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KR20190098052A - 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 궤양성 대장염의 개선 용도 - Google Patents

지방줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 궤양성 대장염의 개선 용도 Download PDF

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KR20190098052A
KR20190098052A KR1020190010222A KR20190010222A KR20190098052A KR 20190098052 A KR20190098052 A KR 20190098052A KR 1020190010222 A KR1020190010222 A KR 1020190010222A KR 20190010222 A KR20190010222 A KR 20190010222A KR 20190098052 A KR20190098052 A KR 20190098052A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
exosomes
ulcerative colitis
present
tff
derived
Prior art date
Application number
KR1020190010222A
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English (en)
Inventor
이용원
조병성
Original Assignee
주식회사 엑소코바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 엑소코바이오 filed Critical 주식회사 엑소코바이오
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Abstract

본 발명은 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 궤양성 대장염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 궤양성 대장염의 원인이 되는 염증성 사이토카인인 IL-6, TNF-α, IL-12 및 IL-23에 대해 작용하여 다양한 원인에 기인하는 궤양성 대장염에 대한 광범위한 적용이 가능하고 효과적으로 궤양성 대장염을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

지방줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 궤양성 대장염의 개선 용도 {A composition comprising an exosome derived from adipose-derived stem cell as an active ingredient and its application for improving Ulcerative Colitis}
본 발명은 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 궤양성 대장염의 개선 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 궤양성 대장염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 궤양성 대장염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 있어서 임상적 적용이 가능한 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 대량으로 수득할 수 있고, 이와 같이 수득된 기능적 활성이 우수한 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 저가로 대량으로 제공할 수 있는 임상 및 상업적으로 뛰어난 기술에 관한 것이다.
염증성 장질환은 대장 및/또는 소장의 점막에 만성 염증 및/또는 궤양을 일으키는 원인 불명의 질환이다. 대표적인 염증성 장질환으로는 궤양성 대장염(UC; Ulcerative Colitis)과 크론병이 있다. 두 질환 모두 복통, 설사 등 유사한 위장관 증상을 나타내고 스테로이드나 면역억제제 같은 치료에 반응한다는 공통점이 있다. 그러나, 유전적 배경 및 병태생리에 차이가 있고 침범부위, 합병증 등의 임상적 양상이 다르다.
궤양성 대장염은 대장의 점막 또는 점막하층에 국한된 염증을 특징으로 하고, 호전과 악화가 반복되는 혈성 설사, 대변 급박감 및 복통 등이 주증상이다. 궤양성 대장염은 항문직장 경계부위부터 병변이 시작되어 연속적, 대칭적으로 근위부로 진행하며, 염증 및 궤양 부위와 정상 부위의 경계가 명확한 경우가 대부분이다. 궤양성 대장염의 경우 대부분 직장을 침범하며, 점막의 부종, 발적, 궤양 등의 병변이 직장으로부터 연속되어 존재한다. 반면에 크론병은 입안에서 항문까지 위장관의 어느 곳에서도 국소적으로 침범할 수 있고, 점막에 염증이 국한되는 궤양성 대장염과는 달리 장의 전층에 염증이 침윤할 수 있다. 또한, 크론병은 궤양성 대장염과는 달리 점막 발적은 경미하고, 아프타성 궤양, 종주형 궤양 등이 비연속적, 비대칭적으로 분포한다.
궤양성 대장염과 크론병은 다양한 원인에 기인하는 만성적인 전신질환으로 수술 및 치료방법과 예후가 다르지만 면역반응 조절 이상과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다.
궤양성 대장염의 치료를 위해 수술이나 식사요법 외에 항염증제, 5-아미노살리실산 계통 약물(예를 들어, 설파살라진), 스테로이드, 면역억제제 등의 약물요법이 이용되고 있다. 그러나 항염증제, 설파살라진이나 스테로이드는 충분한 치료 효과를 얻을 수 없을 뿐만 아니라, 위장관 장애, 간질환, 신장병, 당뇨병, 두통, 발진, 백혈구 감소증과 같은 부작용이 있다. 최근에는 생물학적 제제로서, TNF-α 저해제 등의 면역억제제가 개발되어 사용되고 있으나, 이러한 면역억제제는 인체의 면역을 억제하기 때문에 약물을 장시간 사용할 경우에 인체의 면역기능의 저하로 인하여 암, 결핵 등을 포함하여 여러 가지 감염증 등을 일으킬 수 있다는 단점이 있다.
이러한 문제점을 감안하여 천연물을 이용한 궤양성 대장염 치료제에 대한 연구가 진행되고 있다. 이러한 천연물을 원료로 하는 궤양성 대장염 치료제의 경우, 천연 추출물 내의 유효성분 함량이 적은 관계로 궤양성 대장염 치료 효과를 얻기 위해서는 많은 양의 사용이 필요하고, 이들 중 대부분은 천연물 소재라는 점을 마케팅에 활용하고 있을 뿐 궤양성 대장염 치료의 실질적 효능에 대해서는 과학적 연구가 좀더 필요한 상황이다.
