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KR20180110094A - 샘플 사이클 다중화 및 실시간 이미지화 방법 - Google Patents

샘플 사이클 다중화 및 실시간 이미지화 방법 Download PDF

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KR20180110094A
KR20180110094A KR1020187026049A KR20187026049A KR20180110094A KR 20180110094 A KR20180110094 A KR 20180110094A KR 1020187026049 A KR1020187026049 A KR 1020187026049A KR 20187026049 A KR20187026049 A KR 20187026049A KR 20180110094 A KR20180110094 A KR 20180110094A
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아타 튜나 시프틀리크
디에고 가브리엘 듀포이
피에르 요리스
마틴 히스
Original Assignee
루나포어 테크놀로지스 에스에이
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Publication date
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Abstract

본 발명은 빠르고, 고감도이며 신뢰성 있는 방식으로 동일한 시료 상에 복수-분자 판독값을 통해 다양한 분자 표적의 이미지화를 가능하게 하는 사이클 다중화에 의한 샘플의 실시간 이미지화에 대한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 사이클 다중화에 의한 샘플의 실시간 이미지화 방법에 특히 유용한, 시료 및 이미지화 시약의 분해를 방지하는 이미지화 완충액에 관한 것이다.

Description

샘플 사이클 다중화 및 실시간 이미지화 방법
본 발명은 일반적으로 사이클 다중화(cycle multiplexing)에 의한 샘플, 특히 생물학적 샘플의 실시간(in situ) 이미지화 분야에 관한 것이다.
이미지 기반 샘플 분석 측정 기술은 예를 들어 조직 표본인, 단일 표본 내에 동시에 관찰될 수 있는 측정 분자 수(다중화 정도)에 의해 제한되어왔다. 이는 지금까지 단일 세포 시퀀싱(single-cell sequencing) 또는 질량 세포분석법(mass cytometry)과 같은, 다른 고도 다중화 기술과 비교했을 때, 대규모 ‘-오믹스(omics)’ 사용으로부터의 분석적 접근을 제한하고 있다. 결과적으로, 현재의 이미지 기반 접근만이 드러낼 수 있는, 필수 공간적 세부사항을 놓치고 있다. 전통적 면역조직화학법(immunohistochemistry)보다 면역형광법(immunofluorescence)을 사용하는 것이 부분적으로 이러한 문제를 극복할 수 있지만, 측정은 최대 4-5개의 동시 분자 판독으로 여전히 제한된다. 이미지 기반 다중 샘플 분석 측정의 주요 한계는 신호간의 혼선 없이 단일 표본의 별개의 신호를 분리하는 것이다. 예를 들어, 형광 이미지화의 경우, 스펙트럼의 중첩은 고도 다중화 다색 표지 실험에서 방출된 신호의 명확한 분리를 방해한다. 또한, 형광발색단(fluorophores)은 높은 표지 밀도에서 자기 소멸(self-quenching) 행동을 나타낼 수 있으며, 복수 표지의 동시 적용을 더욱 제한한다. 면역 기반 접근의 다중화 능력에 대한 또 다른 제한은 각각의 1차 항체가 다른 동물 종으로부터 유래되어야만 2차 항체와 함께 특이적으로 증폭 및 검출되는 것을 보장한다는 요구이다. 이는 원칙적으로 직접 면역 형광법, 다시 말해 1차 항체를 직접 표지함으로써 극복될 수 있지만, 이러한 접근법은 감소된 특이성 및 증폭 부족으로 인한 낮은 신호 출력과 같은, 다른 문제를 일으킨다.
면역형광법을 이용한 복수 분자 판독은 WO 2007/047450에 나타난 항체 혼합 방법을 사용하여 달성되어왔다. 이 방법은 이미지 기반이고, 조직 절편에 적용할 수 있고, 비특이적 뉴클레아제를 함유한 환경에서 활용할 수 있다는 장점이 있으나, 최대 동시 검출 수는 제한된다. WO 2008/005464에 기재된 것과 같은 측정 과정에 정량 가능한 참조 표준을 포함하면서, 바이오마커 단백질의 반(semi)-정량적 채점(scoring), 예를 들어 유방암 조직 내의 인간 상피 성장 인자 2(Human Epidermal Growth Factor 2, HER2)의 반-정량적 채점에 적용된 것과 같은 어떤 적용에서의 정량 면역조직화학법 판독의 정확성을 증가시키는 것은 출력 신호를 특정 밴드로 나누기 때문에 복수 동시 판독의 가능성이 더욱 제한될 수 있다.
실시간 이미지화를 이용한 샘플 다중화는 동일한 샘플에 상이한 염색을 적용하고 EP113631에 기재된 것처럼 이미지화 결과로부터 개별 염색 이미지를 추출하는 것을 포함하는 스펙트럼 다중화를 수행하여 달성할 수 있다. 이 기술은 샘플의 각 픽셀으로부터 스펙트럼 데이터를 수집하고, 각 개별 염색으로 인한 결과인 스펙트럼을 계산하여 생성하고, 수정한 색 스펙트럼의 개별 결과를 보여주는 것을 포함한다. 복수 마커 정량화를 허용하는 동안, 장치 성능은 각 신호간의 가능한 혼선 때문에 병행 얼룩의 수에 반비례한다.
면역염색 기술의 최근의 발전은 상기 언급한 한계를 극복하는데 매우 유망하다. 이러한 기술은 일반적인 염색/이미지화 단계 후 염료 불활성 및/또는 항체 용출을 포함하여 추가의 염색 및 이미지화 단계를 허용하는, 복수-사이클 실시간 이미지화를 사용한다.
이러한 접근은 각각의 이미지 획득 후 형광 염료의 화학적 비활성화(Gerdes et al., 2013, PNAS, 110(29), 11982-11987), 맞춤 산성화 과망간산 용액을 순차적으로 이용함으로써 연속적 염색 사이클을 위한 항원-항체 결합의 비파괴적 해리 (WO 2010/115089), 다양하고 상이한 완충액을 이용한 연속적인 항체 용출(Pirici et al., 2009, J. Histochem. Cytochem., 57(6), 567-575), 순차적 복수-표적 검출을 위한 고온에서의 펩티드 탐침(probe) 접촉 및 변성의 연속적 사이클(WO 2009/11714), 변성 및 용출 기술의 조합을 이용한 반복 염색 및 이미지화 사이클(Wahlby et al., 2002, Cytometry, 47(1), 32-41), 각각의 재염색 단계 전에 탈색(bleaching)을 이용한 복수의 순차 염색 사이클 (Friedenberger, 2007, Nature Protocols, 2, 2285 - 2294), 분자 바이오마커의 다중화 프로파일링을 위한 생물학적 표지로서의 생물학적 결합된(bioconjugated) 양자점(quantum dots)의 사용 (Schubert et. al., 2006, Nature Biotechnology 24, 1270-1278), 흥미로운 복수 표적 분자와 결합을 형성하는 수용성 고분자의 사용 (Xing, 2007, Nature Protocols 2, 1152 - 1165)을 포함한다.
모든 이러한 복수-사이클 실시간 이미지화 접근은 반복적이며 상이한 분자 표적에 대해 동일한 종 뿐만 아니라 동일한 화학 시약 또는 형광 발색단에서 생성된 1차 항체의 후속적 활용을 허용하며 이론적으로 무제한의 동일한 조직 절편 상의 다른 목표를 식별할 수 있는 이점이 존재한다.
