KR20190003316A - 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부염 개선 용도 - Google Patents
지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부염 개선 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 및 지방줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 함유 분획물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종을 유효성분으로 포함하는, 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명은 피부염의 원인이 되는 다양한 염증성 사이토카인 및 염증관련 인자의 생성을 감소시키고, 염증 관련 면역세포의 활성 내지는 관여를 저해하여 피부염을 예방, 개선, 완화 또는 치료할 수 있다.
Description
본 발명은 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 또는 지방 줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 함유 분획물 중 적어도 1종을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부염 개선 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 약학 조성물, 피부외용제 및 건강 기능 식품에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료에 있어서 임상적 적용이 가능한 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 대량으로 수득할 수 있고, 이와 같이 수득된 기능적 활성이 우수한 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 조성물을 저가로 대량으로 제공할 수 있는 임상 및 상업적으로 뛰어난 기술에 관한 것이다.
인체의 피부는 물리적, 화학적으로 외부로부터 신체를 보호하는 동시에 전신의 대사에 필요한 생화학적 기능을 수행하는 기관이다. 일반적으로 사람의 피부에 나타나는 염증성 피부질환을 피부염이라고 한다. 비교적 흔한 피부염(dermatitis)으로는 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrhoic dermatitis) 등이 있다.
접촉성 피부염은 외부 물질과의 접촉에 의해 발생하는 피부염이다. 접촉성 피부염은 발생하는 기전에 따라 자극성 접촉 피부염과 알레르기성 접촉 피부염이 있으며, 한 가지 물질이 이러한 두 가지 반응을 동시에 일으킬 수 있다. 접촉성 피부염을 일으키는 물질의 대부분은 유기 화합물이다. 이러한 물질에 감작된 피부에 재차 피부염 유발 물질이 접촉하게 되면 기억세포가 이를 감지하여 여러 화학 물질이 분비되어 염증을 일으키는 것으로 알려져 있다.
아토피성 피부염은 가려움과 습진성 병변이 특징인 만성적인 염증성 피부질환이다. 지금까지의 연구결과에 따르면 아토피성 피부염의 발병에는 여러 가지 인자들이 관여하는 것으로 알려져 있다. 아토피성 피부염이 유발될 경우 호산구(eosinophil), 호중구(neutrophil) 및 비만세포 같은 염증 관련 세포가 병변 부위에서 관찰되며, 비만 세포로부터 생성되는 면역글로불린 IgE가 증가한다. 또한 T 세포의 이상증식이 나타나는데, 이 과정에서 염증성 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-13이 증가하여 면역반응을 증폭시킨다. 최근에는 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)가 피부염의 중증도와 연관되어 있고, 아토피성 피부염에서 나타나는 가려움 증세의 원인이라고 알려졌다. 또한, 지루성 피부염은 피지샘의 활동이 증가되어 피지 분비가 왕성한 두피와 얼굴, 그 중에서도 눈썹, 코, 입술 주위, 귀, 겨드랑이, 가슴, 서혜부 등에 발생하는 만성 염증성 피부 질환이다.
이러한 연구 결과들을 바탕으로, 염증 및 면역 억제를 통해 피부염 치료제를 개발하고자 하는 노력들이 있다. 현재까지 개발된 피부염 치료제로는 스테로이드, 항히스타민제, 및 사이클로스포린 A와 같은 면역 억제제 등이 있다. 그러나, 이들 약제는 피부 위축, 혈관 확장, 색소 탈실, 주사 부위의 과민반응, 내성 및 호중구감소증(neutropenia) 등의 심각한 부작용을 일으키는 문제점이 있다. 또한, 이들 약제는 근본적인 치료보다는 증상을 적절한 수준으로 조절하는데 도움을 주는 한계도 있다.
이러한 문제점을 감안하여 천연물을 이용한 피부염 치료제에 대한 연구가 활발하다. 이러한 천연물을 원료로 하는 피부염 치료제의 경우, 천연 추출물 내의 유효성분 함량이 적은 관계로 피부염 치료 효과를 얻기 위해서는 많은 양의 사용이 필요하고, 이들 중 대부분은 천연물 소재라는 점을 마케팅에 활용하고 있을 뿐 피부염 치료의 실질적 효능에 대해서는 과학적 연구가 좀더 필요한 상황이다.
또한, 줄기세포를 이용한 피부 재생 및 치료 방법이 제안되고 있다. 배아줄기세포 또는 태아조직 유래 줄기세포는 분화능력 및 재생치료능력이 우수하고 거부반응이 적지만, 윤리적 문제로 임상에 적용될 수 없고 종양을 형성할 수 있는 위험성이 존재한다. 이에 대한 대안으로서 성체줄기세포를 이용한 피부 재생 및 치료 방법이 제안되었다. 그러나, 환자 자신의 성체줄기세포가 이닌 타인의 성체줄기세포를 사용한 경우 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)을 일으킬 위험이 있고, 자가 성체줄기세포를 이용하여 치료를 하기 위해서는 환자로부터 성체줄기세포를 채취한 후 이를 배양하는 과정이 필요하여 복잡하고 비용이 많이 드는 문제가 있다.
최근에는 전술한 바와 같은 줄기세포의 문제점을 감안하여 성체줄기세포를 배양하여 얻은 배양액을 이용하여 피부 재생 치료를 하고자 하는 시도가 있다. 그러나, 성체줄기세포 배양액에는 성체줄기세포가 분비하는 다양한 단백질, 사이토카인, 성장인자 등이 함유되어 있는 반면, 세포가 성장하면서 분비한 노폐물, 오염방지를 위해 첨가된 항생제, 동물유래 혈청 등의 성분도 포함되어 있기 때문에 피부에 사용할 경우 각종 위험에 노출될 가능성이 높다. 따라서, 성체줄기세포 배양액을 이용하기 위해서는 노폐물이나 각종 위험 성분을 제거하기 위한 별도의 공정이 필요하고 이에 따라 비용이 많이 들게 된다.
한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 거동을 제어하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)' 또는 '세포외 소포체(extracellular vesicle)'가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, mRNA, miRNA, DNA 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 거동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 거동, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
본 발명자들은 가려움 및 염증을 수반하는 피부염과 관련하여 종래 알려진 피부염 치료제에 비하여 효과가 뛰어나고 안전한 치료제를 개발하고자 노력하였다. 이에 본 발명자들은 지방줄기세포로부터 유래된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 새로운 용도에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 지방줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 전술한 바와 같은 줄기세포 자체나 줄기세포 배양액의 안전성 문제를 해결할 수 있고, 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료에 효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
Pin Li et al., Progress in Exosome Isolation Techniques, Theranostics, 2017, 7(3): 789-804 (2017.01.26)
Coumans et al., Methodological Guidelines to Study Extracellular Vesicles, Circulation Research, 2017, 120:1632-1648 (2017.05.12)
본 발명의 목적은 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 또는 지방줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 함유 분획물 중 적어도 1종을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부염 개선 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 약학 조성물, 피부외용제 및 건강 기능 식품을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 대량으로 수득할 수 있고, 이와 같이 수득된 기능적 활성이 우수한 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하는 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여, 피부염의 예방, 개선 또는 완화를 통한 미용방법을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 및 지방줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 함유 분획물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종을 유효성분으로 포함하는, 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료에 있어서 임상적 적용이 가능한 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 대량으로 수득할 수 있고, 이와 같이 수득된 기능적 활성이 우수한 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 조성물을 저가로 대량으로 제공할 수 있는 임상 및 상업적으로 뛰어난 신규한 기술을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)"는 세포막 유래 소포체(membrane vesicles), 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 또는 이의 등가물을 포괄하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미하며(단, 분리 대상이 되는 줄기세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3), 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, mRNA, miRNA, DNA 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 거동을 조절한다고 알려져 있다. 본 발명에서 사용되는 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용하여 지방줄기세포 배양액으로부터 분리할 수 있고, 본 명세서에서 설명되는 일 구체예의 분리방법에 따라 분리할 수도 있다(대한민국 공개특허공보 제10-2016-0116802호; Pin Li et al., Progress in Exosome Isolation Techniques, Theranostics, 2017, 7(3): 789-804; Coumans et al., Methodological Guidelines to Study Extracellular Vesicles, Circulation Research, 2017, 120:1632-1648 등 참조).
