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CN102559739B - 重组人源lect2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法 - Google Patents

重组人源lect2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法 Download PDF

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CN102559739B
CN102559739B CN201210018774.8A CN201210018774A CN102559739B CN 102559739 B CN102559739 B CN 102559739B CN 201210018774 A CN201210018774 A CN 201210018774A CN 102559739 B CN102559739 B CN 102559739B
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lect2
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albumen
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pichia spp
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陈炯
史雨红
章瑞程
陆新江
李长红
李明云
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Ningbo University
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Ningbo University
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Abstract

本发明公开了重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法,特点是包括将人工合成的人源LECT2基因插入胞外表达载体pPICZαA中构建重组表达质粒的步骤;酶切线性化后电击导入毕赤酵母X33中,获得重组工程菌株的步骤;经过摇瓶发酵和甲醇诱导,实现重组人源LECT2蛋白的分泌表达的步骤;再利用柱层析进行纯化制备得到纯度为95%以上的重组人源LECT2蛋白的步骤,优点是首次提出了重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中得分泌表达和纯化制备方法,采用毕赤酵母大量表达高活性的重组人源LECT2蛋白,具有稳定、产量高、活性强等优势,可用于制药和诊断检测。

Description

重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域,尤其是涉及重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的分泌表达和纯化制备方法。
背景技术
LECT2蛋白,即白细胞衍生趋化因子2 (leukocyte cell-derived chemotaxin 2)是一个多功能的蛋白质,分子量约为16 kDa,含三个分子内二硫键。LECT2蛋白最初被鉴定为趋化因子,但越来越多的文献表明,LECT2蛋白更类似于细胞因子,是一个多功能的蛋白。报道表明,在小鼠刀豆碱性肝损伤模型试验中,LECT2蛋白的表达瞬时减少;在类风湿性关节炎发展中,血液LECT2蛋白含量与病症严重程度呈负相关;它能触发肝再生的早期事件,表现为肝细胞增殖的伴生抑制;它能通过抑制血管增生达到抑制肝癌的生长和迁移;它也与肾淀粉样病变紧密相关。因此,LECT2蛋白被认为是一种潜在的相关疾病治疗药物和分子诊断标记。
