는 값이 CD4+ 세포의 1.75%가 Treg 세포인 역치 값 또는 환자 전혈의 650개의 Treg/전혈 100 마이크로리터 또는 단위 부피 당 등가의 측정치를 초과하는 환자를 치료하는데 사용하기 위한 수지상 세포 요법인 의약을 제공한다. 일부 실시양태에서, 의약은 수지상 세포 요법 또는 수지상 세포 백신 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 의약은 또 다른 제약 조성물, 예를 들어, 티로신 키나제 억제제에 더하여 수지상 세포 요법 또는 수지상 세포 백신 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 수지상 세포 백신으로 또한 치료되고 있는 환자에게 투여하기 위한 적절한 티로신 키나제 억제제는 관련 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 수니티닙 또는 예를 들어 문헌 [Broekman et al. (2011) World J. Clin. Oncol. 2: 80-93]에 논의된 것들과 같은 다른 티로신 키나제 억제제이다.
"기준선 값" 또는 "기준선"은 특정 치료, 예를 들어, 수니티닙으로의 치료 및/또는 AGS-003으로의 치료를 시작하기 전의 환자에 대한 치료 지표에 대한 카운트 또는 값 또는 다른 측정치를 의미한다. "역치 값"은 환자가 적어도 약 500개의 Treg/전혈 100 마이크로리터, 또는 적어도 약 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 또는 950개 또는 이를 초과하는 개수의 Treg/전혈 100 마이크로리터의 초기 Treg 카운트 또는 값을 갖는 것을 의미한다.
일부 경우에, 증식 중인 세포 집단을 확인하고/하거나 특정 세포 유형 또는 집단이 증식 중인지 여부를 결정하는 것이 유용할 수 있다; 적절한 방법이 관련 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, CFSE를 다른 세포 마커와 함께 사용하여, 증식 중인 세포 유형을 확인할 수 있다. CFSElo T 세포의 빈도는 예를 들어 PME-CD40L DC로의 재자극 후에 시험관 내에서 증식 중인 T 세포의 백분율을 나타낸다. Ki67 염색 또한 유동 세포측정법을 사용하여 세포 증식을 모니터링하는데 사용될 수 있다.
Treg 세포의 감소와 AGS-003에 대한 유리한 반응 사이의 AGS-003-치료 환자에서의 상관관계는 이러한 환자에서의 Treg 세포의 빈도 및/또는 변화를 이들의 면역 반응의 유용한 지표로 만든다. 이러한 방식으로, 치료 (예를 들어, AGS-003 임상 시험에서와 같은 PME-CD40L DC로의 치료) 후의 환자에서의 Treg 세포의 빈도 및/또는 변화는 환자의 가능한 임상 결과를 평가하기 위한 유용한 도구이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, AGS-003으로의 치료는 CD4+/ CD25+/ FoxP3+/ PD-1-인 증식 중인 (Ki67+) Treg 세포의 상실을 초래할 것이고, 이는 유리한 반응을 가리킨다. 일부 실시양태에서, AGS-003으로의 치료는 FoxP3-TSDR 영역의 메틸화의 검정법을 사용하여 결정된 바와 같이 혈액의 단위 부피 당 Treg의 빈도 및/또는 수의 감소를 초래할 것이다. 유사하게, Treg/eff 세포의 양 및/또는 증식 중인 Treg/eff 세포의 양의 증가가 양성 면역 반응을 나타내면서, 환자 내의 Treg/eff 세포의 수의 변화가 환자의 면역 반응의 유용한 지표일 수 있다.
수지상 세포 백신 또는 요법으로 치료된 환자에서 Treg 세포, Treg/eff 세포, 및/또는 CTL의 빈도 및/또는 변화를 모니터링함으로써, 환자 치료가 면역 반응 (예를 들어, 종양-특이적 CTL 및/또는 무진행 생존의 증가에 의해 측정되는 바와 같음)을 유도하는데 있어서 효과적이었는지 또는 효과적일지 여부를 예측 또는 결정하는 것이 가능하다. 유사하게, 환자 내의 Treg 세포, Treg/eff 세포, 및 CTL 중 하나 이상의 빈도 및/또는 변화를 모니터링함으로써, 치료가 면역 반응을 유도하는데 효과적이었을 때를 평가하는 것이 또한 가능하다. 일부 경우에, 환자 내의 Treg 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 100%, 또는 200% 또는 이를 초과하는 %의 감소는 환자의 면역 반응이 충분하여 치료 (예를 들어, AGS-003으로의 치료)가 치료 역치에 도달하였고 적합하게 중단될 수 있다는 것을 나타낼 것이다. 일부 경우에, 환자의 Treg/eff 세포 및/또는 CTL의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 100%, 또는 200% 또는 이를 초과하는 %의 증가는 환자의 면역 반응이 충분하여 치료 (예를 들어, AGS-003으로의 치료)가 치료 역치에 도달하였고 적합하게 중단될 수 있다는 것을 나타낼 것이다. 이러한 증가 및 감소는 유동 세포측정법을 사용하여 결정된 세포 카운트에 의해 직접적으로 측정될 수 있거나, 또는 정량적 PCR 검정법 예컨대 FoxP3-TSDR QAMA 검정법을 사용하여 간접적으로 측정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Tatura et al. (2012) PLoS ONE 7: e49962]을 참조한다).
치료 결정은 공지된 환자 건강 척도를 지침으로 하여, 그리고 또한 본원에 기술된 바와 같은 환자 세포 카운트 또는 수준의 측정치에 의해 임상의의 기술 내에 속한다. 이러한 방식으로, 본 발명은 치료가 효과적일지 또는 효과적이었는지 여부 및/또는 특정 치료가 계속되어야 하는지 또는 중단되어야 하는지 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 환자는 암, 예를 들어, 전이성 신세포 암종으로 진단되었다.
일부 실시양태에서, 암으로 진단된 환자의 효과적인 치료를 결정 또는 확인하는 방법은 환자로부터 분취량의 혈액을 수득하고; 환자 혈액 내에 존재하는 Treg 세포, Treg/eff 세포, 및/또는 CTL의 수 또는 백분율 (예를 들어, 다른 CD4+ 세포에 대해 상대적임)을 정량하고; 상기 환자에게 DC를 포함하는 치료를 투여하고; 시간 간격 후, 환자 혈액 내에 존재하는 동일한 유형의 세포의 수를 정량하고; 이러한 환자에 대한 이러한 세포 카운트 또는 값이 증가되었는지 또는 감소되었는지 여부를 평가하는 것을 포함한다. 이러한 방식으로, Treg 카운트의 감소, Treg/eff 카운트의 증가, 및/또는 CTL 카운트의 증가가 환자의 면역 반응의 지표 또는 척도로서의 역할을 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 원하는 치료 결과는 Treg 세포의 감소가 측정될 수 있도록 면역 반응이 자극된 것이다; 즉, Treg 카운트가 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 또는 이를 초과하는 %만큼 감소된다. 이러한 실시양태에서, 치료는 Treg 카운트의 이러한 감소를 초래하면 효과적인 것으로 결정된다. 관련 분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, RECIST 기준 또한 환자 진행 또는 치료의 유효성 또는 진행을 평가하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료는 RECIST 측정치를 개선시키거나, 환자 군의 전체 생존을 증가시키거나, 또는 1명 이상의 환자에 대해 무진행 생존을 초래하면 효과적인 적으로 결정된다.