그 동안 지방줄기세포 유래의 엑소좀을 이용한 피부 미백, 주름개선 및 피부재생 효과가 보고된 바가 있다. 그리고 지방줄기세포가 아닌 신경줄기세포 유래의 엑소좀이 뇌손상 치료, 줄기세포 이식거부에 따른 염증 질환 치료에 효과가 있다는 보고는 있으나, 현재까지 지방줄기세포 배양액으로부터 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 사용할 때 "피부염의 치료 등"에 효과가 있다는 것에 대해서는 공지된 바가 없었다.
현재까지 대량 배양이 가능한 지방줄기세포를 배양한 후, 지방줄기세포 배양액으로부터 대량으로 경제적으로 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 피부염 치료에 임상적으로 적용가능하게 구현한 치료제는 개발된 바가 없다. 지방에서 유래한 지방줄기세포(adipose-derived stem cells)는 지방 흡입술과 같은 간단한 시술에 의해 대량으로 입수가 가능하고 골수, 제대 또는 제대혈 등에 비해 약 40배 정도의 줄기세포가 있어 상업적으로는 가장 원가가 저렴하고 생산량이 많지만, 지방 내에 세포 잔해물, 노폐물, 단백질 및 거대입자와 같은 불순물이 많아 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 경제적으로 대량으로 분리하는 것이 어렵다. 따라서, 경제성 측면에서 지방줄기세포 배양액으로부터 고순도의 입자크기 분포가 균일한 엑소좀을 대량으로 분리하는 것에는 기술적 장벽이 있었다.
본 발명의 조성물은 주사제와 같은 약학 조성물, 건강 기능 식품 또는 피부외용제로 적용될 때, 유효성분으로 함유된 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료에 유의적인 효과를 나타내며, 줄기세포 자체나 줄기세포 배양액의 안전성 문제를 해결할 수 있다. 따라서, 본 발명의 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 조성물에 포함된 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 종래에 알려진 피부 미백, 주름개선 및 피부재생과는 전혀 다른 메카니즘으로 피부염을 개선, 완화 내지는 치료하며 이러한 효능은 종래기술로부터 전혀 예측할 수 없는 것임을 명백히 밝혀 둔다.
본 발명의 일 구체예의 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 조성물은, 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 및 지방줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 함유 분획물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 또는 상기 분획물은, 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 초미세여과법(ultrafiltration), 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 적어도 1종의 분리방법에 의해 분리될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는, 지방줄기세포 배양액에 부형제(excipient)를 첨가하고 상기 부형제가 첨가된 지방줄기세포 배양액을 여과한 후, 상기 여과된 지방줄기세포 배양액으로부터 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 분리될 수 있다. 상기 분획물은 지방줄기세포 배양액에 부형제(excipient)를 첨가하고 상기 부형제가 첨가된 지방줄기세포 배양액을 여과한 후, 상기 여과된 지방줄기세포 배양액으로부터 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 분리되어 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 함유할 수 있다. 그러나 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 및 분획물은 이에 제한되는 것이 아니며, 전술한 바와 같은 다양한 분리 방법에 의해 수득된 것을 본 발명의 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 조성물에 사용할 수 있음은 물론이다. 이하, 본 명세서에서 설명되는 일 구체예의 분리방법은 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 조성물에 사용될 수 있는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 또는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 함유 분획물에 대한 분리방법의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
한편, "부형제(excipient)"는 통상, 약제에 적당한 굳기나 형상을 주거나, 주제(主劑)의 양이 적은 경우에 일정한 중량을 주어 취급하기 쉬운 크기로 할 목적으로 첨가되는 물질을 의미하나, 본 발명에서는 당업계에 알려진 "부형제(excipient)(또는 첨가제로 불리기도 함)"가 세포 잔해물, 노폐물, 단백질 및 거대 입자와 같은 불순물에 대해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 효율적으로 분별할 수 있는 기능을 부여한다. 본 발명을 제한하지 않는 예시로서, 부형제는 자당(sucrose), 트레할로오스(trehalose), 유당(lactose), 락툴로오스, 말토오스, 셀로비오스, 이소말토오스, 투라노오스, 포도당(dextrose), 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 탈로오스, 만노오스, 타가토오스, 프시코오스, 에리트로오스, 에리트룰로오스, 트레오스, 에리스리톨(erythritol), 아라비노오스, 자일로오스, 릭소오스, 리보오스, 리불로오스, 자일룰로스, 알도헵토오스, 헵툴로오스, 옥툴로오스, 겐티아노스, 움벨리페로스, 플란테오스, 이소리크노오스, 라피노오스, 리크노오스, 스타키오스, 베르바스코오스(verbascose), 만니톨(manitol), 말티톨, 락티톨, 말토트리오스, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 자일리톨, 소르비톨(sorbitol), 전분 분해당, 전분 분해당 환원 알콜, 비이온성 계면활성제 (예를 들어, Tween-20, Triton X-100, Pluonic F-68 등), 글리신(glycine), 히스티딘(histidine), 글리세롤(glycerol) 및 콜레스테롤(cholesterol)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 또는 상기 분획물은 1차 분리 후에 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용한 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 더 수행하여 수득된 것일 수 있다. 상기 탈염과 버퍼교환에 사용되는 완충용액에는 부형제를 첨가할 수 있다. 상기 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행하거나 단속적으로 수행할 수 있다. 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 탈염과 버퍼교환을 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, TFF를 위해 MWCO(molecular weight cutoff) 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 μm TFF 필터를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 분리 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 1/100 내지 1/25의 부피까지 농축하는 과정을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 여과된 지방줄기세포 배양액은 TFF 전에 초음파처리(sonication)될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 또는 상기 분획물은, 시험관내 NO 어세이(nitric oxide assay)에서 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 감소시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 또는 상기 분획물은 서로 다른 배치(batch)의 세포 배양액으로부터 분리되고, 각각의 배치(batch)의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(또는 이들 각각을 함유하는 분획물)는 서로에 대해 동일 내지는 유사한 수준으로 시험관내 NO 어세이(nitric oxide assay)에서의 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 또는 상기 분획물은 단일 배치로부터 복수회에 걸쳐 소분(小分)된 세포 배양액으로부터 분리되고, 각각의 회차의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(또는 이들 각각을 함유하는 분획물)는 서로에 대해 동일 내지는 유사한 수준으로 시험관내 NO 어세이(nitric oxide assay)에서의 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에 있어서, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 또는 상기 분획물은 서로 다른 생산주기에서 배양된 세포 배양액으로부터 분리되고, 각각의 생산주기의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(또는 이들 각각을 함유하는 분획물)는 서로에 대해 동일 내지는 유사한 수준으로 시험관내 NO 어세이(nitric oxide assay)에서의 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물에서 상기 지방줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물은 가려움을 수반하는 다양한 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있으며, 바람직하게는 접촉피부염, 자극 접촉피부염, 알레르기 접촉피부염, 광독성 및 광알레르기 접촉피부염, 접촉 두드러기 증후군, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 자가감작 피부염, 자가면역 프로게스테론 피부염, 울체 피부염, 여드름 또는 습진에 이용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 아토피성 피부염, 여드름 또는 습진에 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 조성물은 약학 조성물 및 식품 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 조성물이 약학 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 과립제, 엘릭시르제(elixirs), 에어로졸 등의 경구투여용 제제, 외용제, 좌제, 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학 조성물의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여로는 경피 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 직장 내 투여 등을 거론할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 활성 물질이 표적 조직 또는 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 치료상 유효량은 질환 치료 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 경구투여용 고형제제는 적어도 1종의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한, 상기 경구투여용 고형제제는 상기 부형제 이외에 실리카, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제(활택제)를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 경구투여용 액상제제는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 또는 좌제일 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 주사제로도 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 수성 주사제, 비수성 주사제, 수성 현탁 주사제, 비수성 현탁 주사제, 또는 용해 또는 현탁하여 사용하는 고형 주사제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 그 종류에 따라 주사용 증류수, 식물유(예를 들어, 낙화생유, 참기름, 동백기름 등), 모노글리세리드, 디글리세리드, 프로필렌글리콜, 캄퍼, 벤조산에스트라디올, 차살리실산비스무트, 아르세노벤졸나트륨, 또는 황산스트렙토마이신 중 적어도 1종을 포함할 수 있고, 선택적으로 안정제나 방부제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약학 조성물은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 질환 종류, 질환의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 일구체예의 조성물이 건강기능 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효 성분으로서 지방 줄기세포부터 유래된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 또는 이를 포함하는 분획물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함한다. 예를 들어, 상기 건강기능 식품 조성물은 영양제, 비타민, 전해질, 착색제, 단백질, 탄수화물, 지방, 조미제, 향미제, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 상기 건강기능 식품 조성물에 첨가되는 성분은 식품첨가물로서 적합해야 하는데, 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검, L-글루타민산나트륨 등을 들 수 있다.