한편, 줄기세포를 이용한 조직 재생 및 치료 방법이 제안되고 있다. 배아줄기세포 또는 태아조직 유래 줄기세포는 분화능력 및 재생치료능력이 우수하고 거부반응이 적지만, 윤리적 문제로 임상에 적용될 수 없고 종양을 형성할 수 있는 위험성이 존재한다. 이에 대한 대안으로서 성체줄기세포를 이용한 조직 재생 및 치료 방법이 제안되었다. 그러나, 환자 자신의 성체줄기세포가 이닌 타인의 성체줄기세포를 사용한 경우 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)을 일으킬 위험이 있고, 자가 성체줄기세포를 이용하여 치료를 하기 위해서는 환자로부터 성체줄기세포를 채취한 후 이를 배양하는 과정이 필요하여 복잡하고 비용이 많이 드는 문제가 있다.
최근에는 전술한 바와 같은 줄기세포의 문제점을 감안하여 성체줄기세포를 배양하여 얻은 배양액을 이용하여 조직 재생 및 치료를 하고자 하는 시도가 있다. 그러나, 성체줄기세포 배양액에는 성체줄기세포가 분비하는 다양한 단백질, 사이토카인, 성장인자 등이 함유되어 있는 반면, 세포가 성장하면서 분비한 노폐물, 오염방지를 위해 첨가된 항생제, 동물유래 혈청 등의 성분도 포함되어 있기 때문에 손상된 조직에 사용할 경우 각종 위험에 노출될 가능성이 높다.
최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
그러나, 엑소좀을 이용한 일부 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 보다 면밀한 임상 및 비임상 연구가 필요하며, 특히 엑소좀이 작용하는 다양한 표적을 과학적으로 규명하여 엑소좀을 다양한 질환 치료에 응용할 수 있는 기술의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명자들은 궤양성 대장염과 관련하여 종래 알려진 치료제에 비하여 효과가 뛰어나고 안전한 치료제를 개발하고자 노력하였다. 이에 본 발명자들은 지방줄기세포로부터 유래된 엑소좀의 새로운 용도에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 지방줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀이 전술한 바와 같은 줄기세포 자체나 줄기세포 배양액의 안전성 문제를 해결할 수 있고, 궤양성 대장염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
대한민국 등록특허공보 제10-1460237호 (2014.11.10) 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0099743호 (2017.09.01) 대한민국 공개특허공보 제10-2016-0116802호 (2016.10.10)
Pin Li et al., Progress in Exosome Isolation Techniques, Theranostics, 2017, 7(3): 789-804 (2017.01.26) Coumans et al., Methodological Guidelines to Study Extracellular Vesicles, Circulation Research, 2017, 120:1632-1648 (2017.05.12)
본 발명의 목적은 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 궤양성 대장염의 개선 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 궤양성 대장염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 궤양성 대장염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 있어서 임상적 적용이 가능한 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 대량으로 수득할 수 있고, 이와 같이 수득된 기능적 활성이 우수한 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 궤양성 대장염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 궤양성 대장염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 궤양성 대장염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 있어서 임상적 적용이 가능한 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 대량으로 수득할 수 있고, 이와 같이 수득된 기능적 활성이 우수한 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 저가로 대량으로 제공할 수 있는 임상 및 상업적으로 뛰어난 신규한 기술을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 지방줄기세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다.
지방줄기세포가 아닌 신경줄기세포 유래의 엑소좀이 뇌손상 치료, 줄기세포 이식거부에 따른 염증 질환 치료에 효과가 있다는 보고가 있다. 또한, 줄기세포 이식을 위해 자궁내막 재생세포 유래의 엑소좀을 줄기세포와 함께 환자에게 투여하여 면역조절(줄기세포로 인한 거부반응 조절)을 하고자 한 사례가 있다. 그러나 이러한 종래기술에서는 줄기세포를 환자에게 투여할 때 발생하는 면역거부를 조절하기 위해 신경줄기세포나 자궁내막 재생세포 유래의 엑소좀을 줄기세포와 병용하여 투여하는 것을 제안하고 있을 뿐이다.
현재까지 대량 배양이 가능한 지방줄기세포를 배양한 후, 지방줄기세포 배양액으로부터 대량으로 경제적으로 분리 정제된 엑소좀을 궤양성 대장염 치료에 임상적으로 적용가능하게 구현한 치료제는 개발된 바가 없다. 지방에서 유래한 지방줄기세포(adipose-derived stem cells)는 지방 흡입술과 같은 간단한 시술에 의해 대량으로 입수가 가능하고 골수, 제대 또는 제대혈 등에 비해 약 40배 정도의 줄기세포가 있어 상업적으로는 가장 원가가 저렴하고 생산량이 많지만, 지방 내에 세포 잔해물, 노폐물, 단백질 및 거대입자와 같은 불순물이 많아 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 경제적으로 대량으로 분리하는 것이 어렵다. 따라서, 경제성 측면에서 지방줄기세포 배양액으로부터 고순도의 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 대량으로 분리하는 것에는 기술적 장벽이 있었다.