본 발명은 Treg 카운트 또는 값을 결정하고/하거나 Treg 증식을 평가하는 것을 포함하는 측정을 위해 환자 혈액의 샘플을 수득하는 단계; 상기 환자에게 시험관 내에서 제조된 자가 성숙 DC를 투여하는 단계; 후속적으로, 치료 후의 Treg 세포의 양, 빈도 및/또는 증식을 결정하기 위해 환자 혈액의 샘플을 수득하는 단계; 및 치료 후의 환자 혈액 내에 존재하는 Treg 세포의 양, 빈도 및/또는 증식을 치료 전의 양에 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 Treg 세포의 유의한 감소 또는 증식 감소는 환자에서 면역 반응이 유도되었음을 나타내는 것인, 암 환자에서 면역 반응을 측정하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 Treg/eff 카운트 또는 값을 결정하는 것을 포함하는 측정을 위해 환자 혈액의 샘플을 수득하는 단계; 상기 환자에게 시험관 내에서 제조된 자가 성숙 DC를 투여하는 단계; 후속적으로, 치료 후의 Treg/eff 세포의 양 및/또는 빈도를 결정하기 위해 환자 혈액의 샘플을 수득하는 단계; 및 치료 후의 환자 혈액 내에 존재하는 Treg/eff 세포의 양 및/또는 빈도를 치료 전의 양에 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 Treg/eff 세포의 유의한 증가 및/또는 증식 중인 Treg/eff 세포의 비율의 유의한 증가는 환자에서 면역 반응이 유도되었음을 나타내는 것인, 암 환자에서 면역 반응을 측정하는 방법을 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, Treg/eff 카운트 또는 값을 결정하는 것은 환자 세포 (예를 들어, PBMC)를 시험관 내에서 배양한 후에 수행된다.
수지상 세포 백신을 환자에게 투여하는 적절한 방법은 관련 분야에 공지되어 있고, 1가지를 초과하는 경로가 특정 세포 조성물을 투여하는데 사용될 수 있지만, 특정 경로가 종종 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 효과적인 반응을 제공할 수 있다. 투여는 궁극적으로 대상체의 혈액 또는 조직 세포와 접촉하도록 성공적으로 세포를 전달하는 것으로 관련 분야에 공지되어 있는 방법에 의한 것일 수 있다. 바람직한 투여 경로는 피내, 결절내 및 정맥내 투여를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
제약상 허용되는 담체는, 부분적으로, 투여되는 특정 조성물 및 이를 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 수지상 세포를 포함하는 제약 조성물의 광범위한 적절한 제형이 있다. 대상체에게 투여되는 세포의 용량은 대상체에서 경시적으로 원하는 이로운 치료 반응을 달성하는데, 예를 들어, 암 세포의 성장을 억제하거나 또는 감염을 억제하는데 효과적인 양 (즉, "유효량")이다; 그러나, 관련 분야의 통상의 기술자는 완전한 치유가 달성되지 않더라도 면역 반응의 임의의 척도의 증가가 환자에게 이로울 수 있다는 것을 인지한다.
투여를 위해, 대상체의 무게 및 전반적인 건강에 적용되는 바와 같이, 유효 용량, 세포 유형의 LD-50 (또는 독성의 다른 척도), 및/또는 다양한 농도에서의 세포 유형의 임의의 부작용에 의해 결정된 속도로 수지상 세포 백신이 투여될 수 있다. 투여는 단일 또는 분할 용량을 통해 달성될 수 있다. 본 발명의 세포는 세포독성제, 뉴클레오티드 유사체 및 생물학적 반응 변형제를 포함하여, 공지된 통상적인 요법에 의한 병태에 대한 다른 치료를 보충할 수 있다. 유사하게, 생물학적 반응 변형제가 임의적으로 치료에 부가된다; 예를 들어, 세포는 임의적으로 아주반트, 또는 시토카인 예컨대 GM-CSF, IL-12 또는 IL-2와 함께 투여된다.
PME-CD40L 프로세스에서 사용되는 IFN-γR 효능제는 IFN-γ 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편일 수 있고, 포유동물 IFN-γ 또는 인간 IFN-γ일 수 있다. 인간 IFN-γ의 cDNA 및 아미노산 서열이 WO2007117682의 서열식별번호: 5 및 6에서 각각 제시된다. 일부 실시양태에서, IFN-γ는 WO2007117682의 서열식별번호: 6에 제시된 서열, 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편을 갖는다. 한 실시양태에서, IFN-γR은 WO2007117682의 서열식별번호: 6과의 서열 동일성이 적어도 80%인 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는 IFN-γR 효능제는 WO2007117682의 서열식별번호: 6과의 서열 동일성이 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%이다. IFN-γR 효능제의 활성을 테스트하는 방법이 관련 분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Magro et al. (2004) Br. J. Pharmacol. 142: 1281-92]을 참조한다). IFN-γR 효능제를 배양 배지에 첨가함으로써 또는 IFN-γR 효능제를 수지상 세포에서 발현시킴으로써 미성숙 DC에 신호가 전달될 수 있다. 일부 실시양태에서, DC가 IFN-γR 효능제, 예컨대 WO2007117682의 서열식별번호: 6, 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편을 코딩하는 mRNA로 형질감염된다. 그 후, 수지상 세포 내에서의 mRNA의 번역 시에 신호전달이 발생할 것이다. IFN-γR 효능제가 미성숙 DC를 함유하는 배양 배지에 첨가될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 배양 배지는 PGE2 및/또는 GM-CSF + IL-4 또는 IL-13를 추가로 포함한다.
PME-CD40L DC를 생산하는데 사용되는 제2 신호는 CD40 효능제, 예를 들어, CD40L로의 일시적인 신호이다. DC에 CD40 효능제를 코딩하는 mRNA가 로딩되면 또는 CD40 효능제를 함유하는 배지가 DC로부터 제거되면 신호가 일시적인 것으로 간주될 수 있다. 따라서, CD40 효능제 폴리펩티드의 지속적인 발현, 예컨대 렌티바이러스 벡터로부터의 CD40L의 구성적 발현은 일시적 발현으로 간주되지 않는다. 1) CD40 효능제 발현을 구동시키는 프로모터가 DC에서 구성적이지 않거나, 또는 2) 발현 벡터가 DC 게놈 내로 통합되거나 또는 다른 방식으로 DC에서 복제되지 않는 한, DC에 CD40 효능제를 코딩하는 RNA 또는 발현 벡터가 로딩/형질감염되면 CD40 효능제 신호가 또한 일시적인 것으로 간주될 수 있다.
PME-CD40L DC를 제조하는 일부 방법에서, CD40 효능제는 CD40L 폴리펩티드 또는 CD40 효능작용 항체이다. 일반적으로, CD40에 결합하는 리간드가 CD40 효능제로서 작용할 수 있고, 예를 들어, CD40 효능제는 CD40에 결합하는 앱타머일 수 있다. 바람직하게는, CD40 효능제는 CD40L을 코딩하는 mRNA로서 전달된다. 미성숙 또는 성숙 DC를 CD40L mRNA로 형질감염시킴으로써 CD40L을 포함하는 제2 신호를 세포에 투여하면 면역억제 반응보다는 면역자극 반응을 유도하는 변형된 PME-CD40L DC가 생산된다.
PME-CD40L DC를 생산하는데 사용되는 일부 방법에서, 형질감염 직후, 따라서 유효량의 CD40L 신호를 생산하는 CD40L mRNA의 번역 전에 CD40L-mRNA-형질감염 수지상 세포가 IFN-γ (및 임의적으로 PGE2)를 함유하는 배지에서 배양된다. 이러한 상황에서, IFN-γ가 CD40L mRNA로의 형질감염 후에 첨가되지만, 수지상 세포는 CD40L mRNA의 번역으로부터 초래되는 신호 전에 IFN-γ 신호를 수신한다. 따라서, 작용제가 세포에 전달되는 순서는 CD40L 신호전달이 IFN-γ 신호전달 후에 발생해야 한다는 점에서만 중요하다. 이러한 방법에서, DC의 신호전달은 생체 내에서 또는 생체 외에서 발생할 수 있거나, 또는 대안적으로 하나 이상의 신호전달 단계는 생체 외에서 발생할 수 있고, 방법의 나머지 단계는 생체 내에서 발생할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "CD40 리간드" (CD40L)는 CD40 수용체를 특이적으로 인식하여 활성화시키고, 이의 생물학적 활성을 활성화시키는 임의의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 이러한 용어는 막횡단 및 가용성 형태의 CD40L을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, CD40 효능제는 포유동물 CD40L, 바람직하게는 인간 CD40L이다. 인간 CD40L cDNA 및 상응하는 아미노산 서열이 각각 WO2007117682의 서열식별번호: 1 및 2에서 제시된다.
