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KR20160027219A - 내배엽 및 간세포를 수득하고 사용하는 조성물 및 방법 - Google Patents

내배엽 및 간세포를 수득하고 사용하는 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20160027219A
KR20160027219A KR1020167004227A KR20167004227A KR20160027219A KR 20160027219 A KR20160027219 A KR 20160027219A KR 1020167004227 A KR1020167004227 A KR 1020167004227A KR 20167004227 A KR20167004227 A KR 20167004227A KR 20160027219 A KR20160027219 A KR 20160027219A
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KR
South Korea
Prior art keywords
cells
endoderm
population
ylmethyl
cell
Prior art date
Application number
KR1020167004227A
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English (en)
Inventor
에스뗄 두드멍
히르데쉬 우팔
Original Assignee
에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에프. 호프만-라 로슈 아게 filed Critical 에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 내배엽 세포 집단 및/또는 내배엽 세포 유래 분화 세포 (예를 들어 간 세포, 췌장 전구체 세포, 췌장 세포, 장 선조 세포, 장 세포, 폐 선조 세포, 폐 세포 등) 을 생성시키기 위한 효율적 방법을 제공한다. 또한, 내배엽 세포 및 내배엽 세포 유래 분화 세포 (예를 들어 간 세포, 췌장 전구체 세포, 췌장 세포, 장 선조 세포, 장 세포, 폐 선조 세포, 폐 세포 등) 의 조성물 및 이러한 세포를 사용하는 방법이 제공된다.

Description

내배엽 및 간세포를 수득하고 사용하는 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS OF OBTAINING AND USING ENDODERM AND HEPATOCYTE CELLS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2012 년 5 월 23 일에 출원한 미국 가출원 특허 제 61/650,762 호에 대해 우선권을 주장하며, 이의 내용은 본원에 그 전체가 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 줄기 세포, 내배엽 세포, 췌장 선조 세포, 간세포 및 내배엽 세포 유래의 기타 세포 분야의 것이다. 일반적으로, 본 발명은 내배엽 세포, 췌장 선조 세포, 간세포 및/또는 내배엽 세포 유래의 기타 세포를 생성시키고 사용하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
세포 치료요법 적용에 고유하게 적합한 줄기 세포를 생성시키는 2 가지 특성은 다능성 및 연장된 기간 동안 배양물에서 이들 세포를 유지시키는 능력이다. 다능성은 모든 세 가지 1 차 배엽 (내배엽, 중배엽, 외배엽) 의 유도체로 분화되고, 그 다음, 배외 조직 (예를 들어 태반) 및 생식 세포에 추가로, 성숙한 유기체의 모든 체세포 유형을 형성하는 줄기 세포의 능력으로 정의된다. 그러나, 줄기 세포의 다능성은 또한 이들 세포 및 그의 유도체의 연구 및 조작에 대한 고유한 도전 과제를 제시한다. 분화하는 줄기 세포 배양물을 발생시킬 수 있는 다양한 세포 유형으로 인해, 대다수의 세포 유형은 매우 낮은 효율로 생성된다.
연구 및 치료요법에 있어서의 세포에서 유용한 세포 집단을 생성시키기 위한 출발 물질로서 줄기 세포를 사용하기 위해, 원하는 말단 집단으로의 전환량 뿐 아니라 전환률에 있어서의 생성 효율 문제점을 극복하기에 유리할 수 있다. 예를 들어, 이는 증가된 증식 속도로 배양물에서 수득되고/되거나 유지될 수 있는 중내배엽 세포, 내배엽 세포 및 간세포와 같은 세포 유형 집단을 생성시키고, 이로써 세포를 보다 풍부하고 덜 비싸게 제공하기 위한 방법을 확인하기에 유용할 수 있다. 또한, 치료 목적으로 다양한 세포 집단 (예를 들어, 간세포) 을 사용하기 위해, 더 양호한 치료 가능성이 제공되도록 성숙과 같은 향상된 특성을 갖는 세포 집단을 갖는 것이 유용할 수 있다. 따라서, 강건한 내배엽 세포 집단 및 간세포 집단, 그리고 줄기 세포의 이들 세포 유형으로의 효율적인, 유도된 분화를 얻기 위한 방법이 필요하다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 이러한 필요성을 다루며 또한 추가적인 이득도 제공한다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 공개물, 특허 및 특허 출원은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 그 중에서도, 고유한 특성을 갖는 내배엽 세포, 췌장 선조 세포, 간세포 (hepatocyte), 및 내배엽 세포 유래의 기타 세포를 생성하기 위한 조성물 (예를 들어 집단) 및 방법을 제공한다. 이들 세포 집단은 다양한 스크리닝 및/또는 치료적 용도를 위한 효용을 갖는다.
따라서 한 양상에서, 본 발명은 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포의 단리된 집단을 제공한다. 상기 내배엽 세포의 단리된 집단에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현한다. 상기 내배엽 세포의 단리된 집단에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고, 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현한다. 상기 내배엽 세포의 단리된 집단에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현한다. 상기 내배엽 세포의 단리된 집단에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 83% 이상의 세포가 SOX17 를 발현하고, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고, 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현한다. 상기 내배엽 세포의 단리된 집단에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 내배엽 세포는 간세포, 췌장 세포, 췌장 선조 세포, 간 세포 또는 폐 상피 세포가 되는 능력을 갖는다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고/하거나 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 하나 이상의 내배엽 세포 집단을 포함하는 안정한 내배엽 세포의 뱅크 (bank) 를 제공하며, 이때 상기 집단은 이러한 표현형을 10 계대 이상 동안 유지한다. 상기 안정한 내배엽 세포의 뱅크에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 내배엽 세포는 간세포, 췌장 세포, 췌장 선조 세포, 간 세포 또는 폐 상피 세포가 되는 능력을 갖는다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 줄기 세포 집단을 유효량의 PI3K 알파의 선택적 저해제 및 유효량의 액티빈 A 와 접촉시키고, 내배엽 세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함하는, 내배엽 세포 집단의 수득 방법을 제공한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단에서의 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 내배엽 세포 집단에서의 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 내배엽 세포 집단에서의 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 83% 의 세포가 SOX17 을 발현하고 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고, 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 내배엽 세포는 간세포, 췌장 세포, 췌장 선조 세포, 간 세포 또는 폐 상피 세포가 되는 능력을 갖는다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 내배엽 세포는 액티빈 A 및 PI3K 알파의 선택적 저해제와 접촉되지 않은 줄기 세포에 비해 더 큰 생존력 및/또는 증식을 갖는다.
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에에서, 줄기 세포는 성체 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포이다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 줄기 세포는 적격 (qualified) 마트리겔에서 배양된다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 줄기 세포는 현탁액에서 배양된다.
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, PI3K 알파의 선택적 저해제는 하기 식 (I) 의 융합 피리미딘인 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 염이다:
Figure pat00001
[식 중,
A 는 티오펜 또는 푸란 고리이고; n 은 1 또는 2 이고; R1 은 하기 식의 기이고:
Figure pat00002
{식 중,
m 은 0 또는 1 이고; R30 은 H 또는 C1-C6 알킬이고; R4 및 R5 는 이들이 부착되는 N 원자와 함께, N, S 및 O 에서 선택되는 0 또는 1 개의 추가적인 헤테로원자를 포함하는 5- 또는 6-원 포화 N-함유 헤테로시클릭기를 형성하고, 이는 벤젠 고리에 융합될 수 있고 비치환되거나 치환되거나; R4 및 R5 는 알킬이고 다른 것은 상기 정의한 바와 같은 5- 또는 6-원 포화 N-함유 헤테로시클릭기 또는 상기 정의한 바와 같은 5- 또는 6-원 포화 N-함유 헤테로시클릭기에 의해 치환되는 알킬기임};
R2 는 하기에서 선택되고:
(a)
Figure pat00003
{식 중,
R6 및 R7 은 이들이 부착되는 질소 원자와 함께, 비치환되거나 치환되는 모르폴린, 티오모르폴린, 피페리딘, 피페라진, 옥사제판 또는 티아제판기를 형성함}; 및
(b)
Figure pat00004
{식 중,
Y 는 사슬의 구성 탄소 원자 및/또는 사슬의 하나의 말단 또는 양쪽 말단 모두 사이에, O, N 및 S 에서 선택되는 1 또는 2 개의 헤테로원자를 함유하는 C2-C4 알킬렌 사슬이고, 이는 비치환되거나 치환됨};
R3 은 비치환되거나 치환되는 인다졸기임].
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 융합 피리미딘은 하기 식 (Ia) 의 것이다:
Figure pat00005
[식 중, X 는 S 또는 O 이고, R1, R2, R3 및 n 은 상기 정의한 바와 같음].
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 융합 피리미딘은 하기 식 (Ib) 의 것이다:
Figure pat00006
[식 중, X 는 S 또는 O 이고, R1, R2, R3 및 n 은 상기 정의한 바와 같음].
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 화합물은: 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-술폰산 디메틸아미드; {4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-모르폴린-4-일-메타논; 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-카르복실산 (2-메톡시-에틸)-메틸-아미드; {4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-N,N-디메틸-아세트아미드; 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-카르복실산 디메틸아미드; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-[4-(3-모르폴린-4-일-프로판-1-술포닐)-피페라진-1-일메틸]-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-(2-메톡시-에틸)-메틸-아민; (3-{4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-술포닐}-프로필)-디메틸-아민; 2-{4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-2-메틸-프로판-1-올; 1'-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-[1,4']바이피페리디닐; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-모르폴린-4-일-피페리딘-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-피리미딘-2-일-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 1-(2-히드록시-에틸)-4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-2-온; 6-(4-시클로프로필메틸-피페라진-1-일메틸)-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-피리딘-2-일-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-[4-(2,2,2-트리플루오로-에틸)-피페라진-1-일메틸]-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-티아졸-2-일-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(6-플루오로-1H-인다졸-4-일)-6-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-피리딘-2-일메틸-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-티아졸-2-일메틸-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(5-메틸-푸란-2-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-카르복실산 아미드; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(2-메톡시-1,1-디메틸-에틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[(3R,5S)-4-(2-메톡시-에틸)-3,5-디메틸-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-카르복실산 (2-메톡시-에틸)-메틸-아미드; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-카르복실산 디메틸아미드; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-피리딘-3-일메틸-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-카르복실산 메틸아미드; 2-{4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-N-메틸-이소부티르아미드; 2-{4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-2-메틸-1-피롤리딘-1-일-프로판-1-온; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(1-메틸-1H-이미다졸-2-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(5-메틸-이속사졸-3-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 1-{4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-2-메틸-프로판-2-올; 시클로프로필메틸-{1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-(2-메톡시-에틸)-아민; 6-[4-(1-에틸-1-메톡시메틸-프로필)-피페라진-1-일메틸]-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(1-메톡시메틸-시클로프로필)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-(2-메톡시-에틸)-(2,2,2-트리플루오로-에틸)-아민; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(2-메톡시-에틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-메탄올; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-피리딘-4-일메틸-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(6-메틸-피리딘-2-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(4-메틸-티아졸-2-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-피리딘-2-일-아민; N-{1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-2-메톡시-N-메틸-아세트아미드; N-{1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-N-메틸-메탄술폰아미드; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-(3-메톡시-프로필)-메틸-아민; 6-((3S,5R)-3,5-디메틸-4-피리딘-2-일메틸-피페라진-1-일메틸)-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(4-메톡시메틸-피페리딘-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-(2-메톡시-에틸)-티아졸-2-일메틸-아민; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-4-피리딘-2-일메틸-피페리딘-4-올; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-이소프로필-(2-메톡시-에틸)-아민; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-[4-(피리딘-2-일옥시)-피페리딘-1-일메틸]-티에노[3,2-d]피리미딘; N-{1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-N-(2-메톡시-에틸)-메탄술폰아미드; 2-{1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-프로판-2-올; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-[4-(1-옥시-피리딘-3-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-모르폴린-4-일메틸-피페리딘-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일메틸}-(2-메톡시-에틸)-메틸-아민; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일메틸}-디메틸-아민; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-3-일}-(2-메톡시-에틸)-메틸-아민; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-3-카르복실산 메틸아미드; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(3-메톡시메틸-피페리딘-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-피리딘-2-일메틸-피페리딘-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(2-메톡시-에톡시)-피페리딘-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 6-((3R,5S)-3,5-디메틸-4-티아졸-2-일메틸-피페라진-1-일메틸)-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-[4-(1-옥시-피리딘-2-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(2-메톡시-에틸)-피페리딘-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(4-메탄술포닐-피페리딘-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-(3-메탄술포닐-프로필)-메틸-아민; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(3-메톡시-프로판-1-술포닐)-피페리딘-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; (R)-1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-3-카르복실산 메틸아미드; (S)-1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-3-카르복실산 메틸아미드; 6-(4-이미다졸-1-일메틸-피페리딘-1-일메틸)-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-모르폴린-4-일메틸-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(3-메틸-피페리딘-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-3-일}-메탄올; 2-{1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-에탄올; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-4-티아졸-2-일-피페리딘-4-올; 2-(1-메틸-1H-인다졸-4-일)-6-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(2-메틸-2H-인다졸-4-일)-6-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-티아졸-4-일메틸-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘;1-{4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-3-페녹시-프로판-2-올; 6-[4-(1H-이미다졸-2-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 6-[4-(3H-이미다졸-4-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-((2S,6R)-2,4,6-트리메틸-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; {4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-1-메탄술포닐-피페라진-2-일}-메탄올; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(4-메탄술포닐-3-메톡시메틸-피페라진-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 및 상기 언급한 유리 화합물의 약학적으로 허용가능한 염에서 선택된다.
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, PI3K 알파의 선택적 저해제는 하기 화합물에서 선택된다:
Figure pat00007
Figure pat00008
, INK1117 및 BYL719.
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, PI3K 알파의 선택적 저해제는 하기에서 선택된다:
Figure pat00009
Figure pat00010
Figure pat00011
, INK1117 및 BYL719.
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, PI3K 알파의 선택적 저해제는 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-6-[(4-메틸술포닐피페라진-1-일)메틸]티에노[3,2-d]피리미딘-4-일]모르폴린이다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, P13K 알파의 선택적 저해제는 또한 PI3K 델타의 저해제이다.
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, PI3K 알파의 선택적 저해제의 유효량은 750nM 이다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 액티빈 A 의 유효량은 100ng/ml (배지) 이다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 세포를 배양하는 것은 Wnt3a 의 부재 하에 세포를 배양하는 것을 포함한다.
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 방법은 줄기 세포 집단을 유효량의 mTOR 저해제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 방법은 줄기 세포 집단을 PI3K 델타의 선택적 저해제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 상기 언급한 방법 중 임의의 하나를 사용하여 수득한 내배엽 세포 집단을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 줄기 세포 집단을 유효량의 mTOR 의 저해제 및 유효량의 액티빈 A 와 접촉시키고, 내배엽 세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함하는, 내배엽 세포 집단의 수득 방법을 제공한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단에서의 61% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하거나, 내배엽 세포 집단에서의 40% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단에서의 61% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 내배엽 세포 집단에서의 40% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현한다.상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 내배엽 세포는 간세포, 췌장 세포, 췌장 선조 세포, 간 세포 또는 폐 상피 세포가 되는 능력을 갖는다.
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, mTOR 의 저해제는 siRNA 또는 소분자이다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 상기 소분자는 하기로 이루어지는 군에서 선택된다;
Figure pat00012
AP23573, Torsel, INK128, AZD80555, AZD2012, CC-223, KU-0063794, OSI-027, 시롤리무스 라파마이신 및 에버로리무스.
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 상기 소분자는 하기로 이루어지는 군에서 선택된다:
Figure pat00013
또한, 상기 언급한 방법 중 임의의 하나를 사용하여 수득한 내배엽 세포 집단이 본 발명에 의해 제공된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 내배엽 세포의 관심 세포 유형으로의 분화를 촉진하는 인자의 확인 방법을 제공하며, 상기 방법은: 집단에서의 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 집단에서의 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 집단에서의 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 상기 인자와 접촉시키고, 관심 세포 유형으로의 분화에 대해 내배엽 세포 집단을 모니터링하고, 이로써 내배엽 세포의 관심 세포 유형으로의 분화를 촉진하는 인자를 확인하는 것을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 내배엽 세포의 분화를 저해하는 인자의 확인 방법을 제공하며, 상기 방법은: 집단에서의 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 집단에서의 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 집단에서의 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 상기 인자와 접촉시키고, 분화에 대해 세포를 모니터링하고, 이로써 내배엽 세포의 분화를 저해하는 인자를 확인하는 것을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 독성에 대해 후보 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하며, 상기 방법은: 집단에서의 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 집단에서의 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 집단에서의 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 약물과 접촉시키고, 독성에 대해 세포를 모니터링하고, 이로써 후보 약물이 독성인지 여부를 확인하는 것을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 집단에서의 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 집단에서의 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 집단에서의 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 세포-기반 치료요법을 이를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법을 제공한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 상기 환자는 간 섬유증, 경화증, 간 부전, 간암 및 췌장암, 췌장 부전, 장 조직 대체 효소 결함, 크론씨병, 염증성 장 증후군 및 장암을 앓고 있는 환자이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 간세포 집단의 수득 방법을 제공하며, 상기 방법은 집단에서의 83% 이상의 세포가 SOX17 를 발현하고, 집단에서의 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 집단에서의 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을, 간세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 배양하는 것을 포함한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 집단에서의 56% 이상의 간세포가 AFP 를 발현한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 줄기 세포 집단을 유효량의 PI3K 알파의 선택적 저해제 및 유효량의 액티빈 A 와 접촉시키고, 간세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 세포를 배양함으로써, 내배엽 세포가 수득된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 간세포 집단의 수득 방법을 제공하며, 상기 방법은 줄기 세포 집단을 유효량의 PI3K 알파의 선택적 저해제 및 유효량의 액티빈 A 와 함께 배양하고, 간세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 간세포 집단을 수득하기에 충분한 조건은 유효량의 액티빈 A 를 함유하며 다른 성장 인자를 함유하지 않는 배지에서 내배엽 세포를 배양하는 것을 포함한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 다른 성장 인자는 FGF2, FGF4, BMP2 및 BMP4 로 이루어지는 군에서 선택된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 상기 방법 중 임의의 하나를 사용하여 수득한 간세포 집단을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 하기 중 하나 이상인 간세포의 단리된 집단을 제공한다: 간세포가 알부민, A1AT, 또는 알부민 및 A1AT 를 분비함; CYP1A1/2 활성이 유도성임; 및 간세포가 AFM, AFP, AGXT, ALB, CEBPA, CYP2C19, CYP2C9, CYP3A4, CYP3A7, CYP7A1, CABP1, FOXA1, FOXA2, GSTA1, HNF1A, HNF1B, HNF4a, IL6R, SERPINA1, SERPINA3, SERPINA7, SLCO2B1, TAT, VCAM1, 또는 이의 조합을 발현함.
또 다른 양상에서, 본 발명은 상기 유효량의 간세포 집단을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 세포-기반 치료요법을 이를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법 중 임의의 하나에 의해 수득한 간세포 집단을 후보 약물과 접촉시키고, 독성에 대해 간세포를 모니터링하고, 이로써 후보 약물이 독성인지 여부를 확인하는 것을 포함하는, 독성에 대해 후보 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 췌장 선조 세포의 수득 방법을 제공하며, 상기 방법은: 줄기 세포 집단을 유효량의 (1) mTOR 저해제 및 유효량의 액티빈 A 또는 (2) PI3K 알파의 선택적 저해제 및 유효량의 액티빈 A 또는 (3) mTOR 저해제, PI3K 알파의 선택적 저해제, 및 유효량의 액티빈 A 와 함께 배양하고, 내배엽 세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 세포를 배양하고; 내배엽 세포의 췌장 선조 세포로의 분화를 촉진하기에 충분한 조건 하에 내배엽 세포를 배양하는 것을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 췌장 선조 세포의 수득 방법을 제공하며, 상기 방법은: 상기 기재한 내배엽 세포의 출발 집단을 내배엽 세포의 췌장 선조 세포로의 분화를 촉진하기에 충분한 조건 하에 배양하는 것을 포함한다.
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 췌장 선조 세포는 췌장 내분비 세포, 췌장 외분비 세포 및 췌장 췌관 세포로 분화될 수 있다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 췌장 내분비 세포는 알파 세포, 베타 세포, 델타 세포 및 감마 세포로 이루어지는 군에서 선택된다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 췌장 내분비 세포는 글루카곤, 인슐린, 소마토스타틴 및 췌장 폴리펩티드 중 하나 이상을 생성시킬 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 분화된 췌장 세포의 수득 방법을 제공하며, 상기 방법은 췌장 선조 세포의 분화된 췌장 세포로의 분화를 촉진하기에 충분한 조건 하에 상기 방법 중 임의의 하나에 의해 생성된 췌장 선조 세포를 배양하는 것을 포함한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 분화된 췌장 세포는 췌장 내분비 세포, 췌장 외분비 세포 및 췌장 췌관 세포로 이루어지는 군에서 선택된다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 분화된 췌장 세포는 글루카곤, 인슐린, 소마토스타틴 및 췌장 폴리펩티드 중 하나 이상을 생성시킬 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 상기 방법에 의해 생성되는 췌장 선조 세포의 단리된 집단을 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 췌장 선조 세포가 Pdx1, C-펩티드, ARX, GLIS3, HNF1a, HNF1b, HNF4a, KRT19, MNX1, RFX6, SERPINA3, ONECUT1, NKX2-2 또는 이의 임의의 조합인 췌장 선조 세포의 단리된 집단을 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 상기 방법에 의해 생성된 분화된 췌장 세포의 단리된 집단을 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 췌장 세포가 현탁액에서 클러스터를 형성하며 현탁액에서 생존가능한, 분화된 췌장 세포의 단리된 집단을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 상기 기재된 유효량의 췌장 선조 세포 집단을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 세포-기반 치료요법을 이를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법을 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 상기 기재된 유효량의 분화된 췌장 세포 집단을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 세포-기반 치료요법을 이를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법을 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 상기 방법 중 임의의 하나에 의해 수득된 췌장 세포 집단을 후보 약물과 접촉시키고, 독성에 대해 췌장 세포를 모니터링하고, 이로써 후보 약물이 독성인지 여부를 확인하는 것을 포함하는, 독성에 대해 후보 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 75% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 75% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 75% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포의 단리된 집단을 포함하는 집단을 제공한다. 상기 집단 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현한다. 상기 집단 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현한다. 상기 집단 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현한다. 상기 집단 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현한다. 상기 집단 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고, 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현한다. 상기 기재된 내배엽 세포의 단리된 집단의 임의의 구현예에서, 내배엽 세포는 간세포가 되는 능력을 갖는다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 75% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 75% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고/하거나 75% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하며 이 집단이 극저온으로 저장되는, 하나 이상의 내배엽 세포 집단을 포함하는 내배엽 세포의 뱅크를 제공한다. 상기 뱅크 중 임의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 내배엽 세포의 뱅크는 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고/하거나 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하며 이 집단이 극저온으로 저장되는, 하나 이상의 내배엽 세포 집단을 포함한다. 상기 뱅크 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 뱅크에서의 내배엽 세포는 간세포가 되는 능력을 갖는다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 줄기 세포 집단을 유효량의 PI3K 알파의 선택적 저해제 및 유효량의 액티빈 A 와 접촉시키고, 내배엽 세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 세포를 배양함으로써 내배엽 세포 집단을 수득하는 방법을 제공한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단에서의 75% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 내배엽 세포 집단에서의 75% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 내배엽 세포 집단에서의 75% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단에서의 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 내배엽 세포 집단에서의 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 내배엽 세포 집안에서의 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고, 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고, 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 상기 기재한 방법에 의해 수득된 내배엽 세포는 간세포가 되는 능력을 갖는다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 내배엽 세포는 액티빈 A 및 PI3K 알파의 선택적 저해제와 접촉되지 않은 줄기 세포에 비해 더 큰 생존력 및/또는 증식을 갖는다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 내배엽 세포는 PI3K 알파의 선택적 저해제와 접촉되지 않은 대조군에 비해 더 큰 생존력 및/또는 증식을 갖는다.
다양한 구현예에서, 방법에서 사용된 줄기 세포는 성체 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포이다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 줄기 세포는 적격 마트리겔, 젤라틴 또는 콜라겐에서 배양된다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 줄기 세포는 현탁액에서 배양된다.
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, PI3K 알파의 선택적 저해제는 하기 식 (I) 의 융합 피리미딘인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다:
Figure pat00014
[식 중,
A 는 티오펜 또는 푸란 고리를 나타내고; n 은 1 또는 2 이고; R1 은 하기 식의 기이고:
Figure pat00015
{식 중,
m 은 0 또는 1 이고; R30 은 H 또는 C1-C6 알킬이고; R4 및 R5 는 이들이 부착되는 N 원자와 함께, N, S 및 O 에서 선택되는 0 또는 1 개의 추가적인 헤테로원자를 포함하는 5- 또는 6-원 포화 N-함유 헤테로시클릭기를 형성하고, 이는 벤젠 고리에 융합될 수 있으며 비치환되거나 치환되거나; R4 및 R5 중 하나는 알킬이고 다른 것은 상기 정의한 바와 같은 5- 또는 6-원 포화 N-함유 헤테로시클릭기 또는 상기 정의한 바와 같은 5- 또는 6-원 포화 N-함유 헤테로시클릭기에 의해 치환되는 알킬기임};
R2 는 하기에서 선택되고:
(a)
Figure pat00016
{식 중,
R6 및 R7 은 이들이 부착되는 질소 원자와 함께, 비치환되거나 치환되는 모르폴린, 티오모르폴린, 피페리딘, 피페라진, 옥사제판 또는 티아제판기를 형성함}; 및
(b)
Figure pat00017
{식 중,
Y 는 사슬의 구성 탄소 원자 및/또는 사슬의 하나의 말단 또는 양쪽 말단 모두 사이에, O, N 및 S 에서 선택되는 1 또는 2 개의 헤테로원자를 함유하는 C2-C4 알킬렌 사슬이고, 이는 비치환되거나 치환됨};
R3 은 비치환되거나 치환되는 인다졸기임].
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, PI3K 알파의 선택적 저해제의 융합 피리미딘은 하기 식 (Ia) 의 것이다:
Figure pat00018
[식 중, X 는 S 또는 O 이고, R1, R2, R3 및 n 은 상기 정의한 바와 같음].
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, PI3K 알파의 선택적 저해제의 융합 피리미딘은 하기 식 (Ib) 의 것이다:
Figure pat00019
[식 중, X 는 S 또는 O 이고, R1, R2, R3 및 n 은 상기 정의한 바와 같음].
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, PI3K 알파의 선택적 저해제는 하기에서 선택되는 화합물, 또는 화합물의 조합: 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-술폰산 디메틸아미드; {4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-모르폴린-4-일-메타논; 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-카르복실산 (2-메톡시-에틸)-메틸-아미드; {4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-N,N-디메틸-아세트아미드; 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-카르복실산 디메틸아미드; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-[4-(3-모르폴린-4-일-프로판-1-술포닐)-피페라진-1-일메틸]-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-(2-메톡시-에틸)-메틸-아민; (3-{4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-술포닐}-프로필)-디메틸-아민; 2-{4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-2-메틸-프로판-1-올; 1'-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-[1,4']바이피페리디닐; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-모르폴린-4-일-피페리딘-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-피리미딘-2-일-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 1-(2-히드록시-에틸)-4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-2-온; 6-(4-시클로프로필메틸-피페라진-1-일메틸)-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-피리딘-2-일-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-[4-(2,2,2-트리플루오로-에틸)-피페라진-1-일메틸]-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-티아졸-2-일-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(6-플루오로-1H-인다졸-4-일)-6-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-피리딘-2-일메틸-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-티아졸-2-일메틸-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(5-메틸-푸란-2-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-카르복실산 아미드; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(2-메톡시-1,1-디메틸-에틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[(3R,5S)-4-(2-메톡시-에틸)-3,5-디메틸-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-카르복실산 (2-메톡시-에틸)-메틸-아미드; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-카르복실산 디메틸아미드; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-피리딘-3-일메틸-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-카르복실산 메틸아미드; 2-{4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-N-메틸-이소부티르아미드; 2-{4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-2-메틸-1-피롤리딘-1-일-프로판-1-온; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(1-메틸-1H-이미다졸-2-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(5-메틸-이속사졸-3-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 1-{4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-2-메틸-프로판-2-올; 시클로프로필메틸-{1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-(2-메톡시-에틸)-아민; 6-[4-(1-에틸-1-메톡시메틸-프로필)-피페라진-1-일메틸]-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(1-메톡시메틸-시클로프로필)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-(2-메톡시-에틸)-(2,2,2-트리플루오로-에틸)-아민; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(2-메톡시-에틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-메탄올; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-피리딘-4-일메틸-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(6-메틸-피리딘-2-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(4-메틸-티아졸-2-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-피리딘-2-일-아민; N-{1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-2-메톡시-N-메틸-아세트아미드; N-{1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-N-메틸-메탄술폰아미드; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-(3-메톡시-프로필)-메틸-아민; 6-((3S,5R)-3,5-디메틸-4-피리딘-2-일메틸-피페라진-1-일메틸)-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(4-메톡시메틸-피페리딘-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-(2-메톡시-에틸)-티아졸-2-일메틸-아민; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-4-피리딘-2-일메틸-피페리딘-4-올; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-이소프로필-(2-메톡시-에틸)-아민; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-[4-(피리딘-2-일옥시)-피페리딘-1-일메틸]-티에노[3,2-d]피리미딘; N-{1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-N-(2-메톡시-에틸)-메탄술폰아미드; 2-{1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-프로판-2-올; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-[4-(1-옥시-피리딘-3-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-모르폴린-4-일메틸-피페리딘-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일메틸}-(2-메톡시-에틸)-메틸-아민; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일메틸}-디메틸-아민; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-3-일}-(2-메톡시-에틸)-메틸-아민; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-3-카르복실산 메틸아미드; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(3-메톡시메틸-피페리딘-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-피리딘-2-일메틸-피페리딘-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(2-메톡시-에톡시)-피페리딘-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 6-((3R,5S)-3,5-디메틸-4-티아졸-2-일메틸-피페라진-1-일메틸)-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-[4-(1-옥시-피리딘-2-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(2-메톡시-에틸)-피페리딘-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(4-메탄술포닐-피페리딘-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-(3-메탄술포닐-프로필)-메틸-아민; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(3-메톡시-프로판-1-술포닐)-피페리딘-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; (R)-1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-3-카르복실산 메틸아미드; (S)-1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-3-카르복실산 메틸아미드; 6-(4-이미다졸-1-일메틸-피페리딘-1-일메틸)-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-모르폴린-4-일메틸-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(3-메틸-피페리딘-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-3-일}-메탄올; 2-{1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-에탄올; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-4-티아졸-2-일-피페리딘-4-올; 2-(1-메틸-1H-인다졸-4-일)-6-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(2-메틸-2H-인다졸-4-일)-6-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-티아졸-4-일메틸-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 1-{4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-3-페녹시-프로판-2-올; 6-[4-(1H-이미다졸-2-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 6-[4-(3H-이미다졸-4-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-((2S,6R)-2,4,6-트리메틸-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; {4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-1-메탄술포닐-피페라진-2-일}-메탄올; 및 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(4-메탄술포닐-3-메톡시메틸-피페라진-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 및 상기 언급한 유리 화합물의 약학적으로 허용가능한 염이다.
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, PI3K 알파의 선택적 저해제는 하기에서 선택되는 화합물, 또는 화합물의 조합이다:
Figure pat00020
Figure pat00021
Figure pat00022
, INK1117 및 BYL7.
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, PI3K 알파의 선택적 저해제는 화합물 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-6-[(4-메틸술포닐피페라진-1-일)메틸]티에노[3,2-d]피리미딘-4-일]모르폴린이다.
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, P13K 알파의 선택적 저해제는 또한 PI3K 델타의 저해제이다.
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, PI3K 알파의 선택적 저해제의 유효량은 750nM 이다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 액티빈 A 의 유효량은 100ng/ml (배지) 이다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 세포를 배양하는 것은 Wnt3a 의 부재 하에 세포를 배양하는 것을 포함한다.
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 방법은 줄기 세포 집단을 유효량의 mTOR 저해제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, PI3K 알파의 선택적 저해제는 또한 선택적 저해제 mTOR 키나아제이다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 방법은 줄기 세포 집단을 PI3K 델타의 선택적 저해제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다.
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 방법을 사용하여 수득된 내배엽 세포 집단을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 줄기 세포 집단을 유효량의 mTOR 의 저해제 및 유효량의 액티빈 A 와 접촉시키고, 내배엽 세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함하는, 내배엽 세포 집단의 수득 방법을 제공한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 수득된 내배엽 세포 집단은 내배엽 세포 집단에서의 61% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하거나, 내배엽 세포 집단에서의 40% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하는 집단이다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 수득한 내배엽 세포 집단은 내배엽 세포 집단에서의 61% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 내배엽 세포 집단에서의 40% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하는 집단이다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 수득한 내배엽 세포 집단은 내배엽 세포가 간세포가 되는 능력을 갖는 집단이다.
상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 방법은 줄기 세포 집단을 유효량의 mTOR 의 저해제 및 유효량의 액티빈 A 와 접촉시키는 것을 포함하며, 이때 상기 mTOR 의 저해제는 siRNA 또는 소분자이다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, mTOR 의 저해제는 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 소분자이다:
Figure pat00023
Figure pat00024
KU-0063794,
AP23573 (또한 리다포롤리무스 또는 데포롤리무스로도 알려져 있음), Torsel (또한 템시롤리무스 또는 CI-779 로도 알려져 있음), INK128, AZD2012, CC-223, OSI-027, 시롤리무스 (라파마이신) 및 에버로리무스. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, mTOR 의 저해제는 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 소분자이다:
Figure pat00025
또 다른 양상에서, 본 발명은 집단에서의 75% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 집단에서의 75% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 집단에서의 75% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 내배엽 세포의 관심 세포 유형으로의 분화를 촉진하는 인자와 접촉시키고, 관심 세포 유형으로의 분화에 대해 내배엽 세포 집단을 모니터링하고, 이로써 내배엽 세포의 관심 세포 유형으로의 분화를 촉진하는 인자를 확인함에 의한, 내배엽 세포의 관심 세포 유형으로의 분화를 촉진하는 인자의 확인 방법을 제공한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 집단에서의 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 집단에서의 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 집단에서의 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현한다.
본 발명은 또한 집단에서의 75% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 집단에서의 75% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 집단에서의 75% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 내배엽 세포의 분화를 저해하는 인자와 접촉시키고, 분화에 대해 세포를 모니터링하고, 이로써 내배엽 세포의 분화를 저해하는 인자를 확인함에 의한, 내배엽 세포의 분화를 저해하는 인자의 확인 방법을 제공한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현한다.
본 발명은 또한 내배엽 세포 집단을 약물과 접촉시키고, 독성에 대해 세포를 모니터링하고 (이때 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현함), 이로써 후보 약물이 독성인지 여부를 확인함에 의한, 독성에 대해 후보 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 집단에서의 75% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 집단에서의 75% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 집단에서의 75% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 환자에게 투여함으로써 세포-기반 치료요법을 이를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법을 제공한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 투여되는 내배엽 세포 집단은 집단에서의 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 집단에서의 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 집단에서의 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 집단이다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 환자는 간 섬유증, 경화증, 간 부전, 당뇨병, 간암 및 췌장암, 췌장 부전, 장 질환 예컨대 조직 대체 효소 결함, 크론씨병, 염증성 장 증후군 및 장암을 앓고 있는 환자이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 집단에서의 75% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 집단에서의 75% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 집단에서의 75% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을, 간세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 배양함으로써 간세포 집단을 수득하는 방법을 제공한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 간세포를 수득하기에 충분한 조건 하에 배양되는 내배엽 세포 집단은 집단에서의 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 집단에서의 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 집단에서의 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 집단이다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 내배엽 세포는 줄기 세포 집단을 유효량의 PI3K 알파의 선택적 저해제 및 유효량의 액티빈 A 와 접촉시키고, 간세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 세포를 배양함으로써 수득된다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 간세포 집단을 수득하기에 충분한 조건은 유효량의 액티빈 A 를 함유하며 다른 성장인자를 함유하지 않는 배지에서 내배엽 세포를 배양하는 것을 포함한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 다른 성장 인자는 HGF, 레티노산, FGF8, FGF1, DMSO, FGF7, FGF10, OSM, 덱사메타손 FGF2, FGF4, BMP2 및 BMP4 로 이루어지는 군에서 선택된다.
