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KR20160113710A - 관류 배지 - Google Patents

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KR20160113710A
KR20160113710A KR1020167023816A KR20167023816A KR20160113710A KR 20160113710 A KR20160113710 A KR 20160113710A KR 1020167023816 A KR1020167023816 A KR 1020167023816A KR 20167023816 A KR20167023816 A KR 20167023816A KR 20160113710 A KR20160113710 A KR 20160113710A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
medium
perfusion
feed
amino acid
Prior art date
Application number
KR1020167023816A
Other languages
English (en)
Inventor
엘라 푸하치
제임스 러셀 그로브
Original Assignee
코히러스 바이오사이언시즈, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 코히러스 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 filed Critical 코히러스 바이오사이언시즈, 인코포레이티드
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Abstract

관류 방법에서 치료용 단백질 생산을 위한 우수한 세포 밀도, 역가 및 생산물 품질을 제공하는 관류 배지가 개시된다.

Description

관류 배지{PERFUSION MEDIA}
본 발명은 관류 방법에서 치료용 단백질을 제조하는 데 적합한 배지에 관한 것이다.
약학적 적용을 목표로 하는 단백질은 배치(batch), 유가(fed batch) 방법 또는 관류법을 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명은 치료용 단백질의 제조에 사용되는 것들을 포함하는 관류 공정에 관한 것이다.
치료용 단백질을 제조하기 위한 관류 공정은 배양 배지 조성물, 온도, 대사 노폐물의 축적 및 생물 반응기 물리-화학적 파라미터의 변화에 민감하다. 부적절하거나 변동(fluctuating) 조건은 단백질의 글리코프로파일(glycoprofile)과 같은 단백질 번역 후 변형에 영향을 미치고, 후자는 약동학적 특성과 관계가 있는 것으로 알려져 있다.
제품의 개선된 비용과 함께 주어진 시간에 많은 제품의 생산을 가능하게 하기 때문에 관류 공정은 유가 공정보다 바람직하다. 그러므로 관류 공정을 지원하는 적합한 공급 조건을 개발하는 문제를 극복하는 것이 요구된다.
미국 특허 7,300,773 및 EP 1,781,802는 특정 농도의 아미노산 및/또는 무기 이온을 갖는 것으로 기재된 공급 배지가 있는 유가 공정을 이용하는 융합 단백질 TNFR-IG의 제조를 개시한다.
본 발명자들은 관류 공정에 사용되는 배지가 배치 또는 유가 공정에서 사용하기 위한 배지보다 영양 함량, 특히 아미노산 함량의 관점에서 실질적으로 덜 풍부해야한다는 사실을 발견하였다. 이러한 목적을 위해, 영양소 함량은 관류 반응기 부피 내 주어진 영양의 농도로 이해되어야한다. 특히, 본 발명은 관류는 70 mM 미만 또는 동일, 바람직하게는 약 15 mM 내지 약 65 mM의 범위의 총 아미노산 농도를 포함하는 피드 배지의 존재하에서 실시되는 관류 방법에 관한 것이다. 본 발명의 다양한 구현예에서, 상기 총 아미노산 농도는 약 15 내지 20 mM; 약 20 내지 25 mM; 약 25 내지 30 mM; 약 30 내지 35 mM; 약 35 내지 40 mM; 약 40 내지 45 mM; 약 45 내지 50 mM; 약 50 내지 55 mM; 약 55 내지 60 mM; 약 60 내지 65 mM; 및 65 및 70 mM 범위로부터 선택된 범위이다.
본 명세서에 규정된 총 아미노산 농도는 미국 특허 7,300,773의 유가 및 관류 공정 모두에 대해 권장한 것보다 적다. 비교로서, 미국 특허 7,300,773은 70 mM 이상의 총 아미노산 농도를 필요로 한다. 관류 시스템(컬럼 18, 5 줄 내지 11 줄)에서 이용 가능성이 당업계의 당업자에게 이해될 수 있는 이러한 농도의 '773 특허에서의 주장에도 불구하고, 반대로, 본 발명은 '773 특허에 기재된 고농도의 총 아미노산 농도를 만족하는 피드 배지를 이용하는 치료용 단백질의 제조를 위한 관류 공정을 실시하는 것이 목적 단백질의 실질적으로 감소된 양의 생산을 초래하므로, 따라서, 총 아미노산 농도의 관점에서 관류를 위한 배지에서의 아미노산 농도는 필수적으로 감소, 바람직하게는 실질적으로 감소되어야 한다는 본 발명자들의 발견을 부분적으로 기반으로 한다. 제공된 본 발명의 아미노산 농도 제한이 만족되면, 일반적으로 피드 배지에 이용되는 다양한 비-아미노산 성분(예를 들어 비타민, 가수물 등)은 본 교시의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 공지된 방식으로 당업자가 경험적으로 조정할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 생체 단백질의 제조를 위한 관류 방법은 상술한 감소된 총 아미노산 농도를 만족하는 피드 배지를 이용하며, 피드 배지는 추가적으로 다음의 조건 중 하나 이상에 의해 특징된다: 약 2 보다 큰 비율의 누적 아스파라긴에 대한 몰(molar) 글루타민 ; 약 0.2 보다 큰 비율의 총 아미노산 농도에 대한 몰(molar) 글루타민; 1 보다 큰 비율의 총 아미노산에 대한 몰 무기 이온; 및 16 mM 미만의 단위 부피당 글루타민 및 아스파라긴의 조합량. 이러한 기준은 관류 반응 용기에 정상 상태의 농도와 양을 나타내는 것으로 이해되어야한다.
본 발명은 단백질 제조를 위한 관류 공정에 이용하는 데 적합한 배지를 만들기 위해 치료용 단백질의 유가 생산에 적합하지 않은 추가적인 피드 배지 변형에 관한 것으로, 상기 변형이 유가 배지의 풍부한 영양을 감소시키는 것을 포함하며, 이에 의해 관류 반응기에 이용하는 경우, 피드 배지의 총 아미노산 농도는 약 40 내지 약 95%의 범위, 바람직하게는 유가 피드 배지의 총 아미노산 농도의 약 50 내지 약 70%의 범위이다. 바람직하게는, 상기 방법은 (ⅰ) 고영양 피드를 이용하여 유가 공정으로 달성가능한 것과 유사한 생산 역가; 및/또는 (ⅱ) 이러한 관류 방법을 유가 공정에서 사용된 것과 동일한 배지를 이용하여 실시한 경우 관류 반응기에서 생성되는 것과 달리 암모니아의 수준을 상당히 감소시키는 것 모두를 달성한다.