PME-CD40L DC를 제조하는데 사용되는 일부 방법에서, 방법은 (a) 단리된 미성숙 수지상 세포 (iDC)에 인터페론 감마 수용체 (IFN-γR) 효능제 및 TNF-αR 효능제를 포함하는 제1 신호를 신호전달하여, IFN-γR-효능제-신호전달 수지상 세포를 생산하고; (b) 상기 IFN-γR-효능제-신호전달 수지상 세포에 유효량의 CD40L 폴리펩티드를 포함하는 제2의 일시적인 신호를 신호전달하여 CD83+ CCR7+ 성숙 수지상 세포를 생산하는 순차적인 단계를 포함하고, 여기서 CD40L 폴리펩티드는 본질적으로 WO2007117682의 서열식별번호: 2의 아미노산 잔기 21-261 또는 WO2007117682의 서열식별번호: 2의 아미노산 잔기 21-261과의 서열 동일성이 적어도 80%인 폴리펩티드로 이루어진다.
PME-CD40L DC를 제조하는데 사용되는 일부 방법에서, 방법은 (a) 단리된 미성숙 수지상 세포 (iDC)를 TNF-αR 효능제 및 PGE2의 존재 하에 인터페론 감마 수용체 (IFN-γR) 효능제와 함께 약 12 내지 30시간 동안 배양하여, CD83+ 성숙 수지상 세포를 생산하고; (b) 단계 (a)를 시작하고 나서 약 12 내지 30시간 후에, 상기 CD83+ 성숙 수지상 세포 (mDC)에 WO2007117682의 서열식별번호: 2의 아미노산 잔기 21-261로 이루어지는 CD40L 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA 및 하나 이상의 항원을 코딩하는 mRNA를 형질감염시켜, CD83+ CCR7+ 성숙 수지상 세포를 생산하는 순차적인 단계를 포함한다.
PME-CD40L DC를 생산하는데 사용되는 방법은 미성숙 또는 성숙 DC에 유효량의 항원을 전달하는 것을 또한 포함할 수 있고, 그 후 항원이 성숙 DC에 의해 프로세싱되어 제시될 것이다. 항원은 천연 발생일 수 있거나 또는 재조합으로 생산될 수 있다. 항원은 관련 분야에 공지된 방법을 사용하여 폴리펩티드 또는 단백질로서 또는 이들을 코딩하는 핵산으로서 세포에 전달될 수 있다. 일부 방법에서, 하나 이상의 항원을 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 관련 분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법 예컨대 전기천공에 의해 iDC, 신호가 전달된 DC 또는 CCR7+ 성숙 DC 내로 도입된다. 가장 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 mRNA이다. 바람직한 실시양태에서, 항원 또는 항원-코딩 mRNA는 CD40 효능제를 코딩하는 mRNA와 함께 또는 CD40 효능제 신호전달과 실질적으로 동반되어 도입된다.
수지상 세포에 항원을 로딩하는 방법이 관련 분야에 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 수지상 세포를 항원을 함유하는 배지에서 배양한다. 그 후, DC가 항원을 집어 올려 MHC 분자와 함께 세포 표면 상에 프로세싱한다. 바람직하게는, 항원을 코딩하는 핵산, 예를 들어, mRNA로의 형질감염에 의해 항원이 DC에 로딩된다. 항원을 코딩하는 mRNA가 DC 내로 도입될 수 있고, CD40L 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA와 공동-형질감염될 수 있다. DC를 형질감염시키는 방법이 관련 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
항원은 단일한 공지된 항원일 수 있거나 또는 항원 수집물일 수 있다. 항원 수집물은 하나의 특정한 공급원, 예를 들어 환자의 암 세포 또는 HIV-감염 세포로부터 유래될 수 있거나, 또는 여러 공급원, 예를 들어, 여러 상이한 환자로부터의 HIV-감염 세포로부터 유래될 수 있다. PME-CD40L DC를 생산하는 방법에서 사용하기 위한 항원은 병원체, 병원체 용해물, 병원체 추출물, 병원체 폴리펩티드, 바이러스 입자, 박테리아, 단백질, 폴리펩티드, 암 세포, 암 세포 용해물, 암 세포 추출물, 및 암-세포-특이적 폴리펩티드로부터의 항원을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, PME-CD40L DC를 생산하는데 사용될 수 있는 항원은 널리 공지되어 있는 항원, 예를 들어, MART-1을 포함한다.
대안적으로 항원은 임의의 천연-발생 화합과 별개인 구조를 가질 수 있거나, 또는 제1 폴리펩티드 (예를 들어, 제1 항원)로부터의 서열의 일부분을 제2 폴리펩티드 (예를 들어, 제2 항원, 신호 서열, 막횡단 도메인, 정제 모이어티 등)로부터의 서열의 일부분에 펩티드 결합에 의해 연결함으로써 생산된 융합 단백질일 수 있다. 관련 분야의 통상의 기술자는 본 발명에 따라 사용하기 위한 이러한 융합 단백질의 다양성을 이해할 것이다.
바람직한 실시양태에서, 수지상 세포에 제공되는 항원은 암 세포 또는 병원체로부터의 것이다. 암 세포는 신장암 세포 (예를 들어, 신세포 암종으로부터의 것), 다발성 골수종 세포 또는 흑색종 세포를 포함하여 임의 유형의 암 세포일 수 있다. 바람직한 병원체는 HIV 및 HCV를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 항원은 암 세포 또는 병원체 또는 병원체-감염 세포 (예를 들어, HIV-감염 세포)로부터 단리되거나 유래되는 RNA의 형태로 DC에 전달된다. 임의의 세포 (예를 들어, 암 세포 또는 병원체-감염 세포)로부터 추출된 RNA의 RT-PCR, 및 시험관내 전사를 위한 방법이 WO2006031870 (니콜레트 등) 및 미국 공개 20070248578 (체레파노바 등)에 개시되어 있고, 이들의 내용은 참고로 포함된다.
명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태의 관사는 문맥적으로 명확하게 달리 나타내지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 이의 혼합물을 포함하여 복수의 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하지만, 다른 것을 배제하지 않는다는 것을 의미하도록 의도된다. "본질적으로 ~로 이루어지는"은, 조성물 및 방법을 규정하는데 사용되는 경우, 임의의 본질적인 유의성이 있는 다른 요소를 조합에 배제하는 것을 의미할 것이다. 따라서, 본원에서 정의된 바와 같은 요소로 본질적으로 이루어지는 조성물은 단리 및 정제 방법으로부터의 미량의 오염물 및 제약상 허용되는 담체, 예컨대 포스페이트 완충 염수, 보존제 등을 배제하지 않을 것이다. "~로 이루어지는"은 다른 성분 및 실질적인 방법 단계의 미량을 초과하는 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. 각각의 이러한 이행 용어에 의해 정의되는 실시양태가 본 발명의 범주 내에 속한다.
용어 "항원"은 관련 분야에서 잘 이해되고, 면역원성인 임의의 물질, 즉, 면역원을 포함한다. 다중 면역원에 대한 면역 반응이 동시에 조정될 수 있도록, 용어 "항원" 또는 "면역원"은 1개를 초과하는 면역원의 수집물에 적용된다. 또한, 이러한 용어는 면역원 또는 항원의 다양한 상이한 제형들 중 임의의 것을 포함한다. 용어 "종양 연관 항원", "종양 항원", 또는 "TAA"는 종양과 연관된 항원을 지칭한다. 널리 공지되어 있는 TAA의 예는 gp100, MART 및 MAGE를 포함한다. 다른 종양 항원이 특정 환자 내의 특정 종양에 대해 특이적일 수 있다.
용어 "주요 조직적합성 복합체" 또는 "MHC"는 T 세포로의 항원 제시 및 신속한 이식 거부에 요구되는 세포-표면 분자를 코딩하는 유전자의 복합체를 지칭한다. 인간에서, MHC는 일명 "인간 백혈구 항원" 또는 "HLA" 복합체이다. 관련 분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, MHC에 의해 코딩되는 단백질은 "MHC 분자"로 공지되고, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자로 분류된다.
