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KR20180103162A - 단일 세포 분리를 위한 미세유체 분취 방법 - Google Patents

단일 세포 분리를 위한 미세유체 분취 방법 Download PDF

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KR20180103162A
KR20180103162A KR1020187024552A KR20187024552A KR20180103162A KR 20180103162 A KR20180103162 A KR 20180103162A KR 1020187024552 A KR1020187024552 A KR 1020187024552A KR 20187024552 A KR20187024552 A KR 20187024552A KR 20180103162 A KR20180103162 A KR 20180103162A
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Abstract

본 발명에 따른 페트리 접시에 장착되도록 제작된 미세유체 분취용(microfluidic aliquoting, MA) 칩은 일반적으로 복수 개의 마이크로채널에 의해 복수 개의 측면 웰(출구)에 연결되는 중심웰(입구)을 포함한다. 여러 개의 세포를 포함하는 비교적 많은 용량의(예, 120 μL) 세포 현탁액을 상기 MA 칩의 입구로 주입할 수 있고, 단일 세포들은 정압 구동 흐름(positive pressure-driving flow)에 의해서 1 분 미만의 시간 내에 단일 세포들을 포함하는 여러 개의(예, 120개) 측면 웰들로 실질적으로 동시에 그리고 균일하게 분포될 수 있다. 상기 MA 칩은 높은 세포 재생 효율을 가진다. 상기 MA 칩은 단일 세포들의 신속한 분리 및 용이한 식별, 높은 세포 생존력, 높은 농축 인자, 및 서브마이크로리터의(submicroliter) 단일 세포 현탁액의 편리한 이동과 같은 이점을 가지므로, 혈액으로부터의 CTC 분리, 단일 세포 클로닝, PCR, 및 시퀀싱(sequencing)에 용이하게 적용될 수 있다.

Description

단일 세포 분리를 위한 미세유체 분취 방법{MICROFLUIDIC ALIQUOTING FOR SINGLE-CELL ISOLATION}
본 발명의 일부 구체예는 광범위하게는 단일 세포 분리를 위한(예, 처리 또는 분석용) 방법 및 장치에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 미세유체기술(microfluidic technology)을 이용하여 단일 세포들을 분리하는 기술에 관한 것이다.
미세유체학은 엔지니어링, 물리학, 화학, 생화학, 나노 기술 및 생명 공학을 아우르는 종합적인 학문으로, 작은 부피의 유체를 처리하여 복합법(multiplexing), 자동화 및 고효율 스크리닝(high-throughput screening)을 구현하는 시스템 설계에 실용적으로 적용 가능하다. 미세유체기술의 발달은 효소분석(예: 포도당 및 젖산 분석), DNA 분석(예: 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR) 및 고속 시퀀싱) 및 단백질 유전 정보학(proteomics)을 위한 분자 생물학적 과정들을 혁신적으로 변화시키고 있다. 미세유체 바이오칩의 기본 사상은 하나의 칩에 샘플 전처리 및 샘플 준비뿐 아니라 검출과 같은 분석 작업을 통합하는 것이다.
세포군에서 표현형 및 유전형의 이질성이 널리 존재한다는 증거가 증가하고 있다. 희소한 개별 세포의 주요 정보는 대량 세포 분석에 의해 밝혀지지 않을 수 있다. 따라서, 단일세포 분석, 특히 DNA 및 RNA 시퀀싱은 클론 돌연변이(clonal mutation), 종양 진화, 배아 발달 및 면역학적 연구에 매우 중요하다.
이러한 하류(downstream) 단일 세포 유전학적 분석을 위한 초기 단계와 핵심 단계는 서브마이크로리터(submicroliter) 부피의 배지에서 이질적인 세포군에서부터 원하는 살아있는 단일 세포를 효과적으로 분리하고, 이에 대한 PCR 분석을 수행하는 것이다(PCR은 DNA 단편의 하나 또는 다수개의 복제물(copy)을 몇 자리수로 증폭하여 특정 DNA 서열의 수천에서 수백만 복제물을 생성하는데 사용되는 분자 생물학적 기술이다).
포르말린으로 고정된 파라핀에 내포된(formalin-fixed paraffin-embedded) 조직으로부터 단일 세포를 분리하는데 주로 사용되는 레이저 포획 미세절제(laser capture microdissection) 이외에, 현재 세포 현탁액으로부터 단일 세포 분리하기 위한 4 가지 주요 접근법이 사용된다.
- 가장 많이 사용되는 방법인 계단희석법(serial dilution)은 콜로니(colony) 형성을 위해 광범위하게 적용되었지만, 보다 나은 증폭 반응을 위해 단일 세포를 서브마이크로리터의 현탁액으로 분리해야 하는 PCR 분석에는 적합하지 않다. 그럼에도 불구하고, 이러한 콜로니들은, 96 웰 배양접시에 접종된 후, 정확하게 계산하기가 매우 어려운 상기 콜로니들의 단일 세포에서의 유래 여부를 판단하기 위한 추가 분석을 위해 여전히 필요하다.
- 미세조작기술(micromanipulation)은 주로 게놈/전사체 시퀀싱을 위한 단일 세포를 분리하기 위해 개발되었다. 그러나 오랜 공정 시간과 낮은 처리량으로 인해, 수십, 심지어 수백 개의 단일 세포들(10)을 신속하게 준비해야 하는 높아진 요구조건을 충족시키기는 어렵다. 또한, 연구원의 입을 사용하여 단일 세포를 빨아들이는 것은 개인 기술에 크게 의존할 수 있다.
- 유동세포 분석법(flow cytometry)은 미리 설정된 형광 게이팅 전략(fluorescence gating strategy)을 기반으로 특정 세포를 고효율로 분류하는데 특히 적합하게 잘 확립된 방법이지만, 단일세포 생존력을 높게 유지하는 것이 어려우며, 희소한 임상 시료와 같은 제한된 수의 세포에서는 적용할 수 없다.
- 마이크로채널과 세포의 크기가 비슷하기 때문에, 최근 개발된 미세유체기술은 단일 세포 조작을 위한 중요한 방법을 제공한다. 그러나, 미세유체 조작을 위한 추가 기술을 요구하고, 기존 실험 플랫폼과의 호환성이 부족하고, 추가 분석을 위해 분리된 단일 세포를 마이크로칩에서부터 선택적으로 회수할 수 없거나 어렵다는 것과 같은 미세유체기술의 잠재적인 단점들은 일반 실험실에서 이의 적용을 크게 제한한다.
본 명세서에서 참고로 인용된 미국특허 제6632656호(2003-10-14; Thomas 외)는 액체 배지에서 세포 성장 및 세포기반 분석을 수행하기 위한 장치 및 방법을 기재한다. 상기 장치는 복수 개의 미세(micro)채널부재들을 지지하는 베이스 플레이트(상기 미세채널부재 각각은 세포 성장 챔버, 액체 시료를 공급하기 위한 입구 채널 및 상기 입구 채널로부터 액체 시료를 제거하기 위한 출구 채널을 포함함); 및 상기 챔버들 및 연결 채널들을 형성하기 위하여 상기 베이스 플레이트 위에 위치하는 커버 플레이트(상기 커버 플레이트는 상기 채널로의 접근을 제공하기 위한 구멍들을 구비함)를 포함한다. 세포 부착 및 세포 성장을 위한 수단이 세포성장 챔버에 포함된다. 이하, 도면을 참고하여 하기에서 더욱 상세히 설명된다:
도 1b에 도시된 것처럼, 상기 장치는 디스크의 중심을 향해 위치하고 차례로 복수 개의 방사상으로 분산된 미세채널 분석부재들(6)에 연결된 환형 시료 저장조(9)에 연결된 시료 주입구를 제공하도록 미세 가공된 회전 가능한 디스크(18)를 포함하고, 상기 미세채널부재 각각은 세포 성장 챔버, 시료입구채널, 상기 시료입구채널로부터 액체를 제거하기 위한 출구채널, 및 폐쇄된 챔버들 및 연결 채널들을 형성하기 위한 상기 디스크 위에 위치하는 커버 플레이트를 포함한다. 상기 미세채널부재 각각의 하나의 단부는 상기 중앙 시료 저장조(9)에 연결되고, 상기 단부에 대향하는 단부는 공통 웨이스트 채널(waste channel, 10)에 연결된다.
미세 가공된 장치의 방사상으로-분산된 미세채널부재들(6, 도 1a에 도시됨) 각각은 이의 좌측 단부에 위치한 저장조(9)에 연결된 시료 입구 채널(1), 세포 성장이 이루어지고 채널(4)을 통해 분석 챔버(3)에 연결되는 세포 성장 챔버(2), 및 웨이스트 채널(10)에 우측 단부가 연결된 출구 채널(5)를 포함한다.
적합하게는, 상기 디스크(18)는 1 또는 2 피스(piece) 주형 구조로 이루어지고, 소정의 위치에 개구부를 갖는 폐쇄 구조를 제공하기 위하여 함께 조립된 별개의 주형에 의해 임의의 투명한 플라스틱 또는 고분자 재료로 형성되어, 상기 장치에 액체를 주입하고 이로부터 폐액을 제거하는 것이 가능하다. 가장 단순한 형태로, 상기 장치는 2 개의 보완적인 부분으로서 제조되며, 상기 2개의 부분 중 하나 또는 각각은 함께 고정될 때 고체 디스크의 몸체 내에 일련의 상호 연결된 미세채널부재들을 형성하는 성형 구조물들을 포함한다.
또는, 상기 미세채널부재들은 상기 미세채널부재들을 형성하는 상기 미세채널들 및 챔버들을 디스크의 표면 내에서 미세가공하는 미세가공법(micro-machining)에 의해 형성될 수 있으며, 커버 플레이트(예, 플라스틱 필름)는 상기 채널들 및 챔버들을 둘러싸도록 표면에 부착된다.