본 발명의 일 구현예에서, 관류 방법은 다음의 단계를 사용한다: (a) 목적의 치료용 단백질을 발현할 수 있는 세포 및 상기 발현을 실시하는 데 적합한 배양 배지를 포함하는 혼합물을 준비하는 단계; (b) 상기 혼합물을 함유하는 적합한 용기에서, 상기 세포가 상기 단백질을 생산하도록 유발하는 단계; 및 (c) 주기적으로 또는 연속적으로 상기 반응 용기로부터 소모된 배양 배지를 제거하고, 상기 반응 용기에 새로운 배양 배지를 첨가하는 단계.
본 발명은 임의의 치료용 단백질의 제조에 적용할 수 있다. 일 구체예에서, 치료용 단백질은 임의의 융합 단백질 또는 임의의 항체로부터 선택될 수있다. 융합 단백질은 TNFR-Fc(때때로 TNFR-Ig 언급) 융합 단백질을 포함할 수 있다. 항체는 항-TNF 항체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제조에 적합한 단백질의 또 다른 비 제한적인 예로는 에타너셉트(etanercept), 아달리무맙(adalimumab), 리툭시맙(rituximab), 트라스투주맙(trastuzumab), 베바시주맙(bevacizumab), 에쿠리주맙(eculizumab) 및 나탈리주맙(natalizumab) 뿐만 아니라, 이의 바이오시밀러(biosimilar) 또는 바이오베터(biobetter) 이형태(variants)를 포함한다. 본 발명의 관류 공정은 임의의 특정 치료용 단백질에 한정되는 것은 아니라는 것을 이해해야 한다. 따라서, 여기에 언급된 것이 아닌 다른 단백질, 예컨대, 에리스로포이에틴(erythropoetins)을 제조할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 치료용 단백질을 제조하는 관류 방법으로서, (a) 치료용 단백질을 발현할 수 있는 CHO 세포 및 상기 발현을 실시하는 데 적합한 배양 배지를 포함하는 혼합물을 준비하는 단계; (b) 상기 혼합물을 함유하는 적합한 용기에서, 상기 세포가 상기 단백질을 생산하도록 유발하는 단계; 및 (c) 주기적으로 또는 연속적으로 상기 반응 용기로부터 소모된 배양 배지를 제거하고, 상기 반응 용기에 새로운 배양 배지를 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 배양 배지는 (i) 약 15 내지 약 65 mM의 총 아미노산 농도; 및 적절한 기본 배지(예컨대, SFM4CHO, BalanCD CHO Growth A, HyCell CHO, 등), 복합 화학적-정의 피드(예컨대, BalanCD CHO Feed 1), 덱사메타손, ManNAc, 면화씨 가수 분해물 및 D-(+)-갈락토스 중 최소 1 종을 포함한다.
본 관류 방법의 다른 구현예에서, 단계 (a) 이전에, 에타너셉트를 발현할 수 있는 상기 세포가 (i) 약 28℃ 내지 약 37℃; 및 (ii) 약 35℃ 내지 약 36℃로부터 선택된 온도의 성장 단계에서 성장된다.
본 관류 방법의 다른 구현예에서, (b) 및 (c) 단계에서 발생되는 상기 에타너셉트의 제조 동안 반응 용기는 (ⅰ) 약 32℃ 초과; (ⅱ) 약 34℃ 초과; (ⅲ) 약 35℃ 초과; (iv) 약 33℃ 내지 약 36℃의 범위; (v) 약 35℃ 내지 약 36℃의 범위; (vi) 32.5℃; (vii) 33.5℃; (viii) 34.5℃; 및 (ix) 35.5℃로부터 선택된 온도에서 유지된다. 이러한 온도에서 우수한 생성물 품질, 적절히 폴딩된 단백질(properly folded proteins) 및 우수한 역가를 생산하는 능력은, 단백질 제조 과정에서 단백질 제조 동안(성장 단계에 비해) 낮은 온도의 사용에 대해 반대로 교시한 기술 분야에서 놀랍고 예기치 못한 것이다.
물질의 조성물로서, 본 발명은 치료용 단백질을 제조하는 관류 방법에 있어서, 목적의 총 아미노산 농도를 제공하도록 제형화된 배지 조성물이 관한 것이며, 상기 목적의 농도는 상기 방법에 이용되는 관류 반응기의 부피를 기반으로 하여, 약 15 내지 20 mM; 약 20 내지 25 mM; 약 25 내지 30 mM; 약 30 내지 35 mM; 약 35 내지 40 mM; 약 40 내지 45 mM; 약 45 내지 50 mM; 약 50 내지 55 mM; 약 55 내지 60 mM; 약 60 내지 65 mM로부터 선택된 범위이고, 상기 조성물을 판매를 위해 제공, 권장 또는 광고를 하는 경우 이러한 관류 과정에서의 의도된 용도로서의 사용을 돕거나 제시하는 서면 또는 구두 권고서 또는 지시서와 함께 수반된다.
본 발명의 다른 조성물 구현예는 약 15 내지 20 mM; 약 20 내지 25 mM; 약 25 내지 30 mM; 약 30 내지 35 mM; 약 35 내지 40 mM; 약 40 내지 45 mM; 약 45 내지 50 mM; 약 50 내지 55 mM; 약 55 내지 60 mM; 약 60 내지 65 mM로 이루어진 군으로부터 선택된 범위의 총 아미노산 농도 범위를 포함하는 피드 배지 조성물이고, 추가적으로 바람직하게는 면화씨 가수 분해물, 덱사메타손, ManNAc, 및/또는 D-(+)-갈락토스 중 최소 1 종을 포함한다.
임의의 상기 구현예에서, 바람직한 아마노산 농도의 범위는 약 15 내지 30 mM이고, 상기 배지는 정의된 및 비-정의된 배지를 포함할 수 있다.
용어 "배양", "세포 밀도", "세포 생존율", "역가", "배지"(또는 "media") "시딩(seeding)", "성장 단계(growth phase)", "제조 단계(production phase)"는 당업계에서 잘 이해되는 의미로 이해될 수 있다. 예를 들어, 참조는 미국 특허 7,300,773일 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 저농도 피드(SF3 및 SF4)를 함유하는 배양물의 viable cell density(VCD)에 대한 도표이다.
도 2는 보다 풍부한 고농도 영양 배지를 함유하는 배양물의 VCD에 대한 도표이다.
도 3은 보다 풍부한 고농도 영양 배지를 함유하는 배양물에서의 암모니아 수준에 대한 도표이다.
도 4는 감소된 영양 배지 및 보다 풍부한 고농도 영양 배지에서의 단백질 생산에 대한 막대 차트이다.