본 발명의 일구체예의 건강기능 식품 조성물의 형태는 특별히 제한되지는 않으나 드링크제, 과일 쥬스 음료, 야채 음료, 차, 기능수, 알콜 음료, 비타민 복합제 등을 포함할 수 있다. 상기 건강기능 식품 조성물은 최종 식품 중량에 대해 지방 줄기세포부터 유래된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 또는 이를 포함하는 분획물을 약 0.01 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 0.1 내지 90 중량% 정도 포함하는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 일 구체예의 조성물이 피부외용제로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장품이나 피부외용제에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예의 피부외용제는 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 이외에, 그 작용(피부염 및 가려움증의 억제 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 피부염 치료제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 또는 이를 함유하는 분획물은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 피부외용제에서, 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제는 예를 들면, 패취, 마스크팩, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제가 화장료 조성물로 제조되는 경우, 피부염의 예방, 개선, 완화, 또는 정상화시킬 목적으로 사용되며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 피부외용제 및/또는 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 피부외용제 및/또는 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 조성물을 이용하여, 피부염의 예방, 개선 또는 완화를 통한 미용방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 상기 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 조성물은 피부염의 원인이 되는 다양한 염증성 사이토카인 및 염증관련 인자의 생성을 감소시키고, 염증 관련 면역세포의 활성 내지는 관여를 저해하여 피부염을 예방, 개선, 완화 또는 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 피부염의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물, 피부외용제 및 건강 기능 식품으로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 고순도이면서 입자크기 분포가 균일한 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 또는 이를 포함하는 분획물을 저가로 대량으로 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명은 기능적 활성이 우수한 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 또는 이를 포함하는 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 조성물을 저가로 대량으로 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 스케일-업(scale-up)이 가능하고 GMP(Good Manufacturing Practice)에도 적합하다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 지방줄기세포 배양액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 및/또는 이를 포함하는 분획물을 제조하는 방법에 있어서 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리 및 정제하는 과정을 설명하는 플로우챠트이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따라 지방줄기세포 배양액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 및/또는 이를 포함하는 분획물을 제조하는 단계(step)별로 용액 내에 포함되어 있는 단백질의 총량 비율(Relative amount of protein)을 측정한 결과를 나타낸다. 각 단계별 단백질 총량의 비율은 줄기세포 배양액 전체에 대한 단백질 총량의 상대적 비율로 나타내었다. 실험 결과는 2개의 서로 다른 배치에서 얻어진 결과를 각각 도시하였다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성(productivity)과 순도(purity)를 측정한 결과를 도시한 것이다. 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성은 "줄기세포 배양액(CM)단위 mL 당 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 입자수"로 계산하였고, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 순도는 "최종 분획물에 포함되어 있는 단백질 단위 μg 당 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 입자수"로 계산하였다. 실험 결과는 5개의 서로 다른 배치(batch)에서 얻어진 결과를 도시하였다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 세포체의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 세포체에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 5는 부형제 첨가에 따라 균일하고 순도가 높은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 수득되는 것을 보여주는 입자 크기 분포(균일한 분포)에 관한 NTA 분석 결과를 도시한다. 첨가된 부형제의 양이 증가함에 따라 단일한 피크를 갖는 입자 크기 분포 결과를 얻을 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 및/또는 이를 포함하는 분획물의 제조과정에서 부형제 첨가 여부에 따른 입자 크기 분포를 나타내는 NTA 분석 결과를 도시한다. "A"는 제조 과정 전과정에서 부형제를 첨가한 경우, B는 세포 배양액을 동결 보관하였다가 해동한 후 부형제를 첨가한 경우, "C"는 부형제를 첨가하지 않고 제조한 결과를 나타낸다. "D"에는 A 내지 C 방법에 의하여 분리한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 상대적인 생산성(Relative productivity)과 상대 농도(Relative concentration)를 비교한 결과를 도시하였다. "E"에는 A 내지 C 방법에 의하여 분리한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 평균 입자크기(Mean size)를 도시하였다.
도 7은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한, 염증 반응의 일종인 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 7에서 PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), EXO는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(Exosome and/or EV), CM은 지방줄기세포 배양액(conditioned media), CM-EXO는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 제거된 지방줄기세포 배양액(exosome-depeleted conditioned media)을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한, 염증성 사이토카인인 TNF-α 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 8에서, PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), 각 숫자는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 처리량(μg/mL)을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 2개의 서로 다른 배치로 생산한 배양액에서 각각 분리 정제하고, 이와 같이 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. C는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), Harvest 1과 2는 배치(batch) 1에서 1차 및 2차에 걸쳐 생산된 배양액에서 각각 분리 정제한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 사용하였음을 의미한다.
도 10은 단일 배치로 생산된 배양액을 3회에 걸쳐 나누어 본 발명의 일 구체예에 따른 방법으로 분리 정제하고, 이와 같이 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. C는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)을 의미한다.
도 11은 서로 다른 생산 주기(campaign)에서 생산된 배양액으로부터 본 발명의 일 구체예에 따른 방법으로 분리 정제하고, 이와 같이 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. NO 형성의 감소 정도는 인산염 완충용액과 덱사메타손을 처리한 대조군에서 형성된 NO에 대하여 각각의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 처리 농도별로 감소한 NO 양을 백분율(%)로 표시하였다.
도 12는 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성 감소 효과와, 종래의 침전법(PPT)에 의해 분리된 세포외 소포체에 의한 NO 형성 감소 효과를 비교한 실험 결과를 도시한다. A는 종래의 침전법에 의해 분리된 세포외 소포체의 NTA 분석 결과이고, B는 본 발명의 일 구체예에 따른 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 NTA 분석 결과이며, C는 NO 형성 감소 효과를 비교 도시한 그래프이다. NO 형성의 감소 정도는 양성대조군인 덱사메타손(Dex)에 의한 NO 형성 감소 정도에 대한 상대 비율(%)로 표시하였다.
도 13은 아토피가 유발된 마우스(피부염 유발 동물모델 1)에서 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 처리한 결과, 아토피 증상이 완화됨을 확인한 결과를 도시한다. "A"는 아토피가 유발된 마우스 사진과 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 처리에 의한 아토피 증상 완화를 보여주는 사진들이다. "B"는 각 실험군의 아토피 임상 스코어를 도식화한 그래프이다. "C"는 각 실험군에서 측정된 귀의 두께를 정상군과 비교하여 상대적인 변화량을 도시한 그래프이다.