유망하긴 하나, 예를 들어 종양 절편과 같은 샘플의 고처리, 다중화 분자 프로파일링에 대한 다중 사이클 실시간 이미지화 기술의 변환은 쉽지 않다. 첫째, 장기 배양(incubation) 및 세정 사이클(보통 수시간 까지)은 변동하는 대기 조건 하에서 조직 항원의 분해를 야기하는 매우 긴 총 프로토콜 지속시간을 초래한다. 둘째, 샘플 커버슬립(coverslip) 단계의 이미지화의 반복된 장착/탈착은 조직의 완전성을 더욱 악화시킨다. 그러므로 이러한 사이클의 수동 처리는 재현 가능성에 영향을 미치고 고처리량에서 조직 표본의 믿을만한 분자 프로파일링을 실질적으로 방해하며 고처리량, 신뢰성 및 상대적으로 저렴한 구현 특성을 필요로 하는 진단 목적과 같은 적용에서 복수 사이클 기술의 사용을 비현실적으로 만든다.
샘플의 실시간 이미지화를 위해 이용 가능한 기존 방법의 또 다른 한계는 다중 사이클 분석을 실현하기 위한 대면적 이미지화 요구 사항으로부터 또한 기인한다. 상기 표본은 각 사이클 사이에서의 수동 처리 및 뒤따른 수동 처리를 실현시키기 위해 이미지화 시스템으로부터 제거되기 때문에, 상기 표본은 대면적 이미지화 후속 분자 마커를 위해 이미지화 시스템에 복원되고 모든 사이클에서 상기 표본으로부터 얻은 이미지를 겹치고, 각 사이클에서 이미지화 시스템에 대한 표본 배치의 미묘한 차이는 상기 표본 전체에 걸쳐 분자 신호의 위치에 오류를 발생시킨다. 이는 분자 신호, 특히 고해상도 또는 초해상도(super-resolution) 현미경 시스템으로만 관찰할 수 있는 세포 이하 부분의 정확한 위치 측정을 방해한다.
수직 미세유체 시스템은 면역분석 또는 유전분석에 사용될 수 있는 가능한 도구로서 또한 도입되었다. 넓은 챔버와 수직 접근 구멍(access hole)으로 구성된 미세유체 탐침이 샘플의 소영역 지점을 염색하도록 개발되었다(WO 2014/001935). 각 사이클 내 염색된 영역의 치수는 약 100 μm이다. 그러므로, 더 큰 이미지를 얻기 위해서는 많은 염색 단계로 샘플 표면을 스캔해야 할 필요성이 있다. 가능한 위치 측정 오류 및 스캐닝 과정으로 인해 증가된 분석시간 문제 또한 이 방법에 존재한다.
순차적 염색과 이미지화 단계 사이의 용이한 전이를 가능하게 하는 상부 개방 미세유체 장치가 최근 발표되었다(WO 2014/035917). 상기 방법은 이미지화 영역 및 과정 시간 요구사항을 해결하지는 못하지만, 여분의 시간 소비, 조직 손실 및 슬라이드 대 슬라이드 이미지 변화와 같은 이러한 단계의 필요성을 제거함으로써 각각의 연속적인 실행 사이에서 샘플의 커버슬립을 제거해야하는 몇 가지 단점을 극복하는 것을 목표로 한다.
마지막으로, 샘플의 순차적이고 반복된 형광 발색단의 노출을 포함하는 실시간 이미지화가 샘플에 유발된 손상으로 이어지는 것이 관찰되었다. 특히, 형광 표지 항체는 보통 이미지화 중에 샘플 또는 조직에 교차결합되어 이후 샘플 또는 조직으로부터 제거될 수 없으며, 이는 사이클 다중화에 의한 실시간 이미지화의 사용을 더욱 제한한다.
그러므로, 특히 현재 수요가 상당히 확대되고 있는 진단 또는 치료 과정 모니터링 분야의 응용 분야를 위한, 분자 신호의 정확한 위치 측정에 대한 고처리, 고감도, 신뢰성 및 정확성을 갖춘 동일한 시료에 대한 다중 분자 판독을 허용하는 사이클 다중화에 의한 실시간 이미지화를 위한 새로운 기술, 기기 및 도구가 필요하다.
본 발명의 목적은 효율적이고 정확하고 신뢰할 수 있는 방식으로 동일한 샘플에 대한 다중 분자 판독을 통해 다양한 분자 표적의 이미지화를 가능하게 하는 사이클 다중화에 의한 샘플의 실시간 이미지화 방법을 제공한다.
빠르고 민감한 방식으로 샘플에 대해 다양한 분자 표적의 이미지화를 가능하게 하는 사이클 다중화에 의한 샘플의 실시간 이미지화 방법을 제공하는 것이 유리하다.
다중화 과정의 각 사이클 사이의 샘플 지지체로부터 샘플을 탈착하는 것을 피함으로써 샘플의 완전성이 유지되는 사이클 다중화에 의한 샘플의 실시간 이미지화 방법을 제공하는 것이 유리하다.
다중화 과정의 각 사이클 사이의 샘플 지지체로부터 샘플을 탈착할 필요를 피함으로써 및 탈착으로부터 초래되는 재현성의 저하를 방지함으로써 총 분석 시간이 감소되는 사이클 다중화에 의한 샘플의 실시간 이미지화 방법을 제공하는 것이 유리하다.
미세유체 채널 내의 샘플 지지체 상에 고정된 샘플을 샘플 표지 및 이미지화의 완전한 사이클을 수행하고 고처리량 방식으로 이러한 사이클을 반복하는 특정한 순서대로 수행하는 샘플의 표면에서 직접 유동하는 샘플의 표면에서 완전히 제어할 수 있는 이미지화 탐침에 적용하는 사이클 다중화에 의한 샘플의 실시간 이미지화 방법을 제공하는 것이 유리하다.
다중화 과정에서 자유 라디칼 산소 종의 형성을 통한 샘플의 저하 및 이미지화 탐침의 저하를 방지하는 이미지화 완충액의 사용을 통해 이미지화 사이클이 진행되는 동안 샘플 완전성을 보존할 수 있는 사이클 다중화에 의한 샘플의 실시간 이미지화 방법을 제공하는 것이 유리하다.
각각의 후속 사이클에서 필요한 시약 용출 시간을 감소시키고 측정된 이미지화 신호의 재현성 및/또는 감도의 저하 없이 가능한 샘플 표지 사이클의 수를 증가시키는 본 발명에 따른 사이클 다중화에 의한 실시간 이미지화 방법을 사용할 때, 고강도 형광 하에서 이미지화 시약의 교차결합을 방지하는 이미지화 완충액을 제공하는 것이 유리하다.
본 발명의 목적은 청구항 제1항에 따른 방법을 제공함으로써 달성된다.
본 발명의 제1 측면에 따라, 본원에 기재된 것은 하기 단계를 포함하는 사이클 다중화에 의한 샘플의 실시간 이미지화 방법이다:
(i) 샘플 지지체 상에 고정된 샘플을 제공하는 단계;
(ii) 균일한 방식으로 미세유체 챔버의 내부에 유체 물질 및 시약의 이류 운송을 위한 미세유체 챔버를 통해 압력 하에 유체 공급 시스템으로부터 공급된 유체를 처리하도록 배열된 미세유체 챔버, 상기 미세유체 챔버의 하나의 끝에 하나 이상의 유체 주입구 및 상기 미세유체 챔버의 다른 끝에서 하나 이상의 유체 배출구를 포함하는 미세유체 장치를 제공하는 것으로서, 여기서 미세 유체 챔버의 하나 이상의 벽은 상기 샘플 지지체에 의해 형성되고 상기 미세유체 챔버의 부피는 약 2.5 μl 내지 200 μl인 것인 단계;
(iii) 마이크로 챔버의 내부를 향하도록 샘플과 함께 상기 미세유체 챔버 상에 상기 샘플 지지체를 장착하는 단계;
(iv) 약 1 μl/s 내지 약 100 μl/s 범위의 유속에서, 미세유체 챔버 내에 유체 투입구를 통해, 하나 이상의 이미지화 탐침을 포함하는, 복수의 시약을 순서대로 주입하는 단계;
(v) 하나 이상의 이미지화 탐침과 반응한 샘플의 성분에 의해 방출되는 신호를 이미지화 하는 단계;
(vi) 상이한 이미지화 탐침으로 (iv) 및 (v) 단계를 반복하는 단계;
여기서 상기 복수의 시약을 순서대로 주입하는 단계는 하기를 포함한다:
- 샘플에 잠재적으로 잔류하는 표지 탐침(예를 들어, 항체 또는 마커)과 같은 바람직하지 않은 물질을 제거하기 위해 용출 완충액이 주입되는 용출 단계;
- 차단 완충액이 주입되는 비특이적 결합 차단 단계;
- 이미지화 탐침이 주입된 샘플 표지 단계; 및
- 이러한 각각의 단계는 세정 완충액이 주입되는 선택적인 세정 단계에 의해 선행 및/또는 후속될 수 있는, 이미지화 완충액이 주입되는 선택적인 사전-이미지화 단계.
