JP2020534247A - 脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物の皮膚炎の改善の用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用組成物を提供する。本発明の組成物は、皮膚炎を引き起こす複数のサイトカイン標的に対して作用し、様々な原因に起因する皮膚炎に対する広範囲の適用が可能であり、効果的に皮膚炎を抑制及び緩和させることができる。また、本発明の組成物は、角質層の水分蒸発を減少させ、皮膚の保湿を向上させ、皮膚バリアを保護及び強化させることができ、このような皮膚バリアの保護及び強化により皮膚炎を予防、改善、緩和、又は治療することができる。【選択図】図１４

Description

本発明は、脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物の皮膚炎の改善の用途に関する。

また、本発明は、前記組成物を含む皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用薬学組成物、皮膚外用剤及び化粧料組成物に関する。

さらに、本発明は、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療において臨床的適用が可能な高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一な脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを大量に得ることができ、このように得られた機能的活性に優れた脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物を低価で大量に提供することができる臨床的及び商業的に優れた技術に関する。

人体の皮膚は、物理的、化学的に外部から身体を保護すると同時に、全身の代謝に必要な生化学的機能を実行する器官である。一般的に、人の皮膚に現れる炎症性皮膚疾患を皮膚炎という。比較的に多い皮膚炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）としては、アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、接触性皮膚炎（ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、脂漏性皮膚炎（ｓｅｂｏｒｒｈｅｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）などがある。

接触性皮膚炎は、外部物質との接触によって発生する皮膚炎である。接触性皮膚炎は、発生する機序により刺激性接触性皮膚炎及びアレルギー性接触皮膚炎があり、一つの物質が、このような２つの反応を同時に起こすことがある。接触性皮膚炎を引き起こす物質のほとんどは有機化合物である。このような物質に感作された皮膚に再度皮膚炎誘発物質が接触すると、記憶細胞がこれを感知して、複数の化学物質が分泌され、炎症を起こすことが知られている。

アトピー性皮膚炎は、かゆみや湿疹性病変が特徴である慢性炎症性皮膚疾患である。これまでの研究結果によると、アトピー性皮膚炎の発症には、様々な因子が関与することが知られている。アトピー性皮膚炎が誘発される場合、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ）、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）及び肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）のような炎症に関連細胞が病変部位で観察され、肥満細胞から生成された免疫グロブリンＩｇＥが増加する。また、Ｔ細胞の異常増殖が現れるが、この過程で炎症性サイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等が増加して免疫反応を増幅させる。最近では、ＴＳＬＰ（Ｔｈｙｍｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）が皮膚炎の重症度と関連しており、アトピー性皮膚炎で現れるかゆみ症状の原因であると分かった。また、脂漏性皮膚炎は、皮脂腺の活動が増加して皮脂の分泌が盛んな頭皮と顔、その中でも眉、鼻、唇の周り、耳、脇の下、胸、鼠径部などに発生する慢性炎症性皮膚疾患である。

このような研究結果をもとに、炎症及び免疫抑制を介して皮膚炎治療剤を開発しようとする努力がある。現在までに開発された皮膚炎の治療剤としては、ステロイド、抗ヒスタミン剤、及びシクロスポリンＡのような免疫抑制剤などがある。しかし、これらの薬剤は、皮膚萎縮、血管拡張、色素脱失、注射部位の過敏反応、耐性及び好中球減少症（ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ）などの深刻な副作用を引き起こす問題がある。また、これらの薬剤は、根本的な治療というよりは、症状を適切なレベルに調節するのを助けるという限界もある。

このような問題点を勘案して天然物を用いた皮膚炎治療剤に関する研究が活発である。このような天然物を原料とする皮膚炎治療剤の場合、天然抽出物内の有効成分の含有量が少ない関係で皮膚炎治療効果を得るためには、大量の使用が必要であり、これらの大部分は、天然物素材という点をマーケティングに活用しているだけであり、皮膚炎治療の実質的効能については、科学的な研究がもっと必要な状況である。

一方、幹細胞を用いた皮膚再生及び治療方法が提案されている。胚性幹細胞又は胎児組織由来幹細胞は、分化能及び再生治療能力に優れており、拒否反応が少ないが、倫理的な問題で臨床に適用することができず、腫瘍を形成する危険性がある。これに対する代案として、成体幹細胞を用いる皮膚再生及び治療方法が提案された。しかし、患者自身の成体幹細胞でなく他人の成体幹細胞を用いた場合、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）を引き起こす危険性があり、自己成体幹細胞を用いて治療をするためには、患者から成体幹細胞を採取した後、これを培養する過程が必要で、複雑で費用が多くかかるという問題がある。

最近では、前述のような幹細胞の問題点を勘案して成体幹細胞を培養して得られた培養液を用いて、皮膚再生及び治療をしようとする試みがある。しかし、成体幹細胞の培養液には、成体幹細胞が分泌する様々なタンパク質、サイトカイン、成長因子などが含まれているのに対し、細胞が成長して分泌された老廃物、汚染防止のために添加された抗生剤、動物由来の血清等の成分も含まれているので、皮膚に使用する場合、様々な危険にさらされる可能性が高い。

最近、細胞分泌物（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）に細胞の行動（ｂｅｈａｖｉｏｒ）を調節する様々な生体活性因子が含まれているという研究が報告されており、特に細胞分泌物内には細胞間シグナル伝達機能を有する「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」が含まれており、その成分と機能に対する研究が活発に進められている。

細胞は、細胞外環境に様々な膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）タイプの小胞体を放出するが、通常、このような放出小胞体を細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＥＶｓ）と呼んでいる。細胞外小胞は、細胞膜由来小胞体、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅｓ）、シェディング小胞体（ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、マイクロパーティクル（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、エキソソーム等と呼ばれており、場合によっては、エキソソームとは区別されて用いられることもある。

エキソソームは細胞膜の構造と同じ二重リン脂質膜からなる数十ないし数百ナノメートルの大きさの小胞体で内部にはエキソソームカーゴ（ｃａｒｇｏ）と呼ばれるタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）などが含まれている。エキソソームカーゴには、広範囲のシグナル伝達要素（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）が含まれており、これらのシグナル伝達要素は、細胞タイプに特異的で分泌細胞の環境に応じて異なるように調節されることが知られている。エキソソームは細胞が分泌する細胞間のシグナル伝達媒体で、これにより伝達された様々な細胞シグナルは、標的細胞の活性化、成長、移動、分化、脱分化、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を含む細胞の行動を調節すると知られている。エキソソームは由来した細胞の性質及び状態に応じて特異的な遺伝物質と生体活性因子が含まれている。増殖する幹細胞由来のエキソソームの場合、細胞の移動、増殖及び分化のような細胞行動を調節し、組織再生に関する幹細胞の特性が反映されている（非特許文献１）。

しかし、エキソソームを用いた一部疾患の治療に対する可能性の提示など、様々な研究が行われているにもかかわらず、より綿密な臨床及び非臨床研究が必要であり、特にエキソソームが作用する様々な標的を科学的に究明してエキソソームを様々な疾患の治療に応用できる技術の開発が必要な実情である。

本発明者らは、かゆみ及び炎症を伴う皮膚炎と関連して、従来知られている皮膚炎治療剤に比べて効果が優れ、安全な治療剤を開発しようと努力した。そこで、本発明者らは、脂肪由来幹細胞由来のエキソソームの新たな用途について鋭意研究を重ねていたところ、脂肪由来幹細胞培養液から分離されたエキソソームが前述したような幹細胞自体や幹細胞培養液の安全性の問題を解決することができ、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療に効果的であることを確認して、本発明を完成した。

一方、前記した背景技術として説明された事項は、本発明の背景に対する理解を進めるためのものであり、本発明の「先行技術」として利用されうるという承認として引用したものではないことを理解しなければならない。

Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００２（２）５６９−５７９ Ｖａｓｉｌｉｙ Ｓ． Ｃｈｅｒｎｙｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．， "Ｓｉｚｅ ａｎｄ ｓｈａｐｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒａｔｅｄ ａｎｄ ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ"， Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ， （２０１５） ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００２１６−０１５−８５３５−３ Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ２００２； １１８： ３２７−３３４ Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ． ２００１； ２９３：４４８−４５４ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（２００８）１２８（１）、７９−８６

本発明の目的は、脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物の皮膚炎の改善の用途を提供することにある。特に、本発明の目的は、皮膚炎を引き起こす複数のサイトカイン標的に対して作用し、様々な原因に起因する皮膚炎に対する広範囲の適用が可能であり、効果的に皮膚炎を抑制及び緩和させることができ、皮膚バリア保護及び強化によって皮膚炎を予防、改善、緩和、又は治療することができる組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記組成物を含む皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用薬学組成物、皮膚外用剤、及び化粧料組成物を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一な脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを大量に得ることができ、このように得られた機能的活性に優れた脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、前記組成物を用いて、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療する方法を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、前記組成物を用いて、治療用を除く哺乳動物の皮膚の状態を調節する美容方法を提供することにある。

しかし、前述したような本発明の課題は例示的なものであり、これにより本発明の範囲が制限されるものではない。また、本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってより明確になる。

前記のような目的を達成するために、本発明は、脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用組成物を提供する。

また、本発明は、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療において臨床的適用が可能な高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一な脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを大量に得ることができ、このように得られた機能的活性に優れた脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物を低価で大量に提供することができる臨床的及び商業的に優れた新規な技術を提供する。

本明細書において、用語「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）」は、細胞膜の構造と同じ二重のリン脂質膜からなる数十ないし数百ナノメートル（好ましくは約３０〜２００ｎｍ）サイズの小胞体を意味する（ただし、分離対象となる幹細胞の種類、分離方法及び測定方法に従って、エキソソームの粒子サイズは可変でありうる）（非特許文献２）。エキソソームにはエキソソームカーゴ（ｃａｒｇｏ）と呼ばれるタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）等が含まれている。エキソソームカーゴには広範囲のシグナル伝達要素（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）が含まれており、これらのシグナル伝達要素は、細胞タイプに特異的で分泌細胞の環境に応じて異なるように調節されることが知られている。エキソソームは細胞が分泌する細胞間のシグナル伝達媒体であり、これにより伝達された様々な細胞シグナルは、標的細胞の活性化、成長、移動、分化、脱分化、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を含む細胞の行動を調節すると知られている。

本明細書において、用語「イオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」は、有効物質が適用された皮膚に微細電流を流して電位差を与え、皮膚の電気的環境を変化させることによりイオン化した有効成分を電気的反発力で皮膚を透過させる方法を意味する。本発明の一具体例に用いられるイオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）は、皮膚上の電極パッチに外部電源からの電流が流れ込み、皮膚に微細電流が導入される方式、電極パッチ自体にバッテリーが装着されて、皮膚に微細電流が導入される方式、高濃度電解質溶液及び低濃度電解質溶液との間のイオン濃度差により電流を発生させる逆電気透析（Ｒｅｖｅｒｓｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ）手段が装着されたパッチを介して皮膚に微細電流が導入される方式などを含んでもよい。しかし、本発明はこれに限定されるものではなく、様々な方式のイオントフォレシスを用いることができるのは言うまでもない。

脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを用いた、限定的なシワ改善及び皮膚再生効果が報告されている。そして脂肪由来幹細胞でなく神経幹細胞由来のエキソソームが脳損傷の治療、幹細胞の移植拒否による炎症疾患の治療に効果があるという報告があったが、現在まで脂肪由来幹細胞培養液から分離精製されたエキソソームを使用するとき、「皮膚炎の治療等」に効果があるものについては公知されたところはなかった。

現在までに大量培養が可能な脂肪由来幹細胞を培養した後、脂肪由来幹細胞培養液から大量に経済的に分離精製されたエキソソームを皮膚炎治療に臨床的に適用可能に具現した治療剤は開発されたことがない。脂肪由来の脂肪由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は、脂肪吸引術のような簡単な施術により大量に入手可能であり、骨髄、臍帯又は臍帯血などに比べて約４０倍程度の幹細胞があり、商業的には最も原価が安く生産量が多いが、脂肪内に細胞残骸物、老廃物、タンパク質及び巨大粒子のような不純物が多く、脂肪由来幹細胞培養液から高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一なエキソソームを経済的で大量に分離することは難しい。したがって、経済性の面で脂肪由来幹細胞培養液から高純度の粒子サイズ分布が均一なエキソソームを大量に分離することは、技術的な障壁があるといえる。

本発明の組成物は、注射剤のような薬学組成物、又は皮膚外用剤として適用されるとき、有効成分として含有された脂肪由来幹細胞由来のエキソソームが皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療に有意な効果を示し、幹細胞自体や幹細胞培養液の安全性の問題を解決することができる。したがって、本発明の皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用組成物に含まれる脂肪由来幹細胞由来のエキソソームは、従来の公知の制限的なシワ改善及び皮膚再生とは全く異なるメカニズムで皮膚炎を改善、緩和、ないしは治療し、このような効能は、従来技術からは全く予測できないものであることを明らかにしておく。

本発明の一具体例の皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用組成物は、脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む。

本発明の一具体例の組成物において、前記エキソソームは次のステップを実行して得ることができる：（ａ）脂肪由来幹細胞培養液にトレハロースを添加するステップ、（ｂ）前記トレハロースが添加された脂肪由来幹細胞培養液をろ過するステップ、（ｃ）ろ過された前記脂肪由来幹細胞培養液から、ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いてエキソソームを分離するステップ、及び（ｄ）脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に使用される緩衝溶液にトレハロースを添加し、前記トレハロースが添加された緩衝溶液を用いたＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて、分離された前記エキソソームに対する脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行うステップ。

本発明の一具体例の組成物において、前記（ｄ）ステップで脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に使用される緩衝溶液にトレハロースを添加すると、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームを効果的に得ることができる（図６Ａ乃至図６Ｅ参照）。

一方、本発明においてトレハロースは、細胞残骸物、老廃物、タンパク質及び巨大粒子のような不純物に対してエキソソームを効率的に分別できる機能を付与する。

本発明の一具体例の組成物において、前記脱塩とバッファー交換は連続的又は断続的に行うことができる。開始体積（ｓｔａｒｔｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ）に対して少なくとも４倍、好ましくは６倍乃至１０倍以上、より好ましくは１２倍以上の体積を有する緩衝溶液を用いて脱塩とバッファー交換を行うことができる。

本発明の一具体例の組成物において、ＴＦＦのためにＭＷＣＯ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）１００，０００Ｄａ（Ｄａｌｔｏｎ）、３００，０００Ｄａ、５００，０００Ｄａ又は７５０，０００ＤａのＴＦＦフィルタ、又は０．０５μｍ ＴＦＦフィルタを使用することができる。

本発明の一具体例の組成物において、前記（ｃ）のステップは、ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて１／１００乃至１／２５の体積まで濃縮する過程をさらに含むことができる。

本発明の一具体例の組成物において、ろ過された前記脂肪由来幹細胞培養液はＴＦＦの前に超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）されてもよい。

本発明の一具体例の組成物において、前記エキソソームは、皮膚組織又は皮膚細胞でＩＬ−４及びＩＬ−３１の発現量を減少させることを特徴とする。さらに、前記エキソソームは、皮膚組織又は皮膚細胞において、ＩＬ−２３又はＴＮＦ−αのうち少なくとも一つの発現量を減少させることができる。

本発明の一具体例の組成物において、前記エキソソームは血中ＩｇＥのレベルと、血中白血球及び好酸球の数を減少させることができる。

本発明の一具体例の組成物において、前記エキソソームは皮膚組織で肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）、ＣＤ８６＋細胞及びＣＤ２０６＋細胞の数を減少させることができる。

本発明の一具体例の組成物において、前記エキソソームはＴＥＷＬを減少させ、皮膚水分含有量（ｓｋｉｎ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）を増加させることを特徴とする。

本発明の一具体例の組成物において、前記エキソソームは、試験管内分析でＴＮＦ−α ｍＲＮＡ発現、ＩＬ−６ ｍＲＮＡ発現、及びＩＬ−１β ｍＲＮＡの発現を減少させることを特徴とする。

本発明の一具体例の組成物において、前記脂肪由来幹細胞の種類は、病原体による感染の危険性がなく、免疫拒否反応を起こさないものであれば制限されないが、ヒト脂肪由来幹細胞であることが好ましい。

本発明の一具体例の組成物は、かゆみを伴う様々な皮膚炎の予防、改善、緩和又は治療に効果的に用いることができ、接触皮膚炎、刺激性接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、光毒性及び光アレルギー性接触皮膚炎、接触蕁麻疹症候群、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、自家感作性皮膚炎、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、うっ滞性皮膚炎、にきび、又は湿疹に用いることができ、アトピー性皮膚炎、にきび、又は湿疹に使用することがより好ましい。

本発明の一具体例の組成物は、薬学組成物として製造することができる。本発明の一具体例の組成物が薬学組成物として製造される場合、本発明の一具体例による薬学組成物は、経口又は非経口の様々な剤形であってもよい。

本発明の一具体例の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤等を含むことができる。前記担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、トレハロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース（ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油などを挙げることができ、これに限定されない。本発明の一具体例の薬学組成物は、通常の方法によって散剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、エマルジョン、シロップ、顆粒剤、エリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒｓ）、エアロゾルなどの経口投与用製剤、外用剤、坐剤、又は滅菌注射溶液の形態に製剤化して使用することができる。

本発明の一具体例の薬学組成物の投与は、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記薬学組成物の投与経路は、薬物が目的の組織に到達することができる限り、いかなる一般的な経路を通じて投与することができる。例えば、本発明の一具体例の薬学組成物は、経口又は非経口投与することができ、非経口投与には、経皮投与、腹腔内投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、局所投与、直腸内投与などを挙げことができる。しかし、これに制限されるものではなく、当業界で知られている様々な投与方法を排除しない。また、本発明の一具体例の薬学組成物は、活性物質が標的組織又は細胞に移動することができる任意の装置によって投与することができる。また、本発明の一具体例の薬学組成物の有効量は、疾患の治療効果を期待するために投与に要求される量を意味する。

本発明の一具体例の薬学組成物の非経口投与用製剤は、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、又は坐剤であってもよい。本発明の一具体例の薬学組成物の非経口投与用製剤は、注射剤として製造されてもよい。本発明の一具体例の注射剤は、水性注射剤、非水性注射剤、水性懸濁注射剤、非水性懸濁注射剤、若しくは溶解又は懸濁して使用する固形注射剤などであってもよいが、これらに限定されるものではない。本発明の一具体例の注射剤は、その種類に応じて注射用蒸留水、植物油（例えば、落花生油、ごま油、ツバキ油等）、モノグリセリド、ジグリセリド、プロピレングリコール、カンフル、安息香酸エストラジオール、次サリチル酸ビスマス、アルセノベンゾールナトリウム、又は硫酸ストレプトマイシンの少なくとも１種を含むことができ、選択的に安定剤や防腐剤を含むことができる。

本発明の一具体例の薬学組成物の配合比率は、前述のような追加成分の種類や量、形態などに応じて適当に選択することができる。例えば、注射剤全量に対して、本発明の薬学組成物は、約０．１〜９９重量％、好ましくは約１０〜９０重量％程度含まれてもよい。また、本発明の一具体例の薬学組成物の適切な投与量は、患者の疾患の種類、疾患の軽重、剤形の種類、製剤化方法、患者の年齢、性別、体重、健康状態、食餌、排泄率、投与時間及び投与方法によって調節することができる。例えば、成人に本発明の一具体例の薬学組成物を投与する場合、一日に０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量で１回〜数回に分けて投与することができる。

一方、本発明の一具体例の組成物が皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物として製造される場合、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常、化粧品や皮膚外用剤に用いられる成分、例えば保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、乳化剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。

また、本発明の一具体例の皮膚外用剤は、脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム以外に、その作用（皮膚炎及びかゆみの抑制等）を損なわない限度で、従来から使用されてきた皮膚炎治療剤及び／又は保湿剤を共に混合して使用することができる。例えば、本発明のエキソソームは、ハイドロゲル、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム等）、又はヒアルロン酸ゲルのうち少なくとも１種に担持又は混合されてもよい。本発明の一具体例の皮膚外用剤において、前記ハイドロゲルの種類は限定されないが、ゲル化ポリマーを多価アルコールに分散させて得られたハイドロゲルであることが好ましい。前記ゲル化ポリマーは、プルロニック、精製寒天、アガロース、ゲランガム、アルギン酸、カラギーナン、カシアガム、キサンタンガム、ガラクトマンナン、グルコマンナン、ペクチン、セルロース、グアーガム、及びローカストビーンガムからなる群から選ばれた少なくとも１種であってもよく、前記多価アルコールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、イソブチレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、キシリトール、及びグリセリンからなる群から選ばれた少なくとも１種であってもよい。

本発明の一具体例の皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、例えば、パッチ、マスクパック、シートマスク、クリーム、トニック、軟膏、懸濁液、乳濁液、ペースト、ローション、ゲル、オイル、パック、スプレー、エアゾール、ミスト、ファンデーション、パウダー、油紙などの様々な形態に適用することができる。例えば、前記皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、パッチ、マスクパック又はシートマスクの少なくとも一面に塗布又は浸漬することができる。

本発明の一具体例の皮膚外用剤が化粧料組成物として製造される場合、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は正常化させる目的で使用され、化粧品剤形は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤形でも製造することができる。例えばパッチ、マスクパック、シートマスク、柔軟化粧水、栄養化粧水、収斂化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、アイクリーム、クレンジングクリーム、エッセンス、アイエッセンス、クレンジングローション、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、サンスクリーン、口紅、石鹸、シャンプー、界面活性剤含有クレンジング、入浴剤、ボディローション、ボディクリーム、ボディオイル、ボディエッセンス、ボディ洗浄剤、染毛剤、ヘアトニックなどに剤形化することができるが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例の皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、皮膚外用剤及び／又は化粧品に通常的に用いられる成分を含み、例えば抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、及び香料のような通常の補助剤そして担体を含むことができる。また、皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物に対するそれぞれの剤形において、他の成分は、皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物の種類又は使用目的などによって、当業者が困難なく、適宜選定して配合することができる。

本発明の他の具体例は、前記化粧料組成物を用いて、治療用を除く哺乳動物の皮膚の状態を調節する美容方法を提供する。本発明の美容方法において、皮膚の状態の調節とは皮膚の状態を改善させ／させたり、皮膚の状態を予防的に調節することを意味し、皮膚の状態の改善とは皮膚組織の外観及び感覚の視覚的並びに／又は触覚的に知覚することができる肯定的な変化を意味する。

本発明の一具体例の美容方法は、（ａ）前記化粧料組成物を哺乳動物の皮膚に直接塗布すること、（ｂ）前記化粧料組成物が塗布又は浸漬されたパッチ、マスクパック又はシートマスクを哺乳動物の皮膚に接触又は付着すること、または、前記（ａ）及び（ｂ）を順次進行することを含む。

本発明の一具体例の美容方法は、前記化粧料組成物が適用された哺乳動物の皮膚に微細電流を流してイオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行うことをさらに含むことができる。また、本発明の一具体例の美容方法は、イオントフォレシス装置を前記哺乳動物の皮膚に接触又は付着させることをさらに含むことができる。

本発明の一具体例の美容方法において、前記イオントフォレシス装置は、可撓性電池、リチウムイオン二次電池、アルカリ電池、乾電池、水銀電池、リチウム電池、ニッケルカドミウム電池、及び逆電気透析(ｒｅｖｅｒｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ)電池から構成された群から選ばれた少なくとも１種の電池を含むか、前記少なくとも１種の電池が装着されたパッチ、マスクパック又はシートマスクを含むことができる。

本発明のもう一つの具体例は、前記薬学組成物の治療学的に有効な量を哺乳動物に投与するステップを含む、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療する方法を提供する。

本発明の皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療する方法において、前記哺乳動物はヒト、イヌ、ネコ、齧歯類、ウマ、ウシ、サル、又はブタであってもよい。

本発明の組成物は、皮膚炎の原因となる様々な炎症性サイトカイン及び炎症関連因子の生成を減少させ、炎症関連免疫細胞の活性ないしは関与を阻害して皮膚炎を予防、改善、緩和、又は治療することができる。また、本発明の組成物は、角質層の水分の蒸発を減少させ、皮膚の保湿を向上させ、皮膚バリアを保護及び強化することができ、このような皮膚バリアの保護及び強化を通じて皮膚炎を予防、改善、緩和、又は治療することができる。

特に、本発明の組成物は、皮膚炎を引き起こす複数のサイトカイン標的に対して作用し、様々な原因に起因する皮膚炎に対する広範囲の適用が可能であり、効果的に皮膚炎を抑制及び緩和させることができる。また、本発明の組成物は、皮膚炎の軽症、中等度、重症の疾患進行程度によって発現様相が異なるサイトカインの標的を調節できるので軽症、中等度、重症の皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療に適用が可能であると期待される。さらに、本発明の組成物は、皮膚炎の急性、慢性などの発症様相によって発現様相が異なるサイトカインの標的を調節できるので、急性及び慢性皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療に適用が可能であると期待される。

したがって、本発明の組成物は、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用薬学組成物、皮膚外用剤、及び化粧料組成物として有用に使用することができる。

また、本発明は、高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一な脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを低価で大量に得ることができる。したがって、本発明は、機能的活性に優れた脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物を低価で大量に提供することができる。また、本発明の組成物は、スケールアップ（ｓｃａｌｅ−ｕｐ）が可能であり、ＧＭＰ（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）にも適している。

