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KR20170042758A - 안티센스 유전자 조절을 위한 생체에 적합한 무한 배위 중합체 나노입자-핵산 컨쥬게이트 - Google Patents

안티센스 유전자 조절을 위한 생체에 적합한 무한 배위 중합체 나노입자-핵산 컨쥬게이트 Download PDF

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Publication number
KR20170042758A
KR20170042758A KR1020177007387A KR20177007387A KR20170042758A KR 20170042758 A KR20170042758 A KR 20170042758A KR 1020177007387 A KR1020177007387 A KR 1020177007387A KR 20177007387 A KR20177007387 A KR 20177007387A KR 20170042758 A KR20170042758 A KR 20170042758A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
polynucleotide
metal
alkylene
icp
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
KR1020177007387A
Other languages
English (en)
Inventor
채드 에이. 머킨
콜린 마이클 칼라브레제
윌리엄 이. 브릴레이
티모시 제이. 메르켈
Original Assignee
노오쓰웨스턴 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노오쓰웨스턴 유니버시티 filed Critical 노오쓰웨스턴 유니버시티
Publication of KR20170042758A publication Critical patent/KR20170042758A/ko
Withdrawn legal-status Critical Current

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Abstract

본 명세서에서는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 금속-리간드 복합체, 이의 제조를 위한 화합물 및 이의 사용 방법이 개시된다.

Description

안티센스 유전자 조절을 위한 생체에 적합한 무한 배위 중합체 나노입자-핵산 컨쥬게이트{BIOCOMPATIBLE INFINITE COORDINATION POLYMER NANOPARTICLE-NUCLEIC ACID CONJUGATES FOR ANTISENSE GENE REGULATION}
정부 지원의 언급
본 발명은 군연구실(Army Research Office)에 의해 부여된 W911NF-11-1-0229; 미국국립보건원에 의해 부여된 U54 CA151880; 및 미국 국방 첨단과학기술 연구소(Defense Advanced Research Projects Agency: DARPA)에 의해 부여된 HR0011-13-2-0018 하에서 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 가진다.
전자적으로 제출된 자료의 참고에 의한 포함
본 명세서와 동시에 제출되고 다음과 같이 확인된 컴퓨터-판독 가능한 뉴클레오타이드/아미노산 서열은 그것 전체가 참고로 포함된다: 2015년 8월 20일자로 생성된 ASCII (텍스트) 파일명 "2014-110_Seqlisitng.txt", 2,619 바이트.
구형핵산(spherical nucleic acid: SNA)은 프로그래밍 가능한 물질 합성, 생체 검출 및 세포내 유전자 조절에서 유망함을 나타낸 흥미로운 새로운 부류의 물질로서 나타났다. 이러한 구조는 종종 올리고뉴클레오타이드의 밀집한 층으로 기능화된 나노입자 코어를 포함한다. 가장 크게 연구된 SNA 작제물은 알킬티올-변형된 DNA로 기능화된 금 코어로 구성된다. 금으로 이루어진 SNA는 의학적 진단 및 연구 도구로서 유망한 상업적 전망을 나타내었고, 생체내에서 급성 독성을 나타내지 않았지만, 금 나노입자 및 그들의 대사경로의 잠재적인 장기간 독성에 관한 문제가 있다. 결과적으로, 생체에 적합한 물질로 이루어진 코어를 갖는 SNA의 새로운 형태는 이후에 고도로 추구된다.
a) R. J. Macfarlane, B. Lee, M. R. Jones, N. Harris, G. C. Schatz, C. A. Mirkin, Science 2011, 334, 204-208; b) D. Nykypanchuk, M. M. Maye, D. van der Lelie, O. Gang, Nature 2008, 451, 549-552. a) D. Zheng, D. S. Seferos, D. A. Giljohann, P. C. Patel, C. A. Mirkin, Nano Lett. 2009, 9, 3258-3261; b) D. S. Seferos, D. A. Giljohann, H. D. Hill, A. E. Prigodich, C. A. Mirkin, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 5477; c) A. E. Prigodich, P. S. Randeria, W. E. Briley, N. J. Kim, W. L. Daniel, D. A. Giljohann, C. A. Mirkin, Anal. Chem. 2012, 84, 2062-2066. a) N. L. Rosi, D. A. Giljohann, C. S. Thaxton, A. K. R. Lytton-Jean, M. S. Han, C. A. Mirkin, Science 2006, 312, 1027-1030; b) D. A. Giljohann, D. S. Seferos, A. E. Prigodich, P. C. Patel, C. A. Mirkin, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 2072. a) J. I. Cutler, K. Zhang, D. Zheng, E. Auyeung, A. E. Prigodich, C. A. Mirkin, J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 9254-9257; b) K. L. Young, A. W. Scott, L. Hao, S. E. Mirkin, G. Liu, C. A. Mirkin, Nano Lett. 2012, 12, 3867-3871. C. A. Mirkin, R. L. Letsinger, R. C. Mucic, J. J. Storhoff, Nature 1996, 382, 607-609. a) J. I. Cutler, D. Zheng, X. Xu, D. A. Giljohann, C. A. Mirkin, Nano Lett. 2010, 10, 1477-1480; b) K. Wagner, A. Kautz, M. Roder, M. Schwalbe, K. Pachmann, J. H. Clement, M. Schnabelrauch, Appl. Organomet. Chem. 2004, 18, 514-519. a) D. G. Thompson, A. Enright, K. Faulds, W. E. Smith, D. Graham, Anal. Chem. 2008, 80, 2805-2810; b) J. A. Dougan, C. Karlsson, W. E. Smith, D. Graham, Nucleic Acids Res. 2007, 35, 3668-3675; c) J. S. Lee, A. K. Lytton-Jean, S. J. Hurst, C. A. Mirkin, Nano Lett. 2007, 7, 2112-2115. a) Y. Li, X. Duan, L. Jing, C. Yang, R. Qiao, M. Gao, Biomaterials 2011, 32, 1923-1931; b) D. Z. Sun, O. Gang, Langmuir 2013, 29, 7038-7046. a) A. M. Rush, M. P. Thompson, E. T. Tatro, N. C. Gianneschi, ACS Nano 2013, 7, 1379-1387; b) M. P. Chien, M. P. Thompson, N. C. Gianneschi, Chem. Commun. (Cambridge, U. K.) 2011, 47, 167-169; c) Z. Li, Y. Zhang, P. Fullhart, C. A. Mirkin, Nano Lett. 2004, 4, 1055-1058. J. I. Cutler, E. Auyeung, C. A. Mirkin, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 1376-1391. a) A. K. Lytton-Jean, R. Langer, D. G. Anderson, Small 2011, 7, 1932-1937; b) A. M. Rush, D. A. Nelles, A. P. Blum, S. A. Barnhill, E. T. Tatro, G. W. Yeo, N. C. Gianneschi, J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 7615-7618. a) S. Dhar, W. L. Daniel, D. A. Giljohann, C. A. Mirkin, S. J. Lippard, J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 14652; b) X.-Q. Zhang, X. Xu, R. Lam, D. Giljohann, D. Ho, C. A. Mirkin, ACS Nano 2011, 5, 6962-6970. M. Wei, N. Chen, J. Li, M. Yin, L. Liang, Y. He, H. Song, C. Fan, Q. Huang, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 1202-1206. a) P. C. Patel, D. A. Giljohann, W. L. Daniel, D. Zheng, A. E. Prigodich, C. A. Mirkin, Bioconjugate Chem. 2010, 21, 2250-2256; b) C. H. J. Choi, L. Hao, S. P. Narayan, E. Auyeung, C. A. Mirkin, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013, 110, 7625-7630. S. A. Jensen, E. S. Day, C. H. Ko, L. A. Hurley, J. P. Luciano, F. M. Kouri, T. J. Merkel, A. J. Luthi, P. C. Patel, J. I. Cutler, W. L. Daniel, A. W. Scott, M. W. Rotz, T. J. Meade, D. A. Giljohann, C. A. Mirkin, A. H. Stegh, Sci.Transl. Med. 2013, 5. A. M. Alkilany, C. J. Murphy, J. Nanopart. Res. 2010, 12, 2313-2333. a) A. M. Spokoyny, D. Kim, A. Sumrein, C. A. Mirkin, Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 1218-1227; b) W. Lin, W. J. Rieter, K. M. Taylor, Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 650-658. a) W. J. Rieter, K. M. Pott, K. M. L. Taylor, W. Lin, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 11584; b) P. F. Gao, L. L. Zheng, L. J. Liang, X. X. Yang, Y. F. Li, C. Z. Huang, J. Mater. Chem. B 2013, 1, 3202-3208. R. C. Huxford, K. E. deKrafft, W. S. Boyle, D. Liu, W. Lin, Chem. Sci. 2012, 3, 198-204. Z. D. Liu, R. C. Hider, Coord. Chem. Rev. 2002, 232, 151-171. J. Burgess, M. Rangel, Adv. Inorg. Chem. 2008, 60, 167-243. V. M. Nurchi, G. Crisponi, T. Pivetta, M. Donatoni, M. Remelli, J. Inorg. Biochem. 2008, 102, 684-692. a) G. Szigethy, K. N. Raymond, Inorg. Chem. 2010, 49, 6755-6765; b) S.-H. Cho, T. Gadzikwa, M. Afshari, S. T. Nguyen, J. T. Hupp, Eur. J. Inorg. Chem. 2007, 4863-4867; c) D. L. Caulder, C. Bruckner, R. E. Powers, S. Konig, T. N. Parac, J. A. Leary, K. N. Raymond, J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 8923-8938. R. C. Scarrow, P. E. Riley, K. Abudari, D. L. White, K. N. Raymond, Inorg. Chem. 1985, 24, 954-967. S. J. Hurst, A. K. R. Lytton-Jean, C. A. Mirkin, Anal. Chem. 2006, 78, 8313-8318. Note that the gold core is capable of quenching the fluorescence of dye-labeled oligonucleotides, which may lower the apparent fluorescence intensity. K. Zhang, L. Hao, S. J. Hurst, C. A. Mirkin, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 16488-16491.
본 명세서에서 다음의 구조식을 갖는 화합물이 제공되며
Figure pct00001
, 식 중, L은 C1- 20알킬렌 또는 -C(O)NH-C1- 20알킬렌이고; n은 1 또는 2이다. 일부 경우에, n은 1이고, 특정 경우에, 피리돈은 페닐 고리 상의 파라 위치에 부착된다. 일부 경우에, n은 2이며, 특정 경우에, 피리돈은 페닐 고리 상에서 각각의 메타 위치에 부착된다. 다양한 경우에, L은 C1- 20알킬렌이다. 일부 경우에, L은 -C(O)NH-C1-20알킬렌이다.
또한 본 명세서에서 본 명세서에 개시된 화합물 및 Fe(III)를 포함하는 금속-리간드 복합체가 제공된다. 일부 경우에, 금속-리간드 복합체는 Fe2(화합물)3의 반복되는 화학식, 또는 2개의 Fe(III) 이온마다 3개의 화합물 모이어티의 비를 갖는 무한 배위 중합체(infinite coordination polymer: ICP) 형태이다. 일부 경우에, 금속-리간드 복합체는 트라이아졸 결합을 형성하기 위해 폴리뉴클레오타이드 상의 알킨를 통해 화합물 중 하나 상의 아자이드에 공유적으로 부착된 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드는 ICP 상의 표면 아자이드에 부착된다.
추가로 말단에서
Figure pct00002
를 포함하는 모이어티를 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 식 중, L은 C1- 20알킬렌 또는 -C(O)NH-C1- 20알킬렌이고; n은 1 또는 2이다. 일부 경우에, n은 1이고, 특정 경우에, 피리돈은 페닐 고리 상의 파리 위치에 부착된다. 일부 경우에, n은 2이고, 특정 경우에, 피리돈은 페닐 고리 상의 각각의 메타 위치에 부착된다. 다양한 경우에, L은 C1- 20알킬렌이다. 일부 경우에, L은 -C(O)NH-C1- 20알킬렌이다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드의 말단은 구조식
Figure pct00003
또는 이들의 혼합물을 가지며, L2는 C1-10 알킬렌, -C(O)-C1-10 알킬렌-Y- 및 -C(O)-C1-10 알킬렌-Y-C1-10 알킬렌-(OCH2CH2)m-Y-이고; 각각의 Y는 결합, C(O), O, NH, C(O)NH, 및 NHC(O)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; m은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 5 내지 100개의 핵염기, 또는 10 내지 60개의 핵염기, 또는 15 내지 30개의 핵염기를 포함할 수 있다. 추가로 본 명세서에서 본 명세서에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 및 Fe(III)를 포함하는 금속-리간드 복합체가 제공된다.
추가로 본 명세서에서 본 명세서에 개시된 제1 금속-리간드 복합체 및 본 명세서에 개시된 제2 금속-리간드 복합체를 포함하는 초분자 구조가 제공되되, 제1 금속-리간드 복합체의 폴리뉴클레오타이드는 적절한 조건 하에서 혼성화되기 위해 제2 금속-리간드 복합체의 폴리뉴클레오타이드에 대해 충분히 상보성이다.
