JP7514348B2

JP7514348B2 - ヒアルロン酸を含む、幹細胞由来エクソソーム生成促進及び幹細胞能増強用組成物

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Publication number: JP7514348B2
Application number: JP2023039189A
Authority: JP
Inventors: スゥ・キム; スルギ・リ; ジミン・キム
Original assignee: プレクソジェンインコーポレイテッド
Priority date: 2019-06-10
Filing date: 2023-03-14
Publication date: 2024-07-10
Anticipated expiration: 2040-05-20
Also published as: CN118147050A; US20220195384A1; CN117384828A; CN117384829A; JP2022533277A; JP2023075261A; JP2023078272A; EP4219686A1; JP2023075260A; CN117384827A; CN113728091B; JP7514349B2; CN118147051A; EP3981871A4; CN113728091A; EP3981871A1; JP7246569B2; WO2020251181A1

Description

本発明は、幹細胞由来エクソソーム生成促進及び幹細胞能増強用組成物に関する。

細胞外小胞体（ＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＶｅｓｉｃｌｅｓ）は、微小小胞体（Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）、エクソソーム（Ｅｘｏｓｏｍｅ）などを含む３０～１０００ｎｍサイズの球形脂質二重層（ｌｉｐｉｄ－ｂｉｌａｙｅｒ）で構成された小胞体（ｖｅｓｉｃｌｅ）である。

エクソソームの脂質二重層は、起源細胞（供与細胞）のようなリン脂質二重膜構造となっており、細胞が細胞外に分泌する物質の構成体であって、細胞－細胞間のコミュニケーション及び細胞性免疫調節などの機能的な役割を担うものと知られている。

エクソソームは、起源細胞（供与細胞）特有の生物学的機能を反映する細胞特異的構成成分を含有し、リン脂質、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの他にも様々な水溶性タンパク質、外在性タンパク質、及び膜貫通タンパク質成分などを含む。

このようなエクソソームは、肥満細胞、リンパ球、星状細胞、血小板、神経細胞、内皮細胞、上皮細胞などのあらゆる動物細胞から排出され、血液、尿、粘液、唾液、胆汁、腹水、脳脊髓液などの様々な体液から発見される。エクソソームは、血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ－ＢｒａｉｎＢａｒｒｉｅｒ；ＢＢＢ）も通過でき、表皮細胞及び内皮細胞の細胞膜透過が可能な程度に選択的透過性が高いことから、特定薬物のナノキャリア（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）であるＤＤＳ（ｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙｓｙｓｔｅｍ）の開発にも活用されている。

間葉系幹細胞から分泌するエクソソーム及び微小小胞体（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）は、細胞－細胞間コミュニケーション（ｃｅｌｌ－ｔｏ－ｃｅｌｌｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）に関与し、幹細胞が有する再生医学的な治療効能を示すものと知られている。

エクソソームは、長期間生存せずに生体内に移植された幹細胞から分泌されるパラクリン因子（ｐａｒａｃｒｉｎｅｆａｃｔｏｒｓ）にトロフィック効果（ｔｒｏｐｈｉｃｅｆｆｅｃｔ）をもたらすことが知られている。分泌されるそのような因子は、エクソソームのような細胞外小胞体によって分泌される、成長因子（ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）などの低分子であり、そのようなエクソソームは幹細胞に由来する。このため、エクソソームは、幹細胞の特性を究明し、その治療効能を評価するのに活用されている。

最近では、間葉系幹細胞自体を使用せず、間葉系幹細胞が分泌するエクソソームを用いて様々な疾患の治療効果に対する研究が活発に行われており、学界及び産業界では、それが既存の幹細胞治療法の限界を克服できる新しい代案になり得ると期待されている。

このようなエクソソームを商業的に用いるためには、多量の、そして良質のエクソソームが必要である。しかし、現在、幹細胞から得られるエクソソームの量は極めて少量であり、幹細胞由来エクソソームの生産量を増加させ得る物質の開発も不十分である。

一方、間葉系幹細胞は、培養期間が長くなると同時に、数回の継代培養を経ることで、増殖能力と様々な系統への分化能力とが減少することが知られている。また、初期継代（ｐａｓｓａｇｅ）の間葉系幹細胞に比べて、後期継代の間葉系幹細胞においてコロニー形成能力が顕著に減少することが知られている。間葉系幹細胞の老化は、骨髄供与者の年齢ではなく、長い培養期間によって弱化した増殖能力と関連があり、テロメラーゼ活性（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ）の減少とも関連があると考えられる。

このように、現在、ヒトから得られる間葉系幹細胞の量は制限されており、得られた細胞を特定系統へと分化誘導するうえで、継代培養に伴う分化能力の減少のような不都合は避けられない。このような不都合は、正確なターゲット細胞への分化誘導及びそのための適切な幹細胞の大量確保が要求される臨床適用においては非現実的である。このため、長い期間にわたって増殖率を維持し、様々な系統への分化能力を維持できる方法の必要性が台頭している。

そこで、幹細胞由来エクソソームの生産を促進する他、幹細胞の増殖率及び分化能を長期間維持できる新規の方法及び物質の開発に対する必要性が提起された。

本発明者らは、幹細胞由来エクソソームの生産を促進するだけでなく、幹細胞の増殖率及び分化能を長期間維持できる方法及び物質を開発しようと努力した。その結果、エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（Ｐｈｏｒｂｏｌ１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３－ａｃｅｔａｔｅ；ＰＭＡ）、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、及びラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）からなる群から選ばれる一つ以上を幹細胞に前処理する場合、幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）及び増殖能（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）が増強するだけでなく、幹細胞由来エクソソームの数、エクソソーム内のタンパク質及びＲＮＡの含有量が大きく増加することを究明し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は、エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記幹細胞由来エクソソーム生成促進又は幹細胞の幹細胞能増強用組成物を含む幹細胞治療剤を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）で前処理された幹細胞由来エクソソームを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を増強させる方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）を含む組成物の幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）で前処理された幹細胞由来エクソソームを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を増強させる方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）を含む組成物の幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）で前処理された幹細胞由来エクソソームを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を増強させる方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）を含む組成物の幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）で前処理された幹細胞由来エクソソームを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を増強させる方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）を含む組成物の幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）で前処理された幹細胞由来エクソソームを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を増強させる方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）を含む組成物の幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）で前処理された幹細胞由来エクソソームを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を増強させる方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）を含む組成物の幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）で前処理された幹細胞由来エクソソームを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を増強させる方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）を含む組成物の幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノールを含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用幹細胞治療剤を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノールを含む幹細胞の幹細胞能（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノールを含む幹細胞の幹細胞能増強用幹細胞治療剤を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノールで前処理された幹細胞由来エクソソームを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノールで前処理された幹細胞由来エクソソームを有効成分として含む幹細胞治療剤を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノールを含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノールを含む細胞培養培地で幹細胞を培養する前処理段階を含む幹細胞の幹細胞能を増強させる方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノールを含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、ラニフィブラノールを含む組成物の幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用途を提供することである。

本発明者らは、幹細胞由来エクソソームの生産を促進するだけでなく、幹細胞の増殖率及び分化能を長期間維持できる方法及び物質を開発しようと努力した。その結果、エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（Ｐｈｏｒｂｏｌ１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３－ａｃｅｔａｔｅ；ＰＭＡ）、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、及びラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）からなる群から選ばれる一つ以上を幹細胞に前処理する場合、幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）及び増殖能（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）が増強する他にも、幹細胞由来エクソソームの数、エクソソーム内のタンパク質及びＲＮＡの含有量が大きく増加することを究明した。

本発明は、エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（Ｐｈｏｒｂｏｌ１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３－ａｃｅｔａｔｅ；ＰＭＡ）、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、及びラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）からなる群から選ばれる一つ以上を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進又は幹細胞の幹細胞能増強用組成物、前記組成物を含む幹細胞治療剤、エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（Ｐｈｏｒｂｏｌ１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３－ａｃｅｔａｔｅ；ＰＭＡ）、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、及びラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）からなる群から選ばれる一つ以上で前処理された幹細胞由来エクソソーム、前記幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤、幹細胞由来エクソソームの生産方法、及び幹細胞の幹細胞能を増強させる方法に関する。

以下、本発明をより詳細に説明する。

本発明の一態様は、エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物に関する。

本発明のエキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）は、グルカゴン様ペプチド（ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ；ＧＬＰ）受容体のペプチドアゴニストである。エキセンジン－４は、インスリン分泌を促進するものと知られており、２型糖尿病及びパーキンソン病治療用途として臨床的に用いられてきた。

本発明の一態様は、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（Ｐｈｏｒｂｏｌ１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３－ａｃｅｔａｔｅ；ＰＭＡ）を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物に関する。

本発明のホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）は、１２－０－テトラデカノイルホルボール－１３－酢酸（１２－Ｏ－Ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ－１３－ａｃｅｔａｔｅ；ＴＰＡ）などとも知られており、シグナル変換酵素（ｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅ）であるタンパク質リン酸化酵素Ｃ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣ；ＰＫＣ）を活性化させる役割を担う。また、ＰＭＡは、腫瘍プロモーターとして用いられ、Ｂ細胞などの分裂を刺激し、様々な細胞で活性化を誘導してサイトカインを生産する役割を担う。このことから、炎症反応誘導剤などの研究に用いられてきた。

本発明の一態様は、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物に関する。

本発明のインターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）は、活性化されたＴ細胞やＮＫ細胞、ＣＤ４及びＣＤ８陽性リンパ球によって生成されるサイトカインであり、分裂促進因子又は成長因子としてＴリンパ球をはじめとする様々な細胞の活性化と増殖分化、抗原提示細胞上のＭＨＣの発現を高める作用に関与し、免疫及び炎症反応において重要な役割を担う。また、インターフェロン－ガンマは、感染及び自己免疫治療用途として臨床的に用いられてきた。

