JP2014506259A

JP2014506259A - Ｉｌ−２１リガンド

Info

Publication number: JP2014506259A
Application number: JP2013548861A
Authority: JP
Inventors: ラーシュ・アンデシュ・スヴェンソン; メッテ・ダール・アンデルセン; イェンス・ブラインホルト; シャーロット・ヴィーベリ; ベーリット・オールセン・クローグ; ドロテ・ルンズゴー; ハネ・ベネディクト・ラスムッセン
Original assignee: ノヴォノルディスクアー／エス
Priority date: 2011-01-17
Filing date: 2012-01-17
Publication date: 2014-03-13
Also published as: CN103443124A; WO2012098113A1; US20130323259A1; EP2665750A1

Abstract

本発明は、IL-21分子の表面上の不連続なエピトープに結合するIL-21リガンド、ならびにその使用に関する。

Description

本発明は、IL-21上に存在する不連続なエピトープ、およびこのエピトープに結合するリガンドに関する。

IL-21は、I型サイトカインであり、自然免疫応答と適応免疫応答の両方に多面発現効果を発揮する。それは、主に、活性化CD4+ T細胞、濾胞性T細胞、およびナチュラルキラー細胞によって産生される。加えて、最近の証拠から、Th17細胞が大量のIL-21を産生できることが示唆されている。

IL-21は、CD8+ T細胞の細胞傷害性を増加させ、抗原の存在下で、CD8+細胞の増殖を促進することができる。IL-21は、Th17細胞の発生を促進することが知られているサイトカインのIL-6によって誘導される。IL-21は、自己分泌様式でTヘルパー細胞に作用して、それ自体の産生を促進し、かつTヘルパー細胞のTh17細胞への分化を援助する。これと一致して、IL-21欠損マウスは、Th17応答障害を示す。IL-21はまた、B細胞に作用し、抗体産生を増加させる;しかしながら、IL-21は、機能性抗体の産生に必須ではないが、IL-21Rα陰性マウスは、CD8+細胞の増殖低下および細胞傷害性の減少を示す。最近の一連の研究により、CD4+細胞によって産生されるIL-21は、CD8+ T細胞のウイルス感染を制御する能力にとって重要であることが示唆されている。

IL-21の免疫を増大させる能力は、IL-21の治療的使用への多大な関心を駆り立てている。それは、現在、臨床試験において、転移性黒色腫型および腎臓癌に対して評価されている。動物研究により、IL-21と腫瘍特異的抗体との相乗効果が実証されており、抗腫瘍抗体の増強剤としてのIL-21の将来的な治療的使用を示唆し得る。さらに、IL-21は、自己免疫疾患において複雑な役割を果たしている。IL-21のIgE産生を下方制御する能力は、それが喘息およびアレルギーに対して治療的に用いられ得ることを示唆する。動物研究からの結果はこの見解を支持する。他方、IL-21のTh17発生を促進する能力により、それが炎症促進性サイトカインとみなされ、いくつかの異なるIL-21阻害剤およびIL-21Rα阻害剤が、現在、様々な異なる自己免疫疾患の治療に用いる可能性を研究されている。

IL-21は、クラスIサイトカインに典型的な上-上-下-下のトポロジーで配置された4ヘリックスバンドル構造を有する。IL-21は、プライベート鎖(private chain)IL-21Rαと、共通のγC鎖とからなるヘテロ二量体の受容体複合体を通してシグナル伝達し、後者のγC鎖は、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、およびIL-15が共有する。IL-21Rα鎖は、IL-21と高親和性で結合し、結合エネルギーの大部分を提供する。しかしながら、γC鎖との相互作用は、シグナル伝達に必要とされ、IL-21Rαと結合するがγCと正しく相互作用することができないIL-21変異体は、IL-21シグナル伝達の強力なアンタゴニストである。IL-2およびIL-15の両方は、それぞれ第3の受容体鎖のIL-2RαおよびIL-15Rαを用いる。これらの受容体は、シグナル伝達に消費されるが、IL-2またはIL-15を捕捉する受容体複合体の高親和性コンポーネントとして働き、それをIL-2Rβに提示し、その後にγCの動員が起きる。

IL-21に特異的なモノクローナル抗体は、当技術分野において、例えば、WO2007111714およびWO2010055366(Zymo-Genetics, Inc.)から知られている。特に、WO2010055366は、クローン番号362.78.1.44で表された抗IL-21抗体を記載し、その抗体は、ヒトおよびカニクイザルのIL-21に対する特異性を示す、それの同族抗原に対する高い親和性および他の望ましい特性を有する。WO2010055366において、クローン362.78.1.44は、ヒトIL-21上の不連続なエピトープとの結合として特徴づけられ、そのエピトープは、WO2010055366において配列番号2として示されているIL-21配列の残基Ile45〜Leu56、およびGlu129〜Leu144にわたる2つのペプチド由来のアミノ酸を含む。

WO2007111714 WO2010055366 WO 01/46420

Kabat, EA、Wu, TT、Perry, HMら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、US Department of Health and Human Services、Public Health Service、National Institutes of Health、NIH Publication No. 91-3242、1991 Wardら、(1989) Nature 341:544〜546頁 Birdら、(1988) Science 242:423〜426頁 Hustonら、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879〜5883頁 Hol-liger, P.ら、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444〜6448頁 Poljak, R. J.ら、(1994) Structure 2:1121〜1123頁 Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、(1988) Colliganら編、Current Protocols in Immunology、Greene Publishing Assoc.およびWiley Interscience、N.Y.、(1992、1993) Muller、Meth. Enzymol.、92:589〜601頁(1983) B.LeeおよびF.M.Richards、J.Mol.Biol.、55、379〜400頁(1971) E.B.SaffおよびA.B.J.Kuijlaars、The Mathematical Intelligencer、19、5〜11(1997) Dorner T et al (2009) Arthritis Res. Therapy Ozaki, K. et al.、Science、2002年 Ettinger R. J. et al.、J Immunol, 2005年 Kuchen, S., et al.、J Immunol、2007年 Ettinger, R. et al.、Immunol Rev、2008年 Leonard, W. J. et al.、Nat. Rev. Immunol. 2005年 Wales and Engen、Mass Spectrom. Rev. 25、158頁(2006) Andersen and Faber、Int. J. Mass Spec.、302、139〜148頁(2011) Weis et al.、J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17、1700 (2006) Garcia、Pantazatos and Villareal、Assay and Drug Dev. Tech. 2、81頁(2004) Mandell、Falick and Komives、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95、14705頁(1998) Durocher et al. Nucleic Acid Research、2002年

本発明者らは、より高い親和性のリガンドによって特徴的に結合されるIL-21の新規のエピトープを本明細書で定義する。リガンドとこのエピトープの結合は、ヒトIL-21(hIL-21)のヘリックスCを安定化する。これにより、IL-21の全体的な安定化がもたらされ、高親和性結合および/またはIL-21誘導効果の効率的阻害を促進すると考えられる。

本発明のエピトープは、天然のIL-21受容体、IL-21Rα(配列番号14)によって結合される。本発明者らは、IL-21とIL-21Rαの相互作用を担い、したがって、IL-21とその同族受容体との相互作用を妨げることによってIL-21の活性を阻害するように設計されている抗体の標的となる、これら2つの分子の結合面を同定する。

本発明者らはまた、本発明によるエピトープに特異的に結合する抗体などのリガンド、加えて、そのようなリガンドを作製し、用いるための方法を記載する。

他に指定がない限り、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。本発明の実施は、他に規定がない限り、当業者に知られた、化学、生化学、生物物理学、分子生物学、細胞生物学、遺伝学、免疫学、および薬理学の通常の方法を用いる。

本明細書で言及された配列を示す図である。質量分析法によってモニターされるHXは、NNC 0114-0005結合およびNNC 0114-0019結合に関与するhIL-21の領域を同定することを示す図である。(A)ヘリックスAに位置するペプチド断片29〜44、MQGQDRHMIRMRQLID (m/z = 676.68、z= 3)に対応する質量/電荷スペクトル。(B)ヘリックスCに位置するペプチド断片93〜99、ERIINV (m/z = 743.47、z= 1)に対応する質量/電荷スペクトル。すべてのスペクトルについて、上方のパネルは、非重水素化対照を示し、2番目のパネルは、D₂Oとの100秒間の交換後のペプチドを示し、3番目および下方のパネルは、それぞれNNC 0114-0005またはNNC 0114-0019の存在下での100秒間の交換後のペプチドを示す。 NNC 0114-0005またはNNC 0114-0019の非存在下または存在下でのhIL-21の代表的なペプチドの水素交換時間プロットを示す図である。hIL-21ペプチドの重水素取り込み(Da)は、NNC 0114-0005 (×)もしくはNNC 0114-0019 (△)の存在下または非存在下(■)において対数スケールで時間に対してプロットされている。ペプチドQ30〜M39は、NNC 0114-0005およびNNC 0114-0019の両方が結合する、hIL-21ヘリックスAの領域を表す。ペプチドE93〜V98は、NNC 0114-0005だけが結合し、NNC 0114-0019は結合しない、hIL-21ヘリックスCの領域を表す。ペプチドR40〜N51およびF136〜S162は、NNC 0114-0005もNNC 0114-0019も結合しない、hIL-21の領域を表す。しかしながら、hIL-21構造の著しい安定化は、300秒を超える長時間の時点における重水素交換の著しい減少によって示されているように、NNC 0114-0005がhIL-21に結合している場合に観察されるが、NNC 0114-0019が結合している場合には観察されない。 NNC 0114-0005の存在下および非存在下におけるhIL-21のHX分析されたペプチドの配列範囲を示す図である。一次配列が、(水平バーとして示された)HX分析されたペプチドの上に示されている。NNC 0114-0005の存在下および非存在下の両方において類似した交換パターンを示すペプチドは、白色で示され、NNC 0114-0005結合によって重水素取り込みの低下を示すペプチドは黒色に色づけされている。枠で囲まれた配列領域は、エピトープを定義する。 NNC 0114-0019の存在下および非存在下におけるHX分析されたhIL-21のペプチドの配列範囲を示す図である。一次配列が、(水平バーとして示された)HX分析されたペプチドの上に示されている。NNC 0114-0019の存在下および非存在下の両方において類似した交換パターンを示すペプチドは、白色で示され、NNC 0114-0019結合によって重水素取り込みの低下を示すペプチドは黒色に色づけされている。枠で囲まれた配列領域は、エピトープを定義する。 0114-0005、0114-0038、0114-0039、0114-0040、0114-0041、または0114-0042の非存在下または存在下におけるhIL-21の代表的なペプチドの水素交換時間プロットを示す図である。hIL-21ペプチドの重水素取り込み(Da)は、0114-0005(×)、0114-0038(△)、0114-0039(□)、0114-0040(+)、0114-0041(○)、または0114-0042(-)の存在下または非存在下(■、▲)において対数スケールで時間に対してプロットされている。ペプチドM29〜D44は、0114-0005、0114-0038、0114-0039、0114-0040、0114-0041、および0114-0042が結合する、hIL-21ヘリックスAの領域を表す。ペプチドI45〜N51は、0114-0005、0114-0038、0114-0039、0114-0040、0114-0041、および0114-0042の結合が初期の時点において非常に弱い重水素交換差として見ることができる、hIL-21の領域を表す。さらに、hIL-21と0114-0005、0114-0038、0114-0039、0114-0040、0114-0041、または0114-0042の結合によるhIL-21構造の著しい安定化は、300秒を超える長時間の時点における重水素交換の顕著な減少によって観察される。ペプチドE93〜V98は、0114-0005、0114-0038、0114-0039、0114-0040、0114-0041、および0114-0042が結合する、hIL-21ヘリックスCの領域を表す。ペプチドE138〜S162は、mAbのいずれも結合しない、hIL-21の領域を表す。しかしながら、hIL-21構造の安定化は、300秒を超える長時間の時点における重水素交換の減少によって示されているように、0114-0005、0114-0038、0114-0039、0114-0040、0114-0041、または0114-0042がhIL-21に結合している場合に観察される。 0114-0005、0114-0038、0114-0039、0114-0040、0114-0041、および0114-0042の存在下および非存在下におけるHX分析されたhIL-21のペプチドの配列範囲を示す図である。一次配列が、(水平バーとして示された)HX分析されたペプチドの上に示されている。すべてのペプチドは、調べられたmAbのいずれの結合によっても類似した交換挙動を示した。0114-0005、0114-0038、0114-0039、0114-0040、0114-0041、または0114-0042の存在下および非存在下の両方において初期時点に類似した交換パターンを示すペプチドは、白色で示され、0114-0005、0114-0038、0114-0039、0114-0040、0114-0041、または0114-0042結合によって重水素取り込みの低下を示すペプチドは黒色に色づけされている。

定義
本明細書で用いられる場合、用語「治療」は、医学療法を必要としている任意のヒトまたは他の動物の対象の医学療法を指す。前記対象は、医師または獣医師による身体検査を受けていることが予想され、その医師は、前記の特定の治療を用いることが前記ヒトまたは他の動物対象の健康にとって有益であることを示す暫定的または確定的診断を下している。前記治療のタイミングおよび目的は、対象の健康の現状により個体によって異なり得る。したがって、前記治療は、予防的、緩和的、対症的、および/または治癒的であり得る。

本発明に関して、予防的、緩和的、対症的、および/または治癒的治療は、本発明の別々の態様を表し得る。

抗体NNC 0114-0005によって結合されるhIL-21のエピトープは、X線結晶学およびHX-MSによって定義されており、本明細書に記載されている。

この関連において、特異的結合は、免疫グロブリン分子の場合、免疫グロブリン可変ドメインの一部である少なくとも1つのCDRによって形成される免疫グロブリン結合部位とエピトープとの間の相互作用の結果として生じる結合である。好ましくは、特異的結合は、免疫グロブリン結合部位を形成する、免疫グロブリン軽鎖内の2つまたは3つなどの1つまたは複数のCDRおよび免疫グロブリン重鎖内の2つまたは3つなどの1つまたは複数のCDRとエピトープとの間の相互作用の結果として生じる。

特異的結合はまた、所定の結合親和性で生じる結合として特徴づけられる場合がある。例えば、結合定数は、好ましくは、1μM以下のオーダー、例えば、100nM、10nM、1nM、100pM、1pM、またはそれ未満である。

「不連続な」エピトープは、直鎖ペプチド配列においてお互いに隣接していない、ポリペプチドの2つ以上の分離した領域によって形成されるが、ポリペプチドの三次元構造においてエピトープを形成するように配置されているエピトープである。

本明細書で用いられる場合、「単離された」化合物は、それの自然環境から取り出されている化合物である。「精製された」化合物は、それがそれの自然環境で存在している形より純粋である形で存在するように、純度が増加している化合物である。

抗体
本発明において有用な好ましいリガンドは、免疫グロブリンに基づいている。本発明において適した免疫グロブリンには、抗体およびT細胞受容体(TCR)分子が挙げられる。

本明細書で用いられる場合、用語「抗体」、「モノクローナル抗体」、および「mAb」は、抗原へ特異的に結合する能力を有する、本発明による免疫グロブリン分子およびその断片を指すことを意図される。完全長抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖である、4つのポリペプチド鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではVHと略される)および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、CH1、CH2、およびCH3という3つのドメインで構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではVLと略される)および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、CLという1つのドメインで構成される。VH領域およびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と名付けられた、より保存されている領域と共に散在した、相補性決定領域(CDR)と名付けられた、超可変性の領域へさらに細分することができる。各VHおよび各VLは、3つのCDRおよび4つのFRで構成され、それらは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順序で配置されている。抗体配列における可変領域およびCDRは、既知の可変領域のデータベースに対してその配列を整列させることによって同定され得る(フレームワークおよびCDRは、本明細書ではKabatナンバリングスキーム(Kabat, EA、Wu, TT、Perry, HMら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、US Department of Health and Human Services、Public Health Service、National Institutes of Health、NIH Publication No. 91-3242、1991)に従って定義される)。