상기 장치의 크기는 용도에 따라 어느 정도 결정될 것이다. 즉, 상기 장치는 진핵 세포를 사용하는데 적합한 크기일 것이다. 이는 세포 이동이 가능하도록 설계된 모든 채널에 하한치를 부과하고 각 분석에 존재하는 세포의 수에 따라 세포 억제 또는 성장 영역의 크기를 결정한다. 부착성으로 배지에서 성장하는 포유 동물 세포는 평균적으로 ~ 300㎛2의 면적을 가지며, 비부착성 세포 및 부착되지 않은 부착성 세포는 ~ 10 ㎛의 구형 직경을 갖는다. 결과적으로, 상기 장치 내의 세포의 이동을 위한 채널들은 대략 20 내지 30 ㎛ 또는 이 보다 큰 크기를 가질 가능성이 있다. 세포가 차지하는 영역의 크기는 분석을 수행하는데 필요한 세포의 수에 따라 달라진다(상기 세포수는 민감도 및 통계적 요구에 의해 결정된다). 일반적인 분석에서는 최소 500 내지 1000개의 세포를 필요하고, 이를 위해 부착 세포의 경우 150,000 내지 300,000 ㎛2의 구조물, 즉 직경이 약 400 내지 600 ㎛인 원형 "웰"을 필요로 할 것으로 생각된다.
상기 미세채널들은 바람직하게는 시료입구를 통해 액체 배지 내의 세포 현탁액을 상기 시료 저장조를 주입함으로써 상기 세포 성장 챔버에 동시에 주입되고, 이 후 상기 세포 현탁액이 원심력에 의해 상기 디스크의 외주를 향해 외측으로 이동하기에 충분한 속도로 적절한 수단에 의해 디스크(18)가 회전할 수 있도록 구성된다. 상기 액체의 이동으로 인해 상기 세포 성장 챔버들(2, 7)을 향하여 상기 입구 미세채널들(1, 8) 각각을 따라 세포 현탁액이 분배된다. 상기 디스크의 회전 속도는 상기 액체가 상기 세포 성장 챔버(2, 7)를 채우기 위해 흐를 수 있도록 충분한 원심력을 제공하지만, 액체가 상기 세포 성장 챔버의(2, 7)의 대향면에 위치한 작은 직경의 제한된 채널(4, 16)에 들어가기에 충분한 힘을 제공하지는 않는다.
본 발명의 목적은 간단하고 신속하며 다용도인 단일세포 분리 기술(방법 및 장치)을 제공하는 것이다.
일반적으로, 분취(aliquoting)는 대량의 물질(일반적으로, 액체)에서 대표 시료를 채취하는 것을 의미한다. 이 경우, 분취는 다수의 세포를 갖는 현탁액으로부터 단일 세포를 분리하는 것을 의미한다. 이 과정은 미세유체기술을 사용하여 액체 환경에서 이루어지므로 "미세유체분취 (microfluidic aliquoting)"로 불린다.
본 발명에 따르면, 일반적으로 디스크 형태를 가질 수 있으며, 페트리 접시에 끼워지도록 제작될 수 있는 미세유체분취(MA) 칩은(또는 기판, "MA 칩", "MA-칩" 또는 이의 변형된 표현으로 언급될 수 있음) 복수 개의 마이크로채널(채널들)에 의해 복수 개의 측면 웰들(또는 외각 웰들, 출구)에 연결된 중심웰(입구)을 포함할 수 있다. 작동 시, 소수의 세포를(예: 약 2 내지 120개의 세포) 포함하는 세포 현탁액을 상기 MA 칩의 입구에 주입할 수 있고(피펫을 사용하여 정압에 의해 상기 중심웰로 밀어냄), 단일 세포들은 상기 마이크로채널들을 통해 정압 구동 흐름에 의해 상기 측면웰들(외각웰들)의 일부로 이동될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예(실시예)에 따라서, 단일 세포 분리용 미세유체 분취(MA) 칩은 반경, 중심, 상부면, 하부면, 외각 가장자리, 및 두께를 갖는 디스크 형태의 칩; 실질적으로 상기 칩의 중심에 배치되고, 상기 칩의 상부면으로 연장되며, 상기 칩의 상부면으로부터 접근 가능한 단일 중심웰(입구); 상기 칩의 외각의 환상 부분에 배치되고, 상기 칩의 상부면으로 연장되며, 상기 칩의 상부면으로부터 접근 가능한 복수 개의 측면 웰들(출구); 및 상기 칩의 하부면에서 연장되며, 상기 중심웰 및 상기 측면 웰들과 유체 소통하여(fluid communication) 상기 중심웰에서부터 상기 측면 웰들까지 연장되는 복수 개의 채널들;을 포함할 수 있다.
상기 칩은 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(poly(methyl methacrylate), PMMA), 폴리스티렌(polystyrene, PS), 및 폴리카보네이트(polycarbonate, PC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 가요성 또는 반강성 재료로 제조된 얇은 시트를 포함할 수 있다. 상기 칩은 약 1 mm의 두께를 가질 수 있고, 페트리 접시 내에 장착 가능한 크기 및 형태를 가질 수 있으며, 약 3 cm의 반경을 가질 수 있다. 상기 중심웰은 상기 칩을 완전히 통과하도록 연장될 수 있고; 상기 측면 웰들은 상기 칩을 완전히 통과하도록 연장될 수 있다.
상기 중심웰은 약 3 mm의 직경 및 약 4 ㎕의 부피를 가질 수 있다. 상기 측면 웰들 중 적어도 일부는 약 1.5 mm의 직경 및 약 1 ㎕의 부피를 가질 수 있다.
상기 복수개의 측면 웰들의 제1 세트는 상기 칩의 중심에서부터 제1 반경(r1)에 위치할 수 있고, 상기 복수개의 측면 웰들의 제2 세트는 상기 칩의 중심에서부터 제2 반경(r2)에 위치할 수 있다. 상기 제2 반경(r2)은 상기 제1 반경(r1) 보다 클 수 있다. 상기 측면 웰들의 제1 세트 및 제2 세트는 상기 측면 웰들의 제2 세트가 60개의 측면 웰을 포함하는 상기 제1 세트 사이의 원주 위치에 위치하도록 상호배치(interleave)될 수 있다. 상기 측면 웰들의 제1 세트 및 제2 세트는 상기 칩의 외각의 환상 부분 주위에 균등하게 분포할 있고, 상기 칩의 외각의 환상 부분은 상기 칩의 반경의 적어도 70%에서부터 상기 칩의 외각 가장자리까지 연장할 수 있다.
상기 채널들은 상기 중심웰에서부터 상기 측면 웰들로 방사상으로 연장할 수 있다. 상기 채널들은 상기 칩 내로 단지 부분적으로 연장할 수 있다. 상기 채널들은 약 30 ㎛의 너비를 가질 수 있다. 상기 채널들은 상기 중심웰에서부터 상기 측면 웰들까지 단일 세포들의 이동을 수용할 수 있는 크기 및 형상을 가질 수 있다.
상기 MA 칩은 현미경 관찰하에 상기 측면 웰들을 고유하게 식별할 수 있도록 상기 측면 웰들의 적어도 일부의 내측에 위치하는 비교적 작은 ㎛ 단위의 표식들; 및 육안에 의해 상기 측면 웰들을 고유하게 식별할 수 있도록 상기 측면 웰들의 적어도 일부의 외측에 위치하는 비교적 큰 mm 단위의 표식들;을 더 포함할 수 있다.
상기 MA 칩은 상기 중심웰 내로 세포 현탁액을 주입하기 위한 캡을 더 포함할 수 있고, 상기 캡은 관통 연장하는 구멍을 가지며, 상기 중심웰의 상부에 배치될 수 있다.
상기 캡은 원통형일 수 있고, 상기 캡의 하부면으로부터 상기 중심웰 내로 연장하는 립 또는 숄더를 포함할 수 있으며, 상기 립 또는 숄더는 세포 현택액의 주입 동안 상기 캡을 일시적으로 고정할 수 있다. 상기 캡은 상기 칩과 일체로 형성될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예(실시예)에 따라서, 소수 개의 세포를 함유하는 세포 현탁액에서 단일 세포들을 분리하는 방법은 단일 중심웰 및 복수개의 마이크로채널에 의해 상기 중심웰에 연결되는 복수개의 측면 웰들을 포함하는 미세유체 분취(MA) 칩 내로 소수개의 세포를 함유하는 세포 현탁액을 주입하는 단계; 및 상기 마이크로채널들을 통해 정압 구동 흐름에 의해 단일 세포들을 상기 측면 웰들로 이동시키는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 방법은 혈액에서 하나의 또는 희소한 순환성 종양 세포(circulating tumor cells, CTCs)를 동정하고 분리하는 단계를 포함할 수 있고, 상기 CTC 세포들은 단일 또는 다단계의 MA 칩 공정 후에 포획될 수 있다. 상기 방법은 단일세포 및 대상을 복잡한 매트릭스에서 동정 및 분리하는 단계를 포함할 수 있고, 이 단계는 박테리아, 비드(bead), 입자, 바이러스를 포함하는 단일 대상을 매트릭스에서부터 분리하는 것, 결핵균을 분리하는 것, 및 특정 유전자형/ 표현형의 효모 세포를 분리하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 상기 측면 웰들 내의 세포를 식별하는 단계; 및 단일 세포 만을 함유하는 상기 측면 웰들로부터 세포들을 회수하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구체예(실시예)에 따라서, 단일 세포 분석을 수행하는 방법은 중심 및 표면을 갖는 디스크 형태의 칩; 상기 칩의 실질적인 중심에 위치하는 단일 중심웰(입구); 상기 칩의 외각의 환상 부분에 위치하는 복수 개의 측면 웰(출구); 및 상기 중심웰에서부터 상기 측면 웰들로 연장하는 복수 개의 채널들;을 포함하는 미세유체 분취액 칩을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 단일 세포 분석을 수행하는 방법은 단일 중심웰 및 복수개의 마이크로채널에 의해 상기 중심웰에 연결되는 복수개의 측면 웰들을 포함하는 미세유체 분취(MA) 칩의 입구로 세포 현탁액을 주입하는 단계; 및 상기 마이크로채널들을 통해 정압 구동 흐름에 의해 단일 세포들을 상기 측면 웰들로 이동시키는 단계;를 더 포함할 수 있다. 상기 단일 세포 분석을 수행하는 방법은 상기 중심웰 내로 세포가 불포함된 배지를 첨가하여 상기 채널들에 잔여하는 단일 세포들이 상기 측면 웰들로 흘러가도록 양성 정수압을 생성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 설명되는 미세유체 분취는 세포 크기, 형태 및 이동성과 무관하게 편리하고, 신속하며, 식별 가능하고, 손상이 없는 단일 세포 분리를 가능하게 할 수 있다. 분리된 단일 세포는 증식하여 상기 측면 웰들 내에서 클로닝을 형성하거나 후속 PCR 및 서열 분석을 위한 서브마이크로리터의 단일 세포 현탁액으로서 상기 측면 웰들로부터 용이하게 회수될 수 있다. 고효율 농축 능력으로 인해, 상기 방법은 혈액에서 단일 암세포를 분리하는 데에도 적용될 수 있다.
