KR20190097468A

KR20190097468A - 오리나무 추출물을 함유하는 탈모 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20190097468A
Application number: KR1020180016938A
Authority: KR
Inventors: 최선은; 박광현; 이경화; 진혜영; 이용조
Original assignee: 남부대학교산학협력단
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2018-02-12
Publication date: 2019-08-21
Also published as: CN110151802A

Abstract

본 발명은 세포 사멸 억제 활성 및 항산화 활성을 가진 오리나무 추출물을 포함하여, 탈모 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

Description

오리나무 추출물을 함유하는 탈모 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물 {COMPOISTION CONTAINING ALNUS JAPONICA FOR PREVENTING, TREATING OR IMPROVING HAIR LOSS}

본 발명은 오리나무 추출물을 함유하는 탈모 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물 에 관한 것이다.

국내 자생하는 오리나무(Alnus japonica)의 가지를 한방에서는 적양이라 부르며 청열, 강화 작용이 있는 것으로 알려져 있으며, 민간에서는 고열, 육혈, 설사, 치통, 숙취해소, 암 등에 쓰여온 것으로 알려져 있다. (비특허문헌 1)

한편, red alder라고 불리는 같은 속 식물인 A. rubra 는 북아메리카에서는 만성 헤르페스질환, 습진, 소양증 등 다양한 만성 난치성 피부질환에 쓰여 온 것을 알 수 있었다. (비특허문헌 2)

A. 속 식물들은 동양과 서양에서 예로부터 다양한 질환 중 특히 피부질환들에 대해서 공통적으로 사용되어 왔던 점을 알 수 있었다.

최근까지 A. 속 식물로부터 diarylheptanoid 계열의 화합물을 분리하고, 항산화활성, 항염증활성, 항아토피활성 등에 대한 A. 속 식물의 자원의 활용성에 대한 연구가 다수 발표 되었다. (비특허문헌 3 및 4)

이렇게 강력하고 효과적인 생리활성의 주효 효능 물질로서는 A. 속 식물에서 높은 함량으로 존재하는 주된 diarylheptanoid계열 화합물로 알려진 oregonin이 핵심적인 역할을 하는 것으로 판단된다. 그 이유는 A. 속 식물의 화학적 계통 분류 연구에 있어서 지표 물질로서 oregonin을 중점적으로 연구하는 국내외 연구동향을 살펴보면 알 수 있다. (비특허문헌 5 및 6)

본 연구에서 주로 수행한 연구내용인 세포사멸과 웨스턴 블랏팅 실험에서 측정한 바이오 마커 즉, Bcl-2, Bax, caspase-3, PARP 이들에 대한 과학적 근거는 다음과 같다. 세포가 내외부의 요인으로 인해 죽음에 이르는 것을 크게 세포사멸(apoptosis)와 세포괴사(necrosis) 로 구분할 수 있다.

이 가운데 세포사멸은 세포 내부의 신호에 따른 여러 단백질 활성의 조절과 유전자의 발현을 통하여 프로그램화된 세포 사멸의 과정으로 일어나는 능동적으로 진행되는 세포의 죽음으로 알려져 있다. (비특허문헌 7)

외부 요소로서 대표적인 것은 방사선, 고열 충격, 독소, 박테리아나 바이러스에 의한 감염 등에 의한 세포의 손상이나 심한 스트레스로 세포사멸 반응이 나타나며, 그 이상은 다양한 질병을 초래하는데 정상적인 세포의 사멸을 유도하는 것은 장기의 손상과 연관될 수 있다.

세포사멸과 관련된 유전자 중 대표적인 것은 세포사멸을 억제하는 유전자인 Bcl-2와 Bcl-2를 유도하는 유전자인 Bax가 존재하여 길항적으로 조절되는 것으로 보고되고 있다. (비특허문헌 8)

또한, 세포사멸을 유도하는 경로에서 활성화되는 단백질 분해효소 (protease) 중, caspase들은 세포가 사멸하는 과정에서 각 소기관별로 다양하게 활성화되는 가장 중요한 실행자로 알려져 있으며, 이 효소의 활성을 통하여 세포사멸의 정도 및 경로를 파악할 수 있다. (비특허문헌 9)