본 발명은 줄기 세포 집단을 유효량의 PI3K 알파의 선택적 저해제 및 유효량의 액티빈 A 와 함께 배양하고, 간세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 세포를 배양함으로써 간세포 집단을 수득하는 방법을 제공한다. 상기 방법 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 간세포 집단에 의한 AFP 의 분비는 시간 경과에 따라 감소한다.
본 발명은 또한 상기 방법 중 임의의 하나를 사용하여 수득된 간세포 집단을 제공한다. 상기 집단 중 임의의 하나에 따른 (예를 들어 이에 적용된) 일부 구현예에서, 집단에서의 간세포에 의한 AFP 의 분비는 시간 경과에 따라 감소한다.
본 발명은 본원에 기재된 방법 중 임의의 하나를 사용하여 수득된 유효량의 간세포 집단을 환자에게 투여함으로써 세포-기반 치료요법을 이를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 방법 중 임의의 하나에 의해 수득된 간세포 집단을 후보 약물과 접촉시키고, 독성에 대해 간세포를 모니터링하고, 이로써 후보 약물이 독성인지 여부를 확인함으로써 독성에 대해 후보 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
도 1 은 줄기 세포 집단을 PI3K 저해제와 접촉시킴으로써 내배엽 세포 집단이 수득되었다는 것을 나타낸다.
도 2 는 줄기 세포 집단을 화합물 A, PI3K 알파의 선택적 저해제 (또한 PI3K 델타의 선택적 저해제임) 와 접촉시킴으로써 내배엽 세포 집단이 수득되었다는 것을 나타낸다.
도 3 은 내배엽에 대한 화합물 A 의 영향이 배양 배지와 관계가 없었다는 것을 나타낸다.
도 4 는 내배엽 분화에 대한 다양한 동형-특이적 PI3K 저해제의 영향을 나타낸다.
도 5 는 PI3K 베타, 델타, 또는 베타 및 델타의 저해의 영향에 비해 PI3K 알파의 저해가 내배엽 분화를 유의하게 증가시켰다는 것을 나타낸다.
도 6 은 시간 경과 실험의 결과를 제공한다.
도 7 은 용량-반응 실험의 결과를 제공한다.
도 8 은 본 발명의 방법에 의해 수득된 내배엽 세포의 증식을 다른 방법을 사용하여 수득된 내배엽 세포와 비교한 증식/생존력 검정의 결과를 제공한다.
도 9 는 줄기 세포를 액티빈 A 및 다양한 용량의 PI3K 알파 저해제와 접촉시켜 수득된 내배엽 세포의 대사 활성을, 줄기 세포를 액티빈 A 단독과 접촉시켜 수득된 내배엽 세포 및 줄기 세포와 비교한 ATP 정량의 결과를 제공한다.
도 10 은 내배엽 분화에 대한 다양한 mTOR 저해제 및 Akt 저해제의 영향을 나타낸다.
도 11 은 내배엽 분화에 대한 다양한 mTOR 저해제 (에버로리무스, KU 0063794 및 WYE-354) 및 하나의 Akt 저해제 (GSK 690693) 의 영향을 나타낸다.
도 12 는 mTOR 의 저해 (Akt 의 저해는 아님) 가 내배엽 분화를 증가시켰다는 것을 나타낸다.
도 13 은 mTOR 및 P13K 알파의 동시 저해가 mTOR 또는 P13K 알파 단독의 저해보다 더 효과적으로 내배엽 형성을 증가시켰다는 것을 나타낸다.
도 14 는 줄기 세포 집단을 PI3K 알파 저해제와 접촉시켜 수득된 내배엽 세포가 BMP2 및 FGF4 의 부재 하에 간세포로 전환될 수 있었다는 것을 나타낸다.
도 15 는 본 발명에 의해 수득된 간세포가 시간 경과에 따른 알파 태아 단백질 (AFP) 생성에 있어서 점진적 이중 감소를 보인다는 것을 나타낸다.
도 16 은 AFP 수준을 측정하는 실험의 결과를 나타낸다. 제 0 일 - 제 3 일: 액티빈 A 또는 액티빈 A + PI3K 저해제. 제 4 일 - 제 10 일 - DMEM/F12 + Glutamax + B27. 분화 제 10 일에, 배지를 바꾼다. 24 시간 후, 배지를 1/500 (상기 범위 내에 있음) 로 희석하고 AlphaLisa 에 의해 분석하였다. PI3K 저해제가 내배엽 단계에서 사용되지 않는 경우, AFP 수준은 매우 낮으며 이는 간세포 수준이 매우 낮다는 것을 나타낸다. PI3K 저해제가 내배엽 단계에서 사용되는 경우, AFP 의 발현 배수는 거의 100 (1/500 희석 샘플에 대해) 이며 이는 간세포 수준이 높다는 것을 나타낸다. 배수로의 데이터 표시는 상이한 샘플/실험의 비교를 가능하게 한다. 배수 = 세포와 접촉한 신호 배지 / 세포와 접촉하지 않은 신호 미가공 배지 (Signal raw medium).
도 17 은 제 20 일에 간세포 유래 줄기 세포에서의 알부민 및 HNF4a 를 측정하는 결과를 나타낸다. 제 20 일에서의 간세포 집단 유래 줄기 세포: 제 0 일 - 제 3 일: 액티빈 A + PI3K 저해제 (화합물 A). 제 3 일 - 제 20 일: 기본 배지 (DMEM/F12 + glutamax + B27).
도 18 은 배양물 중 1 일 후 세포에서의 중내배엽 마커 유전자의 발현에 대한 가변적 정도의 mTOR 저해 및 PI3K 알파 저해의 영향을 측정하기 위해 수행한 용량 반응 매트릭스 실험의 결과를 나타낸다.
도 19 는 배양물 중 1 일 후 세포에서의 추가적인 중내배엽 마커 유전자의 발현에 대한 가변적 정도의 mTOR 저해 및 PI3K 알파 저해의 영향을 측정하기 위해 수행한 용량 반응 매트릭스 실험의 결과를 나타낸다.
도 20 은 배양물 중 2 일 후 세포에서의 내배엽 마커 유전자의 발현에 대한 가변적 정도의 mTOR 저해 및 PI3K 알파 저해의 영향을 측정하기 위해 수행한 용량 반응 매트릭스 실험의 결과를 나타낸다.
도 21 은 배양물 중 2 일 후 세포에서의 중배엽 마커 유전자의 발현에 대한 가변적 정도의 mTOR 저해 및 PI3K 알파 저해의 영향을 측정하기 위해 수행한 용량 반응 매트릭스 실험의 결과를 나타낸다.
도 22 는 낮은 세포 독성을 갖는 높은 SOX17 발현 수준을 유도하는 소분자 화합물의 농도를 측정하기 위해 수행한 실험의 결과를 나타낸다.
도 23 은 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 다양한 소분자 화합물의 키나아제 프로파일을 나타낸다.
도 24 는 내배엽 분화에 대한 다양한 소분자 화합물의 영향을 측정하기 위해 수행한 실험의 결과를 나타낸다.
도 25 는 내배엽 마커 유전자의 발현에 대한 다양한 소분자 화합물의 영향을 측정하기 위해 수행한 실험의 결과를 나타낸다.
도 26 은 본 발명의 방법을 사용하여 수득된 내배엽 세포의 유지 및 증식에 대한 BMP 의 영향을 측정하기 위해 수행한 실험의 결과를 나타낸다.
도 27 은 본 발명의 방법을 사용하여 수득된 내배엽 세포에서의 내배엽 마커 유전자 발현에 대한 다양한 세포 배양 배지의 영향을 측정하기 위해 수행한 실험의 결과를 나타낸다.
도 28 은 본 발명의 방법에 의해 수득된 내배엽 세포의 유지 및 증식을 검정하기 위해 수행한 실험의 결과를 나타낸다.
도 29 는 9 회 계대한, 본 발명의 방법에 의해 수득된 내배엽 세포에서의 내배엽 마커 유전자 발현 정도를 평가하기 위해 수행한 실험의 결과를 나타낸다.
도 30A 는 현탁액에서 성장시켰을 때 본 발명의 방법에 의해 수득된 췌장 선조 세포의 생존력을 현탁액에서 성장시켰을 때 다른 방법에 의해 수득된 췌장 선조 세포의 생존력과 비교하기 위해 수행한 실험의 결과를 나타낸다. 도 30B 는 제 13 일에서 다른 방법에 의해 수득된 췌장 선조 세포의 Pdx 발현 수준에 대한 본 발명의 방법에 의해 수득된 췌장 선조 세포의 Pdx 발현 수준의 비교를 나타낸다.
도 31 은 AP 췌장 세포 및 AA 췌장 세포에서의 췌장 마커 유전자의 발현 수준을 비교하기 위해 수행한 실험의 결과를 나타낸다.
도 32 는 AP 췌장 세포 및 AA 췌장 세포에서의 내배엽 마커 유전자의 발현을 비교하기 위해 수행한 실험의 결과를 나타낸다.
도 33 은 AP 간 세포 및 AA 간 세포에 의한 AFP 분비를 비교하기 위해 수행한 실험의 결과를 나타낸다.
도 34 는 AP 간 세포 및 AA 간 세포에 의한 알부민 분비를 비교하기 위해 수행한 실험의 결과를 나타낸다.
도 35 는 AP 간 세포 및 AA 간 세포에 의한 A1AT 분비를 비교하기 위해 수행한 실험의 결과를 나타낸다.
도 36 은 AP 간 세포 및 AA 간 세포에서의 내배엽 마커 유전자 발현을 비교하기 위해 수행한 실험의 결과를 나타낸다.
도 37 은 AP 간 세포 및 AA 간 세포에서의 간 마커 유전자 발현 수준을 비교하기 위해 수행한 실험의 결과를 나타낸다.
도 38 은 AP 간 세포 및 AA 간 세포에서의 CYP 활성을 비교하기 위해 수행한 실험의 결과를 나타낸다.
도 39 는 AP 간 세포 및 AA 간 세포에서 CYP 활성이 유도될 수 있는지 여부를 측정하기 위해 수행한 실험의 결과를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 그 중에서도, 출발 세포 집단 (예를 들어, 줄기 세포) 의 내배엽 세포, 췌장 선조 세포, 간세포, 내배엽 세포 유래의 기타 분화 세포 (예를 들어, 장 선조 세포, 장 세포, 폐 선조 세포, 폐 세포 등) 로의 효율적 전환 방법, 이들 세포의 집단 및 중간체 세포 집단(들), 이들 세포를 포함하는 조성물 뿐 아니라 본원에 기재된 바와 같은 다양한 세포 집단 및/또는 성분을 포함하는 조성물, 및 이의 용도를 제공한다. 추가적으로, 본 발명은 내배엽 세포의 단리된 집단, 췌장 선조 세포의 단리된 집단, 간세포 선조 세포의 단리된 집단, 간세포의 단리된 집단, 내배엽 세포 유래의 다분화능 세포의 단리된 집단, 및 그들의 사용 방법을 제공한다. 본원에 기재된 방법은 출발 세포 집단을 높은 효율을 갖는 내배엽 세포, 췌장 세포 및/또는 간세포의 고도의 동질 집단으로 전환시킬 수 있다. 췌장 세포가 비제한적으로, 췌장 선조 세포, 및 예를 들어 췌장 췌관 세포 및 췌장 외분비 세포를 포함하는 추가로 분화된 세포를 포함한다는 것이 이해된다. 또한, 간세포가 비제한적으로, 간세포 선조 세포, 및 예를 들어 간세포를 포함하는 추가로 분화된 세포를 포함한다는 것이 이해된다.
본 발명의 내배엽 세포 집단은 집단에서의 상당한 백분율의 세포가 SOX17, FoxA2 및 CXCR4 와 같은 내배엽 마커를 발현한다는 점에 있어서 다른 내배엽 세포 집단과 구별된다. 따라서, 내배엽 세포의 고도의 동종 집단이 생성될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성된 내배엽 세포 집단은 다른 방법에 의해 생성된 내배엽 세포 집단보다 더 표현형적으로 안정하고 증식성이다. 또한, 본원에서 기재된 내배엽 세포 집단이 추가적인 성장 인자의 부재 하에 높은 효율을 갖는 간세포로 분화되는 것이 관찰된다. 본 발명의 간세포는 상당한 백분율의 간세포가 알파 태아 단백질 (AFP) 을 감소시키는 점에 있어서 다른 간세포 집단과 구별되는데, 이는 간세포의 성숙을 나타낸다. 또한, 본원에 기재된 내배엽 세포 집단이 췌장 선조 세포 또는 내배엽 세포 유래의 기타 분화 세포 (예를 들어 장 선조 세포, 장 세포, 폐 선조 세포, 폐 세포 등) 로 분화되는 것이 관찰된다. 본 발명의 췌장 선조 세포는 상당한 백분율의 췌장 선조 세포가 췌장 마커 유전자의 증가된 발현을 나타낸다는 점에 있어서 다른 췌장 선조 세포 집단과 구별된다. 더욱이, 본 발명의 췌장 선조 세포는 인슐린 및 글루카곤을 발현하는 3 차원적 세포 클러스터를 형성할 수 있다는 점에 있어서 다른 집단과 형태학적으로 구별된다.
본원에 기재된 세포 집단에 대한 언급 대상이 단리된 집단을 고려하고 포함한다는 것이 이해된다.
일반적인 방법
다르게 나타내지 않는 한, 본 발명의 실행은 당업자의 기술력 내에 있는 줄기 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래의 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook et al., 2001) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (P. Herdewijn, ed., 2004); Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir &C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR : The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991) Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999), Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (Notaranni et al. eds., Oxford University Press 2006); Essentials of Stem Cell Biology (R. Lanza, ed., Elsevier Academic Press 2006); Stem Cell Assays (Methods in Molecular Biology) (Mohan C. Vemuri, Ed., Humana Press; first edition (August 10, 2007); Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Darwin J. Prockop, Donald G. Phinney, Bruce A. Bunnell, Eds., first edition (March 7, 2008)); Handbook of Stem Cells (Robert Lanza, et al., Eds., Academic Press (September 14, 2004); Stem Cell Culture Vol 86: Methods in Cell Biology (Jennie P. Mather, Ed., Academic Press, first edition (May 15, 2008)); Practical Hematopoietic Stem Cell Transplantation (Andrew J. Cant, et al. Eds., Wiley-Blackwell, first edition (January 22, 2007)); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Kevin D. Bunting, Ed., Humana Press, 2nd ed. edition (January 31, 2008)); Bone Marrow and Stem Cell Transplantation (Methods in Molecular Medicine) (Meral Beksac, Ed., Humana Press; first edition (May 3, 2007)); Stem Cell Therapy and Tissue Engineering for Cardiovascular Repair: From Basic Research to Clinical Applications (Nabil Dib, et al., Eds., Springer, first edition (November 16, 2005)); Blood And Marrow Stem Cell Transplantation: Principles, Practice, And Nursing Insights (Kim Schmit-Pokorny (Author) and Susan Ezzone (Editor), Jones & Bartlett Publishers; third edition (May 22, 2006)); Hematopoietic Stem Cell Protocols (Christopher A. Klug and Craig T. Jordan, Eds., Humana Press; first edition (December 15, 2001)); 및 Clinical Bone Marrow and Blood Stem Cell Transplantation (Kerry Atkinson, et al., Eds., Cambridge University Press; third edition (December 8, 2003)) 와 같은 문헌에서 충분히 설명된다.
다르게 정의하지 않는 한, 본원에서 사용한 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계에서의 통상의 기술력 중 하나에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
정의
본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "PI3K 알파의 선택적 저해제" 는 클래스 I PI3K (PI3 키나아제) 의 활성을 선택적으로 감소시키는 임의의 분자 또는 화합물을 지칭하며, 이때 상기 PI3K 는 적어도 하나 또는 하나 초과의 다른 클래스 I PI3K 동형, 예를 들어 p110 베타, p110 델타 또는 p110 감마 촉매 서브유닛을 갖는 PI3K 에 대해 p110 알파 촉매 서브유닛을 갖는다 (즉, 적어도 하나 초과 또는 하나 초과의 상기 동형 활성을 감소시킴).
본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 "PI3K 델타의 선택적 저해제" 는 클래스 I PI3K (PI3 키나아제) 의 활성을 선택적으로 감소시키는 임의의 분자 또는 화합물을 지칭하며, 이때 상기 PI3K 는 적어도 하나 또는 하나 초과의 다른 클래스 I PI3K 동형, 예를 들어 p110 알파, p110 베타 또는 p110 감마 촉매 서브유닛을 갖는 PI3K 에 대해 p110 델타 촉매 서브유닛을 갖는다 (즉, 적어도 하나 초과 또는 하나 초과의 상기 동형 활성을 감소시킴).
본원에서 사용하는 바와 같이, mTOR 저해제는 mTOR 을 포함하는 단백질 복합체의 활성을 감소시키는 임의의 분자 또는 화합물을 지칭한다. 일부 구현예에서, mTOR 저해제는 선택적 mTOR 저해제이며, 이는 mTOR 의 PI3K 신호 전달 경로 업스트림에서의 성분에 영향을 주지도, mTOR 의 다운스트림 기질에 영향을 주지도 않는다는 것을 의미한다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 내배엽 세포 (또는 간세포, 췌장 선조 세포, 또는 내배엽 세포 유래의 다른 분화 세포, 비제한적으로 예를 들어 장 선조 세포, 장 세포, 폐 선조 세포, 폐 세포 등) 의 "단리된 집단" 은 추가적인 성분 (예를 들어, 세포 찌꺼기) 을 실질적으로 갖지 않는 세포 제조물이 제공되도록 조작된 하나 이상의 내배엽 또는 간세포의 집단을 지칭한다. 다양한 양상의 단리된 집단이 본원에서 기재된다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 내배엽 세포의 "동종 집단" 은 집단의 상당 부분이 내배엽 세포인 세포 집단을 지칭한다. 동종성 정도를 포함하는 동종성을 반영하는 다양한 구현예가 본원에서 기재된다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 간세포 (hepatocyte cell 또는 hepatocyte) 의 "동종 집단" 은 집단의 상당 부분이 간세포인 세포 집단을 지칭한다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 용어 췌장 선조 세포 (및/또는 췌장 세포) 의 "동종 집단" 은 집단의 상당 부분이 췌장 선조 세포 (및/또는 췌장 세포) 인 세포 집단을 지칭한다.
본원에서 사용하는 바와 같이, "유효량" 은 본원에 기재된 임의의 방법의 목표 (예를 들어, 원하는 결과) 를 달성하기에 유효한 양을 지칭한다.
본원에서 사용하는 바와 같이, 다르게 나타내지 않는 한, 단수형 표현은 복수형 표현을 포함한다.
"약" 에 대한 언급은 이러한 기술 분야에서의 당업자에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 보통의 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 값 또는 매개변수에 대한 "약" 의 언급은 값 또는 매개변수 자체에 대해 지시된 양상을 포함 (하고 기재) 한다. 예를 들어, "약 X" 를 지칭하는 설명은 "X" 의 설명을 포함한다.
본원에 기재된 본 발명의 양상은 양상을 "포함하는 것", "이로 구성되는 것" 및 "이로 본질적으로 이루어지는 것" 을 포함한다.
중내배엽 세포
중내배엽 세포는 중배엽 및 내배엽 계통의 공통적 선조이다. 따라서, 줄기 세포의 중내배엽 세포로의 분화는 내배엽 세포의 효율적 생성에 있어서 중요한 중간 단계이다. 출원인은, 하기에서 더 상세히 기재하는 바, 중내배엽-특이적 마커 유전자, 내배엽-특이적 마커 유전자 및 중배엽-특이적 마커 유전자의 발현 수준에 의해 나타내는 바와 같이, mTOR 저해가 줄기 세포의 중내배엽으로의 분화 동안, 및 중내배엽의 내배엽으로의 분화에 있어서 PI3K 알파 저해와 다른 역할을 담당한다는 것을 발견하였다. 중내배엽 분화를 위해, mTOR 저해는 중요하다. 하기에서 더 상세히 기재하는 바와 같이, mTOR 저해와 PI3K 알파 저해 사이의 적절한 균형이 최적의 내배엽 세포 집단을 수득하기 위해 필요하다.
따라서, 본 발명은 중내배엽 세포 집단 뿐 아니라, 줄기 세포 집단을 유효량의 mTOR 의 저해제 및 유효량의 액티빈 A 와 접촉시키고, 중내배엽 세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 세포를 배양함으로써 중내배엽 세포 집단을 수득하는 방법을 제공한다. 이러한 방법이 본원에 기재된 mTOR 저해제(들) 중 하나 또는 임의의 조합을 사용하여 실행될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 이러한 방식으로 수득된 중내배엽 세포가 내배엽 세포 집단, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 내배엽 세포 집단으로 분화될 수 있다는 것이 또한 이해될 것이다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 유효량의 mTOR 저해제는 배양물 중 6 시간 후, 배양물 중 8 시간 후, 배양물 중 10 시간 후, 배양물 중 12 시간 후, 배양물 중 14 시간 후, 배양물 중 16 시간 후, 배양물 중 18 시간 후, 배양물 중 20 시간 후, 배양물 중 22 시간 후, 배양물 중 24 시간 후, 또는 배양물 중 24 시간 초과 후 (예컨대 배양물 중 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 56, 58, 60 시간 후 또는 60 시간 초과 후) 세포에서의 중내배엽 마커 유전자의 발현을 상향조절한다 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함). 일부 구현예에서, 상향조절되는 중내배엽 마커 유전자는 DKK1, EOMES, FGF17, FGF8, GATA6, MIXL1, T (단미증(Brachyury)), WNT3A, GSC, LHX1, TBX6, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 상향조절되는 중내배엽 마커 유전자는 DKK1, FGF17, MIXL1, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, DKK1, FGF17, MIXL1, 또는 이의 임의의 조합의 발현은 배양물 중 1 일 후 상향조절된다. 일부 구현예에서, mTOR 저해제는 siRNA 이다. 일부 구현예에서, mTOR siRNA 의 유효량은 0.2 nM, 2 nM 또는 20 nM 이다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 유효량의 mTOR 저해제는 배양물 중 6 시간 후, 배양물 중 8 시간 후, 배양물 중 10 시간 후, 배양물 중 12 시간 후, 배양물 중 14 시간 후, 배양물 중 16 시간 후, 배양물 중 18 시간 후, 배양물 중 20 시간 후, 배양물 중 22 시간 후, 배양물 중 24 시간 후, 또는 배양물 중 24 시간 초과 후 (예컨대 배양물 중 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 56, 58, 60 시간 후 또는 60 시간 초과 후) 세포에서의 내배엽 마커 유전자 발현을 상향조절한다 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함). 일부 구현예에서, 배양물 중 1 일 후 세포에서 상향조절되는 내배엽 마커 유전자는 CDH2, CER1, CXCR4, FGF17, FoxA2, GATA4, GATA6, HHEx, HNF1B, KIT, SOX17, TDGF1, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, mTOR 저해제는 siRNA 이다. 일부 구현예에서, mTOR siRNA 의 유효량은 0.2 nM, 2 nM 또는 20 nM 이다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 유효량의 mTOR 저해제는 배양물 중 6 시간 후, 배양물 중 8 시간 후, 배양물 중 10 시간 후, 배양물 중 12 시간 후, 배양물 중 14 시간 후, 배양물 중 16 시간 후, 배양물 중 18 시간 후, 배양물 중 20 시간 후, 배양물 중 22 시간 후, 배양물 중 24 시간 후, 또는 배양물 중 24 시간 초과 후 (예컨대 배양물 중 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 56, 58, 60 시간 후 또는 60 시간 초과 후) 세포에서의 중배엽 마커 유전자 발현을 하향조절한다 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함). 일부 구현예에서, 배양물 중 2 일 후 세포에서 하향조절되는 중배엽 마커 유전자는 PDGFRa, BMP4, GATA4, HAND1, ISL1, NCAM1, NKX2-5, TBX6, T (단미증) 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, mTOR 저해제는 siRNA 이다. 일부 구현예에서, mTOR siRNA 의 유효량은 0.2 nM, 2 nM 또는 20 nM 이다.
상기 나타낸 바와 같이, 출원인은 또한 mTOR 저해 및 P13K 저해가 중내배엽 형성에 대해 상승작용을 나타낸다는 것을 발견하였다. 따라서, 중내배엽 세포 집단은 세포의 출발 근원 (예를 들어 성체 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포) 을, 중내배엽 세포 집단이 생성되도록 mTOR 및/또는 PI3K 의 하나 이상의 저해제(들) 와 시간에 걸쳐 접촉시켜 수득될 수 있다. 본원에 기재된 중내배엽 세포 집단이 본원에 기재된 mTOR 저해제(들) 및/또는 PI3K 알파 저해제(들) 의 임의의 조합을 사용하여 수득될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 대안적으로, 이중 mTOR/PI3K 알파 저해제, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 이중 mTOR/PI3K 알파 저해제 (예를 들어 NVPBKM120, GDC0941-PC) 가 본 발명의 중내배엽 세포 집단을 수득하는데 사용될 수 있다. 이러한 방식으로 수득된 중내배엽 세포가 내배엽 세포 집단, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 내배엽 세포 집단으로 분화될 수 있다는 것이 또한 이해될 것이다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 유효량의 mTOR 저해제 및/또는 유효량의 PI3K 알파 저해제는 배양물 중 6 시간 후, 배양물 중 8 시간 후, 배양물 중 10 시간 후, 배양물 중 12 시간 후, 배양물 중 14 시간 후, 배양물 중 16 시간 후, 배양물 중 18 시간 후, 배양물 중 20 시간 후, 배양물 중 22 시간 후, 배양물 중 24 시간 후, 또는 배양물 중 24 시간 초과 후 (예컨대 배양물 중 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 56, 58, 60 시간 후 또는 60 시간 초과 후) 세포에서의 중내배엽 마커 유전자 발현을 상향조절한다 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함). 일부 구현예에서, 상향조절되는 중내배엽 마커 유전자는 DKK1, EOMES, FGF17, FGF8, GATA6, MIXL1, T (단미증), WNT3A, GSC, LHX1, TBX6, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 상향조절되는 중내배엽 마커 유전자는 LHX1, GATA6, EOMES, GSC 및 TBX6, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, LHX1, GATA6, EOMES, GSC 및 TBX6, 또는 이의 임의의 조합의 발현은 배양물 중 1 일 후 상향조절된다. 일부 구현예에서, mTOR 저해제는 siRNA 이다. 일부 구현예에서, mTOR siRNA 의 유효량은 0.2 nM, 2 nM 또는 20 nM 이다. 일부 구현예에서, PI3K 알파 저해제는 siRNA 이다. 일부 구현예에서, PI3K 알파 siRNA 의 유효량은 0.2 nM, 2 nM 또는 20 nM 이다. 일부 구현예에서, mTOR siRNA 의 유효량은 20 nM 이고 PI3K siRNA 의 유효량은 2 nM 이다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 유효량의 mTOR 저해제 및/또는 유효량의 PI3K 알파 저해제는 배양물 중 6 시간 후, 배양물 중 8 시간 후, 배양물 중 10 시간 후, 배양물 중 12 시간 후, 배양물 중 14 시간 후, 배양물 중 16 시간 후, 배양물 중 18 시간 후, 배양물 중 20 시간 후, 배양물 중 22 시간 후, 배양물 중 24 시간 후, 또는 배양물 중 24 시간 초과 후 (예컨대 배양물 중 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 56, 58, 60 시간 후 또는 60 시간 초과 후) 세포에서의 내배엽 마커 유전자 발현을 상향조절한다 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함). 일부 구현예에서, 상향조절되는 내배엽 마커 유전자는 CDH2, CER1, CXCR4, FGF17, FoxA2, GATA4, GATA6, HHEx, HNF1B, KIT, SOX17, TDGF1, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 상향조절되는 내배엽 마커는 CER1, Hhex 및 FGF17, 및 CXCR4 이다. 일부 구현예에서, CER1, Hhex 및 FGF17, 및 CXCR4, 또는 이의 임의의 조합의 발현은 배양물 중 2 일 후 상향조절된다. 일부 구현예에서, mTOR 저해제는 siRNA 이다. 일부 구현예에서, mTOR siRNA 의 유효량은 0.2 nM, 2 nM 또는 20 nM 이다. 일부 구현예에서, PI3K 알파 저해제는 siRNA 이다. 일부 구현예에서, PI3K 알파 siRNA 의 유효량은 0.2 nM, 2 nM 또는 20 nM 이다. 일부 구현예에서, mTOR siRNA 의 유효량은 20 nM 이고 PI3K siRNA 의 유효량은 2 nM 이다.
상기 방법의 일부 구현예에서, 유효량의 mTOR 저해제 및/또는 유효량의 PI3K 알파 저해제는 배양물 중 6 시간 후, 배양물 중 8 시간 후, 배양물 중 10 시간 후, 배양물 중 12 시간 후, 배양물 중 14 시간 후, 배양물 중 16 시간 후, 배양물 중 18 시간 후, 배양물 중 20 시간 후, 배양물 중 22 시간 후, 배양물 중 24 시간 후, 또는 배양물 중 24 시간 초과 후 (예컨대 배양물 중 26, 28, 30, 32, 34, 36 시간 후 또는 36 시간 초과 후) 세포에서의 중배엽 마커 유전자 발현을 하향조절한다 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함). 일부 구현예에서, 배양물 중 2 일 후 세포에서 하향조절되는 중배엽 마커 유전자는 PDGFRa, BMP4, GATA4, HAND1, ISL1, NCAM1, NKX2-5, TBX6, T (단미증) 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, 하향조절되는 중배엽 마커 유전자는 CER1, Hhex 및 FGF17, 및 CXCR4, 또는 이의 임의의 조합이다. 일부 구현예에서, CER1, Hhex 및 FGF17, 및 CXCR4, 또는 이의 임의의 조합의 발현은 배양물 중 2 일 후 하향조절된다. 일부 구현예에서, mTOR 저해제는 siRNA 이다. 일부 구현예에서, mTOR siRNA 의 유효량은 0.2 nM, 2 nM 또는 20 nM 이다. 일부 구현예에서, PI3K 알파 저해제는 siRNA 이다. 일부 구현예에서, PI3K 알파 siRNA 의 유효량은 0.2 nM, 2 nM 또는 20 nM 이다. 일부 구현예에서, mTOR siRNA 의 유효량은 20 nM 이고 PI3K siRNA 의 유효량은 20 nM 이다. 일부 구현예에서, mTOR siRNA 의 유효량은 20 nM 이고 PI3K siRNA 의 유효량은 0.2-2 nM 이다.
출원인은 중내배엽 및 내배엽 형성에 있어서 mTOR 및 PI3K 알파 저해의 다른 역할을 확인하였다. mTOR 의 저해 및 PI3K 알파의 저해 각각은 중내배엽 마커 유전자, 내배엽 마커 유전자 및 중배엽 마커 유전자의 발현에 특히 기여할 수 있다. 중내배엽 형성에 대해, mTOR 저해는 중요하다. 이 단계에서, 높은 정도의 PI3K 알파 저해의 기여는 mTOR 저해의 영향 증진을 돕는다. 높은 정도의 PI3K 알파 저해는 또한 LHX1 과 같이 mTOR 저해에 의해 덜 영향받는 마커에 대한 중요한 기여 인자일 수 있다. 중내배엽의 내배엽으로의 추가 분화에 대해, PI3K 알파 및 mTOR 저해 모두 내배엽 유전자의 최고 발현을 얻기에 중요하다. PI3K 알파 저해는 다른 계통, 특히 중배엽이 형성되는 것을 방지하기 위해 이 단계에서 중요하다.
내배엽 세포
줄기 세포의 중내배엽 세포로의 분화, 및 내배엽 세포로의 추가 분화는 연구 및 재생 의학에서 사용되는 유용한 다수의 세포, 예를 들어 간세포, 췌장 선조 세포, 췌장 세포, 또는 내배엽 세포 유래의 다른 분화 세포, 예컨대 장 선조 세포, 장 세포, 폐 선조 세포, 폐 세포 등의 효율적 생성에 있어서 중요한 단계이다. 그러나, 분화하는 줄기 세포 배양물에서 발생할 수 있는 다양한 세포 유형으로 인해, 대부분의 세포 유형은 매우 낮은 효율로 생성된다. 더욱이, 시험관내 줄기 세포 분화는 다소 비동시적이다. 그와 같이, 세포의 한 군은 장배 형성과 연관된 유전자를 발현할 수 있는 한편, 또 다른 군은 최종 분화를 시작할 수 있다. 상기 언급한 혼합 및 비동시적 줄기 세포 분화의 문제점을 다루는 효과적인 방법으로서, 발명자는 고유한 특성을 갖는 내배엽 세포 집단을 생성시키는 신규한 방법을 발견하였다. 하기 더 상세히 설명한 바와 같이, 본원에 기재된 방법 및/또는 프로토콜은 세포 집단의 상당 부분이 내배엽 세포인 내배엽 세포 집단을 효율적으로 생성시키는데 사용될 수 있다. 이러한 내배엽 세포 집단은 예를 들어, 간세포, 췌장 선조 세포, 췌장 세포, 또는 내배엽 세포 유래의 다른 분화 세포, 예컨대 장 선조 세포, 장 세포, 폐 선조 세포, 폐 세포 등으로 신속하게, 간세포, 췌장 선조 세포, 췌장 세포, 또는 내배엽 세포 유래의 다른 분화 세포, 예컨대 장 선조 세포, 장 세포, 폐 선조 세포, 폐 세포 등의 동질 집단이 생성되는 방식으로 효율적으로 전환될 수 있다.
내배엽 세포 집단은, 세포의 출발 근원을, 내배엽 세포 집단이 생성되도록 PI3K 알파 및 액티빈 A 의 하나 이상의 선택적 저해제(들) 와 함께, 시간에 걸쳐 (예를 들어, 1-5 일) 배양함으로써 생성될 수 있다. 내배엽 세포 집단은 또한 세포의 출발 근원을, 내배엽 세포 집단이 생성되도록 PI3K 델타 및 액티빈 A 의 하나 이상의 선택적 저해제(들) 와 함께, 시간에 걸쳐 (예를 들어, 1-5 일) 배양함으로써 생성될 수 있다. 대안적으로, 액티빈 A 와 조합된 PI3K 알파 및/또는 PI3K 델타의 하나 이상의 선택적 저해제(들) 가 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 배아 줄기 세포 (예를 들어, 인간 배아 줄기 세포), 성체 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포를 포함하는 다양한 유형의 줄기 세포를 사용하여 실행될 수 있다. 본 발명의 방법은 임의의 공지된 줄기 세포주에 대해 실행될 수 있다. 줄기 세포는 단일 세포 수준에서의, 자가 분열하는 능력, 및 자가 분열 선조체, 비-분열 선조체 및 말기 분화 세포를 포함하는 자손 세포가 생성되도록 분화하는 능력 모두에 의해 정의된 미분화 세포이다. 이러한 줄기 세포의 근원은 1 차 배아 또는 태아 조직, 탯줄 조직, 태반 조직, 체세포, 골수, 혈액 및 기타 세포 유형을 포함한다. 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포 및/또는 유도 만능 줄기 세포의 근원, 제조 및 배양에 관한 추가 세부사항이 예를 들어 USP 7,326,572; USP 8,057,789; USP 7,259,011; USP 7,015,037; USP 7,659, 118; USP 8,058,065; USP 8,048,675 및 US 특허 출원 공개 번호 US 2007/0281355 에 기재되어 있고, 이의 내용은 본원에 그 전체가 참조로 명백히 포함된다. 모든 경우, 인간 배아는 본원에 기재된 방법 및 조성물에 대한 줄기 세포 수득 과정에서 파괴되지 않는다. 다수의 줄기 세포는 인간 배아의 사전 파괴에 의해 수득되지 않는다.