本発明の一態様は、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物に関する。

本発明のテトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）は、カルシウムチャネル遮断剤（ｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｂｒｏｋｅｒ）であって、カルシウムチャネル活性を非選択的に抑制し、様々な細胞類型において細胞周期及び細胞死滅のＧ１段階のＧ１遮断を誘導し、免疫抑制、抗炎症、抗線維化、抗凝固作用などの効果があり、肝細胞グリコーゲン合成を増加させてブドウ糖の利用を増加させ、血漿のブドウ糖濃度を下げたりすることもある。また、テトランドリンは、糖尿病の併用治療剤、高血圧、不整脈、鎮痛と鎮痙剤、肝硬化及びリウマチ性関節炎治療剤などの用途として臨床的に用いられてきた。

本発明の一態様は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物に関する。

本発明のヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）は、Ｄ－グルクロン酸（Ｄ－ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）及びＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－グルコサミン）の二糖類単位体がβ（１→４）グリコシド間結合（ｉｎｔｅｒｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃｌｉｎｋａｇｅ）によって連結された天然線形多糖類である。ヒアルロン酸は、真皮を構成する成分の一つとして知られており、生体適合性及び生分解性に優れ、体内で免疫拒絶反応及び毒性がない、優れた生体材料として知られている。また、ヒアルロン酸は、高粘度且つ高弾性の天然グリコサミノグリカン巨大分子であって、種々の機能及び物理化学的な性質を有していることから、関節炎治療、眼科手術、フィラー、傷治療、薬物伝達体、癒着防止剤、組織工学、及び化粧品などの用途として臨床的に用いられてきた。

本発明の一態様は、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物に関する。

本発明のＰ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）は、タキキニン神経ペプチドファミリー（ｔａｃｈｙｋｉｎｉｎｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｆａｍｉｌｙ）のウンデカペプチド（ｕｎｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ）で、ＮＫ１レセプター（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に作用する神経ペプチドであって、神経伝達物質及び神経調節物質として作用する。また、Ｐ物質は、強力な血管拡張剤であって、細胞成長を促進するものと知られており、治療し難い潰瘍などの治癒を促進する他、慢性蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、慢性腎臓疾患、及び炎症や疼痛調節にも効果があると知られている。さらに、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）は、皮膚細胞増殖及び再生にも役立ち、化粧品の原料としても使用され、高血圧及び肝硬変疾患などの治療用途として臨床的に用いられてきた。

本発明の一態様は、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物に関する。

本発明のレスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）は、植物がカビや害虫のような有害な環境に直面した際に生成するファイトアレキシン（ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ）であって、ポリフェノール系物質である。脱アセチル酵素であるＳｉｒｔ１（Ｓｉｒｔｕｉｎ－１）を活性化させてミトコンドリアの機能を増進させ、糖代謝の流れを増進させることができる。また、レスベラトロールは、抗癌、抗ウイルス、神経保護、抗老化、抗炎症、及び延命効果などを含む抗疾患効果がある。また、レスベラトロールは、抗酸化作用を示し、窒素酸化物（ＮＯ）生成を刺激して血管を拡張させることにより、再灌流障害からの保護と不整脈を抑制する効果がある。これにより、レスベラトロールは、心血管や脳の疾患などの治療剤として研究し続けられており、抗老化、抗癌関連健康機能食品、及びシワ改善化粧品原料などの様々な分野に臨床的に用いられてきた。

本発明の一態様は、ラニフィブラノールを含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物である。

本発明のラニフィブラノールは、ＰＰＡＲ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）であって、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ、及びＰＰＡＲγと知られた３つのＰＰＡＲアイソフォームをそれぞれ活性化させ、身体内で抗線維化、抗炎症そして有益な代謝変化を誘導するものと知られている小分子（ｓｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅ）である。ＰＰＡＲは、遺伝子の発現を調節する核ホルモン受容体ファミリーに属するリガンド活性化転写因子である。ＰＰＡＲは、細胞分化、発達、及び腫瘍形成の調節に必須な役割を担う。ラニフィブラノールは、繊維症を調節するＰＰＡＲを活性化させて、結合組織の異常成長を減少させることが知られている。また、ラニフィブラノールは、全身性硬化症治療剤、特発性肺線維症治療剤などの用途として臨床的に用いられてきた。

本発明に係る前記組成物は、上述した成分に加えて、公知のエクソソーム生成促進物質をさらに含むことができる。

本明細書において“エクソソーム（Ｅｘｏｓｏｍｅ）”は、細胞由来性小胞体であり、殆どの真核生物の体液に存在する。エクソソームの直径は、３０～２００ｎｍ程度であり、これはＬＤＬタンパク質よりは大きいが、赤血球よりは遥かに小さい。

前記エクソソームは、多重小胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒｂｏｄｉｅｓ）が細胞膜と融合する際に細胞から放出されるか、或いは細胞膜から直ちに放出され得る。

このようなエクソソームが凝固、細胞間信号伝達などのような重要ながらも特化した機能を担うという点は、よく知られている。

本明細書において“幹細胞（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）”は未分化な細胞であって、自己複製能力を有する上に、２つ以上の異なる種類の細胞に分化する能力を有する細胞のことを指す。

前記幹細胞は、自己又は同種由来幹細胞でよく、ヒト及び非ヒト哺乳類を含む任意類型の動物由来であり得、前記幹細胞が成体から由来したものであれ、胚から由来したものであれ、それに限定されない。

具体的に、前記幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、又は人工多能性幹細胞であり得るが、これに制限されるものではない。

本明細書において“胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ）”は、胚の発生過程で抽出した細胞であり、受精卵が母体の子宮に着床する直前である胞胚期の胚から内部細胞塊（ｉｎｎｅｒｃｅｌｌｍａｓｓ）を抽出して体外で培養したものを意味する。

前記胚性幹細胞は、個体のあらゆる組織の細胞に分化できる多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）であるか、全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）の自己複製能（ｓｅｌｆｒｅｎｅｗａｌ）を有する細胞を意味し、広義には、胚性幹細胞から由来した胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄｂｏｄｉｅｓ）も含む。

前記胚性幹細胞は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ウサギなどのあらゆる由来の胚性幹細胞を含むことができるが、これに制限されるものではない。

本明細書において“成体幹細胞（ａｄｕｌｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）”は、臍帯血又は成体骨髄、血液などから抽出される細胞であって、具体的な臓器の細胞に分化する直前の細胞を意味し、必要時に身体内組織に発達できる能力を保有した未分化状態の細胞を意味する。

前記成体幹細胞は、ヒト又は動物の様々な組織起源の成体幹細胞、ヒト又は動物組織由来の間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌ）、ヒト又は動物の様々な組織起源の人工多能性幹細胞から由来した間葉系幹細胞及び多分化能幹細胞を含むことができるが、これに制限されるものではない。

前記ヒト又は動物組織は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜及び／又は胎盤であってよいが、これに制限されるものではない。

前記ヒト又は動物の様々な組織起源の幹細胞は、例えば、造血幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、血管内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚神経幹細胞及び／又は精巣幹細胞であってよいが、これに制限されるものではない。

本明細書において“人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）”は、分化した細胞から人為的な逆分化過程によって多能性分化能を有するように誘導された細胞を意味し、“逆分化幹細胞”と同じ意味で使われてもよい。

前記人為的な逆分化過程は、レトロウイルス、レンチウイルス、及びセンダイウイルスを用いたウイルス媒介又は非ウイルス性ベクターの利用、タンパク質及び細胞抽出物などを用いる非ウイルス媒介逆分化因子の導入によって行われるか、或いは幹細胞抽出物、化合物などによる逆分化過程を含むことができる。

前記人工多能性幹細胞は、胚性幹細胞とほぼ同じ性質を示す。具体的には、それらは、細胞形態学的類似性、類似の遺伝子及びタンパク質発現パターン、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏでの全能性、テラトーマ（ｔｅｒａｔｏｍａ）形成、マウス胚盤胞への挿入時のキメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）マウスの作製、並びに遺伝子の生殖細胞系伝達（ｇｅｒｍｌｉｎｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）を含む側面において共通している。

前記人工多能性幹細胞は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ウサギなどのあらゆる由来の人工多能性幹細胞を含むことができるが、これに制限されるものではない。

本明細書において用語“生成促進”とは、対照群に比べて特定物質の生産、生成、放出などが同一時間内で増加することを意味する。

具体的には、幹細胞からエクソソームが生産される数量と、エクソソーム内タンパク質、ＲＮＡなどの含有量が増加することを意味する。

本発明の他の態様は、エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用組成物に関する。

本発明の他の態様は、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用組成物に関する。

本発明の他の態様は、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用組成物に関する。

本発明の他の態様は、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用組成物に関する。

本発明の他の態様は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用組成物に関する。

本発明の他の態様は、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用組成物に関する。

本発明の他の態様は、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用組成物に関する。

本発明の他の態様は、ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用組成物に関する。

本明細書において用語“幹細胞能”とは、全てのタイプの細胞に分化する多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、及び無限に分裂してより多くの同じ幹細胞を産生する自己複製能（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）を総称する意味で当業界に通用されている。

具体的には、未分化細胞を、未分化状態を維持しながら幹細胞の増殖能（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を増強させたり、テロメラーゼ活性を向上させたり、幹細胞性因子（ｓｔｅｍｎｅｓｓａｃｔｉｎｇｓｉｇｎａｌｓ）の発現を向上させたり、細胞運動性を向上させたりすることを指し、それら特徴の一つ以上が現れることを含むことができる。

