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CN102597740B - 用于抗原提取过程的方法和装置 - Google Patents

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CN102597740B CN201080038562.5A CN201080038562A CN102597740B CN 102597740 B CN102597740 B CN 102597740B CN 201080038562 A CN201080038562 A CN 201080038562A CN 102597740 B CN102597740 B CN 102597740B
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Abstract

本发明提供甲醛固定的组织样品的抗原提取的方法，所述方法包括在大于90℃的温度在第一抗原提取溶液中培养甲醛固定的组织样品，将组织样品转移到第二抗原提取溶液，并在大于90℃的温度在第二抗原提取溶液中培养组织样品。本发明还提供进行所述方法的试剂盒和样品输送装置。

Description

用于抗原提取过程的方法和装置
背景
诊断细胞成像使用多种方法，通过这些方法，可使细胞或组织产生的分子特异定位到那些细胞或组织。这给研究者提供那些所给分子的产生或活性的部位方面的信息。对于常规病理学中蛋白的特异定位，常规利用称为免疫组织化学(IHC)的程序。在IHC中，将用于特异抗原的抗体施加到识别已知特异分子的固定组织样品作为第一步骤。然后用已与酶(如辣根过氧化物酶)化学偶合的第二抗体检测此抗体。在用显色底物(如二氨基联苯胺(DAB))培养后，在已于关注蛋白的特异部位结合到第一抗体的第二抗体部位产生有色沉积。此程序目前用于临床病理学实验室中超过200种抗体，在研究环境中多更多。
组织处理的性质需要样品在嵌入石蜡和在切片机上微切片之前“固定”，以产生适用于免疫染色的组织切片。在此过程期间，用产生保持组织细胞特征的化学交联的甲醛处理保存蛋白。甲醛主要通过使蛋白中的伯胺基与蛋白或DNA中的其它邻近氮原子通过-CH2-键交联而保存或固定组织或细胞。然而，组织固定的过程经常掩盖对诊断和预测目的所期望检测的特异蛋白上的抗原。为了检测单个靶分子，一般使程序最佳化，并且在需要时，为了检测另外的靶分子，以不同方式处理连续切片。随着检测单一样品中多种抗原的能力的提高，需要与检测多种蛋白相容的一致的组织处理。
简述
第一方面，本发明提供甲醛固定的组织样品的抗原提取的方法，所述方法包括以下步骤：在大于90℃的温度在第一抗原提取溶液中培养甲醛固定的组织样品，将组织样品转移到第二抗原提取溶液，并在大于90℃的温度在第二抗原提取溶液中培养组织样品。
第二方面，本发明提供用于提取甲醛固定的组织样品中的抗原的试剂盒，所述试剂盒包含提取样品中至少一部分未提取抗原的第一抗原提取溶液，和提取样品中至少一些另一部分未提取抗原的第二抗原提取溶液。
第三方面，本发明提供用于进行抗原提取方法的样品处理装置，所述样品处理装置包含样品处理子系统、试剂分配子系统和信号检测子系统。
附图
当参考附图阅读以下详细描述时，本发明的这些和其他特征、方面和优点将变得更好理解，其中在全部附图中相同的符号代表相同的部件：
图1为用于使甲醛固定的组织样品与抗原提取溶液接触的代表性样品处理装置。
图2为显示与一步程序比较用二步程序的增强染色的单色显微相片(在20X或63X放大倍数)。
图3显示单色显微相片(在20X放大倍数)，其显示在BrCA肿瘤的多元分析FISH中用二步程序的增强染色。
图4为人工二步抗原提取方法与自动方法比较的定量分析结果的条形图。
图5显示在通过人工二步抗原提取方法或两种自动抗原提取方法之一制备的样品上对抗原-S6染色的漂白作用的单色显微相片(在20X放大倍数)。
详述
为了更清楚和简要地描述和指出要求保护的本发明的主题，对在以下说明及其所附权利要求中使用的具体术语提供以下定义。
定义
“抗体”是指特异结合到另一个分子的特定空间和极性组织从而定义为与所述特定空间和极性组织互补的免疫球蛋白。抗体可以为单克隆或多克隆，并且可通过在本领域公知的技术制备，例如宿主的免疫和血清的收集(多克隆)，或者通过制备连续杂交细胞系，并收集分泌的蛋白(单克隆)，或者通过克隆和表达核苷酸序列或其诱变处理的变种，至少对天然抗体的特异结合所需的氨基酸序列编码。抗体可包括完全免疫球蛋白或其片段，这些免疫球蛋白包括不同种类和同种型，如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM。功能抗体片段可包括能够保持以相似亲合力结合到全长抗体的抗体部分(例如，Fab、Fv和F(ab′)2或Fab′)。另外，在适当时，可使用免疫球蛋白或其片段的聚集体、聚合物和缀合物，只要实质保持对特定分子的结合亲合力。
