KR20120041965A

KR20120041965A - 자외선에 의한 피부손상의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20120041965A
Application number: KR1020100103399A
Authority: KR
Inventors: 유익동; 류인자; 김영희
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2010-10-22
Filing date: 2010-10-22
Publication date: 2012-05-03
Also published as: KR101415170B1

Abstract

본 발명은 자외선에 의한 피부손상을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 시리아쿠신계 화합물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 자외선에 의한 피부 손상을 유발하는 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloproteinases: MMPs)의 발현을 효과적으로 억제하여 피부염증 치료 및 콜라겐의 생성을 유도하고, 피부노화를 유발하는 인간 호중성 엘라스타제(human neutrophil elastase: HNE)의 활성을 억제하므로, 자외선에 의한 피부손상을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

자외선에 의한 피부손상의 예방 및 치료용 조성물{Compositions for preventing or treating skin damage by ultraviolet rays}

본 발명은 시리아쿠신계 화합물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부손상의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

자외선에 의해 손상 받은 피부는 구조 및 기능에 여러 가지 변화를 일으킨다. 이러한 변화들 중에서 콜라겐, 엘라스틴 및 피부 결합 조직의 다른 성분의 낮은 수준으로 인해 피부가 얇아지는 것이 주요하다. 태양광선과 산소는 피부세포에 자유라디칼(free radical)과 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성시켜 DNA의 손상과 세포막 지질의 과산화를 유발한다. 또한, 콜라겐과 같은 세포외 매트릭스를 파괴하는데 관여하는 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloproteinase, MMPs) 효소의 발현에 영향을 주어, 결합조직을 손상시키며, 피부 염증을 유발시켜 조직을 파괴하고 노화를 가속화시킨다.

피부 노화는 피부 기능 및 외모에 영향을 주는 복잡한 생물학적 과정이다. 피부와 연결되는 조직(tissue)은 여러 타입의 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 파이브로넥틴(fibronectin), 프로테오글리칸(proteoglycan) 및 다른 세포외 매트릭스(extracellular matrix: ECM) 단백질을 포함하는데, 그 중에서 타입-1 콜라겐이 가장 풍부하다(Kligman, 1969; Bernstein et al., 1994; Rittie and Fisher, 2002).

자외선 조사에 따른 인간 피부의 노화는 햇빛에 노출되는 정도의 누적 과정인데(Imokawa, 208; Imokawa 2009), 이로 인한 세포외 매트릭스 단백질 내의 양적 및 질적 변화는 광 손상(photo-damage)과 관련되고, 결국 피부 노화로 나타나게 된다(Imokawa, 2009). 엘라스틴은 세포외 매트릭스의 구조적으로 중요한 단백질로서, 피부, 폐, 인대 및 동맥혈관 벽을 포함하는 여러 조직에 탄력 및 탄성을 제공해주는 탄력섬유(elastic fiber)의 주요 성분으로(Wiedow et al., 1990; Tsukahara et al., 2006), 피부에서 엘라스틴의 감소는 주름 형성의 원인이 된다(Tsuji et al., 2001).

인간 호중성 엘라스타제(human neutrophil elastase: HNE)는 다형핵 백혈구의 아주르 과립(azurophil granules)에 주로 존재하는 세린 단백질 분해 효소(serine protease)로써, 엘라스틴, 콜라겐, 파리브로넥틴, 라미닌(laminin), 프로테오글리칸(Wiedow et al., 1990; Tsuji et al., 2001; Tsukahara et al., 2006) 및 연골 조직과 같은 여러 연결 조직(Antonicelli et al., 2007)과 같은 세포외 매트릭스 단백질을 분해하는 효소이다.

생물학적으로, 엘라스틴 분해효소(elastase)의 활성은 피부노화를 증가시키고 피부탄력의 감소를 유발하는 것으로 알려져 있고(Labat-Robert et al., 2000; Tsukahara et al., 2001; Tzaphlidou, 2004), 엘라스틴 분해효소의 활성 저해는 곧 피부노화를 억제할 수 있다(Kim et al., 2009; Xu et al., 2010).

매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloproteinase: MMPs)는 자외선-B(290?320 nm)의 조사에 의해 발현되는 효소로 다양한 세포외 매트릭스 단백질의 구성성분을 분해시킨다. MMPs는 콜라게나아제(collagenase), 젤라티나아제(gelatinases), 스트롬라이신(stromelysins), 막-타입 MMPs(membrane-type MMPs) 등의 하위 그룹으로 분류되며, 자극받지 않은 피부 세포 및 건강한 조직에서는 거의 발현되지 않으나, 자외선 또는 적외선 조사, 성장 인자, 사이토카인(cytokines) 및 암 촉진 인자와 같은 다양한 세포외 자극에 의해서 발현이 유도된다(Rittie and Fisher, 2002).

젤라티나아제(즉, MMP-2 및 MMP-9) 활성은 자외선-B 조사에 의하여 증가하는데, 상기 젤라티나아제의 활성을 억제하면 피부 표피 두께의 증가 및 주름 형성을 억제할 수 있다(Inomata et al., 2003; Suganuma et al., 2010).

MMP-1은 콜라겐 1을 분해하는 주요 효소로서(Dong et al., 2008), 햇빛 노출에 의해 유도되고 손상된 표피의 케라티노사이트(keratinocyte)(Fagot et al., 2004) 및 섬유아세포(fibroblasts)(Fagot et al., 2002; Dong et al., 2008)에서 방출된다.