본원에 기재된 내배엽 세포 집단을 생성하는 일부 방법에서, 줄기 세포는 피더 (feeder) 층에서 유지된다. 이러한 방법에서, 줄기 세포를 만능 상태로 유지시키는 임의의 피더 층이 사용될 수 있다. 인간 배아 줄기 세포의 배양용으로 흔히 사용되는 한 피더 층은 마우스 섬유아세포의 층이다. 보다 최근에는, 인간 섬유아세포 피더 층이 줄기 세포 배양에서의 사용을 위해 개발되었다 (U.S. 특허 출원 공개 번호 US 2002/0072117 및 US 2010/0028307 참조, 상기 개시물은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 내배엽 세포 집단을 생성하는 본 발명의 대안적 방법은 피더 층을 사용하지 않고 만능 줄기 세포, 예를 들어 인간 배아 줄기 세포를 유지시킨다. 피더-불포함 조건 하에 줄기 세포를 유지시키는 방법은 U.S. 특허 출원 공개 번호 US 2003/0175956 에 기재되어 있으며, 상기 개시물은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
상기 방법의 특정 구현예에서, 줄기 세포는 적격 MATRIGEL® (Becton Dickenson) 의 층에서 유지된다. MATRIGEL® 은 실온에서 겔화되어 재구성된 기저막을 형성하는 엔겔브레쓰 홈-스웜 (Engelbreth-Holm-Swarm) 종양 세포로부터의 가용성 제제이다. 본 발명의 방법은 또한 젤라틴 (Sigma) 상에서 수행될 수 있다. 본원에서 기재된 방법에서 사용하기에 적합한 추가적인 배양 기질은 U.S. 특허 출원 공개 번호 US 2010/0028307 에 상세히 설명되어 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 줄기 세포는 콜라겐 층에서 유지된다.
본원의 방법에서 사용되는 줄기 세포는 혈청의 존재 또는 부재 하에 배양물 중에서 유지될 수 있다. 일부 배아 줄기 세포 유지 절차에서, 혈청 대체물이 사용된다. 다른 것들 중에서, 개시물 전체가 본원에 참조로 포함되는 U.S. 특허 출원 공개 번호 2003/0190748 에서 기재된 것들과 같은 무-혈청 배양 기술이 사용된다.
본원에 기재된 방법의 특정 구현예에서, 본원에 기재된 내배엽 세포의 단리된 집단은 현탁액 중 배양된 줄기 세포로부터 수득된다. 이러한 방식으로 줄기 세포를 배양하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며 예를 들어 [Amit et al. (2011) Nature Protocols 6: 572-579; Zweigerdt et al. (2011) Nature Protocols 6: 689-700; Singh et al. (2010) Stem Cell Res 4: 165-170; Kehoe et al. (2010) Tissue Eng Part A. 16: 405-21; 및 Olmer et al. (2011) Stem Cell Research 5: 51-64] 에 기재되어 있다. 현탁액 중에서 줄기 세포를 배양하는 추가적인 방법은 USP 8,008,075; USP 7,790,456; 및 USP 5,491,090 에 기재되어 있으며, 이들 각각의 내용은 본원에 그 전체가 참조로 포함된다. 현탁액 중에서 줄기 세포를 배양하는 또 다른 방법이 하기 실시예 1 에서 기재된다.
본 발명은 내배엽 세포 집단의 수득 방법을 기재하기 위해, 상기 또는 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같은 임의의 매개변수 및 모든 매개변수를 임의의 조합으로 고려한다.
내배엽 세포 생성 방법
내배엽 세포는 세포의 출발 근원, 예컨대 줄기 세포 (예를 들어 성체 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포) 가 하기 옵션 중 임의의 하나와 접촉하는 경우 수득될 수 있다: (1) 액티빈 A 및 PI3K 알파의 선택적 저해제; (2) 액티빈 A 및 PI3k 델타의 선택적 저해제, 및 (3) 액티빈 A 및 PI3K 알파 및/또는 PI3K 델타의 하나 이상의 선택적 저해제. 하기에서 보다 상세히 설명한 바와 같이, 다양한 유형의 화합물 또는 클래스의 화합물이 액티빈 A 와 함께 사용되어 내배엽 세포 집단이 생성될 수 있다. 또한, mTOR 의 저해제가 내배엽 세포의 효율적 생성을 위해 액티빈 A 및 PI3K 알파 및/또는 PI3K 델타의 선택적 저해제와 함께 사용될 수 있다.
내배엽은 또한 세포의 출발 근원, 예컨대 줄기 세포 (예를 들어 성체 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포) 가 mTOR 저해제와 접촉되는 경우 수득될 수 있다.
mTOR 키나아제 저해제
mTOR 키나아제 저해제는 단독으로 또는 다른 화합물 (예를 들어, PI3K 알파 저해제) 과 조합으로 사용되어 중내배엽 세포, 내배엽 세포, 및 내배엽 세포 유래의 분화 세포 (예를 들어 장 선조 세포, 장 세포, 폐 선조 세포, 폐 세포, 간세포, 췌장 세포 등) 를 생성시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 내배엽 세포는 줄기 세포 집단을 유효량의 TGF 베타 패밀리 멤버 (예컨대 액티빈 A) 및 유효량의 mTOR 키나아제의 저해제 또는 PI3K 및 mTOR 키나아제 둘 모두의 선택적 이중 저해제, 특정 구현예에서는 mTOR 키나아제 저해제 및 PI3K 알파 선택적 저해제의 이중 저해제와 접촉시켜 생성될 수 있다. mTOR 는 포스포이노시티드-3-키나아제-유사 키나아제 (PIKK) 패밀리 멤버로 간주되는 289 kDa 세린/트레오닌 키나아제인데, 이는 포스포이노시티드 3-키나아제 (PI3K) 지질 키나아제의 촉매 도메인에 상동인 유의한 서열을 갖는 카르복실 말단 키나아제 도메인을 포함하기 때문이다. C-말단에서의 촉매 도메인에 추가로, mTOR 키나아제는 또한 FKBP12-라파마이신 결합 (FRB) 도메인, C-말단 근처의 추정 리프레서 도메인 및 N-말단에서의 20 개 이하의 직렬-반복 HEAT 모티프 뿐 아니라 FRAP-ATM-TRRAP (FAT) 및 FAT C-말단 도메인을 포함한다. [Huang and Houghton, Current Opinion in Pharmacology, 2003, 3, 371-377]을 참고한다. 문헌에서, mTOR 키나아제는 또한 FRAP (FKBP12 및 라파마이신 연관 단백질), RAFT1 (라파마이신 및 FKBP12 표적 1), RAPT1 (라파마이신 표적 1) 로서 지칭된다.
mTOR 키나아제는 PI3K-Akt 경로를 통해 성장 인자에 의해 또는 세포 스트레스, 예컨대 영양분의 결핍 또는 저산소증에 의해 활성화될 수 있다. mTOR 키나아제의 활성화는 번역, 전사, mRNA 턴오버 (turnover), 단백질 안정성, 액틴 세포골격 재편성 및 오토파지 (autophagy) 를 포함하는 광범위한 세포 기능을 통해 세포 성장 및 세포 생존을 조절하는데 있어서 중심적인 역할을 하는 것으로 여겨진다. mTOR 세포 신호전달 생물학 및 mTOR 신호전달 상호작용 조정의 잠재적 치료 효과의 상세한 개관에 대해서는, [Sabatini, D. M. and Guertin, D. A. (2005) An Expanding Role for mTOR in Cancer TRENDS in Molecular Medicine, 11, 353-361; Chiang, G. C. and Abraham, R. T. (2007) Targeting the mTOR signaling network in cancer TRENDS 13, 433-442; Jacinto and Hall (2005) Tor signaling in bugs, brain and brawn Nature Reviews Molecular and Cell Biology, 4, 117-126; 및 Sabatini, D. M. and Guertin, D. A. (2007) Defining the Role of mTOR in Cancer Cell, 12, 9-22] 를 참고한다.
예를 들어, mTOR 키나아제의 업스트림에 존재하는 PI3K-AKT 신호전달 경로가 암 세포에서 종종 과다 활성화되어, 그 후 mTOR 키나아제와 같은 다운스트림 표적의 과잉 활성화를 초래한다는 것을 나타내는 증거가 존재한다. 보다 특히, 상이한 인간 종양에서 돌연변이화되는 PI3K-AKT 경로의 성분은 성장 인자 수용체의 활성화 돌연변이 및 PI3K 와 AKT 의 증폭 및 과발현을 포함한다. 또한, 교모세포종, 간세포 암종, 폐 암종, 흑색종, 자궁내막암종 및 전립선 암을 포함하는 많은 종양 유형이 PI3K-AKT 경로의 음성 조절제의 기능 손실 돌연변이, 예컨대 염색체 10 에서 결실된 포스파타아제 및 텐신 상동체 (PTEN) 및 결절성 경화증 (TSC1/TSC2) (또한 mTOR 키나아제의 과잉활성을 초래함) 를 포함한다는 것을 나타내는 증거가 존재한다. 상기는 mTOR 키나아제의 저해제가 mTOR 키나아제 신호전달의 과잉활성에 의해 적어도 일부 초래된 질환의 치료를 위해 효과적인 치료제일 수 있다는 것을 제시한다.
mTOR 키나아제는 2 개의 물리적 및 기능적으로 다른 신호전달 복합체로서 존재한다 (즉, mTORC1 및 mTORC2). mTORC1 은 또한 "mTOR-Raptor 복합체" 또는 "라파마이신-민감성 복합체" 로도 알려져 있는데, 이것이 소분자 저해제 라파마이신에 결합하고 이에 의해 저해되기 때문이다. mTORC1 은 단백질 mTOR, Raptor 및 mLST8 의 존재 하에 규정된다. 라파마이신 그 자체는 매크롤라이드이며 mTOR 키나아제의 제 1 소분자 저해제로서 발견되었다. 생물학적으로 활성이 되어, 라파마이신은 집합적으로 이뮤노필린으로 지칭하는 시토졸성 결합 단백질인 mTOR 및 FKBP12 와 3 원 복합체를 형성한다. 라파마이신은 mTOR 및 FKBP12 의 이량체화를 유도하는 작용을 한다. 라파마이신-FKBP12 복합체의 형성은 기능 획득을 초래하는데, 상기 복합체가 mTOR 에 직접적으로 결합하고 mTOR 의 기능을 저해하기 때문이다.
제 2 의, 보다 최근에 발견된 mTORC 복합체, mTORC2 는 단백질 mTOR, Rictor, Protor-1, mLST8 및 mSIN1 의 존재에 의해 특징지어진다. mTORC2 는, 라파마이신에 결합하지 않기 때문에, "mTOR-Rictor 복합체" 또는 "라파마이신-둔감화" 복합체로도 지칭된다.
mTOR 복합체 모두는 세포의 성장 및 증식, 및 생존에 영향을 주는 세포내 신호전달 경로에서 중요한 역할을 한다. 예를 들어, mTORC1 의 다운스트림 표적 단백질은 리보솜 S6 키나아제 (예를 들어 S6K1, S6K2) 및 진핵세포 개시 인자 4E 결합 단백질 (4E-BP1) 를 포함한다 (이는 세포에서 단백질 번역의 핵심 조절자임). 또한, mTORC2 는 AKT (S473) 의 인산화를 담당하며; AKT 의 과잉활성화로 인한 비제어된 세포 증식이 여러 암 유형의 특징이라는 것이 연구에서 나타났다.
일부 구현예에서, 유효량의 액티빈 A 의 존재 하 배양된 줄기 세포에서의 mTOR 활성을 저해하는 것은 내배엽 분화를 증진시킨다. 따라서, 본 발명은 줄기 세포 집단을 유효량의 mTOR 의 저해제 및 유효량의 액티빈 A 와 접촉시키고, 내배엽 세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 세포를 배양함으로써 내배엽 세포 집단을 수득하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 내배엽은 줄기 세포를 유효량의 Akt 저해제, 즉 PI3K 신호전달 경로에서 mTOR 의 업스트림 성분, 및 유효량의 액티빈 A 와 접촉시킴으로써 효율적으로 수득되지 않는다. 예시적 AKT 저해제는 예를 들어 Palomid 529, AT7867, 및 실시예에서 사용된 AKT 저해제를 포함한다.
줄기 세포를 유효량의 mTOR 의 저해제 및 유효량의 액티빈 A 와 접촉시켜 수득된 내배엽 세포 집단은 예를 들어, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 또는 40% 초과, 예를 들어 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 또는 75% 초과의 세포가 FoxA2 를 발현하는 집단일 수 있다. 특정 양상에서, 줄기 세포를 mTOR 의 저해제 및 액티빈 A 와 접촉시켜 수득된 내배엽 세포 집단은 예를 들어, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 또는 40% 초과, 예를 들어 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 또는 75% 초과, 예를 들어 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 또는 90% 초과의 세포가 FoxA2 를 발현하는 집단일 수 있다. 줄기 세포를 mTOR 의 저해제와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해 수득된 내배엽 세포 집단은 예를 들어, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 또는 40% 초과, 예를 들어 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 또는 75% 초과의 세포가 CXCR4 를 발현하는 집단일 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 내배엽 형성에 적합한 배지 중에서 적어도 약 1, 2 또는 3 일 배양 후 수득된다 (예를 들어 실시예 참고). 다른 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 적어도 약 4 또는 5 일 배양 후 수득된다. 다른 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 5 일 초과 배양 후 수득된다.
상기 방법에 의해 수득된 내배엽 세포 집단은 예를 들어 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 또는 40% 초과, 예를 들어 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 또는 75% 초과의 세포가 SOX 17 및 Fox A2 를 발현하는 집단일 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 약 40% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고 61% 이상의 세포가 SOX 17 을 발현하는 줄기 세포 집단을 수득하는데 사용될 수 있다. 특정 양상에서, 예를 들어, 줄기 세포를 유효량의 mTOR 저해제 및 유효량의 액티빈 A 와 접촉시켜 생성된 내배엽 세포 집단에서의 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상 또는 약 75% 초과의 세포가 SOX17 및 CXCR4 를 발현한다. 줄기 세포 집단을 mTOR 저해제와 접촉시켜 수득된 내배엽 세포 집단은 예를 들어 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 또는 40% 초과, 예를 들어 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 또는 75% 초과의 세포가 CXCR4 및 Fox A2 를 발현하는 집단일 수 있다. 줄기 세포 집단을 mTOR 의 저해제와 접촉시키는 것을 포함하는 본 발명의 방법은 예를 들어 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 또는 40% 초과, 예를 들어 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 또는 75% 초과의 세포가 SOX 17, Fox A2 및 CXCR4 를 발현하는 세포 집단을 생성시키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 내배엽 형성에 적합한 배지 중에서 적어도 약 1, 2 또는 3 일 배양 후 수득된다 (예를 들어 실시예 참고). 다른 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 적어도 약 4 또는 5 일 배양 후 수득된다. 다른 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 5 일 초과 배양 후 수득된다.
줄기 세포를 유효량의 mTOR 저해제 및 유효량의 액티빈 A 와 접촉시키는 것을 포함하는 본 발명의 방법은 mTOR 유전자로부터 전사된 mRNA 를 특이적으로 불활성화시키는 siRNA 와 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 구현예에서, 상기 방법은 줄기 세포를 5nM 이상, 6nM 이상, 7nM 이상, 8nM 이상, 9nM 이상, 10nM 이상, 또는 10nM 초과의 siRNA 와 접촉시키는 것을 포함한다.
상기 방법으로 사용하는 mTOR 저해제는 소분자일 수 있다. 예를 들어, 하기 나타내거나 열거한 소분자 중 임의의 하나 또는 조합을 방법에서 사용할 수 있다:
Figure pat00026
Figure pat00027
Figure pat00028
Figure pat00029
Merck 의 AP23573 (또한 리다포롤리무스 또는 데포롤리무스로도 공지됨), Pfizer 의 Torsel (또한 템시롤리무스 또는 CI-779 로도 공지됨), Intellikine 의 INK128, AstraZeneca 의 AZD2012, Celgene 의 CC-223, KU-0063794, OSI 의 OSI-027, 시롤리무스 (라파마이신) 및 에버로리무스. 토린 1 이 또한 사용될 수 있다.
PI3K 및 mTOR 의 이중 저해제, 및 PI3K 알파 및 mTOR 의 이중 저해제의 특정 구현예에서, 상기 방법으로 사용한 것은 소분자일 수 있다. 예를 들어, 하기 나타내거나 열거한 소분자 중 임의의 하나 또는 조합을 방법에서 사용할 수 있다:
Figure pat00030
Figure pat00031
Figure pat00032
줄기 세포 집단을 유효량의 mTOR 저해제와 접촉시키는 것을 포함하는 본 발명의 방법은 줄기 세포를 유효량의 mTOR 저해제 또는 PI3K (예를 들어 PI3K 알파 저해제) 및 mTOR 키나아제의 이중 저해제와 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, mTOR 저해제는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체 (예를 들어, 에버로리무스, 템시롤리무스), KU0063794 또는 WYE-354 이다. 이러한 mTOR 저해제 중 임의의 하나 또는 조합의 유효량은 예를 들어, 약 1 nM 내지 약 1 μM, 약 10 nM 내지 약 950 nM, 약 25 nM 내지 약 900 nM, 약 50 nM 내지 약 800 nM, 또는 대략 750 nM 일 수 있다.
PI3K 알파 및 mTOR 의 임의의 이중 저해제의 유효량은 예를 들어, 약 1 nM 내지 약 1 μM, 약 10 nM 내지 약 950 nM, 약 25 nM 내지 약 900 nM, 약 50 nM 내지 약 800 nM, 또는 대략 750 nM 일 수 있다.
유리하게, 줄기 세포를 액티빈 A 및 mTOR 의 저해제와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해 수득된 내배엽 세포 집단은 간세포, 췌장 세포 및 장 세포로 분화되는 능력을 갖는다. 내배엽 세포는 또한 폐 세포, 예컨대 폐 상피 세포 및 기도 선조 세포로 분화되는 능력을 갖는다.
줄기 세포 집단을 mTOR 저해제와 접촉시키는 것을 포함하는 방법은 줄기 세포를 US 2010/0069357, US 2010/0331305, US 2011/0086840, US 2011/0086841, US 7,902,189B2, US 77/50003B2, US 2009/0270390A1, US 2009/0233926A1, US 2009/0018134A1, WO 2008/032077A1, WO 2008/032089A1, WO 2008/032091A1, WO 2008/032086A1, WO 2008/032072A1, WO 2008/032027A1, US 2010/0022534A1, WO 2008/032033A1, WO 2008/032036A1, WO 2008/032041A1, WO 2008/032060A1, WO 2006/051270A1, USP 5536729 USP 5665772, US 81/01602B2, US 75/04397B2, US 80/39469B2, US 81/29371B2, US 81/29371B2, US 2010/0068204A1, US 2010/0061982A1, US 2010/0041692A1, US 2010/0015141A1, US 2010/0003250A1, US 2009/0311217A1, US 2009/0298820A1, US 2009/0227575A1, US 2009/0192147A1, US 2009/0192176A1, US 2009/0181963A1, US 2009/0149458A1, US 2009/0149458A1, US 2008/0233127A1, US 2008/0234262A1,US 2010/0069357A1, US 2010/0331305A1, US 2011/0086840A1, US 2011/0086841A1, 및 Shuttleworth et al. (2011) Current Medicinal Chemistry 18: 2686-2714 (그 내용은 전체가 본원에 참조로 명백히 포함됨) 에서 기재된 mTOR 저해제 중 임의의 하나 또는 조합과 접촉시키는 것을 포함한다.
본원에서 기재된 바와 같이, 내배엽 세포 집단을 수득하는 특정 구현예는 줄기 세포 집단을 유효량의 mTOR 저해제 및 유효량의 PI3K 알파의 선택적 저해제와 접촉시키는 것을 수반한다. 상기 방법이 본원에 기재된 mTOR 저해제 중 임의의 하나 또는 조합과 함께 본원에 나타낸 PI3K 알파 저해제 중 임의의 하나 또는 조합의 용도를 포함한다는 것이 이해될 것이다.
포스파티딜이노시톨 3-키나아제
포스파티딜이노시톨 (PI) 은 세포내 신호 전달에 참여하는 세포막에서 발견된 다수의 인지질 중 하나이다. 3'-인산화 포스포이노시티드를 통한 세포 신호전달은 다양한 세포 과정, 예를 들어 악성 변환, 성장 인자 신호전달, 염증, 및 면역력에 연루된다 (Rameh et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:8347-8350). 이러한 인산화 신호전달 생성물, 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 (또한 PI 3-키나아제 또는 PI3K 로서 지칭함) 를 생성시키는 책임을 갖는 효소는 본래, 바이러스 종양 단백질 및 이노시톨 고리의 3'-히드록실에서 포스파티딜이노시톨 (PI) 및 이의 인산화 유도체를 인산화시키는 성장 인자 수용체 티로신 키나아제와 연관된 활성으로서 확인되었다 (Panayotou et al (1992) Trends Cell Biol 2:358-60). 포스포이노시티드 3-키나아제 (PI3K) 는 이노시톨 고리의 3-히드록실 잔기에서 지질을 인산화시키는 지질 키나아제이다 (Whitman et al (1988) Nature, 332:664). PI3-키나아제에 의해 생성된 3-인산화 인지질 (PIP3) 은 Akt 및 PDK1, 포스포이노시티드-의존성 키나아제-1 과 같은, 지질 결합 도메인 (플랙스트린 (plekstrin) 상동성 (PH) 부위 포함) 을 갖는 키나아제를 유도하는 제 2 메신저로서 작용한다 (Vivanco et al (2002) Nature Rev. Cancer 2: 489; Phillips et al (1998) Cancer 83:41).
PI3 키나아제 패밀리는 구조적 상동성에 의해 하위분류되는 15 개 이상의 상이한 효소를 포함하며 효소 촉매작용에 의해 형성된 생성물 및 서열 상동성을 기반으로 3 개 클래스로 나뉜다. 클래스 I PI3 키나아제는 2 개의 서브유닛: 110 kd 촉매 서브유닛 및 85 kd 조절 서브유닛으로 구성된다 (Otsu et al (1991) Cell 65:91-104; Hiles et al (1992) Cell 70:419-29). 조절 서브유닛은 SH2 도메인을 포함하고 티로신 키나아제 활성을 갖는 성장 인자 수용체에 의해 인산화된 티로신 잔기 또는 발암유전자 생성물에 결합하여, 그의 지질 기질을 인산화시키는 p110 촉매 서브유닛의 PI3K 활성을 유도한다. 클래스 I PI3 키나아제는 사이토카인, 인테그린, 성장 인자 및 면역수용체 다운스트림의 중요한 신호 전달 이벤트에 관여하는데, 이는 상기 경로의 제어가 세포 증식 조절 및 발암과 같은 중요한 치료 효과를 유도할 수 있다는 것을 제시한다. 클래스 I PI3K 는 포스파티딜이노시톨 (PI), 포스파티딜이노시톨-4-포스페이트 및 포스파티딜이노시톨-4,5-바이포스페이트 (PIP2) 를 인산화시켜 포스파티딜이노시톨-3-포스페이트 (PIP), 포스파티딜이노시톨-3,4-바이포스페이트 및 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트를 각각 생성시킬 수 있다. 클래스 II PI3K 는 PI 및 포스파티딜이노시톨-4-포스페이트를 인산화시킨다. 클래스 III PI3K 는 PI 만을 인산화시킬 수 있다. 암에서의 핵심 PI3-키나아제 동형은 p110 알파에서의 재발성 발암성 돌연변이에 의해 나타나는 바와 같이 클래스 I PI3-키나아제, p110 알파이다 (Samuels et al (2004) Science 304:554). (U.S. 특허 번호 5,824,492; U.S. 특허 번호 5,846,824; U.S. 특허 번호 6,274,327). 다른 동형은 암에 있어서 중요할 수 있으며 또한 심혈관 및 면역염증성 질환에 연루되고 (Workman P (2004) Biochem Soc Trans 32:393-396; Patel et al (2004) Proc. Am. Assoc. of Cancer Res. (Abstract LB-247) 95th Annual Meeting, March 27-31, Orlando, Fla., USA; Ahmadi K and Waterfield M D (2004) "Phosphoinositide 3-Kinase: Function and Mechanisms" Encyclopedia of Biological Chemistry (Lennarz W J, Lane M D eds) Elsevier/Academic Press), p110 알파의 발암성 돌연변이는 결장, 유방, 뇌, 간, 난소, 위, 폐 및 두경부의 고형 종양에서 상당히 자주 발견되어왔다. PTEN 이상은 교모세포종, 흑색종, 전립선, 자궁내막, 난소, 유방, 폐, 두경부, 간세포 및 갑상선 종양에서 발견된다.
4 개의 구분되는 클래스 I PI3K 가 확인되어 PI3K 알파, 베타, 델타 및 감마로 지정되었으며, 각각 상이한 110 kDa 촉매 서브유닛 및 조절 서브유닛으로 이루어진다. 촉매 서브유닛 중 3 개, 즉 p110 알파, p110 베타 및 p110 델타는 각각 동일한 조절 서브유닛인 p85 와 상호작용하는 한편; p110 감마는 상이한 조절 서브유닛인 p101 과 상호작용한다. 인간 세포 및 조직에서의 이러한 PI3K 각각의 발현 패턴은 뚜렷이 구분된다. 각각의 PI3K 알파, 베타 및 델타 하위유형에서, p85 서브유닛은 표적 단백질에서 그의 SH2 도메인과 인산화된 티로신 잔기 (적절한 서열 맥락으로 존재) 와의 상호작용에 의해 혈장 멤브레인에 대해 PI3 키나아제를 국부화시키는 작용을 한다 (Rameh et al (1995) Cell, 83:821-30; Volinia et al (1992) Oncogene, 7:789-93).
PI3K 신호전달이 억제되는 경우, 액티빈 A, TGF 베타 패밀리 멤버가 내배엽 분화를 유도한다는 것이 이미 입증된 바 있다 (McLean et al. (2007) Stem Cells 25: 29; Ramasamy et al. (2010) Differentiation 80: S25). 예를 들어, 제목 "Compositions and Methods For Self-Renewal and Differentiation in Human Embryonic Stem Cells" 의 US 2007/0281335 (그 전체가 본원에 참조로 포함됨) 를 또한 참고한다. 다양한 PI3K 저해제가 내배엽 세포 집단을 줄기 세포 집단으로부터 분화시키는데 사용되어왔으나 (예를 들어, Knight (2010) Current Topics in Microbiology and Immunology 247: 263-277; McNamara et al. (2011) Future Med Chem 3: 549-565 참조), 이러한 발견은 세포 근원의 출발 집단 (예컨대 줄기 세포) 의 내배엽 세포, 간세포 또는 췌장 선조 세포로의 효율적 전환을 산출해내지 못했다.
출원인은 p110 알파의 활성을 특이적으로 저해하는 것이 p110 베타, p110 델타 또는 p110 감마의 활성을 저해하는 것보다 더 효과적이고 더 강건하게 내배엽 분화를 증진시킨다는 것을 발견하였다. 따라서 본 발명은 내배엽 세포 집단, 예를 들어 본원에 기재된 집단의 특징 중 임의 하나 이상을 갖는 내배엽 세포 집단을 수득하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 줄기 세포 집단을 유효량의 액티빈 A 및 유효량의 PI3K 알파 동형의 선택적 저해제와 접촉시키고, 내배엽 세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 줄기 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, PI3K 알파의 선택적 저해제는 PI3K 가 p110 알파 촉매 서브유닛을 갖는 경우 클래스 I PI3K 를 특이적으로 저해한다. 일부 구현예에서, 이는 p110 베타, 델타 또는 감마 서브유닛을 포함하는 클래스 I PI3K; 클래스 II PI3K; 또는 클래스 III PI3K 의 활성에 영향을 주지 않는다.
이러한 방법에서, 일부 구현예에서, 유효량의 PI3K 알파의 선택적 저해제는 약 1 μM 이상, 약 750 nM 이상, 약 500 nM 이상, 약 250 nM 이상, 약 100 nM 이상, 약 50 nM 이상, 약 25 nM 이상, 약 10 nM 이상, 약 5 nM 이상 또는 약 1 nM 이상의 역가 (IC50) 에서 PI3K 알파를 저해하는 것이다.
이러한 방법에서, PI3K 알파의 선택적 저해제는 하나 이상의 다른 PI3K 동형에 대해 1000 배 이상의 선택성으로, 하나 이상의 다른 PI3K 동형에 대해 750 배 이상의 선택성으로, 하나 이상의 다른 PI3K 동형에 대해 500 배 이상의 선택성으로, 하나 이상의 다른 PI3K 동형에 대해 250 배 이상의 선택성으로, 하나 이상의 다른 PI3K 동형에 대해 100 배 이상의 선택성으로, 다른 PI3K 동형에 대해 50 배 이상의 선택성으로, 하나의 다른 PI3K 동형에 대해 25 배 이상의 선택성으로, 하나 이상의 다른 PI3K 동형에 대해 10 배 이상의 선택성으로, 하나 이상의 다른 PI3K 동형에 대해 5 배 이상의 선택성으로, 또는 하나 이상의 다른 PI3K 동형에 대해 2 배 이상의 선택성으로 PI3K 알파 (IC50) 를 저해하는 것이다.
따라서 본 발명의 방법은 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 또는 약 83% 이상의 세포가 SOX 17 을 발현하는 내배엽 세포 집단을 수득하는데 사용될 수 있다. 상기 방법은 내배엽 세포의 단리된 집단에서의 83% 초과, 예를 들어 약 84% 이상, 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 또는 99% 초과의 세포가 SOX17 을 발현하는 내배엽 세포 집단을 수득하는데 또한 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 내배엽 세포의 단리된 집단에서의 100% 의 세포가 SOX17 을 발현한다. 일부 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 내배엽 형성에 적합한 배지 중에서 적어도 약 1, 2 또는 3 일 배양 후 수득된다 (예를 들어 실시예 참고). 다른 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 적어도 약 4 또는 5 일 배양 후 수득된다. 다른 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 5 일 초과 배양 후 수득된다.
추가적으로, 본 발명의 방법은 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 71% 이상, 약 72% 이상, 약 73% 이상, 약 74% 이상, 약 75% 이상, 약 76% 이상, 또는 약 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 수득하는데 사용될 수 있다. 추가적으로, 상기 방법으로 약 77% 초과, 예를 들어 약 78% 이상, 약 79% 이상, 약 80% 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 약 83% 이상, 약 84% 이상, 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 90% 초과, 약 93% 초과, 약 95% 초과, 약 97% 초과, 또는 약 99% 초과의 세포가 FoxA2 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 생성시킬 수 있다. 한 구현예에서, 내배엽 세포의 단리된 집단에서의 100% 의 세포가 FoxA2 를 발현한다. 일부 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 내배엽 형성에 적합한 배지 중에서 적어도 약 1, 2 또는 3 일 배양 후 수득된다 (예를 들어 실시예 참고). 다른 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 적어도 약 4 또는 5 일 배양 후 수득된다. 다른 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 5 일 초과 배양 후 수득된다.
일부 양상에서, 본 발명은 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 또는 약 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 수득하는 방법을 제공한다. 본원에 제공된 방법에 의해 수득된 내배엽 세포 집단은 76% 초과, 예를 들어 약 77% 이상, 약 78% 이상, 약 79% 이상, 약 80% 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 약 83% 이상, 약 84% 이상, 85% 초과, 86% 초과, 87% 초과, 88% 초과, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 90% 초과, 약 93% 초과, 약 95% 초과, 약 97% 초과, 또는 약 99% 초과의 세포가 CXCR4 를 발현하는 집단일 수 있다. 한 구현예에서, 내배엽 세포의 단리된 집단에서의 100% 의 세포가 CXCR4 를 발현한다. 일부 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 내배엽 형성에 적합한 배지 중에서 적어도 약 1, 2 또는 3 일 후 수득된다 (예를 들어 실시예 참고). 다른 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 적어도 약 4 또는 5 일 배양 후 수득된다. 다른 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 5 일 초과 배양 후 수득된다.
따라서, 본 발명은 약 50% 이상, 약 65% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 또는 약 75% 초과의 세포가 Sox17 및 FoxA2 모두를 발현하는 내배엽 세포 집단을 수득하는 방법을 제공한다. 본 발명의 내배엽 세포 집단은 예를 들어 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하는 집단일 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 내배엽 형성에 적합한 배지 중에서 적어도 약 1, 2 또는 3 일 배양 후 수득된다 (예를 들어 실시예 참고). 다른 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 적어도 약 4 또는 5 일 배양 후 수득된다. 다른 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 5 일 초과 배양 후 수득된다.
본 발명의 방법은 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 75% 이상의 세포가 SOX17 및 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 수득하는데 사용될 수 있다. 특정 양상에서, 상기 방법은 75% 초과, 예를 들어 약 76% 이상, 약 77% 이상, 약 78% 이상, 약 79% 이상, 약 80% 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 또는 약 83% 이상의 세포가 SOX17 및 CXC4 를 모두 발현하는 세포 집단을 수득하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 수득하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 내배엽 형성에 적합한 배지 중에서 적어도 약 1, 2 또는 3 일 배양 후 수득된다 (예를 들어 실시예 참고). 다른 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 적어도 약 4 또는 5 일 배양 후 수득된다. 다른 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 5 일 초과 배양 후 수득된다.
추가적으로, 본 발명의 방법에 의해 생성된 내배엽 세포 집단은 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 75% 이상, 또는 약 75% 초과의 세포가 FoxA2 및 CXCR4 를 모두 발현하는 집단일 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 약 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고 약 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 수득하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 내배엽 형성에 적합한 배지 중에서 적어도 약 1, 2 또는 3 일 배양 후 수득된다 (예를 들어 실시예 참고). 다른 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 적어도 약 4 또는 5 일 배양 후 수득된다. 다른 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 5 일 초과 배양 후 수득된다.
본 발명에 의해 제공된 방법은 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 또는 75% 초과, 예를 들어 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 또는 83% 초과의 세포가 SOX17, FoxA2 및 CXCR4 를 발현하는 집단을 수득하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 의해 제공된 방법은 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99% 초과의 세포가 SOX17, FoxA2 및 CXCR4 를 발현하는 집단을 수득하는데 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 내배엽 세포의 단리된 집단에서의 100% 의 세포가 SOX17, FoxA2 및 CXCR4 를 발현한다. 특정 양상에서 본원에 제공된 방법은 83% 이상의 세포가 SOX17 를 발현하고, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고, 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포의 단리된 집단을 수득하는데 사용될 수 있다. 특정 양상에서 본원에 제공된 방법은 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포의 단리된 집단을 수득하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 내배엽 형성에 적합한 배지 중에서 적어도 약 1, 2 또는 3 일 배양 후 수득된다 (예를 들어 실시예 참고). 다른 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 적어도 약 4 또는 5 일 배양 후 수득된다. 다른 구현예에서, 이러한 내배엽 세포 집단은 5 일 초과 배양 후 수득된다.
본 발명에 의해 제공된 방법은 62% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 50% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고, 35% 이상의 세포가 유효량의 액티빈 A 및 유효량의 PI3K 저해제와 함께 배양물 중 2 일 후 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 수득하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고, 76% 이상의 세포가 유효량의 액티빈 A 및 유효량의 PI3K 저해제와 함께 배양물 중 3 일 후 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 수득하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 88% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 82% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고, 75% 이상의 세포가 유효량의 액티빈 A 및 유효량의 PI3K 저해제와 함께 배양물 중 4 일 후 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 수득하는데 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 91% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 87% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고, 82% 이상의 세포가 유효량의 액티빈 A 및 유효량의 PI3K 저해제와 함께 배양물 중 5 일 후 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 수득하는데 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 91% 초과, 예를 들어 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 99% 초과의 세포가 SOX17 를 발현하고, 87% 초과, 예를 들어 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 99% 초과의 세포가 FoxA2 를 발현하고, 82% 초과, 예를 들어 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 99% 초과의 세포가 유효량의 액티빈 A 및 유효량의 PI3K 저해제와 함께 배양물 중 5 일 후 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 수득하는데 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 유효량의 액티빈 A 및 유효량의 PI3K 저해제와 함께 배양하는 경우 내배엽 세포의 단리된 집단 중 100% 의 세포가 SOX17, FoxA2 및 CXCR4 를 발현한다. 일부 구현예에서, 이러한 집단은 배양물 중 1, 2, 3 또는 4 일 후 수득된다.
