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KR20160021823A - 렉틴-유사 산화된 ldl 수용체1 항체 및 사용 방법 - Google Patents

렉틴-유사 산화된 ldl 수용체1 항체 및 사용 방법 Download PDF

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KR20160021823A
KR20160021823A KR1020167000868A KR20167000868A KR20160021823A KR 20160021823 A KR20160021823 A KR 20160021823A KR 1020167000868 A KR1020167000868 A KR 1020167000868A KR 20167000868 A KR20167000868 A KR 20167000868A KR 20160021823 A KR20160021823 A KR 20160021823A
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커트 알렉스 헬드와인
이고르 스플라우스키
제니퍼 브로그돈
조슈아 골드스타인
윌리엄 돌
존 트라우거
총후이 장
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노파르티스 아게
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Abstract

본 발명은 인간 렉틴-유사 산화된 LDL (저밀도 지단백질) 수용체 1 (이하에서, 때로는 "LOX-1"로 언급됨)에 결합하는 모노클로날 항체 및 그를 포함하는 제약 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다.

Description

렉틴-유사 산화된 LDL 수용체1 항체 및 사용 방법 {LECTIN-LIKE OXIDIZED LDL RECEPTOR1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
혈관 질환은 전세계 이환율 및 사망률의 주요 원인 중 하나로 남아있다. 통상의 위험 인자를 표적화하는 약물은 일부의 혈관 위험을 낮춘다. 그러나, 실험 및 임상 데이터는 다른 신규 인자가 관상동맥, 뇌 및 말초 동맥 질환 및 그의 임상 징후에 대한 대부분의 위험을 설명할 수 있는 것으로 시사한다.
스캐빈저 수용체에 의해 매개되는 산화 변형된 저밀도 지단백질 (LDL) 입자 (oxLDL)의 혈관 세포에 의한 흡수의 조절이상은 아테롬발생의 결정적인 단계인 것으로 간주된다. 스캐빈저 수용체는 산화된 지질의 흡수를 매개하는 것 이외에도, 내피 세포 및 대식세포의 활성화에 수반되며 아테롬성동맥경화증 및 플라크 미란/파열의 진행 뿐만 아니라 손상된 조직 관류 및 산소 전달/이용을 갖는 미세혈관 기능장애로 이어져 심근 또는 하지 허혈을 유발하는 산화촉진 및 염증유발 신호전달 경로의 활성화를 매개할 수 있다.
렉틴-유사 산화된 저밀도 지단백질 수용체 1 (LOX-1)은 혈관 내피 세포, 단핵구 및 대식세포, 혈관 평활근 세포 및 혈소판 상에서 발현되는 다중기능적 스캐빈저 수용체이다. LOX-1은 oxLDL 및 다른 산화된 지질에 결합하여, NADPH 옥시다제의 활성화 및 슈퍼옥시드 음이온을 비롯한 반응성 산소 종의 생성을 유발한다. 슈퍼옥시드 음이온은 내피 산화질소를 불활성화하고, MAP 키나제 및 NF-κB를 활성화한다. 이것은 이후 염증성 부착 분자, 시토카인 및 케모카인, 뿐만 아니라 매트릭스 메탈로프로테이나제 및 아폽토시스촉진 매개자의 발현을 유도한다.
내피 세포, 평활근 세포 및 대식세포에서의 oxLDL - LOX-1 매개된 신호전달의 염증유발, 산화촉진 및 아폽토시스촉진 결과는 아테롬성동맥경화증 및 플라크 불안정성의 진행에 있어서 주요 역할을 하는 것으로 생각되고, 또한 손상된 조직 관류 및 산소 전달에서 역할을 하여 허혈을 유발할 수 있다. 진행성 아테롬성동맥경화증 및 기관 허혈의 임상 결과는 급성 관상동맥 증후군, 심근경색, 불안정형 협심증, 졸중, 협심증, 파행 및 중증 사지 허혈을 포함한다. 또한 산화성 스트레스, 혈관 염증 및 생성된 미세혈관 기능장애는 신병증 및 망막병증을 비롯한 당뇨병성 혈관 질환의 원인이 되는 것으로 생각된다.
기저 LOX-1 내피 발현 수준은 정상 생리학적 상태 하에서 비교적 낮지만, 혈관 LOX-1 발현은 혈관 질환과 연관된 상태에서 상향조절된다. 내피 LOX-1 수준은 산화성 스트레스, 염증유발 시토카인, C-반응성 단백질 (CRP) 및 안지오텐신 II에 의해 증가되는 것으로 나타났다. LOX-1은 또한 아테롬성동맥경화성 및 당뇨병성 동물의 내피에서 및 혈관 질환을 가진 환자로부터 단리된 단핵구/대식세포에서 상향조절된다. 고혈당증, 진행성 당화 최종 산물 및 아테롬발생 지단백질은 또한 LOX-1 발현을 상향조절하여, 당뇨병과 혈관 합병증 사이의 특정한 분자 기계론적 연관성을 제공한다.
시토카인 및 CRP에 의한 LOX-1의 상향조절은 또한 고위험 환자 및 당뇨병에서 통상의 혈관 위험 인자와 가속된 혈관 질환 사이의 연관성을 시사한다. CRP 및 가용성 LOX-1 둘 다는 급성 관상동맥 증후군을 가진 환자에서 상승된다. 시험관내 데이터는 항-LOX-1 항체가 인간 대동맥 내피 세포에 대한 CRP 매개된 단핵구 부착을 방지하는 것으로 제시하였으며, 이는 추가로 혈관 염증과 관련된 부착 분자로서의 LOX-1에 대한 역할을 지지한다 (Li et al., Circulation Research 2004, 95: 877-883).
oxLDL 및 다른 산화된 지단백질의 상승된 수준과 커플링된 LOX-1의 증가된 발현은 부분적으로 NADPH 옥시다제의 활성화 및 반응성 산소 종의 생성에 의해 내피 기능장애를 유도한다. 실험적으로, 산화제 스트레스 유도된 내피 기능장애는 ApoE-녹아웃 마우스에서 중화 항-LOX-1 항체에 의해 역전될 수 있다 (Xu et al., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2007, 27:871-877). 이 연구에서, 항-LOX-1 항체는 생체이용가능한 산화질소 및 eNOS 단백질 발현 둘 다를 증가시켰다.
실험적 생체내 데이터는 산화된 지질의 존재 하에서의 혈관 및 대식세포 LOX-1의 과다발현이 산화촉진 및 염증유발 신호전달 경로를 활성화함으로써 아테롬성동맥경화증 및 미세혈관 기능장애의 원인이 된다는 것을 나타낸다. 따라서, LOX-1의 억제는 아테롬성동맥경화증 및 그의 급성 합병증, 예컨대 급성 관상동맥 증후군, 심근경색 및 불안정형 협심증의 발생 및 진행을 예방할 것으로 예상된다. 추가로 LOX-1 억제는 또한 미세혈관 기능장애를 개선하여, 조직 허혈의 임상 징후, 예컨대 만성 협심증, 불응성 협심증, 파행 및 중증 사지 허혈을 예방할 것으로 예상된다.
LOX-1 억제는 아테롬성동맥경화성 혈관 질환의 치료 및 예방, 뿐만 아니라 산화성 스트레스 및 염증을 특징으로 하는 다른 병리학적 상태, 예컨대 류마티스 관절염, 다양한 형태의 혈관염, 포도막염, 연령 관련 황반 변성의 치료, 및 자가면역 질환 (예를 들어 홍반성 루푸스, 건선)에서의 심혈관 사건의 예방에 유용하다.
요약하면, 실험 및 임상 데이터는 LOX-1이 중대한 산화된 지질 수용체 연관 산화성 스트레스, 염증 및 혈관 질환일 수 있는 것으로 시사한다. 본 발명에 기재된 항-LOX-1 항체 및 항원 결합 단편은 LOX-1에 대한 oxLDL 및 다른 산화된 지질/지단백질의 결합을 억제하여, LOX-1의 활성화를 방지함으로써, 혈관 산화성 스트레스 및 염증을 감소시킨다. 이들 항체는 혈관 질환의 급성 및 만성 징후를 예방 및 개선하고, 산화성 스트레스 및 염증을 특징으로 하는 다른 질환을 예방 및 개선할 것으로 예상된다.