그러나, 시리아쿠신계 화합물의 자외선 조사에 의해 손상된 피부에 대한 효과는 알려져 있지 않다.

이에, 본 발명자들은 자외선에 의한 피부손상을 치료하는 조성물을 개발하기 위하여 연구하던 중, 시리아쿠신계 화합물이 HNE 효소의 활성을 억제하고, 자외선에 의해 유도되는 MMP-1 및 MMP-2의 발현을 억제하여 인간피부섬유아세포(human dermal fibroblast cells: HDFCss)에서 프로-콜라겐(pro-collagen)의 발현을 증가시켜, 자외선에 의한 피부손상을 치료하는 조성물로 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 자외선에 의한 피부손상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 자외선에 의한 피부손상을 예방 또는 개선하기 위한 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 자외선에 의한 피부손상을 예방 또는 개선하기 위한 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 시리아쿠신계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,

R₁은 CH₃이거나 이웃 C=O 치환기와 결합하여 5환 고리를 형성할 수 있고,

R₂는 H 또는 CH₃이고,

R₃는 H 또는 OH이다).

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 시리아쿠신계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 개선하기 위한 화장료 조성물을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 시리아쿠신계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 개선하기 위한 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 시리아쿠신계 화합물은 자외선에 의한 피부 손상을 유발하는 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloproteinases: MMPs)의 발현을 효과적으로 억제하여 피부염증 예방 및 콜라겐의 생성을 유도하고, 피부노화를 유발하는 인간 호중성 엘라스타제(human neutrophil elastase: HNE)의 활성을 억제하므로, 자외선에 의한 피부손상을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 분획도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 시리아쿠신 A가 MMP-1을 억제하는 정도를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 시리아쿠신 A가 MMP-1을 억제하는 정도를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 시리아쿠신 B가 MMP-1을 억제하는 정도를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 시리아쿠신 B가 MMP-1을 억제하는 정도를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 시리아쿠신계 화합물이 MMP-2를 억제하는 정도와 프로-콜라겐 생성을 유도하는 정도를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 시리아쿠신계 화합물 처리에 따른 세포의 생존도를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 시리아쿠신계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

(상기 화학식 1에서,

R₂는 H 또는 CH₃이고,

R₃는 H 또는 OH이다.)

바람직하게는, 상기 시리아쿠신계 화합물은 하기 화학식 1a~1c의 화합물로 부터 선택될 수 있다.

[화학식 1a]

[화학식 1b]

[화학식 1c]

이때, 상기 화학식 1a의 화합물은 시리아쿠신 A,

상기 화학식 1b의 화합물은 시리아쿠신 B,

상기 화학식 1c의 화합물은 시리아쿠신 C로 불린다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 시리아쿠신계 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 시리아쿠신계 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다.

동량의 시리아쿠신계 화합물 및 산 수용액 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비 용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 시리아쿠신계 화합물은 무궁화 나무 추출물로부터 분리할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

일례로, 상기 시리아쿠신계 화합물은 도 1에 나타낸 바와 같이,

무궁화 근피를 메탄올로 추출하여 무궁화 나무 추출물을 얻는 단계(단계 1);

상기 단계 1에서 얻은 무궁화 나무 추출물을 물에 현탁시킨 후, 추출 용매로 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올을 순차적으로 사용하여 무궁화의 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올 분획물을 얻는 단계(단계 2);

상기 단계 2에서 얻은 무궁화의 클로로포름 분획물로부터 실리카겔 크로마토그래피를 수행하여 활성 분획물을 분리하는 단계(단계 3); 및

상기 단계 3에서 얻은 활성 분획물로부터 시리아쿠신계 화합물을 분리하는 단계(단계 4)를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

이하, 본 발명의 제조방법을 단계별로 살펴본다(도 1 참조).

본 발명에 따른 단계 1은 무궁화 나무 추출물을 얻는 단계로써, 구체적으로 하기의 단계들을 수행함으로써 제조될 수 있다.

a) 무궁화 나무에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

b) 상기 단계 a)의 추출물을 냉각시킨 후 여과하는 단계; 및

c) 상기 단계 b)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계.

상기 단계 1에 있어서, 단계 a)의 무궁화 나무는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 무궁화 나무는 식물 전체를 이용할 수 있고, 근피를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 상기 알코올로는 C₁ 내지 C₄ 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하고, 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 더욱 바람직하며, 메탄올을 이용하는 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 추출 방법으로는 여과법, 열수추출, 침지추출, 환류냉각추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있으며, 열수추출 방법으로 1회 내지 5회 추출하는 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 추출용매는 건조된 무궁화 나무가 줄기 중량에 1 내지 10배 첨가할 수 있으며, 1 내지 5배 첨가하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20 내지 30인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 24 내지 72시간인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 단계 1에 있어서, 단계 c)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명에 따른 단계 2는 상기 단계 1에서 얻은 무궁화 나무 추출물로부터 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 무궁화 나무의 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물을 얻는 단계이다.

본 발명에 따른 일실시 형태에 있어서, 상기 단계 1에서 제조된 무궁화 나무 알코올 추출물, 예를 들면 메탄올 추출물에 물과 n-헥산을 넣고, 분액깔때기(seperatory funnel)를 이용하여 물층과 유기층으로 분획하고, 유기층 분획물을 감압증류기를 이용하여 감압농축시켜 n-헥산 분획물을 수득할 수 있다.