一方、前述のような効果によって、本発明の範囲が制限されるものではない。

本発明の一具体例により脂肪由来幹細胞培養液からエキソソームを製造する方法においてエキソソームを分離及び精製する過程を説明するフローチャートである。 本発明の一具体例により脂肪由来幹細胞培養液からエキソソームを製造するステップ（ｓｔｅｐ）別に溶液内に含まれているタンパク質の総量の割合（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示す。各ステップ別のタンパク質総量の割合は、幹細胞培養液全体に対するタンパク質総量の相対的な割合で示した。実験結果は、２つの異なるバッチから得られた結果をそれぞれ示した。 本発明の一具体例により得られたエキソソームの生産性（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）と純度（ｐｕｒｉｔｙ）を測定した結果を図示したものである。エキソソームの生産性は、「幹細胞培養液（ＣＭ）単位ｍＬ当り得られたエキソソームの粒子数」で計算し、エキソソームの純度は、「最終分画物に含まれているタンパク質の単位μｇ当りエキソソームの粒子数」で計算した。実験結果は、５つの異なるバッチ（ｂａｔｃｈ）から得られた結果を示した。 本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。ＴＲＰＳ（ｔｕｎａｂｌｅ ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ ｐｕｌｓｅ ｓｅｎｓｉｎｇ）分析による粒子サイズ分布と粒子数を示す。 本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。ＮＴＡ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）分析による粒子サイズ分布と粒子数を示す。 本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。ＴＥＭ（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）分析による粒子画像を倍率により図示した。 本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。本発明の一具体例によって得られたエキソソームのウエスタンブロットの結果を示す。 本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。本発明の一具体例によって得られたエキソソームに対するマーカー分析においてＣＤ６３及びＣＤ８１のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 トレハロース添加によって、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームが得られることを示す粒子サイズ分布に関するＮＴＡ分析結果を示す。添加されたトレハロースの量が増加するにつれて、単一のピークを有する粒子サイズ分布の結果を得ることができる。 トレハロース添加によって、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームが得られることを示す粒子サイズ分布に関するＮＴＡ分析結果を示す。添加されたトレハロースの量が増加するにつれて、単一のピークを有する粒子サイズ分布の結果を得ることができる。 トレハロース添加によって、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームが得られることを示す粒子サイズ分布に関するＮＴＡ分析結果を示す。添加されたトレハロースの量が増加するにつれて、単一のピークを有する粒子サイズ分布の結果を得ることができる。 本発明の一具体例によるエキソソームの製造過程でトレハロース添加の有無による粒子サイズ分布を示すＮＴＡ分析結果を示す。製造過程の全過程でトレハロースを添加した場合の結果を示す。 本発明の一具体例によるエキソソームの製造過程でトレハロース添加の有無による粒子サイズ分布を示すＮＴＡ分析結果を示す。細胞培養液を凍結保管し、解凍後、トレハロースを添加した場合の結果を示す。 本発明の一具体例によるエキソソームの製造過程でトレハロース添加の有無による粒子サイズ分布を示すＮＴＡ分析結果を示す。トレハロースを添加せずに製造した場合の結果を示す。 図６Ａ乃至図６Ｃの方法により分離したエキソソームの相対的な生産性（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）と相対的な濃度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を比較した結果を示した。 図６Ａ乃至図６Ｃの方法により分離したエキソソームの平均粒子サイズ（Ｍｅａｎ ｓｉｚｅ）を示した。 ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳと共に、本発明のエキソソームを処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、及びｉＮＯＳ ｍＲＮＡの発現量が減少したことを確認したリアルタイムＰＣＲの結果を図示したグラフである。 本発明の一具体例によるエキソソームによる、炎症反応の一種であるＮＯ形成の減少効果を確認した実験結果を示す。図８においてＰＢＳはリン酸緩衝塩類溶液 （ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）、ＤＥＸはデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、ＥＸＯはエキソソーム、ＣＭは脂肪由来幹細胞培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）、ＣＭ−ＥＸＯはエキソソームが除去された脂肪由来幹細胞培養液（ｅｘｏｓｏｍｅ−ｄｅｐｅｌｅｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）を示す。 本発明の一具体例によるエキソソームによる、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α形成の減少効果を確認した実験結果を示す。図９において、ＰＢＳはリン酸緩衝塩類溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）、ＤＥＸはデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、各数字はエキソソーム処理量（μｇ／ｍＬ）を示す。 本発明の一具体例により分離されたエキソソームによるＮＯ形成減少効果と、従来の沈殿法（ＰＰＴ）によって分離されたエキソソームによるＮＯ形成減少効果を比較した実験結果を示す。従来の沈殿法により分離されたエキソソームのＮＴＡ分析結果である。 本発明の一具体例により分離されたエキソソームによるＮＯ形成減少効果と、従来の沈殿法（ＰＰＴ）によって分離されたエキソソームによるＮＯ形成減少効果を比較した実験結果を示す。本発明の一具体例による方法によって分離精製されたエキソソームのＮＴＡ分析結果である。 本発明の一具体例により分離されたエキソソームによるＮＯ形成減少効果と、従来の沈殿法（ＰＰＴ）によって分離されたエキソソームによるＮＯ形成減少効果を比較した実験結果を示す。ＮＯ形成減少効果を比較図示したグラフである。ＮＯ形成の減少程度は陽性対照群であるデキサメタゾン（Ｄｅｘ）によるＮＯ形成の減少程度の相対比率（％）で表示した。 アトピーが誘発されたマウス（皮膚炎誘発動物モデル１）で、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した結果、アトピーの症状が緩和されたことを確認した結果を示す。 皮膚炎誘発動物モデル１に、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した後、皮膚損傷領域のサンプルで炎症性サイトカインであるＩＬ−４及びＩＬ−３１ ｍＲＮＡの変化量を確認したリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。 アトピーが誘発されたマウス（皮膚炎誘発動物モデル２）で、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した結果、エキソソームの用量依存的にアトピーの症状が緩和されたことを確認した結果を示す。 図１３の結果を数値化して比較したグラフである。 皮膚炎誘発動物モデル２に、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した後、皮膚損傷領域のサンプルで炎症性サイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−３１、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２３ ｍＲＮＡの変化量を確認したリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。 皮膚炎誘発動物モデル２に、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した後、血液中に存在する（Ａ）ＩｇＥ、（Ｂ）白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）、及び（Ｃ）好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）を測定して示したグラフである。 ＰＫＨ６７で染色されたエキソソームを確認した蛍光強度の測定結果を示す。 ブタ皮膚組織内部に、蛍光染色された本発明のエキソソームが伝達された程度を確認した蛍光顕微鏡画像である。蛍光染色された本発明のエキソソームを緩衝溶液に希釈してブタ皮膚表面に塗布し、一定時間経過後に確認した蛍光顕微鏡画像である。 マウス皮膚組織の内部に、蛍光染色された本発明のエキソソームが伝達された程度を確認した共焦点蛍光顕微鏡画像と、これから各画像上の蛍光強度を測定して得た総蛍光強度を比較して示したグラフである。図１９の上段は、蛍光染色された本発明のエキソソームを緩衝溶液に希釈してマウス皮膚表面に塗布し、一定時間経過後に確認した共焦点蛍光顕微鏡画像である。 ヒト皮膚繊維芽細胞であるＨＳ６８細胞に本発明の一具体例によるエキソソームを処理した後、細胞毒性がないことを確認した結果を示す。 本発明の一具体例によるエキソソームを含む組成物をヒトの皮膚（患部）に塗布した後、前記組成物が塗布された皮膚（患部）に微細電流を流すイオントフォレシスを行った結果、皮膚炎がひどい皮膚（患部）の紅斑などが著しく改善されたことを示す写真である。 自然発生重症アトピー性皮膚炎に苦しむシェットランド・シープドッグに本発明の一具体例によるエキソソームを皮下注射した結果、アトピーの症状が著しく改善されたことを示す写真である。 皮膚炎の原因となる皮膚バリアの損傷が誘発されたマウスに、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した結果、エキソソームの用量依存的にＴＥＷＬ（ｔｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｗａｔｅｒ ｌｏｓｓ）が減少することを示すグラフである。 皮膚炎の原因となる皮膚バリアの損傷が誘発されたマウスに、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した結果、エキソソームの用量依存的に皮膚水分含有量（ｓｋｉｎ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）が増加することを示すグラフある。 皮膚炎の原因となる皮膚バリアの損傷が誘発されたマウスの体重を測定した結果、デキサメタゾン処理群では副作用として体重が減少した一方、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した実験群では体重がほとんど減少しないことを示すグラフである。 ＴＨＰ−１単核球をマクロファージに分化させた後、得られたＴＨＰ−１由来マクロファージに対して、ＬＰＳ及びＩＦＮ−γと共に本発明のエキソソームを処理（ｃｏ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）した場合、親炎症性サイトカインであるＩＬ−６のｍＲＮＡの発現量が減少したことを確認したリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。 ＴＨＰ−１単核球をマクロファージに分化させた後、得られたＴＨＰ−１由来マクロファージに対して、本発明のエキソソームを前処理（ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）して一定時間培養した後ＬＰＳ及びＩＦＮ−γを処理した場合、親炎症性サイトカインであるＩＬ−６のｍＲＮＡの発現量が減少したことを確認したリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。 ＴＨＰ−１単核球をマクロファージに分化させた後、得られたＴＨＰ−１由来マクロファージに対して、本発明のエキソソームを前処理（ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）して一定時間培養した後ＬＰＳ及びＩＦＮ−γを処理した場合、親炎症性サイトカインであるＩＬ−１βのｍＲＮＡの発現量が減少したことを確認したリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。 ＴＨＰ−１単核球をマクロファージに分化させた後、得られたＴＨＰ−１由来マクロファージに対して、本発明のエキソソームを前処理（ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）して一定時間培養した後ＬＰＳ及びＩＦＮ−γを処理した場合、親炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αのｍＲＮＡの発現量が減少したことを確認したリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。

以下、本発明を下記の実施例でより詳細に記述する。ただし、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものに過ぎず、本発明の権利範囲を制限したり限定するものではない。本発明の詳細な説明及び実施例から、本発明が属する技術分野の通常の技術者が容易に類推できることは本発明の権利範囲に属するものと解釈される。本発明に引用された参考文献は、本発明に参考として統合される。

明細書全体で、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、これは特に反対となる記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含みうることを意味する。

実施例１：細胞の培養
マウスマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７は、韓国細胞株バンクから購入して培養した。細胞培養のために１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）及び１％抗生剤−抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）が含有されたＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）培地に５％ＣＯ_２、３７℃の条件で継代培養した。

ヒト皮膚繊維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）であるＨＳ６８細胞はＡＴＣＣから購入し、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）及び１％抗生剤−抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）が含有されたＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）培地に５％ＣＯ_２、３７℃の条件で継代培養した。

当該発明の属する技術分野で公知の細胞培養方法により、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で脂肪由来幹細胞を培養した。次に、リン酸緩衝塩類溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）で洗浄した後、無血清、無フェノールレッド培地に交換して、１日〜１０日間培養し、その上清（以下、培養液）を回収した。

エキソソームの分離過程で粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームを得るために培養液にトレハロースを２重量％添加した。トレハロースを添加した後、培養液を０．２２μｍフィルタでろ過して細胞残骸物、老廃物及び巨大粒子等の不純物を除去した。ろ過された培養液は、すぐに分離過程を経てエキソソームを分離した。また、ろ過された培養液は、冷蔵庫（１０℃以下）で保管した後、エキソソーム分離に使用した。また、ろ過された培養液は、−６０℃以下の超低温冷凍庫で凍結保管してから解凍した後、エキソソームの分離を行った。その後、培養液からタンジェント流ろ過装置（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ；ＴＦＦ）を用いて、エキソソームを分離した。

実施例２：ＴＦＦ法によるエキソソームの分離及び精製
実施例１で０．２２μｍフィルタでろ過された培養液からエキソソームを分離、濃縮、脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）をするためにＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）法を使用した。ＴＦＦ法を用いてエキソソームを分離、濃縮する前に培養液を超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）して潜在的なエキソソームの塊を解いた。ＴＦＦ法のためのフィルタとしては、カートリッジフィルタ（ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ｆｉｌｔｅｒ、別名ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｆｉｌｔｅｒ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）、又はカセットフィルタ（ｃａｓｓｅｔｔｅ ｆｉｌｔｅｒ；Ｐａｌｌ又はＳａｒｔｏｒｉｕｓ又はＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入）を使用した。ＴＦＦフィルタは、様々な分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ；ＭＷＣＯ）によって選択されてもよい。選択されたＭＷＣＯによって選別的にエキソソームを分離、濃縮し、ＭＷＣＯよりも小さい粒子やタンパク質、脂質、核酸、低分子化合物等は除去した。

エキソソームを分離、濃縮するためにＭＷＣＯ １００，０００Ｄａ（Ｄａｌｔｏｎ）、３００，０００Ｄａ、又は５００，０００ＤａのＴＦＦフィルタを使用した。培養液をＴＦＦ法を用いて１／１００〜１／２５程度の体積になるまで濃縮し、ＭＷＣＯよりも小さい物質は除去してエキソソームを分離した。

分離、濃縮されたエキソソーム溶液はＴＦＦ法を用いて、さらに脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行った。このとき、脱塩とバッファー交換は連続的に実行（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）又は断続的に実行（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）し、開始体積（ｓｔａｒｔｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ）に対して少なくとも４倍、好ましくは６倍〜１０倍以上、より好ましくは１２倍以上の体積を有する緩衝溶液を用いて行った。緩衝溶液には、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームを得るためにＰＢＳに溶かした２重量％のトレハロースを添加した。トレハロース処理により、高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一なエキソソームを高収率で得ることができる効果を確認した結果は、図６Ａ〜図６Ｅに示した。

実施例３：分離されたエキソソームの特性の分析
分離されたエキソソーム、培養液、及びＴＦＦ分離過程の分画物におけるタンパク質の量は、ＢＣＡ発色法（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）、又はフルオロプロファイル（ＦｌｕｏｒｏＰｒｏｆｉｌｅ）蛍光法（Ｓｉｇｍａから購入）を用いて測定した。本発明の一具体例のＴＦＦ法によりエキソソームが分離、濃縮されてタンパク質、脂質、核酸、低分子化合物等が除去される程度は、タンパク質定量法によってモニタリングし、その結果を図２に示した。その結果、本発明の一具体例のＴＦＦ法によって非常に効果的に培養液に存在するタンパク質が除去されることが分かった。

本発明の一具体例のＴＦＦ法によりエキソソームを分離する場合、生産性と純度を独立した５つのバッチで比較した結果を図３に示した。独立した５つのバッチから得られた結果を分析した結果、本発明の一具体例のＴＦＦ法によって非常に安定的にエキソソームを分離できることを確認した。

分離されたエキソソームはナノ粒子トラッキング解析（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ：ＮＴＡ；Ｍａｌｖｅｒｎから購入）、又は可変抵抗パルス検出（ｔｕｎａｂｌｅ ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ ｐｕｌｓｅ ｓｅｎｓｉｎｇ：ＴＲＰＳ；Ｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅから購入）によって粒子のサイズと濃度を測定した。分離されたエキソソームの均一度とサイズは、透過型電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＴＥＭ）を用いて分析した。本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームのＴＲＰＳ、ＮＴＡ、ＴＥＭの分析結果は、図４Ａ〜図４Ｃに示した。

ＴＦＦ法でエキソソームを分離した後、トレハロースの添加の有無によるエキソソームのサイズ分布をＮＴＡ分析した結果を図５Ａ〜図５Ｃに示した。トレハロース濃度を０重量％、１重量％及び２重量％に増加させ（図５Ａ〜図５Ｃの上から下）、３回繰り返して実験した。トレハロースが存在しない場合、３００ｎｍ以上の大きさを有する粒子が確認されるのに対し、トレハロースの添加量を増やすと３００ｎｍ以上の大きさを有する粒子が減少し、エキソソームのサイズ分布が均一になることを確認した。

ＴＦＦ法でエキソソームを分離する過程でトレハロースの添加による効果をさらに調査した。図６Ａ〜図６Ｃに示すようにエキソソームの製造過程の全過程にＰＢＳに溶かした２重量％のトレハロースを添加した場合、均一のサイズ分布を有するエキソソームを得ることができた（図６Ａ）。一方、トレハロースを添加せずに凍結保存した培養液を使用するが、脱塩とバッファー交換の過程においてのみトレハロースを添加してＴＦＦ過程を進めた場合や、トレハロースを全く添加せずにＴＦＦ過程を進めた場合、サイズが大きい粒子が多く含まれる不均一なエキソソームを得た（図６Ｂ及び図６Ｃ）。

分離されたエキソソームの相対的な生産性と濃度を比較した結果、エキソソームの製造過程の全過程にトレハロースを添加した場合、非常に高い生産性でエキソソームを得ることができ、得られたエキソソームの濃度も５倍以上高かった（図６Ｄ）。ＮＴＡ分析の結果から示されたように、分離されたエキソソームの平均サイズもエキソソームの製造過程の全過程にトレハロースを添加した場合、２００ｎｍで均一に確認された（図６Ｅ）。

図４Ｄは、本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームに対してウエスタンブロットを行った結果として、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＴＳＧ１０１マーカーの存在を確認した。各マーカーに対する抗体には、それぞれ抗ＣＤ９（Ａｂｃａｍから購入）、抗ＣＤ６３（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）、抗ＣＤ８１（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）、及び抗ＴＳＧ１０１（Ａｂｃａｍから購入）を使用した。

図４Ｅは、本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームに対してフローサイトメトリーを用いて分析した結果としてＣＤ６３及びＣＤ８１マーカーの存在を確認した。ＣＤ６３に対して陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）であるエキソソームを分離するためにエキソソームヒューマンＣＤ６３分離／検出キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）をメーカーの方法に従って使用し、ＰＥ―マウス抗ヒトＣＤ６３（ＰＥ−Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ６３）（ＢＤから購入）及びＰＥ―マウス抗ヒトＣＤ８１（ＰＥ−ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ８１）（ＢＤから購入）を使用してマーカーを染色した後、フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。

前記の結果を総合すると、本発明の一具体例の分離方法は、タンジェント流ろ過を用いた分離及び／又は精製の過程でトレハロースを添加して、高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一なエキソソームを高収率で経済的で、かつ効率的に分離及び精製できることが確認できた。また、本発明の一具体例の分離方法の工程は、スケールアップが可能でありＧＭＰにも適合することが分かった。

実施例４：エキソソーム処理による細胞毒性の測定
ヒト皮膚繊維芽細胞であるＨＳ６８細胞で本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームの毒性を評価するために、細胞に濃度別にエキソソームを処理し、細胞の増殖率を確認した。ＨＳ６８細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに懸濁させた後、８０〜９０％の密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を有するように分株し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した。２４時間後、培養液を除去し、実施例２で準備されたエキソソームを濃度別に処理して、２４〜７２時間培養しながら細胞生存率を評価した。細胞生存率をＷＳＴ−１試薬（ＷＳＴ−１ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｔａｋａｒａから購入）、ＭＴＴ試薬（Ｓｉｇｍａから購入）、セルタイターグロ試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｐｒｏｍｅｇａから購入）、又はアラマールブルー試薬（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ ｒｅａｇｅｎｔ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）とマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓから購入）を用いて測定した。

比較群はエキソソームが処理されていない一般の細胞培養培地で培養された細胞数を基準にしており、試験された濃度範囲内で、本発明のエキソソームによる細胞毒性が示されないことを確認した（図２０）。

実施例５：マクロファージ細胞株を用いた炎症反応の測定
ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に懸濁させ、これをマルチウェルプレート（ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）の各ウェルに８０〜９０％の密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を有するように分株した。翌日ＬＰＳが含まれた新たな無血清培地に希釈した本発明のエキソソーム（実施例２で準備されたエキソソーム）を適正濃度で１〜２４時間処理して培養した。培養が終わった培養上清を取り、培養液中に存在するＮＯ及び炎症性サイトカインを測定して炎症反応を確認した。培養液内の炎症反応は、ＮＯ検出キット（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（イントロンバイオもしくはプロメガから購入）を用いて測定した。ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍから購入）メーカーのマニュアル通りに実施して、ＬＰＳのみを処理した群と本発明のエキソソームが共に処理された群の炎症性サイトカインＴＮＦ−αの量を確認した。陽性対照群としてデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）（Ｓｉｇｍａから購入）を処理した。また、前記のように処理されたＲＡＷ２６４．７細胞から得られた総ＲＮＡからｃＤＮＡを製造し、リアルタイムＰＣＲ法を用いてｉＮＯＳ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１βのｍＲＮＡの変化量を測定した。前記遺伝子を定量するための標準遺伝子としてＧＡＰＤＨ遺伝子を使用した。リアルタイムＰＣＲに使用したプライマーの種類と配列は下記の表１の通りである。

まず、図７に示すように、マウスのマクロファージであるＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳと共に、本発明のエキソソームを処理した場合、ＬＰＳによって誘導される炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１βのｍＲＮＡの発現量が減少し、ＮＯ生成酵素であるｉＮＯＳのｍＲＮＡの発現量が減少した。

次に、図８に示すように、マウスのマクロファージであるＲＡＷ２６４．７細胞にＬＰＳ存在下で、本発明のエキソソームを処理した結果、ＬＰＳによって誘導される炎症反応であるＮＯ生成を濃度依存的に減少させることを確認した。また、図９に示すように、マウスのマクロファージであるＲＡＷ２６４．７細胞にＬＰＳ存在下で、本発明のエキソソームを処理した結果、ＬＰＳによって誘導される炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αの生成を減少させることを確認した。このような結果は、本発明のエキソソームが皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療のために有用な機能的活性、すなわちＬＰＳにより誘導された炎症反応を減少させる活性を有し、本発明のエキソソームは皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療のための組成物の有効成分として有効に活用できることを強く示唆している。

実施例６：分離方法によるＮＯ形成の減少効果の比較
分離方法によるエキソソームのＮＯ形成の減少効果を比較するために、本発明の一具体例のＴＦＦ分離精製によって得られたエキソソーム以外に、従来の沈殿法によって分離されたエキソソームを準備した。沈殿法はメーカー（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプロトコルに基づいて実施した。従来の沈殿法によって分離されたエキソソーム（図１０Ａ参照）は、本発明の一具体例のＴＦＦ法によって分離精製されたエキソソーム（図１０Ｂ参照）と比較して、粒子サイズ分布の均一度が低く、様々なサイズを有することを確認した。また、図１０Ｃに示すように、本発明の一具体例のＴＦＦ法によって分離精製されたエキソソームは、従来の沈殿法によって得られたエキソソームに比べてはるかに高いレベルでＮＯ形成を抑制することを確認した。このような結果は、本発明の一具体例により分離精製されたエキソソームが従来の方法により分離されたエキソソームに比べて、粒子サイズ分布の均一度とＮＯ形成抑制の面で優れていることを示している。

したがって、本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームは、従来の分離方法によって得られたエキソソームと比較して性能又は機能的活性（例えば、粒子サイズ分布の均一性、ＮＯ生成抑制、炎症反応の減少等）にはるかに優れ、このように機能的活性に優れた幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する本発明の組成物は、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療効果の面で従来技術よりもはるかに優れているといえる。

実施例７：皮膚炎誘発動物モデル
雄ＮＣ／Ｎｇａマウス（１６〜１８ｇ、５週齢；中央実験動物から購入）を購入して７日間の適応期を通じて本実験に使用した。適応期を経たマウスは皮膚炎誘発後、以下のようにそれぞれ５群に分類した。
（１）Ｎｏｒｍａｌ：正常対照群
（２）Ｖｅｈｉｃｌｅ（皮膚炎誘発群）：イエダニ抽出物により皮膚炎を誘発した陰性対照群
（３）ＩＶ：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に２．８μｇの用量で週３回ずつ２週間、血管内投与（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（４）ＳＣ：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に２．８μｇの用量で週３回ずつ２週間、皮下投与（ＳＣ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（５）Ｐｒｅｄ：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）を毎日経口投与した実験群
ＮＣ／Ｎｇａマウス（中央実験動物から購入）の耳介部分をカミソリで除毛した後、除毛剤を適量塗布して除毛した。除毛剤をふき取った後、ＡＤ誘発試薬（イエダニ抽出物；ＢｉｏＳｔｉｒ Ｉｎｃ．から購入）をマイクロピペットチップ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｐｅｔ ｔｉｐ）を用いて、耳介部分に均一に塗布した。必要に応じてカミソリで除毛した後、４％ＳＤＳ水溶液１５０μＬをマイクロピペットチップ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｐｅｔ ｔｉｐ）を用いて、耳介部分に均一に塗布した。ドライヤーを用いて冷風で乾燥させた後、約２〜３時間自然乾燥させた後、ＡＤ誘発試薬をマイクロピペットチップ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｐｅｔ ｔｉｐ）を用いて耳介部分に均一に塗布した。すべての前処理は、１週間に２回、計３週間、６回の処理で行った。

実施例２で準備されたエキソソーム投与開始前の皮膚臨床指数の評価を実施して順位化したスコアに基づいて、各群の平均スコアが最大限均一に分布するように、ランダム法で分配して群を分離した。

図１１Ａは、アトピーが誘発されたマウスの写真（Ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）と、本発明の一具体例によるエキソソーム処理（ＩＶ及びＳＣ）によるアトピー症状の緩和を示す写真である。図１１Ｂは（２）〜（５）の各実験群のアトピー臨床スコアを図式化したグラフであり、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した群において、アトピー臨床スコアが改善されたことを確認した。また、図１１Ｃは、（２）〜（５）の各実験群で測定された耳の厚さを（１）の正常群と比較して相対的な変化量を示したグラフであり、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した群で、耳の厚さが減少したことを確認した。

まとめると、前記の実験を通じて、本発明のエキソソームが処理された群（ＩＶ及びＳＣの両方）において、皮膚臨床指数と耳の厚さが減少されたことを確認した。

実施例８：皮膚炎誘発動物モデル２
エキソソームの用量依存的な効果を確認するために、実施例７と同様に、皮膚炎を誘発した後、以下のように９群に分類した。
（１）Ｎｏｒｍａｌ：正常対照群（図１３で「Ｎ」と表記）
（２）Ｃｏｎｔｒｏｌ（皮膚炎誘発群）：イエダニ抽出物により皮膚炎を誘発した陰性対照群（図１３で「Ｃ」と表記）
（３）ＩＶ、Ｌ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｌｏｗ）：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に０．１４μｇの用量で週３回ずつ４週間、血管内投与（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（４）ＩＶ、Ｍ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｍｅｄｉｕｍ）：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に１．４μｇの用量で週３回ずつ４週間、血管内投与（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（５）ＩＶ、Ｈ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｈｉｇｈ）：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に１０μｇの用量で週３回ずつ４週間、血管内投与（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（６）ＳＣ、Ｌ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｌｏｗ）：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に０．１４μｇの用量で週３回ずつ４週間、皮下投与（ＳＣ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（７）ＳＣ、Ｍ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｍｅｄｉｕｍ）：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に１．４μｇの用量で週３回ずつ４週間、皮下投与（ＳＣ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（８）ＳＣ、Ｈ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｈｉｇｈ）：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に１０μｇの用量で週３回ずつ４週間、皮下投与（ＳＣ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（９）Ｐｒｅｄ：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）を毎日経口投与した実験群（図１３で「Ｐ」と表記）