本発明の前記各組成物は、培地組成物として幹細胞培養に用いられてよく、生体内（ｉｎｖｉｖｏ）エクソソーム生成促進用途の薬剤学的組成物として幹細胞と共に生体内に併用投与されたり、先行又は後行して投与されたりすることで、幹細胞のｉｎｖｉｖｏ効能を強化させることができる。

前記幹細胞のｉｎｖｉｖｏ効能強化とは、関節炎、抹消神経障害などの特定の疾患の治療のための幹細胞の効能（ｉｎｖｉｖｏ効能）が、幹細胞によって分泌されるエクソソームによって媒介されるという仮定の下で、本開示の組成物と幹細胞との同時投与は、幹細胞からのエクソソームの産生を促進し、その結果、疾患に対する幹細胞の治療効果（ｉｎｖｉｖｏ効能）を強化することを意味する。

本発明の前記各組成物が培地組成物である場合、前記“培地組成物”は、生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）で細胞の成長、生存、及び増殖に必要な必須成分を含む組成物を意味するものであり、当該分野で通常用いられる幹細胞培養用培地をいずれも含み、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（ＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（ＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ－１０（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ：ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ－１０）、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ：ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ－１２）、α－ＭＥＭ（α－ＭｉｎｉｍａｌｅｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、Ｇ－ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｏｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、ＫｎｏｃｋＯｕｔＤＭＥＭ、Ｅ８（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８Ｍｅｄｉｕｍ）などの商業的に製造された培地又は人為的に合成した培地を用いることができるが、これに制限されるものではない。

前記培地組成物は、一般に、炭素源、窒素源及び微量元素成分を含み、アミノ酸、抗生剤などをさらに含むことができる。

また、前記培地組成物は、本発明の構成成分エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）を従来の幹細胞培養用培地内に添加して製造できる。

また、前記培地組成物は、本発明の構成成分ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）を従来の幹細胞培養用培地内に添加して製造できる。

また、前記培地組成物は、本発明の構成成分インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）を従来の幹細胞培養用培地内に添加して製造できる。

また、前記培地組成物は、本発明の構成成分テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）を従来の幹細胞培養用培地内に添加して製造できる。

また、前記培地組成物は、本発明の構成成分ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）を従来の幹細胞培養用培地内に添加して製造できる。

また、前記培地組成物は、本発明の構成成分Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）を従来の幹細胞培養用培地内に添加して製造できる。

また、前記培地組成物は、本発明の構成成分レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）を従来の幹細胞培養用培地内に添加して製造できる。

また、前記培地組成物は、本発明の構成成分ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）を従来の幹細胞培養用培地内に添加して製造できる。

前記本発明の構成成分エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）は、培地内に１０～１０００ｎＭ、１０～１００ｎＭ、１０～９０ｎＭ、１０～８０ｎＭ、１０～７０ｎＭ、１０～６０ｎＭ、１０～５０ｎＭ、１０～４０ｎＭ、１０～３０ｎＭ、又は２０ｎＭの濃度で添加されてよいが、これに制限されるものではない。

前記本発明の構成成分ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）は、培地内に１～１０００ｎＭ、１～５００ｎＭ、１～１００ｎＭ、１～９０ｎＭ、１～８０ｎＭ、１～７０ｎＭ、１～６０ｎＭ、１～５０ｎＭ、１～４０ｎＭ、１～３０ｎＭ、１～２０ｎＭ、又は１０ｎＭの濃度で添加されてよいが、これに制限されるものではない。

前記本発明の構成成分インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）は、培地内に１～１０００ｎｇ／ｍＬ、１～５００ｎｇ／ｍＬ、１～１００ｎｇ／ｍＬ、１～９０ｎｇ／ｍＬ、１～８０ｎｇ／ｍＬ、１～７０ｎｇ／ｍＬ、１～６０ｎｇ／ｍＬ、１～５０ｎｇ／ｍＬ、１～４０ｎｇ／ｍＬ、１～３０ｎｇ／ｍＬ、１～２０ｎｇ／ｍＬ、又は１０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加されてよいが、これに制限されるものではない。

前記本発明の構成成分テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）は、培地内に１～１０００μＭ、１～５００μＭ、１～１００μＭ、１～９０μＭ、１～８０μＭ、１～７０μＭ、１～６０μＭ、１～５０μＭ、１～４０μＭ、１～３０μＭ、１～２０μＭ、又は１０μＭの濃度で添加されてよいが、これに制限されるものではない。

前記本発明の構成成分ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）は、培地内に１～１０００μｇ／ｍＬ、１～５００μｇ／ｍＬ、１～１００μｇ／ｍＬ、１～９０μｇ／ｍＬ、１～８０μｇ／ｍＬ、１～７０μｇ／ｍＬ、１～６０μｇ／ｍＬ、１～５０μｇ／ｍＬ、１～４０μｇ／ｍＬ、１～３０μｇ／ｍＬ、１～２０μｇ／ｍＬ、又は１０μｇ／ｍＬの濃度で添加されてよいが、これに制限されるものではない。

前記本発明の構成成分Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）は、培地内に１０～１０００ｎＭ、１０～１００ｎＭ、１０～９０ｎＭ、１０～８０ｎＭ、１０～７０ｎＭ、１０～６０ｎＭ、１０～５０ｎＭ、１０～４０ｎＭ、２０～４０ｎＭ、又は３０ｎＭの濃度で添加されてよいが、これに制限されるものではない。

前記本発明の構成成分レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）は、培地内に１～１０００ｎＭ、１～５００ｎＭ、１～１００ｎＭ、１～９０ｎＭ、１～８０ｎＭ、１～７０ｎＭ、１～６０ｎＭ、１～５０ｎＭ、１～４０ｎＭ、１～３０ｎＭ、１～２０ｎＭ、又は１０ｎＭの濃度で添加されてよいが、これに制限されるものではない。

前記本発明の構成成分ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）は、培地内に１～１０００μＭ、１～５００μＭ、１～１００μＭ、１～９０μＭ、１～８０μＭ、１～７０μＭ、１～６０μＭ、１～５０μＭ、１～４０μＭ、１～３０μＭ、１～２０μＭ、又は１０μＭの濃度で添加されてよいが、これに制限されるものではない。

本発明の前記各組成物が薬剤学的組成物である場合、本発明の薬剤学的組成物に含まれてよい薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。好適な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。

本発明の薬剤学的組成物は、経口及び非経口で投与でき、例えば、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与、硬膜内投与、眼球投与、皮膚投与、及び経皮投与などで投与できる。

本発明の薬剤学的組成物の適度の投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び応答感度のような要因によって様々であり、熟練した通常の医師は、所望する治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方できる。本発明の一実施形態によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は、０．０００１～１０００ｍｇ／ｋｇである。

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて処方され得る。本開示の組成物は、単位容量の形態に調製され得るか、或いは、複数回投与容器に含まれ得る。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

本発明のさらに他の態様は、エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）で前処理された幹細胞由来エクソソームに関する。

本発明のさらに他の態様は、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）で前処理された幹細胞由来エクソソームに関する。

本発明のさらに他の態様は、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）で前処理された幹細胞由来エクソソームに関する。

本発明のさらに他の態様は、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）で前処理された幹細胞由来エクソソームに関する。

本発明のさらに他の態様は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）で前処理された幹細胞由来エクソソームに関する。

本発明のさらに他の態様は、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）で前処理された幹細胞由来エクソソームに関する。

本発明のさらに他の態様は、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）で前処理された幹細胞由来エクソソームに関する。

本発明のさらに他の態様は、ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）で前処理された幹細胞由来エクソソームに関する。

前記本発明の各組成物及び前記幹細胞由来エクソソームに共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。

本発明のさらに他の態様は、上述したエキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）を含む組成物、エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）で前処理された幹細胞又はエキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）で前処理された幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤に関する。

本発明のさらに他の態様は、上述したホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）を含む組成物、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）で前処理された幹細胞又はホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）で前処理された幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤に関する。

本発明のさらに他の態様は、上述したインターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）を含む組成物、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）で前処理された幹細胞又はインターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）で前処理された幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤に関する。

本発明のさらに他の態様は、上述したテトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）を含む組成物、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）で前処理された幹細胞又はテトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）で前処理された幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤に関する。

本発明のさらに他の態様は、上述したヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）を含む組成物、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）で前処理された幹細胞又はヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）で前処理された幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤に関する。

本発明のさらに他の態様は、上述したＰ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）を含む組成物、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）で前処理された幹細胞又はＰ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）で前処理された幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤に関する。

本発明のさらに他の態様は、上述したレスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）を含む組成物、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）で前処理された幹細胞又はレスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）で前処理された幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤に関する。

本発明のさらに他の態様は、上述したラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）を含む組成物、ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）で前処理された幹細胞又はラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）で前処理された幹細胞由来エクソソームを含む幹細胞治療剤に関する。

本発明において“細胞治療剤”とは、細胞と組織の機能を復元させるために、生きている自家（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）、同種（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）、異種（ｘｅｎｏｇｅｎｉｃ）細胞を体外で増殖・選別したり、その他の方法で細胞の生物学的特性を変化させたりするなどの一連の行為により、治療、診断、及び予防の目的に用いられる医薬品を意味する。

このような細胞治療剤は、２種類に大別でき、その第一は、組織再生、臓器機能回復、又は免疫細胞の機能調節のための“幹細胞治療剤”であり、第二は、生体内免疫反応の抑制或いは免疫反応の亢進などの免疫反応調節のための“免疫細胞治療剤”である。