그 후, 상기 물층에 클로로포름을 넣고, 분액깔때기를 이용하여 물층과 유기층으로 분획하고, 얻은 유기층 분획물을 감압증류기를 이용하여 감압농축시켜 클로로포름 분획물을 수득할 수 있고, 상기 물층에 다시 에틸아세테이트를 넣고, 분액깔때기를 이용하여 물층과 유기층으로 분획하고, 얻은 유기층 분획물을 감압증류기를 이용하여 감압농축시켜 에틸아세테이트 분획물을 수득할 수 있고, 상기 물층에 다시 부탄올을 넣고, 분액깔때기를 이용하여 물층과 유기층으로 분획하고, 얻은 유기층 분획물을 감압증류기를 이용하여 감압농축시켜 부탄올 분획물을 수득할 수 있다.

본 발명에 따른 단계 3은 상기 단계 2에서 얻은 무궁화 나무 클로로포름 분획물을 실리카 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 활성 분획물을 분리하는 단계이다.

본 발명에 따른 일실시 형태에 있어서, 상기 단계 2로부터 얻은 분획물들 중 클로로포름 분획물에 대하여 n-헥산:EtOAc(10:1 ~ 1:1)의 혼합용매를 용출용매로 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 10개의 분획물(A~J)로 분리하였으며, 이중, 분획물 A 및 B를 활성 분획물로서 다음 단계에 사용하였다.

본 발명에 따른 단계 4는 상기 단계 3에서 얻은 활성 분획물로부터 시리아쿠신계 화합물을 분리하는 단계이다.

구체적으로, 상기 시리아쿠신 A는 상기 단계 3에서 얻은 활성 분획물 A를 n-헥산:EtOAc(10:1 ~ 1:1)의 혼합용매를 용출용매로 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행한 다음, 클로로포름:메탄올(1:1)의 혼합용매를 용출용매로 사용한 세파덱스 LH-20 컬럼크로마토그래피를 수행하고, 70% 메탄올을 용출용매로 사용한 ODS 컬럼(21×250 mm)으로 prep. HPLC를 수행하여 얻을 수 있다.

또한, 상기 시리아쿠신 C는 상기 단계 3에서 얻은 활성 분획물 B를 클로로포름:메탄올(100:1 ~ 1:1)의 혼합용매를 용출용매로 사용한 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 수행한 다음, 100% 메탄올을 용출용매로 사용한 LH-20 컬럼크로마토그래피를 수행하여 얻을 수 있다. 이때, 본 시리아쿠신 C를 얻는 과정에서는 시리아쿠신 C와 활성 분획물 B2가 분리되는데, 상기 활성 분획물 B2는 시리아쿠신 B를 얻기 위해 사용하였다.

나아가, 시리아쿠신 B는 본 단계 4에서 분리한 활성 분획물 B2를 클로로포름:메탄올(10:1)의 혼합용매를 용출용매로 사용하여 Prep. 실리카겔 TLC를 수행하여 얻을 수 있다.

본 발명자들은 시리아쿠신계 화합물의 자외선에 의한 피부노화를 개선하는 효과를 알아보기 위하여, 엘라스틴, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 프로테오글라칸 등과 같은 세포외 매트릭스 단백질(ECM)을 분해하여 피부 노화를 촉진하는 인간 호중성 엘라스타제(Human neutrophil elastase: HNE) 효소의 활성억제능을 측정하였다. 그 결과, 시리아쿠신계 화합물은 HNE 활성을 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다(표 2 참조).

또한, 본 발명자들은 시리아쿠신계 화합물의 자외선에 의한 피부손상을 치료하는 효과를 알아보기 위하여, 다양한 세포외 구성성분(콜라겐, 젤라틴 등)을 분해시키는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMPs) 효소 활성 저해도를 확인하였다. 그 결과, 시리아쿠신계 화합물은 인간피부섬유아세포(human dermal fibrobrast cells: HDFCs)에서 자외선-B(290~320 nm) 조사에 의해 발현되는 MMP-1 및 MMP-2의 발현을 효과적으로 억제하고, 프로-콜라겐의 합성을 유도하는 것을 확인하였다(도 2, 3, 4, 5 및 6 참조).

나아가, 본 발명자들은 시리아쿠신계 화합물의 세포독성을 알아보기 위하여 테트라졸리움 변색 검사법을 사용하여 인간피부섬유아세포(HDFCs)의 생존도를 확인하였다. 그 결과, 시리아쿠신계 화합물을 처리한 인간피부섬유아세포(HDFCs)의 생존도는 90% 이상을 나타내어, 시리아쿠신계 화합물에 의한 세포의 생존도에 유의적인 변화가 없음을 확인하였다(표 3 및 도 7 참조).

따라서, 본 발명에 따른 시리아쿠신계 화합물은 자외선에 의한 피부손상의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 자외선에 의한 피부손상은 피부의 표피조직 또는 결합조직 손상으로 인하여 유발되는 피부염증, 홍반, 일광각화증, 일광화상 또는 피부노화 등을 포함한다.