본 발명은 인간 렉틴-유사 산화된 LDL (저밀도 지단백질) 수용체 1 (이하에서, 때로는 "LOX-1"로 언급됨)에 결합하는 모노클로날 항체 및 그를 포함하는 제약 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다.
본원에 기재된 단리된 항-LOX-1 항체 또는 항원 결합 단편은 100 pM 이하의 평형 해리 상수 (KD)로 LOX-1에 결합한다. 예를 들어, 본원에 기재된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 100 pM 이하, 50 pM 이하, 45 pM 이하, 40 pM 이하, 35 pM 이하의 KD로 인간 LOX-1에 결합할 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 비아코어(Biacore)에 의해 측정 시에 34 pM 이하의 KD로 또는 용액 평형 적정 검정 (SET)에 의해 측정 시에 4 pM 이하의 KD로 인간 LOX-1에 결합할 수 있고; 또한 비아코어에 의해 측정 시에 53 pM 이하의 KD로 또는 SET에 의해 측정 시에 4 pM 이하의 KD로 시노몰구스 원숭이 LOX-1에 결합할 수 있다.
본 발명은 인간 및 시노몰구스 원숭이 LOX-1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 LOX-1 C-말단 렉틴-유사 도메인 (oxLDL 결합 도메인)에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 LOX-1로부터의 아미노산 잔기 228-246 (FRVRGAVSQTYPSGTCAYI; 서열 3)을 포함하는 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 LOX-1 (서열 1)의 아미노산 잔기 Arg229 및 Arg231을 포함하는 인간 LOX-1 상의 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다.
본 발명은 또한 LOX-1에 결합하고, 추가로 표 1에 기재된 바와 같은 항체와 결합에 대해 경쟁하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 추가로 표 1에 기재된 바와 같은 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본원에 기재된 단리된 항체 및 항원 결합 단편의 결합 친화도는 용액 평형 적정 (SET)에 의해 결정될 수 있다. SET 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 하기에 추가로 상세하게 기재되어 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 단리된 항체 또는 단편의 결합 친화도는 비아코어 검정에 의해 결정될 수 있다. 비아코어 동역학 검정을 위한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 하기에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
본원에 기재된 단리된 항-LOX-1 항체 및 항원 결합 단편은 oxLDL (또한 변형된 LDL로 공지됨)에 대한 LOX-1 결합을 억제하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 단리된 항-LOX-1 항체 및 항원 결합 단편은 100 nM 이하, 50 nM 이하, 35 nM 이하, 25 nM 이하, 10 nM 이하 또는 5.2 nM 이하의 IC50으로 변형된 LDL (저밀도 지단백질)의 다중 형태에 대한 LOX-1 결합을 억제하는데 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 100 nM 이하, 50 nM 이하, 35 nM 이하, 25 nM 이하, 10 nM 이하 또는 5.2 nM 이하의 IC50으로 황산구리에 의해 산화 변형된 LDL (ox-LDL)에 대한 LOX-1 결합을 억제할 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 100 nM 이하, 50 nM 이하, 35 nM 이하, 25 nM 이하, 20 nM 이하 또는 18 nM 이하의 IC50으로 말론디알데히드 변형된 LDL에 대한 LOX-1 결합을 억제할 수 있다. 보다 구체적으로, 본원에 기재된 바와 같은 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 100 nM 이하, 50 nM 이하, 35 nM 이하, 25 nM 이하, 10 nM 이하 또는 5 nM 이하의 IC50으로 하이포클로라이트 변형된 LDL에 대한 LOX-1 결합을 억제할 수 있다.
단리된 항-LOX-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 LOX-1 및/또는 NADPH 옥시다제의 발현을 감소시키는데 사용될 수 있다 (NADPH는 NADP 또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트의 환원된 형태이다).
단리된 항-LOX-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 예를 들어 LOX-1에 대한 oxLDL의 결합을 억제하는 것을 통해 산화성 스트레스를 억제하는데 (예를 들어, 그의 유도를 차단하는데) 사용될 수 있다. 단리된 항-LOX-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 oxLDL-자극된 반응성 산소 종 (ROS) 생산을 차단하는데 사용될 수 있다. 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 사용하여 예방, 치료 또는 개선할 수 있는 혈관 산화성 스트레스는 혈관수축을 유도하고 혈관확장을 손상시키고 산소 요구를 증가시킴으로써 심근 허혈을 야기한다.
단리된 항-LOX-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 내피 산화질소 신타제 (eNOS) 수준을 건강한 항상성 상태로 회복시키는데 사용될 수 있다. 내피 NOS는 혈관에서 산화질소 (NO)를 생성하며 평활근 수축 및 혈소판 응집을 억제함으로써 혈관 긴장도를 조절하는데 수반되는 산화질소 신타제이고; 그의 하향조절은 LOX-1-관련 내피 세포 기능장애와 연관된다.
본원에 기재된 바와 같은 단리된 항-LOX-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 모노클로날 항체, 인간 또는 인간화 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 항체, Fab 단편, Fv 단편, F(ab')2 단편 또는 scFv 단편 및/또는 IgG 이소형일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 단리된 항-LOX-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 아미노산이 각각의 인간 VH 또는 VL 배선 서열로부터의 항체 프레임워크로 치환된 프레임워크를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 표 1에 기재된 Fab의 전체 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 보다 구체적으로, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Fab FF1, FF3, FF4, FF5 및 FF6의 중쇄 및 경쇄 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 추가 측면은 표 1에 기재된 Fab의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 보다 구체적으로, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Fab FF1, FF3, FF4, FF5 및 FF6의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 서열 8, 28, 48, 68 및 88로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1; 서열 9, 29, 49, 69 및 89로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2; 및 서열 10, 30, 50, 70 및 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR3을 포함하며, 인간 LOX-1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 이러한 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 18, 38, 58, 78 및 98로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1; 서열 19, 39, 59, 79 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2; 및 서열 20, 40, 60, 80 및 100으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 서열 18, 38, 58, 78 및 98로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1; 서열 19, 39, 59, 79 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2; 및 서열 20, 40, 60, 80 및 100으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3을 포함하며, 인간 LOX-1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 가지며, 여기서 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 서열 8, 9 및 10을 포함하고 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 서열 18, 19 및 20을 포함하거나; 또는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 서열 28, 29 및 30을 포함하고 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 서열 38, 39 및 40을 포함하거나; 또는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 서열 48, 49 및 50을 포함하고 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 서열 58, 59 및 60을 포함하거나; 또는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 서열 68, 69 및 70을 포함하고 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 서열 78, 79 및 80을 포함하거나; 또는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 서열 88, 89 및 90을 포함하고 LCDR1, LCDR2, LCDR3은 서열 98, 99 및 100을 포함하는 것인, LOX-1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 코티아(Chothia)에 의해 정의된 바와 같은 서열 14, 34, 54, 74 또는 94의 가변 중쇄의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 서열 24, 44, 64, 84 또는 104의 가변 경쇄의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 측면에서 항체 또는 항원 결합 단편은 카바트(Kabat)에 의해 정의된 바와 같은 서열 14, 34, 54, 74 또는 94의 중쇄 가변 도메인 서열의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 서열 24, 44, 64, 84 또는 104의 경쇄 가변 도메인 서열의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 가질 수 있다.
본 발명의 한 측면에서 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 14, 34, 54, 74 및 94로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 경쇄 가변 도메인 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인이 결합하여 LOX-1에 대한 항원 결합 부위를 형성한다. 특히 경쇄 가변 도메인 서열은 서열 24, 44, 64, 84 및 104로부터 선택될 수 있으며, 여기서 상기 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 LOX-1에 결합한다.
