KR20200039370A

KR20200039370A - 피부면역 질환의 치료, 예방 또는 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20200039370A
Application number: KR1020180119213A
Authority: KR
Inventors: 최선은; 박광현; 문명재
Original assignee: 남부대학교산학협력단
Priority date: 2018-10-05
Filing date: 2018-10-05
Publication date: 2020-04-16
Also published as: KR102155704B1

Abstract

본 발명은 느릅나무 초임계 추출박 유래의 유효 성분을 포함하고, 피부면역 질환을 치료, 예방 또는 개선할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

Description

피부면역 질환의 치료, 예방 또는 개선용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING, TREATING OR IMPROVING SKIN IMMUNITY DISEASE}

본 발명은 느릅나무 초임계 추출박(residue) 유래의 유효 성분을 포함하는 피부면역 질환의 치료, 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

인간의 생명유지를 위해서 산소가 반드시 필요하지만 에너지 생산 과정 중 활성산소종과 자유라디칼이 생성되어 산화적 스트레스를 주어 노화를 비롯하여 면역질환, 성인병, 난치성피부면역질환, 심혈관질환, 암 등과 같은 여러 질환을 불러일으키는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1 및2).

현대인의 건강하지 못한 불규칙한 생활 및 식습관을 포함하여 일상생활 및 직장생활의 스트레스 환경에서 활성 산소종의 위협에 노출이 많아짐에 따라서 현대인들은 산화적 스트레스를 줄일 수 있는 생리활성 소재 즉, 항산화제의 필요성에 대해서 긍정적으로 평가하는 전문가들의 의견이 많은 현실이다(비특허문헌 3).

이러한 이유로 항산화제 도입에 있어서 우선 고려했던 점은 우수한 항산화 활성과 경제성이라고 할 수 있다. 그에 따라서 인공합성항산화제가 많이 이용되었으나, 최근 들어서는 인체의 안전성과 가습기 살균제 합성 화합물의 인체 유해성 논란 등의 사회적 이슈로 인해서 국내는 물론이고 전 세계적으로 부작용이 없으면서 효능이 보장되는 즉, 천연물 유래 항산화제 개발 연구가 꾸준히 이뤄지고 있다(비특허문헌 4 및 5).

또한, 산화적 스트레스는 알러지 질환과도 연관성이 있는데, 알러지 관련 질환의 대표적인 질환들로는 알러지성 아토피피부염, 알러지성 결막염, 알러지성 비염 및 천식 등 이 있는데 이들 알러지성 질환들과 체내 비만세포가 유발하는 것으로 잘 알려져 있다. 비만세포는 탈과립화를 통해서 히스타민, β-hexosaminidase, 대사산물, 염증성 사이토카인, immunoglobulin E (IgE) 등의 방출과 연관성이 매우 높다. 알러지성 치료는 원인제거는 현실적으로 어렵고, 증상을 완화하는 방향으로 연구가 진행되고 있고, 기존 약물들이 내성 및 부작용의 보고들로 인해서 수많은 연구자들은 천연물로 부터 부작용 및 내성이 없는 항히스타민제 등의 알러지 및 피부면역질환 치료제 또는 개선제를 개발하고자 많은 연구자들이 노력하고 있다(비특허문헌 6 내지 10).

한편, 항산화 활성과 항알러지 효능이 우수한 천연소재를 활용할 때는 생물제조 최적의 공정에 대한 검토와 고민이 필요하다. 비용, 공간, 시설 및 인프라 등을 고려함과 동시에 동일한 양의 천연 원물에서 다량의 유효물질을 생산할 수 있도록 최적의 추출공정이 개발되어야 한다. 그에 따라서 천연물 유래 추출물을 생산할 때 학계, 산업계 등에서 가장 많이 활용되는 추출방법은 열수추출, 에탄올추출, 초음파추출, 가압추출, 초임계추출 등 여러 가지 방법들이 시도 되고 있다.

다만, 각 추출방법마다 장점과 단점이 분명히 존재하기에 이는 연구자들이 실험실 수준과 향후 상업화 수준에서 면밀하게 장점과 단점을 다방면으로 고려해야 할 것이다.