또한 본 명세서에서 유전자 산물의 발현을 저해하기에 충분한 조건 하에서 표적 폴리뉴클레오타이드를 본 명세서에 개시된 바와 같은 초분자 복합체 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 금속-리간드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 유전자 산물의 발현을 저해하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물의 발현은 생체내에서 저해된다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물의 발현은 시험관 내에서 저해된다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물의 발현은 적어도 약 5%만큼 저해된다.
또한 본 명세서에서 표적 분자를 본 명세서에 개시된 바와 같은 초분자 복합체 또는 본 명세서에 개시된 바와 같은 금속-리간드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 분자를 검출하는 방법이 제공되되, 표적 분자와 초분자 복합체 또는 금속-리간드 복합체 사이의 접촉은 검출 가능한 변화를 초래한다. 일부 실시형태에서, 검출은 시험관 내이다. 일부 실시형태에서, 검출은 생체 내이다.
도 1은 ICP 입자의 합성 및 조립 및 그들의 세포 흡수를 도시한 도면. a) 비스-3,4-HOPO 아자이드 (4)에 대한 합성 반응식. b) Fe(NO3)3 및 화합물 4로부터의 ICP 입자의 조립, 다음에 Cu가 없는 '클릭(Click)' 반응을 통한 컨쥬게이션. c) ICP-DNA 컨쥬게이트의 세포 흡수를 도시하는 도면.
도 2는 DNA-ICP 입자의 특성규명을 도시한 도면. (a) 운모 상에서 드랍 캐스트(drop-cast) 및 건조시킨 순수(Bare) ICP 입자의 AFM 이미지. b) 운모 상에서 드랍 캐스트 및 건조시킨 DNA-기능화된 ICP 입자. c) 순수 및 DNA-기능화된 ICP의 크기 분포를 비교한 DLS 히스토그램. d) ICP-DNA의 협동적 융점은 다양한 염 농도에 대해 응집한다.
도 3은 DNA-ICP 입자의 UV-Vis 분석을 도시한 도면. a) 260㎚에서 DNA 흡광도의 변화를 나타내는 DNA-ICP 입자와 순수 ICP 입자의 비교. 삽도: 460㎚에서 LMCT 흡광계수의 결정. b) LMCT 흡광도의 pH 의존도. pH가 감소함에 따른 λmax의 적색 이동은 복합체 해리를 나타낸다(삽도 참조).
도 4는 세포의 흡수 및 유전자 넉다운을 도시한 도면. (a) Cy5-ssDNA 및 (b) DNA-ICP 입자(각각의 경우에 100nM DNA)로 처리한 C166 세포의 공초점 현미경 이미지. 호크스트 염색은 핵을 청색으로 나타내는 한편, DNA에 부착된 Cy5 염료는 적색이다. c) 유세포분석기에 의해 정량화된 Cy5 염료의 형광 강도. d) 펠렛화한 MCF-7 유방암 세포에서 취한 DNA-ICP의 육안 시각화 e) 비표적화 DNA-ICP, HER2 표적화 ssDNA + 리포펙타민, 및 HER2 표적화 DNA-ICPS로 처리한 SKOV-3 세포 내 HER2 단백질의 발현.
도 5는 좌: 철(III)에 의한 리간드 4의 적정; 및 우: ICP-N3 입자의 ε460의 결정을 도시한 도면.
도 6은 상보성(좌) 및 비상보성(우) ICP/AuNP-DNA 컨쥬게이트의 열 변성을 도시한 도면.
도 7은 다양한 시점 및 농도에서 모 ICP 리간드 3의 MTT 독성 분석을 도시한 도면.
본 명세서에서 신규한 SNA 나노입자 컨쥬게이트를 합성하기 위한 제2 철이온 및 강성의 다이토픽(ditopic) 킬레이팅 리간드로 이루어진 무한 배위 중합체(ICP) 나노입자의 용도를 사용하는 전략이 제공된다.
본 개시내용은, 예를 들어, 안티센스 유전자 조절, 약물 전달, 및 생체 검출을 위해 사용될 수 있다. 본 개시내용의 몇몇 이점은 생리적 pH 미만에서 분해된 비독성 중심을 포함하며; 그들은 세포막을 가로지를 때 AuNP-SNA보다 더 효과적이거나 또는 더 양호하고; 코어는 비싸지 않은 빌딩 블록으로부터 조립되는데, 이는 그들을 용이하게 확장시킨다.
DNA-기능화된 무한 배위 중합체(ICP) 나노입자는 본 명세서에서 생체에 적합한 유전자 조절제로서 개시된다. ICP 나노입자는 현수 아자이드를 보유하는 질산제2철 및 다이토픽 3-하이드록시-4-피리딘온(HOPO) 리간드로부터 합성되었다. 리간드 용액에 대한 Fe(III)의 첨가는 염의 존재 하에 콜로이드 모양으로 불안정한 나노입자의 용액을 생성하였다. 무 구리 클릭 화학을 통한 Fe(III)-HOPO ICP 입자에 대한 DNA의 컨쥬게이션은 콜로이드적으로 안정한 핵산 나노작제물을 얻었다. DNA-ICP 입자는 서열-특이적 혼성화를 통해 가교될 때, 밀집한 DNA 표면 부하와 일치되는 좁고, 고도로 협동적인 융점 전이를 나타낸다. 세포에 유입되고 단백질 발현을 변경시키는 DNA-ICP 입자의 능력을 또한 평가하였다. 본 발명자들의 결과는 이들 신규한 입자가 형질감염제에 대한 필요 없이 포유류 세포 내로 핵산을 운반하고 효율적인 유전자 넉다운을 할 수 있다는 것을 나타낸다.
구형핵산(SNA)은 프로그램 가능한 물질 합성[1], 생체-검출[2], 및 세포내 유전자 조절[3]에서 전망을 나타낸 흥미로운 새로운 부류의 물질로서 나타났다. 중공, 무 코어 형태가 개발되었지만, 이러한 구조는 종종 올리고뉴클레오타이드의 밀집한 층과 함께 기능화된 나노입자 코어로 구성된다[4]. SNA의 가장 초기의 샘플은 알킬티올-기능화된 DNA의 밀집한 층에 의해 변형된 금 나노입자를 수반하였지만[5], 산화철[6], 은[7], 반도체 양자점[8], 및 유기 코어가 마찬가지로 탐구되었다[9]. 특히, SNA의 화학적 및 생물학적 특성은 그들의 선형 대응관계와 현저하게 상이하다. SNA는 협동적 결합 및 급격한 열변성 프로파일을 나타내며, 양이온성 형질감염제에 대한 필요 없이 세포에 유입되고, 다가 방식으로 수용체에 결합하는 능력을 가진다[10]. 결과적으로, 그들은 유전자 조절[11]. 약물 전달[12]. 및 면역조절 경로를 통해 세포 과정을 조작하기 위한 강력한 새로운 독립체이다[13]. SNA의 활성 흡수는 클래스 A 스캐빈저 수용체(scavenger receptor: SR-A)에 대한 그들의 결합에 의해 촉발되는 카베올린-매개 카베올린-매개 내포작용을 통해 일어난다[14]. 금으로 이루어진 SNA는 의학적 진단 및 연구 도구로서 상업적 전망을 나타내었고 생체내에서 급성 독성을 나타내지 않았지만[15], 금 나노입자 및 그들의 대사경로의 잠재적 장기간 독성에 관한 문제가 있다[16]. 결과적으로, 생체에 적합한 물질로 이루어진 코어를 갖는 SNA의 새로운 형태는 이후에 고도로 추구된다. 본 명세서에서 신규한 SNA 나노입자 컨쥬게이트를 합성하기 위한 제2 철이온 및 강성의 다이토픽 킬레이팅 리간드로 이루어진 무한 배위 중합체(ICP) 나노입자의 용도를 사용하는 전략이 제공된다. 이들 DNA-ICP는 다른 약제학적 용도를 위해 FDA에 의해 승인된 화학적 빌딩 블록으로부터 설계되고, 협동적 결합을 나타내며, 포유류 세포막을 용이하게 가로지르고, 표적화된 방식으로 단백질 발현을 저해할 수 있다.
ICP 나노입자는 금속 노드에 의해 브릿지된 유기 리간드의 무정형 네트워크로 이루어진다[17]. 그들은 ICP 구조를 정하는 리간드/금속 조합물이 DNA-ICP 컨쥬게이트의 독성 및 약동학 프로파일을 최적화하도록 합리적으로 설계될 수 있기 때문에 SNA 구성을 위한 유망한 물질이다. 의학적 적용을 위해 설계된 다수의 ICP의 한 가지 주된 제한은 수성 완충제에서 그들의 불안정성이다. 일부 연구자들은 실리카[18] 또는 지질의 껍질에서 입자 코어를 캡슐화함으로써 이 제한을 피하였다[19]. 대조적으로, 본 명세서에서 수성 조건 하에서 그리고 전문 장비 또는 시약 없이 무기한으로 합성, 정제 및 저장될 수 있는 ICP 입자를 설계하기 위한 전략이 제공된다. 더 나아가, 상대적으로 비독성인 금속 이온의 사용은 생물학적 적용분야에 대한 중대한 필요조건이다. 이들 목표는 신체 내에서 가장 흔한 전이 금속인 FeIII와 조합되어 3-하이드록시-4-피리딘온(3,4-HOPO) 리간드를 강하게 킬레이팅하는 것으로부터 ICP 나노입자를 합성함으로써 달성되었다. 3,4-HOPO의 협동 화학 및 약리학은 체계적으로 조사되었고[20], 1,2-다이메틸 유도체(디페리프론)는 인간에서 철 과다의 치료용으로 FDA-승인되어 있다[21]. 더 나아가, Fe(HOPO)3 복합체는 생리학적 pH 미만에서 해리하는 것으로 알려져 있다[22]. 이는 지금까지 준비된 SNA와 전형적으로 관련되지 않은 신규한 특성인, 세포 유입 후 사이토졸 내로 DNA를 전달하기 위한 잠재적 방출 메커니즘을 제공한다.
등전자성인 다이토픽 HOPO 및 카테콜 리간드는 친산소적 금속 양이온, 예컨대 FeIII, CrIII, GaIII 및 기타와의 불용성 배위 중합체를 형성할 수 있는 것으로 알려져 있지만, 그러나, 이러한 중합체는 저조하게 이해되고 있으며, 문헌에서 잘 연구되어 있지 않다[23]. 이들 리간드는 물질 합성과 대조적으로 금속 격리에 대해 주로 연구되었다. 따라서, 이는 DNA에 의한 변형을 위한 신규한 나노입자 스캐폴드를 구성하기 위한 기회였다. 구체적으로, 신규한 다이토픽 리간드 DABA-비스-HP-N3(4)를 제조하였는데, 이는 비싸지 않은 빌딩 블록 말톨 및 3,5-다이아미노벤조산(DABA, 1)을 의도적으로 사용한다(도 1a). DABA에 의한 말톨의 2회 순차적 산-촉매 축합(1 내지 2; 2 내지 3), 다음에 카복실산의 HATU-매개 아마이드화로 아자이드-보유 다이토픽 리간드 4를 얻었다. 중요하게는, 3의 카복실산은 매우 다양한 아민 빌딩 블록에 의하 아마이드화 되어, 현수 작용기에 의해 지시되는 맞춤 가능한 합성 후 화학에 의해 ICP 입자를 얻었다.
리간드 4로부터 ICP 나노입자를 합성하기 위해, 리간드 4(1.07mM 리간드, 1877㎕)의 묽은 NaOH 용액을 준비하고 나서, 질산제2철 용액(10.8mM, 123㎕)을 그것에 주입하였다(도 1b). 입자 형성은 순간적으로 일어나며, 용액의 색은 트리스-HOPO-FeIII 복합체의 리간드-금속 전하 이동 밴드(LMCT)(λmax
Figure pct00004
460㎚)에 기인하여 투명에서 적색으로 변한다[24]. 얻어진 ICP-N3 나노입자는 저농도의 염(NaCl, 트리스
Figure pct00005
HCl)의 존재 하에서 콜로이드적으로 불안정하여, 적색의, 불용성 물질의 점진적 침전을 야기한다. 조질의 ICP-N3 입자를 원심분리 여과(100kDa 분자량 컷오프)에 의해 정제하고 나서, H2O 중에서 재현탁시켰다. 입자는 그들이 통과되기에 너무 크기 때문에 필터 상에 남겨진다. 필터를 통한 물질의 최소 상실은 고분자량 종의 콜로이드 분산물이 얻어졌음을 나타내었다. 탈이온화된 H2O에서, 합성된 그대로의 입자는 동적 광산란(dynamic light scattering: DLS)에 의해 결정하여 평균 유체 역학 직경이 10 내지 20㎚로 안정하다(도 2c, 좌측). TEM 및 AFM 이미징은 작은 나노입자의 응집물을 나타내었는데, 건조 시 일정 정도의 융합이 생긴다. 더 나아가, ICP-N3 입자의 조성물은 분광학적으로 프로빙되었다. H2O 중에서 고정된 농도의 DABA-비스-HP-N3 리간드를 함유하는 분취액을 준비하고 나서, 0 내지 1.1 당량 범위에서 철의 양을 증가시키면서 처리하였다. 460㎚에서 흡광도는 0.66 당량의 FeIII가 첨가될 때까지 증가되는데, 이는 Fe2L3의 금속-리간드 화학량론과 일치된다(도 5 참조).
