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KR20200053514A - 항체 변이체 - Google Patents

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KR20200053514A
KR20200053514A KR1020207009263A KR20207009263A KR20200053514A KR 20200053514 A KR20200053514 A KR 20200053514A KR 1020207009263 A KR1020207009263 A KR 1020207009263A KR 20207009263 A KR20207009263 A KR 20207009263A KR 20200053514 A KR20200053514 A KR 20200053514A
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KR1020207009263A
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에스더 마리아 퍼레르
Original Assignee
틸로츠 파마 아게
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Publication date
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Abstract

본 발명은, TNFα에 결합하고 또한 변형된 FcRn-결합을 나타내는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 우수한 이펙터 기능 및/또는 약동학적 특성을 갖는다.

Description

항체 변이체
본 발명은 변화된 이펙터 기능 및/또는 변화된 약동학적 특성을 갖는 변형된 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 다양한 장애, 특히 염증 증상의 치료적 처치에 유용하다.
모노클론 항체는 지난 20년에 걸쳐 임상 의학에서 치료제로서 중요성이 증가하고 있다. 수 년동안, 항체를 개선하려는 노력은 이들의 잠재적인 면역원성을 감소시키는데 집중하였으며, 인간화된 또는 심지어는 완전한 인간 항체로 이끌었다. 또 다른 접근법은 이들의 이펙터 기능을 개선함으로써 항체를 최적화하는 것을 목표로 한다. 직접적인 효과는 상기 항체의 가변의 항원 결합 영역에 의해 매개되지만, 간접적인 효과는 불변의 Fc 영역에 의해 매개된다. 이펙터 기능을 개선하려는 노력은 주로 상기 Fc 영역의 조절에 집중된다. 또한, 치료적 항체의 혈청 반감기의 개선이 바람직하며, 이는 필요한 항체의 양을 감소시킬 수 있고, 처치 간격을 연장시킴으로써 환자에 대한 편의성을 증가시킬 수 있다.
치료적 적용을 위해, 면역글로불린 G(IgG)는 여러 이유로 인해 바람직한 선택 종류이었다; IgG는 정제하기 쉽고, 저장시 상대적으로 안정적이며, 정맥내 투여될 수 있고, 연장된 생체내 생물학적 반감기를 가지며, 다양한 Fc-수용체 상호작용(항체-의존적인 세포의 세포독성; ADCC)을 통해 보체 의존적인 세포독성(CDC)의 활성화 및 이펙터 세포의 활성화와 같은 다양한 생물학적 이펙터 기능에 관여할 수 있다. 5종의 면역글로불린 종류 중에서, IgG는 IgG 재순환 수용체인 신생아 Fc 수용체(FcRn)와의 독특한 상호작용으로 인해 가장 긴 생물학적 반감기를 나타낸다. 상기 수용체의 공지된 기능 중 하나는 촉매적 분해로부터 IgG를 구제하는 것이다. 해결된(solved) FcRn-Fc 공결정 구조는 Fc와의 상호작용이 IgG 힌지-CH2-CH3 영역에서 발생함을 보여주었다. 이 상호작용은 엔도좀에서 6.0 내지 6.5의 산성 pH에서 엄격하게 pH-의존적인 방식으로 발생한다. 결합된 IgG 분자는 상기 세포 표면으로 다시 재순환되어, 7.4의 생리학적 pH에서 순환으로 방출되는 반면, 비복합된 IgG 분자는 리소좀 분해가 예정되어있다. 이 재순환은 IgG의 연장된 반감기를 위한 메카니즘이다; 따라서, 상기 FcRn-lgG 상호작용의 조절은 감마 면역글로불린 및 Fc-융합 단백질의 혈청 반감기를 특이적으로 제어할 수 있게 한다.
상기 적용에 따라, IgG의 혈청 체류 시간을 증가시키거나 또는 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 치료적 적용을 위해 더 긴 반감기가 바람직한데, 보다 적은 투약량 및 보다 적은 횟수의 주사가 요구될 것이기 때문이다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 사용, 알부민- 또는 Fc-융합 단백질의 생성 및 상기 FcRn-lgG 상호작용의 강화를 포함하여 상기 반감기를 증가시키기위한 여러 접근법이 연구되었다. PEG화된(PEGylated) 의약품은 1990 년부터 치료소에서 사용되어 왔으며 PEG화는 혈액내 약물 체류의 연장을 위해 확립된 기술이다. 인간 혈청 알부민(HSA)은 pH-의존적인 상호작용을 통해 FcRn에 의해 재순환되기 때문에, 안정성 및 반감기를 향상시키기위한 여러 알부민-융합 단백질도 또한 생산되었다. 또한, 알부민 또는 알부민-결합 도메인에 융합된 항체 단편은 전임상 연구에서 연장된 혈청 체류 시간을 입증하였다. Fc-융합 단백질의 생성은 단백질 또는 펩타이드에, 온전한 항체(intact antibody)와 유사한 특성을 부여하는 또 다른 전략이다.
연구된 Fc 영역의 변형은 문헌[Saxena(2016) Frontiers in Immunology, Vol. 7, Article 580]에 요약되어 있다.
개선된 이펙터 기능 및/또는 약동학을 갖는 항체가 계속 요구되고 있다.
본 출원의 발명자들은 항체의 Fc 영역에 있는 특정 특이적 돌연변이가 pH 6에서 FcRn에 대한 항체 친화도를 급격히 증가시키는 반면, pH 7.4에서의 친화도는 낮게 유지시킴을 밝혔다. 상기 돌연변이를 갖는 항체는 개선된 약동학적 특성을 가질 것으로 예상된다. 또한, 상기 항체는 인플릭시맵(infliximab, IFX)과 같은 공지된 항체와 비교할 때 우수한 이펙터 기능을 나타낸다.
그러므로, 본 발명은 다음의 항목 [1] 내지 [88]에 정의된 청구대상에 관한 것이다:
[1] TNFα-결합 도메인 및 FcRn-결합 부위를 포함하는 항체로서, pH 6에서 인간 FcRn에 대해 높은 친화도를 갖고, 상기 높은 친화도는 100 nM 미만의 해리 평형 상수(KD)를 특징으로 하며, 추가하여, pH 7.4에서 인간 FcRn에 대해 낮은 친화도를 갖고, 상기 낮은 친화도는 1 μM 초과의 KD를 특징으로 하며, 상기 항체의 아미노산 서열은 아미노산 434W를 포함하는 것인 TNFα-결합 도메인 및 FcRn-결합 부위를 포함하는 항체.
[2] 항목 [1]에 있어서, 상기 항체의 아미노산 서열이 아미노산 428E 및/또는 아미노산 311R을 추가로 포함하는 것인 항체.
[3] 항목 [1] 또는 [2]에 있어서, 상기 항체의 아미노산 서열이 아미노산 311R, 428E 및 434W를 포함하는 것인 항체.
[4] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 위치 434(N434W)에서 아스파라긴을 트립토판으로 치환하고, 임의적으로 위치 428(M428E)에서 메티오닌을 글루탐산으로 치환하고, 임의적으로 위치 311(Q311R)에서 글루타민을 아르기닌으로 치환함으로써 수득되는 것인 항체.
[5] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 위치 428(M428E)에서 메티오닌을 글루탐산으로 치환함으로써 수득되는 것인 항체.
[6] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 위치 311(Q311R)에서 글루타민을 아르기닌으로 치환함으로써 수득되는 것인 항체.
[7] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 서열 식별번호: 13에서 보여진 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 항체.
[8] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, pH 6에서 인간 FcRn에 대한 인플릭시맵의 친화도보다 큰 친화도를 갖는 것인 항체.
[9] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, pH 6에서 인간 FcRn에 대한 상기 높은 친화도가 50 nM 미만의 해리 상수 KD를 특징으로 하는 것인 항체.
[10] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, pH 6에서 인간 FcRn에 대한 상기 높은 친화도가 25 nM 미만의 해리 상수 KD를 특징으로 하는 것인 항체.
[11] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, pH 6에서 인간 FcRn에 대한 상기 높은 친화도가 10 nM 미만의 해리 상수 KD를 특징으로 하는 것인 항체.
[12] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 1 nM 내지 500 nM, 또는 2 nM 내지 100 nM, 또는 3 nM 내지 50 nM, 또는 4 nM 내지 25 nM, 또는 5 nM 내지 10 nM 범위의 해리 상수 KD를 특징으로하는, pH 6에서 인간 FcRn에 대한 친화도를 갖는 것인 항체.
[13] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 높은 친화도, 또는 상기 높은 친화도를 특징화한 KD가 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의해 결정되는 것인 항체.
[14] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, pH 7.4에서 인간 FcRn에 대한 상기 낮은 친화도가 10 μM 초과의 KD를 특징으로 하는 것인 항체.
[15] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, pH 7.4에서 인간 FcRn에 대한 친화도를 특징화한 KD가 SPR에 의해 결정되는 것인 항체.
[16] 항목 [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 있어서, pH 7.4에서 인간 FcRn에 대한 친화도가 낮아서, KD 값이 SPR에 의해 결정될 수 없는 것인 항체.
[17] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 200 pM 미만의 KD로 인간 TNFα에 결합하는 것인 항체.
[18] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 100 pM 미만의 KD로 인간 TNFα에 결합하는 것인 항체.
[19] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 50 pM 미만의 KD로 인간 TNFα에 결합하는 것인 항체.
[20] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 25 pM 미만의 KD로 인간 TNFα에 결합하는 것인 항체.
[21] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 10 pM 미만의 KD로 인간 TNFα에 결합하는 것인 항체.
[22] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 정단 측(apical side)으로부터 기저측부 측(basolateral side)으로, 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송되는 것인 항체.
[23] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 서열 식별번호: 1에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열 식별번호: 2에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 대조군 항체보다 더 많은 양으로 정단 측으로부터 기저측부 측으로, 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송되는 것인 항체.
[24] 전술한 항목 중 어느 하나의 항체에 있어서, 인플릭시맵보다 더 많은 양으로 정단 측으로부터 기저측부 측으로, 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송되는 것인 항체.
[25] 항목 [24]에 있어서, 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 항체의 양이, 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 인플릭시맵의 양의 2 배보다 많은 것인 항체.
[26] 항목 [23] 내지 [25] 중 어느 하나에 있어서, 상기 양은 4 시간 이내에 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 항체의 질량을 지칭하는 것인 항체.
[27] 항목 [22] 내지 [26] 중 어느 하나에 있어서, 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 항체의 양이 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 친계(parent) 면역글로불린의 양의 2 배보다 많고, 상기 친계 면역글로불린은 Fc 영역이 단지 야생형 아미노산만을 갖는다는 점에서만 상기 항체와 상이한 것인 항체.
[28] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인플릭시맵의 백분율보다 더 많은 백분율의 항체가 10 배 과량의 경쟁 면역글로불린의 존재 하에서 정단 측으로부터 기저측부 측으로, 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송되고, 상기 백분율은 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 면역글로불린의 전체 질량을 지칭하는 것인 항체.
[29] 항목 [28]에 있어서, 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 항체의 백분율이 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 친계 먼역글로불린의 백분율의 3 배보다 크고, 상기 친계 면역글로불린이 Fc 영역이 단지 야생형 아미노산만을 갖는다는 점에서만 상기 항체와 상이한 것인 항체.
[30] 항목 [28] 또는 [29]에 있어서, 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 항체의 백분율이 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 인플릭시맵의 백분율의 3 배보다 큰 것인 항체.
[31] 항목 [22] 내지 [30] 중 어느 하나에 있어서, 상기 분극된 세포 단일층이 분극된 T84 세포의 단일층인 것인 항체.
[32] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 100 nM 미만, 바람직하게는 10 nM 미만의 KD로 CD64에 결합하는 것인 항체.
[33] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 10 μM 미만의 KD로 CD32a(H)에 결합하는 것인 항체.
[34] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 10 μM 미만의 KD로 CD32a(R)에 결합하는 것인 항체.
[35] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 10 μM 미만의 KD로 CD32b에 결합하는 것인 항체.
[36] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 500 nM 미만, 바람직하게는 100 nM 미만의 KD로 CD16a(V)에 결합하는 것인 항체.
[37] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 10 μM 미만, 바람직하게는 1 μΜ 미만의 KD로 CD16a(F)에 결합하는 것인 항체.
[38] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 10 μM 미만, 바람직하게는 1 μΜ 미만의 KD로 CD16b(NA2)에 결합하는 것인 항체.
[39] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인플릭시맵보다 더 높은 강도로 인간 C1q에 결합하는 것인 항체.
[40] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 상대 EC50 및/또는 상대 최대 사멸 측면에서 인플릭시맵보다 더 큰, 토끼 보체의 보체-의존적 세포독성을 갖는 것인 항체.
[41] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인플릭시맵 이상의 수준에서 CD14 + CD206 + 대식세포를 유도할 수 있는 것인 항체.
[42] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 인플릭시맵 이상의 정도로 T-세포 증식을 억제할 수 있는 것인 항체.
[43] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 비-푸코실화된 항체 또는 감소된 푸코실화를 갖는 항체인 것인 항체.
[44] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서,(i) 서열 식별번호: 3에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 식별번호: 4에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 식별번호: 5에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 도메인, 및(ii) 서열 식별번호: 6에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 식별번호: 7에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 식별번호: 8에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 도메인을 갖는 것인 항체.