J. Zhao, M. Lahiri-Chatterjee, Y. Sharma, & R. Agarwal. (2000). Inhibitory effect of a flavonoid antioxidant silymarin on benzoyl peroxide-induced tumor promotion, oxidative stress and inflammatory responses in SENCAR mouse skin. Carcinogenesis, 21, 811-816. M. Valko, D. Leibfritz, J. Moncol, M. T. Cronin, M. Mazur, & J. Telser. (2007). Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 39, 44-84. M. J. Kim, W. M. Chu, & E. J. Park. (2012). Antioxidant and antigenotoxic effects of shiitake mushrooms affected by different drying methods. Journal of The Korean Society of Food Science and Nutrition, 41, 1041-1048. J. W. Kim, J. K. Kim, I. S. Song, E. S. Kwon, & K. S. Youn. (2013). Comparison of antioxidant and physiological properties of Jerusalem artichoke leaves with different extraction processes. Journal of The Korean Society of Food Science and Nutrition, 42, 68-75. Y. J. Cho, S. K. Lee, Y. H. Ahn, & J. H. Pyee. (2003). Development of ultrasonication-assisted extraction process for manufacturing extracts with high content of pinosylvin from pine leaves. Journal of the Korean Society for Agricultural Machinery, 28, 325-334. A. J. Nauta, F. Engels, L. M. Knippels, J. Garssen, F. P. Nijkamp, & F. A. Redegeld. (2008). Mechanisms of allergy and asthma. European Journal of Pharmacology, 585, 354-360. S. J. Galli. (1993). New concepts about the mast cell. The New England Journal of Medicine, 328, 257-265. T. Mainardi, S. Kapoor, & L. Bielory. (2009). Complemenatry and alternative medicine: herbs, phytochemicals and vitamins and their immunologic effects. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 123, 283-294. J. M. Kim, D.J. Kim, T. H. Kim, J. M. Baek, H. S. Kim, & M. Cho. (2010). Effects of water extract of glycyrrhiza uralensis on β-hexosaminidase release and expression of the cytokines of RBL-2H3 mast cells. Korean Journal of Medicinal Crop Science, 18, 231-237. M. Fu, S. Fu, S. Ni, L. Zou, Y. Liu, & T. Hong. (2017). Anti-inflammatory effect of epigallocatechin gallate in a mouse model of ovalbumin-induced allergic rhinitis. International Immunopharmacology, 49, 102-108. M. McHugh, V. Krukonis & H. Brenner. (1994). Supercritical fluid extraction: Principles and practice, 2nd ed, United States of America : Butterworth- Heinemann, 1-16. G. G. Hoyer. (1985). Extraction with supercritical fluids: why, how and so what, Chemtech, 15, 440-448. E. Stahl, K. W. Quirin & D. Gerard. (1988). Dense gases for extraction and refining. Springer Verlag, Berlin, Germany, 173. Y. H. Choi, E. J. Park, Y. L. Kim, Y. W. Chin, J. W. Kim, S. H. Jeon, S. N. Joung & K. P. Yoo. (1999). Selective extraction of cytotoxic substances from medicinal plants using supercritical carbon dioxide. Korean Journal of Phamacognosy, 30, 59-64. J. H. Seo, Y. J. Lee, Y. I. Jo, J. Y. Ko, M. J. Mun, K. H. Park & S. E. Choi. (2018) Anti-fungal, anti-oxidant, and anti-inflammatory effects of supercritical fluid extracts from Ulmus davidiana. Journal of the Korea Convergence Society, 9, 225-233. T. Hatano, R. Edamatsu, M. Hiramatsu, A. Mori, Y. Fujita, T. Yasuhara, T. Yoshida & T. Okuda. (1989). Effects of the interaction of tannins with co-existing substances. Ⅵ. Effects of tannins and ralated polyphenols on superoxide anion radical, and on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 37, 2016-2021. R. Re, N. Pellegrini, A. Proteggente, A. Pannala, M. Yang, & C. Rice-Evans. (1999). Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology & Medicine, 26, 1231-1237. T. Mosmann. (1983). Rapid colorimetric assay for the cellular growth and survival. Journal of Immunological Methods, 65, 55-63. M. Matsubara, S. Masaki, K. Ohmori, A. Karasawa, & K. Hasegawa. (2004). Differential regulation of IL-4 expression and degranulation by anti-allergic olopatadine in rat basophilic leukemia (RBL-2H3) cells. Biochemical Pharmacology, 67, 1315-1326. O. Folin & W. Denis. (1912). On phosphotungstic- phosphomolybdic compounds as color reagent, Journal of Biological Chemistry, 12, 239-243. R. G. D. Steel, & J. H. Torrie. (1980). Principle and procedures of statistics. 1st ed. Kogakusha, Tokyo, Japan : McGraw-Hill 187- 221.