한정된 액체를 병렬분석(parallel analysis)을 위해 단일/다중 채널 피펫을 사용하여 같은 부피로 여러 개의 분액으로 나누는 것은 생물학적 및 화학적 실험실에서 이루어지는 보편적인 실험 과정이다(예, 수동/자동 피펫에 의해 세포 현탁액에서 단세포를 분리하는데 널리 사용되는 연속 계단희석법(serial dilution)). 그러나, 많은 양의 분액 부피 및 단세포를 정확하게 식별하는데 있어서 어려움은 단일 세포 유전 분석에 제약이 되며, 매우 시간 소모적이다.
이와 대조적으로, 본 명세서에 기재된 미세유체 분취는 분액 부피 및 노동력을 감소시키는데 있어서 상당한 이점을 갖는다. 여러 개의(예, 120) 서브마이크로리터의 분취액은 1 분 이내에 잘 준비될 수 있고, 단일 세포를 포함하는 단일 웰들은 일반적인 도립 현미경 관찰하에서 신속하고 정확하게(예: 1 초당 1 회의 속도로) 확인될 수 있다.
미세유체 분취는 최소의 샘플 손실과 함께(웰당 약 18 nl, 단일 마이크로 채널 부피와 실질적으로 동일 할 수 있음) 여러 개의 서브마이크로리터의 분취액을 빠르게 확보할 수 있는 간단하고 효과적인 전략이다. 또한, 미세유체 분취는 복잡한 도구, 추가 교육, 그리고 미세 유체에 대한 배경 지식조차도 요구하지 않는 간단하고 경험에 영향을 받지 않은 방법이다.
본 명세서에 개시된 MA 칩 이외에, 피펫, 페트리 접시 및 광학 현미경과 같은 본 발명의 공정에 사용되는 장비들은 통상적인 실험실에서 용이하게 이용 가능하다. 원래의 세포 현탁액의 주입 및 단일 세포 현탁액의 이동을 포함하는 전체 공정 동안 액체는 피펫을 사용하여 용이하게 취급될 수 있어서 초보자가 쉽게 이용할 수 있다.
단일세포 분리용인 상기 MA 칩을 사용함에 따른 몇 가지 특징과 장점은 다음과 같다:
- 쉬운 조작. 단일 세포 현탁액 도입 및 수집 공정 모두 사전 훈련을 요구함 없이 일반적으로 사용되는 공기변위피펫만을 사용하여 이루어질 수 있다.
- 빠른 시료 주입. 단일 세포 현탁액을 120(일백이십)개의 1 ㎕ 부피 측면 웰들로 분배하는데 단지 1 분 미만이 소요될 수 있다.
- 용이한 단일 세포 식별. 1.5 mm 직경의 측면 웰 내의 단일 세포들은 일반적인 광학 현미경(초당 1 개의 웰)에 의해 매우 쉽게 확인할 수 있다.
- 용이한 측면 웰 추적. 1.5 mm 직경의 측면 웰들 각각은 현미경 관찰을 위한 작은 마이크로단위 크기의 숫자와 육안 관찰을 위한 큰 매크로단위 크기의 숫자 모두로 표시된다.
- 단일 세포 PCR과의 호환성. 단일 세포를 약 1 ㎕ 부피의 액체로 분리하고, 후속 단일 세포 PCR 및 시퀀싱을 위해 일반적으로 사용되는 피펫을 사용하여 바이알(vial)로 옮길 수 있다.
- 높은 세포 생존력 및 클로닝 형성 가능. 상기 분리된 단일 세포들은 건강하며 클로닝을 형성할 때까지 측면 웰들 내에서 정상적으로 증식 할 수 있다.
- 선택적 단일 세포 분리. 단일 세포는, 혈액에서 순환성 종양 세포(CTCs)를 분리하는 경우처럼, 크기, 부유/부착 형태 및 형광성을 기준으로 하여 선택적으로 분리될 수 있다.
- 고효율 처리공정. 하나의 MA 칩은 단일 세포 분리 및 분석을 위한 120(일백이십)개의 측면 웰을 제공한다.
- 크기 및 형태가 다른 셀과 높은 호환성 1 ㎛ 내지 30 ㎛의 직경을 갖는 단일 유핵 세포와 단일 원핵 세포를 효과적으로 1 ㎕ 부피 측면 웰들 내로 분리할 수 있다.
- 낮은 비용. 대량 생산 시, 각 MA 칩의 비용은 1 달러 미만일 수 있다.
- 멸균. 상기 MA 칩은 멸균기, 알콜 침지, 및 자외선 노출과 같은 표준 방법으로 멸균될 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 양태는 일 예로서 제공되는 본 발명의 구체예들에 따른 특징들을 설명하는 하기의 상세한 설명 및 첨부된 도면에 의해 명확해질 것이다. 상기 요약은 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니며, 본 발명의 범위는 오직 첨부된 청구항에 의해 한정된다.
본 발명의 하나 이상의 구체예들은 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명된다. 첨부된 도면들은 단지 설명을 위해 제공되는 것으로, 단지 본 발명의 전형적인 또는 예시적인 구체예들을 나타낸다. 이러한 도면들은 본 발명의 이해를 돕고자 제공되는 것으로 본 발명의 범위 또는 적용을 한정하는 것으로 고려되어서는 안 된다. 명료하고 용이한 설명을 위하여 도면들이 반드시 일정한 비율로 표시된 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 명세서에 포함된 도면들 중 일부는 상이한 시야각에서 관찰된 본 발명의 다양한 구체예들을 도시한다. 하기의 상세한 설명에서 평면도, 저면도, 또는 측면도와 같은 도면들이 언급되지만, 이러한 도면들은 단지 설명을 위한 것으로, 별도로 명시되지 않는 한, 본 발명이 특정한 공간상의 방향으로 구현되거나 이용되는 것을 암시하거나 요구하는 것은 아니다.
도 1은 예시적인 구체예로서 미세유체 분취(MA) 칩의 평면도를 도시한다.
도 1a는 선 1A-1A를 따라 절개한 도 1의 MA 칩의 일부의 단면도를 도시한다(도 1a의 도면은 MA 칩의 오른쪽 엣지에서부터 중심웰의 약간 왼쪽부분까지를 도시한다).
도 1b는 도 1의 MA 칩의 일부분을 확대한 평면도를 도시한다.
도 1c는 도 1의 MA 칩의 일부를 확대한 평면도를 도시한다.
도 2는 미세유체 분취 방법의 순서도를 도시한다.
상기 도면들은 본 발명을 기재된 형태로 정확하게 구현하거나 제한하기 위한 것이 아니다. 본 발명은 수정되거나 변경된 형태로 실시될 수 있으며 오직 청구항 및 이들의 균등물에 의해서만 제한됨을 이해해야 한다.
일부 경우에서, 본 발명은 본 명세서에서 예시적인 환경들과 관련하여 설명된다. 이러한 예시적인 환경들에서의 설명은 본 발명의 다양한 특징들 및 구체예들을 예시적인 응용의 맥락에서 나타내고자 제공된다. 이러한 설명을 읽는 당업자들은 본 발명이 상이한 대안 환경에서 어떻게 구현될 수 있는지 명백하게 이해할 것이다.
별도로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적이고 과학적인 용어들은 본원 발명이 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에서 언급되는 모든 특허, 출원서, 공개문헌들은 전체적으로 참조로 포함된다. 본 절에서 설명되는 정의가 본 명세서에 참조로 포함된 출원서, 공개공보, 및 기타 공개문헌에서 기재된 정의에 반하거나 일치하지 않을 경우, 본 명세서에서 제공되는 정의는 본 명세서에서 참조로 포함된 문헌에서의 정의보다 우선한다.
본 명세서에 기재된 임의의 치수는 별도로 언급되지 않는 한 예시적이며 근사치로 간주되어야 하며, 설명될 수 있는 다양한 요소의 상대적인 척도를 나타내는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명에 따라서, 여러 개의 세포를 포함하는 비교적 많은 양의 세포 현탁액(예, 120 uL)이 일반적으로 1 분 미만의 시간 내에 단일 세포들을 갖는 여러 개의 분취액(예, 120)들로 실질적으로 동시적으로 균일하게 분포될 수 있다. 무작위적이고 신뢰할 수 있는 단일 세포 분리는 여러 개의 개별 측면 웰들 및 여러 개의 개별 마이크로채널들에 의해서 유체 소통하는 단일 중심웰을 포함하는 미세유체 분취액 칩(MA 칩)을 사용하여 구현될 수 있다. 상기 MA 칩은 중심웰에 있는 소수개의 세포들(예, 약 2 내지 120개의 세포)로부터 측면 웰들에 있는 단일 세포들을 정압 구동 흐름에 의해 효과적으로 분리하는데 사용될 수 있다. 상기 MA 칩은 높은 세포 재생 효율을 가진다. 단일 세포들의 신속한 분리 및 용이한 식별, 높은 세포 생존력, 및 서브마이크로리터의 단일세포 현탁액의 편리한 이동으로 인하여, 상기 MA 칩은 단일 세포 클로닝, PCR, 및 시퀀싱에 용이하게 적용될 수 있다.
MA 칩의 예시적인 구체예
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 미세유체 분취(MA) 칩(100)을 도시하며, 상기 미세유체 분취(MA) 칩(100)은 "MA 칩"로도 언급될 수 있다. 도 1a는 도 1의 MA 칩의 일부분을 도시한다. 도 1b는 도 1의 MA 칩의(확대된)일부를 도시한다. 도 1c는 도 1의 MA 칩의(확대된)일부를 도시한다.
상기 MA 칩은 약 1 mm의 두께를 갖는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)과 같은 가요성이거나 반강성인 재료로 이루어진 얇은 시트(102)를 포함할 수 있다. 상기 MA 칩은 기하학적 중심(CL) 및 약 6 cm의 직경(약 3 cm의 반경)을 갖는 전체적으로 디스크 형태일 수 있다. 상기 MA 칩은 약 1.7 g의 총 중량을 가질 수 있다. 상기 MA 칩은 약 8.5 cm의 직경을 갖는 페트리 접시에 장착 가능한 크기 및 형태를 가질 수 있다. 상기 MA 칩을 형성하는 상기 시트는 상기 MA 칩 전체의 상하부면 각각에 상응하는 상부면(102a) 및 하부면(102b)을 포함할 수 있다.
