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KR20190004319A - Cd40l-fc 융합 폴리펩티드 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Cd40l-fc 융합 폴리펩티드 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20190004319A
KR20190004319A KR1020187034692A KR20187034692A KR20190004319A KR 20190004319 A KR20190004319 A KR 20190004319A KR 1020187034692 A KR1020187034692 A KR 1020187034692A KR 20187034692 A KR20187034692 A KR 20187034692A KR 20190004319 A KR20190004319 A KR 20190004319A
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KR
South Korea
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ser
gly
leu
fusion protein
cd40l
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KR1020187034692A
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English (en)
Inventor
마누엘 바카
스테이시 드라빅
피터 엠티지
로널드 허브스트
Original Assignee
메디뮨 엘엘씨
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Publication date
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Abstract

본원에서는 CD40L-Fc 융합 단백질 및 암의 치료에 융합 단백질을 이용하는 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 CD40L-Fc 융합 단백질을 투여하거나 CD40L-Fc 융합 단백질을 하나 이상의 면역 관문 억제제(예를 들어, 항-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체)와 함께 투여하는 단계를 포함한다.

Description

CD40L-FC 융합 폴리펩티드 및 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 특허 출원은 2016년 05월 13일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/336,129호의 이익을 주장하며, 이의 전문은 본원에서 참고로 포함된다.
서열목록에 대한 참조
본원에는 2017년 05월 11일자로 제작된 "CD40F-100-WO-SeqListing.txt"란 표제로 제출되고 41,547바이트의 크기를 갖는 원문으로서 본 출원과 함께 제출된 서열목록이 참고로 포함된다.
암은 세계적으로 건강상 주요 부담이 되고 있다. 암 치료에서의 진전에도 불구하고, 보다 효과적이면서 독성이 보다 낮은 요법제에 대해 충족되지 않은 의료 요구, 특히 기존의 치료제에 대해 내성을 갖는 질병 또는 암이 진행된 이들 환자를 위한 충족되지 않은 의료 요구가 계속되고 있다.
종양 제어에서 면역 시스템, 특히 T 세포 매개 세포 독성의 역할은 잘 알려져 있다. 암 환자에서 T 세포가 질병의 초기 및 말기 단계에서 종양 성장 및 생존을 제어한다는 증거가 증가하고 있다. 그러나 암 환자에서 종양 특이적 T 세포 반응을 개시하고 유지하는 것은 어렵다.
최근까지 많은 관심을 받은 T 세포 경로는 세포 독성 T 림프구 항원-4(CTLA-4; CD 152) 및 예정된 사멸 리간드1(PD-L1; B7-H1 또는 CD274로도 공지됨)을 통한 신호전달을 들 수 있다. 그러나 최근에 CD40 리간드(CD40L)는 종양 제어를 위한 매개인자로서의 관심을 이끌어냈다.
CD40L은 주로 활성화된 T 세포(Th0, Th1 및 Th2 서브타입을 포함함) 상에서 발현되는 분자의 TNF 부류의 멤버이며, 이러한 부류의 기타 멤버와 유사한 동종 삼량체를 형성한다. 더욱이, CD40L은 또한 비만 세포 및 활성화된 호염기구(basophil) 및 호산구(eosinophil) 상에서 발현되는 것으로 밝혀져 있다. CD40L은 항원 제시 세포(APC) 상의 이의 수용체인 CD40에 결합하며, 이는 표적 세포의 유형에 따라 다수의 효과를 야기한다. 일반적으로, CD40L은 공동 자극 분자의 역할을 하며, APC 상의 MHC 분자에 의한 T 세포 수용체의 자극에 관련하여 APC에서의 활성화를 유도한다.
암 및 기타 질병을 방지하기 위한 전략을 개발하는데 있어서 과거 10년과 이루어낸 유의한 진전에도 불구하고, 진전되고 다루기 힘든 전이성 질병에 걸린 환자는 제한된 임상 옵션을 갖는다. 화학 요법, 방사선 조사 및 고용량 화학 요법은 투여량 제한적인 방법이었다. 특히 기존의 치료제에 대해 내성을 갖는 질병 또는 암이 진행된 이들 환자에 대해 보다 양호한 치료 효능, 보다 장기적인 임상적 이점 및 개선된 안전성 프로파일을 갖는 신규하고 독성이 덜한 방법 및 치료제에 대한 실질적인 미충족 요구가 여전히 존재한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 펩티드 링커를 통해 서로 공유 결합되는 3개의 CD40 리간드(CD40L) 소단위 또는 이의 절편의 단일쇄 융합체(scCD40L) 및 Fc 단량체를 포함하는 융합 단백질(예를 들어, CD40L-Fc 융합 단백질)을 제공하며, 이때 scCD40L은 펩티드 링커를 통해 Fc 단량체에 공유 결합된다.
다른 양태에서, 본 발명은 2개의 융합 단백질(예를 들어, CD40L-Fc 융합 단백질)의 이량체를 제공하며, 여기서 각각의 융합 단백질은 펩티드 링커를 통해 서로 공유 결합되는 3개의 CD40 리간드(CD40L) 소단위 또는 이의 절편의 단일쇄 융합체(scCD40L) 및 Fc 단량체를 포함하며, 이때 scCD40L은 펩티드 링커를 통해 Fc 단량체에 공유 결합되고, 이량체는 Fc 단량체의 상호작용을 통해 형성된다.
특정한 양태에서, 본 발명은 단일쇄 융합체를 함유하는 융합 단백질을 제공하며, 여기서 상기 단일쇄 융합체는, N-말단에서 C-말단 방향으로, 하기 아미노산 서열을 갖는 제1 CD40L 소단위를 갖고;
NPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL(서열 번호 1)
상기 제1 CD40L 소단위는 하기 아미노산 서열을 갖는 제1 펩티드 링커에 공유 결합되고;
GGGGSGGGS(서열 번호 2)
상기 제1 펩티드 링커는 하기 아미노산 서열을 갖는 제2 CD40L 소단위에 공유 결합되고;
QIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL(서열 번호 3)
상기 제2 CD40L 소단위는 하기 아미노산 서열을 갖는 제2 펩티드 링커에 공유 결합되고;
GGGGSGGGS(서열 번호 2)
상기 제2 펩티드 링커는 하기 아미노산 서열을 갖는 제3 CD40L 소단위에 공유 결합되고;
QIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL(서열 번호 3)
상기 제3 CD40L 소단위는 하기 아미노산 서열을 갖는 제3 펩티드 링커에 공유 결합되고;
GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 4)
상기 제3 펩티드 링커는 Fc 폴리펩티드에 공유 결합된다.
다른 양태에서, 본 발명은 CD40 폴리펩티드를 활성화시키는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 CD40 폴리펩티드를 본원에 기술된 임의의 양태에 따른 단리된 융합 단백질(예를 들어, CD40L-Fc 융합 단백질)과 접촉시키는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 개체에서 항종양 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 본원에 기술된 임의의 양태에 따른 단리된 융합 단백질(예를 들어, CD40L-Fc 융합 단백질)을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 암에 걸린 개체를 치료하는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 본원에 기술된 임의의 양태에 따른 단리된 융합 단백질(예를 들어, CD40L-Fc 융합 단백질) 및 임의적으로는 하나 이상의 면역 관문 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 양태에 따른 융합 단백질(예를 들어, CD40L-Fc 융합 단백질)을 암호화하는 핵산 분자를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
관련 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 양태에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 제공한다.
다른 관련 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 양태에 따른 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공하며, 이때 상기 숙주 세포는 본원에 기술된 임의의 양태에 따른 단리된 융합 단백질(예를 들어, CD40L-Fc 융합 단백질)을 발현하는 숙주 세포를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 양태에 따른 융합 단백질(예를 들어, CD40L-Fc 융합 단백질)을 제조하는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 본원에 기술된 임의의 양태에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 융합 단백질을 단리하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 양태에 따른 단리된 융합 단백질(예를 들어, CD40L-Fc 융합 단백질), 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포를 함유하는 키트를 제공한다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 실시형태에서, 융합 단백질(예를 들어, CD40L-Fc 융합 단백질)은 CD40(예를 들어, CD40 작용제)과 결합하고 이를 활성화시킨다. 다양한 실시형태에서, scCD40L은 CD40L 동종 삼량체 내로 접혀 들어간다. 다양한 실시형태에서, 단리된 융합 단백질(예를 들어, CD40L-Fc 융합 단백질)은 이량체이다. 다양한 실시형태에서, CD40L 소단위와 Fc 단량체의 비율은 3:1이다. 다양한 실시형태에서, 단리된 융합 단백질은 약 21℃ 이상에서 적어도 3일 동안 약 10% 미만의 응집율을 갖는다. 다양한 실시형태에서, 단리된 융합 단백질은 약 21℃에서 적어도 7일 이상 동안 약 1% 미만의 응집율을 갖는다.
특정 실시형태에서, 단리된 융합 단백질은 약 45℃에서 적어도 3일 이상 동안 약 10% 미만의 응집율을 갖는다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 실시형태에서, CD40L-Fc 융합 단백질 또는 CD40L 소단위는 하기 아미노산 서열에 대해 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다:
QIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL(서열 번호 3).
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 실시형태에서, 하나 이상의 CD40L 소단위는 74번째 위치에 Trp 잔기(예를 들어, 전장 막 결합 CD40L의 194번째 위치에서의 C→W 치환에 상응함)를 갖는다. 본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 실시형태에서, 하나 이상의 CD40L 소단위는 인간 CD40L 서열을 갖는다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 실시형태에서, scCD40L은 Fc 단량체의 N-말단 또는 C-말단에 결합된다. 특정 실시형태에서, Fc 단량체는 힌지 영역을 함유한다. 본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 실시형태에서, Fc 단량체는 인간 Fc 서열(예를 들어, IgG4 아미노산 서열)을 포함한다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 실시형태에서, CD40L 소단위 또는 이의 절편과 공유 결합하는 펩티드 링커는 약 9 내지 약 20개의 아미노산을 함유한다.
특정 실시형태에서, CD40L 소단위 또는 이의 절편과 공유 결합하는 펩티드 링커는 약 9 내지 약 15개의 아미노산을 함유한다. 특정한 실시형태에서, CD40L 소단위 또는 이의 절편과 공유 결합하는 펩티드 링커는 9개의 아미노산을 함유한다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 실시형태에서, 펩티드 링커는 하나 이상의 글리신(Gly) 또는 세린(Ser) 아미노산 잔기를 함유한다. 다양한 실시형태에서, CD40L 소단위들 사이의 링커는 (Gly4Ser)n(서열 번호 5)(여기서 n은 2, 3 및 4로부터 선택된 양의 정수임); (Gly3Ser)n(서열 번호 6)(여기서 n은 3, 4 및 5로부터 선택됨); Gly(Gly3Ser)n(서열 번호 7)(여기서 n은 2, 3 및 4로부터 선택됨); 또는 Gly(Gly2Ser)n(서열 번호 8)(여기서 n은 3, 4, 5 및 6으로부터 선택됨)이다. 특정한 실시형태에서, 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 4) 또는 GGGGSGGGS(서열 번호 2)이다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 실시형태에서, 융합 단백질(예를 들어, CD40L-Fc 융합 단백질)은 하기 아미노산 서열을 함유한다:
NPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGGGGSGGGSQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGGGGSGGGSQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열 번호 9; scCD40L-IgG4P-FP6; MEDI5083);
NPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGGGGSGGGGSGGGGSQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGGGGSGGGGSGGGGSQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열 번호 10; scCD40L-IgG4P-FP7); 또는
DPQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKKGYYTMKSNLVMLENGKQLTVKREGLYYVYTQVTFCSNREPSSQRPFIVGLWLKPSSGSERILLKAANTHSSSQLCEQQSVHLGGVFELQAGASVFVNVTEASQVIHRVGFSSFGLLKLGGGSGGSQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKKGYYTMKSNLVMLENGKQLTVKREGLYYVYTQVTFCSNREPSSQRPFIVGLWLKPSSGSERILLKAANTHSSSQLCEQQSVHLGGVFELQAGASVFVNVTEASQVIHRVGFSSFGLLKLGGGSGGSQIAAHVVSEANSNAASVLQWAKKGYYTMKSNLVMLENGKQLTVKREGLYYVYTQVTFCSNREPSSQRPFIVGLWLKPSSGSERILLKAANTHSSSQLCEQQSVHLGGVFELQAGASVFVNVTEASQVIHRVGFSSFGLLKLGGGGSGGGGSGGGGSVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(서열 번호 11; 쥐 대리 FP5 유사 마우스 IgG1 D265A Fc).
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 실시형태에서, 융합 단백질(예를 들어, CD40L-Fc 융합 단백질)은 최대 6개의 CD40 폴리펩티드에 결합한다. 다양한 실시형태에서, CD40 폴리펩티드는 세포 상에 있다. 다양한 실시형태에서, 세포는 CD40 폴리펩티드를 발현한다. 특정 실시형태에서, 세포는 항원 제시 세포, 대식세포, B 세포 또는 수지상 세포이다. 다양한 실시형태에서, 세포는 개체 내에 존재한다. 특정 실시형태에서, 개체는 암에 걸려있다.
본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 실시형태에서, 하나 이상의 면역 관문 억제제는 PD-L1 또는 CTLA-4 길항제를 포함한다. 다양한 실시형태에서, PD-L1 또는 CTLA-4 길항제는 항체이다. 특정 실시형태에서, 항-PD-L1 항체는 더발루맙(durvalumab)이다. 특정 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체는 트레멜리무맙(tremelimumab)이다. 본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 실시형태에서, 면역 반응 및/또는 항암 반응은 향상된다. 본원에 기술된 임의의 양태의 다양한 실시형태에서, 종양 미세환경의 면역 억제는 감소한다.
정의
달리 언급하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당해 기술분야의 숙련자에 의해 흔히 이해되는 의미를 갖는다. 하기 참고문헌에서는 당업자에게 본 발명에서 사용된 다수의 용어에 대한 일반적이 정의가 제공된다: 문헌{Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)]; 문헌{The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)}; 문헌{The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991}); 및 문헌{Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)}. 본원에서 사용된 바와 같이, 하기 용어는, 달리 언급하지 않는 한, 하기에서 이들에 대해 주어진 의미를 갖는다.
"항종양 활성"은 종양 세포의 증식 또는 생존을 감소 또는 안정화시키는 임의의 생물학적 활성을 의미한다. 하나의 실시형태에서, 항종양 활성은 항종양 면역 반응이다.
"면역 조절제"는 면역 반응(예를 들어, 항종양 면역 반응)을 향상시키는 약제를 의미한다. 본 발명의 예시적인 면역 조절제는 항-CTLA-4 항체, 항-PD-L1 항체 및 이의 절편과 같은 항체뿐만 아니라 CD40L-Fc 융합 단백질 또는 이의 절편과 같은 단백질을 포함한다.
"CD40L 폴리펩티드"는 NCBI 등록 번호 NP_000065에 대해 적어도 약 85% 아미노산 동일성을 갖고 CD40 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 절편을 의미한다. "CD40L"이란 용어는 전장 CD40L 및 가용성 절편, 예를 들어 단백질 분해(proteolysis)로부터 얻어진 CD40L의 세포 외 도메인 형태, 및 CD40L의 단량체 형태뿐만 아니라 올리고머 형태, 예를 들어 삼량체성 CD40L 둘 모두를 지칭한다. 막 결합 및 가용성 형태인 인간 CD40L의 아미노산 서열은 하기에 나타나 있다:
CD40L sp|P29965|CD40L_인간 - 막 결합 형태(서열 번호 12)
세포질 도메인 = 1~20; 신호 앵커 II형 막 단백질 영역 = 21~46; 가용성 형태 = 113~261
MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLH
EDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNP
QIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSN
REASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVN
VTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL
CD40L - 가용성 형태(서열 번호 13)
MQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIY
AQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQ
PGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL
"CD40L 핵산 분자"는 CD40L 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. NCBI 등록 번호 NM_000074에는 예시적인 CD40L 핵산 분자 서열이 제공된다.
"CD40 폴리펩티드"는 NCBI 등록 번호 NP_001241에 대해 적어도 약 85% 아미노산 동일성을 갖고 CD40L 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 절편을 의미한다. 하기에는 예시적인 CD40 아미노산 서열이 제공된다(서열 번호 14):
MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETECL
PCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCEEGWHCTSEACESCV
LHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFEKCHPWTSCETKDLVVQQAGTN
KTDVVCGPQDRLRALVVIPIIFGILFAILLVLVFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPD
DLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQEDGKESRISVQERQ
"CD40 핵산 분자"는 CD40 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. NCBI 등록 번호 NM_001250에는 예시적인 CD40 핵산 분자 서열이 제공된다.
"PD-L1 폴리펩티드"는 NCBI 등록 번호 NP_001254635에 대해 적어도 약 85% 아미노산 동일성을 갖고 PD-1 및 CD80 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 절편을 의미한다. 하기에는 예시적인 PD-L1 아미노산 서열이 제공된다(서열 번호 15):
MRIFAVFIFMTYWHLLNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQV
LSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHP
PNERTHIVILGAILLCLGVALTFIFR1RKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHIEET
"PD-L1 핵산 분자"는 PD-L1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. NCBI 등록 번호 NM_001267706에는 예시적인 PD-L1 핵산 분자 서열이 제공된다.
"항-PD-L1 항체"는 PD-L1 폴리펩티드와 선택적으로 결합하는 항체를 의미한다. 예시적인 항-PD-L1 항체는, 예를 들어 US20130034559/US8779108 및 US20140356353에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다. 더발루맙(MEDI4736)은 예시적인 항-PD-L1 항체이다. 기타 항-PD-L1 항체로는 BMS-936559(브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb)) 및 MPDL3280A(로슈(Roche))를 들 수 있다.