순수 ICP-N3 입자에 대한 컨쥬게이션을 위해, 모든 올리고뉴클레오타이드를 자동화 DNA 합성기 상에서 생성하고 나서, 역상 HPLC에 의해 정제하고, MALDI-ToF에 의해 특성규명하였다. 다이벤조사이클로옥틴(DBCO) 포스포르아미다이트는 상업적으로 입수 가능하며, 올리고뉴클레오타이드의 5' 말단 상에 용이하게 포함된다. 사이아닌 5(Cy5) 염료에 의해 변형된 DNA 가닥은 세포내 이미징 연구를 위해 사용되었다. 5' 알킬티올에 의해 변형된 DNA 가닥을 사용하여 DNA-ICP 입자와 비교를 위한 AuNP-SNA를 구성하였다(표 1).
DBCO-보유 올리고뉴클레오타이드를 수성 NaCl(0.5M) 중에서 두 반응물을 단순히 혼합함으로써 ICP-N3 입자에 컨쥬게이팅시키고, 그 다음에 비반응 DNA를 제거하기 위한 한외여과를 반복하였다. 얻어진 DNA-ICP 입자를 트리스-HCl 완충제(100mM, pH 8.0) 중에서 현탁시키고 나서, 무기한으로 5℃에서 저장할 때 콜로이드로 안정하게 남아있었다. 대조적으로, 순수 ICP-N3 입자는 동일한 이온 강도의 용액 중에 저장될 때 침전되었다.
콜로이드 안정성을 나타내는 것에 추가로, DNA-ICP 나노입자는 또한 순수 ICP-N3 입자에 비교하여 크기, 표면 전하 및 형태가 상이한 것을 발견하였다. DLS 및 제타 퍼텐셜 측정은 각각 유체 역학 직경(도 2c, 우측) 및 표면 전하의 일관된 증가를 나타내었다. 추가로, UV-Vis 분광학을 사용하여 260㎚에서 흡광도에 대한 DNA의 상대적 분포를 계산할 수 있었고, 따라서 DNA 농도를 결정할 수 있었다. 유도결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS)을 또한 ICP 입자의 흡광 계수 ε460을 직접적으로 계산하기 위해 사용하였다(도 3a). 추가적으로, 입자를 크기 및 형태의 변화를 시각화하기 위해 DNA와의 컨쥬게이션 후에 AFM에 의해 이미징하였다(도 2a,b). 마지막으로, 생리적 pH(7.4)로부터 낮은 리소좀 pH(4.0)의 범위인 수성 완충제 중의 DNA-ICP 입자의 인큐베이션은 LMCT λmax에서, 투명에서 적색이동을 나타내었는데, 이는 입자를 포함하는 트리스-협동된 FeIII 노드의 부분적 해리를 나타낸다(도 3b).
DNA-ICP 입자에 대한 올리고뉴클레오타이드의 표면 밀도를 프로빙하기 위해, 열변성 실험을 수행하되, 상보성 서열을 지니는 ICP(A-ICP 및 B-ICP)를 혼합하고 나서, 혼성화시키고, 이어서 이중가닥의 용융 전이 초과로 가열하였다. 유리 이중 가닥 DNA 이중가닥은 0.3M NaCl 중에서 Tm = 54.0℃로 17개의 염기쌍 중복을 가진다. 대조적으로, 동일한 상보성 가닥은 ICP-N3 입자에 컨쥬게이팅될 때 Tm = 66.9℃, 거의 13℃의 증가로 이중가닥을 형성한다. 추가로, DNA-ICP 입자 응집물의 용융 전이는 협동성의 극도로 좁은 특징이며; 용융 곡선의 최대 반값폭(FWHM)은 전형적으로 유리 이중 가닥 DNA에 대한 10 내지 20℃에 비해 2℃ 미만이다. A-ICP 및 B-ICP 입자는 0.1M 내지 1M NaCl 범위의 염 농도에서 용융되었는데, 이는 이온 강도가 증가됨에 따라 Tm의 증가를 나타낸다. (도 2d). 대조군 실험으로서, A-ICP 입자는 단독으로 실험 조건 하에서 응집 또는 용융을 나타내지 않았고, A-ICP 입자는 비상보성 입자(비표적-ICP)와 혼합되지도 않았다.
DNA-ICP 입자가 그들의 금 상대와 유사한 DNA 인식 및 결합 특성을 갖는지의 여부를 결정하기 위해 DNA-ICP 입자의 통상적인 AuNP-SNA와의 상호작용을 또한 연구하였다. 금 나노입자(15㎚, 테드 펠라(Ted Pella))를 알킬티올 변형된 올리고뉴클레오타이드 A-SH에 의해 기능화시켰고, 확립된 프로토콜에 따라 정제하여 A-AuNP 입자를 얻었다[25]. A-AuNP 및 B-ICP 입자를 1:1 비로 혼합하였을 때, λmax
Figure pct00006
520㎚에서 AuNP 플라즈몬 공명의 수반된 확장 및 적색 이동과 함께 응집이 관찰되었다. 0.3 내지 0.7M NaCl 범위의 염 농도에서 열 변성 곡선을 수집하였다. 대조군으로서, 비-상보성 미스매치 입자 A-AuNP 및 A-ICP를 또한 혼합하고 나서, 예상한 바와 같이, 응집 또는 용융 거동을 나타내지 않았다(도 6 참조). 전반적으로, 열변성 연구는 ICP-N3 입자 상에서 고 DNA 표면 부하를 정량적으로 시사한다. 이전의 연구는 급격한 열변성 곡선(FWHM < 2℃)이, 올리고뉴클레오타이드 부하가 10㎚ 입자 코어에 대해 대략 50개 가닥으로 접근하거나 또는 초과할 때에만 생긴다는 것을 나타내었다[6a].
올리고뉴클레오타이드 서열
올리고 명칭 서열 서열번호
A-DBCO 5'-DBCO-TEG-A4-AATCCTTATCAATATTT-3' 1
B-DBCO 5'-DBCO-TEG-A4-AAATATTGATAAGGATT-3' 2
A-SH 5'-HS-(CH2)6-A4-AATCCTTATCAATATTT-3' 3
Her2-DBCO 5'-DBCO-CTCCATGGTGCTCAC-3' 4
비표적-DBCO 5'-DBCO-CTCCTTCACCTTCGCGCAGC-3' 5
Cy5-DBCO 5'-DBCO-TEG-CCTCCTCCT-Cy5-CCTCCTCCT-3' 6
Cy5-SH 5'-HS-(CH2)6-CCTCCTCCT-Cy5-CCTCCTCCT-3' 7
DNA-ICP 표면에 대한 높은 겉보기 올리고뉴클레오타이드 밀도에 기인하여, 그들은 금 선행자와 매우 유사하게 효율적인 유전자 전달제로서 작용한다는 가설을 세웠다[3]. 이 추정을 시험하기 위해, ICP-N3 입자를 내부 형광단-표지를 보유하는 폴리(CCT) 올리고뉴클레오타이드 Cy5-DBCO에 의해 기능화하여 Cy5-ICP 입자를 얻었다. 마찬가지로, 금 나노입자(15㎚)를 유사한 Cy5-SH 올리고뉴클레오타이드에 의해 기능화시켜 형광 측정에 의해 결정한 바와 같이 AuNP 당 대략 113개 가닥의 부하를 갖는 Cy5-AuNP 입자를 얻었다.
공초점 현미경(도 3a,b) 및 유세포분석기(도 4c)에 의해 헬라(HeLa) 자궁경부암 세포에서 흡수를 시험하였다. DNA-ICP 입자는 유리 DNA 가닥보다 더 효율적으로 세포막을 가로지르는 것을 발견하였고, 동일한 서열을 보유하는 AuNP-SNA 나노입자[26]에 대해 비슷한 흡수를 나타내었다. 이들 결과는 DNA-ICP 나노입자가 입자 결합 또는 유리 형태로 다량의 DNA를 사이토졸에 수송할 가능성을 가진다는 것을 시사한다. 더 나아가, 24시간 동안 MCF-7 유방암 세포에서 DNA-ICP의 인큐베이션 후에 철 농도의 용량-의존적 증가가 발견되었다. 철 복합체의 색은 DNA-ICP로 처리한 펠렛화된 세포에서 육안으로 볼 수 있었다(도 4d). C166 마우스 내피 세포에 의한 추가적인 공초점 현미경 실험은 DNA-ICP가 형질감염제에 대한 필요 없이 수많은 세포주를 용이하게 유입한다는 것을 확인하였다.
AuNP-SNA와 유사한 방식으로 세포에 유입하는 DNA-ICP 컨쥬게이트의 능력이 입증되었으며, 공지된 암-관련 mRNA 전사체를 표적화함으로써 단백질 발현을 변경시키는 그들의 능력을 조사하였다. 개념 증명으로서, SKOV-3 난소암 세포는, 그들이 악성 세포 성장 및 분화로 야기하는 신호 형질도입 경로에 연루된 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2)를 과발현시키기 때문에 선택되었다[27]. 항-HER2 DNA-ICPS를 이용하여 일련의 유전자 넉다운 실험을 수행하였다. SKOV-3 세포를 상이한 농도의 안티센스 DNA-ICPS(HER2-ICP) 또는 비표적화 DNA-ICPS(비표적-ICP)와 함께, 양성 대조군으로서 리포펙타민(등록상표)(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies))과 복합체화된 유리 항-HER2 DNA와 함께 인큐베이션시켰다. 3일 후에, 세포를 채취하고 나서, HER2 발현을 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정하였다(도 4e). 이들 결과는 항-HER2 DNA-ICP가 DNA 농도(1 내지 10μM)에 따라서 55 내지 81%만큼 HER2 발현을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 이는 상업적 형질감염제에 의해 달성된 결과와 비슷하며, 더 나아가 HER2 발현의 변화는 비표적화 DNA-ICP에 의해 관찰되지 않았다. 마지막으로, 비독성 효과 또는 세포사는 MTT 분석에 의해 예측된 바와 같이 DNA-ICPS에 의한 처리로부터 초래되었다.
결론적으로, 본 명세서에서, 형질감염제 없이 세포 유입 및 유전자 조절할 수 있는 생체 적합성, DNA-장식 무한 배위 중합체 나노입자를 합성하는 손쉬운 방법이 제공된다. 수 중에서 합성된 철(III)-기반 ICP 나노입자는 올리고뉴클레오타이드에 직접적으로 컨쥬게이팅되고, 세포막을 가로질러서 그들을 운반한다. 더 나아가, 코어는 상당한 건강 위험을 제기하는 것으로 예상되지 않은 양성 빌딩 블록을 포함한다. 이 작업은 암 및 기타 유전 질환의 치료에서 생체내 적용을 위해 임상적으로 실행 가능한 유전자 조절 작제물의 구성에 대해 주된 단계를 나타낸다.
금속-리간드 복합체
다양한 양상에서, 본 개시내용은 Fe(III) 및 구조식
Figure pct00007
의 화합물의 본 명세서에 개시된 치환체와의 금속-리간드 복합체를 제공한다. 일부 경우에, 금속-리간드 복합체는 일반식 Fe2(화합물)3의 무한 배위 중합체이다. 다양한 경우에, 금속-리간드 복합체는
Figure pct00008
의 표면 화합물의 아자이드를 지니는 구조를 형성하기 위해, 하나의 화합물로부터 표면 아자이드를 통해 부착된 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있되, 식 중, L은 C1- 20알킬렌 또는 -C(O)NH-C1- 20알킬렌이고; n은 1 또는 2이다. 폴리뉴클레오타이드는 표면 화합물의 아자이드에 대한 부착을 위해 폴리뉴클레오타이드의 말단에서 알킨(예를 들어, DBCO)을 포함할 수 있다.