본 발명의 조성물은 약학 조성물로 적용될 때, 유효성분으로 함유된 지방줄기세포 유래의 엑소좀이 궤양성 대장염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 유의적인 효과를 나타내며, 줄기세포 자체나 줄기세포 배양액의 안전성 문제를 해결할 수 있다. 또한, 본 발명은 궤양성 대장염 치료제로서의 적용이 가능한 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물을 저가로 대량으로 제공할 수 있고, 엑소좀 치료제의 임상 적용 및 상업화를 가능하게 하는 점에서 종래기술과 명백히 차별화되는 기술이다.
본 발명의 일 구체예의 궤양성 대장염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 조성물은 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은 궤양성 대장염의 원인이 되는 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-12 및 IL-23의 생성량 또는 발현량을 감소시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은 하기의 단계들을 수행하여 수득될 수 있다: (a) 지방줄기세포 배양액에 트레할로오스를 첨가하는 단계, (b) 상기 트레할로오스가 첨가된 지방줄기세포 배양액을 여과하는 단계, (c) 상기 여과된 지방줄기세포 배양액으로부터, TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 엑소좀을 분리하는 단계, 및 (d) 탈염과 버퍼교환(diafiltration)에 사용되는 완충용액에 트레할로오스를 첨가하고, 상기 트레할로오스가 첨가된 완충용액을 이용한 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여, 상기 분리된 엑소좀에 대한 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하는 단계.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 (d) 단계에서 탈염과 버퍼교환(diafiltration)에 사용되는 완충용액에 트레할로오스를 첨가하면, 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 효과적으로 수득할 수 있다(도 6 참조). 본 발명에서는 TFF에 의한 엑소좀 분리 전의 사전 여과 과정((b) 단계)과 엑소좀 분리 후 TFF에 의한 탈염 및 버퍼교환 과정((d) 단계)에서 트레할로우스를 사용하는 것에 의해 고순도의 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 수득할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서 트레할로오스는 세포 잔해물, 노폐물, 단백질 및 거대 입자와 같은 불순물에 대해 엑소좀을 효율적으로 분별할 수 있는 기능을 부여한다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행하거나 단속적으로 수행할 수 있다. 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 탈염과 버퍼교환을 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, TFF를 위해 MWCO(molecular weight cutoff) 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 μm TFF 필터를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 (c) 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 1/100 내지 1/25의 부피까지 농축하는 과정을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에서 상기 지방줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물은 다양한 원인에 기인하여 발병되는 궤양성 대장염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물은 약학 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 궤양성 대장염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 조성물이 약학 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 과립제, 엘릭시르제(elixirs), 에어로졸 등의 경구투여용 제제, 외용제, 좌제, 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학 조성물의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여로는 경피 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 림프 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 직장 내 투여 등을 거론할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 활성 물질이 표적 조직 또는 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 유효량은 치료 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 또는 좌제일 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 주사제로도 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 수성 주사제, 비수성 주사제, 수성 현탁 주사제, 비수성 현탁 주사제, 또는 용해 또는 현탁하여 사용하는 고형 주사제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 그 종류에 따라 주사용 증류수, 식물유(예를 들어, 낙화생유, 참기름, 동백기름 등), 모노글리세리드, 디글리세리드, 프로필렌글리콜, 캄퍼, 벤조산에스트라디올, 차살리실산비스무트, 아르세노벤졸나트륨, 또는 황산스트렙토마이신 중 적어도 1종을 포함할 수 있고, 선택적으로 안정제나 방부제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약학 조성물은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 질환 종류, 질환의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 약학 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 궤양성 대장염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지일 수 있다.
본 발명의 조성물은 궤양성 대장염의 원인이 되는 다양한 염증성 사이토카인 및 염증관련 인자의 생성을 감소시키고, 궤양성 대장염 증상 관련 지표들을 개선하여 궤양성 대장염을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료할 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 궤양성 대장염의 원인이 되는 염증성 사이토카인인 IL-6, TNF-α, IL-12 및 IL-23에 대해 작용하여 다양한 원인에 기인하는 궤양성 대장염에 대한 광범위한 적용이 가능하고 효과적으로 궤양성 대장염을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 궤양성 대장염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 있어서 임상적 적용이 가능한 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 저가로 대량으로 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명은 기능적 활성이 우수한 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 저가로 대량으로 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 스케일-업(scale-up)이 가능하고 GMP(Good Manufacturing Practice)에도 적합하다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 지방줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 제조하는 방법에 있어서 엑소좀을 분리 및 정제하는 과정을 설명하는 플로우챠트이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따라 지방줄기세포 배양액으로부터 엑소좀을 제조하는 단계(step)별로 용액 내에 포함되어 있는 단백질의 총량 비율(Relative amount of protein)을 측정한 결과를 나타낸다. 각 단계별 단백질 총량의 비율은 지방줄기세포 배양액 전체에 대한 단백질 총량의 상대적 비율로 나타내었다. 실험 결과는 2개의 서로 다른 배치에서 얻어진 결과를 각각 도시하였다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 생산성(productivity)과 순도(purity)를 측정한 결과를 도시한 것이다. 엑소좀의 생산성은 "지방줄기세포 배양액(CM) 단위 mL 당 얻어진 엑소좀의 입자수"로 계산하였고, 엑소좀의 순도는 "최종 분획물에 포함되어 있는 단백질 단위 μg 당 엑소좀의 입자수"로 계산하였다. 실험 결과는 5개의 서로 다른 배치(batch)에서 얻어진 결과를 도시하였다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 4A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 4B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 4C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "도 4D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 4E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 5는 트레할로오스 첨가에 따라 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀이 수득되는 것을 보여주는 입자 크기 분포에 관한 NTA 분석 결과를 도시한다. 첨가된 트레할로오스의 양이 증가함에 따라 단일한 피크를 갖는 입자 크기 분포 결과를 얻을 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀의 제조과정에서 트레할로오스 첨가 여부에 따른 입자 크기 분포를 나타내는 NTA 분석 결과를 도시한다. "도 6A"는 제조 과정 전과정에서 트레할로오스를 첨가한 경우, "도 6B"는 세포 배양액을 동결 보관하였다가 해동한 후 트레할로오스를 첨가한 경우, "도 6C"는 트레할로오스를 첨가하지 않고 제조한 결과를 나타낸다. "도 6D"에는 도 6A 내지 도 6C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 상대적인 생산성(Relative productivity)과 상대 농도(Relative concentration)를 비교한 결과를 도시하였다. "도 6E"에는 도 6A 내지 도 6C 방법에 의하여 분리한 엑소좀의 평균 입자크기(Mean size)를 도시하였다.