더발루맙 VL(서열 번호 16)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIK
더발루맙 VH(서열 번호 17)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS
더발루맙 VH CDR1(서열 번호 18)
GFTFSRYWMS
더발루맙 VH CDR2(서열 번호 19)
NIKQDGSEKYYVDSVKG
더발루맙 VH CDR3(서열 번호 20)
EGGWFGELAFDY
더발루맙 VL CDR1(서열 번호 21)
RASQRVSSSYLA
더발루맙 VL CDR2(서열 번호 22)
DASSRAT
더발루맙 VL CDR3(서열 번호 23)
QQYGSLPWT
"PD-1 폴리펩티드"는 NCBI 등록 번호 NP_005009에 대해 적어도 약 85% 아미노산 동일성을 갖고 PD-L1 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 절편을 의미한다. 하기에는 예시적인 PD-1 아미노산 서열이 제공된다(서열 번호 24):
MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTS
ESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGT
YLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGS
LVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVP
CVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL
"PD-1 핵산 분자"는 PD-1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. NCBI 등록 번호 NM_005018에는 예시적인 PD-1 핵산 분자 서열이 제공된다.
"CTLA-4 폴리펩티드"는 유전자은행(GenBank) 등록 번호 AAL07473.1에 대해 적어도 85% 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 또는 T 세포 억제 활성을 갖는 이의 절편을 의미한다. 하기에는 예시적인 CTLA-4 아미노산 서열이 제공된다(서열 번호 25):
gi|15778586|gb|AAL07473.1|AF414120_1 CTLA-4[호모사피엔스]
MACLGFQRHKAQLNLATRTWPCTLLFFLLFIPVFCKAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVR
VTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYY
LGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPE
CEKQFQPYFIPIN
"CTLA-4 핵산 분자"는 CTLA-4 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 유전자은행 등록 번호 AF414120.1에는 예시적인 CTLA-4 핵산 분자가 제공된다.
"항-CTLA-4 항체"는 CTLA-4 폴리펩티드와 선택적으로 결합하는 항체를 의미한다. 예시적인 항-CTLA-4 항체는, 예를 들어 미국 특허 제6,682,736호; 제7,109,003호; 제7,123,281호; 제7,411,057호; 제7,824,679호; 제8,143,379호; 제7,807,797호; 및 제8,491,895호(트레멜리무맙은 여기서 11.2.1임)에 개시되어 있으며, 이는 본원에서 참고로 포함된다. 트레멜리무맙은 예시적인 항-CTLA-4 항체이다. 하기에는 트레멜리무맙 서열이 제공된다.
트레멜리무맙: 미국 특허 제 6,682,736
트레멜리무맙 VL(서열 번호 26)
PSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLDWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV
트레멜리무맙 VH(서열 번호 27)
GVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPRGATLYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH
트레멜리무맙 VH CDR1(서열 번호 28)
GFTFSSYGMH
트레멜리무맙 VH CDR2(서열 번호 29)
VIWYDGSNKYYADSV
트레멜리무맙 VH CDR3(서열 번호 30)
DPRGATLYYYYYGMDV
트레멜리무맙 VL CDR1(서열 번호 31)
RASQSINSYLD
트레멜리무맙 VL CDR2(서열 번호 32)
AASSLQS
트레멜리무맙 VL CDR3(서열 번호 33)
QQYYSTPFT
이러한 개시내용에 사용된 바와 같은 "항체"란 용어는 면역글로불린 또는 이의 절편 또는 이의유도체를 지칭하고, 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 항체의 생성 유무와는 무관하게 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 상기 용어는 다클론성, 단클론성, 단일 특이성, 다중 특이성, 비특이성, 인간화, 단일쇄, 키메라, 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이 및 그래프팅(grafting)된 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 개시내용을 위해 "온전한 항체"에서와 같이 "온전한"이란 용어로 달리 변형되지 않는 한, "항체"란 용어는 또한 항체 절편, 예를 들어 Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, 및 항원 결합 기능, 즉 예를 들어 CTLA-4 또는 PD-L1과 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 기타 항체 절편을 포함한다. 전형적으로, 이 같은 절편은 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다.
"항원 결합 도메인", "항원 결합 절편" 및 "결합 절편"이란 용어는 항체와 항원 사이의 특이적 결합에 관여하는 아미노산을 포함하는 항체 분자의 일부를 지칭한다. 일부 경우, 항원이 크면 항원 결합 도메인은 항원의 일부에만 결합할 수 있다. 항원 결합 도메인과의 특이적 상호작용에 관여하는 항원 분자의 일부분은 "에피토프(epitope)" 또는 "항원 결정인자"로서 지칭된다. 항원 결합 도메인은 전형적으로 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하지만, 이는 필수적으로 둘 모두를 포함할 필요는 없다. 예를 들어, 소위 Fd 항체 절편은 VH 도메인으로만 이루어져 있지만, 여전히 온전한 항체의 일부 항원 결합 기능을 보유한다.
항체의 결합 절편은 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 개열(cleavage)에 의해 생성된다. 결합 절편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 및 단일쇄 항체를 포함한다. "이중 특이성" 또는 "이중 작용성" 항체 이외의 항체는 이의 결합 부위 각각이 동일한 것으로 이해된다. 효소인 파파인(papain)에 의한 항체의 소화로 인해 "Fab" 절편으로도 알려져 있는 2개의 동일한 항원-결합 절편 및 항원 결합 활성을 갖지 않지만 결정화하는 능력을 갖는 "Fc" 절편으로도 알려진 2개의 동일한 항원 결합 절편이 생성된다. 효소인 펩신에 의한 항체의 소화로 인해 항체 분자의 2개 암(arm)이 결합된 채로 유지되고 2개의 항원 결합 부위를 포함하는 F(ab')2 절편이 생성된다. F(ab')2 절편은 항원을 가교하는 능력을 갖는다. 본원에서 사용되는 경우 "Fv"는 항원 인식 및 항원 결합 부위를 둘 모두 보유하는 항체의 최소 절편을 지칭한다. 본원에서 이용되는 경우 "Fab"는 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 CH1 도메인을 포함하는 항체의 절편을 지칭한다.
"mAb"란 용어는 단클론성 항체를 지칭한다. 본 발명의 항체는 전체 천연 항체, 이중 특이성 항체; 키메라 항체; Fab, Fab', 단일쇄 V 영역 절편(scFv), 융합 폴리펩티드 및 비통상적 항체를 제한 없이 포함한다.
이러한 개시내용에서, "포함하는", "포함하기", "함유하기" 및 "가지기" 등은 미국 특허법에서 이들에 부여된 의미를 가질 수 있고, "포함하는", "포함하기" 등을 의미할 수 있으며; "본질적으로 ~로 구성되기" 또는 "본질적으로 ~로 구성되는" 등은 미국 특허법에서 부여된 의미를 가지며, 상기 용어는 개방형으로, 인용되는 기본적이거나 신규한 특징이 인용되는 것 이외의 존재에 의해 변경되지 않는 한, 인용되는 것 이외의 존재를 허용하지만 선행 기술의 실시형태를 배제한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "결정하기", "평가하기", "검정하기", "측정하기" 및 "검출하기"란 용어는 정성적 및 정량적 결정 둘 모두를 나타내며, 이와 같이 "결정하기"란 용어는 본원에서 "검정하기", "측정하기" 등과 상호 교환 가능하게 사용된다. 정량적 결정이 의도는 경우, 피분석물 등의 "양을 결정하기"란 어구가 사용된다. 정성적 및/또는 정량적 결정이 의도되는 경우, 피분석물의 "수준을 결정하기" 또는 피분석물을 "검출하기"란 어구가 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "Fc 도메인"이란 용어는 항체 불변 영역의 일부분을 지칭한다. 전통적으로, Fc 도메인이란 용어는 항체의 쌍을 이룬 CH2, CH3 및 힌지 영역을 포함하는 프로테아제(protease; 예를 들어 파파인) 개열 생성물을 지칭한다. 이러한 개시내용의 문맥에서, Fc 도메인 또는 Fc란 용어는, 생산 수단과는 무관하게 면역글로불린 폴리펩티드의 CH2, CH3 및 힌지 영역 전체 또는 일부분을 포함하는 임의의 폴리펩티드(또는 이 같은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산)를 지칭한다.
"융합 폴리펩티드" 또는 "융합 단백질"은 2개 이상의 상이한 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드, 또는 동일한 폴리펩티드에 자연적으로 존재하지 않는 이의 활성 절편을 의미한다. 다양한 실시형태에서, 2개 이상의 상이한 폴리펩티드는 펩티드 결합 또는 펩티드 링커에 의해 작동 가능하게 함께 공유 결합되며, 예를 들어 프레임 내에서 화학적으로 결합 또는 융합된다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드와 관련하여 "동일한" 또는 "동일성" 비율이란 용어는, 임의의 보존적 아미노산 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않고 최대 상응성(maximum correspondence)을 위해 (필요하면, 갭을 도입하여) 비교되고 정렬되는 경우, 동일한 2개 이상의 서열 또는 부분서열(subsequence), 또는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 소정의 비율(%)로 갖는 2개 이상의 서열 또는 부분서열을 지칭한다. 동일성 비율은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 이용하여, 또는 시각 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 획득하기 위해 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌{Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 5873~5877}에서 변형되고 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(문헌{Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25: 3389~3402}) 내로 통합된 바와 같은 문헌{Karlin et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 2264~2268} 참조). 특정 실시형태에서, 문헌{Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389~3402}에 개시된 바와 같은 Gapped BLAST가 사용될 수 있다. BLAST-2, WU-BLAST-2(문헌{Altschul et al., 1996, MeTh0ds in Enzymology, 266: 460~480}), ALIGN, ALIGN-2(캘리포니아주 사우스샌프란시스코 소재의 제넨테크(Genentech)) 또는 Megalign(DNASTAR)가 또한 사용될 수 있다.
"단리된"이란 용어는 자연 환경에서 존재하는 기타 성분들이 실질적으로 없는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 단리된 단백질에는 실질적으로 상기 단백질이 유래하는 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 기타 단백질이 없다. 또한 "단리된"이란 용어는 단리된 단백질이 약학 조성물로서 투여되기에 충분히 순수거나, 적어도 70~80%(w/w) 순수하고, 보다 바람직하게는 적어도 80~90%(w/w) 순수하고, 더욱 더 바람직하게는 90~95% 순수하고, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(w/w) 순수한 제제를 지칭한다.
"참고"는 비교 기준(standard of comparison)을 의미한다.
"특이적으로 결합하는"은 약제(예를 들어, CD40L)가 분자(예를 들어, CD40 폴리펩티드)를 인식하여 이와 결합하지만, 시료, 예를 들어 생물학적 시료 내의 기타 분자를 실질적으로 인식하여 이와 결합하지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 특이적으로 결합하는 2개의 분자는 생리적 조건 하에 비교적 안정한 복합체를 형성한다. 특이적 결합은, 통상 중간 내지 높은 용량과 함께 낮은 친화도를 갖는 비특이적 결합과 구별되는 바와 같이, 높은 친화도 및 중간 내지 낮은 용량을 특징으로 한다.
"개체"는 인간 또는 비인간 포유동물, 예를 들어 소, 말, 개, 양 또는 고양이를 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물을 의미한다.
본원에서 제공되는 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50으로 이루어진 군으로부터의 임의의 숫자, 숫자의 조합, 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료하는", "치료하기", "치료" 등의 용어는 질환 및/또는 이와 연관된 증상을 감소 또는 완화시키는 것을 지칭한다. 배제되지는 않지만, 질환 또는 병태를 치료한다는 것은 질환, 병태 또는 이와 연관된 증상의 완전 제거를 요구하지는 않는 것으로 인지될 것이다.
문맥 상 구체적으로 언급되거나 자명하지 않은 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "또는"이란 용어는 포괄적인 것으로 이해된다. 문맥 상 구체적으로 언급되거나 자명하지 않은 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "하나"와 같이 단수 용어는 단수 또는 복수인 것으로 이해된다.
더욱이, 본원에서 사용되는 "및/또는"은 2개의 명시된 특징 또는 성분에 대해 단독 또는 함께 구체적으로 개시한 것으로서 간주되어야 한다. 따라서, 문구에서 사용된 바와 같이, "및/또는"이란 용어는 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독) 및 "B" (단독)을 포함하도록 하기 위한 것이다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 문구에서 사용된 바와 같이 "및/또는"이란 용어는 하기 실시형태 각각, 즉 A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독)을 포함하도록 하기 위한 것이다.
문맥 상 구체적으로 언급되거나 자명하지 않은 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "약"이란 용어는 당해 기술분야에서 정상적인 허용 범위 내에, 예를 들어 평균의 표준 편차가 2 이내인 것으로 이해된다. 약은 언급되는 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 이내인 것으로 이해될 수 있다. 문맥 상 달리 명확하지 않는 한, 본원에서 제공되는 모든 수치는 약이란 용어로 수식된다.
본원에서 변수에 대한 임의의 정의에서 화학적 군의 목록의 설명에는 임의의 단일 군 또는 나열된 군의 조합으로서의 해당 변수에 대한 정의가 포함된다. 본원에서 변수 또는 양태에 대한 실시형태의 설명에는 임의의 단일 실시형태로서 또는 임의의 기타 실시형태 또는 이들의 일부와 함께 해당 실시형태가 포함된다.
본원에서 제공되는 임의의 조성물 또는 방법은 본원에서 제공되는 하나 이상의 임의의 기타 조성물 및 방법과 조합될 수 있다.
도 1은 인간 아미노산 서열을 포함하는 본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질의 개략도를 보여준다. 도시된 바와 같이, MEDI5083 CD40L-FP는 3 x CD40L 소단위 + IgG4P Fc의 단일쇄 융합체(148kDa), 9-GlySer 링커 영역, 및 개발용으로 돌연변이되는 잔기 194(쌍을 이루지 않은 Cys)를 포함한다. 소단위 간 링커: 서열 번호 2.
도 2는 1일째 날(상부 좌측), 3일째 날(상부 우측) 및 7일째 날(하부 좌측)에 45℃에서 (전장 막 결합 CD40L 아미노산 서열과 관련하여) C194W 치환을 포함하는 CD40L-Fc 융합 단백질인 scCD40L-IgG4P-FP7에 대한 안정성 데이터를 보여주는 일련의 대표적인 고성능 크기 배제 크로마토그래피(HPSEC) 크로마토그램이다.
도 3은 NFκB 루시페라아제 검정에 의해 측정할 때 MEDI5083 안정성 시료의 생물 활성을 보여주는 그래프이다.
도 4는 HuCD40 293 HEK NFκB c3 세포 모델에서 MEDI5083에 대해 인용된 CD40L-FP7 및 인간 IgG4P 아이소타입 대조군(isotype control)에 대한 생물 활성 평가를 보여주는 그래프이다.
도 5는 라모스-블루 NFκB(Ramos-Blue NFκB)/AP-1 B-세포 세포 모델에서 MEDI5083에 대해 인용된 CD40L-FP7 및 인간 IgG4P 아이소타입 대조군에 대한 생물 활성 평가를 보여주는 그래프이다.
도 6은 MEDI5083이 인간 일차 B 세포 증식을 자극한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 7은 MEDI5083이 인간 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC)를 활성화하고 성숙(maturation)시킨다는 것을 보여주는 한 세트의 그래프이다. 활성화는 마커인 CD80(상부 좌측), CD83(상부 중앙) 및 CD86(상부 우측)에서의 증가로 나타나 있다. 성숙은 마커인 HLA-ABC(하부 좌측) 및 HLA-DR(하부 중앙)에서의 증가로 나타나 있다.
도 8은 MEDI5083이 인간 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC)에서 Th1 사이토카인/케모카인 반응을 유도한다는 것을 보여주는 한 세트의 그래프이다. IL12p70(상부 좌측), IFNγ(상부 중앙), TNF-α(상부 우측), IL-8(하부 중앙) 및 IL-10(하부 우측)의 분비의 증가가 나타나 있다. IL-1β(하부 좌측)의 분비의 증가는 관찰되지 않았다.
도 9는 MEDI5083이 용량 의존적 방식으로 mDC 활성화 및 성숙을 통해 T 세포 증식을 조장한다는 것을 보여주는 한 세트의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 히스토그램이다. 인간 CD4+(상부 열) 및 CD8+(중간 열) 림프구의 시험관 내 증식은 카르복시플루오레신 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CFSE)의 희석을 이용한 유세포 분석법(flow cytometry)에 의해 모니터링되었다.
도 10은 MEDI5083이 인간 억제성(M2):자극성(M1) 대식세포 비율을 면역 자극성 표현형을 향해 이동시킨다는 것을 보여주는 한 세트의 그래프이다.
도 11은 인간 단핵구 유래 대식세포 M1/M2 분극(polarization)을 보여주는 한 세트의 그래프이다.
도 12는 MEDI5083이 인간 CD40에 대해 고도로 특이적임을 보여주는 그래프이다.
도 13은 마우스 대리 CD40L-FP가 저반응성 종양 모델에서 유의한 항종양 활성을 갖는다는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. 각각의 처리 그룹으로부터의 평균 종양 부피는 좌측에 작도(plotting)되어 있고, 개별 마우스의 반응은 우측의 그래프에 작도되어 있다.
도 14는 B16-F10 종양 모델에서 α-PD-L1과 함께 마우스 대리 CD40L-FP의 항종양 활성을 보여주는 그래프이다.
도 15는 B16-F10 종양 모델에서 α-PD-L1과 함께 마우스 대리 CD40L-FP의 항종양 활성을 보여주는 일련의 그래프이다. 개별 마우스의 반응은 그래프에 작도되어 있다.
도 16은 B16-F10 종양 모델에서 α-CTLA-4와 함께 마우스 대리 CD40L-FP의 항종양 활성을 나타낸 그래프이다.
도 17은 B16-F10 종양 모델에서 α-CTLA-4와 함께 마우스 대리 CD40L-FP의 항종양 활성을 보여주는 일련의 그래프이다. 개별 마우스의 반응은 그래프에 작도되어 있다.
도 18은 α-PD-L1과 함께 마우스 대리 CD40L-FP가 B16-F10 종양 모델에서 종양 성장을 중단시킨다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 19는 하나 이상의 α-PD-L1 및 α-CTLA4와 함께 마우스 대리 CD40L-FP의 항종양 활성을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 20은 B16-F10 종양 모델에서 α-PD-1과 함께 마우스 대리 CD40L-FP의 항종양 활성을 보여주는 그래프이다.
도 21은 B16-F10 종양 모델에서 α-PD-1과 함께 마우스 대리 CD40L-FP의 항종양 활성을 보여주는 일련의 그래프이다. 개별 마우스의 반응은 그래프에 작도되어 있다.