前記本発明の各組成物及びその構成成分エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（Ｐｈｏｒｂｏｌ１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３－ａｃｅｔａｔｅ；ＰＭＡ）、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）又はラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）は、幹細胞の幹細胞能を増強させ、幹細胞由来エクソソームの生成を促進し、これにより、幹細胞の治療効能を強化させる効果を有するので、本明細書でいう“細胞治療剤”は、“幹細胞治療剤”を意味する。

前記幹細胞治療剤は、心筋梗塞、心不全などの循環器疾患、肝臓癌、胃癌、大腸癌、前立腺癌、膀胱癌、肺癌などの癌疾患、アトピー性皮膚炎、関節炎、自己免疫性脳脊髓炎、全身性エリテマトーデス、大腸炎、及び多発性硬化症のような炎症性疾患、並びに自己免疫性疾患などのそれを必要とする対象の疾患を治療する用途に用いられてよいが、これに制限されない。

前記幹細胞治療剤は、上述した本発明の各組成物と構成成分を共通とするので、これら両者に共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。

本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む幹細胞由来エクソソームの生産方法に関する。

ａ）エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。

ａ）ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。

ａ）インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。

ａ）テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。

ａ）ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。

ａ）Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。

ａ）レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。

ａ）ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。

前記方法は、次の段階をさらに含むことができる。

ｂ）培養された幹細胞を洗浄した後、細胞培養培地でさらに培養する段階；及び

ｃ）エクソソームを分離する段階。

以下、本発明の幹細胞由来エクソソームの生産方法について詳しく説明する。

ａ）段階

本段階は、幹細胞をエキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）又はラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）で前処理して幹細胞に刺激を加える過程である。本過程によって、幹細胞は、前記物質で前処理されていない幹細胞に比べてより多い数のエクソソームを生産し、エクソソーム内タンパク質及びＲＮＡの含有量も増加する。

ｂ）段階

本段階は、本発明に係る前記物質で前処理された幹細胞を洗浄して前記前処理物質を除去し、新しい細胞培養培地で培養することにより、幹細胞からエクソソームの分泌又は生産を誘導する過程である。前記ａ）段階の幹細胞前処理物質（エキセンジン－４）は、前記ｂ）段階の洗浄過程によって除去され、洗浄後の幹細胞、幹細胞で生産されたエクソソーム又は培養培地内に残留しない。したがって、前記ａ）段階において本発明の幹細胞前処理物質で処理された幹細胞と幹細胞で生産されたエクソソーム及び培養培地は、上述した前処理物質の残留による影響無しで後続の研究又は疾病の治療目的に有用に利用可能である。

本段階の細胞培養培地は、エクソソームが除去されたウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）をさらに含む。前記細胞培養培地にエクソソームを除去したＦＢＳを使用する理由は、通常使用するＦＢＳにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれているので、幹細胞が分泌するエクソソームの他にＦＢＳ由来エクソソームが混入することを防止するためである。

本段階の追加培養は、１２時間～１２０時間、２４時間～９６時間、４８時間～９６時間、又は６０時間～８４時間、最も具体的には７２時間培養されてよいが、これに制限されるものではない。

ｃ）段階

本段階は、前記ｂ）段階で追加培養した幹細胞の培養培地を、２００～４００×ｇで５～２０分間遠心分離し、残っている細胞及び細胞残余物を除去した後、上清液を取って９，０００～１２，０００×ｇで６０～８０分間高速遠心分離した後、再び上清液を取って９０，０００～１２０，０００×ｇで８０～１００分間遠心分離し上清液を除去することにより、下層に残っているエクソソームを得ることができる。

本発明の具体例によれば、間葉系幹細胞培養培地を回収し、３００×ｇで１０分間遠心分離して残っている細胞及び細胞残余物を除去し、上清液を取って０．２２μｍフィルターを用いて濾過した後、高速遠心分離機（ｈｉｇｈｓｐｅｅｄｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１０，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心分離する。遠心分離された上清液を再び取り、超遠心分離機（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１００，０００×ｇ、４℃で９０分間遠心分離して上清液を除去することにより、下層に残っているエクソソームを分離した。

本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を増強させる方法に関する。

前記幹細胞の幹細胞能を増強させる方法は、上述した本発明の幹細胞由来エクソソームの生産方法と共通の段階を有し、これら両者に共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。

本発明のさらに他の態様は、エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途である。

本発明のさらに他の態様は、エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）を含む組成物の幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用途である。

本発明のさらに他の態様は、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途である。

本発明のさらに他の態様は、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ）を含む組成物の幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用途である。

本発明のさらに他の態様は、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途である。

本発明のさらに他の態様は、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）を含む組成物の幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用途である。

本発明のさらに他の態様は、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途である。

本発明のさらに他の態様は、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）を含む組成物の幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用途である。

本発明のさらに他の態様は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途である。

本発明のさらに他の態様は、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）を含む組成物の幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用途である。

本発明のさらに他の態様は、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途である。

本発明のさらに他の態様は、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）を含む組成物の幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用途である。

本発明のさらに他の態様は、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）を含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途である。

本発明のさらに他の態様は、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）を含む組成物の幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用途である。

本発明のさらに他の態様は、ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）含む組成物の幹細胞由来エクソソーム生成促進用途である。

本発明のさらに他の態様は、ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）含む組成物の幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）増強用途である。

本発明は、エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（Ｐｈｏｒｂｏｌ１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３－ａｃｅｔａｔｅ；ＰＭＡ）、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、及びラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）から選ばれる一つを含む幹細胞由来エクソソーム（Ｅｘｏｓｏｍｅｓ）生成促進及び幹細胞の機能強化用組成物に関する。本発明の組成物を幹細胞培養に用いる場合、幹細胞の幹細胞能及び幹細胞由来エクソソームの生産量が増加するので、より効率的に良質の幹細胞及び幹細胞由来エクソソームを生産できるところ、これを関連研究開発及び製品化に有用に用いることができる。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４））処理による幹細胞増殖率（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４））処理による幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の増強を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４））処理によるエクソソームのサイズによる分布を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４））処理によるエクソソーム数の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４））処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４））処理によるエクソソーム由来ＲＮＡ量の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ））処理による幹細胞増殖率（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ））処理による幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の増強を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ））処理によるエクソソームのサイズによる分布を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ））処理によるエクソソーム数の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ））処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（ＰＭＡ））処理によるエクソソーム由来ＲＮＡ量の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ））処理による幹細胞増殖率（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ））処理による幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の増強を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ））処理によるエクソソームのサイズによる分布を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ））処理によるエクソソーム数の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ））処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ））処理によるエクソソーム由来ＲＮＡ量の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ））処理による幹細胞増殖率（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ））処理による幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の増強を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ））処理によるエクソソームのサイズによる分布を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ））処理によるエクソソーム数の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ））処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ））処理によるエクソソーム由来ＲＮＡ量の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ））処理による幹細胞増殖率（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ））処理による幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の増強を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ））処理によるエクソソームのサイズによる分布を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ））処理によるエクソソーム数の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ））処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ））処理によるエクソソーム由来ＲＮＡ量の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ））処理による幹細胞増殖率（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ））処理による幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の増強を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ））処理によるエクソソームのサイズによる分布を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ））処理によるエクソソーム数の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ））処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ））処理によるエクソソーム由来ＲＮＡ量の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ））処理による幹細胞増殖率（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ））処理による幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の増強を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ））処理によるエクソソームのサイズによる分布を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ））処理によるエクソソーム数の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ））処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ））処理によるエクソソーム由来ＲＮＡ量の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ））処理による幹細胞増殖率（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の増加を確認したグラフである。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ））処理による幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の増強を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ））処理によるエクソソームのサイズによる分布を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ））処理によるエクソソーム数の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ））処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加を確認した図である。

本発明の一実施例によって、幹細胞前処理物質（ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ））処理によるエクソソーム由来ＲＮＡ量の増加を確認した図である。

エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（Ｐｈｏｒｂｏｌ１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３－ａｃｅｔａｔｅ；ＰＭＡ）、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）、及びラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）からなる群から選ばれる一つ以上を含む幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物。

以下、本発明を下記の実施例によってより詳細に説明する。ただし、これらの実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。

実施例１．エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）処理による幹細胞由来エクソソーム分離

エキセンジン－４前処理

エキセンジン－４２０ｎＭが含まれた培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）；１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］で、臍帯組織由来間葉系幹細胞（ＰｒｉｍａｒｙＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄ－ＤｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ＡＴＣＣＮｏ．ＰＣＳ－５００－０１０；ＬｏｔＮｏ．６３８２２４２８）を１週間培養した。

追加培養

培養を完了した後、エキセンジン－４が前処理された間葉系幹細胞を洗浄し、エクソソームが除去されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加した培養培地でさらに７２時間培養した。エクソソームが除去されたＦＢＳを使用する理由は、通常使用するＦＢＳにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれていることから、細胞が分泌するエクソソームの他にＦＢＳ由来エクソソームが混入することを防止するためである。

エクソソーム分離

７２時間培養後に、前処理物質が処理された間葉系幹細胞培養培地を回収して３００×ｇで１０分間遠心分離し、残っている細胞及び細胞残余物を除去した。上清液を取って０．２２μｍフィルターを用いて濾過した後、高速遠心分離機（ｈｉｇｈｓｐｅｅｄｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１０，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心分離した。遠心分離された上清液を再び取り、超遠心分離機（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用いて１００，０００×ｇ、４℃で９０分間遠心分離し、上清液を除去した。下層に残っているエクソソームをＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｄｓａｌｉｎ）に希釈し、以降の実験に使用した。

実施例２．ＰＭＡ処理による幹細胞由来エクソソーム分離

ＰＭＡ前処理

ＰＭＡ１０ｎＭが含まれた培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）；１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］で、臍帯組織由来間葉系幹細胞（ＰｒｉｍａｒｙＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄ－ＤｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ＡＴＣＣＮｏ．ＰＣＳ－５００－０１０；ＬｏｔＮｏ．６３８２２４２８）を１週間培養した。