도 14는 아토피가 유발된 마우스(피부염 유발 동물모델 2)에서 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 처리한 결과, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 용량 의존적으로 아토피 증상이 완화됨을 확인한 결과를 도시한다. "A"는 아토피가 유발된 마우스 사진(Day 0)과 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 처리에 의해 용량 의존적으로 아토피 증상이 완화된 것(Day 28)을 보여주는 사진들이다. "B"는 각 실험군의 아토피 임상 스코어를 도식화한 그래프이다.
도 15는 아토피가 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 처리한 후 귀 조직에서 염증성 사이토카인인 IL-4 및 IL-31 mRNA의 변화량을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 16은 아토피가 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 처리한 후 귀 조직을 톨루이딘 블루로 염색한 결과 및 마스트 세포(비만세포)의 수를 측정하여 도시한 그래프이다.
도 17은 아토피가 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 처리한 후 혈액 내에 존재하는 (A) IgE, (B) 백혈구(white blood cells), 및 (C) 호산구(eosinophils)를 측정하여 도시한 그래프이다.
도 18은 PKH67로 염색된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 확인한 형광강도 측정 결과를 도시한다.
도 19는 돼지 피부조직 내부로, 형광염색된 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 전달된 정도를 확인한 형광현미경 이미지이다. 형광염색된 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 완충용액에 희석하여 돼지 피부표면에 도포하고 일정 시간 경과 후 확인한 형광현미경 이미지이다.
도 20은 생쥐 피부조직 내부로, 형광염색된 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 전달된 정도를 확인한 공초점형광현미경 이미지와, 이로부터 각 이미지 상의 형광강도를 측정하여 얻은 총 형광강도를 비교하여 도시한 그래프이다. 도 20의 상단은 형광염색된 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 완충용액에 희석하여 생쥐 피부표면에 도포하고 일정 시간 경과한 후 확인한 공초점형광현미경 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 구체예에 따라 지방줄기세포 배양액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 및/또는 이를 포함하는 분획물을 제조하는 단계(step)별로 용액 내에 포함되어 있는 단백질의 총량 비율(Relative amount of protein)을 측정한 결과를 나타낸다. 각 단계별 단백질 총량의 비율은 줄기세포 배양액 전체에 대한 단백질 총량의 상대적 비율로 나타내었다. 실험 결과는 2개의 서로 다른 배치에서 얻어진 결과를 각각 도시하였다.
도 3은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성(productivity)과 순도(purity)를 측정한 결과를 도시한 것이다. 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 생산성은 "줄기세포 배양액(CM)단위 mL 당 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 입자수"로 계산하였고, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 순도는 "최종 분획물에 포함되어 있는 단백질 단위 μg 당 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 입자수"로 계산하였다. 실험 결과는 5개의 서로 다른 배치(batch)에서 얻어진 결과를 도시하였다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 세포체의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 세포체에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 5는 부형제 첨가에 따라 균일하고 순도가 높은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 수득되는 것을 보여주는 입자 크기 분포(균일한 분포)에 관한 NTA 분석 결과를 도시한다. 첨가된 부형제의 양이 증가함에 따라 단일한 피크를 갖는 입자 크기 분포 결과를 얻을 수 있다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 및/또는 이를 포함하는 분획물의 제조과정에서 부형제 첨가 여부에 따른 입자 크기 분포를 나타내는 NTA 분석 결과를 도시한다. "A"는 제조 과정 전과정에서 부형제를 첨가한 경우, B는 세포 배양액을 동결 보관하였다가 해동한 후 부형제를 첨가한 경우, "C"는 부형제를 첨가하지 않고 제조한 결과를 나타낸다. "D"에는 A 내지 C 방법에 의하여 분리한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 상대적인 생산성(Relative productivity)과 상대 농도(Relative concentration)를 비교한 결과를 도시하였다. "E"에는 A 내지 C 방법에 의하여 분리한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 평균 입자크기(Mean size)를 도시하였다.
도 7은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한, 염증 반응의 일종인 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 7에서 PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), EXO는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(Exosome and/or EV), CM은 지방줄기세포 배양액(conditioned media), CM-EXO는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 제거된 지방줄기세포 배양액(exosome-depeleted conditioned media)을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한, 염증성 사이토카인인 TNF-α 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 8에서, PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), 각 숫자는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 처리량(μg/mL)을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 2개의 서로 다른 배치로 생산한 배양액에서 각각 분리 정제하고, 이와 같이 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. C는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), Harvest 1과 2는 배치(batch) 1에서 1차 및 2차에 걸쳐 생산된 배양액에서 각각 분리 정제한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 사용하였음을 의미한다.
도 10은 단일 배치로 생산된 배양액을 3회에 걸쳐 나누어 본 발명의 일 구체예에 따른 방법으로 분리 정제하고, 이와 같이 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. C는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)을 의미한다.
도 11은 서로 다른 생산 주기(campaign)에서 생산된 배양액으로부터 본 발명의 일 구체예에 따른 방법으로 분리 정제하고, 이와 같이 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. NO 형성의 감소 정도는 인산염 완충용액과 덱사메타손을 처리한 대조군에서 형성된 NO에 대하여 각각의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 처리 농도별로 감소한 NO 양을 백분율(%)로 표시하였다.
도 12는 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 NO 형성 감소 효과와, 종래의 침전법(PPT)에 의해 분리된 세포외 소포체에 의한 NO 형성 감소 효과를 비교한 실험 결과를 도시한다. A는 종래의 침전법에 의해 분리된 세포외 소포체의 NTA 분석 결과이고, B는 본 발명의 일 구체예에 따른 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 NTA 분석 결과이며, C는 NO 형성 감소 효과를 비교 도시한 그래프이다. NO 형성의 감소 정도는 양성대조군인 덱사메타손(Dex)에 의한 NO 형성 감소 정도에 대한 상대 비율(%)로 표시하였다.
도 13은 아토피가 유발된 마우스(피부염 유발 동물모델 1)에서 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 처리한 결과, 아토피 증상이 완화됨을 확인한 결과를 도시한다. "A"는 아토피가 유발된 마우스 사진과 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 처리에 의한 아토피 증상 완화를 보여주는 사진들이다. "B"는 각 실험군의 아토피 임상 스코어를 도식화한 그래프이다. "C"는 각 실험군에서 측정된 귀의 두께를 정상군과 비교하여 상대적인 변화량을 도시한 그래프이다.
도 14는 아토피가 유발된 마우스(피부염 유발 동물모델 2)에서 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 처리한 결과, 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 용량 의존적으로 아토피 증상이 완화됨을 확인한 결과를 도시한다. "A"는 아토피가 유발된 마우스 사진(Day 0)과 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 처리에 의해 용량 의존적으로 아토피 증상이 완화된 것(Day 28)을 보여주는 사진들이다. "B"는 각 실험군의 아토피 임상 스코어를 도식화한 그래프이다.
도 15는 아토피가 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 처리한 후 귀 조직에서 염증성 사이토카인인 IL-4 및 IL-31 mRNA의 변화량을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 16은 아토피가 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 처리한 후 귀 조직을 톨루이딘 블루로 염색한 결과 및 마스트 세포(비만세포)의 수를 측정하여 도시한 그래프이다.
도 17은 아토피가 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 처리한 후 혈액 내에 존재하는 (A) IgE, (B) 백혈구(white blood cells), 및 (C) 호산구(eosinophils)를 측정하여 도시한 그래프이다.
도 18은 PKH67로 염색된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 확인한 형광강도 측정 결과를 도시한다.
도 19는 돼지 피부조직 내부로, 형광염색된 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 전달된 정도를 확인한 형광현미경 이미지이다. 형광염색된 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 완충용액에 희석하여 돼지 피부표면에 도포하고 일정 시간 경과 후 확인한 형광현미경 이미지이다.
도 20은 생쥐 피부조직 내부로, 형광염색된 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 전달된 정도를 확인한 공초점형광현미경 이미지와, 이로부터 각 이미지 상의 형광강도를 측정하여 얻은 총 형광강도를 비교하여 도시한 그래프이다. 도 20의 상단은 형광염색된 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 완충용액에 희석하여 생쥐 피부표면에 도포하고 일정 시간 경과한 후 확인한 공초점형광현미경 이미지이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
마우스 대식세포주인 Raw 264.7은 한국세포주은행에서 구입하여 배양하였다. 세포 배양을 위해 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: Thermo Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: Thermo Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (Thermo Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline; PBS,Thermo Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.
엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 분리 과정에서 균일하고 순도가 높은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 수득하기 위하여 배양액에 부형제를 첨가하였다. 부형제로서는 자당(sucrose), 트레할로오스(trehalose), 유당(lactose), 락툴로오스, 말토오스, 셀로비오스, 이소말토오스, 투라노오스, 포도당(dextrose), 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 탈로오스, 만노오스, 타가토오스, 프시코오스, 에리트로오스, 에리트룰로오스, 트레오스, 에리스리톨(erythritol), 아라비노오스, 자일로오스, 릭소오스, 리보오스, 리불로오스, 자일룰로스, 알도헵토오스, 헵툴로오스, 옥툴로오스, 겐티아노스, 움벨리페로스, 플란테오스, 이소리크노오스, 라피노오스, 리크노오스, 스타키오스, 베르바스코오스(verbascose), 만니톨(manitol), 말티톨, 락티톨, 말토트리오스, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 자일리톨, 소르비톨(sorbitol), 전분 분해당, 전분 분해당 환원 알콜, 비이온성 계면활성제 (예를 들어, Tween-20, Triton X-100, Pluonic F-68 등), 글리신(glycine), 히스티딘(histidine), 글리세롤(glycerol) 및 콜레스테롤(cholesterol)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종을 0.01 내지 30 중량% 첨가하였다. 부형제를 첨가한 후 배양액을 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하였다.
실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 분리 및 정제
실시예 1에서 0.22 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 이용하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리, 농축하기 전 배양액을 초음파처리(sonication)하여 잠재적인 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 덩어리를 풀어주었다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare 또는 Spectrum Labs에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 μm 크기의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 균일하고 순도가 높은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 수득하기 위하여 부형제를 첨가하였다. 부형제 처리에 따라 고순도이면서 균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 높은 수율로 수득할 수 있는 효과를 확인한 결과는 도 6에 도시하였다.
한편, 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 전술한 바와 같은 분리방법 외에도 당업계에 알려진 다양한 방법을 이용하여 지방줄기세포 배양액으로부터 분리할 수 있다(대한민국 공개특허공보 제10-2016-0116802호; Pin Li et al., Progress in Exosome Isolation Techniques, Theranostics, 2017, 7(3): 789-804; Coumans et al., Methodological Guidelines to Study Extracellular Vesicles, Circulation Research, 2017, 120:1632-1648 참조). 예를 들어, 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는, 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 초미세여과법(ultrafiltration), 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 중 적어도 1종의 분리방법에 의해 분리될 수 있다.
그러나 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 전술한 바와 같은 방법들에 의해 분리된 것에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 분리 방법에 의해 수득된 것을 사용할 수 있음은 물론이다. 상기와 같은 분리방법들은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 대한 분리방법의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
실시예 3: 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 특성 분석
분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 배양액, TFF 분리과정의 분획물에서 단백질의 양은 BCA 발색법(Thermo Fisher에서 구입) 또는 플루오로프로파일(FluoroProfile) 형광법(Sigma에서 구입)을 이용하여 측정하였다. 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 분리, 농축되고 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등이 제거되는 정도는 단백질 정량법에 의하여 모니터링하여 그 결과를 도 2에 도시하였다. 그 결과 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 효과적으로 배양액에 존재하는 단백질이 제거됨을 알 수 있었다.
본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하는 경우 생산성과 순도를 독립적인 다섯 배치에서 비교한 결과를 도 3에 도시하였다. 독립적인 다섯 배치로부터 얻어진 결과를 분석한 결과, 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의하여 매우 안정적으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리할 수 있음을 확인하였다.
분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis: NTA; Malvern에서 구입) 또는 가변 저항펄스 감지(tunable resistive pulse sensing: TRPS; Izon Science에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 TRPS, NTA, TEM 분석 결과는 도 4에 도시하였다.
TFF 방법으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리한 후, 부형제의 첨가 여부에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 크기 분포를 NTA 분석한 결과를 도 5에 도시하였다. 부형제가 존재하지 않는 상태에서 TFF 방법으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리한 경우, 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 확인되는 반면, 부형제의 첨가양을 늘려주면 300 nm 이상의 크기를 갖는 입자가 줄어들고 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 크기 분포가 균일해지는 것을 확인하였다.
TFF 방법으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하는 과정에 부형제의 첨가 여부를 추가로 조사하였다. 도 6에서 보는 바와 같이 TFF 전과정에 부형제를 첨가한 경우, 균일한 크기 분포를 갖는 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 얻을 수 있었다(도 6A). 반면 부형제를 첨가하지 않고 동결 보관하였던 배양액을 사용한 경우나 부형제를 전혀 첨가하지 않고 TFF 과정을 진행한 경우, 크기가 큰 입자가 많이 포함된 불균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 얻었다(도 6B 및 도 6C).
분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 상대적인 생산성과 농도를 비교한 결과, TFF 전과정에 부형제를 첨가한 경우 매우 높은 생산성으로 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 얻을 수 있었으며, 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 농도도 5배 이상 높았다(도 6D). NTA 분석 결과에서 나타난 바와 같이, 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 평균 크기도 TFF 전과정에 부형제를 첨가한 경우 200 nm로 균일하게 확인되었다(도 6E).
도 4D는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD9, CD63, CD81 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD9 (Abcam에서 구입), 항-CD63 (System Biosciences에서 구입), 항-CD81 (System Biosciences에서 구입), 및 항-TSG101 (Abcam에서 구입)을 사용하였다.
도 4E는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD63에 대해 양성(positive)인 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD63 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
상기 결과들을 종합하면, 본 발명은 접선흐름여과를 이용한 분리 및/또는 정제 과정에서 기존에 부형제(excipient)로 알려진 물질을 첨가하여 고순도이면서 균일한 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 높은 수율로 경제적이면서 효율적으로 분리 및 정제할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 분리방법의 공정들은 스케일-업이 가능하고 GMP에도 적합함을 알 수 있었다.
실시예 4: 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 처리에 따른 Raw 264.7 세포 독성 측정
Raw 264.7 세포에서 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. Raw 264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 세포를 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 농도 별로, 예를 들어 3×106 입자/ml, 1×107 입자/ml, 3×107 입자/ml, 1×108 입자/ml, 3×x108 입자/ml, 1×109 입자/ml의 농도로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하거나, 총 단백질량을 기준으로 0.03 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.3 μg/mL, 1 μg/mL, 3 μg/mL, 10 μg/mL로 처리하여 24 내지 72 시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(Thermo Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.
비교군은 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다.
실시예 5: 마크로파지 세포주를 이용한 염증 반응 측정
Raw 264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 현탁시키고 이를 멀티웰 플레이트(multiwell plate)의 각 웰에 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하였다. 다음 날 LPS가 포함된 새로운 배지에 희석한 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체)를 적정 농도로 24시간 동안 처리하여 배양하였다. 배양이 끝난 배양상층액을 취하고 배양액 내에 존재하는 NO 및 염증성 사이토카인을 측정하여 염증 반응을 확인하였다. 배양액 내의 염증 반응은 NO 검출키트(detection kit)(인트론바이오에서 구입)를 이용하여 측정하였다. ELISA 키트 (R&D system에서 구입) 제조사의 매뉴얼대로 수행하여 LPS만을 처리한 군과 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 함께 처리된 군의 염증성 사이토카인 TNF-α 양을 확인하였다. 양성대조군으로 덱사메타손(dexamethasone) (Sigma에서 구입)을 처리하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW264.7 세포에 LPS 존재 하에서 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 처리한 결과 LPS에 의해 유도되는 염증 반응인 NO 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다. 또한, 도 8에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW264.7 세포에 LPS 존재 하에서 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 처리한 결과 LPS에 의해 유도되는 염증성 사이토카인인 TNF-α 생성을 감소시킴을 확인하였다. 이러한 결과들은 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료를 위해 유용한 기능적 활성, 즉 LPS에 의해 유도된 염증 반응을 감소시키는 활성을 가지며, 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료를 위한 조성물의 유효 성분으로서 유용하게 활용될 수 있는 것임을 강력히 시사한다.