용어 "항원 제시 세포 (APC)"는 하나 이상의 항원을 면역계의 특정한 이펙터 세포에 의해 인식될 수 있는 펩티드-MHC 복합체의 형태로 제시함으로써, 제시되고 있는 항원 또는 항원들에 대한 효과적인 세포성 면역 반응을 유도할 수 있는 세포 클래스를 지칭한다. APC는 무손상 전체 세포 예컨대 대식세포, B-세포, 내피 세포, 활성화된 T-세포, 및 수지상 세포일 수 있다. 다수의 세포 유형이 T-세포 인식을 위해 자신의 세포 표면 상에 항원을 제시할 수 있지만, 수지상 세포만 세포독성 T-림프구 (CTL) 반응을 위해 나이브 T-세포를 활성화시키도록 항원을 제시하는 능력이 있다.
용어 "수지상 세포" (본원에서 또한 "DC")는 다양한 림프양 및 비-림프양 조직에서 발견되는 형태학적으로 유사한 세포 유형의 광범위한 집단을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Steinman (1991) Ann. Rev. Immunol. 9: 271-296] 참조). 수지상 세포는 생물 내의 가장 강력하고 바람직한 APC를 구성한다. DC는 단핵구로부터 분화될 있지만, 표현형적으로 단핵구와 별개이다; 예를 들어, CD14 항원이 수지상 세포에서는 발견되지 않지만, 단핵구에서는 발현된다. 또한, 성숙 수지상 세포는 포식성이지 않은 반면, 단핵구는 강력한 포식작용 세포이다. 성숙 DC가 T 세포 활성화 및 증식에 필요한 모든 신호를 제공할 수 있는 것으로 나타났다.
용어 "면역 이펙터 세포"는 항원에 결합할 수 있고 면역 반응을 매개하는 세포를 지칭한다. 이러한 세포는 T 세포, B 세포, 단핵구, 대식세포, NK 세포 및 세포독성 T 림프구 (CTL)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. "나이브" 면역 이펙터 세포는 이러한 세포를 활성화시킬 수 있는 항원에 노출된 적이 없는 면역 이펙터 세포이다. 나이브 면역 이펙터 세포의 활성화는 펩티드:MHC 복합체의 인식, 및 세포가 항원-특이적 아암의 이펙터 T 세포로 증식 및 분화하기 위한 전문 APC에 의한 공동자극 신호의 동시 전달 양쪽 모두를 필요로 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "교육된 항원-특이적 면역 이펙터 세포"는 이전에 항원과 조우한 상기 정의된 바와 같은 면역 이펙터 세포이다. 이의 나이브 대응물과 대조적으로, 교육된 항원-특이적 면역 이펙터 세포의 활성화는 공동자극 신호를 필요로 하지 않는다; 펩티드:MHC 복합체의 인식이 충분하다.
"활성화된"은, T 세포와 관련하여 사용되는 경우, 세포가 더 이상 G0 기에 있지 않고, 세포 유형에 특징적인 세포독소, 시토카인 및 다른 관련된 막-회합 단백질 (예를 들어, CD8+ 또는 CD4+) 중 하나 이상을 생산하기 시작하며, 특정한 펩티드/MHC 복합체를 표면에 디스플레이하는 임의의 표적 세포를 인식하여 이에 결합할 수 있고, 자신의 이펙터 분자를 방출할 수 있다는 것을 의미한다.
"면역 반응"은 외래 물질에 대한 림프구의 항원-특이적 반응을 광범위하게 지칭한다. 면역 반응을 유발할 수 있는 임의의 물질을 "면역원성"이라고 하고, 이는 "면역원"으로 지칭된다. 면역 반응은 체액성 (항체 활성을 통함) 또는 세포-매개 (T 세포 활성화를 통함)일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "대상체에서 면역 반응을 유도함"이라는 구절 또는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 것은 관련 분야에서 이해되고, 항원을 대상체 내로 도입하기 전의 면역 반응 (존재하는 경우)에 비교하여, 항원을 대상체 내로 도입한 후에 검출 또는 측정될 수 있는 항원에 대한 면역 반응의 적어도 약 2배, 또는 대안적으로 적어도 약 5배, 또는 대안적으로 적어도 약 10배, 또는 대안적으로 적어도 약 100배, 또는 대안적으로 적어도 약 500배, 또는 대안적으로 적어도 약 1000배 또는 이를 초과하는 배수의 증가를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응이 치료 전의 항원에 대해 대상체가 나타내는 면역 반응에 비교하여 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 이를 초과하는 %만큼 증가되면 치료가 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 유도한 것으로 간주된다. 항원에 대한 면역 반응은 항원-특이적 항체의 생산 또는 항원-특이적 생산의 증가; 확인가능한 면역 세포 유형의 양 또는 빈도의 증가 또는 감소; 및 항원에 특이적으로 결합하는 분자를 자신의 표면 상에 발현하는 면역 세포의 생산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 소정의 항원에 대한 면역 반응이 유도되었는지 여부를 결정하는 방법이 관련 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, ELISA 검정법을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 관련 분야에 공지되어 있는 다양한 면역검정법 중 임의 것을 사용하여 항원-특이적 항체를 검출할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "시토카인"은 세포 상에서 다양한 효과, 예를 들어, 성장 또는 증식 유도를 발휘하는 다수의 인자 중 어느 하나를 지칭한다. 본 발명의 실행에서 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있는 시토카인의 비-제한적 예는 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-12 (IL-12), 및 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 포함한다. 시토카인은 쉽게 상업적으로 입수가능하고, '천연'의 정제된 시토카인일 수 있거나 또는 재조합으로 생산될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산", 및 "핵산 분자"는 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭하도록 상호교환가능하게 사용된다. 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 및/또는 이들의 유사체를 함유할 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는, 예를 들어, 유전자 또는 유전자 단편, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 단리된 DNA, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, mRNA는 수지상 세포에서 번역될 수 있는 RNA를 지칭한다. 이러한 mRNA는 전형적으로 캡핑되고, 리보솜 결합 부위 (코작(Kozak) 서열) 및 번역 개시 코돈이 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, cDNA 서열에 상응하는 RNA는 뉴클레오티드가 데옥시리보뉴클레오티드 대신 리보뉴클레오티드이고, DNA 내의 임의의 티민 (T) 염기가 RNA에서 우라실 (U) 염기로 교체되는 것을 제외하고는, cDNA 서열과 동일한 서열을 갖는 RNA 서열을 지칭한다.
용어 "펩티드"는 2개 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티드모방체의 화합물을 지칭하도록 이의 가장 넓은 의미로 사용된다. 서브유닛들은 펩티드 결합에 의해 연결될 수 있거나, 또는, 일부 실시양태에서는, 다른 결합, 예를 들어, 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 및 L 양쪽 모두의 광학 이성질체를 포함하는 천연 및/또는 비-천연 또는 합성 아미노산, 아미노산 유사체, 및 펩티드모방체를 지칭한다. 펩티드 사슬이 비교적 짧으면 3개 이상의 아미노산의 펩티드가 통상적으로 올리고펩티드로 칭해지는 반면, 펩티드 사슬이 길면 펩티드가 통상적으로 폴리펩티드 또는 단백질로 칭해진다.
폴리펩티드 또는 단백질에 대한 "보존적 변경"은 유사한 전하 밀도, 소수성 또는 친수성, 크기 및/또는 형상의 대안적인 아미노산 (예를 들어, Ile의 경우 Val)을 초래하는 변경이다. 대조적으로, "비-보존적 변경"은 상이한 전하 밀도, 소수성 또는 친수성, 크기 및/또는 형상의 대안적인 아미노산 (예를 들어, Phe의 경우 Val)을 초래하는 변경이다. 이러한 변형을 만드는 수단이 관련 분야에 널리 공지되어 있다.