追加培養

培養を完了した後、ＰＭＡが前処理された間葉系幹細胞を洗浄し、エクソソームが除去されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加した培養培地でさらに７２時間培養した。エクソソームが除去されたＦＢＳを使用する理由は、通常使用するＦＢＳにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれていることから、細胞が分泌するエクソソームの他にＦＢＳ由来エクソソームが混入することを防止するためである。

エクソソーム分離

実施例３．インターフェロン－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）処理による幹細胞由来エクソソーム分離

インターフェロン－γ前処理

インターフェロン－γ １０ｎｇ／ｍＬが含まれた培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）；１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］で、臍帯組織由来間葉系幹細胞（ＰｒｉｍａｒｙＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄ－ＤｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ＡＴＣＣＮｏ．ＰＣＳ－５００－０１０；ＬｏｔＮｏ．６３８２２４２８）を１週間培養した。

追加培養

培養を完了した後、インターフェロン－γが前処理された間葉系幹細胞を洗浄し、エクソソームが除去されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加した培養培地でさらに７２時間培養した。エクソソームが除去されたＦＢＳを使用する理由は、通常使用するＦＢＳにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれていることから、細胞が分泌するエクソソームの他にＦＢＳ由来エクソソームが混入することを防止するためである。

エクソソーム分離

実施例４．テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）処理による幹細胞由来エクソソーム分離

テトランドリン前処理

テトランドリン１０μＭが含まれた培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）；１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］で、臍帯組織由来間葉系幹細胞（ＰｒｉｍａｒｙＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄ－ＤｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ＡＴＣＣＮｏ．ＰＣＳ－５００－０１０；ＬｏｔＮｏ．６３８２２４２８）を１週間培養した。

追加培養

培養を完了した後、テトランドリンが前処理された間葉系幹細胞を洗浄し、エクソソームが除去されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加した培養培地でさらに７２時間培養した。エクソソームが除去されたＦＢＳを使用する理由は、通常使用するＦＢＳにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれていることから、細胞が分泌するエクソソームの他にＦＢＳ由来エクソソームが混入することを防止するためである。

エクソソーム分離

実施例５．ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）処理による幹細胞由来エクソソーム分離

ヒアルロン酸前処理

ヒアルロン酸１０ｕｇ／ｍＬが含まれた培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）；１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］で、臍帯組織由来間葉系幹細胞（ＰｒｉｍａｒｙＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄ－ＤｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ＡＴＣＣＮｏ．ＰＣＳ－５００－０１０；ＬｏｔＮｏ．６３８２２４２８）を１週間培養した。

追加培養

培養を完了した後、ヒアルロン酸が前処理された間葉系幹細胞を洗浄し、エクソソームが除去されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加した培養培地でさらに７２時間培養した。エクソソームが除去されたＦＢＳを使用する理由は、通常使用するＦＢＳにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれていることから、細胞が分泌するエクソソームの他にＦＢＳ由来エクソソームが混入することを防止するためである。

エクソソーム分離

実施例６．Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）処理による幹細胞由来エクソソーム分離

Ｐ物質前処理

Ｐ物質３０ｎＭが含まれた培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）；１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］で、臍帯組織由来間葉系幹細胞（ＰｒｉｍａｒｙＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄ－ＤｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ＡＴＣＣＮｏ．ＰＣＳ－５００－０１０；ＬｏｔＮｏ．６３８２２４２８）を１週間培養した。

追加培養

培養を完了した後、Ｐ物質が前処理された間葉系幹細胞を洗浄し、エクソソームが除去されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加した培養培地でさらに７２時間培養した。エクソソームが除去されたＦＢＳを使用する理由は、通常使用するＦＢＳにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれていることから、細胞が分泌するエクソソームの他にＦＢＳ由来エクソソームが混入することを防止するためである。

エクソソーム分離

実施例７．レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）処理による幹細胞由来エクソソーム分離

レスベラトロール前処理

レスベラトロール１０ｎＭが含まれた培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）；１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］で、臍帯組織由来間葉系幹細胞（ＰｒｉｍａｒｙＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄ－ＤｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ＡＴＣＣＮｏ．ＰＣＳ－５００－０１０；ＬｏｔＮｏ．６３８２２４２８）を１週間培養した。

追加培養

培養を完了した後、レスベラトロールが前処理された間葉系幹細胞を洗浄し、エクソソームが除去されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加した培養培地でさらに７２時間培養した。エクソソームが除去されたＦＢＳを使用する理由は、通常使用するＦＢＳにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれていることから、細胞が分泌するエクソソームの他にＦＢＳ由来エクソソームが混入することを防止するためである。

エクソソーム分離

実施例８．ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ）処理による幹細胞由来エクソソーム分離

ラニフィブラノール前処理

ラニフィブラノール１０μＭが含まれた培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）；１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］で、臍帯組織由来間葉系幹細胞（ＰｒｉｍａｒｙＵｍｂｉｌｉｃａｌＣｏｒｄ－ＤｅｒｉｖｅｄＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ＡＴＣＣＮｏ．ＰＣＳ－５００－０１０；ＬｏｔＮｏ．６３８２２４２８）を１週間培養した。

追加培養

培養を完了した後、ラニフィブラノールが前処理された間葉系幹細胞を洗浄し、エクソソームが除去されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加した培養培地でさらに７２時間培養した。エクソソームが除去されたＦＢＳを使用する理由は、通常使用するＦＢＳにはウシ血清由来のエクソソームが非常に多く含まれていることから、細胞が分泌するエクソソームの他にＦＢＳ由来エクソソームが混入することを防止するためである。

エクソソーム分離

実験例１．エキセンジン－４処理による幹細胞機能強化

１－１．エキセンジン－４処理による幹細胞増殖率（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の増加

１００ｕＬ培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］が含まれた９６ウェルプレートに、間葉系幹細胞及び前記実施例のエキセンジン－４で前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、ウェル当たりに３０００細胞ずつ播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、２４時間、ＣＯ_２培養器で培養した。その後、ＣＣＫ溶液（１０ｕＬ／ウェル）を添加し、ＣＯ_２培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で４時間培養した後、４５０ｎｍ（４２０～４８０ｎｍ）波長で吸光度を測定し、増殖率を確認した。

図１から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［エキセンジン－４］を前処理した間葉系幹細胞の細胞増殖率が、１から３．４へと約３４０％増加した。

１－２．エキセンジン－４処理による幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の増強

１０ｍＬ培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］が含まれた１００ｍｍ細胞培養皿（ｄｉｓｈ）に、間葉系幹細胞及び前記実施例のエキセンジン－４で前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、皿当たりに１０００細胞ずつ播種し、２１日間培養した。培養された細胞が付着した皿をＰＢＳで２回洗浄し、常温で、約２分間９５％メタノールで固定した。固定された細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％クリスタルバイオレット溶液［ｃｒｙｓｔａｌｖｉｏｌｅｔ（ｓｉｇｍａ，Ｃ－３８８６，ＵＳＡ）５ｇ、メタノール１００ｍｌ］を添加して５分間染色し、水で洗浄後に室温で乾燥させた。各皿で５０個以上の細胞で構成されたコロニーの数を計数して比較した。

図２Ａ及び図２Ｂから確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞（２８．６個）に比べて、幹細胞前処理物質［エキセンジン－４］を前処理した間葉系幹細胞の細胞（１８５個）のＣＦＵ－Ｆコロニー数が約６４７％増加した。

実験例２．エキセンジン－４処理によるエクソソーム生産効率の増加

２－１．エキセンジン－４処理によるエクソソーム数の増加

ナノパーティクルトラッキングアッセイ（ＮａｎｏＳｉｇｈｔＮＳ３００，Ｍａｌｖｅｒｎ）により、前記実施例で分離されたエクソソーム数を確認した。このとき、比較のために、何ら前処理物質も処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームの数を確認した。結果を、下記の表１、図３及び図４に示す。

（ＭＳＣ：未処理間葉系幹細胞、Ｅｘｅ４－ＭＳＣ：エキセンジン－４処理間葉系幹細胞）

前記表１及び図４から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［エキセンジン－４］を前処理した間葉系幹細胞において約５．８５倍多い数のエクソソームが生産された。

前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、間葉系幹細胞が生産するエクソソームの数が増加することが分かる。

２－２．エキセンジン－４処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加

エクソソームタンパク質分離キット（ＴｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームからタンパク質を分離し、ブラッドフォード分析（ｂｒａｄｆｏｒｄａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて５９５ｎｍで吸光度を測定し、タンパク質を定量した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームからタンパク質を分離して定量した。結果を、下記の表２及び図５に示す。

前記表２及び図５から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［エキセンジン－４］を前処理した間葉系幹細胞において約５．４倍多い量のエクソソーム由来タンパク質が生産された。

前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来タンパク質（ｅｘｏｓｏｍａｌｐｒｏｔｅｉｎ）の含有量も増加することが分かる。

２－３．エキセンジン－４処理によるエクソソーム由来ＲＮＡ量の増加

ＲＮＡ分離用キット（ＴｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームから全エクソソームＲＮＡを分離し、ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いてＲＮＡの濃度を測定した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームから全エクソソームＲＮＡを分離して濃度を測定した。結果を、下記の表３及び図６に示す。

前記表３及び図６から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［エキセンジン－４］を前処理した間葉系幹細胞において約５．６倍多い量のエクソソーム由来ＲＮＡが生産された。