상기 MA 칩은 다각형과 같은 디스크 형태를 가질 수 있다. 이하에서는 디스크 형태의 MA 칩이 주로 설명된다.
이하, 상기 MA 칩 전체에 형성된 상하부면에 연장되는 다양한 구성들(중심웰, 측면 웰, 채널)이 주로 설명될 것이다.
상기 MA 칩은 상기 중심웰(110)에서 동일한 복수개의 측면 웰들(114a 및 114b)(집합적으로 "114"로도 언급됨)로 방사상으로 연장하는 복수 개의 채널들(112a 및 112b)(집합적으로 "112"로도 언급됨)에 의해 연결된 단일(하나의) 중심웰(110)을 포함한다. 상기 채널들(112)은 상기 중심웰(110) 및 상기 측면 웰들(114)과 유체소통한다.
상기 중심웰(110)은 입구로서 사용될 수 있으며, 상기 MA 칩의 상부면 내에 예를 들어 약 500 ㎛와 같이 적어도 부분적으로 연장하는 둥근 구멍 형태일 수 있다. 도 1a에서 잘 도시된 것처럼, 상기 중심웰은 상기 MA 칩을 완전히 통과하도록 연장할 수 있다. 상기 중심웰은 약 3 mm의 직경을 가진다. 상기 중심웰의 부피는 4 ㎕ 일 수 있다. 상기 중심웰은 상기 MA 칩의 기하학적 중심에 배치될 수 있다. 상기 중심웰은 사용자가 상기 MA 칩의 상부면에 접근 가능하도록 하며, 상기 MA 칩 내로 세포 현탁액을 주입하는데 사용된다.
상기 측면웰들(또는 외측웰들, 114)은 출구로 사용될 수 있으며, 상기 MA 칩의 상부면 내로 예를 들어 약 500 ㎛와 같이 적어도 부분적으로 연장하는 둥근 구멍 형태일 수 있다. 도 1a에서 잘 도시된 것처럼, 상기 측면 웰들은 상기 MA 칩을 완전히 통과하도록 연장할 수 있다. 상기 측면 웰들은 약 1.5 mm의 직경을 가질 수 있다. 상기 측면 웰들의 부피는 1 ㎕ 일 수 있다. 상기 측면 웰들은 상기 MA 칩의 외주 외각 부분(또는 환상 부분) 주위에 분포될 수 있다. 상기 측면 웰들은 사용자가 상기 MA 칩의 상부면에 접근 가능하도록 하며, 상기 MA 칩으로부터 분리된 세포를 회수하는데 사용된다.
예를 들어, 120(일백이십개)의 측면 웰들(114)이 포함될 수 있다. 상기 여러 개의 측면 웰들은 상기 MA 칩의 중심에서부터 제1 반경(r1)에 배치된 제1 세트(114a)의 측면 웰들 및 상기 MA 칩의 중심에서부터 제2 반경(r2)에 배치된 제2 세트(114b)의 측면 웰들을 포함하는 형태로 배열될 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 측면 웰 세트는 상기 MA 칩의 기하학적 중심에서부터 25 mm의 반경(r1)에 있는 원주 주변에 균등하게(6 도 마다) 배열된(배치된, 분포된) 60(육십)개의 측면 웰들을 포함할 수 있다. 그리고, 상기 제2 측면 웰 세트는 상기 MA 칩의 기하학적 중심에서부터 28 mm의 반경(r2)에 있는 원주 주변에 균등하게(6 도 마다) 배열된(배치된, 분포된) 60(육십)개의 측면 웰들을 포함할 수 있다. 상기 60개의 측면 웰을 포함하는 제2 세트가 상기 60개의 측면 웰을 포함하는 제1 세트 사이에 원주 위치에 배치되도록 상기 제1 및 제2 측면 웰 세트는 엇갈리게 상호배치(interleave) 될 수 있다. 이 경우 120개의 측면 웰들이 상기 MA 칩의 외각의 외주 부분(간략하게 "원주"로도 언급됨)에 3 도의 각도마다 균등하게 배치될 것이다. 상기 측면 웰의 수는 이로 한정되는 것은 아니며 더 많거나 적은 수는 웰이 상기와 다르게 배치될 수도 있다. 도 1에서는 명확한 설명을 위해 상기 측면 웰들(114a 및 114b)의 일부 만을 참조번호로 나타내었다. 도 1a 및 1b는 일반적으로 상기 제1 측면 웰 세트(114a) 중 하나이거나 제2 측면 웰 세트(114b) 중 하나일 수 있는 측면웰(114)을 언급한다. 도 1c는 상기 120개의 측면 웰들(114a 및 114b) 중 단지 4개의 측면 웰들 만을 도시하고, 이 중 일부는 참조번호로 나타내었다.
상기 MA 칩(100)은 중심부 및 3 cm의 반경을 갖는 디스크 형태일 수 있다. 상기 중심웰은 상기 디스크의 중심에 배치될 수 있다. 상기 측면 웰들은 상기 디스크의 중심으로부터 25 mm 또는 28 mm 위치의 반경부분들 디스크의 "외각의 외주 부분"(또는 "외각의 환상 부분")에 배치될 수 있다. 상기 디스크의 외각의 환상 부분은(상기 측면 웰들이 위치함) 상기 디스크의 전체 반경(r)의 적어도 약 50%(예, 적어도 60% 또는 적어도 70% 또는 적어도 75% 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 최대로 거의 100%)에서부터 상기 디스크의 외각 가장자리(100%의 반경("r"))까지 연장하는 상기 디스크의 일부분으로서 정의될 수 있다. 도 1c의 부재(104) 참조.
상기 MA 칩의 외각의 외주 부분(또는 영역)은 고리형일 수 있다. 고리형은 2개의 동심원으로 둘러싸인 링 형태의 영역이다. 도 1c는 상기 MA 칩의 일부분을 도시하며, 상기 일부분은 반경(r)을 갖는 디스크 형태이다(상기 MA 칩의 중심부는 도시되지 않음.) 상기 제1 측면 웰 세트(114a)는 상기 MA 칩의 중심으로부터 반경(r1)에 배치될 수 있다. 상기 제2 측면 웰 세트(114b)는 상기 MA 칩의 중심으로부터 반경(r2)에 배치될 수 있고, 여기에서 r2는 r1보다 크다(r2 > r1). 상기 MA 칩의 외각의 외주 부분은 상기 MA 칩의 중심으로부터 반경(r3)에서부터 상기 MA 칩의 중심으로부터 반경(r)에 위치하는 상기 MA 칩의 외각 가장자리까지 연장할 수 있으며, 반경(r3)은 반경(r1)보다 작을 수 있다(r3 < r1).
상기 채널들(112, 본 명세서에서 "마이크로채널들"로도 언급됨)은 길이 및 너비를 가지고 신장될 수 있으며, 예를 들어 30 ㎛(칩의 두께가 1 mm일 경우 단지 일부분임)와 같이 적어도 부분적으로 상기 MA 칩의 하부면으로 연장할 수 있다. 이는 도 1a에 도시된다. 상기 마이크로채널들은 상기 MA 칩에 적어도 부분적으로 연장하는 것이 바람직하지만, 상기 MA 칩 전체에 연장될 수 있다. 상기 마이크로채널들은 30 ㎛의 너비를 가질 수 있다. 상기 마이크로채널들의 치수는 20 ㎛ 내지 100 ㎛일 수 있으며, 이러한 치수는 깊이 및 너비 모두에서 적용 가능하다.
상기 마이크로채널들(112)은 상기 중심웰에서부터 상기 측면 웰들로, 예를 들어 상기 중심웰의 외각 가장자리에서부터 상기 측면 웰들의 내부 가장자리로, 방사상으로 연장할 수 있다. 각각의 측면 웰에 대하여 하나의 마이크로채널이 있을 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 단독의(하나의) 중심웰에서부터 상기 120(일백이십)개의 측면 웰들로 연장하는 120(일백이십)개의 마이크로채널들이 존재할 수 있다. 상기 마이크로채널들은 일반적으로 유체 소통 및 상기 중심웰(입구)과 상기 측면 웰들(출구들) 사이에서의 세포 이동(움직임)을 위해 제공된다. 상기 마이크로채널들은 상기 입구에 상기 출구들을 연결하기 위한 채널, 관, 도관, 또는 연결자로 간주될 수 있다. 각각의 마이크로채널의 하나의 단부는 상기 중심웰에 (유체연통으로)연결될 수 있는 반면, 상기 각각의 마이크로채널의 다른 하나의 단부는 상기 복수개의 측면 웰들 중 주어진 하나에 (유체연통으로)연결될 수 있다. 또는, 상기 마이크로채널들은 외각 웰에서부터 상기 측면 웰들로 연장하는 방사상 형태가 아닌 다른 형태로(예, 허브에서부터 바퀴살부분으로 연장하는 스포크(spoke) 형태로) 연장될 수 있다.
상기 측면 웰들은 상기 MA 칩의 중심에서부터 상이한 반경들(r1, r2)에 배열될 수 있기 때문에, 상기 마이크로채널들은 상기 제1 측면 웰 세트(114a)로 연장하는 60(육십) 개의 마이크로채널들을 포함하는 제1 세트(112a) 및 상기 제2 측면 웰 세트(114)로 연장하는 60(육십)개의 마이크로채널들을 포함하는 제2 세트로 배열될 수 있다. 상기 제1 마이크로채널 세트는 약 23 mm의 길이를 가질 수 있다. 상기 제2 마이크로채널 세트는 약 25 mm의 길이를 가질 수 있다. 상기 측면 웰들은 엇갈리게 배열되기 때문에(r1, r2, r1, r2), 상기 측면 웰들 사이 길이가 길 경우, 상기 제2 마이크로채널 세트(112b)는 상기 제1 측면 웰 세트(114) 중 두 개의 인접한 웰 사이를 통과하는데 필요할 수 있다(상기 측면 웰들 사이 길이가 짧을 경우, 상기 제1 마이크로채널 세트(112a)는 상기 제1 측면 웰 세트(114a)로 연장하고, 웰 사이를 통과하는 것이 필요하지 않다). 명료한 설명을 위하여, 도 1에서 단지 몇개의 마이크로채널들(112a 및 112b)만을 참조번호와 함께 도시된다. 도 1a 및 1b는 일반적으로 상기 제1 마이크로채널 세트(112a) 중 하나의 마이크로 채널 또는 상기 제2 마이크로채널 세트(112b) 중 하나의 마이크로 채널일 수 있는 마이크로채널(112)을 의미한다. 도 1c는 120개의 마이크로채널들 중 단지 4개의 마이크로채널(112a 및 112b)을 도시하며, 이들 중 일부는 참조번호와 함께 나타낸다.