용어 "유전적으로 변형된"은 차례로 세포 또는 이의 자손의 유전자형 또는 표현형을 변형시키는 외래 유전자 또는 핵산 서열을 함유하고/하거나 발현하는 것을 의미한다. 달리 말하면, 이는 세포의 내인성 뉴클레오티드의 임의의 부가, 결실 또는 파괴를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드의 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되고, mRNA가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 프로세스를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 적합한 진핵생물 숙주의 게놈 DNA로부터 유래되면, 발현은 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 발현에 요구되는 조절 요소가 관련 분야에 공지되어 있고, RNA 중합효소에 결합하는 프로모터 서열 및 리보솜 결합을 위한 전사 개시 서열을 포함한다. 박테리아 및/또는 진핵생물 발현을 위한 적합한 벡터가 관련 분야에 공지되어 있고, 상업적으로 입수가능하다.
"전사 제어 하에 있는"은 관련 분야에서 이해되는 용어이고, 폴리뉴클레오티드 서열 (일반적으로 DNA 서열)의 전사가 전사 개시에 기여하거나 또는 전사를 촉진하는 요소에 서열이 작동적으로 연결되는 것에 의존적이라는 것을 가리킨다. "작동적으로 연결된"은 요소가 이들이 기능하도록 배열된 것인 병렬배치를 지칭한다.
"유전자 전달 비히클"은 삽입된 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 운반할 수 있는 임의의 분자로 정의된다. 유전자 전달 비히클의 예는 리포솜, 생체적합성 중합체, 및 다양한 진핵생물 및 원핵생물 숙주에서의 발현을 위해 기술된 관련 분야에서 사용되는 기타 재조합 비히클을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "유전자 전달", "유전자 이동", "형질감염" 등은 도입에 사용되는 방법과 관계 없이 외인성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 것을 지칭한다. 형질감염은 임의의 핵산을 세포 내부로 전달하는 것을 지칭하고, 다양한 기술 예컨대 전기천공; 단백질-기반, 지질-기반 및 양이온성 이온-기반 핵산 전달 복합체; 바이러스 벡터; "유전자 총" 전달; 및 관련 분야에 공지되어 있는 다양한 다른 기술을 포함할 수 있다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 안정적으로 유지될 수 있거나 또는 일시적으로 발현될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, mRNA는 DC 내로 도입되고, 일시적으로 발현된다. 안정적인 유지는 도입된 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포와 상용성인 복제 기원을 함유하거나 또는 숙주 세포의 레플리콘 예컨대 염색체외 레플리콘 (예를 들어, 플라스미드) 또는 핵 또는 미토콘드리아 염색체 내로 통합되는 것을 전형적으로 필요로 한다. 다수의 벡터가 유전자를 포유동물 세포에 전달하는 것을 매개할 수 있고, 관련 분야에 공지되어 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 이의 일부분 (또는 폴리펩티드 또는 이의 일부분)의 서열은 2개의 서열이 정렬 및 비교되었을 때 특정한 백분율의 염기 또는 아미노산이 동일한 경우에 또 다른 서열에 대한 이러한 백분율의 "서열 동일성" (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)을 갖는다. 적합한 정렬 및 2개의 서열 사이의 퍼센트 서열 동일성을 널리 공지되어 있고 공개적으로 입수가능한 정렬 프로그램 + 디폴트 파라미터 중 하나, 예를 들어, "BLAST"를 사용하여 결정할 수 있다.
용어 "단리된"은 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 이들의 단편과 천연에서 정상적으로 회합되는 세포성 또는 다른 방식의 구성성분으로부터 분리되는 것을 의미한다. 예를 들어, 단리된 폴리뉴클레오티드는 염색체 내에서 정상적으로 이와 회합되는 5' 및 3' 서열로부터 분리된 것이다. 포유동물 세포 예컨대 수지상 세포는 세포가 생물 내에서 발견되는 해부학적 부위로부터 제거되었으면 생물로부터 단리된 것이다. 추가적으로, "농축된", "분리된", 또는 "희석된" 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 또는 이들의 단편(들)은 부피 당 분자의 농도 또는 수가 이의 천연 발생 대응물의 것보다 더 크다는 점에서 이의 천연 발생 대응물과 구별된다.
"숙주 세포", "표적 세포", 또는 "수용자 세포"는 벡터 또는 외인성 핵산 분자, 폴리뉴클레오티드 및/또는 단백질 혼입에 대한 수용자일 수 있거나 수용자였던 임의의 세포 또는 세포 배양물을 포함하도록 의도된다. 이는 또한 단일 세포의 자손을 포함하도록 의도된다. 일부 경우에, 자손 세포는 천연이거나, 우연이거나 또는 의도적인 돌연변이로 인해 (형태학 면에서 또는 게놈 또는 총 DNA 전량 면에서) 원래의 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있다. 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있고, 박테리아 세포, 효모 세포, 동물 세포, 및 포유동물 세포, 예를 들어, 뮤린, 래트, 원숭이 또는 인간을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"대상체" 또는 "환자"는 포유동물이다; 다수의 실시양태에서, 환자는 인간 환자이다. 대상체 또는 환자는 원숭이 또는 유인원, 또는 임의의 가축 예컨대 개, 고양이, 말 등을 포함하는 임의의 다른 포유동물일 수도 있다.
"암"은 암 세포가 세포 증식 제어의 유의한 상실을 특징으로 하는 이상 성장 표현형을 나타내도록 (즉, 신생물성임), 상대적으로 자율적인 성장을 나타내는 세포의 비정상적인 존재를 의미한다. 암성 세포는 양성 또는 악성일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 암은 방광, 혈액, 뇌, 유방, 결장, 소화관, 폐, 난소, 췌장, 전립선 또는 피부의 세포에 영향을 미친다. 암 세포의 정의는, 본원에서 사용된 바와 같이, 원발성 암 세포을 포함할 뿐만 아니라, 전이된 암 세포, 시험관내 배양물, 및 암 세포로부터 유래된 세포주를 포함하여, 암 세포 조상으로부터 유래된 임의의 세포를 또한 포함한다. 암은 고형 종양, 액체 종양, 혈액학적 악성종양, 신세포 암종, 흑색종, 유방암, 전립선암, 고환암, 방광암, 난소암, 뇌암, 위암, 식도암, 췌장암, 폐암, 신경모세포종, 아교모세포종, 망막모세포종, 백혈병, 골수종, 림프종, 간세포암, 선종, 육종, 암종, 모세포종 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로 고형 종양으로 구현되는 암의 유형을 지칭할 때, "임상적으로 검출가능한" 종양은 종양 덩어리를 기초로, 예를 들어, CAT 스캔, 자기 공명 영상 (MRI), X-레이, 초음파 또는 촉진과 같은 절차에 의해 검출가능한 종양이다. 생화학적 또는 면역학적 발견만으로는 이러한 정의를 충족시키는데 불충분할 수 있다.
용어 "배양함"은 적절한 배지에서의 세포의 시험관내 유지, 분화 및/또는 증식을 지칭한다.
"강화된"은 조성물이 또 다른 조성물, 예를 들어, 생물에서 세포가 존재하는 조직, 또는 세포가 이전에 존재한 세포의 군, 혼합물 또는 배양물에서 발견되는 것보다 더 큰 전체 세포 중 백분율로 존재하는 세포를 포함하는 것을 의미한다. 조성물 (예를 들어, 분취량의 배지 또는 저장 완충제)에서 '강화된' 세포는 이러한 조성물 내의 세포의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 70% 초과로 존재한다. 유사하게, 특정 세포 유형의 세포 (예를 들어, Treg 세포)가 조성물 (예를 들어, 분취량의 배지 또는 저장 완충제) 내의 세포의 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 또는 99% 초과로 존재하면, 세포가 "정제된" 또는 "단리된" 것으로 간주된다. 반대로, "고갈된"은, 예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 또는 이를 초과하는 %, 또는 100%만큼, 이러한 세포 유형의 빈도가 세포의 특정 조성물 또는 군에서 감소되는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "강화함" 또는 "강화"는 세포가 세포의 집단 또는 군으로부터 이를 선택적으로 또는 우선적으로 제거하는 양성 선별을 사용하여 "강화되는" 것 또는 세포가 원하는 세포 유형(들)이 남도록 세포의 출발 집단 또는 군으로부터 다른 세포를 선택적으로 또는 우선적으로 제거하는 음성 선별을 사용하여 "강화되는" 것을 의미한다. 양성 및/또는 음성 선별은 관련 분야에 공지되어 있는 물질 및 기술을 사용하여 쉽게 달성될 수 있다. 예를 들어, 특정 세포 표면 마커를 발현하는 세포를 마커에 결합하고 칼럼 또는 자기 비드에 커플링된 모노클로날 항체를 사용하여 다른 세포로부터 분리할 수 있다; 분리는 표준 기술 및/또는 제조사 또는 공급자의 지시에 따라 쉽게 수행된다.