“抗原”是指可结合抗体或抗体片段的物质。抗原可以为内源性，由此使它们由于正常或异常细胞代谢或由于病毒或胞内细菌感染在细胞内产生。内源性抗原包括异种(异源)、自体和个体基因型或同种(同源)抗原。抗原也可以为肿瘤特异抗原或由肿瘤细胞展现。在此情况下，将它们称为肿瘤特异抗原(TSA)，一般产生于肿瘤特异突变。抗原也可以为由肿瘤细胞和正常细胞展现的肿瘤相关抗原(TAA)。抗原也包括CD抗原，CD抗原是指由白细胞表达的任何一些细胞-表面标记，并且可用于区分细胞谱系或发育阶段。这些标记可通过特异单克隆抗体识别，并且通过它们的分化簇编号。
“FISH”和“CISH”分别指荧光原位杂交和显色原位杂交。FISH是用于检测和定位在染色体上是否存在特异DNA序列或在转录部位和在细胞其它部分中是否存在RNA序列的细胞遗传学技术。FISH使用只结合到部分染色体的荧光探针，用那些部分它们显示高度序列相似性。CISH允许在福尔马林固定的石蜡嵌入(FFPE)组织上在亮视野显微镜下用常规酶促反应检测基因扩增、染色体易位和染色体数。
“免疫染色”是指检测样品中特异蛋白的基于抗体的方法。免疫染色包括免疫细胞化学染色和免疫组织化学染色两者。免疫细胞化学(ICC)染色是指使用靶向细胞上的抗原的抗体的技术。可进行此染色，以确定存在某些疾病，例如癌症的类型。免疫组织化学(IHC)染色是指通过使用标记的抗体作为特异试剂通过抗原-抗体相互作用使组织切片中的抗原染色和定位，所述相互作用通过标记可视化，所述标记比如荧光团、反应的酶底物、放射性元素或胶体金。
“探针”是指具有结合剂和标记(如信号发生剂或酶)的剂。在一些实施方案中，结合剂和标记(信号发生剂或酶)在单一实体中具体化。本文所用的“结合剂”是指能够与另一个分子(如结合到抗体的抗原)反应或缔合的分子。结合剂和标记可直接(例如，通过结合到结合剂的荧光分子)或间接(例如，通过连接剂，可包括分裂部位)结合，并在单一步骤施加到组织样品。在供选的实施方案中，结合剂和标记在离散的实体中具体化(例如，能够结合靶和酶的第一抗体或能够结合第一抗体的信号发生剂标记的第二抗体)。在结合剂和标记(信号发生剂或酶)为分离的实体时，它们可在单一步骤或多个步骤施加到组织样品。术语“荧光探针”是指具有偶合到荧光信号发生剂的结合剂的剂。
“信号发生剂”是指能够提供用一种或多种检测技术(例如光谱测定法、量热法、光谱法或目测)可检测的信号的分子。可检测信号的适合实例可包括光学信号和电学信号或放射信号。信号发生剂的实例包括一种或多种生色团、荧光团、拉曼活性标记或放射性标记。如上所述，关于探针，在一些实施方案中，信号发生剂和结合剂可存在于单一实体中(例如，具有荧光标记的靶结合蛋白)。或者，结合剂和信号发生剂可以为在引入样品前或引入样品后相互缔合的离散实体(例如，受体蛋白和对抗那种特定受体蛋白的标记的抗体)。
“荧光团”或“荧光信号发生剂”是指在通过曝露于特定光波长激发时发射不同波长的光的化合物。荧光团可根据它们的发射分布或“颜色”来描述。绿色荧光团(例如，Cy3、FITC和Oregon Green)可表征为其一般在515至540纳米范围波长的发射。红色荧光团(例如，Texas Red、Cy5和四甲基若丹明)可表征为其一般在590至690纳米范围波长的发射。荧光团的实例包括但不限于4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸基茋-2，2′-二磺酸、吖啶、吖啶和吖啶异硫氰酸酯的衍生物、5-(2′-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3，5-二磺酸盐(Lucifer Yellow VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、氨基苯甲酰胺、Brilliant Yellow、香豆素、香豆素衍生物、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，Coumarin 120)、7-氨基-三氟甲基香豆素(Coumaran 151)、焰红染料(cyanosine)、4′，6-二脒基(diaminidino)-2-苯基吲哚(DAPI)、5′，5″-二溴连苯三酚-砜酞(Bromopyrogallol