[45] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 서열 식별번호: 9에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인, 및 서열 식별번호: 10에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 것인 항체.
[46] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 서열 식별번호: 1에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열 식별번호: 11에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 것인 항체.
[47] 항목 [1] 내지 [43] 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는(i) 서열 식별번호: 14에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 식별번호: 15에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 식별번호: 16에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 도메인, 및(ii) 서열 식별번호: 17에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 식별번호: 18에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 식별번호: 19에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 도메인을 갖는 것인 항체.
[48] 항목 [47]에 있어서, 서열 식별번호: 20에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 식별번호: 21 또는 서열 식별번호: 22에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 것인 항체.
[49] 항목 [47] 또는 [48]에 있어서, 서열 식별번호: 23 또는 서열 식별번호: 24에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열 식별번호: 12에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 것인 항체.
[50] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 인간 TNFα에 특이적으로 결합하는 것인 항체.
[51] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 TNFβ에 유의하게 결합하지 않는 것인 항체.
[52] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체가,
(i) 125 pM 미만의 해리 상수(KD)로 인간 TNFα에 결합하고;
(ii) 마카카 물라타(Macaca mulatta) TNFα 및 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis) TNFα와 교차-반응성이고;
(iii) L929 어세이에 의해 결정될 때 인플릭시맵보다 더 큰 효능을 갖고; 및/또는
(iv) 적어도 2의 화학량론(항체: TNFαTrimer)으로 인간 TNFαTrimer에 결합할 수 있는 것인 항체.
[53] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 1 nM 미만의 KD로 마카카 물라타로부터의 TNFα에 결합하는 것인 항체.
[54] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 1 nM 미만의 KD로 마카카 파시쿨라리스로부터의 TNFα에 결합하는 것인 항체.
[55] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, L929 어세이에서 결정될 때, TNFα-유도된 아포토시스를 억제하는 항체 효능(상대 효능)이 인플릭시맵의 상기 효능에 대하여 3.5보다 더 크고, 상기 상대 효능이 L929 어세이에서 상기 항체의 ng/mL 단위의 IC50 값에 대한, L929 어세이에서 인플릭시맵의 ng/mL 단위의 IC50 값의 비인 것인 항체.
[56] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 시차 주사 형광분석법에 의해 결정될 때 scFv 형식의 항체의 가변 도메인의 용융 온도가 적어도 65 ℃인 것인 항체.
[57] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 시차 주사 형광분석법에 의해 결정될 때 scFv 형식의 항체의 가변 도메인의 용융 온도가 적어도 68 ℃인 것인 항체.
[58] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 시차 주사 형광분석법에 의해 결정될 때 상기 용융 온도가 적어도 70 ℃인 것인 항체.
[59] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체가 인간 TNFα와 TNF 수용체 I(TNFRI) 사이의 상호작용을 차단할 수 있는 것인 항체.
[60] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체가 인간 TNFα와 TNF 수용체 II(TNFRII) 사이의 상호작용을 차단할 수 있는 것인 항체.
[61] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 혼합 림프구 반응에서 말초 혈액 단핵 세포의 세포 증식을 억제할 수 있는 것인 항체.
[62] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, CD14+ 단핵구로부터 인터류킨-1β의 LPS-유도된 분비를 억제할 수 있는 것인 항체.
[63] 항목 [62]에 있어서, 인터류킨-1β의 LPS-유도된 분비를 억제하기 위한 IC50 값이 1 nM 미만인 것인 항체.
[64] 항목 [63]에 있어서, 인터류킨-1β의 LPS-유도된 분비를 억제하기 위한 IC50 값이, 몰 기준으로, 아달리무맵(adalimumab)의 상기 IC50 값보다 낮은 것인 항체.
[65] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, CD14+ 단핵구로부터 TNFα의 LPS-유도된 분비를 억제할 수 있는 것인 항체.
[66] 항목 [65]에 있어서, TNFα의 LPS-유도된 분비를 억제하기 위한 IC50 값이 1 nM 미만인 것인 항체.
[67] 항목 [66]에 있어서, TNFα의 LPS-유도된 분비를 억제하기 위한 IC50 값이, 몰 기준으로, 아달리무맵의 상기 IC50 값보다 낮은 것인 항체.
[68] 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 면역글로불린 G(IgG), 바람직하게는 lgG1인 것인 항체.
[69] 전술한 항목 중 어느 하나의 항체를 코딩하는 핵산.
[70] 항목 [69]의 핵산을 포함하는 벡터 또는 플라스미드.
[71] 항목 [69]의 핵산 또는 항목 [70]의 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 세포.
[72] 항체를 코딩하는 핵산의 발현을 허용하는 조건 하에 배지 중에서 항목 [71]의 세포를 배양하는 단계, 및 상기 세포로부터 또는 상기 배지로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는 것인, 항목 [1] 내지 [68] 중 어느 하나의 항체의 제조 방법.
[73] 항목 [1] 내지 [68] 중 어느 하나에 있어서, 염증 증상 또는 TNFα-관련 장애의 치료에서의 용도를 위한 항체.
[74] 항목 [73]에 있어서, 상기 염증성 장애가 하기 "치료될 장애" 섹션에 열거된 질병 및 장애의 목록으로부터 선택되는 용도를 위한 항체.
[75] 항목 [73]에 있어서, 상기 염증성 장애가 위장관의 염증성 장애인 용도를 위한 항체.
[76] 항목 [75]에 있어서, 상기 위장관의 염증성 장애가 염증성 장 질병인 용도를 위한 항체.
[77] 항목 [75] 또는 [76]에 있어서, 상기 위장관의 염증성 장애가 크론 병인 용도를 위한 항체.
[78] 항목 [77]에 있어서, 상기 크론 병이, 회장(ileal), 결장, 회결장 및/또는 단리된 상부 크론 병(위, 십이지장 및/또는 공장(jejunal))으로 이루어지고 비-협착성/비-침투성, 협착성, 침투성 및 항문 주위 질병 거동을 포함하는 군으로부터 선택되고, 상기 언급한 것 중 임의의 국소화 및 질병 거동의 임의의 조합을 허용하는 용도를 위한 항체.
[79] 항목 [75] 또는 [76]에 있어서, 상기 위장관의 염증성 장애가 궤양성 대장염인 용도를 위한 항체.
[80] 항목 [79]에 있어서, 상기 궤양성 대장염은 궤양성 직장염, 외음핵 염, 좌측-대장염, 범-궤양성 대장염 및 주머니염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용도를 위한 항체.
[81] 항목 [75] 또는 [76]에 있어서, 상기 위장관의 염증성 장애가 미세 장염(microscopic colitis)인 용도를 위한 항체.
[82] 항목 [73]에 있어서, 상기 염증성 장애가 관절염인 용도를 위한 항체.
[83] 항목 [73] 또는 [82]에 있어서, 상기 염증성 장애가 류마티스 관절염인 용도를 위한 항체.
[84] 항목 [73] 내지 [83] 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 항체를 대상체에게 경구 투여하는 단계를 포함하는 용도를 위한 항체.
[85] 항목 [73] 내지 [84] 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 항체를 국소 적용하는 단계를 포함하는 용도를 위한 항체.
[86] 항목 [1] 내지 [68] 중 어느 하나의 항체를 포함하는 약학 조성물.
[87] TNFα에 대한 항체의 트랜스사이토시스를 개선시키는 방법으로서, 상기 항체의 아미노산 서열에 치환체 Q311R, M428E 및 N434W를 도입하는 닥계를 포함하는 것인 방법.
[88] TNFα에 대한 항체의 혈장 반감기를 연장시키는 방법으로서, 상기 항체의 아미노산 서열에 치환체 Q311R, M428E 및 N434W를 도입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
도 1: 상기 L929 어세이에서 인간 TNFα를 중화시키는 항-TNFα 항체 변이체의 효능. 항-TNFα 항체 변이체 및 기준 인플릭시맵의 투약량 반응 곡선이 보여지고 있다.
도 2: 분극된 T84 세포를 가로지르는 항-TNFα IgG 변이체의 수송. 첨가 4 시간 후에 정단으로부터 기저측부 저장소까지의 항-TNFα 항체 변이체 및 인플릭시맵(IFX)의 양이 보여지고 있다. ng/cm2로 제시되어 있다. 오차 막대는 2 내지 4 개의 개별 단일층의 SD를 가리킨다.
도 3: 과량의 골수종 IgG의 존재하에 분극된 T84 세포를 가로지르는 항-TNFα IgG 변이체의 수송. 첨가 4 시간 후에 10-배 과량의 인간 골수종 IgG의 존재 하에 정단으로부터 기저측부 저장소까지 수송된 항-TNFα Ab 변이체 및 IFX의 양이 보여지고 있다. ng/cm2로 제시되어 있다. 오차 막대는 3 내지 4 개의 개별 단일층의 SD를 가리킨다.
도 4: ADCC 활성. 항-TNFα 항체 변이체, 야생형 항체 및 IFX에 의한 ADCC의 유도.
도 5: 인간 C1q에 대한 결합. 인간 C1q에 대한 IFX 및 항-TNFα 항체 변이체의 결합. 각 농도는 2회반복으로(duplicate) 어세이되었다. 오차 막대는 SD를 가리킨다.
도 6: CDC 활성. IFX와 비교하여 다양한 항-TNFα 변이체에 대한 세포 사멸 백분율. 각 샘플 점수는 6 회의 독립적인 반복실험의 평균이다.
도 7 : IFX의 유도에 대한 각 화합물에 의한 CD14+CD206+ 대식세포의 유도. 4 회의 독립적인 실험의 요약된 데이터. 막대는 평균을 표시하고, 오차 막대는 SEM을 표시한다.
도 8: IFX에 대한 각 화합물에 의한 T-세포 증식의 억제. 3 회의 독립적인 실험의 요약된 데이터. 막대는 평균을 표시하고, 오차 막대는 SEM을 표시한다.
도 9 : 부위 지정 돌연변이 생성의 개략적인 제시이다.
도 10: 항-TNFα 항체 변이체의 N297에 부착된 지배적인 N-글리칸 형태의 개략적인 예시이다. 시험된 항-TNFα 항체 변이체의 패널 중에서 지배적인 2 개의 N-글리칸 프로파일은 4GlcNac-1Fuc-3Man 및 4GlcNac-1Fuc-3Man-1Gal인 반면, 2FF의 존재하에 생성된 IgG 변이체의 경우에는 푸코스 결핍을 제외하고 동일한 이중-안테나 구조가 발생하였다.
본 발명은, TNFα에 결합할 수 있고 FcRn-결합 부위를 포함하는 항체에 관한 것이다. 본 출원에 따르면, 항체는 pH 6에서 FcRn, 바람직하게는 인간 FcRn에 결합할 수 있다면 FcRn-결합 부위를 포함한다. pH 6에서 FcRn에 대한 결합은 예를 들어 본 출원의 실시예 4에 기재된 바와 같이, SPR에 의해 결정될 수 있다. pH 6에서 FcRn에 대한 항체의 결합이 SPR에 의해 검출될 수 있다면, 이러한 항체는 FcRn 결합 부위를 갖는다. 본 발명의 항체는 100 nM 미만의 해리 평형 상수(KD)를 특징으로 하는, pH 6에서 인간 FcRn에 대해 높은 친화도를 갖는다. 상기 항체는 1μM 초과의 KD를 특징으로 하는, pH 7.4에서 인간 FcRn에 대해 낮은 친화도를 추가로 갖는다. 상기 항체의 아미노산 서열은 434 위치(EU 넘버링)에서 아미노산 트립토판을 포함한다.
본 명세서 및 청구범위 전체에서, 카밧트 넘버링 시스템은 상기 가변 도메인에서 잔기를 지칭할 때 일반적으로 사용된다(대략적으로, 경쇄의 1-107 잔기 및 중쇄의 1-113 잔기)(Kabat 등, Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)). 상기 "EU 넘버링 시스템" 또는 "EU 인덱스"는 면역글로불린 중쇄 불변 영역에서의 잔기를 지칭할 때 일반적으로 사용된다(예를 들어, Kabat 등에서 보고된 EU 인덱스, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991). 본원에 참조로 명시적으로 포함됨). 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 가변 도메인에서 잔기 번호에 대한 지칭은 카밧트 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다. 본원에서 달리 언급되지 않는 한, 항체의 불변 도메인에서 잔기 번호에 대한 지칭은 EU 넘버링 시스템에 의한 잔기 넘버링을 의미한다(예를 들어, WO2006/073941호 참조).
항체
본 출원의 문맥에서, 용어 "항체"는 "면역글로불린"(Ig)의 동의어로 사용되며, 이는 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD 클래스(또는 그의 임의의 서브클래스)에 속하는 단백질로 정의되고, 모든 통상적으로 공지된 항체 및 그의 기능적 단편을 포함한다. 본 발명의 문맥에서, 항체/면역글로불린의 "기능적 단편"은 이러한 친계 항체(parental antibody)의 특성 중 하나 이상을 본질적으로 유지하는 친계 항체의 항원-결합 단편 또는 다른 유도체로서 정의된다. 항체/면역글로불린의 "항원-결합 단편" 또는 "항원-결합 도메인"은 항원-결합 영역을 유지하는 단편(예를 들어, IgG의 가변 영역)으로 정의된다. 항체의 "항원-결합 영역"은 전형적으로 항체의 하나 이상의 초가변 영역(들), 즉, CDR-1, -2 및/또는 -3 영역에서 발견된다. 본 발명의 항체는 이작용성 또는 다작용성 구조체(construct)의 일부일 수 있다.