도 7은 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 8은 RAW 264.7 세포에 대해 LPS와 함께 본 발명의 엑소좀을 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 TNF-α 및 IL-6의 mRNA 발현량이 감소한 것을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀에 의한, 염증 반응의 일종인 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 9에서 PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), EXO는 엑소좀, CM은 지방줄기세포 배양액(conditioned media), CM-EXO는 엑소좀이 제거된 지방줄기세포 배양액(exosome-depeleted conditioned media)을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀에 의한, 염증성 사이토카인인 TNF-α 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 10에서, PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), 각 숫자는 엑소좀 처리량(μg/mL)을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀에 의한 NO 형성 감소 효과와, 종래의 침전법(PPT)에 의해 분리된 엑소좀에 의한 NO 형성 감소 효과를 비교한 실험 결과를 도시한다. 도 11A는 종래의 침전법에 의해 분리된 엑소좀의 NTA 분석 결과이고, 도 11B는 본 발명의 일 구체예에 따른 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀의 NTA 분석 결과이며, 도 11C는 NO 형성 감소 효과를 비교 도시한 그래프이다. NO 형성의 감소 정도는 양성대조군인 덱사메타손(Dex)에 의한 NO 형성 감소 정도에 대한 상대 비율(%)로 표시하였다.
도 12는 궤양성 대장염이 유발된 생쥐에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 궤양성 대장염 유발 개시 후 6일째에 출혈 점수가 감소한 것을 나타내는 그래프이다.
도 13은 궤양성 대장염이 유발된 생쥐에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 궤양성 대장염 유발 개시 후 7일째에 분변 양상 평가 점수(즉, 설사 증상)가 감소한 것을 나타내는 그래프이다.
도 14는 궤양성 대장염이 유발된 생쥐에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 궤양성 대장염에 의한 개체 사망율이 감소하고 개체 사망을 지연하는 효과가 있음을 나타내는 그래프이다.
도 15는 궤양성 대장염이 유발된 생쥐에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 궤양성 대장염 유발 개시 후 7일째에 전체 임상증상 평가 점수가 감소한 것을 나타내는 그래프이다.
도 16은 THP-1 단핵구를 대식세포로 분화시킨 후 얻은 THP-1 유래 대식세포에 대해, LPS 및 IFN-γ와 함께 본 발명의 엑소좀을 처리(co-treatment)한 경우, 친염증성 사이토카인인 IL-6의 mRNA의 발현량이 감소한 것을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 17 내지 도 20은 THP-1 단핵구를 대식세포로 분화시킨 후 얻은 THP-1 유래 대식세포에 대해, 본 발명의 엑소좀을 전처리(pre-treatment)하고 일정 시간 배양한 다음 LPS 및 IFN-γ를 처리한 경우, 친염증성 사이토카인인 IL-6, TNF-α, IL-12 및 IL-23의 mRNA의 발현량이 감소한 것을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
마우스 대식세포주인 RAW 264.7은 한국세포주은행에서 구입하여 배양하였다. 세포 배양을 위해 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.
엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.
실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제
실시예 1에서 0.22 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다. 트레할로오스 처리에 따라 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 수득할 수 있는 효과를 확인한 결과는 도 6에 도시하였다.
실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석
분리된 엑소좀, 배양액, 및 TFF 분리과정의 분획물에서 단백질의 양은 BCA 발색법(ThermoFisher Scientific에서 구입) 또는 플루오로프로파일(FluoroProfile) 형광법(Sigma에서 구입)을 이용하여 측정하였다. 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀이 분리, 농축되고 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등이 제거되는 정도는 단백질 정량법에 의하여 모니터링하여 그 결과를 도 2에 도시하였다. 그 결과 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 효과적으로 배양액에 존재하는 단백질이 제거됨을 알 수 있었다.