皮膚炎誘発は実施例７と同様に行い、ＡＤ誘発試薬を過量に塗布してエキソソームを投与する時点で平均皮膚臨床指数が９になるようにした。実施例２で準備されたエキソソーム投与開始前の皮膚臨床指数の評価を実施して順位化したスコアに基づいて、各群の平均スコアが最大限均一に分布するように、ランダム法で分配して群を分離した。

図１３の上段（上から一番目及び二番目）は、アトピーが誘発されたマウスの写真（０日目）と、本発明の一具体例によるエキソソーム処理により用量依存的にアトピーの症状が緩和されたこと（２８日目）を示す写真である。図１４Ａは（２）〜（９）の各実験群のアトピー臨床スコアの相対的改善度を図式化したグラフであり、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した群（ＩＶ及びＳＣ）で用量依存的にアトピー臨床スコアが改善されたことを確認した。

図１３の中段（上から三番目及び四番目）は、耳の皮膚組織の切片（ｓｅｃｔｉｏｎ）を、Ｈ＆Ｅ及びトルイジンブルーで染色した結果である。犠牲にしたマウスの耳の皮膚組織をＨ＆Ｅで染色した後、耳の皮膚組織の厚さを測定した。図１４Ｂは（２）〜（９）の各実験群で測定された耳の皮膚組織の厚さを（１）の正常群と比較して示したグラフであり、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した群（ＩＶ及びＳＣ）で耳の皮膚組織の厚さが用量依存的に減少したことを確認した。また、犠牲にしたマウスの耳の皮膚組織をトルイジンブルーで染色した後、炎症細胞の一種であるマスト細胞の流入の程度を測定した。図１４Ｃは（２）〜（９）の各実験群で測定されたマスト細胞の数を（１）の正常群と比較して示したグラフであり、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した群（ＩＶ及びＳＣ）でマスト細胞の流入が用量依存的に減少したことを確認した。

図１３の下段（上から五番目及び六番目）は、犠牲にしたマウスの耳の皮膚組織を抗−ＣＤ８６抗体及び抗−ＣＤ２０６抗体で免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）をした結果である。正常な皮膚では発見されず、アトピー性皮膚炎の病変に豊富に存在する炎症性樹状表皮細胞（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ；ＩＤＥＣｓ）は、その表面にＣＤ８６抗原及びＣＤ２０６抗原を発現することが知られている（非特許文献３、 非特許文献４）。したがって、アトピー性皮膚炎の病変内ＣＤ８６＋細胞数及びＣＤ２０６＋細胞数を測定すると皮膚炎の症状の改善程度を判断することができる。

犠牲にしたマウスの耳の皮膚組織切片を抗−ＣＤ８６抗体及び抗−ＣＤ２０６抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）をした後、ＣＤ８６＋細胞数及びＣＤ２０６＋細胞数を測定した。図１４Ｄ及び図１４Ｅは（２）〜（９）の各実験群で測定されたＣＤ８６＋細胞数及びＣＤ２０６＋細胞数を（１）の正常群と比較して示したグラフであり、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した群（ＩＶ及びＳＣ）でＣＤ８６＋細胞数及びＣＤ２０６＋細胞数が用量依存的に減少したことを確認した。このような結果は、アトピー性皮膚炎の病変内の炎症性樹状表皮細胞の浸潤が減少し、皮膚炎の症状が緩和ないしは改善されたことを示唆している。

まとめると、前記実験により、本発明のエキソソームが処理された群（ＩＶ及びＳＣの両方）で用量依存的に皮膚臨床指数、耳の皮膚組織の厚さ、マスト細胞の流入、及び炎症性樹状表皮細胞の浸潤が減少されたことを確認した。

実施例９：サイトカインｍＲＮＡ発現量の測定
犠牲にしたマウスの皮膚の損傷部位の組織を粉砕して得られた総ＲＮＡからｃＤＮＡを製造してリアルタイムＰＣＲ法を用いて、皮膚炎の主な原因となる様々な炎症性サイトカインｍＲＮＡの変化量を測定した。ＩＬ−４、ＩＬ−３１、ＩＬ−２３及びＴＮＦ−αの遺伝子を定量するための標準遺伝子としてＧＡＰＤＨ遺伝子を使用した。リアルタイムＰＣＲに使用したプライマーの種類と配列は下記表２の通りである。

前記動物モデル１の実験を通じて、本発明のエキソソームが処理された群（ＩＶ及びＳＣの両方）で皮膚炎の原因となる炎症関連サイトカインであるＩＬ−４及びＩＬ−３１のｍＲＮＡ発現量がすべて減少することを確認した（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。また、前記動物モデル２の実験を通じて、本発明のエキソソームが処理された群（ＩＶ及びＳＣの両方）で皮膚炎の原因となる様々な炎症関連サイトカイン、すなわちＩＬ−４、ＩＬ−３１、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２３のｍＲＮＡ発現量がすべて用量依存的に減少することを確認した（図１５Ａ〜図１５Ｄ）。

本発明のエキソソームが処理された群は、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）及びプレドニゾロン処理群に比べて用量依存的にＩＬ−４、ＩＬ−３１、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２３のｍＲＮＡ発現量をすべて減少させたが、これらの炎症関連サイトカインは、皮膚炎関連治療剤の開発のための主要標的である。これら複数の標的に対する発現量の減少は、皮膚炎の抑制及び緩和と関連している。ＩＬ−４は、ＩｇＥへのアイソタイプクラススイッチング（ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）を開始し、好酸球を活性化させる。また、ＩＬ−３１は、ＩｇＥへのアイソタイプクラススイッチング（ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）に影響を与え、炎症性細胞が皮膚に集まるようにし、増加したＩＬ−３１は皮膚炎の悪化と関連があることが知られている。ＩＬ−２３は、Ｔｈ０タイプのＴ細胞をＴＮＦ−αを生成する病原性ヘルパーＴ細胞に分化させ、ＴＮＦ−αは血漿中の濃度が高ければ皮膚炎の悪化と関連があることが知られている。このような点を総合的に考慮すると、本発明のエキソソームは皮膚炎の主な原因となる複数のサイトカインの発現を抑制し、炎症反応を調節すると判断される。

したがって、本発明のエキソソームは皮膚炎を引き起こす様々な炎症性サイトカインの標的（すなわち、ＩＬ−４、ＩＬ−３１、ＩＬ−２３、及びＴＮＦ−α）に対して作用し、様々な原因に起因する皮膚炎に対する広範囲の適用が可能であり、効果的に皮膚炎を抑制及び緩和させることができると期待される。

実施例１０：血液分析
犠牲にしたマウスの血液から血漿を分離して、血中の免疫グロブリンＥ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ；ＩｇＥ）の濃度をＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを用いて測定した。前記実験を通じて、実施例２で準備されたエキソソームが処理された群でエキソソームの用量依存的に血中ＩｇＥレベルが減少したことを確認した（図１６Ａ）。

また、犠牲にしたマウスの全血を用いて血中の細胞の数を測定した。サイトスピン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）を用いて、一定量の全血細胞を１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、スライド乾燥させてからＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋ染色を行い、その後、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）及び好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）の数を測定した。前記実験を通じて、実施例２で準備されたエキソソームが処理された群でエキソソームの用量依存的に血中白血球及び好酸球の数が減少することを確認した（図１６Ｂ及び図１６Ｃ）。

前記のような結果から、本発明の組成物は、皮膚炎の原因となる炎症反応因子である血中ＩｇＥレベルを減少させるだけでなく、血中白血球及び好酸球の数を減少させ、また、様々な炎症性サイトカイン及び炎症関連因子の生成を減少させ、炎症関連免疫細胞の活性ないしは関与を阻害することがわかり、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用薬学組成物、皮膚外用剤及び化粧料組成物として有用に使用することができる。

実施例１１：皮膚炎の原因となる皮膚バリアの損傷が誘発された動物モデル
皮膚バリアが損傷すると、化学物質や微生物などが皮膚中に容易に浸透して皮膚炎を誘発したり悪化させ、皮膚炎は再び皮膚バリアの損傷を誘発したり悪化させるという悪循環を繰り返して皮膚炎の症状はますます悪化する。したがって、角質層の水分蒸発を減少させて皮膚の保湿を向上させ、皮膚バリアを保護及び強化すると、皮膚炎の症状を改善、緩和、又は治療することができる。

皮膚炎が原因とされる皮膚バリアの損傷が誘発された動物モデルを確立するためにオキサゾロン（ｏｘａｚｏｌｏｎｅ）を使用する。オキサゾロンは、皮膚への塗布時に皮膚バリア機能の損傷をもたらすが、ＴＥＷＬ（ｔｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｗａｔｅｒ ｌｏｓｓ）の増加として表われる皮膚角質層の水分減少、皮膚バリアの構造タンパク質であるロリクリン、インボルクリン、フィラグリンの発現の減少、皮膚角質層のｐＨ増加を誘発して皮膚炎の原因となる皮膚バリア機能が損傷された動物モデルを提供することができる（非特許文献５参照）。

雌ＳＫＨ−１マウス（５週齢；中央実験動物から購入）を購入して７日間の適応期を経て本実験に使用した。適応期を経たマウスは皮膚バリアの損傷を誘発した後、以下のように、それぞれ６群に分類した。
（１）Ｎｏｒｍａｌ：正常対照群（図２３で「Ｎ」と表記）。
（２）Ｃｏｎｔｒｏｌ（皮膚バリアの損傷誘発群）：オキサゾロンにより皮膚バリアの損傷を誘発した陰性対照群（図２３で「Ｃ」と表記）。
（３）エキソソーム低用量：オキサゾロンにより皮膚バリアの損傷を誘発した後、実施例２で準備されたエキソソームを、個体ごとに１μｇの用量で週３回ずつ４週間皮下投与（ＳＣ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群（図２３で「Ｌ」と表記）。
（４）エキソソーム中用量：オキサゾロンにより皮膚バリアの損傷を誘発した後、実施例２で準備されたエキソソームを、個体ごとに３μｇの用量で週３回ずつ４週間皮下投与した実験群（図２３で「Ｍ」と表記）；
（５）エキソソーム高用量：オキサゾロンにより皮膚バリアの損傷を誘発した後、実施例２で準備されたエキソソームを、個体ごとに１０μｇの用量で週３回ずつ４週間皮下投与した実験群（図２３で「Ｈ」と表記）；
（６）デキサメタゾン：オキサゾロンにより皮膚バリアの損傷を誘発した後、エタノールに溶解させた０．０３％デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａから購入）を、個体ごとに１００μＬずつ週３回ずつ４週間皮下投与した実験群（陽性対照群）（図２３で「Ｄ」と表記）。

（２）〜（６）の各実験群のマウス背皮膚（ｂａｃｋ ｓｋｉｎ）に２％オキサゾロン（Ｓｉｇｍａから購入）２００μＬを塗布して感作し、感作後５〜７日間皮膚バリアの回復期間を経た後、約１５日間の一日置きに（２）〜（６）の各実験群のマウス背皮膚に０．０２５％〜０．０５％オキサゾロン１００μＬを塗布して皮膚バリアの損傷を誘発した。また、皮膚バリアの損傷を維持するためにエキソソーム処理期間中に一日置きに（２）〜（６）の各実験群のマウス背皮膚に０．０２５％〜０．０５％オキサゾロン１００μＬを塗布して処理した。

本発明のエキソソームが処理される前後に、ＴＥＷＬ測定装置を用いて、皮膚の平均水分蒸発量を測定し、水分測定器（Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ ＣＭ８２５）（Ｃｏｕｒａｇｅ−Ｋｈａｚａｋａ ｅｌｅｔｒｏｎｉｃ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、皮膚の水分含有量を測定した。

その結果、本発明の一具体例のエキソソームが処理された（３）〜（５）の実験群でエキソソームの用量依存的にＴＥＷＬ（ｔｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｗａｔｅｒ ｌｏｓｓ）の減少、すなわち角質層の水分蒸発量の減少を確認した（図２３）。また、本発明の一具体例のエキソソームが処理された（３）〜（５）の実験群でエキソソームの用量依存的に皮膚の水分含有量（ｓｋｉｎ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）の増加を確認した（図２４）。したがって、本発明のエキソソームを有効成分として含む組成物は、角質層の水分の蒸発を減少させ、皮膚の保湿を向上させて皮膚バリアを保護及び強化することができ、このような皮膚バリアの保護及び強化を通じて皮膚炎の症状を改善、緩和、又は治療することができる。

一方、各実験群の体重を測定した結果、デキサメタゾンを処理した（６）の実験群では、副作用で体重が減少したが、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した（３）〜（５）の実験群では、正常対照群に比べて体重がほとんど減少しなかった（図２５）。つまり、皮膚バリアの損傷の回復ないしは緩和、皮膚炎の治療のために一般的に使用されるデキサメタゾンが体重の減少のような副作用を示す一方で、本発明の一具体例によるエキソソームを有効成分として含む組成物は、皮膚バリアを保護及び強化させながら体重減少のような副作用を減らすことができる利点がある。

実施例１２：本発明のエキソソームの皮膚透過能力試験
蛍光染色されたエキソソームを製造するためにＰＫＨ６７染料（Ｓｉｇｍａから購入）を使用した。１ｍＭのＰＫＨ６７をＤｉｌｕｅｎｔ Ｃ（Ｓｉｇｍａから購入）に希釈して、１０μＭのＰＫＨ６７溶液を製造した後、適正濃度のエキソソーム溶液と混合して、常温で光を遮断した状態で１０分間反応させた。反応が終わった後、ＰＫＨ６７で染色されたエキソソーム（以下、「ＰＫＨ−エキソソーム」と略称）から残りのＰＫＨ６７染料を除去するためにＭＷ３０００スピンカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）を使用した。蛍光測定器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓから購入）を用いて確認した結果、エキソソームと反応しないＰＫＨ６７を除去した後、ＰＫＨ−エキソソームで十分な強度の蛍光が検出されることを確認した（図１７）。

ＰＫＨ−エキソソームを適正濃度、例えば１×１０^５粒子／ｍＬ〜１×１０^９粒子／ｍＬの濃度でリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）に分散させた後、ブタ皮膚組織の皮膚外側面に塗布した。塗布されたＰＫＨ−エキソソームの乾燥を防ぐために不織布を被せた後、適正時間、例えば３０分〜１時間反応させ、ＰＫＨ−エキソソームが皮下組織に伝達されるようにした。反応が終了した後、ブタ皮膚組織を３．７％ホルムアルデヒド溶液に浸し、一晩反応させ、リン酸緩衝塩類溶液で５分間ずつ３回洗浄した。洗浄されたブタ皮膚組織を３０％スクロース溶液に浸して処理した後、ＯＣＴ化合物を処理した。再びリン酸緩衝塩類溶液で５分間ずつ３回洗浄した後、ミクロトームを用いて縦断面で切片を作製し、スライドガラス上に組織切片を位置させた。一方、組織切片の作製は、ホルムアルデヒド溶液で組織を固定する前に行うこともできる。組織切片でＰＫＨ−エキソソームから検出される蛍光は、蛍光顕微鏡を用いて観察した。以上の方法でブタ皮膚組織の表皮を透過して皮下組織に伝達されたＰＫＨ−エキソソームを確認した（図１８）。図１８で確認されるように、本発明のエキソソームは皮膚バリアを効果的に通過して皮膚組織の内部に深く伝達でき、皮膚に対して効果的に吸収される。したがって、前記エキソソームを有効成分として含有する皮膚外用剤又は化粧料組成物は、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療などにおいて、効果的に作用すると期待される。

次に、ヘアレスマウスの皮膚組織を摘出してフランツ拡散セル（Ｆｒａｎｚ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ｃｅｌｌ）のチャンバの上部に位置させた。このとき、拡散セルの内部はリン酸緩衝塩類溶液で満たされた。ＰＫＨ−エキソソームを適正濃度、例えば１×１０^５粒子／ｍＬ〜１×１０^９粒子／ｍＬの濃度でリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）に分散させた後、マウスの皮膚組織の外側に塗布した。このとき、ＰＫＨ−エキソソームの乾燥を防ぐために不織布をマウスの皮膚組織の外側に予め位置させ、不織布と皮膚組織の間にＰＫＨ−エキソソームを注入した。その後、３０分〜１時間反応させた。反応が終わった後、すぐに共焦点蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ＳＰ８Ｘ）を用いて皮膚組織の内部に伝達されたＰＫＨ−エキソソームを確認し、１時間〜６時間、皮膚組織とＰＫＨ−エキソソーム溶液をさらに反応させた後、共焦点蛍光顕微鏡でＰＫＨ−エキソソームを確認した。以上の方法で確認した結果、本発明のエキソソームは皮膚バリアを効果的に通過して皮膚組織の内部に深く伝達でき、皮膚に効果的に吸収される（図１９）。

したがって、前記エキソソームを有効成分として含有する皮膚外用剤又は化粧料組成物は、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療などにおいて、効果的に作用すると期待される。

実施例１３：ヒト皮膚に対するエキソソームを有効成分として含む組成物の処理
本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームを含有する組成物（エキソソームを含む懸濁液）を、重症アトピー患者３人の患部（手、首、腕など）に１〜２週間週３回にわたり塗布した後、イオントフォレシス装置を使用して、前記組成物が塗布された患部に微細電流を流すイオントフォレシスを行った。その結果、患者の激しいかゆみが著しく緩和され、皮膚炎に関連する紅斑の症状も顕しく改善された（図２１）。本発明のエキソソームを含有する組成物を適用した患者全員が激しいかゆみや皮膚炎に関連する紅斑の症状が緩和され、ステロイドや抗ヒスタミン製剤の処方を中止してもよい程度に症状が改善された。

したがって、本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームを有効成分として含有する皮膚外用剤又は化粧料組成物は、前記のような臨床試験で確認されるように、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療効果を示すことがわかる。

実施例１４：イヌ科動物に対するエキソソームを有効成分として含む組成物の処理
自然に発生した重症アトピー性皮膚炎に苦しむシェットランド・シープドッグ（Ｓｈｅｔｌａｎｄ Ｓｈｅｅｐｄｏｇ）（体重１３ｋｇ、９年齢）を対象に実験を行った。本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソーム（実施例２で準備されたエキソソーム）を含有する組成物を、自然発生重症アトピー性皮膚炎に苦しむシェットランド・シープドッグに５週間の合計１２回にわたって皮下注射した。１回の注射の際、実施例２で準備されたエキソソームを個体ごとに１１７μｇの用量で注射した。１週目及び２週目には、週に３回皮下注射し、３週目、４週目、５週目には、週に２回皮下注射した。そして、本発明のエキソソーム投与後、他の薬物の投与を中止した。

図２２Ａは、本発明のエキソソームを投与する前の患部の写真であり、腹部に紅斑と炎症がひどいことがわかる。本発明のエキソソーム投与後３日目から皮膚炎の症状が著しく改善され（図２２Ｂ）、投与後１０日目（図２２Ｃ）及び投与後２週目（図２２Ｄ）は、皮膚炎がほとんど消えたことが確認できた。また、本発明のエキソソーム投与後、実験対象であるシェットランド・シープドッグの活力が明確に増加し、体重が１６ｋｇに増加した。このような活力増加及び体重増加は、皮膚炎の症状の改善に起因したものと判断される。

本発明のエキソソームの皮膚炎の治療効果が持続するか否かを確認するために、本発明のエキソソーム投与終了後、実験対象であるシェットランド・シープドッグの患部を継続的に観察した。その結果、投与終了後５０日目（図２２Ｅ）及び９３日目（図２２Ｆ）にも皮膚炎の症状改善効果が持続されたことが確認できた。

したがって、本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームを有効成分として含有する組成物は、前記のようなイヌ科動物に対する動物実験で確認されるように、皮膚炎を効果的に緩和ないしは改善させることができ、皮膚炎の治療効果が持続的に維持される。

実施例１５：ＴＨＰ−１単核球を用いた抗炎症効果の確認
ＴＨＰ−１単核球（ＴＨＰ−１ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅ）をマクロファージに分化させた後、本発明のエキソソームの抗炎症効果を次のように確認した。

ＴＨＰ−１単核球を、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、及び１００ｎＭホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（Ｐｈｏｒｂｏｌ １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−ａｃｅｔａｔｅ）（Ｓｉｇｍａから購入）が添加されたＲＰＭＩ１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ １６４０；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）培地に懸濁させた後、１２ウェルプレートに６×１０^５細胞／ｍＬの密度で接種し、３７℃、５％ＣＯ_２培養器で４８時間培養し、ＴＨＰ−１由来マクロファージ（ＴＨＰ−１ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）に分化を誘導した。その後、分化された細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテートが含まれていないＲＰＭＩ１６４０培地で２４時間培養して細胞を安定化した。

同時処理（ｃｏ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）実験群の場合、ＴＨＰ−１由来マクロファージに対してＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）が含まれていないＲＰＭＩ１６４０培地と１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ（ｓｉｇｍａから購入）及び２０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ−γ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入）を処理してＴＨＰ−１由来マクロファージを活性化させ、また陽性対照群であるデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａから購入）、又は本発明のエキソソーム（実施例２で準備されたエキソソーム）を処理して２４時間培養した。一方、前処理（ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）実験群の場合、ＴＨＰ−１由来マクロファージに対してＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）が含まれていないＲＰＭＩ１６４０培地と陽性対照群であるデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａから購入）、又は本発明のエキソソーム（実施例２で準備されたエキソソーム）を処理して２４時間培養した後、１００ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ（ｓｉｇｍａから購入）及び２０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ−γ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入）を処理して４時間培養し、ＴＨＰ−１由来マクロファージを活性化した。

培養が終わったＴＨＰ−１由来マクロファージ（ＴＨＰ−１ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）から分離したＲＮＡからｃＤＮＡを製造してリアルタイムＰＣＲ法を用いて、親炎症性サイトカイン（Ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）であるＩＬ−６、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現量を測定した。前記遺伝子を定量するための標準遺伝子としてＧＡＰＤＨを使用した。ＰＣＲに使用したプライマーの種類と配列は下記の表３の通りである。

図２６に示すように、ＴＨＰ−１単核球をマクロファージに分化させた後得られたＴＨＰ−１由来マクロファージに対して、ＬＰＳ及びＩＦＮ−γと共に本発明のエキソソームを処理（ｃｏ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）した場合、陰性対照群に比べて親炎症性サイトカインであるＩＬ−６のｍＲＮＡの発現量が減少した。また、図２７〜図２９に示すように、ＴＨＰ−１単核球をマクロファージに分化させた後得られたＴＨＰ−１由来マクロファージに対して、ＬＰＳ及びＩＦＮ−γ処理の前に、本発明のエキソソームを前処理（ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）した場合、陰性対照群に比べて親炎症性サイトカインであるＩＬ−６、ＩＬ−１β、及びＴＮＦ−αのｍＲＮＡの発現量が減少した。

親炎症性サイトカインであるＩＬ−６、ＩＬ−１β、及びＴＮＦ−αは、親炎症性Ｍ１マクロファージでは発現が増加し、抗炎症性Ｍ２マクロファージでは発現が減少する。したがって、前記結果は、本発明のエキソソームが炎症反応及びこれによる皮膚炎の症状を抑制、緩和、及び減少させることができることを示唆しており、前述で挙げた動物実験の結果を強力に裏付ける結果といえる。

実施例１６：本発明のエキソソームを含む化粧料組成物の製造
前記実施例２で準備された１７０４μｇ／ｍＬの濃度のエキソソームを下記表４に記載された成分と混合して懸濁した後、化粧料組成物（ローション）を製造した。各成分の含有量は下記表４の通りである。

以上、本発明を前記実施例を挙げて説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者であれば、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく修正、変更をすることができ、このような修正と変更も本発明に属するものであることがわかるであろう。

本発明は、脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物の皮膚炎の改善の用途に関する。

また、本発明は、前記組成物を含む皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用薬学組成物、皮膚外用剤及び化粧料組成物に関する。

さらに、本発明は、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療において臨床的適用が可能な高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一な脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを大量に得ることができ、このように得られた機能的活性に優れた脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物を低価で大量に提供することができる臨床的及び商業的に優れた技術に関する。

人体の皮膚は、物理的、化学的に外部から身体を保護すると同時に、全身の代謝に必要な生化学的機能を実行する器官である。一般的に、人の皮膚に現れる炎症性皮膚疾患を皮膚炎という。比較的に多い皮膚炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）としては、アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、接触性皮膚炎（ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、脂漏性皮膚炎（ｓｅｂｏｒｒｈｅｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）などがある。

接触性皮膚炎は、外部物質との接触によって発生する皮膚炎である。接触性皮膚炎は、発生する機序により刺激性接触性皮膚炎及びアレルギー性接触皮膚炎があり、一つの物質が、このような２つの反応を同時に起こすことがある。接触性皮膚炎を引き起こす物質のほとんどは有機化合物である。このような物質に感作された皮膚に再度皮膚炎誘発物質が接触すると、記憶細胞がこれを感知して、複数の化学物質が分泌され、炎症を起こすことが知られている。