抗体の結晶性断片領域(「Fc領域」/「Fcドメイン」)は、Fc受容体と呼ばれる細胞表面受容体および補体系のいくつかのタンパク質と相互作用する、抗体の尾部領域である。この特性により、抗体が免疫系を活性化することが可能になる。しかしながら、Fcドメインは、これらのエフェクター機能の改変を結果として生じるアミノ酸変異を含むことができる。好ましくは、改変型Fcドメインは、特定のFc受容体に対する親和性の減少(L234A、L235E、およびG237A)、およびC1q媒介性補体結合の低下(A330SおよびP331S)をそれぞれ生じる変異の1つまたは複数、好ましくは全部を含む(EUインデックスによる残基ナンバリング)。そのようなFcドメインは、長いインビボ半減期をなおも保持するであろう。

「Fab領域」/「Fabドメイン」/「Fab断片」と呼ばれる抗体の他の部分は、その抗体が結合することができる特異的標的を定義する可変セクションを含有する。これらの断片は、よく知られた方法を用いて、例えば、(Fab断片を生成するための)パパイン、または(F(ab')₂断片を生成するための)ペプシンなどの酵素でのタンパク質分解性切断により、無傷の抗体から生成することができる。あるいは、抗体断片は、標準組換えDNAおよびタンパク質発現テクノロジーを用いて組換えで産生されてもよい。

したがって、用語「抗体」内に包含される結合断片の例には以下が挙げられるが、それらに限定されない:(i)VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる一価断片である、Fab断片;(ii)ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結した2つのFab断片を含む二価断片であるF(ab)2およびF(ab')2断片;(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFd断片;(iv)抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるscFv断片;(v)VHドメインからなるdAb断片(Wardら、(1989) Nature 341:544〜546頁);および(vi)単離された相補性決定領域(CDR)。さらに、Fv断片の2つのドメインである、VLおよびVHは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を用いて、VL領域とVH領域がペアとなって一価分子(一本鎖Fv(scFv)として知られている;例えば、Birdら、(1988) Science 242:423〜426頁、およびHustonら、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879〜5883頁参照)を形成している単一のタンパク質鎖としてそれらが生成されることを可能にする合成リンカーによって連結することができる。そのような一本鎖抗体もまた、用語「抗体」内に包含されることを意図される。ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の型もまた、用語「抗体」内に包含される。ダイアボディは、VHドメインとVLドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現しているが、同じ鎖上のその2つのドメイン間でのペア形成を可能にするのには短すぎるリンカーを用いて、それにより、そのドメインを別の鎖の相補性ドメインとペアになるように強制し、2つの抗原結合部位を生じている、二価の二重特異性抗体である(例えば、Hol-liger, P.ら、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444〜6448頁;Poljak, R. J.ら、(1994) Structure 2:1121〜1123頁参照)。

抗原が、(1)単一のペプチド鎖からなるペプチド抗原決定基、(2)それぞれのアミノ酸配列が、ポリペプチド配列に沿ってバラバラに位置している、1つより多い空間的に隣接したペプチド鎖からなる立体構造的抗原決定基、および(3)全体かまたは一部かのいずれかにおいて、炭水化物基などの翻訳後に抗原に共有結合性に付着した分子構造からなる翻訳後抗原決定基を含む、1つまたは複数の抗原決定基(エピトープ)を有し得ることは理解されている。

本明細書で用いられる場合、用語「ヒト抗体(antibody)」、「ヒト抗体(antibodies)」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来した可変領域および定常領域を有する抗体を意味する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を、例えば、CDR内に、特にCDR3内に含んでもよい(例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発により、またはインビボでの体細胞変異により導入される変異)。

マウスなどの別の哺乳類種から生じた抗体に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上へグラフトされており、任意で、変異誘発によりさらに操作されている可能性がある、本発明による抗体は、「ヒト化抗体」と呼ばれる。

用語「キメラ抗体(antibody)」または「キメラ抗体(antibodies)」は、軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子が、典型的には遺伝子操作により、異なる種に属する免疫グロブリン可変領域遺伝子および定常領域遺伝子から構築されている、本発明による抗体を指す。例えば、マウスモノクローナル抗体の遺伝子の可変セグメントを、ヒト定常セグメントに連結することができる。

エピトープ
本明細書で用いられる場合、用語「エピトープ」は、抗体(Ab)などの「抗原結合ポリペプチド」と、それの対応する抗原(Ag)との間の分子相互作用の関連において定義される。一般的に、「エピトープ」は、Abが特異的に結合するAg上の区域または領域、すなわち、Abと物理的に接触する区域または領域を指す。物理的接触は、Ab分子とAg分子における原子についての様々な判定基準(例えば、3Å、4Å、5Åなどの2〜6Åの距離カットオフ、または溶媒露出度)を通して定義され得る。タンパク質エピトープは、Abとの結合に直接関与するAg内のアミノ酸残基(エピトープの免疫優性コンポーネントとも呼ばれる)、およびAbによって効果的に遮断されるAgのアミノ酸残基など、結合に直接には関与しない他のアミノ酸残基、すなわち、Abの「溶媒排除表面」および/または「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。

所定の抗体(Ab)/抗原(Ag)ペアについてのエピトープは、様々な実験的および計算的エピトープマッピング方法を用いて詳細の異なるレベルにおいて記載し、特徴づけることができる。実験的方法には、変異誘発、X線結晶解析法、核磁気共鳴(NMR)分光法、水素重水素交換質量分析法(HX-MS)、および様々な競合結合方法、当技術分野において知られている方法が挙げられる。各方法は独特の原理に依存しているため、エピトープの記載は、それを決定している方法と密接に関連している。したがって、用いられるエピトープマッピング方法に依存して、所定のAb/Agペアについてのエピトープは、異なって記載される場合がある。

本発明の抗体は、それらが認識し、または特異的に結合するIL-21タンパク質のエピトープまたは部分に関して記載または特定化されてもよい。エピトープまたはポリペプチド部分は、例えば、N末端位置およびC末端位置により、または連続したアミノ酸残基のサイズにより、特定化されてもよい。本発明の抗体はまた、それらの交差反応性に関して記載または特定化されてもよい。ポリペプチドの任意の他の類似体、オルソログ、または相同体を結合しない抗体が含まれる。

同じ抗原に結合する抗体は、それらの共通の抗原に同時に結合するそれらの能力に関して特徴づけることができ、「競合結合」/「ビニング(binning)」に供され得る。本文脈において、用語「ビニング」は、同じ抗原に結合する抗体をグループ化する方法を指す。抗体の「ビニング」は、表面プラズモン共鳴(SPR)、ELISA、またはフローサイトメトリーなどの標準技術に基づいたアッセイにおいて2つの抗体とそれらの共通の抗原の競合結合に基づいてもよい。

「ビン(bin)」は、参照抗体を用いて定義される。第2抗体が、参照抗体と同時には抗原に結合することができない場合には、その第2抗体は、参照抗体と同じ「ビン」に属すると言われる。この場合、参照抗体および第2抗体は、その抗原との結合について競合しており、したがって、抗体のペアは、「競合抗体」と呼ばれる。第2抗体が、参照抗体と同時に抗原に結合する能力がある場合には、その第2抗体は、別の「ビン」に属すると言われる。この場合、参照抗体および第2抗体は、その抗原との結合について競合しておらず、したがって、抗体のペアは、「非競合抗体」と呼ばれる。

抗体「ビニング」は、エピトープについての直接的情報を提供しない。競合抗体、すなわち、同じ「ビン」に属する抗体は、同一のエピトープ、重複エピトープ、またはさらに別々のエピトープを有する場合がある。後者は、抗原上のエピトープに結合した参照抗体が、第2抗体が抗原上の第2抗体のエピトープに接触するのに必要とされる空間を塞ぐ場合である(「立体障害」)。非競合抗体は、一般的に、別々のエピトープを有する。

本明細書で用いられる場合、用語「親和性」は、抗体とエピトープの結合の強度を定義する。抗体の親和性は、[Ab]×[Ag] / [Ab-Ag](ただし、[Ab-Ag]は、平衡時における、抗体-抗原複合体のモル濃度であり、[Ab]は結合していない抗体のモル濃度であり、[Ag]は結合していない抗原のモル濃度である)として定義される、平衡解離定数KDによって測定される。KDはまた、例えば、SPR方法によって決定される、複合体形成および解離の動態学から記載することもできる。一価複合体の会合および解離に対応する速度定数は、それぞれ、会合速度定数ka(またはk_on)および解離速度定数kd(またはk_off)と呼ばれる。その後、KDは、式KD=kd/kaによってkaおよびkdに関連づけられる。親和定数KAは、1/KDによって定義される。競合阻害によって抗体特異性および親和性を決定するための好ましい方法は、Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、(1988)、Colliganら編、Current Protocols in Immunology、Greene Publishing Assoc.およびWiley Interscience、N.Y.、(1992、1993)、ならびにMuller、Meth. Enzymol.、92:589〜601頁(1983)に見出すことができる。

抗体またはその断片は、例えば、脂肪酸または脂肪酸誘導体、PEG(ポリエチレングリコール)、または半減期を増加させる多糖ポリマーおよびペプチド由来ポリマーを含む他の水溶性ポリマーなどの分子とコンジュゲートすることによって、その血中半減期を増加させるために修飾されてもよい。

リガンドの構造
上記のように、本明細書で言及されるようなリガンドは、お互いに相補的であり、したがって、お互いに会合して、VH/VLペアを形成することができる、少なくとも1つの重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む抗体(例えば、IgG、IgM、IgA、IgA、IgE)または断片(例えば、Fab、Fv、ジスルフィド結合したFv、scFv、ダイアボディ)であってもよい。それは、抗体を自然に産生する任意の種由来であってもよいし、または組換えDNAテクノロジーによって作製されてもよいし、またはファージディスプレイなどの分子ディスプレイテクノロジーを用いる配列ライブラリー(ライブラリー配列は、単離されるのが、血清、B細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母、または細菌からかに関わらない)から単離されてもよい。

本発明の好ましい実施形態において、リガンドは、抗体の少なくとも1つの単一重鎖可変ドメインおよび抗体の1つの単一軽鎖可変ドメインを、その2つの領域が会合して、相補的VH/VLペアを形成することができるように含む。

V遺伝子レパートリーが用いられる場合、ポリペプチド配列のバリエーションは、好ましくは、可変ドメインの構造ループ内に位置する。いずれの可変ドメインのポリペプチド配列も、各可変ドメインのそれの相補的ペアとの相互作用を増強するために、DNAシャッフリングにより、または変異により変化してもよい。本発明の好ましい実施形態において、リガンドは一本鎖Fv断片である。本発明の代替の実施形態において、リガンドは、抗体のFab領域からなる。

さらなる態様において、本発明は、少なくとも本明細書で定義されているようなリガンドをコードする核酸を提供する。したがって、さらなる態様において、本発明は、少なくとも本明細書で定義されているようなリガンドをコードする核酸を含むベクターを提供する。

治療的適用
IL-21は、T細胞媒介性免疫に関与し、いくつかの炎症性サイトカインを促進することが示されている。したがって、本発明によるリガンドは、炎症、自己免疫、そのような機構に関わる状態、加えて移植片対宿主病などの不適当な、または望ましくない免疫応答(免疫障害)に関わる疾患の治療に用いることができる。一実施形態において、そのような疾患または障害は、自己免疫疾患および/または炎症性疾患である。そのような自己免疫疾患および/または炎症性疾患の例は、全身性エリテマトーデス(SLE)、関節リウマチ(RA)、および炎症性腸疾患(IBD)(潰瘍性大腸炎(UC)およびクローン病(CD)を含む)、多発性硬化症(MS)、強皮症、および1型糖尿病(T1 D)、ならびにPV(尋常性天疱瘡)、乾癬、アトピー性皮膚炎、セリアック病、コル(kol)、橋本甲状腺炎、グレーブス病(甲状腺)、シェーグレン症候群、ギランバレー症候群、グッドパスチャー症候群、アジソン病、ウェゲナー肉芽腫症、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、リウマチ性多発筋痛症、レイノー現象、側頭動脈炎、巨細胞性動脈炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、ベーチェット病、原発性胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎、心筋炎、リウマチ熱、強直性脊椎炎、糸球体腎炎、サルコイドーシス、皮膚筋炎、重症筋無力症、多発性筋炎、円形脱毛症、I型糖尿病、大腸炎関連腫瘍形成、および白斑などの他の疾患および障害である。他の例は、PCT出願WO 01/46420(自己免疫疾患および/または炎症性疾患の治療のためのIL-17の使用に向けられており、その中で、そのような疾患のいくつかの例が示されている)およびWO2010/055366に見出すことができ、それらの内容は参照により本明細書に明確に組み入れられている。

一実施形態において、そのような疾患または障害は、SLE、RA、またはIBDである。一実施形態において、そのような疾患または障害はMSである。

本発明のIL-21リガンドは、当技術分野において知られているような他の薬物と組み合わせて投与されてもよい。

医薬組成物
本発明はさらに、薬学的に許容される担体、および本発明によるポリペプチド/リガンド/抗体を含む医薬組成物/製剤、加えて、そのような組成物を含むキットを含む。本発明による医薬組成物は、水性製剤、または投与前に水/水性バッファー中に再構成される乾燥製剤の形をとってもよい。

本発明によるリガンド/抗体/ポリペプチドを含む医薬組成物は、本発明による化合物を含む容器を含むキットとして供給されてもよい。治療用ポリペプチドは、単回または複数回投与用の注射溶液の形で、または注射前に再構成される滅菌粉末として、提供することができる。本発明による化合物を含む医薬組成物は、皮下および/またはIV投与に適している。

さらに、上記のようなアッセイ方法を用いて同定可能なリガンドの治療的有効量を対象に投与する工程を含む、異常な免疫応答に関連した状態を治療するための方法が提供される。

アミノ酸I37〜Y52およびN92〜P108は、ヒトIL-21上の新規なエピトープを定義する。本発明者らは、IL-21に結合する高親和性リガンドが、その列挙されたアミノ酸範囲内に入るIL-21と接触する可能性がより高いことを決定している。このエピトープに結合することによって、リガンドは、IL-21に安定効果を生じる。特に、高可動性のヘリックスCは、結合状態において安定化され、遊離状態におけるIL-21分子に存在するエネルギーを大いに低下させる。

さらに、本発明者らは、そのエピトープがモノクローナル抗体NNC 0114-0005(本明細書では例えば、「0005」と呼ばれることもある)によって特異的に結合されることを決定している。軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの配列は、それぞれ配列番号10および配列番号11に示されている。この抗体は、WO2010/055366に開示されている同じ抗体であり、そこでは、ハイブリドーマクローン番号362.78.1.44により名付けられている。この抗体はまた、本明細書で「0005」、「NNC-0000-0005」、「0006」、および「NNC-0000-0006」のようないくつかの様式で呼ばれることがある。しかしながら、WO2010/055366において、その同じ抗体によってターゲットされるエピトープは、残基Ile45〜Leu56、およびGlu129〜Leu144を含むと間違って定義されている。本発明者らは今、これが間違いであることを示している。

同様に、本明細書で定義されるエピトープはまた、モノクローナル抗体NNC 0114-0015(本明細書では「0015」と呼ばれることもある)によっても結合され、その抗体は、WO2010/055366に開示されており、ハイブリドーマクローン番号362.597.3.15と名付けられている。軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの配列は、それぞれ配列番号12および配列番号13に示されている。NNC 0114-0015は、NNC 0114-0005に対して単一のアミノ酸変化、HC S31T(Kabatによるナンバリング(Kabat, EA、Wu, TT、Perry, HMら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、US Department of Health and Human Services、Public Health Service、National Institutes of Health、NIH Publication No. 91-3242、1991))を有する。

第1の態様において、本明細書で定義されたエピトープへ特異的に結合するリガンド、好ましくは抗体であって、ただし、リガンドが、天然に存在するIL-21Rα(成熟IL-21Rαタンパク質の一部ではないシグナル配列を含む完全IL-21Rα配列を示す配列番号14、または本明細書に記載されているようなIL-21についての結合部位を含む任意の以前に記載されたIL-21R変異体)でも、モノクローナル抗体NNC 0114-0005でもNNC 0114-0015(それらの軽鎖と重鎖は、本明細書で、それぞれ配列番号10と配列番号11、および配列番号12と配列番号13に示されている)でもない、リガンドが提供される。