도 1은 실시예 1에 기재된것과 같이 발명의 과정을 수행하는 기기의 예시적 설정의 설명이다.
도 2는 상기 방법(2A)의 이미지화 사이클에서 사용된 시약 순서를 도시하며, 각각의 주요 유동 단계 사이에서 선택적인 세정 완충액을 생략하고 주입된 시약의 순서 및 상기 순서를, 다른 시약(2B)으로 n회 반복하는 것을 나타내는 표지 탐침으로서 샘플 상에 다양한 표적 성분(T1, T2, Tn)을 표적화하는 항체를 사용한 복수-샘플 표지 및 주입된 이미지화 공정의 흐름도이다.
도 3은 본 발명에 따른 방법에서 사용된 샘플의 실시예 2에 기재된 것과 같은 40배 배율의 공초점 형광 현미경에 의해 얻은 이미지이다. A: PBS가 본 발명의 다중화 프로토콜에 따른 이미지화 완충액으로서 사용되고 항원 및 항체 사이의 교차결합이 발생하는 곳; B: 라디칼 제거제(10mM 트롤록스(Trolox))가 보충된 PBS로 구성된 이미지화 완충액이 본 발명의 다중화 프로토콜에 따른 이미지화 완충액으로서 사용되고 항원 및 항체 사이의 교차결합을 방지하는 곳.
도 4는 단일 유방암 조직 절편 상의 다양한 바이오마커의 다중화 동일지역(colocalized) 염색 실시예 3에서 얻은 연속적 이미지를 나타낸다. 상기 A 내지 G의 이미지 순서는 프로토콜에 표시된 획득 순서에 해당한다.
도면, 특히 첫째로 도 1 및 도 2를 참조하여, 하기 단계를 포함하는 사이클 다중화에 의한 샘플의 실시간 이미지화 방법의 설명이 제공된다:
(i) 샘플 지지체(2) 상에 고정된 샘플(1)을 제공하는 단계;
(ii) 균일한 방식으로 미세유체 챔버의 내부(10)에 유체 물질 및 시약의 이류 운송을 위한 미세유체 챔버를 통해 압력 하에 유체 공급 시스템(8)으로부터 공급된 유체를 처리하도록 배열된미세유체 챔버(4), 상기 미세유체 챔버의 하나의 끝에 하나 이상의 유체 주입구(6) 및 상기 미세유체 챔버의 다른 끝에서 하나 이상의 유체 배출구(7)를 포함하는 미세유체 장치(3)를 제공하는 것으로서, 여기서 미세유체 챔버의 하나 이상의 벽(5a)은 상기 샘플 지지체(2)에 의해 형성되고 유지 수단(11)을 통해 미세유체 챔버(5b)의 다른 벽은 제거할 수 있는 방법으로 장착되며 상기 미세유체 챔버의 부피는 약 2.5 μl 내지 200 μl인 것인 단계;
(iii) 샘플(1)이 미세유체 챔버(12)의 내부를 향하도록 샘플과 함께 상기 미세유체 챔버 상에 상기 샘플 지지체를 장착하는 단계;
(iv) 약 1 μl/s 내지 약 100 μl/s 범위의 유속에서, 미세유체 챔버 내로 유체 투입구(6)를 따라, 하나 이상의 이미지화 탐침을 포함하는, 복수의 시약을 순서대로 주입하는 단계;
(v) 상기 하나 이상의 이미지화 탐침과 반응한 샘플의 성분에 의해 방출되는 신호를 이미지화 하는 단계;
(vi) 상이한 이미지화 탐침으로 (iv) 및 (v) 단계를 반복하는 단계;
여기서 상기 복수의 시약을 순서대로 주입하는 단계는 하기를 포함한다:
-샘플에 잠재적으로 잔류하는 표지 탐침(예를 들어, 항체 또는 마커)과 같은 바람직하지 않은 물질을 제거하기 위해 용출 완충액이 주입되는 선택적인 용출 단계(S1);
-차단 완충액이 주입되는 비특이적 결합 차단 단계(S2);
-이미지화 탐침이 주입된 샘플 표지 단계(S3' 및 S3'''을 포함하는 S3); 및 이러한 각각의 단계는 세정 완충액이 주입되는 선택적인 세정 단계의 선행 및/또 는 후속될 수 있는, 이미지화 완충액이 주입되는 선택적인 사전-이미지화 단계(S4).
다른 구체예에서, 상기 이미지화 탐침은 샘플 상의 특정 분자 집단과 상호작용하기에 적합한 표지된 탐침이다. 예를 들어, 이미지화 탐침은 샘플(상보적인 서열)로부터 RNA 또는 DNA 서열과 실시간에서 혼성화하는데 유용한 표지된 RNA 또는 DNA 서열일 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 이미지화 탐침은 표적 항원과 직접 결합하는 표지된 1차 항체(예를 들어 형광성)이다.
다른 구체예에서, 상기 이미지화 탐침은 샘플 내에서 분석된 분자 집단을 표적으로 하는 특정 항체 및 색원체(chromogen) 또는 형광 탐침 분자와 같은 표지 탐침 서열의 주입으로부터 유래한다. 일 구체예에서, 상기 이미지화 탐침은 1차 항체 후에 주입된 표지된 2차(예를 들어 형광성) 항체로부터 유래한다.
특정 구체예에 따라서, 주입된 복수 시약의 유속은 1 μl/s 내지 약 30 μl/s, 예를 들어 약 5 μl/s 내지 약 30 μl/s (예를 들어, 약 25 μl/s)의 범위이다.
다른 특정 구체예에 따라서 샘플 지지 벽에서 미세유체 챔버의 반대쪽 벽까지 거리에 의해 정의된 미세 유체 챔버의 높이는 약 10 μm 내지 약 300 μm의 범위이고, 미세유체 챔버의 대각선 또는 직경은 약 100μm 내지 약 56mm 범위로, 얕고 넓은 형상을 형성한다.
다른 구체예에서, 주입된 복수 시약의 순서에서 각 단계는 미세유체 챔버로부터 용액 유동 단계 순서 내의 이전 용액을 제거하는데 필요한 시간 동안 적용되며, 여기서 상기 제거는 이전에 주입된 농도의 1%까지 이전 용액의 농도가 감소하는 것에 해당한다.
다른 구체예에서, 주입된 복수 시약의 순서에서 각 단계는 미세유체 챔버 내 의도된 프로토콜 농도의 99%까지 주입된 용액의 농도를 증가시키는데 필요한 시간 동안 적용된다.
일 구체예에서, 주입된 복수 시약의 순서에서 각 단계는 약 1초 내지 약 120초, 예를 들어 약 5초 내지 약 20초(예를 들어 약 10초)까지 지속된다.