본 발명은 또한 서열 24, 44, 64, 84 및 104로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하며, 인간 LOX-1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 중쇄 가변 도메인 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인이 결합하여 LOX-1에 대한 항원 결합 부위를 형성한다.
특히, LOX-1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 각각 서열 14 및 24; 34 및 44; 54 및 64; 74 및 84; 또는 94 및 104의 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 가질 수 있다.
본 발명은 추가로 서열 14, 34, 54, 74 및 94로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하며, LOX-1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 한 측면에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 서열 24, 44, 64, 84 및 104로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 본 발명의 추가 측면에서, 단리된 항체 또는 항원 결합 단편은 카바트에 의해 정의된 바와 같은 및 표 1에 기재된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 갖는다.
본 발명은 또한 서열 24, 44, 64, 84 및 104로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 가지며, LOX-1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, LOX-1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열 16, 36, 56, 76 또는 96의 서열을 포함하는 중쇄를 가질 수 있다. 단리된 항체는 또한 중쇄와 결합하여 인간 LOX-1에 대한 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 경쇄를 포함할 수 있다. 특히, 경쇄는 서열 26, 46, 66, 86 또는 106을 포함하는 서열을 가질 수 있다. 특히, LOX-1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 각각 서열 16 및 26; 36 및 46; 56 및 66; 76 및 86; 또는 96 및 106의 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 가질 수 있다.
본 발명은 추가로 서열 16, 36, 56, 76 또는 96으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 중쇄를 포함하며, LOX-1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 한 측면에서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 또한 서열 26, 46, 66, 86 또는 106으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함한다.
본 발명은 추가로 서열 26, 46, 66, 86 또는 106으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄를 포함하며, LOX-1에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 제약상 허용되는 담체와 조합된 항체 조성물. 특히, 본 발명은 추가로 표 1의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 예컨대, 예를 들어 항체 FF1, FF3, FF4, FF5 및 FF6을 포함하는 제약 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한 표 1의 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중 2종 이상의 조합을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 서열 14, 34, 54, 74 및 94로부터 선택된 서열을 갖는 가변 중쇄를 코딩하는 단리된 핵산 서열에 관한 것이다. 특히 핵산은 서열 15, 35, 55, 75 및 95로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성인 서열을 갖는다. 본 발명의 추가 측면에서 서열은 서열 15, 35, 55, 75 및 95이다.
본 발명은 또한 서열 25, 45, 65, 85 및 105로부터 선택된 서열을 갖는 가변 경쇄를 코딩하는 단리된 핵산 서열에 관한 것이다. 특히 핵산은 서열 25, 45, 65, 85 및 105로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성인 서열을 갖는다. 본 발명의 추가 측면에서 서열은 서열 25, 45, 65, 85 및 105이다.
본 발명은 또한 서열 25, 45, 65, 85 및 105로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 재조합 DNA 서열 및 상기 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 제2 재조합 DNA 서열을 포함하며, 여기서 상기 DNA 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고 숙주 세포에서 발현될 수 있는 것인 단리된 숙주 세포에 관한 것이다. 항체는 인간 모노클로날 항체일 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 숙주 세포가 비-인간 포유동물 세포인 것이 고려된다.
본 발명은 또한 세포를 본원에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, LOX-1 발현 및/또는 NADPH 옥시다제 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 세포를 본원에 기재된 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량과 접촉시키는 단계를 포함하는, 인간 산화된 LDL 수용체 (LOX-1)에 대한 산화된 LDL (oxLDL)의 결합을 억제하거나 또는 세포 내로의 산화된 LDL의 인간 산화된 LDL 수용체-매개 혼입을 억제하는 방법에 관한 것이다.
세포는 인간 세포인 것으로 고려된다. 추가로, 세포는 대상체 내에 있는 것으로 고려된다. 한 실시양태에서, 세포는 내피 세포인 것으로 고려된다. 다른 실시양태에서, 세포는 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 혈관 평활근 세포 (SMC), 연골세포 및 심근세포 중 하나 이상일 수 있다. 추가로, 대상체는 인간인 것으로 고려된다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 LOX-1-연관 장애를 치료, 개선 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, LOX-1-연관 장애는 파행 (예를 들어, 간헐성 파행, 러더포드 부류 II/III 파행)과 연관된다. 한 측면에서, LOX-1-연관 장애는 협심증 (예를 들어, 불응성 협심증)과 연관된다. 대상체는 인간인 것으로 고려된다.
임의의 상기 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
용어 "LOX-1 단백질" 또는 "LOX-1 항원" 또는 "LOX-1" 또는 "Lox1"은 상호교환가능하게 사용되며, 다양한 종에서의 렉틴-유사 산화된 LDL 수용체 1 (LOX-1) 단백질을 지칭한다. 예를 들어, 인간 LOX-1은 표 1에 나타낸 바와 같은 서열 (서열 1)을 가지며, 이전의 보고서 및 문헌에 기재되었다 (Nature, Vol. 386, p. 73-77, 1997; Genomics, Vol. 54, No. 2, p. 191-199, 1998; Biochem. J., Vol. 339, Part 1, P. 177-184, 1999; 진뱅크(Genbank) 수탁번호 NP 002534). 그것은 혈관 세포에 의한 oxLDL의 흡수 및 혈관 세포에서의 oxLDL 신호전달을 매개하는 부류 E 스캐빈저 수용체이며, 이에 따라 oxLDL의 독성 효과의 매개자이다. LOX-1은 혈관 내피 세포의 표면 상에 발현되며, 혈관 내피 세포 상에 단핵구 및 대식세포의 축적과 관련되었다.
또한, 본 발명과 관련하여, 용어 "LOX-1"은 상기 언급된 보고서에 기재된 천연 1차 구조의 경우 (아미노산 서열)와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 천연 인간 산화된-LDL 수용체의 돌연변이체를 포함한다. 본원에서, 용어 "실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 천연 인간 산화된-LDL 수용체의 돌연변이체"는 이러한 돌연변이 단백질을 지칭한다.
시험관내 및/또는 생체내에서 형성된 변형된 LDL의 다중 형태는 LOX-1에 결합하는 것으로 나타났다. 본원에 사용된 용어 "변형된 LDL" 및 "산화된 LDL" (및 "oxLDL")은 다양한 화학적 및 물리적 인자 (예를 들어, 열)와 조합되어 세포, 예컨대 혈관 내피 세포에 의해 산화되는 저밀도 지단백질을 기재하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. LDL은, 예를 들어 아테롬발생 조건 하에 혈관 벽 내에서 산화되어 oxLDL을 형성한다. 용어 "변형된 LDL"은 하기를 포괄할 수 있다: 산화된 LDL, 황산구리에 의해 산화 변형된 LDL, 아세틸 LDL, 염소화 LDL (예를 들어, 화학적 염소화 반응을 통해 변형된 LDL), 미엘로퍼옥시다제 변형된 LDL, 하이포클로라이트 변형된 LDL, 숙시닐 LDL 및 말론디알데히드 변형된 LDL (즉, 생체내에서 산화성 스트레스의 결과로 생산되는, 말론디알데히드와의 반응을 통해 변형된 LDL).