アトピー性皮膚炎は、かゆみや湿疹性病変が特徴である慢性炎症性皮膚疾患である。これまでの研究結果によると、アトピー性皮膚炎の発症には、様々な因子が関与することが知られている。アトピー性皮膚炎が誘発される場合、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ）、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）及び肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）のような炎症に関連細胞が病変部位で観察され、肥満細胞から生成された免疫グロブリンＩｇＥが増加する。また、Ｔ細胞の異常増殖が現れるが、この過程で炎症性サイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等が増加して免疫反応を増幅させる。最近では、ＴＳＬＰ（Ｔｈｙｍｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）が皮膚炎の重症度と関連しており、アトピー性皮膚炎で現れるかゆみ症状の原因であると分かった。また、脂漏性皮膚炎は、皮脂腺の活動が増加して皮脂の分泌が盛んな頭皮と顔、その中でも眉、鼻、唇の周り、耳、脇の下、胸、鼠径部などに発生する慢性炎症性皮膚疾患である。

このような研究結果をもとに、炎症及び免疫抑制を介して皮膚炎治療剤を開発しようとする努力がある。現在までに開発された皮膚炎の治療剤としては、ステロイド、抗ヒスタミン剤、及びシクロスポリンＡのような免疫抑制剤などがある。しかし、これらの薬剤は、皮膚萎縮、血管拡張、色素脱失、注射部位の過敏反応、耐性及び好中球減少症（ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ）などの深刻な副作用を引き起こす問題がある。また、これらの薬剤は、根本的な治療というよりは、症状を適切なレベルに調節するのを助けるという限界もある。

このような問題点を勘案して天然物を用いた皮膚炎治療剤に関する研究が活発である。このような天然物を原料とする皮膚炎治療剤の場合、天然抽出物内の有効成分の含有量が少ない関係で皮膚炎治療効果を得るためには、大量の使用が必要であり、これらの大部分は、天然物素材という点をマーケティングに活用しているだけであり、皮膚炎治療の実質的効能については、科学的な研究がもっと必要な状況である。

一方、幹細胞を用いた皮膚再生及び治療方法が提案されている。胚性幹細胞又は胎児組織由来幹細胞は、分化能及び再生治療能力に優れており、拒否反応が少ないが、倫理的な問題で臨床に適用することができず、腫瘍を形成する危険性がある。これに対する代案として、成体幹細胞を用いる皮膚再生及び治療方法が提案された。しかし、患者自身の成体幹細胞でなく他人の成体幹細胞を用いた場合、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）を引き起こす危険性があり、自己成体幹細胞を用いて治療をするためには、患者から成体幹細胞を採取した後、これを培養する過程が必要で、複雑で費用が多くかかるという問題がある。

最近では、前述のような幹細胞の問題点を勘案して成体幹細胞を培養して得られた培養液を用いて、皮膚再生及び治療をしようとする試みがある。しかし、成体幹細胞の培養液には、成体幹細胞が分泌する様々なタンパク質、サイトカイン、成長因子などが含まれているのに対し、細胞が成長して分泌された老廃物、汚染防止のために添加された抗生剤、動物由来の血清等の成分も含まれているので、皮膚に使用する場合、様々な危険にさらされる可能性が高い。

最近、細胞分泌物（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）に細胞の行動（ｂｅｈａｖｉｏｒ）を調節する様々な生体活性因子が含まれているという研究が報告されており、特に細胞分泌物内には細胞間シグナル伝達機能を有する「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」が含まれており、その成分と機能に対する研究が活発に進められている。

細胞は、細胞外環境に様々な膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）タイプの小胞体を放出するが、通常、このような放出小胞体を細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＥＶｓ）と呼んでいる。細胞外小胞は、細胞膜由来小胞体、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅｓ）、シェディング小胞体（ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、マイクロパーティクル（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、エキソソーム等と呼ばれており、場合によっては、エキソソームとは区別されて用いられることもある。

エキソソームは細胞膜の構造と同じ二重リン脂質膜からなる数十ないし数百ナノメートルの大きさの小胞体で内部にはエキソソームカーゴ（ｃａｒｇｏ）と呼ばれるタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）などが含まれている。エキソソームカーゴには、広範囲のシグナル伝達要素（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）が含まれており、これらのシグナル伝達要素は、細胞タイプに特異的で分泌細胞の環境に応じて異なるように調節されることが知られている。エキソソームは細胞が分泌する細胞間のシグナル伝達媒体で、これにより伝達された様々な細胞シグナルは、標的細胞の活性化、成長、移動、分化、脱分化、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を含む細胞の行動を調節すると知られている。エキソソームは由来した細胞の性質及び状態に応じて特異的な遺伝物質と生体活性因子が含まれている。増殖する幹細胞由来のエキソソームの場合、細胞の移動、増殖及び分化のような細胞行動を調節し、組織再生に関する幹細胞の特性が反映されている（非特許文献１）。

しかし、エキソソームを用いた一部疾患の治療に対する可能性の提示など、様々な研究が行われているにもかかわらず、より綿密な臨床及び非臨床研究が必要であり、特にエキソソームが作用する様々な標的を科学的に究明してエキソソームを様々な疾患の治療に応用できる技術の開発が必要な実情である。

本発明者らは、かゆみ及び炎症を伴う皮膚炎と関連して、従来知られている皮膚炎治療剤に比べて効果が優れ、安全な治療剤を開発しようと努力した。そこで、本発明者らは、脂肪由来幹細胞由来のエキソソームの新たな用途について鋭意研究を重ねていたところ、脂肪由来幹細胞培養液から分離されたエキソソームが前述したような幹細胞自体や幹細胞培養液の安全性の問題を解決することができ、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療に効果的であることを確認して、本発明を完成した。

一方、前記した背景技術として説明された事項は、本発明の背景に対する理解を進めるためのものであり、本発明の「先行技術」として利用されうるという承認として引用したものではないことを理解しなければならない。

Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 ２００２（２）５６９−５７９ Ｖａｓｉｌｉｙ Ｓ． Ｃｈｅｒｎｙｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．， "Ｓｉｚｅ ａｎｄ ｓｈａｐｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒａｔｅｄ ａｎｄ ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ"， Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ， （２０１５） ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００２１６−０１５−８５３５−３ Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ２００２； １１８： ３２７−３３４ Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ． ２００１； ２９３：４４８−４５４

本発明の目的は、脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物の皮膚炎の改善の用途を提供することにある。特に、本発明の目的は、皮膚炎を引き起こす複数のサイトカイン標的に対して作用し、様々な原因に起因する皮膚炎に対する広範囲の適用が可能であり、効果的に皮膚炎を抑制及び緩和させることができる組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記組成物を含む皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用薬学組成物、皮膚外用剤、及び化粧料組成物を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一な脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを大量に得ることができ、このように得られた機能的活性に優れた脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、前記組成物を用いて、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療する方法を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、前記組成物を用いて、治療用を除く哺乳動物の皮膚の状態を調節する美容方法を提供することにある。

しかし、前述したような本発明の課題は例示的なものであり、これにより本発明の範囲が制限されるものではない。また、本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってより明確になる。

前記のような目的を達成するために、本発明は、脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用組成物を提供する。

また、本発明は、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療において臨床的適用が可能な高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一な脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを大量に得ることができ、このように得られた機能的活性に優れた脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物を低価で大量に提供することができる臨床的及び商業的に優れた新規な技術を提供する。

本明細書において、用語「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）」は、細胞膜の構造と同じ二重のリン脂質膜からなる数十ないし数百ナノメートル（好ましくは約３０〜２００ｎｍ）サイズの小胞体を意味する（ただし、分離対象となる幹細胞の種類、分離方法及び測定方法に従って、エキソソームの粒子サイズは可変でありうる）（非特許文献２）。エキソソームにはエキソソームカーゴ（ｃａｒｇｏ）と呼ばれるタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）等が含まれている。エキソソームカーゴには広範囲のシグナル伝達要素（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）が含まれており、これらのシグナル伝達要素は、細胞タイプに特異的で分泌細胞の環境に応じて異なるように調節されることが知られている。エキソソームは細胞が分泌する細胞間のシグナル伝達媒体であり、これにより伝達された様々な細胞シグナルは、標的細胞の活性化、成長、移動、分化、脱分化、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を含む細胞の行動を調節すると知られている。

本明細書において、用語「イオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」は、有効物質が適用された皮膚に微細電流を流して電位差を与え、皮膚の電気的環境を変化させることによりイオン化した有効成分を電気的反発力で皮膚を透過させる方法を意味する。本発明の一具体例に用いられるイオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）は、皮膚上の電極パッチに外部電源からの電流が流れ込み、皮膚に微細電流が導入される方式、電極パッチ自体にバッテリーが装着されて、皮膚に微細電流が導入される方式、高濃度電解質溶液及び低濃度電解質溶液との間のイオン濃度差により電流を発生させる逆電気透析（Ｒｅｖｅｒｓｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ）手段が装着されたパッチを介して皮膚に微細電流が導入される方式などを含んでもよい。しかし、本発明はこれに限定されるものではなく、様々な方式のイオントフォレシスを用いることができるのは言うまでもない。

脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを用いた、限定的なシワ改善及び皮膚再生効果が報告されている。そして脂肪由来幹細胞でなく神経幹細胞由来のエキソソームが脳損傷の治療、幹細胞の移植拒否による炎症疾患の治療に効果があるという報告があったが、現在まで脂肪由来幹細胞培養液から分離精製されたエキソソームを使用するとき、「皮膚炎の治療等」に効果があるものについては公知されたところはなかった。

現在までに大量培養が可能な脂肪由来幹細胞を培養した後、脂肪由来幹細胞培養液から大量に経済的に分離精製されたエキソソームを皮膚炎治療に臨床的に適用可能に具現した治療剤は開発されたことがない。脂肪由来の脂肪由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は、脂肪吸引術のような簡単な施術により大量に入手可能であり、骨髄、臍帯又は臍帯血などに比べて約４０倍程度の幹細胞があり、商業的には最も原価が安く生産量が多いが、脂肪内に細胞残骸物、老廃物、タンパク質及び巨大粒子のような不純物が多く、脂肪由来幹細胞培養液から高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一なエキソソームを経済的で大量に分離することは難しい。したがって、経済性の面で脂肪由来幹細胞培養液から高純度の粒子サイズ分布が均一なエキソソームを大量に分離することは、技術的な障壁があるといえる。

本発明の組成物は、注射剤のような薬学組成物、又は皮膚外用剤として適用されるとき、有効成分として含有された脂肪由来幹細胞由来のエキソソームが皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療に有意な効果を示し、幹細胞自体や幹細胞培養液の安全性の問題を解決することができる。したがって、本発明の皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用組成物に含まれる脂肪由来幹細胞由来のエキソソームは、従来の公知の制限的なシワ改善及び皮膚再生とは全く異なるメカニズムで皮膚炎を改善、緩和、ないしは治療し、このような効能は、従来技術からは全く予測できないものであることを明らかにしておく。

本発明の一具体例の皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用組成物は、脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む。

本発明の一具体例の組成物において、前記エキソソームは次のステップを実行して得ることができる：（ａ）脂肪由来幹細胞培養液にトレハロースを添加するステップ、（ｂ）前記トレハロースが添加された脂肪由来幹細胞培養液をろ過するステップ、（ｃ）ろ過された前記脂肪由来幹細胞培養液から、ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いてエキソソームを分離するステップ、及び（ｄ）脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に使用される緩衝溶液にトレハロースを添加し、前記トレハロースが添加された緩衝溶液を用いたＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ
Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて、分離された前記エキソソームに対する脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行うステップ。

本発明の一具体例の組成物において、前記（ｄ）ステップで脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に使用される緩衝溶液にトレハロースを添加すると、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームを効果的に得ることができる（図６Ａ乃至図６Ｅ参照）。

一方、本発明においてトレハロースは、細胞残骸物、老廃物、タンパク質及び巨大粒子のような不純物に対してエキソソームを効率的に分別できる機能を付与する。

本発明の一具体例の組成物において、前記脱塩とバッファー交換は連続的又は断続的に行うことができる。開始体積（ｓｔａｒｔｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ）に対して少なくとも４倍、好ましくは６倍乃至１０倍以上、より好ましくは１２倍以上の体積を有する緩衝溶液を用いて脱塩とバッファー交換を行うことができる。

本発明の一具体例の組成物において、ＴＦＦのためにＭＷＣＯ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）１００，０００Ｄａ（Ｄａｌｔｏｎ）、３００，０００Ｄａ、５００，０００Ｄａ又は７５０，０００ＤａのＴＦＦフィルタ、又は０．０５μｍ ＴＦＦフィルタを使用することができる。

本発明の一具体例の組成物において、前記（ｃ）のステップは、ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて１／１００乃至１／２５の体積まで濃縮する過程をさらに含むことができる。

本発明の一具体例の組成物において、前記エキソソームは、皮膚組織又は皮膚細胞でＩＬ−４及びＩＬ−３１の発現量を減少させることを特徴とする。さらに、前記エキソソームは、皮膚組織又は皮膚細胞において、ＩＬ−２３又はＴＮＦ−αのうち少なくとも一つの発現量を減少させることができる。

本発明の一具体例の組成物において、前記エキソソームは血中ＩｇＥのレベルと、血中白血球及び好酸球の数を減少させることができる。

本発明の一具体例の組成物において、前記エキソソームは皮膚組織で肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）、ＣＤ８６＋細胞及びＣＤ２０６＋細胞の数を減少させることができる。

本発明の一具体例の組成物において、前記脂肪由来幹細胞の種類は、病原体による感染の危険性がなく、免疫拒否反応を起こさないものであれば制限されないが、ヒト脂肪由来幹細胞であることが好ましい。

本発明の一具体例の組成物は、かゆみを伴う様々な皮膚炎の予防、改善、緩和又は治療に効果的に用いることができ、接触皮膚炎、刺激性接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、光毒性及び光アレルギー性接触皮膚炎、接触蕁麻疹症候群、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、自家感作性皮膚炎、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、うっ滞性皮膚炎、にきび、又は湿疹に用いることができ、アトピー性皮膚炎、にきび、又は湿疹に使用することがより好ましい。

本発明の一具体例の組成物は、薬学組成物として製造することができる。本発明の一具体例の組成物が薬学組成物として製造される場合、本発明の一具体例による薬学組成物は、経口又は非経口の様々な剤形であってもよい。

本発明の一具体例の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤等を含むことができる。前記担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、トレハロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース（ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油などを挙げることができ、これに限定されない。本発明の一具体例の薬学組成物は、通常の方法によって散剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、エマルジョン、シロップ、顆粒剤、エリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒｓ）、エアロゾルなどの経口投与用製剤、外用剤、坐剤、又は滅菌注射溶液の形態に製剤化して使用することができる。

本発明の一具体例の薬学組成物の投与は、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記薬学組成物の投与経路は、薬物が目的の組織に到達することができる限り、いかなる一般的な経路を通じて投与することができる。例えば、本発明の一具体例の薬学組成物は、経口又は非経口投与することができ、非経口投与には、経皮投与、腹腔内投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、局所投与、直腸内投与などを挙げことができる。しかし、これに制限されるものではなく、当業界で知られている様々な投与方法を排除しない。また、本発明の一具体例の薬学組成物は、活性物質が標的組織又は細胞に移動することができる任意の装置によって投与することができる。また、本発明の一具体例の薬学組成物の有効量は、疾患の治療効果を期待するために投与に要求される量を意味する。

本発明の一具体例の薬学組成物の非経口投与用製剤は、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、又は坐剤であってもよい。本発明の一具体例の薬学組成物の非経口投与用製剤は、注射剤として製造されてもよい。本発明の一具体例の注射剤は、水性注射剤、非水性注射剤、水性懸濁注射剤、非水性懸濁注射剤、若しくは溶解又は懸濁して使用する固形注射剤などであってもよいが、これらに限定されるものではない。本発明の一具体例の注射剤は、その種類に応じて注射用蒸留水、植物油（例えば、落花生油、ごま油、ツバキ油等）、モノグリセリド、ジグリセリド、プロピレングリコール、カンフル、安息香酸エストラジオール、次サリチル酸ビスマス、アルセノベンゾールナトリウム、又は硫酸ストレプトマイシンの少なくとも１種を含むことができ、選択的に安定剤や防腐剤を含むことができる。

本発明の一具体例の薬学組成物の配合比率は、前述のような追加成分の種類や量、形態などに応じて適当に選択することができる。例えば、注射剤全量に対して、本発明の薬学組成物は、約０．１〜９９重量％、好ましくは約１０〜９０重量％程度含まれてもよい。また、本発明の一具体例の薬学組成物の適切な投与量は、患者の疾患の種類、疾患の軽重、剤形の種類、製剤化方法、患者の年齢、性別、体重、健康状態、食餌、排泄率、投与時間及び投与方法によって調節することができる。例えば、成人に本発明の一具体例の薬学組成物を投与する場合、一日に０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量で１回〜数回に分けて投与することができる。

一方、本発明の一具体例の組成物が皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物として製造される場合、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常、化粧品や皮膚外用剤に用いられる成分、例えば保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、乳化剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。

また、本発明の一具体例の皮膚外用剤は、脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム以外に、その作用（皮膚炎及びかゆみの抑制等）を損なわない限度で、従来から使用されてきた皮膚炎治療剤及び／又は保湿剤を共に混合して使用することができる。例えば、本発明のエキソソームは、ハイドロゲル、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム等）、又はヒアルロン酸ゲルのうち少なくとも１種に担持又は混合されてもよい。本発明の一具体例の皮膚外用剤において、前記ハイドロゲルの種類は限定されないが、ゲル化ポリマーを多価アルコールに分散させて得られたハイドロゲルであることが好ましい。前記ゲル化ポリマーは、プルロニック、精製寒天、アガロース、ゲランガム、アルギン酸、カラギーナン、カシアガム、キサンタンガム、ガラクトマンナン、グルコマンナン、ペクチン、セルロース、グアーガム、及びローカストビーンガムからなる群から選ばれた少なくとも１種であってもよく、前記多価アルコールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、イソブチレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、キシリトール、及びグリセリンからなる群から選ばれた少なくとも１種であってもよい。

本発明の一具体例の皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、例えば、パッチ、マスクパック、シートマスク、クリーム、トニック、軟膏、懸濁液、乳濁液、ペースト、ローション、ゲル、オイル、パック、スプレー、エアゾール、ミスト、ファンデーション、パウダー、油紙などの様々な形態に適用することができる。例えば、前記皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、パッチ、マスクパック又はシートマスクの少なくとも一面に塗布又は浸漬することができる。

本発明の一具体例の皮膚外用剤が化粧料組成物として製造される場合、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は正常化させる目的で使用され、化粧品剤形は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤形でも製造することができる。例えばパッチ、マスクパック、シートマスク、柔軟化粧水、栄養化粧水、収斂化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、アイクリーム、クレンジングクリーム、エッセンス、アイエッセンス、クレンジングローション、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、サンスクリーン、口紅、石鹸、シャンプー、界面活性剤含有クレンジング、入浴剤、ボディローション、ボディクリーム、ボディオイル、ボディエッセンス、ボディ洗浄剤、染毛剤、ヘアトニックなどに剤形化することができるが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例の皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、皮膚外用剤及び／又は化粧品に通常的に用いられる成分を含み、例えば抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、及び香料のような通常の補助剤そして担体を含むことができる。また、皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物に対するそれぞれの剤形において、他の成分は、皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物の種類又は使用目的などによって、当業者が困難なく、適宜選定して配合することができる。

本発明の他の具体例は、前記化粧料組成物を用いて、治療用を除く哺乳動物の皮膚の状態を調節する美容方法を提供する。本発明の美容方法において、皮膚の状態の調節とは皮膚の状態を改善させ／させたり、皮膚の状態を予防的に調節することを意味し、皮膚の状態の改善とは皮膚組織の外観及び感覚の視覚的並びに／又は触覚的に知覚することができる肯定的な変化を意味する。

本発明の一具体例の美容方法は、（ａ）前記化粧料組成物を哺乳動物の皮膚に直接塗布すること、（ｂ）前記化粧料組成物が塗布又は浸漬されたパッチ、マスクパック又はシートマスクを哺乳動物の皮膚に接触又は付着すること、または、前記（ａ）及び（ｂ）を順次進行することを含む。

本発明の一具体例の美容方法は、前記化粧料組成物が適用された哺乳動物の皮膚に微細電流を流してイオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行うことをさらに含むことができる。また、本発明の一具体例の美容方法は、イオントフォレシス装置を前記哺乳動物の皮膚に接触又は付着させることをさらに含むことができる。

本発明の一具体例の美容方法において、前記イオントフォレシス装置は、可撓性電池、リチウムイオン二次電池、アルカリ電池、乾電池、水銀電池、リチウム電池、ニッケルカドミウム電池、及び逆電気透析（ｒｅｖｅｒｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ）電池から構成された群から選ばれた少なくとも１種の電池を含むか、前記少なくとも１種の電池が装着されたパッチ、マスクパック又はシートマスクを含むことができる。

本発明のもう一つの具体例は、前記薬学組成物の治療学的に有効な量を哺乳動物に投与するステップを含む、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療する方法を提供する。

本発明の皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療する方法において、前記哺乳動物はヒト、イヌ、ネコ、齧歯類、ウマ、ウシ、サル、又はブタであってもよい。

本発明の組成物は、皮膚炎の原因となる様々な炎症性サイトカイン及び炎症関連因子の生成を減少させ、炎症関連免疫細胞の活性ないしは関与を阻害して皮膚炎を予防、改善、緩和、又は治療することができる。

特に、本発明の組成物は、皮膚炎を引き起こす複数のサイトカイン標的に対して作用し、様々な原因に起因する皮膚炎に対する広範囲の適用が可能であり、効果的に皮膚炎を抑制及び緩和させることができる。また、本発明の組成物は、皮膚炎の軽症、中等度、重症の疾患進行程度によって発現様相が異なるサイトカインの標的を調節できるので軽症、中等度、重症の皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療に適用が可能であると期待される。さらに、本発明の組成物は、皮膚炎の急性、慢性などの発症様相によって発現様相が異なるサイトカインの標的を調節できるので、急性及び慢性皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療に適用が可能であると期待される。

したがって、本発明の組成物は、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用薬学組成物、皮膚外用剤、及び化粧料組成物として有用に使用することができる。

また、本発明は、高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一な脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを低価で大量に得ることができる。したがって、本発明は、機能的活性に優れた脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物を低価で大量に提供することができる。また、本発明の組成物は、スケールアップ（ｓｃａｌｅ−ｕｐ）が可能であり、ＧＭＰ（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）にも適している。

一方、前述のような効果によって、本発明の範囲が制限されるものではない。

本発明の一具体例により脂肪由来幹細胞培養液からエキソソームを製造する方法においてエキソソームを分離及び精製する過程を説明するフローチャートである。 本発明の一具体例により脂肪由来幹細胞培養液からエキソソームを製造するステップ（ｓｔｅｐ）別に溶液内に含まれているタンパク質の総量の割合（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示す。各ステップ別のタンパク質総量の割合は、幹細胞培養液全体に対するタンパク質総量の相対的な割合で示した。実験結果は、２つの異なるバッチから得られた結果をそれぞれ示した。 本発明の一具体例により得られたエキソソームの生産性（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）と純度（ｐｕｒｉｔｙ）を測定した結果を図示したものである。エキソソームの生産性は、「幹細胞培養液（ＣＭ）単位ｍＬ当り得られたエキソソームの粒子数」で計算し、エキソソームの純度は、「最終分画物に含まれているタンパク質の単位μｇ当りエキソソームの粒子数」で計算した。実験結果は、５つの異なるバッチ（ｂａｔｃｈ）から得られた結果を示した。 本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。ＴＲＰＳ（ｔｕｎａｂｌｅ ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ ｐｕｌｓｅ ｓｅｎｓｉｎｇ）分析による粒子サイズ分布と粒子数を示す。 本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。ＮＴＡ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）分析による粒子サイズ分布と粒子数を示す。 本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。ＴＥＭ（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）分析による粒子画像を倍率により図示した。 本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。本発明の一具体例によって得られたエキソソームのウエスタンブロットの結果を示す。 本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。本発明の一具体例によって得られたエキソソームに対するマーカー分析においてＣＤ６３及びＣＤ８１のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 トレハロース添加によって、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームが得られることを示す粒子サイズ分布に関するＮＴＡ分析結果を示す。添加されたトレハロースの量が増加するにつれて、単一のピークを有する粒子サイズ分布の結果を得ることができる。 トレハロース添加によって、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームが得られることを示す粒子サイズ分布に関するＮＴＡ分析結果を示す。添加されたトレハロースの量が増加するにつれて、単一のピークを有する粒子サイズ分布の結果を得ることができる。 トレハロース添加によって、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームが得られることを示す粒子サイズ分布に関するＮＴＡ分析結果を示す。添加されたトレハロースの量が増加するにつれて、単一のピークを有する粒子サイズ分布の結果を得ることができる。 本発明の一具体例によるエキソソームの製造過程でトレハロース添加の有無による粒子サイズ分布を示すＮＴＡ分析結果を示す。製造過程の全過程でトレハロースを添加した場合の結果を示す。 本発明の一具体例によるエキソソームの製造過程でトレハロース添加の有無による粒子サイズ分布を示すＮＴＡ分析結果を示す。細胞培養液を凍結保管し、解凍後、トレハロースを添加した場合の結果を示す。 本発明の一具体例によるエキソソームの製造過程でトレハロース添加の有無による粒子サイズ分布を示すＮＴＡ分析結果を示す。トレハロースを添加せずに製造した場合の結果を示す。 図６Ａ乃至図６Ｃの方法により分離したエキソソームの相対的な生産性（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）と相対的な濃度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を比較した結果を示した。 図６Ａ乃至図６Ｃの方法により分離したエキソソームの平均粒子サイズ（Ｍｅａｎ ｓｉｚｅ）を示した。 本発明の一具体例によるエキソソームによる、炎症反応の一種であるＮＯ形成の減少効果を確認した実験結果を示す。図７においてＰＢＳはリン酸緩衝塩類溶液 （ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）、ＤＥＸはデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、ＥＸＯはエキソソーム、ＣＭは脂肪由来幹細胞培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）、ＣＭ−ＥＸＯはエキソソームが除去された脂肪由来幹細胞培養液（ｅｘｏｓｏｍｅ−ｄｅｐｅｌｅｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）を示す。 本発明の一具体例により分離されたエキソソームによるＮＯ形成減少効果と、従来の沈殿法（ＰＰＴ）によって分離されたエキソソームによるＮＯ形成減少効果を比較した実験結果を示す。従来の沈殿法により分離されたエキソソームのＮＴＡ分析結果である。 本発明の一具体例により分離されたエキソソームによるＮＯ形成減少効果と、従来の沈殿法（ＰＰＴ）によって分離されたエキソソームによるＮＯ形成減少効果を比較した実験結果を示す。本発明の一具体例による方法によって分離精製されたエキソソームのＮＴＡ分析結果である。 本発明の一具体例により分離されたエキソソームによるＮＯ形成減少効果と、従来の沈殿法（ＰＰＴ）によって分離されたエキソソームによるＮＯ形成減少効果を比較した実験結果を示す。ＮＯ形成減少効果を比較図示したグラフである。ＮＯ形成の減少程度は陽性対照群であるデキサメタゾン（Ｄｅｘ）によるＮＯ形成の減少程度の相対比率（％）で表示した。 アトピーが誘発されたマウス（皮膚炎誘発動物モデル１）で、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した結果、アトピーの症状が緩和されたことを確認した結果を示す。 皮膚炎誘発動物モデル１に、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した後、皮膚損傷領域のサンプルで炎症性サイトカインであるＩＬ−４及びＩＬ−３１ ｍＲＮＡの変化量を確認したリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。 アトピーが誘発されたマウス（皮膚炎誘発動物モデル２）で、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した結果、エキソソームの用量依存的にアトピーの症状が緩和されたことを確認した結果を示す。 図１１の結果を数値化して比較したグラフである。 皮膚炎誘発動物モデル２に、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した後、皮膚損傷領域のサンプルで炎症性サイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−３１、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２３ ｍＲＮＡの変化量を確認したリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。 皮膚炎誘発動物モデル２に、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した後、血液中に存在する（Ａ）ＩｇＥ、（Ｂ）白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）、及び（Ｃ）好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）を測定して示したグラフである。 ＰＫＨ６７で染色されたエキソソームを確認した蛍光強度の測定結果を示す。 ブタ皮膚組織内部に、蛍光染色された本発明のエキソソームが伝達された程度を確認した蛍光顕微鏡画像である。蛍光染色された本発明のエキソソームを緩衝溶液に希釈してブタ皮膚表面に塗布し、一定時間経過後に確認した蛍光顕微鏡画像である。 マウス皮膚組織の内部に、蛍光染色された本発明のエキソソームが伝達された程度を確認した共焦点蛍光顕微鏡画像と、これから各画像上の蛍光強度を測定して得た総蛍光強度を比較して示したグラフである。図１９の上段は、蛍光染色された本発明のエキソソームを緩衝溶液に希釈してマウス皮膚表面に塗布し、一定時間経過後に確認した共焦点蛍光顕微鏡画像である。 ヒト皮膚繊維芽細胞であるＨＳ６８細胞に本発明の一具体例によるエキソソームを処理した後、細胞毒性がないことを確認した結果を示す。 本発明の一具体例によるエキソソームを含む組成物をヒトの皮膚（患部）に塗布した後、前記組成物が塗布された皮膚（患部）に微細電流を流すイオントフォレシスを行った結果、皮膚炎がひどい皮膚（患部）の紅斑などが著しく改善されたことを示す写真である。 自然発生重症アトピー性皮膚炎に苦しむシェットランド・シープドッグに本発明の一具体例によるエキソソームを皮下注射した結果、アトピーの症状が著しく改善されたことを示す写真である。