Caspase 계열의 효소가 활성화되면 다양한 표적 단백질들을 분해하여 세포사멸을 비가역적으로 진행시키게 되는데, 특히 caspase-3는 DNA repair, DNA stability 및 전사조절에 관여하는 PARP 단백질 등의 발현을 증대시키고 PARP 단백질의 절단을 유도하고 최종적인 세포 사멸 단계로 접어들게 된다. (비특허문헌 10)

따라서 정상세포에서 세포사멸을 유도하는 외부 자극, 예를 들면 약물 또는 산화적 스트레스 등으로 인해 세포 사멸에 이르게 되는 것을 차단하기 위해서는 상기에 기술된 factor 등의 발현을 조절하는 것은 매우 중요하다.

한편, 유전적 요인을 포함한 다양한 직접 또는 간접적인 영향들로 인해 탈모환자가 급증하고 있고, 탈모증상이 발병하는 연령층이 점점 낮아지고 있는 심각한 추세라고 할 수 있다. (비특허문헌 11)

탈모증상으로 인하여 심각한 정신적 스트레스로 인해 사회활동에 지장을 느낄 수 있다는 점에서, 탈모증상의 개선 또는 치료를 단순히 미용목적을 위한 것이라고만 볼 수 없는 실정이다.

이렇게 탈모증상에 대한 문제가 크게 이슈화되면서 신규 기능성 소재 개발에 많은 노력이 이루어지고 있지만, 명확한 효능이 있으면서, 인체에 안전성이 확보된 천연물 유래 탈모 증상 개선 및 치료 신소재를 발굴하려는 연구가 꾸준히 진행되고 있다. (비특허문헌 12)