"세포 표면 마커" (때때로 본원에서 "마커" 또는 "세포 마커"로 지칭됨)는 임의의 적절한 방법을 사용하여, 예를 들어, 표지된 항체 또는 관련 분야에 공지되어 있는 다른 수단을 사용하여 검출될 수 있는, 세포 표면에서 발현되는 분자를 의미한다. 세포 표면 마커는 단백질, 당단백질, 또는 단백질 및/또는 당단백질의 군을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 세포 표면 마커는 특정 세포 유형 또는 하나 이상의 세포 기능과 상호관련되거나 또는 이를 나타내는 것으로 공지되어 있다. 마커의 특정한 세트 또는 조합, 또는 이의 일부 서브세트의 발현에 의해 특정 세포 집단을 확인할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세포 표면 마커 또는 다른 마커와 관련된 "양성 발현" 또는 "~에 대해 양성"은 세포 상에서 또는 세포 군 또는 세포 집단에서 마커가 검출가능한 수준으로 발현된다는 것을 일반적으로 의미한다. 일부 경우에, "양성 발현" 또는 "~에 대해 양성"은 다른 세포 또는 다른 세포 군 또는 집단에 비교함으로써 평가될 수 있거나, 또는 배경, 저 또는 음성으로 확인되는 선택된 발현 수준일 수 있는, 배경 수준 또는 "저" 또는 "음성" 수준을 유의하게 초과하는 수준으로 특정 세포 표면 마커를 발현하는 세포를 지칭하도록 사용된다. 관련 분야의 통상의 기술자는 마커 발현을 검출하고, "양성" 발현을 "배경" 또는 "음성" 발현과 구별하는 발현 수준 또는 수준들을 결정하기 위한 기술에 친숙하다. "양성 발현"이 있거나 또는 특정 마커에 대해 "양성인" 세포는 배경 발현보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 또는 500% 더 높거나 또는 배경, 저 또는 음성 발현보다 적어도 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 또는 100배 더 높은 발현을 나타낼 수 있다. 일부 실시양태에서, 마커는 세포 내에서 발현되지만, 관련 분야에 공지된 기술을 사용하여 발현이 검출가능하다. 일반적으로, 예를 들어, 본원의 실시예에 기술되고 관련 분야에 공지되어 있는 실험에 의해 입증되는 바와 같이 (예를 들어, 문헌 [Hasan et al. (2015) Clin. Immunol. 157: 261-76]을 참조한다), 마커의 발현은 제조사 또는 공급자의 지시에 따라 FACS 장치를 사용하여 측정될 수 있는 형광 표지 또는 기타 표지에 커플링된, 마커 (예를 들어, 항체)에 결합하는 모이어티로 검출된다.
"제약 조성물"은 활성 작용제와 조성물을 시험관내 또는 생체내에서의 진단 또는 치료 용도에 적합하게 만드는 불활성 또는 활성 담체의 조합물을 포함하도록 의도된다. 용어 "제약상 허용되는 담체"는 표준 제약 담체, 예컨대 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 및 에멀션, 예컨대 유/수 또는 수/유 에멀션, 및 다양한 유형의 습윤화제 중 임의의 것을 포함한다. 조성물은 안정화제 및 보존제를 또한 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 아주반트의 예에 대해, 문헌 [Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1990))]을 참조한다.
"유효량"은 임의의 이롭거나 원하는 결과, 예컨대 강화된 면역 반응, 치료, 의학적 병태 (질환, 감염 등)의 방지 또는 호전을 일으키는데 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다. 적절한 투여량은 체중, 연령, 건강, 치료되는 질환 또는 병태 및 투여 경로에 따라 변할 것이다; 유효량을 결정하는 방법이 관련 분야에 공지되어 있다. 관련 분야의 통상의 기술자는 환자의 암이 완전히 치유되지 않더라도, 예를 들어, 다른 치료가 그렇지 않은 경우에 효과적일 것보다 더욱 효과적일 수 있도록 환자의 면역 반응을 강화함으로써, 임의의 양성 면역 반응이 환자 (예를 들어, 암 환자)에게 이익을 제공할 수 있다는 것을 이해한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "신호전달"은 미성숙 또는 성숙 수지상 세포를 IFN-γ 수용체 효능제, TNF-α 수용체 효능제, CD40L 폴리펩티드 또는 다른 CD40 효능제와 접촉시키는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 이러한 효능제는 외부적으로 (예를 들어, 세포 배양 배지 내에) 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 효능제는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 미성숙 또는 성숙 수지상 세포를 형질감염시키는 것을 통해 제공된다. 폴리펩티드(들)가 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 수지상 세포를 형질감염시키는 것에 의해 제공되는 경우, 신호전달은 핵산으로의 형질감염 시보다는 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 번역 시에 달성된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "성숙 수지상 세포"는 미성숙 DC (iDC)에 비교하여 공동-자극 분자 CD83의 세포 표면 발현 상승을 나타내는 수지상 세포를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유의한 차이"는 측정된 파라미터의 증가 또는 감소가 적합한 통계 검정을 사용하여 결정되었을 때 통계적으로 유의하다는 것을 의미한다. 이러한 방법은 관련 분야에 공지되어 있고, 적합한 검정이 관련 분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 선택된다.
본 개시내용 전반에 걸쳐, 다양한 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서가 확인 인용에 의해 참조된다. 이러한 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서의 개시내용은 이에 의해 본 개시내용에 명확하게 참조로 포함되어, 본 발명이 관련되는 최신 단계를 더욱 완전하게 기술한다.
본 발명의 실행은, 달리 나타내지 않는 한, 관련 분야의 통상의 기술자가 쉽게 수행할 수 있는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용한다. 이러한 기술은 관련 분야에 공지되어 있고, 문헌에 설명되어 있다. 상기 설명에 따라, 하기의 예는 본 발명의 다양한 측면을 예시하도록, 그러나 제한하지 않도록 의도된다.
실험예
실시예 1
DC 성숙 프로세스 및 평가
PME-CD40L 수지상 세포 (DC)를 본질적으로 문헌 [Amin et al. (2015) J. Immunother. Cancer 3:14]에 기술된 바와 같이 제조하였다 (본원에서 "AGS-003" 또는 "AGS-003 DC"로 지칭됨). 간략하게, 자가 종양 전체 RNA를 신장절제술 또는 전이암절제술 조직 샘플로부터 단리하고, 기존에 문헌 [Slagter-Jager et al. (2013) Mol. Ther. Nucl. Acids 2013: 2e91]에 기술된 바와 같은 RT/PCR 및 시험관내 전사 기술을 사용하여 메신저 RNA를 증폭시켰다. 문헌 [Tcherepanova et al. (2008) PLoS One 3(1):e1489]에 기술된 바와 같은 시험관내 전사 및 전사-후 캡핑 방법을 사용하여 CD40L RNA를 제작하였다. COBE 스펙트라(Spectra)® 백혈구성분채집술 시스템 (감브로 BCT(Gambro BCT), 콜로라도주 레이크우드)을 사용하여 임상 장소의 공여자 센터에서 환자가 백혈구성분채집술을 받았다. 단핵구를 AIM-V 배지 + GM-CSF (베를렉스(Berlex)) 및 IL-4 (R&D 시스템즈(R&D Systems))에서 배양하여, 미성숙 DC를 생성시킨 후, 이를 TNF-알파 (R&D 시스템즈), IFN-감마 (인터뮨(InterMune)), 및 프로스타글란딘 E2 (시그마(Sigma))를 사용하여 성숙시켰다. 증폭된 종양 RNA 및 CD40L RNA를 성숙-후 전기천공 프로토콜을 사용하여 성숙 DC에 전기천공시켰다 (Calderhead et al. (2008) J. Immunother. 31:731-41).