일부 구현예에서, 세포 집단 (예를 들어, 내배엽 세포 집단) 은 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 마커의 상한치와 연결된 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 마커 (예를 들어 SOX17, FOXA2, CXCR4) 의 기재된 하한치를 갖는다. 본 발명은 본원에 인용된 임의의 수치의 하한치 및 상한 백분율 모두를 포함하는 범위를 고려한다. 예를 들어, 한 구현예는 집단에서의 약 50% 내지 약 90% 의 내배엽 세포가 SOX17 을 발현하는 내배엽 세포 집단을 고려한다. 추가예로서, 일부 구현예에서, 백분율의 상한치는 대략 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 중 임의의 것일 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 높은 효율로 내배엽 세포 집단을 수득하는데 사용될 수 있다. 유리하게는, 내배엽 세포 집단은 다운스트림 적용에 사용하기 전에 세포를 분류할 (즉, 내배엽 세포 집단을 향상시킬) 필요성을 배제시키는 동질 집단이다. 유리하게, 본 발명의 방법은 간세포, 췌장 세포 및 장 세포 중 임의의 하나 이상으로 분화하는 능력을 갖는 내배엽 세포 집단을 수득하는데 사용될 수 있다.
본 방법의 특정 구현예에서, 줄기 세포는 PI3K 알파의 선택적 저해제 및 TGF 베타 패밀리의 멤버와 접촉된다. 상기 방법은 줄기 세포를 Nodal, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, TGF-베타, BMP2, BMP4, 및 전술한 것들 중 둘 이상의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 TGF 베타 패밀리 멤버와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에서, 유효량의 TGF 베타 패밀리 멤버는 약 1 ng/ml 내지 약 1 mg/ml, 약 5 ng/ml 내지 약 600 ng/ml, 약 10 ng/ml 내지 약 500 ng/ml, 약 25 ng/ml 내지 약 250 ng/ml, 약 50 ng/ml 내지 약 200 ng/ml, 또는 대략 100 ng/ml 일 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 줄기 세포는 유효량의 액티빈 A 와 접촉된다. 이들 방법에서, 유효량의 액티빈 A 는 약 25 ng/ml, 약 50 ng/ml, 약 75 ng/ml, 약 100 ng/ml, 약 150 ng/ml 또는 약 200 ng/ml 일 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 줄기 세포는 약 1 ng/ml - 600 ng/ml, 5 ng/ml - 500 ng/ml, 약 10 ng/ml - 400 ng/ml, 약 25 ng/ml - 200 ng/ml, 약 25 ng/ml - 150 ng/ml, 또는 약 25 ng/ml - 100 ng/ml 의 유효량의 액티빈 A 와 접촉된다.
본 발명의 특정 방법은 줄기 세포 집단을 유효량의 TGF 베타 패밀리 멤버 (예컨대 액티빈 A) 및 PI3K 알파의 선택적 저해제, 및 유효량의 mTOR 저해제와 추가로 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 줄기 세포 집단을 유효량의 PI3K 알파의 선택적 저해제 및 유효량의 mTOR 저해제와 접촉시키는 것을 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명의 방법은 줄기 세포 집단을 PI3K 알파 및 mTOR 키나아제에 대해 선택적인 이중 저해제 유효량과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 다른 양상에서, 본 발명의 방법은 줄기 세포 집단을 유효량의 PI3K 알파의 선택적 저해제 및 유효량의 PI3K 델타의 선택적 저해제와 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
특정 양상에서, 본 발명의 방법은 줄기 세포 집단을 유효량의 액티빈 A 및 유효량의 PI3K 알파의 선택적 저해제 (PI3K 델타의 선택적 저해제인 것으로 또한 입증됨), 예를 들어 그 구조를 하기에 제공하는, 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-6-[(4-메틸술포닐피페라진-1-일)메틸]티에노[3,2-d]피리미딘-4-일]모르폴린인 화합물 A 와 접촉시키는 것을 포함한다:
Figure pat00033
이러한 방법에서, PI3K 델타의 선택적 저해제인 것으로 또한 입증된 PI3K 알파의 선택적 저해제의 유효량은 예를 들어 300 nM 이상, 400 nM 이상, 500 nM 이상, 또는 500 nM 초과, 예를 들어 550 nM, 600 nM 이상, 650 nM 이상, 700 nM 이상, 또는 750 nM 이상일 수 있다. 특정 양상에서, 상기 방법에서 사용될 수 있는 PI3K 델타의 선택적 저해제인 것으로 또한 입증된 PI3K 알파의 선택적 저해제의 유효량은 예를 들어 750nM 초과, 800nM 이상, 850nM 이상, 900nM 이상, 950nM 이상, 또는 950nM 초과일 수 있다.
상기 방법의 특정 양상에서, 내배엽 세포 집단, 예를 들어 본원에 기재된 임의의 집단을 생성시키기에 충분한 조건 하에 줄기 세포를 배양하는 것은 유효량의 액티빈 A 및 유효량의 PI3K 알파의 선택적 저해제를 함유하는 배지 중에서 3 일 이상, 4 일 이상, 5 일 이상, 6 일 이상, 7 일 이상, 또는 7 일 초과 동안 줄기 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 내배엽 세포 집단이 줄기 세포를 유효량의 액티빈 A 및 유효량의 PI3K 알파의 선택적 저해제와 접촉시키고 Wnt3a 의 부재 하에 줄기 세포를 배양함으로써 수득될 수 있다는 것이다. 따라서, 상기 및 본원의 다른 곳에서 기재된 임의의 방법은 Wnt3a 의 부재 하에 수행될 수 있다. 더욱이, 상기 방법은 줄기 세포를 배양하는 배지에 의해 제한되지 않는다. 한 양상에서, 상기 방법은 예를 들어 화학적으로 규정된 배지 또는 조건화 배지 중에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포는 예컨대 DMEM/F12, RPMI, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 줄기 세포 배양 배지 중에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, pan-PI3K 키나아제는 사용되지 않는다. 사용되지 않는 pan-PI3K 의 비제한적 예는 Ly294002 이다.
또한, 상기 기재된 임의의 방법은 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 수득된 내배엽 세포 집단, 즉 유효량의 PI3K 알파의 선택적 저해제 및 유효량의 액티빈 A 와 접촉되지 않은 줄기 세포로부터 수득된 내배엽 세포 집단에 비해 더 큰 생존력 및/또는 증식을 나타내는 내배엽 세포 집단을 수득하는데 사용될 수 있다. 상기 방법에 의해 수득된 내배엽 세포는 다른 방법에 의해 수득된 내배엽 세포, 예를 들어 유효량의 PI3K 알파의 선택적 저해제 및 유효량의 액티빈 A 와 접촉되지 않은 줄기 세포로부터의 내배엽 세포보다 더 큰 표현형적 안정성을 나타내며 보다 증식성이다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 배양물 중에서 3 일 이상, 4 일 이상, 5 일 이상, 6 일 이상, 7 일 이상, 8 일 이상, 9 일 이상, 10 일 이상, 또는 10 일 초과 (예를 들어 배양물 중에서 11 일 초과, 12 일 초과, 13 일 초과, 14 일 초과, 또는 15 일 초과) 후에 생존가능하며 증식성인 내배엽 세포 집단을 수득하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 2 계대 후, 3 계대 후, 4 계대 후, 5 계대 후, 6 계대 후, 7 계대 후, 8 계대 후, 9 계대 후, 10 계대 이하 동안, 또는 10 계대 초과 (예를 들어, 11 계대 또는 12 계대) 후 표현형적으로 안정하고 증식성인 내배엽 세포 집단을 수득하는데 사용될 수 있다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 이러한 내배엽 집단은 피더 층 (예를 들어 마트리겔층 또는 콜라겐층) 의 부재 하 성장한 경우 표현형적으로 안정하고 증식성으로 남아 있다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 이러한 내배엽 집단은 TesR2 배지 + 30% 마우스 배아 섬유아세포-조건화 배지 (MEF) 중에서 성장한 경우 표현형적으로 안정하고 증식성으로 남아 있다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 이러한 내배엽 집단은 TesR2 배지 + 30% MEF 중에서 및 BMP4 의 존재 하 성장한 경우 표현형적으로 안정하고 증식성으로 남아 있다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 이러한 내배엽 집단은 TesR2 배지 + 30% MEF 중에서 및 BMP4 의 존재 하 성장한 경우 표현형적으로 안정하고 증식성으로 남아 있다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 이러한 내배엽 집단은 TesR2 배지 + 30% MEF 중에서, 그리고 BMP4, 및 FGF2, VEGF 및/또는 EGF 의 임의의 조합의 존재 하 성장한 경우 표현형적으로 안정하고 증식성으로 남아 있다. 또한, 본원에 기재된 방법 중 임의의 하나에 의해 수득된 내배엽 세포 집단은 본 발명의 범주 내에 고려된다. 유리하게는, 줄기 세포를 유효량의 액티빈 A 및 유효량의 PI3K 알파의 선택적 저해제와 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해 수득된 내배엽 세포 집단은 간세포, 췌장 세포 및 장 세포로 분화하는 능력을 갖는다.
PI3K 알파의 선택적 저해제
상기 기재된 방법의 특정 구현예에서, PI3K 알파의 선택적 저해제는 U.S. 특허 출원 번호 US 2008/0207611 에서 개시된 바와 같은 식 (I) 의 융합 피리미딘인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다:
Figure pat00034
[식 중,
A 는 티오펜 또는 푸란 고리를 나타내고; n 은 1 또는 2 이고; R1 은 하기 식의 기이고:
Figure pat00035
{식 중,
m 은 0 또는 1 이고; R30 은 H 또는 C1-C6 알킬이고; R4 및 R5 는 이들이 부착되는 N 원자와 함께, N, S 및 O 에서 선택되는 0 또는 1 개의 추가적인 헤테로원자를 포함하는 5- 또는 6-원 포화 N-함유 헤테로시클릭기를 형성하고, 이는 벤젠 고리에 융합될 수 있으며 비치환 또는 치환되거나; R4 및 R5 중 하나는 알킬이고 다른 것은 상기 정의한 바와 같은 5- 또는 6-원 포화 N-함유 헤테로시클릭기이거나 상기 정의한 바와 같은 5- 또는 6-원 포화 N-함유 헤테로시클릭기에 의해 치환되는 알킬기임};
R2 는 하기에서 선택되고:
(a)
Figure pat00036
{식 중,
R6 및 R7 은 이들이 부착되는 질소 원자와 함께, 비치환 또는 치환되는 모르폴린, 티오모르폴린, 피페리딘, 피페라진, 옥사제판 또는 티아제판기를 형성함}; 및
(b)
Figure pat00037
{식 중,
Y 는 사슬의 구성 탄소 원자 및/또는 사슬의 하나의 말단 또는 양쪽 말단 모두 사이에, O, N 및 S 에서 선택되는 1 또는 2 개의 헤테로원자를 함유하는 C2-C4 알킬렌 사슬이고, 이는 비치환되거나 치환됨};
R3 은 비치환 또는 치환되는 인다졸기임].
상기 방법에 대한 특정 구현예에서, PI3K 알파 저해제는 U.S. 특허 출원 번호 US 2008/0207611 에서 개시된 바와 같은 하기 식 (Ia) 의 융합 피리미딘 고리인 화합물일 수 있다:
Figure pat00038
[식 중,
X 는 S 또는 O 이고 R1, R2, R3 및 n 은 상기 정의한 바와 같음].
추가적으로, 본원에 기재된 방법에서 사용된 PI3K 알파 저해제는 하기 식 (Ib) 의 융합 피리미딘 고리인 화합물일 수 있다:
Figure pat00039
[식 중,
X 는 S 또는 O 이고 R1, R2, R3 및 n 은 상기 정의한 바와 같음].
식 (I), 식 (Ia) 또는 식 (Ib) 에서, 기 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R30, A, Y, X, 첨자 m 은 (이러한 기는 식 (I), 식 (Ia) 또는 식 (Ib) 에서 나타남) 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함되는 US2008/0207611 에서 개시되는 바와 같은 의미를 갖는다.
특정 구현예에서, 내배엽을 수득하는 방법에서 사용된 선택적 PI3K 알파 저해제는 하기 화합물: 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-술폰산 디메틸아미드; {4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-모르폴린-4-일-메타논; 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-카르복실산 (2-메톡시-에틸)-메틸-아미드; {4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-N,N-디메틸-아세트아미드; 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-카르복실산 디메틸아미드; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-[4-(3-모르폴린-4-일-프로판-1-술포닐)-피페라진-1-일메틸]-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-(2-메톡시-에틸)-메틸-아민; (3-{4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-술포닐}-프로필)-디메틸-아민; 2-{4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-2-메틸-프로판-1-올; 1'-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-[1,4']바이피페리디닐; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-모르폴린-4-일-피페리딘-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-피리미딘-2-일-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 1-(2-히드록시-에틸)-4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-2-온; 6-(4-시클로프로필메틸-피페라진-1-일메틸)-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-피리딘-2-일-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-[4-(2,2,2-트리플루오로-에틸)-피페라진-1-일메틸]-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-티아졸-2-일-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(6-플루오로-1H-인다졸-4-일)-6-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-피리딘-2-일메틸-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-티아졸-2-일메틸-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(5-메틸-푸란-2-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-카르복실산 아미드; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(2-메톡시-1,1-디메틸-에틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[(3R,5S)-4-(2-메톡시-에틸)-3,5-디메틸-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-카르복실산 (2-메톡시-에틸)-메틸-아미드; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-카르복실산 디메틸아미드; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-피리딘-3-일메틸-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-카르복실산 메틸아미드; 2-{4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-N-메틸-이소부티르아미드; 2-{4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-2-메틸-1-피롤리딘-1-일-프로판-1-온; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(1-메틸-1H-이미다졸-2-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(5-메틸-이속사졸-3-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 1-{4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-2-메틸-프로판-2-올; 시클로프로필메틸-{1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-(2-메톡시-에틸)-아민; 6-[4-(1-에틸-1-메톡시메틸-프로필)-피페라진-1-일메틸]-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(1-메톡시메틸-시클로프로필)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-(2-메톡시-에틸)-(2,2,2-트리플루오로-에틸)-아민; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(2-메톡시-에틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-메탄올; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-피리딘-4-일메틸-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(6-메틸-피리딘-2-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(4-메틸-티아졸-2-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-피리딘-2-일-아민; N-{1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-2-메톡시-N-메틸-아세트아미드; N-{1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-N-메틸-메탄술폰아미드; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-(3-메톡시-프로필)-메틸-아민; 6-((3S,5R)-3,5-디메틸-4-피리딘-2-일메틸-피페라진-1-일메틸)-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(4-메톡시메틸-피페리딘-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-(2-메톡시-에틸)-티아졸-2-일메틸-아민; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-4-피리딘-2-일메틸-피페리딘-4-올; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-이소프로필-(2-메톡시-에틸)-아민; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-[4-(피리딘-2-일옥시)-피페리딘-1-일메틸]-티에노[3,2-d]피리미딘; N-{1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-N-(2-메톡시-에틸)-메탄술폰아미드; 2-{1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-프로판-2-올; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-[4-(1-옥시-피리딘-3-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-모르폴린-4-일메틸-피페리딘-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일메틸}-(2-메톡시-에틸)-메틸-아민; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일메틸}-디메틸-아민; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-3-일}-(2-메톡시-에틸)-메틸-아민; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-3-카르복실산 메틸아미드; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(3-메톡시메틸-피페리딘-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-피리딘-2-일메틸-피페리딘-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(2-메톡시-에톡시)-피페리딘-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 6-((3R,5S)-3,5-디메틸-4-티아졸-2-일메틸-피페라진-1-일메틸)-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-[4-(1-옥시-피리딘-2-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(2-메톡시-에틸)-피페리딘-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(4-메탄술포닐-피페리딘-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-(3-메탄술포닐-프로필)-메틸-아민; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-[4-(3-메톡시-프로판-1-술포닐)-피페리딘-1-일메틸]-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; (R)-1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-3-카르복실산 메틸아미드; (S)-1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-3-카르복실산 메틸아미드; 6-(4-이미다졸-1-일메틸-피페리딘-1-일메틸)-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-모르폴린-4-일메틸-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(3-메틸-피페리딘-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; {1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-3-일}-메탄올; 2-{1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페리딘-4-일}-에탄올; 1-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-4-티아졸-2-일-피페리딘-4-올; 2-(1-메틸-1H-인다졸-4-일)-6-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(2-메틸-2H-인다졸-4-일)-6-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-(4-티아졸-4-일메틸-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; 1-{4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-피페라진-1-일}-3-페녹시-프로판-2-올; 6-[4-(1H-이미다졸-2-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 6-[4-(3H-이미다졸-4-일메틸)-피페라진-1-일메틸]-2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘; 2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-6-((2S,6R)-2,4,6-트리메틸-피페라진-1-일메틸)-티에노[3,2-d]피리미딘; {4-[2-(1H-인다졸-4-일)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘-6-일메틸]-1-메탄술포닐-피페라진-2-일}-메탄올; 및 2-(1H-인다졸-4-일)-6-(4-메탄술포닐-3-메톡시메틸-피페라진-1-일메틸)-4-모르폴린-4-일-티에노[3,2-d]피리미딘 중 임의의 하나 또는 조합; 및 상기 언급한 유리 화합물의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다. 본원에서 개시된 구현예가 이의 염을 포함한다는 것이 이해된다.
일부 구현예에서, 상기 방법에서 사용된 선택적 PI3K 알파 저해제는 하기의 선택적 PI3K 알파 저해제 중 임의의 하나 또는 조합 또는 하기의 PI3K 알파 저해제와 PI3K 경로의 또 다른 선택적 저해제, 예를 들어 또 다른 PI3K 알파 저해제, PI3K 델타 저해제 또는 mTOR 저해제와의 조합일 수 있다.
Figure pat00040
Intellikine 의 INK1117, D106669, 또는 Novartis 의 BYL719.
본 발명의 방법은 또한 하기의 PI3K 알파 저해제 중 임의의 하나 또는 조합 또는 하기의 PI3K 알파 저해제와 PI3K 경로의 또 다른 선택적 저해제, 예를 들어 또 다른 PI3K 알파 저해제, PI3K 델타 저해제, mTOR 저해제와의 조합을 사용할 수 있다:
Figure pat00041
Figure pat00042
Figure pat00043
, 또는
Figure pat00044
PIK-75.
일부 구현예에서 PI3K 알파의 선택적 저해제는 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-6-[(4-메틸술포닐피페라진-1-일)메틸]티에노[3,2-d]피리미딘-4-일]모르폴린 (또한 본원에서 "화합물 A" 로서 지칭함) 이며, 이의 구조를 하기에 제공한다:
Figure pat00045
.
본 발명에 의해 제공된 방법에서 사용될 수 있는 추가적인 PI3K 알파 저해제는 또한 US 2005/014771A1, US 2010/0137585A1, WO 2006/046040, US 2009/0156601, US 2008/0039459, US 2011/0105461, US 2008/0076768 (US7781433), WO 2007/132171, US 2008/0269210, US 2009/0118275, WO 2009/066084, US 2011/0172216, US 2009/0247567, US 2009/0318411, WO 2010/059788, US 2010/0233164, US 2011/007629, US 2011/0251202A1, US 2011/0003786A1, US 2011/0003818A1, US 2010/0298286A1, US 2010/0249126A1, US 2010/0105711A1, US 2010/0075965A1, US 2010/0311729A1, US 2010/0048547A1, US 2009/0163469A1, US 2009/0318410A1, US 2009/0286779A1, US 2009/0258882A1, US 2009/0318410A1, US 2009/0131457A1, US 2012/0059000A1, US 2011/0124641A1, US 2011/0172228A1, US 2011/0160232A1, US 2011/0281866A1, US 2011/0046165A1, US 2011/0077268A1, US 2011/0269779A1, US 2010/0184760A1, US 2010/0190749A1, US 2009/0312319A1, WO 2011/149937A1, WO 2011/022439A1 및 WO 2010/129816A2, US 2008/0207611, USP 7781433, US 2008/0076758, US20080242665 및 US 2011/0076291 (각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨) 에 기재되어 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 것으로 고려되는 추가적인 PI3K 알파 저해제는 US 2005/014771, US 2010/013758, US 2008/0207611, WO2006/046040, US 2009/0156601, US 2008/0039459, US 2011/0105461, US 2008/0076768, US 2008/0076758, WO 2007/132171, US 2008/0269210, US 2008/0242665, US 2009/0118275, WO 2009/066084, US 2011/0172216, US 2009/0247567, US 2009/0318411, WO 2010/059788, US 2010/0233164, US 2011/007629, US 2011/007629 및 Shuttleworth et al. (2011) Current Medicinal Chemistry 18: 2686-2714 (각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨) 에서 기재되어 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 또 다른 PI3K 알파 저해제는 PI103 이다.
상기 참고문헌에서 기재된 PI3K 알파의 선택적 저해제의 임의의 조합 (2, 3, 4 가지 또는 그 이상) 이 본원에 제공된 방법에서 사용되어 내배엽 세포 집단을 생성시킬 수 있다는 것이 이해된다.
PI3K 델타의 저해제
특정 구현예에서, 내배엽 세포는 줄기 세포 집단을 유효량의 PI3K 알파의 선택적 저해제 및 PI3K 델타의 선택적 저해제와 접촉시켜 생성될 수 있다. 이들은 줄기 세포를 PI3K 델타의 임의의 선택적 저해제와 함께 본원에 기재된 PI3K 알파의 선택적 저해제 중 임의의 하나 또는 조합과 접촉시킴으로써 내배엽 세포 집단을 수득하는 것을 포함한다.
본 발명에 의해 제공된 방법에서 사용될 수 있는 추가적인 PI3K 델타 저해제는 US 2009/0131429, US 2009/0042884, US 2010/0016306, WO 2008/125839, WO 2008/125833, WO 2008/125835, US 2010/0190769, WO 2008/152387, WO 2008/152394, US 2011/0021496, WO 2009/053716, US 2010/0305096, US 2010/0305084, US 2011/0207713, US 2009/0131429, US 2009/0042884, US 2010/0016306, WO 2008/125839, WO2008/125833, WO 2008/125835, US 2010/0190769, WO 2008/152387, WO 2008/152394, US2011/0021496, WO 2009/053716, US 2010/0305096, US 2010/0305084, US 2011/0207713 (그 내용 전체가 본원에 참조로 포함됨) 에 기재되어 있다.
내배엽 세포 집단
본 발명은 본원에 기재된 방법으로부터 생기는 내배엽 세포 집단을 제공한다. 본 발명이 집단 그 자체 뿐 아니라 상기 방법에 의해 생성된 집단을 고려하고 포함한다는 것이 이해된다. 다른 관련 구현예가 하기 및 본원에서 기재된 바와 같이 추가로 제공된다.
내배엽 세포의 표현형
본 발명에 의해 제공된 내배엽 세포의 집단 또는 단리된 집단은 하기의 생물학적 마커: SOX 17, CXCR4, FoxA1, FoxA2, FoxA3, CD55 (또는 DAF1), Cer1 (Cerberus 1), HNF1a, HNF1b, HNF4a, Gata3, Gata4, Gata6, Hhex 및 LHX1 중 하나 이상의 발현에 관련된 다양한 표현형에 의해 기재될 수 있다.
이들 마커 중 임의의 하나 이상의 존재 및/또는 발현 수준은 본 발명에 의해 제공된 내배엽 세포 집단을 내배엽 분화의 공지된 방법을 사용하여 수득된 내배엽 세포 집단과 구별시킨다. 이들 마커는 면역조직화학, 유동세포분석법 및 형광 영상 분석을 비제한적으로 포함하는 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 검출될 수 있다. 이러한 기술의 세부사항을 실시예 1 에서 발견할 수 있다. 본원에 기재된 마커는 내배엽 세포를 배양하는 상이한 시점, 예를 들어 액티빈 A 및 PI3K 알파의 선택적 저해제 및 임의로는 PI3K 델타 또는 mTOR 키나아제 저해제의 선택적 저해제 첨가 후 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일 또는 그 이상에서 측정될 수 있다.
본 발명은 집단에서의 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 또는 약 83% 이상의 세포가 SOX 17 을 발현하는 내배엽 세포 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단은 배양물 중에서 약 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일 또는 그 이상 후에 이러한 양의 SOX17 을 갖는다.
본 발명은 또한, 내배엽 세포의 단리된 집단에서의 83% 초과, 예를 들어 약 84% 이상, 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 또는 99% 초과의 세포가 SOX17 을 발현하는 내배엽 세포 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단은 배양물 중에서 약 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일 또는 그 이상 후에 이러한 양의 SOX17 을 갖는다.
추가적으로, 본 발명은 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 71% 이상, 약 72% 이상, 약 73% 이상, 약 74% 이상, 약 75% 이상, 약 76% 이상, 또는 약 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 제공한다. 본 발명의 내배엽 세포 집단은 약 77% 초과, 예를 들어 약 78% 이상, 약 79% 이상, 약 80% 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 약 83% 이상, 약 84% 이상, 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 90% 초과, 약 93% 초과, 약 95% 초과, 약 97% 초과, 또는 약 99% 초과의 세포가 FoxA2 를 발현하는 집단일 수 있다. 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단은 배양물 중에서 약 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일 또는 그 이상 후에 이러한 양을 갖는다.
일부 양상에서, 본 발명은 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 또는 약 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 제공한다. 본 발명의 내배엽 세포 집단은 76% 초과, 예를 들어 약 77% 이상, 약 78% 이상, 약 79% 이상, 약 80% 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 약 83% 이상, 약 84% 이상, 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 90% 초과, 약 93% 초과, 약 95% 초과, 약 97% 초과, 또는 약 99% 초과의 세포가 CXCR4 를 발현하는 집단일 수 있다. 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단은 배양물 중에서 약 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일 또는 그 이상 후에 이러한 양을 갖는다.
본 발명의 내배엽 세포 집단을 특징짓는 또 다른 방식은 이들이 발현하는 마커의 조합에 의한 것이다. 따라서, 본 발명은 약 50% 이상, 약 65% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 또는 약 75% 초과의 세포가 Sox17 및 FoxA2 모두를 발현하는 내배엽 세포 집단을 제공한다. 본 발명의 내배엽 세포 집단은 예를 들어 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하는 집단일 수 있다.
본 발명의 내배엽 세포 집단은 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 75% 이상의 세포가 SOX17 및 CXCR4 모두를 발현하는 집단일 수 있다. 특정 양상에서, 본 발명의 내배엽 세포 집단은 75% 초과, 예를 들어 약 76% 이상, 약 77% 이상, 약 78% 이상, 약 79% 이상, 약 80% 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 또는 약 83% 이상의 세포가 SOX17 및 CXC4 모두를 발현하는 세포 집단일 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단은 배양물 중에서 약 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일 또는 그 이상 후에 이러한 양을 갖는다.
추가적으로, 본 발명의 내배엽 세포 집단은 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 75% 이상, 또는 약 75% 초과의 세포가 FoxA2 및 CXCR4 모두를 발현하는 집단일 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 약 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고 약 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단은 배양물 중에서 약 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일 또는 그 이상 후에 이러한 양을 갖는다.
본 발명의 내배엽 세포 집단은 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상 또는 75% 초과, 예를 들어 약 76% 이상, 약 77% 이상, 약 78% 이상, 약 79% 이상, 약 80% 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 약 83% 이상, 또는 83% 초과, 예를 들어 약 85% 이상, 약 87% 이상, 또는 87% 초과의 세포가 SOX17, FoxA2 및 CXCR4 를 발현하는 집단일 수 있다. 추가 구현예에서, 내배엽 세포의 단리된 집단은 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하고, 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 집단일 수 있다. 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단은 배양물 중에서 약 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일 또는 그 이상 후에 이러한 양을 갖는다.
안정한 내배엽
본 발명에 의해 제공된 내배엽 세포는 또한 배양물 중 다수의 계대를 통해 다분화능 세포로서 표현형적으로 안정하게 남아 있는 능력 뿐 아니라 이러한 표현형을 유지하면서 증식 (즉, 분화) 하는 능력에 의해 기재될 수 있다. 다분화능 상태로 유지될 수 있는 안정한 내배엽 세포는 시험관내 내배엽 발생 및 분화를 연구하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 내배엽 세포 집단을 특징짓는 또 다른 방식은 표현형을 유지하면서 배양물 중 다수의 계대를 통해 증식성 (즉, 세포 분화 가능) 을 유지하는 능력에 의한 것이다. 내배엽 세포의 확장성 집단은 그로부터 예를 들어 간 세포, 간세포 전구체 세포, 췌장 전구체 세포, 췌장 세포, 간세포 또는 내배엽 세포 융래의 다른 분화 세포 (예를 들어 장 선조 세포, 장 세포, 폐 선조 세포, 폐 세포 등) 가 수득되는 다량의 선조 세포를 제공하여, 세포 치료요법 적용을 위한 임상적 필요성을 충족시킬 수 있다. 안정하고 확장가능한 내배엽을 생성시키는 것은 인간에서 시도되어왔다 (Seguin, et al. (2008) "Establishment of endoderm progenitors by SOX transcription factor expression in human embryonoc stem cells." Cell Stem Cell, 3(2): 182-19; Cheng, et al. (2012). "Self-renewing endodermal progenitor lines generated from human pluripotent stem cells." Cell Stem Cell, 10(4): 371-384) and mouse cells (Morrison, et al. (2008). "Anterior definitive endoderm from ESCs reveals a role for FGF signaling." Cell Stem Cell, 3(4): 402-415). 그러나, 이러한 방법은 CXCR4+ 세포를 얻기 위한 분류 단계를 여전히 포함한다. 표현형적으로 안정한, 본 발명의 내배엽 세포의 증식성 집단은 어떠한 분류 단계도 포함하지 않는 방법을 사용하여 수득될 수 있다.
따라서, 본 발명의 내배엽 세포 집단은 특정 기간에 걸쳐, 예를 들어 배양물 중 3 일 이상, 4 일 이상, 5 일 이상, 6 일 이상, 7 일 이상, 8 일 이상, 9 일 이상, 10 일 이상, 또는 10 일 초과, 예컨대 배양물 중 11 일 초과, 12 일 초과, 13 일 초과, 14 일 초과, 15 일 초과, 배양물 중 16 일 초과, 배양물 중 17 일 초과, 배양물 중 18 일 초과, 배양물 중 19 일 초과, 배양물 중 20 일 초과, 배양물 중 21 일 초과, 배양물 중 22 일 초과, 배양물 중 23 일 초과, 또는 배양물 중 24 일 초과 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 에 걸쳐 SOX 17, CXCR4, FoxA1, FoxA2, FoxA3, CD55 (또는 DAF1), Cer1 (Cerberus 1), HNF1a, HNF1b, HNF4a, Gata3, Gata4, Gata6, Hhex 및 LHX1 중 하나 이상의 발현과 관련된 상기 기재된 임의의 표현형을 유지하는 그의 능력에 의해 특징지어지는 집단일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 내배엽 세포 집단은 약 2 계대 이상, 약 3 계대 이상, 약 4 계대 이상, 약 5 계대 이상, 약 6 계대 이상, 약 7 계대 이상, 약 8 계대 이상, 약 9 계대 이상, 10 계대 이하, 또는 적어도 약 10 계대 초과 (예를 들어 11 계대 또는 12 계대) (이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 동안 SOX 17, CXCR4, FoxA1, FoxA2, FoxA3, CD55 (또는 DAF1), Cer1 (Cerberus 1), HNF1a, HNF1b, HNF4a, Gata3, Gata4, Gata6, Hhex 및 LHX1 중 하나 이상의 발현과 관련된 상기 기재된 임의의 표현형을 유지하는 그의 능력에 의해 특징지어지는 바와 같이 표현형적으로 안정한 집단일 수 있다.
일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단은 피더 층 (예를 들어 마트리겔 층 또는 콜라겐 층) 의 부재 하 성장한 경우, SOX 17, CXCR4, FoxA1, FoxA2, FoxA3, CD55 (또는 DAF1), Cer1 (Cerberus 1), HNF1a, HNF1b, HNF4a, Gata3, Gata4, Gata6, Hhex 및 LHX1 중 하나 이상의 발현과 관련된 상기 기재한 임의의 표현형을 유지하는 그의 능력에 의해 특징지어진 바와 같이, 다분화능 세포로서 표현형적으로 안정하게 남아 있을 수 있는 집단이다. 일부 구현예에서 내배엽 세포 집단은 TesR2 배지 + 30% 마우스 배아 섬유아세포-조건화 배지 (MEF) 에서 성장한 경우, SOX 17, CXCR4, FoxA1, FoxA2, FoxA3, CD55 (또는 DAF1), Cer1 (Cerberus 1), HNF1a, HNF1b, HNF4a, Gata3, Gata4, Gata6, Hhex 및 LHX1 중 하나 이상의 발현과 관련된 상기 기재한 임의의 표현형을 유지하는 그의 능력에 의해 특징지어진 바와 같이, 다분화능 세포로서 표현형적으로 안정하게 남아 있을 수 있는 집단이다. 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단은 TesR2 배지 + 30% MEF 에서, 그리고 BMP4 의 존재 하에 성장한 경우, SOX 17, CXCR4, FoxA1, FoxA2, FoxA3, CD55 (또는 DAF1), Cer1 (Cerberus 1), HNF1a, HNF1b, HNF4a, Gata3, Gata4, Gata6, Hhex 및 LHX1 중 하나 이상의 발현에 관련된 상기 기재한 임의의 표현형을 유지하는 그의 능력에 의해 특징지어진 바와 같이, 다분화능 세포로서 표현형적으로 안정하게 남아 있을 수 있는 집단이다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단은 TesR2 배지 + 30% MEF 에서, 그리고 BMP4, FGF2, VEGF 및 EGF 의 존재 하에 성장한 경우, SOX 17, CXCR4, FoxA1, FoxA2, FoxA3, CD55 (또는 DAF1), Cer1 (Cerberus 1), HNF1a, HNF1b, HNF4a, Gata3, Gata4, Gata6, Hhex 및 LHX1 중 하나 이상의 발현과 관련된 상기 기재한 임의의 표현형을 유지하는 그의 능력에 의해 특징지어진 바와 같이, 다분화능 세포로서 표현형적으로 안정하게 남아 있을 수 있는 집단이다. 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단은 분류 단계를 포함하지 않는 방법을 사용하여 수득한 경우, SOX 17, CXCR4, FoxA1, FoxA2, FoxA3, CD55 (또는 DAF1), Cer1 (Cerberus 1), HNF1a, HNF1b, HNF4a, Gata3, Gata4, Gata6, Hhex 및 LHX1 중 하나 이상의 발현과 관련된 상기 기재한 임의의 표현형을 유지하는 그의 능력에 의해 특징지어진 바와 같이, 다분화능 세포로서 표현형적으로 안정하게 남아 있을 수 있는 집단이다.
본 발명의 내배엽 세포 집단은 특정 기간, 예를 들어 배양물 중 3 일 이상, 4 일 이상, 5 일 이상, 6 일 이상, 7 일 이상, 8 일 이상, 9 일 이상, 10 일 이상, 또는 10 일 초과, 예컨대 배양물 중 11 일 초과, 12 일 초과, 13 일 초과, 14 일 초과, 15 일 초과, 배양물 중 16 일 초과, 배양물 중 17 일 초과, 배양물 중 18 일 초과, 배양물 중 19 일 초과, 배양물 중 20 일 초과, 배양물 중 21 일 초과, 배양물 중 22 일 초과, 배양물 중 23 일 초과, 또는 배양물 중 24 일 초과 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함) 에 걸쳐 증식성으로 남아 있는 집단일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 내배엽 세포 집단은 약 2 계대 이상 동안, 약 3 계대 이상 동안, 약 4 계대 이상 동안, 약 5 계대 이상 동안, 약 6 계대 이상 동안, 약 7 계대 이상 동안, 약 8 계대 이상 동안, 약 9 계대 이상 동안, 10 계대 이하 동안, 또는 적어도 약 10 계대 초과 동안 (예를 들어, 11 계대 또는 12 계대) 증식성으로 남아 있는 집단일 수 있다.
일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단은 피더 층 (예를 들어 마트리겔 층 또는 콜라겐 층) 의 부재 하 성장한 경우 증식성으로 남아 있을 수 있는 집단이다. 일부 구현예에서 내배엽 세포 집단은 TesR2 배지 + 30% 마우스 배아 섬유아세포-조건화 배지 (MEF) 에서 성장한 경우 증식성으로 남아 있을 수 있는 집단이다. 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단은 TesR2 배지 + 30% MEF 에서, 그리고 BMP4 의 존재 하에 성장한 경우 증식성으로 남아 있을 수 있는 집단이다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단은 TesR2 배지 + 30% MEF 에서, 그리고 BMP4, FGF2, VEGF 및 EGF 의 존재 하에 성장한 경우 증식성으로 남아 있을 수 있는 집단이다. 일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단은 분류 단계를 포함하지 않는 방법을 사용하여 수득한 경우 증식성으로 남아 있을 수 있는 집단이다.