본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀을 분리하는 경우 생산성과 순도를 독립적인 다섯 배치에서 비교한 결과를 도 3에 도시하였다. 독립적인 다섯 배치로부터 얻어진 결과를 분석한 결과, 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 안정적으로 엑소좀을 분리할 수 있음을 확인하였다.
분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입) 또는 가변 저항펄스 감지(tunable resistive pulse sensing: TRPS; Izon Science에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀의 TRPS, NTA, TEM 분석 결과는 도 4A 내지 도 4C에 도시하였다.
TFF 방법으로 엑소좀을 분리한 후, 트레할로오스의 첨가 여부에 따른 엑소좀의 크기 분포를 NTA 분석한 결과를 도 5에 도시하였다. 트레할로오스 농도를 0 중량%, 1 중량% 및 2 중량%로 증가시켰고(도 5의 위에서부터 아래), 3회 반복하여 실험하였다. 트레할로오스가 존재하지 않은 경우 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 확인되는 반면, 트레할로오스의 첨가량을 늘려주면 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 줄어들고 엑소좀의 크기 분포가 균일해지는 것을 확인하였다.
TFF 방법으로 엑소좀을 분리하는 과정에 트레할로오스의 첨가에 따른 효과를 추가로 조사하였다. 도 6에서 보는 바와 같이 엑소좀의 제조과정 전과정에 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가한 경우, 균일한 크기 분포를 갖는 엑소좀을 얻을 수 있었다(도 6A). 반면 트레할로오스를 첨가하지 않고 동결 보관하였던 배양액을 사용하되, 탈염과 버퍼교환 과정에서만 트레할로오스를 첨가하여 TFF 과정을 진행한 경우나, 트레할로오스를 전혀 첨가하지 않고 TFF 과정을 진행한 경우, 크기가 큰 입자가 많이 포함된 불균일한 엑소좀을 얻었다(도 6B 및 도 6C).
분리된 엑소좀의 상대적인 생산성과 농도를 비교한 결과, 엑소좀의 제조과정 전과정에 트레할로오스를 첨가한 경우 매우 높은 생산성으로 엑소좀을 얻을 수 있었으며, 얻어진 엑소좀의 농도도 5배 이상 높았다(도 6D). NTA 분석 결과에서 나타난 바와 같이, 분리된 엑소좀의 평균 크기도 엑소좀의 제조과정 전과정에 트레할로오스를 첨가한 경우 200 nm로 균일하게 확인되었다(도 6E).
도 4D는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD9, CD63, CD81 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD9 (Abcam에서 구입), 항-CD63 (System Biosciences에서 구입), 항-CD81 (System Biosciences에서 구입), 및 항-TSG101 (Abcam에서 구입)을 사용하였다.
도 4E는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD63에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD63 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
상기 결과들을 종합하면, 본 발명은 접선흐름여과를 이용한 제조과정에서 트레할로오스를 첨가하여 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 분리 및 정제할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 분리방법의 공정들은 스케일-업이 가능하고 GMP에도 적합함을 알 수 있었다.
실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정
인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.
비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 본 발명의 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 7).
실시예 5: 마크로파지 세포주를 이용한 염증 반응 측정
RAW 264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 현탁시키고 이를 멀티웰 플레이트(multiwell plate)의 각 웰에 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하였다. 다음 날 LPS가 포함된 새로운 무혈청 배지에 희석한 본 발명의 엑소좀 (실시예 2에서 준비된 엑소좀)을 적정 농도로 1~24시간 동안 처리하여 배양하였다. 배양이 끝난 배양상층액을 취하고 배양액 내에 존재하는 NO 및 염증성 사이토카인을 측정하여 염증 반응을 확인하였다. 배양액 내의 염증 반응은 NO 검출키트(detection kit)(인트론바이오 혹은 프로메가에서 구입)를 이용하여 측정하였다. ELISA 키트 (R&D system에서 구입) 제조사의 매뉴얼대로 수행하여 LPS만을 처리한 군과 본 발명의 엑소좀이 함께 처리된 군의 염증성 사이토카인 TNF-α 양을 확인하였다. 양성대조군으로 덱사메타손(dexamethasone) (Sigma에서 구입)을 처리하였다. 또한, 위와 같이 처리된 RAW 264.7 세포로부터 얻은 총 RNA로부터 cDNA를 제조하였고 리얼타임 PCR 방법을 이용하여 TNF-α 및 IL-6의 mRNA 변화량을 측정하였다. 상기 유전자들을 정량하기 위한 표준 유전자로서 GAPDH 유전자를 사용하였다. 리얼타임 PCR에 사용한 프라이머의 종류와 서열은 하기의 표 1과 같다.