Red)、7-二乙基氨基-3-(4′-异硫氰酸基苯基)4-甲基香豆素，-，4，4′-二异硫氰酸基二氢-茋-2，2′-二磺酸、4，4′-二异硫氰酸基茋-2，2′-二磺酸、5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹酰氯)、曙红、曙红衍生物(如，曙红异硫氰酸酯)、赤藓红、赤藓红衍生物(如赤藓红B和赤藓红异硫氰酸酯)；乙啶；荧光素和衍生物，如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2′7′-二甲氧基-4′5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、QFITC(XRITC)；荧光胺衍生物(在与胺反应后为荧光性)；IR144；IR1446；孔雀绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；碱性副品红；酚红，B-藻红素；邻苯二甲醛衍生物(在与胺反应后为荧光性)；芘和衍生物，如芘、芘丁酸酯和琥珀酰亚氨基1-芘丁酸酯；Reactive Red 4(Cibacron.RTM.Brilliant Red 3B-A)、若丹明和衍生物(如6-羧基-X-若丹明(ROX)、6-羧基若丹明(R6G)、丽丝胺若丹明B磺酰氯、若丹明(Rhod)、若丹明B、若丹明123、若丹明X异硫氰酸酯、磺基若丹明B、磺基若丹明101和磺基若丹明101的磺酰氯衍生物(Texas Red)；N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)；四甲基若丹明，四甲基若丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；玫红酸和镧系螯合物衍生物，量子点，菁，吡喃鎓(pyrelium)染料和方酸。
“靶”是指存在于组织样品时可检测的组织样品组分。靶可以为存在天然产生的特异结合剂(例如，抗体)或可制备特异结合剂(例如，小分子结合剂或适配体)的任何物质。通常，结合剂可通过靶的一个或多个离散化学部分或靶的三维结构组分(例如，产生于肽折叠的3D结构)结合到靶。靶可包括一种或多种天然或改性肽、蛋白(例如，抗体、亲和体或适配体)、核酸(例如，多核苷酸、DNA、RNA或适配体)、多糖(例如，凝集素或糖)、脂质、酶、酶底物、配体、受体、抗原或半抗原。在一些实施方案中，靶可包括蛋白或核酸。在一些实施方案中，靶可包括蛋白和核酸二者。
本发明包括总的来说涉及应用于分析、诊断或预测应用(如分析物检测、组织化学、免疫染色、免疫组织化学、免疫细胞化学或免疫荧光)的方法的实施方案。在一些实施方案中，本文公开的方法可特别应用于免疫组织化学和免疫细胞化学。
根据一个实施方案，描述了一种方法，其中处理从病理学取样得到的组织切片，然后蛋白检测用于生物标记评价。在一个实施方案中，方法包括两步程序，此程序可应用于多种蛋白抗原，并且可提供高水平抗原提取。在某些实施方案中，这允许临床相关样品的多元诊断。
在一些实施方案中，组织样品包括来自健康或患病组织的组织切片(例如，来自结肠、乳腺组织、前列腺的组织切片)。组织样品可包括组织切片的单一部分或片，例如，从组织切片切割的组织或细胞的薄片。在一些实施方案中，组织样品的相同切片可在形态学和分子水平两者分析。
在一些实施方案中，可首先使组织样品固定，然后通过醇的递增系列脱水，渗透，并用石蜡或其它切片介质嵌入，以便可切割组织样品。在供选的实施方案中，可切割组织样品，随后固定。在一些实施方案中，可在石蜡中嵌入组织样品并处理。可使用的石蜡的实例包括但不限于Paraplast、Broloid和Tissuecan。一旦嵌入组织样品，就可将样品通过切片机切成切片。切片的厚度可根据组织和分析的类型改变。在某些实施方案中，切片可具有约2微米至约5微米范围的优选厚度。
一旦切割，就可用粘合剂使切片附着到玻片。玻片粘合剂的实例可包括但不限于硅烷、明胶、聚L-赖氨酸。在实施方案中，如果石蜡用作嵌入材料，则可使组织切片去石蜡，并在水中重新水合。组织切片可例如用有机剂(如二甲苯或醇的逐渐递减系列)去石蜡。
在其他实施方案中，甲醛固定的组织样品可粘着到固体载体上，以允许其在制备和成像过程期间分析、转移和移动。通过物理吸附、共价键形成或其组合，可使组织样品固定在固体载体上。固体载体可包括聚合、玻璃或金属材料。固体载体的实例包括膜、微量滴定板、珠料、过滤器、试片、玻片、盖片和试管。
在一个实施方案中，描述了一种方法，其中使甲醛固定的组织样品与第一抗原提取溶液接触，并加热到大于90℃的温度经历大于10分钟的时间，更优选约20分钟时间。加热可用高压锅、高压灭菌器、水浴、热板、微波或蒸汽加热器进行，以对浸入抗原提取溶液的组织样品提供均匀加热。然后，不用另外的处理，将组织样品转移到第二抗原提取溶液(其预热到大于90℃的温度)经历相似时间。预热可用高压锅、高压灭菌器、水浴、热板、微波、蒸汽加热或其组合进行，并且可在加热第一抗原提取溶液时进行。在第二抗原提取溶液培养样品优选在大气压并且通过只在热溶液中浸渍而进行。这可防止组织损害。
在一个实施方案中，第一抗原提取溶液为具有约5和约7之间范围pH的缓冲溶液。第一抗原提取溶液可以为用于保持pH在微酸性至中性范围的常用缓冲溶液。在某些实施方案中，缓冲剂可包括柠檬酸、磷酸二氢钾、硼酸、二乙基巴比妥酸、哌嗪-N，N′-双(2-乙磺酸)、二甲基次胂酸、2-(N-吗啉代)乙磺酸或其组合。在其它实施方案中，缓冲溶液可以为在升高的温度具有约6.0的pH的柠檬酸磷酸钠缓冲溶液。