바람직하게 상기 항체는 단일클론 항체이다. 본원에 사용될 때 용어 "단일클론 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생성된 항체로 제한되지 않는다. 용어 "단일클론 항체"는 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론을 포함하는 단일클론으로부터 유래된 항체를 지칭하며, 그것이 생산되는 방법을 지칭하는 것은 아니다. 모노클론 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술 또는 이들의 조합의 사용을 포함하여 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다.(Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N.Y.)
인간의 항-TNFα 항체의 생체내 사용에 관한 실시양태를 포함하는 다른 실시양태에서, 키메라, 영장류, 인간화된 또는 인간 항체가 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체이고, 더욱 바람직하게는 단일클론 인간 항체 또는 단일클론 인간화된 항체이다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 면역글로불린, 바람직하게는 면역글로불린 G(IgG)이다. 본 발명의 IgG의 서브클래스는 제한되지 않으며, IgG1, lgG2, lgG3 및 lgG4를 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 IgG는 서브클래스 1, 2 또는 4이며, 즉 각각 IgG1, lgG2 또는 lgG4 분자이다. 가장 바람직하게, 본 발명의 IgG는 서브클래스 1이며, 즉 IgG1 분자이다.
TNFα-결합 도메인
본 발명의 항체의 TNFα-결합 도메인은 특별히 제한되지 않는다. 이것은 TNFα에 결합할 수 있는 임의의 항체로부터 유래될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 항체는 TNFα에 특이적으로 결합한다. 본원에서 사용될 때, 항체가 인간 TNFα와 하나 이상의 기준 분자(들)를 구별할 수 있을 때에 항체가 인간 TNFα에 대해 "특이적으로 인식" 또는 "특이적으로 결합"한다. 바람직하게, 상기 기준 분자의 각각에 결합하기위한 IC50 값은 TNFα에 결합하기위한 IC50 값보다 적어도 1,000 배 더 크다. 가장 일반적인 형태(및 정의된 기준이 언급되지 않은 경우)에서, "특이적 결합"은, 예를 들어 당업계에 공지된 특이성 어세이 방법에 따라 결정될 때 인간 TNFα 및 미관련 생체분자를 구별하는 항체의 능력을 지칭한다. 이러한 방법은 웨스턴 블롯 및 ELISA 시험을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 표준 ELISA 어세이가 수행될 수 있다. 전형적으로, 결합 특이성의 결정은 단일 기준 생체분자가 아니라 분유, BSA, 트랜스페린 등과 같은 약 3 내지 5 종의 미관련 생체분자 세트를 사용함으로써 수행된다. 일 실시양태에서, 특이적 결합은 인간 TNFα와 인간 TNFβ을 구별하는 항체의 능력을 지칭한다.
본 발명의 항체는 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함한다. 상기 VL 도메인은 CDR1 영역(CDRL1), CDR2 영역(CDRL2), CDR3 영역(CDRL3) 및 프레임워크 영역을 포함한다. 상기 VH 도메인은 CDR1 영역(CDRH1), CDR2 영역(CDRH2), CDR3 영역(CDRH3) 및 프레임워크 영역을 포함한다.
용어 "CDR"은 항원 결합에 주로 기여하는 항체의 가변 도메인 내의 6 개의 초가변 영역 중 하나를 지칭한다. 상기 6 개의 CDR에 대해 가장 일반적으로 사용되는 정의 중 하나는 문헌[Kabat E. A. et al.(1991) Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication 91-3242]에 의해 제공되었다. 본원에 사용될 때, CDR의 카밧트 정의는 오로지 경쇄 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3 (CDR L1, CDR L2, CDR L3 또는 L1, L2, L3) 뿐만 아니라 중쇄 가변 도메인의 CDR2 및 CDR3(CDR H2, CDR H3 또는 H2, H3)에만 적용된다. 그러나, 본원에 사용될 때 중쇄 가변 도메인의 CDR1(CDR H1 또는 H1)은 하기 잔기(카밧트 넘버링)에 의해 정의된다: 이는 26 위치에서 시작하여 36 위치 이전에 종료된다.
본 발명의 일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 원 출원인 PCT 출원 PCT/EP2017/056218, PCT/EP2017/056246, PCT/EP2017/056237 및 PCT/EP2017/056227 중 어느 하나에 개시된 것과 같은 항-TNFα 항체이다. 본 발명의 추가적인 또 다른 실시양태에서, 상기 항체는 원 출원된 PCT 출원 PCT/EP2017/056218, PCT/EP2017/056246, PCT/EP2017/056237 및 PCT/EP2017/056227에 개시된 바와 같은 아미노산 서열과 함께 상보성-결정 영역(CDR)을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및/또는 중쇄 가변 도메인을 갖는 항-TNFα 항체이다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 PCT/EP2017/056218, PCT/EP2017/056246, PCT/EP2017/056237 또는 PCT/EP2017/056227에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및/또는 중쇄 가변 도메인을 갖는 항-TNFα 항체이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 원 출원된 PCT/EP2017/056218의 청구항 제2항, PCT/EP2017/056246의 청구항 제2항, PCT/EP2017/056237의 청구항 제2항 또는 PCT/EP2017/056227의 청구항 제2항에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 갖는 항-TNFα 항체이다. 본 발명의 추가적인 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 항-TNFα 항체는 PCT/EP2017/056218의 청구항 제4항, PCT/EP2017/656246의 청구항 제5항 및 제6항, PCT/EP2017/056237의 청구항 제5항 및 제6항, PCT/EP2017/056227의 청구항 제4항 및 이들의 조합에 따른 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및/또는 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 국제 특허 출원 PCT/EP2017/056218, PCT/EP2017/056246, PCT/EP2017/056237 및 PCT/EP2017/056227의 각각의 개시 내용은 본원에 전체적으로 포함된다. 이들은 본 출원의 개시내용의 일부를 형성한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는(i) 서열 식별번호: 3에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 식별번호: 4에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 식별번호 5에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 도메인, 및(ii) 서열 식별번호: 6에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 식별번호: 7에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 식별번호: 8에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 도메인을 포함한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 본 발명 항체는 서열 식별번호: 9에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함한다. 또 다른 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 서열 식별번호: 10에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 가장 바람직하게, 본 발명의 항체는(i) 서열 식별번호: 9에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인, 및(ii) 서열 식별번호: 10에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는(i) 서열 식별번호: 14에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 식별번호: 15에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2 영역, 및 서열 식별번호: 16에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VL 도메인, 및(ii) 서열 식별번호: 17에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR1 영역, 서열 식별번호: 18에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열 식별번호: 19에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 CDR3 영역을 포함하는 VH 도메인을 포함한다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 서열 식별번호: 20에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함한다. 또 다른 더욱 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 서열 식별번호: 21 또는 서열 식별번호: 22에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 가장 바람직하게, 본 발명의 항체는(i) 서열 식별번호: 20에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인, 및(ii) 서열 식별번호: 21 또는 서열 식별번호: 22에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함한다.
본 발명의 항체는 인간 TNFα에 대해 높은 친화도를 갖는다. 용어 "KD"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다. 전형적으로, 본 발명의 항체는 BIACORE 장비로 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술을 사용하여 결정될 때 대략 2 x 10-10 M 미만, 바람직하게는 1.5 x 10-10 M 미만, 바람직하게는 1.25 x 10-10 M 미만, 더욱 바람직하게는 1 x 10-10 M 미만, 가장 바람직하게는 7.5 x 10-11 M 미만 또는 심지어는 5 x 10-11 M 미만의 해리 평형 상수(KD)로 인간 TNFα에 결합한다. 특히, 상기 KD의 결정은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행된다.
FcRn에 대한 친화도에 영향을 미치는 변형
본 발명의 항체는 본원에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 "아미노산 변형"에 의해 야생형 항체의 비변성 서열(native sequence)의 아미노산 서열과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 적어도 하나의 아미노산 변형은 인간 FcRn에 대한 항체의 친화도에 영향을 미친다. 전형적으로, 상기 적어도 하나의 아미노산 변형은 pH 6에서 인간 FcRn에 대한 항체의 친화도를 증가시킨다. 일 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 아미노산 변형은 pH 6에서 인간 FcRn에 대한 항체의 친화도를 증가시키며, pH 7.4에서 인간 FcRn에 대한 친화도를 실질적으로 변화시키지 않는다. 바람직하게, 상기 변형된 항체는 야생형 항체의 또는 친계 항체의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환체, 예컨대, 약 1 내지 약 10 개의 아미노산 치환체, 및 바람직하게는 약 1 내지 약 5 개의 아미노산 치환체를 갖는다. 바람직하게, 상기 적어도 하나의 아미노산 변형은 상기 항체의 FcRn 결합 부위 내에 있다. 상기 항체는 예를 들어 구조적 변화에 의해 FcRn 결합에 영향을 주는 항체의 FcRn 결합 부위 외부에서 하나 이상의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 상기 아미노산 변형(들)은 그 자체로 공지된 방법에 의해, 예를 들어 문헌["Antibody Engineering - Methods and Protocols", edited by Patrick Chames, 2nd ed, 2012, Chapter 31(ISBN 978-1-61779-973-0]에 기재된 바와 같은 부위-지정 돌연변이 발생에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 항체는 434 위치(EU 넘버링)에서 아미노산 트립토판을 포함한다. 이것은 본원에서 "434W"로 지칭된다. 비-변형된 인간 IgG 항체의 434 위치에서의 비변성 아미노산은 아스파라긴(N)이다. 따라서, 본 발명의 항체는 돌연변이 N434W를 항체에 도입함으로써 수득될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 434 위치에서 아스파라긴을 트립토판으로 치환함으로써 수득가능하거나 또는 수득된다.
본 발명의 항체는 428 위치(EU 넘버링)에서 아미노산 글루탐산을 포함한다. 이것은 본원에서 "428E"로 지칭된다. 비-변형된 인간 IgG 항체의 428 위치에서 비변성 아미노산은 메티오닌(M)이다. 따라서, 본 발명의 항체는 돌연변이 M428E를 항체에 도입함으로써 수득될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 428 위치에서 메티오닌을 글루탐산으로 치환함으로써 수득가능하거나 또는 수득된다.
바람직하게, 본 발명의 항체는 311 위치(EU 넘버링)에서 아미노산 아르기닌을 추가로 포함한다. 이것은 본원에서 "311R"로 지칭된다. 비-변형된 인간 IgG 항체의 311 위치에서의 비변성 아미노산은 글루타민(Q)이다. 따라서, 본 발명의 항체는 돌연변이 Q311R을 항체에 도입함으로써 수득될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 311 위치에서 아르기닌을 글루타민으로 치환함으로써 수득가능하거나 또는 수득된다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체는 아미노산 434W 및 아미노산 428E를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 아미노산 434W 및 아미노산 311R을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 아미노산 434W, 428E 및 311R을 포함한다. 상기 항체는 Q311R, M428E 및 N434W 돌연변이를 항체에 도입함으로써 수득될 수 있다.
상기 불변 도메인의 나머지 아미노산 서열은 전형적인 인간 IgG의 비변성 아미노산 서열과 동일할 수 있다. 그러나, 상기 항체가 여전히 TNFα-결합 활성 및 이펙터 기능을 갖는 한, 상기 항체의 아미노산 서열은 비변성 항체의 Fc 영역의 비변성 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 추가적인 돌연변이 또는 치환체를 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 힌지 영역을 포함하는 본 발명의 항체의 Fc 영역은 서열 식별번호: 13에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
일 실시양태에서, 본 발명의 항체의 중쇄는 서열 식별번호: 11에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는다. 바람직하게, 이 항체는 서열 식별번호: 1에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체의 중쇄는 서열 식별번호: 12에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는다. 바람직하게, 이 항체는 서열 식별번호: 23 또는 서열 식별번호: 24에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 추가로 포함한다.
본 발명의 바람직한 측면에서, 본 발명의 항체는 비-푸코실화 항체 또는 감소된 푸코실화를 갖는 항체이다.
본원에서 사용될 때 용어 "감소된 푸코실화를 갖는 항체"는 상기 항체의 N-글리칸의 90% 미만이 푸코실화된 항체를 지칭한다. 푸코실화의 백분율을 결정하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게, 푸코실화의 백분율은 본 출원의 실시예 11에 기재된 바와 같이 결정된다.
일 실시양태에서, 상기 항체의 N-글리칸의 75% 미만, 또는 50% 미만, 또는 25% 미만이 푸코실화된다. 가장 바람직하게, 상기 항체의 N-글리칸의 15% 미만이 푸코실화된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체의 N-글리칸은 임의의 푸코스를 함유하지 않는다.
바람직하게, 상기 항체의 N297(EU 넘버링)에서 N-글리칸의 90% 미만이 푸코실화된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 항체의 N297(EU 넘버링)에서 N-글리칸의 75% 미만, 또는 50% 미만, 또는 25% 미만이 푸코실화된다. 가장 바람직하게, 상기 항체의 N297(EU 넘버링)에서 N-글리칸의 15% 미만이 푸코실화된다.
또 다른 실시양태에서, 상기 항체의 N297에서 N-글리칸은 어떠한 푸코스도 함유하지 않는다.