본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 시리아쿠신계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 시리아쿠신계 화합물을 포함하는 약학적 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 조성물을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥 내 투여가 가장 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1일 0.0001 내지 0.03 g/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 8 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 기능성 화장품으로는 로션, 스킨, 겔, 크림, 패치 또는 분무제 등이 있으나 여기에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 상기 시리아쿠신계 화합물을 함유하는 기능성 화장품을 제조함에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 시리아쿠신계 화합물을 0.1~10.0 중량%로 첨가할 수 있다. 상기 화장료는 본 발명의 시리아쿠신계 화합물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장료에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 개선하기 위한 목적으로 식품, 음료 등의 건강보조 식품에 첨가할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 조성물을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 무궁화 나무 추출물의 제조

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 시리아쿠신계 화합물은 도 1에 나타낸 바와 같이, 하기의 단계들을 실시하여 제조하였다.

단계 1: 무궁화 나무 추출물의 제조

음건한 무궁화 나무 근피 1.6 kg을 세절하여 준비하고, 준비된 무궁화 나무 근피에 메탄올 20 ℓ를 첨가하여 상온에서 48시간 동안 추출하고, 여과하는 과정을 2회 반복하여 얻은 추출물을 감압증류기를 이용하여 농축시켜 무궁화 나무 메탄올 추출물을 850 g 수득하였다.

단계 2: 무궁화 나무의 분획물 제조

상기 단계 1에서 제조한 무궁화 나무 메탄올 추출물에 2 ℓ의 물과 2 ℓ의 n-헥산을 넣고, 분핵깔때기(seperatory funnel)를 이용하여 물층과 유기층으로 분획하고, 유기층 분획물을 감압증류기를 이용하여 감압농축시켜 n-헥산 분획물 210 g을 수득하였다.

또한, 상기 물층에 클로로포름(CHCl₃) 2 ℓ를 넣고, 분액 깔때기를 이용하여 물층과 유기층으로 분획하고, 얻은 유기층 분획물을 감압증류기를 이용하여 감압농축시켜 클로로포름 분획물 184 g을 수득하였다.

나아가, 상기 물층에 에틸아세테이트 2 ℓ를 넣고, 분액깔때기를 이용하여 물층과 유기층으로 분획하고, 얻은 유기층 분획물을 감압증류기를 이용하여 감압농축시켜 에틸아세테이트 분획물 115 g을 수득하였다.

또한, 상기 물층에 n-부탄올 2 ℓ를 넣고, 분액 깔때기를 이용하여 물층과 유기층으로 분획하고, 얻은 유기층 분획물을 감압증류기를 이용하여 감압농축시켜 n-부탄올 분획물 225 g을 수득하였다.

상기 분획물 중, 인간 호중성 엘라스타제(HNE:human neutrophil elastase) 억제 효과 분석실험 결과, 클로로포름 분획물에서 HNE 억제 효능이 가장 좋은 것으로 나타났다.

단계 3: 활성 분획물의 제조 1

상기 단계 2에서 얻은 분획물 중, HNE 억제 효능이 가장 우수한 클로로포름 분획물 184 g을 70-230 메시(mesh)의 실리카로 충진된 직경 7 ×57 ㎝의 컬럼에 로딩(loading)하고, n-헥산과 에틸아세테이트의 용출용매 비율이 10:1 ~ 1:1(v/v)까지 농도 구배한 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 수행하였다. 또한, 상기 컬럼크로마토그래피를 수행하며 TLC(thin layer chromatography) 분석과 HNE 억제 활성을 함께 관찰하면서 활성 분획물 A 및 B를 분리하여 얻고 다음 단계에서 사용하였다.

단계 4-1: 시리아쿠신 A의 제조

상기 단계 3에서 얻은 활성 분획물 A 312 ㎎을 상기 단계 3에서 수행한 실리카겔 컬럼크로마토그래피와 동일하게 한번 더 수행한 다음, 세파덱스(sephadex) LH-20 겔로 충전된 컬럼에 로딩하고 클로로포름 및 메탄올의 부피비가 1:1인 혼합용매를 용출용매로 이용하여 컬럼크로마토그래피를 수행하고, 마지막으로 센슈 팍 ODS(Senshu pak ODS, 제조사:YMC, RP-18, 일본) 겔로 충진된 직경 20×250 mm 컬럼에 로딩하고 70% 메탄올 수용액을 용출용매로 이용하여 8 ㎖/min 조건의 HPLC(Waters 515 pump, 2,996 photodiode array detector, USA)를 수행하여 정제된 시리아쿠신 A 35.5 ㎎을 수득하였다.

단계 4-2: 시리아쿠신 C의 제조

상기 단계 3에서 얻은 활성 분획물 B 286 ㎎을 비율이 100:1 ~ 1:1(v/v)까지 농도 구배로 한 클로로포름과 메탄올의 혼합용매를 용출용매로 사용한 것을 제외하고는 상기 단계 3의 실리카겔 컬럼크로마토그래피와 동일하게 수행한 다음, 세파덱스(sephadex) LH-20 겔로 충전된 컬럼에 로딩하고 100% 메탄올을 용출용매로 컬럼크로마토그래피를 수행하여 정제된 시리아쿠신 C 3 mg을 수득하였다. 이때, 본 단계에서는 시리아쿠신 C와 활성 분획물 B2가 분리되는데, 상기 활성 분획물 B2는 시리아쿠신 B를 얻기 위한 다음 단계에서 사용하였다.

단계 4-3: 시리아쿠신 B의 제조

상기 단계 4-2에서 얻은 활성 분획물 B2 22.5 ㎎을 클로로포름과 메탄올의 용출용매 비율이 10:1인 혼합용매를 사용하여 실리카겔 프렙 TLC(silica gel prep TLC)를 수행하여 정제된 시리아쿠신 B 3.5 ㎎을 수득하였다.