도 22는 마우스 대리 CD40L-FP가 B16-F10 종양 모델에서 혈청 사이토카인/케모카인 분비를 유도한다는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. IFNγ(상부 좌측), TNF-α(상부 우측), IL12(하부 좌측) 및 KC/GRO(하부 우측)의 수준의 증가는 두 번째 투여(T1) 24시간 이후에 관찰되었다.
도 23은 마우스 대리 CD40L-FP가 B16-F10 종양 모델에서 혈청 사이토카인/케모카인 분비를 유도한다는 것을 보여주는 일련의 그래프이다. IFNγ(상부 좌측), TNF-α(상부 우측), IL12(하부 좌측) 및 KC/GRO(하부 우측)의 수준의 증가는 네 번째 투여(T2) 24시간 이후에 관찰되었다.
도 24는 마우스 대리 CD40L-FP가 마우스에서 종양 내 CD8+ T 세포 활성화 및 PD-L1 발현을 증가시킨다는 것을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 25는 마우스 대리 CD40L-FP가 마우스에서 비장 골수성 세포 성숙 및 B 세포 활성화를 조장한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 26은 마우스 대리 CD40L-FP가 마우스에서 TH1 사이토카인 및 CXCL-1 케모카인 분비를 유도한다는 것을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 27은 원숭이에서 MEDI5083 단일 투여 이후 B 세포 활성화 및 추적(trafficking)을 설명하기 위한 약동 및 약역학(PK-PD) 모델을 보여주는 일련의 그래프이다.
본 발명은 3개의 CD40 리간드(CD40L) 소단위 및 Fc 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질(CD40L-Fc)을 특징으로 한다. 하나의 양태에서, CD40L-Fc 융합 단백질은 펩티드 링커를 통해 결합된 3개의 CD40 리간드(CD40L) 소단위 및 Fc 단량체의 단일쇄 융합체를 포함한다. CD40L 소단위들 사이에 9개 이상의 아미노산 길이를 갖는 펩티드 링커는 안정성을 보유하고/하거나 이 같은 융합 단백질의 응집을 하지 않지 않는 것으로 밝혀져 있다. 이는 아미노산 길이가 8개 초과인 펩티드 링커를 통해 결합하는 경우 용이하게 응집되는 기타 TNF 부류 리간드와는 대조적이다. 따라서 본 발명은 부분적으로 이들 발견에 기반을 두고 있다.
또한 본 발명은 암을 치료하는데 유용한 조성물 및 방법을 특징으로 하며, 이때 상기 조성물은 CD40L-Fc 융합 단백질(예를 들어, MEDI5083)을 포함한다. 다양한 실시형태에서, CD40L-Fc 융합 단백질(예를 들어, MEDI5083)은 항-CTLA-4 항체 및/또는 항-PD-L1 항체 중 하나 이상을 포함하는 면역 관문 억제제와 함께 투여된다. 본원에서 하기에 보고된 바와 같이, 이들 약제에 의한 처리는 마우스 종양 모델에서 종양 부피를 감소시키고/시키거나 종양 성장을 지연시킨다.
CD40L-Fc 융합 단백질
본 발명은 펩티드 링커를 통해 공유 결합되는 3개의 CD40 리간드(CD40L) 소단위 또는 이의 절편의 단일쇄 융합체(scCD40L), 및 펩티드 링커를 통해 scCD40L에 공유 결합되는 Fc 단량체를 포함하는 CD40L-Fc 융합 단백질을 제공한다. 다양한 양태에서, 융합 단백질의 3개의 CD40L 소단위는 펩티드 링커가 하나의 CD40L 소단위의 C-말단을 다른 CD40L 소단위의 N-말단에 연결시키도록 배열된다. 따라서 본 발명의 융합 단백질은, N-말단에서 C-말단 방향으로, 펩티드 링커를 통해 제2 CD40L 소단위의 N-말단에 연결된 제1 CD40L 소단위의 C-말단 및 제3 CD40L 소단위의 N-말단에 연결된 제2 CD40L 소단위의 C-말단을 포함하는 일부분을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 3개의 CD40L 소단위의 단일쇄 융합체는 C-말단 또는 N-말단에서 펩티드 링커를 통해 Fc 폴리펩티드에 연결된다. 즉, Fc 폴리펩티드의 N-말단은 3개의 CD40L 소단위의 단일쇄 융합체의 제3 CD40L 소단위의 C-말단에 연결되거나, Fc 폴리펩티드의 C-말단은 3개의 CD40L 소단위의 단일쇄 융합체의 제1 CD40L 소단위의 N-말단에 연결된다.
CD40L(CD154, CD40 리간드, gp39 또는 TBAM로도 공지됨)은 33 kDa의 II형 막 당단백질(스위스-프로트(Swiss-Prot) 등록 번호: P29965)이다. 게다가, 보다 짧은 18 kDa의 CD40L 가용성 형태가 존재한다(sCD40L 또는 가용성 CD40L로도 공지됨). 이들 CD40L의 가용성 형태는 막 결합 단백질의 단백질 분해 가공에 의해 생성되지만, 고차원 올리고머화(예를 들어, 삼량화(trimerization))의 부재 하에는 가용성 종의 세포 활성이 약하다. CD40L은 CD40과 결합하여 이를 활성화시킨다. 다양한 실시형태에서, CD40L-Fc 융합 단백질은 CD40L 삼량체로 자가 조립되는 3개의 CD40L 소단위의 영역을 포함한다. 하나의 양태에서, CD40L-Fc 융합 단백질은 CD40에 결합하고 적어도 하나의 CD40 매개 활성을 자극할 수 있는 다합체 형태로 조립될 수 있다. 다양한 실시형태에서, CD40L 소단위는 인간 CD40L에서 유래한 아미노산 서열을 갖는다. 부가적인 CD40L 유사체는 마우스, 닭, 붉은털원숭이(Rhesus), 게먹이원숭이(cynomolgus), 래트 및 토끼에서 유래한 이들 CD40L 유사체를 포함한다. CD40L-Fc 융합 단백질 내의 CD40L 소단위의 조합은 등가 동의성(homomericity) 또는 이가 동의성(heteromericity)일 수 있다. 일부 실시형태에서, CD40L-Fc 융합 단백질 내의 모든 CD40L 소단위의 아미노산 서열은 동일하다. 기타 실시형태에서, CD40L-Fc 융합 단백질 내의 적어도 2개의 CD40L 소단위의 아미노산 서열은 서로 상이하다.
본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질은 Fc 도메인을 포함하지만 이에 제한되지 않는 항체(예를 들어, IgG)의 도메인 또는 절편에 융합되는 CD40L 삼량체를 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질은 Fc 도메인에 융합되는 CD40L 삼량체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질은 Fc 도메인을 통해 이량화(dimerization)된다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 IgG4P Fc 도메인의 아미노산 서열을 갖는다. IgG4P Fc는 (EU 넘버링에 따라) 228번째 위치에 힌지 영역에서 세린의 프롤린으로의 치환을 함유하는 IgG4 결정화 절편 감마(Fcγ) 도메인이다. IgG4P Fc에서 세린의 프롤린으로의 치환은 안정성을 증진시키고, 중쇄 간 이황화 결합의 완전한 형성을 제공하고/하거나 "반항체 교환(half-antibody exchange)"을 통한 이량체의 재조합을 방지한다(문헌{Nirula et al. (2011) Curr. Opin. Rheumatol. 23(1): 119~124}; 문헌{Aalberse et al. (2009) Clin. Exp. Allergy 39(4): 469~477}. 특정한 실시형태에서, IgG4P Fc 도메인의 아미노산 서열은 인간 서열이다. Fc 영역의 변이체(예를 들어, 아미노산 치환 및/또는 부가 및/또는 결실)은 항체의 효과기 기능(effector function)을 향상 또는 감소시키는 것으로 당해 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질은 Fc 도메인을 포함하며, 이때 Fc 영역 내에서는 CD40L-Fc 융합 단백질의 기능 특성을 변경하기 위해 하나 이상의 변경이 이루어져 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질은 Fc 도메인을 포함하며, 이때 Fc 영역 내에서는 적어도 하나의 FcγR 매개 효과기 기능을 감소 또는 제거하기 위해 하나 이상의 변경이 이루어져 있다.
다양한 양태에서, 본 발명의 개시내용에는 카바트(Kabat)로 개시된 바와 같이 EU 인덱스(EU index)로 넘버링할 때 228 및 235로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 변형을 포함하는 IgG4 Fc를 갖는 CD40L-Fc 융합 단백질이 제공된다. 또 다른 구체적인 양태에서, Fc 영역은 IgG4 Fc 영역이고, 변이체 아미노산은 카바트로 개시된 바와 같이 EU 인덱스로 넘버링할 때 228P, 235E 및 235Y 중 하나 이상이다.
본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질 내의 CD40L 소단위 및 Fc 폴리펩티드는 폴리펩티드 링커에 의해 연결되며, 여기서 각각의 링커는 적어도 2개의 폴리펩티드 또는 소단위에 융합된다. CD40L-Fc 융합 단백질 내의 링커의 조합은 등가 동의성 또는 이가 동의성일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질 내에 존재하는 모든 펩티드 링커의 아미노산 서열은 동일하다. 기타 실시형태에서, 본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질 내에 존재하는 적어도 2개의 펩티드 링커의 아미노산 서열은 서로 상이하다. 링커 폴리펩티드는 이들이 목적하는 활성을 보유하도록 서로에 대해 정확한 구성을 취하는 방식으로 2개 이상의 단량체 소단위를 결합시키기에 적합한 길이를 가져야 한다. 폴리펩티드를 신규한 결합된 융합 폴리펩티드 내에 연결시키기 위한 자연적으로 발생하는 펩티드 링커뿐만 아니라 인공 펩티드 링커의 용도는 문헌에 널리 공지되어 있다. 따라서, 2개 이상의 단량체 소단위를 융합시키는 링커는 천연 링커, 인공 링커 또는 이들의 조합이다.
본원에 개시된 바와 같이, CD40L 소단위들 사이에 9개의 이상의 아미노산 길이를 갖는 펩티드 링커는 안정성을 보유하고/하거나 이 같은 융합 단백질의 응집을 야기하지 않는 것으로 밝혀져 있다. 따라서 폴리펩티드 링커는 9 내지 약 20개의 아미노산 잔기, 9 내지 약 15개의 아미노산 잔기 또는 9개의 아미노산 잔기를 포함한다. 폴리펩티드 링커 내에 봉입(inclusion)하기 위해 선택된 아미노산 잔기는 본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질의 활성 또는 기능을 유의하게 방해하지 않는 특성을 나타내야 한다. 따라서 폴리펩티드 링커는 대체로 본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질의 활성 또는 기능과는 상반될 수 있는 전하를 나타내지 않아야 하거나, 내부 접힘을 방해하지 않아야 하거나, 결합을 심각하게 지연시킬 수 있는 하나 이상의 단량체 소단위 내의 아미노산 잔기와 결합을 형성하거나 기타 상호작용을 하여야 한다.
다양한 실시형태에서, 폴리펩티드 링커는 구성적 유연성을 갖는다. 적합한 유연한 링커로는 Gly와 Ser의 비율이 1 이상인 Gly 및 Ser 잔기의 조합을 갖는 링커를 들 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 링커 서열은 X가 알라닌(A), 세린(S), 글리신(G), 이소류신(I), 류신(L) 또는 발린(V)이고 n이 양의 정수인 (G-G-G-G-X)n(서열 번호 34) 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 폴리펩티드 링커 서열은 n이 양의 정수인 (G-G-G-S)n(서열 번호 6), (G-G-G-G-S)n(서열 번호 5), G(G-G-G-S)n(서열 번호 7), (G-G-G-G-G)n(서열 번호 35) 또는 (G-G-G-G-A)n(서열 번호 36) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 링커는 본질적으로 조직화되지 않은 천연 또는 인공 폴리펩티드이다(예를 들어, 문헌{Schellenberger et al., Nature Biotechnol. 27: 1186~1190, 2009} 참조, 및 또한 문헌{Sickmeier et al., Nucleic Acids Res. 35: D786~93, 2007} 참조).
특정 실시형태에서, CD40L 소단위들 사이의 링커는 n이 2, 3 및 4로부터 선택된 양의 정수인 (Gly4Ser)n(서열 번호 5); n이 3, 4 및 5로부터 선택되는 (Gly3Ser)n(서열 번호 6); n이 2, 3 및 4로부터 선택되는 Gly(Gly3Ser)n(서열 번호 7); 또는 n이 3, 4, 5 및 6으로부터 선택되는 Gly(Gly2Ser)n(서열 번호 8)이다. 특정한 실시형태에서, 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 4) 또는 GGGGSGGGS(서열 번호 2)이다.
특정 실시형태에서, CD40L-Fc 융합 단백질은 단일쇄 융합체를 함유하며, 여기서 상기 단일쇄 융합체는, N-말단에서 C-말단 방향으로, 하기 아미노산 서열을 갖는 제1 CD40L 소단위를 갖고;
NPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL(서열 번호 1)
상기 제1 CD40L 소단위는 하기 아미노산 서열을 갖는 제1 펩티드 링커에 공유 결합되고;
GGGGSGGGS(서열 번호 2)
상기 제1 펩티드 링커는 하기 아미노산 서열을 갖는 제2 CD40L 소단위에 공유 결합되고;
QIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL(서열 번호 3)
상기 제2 CD40L 소단위는 하기 아미노산 서열을 갖는 제2 펩티드 링커에 공유 결합되고;
GGGGSGGGS(서열 번호 2)
상기 제2 펩티드 링커는 하기 아미노산 서열을 갖는 제3 CD40L 소단위에 공유 결합되고;
QIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL(서열 번호 3)
상기 제3 CD40L 소단위는 하기 아미노산 서열을 갖는 제3 펩티드 링커에 공유 결합되고;
GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 4)
상기 제3 펩티드 링커는 Fc 폴리펩티드에 공유 결합된다.
특정한 실시형태에서, CD40L-Fc 융합 단백질은 하기 아미노산 서열들 중 하나를 포함하거나 이들 서열 중 하나로 이루어져 있다:
NPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGGGGSGGGSQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGGGGSGGGSQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLWLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKLGGGGSGGGGSGGGGSESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(서열 번호 9; scCD40L-IgG4P-FP6; MEDI5083);
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항종양 요법
본원에서는 암을 치료하기 위한 방법이 제공되며, 이때 상기 방법은 CD40L-Fc 융합 단백질(예를 들어, MEDI5083)을 단독 또는 면역 관문 억제제(예를 들어, 항-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체 및/또는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 절편)와 함께 투여하는 단계를 포함한다. 본원에 나타낸 바와 같이, CD40L-Fc 융합 단백질(예를 들어, MEDI5083)의 단독 투여 또는 항-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체 및/또는 항-PD-1 항체와 함께 투여는 마우스 종양 모델에서 종양 부피의 감소를 초래하였다. 특정 양태에서, 고형 종양이 발현된 환자에는 CD40L-Fc 융합 단백질(예를 들어, MEDI5083)이 단독 투여되거나, 항-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체 및/또는 항-PD-1 항체와 함께 투여된다.
CD40L-Fc 융합 단백질(예를 들어, MEDI5083)을 단독 또는 항-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체 및/또는 항-PD-1 항체와 함께 포함하는 암 요법에 의한 처리는, 예를 들어 암의 진행 속도의 감소, 종양 성장의 지연 또는 안정화, 종양 수축 및/또는 종양 퇴화를 포함한다. 일부 양태에서, 종양 성장의 감소 또는 지연은 통계적으로 유의할 수 있다. 종양 성장의 감소는 예상되는 종양 성장에 대해, 큰 환자 개체군에 기반을 둔 예상되는 종양 성장에 대해, 또는 대조 개체군의 종양 성장에 대해 기준선에서의 환자의 종양 성장과 비교하여 측정될 수 있다. 기타 실시형태에서, 본 발명의 방법은 생존율을 증가시킨다.
암 치료제의 투여에 대한 임상 반응은 자기 공명 영상(MRI) 스캔(scan), x-방사선 영상, 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캔, 유세포 분석법 또는 형광 활성화 세포 분류기(FACS) 분석, 조직학, 육안 병리학, 및 혈액 화학분석(ELISA, RIA 및 크로마토그래피에 의해 검출 가능한 변화를 포함하지만 이에 제한되지 않음)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임상의에 공지된 진단 기법을 이용하여 평가될 수 있다.
T 세포 조절 경로
T 세포가 암 환자에서 질병의 초기 단계 및 말기 단계 둘 모두에서 종양 성장 및 생존을 제어한다는 증거가 증가하고 있다. 그러나 암 환자에서 종양 특이적 T 세포 반응을 개시하고 유지하기는 어렵다.
세포 독성 T 림프구 항원-4(CTLA-4, CD152) 및 예정된 사멸 리간드 1(PD-L1; B7H-1 또는 CD274로도 공지됨)을 통해 유의한 주의 신호가 수신되는 T 세포 조절 경로.
CTLA-4는 활성화된 T 세포 상에서 발현되고, CD28 매개 T 세포 활성화 이후에 T 세포 반응을 억제하기 위해 공-억제제(co-inhibitor)로서 작용한다. CTLA-4는 TCR 관여 이후에 순수한 기억 T 세포의 초기 활성화 크기를 조절하는 것으로 여겨지며, 항종양 면역력 및 자가 면역력 둘 모두에 영향을 미치는 중추 억제 경로의 일부인 것으로 여겨진다. CTLA-4는 T 세포 상에서 발현되고, 이의 리간드인 CD80(B7.1) 및 CD86(B7.2)의 발현은 주로 항원 제시 세포, T 세포 및 기타 면역 매개 세포에 제한된다. CTLA-4 신호전달 경로를 차단하는 길항적 항-CTLA-4 항체는 T 세포 활성화를 향상시키는 것으로 보고된 바 있다. 이 같은 항체 중 하나인 이필리무맙(ipilimumab)은 전이성 흑색종의 치료를 위해 2011년에 FDA에 의해 승인을 받았다. 진행성 흑색종의 치료를 위한 단계 III 시험에서 다른 항-CTLA-4 항체인 트레멜리무맙에 대해 시험하였지만, 그 당시의 치료 기준(테모졸로마이드(temozolomide) 또는 다카르바진(dacarbazine))과 비교하여 환자의 전체 생존율이 유의하게 증가하지는 않았다.