Lee S. J. 1966. Korea folk medicine, Seoul National University Publishing Center Press, Seoul, 40. Boericke, W. 1927. Pocket Manual of Homeopathic Materia Medica with Repertory (Ninth Edition). Boericke & Tafel, INC. Santa Rosa, CA. 24. Choi, S.E., K.H. Park, M.H. Kim, J.H. Song, H.Y. Jin, and M.W. Lee, 2012. Diarylheptanoids from the Bark of Alnus pendula Matsumura. Nat. Prod. Sci. 18:106. Choi, S.E., M.S. Jeong, M.J. Kang, D.I. Lee, S.S. Joo, C.S. Lee, H. Bang, M.K. Lee, S.C. Myung, Y.W. Choi, K. Lee, S.J. Seo, and M.W. Lee. 2010. Effect of topical application and intraperitoneal injection of oregonin on atopic dermatitis in NC/Nga mice. Exp. Dermatol. 19:e37-e43. Choi, S.E. 2013. Chemotaxonomic significance of oregonin in Alnus species. Asian J. Chem. 25:6989. Lim, H.W., M.K. Kim, H.J. Kim, J.G. Shim, G.H. Kim, H.K. Choi and M.W. Lee. 2004. Quantitative determination of diarylheptanoid compounds from Korean Alnus. Kor. J. Pharmacogn. 35:384-387. Clarke, P.G., S. Clarke. 1995. Historic apoptosis. Nature. 378:230. Alnermri, E. S. 1997. Mammalian cell death proteases: a family of highly conserved aspartate specific cystein proteases. J. Cell. Biochem. 64:32-42. Zhap, Z.Q., J.M. Budde, C. Morris, N.P. Wang, D.A. Velez, S. Murak, R.A. Guyton and J.J. Vinten. 2001. Adenosine attenuated reperfusion induced apoptotic cell death by modulation expression of Bcl-2 and Bax proteins. J. Mol. Cell. Cardiol. 33:57-68. Muller S, J.P. Briand, S. Barakat, J. Lagueux, G.G. Poirier, G. De Murcia and D.A. Isenberg. 1994. Autoantibodies reacting with poly(ADP-ribose) and with a zinc-finger functional domain of poly(ADP-ribose) polymerase involved in the recognition of damaged DNA. Clin. Immunol. Immunopathol. 73 :187-96. Park, Y. O. and Kim, Y. C. (2008) The Effects of Chamaecyparis Obtusa Oil on the Activities of enzyme relevant to hair growth. J. Kor. Soc. Cosm. 14: 355-364. Kim, J. H., Sang, M. Y., Choi, J. E. and Son, S. W. (2009) Study of the efficacy of Korean red ginseng in the treatment of androgenic alopecia. J. Ginseng Res. 33: 223-228. Hatano, T., Edamatsu, R., Hiramatsu, M., Mori, A., Fujita, Y., Yasuhara, T., Yoshida, T., and Okuda, T. (1989), Effects of the interaction of tannins with co-existing substances. Ⅵ. Effects of tannins and ralated polyphenols on superoxide anion radical, and on 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl radical, Chem. Pharm. Bull. 37: 2016-2021. Re, R., N. Pellegrini, A. Proteggente, A. Pannala, M. Yang, and C.Rice-Evans. (1999) Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Rad. Biol. Med. 26: 1231-1237. Boivin, W.A., Jiang, H., Utting, O. B. and Hunt, D. W. C. 2006. Influence of interleukin-1α on androgen receptor expression and cytokine secretion by cultured human dermal papilla cells. Exp. Dermatol. 15:784-793. Burnette, W. N. 1981. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 112:195203. Kim, H. J., K.H. Kim, S.H. Yeom, M.K. Kim, J.G. Shim, H.W. Lim, and M.W. Lee. 2005. New diarylheptanoids from the barks of Alnus japonica Steudel, Chin. Chem. Lett. 16(10):1337-1340. Oltvai, Z.N., C.L. Milliman and S.J. Korsmeyer. 1993. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell. 74:60919. Sedlak, T.W., Z.N. Oltvai, E. Yang, K. Wang, L.H. Boise, C.B. Thompson and S.J. Korsmeyer. 1995. Multiple Bcl-2 family members demonstrate selective dimerizations with Bax. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:78347838. Tsujimoto, Y., L.R. Finger, J. Yunis, P.C. Nowell and C.M. Croce. 1984. Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t(14;18) chromosome translocation. Science. 226:10971099. Cleary, M. L., S.D. Smith, and J. Sklar. 1986 Cloning and structural analysis of cDNAs for bcl-2 and a hybrid bcl-2/immunoglobulin transcript resulting from the t(14;18) translocation. Cell. 47:1928. Godon, C., F.P. Cordelieres, D. Biard, N. Giocanti, F. Megnin-Chanet, J. Hall and V. Favaudon. 2008. PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility. Nucleic Acids Research. 36:44544464. Schultz, N., E. Lopez, N. Saleh-Gohari and T. Helleday. 2003. Poly(ADP-ribose) polymerase (PARP-1) has a controlling role in homologous recombination. Nucleic Acids Res. 31:49594964. Alnemri, E. S., Livingston, D. J., Nicholson, D. W., Salvesen, G., Thornberry, N. A., Wong, W. W. and Yuan, J. 1996. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell. 87:171. Harrington, H. A., L.K. Ho, S. Ghosh and K.C. Tung 2008. Construction and analysis of a modular model of caspase activation in apoptosis. Theor. Biol. Med. Model. 5:26.

본 발명의 일 목적은 오리나무 추출물을 유효성분으로 포함하여, 모낭의 발달과 성장을 조절하는 기관인 모유두에 위치한 모유두 세포(Hair Follicle Dermal Papilla Cell, HFDPC)의 세포 사멸을 억제 활성 및 항산화 활성을 가진 탈모 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 제공하고자 한다.

본 연구는 모낭의 발달과 성장을 조절하는 기관인 모유두에 위치한 모유두 세포의 사멸로 인해 탈모증상이 악화되는 실험모델을 활용하여, 오리나무로부터 추출한 오레고닌(oregonin)이 모유두 세포의 세포 사멸을 효과적으로 억제하는지에 대한 가능성을 검토하기 위하여 본 연구를 수행하였다.

본 발명의 일 구현 예는, 오리나무 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 모유두 세포의 세모 사멸에 대한 억제 활성 및 항산화 활성을 갖는 약학 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 오리나무는 가지, 잎, 열매, 수피, 뿌리 등의 부위를 사용할 수 있으며 바람직하게는 오리나무 가지를 사용할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서, 오리나무 추출물은 그 추출 방법에 있어 단순한 추출방법에서부터 지용성 성분까지 추출할 수 있는 모든 방법이 적용될 수 있으며, 추출이 용이하도록 분쇄하여 추출 용매에 의해 추출하고 이를 여과 및 농축하여 얻을 수 있다.