여러 가지 추출방법 중 특히 초임계추출 기술은 환경친화적인 측면과 유기용매의 인체 안전성, 환경오염 등의 문제를 해결하기 위한 방법으로 알려져 있다(비특허문헌 11 내지 14).

그에 따라서 최근 본 연구팀도 느릅나무를 초임계 추출 기술을 활용하여 느릅나무 초임계 추출물을 대상으로 다양한 생리활성 연구를 수행한 바 있다(비특허문헌 15).

이번 연구에서는 초임계 추출 후에 남은 자원 즉, 초임계 추출박의 자원 재활용의 가치를 검증하기 위해서 느릅나무 초임계 추출박을 60%주정으로 추출하여 항산화 및 항알러지 활성 연구를 수행하였다.

또한, 느릅나무 초임계 추출물의 부가가치를 높이기 위해서 폴리페놀 증대 생산방법의 일환으로 에틸아세테이트 용매 분획을 추가로 실시하여 생리활성을 검증 및 비교 연구를 통해서 느릅나무 초임계 추출박 추출물의 천연물 유래 신소재로서의 가능성을 확인하기 위해 본 연구를 수행하였다.

본 발명의 연구자들은 선행 연구들에서 느릅나무 초임계 추출박을 활용하여 생리활성 연구를 수행한 바 없음을 확인하였으며, 느릅나무 초임계 추출박의 60% 주정추출물(USCFR) 및 주정추출물의 에틸아세테이트 용매 분획물(USCFREA)의 항산화 및 항알러지 활성에 기반하여, 피부면역 질환의 치료, 예방 또는 개선용 조성물에 관한 연구를 실시하였다.

본 발명의 일 구현 예는, 느릅나무 초임계 추출박의 주정추출물(USCFR) 또는 에틸아세테이트 용매 분획물(USCFREA)을 유효 성분으로 포함하는, 피부면역 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 약학 조성물은 강력한 항산화 활성과 항알러지 효능에 기반하여, 산화적 스트레스 관련 질환 및 알러지성 질환 중 피부면역 질환, 예컨대, 만성 염증성 피부면역 질환을 치료 또는 예방할 수 있다.

한편, 본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 피부면역 질환의 증상을 차단하거나, 그 증상의 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서, "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 피부면역 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명의 느릅나무는 가지, 잎, 열매, 수피, 뿌리 등의 부위를 사용할 수 있으며 바람직하게는 느릅나무 가지를 사용할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.

본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예는, 느릅나무 초임계 추출박의 주정추출물(USCFR) 또는 에틸아세테이트 용매 분획물(USCFREA)을 유효 성분으로 포함하는, 피부면역 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 화장료 조성물은 강력한 항산화 활성과 항알러지 효능에 기반하여, 산화적 스트레스 관련 질환 및 알러지성 질환 중 피부면역 질환, 예컨대, 만성 염증성 피부면역 질환을 예방 또는 개선할 수 있다.

한편, 본 발명에서, "개선"은 본 발명의 화장료 조성물을 이용하여 피부면역 질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명에서 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제{화장용}, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜 워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다.

이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 물, 식염수, DMSO 또는 이들의 조합을 사용할 수 있고, 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다.

오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.

지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면 활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다.

그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.