PD-L1은 또한 T 세포 활성화의 제어와 연관된 수용체와 리간드의 복합 시스템의 일부이다. 정상 조직에서, PD-L1은 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 대식세포, 중간엽 줄기 세포, 골수 유래 비만 세포뿐만 아니라 다양한 비-조혈성 세포 상에서 발현된다. 이의 정상적인 기능은 이들 2개의 수용체, 즉 예정된 사멸 1(PD-1 또는 CD279로도 공지됨) 및 CD80(B7-1 또는 B7.1로도 공지됨)과의 상호작용을 통해 T 세포 활성화와 내성 사이의 균형을 조절하는 것이다. 또한 PD-L1은 종양에 의해 발현되고, 다수의 부위에서 작용하여 종양이 숙주 면역 시스템에 의한 검출 및 제거를 회피하는 것을 도와준다. PD-L1은 매우 다양한 범위의 암에서 높은 빈도로 발현된다. 일부 암에서, PD-L1의 발현은 생존율의 감소 및 좋지 않은 예후와 연관되어 있었다. PD-L1과 이의 수용체(예를 들어, PD-1) 사이의 상호작용을 차단하는 항체는 PD-L1 의존성 면역 억제 효과를 완화시키고 시험관 내에서 항종양 T 세포의 세포 독성 활성을 향상시킬 수 있다.
CD40L은 활성화된 T 세포 상에서 주로 발현되는 분자의 TNF 부류(Th0, Th1, 및 Th2 서브타입을 포함함)의 멤버이며, 이러한 부류의 기타 멤버와 유사하게 동종 삼량체를 형성한다. 더욱이, CD40L은 또한 비만 세포 및 활성화된 호염기구 및 호산구 상에서 발현되는 것으로 밝혀져 있다. CD40L은 항원 제시 세포(APC) 상의 수용체인 CD40에 결합하며, 이는 표적 세포의 유형에 따라 많은 효과를 초래한다. 일반적으로, CD40L은 공동 자극 분자의 역할을 하며, APC 상의 MHC 분자에 의한 T 세포 수용체의 자극과 연관하여 APC에서 활성화를 유도한다.
CD40L에 의한 수용체인 CD40을 통한 신호전달은 CD40 보유 세포의 활성화 및 최적의 T 세포 프라이밍(T-cell priming)을 초래하는 일련의 이벤트를 개시한다. 보다 구체적으로, CD40L과 CD40 사이의 동족성 상호작용은 B 세포를 항체 분비 세포 및 기억 B 세포로 분화하는 것을 조장한다(문헌{Burkly, In Adv. Exp. Med. Bio., Vol. 489., D. M. Monroe, U. Hedner, M. R. Hoffman, C. Negrier, G. F. Savidge, and G. C. I. White, eds. Klower Academic/Plenum Publishers, 2001, p. 135}). 게다가, CD40L과 CD40 사이의 상호작용은 대식세포 및 수지상 세포의 활성화 및 천연 살해 세포 및 세포 독성 T 림프구의 생성을 통해 세포 매개 면역력을 증진시킨다(앞서 언급된 버클리(Burkly)의 문헌 참조).
단일쇄 Fc 융합 단백질
본 발명의 단일쇄 CD40L-Fc 융합 단백질은 안정성 및 생물 활성이 입증되었다. 본원에 개시된 바와 같이, CD40L의 안정성 및 활성은 적어도 부분적으로는 본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질에서 사용되는 링커의 길이에서 기인하였다. 이는, 아미노산 길이가 8 초과의 펩티드 링커가 사용되는 경우에 기타 TNF 리간드 Fc 융합 단백질이 생성되었지만 응집하는 경향이 있었기 때문에 놀랍고도 예상치 못한 일이었다. 또한 본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질은 단일쇄 Fc 단백질의 기타 특성 및 이점을 제공한다.
TNF 리간드 부류의 자연적으로 발생하는 가용성 사이토카인 멤버는 동종 삼량체로서의 이들의 생물 활성을 나타내는 것을 알려져 있다. 그러나 TNF 리간드의 삼량체성 복합체는 이들의 단량체의 해리를 통해 변성되는 경향이 있으며, 재조합 단량체 단위로부터 제조하기는 어렵다. 동종 삼량체를 단량체로 해리하는 것을 방지하기 위해, TNF 리간드의 적어도 3개의 단량체는 "단일쇄(sc)" 분자를 형성하기 위해 펩티드 링커에 의해서 이들의 C 말단 및 N 말단을 통해 서로 공유 결합된다. 따라서 전체 분자(2개의 펩티드 링커를 갖는 TNF 리간드 부류의 멤버의 적어도 3개의 단량체)는 단량체로의 해리가 더 이상 일어날 수 없도록 단일 단백질 가닥으로 이루어져 있다.
또한, 본 발명의 단일쇄 융합 단백질에서와 같이, 삼량체의 이량화를 구현하기 위해 Fc 도메인에 대한 TNF 리간드의 융합이 사용될 수 있다. 가용성 도메인의 이량화는 이황화 결합을 통해 2개의 Fc-도메인의 조립에 의해 달성된다. 세포 또는 이웃하는 세포 상의 단일쇄 TNF 리간드의 국소 부유화(local enrichment)는 이들 융합 단백질의 생물 활성을 증가시키려는 가능성을 갖는다.
항-PD-L1 항체
더발루맙(MEDI4736)은 PD-L1에 대해 선택적이고 PD-1 및 CD80 수용체에 대한 PD-L1의 결합을 차단하는 예시적인 항-PD-L1 항체이다. 더발루맙은 시험관 내에서 인간 T 세포 활성화의 PD-L1 매개 억제를 완화시킬 수 있고, T 세포 의존성 기작을 통해 이종 이식 모델에서 종양 성장을 억제한다.
본원에서 제공된 방법에서 사용하기 위한 더발루맙(또는 이의 절편)에 대한 정보는 미국 특허 제8,779,108호에서 찾아볼 수 있으며, 이의 전문은 본원에서 그 전체가 참고로 포함된다. 더발루맙의 결정화 절편(Fc) 도메인은 항체 의존성 세포 매개 세포 독성(ADCC)을 매개하는데 관여하는 보체 성분 C1q 및 Fcγ 수용체에 대한 결합을 감소시키는 IgG1 중쇄의 불변 도메인에서 3중 돌연변이를 함유한다.
본원에서 제공된 방법에서 사용하기 위한 더발루맙 및 이의 항원 결합 절편은 중쇄 및 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정한 양태에서, 본원에서 제공된 방법에서 사용하기 위한 더발루맙 또는 이의 항원 결합 절편은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정한 양태에서, 본원에서 제공된 방법에서 사용하기 위한 더발루맙 또는 이의 항원 결합 절편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 상기 본원에서 나타낸 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열(카바트에 의해 정의됨)을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상기 본원에서 나타낸 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열(카바트에 의해 정의됨)을 포함한다. 당업자들이라면 당업자들에게 공지된 초티아(Chothia) 정의, Abm 정의 또는 기타 CDR 정의를 용이하게 확인할 수 있을 것이다. 특정한 양태에서, 본원에서 제공된 방법에서 사용하기 위한 더발루맙 또는 이의 항원 결합 절편은 전문이 본원에서 참고로 포함되는 미국 특허 제8,779,108호에 개시된 바와 같은 2.14H90PT 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
항-CTLA-4 항체
CTLA-4와 특이적으로 결합하고 CTLA-4 활성을 억제하는 항체는 항종양 면역 반응을 향상시키는데 유용하다. 본원에서 제공된 방법에 사용하기 위한 트레멜리무맙(또는 이의 항원 결합 절편)에 대한 정보는 US 6,682,736(여기서 이는 11.2.1로서 지칭됨)에서 찾아볼 수 있으며, 이의 전문은 전체가 본원에서 참고로 포함된다. 트레멜리무맙(CP-675,206, CP-675, CP-675206 및 티실리무맙(ticilimumab)으로도 공지됨)은 CTLA-4에 대해 고도로 선택적이며 CD80(B7.1) 및 CD86(B7.2)에 대한 CTLA-4의 결합을 차단하는 인간 IgG2 단클론성 항체이다. 이는 시험관 내에서 면역 활성화를 초래하는 것으로 나타나 있으며, 트레멜리무맙으로 처치된 일부 환자에서는 종양 퇴화가 나타났다.
본원에서 제공된 방법에 사용하기 위한 트레멜리무맙은 중쇄 및 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정한 양태에서, 본원에서 제공된 방법에 사용하기 위한 트레멜리무맙 또는 이의 항원 결합 절편은 상기 본원에서 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 상기 본원에서 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 특정한 양태에서, 본원에서 제공된 방법에 사용하기 위한 트레멜리무맙 또는 이의 항원 결합 절편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 상기 본원에서 나타낸 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열(카바트에 의해 정의됨)을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 상기 본원에서 나타낸 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열(카바트에 의해 정의됨)을 포함한다. 당업자들이라면 당업자들에게 공지된 초티아 정의, Abm 정의 또는 기타 CDR 정의를 용이하게 확인할 수 있을 것이다. 특정한 양태에서, 본원에서 제공된 방법에서 사용하기 위한 트레멜리무맙 또는 이의 항원 결합 절편은 전문이 본원에서 참고로 포함되는 US 6,682,736에 개시된 바와 같은 11.2.1 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
기타 항-CTLA-4 항체는, 예를 들어 US 20070243184에 개시되어 있다. 하나의 실시형태에서, 항-CTLA-4 항체는 MDX-010로 지칭되는 이필리무맙; BMS-734016이다.
항체
CTLA-4 및 PD-L1과 선택적으로 결합하고 CTLA-4 및 PD-L1의 결합 또는 활성화를 억제하는 항체는 본 발명의 방법에서 유용하다.
일반적으로, 항체는, 예를 들어 통상의 하이브리도마 기법(hybridoma technique; 문헌{Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495~499}), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 항체 라이브러리(antibody library)를 이용하여 수행된 파지 디스플레이(phage display; 문헌{Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624~628}; 문헌{Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581~597})를 이용하여 이루어질 수 있다. 기타 항체 생산 기법에 대해서는 문헌{Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988}을 또한 참고한다. 본 발명은 임의의 특정한 공급원, 기원 종(species of origin), 생산 방법에 제한되지 않는다.
면역글로불린으로도 공지된 온전한 항체는 전형적으로 사량체의 글리코실화(glycosylation) 단백질로서 각각이 대략 25 kDa인 2개의 경쇄(L) 및 각각이 대략 50 kDa인 2개의 중쇄(H)로 구성된다. λ 사슬 및 κ 사슬로서 지정된 경쇄의 2개의 유형은 항체에서 발견된다. 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 면역글로불린은 5개의 주요 부류, 즉 A, D, E, G 및 M으로 할당될 수 있고, 이들 중 몇몇은 하위 부류(아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다.
상이한 부류의 면역글로불린에 대한 소단위 구조 및 3차원 구성은 당업계에 널리 공지되어 있다. 항체 구조의 검토에 대해서는 앞서 언급된 할로우(Harlow) 등의 문헌을 참고한다. 간단히 말해, 각각의 경쇄는 N 말단 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)으로 구성된다. 각각의 중쇄는 N 말단 가변 도메인(VH), 3개 또는 4개의 불변 도메인(CH) 및 힌지 영역으로 구성된다. VH에 가장 인접한 CH 도메인은 CH1으로서 지정된다. VH 및 VL 도메인은 골격 영역으로 지칭되는 상대적으로 보존된 서열의 4개의 영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 이루어져 있으며, 이때 상기 4개의 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변 서열의 3개의 영역을 위한 스캐폴드(scaffold)를 형성한다. CDR은 항원과의 특이적 상호작용에 관여하는 대부분의 잔기를 함유한다. 3개의 CDR은 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 지칭된다. 중쇄 상의 CDR 구성성분은 H1, H2 및 H3으로서 지칭되는 반면, 경쇄 상의 CDR 구성성분은 L1, L2, 및 L3으로서 지칭된다, 따라서. CDR3 및 특히 H3은 항원 결합 도메인 내에서 분자 다양성의 최대 공급원이다. H3은, 예를 들어 2개의 아미노산 잔기만큼 짧거나, 26개 초과일 수 있다.
Fab 절편(절편 항원 결합)은 불변 영역들 사이의 이황화 결합에 의해 공유 결합되는 VH-CH1 및 VL-CL 도메인으로 이루어져 있다. Fv 내의 비공유 결합된 VH 및 VL 도메인이 숙주 세포에 동시 발현되는 경우에 해리되려는 경향을 극복하기 위해, 소위 단일쇄(sc) Fv 절편(scFv)이 제조될 수 있다. scFv에서, 유연하면서 적절히 긴 폴리펩티드는 VH의 C-말단을 VL의 N-말단에 결합시키거나 VL의 C-말단을 VH의 N-말단에 결합시킨다. 가장 흔하게는, 15개의 잔기로 이루어진 (Gly4Ser)3 펩티드가 링커로 사용되지만, 기타 링커는 또한 당업계에 공지되어 있다.
항체 다양성은 가변 영역을 암호화하는 다수의 생식세포 유전자의 조합적 조립(combinatorial assembly)의 결과이며, 다양한 체세포 이벤트(somatic event)의 결과이다. 체세포 이벤트는 온전한 VH 영역을 제조하기 위한 다양성(D) 및 연결(J) 유전자 단편을 갖는 가변성 유전자 단편의 재조합, 및 온전한 VL 영역을 제조하기 위한 가변성 및 연결 유전자 단편의 재조합을 포함한다. 재조합 공정 자체는 부정확하며, 그 결과 V(D)J 연접부(junction)에서 아미노산의 손실 또는 부가가 야기된다. 이들 다양성 기작은 항원에 대한 노출 이전에 발생 중인 B 세포에서 일어난다. 항원 자극 이후, B 세포에서 발현된 항체 유전자는 체세포 돌연변이를 겪게 된다.
생식세포 유전자 단편의 추정 수치, 이들 단편의 무작위 재조합 및 무작위 VH-VL 쌍 형성에 기초하여 최대 1.6 x l07개의 상이한 항체를 생산할 수 있다(문헌{Fundamental Immunology, 3rd ed., ed. Paul, Raven Press, New York, N.Y., 1993}). 항체 다양성에 기여하는 기타 공정(예를 들어, 체세포 돌연변이)을 설명하는 경우, 잠재적으로는 1 x 1010개 이상의 상이한 항체가 생성되는 것으로 여겨진다(문헌{Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1995}). 항체 다양성과 연관된 다수의 공정으로 인해, 독립적으로 생성된 항체가 CDR에서 동일하거나 심지어는 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 가질 가능성은 극히 적다.
예시적인 항-CTLA-4 및 항-PD-L1 CDR의 서열은 본원에서 제공된다. CDR을 보유하기 위한 구조는 일반적으로 항체 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 일부분일 것이며, 이때 CDR은 자연적으로 발생하는 VH 및 VL의 CDR에 상응하는 위치에 위치한다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는, 예를 들어 문헌{Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, No. 91~3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, Md., 1991}에 개시된 바와 같이 결정될 수 있다.
본 발명의 항체(예를 들어, 항-CTLA-4, 항-PD-L1)는 임의적으로는 항체 불변 영역 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 이의 C 말단에 인간 Cκ 또는 Cλ 사슬을 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인이 부착될 수 있다. 유사하게, VH 도메인에 기반을 둔 특정 항원 결합 도메인은 임의의 항체 동위원소, 예를 들어 IgG, IgA, IgE 및 IgM 및 임의의 동위원소의 하위 부류(IgG1 및 IgG4를 포함하지만 이에 제한되지 않음)에서 유래하는 면역글로불린 중쇄 모두 또는 일부가 부착될 수 있다.
당업자라면 CTLA-4 및 PD-L1과는 다소 다른 단백질을 검출, 측정 및 억제하기 위해 본 발명의 항체가 사용될 수 있는 것으로 인지할 것이다. 항체는 표적 단백질이 본원에 개시된 적어도 100개, 80개, 60개, 40개 또는 20개의 인접 아미노산의 임의의 서열에 대해 적어도 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 동일한 서열을 포함하는 한 결합 특이성을 보유하는 것으로 예상된다. 동일성 비율(%)은, 예를 들어 문헌{Altshul et al. (1990) J. Mol. Biol., 215: 403~410}에 개시된 베이직 로컬 얼라인먼트 툴(BLAST), 문헌{Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol., 48: 444~453}의 알고리즘 또는 문헌{Meyers et al. (1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11~17}의 알고리즘과 같은 표준 정렬 알고리즘에 의해 결정된다.
서열 상동성 분석 이외에, 개시된 항체 및 이들의 항원과의 복합체에 의해 추정되는 특정 3D 구조를 확인하기 위해 에피토프 매핑(epitope mapping; 예를 들어 문헌{Epitope Mapping Protocols, ed. Morris, Humana Press, 1996} 참고) 및 2차 및 3차 구조 분석이 수행될 수 있다. 이 같은 방법으로는 X선 결정학(문헌{Engstom (1974) Biochem. Exp. Biol., 11:7~13} 및 본원에 개시된 항체에 대한 가상 재현(virtual representation)의 컴퓨터 모델링(문헌{Fletterick et al. (1986) Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.})을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
유도체
본 발명의 폴리펩티드(예를 들어, CD40L) 및 항체(예를 들어, 항-CTLA-4, 항-PD-L1)는 이들의 표적과 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 이들 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 이 같은 변이체는 당업계에 널리 공지된 기법을 이용하여 당업자에 의해 이들 폴리펩티드 또는 항체의 서열로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가는 FR 및/또는 CDR 내에서 이루어질 수 있다. 보통 FR에서의 변경이 항체의 안정성 및 면역원성을 개선하기 위해 설계될지라도 CDR에서의 변경은 전형적으로 이의 표적에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 설계된다. 또한 FR의 변이체는 자연적으로 발생하는 면역글로불린 알로타입(immunoglobulin allotype)을 포함한다. 이 같은 친화도 증가 변화는 통상의 기법에 의해 경험적으로 결정되며, 여기서 상기 기법은 CDR를 변경하는 단계 및 이의 표적에 대한 항체의 친화도를 시험하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 개시된 CDR 중 임의의 하나에서 이루어질 수 있다. 문헌{Antibody Engineering, 2nd ed., Oxford University Press, ed. Borrebaeck, 1995}에 개시된 방법에 따라 다양한 변경이 이루어질 수 있다. 이들은 서열 내에서 기능적으로 동일한 아미노산 잔기를 암호화하는 상이한 코돈(codon)의 치환에 의해 변경되어 "침묵(silent)" 변경을 야기하는 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 비극성 아미노산으로는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 들 수 있다. 극성의 중성 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 들 수 있다. 양으로 하전된 (염기성) 아미노산으로는 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 들 수 있다. 음으로 하전된 (산성) 아미노산으로는 아스파르트산 및 글루탐산을 들 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 및/또는 항체의 유도체 및 유사체는 재조합 및 합성 방법을 포함하여 당업계에 널리 공지된 다양한 기법에 의해 생산될 수 있다(문헌{Maniatis (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.} 및 문헌{Bodansky et al. (1995) The Practice of Peptide Synthesis, 2nd ed., Spring Verlag, Berlin, Germany}).