말단에서 본 명세서에 개시된 바와 같은 모이어티를 함유하는 폴리뉴클레오타이드는 반응성 작용기를 갖도록 변형된 폴리뉴클레오타이드에 모이어티를 부착함으로써 얻어질 수 있다. 예를 들어, 아미노알킬-변형된 폴리뉴클레오타이드는 카복실산기 또는 활성화된 카복실산기를 갖는 리간드 또는 리간드 전구체에 부착될 수 있다. 카복실산기를 활성화시키기 위한 적합한 시약은 카보다이이미드(예를 들어, 다이사이클로헥실카보다이이미드, 다이아이소프로필카보다이이미드, 1-에틸-3-[3-다이메틸아미노프로필]카보다이이미드, 페닐 에틸 카보다이이미드, 페닐 아이소프로필 카보다이이미드), 벤조트라이아졸(예를 들어, 1-하이드록시-1H-벤조트라이아졸, 1-하이드록시-7-아자벤조트라이아졸, O-(7-아자벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라-메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트, O-(벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트), 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드는 HOPO-리간드:
Figure pct00009
의 아자이드와의 반응을 위해 DBCO-유형 모이어티와의 말단에서 변형되며, 여기서 L은 폴리뉴클레오타이드의 말단에 대한 링커이다. L2는 C1-10 알킬렌, -C(O)-C1-10 알킬렌-Y-, 및 -C(O)-C1-10 알킬렌-Y- C1-10 알킬렌-(OCH2CH2)m-Y-일 수 있되; 각각의 Y는 결합, C(O), O, NH, C(O)NH 및 NHC(O)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; m은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다. 예를 들어, DBCO 작용기는
Figure pct00010
의 구조를 갖는 링커를 통해 부착될 수 있으며, 여기서 말단의 "O"는 폴리뉴클레오타이드 상의 말단의 뉴클레오타이드로부터 유래된다.
금속-리간드 복합체는 전형적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 아자이드 화합물의 용액을 적합한 용매 중의 Fe3 +의 용액과 조합함으로써 제조된다. 일반적으로, 용매 중에서 조합될 때 Fe3 + 대 화합물의 몰 비는 적어도 1:10, 예를 들어, 적어도 1:5, 적어도 1:3, 적어도 1:2, 적어도 1:1.5, 적어도 1:1, 적어도 1:0.75, 적어도 1:0.5, 적어도 1:0.25, 및/또는 적어도 1:0.1이다. 적합한 용매는 물 및 수성 완충제 용액, 예컨대 인산염 완충 식염수를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일반적으로, 용매의 pH는 약 6 내지 약 11, 예를 들어, 약 7 내지 약 10, 약 7 내지 약 9, 및/또는 약 7 내지 약 8이다. 이어서, 하나의 말단에서 알킨 모이어티를 지니는 폴리뉴클레오타이드는 금속-리간드 복합체와 반응되어 표면 아자이드를 통해 부착된다.
다양한 양상에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 제1 금속-리간드 복합체 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 금속-리간드 복합체를 포함하는 초분자 복합체를 제공하되, 제1 금속-리간드 복합체의 폴리뉴클레오타이드 및 제2 금속-리간드 복합체의 폴리뉴클레오타이드는 적절한 조건 하에서 혼성화하기에 충분하게 상보성이다. 다양한 실시형태에서, 초분자 복합체는 제2 폴리뉴클레오타이드와 혼성화된 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 초분자 복합체 내에서 혼성화된 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드의 융점(Tm)은 적어도 약 30℃, 적어도 약 35℃, 적어도 약 40℃, 적어도 약 45℃, 적어도 약 50℃, 적어도 약 55℃, 적어도 약 60℃, 적어도 약 65℃, 적어도 약 70℃, 적어도 약 75℃, 적어도 약 80℃, 적어도 약 85℃, 적어도 약 90℃, 적어도 약 95℃, 및/또는 적어도 약 100℃이다. 초분자 복합체는 전형적으로 평균 입자 직경이 약 1㎚ 내지 약 1000㎚, 예를 들어, 약 2㎚ 내지 약 900㎚, 약 3㎚ 내지 약 800㎚, 약 4㎚ 내지 약 700㎚, 약 5㎚ 내지 약 600㎚, 약 5㎚ 내지 약 500㎚, 약 5㎚ 내지 약 400㎚, 약 5㎚ 내지 약 300㎚, 약 5㎚ 내지 약 200㎚, 약 10㎚ 내지 약 200㎚, 약 10㎚ 내지 약 100㎚, 약 10㎚ 내지 약 90㎚, 약 10㎚ 내지 약 80㎚, 약 10㎚ 내지 약 70㎚, 약 10㎚ 내지 약 60㎚, 약 10㎚ 내지 약 50㎚, 약 20㎚ 내지 약 40㎚, 및/또는 약 30㎚인 나노입자로서 존재한다.
초분자 복합체는 전형적으로 적합한 용매 중에서 제1 폴리뉴클레오타이드-금속-리간드 복합체 용액을 제2 폴리뉴클레오타이드-금속-리간드 복합체 용액과 조합하여 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드의 충분한 상보성에 기인한 혼성화를 통해 초분자 복합체를 형성함으로써 제조된다. 용액은 염화나트륨을 추가로 포함할 수 있다.
다양한 양상에서, 본 개시내용은 유전자 산물의 발현을 저해하기에 충분한 조건 하에서 표적 폴리뉴클레오타이드를 본 명세서에 기재된 바와 같은 초분자 복합체 또는 금속-리간드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 유전자 산물의 발현을 저해하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물의 발현은 생체내에서 저해된다. 일부 실시형태에서, 유전자 산물의 발현은 시험관내에서 저해된다. 다양한 실시형태에서, 유전자 산물의 발현은 표적 폴리뉴클레오타이드를 초분자 복합체 또는 금속-리간드 복합체와 접촉시키는 것 없이 유전자 산물의 발현에 대해 적어도 약 5%, 예를 들어, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 및/또는 적어도 약 95%만큼 저해된다. 다양한 양상에서, 본 개시내용은 또한 표적 분자를 본 명세서에 기재된 바와 같은 초분자 복합체 또는 금속-리간드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 분자의 검출 방법을 제공하되, 표적 분자와 초분자 복합체 또는 금속-리간드 복합체 사이의 접촉은 검출 가능한 변화를 초래한다. 일부 실시형태에서, 검출은 시험관내이다. 일부 실시형태에서, 검출은 생체내이다.
폴리뉴클레오타이드
본 개시내용에 의해 상정된 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 나타낸 바와 같은 DNA, RNA, 이들의 변형된 형태 및 조합을 포함한다. 따라서, 일부 양상에서, 금속-리간드 복합체, 초분자 복합체 또는 나노입자는 DNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA는 이중 가닥이고, 추가 실시형태에서 DNA는 단일 가닥이다. 추가 양상에서, 금속-리간드 복합체, 초분자 복합체 또는 나노입자는 RNA를 포함하고, 또한 추가 양상에서 금속-리간드 복합체, 초분자 복합체 또는 나노입자는 이중 가닥 RNA를 포함하고, 구체적 실시형태에서, 이중 가닥 RNA 제제는 작은 간섭 RNA(siRNA)이다. 용어 "RNA"는 2개의 별도의 가닥뿐만 아니라 단일 가닥 구조의 이중가닥을 포함한다. 단일 가닥 RNA는 또한 2차 구조를 지니는 RNA를 포함한다. 일 양상에서, 헤어핀 루프를 갖는 RNA가 상정된다.
일부 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는, 금속-리간드 복합체, 초분자 복합체 또는 나노입자 및 표적 폴리뉴클레오타이드의 부분인 폴리뉴클레오타이드의 혼성화가 일어나도록 폴리뉴클레오타이드의 표적 서열에 대해 충분히 상보성인 서열로 구성된다. 이중 가닥 분자가 또한 표적 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 서열에 대해 혼성화하는 단일 가닥 서열을 포함한다면, 폴리뉴클레오타이드는 다양한 양상에서 단일 가닥 또는 이중 가닥이다. 일부 양상에서, 금속-리간드 복합체, 초분자 복합체 또는 나노입자의 부분인 폴리뉴클레오타이드의 혼성화는 이중 가닥 표적 폴리뉴클레오타이드와의 삼중가닥 구조를 형성할 수 있다. 다른 양상에서, 삼중가닥 구조는 단일-가닥 표적 폴리뉴클레오타이드에 대해 금속-리간드 복합체, 초분자 복합체 또는 나노입자의 부분인 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드의 혼성화에 의해 형성될 수 있다. 삼중가닥 폴리뉴클레오타이드 복합체의 추가 설명은 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 PCT/US2006/40124에서 찾는다.
"폴리뉴클레오타이드"는 개개로 중합된 뉴클레오타이드 서브유닛을 포함하는 것으로 당업계에서 이해된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "뉴클레오타이드" 또는 그의 복수는 본 명세서에서 논의되는 변형된 형태 및 당업계에 공지된 다른 것과 상호교환 가능하다. 특정 예에서, 본 기술은 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 천연 유래뉴클레오타이드, 및 비-천연 유래뉴클레오타이드를 포함하는 용어 "핵염기"를 사용한다. 따라서, 뉴클레오타이드 또는 핵염기는 천연 유래 핵염기 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 티민(T) 및 유라실(U)을 의미한다. 비-천연 유래 핵염기는, 예를 들어 그리고 제한 없이, 베너(Benner) 등의 미국 특허 제5,432,272호 및 문헌[Susan M. Freier and Karl-Heinz Altmann, 1997, Nucleic Acids Research, vol. 25: pp 4429-4443]에 기재되어 있는 잔틴, 다이아미노퓨린, 8-옥소-N6-메틸아데닌, 7-데아자잔틴, 7-데아자구아닌, N4,N4-에탄옥시토신, N',N'-에타노-2,6-다이아미노퓨린, 5-메틸사이토신(mC), 5-(C3-C6)-알킨일-사이토신, 5-플루오로유라실, 5-브로모유라실, 슈도아이소사이토신, 2-하이드록시-5-메틸-4-트라이아졸로피리딘, 아이소사이토신, 아이소구아닌, 이노신 및 "비-천연 유래" 핵염기를 포함한다. 용어 "핵염기"는 또한 공지된 퓨린 및 피리미딘 헤테로사이클뿐만 아니라 이들의 복소환식 유사체 및 호변 이성질체를 포함한다. 추가적인 천연 및 비-천연 유래 핵염기는 미국 특허 제3,687,808호(메리건(Merigan) 등), 문헌[Chapter 15, Sanghvi, Antisense Research and Application, Ed. S. T. Crooke and B. Lebleu, CRC Press, 1993, Englisch et al., 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613-722](특히, 페이지 622 및 623, 및 문헌[Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz Ed., John Wiley & Sons, 1990, 페이지 858-859, Cook, Anti-Cancer Drug Design 1991, 6, 585-607] 참조, 이들 각각은 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨)에 개시된 것을 포함한다. 다양한 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 또한 가장 고전적인 의미에서는 뉴클레오사이드 염기가 아니지만, 뉴클레오사이드 염기로서 작용하는 특정 "보편적 염기"를 포함하는, 핵염기와 같이 작용할 수 있는 복소환식 화합물과 같은 화합물을 포함하는 비천연 유래뉴클레오타이드의 범주인 하나 이상의 "뉴클레오타이드 염기" 또는 "염기 단위"를 포함한다. 보편적인 염기는 3-나이트로피롤, 선택적으로 치환된 인돌(예를 들어, 5-나이트로인돌), 및 선택적으로 치환된 하이포잔틴을 포함한다. 다른 바람직한 보편적 염기는 당업계에 공지된 해당되는 보편적 염기를 포함하는 피롤, 다이아졸 또는 트라이아졸 유도체를 포함한다.
변형된 뉴클레오타이드는 유럽 특허 제1 072 679호 및 WO 97/12896에 기재된 바와 같고, 이의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 변형된 뉴클레오타이드는, 제한 없이, 5-메틸사이토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 사이토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸, 및 아데닌 및 구아닌의 기타 알킬 유도체, 2-프로필, 및 아데닌 및 구아닌의 기타 알킬 유도체, 2-티오유라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로유라실 및 사이토신, 5-프로핀일 유라실 및 사이토신 및 피리미딘 염기의 기타 알킨일 유도체, 6-아조 유라실, 사이토신 및 티민, 5-유라실(슈도유라실), 4-티오유라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트라이플루오로메틸 및 기타 5-치환된 유라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 추가 변형된 염기는 삼환식 피리미딘, 예컨대 펜옥사진 사이티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조옥사진-2(3H)-온), 페노티아진 사이티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 예컨대 치환된 펜옥사진 사이티딘(예를 들어 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조옥스-아진-2(3H)-온), 카바졸 사이티딘 (2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 사이티딘(H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)을 포함한다. 변형된 염기는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예를 들어, 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 대체되는 것을 포함할 수 있다. 추가적인 핵염기는 미국 특허 제3,687,808호에 개시된 것, 문헌[The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 페이지 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것, 문헌[Englisch et al., 1991, Angewandte Chemie, International Edition, 30: 613]에 개시된 것, 및 문헌[Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, 페이지 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993]에 개시된 것을 포함한다. 특정 이들 염기는 결합 친화도를 증가시키는 데 유용하고, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로핀일유라실 및 5-프로핀일사이토신을 포함하는, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸사이토신 치환은 핵산 이중 가닥 안정성을 0.6 내지 1.2℃만큼 증가시키는 것으로 나타났고, 특정 양상에서 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합된다. 미국 특허 제3,687,808호; 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121호, 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,645,985호; 제5,830,653호; 제5,763,588호; 제6,005,096호; 제5,750,692 및 제5,681,941호를 참조하며, 이들의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
사전 결정된 서열의 폴리뉴클레오타이드의 제조방법은 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed. 1989) 및 F. Eckstein (ed.) Oligonucleotides and Analogues, 1st Ed. (Oxford University Press, New York, 1991)] 참조. 고체상 합성 방법은 폴리리보뉴클레오타이드와 폴리데옥시리보뉴클레오타이드 둘 다에 대해 바람직하다(DNA를 합성하는 잘 공지된 방법은 또한 RNA를 합성하는 데 유용하다). 폴리리보뉴클레오타이드는 또한 효소적으로 제조될 수 있다. 비-천연 유래 핵염기는 폴리뉴클레오타이드 내로도 혼입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,223,833호; 문헌[Katz, J. Am. Chem. Soc., 74:2238 (1951); Yamane, et al., J. Am. Chem. Soc., 83:2599 (1961); Kosturko, et al., Biochemistry, 13:3949 (1974); Thomas, J. Am. Chem. Soc., 76:6032 (1954); Zhang, et al., J. Am. Chem. Soc., 127:74-75 (2005); 및 Zimmermann, et al., J. Am. Chem. Soc., 124:13684-13685 (2002)] 참조.