利用加热，第一抗原提取溶液可作用于使在样品固定期间在福尔马林和抗原之间可能形成的交联键水解。这导致提取样品中至少一些部分抗原。
在一个实施方案中，第二抗原提取溶液为具有约7.5至约11范围的碱性pH的缓冲溶液。第二抗原提取溶液可以为用于保持pH在微碱性范围的常用缓冲溶液。在某些实施方案中，缓冲溶液可包含三(羟基甲基)甲基胺(TRIS)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(TAPS)、N，N-双(2-羟基乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟基甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、4-2-羟基乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-{[三(羟基甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)或其组合。在另一个实施方案中，缓冲溶液可以为在升高的温度具有约10的pH的TRIS-HCl缓冲剂。
与第一抗原提取溶液一样，第二抗原提取溶液可作用于使在样品固定期间在福尔马林和抗原之间可能形成的交联键水解。被提取的抗原部分为样品中未提取抗原的至少一些另一部分。
应了解，在其它实施方案中，第一抗原提取溶液可以为约7.5至约11范围的缓冲溶液，第二抗原提取溶液可以为约5至约7范围的缓冲溶液。
通过暴露于第一和第二抗原提取溶液提取的抗原可对免疫染色更敏感，以允许分析和功能形态学研究两者。免疫染色包括免疫组织化学(IHC)染色和免疫细胞化学(ICC)染色两者。在某些实施方案中，改良可包括增加的正染色强度，并减小背景染色。
在某些实施方案中，在施加第二抗原提取溶液后，可进行样品的免疫染色。可使抗体溶液(例如，探针)经历足够时间并在适用于使标记抗体结合到抗原的条件下与组织切片接触。可使用两种检测方法：直接或间接。在直接检测中，信号发生剂标记的第一抗体(例如，荧光团标记的第一抗体)可用抗原在组织样品中培养，这可以可视化，不用其它抗体相互作用。在间接检测中，未缀合的第一抗体可用抗原培养，然后，可使标记的第二抗体结合到第一抗体。可发生信号扩增，因为数个第二抗体可以与第一抗体上的不同表位反应。在可使第二抗体缀合到酶促标记的实施方案中，可加入显色或荧光底物，以提供抗原的可视化。在一些实施方案中，可使两种或更多种(最多四种)第一抗体(标记或未标记)与组织样品接触。然后，可使未标记抗体与相应的标记的第二抗体接触。在一些实施方案中，其它方法可用于信号增强，例如使用标记的第三或第四抗体。
在一些实施方案中，在抗原提取过程后，将核酸探针施加到样品，以进行荧光原位杂交(FISH)或显色原位杂交(CISH)。
可用检测系统检测来自探针中的信号发生剂的信号。所用检测系统的性质可取决于所用信号发生剂的性质。检测系统可包括电子自旋共振(ESR)检测系统、电荷耦合器件(CCD)检测系统(例如，对于放射性同位素)、荧光检测系统、电检测系统、照相软片检测系统、化学发光检测系统、酶检测系统、原子力显微镜(AFM)检测系统和扫描隧道显微镜(STM)检测系统(两者例如用于检测微珠)、光学检测系统、近场检测系统或总内反射(TIR)检测系统。
可用一种或多种上述技术观察来自第一信号发生剂的第一信号的一个或多个特征。在一些实施方案中，可用一种或多种上述技术测定信号强度、信号波长、信号位置、信号频率或信号转移。在一些实施方案中，可观察、检测并记录信号的一个或多个前述特征。在一些实施方案中，信号发生剂可包括荧光团，并且可用荧光检测系统测定荧光波长或荧光强度。在一些实施方案中，可原位观察信号，即，可从通过结合剂结合到组织样品中的靶的信号发生剂直接观察信号。在一些实施方案中，可在组织样品内分析来自信号发生剂的信号，排除单独的基于阵列的检测系统的需要。在其它实施方案中，在探针结合后，可使信号从结合剂分离，并离开生物样品检测。分离信号的方法可包括但不限于ELISA和质谱法、杂化微阵列。
在一些实施方案中，观察信号可包括捕获组织样品的图像。在一些实施方案中，根据本文公开的方法，可用连接到成像装置的显微镜作为检测系统。在一些实施方案中，可激发信号发生剂(如，荧光团)，并可观察得到的信号(如，荧光信号)，并以数字信号的形式记录(如，数字化图像)。对于用适合的荧光过滤器结合在样品中的不同信号发生剂(如果存在)，可重复相同程序。
可使化学剂施加到组织样品以修改信号。在一些实施方案中，信号修改可包括一种或多种信号特征变化，例如，信号强度减小、信号峰转移、共振频率变化或导致信号去除的信号发生剂分裂(去除)。