以下、本発明を下記の実施例でより詳細に記述する。ただし、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものに過ぎず、本発明の権利範囲を制限したり限定するものではない。本発明の詳細な説明及び実施例から、本発明が属する技術分野の通常の技術者が容易に類推できることは本発明の権利範囲に属するものと解釈される。本発明に引用された参考文献は、本発明に参考として統合される。

明細書全体で、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、これは特に反対となる記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含みうることを意味する。

実施例１：細胞の培養
マウスマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７は、韓国細胞株バンクから購入して培養した。細胞培養のために１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）及び１％抗生剤−抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）が含有されたＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）培地に５％ＣＯ_２、３７℃の条件で継代培養した。

ヒト皮膚繊維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）であるＨＳ６８細胞はＡＴＣＣから購入し、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）及び１％抗生剤−抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）が含有されたＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）培地に５％ＣＯ_２、３７℃の条件で継代培養した。

当該発明の属する技術分野で公知の細胞培養方法により、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で脂肪由来幹細胞を培養した。次に、リン酸緩衝塩類溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）で洗浄した後、無血清、無フェノールレッド培地に交換して、１日〜１０日間培養し、その上清（以下、培養液）を回収した。

エキソソームの分離過程で粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームを得るために培養液にトレハロースを２重量％添加した。トレハロースを添加した後、培養液を０．２２μｍフィルタでろ過して細胞残骸物、老廃物及び巨大粒子等の不純物を除去した。ろ過された培養液は、すぐに分離過程を経てエキソソームを分離した。また、ろ過された培養液は、冷蔵庫（１０℃以下）で保管した後、エキソソーム分離に使用した。また、ろ過された培養液は、−６０℃以下の超低温冷凍庫で凍結保管してから解凍した後、エキソソームの分離を行った。その後、培養液からタンジェント流ろ過装置（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ；ＴＦＦ）を用いて、エキソソームを分離した。

実施例２：ＴＦＦ法によるエキソソームの分離及び精製
実施例１で０．２２μｍフィルタでろ過された培養液からエキソソームを分離、濃縮、脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）をするためにＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）法を使用した。ＴＦＦ法を用いてエキソソームを分離、濃縮する前に培養液を超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）して潜在的なエキソソームの塊を解いた。ＴＦＦ法のためのフィルタとしては、カートリッジフィルタ（ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ｆｉｌｔｅｒ、別名ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｆｉｌｔｅｒ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）、又はカセットフィルタ（ｃａｓｓｅｔｔｅ ｆｉｌｔｅｒ；Ｐａｌｌ又はＳａｒｔｏｒｉｕｓ又はＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入）を使用した。ＴＦＦフィルタは、様々な分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ；ＭＷＣＯ）によって選択されてもよい。選択されたＭＷＣＯによって選別的にエキソソームを分離、濃縮し、ＭＷＣＯよりも小さい粒子やタンパク質、脂質、核酸、低分子化合物等は除去した。

エキソソームを分離、濃縮するためにＭＷＣＯ １００，０００Ｄａ（Ｄａｌｔｏｎ）、３００，０００Ｄａ、又は５００，０００ＤａのＴＦＦフィルタを使用した。培養液をＴＦＦ法を用いて１／１００〜１／２５程度の体積になるまで濃縮し、ＭＷＣＯよりも小さい物質は除去してエキソソームを分離した。

分離、濃縮されたエキソソーム溶液はＴＦＦ法を用いて、さらに脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行った。このとき、脱塩とバッファー交換は連続的に実行（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）又は断続的に実行（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）し、開始体積（ｓｔａｒｔｉｎｇ
ｖｏｌｕｍｅ）に対して少なくとも４倍、好ましくは６倍〜１０倍以上、より好ましくは１２倍以上の体積を有する緩衝溶液を用いて行った。緩衝溶液には、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームを得るためにＰＢＳに溶かした２重量％のトレハロースを添加した。トレハロース処理により、高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一なエキソソームを高収率で得ることができる効果を確認した結果は、図６Ａ〜図６Ｅに示した。

実施例３：分離されたエキソソームの特性の分析
分離されたエキソソーム、培養液、及びＴＦＦ分離過程の分画物におけるタンパク質の量は、ＢＣＡ発色法（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）、又はフルオロプロファイル（ＦｌｕｏｒｏＰｒｏｆｉｌｅ）蛍光法（Ｓｉｇｍａから購入）を用いて測定した。本発明の一具体例のＴＦＦ法によりエキソソームが分離、濃縮されてタンパク質、脂質、核酸、低分子化合物等が除去される程度は、タンパク質定量法によってモニタリングし、その結果を図２に示した。その結果、本発明の一具体例のＴＦＦ法によって非常に効果的に培養液に存在するタンパク質が除去されることが分かった。

本発明の一具体例のＴＦＦ法によりエキソソームを分離する場合、生産性と純度を独立した５つのバッチで比較した結果を図３に示した。独立した５つのバッチから得られた結果を分析した結果、本発明の一具体例のＴＦＦ法によって非常に安定的にエキソソームを分離できることを確認した。

分離されたエキソソームはナノ粒子トラッキング解析（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ：ＮＴＡ；Ｍａｌｖｅｒｎから購入）、又は可変抵抗パルス検出（ｔｕｎａｂｌｅ ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ ｐｕｌｓｅ ｓｅｎｓｉｎｇ：ＴＲＰＳ；Ｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅから購入）によって粒子のサイズと濃度を測定した。分離されたエキソソームの均一度とサイズは、透過型電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ
ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＴＥＭ）を用いて分析した。本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームのＴＲＰＳ、ＮＴＡ、ＴＥＭの分析結果は、図４Ａ〜図４Ｃに示した。

ＴＦＦ法でエキソソームを分離した後、トレハロースの添加の有無によるエキソソームのサイズ分布をＮＴＡ分析した結果を図５Ａ〜図５Ｃに示した。トレハロース濃度を０重量％、１重量％及び２重量％に増加させ（図５Ａ〜図５Ｃの上から下）、３回繰り返して実験した。トレハロースが存在しない場合、３００ｎｍ以上の大きさを有する粒子が確認されるのに対し、トレハロースの添加量を増やすと３００ｎｍ以上の大きさを有する粒子が減少し、エキソソームのサイズ分布が均一になることを確認した。

ＴＦＦ法でエキソソームを分離する過程でトレハロースの添加による効果をさらに調査した。図６Ａ〜図６Ｃに示すようにエキソソームの製造過程の全過程にＰＢＳに溶かした２重量％のトレハロースを添加した場合、均一のサイズ分布を有するエキソソームを得ることができた（図６Ａ）。一方、トレハロースを添加せずに凍結保存した培養液を使用するが、脱塩とバッファー交換の過程においてのみトレハロースを添加してＴＦＦ過程を進めた場合や、トレハロースを全く添加せずにＴＦＦ過程を進めた場合、サイズが大きい粒子が多く含まれる不均一なエキソソームを得た（図６Ｂ及び図６Ｃ）。

分離されたエキソソームの相対的な生産性と濃度を比較した結果、エキソソームの製造過程の全過程にトレハロースを添加した場合、非常に高い生産性でエキソソームを得ることができ、得られたエキソソームの濃度も５倍以上高かった（図６Ｄ）。ＮＴＡ分析の結果から示されたように、分離されたエキソソームの平均サイズもエキソソームの製造過程の全過程にトレハロースを添加した場合、２００ｎｍで均一に確認された（図６Ｅ）。

図４Ｄは、本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームに対してウエスタンブロットを行った結果として、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＴＳＧ１０１マーカーの存在を確認した。各マーカーに対する抗体には、それぞれ抗ＣＤ９（Ａｂｃａｍから購入）、抗ＣＤ６３（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）、抗ＣＤ８１（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）、及び抗ＴＳＧ１０１（Ａｂｃａｍから購入）を使用した。

図４Ｅは、本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームに対してフローサイトメトリーを用いて分析した結果としてＣＤ６３及びＣＤ８１マーカーの存在を確認した。ＣＤ６３に対して陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）であるエキソソームを分離するためにエキソソームヒューマンＣＤ６３分離／検出キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）をメーカーの方法に従って使用し、ＰＥ―マウス抗ヒトＣＤ６３（ＰＥ−Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ６３）（ＢＤから購入）及びＰＥ―マウス抗ヒトＣＤ８１（ＰＥ−ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ８１）（ＢＤから購入）を使用してマーカーを染色した後、フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。

前記の結果を総合すると、本発明の一具体例の分離方法は、タンジェント流ろ過を用いた分離及び／又は精製の過程でトレハロースを添加して、高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一なエキソソームを高収率で経済的で、かつ効率的に分離及び精製できることが確認できた。また、本発明の一具体例の分離方法の工程は、スケールアップが可能でありＧＭＰにも適合することが分かった。

実施例４：エキソソーム処理による細胞毒性の測定
ヒト皮膚繊維芽細胞であるＨＳ６８細胞で本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームの毒性を評価するために、細胞に濃度別にエキソソームを処理し、細胞の増殖率を確認した。ＨＳ６８細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに懸濁させた後、８０〜９０％の密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を有するように分株し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した。２４時間後、培養液を除去し、実施例２で準備されたエキソソームを濃度別に処理して、２４〜７２時間培養しながら細胞生存率を評価した。細胞生存率をＷＳＴ−１試薬（ＷＳＴ−１ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｔａｋａｒａから購入）、ＭＴＴ試薬（Ｓｉｇｍａから購入）、セルタイターグロ試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｐｒｏｍｅｇａから購入）、又はアラマールブルー試薬（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ ｒｅａｇｅｎｔ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）とマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓから購入）を用いて測定した。

比較群はエキソソームが処理されていない一般の細胞培養培地で培養された細胞数を基準にしており、試験された濃度範囲内で、本発明のエキソソームによる細胞毒性が示されないことを確認した（図２０）。

実施例５：マクロファージ細胞株を用いた炎症反応の測定
ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に懸濁させ、これをマルチウェルプレート（ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）の各ウェルに８０〜９０％の密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を有するように分株した。翌日ＬＰＳが含まれた新たな無血清培地に希釈した本発明のエキソソーム（実施例２で準備されたエキソソーム）を適正濃度で１〜２４時間処理して培養した。培養が終わった培養上清を取り、培養液中に存在する ＮＯを測定して炎症反応を確認した。培養液内の炎症反応は、ＮＯ検出キット（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（イントロンバイオもしくはプロメガから購入）を用いて測定した 。陽性対照群としてデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）（Ｓｉｇｍａから購入）を処理した。

図７に示すように、マウスのマクロファージであるＲＡＷ２６４．７細胞にＬＰＳ存在下で、本発明のエキソソームを処理した結果、ＬＰＳによって誘導される炎症反応であるＮＯ生成を濃度依存的に減少させることを確認した。このような結果は、本発明のエキソソームが皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療のために有用な機能的活性、すなわちＬＰＳにより誘導された炎症反応を減少させる活性を有し、本発明のエキソソームは皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療のための組成物の有効成分として有効に活用できることを強く示唆している。

実施例６：分離方法によるＮＯ形成の減少効果の比較
分離方法によるエキソソームのＮＯ形成の減少効果を比較するために、本発明の一具体例のＴＦＦ分離精製によって得られたエキソソーム以外に、従来の沈殿法によって分離されたエキソソームを準備した。沈殿法はメーカー（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプロトコルに基づいて実施した。従来の沈殿法によって分離されたエキソソーム（図８Ａ参照）は、本発明の一具体例のＴＦＦ法によって分離精製されたエキソソーム（図 ８Ｂ参照）と比較して、粒子サイズ分布の均一度が低く、様々なサイズを有することを確認した。また、図８Ｃに示すように、本発明の一具体例のＴＦＦ法によって分離精製されたエキソソームは、従来の沈殿法によって得られたエキソソームに比べてはるかに高いレベルでＮＯ形成を抑制することを確認した。このような結果は、本発明の一具体例により分離精製されたエキソソームが従来の方法により分離されたエキソソームに比べて、粒子サイズ分布の均一度とＮＯ形成抑制の面で優れていることを示している。

したがって、本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームは、従来の分離方法によって得られたエキソソームと比較して性能又は機能的活性（例えば、粒子サイズ分布の均一性、ＮＯ生成抑制、炎症反応の減少等）にはるかに優れ、このように機能的活性に優れた幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する本発明の組成物は、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療効果の面で従来技術よりもはるかに優れているといえる。

実施例７：皮膚炎誘発動物モデル
雄ＮＣ／Ｎｇａマウス（１６〜１８ｇ、５週齢；中央実験動物から購入）を購入して７日間の適応期を通じて本実験に使用した。適応期を経たマウスは皮膚炎誘発後、以下のようにそれぞれ５群に分類した。
（１）Ｎｏｒｍａｌ：正常対照群
（２）Ｖｅｈｉｃｌｅ（皮膚炎誘発群）：イエダニ抽出物により皮膚炎を誘発した陰性対照群
（３）ＩＶ：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に２．８μｇの用量で週３回ずつ２週間、血管内投与（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（４）ＳＣ：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に２．８μｇの用量で週３回ずつ２週間、皮下投与（ＳＣ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（５）Ｐｒｅｄ：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）を毎日経口投与した実験群
ＮＣ／Ｎｇａマウス（中央実験動物から購入）の耳介部分をカミソリで除毛した後、除毛剤を適量塗布して除毛した。除毛剤をふき取った後、ＡＤ誘発試薬（イエダニ抽出物；ＢｉｏＳｔｉｒ Ｉｎｃ．から購入）をマイクロピペットチップ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｐｅｔ
ｔｉｐ）を用いて、耳介部分に均一に塗布した。必要に応じてカミソリで除毛した後、４％ＳＤＳ水溶液１５０μＬをマイクロピペットチップ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｐｅｔ ｔｉｐ）を用いて、耳介部分に均一に塗布した。ドライヤーを用いて冷風で乾燥させた後、約２〜３時間自然乾燥させた後、ＡＤ誘発試薬をマイクロピペットチップ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｐｅｔ ｔｉｐ）を用いて耳介部分に均一に塗布した。すべての前処理は、１週間に２回、計３週間、６回の処理で行った。

実施例２で準備されたエキソソーム投与開始前の皮膚臨床指数の評価を実施して順位化したスコアに基づいて、各群の平均スコアが最大限均一に分布するように、ランダム法で分配して群を分離した。

図９Ａは、アトピーが誘発されたマウスの写真（Ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）と、本発明の一具体例によるエキソソーム処理（ＩＶ及びＳＣ）によるアトピー症状の緩和を示す写真である。図９Ｂは（２）〜（５）の各実験群のアトピー臨床スコアを図式化したグラフであり、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した群において、アトピー臨床スコアが改善されたことを確認した。また、図９Ｃは、（２）〜（５）の各実験群で測定された耳の厚さを（１）の正常群と比較して相対的な変化量を示したグラフであり、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した群で、耳の厚さが減少したことを確認した。

まとめると、前記の実験を通じて、本発明のエキソソームが処理された群（ＩＶ及びＳＣの両方）において、皮膚臨床指数と耳の厚さが減少されたことを確認した。

実施例８：皮膚炎誘発動物モデル２
エキソソームの用量依存的な効果を確認するために、実施例７と同様に、皮膚炎を誘発した後、以下のように９群に分類した。
（１）Ｎｏｒｍａｌ：正常対照群（図１１で「Ｎ」と表記）
（２）Ｃｏｎｔｒｏｌ（皮膚炎誘発群）：イエダニ抽出物により皮膚炎を誘発した陰性対照群（図１１で「Ｃ」と表記）
（３）ＩＶ、Ｌ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｌｏｗ）：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に０．１４μｇの用量で週３回ずつ４週間、血管内投与（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（４）ＩＶ、Ｍ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｍｅｄｉｕｍ）：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に１．４μｇの用量で週３回ずつ４週間、血管内投与（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（５）ＩＶ、Ｈ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｈｉｇｈ）：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に１０μｇの用量で週３回ずつ４週間、血管内投与（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（６）ＳＣ、Ｌ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｌｏｗ）：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に０．１４μｇの用量で週３回ずつ４週間、皮下投与（ＳＣ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（７）ＳＣ、Ｍ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｍｅｄｉｕｍ）：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に１．４μｇの用量で週３回ずつ４週間、皮下投与（ＳＣ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（８）ＳＣ、Ｈ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｈｉｇｈ）：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に１０μｇの用量で週３回ずつ４週間、皮下投与（ＳＣ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（９）Ｐｒｅｄ：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）を毎日経口投与した実験群（図１１で「Ｐ」と表記）

皮膚炎誘発は実施例７と同様に行い、ＡＤ誘発試薬を過量に塗布してエキソソームを投与する時点で平均皮膚臨床指数が９になるようにした。実施例２で準備されたエキソソーム投与開始前の皮膚臨床指数の評価を実施して順位化したスコアに基づいて、各群の平均スコアが最大限均一に分布するように、ランダム法で分配して群を分離した。

図１１の上段（上から一番目及び二番目）は、アトピーが誘発されたマウスの写真（０日目）と、本発明の一具体例によるエキソソーム処理により用量依存的にアトピーの症状が緩和されたこと（２８日目）を示す写真である。図１２Ａは（２）〜（９）の各実験群のアトピー臨床スコアの相対的改善度を図式化したグラフであり、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した群（ＩＶ及びＳＣ）で用量依存的にアトピー臨床スコアが改善されたことを確認した。

図１１の中段（上から三番目及び四番目）は、耳の皮膚組織の切片（ｓｅｃｔｉｏｎ）を、Ｈ＆Ｅ及びトルイジンブルーで染色した結果である。犠牲にしたマウスの耳の皮膚組織をＨ＆Ｅで染色した後、耳の皮膚組織の厚さを測定した。図１２Ｂは（２）〜（９）の各実験群で測定された耳の皮膚組織の厚さを（１）の正常群と比較して示したグラフであり、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した群（ＩＶ及びＳＣ）で耳の皮膚組織の厚さが用量依存的に減少したことを確認した。また、犠牲にしたマウスの耳の皮膚組織をトルイジンブルーで染色した後、炎症細胞の一種であるマスト細胞の流入の程度を測定した。図１２Ｃは（２）〜（９）の各実験群で測定されたマスト細胞の数を（１）の正常群と比較して示したグラフであり、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した群（ＩＶ及びＳＣ）でマスト細胞の流入が用量依存的に減少したことを確認した。

図１１の下段（上から五番目及び六番目）は、犠牲にしたマウスの耳の皮膚組織を抗−ＣＤ８６抗体及び抗−ＣＤ２０６抗体で免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）をした結果である。正常な皮膚では発見されず、アトピー性皮膚炎の病変に豊富に存在する炎症性樹状表皮細胞（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ；ＩＤＥＣｓ）は、その表面にＣＤ８６抗原及びＣＤ２０６抗原を発現することが知られている（非特許文献３、 非特許文献４）。したがって、アトピー性皮膚炎の病変内ＣＤ８６＋細胞数及びＣＤ２０６＋細胞数を測定すると皮膚炎の症状の改善程度を判断することができる。

犠牲にしたマウスの耳の皮膚組織切片を抗−ＣＤ８６抗体及び抗−ＣＤ２０６抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）をした後、ＣＤ８６＋細胞数及びＣＤ２０６＋細胞数を測定した。図１２Ｄ及び図１２Ｅは（２）〜（９）の各実験群で測定されたＣＤ８６＋細胞数及びＣＤ２０６＋細胞数を（１）の正常群と比較して示したグラフであり、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した群（ＩＶ及びＳＣ）でＣＤ８６＋細胞数及びＣＤ２０６＋細胞数が用量依存的に減少したことを確認した。このような結果は、アトピー性皮膚炎の病変内の炎症性樹状表皮細胞の浸潤が減少し、皮膚炎の症状が緩和ないしは改善されたことを示唆している。

まとめると、前記実験により、本発明のエキソソームが処理された群（ＩＶ及びＳＣの両方）で用量依存的に皮膚臨床指数、耳の皮膚組織の厚さ、マスト細胞の流入、及び炎症性樹状表皮細胞の浸潤が減少されたことを確認した。

実施例９：サイトカインｍＲＮＡ発現量の測定
犠牲にしたマウスの皮膚の損傷部位の組織を粉砕して得られた総ＲＮＡからｃＤＮＡを製造してリアルタイムＰＣＲ法を用いて、皮膚炎の主な原因となる様々な炎症性サイトカインｍＲＮＡの変化量を測定した。ＩＬ−４、ＩＬ−３１、ＩＬ−２３及びＴＮＦ−αの遺伝子を定量するための標準遺伝子としてＧＡＰＤＨ遺伝子を使用した。リアルタイムＰＣＲに使用したプライマーの種類と配列は下記表１の通りである。

前記動物モデル１の実験を通じて、本発明のエキソソームが処理された群（ＩＶ及びＳＣの両方）で皮膚炎の原因となる炎症関連サイトカインであるＩＬ−４及びＩＬ−３１のｍＲＮＡ発現量がすべて減少することを確認した（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。また、前記動物モデル２の実験を通じて、本発明のエキソソームが処理された群（ＩＶ及びＳＣの両方）で皮膚炎の原因となる様々な炎症関連サイトカイン、すなわちＩＬ−４、ＩＬ−３１、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２３のｍＲＮＡ発現量がすべて用量依存的に減少することを確認した（図１３Ａ〜図１３Ｄ）。

本発明のエキソソームが処理された群は、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）及びプレドニゾロン処理群に比べて用量依存的にＩＬ−４、ＩＬ−３１、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２３のｍＲＮＡ発現量をすべて減少させたが、これらの炎症関連サイトカインは、皮膚炎関連治療剤の開発のための主要標的である。これら複数の標的に対する発現量の減少は、皮膚炎の抑制及び緩和と関連している。ＩＬ−４は、ＩｇＥへのアイソタイプクラススイッチング（ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）を開始し、好酸球を活性化させる。また、ＩＬ−３１は、ＩｇＥへのアイソタイプクラススイッチング（ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）に影響を与え、炎症性細胞が皮膚に集まるようにし、増加したＩＬ−３１は皮膚炎の悪化と関連があることが知られている。ＩＬ−２３は、Ｔｈ０タイプのＴ細胞をＴＮＦ−αを生成する病原性ヘルパーＴ細胞に分化させ、ＴＮＦ−αは血漿中の濃度が高ければ皮膚炎の悪化と関連があることが知られている。このような点を総合的に考慮すると、本発明のエキソソームは皮膚炎の主な原因となる複数のサイトカインの発現を抑制し、炎症反応を調節すると判断される。