본원에 사용된 용어 "항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원-결합 부분") 또는 단일 쇄를 의미한다. 전체 항체는 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 전형적 보체계의 제1 성분 (Clq)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 항체의 "항원 결합 부분" 또는 "항원 결합 단편"이라는 용어는 주어진 항원 (예를 들어, 인간 산화된 LDL 수용체 (LOX-1))에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 무손상 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 무손상 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 용어 항체의 항원 결합 부분 또는 항원 결합 단편에 포괄되는 결합 단편의 예는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; VH 도메인 또는 VL 도메인으로 이루어진 단일 도메인 항체 (dAb) 단편 (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546); 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
추가로, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되기는 하지만, 재조합 방법을 사용하여 이들이 단일 단백질 쇄가 될 수 있게 하는 인공 펩티드 링커에 의해 이들을 연결시킬 수 있으며, 여기서 VL 및 VH 영역은 쌍형성하여 1가 분자 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어 [Bird et al., 1988 Science 242:423-426; 및 Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조)를 형성한다. 이러한 단일 쇄 항체는 하나 이상의 항원 결합 부분 또는 항체의 단편을 포함한다. 이들 항체 단편은 통상의 기술자에게 공지된 통상의 기술을 사용하여 수득되고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
항원 결합 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv 내로 혼입될 수 있다 (예를 들어, [Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136] 참조). 항체의 항원 결합 부분은 피브로넥틴 유형 III (Fn3)과 같은 폴리펩티드에 기반한 스캐폴드에 그라프팅될 수 있다 (피브로넥틴 폴리펩티드 모노바디를 기재하는 미국 특허 번호 6,703,199 참조).
항원 결합 단편이 한 쌍의 탠덤 Fv 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 단일 쇄 분자 내로 혼입될 수 있고, 이는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성한다 (Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062; 및 미국 특허 번호 5,641,870).
본원에 사용된 용어 "친화도"는 단일 항원 부위에서의 항체와 항원 사이의 상호작용의 강도를 지칭한다. 각각의 항원 부위 내에서, 항체 "아암"의 가변 영역은 다수의 부위에서 항원과 약한 비-공유결합력을 통해 상호작용하고; 상호작용이 더 많을수록 친화도가 더 강해진다. 본원에 사용된 용어 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (예를 들어: Fab 단편)에 대한 "고친화도"는 일반적으로 10-9M 이하의 KD를 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 지칭한다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩된 것, 뿐만 아니라 나중에 변형되는 그러한 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카르복실 기, 아미노 기 및 R 기에 결합되는 알파 탄소를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "결합 특이성"은 단지 하나의 항원 결정기와 반응하는 개별 항체 결합 부위의 능력을 지칭한다.
어구 항체 (예를 들어, LOX-1-결합 항체)에 "특이적으로 (또는 선택적으로) 결합하는"은 단백질 및 다른 생물제제의 불균질 집단에서 동족 항원 (예를 들어, 인간 LOX-1 또는 시노몰구스 LOX-1)의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "LOX-1 매개된"은 LOX-1 수용체가 세포 표면 상의 LOX-1에 대한 LOX-1 리간드, 예를 들어 oxLDL의 결합 시에 세포 반응을 매개한 다음 세포가 특정 염증유발 분자의 생산을 증가시키도록 한다는 사실을 지칭한다. 용어 "염증유발 유전자"는 염증 과정에서 역할을 하는 임의의 분자, 예컨대 비제한적으로 시토카인, 케모카인 또는 세포-부착 분자를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 예시적인 "염증유발" 유전자는 인터류킨-8 (IL-8), 세포간 부착 분자-1 (ICAM-1), 혈관 세포 부착 분자-1 (VCAM-1) 및 단핵구 화학주성 단백질-1 (MCP-1)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "LOX-1-연관 장애", "LOX-1-연관 상태", "LOX-1의 상승된 수준과 연관된 질환 또는 상태" 또는 유사 용어는, LOX-1 단백질 수준이 비정상적으로 높고/거나 LOX-1 단백질 수준의 감소가 요구되는 임의의 수의 상태 또는 질환을 지칭한다. 이들 상태는 심혈관 장애, 내피 세포 기능장애, 내피 세포 장애, 아테롬성동맥경화증, 동맥경화증, 고혈압, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병, 산화질소 결핍, 심근경색, 혈관 산화성 스트레스, 심근 허혈, 허혈-재관류, 패혈증, 당뇨병성 신병증, 신질환, 심근병증, 심부전, 말초 동맥 질환, 관상동맥 심장 질환, 파행 (예를 들어, 간헐성 파행, 러더포드 부류 II/III 파행), 말초 동맥 질환 (PAD), 협심증 (예를 들어, 불응성 협심증), 관상 동맥 질환 (CAD) (예를 들어, 심장에 공급되는 동맥의 아테롬성동맥경화증으로 인함), 졸중 및 비정상적 내피-의존성 혈관확장을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "내피 세포 기능장애"는 정상 기능을 유지하기 위한 내피 세포의 무능을 의미한다. 내피는 혈관 평활근 긴장도 및 성장, 혈관 투과성, 염증 반응, 응고 및 혈소판 부착을 조절하는데 중대한 역할을 한다. 내피 세포 기능의 비제한적 예는 균형잡힌 혈관 긴장도의 유지, 혈전증의 억제, 염증유발 과정의 억제, 혈관 완전성 (예를 들어, 혈관계의 비-누출)의 유지, 및 내피 및 평활근 세포 둘 다에서의 항증식 상태의 유지를 포함한다. 아테롬성동맥경화증, 예컨대 이상지혈증, 고혈압, 당뇨병 및 흡연에 대한 소인이 있는 통상의 조건 및 위험 인자는 모두 아테롬성동맥경화증의 발생, 진행 및 합병증을 촉진하는 내피 기능장애와 연관된다. 내피 기능장애는 일반적으로 손상된 내피-의존성 혈관확장으로 평가되었다. 이것은 내피-의존성 혈관확장이 다른 중요한 내피 기능에 대한 대용 마커인 것으로 가정한다. 이러한 가정에 대한 기초는 L-아르기닌으로부터 내피 NO 신타제 (eNOS)에 의해 합성된 내피-유래 산화질소가 내피-의존성 혈관확장 및 다른 내피 혈관보호 기능을 매개한다는 관찰이다. 증가하는 임상 데이터베이스는 내피 기능장애 (손상된 내피 의존성 혈관확장)가 심근 허혈 및 경색, 급성 관상동맥 증후군, 파행 및 중증 사지 허혈, 일과성 허혈 발작 및 졸중을 비롯한 주요 유해 심혈관 사건과 밀접하게 연관되어 있다는 것을 시사한다.
축적되는 실험 데이터는 또한 내피 및 심내막 손상된 eNOS-유래 NO 이용가능성이 또한 심부전의 발생 및 진행의 원인이 되는 비정상적 좌심실 재형성 및 기능장애로 이어질 수 있다는 것을 시사한다.
본원에 사용된 "내피 세포 장애"는 내피 세포 기능장애를 특징으로 하는 임의의 장애이다. 내피 세포 기능장애를 특징으로 하는 질환 또는 장애의 비제한적 예는 혈관신생 장애, 예컨대 종양 성장을 지지하는 신생혈관화를 요구하는 암, 감염성 질환, 자가면역 장애, 혈관 기형, 디조지 증후군, HHT, 해면상 혈관종, 이식 동맥병증, 혈액투석과 연관된 혈관 통로 협착, 혈관염, 맥관염, 혈관 염증성 장애, 아테롬성동맥경화증, 비만, 건선, 사마귀, 알레르기성 피부염, 반흔 켈로이드, 화농성 육아종, 수포성 질환, 카포시 육종, 지속성 과형성 유리체 증후군, 미숙아 망막병증, 맥락막 신생혈관화, 황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 안구 신생혈관화, 원발성 폐고혈압, 천식, 비강 폴립, 염증성 장 및 치주 질환, 복수, 복막 유착, 피임, 자궁내막증, 자궁 출혈, 난소낭, 난소 과다자극, 관절염, 류마티스 관절염, 만성 관절 류마티즘, 활막염, 골관절염, 골수염, 골극 형성, 패혈증 및 혈관 누출을 포함한다. 내피 세포 기능장애는 내피 부착 분자의 증가된 발현 또는 산화질소 신타제 (eNOS)의 감소된 발현 또는 생물학적 활성을 검출하는 것을 비롯한 관련 기술분야에 공지된 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
본원에 사용된 "파행"은 중증 파행 및 다른 유사 용어를 포함하며, 이동 장애 및 높은 미충족 의료 필요성을 기재한다. 파행은 하지 허혈, 근육 피로 야기, 휴식에 의해 완화되는 분투 시의 통증, 제한된 이동 및 감소된 삶의 질을 특징으로 하는 상태이며, 아테롬성동맥경화증 및 비정상적 (예를 들어, 손상된) 내피-의존성 혈관확장에 의해 야기된다. 미국에서 그의 유병률은 8-12백만명 환자이다. 간헐성 파행을 가진 환자 중에서, 7%는 하지 우회로 수술을 겪을 것이고, 4%는 대절단을 요구할 것이고, 16%는 파행 악화를 발달시킬 것이다. 심혈관 사건, 예컨대 심근경색 및 졸중은 5년에 걸쳐 중증 파행 환자의 20%에서 발생한다. 현행 요법은 수술이고, 덜 침습적인 수단을 통한 치료, 예컨대 본 발명의 항-LOX-1 항체의 투여는 엄청난 치료 돌파구를 나타낼 것이다.