추출 용매로는 물, 에탄올, 메탄올, 부탄올, n-헥산, n-헵탄 또는 DMSO 등이 있고 이들 중 2 이상의 용매를 혼합하여 추출 용매로 사용할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 추출하고자 하는 원료의 양, 추출 방법 등에 따라 당업자가 공지의 방법으로부터 적절히 선택할 수 있다. 추출 시간 및 온도도 추출 효율, 추출 용매 등을 고려하여 당업자가 공지의 방법으로부터 적절히 선택 가능하다.

또한, 추출 방법에 의해 추출된 추출물을 감압 여과 등의 공지의 여과 방법에 의해 여과한 후 증류 등에 의해 농축할 수 있다. 이와 같은 추출, 여과 및 농축 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 따라서 당업자는 이를 적절히 선택하여 오리나무 추출물을 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예는 오리나무 추출물을 함유하는 탈모 질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

한편, 본 발명에서, "예방"은 모유두 세포의 세포 사멸을 억제하고, 항산화 활성을 가진 본 발명의 오리나무 추출물을 포함하는 조성물을 이용하여, 탈모 질환의 증상을 차단하거나, 그 증상의 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서, "치료"는 모유두 세포의 세포 사멸을 억제하고, 항산화 활성을 가진 본 발명의 오리나무 추출물을 포함하는 조성물을 이용하여 탈모 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.

본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예는, 오리나무 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 탈모 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

한편, 본 발명에서, "개선"은 모유두 세포의 세포 사멸을 억제하고, 항산화 활성을 가진 본 발명의 오리나무 추출물을 포함하는 조성물을 이용하여 탈모 질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명에서 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제{화장용}, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜 워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다.

이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 물, 식염수, DMSO 또는 이들의 조합을 사용할 수 있고, 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다.

오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.

지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면 활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다.

그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.

본 발명의 또 다른 구현 예는, 오리나무 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 탈모 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 오리나무 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 모유두 세포의 세포 사멸에 기인한 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식물추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있다.

여기서, 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.

그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에 따른 약학 조성물, 화장료 조성물 및 식품 조성물은 모유두 세포의 세포 사멸을 억제하고, 항산화 활성을 가진 오리나무 추출물을 함유하여, 탈모 질환의 예방, 치료 또는 개선용으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 관한 이해를 돕기 위해 상세한 설명의 일부로 포함되는, 첨부 도면은 본 발명에 대한 실시예를 제공하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 기술적 특징을 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 오레고닌 표준품 및 오리나무 추출물 표품의 HPLC 크로마토그램을 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 오레고닌 표품의 LC/MS 스펙트럼을 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 DPPH 프리 레디칼 소거작용의 측정 데이터를 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 ABTS 프리 레디칼 소거작용의 측정 데이터를 도시한 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 오레고닌의 세포 사멸 억제 활성에 대한 실험 데이터이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실험의 준비

실험 재료

오리나무(A. japonica)는 국립수목원에서 제공받아 실험에 사용하였으며, 표준품은 남부대학교 천연 기능성 소재 연구실에서 보관하고 있다. (AJ2017-09)

실험 기기 및 시약

1H 및 13C-NMR spectra는 JEOL-JNM-AL300(300MHz, 75MHz)로 측정하였다.

High pressure liquid chromatography(HPLC)는 Waters 2695 system (USA)을 이용하였으며, 세부적으로는 2487 Dual rhamda Absorbance Detector, Guard column : Phenomenex KJ0-4282 Guard column, Column : VDSpher 100 C18-E(100A, 4.6*250mm, 5um), Column oven temperature : 25 degree celcious, Mobile phase : 1% Acetic acid(A), 1% Acetic acid in acetonitrile, Data system : Empower 2 Softwaer (Waters Co., USA)을 각각 이용하였다.

LC/MS는 Shimadzu prominence UFLC-MS system, Pump A: LC-30AD, Pump B: LC-30AD, Detector: SPD-20A, Auto sampler: SIL-20A XR, Column Oven: CTO-20A, Communications Bus Module: CBM-20A, MS: ESI-IT-TOF MS을 이용하였다.