前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来ＲＮＡ（ｅｘｏｓｏｍａｌＲＮＡ）の含有量も増加することが分かる。

実験例３．ＰＭＡ処理による幹細胞機能強化

３－１．ＰＭＡ処理による幹細胞増殖率（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の増加

１００ｕＬ培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］が含まれた９６ウェルプレートに、間葉系幹細胞及び前記実施例のＰＭＡで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、ウェル当たりに３０００細胞ずつ播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、２４時間、ＣＯ_２培養器で培養した。その後、ＣＣＫ溶液（１０ｕＬ／ウェル）を添加し、ＣＯ_２培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で４時間培養した後、４５０ｎｍ（４２０～４８０ｎｍ）波長で吸光度を測定し、増殖率を確認した。

図７から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［ＰＭＡ］を前処理した間葉系幹細胞の細胞増殖率が、１から２．２へと約２２０％増加した。

３－２．ＰＭＡ処理による幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の増強

１０ｍＬ培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］が含まれた１００ｍｍ細胞培養皿（ｄｉｓｈ）に、間葉系幹細胞及び前記実施例のＰＭＡで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、皿当たりに１０００細胞ずつ播種して２１日間培養した。培養された細胞が付着した皿をＰＢＳで２回洗浄し、常温で、約２分間９５％メタノールで固定した。固定された細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％クリスタルバイオレット溶液［ｃｒｙｓｔａｌｖｉｏｌｅｔ（ｓｉｇｍａ，Ｃ－３８８６，ＵＳＡ）５ｇ、メタノール１００ｍｌ］を添加して５分間染色し、水で洗浄後に室温で乾燥させた。各皿で５０個以上の細胞で構成されたコロニーの数を計数して比較した。

図８Ａ及び図８Ｂから確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞（２８．６個）に比べて、幹細胞前処理物質［ＰＭＡ］を前処理した間葉系幹細胞の細胞（２８５．７個）のＣＦＵ－Ｆコロニー数が約９９６．５％増加した。

実験例４．ＰＭＡ処理によるエクソソーム生産効率の増加

４－１．ＰＭＡ処理によるエクソソーム数の増加

ナノパーティクルトラッキングアッセイ（ＮａｎｏＳｉｇｈｔＮＳ３００，Ｍａｌｖｅｒｎ）により、前記実施例で分離されたエクソソーム数を確認した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームの数を確認した。結果を、下記の表４、図９及び図１０に示す。

（ＭＳＣ：未処理間葉系幹細胞、ＰＭＡＭＳＣ：ＰＭＡ処理間葉系幹細胞）

前記表４及び図１０から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［ＰＭＡ］を前処理した間葉系幹細胞において約５．２倍多い数のエクソソームが生産された。

４－２．ＰＭＡ処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加

エクソソームタンパク質分離キット（ＴｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームからタンパク質を分離し、ブラッドフォード分析（ｂｒａｄｆｏｒｄａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて５９５ｎｍで吸光度を測定し、タンパク質を定量した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームからタンパク質を分離して定量した。結果を、下記の表５及び図１１に示す。

前記表５及び図１１から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［ＰＭＡ］を前処理した間葉系幹細胞において約５倍多い量のエクソソーム由来タンパク質が生産された。

４－３．ＰＭＡ処理によるエクソソーム由来ＲＮＡ量の増加

ＲＮＡ分離用キット（ＴｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームから全エクソソームＲＮＡを分離し、ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いてＲＮＡの濃度を測定した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームから全エクソソームＲＮＡを分離して濃度を測定した。結果を、下記の表６及び図１２に示す。

前記表６及び図１２から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［ＰＭＡ］を前処理した間葉系幹細胞において約４倍多い量のエクソソーム由来ＲＮＡが生産された。

実験例５．インターフェロン－γ処理による幹細胞機能強化

５－１．インターフェロン－γ処理による幹細胞増殖率（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の増加

１００ｕＬ培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］が含まれた９６ウェルプレートに、間葉系幹細胞及び前記実施例のインターフェロン－γで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、ウェル当たりに３０００細胞ずつ播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、２４時間、ＣＯ_２培養器で培養した。その後、ＣＣＫ溶液（１０ｕＬ／ウェル）を添加し、ＣＯ_２培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で４時間培養した後、４５０ｎｍ（４２０～４８０ｎｍ）波長で吸光度を測定し、増殖率を確認した。

図１３から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［インターフェロン－γ］を前処理した間葉系幹細胞の細胞増殖率が、１から２．４２へと約２４２％増加した。

５－２．インターフェロン－γ処理による幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の増強

１０ｍＬ培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］が含まれた１００ｍｍ細胞培養皿（ｄｉｓｈ）に、間葉系幹細胞及び前記実施例のインターフェロン－γで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、皿当たりに１０００細胞ずつ播種して２１日間培養した。培養された細胞が付着した皿をＰＢＳで２回洗浄し、常温で、約２分間９５％メタノールで固定した。固定された細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％クリスタルバイオレット溶液［ｃｒｙｓｔａｌｖｉｏｌｅｔ（ｓｉｇｍａ，Ｃ－３８８６，ＵＳＡ）５ｇ、メタノール１００ｍｌ］を添加して５分間染色し、水で洗浄後に室温で乾燥させた。各皿で５０個以上の細胞で構成されたコロニーの数を計数して比較した。

図１４Ａ及び図１４Ｂから確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞（２８．６個）に比べて、幹細胞前処理物質［インターフェロン－γ］を前処理した間葉系幹細胞の細胞（１３６個）のＣＦＵ－Ｆコロニー数が約４７６％増加した。

実験例６．インターフェロン－γ処理によるエクソソーム生産効率の増加

６－１．インターフェロン－γ処理によるエクソソーム数の増加

ナノパーティクルトラッキングアッセイ（ＮａｎｏＳｉｇｈｔＮＳ３００，Ｍａｌｖｅｒｎ）により、前記実施例で分離されたエクソソーム数を確認した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームの数を確認した。結果を、下記の表７、図１５及び図１６に示す。

（ＭＳＣ：未処理間葉系幹細胞、ＩＦＮγ ＭＳＣ：インターフェロン－γ処理間葉系幹細胞）

前記表７及び図１６から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［インターフェロン－γ］を前処理した間葉系幹細胞において約６．７倍多い数のエクソソームが生産された。

６－２．インターフェロン－γ処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加

エクソソームタンパク質分離キット（ＴｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームからタンパク質を分離し、ブラッドフォード分析（ｂｒａｄｆｏｒｄａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて５９５ｎｍで吸光度を測定し、タンパク質を定量した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームからタンパク質を分離して定量した。結果を、下記の表８及び図１７に示す。

前記表８及び図１７から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［インターフェロン－γ］を前処理した間葉系幹細胞において約６．２倍多い量のエクソソーム由来タンパク質が生産された。

６－３．インターフェロン－γ処理によるエクソソーム由来ＲＮＡ量の増加

ＲＮＡ分離用キット（ＴｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームから全エクソソームＲＮＡを分離し、ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いてＲＮＡの濃度を測定した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームから全エクソソームＲＮＡを分離して濃度を測定した。結果を、下記の表９及び図１８に示す。

前記表９及び図１８から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［インターフェロン－γ］を前処理した間葉系幹細胞において約５．０倍多い量のエクソソーム由来ＲＮＡが生産された。

前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来ＲＮＡ（ｅｘｏｓｏｍａｌＲＮＡ）の含有量も増加することが分かる。

実験例７．テトランドリン処理による幹細胞機能強化

７－１．テトランドリン処理による幹細胞増殖率（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の増加

１００ｕＬ培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］が含まれた９６ウェルプレートに、間葉系幹細胞及び前記実施例のテトランドリンで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、ウェル当たりに３０００細胞ずつ播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、２４時間、ＣＯ_２培養器で培養した。その後、ＣＣＫ溶液（１０ｕＬ／ウェル）を添加し、ＣＯ_２培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で４時間培養した後、４５０ｎｍ（４２０～４８０ｎｍ）波長で吸光度を測定し、増殖率を確認した。

図１９から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［テトランドリン］を前処理した間葉系幹細胞の細胞増殖率が、１から２．６へと約２６０％増加した。

７－２．テトランドリン処理による幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の増強

１０ｍＬ培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］が含まれた１００ｍｍ細胞培養皿（ｄｉｓｈ）に、間葉系幹細胞及び前記実施例のテトランドリンで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、皿当たりに１０００細胞ずつ接種して２１日間培養した。培養された細胞が付着した皿をＰＢＳで２回洗浄し、常温で、約２分間９５％メタノールで固定した。固定された細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％クリスタルバイオレット溶液［ｃｒｙｓｔａｌｖｉｏｌｅｔ（ｓｉｇｍａ，Ｃ－３８８６，ＵＳＡ）５ｇ、メタノール１００ｍｌ］を添加して５分間染色し、水で洗浄後に室温で乾燥させた。各皿で５０個以上の細胞で構成されたコロニーの数を計数して比較した。

図２０Ａ及び図２０Ｂから確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞（２８．７個）に比べて、幹細胞前処理物質［テトランドリン］を前処理した間葉系幹細胞の細胞（１２１．３個）のＣＦＵ－Ｆコロニー数が約４２３％増加した。

実験例８．テトランドリン処理によるエクソソーム生産効率の増加

８－１．テトランドリン処理によるエクソソーム数の増加

ナノパーティクルトラッキングアッセイ（ＮａｎｏＳｉｇｈｔＮＳ３００，Ｍａｌｖｅｒｎ）により、前記実施例で分離されたエクソソーム数を確認した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームの数を確認した。結果を、下記の表１０、図２１及び図２２に示す。