在一些实施方案中，化学剂可以为溶液的形式，并且可使组织样品与化学剂溶液接触预定量的时间。化学剂溶液的浓度和接触时间可取决于期望的信号修改的类型。在一些实施方案中，可选择用于化学剂的接触条件，使得结合剂、靶、组织样品和结合剂与靶之间的结合可不受影响。在一些实施方案中，化学剂可只影响信号发生剂，化学剂可不影响靶/结合剂结合或结合剂完整性。因此，例如，结合剂可包括第一抗体或第一抗体/第二组合。根据本文公开方法的化学剂可只影响信号发生剂，第一抗体或第一抗体/第二抗体组合可基本保持不受影响。在一些实施方案中，结合剂(如，第一抗体或第一抗体/第二抗体组合)可在使样品与化学剂接触后保持结合到组织样品中的靶。在一些实施方案中，结合剂可在使样品与化学剂接触后保持结合到组织样品中的靶，并且结合剂整体性可保持基本不受影响(例如，在化学剂存在下抗体可实质上不变性或洗脱)。在其它实施方案中，化学剂可影响靶/结合剂结合或结合剂/信号接触/连接。
在一些实施方案中，可通过“脱去探针并重新探测样品来检测多个靶。脱去一般指任何方法，例如但不限于浸入非标记溶液或其它物质或通过重新施加非标记溶液或其它物质(所述其它物质比如但不限于水、盐水、缓冲盐水或乙醇)冲洗，以提供用于从样品离解、分散和去除探针的介质。在一些实施方案中，可用光荧光漂白报道基因或信号发生剂，从而允许信号发生剂重新用于新的探针上而检测多个靶。可反复重复这些过程，以达到相同样品的多重探测。
在一些实施方案中，可在使样品与化学剂接触后观察信号的特征，以确定信号修改的有效性。例如，可在施加化学剂之前观察颜色，在施加化学剂之后颜色可不存在。在另一个实例中，可在与化学剂接触之前和在与化学剂接触之后观察来自荧光信号发生剂的荧光强度。在一些实施方案中，可将信号强度减小预定量称为信号修改。在一些实施方案中，信号修改可以指信号强度减小大于约50％范围的量。在一些实施方案中，信号修改可以指信号强度减小大于约60％范围的量。在一些实施方案中，信号修改可以指信号强度减小大于约80％范围的量。
在一些实施方案中，可用本文以上对第一探针所述的一种或多种程序使组织样品与第二探针接触。第二探针可能够结合到不同于第一探针结合的靶的靶上。在其中多个探针可与组织样品在第一探针接触步骤中接触的实施方案中，第二探针可能够结合不同于第一探针组结合的靶的靶。在一些实施方案中，可使组织样品与多个探针在第二探针接触步骤中接触。
可用一种或多种上述检测方法观察来自第二信号发生剂(存在于随后探针)的随后(例如，第二、第三等)信号的一个或多个特征。在一些实施方案中，可用一种或多种上述技术测定信号强度、信号波长、信号位置、信号频率或信号转移。与第一信号类似，得到的随后信号(例如，荧光信号)可以数字信号形式记录(如，数字化图像)。在一些实施方案中，观察随后信号也可包括捕获组织样品的光学图像。
在一些实施方案中，在使样品与随后(例如，第二、第三等)探针接触后，可重复剂修改(agent modification)和随后的探针给予多次。在一些实施方案中，在观察来自第二探针的第二信号后，可使组织样品与化学剂接触，以修改来自第二探针的信号。另外，可使第三探针与组织样品接触，其中第三探针可能够结合不同于第一和第二探针的靶。同样，可观察来自第三探针的信号，随后施加化学剂以修改信号。可用能够结合到另外的靶的第n个探针反复重复接触、结合和观察步骤多次，以用多种探针和/或信号发生剂为使用者提供关于多个靶的信息。
在一些实施方案中，可使一系列探针与组织样品以连续方式接触，以得到组织样品的多元分析。在一些实施方案中，可使一系列探针组(在一组中包括约4个探针)与组织样品以序列方式接触，以得到组织样品的多元分析。多元分析一般指用相同的检测机制分析组织样品中的多个靶。
在某些实施方案中，提供了可用于进行上述抗原提取方法的试剂盒。试剂盒可包含一种或多种抗原提取溶液。试剂盒也可进一步包含使用说明书。
在一些实施方案中，试剂盒包含一种或多种用于免疫染色和检测的另外的试剂。例如，在一些实施方案中，试剂盒可包含信号发生剂，如生色团、荧光团、拉曼活性标记或放射性标记。试剂盒也可包含能够如上所述改善检测或放大信号的试剂，包括但不限于聚合酶酶、其它缓冲剂、金属阳离子和盐。
根据一个实施方案，如图1所示，描述了用于使甲醛固定的组织样品15与上述抗原提取溶液和其它洗涤和染色溶液接触的样品处理装置10。样品处理装置可包含样品处理子系统20和试剂分配子系统30。在某些实施方案中，装置也可包括信号检测子系统40。在一个实施方案中，可将样品处理装置作为分析装置的组件(如自动高通量系统)结合，所述分析装置能够使甲醛固定的组织样品在一个系统中染色和成像并仍进一步分析图像。
因此，在一个实施方案中，系统可包括为了定位和移动用于分析的甲醛固定的组织样品的样品处理子系统，和使样品与第一抗原提取溶液、第二抗原提取溶液和免疫染色试剂的至少一种接触的试剂分配子系统。样品处理系统可包括多种组件，并允许样品从一个区域移到下一个区域。例如，可用一个装置使样品与试剂接触，移动并固定到用于成像的台(stage)，台的移动是可控制的。台可结合到显微镜，并且能够使样品移动通过成像视野。