본 발명의 또 다른 구현 예는, 느릅나무 초임계 추출박의 주정추출물(USCFR) 또는 에틸아세테이트 용매 분획물(USCFREA)을 유효 성분으로 포함하는, 피부면역 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 식품 조성물은 강력한 항산화 활성과 항알러지 효능에 기반하여, 산화적 스트레스 관련 질환 및 알러지성 질환 중 피부면역 질환, 예컨대, 만성 염증성 피부면역 질환을 예방 또는 개선할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식물추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있다.

여기서, 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.

그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물, 화장료 조성물 및 식품 조성물은 강력한 항산화 및 항알러지 활성을 갖는 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물(USCFR) 또는 에틸아세테이트 용매 분획물(USCFREA)을 함유하여, 피부면역 질환의 예방, 치료 또는 개선용으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 관한 이해를 돕기 위해 상세한 설명의 일부로 포함되는, 첨부 도면은 본 발명에 대한 실시예를 제공하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 기술적 특징을 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 및 에틸아세테이트 용매 분획물을 추출하는 과정을 간략히 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물의 DPPH 래디컬 소거능을 비타민 C와 비교한 결과를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물의 ABTS radical 소거능을 비타민 C와 비교한 결과를 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물의 항알러지 효능 검정 데이터를 도시한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물의 에틸아세테이트 용매 분획물의 항알러지 효능 검정 데이터를 도시한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물의 항알러지 효능 검정 데이터를 도시한 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물의 에틸아세테이트 용매 분획물의 항알러지 효능 검정 데이터를 도시한 도면이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험재료

본 연구에서 느릅나무 가지 추출은 초임계유체 추출 연구용 장비(ISA-SEFE-0500-0700-080, Ilsin Autoclave, Daejeon, Korea)를 사용하였다. 본 연구에서 사용된 느릅나무 가지는 서울약령시장에서 구입한 것으로, 이물질을 제거하고 세척한 후, 음건하여 실험재료로 사용하였다.

느릅나무 초임계 추출박 추출방법

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 및 에틸아세테이트 용매 분획물을 추출하는 과정을 간략히 도시한 도면이다.

도 1을 참조하면, 건조된 시료 96kg을 200mesh의 분쇄망을 통과하도록 분쇄하고, 분쇄된 느릅나무 가지를 추출조의 온도를 50℃ 로 조절하여 온도를 유지시킨다.

온도가 안정화되면 느릅나무 가지 시료를 넣고 CO2 가스를 등압으로 유지시킨 후, 고압펌프를 이용하여 line을 통해 실험압력 조건인 400bar에 도달할 때까지 Control valve를 조절하여 주입하였다.

설정 압력에 도달하면, 추출조 하부로 에탄올 (HPLC grade)을 분당 3mL씩 60분 동안 총 180mL를 투입하여 추출을 진행하였으며, 시료에 남아있는 잔존 에탄올을 제거하기 위해 설정된 압력과 온도로 30분 동안 고압펌프를 이용하여 CO2를 흘려보내며 추출을 완료 하였다.

이상과 같이 느릅나무 가지를 초임계 추출을 하고 난 후의 느릅나무 초임계 추출박 시료 96kg을 음건하여 60% 주정으로 실온에서 1회 추출하여 여과하였다. 그 추출액을 감압농축 및 동결건조를 실시해 최종 4.62kg의 느릅나무 초임계 추출박 60% 주정추출물(USCFR)을 확보하였다.

확보된 느릅나무 초임계 추출박 60% 주정추출물(USCFR)을 1kg 정량하여 분별깔때기를 이용하여 에틸아세테이트 용매분획을 실시하여 에틸아세테이트 용매 분획물(USCFREA) 183.4g을 확보하였다.

DPPH 라디칼 소거능 활성

비특허문헌 16에 개시된 방법을 참조하여 DPPH 프리 라디칼 소거능 활성을 측정하였다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물의 DPPH 래디컬 소거능을 비타민 C와 비교한 결과를 도시한 도면이다.

도 2를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 60% 주정추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물 2.5-100ppm 까지 측정한 결과, 모든 실험 농도에서 농도 의존적으로 통계적으로 유의적인 DPPH 라디칼 소거능이 관찰되었다.