LECT2蛋白的制备可以从血清中分离纯化,但由于血清少,含量低,如果从血清中分离提取LECT2蛋白,产量极低,成本极高,并且不同物种的LECT2蛋白不能替代,因此无法规模化生产。在外源基因表达系统中,原核表达系统产量高,成本低,但用于表达真核基因有重大缺陷,由于缺少翻译后的加工修饰,表达产物的生物学活性往往会受到影响。真核表达系统中的中国仓鼠卵巢细胞表达系统,活性较高,但产量低,并且细胞培养成本很高。真核表达系统中的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统,表达量大,并且具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后加工修饰功能,重组蛋白生物学活性高,是表达真核基因的理想系统之一。但是,目前国内外均未见采用毕赤酵母表达制备重组人源LECT2蛋白并进一步进行纯化制备的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种表达水平高、生产成本低及产量高的重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:将人工合成的人源LECT2基因插入胞外表达载体pPICZαA中;酶切线性化后电击导入毕赤酵母X33中,获得重组工程菌株;经过摇瓶发酵和甲醇诱导,实现重组人源LECT2蛋白的分泌表达;再利用柱层析进行纯化制备得到纯度为95%以上的重组人源LECT2蛋白,步骤如下:
(1)构建重组表达质粒
抽取人外周血细胞中RNA,逆转录合成cDNA得到人源LECT2蛋白基因序列,登录号为NM002302,以此为模板设计引物进行PCR扩增人源LECT2蛋白,将含人源LECT2基因的PCR扩增产物用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切,将用相同限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切的的质粒pPICZαA与酶切后的PCR产物用T4 DNA连接酶连接,转化大肠杆菌DH5a中,得到重组表达质粒pPICZα-LECT2;
(2)筛选高表达重组工程菌株
将重组表达质粒pPICZα-LECT2经SacI酶切后,将感受态毕赤酵母X33细胞与经SacI酶切线性化的重组表达质粒pPICZα-LECT2按比例16ul:1ug混合后,进行电击转化获得转化子,将转化子经博莱霉Zeocin高抗性筛选及PCR鉴定,阳性克隆为重组工程菌X33/ pPICZα-LECT2;将获得的博莱霉高抗性重组工程菌株X33/ pPICZα-LECT2接种于BMGY培养基中,培养至OD600达2.0~6.0收集细胞,重悬于BMMY培养基中,0.5%甲醇诱导表达,上清液用SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot免疫印迹鉴定分析,筛选表达水平为60-70mg/L的菌株,得到高表达重组工程菌株;
(3)高表达酵母菌株扩大培养
将高表达重组工程菌株接种于100mL BMGY培养基生长,30 ℃培养22-26小时直至OD600达2.0~6.0,1500rpm离心5min收集菌体,然后将菌体转入400mL BMMY培养基中进行甲醇诱导,0.5%甲醇诱导表达,30℃继续培养70-75小时,每24小时补加一次甲醇,使毕赤酵母分泌表达重组人源LECT2蛋白;
(4)重组人源LECT2蛋白的纯化
收集步骤(3)扩大发酵后得到的上清液,经强阳离子交换柱层析,收集第二洗脱峰的洗脱液浓缩后,再经superdex 75分子筛分离纯化,收集最高洗脱峰的洗脱液进行真空冷冻干燥,即得到纯度达95%以上的重组人源LECT2蛋白。
步骤(1)中PCR引物序列如下:
正向引物为5’-GGAATTCGGGCCATGGGCTAATATATG-3’,
反向引物为5’-GGGTACCCAGGTATGCAGTAGGGTCAC-3’。