때로는 탈푸코실화된(afucosylated) 항체로도 지칭되는 비-푸코실화된 항체가 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 완전히 탈푸코실화되고 ADCC-강화된 단일클론 항체 변이체를 생성시키기 위해 예를 들어, CHO 세포에서 α1,6-푸코실트랜스퍼라제(FUT8) 및 GDP-만노스 4,6-디하이드라타제(GMD)에 대한 유전자의 상승적 녹다운(knockdown)이 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Imai-Nishiya et al.(2007) BMC Biotechnol. 7, 84] 참조). α1,6-푸코실트랜스퍼라제의 촉매적 코어를 코딩하는 영역에서 FUT8 유전자를 절단하고 그에 따라 CHO 세포에서 상응하는 효소 기능을 방해하는 징크-핑거 뉴클레아제(ZFN)를 사용하는 방법이 코어 푸코스가 완전히 결핍된 단일클론 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Malphettes et al.(2010) Biotechnol. Bioeng. 106, 774-783] 참조).
감소된 푸코실화를 갖는 항체는 배지에 2-데옥시-2-플루오로-2-푸코스와 같은 디코이 기질을 첨가하여(예를 들어, 문헌[Dekker et al.(2016) Sci Rep 6: 36964] 참조), IgG-Fc 글리칸에서 푸코스의 혼입을 감소시킴으로써 제조될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 높은 시알산 함량을 갖는다. 예를 들어, 시알릴화의 증가가 시티딘 모노포스페이트-시알산 신타아제(CMP-SAS), 시티 딘 모노포스페이트-시알산 트랜스포터(CMP-SAT), 및 α2,3-시알릴트랜스퍼라제(예를 들어, 문헌[Son et al.(2011) Glycobiology 21, 1019-1028] 참조)의 동시 형질주입에 의해 달성될 수 있다.
FcRn에 대한 친화도
본 발명의 항체의 인간 FcRn에 대한 pH 6에서의 친화도가 높다. pH 6에서 인간 FcRn에 대한 항체의 높은 친화도 결합은 100 nM 미만의 KD 값을 특징으로한다. 바람직하게, pH 6에서 상기 높은 친화도 결합의 KD 값은 75 nM 미만, 또는 50 nM 미만, 또는 25 nM 미만, 또는 심지어는 10 nM 미만이다. 예를 들어, pH 6에서 인간 FcRn에 대한 친화도를 특징화하는 KD 값은 1 nM 내지 500 nM, 또는 2 nM 내지 100 nM, 또는 3 nM 내지 50 nM, 또는 4 nM 내지 25 nM 또는 5 nM 내지 10 nM의 범위일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, pH 6에서 인간 FcRn에 대한 본 발명의 항체의 친화도는 pH 6.0에서 인간 FcRn에 대한 인플릭시맵의 친화도보다 더 크다.
인간 FcRn에 대한 본 발명의 항체의 친화도는 바람직하게는 예를 들어 본 출원의 실시예 4에 기재된 바와 같이 표면 플라즈마 공명(SPR)에 의해 결정된다.
본 발명의 항체는 전형적으로 pH 7.4에서 인간 FcRn에 대해 낮은 친화도를 갖는다. 상기 낮은 친화도는 1 μM 초과의 KD 값을 특징으로한다. 바람직하게, pH 7.4에서 인간 FcRn에 대한 낮은 친화도는 2 μM 초과, 또는 5 μΜ 초과, 또는 10 μΜ 초과의 KD 값을 특징으로한다.
특정 실시양태에서, 상기 낮은 친화도는 너무 낮아서, KD 값이 SPR에 의해 결정될 수 없다.
특별한 실시양태에서,(ii) pH 6.0에서 인간 FcRn에 대한 결합의 경우에 KD 값에 대한(i) pH 7.4에서 인간 FcRn에 대한 본 발명 항체의 결합의 경우에 KD 값의 비는 적어도 100 이다. 바람직하게, 이 비는 적어도 200, 또는 적어도 300, 또는 적어도 400, 또는 적어도 500, 또는 적어도 600, 또는 적어도 700, 또는 적어도 800, 또는 적어도 900, 또는 적어도 1000 이다.
항체의 기능적 특성
본 발명의 항체는 정단 측으로부터 기저측부 측으로, 분극된 세포 단일층을 가로질러 효율적으로 수송된다. 전형적으로, 상기 분극된 세포 단일층을 가로지르는 수송은 인플릭시맵의 경우보다 많은 양으로 존재하고, 여기서 인플릭시맵 내의 항체의 양은 상기 분극된 세포 단일층의 질량/㎠를 지칭한다. 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 인플릭시맵의 양에 대한, 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 항체의 양은 적어도 110%, 바람직하게는 적어도 125%, 보다 바람직하게는 적어도 150%, 또는 적어도 175%, 또는 적어도 200%이다(수송된 인플릭시맵의 양이 100%로 설정됨).
또한, 상기 항체는 과량의 경쟁 면역글로불린의 존재 하에서 상기 정단 측으로부터 상기 기저측부 측으로, 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 특이적으로 수송된다. 이것은 본원에서 특이적 수송으로 지칭된다.
상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 면역글로불린의 전체 질량의 백분율은 10-배 초과의 경쟁 면역글로불린의 존재 하에서 상기 정단 측으로부터 상기 기저측부 측으로, 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 인플릭시맵의 백분율보다 크다. 10-배 초과의 미관련 항체의 존재하에 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 인플릭시맵의 백분율에 대해, 10-배 초과의 미관련 면역글로불린의 존재하에 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 본 발명의 항체의 백분율은 적어도 150%, 또는 적어도 200%, 또는 적어도 250%, 또는 적어도 300% 이다(인플릭시맵은 100%로 설정됨).
바람직하게, 상기 분극된 세포 단일층은 분극된 T84 세포의 단일층이다. 트랜스사이토시스의 수송 어세이를 모방한 공정이 본 출원의 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
본 발명의 항체는 CD64, CD32a(H), CD32a(R), CD32b, CD16a(V), CD16a(F) 및 CD16b(NA2)에 결합한다.
본 발명의 항체는 전형적으로 100 nM 미만, 바람직하게는 10 nM 미만의 KD로 CD64에 결합한다.
본 발명의 항체는 전형적으로 10 μM 미만의 KD로 CD32a(H)에 결합한다.
본 발명의 항체는 전형적으로 10 μM 미만의 KD로 CD32a(R)에 결합한다.
본 발명의 항체는 전형적으로 10 μM 미만의 KD로 CD32b에 결합한다.
본 발명의 항체는 전형적으로 예를 들어 500 nM 미만, 바람직하게는 100 nM 미만의 KD로 CD16a(V)에 결합한다.
본 발명의 항체는 전형적으로 예를 들어 10 μM 미만, 바람직하게는 1 μM 미만의 KD로 CD16a(F)에 결합한다.
본 발명의 항체는 전형적으로 예를 들어 10 μM 미만, 바람직하게는 1 μM 미만의 KD로 CD16b(NA2)에 결합한다.
본 발명의 항체는 인간 C1q에 추가로 결합한다. 바람직하게, 이 결합은 인간 C1q에 대한 인플릭시맵의 결합보다 더 강하다.
본 발명의 항체는 토끼 보체의 보체-의존적 세포독성(CDC)을 추가로 갖는다. 본 발명의 항체의 이러한 CDC는 바람직하게는 상대 EC50 및/또는 상대적 최대 사멸의 측면에서 인플릭시맵의 CDC보다 더 크다.
본 발명의 항체는 CD14+CD206+ 대식세포를 추가로 유도할 수 있다. 유도 수준은 바람직하게는 인플릭시맵의 수준에 비슷하거나, 이와 같거나 또는 이보다 크다.
본 발명의 항체는 T-세포 증식을 추가로 억제할 수 있다. T-세포 증식의 억제 정도는 바람직하게는 인플릭시맵의 억제 정도와 비슷하거나, 이와 같거나 또는 이보다 크다.
약학 조성물 및 치료
질병의 치료는 임의의 임상 단계 또는 징후에서 질병의 임의의 형태를 갖는 것으로 이미 진단된 환자의 치료; 상기 질병의 징후 또는 사인(sign)의 발병 또는 진화 또는 악화요인(aggravation) 또는 악화(deterioration)의 지연; 및또는 상기 질병의 중증도의 예방 및/또는 감소를 포함한다.
항-TNFα 항체가 투여되는 "대상체" 또는 "환자"는 포유 동물, 예를 들어 비-영장류(예: 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 랫트 등) 또는 영장류(예: 원숭이 또는 인간)일 수 있다. 특정 측면에서, 상기 인간은 소아 환자이다. 다른 측면에서, 상기 인간은 성인 환자이다.
항-TNFα 항체 및 임의로 하나 이상의 추가적인 치료제, 예컨대 하기 기재된 제 2 치료제를 포함하는 조성물이 본원에 기재되어 있다. 상기 조성물은 전형적으로 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 멸균 약학 조성물의 일부로서 공급된다. 이 조성물은(환자에게 투여하는 바람직한 방법에 따라) 임의의 적합한 형태일 수 있다.
상기 항-TNFα 항체는 경구, 경피, 피하, 비강내, 정맥내, 근육내, 경막내, 국소적 또는 국부적, 예컨대 점막내와 같은 다양한 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 임의의 주어진 경우에 투여에 가장 적합한 경로는 특정 항체, 대상체, 및 질병의 특성 및 중증도, 및 상기 대상체의 신체 증상에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 항-TNFα 항체는 정맥내 투여될 것이다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 경구 투여된다. 상기 투여가 경구 경로에 의한 경우, 상기 항체는 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG1이다.
전형적인 실시양태에서, 항-TNFα 항체는 0.5 mg/kg 체중 내지 20 mg/kg 체중으로 정맥내 투여를 허용하기에 충분한 농도로 약학 조성물에 존재한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합한 항체의 농도는 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 또는 상기 값의 임의의 값 사이의 농도 범위, 예를 들어, 1 mg/kg 내지 10 mg/kg, 5 mg/kg 내지 15 mg/kg, 또는 10 mg/kg 내지 18 mg/kg을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다,
항-TNFα 항체의 유효 투약량은 단일(예를 들어, 볼러스(bolus)) 투여, 다중 투여 또는 연속 투여당 약 0.001 내지 약 750 mg/kg의 범위일 수 있거나, 또는 단일(예를 들어, 볼러스) 투여, 다중 투여 또는 연속 투여당 약 0.01-5000 μg/ml의 혈청 농도를 달성하기 위한 범위, 또는 치료되는 증상, 투여 경로 및 상기 대상체의 연령, 체중 및 증상에 따라 상기 범위 내의 임의의 유효 범위 또는 값일 수 있다. 경구 투여의 경우, 상기 혈청 농도는 매우 낮거나 또는 심지어는 검출 한계 미만일 수 있다. 특정 실시양태에서, 각각의 투약량은 체중 킬로그램 당 약 0.5 mg 내지 약 50 mg 또는 체중 킬로그램 당 약 3 mg 내지 약 30 mg의 범위일 수 있다. 상기 항체는 수용액으로서 제형화될 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 경구 투여된다. 상기 투여가 경구 경로에 의한 경우, 상기 항체는 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG1이다. 상기 항체가 경구 투여되는 경우, 항체의 일일 투여량은 전형적으로 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg 체중, 또는 약 0.05 mg/kg 내지 약 50 mg/kg 체중, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 25 mg/kg 체중, 또는 약 0.15 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 체중, 또는 약 0.16 mg/kg 내지 약 5 mg/kg 체중, 또는 약 0.2 mg/kg 내지 약 2 mg/kg 체중, 또는 약 0.2 mg/kg 내지 약 1 mg/kg 체중의 범위이다. 일반적으로, 유리한 투약량은 하루에 1 내지 200 mg, 바람직하게는 하루에 5 내지 100 또는 10 내지 50 mg의 투약량이다.
약학 조성물은 투약량 당 항-TNFα 항체의 미리 결정된 양을 함유하는 단위 투약량 형태로 편리하게 제공될 수 있다. 이러한 단위는 0.5 mg 내지 5 g, 예를 들어, 비제한적으로, 1 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg, 1000 mg, 또는 전술한 값 중 임의의 두 값 사이의 임의의 범위, 예를 들어 10 mg 내지 1000 mg, 20 mg 내지 50 mg, 또는 30 mg 내지 300 mg을 함유할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 예를 들어 치료될 증상 또는 투여 경로에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다.
항-TNFα 항체의 유효 투약량, 투약의 총 횟수 및 치료 기간의 결정은 당업자의 능력 범위 내에 충분하게 있으며, 표준 투약량 증가 연구를 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 적합한 항-TNFα 항체의 치료적 제형은 원하는 순도를 갖는 항체를 당업계에서 전형적으로 사용되는 임의의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제,(이들 모두는 본원에서 "캐리어"로 지칭됨), 즉, 완충제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 비-이온성 세제, 산화빙지제 및 기타 다양한 첨가제와 혼합함으로써 동결건조 제형 또는 수용액으로서 저장용으로 제조될 수 있다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition(Osol, ed. 1980)]을 참조한다. 이러한 첨가제는 사용된 투약량 및 농도에서 수용자에게 무독성이어야한다.