본원에 사용된 "불응성 협심증"은 심근의 허혈로 인한, 일반적으로는 관상 동맥의 폐쇄 또는 연축 (예를 들어, 관상 동맥 질환으로부터)으로 인한 흉통에 의해 표시되며 쇠약 증상, 매우 제한된 신체 활동 및 열악한 삶의 질을 갖는 상태이다. 미국에서 1-1.8백만명의 환자인 불응성 협심증 환자는 1년에 10% 비율의 증가된 심혈관성 사망률을 경험하며; 1년에 적어도 100,000건의 새로운 불응성 협심증 사례가 발생한다.
용어 "키메라 항체"는 (a) 항원 결합 부위 (가변 영역)가, 상이하거나 또는 변경된 부류, 이펙터 기능 및/또는 종의 불변 영역, 또는 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예를 들어 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 연결되도록 불변 영역 또는 그의 일부가 변경, 대체 또는 교환되거나; 또는 (b) 가변 영역 또는 그의 일부가, 상이하거나 또는 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경, 대체 또는 교환된 항체 분자이다. 예를 들어, 마우스 항체는 그의 불변 영역을 인간 이뮤노글로불린으로부터의 불변 영역으로 대체함으로써 변형시킬 수 있다. 인간 불변 영역으로의 대체로 인해, 키메라 항체는 원래의 마우스 항체와 비교하여 인간에서 감소된 항원성을 가지면서 항원을 인식하는 그의 특이성은 보유할 수 있다.
용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정한 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축중성 때문에, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌이 지정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩되는 폴리펩티드를 변경시키지 않으면서, 기재된 상응하는 코돈 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 일종인 "침묵 변이"이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기재한다. 통상의 기술자는 핵산 내의 각각의 코돈 (통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에 내포된다.
폴리펩티드 서열의 경우에, "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는, 폴리펩티드 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체 및 대립유전자에 부가적인 것이고 이들을 배제하지 않는다. 하기 8개의 군은 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌 (A), 글리신 (G), 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E), 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q), 4) 아르기닌 (R), 리신 (K), 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V), 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W), 7) 세린 (S), 트레오닌 (T), 및 8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins (1984)] 참조). 일부 실시양태에서, 용어 "보존적 서열 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치거나 이를 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하는데 사용된다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정기를 의미한다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 기로 이루어지고, 통상적으로 특정한 3차원 구조적 특징, 뿐만 아니라 특정한 전하 특징을 갖는다. 입체형태적 및 비입체형태적 에피토프는, 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재 하에 상실되지만 후자에 대한 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역이 둘 다 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우에, 불변 영역도 또한 이러한 인간 서열, 예를 들어 인간 배선 서열, 또는 인간 배선 서열의 돌연변이된 버전으로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
용어 "인간 모노클로날 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역이 둘 다 인간 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는, 단일 결합 특이성을 디스플레이하는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득되는 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
"인간화" 항체는 인간에서 덜 면역원성이면서 비-인간 항체의 반응성을 보유하는 항체이다. 이것은, 예를 들어 비-인간 CDR 영역을 보유시키고 항체의 나머지 부분을 그의 인간 대응부 (즉, 불변 영역 뿐만 아니라 가변 영역의 프레임워크 부분)로 대체하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; 및 Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994]을 참조한다. 인간 공학 기술의 다른 예는 US 5,766,886에 개시된 조마(Xoma) 기술을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 2개의 서열은, 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의한 측정 시에 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대한 상응하도록 비교 및 정렬했을 때, 2개의 서열이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정된 백분율 (즉, 특정된 영역에 걸쳐, 또는 특정되지 않은 경우에는 전체 서열에 걸쳐 60% 동일성, 임의로 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성)을 갖는 경우에 "실질적으로 동일하다". 임의로, 동일성은 적어도 약 50개 뉴클레오티드 (또는 10개 아미노산) 길이의 영역에 걸쳐, 또는 보다 바람직하게는 100 내지 500개 또는 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드 (또는 20, 50, 200개 또는 그 초과의 아미노산) 길이에 걸쳐 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열이 시험 서열과 비교되는 참조 서열로서 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우에, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우에는 하위서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터를 사용할 수 있거나, 또는 대안적 파라미터를 지정할 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열에 대한 시험 서열의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
본원에 사용된 "비교 윈도우"는 2개의 서열을 최적으로 정렬시킨 후에 서열을 인접 위치의 동일한 수의 참조 서열과 비교할 수 있는, 20 내지 600개, 통상적으로 약 50 내지 약 200개, 보다 통상적으로 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택된 인접 위치의 수 중 어느 하나의 절편에 대한 언급을 포함한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 문헌 [Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국부 상동성 알고리즘에 의해, 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 문헌 [Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988]의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행 (위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575에 소재하는 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)에 의해, 또는 수동 정렬 및 육안 검사 (예를 들어, 문헌 [Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)] 참조)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 퍼센트를 결정하는데 적합한 알고리즘의 두가지 예는 각각 문헌 [Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977] 및 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990]에 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공중 이용가능하다. 이러한 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열 내 동일한 길이의 워드와 정렬했을 때 특정 양의 값의 역치 점수 T에 매칭되거나 이를 충족시키는, 질의 서열 내의 길이 W의 짧은 워드를 확인함으로써 높은 점수의 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 수반한다. T는 이웃 워드 점수 역치를 지칭한다 (Altschul et al., 상기 문헌). 이들 초기 이웃 워드 히트는 이것을 함유하는 보다 긴 HSP를 찾는 검색을 개시하기 위한 시드로서 작용한다. 워드 히트는 누적 정렬 점수가 증가될 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 연장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M (매칭 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 > 0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 패널티 점수; 항상 < 0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우에는 점수화 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 계산한다. 누적 정렬 점수가 그의 최대 달성 값으로부터 X의 양만큼 하락하거나; 하나 이상의 음으로 점수화된 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 점수가 0 이하로 떨어지거나; 또는 어느 한쪽의 서열의 말단에 도달한 경우에, 각 방향으로의 워드 히트의 연장이 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 워드길이 (W) 11, 기대값 (E) 10, M=5, N=-4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우에, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드길이 3, 및 기대값 (E) 10, 및 BLOSUM62 점수화 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989] 참조) 정렬 (B) 50, 기대값 (E) 10, M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성에 대한 통계적 분석을 수행한다 (예를 들어, 문헌 [Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 발생할 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률 (P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 페널티 12 및 캡 페널티 4를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입된 문헌 [E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988)]의 알고리즘을 사용하여 2개의 아미노산 서열 간의 퍼센트 동일성이 또한 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램 (월드 와이드 웹 상의 gcg.com에서 이용가능함)에 혼입된 문헌 [Needleman and Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.
상기 나타낸 서열 동일성의 백분율 이외에, 2개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는, 제1 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드가 하기 기재된 바와 같이 제2 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드에 대해 생성된 항체와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 전형적으로, 예를 들어 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우에 제2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는, 2개의 분자 또는 그의 보체가 하기 기재된 바와 같이 엄격한 조건 하에 서로 혼성화된다는 것이다. 2개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는 동일한 프라이머를 사용하여 서열을 증폭시킬 수 있다는 것이다.