系统也可包括信号检测子系统(未显示)，以通过染色过程捕获样品的图像。图像可用各种照明源捕获。在某些实施方案中，图像捕获可以为能够以不同放大倍数捕获和转移样品的数字图像的成像显微镜的部分。在另一个实施方案中，自动系统可包括计算机可读介质，所述可读介质可包括分析经染色甲醛固定组织样品的自动技术的说明书。
在其它实施方案中，样品处理装置可能够循环通过抗原提取、荧光标记、成像和脱去荧光探针的多个步骤。染色也可包括免疫过氧化物酶标记。在一个实施方案中，可使用醇可溶性过氧化物酶底物，3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)，随后去除AEC沉淀物，任选用温和过氧化物处理进一步使过氧化物酶失活，并重复染色。在其它实施方案中，可通过化学处理、热处理或其组合脱去荧光探针。
取样处理装置可自动化，使得可原位进行多个循环，以使样品位移最大限度地减小，并帮助在一个组织切片或细胞样品中映射多个标记。
试验
方法
利用试验设计(DOE)方法分析影响信噪比(ration)的变量，所述信噪比为系统灵敏度的反映。变量包括温度、暴露时间、pH和洗涤次序。图像用Zeiss Axilmager Z1显微镜在20x或63x放大倍数获得。图像定量用GNU图像操作程序(GIMP)软件进行，在从未染色区域减去背景像素强度后计算平均像素强度/面积。将平均像素强度计算为相同组织的10个图像的平均值。
研究使用以下材料：人存档组织来自多种来源，并包括乳腺、前列腺、肺、结肠、胎盘、唾液腺、淋巴结、脑和皮肤的样品。所有样品来自组织存档。所用的用于固定的细节未知，并假定具有以下标准病理学实践。用于AR的抗体从Lab Vision Corporation(Thermo FisherScientific的一部分)得到，并用标准程序在室内与Cy3和Cy5荧光染料缀合。基于柠檬酸盐的抗原提取溶液从Vector Laboratories得到，并以6.0的最终pH值1∶20稀释。基于Tris的缓冲剂由10mM Tris(三(羟基甲基)氨基甲烷)、1mM EDTA(乙二胺四乙酸)、1％Tween-20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)组成，得到8的pH值(从新制备的10x原料溶液制备)。用设定在HI功率的标准家用高压锅加热20分钟，并人工监控。
福尔马林固定的石蜡嵌入组织切片通过如下处理：在65℃烘烤玻片1小时，并用histochoice清洁剂从样品切片去除蜡。发现不需要烘烤样品，但作为标准实践自始至终使用。
然后使样品通过一系列递减浓度的醇洗液(一般100、95、70、50％)处理，各2x10分钟洗涤，然后带到PBS溶液中的盐水条件10分钟。然后，在包含0.3％Triton X-100的PBS中用简短处理渗透(premeablize)样品，随后进行提取过程。
提取过程包括将样品放入高压锅或微波中的溶液A(Tris pH 8.0，具有1％Tween 20)经历约20分钟。在加热循环结束，将样品放入在加热室中的预热溶液B(柠檬酸盐溶液pH 6)，不用另外加热。在两种热溶液之间，样品不转移到冷PBS溶液，也不在第二溶液中暴露于另外加热。在第二溶液中的样品已达到室温后(约20分钟)，在PBS中彻底清洗样品，然后进行任何另外的处理步骤，例如封闭或过氧化物酶处理(用于内源性过氧化物酶失活)。
样品可然后经历免疫检测。在第一轮免疫检测后，可使样品消除信号，并重新探测另外的抗原。
或者，使用类似于人工过程条件的程序设置，用DiscoveryXT自动染色机(Ventana Medical Systems，Inc.)处理玻片。在样品条形编码并制备试剂后，将玻片装入自动染色机，并如下处理：将样品加热，通过在EZ-prep试剂(用于Ventana Discovery XT的除蜡溶液)中清洗脱蜡。分别使用CC1和CC2(Ventana提供的用在Discovery XT自动染色机上的用于抗原提取的两种溶液)、Tris和柠檬酸基溶液进行抗原提取。为了与人工二步方法比较的目的，进行短时和中间时间抗原提取，这在Discovery XT自动染色机程序中作为温和和标准参考。应了解，在自动系统上，组织样品在两个抗原提取步骤之间清洗，这是本文所述人工方法和自动方法之间的关键差异。然后随着二步人工方法处理的样品将玻片人工染色。
结果和观察
为了分析，最初选择雄激素受体抗体用于检测人档案前列腺组织切片中的AR。选择此组合是由于在没有表位解掩蔽(未显示)存在下进行染色时缺乏可检测信号产生。利用用于抗原解掩蔽的两种一般缓冲剂(柠檬酸盐或Tris)并在高压锅中处理样品20分钟，用荧光染料产生中度强度染色。使用的柠檬酸盐解掩蔽条件代表通过多种抗体检测AR的常用方案。试验了不同条件，包括单独柠檬酸盐(组1)、单独Tris(组2)、先Tris然后柠檬酸盐(组3)和先柠檬酸盐然后Tris(组4)。所有条件在玻片上三重试验，除了将10个玻片染色以建立基线测量的对照样品。