완충제는 생리학적 상태에 근접한 범위로 pH를 유지하도록 돕는다. 이들은 약 2 mM 내지 약 50 mM 범위의 농도로 존재할 수 있다. 적합한 완충제는 유기산 및 무기산 모두 및 이의 염, 예컨대 시트레이트 완충제(예를 들어, 모노소듐 시트레이트-디소듐 시트레이트의 혼합물, 시트르산-트리소듐 시트레이트의 혼합물, 시트르산-모노소듐 시트레이트의 혼합물 등), 시트레이트-포스페이트 완충제, 숙시네이트 완충제(예를 들어, 숙신산-모노소듐 숙시네이트의 혼합물, 숙신산-소듐 하이드록사이드의 혼합물, 숙신산-디소듐 숙시네이트의 혼합물 등), 타르트레이트 완충제(예를 들어, 타르타르산-소듐 타르트레이트의 혼합물, 타르타르산-포타슘 타르트레이트의 혼합물, 타르타르산-소듐 하이드록사이드의 혼합물 등), 푸마레이트 완충제(예를 들어, 푸마르산-모노소듐 푸마레이트의 혼합물, 푸마르산-디소듐 푸마레이트의 혼합물, 모노소듐 푸마레이트-디소듐 푸마레이트의 혼합물 등), 글루코네이트 완충제(예를 들어, 글루콘산-소듐 글리코네이트의 혼합물, 글루콘산-소듐 하이드록사이드의 혼합물, 글루콘산-포타슘 글리우코네이트의 혼합물 등), 옥살레이트 완충제(예를 들어, 옥살산-소듐 옥살레이트의 혼합물, 옥살산-소듐 하이드록사이드의 혼합물, 옥살산-포타슘 옥살레이트의 혼합물 등), 락테이트 완충제(예를 들어, 락트산-소듐 락테이트의 혼합물, 락트산-소듐 하이드록사이드의 혼합물, 락트산-포타슘 락테이트의 혼합물 등) 및 아세테이트 완충제(예를 들어, 아세트산-소듐 아세테이트의 혼합물, 아세트산-소듐 하이드록사이드의 혼합물 등)를 포함한다. 부가적으로, 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제 및 Tris와 같은 트리메틸 아민 염이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 적어도 1종의 염, 예를 들어 염화나트륨을 추가로 포함할 수 있다. 상기 염 농도는 바람직하게는 100 mM 내지 200 mM 범위, 예를 들어 약 150 mM 이다.
보존제는 미생물 성장을 지연시키기 위해 첨가될 수 있으며, 0.2% 내지 1%(w/v) 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 적합한 보존제는 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤잘코늄 할라이드(예를 들어, 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드), 헥사메토늄 클로라이드, 및 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올 및 3-펜탄올을 포함한다. 액체 조성물의 등장성을 확보하기 위해 때때로 "안정화제(stabilizer)"로 알려진 등장화제(isotonifier)가 첨가될 수 있으며, 다가 당 알코올, 바람직하게는 3가 이상의 당 알코올, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함할 수 있다. 안정화제는 증량제부터, 치료제를 가용화시키거나 또는 변성(denaturation) 또는 용기 벽에의 부착의 방지를 돕는 첨가제에 이르기까지 기능적 범위일 수 있는 광범위한 카테고리의 부형제를 지칭한다. 전형적인 안정화제는 다가 당 알코올(상기 열거됨); 아르기닌, 라이신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등과 같은 아미노산, 락토오스, 트레할로스, 스타키오스(stachyose), 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 리비 톨, 미오이노시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등과 이노시톨과 같은 사이클리톨을 비롯한 유기 당 또는 당 알코올; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 우레아, 글루타티온, 티오산, 소듐 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 소듐 티오 설페이트와 같은 황 함유 환원제; 저 분자량 폴리펩티드(예를 들어, 10개 잔기 이하의 펩티드); 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 자일로스, 만노스, 과당, 포도당과 같은 폴리비닐피 롤리돈 단당류와 같은 친수성 중합체; 락토오스, 말토오스, 수크로오스와 같은 이당류 및 라피노스와 같은 삼당류; 및 덱스트란과 같은 다당류일 수 있다. 안정화제는 활성 단백질 중량부당 0.1 내지 10,000 중량의 범위로 존재할 수 있다.
비-이온성 계면활성제 또는 세제("습윤제"로도 알려져 있음)를 첨가하여, 상기 치료제를 가용화할 뿐만 아니라, 치료용 단백질이 교반-유도된 응집되는 것으로부터 보호하는 것을 도울 수 있으며, 이는 상기 단백질의 변성을 일으키지 않으면서 상기 제형이 전단 표면 응력에 노출되도록 한다. 적합한 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트(20, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), 플루로닉 폴리올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르(TWEEN®-20, TWEEN®-80 등)를 포함한다. 비-이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml의 범위, 또는 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 범위로 존재할 수 있다.
추가적인 다양한 부형제는 증량제(예: 전분), 킬레이트화제(예: EDTA), 산화방지제(예: 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E), 프로테아제 억제제 및 공-용매를 포함한다.
본원의 제형은 또한 그의 항-TNFα 항체 이외에 제 2 치료제를 함유할 수 있다. 적합한 제 2 치료제의 예가 하기에 제공된다.
투약 스케줄은 질병의 유형, 질병의 중증도, 및 항-TNFα 항체에 대한 환자의 민감도를 포함하여 다수의 임상적 요인에 따라 한 달에 한 번부터 매일까지 다양할 수 있다. 특정 실시양태에서, 그의 항-TNFα 항체는 매일, 1 주에 2 회, 1 주에 3 회, 격일로, 5 일마다, 1 주에 1 회, 10 일마다, 2 주마다, 3 주마다, 4 주마다 또는 한 달에 1 회 또는 전술한 값의 임의의 두 값 사이의 임의의 범위, 예컨대, 4일마다 내지 매달마다, 10 일마다 내지 2 주마다 또는 1 주에 2회 내지 3회 등이다.
투여되는 항-TNFα 항체의 투약량은 특정 항체, 대상체 및 질병의 특성 및 중증도, 대상체의 신체 증상, 치료 요법(예를 들어, 제 2 치료제가 사용되는지 여부), 및 선택된 투여 경로에 따라 다양할 것이다; 적절한 투약량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
그의 항-TNFα 항체의 개별 투약량의 최적의 양 및 간격은 치료되는 증상의 특성 및 정도, 투여의 형태, 경로 및 부위, 및 치료되는 특정 대상체의 연령 및 증상에 의해 결정될 것이고 의사는 궁극적으로 사용될 적절한 투약량을 결정할 것임을 당업자는 인식할 것이다. 이 투약량은 적절한 빈도로 반복될 수 있다. 부작용이 발생하면, 통상적인 임상 실무에 따라 투약의 양 및/또는 빈도가 변화 또는 감소될 수 있다.
치료될 장애
본 발명은 대상체에게 본원에 정의된 바와 같은 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 인간 TNFα-관련 질병을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 용어 "TNFα-관련 장애"또는 "TNFα-관련 질병"은 TNFα의 참여를 필요로하는 징후 또는 질병 상태의 임의의 장애, 발병, 진행 또는 지속성을 지칭한다. 예시적인 TNFα-관련 장애는 일반적인 염증의 만성 및/또는 자가면역 상태, 일반적인 면역 매개성 염증성 장애, 염증성 CNS 질병, 눈, 관절, 피부, 점막, 중추 신경계, 위장관, 요로 또는 폐에 영향을 주는 염증성 질병, 일반적인 포도막염 상태, 망막염, HLA-B27+ 포도막염, 베체트병, 안구 건조증, 녹내장, 쇼그렌 증후군, 당뇨병(당뇨병성 신경병증 포함), 내인슐린성, 일반적인 관절염 상태, 류마티스 관절염, 골관절염, 반응성 관절염 및 라이터 증후군, 청소년 관절염, 강직성 척추염, 다발성 경화증, 길랑바레 증후군, 중증 근무력증, 근위축성 측삭 경화증, 유육종증, 사구체 신염, 만성 신장 질병, 방광염. 건선(건선성 관절염 포함), 화농성 한선염, 지방층염, 괴저성 농피증, SAPHO 증후군(협착염, 여드름, 농포, 골비대증 및 골염), 여드름, 스위트 증후군, 천포창, 크론병(창자외발현 포함), 궤양성 대장염, 천식 기관지, 과민성 폐렴, 일반 알레르기, 알레르기성 비염, 알레르기성 부비동염, 만성 폐쇄성 폐 질병(COPD), 폐 섬유증, 베게너 육아종증, 가와사키 증후군, 거대 세포 동맥염, 척-스트라우스 혈관염, 결절성 다발동맥염, 화상, 이식 대 숙주 질병, 숙주 대 이식 반응, 장기 또는 골수 이식 후의 거부 에피소드, 일반적인 혈관염의 전신 및 국소 상태, 전신 및 피부 홍반성 루푸스, 다발성근염 및 피부염, 경화증, 자간전증, 급성 및 만성 췌장염, 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 눈 수술 후(예: 백내장(눈 렌즈 교체) 또는 녹내장 수술), 관절 수술(관절경 수술 포함), 관절-관련 구조체(예: 인대)에서의 수술, 구강 및/또는 치과 수술, 최소 침습성 심혈관 시술(예: PTCA, 천식절제술, 스텐트 배치), 복강경 및/또는 내시경 복부내 및 부인과 시술, 내시경 비뇨기과 시술(예: 전립선 수술, 요도경 검사, 방광경 검사, 간질성 방광염) 또는 일반적인 수술 전후 염증(예방)과 같은 수술후 염증, 물집 피부염, 호중구 피부염, 독성 표피 괴사, 농포성 피부염, 뇌 말라리아, 용혈성 요독 증후군, 동종이식 거부, 중이염, 독사교상, 결절성홍반, 골수이형성 증후군, 일차 경화성 담관염, 혈청음성 척추동맥병증, 자가면역용혈빈혈, 구강 안면 육아종증, 증식성화농성구내염, 애프더성 구염, 지도모양 혀, 이동성 구내염, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅턴 병, 벨 마비, 크로이츠펠트-야콥병 및 일반적인 신경변성 증상을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
암-관련 골용해, 암-관련 염증, 암-관련 통증, 암-관련 악액질, 골 전이, TNFα의 중추 또는 말초 효과에 의해 유발되는지 여부 및 이들이 염증으로 분류되는지 여부에 상관없이 급성 및 만성 통증 형태, 통증, 좌골 신경통, 요통, 수근관 증후군, 복합 국소 통증 증후군(CRPS), 통풍, 포진후 신경통, 섬유 근육통, 국소 통증 상태, 전이성 종양으로 인한 만성 통증 증후군, 월경의 통각수용성 또는 신경병증 형태.
치료될 특정 장애는 일반적인 관절염 상태, 류마티스 관절염, 골관절염, 반응성 관절염, 소아 관절염; 건선성 관절염을 포함한 건선; 크론병, 직장염을 비롯한 궤양성 대장염, S상결장염, 외음핵 염, 좌측 대장염, 광범위한 대장염 및 췌장염, 미확인 대장염, 콜라겐성 및 림프 구성 대장염을 포함한 미세 대장염, 결합 조직 질병의 대장염, 전환 대장염, 게실질병의 대장염, 호산구성 대장염 및 주머니염을 포함한 염증성 장 질환을 포함한다.
가장 바람직하게, 본 발명의 항체는 염증성 장 질병, 특히 크론 병, 궤양성 대장염 또는 미세결장염을 치료하기 위해 사용된다. 상기 크론 병은 비-협착성/비-침투성, 협착성, 침투성 및 항문성 질병 거동을 포함하는 회장, 결장성, 회결장 또는 분리된 상부 크론 병(위, 십이지장 및/또는 공장)일 수 있으며, 상기 언급된 것의 임의의 국소화 및 질병 거동의 임의의 조합을 허용한다. 상기 궤양성 대장염은 궤양성 직장염, 외음핵 염, 좌측 대장염, 범-궤양성(pan-ulcerative) 대장염 및 주머니염일 수 있다.
병용 요법 및 기타 측면
바람직하게, 그의 항-TNFα 항체로 치료되는 환자는 또한 또 다른 통상적인 의약으로 치료된다. 예를 들어, 염증성 장 질병을 앓는 환자, 특히 중등도 내지 중증의 질병이 있는 경우에는 전형적으로 메살라진 또는 그의 유도체 또는 전구약물, 코르티코스테로이드, 예를 들어 부데소니드 또는 프레드니솔론(경구 또는 정맥내), 면역억제제, 예를 들어 아자티오프린/6-머캅토푸린(6-MP) 또는 메토트렉세이트, 시클로스포린 또는 타크롤리무스로도 치료된다. 상기 환자에게 공-투여될 수 있는 다른 의약은 다른 항-TNFα 항체(예: 인플릭시맵, 아달리무맵, 에타너셉트, 세르톨리주맵 페골, 골리무맵), 인테그린 길항제(예: 나탈리주맵, 베돌리주맵), 항-IL-23 항체(예: MEDI2070), 항-β7 항체(예: 에트롤리주맵), JAK/STAT 경로에서의 JAK 억제제(예: 토파시티닙) 및 기타를 포함한다. 상기 환자에게 공-투여될 수 있는 추가적인 의약은 안정하고 보다 오랫동안 차도를 유지하기 위해 면역억제제(예를 들어, 아자티오프린/6-MP 또는 메토트렉세이트 또는 경구 사이클로스포린)를 포함한다. 본 발명의 추가적인 또 다른 측면은 염증을 감소시키기 위해 본원에서 상기 정의된 바와 같은 항-TNFα 항체의 용도이다.
본 발명의 추가적인 또 다른 측면은 염증 증상을 앓는 환자의 염증을 감소시키는 데 사용하기위한 본원에서 상기 정의된 바와 같은 항-TNFα 항체이다.