용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, LOX-1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 LOX-1 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없음). 그러나, LOX-1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 항원에 대한 교차 반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
용어 "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 부류 (예를 들어, IgM, IgE, IgG, 예컨대 IgG1 또는 IgG4)를 지칭한다. 이소형은 또한 Fc 기능을 변경시키는 변형, 예를 들어 이펙터 기능 또는 Fc 수용체에 대한 결합을 증진시키거나 감소시키는 변형이 이루어진, 이들 부류 중 하나의 변형된 버전을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "kassoc" 또는 "ka"는 특정한 항체-항원 상호작용의 회합률을 지칭하는 것으로 의도되는 반면, 본원에 사용된 용어 "kdis" 또는 "kd"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리율을 지칭하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "KD"는 ka에 대한 kd의 비 (즉, kd/ka)로부터 수득되는 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도되며, 몰 농도 (M)로 표현된다. 항체에 대한 KD 값은 관련 기술분야에 널리 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 방법은 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어® 시스템을 사용하여 표면 플라즈몬 공명을 측정하는 것, 또는 용액 평형 적정 (SET)에 의해 용액 중에서의 친화도를 측정하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
용어 "핵산"은 본원에서 용어 "폴리뉴클레오티드"와 상호교환가능하게 사용되며, 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 합성, 자연 발생 및 비-자연 발생이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는, 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포괄한다. 이러한 유사체의 예는 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNA)을 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 명시적으로 나타낸 서열 뿐만 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축중성 코돈 치환) 및 상보적 서열을 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 하기 상술되는 바와 같이, 축중성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).
용어 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA) 절편 사이의 기능적 관계를 지칭한다. 전형적으로, 상기 용어는 전사되는 서열에 대한 전사 조절 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서 서열이 적절한 숙주 세포 또는 다른 발현 시스템 내에서 코딩 서열의 전사를 자극하거나 조절하는 경우에, 이것은 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, 전사되는 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터 전사 조절 서열은 전사되는 서열에 물리적으로 인접하며, 즉 이들은 시스-작용성이다. 그러나, 일부 전사 조절 서열, 예컨대 인핸서는 전사를 증진시키는 코딩 서열에 물리적으로 인접하거나 또는 근접하여 위치할 필요가 없다.
본원에 사용된 용어 "최적화된"은, 뉴클레오티드 서열이 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로는 진핵 세포, 예를 들어 피키아(Pichia) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO) 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 코딩하도록 변경되었음을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은, 또한 "모" 서열로도 공지되는 출발 뉴클레오티드 서열에 의해 본래 코딩되는 아미노산 서열을 완전하게 또는 가능한 한 많이 보유하도록 조작된다. 본원의 최적화된 서열은 포유동물 세포에서 바람직한 코돈을 갖도록 조작되었다. 그러나, 다른 진핵 세포 또는 원핵 세포에서의 이들 서열의 최적화된 발현도 또한 본원에서 고려된다. 최적화된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열도 또한 최적화된 것으로 지칭된다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 상기 용어는 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 1개 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체에도 적용된다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 폴리펩티드 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체도 함축적으로 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말인 동물 (예를 들어, 마우스) 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, 재조합의 조합형 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 전부 또는 일부를 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 특정 실시양태에서, 그러나, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우에, 생체내 체세포 돌연변이유발)될 수 있고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만, 생체내 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정한 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손까지도 지칭하는 것으로 의도됨을 이해하여야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로는 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다.
용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 동물은 모든 척추동물 (예를 들어: 포유동물 및 비-포유동물), 예컨대 비-인간 영장류 (예를 들어: 시노몰구스 원숭이), 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 언급되는 경우를 제외하고, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 본원에 사용된 용어 "시노" 또는 "시노몰구스"는 시노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))를 지칭한다.
본원에 사용된, 임의의 질환 또는 장애 (즉, LOX-1 연관 장애)에 대한 용어 "치료하는" 또는 "치료"는, 한 실시양태에서, 질환 또는 장애의 개선 (즉, 질환 또는 그의 임상 증상 중 적어도 하나의 발생의 둔화 또는 저지 또는 감소)을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 환자에 의해 식별가능하지 않을 수 있는 것을 비롯한 적어도 하나의 물리적 파라미터를 완화 또는 개선하는 것을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애를 물리적으로 (예를 들어, 식별가능한 증상의 안정화), 생리학적으로 (예를 들어, 물리적 파라미터의 안정화), 또는 둘 다로 조절하는 것을 지칭한다. 또 다른 실시양태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 장애의 발병 또는 발생 또는 진행을 예방하거나 또는 지연시키는 것을 지칭한다.
"예방"은 그것이 예를 들어 LOX-1 연관 장애를 비롯한 본원에 기재된 적응증에 관한 것일 때, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 LOX-1 연관 질환 파라미터의 악화에 대한 위험이 있는 환자에서 상기 악화를 예방하거나 또는 둔화시키는 임의의 작용을 의미한다.
용어 "벡터"는 그것이 연결된 또 다른 폴리뉴클레오티드를 수송할 수 있는 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 벡터의 한 유형은 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스 벡터 (AAV 또는 AAV2)이다. 특정 벡터는 그것이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" (또는 간단하게 "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 이는 플라스미드가 가장 흔하게 사용되는 벡터의 형태이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)와 같이, 동등한 기능을 하는 발현 벡터의 이러한 다른 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
도 1a-1c는 본 발명의 LOX-1 항체에 의한 LOX-1 단백질에의 OxLDL 결합의 억제를 도시한다. 도 1a는 고 결합 OxLDL을 나타내고, 도 1b는 말론디알데히드-LDL을 나타내고, 도 1c는 하이포클로라이트 변형된 LDL을 나타낸다 (모두 본원에 기재된 바와 같음).
도 2는 인간 LOX-1 형질감염된 HEK293 세포에 대한 diI-표지된 OxLDL 결합을 억제하는 LOX-1 항체를 도시한다.
도 3은 인간 LOX-1 형질감염된 HEK293 세포에서 oxLDL 유도된 반응성 산소 종 (ROS) 생산의 LOX-1 항체 억제의 용량 반응 곡선을 도시한다.
도 4a-4f는 인간 LOX-1 형질감염된 HEK293 세포에서 oxLDL 유도된 반응성 산소 종 (ROS) 생산을 억제하는 LOX-1 항체 (단독의 항체 또는 가교 Fab2의 존재 하의 항체)를 입증한다. 도 4a는 항체 FF1을 나타내고, 도 4b는 항체 FF3을 나타내고, 도 4c는 항체 FF4를 나타내고, 도 4d는 항체 FF5를 나타내고, 도 4e는 항체 FF6을 나타내고, 도 4f는 대조군 hIgG1-LALA를 나타낸다.
도 5는 인간 호중구의 표면 상의 LOX-1에 대한 LOX-1 항체 결합을 도시한다.
도 6a-6b는 인간 또는 시노몰구스 원숭이 APP-Avi-LOX-1 단백질을 사용한 용액 평형 적정 (SET) 검정에 의한 항체 해리 상수 (KD) 결정을 도시한다. 도 6a는 인간 LOX-1에 대한 데이터를 도시하고, 도 6b는 시노 LOX-1에 대한 데이터를 도시한다.
본 발명은 부분적으로, LOX-1에 특이적으로 결합하여 그의 생물학적 활성을 억제하는 항체 분자의 발견을 기초로 한다. 본 발명은 전체 IgG 포맷 항체 뿐만 아니라 그의 항원 결합 단편, 예컨대 Fab 단편 (예를 들어, 항체 E2E10, FF1, FF3, FF4, FF5, FF6) 둘 다에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 LOX-1 (예를 들어, 인간 LOX-1 및 시노몰구스 원숭이 LOX-1)에 특이적으로 결합하는 항체, 제약 조성물, 제조 방법, 및 이러한 항체 및 조성물의 사용 방법을 제공한다.