步骤(2)中所述的感受态毕赤酵母X33的制备方法如下:将毕赤酵母X33接种于YPD培养基中,30℃振荡培养至OD600为1.3-1.5,离心收集菌体,用预冷无菌水和1 mol/L山梨醇各洗一次,最后用1 mol/L山梨醇200μL悬浮,即得到X33感受态毕赤酵母。
于步骤(2)具体过程如下:
(1)电击转化感受态毕赤酵母X33获得转化子
将80μL 感受态毕赤酵母X33细胞和5μg SacI酶切线性化的重组表达质粒混合,在1500V,25μF,200W条件下电击转化,用浓度为1 mol/L山梨醇悬浮,30℃静置1小时,再加入YPD培养基,振荡培养3小时得到转化液,将转化液涂布含100μg/ml博莱霉Zeocin的YPDS平板,30 ℃培养3~4 天,得到大量转化子;
(2)博莱霉高抗性重组工程菌株X33/ pPICZα-LECT2的制备
将转化子点到含1000 μg/ml博莱霉的YPDS培养基上,获得博莱霉高抗性菌株,将博莱霉高抗性菌株的菌落置于无菌水中,混匀并煮沸,离心后取上清进行PCR扩增,阳性克隆获得博莱霉高抗性重组工程菌株X33/ pPICZα-LECT2;
(3)高表达重组工程菌株的制备
将博莱霉高抗性重组工程菌株X33/ pPICZα-LECT2接种于5mL BMGY培养基中,30 ℃培养22-26小时至OD600达2.0~6.0,1500rpm离心5min收集菌体,用40 mL BMMY培养液悬浮菌体,0.5%甲醇诱导表达,30℃继续培养70-75小时,每24小时补加一次甲醇,取发酵液离心,上清液用于12% SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot蛋白免疫印迹鉴定分析,筛选表达水平为60-70mg/L的菌株,得到高表达重组工程菌株。
步骤(4)具体如下:收集步骤(3)扩大发酵后得到的上清液浓缩至10 mL后,上样强阳离子交换柱,以3.0 ml/min 的流速洗脱,洗脱液为1mol/L 氯化钠溶液,收集第二洗脱峰的洗脱液浓缩至500ul后,上样superdex 75分子筛层析柱,以1.0 ml/min 的流速洗脱,洗脱液为100mmol/L碳酸铵溶液,收集最高洗脱峰的洗脱液进行真空冷冻干燥,即得到纯度达95%以上的重组人源LECT2蛋白。
与现有技术相比,本发明的优点在于:本发明首次提出了一种重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中得分泌表达和纯化制备方法,具体是通过获得毕赤酵母重组工程菌株,经发酵和诱导高效分泌表达,再通过柱层析的方法纯化,获得纯度较高的重组人源LECT2蛋白。本发明选用毕赤酵母表达系统表达,分泌型表达菌株的表达水平达到64mg/L左右。通过柱层析重组蛋白纯度为96%。利用趋化小室检测表明,该重组人源LECT2蛋白具有趋化活性。
    鉴于人源LECT2蛋白的多功能性及与多种疾病的相关性,因此采用毕赤酵母大量表达高活性的重组人源LECT2蛋白,具有稳定、产量高、活性强等优势,可用于制药和诊断检测。
附图说明
图1为重组人源LECT2蛋白UV280 nm 处的UNQsphere S阳离子交换柱洗脱曲线;
图2为重组人源LECT2蛋白UV280 nm 处的Superdex75分子筛洗脱曲线。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一、具体实施例
实施例1
本发明重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法将人工合成的人源LECT2基因插入胞外表达载体pPICZαA中;酶切线性化后电击导入毕赤酵母X33中,获得重组工程菌株;经过摇瓶发酵和甲醇诱导,实现重组人源LECT2蛋白的分泌表达;再利用柱层析进行纯化制备得到纯度为95%以上的重组人源LECT2蛋白,步骤具体如下:
(1)构建重组表达质粒