본 발명의 추가적인 측면은 본원에서 상기 정의된 바와 같은 항-TNFα 항체의 유효량을, 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증 증상을 치료하는 방법이다. 상기 염증 증상은 바람직하게는 상기 기재된 증상 중 하나이다.
본 발명의 추가적인 측면은 본원에서 상기 정의된 바와 같은 항-TNFα 항체의 유효량을, 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증 증상을 예방하는 방법이다. 상기 염증 증상은 바람직하게는 상기 기재된 증상 중 하나이다.
본 발명의 추가적인 또 다른 측면은 개선된 트랜스사이토시스를 갖는 변형된 항체를 수득하기 위해 상기 항체의 아미노산 서열에 Q311R, M428E 및 N434W 치환체를 도입하는 단계를 포함하는, TNFα에 대한 항체의 트랜스사이토시스를 개선시키는 방법이다. 상기 변형된 항체는 바람직하게는 본원에서 상기 정의된 바와 같은 항체이다.
본 발명의 추가적인 또 다른 측면은 연장된 혈장 반감기를 갖는 변형된 항체를 수득하기 위해 상기 항체의 아미노산 서열에 Q311R, M428E 및 N434W 치환체를 도입하는 단계를 포함하는, TNFα에 대한 항체의 혈장 반감기를 연장시키는 방법이다. 상기 변형된 항체는 바람직하게는 본원에서 상기 기재된 바와 같은 항체이다. 상기 혈장 반감기는 비-변형된 항체(즉, Q311R, M428E 및 N434W가 결핍된 친계 항체)의 혈장 반감기에 비해 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40% 또는 적어도 50% 증가될 수 있다 .
Figure pct00001
실시예
항체 변이체
항체 아미노산 서열의 Fc 영역에 치환체를 도입함으로써 항-TNFα 항체(이하 "친계 항체"또는 "Ab-wt"로 지칭됨)의 여러 변이체를 발생시켰다. Ab-wt의 경쇄는 서열 식별번호: 1에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖고, Ab-wt의 중쇄는 서열 식별번호: 2에서 보여진 것과 같은 아미노산 서열을 갖는다. 상기 돌연변이는 기존의 방법에 의해 부위-지정된 돌연변이생성에 의해 도입하였다. 즉, 돌연변이는 PCR에 의해 도입하였다. 정방향 프라이머는 의도된 돌연변이를 함유하도록 설계된 반면, 역방향 프라이머는 2개의 프라이머의 5' 말단이 연속해서(그러나 겹치지는 않음) 어닐링되도록 설계되었다(도 9). 25회 사이클(10 초 동안 98 ℃, 30 초 동안 64 ℃, 3 분 동안 72 ℃) 동안 PCR을 실행하였다. 아가로스 겔 상에서 PCR 산물을 가동시키기 전에, 제한 효소 Dpnl을 사용하여 PCR 산물의 풀(pool)에서 돌연변이되지 않은 PCR 주형을 제거하였다. PCR 산물의 겔 정제 이후에, 평활 말단(blunt end)을 결찰하여, 원형화된 플라스미드를 수득하였고, 이를 수용성(competent) 대장균 세포 내로 형질전환시켰다. 밤새 인큐베이션한 후에, 여러 콜로니를 채취하고, 플라스미드 DNA를 단리하고, 서열 분석하여 상기 돌연변이가 도입되었음을 확인하였다.
상기 비-푸코실화된 변이체는 0.15 mM의 디코이 기질 2-데옥시-2-플루오로-2-푸코즈를 배양 배지에 첨가함으로써 발생되었다(문헌 [Dekkers et al.(2016) Sci Rep 6: 36964]). 이는 하기 실시예 11에서 보여지는 바와 같이 IgG-Fc 글리안에 푸코스의 도입을 유의미하게 감소시켰다.
Figure pct00002
항체 Ab-REW 및 Ab-REW-2FF는 본 발명에 따른 항체이다.
실시예 1. TNFα에 대한 친화도
방법:
TNFα에 대한 친화도는 Biacore에 의해 측정하였다. 표준 아민 고정화 Biacore 절차를 사용하여 CM5 칩을 제조하였다. CM5 칩의 삽입시에, 시스템을 프라이밍한 다음 BIA-정규화 솔루션(Biacore Preventative Maintenance Kit 2)으로 정규화하였다. PBS-T 실행 완충액을 갖는 시스템에 상기 칩을 추가하였다; 고정화하기 전에 상기 칩 표면을 50 mM NaOH의 3 회 주입으로 프라이밍하였다. 단백질 A를 상기 칩 표면 상에 고정화하였다. 이를 위해, 상기 단백질을 pH 4.5에서 10 mM 아세테이트 완충액에 5 μg/mL로 희석하고, 주입하여 모든 4 개의 유세포(flow cell)에서 약 1000 RU의 결합 반응을 발생시켰다. 모든 칩 유세포로부터 비-공유 결합된 물질을 제거하기 위해, 3 회의 15 초 50 mM NaOH 세척을 수행하였다. 상기 단백질 A 칩 상에서, 유세포 2 및 4에서 항체를 포획하였고, 유세포 1 및 3은 기준 감산을 위해 사용되었다. 시험 항체를 PBS-T에서 10 nM로 희석하고 2.5-7.5 uL 주입하여 120 RU의 포획된 항체를 수득하였다. 공급업체의 지시에 따라 분석물 TNFα를 물 중에서 500 ㎍/mL로 제조하고, 실행 완충액 PBS-T로 추가 희석하였다. 단일 사이클 동역학을 이용하여 정상 상태 친화도를 추정하였다. 각각의 단일 사이클 분석 사이클에 대해 5 개의 분석물 농도의 적정을 리간드에 주입한 다음, 복합체의 해리를 측정하였다. 글리신 pH 1.7을 사용하여 표면을 재생시켰다. 리간드 결합된 포획 표면(fc 2 및 4)으로부터의 데이터가, 리간드가 포획되지 않은 기준 표면(fc 1 및 3 각각)에서 감산되는 이중 기준 방법이 사용되었다. 완충액의 블랭크 주입을 3-4 사이클마다 실행한 다음, 분석물 주입 사이클로부터 감산하여 리간드 포획 표면의 작은 변화를 교정하였다. 각 분석 실행의 시작과 끝에서 분석물의 반복 주입을 이용하여, 샘플 분해 또는 기기 성능의 변화를 확인하였다. 모든 분석을 25 ℃에서 수행하였고, 샘플 랙(sample rack)을 실험 실행동안 10 ℃에서 인큐베이션하였다. 각 실험은 적어도 3회 실행하였다. 일대일 결합 모델을 이용하여, 결과로 얻은 동역학적 데이터를 정합시켰다.
결과:
모든 항체는 TNFα와 유사한 결합 동역학을 나타내어, 도입된 임의의 변형이 항원 결합 영역에서 유의한 변화로 이끌지 않았음을 가리킨다. 항체 Ab-REW-2FF의 경우, 해리 속도를 측정할 수 없었고, 따라서 친화도(KD)를 결정할 수 없었다. 그러나, 회합 속도는 다른 항체와 유사하여, 돌연변이의 도입이 결합에 유의미하게 영향을 미치지 않음을 가리킨다.
Figure pct00003
실시예 2. 효능
방법:
L929 세포를 항-TNFα 항체 변이체의 연속 희석의 존재하에 0.25 ng/mL의 TNFα 및 1 μg/웰의 액티노마이신 D와 함께 인큐베이션하였다. 37℃/5% CO2에서 20 시간동안 인큐베이션한 후, MTS(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨 및 전자 커플링 시약(페나진 에토설페이트, PES)을 사용하여 증식 반응을 측정하였다. 대사적으로 활성인 세포에 존재하는 탈수소효소에 의해 MTS를 포르마잔 산물로 전환시켰다. 492 nm에서 흡광도에 의해 측정될 때 포르마잔 산물의 양은 배양물 중 생세포의 수에 정비례하였다.
결과:
결과가 도 1에 도시되어 있다. 항-TNFα 항체의 Fc 영역으로의 돌연변이 도입은 효능에 영향을 미치지 않았다.
실시예 3. Fcγ 수용체(CD64, CD32a, CD32b, CD16a, CD16b)에 대한 친화도
방법:
FcγRs에 대한 친화도는 Biacore에 의해 측정하였다. 표준 아민 고정화 Biacore 절차를 사용하여 CM5 칩을 제조하였다. CM5 칩의 삽입시에 상기 시스템을 프라이밍한 다음, BIA-정규화 솔루션(Biacore Preventative Maintenance Kit 2)으로 정규화하였다. 포스페이트 완충된 생리식염수 Tween-20(PBS-T) 실행 완충액과 함께 상기 시스템에 상기 칩을 추가하였다; 고정화하기 전에 상기 칩 표면을 3 회의 50 mM NaOH의 주입으로 프라이밍하였다. FcγRs는 His-태그 포획 시스템을 사용하여 상기 칩 표면 상에 고정화하였다. 상기 항-His 태그 칩은 상기 Biacore 키트 지침서에 따라 제조되었으며, 약 12000 RU의 항체가 모든 4개의 유세포에 침착되었다. 모든 칩 유세포로부터 비-공유 결합된 물질을 제거하기 위해, 3 회의 30 초 10mM 글리신 pH 1.5 세척을 수행하였다. 상기 Fcγ 수용체를 PBS-T에서 0.5 내지 2 ㎍/mL 범위로 희석하였고, 2.5 내지 5.0 μL를 상기 칩 상에 주입하여 60 내지 200 RU의 포획 수준을 발생시켰다. 분석 전에 항체를 PBS-T로 희석시켰다. 단일 사이클 동역학을 이용하여 정상 상태 친화도를 추정하였다. 각각의 단일 사이클 분석 사이클에 대해 5 개의 항체 농도의 적정을 FcγR 리간드 상에 주입한 후에 상기 복합체의 해리를 측정하였다. 항-His 포획 표면에 대해 권장된 용액, 10 mM 글리신 pH 1.5를 사용하여 상기 표면을 재생시켰다. 리간드 결합된 포획 표면(fc 2 및 4)으로부터의 데이터가, 리간드가 포획되지 않은 기준 표면(fc 1 및 3 각각)에서 감산되는 이중 참조 방법을 사용하였다. 상기 리간드 포획 표면의 작은 변화를 보정하기 위해 모든 항체 적정 사이클에 대해 완충액의 블랭크 주입을 실행하고, 그 다음에 분석물 주입 사이클로부터 감산하였다. 모든 분석을 25 ℃에서 수행하였고, 샘플 랙을 실험 실행하는 동안 10 ℃에서 인큐베이션하였다. 각 실험은 적어도 3회 실행하였다.
결과:
CD64에 대한 결합은 가공된 항-TNFα 항체로 인한 영향을 받지 않았다. 상기 돌연변이의 도입은 CD32a(H), CD32a(R) 및 CD32b에 대한 친화도에 영향을 미치지 않았다. 그러나, Ab-REW-2FF는 CD16a(V)에 대한 친화도에서 5.5-배의 증가를 보여주었다. 상기 비-푸코실화된 항체 Ab-REW-2FF는 또한 낮은 친화도 CD16a 수용체에 대해 또한 CD16b에 대해 개선된 결합을 가졌다.
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 4. FcRn에 대한 친화도
방법:
제조업체에 의해 기재된 바와 같이 아민-커플링 화학약품을 사용하여 항-TNFα lgG1 항체(약 500 공명 단위(RU))에 의해 커플링된 CM5 센서 칩과 함께 Biacore 3000 기기를 사용하여 SPR을 수행하였다. 아민-커플링 키트(GE Healthcare)를 사용하여 pH 4.5의 10 mM 아세트산 나트륨 중 2.0 ug/mL의 각 단백질을 주입함으로써 커플링을 수행하였다. HBS-P 완충액 pH 7.4(10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% 계면활성제 P20) 또는 포스페이트 완충액 pH 6.0(67 nM 포스페이트 완충액, 150 mM NaCl, 0.005% TWEEN 20)을 실행 및 희석 완충액으로서 사용하였다. pH 7.4 또는 pH 6.0에서 고정화된 항체 상에 적정된 양(1000 내지 31.2 nM)의 단량체 His-태그된 인간 FcRn(hFcRn)을 주입함으로써 결합 동역학을 결정하였다. 모든 SPR 실험은 40 ul/분의 유속으로 25 ℃에서 수행하였다. 결합 데이터는 제로-조정되었고, 기준 세포 값을 감산하였다. BIA평가 소프트웨어(버전 4.1)에 의해 제공된 랑그뮈어(Langmuir) 1:1 리간드 결합 모델을 사용하여, 결합 동역학을 결정하였다.
결과:
결과는 야생형 항체 Ab-wt가 엄격하게 pH 의존적으로 hFcRn에 결합함을 보여 주었다. 모든 가공된 항체 변이체는 pH 6.0에서 FcRn에 대해 더 높은 친화도를 가졌지만, pH 의존성을 유지하였고 pH 7.4에서 상기 수용체에 결합하지 않았다. 놀랍게도, REW 함유 변이체는 산성 pH에서 > 160 배 더 강한 결합을 보여주었고, 중성 pH에서 시험된 조건 하에서 검출가능한 결합을 보여주지 않았다. 상기 항체 변이체는 야생형 lgG1 Fc 영역을 함유하는 인플릭시맵과 비교하여 FcRn에 대해 개선된 결합을 보여주었다.