금속-리간드 복합체 및 초분자 복합체는 일반적으로 길이로 약 5개의 뉴클레오타이드 내지 약 500개의 뉴클레오타이드, 또는 5 내지 약 100개의 뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 더 구체적으로는, 금속-리간드 복합체 및 초분자 복합체는 길이로 약 5 내지 약 90개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 5 내지 약 80개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 5 내지 약 70개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 5 내지 약 60개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 5 내지 약 50개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 5 내지 약 45개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 5 내지 약 40개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 5 내지 약 35개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 5 내지 약 30개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 5 내지 약 25개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 5 내지 약 20개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 5 내지 약 15개의 뉴클레오타이드, 길이로 약 5 내지 약 10개의 뉴클레오타이드인 폴리뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드가 목적으로 하는 결과를 달성할 수 있는 정도로 구체적으로 개시된 크기의 길이로 모든 폴리뉴클레오타이드 중합체를 포함한다. 따라서, 길이로 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100개 이상의 뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드가 상정된다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드는 또한 앱타머를 포함한다. 앱타머의 생성 및 용도는 당업자에게 공지된 바와 같다. 일반적으로, 앱타머는 표적 리간드에 단단히 결합할 수 있고, 조심 스럽게 구별될 수 있는 핵산 또는 펩타이드 결합 종이다(본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 문헌[Yan et al., RNA Biol. 6(3) 316-320 (2009)]). 앱타머는, 일부 실시형태에서, 기하급수적 농축에 의한 리간드의 체계적 발전(SELEX) 과정으로 불리는 기법에 의해 얻을 수 있다(문헌[Tuerk et al., Science 249:505-10 (1990)], 미국 특허 제5,270,163호, 및 미국 특허 제5,637,459호, 이들 각각은 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨). 핵산 앱타머의 일반적 논의는, 예를 들어 그리고 제한 없이, 문헌[Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols (Edited by Mayer, Humana Press, 2009) 및 Crawford et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2(1): 72-79 (2003)]에서 발견된다. RNA 앱타머의 선택, DNA 앱타머의 선택, 표적 단백질에 공유 결합할 수 있는 앱타머의 선택, 변형된 앱타머 라이브러리의 용도 및 진단제 및 치료제로서 앱타머의 용도를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 앱타머의 추가적인 논의는 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 문헌[Kopylov et al., Molecular Biology 34(6): 940-954 (2000), Molekulyarnaya Biologiya로부터 번역됨, Vol. 34, No. 6, 2000, pp. 1097-1113]에서 제공된다. 다양한 양상에서, 앱타머는 길이로 10 내지 100개의 뉴클레오타이드이다.
다양한 양상에서, 상기 방법은 표적 폴리뉴클레오타이드에 대해 100% 상보성, 즉, 완전한 매치인 폴리뉴클레오타이드의 사용을 포함하는 반면, 다른 양상에서, 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드의 길이에 대해 적어도(이상을 의미) 약 95% 상보성, 폴리뉴클레오타이드가 표적 유전자 산물의 목적으로 하는 저해를 달성할 수 있는 정도로 폴리뉴클레오타이드의 길이 이상으로 표적 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 약 90%, 적어도 약 85%, 적어도 약 80%, 적어도 약 75%, 적어도 약 70%, 적어도 약 65%, 적어도 약 60%, 적어도 약 55%, 적어도 약 50%, 적어도 약 45%, 적어도 약 40%, 적어도 약 35%, 적어도 약 30%, 적어도 약 25%, 적어도 약 20% 상보성이다. 혼성화 정도는 표적 폴리뉴클레오타이드의 얻어진 검출, 또는 유전자 산물 발현의 저해 정도보다 상당히 더 적다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
폴리뉴클레오타이드 밀도
본 명세서에 제공된 바와 같은 금속-리간드 복합체 및 초분자 복합체는 복합체 표면 상에서 폴리뉴클레오타이드 밀도를 가진다. 일부 양상에서, 세포에 의한 나노입자의 분해 및/또는 흡수에 대한 폴리뉴클레오타이드의 저항성은 복합체와 관련된 폴리뉴클레오타이드의 밀도에 의해 영향받는다. 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 PCT/US2008/65366에 기재된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드 기능화된 복합체 표면 상에서 폴리뉴클레오타이드의 고밀도는 세포에 의한 복합체의 증가된 흡수와 관련된다.
복합체 및 폴리뉴클레오타이드의 목적으로 하는 조합을 위해 복합체를 안정하게 만드는 데 적합한 표면 밀도 및 복합체를 얻는데 필수적인 조건은 경험적으로 결정될 수 있다. 광범위하게, 사용된 폴리뉴클레오타이드가 작을 수록, 해당 폴리뉴클레오타이드의 표면 밀도는 더 높을 수 있다. 일반적으로, 적어도 1p㏖/㎠의 표면 밀도는 안정한 복합체를 제공하는 데 적절할 것이다. 일부 양상에서, 표면 밀도는 적어도 10p㏖/㎠이다. 또한 폴리뉴클레오타이드가 적어도 2p㏖/㎠, 적어도 3p㏖/㎠, 적어도 4p㏖/㎠, 적어도 5p㏖/㎠, 적어도 6p㏖/㎠, 적어도 7p㏖/㎠, 적어도 8p㏖/㎠, 적어도 9p㏖/㎠, 적어도 10p㏖/㎠, 적어도 약 15p㏖/㎠, 적어도 약 20p㏖/㎠, 적어도 약 25p㏖/㎠, 적어도 약 30p㏖/㎠, 적어도 약 35p㏖/㎠, 적어도 약 40p㏖/㎠, 적어도 약 45p㏖/㎠, 적어도 약 50p㏖/㎠, 적어도 약 55p㏖/㎠, 적어도 약 60p㏖/㎠, 적어도 약 65p㏖/㎠, 적어도 약 70p㏖/㎠, 적어도 약 75p㏖/㎠, 적어도 약 80p㏖/㎠, 적어도 약 85p㏖/㎠, 적어도 약 90p㏖/㎠, 적어도 약 95p㏖/㎠, 적어도 약 100p㏖/㎠, 적어도 약 125p㏖/㎠, 적어도 약 150p㏖/㎠, 적어도 약 175p㏖/㎠, 적어도 약 200p㏖/㎠, 적어도 약 250p㏖/㎠, 적어도 약 300p㏖/㎠, 적어도 약 350p㏖/㎠, 적어도 약 400p㏖/㎠, 적어도 약 450p㏖/㎠, 적어도 약 500p㏖/㎠, 적어도 약 550p㏖/㎠, 적어도 약 600p㏖/㎠, 적어도 약 650p㏖/㎠, 적어도 약 700p㏖/㎠, 적어도 약 750p㏖/㎠, 적어도 약 800p㏖/㎠, 적어도 약 850p㏖/㎠, 적어도 약 900p㏖/㎠, 적어도 약 950p㏖/㎠, 적어도 약 1000p㏖/㎠ 이상의 표면 밀도에서 나노입자 중에 존재하는 방법이 제공된다.
복합체 내 폴리뉴클레오타이드의 밀도는 표면상에서 폴리뉴클레오타이드와의 및/또는 복합체 그 자체와의 특이적 생체분자 및/또는 비-생체분자 상호작용을 조절한다는 것이 상정된다. 다양한 조건 하에서, 일부 폴리펩타이드는 폴리뉴클레오타이드의 밀도에 의해 야기되는 입체 장애에 기반한 복합체의 부분인 폴리뉴클레오타이드와의 상호작용이 금지될 수 있다. 입체 장애에 의해 달리 불가능하게 된 생체분자 및/또는 비생체분자와 폴리뉴클레오타이드의 상호작용은 바람직한 양상에서, 복합체에서 폴리뉴클레오타이드의 밀도는 생체분자 및/또는 비-생체분자가 폴리뉴클레오타이드와 상호작용하는 것을 허용하도록 감소된다.
또한 폴리뉴클레오타이드 표면 밀도는 복합체와 관련된 폴리뉴클레오타이드의 안정성을 조절한다는 것이 상정된다. 따라서, 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 복합체가 제공되되, 폴리뉴클레오타이드는 복합체의 일부가 아닌 동일한 폴리뉴클레오타이드의 반감기와 적어도 실질적으로 동일한 반감기를 가진다. 다른 실시형태에서, 복합체와 관련된 폴리뉴클레오타이드는 복합체의 부분이 아닌 동일한 폴리뉴클레오타이드의 반감기보다 약 5% 초과 내지 약 1,000,000-배 초과인 반감기를 가진다.
표적 폴리뉴클레오타이드의 검출 방법
본 개시내용은 표적 분자를 본 명세서에 기재된 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 분자의 검출 방법을 제공한다. 접촉시키는 단계는, 다양한 양상에서, 개시내용에 의해 제공되는 바와 같이 유전자 발현의 조절을 초래한다. 다른 양상에서, 접촉시키는 단계는 검출 가능한 변화를 초래하되, 검출 가능한 변화는 표적 분자의 검출을 나타낸다. 검출 가능한 표지의 검출은 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 수행되며, 검출 가능한 표지는 금속-리간드 복합체 또는 초분자 복합체의 부분인 분자일 수 있거나 또는 표적 분자일 수 있다.
유전자 발현의 저해방법
본 개시내용에 의해 제공되는 추가적인 방법은 표적 폴리뉴클레오타이드를 본 명세서에 기재된 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 폴리뉴클레오타이드로부터 발현된 유전자 산물의 발현을 저해하는 방법을 포함하되, 접촉시키는 단계는 유전자 산물의 발현을 저해하는 데 충분하다. 유전자 산물의 저해는 표적 폴리뉴클레오타이드의 본 개시내용의 복합체와의 혼성화로부터 초래된다.
금속-리간드 복합체 또는 초분자 복합체의 부분인 폴리뉴클레오타이드의 서열은 표적 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 혼성화하기 위해 그의 표적 폴리뉴클레오타이드의 서열에 대해 100% 상보성일 필요는 없다는 것이 이해된다. 게다가, 금속-리간드 복합체 또는 초분자 복합체의 부분인 폴리뉴클레오타이드는 개재 또는 인접한 세그먼트가 혼성화 사건(예를 들어 그리고 제한 없이, 루프 구조 또는 헤어핀 구조)에 수반되지 않도록 하나 이상의 세그먼트에 걸쳐 표적 폴리뉴클레오타이드에 혼성화할 수 있다. 상보성 백분율은 금속-리간드 복합체 또는 초분자 복합체의 부분인 폴리뉴클레오타이드의 길이에 대해 결정된다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드의 20개의 뉴클레오타이드 중 18개가 총 길이 100개의 뉴클레오타이드의 표적 폴리뉴클레오타이드에서 20개의 뉴클레오타이드 영역에 대해 상보성인 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 금속-리간드 복합체 또는 초분자 복합체를 고려하면, 금속-리간드 복합체 또는 초분자 복합체의 부분인 폴리뉴클레오타이드는 90% 상보성이다. 이 예에서, 남아있는 비상보성 뉴클레오타이드는 상보성 뉴클레오타이드와 무리를 이루거나 산재될 수 있고, 서로 또는 상보성 뉴클레오타이드에 대해 인접할 필요는 없다. 표적 폴리뉴클레오타이드의 영역과 금속-리간드 복합체 또는 초분자 복합체의 부분인 폴리뉴클레오타이드의 상보성 백분율은 당업계에 공지된 BLAST 프로그램(기본적 국소 정렬 검색 도구) 및 PowerBLAST 프로그램을 이용하여 일상적으로 결정될 수 있다(Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656).
유전자 산물 발현을 저해하는 방법은 표적 유전자 산물의 발현이 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 금속-리간드 복합체 또는 초분자 복합체가 없을 때의 유전자 산물 발현에 비해, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%만큼 저해된다는 것을 포함한다. 다시 말해서, 제공된 방법은 표적 유전자 산물의 어느 정도의 발현의 저해를 본질적으로 초래하는 것을 포함한다.