최종 AGS-003 제품을 80% 자가 혈장, 10% 덱스트로스 (50% w/v) (호스피라(Hospira)), 및 10% DMSO (시그마)에 1.4 × 107개의 DC/0.7 mL로 제형화하고, 액체 질소 상에서 냉동보존하였다. 임상 용도로 방출하기 전에 최종 제품의 해동된 샘플을 멸균성, 마이코플라즈마, 내독소, 및 생존에 대해 평가하였다.
유동 세포측정법 분석을 위해, DC를 수확하고, 냉장 PBS/1% FCS에 재현탁시킨 후, CD1a, CD209, 인간 백혈구 항원 (HLA)-ABC, HLA-DR, CD80, CD86, CD38, CD40, CD25, CD123, CD83, CCR6, CCR7, CD70, 및 CD14에 대해 특이적인 피코에리트린 (PE) 또는 FITC-접합 항체와 혼합하였다; 아이소타입-매칭 항체가 대조군으로서 사용되었다. 철저한 세정 후, LSRII 유동 세포측정기 (BD 바이오사이언시즈™) 및 플로우조(FlowJo) 소프트웨어 (트리스타(Treestar))로 형광 분석을 수행하였다. 8-㎛ 세공 크기의 폴리카르보네이트 필터를 통과하는 이동에 의해 DC의 화학주성을 측정하였다. DC 상청액 내의 IL-10 및 IL-12 농도를 ELISA를 사용하여 결정하였다.
실시예 2
AGS-003이 Treg 이펙터 세포를 생산한다
아고스 쎄라퓨틱스 인크의 임상 시험 ("ADAPT 시험")에서, 신세포 암종 (RCC) 환자를 본질적으로 문헌 [Amin et al. (2015) J. Immunother. Cancer 3:14]에 기술된 바와 같이 자가 수지상 세포 요법 AGS-003으로 치료하였다. 환자 T 세포의 집단에 대한 이러한 요법의 효과를 CD3, CD4, CD25, CD127을 포함하는 다양한 세포 표면 표현형 마커의 발현, 및 FoxP3을 포함하는 마커의 세포내 발현을 평가하는 다색 세포 유동측정법을 사용하여 모니터링하였다.
AGS-003으로의 치료 전에 환자로부터 수득된 환자 PBMC를 시험관 내에서 AGS-003과 함께 배양한 후, 다색 세포 유동측정법을 사용하여 평가하였다. 하기 제시된 데이터는 임의의 치료 전에 수집된 환자 PBMC는 조절 T 세포 ("Treg")를 함유하는 한편, AGS-003 DC 제품과 함께 시험관 내에서 배양 시, Treg 이펙터 (Treg/eff) 세포가 생산된다는 것을 나타낸다. Treg 이펙터 세포는 PD-1의 발현 및 CXCR4 발현의 결여에 의해 "고전적" Treg와 상이하다. 추가로, 환자 PBMC를 시험관 내에서 AGS-003 DC 제품으로 자극하면 Treg 이펙터 세포의 증식이 유도되고, 고전적 Treg 세포는 그렇지 않다.
ADAPT 환자에서의 T 세포의 연구. 억제인자 활성이 있는 T 조절 세포는 CD3+/CD4+/CD25+/CD127-/FoxP3+이다. FoxP3 발현은 염증유발성 이펙터 기능이 있는 CD3 T 세포에 대한 초기 활성화 마커일수도 있고, 따라서, 본 발명이 어떠한 특정한 작용 메커니즘에도 제한되지 않으면서, AGS-003의 생체내 투여가 FoxP3+ Treg 세포의 기능을 억제인자 기능에서 염증유발성 기능으로 이동시킬 수 있는 것이 가능하다. AGS-003으로 치료된 환자로부터 수집된 데이터는 시험관 내에서 AGS-003 수지상 세포 (DC)와 함께 배양되었을 때 FoxP3+ Treg/eff 세포가 증식된다는 것을 시사한다. 이러한 AGS-003-유도 Treg/eff 세포는 PD-1의 양성 발현 및 케모카인 수용체 CXCR4의 음성 발현 (즉, 발현 결여)에 의해 "고전적" Treg와 상이하다. 따라서, AGS-003 DC와의 배양 후에 증식할 수 있는 활성화된 CD4+/FoxP3+/PD-1+/CXCR4- T 세포의 신규 집단을 확인하기 위해 "Treg/eff"라는 명칭이 본원에서 사용된다.
말초 전혈 수집물 내의 T 조절 세포의 수를 결정하는 방법 . 소량의 전혈을 헤파린 술페이트 튜브에서 수집하고, 항-CD3, 항-CD25, 항-CD4 및 항-CD127 항체를 포함하는 플루오로크롬-접합 항체의 칵테일로 염색하였다. 염색 후, 적혈구를 용해시키고, 표지된 세포를 고정하고, 투과화하였다. 투과화된 세포에서 형광 접합 항-FoxP3 항체를 사용하여 세포내 FoxP3 발현을 검출하였다. 표지된 세포를 고정된 부피의 트루카운트 비드 튜브 (BD 바이오사이언시즈)에 첨가하고, 세포 이벤트를 유동 세포측정기에서 수집하였다. Treg 세포의 수는 세포 개수/전혈 100 마이크로리터로서 표현된다.
시험관내 PBMC 배양물에서 T 조절 세포의 수를 결정하는 방법 . 시험관내 배양 후, PBMC를 항-CD3, 항-CD25, 항-CD4 및 항-CD127 항체를 함유하는 플루오로크롬 접합 항체의 칵테일로 염색하였다. 다른 세포 표면 마커 (예를 들어, 항-PD-1 및 항-CXCR4)를 염색하기 위해 추가적인 접합 항체가 칵테일에 첨가될 수 있다. 그 후, 세포를 고정하고, 투과화하고, FoxP3의 발현을 형광-접합 항-FoxP3 항체를 사용하여 검출하였다. 추가적인 접합 항체 예컨대 항-Ki67가 증식 중인 세포의 수를 측정하기 위해 고정/투과화 세포에 첨가될 수 있다 (예를 들어, 도 3에 제시된 데이터를 참조한다). 표지된 세포를 고정된 부피의 트루카운트 비드 튜브 (BD 바이오사이언시즈®)에 첨가하고, 세포 이벤트를 유동 세포측정기에서 수집하였다. T 조절 세포의 수는 세포 개수/배양물 mL로서 표현된다.
전혈 내의 T 조절 세포를 확인하기 위한 게이팅 전략. 도 1은 전혈 내의 T 조절 세포를 확인하기 위한 다색 세포 유동측정법 게이팅 전략을 나타낸다. FoxP3+/CD4+/CD25+/CD127- Treg 세포의 집단을 정량하기 위해, CD3+ T 세포를 게이팅하여 FoxP3+ 및 CD4+ 세포를 확인한 후, 이를 추가로 게이팅하여 CD25+ 및 CD127- 세포를 확인하였다. 트루카운트 비드 튜브 (BD 바이오사이언시즈®)를 사용하여 T 조절 세포의 수를 결정하였고, 이는 세포 개수/전혈 100 마이크로리터로서 표현되었다.