（ＭＳＣ：未処理間葉系幹細胞、ＴｅｔＭＳＣ：テトランドリン処理間葉系幹細胞）

前記表１０及び図２２から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［テトランドリン］を前処理した間葉系幹細胞において約４．３倍多い数のエクソソームが生産された。

８－２．テトランドリン処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加

エクソソームタンパク質分離キット（ＴｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームからタンパク質を分離し、ブラッドフォード分析（ｂｒａｄｆｏｒｄａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて５９５ｎｍで吸光度を測定し、タンパク質を定量した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームからタンパク質を分離して定量した。結果を、下記の表１１及び図２３に示す。

前記表１１及び図２３から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［テトランドリン］を前処理した間葉系幹細胞において約４．５倍多い量のエクソソーム由来タンパク質が生産された。

８－３．テトランドリン処理によるエクソソーム由来ＲＮＡ量の増加

ＲＮＡ分離用キット（ＴｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームから全エクソソームＲＮＡを分離し、ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いてＲＮＡの濃度を測定した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームから全エクソソームＲＮＡを分離して濃度を測定した。結果を、下記の表１２及び図２４に示す。

前記表１２及び図２４から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［テトランドリン］を前処理した間葉系幹細胞において約４．４倍多い量のエクソソーム由来ＲＮＡが生産された。

実験例９．ヒアルロン酸処理による幹細胞機能強化

９－１．ヒアルロン酸処理による幹細胞増殖率（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の増加

１００ｕＬ培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］が含まれた９６ウェルプレートに、間葉系幹細胞及び前記実施例のヒアルロン酸で前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、ウェル当たりに３０００細胞ずつ播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、２４時間、ＣＯ_２培養器で培養した。その後、ＣＣＫ溶液（１０ｕＬ／ウェル）を添加し、ＣＯ_２培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で４時間培養した後、４５０ｎｍ（４２０～４８０ｎｍ）波長で吸光度を測定し、増殖率を確認した。

図２５から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［ヒアルロン酸］を前処理した間葉系幹細胞の細胞増殖率が、１から３．６へと約３６４％増加した。

９－２．ヒアルロン酸処理による幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の増強

１０ｍＬ培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］が含まれた１００ｍｍ細胞培養皿（ｄｉｓｈ）に、間葉系幹細胞及び前記実施例のヒアルロン酸で前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、皿当たりに１０００細胞ずつ播種して２１日間培養した。培養された細胞が付着した皿をＰＢＳで２回洗浄し、常温で、約２分間９５％メタノールで固定した。固定された細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％クリスタルバイオレット溶液［ｃｒｙｓｔａｌｖｉｏｌｅｔ（ｓｉｇｍａ，Ｃ－３８８６，ＵＳＡ）５ｇ、メタノール１００ｍｌ］を添加して５分間染色し、水で洗浄後に室温で乾燥させた。各皿で５０個以上の細胞で構成されたコロニーの数を計数して比較した。

図２６Ａ及び図２６Ｂから確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞（２８．６個）に比べて、幹細胞前処理物質［ヒアルロン酸］を前処理した間葉系幹細胞の細胞（１６７．６個）のＣＦＵ－Ｆコロニー数が約５８６％増加した。

実験例１０．ヒアルロン酸処理によるエクソソーム生産効率の増加

１０－１．ヒアルロン酸処理によるエクソソーム数の増加

ナノパーティクルトラッキングアッセイ（ＮａｎｏＳｉｇｈｔＮＳ３００，Ｍａｌｖｅｒｎ）により、前記実施例で分離されたエクソソーム数を確認した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームの数を確認した。結果を、下記の表１３、図２７及び図２８に示す。

（ＭＳＣ：未処理間葉系幹細胞、ＨＡＭＳＣ：ヒアルロン酸処理間葉系幹細胞）

前記表１３及び図２８から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［ヒアルロン酸］を前処理した間葉系幹細胞において約５．２倍多い数のエクソソームが生産された。

前記結果から、本発明に係る前記幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理時に、間葉系幹細胞が生産するエクソソームの数が増加することが分かる。

１０－２．ヒアルロン酸処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加

エクソソームタンパク質分離キット（ＴｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームからタンパク質を分離し、ブラッドフォード分析（ｂｒａｄｆｏｒｄａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて５９５ｎｍで吸光度を測定し、タンパク質を定量した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームからタンパク質を分離して定量した。結果を、下記の表１４及び図２９に示す。

前記表１４及び図２９から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［ヒアルロン酸］を前処理した間葉系幹細胞において約５．３５倍多い量のエクソソーム由来タンパク質が生産された。

１０－３．ヒアルロン酸処理によるエクソソーム由来ＲＮＡ量の増加

ＲＮＡ分離用キット（ＴｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームから全エクソソームＲＮＡを分離し、ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いてＲＮＡの濃度を測定した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームから全エクソソームＲＮＡを分離して濃度を測定した。結果を、下記の表１５及び図３０に示す。

前記表１５及び図３０から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［ヒアルロン酸］を前処理した間葉系幹細胞において約５．３倍多い量のエクソソーム由来ＲＮＡが生産された。

実験例１１．Ｐ物質処理による幹細胞機能強化

１１－１．Ｐ物質処理による幹細胞増殖率（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の増加

１００ｕＬ培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］が含まれた９６ウェルプレートに、間葉系幹細胞及び前記実施例のＰ物質で前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、ウェル当たりに３０００細胞ずつ播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、２４時間、ＣＯ_２培養器で培養した。その後、ＣＣＫ溶液（１０ｕＬ／ウェル）を添加し、ＣＯ_２培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で４時間培養した後、４５０ｎｍ（４２０～４８０ｎｍ）波長で吸光度を測定し、増殖率を確認した。

図３１から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［Ｐ物質］を前処理した間葉系幹細胞の細胞増殖率が、１から２．９へと約２９０％増加した。

１１－２．Ｐ物質処理による幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の増強

１０ｍＬ培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］が含まれた１００ｍｍ細胞培養皿（ｄｉｓｈ）に、間葉系幹細胞及び前記実施例のＰ物質で前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、皿当たりに１０００細胞ずつ播種して２１日間培養した。培養された細胞が付着した皿をＰＢＳで２回洗浄し、常温で、約２分間９５％メタノールで固定した。固定された細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％クリスタルバイオレット溶液［ｃｒｙｓｔａｌｖｉｏｌｅｔ（ｓｉｇｍａ，Ｃ－３８８６，ＵＳＡ）５ｇ、メタノール１００ｍｌ］を添加して５分間染色し、水で洗浄後に室温で乾燥させた。各皿で５０個以上の細胞で構成されたコロニーの数を計数して比較した。

図３２Ａ及び図３２Ｂから確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞（２８．７個）に比べて、幹細胞前処理物質［Ｐ物質］を前処理した間葉系幹細胞の細胞（１１６個）のＣＦＵ－Ｆコロニー数が約４０４％増加した。

実験例１２．Ｐ物質処理によるエクソソーム生産効率の増加

１２－１．Ｐ物質処理によるエクソソーム数の増加

ナノパーティクルトラッキングアッセイ（ＮａｎｏＳｉｇｈｔＮＳ３００，Ｍａｌｖｅｒｎ）により、前記実施例で分離されたエクソソーム数を確認した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームの数を確認した。結果を、下記の表１６、図３３及び図３４に示す。

（ＭＳＣ：未処理間葉系幹細胞、ＳｕｂｓＰＭＳＣ：Ｐ物質処理間葉系幹細胞）

前記表１６及び図３４から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［Ｐ物質］を前処理した間葉系幹細胞において約４．３倍多い数のエクソソームが生産された。

１２－２．Ｐ物質処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加

エクソソームタンパク質分離キット（ＴｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームからタンパク質を分離し、ブラッドフォード分析（ｂｒａｄｆｏｒｄａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて５９５ｎｍで吸光度を測定し、タンパク質を定量した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームからタンパク質を分離して定量した。結果を、下記の表１７及び図３５に示す。

前記表１７及び図３５から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［Ｐ物質］を前処理した間葉系幹細胞において約５．２倍多い量のエクソソーム由来タンパク質が生産された。

１２－３．Ｐ物質処理によるエクソソーム由来ＲＮＡ量の増加

ＲＮＡ分離用キット（ＴｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームから全エクソソームＲＮＡを分離し、ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いてＲＮＡの濃度を測定した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームから全エクソソームＲＮＡを分離して濃度を測定した。結果を、下記の表１８及び図３６に示す。

前記表１８及び図３６から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［Ｐ物質］を前処理した間葉系幹細胞において約４．９倍多い量のエクソソーム由来ＲＮＡが生産された。

実験例１３．レスベラトロール処理による幹細胞機能強化

１３－１．レスベラトロール処理による幹細胞増殖率（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の増加

１００ｕＬ培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］が含まれた９６ウェルプレートに、間葉系幹細胞及び前記実施例のレスベラトロールで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、ウェル当たりに３０００細胞ずつ播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、２４時間、ＣＯ_２培養器で培養した。その後、ＣＣＫ溶液（１０ｕＬ／ウェル）を添加し、ＣＯ_２培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で４時間培養した後、４５０ｎｍ（４２０～４８０ｎｍ）波長で吸光度を測定し、増殖率を確認した。

図３７から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［レスベラトロール］を前処理した間葉系幹細胞の細胞増殖率が、１から３．２２へと約３２２％増加した。