표 1은 양성대조군인 비타민 C와 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물 및 에틸아세테이트 용매 분획물의 DPPH 라디칼 소거능을 비교한 결과이다.

Groups	Vitamin C	USCFR	USCFREA
IC₅₀(ppm)	7.42±0.09	22.94±0.19	17.80±0.14

표 1을 참조하여 IC50 값을 비교해 보면, 양성대조군인 비타민 C는 7.42±0.09ppm, 느릅나무 초임계 추출박 60% 주정추출물은 22.94±0.19ppm, 느릅나무 초임계 추출박 60% 주정추출물의 에틸아세테이트 용매 분획물은 17.80±0.14ppm으로 확인되었다. 이러한 수치는 기존 천연물 유래 초임계 추출물에서는 확인되기 어려운 강력한 항산화 활성으로서, 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물은 비타민 C를 대체 또는 병용할 수 있는 강력한 천연 항산화제로서의 자원적 가치가 충분히 있음을 확인하였다.

ABTS 라디칼 소거능 활성

비특허문헌 17에 개시된 방법을 참조하여, ABTS 라디칼 소거능 활성을 측정하였다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물의 ABTS radical 소거능을 비타민 C와 비교한 결과를 도시한 도면이다.

도 3을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 가지 초임계 추출박 60% 주정추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물을 각각 2.5-100ppm 까지 측정한 결과 모든 실험 농도에서 농도 의존적으로 유의적인 ABTS 라디컬 소거능이 관찰되었다. 특히, 실험 최고 농도인 100ppm 에서는 양성 대조군인 비타민 C 항산화 활성과 동등한 것을 확인하였다.

표 2는 양성대조군인 비타민 C와 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물 및 에틸아세테이트 용매 분획물의 ABTS 라디칼 소거능을 비교한 결과이다.

Groups	Vitamin C	USCFR	USCFREA
IC₅₀(ppm)	7.50±0.05	6.43±0.10	5.34±0.06

표 2를 참조하여 IC50 값을 비교해 보면, 양성대조군인 비타민 C는 7.50±0.05ppm, 느릅나무 가지 초임계 추출박 60% 주정추출물은 6.43±0.10ppm, 느릅나무 초임계 추출박 60% 주정추출물의 에틸아세테이트 용매 분획물은 5.34±0.06ppm으로 확인이 되어 양성대조군인 비타민 C에 비해서 매우 강력한 항산화 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물은 항산화 활성에 기반하여, 산화적 스트레스로 인해 유발하는 면역질환, 노화질환, 만성 염증성 알러지성 질환군을 포함한 난치성 피부면역 질환의 예방 또는 치료에 도움을 줄 수 있는 신규 천연항산화제로 개발이 가능한 것을 확인하였다.

RBL-2H3세포 배양

RBL-2H3세포는 American Type Culture Collection(ATCC, USA)로부터 구매하였으며, 15% Fetal bovine serum(FBS; Gibco, USA)과 100unit/ml의 penicillin-streptomycin(Gibco, USA)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium; Gibco, USA)에 2mM L-glutamine(Gibco,USA)를 첨가한 배지에서 배양하였다. 성장배지는 2-3일 마다 교환해 주었으며, 37℃, 5% CO2 조건을 유지하였다.

MTT assay 세포독성 평가

비특허문헌 18에 개시된 방법을 참조하여, 본 실험에서는 RBL-2H3 cells에 대한 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물의 항알러지 효능 검정을 위해서 RBL-2H3 세포를 대상으로 세포독성을 검정하기 위하여 MTT assay세포독성 평가를 수행하였다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물의 항알러지 효능 검정 데이터를 도시한 도면이고, 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물의 에틸아세테이트 용매 분획물의 항알러지 효능 검정 데이터를 도시한 도면이다.

도 4 및 5를 참조하면, MTT assay 세포독성 평가를 수행한 각각의 실험 농도에서 RBL-2H3 세포에 어떠한 독성도 없었음을 확인하였다.