저해 정도는 생체내에서 체액 샘플로부터 또는 생검 샘플로부터 또는 당업계에 잘 공지된 기법을 이미징함으로써 결정된다. 대안적으로, 저해 정도는 일반적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물의 사용으로부터 얻어진 생체내에서 예상될 수 있는 저해 정도의 예측 가능한 측정으로서 시험관내에서 세포 배양 분석에서 결정된다. 표적 폴리뉴클레오타이드의 저해가 주어진 세포에 대한 저해 효과를 평가하는 데 사용된다는 것은 본 개시내용에 의해 상정된다. 비제한적 예로서, 유전자 산물의 저해 효과를 연구할 수 있되, 유전자 산물은 신호 형질도입 경로의 부분이다. 대안적으로, 유전자 산물의 저해를 연구할 수 있되, 유전자 산물은 세포자멸사 경로에 수반된다는 가설을 세운다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법은 목적으로 하는 결과를 달성하기 위해 조합되어 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어 그리고 제한 없이, 본 명세서에 기재된 방법은 표적 폴리뉴클레오타이드를 검출할 뿐만 아니라 그의 발현을 조절하는 것을 허용하도록 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 조합은 시험관내 또는 생체내에서 시간에 따른 표적 폴리뉴클레오타이드 발현의 저해를 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 시간에 따른 정량화는, 일 양상에서 구체화된 시점에 배양물로부터 세포를 제거함으로써 그리고 각각의 시점에 표적 폴리뉴클레오타이드의 발현의 상대적 수준을 평가함으로써 달성된다. 일 양상에서 시간에 따라 검출 가능한 표지의 시각화를 통해 평가한 바와 같은 표적 폴리뉴클레오타이드 양의 감소는 표적 폴리뉴클레오타이드의 저해율을 나타낸다.
따라서, 표적 폴리뉴클레오타이드에 대해 혼성화하기 위해 그리고 표적 폴리뉴클레오타이드 발현을 저해하기 위해 주어진 폴리뉴클레오타이드의 유효성을 결정하는 것뿐만 아니라 세포 상에서 주어진 폴리뉴클레오타이드의 저해 효과를 결정하는 것은 고려되는 양상이다.
실시예
일반적 물질 및 방법: 3,5-다이아미노벤조산을 TCI 아메리카(TCI America)(오리건주 포틀랜드에 소재)로부터 구입하였다. 4-아지도-부탄-1-아민을 신토닉스 인코포레이티드(Synthonix, Inc.)(노스캐롤라이나주 웨이크 포레스트에 소재)로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오타이드 합성을 위한 모든 시약을 글렌 리서치사(Glen Research)(버지니아주 스털링에 소재)로부터 구입하고 나서, 제조업자의 설명서에 따라 사용하였다. 완충제 용액을 인비트로젠(Invitrogen)(캘리포니아주 칼스베드에 소재)으로부터 구입하였다. 중수소화된 용매를 캠브릿지 아이소토프 래버러토리즈 인코포레이티드사(Cambridge Isotope Laboratories Inc.)(매사추세츠주 앤도버에 소재)로부터 구입하였다. 금 나노입자를 테드 펠라(Ted Pella)(캘리포니아주 레딩에 소재)로부터 구입하였다. 아미콘(Amicon)(등록상표) 초 원심분리 필터 유닛을 EMD 밀리포어사(EMD Millipore)(매사추세츠주 빌러리카에 소재)로부터 구입하였다. 모든 다른 시약을 시그마-알드리치사(Sigma-Aldrich)(미조리주 세인트 루이스에 소재)로부터 구입하였고, 추가 정제 없이 사용하였다. 1H NMR 스펙트럼을 브루커 아반스(Bruker Avance) 400㎒ NMR 분광기 상에서 기록하였다. 'H NMR 스펙트럼을 중수소화된 용매 중에서 잔여 양성자 신호에 대해 내부에서 참조하였다. 화합물 3 및 4에 대한 13C NMR 스펙트럼을 100℃의 내부 온도에서 작동하는 애질런트(Agilent) DD2 500㎒ NMR 분광기 상에서 수집하였다. 전기분무 이온화(ESI) 질량 스펙트럼을 양성 이온화 방식으로 애질런트 6120 LC-TOF 기기 상에서 기록하였다. UV-Vis 스펙트럼 및 열변성 곡선을 경로 길이가 1㎝인 쿼츠 큐벳에서 애질런트 카리(Agilent Cary) 5000 UV-Vis 분광기 상에서 수집하였다. 매트릭스 지원 레이저 탈착/이온화 비행시간(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight: MALDI-ToF) 데이터를 기질 물질로서 2,5-다이하이드록시아세토펜온(DHAP)을 이용하는 브루커 오토플렉스(Bruker AutoFlex) III MALDI-ToF 질량 분광기 상에서 수집하였다. FTIR 스펙트럼을 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) 스펙트럼 100 FTIR 분광기 상에서 수집하였다. AFM 이미지를 포인트프로브-플러스(POINTPROBE-PLUS)(등록상표) 실리콘-SPM-센서(Silicon-SPM-Sensor)를 구비한 비접촉 방식으로 브루커 디멘션 아이콘(Bruker Dimension Icon) 원자력 현미경 상에서 수집하였다. TEM 이미지를 200kV의 가속 전압에서 작동하는 히타치(Hitachi) H8100 투과 전자 현미경 상에서 수집하였다. TEM 및 EDX 데이터를 2개의 써모 사이언티픽(Thermo Scientific) X선 EDX 검출기를 구비한 히타치(Hitachi) HD2300 STEM 상에서 수집하였다. 동적 광산란(Dynamic light scattering: DLS) 및 제타 퍼텐셜 측정을 제타사이저 나노 ZS(Zetasizer Nano ZS)(말번 인스트루먼츠 엘티디(Malvern Instruments Ltd)) 상에서 수집하였다. ICP-MS 데이터를 써모 X-시리즈 II ICP-MS 상에서 수집하였다. 원소 분석을 인터테크 파마슈티칼 서비스(Intertek Pharmaceutical Services)(뉴저지주 화이트하우스에 소재)에 의해 떨어진 곳에서 수행하였다.
Figure pct00011
다이아미노벤조산 모노- 하이드록시피리딘온 (2) 자기 교반기를 지니는 100㎖ 둥근 바닥 플라스크에 3,5-다이아미노벤조산(5.00g, 32.86m㏖), 말톨(8.70g, 69.00m㏖) 및 30㎖의 산성 n-프로판올(49:1 프로판올/12M HCl)을 첨가하였다. 반응 용기를 수랭식 컨덴서에 맞추고 나서, 혼합물을 16시간 동안 환류로 가열하였다. 얻어진 현탁액을 진공 여과시키는 한편 열 및 고체를 아세톤(200㎖)을 이용하여 세척하여 4.84 g의 (2)를 황갈색 분말(18.60m㏖, 57%)로서 수득하였다. 프로판올을 5:1 EtOH/H2O로 대체하여 유사한 수율을 얻었다. 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d6) 8 7.52 (d, J= 7.4 Hz, 1H), 7.28 - 7.26 (m, 1H), 6.92 (t, J= 1.7 Hz, 1H), 6.67 (t, J= 2.1 Hz, 1H), 6.16 (d, J= 7.3 Hz, 1H), 5.77 (s, 2H), 1.96 (s, 3H). 13C NMR (101 ㎒, DMSO-d6) 8 169.96, 167.24, 150.62, 145.45, 142.79, 138.07, 133.21, 129.02, 115.64, 115.35, 114.34, 111.30, 13.61. HRMS-ESI (m/z): [M+H]+ C13H13N2O4에 대한 계산치 261.0870, 계산치 261.0875.
Figure pct00012
다이아미노벤조산 비스 - 하이드록시피리딘온 (3) 자기 교반기를 지니는 100㎖ 둥근 바닥 플라스크에 (2)(5.90g, 22.67m㏖), 말톨(3.57g, 28.34m㏖), 및 30㎖의 산성 2-에톡시에탄올(49:1 에톡시에탄올/12M HCl)을 첨가하였다. 반응 용기를 수랭식 컨덴서에 맞추고 나서, 혼합물을 64시간 동안 환류로 가열하였다. 얻어진 현탁액을 진공 여과시키는 한편 열 및 고체를 물(50㎖), 다음에 아세톤(50㎖)을 이용하여 세척하여 순갈색 고체로서 조질의 생성물을 얻었다. 비스 생성물을 비등 피리딘(100㎖)으로부터의 침전, 여과, 및 뜨거운 다이메틸폼아마이드(100㎖)로부터의 추가 침전 및 진공에서 건조에 의해 선택적으로 단리시켜 메탄올 중에서 드물게 가용성이고, 뜨거운 DMSO 및 DMF 중에서 가용성인 회색 분말로서 0.98 g의 (3)(2.66m㏖, 12%)을 얻었다. 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d6) 8 8.03 (d, J= 2.0 Hz, 2H), 8.00 (t, J= 2.0 Hz, 1H), 7.64 (d, J= 7.4 Hz, 2H), 6.22 (d, J= 7.4 Hz, 211), 2.02 (s, 6H). 13C NMR (126 ㎒, DMSO-d6) 8 170.43, 165.59, 145.52, 142.92, 138.79, 138.26, 134.82, 130.74, 130.47, 128.55, 111.45, 111.28, 13.79, 13.60. HRMS-ESI (m/z): [M+H]+ C19H17N2O6에 대한 계산치 369.1081, 실측치 369.1084.
Figure pct00013
다이아미노벤조산 비스 - HP 아자이드 (4) 자기 교반기를 지니는 50㎖ 둥근 바닥 플라스크에 무수 DMSO(30㎖) 중에서 완전히 용해시킨 (3)(0.400g, 1.09m㏖)을 첨가하였다. HATU(0.414g, 1.09m㏖) 및 다이아이소프로필에틸아민(0.48㎖, 2.73m㏖)을 후속적으로 첨가하고 나서, 반응 용기를 고무 마개로 캡핑하였다. 5분 후에, 4-아지도부탄-1-아민(0.187g, 1.64m㏖)을 주사기를 통해 주입하고 나서, 혼합물을 4시간 동안 N2 하에서 교반시켰다. 유기상을 1 용적의 물로 희석시키고 나서, 1시간 동안 방치하였다. 얻어진 회색 침전물을 진공 여과에 의해 수집하고 나서, 물(150㎖)로 광범위하게 세척한 다음, 아세토나이트릴(100㎖)로 세척하고, 필터 상에서 건조시켰다. 얻어진 아자이드 단량체(4)를 추가 정제 없이 사용하였다. (0.283g, 0.61m㏖, 56%). 1H NMR (400 ㎒, DMSO-d6) 8 8.72 (t, J= 5.7 Hz, 1H), 8.00 (d, J= 2.0 Hz, 2H), 7.91 (t, J= 1.9 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 7.3 Hz, 211), 6.23 (d, J= 7.4 Hz, 211), 3.41 - 3.19 (m, 411), 2.03 (s, 611), 1.60 -1.53 (m, 411). 13C NMR (126 ㎒, DMSO-d6) 8 170.41, 164.21, 145.55, 142.74, 138.81, 138.27, 137.87, 128.68, 128.54, 126.92, 126.78, 111.39, 111.23, 51.14, 39.56, 26.72, 26.37, 13.81, 13.62. HRMS-ESI (m/z): [M+H]+ C23H25N6O5에 대한 계산치 465.1881, 실측치 465.1881. FTIR (KBr): vmax. 2093㎝-1 (N=N=N 신장).
DABA - 비스 -HP-N3 ICP 입자(ICP-N3 NP)의 합성 전형적인 실험에서, 2.28mM 리간드 및 24.5mM NaOH로 이루어진 DABA-비스-HP-N3의 수성 저장 용액을 준비하였다. 리간드는 그의 2나트륨 염으로서 수 중에서 자유롭게 가용성이다. 10.80mM Fe3+ 및 4mM HCl(안정제로서)로 이루어진 Fe(NO3)3·9H2O의 저장 용액을 준비하였다. 유리 바이알에 877㎕ 리간드 저장 용액, 다음에 1㎖ 밀리-큐(Milli-Q) H2O, 다음에 123㎕ Fe(III) 저장액을 첨가하고 나서, 얻어진 오렌지-적색 혼합물(2㎖)을 10분 동안 진탕시켰다. 합성한 그대로의 입자는 평균 직경이 10 내지 20㎚(DLS)의 범위이다. 입자를 공칭 분자량 컷오프(MWCO) 100kDa로 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 15㎖ 원심분리 필터를 통한 여과에 의해 정제하고 나서, 3 x 3㎖ 부분의 밀리-큐 H2O로 세척하고, 각각 10분 동안 5000rcf에서 회전시켰다. 입자를 2㎖의 H2O 중에서 재현탁시켜 대략의 아자이드 농도 1mM을 제공하였다. 입자 용액을 동결건조시키고 나서, 얻어진 진한 적색 분말을 FTIR(KBr)에 의해 특성규명하였는데, 2093㎝-1에서 특징적 아자이드 신장이 나노입자 합성 후에 유지된다는 것을 나타낸다.