다른 특정 구체예에서, 복수 시약을 순서대로 주입하는 단계는 하기를 포함한다:
- 세정 완충액을 주입하는 세정 단계(S0);
- 차단 완충액을 주입하는 비특이적 결합 차단 단계(S2);
- 이전에 주입된 차단 완충액이 임의의 유동 조건이 있거나 없는 상태로 배양하는, 선택적 배양 단계;
- 세정 완충액이 주입되는 선택적인 세정 단계;
- 이미지화 탐침이 주입되는 샘플 표지 단계(S3);
- 이전에 주입된 차단 완충액이 임의의 유동 조건이 있거나 없는 상태로 배양하는, 선택적 배양 단계;
- 세정 완충액이 주입되는 세정 단계(S3a)
- 이미지화 완충액이 주입되는 선택적인 사전 이미지화 단계;
여기서 상기 샘플 표지 단계는 이미지화 탐침에 이르는 직접 표지 탐침 또는 표지 탐침 서열을 주입하는 단계를 포함한다.
특정 구체예에 따라서, 상기 샘플 표지 단계는 이미지화 탐침이 이끄는 표지 탐침의 서열을 주입하는 단계를 포함하고, 1차 항체가 주입되는 1차 단계(S3'), 세정 완충액이 주입되는 세정 단계(S3'') 및 표지된 2차 항체가 주입되는 추가 단계(S3'''')를 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 샘플 표지 단계는 1차 항체가 주입되는 1차 단계(SB3'), 세정 완충액이 주입되는 세정 단계(SB3''), 효소-결합 2차 항체가 주입되는 2차 단계(SB3'''), 세정 완충액이 주입되는 세정 단계(SB3''''), 및 2차 항체에 연결된 효소와 반응하는 색원체(chromogen) 또는 형광 검출 분자가 SB3'''''으로 주입되는 추가 단계를 포함한다.
다른 특정 구체예에서, 상기 샘플 표지 단계는 1차 항체가 주입되는 1차 단계(SB3'), 세정 완충액이 주입되는 세정 단계(SC3''), 포스트 1차 항체(post-primary antibody)가 주입되는 2차 단계(SC3''), 2차 항체와 연결된 효소가 주입되는 3차단계(SC3'''), 세정 완충액이 주입되는 세정 단계(SC3''''), 및 2차 항체에 연결된 효소와 반응하는 색원체(chromogen) 또는 형광 검출 분자가 SC3'''''으로 주입되는 추가 단계를 포함한다.
다른 특정 구체예에서, 상기 샘플 표지 단계는 표지된 RNA 또는 DNA 탐침과 같은, 샘플 내 일부 DNA/RNA 물질로 실시간 혼성화와 같은 하나 이상의 표지된 탐침을 주입하는 단계를 포함한다.
추가의 특정 구체예에서, 상기 샘플 표지 단계가 샘플 내 일부 DNA/RNA 물질로 실시간 혼성화를 위한 하나 이상의 표지된 탐침을 주입하는 것을 포함할 때, 본 발명의 방법은 RNA 또는 DNA 탐침과 샘플 내의 일부 DNA/RNA 물질의 혼성화 및 탈혼성화(de-hybridization) 단계에 필요한 미세유체 챔버 내의 온도 사이클을 적용하는 것을 더 포함한다. 예를 들어 미세유체 챔버 또는 샘플 지지체 외부의 히터는 이러한 온도 사이클에 적용할 수 있다. 실시간 혼성화는 예를 들어 Modern Pathology (2011, 24, 613-623; doi:10.1038/modpathol.2010.228)에서 정의된 것과 같은 것으로 달성될 수 있다. 그 후 이미지화는 RNA 및 DNA 서열 검출(표지된 상보적인 서열 탐침)을 위한 고정된 혼성화 탐침 상에서 달성된다.
특정 구체예에서, 상기 샘플 표지 단계가 샘플 내 일부 DNA/RNA 물질로 실시간 혼성화를 위한 하나 이상의 표지된 탐침을 주사하는 것을 포함할 때, 표지된 탐침의 주사는 이미지 완충액, 특히 예를 들어 본원에 기재된 항산화제 및/또는 라디칼 제거제를 하나 이상 포함하는 이미지화 완충액의 주입이 뒤따른다.
다른 특정 구체예에서, 상기 샘플 표지 단계가 샘플 내 일부 DNA/RNA 물질로 실시간 혼성화를 위한 하나 이상의 표지된 탐침을 주입하는 단계를 포함할 때, 용출 단계는 다른 샘플 표지 단계를 반복하기 전에 샘플 상에 잠재적으로 잔류하는 바람직하지 않은 실시간 혼성화된 탐침 또는 마커의 제거를 보장하기 위해 온도 사이클(예를 들어 약 10℃ 내지 약 100℃의 온도 범위에서)를 적용하면서 수행된다. 이 경우, 상기 용출 완충액은 Zhang et al., 2011, 17(10): 2867-2873에 기재된 것과 같은 알칼리성 탈혼성화 완충액을 포함하고(예를 들어 pH 11.2에서) 상기 용출 단계는 새로운 샘플 표지 단계를 수행하기 전에 탈혼성화 온도(예를 들어 약 10℃ 내지 약 100℃의 온도 범위에서)에서 세정 완충액으로 세정 단계가 뒤따른다.
특정 구체예에서, 주입된 복수 시약의 순서에서 각 단계는 각각의 시약에 대해 2개의 유속 단계를 포함한다:
- 시약이 약 1 μl/s 및 약 100 μl/s 사이의 범위 내의 초기 유속에서 시약이 주입되는 제1 유속 단계;
- 순서에서 다음 시약을 주입하기 전에, 샘플 내에 상기 시약의 충분한 유량을 보장하기 위해 동일한 시약을 더 낮은 흐름에서 주입하는 (통상적으로, 약 0.001 내지 약 1.0μl/s) 제2 유속 단계.
추가의 특정 구체예에서, 시약의 상기 제2 유속 단계는 약 1분에서 약 30분까지 지속된다(예를 들어 약 2에서 약 15분).
특정 구체예에 따라서, 제2 유속 단계의 지속시간은 사용된 미세유체 채널의 부피와 샘플과 함께하는 시약의 배양에 필요한 시간에 의존한다. 챔버 높이가 100 μm 미만인 경우 약 1분의 계산된 배양 시간이 필요하다.
일 구체예에서, 상기 이미지화 단계 (v)는 공초점 형광 현미경에 의해 수행된다.
일 구체예에서, 상기 이미지화 단계 (v)는 형광 현미경에 의해 수행된다.
일 구체예에서, 상기 이미지화 단계 (v)는 명시야(bright-field) 현미경에 의해 수행된다.
특정 구체예에 따라서, 세정 완충액은 인산완충식염수(PBS, Phosphate Buffered Saline) 및 트리스완충식염수(TBS, Tris-buffered Saline)로부터 선택된다.
특정 구체예에 따라, 용출 완충액은 세제(TritonX)가 보충된 낮은 pH(예를 들어 pH 2)의 용액으로부터 선택된다. 상기 용출 완충 용액은 고 이온염 농도(예를 들어 약 0.001M NaCl 내지 약 1M NaCl 까지), 카오트로픽제(chaotropic agent) 및/또는 환원/산화제를 더 포함할 수 있다.
특정 구체예에 따라서, 차단 완충액은 시트르산 나트륨 완충액 및 단백질(예를 들어, 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin) 또는 혈청) 및/또는 세제(예를 들어, 트윈(Tween))가 보충된 PBS로부터 선택된다.
특정 구체예에 따라서, 상기 비특이적 결합 차단 단계(S2)는 선택적이다.
특정 구체예에 따라서, 상기 샘플 표지 단계는 1차 항체가 주입되는 제1 단계(S3'), 세정 완충액이 주입되는 세정 단계(S3'') 및 2차 항체가 주입되는 추가 단계(S3'''')를 포함한다.