하나의 실시형태에서, 본 발명의 VH 도메인의 아미노산 서열 변이체인 VH 도메인을 제조하기 위한 방법은 본원에 개시된 VH 도메인의 아미노산 서열 내에 하나 이상의 아미노산을 부가, 결실, 치환 또는 삽입하는 단계, 이렇게 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 임의적으로 조합하는 단계, 및 항원에 대한 특이적 결합에 대해 VH 도메인 또는 VH/VL 조합(들)을 시험하는 단계를 포함한다. 본원에 개시된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체가 하나 이상의 VH 도메인과 조합되는 유사한 방법이 이용될 수 있다.
유사한 셔플링(shuffling) 또는 조합 기법이 또한 β-락타마아제 유전자와 관련한 기법을 기술하지만 상기 접근법이 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다는 것을 관찰한 스테머(Stemmer)(문헌{Nature (1994) 370: 389~391})에 의해 개시된다.
추가의 실시형태에서, 당업자라면 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자의 무작위 돌연변이 유발을 이용하여 본원에 개시된 서열에서 유래하는 하나 이상의 서열을 보유하는 신규한 VH 또는 VL 영역을 생성할 수 있다. 이 같은 하나의 기법인 오류 유발 PCR(error-prone PCR)은 그램(Gram) 등(문헌{Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1992) 89: 3576~3580})에 의해 개시된다.
사용 가능한 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR에 대한 돌연변이 유발을 유도하는 것이다. 이 같은 기법은 바바스(Barbas) 등(문헌{Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. (1994) 91: 3809~3813}) 및 쉬어(Schier) 등(문헌{J. Mol. Biol. (1996) 263: 551~567})에 의해 개시된다.
유사하게, 하나 이상 또는 3개의 CDR이 모두 다양한 VH 또는 VL 도메인 내로 이식될 수 있으며, 이어 상기 VH 또는 VL 도메인은 CTLA-4 또는 PD-L1에 특이적인 항원 결합 절편에 대해 선별된다.
면역글로불린 가변 도메인의 일부분은 실질적으로 본원에서 개시된 바와 같은 CDR, 및 임의적으로는 본원에서 개시된 바와 같은 scFv 절편에서 유래한 간섭 골격 영역 중 적어도 하나를 포함할 것이다. 상기 일부분은 FR1 및 FR4 중 하나 또는 둘 모두를 적어도 약 50%씩 포함할 수 있으며, 이때 50%는 FR1의 C 말단이 50%이고, FR4의 N 말단이 50%이다. 가변 도메인의 실질적인 부분의 N 말단부 또는 C 말단부에 있는 부가적인 잔기는 정상적으로는 자연적으로 발생하는 가변 도메인 영역과는 무관한 잔기일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기법에 의한 항체의 구축은 클로닝 또는 기타 조작 단계를 용이하게 하기 위해 도입되는 링커에 의해 암호화되는 N 또는 C 말단 잔기의 도입을 초래할 수 있다. 기타 조작 단계는 면역글로불린 중쇄 불변 영역, 기타 가변 도메인(예를 들어, 이중체(diabody)의 생산에서), 또는 하기에서 더욱 상세하게 토의된 바와 같은 단백질성 표지를 포함하는 추가적인 단백질 서열에 가변 도메인을 연결하기 위해 링커를 도입하는 단계를 포함한다.
당업자라면 본 발명의 항체가 VL 또는 VH 도메인에서 유래한 단일 CDR만을 함유하는 항원 결합 절편을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, CTLA-4 및 PD-L1에 결합할 수 있는 2개의 도메인에 특이적인 항원 결합 절편을 형성할 수 있는 상보성 도메인을 선별하기 위해 단일쇄 특이적 결합 도메인들 중 하나만이 사용될 수 있다.
본원에 개시된 본 발명의 항체(예를 들어, 항-CTLA-4 및/또는 항-PD-L1)는 다른 기능성 분자, 예를 들어 다른 펩티드 또는 단백질(알부민, 다른 항체 등)에 결합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 화학적 가교 또는 재조합 방법에 의해 결합될 수 있다. 또한 항체는 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호; 또는 제4,179,337호에 개시된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체들 중 하나, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 결합될 수 있다. 항체는, 예를 들어 이들의 순환 반감기를 증가시키기 위해 중합체에 대한 공유 접합에 의해 화학적으로 개질될 수 있다. 또한 이들을 부착시키기 위한 예시적인 중합체 및 방법은 미국 특허 제4,766,106호; 제4,179,337호; 제4,495,285호; 및 제4,609,546호에 나타나 있다.
개시된 항체는 또한 고유의 패턴과는 상이한 글리코실화 패턴을 갖도록 변경될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 탄수화물 모이어티(moiety)가 결실되고/되거나 하나 이상의 글리코실화 부위가 고유 항체에 부가될 수 있다. 본원에 개시된 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가는 당업계에 공지된 글리코실화 부위 공통 서열(consensus sequence)을 함유하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 달성될 수 있다. 항체 상의 탄수화물 모이어티의 개수를 증가시키는 다른 수단은 항체의 아미노산 잔기에 대한 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링에 의한 것이다. 이 같은 방법은 WO 87/05330 및 문헌{Aplin et al. (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., 22: 259~306}에 개시되어 있다. 항체로부터 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는, 예를 들어 문헌{Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259: 52}; 및 문헌{Edge et al. (1981) Anal. Biochem., 118: 131} 및 문헌{Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol., 138: 350}에 개시된 바와 같이 화학적 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 또한 항체는 검출 가능한 표지 또는 기능성 표지로 태깅(tagging)될 수 있다. 검출 가능한 표지로는 통상적인 화학을 이용하여 항체에 또한 부착될 수 있는 131I 또는 99Tc와 같은 방사성 표지를 들 수 있다. 또한 검출 가능한 표지로는 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase) 또는 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 같은 효소 표지를 들 수 있다. 검출 가능한 표지는 비오틴과 같은 화학적 모이어티를 추가로 포함하며, 이는 특정 동족성 검출 가능한 모이어티, 예를 들어, 표지된 아비딘(avidin)에 대한 결합을 통해 검출될 수 있다.
CDR 서열이 본원에 개시된 CDR 서열과는 단지 빈약하게 상이한 항체는 본 발명의 범주 내에 포함된다. 전형적으로, 아미노산은 유사한 전하, 소수성 또는 입체 화학적 특성을 갖는 관련된 아미노산에 의해 치환된다. 이 같은 치환은 당업자에 통상적인 기술 범위 내에서 있을 수 있다. CDR에서와는 달리, 항체의 결합 특징에 악영향을 미치지 않으면서 FR에서 보다 많은 실질적인 변경이 이루어질 수 있다. FR에 대한 변경은 비인간 유래 골격 잔기의 인간화 또는 항원 접촉을 위해 또는 결합 부위를 안정화시키는데 중요한 특정 골격 잔기의 조작(engineering), 예를 들어 불변 영역의 부류 또는 하위부류의 변경; 예를 들어 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호 및 문헌{Lund et al. (1991) J. Immun. 147: 2657~2662} 및 문헌{Morgan et al. (1995) 면역학 86: 319~324}에 개시된 바와 같은 Fc 수용체 결합과 같이 효과기 기능을 변경할 수 있는 특정 아미노산 잔기의 변경, 또는 불변 영역이 유래하는 종의 변경을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
당업자라면 상술한 변경이 전적으로 충분한 것이 아니며, 다수의 기타 변경은 본 발명의 개시내용의 교시 측면에서 당업자에게 자명할 것이라는 것을 인지할 것이다.
병합 요법
본원에서 제공된 바와 같이, CD40L-Fc 융합 단백질 단독 또는 면역 관문 억제제(예를 들어, 항-CTLA4 항체, 항-PD-L1 항체 및/또는 항-PD-1 항체 또는 이의 항원 결합 절편)과 함께 본 발명의 조합을 이용하여 고형 종양에 걸린 환자의 처치는 부가 또는 시너지 효과(synergistic effect)를 초래할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "시너지"란 용어는 요법제의 조합(예를 들어, CD40L-Fc 융합 단백질, 항-CTLA-4 항체 및 항-PD-L1 항체의 조합)을 지칭한다.
일부 실시형태에서, 요법제의 조합(예를 들어, CD40L-Fc 융합 단백질, 항-CTLA-4 항체 및 항-PD-L1 항체의 조합)의 시너지 효과는 보다 적은 복용량의 하나 이상의 치료제의 사용 및/또는 고형 종양에 걸린 환자에 대한 상기 치료제의 덜 빈번한 투여를 허용할 수 있다. 예를 들어, 보다 적은 복용량의 치료제를 시용하고/하거나 보다 덜 빈번하게 상기 요법제를 투여하는 능력은 고형 종양의 치료에서 상기 요법제의 효능을 감소시키지 않으면서 개체에 대한 상기 요법제의 투여와 연관된 독성을 감소시킬 잠재성을 갖는다.
병합 요법에서, CD40L-Fc 융합 단백질, 항-CTLA-4 항체 및 항-PD-L1 항체의 조합은 1회 이상의 별도의 투여에서 1회 투여 시에 함께 투여될 수 있다. 또한, 시너지 효과는 고형 종양의 관리, 치료 또는 완화 시에 치료제 효능의 개선을 초래할 수 있다. 치료제의 조합의 시너지 효과는 임의의 단일 요법의 사용과 연관된 불리하거나 원치 않은 부작용을 피하거나 감소시킬 수 있다.
CD40L-Fc 융합 단백질 생산
본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질의 재조합 발현은 CD40L-Fc 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 구축이 요구된다. 일단 CD40L-Fc 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, CD40L-Fc 융합 단백질을 생산하기 위한 벡터는 당업계에 널리 공지된 기법을 이용하는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 따라서 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 CD40L-Fc 융합 단백질을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현함으로써 단백질을 제조하기 위한 방법이 제공된다. CD40L 또는 Fc 폴리펩티드 코딩 서열(coding sequence) 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구축하기 위해 당업자에게 널리 공지된 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법으로는, 예를 들어 시험관 내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체 내 유전자 재조합을 들 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제 가능한 벡터를 제공하며, 이때 상기 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 결합된다.
발현 벡터는 통상적인 기법에 의해 숙주 세포로 전달된 후, 형질 감염된 세포는 통상적인 기법에 의해 배양되어 본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질을 생산한다. 따라서 본 발명은 본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포를 포함하며, 이때 상기 폴리뉴클레오티드는 이종성 프로모터에 작동 가능하게 결합된다. 적합한 숙주 세포로는 박테리아(예를 들어, 대장균(E. coli) 및 바실러스 서브틸리스(B. subtilis))와 같은 미생물을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질을 발현하기 위해 다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 이용될 수 있다. 이 같은 숙주-발현 시스템은 관심 있는 코딩 서열을 생산하고 후속적으로 정제할 수 있는 비히클을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질 전환 또는 형질 감염되는 경우에 원 위치에서 본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질을 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들로는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질 전환된 박테리아(예를 들어, 대장균 및 바실러스 서브틸리스)와 같은 미생물을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않으며, 이때 상기 발현 벡터는 CD40L-Fc 융합 단백질 코딩 서열 또는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, NSO, 및 3T3 세포)을 함유한다. 일단 재조합 발현에 의해 본 발명의 CD40L-Fc 융합 단백질이 생산되는 경우, 이는 단백질의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 정제될 수 있다.
CD40L-Fc 융합 단백질 특징 및 활성을 평가하기
단리되거나 다합체 일부로서의 본 발명의 CD40L-Fc 단량체 소단위의 안정성은 당업계에 널리 공지된 기법, 예를 들어 열적(Tm) 및 무질서 변성(chaotropic denaturation; 예를 들어 우레아 또는 구아니딘 염에 의한 처리), 프로테아제 처리(예를 들어, 써몰리신(thermolysin)에 의한 처리) 또는 단백질 안정성을 결정하기 위한 당업계에서 허용되는 다른 방법에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 단백질 안정성을 측정하기 위해 사용되는 기법에 대한 포괄적 검토는, 예를 들어 문헌{"Current Protocols in Molecular Biology" and "Current Protocols in Protein Science" by John Wiley and Sons. 2007}에서 찾아볼 수 있다.
CD40에 대한 CD40L-Fc 융합 단백질의 결합 친화도 및 기타 결합 특징은, 예를 들어 당업계에 공지된 다양한 시험관 내 검정 방법, 예를 들어 평형 방법(예를 들어, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 또는 동력학(예를 들어, BIACORE® 분석), 및 간접 결합 검정, 경쟁적 결합 검정, 겔 전기영동 및 크로마토그래피(예를 들어, 겔 여과)와 같은 기타 방법에 의해 결정될 수 있다. 이들 및 기타 방법은 검사될 하나 이상의 성분에 대한 표지를 이용하고/하거나, 발색성, 형광성, 발광성 또는 동위원소 표지를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 검출 방법을 이용할 수 있다. 결합 친화도 및 동력학에 대한 상세한 설명은 문헌{Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)}에서 찾아볼 수 있다.
CD40L-Fc 융합 단백질의 기능 또는 활성을 결정하기 위한 부가적인 시험관 내 및 생체 내 방법이 본원에 개시되어 있다. 면역 반응들 중 하나 이상(예를 들어, T 세포 기능 및 기억, B 세포 활성화 또는 증식, 수지상 세포 성숙 또는 활성화, Th1 사이토카인 또는 케모카인 반응, 단핵구 유래 대식세포 M1/M2 분극, 항원 제시 및/또는 종양 미세환경의 면역 억제 중 하나 이상)을 결정하기 위해 이들 검정이 사용될 수 있다. 항-암 또는 항종양 활성을 평가하기 위한 다양한 생체 내 동물 모델, 예를 들어 B16-F10 종양 마우스 모델이 당업계에 공지되어 있다. 부가적으로는, 약역학 및 약동학 특징을 평가하기 위한 방법이 또한 널리 공지되어 있다.
키트
본 발명은 항종양 활성을 향상시키기 위한 키트를 제공한다. 다양한 실시형태에서, 키트는 CD40L-Fc 융합 단백질(예를 들어, MEDI5083)을 포함한다. 키트는, 예를 들어 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 트레멜리무맙), 항-PD-L1 항체(예를 들어, 더발루맙), 및/또는 항-PD-1 항체를 포함하는 부가적인 치료용 조성물을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 치료용 조성물을 함유하는 멸균 용기를 포함하고; 이 같은 용기는 상자, 앰풀, 병, 바이얼(vial), 튜브, 봉투, 파우치, 블리스터 팩(blister pack) 또는 당업계에 공지된 기타 적합한 용기 형태일 수 있다. 이 같은 용기는 플라스틱, 유리, 접합지(laminated paper), 금속 호일 또는 약제를 담기에 적합한 기타 재료로 만들어질 수 있다.
필요한 경우, 키트는 본 발명의 치료 조합을 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 특정한 실시형태에서, 설명서는 하기 내용, 즉 치료제에 대한 설명; 항종양 활성을 향상시키기 위한 투여 계획 및 투여; 주의 사항; 경고문; 징후; 사용금지 사항; 과량 투여 정보; 부작용; 동물 약리학; 임상 연구; 및/또는 인용문헌 중 적어도 하나를 포함한다. 설명서는 용기(존재하는 경우)에 직접 인쇄되거나 용기에 도포된 표지로서 인쇄될 수 있거나, 별도의 시트, 팜플렛, 카드 또는 용기 내에 또는 이와 함께 공급되는 폴더(folder)로서 인쇄될 수 있다.
달리 언급하지 않는 한, 본 발명의 관행은 분자생물학(재조합 기법을 포함함), 미생물학, 세포생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법을 이용하며, 이들 기법은 충분히 당업자의 범위 내에 있다. 이 같은 기법은 문헌{"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989)}; 문헌{"Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984)}; 문헌{"Animal Cell Culture" (Freshney, 1987)}; 문헌{"Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996)}; 문헌{"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987)}; 문헌{"Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987)}; 문헌{"PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994)}; 문헌{"Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)}과 같은 문헌에 상세하게 설명되어 있다. 이들 기법은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 생산에 응용 가능하며, 이와 같이 본 발명을 수행하고 실시할 때 고려될 수 있다. 특정한 실시형태를 위한 특히 유용한 기법은 하기 섹션에서 토의될 것이다.
하기 실시예는 본 발명의 평가, 선별 및 치료 방법을 어떻게 수행하고 이용하는지에 대한 완전한 개시와 설명을 당업자에게 제공하기 위해 개시되며, 본 발명자들이 자신의 발명에 대해 간주하는 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예
이하 본 발명은 하기 실시예를 참고하여 설명된다. 이들 실시예는 단순히 예시적이며, 본 발명은 결코 이들 실시예에 제한되는 것으로 이해되어서는 안 되지만, 오히려 본원에서 제공된 교시의 결과로서 자명하게 되는 임의의 모든 변형을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예 1: CD40L-Fc의 생성 및 안정성 연구
CD40L은 공동 자극 분자의 역할을 하고, 항원 제시 세포(APC) 상의 수용체인 CD40에 결합하며, 이는 항종양 항체 면역 반응의 B 세포 활성화 및 제시, 대식세포 및 수지상 세포의 활성화 및 천연 살해 세포 및 세포 독성 T 림프구의 생성을 포함하여 표적 세포 유형에 따라 많은 효과를 초래한다.