본 발명의 한 양상은 내배엽 세포 집단, 예를 들어 표현형적으로 안정하고/하거나 증식성인 집단이 내배엽 세포의 뱅크 형태로 극저온 동결될 수 있다. 이러한 뱅크는 향후 치료적 또는 실험적 사용을 위해 해동될 수 있다. 표현형적으로 안정하고 증식성인 내배엽 세포의 뱅크는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 극저온 보관될 수 있다.
일부 구현예에서, 내배엽 세포의 단리된 집단 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 내배엽 세포 집단) 은 추가적인 성분 (예를 들어 세포 찌꺼기) 이 실질적으로 없는 세포 제제가 제공되도록 조작된다. 일부 구현예에서, 세포 제제는 적어도 약 60% (중량, 부피 또는 수), 세포가 생성되거나 배양되는 경우 존재하는 다른 성분을 갖지 않는다. 다양한 양상에서, 세포는 약 75% 이상, 또는 약 85% 이상, 또는 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상 (중량, 부피 또는 수) 순수하다. 일부 양상에서, 백분율은 세포 배양물 또는 집단에서의 내배엽 또는 간세포의 백분율을 지칭한다. 내배엽 또는 간세포의 집단 또는 단리된 집단은 예를 들어 천연 근원으로부터의 정제, 예를 들어 기계적 또는 물리적 또는 화학적 추출, 형광-활성화 세포 분류, 또는 당업자에게 공지된 기타 기술에 의해 수득될 수 있다. 순도는 임의의 적절한 방법, 예컨대 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 또는 시각적 검사에 의해 검정될 수 있다.
일부 구현예에서, 내배엽 세포의 동질 집단은 본원에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다. 내배엽 세포의 동종 집단은 집단의 상당 부분이 내배엽 세포인 세포 집단이다. 상당 부분은 집단에서의 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과의 세포가 내배엽 세포인 것이다.
본 발명의 내배엽 세포 집단은 간세포, 췌장 세포 및 장 세포 중 임의의 하나 이상으로 분화되는 능력을 갖는다. 따라서, 상기 기재된 임의의 특징을 갖는 내배엽 세포 집단은 순수한 조직 또는 세포 유형의 발생에 유리하게 사용될 수 있다.
본 발명의 한 양상은 내배엽 세포 집단, 예를 들어 상기 기재된 집단의 임의의 특징을 갖는 집단은 내배엽 세포의 뱅크 형태로 극저온 보존될 수 있다. 이러한 뱅크는 향후 치료적 또는 실험적 사용을 위해 해동될 수 있다. 내배엽 세포 뱅크는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 극저온 보관될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 유효량의 액티빈 A 및 유효량의 PI3K 알파 저해제를 포함하는 배지에서의 시험관내 세포 배양이며, 이때 상기 세포는 줄기 세포, 내배엽 세포 및/또는 줄기 세포로부터 분화한 세포, 즉 임의의 다양한 내배엽 전구체 세포를 포함한다. 본 발명은 줄기 세포 집단으로부터의 본원에 기재된 임의의 내배엽 세포 집단 형성을 초래하는 경로에서의 임의의 중간체 세포 유형을 고려하고 포함한다.
본 발명은 또한 내배엽 세포, 간세포 및 임의의 중간체를 포함하는 제조 물품을 고려한다 (예를 들어 장치, 의료 장치, 이식 장치, 기구, 세포 배양 용기, 세포 배양 플레이트, 스캐폴딩 (scaffolding)).
본 발명은 내배엽 세포 집단을 기재하고 특징짓기 위해 상기 및 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같은 임의의 매개변수 및 모든 매개변수를 임의의 조합으로 고려한다.
내배엽 세포 사용 방법
본 발명은 다양한 연구 및 치료적 적용에서 사용될 수 있는 내배엽 세포를 제공한다. 예를 들어, 본원에 기재된 집단으로부터의 내배엽 세포는 세포 및 조직 분화에 있어서의 추가 연구에 사용될 수 있다. 내배엽 세포는 또한 새로운 후보 약물을 시험하기 위한 독성 검정에서 사용될 수 있다. 또한, 내배엽 세포 유도체 (간세포, 췌장 세포 및 장 세포 포함) 는 재생 의학 및 치료적 사용을 위해 사용될 수 있다.
내배엽 세포의 관심 세포 유형으로의 분화를 촉진하는 인자의 확인 방법
본 주제의 발명은 연구 적용, 예컨대 발생 신호전달 경로 연구를 위한 내배엽 세포의 준비된 근원을 제공한다. 따라서, 본 발명은 내배엽 세포 집단의 관심 세포 유형, 예를 들어 간세포, 췌장 세포 또는 장 세포로의 분화를 촉진하는 증강제에 대한 인자를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 내배엽 세포 집단, 예를 들어 본 발명에 의해 제공되거나 본 발명에 의해 제공된 방법 중 임의의 하나를 사용하여 수득된 집단을 인자와 접촉시키고, 세포로의 분화에 대해 내배엽 세포 집단을 모니터링하는 것을 포함한다.
내배엽 세포를 이러한 인자와 접촉시키는 것의 영향은 예를 들어 발현된 표현형의 비, 세포 생존력, 및 내배엽 세포의 시험 집단의 유전자 발현에서의 변경을 상기 인자와 접촉되지 않은 내배엽 세포 집단과 비교하여 모니터링함으로써 확인될 수 있다. 이들 세포 집단 사이의 표현형을 모니터링하고 비교하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 세포의 물리적 특징은 현미경을 통해 세포 형태 및 성장을 관찰함으로써 분석될 수 있다. 증가 또는 감소된 수준의 단백질, 예컨대 세포-유형 특이적 효소, 수용체 및 기타 세포 표면 분자는 이러한 분자의 변경 수준을 확인할 수 있는 당업계에 공지된 임의의 기술로 분석될 수 있다. 이러한 기술은 이러한 분자에 대한 항체를 사용하는 면역조직화학, 또는 생화학 분석을 포함한다. 이러한 생화학 분석은 단백질 검정, 효소 검정, 수용체 결합 검정, 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 전기영동 분석, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 로의 분석, 웨스턴 불롯 및 방사면역 검정 (RIA) 을 포함한다. 핵산 분석, 예컨대 노던 블롯, S1 맵핑, 프라이머 연장 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 을 사용하여 이들 분자, 또는 이들 분자를 합성하는 효소를 코딩하는 mRNA 수준을 검사할 수 있다.
내배엽 세포 분화를 저해하는 인자의 확인 방법
발생 신호전달 경로를 연구하는데 있어서, 이는 내배엽 세포 집단이 분화하는 것을 저해하는 인자를 확인하는데 동등하게 중요할 수 있다. 이러한 인자를 확인하기 위한 본 발명에 의해 제공되는 방법은 내배엽 세포 집단, 예를 들어 본 발명에 의해 제공되거나 본 발명에 의해 제공된 방법 중 임의의 하나를 사용하여 수득된 집단을 인자와 접촉시키고, 세포로의 분화에 대해 내배엽 세포 집단을 모니터링하는 것을 포함한다. 내배엽 세포를 이러한 인자와 접촉시키는 것의 영향은 표현형, 세포 생존력 및 내배엽 세포의 시험 집단의 유전자 발현에 있어서의 변경을 상기 인자와 접촉되지 않은 내배엽 세포 집단과 비교하여 모니터링함으로써 확인될 수 있다. 시험 집단의 표현형은 상기 기재한 바와 같이 모니터링될 수 있다.
세포-기반 치료요법
또 다른 양상에서, 본 발명은 내배엽 세포, 예를 들어 본원에 기재된 집단으로부터의, 본원에 기재된 방법에서 수득된 집단으로부터의, 또는 하나 이상의 내배엽 세포 집단(들) 의 뱅크로부터의 내배엽 세포를 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 다양한 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 내배엽 세포의 고도의 동질 집단은 간과 같은 한 부위에서 대상에게 직접 투여될 수 있으며, 내배엽 세포는 간세포로 분화될 수 있다. 세포 치료요법을 위해, 세포를 대상에게 직접 투여하여 불리한 의학적 상태를 치료할 수 있다. 이러한 의학적 상태는 예를 들어 간 섬유증, 경화증, 간 부전, 간암 및 췌장암, 췌장 부전, 장 장애 예컨대 조직 대체 효소 결함, 크론씨병, 염증성 장 증후군 및 장암을 포함할 수 있다.
본 발명의 내배엽 세포는 예를 들어 자가이식편, 동형 이식, 동종이식편 및 이종이식편으로서 투여될 수 있다. 거부 반응 또는 수용자에서의 비-자가 세포 이동과 관련된 기타 사안이 발생한다면, 이식편 거부 반응 분야에서 당업자에게 공지된 이러한 거부 반응을 다루는 방법 및 조성물을 사용할 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 내배엽 세포는 세포가 전달될 해부학상 부위(들) 에 따라, 예를 들어 혈관내, 두개내, 대뇌내, 근육내, 피내, 정맥내, 안구내, 경구, 비강, 국소, 또는 개방형 수술 절차에 의해 환자에게 투여될 수 있다.
본 주제 발명의 세포는 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물 내에서 또는 별개로 환자에게 투여될 수 있다. 본원에서 사용하는 바와 같이, 약학적으로 허용가능한 담체는 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장제 등을 포함한다. 약학적 조성물은 약학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위한 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 제형은 당업자에게 널리 공지되어 있고 쉽게 이용가능한 수많은 자료에 기재되어 있다. 예를 들어, [Remington's Pharmaceutical Science (Martin E. W., Easton Pa., Mack Publishing Company, 19th ed.)] 는 본 주제 발명과 관련하여 사용될 수 있는 제형을 기재하고 있다. 비경구 투여에 적합한 제형은 예를 들어, 산화방지제, 완충액, 세균발육억제제 및 용질 (의도된 수용자의 혈액과 제형이 등장성이 되도록 함) 을 함유할 수 있는 무균 주사용액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 무균 현탁액을 포함한다. 상기 특히 언급한 성분에 추가로, 본 주제 발명의 제형이 제형의 유형 및 의문의 투여 경로를 유념하여 선행 기술에서 통상적인 기타 작용제를 포함할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
간세포 생성 방법
간세포의 고유한 집단, 예를 들어 본원에 기재된 집단 중 임의의 하나는 본원에 기재된 본 발명의 방법을 사용하여 효율적이고 신속한 방식으로 생성될 수 있다. 특히, 간세포 집단은 임의의 성장 인자를 사용하지 않고 생성될 수 있다. 상기 간세포 집단은 간세포의 큰 성숙도를 나타내는 간세포의 표현형 (예를 들어 낮은 AFP 수준, 알부민 수준의 증가 및/또는 A1AT 수준의 증가) 에 의해 다른 간세포 집단과 상이하다.
간세포는 세포의 출발 근원 (예를 들어, 줄기 세포) 을 액티빈 A 및 유효량의 PI3K 알파의 저해제 (예를 들어 화합물 A) 와 접촉시키고, 간세포로 효율적으로 분화할 내배엽 세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 세포를 배양함으로써 수득될 수 있다. 내배엽 세포 집단을 배양하는 방법은 하기에서 기재된다. 이러한 내배엽 세포 집단, 또는 본 발명의 임의의 방법을 사용하여 수득된 내배엽 세포 집단은 하나 이상의 임의 유형의 배양 용기, 예컨대 플라스틱 배양 디쉬 또는 다중웰 플레이트에 플레이팅될 수 있고/있거나 증식 배지 또는 간세포 배지에서 피더 층 상에서 유지될 수 있다. 간세포 배지는 DMEM/F12, GlutaMAXTM (Life Technologies) 또는 L 글루타민, 및 B-27® 보충제 (Life Technologies); William's E (Life Technologies, CM6000) 및 제 1 간세포 유지 보충제 (Life Technologies, CM4000) (덱사메타손 포함 또는 불포함); RPMI, GlutaMAXTM 또는 L 글루타민, 및 B-27® 보충제; DMEM, GlutaMAXTM 또는 L 글루타민, 및 B-27® 보충제; DMEM/F12 및 혈청 (B-27® 결핍); DMEM 및 혈청 (B-27® 결핍); RPMI 및 혈청 (B-27® 결핍); William's E 및 혈청 (B-27® 결핍); DMEM/F12 및 KOSR, DMEM 및 KOSR, RPMI 및 KOSR, 또는 William's E 및 KOSR 일 수 있다.
일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단에서의 상당 부분의 세포는 간세포로 분화된다. 일부 양상에서, 내배엽 세포 집단에서의 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 세포가 간세포로 분화된다. 일부 양상에서, 분화는 내배엽 세포가 간세포 배지 중에서 배양된 후 적어도 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일 또는 그 이상 안에 일어난다. 이론에 의해 구속됨이 없이, 내배엽 세포 집단이 간세포 배지 중에서 더 오래 배양될 수록, 내배엽 집단에서의 더 많은 양의 세포가 간세포로 분화될 것이다. 5 일 이상 동안 내배엽 배지 (예시적 내배엽 배지가 실시예 부분에서 기재되어 있음) 중에서 배양된 내배엽 세포를 사용하여, 간세포의 고도의 동종 집단이 생성된다. 분화는 FGF 와 같은 성장 인자의 부재 하에 일어날 수 있다.
따라서 한 구현예에서, 간세포 집단을 수득하는 방법은 줄기 세포 집단 (예를 들어, 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포) 을 유효량의 액티빈 A 및 유효량의 PI3K 알파의 저해제 (예를 들어 화합물 A) 와 접촉시키고, 간세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재한 바와 같은 내배엽 세포 집단은 약 1, 2, 3, 4 또는 5 일 배양 후에 수득된다. 다른 구현예에서, 내배엽 세포 집단은 내배엽 배지로부터 제거된 후 성장 인자 또는 PI3K 저해제를 갖지 않는 간세포 배지 (실시예에서 기재된 바와 같음) 에서 배양되어, 낮은 AFP 수준 및 증가된 알부민 수준에 의해 나타나는 바와 같이 성숙한 간세포 집단이 생성된다.
실시예에서 나타낸 바와 같이, PI3K 저해제 (예를 들어 PI3K 알파 또는 PI3K 델타 저해제) 가 내배엽 단계에서 사용되지 않는 경우, AFP 수준은 낮다. 반대로, PI3K 저해제 (예를 들어 PI3K 알파 또는 PI3K 델타 저해제) 가 내배엽 단계에서 사용되는 경우, AFP 수준은 더 높을 수 있다 (예를 들어 거의 100-배). 따라서, 당업자는 PI3K 저해제를 사용하여 간세포에 대한 성숙도 수준을 조정할 수 있다.
특정 구현예에서, 간세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 내배엽 세포를 배양하는 것은 HGF, 레티노산, FGF8, FGF1, DMSO, FGF7, FGF10, OSM, 덱사메타손, FGF2, FGF4, BMP2 및 BMP4 중 임의의 하나 이상의 부재 하에 내배엽 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
따라서, 상기 기재된 방법 중 임의의 하나에 의해 수득된 간세포 집단은 또한 본 발명의 특징이다. 유리하게는, 간세포 집단이 수득되고나면, 이는 성장 인자의 부재 하에 배지 중에서 유지될 수 있다. 이는 본원의 방법에 따라 수득된 간세포가 다운스트림 적용에서 사용하기에 특히 유리하게 한다.
간세포의 조성물
본 발명의 간세포는 그의 표현형에 있어서 다른 간세포와 달리 독특하다. 본 발명에 의해 제공된 간세포 집단은 생물학적 마커의 발현과 관련된 다양한 표현형에 의해 기재될 수 있다. 이들 마커는 면역조직화학, 유동 세포 분석법 및 형광 영상 분석을 비제한적으로 포함하는 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 검출될 수 있다. 이러한 기술의 세부사항은 실시예 13 에서 발견될 수 있다. 사용될 수 있는 마커의 비제한적 예는 하기 중 하나 이상을 포함한다:
Figure pat00046
Figure pat00047
Figure pat00048
한 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 간세포는 HepG2 세포에 비해 감소된 AFP 수준을 갖는다. 또 다른 구현예 및 나타낸 실시예에서, 간세포는 초기에 HepG2 세포에서 검출된 AFP 발현 수준과 비슷한 AFP 생성 증가를 나타낸다. 이후 AFP 생성 수준이 감소된다 (하기 도 15 및 실시예 14 참고). AFP 생성 수준의 감소는 간세포의 성숙을 나타낸다. 도 16 에 의해 예시된 한 구현예는, PI3K 저해제가 내배엽 단계에서 사용되는 경우, AFP 수준이 PI3K 알파 선택적 저해제가 첨가되지 않은 대조군에 비해 거의 100 배라는 것을 보여준다. 도 17 에 의해 예시된 또 다른 구현예는, 제 20 일에 간세포에서 유래한 줄기 세포가 간세포로의 형질전환을 나타내는 알부민 및 HNF4a 의 마커의 발현을 보여준다는 것이다. 따라서 일부 구현예에서, 본 발명은 집단에서의 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 또는 약 83% 이상, 약 84% 이상, 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 99% 초과 또는 100% 의 세포가 감소된 AFP 수준을 갖는 간세포 (hepatocytes 또는 hepatocyte cells) 집단 (예를 들어 동종 집단) 을 포함한다. 감소된 AFP 수준은 PI3K 알파 선택적 저해제가 첨가되지 않은 대조군에 비해 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 또는 그 이상의 배수로 더 높을 수 있다. 감소된 AFP 수준은 또한 실시예 및 도면에서 나타낸 바와 같이 백분율 감소에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 성장 인자를 갖지 않는 배지 중 세포를 포함하는 시험관내 세포 배양물이며, 이때 세포는 내배엽 세포, 간세포 및 내배엽 세포로부터 분화된 세포, 즉 임의의 다양한 간세포 전구체 세포를 포함한다. 예를 들어, 배지는 DMEM/F12, GlutaMAXTM (Life Technologies) 또는 L 글루타민, 및 B-27® 보충제 (Life Technologies); William's E (Life Technologies, CM6000) 및 제 1 간세포 유지 보충제 (Life Technologies, CM4000) (덱사메타손 포함 또는 불포함); RPMI, GlutaMAXTM 또는 L 글루타민, 및 B-27® 보충제; DMEM, GlutaMAXTM 또는 L 글루타민, 및 B-27® 보충제; DMEM/F12 및 혈청 (B-27® 결핍); DMEM 및 혈청 (B-27® 결핍); RPMI 및 혈청 (B-27® 결핍); William's E 및 혈청 (B-27® 결핍); DMEM/F12 및 KOSR, DMEM 및 KOSR, RPMI 및 KOSR, 또는 William's E 및 KOSR 일 수 있다.
본 발명은 집단에서의 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 또는 약 83% 이상, 약 84% 이상, 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 99% 초과 또는 100% 의 세포가 본원에 기재된 바와 같은 임의의 하나 이상 (예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 이상) 의 간세포 마커를 발현하는 간세포 (hepatocytes 또는 hepatocyte cells) 집단 (예를 들어 동종 집단) 을 제공한다. 일부 구현예에서, 이러한 간세포 마커의 출현은 배양물 중 약 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일 또는 그 이상 (예를 들어 배양물 중 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일 또는 그 이상) 후에 측정된다.
본 발명은 집단에서의 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 또는 약 83% 이상, 약 84% 이상, 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 99% 초과 또는 100% 의 세포가 알부민을 분비하는 간세포 (hepatocytes 또는 hepatocyte cells) 집단 (예를 들어 동종 집단) 을 제공한다. 분비된 알부민 수준은 PI3K 알파 선택적 저해제가 첨가되지 않은 대조군에 비해 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 또는 그 이상의 배수로 더 높을 수 있다.
본 발명은 집단에서의 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 또는 약 83% 이상, 약 84% 이상, 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 99% 초과 또는 100% 의 세포가 A1AT 를 분비하는 간세포 (hepatocytes 또는 hepatocyte cells) 집단 (예를 들어 동종 집단) 을 제공한다. 분비된 A1AT 수준은 PI3K 알파 선택적 저해제가 첨가되지 않은 대조군에 비해 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 또는 그 이상의 배수로 더 높을 수 있다.
본 발명은 간세포 (hepatocyte cells) (또는 hepatocytes) 의 동종 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 간세포 (hepatocyte cells) (또는 hepatocytes) 의 동종 집단은 집단의 상당 부분이 간세포인 세포 집단일 수 있다. 상당 부분은 집단에서의 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과의 세포가 간세포인 것이다.
일부 구현예에서, 세포 집단 (예를 들어 간세포 집단) 은 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 마커의 상한치와 연결된 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 마커 (예를 들어 상기 표에서의 AFP 및 마커) 의 기재된 하한치를 갖는다. 본 발명은 본원에 인용된 임의의 수치의 하한치 및 상한 백분율 모두를 포함하는 범위를 고려한다. 예를 들어, 한 구현예는 집단에서의 약 50% 내지 약 90% 의 간세포가 감소된 AFP 를 갖는 내배엽 세포 집단을 고려한다. 추가예로서, 일부 구현예에서, 백분율의 상한치는 대략: 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 중 임의의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 마커는 AFP 이다.
일부 구현예에서, CYP 효소 활성은 본원에 기재된 간세포 집단에서 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, CYP 활성은 질량 분석계를 통해 검출된다. 일부 구현예에서, CYP2B6, CYP3A4/5, CYP1A1/2 및 알데히드 옥시다아제 (AO) 중 임의의 하나 이상의 활성이 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, CYP 효소 활성 및/또는 알데히드 옥시다아제 (AO) 활성은 10 μM 리팜피신, 1 mM 페노바르비탈 및 1 μM 3-메틸콜란트렌 (3MC) 에 의해 유도된다.
본 발명은 내배엽 세포 집단으로부터의 본원에 기재된 임의의 간세포 집단 형성을 초래하는 경로에서의 임의의 중간체 세포 유형을 포함하는 배양물을 고려하고 포함한다. 간세포의 단리된 집단 (본원에 개시된 방법에 의해 생성된 것들 포함) 및 임의의 간세포 집단 형성을 초래하는 경로에서의 임의의 중간체 세포 유형이 또한 본 발명에 의해 포함된다.
간세포 사용 방법
본 발명에 의해 제공된 내배엽 세포 집단에서 유래한 간세포에 대해서, 예를 들어 흡수, 분포, 대사, 배설 및 독성 연구 및 치료적 간 재생을 포함하는 다양한 연구 및 임상적 적용에서의 유리한 용도가 발견될 수 있다. 본 발명은 퇴행성 간 질환 또는 간 기능의 유전성 결함을 치료하는데 사용될 수 있는 간세포 집단을 제공한다. 간이 약물 (예를 들어 소분자 약물) 의 청소 및 대사를 제어하기 때문에, 본 발명에 의해 제공된 간세포는 또한 생체내 간 세포에 대한 후보 약물의 영향을 평가하고/하거나 모델링하는데 사용될 수 있다.
세포-기반 치료요법
간염 및 경화증과 같은 간 질환은 개발도상국에서 가장 흔한 사망 원인 중 하나가 되며, 간 이식이 종종 유일하게 이용가능한 치료이다. 그러나, 적합한 기증자 간이 부족하다. 치료적 간 재생을 위한 간세포의 사용은, 간 질환 치료를 위해 기증자 간으로부터 세포를 이용하는 현재 세포 치료요법 절차에 대해 방대한 개선을 부여할 수 있다. 본 발명은 이러한 치료를 위해 개발될 수 있는 간세포 근원을 제공한다.
따라서 특정 양상에서, 본 발명은 임의의 집단으로부터 수득하거나 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 수득한 간세포를 환자에게 투여함으로써, 세포-기반 치료요법을 이를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법을 제공한다.
간세포는 순환계에 충분하게 접근되는 임의의 부위, 통상 복강 내에서 투여될 수 있다. 일부 대사 및 해독작용 기능을 위해, 세포가 담관에 접근되는 것이 유리하다. 따라서, 세포는 간 (예를 들어 만성 간 질환 치료에서) 또는 지라 (예를 들어 급성 간 부전 치료에서) 근처에서 투여될 수 있다. 한 방법에서, 세포는 간동맥 또는 간문맥을 통해, 내재 카테터를 통한 투입에 의해 간 순환에 투여된다. 간문맥 내의 카테터는 세포가 지라 또는 간 또는 이 둘의 조합에 주로 흘러들어가도록 조작될 수 있다.
또 다른 방법에서, 세포는 통상 볼루스를 제자리에 유지시킬 부형제 또는 매트릭스 중에서, 표적 기관 근처의 캐비티 내에 볼루스를 위치시켜 투여될 수 있다. 또 다른 방법에서, 세포는 간 또는 지라의 엽 (lobe) 에 직접적으로 주입될 수 있다.
이러한 치료요법을 위해 적절할 수 있는 인간 상태에는 임의의 원인으로 인한 간 부전, 바이러스성 간염, 약물-유도성 간 손상, 경화증, 유전성 간 부전증 (예컨대 윌슨병, 길베르 증후군, 또는 a1-안티트립신 결함), 간담도계 암종, 자가면역성 간 질환 (예컨대 자가면역성 만성 간염 또는 원발성 담즙성 경화증), 및 손상된 간 기능을 초래하는 임의의 기타 상태가 포함된다. 인간 치료요법을 위해서, 용량에 있어서는 대상의 체중, 고통의 성질 및 중증도, 및 투여된 세포의 복제 능력에 대한 임의의 조절을 고려해야 한다. 의사 또는 관리 임상의는 치료 방식 및 적절한 용량을 결정할 수 있다.
독성에 대해 후보 약물을 스크리닝하는 방법
약물의 대사 및 이의 독성을 연구하는 것은 신규한 약학적 화합물의 개발에 있어서 필요한 단계이다. 신규한 약학제의 비용 효율적 개발은 세포-기반 검정에서 후보 약물을 사전스크리닝하는 능력에 따라 좌우될 수 있다. 간세포는 참조 세포 모델로 고려되는데, 이들이 다수의 약물-대사작용 효소를 발현하고, 효소 유도물질에 반응하고, 생체내 수득될 수 있는 대사 프로파일과 유사한 시험관내 대사 프로파일을 생성시킬 수 있기 때문이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 후보 약물의 독성을 시험하기 위한 시약으로서 사용될 수 있는 간세포 근원을 제공한다. 따라서, 본 발명은 간세포 집단, 예를 들어 본 발명에 의해 제공된 집단 또는 본 발명에 의해 제공된 방법 중 임의의 하나를 사용하여 수득된 집단을 후보 약물과 접촉시키고, 독성에 대해 간세포 집단을 모니터링하는 것을 포함하는, 독성에 대해 후보 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
후보 약학 화합물의 활성 평가는 일반적으로, 본 발명의 간세포를 후보 화합물과 조합하고, 화합물에 기인하는 세포의 형태, 마커 표현형, 또는 대사 활성에 있어서의 임의의 변화 (미처리 세포 또는 불활성 화합물로 처리된 세포와 비교하여) 를 측정한 후, 관찰된 변화를 화합물의 영향과 상호관련시키는 것을 포함한다. 화합물이 간 세포에 대해 약물학적 영향을 갖는 것으로 설계되거나, 다른 곳에서 영향을 갖는 것으로 설계된 화합물이 의도되지 않은 간 부작용을 가질 수 있기 때문에, 스크리닝이 수행될 수 있다. 둘 이상의 약물을 조합으로 (동시에 또는 연속하여 세포와 조합하여) 시험하여, 가능한 약물-약물 상호작용 영향을 검출할 수 있다.
세포독성은 세포 생존력, 생존, 형태, 및 효소의 배양 배지로의 누출에 대한 영향에 의해 우선 먼저 측정될 수 있다. 보다 상세한 분석을 수행하여 화합물이 독성 유발 없이 세포 기능 (예컨대 글루코오스신행합성, 요소형성 및 혈장 단백질 합성) 에 영향을 주는지 여부를 측정한다. 락테이트 탈수소효소 (LDH) 는 간 동질효소 (V 유형) 가 배양 조건 중에서 안정하여 12-24 시간 인큐베이션 후 배양 상청액에서의 재현가능한 측정을 가능하게 하므로, 양호한 마커이다. 미토콘드리아 글루타메이트 옥살로아세테이트 트랜스아미나아제 및 글루타메이트 피루베이트 트랜스아미나아제와 같은 효소의 누출이 또한 사용될 수 있다.
간독성을 평가하기 위한 다른 현재 방법은 알부민, 콜레스테롤 및 리포단백질의 합성 및 분비; 접합된 담즙산 및 빌리루빈의 이송; 요소생성; 시토크롬 p450 수준 및 활성; 글루타티온 수준; 알파-글루타티온 s-트랜스퍼라아제의 방출; ATP, ADP 및 AMP 대사; 세포내 K+ 및 Ca2 + 농도; 핵 기질 단백질 또는 올리고뉴클레오솜의 방출; 및 세포자멸사 (세포 라운딩 (rounding), 크로마틴의 응축, 및 핵 분절화에 의해 나타남) 유도의 측정을 포함한다. DNA 합성은 [3H]-티민 또는 BrdU 혼입으로서 측정될 수 있다. DNA 합성 또는 구조에 대한 약물의 영향은 DNA 합성 또는 수복을 측정하여 결정될 수 있다. 특히 세포 주기에서 계획되지 않은 시간에서의, 또는 세포 복제에 필요한 수준 초과의 [3H]-티민 또는 BrdU 혼입은 약물 효과와 일치한다. 원치않는 효과는 또한, 추가의 정교화를 위해 중기 스프레드 (metaphase spread) 에 의해 측정된 통상적이지 않은 비율의 자매 염색분체 교환을 포함할 수 있다 (예를 들어, A. Vickers (pp 375-410 in In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997 참고). 잠재적 간독성에 대해 후보 약물을 스크리닝하는 추가의 방법이 [Castell et al., In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997)] 에 기재되어 있다.
췌장 선조 세포 생성 방법
췌장 선조 세포의 고유한 집단, 예를 들어, 본원에 기재된 집단 중 임의의 하나는 본원에 기재된 본 발명의 방법을 사용하여 효율적이고 신속한 방식으로 생성될 수 있다. 체장 선조 세포 집단은 췌장 선조 세포의 큰 성숙도를 나타내는 췌장 선조 세포의 표현형 (예를 들어 췌장 계통 마커 유전자의 증가된 발현, 세포 클로스터를 형성하는 증진된 능력, 현탁액에서 성장하는 능력) 에 의해 다른 췌장 선조 세포와 상이하다.
췌장 선조 세포는 세포의 출발 근원 (예를 들어 줄기 세포) 을 액티빈 A 및 유효량의 PI3K 알파의 저해제, 예를 들어 화합물 A 와 접촉시키고, 췌장 선조 세포로 효과적으로 분화할 내배엽 세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 세포를 배양함으로써 수득될 수 있다. 내배엽 세포 집단을 배양하는 방법은 하기에 기재되어 있다. 이러한 내배엽 세포 집단, 또는 본 발명의 임의의 방법을 사용하여 수득된 내배엽 세포 집단은 하나 이상의 임의 유형의 배양 용기, 예컨대 플라스틱 배양 디쉬 또는 다중웰 플레이트에서 플레이트되고/되거나 증식 배지 중 피더 층 상에서 유지될 수 있다.
췌장 선조 세포는 본원에 기재된 내배엽 세포 집단을 1 일 이상, 2 일 이상, 3 일 이상, 또는 3 일 초과 동안 50 ng/ml FGF10, 20 ng/ml FGF7, 100 ng/ml 노긴 (Noggin) 및 헤지호그 (hedgehog) 저해제가 보충된 배지 중에서 배양한 후 상기 세포를 1 일 이상, 2 일 이상, 3 일 이상, 4 일 이상, 또는 4 일 초과 동안 2 uM 레티노산 (Sigma) 이 추가로 보충된 동일한 칵테일 중에서 배양함으로써 수득될 수 있다. 50 ng/ml FGF10, 20 ng/ml FGF7, 100 ng/ml 노긴, 헤지호그 저해제 및 2 uM 레티노산의 존재 하에 배양물 중에서 4 일 이상, 5 일 이상, 6 일 이상, 7 일 이상, 8 일 이상, 9 일 이상, 10 일 이상, 또는 10 일 초과 후, 세포를 1 일 이상, 2 일 이상, 3 일 이상, 또는 3 일 초과 동안 1 uM 노치 (Notch) 저해제 DAPT, 10 mM 니코틴아미드 및 50 ng/ml 엑센딘 (Exendin) 4 와 함께 배양할 수 있다. 성숙을 위해, 세포를 4 일 이상의 추가 일수 동안, 5 일 이상의 추가 일수 동안, 6 일 이상의 추가 일수 동안, 7 일 이상의 추가 일수 동안, 또는 7 일 초과의 추가 일수 동안 50 ng/ml 엑센딘 4, 50 ng/ml EGF 및 50 ng/ml IGF1 중에서 배양할 수 있다. 만능 줄기 세포의 췌장 세포로의 분화가 다양한 기본 배지 중에서 실행될 수 있다는 것이 이해된다.
특정 구현예에서, 췌장 선조 세포 수득 방법은 (-)- 인돌락탐 V, KAAD 시클로파민, 베타셀루린, HGF, 폴리스타틴, SU5402 (FGFR 특이적 티로신 키나아제 저해제), FGF4, FGF2, BMP4, 또는 이의 임의의 조합과 함께 내배엽 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단에서의 상당 부분의 세포는 췌장 선조 세포로 분화된다. 일부 양상에서, 내배엽 세포 집단에서의 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 세포가 췌장 선조 세포로 분화된다. 일부 양상에서, 분화는 내배엽 세포가 상기 기재된 방법에 따라 배양되고 적어도 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일 또는 그 이상 후에 일어난다. 본원에 기재된 방법에 따라 배양된 내배엽 세포를 사용하여 췌장 선조 세포의 고도의 동종 집단을 생성시킬 수 있다.
다른 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 따라 배양된 내배엽 세포 집단은 성숙한 췌장 선조 세포 집단을 생성시킬 수 있다. 실시예에서 나타내고 하기에서 더 상세히 기재한 바와 같이, PI3K 저해제 (예를 들어 PI3K 알파 또는 PI3K 델타 저해제 예컨대 화합물 A) 가 내배엽 단계에서 사용되는 경우, PI3K 알파 선택적 저해제가 첨가되지 않은 대조군에 비해, 생성된 췌장 선조 세포에서의 췌장 계통 마커 유전자의 발현은 더 높을 수 있고, 세포에 의해 형성된 클러스터는 더 크고 더 많을 수 있으며, 세포는 현탁액 중에서 보다 생존가능할 수 있다. 따라서, 당업자는 PI3K 저해제를 사용함으로써 췌장 선조 세포에 대한 성숙도 수준을 조정할 수 있다.
본원에 기재된 방법에 의해 수득된 췌장 선조 세포는 췌장 외분비 세포로 추가로 분화될 수 있다. 특정 구현예에서, 췌장 선조 세포는 글루카곤-유사-펩티드 1 (GLP1), 덱사메타손, 도르소모르핀, 또는 이의 임의의 조합의 존재 하에 배양되어 췌장 외분비 세포를 형성할 수 있다. 특정 구현예에서, 췌장 선조 세포는 [Delaspre, et al. (2013). "Directed pancreatic acinar differentiation of mouse embryonic stem cells via embryonic signaling molecules and exocrine transcription factors." PLoS One, 8(1), e54243] 에서 기재된 바와 같이 배양되어 췌장 외분비 세포를 형성할 수 있다. 특정 구현예에서, 췌장 선조 세포는 [Shirasawa, et al. (2011). "A novel stepwise differentiation of functional pancreatic exocrine cells from embryonic stem cells." Stem Cells Dev, 20(6), 1071-1078] 에서 기재된 바와 같이 배양되어 췌장 외분비 세포 집단을 형성할 수 있다.