특정 구체예에 따라서, 본 발명의 상기 1차 항체는 Dabbs, Diagnostic Immunohistochemistry: theranostic and diagnostic applications, 4th edition, 2014, ISBN 978-1-4557-4461-9에 기재된 것과 같은 임의의 면역조직화학 및 면역형광 분석을 위한 임의의 적합한 항체일 수 있다. 예를 들어, 적절한 항체는 임상적으로 관련된 에피토프(epitope)에 대해 지시된 마우스 또는 토끼 항-인간 면역글로불린(Immunoglobulin) G 또는 Y 항체이다.
다른 특정 구체예에 따라서, 상기 이미지화 완충액은 하나 이상의 항산화제 및/또는 라디칼 제거제를 포함한다. 항산화제 및/또는 라디칼 제거제의 예시는 아스코르브산, 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카복실산(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid, Trolox), 사이클로옥타테트라엔, 리포익산 및 4-니트로벤질 알콜로부터 선택된다.
다른 특정 구체예에 따르면, 상기 이미지화 완충액은 증류수, 인산완충식염수(PBS, Phosphate Buffered Saline) 및 트리스완충식염수(TBS, Tris-buffered Saline)로부터 선택된다.
다른 특정 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 이미지화 완충액은 하나 이상의 항산화제 및/또는 라디칼 제거제를 포함하며, 여기서 상기 하나 이상의 항산화제 및/또는 라디칼 제거제는 가용성 형태, 즉, 이미지화 완충 용액의 형태이다(Altman et al., 2011, Nat Methods, 9(1), 68-71).
다른 구체예에서, 상기 유동은 연속적인 방법으로 적용된다.
특정 구체예에 따라서, 본 발명에 따른 방법은 단계 (iv) 내지 (vi)를 약 2 내지 80 사이클 이상, 특히 단계 (iv) 내지 (vi)를 약 20 내지 80 사이클 이상 포함한다.
특정 구체예에 따라서, 본 발명에 따른 방법은 단계 (iv) 내지 (vi)를 2 내지 약 200 사이클까지, 특히 2 내지 약 20 사이클까지 또는 2 내지 약 100 사이클까지 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 본원에 기재된 것은 적어도 하나의 항산화제 및/또는 라디칼 제거제를 포함하는 이미지화 완충액, 특히 여기서 적어도 하나의 항산화제 및/또는 라디칼 제거제는 약 1mM에서 약 1,000mM(예를 들어, 약 10 내지 약 1,000mM 또는 약 1 내지 약 10mM) 사이로 포함되는 농도로 존재한다.
다른 구체예에 따라, 약 10 내지 약 1,000mM의 아스코르브산(예를 들어, 약 100mM) 또는 약 1 내지 약 10mM의 트롤록스 또는 리포산을 포함하는 본 발명에 따른 이미지화 완충액을 제공한다.
추가의 특정 구체예에서, 본원에 기재된 것과 같은 사이클 다중화에 의한 샘플의 실시간 이미지화 방법을 제공하고 여기서 상기 발명에 따른 이미지화 완충액은 사전-이미지화 단계에서 주입된다.
일 측면에 따라, 본 발명의 방법은 특히 생물학적 샘플, 조직 절편, 세포 배양, 단백질 또는 핵산 제조를 포함하는 다양한 샘플 상의 분자 프로파일링의 사이클 다중화에 의한 샘플의 실시간 이미지화를 허용한다.
다른 측면에 따라, 상기 샘플은 상이한 유형의 기술에 의해 고정된 것과 같은 본 발명의 방법에 의한 분석을 위해 제공되는 것이고 포르말린-고정 파라핀-포매 (FFPE) 조직 샘플, 극저온 고정 조직 샘플, 세포 얼룩, 바늘 생검 샘플 및 고정된 세포 제조를 포함한다. 샘플 유형 및 원하는 응용에 따라 다양한 유형의 샘플 제조 단계를 구현할 수 있다.
다른 측면에 따라, 표지 탐침은 화학 염료, 항체 및 항체 단편 또는 실시간 혼성화 또는 증폭 탐침과 같은 이미지화 탐침 유도하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
앞서 언급한 특징들은 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다.
본 발명의 유리한 특징은 배양, 세척 및 용출 사이클 시간이 수 분으로 감소되어 동요하는 주위의 조건 및 강한 완충액에 노출되는 동안 샘플 항원의 분해를 방지하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 유리한 특징은 전용 또는 맞춤 시약, 완충액 또는 다중 표지를 위한 검출 시스템을 필요로 하지 않으면서 통상적인 검출 시스템과 결합된 통상적인 1차 및 2차 항체와 같은 통상적인 샘플 표지를 허용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 방법에 대한 주목할만한 이점은 샘플 완전성에 영향을 미치고 재생산의 열화를 초래하고 이러한 공정의 완전 자동화를 막는 각 이미지화 사이클을 통한 샘플 커버슬립의 반복적인 장착 및 탈착 필요성을 제거하였다는 것이다.
본 발명의 방법에 대한 추가의 주목할만한 이점은 다중화 분석을 위해 100%의 샘플 영역을 사용한다는 것이다.
본 발명의 다른 유리한 특징은, 다음 분석 단계를 수행하기 전에 용출 단계를 거치는 동안 분석물로부터 형광 분자와 같은 표지 탐침을 효율적으로 제거하기 위해 이미지화 단계를 거치는 동안 특이적 이미지화 완충 조성물을 사용하여 다중-사이클 성능을 추가적으로 개선하는 방법을 제공하는 것이고 샘플 표지 단계를 거치는 동안 사용한 표지된 분자의 샘플의 광 유발 변형을 방지하는 것이다.
샘플 분석과는 별개로, 본 발명에 따른 방법은 현정 혼성화와 같은 유전적 서열 검출을 다중화하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 청구항, 상세한 설명 및 도면으로부터 명백해질 것이다. 본 발명을 설명하였지만, 하기의 실시예는 설명하기 위해 제시되었으며, 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 연속적인 샘플 표지 사이클을 수행하기 위한 다중화 프로토콜 실시예
사이클 다중화에 의한 샘플의 실시간 이미지화에 대한 본 발명의 방법은 도 1에 예시된 바와 같이 포르말린-고정 파라핀-포매 (formalin-fixed parafiin-embedded, FFPE) 조직 상의 장치 내에 구현된다.
a) 샘플 제조 예시
상이한 유형의 샘플 제조 단계는 샘플 유형과 원하는 응용에 따라 구현될 수 있다. 본 실시예에서, 다중염색 공정 전에 수행했던 FFPE 샘플 조직에 대한 상기 샘플 제조 단계는 통상적인 실시예로서 여기에 기재된다.
상기 생물학적 샘플을 먼저 10분간 65℃에서 탈수한다. 5분간 냉각시킨 후에, 상기 조직 절편을 히스토클리어(Histoclear) 용액 (예를 들어 자이롤(xylol)) 내에 10분간 탈왁스(dewax)시킨 후 각각 100%, 95%, 70% 및 40% 에탄올로 재수화한다. 마지막으로 20분 동안 95℃의 수조 또는 전기 압력 쿠커(cooker) 내에 나트륨 시트레이트 완충액 (약 pH 6) 또는 EDTA 완충액 (약 pH 9)으로 열 유발 항원 회수 과정(heat-induced antigen-retrieval process)을 수행한다. 정확한 프로토콜은 사용된 표지 탐침에 의존한다. 그 후 상기 샘플은 다음의 예시적인 장치에 예시된 바와 같이 본 발명의 방법을 수행하기 위해 준비된다.
b) 본 발명의 방법을 구현하기 위한 장치의 예시
도 1은 본 발명의 방법을 구현하기 위한 예시적인 장치(3)의 단면도를 보여주며 여기서 예를 들어 a)에서 제조된 것과 같은 샘플(1)은 샘플 지지체(2) 상에 고정되며 상기 샘플 지지체는 샘플(1)이 마이크로유체 챔버의 내부 부분을 향하도록, 상기 마이크로유체 챔버의 유체 공급 주입구를 향하는 마이크로유체 챔버(5b)의 벽 상에 유지된다.
c) 이미지화 시약 순서의 예시
본 발명의 다중화 방법의 초기 사이클은 조직 및 시약 제조 후에 시작될 수 있다. 연속적인 샘플 표지 및 이미지화 사이클을 수행하기 위해 이용되는 본 발명에 따른 다중화 방법에 사용되는 이미지화 시약 순서(세정/용출 용액, 차단 용액, 표지 탐침 용액 등)가 도 2A에 개략적으로 나와 있다. 이러한 이미지화 시약 순서는 유체 공급 시스템(8)에 의해 유체 투입구(6)를 통해 유체공급 챔버(4) 내에 연속적으로 도입된다.