LC condition은 Column: Waters ACQUITY UPLC^® BEH C18 2.1 x 150 mm, 1.7 um, Column Oven Temperature: 35°C, UV detector: 280 nm, injection volume: 1 ul, flow: 0.21 ml/min, Solvent A: Water in 0.1% formic acid, Solvent B: Acetonitrile, solvent condition이며, MS condition은 Nebulizing gas flow: 1.5 L/min, CDL Temperature : 200°C, Heat Block Temperature : 200°C를 각각 설정하여 실험에 활용하였다.

Thin layer chromatography (TLC) plate는 pre-coated silica gel 60 F₂₅₄ plate (Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하였다.

추출 및 분리

오리나무 가지 200g을 절단한 후 70% EtOH으로 실온에서 1회 추출하여 여과하였다. 그 추출액을 감압 농축과 동결건조를 통해 최종 23.01g을 확보 하였고, HPLC loading용으로 정량하여 실험에 사용하였다.

기존에 실험실에서 보유중인 오리나무 가지로부터 분리, 정제한 표품인 oregonin (1)을 1 mg 을 정확히 취해 80% MeOH를 가하여 전체량이 1 ㎖ 가 되도록 하여 stock solution(1000 ppm)을 조제하였다. 이 stock solution을 희석하여 125, 250, 500, 1000 ppm 농도의 표준용액을 조제하였다. 표준용액을 20㎕ 씩 취하여 표준용액이 잘 분리되는 HPLC chromatogram을 얻었다. 또한 실험의 재현성을 위해 반복실험을 통해서 표준용액과 오리나무 가지 추출물 미지검액의 retention time의 평균과 표준오차를 구하였다.

표품의 분석조건을 아래와 같이 설정한 다음, 반복정제를 통해서 oregonin 표준품과 동일한 RT값을 나타내는 peak를 수집하여 단일 화합물을 확보하여 NMR과 LC/MS데이터를 측정하였다.

분석 조건

HPLC Method 분석조건

- Mobile phase : Water (Solvent A), Acetonitrile (Solvent B)

- Gradient program : 0-12 min 10 B%, 12-24 min 25 B%, 24-25 min 40 B%

- Flow rate : 1 ml/min

- Wavelength : 280 nm

- Inject volumn : 20 ul

- Total run time : 40 min

- Column oven temperature : 25 degree celcious

- Guard column : Phenomenex KJ0-4282 Guard column

- Column : VDSpher 100 C18-E (5um, 250 X 4.6 mm)

	0 min	12 min	24 min	25 min
Solvent A(H₂0)	100	90	75	60
Solvent B (CH₃CN)	0	10	25	40

표 1은 Water(Solvent A), Acetonitrile (Solvent B)에 따른 용매계(Solvent System)의 HPLC method이다.

LC Method 분석조건

LC condition

- Column: Waters ACQUITY UPLC^® BEH C18 2.1 x 150 mm, 1.7 um Column Oven Temperature: 35°C

- UV detector: 254 nm

- injection volume: 1 ul

- flow: 0.21 ml/min

- Solvent A: Water in 0.1% formic acid

- Solvent B: Acetonitrile

MS condition

- Nebulizing gas flow: 1.5 L/min

- CDL Temperature : 200°C

- Heat Block Temperature : 200°C

	0 min	20 min	24 min	25 min	30 min
Solvent A	95	40	40	95	95
Solvent B	5	60	60	5	5

표 2는 Solvent A(Water in 0.1% formic acid) 및 Solvent B(Acetonitrile)에 대한 용매계(Solvent System)의 LC/MS method이다.

분석 결과

도 1은 오레고닌 표준품 및 오리나무 추출물 표품의 HPLC 크로마토그램의 실험 데이터를 도시한 도면이다. 구체적으로 도 1a는 오레고닌 표준품의 HPLC 크로마토그램이고, 도 1b는 오리나무 추출물 표품의 HPLC 크로마토그램이다.

Samples	Retention Time (min)
오레고닌(oregonin) 표준품	15.561±0.019
오리나무 추출물(A. japonica Extract) 표품	15.107±0.021

표 3은 오레고닌 표준품과 동일한 Retention Time을 나타내는 표품(오리나무 추출물)의 Peak Retention Time을 분석한 결과이다.