好ましくは、リガンドは、抗体もしくは抗体断片などの免疫グロブリン、またはTCR(T細胞受容体)もしくはその断片である。

本発明者らは、列挙されたエピトープを結合するリガンドが、ヘリックスCおよび分子全体を安定化することによって、IL-21を安定化することを示している。結合したIL-21は、結合していない分子と比較して、非常に低いエネルギー状態に達するため、IL-21分子の安定化は、そのリガンドの結合の親和性を増加させると考えられる。

本発明の別の態様または実施形態において、リガンドは抗体または抗体断片であり、その重鎖は、配列番号11に示されているCDR1、CDR2、またはCDR3の少なくとも1つを含み、軽鎖は、配列番号10に示されているCDR1、CDR2、またはCDR3の少なくとも1つを含む。列挙されている配列番号10および11のCDRは、Kabatスキーム(Kabat, EA、Wu, TT、Perry, HMら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、US Department of Health and Human Services、Public Health Service、National Institutes of Health、NIH Publication No. 91-3242、1991)に従って定義される。

一実施形態において、軽鎖は、配列番号10に示されている配列を含む。

一実施形態において、重鎖は、配列番号11に示されている配列を含む。

リガンドは、抗体エフェクター機能を媒介するFcをさらに含んでもよい。

別の態様において、本明細書で同定された、IL-21とIL-21Rαの間で形成される界面でIL-21エピトープへ特異的に結合するリガンド、好ましくは抗体が提供される。好ましくは、リガンドは、以下の残基:R34、R38、Q41、K102、およびR105の任意の1つまたは複数を包含するエピトープにおいて結合する。好ましくは、リガンドは、少なくともR34とK102;またはR34とR105;またはR34とK102とR105;またはR38とK102;またはR38とR105;またはR38とK102とR105;またはQ41とK102;またはQ41とR105;またはQ41とK102とR105;またはR105とR34とR38;またはR105とR34とR38とQ41;またはK102とR34とQ41;またはR34とR38とQ41とK102とR105;またはR38とQ41とK102とR105;またはR34とQ41とK102とR105;またはR34とR38とK102とR105に結合する。

本明細書で同定されたIL-21:IL-21R結合面でIL-21Rαに結合する抗IL-21Rαリガンドもまた包含される。

別の態様において、本発明によるIL-21の不連続なエピトープへ特異的に結合するリガンド、好ましくは抗体であって、ただし、リガンドが、(i)天然に存在するIL-21Rα(配列番号14)、(ii)軽鎖および重鎖が、それぞれ配列番号10および配列番号11に示されているモノクローナル抗体NNC 0114-0005、ならびに(iii)軽鎖および重鎖が、それぞれ配列番号12および配列番号13に示されているモノクローナル抗体NNC 0114-0015ではない、リガンドが提供される。したがって、本発明は、以下の化合物:IL-21Rα、モノクローナル抗体NNC 0114-0005、およびモノクローナル抗体NNC 0114-0015を除く、そのような特性を有する任意のリガンドを含む。

別の態様において、IL-21上の不連続なエピトープに結合するリガンド、好ましくは抗体であって、前記エピトープが、配列番号1に示されているIL-21のアミノ酸I37〜Y52の少なくとも1つ、およびアミノ酸N92〜P108の少なくとも1つを含み、ただし、リガンドが、(i)天然に存在するIL-21Rα(配列番号14)、(ii)軽鎖および重鎖が、それぞれ配列番号10および配列番号11に示されているモノクローナル抗体NNC 0114-0005、ならびに(iii)軽鎖および重鎖が、それぞれ配列番号12および配列番号13に示されているモノクローナル抗体NNC 0114-0015ではない、リガンドが提供される。したがって、本発明は、以下の化合物: IL-21Rα、モノクローナル抗体NNC 0114-0005、およびモノクローナル抗体NNC 0114-0015を除く、そのような特性を有する任意のリガンドを含む。

一実施形態において、本発明によるリガンドは、配列番号1に示されているIL-21のアミノ酸I37〜Y52およびN92〜P108を含むエピトープに結合する。

本発明の別の態様または実施形態において、リガンドは、配列番号10により下記に列挙された残基に対応するCDR1、CDR2、またはCDR3の少なくとも1つを含む軽鎖、および配列番号11により下記に列挙された残基に対応するCDR1、CDR2、またはCDR3の少なくとも1つを含む重鎖を含む。
0114-0005 CDR_L1: 配列番号10のR24-A35。
0114-0005 CDR_L2: 配列番号10のG51-T57。
0114-0005 CDR_L3: 配列番号10のQ90-T96。
0114-0005 CDR_H1: 配列番号11のS31-H35。
0114-0005 CDR_H2: 配列番号11のF50-G66。
0114-0005 CDR_H3: 配列番号11のD99-V115。

別の実施形態において、本発明によるリガンドは、配列番号10に示されているCDR1およびCDR3の少なくとも1つを含む軽鎖、ならびに配列番号11に示されているCDR2およびCDR3の少なくとも1つを含む重鎖を含む。

別の態様において、IL-21とIL-21Rαの間の結合面でIL-21に結合するリガンド、好ましくは抗体であって、前記リガンドが、配列番号1に示されているIL-21の配列におけるR34、R38、Q41、R105、およびK102の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、好ましくは少なくとも4つを含むエピトープに結合し、ただし、リガンドが、(i)天然に存在するIL-21Rα(配列番号14)、(ii)軽鎖および重鎖が、それぞれ配列番号10および配列番号11に示されているモノクローナル抗体NNC 0114-0005、ならびに(iii)軽鎖および重鎖が、それぞれ配列番号12および配列番号13に示されているモノクローナル抗体NNC 0114-0015ではない、リガンドが提供される。したがって、本発明は、以下の化合物:IL-21Rα、モノクローナル抗体NNC 0114-0005、およびモノクローナル抗体NNC 0114-0015を除く、そのような特性を有する任意のリガンドを含む。

一実施形態において、本発明によるリガンドは、R34、R38、Q41、R105、およびK102を含むIL-21上のエピトープに結合する。

別の実施形態において、本発明によるリガンドは、IL-21とIL-21Rαの結合に干渉する。

別の実施形態において、ヒトIL-21と本発明によるリガンドの相互作用のKDが10^-12(M)以下である。別の実施形態において、本発明によるリガンドは、好ましくは抗体であり、前記抗体は、配列番号1に示されているIL-21の配列におけるR34、R38、Q41、R105、およびK102に結合し、ヒトIL-21と前記抗体の相互作用のKDが10^-12(M)以下である。

別の実施形態において、本発明によるリガンドは抗体であり、前記抗体が、配列番号10に示されているCDR3アミノ酸配列、および配列番号11に示されているCDR3アミノ酸配列を含む。

別の実施形態において、本発明によるリガンドは抗体であり、ヒトIL-21と前記抗体の相互作用のKDが10^-12(M)以下であり、前記抗体が、配列番号1に示されているIL-21の配列におけるR34、R38、Q41、R105、およびK102に結合し、前記抗体が、IL-21Rとの結合についてIL-21と競合する。

別の実施形態において、本発明によるリガンドは、例えば、抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、または二価抗体などの抗体である。

本発明による別の態様または実施形態において、リガンドは、軽鎖および重鎖が、それぞれ配列番号10および配列番号11に示されているモノクローナル抗体NNC 0114-0005の変異体である抗体であって、前記リガンドが、配列番号10および/または配列番号11のCDR配列内に1つまたは複数の変異を含み、前記変異が、CDR H1 S31A、CDR H2 Y53F、CDR H2 A61S、CDR H2 S63T、CDR H2S63A、CDR H2 K65R、CDR L1 R24K、CDR L1 S26T、CDR L1 S31T、CDR L1 S31A、CDR L2 S53T、CDR L2 S52A、CDR L2 S54A、CDR L2 S54T、およびCDR L2 R55Kからなるリストの1つまたは複数から選択される。もちろん、そのような変異抗体が所定の位置に1つの変異を含むことができるのみであることは理解されている。

別の態様において、本発明によるリガンド、好ましくは抗体、および任意で、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤/担体を含む医薬組成物が提供される。そのような賦形剤/担体は当技術分野においてよく知られている。そのような医薬組成物は、好ましくは、IV投与および/または皮下投与用として意図される。

別の態様において、免疫障害を治療するための本発明によるリガンド、好ましくは抗体の使用が提供される。免疫障害は、好ましくは、自己免疫疾患である。

最後の態様において、免疫障害を治療する方法であって、それを必要としている者に、本発明によるリガンド、好ましくは抗体の適切な用量を投与する工程を含む、方法が提供される。一実施形態において、本発明によるリガンドは、自己免疫疾患の治療においてB細胞分化を低下させるために用いることができる。

本発明によるリガンドは、自己免疫疾患を含む、異常な免疫応答に関わる状態を治療するのに適している。IL-21は、いくつかのT細胞特異的相互作用において示され、免疫刺激性サイトカインである。したがって、異常な免疫応答に関わる状態の治療に用いる、本明細書に記載されているIL-21特異的リガンドが提供される。さらに、異常な免疫応答に関わる状態を治療する方法であって、それを必要としている対象に、本発明によるリガンドを投与する工程を含む方法が提供される。

IL-21:IL-21Rα複合体およびFab NNC 0114-0009:IL-21複合体の、それらの結合面を含む詳細な三次元構造知識の本明細書における提供により、所望の特性を有する相互作用分子の変異体を合理的に設計するための基盤を形成することができる。抗体について改善することが望ましい可能性がある特性は、化学的または物理的特性、例えば、溶解性、粘性、および安定性であり得る。調節することが望ましい可能性がある他の特性は、抗体の抗原性、ならびに抗抗体によって結合されるそれらの能力、およびエフェクター機能を誘導するそれらの能力である。

本発明による異なる態様および実施形態を組み合わせ得ることは理解されている。

(実施例)
(実施例1)
抗IL-21 Fabと複合体化したhIL-21の結晶構造
ヒト抗IL-21モノクローナル抗体NNC 0114-0005のFab断片(このFab断片はまた本明細書で、例えば、「Fab 0114-0005」と呼ばれることもある)、NNC 0114-0009と複合したhIL-21の三次元構造を、X線結晶学を用いて、解析し、1.75Å解像度まで精密化した。その結果は、hIL-21上のエピトープが、プライベートhIL-21受容体鎖(IL21Rα)に対する結合部位と広範な重複を有することを示している。したがって、その高親和性によって、抗IL-21 mAbは、hIL-21とIL21Rαの結合を効率的に遮断し、それゆえに、それの同族受容体を通じてhIL-21によって媒介される生物学的効果を阻害する。

hIL-21(配列番号1の残基30〜162)および抗IL-21 Fab NNC 0114-0009(配列番号16に対応する軽鎖、および配列番号17の残基1〜234に対応する重鎖断片を含む)を、少しモル過剰のhIL-21と混合し、その複合体を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。その後、複合体を約10.3mg/mlまで濃縮した。1:2(沈殿剤溶液の体積:タンパク質溶液の体積)の比で混合して、25% w/v PEG 3350、0.1Mクエン酸、pH3.5中、ハンギングドロップ(hanging drop)技術を用いて結晶を成長させた。全滴径は3.0μlであった。75%の沈殿剤溶液および25%のグリセロールを含有する3μlの凍結用溶液を、結晶を含有する液滴に移すことによって結晶を凍結のために調製し、浸漬を約15秒間、行った。その後、結晶を、液体N₂において急速凍結し、極低温N₂ガス流によってデータ収集中、100Kの温度に保った。MAX-lab、Lund、Swedenにおいて、最初は、Rigaku 007HF回転陽極源で2.03Å解像度まで、その後、同じ結晶を用いて、ビームラインBL911-2 [1]で1.75Å解像度まで、結晶学的データを収集した。データの空間群決定、積分、およびスケーリングを、XDSソフトウェアパッケージ[2]によって行い、Pointlessソフトウェア[3]によってさらにチェックした。シンクロトロンデータの格子パラメータは、それぞれ、40.7、133.3、53.4Å、90°、106.87°、および90°、ならびに空間群P2₁であると決定された。1.75Å解像度までのR-symは5.1%であり、完全性は98.1%であった。CCP4スイート[6]のPhaserソフトウェアプログラム[4;5]を用いる分子置換を、構造決定に用いた。Protein Data Bank(PDB)寄託[7]構造3KDM[8]からのFab分子、およびIL-21/IL-21Rα複合体構造のより前に決定されたX線結晶構造(実施例2)からのhIL-21分子を、構造決定に用いた。

Fab分子を、可変ドメインおよび定常ドメイン、それぞれを含有する2つの部分に分けた。その2つの部分を、分子置換計算における研究モデルとしてそれぞれ、用いた。IL-21について、未定の可動性ループを除く分子全体を、研究モデルとして用いた。その後、ソフトウェアARP/wARP[9]を、モデル構築の最初のラウンドに用い、続いて、CCP4ソフトウェアパッケージのRefmac5 [10]およびPhenixソフトウェアパッケージ[12]のPhenix.refine [11]を用いる結晶学的精密化、およびCootソフトウェアプログラム[13]を用いる電子密度マップ、モデル補正および構築のコンピュータグラフィックス検査を行った。その手順は、さらなる有意な改善をモデルに施すことができなくなるまで、その手順を循環させた。全データについての最終RおよびR-freeは、それぞれ、0.191および0.241であり、モデルは、0.023Åの理想的な結合距離からの標準偏差(RMSD)を示した。最終精密化サイクルからのPDBファイルのヘッダーはTable 1(表1)に示されている。

結果
抗IL-21 FabはhIL-21分子とIL-21Rαの結合を効率的に遮断する。

CCP4プログラムスイートのソフトウェアプログラムAreaimol(B.LeeおよびF.M.Richards、J.Mol.Biol.、55、379〜400頁(1971)、E.B.SaffおよびA.B.J.Kuijlaars、The Mathematical Intelligencer、19、5〜11(1997))によるペアワイズ相互作用において排除された面積の計算により、それぞれ、hIL-21について1189Å²および抗IL-21について1084Å²の結晶構造のhIL-21/抗IL-21 Fab分子複合体が示された。IL-21分子と抗IL-21 Fabのペアワイズ相互作用において排除された平均面積は、1136Å²であると計算された。

hIL-21と抗IL-21 Fabの間の直接的接触を、抗IL-21 FabとhIL-21分子の間の4.0Åのカットオフ距離を用いて、CCP4プログラムスイート[6]のCONTACTソフトウェアを実行することによって同定した。hIL-21/抗IL-21 Fab複合体結晶構造からの結果はTable 2(表2)に示されている。抗IL-21についての生じたhIL-21エピトープは、hIL-21(配列番号1)の以下の残基を含むことが見出された:Ile 37、Arg 38、Gln 41、Asp 44、Ile 45、Asp 47、Gln 48、Asn 51、Tyr 52、Asn 92、Arg 94、Ile 95、Asn 97、Val 98、Val 98、Ser 99、Lys 101、Lys 102、Arg 105、Lys 106、Pro 107およびPro 108。

したがって、hIL-21エピトープは、ヘリックスAおよびCの残基を含む。加えて、いくつかの接触残基(Arg105〜Pro108)を、ヘリックスCの後に続くループセグメント内に同定した。これらの接触区域は、hIL-21上のIL-21Rαに対する結合部位として決定されているもの(実施例2)と非常によく一致した。

hIL-21に対する抗IL-21パラトープは、軽(L)鎖(配列番号16、Table 2(表2))の残基Glu 1、Gln 27、Ser 28、Val 29、Ser 30、Ser 32、Tyr 33、Gln 91、Tyr 92、Gly 93、Ser 94、およびTrp 95、ならびに重(H)鎖(配列番号17、Table 2(表2))の残基Trp 47、Trp 52、Ser 56、Asp 57、Tyr 59、Tyr 60、Asp 99、Asp 101、Ser 102、Ser 103、Asp 104、Trp 105、Tyr 106、Gly 107、Asp 108、Tyr 109、およびPhe 111を含んだ。hIL-21エピトープおよび水素結合に関与する残基もまた、Table 2(表2)におけるhIL-21のアミノ酸配列内に示されている。