상기 마이크로채널들은 약 30 ㎛의 너비(또는 측면 길이)를 가질 수 있다. 상기 마이크로채널들은 모두 서로 동일한 너비를 가질 수 있다. 상기 마이크로채널들의 단면적은 정사각형일 수 있고, 너비와 깊이는 유사할 수 있으며, 곧은 측벽들을 가질 수 있다. 상기 마이크로채널들은 테이퍼형의(tapered) 또는 반원형의 단면을 가질 수 있다. 일반적으로, 상기 마이크로채널들은 상기 중심웰에서부터 상기 측면 웰들로 단일 세포들의 이동(유체 내에서)을 가능하게 할 수 있는(그리고 선택적으로 용이하게 하는) 크기 및 형태를 가질 수 있다. 상기 마이크로채널들 각각은 약 18 nl의 부피를 가질 수 있다.
도 1a는 상기 마이크로채널들(112)이 평평한 것으로 도시한다(예를 들어, 상기 MA 칩이 평평한 테이블 상단 위에 위치하는 페트리 접시 안에 존재함). 상기 마이크로채널들은 상기 측면 웰들(114)을 향하여 기울어져서 상기 중심웰에서부터 상기 측면 웰들로의 정압 구동 유체 흐름(positive pressure-driving fluid flow)을 도울 수 있다. 즉, 마이크로채널은 이의 중심웰 단부가 더 얕을 수 있고, 이의 측면 웰 단부에서 더 깊을 수 있다. 마이크로채널의 너비는 상기 중심웰에서부터 측면 웰까지의 마이크로채널의 전체 크기(길이)에 따라 균일하거나 변할 수 있다. 일반적으로, 주어진 MA 칩 상의 상기 마이크로채널들 모두는 서로 동일한 너비 및 길이를 가지거나, 일부 마이크로채널들은 상이한 너비 및 깊이를 가질 수 있다(도 1에서, 일부 상기 마이크로채널들(112a)이 다른 마이크로채널들(112b)에 비해 짧게 도시된다). MA 칩들은 서로 균일한 너비(및 깊이)를 갖는 마이크로채널들을 포함하도록 제작될 수 있다. 도면에서 MA 칩은 균일한 마이크로채널을 포함하는 것으로 도시되지만, MA 칩은 상이한 크기(즉, 너비 및/또는 깊이)의 마이크로채널들을 포함하도록 제작될 수 있다.
상기 캡(120)은 상기 중심웰(110) 위에 배치될 수 있다. 상기 캡은 약 5 mm의 외경 및 약 3.0 mm의 내경(또는 관통 구멍)를 갖는 실린더 형태일 수 있으며, 상기 실린더는 하나의 단부로부터 다른 단부까지 균일한 보어(bore)를 가질 수 있다. 상기 캡의 길이는 약 5 mm일 수 있다. 상기 캡은 상기 MA 칩(100)으로부터 분리되는 PDMS와 같은 플라스틱으로 이루어질 수 있으며, 상기 MA 칩(100)와 함께 사용되는 부재일 수 있다. 상기 캡은 상기 도면에서 상기 MA 칩으로부터 이격되는 것으로 도시된다. 상기 캡은 약 112 ㎕의 부피를 가질 수 있다. 상기 캡을 통과 연장하는 상기 구멍(보어)는 약 1.5 mm의 직경을 가질 수 있다. 상기 캡은 상기 MA 칩과 분리된 부재로서 제공되기보다는 상기 MA 칩과 일체로서 제공될 수 있다.
도 1a에 도시하였듯이, 상기 캡(120)은 상기 중심웰(110)의 상부에 배치되어 클로닝 또는 회수에 사용되는 웰 내에서 부유된 적은 부피의(예, 1 ㎕) 단일 세포들을 함유하는 많은 수의(예, 120) 측면 웰들로 큰 부피의(예, 120 ㎕) 세포 현탁액의 용이한 주입이 가능 하도록 120 μL 세포 현탁액을 함유하는 피펫 팁(미도시)을 단일 중심웰로 연결할 수 있다.
상기 캡(120)의 상부면 및 하부면은 개방된다. 상기 캡의 하부면은 상기 중심웰 상부 내에 약간 연장하여 세포 현탁액의 주입 동안에 주입되는 세포 현탁액을 임시적으로 보관할 수 있도록 상기 캡의 하부면으로부터(도시된 것처럼) 연장하는 립(lip) 또는 숄더(shoulder)를 포함할 수 있다. 상기 캡은 상기 중심웰 위로 사용적합하게 배치되고, 깔대기(원뿔형이 아니라 원통형임에도 불구하고)와 같은 방식으로 작용하여 상기 중심웰로 세포 현탁액의 주입을 용이하게 한다. 상기 캡의 상부면은 닫히지 않고, 상기 캡은 침니(chimney)와 유사하며, 가이드로서 기능을 하며, "배럴(barrel)", 또는 "연관(flue)" 또는 "덕트(duct)"로 언급될 수 있다.
상기 다수의 개별 측면 웰들을 식별하고 이들을 용이하게 구별하기 위하여, 상기 MA 칩의 상부면(102a)에 표시자가 제공될 수 있다. 예를 들어, "1" 내지 "120" 범위의 비교적 작은 마이크로미터(um)-단위의 숫자들은 현미경 관찰 하에서 측면 웰들에 대응하도록(고유한 식별번호를 갖도록) 개별 측면 웰들 각각에 인접한 상기 MA 칩의 상부면(예, 반경 방향으로/내측에) 상에 위치할 수 있다. 상기 ㎛-단위의 표식들은 도 1에서 도시되지 않는다. 이러한 ㎛-단위의 표식들 중 일부는 도 1c에서 관찰될 수 있다. 또한, 예를 들어 "2" 내지 "120" 범위의 짝수와 같은 비교적 큰 밀리미터(mm) 단위 수들의 세트(또는 서브세트(subset))는 측면 웰들에 인접하여(예, 반경 방향을 벗어나/외측에, 즉, 상기 MA 칩의 중심으로부터 더 큰 반경(r2)에 위치한 상기 제2 측면 웰 세트(112b)의 반경방향 외측에) 격행으로 상기 MA 칩의 상부면 상에 위치하여 육안으로 관찰될 수 있도록 상기 측면 웰들에 상응하게 표시될 수 있다. 홀수 측면 웰들(112a)의 mm-단위 표식들은 공간 부족으로 인해 제품에서 생략될 수 있다(또는, "1" 내지 "119" 범위의 mm 단위 홀수 숫자들은 상기 제1 측면 웰 세트(112a) 외측에 배치될 수 있고, 짝수 측면 웰들에 대한 mm 단위 표식들은 생략될 수 있다(또는, 공간이 충분하다면 상기 측면 웰들 모두에 대한 mm 단위의 번호가 포함될 수 있다) 이러한 mm 단위 표식들은 도 1a 및 도 1c에 도시한다. 상기 mm 단위의 숫자들은 상기 제공된 측면 웰들의 ㎛-단위의 숫자들에 상응해야 한다. 상기 측면 웰들 각각을 식별하고 구분 가능할 수 있는 다른 표시들이(예, 표식, 문자, 색상, 기호) 사용될 수 있다. 이러한 표시들 모두 또는 일부는 측면 웰들을 식별할 수 있도록 상기 MA 칩의 하부면에 위치할 수 있다. 상기 측면 웰들이 상기 MA 칩을 완전히 통과하도록 연장하지 않는다면, 측면 웰들의 하부에 개별 측면 웰 식별을 위한 표지가 위치할 수 있다.
상기 MA 칩의 설계 및 제조
상기 MA 칩은 종래의 포토리소그래피 및 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 성형 기술들을 이용하여 제조될 수 있다. PDMS는 일반적으로 실리콘으로 언급되는 고분자 유기 규소 화합물에 속한다. PDMS 는 가장 널리 사용되는 실리콘계 유기 고분자이고, 특히 특이한 유동학적 특성(또는 유동성)을 가지는 것을 알려져 있다. PDMS은 광학적으로 투명하고, 일반적으로 불활성이고, 비독성이며, 불연성이다. PDMS는 디메티콘(dimethicone)으로도 불려지며, 여러 종류의 실리콘 오일(중합된 실록산) 중 하나이다. PDMS는 콘택트 렌즈 및 의료 기기에서부터 엘라스토머(elastomer)에 이르기까지 다양한 용도에 사용된다.
상기 MA 칩은 AutoCAD 소프트웨어(Autodesk)를 이용하여 설계되고, 이 후 4-인치 유리 포토마스크(glass photomask, Photo Sciences, Inc.)로 인쇄될 수 있다. 상기 PDMS MA 칩은 표준 포토리소그래피 및 엘라스토머 성형(elastomeric molding)에 의해 제조될 수 있다. 요약하면, SU-8 3025 네거티브(negative) 포토레지스트(MicroChem Corp.)는 1 분 동안 2000 rpm (Laurell Technologies Corp.)에서 4 인치 실리콘 웨이퍼(Silicon Quest International Inc.) 상으로 스핀 코팅(spin-coating)되어 30 ㎛ 두께의 시트를 형성할 수 있다. 베이킹(baking), UV 노출, 및 현상(developing)을 수행한 이후, 혼합된 폴리디메틸실록산(PDMS; 10A: 1B; Dow Corning Corp.)을 상기 포토레지스트 상에 붓고, 80°C에서 25 분간 가열할 수 있다. 경화된 후에, 상기 1 mm 두께의 PDMS 시트를 벗겨 내고, 펀치를(Ted Pella, Inc) 사용하여 구멍을 뚫을 수 있다. 상기 둥근 PDMS MA 칩은 공기 방울 발생 없이 시중에서 판매되는 8.5 cm의 직경을 가진 페트리 접시(Fisher Scientific)로 자동으로 밀봉될 수 있다. 필요한 경우, 상기 MA 칩은 표준 멸균기(autoclave)를 사용하여 멸균될 수 있다.
MA칩은 PDMS 외에 폴리(메틸 메타크릴레이트(poly(methyl methacrylate), PMMA), 폴리스티렌(polystyrene, PS), 및 폴리카보네이트(polycarbonate, PC)를 포함하는 다른 재료들로 제조될 수 있다.