LOX-1 단백질
본 발명은 LOX-1에 특이적으로 결합하여 그의 산화촉진 및 염증유발 활성을 비롯한 그의 생물학적 활성을 억제하는 항체를 제공한다. 산화 변형된 LDL (oxLDL)에 대한 수용체인 LOX-1은 혈관 세포 (내피 세포 및 평활근 세포), 호중구, 단핵구 및 대식세포, 및 혈소판의 표면 상에 발현된다. 또한, LOX-1은 인간 및 동물 아테롬성동맥경화성 병변을 비롯한 혈관 질환에서 상향조절된다 (Kataoka H, et al., Circulation 99; 3110-3117). LOX-1은 또한 전신 염증성/자가면역 질환 (예를 들어, 류마티스 관절염, 포도막염, 연령-관련 황반 변성 및 전자간증)에서 상향조절된다. OxLDL은 혈관 질환의 발병기전에 관련된다. oxLDL 이외에도, LOX-1은 아세틸화 LDL, 진행성 당화 최종 산물 (AGE), 열 쇼크 단백질 70 (HSP70), 아폽토시스 세포, 노화 적혈구, 백혈구, 활성화 혈소판, 박테리아, 포스파티딜세린 및 C 반응성 단백질 (CRP)을 비롯한 다른 리간드에 결합한다.
LOX-1은 C-유형 렉틴 패밀리에 속하는 유형-II 막 단백질이다. LOX-1은 또한 부류 E 스캐빈저 수용체로서 분류된다. LOX-1은 다음 4개의 도메인으로 이루어진다: 짧은 N-말단 세포질 도메인, 막횡단 영역, 연결 목부 및 C-말단에서의 렉틴-유사 도메인. C-말단 렉틴-유사 도메인 (CTLD; 또한 oxLDL 결합 도메인로 지칭됨)은 리간드 결합 도메인이다 (Sawamura T, et al., Nature 386; 73-77; Shi X, et al., J Cell Sci. 114; 1273-1282). 인간 LOX-1은 표 1에 나타낸 바와 같은 서열 (서열 1)을 가지며, 이전의 보고서 및 문헌에 기재되었다 (Nature, Vol. 386, p. 73-77, 1997; Genomics, Vol. 54, No. 2, p. 191-199, 1998; Biochem. J., Vol. 339, Part 1, P. 177-184, 1999; 진뱅크 수탁번호 NP 002534).
oxLDL / LOX-1 경로는 산화성 스트레스, 혈관 염증, 아테롬성동맥경화증 및 손상된 조직 혈류 및 산소 전달에 기여한다. LOX-1 리간드 (예를 들어, oxLDL)의 결합에 의한 LOX-1의 활성화는 NADPH 옥시다제의 활성화로 인한 반응성 산소 종의 생성 및 NFkB 및 MAP 키나제 경로의 후속 활성화를 유발하여 염증을 유발한다. oxLDL/LOX-1 신호전달 경로는, LOX-1 유도된 반응성 산소 종이 추가의 oxLDL의 형성을 유발하고 LOX-1 발현을 상향조절한다는 점에서, 양성 피드백 루프로서 작용한다. 대식세포의 표면 상에 발현된 LOX-1에 대한 oxLDL의 결합은 또한 거품 세포 형성 및 아테롬성동맥경화증의 원인이 되는 oxLDL의 흡수를 유발한다. 중요하게, 혈관 염증은 심근경색 및 허혈성 졸중을 비롯한 아테롬성동맥경화증의 급성 혈전성 합병증의 병리생물학에 결정적인 것으로 생각된다. LOX-1 활성화는 또한 NADPH 옥시다제를 수반하는 메카니즘에 의해 혈관확장을 손상시킴으로써 혈관운동 기능을 변경시키는 것으로 나타났다. 손상된 혈관확장은 만성 관상 동맥 질환 및 협심증을 가진 환자 및 말초 동맥 질환 및 파행을 가진 환자에서 발생하는 것으로 나타났다.
LOX-1 녹아웃 마우스 및 LOX-1 길항제 항체를 사용한 연구는 LOX-1의 억제가 유익한 심혈관 효과를 가질 수 있는 것으로 제시하였다. 예를 들어, LOX-1을 녹아웃시키는 것은 혈관이완의 oxLDL-매개 손상을 예방하고, 아테롬성동맥경화증을 감소시킨다 (Mehta et al., Circulation Research 2007, 100: 1634). 또한, 항-LOX-1 항체는 (i) 인간 내피 세포에서 oxLDL-유도된 산화성 스트레스를 차단하고 (Ou et al., J Appl Phys 2010, 108: 1745); (ii) 슈퍼옥시드 생산을 억제하며 eNOS 발현을 회복시켜 개선된 NO 생체이용률 및 혈관확장을 유발하는 것으로 (Xu et al., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2007, 27: 871-877) 나타났다.
본 발명자들은, 예를 들어 본 발명의 항-LOX-1 항체의 투여를 통해 LOX-1을 억제하는 것이 허혈성 조직으로의 혈류 및 산소 전달을 개선하여, 협심증, 파행 및 중증 사지 허혈을 비롯한 만성 혈관 질환을 가진 환자에게 치료 이익을 가져올 것임을 제안한다. 예를 들어 본 발명의 항-LOX-1 항체의 투여를 통해 LOX-1을 억제하는 것은 또한 아테롬성동맥경화증의 진행을 둔화 또는 역전시키고, 그의 급성 혈전성 합병증 (예를 들어, 급성 관상동맥 증후군, 불안정형 협심증, 심근경색 및 허혈성 졸중)의 발생률을 감소시킬 수 있다.
LOX-1 항체 & 항원 결합 단편
본 발명은 LOX-1에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 및 시노몰구스 원숭이 LOX-1에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 실시예에 기재된 바와 같이 단리된 인간 모노클로날 항체 및 Fab를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 LOX-1 단백질 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 LOX-1)에 특이적으로 결합하며, 서열 14, 34, 54, 74 또는 94의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인을 포함하는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 LOX-1 단백질에 특이적으로 결합하며, 하기 표 1에 열거된 VH CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR을 포함하는 항체를 제공한다. 특히, 본 발명은 LOX-1 단백질 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 LOX-1)에 특이적으로 결합하며, 하기 표 1에 열거된 VH CDR 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 3개 또는 그 초과의 VH CDR을 포함하는 (또는 대안적으로, 그로 이루어진) 항체를 제공한다.
본 발명은 LOX-1 단백질에 특이적으로 결합하며, 서열 24, 44, 64, 84 또는 104의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 LOX-1 단백질 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 LOX-1)에 특이적으로 결합하며, 하기 표 1의 VL CDR 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR을 포함하는 항체를 제공한다. 특히, 본 발명은 LOX-1 단백질 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 LOX-1)에 특이적으로 결합하며, 하기 표 1에 열거된 VL CDR 중 임의의 것의 아미노산 서열을 갖는 1, 2, 3개 또는 그 초과의 VL CDR을 포함하는 (또는 대안적으로, 그로 이루어진) 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 항체는, 돌연변이되었지만 CDR 영역에서 표 1에 기재된 서열에 도시된 CDR 영역과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95 퍼센트 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표 1에 기재된 서열에 도시된 CDR 영역과 비교하였을 때 CDR 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이된 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 LOX-1 단백질 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 LOX-1)에 특이적으로 결합하는 항체의 VH, VL, 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 이러한 핵산 서열은 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다 (예를 들어, 표 1은 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 최적화된 핵산 서열을 제시함).
<표 1> LOX-1 항체, Fab 및 LOX-1 단백질의 예
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본 발명의 다른 항체는, 아미노산 또는 아미노산을 코딩하는 핵산이 돌연변이되었지만 표 1에 기재된 서열과 적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95 퍼센트 동일성을 갖는 것을 포함한다. 일부 실시양태는 표 1에 기재된 서열에 도시된 가변 영역과 비교했을 때 가변 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산이 돌연변이되었지만 실질적으로 동일한 항원 결합 활성을 보유하는 돌연변이체 아미노산 서열을 포함한다.