<분석> 시리아쿠신 A, B 및 C의 동정

상기 실시예 1에서 얻은 활성 분획물 A, B1 및 B2의 구조 분석을 위하여, NMR 분석 및 질량 분석을 실시하였다. 분자량 및 분자식은 JEOL사의 JMS-SX 102A를 이용하여 HREI-MS측정을 통하여 결정하였으며, 핵자기공명기(Varian UNITY 300)를 이용한 1D(¹H, ¹³C, DEPT) 및 2D(¹H-¹H COSY, ¹H-¹³C HMQC, ¹H-¹³C HMBC) NMR 스펙트럼(spectrum) 분석을 통하여 그 구조를 하기 표 1의 화학식 1A, 1B 및 1C로 동정하였다. 분석결과는 하기 표 1에 나타내었다.

구조	분광학적 분석	데이터
[화학식 1a]	HREI-MS	233.0808 [M + H]⁺
	¹H NMR	11.02(1-CHO), 13.82(2-OH), 6.93(H-3), 7.99(H-4), 7.51(H-5), 2.29(6-CH₃), 9.66(7-OH), 3.67(8-OCH₃)
	¹³C NMR	dc112.3(C-1), 199.2(1-CHO), 166.3(C-2), 116.4(C-3), 140.0(C-4), 124.3(C-4a), 127.7(C-5), 126.3(C-6), 16.3(6-CH₃), 151.2(C-7), 141.7(C-8), 59.5(8-OCH₃), 125.9(C-8a)
[화학식 1B]	HREI-MS	263.0915 [M + H]⁺
	¹H NMR	11.22(1-CHO), 14.05(2-OH), 7.08(H-3), 7.91(H-4), 7.58(H-5), 4.84(6-CH₃), 4.09(7-OCH₃), 3.92(8-OCH₃)
	¹³C NMR	112.6(C-1), 198.6(1-CHO), 166.5(C-2), 118.9(C-3), 138.9(C-4), 126.0(C-4a), 124.7(C-5), 132.2(C-6), 61.4(6-CH₂), 148.0(C-8), 59.7(8-OCH₃), 127.3(C-8a)
[화학식 1C]	HREI-MS	231.0638 [M + H]⁺
	¹H NMR	7.05(H-3), 7.86(H-4), 7.36(H-5), 2.37(6-CH₃), 4.31(7-OCH₃)
	¹³C NMR	119.2(C-1), 167.8(1-CHO), 158.5(C-2), 119.0(C-3), 134.8(C-4), 100.3(C-4a), 122.4(C-5), 129.9(C-6), 17.9(6-CH₃), 140.2(C-7), 59.9(7-OCH₃), 131.6(C-8), 131.7(C-8a)

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 분석결과 활성 분획물 A는 시리아쿠신 A이고, 활성 분획물 B1은 시리아쿠신 C이며, 활성 분획물 B2는 시리아쿠신 B임을 확인하였다.

< 실험예 1> 인간 호중성 엘라스타제( HNE )의 억제 효과 측정

인간 호중성 엘라스타제(Human neutrophil elastase: HNE)는 엘라스틴, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 프로테오글라칸 등과 같은 세포외 매트릭스 단백질(ECM)을 분해하는 피부 노화와 관련된 효소이다. 본 실험예 1에서는 실시예 1에서 제조한 시리아쿠신 A, B 및 C가 HNE를 억제하는 효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 수행하였다.

먼저, 96웰-배양 접시의 웰에 각각 40 ㎕ 기질용액[1.4 mM N-methoxysuccinyl-ala-ala-pro-val-p-nitroanilide in 10 mM Tris-HCl buffer(pH 7.5)], 10 ㎕ 효소액(0.18 units HNE) 및 실시예 1에서 제조한 시라아큐신 A, B, C 및 대조군으로 EGCG(epigallocatechin-3-gallate)를 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액에 용해시키고 Tris-HCl 전개용액으로 희석하여 1, 3, 10 및 30 μM 농도로 제조하여 50 ㎕씩 혼합하여 넣어주고 37 ℃, 차광 조건의 세포배양기에서 1시간 동안 배양한 다음, 0.2 ㎎/㎖ 농도의 대두 트립신 저해제를 100 ㎕ 첨가하여 반응을 종결하였다. 반응이 끝난 샘플들을 ELISA 리더기(모델명: VersaMax, 제조사: Molecular devices, 미국)를 사용하여 405 nm 파장 영역의 흡광도를 측정하고, 하기의 수학식으로 HNE 저해 활성도를 계산하였다.

Ab: 대조군의 흡광도

As: 샘플의 흡광도

상기 수학식으로 계산된 시리아쿠신 A, B 및 C의 HNE 저해 활성도를 하기 표 2에 나타내었다.

화합물의 농도에 따른 HNE 저해활성도(%)					IC₅₀(μM)
화합물	1 μM	3 μM	10 μM	30 μM	IC₅₀(μM)
시리아쿠신 A	19.7±1.6	25.7±1.7	51.9±1.1	76.6±0.7	8.0
시리아쿠신 B	15.3±1.8	30.1±2.1	86.3±0.6	93.3±1.2	5.2
시리아쿠신 C	16.5±2.2	22.9±1.0	74.4±1.2	89.6±1.0	6.1
대조군: EGCG	45.3±1.6	63.0±0.5	75.8±0.8	83.2±1.2	1.1

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조한 시리아쿠신 A, B 및 C는 엘라스틴의 분해를 억제하는 피부노화 억제 물질로 유효함을 확인하였다.