したがって、本発明のエキソソームは皮膚炎を引き起こす様々な炎症性サイトカインの標的（すなわち、ＩＬ−４、ＩＬ−３１、ＩＬ−２３、及びＴＮＦ−α）に対して作用し、様々な原因に起因する皮膚炎に対する広範囲の適用が可能であり、効果的に皮膚炎を抑制及び緩和させることができると期待される。

実施例１０：血液分析
犠牲にしたマウスの血液から血漿を分離して、血中の免疫グロブリンＥ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ；ＩｇＥ）の濃度をＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを用いて測定した。前記実験を通じて、実施例２で準備されたエキソソームが処理された群でエキソソームの用量依存的に血中ＩｇＥレベルが減少したことを確認した（図１４Ａ）。

また、犠牲にしたマウスの全血を用いて血中の細胞の数を測定した。サイトスピン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）を用いて、一定量の全血細胞を１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、スライド乾燥させてからＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋ染色を行い、その後、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）及び好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）の数を測定した。前記実験を通じて、実施例２で準備されたエキソソームが処理された群でエキソソームの用量依存的に血中白血球及び好酸球の数が減少することを確認した（図１４Ｂ及び図１４Ｃ）。

前記のような結果から、本発明の組成物は、皮膚炎の原因となる炎症反応因子である血中ＩｇＥレベルを減少させるだけでなく、血中白血球及び好酸球の数を減少させ、また、様々な炎症性サイトカイン及び炎症関連因子の生成を減少させ、炎症関連免疫細胞の活性ないしは関与を阻害することがわかり、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用薬学組成物、皮膚外用剤及び化粧料組成物として有用に使用することができる。

実施例１１：本発明のエキソソームの皮膚透過能力試験
蛍光染色されたエキソソームを製造するためにＰＫＨ６７染料（Ｓｉｇｍａから購入）を使用した。１ｍＭのＰＫＨ６７をＤｉｌｕｅｎｔ Ｃ（Ｓｉｇｍａから購入）に希釈して、１０μＭのＰＫＨ６７溶液を製造した後、適正濃度のエキソソーム溶液と混合して、常温で光を遮断した状態で１０分間反応させた。反応が終わった後、ＰＫＨ６７で染色されたエキソソーム（以下、「ＰＫＨ−エキソソーム」と略称）から残りのＰＫＨ６７染料を除去するためにＭＷ３０００スピンカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）を使用した。蛍光測定器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓから購入）を用いて確認した結果、エキソソームと反応しないＰＫＨ６７を除去した後、ＰＫＨ−エキソソームで十分な強度の蛍光が検出されることを確認した（図１５）。

ＰＫＨ−エキソソームを適正濃度、例えば１×１０^５粒子／ｍＬ〜１×１０^９粒子／ｍＬの濃度でリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）に分散させた後、ブタ皮膚組織の皮膚外側面に塗布した。塗布されたＰＫＨ−エキソソームの乾燥を防ぐために不織布を被せた後、適正時間、例えば３０分〜１時間反応させ、ＰＫＨ−エキソソームが皮下組織に伝達されるようにした。反応が終了した後、ブタ皮膚組織を３．７％ホルムアルデヒド溶液に浸し、一晩反応させ、リン酸緩衝塩類溶液で５分間ずつ３回洗浄した。洗浄されたブタ皮膚組織を３０％スクロース溶液に浸して処理した後、ＯＣＴ化合物を処理した。再びリン酸緩衝塩類溶液で５分間ずつ３回洗浄した後、ミクロトームを用いて縦断面で切片を作製し、スライドガラス上に組織切片を位置させた。一方、組織切片の作製は、ホルムアルデヒド溶液で組織を固定する前に行うこともできる。組織切片でＰＫＨ−エキソソームから検出される蛍光は、蛍光顕微鏡を用いて観察した。以上の方法でブタ皮膚組織の表皮を透過して皮下組織に伝達されたＰＫＨ−エキソソームを確認した（図１６）。図１６で確認されるように、本発明のエキソソームは皮膚バリアを効果的に通過して皮膚組織の内部に深く伝達でき、皮膚に対して効果的に吸収される。したがって、前記エキソソームを有効成分として含有する皮膚外用剤又は化粧料組成物は、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療などにおいて、効果的に作用すると期待される。

次に、ヘアレスマウスの皮膚組織を摘出してフランツ拡散セル（Ｆｒａｎｚ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ｃｅｌｌ）のチャンバの上部に位置させた。このとき、拡散セルの内部はリン酸緩衝塩類溶液で満たされた。ＰＫＨ−エキソソームを適正濃度、例えば１×１０^５粒子／ｍＬ〜１×１０^９粒子／ｍＬの濃度でリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）に分散させた後、マウスの皮膚組織の外側に塗布した。このとき、ＰＫＨ−エキソソームの乾燥を防ぐために不織布をマウスの皮膚組織の外側に予め位置させ、不織布と皮膚組織の間にＰＫＨ−エキソソームを注入した。その後、３０分〜１時間反応させた。反応が終わった後、すぐに共焦点蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ＳＰ８Ｘ）を用いて皮膚組織の内部に伝達されたＰＫＨ−エキソソームを確認し、１時間〜６時間、皮膚組織とＰＫＨ−エキソソーム溶液をさらに反応させた後、共焦点蛍光顕微鏡でＰＫＨ−エキソソームを確認した。以上の方法で確認した結果、本発明のエキソソームは皮膚バリアを効果的に通過して皮膚組織の内部に深く伝達でき、皮膚に効果的に吸収される（図１７）。

したがって、前記エキソソームを有効成分として含有する皮膚外用剤又は化粧料組成物は、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療などにおいて、効果的に作用すると期待される。

実施例１２：ヒト皮膚に対するエキソソームを有効成分として含む組成物の処理
本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームを含有する組成物（エキソソームを含む懸濁液）を、重症アトピー患者３人の患部（手、首、腕など）に１〜２週間週３回にわたり塗布した後、イオントフォレシス装置を使用して、前記組成物が塗布された患部に微細電流を流すイオントフォレシスを行った。その結果、患者の激しいかゆみが著しく緩和され、皮膚炎に関連する紅斑の症状も顕しく改善された（図１９）。本発明のエキソソームを含有する組成物を適用した患者全員が激しいかゆみや皮膚炎に関連する紅斑の症状が緩和され、ステロイドや抗ヒスタミン製剤の処方を中止してもよい程度に症状が改善された。

したがって、本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームを有効成分として含有する皮膚外用剤又は化粧料組成物は、前記のような臨床試験で確認されるように、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療効果を示すことがわかる。

実施例１３：イヌ科動物に対するエキソソームを有効成分として含む組成物の処理
自然に発生した重症アトピー性皮膚炎に苦しむシェットランド・シープドッグ（Ｓｈｅｔｌａｎｄ Ｓｈｅｅｐｄｏｇ）（体重１３ｋｇ、９年齢）を対象に実験を行った。本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソーム（実施例２で準備されたエキソソーム）を含有する組成物を、自然発生重症アトピー性皮膚炎に苦しむシェットランド・シープドッグに５週間の合計１２回にわたって皮下注射した。１回の注射の際、実施例２で準備されたエキソソームを個体ごとに１１７μｇの用量で注射した。１週目及び２週目には、週に３回皮下注射し、３週目、４週目、５週目には、週に２回皮下注射した。そして、本発明のエキソソーム投与後、他の薬物の投与を中止した。

図２０Ａは、本発明のエキソソームを投与する前の患部の写真であり、腹部に紅斑と炎症がひどいことがわかる。本発明のエキソソーム投与後３日目から皮膚炎の症状が著しく改善され（図２０Ｂ）、投与後１０日目（図２０Ｃ）及び投与後２週目（図２０Ｄ）は、皮膚炎がほとんど消えたことが確認できた。また、本発明のエキソソーム投与後、実験対象であるシェットランド・シープドッグの活力が明確に増加し、体重が１６ｋｇに増加した。このような活力増加及び体重増加は、皮膚炎の症状の改善に起因したものと判断される。

本発明のエキソソームの皮膚炎の治療効果が持続するか否かを確認するために、本発明のエキソソーム投与終了後、実験対象であるシェットランド・シープドッグの患部を継続的に観察した。その結果、投与終了後５０日目（図２２Ｅ）及び９３日目（図２２Ｆ）にも皮膚炎の症状改善効果が持続されたことが確認できた。

したがって、本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームを有効成分として含有する組成物は、前記のようなイヌ科動物に対する動物実験で確認されるように、皮膚炎を効果的に緩和ないしは改善させることができ、皮膚炎の治療効果が持続的に維持される。

実施例１４：本発明のエキソソームを含む化粧料組成物の製造
前記実施例２で準備された１７０４μｇ／ｍＬの濃度のエキソソームを下記表２に記載された成分と混合して懸濁した後、化粧料組成物（ローション）を製造した。各成分の含有量は下記表２の通りである。

以上、本発明を前記実施例を挙げて説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者であれば、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく修正、変更をすることができ、このような修正と変更も本発明に属するものであることがわかるであろう。

本発明は、脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物の皮膚炎の改善の用途に関する。

また、本発明は、前記組成物を含む皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用薬学組成物、皮膚外用剤及び化粧料組成物に関する。

さらに、本発明は、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療において臨床的適用が可能な高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一な脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを大量に得ることができ、このように得られた機能的活性に優れた脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物を低価で大量に提供することができる臨床的及び商業的に優れた技術に関する。

人体の皮膚は、物理的、化学的に外部から身体を保護すると同時に、全身の代謝に必要な生化学的機能を実行する器官である。一般的に、人の皮膚に現れる炎症性皮膚疾患を皮膚炎という。比較的に多い皮膚炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）としては、アトピー性皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、接触性皮膚炎（ｃｏｎｔａｃｔ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、脂漏性皮膚炎（ｓｅｂｏｒｒｈｅｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）などがある。

接触性皮膚炎は、外部物質との接触によって発生する皮膚炎である。接触性皮膚炎は、発生する機序により刺激性接触性皮膚炎及びアレルギー性接触皮膚炎があり、一つの物質が、このような２つの反応を同時に起こすことがある。接触性皮膚炎を引き起こす物質のほとんどは有機化合物である。このような物質に感作された皮膚に再度皮膚炎誘発物質が接触すると、記憶細胞がこれを感知して、複数の化学物質が分泌され、炎症を起こすことが知られている。

アトピー性皮膚炎は、かゆみや湿疹性病変が特徴である慢性炎症性皮膚疾患である。これまでの研究結果によると、アトピー性皮膚炎の発症には、様々な因子が関与することが知られている。アトピー性皮膚炎が誘発される場合、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ）、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）及び肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）のような炎症に関連細胞が病変部位で観察され、肥満細胞から生成された免疫グロブリンＩｇＥが増加する。また、Ｔ細胞の異常増殖が現れるが、この過程で炎症性サイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等が増加して免疫反応を増幅させる。最近では、ＴＳＬＰ（Ｔｈｙｍｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）が皮膚炎の重症度と関連しており、アトピー性皮膚炎で現れるかゆみ症状の原因であると分かった。また、脂漏性皮膚炎は、皮脂腺の活動が増加して皮脂の分泌が盛んな頭皮と顔、その中でも眉、鼻、唇の周り、耳、脇の下、胸、鼠径部などに発生する慢性炎症性皮膚疾患である。

このような研究結果をもとに、炎症及び免疫抑制を介して皮膚炎治療剤を開発しようとする努力がある。現在までに開発された皮膚炎の治療剤としては、ステロイド、抗ヒスタミン剤、及びシクロスポリンＡのような免疫抑制剤などがある。しかし、これらの薬剤は、皮膚萎縮、血管拡張、色素脱失、注射部位の過敏反応、耐性及び好中球減少症（ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ）などの深刻な副作用を引き起こす問題がある。また、これらの薬剤は、根本的な治療というよりは、症状を適切なレベルに調節するのを助けるという限界もある。

このような問題点を勘案して天然物を用いた皮膚炎治療剤に関する研究が活発である。このような天然物を原料とする皮膚炎治療剤の場合、天然抽出物内の有効成分の含有量が少ない関係で皮膚炎治療効果を得るためには、大量の使用が必要であり、これらの大部分は、天然物素材という点をマーケティングに活用しているだけであり、皮膚炎治療の実質的効能については、科学的な研究がもっと必要な状況である。

一方、幹細胞を用いた皮膚再生及び治療方法が提案されている。胚性幹細胞又は胎児組織由来幹細胞は、分化能及び再生治療能力に優れており、拒否反応が少ないが、倫理的な問題で臨床に適用することができず、腫瘍を形成する危険性がある。これに対する代案として、成体幹細胞を用いる皮膚再生及び治療方法が提案された。しかし、患者自身の成体幹細胞でなく他人の成体幹細胞を用いた場合、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ）を引き起こす危険性があり、自己成体幹細胞を用いて治療をするためには、患者から成体幹細胞を採取した後、これを培養する過程が必要で、複雑で費用が多くかかるという問題がある。

最近では、前述のような幹細胞の問題点を勘案して成体幹細胞を培養して得られた培養液を用いて、皮膚再生及び治療をしようとする試みがある。しかし、成体幹細胞の培養液には、成体幹細胞が分泌する様々なタンパク質、サイトカイン、成長因子などが含まれているのに対し、細胞が成長して分泌された老廃物、汚染防止のために添加された抗生剤、動物由来の血清等の成分も含まれているので、皮膚に使用する場合、様々な危険にさらされる可能性が高い。

最近、細胞分泌物（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）に細胞の行動（ｂｅｈａｖｉｏｒ）を調節する様々な生体活性因子が含まれているという研究が報告されており、特に細胞分泌物内には細胞間シグナル伝達機能を有する「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」が含まれており、その成分と機能に対する研究が活発に進められている。

細胞は、細胞外環境に様々な膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）タイプの小胞体を放出するが、通常、このような放出小胞体を細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＥＶｓ）と呼んでいる。細胞外小胞は、細胞膜由来小胞体、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅｓ）、シェディング小胞体（ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、マイクロパーティクル（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、エキソソーム等と呼ばれており、場合によっては、エキソソームとは区別されて用いられることもある。

エキソソームは細胞膜の構造と同じ二重リン脂質膜からなる数十ないし数百ナノメートルの大きさの小胞体で内部にはエキソソームカーゴ（ｃａｒｇｏ）と呼ばれるタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）などが含まれている。エキソソームカーゴには、広範囲のシグナル伝達要素（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）が含まれており、これらのシグナル伝達要素は、細胞タイプに特異的で分泌細胞の環境に応じて異なるように調節されることが知られている。エキソソームは細胞が分泌する細胞間のシグナル伝達媒体で、これにより伝達された様々な細胞シグナルは、標的細胞の活性化、成長、移動、分化、脱分化、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を含む細胞の行動を調節すると知られている。エキソソームは由来した細胞の性質及び状態に応じて特異的な遺伝物質と生体活性因子が含まれている。増殖する幹細胞由来のエキソソームの場合、細胞の移動、増殖及び分化のような細胞行動を調節し、組織再生に関する幹細胞の特性が反映されている（非特許文献１）。

しかし、エキソソームを用いた一部疾患の治療に対する可能性の提示など、様々な研究が行われているにもかかわらず、より綿密な臨床及び非臨床研究が必要であり、特にエキソソームが作用する様々な標的を科学的に究明してエキソソームを様々な疾患の治療に応用できる技術の開発が必要な実情である。

本発明者らは、かゆみ及び炎症を伴う皮膚炎と関連して、従来知られている皮膚炎治療剤に比べて効果が優れ、安全な治療剤を開発しようと努力した。そこで、本発明者らは、脂肪由来幹細胞由来のエキソソームの新たな用途について鋭意研究を重ねていたところ、脂肪由来幹細胞培養液から分離されたエキソソームが前述したような幹細胞自体や幹細胞培養液の安全性の問題を解決することができ、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療に効果的であることを確認して、本発明を完成した。

一方、前記した背景技術として説明された事項は、本発明の背景に対する理解を進めるためのものであり、本発明の「先行技術」として利用されうるという承認として引用したものではないことを理解しなければならない。

Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 ２００２（２）５６９−５７９ Ｖａｓｉｌｉｙ Ｓ． Ｃｈｅｒｎｙｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．， "Ｓｉｚｅ ａｎｄ ｓｈａｐｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒａｔｅｄ ａｎｄ ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ"， Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ， （２０１５） ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００２１６−０１５−８５３５−３ Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ２００２； １１８： ３２７−３３４ Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ． ２００１； ２９３：４４８−４５４

本発明の目的は、脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物の皮膚炎の改善の用途を提供することにある。特に、本発明の目的は、皮膚炎を引き起こす複数のサイトカイン標的に対して作用し、様々な原因に起因する皮膚炎に対する広範囲の適用が可能であり、効果的に皮膚炎を抑制及び緩和させることができる組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記組成物を含む皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用薬学組成物、皮膚外用剤、及び化粧料組成物を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一な脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを大量に得ることができ、このように得られた機能的活性に優れた脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、前記組成物を用いて、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療する方法を提供することにある。

本発明のさらなる目的は、前記組成物を用いて、治療用を除く哺乳動物の皮膚の状態を調節する美容方法を提供することにある。

しかし、前述したような本発明の課題は例示的なものであり、これにより本発明の範囲が制限されるものではない。また、本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってより明確になる。

前記のような目的を達成するために、本発明は、脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用組成物を提供する。

また、本発明は、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療において臨床的適用が可能な高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一な脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを大量に得ることができ、このように得られた機能的活性に優れた脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物を低価で大量に提供することができる臨床的及び商業的に優れた新規な技術を提供する。

本明細書において、用語「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）」は、細胞膜の構造と同じ二重のリン脂質膜からなる数十ないし数百ナノメートル（好ましくは約３０〜２００ｎｍ）サイズの小胞体を意味する（ただし、分離対象となる幹細胞の種類、分離方法及び測定方法に従って、エキソソームの粒子サイズは可変でありうる）（非特許文献２）。エキソソームにはエキソソームカーゴ（ｃａｒｇｏ）と呼ばれるタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）等が含まれている。エキソソームカーゴには広範囲のシグナル伝達要素（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）が含まれており、これらのシグナル伝達要素は、細胞タイプに特異的で分泌細胞の環境に応じて異なるように調節されることが知られている。エキソソームは細胞が分泌する細胞間のシグナル伝達媒体であり、これにより伝達された様々な細胞シグナルは、標的細胞の活性化、成長、移動、分化、脱分化、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を含む細胞の行動を調節すると知られている。

本明細書において、用語「イオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」は、有効物質が適用された皮膚に微細電流を流して電位差を与え、皮膚の電気的環境を変化させることによりイオン化した有効成分を電気的反発力で皮膚を透過させる方法を意味する。本発明の一具体例に用いられるイオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）は、皮膚上の電極パッチに外部電源からの電流が流れ込み、皮膚に微細電流が導入される方式、電極パッチ自体にバッテリーが装着されて、皮膚に微細電流が導入される方式、高濃度電解質溶液及び低濃度電解質溶液との間のイオン濃度差により電流を発生させる逆電気透析（Ｒｅｖｅｒｓｅｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ）手段が装着されたパッチを介して皮膚に微細電流が導入される方式などを含んでもよい。しかし、本発明はこれに限定されるものではなく、様々な方式のイオントフォレシスを用いることができるのは言うまでもない。

脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを用いた、限定的なシワ改善及び皮膚再生効果が報告されている。そして脂肪由来幹細胞でなく神経幹細胞由来のエキソソームが脳損傷の治療、幹細胞の移植拒否による炎症疾患の治療に効果があるという報告があったが、現在まで脂肪由来幹細胞培養液から分離精製されたエキソソームを使用するとき、「皮膚炎の治療等」に効果があるものについては公知されたところはなかった。

現在までに大量培養が可能な脂肪由来幹細胞を培養した後、脂肪由来幹細胞培養液から大量に経済的に分離精製されたエキソソームを皮膚炎治療に臨床的に適用可能に具現した治療剤は開発されたことがない。脂肪由来の脂肪由来幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は、脂肪吸引術のような簡単な施術により大量に入手可能であり、骨髄、臍帯又は臍帯血などに比べて約４０倍程度の幹細胞があり、商業的には最も原価が安く生産量が多いが、脂肪内に細胞残骸物、老廃物、タンパク質及び巨大粒子のような不純物が多く、脂肪由来幹細胞培養液から高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一なエキソソームを経済的で大量に分離することは難しい。したがって、経済性の面で脂肪由来幹細胞培養液から高純度の粒子サイズ分布が均一なエキソソームを大量に分離することは、技術的な障壁があるといえる。

本発明の組成物は、注射剤のような薬学組成物、又は皮膚外用剤として適用されるとき、有効成分として含有された脂肪由来幹細胞由来のエキソソームが皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療に有意な効果を示し、幹細胞自体や幹細胞培養液の安全性の問題を解決することができる。したがって、本発明の皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用組成物に含まれる脂肪由来幹細胞由来のエキソソームは、従来の公知の制限的なシワ改善及び皮膚再生とは全く異なるメカニズムで皮膚炎を改善、緩和、ないしは治療し、このような効能は、従来技術からは全く予測できないものであることを明らかにしておく。

本発明の一具体例の皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用組成物は、脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む。

本発明の一具体例の組成物において、前記エキソソームは次のステップを実行して得ることができる：（ａ）脂肪由来幹細胞培養液にトレハロースを添加するステップ、（ｂ）前記トレハロースが添加された脂肪由来幹細胞培養液をろ過するステップ、（ｃ）ろ過された前記脂肪由来幹細胞培養液から、ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いてエキソソームを分離するステップ、及び（ｄ）脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に使用される緩衝溶液にトレハロースを添加し、前記トレハロースが添加された緩衝溶液を用いたＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ
Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて、分離された前記エキソソームに対する脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行うステップ。

本発明の一具体例の組成物において、前記（ｄ）ステップで脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に使用される緩衝溶液にトレハロースを添加すると、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームを効果的に得ることができる（図６Ａ乃至図６Ｅ参照）。

一方、本発明においてトレハロースは、細胞残骸物、老廃物、タンパク質及び巨大粒子のような不純物に対してエキソソームを効率的に分別できる機能を付与する。

本発明の一具体例の組成物において、前記脱塩とバッファー交換は連続的又は断続的に行うことができる。開始体積（ｓｔａｒｔｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ）に対して少なくとも４倍、好ましくは６倍乃至１０倍以上、より好ましくは１２倍以上の体積を有する緩衝溶液を用いて脱塩とバッファー交換を行うことができる。

本発明の一具体例の組成物において、ＴＦＦのためにＭＷＣＯ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）１００，０００Ｄａ（Ｄａｌｔｏｎ）、３００，０００Ｄａ、５００，０００Ｄａ又は７５０，０００ＤａのＴＦＦフィルタ、又は０．０５μｍ ＴＦＦフィルタを使用することができる。

本発明の一具体例の組成物において、前記（ｃ）のステップは、ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて１／１００乃至１／２５の体積まで濃縮する過程をさらに含むことができる。

本発明の一具体例の組成物において、前記エキソソームは、皮膚組織又は皮膚細胞でＩＬ−４及びＩＬ−３１の発現量を減少させることを特徴とする。さらに、前記エキソソームは、皮膚組織又は皮膚細胞において、ＩＬ−２３又はＴＮＦ−αのうち少なくとも一つの発現量を減少させることができる。

本発明の一具体例の組成物において、前記エキソソームは血中ＩｇＥのレベルと、血中白血球及び好酸球の数を減少させることができる。

本発明の一具体例の組成物において、前記エキソソームは皮膚組織で肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）、ＣＤ８６＋細胞及びＣＤ２０６＋細胞の数を減少させることができる。

本発明の一具体例の組成物において、前記脂肪由来幹細胞の種類は、病原体による感染の危険性がなく、免疫拒否反応を起こさないものであれば制限されないが、ヒト脂肪由来幹細胞であることが好ましい。

本発明の一具体例の組成物は、かゆみを伴う様々な皮膚炎の予防、改善、緩和又は治療に効果的に用いることができ、接触皮膚炎、刺激性接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、光毒性及び光アレルギー性接触皮膚炎、接触蕁麻疹症候群、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、自家感作性皮膚炎、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、うっ滞性皮膚炎、にきび、又は湿疹に用いることができ、アトピー性皮膚炎、にきび、又は湿疹に使用することがより好ましい。

本発明の一具体例の組成物は、薬学組成物として製造することができる。本発明の一具体例の組成物が薬学組成物として製造される場合、本発明の一具体例による薬学組成物は、経口又は非経口の様々な剤形であってもよい。

本発明の一具体例の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤等を含むことができる。前記担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、トレハロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース（ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油などを挙げることができ、これに限定されない。本発明の一具体例の薬学組成物は、通常の方法によって散剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、エマルジョン、シロップ、顆粒剤、エリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒｓ）、エアロゾルなどの経口投与用製剤、外用剤、坐剤、又は滅菌注射溶液の形態に製剤化して使用することができる。

本発明の一具体例の薬学組成物の投与は、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記薬学組成物の投与経路は、薬物が目的の組織に到達することができる限り、いかなる一般的な経路を通じて投与することができる。例えば、本発明の一具体例の薬学組成物は、経口又は非経口投与することができ、非経口投与には、経皮投与、腹腔内投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、局所投与、直腸内投与などを挙げことができる。しかし、これに制限されるものではなく、当業界で知られている様々な投与方法を排除しない。また、本発明の一具体例の薬学組成物は、活性物質が標的組織又は細胞に移動することができる任意の装置によって投与することができる。また、本発明の一具体例の薬学組成物の有効量は、疾患の治療効果を期待するために投与に要求される量を意味する。