한편, 본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 줄기세포 배양액의 생산 배치(batch), 생산 주기, 배양액의 소분(小分) 여부와 관계 없이 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 성능 내지는 기능적 활성이 동일 내지는 유사하게 유지되는지 여부를 확인하였다. 도 9에서 도시한 바와 같이 서로 다른 배치의 줄기세포 배양으로부터 1회 또는 2회에 걸쳐 생산된 줄기세포 배양액에서 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리 정제된 각 배치의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 서로에 대해 실질적으로 동일 내지는 유사한 정도로, RAW264.7 세포에서 LPS에 의해 유도되는 NO 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다. 또한, 도 10에 도시된 바와 같이, 하나의 배치로 생산된 줄기세포 배양액을 3회에 걸쳐 나누어 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리 정제된 각 회차의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 서로에 대해 실질적으로 동일 내지는 유사한 정도로, RAW264.7 세포에서 LPS에 의해 유도되는 NO 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다. 추가로, 도 11에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 주기별로 분리 정제된 각 주기의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 서로에 대해 실질적으로 동일 내지는 유사한 정도로, RAW264.7 세포에서 LPS에 의해 유도되는 NO 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다.
상기의 결과들은 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하는 조성물은 피부에서의 염증성 물질의 생성을 감소시켜 피부염을 효과적으로 개선 내지는 완화시킬 수 있음을 시사하며, 이를 통해 본 발명의 조성물은 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료에 유용할 것으로 기대된다.
실시예 6: 분리 방법에 따른 NO 형성 감소 효과의 비교
본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 분리 방법에 따른 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 NO 형성 감소 효과를 비교하기 위하여 본 발명의 일 구체예의 TFF 분리 정제에 의해 얻어진 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 이외에 종래의 침전법에 의해 분리된 세포외 소포체를 준비하였다. 침전법은 제조사(System Biosciences)의 프로토콜에 따라 시행하였다. 종래의 침전법에 의해 분리된 세포외 소포체(도 12A 참조)는 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(도 12B 참조)와 비교하여 균일도가 낮고 다양한 크기를 갖는 것을 확인하였다. 또한, 도 12C에 도시한 바와 같이 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 종래의 침전법에 의해 얻어진 세포외 소포체에 비해 훨씬 높은 수준으로 NO 형성을 억제함을 확인하였다. 이러한 결과들은 본 발명의 일 구체예에 따라 분리 정제된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 종래 방법에 따라 분리된 세포외 소포체에 비해 입자크기 분포의 균일도와 NO 형성 억제 측면에서 우수하다는 것을 보여주고 있다.
따라서, 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 종래의 분리 방법에 따라 수득된 세포외 소포체와 비교하여 성능 또는 기능적 활성(예를 들어, 입자크기 분포의 균일성, NO 생성 억제, 염증 반응 감소 등)이 훨씬 우수하고, 이와 같이 기능적 활성이 우수한 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료 효과 면에서 종래기술 보다 훨씬 우수하다고 할 수 있다.
실시예 7: 피부염 유발 동물모델 1
수컷 NC/Nga 생쥐 (16-18 g, 5주령; 중앙실험동물에서 구입)를 구매하여 7일 동안의 적응기를 통해 본 실험에 사용하였다. 적응기를 거친 생쥐는 피부염 유발 후 아래와 같이 각각 5군으로 분류 하였다.
(1) Normal: 정상 대조군
(2) Vehicle (피부염 유발군): 집먼지 진드기 추출물로 피부염을 유발한 음성 대조군
(3) IV: 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 개체 당 2.8 μg을 주 3회씩 2주간 혈관 내 투여(IV: intravenous injection)한 실험군
(4) SC: 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 개체 당 2.8 μg을 주 3회씩 2주간 피하 투여(SC: subcutaneous injection)한 실험군
(5) Pred: 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 프레드니솔론(prednisolone)을 매일 경구투여한 실험군
NC/Nga 마우스(중앙실험동물에서 구입)의 귓바퀴부분을 면도기로 제모한 후, 제모제를 적량 도포하여 제모하였다. 제모제를 닦아낸 후 AD 유발시약(집먼지 진드기 추출물; BioStir Inc.에서 구입)을 마이크로 파이펫 팁(micro pipet tip)을 이용하여 귓바퀴 부분에 균일하게 도포하였다. 필요에 따라 면도기로 제모한 후, 4% SDS 수용액 150 μL를 마이크로 파이펫 팁(micro pipet tip)을 이용하여 귓바퀴부분에 균일하게 도포하였다. 드라이어를 이용하여 냉풍으로 건조시킨 후, 약 2-3 시간 동안 자연건조시킨 다음, AD 유발시약을 마이크로 파이펫 팁(micro pipet tip)을 이용하여 귓바퀴 부분에 균일하게 도포하였다. 모든 전 처리는 1주간 2회, 총 3주간 6회 처리로 진행하였다.
실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 투여개시 전 피부 임상지수 평가를 실시하여 순위화한 점수에 따라 각 군의 평균 점수가 최대한 균일하게 분포하도록 무작위법으로 분배하여 군을 분리하였다. 상기 실험을 통하여 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 처리된 군(Exosome, IV 그룹 및 Exosome, SC 그룹 모두)에서 피부 임상지수와 귀 두께가 감소됨을 확인하였다(도 13).
실시예 8: 피부염 유발 동물모델 2
엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 용량 의존적인 효과를 확인하기 위하여 실시예 7에서와 같이 피부염을 유발한 후 아래와 같이 9군으로 분류하였다.
(1) Normal: 정상 대조군 (도 14에서 "N"으로 표기)
(2) Control (피부염 유발군): 집먼지 진드기 추출물로 피부염을 유발한 음성 대조군 (도 14에서 "C"로 표기)
(3) IV, L (exosome and/or EV, low): 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 개체 당 0.14 μg을 주 3회씩 4주간 혈관 내 투여(IV: intravenous injection)한 실험군
(4) IV, M (exosome and/or EV, medium): 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 개체 당 1.4 μg을 주 3회씩 4주간 혈관 내 투여(IV: intravenous injection)한 실험군
(5) IV, H (exosome and/or EV, high): 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 개체 당 10 μg을 주 3회씩 4주간 혈관 내 투여(IV: intravenous injection)한 실험군
(6) SC, L (exosome and/or EV, low): 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 개체 당 0.14 μg을 주 3회씩 4주간 피하 투여(SC: subcutaneous injection)한 실험군
(7) SC, M (exosome and/or EV, medium): 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 개체 당 1.4 μg을 주 3회씩 4주간 피하 투여(SC: subcutaneous injection)한 실험군
(8) SC, H (exosome and/or EV, high): 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 개체 당 10 μg을 주 3회씩 4주간 피하 투여(SC: subcutaneous injection)한 실험군
(9) Pred: 집먼지 진드기 추출물로 피부염 유발 후 프레드니솔론(prednisolone)을 매일 경구투여한 실험군 (도 14에서 "P"로 표기)
피부염 유발은 실시예 7에서와 같이 진행하였으며, AD 유발시약을 과량으로 도포하여 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 투여하는 시점에서 평균 피부 임상지수가 9가 되도록 하였다. 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 투여개시 전 피부 임상지수 평가를 실시하여 순위화한 점수에 따라 각 군의 평균 점수가 최대한 균일하게 분포하도록 무작위법으로 분배하여 군을 분리하였다. 상기 실험을 통하여 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 처리된 군(Exosome, IV 그룹 및 Exosome, SC 그룹 모두)에서 용량 의존적으로 피부 임상지수가 감소됨을 확인하였다(도 14의 A 및 B).