도 5는 셀 부스트 5 피드의 두 가지 다른 농도로 보충된 SFM4CHO 기본 배지의 전하 종류의 분포뿐만 아니라 상업적 에타너셉트(Enbrel®)의 것을 포함하는 등전점 초점(IEF) 겔의 이미지이다.
도 6은 10% 및 20% CHOZN 피드를 함유하는 배양물의 VCD에 대한 도표이다.
도 7은 10% 및 20% CHOZN 피드를 함유하는 배양물의 VCD에 대한 도표이다.
도 8은 10% 및 20%의 피드 배양물을 함유하는 배양물로부터 분리된 생성물에서의 동형 분포 뿐만 아니라 레퍼런스 기준의 것을 함유하는 IEF 겔의 이미지이다.
도 9는 저(10%) 및 고(20%) 피드 농도를 함유하는 배양물에서 단백질 생산에 대한 막대 도표이다.
도 10은 실시예 7에 기술된 바와 같이 성장된 배양물의 VCD 및 생존율에 대한 도표이다.
본 발명은 관류로 공지된 공정을 통한 융합 단백질 또는 항체 제조 방법을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "관류(perfusion)"는 그 안에 함유된 생성물을 연속적으로 수확하고 소모된 배지 내에 존재하는 폐기물 및 독성 물질은 생물 반응기로부터 제거할 수 있도록 하기 위해서, 소모된 배양 배지를 연속적으로 제거, 즉, 수확하면서(바람직하게는 생성물과 함께), 현탁 세포 배양물에 연속적으로 또는 주기적으로, 가장 바람직하게는 연속적으로, 생물 반응기에 신선한 배지를 공급하는 공정을 일반적으로 나타내는 것을 의미한다. 당업계에 잘 알려진 적절한 여과 수단을 사용하여 세포들은 수확 스트림으로부터 연속적으로 여과된 후, 일정한 배양 부피를 유지하기 위해 생물 반응기로 복귀된다. 통상적으로 연속적으로 실시되는 이러한 공정은 세포가 높은 밀도에 도달하도록 한다. 따라서, 10-75000000 세포/㎖ 만큼 높은 밀도는 일상적으로 도달하여 장기간, 예를 들어 최소 2 주, 일반적으로 20일 내지 60 일 동안 유지될 수 있다. 이는 배치(batch) 또는 유가(fed-batch) 배양과 대조적으로 장기간 동안 생산할 수 있는 매우 높은 생산성 세포 배양 공정을 야기할 수 있다. 대안적으로, 제거한 소모된 배지로부터 연속적으로 생성물을 수확하는 대신, 생성물을 유지하여 배양물에서 농축시킨 후 주기적으로 수확하거나 또는 배양 종료 시 수확할 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 적절한 크기의 필터의 활용은 생물 반응기 배양물 내 재조합 생성물은 유지시키고, 폐기물만이 제거되도록 할 수 있다. 본 발명의 목적은 관류 방법, 특히 이러한 융합 단백질 또는 항체와 같은 치료용 단백질의 제조 방법에 사용하기에 적합한 피드 배지를 제공하는 것이다.
세포 배양 관류 공정은 일반적으로 하루에 0.5 내지 2 생물 반응기 부피의 피드 배지 교환 속도를 거친다. 본 발명은 이러한 관류 공정이 전형적으로 유가 공정에 사용되는 피드 배지에서 이용되는 것과 같은 고농도 영양을 필요로 하지 않으며, 실제로, 실질적으로 낮은 농도를 필요로 한다는 본 발명자의 발견에 기초한다. 특히, 본 발명자들은 치료용 단백질(예를 들어, 융합 단백질 또는 항체) 생산을 위해 유가 공정에 사용되는 영양, 특히, 아미노산의 농도가, 특정 수준으로 감소되어야 한다는 것을 발견하였으며, 한편으로는 일정-상태 수준으로 세포의 대사 요구를 지지하는데 충분히 영양이 풍부하나, 다른 한편으로는 암모니아 또는 락트산의 과잉 생산과 같은 다른 유해 효과를 야기하는 그렇게 높지 않은 영양은 배양 생존율, 전체 역가 및 생성물 품질을 저하시킬 것이다. 본 발명은 감소된 총 아미노산 농도 수준의 관점에서 감소된 영양 수준을 필요로 한다. 추가의 영양 성분은 경험적으로 세포 밀도, 관류 속도 및 특정 생산성 속도(productivity rate, PCD)에 기초하여 공지된 방식으로 결정될 수 있고, 영양 수준이 감소된 결과는 본 발명에서 규정된 전체 아미노산 농도 수준 내에 제공된다. 본 발명은 관류(증식이 아닌 생산을 자극) 배지 제제 내 아미노산의 소모가 감소되는 발견을 추가적으로 전제로 한다. 따라서, 이러한 배지는 현저히 낮은 농도의 아미노산으로 원하는 생산성을 지원할 것이다. 또한, 글루타민, 비타민 등의 다른 피드 요소의 감소가 가능하다.
본 발명의 관류 방법은 특히 에타너셉트(바이오시밀러 및 바이오베터 이형태를 포함)로 알려진 융합 단백질을 제조하는 데 적합하다. 에타너셉트(etanercept)는 인간 IgG1의 Fc 부분에 연결된 인간 75 킬로달톤(p75) 종양 괴저 인자 수용체(TNFR)의 세포외 리간드-결합 부분으로 이루어진 이량체성 융합 폴리펩타이드이다. 에타너셉트는 934개의 아미노산으로 이루어지고, 대략 150 킬로달톤의 겉보기 분자량을 갖는다(Physicians Desk Reference, 2002, Medical Economics Company Inc.). 에타너셉트의 Fc 성분은 인간 IgG1의 불변 중쇄(constant heavy) 2(CH2) 도메인, 불변 중쇄 3(CH3) 도메인 및 힌지 영역을 함유하지만, 불변 중쇄 1(CH1) 도메인은 함유하지 않는다. Fc 도메인은 상기한 도메인 중의 하나 또는 전부를 함유할 수 있다. 에타너셉트는 중국 햄스터 난소("CHO": Chinese hamster ovary) 포유류 세포 발현 시스템에서 재조합 DNA 기술에 의해 공지된 방식으로 제조될 수 있다.