펩티드 링커를 통해 결합되는 3개의 CD40 리간드(CD40L) 소단위 및 Fc 단량체(IgG4P Fc)의 단일쇄 융합체(CD40L-Fc)를 포함하는 융합 단백질이 구축되었다(도 1). CD40L-Fc 융합 단백질은 scCD40L-IgG4P-FP6(MEDI5083), scCD40L-IgG4P-FP7 및 쥐 대리(FP5 유사 마우스 IgG1 D265A Fc)를 포함하였다. CD40L-Fc 구조체의 물리적 특징을 시험하였으며, 이들은 유사한 것이 관찰되었다(표 1).
CD40L-Fc 구조체의 비교
구조체 유닛 간 링커 서열 단백질 A로부터의 비응집율(%) 광 산란에 의한 MW(kDa) 최종 수율(㎎/ℓ)
FP7 C194W GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 4) 90 157 155
FP6 C194W GGGGSGGGS(서열 번호 2) 87 157 78
WT FP5 GGGSGGS(서열 번호 37) 85 143 101
안정성 데이터는 하기 프로토콜에 따라 생성되었다. 시료를 PBS에서 5 ㎎/㎖까지 농축하고, 실온 및 45℃에서 배양하였다. 시료를 다양한 시점(예를 들어, 1일, 3일, 7일째 날 등)에 고성능 크기 배제 크로마토그래피(HPSEC)에 의해 시험하였다. FP7 C194W에 대한 대표적인 HPSEC 크로마토그램은 도 2에 도시되어 있다. CD40L-Fc구조체에 대한 안정성 데이터는 최대 7일 동안 실온에서 시간이 지남에 따라 최소 변화를 나타냈으며, 45℃에서는 시간이 지남에 따라 응집의 증가를 나타냈다(표 2).
CD40L-Fc 구조체에 대한 안정성 데이터
구조체 1일째, 실온 3일째, 실온 7일째, 실온 1일째, 45℃ 3일째, 45℃ 7일째, 45℃
FP7 C194W 100 100 100 96 93 81
FP6 C194W 100 100 99 96 93 86
WT FP5 100 99 100 96 82 76
본원에 개시된 바와 같이, 안정성 프로그램 상에서 FP6의 시료를 HEK293 인간 CD40 NFκB 루시페라아제 리포터 시스템에서 생물 활성에 대해 시험하였다. NFκB 루시페라아제 검정에 의해 측정할 때 MEDI5083 안정성 시료의 생물 활성은 곡선의 일반적인 형태 및 매개 변수 및 특히 예상되는 100~200 pM 범위에서의 등급인 IC50 값에서 둘 모두 대조군 시료에 필적하였다(도 3).
실시예 2: CD40L-Fc 융합 단백질 CD40L-FP7은 CD40L 생물 활성을 갖는다
FP6 CD40L 융합 단백질(MEDI5083)은 B 세포 및 수지상 세포와 같은 면역 시스템 세포에서 표면 결합된 인간 CD40을 통한 결합 및 신호전달을 통해 생물학적 활성을 나타낸다. CD40L 융합 단백질 FP7의 CD40 매개 활성을 결정하기 위해, HEK293 CD40 NFκB-Luc 세포주 및 라모스-블루 NFκB/AP-1 리포터 B-림프구 시스템을 사용하였다.
인간 CD40 및 NFκB-루시페라아제 리포터 시스템으로 형질 감염된 인간 HEK 세포 또는 NFκB/AP-1 리포터 시스템으로 형질 감염된 라모스-블루 세포를 이용하여 신속하면서도 간단한 대리 검정을 개발하였다. 이러한 연구에서, FP7 CD40L 융합 단백질(메드이뮨(MedImmune))의 활성을 MEDI5083(메드이뮨) 및 아이소타입 대조군(아이소타입 인간 IgG4; 메드이뮨)에 대비하여 평가하였다. FP7 CD40L 및 MEDI5083을 2X 및 1X 약물 희석안(drug dilution scheme)에 따라 제조하였다. 2X 약물에 대해서는 하기 희석안을 사용하였다: 200 nM, 66.7 nM, 22.2 nM, 7.4 nM, 2.5 nM, 823 pM, 274 pM, 92 pM, 31 pM, 10 pM, 3.4 pM 및 0 pM. 1X 약물에 대해서는 하기 희석안을 사용하였다: 100 nM, 33.4 nM, 11.1 nM, 3.7 nM, 1.3 nM, 412 pM, 137 pM, 46 pM, 15 pM, 5 pM, 1.7 pM 및 0 pM.
재료 및 방법
Hu CD40 HEK 생물 활성 검정 프로토콜
Hu CD40 293 HEK NFκB c3 세포를 10% 열-불활성화 FBS(HI-FBS; 집코) 및 펜스트렙(Pen Strep; 집코)가 보충된 DMEM(집코(GIBCO))에서 유지하였다. 세포는 부착성이며, 밀집도(confluency)가 증가함에 따라 세포 적층 또는 세포섬(island)을 형성하는 경향이 있다. 세포가 75% 밀집도에 접근함에 따라 분할된다. 세포를 수확하기 위해 배지를 흡입하고, 0.25% 트립신-EDTA(5 ㎖; 집코)를 첨가하고, 세포층을 흔들면서 코팅하였다. 트립신을 제거하고, 배지(lO ㎖)를 첨가하고, 교반에 의해 세포를 제거하였다. 수확된 세포를 2% HI-FBS가 보충된 DMEM에서 5 x 105개의 세포/㎖로 조절하고, 편평 바닥의 폴리 D-L 리신 바이오코트(Biocoat) 96웰 플레이트(5 x 104개의 세포/웰; 코닝(Corning))의 웰에 첨가하고(100 ㎕), 24시간 동안 37℃ 배양기에 넣어 두었다. 배양 이후, 플레이트로부터 배지를 흡입하였다. 백(100) ㎕의 1X 약물을 각 웰에 조심스럽게 첨가하고(예를 들어, 웰 측면 아래로), 세포의 분리를 최소화하도록 조심하였다. 세포를 24시간 동안 37℃ 배양기로 되돌려 보냈다. 루시페라아제 시약(브라이트-글로(Bright-Glo) 루시페라아제 검정 기질; 프로메가(Promega))을 준비하고, 실온까지 평형화하도록 하였으며, 각 웰에 첨가하였다(100 ㎕). 세포 및 시약을 충분히 혼합하여 완전한 세포 용균을 확인하였으며, 퍼킨엘머 인비젼-02(PerkinElmer Evision-02) 발광측정기 플레이트 판독기 상에서 즉시 판독하였다.
라모스-블루 생물 활성 검정 프로토콜
라모스-블루 NFκB/AP-1 리포터 B-림프구(인비보젠(InvivoGen))를 10% HI-FBS(집코), 펜스트렙(집코) 및 제오신(Zeocin; 100 ㎍/㎖; 인비보젠) 배지가 보충된 IMDM GlutaMAX(집코)에서 유지하였다. 세포는 비부착성이며, 배양은 5 x 105개의 세포/㎖에서 개시되고, 6 x 106개의 세포/㎖ 미만으로 유지되었다. -1일째 날, 세포를 10% HI-FBS 및 펜/스트렙(pen/strep; 제오(Zeo) 부재) 배지가 첨부된 IMDM GlutaMAX로 분할하였다. 세포를 수확하고, 4 x 106개의 세포/㎖로 조절하였으며, 편평 바닥의 96웰 플레이트(4 x 105개의 세포/웰; 팰콘(Falcon))의 웰에 첨가하였다(100 ㎕). 제오 부재 배지 중의 백(100) ㎕의 2X 약물을 각 웰에 첨가하고, 세포를 24시간 동안 37℃ 배양기 내에 넣어 두었다. 라모스-블루 세포로부터의 상층액(40㎕)을 편평 바닥의 96웰 플레이트의 웰에 전달하였다. AP-1 QUANTI-Blue 시약(lOO㎖의 멸균수에 용해된 하나의 파우치(pouch); 인비보젠)을 준비하고, AP-1 QUANTI-Blue 시약(160㎕)을 각 웰에 첨가하였다. 세포 및 AP-1 QUANTI-Blue 시약이 담겨 있는 플레이트를 최대 1시간 동안 37℃ 배양기에 넣고, 655㎚에서 스펙트라맥스 M5(SpectraMax M5) 분광 광도계 상에서 판독하였다.
CD40L-FP7은 리포터 세포주 검정 둘 모두에서 MEDI5083와 동일한 생물학적 활성을 나타냈다(도 4 및 도 5 및 표 3 및 표 4). CD40L-FP7 융합 단백질 내의 CD40L 소단위는 9개의 아미노산으로 이루어진 GlySer 펩티드 링커를 통해 결합된다. 놀랍게도, 기타 단일쇄 TNF 리간드-Fc 융합 단백질과 비교하여 증가된 링커 길이(8개 초과의 아미노산)를 가짐에도 불구하고, 링커의 9개의 아미노산 길이는 CD40L 활성을 감소시키지 않았으며, CD40L-FP7 융합 단백질의 응집도 없었다. 인간 IgG4P 아이소타입 대조군 NIP-228은 리포터 검정에서 배경 초과의 활성을 나타내지 않았다. 라모스-블루 리포터 검정에 있어서, 60분(도 5) 및 30분 동안 QUANTI-Blue AP-1 검출 배지와 함께 배양하면 유사한 곡선을 나타냈다. 그러나 60분 동안 QUANTI-Blue AP-1 검출 배지와 함께 배양하면 30분보다 긴 역학 범위를 초래하였다. 다른 실험에서, MEDI5083은 인간 일차 B 세포 증식을 자극하였다(도 6). 따라서 이들 실험에 따르면 MEDI5083은 생물 활성을 가지며, 적응성 면역을 활성화시킬 수 있는 것으로 나타났다.
MEDI5083에 대해 인용된 CD40L-FP7 및 인간 IgG4P 아이소타입 대조군에 대한 생체 이용 가능성 평가: HuCD40 293 HEK NFκB c3 세포 모델
최적 적합 값 시험 샘플 설명
MEDI5083 CD40L-FP7 HuIgG4P
바닥 71966 67530 75990
상부 167096 162767 71170
로그EC50 -0.6775 -0.3582 ~ 0.3561
사면 2.397 1.424 ~ -60.20
EC50(nM) 0.2102 0.4383 ~ 2.270
스판(Span) 95130 95237 -4820
R 스퀘어(R Square) 0.9850 0.9695 0.2588
MEDI5083에 대해 인용된 CD40L-FP7 및 인간 IgG4P 아이소타입 대조군에 대한 생체 이용 가능성 평가: 라모스-블루 NFκB/AP-1 B-세포 세포 모델
최적 적합 값 시험 샘플 설명
MEDI5083 CD40L-FP7 HuIgG4P
바닥 0.08990 0.06519 0.07544
상부 1.667 1.618 ~ 27.19
로그EC50 -1.146 -0.9699 ~ 2.317
사면 1.023 0.9531 ~ 12.20
EC50(nM) 0.07153 0.1072 ~ 207.5
스판(Span) 1.577 1.553 ~ 27.11
R 스퀘어(R Square) 0.9810 0.9965 0.1639
실시예 3: CD40L-Fc 융합 단백질 MEDI5083은 인간 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC)를 활성화한다
MEDI5083은 수지상 세포, B 세포 및 대식세포와 같은 면역 시스템 세포에서 수용체 CD40을 통해 생물학적 활성을 나타낸다. CD40L 활성화제는 FACS 및 ELISA에 의해 각각 검출 가능한 수지상 세포에서의 세포 표면 활성화 마커 및 염증성 사이토카인 분비를 증가시키는 것으로 나타났다. 이러한 연구는 MEDI5083에 의한 MoDC의 전처리에 의해 인간 MoDC에서의 반응이 향상되는지를 결정하기 위해 설계되었다.
재료 및 방법
MoDC 개시 및 배양
48시간 마다 사이토카인을 재공급하면서 인간 단핵구(예를 들어, 신선함)를 GM-CSF 및 IL-4(둘 모두 100 ng/㎖; R&D 시스템즈)가 보충된 RPMI (RPMI 1640 + Glut 배지; 집코) + 10% 열-불활성화 FBS (HI-FBS; 집코)(= cRPMI)에서 6일 동안 배양하였다. 6일 후, 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC)(부착 손실 및 세포막 압출물의 외관을 특징으로 함)를 계수하고, cRPMI에서 1 x 106개의 세포/㎖로 조절하였다. 6일째 날, 각각의 기증자로부터의 1 x 106개의 세포/㎖의 분취액에 대해 FACS(MACSQUANT Pippen)에 의해 특성분석이 수행되었다.
MoDC 약물 처리 및 활성화
각각의 기증자에 있어서, cRPMI 중의 MoDC(100 ㎕)를 96웰 플레이트의 웰에 첨가하였다(웰 당 1 x 105개의 세포). cRPMI 중의 MEDI5083(1:3 희석)의 약물 저장액(4X)을 생성하여 100 nM 내지 15 pM 범위의 FP6의 최종 농도를 제공하였다. 4X 약물에 대해서는 하기 희석안을 사용하였다: 200 nM, 100 nM, 33.3 nM, 11.1 nM, 3.7 nM, 1.2 nM, 400 pM, 140 pM, 46 pM, 15 pM 및 0 pM. 아이소타입 대조군(100 nM)은 약물 없이(0 pM) 사용하였다. 게다가, 조합 웰에 첨가될 약물의 고정 농도를 위해, cRPMI 중의 4X 약물 저장액을 생성하여 4 nM MEDI5083의 최종 농도를 제공하였다. 4X 약물(50 ㎕) 및 50 ㎕의 cRPMI를 단일 약물 처리 웰에 첨가하였다. 24시간 후, 상층액(130 ㎕)을 수확하고, 표지된 96웰 플레이트로 전달하고, 후속적인 사이토카인 분석(IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-8, TNF-α)을 위해 냉동시켰다. 세포를 FACS에 의해 가공하였다.
세포 외 FACS 염색 프로토콜: 표현형/기능성 패널
24시간 후, MoDC 세포는 플레이트에 부착하였다. Ca/Mg 부재 DPBS(DPBS; 집코)(200 ㎕)를 웰에 첨가하고, 세척을 위해 5분 동안 1,500 rpm으로 회전시켰다. 예비 가온된 트리플 익스프레스(TrypLE Express; 100 ㎕; 집코)를 첨가하고, 세포를 15분 동안 37℃에서 방치하였다. FACS 완충액(5% HI-FBS 및 0.1% 아지드화나트륨(시그마(SIGMA))이 보충된 DPBS)을 첨가하고, 세포를 2회 세척하였다. 세포를 30 ㎕의 10 ㎍/㎖ 인간 IgG에 다시 현탁하고, 실온에서 10분 동안 배양하였다. 이때, MoDC를 보상 플레이트에 첨가하고, 적절한 항체를 첨가하였다. FACS 완충액 + 아지드(100 ㎕) 중의 항체 마스터믹스(antibody mastermix) 및 FMO(형광 마이너스 원(fluorescence minus one)) 대조군을 첨가하고, 세포를 20분 동안 4℃에서 배양하였다. 세포 표면 마커인 CD14, CD40, CD206, CD163, CD68, CD80, HLA-DR, CD274(PD-L1)에 대한 항체를 사용하였다. 세포를 FACS 완충액로 2회 세척한 후, FACS 완충액(100 ㎕)에 다시 현탁하고, 시료를 유세포 분석기 상에서 획득하였다. Flow Jo v9 상에서 데이터를 분석하였다.
MEDI5083은 항원 제시와 연관된 세포 표면 마커인 HLA-ABC, HLA-DR, CD80 및 CD86, 및 활성화 항원인 CD83을 높은 수준으로 유도하였다(도 7 및 표 5 참조).
EC50 값
마커 EC 50 (nM)
CD80 0.813
CD83 0.234
CD86 0.447
HLA-ABC 0.988
HLA-DR 0.473
활성화 항원인 CD40 및 PD-L1, 및 림프절 호밍(lymph node homing) CCL19 및 CCL21 수용체 CCR7을 포함한 부가적인 세포 표면 마커가 또한 높은 수준으로 관찰되었다. 발현된 CD40이 고농도에서 하향 조절되는 것으로 나타났을지라도 모든 MoDC 세포 표면 마커의 발현은 용량 반응 방식으로 증가하였으며, 3.7 내지 11.1 nM에서 안정 상태를 유지하였다. 따라서 MEDI5083은 인간 단핵구 유래 수지상 세포(MoDC)를 활성화시키고 성숙시킬 수 있었다. 이들 실험에 따르면 MEDI5083은 선천 면역을 활성화시킬 수 있는 것으로 증명되었다.
MEDI5083은 IL-12p70, IFN-γ, TNF-α 및 IL-10의 분비의 용량 의존성 증가를 유도하였다(도 8). IL-8 분비는 초기에 유도되었지만, 3.7 μM 이상의 용량에서 억제되었다. MEDI5083의 경우에 IL-1β에 대한 어떠한 영향도 관찰되지 않았다. 다른 실험에서, MEDI5083에 의한 mDC 활성화 및 성숙은 T 세포 증식을 용량 의존적 방식으로 조장하였다(도 9). 따라서 MEDI5083은 인간 MoDC에서 Th1 사이토카인/케모카인 반응을 유도하고 T 세포 증식을 조장할 수 있었다. 이들 실험에 따르면 MEDI5083은 선천성 및 적응성 면역 반응을 가교시키는 잠재성을 갖는 것으로 나타나 있다.
실시예 4: CD40L-Fc 융합 단백질 MEDI5083은 인간 대식세포 분극을 활성화한다
단핵구는 매우 유연하며, 시험관 내에서 전염증성 M1 표현형 또는 억제제/상처 치유 M2 표현형을 갖는 분화된 대식세포일 수 있다. M1 대식세포는 PDL1hi/CD80hi/CD40hi/HLA-DRhi/CD206lo/CD163lo/CD14lo인 반면, M2 대식세포는 PDL1lo/CD80lo/CD40lo/HLA-DRlo/CD206hi/CD163hi/CD14hi이다. 게다가, M1 대식세포는 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12 및 IL-23을 생성하는 반면, M2 대식세포는 억제성 사이토카인인 IL-10 및 TGF-β를 생성한다. 종양 환경에서, M2 대식세포는 암 항원에 대한 면역 반응을 억제할 수 있다. M1 표현형을 향한 스위칭 분극(switching polarization)은 이러한 효과보다 더 중요할 수 있으며, 종양 퇴화를 가능케 한다. 이러한 실험은 인간 CD40L/인간 IgG4 융합 단백질인 MEDI5083이 M1 및 M2-분극된 대식세포에 미치는 영향을 평가하기 위해 설계되었다.