(実施例2)
hIL-21Rαの細胞外ドメインと複合体化したhIL-21の結晶構造
hIL-21Rαの可溶性断片と複合体化したhIL-21の三次元構造を、X線結晶学を用いて、解析し、2.8Å解像度まで精密化した。結果は、hIL-21RαとhIL-21のヘリックスAおよびCとの結合を示している。したがって、hIL-21上のhIL-21Rα結合部位は、実施例1における抗IL-21とhIL-21の結合について記載されたものと非常に類似しており、hIL-21とその2つの分子についての直接的な結合競合を証明している。

材料および方法
複合体形成
hIL-21(配列番号1の残基30〜162)およびhIL-21Rα(配列番号14)を室温で1.5:1の比で混合することによって、hIL-21とhIL-21Rαの複合体を形成した。hIL-21は最も容易に入手できるため、過剰レベルのhIL-21を用いた。さらに、hIL-21(≒15〜16kDa)はhIL-21Rα(28kDa)よりはるかに小さいので、それは、ゲル濾過によって複合体(≒43kDa)からより容易に分離される。複合体をHiLoad 16/60 Superdex 75カラム(GFC)(GE Healthcare)上へ負荷し、PBSバッファー(10mMリン酸、150mM NaCl、pH7.4)で溶出した。複合体を含有する画分を、10000Da分子量カットオフを有するAmicon Ultra-4遠心濾過デバイスを用いて5mg/mlまで濃縮した。しかしながら、結晶化過程を容易にするために成熟IL-21Rに、N80Q、N87Q、N118Q、およびN108Dの追加の変異を導入した。

結晶化
100μlの1.8〜1.9M硫酸二アンモニウムおよび0.1M酢酸ナトリウムを含有するリザーバ溶液、pH5.5を用いたシッティングドロップ(sitting drops)法において18℃で、すべての結晶を成長させた。1μlのリザーバ溶液および1μLタンパク質溶液をペデスタルにおいて混合した。大きい単一の結晶が10〜14日後に出現した。3.0M硫酸二アンモニウムおよび0.1M酢酸ナトリウムを含有する凍結用溶液、pH5.5を用いてこれらを急速凍結した。

0.1μLの2mM Ta₆Br₂溶液を加えることによって、臭化タンタル誘導体を得た。これを2時間、放置し、その時点で、結晶が緑色に変わっていた。3.0M硫酸二アンモニウムおよび0.1M酢酸ナトリウムを含有する凍結用溶液、pH5.5を用いて結晶を急速凍結した。

hIL-21Rαと複合体化したセレノメチオニンhIL-21(semetIL-21)の結晶を、野生型タンパク質と同じ方法で生成させた。

データ収集
Swiss Light Source(SLS)のPXIII(X06DA)ビームラインにおいて全データを収集した。天然のデータセットについて、1.0度の振幅を以て180個のフレームが収集された。Se-メチオニンデータセットについて、1.0度の振幅を以て720個のフレームが収集され、臭化タンタルデータセットについて、1.0度の振幅を以て1080個のフレームが収集された。データの空間群決定、積分、およびスケーリングは、xdsソフトウェアパッケージ[2]によって行われた。データについての格子パラメータは、a、b、およびcについて、それぞれ、83Å、152Å、365Åであり、空間群はP2₁2₁2₁であり、非対称ユニットあたり8つの独立したhIL-21/hIL-21Rα複合体分子を有することが決定された。

位相整合(phasing)、モデル構築、および精密化
最初のモデルを構築するために、臭化タンタルおよびSe-メチオニンデータセットからの相を用いて作成された電子密度マップを用いた。Se-メチオニン部位を用いて、hIL-21の既知のNMR構造の8つのコピー[14]を、マップ内に配置することができた。このモデルから、最初の非結晶学的対称性(NCS)オペレーターが計算され、NCS拘束を用いることによって、新しい相が導かれた。新しい相を、実験相と共に用いて、改善された電子密度マップを計算した。IL-2Rβ座標に基づいたポリアラニンモデルを作成し、それの2つの構成物のフィブロネクチンドメインへ分割した。2つのフィブロネクチンドメインを、hIL-21Rαについての密度を含むマップの領域に配置した。Resolveソフトウェア[15]を用いて、8つのオペレーターを有する1つのNCS群が、hIL-21について、加えて、IL-2Rβ/IL-21Rαの2つのフィブロネクチンドメインのそれぞれについて、作成された。これに続いて、Resolveにおいて密度改変および位相拡張が行われた。hIL-21Rα構造を、分子グラフィックスソフトウェアCoot[13]において構築し、Phenixソフトウェアパッケージ[12]のソフトウェアプログラムPhenix.refine[11]による結晶学的精密化を用い、続いて、それぞれ、Resolveによる相改善を行った。その手順は、さらなる有意な改善をモデルに施すことができなくなるまで、その手順を循環させた。hIL-21Rα/hIL-21複合体を形成する、hIL-21RαおよびhIL-21の両方の8つの分子を含む最終モデルは、2.8Å解像度まで精密化された。2.0より大きいF(obs)/δ[F(obs)]を有するデータについての最終RおよびR-freeは、それぞれ、0.246および0.274であり、モデルは、0.011Åの理想的な結合距離からの標準偏差(RMSD)を示した(Table 3(表3))。

結果
hIL-21Rαの可溶性断片と複合体化したhIL-21の結晶構造は、hIL-21RαとhIL-21のヘリックスAおよびCとの結合を示した。したがって、hIL-21上のhIL-21Rα結合部位は、実施例1における抗IL-21の結合について記載されたものと非常に類似しており、hIL-21とその2つの分子についての直接的な結合競合を証明している。

CCP4プログラムスイート[6]のソフトウェアプログラムAREAIMOLによるペアワイズ相互作用において排除された面積の計算により、それぞれ、hIL-21について984Å²およびhIL-21Rαについて998Å²の結晶構造のhIL-21/hIL-21Rα分子複合体が示された。hIL-21分子とhIL-21Rα分子の間でのペアワイズ相互作用において排除された平均面積は、991Å²であると計算された。

hIL-21とhIL-21Rαの間の直接的接触を、hIL-21Rα分子とhIL-21分子の間の4.0Åのカットオフ距離を用いてCCP4プログラムスイート[6]のCONTACTソフトウェアを実行することによって同定した。非対称ユニット中に含まれる8つのNCS拘束複合体のうちのhIL-21/hIL-21Rα複合体の1つからの結果はTable 4(表4)に示されている。生じたhIL-21Rαに対するhIL-21界面残基は、hIL-21(配列番号1、Table 4(表4))の以下の残基を含むことが見出された: His 35、Ile 37、Arg 38、Arg 40、Gln 41、Asp 44、Ile 45、Gln 48、Tyr 52、Ile 95、Val 98、Ser 99、Lys 102、Arg 105、Lys 106、Pro 107、Pro 108、およびSer 109。

したがって、hIL-21Rαに対する界面残基hIL-21は、ヘリックスAおよびCの残基を含む。これらの接触区域は、hIL-21上の抗IL-21に対する結合部位として決定されているもの(実施例1)と非常によく一致した。

hIL-21に対するhIL-21Rα界面残基は、hIL-21Rα鎖(配列番号14、Table 4(表4))の残基Tyr 12、Gln 35、Gln 37、Tyr 38、Glu 40、Leu 41、Phe 69、His 70、Phe 71、Met 72、Ala 73、Asp 74、Asp 75、Ile 76、Leu 96、Ala 98、Pro 128、Ala 129、Tyr 131、Met 132、Lys 136、Ser 192、およびTyr 193を含んだ。

(実施例3)
本明細書に記載されたエピトープに結合するNNC 0114-0005の変異体を設計するために、抗IL-21 Fab NNC 0114-0009についてのKabat定義済みのCDR-ループを分析する。Fab NNC 0114-0009は、NNC 0114-0005のFab断片を表す。

CDR領域は以下の残基(CDR-残基)を含む:
CDR_L1: R24 A25 S26 Q27 S28 V29 S30 S31 S32 Y33 L34 A35
CDR_L2: G51 A52 S53 S54 R55 A56 T57
CDR_L3: Q90 Q91 Y92 G93 S94 W95 T96
CDR_H1: S31 Y32 G33 M34 H35
CDR_H2: F50 I51 W52 Y53 D54 G55 S56 D57 K58 Y59 Y60 A61 D62 S63 V64 K65 G66
CDR_H3: D99 G100 D101 S102 S103 D104 W105 Y106 G107 D108 Y109 Y110 F111 G112 M113 D114 V115

4Å距離カットオフを用いて定義されたパラトープは、Fab NNC 0114-0009:hIL-21複合体の結晶構造から決定される。パラトープは、以下の残基を含むことが決定される:
CDR_L1では、Q27 S28 V29 S30 S32 Y33
CDR_L2では、なし
CDR_L3では、Q91 Y92 G93 S94 W95
CDR_H1では、なし
CDR_H2では、W52 S56 D57 Y59 Y60
CDR_H3では、D99 D101 S102 S103 D104 W105 Y106 G107 D108 Y109 F111

したがって、パラトープに含まれないCDR-残基は以下である(合計38個):
CDR_L1では、R24 A25 S26 S31 L34 A35
CDR_L2では、G51 A52 S53 S54 R55 A56 T57
CDR_L3では、Q90 T96
CDR_H1では、S31 Y32 G33 M34 H35
CDR_H2では、F50 I51 Y53 D54 G55 K58 A61 D62 S63 V64 K65 G66
CDR_H3では、G100 Y110 G112 M113 D114 V115

38個の非パラトープCDR-残基の中で、13個を可能性のある変異部位として選択した。選択は、結晶構造の洞察に基づいた。広範囲に埋もれた残基、および側鎖がいくつかの重要な相互作用に関与していると思われる残基を、除外した。同定された可能性のある変異部位はTable 5(表5)に列挙されている。これらの部位における特定の変異(Table 5(表5))を、タンパク質構造に効果を生じず、または極小の効果を生じるように選んだ。

この実施例は、Fab NNC 0114-0009:IL-21の結晶構造に含まれる情報に基づいて、本発明による抗体を設計するのに適用できる1つの方法を記載する。当然、本発明によるリガンドを設計するのにいくつかの他のアプローチを採用できるということになる。

1つのアプローチは、例えば、1つまたは複数の保存的置換を行い得ることを除いて、Fab0009のパラトープを本質的に含むリガンドを設計することであり得る。

別のアプローチは、IL-21とIL-21Rαの間の結合面の構造に基づいてIL-21リガンドを設計することであり得る。このリガンドは、例えば、前記IL-21Rα結合面の構造を本質的に保持する抗体またはIL-21Rα変異体/模倣体の形をとることができる。

当然、そのようなアプローチの1つまたは複数を組み合わせ得るということになる。

自己免疫障害および他の免疫関連障害は、例えば、治療用ヒトモノクローナル抗体で治療することができる。しかしながら、前記モノクローナル抗体は、免疫原性であって、抗抗体の形成を生じる可能性がある。そのような抗抗体が、標的分子との結合に直接関与する治療用抗体の区域に結合することは考えられる。NNC 0114-0005に対する抗抗体の発生をもたらすそのような免疫原性部位が認識され、かつ特徴づけられるならば、Fab NNC 0114-0009:IL-21複合体の三次元構造から導かれた抗体NNC 0114-0005についてのパラトープの詳細な記載は、hIL-21との高親和性結合を保持するが、潜在的に、より免疫原性が低いNNC 0114-0005の変異体を合理的に設計する可能性を提供する。あるいは、NNC 0114-0005の変異体は、特異的な抗抗体との望ましくない結合が低下し、または防止されるように、設計されてもよい。したがって、結晶構造情報を用いて、NNC 0114-0005の改善されたバージョンを提供することが可能である。

このFab断片およびそれのパラトープの結晶構造の提供によってまた、IL-21との高親和性結合を含む、生物学的機能性を保持しながら、このパラトープを含む分子の安定性、溶解性、または他の化学的もしくは物理的特性に関する改善を潜在的に生じ得る、例えば、その中の残基の置換の可能性が与えられる。安定性は、例えば、凝集、自己会合、断片化、およびジスルフィド形成/交換を低下させることによって改善することができる。溶解性の改善には、粘性の改善をもたらす特性を含んでもよい。

この結晶構造の提供はさらに、例えば、脱アミド、異性化、および/または酸化を受ける傾向を低下させており、それにより、IL-21に対する高親和性を含む生物学的機能性を保持しながら、このパラトープを含む分子の物理的/化学的安定性を改善する改変型分子を提供する可能性を与える。

抗体NNC 0114-0005における潜在的安定性が改善した変異の1つの例は、メチオニン残基の変異による潜在的酸化部位の除去である。そのような変異の1つの特定の例は、重鎖(配列番号10)における位置34のメチオニンの、類似した特性をもつアミノ酸、例えば、イソロイシンへの変化である。

抗体NNC 0114-0005における潜在的安定性が改善した変異の1つの例は、アスパラギン酸残基の異性化についての潜在的ホットスポット(DXモチーフ、例えば、DGモチーフおよびDS-モチーフ)の除去である。そのような潜在的易変DX-モチーフは、構成物DまたはX残基の一方または両方の適切な変異によって除去することができる。そのような変異の1つの特定の例は、重鎖(配列番号10)における(DGモチーフに存在する)位置54のアスパラギン酸の、類似した特性をもつアミノ酸、例えば、グルタミン酸への変化である。そのような変異の第2の特定の例は、重鎖(配列番号10)における(DGモチーフに存在する)位置99のアスパラギン酸の、類似した特性をもつアミノ酸、例えば、グルタミン酸への変化である。そのような変異の第3の特定の例は、重鎖(配列番号10)における(DSモチーフに存在する)位置101のアスパラギン酸の、類似した特性をもつアミノ酸、例えば、グルタミン酸への変化である。

抗体NNC 0114-0005における潜在的安定性が改善した変異の1つの例は、アスパラギン残基の脱アミドについての潜在的ホットスポット(NXモチーフ、例えば、NGモチーフおよびNS-モチーフ)の除去である。そのような潜在的易変NX-モチーフは、構成物NまたはX残基の一方または両方の適切な変異によって除去することができる。そのような変異の1つの特定の例は、重鎖(配列番号10)における(NSモチーフに存在する)位置74のアスパラギンの、類似した特性をもつアミノ酸、例えば、グルタミン、N74への変化である。

(実施例4)
抗hIL-21抗体とhIL-21の間の相互作用の表面プラズモン共鳴(SPR)による研究
表面プラズモン共鳴を通して分子相互作用をリアルタイムに測定するBiacore T100装置ですべての結合研究を実施した。実験を25℃で実行し、試料を試料コンパートメント内に15℃で保存した。Biacoreによって報告されるシグナル(RU、応答単位)は、4つの連続フローセルにおける個々のセンサーチップ表面上の質量に直接相関する。

BiacoreヒトまたはマウスFc捕捉キットからの抗hFcモノクローナル抗体または抗mFcポリクローナル抗体を、製造会社の使用説明書に従って、CM4センサーチップのフローセル上に固定化した。捕捉抗体の最終固定化レベルは、1つの実験において約2,000RUであった。ヒト抗IL-21抗体NNC 0114-0005、NNC 0114-0015、およびラット抗IL-21抗体NNC 0114-0019の捕捉については、各抗体をランニングバッファー(1mg/ml BSAを含有する、10mM Hepes、0.3M NaCl、5mM CaCl2、0.05%サーファクタントP20、pH8.0)中へ0.25〜1μg/mlまで希釈し、フローセル2〜4のうちの1つにおいて10μl/分で180秒間、注入することにより行い、抗Fc抗体のみが固定化されているフローセル1において参照表面を作製した。試験抗体の最終捕捉レベルは、典型的には、1つの実験において、約20RUから約160RUまでの範囲であった。hIL-21タンパク質の結合を、参照フローセルとの結合と比べた、種々の捕捉された抗IL-21抗体との結合の比較分析を可能にするように、すべてのフローセルに対して分析物を注入することによって行った。hIL-21タンパク質を、0.008〜2nMまでランニングバッファー中へ1:2の段階希釈し、50μl/分で600秒間、注入し、600秒間または3600秒間、解離させた。分析物の毎回の注入サイクル後に、20mM HClの50μl/分での2回の注入により、CM4表面を再生した。この再生工程は、固定化捕捉抗体表面からの抗IL-21抗体およびいかなる結合したIL-21をも除去し、次の相互作用試料ペアの続いての結合を可能にした。再生手順は、直接固定化された抗ヒトFc捕捉抗体をチップ表面から除去しなかった。

ka(会合速度)、kd(解離速度)、およびKD(結合親和性)などの動態学的データを得るために、データ分析を、Biacore T100評価ソフトウェア2.0.3を用いて実施した。参照対照表面との有意な非特異的結合は観察されなかった。結合曲線を、二重参照(参照表面シグナル、および捕捉された抗IL-21抗体へのブランクバッファー注入の引き算)によって処理した。これは、装置ノイズ、バルクシフト、および試料注入中のドリフトについての補正を可能にした。