본 발명의 관류 방법은 아달리무맙으로 알려진 항-TNF 항체를 제조하는 데 적합하다. 아달리무맙(Humira®)은 인간 TNF에 특이적인 재조합 사람 IgG1 모노클로날 항체이다. 아달리무맙은 또한 D2E7로서 공지되어 있다. 아달리무맙은 각각 약 24 kDa의 분자량을 갖는 2 개의 경쇄와 각각 약 49 kDa의 분자량을 갖는 2 개의 IgG1 중쇄를 갖는다. 각 경쇄는 214 개의 아미노산 잔기로 구성되어 있으며, 각 중쇄는 451 개의 아미노산 잔기로 구성된다. 따라서, 아달리무맙은 1330 개의 아미노산으로 구성되고 약 148 kDa의 총 분자량을 갖는다. 또한, 용어 아달리무맙은 시판되는 Humira®에서 사용되는 아달리무맙 단백질의 소위 바이오-시밀러 또는 바이오-베터 이형태를 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명에 이용되는 피드 배지는 바람직하게는 덱사메타손이 보충된 BalanCD®, 및 HyCell®와 같은 기본 배지를 포함한다. 단백질(예를 들어, 에타너셉트 또는 이의 바이오시밀러 또는 바이오베터 이형태)을 생산하는 세포는 최소 10,000,000 세포/ml, 바람직하게는 최소 5,000,000 세포/ml, 가장 바람직하게는 최소 약 10,000,000 세포/ml의 밀도로 관류 용기에 존재한다. 단계 (a) 이전에, 상기 목적의 단백질에 대한 성장 단계 동안(제조의 실질적인 개시 전), 상기 목적 단백질을 발현할 수 있는 상기 세포가 약 28℃ 내지 약 37℃; 및 (ii) 바람직하게는 약 35℃ 내지 약 36℃로부터 선택된 온도의 성장 단계에서 성장될 수 있다. 관류 공정을 포함하는 후속 생산 단계 동안, 에타너셉트 생산이 (ⅰ) 약 32℃ 초과; (ⅱ) 약 34℃ 초과; (ⅲ) 약 35℃ 초과; (iv) 약 33℃ 내지 약 36℃의 범위; (v) 약 35℃ 내지 약 36℃의 범위; (vi) 32.5℃; (vii) 33.5℃; (viii) 34.5℃; 및 (ix) 35.5℃로부터 선택된 온도에서 실시된다. 본 발명의 방법은 바람직하게는 연속적으로 또는 주기적으로, 그러나 바람직하게는 연속적으로 관류 공정의 생산 단계 동안 에타너셉트를 수확하는 단계를 포함한다. 또한, 소모된 배지의 제거 및 새로운 배양 배지로의 교체는 바람직하게는 연속적으로 발생한다. 연속적으로 배출된 배양 배지에 존재하는 목적 단백질의 수확은 바람직하게는 연속적으로 실시된다.
본 발명의 관류 방법은 예컨대, 융합 단백질 및 모노클로날 항체를 포함하는 임의의 치료용 단백질에 이용될 수 있다. 본 발명의 관류 방법에서 생산에 적합한 단백질의 예는 에타너셉트(etanercept), 아달리무맙(adalimumab), 리툭시맙(rituximab), 트라스투주맙(trastuzumab), 베바시주맙(bevacizumab), 인플릭시맙 (infliximab), 에쿠리주맙(eculizumab) 및 나탈리주맙(natalizumab) 뿐만 아니라, 상기 단백질의 바이오시밀러(biosimilar) 또는 바이오베터(biobetter) 이형태(variants)를 포함한다. 본 발명의 관류 공정은 임의의 특정 치료용 단백질에 한정되는 것은 아니라는 것을 이해해야 한다.
기재된 방법의 부피 생산성 및 생산된 에타너셉트의 품질은 당업자에게 잘 알려진 다양한 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 이러한 방법은 IEF(isoelectric focusing) 겔, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 등과 같은 총 및 활성 단백질(역가), 단백질 시알릴화의 품질 수준을 정량하는 어세이들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 관류 공정은 당업계에서 필요하거나 바람직하다고 생각되는 것보다 바람직하게는 높은 제조 온도에서 우수한 수율로 정확하게 폴딩된 단백질을 생산할 수 있다.
실시예
하기 물질이 실시예에 사용된다.
Figure pct00001

실시예 1
이 실험에서, 본 발명자들은 EX-CELL CHOZN 및 피드(feed) 1 피드, 면화씨 가수 분해물(Cotton Seed Hydrolysate), 갈락토스(Galactose), L-글루타민, 및 글루코스가 보충된 하이클론™ HyCell 배지와 BalanCD™ CHO 성장 A의 1:1 혼합물로 구성된 피드 배지를 이용하였다. 일부 조건은 비타민, 아미노산 및 고농도의 CHOZN 및 피드 1의 추가적 보충을 포함하며, 이는 배지를 유의하게 풍부하게 만든다(하기 SF5, SF6 및 SF7 참조). 피드 배지의 첨가 전에, 시드 밀도는 배양물의 밀리리터 당 40,000,000 세포였다. 관류 방법을 씨딩 후 배지 24 시간 전체 교환한 배양물에서 시뮬레이션하고, 이후 배양물을 96 시간 동안 계속하였다(더 이상의 공급 또는 배지 교환 없이). 배양물의 성능은 생존 세포 밀도, 생존율, 대사 프로파일(암모니아 및 락테이트 생산, L-글루타민 및 글루코스 소모, pH 수준, 글루타메이트 생산) 및 생산성에 대해 모니터링하였다. 하기 제시된 데이터에 나타낸 바와 같이, 많은 비타민 및 아미노산이 보충된 배양물(SF5 및 SF6 참조, 아래)은 높은 수준의 암모니아(> 40 mM)를 생성하였고, 이는 생존율의 조기 감소를 초래했다. 본 발명자들은 생존 세포에 대해 획득한 데이터와 비교한 경우 매우 높은 암모니아 수준 이외의 다른 신진 대사의 변화는 관찰하지 못했다. 또한, 생존율을 모든 배양물과 비교한 경우 더 높은 영양의 영양 배지에서 얻은 역가도 시간 동안 부정적으로 영향을 받았다. 높은 생존율을 유지하는 기타 비타민과 아미노산(SF3 및 SF4)이 없는 저영양 배양물은 좋은 생산성을 가지고, 좋은 생성물 품질의 수율을 얻었다(하기 데이터 섹션 참조).