Figure pct00006
실시예 5. 트랜스사이토시스
방법:
0.4 μm의 기공 크기를 갖는 콜라겐 코팅된 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 막을 갖는 트랜스웰 필터(1.12 ㎝2)를 완전 성장 배지에서 O/N 인큐베이션하고, 이후에 웰당 1.0 x 106 T84 세포를 씨딩하였다. 경상피 전기 저항(TEER)은 MILLICELL-ERS-2 볼트-옴 미터를 사용하여 매일 모니터링하였다. 약 1000 내지 1300 Ω x cm2의 TEER 값을 갖는 컨플루언스(confluence)에 도달하기 전에 배양물을 4 내지 5 일동안 성장시켰다. 실험 전에, 단일층을 행크 평형염 용액(HBSS)에서 1 시간동안 굶겼다. 이 후, 400 nM의 항체 변이체 또는 IFX 단독 또는 관련없는 특이성을 갖는 4000 nM의 인간 골수종 IgG와 함께 정단 트랜스웰 챔버에 첨가하였다. 첨가 0 및 4 시간 후에 기저측부 저장소로부터 샘플을 수집하였다. 기저측부 저장소에서의 항체 농도는 ELISA에 의해 결정하였다. 즉, 96-웰 Maxisorp 플레이트를 재조합 TNFα 또는 염소의 항-인간 Fc 특이적 항체로 O/N 코팅하였고, 이들 모두를 PBS에서 1 μg/ml로 희석하였다. 이후에, 상기 플레이트를 실온에서 2 시간동안 4% 탈지유를 함유하는 PBS로 차단한 후에 0.05% TWEEN 20을 함유하는 PBS로 4회 세척하였다. 상기 트랜스사이토시스 실험 동안에 수집된 샘플을 상기 웰에 첨가하고, 상기와 같이 세척하기 전에 실온에서 2 시간동안 인큐베이션하였다. 염소의 알칼리성 포스파타제(ALP)-접합된 항-인간 Fc 특이적 항체를 사용하여, 포획된 항체 변이체, IFX 또는 전체 IgG를 검출하였다. 100 μl ALP-기질을 첨가하여 결합을 시각화하고, 405 nm 흡수 스펙트럼을 기록하였다. 항체 변이체, IFX 및 수송된 전체 IgG의 양은 개별 항체 변이체 각각의 표준 곡선으로부터 계산되었다.
분극된 인간 상피 세포에 걸친 항체 변이체의 트랜스사이토시스
결과:
조작된 항-TNFα 항체 변이체는 세포 단일층을 가로지른 트랜스사이토시스에 대해 시험되었고, 또 다른 인간 IgG1 항-TNFα 항체로서 wt 항체 또는 IFX와 비교되었다. 결과가 도 2에 도시되어 있다. wt 항-TNFα 항체는 정단으로부터 기저측부 저장소까지 수송되었다. wt Fc 영역을 갖는 또 다른 lgG1 항체인 IFX와 비교할 때, 2.8배 더 많은 Ab-REW가 수송되었으며, 이는 Ab-REW-2FF의 경우에서도 마찬가지이었다.
경쟁 IgG의 존재 하에서 분극된 인간 상피 세포에 걸친 항체 변이체의 트랜스사이토시스
결과:
첨가 4 시간 후에 항-TNFα 항체 변이체가 10-배 과량의 인간 골수종 IgG와 함께 인큐베이션될 때, 정단으로부터 기저측부 저장소까지 분극화된 T84 세포 단일층을 가로질러 수송된 면역글로불린의 총량이 모든 항체에 대해 유사하였다. 그러나, pH 6.0에서 FcRn에 대해 증가된 친화도는 또한 무관련 특이성을 갖는 과량의 경쟁 인간 IgG의 존재 하에서 세포 단일층을 가로질러 유의미하게 더 높은 백분율의 특이적 항-TNFα 수송을 초래하였다. 결과가 도 3에 도시되어 있다.
실시예 6. ADCC
방법:
Promega로부터 ADCC 리포터 바이오어세이 코어 키트를 사용하였다. 즉, 1 x 105/mL의 mTNFα CHO-K1 표적 세포를 백색(투명 바닥) 조직 배양 플레이트 상에 웰당 100 μL로 씨딩하였다. 상기 플레이트를 37 ℃/5% CO2에서 O/N으로 인큐베이션하였다. 2 일째에, 95 μL의 어세이 배지를 제거하고 3 x 106/mL로 25 μL의 가공된 Jurkat 이펙터 세포로 교체하였다. 이어서 상기 플레이트를 37 ℃/5% CO2에서 6 시간동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝날 쯤으로 가면서 BioGlo™ 시약을 준비하였다. 웰당 75 μL의 BioGlo™ 시약을 첨가하기 전에 플레이트를 10 내지 20 분동안 RT로 평형화시켰다. 암실에서 5 내지 10 분동안 인큐베이션한 후, 발광을 측정하였다. 데이터를 정합시키기 위해 4-PL 모델을 사용하였다.
결과:
결과(도 4 참조)는 모든 항-TNFα 항체가 ADCC를 유도하지만 뚜렷하게 다른 강도를 가짐을 보여 주었다. 야생형 항체 Ab-wt와 비교하여, 상기 항체 변이체는 증가된 ADCC를 보여주었다. 구체적으로 상기 비-푸코실화된 항체 변이체 Ab-REW-2FF는 유의미하게 개선된 ADCC를 가졌다.
실시예 7. C1q 결합
방법:
96-웰 MaxiSorp 플레이트를 사용하여 ELISA를 수행하였고, 이 때 상기 웰은 PBS에서 1 μg/mL로 희석된 인간 TNFα로 코팅되었다. 4 ℃에서 O/N 인큐베이션한 후에, 상기 플레이트를 4% 탈지유를 함유한 PBS로 1 시간동안 차단하고, 0.05% TWEEN-20(PBS-T)을 함유하는 PBS로 4 회 세척하였다. 이어서, 적정된 양의 항-TNFα IgG 항체를 PBS-T에 희석시키고, 첨가하고, 실온에서 1 시간동안 인큐베이션하였다. PBS-T를 사용하여 세척한 후에, 인간 C1q(0.5 μg/mL)를 0.1 M Veronal 완충액(0.25 mM CaCl2 및 0.8 mM MgCl2 pH 7.2)에 희석시키고, 상기 웰에 첨가하고, 1 시간동안 인큐베이션하였다. 이후에, PBS-T에 1:5000으로 희석된 토끼 항-인간 C1q를 상기 웰에 첨가하여 1 시간동안 인큐베이션하기 전에, 상기 웰을 상기와 같이 세척하였다. 세척 후, PBS-T에 1:5000으로 희석된 당나귀로부터의 HRP-접합된 항-토끼 IgG를 첨가하였다. 이후에, 상기 웰을 세척하고, 100 μL, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 기질을 각 웰에 첨가하였다. Sunrise 분광광도계를 사용하여 620 nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과:
인간 C1q를 첨가하기 전에 상기 항-TNFα 항체 변이체를 인간 TNFα 상에서 포획하였다. 결과(도 5 참조)는 상기 항체가 C1q에 결합하지만 뚜렷하게 다른 결합 강도를 가짐을 보여주었다. 구체적으로, Ab-REW 및 Ab-REW-2FF는 IFX보다 다소 더 강하게 결합하였다. N297에 부착된 이중-안테나 N-글루칸에서 푸코스의 존재는 결합에 영향을 주지 않거나 또는 단지 약간의 영향을 주었다. 가장 강한 결합부터 가장 약한 결합까지의 결합 서열은 다음과 같았다 : Ab-REW > Ab-REW-2FF > IFX.
실시예 8. CDC
방법:
항-TNFα CDC 어세이는 토끼 보체의 항체 의존적 세포독성을 측정하였다. 보체의 세포독성 잠재력을 촉진시키는 항-TNFα 항체의 존재하에, mTNFα를 발현하는 표적 세포를 마이크로플레이트에 씨딩하였다. 6 개의 독립적인 샘플 복제물(항-TNFα 항체 변이체) 및 4 개의 참조 표준 복제물(IFX)을 60 μg/mL으로 제조하고, 연속 희석하고(1.3 배 희석 단계), 사용할 때까지 희석 플레이트를 밀봉하였다. LUC 생존력 리포터를 함유하는 표적 세포를 1.5 x 105/ml로 제조하고 37 ℃에서 수조에 저장하였다. 토끼 보체는 DMEM 고 글루코오스에서 3-배 최종 어세이 농도로 희석하였다. 제조 직후에, 보체를 표적 세포와 1:1 비(v/v)로 결합시켰다. 40 μL의 보체/표적 세포 제제를 어세이 플레이트의 각 웰로 옮겼다. 희석 플레이트에서 제조된 항체를 상기 세포(20 μL/웰)로 옮기고, 이어서 상기 플레이트를 36 ℃/1% CO2에서 3.5 시간동안 인큐베이션하였다. 어세이 플레이트를 35 분동안 암실에서 RT로 평형화시켰다. 사용하기 전에 120 분동안 주위 온도로 평형화시킨 Steady Glo를 상기 어세이 플레이트(20 μL/웰)에 첨가하였고, 형광을 측정하기 전에 35 분동안 암실에서 실온으로 저장하였다. 이어서, 각 샘플의 각 농도에 대해 세포 사멸 백분율을 계산하였고, 4-PL 모델을 사용하여 데이터를 정합시켰다.
결과:
결과가 도 6과 표 7에서 보여진다. CDC 어세이에서 시험 샘플 성능에 대한 상대 EC50 및 상대 최대 사멸% 결과는 두 활성 측정에 걸쳐 일관된 명확한 활성 순위를 제공하였다. Ab-REW는 푸코스 함량에 관계없이 IFX보다 더 큰 CDC 활성을 보여주었다. 푸코스 변이체 샘플 사이의 직접적인 비교에서, CDC 활성에 대한 푸코스 함량의 영향을 보다 잘 이해하기 위해 Ab-REW와 비교하여 Ab-REW-2FF가 유사한 CDC 활성 반응을 제공하였다. 상기 비교는 97.1%의 상대 EC50 반응 및 100.4%의 상대 최대 사멸% 반응을 보여주었다.
Figure pct00007
실시예 9. 규제 대식세포의 유도
방법:
말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 건강한 버피 코트로부터 단리하였다. Ficoll 구배 원심분리를 통해 세포를 단리하였다. 2 개의 개별 공여체의 세포를 동일한 수로 혼합하고, 상기 혼합물의 2 x 105 세포를 100 μL/웰의 전체 부피 중 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 37 ℃/5% CO2에서 48 시간동안 인큐베이션하였다. 48 시간 후에, 항-TNFα 항체 변이체 또는 IFX를 첨가하여 최종 농도 10 μg/mL에 도달하였다. 각 화합물을 5 회 또는 6 회 반복실험으로 첨가하였다. 최종 부피는 150 μL/웰이었다. 인간 혈청 lgG1(시그마 #I5154)을 대조군으로 사용하였다. 상기 화합물을 첨가한 후에, 혼합 림프구 반응(MLRs)을 37 ℃/5% CO2에서 추가로 4 일동안 배양하였다. 그 후, 플레이트를 PBS/5 mM EDTA(PBS/EDTA)를 사용하여 세척하고, 실온에서 20 분동안 50 μL/웰 PBS/EDTA와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 원심 분리하고, 액체를 튕겼다(flick out). 항체를 PBS/EDTA(항-CD14-PE, 항-CD206-APC, 둘다 1:10으로 희석함)에 희석시켰다. 세포를 50 μL의 항체 용액에 재현탁시키고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 PBS/EDTA로 세척하고, 50μL의 PBS/EDTA에 재현탁시켰다. 염색된 샘플은 FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 FACS Fortessa 상에서 분석하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행하였다.
결과:
조절 대식세포의 유도가 4 개의 독립적인 MLRs에서 분석되었고, 모든 실험에서 성공적이었다(IFX를 IgG 대조군과 비교). 그 결과가 도 7에 도시된다. 각각의 실험이 개체간 편차를 갖는 다른 공여체를 사용하여 수행되었다는 사실로 인해, IFX에 의한 유도의 수준은 실험마다 다를 수 있다. 모든 시험된 항-TNFα 항체 변이체는 화합물 사이에 약간의 편차를 갖는 CD14+CD206+ 조절 대식세포를 유도하였다. Ab-REW 및 Ab-REW-2FF는 IFX보다 약간 더 많은 조절 대식세포를 유도했지만, Ab-REW-2FF의 경우에만 증가가 유의미하였다.
실시예 10. T-세포 증식의 억제
방법:
건강한 버피 코트로부터 PBMC를 단리하였다. 세포는 Ficoll 구배 원심분리를 통해 단리하였다. 2개의 개별 공여체의 세포를 동일한 수로 혼합하였고, 상기 혼합물의 2 x 105 세포를 총 부피 100 μL/웰로 96 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 37 ℃/5% CO2에서 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 48 시간 후, 항-TNFα 항체 변이체 또는 IFX를 첨가하여 최종 농도 10 μg/mL에 도달하였다. 각 화합물을 5 회 또는 6 회 반복실험으로 첨가하였다. 최종 부피는 150 μL/웰이었다. 인간 혈청 lgG1(Sigma #15154)을 대조군으로 사용하였다. 상기 화합물을 첨가한 후, 혼합된 림프구 반응(MLRs)을 37 ℃/5% CO2에서 추가로 2 일동안 배양하였다. 그 후에, 삼중수소 티미딘(3H 티미딘, 0.5 마이크로큐리/웰)을 상기 배양물에 첨가하였다. 배양물을 37 ℃/5% CO2에서 18시간 동안 추가로 배양하였다. 샘플은 Microbeta Filtermat 96 세포 수확기(harvester)를 사용하여 수확하고, 단일 검출기가 장착된 Microbeta MicroplateCounter를 사용하여 분석하였다. 샘플을 10 초/웰로 계수하고 분당 계수(cpm)로 전환하였다.