１３－２．レスベラトロール処理による幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の増強

１０ｍＬ培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］が含まれた１００ｍｍ細胞培養皿（ｄｉｓｈ）に、間葉系幹細胞及び前記実施例のレスベラトロールで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、皿当たりに１０００細胞ずつ播種して２１日間培養した。培養された細胞が付着した皿をＰＢＳで２回洗浄し、常温で、約２分間９５％メタノールで固定した。固定された細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％クリスタルバイオレット溶液［ｃｒｙｓｔａｌｖｉｏｌｅｔ（ｓｉｇｍａ，Ｃ－３８８６，ＵＳＡ）５ｇ、メタノール１００ｍｌ］を添加して５分間染色し、水で洗浄後に室温で乾燥させた。各皿で５０個以上の細胞で構成されたコロニーの数を計数して比較した。

図３８Ａ及び図３８Ｂから確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞（２８．６個）に比べて、幹細胞前処理物質［レスベラトロール］を前処理した間葉系幹細胞の細胞（３１１個）のＣＦＵ－Ｆコロニー数が約１０８７％増加した。

実験例１４．レスベラトロール処理によるエクソソーム生産効率の増加

１４－１．レスベラトロール処理によるエクソソーム数の増加

ナノパーティクルトラッキングアッセイ（ＮａｎｏＳｉｇｈｔＮＳ３００，Ｍａｌｖｅｒｎ）により、前記実施例で分離されたエクソソーム数を確認した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームの数を確認した。結果を、下記の表１９、図３９及び図４０に示す。

（ＭＳＣ：未処理間葉系幹細胞、ＲｅｓｖＭＳＣ：レスベラトロール処理間葉系幹細胞）

前記表１９及び図４０から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［レスベラトロール］を前処理した間葉系幹細胞において約５．２倍多い数のエクソソームが生産された。

１４－２．レスベラトロール処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加

エクソソームタンパク質分離キット（ＴｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームからタンパク質を分離し、ブラッドフォード分析（ｂｒａｄｆｏｒｄａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて５９５ｎｍで吸光度を測定し、タンパク質を定量した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームからタンパク質を分離して定量した。結果を、下記の表２０及び図４１に示す。

前記表２０及び図４１から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［レスベラトロール］を前処理した間葉系幹細胞において約５．４倍多い量のエクソソーム由来タンパク質が生産された。

１４－３．レスベラトロール処理によるエクソソーム由来ＲＮＡ量の増加

ＲＮＡ分離用キット（ＴｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームから全エクソソームＲＮＡを分離し、ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いてＲＮＡの濃度を測定した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームから全エクソソームＲＮＡを分離して濃度を測定した。結果を、下記の表２１及び図４２に示す。

前記表２１及び図４２から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［レスベラトロール］を前処理した間葉系幹細胞において約４．７倍多い量のエクソソーム由来ＲＮＡが生産された。

実験例１５．ラニフィブラノール処理による幹細胞機能強化

１５－１．ラニフィブラノール処理による幹細胞増殖率（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の増加

１００ｕＬ培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］が含まれた９６ウェルプレートに、間葉系幹細胞及び前記実施例のラニフィブラノールで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、ウェル当たりに３０００細胞ずつ播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、２４時間、ＣＯ_２培養器で培養した。その後、ＣＣＫ溶液（１０ｕＬ／ウェル）を添加し、ＣＯ_２培養器（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で４時間培養した後、４５０ｎｍ（４２０～４８０ｎｍ）波長で吸光度を測定し、増殖率を確認した。

図４３から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［ラニフィブラノール］を前処理した間葉系幹細胞の細胞増殖率が、１から１．８１へと約１８１％増加した。

１５－２．ラニフィブラノール処理による幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の増強

１０ｍＬ培養培地［高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１９９５－０６５）、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔｎｏ．１１１４０－０５０）］が含まれた１００ｍｍ細胞培養皿（ｄｉｓｈ）に、間葉系幹細胞及び前記実施例のラニフィブラノールで前処理された間葉系幹細胞をそれぞれ、皿当たりに１０００細胞ずつ播種して２１日間培養した。培養された細胞が付着した皿をＰＢＳで２回洗浄し、常温で、約２分間９５％メタノールで固定した。固定された細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、０．５％クリスタルバイオレット溶液［ｃｒｙｓｔａｌｖｉｏｌｅｔ（ｓｉｇｍａ，Ｃ－３８８６，ＵＳＡ）５ｇ、メタノール１００ｍｌ］を添加して５分間染色し、水で洗浄後に室温で乾燥させた。各皿で５０個以上の細胞で構成されたコロニーの数を計数して比較した。

図４４Ａ及び図４４Ｂから確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞（４０個）に比べて、幹細胞前処理物質［ラニフィブラノール］を前処理した間葉系幹細胞の細胞（５６．７個）のＣＦＵ－Ｆコロニー数が約１４２％増加した。

実験例１６．ラニフィブラノール処理によるエクソソーム生産効率の増加

１６－１．ラニフィブラノール処理によるエクソソーム数の増加

ナノパーティクルトラッキングアッセイ（ＮａｎｏＳｉｇｈｔＮＳ３００，Ｍａｌｖｅｒｎ）により、前記実施例で分離されたエクソソーム数を確認した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームの数を確認した。結果を、下記の表２２、図４５及び図４６に示す。

（ＭＳＣ：未処理間葉系幹細胞、Ｌａｎｉ－ＭＳＣ－Ｅｘｏ：ラニフィブラノール処理間葉系幹細胞）
前記表２２及び図４６から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［ラニフィブラノール］を前処理した間葉系幹細胞において約４．９５倍多い数のエクソソームが生産された。

１６－２．ラニフィブラノール処理によるエクソソーム由来タンパク質量の増加

エクソソームタンパク質分離キット（ＴｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームからタンパク質を分離し、ブラッドフォード分析（ｂｒａｄｆｏｒｄａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて５９５ｎｍで吸光度を測定し、タンパク質を定量した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームからタンパク質を分離して定量した。結果を、下記の表２３及び図４７に示す。

（ＭＳＣ：未処理間葉系幹細胞、Ｌａｎｉ－ＭＳＣ－Ｅｘｏ：ラニフィブラノール処理間葉系幹細胞）

前記表２３及び図４７から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質［ラニフィブラノール］を前処理した間葉系幹細胞において約４．６倍多い量のエクソソーム由来タンパク質が生産された。

１６－３．ラニフィブラノール処理によるエクソソーム由来ＲＮＡ量の増加

ＲＮＡ分離用キット（ＴｏｔａｌｅｘｏｓｏｍｅＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記実施例で分離されたエクソソームから全エクソソームＲＮＡを分離し、ナノドロップ（ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いてＲＮＡの濃度を測定した。このとき、比較のために、何ら前処理物質を処理していない以外は、実施例と同じ方法で分離されたエクソソームから全エクソソームＲＮＡを分離して濃度を測定した。結果を、下記の表２４及び図４８に示す。

前記表２４及び図４８から確認できるように、何ら物質を処理していない間葉系幹細胞に比べて、幹細胞前処理物質（ラニフィブラノール）を前処理した間葉系幹細胞において約４．１倍多い量のエクソソーム由来ＲＮＡが生産された。

結び

本発明に係る幹細胞前処理物質（エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（Ｐｈｏｒｂｏｌ１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３－ａｃｅｔａｔｅ；ＰＭＡ）、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）又はラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ））を間葉系幹細胞に処理すると、幹細胞の幹細胞能（Ｓｔｅｍｎｅｓｓ）が増加することが分かる。また、本発明に係る幹細胞前処理物質を間葉系幹細胞に処理すると、エクソソームの数の他に、エクソソーム由来タンパク質（ｅｘｏｓｏｍａｌｐｒｏｔｅｉｎ）の生産量も、エクソソーム由来ＲＮＡ（ｅｘｏｓｏｍａｌＲＮＡ）の含有量も増加することが分かる。

したがって、本発明に係る幹細胞前処理物質（エキセンジン－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）、ホルボール１２－ミリステート１３－酢酸（Ｐｈｏｒｂｏｌ１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３－ａｃｅｔａｔｅ；ＰＭＡ）、インターフェロン－ガンマ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、テトランドリン（Ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ）、ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）、Ｐ物質（ＳｕｂｓｔａｎｃｅＰ）、レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）又はラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ））は、幹細胞の幹細胞能を増強させる他に、幹細胞由来エクソソーム生成も促進させるので、優れた機能性を有する幹細胞の生産及びエクソソームの大量生産用途への使用が期待される。

Claims

ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）を含むことを特徴とする幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物。
前記幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、又は人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）である、請求項１に記載の幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物。
前記成体幹細胞は、ヒト若しくは動物組織起源の成体幹細胞、ヒト若しくは動物組織由来の間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌ）、又はヒト若しくは動物組織起源の人工多能性幹細胞から由来した間葉系幹細胞である、請求項２に記載の幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物。
前記ヒト若しくは動物組織は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、及び胎盤からなる群から選ばれる、請求項３に記載の幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物。
前記ヒト若しくは動物組織起源の成体幹細胞は、造血幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、血管内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚神経幹細胞、及び精巣幹細胞からなる群から選ばれる、請求項３に記載の幹細胞由来エクソソーム生成促進用組成物。
次の段階を含むことを特徴とする幹細胞由来エクソソームの生産方法：
ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）を含む細胞培養培地で幹細胞を培養する段階。
次の段階をさらに含む、請求項６に記載の幹細胞由来エクソソームの生産方法：
培養された幹細胞を洗浄した後、細胞培養培地でさらに培養する段階；及び
エクソソームを分離する段階。
前記細胞培養培地は、エクソソームが除去されたウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）を含む、請求項６に記載の幹細胞由来エクソソームの生産方法。
前記幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞又は人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ；ｉＰＳＣ）である、請求項６に記載の幹細胞由来エクソソームの生産方法。