24 시간에 단일 피드 교체 후 96 시간 생산 단계(96 시간 동안 추가적인 배지 교환 없음)를 이용하는 본 실시예 1은 관류(배지는 연속적으로 또는 주기적으로 교환)에 사용하기 위한 배지가 SF3 및 SF4의 피드에 사용되는 것보다 낮은 수준의 감소된 영양의 수준을 필수적으로 필요로 할 것이라는 것을 증명한다. 따라서, 하기 실시예 2 및 3에 제공된 바와 같이, 관류 공정에서 사용되는 피드 배지는 여전히 70 mM 미만, 바람직하게는 약 15 mM 내지 약 30 mM 범위의 총 아미노산 함량을 이용해야 하고, 이는 우수한 세포 밀도, 세포 생존율 및 생산 역가를 초래한다. 본 명세서에서 이용되는 총 아미노산 함량은 관류 반응 용기의 부피에 기초하여 안정 상태의 총 아미노산 농도를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예 1의 결과
하기 표 1은 상술한 바와 같은 씨딩 후 24 시간째에 배지가 변경되고 이어서 추가적으로 96 시간 동안 계속되는(임의의 추가 배지 교환 없이) 5 개의 실험에 사용된 피드 배지(SF3 내지 SF7)를 요약한다. 이 실험은 고영양 피드(SF5, SF6, SF6 및 SF7 실행)와 저영양 피드(SF3, SF4 실행)를 비교하였다. 표에 나타낸 피드는 BalanCD 및 Hycell(상기 물질 리스트에서 식별)로 이루어진 기본 배지를 보충하기 위해 사용하였다. 비타민((Invitrogen, cat# 11120-052) 및 아미노산(Invitrogen, cat# 11130-036)을 100 배 스톡으로부터 1X 농도로 첨가하였다.
관류 피드
피드 SF3
저영양 피드 		SF4
저영양 피드 		SF5
고영양 피드 		SF6
고영양 피드 		SF7
고영양 피드
CHOZN 10% 10% 10% 10% 20%
CSH 7.5% 7.5% 7.5%
피드 1 10% 10% 10% 10% 20%
L-Gln 8 mM 8 mM 8 mM 8 mM 8 mM
비타민 1x 1x
AA 1x
Gal 10 mM 10 mM 10 mM 10 mM 10 mM
도 1은 본 발명에 따른 저농도 피드(SF3 및 SF4)를 함유하는 배양물의 VCD(viable cell density)에 대한 데이터를 보여준다. 매우 높은 배양 밀도를 획득하였다. 상대적으로 저영양 배지(비타민 또는 아미노산의 추가 보충이 없는, 10% CHOZN + 7.5% 면화씨 가수 분해물(CSH) 및 10% 피드 1)(SF3 및 SF4 참조)는 최소 96 시간 동안 세포가 높은 생존율을 유지하기에 충분한 영양적 지원을 제공하였다.
도 2는 (피드 SF5, SF6 및 SF7의 경우) 더욱 고농도 영양 배지(비타민 및 아미노산이나 복합 피드의 보충으로 인한)가 감소된 배양물 수명을 초래한다는 것을 보여준다. 특히, 본 발명자들은 배양물의 대사적 필요량을 초과하는 것으로 나타난 농도의 아미노산의 첨가는 생존율의 급격한 감소를 초래한다는 것을 발견하였다. 짧은 수명을 갖는 모든 배양물들(예를 들어, SF6 및 SF7)이 높은 수준으로 암모니아를 생산하였다는 것을 추가적으로 확인하였다(도 3 참조).
도 3은 고영양 피드 배지를 이용한 배양물(상기 표 1에서 SF6 및 SF7 참조)이 납득할 수 없을 정도로 높은 암모니아 생산을 나타낸다는 것을 보여주며, 이에 본 발명자는 생존율 조기 감소를 초래하거나 기여할 수 있을 것으로 가정하였다.
도 4는 감소된 역가에 의해 나타난 바와 같이 고영양 배지(예를 들어, SF5, SF6 및 SF7)에서의 단백질 생산에 음성적인 영향을 보여준다. SF5, SF6 SF7의 고영양 피드를 사용한 배양물에서 얻은 생성물과 본 발명에 따른 SF3 및 SF4의 감소된 영양 피드를 사용한 배양물에서 얻은 생성물을 비교한다.
실시예 2
실시예 1에서 획득한 데이터를 기반으로 하여, 본 발명에 따르면, 본 발명자들은 연속적이거나 주기적으로 배지를 교체한 관류 공정에 이용하는 경우 상기 실시예 1에서의 SF3 및 SF4 실시에 이용된 것과 같은 감소된 영양물이 있는 배지를 변경하여 추가적으로 상당히 총 아미노산 농도가 감소될 수 있다는 것을 발견하였다. 특히, 관류 공정에서, 70 mM 미만, 바람직하게는 약 15 mM 내지 약 65 mM, 보다 바람직하게는 약 20 mM 내지 약 30 mM 범위의 아미노산의 총 농도가, 치료용 단백질, 예를 들어, TNFR-Fc 융합 단백질 또는 항-TNF 모노클로날 항체를 제조하는 관류 공정에서 세포 배양시 대사적 요구를 지원할 것이다. 따라서, 주기적인 배지 교체를 포함하는 관류 공정에서, 본 발명에 따른 관류 방법은 70 mM 미만, 바람직하게는 약 15 mM 내지 약 65 mM, 보다 바람직하게는 약 20 mM 내지 약 30 mM 범위의 아미노산의 총 농도를 갖는 피드 배지가 매 24 시간마다 새로운 배지로 교체된다. 관류를 시뮬레이션하는 이러한 공정은 하루에 1 생물 반응기 부피의 관류 속도에 해당한다. 세포는 바람직하게는 밀리리터 당 50000000 세포 밀도로 접종하고, 배지는 매 24 시간마다 새로운 배지로 총 3 회 교체된다. 배양은 4 일 (총 96 시간)째에 종료된다. 생존 세포 밀도와 생존율은 매일 확인한다. 생성물 품질을 반영하는 역가 및 동형(isoform)은 당업계에 공지된 적절한 검정법을 사용하여 각 샘플을 수확하는 데 결정된다. 개선된 역가 및 생성물 품질(96 시간 샘플)에 의해 반영된 생산 모드로 신진 대사를 서서히 전환하기 위해 세포는 약 3 일 (72 시간)을 필요로 할 수 있다. 실질적으로 낮은 총 아미노산 농도를 함유한 피드 배지를 사용했음에도 불구하고, 총 누적 아미노산 농도가 70 mM 초과를 필요로 하는 US 특허 7,300,773에서 권고하는 바와 같이 유가 방법에 일반적으로 이용되는 배지와 비교하여, 상기 방법은 우수한 세포 밀도 및 세포 생존율 뿐만 아니라 우수한 역가를 초래한다.