본원에 기재된 방법에 의해 수득된 췌장 선조 세포는 췌장 췌관 세포로 추가 분화될 수 있다. 특정 구현예에서, 췌장 선조 세포는 EGF, FGF10, PDGF-AA, 또는 이의 임의의 조합의 존재 하에 배양되어 췌장 췌관 세포 집단을 형성할 수 있다. 특정 구현예에서, 췌장 선조 세포는 [Rhodes, et al. (2012). "Induction of mouse pancreatic ductal differentiation, an in vitro assay." In Vitro Cell Dev Biol Anim, 48(10), 641-649] 에서 기재된 바와 같이 배양되어 췌장 췌관 세포 집단을 형성할 수 있다.
따라서, 상기 기재된 방법 중 임의의 하나에 의해 수득된 췌장 선조 세포 집단, 췌장 외분비 세포, 및/또는 췌장 췌관 세포 집단은 또한 본 발명의 특징이다.
췌장 선조 세포의 조성물
본 발명의 췌장 선조 세포는 그 표현형에 있어서 다른 췌장 선조 세포와 상이하다. 본 발명에 의해 제공된 췌장 선조 세포 집단은 생물학적 마커의 발현과 관련된 다양한 표현형에 의해 기재될 수 있다. 이러한 마커는 면역조직화학, 유동세포분석법 및 형광 영상 분석을 비제한적으로 포함하는 당업계에서 공지된 표준 방법에 의해 검출될 수 있다. 사용될 수 있는 마커의 비제한적 예는 Pdx1, ARX, GCG, GLIS3, HNF1A, HNF1B, HNF4a, INS, KRT19, MNX1, NEUROD1, NKX202, ONECUT1, RFX6, SERPINA3, SST, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다.
따라서 일부 구현예에서, 본 발명은 집단에서의 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 81% 이상, 약 82% 이상, 또는 약 83% 이상, 약 84% 이상, 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 99% 초과 또는 100% 의 세포가 Pdx1, ARX, GCG, GLIS3, HNF1A, HNF1B, HNF4a, INS, KRT19, MNX1, NEUROD1, NKX202, ONECUT1, RFX6, SERPINA3, SST, C-펩티드, 또는 이의 임의의 조합을 발현하는 췌장 선조 세포의 집단 (예를 들어 동종 집단) 을 포함한다. Pdx1, ARX, GCG, GLIS3, HNF1A, HNF1B, HNF4a, INS, KRT19, MNX1, NEUROD1, NKX202, ONECUT1, RFX6, SERPINA3, SST, C-펩티드, 또는 이의 조합의 발현 수준은 PI3K 알파 선택적 저해제가 첨가되지 않은 대조군에 비해 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 또는 그 이상의 배수로 더 높다. Pdx1, ARX, GCG, GLIS3, HNF1A, HNF1B, HNF4a, INS, KRT19, MNX1, NEUROD1, NKX202, ONECUT1, RFX6, SERPINA3, SST, C-펩티드, 또는 이의 임의의 조합의 발현 수준은 분화 7 일 후, 8 일 후, 9 일 후, 10 일 후, 11 일 후, 12 일 후, 또는 12 일 초과 후 (예를 들어 13, 14, 15, 16, 17, 18 일 초과) 에 검출될 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 췌장 선조 세포 집단은 세포 형태와 관련된 다양한 표현형, 예를 들어 3 차원 세포 클러스터의 형성에 의해 기재될 수 있다. 특히, PI3K 저해제 (예를 들어 PI3K 알파 또는 PI3K 델타 저해제 예컨대 화합물 A) 가 내배엽 단계에서 사용되는 경우, PI3K 알파 선택적 저해제 (예를 들어 화합물 A) 가 첨가되지 않은 대조군에 비해 생성된 췌장 선조에 의해 형성된 3 차원 클러스터가 더 크고 더 많을 수 있다. 이러한 클러스터의 형성은 시각적으로 모니터링될 수 있다 (예를 들어 현미경 사용). 특정 구현예에서, 제공된 췌장 선조 세포는 PI3K 알파 선택적 저해제가 첨가되지 않은 대조군에 비해 제 3 일, 제 4 일, 제 5 일, 제 6 일, 제 7 일, 제 8 일, 제 9 일, 제 10 일, 제 11 일, 제 12 일, 제 13 일, 제 14 일, 제 15 일, 제 16 일, 제 17 일, 제 18 일, 제 19 일, 제 20 일, 또는 제 21 일 후에 더 크고 더 많은 세포 클러스터를 형성할 수 있다.
또한, 본 발명의 췌장 선조 세포는 인슐린, 글루카곤 및 C 펩티드를 발현할 수 있고, 현탁액 중에서 성장할 수 있고, 현탁액 중에서 더 길게 생존가능하다 (PI3K 알파 선택적 저해제 (예를 들어 화합물 A) 가 첨가되지 않은 경우에 비해). 일부 구현예에서, 본원에 제공된 췌장 선조 세포는 현탁액 중에서 1 일 후, 2 일 후, 3 일 후, 4 일 후, 5 일 후, 6 일 후, 7 일 후, 8 일 후, 9 일 후, 10 일 후, 11 일 후, 12 일 후, 13 일 후, 14 일 후, 15 일 후, 16 일 후, 17 일 후, 18 일 후, 19 일 후, 20 일 후 또는 20 일 초과 후 생존가능하게 남아 있다.
본 발명은 내배엽 세포 집단으로부터 본원에 기재된 임의의 췌장 선조 세포 집단 형성을 초래하는 경로에서의 임의의 중간체 세포 유형을 포함하는 배양물을 고려하고 포함한다. 췌장 선조 세포의 단리된 집단 (본원에 개시된 방법에 의해 생성된 것들 포함) 및 임의의 췌장 선조 세포 집단 형성을 초래하는 경로에서의 임의의 중간체 세포 유형이 또한 본 발명에 의해 포함된다.
췌장 선조 세포 사용 방법
본 발명에 의해 제공된 내배엽 세포 집단에서 유래한 췌장 선조 세포, 췌장 췌관 세포, 췌장 내분비 세포 및 췌장 외분비 세포는 예를 들어 세포-기반 치료요법을 포함하는 다양한 연구 및 임상적 적용에서 유리하게 사용될 수 있다. 본 발명은 췌장 질환, 예를 들어 당뇨병, 또는 췌장 기능의 유전성 결함, 예를 들어 낭포성 섬유증 또는 슈와크만-다이아몬드 (Schwachman-Diamond) 증후군과 연관된 외분비 췌장 저하증을 치료하는데 사용될 수 있는 췌장 선조 세포 집단을 제공한다.
세포-기반 치료요법
만성 췌장 질환 및 장애, 예컨대 췌장염 및 당뇨병은 개발 도상국에서 점점 더 우세해지고 있다. 췌장 이식이 삶의 질 및 양 모두를 상당히 향상시킬 수 있으나, 기증자 기관 부족이 주요 과제로 남아 있다. 치료상 췌장 재생을 위한 췌장 선조 세포의 사용은, 췌장 질환 치료를 위해 기증자 췌장으로부터 세포를 이용하는 현재 세포 치료요법 절차에 대해 방대한 개선을 부여할 수 있다. 본 발명은 이러한 치료를 위해 개발될 수 있는 췌장 선조 세포 근원을 제공한다.
따라서 특정 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 수득된 췌장 선조 세포 또는 집단을 포함하는 집단을 환자에게 투여함으로서, 세포-기반 치료요법을 이를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법을 제공한다.
췌장 선조 세포는 순환계에 충분하게 접근되는 임의의 부위, 통상 복강 내에서 투여될 수 있다. 따라서, 세포는 췌장 (예를 들어 만성 췌장 질환 치료에서) 근처에서 투여될 수 있다. 한 방법에서, 세포는 간의 간문맥을 통해, 내재 카테터를 통한 투입에 의해, 또는 복부의 소규모 절개를 통해 투여될 수 있다. 간문맥 내의 카테터는 세포가 간에 주로 흘러들어가도록 조작될 수 있다.
또 다른 방법에서, 세포는 통상 볼루스를 제자리에 유지시킬 부형제 또는 매트릭스 중에서, 표적 기관 근처의 캐비티 내에 볼루스를 위치시켜 투여될 수 있다. 또 다른 방법에서, 세포는 췌장에 직접적으로 주입될 수 있다.
이러한 치료요법을 위해 적절할 수 있는 인간 상태에는 임의의 원인, 예컨대 췌장에 대한 손상, 외분비 췌장 저하증 (예를 들어 낭포성 섬유증, 슈와크만-다이아몬드 증후군, 만성 췌장염 또는 췌장관의 차단으로 인한), 췌장 선암, 섬 세포 신경내분비 종양, 자가면역성 췌장 질환 (예컨대 자가면역성 췌장염 또는 제 I 형 당뇨병), 제 II 형 당뇨병, 및 손상된 췌장 기능을 초래하는 임의의 다른 상태가 포함된다. 인간 치료요법을 위해서, 용량에 있어서는 대상의 체중, 고통의 성질 및 중증도, 및 투여된 세포의 복제 능력에 대한 임의의 조절을 고려해야 한다. 의사 또는 관리 임상의는 치료 방식 및 적절한 용량을 결정할 수 있다.
독성에 대해 후보 약물을 스크리닝하는 방법
상기 나타낸 바와 같이, 약물의 대사 및 이의 독성을 연구하는 것은 신규한 약학적 화합물의 개발에 있어서 필요한 단계이다. 신규한 약학제의 비용 효율적 개발은 세포-기반 검정에서 후보 약물을 사전스크리닝하는 능력에 따라 좌우될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 후보 약물의 독성을 시험하기 위한 시약으로서 사용될 수 있는 췌장 선조 세포 및/또는 췌장 세포의 근원을 제공한다. 따라서, 본 발명은 췌장 선조 세포 및/또는 췌장 세포 집단, 예를 들어 본 발명에 의해 제공된 집단 또는 본 발명에 의해 제공된 방법 중 임의의 하나를 사용하여 수득된 집단을 후보 약물과 접촉시키고, 독성에 대해 췌장 선조 세포 및/또는 췌장 세포 집단을 모니터링하는 것을 포함하는, 독성에 대해 후보 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
후보 약학 화합물의 활성 평가는 일반적으로, 본 발명의 췌장 선조 세포 및/또는 췌장 세포를 후보 화합물과 조합하고, 화합물에 기인하는 세포의 형태, 마커 표현형, 또는 대사 활성에 있어서의 임의의 변화 (미처리 세포 또는 불활성 화합물로 처리된 세포와 비교하여) 를 측정한 후, 관찰된 변화를 화합물의 영향과 상호관련시키는 것을 포함한다. 화합물이 췌장 선조 세포 및/또는 췌장 세포에 대해 약물학적 영향을 갖는 것으로 설계되거나, 다른 곳에서 영향을 갖는 것으로 설계된 화합물이 의도되지 않은 간 부작용을 가질 수 있기 때문에, 스크리닝이 수행될 수 있다. 둘 이상의 약물을 조합으로 (동시에 또는 연속하여 세포와 조합하여) 시험하여, 가능한 약물-약물 상호작용 영향을 검출할 수 있다.
세포독성은 세포 생존력, 생존, 형태, 및 효소의 배양 배지로의 누출에 대한 영향에 의해 우선 먼저 측정될 수 있다. 보다 상세한 분석을 수행하여 화합물이 독성 유발 없이 세포 기능 (예컨대 글루코오스신행합성, 요소형성 및 혈장 단백질 합성) 에 영향을 주는지 여부를 측정한다.
독성을 평가하기 위한 다른 현재 방법은 ATP, ADP 및 AMP 대사; 세포내 K+ 및 Ca2 + 농도; 핵 기질 단백질 또는 올리고뉴클레오솜의 방출; 및 세포자멸사 (세포 라운딩, 크로마틴의 응축, 및 핵 분절화에 의해 나타남) 유도를 포함한다. DNA 합성은 [3H]-티민 또는 BrdU 혼입으로서 측정될 수 있다. DNA 합성 또는 구조에 대한 약물의 영향은 DNA 합성 또는 수복을 측정하여 결정될 수 있다. 특히 세포 주기에서 계획되지 않은 시간에서의, 또는 세포 복제에 필요한 수준 초과의 [3H]-티민 또는 BrdU 혼입은 약물 효과와 일치한다. 원치않는 효과는 또한, 추가의 정교화를 위해 중기 스프레드에 의해 측정된 통상적이지 않은 비율의 자매 염색분체 교환을 포함할 수 있다 (예를 들어, A. Vickers (pp 375-410 in In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997 참고). 잠재적 독성에 대해 후보 약물을 스크리닝하는 추가의 방법이 [Castell et al., In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997)] 에 기재되어 있다.
폐 세포, 갑상선 세포 및 기도 선조 세포의 생성 방법
폐 세포, 갑상선 세포 및/또는 기도 선조 세포 집단은 본원에 기재된 본 발명의 방법을 사용하여 효율적이고 신속한 방식으로 생성될 수 있다. 폐 세포, 갑상선 세포 및/또는 기도 선조 세포는 세포의 출발 근원 (예를 들어 줄기 세포) 을 액티빈 A 및 유효량의 PI3K 알파의 저해제, 예를 들어 화합물 A 와 접촉시키고, 폐 세포, 갑상선 세포 또는 기도 선조 세포로 효율적으로 분화될 내배엽 세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 세포를 배양함으로써 수득될 수 있다. 내배엽 세포 집단을 배양하는 방법은 하기에서 기재된다. 이러한 내배엽 세포 집단, 또는 본 발명의 임의의 방법을 사용하여 수득된 내배엽 세포 집단은 하나 이상의 임의 유형의 배양 용기, 예컨대 플라스틱 배양 디쉬 또는 다중웰 플레이트에 플레이팅될 수 있고/있거나 증식 배지에서 피더 층 상에서 유지될 수 있다.
폐 세포 및/또는 갑상선 세포는 본원에서 기재된 내배엽 세포 집단을 100 ng/ml 노긴 및 10 mM SB431542 (TGF베타 저해제) 가 보충된 기본 배지 중에서 배양함으로써 수득될 수 있다. 24 시간 후, 배지를 Nkx2-1 유도 배지: 100 ng/ml mWnt3a, 10 ng/ml mKGF, 10 ng/ml hFGF10, 10 ng/ml mBMP4, 20 ng/ml hEGF, 500 ng/ml mFGF2 및 100 ng/ml 헤파린 나트륨 염 (Sigma) 이 보충된 cSFDM 으로 교체할 수 있다. 이후 세포를 mFGF2 (500 ng/ml), hFGF10 (100 ng/ml) 및 100 ng/ml 헤파린 나트륨 염 (Sigma) 이 보충된 cSFDM 중에서 7 일 동안 배양할 수 있다. 제 22 일에, 세포를 폐 성숙 배지 : Ham's F12 배지 +15 mM HEPES (pH 7.4) +0.8 mM CaCl2 + 0.25% BSA + 5 mg/ml 인슐린 + 5 mg/ml 트랜스페린 + 5 ng/ml Na 셀레나이트 + 50 nM 덱사메타손 + 0.1 mM 8-Br-cAMP + 0.1 mM IBMX + 10 ng/ml KGF 중에서 배양할 수 있다. 일부 구현예에서, 내배엽 세포를 [Longmire, et al. (2012). "Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells." Cell Stem Cell, 10(4), 398-411] 에서 기재된 바와 같이 배양할 수 있다.
대안적으로, 폐 세포 및/또는 기도 선조 세포를 생성시키기 위해, 분화의 제 3 일에서, 본원에 기재된 내배엽 세포 집단을 20 ng/ml BMP4 또는 4 uM 도르소모르핀 (BMP 저해제) 를 포함하거나 포함하지 않는 500 nM A-83-01 (TGF 베타 저해제) 에 2 일, 3 일, 4 일, 또는 4 일 초과까지 노출시킬 수 있다. 세포를 이후 2 일 이상, 3 일 이상, 또는 3 일 초과 동안 10 ng/ml BMP4, 20 ng/ml FGF2 + 10 nM GSK3iXV 에 노출시킬 수 있다. 기도 선조 세포를 수득하기 위해서, 세포를 20 ng/ml BMP7, 20 ng/ml FGF7, 100 nM IWR-1 (WNT 안타고니스트) 및 1 mM PD98059 에 1 일 이상, 2 일 이상, 또는 2 일 초과 동안 노출시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 내배엽 세포 집단은 [Mou, et al. (2012). "Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell Stem Cell, 10(4), 385-397] 에서 기재된 바와 같이 배양될 수 있다.
일부 구현예에서, 내배엽 세포 집단에서의 상당 부분의 세포가 폐, 갑상선 및/또는 기도 선조 세포로 분화된다. 일부 양상에서, 내배엽 세포 집단에서 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 세포가 폐, 갑상선 및/또는 기도 선조 세포로 분화된다. 일부 양상에서, 분화는 내배엽 세포가 본원에 기재된 방법에 따라 배양된 후 적어도 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 14 일, 15 일, 16 일, 17 일, 18 일, 19 일, 20 일 또는 그 이상 안에 일어난다.
폐 세포, 갑상선 세포 및 기도 선조 세포의 용도
본 발명에 의해 제공된 내배엽 세포 집단에서 유래한 폐 세포, 갑상선 세포 및 기도 선조 세포는 예를 들어 세포-기반 치료요법을 포함하는 다양한 연구 및 임상적 적용에서 유리하게 사용될 수 있다. 본 발명은 폐 손상, 호흡기 질환, 예를 들어 급성 호흡 곤란 증후군, 폐기종, 중피종 등, 및 갑상선 질환, 예를 들어 갑상선암, 하시모토 만성 림프구성 갑상선염 등의 치료에 사용될 수 있는 폐 세포, 갑상선 세포 및 기도 선조 세포 집단을 제공한다.
세포-기반 치료요법
폐 이식이 폐 손상 또는 폐 질환을 갖는 환자에 대해 삶의 질 및 양 모두를 상당히 향상시킬 수 있으나, 기증자 기관 부족이 주요 과제로 남아 있다. 치료상 폐 또는 갑상선 재생을 위한 폐 세포, 갑상선 세포 또는 기도 선조 세포의 사용은, 폐 또는 갑상선 질환 치료를 위한 현재 치료요법에 대해 방대한 개선을 부여할 수 있다. 본 발명은 이러한 치료를 위해 개발될 수 있는 폐 세포, 갑상선 세포 또는 기도 선조 세포의 근원을 제공한다.
따라서 특정 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 수득된 집단 또는 임의의 집단으로부터 수득된 폐 세포, 갑상선 세포 또는 기도 선조 세포를 포함하는 집단을 환자에게 투여함으로써, 세포-기반 치료요법을 이를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법을 제공한다.
폐 세포, 갑상선 세포 또는 기도 선조 세포는 순환계에 충분하게 접근되는 임의의 부위에서 투여될 수 있다. 따라서, 세포는 폐에서의 또는 폐 근처에서의 동맥에서 (예를 들어 폐 질환 치료에서) 또는 목에서의 또는 목 근처에서의 동맥에서 (예를 들어 갑상선 질환 치료에서) 투여될 수 있다. 한 방법에서, 세포는 흡입을 통해, 내재 카테터를 통한 투입에 의해, 또는 폐 또는 갑상선의 소규모 절개를 통해 투여될 수 있다.
또 다른 방법에서, 세포는 통상 볼루스를 제자리에 유지시킬 부형제 또는 매트릭스 중에서, 표적 기관 근처의 캐비티 내에 볼루스를 위치시켜 투여될 수 있다. 또 다른 방법에서, 세포는 폐 또는 갑상선에 직접적으로 주입될 수 있다.
이러한 치료요법을 위해 적절할 수 있는 인간 상태에는 임의의 원인, 예컨대 폐에 대한 손상 (예컨대 섬유성 손상), 폐암 (예컨대 중피종 및 기타의 것들), 폐기종, 천식, 낭포성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 간질성 폐 질환, 갑상선 손상, 갑상선암, 크론씨병, 그레이브병, 하시모토 만성 림프구성 갑상선염 및 기타의 것들이 포함된다. 인간 치료요법을 위해서, 용량에 있어서는 대상의 체중, 고통의 성질 및 중증도, 및 투여된 세포의 복제 능력에 대한 임의의 조절을 고려해야 한다. 의사 또는 관리 임상의는 치료 방식 및 적절한 용량을 결정할 수 있다.
장 세포의 용도
본 발명에 의해 제공된 내배엽 세포 집단에서 유래한 장 세포는 예를 들어 세포-기반 치료요법을 포함하는 다양한 연구 및 임상적 적용에서 유리하게 사용될 수 있다. 본 발명은 염증성 장 질환 (IBD), 셀리악병, 크론씨병, 궤양, 궤양성 대장염, 장암 등을 치료하는데 사용될 수 있는 장 세포 집단을 제공한다.
세포-기반 치료요법
치료상 재생을 위한 장 세포의 사용은, 장 질환 치료를 위한 현재 치료요법 절차에 대해 방대한 개선을 부여할 수 있다. 본 발명은 이러한 치료를 위해 개발될 수 있는 장 세포 근원을 제공한다.
따라서 특정 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 방법을 사용하여 수득된 집단 또는 임의의 집단으로부터 수득된 장 세포를 환자에게 투여함으로서, 세포-기반 치료요법을 이를 필요로 하는 환자에게 제공하는 방법을 제공한다.
장 세포는 순환계에 충분하게 접근되는 임의의 부위에서 투여될 수 있다. 따라서, 세포는 복부에서의 또는 복부 근처에서의 동맥에서 투여될 수 있다. 한 방법에서, 세포는 내재 카테터를 통한 투입에 의해, 또는 복부의 소규모 절개를 통해 투여될 수 있다. 또 다른 방법에서, 세포는 통상 볼루스를 제자리에 유지시킬 부형제 또는 매트릭스 중에서, 표적 기관 근처의 캐비티 내에 볼루스를 위치시켜 투여될 수 있다. 또 다른 방법에서, 세포는 복부에 직접적으로 주입될 수 있다.
이러한 치료요법을 위해 적절할 수 있는 인간 상태에는 임의의 원인, 예컨대 장 손상, 장암, 염증성 장 증후군, 셀리악병, 크론씨병, 창자 손상, 궤양, 혈관이형성증, 장 흡수 또는 분비의 장애, 및 기타의 것들이 포함된다. 인간 치료요법을 위해서, 용량에 있어서는 대상의 체중, 고통의 성질 및 중증도, 및 투여된 세포의 복제 능력에 대한 임의의 조절을 고려해야 한다. 의사 또는 관리 임상의는 치료 방식 및 적절한 용량을 결정할 수 있다.
하기 실시예를 설명의 목적으로 제공하나 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지는 않는다.
실시예
실시예 1: 내배엽 분화를 위한 방법 및 재료
내배엽 마커
다양한 세포-유형 특이적 마커를 사용하여, 하기 기재한 유세포 분석, 형광 영상화 및 면역검정 실험에서 줄기 세포의 내배엽 세포로의 분화를 모니터링하였다. 내배엽 전환을 검출하기 위해서, hESC-유래 세포 샘플을 SOX17, FoxA2 및 CXCR4 단백질 발현을 위해 염색하였다. SOX17, FoxA2 및 CXCR4 는 내배엽 세포에 의해 발현되나 줄기 세포에 의해서는 발현되지 않는 단백질이다. 줄기 세포를 검출하기 위해, 세포 샘플을 OCT4, 줄기 세포에 의해 발현되나 내배엽 세포에 의해서는 발현되지 않는 단백질의 발현을 위해 염색하였다.
hESC 및 마트리겔을 사용하는 내배엽 분화 프로토콜
미분화된 인간 배아 줄기 세포 (hES) 를 TesRTM2 배지 (STEMCELLTM Technologies #05860) 중 적격 마트리겔 (BD, #354277) 상에서 40,000 세포/cm2 의 밀도로 유지시켰다. 배양물을 주 2 회 수동으로 계대하였다. 내배엽 분화에 대해 준비하기 위해서, hESC 세포를 TesRTM2 배지에 밤새 계대하였다. 다음날, TesRTM2 배지를 기본 배지 (B27 (Invitrogen, #17504-044) 이 보충된 DMEM/F12 + Glutamax (Invitrogen, #10565)) 로 교체하였다. 이러한 방법에 대해 줄기 세포를 수득하는 과정에서 인간 배아는 파괴되지 않았다. 또한, 인간 배아의 사전 파괴에 의해 다수의 줄기 세포가 수득되지 않는다.
다르게 나타내지 않는 한, 기본 배지에 100 μg/ml 인간 액티빈 A (Peprotech, #120-14) 를 보충하였다. 나타내는 경우, 기본 배지에 또한 유효량의, 예를 들어, 성장 인자 예컨대 50 μg/ml 인간 Wnt3a (R&D, #5036-WN-010), 동형-특이적 P13K 저해제 또는 mTOR 저해제를 보충하였다. 3 일 처리 후, hES-유래 세포를 유세포 분석기, 영상화, 또는 AlphaLisa 를 통해 수확하고, 표지하고, 분석하였다.
hESC 및 현탁액을 사용하는 내배엽 분화 프로토콜
현탁액 중 배양된 hESC 를 사용하여 내배엽 분화 프로토콜을 수행한다. 적격 마트리겔 상에서 성장한 융합성 미분화 hESC 를 세포가 플레이트로부터 분리될 때까지 TrypLE (Life Technologies, #12563-029) 와 함께 인큐베이션함으로써 분리시킨다. 이후 세포를 DMEM:F12 (50:50) 로 희석하고, 원뿔형 튜브에서 수집하고, 300 x g 에서 8 분 동안 원심분리한다. 상청액을 흡입한 후, 펠렛화된 세포를 단일 세포 현탁액에 모두 재현탁하고, 혈구계산기를 사용하여 계수한다. 20 ml 의 4 x 104 세포/mL 을 10 μM ROCK 저해제 Y-26732 및 Pen/Strep 용액이 보충된 TeSR2 배지 중 T75 Corning Low Attachment 플라스크에서 플레이팅한다. 현탁된 세포를 수집하고, 이를 원뿔형 튜브에 가라앉히고, 기존 배지를 부드럽게 피펫으로 빼냄으로써 배지를 하루걸러 교환한다. 세포는 구면 중심 바깥쪽으로부터 확장되는 클러스터를 형성하기 시작한다. 분명한 구면 가장자리를 갖는 타이트한 클러스터는 다능성의 유지를 나타내는 한편 불분명한 경계부를 갖는 단일 세포 또는 클러스터는 통상 자연 분화 및/또는 세포 사멸을 나타낸다. 각 플라스크에 배지를 수집하고 세포 클러스터를 가라앉혀, 세포를 3-4 일 주기로 계대한다. 기존 배지를 부드럽게 피펫으로 빼내고, 상기 기재한 바와 같이 TrypLE 를 사용하여 클러스터를 단일 세포로 분리시킨다. 이후, 분리된 세포를 상기 기재한 바와 같이, 즉, 10 μM ROCK 저해제 Y-26732 및 Pen/Strep 용액이 보충된 TeSR2 배지 중 T75 Corning Low Attachment 플라스크 당 20 ml 의 4 x 104 세포/mL 를 플레이팅한다.
내배엽 분화를 준비하기 위해, 현탁액 중 배양한 hESC 세포를 TesRTM2 배지 중에서 밤새 플레이트에 계대한다. 다음날, TesRTM2 배지를 기본 배지 (B27 (Invitrogen, #17504-044) 가 보충된 DMEM/F12 + Glutamax (Invitrogen, #10565)) 로 교체한다. 상기 기재한 바와 같이 세포가 내배엽으로 분화된다.
다르게 나타내지 않는 한, 기본 배지에 100 μg/ml 인간 액티빈 A (Peprotech, #120-14) 를 보충하였다. 나타내는 경우, 기본 배지에 또한 유효량의, 예를 들어 성장 인자 예컨대 50 μg/ml 인간 Wnt3a (R&D, #5036-WN-010), 동형-특이적 P13K 저해제 또는 mTOR 저해제를 보충하였다. 3 일 처리 후, hES-유래 세포를 유세포 분석기, 영상화 또는 AlphaLisa 를 통해 수확하고, 표지하고, 분석하였다.
비-배아 줄기 세포 및 마트리겔을 사용하는 내배엽 분화 프로토콜
비-배아 줄기 세포 (성체 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포) 를 TesRTM2 배지 (STEMCELLTM Technologies #05860) 중 적격 마트리겔 (BD, #354277) 상에서 40,000 세포/cm2 의 밀도로 유지시킨다. 배양물을 주 2 회 수동으로 계대한다. 내배엽 분화를 준비하기 위해, 성체 줄기 세포 또는 iPS 세포를 TesRTM2 배지에 밤새 계대한다. 다음날, TesRTM2 배지를 기본 배지 (B27 (Invitrogen, #17504-044) 이 보충된 DMEM/F12 + Glutamax (Invitrogen, #10565)) 로 교체한다. iPS 세포를 배양하기 위한 또 다른 옵션은 TesR2 및 마우스 배아 섬유아세포 (MEF) 조건화 배지 (R&D Systems, #AR005) 의 믹스를 사용하는 것이다. 이후 세포가 상기 기재한 바와 같이 내배엽으로 분화된다.
비-배아 줄기 세포 및 현탁액을 사용하는 내배엽 분화
이 실시예는 현탁액 중 배양된 비-배아 줄기 세포 (성체 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포) 를 사용하는 내배엽 분화 프로토콜을 기술한다. 적격 마트리겔 상에서 성장한 융합성 미분화 성체 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포를 세포가 플레이트에서 분리될 때까지 TrypLE (Life Technologies, #12563-029) 와 함께 인큐베이션하여 분리시킨다. 세포를 이후 DMEM:F12 (50:50) 로 희석하고, 원뿔형 튜브에서 수집하고, 300 x g 에서 8 분 동안 원심분리한다. 상청액을 흡입한 후, 펠렛화된 세포를 단일 세포 현탁액에 모두 재현탁하고 혈구계산기를 사용하여 계수한다. 20 ml 의 4 x 104 세포/mL 를 10 μM ROCK 저해제 Y-26732 및 Pen/Strep 용액이 보충된 TeSR2 배지 중 T75 Corning Low Attachment 플라스크에서 플레이팅한다. 현탁된 세포를 수집하고, 이를 원뿔형 튜브에 가라앉히고, 기존 배지를 부드럽게 피펫으로 빼냄으로써 배지를 하루걸러 교환한다. 세포는 구면 중심 바깥쪽으로부터 확장되는 클러스터를 형성하기 시작한다. 분명한 구면 가장자리를 갖는 타이트한 클러스터는 다능성의 유지를 나타내는 한편 불분명한 경계부를 갖는 단일 세포 또는 클러스터는 통상 자연 분화 및/또는 세포 사멸을 나타낸다. 각 플라스크에 배지를 수집하고 세포 클러스터를 가라앉혀, 세포를 3-4 일 주기로 계대한다. 기존 배지를 부드럽게 피펫으로 빼내고, 상기 기재한 바와 같이 TrypLE 를 사용하여 클러스터를 단일 세포로 분리시킨다. 이후, 분리된 세포를 상기 기재한 바와 같이, 즉, 10 μM ROCK 저해제 Y-26732 및 Pen/Strep 용액이 보충된 TeSR2 배지 중 T75 Corning Low Attachment 플라스크 당 20 ml 의 4 x 104 세포/mL 를 플레이팅한다.
내배엽 분화를 준비하기 위해, 현탁액 중 배양한 성체 줄기 세포 또는 iPS 세포를 TesRTM2 배지 중에서 밤새 플레이트에 계대한다. 다음날, TesRTM2 배지를 기본 배지 (B27 (Invitrogen, #17504-044) 가 보충된 DMEM/F12 + Glutamax (Invitrogen, #10565)) 로 교체한다. iPS 세포를 배양하기 위한 또 다른 옵션은 TesR2 및 마우스 배아 섬유아세포 (MEF) 조건화 배지 (R&D Systems, #AR005) 의 믹스를 사용하는 것이다. 세포가 이후 상기 기재한 바와 같이 내배엽으로 분화된다.
유세포 분석 프로토콜
유세포 분석을 위해 세포를 준비하기 위해, 내배엽 분화 조건 하에 성장시킨 hESC-유래 세포를 Accutase (Innovative Cell technologies, #AT -104) 를 사용하여 분리하였다. 간략하게, 세포를 PBS 중에서 1 회 세척하고, 10 분 동안 실온에서 Accutase 와 함께 인큐베이션하고, 펠렛화하고, 저온 PBS 중에서 세척하였다. Accutase-분리 hESC-유래 세포 샘플을 항-CXC4 항체, 항-SOX17 항체 또는 항-FoxA2 항체로 염색하였다. 추가적인 세포 샘플을 아이소타입 대조군 항체 (예를 들어 IgG1 또는 IgG2) 로 염색하였다.
항-CXCR4 항체로 염색한 세포를 저온 DPBS 로 1 회 세척한 후, 마우스 항-인간 CD184 (CXCR4)-IgG2-PE (BD, #555974) 로 1 시간 동안 4℃ 에서 직접 염색하였다. 항-SOX17 항체 또는 항-FoxA2 항체로 염색한 세포를 고정 완충액 (BD, #554655) 중에서 25 분 동안 4℃ 에서 먼저 고정하고, Perm 완충액 III (BD, #554656) 중에서 30 분 동안 얼음 상에서 침투시켰다. 항-SOX17 염색을 마우스 항-SOX17 IgG1-PE 항체 (BD, #561591) 를 사용하여 실온에서 30 분 동안 수행하였다. 항-FoxA2 염색을 마우스 항-인간 FoxA2 IgG1 (BD, #561589) 을 사용하여 동일한 조건 하에서 수행하였다. 세포의 대조군 샘플을 상기 기재한 바와 같이 고정하고, 항-IgG1-PE 항체 (BD, #554680) 로 실온에서 30 분 동안 또는 항-IgG2-PE 항체 (BD, #55574) 로 1 시간 동안 4℃ 에서 염색하였다.
항체-염색된 hESC-유래 세포를 이후 BD LSRFortessaTM 세포 분석기를 사용하여 유세포 분석을 통해 분석하였다. 역치 매개변수를 15,000 으로 설정하고; SSC 및 FSC 매개변수를 설정하고 SSC 를 설정하여 전체 세포 집단이 기록 데이터 범위 내에 맞추고; 전압을 비염색 세포 또는 아이소타입 대조군 항체로 염색된 세포가 103 미만의 형광을 갖도록 설정하였다. 샘플 당 대략 1 x 106 세포를 분석하였다.
영상화 프로토콜
면역형광 영상화 전에, hESC-유래 세포를 실온에서 PBS 로 3 회 세척하고, PBS 로 희석한 4% 메탄올-불포함 포름알데히드 중에서 20 분 동안 고정하였다. 세포 샘플을 이후 실온에서 PBS 중 3 회 헹구고, 블로킹 완충액 (0.3% Triton X-100 및 5% 염소 혈청 (1x PBS 중)) 에서 1 시간 동안 실온에서 블로킹하였다. 블로킹 단계 후, 세포 샘플을 PBS 중에서 3 회 다시 헹구었다. SOX17 발현이 검출된 세포 샘플을 2 시간 동안 실온에서 블로킹 완충액 중 2 μg/ml 마우스 항-SOX17 클론 P7969 1 차 항체 (BD, #561590) 와 함께 인큐베이션하였다. FoxA2 발현이 검출된 세포 샘플을 블로킹 완충액 중 토끼 항-FoxA2 1 차 항체 (CS, #3143) 의 1:500 희석물 중에서 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 대안적으로, 이들 인큐베이션을 밤새 4℃ 에서 수행할 수 있다.
2 차 항체로 염색하기 전에, 세포 샘플을 PBS 중에서 3 회 헹구었다. 항-SOX17 항체로 염색한 세포를 이후 2 μg/ml 염소 항-마우스-Alexa488 2 차 항체 (Invitrogen, #A11029) 와 함께 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그런 다음, 항-FoxA2 항체로 염색된 세포를 2 μg/ml 염소 항-토끼-Alexa594 2 차 항체 (Invitrogen, #A11037) 와 함께 동일한 인큐베이션 조건 하에 인큐베이션하였다.
2 차 항체로의 염색 후에 핵 염색을 수행하였다. 간략하게, 세포 샘플을 PBS 로 3 회 세척하고, PBS 중 1/10000 희석한 Hoechst 33258 (Invitrogen, #H3569) 로 10 분 동안 실온에서 염색하였다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS 로 다시 세척하였다. Hoechst-염색된 세포를 이후 표준 형광 현미경 관찰 기술을 사용하는 Perkin Elmer Operetta system 또는 Zeiss 현미경을 사용하여 영상화하였다.