第一系列试验使用Lab Vision AR抗体，随后用驴抗兔Cy3第二抗体检测。所有数据采集使用相等的暴露时间，并且在染色后立即收集图像。如图2所示，二步方法与单独柠檬酸盐或Tris比较时提供对AR染色的显著增强。图2为染色的单色图像，在右侧显示使用二步程序增强的染色。
通常，对于各组玻片，与对照样品比较，利用二步方法对AR观察到染色强度增加到二倍或更多。控制暴露于加热溶液的时间，并且所有玻片接受总共50分钟时间。对于所有试验玻片，在家用高压锅中在压力下进行第一加热步骤。在25分钟后，将来自组1和2的玻片放入新的一瓶预热溶液(在第一步骤正在进行的同时在单独瓶中加热的与第一步骤相同的溶液)，并使之在高压锅中冷却(不在压力下)另外25分钟。然后在PBS中洗涤玻片，并用第一抗体在4℃染色过夜。对于来自组3和组4的玻片，将溶液在处理的后25分钟期间改变到上述各自条件，并与其它组平行处理。
也试验对二步程序的数个变换。在一个变换中，其中使用两种溶液的次序不影响结果。如果首先使用酸性溶液，随后使用碱性溶液，观察不到结果差异，反之亦然。
方法中的其它变换证明对过程有害。这些包括对样品重新加压第二时间，和在第一和第二步骤之间在PBS中洗涤。这两种变化均导致组织从玻片显著损失，因此要避免。
在对AR的第一抗体的试验并且用第二抗体检测后，试验Cy5-直接缀合的AR抗体。用直接缀合物发现类似结果，其中在其它市售抗体的宽取样试验中观察到增强的染色。此方法也导致用一些市售级磷酸基-表位增强的染色，这些磷酸基-表位通常不稳定，并倾向于在提取过程中降解。
此程序也可应用于其它应用，例如，从FFPE组织的蛋白分离，其中抗原提取方法已显示提高蛋白提取和回收。此程序也可用于来自FFPE组织的激光捕获显微切割，所述FFPE组织作为蛋白组学分析的蛋白源。
在另一个实施方案中，本发明可在FISH或CISH分析之前用于FFPE样品上。一般在DNA变性和探针杂化之前使正经过FISH或CISH分析的FFPE样品暴露于加热预处理步骤。根据一个实施方案，在FISH或CISH分析前，二步程序可代替加热预处理步骤或用于制备组织样品的其它程序。图3显示单色显微相片(在20X和63X放大倍数)，其显示用不同抗体在BrCA肿瘤的多元FISH分析中用二步程序的增强染色。
方法比较
也用Discovery XT自动染色机评价自动过程。在自动染色机和涉及仪器操作的人工二步方法之间有过程条件差异。例如，自动染色机用加热和清洁剂使样品脱蜡，而人工方法使用无毒HistochoiceTM蜡清洁试剂(Amresco)。
在通过本文所述人工二步抗原提取或使用Discovery XT自动染色机的两种类似方法制备细胞后，对于S6、磷酸基-S6ser235/236或磷酸基-S6ser240/244将福尔马林固定的石蜡嵌入(FFPE)LNCaP细胞(American Type Culture Collection(ATCC，Maryland))染色。虽然抗原提取用人工或自动方法完成，但在连续信号去除/修改和重新染色中观察到差异。在大多数情况下，使用自动系统，染色减小产生于1或5个信号修改步骤。对于S6，使用自动方法在恰好一轮信号修改后导致完全染色损失。在所有情况下，人工二步方法提供各抗原的最佳保存。在使任一种磷酸基-表位染色时，人工二步方法也显示较小灵敏度。
差异示于图4中，图4为与两种自动方法比较通过人工二步抗原提取方法提供的较大表位稳定性的定量分析的图解表示。平均像素强度显示评价对抗原-S6的漂白作用。通过三种不同的脱蜡和抗原提取方法制备玻片，并在染色前经过0、1和5轮漂白。定量分析指示人工二步方法最佳保存抗原。在相同蛋白上的不同表位对漂白差别化反应，这可表明占主导的表位作用，不损失蛋白。这也显示于图5中，图5为人工二步抗原提取方法与两种自动方法比较对抗原-S6的漂白作用的单色显微相片(在20X放大倍数)。
在不脱离其精神或基本特征下，本发明可以其他具体形式具体化。因此，前述实施方案在所有方面应认为是说明性，而不是对本文所述发明的限制。因此，本发明的范围由附加权利要求而非前述说明指示，在权利要求的等价的含义和范围内的所有变化因此旨在包含于其中。

Claims (23)

1.一种甲醛固定的组织样品的抗原提取的方法，所述方法包含以下步骤：
在大于90℃的温度在第一抗原提取溶液中培养甲醛固定的组织样品；
将甲醛固定的组织样品转移到第二抗原提取溶液；并且
在大于90℃的温度在第二抗原提取溶液中培养甲醛固定的组织样品；
其中第一抗原提取溶液包含具有5和7之间pH范围的缓冲溶液，第二抗原提取溶液包含具有7.5和11之间pH范围的缓冲溶液；或者