오레고닌 표품 ( Oregonin (1))

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 오레고닌 표품의 LC/MS 스펙트럼을 도시한 도면이다. 구체적으로 도 2a는 오레고닌 표품의 Positive LC/MS 스펙트럼을 도시한 도면이고, 도 2b는 오레고닌 표품의 Negative LC/MS 스펙트럼을 도시한 도면이다.

도 2를 참조하면, 오레고닌 표품의 LC/MS 스펙트럼 Positive mode는 501 [M+H]⁺이고, LC/MS 스펙트럼 Negative mode는 477 [M-H]^-이다.

¹H-NMR (300MHz, DMSO-d₆+D₂O): δ6.61-6.53(4H in total, H-2', 2'', 5', 5''), 6.42-6.37(2H in total, H-6'', 6'), 4.25(1H, brd, J=7.8Hz, xyl-1), 4.13 (1H, m, H-5), 3.72 (1H, dd, J=11.4, 6Hz xyl-5e), 3.27(1H, m, xyl-4), 3.07-2.50 (8H in total, H-1,2,4,7), 1.66-1.59 (2H in total, m, H-6).

Carbon No.	Compound 1
C-1	28.4
C-2	44.9
C-3	209.0
C-4	47.2
C-5	76.6
C-6	39.7
C-7	30.3
C-1′	132.9
C-1″	133.0
C-2′	115.4
C-2″	115.4
C-3′	145.9
C-3″	145.8
C-4′	134.1
C-4″	143.1
C-5′	115.6
C-5″	115.7
C-6′	118.8
C-6″	118.8
Xyl-1	102.6
Xyl-2	74.3
Xyl-3	16.6
Xyl-4	69.5
Xyl-5	65.8

표 4는 ¹³C-NMR (75 MHz, DMSO-d₆+D₂O)의 spectra이다.

DPPH 프리 라디칼 소거 활성 분석

DPPH 프리 래디칼 소거 활성은 비특허문헌 13에 개시된 방법에 의하여 실시하였다.

시료를 각 농도별로 조제한 용액 100㎕ (control : 99.5% ethanol) 에 0.1mM DPPH 용액 (99.5% ethanol) 1.9 ㎖을 가하였다. 각 시료는 5가지 농도로 조제하였다.

Vortex mixer로 10초간 진탕한 후 37℃에서 30분 동안 incubation 시키고, spectrophotometer를 이용하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였다.

양성 대조약물로는 L-ascorbic acid를 5가지 농도로 조제하여 측정하였다. 각 시료의 항산화작용은 IC₅₀ 치 (DPPH 래디칼 형성을 50%로 억제하는 데 필요한 농도) 로 나타내었다.

ABTS 프리 라디칼 소거 활성 분석

ABTS 라디칼 소거 활성은 비특허문헌 14에 개시된 방법을 수정하여 측정하였다.

ABTS(Sigma Co. USA) 시약을 증류수에 용해하여 7.0 mM의 농도로 준비하고, potassium perdulfate(Sigma Co. USA)를 증류수에 용해하여 2.45mM 농도로 준비하여 두 용액을 1:1 비율로 섞어서 12~16시간 동안 암실상태로 방치하여 radical stock solution을 제조하고 제조된 solution을 PBS buffer(pH 7.4)로 희석하여 750 nm에서 흡광도를 측정하여 0.7~1.0 사이의 흡광값이 나오도록 희석하여 준비하였다.

농도별로 시료를 준비하여 96 well plate에 sample:ABTS 반응 비율을 1:9 로 맞춰서 30분 동안 암실에서 반응을 시키고, 반응이 끝난 후 750 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

모유두 세포( HFDPC Cell)의 준비

모유두 세포(HFDPC cell)는 PromoCell (Heidelberg, Germany)로부터 구입하여 사용하였고, 배지는 manufacture‘s instroduction 에 준하여 선택하여 사용하였다.

모유두 세포는 37℃ 온도 및 5%의 CO2를 유지하는 incubator에서 배양하였다.

배지는 2일마다 교환하였으며, 세포의 밀도가 80 - 90%가 도달하기 이전에 계대 배양하였다. 냉동보관한 세포를 해동한 후 2∼3 passage 까지만 사용하였으며, 사용 후 세포는 고압멸균 후 폐기하였다. (비특허문헌 15)

웨스턴 블롯팅 분석(Western blotting)

세포를 PBS로 두 번 세척하고, lysis buffer (50 mMTris-HCl [pH 7.4], 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mMNaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM sodium orthovanadate, 1 mMNaF, 1 μg/mL aprotinin, 1 μg/mL leupeptin, and 1 μg/mL pepstatin)를 넣고 약 5분간 얼음에 배양시킨 후 14,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 상등액을 취해서 SDS 샘플 완충액을 넣은 후 100℃에서 5분 동안 끓여서 단백질의 변성을 유도하였다.