本発明の一具体例の薬学組成物の非経口投与用製剤は、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、又は坐剤であってもよい。本発明の一具体例の薬学組成物の非経口投与用製剤は、注射剤として製造されてもよい。本発明の一具体例の注射剤は、水性注射剤、非水性注射剤、水性懸濁注射剤、非水性懸濁注射剤、若しくは溶解又は懸濁して使用する固形注射剤などであってもよいが、これらに限定されるものではない。本発明の一具体例の注射剤は、その種類に応じて注射用蒸留水、植物油（例えば、落花生油、ごま油、ツバキ油等）、モノグリセリド、ジグリセリド、プロピレングリコール、カンフル、安息香酸エストラジオール、次サリチル酸ビスマス、アルセノベンゾールナトリウム、又は硫酸ストレプトマイシンの少なくとも１種を含むことができ、選択的に安定剤や防腐剤を含むことができる。

本発明の一具体例の薬学組成物の配合比率は、前述のような追加成分の種類や量、形態などに応じて適当に選択することができる。例えば、注射剤全量に対して、本発明の薬学組成物は、約０．１〜９９重量％、好ましくは約１０〜９０重量％程度含まれてもよい。また、本発明の一具体例の薬学組成物の適切な投与量は、患者の疾患の種類、疾患の軽重、剤形の種類、製剤化方法、患者の年齢、性別、体重、健康状態、食餌、排泄率、投与時間及び投与方法によって調節することができる。例えば、成人に本発明の一具体例の薬学組成物を投与する場合、一日に０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量で１回〜数回に分けて投与することができる。

一方、本発明の一具体例の組成物が皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物として製造される場合、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常、化粧品や皮膚外用剤に用いられる成分、例えば保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、乳化剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。

また、本発明の一具体例の皮膚外用剤は、脂肪由来幹細胞由来のエキソソーム以外に、その作用（皮膚炎及びかゆみの抑制等）を損なわない限度で、従来から使用されてきた皮膚炎治療剤及び／又は保湿剤を共に混合して使用することができる。例えば、本発明のエキソソームは、ハイドロゲル、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム等）、又はヒアルロン酸ゲルのうち少なくとも１種に担持又は混合されてもよい。本発明の一具体例の皮膚外用剤において、前記ハイドロゲルの種類は限定されないが、ゲル化ポリマーを多価アルコールに分散させて得られたハイドロゲルであることが好ましい。前記ゲル化ポリマーは、プルロニック、精製寒天、アガロース、ゲランガム、アルギン酸、カラギーナン、カシアガム、キサンタンガム、ガラクトマンナン、グルコマンナン、ペクチン、セルロース、グアーガム、及びローカストビーンガムからなる群から選ばれた少なくとも１種であってもよく、前記多価アルコールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、イソブチレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、キシリトール、及びグリセリンからなる群から選ばれた少なくとも１種であってもよい。

本発明の一具体例の皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、例えば、パッチ、マスクパック、シートマスク、クリーム、トニック、軟膏、懸濁液、乳濁液、ペースト、ローション、ゲル、オイル、パック、スプレー、エアゾール、ミスト、ファンデーション、パウダー、油紙などの様々な形態に適用することができる。例えば、前記皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、パッチ、マスクパック又はシートマスクの少なくとも一面に塗布又は浸漬することができる。

本発明の一具体例の皮膚外用剤が化粧料組成物として製造される場合、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は正常化させる目的で使用され、化粧品剤形は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤形でも製造することができる。例えばパッチ、マスクパック、シートマスク、柔軟化粧水、栄養化粧水、収斂化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、アイクリーム、クレンジングクリーム、エッセンス、アイエッセンス、クレンジングローション、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、サンスクリーン、口紅、石鹸、シャンプー、界面活性剤含有クレンジング、入浴剤、ボディローション、ボディクリーム、ボディオイル、ボディエッセンス、ボディ洗浄剤、染毛剤、ヘアトニックなどに剤形化することができるが、これに限定されるものではない。

本発明の一具体例の皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、皮膚外用剤及び／又は化粧品に通常的に用いられる成分を含み、例えば抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、及び香料のような通常の補助剤そして担体を含むことができる。また、皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物に対するそれぞれの剤形において、他の成分は、皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物の種類又は使用目的などによって、当業者が困難なく、適宜選定して配合することができる。

本発明の他の具体例は、前記化粧料組成物を用いて、治療用を除く哺乳動物の皮膚の状態を調節する美容方法を提供する。本発明の美容方法において、皮膚の状態の調節とは皮膚の状態を改善させ／させたり、皮膚の状態を予防的に調節することを意味し、皮膚の状態の改善とは皮膚組織の外観及び感覚の視覚的並びに／又は触覚的に知覚することができる肯定的な変化を意味する。

本発明の一具体例の美容方法は、（ａ）前記化粧料組成物を哺乳動物の皮膚に直接塗布すること、（ｂ）前記化粧料組成物が塗布又は浸漬されたパッチ、マスクパック又はシートマスクを哺乳動物の皮膚に接触又は付着すること、または、前記（ａ）及び（ｂ）を順次進行することを含む。

本発明の一具体例の美容方法は、前記化粧料組成物が適用された哺乳動物の皮膚に微細電流を流してイオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行うことをさらに含むことができる。また、本発明の一具体例の美容方法は、イオントフォレシス装置を前記哺乳動物の皮膚に接触又は付着させることをさらに含むことができる。

本発明の一具体例の美容方法において、前記イオントフォレシス装置は、可撓性電池、リチウムイオン二次電池、アルカリ電池、乾電池、水銀電池、リチウム電池、ニッケルカドミウム電池、及び逆電気透析（ｒｅｖｅｒｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ）電池から構成された群から選ばれた少なくとも１種の電池を含むか、前記少なくとも１種の電池が装着されたパッチ、マスクパック又はシートマスクを含むことができる。

本発明のもう一つの具体例は、前記薬学組成物の治療学的に有効な量を哺乳動物に投与するステップを含む、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療する方法を提供する。

本発明の皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療する方法において、前記哺乳動物はヒト、イヌ、ネコ、齧歯類、ウマ、ウシ、サル、又はブタであってもよい。

本発明の組成物は、皮膚炎の原因となる様々な炎症性サイトカイン及び炎症関連因子の生成を減少させ、炎症関連免疫細胞の活性ないしは関与を阻害して皮膚炎を予防、改善、緩和、又は治療することができる。

特に、本発明の組成物は、皮膚炎を引き起こす複数のサイトカイン標的に対して作用し、様々な原因に起因する皮膚炎に対する広範囲の適用が可能であり、効果的に皮膚炎を抑制及び緩和させることができる。また、本発明の組成物は、皮膚炎の軽症、中等度、重症の疾患進行程度によって発現様相が異なるサイトカインの標的を調節できるので軽症、中等度、重症の皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療に適用が可能であると期待される。さらに、本発明の組成物は、皮膚炎の急性、慢性などの発症様相によって発現様相が異なるサイトカインの標的を調節できるので、急性及び慢性皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療に適用が可能であると期待される。

したがって、本発明の組成物は、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用薬学組成物、皮膚外用剤、及び化粧料組成物として有用に使用することができる。

また、本発明は、高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一な脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを低価で大量に得ることができる。したがって、本発明は、機能的活性に優れた脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む組成物を低価で大量に提供することができる。また、本発明の組成物は、スケールアップ（ｓｃａｌｅ−ｕｐ）が可能であり、ＧＭＰ（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）にも適している。

一方、前述のような効果によって、本発明の範囲が制限されるものではない。

本発明の一具体例により脂肪由来幹細胞培養液からエキソソームを製造する方法においてエキソソームを分離及び精製する過程を説明するフローチャートである。 本発明の一具体例により脂肪由来幹細胞培養液からエキソソームを製造するステップ（ｓｔｅｐ）別に溶液内に含まれているタンパク質の総量の割合（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ）を測定した結果を示す。各ステップ別のタンパク質総量の割合は、幹細胞培養液全体に対するタンパク質総量の相対的な割合で示した。実験結果は、２つの異なるバッチから得られた結果をそれぞれ示した。 本発明の一具体例により得られたエキソソームの生産性（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）と純度（ｐｕｒｉｔｙ）を測定した結果を図示したものである。エキソソームの生産性は、「幹細胞培養液（ＣＭ）単位ｍＬ当り得られたエキソソームの粒子数」で計算し、エキソソームの純度は、「最終分画物に含まれているタンパク質の単位μｇ当りエキソソームの粒子数」で計算した。実験結果は、５つの異なるバッチ（ｂａｔｃｈ）から得られた結果を示した。 本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。ＴＲＰＳ（ｔｕｎａｂｌｅ ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ ｐｕｌｓｅ ｓｅｎｓｉｎｇ）分析による粒子サイズ分布と粒子数を示す。 本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。ＮＴＡ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）分析による粒子サイズ分布と粒子数を示す。 本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。ＴＥＭ（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）分析による粒子画像を倍率により図示した。 本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。本発明の一具体例によって得られたエキソソームのウエスタンブロットの結果を示す。 本発明の一具体例によって得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものである。本発明の一具体例によって得られたエキソソームに対するマーカー分析においてＣＤ６３及びＣＤ８１のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 トレハロース添加によって、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームが得られることを示す粒子サイズ分布に関するＮＴＡ分析結果を示す。添加されたトレハロースの量が増加するにつれて、単一のピークを有する粒子サイズ分布の結果を得ることができる。 トレハロース添加によって、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームが得られることを示す粒子サイズ分布に関するＮＴＡ分析結果を示す。添加されたトレハロースの量が増加するにつれて、単一のピークを有する粒子サイズ分布の結果を得ることができる。 トレハロース添加によって、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームが得られることを示す粒子サイズ分布に関するＮＴＡ分析結果を示す。添加されたトレハロースの量が増加するにつれて、単一のピークを有する粒子サイズ分布の結果を得ることができる。 本発明の一具体例によるエキソソームの製造過程でトレハロース添加の有無による粒子サイズ分布を示すＮＴＡ分析結果を示す。製造過程の全過程でトレハロースを添加した場合の結果を示す。 本発明の一具体例によるエキソソームの製造過程でトレハロース添加の有無による粒子サイズ分布を示すＮＴＡ分析結果を示す。細胞培養液を凍結保管し、解凍後、トレハロースを添加した場合の結果を示す。 本発明の一具体例によるエキソソームの製造過程でトレハロース添加の有無による粒子サイズ分布を示すＮＴＡ分析結果を示す。トレハロースを添加せずに製造した場合の結果を示す。 図６Ａ乃至図６Ｃの方法により分離したエキソソームの相対的な生産性（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）と相対的な濃度（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を比較した結果を示した。 図６Ａ乃至図６Ｃの方法により分離したエキソソームの平均粒子サイズ（Ｍｅａｎ ｓｉｚｅ）を示した。 本発明の一具体例によるエキソソームによる、炎症反応の一種であるＮＯ形成の減少効果を確認した実験結果を示す。図７においてＰＢＳはリン酸緩衝塩類溶液 （ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）、ＤＥＸはデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、ＥＸＯはエキソソーム、ＣＭは脂肪由来幹細胞培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）、ＣＭ−ＥＸＯはエキソソームが除去された脂肪由来幹細胞培養液（ｅｘｏｓｏｍｅ−ｄｅｐｅｌｅｔｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ）を示す。 本発明の一具体例により分離されたエキソソームによるＮＯ形成減少効果と、従来の沈殿法（ＰＰＴ）によって分離されたエキソソームによるＮＯ形成減少効果を比較した実験結果を示す。従来の沈殿法により分離されたエキソソームのＮＴＡ分析結果である。 本発明の一具体例により分離されたエキソソームによるＮＯ形成減少効果と、従来の沈殿法（ＰＰＴ）によって分離されたエキソソームによるＮＯ形成減少効果を比較した実験結果を示す。本発明の一具体例による方法によって分離精製されたエキソソームのＮＴＡ分析結果である。 本発明の一具体例により分離されたエキソソームによるＮＯ形成減少効果と、従来の沈殿法（ＰＰＴ）によって分離されたエキソソームによるＮＯ形成減少効果を比較した実験結果を示す。ＮＯ形成減少効果を比較図示したグラフである。ＮＯ形成の減少程度は陽性対照群であるデキサメタゾン（Ｄｅｘ）によるＮＯ形成の減少程度の相対比率（％）で表示した。 アトピーが誘発されたマウス（皮膚炎誘発動物モデル１）で、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した結果、アトピーの症状が緩和されたことを確認した結果を示す。 皮膚炎誘発動物モデル１に、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した後、皮膚損傷領域のサンプルで炎症性サイトカインであるＩＬ−４及びＩＬ−３１ ｍＲＮＡの変化量を確認したリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。 アトピーが誘発されたマウス（皮膚炎誘発動物モデル２）で、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した結果、エキソソームの用量依存的にアトピーの症状が緩和されたことを確認した結果を示す。 図１１の結果を数値化して比較したグラフである。 皮膚炎誘発動物モデル２に、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した後、皮膚損傷領域のサンプルで炎症性サイトカインであるＩＬ−４、ＩＬ−３１、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２３ ｍＲＮＡの変化量を確認したリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。 皮膚炎誘発動物モデル２に、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した後、血液中に存在する（Ａ）ＩｇＥ、（Ｂ）白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）、及び（Ｃ）好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）を測定して示したグラフである。 ＰＫＨ６７で染色されたエキソソームを確認した蛍光強度の測定結果を示す。 ブタ皮膚組織内部に、蛍光染色された本発明のエキソソームが伝達された程度を確認した蛍光顕微鏡画像である。蛍光染色された本発明のエキソソームを緩衝溶液に希釈してブタ皮膚表面に塗布し、一定時間経過後に確認した蛍光顕微鏡画像である。 マウス皮膚組織の内部に、蛍光染色された本発明のエキソソームが伝達された程度を確認した共焦点蛍光顕微鏡画像と、これから各画像上の蛍光強度を測定して得た総蛍光強度を比較して示したグラフである。図１９の上段は、蛍光染色された本発明のエキソソームを緩衝溶液に希釈してマウス皮膚表面に塗布し、一定時間経過後に確認した共焦点蛍光顕微鏡画像である。 ヒト皮膚繊維芽細胞であるＨＳ６８細胞に本発明の一具体例によるエキソソームを処理した後、細胞毒性がないことを確認した結果を示す。 本発明の一具体例によるエキソソームを含む組成物をヒトの皮膚（患部）に塗布した後、前記組成物が塗布された皮膚（患部）に微細電流を流すイオントフォレシスを行った結果、皮膚炎がひどい皮膚（患部）の紅斑などが著しく改善されたことを示す写真である。 自然発生重症アトピー性皮膚炎に苦しむシェットランド・シープドッグに本発明の一具体例によるエキソソームを皮下注射した結果、アトピーの症状が著しく改善されたことを示す写真である。

以下、本発明を下記の実施例でより詳細に記述する。ただし、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものに過ぎず、本発明の権利範囲を制限したり限定するものではない。本発明の詳細な説明及び実施例から、本発明が属する技術分野の通常の技術者が容易に類推できることは本発明の権利範囲に属するものと解釈される。本発明に引用された参考文献は、本発明に参考として統合される。

明細書全体で、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、これは特に反対となる記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含みうることを意味する。

実施例１：細胞の培養
マウスマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７は、韓国細胞株バンクから購入して培養した。細胞培養のために１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）及び１％抗生剤−抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）が含有されたＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）培地に５％ＣＯ_２、３７℃の条件で継代培養した。

ヒト皮膚繊維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）であるＨＳ６８細胞はＡＴＣＣから購入し、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）及び１％抗生剤−抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）が含有されたＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）培地に５％ＣＯ_２、３７℃の条件で継代培養した。

当該発明の属する技術分野で公知の細胞培養方法により、５％ＣＯ_２、３７℃の条件で脂肪由来幹細胞を培養した。次に、リン酸緩衝塩類溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）で洗浄した後、無血清、無フェノールレッド培地に交換して、１日〜１０日間培養し、その上清（以下、培養液）を回収した。

エキソソームの分離過程で粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームを得るために培養液にトレハロースを２重量％添加した。トレハロースを添加した後、培養液を０．２２μｍフィルタでろ過して細胞残骸物、老廃物及び巨大粒子等の不純物を除去した。ろ過された培養液は、すぐに分離過程を経てエキソソームを分離した。また、ろ過された培養液は、冷蔵庫（１０℃以下）で保管した後、エキソソーム分離に使用した。また、ろ過された培養液は、−６０℃以下の超低温冷凍庫で凍結保管してから解凍した後、エキソソームの分離を行った。その後、培養液からタンジェント流ろ過装置（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ；ＴＦＦ）を用いて、エキソソームを分離した。

実施例２：ＴＦＦ法によるエキソソームの分離及び精製
実施例１で０．２２μｍフィルタでろ過された培養液からエキソソームを分離、濃縮、脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）をするためにＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）法を使用した。ＴＦＦ法を用いてエキソソームを分離、濃縮する前に培養液を超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）して潜在的なエキソソームの塊を解いた。ＴＦＦ法のためのフィルタとしては、カートリッジフィルタ（ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ｆｉｌｔｅｒ、別名ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｆｉｌｔｅｒ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）、又はカセットフィルタ（ｃａｓｓｅｔｔｅ ｆｉｌｔｅｒ；Ｐａｌｌ又はＳａｒｔｏｒｉｕｓ又はＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入）を使用した。ＴＦＦフィルタは、様々な分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ；ＭＷＣＯ）によって選択されてもよい。選択されたＭＷＣＯによって選別的にエキソソームを分離、濃縮し、ＭＷＣＯよりも小さい粒子やタンパク質、脂質、核酸、低分子化合物等は除去した。

エキソソームを分離、濃縮するためにＭＷＣＯ １００，０００Ｄａ（Ｄａｌｔｏｎ）、３００，０００Ｄａ、又は５００，０００ＤａのＴＦＦフィルタを使用した。培養液をＴＦＦ法を用いて１／１００〜１／２５程度の体積になるまで濃縮し、ＭＷＣＯよりも小さい物質は除去してエキソソームを分離した。

分離、濃縮されたエキソソーム溶液はＴＦＦ法を用いて、さらに脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行った。このとき、脱塩とバッファー交換は連続的に実行（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）又は断続的に実行（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）し、開始体積（ｓｔａｒｔｉｎｇ
ｖｏｌｕｍｅ）に対して少なくとも４倍、好ましくは６倍〜１０倍以上、より好ましくは１２倍以上の体積を有する緩衝溶液を用いて行った。緩衝溶液には、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームを得るためにＰＢＳに溶かした２重量％のトレハロースを添加した。トレハロース処理により、高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一なエキソソームを高収率で得ることができる効果を確認した結果は、図６Ａ〜図６Ｅに示した。

実施例３：分離されたエキソソームの特性の分析
分離されたエキソソーム、培養液、及びＴＦＦ分離過程の分画物におけるタンパク質の量は、ＢＣＡ発色法（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）、又はフルオロプロファイル（ＦｌｕｏｒｏＰｒｏｆｉｌｅ）蛍光法（Ｓｉｇｍａから購入）を用いて測定した。本発明の一具体例のＴＦＦ法によりエキソソームが分離、濃縮されてタンパク質、脂質、核酸、低分子化合物等が除去される程度は、タンパク質定量法によってモニタリングし、その結果を図２に示した。その結果、本発明の一具体例のＴＦＦ法によって非常に効果的に培養液に存在するタンパク質が除去されることが分かった。

本発明の一具体例のＴＦＦ法によりエキソソームを分離する場合、生産性と純度を独立した５つのバッチで比較した結果を図３に示した。独立した５つのバッチから得られた結果を分析した結果、本発明の一具体例のＴＦＦ法によって非常に安定的にエキソソームを分離できることを確認した。

分離されたエキソソームはナノ粒子トラッキング解析（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ：ＮＴＡ；Ｍａｌｖｅｒｎから購入）、又は可変抵抗パルス検出（ｔｕｎａｂｌｅ ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ ｐｕｌｓｅ ｓｅｎｓｉｎｇ：ＴＲＰＳ；Ｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅから購入）によって粒子のサイズと濃度を測定した。分離されたエキソソームの均一度とサイズは、透過型電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ
ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＴＥＭ）を用いて分析した。本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームのＴＲＰＳ、ＮＴＡ、ＴＥＭの分析結果は、図４Ａ〜図４Ｃに示した。

ＴＦＦ法でエキソソームを分離した後、トレハロースの添加の有無によるエキソソームのサイズ分布をＮＴＡ分析した結果を図５Ａ〜図５Ｃに示した。トレハロース濃度を０重量％、１重量％及び２重量％に増加させ（図５Ａ〜図５Ｃの上から下）、３回繰り返して実験した。トレハロースが存在しない場合、３００ｎｍ以上の大きさを有する粒子が確認されるのに対し、トレハロースの添加量を増やすと３００ｎｍ以上の大きさを有する粒子が減少し、エキソソームのサイズ分布が均一になることを確認した。

ＴＦＦ法でエキソソームを分離する過程でトレハロースの添加による効果をさらに調査した。図６Ａ〜図６Ｃに示すようにエキソソームの製造過程の全過程にＰＢＳに溶かした２重量％のトレハロースを添加した場合、均一のサイズ分布を有するエキソソームを得ることができた（図６Ａ）。一方、トレハロースを添加せずに凍結保存した培養液を使用するが、脱塩とバッファー交換の過程においてのみトレハロースを添加してＴＦＦ過程を進めた場合や、トレハロースを全く添加せずにＴＦＦ過程を進めた場合、サイズが大きい粒子が多く含まれる不均一なエキソソームを得た（図６Ｂ及び図６Ｃ）。

分離されたエキソソームの相対的な生産性と濃度を比較した結果、エキソソームの製造過程の全過程にトレハロースを添加した場合、非常に高い生産性でエキソソームを得ることができ、得られたエキソソームの濃度も５倍以上高かった（図６Ｄ）。ＮＴＡ分析の結果から示されたように、分離されたエキソソームの平均サイズもエキソソームの製造過程の全過程にトレハロースを添加した場合、２００ｎｍで均一に確認された（図６Ｅ）。

図４Ｄは、本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームに対してウエスタンブロットを行った結果として、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、及びＴＳＧ１０１マーカーの存在を確認した。各マーカーに対する抗体には、それぞれ抗ＣＤ９（Ａｂｃａｍから購入）、抗ＣＤ６３（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）、抗ＣＤ８１（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）、及び抗ＴＳＧ１０１（Ａｂｃａｍから購入）を使用した。

図４Ｅは、本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームに対してフローサイトメトリーを用いて分析した結果としてＣＤ６３及びＣＤ８１マーカーの存在を確認した。ＣＤ６３に対して陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）であるエキソソームを分離するためにエキソソームヒューマンＣＤ６３分離／検出キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）をメーカーの方法に従って使用し、ＰＥ―マウス抗ヒトＣＤ６３（ＰＥ−Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ６３）（ＢＤから購入）及びＰＥ―マウス抗ヒトＣＤ８１（ＰＥ−ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ８１）（ＢＤから購入）を使用してマーカーを染色した後、フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。

前記の結果を総合すると、本発明の一具体例の分離方法は、タンジェント流ろ過を用いた分離及び／又は精製の過程でトレハロースを添加して、高純度でありながら、粒子サイズ分布が均一なエキソソームを高収率で経済的で、かつ効率的に分離及び精製できることが確認できた。また、本発明の一具体例の分離方法の工程は、スケールアップが可能でありＧＭＰにも適合することが分かった。

実施例４：エキソソーム処理による細胞毒性の測定
ヒト皮膚繊維芽細胞であるＨＳ６８細胞で本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームの毒性を評価するために、細胞に濃度別にエキソソームを処理し、細胞の増殖率を確認した。ＨＳ６８細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭに懸濁させた後、８０〜９０％の密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を有するように分株し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した。２４時間後、培養液を除去し、実施例２で準備されたエキソソームを濃度別に処理して、２４〜７２時間培養しながら細胞生存率を評価した。細胞生存率をＷＳＴ−１試薬（ＷＳＴ−１ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｔａｋａｒａから購入）、ＭＴＴ試薬（Ｓｉｇｍａから購入）、セルタイターグロ試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｐｒｏｍｅｇａから購入）、又はアラマールブルー試薬（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ ｒｅａｇｅｎｔ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）とマイクロプレートリーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓから購入）を用いて測定した。

比較群はエキソソームが処理されていない一般の細胞培養培地で培養された細胞数を基準にしており、試験された濃度範囲内で、本発明のエキソソームによる細胞毒性が示されないことを確認した（図１８）。

実施例５：マクロファージ細胞株を用いた炎症反応の測定
ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に懸濁させ、これをマルチウェルプレート（ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）の各ウェルに８０〜９０％の密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）を有するように分株した。翌日ＬＰＳが含まれた新たな無血清培地に希釈した本発明のエキソソーム（実施例２で準備されたエキソソーム）を適正濃度で１〜２４時間処理して培養した。培養が終わった培養上清を取り、培養液中に存在する ＮＯを測定して炎症反応を確認した。培養液内の炎症反応は、ＮＯ検出キット（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）（イントロンバイオもしくはプロメガから購入）を用いて測定した 。陽性対照群としてデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）（Ｓｉｇｍａから購入）を処理した。

図７に示すように、マウスのマクロファージであるＲＡＷ２６４．７細胞にＬＰＳ存在下で、本発明のエキソソームを処理した結果、ＬＰＳによって誘導される炎症反応であるＮＯ生成を濃度依存的に減少させることを確認した。このような結果は、本発明のエキソソームが皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療のために有用な機能的活性、すなわちＬＰＳにより誘導された炎症反応を減少させる活性を有し、本発明のエキソソームは皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療のための組成物の有効成分として有効に活用できることを強く示唆している。

実施例６：分離方法によるＮＯ形成の減少効果の比較
分離方法によるエキソソームのＮＯ形成の減少効果を比較するために、本発明の一具体例のＴＦＦ分離精製によって得られたエキソソーム以外に、従来の沈殿法によって分離されたエキソソームを準備した。沈殿法はメーカー（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプロトコルに基づいて実施した。従来の沈殿法によって分離されたエキソソーム（図８Ａ参照）は、本発明の一具体例のＴＦＦ法によって分離精製されたエキソソーム（図 ８Ｂ参照）と比較して、粒子サイズ分布の均一度が低く、様々なサイズを有することを確認した。また、図８Ｃに示すように、本発明の一具体例のＴＦＦ法によって分離精製されたエキソソームは、従来の沈殿法によって得られたエキソソームに比べてはるかに高いレベルでＮＯ形成を抑制することを確認した。このような結果は、本発明の一具体例により分離精製されたエキソソームが従来の方法により分離されたエキソソームに比べて、粒子サイズ分布の均一度とＮＯ形成抑制の面で優れていることを示している。