< 실험예 2> 매트릭스 메탈로프로테아제(MMPs)의 발현 억제 측정

매트릭스 메탈로프로테아제(MMPs)는 자외선 조사에 의해 발현되고, 다양한 세포외 구성성분(콜라겐, 젤라틴 등)을 분해시키는 효소군으로 MMP-1, MMP-2 등의 하위 그룹으로 분류되는 피부 노화와 관련된 효소이다. 본 실험예 2에서는 실시예 1에서 제조한 시리아쿠신 A 및 B가 인간피부섬유아세포(HDFCs: human dermal fibrobrast cells)에서 MMP의 발현을 억제하는 효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 수행하였다.

인간피부섬유아세포(HDFCs: human dermal fibrobrast cells, CRL-2076)는 American Type Culture Collection에서 구입하여 사용하였다. 상기 HDFCs는 100 U/ ㎖ 페니실린 A, 100 U/ ㎖ 스트렙토마이신과 함께 6-웰 배양 접시(제조사:BD Falcon)에 담아 세포배양기(DMEM, 제조사: Gibco)에서 5% CO₂, 37 ℃ 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 하루 동안 배양한 HDFCs를 PBS(phosphate-buffered saline)용액으로 2회 세척하고 UV-B(290?320 nm)를 10 mJ/cm² 세기로 조사하였다. UV 조사 후 바로 PBS 용액으로 다시 한번 세척하고 실시예 1에서 제조한 시리아쿠신 A 및 B를 0, 1, 2, 5, 10, 20 μM 농도로 첨가하여 세포배양기에서 5% CO₂, 37 ℃으로 48시간 동안 배양하여 샘플을 제조하였다.

상기에서 제조한 샘플은 용해 버퍼(lysis buffer)[0.5 v/v% Nonidet P-40 in 20 mM Tris-HCl(pH 8.3); 150 mM NaCl; protease inhibitors(2 ㎍/㎖ aprotinin, pepstatin, and chymostatin); 1 ㎍/㎖ leupeptin and pepstatin; 1mM phenylmethyl sulfonyl fluoride(PMSF); and 1mM Na₄VO₃]에 녹인 후 4 ℃에서 30분간 배양하여 총단배질을 얻었다. 다음으로, 상기에서 처리한 샘플을 4 ℃, 12,000 중력가속도(g)로 5분간 원심분리하여 상등액을 MMP 단백질 발현이 유도된 HDFCs 샘플로 사용하였다.

MMP -1의 발현양 및 프로-콜라겐의 합성량 측정

상기에서 제조한 HDFCs 샘플을 소듐 도데실 설페이트(SDS) 샘플 버퍼에 넣고 5분간 가열하여 단백질을 변성시켰다. 총단백질은 10% 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS_PAGE)으로 크기별로 분리하고, 니트로셀루로오즈 막(제조사: Amersham international)에 옮겼다. 다음으로, 상기 니트로셀루로오즈 막을 1:1000으로 희석된 모노크로날(monoclonal) 안티-MMP-1 항체(제조사: Calbiochem) 및 1:500으로 희석된 폴리클로날(polyclonal) 안티-프로-콜라겐 타입-1 항체(제조사: Santa Cruz Biotechnology Inc.)와 혼합한 다음, 일반적인 상호작용을 방지하기 위하여, 5% 탈지 우유를 함유하는 트리스-버퍼 살린(Tris-buffered saline)과 트윈 20(TBST)[10 mM Tris-HCl, pH 7.6; 150 mM NaCl; 0.5% Tween 20]과 함께 1시간 동안 배양하였다. 이때, 상기 항체는 2차 항체로서, 1:1000으로 희석된 HRP-복합 안티-쥐 IgG 항체 및 1:500으로 희석된 안티-염소 IgG 항체와 함께 배양한 것을 사용하였다. MMP-1 및 프로-콜라겐 단백질의 발현양은 ECL 시스템(제조사: Amersham international)을 수행하여 농도계측 프로그램(TINA)으로 정량화하였다.

MMP -2의 발현양 측정

상기에서 제조한 HDFCs 샘플 15 ㎕를 트리스-글리신 SDS 샘플 버퍼(2×)에 넣고 혼합한 다음, 25 ㎕를 10% SDS-PAGE에 로딩(loading)하고 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후 SDS 겔은 1× 자아모그램(zymogram) 재생 버퍼(제조사: Invitrogen, USA)와 함께 상온에서 30분 동안 배양하였다. 다음으로, 1× 자아모그램 전개 버퍼(제조사: Invitrogen, USA)를 첨가하여 30분 동안 전개시킨 후 새로운 1× 자아모그램 전개 버퍼로 교환해주었다. 상기와 같이 처리한 SDS 겔을 37 ℃에서 하루 동안 배양하고 0.05% 염색 시약(Commassie Brilliant Blue solution)으로 염색한 다음, 푸른 배경에서 단백질 띠(bands)가 선명하게 보일 때까지 10% 아세트산 및 40% 메탄올을 포함하는 염색 제거 시약으로 염색을 제거하였다.

상기 실험결과를 도 2, 3, 4, 5 및 6에 나타내었다.