실시예 3
연속적으로 배지를 교체하는 관류
연속 관류 공정이 반응기에 새로운 배지가 연속적으로 도입되는 데 이용되는 것을 제외하고는 실시예 2를 반복하고, 당업계에 잘 공지된 방식으로 나머지 배지를 연속적으로 제거하여, 이에 의해, 본 발명에 따르면, 반응기내 피드 배지의 정상 상태의 총 아미노산 농도는 70 mM 미만, 바람직하게는 약 15 mM 내지 약 65 mM, 보다 바람직하게는 약 20 mM 내지 약 55 mM 범위이다. 연속 관류 공정은 우수한 세포 밀도, 세포 생존율 및 역가를 초래한다. 총 아미노산 농도에 대한 필요 요건외에, 피드 배지는 바람직하게는 관류 반응기 내 정상 상태의 배지 농도의 다음 조건 중 하나 이상을 만족하도록 제형화된다: (ⅰ) 약 70 mM 미만 단위 체적 당 정상 상태의 총 아미노산 양; (ⅱ)약 2 보다 큰 비율의 누적 아스파라긴에 대한 정상 상태의 글루타민; (ⅲ) 약 0.2 보다 큰 비율의 총 아미노산에 대한 정상 상태의 글루타민; (ⅳ) 1 보다 큰 총 아미노산 배급에 대한 정상 상태의 몰 무기 이온; 및 (V) 16 mM 미만의 단위 부피당 글루타민 및 아스파라긴의 정상 상태의 조합량. 용어 정상 상태는 상기 표현된 바와 같이, 피드 성분의 농도 및 비율이 관류 반응 용기에서 명시된 수준으로 기본적으로 일정하게 유지되는 것을 나타내기 위해 의도된다.
실시예 4
본 발명자는 성장, 생산성 및 생성물 품질에 대한 관류 조건 하에서 강력한 배양 성능을 허용하는 다양한 배지 조성물을 평가하였다. 밀리미터당 10000000 세포의 세포 밀도를 달성하는 본 실험 중 하나에서, 본 발명자들은 2 가지 상이한 농도의 셀 부스트 5 피드(Cell Boost 5 Feed)로 보충된 SFM4CHO 기본 배지로 실험하였고 약 50 mM의 총 아미노산 농도를 초래하는 저농도(10 % 공급)는 약 100 mM의 총 아미노산 농도를 초래하는 20% 피드로 보충된 배양물보다 더 좋은 생성물 품질을 초래한다는 것을 발견하였다. 품질의 차이는 도 5에 나타낸 데이터)에 의해 증명된다. 추가적으로 겔로 이동된 산성 밴드가 우세한 레인 2 및 4는 판매용 에타너셉트(etanercept)(Enbrel®)(레인 6)의 것과 매우 유사한 전하 종류의 분포를 나타낸다. 반면, 고농도 피드(레인 3 및 5)에서의 시료는 낮은 산성 및 급격하게 이동된 종류를 보여주며, Enbrel®과 덜 유사하다.
후속 실험은 정확하게 동일한 피드 조건을 이용한 높은 배양 밀도(ml 당 25,000,000 세포)로 테스트하였다. 본 발명자들은 낮은 함량의 셀 부스트 5 피드가 있는 배지 제제가 배양 생존율을 유지할 수 없고, 궁극적으로 생성물 품질의 저하를 초래한다는 것을 발견하였다. 그러나, 본 발명자들은 더 높은 총 아미노산 농도 (약 100 mM)를 함유하는 피드 배지가 높은 생존율을 지원하는 반면, 생성물 품질은 낮은 세포 밀도에서 관찰된 것과 유사한 것이 아니라는 것을 발견하였다. 이 결과는 ml 당 용액 25-50000000 세포의 세포 밀도를 지지하면서 양호한 생성물 품질을 제공할 수 있는 다른 배지와 피드를 찾는 추가적인 조사를 필요로 한다. 따라서, 본 발명자들은 배양물의 ml 당 30-50000000 세포로 씨딩된 배양물의 가장 긴 수명을 지지할 수 있는 배지 조성을 확인하기 위하여 일부 기본 배지 및 배치 모드의 배지 조합을 조사하였다. 본 조사는 상기 실시예 1에 기재된 실험 및 발견을 포함한다.
실시예 5
TNFR - Fc 융합 단백질의 관류 생산에서의 배지 요구 사항
본 발명자들은 에타너셉트에 대한 바이오시밀러로 개발중인 TNFR-Fc 융합 단백질의 생산에 고밀도 배양(25 × 106 세포/㎖)을 사용하는 관류를 시뮬레이션하는 다양한 배지 교환 실험을 실시하였다. 이 실험에서, 본 발명자들은 높은 생존율이 영양물의 감소된 농도를 제공하는 피드로 달성될 수 있음을 지속적으로 발견하였다. 본 발견은 2 개의 고밀도 배양물을 정립하는 실험으로 예시화되고, 각 배양물의 밀리리터 당 25,000,000 세포를 함유하는, 두 배양물 모두는 동일한 기본 배지 (BalanCD/Hycell, 1:1) 및 10 mM의 갈락토스 및 10 mM ManNAc의 추가 보충제를 이용하였다. 두 배양물의 차이는 CHOZN 피드(10% 대 20%) 및 면화씨 가수 분해물(7.5% 대 15%)로 보충된 수준이었다. 추가 아미노산이 제공된 피드 모두를 배양물에 공급한다. 저농도 피드의 배양물의 생존율은 고농도 배지의 배양물의 것과 일치하였다. 이러한 결과는 20%(98 mM 총 아미노산 함량)에서 10%(78 mM 총 아미노산 함량)로의 피드 농도의 감소가 배양물의 영양 요구를 제한하지 않았다는 것을 나타내며, 본 발명자들이 본 발명에서 규정한 수준으로 총 아미노산 농도가 추가적으로 감소될 수 있다는 것을 명확하게 보여준다. 데이터는 도 6 및 도 7에 나타낸다.
아미노산 함량에 대하여 소모된 배지 분석은, 배양 48 시간 후에도, 저 피드 함량의 배양물이 유효한 방식으로 제공된 임의의 아미노산을 고갈하지 않았다는 것을 보여준다. 이는 아미노산 함량이 배양물의 영양 요구보다 높고, 본 발명에 따르면 78 mM 아래로 감소될 수 있다는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명자들은, 일정한 속도로 배지를 관류한 세포가 훨씬 낮은 수준의 아미노산을 요구할 것이며, 1일 당 생물 반응기 부피와 동일한 관류 속도가 약 20-50 mM 범위의 정상 상태의 총 아미노산 농도를 필요로 한다는 것을 발견하였다.