리얼타임 PCR에 사용된 프라이머 종류 및 염기서열
유전자 서열
정방향 프라이머 (5' → 3') 역방향 프라이머 (5' → 3')
TNF-α TCT CAT CAG TTC TAT GGC CCA GAC (서열번호 1) GGC ACC ACT AGT TGG TTG TCT TTG (서열번호 2)
IL-6 GCC AGA GTC CTT CAG AGA GAT ACA (서열번호 3) ATT GGA TGG TCT TGG TCC TTA GCC (서열번호 4)
GAPDH GAC ATC AAG AAG GTG GTG AAG CAG (서열번호 5) CCC TGT TGC TGT AGC CGT ATT CAT (서열번호 6)
궤양성 대장염 환자에서 친염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 수치가 증가하는 것이 알려져 있으며, 환자의 생검에서 TNF-α의 발현이 증가하고 생검 및 혈청에서 IL-6의 레벨이 증가하는 것이 보고된 바가 있다(Hindawi Publishing Corporation, Ulcers Volume 2011. Review Article, Cytokine Networks in Ulcerative Colitis, pp. 1-5). 이 밖에도 다양한 문헌에서 확인되는 바와 같이 TNF-α 및 IL-6은 궤양성 대장염 발병과 밀접한 관련이 있다. 따라서, 염증반응에 관여하는 대식세포에서 TNF-α 및 IL-6의 생성량이나 발현량 변화를 분석하면 본 발명의 엑소좀이 궤양성 대장염이나 이에 관여하는 염증 반응을 억제, 감소 또는 완화시키는 시험관내 효능을 평가할 수 있다.
이와 관련하여 도 8에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 대해 LPS와 함께 본 발명의 엑소좀을 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 mRNA의 발현량이 감소하였다. 다음으로, 도 9에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS 존재 하에서 본 발명의 엑소좀을 처리한 결과 LPS에 의해 유도되는 염증 반응인 NO 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다. 또한, 도 10에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS 존재 하에서 본 발명의 엑소좀을 처리한 결과 LPS에 의해 유도되는 염증성 사이토카인인 TNF-α 생성을 감소시킴을 확인하였다.
이러한 결과들은 본 발명의 엑소좀이 궤양성 대장염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료를 위해 유용한 기능적 활성, 즉 궤양성 대장염의 원인이 되는 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 생성량 및/또는 발현량을 감소시키는 활성을 가지고 있는 것을 보여주고 있다.
따라서, 본 발명의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물은 장내의 염증 반응을 감소시켜 염증 반응에 기인한 궤양성 대장염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 유용할 것으로 기대된다.
실시예 6: 분리 방법에 따른 NO 형성 감소 효과의 비교
분리 방법에 따른 엑소좀의 NO 형성 감소 효과를 비교하기 위하여 본 발명의 일 구체예의 TFF 분리 정제에 의해 얻어진 엑소좀 이외에 종래의 침전법에 의해 분리된 엑소좀을 준비하였다. 침전법은 제조사(System Biosciences)의 프로토콜에 따라 시행하였다. 종래의 침전법에 의해 분리된 엑소좀(도 11A 참조)은 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀(도 11B 참조)과 비교하여 입자크기 분포의 균일도가 낮고 다양한 크기를 갖는 것을 확인하였다. 또한, 도 11C에 도시한 바와 같이 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀은 종래의 침전법에 의해 얻어진 엑소좀에 비해 훨씬 높은 수준으로 NO 형성을 억제함을 확인하였다. 이러한 결과들은 본 발명의 일 구체예에 따라 분리 정제된 엑소좀이 종래 방법에 따라 분리된 엑소좀에 비해 입자크기 분포의 균일도와 NO 형성 억제 측면에서 우수하다는 것을 보여주고 있다.
따라서, 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀은 종래의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀과 비교하여 성능 또는 기능적 활성(예를 들어, 입자크기 분포의 균일성, NO 생성 억제, 염증 반응 감소 등)이 훨씬 우수하고, 이와 같이 기능적 활성이 우수한 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 궤양성 대장염을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 효과 면에서 종래기술 보다 훨씬 우수하다고 할 수 있다.
실시예 7: 궤양성 대장염 유발 동물모델
궤양성 대장염 치료 효과를 확인하기 위한 동물 모델을 확립하기 위해 DSS(dextran sodium sulfate)를 사용한다. DSS를 섭취한 마우스는 인간의 궤양성 대장염과 유사한 증세를 나타낸다(Cooper HS, Merthy SN, Shs RS, Sedergran DJ. Clinicopsthologic study of dextran sulfate sodium experimental murine solitis. 1993. Laboratory Investigation. 69:238-249).
수컷 C57BL/6NCrljOri 생쥐(6주령, (주)오리엔트바이오에서 구입)를 구매하여 7일 동안의 적응기간을 통해 본 실험에 사용하였다. 적응기간을 거친 생쥐들은 아래와 같이 3군으로 분류하였다. 적응기간 중 건강한 것으로 판정된 생쥐들의 체중을 측정하고 순위화된 체중에 따라 각 군의 평균 체중이 최대한 균일하게 분포하도록 무작위법으로 분배하였다. 하기 (2) 및 (3)의 실험군에 대해 궤양성 대장염 유발 개시일(0일째)부터 2% DSS와 음수를 실험 종료시까지 자유롭게 섭취하도록 하여 궤양성 대장염을 유발시켰다.