결과:
T-세포 증식의 억제는 3 개의 독립적인 MLR에서 측정하였고, 양성 대조군으로서 IFX가 억제를 유도한 경우 성공인 것으로 정의하였다. 개별 실험에서 IFX에 의한 억제 수준은 아마도 조절 대식세포 유도에서의 편차로 인해 다를 수 있다. 각 실험에서, T-세포 증식을 억제하는 항-TNFα 항체 변이체의 효능을 양성 대조군 IFX에 대해 계산하였다. 항체 Ab-REW-2FF는 IFX와 비교하여 유의미하게 향상된 억제를 보여준 반면 Ab-REW에 의한 억제는 IFX와 유사하였다(도 8 참조).
실시예 11. N-글리칸의 분석
방법:
100 μL의 50 mM 암모늄 바이카보네이트(pH 7.8)에 용해된 1㎍ 트립신을 첨가하고 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하기 전에, 50 ㎕의 각각의 IgG 변이체(1 mg/ml) 를 13,000xg으로 10 분동안 회전시켰다. 원심분리 장치를 13,000xg으로 10 분동안 회전시키고, 관통액을 Eppendorf 튜브로 옮기고 SpeedVac(Heto Maxi dry)에서 건조시켰다. 건조된 샘플을 20 ㎕의 1% 포름산에 용해시키고, 30 초동안 초음파 처리한 후, 16,100xg으로 10 분동안 원심분리하였다. 이후에, 각각의 샘플을 새로운 바이알로 옮기고, Dionex Ultimate 3000 UHPLC 시스템(Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하여 단백질분해 펩티드의 역상(C18) 나노 온라인 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석(LC-MS/MS) 분석을 수행하였다. 5 ㎕의 펩티드 용액을 추출 컬럼에 주입하고, 펩티드를 추출 컬럼으로부터 분석 컬럼 상으로 역세척 모드로 용리시켰다. 이동상은 아세토니트릴 및 질량 분석 등급의 물로 구성되고, 이들 모두는 0.1% 포름산을 함유하였다. 크로마토그래피 분리는 0.3 μL/분의 유속으로 60 분동안 물 중 3 내지 50%의 아세토니트릴의 이진 구배(binary gradient)를 사용하여 달성되었다. LC 시스템은 나노전자분무 이온 소스를 통해, Q 정합 하이브리드 쿼드러플 오비트랩 분석기 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific, USA)에 결합시켰다. 펩티드 샘플을 20에서 정규화된 충돌 에너지를 갖는 고 에너지 충돌 해리(HCD) 단편화 방법으로 분석하여, m/z 300 내지 2000의 질량 범위의 하나의 Orbitrap 서베이 스캔(survey scan)을 획득한 다음, 상기 Orbitrap에서 가장 강한 10 개 이온의 MS/MS를 획득하였다.
Xcalibur v2.0에서 데이터 분석을 수행하였다. 모든 N-글리코-펩타이드에 대한 MS/MS 스펙트럼은 옥소늄 이온 검색에 의해 추출하였다; 204.086(N-아세틸헥 소사민) 및 366.1388(N-아세틸헥소사민-헥소스). 20에서 정규화된 충돌 에너지를 갖는 HCD 단편화를 사용함으로써 글리칸 구조 및 IgG에 대한 펩티드 질량을 검출하였다. 표적 글리콜-펩티드(lgG1에 대한 EEQYNSTYR)에 대해 추출된 이온 크로마토그램을 10 ppm 정확도로 추출하였고, 상응하는 MS/MS 스펙트럼을 수동으로 확인하였다. 35에서 정규화된 충돌 에너지를 갖는 HCD 단편화를 사용하여 상기 펩티드 서열을 검출하고, 상기 펩티드 질량이 정확한 펩티드 서열에 해당하는 것을 확인하였다. 모든 추출된 글리콜-펩티드에 대한 곡선 아래 면적을 계산하고, 각 글리코 형태에 대한 백분율 비를 결정하였다.
결과:
Ab-REW의 경우, 2개의 N-글리칸 형태가 지배적이며, 총 N-글리칸 풀, 즉 4GlcNac-1Fuc-3Man 및 4GlcNac-1Fuc-3Man-1Gal의 > 90%에 해당하였다, 지배적인 N-글리칸 형태 모두는 코어 푸코스를 함유하였다. Ab-REW의 "비-푸코실화된" 버전(Ab-REW-2FF)을 생성하기 위해, 디코이 기질 2-데옥시-2-플루오로-1-푸코스(2FF)를 사용하였다. 이 항체의 MS 맵핑은 > 90%부터 13% 까지의 감소가 검출됨에 따라 상기 전략이 푸코스의 도입을 성공적으로 크게 감소시킨 것으로 밝혀냈다. 처리 후에 지배적인 N-글리칸 형태는 이들 구조가 푸코스가 결핍된 것을 제외하고는 2FF가 없는 상태에서 생성된 변이체와 동일하였다(도 10 참조).
Figure pct00008
<110> Tillotts Pharma AG <120> Antibody variants <130> PWO00309TIL <150> EP17191989.7 <151> 2017-09-19 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of Ab-wt, the parent antibody of the modified antibodies used in the examples (clone 16-22-H05) <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Phe Ser Gly 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Ala Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Tyr Ser Ser Ser 85 90 95 Ser Ser Asp Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 100 105 110 Leu Gly Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 115 120 125 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 130 135 140 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 145 150 155 160 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys 165 170 175 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 180 185 190 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 195 200 205 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 2 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of Ab-wt, the parent antibody of the modified antibodies used in the examples (clone 16-22-H05) <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Thr Tyr Ile Tyr Pro Gly Phe Ala Ile Thr Asn Phe Ala Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Val Tyr Ala Thr Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L1 of clone 16-22-H05 <400> 3 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Phe Ser Gly Leu Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L2 of clone 16-22-H05 <400> 4 Gly Ala Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L3 of clone 16-22-H05 <400> 5 Gln Ser Tyr Tyr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Asp Gly Ser Tyr Ala 1 5 10 15 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H1 of clone 16-22-H05 <400> 6 Gly Ile Asp Phe Asn Asn Tyr Gly Ile Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 of clone 16-22-H05 <400> 7 Tyr Ile Tyr Pro Gly Phe Ala Ile Thr Asn Phe Ala Asn Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H3 of clone 16-22-H05 <400> 8 Asp Pro Val Tyr Ala Thr Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 9 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of humanized IgG of clone 16-22-H05 <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Thr Tyr Ile Tyr Pro Gly Phe Ala Ile Thr Asn Phe Ala Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Val Tyr Ala Thr Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of humanized IgG of clone 16-22-H05 <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Phe Ser Gly 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Ala Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Tyr Tyr Ser Ser Ser 85 90 95 Ser Ser Asp Gly Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 100 105 110 Leu Gly <210> 11 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of Ab-REW (based on clone 16-22-H05) <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Thr Tyr Ile Tyr Pro Gly Phe Ala Ile Thr Asn Phe Ala Asn Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Val Tyr Ala Thr Ser Ser Gly Tyr Phe Asp Leu Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Arg Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 405 410 415 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 420 425 430 Glu His Glu Ala Leu His Trp His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445 Ser Pro Gly Lys 450 <210> 12 <211> 454 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of Ab-REW (based on clone 17-22-B03) <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Ala Cys Ile Asp Ser Arg Arg Glu Glu Ser Asp Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Asn Thr Val 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Gly Gly Asp Gly Val Asp Gly Ala Phe Asp 100 105 110 Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 130 135 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 195 200 205 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 210 215 220 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 245 250 255 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 275 280 285 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 290 295 300 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Arg Asp Trp 305 310 315 320 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 325 330 335 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 340 345 350 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 355 360 365 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 370 375 380 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 385 390 395 400 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 405 410 415 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 420 425 430 Ser Val Glu His Glu Ala Leu His Trp His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 435 440 445 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 13 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc region of Ab-REW (including hinge region) <400> 13 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 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Claims (18)

  1. TNFα-결합 도메인 및 FcRn-결합 부위를 포함하는 항체로서,
    pH 6에서 인간 FcRn에 대해 높은 친화도를 갖고, 상기 높은 친화도는 100 nM 미만의 해리 평형 상수(KD)를 특징으로 하고, 추가하여, pH 7.4에서 인간 FcRn에 대해 친화도를 갖지 않거나 또는 낮은 친화도를 갖고, 상기 낮은 친화도는 10 μM 초과의 KD를 특징으로 하고, 상기 항체의 아미노산 서열은 아미노산 434W를 포함하는 것인,
    TNFα-결합 도메인 및 FcRn-결합 부위를 포함하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체의 아미노산 서열이 아미노산 428E 및/또는 아미노산 311R을 추가로 포함하는 것인 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체의 아미노산 서열이 아미노산 311R, 428E 및 434W를 포함하는 것인 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, pH 6에서 인플릭시맵 보다 큰 인간 FcRn에 대한 친화성을 갖는 것인 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, pH 6에서 인간 FcRn에 대한 상기 높은 친화도가 10 nM 미만의 해리 상수 KD를 특징으로 하는 것인 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 100 pM 미만의 KD로 인간 TNFα에 결합하는 것인 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인플릭시맵보다 더 많은 양으로 정단 측(apical side)으로부터 기저측부 측(basolateral side)으로, 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송되는 것인 항체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 항체의 양이 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 인플릭시맵의 양의 2 배보다 많은 것인 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인플릭시맵의 백분율보다 더 많은 항체의 백분율이, 10 배 초과의 경쟁 면역글로불린의 존재 하에서 정단 측으로부터 기저측부 측으로, 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송되고, 상기 백분율은 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 면역글로불린의 전체 질량을 지칭하는 것인 항체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 항체의 백분율이 상기 분극된 세포 단일층을 가로질러 수송된 인플릭시맵의 백분율의 3 배보다 큰 것인 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 비-푸코실화된 항체(non-fucosylated antibody) 또는, 감소된 푸코실화를 갖는 항체인 것인 항체.
  12. 염증 증상(condition)의 치료에서의 용도를 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 염증 증상이 위장관의 염증 장애인 것인, 용도를 위한 항체.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 치료가 상기 항체의 유효량을 경구 투여하는 단계를 포함하는 것인, 용도를 위한 항체.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 항체가 국소 적용되는 것인, 용도를 위한 항체.
  16. 약학 조성물로서,
    제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 약학 조성물.
  17. TNFα에 대한 항체의 트랜스사이토시스(transcytosis)를 개선하는 방법으로서,
    상기 항체의 아미노산 서열에 치환체 Q311R, M428E 및 N434W를 도입하는 단계를 포함하는 것인, TNFα에 대한 항체의 트랜스사이토시스를 개선하는 방법.
  18. TNFα에 대한 항체의 혈장 반감기를 연장시키는 방법으로서,
    상기 항체의 아미노산 서열에 치환체 Q311R, M428E 및 N434W를 도입하는 단계를 포함하는 것인, TNFα에 대한 항체의 혈장 반감기를 연장시키는 방법.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201900616UA (en) 2016-08-02 2019-02-27 Visterra Inc Engineered polypeptides and uses thereof
WO2020114616A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 Tillotts Pharma Ag Topical treatment of immune checkpoint inhibitor induced diarrhoea, colitis or enterocolitis using antibodies and fragments thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT2348051T (lt) * 2003-11-05 2019-02-25 Roche Glycart Ag Cd20 antikūnai su padidintu fc receptoriaus prisijungimo giminingumu ir efektorine funkcija
WO2006071091A1 (en) * 2004-12-29 2006-07-06 Yuhan Corporation Humanized antibody specific for tumor necrosis factor-alpha
US20080181888A1 (en) 2004-12-31 2008-07-31 Ambrose Christine M Polypeptides That Bind Br3 and Uses Thereof
HUE024903T2 (en) * 2007-12-26 2016-02-29 Xencor Inc FC variants with modified binding to FCRN
SI2307457T2 (sl) * 2008-06-25 2022-10-28 Novartis Ag Stabilna in topna protitelesa, ki inhibirajo TNF
ES2858482T3 (es) 2014-03-26 2021-09-30 Cell Medica Switzerland Ag Miembros de unión al TNF alfa
CA2945882A1 (en) * 2014-04-16 2015-10-22 Ucb Biopharma Sprl Multimeric fc proteins
CR20180365A (es) * 2015-12-16 2018-09-28 Amgen Inc PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO BISPECÍFICO DE ANTI-TL1A/ANTI-TNF-a Y SUS USOS
CN116789830A (zh) 2016-03-14 2023-09-22 奥斯陆大学 具有改变的FcRn结合的工程化免疫球蛋白
LT3219726T (lt) * 2016-03-17 2021-01-25 Tillotts Pharma Ag Anti-tnf alfa antikūnai ir jų funkciniai fragmentai

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