抽取人外周血细胞中RNA,逆转录合成cDNA得到人源LECT2蛋白基因序列,登录号为NM002302,以此为模板设计引物进行PCR扩增人源LECT2蛋白,将含人源LECT2基因的PCR扩增产物用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切,将用相同限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切的的质粒pPICZαA与酶切后的PCR产物用T4 DNA连接酶连接,转化大肠杆菌DH5a中,得到重组表达质粒pPICZα-LECT2,其中PCR引物序列如下:
正向引物为5’-GGAATTCGGGCCATGGGCTAATATATG-3’,
反向引物为5’-GGGTACCCAGGTATGCAGTAGGGTCAC-3’;
(2)筛选高表达重组工程菌株
将重组表达质粒pPICZα-LECT2经SacI酶切后,将感受态毕赤酵母X33细胞与经SacI酶切线性化的重组表达质粒pPICZα-LECT2按比例16ul:1ug混合后,进行电击转化获得转化子,将转化子经博莱霉Zeocin高抗性筛选及PCR鉴定,阳性克隆为重组工程菌X33/ pPICZα-LECT2;将获得的博莱霉高抗性重组工程菌株X33/ pPICZα-LECT2接种于BMGY培养基中,培养至OD600达2.0~6.0收集细胞,重悬于BMMY培养基中,0.5%甲醇诱导表达,上清液用SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot免疫印迹鉴定分析,筛选表达水平为60-70mg/L的菌株,得到高表达重组工程菌株;
(3)高表达酵母菌株扩大培养
将高表达重组工程菌株接种于100mL BMGY培养基生长,30 ℃培养22-26小时直至OD600达2.0~6.0,1500rpm离心5min收集菌体,然后将菌体转入400mL BMMY培养基中进行甲醇诱导,0.5%甲醇诱导表达,30℃继续培养70-75小时,每24小时补加一次甲醇,使毕赤酵母分泌表达重组人源LECT2蛋白;
(4)重组人源LECT2蛋白的纯化
收集步骤(3)扩大发酵后得到的上清液,经强阳离子交换柱层析,收集第二洗脱峰的洗脱液浓缩后,再经superdex 75分子筛分离纯化,收集最高洗脱峰的洗脱液进行真空冷冻干燥,即得到纯度达95%以上的重组人源LECT2蛋白。
 实施例2
本发明重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法,具体包括如下步骤:
1、人源LECT2基因毕赤酵母表达载体的构建
抽取人外周血细胞总RNA,逆转录合成cDNA,根据已发表人源泉LECT2基因序列(NM_002302)设计引物,正向引物为5’-GGAATTCGGGCCATGGGCTAATATATG-3’,反向引物为5’-GGGTACCCAGGTATGCAGTAGGGTCAC-3’。PCR反应条件按照常规设置进行,PCR扩增LECT2,将含LECT2的PCR产物用切胶回收试剂盒回收(OMEGA),回收产物用限制性内切酶EcoRI和KpnI(Takara)双酶切,将酶切后的PCR产物与相同酶切的质粒pPICZαA用T4 DNA连接酶连接,转化大肠杆菌DH5a中,得到重组质粒pPICZα-LECT2,重组子经酶切鉴定和测序验证,表明重组表达质粒的构建完全正确。
2、重组表达质粒电转化毕赤酵母X33及筛选博莱霉高抗性重组工程菌株
接种毕赤酵母X33(Invitrogen)于YPD培养基(Clontech)中,30℃振荡培养至OD600=1.3-1.5,离心,收集菌体,用预冷无菌水和1 mol/L山梨醇各洗一次,最后用1 mol/L山梨醇200μL悬浮,即得到X33感受态细胞毕赤酵母X33;取80μL 感受态毕赤酵母X33细胞和5μg SacI(Takara)酶切线性化的重组表达质粒混合,在1500V,25μF,200W条件下电击转化,用1 mol/L山梨醇1 mL悬浮,30℃静置1小时,再加入1 mL YPD,振荡培养3小时得到转化液,将转化液涂布含100μg/ml博莱霉Zeocin(Invitrogen)YPDS平板,30 ℃培养3~4 天,结果得到1300多个转化子。将这些转化子点到1000μg/ml博莱霉的YPDS培养基上,获得5个博莱霉高抗性菌株。
3、酵母转化子的PCR鉴定
取上述博莱霉高抗性菌株的菌落置于无菌水,混匀和煮沸,离心后取上清进行PCR扩增,其中PCR扩增