(1) 정상 대조군: 궤양성 대장염이 없는 정상 대조군;
(2) UC 유발 대조군(궤양성 대장염 유발 대조군): DSS로 궤양성 대장염을 유발한 음성 대조군;
(3) 엑소좀 투여군: DSS로 궤양성 대장염 유발 개시 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 개체 당 7.5 μg의 용량으로 하루에 2회씩 3일간 (DSS에 의한 궤양성 대장염 유발 개시일로부터 2일째, 4일째 및 6일째) 혈관 내 투여(IV: intravenous injection)한 실험군.
상기 각 군의 생쥐들의 체중을 DSS 투여 전과 투여 후 매일 1회 측정하였다. 투여 및 관찰기간 동안 사망을 포함한 일반증상의 종류, 증상 발현일 및 증상의 정도를 1일 1회 관찰하고 개체별로 기록하였다. 예를 들어, 개체별 체중, 출혈, 대변 형태 등을 관찰하여 아래 제시된 기준(disease activity index; DAI)에 따라 각각 스코어를 부여하였다:
- 체중감소 (%): 0 (< 2 %), 1 (≥2 ~ <5%), 2 (≥5 ~ <10%), 3 (≥10~ <15%), 4 (≥15%);
- 출혈: 0 (직장 출혈 없음), 1 (약한 잠혈), 2 (대변 내 출혈), 3 (직장 출혈);
- 대변 형태: 0 (정상), 1 (무른 대변), 2 (심하지 않은 설사), 3 (설사).
출혈 평가 결과, 본 발명의 엑소좀을 투여한 군의 경우 궤양성 대장염 유발 개시 후 6일째에 궤양성 대장염 유발 대조군에 비해 출혈 점수가 유의적으로 감소한 것이 확인되었다(도 12). 분변 양상 평가 결과, 본 발명의 엑소좀을 투여한 군의 경우 궤양성 대장염 유발 개시 후 7일째에 궤양성 대장염 유발 대조군에 비해 분변 양상 평가 점수(즉, 설사 증상)가 유의적으로 감소한 것이 확인되었다(도 13). 특히, 궤양성 대장염 유발 대조군의 경우 궤양성 대장염 유발 개시 후 8일째 사망율이 70%인 반면에, DSS로 궤양성 대장염 유발 개시 후 본 발명의 엑소좀을 투여한 군에서는 사망율이 20%임을 알 수 있었다(도 14).
상기와 같은 임상증상을 종합적으로 평가한 결과, 본 발명의 엑소좀을 투여한 군의 경우 궤양성 대장염 유발 개시 후 7일째에 궤양성 대장염 유발 대조군에 비해 전체 임상증상 평가 점수가 유의적으로 감소하였다(도 15).
따라서, 본 발명의 엑소좀은 궤양성 대장염으로 인한 출혈 및 설사 증상을 완화시키는 효과와, 궤양성 대장염에 기인하는 개체 사망율을 감소시키고 개체 사망을 지연하는 효과가 있다고 할 수 있다.
실시예 8: THP-1 단핵구를 이용한 항염증 효과 확인
THP-1 단핵구(THP-1 human monocyte)를 대식세포로 분화시킨 후 본 발명의 엑소좀의 항염증 효과를 다음과 같이 확인하였다.
THP-1 단핵구를, 10% FBS(Fetal Bovine Serum), 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 100nM 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(Phorbol 12-myristate 13-acetate)(Sigma에서 구입)가 첨가된 RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute 1640; ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 현탁시킨 후 12웰 플레이트에 6×105 세포/mL의 밀도로 접종하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 배양하여 THP-1 유래 대식세포(THP-1 derived macrophage)로 분화를 유도하였다. 이후 분화된 세포를 PBS로 1회 세척하고, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트가 포함되어 있지 않은 RPMI 1640 배지에서 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화하였다.
동시처리(co-treatment) 실험군의 경우, THP-1 유래 대식세포에 대해 FBS(Fetal Bovine Serum)가 포함되어 있지 않은 RPMI 1640 배지와 100 ng/mL LPS(Sigma에서 구입) 및 20 ng/mL IFN-γ(Peprotech에서 구입)를 처리하여 THP-1 유래 대식세포를 활성화시키고, 또한 양성대조군인 덱사메타손(Sigma에서 구입) 또는 본 발명의 엑소좀(실시예 2에서 준비된 엑소좀)를 처리하여 24시간 배양하였다. 한편, 전처리(pre-treatment) 실험군의 경우, THP-1 유래 대식세포에 대해 FBS(Fetal Bovine Serum)가 포함되어 있지 않은 RPMI 1640 배지와 양성대조군인 덱사메타손(Sigma에서 구입) 또는 본 발명의 엑소좀(실시예 2에서 준비된 엑소좀)를 처리하여 24시간 배양한 다음, 100 ng/mL LPS(Sigma에서 구입) 및 20 ng/mL IFN-γ(Peprotech에서 구입)를 처리하고 4시간 동안 배양하여 THP-1 유래 대식세포를 활성화하였다.
배양이 끝난 THP-1 유래 대식세포(THP-1 derived macrophage)로부터 분리한 RNA로부터 cDNA를 제조하고 리얼타임 PCR 방법을 이용하여 궤양성 대장염의 주요 원인이 되는 친염증성 사이토카인(Pro-inflammatory Cytokine)인 IL-6, TNF-α, IL-12 및 IL-23의 mRNA 발현량을 측정하였다. 상기 유전자들을 정량하기 위한 표준 유전자로서 GAPDH를 사용하였다. PCR에 사용한 프라이머의 종류와 서열은 하기의 표 2와 같다.