NNC 0114-0005および0114-0015は、非常に高い会合速度でhIL-21と相互作用し、その結果、質量輸送限界状態を生じ、正確な動態学的値を最初、得ることができなかった。実施例11に記載されているように、フロー速度、解離時間、表面密度、およびより高い感度の新しいハードウェアにおけるアッセイ改変後、新しい実験を実施した。その後、結果により、ヒトIL-21がNNC 0114-0005および0114-0015に、≦1pMの平均KD、1E-5秒^-1の解離速度、および3〜4E+7(ミリ秒)^-1の会合速度で結合することが示された。したがって、これらの2つの抗体は、ヒトIL-21との類似した結合特性を共有する。

ヒトIL-21は、NNC 0114-0019に、0114-0005および0114-0015と比較して、より遅い会合速度5〜6E+7(ミリ秒)^-1のため、平均10分の1未満の低い親和性で結合する。結果は、各抗体について1〜3つの異なる実験に基づいている。パラメータkaおよびkdの相対標準誤差は、個々の実験において0.2〜1.5%であった。

(実施例5)
NK-92アッセイにおける生理活性
IL-21Rαを内因的に発現し、増殖をIL-2またはIL-21に依存しているNK-92細胞系統を用いるバイオアッセイが開発された。このアッセイは、抗IL-21抗体の効力をインビトロ判定するために使用することが可能である。NK-92細胞系統は末梢血単核球由来のヒト懸濁リンパ芽球であり、ATCC/LGC Promochemから購入することが可能である。抗IL-21抗体によるIL-21の中和は、alamarBlue(登録商標)の添加を介して増殖阻害により測定される(細胞生存率指標)。

通常の維持培養中、NK-92細胞はIL-2により生存可能に保たれる。NK-92細胞は洗浄され、1.6×10⁵細胞/mlの密度(ウェルあたり12,800細胞に等しい)で96ウェルプレート(Matrix Technology)に蒔かれる前記アッセイでは、細胞はプレート内に播種される。細胞は5431pg/mlの一定濃度で組換えヒトIL-21で刺激される。0〜12,800pg/mlに及ぶアッセイ培地中で調製された抗IL-21抗体の段階希釈液は、3つの個別のプレート上の3つの異なる位置に3通り添加される。細胞はHeto Holten社製のインキュベーターにおいてCO₂と一緒に3日間インキュベートされる。3日目に10μlのalamarBlue(登録商標)(Biosource)が添加され、5時間後にSynergy機器(Bio Tek)上で蛍光が測定される。

データは、タンパク質濃度(mg/ml)に相関がある複合効力(U/ml)(3つの独立した位置の幾何平均)としてBioCalc(MicroLex)において解析され、比活性(U/mg)として報告される。NNC114-0005の比活性は1.0U/mgであると判定された。

(実施例6)
B細胞増殖および成熟アッセイ
生物学的に関連する設定における抗IL-21抗体の効果を試験するために、関連IL-21生物学が初代ヒト細胞において研究される3種の機能アッセイが確立された。

抗CD40抗体と組換えIL-21を組み合わせて刺激すると、CD19+CD27高CD38高表現型を有する形質芽細胞の頻度により測定される場合、初代B細胞の増殖およびB細胞成熟が誘導される。抗IL-21抗体は増殖も成熟も妨げることができた。

慢性炎症性疾患とのB細胞の関連性は、文献において、および、例えば、関節リウマチにおけるリツキシマブを用いたB細胞枯渇の臨床効果により記載されてきた。文献において、B細胞は、抗原提示細胞および(自己)抗体の産生細胞としても慢性炎症を推進するのに重要な役割を果たすことが示された(Dorner T et al (2009) Arthritis Res. Therapy)。IL-21はB細胞増殖(CD40同時刺激と組み合わせた場合)、免疫グロブリン(Ig)の特定のIgG1およびIgG3へのクラススイッチ、ならびに活性化されたB細胞のIg産生形質細胞への分化を誘導する(Ozaki, K. et al.、Science、2002年; Ettinger R. J. et al.、J Immunol, 2005年; Kuchen, S., et al.、J Immunol、2007年; Ettinger, R. et al.、Immunol Rev、2008年; Leonard, W. J. et al.、Nat. Rev. Immunol. 2005年)。したがって、IL-21活性の中和はB細胞分化を減少させ、こうして自己免疫患者におけるB細胞免疫刺激特性および自己抗体産生を潜在的に減少させると予想される。

血液バッグは健康なヒト志願者から得られ、PBMCはFicoll-Paque TM Plus(GE Healthcare)勾配遠心分離により50mlのヘパリン処置された末梢血から単離された。血液は室温でリン酸緩衝食塩水(PBS)に100mlまで希釈され、35mlアリコートは、室温で14mlのFicoll-Paque TM Plus(GE Healthcare)の表面を慎重に覆いながら50ml円錐チューブに分配された。チューブは、室温、1680rpm(600×g)で25分間ブレーキなしで回転させた。PBMC界面層は慎重に取り除かれ、2%FCSを含有するPBSで2度洗浄された。B細胞はEasySepヒトB細胞エンリッチメントキット(StemCell Technologies SERL、Grenoble、France)を使用するネガティブ選択により単離された。精製されたB細胞の小さな試料はFACS解析により純度について試験され、すべての実験において95〜97%超の純度であることが分かった。

B細胞は、熱不活化ウシ胎仔血清(FCS)(Gibco)または健康なヒト血清(HS)(Sigma)およびペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco)を補充されたRPMI-1640培地(InVitrogen)において培養された。精製されたヒトB細胞は、96ウェルU底組織培養プレート(BD Biosciences)に50,000細胞/ウェルで蒔かれた。細胞は0.1μg/mlの抗CD-40(ヤギ抗ヒトCD40ポリクローナル;R&D Systems)を用いてまたは用いないでプラス1対3段階希釈として調製された組換えヒトIL-21(Novo Nordisk A/S)の滴定で処理された。次に、細胞のプレートは加湿インキュベーターにおいて37℃、5%CO₂で3日間インキュベートされた。3日後、細胞は1μCi/ウェルの[3H]チミジン(Perkin Elmer Life Sciences)でパルスされた。16時間後、細胞はUniFilter-96 GF/Cフィルタープレート(Packard、Perkin Elmer)上で回収され、[3H]チミジン取り込み量がTopCount NXT (Perkin Elmer Life Sciences)を使用して定量された。50%および90%最大増殖の誘導のために必要なIL-21の有効濃度(それぞれ、EC50およびEC90)は、GraphPad Prism v5.0 ソフトウェア(GraphPad Inc)およびS字型用量応答(可変傾斜)式を使用して計算された。

抗IL-21 mAbの中和潜在力を決定するために、B細胞は96ウェルU底組織培養プレートにウェルあたり50,000細胞で蒔かれた。細胞は0.1μg/mlの抗CD-40 (R&D Systems)、50ng/ml(3.21nM)の組換えヒトIL-21および抗IL-21 mAbの滴定で処理された。細胞は加湿インキュベーターにおいて37℃、5%CO₂で3日間インキュベートされた。3日後、細胞は最後の20時間1μCi/ウェルの[3H]チミジン(Perkin Elmer Life Sciences)でパルスされた。細胞はUniFilter-96 GF/Cフィルタープレート(Packard Instruments、Perkin Elmer)上に回収され、[3H]チミジン取り込み量がTopCount NXT (Perkin Elmer)を使用して定量された。増殖を50%減少させるのに必要な抗IL-21 mAbの阻害濃度(IC50)は、GraphPad Prism v5.0ソフトウェア(GraphPad Inc)およびS字型用量応答(可変傾斜、4パラメータ)式を使用して計算された。

NNC114-0005についてのIC50はこれらの実験では低ナノモル範囲であることが示された。

増殖に関する抗IL-21抗体の阻害効果は、カルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル(CFSE)を使用するフローサイトメトリーによりさらに測定された。精製されたB細胞は0.2μMのCFSEで染色され、96ウェルU底組織培養プレートにウェルあたり50,000細胞で蒔かれた。細胞は0.1μg/mlの抗CD-40 (R&D Systems)、50ng/ml(3.21nM)の組換えヒトIL-21ならびにNNC114-0005およびNNC114-0015の10倍滴定を用いて刺激された。NNC114-0005およびNNC114-0015の開始濃度はそれぞれ50および500ng/mlであった。細胞は加湿インキュベーターにおいて37℃、5%CO₂で6日間インキュベートされた。増殖は、LIVE/DEAD定着死細胞染色で染色後、生B細胞上にゲートをかけることにより、CD19表面発現について測定された。

B細胞上でのNNC114-0005の重要な役割をさらに実証するために、B細胞成熟に対する効果がフローサイトメトリーにより測定された。精製されたB細胞は96ウェルU底組織培養プレートにウェルあたり50,000細胞で蒔かれた。細胞は0.1μg/mlの抗CD-40 (R&D Systems)、50ng/ml(3.21nM)の組換えヒトIL-21ならびにNNC114-0005およびNNC114-0015の3倍滴定を用いて刺激された。NNC114-0005およびNNC114-0015の開始濃度はそれぞれ1および10ng/mlであった。細胞は加湿インキュベーターにおいて37℃、5%CO₂で6日間インキュベートされた。LIVE/DEAD定着死細胞染色での染色およびCD19表面発現後、生B細胞にゲートをかけた。IL-21/抗CD40はB細胞成熟を形質芽細胞に誘導し、形質細胞は、CD27、CD38およびCD138の発現についてB細胞を染色することにより追跡された。形質芽細胞および形質細胞成熟に対するNNC114-0005および-0015の阻害効果は、それぞれCD19+CD27高CD38高およびCD19+CD27高CD138+表現型上にゲートをかけることにより同定された。

(実施例7)
hIL-21上でのmAb NNC0114-0005およびNNC0114-0019のHX-MSによるエピトープマッピング
HX-MSへの導入
HX-MS技術は、タンパク質の水素交換(HX)が質量分析(MS)により容易に追跡することができることを利用する。水素を含有する水性溶媒を重水素を含有する水性溶媒で置き換えることにより、タンパク質中の所与の部位での重水素原子の取り込みにより質量が1Da増加する。この質量増加は交換反応のクエンチ試料において質量分析により時間の関数としてモニターすることが可能である。重水素標識情報は、クエンチ条件下でのペプシン消化および生じたペプチドの質量増加を追跡することによりタンパク質中の領域に亜局在化(sublocalize)することができる。

HX-MSの一使用は、タンパク質同士が複合体を形成すると水素交換が減少する領域を同定することにより分子相互作用に関与している部位を探索することである。通常、結合面は、溶媒の立体排除に起因する水素交換の顕著な減少により明らかにされる。タンパク質同士の複合体形成は、それぞれの結合パートナーの存在下および非存在下でどちらかのタンパク質メンバーに取り込まれる重水素の総量を時間の関数として測定することによるだけでHX-MSにより検出し得る。HX-MS技法は天然の成分、すなわちタンパク質および抗体またはFab断片を使用し、溶液中で実施される。したがって、HX-MSはインビボ状態を模倣する可能性を提供する(HX-MS技術に関する最近の概説は、Wales and Engen、Mass Spectrom. Rev. 25、158頁(2006)参照)。

材料
使用されるタンパク質バッチは以下の通りである:
hIL-21: 残基30〜162に対応し、残基29としてN末端メチオニンを有するヒト組換えIL-21
mAb: NNC 0114-0005
mAb: NNC 0114-0019、クローン番号: WO2007/111714(ATCC受託番号PTA-7142)由来272.21.1.3.4.2

タンパク質はすべて実験前にPBS pH7.4中にバッファー交換された。

方法: HX-MS実験
計測手段およびデータ記録
HX実験は、LeapShellソフトウェア(Leap Technologies Inc.)により操作されるLeapロボット(H/D-x PAL; Leap Technologies Inc.)により自動化され、前記ロボットは重水素交換反応の開始、反応時間制御、クエンチ反応、UPLCシステム上への注入および消化時間制御を実行した。Leapロボットは、それぞれバッファー貯蔵およびHX反応のために20℃に維持されたならびにタンパク質およびクエンチ溶液の貯蔵のために2℃に維持された2つの温度制御されたスタックを備えていた。Leapロボットは、プレおよび分析カラムならびにLCチュービングおよび切換弁を1℃で保持しておく冷却Trio VS装置(Leap Technologies Inc.)をさらに含んでいた。Trio VS装置の切換弁はHPLCからMicrobore UHPLCスイッチ弁(Cheminert、VICI AG)にグレードアップされていた。インラインペプシン消化では、200pmolのhIL-21を含有する100μLのクエンチ試料は、200μL/分の均一濃度流速(0.1%ギ酸対CH₃CN 95対5)を使用して20℃に置かれたPoroszyme(登録商標) Immobilized Pepsin Cartridge(2.1×30mm(Applied Biosystems))上に負荷され通された。得られたペプチドはVanGuardプレカラムBEH C18 1.7μm(2.1×5mm (Waters Inc.))上で捕捉され脱塩された。続いて、弁は切り換えられ、プレカラムは分析カラムUPLC-BEH C18 1.7μm(2.1×100mm (Waters Inc.))と一直線に置かれ、ペプチドは、AQUITY UPLCシステム(Waters Inc.)から200μl/分で送り込まれる15〜35%Bの9min勾配を使用して分離された。移動相はA: 0.1%ギ酸およびB: CH₃CN中0.1%ギ酸で構成されていた。ESI MSデータならびに分離データ依存性MS/MS取得(CID)および上昇エネルギー(MS^E)実験は、Q-TOF Premier MS (Waters Inc.)を使用して陽イオンモードで得られた。ロイシンエンケファリンはロックマス (m/z 556.2771での[M+H]⁺イオン)として使用され、データは連続体モードで収集された(セットアップの追加の説明は、Andersen and Faber、Int. J. Mass Spec.、302、139〜148頁(2011)参照)。

データ解析
ペプシンペプチドは、標準CID MS/MSまたはMS^E法(Waters Inc.)を使用して別々の実験で同定された。MS^EデータはBiopharmaLynx 1.2(version017)を使用して処理された。CIDデータ依存性MS/MSアクイジションは、MassLynxソフトウェアおよび社内MASCOTデータベースを使用して解析された。

HX-MS生データファイルは連続ロックマス補正を受けた。データ解析、すなわち、重水素化ペプチドの重心決定および交換曲線のプロッティングは、プロトタイプカスタムソフトウェア(HDX browser、Waters Inc.)およびHX-Express ((Version Beta); Weis et al.、J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17、1700 (2006))を使用して実施された。すべてのデータは、分解されたペプチド同位体エンベロープのみが解析にかけられることを確認するために視覚的にも評価された。

エピトープマッピング実験
アミド水素/重水素交換(HX)は、対応する重水素化バッファー(すなわち、D₂Oで調製されたPBS、96%D₂O最終、pH7.4(未補正値))へのNNC 0114-0005またはNNC 0114-0019の存在または非存在下でのhIL-21の10倍希釈により開始された。HX反応はすべて20℃で実施され、2.4μMのmAbの非存在または存在下で4μMのhIL-21を含有し、したがって1.2倍のモル過剰なmAb結合部位を与えた。10秒から10000秒に及ぶ適切な時間間隔を開けて、50μlアリコートのHX反応は、50μlの氷冷クエンチングバッファー(1.35M TCEP)によりクエンチされ、2.5の最終pHを得た(未補正値)。NNC 0114-0005およびNNC 0114-0019エピトープを同定する生データの例は図2に示されている。