正向引物为5’-GGAATTCGGGCCATGGGCTAATATATG-3’,
反向引物为5’-GGGTACCCAGGTATGCAGTAGGGTCAC-3’,PCR反应条件按照常规设置进行,阳性克隆为博莱霉高抗性重组工程菌株X33/ pPICZα-LECT2。
4、高表达重组人源LECT2蛋白的工程菌筛选
挑取博莱霉高抗性重组工程菌株X33/ pPICZα-LECT2接种于5mL BMGY培养基中,30 ℃培养22-26小时(OD600达2.0~6.0),1500rpm离心5min收集菌体,用40 mL BMMY培养悬浮菌体,0.5%甲醇诱导表达,30℃继续培养70-75小时,每24小时补加一次甲醇,取发酵液离心,上清用于12% SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot蛋白免疫印迹鉴定分析,筛选表达水平为60-70mg/L的菌株,得到高表达重组工程菌株。
5、扩大培养
将高表达重组工程菌接种于100mL BMGY培养基生长,30 ℃培养22-26小时(OD600达2.0~6.0),1500rpm离心5min收集菌体,然后转入400mL BMMY培养基中进行甲醇诱导,0.5%甲醇诱导表达,30℃继续培养70-75小时,每24小时补加一次甲醇,使毕赤酵母分泌表达重组人源LECT2蛋白。以上所用培养基均为通用培养基,在此不详细说明。
6、纯化重组人源LECT2蛋白
收集扩大培养后得到的培养上清液浓缩至10mL,全部上样强阳离子交换柱(型号UNQsphere S,生产厂家Biorad),以3.0 ml/min 的流速洗脱,洗脱液为1mol/L 氯化钠溶液,收集第二洗脱峰的洗脱液浓缩至500ul后,上样superdex 75分子筛层析柱,以1.0 ml/min 的流速洗脱,洗脱液为100mmol/L碳酸铵溶液,收集最高洗脱峰的洗脱液进行真空冷冻干燥,即得到重组人源LECT2蛋白,其中目的组分采用BCA-200蛋白含量测定试剂盒(Pierce)测定总蛋白量,并用12% SDS-PAGE 检测纯化效果,通过电泳条带的积分光密度计算蛋白纯度为96%,重组人源LECT2蛋白UV280 nm 处的UNQsphere S阳离子交换柱洗脱曲线如图1所示,重组人源LECT2蛋白UV280 nm 处的Superdex75分子筛洗脱曲线如图2所示。
 二、重组人源LECT2蛋白的活性验证
健康志愿者抽血加入抗凝剂,离心去除血浆,加入生理盐水重悬,再加入葡聚糖,缓慢混匀,静置去除红细胞。经Percoll梯度离心,获得人嗜中性粒细胞,按照2×l 0/ mL重悬于RPMI1640(生产厂家Invitrogen)完全培养基备用。利用Beydon趋化小室法(生产厂家Corning)对利用本方法制备得到的重组人源LECT2蛋白进行活性测定。在趋化小室的底孔中,加入重组人源LECT2蛋白,设置浓度梯度分别为0、0.1μg/mL、1.0μg/mL、10μg/mL、100μg/mL,变性重组人源LECT2蛋白作为阴性对照。趋化小室底孔上面覆盖5.0μm孔径的无聚乙烯吡咯酮多聚碳酸酯膜,再覆盖上顶板,于趋化小室顶孔中加入50 μL人嗜中性粒细胞。将整个小室置37℃、5% CO2,孵育箱中作用3h。取出多聚碳酸酯膜,刮去上表面残留的细胞,将整个膜置于甲醛中固定,再进行姬姆萨染色。在显微镜下计数 5个高倍视野中迁移至多聚碳酸酯膜背面的染色细胞总数,并计算趋化指数CTU:100×(SM-RM)/(FM-RM),SM表示待测样品迁移细胞数,RM表示空白对照迁移细胞数,FM表示阳性对照(趋化肽FMLP)迁移细胞数。实验重复3次,采用t检验对数据进行分析。结果表明,与对照相比,重组人源LECT2蛋白针对人嗜中性粒细胞,具有明显的趋化活性。不同稀释浓度的蛋白对靶细胞的趋化呈现量效关系,在浓度为1.0μg/mL时,CTU最高值为250。
上述实施例是对本发明的详细说明,但本发明的保护范围并不限于上述实施方式所述的技术方案,而以权利要求所述的保护范围为准。 
Figure IDA0000132728270000011