ICP-N3 나노입자의 특성규명: 금속-리간드 결합의 화학량론을 결정하기 위해, 본 발명자들은 적정을 수행하되, 1㎖ H2O 중의 고정된 농도의 200μM DABA-비스-11P-N3(4)을 함유하는 샘플을 각각 0 내지 220μM 범위의 Fe(NO3)3·9H2O의 양을 증가시키면서 제조하였다. 460㎚에서의 흡광도를 각각의 샘플에 대해 측정하였다. 460㎚에서의 LMCT 밴드는 트리스-HOPO-Fe3 + 배위 복합체의 특징이다. 등가 지점은 Fe2L3 화학량론과 일치되게 133μM(0.66 당량)에 도달되었다(도 5). 흡광도의 추가적인 증가는 비협동 철 전구체 염의 존재에 기인한다. 추가적으로, 본 발명자들은 입자의 동결건조된 샘플에 대한 원소 분석을 수행하여 그들의 조성을 평가하였다. C69H66Fe2N18O15에 대한 계산치: C 55.28%, H 4.44%, N 16.82%. 실측치 C 49.10%, H 4.18%; N 14.18%. 더 낮게 관찰된 유기물 함량은 ICP 입자의 다공성 특성 및 극성 용매 분자, 예를 들어 H2O를 잡는 그들의 능력에 의해 설명될 수 있다. 마지막으로, 본 발명자들은 에너지 분산 X선 분광학(히타치 H2300-A STEM)에 의해 순수 ICP를 연구하였다.
ICP-MS 및 UV-Vis를 밀리큐 H2O 중에서 입자의 흡광 계수(ε460)를 결정하기 위해 함께 사용하였다. 간략하게, H2O 중의 ICP-N3 입자의 5종의 샘플을 희석을 달리하여 준비하고, 460㎚에서의 흡광도를 UV-Vis에 의해 측정하였다. 후속적으로, 각각의 샘플의 철 농도를 ICP-MS에 의해 결정하였다. 각각의 샘플을 3% HNO3, 5 ppb 인듐(내부 표준) 및 탈이온수로 이루어진 기질 중에서 제조하였다. 철 농도를 A460에 대해 플롯팅하고 나서, 데이터를 단순한 선형 회귀 모델에 의해 적합화하였다. 선의 기울기는 ICP-N3 입자의 LMCT로부터 생기는 약 2870 L
Figure pct00014
㏖l㎝-1의 ε460 에 대응하여, 철 농도의 분광학적 결정을 허용한다.
상기 절차에 의해 생성된 입자의 중량은 10 내지 1000kDa의 범위에 있을 것으로 예상되는데, 합성된 그대로의 입자의 작은 부분인 100kDa 컷오프 필터를 통과하기 때문이다. 이 관찰을 뒷받침하면, 다이토픽 3,4-HOPO에 대한 예측된 중합도는 3,4-HOPO-Fe(III) 복합체의 문헌 안정도 상수로부터 추정할 때, 상기 주어진 반응 조건 하에서 대략 1000개의 반복 단위이다.
모든 DNA 합성을 비-뉴클레오사이드 포스포르아미다이트에 대한 추가 5분 결합 시간으로 표준 제조업자 트라이틸-온(trityl-on) 프로토콜에 따라 바이오오토메이션(BioAutomation) MM48 DNA 합성기 상에서 수행하였다. Ac-dC 및 dmf-dG 포스포르아미다이트를 사용하여 핵염기의 실온 탈보호를 가능하게 하였다. 올리고뉴클레오타이드를 1μ㏖ 규모로 합성하고 나서, 실온에서 2시간 동안 탈보호시킨 폴리(CCT)-Cy5-함유 올리고뉴클레오타이드를 제외하고 실온에서 17시간 동안 진한 NH4OH(30%) 중에서 탈보호시켰다. 얻어진 조질의 올리고뉴클레오타이드를 45분에 걸쳐 트라이에틸암모늄 아세테이트 완충제(pH 7.0) 중의 0 내지 75% 아세토나이트릴의 구배를 이용하여 다이나맥스 마이크로소브(DynaMax Microsorb) C18 칼럼에 맞춘 배리언 프로스타 HPLC(Varian Prostar HPLC) 상에서 정제하였다. 용리액의 광학적 흡광도를 DBCO-함유 올리고뉴클레오타이드에 대해 254/310㎚, Cy5-함유 올리고뉴클레오타이드에 대해 254/649㎚, 및 모든 다른 올리고뉴클레오타이드에 대해 254/280㎚에서 모니터링하였다. DBCO-말단 올리고뉴클레오타이드를 동결건조시키고 나서, H2O 중에서 재현탁시키고, ICP-N3 나노입자에 즉시 컨쥬게이팅하였다. 문헌[Hurst et al., Anal. Chem ., 2006, 78:8313-8318]에 기재된 바와 같이 이황화물-말단 올리고뉴클레오타이드를 동결건조시키고 나서, 유리 티올로 환원시키고, AuNP에 컨쥬게이팅시켰다.
Figure pct00015
AuNP-DNA 컨쥬게이트의 합성 및 특성 규명: 이 연구에서 합성한 AuNP-SNA를 확립한 프로토콜에 따라 준비하였다.3 세포 흡수 실험에서 사용한 AuNP-SNA에 대해, 올리고뉴클레오타이드/AuNP의 수를 형광 측정에 의해 결정하였다. AuNP-SNA에 대한 올리고뉴클레오타이드 부하를 Cy5 표지 AuNP-SNA의 5nM 용액을 이용하여 정량화하였다. Au 코어를 탈이온수 중에서 희석시킨 100mM KCN을 이용하여 용해시켰다. 이어서, 혼합물을 실온에서 20분 동안 인큐베이션시키고 나서, 얻어진 형광을 표준 곡선에 대해 측정하였다. 표준 곡선은 농도 범위에서 등가 올리고뉴클레오타이드 서열로 이루어졌고, 수 중에서 용해시키고, KCN으로 처리하며, SNA와 동일한 방식으로 인큐베이션하였다. 모든 형광 측정은 시너지(Synergy) H4 형광 플레이트 판독기(바이오텍(BioTek))을 이용하여 이루어졌다. 세포 흡수 실험에 대한 양성 대조군으로서 사용한 CCT-Cy5-AuNP에 대한 부하는 113개 가닥/입자(CCT-Cy5-AuNP)였다. Cy5-T20-AuNP에 대한 부하는 157개 가닥/입자(Cy5-T20-AuNP)였다. 비형광 AuNP-SNA(A-AuNP)에 대해 유사한 값을 추정하였다.
DNA-ICP 컨쥬게이트의 합성: 전형적인 절차에서, 2㎖ 밀리큐 H2O 중에서 100μM의 목적으로 하는 사이클로옥틴-DNA, 0.5M NaCl 및 ICP-N3 입자(아자이드 중의 500μM)를 함유하는 용액을 준비하였다. 얻어진 맑은, 오렌지색 용액을 37℃에서 16시간 동안 진탕시켰다. 반응 혼합물을 아미콘(Amicon)(등록상표) 울트라 15㎖ 원심분리 필터(100kDa MWCO)를 통한 한외여과에 의해 정제하고 나서, 0.1M 트리스 완충제(pH 8.0)의 4 x 3㎖ 부분으로 세척하고, 5000rcf에서 10분 동안 회전시켰다. 입자를 1㎖의 0.1M 트리스(pH 8.0) 중에서 재현탁시켰다. DNA-ICP 입자는 1M NaCl 중에서 수 분 내에 침전하는 순수 ICP-N3 입자와 대조적으로 고염 농도(1M NaCl까지)에서 콜로이드로 안정하게 남아있었다. 이 관찰은 안정화 DNA 표면층이 입자에 성공적으로 컨쥬게이팅되었다는 것을 나타낸다.
DNA-ICP 컨쥬게이트의 특성규명: DNA-ICP 입자의 크기, 전하 및 DNA-부하를 DLS, 제타 퍼텐셜 및 UV-Vis에 의해 분석하였다. 입자 용액의 DNA 농도를 비(A260/A460)를 이용하여 UV-Vis에 의해 결정하였다. 밀리큐 H2O 중의 순수 입자는 약 5.4의 A260/A460를 가진다. 10.9 내지 15.5에서 변하는 A260/A460 비를 갖는 DNA-장식 입자를 합성하였는데, 이는 입자에 부착된 DNA의 존재를 나타낸다. 용액 중에 남아있는 유리 DNA가 없음을 보장하기 위해 광범위 세척을 수행하였다. Cy5-함유 DNA의 부하는 잠재적으로 염료 표지의 입체 벌크에 기인하여 상당히 더 낮았다. 최종적으로, 순수 및 DNA-부하 ICP의 제타 퍼텐셜을 10mM 트리스 완충제(pH 8.0) 및 0.1M NaCl 중의 동일한 희석에서 제조한 모든 샘플과 비교하였다. 다음의 데이터를 본 명세서에서 합성한 ICP 입자에 대해 수집하였다:
Figure pct00016
열 변성 연구: 17개의 염기쌍 중복(A-ICP) 및 (B-ICP)을 지니는 상보성 서열을 보유하는 DNA-ICP 입자를 0.1M 트리스 완충제(pH 8.0) 중의 다양한 염 농도에서 혼합하고 나서, 분 당 0.25℃의 속도로 20℃에서 80℃로 가열하였다. 실온에서, 상보성 DNA-ICP를 혼합하고 30 내지 60분 내에 불용성 응집물이 형성되었다. 가열 시, ICP 입자의 높은 DNA 표면 로딩과 일치되는 급격한 용융 전이를 관찰하였다. 미스매칭 서열을 지니는 DNA-ICP의 쌍(B-ICP 및 비표적-ICP)에 대해 동일한 거동이 관찰되지 않았다. 유리 DNA 이중가닥은 NaCl 농도에 따라서 DNA-ICP에 대한 60℃ 초과에 비교하여 0.3M NaCl 중에서 54℃의 융점을 가진다. 금 나노입자/DNA-ICP 쌍(A-AuNP 및 B-ICP)을 이용하여 동일한 실험을 반복하였다. NaCl 농도를 증가시킬 때의 결과를 도 6에 나타낸다.
DABA-BI-HP-N3 리간드의 MTT 독성 분석: 입자 코어를 포함하는 모 리간드를 보장하는 것은 세포 독성을 나타내지 않았고, MTT 분석을 수행하였다. C166 세포를 웰 당 5x103개 세포의 집단에서 96-웰 플레이트에 파종하였다. 24시간 후에, 세포를 0.1㎖의 화합물(3)(옵티멤(OptiMEM) 중의 1μM)로 처리하고 나서, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 화합물을 세포로부터 제거하고 나서, 0.1㎖의 완전 DMEM(10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충)으로 대체하였다. 세포 생존도를 세포에 대한 화합물 3의 첨가 후 24시간, 48시간 및 72시간에 MTT 분석에 의해 측정하였다. 간략하게, 세포를 0.1㎖의 완전 DMEM과 함께 인큐베이션시켰다. 10㎕의 MTT 용액(1x PBS 중의 5㎎/㎖ MTT; 몰레큘러 프로브(Molecular Probes))을 각각의 세포 웰에 첨가하고 나서, 세포를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 0.1㎖의 SDS-HCl 용액(0.01M HCl 중의 0.1 g/㎖ SDS)을 각각의 웰에 첨가하여 포마잔 생성물을 안정화시켰고, 세포를 추가로 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 밤새 인큐베이션 후에, 세포 용해물의 흡광도를 시너지 114 멀티모드 마이크로플레이트 판독기(바이오텍)를 이용하여 570㎚에서 측정하였다. 옵티멤에서 DMSO로 처리한 세포를 함유하는 대조군 웰에 대한 상대적 세포 생존도를 계산하였다. 보고한 값은 도 7에 나타낸 바와 같이 3개의 독립적 실험의 평균 ± SE를 나타낸다.
세포 배양 흡수 연구: 공초점 현미경에 의한 세포 흡수를 시각화하기 위해, 자궁경부암(헬라(HeLa)) 및 C166 마우스 내피 세포를 10% 소 태아 혈청(아틀란타 바이올로지컬스(Atlanta Biologicals)) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(라이프 테크놀로지즈)으로 보충한 DMEM에서 배양시켰다.