結果および考察
NNC 0114-0005のエピトープマッピング
hIL-21の一次配列の100%に及ぶ26ペプチドのHX時間経過は、10から10000秒の間NNC 0114-0005の非存在または存在下でモニターされた(図2、3、4)。しかし、ヘリックスAの中心部分である領域40〜51は急速交換するアミド水素を含有していない(図3)。したがって、HX-MSによりこの領域からエピトープ情報は得られていない。

NNC 0114-0005の存在または非存在下での初期時点(300秒未満)における観察される交換パターンは、2つの異なるグループに分けることができる。1つのグループのペプチドは、初期時点でのNNC 0114-0005の結合による影響を受けない交換パターンを示している。対照的に、hIL-21のもう1つのグループのペプチドは、NNC 0114-0005結合時の交換からの保護を示している(図3)。例えば、D₂Oとの100秒交換時、およそ2個のアミドがNNC 0114-0005結合時の領域E93〜V98における交換から保護されている(図2B、3)。NNC 0114-0005結合時に保護を示している領域は、残基M29〜D44およびK85〜S127に及ぶペプチドを包含している。しかし、それぞれのペプチド内の交換保護の相対量、NNC 0114-0005に対するエピトープならびに残基S109で始まる前方のペプチドにおけるエピトープ効果の欠如を比較することにより、エピトープは残基D33〜D44およびE93〜P108まで狭めることができる。さらに、領域I45〜N51についてはエピトープ情報が得られないために、NNC 0114-0005に対するエピトープはNNC 0114-0005のこの領域に隣接しておりNNC 0114-0005エピトープの追加の部分はI45〜N51領域にも存在する可能性がある。配列中では離れているが、D33〜D44およびE93〜P108領域はhIL-21の3D構造では接近している。

NNC 0114-0019のエピトープマッピング
hIL-21の一次配列の100%に及ぶ26ペプチドのHX時間経過は、10から10000秒の間NNC 0114-0019の非存在または存在下でモニターされた(図2、3、5)。しかし、ヘリックスAの中心部分である領域R40〜N51は急速交換するアミド水素を含有していない(図3)。したがって、HX-MSによりこの領域からエピトープ情報は得られていない。

NNC 0114-0019の存在または非存在下で観察される交換パターンは、2つの異なるグループに分けることができる。1つのグループのペプチドは、NNC 0114-0019の結合による影響を受けない交換パターンを示している。対照的に、hIL-21のもう1つのグループのペプチドは、NNC 0114-0019結合時の交換からの保護を示している(図3)。例えば、D₂Oとの100秒交換時、およそ3個のアミドがNNC 0114-0019結合時の領域Q30〜M39における交換から保護されている(図3)。NNC 0114-0019結合時に保護を示している領域は、残基M29〜D44に及ぶペプチドを包含している(図5)。それぞれのペプチド内の交換保護の相対量を比較することにより、NNC 0114-0019に対するエピトープは残基Q32〜M39、QDRHMIRMまで狭めることができる。

NNC 0114-0005は全hIL-21構造を安定化する
エピトープ効果は別として、hIL-21の一次配列の100%に及ぶ全26ペプチドのHX時間経過は、追加の極めて興味深い驚くべき特長も示した。NNC 0114-0005がhIL-21に結合すると、HX交換の後期時点、すなわち300秒より後ではhIL-21の重水素交換が著しく減少した(例えば、図3におけるR40〜N51およびF136〜S162参照)。時間経過の後期に観察される効果は、ゆっくり交換するアミド水素と関係があり、したがってタンパク質の構造的中心と関係がある。これに対して、初期の効果は表面曝露アミド水素と関係がある。したがって、エピトープ効果は初期の時点に現れ、構造的安定化効果は後期時点に交換減少として現れることになる(Garcia、Pantazatos and Villareal、Assay and Drug Dev. Tech. 2、81頁(2004); Mandell、Falick and Komives、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95、14705頁(1998); Andersen and Faber、Int. J. Mass Spec.、302、139〜148頁(2011))。小さな構造安定化効果は通常、結合部位の周辺で局所的に起こることがあるが、NNC 0114-0005がhIL-21に結合するとこのhIL-21において観察される効果は、以下のいくつかの理由により極めて注目に値する。1)図3に示されるR40〜N51およびF136〜S162は例にすぎない。構造安定化効果は全hIL-21分子のすべての部分で観察される。したがって、NNC 0114-0005がhIL-21に結合するとhIL-21のすべての領域が安定化され、したがってNNC 0114-0005エピトープから極めて遠位のすべての領域も含む。2)安定化効果の規模は図3に示されるように並外れて大きく、6個および4個のアミド水素が10000秒後にはそれぞれ領域R40〜N51およびF136〜S162において交換から保護されている。3)前記効果はNNC 0114-0005がhIL-21に結合したときのみ観察され、NNC 0114-0019がhIL-21に結合したときには見られない。NNC 0114-0019はhIL-21ヘリックスAにおいてのみ結合するが、NNC 0114-0005は、ヘリックスAの重複部分およびhIL-21ヘリックスCの一部に結合する。ヘリックスCの結合および安定化は全hIL-21分子の構造安定化に全体的な効果を有するように思われる。hIL-21のこの構造安定化は、このエピトープに結合するmAbについて観察される高い親和性を説明し、したがってhIL-21効果を中和することに対するこれらの分子の高い効率性を説明することができる。

(実施例8)
変異抗hIL-21のFab、NNCD 0114-0000-0048と複合体化したhIL-21の結晶構造
抗hIL-21ヒトモノクローナル抗体NNC 0114-0005の軽鎖残基54SerからThrへの変異形態(L:S54T)のFab断片(NNCD 0114-0000-0048)と複合体化したhIL-21の三次元構造は、X線結晶学を用いて1.95Å分解能まで解析され精密化された。結果は、hIL-21上のエピトープはプライベートhIL-21受容体鎖(IL-21Rα)に対する結合部位と広範囲に重複していることを示している。したがって、その高親和性によって、抗hIL-21 mAbは、hIL-21とIL-21Rαの結合を効率的に遮断し、したがって、その同族受容体を通じてhIL-21により媒介される生物学的効果を阻害する。

材料および方法
hIL-21(配列番号1の残基30〜162)および抗IL-21 Fab(NNCD 0114-0000-0048)はhIL-21をわずかにモル過剰にして混合され、複合体はサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製された。次に、複合体は約15mg/mlまで濃縮された。結晶は、25% w/v PEG 3350、0.1Mクエン酸、pH3.5中、1対1.5の比(沈殿液容積対タンパク質液容積)で混合して懸滴培養法で成長させた。総液滴サイズは3.0μlであった。結晶は、75%の沈殿液および25%のグリセロールを含有するクリオ液3μlを結晶を含有する液滴に移すことによりクリオ凍結のために準備され、約1分間浸漬させた。次に、結晶は液体N₂中で急速冷凍され、低温貯蔵N₂ガス流によりデータ収集の間100Kの温度に保たれた。結晶学データは、MAX-lab、Lund、SwedenのビームラインBL911-3で1.95Å分解能まで収集された。データの空間群決定、積分およびスケーリングは、XDSソフトウェアパッケージにより行われた。データの細胞パラメータは、それぞれ40.8、132.8、53.3Å、90°、106.83°および90°ならびに空間群P2₁に決定された。1.95Å分解能までのR-symは5.6%、完全性は98.6%であった。結晶は、hIL-21と複合体化したヒト抗hIL-21モノクローナル抗体NNC 0114-0005のFab断片NNC 0114-0009の複合体の結晶と高度に同形であるために(実施例1参照)、この複合体の三次元座標は、CCP4ソフトウェアパッケージのソフトウェアプログラムRefmac5を使用し拘束個別精密化(restrained individuall refinement)が続く結晶学剛体精密化(rigid-body refinemt)の最初の実行のためのインプットとして使用された。精密化モデルは、Cootソフトウェアプログラムを使用して、生成した電子密度地図、モデル補正および構築のコンピュータグラフィックス検査を受けた。変異の部位での差密度ははっきりと見え、それに従ってモデルは補正された。前記手順は、モデルにこれ以上有意義な改良を加えることができなくなるまで循環させた。データすべての最終R-およびRフリーは、それぞれ0.165および0.223であり、モデルは0.023Åの理想的結合距離からの平均平方根偏差(RMSD)を示した(表7)。

結果
軽鎖残基54、SerからThr変異抗IL-21 Fabは、hIL-21の同一エピトープへ結合することにより、ヒト抗hIL-21モノクローナル抗体NNC 0114-0005のFab断片NNC 0114-0009とほぼ同一の方法で、hIL-21分子の部位1とIL-21Rαの結合を効果的に遮断する。

CCP4プログラムスイートのソフトウェアプログラムAREAIMOLによるペアワイズ相互作用において排除された面積の計算は、結晶構造中のhIL-21/抗hIL-21(L:S54T) Fab分子複合体について、それぞれhIL-21で1313、抗IL-21で1226Å²を与えた。IL-21分子と抗IL-21 Fab間のペアワイズ相互作用において排除された平均面積は1270Å²と計算された。

hIL-21と抗hIL-21(L:S54T) Fab間の直接接触は、抗IL-21 FabとhIL-21分子間のカットオフ距離4.0Åを使用してCCP4プログラムスイートのCONTACTソフトウェアを実行することにより同定された。hIL-21/抗IL-21(L:S54T) Fab複合体結晶構造からの結果は表8に示されている。抗IL-21(L:S54T)についての得られたhIL-21エピトープは、hIL-21(配列番号1)の以下の残基Arg 34、His 35、Ile 37、Arg 38、Gln 41、Asp 44、Ile 45、Gln 48、Asn 51、Tyr 52、Asn 92、Arg 94、Ile 95、Val 98、Ser 99、Lys 101、Lys 102、Arg 105、Arg 105、Pro 107およびPro 108を含むことが分かった。

したがって、抗IL-21 hIL-21(L:S54T)エピトープはヘリックスAおよびCの残基を含む。さらに、いくつかの接触残基(Arg105からPro108)がヘリックスCに先行するループセグメントにおいて同定された。これらの接触面積は、hIL-21上のIL-21Rαに対する結合部位として決定された面積とよく一致していた(実施例2)。

hIL-21に対する抗IL-21(L:S54T)パラトープには、軽(L)鎖の残基Glu 1、Gln 27、Ser 28、Val 29、Ser 30、Ser 32、Tyr 33、Gln 91、Tyr 92、Gly 93、Ser 94およびTrp 95(表8)、ならびに重(H)鎖の残基Trp 47、Trp 52、Ser 56、Asp 57、Tyr 59、Tyr 60、Asp 101、Ser 102、Ser 103、Asp 104,、Trp 105、Tyr 106、Gly 107、Asp 108、Tyr 109およびPhe 111(表8)が含まれていた。

(実施例9)
変異抗hIL-21のFab、NNCD 0114-0000-0050と複合体化したhIL-21の結晶構造
aIL-21ヒトモノクローナル抗体NNC 0114-0005の軽鎖残基57 ThrからSerへの変異形態(L:T57S)のFab断片(NNCD 0114-0000-0050)と複合体化したhIL-21の三次元構造は、X線結晶学を用いて1.77Å分解能まで解析され精密化された。結果は、hIL-21上のエピトープがプライベートhIL-21受容体鎖(IL-21Rα)に対する結合部位と広範囲に重複していることを示している。したがって、その高親和性によって、抗IL-21 mAbはhIL-21とIL-21Rαの結合を効率的に遮断し、したがって、その同族受容体を通じてhIL-21により媒介される生物学的効果を阻害する。

材料および方法
hIL-21(配列番号1の残基30〜162)および抗IL-21 Fab(NNCD 0114-0000- 0050)はhIL-21をわずかにモル過剰にして混合され、複合体はサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製された。次に、複合体は約12mg/mlまで濃縮された。結晶は、25% w/v PEG 3350、0.1Mクエン酸、pH3.5中、1対2の比(沈殿液容積対タンパク質液容積)で混合して懸滴培養法で成長させた。総液滴サイズは3.0μlであった。結晶は、75%の沈殿液および25%のグリセロールを含有するクリオ液3μlを結晶を含有する液滴に移すことによりクリオ凍結のために準備され、約1分間浸漬させた。次に、結晶は液体N₂中で急速冷凍され、低温貯蔵N₂ガス流によりデータ収集の間100Kの温度に保たれた。結晶学データは、MAX-lab、Lund、SwedenのビームラインBL911-2で1.77Å分解能まで収集された。データの空間群決定、積分およびスケーリングは、XDSソフトウェアパッケージにより行われた。データの細胞パラメータは、それぞれ40.9、133.0、53.4Å、90°、106.90°および90°ならびに空間群P2₁に決定された。1.77Å分解能までのR-symは5.3%、完全性は97.8%であった。結晶は、hIL-21と複合体化したヒト抗hIL-21モノクローナル抗体NNC 0114-0005のFab断片NNC 0114-0009の複合体の結晶と高度に同形であるために(実施例1参照)、この複合体の三次元座標は、CCP4ソフトウェアパッケージのソフトウェアプログラムRefmac5を使用し拘束個別精密化が続く結晶学剛体精密化の最初の実行のためのインプットとして使用された。精密化モデルは、Cootソフトウェアプログラムを使用して、生成した電子密度地図、モデル補正および構築のコンピュータグラフィックス検査を受けた。変異の部位での差密度ははっきりと見え、それに従ってモデルは補正された。前記手順は、モデルにこれ以上有意義な改良を加えることができなくなるまで循環させた。データすべての最終R-およびRフリーは、それぞれ0.180および0.230であり、モデルは0.023Åの理想的結合距離からの平均平方根偏差(RMSD)を示した(表9)。

結果
軽鎖残基57、ThrからSer変異抗IL-21 Fabは、hIL-21の同一エピトープへ結合することにより、ヒト抗IL-21モノクローナル抗体NNC 0114-0005のFab断片NNC 0114-0009とほぼ同一の方法で、hIL-21分子の部位1とIL-21Rαの結合を効果的に遮断する。

CCP4プログラムスイートのソフトウェアプログラムAREAIMOLによるペアワイズ相互作用において排除された面積の計算は、結晶構造中のhIL-21/抗IL-21(L:T57S) Fab分子複合体について、それぞれhIL-21で1311、抗IL-21で1216Å²を与えた。IL-21分子と抗IL-21 Fab間のペアワイズ相互作用において排除された平均面積は1263Å²と計算された。

hIL-21と抗IL-21(L:T57S) Fab間の直接接触は、抗IL-21 FabとhIL-21分子間のカットオフ距離4.0Åを使用してCCP4プログラムスイートのCONTACTソフトウェアを実行することにより同定された。hIL-21/抗IL-21(L:T57S) Fab複合体結晶構造からの結果は表10に示されている。抗IL-21(L:T57S)についての得られたhIL-21エピトープは、hIL-21(配列番号1)の以下の残基Arg 34、Ile 37、Arg 38、Gln 41、Asp 44、Ile 45、Asp 47、Gln 48、Asn 51、Tyr 52、Asn 92、Arg 94、Ile 95、Val 98、Ser 99、Lys 101、Lys 102、Arg 105、Lys 106、Pro 107およびPro 108を含むことが分かった。

したがって、抗IL-21 hIL-21(L:T57S)エピトープはヘリックスAおよびCの残基を含む。さらに、いくつかの接触残基(Arg105からPro108)がヘリックスCに先行するループセグメントにおいて同定された。これらの接触面積は、hIL-21上のIL-21Rαに対する結合部位として決定された面積とよく一致していた(実施例2)。

hIL-21に対する抗IL-21(L:T57S)パラトープには、軽(L)鎖の残基Glu 1、Gln 27、Ser 28、Val 29、Ser 30、Ser 32、Tyr 33、Gln 91、Tyr 92、Gly 93、Ser 94およびTrp 95(表10)、ならびに重(H)鎖の残基Trp 47、Trp 52、Ser 56、Asp 57、Tyr 59、Tyr 60、Asp 101、Ser 102、Ser 103、Asp 104、Trp 105、Tyr 106、Gly 107、Asp 108、Tyr 109およびPhe 111(表9)が含まれていた。