0단계: 세정 단계
각 사이클은 인산완충식염수(PBS) 및 트리스완충식염수(TBS)와 같은 시스템을 통해 완충액을 흐르게 하여 조직 샘플을 먼저 세척하는 것으로 시작한다.
1단계: 용출 단계
상기 세정 완충액은 용출 완충액에 의해 이미지화 시약의 순서를 따르며, 그 조성 및 pH 조건은 샘플 상에 잠재적으로 잔류하는 바람직하지 않은 물질(예를 들어 항체 또는 마커와 같은 표지 탐침)을 제거하기 위해 분석된 시료에 따라 다를 수 있다. 예를 들어 0.05% 트리톤X 세제가 보충된 pH2의 0.1M 글리신 완충액이 용출 완충액으로 사용될 수 있다.
2단계: 비특이적 결합 차단 단계
그 후 차단 완충액(예를 들어 소혈청알부민과 함께 사용되는 나트륨 시트레이트 완충액 또는 PBS-트윈)을 미세유체 챔버를 통해 이미지화 시약 배열의 순서대로 유입시켜 후속 단계에서 단백질의 비특이적 결합을 저하시킨다.
3단계(3', 3'' & 3'''): 샘플 표지 단계
그 후 이미지화 탐침 또는 이미지화 탐침으로 이어지는 표지 탐침은 미세유체 채널을 흐르는 이미지화 시약의 순서대로 주입된다. 예를 들어 표지된 탐침으로 이어지는 표지 탐침의 순서는 각 단계 사이에 세정 용액과 함께 샘플을 세척하면서 1차 후 2차 항체(표지 탐침)가 흘러가고 배양되는 순서를 포함한다. 상기 표지 탐침의 희석 비율은 최적화된 프로토콜 또는 판매사의 지침에 따라 결정한다. 대안으로, 샘플 표지 단계의 다른 실시예는 실시간 혼성화를 위한 RNA 또는 DNA 표지된 탐침을 주입하는 단계를 포함한다. 이 경우, 상기 방법은 샘플 내의 RNA 또는 DNA 물질과 RNA 또는 DNA 표지 탐침의 상보적인 서열의 혼성화를 보장하기 위한 적절한 온도 사이클을 적용하는 단계를 더 포함한다.
4단계: 이미지화 단계
이미지화는 이러한 사이클의 마지막에, 그리고 궁극적으로 이미지화 완충액이 미세유체 채널 내에 흐른 후에 수행된다.
전체 사이클 과정은 다른 이미지화 탐침으로 약 50회까지 반복될 수 있다. 실시간 혼성화의 관점에서 샘플 표지가 달성되는 하나의 사이클의 경우, 상기 방법은 다른 샘플 표지 단계, 예를 들어 용출 단계와 함께 상기 방법을 반복하기 전에 동안 샘플 상에 잠재적으로 잔류하는 바람직하지 않은 실시간 혼성화 탐침 또는 마커의 제거를 보장하기 위한 온도 사이클의 적용을 더 포함할 수 있다.
도 2B는 도 2A에 개략적으로 나타난 이미지화 시약 배열의 순서 반복 및 상기 순서를 n회 반복한 것을 나타내는 샘플 상의 다양한 표적을 표적화하는 표지 탐침으로서 1차 후 2차 항체를 이용한 다중화 샘플 표지 및 이미지화 공정의 흐름도의 예시를 나타낸다. 하기의 표 1은 통상적인 적용에 대한 샘플 표지의 하나의 사이클의 시간에 따른 차트의 예시를 나타낸다. 각 사이클은 약 10분 미만으로 감소할 수 있으며, 따라서 이러한 특별한 경우 샘플 표지의 약 50사이클이 수행되기 위해서는 약 5시간의 샘플 표지 시간이 필요하도록 이어질 수 있다. 상기 이미지화 시간은 형광 채널의 수, 이미지화 영역 및 각 사이클에 요구되는 해상도에 따라 다르며, 단계 당 1분에서 120분까지 다양하다. 그러므로, 이미지화와 샘플 표지에 요구되는 총 시간은 약 6시간이어서 이미지화와 함께 샘플 표지를 50 사이클 완료한다.
시약 유동 지속시간 (초) 배양 시간 (초) 단계 시간(초)
사
이
클 (n) 		용출 완충액 12 60 72
세정 완충액 20 - 20
차단 완충액 12 60 72
세정 완충액 20 - 20
1차 항체 (n) 12 120 132
세정 완충액 20 - 20
2차 항체 (n) 12 120 132
세정 완충액 20 - 20
이미지화 완충액 20 - 20
합계 148 360 508
d) 샘플 방법의 예시
본 발명의 방법으로 수행된 연속적인 샘플 표지 사이클의 이미지화 결과는 하기에 기재된 바와 같다.
세포 배양(Cell Culture)
헤라 쿄토(HeLa Kyoto) 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 10% 태아소혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 보충된 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium) 내에서 배양시킨다. 트립신화 및 재현탁 후 상기 세포 현탁액을 청소된 청정실에서 무균 조건하에 매우 얇은(ultra-thin) 붕규산염 슬라이드(25X75 mm 두께 170μm)에 피펫으로 로딩하여 10cm 페트리디쉬 내부에 배치하고 80%의 컨플루언스(confluence)에 도달할 때까지 2-3일간 성장시킨다.
고정
상부에 성장시킨 세포가 있는 유리 슬라이드를 페트리디쉬에서 제거하고 인산완충식염수(PBS)로 유리 병 내에서 씻은 후 30분 동안 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde, PFA)가 보충된 PBS 내에 잠기게 한다.
침투
상기 유리 슬라이드를 PBS로 다시 세척한 후 15분 동안 0.25% 트리톤-X 세제가 보충된 PBS 내에 잠기게 한다. 그 후, 상기 슬라이드를 본 발명의 방법을 구현하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 장치 내에 삽입한다.
다중화 단계
샘플 표지, 이미지화 및 용출의 반복 사이클을 장치 내에서 수행하고 이미지화를 수행한다.