생성물 개발 사업의 기본 요구 사항 중 하나는 원하는 품질의 생성물의 높은 역가 발현이다. 대부분의 단백질은 이들의 치료 활성에 대한 적절한 번역 후 변경이 필요하다. 예를 들어, 이 실시예에서 제조된 TNFR-Fc 융합 단백질은 유의한 정도의 시알릴화(sialylation)를 필요로 하고, 이는 분자 전하 프로파일에 기초한 동형의 특정 분포를 초래한다. IEF 겔로 나타낸 등전점 촛점 분석(도 8)은, 피드 함량의 감소가 상용화된 레퍼런스 기준 및 20% 피드로 공급된 배양물로부터 획득한 샘플에 비해 생성물 동형 분석의 변화를 초래하지 않는다는 것을 보여준다.
도 8에서 등전점 촛점(IEF) 겔은 저(10%) 피드 농도를 함유하는 배지(웰 1, 및 4, 제1 및 제2 배지 교환, ME)로부터 분리된 생성물의 등전점 분포가 아미노산 풍부 배양물(20%)(웰 2, 및 5, 제1 및 제2 배지 교환, ME)로부터 분리된 생성물과 비교하여 유사하다는 것을 보여준다. 레퍼런스 기준의 프로파일은 웰 3에 나타낸다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 저농도(10% 피드) 및 고농도(20%)로 공급된 배양물에 대하여 획득된 역가는 피드의 고농도가 낮은 배양 생산성을 초래할 수 있음을 보여준다. 본 발명에서 규정된 관류에 대한 영양 요구를 세포에 제공함에 따라, 불필요한 풍부 배지를 피함으로써, 종래 기술 분야에서 추천하는 배지 요구에 비해 더 나은 생산성 및 생성물 품질을 얻을 수 있는 관류 공정에서 배양 대사 상태를 달성할 수 있다(예, U.S. 7,300,773 참고)
실시예 6
에타너셉트의 바이오시밀러로 개발중인 TNFR-Fc 융합 단백질의 생산을 위해, 씨드 트레인은 SFM4CHO에서 37℃의 대용량 진탕 플라스크로 확장된다. 이 실험은 총 아미노산 농도를 약 15 내지 약 70 mM(아래 표 참조)로 다양하게 하여 9 개로 별도 반복하였으며, 생산 생물 반응기는 배지에서 1 내지 5 x 106 세포/mL의 접종 밀도로 접종된다. 각 실행에서, 제조 단계(연속 관류) 동안 온도는 33.5℃ 내지 35℃이다. ATF™ 세포 보유 장치(Refine Technology)을 이용하여 중공 섬유 필터를 지나는 배지(폐기물 및 목적 생성물을 함유)를 분당 0.05에서 2.0 작업 배양 부피 재순환 속도로 재순환시킨다. 상기 배양을 성장 단계에서 0 내지 2 일 동안 일차 증식시킨 후, 생산 단계를 촉진하기 위하여 하루에 0.2 내지 2 배양 부피의 속도로 관류가 개시된다. 새로운 배지를 소모 배지에 첨가하고, 소모 배지(생성물 함유)는 0.2 ㎛ 기공 크기 중공 섬유 필터를 통해 수확된다. 수확된 유체는 2-8℃에서 냉각시키고, 단백질 A 수지에 의해 캡쳐되어 정제된다. 분취량은역가와 N-글리칸 분배 및 HIC 분석(정확하게 폴딩된 에타너셉트 대 부정확하게 폴딩/응집된(비활성) 물질의 상대량을 평가하기 위하여)와 같은 생성물 품질 특성에 대해 분석된다. 이러한 실행에서 조사된 총 아미노산 농도는 다음과 같다:
전체(정상 상태) 아미노산 농도(약.)
Figure pct00002
1부터 9까지 각 실행에 대한 생존 세포 밀도, 생존율, 생성물 품질 및 역가 분석은 15 내지 70 mM 총 아미노산 농도 범위에서 높은 범위일수록 이러한 특성 저하의 증가와 함께, 상기 범위에서 낮은 범위일수록, 바람직하게는 약 15 내지 약 30 mM에서 이러한 특성이 우수하다는 결과를 보여준다.
실시예 7
에타너셉트의 바이오시밀러로 개발중인 TNFR-Fc 융합 단백질의 생산을 위해, 씨드 트레인을 SFM4CHO에서 37℃의 대용량 진탕 플라스크로 확장하였다. 총 아미노산 농도가 약 20 내지 약 56 mM인 경우, 생산 생물 반응기는 배지 내 일련의 관류 생물 반응기에서 0.3 내지 0.75 x 106 세포/mL의 접종 밀도로 접종하였다. 각 실행에서, 제조 단계(연속 관류) 동안 온도는 35℃ 내지 37℃이다. ATF™ 세포 보유 장치(Refine Technology)를 이용하여 중공 섬유 필터를 지나는 배지(폐기물 및 목적 생성물을 함유)를 하루에 0.5에서 2.0 작업 배양 부피 재순환 속도로 재순환시킨다. 상기 배양은 하루에 세포당 0.05 내지 0.1 nL 세포-특정 관류 속도의 관류와 함께 처음에 8 일까지 성장 단계에서 일차 증식시킨다. 온도를 예를 들어, 33.5℃로 감소시켜서 생산 단계를 용이하게 하였다. 새로운 배지를 소모 배지(생성물 함유)에 첨가하고, 0.2 ㎛ 기공 크기 중공 섬유 필터를 통해 수확하였다. 단백질 A 수지 상의 캡쳐를 위한 제제에서 수확된 유체를 2-8℃에서 냉각시켰다. 분취량은 역가와 N-글리칸 분배 및 HIC 분석(정확하게 폴딩된 에타너셉트 대 부정확하게 폴딩/응집된(비활성) 물질의 상대량을 평가하기 위하여)와 같은 생성물 품질 특성에 대해 분석하였다.
각 실행에 대한 생존 세포 밀도, 생존율, 생성물 품질 및 역가 분석은 20 내지 56 mM 범위의 총 아미노산 농도의 하단부, 바람직하게는 약 15 내지 약 30 mM에서 이러한 특성에 대하여 우수한 결과를 보여준다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 명세서에 설명된 바와 같이 성장된 배양물은 9일 성장 단계 동안 약 3 천만 세포/㎖가 달성되었고 추가로 11 내지 12 일 동안 연장된 생산 단계에서 높은 생존율로 상기 세포 농도를 유지하였다.