β-hexosaminidase 탈과립 억제로 인한 항알러지 효능 평가

비특허문헌 19에 개시된 방법을 참조하여, 본 실험에서는 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물의 항알러지 효능을 평가하기 위해서 RBL-2H3 세포로부터 β-hexosaminidase 탈과립 억제로 인한 항알러지 효능 평가를 수행하였다.

구체적으로, Cell seeding은 RBL-2H3 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁 시킨 후 24 well plate에 2×105cells/mL의 세포수가 되도록 분주하였다. Cell sensitization은 세포 분주 후 500ng/mL 농도의 anti-DNP(dinitrophenol) IgE로 감작하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 12시간 배양하였다. Cell activation은 각 well의 세포들을 Siraganian buffer (119mM NaCl, 5mM KCl, 0.4mM MgCl2, 25mM PIPES, 40mM NaOH, pH7.2)로 2번 세척한 다음 각 well당 5.6mM glucose, 1mM CaCl2, 0.1% BSA가 포함된 Siraganian buffer에 추출물을 농도별로 첨가한 후 30분 동안 37℃, 5%, CO2 incubator에서 배양하고, dinitrophenol-conjugated human serum albumin (DNP-HSA)-specific IgE)의 농도가 100ng/mL이 되도록 처리하여 10분 동안 반응시킨 후, ICE bath에 10분 동안 방치하여 반응을 종결시켰다.

얻어진 상등액은 3분간 3000rpm에서 원심분리 시킨 후, 상등액 30μL를 96 well plate에 옮기고 동량의 substrate buffer (1mM 4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide, 0.1M citrate buffer pH 4.5)를 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 0.1M carbonate buffer 200μL를 첨가하여 반응을 종결시켰다. Microplate reader(TECAN, Salzburg, Austria)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물의 항알러지 효능 검정 데이터를 도시한 도면이고, 도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물의 에틸아세테이트 용매 분획물의 항알러지 효능 검정 데이터를 도시한 도면이다.

도 6을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 가지 초임계 추출박 60% 주정추출물은 세포 독성이 없는 농도 250, 500ug/mL 두 농도에서 normal control군과 negative control군 두 개 군과 비교 하였을 때, 통계적으로 유의성 있게 β-hexosaminidase 분비를 억제하는 것을 확인하였다. 특히, 실험최고 농도인 500ug/mL에서는 normal control군과 동등한 β-hexosaminidase 분비능이 확인되어, 강력한 β-hexosaminidase 분비 억제가 되었음을 확인하였다.

도 7을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 60% 주정추출물의 에틸아세테이트 용매 분획물은 세포 독성이 없는 농도 10, 20ug/mL 두 농도에서 normal control군과 negative control군 두 개 군과 비교 하였을 때, 통계적으로 유의성 있게 β-hexosaminidase 분비를 억제하는 것이 확인되었고, 실험최고 농도인 20ug/mL에서는 normal control군과 동등한 β-hexosaminidase 분비능이 확인되어, 강력한 β-hexosaminidase 분비 억제가 되었음을 확인하였다.

에틸아세테이트 용매 분획물의 실험결과에서 더욱 의미 있다고 할 수 있는 부분은 초임계 추출박 60% 주정추출물에 비해서 훨씬 적은 농도에서도 통계적으로 유의성 있는 β-hexosaminidase 분비 억제능이 확인된 점이다.

이상의 결과를 보아 느릅나무 가지 초임계 추출박 60% 주정추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물은 강력한 β-hexosaminidase 분비 억제능이 확인되어, 알러지성 피부면역 질환과 관련된 천연물 유래 신기능성 소재로 개발 가능하다는 점을 확인하였다.

총 페놀 함량

비특허문헌 20에 개시된 방법을 참조하여, 표준물질로 gallic acid와 ethyl gallate를 사용한 Folin-Denis법에 따라 총 페놀 함량을 산출하였다.

천연물 유래 다양한 기능성 소재 발굴에 있어서 중요한 역할을 하는 것은 poly-phenol 화합물로부터 기인하는 것으로 잘 알려져 있다. 그에 따라서 많은 연구자들이 천연물 유래 신소재 발굴에 있어서 다양한 생리활성과 더불어서 추가로 검정하는 실험이 바로 총 페놀 함량 분석이다.