리얼타임 PCR에 사용된 프라이머 종류 및 염기서열
유전자 서열
정방향 프라이머 (5'→3') 역방향 프라이머 (5'→3')
IL-6 AAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTA (서열번호 7) TGTCCTGCAGCCACTGGTTC (서열번호 8)
TNF-α CTGCCTGCTGCACTTTGGAG (서열번호 9) ACATGGGCTACAGGCTTGTCACT (서열번호 10)
IL-12 GGAGCGAATGGGCATCTGT (서열번호 11) TGGGTCTATTCCGTTGTGTCTTTA (서열번호 12)
IL-23 AGTGCCAGCAGCTTTCACAGA (서열번호 13) AATCAGACCCTGGTGGATCCTT (서열번호 14)
GAPDH CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC (서열번호 15) GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT (서열번호 16)
한편, 앞서 설명한 바와 같이 IL-6 및 TNF-α가 궤양성 대장염의 발병과 밀접한 관련이 있다는 보고 외에 IL-12 및 IL-23도 궤양성 대장염의 발병과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 즉, IL-12는 궤양성 대장염 동물모델의 생검에서 발현이 증가된다는 보고가 있고(World J Gastroenterol 2008 July 21; 14(27): pp.4280-4288), IL-23은 국소적 장관의 염증반응과 관련이 있다고 보고되어 있다(Korean J Gastroenterol Vol.58, No.5, pp.235-244). 따라서, 동물모델이나 염증반응에 관여하는 대식세포에 후보물질 처리 후 IL-12 및 IL-23의 생성량이나 발현량을 분석하면 후보물질의 궤양성 대장염 억제 및 완화에 대한 효능을 평가할 수 있다.
도 16에 도시된 바와 같이, THP-1 단핵구를 대식세포로 분화시킨 후 얻은 THP-1 유래 대식세포에 대해, LPS 및 IFN-γ와 함께 본 발명의 엑소좀을 처리(co-treatment)한 경우, 음성대조군에 비해 궤양성 대장염의 원인이 되는 친염증성 사이토카인인 IL-6의 mRNA의 발현량이 감소하였다. 또한, 도 17 내지 도 20에 도시된 바와 같이, THP-1 단핵구를 대식세포로 분화시킨 후 얻은 THP-1 유래 대식세포에 대해, LPS 및 IFN-γ 처리 전에 본 발명의 엑소좀을 전처리(pre-treatment)한 경우, 음성대조군에 비해 궤양성 대장염의 원인이 되는 것으로 알려진 친염증성 사이토카인인 IL-6, TNF-α, IL-12 및 IL-23의 mRNA의 발현량이 감소하였다. 친염증성 사이토카인인 IL-6, TNF-α, IL-12 및 IL-23는 친염증성 M1 대식세포에서는 발현이 증가하고 항염증성 M2 대식세포에서는 발현이 감소한다. 따라서, 상기 결과들은 본 발명의 엑소좀이 염증반응 및 이로 인한 궤양성 대장염을 억제, 완화 및 감소시킬 수 있는 것을 시사하며, 앞서 논의된 동물실험 결과를 강력히 뒷받침하는 결과라고 할 수 있다.
따라서, 본 발명의 엑소좀은 궤양성 대장염의 원인이 되는 염증성 사이토카인인 IL-6, TNF-α, IL-12 및 IL-23에 대해 작용하여 다양한 원인에 기인하는 궤양성 대장염에 대한 광범위한 적용이 가능하고 효과적으로 궤양성 대장염을 예방, 억제 및 완화시킬 수 있을 것으로 기대된다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
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Claims (9)

  1. 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 궤양성 대장염의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀은 궤양성 대장염의 원인이 되는 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-12 및 IL-23의 생성량 또는 발현량을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 엑소좀은 하기의 단계들을 수행하여 수득되는, 약학 조성물:
    (a) 지방줄기세포 배양액에 트레할로오스를 첨가하는 단계, (b) 상기 트레할로오스가 첨가된 지방줄기세포 배양액을 여과하는 단계, (c) 상기 여과된 지방줄기세포 배양액으로부터, TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 엑소좀을 분리하는 단계, 및 (d) 탈염과 버퍼교환(diafiltration)에 사용되는 완충용액에 트레할로오스를 첨가하고, 상기 트레할로오스가 첨가된 완충용액을 이용한 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여, 상기 분리된 엑소좀에 대한 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하는 단계.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행하거나 단속적으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 탈염과 버퍼교환을 수행하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  6. 제3항에 있어서,
    TFF(Tangential Flow Filtration)를 위해 MWCO(molecular weight cutoff) 100,000 Da, 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 μm TFF 필터를 사용하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 (c) 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 1/100 내지 1/25의 부피까지 농축하는 과정을 더 포함하는, 약학 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 약학 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 궤양성 대장염을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지인, 궤양성 대장염을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법.
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