도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 시리아쿠신 A가 MMP-1을 억제하는 정도를 나타내는 도면이다.

도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 시리아쿠신 A가 MMP-1을 억제하는 정도를 나타내는 그래프이다.

도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 시리아쿠신 B가 MMP-1을 억제하는 정도를 나타내는 도면이다.

도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 시리아쿠신 B가 MMP-1을 억제하는 정도를 나타내는 그래프이다.

도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 시리아쿠신계 화합물이 MMP-2를 억제하는 정도와 프로-콜라겐 생성을 유도하는 정도를 나타내는 도면이다.

도 2, 3, 4 및 5에 나타난 바와 같이, 시리아쿠신 A 및 B는 농도의존적으로 MMP-1의 발현을 저해하는 것으로 나타났다. 구체적으로, 10 μM의 시리아쿠신 A가 첨가된 HDFCs 샘플에서는 MMP-1이 약 50% 정도만 발현되었고, 20 μM이 첨가된 HDFCs 샘플에서는 MMP-1이 약 20% 정도만 발현되었다. 또한, 20 μM의 시리아쿠신 B가 첨가된 HDFCs 샘플에서는 MMP-1이 약 60% 정도 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 시리아쿠신계 화합물은 자외선 조사로 인해 발현되는 MMP-1의 발현을 효과적으로 저해함을 알 수 있다.

또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 자외선 조사는 타입-1 프로-콜라겐의 합성을 방해하고 MMP-2의 발현을 유도한다. 하지만, 시리아쿠신 A는 농도의존적으로 MMP-2의 발현을 저해하여 프로-콜라겐의 합성이 확연히 증가함을 알 수 있다. 특히, 20 μM의 시리아쿠신 A가 첨가된 HDFCs 샘플에서는 MMP-2의 발현이 확연히 줄었음을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 시리아쿠신계 화합물은 인간피부섬유아세포(HDFCss)에서 자외선 조사에 의해 발현되는 MMP-1 및 MMP-2의 발현을 효과적으로 억제하고, 프로-콜라겐의 합성을 유도하므로, 자외선에 의한 피부손상 억제용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

< 실험예 3> 세포독성 검사

실시예 1에서 제조한 시리아쿠신계 화합물의 세포독성을 검사하기 위해서 테트라졸리움 변색 검사법을 사용하여 인간피부섬유아세포(HDFCss)의 생존도를 확인하였다(Denizot and Lang, 1986).

먼저, 인간피부섬유아세포(HDFCs: human dermal fibrobrast cells, CRL-2076)는 American Type Culture Collection에서 구입하여 사용하였다. 상기 HDFCs는 100 U/㎖ 페니실린 A 및 100 U/㎖ 스트렙토마이신과 함께 6-웰 배양 접시(제조사:BD Falcon)에 담아 5% CO₂, 37 ℃ 조건의 세포배양기(DMEM, 제조사: Gibco)에서 24시간 동안 UV-B를 0, 10, 20 및 30 mJ/cm²의세기로 조사하며 배양한 후, 실시예 1의 시리아쿠신 A 및 B를 0, 3, 10 및 30 μM 농도로 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 다음으로, MTT 시약(tetrazolium dye, 2-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-di-phenyl-tetrazolium bromide)을 첨가하고 3시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상등액을 제거해주고 DMSO(dimethyl sulfoxide) 150 ㎕를 첨가하였다. MTT 시약을 세포에 처리하면 살아있는 세포는 발색을 하는데 이것을 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)로 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존도(%)를 측정하였다. 그 결과를 표 3 및 도 7에 나타내었다.

UV-B(10 mJ/cm²) 조사 후 추출물 처리에 따른 세포의 생존도
추출물	대조군(μM)	시리아쿠신 A(μM)			시리아쿠신 B(μM)
추출물	0	3	10	30	3	10	30
세포 생존도(%)	100	103	101	94	101	106	103

도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 시리아쿠신계 화합물 처리에 따른 세포의 생존도를 나타내는 그래프이다.

표 3 및 도 7에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조한 시리아쿠신계 화합물을 처리한 인간피부섬유아세포(HDFCs)의 생존도는 90% 이상으로 나타나, 시리아쿠신계 화합물에 의한 세포의 생존도에 유의적인 변화가 없음을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따른 시리아쿠신계 화합물은 자외선에 의한 피부손상을 치료하기 위한 조성물로 사용할 수 있다.

<제제예 1> 약학적 제제의 제조

1-1. 산제의 제조

화학식 1의 시리아쿠신계 화합물 500 ㎎

유당 100 ㎎

탈크 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1-2. 정제의 제조

화학식 1의 시리아쿠신계 화합물 500 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1-3. 캅셀제의 제조

화학식 1의 시리아쿠신계 화합물 500 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

1-4. 주사제의 제조

화학식 1의 시리아쿠신계 화합물 500 ㎎

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1-5. 액제의 제조

화학식 1의 시리아쿠신계 화합물 100 ㎎

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액체를 제조한다.

< 제제예 2> 화장품의 제조

2-1. 유연 화장수의 제조

시리아쿠신계 화합물을 유효성분으로 함유하는 유연 화장수의 제제예는 하기 표 4의 조성과 같이 제조하였다.