실시예 9: 사이토카인 양 측정
희생시킨 생쥐의 귀 피부 조직을 분쇄하여 원심분리 후 얻어진 상층액으로 단백질을 정량하였다. 조직으로부터 얻은 총 RNA로부터 cDNA를 제조하고 리얼타임 PCR 방법을 이용하여 염증성 사이토카인 mRNA 변화량을 측정하였다. 리얼타임 PCR에 사용한 프라이머의 종류와 서열은 하기 표 1과 같다.
| Gene name |
프라이머 염기서열 (5' → 3') | Position cDNA |
Gene Bank ID |
| IL-4 | 정방향 프라이머 (서열번호 1): ACA GGA GAA GGG ACG CCA T 역방향 프라이머 (서열번호 2): GAA GCC CTA CAG ACG AGC TCA |
180-198 254-274 |
NM_021283.2 |
| IL-31 | 정방향 프라이머 (서열번호 3): CAC ACA GGA ACA ACG AAG CC 역방향 프라이머 (서열번호 4): CGA TAT TGG GGC ACC GAA G |
62-81 136-154 |
NM_029594.1 |
| GAPDH | 정방향 프라이머 (서열번호 5): CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA 역방향 프라이머 (서열번호 6): CCT GCT TCA CCA CCT TCT TGA T |
1125-1144 1291-1312 |
XM_017321385.1 |
상기 실험을 통하여 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 처리된 군(Exosome, IV 그룹 및 Exosome, SC 그룹 모두)에서의 염증관련 사이토카인의 발현량이 감소됨을 확인하였다(도 15).
실시예 10: 마스트 세포의 유입량 측정
희생시킨 생쥐의 귀 피부 조직을 톨루이딘블루로 염색한 후, 염증 세포의 일종인 마스트 세포의 유입 정도를 측정하였다. 상기 실험을 통하여 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 처리된 군(Exosome, IV 그룹 및 Exosome, SC 그룹 모두)에서의 마스트 세포의 유입이 감소됨을 확인하였다(도 16).
실시예 11: 혈액 분석
희생시킨 생쥐의 혈액으로부터 혈장을 분리하여 혈중 면역글로빈 E (Immunoglobulin E; IgE)의 농도를 ELISA Kit를 이용하여 측정하였다. 상기 실험을 통하여 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 처리된 군에서 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 용량 의존적으로 혈중 IgE 수준이 감소됨을 확인하였다(도 17A).
또한, 희생시킨 생쥐의 전혈을 이용하여 혈중 세포의 수를 측정하였다. 사이토스핀(ThermoFisher에서 구입)을 이용하여 일정한 양의 전혈 세포를 1,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 슬라이드 건조시킨 다음 Diff-Quik 염색을 실시한 후, 백혈구(white blood cells) 및 호산구(eosinophils)의 수를 측정하였다. 상기 실험을 통하여 실시예 2에서 준비된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체가 처리된 군에서 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 용량 의존적으로 혈중 백혈구 및 호산구의 수가 감소됨을 확인하였다(도 17B 및 도 17C).
상기와 같은 결과들로부터 본 발명의 조성물은 피부염의 원인이 되는 염증반응 인자인 혈중 IgE 수준을 감소시킬 뿐만 아니라 혈중 백혈구 및 호산구의 수를 감소시키고, 또한 다양한 염증성 사이토카인 및 염증관련 인자의 생성을 감소시키며, 염증 관련 면역세포의 활성 내지는 관여를 저해하는 것을 알 수 있어, 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 약학 조성물, 피부외용제 및 건강 기능 식품으로서 유용하게 사용될 수 있다.
실시예 12: 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체의 피부 투과 능력 시험
형광염색된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 제조하기 위하여 PKH67 염료(Sigma에서 구입)를 사용하였다. 1 mM의 PKH67을 Diluent C (Sigma에서 구입)에 희석하여 10 μM의 PKH67 용액을 제조한 후, 적정 농도의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 용액과 혼합하여 상온에서 빛을 차단한 상태로 10분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, PKH67로 염색된 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체(이하, "PKH-엑소좀"으로 약칭)로부터 잔여 PKH67 염료를 제거하기 위하여 MW3000 스핀 컬럼(Thermo Fisher에서 구입)을 사용하였다. 형광측정기(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 확인한 결과 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체와 반응하지 않은 PKH67을 제거한 후, PKH-엑소좀에서 충분한 강도의 형광이 검출됨을 확인하였다(도 18).
PKH-엑소좀을 적정 농도, 예를 들어 1×105 입자/mL 내지 1×109 입자/mL 농도로 인산완충용액(PBS)에 분산시킨 후, 돼지 피부조직의 피부 바깥면에 도포하였다. 도포된 PKH-엑소좀의 건조를 막기 위하여 부직포를 덮어 준 후 적정 시간, 예를 들어 30분 내지 1시간 동안 반응시켜 PKH-엑소좀이 피하 조직에 전달되도록 하였다. 반응이 종료된 후, 돼지 피부조직을 3.7% 포름알데히드 용액에 담궈 하룻밤 동안 반응시키고, 인산완충용액으로 5분씩 3회 세척하였다. 세척된 돼지 피부조직을 30% 수크로오스 용액에 담가 처리한 후, OCT 화합물을 처리하였다. 다시 인산완충용액으로 5분씩 3회 세척한 후, 마이크로톰을 이용하여 종단면으로 절편을 제작하여 슬라이드글라스 위에 조직 절편을 위치시켰다. 한편 조직 절편의 제작은 포름알데히드 용액으로 조직을 고정하기 전에 진행할 수도 있다. 조직 절편에서 PKH-엑소좀으로부터 검출되는 형광은 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 이상의 방법으로 돼지 피부조직의 표피를 투과하여 피하 조직으로 전달된 PKH-엑소좀을 확인하였다(도 19). 도 19에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 피부장벽을 효과적으로 통과하여 피부조직 내부로 깊숙이 전달될 수 있고, 피부에 대해 효과적으로 흡수될 수 있다. 따라서, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 또는 화장료 조성물은 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료 등에 있어서, 효과적으로 작용할 것으로 기대된다.
다음으로, 헤어리스 마우스의 피부조직을 적출하여 프란츠 확산셀(Franz Diffusion Cell)의 챔버 위쪽에 위치시켰다. 이때, 확산셀의 내부는 인산완충용액으로 채워주었다. PKH-엑소좀을 적정 농도, 예를 들어 1×105 입자/mL 내지 1×109 입자/mL 농도로 인산완충용액(PBS)에 분산시킨 후, 생쥐의 피부조직 바깥쪽에 도포하였다. 이때, PKH-엑소좀의 건조를 막기 위하여 부직포를 생쥐 피부조직 바깥쪽에 미리 위치시키고, 부직포와 피부조직 사이에 PKH-엑소좀을 주입하였다. 그 후 30분 내지 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 즉시 공초점형광현미경(Leica, SP8X)을 이용하여 피부조직 내부로 전달된 PKH-엑소좀을 확인하거나, 1시간 내지 6시간 동안 피부조직과 PKH-엑소좀 용액을 추가로 반응시킨 후, 공초점형광현미경으로 PKH-엑소좀을 확인하였다. 이상의 방법으로 확인한 결과, 본 발명의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는 피부장벽을 효과적으로 통과하여 피부조직 내부로 깊숙이 전달될 수 있고, 피부에 대해 효과적으로 흡수될 수 있다(도 20).
따라서, 상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 또는 화장료 조성물은 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료 등에 있어서, 효과적으로 작용할 것으로 기대된다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
<110> ExoCoBio Inc.