재료 및 방법
단핵구 조작 및 분극 프로토콜(문헌{Mia et al. (2014) Scan J Immunol 79: p305~314})
2명의 기증자(Dl: 8367; D2: 8375)로부터 유래한 신선한 인간 단핵구(올셀즈(Allcells))를 실험에 사용하기 위해 수득하였다. 세포 계측을 수행하고, 세포 분취액(1 x 106개)을 DO/휴지기 단핵구 FACS 기준선을 위해 제거하였다. 잔류 세포를 2개의 동일한 분취액으로 나누고, 세포를 스핀 다운하고(1,500 rpm, 5분), 절반을 10% 열-불활성화 FBS(HI-FBS; 집코), 펜스트렙(집코)(= cRPMI) 및 50 ng/㎖ GM-CSF(R&D 시스템즈)이 보충된 M1 배지(RPMI(RPMI 1640 + Glut 배지; 집코)에 다시 현탁하고, 절반은 M2 배지(50 ng/㎖ M-CSF 포함 cRPMI(R&D 시스템즈))에서 다시 현탁하였다. 분취액(2 ㎖)을 6웰 플레이트의 웰로 전달하고, 격일로 신선한 사이토카인을 첨가하면서 플레이트를 37℃에서 6일 도안 배양하였다. 무혈청 배지에서의 부착 단계는 공개된 프로토콜에는 제거되었다. 사이토카인을 첨가할 때마다 세포 형태를 관찰하고 기록하였다.
6일 후, 대식세포는 M1 또는 M2를 향해 분극되었다. 활성화 자극의 부가는 특징적인 사이토카인의 분비 및 세포 표면 마커의 상향 조절을 초래하였다. 이러한 연구를 위해, 활성화는 3개의 방식으로 수행되었다:
(a) 6일째 날에 부가된 표준 활성화(M1 플레이트에 대해 50 ng/㎖의 LPS(LPS 대장균 0111:B4; 시그마) + 20 ng/㎖의 IFN-γ(R&D 시스템즈) 및 M2 플레이트에 대해 20 ng/㎖의 IL-4(R&D 시스템즈) + 20 ng/㎖의 IL-10(R&D 시스템즈), 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 분석 및 24시간 후의 상층액의 수확.
(b) 6일째 날에 부가된 MEDI5083(4 nM; 메드이뮨) 또는 아이소타입 대조군(4 nM; 메드이뮨)의 동시 첨가와 함께 표준 활성화, FACS 분석 및 24시간 후의 상층액의 수확.
(c) 6일째 날에 부가된 표준 활성화, 24시간 후(7일째 날)에 첨가된 MEDI5083(4 nM; 메드이뮨) 또는 아이소타입 대조군(4 nM; 메드이뮨), FACS 분석 및 추가의 24시간 후의 상층액의 수확.
수확 시에 상층액(500 ㎕)을 제거하고, MSD에 의한 후속적인 사이토카인 분석를 위해 냉동시켰다(인간 TH1/TH2 10-플렉스 플레이트(10-plex plate) IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13, IFN-γ 및 TGF-β).
나머지 배지를 흡입하고, 플레이트를 DPBS(Ca/Mg 부재 DPBS; 집코)로 1회 세척하였으며, 예비 가온된 트리플 익스프레스 해리 완충액(dissociation buffer; 0.5 ㎖; 집코)을 각 웰에 첨가하였다. 세포를 20분 동안 37℃ 배양기에 넣고, 대식세포를 축출하기 위해 플레이트를 태핑(tapping)하고, cRPMI(2 ㎖)를 첨가하고, 세포를 수확하기 위해 5 ㎖ 피펫(pipette)을 이용하여 격렬하게 흡입하였다. 이 과정 이후, 세포를 제거하기 위해 현미경 하에서 웰을 확인하였다. 세포를 스핀 다운하고, cRPMI에서 1 x 106개의 세포/㎖로 조절하고, FACS용으로 가공하였다.
세포 외 FACS 염색 프로토콜(4C)
세포(2 x 105개)를 둥근 바닥 96웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 1500 rpm에서 5분 동안 스핀 다운하였다. FACS 완충액(5% HI-FBS(집코) 및 0.1% 아지드화나트륨(시그마)가 보충된 DPBS(Ca/Mg 부재 DPBS; 집코))을 첨가하고(200 ㎕), 세포를 1회 세척하였다. 세포를 50 ㎕의 1:4 TruStain FcX(바이오레전드(BioLegend)) Fc 수용체 블록(Fc receptor block)에 다시 현탁하고, 10분 동안 실온에서 배양하였다. 항체 패널 마스터믹스(100 ㎕)를 웰에 첨가하고, 세포를 20분 동안 4℃에서 배양하였다. 세포 표면 마커인 CD14, CD40, CD206, CD163, CD68, CD80, HLA-DR, CD274(PD-L1)에 대한 항체를 사용하였다. 세포를 FACS 완충액로 2회 세척하고, FACS 완충액(100 ㎕)에 다시 현탁하였으며, 시료를 MACSQuant 유세포 분석기 상에 획득하였다. Flow Jo v9 상에서 데이터를 분석하였다.
GM-CSF에서의 6일 후, 대식세포는 M0-M1로 지칭된다. 24시간 동안 IFN-γ 및 LPS에 의한 활성화는 완전한 M1 분극을 야기하였다. 마찬가지로, M-CSF에서의 6일 후, 대식세포는 M0-M2로 지칭되고, 24시간 동안 IL-4 및 IL-10에 의한 활성화는 완전한 M12 분극을 야기하였다. 중요하게는, 현미경 하에 관찰한 지 6일 후(활성화 이전), M0-M1 대식세포는 전형적인 편평해지고 납작해진 형태를 가졌으며, M0-M2 대식세포는 전형적인 부착성의 방추사 유사 세포를 가졌다. M2 대식세포에서, 24시간의 활성화 단계에서 MEDI5083(4 nM)의 봉입체는 M2로부터 멀어지게, 그리고 M1을 향해 분극을 이동시키면서 M1 마커를 증가시키고, M2 마커를 감소시켰다(도 10, 해치 바(hatched bar); 도 11). 따라서 이들 실험에 따르면 MEDI5083은 면역 억제를 반전시킬 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 5: CD40L-Fc 융합 단백질 MEDI5083은 CD40와 특이적으로 결합한다
FP6(MEDI5083)의 작용 방식은 주로 CD40 발현 항원 제시 세포(수지상 세포, B 세포, 단핵구 및 대식세포)의 활성화를 통해 이루어진다. FP6은 GITR, TRAIL 및 OX40과 같은 기타 TNF 수용체 하위 부류의 단백질에 결합하지 않으며, 종 특이성을 갖는다(마우스 모델에서는 작용하지 않음).
단순 ELISA는 FP6(MEDI5083)의 인간 CD40 특이성을 평가하기 위해 개발되었다. 단순 ELISA 기반 프로토콜을 개발하려는 초기 시도에 따르면 검정 특이성을 제어하기 위해 사용되는 수용체/Fc 융합 단백질의 Fc 성분에 대한 비특이성 결합을 우회(bypassing)하기 위해 보다 특이적인 항-인간 IgG4 2차 시약을 사용할 필요성이 증명되었다. 게다가, 수용체 및 일차 시약의 보다 적은 유효 농도를 결정하였다. 본 연구에서, 보다 특이적인 2차 시약을 평가하였다.
재료 및 방법
TNF 수용체 결합 검정
Fc 성분을 갖지 않은 TRAIL을 제외한 재조합 Fc 키메라 수용체(5 ㎍/㎖의 50 ㎕)를 플레이트 상에 코팅한 후(1시간, 37℃), 세척 단계(PBS + 0.05% 트윈으로 3회)를 수행하였다. 재조합 수용체는 rhCD40(hIgG1 Fc); rmCD40(hIgG1 Fc); rhGITR(hIgG1 Fc); rhTRAIL; rhOX40(hIgG1 Fc)(R&D 시스템즈)를 포함하였다. Fc-HRP 2차 시약에 대한 직접 결합을 확인하기 위해 대조군으로서 재조합 수용체를 단독으로(일차 아님) 사용하였다. 플레이트를 PBS 중의 4% 우유로 차단한 후(1시간, 37℃), 세척 단계(PBS로 2회)를 수행하였다. 플레이트를, 예를 들어 새로 만든 1% BSA PBS 중의 일차 시약(20 nM의 50 ㎕)과 함께 배양한 후(1시간, 37℃), 세척 단계(PBS + 0.05% 트윈으로 4회)를 수행하였다. 일차 시약은 FP6(hIgG4 Fc), 및 아이소타입 대조군으로서 사용되는 인간 IgG4 항체를 포함하였다. 플레이트를 PBS 중의 4% 우유에서 2차 시약인 HRP 접합 항-Fc(1:25000의 100 ㎕)와 함께 배양한 후, 세척 단계(PBS + 0.05% 트윈으로 4회)를 수행하였다. HRP 접합 항-Fc를 제조하기 위해, 마우스 항-인간 IgG4(H+L)의 1:4 저장액(서모 카탈로그 번호(Thermo cat no.): MAl-34437)을 4% 우유에서 만들고, 1:5000로 희석하였으며, 0.5 ㎎/㎖를 1:25000로 사용하였다. TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 용액을 첨가하였다(100 ㎕/웰). TMB 용액은 첨가 전 15분 이내에 동일한 부피의 RT 용액 A를 용액 B(TMB 기질 시약 키트; BD OptEIA 카탈로그 번호: 3 555214)에 첨가함으로써 제조되었다. 반응액을 실온에서 15분 동안 배양하고, 빛을 차단하였다. HRP 활성을 갖는 웰은 청색으로 변하였다. 정지액(2 N 황산; 100 ㎕)을 첨가하고, 청색으로 변하고 있는 웰은 연노랑으로 변하였다. 플레이트 판독기 상에서 450 ㎚에서 플레이트를 판독하였다.
FP6(MEDI5083) ELISA 검정은 인간 CD40에 대해 높은 특이성으로 매우 효과적이었다(도 12). 낮은 배경 신호는 GITR, TRAIL 및 OX40과 같은 기타 인간 TNF 수용체 부류의 멤버로부터 생성되었으며, 이는 FP6이 GITR, TRAIL 및 OX40와 같은 기타 인간 TNF 수용체 부류의 멤버에 대해 인간 CD40에 대한 높은 특이성을 증명한다는 것을 보여준다. 따라서 단순 ELISA는 인간 CD40에 대한 FP6의 특이성을 평가하기 위해 개발되었다.
이러한 ELISA 검정에서의 주요 성분은 고도로 특이적인 항-인간 IgG4 2차 시약이다. FP6 특이적 ELISA를 생성하기 위한 초기 시도에서는 보다 광범위한 반응성 항-인간 IgG 2차 시약이 사용되었으며, 이들 2차 시약은 FP6에 대한 표적으로서 사용되는 수용체 Fc 융합 단백질의 인간 Fc 영역에 결합하며, 이는 양성 신호의 오류를 야기하였다.
본원에 개시된 실험의 요약에 따르면 MEDI5083은 시험관 내에서 CD40과 특이적으로 결합하고, 면역 반응의 주요 성분을 활성화시키는 것으로 나타났다(표 6).
MEDI5083은 CD40와 특이적으로 결합하고 면역 반응의 주요 성분을 활성화한다
시험관 내 검정 효능
인간 KinExA(KD) ND
인간 CD40 NFκB(n = 10) EC50: 0.1 nM
인간 B 세포 증식(n = 3) EC50: 0.2 nM
인간 DC 세포 성숙/활성화(n = 3) 예
MoDC에 의한 Th-1 분극용 사이토카인의 생산 예
인간 단핵구/MF M2→M1 분극 예
TNF 부류의 교차 반응성(OX40, GITR, TRAIL) 관찰 불능
실시예 6: MEDI5083 마우스 대리 MuCD40L-FP는 마우스 종양 모델에서 항종양 활성을 갖는다
마우스에서 생체 내 CD40L-Fc 융합 단백질의 효과를 연구하기 위해, MEDI5083의 쥐 대리 MuCD40L-FP를 구축하였다. MEDI5083과 같이, MuCD40L-FP는, N-말단에서 C-말단 방향으로, 펩티드 링커를 통해 연결되는 3개의 CD40L 소단위의 단일쇄 융합체를 포함하며, 이는 Fc 폴리펩티드에 연결된다. 그러나 MEDI5083 중의 인간 CD40L 소단위 및 인간 IgG4P 대신에 MuCD40L-FP는 마우스 CD40L 소단위 및 마우스 IgG1 Fc를 포함한다. 게다가, MuCD40L-FP에서 마우스 CD40L 소단위들 사이의 소단위 간 링커는 GGGSGGS(서열 번호 37)로서, GGGGSGGGS(서열 번호 2)와 비교된다.
B16-F10 공통 유전자 마우스 모델에서 마우스 대리 CD40L FP를 시험하였다. MuCD40L-FP는 B16-F10 마우스 모델에서 아이소타입 및 미처리 대조군에 비해 종양 부피를 감소시키고/시키거나 종양 성장을 지연시켰다(도 13). 게다가, MuCD40L-FP로 처리된 마우스는 유의한 체중 감소 또는 기타 관측 가능한 효과가 없었다. 따라서 MuCD40L-FP는 저반응성 종양 모델에서 유의한 항종양 활성을 나타냈다.
B16-F10 공통 유전자 마우스 모델에서 항-PD-L1과 함께 마우스 대리 CD40L FP를 시험하였다. MuCD40L-FP는 항-PD-L1와 함께 B16-F10 마우스 모델에서 항-PD-L1 단독 및 아이소타입 및 미처리 대조군에 비해 개별 마우스에서 종양 부피를 감소시키고/시키거나 종양 성장을 지연시켰다(도 14 및 도 15).
B16-F10 공통 유전자 마우스 모델에서 항-CTLA-4와 함께 마우스 대리 CD40L FP를 시험하였다. MuCD40L-FP는 항-CTLA-4와 함께 B16-F10 마우스 모델에서 항-CTLA-4 단독 및 아이소타입 및 미처리 대조군에 비해 개별 마우스에서 종양 부피를 감소시키고/시키거나 종양 성장을 지연시켰다(도 16 및 도 17).
B16-F10 공통 유전자 마우스 모델에서 항-PD-L1 및 항-CTLA-4와 함께 마우스 대리 CD40L FP를 시험하였다. MuCD40L-FP는 항-PD-L1 및 항-CTLA-4와 함께 B16-F10 마우스 모델에서 항-PD-L1 및 항-CTLA-4의 조합 또는 항-PD-L1 또는 항-CTLA-4가 구비된 MuCD40L-FP에 비해 개별 마우스에서 종양 부피를 감소시키고/시키거나 종양 성장을 지연시켰다(도 18 및 도 19).
B16-F10 공통 유전자 마우스 모델에서 항-PD-1과 함께 마우스 대리 CD40L FP를 시험하였다. MuCD40L-FP는 항-PD-1과 함께 B16-F10 마우스 모델에서 항-PD-1 단독 및 아이소타입 및 미처리 대조군에 비해 개별 마우스에서 종양 부피를 감소시키고/시키거나 종양 성장을 지연시켰다(도 20 및 도 21).
또한 muCD40L-FP, 항-PDL-1, 항-CTLA-4 또는 항-PDl 단독으로 처리되거나 항-PDL-1, 항-PD-1, 항-CTLA-4 또는 항-PDL-1 및 항-CTLA4와 함께 muCD40L-FP로 처리된 B16-F10 종양 보유 마우스로부터 혈청을 수집하였다. 2차 및 4차 처리 이후 24시간 시점에 혈청 사이토카인 수준은 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery) 복합 검정 키트를 사용하여 측정하였다. muCD40L-FP 단독으로 처리하거나 또는 항-PDL-1, 항-PD-1, 항-CTLA-4 또는 항-PDL-1 및 항-CTLA4와 함께 처리하면 2차 처리(도 22) 24시간 후 및 4차 처리(도 23) 24시간 후에 항-PD-L1, 항-CTLA-4 및 항-PD-1 단독 및 아이소타입 및 미처리 대조군에 비해 TH1 사이토카인인 IFNγ, TNFα, IL12 및 KC/GRO T1의 수준의 증가를 유도하였다. 그러나 2차 처리 24시간 후 및 4차 처리 24시간 후에는 IL-IB, IL-2, IL-4, IL-5 또는 IL-10에서는 어떠한 변화도 관찰되지 않았다(데이터 미도시).
따라서 MuCD40L-FP는 단독으로 사용하거나 항-PD-L1 또는 항-PDl 함께 사용하는 경우에 항-PD-L1, 항-PD-1, 항-CTLA-4와 함께 저반응성 종양 모델에서 유의한 항종양 활성을 나타냈다. 이들 데이터에 따르면 면역 관문 억제제와 함께 MEDI5083의 유용성이 증명되었다.
실시예 7: MEDI5083 마우스 대리 MuCD40L-FP는 마우스에서 면역 반응을 활성화시킨다
마우스 대리 MuCD40L-FP의 효과를 이해하기 위해, B16-F10 마우스에서의 면역 반응을 연구하였다. MuCD40L-FP는 미처리 대조군 및 아이소타입 대조군에 비해 마우스에서 종양 내 CD8+ T 세포 활성화 및 PD-L1 발현을 증가시켰다(도 24). MuCD40L-FP가 투여된 마우스는 대조군 마우스에 비해 총 CD8+ T 세포가 증가하였고, CD8+, IFNγ+; CD8+, GrazB+; 및 PD-L1+ T 세포의 비율이 증가하였다. 비장에서, MuCD40L-FP는 미처리 대조군 및 아이소타입 대조군에 비해 B16-F10 마우스에서 골수성 세포 성숙 및 B 세포 활성화를 조장하였다(도 25). 또한 MuCD40L-FP는 B16-F10 마우스에서 TH1 사이토카인 및 CXCL-1 케모카인의 분비를 유도하였다(도 26). MuCD40L-FP가 투여된 마우스는 대조군 마우스에 비해 IFNγ, TNFα, IL-12 및 CXCL1의 분비가 증가하였다.