AlphaLisa 프로토콜
OCT4 를 검출하기 위해서, 세포를 PBS 중에서 3 회 세척하고 50 ul AlphaLisa Lysis 완충액 (Perkin Elmer, #AL003C) 으로 용해하였다. 용해 완충액을 각각의 세포 샘플에 첨가하고, 세포와 5 회 혼합하였다. 그런 다음 상기 세포 샘플을 실온에서 15 분 동안 플레이트 진탕기에서 인큐베이션하였다. 각 샘플로부터의 5 μl 의 용해물을 384 웰 OptiPlate (Perkin Elmer, #6005629) 에 옮겼다. 5 μl 의 10 ug/ml 항-토끼 수용기 비드 (Perkin Elmer, #AL104M) 및 5 μl 의 0.2 nM 의 토끼 항-OCT4 항체 (Cell Signaling, #2890) 를 각각의 웰에 첨가하고 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 5 μl 의 0.5 nM 마우스 항-OCT4 항체 (BD, #611203) 및 5 μl 의 0.5 nM 비오틴화 염소 항-마우스 항체 (Invitrogen, #B2763) 를 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 10 μl 의 스트렙타비딘 공여체 비드 (Perkin Elmer, #6760002B) 를 각각의 웰에 첨가하고 30 분 동안 인큐베이션하였다. OptiPlate 를 이후 Envision Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer, #2104-0010) 를 사용하여 분석하였다. 모든 비드 및 항체를 필요에 따라 IAB 완충액 (Perkin Elmer, #AL000C) + 50mM NaCl 중 희석하였다. 4 회 반복 검정을 수행하였다.
SOX17 을 검출하기 위해서, 세포를 PBS 중에서 3 회 세척하고 50 ul Roche Complete Lysis 완충액 (Roche, #04719956001) 으로 용해하였다. 용해 완충액을 각각의 세포 샘플에 첨가하고, 세포와 5 회 혼합하였다. 그런 다음 상기 세포 샘플을 실온에서 15 분 동안 플레이트 진탕기에서 인큐베이션하였다. 각 샘플로부터의 5 μl 의 용해물을 이후 384 웰 OptiPlate (Perkin Elmer, #6005629) 에 옮겼다. 5 μl 의 10 ug/ml 항-토끼 수용기 비드 (Perkin Elmer, #AL104M) 및 5 μl 의 1 nM 의 토끼 항-SOX17 항체 (Sigma, #AV33271) 를 각각의 웰에 첨가하고, 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 5 μl 의 0.5 nM 마우스 항-SOX 항체 (Sigma, #SAB3300093) 및 5 μl 의 0.5 nM 비오틴화 염소 항-마우스 항체 (Invitrogen, #B2763) 를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 10 μl 의 스트렙타비딘 공여체 비드 (Perkin Elmer, #6760002B) 를 각 웰에 첨가하고 30 분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 OptiPlate 를 Envision Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer, # 2104-0010) 를 사용하여 분석하였다. 모든 비드 및 항체를 필요에 따라 IAB 완충액 (Perkin Elmer, #AL000C) 중 희석하였다. 4 회 반복 검정을 수행하였다.
siRNA 녹다운 (Knockdown) 프로토콜
hESC 세포 샘플을 상기 기재한 바와 같이 제조하고, 액티빈 A 단독 보충된 기본 배지 중에서 분화시켰다. 기본 배지로의 계대 동안, 지질-기재 트랜스펙션 시스템 (Lipofeactamine RNAimax, Invitrogen, #133778-150) 을 사용하여 세포를 하기 표 3 또는 표 4 에서 열거한 적절한 siRNA 로 트랜스펙션시켰다. 세포를 siRNA 와 함께 20 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 배지를 액티빈 A 단독 보충된 배지로 교환하고 교체하였다. PI3K 녹다운 실험 결과를 하기 실시예 2 에서 나타낸다. Akt 및 mTOR 녹다운 실험 결과를 하기 실시예 8 에서 나타낸다.
실시예 2: hESC 를 사용하는 내배엽 분화
내배엽 분화에 대한 다양한 시판 PI3K 저해제의 영향을 비교하였다. hESC 세포 샘플을 상기 기재한 바와 같이 제조하고, 기본 배지 또는 액티빈 A; 액티빈 A 및 50 μg/ml 인간 Wnt3a (R&D, #5036-WN-010); 또는 액티빈 A, Wnt3A 및 하기 표 1 에서 열거한 P13K 저해제 중 하나가 보충된 기본 배지 중에서 분화시켰다.
표 1
Figure pat00049
화합물 A 를 제외하고, 표 1 에서 나타낸 화합물은 동형-선택적 PI3K 저해제가 아니다.
화합물 A 의 구조를 하기에 제공한다:
Figure pat00050
.
3-일 처리 후, 세포를 수확하고 유세포 분석 연구를 위한 제조에서 상기 기재한 바와 같이 항-SOX17 항체로 염색하였다. 유세포 분석 연구 결과를 도 1 에 나타낸다. 표 1 에서 열거한 액티빈 A, Wnt3A 및 P13K 저해제와 함께 배양한 세포는 내배엽으로의 증진된 전환을 나타내었다. 선택적 P13K 알파 저해제 화합물 A 와 함께 배양한 hESC 세포는 약 93.5 - 93.9% (예를 들어 93.88%) 의 SOX17 마커 발현 hESC-유래 세포로, 내배엽으로의 가장 증진된 전환을 나타내었는데, 이는 LY294002 를 포함하는 다른 시험 비-동형 선택적 PI3K 저해제에 비해 우수한 것이다.
실시예 3: Wnt3a 는 내배엽으로의 분화에 대해 필요하지 않음
성장 인자 Wnt3a 가 내배엽 분화에 대해 필요한지 여부를 측정하기 위해 실험을 수행하였다. hESC 세포 샘플을 상기 기재한 바와 같이 제조하고, 기본 배지; 액티빈 A, 50 μg/ml Wnt3a 및 화합물 A 가 보충된 기본 배지, 또는 액티빈 A 및 750 nM 화합물 A 단독을 갖는 기본 배지 중에서 분화시켰다. 3-일 처리 후, 세포를 수확하고 유세포 분석 연구를 위한 제조에서 상기 기재한 바와 같이 항-SOX17 항체로 염색하였다. 유세포 분석 연구 결과를 도 2 에 나타낸다. 이들 결과는, Wnt3a 의 부재 하에 화합물 A 및 액티빈 A 와 함께 배양한 hESC-유래 세포가 화합물 A, 액티빈 A 및 Wnt3a 와 함께 배양한 세포의 경우보다 약간 낮으나 비슷한 효율로 내배엽으로 전환되었다는 것을 나타낸다. 도 3 에서 나타낸 바와 같이, 이러한 영향은 사용한 기본 배지와는 관계가 없었다.
실시예 4: 동형-특이적 PI3K 저해제
내배엽 분화에 대한 동형-특이적 (예를 들어 동형-선택적) PI3K 저해제의 영향을 비교하였다. hESC 세포 샘플을 상기 기재한 바와 같이 제조하고, 하기 표 2 에서 나타낸 동형-특이적 PI3K 저해제 및 성장 인자가 보충된 기본 배지 중에서 분화시켰다.
표 2
Figure pat00051
Figure pat00052
AW = 액티빈 A + Wnt3a
A = 액티빈 A 단독
3-일 처리 후, 세포를 수확하고 유세포 분석 연구를 위한 제조에서 상기 기재한 바와 같이 항-SOX17 항체로 염색하였다. 분석 결과를 도 4 에 나타낸다. 이들 결과는 P13K 알파 동형, 또는 PI3K 알파 및 PI3K 델타 동형 둘 모두에 특히 영향을 주는 PI3K 저해제가 다른 PI3K 동형의 저해제보다 더 효과적으로 내배엽 분화를 증진시킨다는 것을 나타낸다. 내배엽 분화에 대해 가장 확연한 영향을 나타내는 저해제는 화합물 A 및 화합물 J 였는데, 이는 PI3K 알파 및 델타 동형 모두를 저해한다. 화합물 J 와 함께 배양한 약 69.15% 의 hESC-유래 세포 및 화합물 A 와 함께 배양한 약 77.35% 의 hESC-유래 세포는 내배엽-특이적 마커 SOX17 을 발현하였다.
이들 결과를, 특이적 PI3K 동형의 발현이 siRNA 를 사용하여 저해된 녹다운 실험에서 확인하였다. 간략하게, 기본 배지로의 계대 동안, hESC 를 20nM 의 음성 대조군 siRNA, 20nM 의 PI3K 알파 특이적 siRNA (즉, 10nM s10520 및 10nM s10521), 20nM 의 PI3K 베타 특이적 siRNA (즉, 10nM s10524 및 10nM s10525), 20nM 의 PI3K 델타 특이적 siRNA (즉, 10nM s10529 및 10nM s10530), 또는 각각 20nM 의 PI3K 알파, 베타 및 델타 특이적 siRNA (즉, 각각 10nM 의 s10520, s10521, s10524, s10525, s10529 및 s10530) 로 트랜스펙션하였다. 전술한 siRNA 는 Life Technologies 에서 시판되며 하기 표 3 에서 표기된다. 세포를 siRNA 와 함께 20 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 배지를 100 ng/ml 액티빈 A 로 보충된 배지로 교환하고 교체하였다. 750nM 의 PI3K 저해제 화합물 A 가 보충된 액티빈 A 와 함께 기본 배지에서 hESC 세포를 분화시킨 대조군 샘플을 제조하였다.
표 3
Figure pat00053
3-일 처리 후, 세포를 수확하고 유세포 분석 연구를 위한 제조에서 상기 기재한 바와 같이 항-SOX17 또는 항-FoxA2 항체로 염색하였다. 이러한 분석 결과를 도 5 에 나타낸다. PI3K 알파-특이적 siRNA 와 함께 배양한 hESC-유래 세포는 68% 의 세포가 SOX17 을 발현하고 62% 의 세포가 FoxA2 를 발현하는 높은 내배엽 전환 비율을 나타내었다. 그에 반해, PI3K 베타-특이적 siRNA, PI3K 델타-특이적 siRNA, 또는 PI3K 베타-특이적 및 PI3K 델타-특이적 siRNA 둘 모두와 함께 배양한 hESC-유래 세포는 약 25% 의 세포가 SOX17 을 발현하고 ~10% 의 세포가 FoxA2 를 발현하는 낮은 내배엽 전환 비율을 나타내었다. PI3K 알파 동형에 대해 특이적이나 PI3K 베타 동형 또는 PI3K 델타 동형에 대해서는 특이적이지 않은 siRNA 는 내배엽 전환을 증가시키는 것으로 발견되었다.
실시예 5: 내배엽 분화를 위한 시간 경과 (Time Course) 실험
시간 경과 실험을 수행하여, 액티빈 A 및 화합물 A 가 보충된 기본 배지 중에서 배양한 hESC-유래 세포의 전환 효율 및 분화 효율을 측정하였다. hESC 세포를 상기 기재한 바와 같이 배양하고, Wnt3a 가 결핍되어 있으며 액티빈 A 및 750nM 화합물 A 가 보충된 기본 배지에서 분화시켰다. 세포의 6 개 샘플을 제조하였다. 화합물 A + 액티빈 A 로 처리한 후 24 시간에 시작하여 6 일 동안 1 일 당 세포의 1 개 샘플을 수확하였다. 유세포 분석 연구를 위한 제조에서의 항-SOX17, 항-FoxA2 또는 항-CXCR4 항체로 hESC-유래 세포 샘플을 염색하였다.
도 6 에서 나타낸 바와 같이, 전환 효율은 제 3 일에 높았으며 정체기가 시작된다. 분화 효율은 제 5 일에 가장 높았는데, 이때 91% 의 hESC-유래 세포가 SOX17 을 발현하고, 87% 가 FoxA2 를 발현하고, 82% 가 CXCR4 를 발현하였다. 이들 결과는 액티빈 A + 화합물 A 로 처리한 hESC 세포의 내배엽 분화가 시간 의존적이었다는 것을 나타낸다.
실시예 6: 용량 반응
용량 반응 실험을 수행하여, 내배엽 분화를 가장 효과적으로 증진시키는 화합물 A 의 농도를 측정하였다. hESC 세포를 상기 기재한 바와 같이 배양하고, Wnt3a 가 결핍되어있고 액티빈 A 및 0, 100nM, 250nM, 500nM, 750nM 또는 1000nM 화합물 A 가 보충된 기본 배지 중에서 분화시켰다. 미분화된 인간 배아 줄기 세포를 상기 기재한 바와 같이 유지시켰다. 3-일 처리 후, 세포를 수확하고 유세포 분석 연구를 위한 제조에서 상기 기재한 바와 같이 항-SOX17 항체로 염색하였다.
용량 반응 실험 결과를 도 7 에서 나타낸다. SOX17 발현은 화합물 A 농도 증가와 함께 증가한다. 액티빈 A 및 750nM 화합물 A 가 보충된 기본 배지 중에서 배양한 hESC 세포는 84% 의 hESC-유래 세포가 SOX17 을 발현하여, 가장 증진된 내배엽 분화를 나타내었다. 이들 결과를, SOX17 및 FoxA2 의 발현을 모니터링한 영상화 실험에서 확인하였다.
항-SOX17 및 항-OCT4 항체를 사용하여 상기 기재한 바와 같이 수행한 면역검정 (AlphaLisa®, Perkin Elmer) 으로, hESC-유래 세포에서의 SOX17 발현이 750nM 까지의 화합물 A 농도 증가와 함께 증가하는 한편, OCT4, 줄기 세포 마커의 발현은 감소한다는 것을 확인하였다. 이는 내배엽 분화가 줄기 세포 다능성 감소와 동시에 일어난다는 것을 나타낸다.
실시예 7: 생존력 및 증식
시간 경과 실험을 수행하여, 액티빈 A 및 화합물 A 로 처리함으로써 수득한 내배엽 세포의 생존력 및 증식을 모니터링하였다. 다양한 배양 조건을 시험하였다. hESC 세포를 상기 기재한 바와 같이 배양하고, Wnt3a 가 결핍되어있으며 액티빈 A 및 750nM 화합물 A 가 보충된 기본 배지 중에서; TesRTM2 중에서; 기본 배지 단독 중에서; 또는 액티빈 A, Wnt3a 및 5 μM LY294002 가 보충된 기본 배지 중에서 분화시켰다. 각각의 조건 하에 성장한 hESC-유래 세포를, 표준 프로토콜에 따라서 Roche xCELLigence System 을 사용하여 배지 교환 없이, 12 일 동안, 1 일 1 회, 증식 및 생존력에 대해 검정하였다.
xCELLigence 는 임피던스 신호의 함수로서 증식 및 생존력을 측정하였다. 높은 임피던스 신호는 배양 디쉬 표면에 대한 세포 부착을 나타내는데, 이는 증가한 증식과 연관된다. 이에 반해 낮은 임피던스 신호는 배양 디쉬 표면으로부터의 세포의 분리를 나타내는데, 이는 세포 사멸과 연관된다. 도 8 에서 나타낸 바와 같이, 액티빈 A 및 화합물 A 로 처리함으로써 수득한 내배엽 세포는 제 4 일을 지나서 생존가능하고 증식성으로 남아 있다. 반대로, 액티빈 A, Wnt3a 및 LY294002 로 처리함으로써 수득한 줄기 세포 및 내배엽 세포는 제 4 일에 세포 사멸을 나타내기 시작한다. 도 8 에서 결과를 나타낸 실험을 2 반복 수행하였다. 따라서, 각각의 조건에 대해 2 개의 곡선이 존재한다.
이들 결과를 표준 프로토콜에 따라 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega, #G7571) 를 사용하여 확인하고, EnVision® Multilabel Reader (Perkin Elmer 사제) 를 사용하여 분석하였다. 이 검정에서, 시험한 각 샘플 중 대사적으로 활성인 세포를 샘플에 의해 생성된 ATP 수준의 함수로서 정량하였다. 간략하게, 줄기 세포, 자연 분화에 의해 수득한 내배엽 세포, 액티빈 A 처리에 의해 수득한 내배엽 세포, 및 액티빈 및 10nM, 25nM, 50nM, 100nM, 250nM, 500nM, 750nM, 1μM 또는 1.5μM 화합물 A 로의 처리에 의해 수득한 내배엽 세포를, 처리 시작 3 일 및 7 일 후 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay 를 사용하여 시험하였다. 도 9 에서 나타낸 바와 같이, 액티빈 A 및 100nM, 250, 500, 750, 1μM 또는 1.5μM 화합물 A 로의 처리에 의해 수득한 내배엽 세포는 다른 조건 하에 성장한 세포보다 7 일에 더 큰 생존력을 나타내었다.
실시예 8: 안정한 내배엽
표현형적으로 안정하고 확장가능한 (즉, 증식성) 내배엽의 생성은 이미 인간 세포에서 시도된 바 있다 (Seguin, et al. (2008) "Establishment of endoderm progenitors by SOX transcription factor expression in human embryonic stem cells." Cell Stem Cell, 3(2): 182-19; Cheng, et al. (2012). "Self-renewing endodermal progenitor lines generated from human pluripotent stem cells." Cell Stem Cell, 10(4): 371-384) and mouse cells (Morrison, et al. (2008). "Anterior definitive endoderm from ESCs reveals a role for FGF signaling." Cell Stem Cell, 3(4): 402-415). 특정 내배엽 분화 프로토콜은 CXCR4+ 세포를 수득하기 위해 비용이 많이 들고 노동 집약적인 분류 단계를 포함한다. 상이한 계획 (예를 들어, 상이한 리포터 주 및 상이한 성장 인자 사용) 을 사용하여 안정한 내배엽을 개발하였으나, 이들 계획은 재현가능한 결과를 이끌어내지 못했다.
상기 실시예 5 에서의 시간 경과 실험은 hESC-유래 세포가 액티빈 A 및 화합물 A 가 보충된 기본 배지 중에서 배양된 경우, 내배엽 마커의 발현이 6 일에 걸쳐 유지되었다는 것을 나타낸다 (도 6). 이들 데이터를 기반으로, 추가의 실험을 수행하여 이러한 내배엽 집단의 안정성이 계대에 걸쳐 현저히 6 일보다 더 연장될 수 있는지 여부를 측정하였다.
AA 및 AP 세포의 증식 및 유지를 비교하였다:
AA 세포: 줄기 세포 → (액티빈 A) → 내배엽
AP 세포: 줄기 세포 → (액티빈 A + 화합물 A) → 내배엽
상기 흐름도에서 나타낸 바와 같이, hESC 세포를 실시예 5 에서 기재한 바와 같이 배양하고, Wnt3a 가 결핍되어있고 액티빈 A 단독 (AA 세포) 또는 액티빈 A 및 750nM 화합물 A (AP 세포) 가 보충된 기본 배지 중에서 분화시켰다.
제 3 일에, AP 세포를 분류 없이 마트리겔- 또는 콜라겐-코팅 플라스크에 직접 계대하였다. AP 세포를 [Cheng et al. (2012). "Self-renewing endodermal progenitor lines generated from human pluripotent stem cells." Cell Stem Cell, 10(4), 371-384] 에서 기재된 이전의 작업을 기반으로 4 개 성장 인자, BMP4, FGF2, VEGF 및 EGF 의 칵테일 중에서 유지시켰다. BMP4 는 SOX17 발현을 유지하는데 필요하였다. BMP4 없이, SOX17 발현은 빠르게 감소하였고 계대 4 또는 5 에서 손실되었다 (도 26 참고). FGF2, VEGF 및 EGF 는 또한 내배엽 증식에 중요한 것으로 발견되었다. 이들 인자 없이, AP 세포는 계대 4 에서 증식을 중단하였다. 기본 배지의 선택이 또한 중요했다. 피더 세포 층이 본 시스템에서 사용되었기 때문에, 30% MEF 조건화 배지를 첨가하여 증식을 향상시켰다. 도 27 에서 나타낸 바와 같이, 30% 마우스 배아 섬유아세포 (MEF) 조건화 배지가 보충된 TesR2 배지 중에서 이들 인자와 함께 AP 내배엽 집단을 유지시키는 것은 제 3 일에 최고 수준의 SOX17-발현 세포를 생성시켰다. 도 27 에서의 데이터를 2 회 계대한 내배엽 세포로부터 수득하였다.
AP 세포는 이들 최적화 조건 하에 3.5 일 배가 시간으로 10 계대에 걸쳐 고도로 증식성이었다 (도 28 참고). AA 세포 (즉, 액티빈 A 로만 분화된 hESC-유래 줄기 세포) 를 또한 동일한 프로토콜로 유지시킬 수 있었다. 그러나, 오직 소부분의 AA 집단 (약 20%) 만이 CXCR4 및 FoxA2 에 대해 양성이었고, AA 세포는 4 계대 후 증식을 중단하였다. hESC-유래 줄기 세포 분화의 첫 3 일 동안 화합물 A 의 기본 배지 + 액티빈 A 에 대한 첨가는 어떠한 분류 단계 없이 10 계대에 걸쳐 증식성으로 남아 있는 내배엽 세포의 거의 순수한 집단의 유지 (즉, 표현형 유지) 를 가능하게 하였다. 화합물 A 를 기본 배지에 첨가하였을 때, AP 세포 집단은 70% 초과의 세포가 첫 3 계대에 Sox17 및 FoxA2 에 대해 양성을 나타내었다. 계대 4 후, AP 집단은 80-90% 의 세포가 SOX17, CXCR4 및 FoxA2 를 발현하여, 거의 순수하게 남아있었다. 이러한 맥락에서 기본 배지의 선택이 마찬가지로 또한 중요하다. DMEM/F12 + 20% KOSR +30% MEF 중에서 성장한 세포는 2 회 계대한 후 증식하지 않았다.
유세포 분석기에 의해 SOX17, CXCR4 및 FoxA2 의 발현을 모니터링하고, 면역형광 및 유전자 발현을 통해 확인하였다 (도 29 참고). 면역형광 실험으로, SOX17 이 계대 12 에서 AP 세포에 의해 발현되었다는 것을 확인하였다. 추가적인 면역형광 실험을 수행하여, AFP 발현이 AP 내배엽 세포가 계대 12 에서 간세포-유사 세포로의 분화 징후를 보이지 않았다는 것을 나타낸 것을 모니터링하였다. 이들 데이터는 기본 배지, 액티빈 A 및 화합물 A 중에서 배양한 줄기 세포에서 유래한 세포의 AP 집단이, 어떠한 분류 단계도 없이, 피더 세포 층 사용 없이, 10 계대에 걸쳐 동종이며 증식성인 내배엽 집단으로서 안정하였다는 것을 나타낸다.
실시예 9: Akt 저해 또는 mTOR 저해에 의한 내배엽 생성
PI3K 저해제는 일반적으로 Akt 키나아제 및 mTOR 에 의해 매개된 신호전달을 저해한다. hESC 세포를 하기 표 4 에서 열거한 다양한 시판 Akt 또는 mTOR 저해제 중 하나가 보충된 기본 배지 중에서 배양하여, Akt 또는 mTOR 경로의 직접 저해가 효과적인 내배엽 생성을 초래할 수 있는지 여부를 조사하였다. hESC 세포를 상기 기재한 바와 같이 배양하고, Wnt3a 가 결핍되어있고 액티빈 A 및 표 4 에서 열거한 저해제 중 하나의 750nM 가 보충된 기본 배지 중에서 분화시켰다. 3-일 처리 후, 세포를 수확하고 AlphaLisa 분석을 위한 제조에서 상기 기재한 바와 같이 항-SOX17 항체로 염색하였다.
표 4
Figure pat00054
분석 결과를 도 10 에 나타낸다. mTOR 저해제 에버로리무스, KU0063794, 또는 WYE-354 로 처리된 hESC 세포는 액티빈 A 단독 중 배양한 세포 또는 Akt 저해제와 함께 배양한 세포보다 더 양호한 내배엽 전환을 나타내었다. 예를 들어, 에버로리무스, KU0063794, 또는 WYE-354 로 처리한 세포에서의 내배엽 전환은 Akt 저해제 GSK690693 으로 처리한 세포에서의 내배엽 전환보다 더 효율적이었다.
이들 결과는 유세포 분석 실험에서 반복되었다. hESC 세포를 상기 기재한 바와 같이 배양하고, Wnt3a 가 결핍되어있고 액티빈 A 및 750nM 의 에버로리무스, KU00633794, WTE-354 또는 GSK690639 가 보충된 기본 배지 중에서 분화시켰다. 3-일 처리 후, 세포를 수확하고 유세포 분석 연구를 위한 제조에서의 항-SOX17 항체, 항-FoxA2 항체 또는 항-CXCR4 항체로 염색하였다. 이러한 분석 결과를 도 11 에 나타낸다. 에버로리무스, KU00633794, WTE-354 또는 GSK69063 으로 처리한 hESC 세포는 더 높은 정도의 내배엽 전환을 나타낸다. 반대로, 액티빈 A 단독 중 배양한 hESC-유래 세포의 단지 20% 만이 SOX17 을 발현한다.
이들 결과를, Ak1, Akt2, Akt3 또는 mTOR 에 대해 특이적인 siRNA 를 사용하여 녹다운 실험에서 확인하였다. 녹다운 실험을 AKT- 또는 mTOR-특이적 siRNA 를 사용하여 상기 기재한 바와 같이 수행하였다. 이들 siRNA 는 Life Technologies 에서 시판되며 하기 표 5 에서 나타내었다. 세포를 20 시간 동안 siRNA 와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 배지를 액티빈 A 단독으로 보충된 배지로 교환하고 교체하였다. 750nM 의 PI3K 저해제 화합물 A 가 보충된 액티빈 A 를 갖는 기본 배지 중에서 hESC 세포를 분화시킨 대조군 샘플을 제조하였다.
표 5
Figure pat00055
도 12 에서 나타낸 바와 같이, mTOR 발현의 저해는 내배엽 전환 (약 61% 의 hESC-유래 세포가 SOX17 을 발현하고 약 40% 의 세포가 FoxA2 를 발현함) 뿐 아니라 PI3K 알파 발현의 저해 (약 57% 의 hESC-유래 세포가 SOX17 을 발현하고 약 38% 의 세포가 FoxA2 를 발현함) 를 증가시킨다. Akt1, Akt2 또는 Akt3 발현의 저해는 mTOR 저해만큼 유의하게 내배엽 전환을 증가시키지 않는다.
실시예 10: PI3K 알파 및 mTOR 저해의 가산적 또는 상승작용적 영향
녹다운 실험을 수행하여, PI3K 알파 및 mTOR 발현의 동시 녹다운이 내배엽 분화에 대해 가산적이거나 상승작용적인 영향을 갖는지 여부를 측정하였다. 기본 배지로의 계대 동안, 세포를 20nM 의 음성 대조군 siRNA, 20nM 의 PI3K 알파 특이적 siRNA, 20nM 의 mTOR 특이적 siRNA, 또는 각각 20nM 의 PI3K 알파 특이적 siRNA 및 mTOR 특이적 siRNA 로 트랜스펙션시켰다. 세포를 20 시간 동안 siRNA 와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 배지를 액티빈 A 및 750nM 의 PI3K 저해제 화합물 A 가 보충된 기본 배지, 또는 액티빈 A 단독 보충된 기본 배지로 교환하고 교체하였다. 3 일 후, 세포 샘플을 수확하고 유세포 분석 연구를 위한 제조에서의 항-SOX17 항체 또는 항-FoxA2 항체로 염색하였다.
분석 결과를 도 13 에서 나타낸다. PI3K 알파 발현 및 mTOR 발현의 동시 녹다운은 PIK 알파 발현 단독 (33% 의 hESC-유래 세포가 SOX17 을 발현하고 39% 의 세포가 FoxA2 를 발현함) 또는 mTOR 발현 단독 (76% 의 hESC-유래 세포가 SOX17 을 발현하고 69% 의 세포가 FoxA2 를 발현함) 보다 더 높은 수준의 내배엽 전환 (86% 의 hESC-유래 세포가 SOX17 을 발현하고 85% 의 세포가 FoxA2 을 발현함) 을 촉진한다. PI3K 알파 및 mTOR 발현의 부재 하 내배엽 전환 비율은 PI3K 알파 저해제의 경우와 비슷했다.
실시예 11: 중내배엽 , 내배엽 및 중배엽 마커 유전자 발현에 대한 다양한 농 도의 mTOR 저해제 및 PI3K 알파 저해제의 조합의 영향 모니터링
상기 기재한 바와 같이, mTOR 저해 및 PI3K 저해의 조합된 영향은 mTOR 저해 단독 또는 PI3K 알파 저해 단독에 관해 더 높은 수준의 내배엽 전환을 촉진하였다. 다양한 농도의 mTOR siRNA (0, 0.2nM, 2nM 및 20nM) 및 다양한 농도의 PI3K 알파 siRNA (0, 0.2nM, 2nM 및 20nM) 를 사용하여 4 x 4 용량 반응 매트릭스 실험을 수행하여, 개별적 내배엽 마커 유전자 발현에 대한 mTOR 저해 및 PI3K 저해의 조합된 영향을 평가하였다. 상기 기재한 바와 같이, 줄기 세포 분화를 액티빈 A 의 존재 하에 실행하고, 중내배엽 마커 유전자 DKK1, EOMOES, FGF17, FGF8, GATA6, MIXL1, 단미증 (T), WNT3a, GSC, LHX1 및 TBX6, 및 내배엽 마커 유전자 CDH2, CER1, CXCR4, FGF17, FoxA2, GATA4, GATA6, HHEx, HNF1B, KIT, SOX17 및 TDGF1 의 발현을 제 1 일 및 제 2 일에 분석하였다.
제 1 일에, 높은 농도의 mTOR siRNA 가 사용된 경우 대부분의 중내배엽 유전자가 명백하게 상향조절되어, 중내배엽 형성에 있어서의 mTOR 의 우세한 역할이 확인된다 (도 18 및 19). 마커 유전자 발현에 대한 PI3K 알파 저해의 영향은 분석한 마커 유전자에 따라 가변적이었다. DKK1, FGF17, MIXL1 과 같은 일부 마커에 대해, mTOR 저해는 PI3K 알파 저해 없이도 발현에 대해 강력한 영향을 갖는다. LHX1, GATA6, EOMES, GSC 및 TBX6 과 같은 다른 마커에 대해, PI3K 알파 저해는 최대 발현에 도달하기 위해 필요하다 (도 18 및 19).
제 2 일에, 최고 발현 수준에 도달하기 위해서, 대부분의 내배엽 마커는 PI3K 알파 및 mTOR 저해 모두를 필요로 했다 (도 20). 일부 마커, 예를 들어 FoxA2 에 대해, mTOR 및 PI3K 알파 저해의 발현 수준에 대한 동등한 기여가 존재했다. 다른 마커, 예를 들어 CER1, Hhex 및 FGF17 에 대해, PI3K 알파 저해는 내배엽 유전자 발현을 강력하게 상향조절하였으나, mTOR 저해가 이미 특정 수준까지 상승된 유전자 발현을 갖는 경우에만 해당된다. 마커 CXCR4 에 대해, mTOR 단독은 이의 발현을 상향조절하기에 충분하지 않았으며, PI3K 알파 저해가 요구되었다.
상기 기재한 바와 같이 4 x 4 용량 반응 매트릭스 실험을 수행하여, 중배엽 마커 유전자 PDGFRa, BMP4, GATA4, HAND1, ISL1, NCAM1, NKX2-5, TBX6 및 T (단미증) 의 발현에 대한 상이한 수준의 mTOR 저해 및 PI3K 알파 저해의 영향을 분석하였다 (도 21). PI3K 알파 저해는 중배엽 마커에 대해 고유한 영향을 가졌다 (도 21). 심지어 낮은 농도의 PI3K 알파 siRNA 도, 통상 mTOR 저해에 의한 중배엽 마커 ISL1, NKX2-5 및 외배엽 마커 NCAM1 의 높은 발현을 방지하였다. 증가한 농도의 mTOR siRNA 는 중배엽 마커 유전자의 증가한 발현과 상호관련되었다. 더욱이, 증가한 농도의 PI3K 알파 siRNA 는 mTOR 저해의 이러한 영향에 대응하기 위해 필요했다. 핵심 중배엽 마커 BMP4 에 대해, 높은 PI3K 알파 저해만이 이의 상향조절을 방지하였다. 흥미롭게도, 중배엽 마커 단미증 (Brachyury) 을 하향조절하기 위해서, mTOR 및 PI3K 알파 저해 모두가 필요했다.
용량 매트릭스 실험으로, 중내배엽, 내배엽 및 중배엽 마커 유전자의 발현에 있어서의 MTOR 저해 및 PI3K 알파 저해의 분명한 역할을 확인하였다. 또한, 상이한 수준의 mTOR 저해 및 PI3K 알파 저해는 마커 유전자의 발현에 대해 특이적인 영향을 갖는다. 중내배엽 형성에 대해, mTOR 저해는 결정적인 것이다. 이러한 단계에서, mTOR 저해 영향을 증진시키는데 있어서 높은 PI3K 알파 저해 기여가 존재하지만, PI3K 알파 저해는 또한 mTOR 저해에 의해 영향을 덜 받는 마커 (예를 들어 LHX1) 에 대해 중요한 기여인자일 수 있다. 중내배엽의 내배엽으로의 추가 분화에 대해, PI3K 알파 및 mTOR 저해 모두가 내배엽 마커 유전자의 가장 높은 발현을 얻는데 필요하다. 이 단계에서 PI3K 알파 저해는 다른 계통, 특히 중배엽이 형성되는 것을 방지하는데 있어서 필수적이다.
실시예 12: 내배엽 분화를 촉진하는 소분자 저해제 분석
상기 기재한 siRNA 용량 반응 매트릭스 실험을 수행하여, 그의 저해가 내배엽 형성에 필요한 중요한 표적인 PI3K 알파 및 mTOR 을 확인하고, 중내배엽, 내배엽 및 중배엽 마커 유전자 발현에 있어서의 mTOR 저해 및 PI3K 알파 저해의 분명한 역할을 조사하였다. 따라서, 소분자 저해제를 내배엽 형성을 촉진하는 능력에 대해 스크리닝하였다. 그러나, 특정 표적에 대한 상이한 소분자는 여전히 상이한 효능 및 동형 특이성을 가질 수 있다. 더욱이, 이러한 화합물은 또한 분화에 영향을 줄 수 있는 탈표적 효과 (off target effect) 를 종종 가지며, 상기 화합물은 고농도에서 세포에 독성일 수 있다. 실험을 수행하여, 내배엽 분화를 촉진하기 위한 PI3K 알파 및 mTOR 저해의 최적 균형을 제공하는 (예를 들어, 4 x 4 용량 반응 매트릭스 실험에서 확인한 바와 같음) 화합물을 확인하였다.
확장된 분석을 촉진하기 위해, 후속 실험에서 사용하기 위한 화합물 각각의 최적 농도를 결정하는 것이 필요했다. 화합물 각각의 최적 농도를 2 개의 매개변수: 내배엽 분화의 최고 효율 및 낮은 독성을 기반으로 결정하였다. 각각의 화합물을 용량 반응 방식으로 액티빈 A 로 시험하였다. 대조군에 비해 30% 초과의 세포 사멸을 일으킴이 없이 제 3 일에 최고 % 의 SOX17 발현 세포를 제공하는 농도를 각 화합물에 대해 결정하였다. 이러한 분석 결과를 도 22 에 나타낸다. 분화 수율은 제 3 일에 4% 에서 81% SOX17+ 세포가 되었다.
이들 화합물을 내배엽 형성 및 PI3K/AKT/MTOR 경로에 대한 이들의 영향에 대해 추가 분석하고, 이들 결과를 상기 기재한 용량 매트릭스 실험으로부터의 발견과 비교하였다. PI3K/AKT/MTOR 경로에 대한 각 화합물의 영향을 다음의 2 가지 방식으로 평가하였다: 키나아제 프로파일을 통해 (도 23) 및 인 영상화 (phospho imaging) 검정 (즉, mTOR 또는 AKT 의 인산화 형태에 특이적인 항체를 사용하는 면역형광 검정) 을 통해. 시험관내 키나아제 프로파일링은 PI3K 세포 신호전달 경로 내의 수많은 표적에 대한 저해 % 를 제공하였으며, 세포-기반 영상화 검정을 수행하여 분화에 사용된 세포 시스템에서의 인산화 Akt 및 인산화 mTOR 에 대한 각 화합물의 영향을 직접적으로 가시화하였다. 도 23 에서 나타낸 바와 같이, D1066, PKC 및 Palomid 529 는 mTOR 또는 Akt 의 인산화 감소를 나타내지 않았다. 또한, 이들 화합물은 세포-기반 영상화 검정에서 Akt 또는 mTOR 인산화에 대해 어떠한 영향도 나타내지 않았다. PKC412 는 인산화의 강력한 감소를 나타내었으나, 독성일 수 있다. 이들 검정을 기반으로, 화합물을 4 개 카테고리: AKT 저해제, MTORC1 저해제, MTORC1/2 저해제 및 이중 PI3K/MTOR 저해제로 분류하였다 (하기 표 6).