(実施例10)
変異抗IL-21のFab、NNCD 0114-0000-0051と複合体化したhIL-21の結晶構造
抗IL-21ヒトモノクローナル抗体NNC 0114-0005の重鎖残基31 SerからAlaへの変異形態(H:S31A)のFab断片(NNCD 0114-0000-0051)と複合体化したhIL-21の三次元構造は、X線結晶学を用いて1.88Å分解能まで解析され精密化された。結果は、hIL-21上のエピトープがプライベートhIL-21受容体鎖(IL-21Rα)に対する結合部位と広範囲に重複していることを示している。したがって、その高親和性によって、抗IL-21 mAbはhIL-21とIL-21Rαの結合を効率的に遮断し、したがって、その同族受容体を通じてhIL-21により媒介される生物学的効果を阻害する。

材料および方法
hIL-21(配列番号1の残基30〜162)および抗IL-21 Fab(NNCD 0114-0000-0051)はhIL-21をわずかにモル過剰にして混合され、複合体はサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製された。次に、複合体は約16mg/mlまで濃縮された。結晶は、25% w/v PEG 3350、0.1Mクエン酸、pH3.5中、1対2の比(沈殿液容積対タンパク質液容積)で混合して懸滴培養法で成長させた。総液滴サイズは3.0μlであった。結晶は、75%の沈殿液および25%のグリセロールを含有するクリオ液3μlを結晶を含有する液滴に移すことによりクリオ凍結のために準備され、約1分間浸漬させた。次に、結晶は液体N₂中で急速冷凍され、低温貯蔵N₂ガス流によりデータ収集の間100Kの温度に保たれた。結晶学データは、MAX-lab、Lund、SwedenのビームラインBL911-3で1.88Å分解能まで収集された。データの空間群決定、積分およびスケーリングは、XDSソフトウェアパッケージにより行われた。データの細胞パラメータは、それぞれ41.0、133.1、53.4Å、90°、107.00°および90°ならびに空間群P2₁に決定された。1.88Å分解能までのR-symは6.2%、完全性は96.2%であった。結晶は、hIL-21と複合体化したヒト抗IL-21モノクローナル抗体NNC 0114-0005のFab断片NNC 0114-0009の複合体の結晶と高度に同形であるために(実施例1参照)、この複合体の三次元座標は、CCP4ソフトウェアパッケージのソフトウェアプログラムRefmac5を使用し拘束個別精密化が続く結晶学剛体精密化の最初の実行のためのインプットとして使用された。精密化モデルは、Cootソフトウェアプログラムを使用して、生成した電子密度地図、モデル補正および構築のコンピュータグラフィックス検査を受けた。変異の部位での差密度ははっきりと見え、それに従ってモデルは補正された。前記手順は、モデルにこれ以上有意義な改良を加えることができなくなるまで循環させた。データすべての最終R-およびRフリーは、それぞれ0.169および0.222であり、モデルは0.022Åの理想的結合距離からの平均平方根偏差(RMSD)を示した(表11)。

結果
重鎖残基31、SerからAla変異抗IL-21 Fabは、hIL-21上の同一エピトープへ結合することにより、ヒト抗IL-21モノクローナル抗体NNC 0114-0005の抗IL-21 Fab断片NNC 0114-0009とほぼ同一の方法で、hIL-21分子の部位1とIL-21Rαの結合を効果的に遮断する。

CCP4プログラムスイートのソフトウェアプログラムAREAIMOLによるペアワイズ相互作用において排除された面積の計算は、結晶構造中のhIL-21/抗IL-21(H:S31A) Fab分子複合体について、それぞれhIL-21で1305、抗IL-21で1222Å²を与えた。IL-21分子と抗IL-21 Fab間のペアワイズ相互作用において排除された平均面積は1264Å²と計算された。

hIL-21と抗IL-21(H:S31A) Fab間の直接接触は、抗IL-21 FabとhIL-21分子間のカットオフ距離4.0Åを使用してCCP4プログラムスイート(4)のCONTACTソフトウェアを実行することにより同定された。hIL-21/抗IL-21(H:S31A) Fab複合体結晶構造からの結果は表12に示されている。抗IL-21(H:S31A)についての得られたhIL-21エピトープは、hIL-21(配列番号1)の以下の残基[Ref9]
を含むことが分かった。

したがって、抗IL-21 hIL-21(H:S31A)エピトープはヘリックスAおよびCの残基を含む。さらに、いくつかの接触残基(Arg105からPro108)がヘリックスCに先行するループセグメントにおいて同定された。これらの接触面積は、hIL-21上のIL-21Rαに対する結合部位として決定された面積とよく一致していた(実施例2)。

hIL-21に対する抗IL-21(H:S31A)パラトープには、軽(L)鎖の残基Glu 1、Gln 27、Ser 28、Val 29、Ser 30、Ser 32、Tyr 33、Gln 91、Tyr 92、Gly 93、Ser 94およびTrp 95(表12)、ならびに重(H)鎖の残基Trp 47、Trp 52、Ser 56、Asp 57、Tyr 59、Tyr 60、Asp 99、Asp 101、Ser 102、Ser 103、Asp 104、Trp 105、Tyr 106、Gly 107、Asp 108、Tyr 109およびPhe 111(表12)が含まれていた。

それぞれIL-21:Fab断片0114-0051、0048および0050の複合体の共結晶からX線結晶学により決定されたmAb 0114-0038、0042および0044に対する確定エピトープは、IL-21に対するmAb 0114-0005に対する確定エピトープに類似している。

(実施例11)
表面プラズモン共鳴(SPR)によるhIL-21に対する抗hIL-21抗体NNC 0114-0005、NNC 0114-0038、NNC 0114-0042およびNNC 0114-0044についての相互作用速度論の比較
結合研究はすべて、表面プラズモン共鳴を通じて分子相互作用をリアルタイムで測定するBiacore T200機器上で実施された。実験は25℃で実行され、試料は試料コンパートメントに10℃で保存された。Biacoreにより報告されるシグナル(RU、応答単位)は、4つの連続フローセルにおける個々のセンサーチップ表面上の質量に直接相関している。

BiacoreヒトFc捕捉キットの抗ヒトFcモノクローナルは、製造業者の使用説明書に従ってCM4センサーチップのフローセル上に固定化された。捕捉抗体の最終固定化レベルは、1つの実験でおよそ2,000RUであった。ヒト抗hIL-21抗体(1)NNCD 0114-0000-0005 (2) NNCD-0114-0000-0038 抗hIL-21ヒトモノクローナル抗体NNC 0114-0005の重鎖残基31 SerからAlaへの変異形態(H:S31A) (3)NNC-0114-0042 抗hIL-21ヒトモノクローナル抗体NNC 0114-0005の軽鎖残基54 SerからTへの変異形態(L:S53T)または(4)NNC-0114-0044 抗hIL-21ヒトモノクローナル抗体NNC 0114-0005の軽鎖残基57 ThrからSへの変異形態(L:T57S)の捕捉は、それぞれの抗体をランニングバッファー(10mM Hepes 0.3M NaCl、5mM CaCl₂、0.05%界面活性剤P20、pH8.0、1mg/ml BSAを含有する)中に0.06μg/mlまで希釈することにより行われ、フローセル2〜4のうちの1つに180秒間10μl/分で注入され、抗Fc抗体のみを固定化してフローセル1に参照面を作製した。これにより、典型的には、およそ20RUの試験抗体の最終捕捉レベルおよび3〜5RUの分析物のRmax値が生じた。hIL-21タンパク質の結合は、分析物をすべてのフローセル上に注入して参照フローセルとの結合に対する異なる捕捉された抗IL-21抗体との結合の比較分析を可能にすることにより行われた。hIL-21タンパク質はランニングバッファー中に1対3から0.008〜2nMまで段階的に希釈され、210秒間100μl/分で注入され、600または14000秒間解離させておいた。CM4表面は、50μl/分での3M MgCl₂の2回の注入を介した分析物のそれぞれの注入サイクル後に再生された。この再生工程により、固定化された捕捉抗体表面から抗IL-21抗体および結合したいかなるIL-21も取り除かれ、それに続く次の相互作用試料対の結合が可能になった。再生手順では、チップ表面から直接固定化された抗Fc捕捉抗体は取り除かれなかった。

ka(会合速度)、kd(解離速度)およびKD(平衡解離定数)などの速度論データを受け取るために、Biacore T200評価ソフトウェア1.0を使用してデータ解析が実施された。参照対照表面との有意な非特異的結合は観察されなかった。結合曲線はダブルリファレンシング(double referencing)(参照表面シグナルおよび捕捉された抗IL-21抗体上へのブランクバッファー注入の減算)により処理された。これにより、試料注入中の機器ノイズ、バルクシフトおよびドリフトの補正が可能になった。

ヒトIL-21は、1pM以下の平均KD、1E-5s^-1の解離速度および3〜4E+7(Ms)^-1の会合速度でNNCD 0114-0000-0005、0038、0042および0044に結合する。結果は2つの異なる実験に基づいている。パラメータkaおよびkdの相対標準誤差は、個々の実験では0.2〜2.1%であった。

これらのデータは、試験された4つの異なる抗体がヒトIL-21に類似する結合特性を共有していることを明らかに示している。

(実施例12)
抗hIL-21抗体NNC 0114-0005、NNC 0114-0038、NNC 0114-0039およびNNC 0114-0040、NNC 0114-0041およびNNC 0114-0042、NNC 0114-0043、NNC 0114-0044のB細胞増殖および成熟アッセイ
7種の抗IL-21抗体の中和力が比較された。抗体はすべて参照抗体0114-0000-0005に基づいていたが、抗体はそれぞれが点変異を含有して、1個のアミノ酸が異なっていた(実施例3における表6)。抗体は、B細胞増殖アッセイにおいて組換えヒトIL-21を中和するその能力について試験された。抗IL-21 0114-0000-0006および0114-0000-0019はそれぞれ中和および部分的中和対照として含まれた。

mAb 0114-0000-0005およびmAb 0114-0000-0006は組換え的に産生される抗体であり、アミノ酸配列は同一であるが、異なるCHO細胞系統において産生される。mAb 0114-0000-0005は安定したCHO DXB-11細胞系統において産生され、mAb 0114-0000-0006は安定したCHO-K1SV細胞系統において産生された。

ヒトB細胞は4件の個々のドナーから単離された。B細胞は、96ウェルU底組織培養プレートにおいてウェルあたり50,000細胞で蒔かれた。細胞は、0.1μg/mlの抗CD-40(R&D Systems)、50ng/ml(3.21nM)の組換えヒトIL-21で処理された。試験された抗体の数により、すべての抗体を同一ドナーから単離された細胞で試験することはできなかった。したがって、抗体-0038、-0039、-0040および-0041はドナー1および3由来のB細胞で試験され、抗体-0042、-0043および-0044はドナー2および4由来のB細胞で試験された。4件のドナーはすべてドナー変動に対する対照として-0006および-0015で試験された。抗体0114-0000-0019はドナー1および3で試験された。細胞は、加湿インキュベーターにおいて37℃、5% CO₂で3日間インキュベートされた。抗体は滴定され、3日後細胞は最後の20時間、1μCi/ウェルの[³H]-チミジン(Perkin Elmer Life Sciences)でパルスされた。細胞はUniFilter-96 GF/Cフィルタープレート(Packard Instruments、Perkin Elmer)上で回収され、[³H]チミジン取り込み量がTopCount NXT (Perkin Elmer)を使用して定量された。50%増殖を減少させるために必要な抗IL-21 mAbの阻害濃度(IC₅₀)は、GraphPad Prism v5.0ソフトウェア(GraphPad Inc)およびS字型用量応答(可変傾斜、4パラメータ)式を使用して計算された。

7種の変異抗体についてのIC₅₀はすべて、低ナノモル範囲のIC₅₀値に極めて類似しており、NNC-0114-0005についてのIC₅₀に匹敵し得ることが分かった。

(実施例13)
抗hIL-21抗体NNC 0114-0006、NNC 0114-0038、NNC 0114-0039およびNNC 0114-0040、NNC 0114-0041およびNNC 0114-0042、NNC 0114-0043、NNC 0114-0044のNK-92アッセイにおける生理活性
抗体はNK細胞ベースのバイオアッセイにおいて組換えヒトIL-21を中和するその能力について試験された。抗IL-21 mAb(NNC 0114-0000-0006)は参照物質として含まれた。

NK細胞ベースのバイオアッセイは、抗IL-21抗体の生理活性のインビトロ決定のために使用された。NK-92細胞系統(ATCC/LGC Promochem)は末梢血単核球由来のヒト懸濁リンパ芽球である。細胞はIL-21受容体を内因的に発現し、細胞増殖をIL-2またはIL-21に依存している。抗IL-21によるIL-21の中和は、alamarBlue(登録商標)の添加を介して成長阻害により測定される(細胞生存率指標)。

維持中、NK-92細胞はIL-2の添加により増殖状態を保たれた。アッセイでは、NK-92細胞は洗浄され、1.6×10⁵細胞/mlの密度(ウェルあたり12,800細胞に等しい)で96ウェルプレート(Matrix Technology)に蒔かれた。細胞は5431pg/mlの一定濃度で組換えヒトIL-21で刺激された。0〜12,800pg/mlに及ぶアッセイ培地中で調製された抗IL-21抗体の段階希釈物は、96ウェルプレートの3つの異なる位置に3通り添加された。細胞は加湿インキュベーターにおいて37℃、5% CO₂で3日間インキュベートされた。3日目に10μlのalamarBlue(登録商標)(Biosource)が添加され、インキュベーションの5時間後にSynergy機器(Bio Tek)上で蛍光が測定された。

データはBioCalc(MicroLex)において、4パラメータロジスティック曲線モデルで解析された。結果は、それぞれが3組の決定を有する2つの独立した設定に基づいて参照物質(0114-0000-0006)の百分率(%)として与えられる。

7種の変異抗体について測定された生理活性はすべてが、参照物質(NNC 0114-0000-0006)の生理活性に対して比較された場合、極めて類似していることが分かった。

(実施例14)
抗IL-21 mAb 0006およびFab断片の一過性発現のための発現ベクターの作製
エピトープマッピングおよび結合解析を可能にするため、Yves Durocher (Durocher et al. Nucleic Acid Research、2002年)により開発されたHEK293-6E EBNAベースの発現系におけるmAb 0006変異体の一過性発現のために一連のCMVプロモーターベースの発現ベクター(pTTベクター)が作製された。CMVプロモーターに加えて、ベクターはpMB1起点、EBV起点およびAmp耐性遺伝子を含有している。

mAb 0006 VHドメインに対応する領域は、標準PCRおよび制限ベースのクローニング法を使用して、元のmAb 0005発現ベクターから、操作されたヒトIgG1.1(5つのアミノ酸置換: L234A、L235E、G237A、A330S、P331Sを含有する)CHドメインの配列を含有する線形化pTTベースのベクターにクローニングされた。ベクター構築物は、選択のために大腸菌(E.coli)内に形質転換された。最終構築物の配列はDNA塩基配列決定により確認された。

pTTベースのベクターも、mAb 0006 Fab断片の一過性発現のために作製された。aa残基1〜253に対応する領域は、遺伝子ベクター特異的プライマーならびにHCヒンジ領域に成熟前停止コドンおよびクローニング目的で末端制限部位アダプターを含有するプライマーを用いてmAb 0006発現ベクターからPCR増幅された。PCR作製インサートは、制限ベースのクローニングにより線形化pTTベクターにクローニングされ、選択のために大腸菌内に形質転換された。最終構築物の配列はDNA塩基配列決定により確認された。

mAb 0006 VLドメインに対応する領域は、標準PCRおよび制限ベースのクローニング法を使用して、元のmAb 0005発現ベクターから、ヒトカッパCLドメインの配列を含有する線形化pTTベースのベクターにクローニングされた。ベクター構築物は、選択のために大腸菌内に形質転換された。最終構築物の配列はDNA塩基配列決定により確認された。

mAb変異体の組換え発現
Fab断片を含むmAb 0006の変異体は、下に収載された遺伝子抗体発現プロトコールに従って、HEK293-6E細胞へのpTTベースのHCおよびLCベクターの同時トランスフェクトにより発現された。