PMMA는 아크릴 또는 아크릴 유리로도 알려져 있으며, Plexiglas, Acrylite, Lucite, 및 Perspex와 같은 상품명으로도 알려져 있고, 가벼운 시트 형태로 종종 사용되거나 비산방지 기능으로 인해 유리 대체제로서 종종 사용되는 투명한 열가소성 소재이다.
PS는 스티렌 단량체로 제조된 방향족 합성 고분자이다. PS는 고체이거나 발포될 수 있다. 범용 PS는 투명하고, 단단하고, 깨지기 쉽다. PS의 단위중량가격은 저렴하다. PS는 산소 및 수증기에 대한 방어력이 다소 열악하며, 비교적 낮은 융점을 가진다. PS는 가장 널리 사용되는 플라스틱 중 하나이다.
PC는 이의 화학 구조 내에 카르보네이트 기를 함유하는 열가소성 고분자의 그룹이다. 엔지니어링에 사용되는 폴리카보네이트들은 강하고 거친 소재이며, 이들 중 일부 등급은 광학적으로 투명하다. PC는 용이하게 가공되고, 성형되고, 열성형될 수 있다. 이러한 물성들로 인하여, 폴리카르보네이트는 많은 분야에서 적용된다.
단일 세포의 분리 및 회수
도 2A 내지 2E는 상기에서 설명된 MA 칩(100)을 사용하여 단일 세포들을 분리하고 회수하기 위해 수행되는 미세유체 분취 방법(200)의 일 구체예를 도시한다. 상기 방법 또는 과정은 순차적으로 단계들로 이루어진다. 이들 단계 중 일부 단계 또는 단계의 일부는 본 명세서에서 되는 것과 상이한 순서로 수행될 수 있다. 상기 단계 각각을 수행하는데 예상되는 시간이 언급될 수 있다.
단계 1(202, 조립):
상기 MA 칩(100)은 페트리 접시(미도시, 참조. Appendices) 내에 배치된다. 상기 MA 칩(100)은 6 cm의 직경을 가질 수 있고, 상기 페트리 접시는 8.5 직경을 가질 수 있다. 얇은 PDMS 시트의 우수한 탄성 및 유연성으로 인하여, 상기 MA 칩은 돌돌 말린 후에도 평평한 형태를 빠르게 회복할 수 있고, 이후 기포 형성 없이 페트리 접시의 하부면과 같은 단단하고 평평한 표면에 밀착하여 밀봉할 수 있다. 이 단계는 완성하는데 0.1 분(6 초)의 시간이 소용될 것으로 예상된다.
단계 2(204, 캡핑):
상기 캡(120)은 상기 MA 칩의 상부면(100), 상기 중심웰(110)의 상부에 배치될 수 있다(참조. 도 1a) 상기 캡은 실린더 형태일 수 있다. 상기 중심웰의 직경은 3 mm일 수 있다. 상기 캡은 5 mm의 OD(겹치기에 충분함/상기 중심웰보다 큼)를 가질 수 있고, 상기 캡을 통과하도록 연장하는 구멍은 1.5 mm의 직경을 가질 수 있다. 상기 캡의 구멍을 상기 중심웰 위에 잘 맞추어 배치하여, 피펫을 사용하여 상기 중심웰로 세포 현탁액의 주입하는 것을 가능하게 할 수 있다. 상기 캡은 5 mm의 높이를 가질 수 있다. 상기 중심웰 위로 배치되는 PDMS 캡은 피펫을 사용하여 상기 MA 칩 내로 액체(세포 현탁액)를 주입하는 것을 용이하게 한다. 이 단계는 완성하는데 0.1 분(6 초)의 시간이 소요될 것으로 예상된다.
상기 PDMS 캡은 1.5 mm의 직경 및 5 mm의 깊이를 가진 관통구멍을 포함한다. 이러한 크기는 100 내지 1000 ㎕ 피펫 팁과 잘 호환되어, 누출없이 상기 MA 칩으로 액체의 주입을 가능하게 한다.
단계 3(206, 분취):
120 ㎕의 세포 현탁액(미도시)을 분취하기 위하여 100 내지 1000 ㎕ 팁을 갖는 피펫을 사용하여 상기 캡을 통해 상기 MA 칩의 중심웰로(입구) 주입한다(미도시, 부록 참조). 이 단계는 완성하는데 1 분(60 초)의 시간이 소용될 것으로 예상된다.
상기 입구 주위에 균일하게 분포된 압력으로 인해, 상기 세포 현탁액은 상기 많은 수의(예, 120개) 측면 웰들(114) 내로 실질적으로 동시에 그리고 균일하게 분포될 수 있어 무작위적이고 신뢰할 수 있는 단일 세포 분리가 이루어진다. 정압 구동 흐름은 상기 상기 마이크로채널들(112, 112a, 112b)을 통해 상기 중심웰(입구)에서부터 상기 측면 웰들(출구들, 114(114a, 114b)로 단일 세포들을 밀어낸다(운반, 이동, 이송한다). 이를 "미세유체 분취"로 언급할 수 있다.
상기 분취 후에, 상기 마이크로채널들 내의 가능성 있는 단일 세포들을(1.8% 확률) 출구들(측면 웰들)로 밀어내기 위하여 100 ㎕의 세포가 불포함된 배지를 상기 중심웰 내로 적가한다. 즉, 피펫을 사용하여 MA 칩 내로 120 ㎕의 세포 현탁액을 주입한 후에, 하나의 단일 세포가 마이크로채널들에 때때로 잔여할 수 있다(1.8% 확률). 100 ㎕의 세포가 불포함된 배지를 상기 중심웰로 주입함으로써, 양성 정수압(positive hydrostatic pressure)이 중심웰에서부터 측면 웰들로 생성될 것이다. 이러한 양성 정수압은 남아있는 단일 세포들을 밀어내어 상기 측면 웰들 내로 흘러가게 할 것이다.
단계 4(208, 식별):
상기 측면 웰들(114)내의 단일 세포들은 1 well/s의 속도로 도립 현미경에 의해 식별된 후, 상기 측면 웰들 내측에 위치하고 현미경 관찰을 위해 특별히 설계된 마이크로미터 단위의 수들에 따라 기록될 수 있다. X10 대물 렌즈가 장착된 도립 현미경의 영역이(2 mm의 직경을 가짐) MA 칩 웰의 크기보다(1.5 mm의 직경을 가짐) 크기 때문에, 단일 세포들만을 함유하는 단일 측면 웰들만 신속하게 구별할 수 있다. 이 단계를 완성하는데 각각의 웰에 대하여 1초 또는 전체 웰(120개의 측면 웰들)에 대하여 총 2 분(120 초)의 시간이 소요될 것으로 예상된다.
123개의 분리된 단일 세포들이 웰들로 분포되었다는 것은 미소유체의 영향 하에 거의 모든 단일 세포들이 마이크로채널의 연장 방향으로 위치되었다는 것을 나타낸다. 즉, 상기 중심웰에서부터 상기 측면 웰들로의 정압의 영향하에, 모든 단일 세포들은 최종적으로 상기 측면 웰들로 흘러들어갈 수 있다. 1.5 mm 직경 측면 웰 각각에 있는 각각의 단일 세포의 정확한 위치는 웰 마다 상이할 수 있다. 그러나, 상기 세포들은 상기 마이크로채널과 상기 측면 웰들의 교차 영역(교차점, 즉, 측면 웰에 연결된 마이크로채널의 단부를 바로 넘어서는 상기 측면 웰의 방사상으로 최내측 영역)에 위치할 가능성도 있다.
단계 5(210, 회수):
상기 측면 웰들(114b)의 외측에 위치하고 육안으로 관찰하기에 적절한 크기인 밀리미터 단위의 짝수들에 따라서, 원하는 단일 세포들은 상기 MA 칩의 상부면에서부터 상기 측면 웰들 내로 삽입되는 0.1 내지 2.5 ㎕의 피펫 팁을 가진 피펫(미도시)을 사용하여 편리하고 직접적으로 회수될 수 있다.
마지막으로, 세포들을 페트리 접시에서 수거하고, 세포 현탁액 상태로 제조하여 현미경을 사용하여 계수하고, MA 칩 내로 주입하고, 공기변위피펫(air displacement pipette, Eppendorf)을 사용하여 단일 세포 현택액으로서 회수하였다.
상기에서 본 발명의 MA 칩을 사용하여 단일 세포들을 얻는 전체과정을 설명하였다. 상기 MA 칩으로 주입되는 알려진 세포 수를 갖는 단일 세포 현탁액을 제조하는 공정은 하기 4 단계를 포함한다. 1) 피펫을 사용하여 페트리 접시에 1 ㎕의 단일 세포 현탁액을 적가한다. 2) 도립 현미경을 사용하여 세포를 계수한다. 3) 119 ㎕의 세포가 불포함된 배지를 1 ㎕의 상기 단일 세포 현탁액에 첨가한다. 4) 소량의 유체를 분취하기 위하여 알려진 세포 수를 갖은 단일 세포 현탁액 전체를 회수한다. 이 후, 전술된 단계 1 내지 5(조립, 캡핑, 분취, 식별, 회수)를 수행할 수 있다.
캡 대신에, PDMS(또는 다른 재료) 매트(mat)를 상기 MA 칩("MA 디쉬(dish)"로 언급될 수 있음)에 배치할 수 있다. 상기 매트의 두께는 5 mm이고, 매트의 중앙에 1.5 mm 직경의 구멍을 가질 수 있다. 예시적인 절차로서 다음 단계들이 수행될 수 있다.
1) 조직배양접시 표면에 120 웰 MA 디쉬를 올려둔다.
2) MA 디쉬 위에 상기 매트를 올려둔다. 상기 1.5 mm 직경의 구멍을 3 mm 중앙 웰과 수직 방향으로 정렬되도록 배치한다.
3) 피펫 팁을 사용하여 1 cell/ul 미만의 농도가 되도록 단일 세포 현탁액을 120 ㎕를 초과하는 용량으로 흡인한다.
4) 상기 매트 구멍 내로 상기 피펫 팁을 삽입한다.
5) 상기 피펫의 버튼을 아래 방향으로 밀어냄으로써 상기 120 측면 웰들로 단일 세포 현탁액을 주입한다.
6) 각각의 측면 웰은 30 초 이내에 1 ㎕의 세포 현탁액으로 채워질 수 있다.