PD-1 및 CXCR4 발현에 의한 Foxp3+/CD25+ Treg 서브세트의 시험관내 검출 (도 2에 제시된 데이터). PBMC를 ADAPT 임상 시험의 환자로부터 2차 방문 (AGS-003 투여 전) 및 12차 방문 (7회 용량의 AGS-003의 투여 후) 시에 수집하고, 10% AB 혈청을 함유하는 엑스비보 배지에서 6일 동안 배양하였다. 추가 자극을 배양물에 첨가하지 않았다. 제6일에, PBMC 배양물을 유동 세포측정법을 위해 염색하여, 활성화된 FoxP3+/CD25+/CD4+ T 세포의 수를 결정하였다. 먼저, CD4+ T 세포를 게이팅하여 CD25+/CD45RA- T 세포를 확인한 후, 이러한 세포를 PD-1의 발현 및 CD4 발현의 수준을 결정하도록 게이팅하여, Treg를 Treg/eff 세포로부터 구별하였다. Treg 세포는 CD4 저-발현, PD-1- 세포로서 확인된 한편, Treg/eff 세포는 CD4 고-발현, PD-1+ 세포로서 확인되었다. 그 후, 이러한 Treg 및 Treg/eff 집단 각각을 FoxP3 및 CXCR4의 발현에 대해 서브게이팅하였다. 데이터 (도 1에 제시됨)는 PD-1+, CD4 고-발현, 및 FoxP3+로서 확인된 Treg/eff 세포가 CXCR4 음성이고, PD-1-, CD4 저-발현, 및 FoxP3+로서 확인된 Treg 세포가 CXCR4 양성임을 나타냈다. 따라서, 이러한 게이팅 전략은 2개의 FoxP3+ 세포 서브세트를 규정하였다: Treg/eff (Foxp3+/PD-1+ CXCR4-) 및 Treg (Foxp3+/PD-1- CXCR4+). 이러한 방식으로, 고전적 Treg 세포 및 Treg/eff 세포가 PD-1 및 CXCR4의 조합 발현에 의해 구별된다: 고전적 Treg 세포는 PD-1-/CXCR4+이고, Treg 이펙터 세포는 PD-1+/CXCR4-이다. 이러한 데이터는 AGS-003 DC 제품의 생체내 투여가 시험관내 배양 확장 후에 Treg 이펙터 세포의 수를 증가시킬 수 있다는 것을 또한 나타낸다.
CD4+/PD-1+ FoxP3+ T 세포 (Treg/eff 세포)가 AGS-003 DC 제품으로 자극되었을 때 시험관 내에서 증식된다 (도 3에 제시된 데이터). 1차 방문 (기준선) 시에 ADAPT 시험 환자로부터 수집된 PBMC를 자가 AGS-003 DC 제품과 함께 10:1 비의 10% AB 혈청을 함유하는 엑스비보 배지에서 6일 동안 배양하였다. 유동 세포측정법을 사용하여 T reg/eff 세포 (CD4+ CD25+ PD-1+ FoxP3+)를 확인한 후, 세포를 세포 주기 마커 Ki67로 염색하여 증식을 검사하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, T reg/eff 세포는 Ki67에 대해 양성이었고, 이는 증식을 가리킨다. 대조적으로, Treg 세포 (CD4 lo/CD25+/PD-1-/FoxP3+)는 대부분 Ki67의 발현에 대한 염색의 결여를 나타냈고, 이는 이들이 증식 중이지 않았음을 가리킨다. 따라서, 환자 세포와 AGS-003 DC 제품의 공동배양이 Treg/eff 세포의 증식을 유도하였지만, Treg 세포의 증식은 유도하지 않았다.
도 4는 PBMC를 AGS-003 DC 자가 제품과 함께 시험관내 배양하는 것이 Treg/eff 세포 및 CTL의 동반 확장을 일으킨다는 것을 나타낸다. PBMC를 기준선에 15명의 임상 시험 ("ADAPT") 대상체로부터 수집하고, 자가 AGS-003 DC 제품과 함께 6일 동안 시험관 내에서 배양하였다. 제6일에, 용해성 CTL (CD3+/CD8+/CD25+/CD45RA-/GrB+ 세포)의 수를 결정하고, Treg/eff 세포 (CD3+/CD4+/CD25+CD45RA-/PD-1+/Foxp3+ 세포)의 수에 대비하여 플롯팅하였다 (도 4 참조). 배양물 내의 CTL과 Treg/eff 세포의 수 사이에서 통계적으로 유의한 연관이 검출되었다 (ρ=0.59, p<0.0208). 따라서, 본 발명이 어떠한 특정한 작용 메커니즘에 제한되지 않으면서, AGS-003 DC 제품이 적어도 부분적으로 CTL 및 Treg/eff 양쪽 모두의 확장을 야기하는 것에 의해 면역 반응을 자극하는 것이 가능하다.
Claims (12)
- a) 암 환자 혈액 내의 단위 부피 당 Treg의 카운트를 수득하는 단계;
b) 상기 카운트가 단위 부피 당 Treg의 치료 역치 값을 초과하는 것을 확인하는 단계; 및
c) 수지상 세포 백신을 상기 환자에게 투여하는 단계
를 포함하는, 암 환자를 수지상 세포 백신으로 치료하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 수지상 세포 백신이 항원이 로딩된 PME-CD40L 성숙 DC를 포함하는 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 항원을 코딩하는 RNA로의 형질감염에 의해 상기 DC에 상기 항원이 로딩되는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 RNA가 상기 환자의 암 세포로부터 제조되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 Treg 세포가 CD4+, CD25+, 및 FoxP3+ 또는 CD127- 중 하나로서 확인되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 Treg 세포가 CD4+, CD25+, FoxP3+, 및 CD127-로서 확인되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 역치 값이 500개의 Treg/전혈 100 마이크로리터 또는 등가의 측정치를 초과하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 역치 값이 650개의 Treg/전혈 100 마이크로리터 또는 등가의 측정치를 초과하는 것인 방법.
- 전혈 Treg 카운트가 적어도 650개의 Treg/전혈 100 마이크로리터인 환자에서 사용하기 위한, 신세포 암종의 치료를 위한 수지상 세포 백신.
- a) 환자 혈액의 샘플 내에 존재하는 Treg 및/또는 Treg/eff 세포의 수를 정량하여 기준선 판독치를 확립하는 단계;
b) 상기 환자에게 치료를 투여한 후, 상기 환자 혈액의 샘플 내에 존재하는 Treg 및/또는 Treg/eff 세포의 수를 정량하여 치료-후 판독치를 확립하는 단계;
c) 상기 기준선 판독치 및 상기 치료-후 판독치를 비교하여, 환자 혈액의 샘플 내에 존재하는 Treg 및/또는 Treg/eff 세포의 빈도 또는 양이 증가되었는지 여부를 결정하는 단계
를 포함하고, 여기서 Treg 세포의 빈도 또는 양의 유의한 감소 및/또는 Treg/eff 세포의 빈도 또는 양의 유의한 증가가 환자에서 면역 반응이 유도되었음을 나타내는 것인, 치료에 의해 환자에서 면역 반응이 유도되었는지 여부를 결정하는 방법. - 제10항에 있어서, 상기 치료가 상기 환자에게 시험관 내에서 제조된 자가의 성숙 DC를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
- a) 하기로 이루어진 목록으로부터 선택된 하나 이상의 치료 지표의 측정치 또는 값을 수득하는 단계:
i) 혈장 림프구 값;
ii) CD8+ CD28+ 및/또는 CD8+ CD28+ PD-1+ 및/또는 IFN-감마를 분비하는 CD8+ CD28+ PD-1+ 세포인 세포의 카운트;
iii) Treg인 CD4+ 세포의 퍼센트;
iv) 혈소판 카운트;
v) C-반응성 단백질 값;
vi) 림프구/단핵구 비;
vii) 단핵구 카운트 (일루트라(Elutra)-전); 및
viii) 단핵구/백혈구 비;
b) 상기 측정치 또는 값이 적절하게는 치료 역치 값 초과 또는 미만에 속하는 것을 확인하는 단계; 및
c) 수지상 세포 백신을 상기 환자에게 투여하는 단계
를 포함하는, 수지상 세포 요법을 환자에게 투여하는 방법.
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