10% SDS PAGE를 이용하여 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 Polyvinylidene fluoride (PVDF)막에 옮겨 웨스턴 블롯팅 분석(Western blotting)을 각각의 항체를 이용하여 실시하였다. 사용된 항체는 공급처에서 제시하는 희석비율을 사용하였고, 공급처는 Santacruz (UT, USA) 및 Sigma-Aldrich Korea를 통해 구입하여 사용하였다. (비특허문헌 16)

실시예

오레고닌의 구조동정

TLC plate상에서 10%-H₂SO₄ 및 FeCl₃ 용액에 의한 발색과 ¹H, ¹³C-NMR, MS spectrum data를 비특허문헌 17과 비교하여 각각 일치함을 확인하여, 오레고닌의 구조동정을 표품 (oregonin) (1) 로 최종 동정하였다.

DPPH 및 ABTS 프리 라디칼 소거 활성(항산화 활성)

오리나무 가지 추출물과 이로부터 분리한 오레고닌의 항산화 활성을 검정하기 위해서 두가지 실험 방법인 DPPH 라디컬 소거능과 ABTS 라디컬 소거능 측정법을 통해서 항산화 활성을 양성대조군으로 잘알려진 강력한 항산화제인 비타민 C와 IC₅₀를 각각 비교하였다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 DPPH 프리 레디칼 소거작용의 측정 데이터를 도시한 도면이고, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 ABTS 프리 레디칼 소거작용의 측정 데이터를 도시한 도면이다.

도 3 및 4를 참조하면, 오리나무 가지 추출물과 그로부터 분리한 오레고닌(Oregonin)은 양성대조군 비타민 C과 비교하였을 때 두 가지 실험에서 모두 매우 강력한 항산화 활성을 나타내었음을 알 수 있었다.

구체적으로, 오리나무 가지 주정 추출물의 DPPH 라디컬 소거능은 57.64±0.62 ug/ml, ABTS 소거능은 13.18±0.11 ug/ml로 측정되었다.

오레고닌의 DPPH 라디컬 소거능은 14.46±0.08 ug/ml, ABTS 소거능은 4.05±0.04 ug/ml로 측정되었다.

양성대조군인 Vitamin C의 DPPH 라디컬 소거능은 18.18±0.10 ug/ml, ABTS 소거능은 14.96±0.29 ug/ml로 각각 측정되었다.

오리나무 가지 추출물과 그로부터 분리한 오레고닌은 양성대조군과 비교하였을 때 두 가지 실험에서 모두 매우 강력한 항산화 활성을 나타내었음을 알 수 있었다.

Oregonin 처리에 의한 oxidative stress-induced apoptosis 유발분자의 감소효능

도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 오레고닌의 세포 사멸 억제 활성에 대한 실험 데이터이다.

이하에서는, 도 5를 참조하여 오레고닌 및 H₂O₂를 Bax, Bcl-2, PARP-1 및 caspase-3 단백질에 처리했을 경우, Bax, Bcl-2, PARP-1 및 caspase-3 단백질들의 발현 상태에 기반하여, 오레고닌의 세포 사멸 억제 활성에 대해 설명한다.

모유두 세포의 세포독성을 유발하기 위해 처리한 hydrogen peroxide에 의해 유도된 세포 사멸을 측정하기 위하여 600μM의 H₂O₂를 세포에 처리하였다.

비특허문헌 18 및 19에 따르면 Bax (Bcl-2-associated X protein)는 대표적인 세포 사멸 유발단백질 분자로 알려져 있다.

도 5를 참조하면, H₂O₂의 처리는 Bax분자의 발현을 유의하게 증가시키는 것을 알 수 있다.

이에 반해 농도별로 처리한 오레고닌은 농도의존적으로 Bax의 발현을 유의하게 감소시키는 것을 알 수 있다. 이러한 결과에 따르면 오레고닌은 세포 사멸을 효과적으로 억제함을 증명하고 있다.