표 6
Figure pat00056
Figure pat00057
표 6 의 두 번째 열에서, PI3K 알파_MTOR 스코어는 PI3K 알파 및 mTOR 의 인산화를 저해하는 화합물의 능력을 반영하며, 이때 + 는 최소 저해를 나타내고, +++ 는 최대 저해를 나타낸다. 표 6 의 세 번째 열에서, 스코어는 화합물로 처리한 세포에서의 인산화 mTOR (형광 강도에 의해 측정된 바와 같음) 과 화합물로 처리하지 않은 세포에서의 인산화 mTOR (형광 강도에 의해 측정된 바와 같음) 의 비를 나타낸다. 표 6 의 네 번째 열에서, 스코어는 화합물로 처리한 세포에서의 인산화 AKT (형광 강도에 의해 측정된 바와 같음) 와 화합물로 처리하지 않은 세포에서의 인산화 AKT (형광 강도에 의해 측정된 바와 같음) 의 비를 나타낸다. AKT 저해제의 보고된 영향은 인산화 AKT 에 있어서의 증가이다.
수많은 관련 계통 마커의 발현에 대해 등급을 매겨, 내배엽 분화에 대한 화합물 각각의 영향을 평가하였다. 각 화합물에는, 중내배엽, 내배엽 및 중배엽 형성에 대한 전체 스코어가 생기게 하는, 다른 시험 화합물에 대한 단일 마커 발현에 대한 이의 영향에 대한 스코어가 부여되었다. 더 높은 스코어는 특정 계통 (예를 들어 중내배엽, 내배엽 또는 중배엽) 으로부터의 마커 유전자가 고도로 발현되었다는 것을 나타내었다. 각 화합물에 대한 스코어는 하기와 같이 측정되었다: 특정 화합물 + 액티빈 A 의 존재 하 성장한 세포와, 액티빈 A 단독 중에서 성장한 세포 사이의 마커 유전자 발현을 비교하였다. 발현 수준의 비가 <1 인 경우, 마커 유전자에는 0 의 스코어가 주어졌다. 발현 수준의 비가 1 과 모든 화합물의 중간 발현 수준 사이인 경우, 마커 유전자에는 1 의 스코어가 주어졌다. 발현 수준이 모든 화합물의 중간 발현 수준과 최대 발현 수준의 70% 사이인 경우, 마커 유전자에는 2 의 스코어가 주어졌다. 발현 수준의 비가 모든 화합물의 최대 발현 수준의 70% 와 모든 화합물의 최대 발현 수준 사이인 경우, 마커 유전자에는 3 의 스코어가 주어졌다. 모니터링된 내배엽 마커 유전자는 CER1 CXCR4 FGF17 FoxA2 HNF1B SOX17 이고; 모니터링된 중배엽 마커 유전자는 BMP4, ISL1, KDR, HAND1 이고; 모니터링된 중내배엽 마커 유전자는 DKK1, EOMES, MIXL1, GATA4, GATA6, LHX1, WNT3a, T, GSC, TBX6 이었다.
이러한 분석 결과를 도 24 에 나타낸다. MTORC1 및 이중 PI3K/MTOR 저해제는 중내배엽 마커의 가장 높은 발현을 유도하였다. MTORC1/2 및 AKT 저해제는 이중 PI3K/MTOR 저해제와 비교하여 중내배엽 형성에 대해 강력한 영향을 나타내지 않았다. 유도된 이중 PI3K/MTOR 저해제는 내배엽 마커의 가장 높은 발현을 유도하였다. 그러나 실시예 10 에서 이미 나타낸 바와 같이, 상이한 PI3K/MTOR 저해제는 각각의 내배엽 마커 유전자의 발현 수준에 대해 상이한 영향을 가졌으며, 이중 PI3K/MTOR 저해제와 mTORC1 사이의 차이는 마커에 의해 대략적으로 상당히 좌우되었다.
도 25 에서 나타낸 바와 같이, 각각의 내배엽 마커의 발현 수준은 시험한 각각의 화합물에 의해 상이하게 영향받는다. 흥미롭게도, MTORC1 저해제는 SOX17 및 FOXA2 와 같은 중요한 내배엽 유전자 발현을 증가시킬 수 있었으나, 그 중에서도 CXCR4 는 그 발현이 MTORC1 저해제에 의해 증가되지 않은 중요한 내배엽 마커 유전자였다. MTORC1 저해제는 일부 이중 PI3K/MTOR 저해제와 비슷한 수준에서 기준선에 비해 SOX17 및 FoxA2 발현을 증가시켰다. 그러나, MTORC1 저해제는 CXCR4 발현을 증가시키지 않았는데, 이는 실시예 10 에 나타낸 CXCR4 발현에 대한 PI3K 저해의 중요성을 확인시켰다. 중배엽 마커 유전자 발현에 대해서, MTORC1 저해제는 이중 PI3K/MTOR 저해제보다 훨씬 더 높은 스코어를 나타내었다. 흥미롭게도, MTORC1 저해제는 내배엽 마커 유전자 SOX17 및 FOXA2 의 발현을 상향조절시킬 수 있었으나, 내배엽 마커 유전자 CXCR4 의 발현은 상향조절시키지 않았다.
이들 결과는 실시예 10 에서의 관찰과 상호관련된다: mTOR 저해는 중내배엽 형성에 대해서 제 1 일에 중요한 역할을 가졌다. 제 2 일에, PI3K 및 mTOR 둘 모두의 저해는 내배엽 형성에 대해 중요하며, PI3K 알파 저해는 중배엽 형성을 방지하는데 있어서 특히 중요하다.
실시예 13: 간세포 분화
간세포 마커
다양한 세포-유형 특이적 마커를 사용하여 내배엽 세포의 간세포로의 분화를 하기 기재한 유세포 분석 및 형광 영상화 실험에 의해 모니터링하였다. 내배엽 전환을 검출하기 위해, 내배엽-유래 세포 샘플을, 간세포에 의해 발현되나 내배엽 세포에 의해 발현되지는 않는 AFP 또는 HNF4a 단백질의 발현에 대해 염색하였다.
간세포 분화 프로토콜
미분화 인간 배아 줄기 세포 (hESC 를 TesRTM2 배지 (STEMCELLTM Technologies #05860) 중 적격 마트리겔 피더 층 (BD, #354277) 상에서 40,000 세포/cm2 의 밀도로 유지시켰음). 배양물을 주 2 회 수동으로 계대하였다. 내배엽 분화를 준비하기 위해, hESC 세포를 밤새 TesRTM2 배지에 계대하였다. 다음날, TesRTM2 배지를 기본 배지 (B27 (Invitrogen, #17504-044) 이 보충된 DMEM/F12 + Glutamax (Invitrogen, #10565)) 로 교체하였다. 기본 배지에 100 μg/ml 인간 액티빈 A (Peprotech, #120-14) 및 750nM 화합물 A 를 보충하였다. 3 일 처리 후, hES-유래 내배엽 세포를 간모세포 배지 (B27 (Invitrogen, #17504-044) 이 보충된 DMEM/F12 + Glutamax (Invitrogen, #10565)) 중에서 분화시켰다. 표시한 경우, 간모세포 배지에 10, 20 또는 40 ng/ml 의 재조합 인간 FGF2 (Peprotech, #AF-100-18B); 10, 20 또는 40 ng/ml 의 재조합 인간 FGF4 (Peprotech, #AF-100-31); 20, 40 또는 60 ng/ml 재조합 인간 BMP2 (Peprotech, #AF-120-02); 20, 40 또는 60 ng/ml 재조합 인간 BMP4 (Peprotech, #AF-120-05); 또는 0.25% 또는 0.5% DMSO 를 보충하였다. 10-일 처리 후, TrypLE 를 사용하여 내배엽-유래 세포를 수확하였다. 간략하게, 세포를 PBS 중에서 1 회 세척하고, TrypLE 와 함께 5 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 세포를 이후 PBS 로 10-배 희석하고, 펠렛화하고, 추가 분석을 위해 준비하였다.
유세포 분석 프로토콜
유세포 분석 연구 전에, Accutase-분리 내배엽-유래 세포 샘플을 항-AFP 1 차 항체, 그 이후 2 차 항체로 염색하였다.
수확한 내배엽-유래 세포를 저온 DPBS 로 세척하였다. 세포를 고정 완충액 (BD, #554655) 중 25 분 동안 4℃ 에서 고정하고, 사포닌-기재 Perm/Wash Buffer I (BD, #557885) 로 15 분 동안 침투시키고, 침투화 완충액 중 마우스 단일클론 항-AFP 클론 C3 IgG2a (Sigma, #A8452) 의 1:500 희석물로 염색하였다. 실온에서 30 분 인큐베이션 후, 세포를 침투화/세척 완충액 중에서 2 회 세척한 후, 20 μl 의 랫트-항-마우스 IgG2a-PE 2 차 항체 (BD, #340269) 로 25 분 동안 실온에서 염색하였다. 세포를 유세포 분석 연구 전에 침투화/세척 완충액 중에서 3 회 더 세척하였다.
또한, 액티빈 A 및 화합물 A 가 보충된 기본 배지 중에서 배양된 내배엽 세포를 음성 대조군으로서 염색하였다. 잘 분화된 간세포 암종에서 유래한 HepG2 세포를 또한 양성 대조군으로서 염색하였다. 세포를 상기 기재한 바와 같이 유세포 분석기를 통해 분석하였다. 샘플 당 대략 1.5 x 106 세포를 분석하였다.
영상화 프로토콜
면역형광 영상화 전에, 내배엽-유래 세포 샘플을 염색하여 AFP 발현을 검출하였다. 먼저, 세포 샘플을 내배엽 분화를 위한 방법 및 재료에서 상기 기재한 바와 같이 항체 염색을 위해 준비하였다. AFP 발현이 검출된 세포 샘플을 밤새 4℃ 에서 블로킹 완충액 중 마우스 항-AFP 클론 C3 1 차 항체 (Sigma, #A8452) 의 1:500 희석물 중에서 인큐베이션하였다. HNF4a 발현이 검출된 세포 샘플을 밤새 4℃ 에서 블로킹 완충액 중 토끼 단일클론 항-HNF4a 클론 C11F12 (Cell Signaling, #3113) 의 1:100 희석물 중에서 인큐베이션하였다. 그런 다음, 항-AFP 항체로 염색한 세포를 2μg/ml 염소 항-마우스-Alexa488 2 차 항체 (Invitrogen, #A11029) 와 함께 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 항-HNF4a 항체로 염색한 세포를 2μg/ml 염소 항-토끼-Alexa594 2 차 항체 (Invitrogen, #A11037) 와 함께 동일한 인큐베이션 조건 하에 인큐베이션하였다.
염색한 세포를 내배엽 세포에 대해 상기 기재한 바와 같이 영상화하였다.
실시예 14: 성장 인자 부재 하 간세포 분화
내배엽 세포를 상이한 조합의 성장 인자로 처리하고, 간세포로 분화하는 능력에 대해 시험하였다. hESC 는 상기 기재한 바와 같이 내배엽 세포로 분화되었다. 액티빈 A 및 화합물 A 가 보충된 기본 배지 중에서 3 일 후, 내배엽 세포를 간모세포 배지 중 마트리겔 상에서 배양하였다. 배지에 10, 20 또는 40 ng/ml 의 재조합 인간 FGF2; 10, 20 또는 40 ng/ml 의 재조합 인간 FGF4; 20, 40 또는 60 ng/ml 재조합 인간 BMP2; 20, 40 또는 60 ng/ml 재조합 인간 BMP4; 또는 0.25% 또는 0.5% DMSO 를 보충하였다. 액티빈 A 및 화합물 A 와 함께 3 일 동안 배양하여 수득한 내배엽 세포의 대조군 샘플을 임의의 추가적 성장 인자의 부재 하에 간모세포 배지 중에서 추가 배양하였다. 처리 10 일 후, 내배엽-유래 세포를 상기 기재한 바와 같은 유세포 분석 및 영상화 분석을 위해 준비하였다. 줄기 세포를 제외하고, 상기 기재한 모든 조건 하에 배양한 내배엽 세포는 간세포로 분화되었다.
액티빈 A 및 화합물 A 로 처리하여 수득한 내배엽 세포가 간세포로 분화될 수 있었는지를 확인하기 위해, 상기 실험을 반복하였다. 액티빈 A 단독으로 배양하여 수득한 내배엽 세포를 임의의 추가적인 성장 인자의 부재 하에 간모세포 배지 중에서 배양한 추가적인 대조군 샘플을 제조하였다. 각각의 배양물 중 배지를 2 일 마다 교환하고, 세포를 수확하고 유세포 분석 연구를 위한 제조에서 염색하였다.
이러한 분석 결과를 도 14 에 나타낸다. 이후 FGF4 및 BMP2 의 부재 하 간모세포 배지 중 배양한, 액티빈 A 단독으로 처리하여 수득한 내배엽 세포는 단지 7.65% 의 내배엽-유래 세포만이 AFP 를 발현하여, 낮은 간세포 발현을 나타내었다. 반대로, 이후 FGF4 및 BMP2 의 부재 하 간모세포 배지 중 배양한, 액티빈 A 및 화합물 A 의 존재 하에 배양하여 수득한 내배엽 세포는 증가된 간세포 분화를 나타내었다 (56.79% 의 세포가 AFP 를 발현). 이는 내배엽 분화 동안 PI3K 알파 저해제 화합물 A 의 첨가가 간세포 전환을 크게 증진시킨다는 것을 나타낸다.
액티빈 A 및 화합물 A 로 처리되고 FGF4 및 BMP2 처리 없이 분화된 내배엽 세포에서 유래한 간세포는, 이후 FGF4 및 BMP2 를 함유하는 간모세포 배지 중 배양한, 액티빈 A 및 화합물 A 의 존재 하에 배양하여 수득한 내배엽 세포에서 유래한 간세포에 비해 (53.49% (약 53%) 의 세포가 AFP 를 발현), 증가된 간세포 전환을 나타내었다 (56.79% (약 56%) 의 세포가 AFP 를 발현). 이후 추가적인 성장 인자 없이 배양한, 액티빈 A 및 화합물 A 의 존재 하에 배양하여 수득한 내배엽 세포 유래의 간세포에 있어서 AFP 발현 수준은 HepG2 세포 집단에서의 AFP 발현 수준과 비슷했다. 이들 결과는, 액티빈 A 및 화합물 A 로 처리하여 수득한 내배엽이 성장 인자 첨가 없이도 높은 효율로 간세포로 분화될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 15: 간세포의 특징화
시간 경과 실험을 수행하여, 시간의 흐름에 따른 hESC-유래 간세포의 AFP 발현을 측정하였다. 간략하게, hESC 는 상기 기재한 바와 같이 내배엽 세포로 분화되었다. 액티빈 A 및 화합물 A 가 보충된 기본 배지 중에서 3 일 후, 내배엽 세포를 간모세포 배지 (B27 (Invitrogen, #17504-044) 이 보충된 DMEM/F12 + Glutamax (Invitrogen, #10565)) 중 마트리겔 상에서 배양하였다. 배지를 하루 걸러 교환하였다. 세포의 2 개 샘플을 제조하였다. 세포의 1 번째 샘플을 제 10 일에 수확하고, 상기 기재한 바와 같이 유세포 분석 연구를 위한 제조에서의 항-AFP 로 염색하였다. 세포의 2 번째 샘플을 제 20 일에 수확하고 유세포 분석을 위해 제조하였다. 도 15 에서 나타낸 바와 같이, 제 10 일 (즉, 60%) 에서보다 제 20 일 (즉, 30%) 에서 줄기 세포 유래 간세포 집단에서의 더 적은 세포가 AFP 를 발현하였다. 이들 결과는 hESC-유래 간세포의 성숙을 나타낸다.
도 16 은 AFP 수준을 측정하는 실험 결과를 나타낸다. 제 0 일 - 제 3 일: 액티빈 A 또는 액티빈 A + PI3K 저해제. 제 4 일 - 제 10 일: DMEM/F12 + Glutamax + B27. 분화 제 10 일에, 배지를 교환하였다. 24 시간 후, 배지를 1/500 (상기 범위 내에 있음) 로 희석하고 AlphaLisa 에 의해 분석하였다. PI3K 저해제가 내배엽 단계에서 사용되지 않는 경우, AFP 수준은 매우 낮다. PI3K 저해제가 내배엽 단계에서 사용되는 경우, 배수는 거의 100 (1/500 희석된 샘플에 대해) 이다. 데이터를 배수로 표현함으로써 상이한 샘플 / 실험의 비교가 가능하다. 배수 = 세포와 접촉한 신호 배지 / 세포와 접촉하지 않은 신호 원자재 배지.
도 17 은 제 20 일에서 줄기 세포 유래 간세포 상의 알부민 및 HNF4a 를 측정하는 결과를 나타낸다. 제 20 일 에서의 줄기 세포 유래 간세포 집단: 제 0 일 - 제 3 일 : 액티빈 A + PI3K 저해제 (화합물 A). 제 3 일 - 제 20 일: 기본 배지 (DMEM/F12 + glutamax + B27).
또한, 하기 흐름도에서 나타낸 바와 같이, 간세포 선조로 전환하는 AA 및 AP 세포의 능력을 평가하였다:
AA 세포: 줄기 세포 → (액티빈 A) → 내배엽 → 간세포
AP 세포: 줄기 세포 → (액티빈 A + 화합물 A) → 내배엽 → 간세포
AFP, 특이적 태아 간 마커의 발현 (Roelandt, et al. (2010). "Human embryonic and rat adult stem cells with primitive endoderm-like phenotype can be fated to definitive endoderm, and finally hepatocyte-like cells." PLoS One, 5(8): e12101) 을 사용하여 간세포 선조 세포를 확인하였다. 성숙 간세포 마커 유전자 예컨대 알부민, A1AT 뿐 아니라 CK18 의 발현 수준 (Miki, T. (2011). Hepatic differentiation of human embryonic and induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. In M. Kallos (Ed.), Embryonic Stem cells - Differentiation and pluripotent alternatives (pp. 303-320). InTech .) 을 또한 모니터링하여 추가 분화된 세포를 확인하였다. 이들 마커 중 아무것도 AA 또는 AP 내배엽 세포에서 제 3 일에 면역형광에 의해 검출되지 않았다. 분화 제 13 일에, AA 및 AP 집단은 상이한 수준의 마커 발현을 나타내었다. 유세포 분석기에 의한 분석으로, FoxA2 및 AFP 발현이 AA 세포에서 검출되지 않은 반면, AP 세포는 60% 의 FoxA2 발현 세포 및 거의 50% 의 AFP 발현 세포를 포함하였다는 것이 나타났다 (하기 표 7 참고).
표 7
Figure pat00058
배지 중 AFP 및 알부민 분비를 AlphaLisa 검정에 의해 상이한 시점에서 검출하였다 (도 33 및 34). AFP 분비는 AA 및 AP 세포 모두에 대해 제 10 일이 되자마자 증가하기 시작하고, 제 14 일에 정체기에 도달하였다. AP 세포에 대한 AFP 분비는 제 14 일 및 제 20 일에 거의 8,000 ng/ml/일이었는데, 이는 AA 세포보다 13 배 더 높은 것이었다. 알부민, 성숙 간세포에 대한 마커를 분화에 있어서 늦게 배지 중에서 검출하였다. AA 세포에 대해서, 알부민 분비 증가는 제 20 일에 검출되었다. AP 세포에 의한 알부민 분비는 제 14 일이 되자마자 검출되었으며, 제 20 일에서의 알부민 분비 수준은 AA 세포에 비해 상당히 증가하였다. 알부민 분비는 AP 세포에 대해 거의 3,000 ng/ml 에 도달하였는데, 이는 동일한 시점에서의 AA 세포보다 15 배 더 높은 것이었다. AlphaLisa 를 통해, A1AT 분비에 대하여 유사한 시간 경과 실험을 수행하였다. AA 세포에 대해서, A1AT 분비 수준은 시험한 모든 시점에서 검출 한계 미만이었다. 반대로, A1AT 분비는 제 10 일이 되자마자 AP 세포에서 검출가능하였으며 제 20 일에 6000 ng/ml/일에 도달하였다 (도 35). 제 20 일에서 AA 와 AP 세포 사이의 이러한 상당한 차이는 또한 면역형광을 통해 나타났다. 제 20 일에, AA 세포는 AFP 를 발현하였으나 단지 소부분의 세포만이 나머지 마커를 발현하였다. 대다수의 AP 세포는 FoxA2, HNF4a, AFP, 알부민, A1AT 및 CK18 을 제 20 일에 발현하였다. 알부민, A1AT 및 Ck18 의 높은 발현은 AP 간세포-유사 세포가 보다 성숙한 표현형을 갖는다는 것을 나타낸다. 유전자 발현 분석으로, AFP, 알부민 및 A1AT 의 발현 및 AP 세포에서 시간의 흐름에 따른 그의 증가된 발현을 확인하였다 (도 38). 내배엽 마커, SOX17 및 CXCR4 는 제 10 일로부터 AP 세포에서 하향조절되었다 (도 36). 유전자 발현 분석은 또한 AP-간세포 유사 세포에서의 추가적인 간 마커: 간 특이적 마커, AFM 및 AGTX, CYP 효소 예컨대 CYP2C19, CYP2C9, CYP3A4, CYP3A7, CYP7A1, 상 II 대사 효소 예컨대 GSTA1분비 단백질 예컨대 SERPINA1, SERPINA3, SERINA7, TAT, FABP1, 전사 인자, HNF4a, HNF1B, C/EBPa, HNF1A, FOXA2, FOXA1, 운반체 예컨대 SLCO2B1 및 표면 단백질 예컨대 IL6R 및 VCAM1 의 발현을 나타내었다 (도 37). 간 마커의 발현은 AA 분화 세포에서보다 AP-간세포 유사 세포에서 더 높았다 (도 37).
CYP 활성을 또한 질량 분석법을 통해 분석하였다. AP 세포는 제 24 일에서 AA 세포보다 더 높은 CYP1A1/2, CYP2B6, CYP3A4/5 활성 및 알데히드 옥시다아제 (AO) 활성을 가졌다 (도 38). 더욱이, CYP1A1/2 활성은 10 μM 리팜피신 + 1 mM 페노바르비탈 + 1 μM 3-메틸콜란트렌 (3MC) 에 의해 AP 에서 유도가능하였다 (도 39).
따라서, AP 내배엽 세포는 다분화능이었으며 계통 특이적 마커를 발현하는 간세포로 분화될 수 있었다.
실시예 16: 췌장 선조 세포 및/또는 췌장 세포로의 내배엽 세포 분화
다분화능 내배엽 세포는 다양한 세포 계통, 예를 들어 간세포, 폐 세포, 장 세포, 췌장 선조 세포 및 췌장 세포로 분화될 수 있다. 상기 기재한 바와 같이 생성된 내배엽 세포를 상이한 조합의 성장 인자로 처리하고 췌장 선조 세포로 분화되는 그의 능력에 대해 시험하는 실험을 수행하였다.
줄기 세포를 액티빈 A 및 화합물 A 의 존재 하에 상기 기재한 바와 같이 배양하였다. 내배엽 분화 3 일 후, 세포는 췌장 세포로 추가 분화되었다. 내배엽 세포를 50 ng/ml FGF10 (Peprotech), 20 ng/ml FGF7 (Peprotech), 100 ng/ml 노긴 (Peprotech) 및 헤지호그 저해제와 함께 3 일 동안 배양하였다. 세포를 2uM 레티노산 (Sigma) 을 첨가한 동일 칵테일 중에서 추가 4 일 동안 배양하였다. 이 단계에서, 췌장 선조 (제 10 일) 를 1uM Notch 저해제 DAPT (Sigma), 10 mM 니코틴아미드 (Sigma) 및 50 ng/ml 엑센딘 4 (Tocris) 와 함께 3 일 동안 배양하였다. 성숙을 위해, 세포를 50 ng/ml 엑센딘 4, 50 ng/ml EGF (R&D) 및 50 ng/ml IGF1 (R&D) 중에서 추가 7 일 동안 배양하였다.
하기 흐름도에서 나타낸 바와 같이, 췌장 선조 세포로 전환시키는 AA 및 AP 세포의 능력을 평가하였다:
AA 세포: 줄기 세포 → (액티빈 A) → 내배엽 → 췌장 선조 세포
AP 세포: 줄기 세포 → (액티빈 A + 화합물 A) → 내배엽 → 췌장 선조 세포
분화 제 12 일에, 세포 형태에 있어서의 유의한 차이가 AA 및 AP 세포 사이에 이미 분명했다. 예를 들어, 제 12 일에, AA 및 AP 세포 모두는 클러스터를 형성하였다. 그러나, AP 세포에서 유래한 클러스터는 AA 세포에서 유래한 클러스터보다 수가 더 많고 더 컸다.
Pdx1, 특이적 췌장 마커의 발현을 사용하여, 췌장 계통에 속하는 분화 세포를 확인하였다. 유전자 발현 분석 결과는 제 13 일에 AP 세포와 AA 세포 사이의 Pdx1 발현 수준에 있어서 유의한 차이를 나타내었고: AP 세포에서의 Pdx1 발현은 AA 세포에 비해 AP 세포에서 15 배 더 높았다 (도 30B). 추가 성숙 후 (제 20 일), 인슐린 및 글루카곤 발현을 AP 세포의 다수 클러스터 중에서 면역형광에 의해 검출하였다. 반대로, 소수 AA-유래 세포는 인슐린 또는 글루카곤 염색을 나타내었다. AP 집단에서 유래한 췌장 선조 세포 클러스터는 또한 C 펩티드 염색에 대해 양성이었는데, 이는 데노보 (de novo) 인슐린 생성을 나타낸다. 반대로, AA 집단에서 다만 소수의 세포가 C 펩티드를 발현하였다. 유전자 발현 데이터 (도 31) 로, 인슐린 및 글루카곤이 AA-유래 췌장 세포보다 AP-유래 췌장 세포에서 보다 고도로 발현되었다는 것을 확인하였다. 추가적인 췌장 마커, 예컨대 ARX, GLIS3, HNF1a, HNF1b, HNF4a, KRT19, MNX1, RFX6, SERPINA3, ONECUT1, NKX2-2 의 발현 수준을 또한 AP-유래 및 AA-유래 췌장 세포에서 모니터링하였고, 도 31 에서 나타낸 바와 같이, 이들 마커의 발현은 AA-유래 세포에서보다 AP-유래 세포에서 더 높았다. 내배엽 유전자 마커 SOX17 및 CXCR4 는 제 10 일로부터 하향조절되었고, FoxA2 는 분화 전체에 걸쳐 유지되었다 (도 32). 전장 발생에 대한 유전자 마커, HNF4a 및 HNF1b (Naujok, et al. (2011). "Insulin-producing Surrogate β-cells From Embryonic Stem Cells: Are We There Yet?" Molecular Therapy, 19(10), 1759-1768; Kroon et el. (2008). "Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo." Nat Biotechnol, 26(4), 443-452; 및 D'Amour et al. (2006). "Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells." Nat Biotechnol, 24(11), 1392-1401) 가 분화 초기에 발현되었다. 후부 전장 마커, MNX1 (=HLXB9) (Naujok et al.; Kroon et al.; 및 D'Amour et al.) 는 제 10 일에 최고치였다. 췌장 내배엽 마커, 예컨대 NKX2.2 (Naujok et al.; Kroon et al.; 및 D'Amour et al.) 및 ONECUT1 (=HNF6) 은 제 14 일에 발현 최고치에 도달하였다. 마침내, 호르몬 세포 마커, INS, GLC 및 SST 의 발현이 제 14 일에 검출되기 시작하였다. 특이적 췌장 계통 마커의 발현으로, AP 세포가 췌장 세포로 분화 가능하다는 것이 확인되었다.
3 차원적 배양의 가능성을 탐색하기 위해서, AA 및 AP 내배엽 세포를 현탁액 중 추가 분화시켰다. AA 및 AP 내배엽 세포는 이러한 전이 후 매우 상이하게 거동하였다. AA 내배엽 세포는 현탁액 중 단일 세포인 채로 있는 한편, AP 세포는 제 6 일이 되자마자 클러스터를 형성하였다. 세포 생존력 검정 (도 30A 참고) 은, AA 내배엽 세포가 분화 제 6 일에 현탁액 중에서 불량한 생존력을 가졌다는 것을 나타내었다. 그러나 AP 내배엽 세포는 클러스터 내에서 생존가능했다. AP-유래 클러스터는 제 13 일에 Pdx1 발현에 대해 양성이었는데, 이는 상기 세포가 발생적으로 췌장 계통에 속한다는 것을 나타낸다 (도 30B). 또한, 췌장 세포로 분화하는 세포만이 클러스터 형성에 의해 현탁액 중에서 생존가능하게 남아 있는 것으로 보인다.
실시예 17: 췌장 외분비 세포 및 췌장 췌관 세포의 췌장 선조 세포로부터의 분화
췌장 선조 세포를 상기 기재한 바와 같이 생성시켰다. [Shirasawa, S. et al. (2011). "A novel stepwise differentiation of functional pancreatic exocrine cells from embryonic stem cells." Stem Cells Dev, 20(6): 1071-1078] 에서 기재된 바와 같은 성장 인자, 예를 들어 글루카곤-유사-펩티드 1 (GLP1), [Delaspre, et al. (2013). "Directed pancreatic acinar differentiation of mouse embryonic stem cells via embryonic signaling molecules and exocrine transcription factors." PLoS One, 8(1), e54243] 에서 기재된 바와 같은 덱사메타손 및 도르소모르핀과 같은 화합물 및/또는 이의 조합을 췌장 선조 세포 배양물에 첨가하여 췌장 외분비 세포를 형성시킨다.
췌장 췌관 세포를 생성시키기 위해서, 상기 기재된 바와 같이 생성된 췌장 선조 세포를 [Rhodes, J. A., Criscimanna, A., & Esni, F. (2012). "Induction of mouse pancreatic ductal differentiation, an in vitro assay." In Vitro Cell Dev Biol Anim, 48(10), 641-649] 에서 기재된 바와 같이 EGF, FGF10, PDGF-AA 와 함께 배양한다.
실시예 18: 폐 선조 세포, 갑상선 선조 세포 및 기도 선조 세포의 내배엽으로부터의 분화
내배엽 세포를 상기 기재된 바와 같이 생성시켰다. [Longmire, et al. (2012). "Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells." Cell Stem Cell, 10(4), 398-411] 에서 기재된 바와 같이, 기본 배지에 100 ng/ml 노긴 및 10 mM SB431542 (TGF베타 저해제) 를 보충한다. 24 시간 후 배지를 Nkx2-1 유도 배지: 100 ng/ml mWnt3a, 10 ng/ml mKGF, 10 ng/ml hFGF10, 10 ng/ml mBMP4, 20 ng/ml hEGF, 500 ng/ml mFGF2 및 100 ng/ml 헤파린 나트륨 염 (Sigma) 이 보충된 cSFDM 으로 교체한다. 이후 세포를 mFGF2 (500 ng/ml), hFGF10 (100 ng/ml) 및 100 ng/ml 헤파린 나트륨 염 (Sigma) 이 보충된 cSFDM 중에서 7 일 동안 배양한다. 제 22 일에, 세포를 폐 성숙 배지 : Ham's F12 배지 +15 mM HEPES (pH 7.4) + 0.8 mM CaCl2 + 0.25% BSA + 5 mg/ml 인슐린 + 5 mg/ml 트랜스페린 + 5 ng/ml Na 셀레나이트 + 50 nM 덱사메타손 + 0.1 mM 8-Br-cAMP + 0.1 mM IBMX + 10 ng/ml KGF 중에서 배양한다.
대안적으로, 내배엽 세포를 상기 기재된 바와 같이 생성시킨 후 [Mou, et al. (2012). "Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell Stem Cell, 10(4), 385-397] 에서 기재된 바와 같이 처리한다. 간략하게, 내배엽 분화 제 3 일에, 세포를 4 uM 도르소모르핀 (BMP 저해제) 또는 20 ng/ml BMP4 의 존재 또는 부재 하에 500 nM A-83-01 (TGF 베타 저해제) 에 3 일 동안 노출시켰다. 그런 다음, 세포를 10 ng/ml BMP4, 20 ng/ml FGF2 + 10 nM GSK3iXV 에 2-3 일 동안 노출시켰다. 기도 선조 세포를 수득하기 위해, 세포를 20 ng/ml BMP7, 20 ng/ml FGF7, 100 nM IWR-1 (WNT 안타고니스트) 및 1 mM PD98059 중에서 2 일 동안 배양하였다.
실시예 19: 장 선조 세포의 내배엽으로부터의 분화
내배엽 세포를 상기 기재된 바와 같이 생성시켰다. [Spence, et al. (2010). "Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro." Nature, 470(7332), 105-109] 에서 기재된 바와 같이, 내배엽 세포를 500 ng/ml FGF4, 500 ng/ml WNt3a 로 4 일까지 동안 처리한다. 이 기간 동안 형성되는 세포 콜로니를 500 ng/ml R-spondin1, 100 ng/ml 노긴 + 50 ng/ml EGF 가 보충된 마트리겔에 옮긴다.
대안적으로, 내배엽 세포를 상기 기재된 바와 같이 생성시킨 후 [Cheng, et al. (2012). "Self-renewing endodermal progenitor lines generated from human pluripotent stem cells." Cell Stem Cell, 10(4), 371-384] 에서 기재된 바와 같이 처리한다. 간략하게, 분화 제 3 일에, 내배엽 세포를 BMP4 (500 ng/ml) 및 FGF4 (500 ng/ml) 로 2 일 동안 처리하여 콜로니를 형성시킨다. 이후, 37℃ 에서 1 시간 동안 마트리겔을 콜라게나아제 B 처리로 소화시켜 콜로니를 수확한다. 그런 다음 콜로니를, FGF4 (50 ng/ml), Wnt3a (100 ng/ml), R-spondin1 (500 ng/ml), EGF (50 ng/ml) 및 노긴 (100 ng/ml) 이 보충된 미희석 마트리겔 (BD) 과 혼합한다.

Claims (3)

  1. 하기를 포함하는, 독성에 대해 후보 약물을 스크리닝하는 방법:
    간세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에, 내배엽 세포 집단에서의 83% 이상의 세포가 SOX17 을 발현하고, 집단에서의 77% 이상의 세포가 FoxA2 를 발현하거나, 집단에서의 76% 이상의 세포가 CXCR4 를 발현하는 내배엽 세포 집단을 배양하는 것을 포함하는, 간세포 집단의 수득 방법에 의해 수득한 간세포 집단을 후보 약물과 접촉시키고,
    독성에 대해 간세포를 모니터링하고,
    이로써 후보 약물이 독성인지 여부를 확인함.
  2. 하기를 포함하는, 독성에 대해 후보 약물을 스크리닝하는 방법:
    줄기 세포 집단을 유효량의 PI3K 알파의 선택적 저해제 및 유효량의 액티빈 A 와 함께 배양하고, 간세포 집단을 수득하기에 충분한 조건 하에 세포를 배양하는 것을 포함하는, 간세포 집단의 수득 방법에 의해 수득한 간세포 집단을 후보 약물과 접촉시키고,
    독성에 대해 간세포를 모니터링하고,
    이로써 후보 약물이 독성인지 여부를 확인함.
  3. 제 2 항에 있어서,
    간세포 집단을 수득하기에 충분한 조건이 유효량의 액티빈 A 를 함유하며 다른 성장 인자를 함유하지 않는 배지에서 내배엽 세포를 배양하는 것을 포함하는 것인, 독성에 대해 후보 약물을 스크리닝하는 방법.
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