Claims (20)

  1. 70 mM 미만의 총 아미노산 농도를 포함하는 피드(feed) 배지의 존재하에서 관류를 통해 단백질을 생산하는 단계를 포함하는 단백질의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 피드 배지는 약 15 내지 20 mM; 약 20 내지 25 mM; 약 25 내지 30 mM; 약 30 내지 35 mM; 약 35 내지 40 mM; 약 40 내지 45 mM; 약 45 내지 50 mM; 약 50 내지 55 mM; 약 55 내지 60 mM; 약 60 내지 65 mM; 및 65 및 70 mM 범위로 이루어진 군으로부터 선택된 범위의 총 아미노산 농도를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 융합 단백질 또는 항체인 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 단백질은 TNFR-Fc 융합 단백질인 것인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 단백질은 항-TNF 항체인 것인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 단백질은 에타너셉트(etanercept), 아달리무맙(adalimumab), 리툭시맙(rituximab), 트라스투주맙(trastuzumab), 베바시주맙(bevacizumab), 나탈리주맙(natalizumab), 에쿠리주맙(eculizumab) 및 이의 바이오시밀러(biosimilar) 또는 바이오베터(biobetter) 이형태(variants)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 피드 배지는 SFM4CHO® 기본 배지 및 BalanCD 기본 배지, Hycell 기본 배지, 면화씨 가수 분해물(cottonseed hydrolysate), 덱사메타손, ManNAc, 및/또는 D-(+)-갈락토스 중 1 종 이상을 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 다음 단계를 포함하는 것인 방법: (a) 목적의 치료용 단백질을 발현할 수 있는 세포 및 상기 발현을 실시하는 데 적합한 배양 배지를 포함하는 혼합물을 준비하는 단계; (b) 상기 혼합물을 함유하는 적합한 용기에서, 상기 세포가 상기 단백질을 생산하도록 유발하는 단계; 및 (c) 주기적으로 또는 연속적으로 상기 반응 용기로부터 소모된 배양 배지를 제거하고, 상기 반응 용기에 새로운 배양 배지를 첨가하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세포는 CHO 세포인 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 단계 (a) 이전에, 상기 단백질을 발현할 수 있는 상기 세포가 약 28℃ 내지 약 37℃; 및 (ii) 약 35℃ 내지 약 36℃로부터 선택된 온도의 성장 단계에서 성장되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 생산 단계(다음 성장 단계와 구별하여)는 (ⅰ) 약 32℃ 초과; (ⅱ) 약 34℃ 초과; (ⅲ) 약 35℃ 초과; (iv) 약 33℃ 내지 약 36℃의 범위; (v) 약 35℃ 내지 약 36℃의 범위; (vi) 32.5℃; (vii) 33.5℃; (viii) 34.5℃; 및 (ix) 35.5℃로부터 선택된 온도에서 실시되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제조되는 단백질은 에타너셉트의 바이오시밀러(biosimilar)인 것인 방법.
  13. 다음 단계를 포함하는 치료용 단백질을 제조하는 관류 방법으로서,
    (a) 상기 단백질을 발현할 수 있는 CHO 세포 및 상기 발현을 실시하는 데 적합한 배양 배지를 포함하는 혼합물을 준비하는 단계; (b) 상기 혼합물을 함유하는 적합한 용기에서, 상기 세포가 상기 단백질을 생산하도록 유발하는 단계; 및 (c) 주기적으로 또는 연속적으로 상기 반응 용기로부터 소모된 배양 배지를 제거하고, 상기 반응 용기에 새로운 배양 배지를 첨가하는 단계를 포함하고, 상기 배양 배지는 (i) 약 15 내지 약 65 mM의 총 아미노산 농도; 및 복합 화학적-정의 피드, 덱사메타손, ManNAc, 면화씨 가수 분해물 및 D-(+)-갈락토스로 이루어진 군으로부터 선택된 최소 1 종을 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 치료용 단백질은 에타너셉트(etanercept), 아달리무맙(adalimumab), 리툭시맙(rituximab), 트라스투주맙(trastuzumab), 베바시주맙(bevacizumab), 나탈리주맙(natalizumab), 에쿠리주맙(eculizumab) 및 이의 바이오시밀러(biosimilar) 또는 바이오베터(biobetter) 이형태(variants)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 치료용 단백질은 에타너셉트(etanercept), 또는 이의 바이오시밀러(biosimilar) 또는 바이오베터(biobetter) 이형태(variants)인 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 단계 (a) 이전에, 에타너셉트를 발현할 수 있는 상기 세포가 (i) 약 28℃ 내지 약 37℃; 및 (ii) 약 35℃ 내지 약 36℃로부터 선택된 온도의 성장 단계에서 성장되는 것인 관류 방법.
  17. 제16항에 있어서, (b) 및 (c) 단계에서 발생되는 상기 에타너셉트의 제조 동안 반응 용기는 (ⅰ) 약 32℃ 초과; (ⅱ) 약 34℃ 초과; (ⅲ) 약 35℃ 초과; (iv) 약 33℃ 내지 약 36℃의 범위; (v) 약 35℃ 내지 약 36℃의 범위; (vi) 32.5℃; (vii) 33.5℃; (viii) 34.5℃; 및 (ix) 35.5℃로부터 선택된 온도에서 유지되는 것인 관류 방법.
  18. 피드 배지 조성물로서, 약 15 내지 20 mM; 약 20 내지 25 mM; 약 25 내지 30 mM; 약 30 내지 35 mM; 약 35 내지 40 mM; 약 40 내지 45 mM; 약 45 내지 50 mM; 약 50 내지 55 mM; 약 55 내지 60 mM; 약 60 내지 65 mM 범위로 이루어진 군으로부터 선택된 범위의 총 아미노산 농도를 포함하고, 추가적으로 복합 화학적-정의 피드, 면화씨 가수 분해물, 덱사메타손, ManNAc, 및/또는 D-(+)-갈락토스로 이루어진 군으로부터 선택된 최소 1 종을 포함하는 것인 피드 배지 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 관류 반응 용기는 융합 단백질 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 포함하는 것인 피드 배지 조성물.
  20. 치료용 단백질을 제조하는 관류 방법에 있어서, 목적의 총 아미노산 농도를 제공하도록 제형화된 피드 배지 조성물로서, 상기 목적의 농도는 상기 방법에 이용되는 관류 반응기의 부피를 기반으로 하여, 약 15 내지 20 mM; 약 20 내지 25 mM; 약 25 내지 30 mM; 약 30 내지 35 mM; 약 35 내지 40 mM; 약 40 내지 45 mM; 약 45 내지 50 mM; 약 50 내지 55 mM; 약 55 내지 60 mM; 약 60 내지 65 mM 범위로부터 선택된 범위이고, 상기 조성물은 추가적으로 면화씨 가수 분해물, 덱사메타손, ManNAc, 및/또는 D-(+)-갈락토스를 포함하는 것인 피드 배지 조성물.
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