실시예 8: 원숭이에서의 MEDI5083 약동학(PK) 및 약역학(PD) 연구
영장류에서 MEDI5083의 효과를 이해하기 위해, 원숭이에서 약동학(PK) 및 약역학(PD) 연구를 수행하였다. CD40에 대해 작용성 mAb에 관해 공개된 데이터(문헌{Vonderheide et al 2001})에 기초하여 0.3 ㎎/㎏의 초기 용량이 사용되었으며, 이때 MEDI5083은 이에 대해 동일한 작용 기작을 갖는다. 공개된 항-CD40 mAb에 대한 MTD는 0.2 ㎎/㎏였다. 동일한 게먹이원숭이 MTD는 인간 MTD의 3배, 즉 0.6 ㎎/㎏일 것이다. 0.3 ㎎/㎏ 이하의 용량은 시노몰거스 마카크(cynomolgus macaque)에서 안전한 초기 용량인 것으로 예상되었다. 단일 용량 PK/PD 독성학 연구에 따르면 임의의 시험된 용량에서는 독성이 나타나지 않았다(표 7).
단일 용량 PK/PD 독성학 연구(비-GLP)
그룹 ㎎/㎏ 경로 용량 동물
1 비히클 IV & SC 1 3M
2 0.3 IV 1 3M
3 3.0 IV 1 3M
4 30.0 IV 1 3M
5 30.0 SC 1 3M
투여 경로는 인간에서 예상되는 투여 경로와 일치하기 때문에 선택되었으며, 이는 적절한 혈청 수준을 제공하고 약리학 효과와 관련이 있는 것으로 예상된다.
투약 4시간 후에 혈액(0.5~1.0 ㎖)을 수집하였다. B 세포(활성화된 B 세포를 포함함), T 세포(T 헬퍼 세포(T helper cell) 및 세포 독성 T 세포), 천연 살해(NK) 세포 및 수지상 세포를 검출하기 위해 특정 단클론성 항체를 이용하여 혈액을 분석하였다. 상대적 세포수(비율)를 수득하고, 총 림프구 계수를 같은 날에 결정하였다. 하위 개체군의 절대 개수는 상대적 개수 및 총 개수로부터 계산하였다. 또한 Ki67 면역 염색을 위해 혈액 시료를 사용하였다. 혈청은 사이토카인의 분석, 약동학 분석 및 평가 및 항-약물-항체(ADA) 연구를 위해 사용되었다.
PK-PD 모델은 원숭이에서 MEDI5083 단일 투여 이후 B 세포 활성화 및 추적을 설명하기 위해 생성되었다(도 27). 상기 연구로부터 얻어진 PK 결과는 하기와 같이 나열된다: CL = 405 ㎖/일/㎏; Vc = 137 ㎖/㎏; Vp = 122 ㎖/㎏; Vmax = 496 ㎍/일; Vmax = 496 ㎍/일; 및 Km = 0.026 ㎍/㎖. 상기 연구로부터 얻어진 PD 결과는 하기와 같이 나열된다: Ro = 1; Smax = 6.32/일; Kout = 8.13/일; 및 EC50 = 0.08 ㎍/㎖. MEDI5083은 비선형 PK을 나타내며, 이때 개체에서의 혈청 반감기는 2.7 내지 18시간의 범위였다. 흥미롭게도, SC 투여된 MEDI5083은 IV 투여되는 경우보다 긴 반감기를 가졌다(30 ㎎/㎏: IV T1/2: 6시간; SC T1/2: 18시간). B 세포 활성화를 위한 EC50은 0.08 ㎍/㎖(약 50 pM)이었으며, 이는 시험관 내에서의 EC50과 일치하였다. B 세포 추적을 위한 반감기가 B 세포 활성화를 위한 2시간의 반감기에 비교하여 36시간이기 때문에 MEDI5083은 장기적인 PD 효과를 나타냈다. 또한 MEDI5083은 원숭이에서 T 세포 증식(CD8+ 기억 T 세포 Ki67)을 활성화하였다(7일째 날에 30 ㎎/㎏ SC에서 관찰된 PD).
기타 실시형태
본원에 개시된 본 발명을 다양한 용도 및 조건에 맞추기 위해 본 발명에 대해 다양한 변형 및 변경이 이루어질 수 있다는 것이 상술한 설명으로부터 자명하게 될 것이다. 또한 이 같은 실시형태는 하기 특허청구범위의 범위 내에 있다.
본원에서 변형예에 대한 임의의 정의에서 성분 목록에 대한 설명에는 임의의 단일 성분 또는 나열된 성분의 조합(또는 부조합)으로서 이러한 변형예에 대한 정의가 포함된다. 본원에서 실시형태에 대한 설명에는 임의의 단일 실시형태로서 또는 임의의 기타 실시형태와 함께 이러한 실시형태 또는 이의 일부가 포함된다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은, 개별적인 특허 및 간행물 각각이 참고로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 나타나 있는 경우 동일한 정도로 본원에서 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> MedImmune LLC <120> CD40L-Fc FUSION POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE THEREOF <130> CD40F-100-WO-PCT <150> US 62/336,129 <151> 2016-05-13 <160> 37 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40L variant <400> 1 Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr 1 5 10 15 Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn 20 25 30 Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln 35 40 45 Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu 50 55 60 Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Trp Leu Lys Ser Pro 65 70 75 80 Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser 85 90 95 Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu 100 105 110 Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln 115 120 125 Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu 130 135 140 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys 245 250 255 Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly 260 265 270 Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly 275 280 285 Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser 290 295 300 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Ala Ala His Val 305 310 315 320 Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu 325 330 335 Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly 340 345 350 Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln 355 360 365 Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile 370 375 380 Ala Ser Leu Trp Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu 385 390 395 400 Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser 405 410 415 Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe 420 425 430 Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr 435 440 445 Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro 465 470 475 480 Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 485 490 495 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 500 505 510 Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 515 520 525 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 530 535 540 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 545 550 555 560 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 565 570 575 Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 580 585 590 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 595 600 605 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 610 615 620 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 625 630 635 640 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 645 650 655 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 660 665 670 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 675 680 685 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 690 695 <210> 11 <211> 681 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FP5-like, mouse IgG1 D265A <400> 11 Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Val Ser Glu Ala Asn Ser Asn Ala 1 5 10 15 Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Lys Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Lys Ser 20 25 30 Asn Leu Val Met Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Glu 35 40 45 Gly Leu Tyr Tyr Val Tyr Thr Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu 50 55 60 Pro Ser Ser Gln Arg Pro Phe Ile Val Gly Leu Trp Leu Lys Pro Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala Asn Thr His Ser Ser 85 90 95 Ser Gln Leu Cys Glu Gln Gln Ser Val His Leu Gly Gly Val Phe Glu 100 105 110 Leu Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Glu Ala Ser Gln 115 120 125 Val Ile His Arg Val Gly Phe Ser Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ile Ala Ala His Val Val Ser Glu Ala 145 150 155 160 Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Lys Lys Gly Tyr Tyr 165 170 175 Thr Met Lys Ser Asn Leu Val Met Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr 180 185 190 Val Lys Arg Glu Gly Leu Tyr Tyr Val Tyr Thr Gln Val Thr Phe Cys 195 200 205 Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gln Arg Pro Phe Ile Val Gly Leu Trp 210 215 220 Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala Asn 225 230 235 240 Thr His Ser Ser Ser Gln Leu Cys Glu Gln Gln Ser Val His Leu Gly 245 250 255 Gly Val Phe Glu Leu Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr 260 265 270 Glu Ala Ser Gln Val Ile His Arg Val Gly Phe Ser Ser Phe Gly Leu 275 280 285 Leu Lys Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ile Ala Ala His Val 290 295 300 Val Ser Glu Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Lys 305 310 315 320 Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Val Met Leu Glu Asn Gly 325 330 335 Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Glu Gly Leu Tyr Tyr Val Tyr Thr Gln 340 345 350 Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gln Arg Pro Phe Ile 355 360 365 Val Gly Leu Trp Leu Lys Pro Ser Ser Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu 370 375 380 Lys Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ser Gln Leu Cys Glu Gln Gln Ser 385 390 395 400 Val His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe 405 410 415 Val Asn Val Thr Glu Ala Ser Gln Val Ile His Arg Val Gly Phe Ser 420 425 430 Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 435 440 445 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys 450 455 460 Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 465 470 475 480 Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val 485 490 495 Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe 500 505 510 Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu 515 520 525 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His 530 535 540 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala 545 550 555 560 Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg 565 570 575 Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met 580 585 590 Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro 595 600 605 Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn 610 615 620 Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val 625 630 635 640 Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr 645 650 655 Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu 660 665 670 Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 675 680 <210> 12 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45 Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60 Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80 Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys 85 90 95 Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu 100 105 110 Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser 115 120 125 Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly 130 135 140 Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln 145 150 155 160 Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr 165 170 175 Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser 180 185 190 Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala 195 200 205 Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His 210 215 220 Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 245 250 255 Gly Leu Leu Lys Leu 260 <210> 13 <211> 149 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser 1 5 10 15 Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly 20 25 30 Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln 35 40 45 Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr 50 55 60 Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser 65 70 75 80 Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala 85 90 95 Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His 100 105 110 Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn 115 120 125 Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 130 135 140 Gly Leu Leu Lys Leu 145 <210> 14 <211> 277 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu 20 25 30 Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val 35 40 45 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His 65 70 75 80 Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95 Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110 Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125 Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140 Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160 Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln 165 170 175 Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu 180 185 190 Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile 195 200 205 Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn 210 215 220 Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp 225 230 235 240 Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His 245 250 255 Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser 260 265 270 Val Gln Glu Arg Gln 275 <210> 15 <211> 176 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu 1 5 10 15 Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro 20 25 30 Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys 35 40 45 Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys 50 55 60 Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr 65 70 75 80 Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr 85 90 95 Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile 100 105 110 Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His Leu Val 115 120 125 Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr Phe Ile 130 135 140 Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys Gly Ile 145 150 155 160 Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu Glu Thr 165 170 175 <210> 16 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Trp Met Ser 1 5 10 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 24 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp 20 25 30 Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val 50 55 60 Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala 65 70 75 80 Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg 85 90 95 Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg 100 105 110 Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val 130 135 140 Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly 165 170 175 Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys 180 185 190 Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 195 200 205 Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly 210 215 220 Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro 225 230 235 240 Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly 245 250 255 Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg 260 265 270 Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285 <210> 25 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala 1 5 10 15 Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro 20 25 30 Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala 35 40 45 Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly 50 55 60 Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln 65 70 75 80 Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr 85 90 95 Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val 100 105 110 Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile 115 120 125 Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly 130 135 140 Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser 145 150 155 160 Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe 165 170 175 Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys 180 185 190 Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu 195 200 205 Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn 210 215 220 <210> 26 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 1 5 10 15 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys 20 25 30 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 50 55 60 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 85 90 95 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 100 105 110 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 115 120 125 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 130 135 <210> 27 <211> 167 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 1 5 10 15 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro 20 25 30 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn 35 40 45 Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 50 55 60 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu 65 70 75 80 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu 85 90 95 Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His 1 5 10 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Tyr Leu Asp 1 5 10 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr 1 5 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa is any of Ala, Gly, Leu, Ile, Ser and Val <400> 34 Gly Gly Gly Gly Xaa 1 5 <210> 35 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 35 Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 36 Gly Gly Gly Gly Ala 1 5 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide linker <400> 37 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5

Claims (48)

  1. 융합 단백질로서,
    (a) 펩티드 링커를 통해 서로 공유 결합되는 3개의 CD40 리간드(CD40L) 소단위 또는 이의 절편을 포함하는 단일쇄 융합체(scCD40L); 및
    (b) Fc 단량체를 포함하며,
    이때 상기 scCD40L은 펩티드 링커를 통해 상기 Fc 단량체에 공유 결합되는, 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CD40L 소단위는 서열 번호 3에 대해 적어도 약 85%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 CD40L 소단위는 74번째 위치에 Trp 잔기를 포함하는 것인 융합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 74번째 위치의 Trp 잔기는 C→W 치환인 것인 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 CD40L 소단위는 인간 CD40L 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 scCD40L은 상기 Fc 단량체의 N-말단 또는 C-말단에 결합되는 것인 융합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 단량체는 힌지 영역(hinge region)을 포함하는 것인 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 단량체는 인간 Fc 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 단량체는 인간 IgG4 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD40L 소단위 또는 이의 절편과 공유 결합하는 펩티드 링커는 약 9개 내지 약 20개의 아미노산을 포함하는 것인 융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD40L 소단위 또는 이의 절편과 공유 결합하는 펩티드 링커는 약 9개 내지 약 15개의 아미노산을 포함하는 것인 융합 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD40L 소단위 또는 이의 절편과 공유 결합하는 펩티드 링커는 9개의 아미노산을 포함하는 것인 융합 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드 링커는 하나 이상의 글리신(Gly) 또는 세린(Ser) 잔기를 포함하는 것인 융합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 (Gly4Ser)n(서열 번호 5)(여기서 n은 2, 3 및 4로부터 선택된 양의 정수임); (Gly3Ser)n(서열 번호 6)(여기서 n은 3, 4 및 5로부터 선택됨); Gly(Gly3Ser)n(서열 번호 7)(여기서 n은 2, 3 및 4로부터 선택됨); 또는 Gly(Gly2Ser)n(서열 번호 8)(여기서 n은 3, 4, 5 및 6으로부터 선택됨)인 것인 융합 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 서열 번호 4 또는 서열 번호 2인 것인 융합 단백질.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 scCD40L은 CD40L 동종 삼량체 내로 접혀 들어가는 것인 융합 단백질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD40L 소단위 대 Fc 단량체의 비율이 3:1인 것인 융합 단백질.
  18. 단일쇄 융합체를 포함하는 융합 단백질로서,
    상기 단일쇄 융합체는, N-말단에서 C-말단 방향으로, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 제1 CD40L 소단위를 포함하고, 상기 제1 CD40L 소단위는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 제1 펩티드 링커에 공유 결합되고, 상기 제1 펩티드 링커는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 제2 CD40L 소단위에 공유 결합되고, 상기 제2 CD40L 소단위는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 제2 펩티드 링커에 공유 결합되고, 상기 제2 펩티드 링커는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 제3 CD40L 소단위에 공유 결합되고, 상기 제3 CD40L 소단위는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 제3 펩티드 링커에 공유 결합되고, 상기 제3 펩티드 링커는 Fc 폴리펩티드에 공유 결합되는, 융합 단백질.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 9; 서열 번호 10; 또는 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 융합 단백질은 약 21℃ 이상에서 적어도 3일 동안 약 10% 미만의 응집율을 갖는 것인 융합 단백질.
  21. 제20항에 있어서, 상기 단리된 융합 단백질은 약 21℃에서 적어도 7일 이상 동안 약 1% 미만의 응집율을 갖는 것인 융합 단백질.
  22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 융합 단백질은 약 45℃에서 적어도 3일 이상 동안 약 10% 미만의 응집율을 갖는 것인 융합 단백질.
  23. 2개의 융합 단백질을 포함하는 이량체로서,
    각각의 융합 단백질은,
    (a) 펩티드 링커를 통해 서로 공유 결합되는 3개의 CD40 리간드(CD40L) 소단위 또는 이의 절편을 포함하는 단일쇄 융합체(scCD40L); 및
    (b) Fc 단량체를 포함하며,
    이때 상기 scCD40L은 펩티드 링커를 통해 상기 Fc 단량체에 공유 결합되고, 상기 이량체는 상기 Fc 단량체의 상호작용을 통해 형성되는, 2개의 융합 단백질을 포함하는 이량체.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질로부터 선택되는 2개의 융합 단백질을 포함하는 이량체로서,
    상기 이량체는 상기 Fc 단량체의 상호작용을 통해 형성되는, 2개의 융합 단백질을 포함하는 이량체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 또는 이량체와 상기 CD40 폴리펩티드를 접촉시키는 단계를 포함하는, CD40 폴리펩티드를 활성화시키는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 융합 단백질 또는 이량체는 최대 6개의 CD40 폴리펩티드와 결합하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 CD40 폴리펩티드는 세포 상에 존재하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 세포는 개체 내에 존재하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 세포는 CD40 폴리펩티드를 발현하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 세포는 항원 제시 세포, 대식세포, B 세포 또는 수지상 세포인 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 단리된 융합 단백질 또는 이량체를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 항종양 면역 반응을 향상시키는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 개체는 암에 걸린 것인 방법.
  33. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 단리된 융합 단백질 또는 이량체 및 하나 이상의 면역 관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암에 걸린 개체를 치료하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 하나 이상의 면역 관문 억제제는 PD-L1 또는 CTLA-4 길항제를 포함하는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 PD-L1 또는 CTLA-4 길항제는 항체인 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 항-PD-L1 항체는 더발루맙(durvalumab)이고, 상기 항-CTLA-4 항체는 트레멜리무맙(tremelimumab)인 것인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 항-PD-L1 항체는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3; 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 및 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 것인 방법.
  38. 제35항에 있어서, 상기 항-PD-L1 항체는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열 번호 17의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 것인 방법.
  39. 제35항에 있어서, 상기 항-CTLA-4 항체는 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1; 서열 번호 29의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2; 서열 번호 30의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3; 서열 번호 31의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1; 서열 번호 32의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2; 서열 번호 33의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3을 포함하는 것인 방법.
  40. 제35항에 있어서, 상기 항-CTLA-4 항체는 서열 번호 26의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열 번호 27의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 것인 방법.
  41. 제25항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 면역 반응 및 항암 반응 중 하나 이상을 향상시키는 것인 방법.
  42. 제25항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 종양 미세환경의 면역 억제를 감소시키는 것인 방법.
  43. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 단리된 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  44. 제43항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  45. 제44항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  46. 제45항에 있어서, 상기 숙주 세포는 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 단리된 융합 단백질을 발현하는 것인 숙주 세포.
  47. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 또는 이량체를 제조하는 방법으로서,
    (a) 제46항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 융합 단백질 또는 이량체를 단리하는 단계를 포함하는, 융합 단백질 또는 이량체를 제조하는 방법.
  48. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 단리된 융합 단백질, 제43항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제44항에 따른 벡터 또는 제45항 또는 제46항에 따른 숙주 세포를 포함하는 키트.
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