第一抗原提取溶液包含具有7.5和11之间pH范围的缓冲溶液，第二抗原提取溶液包含具有5和7之间pH范围的缓冲溶液；
并且其中所述使用第一和第二抗原提取溶液的步骤相对于使用第一溶液而不使用第二溶液和使用第二溶液而不使用第一溶液，增强组织的抗原提取。
2.权利要求1的方法，其中具有5和7之间pH范围的缓冲溶液包含柠檬酸、磷酸二氢钾、硼酸、二乙基巴比妥酸、哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)、二甲基次胂酸、2-(N-吗啉代)乙磺酸或其组合。
3.权利要求2的方法，其中具有5和7之间pH范围的缓冲溶液包含柠檬酸。
4.权利要求2或3的方法，其中具有7.5和11之间pH范围的缓冲溶液包含三(羟基甲基)甲基胺(TRIS)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(TAPS)、N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟基甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、4-2-羟基乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-{[三(羟基甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)或其组合。
5.权利要求4的方法，其中具有7.5和11之间pH范围的缓冲溶液包含TRIS。
6.权利要求1-3和5中任一项的方法，其中甲醛固定的组织样品嵌入石蜡中。
7.权利要求1-3和5中任一项的方法，其中甲醛固定的组织样品为器官或组织、体液、组织或微阵列的切片部分。
8.权利要求1-3和5中任一项的方法，其中利用第一抗原提取溶液和第二抗原提取溶液的培养步骤包含在加热装置中培养大于10分钟的时间。
9.权利要求8的方法，其中加热装置为高压锅、高压灭菌器、水浴、热板、微波、蒸汽加热或其组合。
10.权利要求1-3、5和9中任一项的方法，所述方法进一步包含抗原免疫染色的步骤。
11.权利要求10的方法，其中免疫染色包含连续免疫过氧化物酶标记和清除。
12.权利要求1-3、5、9和11中任一项的方法，其中甲醛固定的组织样品经历FISH或CISH分析。
13.权利要求1-3、5、9和11中任一项的方法，其中在没有另外的处理的情况下，将组织样品转移到第二抗原提取溶液。
14.一种用于提取甲醛固定的组织样品中的抗原的试剂盒，所述试剂盒包含：
提取样品中至少一部分未提取抗原的第一抗原提取溶液；和
提取样品中至少一些另一部分未提取抗原的第二抗原提取溶液；
其中第一抗原提取溶液为具有5和7之间pH范围的缓冲溶液，第二抗原提取溶液为具有7.5和11之间pH范围的缓冲溶液；并且
其中第一抗原提取溶液包含柠檬酸、磷酸二氢钾、硼酸、二乙基巴比妥酸、哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)、二甲基次胂酸、2-(N-吗啉代)乙磺酸或其组合；
并且其中第二抗原提取溶液包含三(羟基甲基)甲基胺(TRIS)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(TAPS)、N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羟基甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、4-2-羟基乙基-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-{[三(羟基甲基)甲基]氨基}乙磺酸(TES)或其组合。
15.权利要求14的试剂盒，其中第一抗原提取溶液包含柠檬酸。
16.权利要求14或15的试剂盒，其中第二抗原提取溶液包含TRIS。
17.权利要求14或15的试剂盒，所述试剂盒进一步包含一种或多种免疫染色试剂。
18.一种用于进行权利要求10的方法的样品处理装置，所述样品处理装置包含样品处理子系统和试剂分配子系统。
19.权利要求18的装置，其中试剂分配子系统能够使样品与第一抗原提取溶液、第二抗原提取溶液和免疫染色试剂中的至少一种接触。
20.权利要求18或19的装置，其中试剂分配子系统能够使样品与试剂接触，以去除免疫染色试剂。
21.权利要求18或19的装置，其中样品处理装置能够运行多于一个试剂分配循环。
22.权利要求18或19的装置，所述装置进一步包含信号检测子系统。
23.权利要求22的装置，其中样品处理子系统、试剂分配子系统或信号检测子系统中的一个或多个为自动化的。
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