Claims (3)

1.一种重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法,其特征在于步骤如下:
(1)构建重组表达质粒
抽取人外周血细胞中RNA,逆转录合成cDNA得到人源LECT2蛋白基因序列,登录号为NM002302,以此为模板设计引物进行PCR扩增人源LECT2蛋白,将含人源LECT2基因的PCR扩增产物用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切,将酶切后的PCR产物与用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切的质粒pPICZαA用T4DNA连接酶连接,转化大肠杆菌DH5α中,得到重组表达质粒pPICZα-LECT2;
(2)筛选高表达重组工程菌株
将重组表达质粒pPICZα-LECT2经SacI酶切后,将感受态毕赤酵母X33细胞与经SacI酶切线性化的重组表达质粒pPICZα-LECT2按比例16μl:1μg混合后,进行电击转化获得转化子,将转化子经博莱霉素Zeocin高抗性筛选及PCR鉴定,阳性克隆为重组工程菌X33/pPICZα-LECT2;将获得的博莱霉素高抗性重组工程菌株X33/pPICZα-LECT2接种于BMGY培养基中,培养至OD600达2.0~6.0收集细胞,重悬于BMMY培养基中,0.5%甲醇诱导表达,上清液用SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot免疫印迹鉴定分析,筛选表达水平为60-70mg/L的菌株,得到高表达重组工程菌株,具体过程如下:
a.电击转化感受态毕赤酵母X33获得转化子
将80μL感受态毕赤酵母X33细胞和5μg SacI酶切线性化的重组表达质粒混合,在1500V,25μF,200W条件下电击转化,用浓度为1mol/L山梨醇悬浮,30℃静置1小时,再加入YPD培养基,振荡培养3小时得到转化液,将转化液涂布含100μg/ml博莱霉素Zeocin的YPDS平板,30℃培养3~4天,得到大量转化子;
b.博莱霉素高抗性重组工程菌株X33/pPICZα-LECT2的制备
将转化子点到含1000μg/ml博莱霉素的YPDS培养基上,获得博莱霉素高抗性菌株,将博莱霉素高抗性菌株的菌落置于无菌水中,混匀并煮沸,离心后取上清进行PCR扩增,阳性克隆获得博莱霉素高抗性重组工程菌株X33/pPICZα-LECT2;
c.高表达重组工程菌株的制备
将博莱霉素高抗性重组工程菌株X33/pPICZα-LECT2接种于5mL BMGY培养基中,30℃培养22-26小时至OD600达2.0~6.0,1500rpm离心5min收集菌体,用40mL BMMY培养液悬浮菌体,0.5%甲醇诱导表达,30℃继续培养70-75小时,每24小时补加一次甲醇,取发酵液离心,上清液用于12%SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot蛋白免疫印迹鉴定分析,筛选表达水平为60-70mg/L的菌株,得到高表达重组工程菌株;
(3)高表达酵母菌株扩大培养
将高表达重组工程菌株接种于100mL BMGY培养基生长,30℃培养22-26小时直至OD600达2.0~6.0,1500rpm离心5min收集菌体,然后将菌体转入400mLBMMY培养基中进行甲醇诱导,0.5%甲醇诱导表达,30℃继续培养70-75小时,每24小时补加一次甲醇,使毕赤酵母分泌表达重组人源LECT2蛋白;
(4)重组人源LECT2蛋白的纯化
收集步骤(3)扩大发酵后得到的上清液,经强阳离子交换柱层析,收集第二洗脱峰的洗脱液浓缩后,再经superdex75分子筛分离纯化,收集最高洗脱峰的洗脱液进行真空冷冻干燥,即得到纯度达95%以上的重组人源LECT2蛋白,具体如下:收集步骤(3)扩大发酵后得到的上清液浓缩至10mL后,上样强阳离子交换柱,以3.0ml/min的流速洗脱,洗脱液为1mol/L氯化钠溶液,收集第二洗脱峰的洗脱液浓缩至500μl后,上样superdex75分子筛层析柱,以1.0ml/min的流速洗脱,洗脱液为100mmol/L碳酸铵溶液,收集最高洗脱峰的洗脱液进行真空冷冻干燥,即得到纯度达95%以上的重组人源LECT2蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法,其特征在于步骤(1)中
PCR引物序列如下:正向引物为5’-GGAATTCGGGCCATGGGCTAATATATG-3’,
反向引物为5’-GGGTACCCAGGTATGCAGTAGGGTCAC-3’。
3.根据权利要求1所述的重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法,其特征在于步骤(2)中所述的感受态毕赤酵母X33的制备方法如下:将毕赤酵母X33接种于YPD培养基中,30℃振荡培养至OD600为1.3-1.5,离心收集菌体,用预冷无菌水和1mol/L山梨醇各洗一次,最后用1mol/L山梨醇200μL悬浮,即得到X33感受态毕赤酵母。
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Application publication date: 20120711

Assignee: Ningbo Zhenhai Baichuan Biotechnology Co. Ltd.

Assignor: Ningbo Univ.

Contract record no.: 2017990000002

Denomination of invention: Expressing and purifying method of recombinant human-derived LECT2 protein in Pichia pastoris

Granted publication date: 20140625

License type: Common License

Record date: 20170106

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