7) 상기 피펫 팁 및 매트를 제거한다.
8) 각각의 측면 웰을 식별하고, 단일 세포를 함유하고 있는 측면 웰들을 모두 표시하고, 단일 세포들을 후속 PCR 실험을 위해 피펫을 사용하여 바이알로 옮긴다.
9) 또는, 상기 단일 세포들을 세포복제(cell cloning)가 이루어지도록 측면 웰들에 그대로 배양할 수 있다.
의견 및 결론
세포 크기, 형태 및 이동성과 무관하게 다양한 단일 세포의 분리를 위한 미세유체 분취기술, 기능성 및 적용성을 설명하였다. 미세유체 분취는 세포 수에 제한이 있는 확보가 어려운 상당히 중요한 임상 샘플 내의 적은 수의 세포와 혈액에서 순환성 종양 세포(circulating tumor cells, CTCs)를 분리하는데 사용될 잠재력이 있는 수백만 개의 세포에서부터 단일 세포들을 선택적으로 분리하는 것을 가능하게 한다. 또한, 상기 미세유체 분취는 단일 세포의 생존력이 잘 유지되는 단일 세포 복제 및 10 분 이내에 40 나노리터 단일세포 현탁액을 준비 할 수 있는 단일 세포 PCR과도 매우 잘 호환된다. 또한, MA 칩은 1.7 g PDMS(약 0.2 달러)의 비용과 동등한 저비용이며, 접합 및 밸브를 필요로 하지 않으며 대량 생산이 용이해 일반적인 실험실의 단일 세포 연구원들이 바로 사용할 수 있다.
고속의 분취, 작업당 120 개의 분취액과 같은 특징은 하나의 단일 MA 칩이 120개의 농축계수(enrichment factor, EF)를 갖도록 한다. 따라서 이론 상으로는 하나의 표적 세포가 3 내지 4 개의 MA 칩을 통해 수백만 개의 세포로부터 성공적으로 분리될 수 있으며, 해당 EF는 각각 1.7Х106, 2.1Х108 일 수 있다. 따라서, 상기 MA 칩은 높은 세포 재생 효율을 가진다.
상기 MA 칩은 소수의 세포들로부터 단일 세포들을 효과적으로 분리(단리)할 수 있다. 상이한 크기의 마이크로 채널들을 갖는 상이한 MA 칩들은 직경 4 ㎛의 단일 발아 효모, 직경 8 ㎛의 단일 부유성 T 세포, 직경 16 ㎛의 단일 MDA-MB-231 유방암 세포, 및 길이 22 ㎛와 너비 3 ㎛의 이동성 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei)와 같이, 세포의 크기, 형태, 및 이동성과 무관하게, 다양한 종류의 세포들에 적용 가능하다.
폭과 깊이를 포함하는 채널의 크기는 셀의 직경보다 커야 한다. 이는 마이크로 채널 내에서의 이동 중에 세포 손상을 감소시킬 수 있다 - 세포는 상기 중심웰에서부터 상기 측면 웰들로 용이하게 이동할 수 있다. 이 경우, 마이크로 채널의 너비 및 깊이는 모두 30 ㎛이며, 이는 시험된 세포의 직경보다 크다. 일반적으로, 세포 직경보다 큰 치수(너비 및 깊이)를 갖는 마이크로 채널들을 사용할 수 있다.
원래의 현탁액에 소수의 세포(예: 2 내지 20개의 세포)가 존재하더라도 상기 MA 칩은 단일 세포들을 분리할 수 있다.
셀 생존력에서의 손상이 무시할 만하고 현탁액 상태에서 세포가 형태학적으로 명백한 차이가 보이지 않은 경우, 세포들의 부착성에 기초하여 단일 세포들을 선택적으로 분리하는데 MA 칩을 사용할 수 있다. 정압 구동 흐름으로 인해 무시할만한 용해물 손실이 존재하긴 하지만, 원하는 세포들을 이들이 존재하는 웰에 소량의 트립신을 첨가하거나 부착 상태 하에서 직접 용해시켜 회수할 수 있어 단일 세포 수준에서 유전형-표현형 상관 관계를 연구하는데 있어서 잠재적인 가능성을 제공한다.
단일 세포의 신속한 분리 및 용이한 식별, 높은 세포 생존력, 서브마이크로리터의 단일 세포 현탁액의 편리한 이동과 같은 특징들로 인해, MA 칩은 단일 세포 클로닝, PCR 및 시퀀싱과 잘 호환된다. 와이드 타입(wide type, WT)과 PTEN 녹아웃(knock out, KO) SUM 159 세포를 개념 증명 실험으로 사용하였다. PTEN KO 세포는 SUM 159 세포 내로 PTEN(phosphatase 및 tensin 호모로그)과 Cas9 단백질을 표적으로 하는 sgRNA를 코딩하는 플라스미드로 일시적인 형질감염(transient transfection)함으로써 생성되었다. MA 칩에 의한 단일세포 분리 후, 세포가 정상적으로 증식하였고, 정해진 시점에서의 세포 수를 측정하였다. 결과로서, PTEN KO 세포가 25.9 시간으로 WT 세포의 28.3 시간보다 평균 2배 짧은 시간을 가짐을 나타냈다. 이러한 결과는 PTEN의 결핍은 세포 증식을 촉진할 수 있다는 이전의 연구와 일치한다.
본 명세서에 기재된 상기 방법들 및 장치는 복잡한 매트릭스에서부터 단일세포들을(예를 들어, 혈액으로부터 단일 CTC 세포들) 식별하고 분리하는데 사용될 수 있다. 구체적으로, CTC 세포들을 단일 또는 다단계의 MA 칩 공정 후에, 측면 웰들에서 포획될 수 있다. 본 명세서에 개시된 상기 방법들 및 장치는 단일세포 및 대상을 복잡한 매트릭스로부터 분리하는데 사용할 수 있다(예를 들어, 박테리아, 비드(bead), 입자, 바이러스를 포함하는 단일 대상을 매트릭스에서부터 분리하고(예, 결핵균 분리), 단일 클론을(예, 특정 유전자형/ 표현형의 효모 세포) 분리하는데 사용할 수 있다).
미국특허 제6,632,656호와 차이점
본 발명의 MA 칩(100)은 전술된 미국특허 제6,632,656호("Thomas")의 회전 가능한 디스크(18)와 일부 유사한 점을 가진다. 양 발명 모두 일반적인 디스크 형태이다. 미국특허 제6,632,656호("Thomas")의 채널들은 20 내지 30 ㎛의 너비를 가진다. 본 발명의 마이크로채널들(112)은 약 30 ㎛의 너비를 가질 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 MA 칩(100)은 상기 미국특허 제6,632,656호("Thomas")의 회전 가능한 디스크(18)와 다음과 같은 점에 의해 구별될 수 있다:
- 상기 미국특허 제6,632,656호("Thomas")에서, 챔버들(2, 3, 7)은 디스크의 중앙 부분에 위치하는 것으로 도시된다. 웨이스트 채널(waste channel, 10)이 상기 디스크의 외각 부분을 차지한다. 본 명세서에 기재된 MA 칩의 측면 웰들(114, 114a, 114b)은 상기 MA 칩의 외각 부분에 위치한다.
- 상기 미국특허 제6,632,656호("Thomas")에서, 채널(6)은 입구 채널(1), 뒤이어 연결된 챔버(2), 뒤이어 연결된 또 다른 채널(4), 뒤이어 연결된 챔버(3), 뒤이어 연결된 출구 채널(5), 및 뒤이어 연결된 웨이스트 채널(10)을 포함한다. 본 명세서에 기재된 MA 칩의 상기 채널들(112, 112a, 112b)은 상기 중심웰(입구)에서부터 상기 측면 웰들(출구들)까지 연장하며, 상기 중심웰과 상기 측면 웰 사이에 어떠한 부재(다른 챔버 또는 웰)도 존재하지 않는다.
- 상기 미국특허 제6,632,656호("Thomas")에서는 회전과 원심력을 사용하여 채널 내에 있는 세포를 챔버에서 챔버로 이동시킨다. 본 명세서에 기재된 공정(200)에서는 본 명세서에 기재된 MA 칩을 사용하여 주로 정압(positive pressure)에 의존하여 상기 중심웰(입구)에서부터 상기 측면 웰들(출구들)로 세포들을 이동시킨다.
- 세포가 원심력에 의해 이동하는 것을 특징으로 하는 상기 미국특허 제6,632,656호("Thomas")의 챔버들은 닫혀진 상태이다. 세포가 주로 정압에 의해 이동하는 것을 특징으로 하는 본 명세서에 기재된 측면 웰들은 개방된 상태이다(상기 MA 칩의 상부면을 통해 접근 가능함).
- 상기 미국특허 제6,632,656호("Thomas")의 장치에서, 액체 및 세포는 채널들을 통해서 상기 장치 밖으로 흘러 나온다. 그러나, 본 명세서에 기재된 MA 칩의 경우, 입구(중심웰)를 통해 주입된 세포를 함유하는 모든 액체는 완전하게 수집되고 출구들(측면 웰들)에 저장될 수 있다. 즉, 본 발명의 경우, 장치 밖으로 액체가 흐르지 않으며, 시료를 수집하는 방식이 미국특허 제6,632,656호("Thomas")의 장치와는 완전히 다르다.
- 본 명세서에 설명된 MA 칩은 분취(시료를 동일한 부피를 가진 많은 분취물로 나누고, 시료의 소실이 없는 것)에 주안점을 두었다. 대조적으로, 상기 미국특허 제6,632,656호("Thomas")의 장치는 여과, 폐쇄된 챔버들 내로 세포의 포획, 및 장치 밖으로 액체 유출에 주안점을 두었다.
- 상기 미국특허 제6,632,656호("Thomas")는 특정 원심 분리기에 의해 제공되는 원심력을 사용하여 액체를 장치에 주입한다. 반면, 본 발명은 일반적인 공기 치환 피펫(모든 실험실에서 사용됨)만을 사용하여 MA 칩으로 세포 현탁액과 같은 액체를 용이하게 주입한다. 이는 원심분리기와 같은 외부 기기에 대한 의존도를 크게 낮출 것이다.