모든 현미경을 SP5 레이저 주사 공초점 현미경을 이용하여 수행하였다. Nunc Lab-Tek II 보로실리케이트-바닥 챔버 슬라이드(써모 사이언티픽)에서 대략 30% 합류에서 보충한 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, 라이프 테크놀로지즈) 중에서 헬라 세포를 배양시킴으로써 세포 이미지를 얻었다. 세포를 24시간 동안 부착시키고, 이후에 그들을 PBS로 1회 세척하고 나서, 옵티멤에서 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 100nM(DNA 기준)의 농도로 선형 DNA, SNA, 또는 ICP 중 하나로 처리하였다. 24시간 후에, 세포를 옵티멤으로 1회 세척하고 나서, 호크스트 33258(라이프 테크놀로지즈)을 함유하는 DMEM 중에서 재현탁시켰다. 유세포분석기에 대해 등가 방법을 사용하였지만, 그러나 세포를 호크스트로 처리하지 않았고, 대신 05% 트립신-EDTA(GIBCO) 중에서 3분 동안 트립신 처리하고 나서, 옵티멤에서 재현탁시키고, 633㎚ 레이저를 구비한 구아바 이지사이트(Guava Easycyte) 8HT(밀리포어)를 이용하여 분석하였다.
세포 흡수의 육안 시각화를 위해, MCF-7 세포를 6개의 웰 플레이트(400,000개 세포/웰)에 플레이팅하였다. DMEM + 10% FBS 함유 배지에서 24시간 동안 세포를 인큐베이션한 후에, 세포 배지를 옵티멤으로 바꾸고, DNA-ICP의 다음의 농도를 개개 웰에 첨가하였다: 0.0, 0.1, 0.5, 1.0, 2 및 5μM. 입자를 24시간 동안 세포에서 인큐베이션하고 나서, 이후에 세포를 PBS 중에서 3회 세척하고, 세포를 새로운 배지로 보충하고 나서, 세포를 추가 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 이후에, 세포를 엄격하게 세척하여 임의의 세포밖 ICP 입자를 제거하고, 트립신처리하고 나서, PBS를 함유하는 1.5㎖ 에펜도르프관에 즉시 옮겼다. 이어서, 세포를 1100 RPM에서 5분 동안 원심분리시켜 세포 펠렛을 형성하였다.
웨스턴 블롯 및 유전자 넉다운 분석: SKOV3 세포를 미국 조직 배양 수집(ATCC)으로부터 얻었다. 세포를 10% 열-비활성 FBS로 보충한 맥코이(McCoy) 5A 배지에서 37℃로 5% CO2 중에서 인큐베이션시켰다. 세포를 ICP로 처리하기 전에 24시간 파종한 웰 당 100,000개 세포를 지니는 6웰 세포 배양 플레이트(BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))에서 배양시켰다. 배지를 ICP 또는 리포펙타민 RNAimax(라이프 테크놀로지즈) DNA에 의한 처리 직전에 옵티-멤(라이프 테크놀로지즈)으로 대체하였다. 25p㏖의 DNA를 전달하기 위해 제조업자의 설명서에 따라 리포펙타민 형질감염을 수행하였다. 12시간 후에, 배지를 새로운 배지(10% FBS를 지니는 맥코이 5A)로 대체하고 나서, 세포를 다른 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 세포를 PBS로 3회 세척하고 나서, 트립신처리하고, 펠렛을 프로테아제 및 포스파타제 저해제(써모 사이언티픽)를 함유하는 100㎕의 포유류 세포 용해 완충제(셀 시그널링(Cell Signalling)) 중에서 재현탁시켰다. 이어서, 전체 세포 용해물을 정제하고 나서, 원심분리에 의해 수집하고, -80℃에서 냉동시켰다. BCA 단백질 분석 키트(BCA Protein Assay Kit)(피어스(Pierce))를 이용하여 단백질 농도를 결정하였다. 동일한 양의 단백질 샘플(25㎍)을 4 내지 20% 프리캐스트(precast) 구배 겔(바이오-라드(Bio-Rad))에 의해 분획화하고 나서, 나이트로셀룰로스 막(써모 사이언티픽)에 옮겼다. 막을 밤새 건조시키고 나서, PBS로 재수화시키고, 이어서, 차단 완충제(LI-COR 바이오사이언시즈) 중에서 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. HER2에 대해 토끼 1차 항체(1000:1)(셀 시그널링), 베타-튜불린에 대한 마우스 항체(1000:1)(써모 사이언티픽) 및 항-토끼 또는 항-마우스 IgG-염료 컨쥬게이팅된 2차 항체(10,000:1)(LI-COR 바이오사이언시즈(LI-COR Biosciences))를 이용하여 단백질을 검출하였다. 형광 신호를 기록하고 나서, 오디세이 적외선 이미징 시스템(Odyssey Infrared Imaging System)(LI-COR 바이오사이언시즈)을 이요하여 형광 신호를 기록하고 정량화하고 나서, 이미지 스투디오 소프트웨어(Image Studio software)(LI-COR 바이오사이언시즈)를 이용하여 정량화하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Mirkin, et al. <120> Biocompatible Infinite Coordination Polymer Nanoparticle-Nucleic Acid Conjugates For Antisense Gene Regulation <130> 30938/2014-110 <150> US 62/039,696 <151> 2014-08-20 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' DBCO-TEG <400> 1 aaaaaatcct tatcaatatt t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' DBCO-TEG <400> 2 aaaaaatcct tatcaatatt t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Hexane thiol <400> 3 aaaaaatcct tatcaatatt t 21 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' DBCO <400> 4 ctccatggtg ctcac 15 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' DBCO <400> 5 ctccttcacc ttcgcgcagc 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' DBCO-TEG <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is Cy5 <400> 6 cctcctcctc ctcctcct 18 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Hexane thiol <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Cy5 <400> 7 cctcctcctn cctcctcct 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is Cy5 <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> Propane thiol <400> 8 nttttttttt tttttttttt t 21

Claims (28)

  1. 하기 구조를 갖는 화합물:
    Figure pct00017

    식 중,
    L은 C1- 20알킬렌 또는 -C(O)NH-C1- 20알킬렌이고; 그리고
    n은 1 또는 2이다.
  2. 제1항에 있어서, n은 1인, 화합물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 피리돈 모이어티가 파라 위치에서 페닐에 부착된, 화합물.
  4. 제1항에 있어서, n은 2인, 화합물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 피리돈 모이어티가 각각의 메타 위치에서 페닐에 부착된, 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, L은 C1- 20알킬렌인, 화합물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, L은 -C(O)NH-C1- 20알킬렌인, 화합물.
  8. 하기를 포함하는 모이어티를 말단에 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    Figure pct00018

    식 중,
    L은 C1- 20알킬렌 또는 -C(O)NH-C1- 20알킬렌이고; 그리고
    n은 1 또는 2이다.
  9. 제8항에 있어서, n은 1인, 폴리뉴클레오타이드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 피리돈 모이어티가 파라 위치에서 페닐에 부착된, 폴리뉴클레오타이드.
  11. 제8항에 있어서, n은 2인, 폴리뉴클레오타이드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 피리돈 모이어티가 각각의 메타 위치에서 페닐에 부착된, 폴리뉴클레오타이드.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, L은 C1- 20알킬렌인, 폴리뉴클레오타이드.
  14. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, L은 -C(O)NH-C1- 20알킬렌인, 폴리뉴클레오타이드.
  15. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드의 말단은 구조식
    Figure pct00019
    .
    Figure pct00020
    또는 이들의 혼합물을 갖고,
    L2는 C1-10 알킬렌, -C(O)-C1-10 알킬렌-Y-, 및 -C(O)-C1-10 알킬렌-Y-C1-10 알킬렌-(OCH2CH2)m-Y-이며;
    각각의 Y는 결합, C(O), O, NH, C(O)NH 및 NHC(O)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고; 그리고
    m은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5인, 폴리뉴클레오타이드.
  16. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 DNA를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  17. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 5 내지 100개의 핵염기를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  18. 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 및 Fe(III)을 포함하는 금속-리간드 복합체.
  19. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 화합물 및 Fe(III)을 포함하는 금속-리간드 복합체.
  20. 제19항에 있어서, Fe2(화합물)3의 반복 화학식을 갖는 무한 배위 중합체의 형태인, 금속-리간드 복합체.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 트라이아졸 결합을 형성하기 위해 폴리뉴클레오타이드 상의 알킨 모이어티를 통해 상기 화합물 상의 아자이드 모이어티에 공유 부착된 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는, 금속-리간드 복합체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 화합물 상의 표면 아자이드를 통해 부착되는, 금속-리간드 복합체.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항의 제1 금속-리간드 복합체 및 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항의 제2 금속-리간드 복합체를 포함하는 초분자 복합체로서, 상기 제1 금속-리간드 복합체의 상기 폴리뉴클레오타이드는 적절한 조건 하에서 혼성화되도록 상기 제2 금속-리간드 복합체의 상기 폴리뉴클레오타이드에 대해 충분히 상보성인, 금속-리간드 복합체.
  24. 표적 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 유전자 산물의 발현을 저해하는 방법으로서, 상기 유전자 산물의 발현을 저해하기에 충분한 조건 하에서 상기 표적 폴리뉴클레오타이드를 제22항의 초분자 복합체 또는 제21항 또는 제22항의 금속-리간드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 유전자 산물의 발현을 저해하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 유전자 산물의 발현은 생체내에서 저해되는, 유전자 산물의 발현을 저해하는 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 유전자 산물의 발현은 시험관내에서 저해되는, 유전자 산물의 발현을 저해하는 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 산물의 발현은 상기 표적 폴리뉴클레오타이드를 상기 초분자 복합체 또는 상기 금속-리간드 복합체와 접촉시키는 일이 없을 때의 상기 유전자 산물의 발현에 비해서 적어도 약 5%만큼 저해되는, 유전자 산물의 발현을 저해하는 방법.
  28. 표적 분자를 검출하는 방법으로서, 상기 표적 분자를 제22항의 초분자 복합체 또는 제21항 또는 제22항의 금속-리간드 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 표적 분자와 상기 초분자 복합체 또는 상기 금속-리간드 복합체 사이의 접촉은 검출 가능한 변화를 초래하는, 표적 분자를 검출하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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MX2017002085A (es) 2014-08-19 2017-08-21 Univ Northwestern Tratamientos con nanopartículas núcleo-corteza de proteína/oligonucleótido.
JP2017537619A (ja) 2014-11-21 2017-12-21 ノースウェスタン ユニバーシティ 球状核酸ナノ粒子複合体の配列特異的細胞内取込
CA3023451A1 (en) 2016-05-06 2017-11-09 Exicure, Inc. Liposomal spherical nucleic acid (sna) constructs presenting antisense oligonucleotides (aso) for specific knockdown of interleukin 17 receptor mrna
WO2018039629A2 (en) 2016-08-25 2018-03-01 Northwestern University Micellar spherical nucleic acids from thermoresponsive, traceless templates
WO2018201090A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Exicure, Inc. Synthesis of spherical nucleic acids using lipophilic moieties
WO2018209270A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 Northwestern University Adoptive cell therapy using spherical nucleic acids (snas)
CN109420177B (zh) 2017-08-28 2022-03-04 香港中文大学 用于有效体内递送dna纳米结构至动脉粥样硬化斑块的材料和方法
CN111110846B (zh) * 2018-10-30 2021-07-23 国家纳米科学中心 一种金属-核酸纳米颗粒及其制备方法和用途
CN109975540B (zh) * 2019-04-04 2022-02-11 扬州大学 一种核酸抗体修饰的免疫金探针及其制备方法和应用
US20230088835A1 (en) * 2020-03-02 2023-03-23 Northwestern University Fit-flares for detection of intracellular analytes in live cells
US11530406B1 (en) 2021-08-30 2022-12-20 Sachi Bioworks Inc. System and method for producing a therapeutic oligomer
CN118516151A (zh) 2023-02-17 2024-08-20 英菲诺姆国际有限公司 多用途氧吡啶酮和它们的功能用途
JP2024117722A (ja) 2023-02-17 2024-08-29 インフィニューム インターナショナル リミテッド 多目的オキシピリジノン及びその機能的使用
KR20240128568A (ko) 2023-02-17 2024-08-26 인피늄 인터내셔날 리미티드 다목적 옥시피리디논 및 그의 기능적 용도
JP2024117721A (ja) 2023-02-17 2024-08-29 インフィニューム インターナショナル リミテッド 多目的オキシピリジノン及びその機能的使用

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
EP0366685B1 (en) 1987-06-24 1994-10-19 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5637459A (en) 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
DE69126530T2 (de) 1990-07-27 1998-02-05 Isis Pharmaceutical, Inc., Carlsbad, Calif. Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US7223833B1 (en) 1991-05-24 2007-05-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid conjugates
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
EP0637965B1 (en) 1991-11-26 2002-10-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5912340A (en) 1995-10-04 1999-06-15 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Selective binding complementary oligonucleotides
EP1072679A3 (en) 1999-07-20 2002-07-31 Agilent Technologies, Inc. (a Delaware corporation) Method of producing nucleic acid molecules with reduced secondary structure
US20090221095A1 (en) 2005-10-13 2009-09-03 Northwestern University Colorimetric Screening of DNA Binding/Intercalating Agents with Gold Nanoparticle Probes
WO2008151049A2 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Northwestern University Nucleic acid functionalized nanoparticles for therapeutic applications
US20120288935A1 (en) * 2009-09-23 2012-11-15 Northwestern University "Click" Nanoparticle Conjugates

Also Published As

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