원료	함량(중량부)
화학식 1의 시리아쿠신계 화합물	10.00
1,3-부틸렌글리콜	1.00
디소듐이디티에이	0.05
알란토인	0.10
디포타슘글리시리제이트	0.05
시트릭애씨드	0.01
소듐시트레이트	0.02
글리세레스-26	1.00
알부틴	2.00
하이드로제네이티드캐스터오일	1.00
에탄올	30.00
보존제	미량
착색제	미량
착향제	미량
정제수	잔량

2-2. 영양 크림의 제조

시리아쿠신계 화합물을 함유한 영양크림의 제제예는 하기 표 5의 조성과 같이 제조하였다.

원료	함량(중량부)
화학식 1의 시리아쿠신계 화합물	10.0
1,3-부틸렌 글리콜	7.0
글리세린	1.0
D-판테놀	0.1
식물 추출물	3.2
마그네슘알루미늄실리케이트	0.3
PEG-40 스테아레이트	1.2
스테아릭애씨드	2.0
폴리소르베이트 60	1.5
친유형글리세릴스테아레이트	2.0
소르비탄세스퀴올리에이트	1.5
세테아릴알코올	3.0
미네랄오일	4.0
스쿠알란	3.8
카르릴릭/카프릭트리글리세라이드	2.8
식물성 오일	1.8
디메치콘	0.4
디포타슘글리시리제이트	미량
알란토인	미량
소듐 히아루로네이트	미량
토코페릴아세테이트	적량
트리에탄올아민	적량
보존제	적량
착향제	적량
정제수	잔량

<제제예 3> 건강식품의 제조

화학식 1의 시리아쿠신계 화합물 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량 ㎎

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 0.13 ㎎

비타민 B₂ 0.15 ㎎

비타민 B₆ 0.5 ㎎

비타민 B₁₂ 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎎

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<제제예 4> 건강 음료의 제조

화학식 1의 시리아쿠신계 화합물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

<제제예 5> 기타 건강식품의 제조

5-1. 음료의 제조

꿀 522 ㎎

치옥토산아미드 5 ㎎

니코틴산아미드 10 ㎎

염산리보플라빈나트륨 3 ㎎

염산피리독신 2 ㎎

이노시톨 30 ㎎

오르트산 50 ㎎

화학식 1의 시리아쿠신계 화합물 0.48~1.28 ㎎

물 200 ㎖

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

5-2. 츄잉껌의 제조

껌베이스 20 %

설탕 76.36~76.76 %

화학식 1의 시리아쿠신계 화합물 0.24~0.64 %

후르츠향 1 %

물 2 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.

5-3. 캔디의 제조

설탕 50~60 %

물엿 39.26~49.66 %

화학식 1의 시리아쿠신계 화합물 0.24~0.64 %

오렌지향 0.1 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 캔디를 제조하였다.

5-4. 밀가루 식품의 제조

화학식 1의 시리아쿠신계 화합물 0.5 내지 5 중량부를 밀가루 100 중량부에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

5-5. 유제품( dairy products )의 제조

화학식 1의 시리아쿠신계 화합물 5 내지 10 중량부를 우유 100 중량부에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

5-6. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화 시켜서 건조한 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메시의 분말로 제조하였다. 검은콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조한 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메시의 분말로 제조하였다. 상기에서 제조한 곡물류 및 종실류와 화학식 1의 시리아쿠신계 화합물을 다음과 같은 비율로 배합하여 제조하였다.

현미 30 %

율무 15 %

보리 20 %

들깨 7 %

검정콩 7 %

검은깨 7 %

화학식 1의 시리아쿠신계 화합물 3 %

영지 0.5 %

지황 0.5 %

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 시리아쿠신계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물:
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,
R₁은 CH₃이거나 이웃 C=O 치환기와 결합하여 5환 고리를 형성할 수 있고,
R₂는 H 또는 CH₃이고,
R₃는 H 또는 OH이다).
제1항에 있어서, 상기 시리아쿠신계 화합물은 하기 화학식 1a~1c로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물:
[화학식 1a]

[화학식 1b]

[화학식 1c]

.
제1항에 있어서, 상기 자외선에 의한 피부손상은 피부의 표피조직 또는 결합조직 손상으로 인하여 유발되는 피부염증, 홍반, 일광각화증, 일광화상 또는 피부노화인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 시리아쿠신계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 개선하기 위한 화장료 조성물:
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,
R₁ 내지 R₃은 제1항에서 정의한 바와 같다).
제4항에 있어서, 상기 시리아쿠신계 화합물은 하기 화학식 1a~1c로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물:
[화학식 1a]

[화학식 1b]

[화학식 1c]

.
제4항에 있어서, 상기 자외선에 의한 피부 손상은 피부의 표피조직 또는 결합조직 손상으로 인하여 유발되는 피부염증, 홍반, 일광각화증, 일광화상 또는 피부노화인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 시리아쿠신계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 자외선에 의한 피부 손상을 예방 또는 개선하기 위한 건강식품 조성물:
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,
R₁ 내지 R₃은 제1항에서 정의한 바와 같다).
제7항에 있어서, 상기 시리아쿠신계 화합물은 하기 화학식 1a~1c로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건강식품 조성물:
[화학식 1a]

[화학식 1b]

[화학식 1c]

.
제7항에 있어서, 상기 자외선에 의한 피부 손상은 피부의 표피조직 또는 결합조직 손상으로 인하여 유발되는 피부염증, 홍반, 일광각화증, 일광화상 또는 피부노화인 것을 특징으로 하는 건강식품 조성물.