細胞維持
HEK293-6E細胞は、25μg/mlのジェネテシン(Gibco)、0.1% v/vの界面活性剤PluronicF-68(Gibco)および1% v/vペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco)を補充されたFreeStyle(商標)293発現培地(Gibco)において懸濁状態で増殖された。細胞は、振盪インキュベーターにおいて37℃、8% CO₂および125rpmでErlenmeyer振盪フラスコで培養され、細胞密度0.1〜1.5×10⁶細胞/mlで維持された。

DNAトランスフェクション
トランスフェクションのために使用された培養物の細胞密度は0.9〜2.0×10⁶細胞/mlであった。
ml細胞培養物あたり0.5μgのLCベクターDNA+0.5μgのHCベクターDNAの混合物が使用された。
DNAはOpti-MEM培地(Gibco)30μl培地/μg DNAに希釈され、混合され、室温(23〜25℃)で5分間インキュベートされた。
293Fectin(商標)(Invitrogen)はμg DNAあたり1μlの濃度でトランスフェクション試薬として使用された。
293Fectin(商標)は30×Opti-MEM培地(Gibco)に希釈され、混合され、室温(23〜25℃)で5分間インキュベートされた。
DNAおよび293Fectin溶液は混合され、室温(23〜25℃)で25分間インキュベートさせておいた。
次にDNA-293Fectin混合物は細胞培養物に直接添加された。
トランスフェクトされた細胞培養物は、37℃、8% CO₂および125rpmで振盪インキュベーターに移された。
トランスフェクションの5日後、細胞培養物上清は遠心分離により回収され、続いて0.22μm PESフィルター(Corning)を通して濾過された。
抗体産生の定量的解析は、ForteBio Octetシステムを使用して、直接澄ませた細胞培養物上清にバイオレイヤー干渉法(biolayer interferometry)によりまたはSDS-PAGE解析により実施された。

(実施例15)
抗IL-21 mAb 0006の部位特異的変異誘発
抗IL-21 mAb 0006の変異体を作製するために部位特異的変異誘発が実施された。変異は、2つの異なる方法により、mAb 0006 HCまたはLCに導入された。
1)Stratagene社製のQuickChange(登録商標)部位特異的変異誘発キットおよび特異的変異原性プライマーを使用して点変異を導入した。キットは製造業者のプロトコールに従って使用された。
2)変異原性プライマーを用いた標準2ステップオーバーラッピングPCRも代替案として使用して点変異を導入した。

実施例14に記載されるmAb 0006 LCおよびHCに対するpTTベースの発現プラスミドは、変異誘発のための鋳型として使用された。最終構築物すべての配列はDNA塩基配列決定により確認された。

HC変異体S31Aの切断型の発現のための(Fab断片発現のための)プラスミドは、WT Fab発現ベクター中のVHドメイン(前述)をS31A変異体VHドメインで置き換えることにより作製された。ドメインスワッピングは、標準制限ベースのクローニング法により行われた。ベクター構築物は選択のために大腸菌中に形質転換された。最終構築物の配列はDNA塩基配列決定により確認された。

mAb 0006変異体を発現するために、HEK293-6E細胞は、LCプラスミド(WTまたは変異体)およびHCプラスミド(WTまたは変異体)を同時トランスフェクトされた。mAb 0006 Fab断片を発現するために、HEK293-6E細胞は、LCプラスミド(WTまたは変異体)および切断型HCプラスミド(WTまたは変異体)を同時トランスフェクトされた。LC:HCの組合せは下の表17に収載されている。

mAbおよびFab断片変異体の精製
mAb 0006変異体は、GE Healthcare社製のMabSelectSuRe樹脂を使用する標準親和性クロマトグラフィーにより精製された。精製された抗体は、PBSバッファーpH7.2にバッファー交換された。

Fab断片は、GE Healthcare社製のKappaSelect樹脂を使用する標準親和性クロマトグラフィーにより精製された。精製されたFab断片は、PBSバッファーpH7.2にバッファー交換された。

品質評価および濃度決定はSEC-HPLCにより行われた。

(実施例16)
hIL-21上のmAb 0114-0005および0114-0038、-0039、-0040、-0041および-0042のHX-MSによるエピトープマッピング
材料
使用されたタンパク質バッチは以下の通りである:
hIL-21: 残基30〜162に対応し残基29としてN末端メチオニンを有する、ヒト組換えIL-21
mAb: 0114-0005
0005のmAb変異体: 0114-0038、-0039、-0040、-0041および-0042(変異体の説明については実施例15の表17参照)

タンパク質はすべて、実験前にPBS pH7.4中にバッファー交換された。

方法: HX-MS実験
計測手段およびデータ記録
HX実験は、LeapShellソフトウェア(Leap Technologies Inc.)により操作されるLeapロボット(H/D-x PAL; Leap Technologies Inc.)により自動化され、前記ロボットは重水素交換反応の開始、反応時間制御、クエンチ反応、UPLCシステム上への注入および消化時間制御を実行した。Leapロボットは、それぞれバッファー貯蔵およびHX反応のために20℃に維持されたならびにタンパク質およびクエンチ溶液の貯蔵のために2℃に維持された2つの温度制御されたスタックを備えていた。Leapロボットは、プレおよび分析カラムならびにLCチュービングおよび切換弁を1℃で保持しておく冷却Trio VS装置(Leap Technologies Inc.)をさらに含んでいた。Trio VS装置の切換弁はHPLCからMicrobore UHPLCスイッチ弁(Cheminert、VICI AG)にグレードアップされていた。インラインペプシン消化では、200pmolのhIL-21を含有する100μLのクエンチ試料が、200μL/分の均一濃度流速(0.1%ギ酸対CH₃CN 95対5)を使用して20℃に置かれたPoroszyme(登録商標) Immobilized Pepsin Cartridge(2.1×30mm(Applied Biosystems))上に負荷され通された。得られたペプチドはVanGuardプレカラムBEH C18 1.7μm(2.1×5mm (Waters Inc.))上で捕捉され脱塩された。続いて、弁は切り換えられ、プレカラムは分析カラムUPLC-BEH C18 1.7μm(2.1×100mm (Waters Inc.))と一直線に置かれ、ペプチドはAQUITY UPLCシステム(Waters Inc.)から200μl/分で送り込まれる15〜35%Bの9min勾配を使用して分離された。移動相はA: 0.1%ギ酸およびB: CH₃CN中0.1%ギ酸で構成されていた。ESI MSデータならびに分離データ依存性MS/MSアクイジション(CID)および上昇エネルギー(MS^E)実験は、Q-TOF Premier MS (Waters Inc.)を使用して陽イオンモードで得られた。ロイシンエンケファリンはロックマス(m/z 556.2771での[M+H]⁺イオン)として使用され、データは連続体モードで収集された(セットアップの追加の説明は、Andersen and Faber、Int. J. Mass Spec.、302、139〜148頁(2011)参照)。

HX-MS生データファイルはDynamXソフトウェア(Waters Inc.)において処理された。DynamXはロックマス補正および重水素化取り込み決定、すなわち重水素ペプチドの中心決定を実施する。

エピトープマッピング実験
アミド水素/重水素交換(HX)は、対応する重水素化バッファー(すなわち、D₂Oで調製されたPBS、96%D₂O最終、pH7.4(未補正値))への0114-0005またはNNC 0114-0038、-0039、-0040、-0041もしくは-0042の存在または非存在下でのhIL-21の16倍希釈により開始された。HX反応はすべて20℃で実施され、2.4μMのmAbの非存在または存在下で4μMのhIL-21を含有し、したがって1.2倍のモル過剰なmAb結合部位を与えた。10秒から28800秒に及ぶ適切な時間間隔を開けて、50μlアリコートのHX反応は、50μlの氷冷クエンチングバッファー(1.35M TCEP)によりクエンチされ、2.5の最終pHを得た(未補正値)。

結果および考察
0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041および-0042のエピトープマッピング
hIL-21上のmAb 0005のエピトープマッピングは実施例7において既に記載されている。しかし、mAb 0005は参照のために本実験にも含まれた。

hIL-21の一次配列の91%に及ぶ29ペプチドのHX時間経過は、10から28800秒の間0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041または-0042の非存在または存在下でモニターされた。しかし、ヘリックスAの中心部分である領域40〜51は急速交換するアミド水素を含有していない(図6)。したがって、HX-MSによりこの領域からエピトープ情報は得られていない。

エピトープマッピング
0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041または-0042の存在または非存在下での初期時点(300秒未満)における観察される交換パターンは、2つの異なるグループに分けることができる。1つのグループのペプチドは、初期時点でのこれらのmAbの結合による影響を受けない交換パターンを示している。対照的に、hIL-21のもう1つのグループのペプチドは、0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041または-0042結合時の交換からの保護を示している(図6および7)。例えば、D₂Oとの100秒交換時、およそ2個のアミドが0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041または-0042 mAbのいずれかの結合時、領域E93〜V98における交換から保護されている(図6)。興味深いことに、同一グループのhIL-21由来ペプチドはこれらのmAbの結合により影響を受け、したがって0114-0038、-0039、-0040、-0041および-0042に対するエピトープは、実施例7において決定された0114-0005に対するエピトープと同一であると思われる。

0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041および-0042は全hIL-21構造を安定化させる
エピトープ効果は別として、hIL-21の一次配列の91%に及ぶ全29ペプチドのHX時間経過は、追加の極めて興味深い驚くべき特長も示した。0114-0005または-0038、-0039、-0040、-0041および-0042 mAbのいずれかがhIL-21に結合すると、HX交換の後期時点、すなわち300秒より後ではhIL-21の重水素交換が著しく減少した(例えば、図6におけるI45〜N51およびE138〜S162参照)。時間経過の後期に観察される効果は、ゆっくり交換するアミド水素と関係があり、したがってタンパク質の構造的核心と関係がある。対照的に、初期の効果は表面曝露アミド水素と関係がある。したがって、エピトープ効果は初期時点に現れ、構造的安定化効果は後期時点における交換減少として現れることになる(Garcia、Pantazatos and Villareal、Assay and Drug Dev. Tech. 2、81頁(2004); Mandell、Falick and Komives、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95、14705頁(1998); Andersen and Faber、Int. J. Mass Spec.、302、139〜148頁(2011))。小さな構造安定化効果は通常、結合部位の周辺で局所的に起こることがあるが、0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041または-0042がhIL-21に結合するとこのhIL-21において観察される効果は極めて注目に値する。図6に示されるI45〜N51およびE138〜S162は例にすぎない。構造安定化効果は全hIL-21分子のすべての部分で観察される。したがって、0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041または-0042がhIL-21に結合するとhIL-21のすべての領域が安定化され、したがってエピトープから極めて遠位のすべての領域も含む。さらに、安定化効果の規模は図6に示されるように並外れて大きく、2個および3個のアミド水素が28800秒後にはそれぞれ領域I45〜N51およびE138〜S162において交換から保護されている。

結論
0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041または-0042のどれかが結合すると、hIL-21のすべての領域が類似の応答を示した。同一グループのペプチドは初期時点においてmAb結合により影響を受け、したがって0114-0038、-0039、-0040、-0041および-0042に対するエピトープは実施例7において決定された0114-0005に対するエピトープと同一であると思われる。さらに、hIL-21のすべての領域はいずれかのmAbが結合すると構造的安定化効果を示し、したがって0114-0038、-0039、-0040、-0041および-0042はすべてが0114-0005に類似してhIL-21を安定化する。

略語
Aa: アミノ酸
mAb: モノクローナル抗体
HC: 重鎖
LC: 軽鎖
VH: 可変ドメイン-重鎖
VL: 可変ドメイン-軽鎖
CH: 定常領域-重鎖
CL: 定常領域-軽鎖
PCR: ポリメラーゼ連鎖反応
WT: 野生型

(参考文献)

上記の明細書中で言及されるすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれている。本発明の記載された態様および実施形態の様々な修正形態および変形形態が、本発明の範囲から逸脱することなく当業者には明らかとなる。

Claims

IL-21上の不連続なエピトープに結合するリガンドであって、前記エピトープが、配列番号1に示されているIL-21のアミノ酸I37〜Y52の少なくとも1つ、およびアミノ酸N92〜P108の少なくとも1つを含み、ただし、(i)天然に存在するIL-21Rα(配列番号14)、(ii)軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号10および配列番号11に示されているモノクローナル抗体NNC 0114-0005、ならびに(iii)軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号12および配列番号13に示されているモノクローナル抗体NNC 0114-0015ではないリガンド。
配列番号1に示されているIL-21のアミノ酸I37〜Y52およびN92〜P108を含むエピトープに結合する、請求項1に記載のリガンド。
抗体である、請求項1から2のいずれか一項に記載のリガンド。
配列番号10に示されているCDR1、CDR2、またはCDR3の少なくとも1つを含む軽鎖、および配列番号11に示されているCDR1、CDR2、またはCDR3の少なくとも1つを含む重鎖を含む、請求項3に記載の抗体。
配列番号10に示されているCDR1およびCDR3の少なくとも1つを含む軽鎖、ならびに配列番号11に示されているCDR2およびCDR3の少なくとも1つを含む重鎖を含む、請求項4に記載の抗体。
IL-21とIL-21Rαの間の結合面でIL-21に結合するリガンドであって、配列番号1に示されているIL-21のアミノ酸配列におけるR34、R38、Q41、R105、およびK102の少なくとも1つを含むエピトープに結合し、ただし、(i)天然に存在するIL-21Rα(配列番号14)、(ii)軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号10および配列番号11に示されているモノクローナル抗体NNC 0114-0005、ならびに(iii)軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号12および配列番号13に示されているモノクローナル抗体NNC 0114-0015ではないリガンド。
配列番号1に示されているIL-21の配列におけるR34、R38、Q41、R105、およびK102に結合する、請求項6に記載のリガンド。
IL-21とIL-21Rαの結合に干渉する、請求項1から7のいずれか一項に記載のリガンド。
ヒトIL-21とリガンドの相互作用のKDが10^-12(M)以下である、請求項1から8のいずれか一項に記載のリガンド。
軽鎖および重鎖がそれぞれ配列番号10および配列番号11に示されているモノクローナル抗体NNC 0114-0005の変異体である抗体であり、配列番号10および/または配列番号11のCDR配列内に1つまたは複数の変異を含み、前記変異が、CDR H1 S31A、CDR H2 Y53F、CDR H2 A61S、CDR H2 S63T、CDR H2S63A、CDR H2 K65R、CDR L1 R24K、CDR L1 S26T、CDR L1 S31T、CDR L1 S31A、CDR L2 S53T、CDR L2 S52A、CDR L2 S54A、CDR L2 S54T、およびCDR L2 R55Kからなるリストの1つまたは複数から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載のリガンド。
抗体であり、前記抗体が、配列番号10に示されているCDR3アミノ酸配列、および配列番号11に示されているCDR3アミノ酸配列を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載のリガンド。
抗体であり、ヒトIL-21と前記抗体の相互作用のKDが10^-12(M)以下であり、前記抗体が、配列番号1に示されているIL-21の配列におけるR34、R38、Q41、R105、およびK102に結合し、前記抗体が、IL-21Rとの結合についてIL-21と競合する、請求項1から11のいずれか一項に記載のリガンド。
請求項1から12のいずれか一項に記載のリガンド、および任意で、1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
免疫障害を治療するための、請求項1から12のいずれか一項に記載のリガンドまたは請求項13に記載の医薬組成物の使用。
免疫障害を治療する方法であって、請求項1から12のいずれか一項に記載のリガンドまたは請求項13に記載の医薬組成物の適切な用量を、それを必要としている者に投与する工程を含む方法。
免疫障害を治療する方法であって、請求項1から12のいずれか一項に記載のリガンドまたは請求項13に記載の医薬組成物の適切な用量を、それを必要としている者に投与する工程を含み、前記リガンドが、自己免疫疾患の治療においてB細胞分化を低下させるために用いられる方法。