<120> A composition comprising an exosome and/or extracellular vesicle
derived from adipose-derived stem cell as an active ingredient
and its application for improving dermatitis
<130> P17-0031KR
<150> KR 10-2017-0083506
<151> 2017-06-30
<150> KR 10-2017-0111179
<151> 2017-08-31
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-4 forward primer
<400> 1
acaggagaag ggacgccat 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-4 reverse primer
<400> 2
gaagccctac agacgagctc a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-31 forward primer
<400> 3
cacacaggaa caacgaagcc 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-31 reverse primer
<400> 4
cgatattggg gcaccgaag 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH forward primer
<400> 5
catggccttc cgtgttccta 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH reverse primer
<400> 6
cctgcttcac caccttcttg at 22
Claims (35)
- 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 및
지방줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 함유 분획물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종을 유효성분으로 포함하는, 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 또는 상기 분획물은, 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 초미세여과법(ultrafiltration), 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 중 적어도 1종의 분리방법에 의해 분리된, 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는, 지방줄기세포 배양액에 부형제(excipient)를 첨가하고 상기 부형제가 첨가된 지방줄기세포 배양액을 여과한 후, 상기 여과된 지방줄기세포 배양액으로부터 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 분리된, 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 분획물은, 지방줄기세포 배양액에 부형제(excipient)를 첨가하고 상기 부형제가 첨가된 지방줄기세포 배양액을 여과한 후, 상기 여과된 지방줄기세포 배양액으로부터 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 분리되어 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하는, 약학 조성물. - 제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 또는 상기 분획물은, 1차 분리 후에 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용한 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 더 수행하여 수득되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 탈염과 버퍼교환에 사용되는 완충용액에는 부형제를 첨가하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행하거나 단속적으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물. - 제6항에 있어서,
시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 탈염과 버퍼교환을 수행하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물. - 제3항 또는 제4항에 있어서,
TFF(Tangential Flow Filtration)를 위해 MWCO(molecular weight cutoff) 100,000 Da, 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 μm TFF 필터를 사용하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물. - 제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 분리 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 1/100 내지 1/25의 부피까지 농축하는 과정을 더 포함하는, 약학 조성물. - 제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 여과된 지방줄기세포 배양액은 TFF 전에 초음파처리(sonication)되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물. - 제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 부형제는 자당(sucrose), 트레할로오스(trehalose), 유당(lactose), 락툴로오스, 말토오스, 셀로비오스, 이소말토오스, 투라노오스, 포도당(dextrose), 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 탈로오스, 만노오스, 타가토오스, 프시코오스, 에리트로오스, 에리트룰로오스, 트레오스, 에리스리톨(erythritol), 아라비노오스, 자일로오스, 릭소오스, 리보오스, 리불로오스, 자일룰로스, 알도헵토오스, 헵툴로오스, 옥툴로오스, 겐티아노스, 움벨리페로스, 플란테오스, 이소리크노오스, 라피노오스, 리크노오스, 스타키오스, 베르바스코오스(verbascose), 만니톨(manitol), 말티톨, 락티톨, 말토트리오스, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 자일리톨, 소르비톨(sorbitol), 전분 분해당, 전분 분해당 환원 알콜, 비이온성 계면활성제, 글리신(glycine), 히스티딘(histidine), 글리세롤(glycerol) 및 콜레스테롤(cholesterol)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 약학 조성물. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 또는 상기 분획물은, 시험관내 NO 어세이(nitric oxide assay)에서 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 감소시키는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물. - 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 및
지방줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 함유 분획물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종을 유효성분으로 포함하는, 피부외용제. - 제14항에 있어서,
상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 또는 상기 분획물은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염, 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합되어 있는, 피부외용제. - 제15항에 있어서,
상기 하이드로겔은 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔인 것을 특징으로 하는, 피부외용제. - 제16항에 있어서,
상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종이고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종인 것을 특징으로 하는, 피부외용제. - 제14항에 기재된 피부외용제로 이루어진, 피부염의 예방, 개선 또는 완화용 화장료 조성물.
- 제18항에 있어서,
패취, 마스크팩, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더 및 기름 종이로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 형태에 적용하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물. - 제19항에 있어서,
패취 또는 마스크팩의 적어도 일면(一面)에 도포된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물. - 제18항에 기재된 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 국소적으로 적용하는 단계를 포함하는, 피부염의 예방, 개선 또는 완화를 통한 미용방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 약학 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 피부염의 예방, 개선, 완화 또는 치료하는 방법.
- 지방줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체, 및
지방줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 함유 분획물로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종을 유효성분으로 포함하는, 피부염의 예방, 개선 또는 완화용 건강 기능 식품. - 제23항에 있어서,
상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 또는 상기 분획물은, 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 초미세여과법(ultrafiltration), 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 중 적어도 1종의 분리방법에 의해 분리된, 건강 기능 식품. - 제23항에 있어서,
상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체는, 지방줄기세포 배양액에 부형제(excipient)를 첨가하고 상기 부형제가 첨가된 지방줄기세포 배양액을 여과한 후, 상기 여과된 지방줄기세포 배양액으로부터 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 분리된, 건강 기능 식품. - 제23항에 있어서,
상기 분획물은, 지방줄기세포 배양액에 부형제(excipient)를 첨가하고 상기 부형제가 첨가된 지방줄기세포 배양액을 여과한 후, 상기 여과된 지방줄기세포 배양액으로부터 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 분리되어 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 함유하는, 건강 기능 식품. - 제25항 또는 제26항에 있어서,
상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 또는 상기 분획물은, 1차 분리 후에 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용한 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 더 수행하여 수득되는 것을 특징으로 하는, 건강 기능 식품. - 제27항에 있어서,
상기 탈염과 버퍼교환에 사용되는 완충용액에는 부형제를 첨가하는 것을 특징으로 하는, 건강 기능 식품. - 제28항에 있어서,
상기 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행하거나 단속적으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 건강 기능 식품. - 제28항에 있어서,
시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 탈염과 버퍼교환을 수행하는 것을 특징으로 하는, 건강 기능 식품. - 제25항 또는 제26항에 있어서,
TFF(Tangential Flow Filtration)를 위해 MWCO(molecular weight cutoff) 100,000 Da, 300,000 Da, 500,000 Da 또는 750,000 Da의 TFF 필터, 또는 0.05 μm TFF 필터를 사용하는 것을 특징으로 하는, 건강 기능 식품. - 제25항 또는 제26항에 있어서,
상기 분리 단계는 TFF(Tangential Flow Filtration)를 이용하여 1/100 내지 1/25의 부피까지 농축하는 과정을 더 포함하는, 건강 기능 식품. - 제25항 또는 제26항에 있어서,
상기 여과된 지방줄기세포 배양액은 TFF 전에 초음파처리(sonication)되는 것을 특징으로 하는, 건강 기능 식품. - 제25항 또는 제26항에 있어서,
상기 부형제는 자당(sucrose), 트레할로오스(trehalose), 유당(lactose), 락툴로오스, 말토오스, 셀로비오스, 이소말토오스, 투라노오스, 포도당(dextrose), 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 탈로오스, 만노오스, 타가토오스, 프시코오스, 에리트로오스, 에리트룰로오스, 트레오스, 에리스리톨(erythritol), 아라비노오스, 자일로오스, 릭소오스, 리보오스, 리불로오스, 자일룰로스, 알도헵토오스, 헵툴로오스, 옥툴로오스, 겐티아노스, 움벨리페로스, 플란테오스, 이소리크노오스, 라피노오스, 리크노오스, 스타키오스, 베르바스코오스(verbascose), 만니톨(manitol), 말티톨, 락티톨, 말토트리오스, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 자일리톨, 소르비톨(sorbitol), 전분 분해당, 전분 분해당 환원 알콜, 비이온성 계면활성제, 글리신(glycine), 히스티딘(histidine), 글리세롤(glycerol) 및 콜레스테롤(cholesterol)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종인, 건강 기능 식품. - 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 엑소좀 및/또는 세포외 소포체 또는 상기 분획물은, 시험관내 NO 어세이(nitric oxide assay)에서 NO(nitric oxide) 생성을 농도의존적으로 감소시키는 것을 특징으로 하는, 건강 기능 식품.
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