총 페놀 함량을 분석함으로써 신규 천연 소재가 향후 기능성 소재로 활용될 가치에 대해서 평가 및 판단하는 중요한 요소로 받아들여지고 있다. 이는 poly-phenol 화합물이 프리래디컬 소거능을 기반으로한 항산화 활성을 기본으로 한 항염증, 항균, 면역치료 등 다양한 생리활성을 나타내기 때문이다.

표 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 가지 초임계 추출박 60% 주정추출물(USCFR)과 에틸아세테이트 용매 분획물(USCFREA)의 총 페놀 함량이고, 표 4는 기존 연구(비특허문헌 15)에서 확인된 느릅나무 가지 초임계 추출물의 총 페놀 함량이다.

Groups	Phenol
Groups	USCFR	USCFREA
TPCEG	134.17±0.13	154.77±1.05
TPCGA	132.02±0.24	153.18±1.10

Groups	Phenol
TPCEG	51.14±0.11
TPCGA	46.69±0.49

표 3 및 4에서, TPCEG는 ethyl gallate 기준 총 페놀 함량이고, TPCGA는 gallic acid 기준 총 페놀 함량이다.

표 3 및 4를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 가지 초임계 추출박 60% 주정추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물 각각의 ethyl gallate 기준 총 페놀 함량은 느릅나무 가지 초임계 추출물의 ethyl gallate 기준 총 페놀 함량의 약 2.62배, 약 3.03배임을 확인하였다.

그리고 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 가지 초임계 추출박 60% 주정추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물 각각의 gallic acid 기준 총 페놀 함량은 느릅나무 가지 초임계 추출물의 gallic acid 기준 총 페놀 함량의 약 2.83배, 약 3.28배임을 확인하였다.

이러한 실험 결과에 기반하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물과 에틸아세테이트 용매 분획물은 느릅나무 초임계 추출물에 비해 항산화 및 항알러지 효능의 근거가 되는 페놀 화합물을 다량 함유한다는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 느릅나무 초임계 추출박을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물, 화장료 조성물 및 식품 조성물은 강력한 항산화 및 항알러지 활성에 기반하여, 피부면역 질환의 치료, 예방 또는 개선용 조성물로 이용 가능한 점을 확인하였다.

통계 처리

본 연구의 실험 결과들은 3회 반복 측정하여 평균값±표준편차로 나타내었으며, 각 실험 농도 별 표준차이를 검증하기 위해 분산분석을 수행하였으며, 유의성이 발견된 경우 Tukey’s HSD test(비특허문헌 21)에 의해 농도 간의 유의성을 분석하였다. 모든 자료의 통계처리는 SPSS(Statistical Package for Science, version 24.0 SPSS Inc, Chicago, IL, USA)를 사용하여 처리하였고, 유의수준 α=0.05로 하였다.

Claims

느릅나무 초임계 추출박 유래의 유효 성분을 포함하는, 피부면역 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 느릅나무 초임계 추출박 유래의 유효 성분은,
상기 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물 또는 상기 주정추출물의 에틸아세테이트 용매 분획물 중 적어도 하나 이상을 포함하는,
피부면역 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제2항에 있어서,
상기 느릅나무 초임계 추출박 주정추출물은,
상기 느릅나무 초임계 추출박을 60% 주정으로 추출한 추출물을 포함하는,
피부면역 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제2항에 있어서,
상기 에틸아세테이트 용매 분획물은,
상기 느릅나무 초임계 추출박을 60% 주정으로 추출한 추출물을 에틸아세테이트로 분획한 용매 분획물을 포함하는,
피부면역 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 느릅나무 초임계 추출박은,
초임계 추출공법을 이용하여 느릅나무로부터 추출된,
피부면역 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 느릅나무 초임계 추출박은,
느릅나무의 가지, 잎, 열매, 수피 및 뿌리 중 1종 이상으로부터 추출된 추출박을 포함하는,
피부면역 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
느릅나무 초임계 추출박 유래의 유효 성분을 포함하는, 피부면역 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
느릅나무 초임계 추출박 유래의 유효 성분을 포함하는, 피부면역 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.