Oregonin 처리에 의한 oxidative stress-induced apoptosis에 대한 억제분자의 증가효능

상기와 동일한 방법으로 모유두 세포의 세포독성을 유발하기 위해 처리한 hydrogen peroxide에 의해 유도된 세포 사멸을 측정하기 위하여 600 μM의 H₂O₂를 세포에 처리하였다.

비특허문헌 20 및 21에 따르면 Bcl-2는 대표적인 항-apoptosis에 관여하는 단백질분자로 알려져 있다.

도 5를 참조하면, H₂O₂의 처리는 Bcl-2 분자의 발현을 유의하게 감소시키는 것을 알 수 있다.

이에 반해 농도별로 처리한 오레고닌은 농도의존적으로 Bcl-2의 발현을 유의하게 증가시키는 것을 알 수 있다. 이러한 결과에 따르면, 오레고닌은 세포 사멸을 효과적으로 억제함을 증명하고 있다.

Oregonin 처리에 의한 oxidative stress-induced apoptosis에 의해 유도된 PARP-1 단백질의 발현 억제효과

PARP-1은 세포의 핵에 존재하여 대량의 NAD를 사용하여 표적단백질을 poly-ADP ribosylation을 유도하고, 이를 통해 하위세포사멸에 관여하는 신호전달을 활성화시킨다.

비특허문헌 22 및 23에 따르면, PARP-1의 활성화는 세포 사멸의 진행에 대한 지표로 사용되고 있다.

도 5를 참조하면, 모유두 세포에 처리된 600 μM의 H₂O₂는 유의하게 세포내 PARP-1의 발현을 증가시켰고, 이러한 결과는 세포의 사멸을 진행시키고 있음을 증명하고 있다.

이에 반해 오레고닌의 처리는 농도의존적으로 PARP-1의 단백질 발현을 유의하게 억제시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과에 따르면 오레고닌은 세포 사멸을 효과적으로 억제함을 증명하고 있다.

Oregonin 처리에 의한 oxidative stress-induced apoptosis에 의해 유도된 caspase-3 단백질의 발현 억제효과

Caspase-3는 세포의 세포 사멸의 최종단계를 담당하는 분자로서 상기의 다양한분자들의 발현과 세포신호전달기전을 통해 irriversible cell death를 담당하는 단백질이다.

비특허문헌 24 및 25에 따르면, caspase-3의 활성화 또는 단백질 발현량 증가의 확인은 세포 사멸의 진행에 대한 중요한 최종지표로 사용되고 있다.

도 5를 참조하면, 모유두 세포에 처리된 600 μM의 H₂O₂는 유의하게 세포 내 caspase-3의 단백질 발현을 증가시켰고, 이러한 결과는 세포의 사멸을 최종적으로 진행시키고 있음을 증명하고 있다.

이에 반해 오레고닌의 처리는 농도의존적으로 caspase-3 단백질 발현을 유의하게 억제시키는 것을 확인하였다. 이러한 실험 결과에 따르면, 오레고닌은 세포 사멸을 효과적으로 억제함을 증명하고 있다.

Claims

오리나무 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 탈모 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 오리나무 추출물은 오리나무의 가지, 잎, 열매, 수피 및 뿌리 중 1종 이상인, 탈모 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 오리나무 추출물은 오레고닌(oregonin)을 유효 성분으로 포함하는, 탈모 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서,
상기 오레고닌은 Bax(Bcl-2-associated X protein)의 발현을 감소시킴으로써 세포 사멸에 대한 억제 활성을 갖는, 탈모 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서,
상기 오레고닌은 Bcl-2의 발현을 증가시킴으로써 세포 사멸에 대한 억제 활성을 갖는, 탈모 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서,
상기 오레고닌은 PARP-1의 발현을 감소시킴으로써 세포 사멸에 대한 억제 활성을 갖는, 탈모 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서,
상기 오레고닌은 Caspase-3의 발현을 감소시킴으로써 세포 사멸에 대한 억제 활성을 갖는, 탈모 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제3항에 있어서,
상기 오레고닌은 항산화 활성을 갖는, 탈모 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
오리나무 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 탈모 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
오리나무 추출물을 유효 성분으로 포함하는, 탈모 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.