세정: PBS를 10초 동안 25μl/s으로 적용한다. (S0)
차단: 5% 염소 혈청을 보충한 PBS를 10초 동안 25μl/s으로 적용하고 그 후 2분간 0.015μl/s의 연속적인 흐름 하에 배양한다. (S2)
1차 항체 결합: 5% 염소 혈청 및 항원 특이적 마우스 항-인간, 래빗 항-인간 1차 항체를 보충한 PBS (2014, supra, Dabbs에 기재된 바와 같은 임의의 면역조직화학 및 면역형광 분석을 위한 1차 항체)(1:10-1:1000의 희석, 일차 항체 용액의 농도 및 항체 친화도에 의존)는 10초간 15μl/s의 유속으로 적용되고 그 후 15분간 0.015μl/s의 연속적인 흐름 하에 배양한다. (S3')
세정: PBS를 10초 동안 25μl/s으로 적용한다. (S3'')
2차 항체 결합: 5% 염소 혈청, DAPI 및 염소 항-래빗 및 염소 항-마우스 2차 항체가 보충된 PBS (1:250으로 희석, 8μg/ml)는 알렉사 형광단(Alexa fluorophores) 568 및 647로 각각 표지되고, 10초간 15μl/s의 유속으로 적용하고 그 후 15분간 0.015μl/s의 연속적인 흐름 하에 배양한다. (S3''')
세정: PBS를 10초 동안 25μl/s으로 적용한다. (S3a)
이미지화: 이미지화 완충액(100mM의 아스코르브산이 보충된 PBS)을 10초 동안 25μl/s으로 적용하고 그 후 이미지화 과정 전반에 걸쳐 0.015μl/s로 연속적으로 적용한다. (S4)
이미지는 그 후 DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol) 염색 (405nm에서 노출) 및 상기 2개의 면역형광 염색, 알렉사 형광단 488 및 568 (488 및 561nm에서 각각 노출)에 대해 3개의 분리된 채널에서 40x 배율의 공초점 회전 디스크 현미경(confocal spinning disk microscope)으로 얻는다. 약 500-1,000개의 획득 영역(acquisition sites)의 대면적을 스캔하고 각 위치에서 채널당 10개의 초점 면을 획득한다. 상기 DAPI 채널은 각 사이클에서 얻으므로 사이클 간 이동의 경우 다른 사이클에서 획득한 이미지의 계산적 정렬을 위해 사이클에 걸쳐 참조로 사용할 수 있다.
세정: PBS를 10초 동안 25μl/s으로 적용한다.
용출: 용출 완충액(0.05% 트리톤 X 세제가 보충된 pH2의 0.1M 글리신 용액)을 10초 동안 15μl/s의 유속으로 적용하고 그 후 1분 동안 0.015μl/s의 연속적인 흐름 하에 배양한다. 이 단계는 두 번 수행한다.
실시예 2: 본 발명의 방법에서 본 발명의 이미지화 완충액을 사용하는 실시예
본 실시예는 본 발명에 따른 방법에서 특히 유용한 고강도 빛 하에서 샘플로부터 형광 분자의 효율을 개선시키는데 사용되는 본 발명에 따른 이미지화 완충액의 사용을 설명한다.
포르말린으로 고정된 HeLa 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 다중화 프로토콜에 따라 1회의 샘플 표지 사이클에 적용하였다. 그 후 이미지화는 이미지화 완충액으로서 인산완충식염수(PBS) 단독 또는 라디칼-제거제와의 조합으로 사용하여 수행하였다. 그 후, 용출 단계를 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행했고 제2 샘플 표지 사이클을 수행했고 1차 항체 결합 단계를 생략하고, 제1 이미지화 단계와 비교했을 때 더 큰 이미지화 영역을 스캔하는 한편, 다른 레이저 강도 및 노출 시간과 같은 이미지화 파라미터는 변경되지 않은 채로 남겨졌다. 표시된 이미지에서, 윤곽선이 있는 상자는 제1 이미지화 단계의 획득 영역을 나타낸다.
도 3A는 PBS 단독으로 존재 시 이미지화에서 항원과 항체 사이의 광-유도 교차결합을 나타낸다.
도 3B는 10mM의 트롤록스 (Trolox, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)가 보충된 PBS의 존재 시 이미지화에 동일한 사전-표지 및 표지 조건에 노출된 유사한 샘플을 보여준다.
이러한 데이터는 이미지화 완충액에 항산화제 및/또는 라디칼 제거제의 첨가가 샘플의 실시간 이미지화에 사용된 항원 및 항체 사이의 광-유도 교차결합을 방지하고, 샘플로부터 사이클 다중화에 의해 형광 분자 제거 효율을 증가시키므로 본 발명의 방법의 처리량이 증가하게 됨을 지지한다.
실시예 3: 유방암 샘플에서 ER, CK, PR 및 HER2의 다중화된 동일지역 염색(Multiplexed colocalized staining)
포르말린-고정 파라핀-포매(formalin-fixed parafin-embedded, FFPE) 조직 슬라이드는 본 발명에 개시된 방법을 사용하여 각 단계 사이에서 샘플을 이미지화하면서도 염색될 수 있다. 설명을 위한 실시예로서, 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(PR), 사이토케라틴(CK), 상피 성장 인자 수용체 2 (HER2)에 양성인 FFPE 유방암 절편을 예비 시험 결과로부터 도출된 자료에 따라 결정된 복수개의 시약 및 이미지화 단계들을 순서대로 사용하는 본 발명의 방법에 따른 순차적 다중화를 이용하여 염색하였다. 상기 샘플은 먼저 이전의 실시예에 기재되고 이어서 하기의 표2에 요약된 본 발명의 실시간 이미지화 방법이 수행된 바와 같은 탈왁싱, 재수화 및 항원 회수 과정을 통해 염색에 대해 준비되었다. 각 마커는 서로 다른 파장의 형광 검출 탐침(Alexa Fluor)을 사용한 샌드위치 분석을 이용하여 이미지화 단계에서 검출되었다. 항체의 효율적인 용출을 위해, 용출 완충액과 도데실 황산나트륨(SDS, Sodium Dodecyl Sulfate)의 조합이 용출 단계에서 사용되었다. 대조 이미지는 표적화된 바이오마커(ER, PR, CK 및 HER2)의 특이적 검출을 확인하기 위해 각 염색(이미지화 단계 1 내지 4) 후 및 다음 단계에서 이미지화될 다음 바이오마커를 염색하기 전에 항체 제거 완료를 확인하기 위해 다음 사이클로부터 모든 용출 단계 후에 얻어진다. 동일한 슬라이드를 이미지화하고 재염색하기 위해, 글리세롤 기반의 장착 용액(SlowFade Gold)이 이용 되었다. 이 방법으로 얻은 연속 이미지를 도 4에 나타내었으며 각각의 염색(A, C, E 및 G) 및 용출 단계(B, D 및 F) 후의 샘플 이미지는 염색 및 용리 효율 모두를 입증하고자 나타낸다.
단계 시약 유동지속시간 (s) 배양시간
(s) 		단계시간 (s)
샘플제조 탈왁싱 히스토클리어™ - - 600
재수화 100%에서 0% 까지의 에탄올 - - 120
항원 회수 pH 9 트리스/EDTA - - 2400
단계 시약 유동지속시간 (s) 배양시간 (s) 단계시간 (s)








다중화
(n=4) 		사이클 1
샘플 표지 단계 1 1차 항체 (1)
마우스 항-ER, dil 1/50		 10 240 250
세정 완충액: PBS 10 - 10
2차 항체 (1)
Alexa Fluor 546 염소 항-마우스 IgG, dil. 1/40		 10 240 250
세정 완충액: PBS 10 - 10
이미지화 단계 1 반대염색
SlowFade Gold + DAPI		 - - 0
사이클 2
용출 단계 S1'
용출 완충액
EB+SDS 0.5%		 10 240 250
세정 완충액: PBS 10 - 10
샘플 표지 단계 2 1차 항체 (2)
마우스 항-CK, dil 1/100		 10 120 130
세정 완충액 : PBS 10 - 10
2차 항체 (2)
Alexa Fluor 647 염소 항-마우스 IgG, dil. 1/40		 10 120 130
세정 완충액: PBS 10 - 10
이미지화 단계 2 = 이미지화 단계 1과 동일
사이클 3
용출 단계 S1'' = S1'과 동일
샘플 표지 단계 3 1차 항체 (3)
마우스 항-PR, dil 1/100		 10 240 250
세정 완충액: PBS 10 - 10
2차 항체 (3)
Alexa Fluor 647 염소 항-마우스 IgG, dil. 1/40		 10 240 250
세정 완충액: PBS 10 - 10
이미지화 단계 3 = 이미지화 단계 2와 동일
사이클 4
용출 단계 S1''' = S1'과 동일
샘플 표지 단계 4 1차 항체 (4)
토끼 항-HER2, dil 1/250		 10 120 130
세정 완충액: PBS 10 - 10
2차 항체 (4)
Alexa Fluor 594 염소 항-마우스 IgG, dil. 1/40		 10 120 130
세정 완충액: PBS 10 - 10
이미지화 단계 4 = 이미지화 단계 1과 동일
최종 다중화
220 2160 2380
상기 결과는 본 발명에 따른 다중화 방법이 유리하게는 동일한 높은 염색 효율과 대조를 보이는 동일한 생물학적 샘플 상의 다양한 바이오마커에 대한 다중화된 동일지역 염색을 가능하게 하며, 여기서 상기 염색은 다양한 바이오마커를 위한 상이한 이미지화 시약 사이에서 상호작용 없이, 그리고 약 40분의 제한된 전체 실험 시간 내에 관심을 갖게 하는 바이오마커 상에서 선택적으로 수행된다.