- 본 명세서에 기재된 측면 웰들의 직경은 약 1.5 mm이다. 이 크기는 현미경으로 측면 웰들 내의 단일 세포들을 식별하고, 0.1 내지 2.5 ㎕ 피펫 팁을 사용하여 상기 측면 웰들 내의 액체를 회수하는데 중요하다. X10 대물 렌즈(직경 2 mm)가 장착된 도립 현미경의 영역이 MA 칩 웰의 크기(직경: 1.5 mm)보다 크기 때문에, 단일 세포만을 함유하는 단일 웰들 만이 신속하게 구별될 수 있다 (1 well/s). 상기 미국특허 제6,632,656호("Thomas")의 챔버들(2, 3, 7)은 본 발명의 MA 칩의 측면 웰들보다 상당히 크다. 상기 미국특허 제6,632,656호("Thomas")에서, "약 400 내지 600 ㎛의 직경을 가진 원형 '웰들'이 기재된다. 또한, 상기 미국특허 제6,632,656호("Thomas")에서 50 ㎛ 또는 100 ㎛의 깊이와 100 ㎛의 너비를 갖는 채널이 설명되는데, 이는 본 명세서에 기재된 마이크로채널들보다 상당히 크다(특히, 유체의 흐름과 관련이 있는 단면적이 상당히 큼).
- 상기 미국특허 제6,632,656호("Thomas")의 장치는 주로 세포를 성장시키고 분석(예, 약물 스크리닝(screening))하는데 사용된다. 이 장치의 대상은 많은 수의 세포이며, 목적은 많은 수의 세포에 기반한 약물 스크리닝이다. 본 명세서에 기재된 MA 칩은 주로 단일 세포를 선별하거나 분리하는데 사용되며, 대상 샘플은 개별 세포들이며, 목적은 단일 세포 클로닝, PCR, 및 시퀀싱을 포함하는 단일 세포기반의 분석 수행이다.
- 본 명세서에 기재된 MA 칩은 혈액으로부터 단일 CTC 세포(순환성 종양 세포)의 선별 및 분리하는 것과 같이 세포 집단에서부터 표적세포를 분리 또는 선별하는데 있어서 우수한 능력을 가진다. 대조적으로, 상기 미국특허 제6,632,656호("Thomas")의 장치는 이러한 기능이 없으며, 표적세포들을 분리할 수 없다(개별 세포들을 분리하는 기능이 없음).
본 발명이 다양한 예시적인 구체예들 및 실시예들에 의해서 상기에서 설명되었지만, 하나 이상의 구체예들 각각에서 설명되는 다양한 특징, 양태, 및 기능이 이들이 설명되는 특정 구체예로 한정적으로 적용되는 것이 아니며, 구체예들의 설명 여부 및 특징들이 설명된 구체예의 일부로서 기재되었는지 여부와 무관하게, 하나 이상의 다른 구체예들에 단독으로 또는 조합하여 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 범주 및 범위는 상술한 예시적인 구체예들 중 어느 것에 의해서도 제한되어서는 안된다.

Claims (20)

  1. 반경, 중심, 상부면, 하부면, 외각 가장자리, 및 두께를 갖는 디스크 형태의 칩;
    실질적으로 상기 칩의 중심에 배치되고, 상기 칩의 상부면으로 연장되며, 상기 칩의 상부면으로부터 접근 가능한 단일 중심웰(입구);
    상기 칩의 외각의 환상 부분에 배치되고, 상기 칩의 상부면으로 연장되며, 상기 칩의 상부면으로부터 접근 가능한 복수 개의 측면 웰들(출구); 및
    상기 칩의 하부면에서 연장되며, 상기 중심웰 및 상기 측면 웰들과 유체 소통하여(fluid communication) 상기 중심웰에서부터 상기 측면 웰들까지 연장되는 복수 개의 채널들;을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 세포 분리용 미세유체 분취(MA) 칩.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 칩은 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리스티렌(PS), 및 폴리카보네이트(polycarbonate, PC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 가요성 또는 반강성 재료로 제조된 얇은 시트를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 세포 분리용 미세유체 분취(MA) 칩.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 칩은,
    약 1 mm의 두께;
    페트리 접시 내에 장착 가능한 크기 및 형태; 및
    약 3 cm의 반경; 중 적어도 어느 하나의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 단일 세포 분리용 미세유체 분취(MA) 칩.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 중심웰은 상기 칩을 완전히 통과하도록 연장되고; 그리고
    상기 측면 웰들은 상기 칩을 완전히 통과하도록 연장되는; 것을 특징으로 하는 단일 세포 분리용 미세유체 분취(MA) 칩.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 중심웰은,
    약 3 mm의 직경; 및
    약 4 ㎕의 부피; 중 적어도 하나의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 단일 세포 분리용 미세유체 분취(MA) 칩.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 측면 웰들 중 적어도 일부의 각각은,
    약 1.5 mm의 직경; 및
    약 1 ㎕의 부피; 중 적어도 하나의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 단일 세포 분리용 미세유체 분취(MA) 칩.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 복수개의 측면 웰들의 제1 세트는 상기 칩의 중심에서부터 제1 반경(r1)에 위치하고; 그리고 상기 복수개의 측면 웰들의 제2 세트는 상기 칩의 중심에서부터 제2 반경(r2)에 위치하며, 상기 제2 반경(r2)은 상기 제1 반경(r1) 보다 큰 것을 특징으로 하는 단일 세포 분리용 미세유체 분취(MA) 칩.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 측면 웰들의 제1 세트 및 제2 세트는 상기 측면 웰들의 제2 세트가 60개의 측면 웰을 포함하는 상기 제1 세트 사이의 원주 위치에 위치하도록 상호배치(interleave)되는 것을 특징으로 하는 단일 세포 분리용 미세유체 분취(MA) 칩.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 측면 웰들의 제1 세트 및 제2 세트는 상기 칩의 외각의 환상 부분 주위에 균등하게 분포되는 것을 특징으로 하는 단일 세포 분리용 미세유체 분취(MA) 칩.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 칩의 외각의 환상 부분은 상기 칩의 반경의 적어도 70%에서부터 상기 칩의 외각 가장자리까지 연장하는 것을 특징으로 하는 단일 세포 분리용 미세유체 분취(MA) 칩.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 채널들은,
    상기 중심웰에서부터 상기 측면 웰들로 방사상으로 연장;
    상기 칩 내로 단지 부분적으로 연장;
    약 30 ㎛의 너비; 및
    상기 중심웰에서부터 상기 측면 웰들까지 단일 세포들의 이동을 수용할 수 있는 크기 및 형상; 중 적어도 어느 하나의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 단일 세포 분리용 미세유체 분취(MA) 칩.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 칩은,
    현미경 관찰하에 상기 측면 웰들을 고유하게 식별할 수 있도록 상기 측면 웰들의 적어도 일부의 내측에 위치하는 비교적 작은 ㎛ 단위의 표식들; 및
    육안에 의해 상기 측면 웰들을 고유하게 식별할 수 있도록 상기 측면 웰들의 적어도 일부의 외측에 위치하는 비교적 큰 mm 단위의 표식들;을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 세포 분리용 미세유체 분취(MA) 칩.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 칩은 상기 중심웰 내로 세포 현탁액을 주입하기 위한 캡을 더 포함하고, 상기 캡은 관통 연장하는 구멍을 가지며, 상기 중심웰의 상부에 배치되는 것을 특징으로 하는 단일 세포 분리용 미세유체 분취(MA) 칩.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 캡은 원통형이며, 상기 캡의 하부면으로부터 상기 중심웰 내로 연장하는 립 또는 숄더를 포함하며, 상기 립 또는 숄더는 세포 현택액의 주입 동안 상기 캡을 일시적으로 고정시키는 것을 특징으로 하는 단일 세포 분리용 미세유체 분취(MA) 칩.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 캡은 상기 칩과 일체로 형성되는 것을 특징으로 하는 단일 세포 분리용 미세유체 분취(MA) 칩.
  16. 단일 중심웰 및 복수개의 마이크로채널에 의해 상기 중심웰에 연결되는 복수개의 측면 웰들을 포함하는 미세유체 분취(MA) 칩 내로 소수개의 세포를 함유하는 세포 현탁액을 주입하는 단계; 및
    상기 마이크로채널들을 통해 정압 구동 흐름에 의해 단일 세포들을 상기 측면 웰들로 이동시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 소수 개의 세포를 함유하는 세포 현탁액에서 단일 세포들을 분리하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 방법은,
    혈액에서 하나의 또는 희소한 순환성 종양 세포(circulating tumor cells, CTCs)를 동정하고 분리하는 단계; 및
    단일세포 및 대상을 복잡한 매트릭스에서 동정 및 분리하는 단계; 중 적어도 하나를 포함하고,
    상기 CTC 세포들은 단일 또는 다단계의 MA 칩 공정 후에 포획되고, 상기 동정 및 분리하는 단계는 박테리아, 비드(bead), 입자, 바이러스를 포함하는 단일 대상을 매트릭스에서부터 분리하는 것, 결핵균을 분리하는 것, 및 특정 유전자형/표현형의 효모 세포를 분리하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 소수 개의 세포를 함유하는 세포 현탁액에서 단일 세포들을 분리하는 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 방법은,
    상기 측면 웰들 내의 세포를 식별하는 단계; 및
    단일 세포 만을 함유하는 상기 측면 웰들로부터 세포들을 회수하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 소수 개의 세포를 함유하는 세포 현탁액에서 단일 세포들을 분리하는 방법.
  19. 중심 및 표면을 갖는 디스크 형태의 칩;
    상기 칩의 실질적인 중심에 위치하는 단일 중심웰(입구);
    상기 칩의 외각의 환상 부분에 위치하는 복수 개의 측면 웰(출구); 및
    상기 중심웰에서부터 상기 측면 웰들로 연장하는 복수 개의 채널들;을 포함하는 미세유체 분취액 칩을 제공하는 단계를 포함하고,
    단일 중심웰 및 복수개의 마이크로채널에 의해 상기 중심웰에 연결되는 복수개의 측면 웰들을 포함하는 미세유체 분취(MA) 칩의 입구로 세포 현탁액을 주입하는 단계; 및
    상기 마이크로채널들을 통해 정압 구동 흐름에 의해 단일 세포들을 상기 측면 웰들로 이동시키는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 세포 분석을 수행하는 방법,
  20. 제19항에 있어서,
    상기 방법은 상기 중심웰 내로 세포가 불포함된 배지를 첨가하여 상기 채널들에 잔여하는 단일 세포들이 상기 측면 웰들로 흘러가도록 양성 정수압을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 세포 분석을 수행하는 방법.
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