したがって、本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームは、従来の分離方法によって得られたエキソソームと比較して性能又は機能的活性（例えば、粒子サイズ分布の均一性、ＮＯ生成抑制、炎症反応の減少等）にはるかに優れ、このように機能的活性に優れた幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含有する本発明の組成物は、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療効果の面で従来技術よりもはるかに優れているといえる。

実施例７：皮膚炎誘発動物モデル
雄ＮＣ／Ｎｇａマウス（１６〜１８ｇ、５週齢；中央実験動物から購入）を購入して７日間の適応期を通じて本実験に使用した。適応期を経たマウスは皮膚炎誘発後、以下のようにそれぞれ５群に分類した。
（１）Ｎｏｒｍａｌ：正常対照群
（２）Ｖｅｈｉｃｌｅ（皮膚炎誘発群）：イエダニ抽出物により皮膚炎を誘発した陰性対照群
（３）ＩＶ：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に２．８μｇの用量で週３回ずつ２週間、血管内投与（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（４）ＳＣ：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に２．８μｇの用量で週３回ずつ２週間、皮下投与（ＳＣ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（５）Ｐｒｅｄ：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）を毎日経口投与した実験群
ＮＣ／Ｎｇａマウス（中央実験動物から購入）の耳介部分をカミソリで除毛した後、除毛剤を適量塗布して除毛した。除毛剤をふき取った後、ＡＤ誘発試薬（イエダニ抽出物；ＢｉｏＳｔｉｒ Ｉｎｃ．から購入）をマイクロピペットチップ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｐｅｔ
ｔｉｐ）を用いて、耳介部分に均一に塗布した。必要に応じてカミソリで除毛した後、４％ＳＤＳ水溶液１５０μＬをマイクロピペットチップ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｐｅｔ ｔｉｐ）を用いて、耳介部分に均一に塗布した。ドライヤーを用いて冷風で乾燥させた後、約２〜３時間自然乾燥させた後、ＡＤ誘発試薬をマイクロピペットチップ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｐｅｔ ｔｉｐ）を用いて耳介部分に均一に塗布した。すべての前処理は、１週間に２回、計３週間、６回の処理で行った。

実施例２で準備されたエキソソーム投与開始前の皮膚臨床指数の評価を実施して順位化したスコアに基づいて、各群の平均スコアが最大限均一に分布するように、ランダム法で分配して群を分離した。

図９Ａは、アトピーが誘発されたマウスの写真（Ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）と、本発明の一具体例によるエキソソーム処理（ＩＶ及びＳＣ）によるアトピー症状の緩和を示す写真である。図９Ｂは（２）〜（５）の各実験群のアトピー臨床スコアを図式化したグラフであり、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した群において、アトピー臨床スコアが改善されたことを確認した。また、図９Ｃは、（２）〜（５）の各実験群で測定された耳の厚さを（１）の正常群と比較して相対的な変化量を示したグラフであり、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した群で、耳の厚さが減少したことを確認した。

まとめると、前記の実験を通じて、本発明のエキソソームが処理された群（ＩＶ及びＳＣの両方）において、皮膚臨床指数と耳の厚さが減少されたことを確認した。

実施例８：皮膚炎誘発動物モデル２
エキソソームの用量依存的な効果を確認するために、実施例７と同様に、皮膚炎を誘発した後、以下のように９群に分類した。
（１）Ｎｏｒｍａｌ：正常対照群（図１１で「Ｎ」と表記）
（２）Ｃｏｎｔｒｏｌ（皮膚炎誘発群）：イエダニ抽出物により皮膚炎を誘発した陰性対照群（図１１で「Ｃ」と表記）
（３）ＩＶ、Ｌ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｌｏｗ）：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に０．１４μｇの用量で週３回ずつ４週間、血管内投与（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（４）ＩＶ、Ｍ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｍｅｄｉｕｍ）：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に１．４μｇの用量で週３回ずつ４週間、血管内投与（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（５）ＩＶ、Ｈ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｈｉｇｈ）：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に１０μｇの用量で週３回ずつ４週間、血管内投与（ＩＶ：ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（６）ＳＣ、Ｌ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｌｏｗ）：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に０．１４μｇの用量で週３回ずつ４週間、皮下投与（ＳＣ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（７）ＳＣ、Ｍ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｍｅｄｉｕｍ）：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に１．４μｇの用量で週３回ずつ４週間、皮下投与（ＳＣ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（８）ＳＣ、Ｈ（ｅｘｏｓｏｍｅ、ｈｉｇｈ）：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、実施例２で準備されたエキソソームを個体別に１０μｇの用量で週３回ずつ４週間、皮下投与（ＳＣ：ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した実験群
（９）Ｐｒｅｄ：イエダニ抽出物により皮膚炎誘発後、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）を毎日経口投与した実験群（図１１で「Ｐ」と表記）

皮膚炎誘発は実施例７と同様に行い、ＡＤ誘発試薬を過量に塗布してエキソソームを投与する時点で平均皮膚臨床指数が９になるようにした。実施例２で準備されたエキソソーム投与開始前の皮膚臨床指数の評価を実施して順位化したスコアに基づいて、各群の平均スコアが最大限均一に分布するように、ランダム法で分配して群を分離した。

図１１の上段（上から一番目及び二番目）は、アトピーが誘発されたマウスの写真（０日目）と、本発明の一具体例によるエキソソーム処理により用量依存的にアトピーの症状が緩和されたこと（２８日目）を示す写真である。図１２Ａは（２）〜（９）の各実験群のアトピー臨床スコアの相対的改善度を図式化したグラフであり、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した群（ＩＶ及びＳＣ）で用量依存的にアトピー臨床スコアが改善されたことを確認した。

図１１の中段（上から三番目及び四番目）は、耳の皮膚組織の切片（ｓｅｃｔｉｏｎ）を、Ｈ＆Ｅ及びトルイジンブルーで染色した結果である。犠牲にしたマウスの耳の皮膚組織をＨ＆Ｅで染色した後、耳の皮膚組織の厚さを測定した。図１２Ｂは（２）〜（９）の各実験群で測定された耳の皮膚組織の厚さを（１）の正常群と比較して示したグラフであり、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した群（ＩＶ及びＳＣ）で耳の皮膚組織の厚さが用量依存的に減少したことを確認した。また、犠牲にしたマウスの耳の皮膚組織をトルイジンブルーで染色した後、炎症細胞の一種であるマスト細胞の流入の程度を測定した。図１２Ｃは（２）〜（９）の各実験群で測定されたマスト細胞の数を（１）の正常群と比較して示したグラフであり、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した群（ＩＶ及びＳＣ）でマスト細胞の流入が用量依存的に減少したことを確認した。

図１１の下段（上から五番目及び六番目）は、犠牲にしたマウスの耳の皮膚組織を抗−ＣＤ８６抗体及び抗−ＣＤ２０６抗体で免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）をした結果である。正常な皮膚では発見されず、アトピー性皮膚炎の病変に豊富に存在する炎症性樹状表皮細胞（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ；ＩＤＥＣｓ）は、その表面にＣＤ８６抗原及びＣＤ２０６抗原を発現することが知られている（非特許文献３、 非特許文献４）。したがって、アトピー性皮膚炎の病変内ＣＤ８６＋細胞数及びＣＤ２０６＋細胞数を測定すると皮膚炎の症状の改善程度を判断することができる。

犠牲にしたマウスの耳の皮膚組織切片を抗−ＣＤ８６抗体及び抗−ＣＤ２０６抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）をした後、ＣＤ８６＋細胞数及びＣＤ２０６＋細胞数を測定した。図１２Ｄ及び図１２Ｅは（２）〜（９）の各実験群で測定されたＣＤ８６＋細胞数及びＣＤ２０６＋細胞数を（１）の正常群と比較して示したグラフであり、本発明の一具体例によるエキソソームを処理した群（ＩＶ及びＳＣ）でＣＤ８６＋細胞数及びＣＤ２０６＋細胞数が用量依存的に減少したことを確認した。このような結果は、アトピー性皮膚炎の病変内の炎症性樹状表皮細胞の浸潤が減少し、皮膚炎の症状が緩和ないしは改善されたことを示唆している。

まとめると、前記実験により、本発明のエキソソームが処理された群（ＩＶ及びＳＣの両方）で用量依存的に皮膚臨床指数、耳の皮膚組織の厚さ、マスト細胞の流入、及び炎症性樹状表皮細胞の浸潤が減少されたことを確認した。

実施例９：サイトカインｍＲＮＡ発現量の測定
犠牲にしたマウスの皮膚の損傷部位の組織を粉砕して得られた総ＲＮＡからｃＤＮＡを製造してリアルタイムＰＣＲ法を用いて、皮膚炎の主な原因となる様々な炎症性サイトカインｍＲＮＡの変化量を測定した。ＩＬ−４、ＩＬ−３１、ＩＬ−２３及びＴＮＦ−αの遺伝子を定量するための標準遺伝子としてＧＡＰＤＨ遺伝子を使用した。リアルタイムＰＣＲに使用したプライマーの種類と配列は下記表１の通りである。

前記動物モデル１の実験を通じて、本発明のエキソソームが処理された群（ＩＶ及びＳＣの両方）で皮膚炎の原因となる炎症関連サイトカインであるＩＬ−４及びＩＬ−３１のｍＲＮＡ発現量がすべて減少することを確認した（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。また、前記動物モデル２の実験を通じて、本発明のエキソソームが処理された群（ＩＶ及びＳＣの両方）で皮膚炎の原因となる様々な炎症関連サイトカイン、すなわちＩＬ−４、ＩＬ−３１、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２３のｍＲＮＡ発現量がすべて用量依存的に減少することを確認した（図１３Ａ〜図１３Ｄ）。

本発明のエキソソームが処理された群は、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）及びプレドニゾロン処理群に比べて用量依存的にＩＬ−４、ＩＬ−３１、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２３のｍＲＮＡ発現量をすべて減少させたが、これらの炎症関連サイトカインは、皮膚炎関連治療剤の開発のための主要標的である。これら複数の標的に対する発現量の減少は、皮膚炎の抑制及び緩和と関連している。ＩＬ−４は、ＩｇＥへのアイソタイプクラススイッチング（ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）を開始し、好酸球を活性化させる。また、ＩＬ−３１は、ＩｇＥへのアイソタイプクラススイッチング（ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）に影響を与え、炎症性細胞が皮膚に集まるようにし、増加したＩＬ−３１は皮膚炎の悪化と関連があることが知られている。ＩＬ−２３は、Ｔｈ０タイプのＴ細胞をＴＮＦ−αを生成する病原性ヘルパーＴ細胞に分化させ、ＴＮＦ−αは血漿中の濃度が高ければ皮膚炎の悪化と関連があることが知られている。このような点を総合的に考慮すると、本発明のエキソソームは皮膚炎の主な原因となる複数のサイトカインの発現を抑制し、炎症反応を調節すると判断される。

したがって、本発明のエキソソームは皮膚炎を引き起こす様々な炎症性サイトカインの標的（すなわち、ＩＬ−４、ＩＬ−３１、ＩＬ−２３、及びＴＮＦ−α）に対して作用し、様々な原因に起因する皮膚炎に対する広範囲の適用が可能であり、効果的に皮膚炎を抑制及び緩和させることができると期待される。

実施例１０：血液分析
犠牲にしたマウスの血液から血漿を分離して、血中の免疫グロブリンＥ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ；ＩｇＥ）の濃度をＥＬＩＳＡ Ｋｉｔを用いて測定した。前記実験を通じて、実施例２で準備されたエキソソームが処理された群でエキソソームの用量依存的に血中ＩｇＥレベルが減少したことを確認した（図１４Ａ）。

また、犠牲にしたマウスの全血を用いて血中の細胞の数を測定した。サイトスピン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）を用いて、一定量の全血細胞を１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、スライド乾燥させてからＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋ染色を行い、その後、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）及び好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ）の数を測定した。前記実験を通じて、実施例２で準備されたエキソソームが処理された群でエキソソームの用量依存的に血中白血球及び好酸球の数が減少することを確認した（図１４Ｂ及び図１４Ｃ）。

前記のような結果から、本発明の組成物は、皮膚炎の原因となる炎症反応因子である血中ＩｇＥレベルを減少させるだけでなく、血中白血球及び好酸球の数を減少させ、また、様々な炎症性サイトカイン及び炎症関連因子の生成を減少させ、炎症関連免疫細胞の活性ないしは関与を阻害することがわかり、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用薬学組成物、皮膚外用剤及び化粧料組成物として有用に使用することができる。

実施例１１：本発明のエキソソームの皮膚透過能力試験
蛍光染色されたエキソソームを製造するためにＰＫＨ６７染料（Ｓｉｇｍａから購入）を使用した。１ｍＭのＰＫＨ６７をＤｉｌｕｅｎｔ Ｃ（Ｓｉｇｍａから購入）に希釈して、１０μＭのＰＫＨ６７溶液を製造した後、適正濃度のエキソソーム溶液と混合して、常温で光を遮断した状態で１０分間反応させた。反応が終わった後、ＰＫＨ６７で染色されたエキソソーム（以下、「ＰＫＨ−エキソソーム」と略称）から残りのＰＫＨ６７染料を除去するためにＭＷ３０００スピンカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）を使用した。蛍光測定器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓから購入）を用いて確認した結果、エキソソームと反応しないＰＫＨ６７を除去した後、ＰＫＨ−エキソソームで十分な強度の蛍光が検出されることを確認した（図１５）。

ＰＫＨ−エキソソームを適正濃度、例えば１×１０^５粒子／ｍＬ〜１×１０^９粒子／ｍＬの濃度でリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）に分散させた後、ブタ皮膚組織の皮膚外側面に塗布した。塗布されたＰＫＨ−エキソソームの乾燥を防ぐために不織布を被せた後、適正時間、例えば３０分〜１時間反応させ、ＰＫＨ−エキソソームが皮下組織に伝達されるようにした。反応が終了した後、ブタ皮膚組織を３．７％ホルムアルデヒド溶液に浸し、一晩反応させ、リン酸緩衝塩類溶液で５分間ずつ３回洗浄した。洗浄されたブタ皮膚組織を３０％スクロース溶液に浸して処理した後、ＯＣＴ化合物を処理した。再びリン酸緩衝塩類溶液で５分間ずつ３回洗浄した後、ミクロトームを用いて縦断面で切片を作製し、スライドガラス上に組織切片を位置させた。一方、組織切片の作製は、ホルムアルデヒド溶液で組織を固定する前に行うこともできる。組織切片でＰＫＨ−エキソソームから検出される蛍光は、蛍光顕微鏡を用いて観察した。以上の方法でブタ皮膚組織の表皮を透過して皮下組織に伝達されたＰＫＨ−エキソソームを確認した（図１６）。図１６で確認されるように、本発明のエキソソームは皮膚バリアを効果的に通過して皮膚組織の内部に深く伝達でき、皮膚に対して効果的に吸収される。したがって、前記エキソソームを有効成分として含有する皮膚外用剤又は化粧料組成物は、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療などにおいて、効果的に作用すると期待される。

次に、ヘアレスマウスの皮膚組織を摘出してフランツ拡散セル（Ｆｒａｎｚ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ｃｅｌｌ）のチャンバの上部に位置させた。このとき、拡散セルの内部はリン酸緩衝塩類溶液で満たされた。ＰＫＨ−エキソソームを適正濃度、例えば１×１０^５粒子／ｍＬ〜１×１０^９粒子／ｍＬの濃度でリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）に分散させた後、マウスの皮膚組織の外側に塗布した。このとき、ＰＫＨ−エキソソームの乾燥を防ぐために不織布をマウスの皮膚組織の外側に予め位置させ、不織布と皮膚組織の間にＰＫＨ−エキソソームを注入した。その後、３０分〜１時間反応させた。反応が終わった後、すぐに共焦点蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ＳＰ８Ｘ）を用いて皮膚組織の内部に伝達されたＰＫＨ−エキソソームを確認し、１時間〜６時間、皮膚組織とＰＫＨ−エキソソーム溶液をさらに反応させた後、共焦点蛍光顕微鏡でＰＫＨ−エキソソームを確認した。以上の方法で確認した結果、本発明のエキソソームは皮膚バリアを効果的に通過して皮膚組織の内部に深く伝達でき、皮膚に効果的に吸収される（図１７）。

したがって、前記エキソソームを有効成分として含有する皮膚外用剤又は化粧料組成物は、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療などにおいて、効果的に作用すると期待される。

実施例１２：ヒト皮膚に対するエキソソームを有効成分として含む組成物の処理
本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームを含有する組成物（エキソソームを含む懸濁液）を、重症アトピー患者３人の患部（手、首、腕など）に１〜２週間週３回にわたり塗布した後、イオントフォレシス装置を使用して、前記組成物が塗布された患部に微細電流を流すイオントフォレシスを行った。その結果、患者の激しいかゆみが著しく緩和され、皮膚炎に関連する紅斑の症状も顕しく改善された（図１９）。本発明のエキソソームを含有する組成物を適用した患者全員が激しいかゆみや皮膚炎に関連する紅斑の症状が緩和され、ステロイドや抗ヒスタミン製剤の処方を中止してもよい程度に症状が改善された。

したがって、本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームを有効成分として含有する皮膚外用剤又は化粧料組成物は、前記のような臨床試験で確認されるように、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療効果を示すことがわかる。

実施例１３：イヌ科動物に対するエキソソームを有効成分として含む組成物の処理
自然に発生した重症アトピー性皮膚炎に苦しむシェットランド・シープドッグ（Ｓｈｅｔｌａｎｄ Ｓｈｅｅｐｄｏｇ）（体重１３ｋｇ、９年齢）を対象に実験を行った。本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソーム（実施例２で準備されたエキソソーム）を含有する組成物を、自然発生重症アトピー性皮膚炎に苦しむシェットランド・シープドッグに５週間の合計１２回にわたって皮下注射した。１回の注射の際、実施例２で準備されたエキソソームを個体ごとに１１７μｇの用量で注射した。１週目及び２週目には、週に３回皮下注射し、３週目、４週目、５週目には、週に２回皮下注射した。そして、本発明のエキソソーム投与後、他の薬物の投与を中止した。

図２０Ａは、本発明のエキソソームを投与する前の患部の写真であり、腹部に紅斑と炎症がひどいことがわかる。本発明のエキソソーム投与後３日目から皮膚炎の症状が著しく改善され（図２０Ｂ）、投与後１０日目（図２０Ｃ）及び投与後２週目（図２０Ｄ）は、皮膚炎がほとんど消えたことが確認できた。また、本発明のエキソソーム投与後、実験対象であるシェットランド・シープドッグの活力が明確に増加し、体重が１６ｋｇに増加した。このような活力増加及び体重増加は、皮膚炎の症状の改善に起因したものと判断される。

本発明のエキソソームの皮膚炎の治療効果が持続するか否かを確認するために、本発明のエキソソーム投与終了後、実験対象であるシェットランド・シープドッグの患部を継続的に観察した。その結果、投与終了後５０日目（図２０Ｅ）及び９３日目（図２０Ｆ）にも皮膚炎の症状改善効果が持続されたことが確認できた。

したがって、本発明の一具体例の分離方法によって得られたエキソソームを有効成分として含有する組成物は、前記のようなイヌ科動物に対する動物実験で確認されるように、皮膚炎を効果的に緩和ないしは改善させることができ、皮膚炎の治療効果が持続的に維持される。

実施例１４：本発明のエキソソームを含む化粧料組成物の製造
前記実施例２で準備された１７０４μｇ／ｍＬの濃度のエキソソームを下記表２に記載された成分と混合して懸濁した後、化粧料組成物（ローション）を製造した。各成分の含有量は下記表２の通りである。

以上、本発明を前記実施例を挙げて説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者であれば、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく修正、変更をすることができ、このような修正と変更も本発明に属するものであることがわかるであろう。

Claims (26)

1. 脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用薬学組成物。
2. 前記エキソソームは、次のステップを実行して得られる、請求項１に記載の薬学組成物。
   （ａ）脂肪由来幹細胞培養液にトレハロースを添加するステップ、（ｂ）前記トレハロースが添加された脂肪由来幹細胞培養液をろ過するステップ、（ｃ）ろ過された前記脂肪由来幹細胞培養液から、ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いてエキソソームを分離するステップ、及び（ｄ）脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に使用される緩衝溶液にトレハロースを添加し、前記トレハロースが添加された緩衝溶液を用いたＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて、分離された前記エキソソームに対する脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行うステップ。
3. 前記脱塩とバッファー交換は連続的に行われるか、又は断続的に行われることを特徴とする、請求項２に記載の薬学組成物。
4. 開始体積（ｓｔａｒｔｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ）に対して少なくとも４倍の体積を有する緩衝溶液を用いて脱塩とバッファー交換を行うことを特徴とする、請求項２に記載の薬学組成物。
5. ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）のためにＭＷＣＯ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ）１００，０００Ｄａ、３００，０００Ｄａ、５００，０００Ｄａ又は７５０，０００ＤａのＴＦＦフィルタ、又は０．０５μｍ ＴＦＦフィルタを使用することを特徴とする、請求項２に記載の薬学組成物。
6. 前記（ｃ）のステップは、ＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて１／１００乃至１／２５の体積まで濃縮する過程をさらに含む、請求項２に記載の薬学組成物。
7. ろ過された前記脂肪由来幹細胞培養液は、ＴＦＦの前に超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）されることを特徴とする、請求項２に記載の薬学組成物。
8. 前記エキソソームは、皮膚組織又は皮膚細胞でＩＬ−４及びＩＬ−３１の発現量を減少させることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の薬学組成物。
9. さらに、前記エキソソームは皮膚組織又は皮膚細胞でＩＬ−２３又はＴＮＦ−αのうちの少なくとも一つの発現量を減少させることを特徴とする、請求項８に記載の薬学組成物。
10. 前記エキソソームは血中ＩｇＥのレベルと、血中白血球及び好酸球の数を減少させることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の薬学組成物。
11. 前記エキソソームは皮膚組織で肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）、ＣＤ８６＋細胞及びＣＤ２０６＋細胞の数を減少させることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の薬学組成物。
12. 前記エキソソームはＴＥＷＬ（ｔｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｗａｔｅｒ ｌｏｓｓ）を減少させ、皮膚水分含有量を増加させることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の薬学組成物。
13. 前記エキソソームは試験管内分析でＴＮＦ−α ｍＲＮＡ発現、ＩＬ−６ ｍＲＮＡ発現、及びＩＬ−１β ｍＲＮＡ発現を減少させることを特徴とする、請求項１乃至 ７のいずれか一項に記載の薬学組成物。
14. 脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療用の皮膚外用剤。
15. 前記エキソソームは、ハイドロゲル、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、又はヒアルロン酸ゲルのうち少なくとも１種に担持又は混合されている、請求項１４に記載の皮膚外用剤。
16. 前記ハイドロゲルは、ゲル化ポリマーを多価アルコールに分散させて得られたハイドロゲルであることを特徴とする、請求項１５に記載の皮膚外用剤。
17. 前記ゲル化ポリマーは、プルロニック、精製寒天、アガロース、ゲランガム、アルギン酸、カラギーナン、カシアガム、キサンタンガム、ガラクトマンナン、グルコマンナン、ペクチン、セルロース、グアーガム、及びローカストビーンガムからなる群から選ばれた少なくとも１種であり、前記多価アルコールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、イソブチレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、キシリトール、及びグリセリンからなる群から選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１６に記載の皮膚外用剤。
18. 脂肪由来幹細胞由来のエキソソームを有効成分として含む、皮膚炎の予防、改善、又は緩和用の化粧料組成物。
19. パッチ、マスクパック、シートマスク、クリーム、トニック、軟膏、懸濁液、乳濁液、ペースト、ローション、ゲル、オイル、パック、スプレー、エアゾール、ミスト、ファンデーション、パウダー、及び油紙で構成された群から選ばれた少なくとも１種の形態に適用することを特徴とする、請求項１８に記載の化粧料組成物。
20. パッチ、マスクパック又はシートマスクの少なくとも一面に塗布又は浸漬されることを特徴とする、請求項１９に記載の化粧料組成物。
21. （ａ）請求項１８に記載の化粧料組成物を哺乳動物の皮膚に直接塗布すること、（ｂ）前記化粧料組成物が塗布又は浸漬されたパッチ、マスクパック又はシートマスクを哺乳動物の皮膚に接触又は付着すること、または、前記（ａ）及び（ｂ）を順次進行することを含む、治療用を除く哺乳動物の皮膚の状態を調節する美容方法。
22. （ｃ）前記化粧料組成物が適用された哺乳動物の皮膚に微細電流を流してイオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行うことをさらに含む、請求項２１に記載の美容方法。
23. イオントフォレシス装置を前記哺乳動物の皮膚に接触又は付着させることをさらに含む、請求項２２に記載の美容方法。
24. 前記イオントフォレシス装置は、可撓性電池、リチウムイオン二次電池、アルカリ電池、乾電池、水銀電池、リチウム電池、ニッケルカドミウム電池、及び逆電気透析(ｒｅｖｅｒｓｅ ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ)電池で構成された群から選ばれた少なくとも１種の電池を含むか、前記少なくとも１種の電池が装着されたパッチ、マスクパック又はシートマスクを含む、請求項２３に記載の美容方法。
25. 請求項１乃至７のいずれか一項に記載の薬学組成物の治療学的に有効な量を哺乳動物に投与するステップを含む、皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療する方法。
26. 前記哺乳動物はヒト、イヌ、ネコ、齧歯類、ウマ、ウシ、サル、又はブタである、 請求項２５に記載の皮膚炎の予防、改善、緩和、又は治療する方法。