Claims (18)

  1. 하기의 단계를 포함하는 사이클 다중화에 의한 샘플의 실시간(in situ) 이미지화 방법:
    (i) 샘플 지지체 상에 고정된 샘플을 제공하는 단계;
    (ii) 미세유체 챔버, 균일한 방식으로 상기 미세유체 챔버 내부에 유체 물질 및 시약의 이류 수송을 위해 미세유체 챔버를 통해 압력 하에 유체 공급 시스템으로부터 공급된 유체를 전달하기 위해 구성되는 상기 미세유체 챔버의 일 말단의 하나 이상의 유체 투입구 및 상기 미세유체 챔버의 다른 말단의 하나 이상의 유체 배출구를 포함하되,
    여기서 상기 미세유체 챔버의 하나 이상의 벽은 상기 샘플 지지체에 의해 형성되고 상기 미세유체 챔버의 부피는 약 2.5 내지 200㎕인 미세유체 장치를 제공하는 단계;
    (iii) 샘플이 미세유체 챔버의 내부를 향하도록 상기 미세유체 챔버 상에 상기 샘플 지지체를 장착하는 단계;
    (iv) 약 1 ㎕/s 내지 약 100 ㎕/s의 범위의 유속으로 유체 투입구를 통해 미세유체 챔버 내에 하나 이상의 이미지화 탐침을 포함하는, 복수개의 시약을 순서대로 주입하는 단계;
    (v) 상기 하나 이상의 이미지화 탐침과 반응한 샘플의 성분에 의해 방출되는 신호를 이미지화 하는 단계;
    (vi) 상이한 이미지화 탐침으로 (iv) 및 (v) 단계를 반복하는 단계;
    여기서 상기 복수개의 시약을 순서대로 주입하는 단계는
    - 샘플 상에 잠재적으로 잔류하는 바람직하지 않은 물질을 제거하기 위해 용출 완충액을 주입하는 용출 단계;
    - 차단 완충액을 주입하는 비특이적 결합 차단 단계;
    - 이미지화 탐침을 주입하는 샘플 표지 단계; 및
    - 이미지화 완충액을 주입하는 선택적인 사전-이미지화 단계를 포함하고 이러한 각각의 단계는 세정 완충액을 주입하는 선택적인 세정 단계에 의해 선행 및/또는 후속될 수 있는 것이고,
    여기서 상기 하나 이상의 이미지화 탐침은 표지 탐침 및 색원체 또는 형광 검출 분자로서, 상기 샘플 내에 분석될 분자체들을 표적으로 하는 일련의 특이적 항체를 주입하여 초래됨.
  2. 제1항에 있어서, 주입되는 복수개의 시약 순서의 각 단계는 각각의 시약에 대해 2개의 유속 단계를 포함하는 방법:
    - 시약이 약 1 ㎕/s 내지 약 100 ㎕/s 범위의 초기 유속으로 주입되는 제1 유속 단계;
    - 순서 내 다음 시약을 주입하기 전에, 동일한 시약을 더 낮은 흐름(통상적으로, 약 0.001 내지 약 1.0 ㎕/s)으로 주입하여 샘플과 상기 시약을 배양하도록 보장하는 제2 유속 단계.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제1 유속 단계는 약 1초에서 약 120초까지 지속되는 것인 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 제2 유속 단계는 약 1분에서 약 30분까지 지속되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 표지 단계는 1차 항체가 주입되는 제1 단계(S3'), 세정 완충액이 주입되는 세정 단계(S3'') 및 제2 항체가 주입되는 추가 단계(S3''')를 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수개의 시약을 순서대로 주입하는 단계는 하기를 포함하는 방법:
    - 세정 완충액이 주입되는 세정 단계(S0);
    - 차단 완충액이 주입되는 비특이적 결합 차단 단계(S2);
    - 이미지화 탐침이 주입되는 샘플 표지 단계(S3);
    - 세정 완충액이 주입되는 세정 단계(S3a);
    - 이미지화 완충액이 주입되는 선택적 사전-이미지화 단계(S4)
    여기서 상기 샘플 표지 단계는 1차 항체가 주입되는 제1 단계(S3'), 세정 완충액이 주입되는 세정 단계(S3'') 및 제2 항체가 주입되는 추가 단계(S3''')를 포함함.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 표지 단계는 샘플 내 표지된 RNA 또는 DNA 탐침과 같은 일부 DNA/RNA 물질과 함께 실시간 혼성화를 위해 하나 이상의 표지된 탐침을 주입하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 샘플 표지 단계는 상기 샘플 내 DNA/RNA 물질을 RNA 또는 DNA 탐침과 혼성화하기 위해 미세유체 챔버 내에 온도 사이클을 적용하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이미지화 단계 (v)는 형광 현미경 또는 명시야 현미경에 의해 수행되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 (iv) 내지 (v) 단계를 약 2 내지 80 사이클 포함하는 것인 방법.
  11. 제7항에 있어서, (vi) 단계 하의 용출 단계는 다른 샘플 표지 단계의 방법을 반복하기 전에 샘플 상에 잠재적으로 잔류하는 바람직하지 않은 실시간 혼성화 탐침 또는 마커의 제거를 보장하기 위해 온도 사이클을 적용하면서 수행되는 것인 방법.
  12. 하나 이상의 항산화제 및/또는 라디칼 제거제가 약 1mM 내지 약 1,000mM 사이로 포함되는 농도로 존재하는, 하나 이상의 항산화제 및/또는 라디칼 제거제를 포함하는 이미지화 완충액.
  13. 제10항에 있어서, 상기 항산화제 및/또는 라디칼 제거제는 아스코르브산, 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산(트롤록스), 사이클로옥타테트라엔, 리포익산 및 4-니트로벤질 알콜 중에서 선택되는 것인 이미지화 완충액.
  14. 약 100mM의 아스코르브산을 포함하는 제12항 또는 제13항에 따른 이미지화 완충액.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이미지화 완충액은 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 이미지화 완충액인 방법.
  16. 약 1mM 내지 약 1‘000mM 사이로 포함되는 농도로 하나 이상의 항산화제 및/또는 라디칼 제거제를 포함하는, 이미지화 탐침에 의해 방출된 신호를 이미지화하기 위한 이미지화 완충액으로서의 용액의 용도.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항산화제 및/또는 라디칼 제거제는 아스코르브산, 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산(트롤록스), 사이클로옥타테트라엔, 리포익산 및 4-니트로벤질 알콜에서 선택되는 것인 용액의 용도.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 약 100mM의 아스코르브산을 포함하는 용액의 용도.
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