각각의 이들 항체는 LOX-1에 결합할 수 있기 때문에, VH, VL, 전장 경쇄 및 전장 중쇄 서열 (아미노산 서열 및 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)은 "혼합 및 매칭"되어 본 발명의 다른 LOX-1-결합 항체를 생성할 수 있다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 LOX-1-결합 항체는 관련 기술분야에 공지된 결합 검정 (예를 들어, ELISA, 및 실시예 섹션에 기재된 다른 검정)을 사용하여 시험될 수 있다. 이들 쇄가 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VH/VL 쌍으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 전장 중쇄 / 전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 중쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 중쇄 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 VH/VL 쌍으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 VL 서열로 대체되어야 한다. 마찬가지로, 특정한 전장 중쇄 / 전장 경쇄 쌍으로부터의 전장 경쇄 서열은 구조적으로 유사한 전장 경쇄 서열로 대체되어야 한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 서열 14, 34, 54, 74 및 94로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 서열 24, 44, 64, 84 및 104로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 가지며, LOX-1 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 LOX-1)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다.
보다 구체적으로, 특정 측면에서, 본 발명은 각각 서열 14 및 24; 34 및 44; 54 및 64; 74 및 84; 또는 94 및 104로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 서열 16, 36, 56, 76 또는 96으로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물 세포에서의 발현이 최적화된 아미노산 서열을 포함하는 전장 중쇄, 및 서열 26, 46, 66, 86 또는 106으로 이루어진 군으로부터 선택된 포유동물 세포에서의 발현이 최적화된 아미노산 서열을 포함하는 전장 경쇄를 갖는 단리된 항체; 또는 (ii) 그의 항원 결합 부분을 포함하는 기능적 단백질을 제공한다. 보다 구체적으로, 특정 측면에서, 본 발명은 각각 서열 14 및 24; 34 및 44; 54 및 64; 74 및 84; 또는 94 및 104로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 갖는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 영역을 제공한다
본원에 사용된 용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 서열을 지칭한다. 일반적으로, 각 중쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR (HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 각 경쇄 가변 영역 내에 3개의 CDR (LCDR1, LCDR2, LCDR3)이 존재한다.
주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌 [Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" numbering scheme), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" numbering scheme)]에 기재된 것을 비롯한 널리 공지된 다수의 스킴 중 임의의 것을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다.
예를 들어, 카바트 하에서, 항체 FF1의 중쇄 가변 도메인 (VH)에서의 CDR 아미노산 잔기는 31-35 (HCDR1), 50-66 (HCDR2) 및 99-104 (HCDR3)로 넘버링되고; 경쇄 가변 도메인 (VL)에서의 CDR 아미노산 잔기는 24-34 (LCDR1), 50-55 (LCDR2) 및 89-97 (LCDR3)로 넘버링된다. 코티아 하에서, VH에서의 CDR 아미노산은 26-32 (HCDR1), 52-57 (HCDR2) 및 99-104 (HCDR3)로 넘버링되고; VL에서의 아미노산 잔기는 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) 및 91-96 (LCDR3)으로 넘버링된다. 카바트 및 코티아 둘 다의 CDR 정의를 조합함으로써, CDR은 인간 VH에서의 아미노산 잔기 26-35 (HCDR1), 50-66 (HCDR2) 및 90-104 (HCDR3), 및 인간 VL에서의 아미노산 잔기 24-34 (LCDR1), 50-55 (LCDR2) 및 89-97 (LCDR3)로 이루어진다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표 1에 기재된 바와 같은 중쇄 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 또는 그의 조합을 포함하는 LOX-1 결합 항체를 제공한다. 항체의 VH CDR1의 아미노산 서열은 서열 8, 28, 48, 68 및 88에 제시된다. 항체의 VH CDR2의 아미노산 서열은 서열 9, 29, 49, 69 및 89에 제시된다. 항체의 VH CDR3의 아미노산 서열은 서열 10, 30, 50, 70 및 90에 제시된다. 항체의 VL CDR1의 아미노산 서열은 서열 18, 38, 58, 78 및 98에 제시된다. 항체의 VL CDR2의 아미노산 서열은 서열 19, 39, 59, 79 및 99에 제시된다. 항체의 VL CDR3의 아미노산 서열은 서열 20, 40, 60, 80 및 100에 제시된다. 이들 CDR 영역은 카바트 시스템을 사용하여 설명된다.
대안적으로, 코티아 시스템 (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948)을 사용하여 정의되는 바와 같이, 항체의 VH CDR1의 아미노산 서열은 서열 11, 31, 51, 71 및 91에 제시된다. 항체의 VH CDR2의 아미노산 서열은 서열 12, 32, 52, 72 및 92에 제시된다. 항체의 VH CDR3의 아미노산 서열은 서열 13, 33, 53, 73 및 93에 제시된다. 항체의 VL CDR1의 아미노산 서열은 서열 21, 41, 61, 81 및 101에 제시된다. 항체의 VL CDR2의 아미노산 서열은 서열 22, 42, 62, 82 및 102에 제시된다. 항체의 VL CDR3의 아미노산 서열은 서열 23, 43, 63, 83 및 103에 제시된다.
각각의 이들 항체가 LOX-1에 결합할 수 있고 항원-결합 특이성이 주로 CDR1, 2 및 3 영역에 의해 제공된다는 것을 고려하면, VH CDR1, 2 및 3 서열 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 "혼합 및 매칭"될 수 있지만 (즉, 상이한 항체로부터의 CDR이 혼합 및 매칭될 수 있지만), 각각의 항체가 바람직하게는 VH CDR1, 2 및 3 및 VL CDR1, 2 및 3을 함유하여 본 발명의 다른 LOX-1 결합 분자를 생성한다. 이러한 "혼합 및 매칭"된 LOX-1 결합 항체는 관련 기술분야에 공지된 결합 검정 및 실시예에 기재된 것 (예를 들어, ELISA, SET, 비아코어)을 사용하여 시험될 수 있다. VH CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VH 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 마찬가지로, VL CDR 서열이 혼합 및 매칭되는 경우에, 특정한 VL 서열로부터의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체되어야 한다. 1개 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열을 본 발명의 모노클로날 항체에 대해 본원에 제시된 CDR 서열로부터의 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 신규한 VH 및 VL 서열이 생성될 수 있다는 것은 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 상기에 더하여, 한 실시양태에서, 단일 가변 도메인으로서 LOX-1에 결합하는 본원에 기재된 항체의 항원 결합 단편은 VH CDR1, 2 및 3 또는 VL CDR 1, 2 및 3을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 표 1에 기재된 Fab의 중쇄 및 경쇄 서열을 가질 수 있다. 보다 구체적으로, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Fab FF1, FF3, FF4, FF5 및 FF6의 중쇄 및 경쇄 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, LOX-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 카바트에 의해 정의되고 표 1에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 CDR1, 중쇄 가변 영역 CDR2, 중쇄 가변 영역 CDR3, 경쇄 가변 영역 CDR1, 경쇄 가변 영역 CDR2 및 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, LOX-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 코티아에 의해 정의되고 표 1에 기재된 바와 같은 중쇄 가변 영역 CDR1, 중쇄 가변 영역 CDR2, 중쇄 가변 영역 CDR3, 경쇄 가변 영역 CDR1, 경쇄 가변 영역 CDR2 및 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.
구체적 실시양태에서, 본 발명은 서열 8의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 9의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 10의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 18의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 19의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 20의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, LOX-1에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 서열 28의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 29의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 30의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 38의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 39의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 40의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, LOX-1에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 서열 48의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 49의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 50의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 58의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 59의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 60의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, LOX-1에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 서열 68의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 69의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 70의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 78의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 79의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 80의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, LOX-1에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 서열 88의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 89의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 90의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 98의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 99의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 100의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, LOX-1에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 서열 11의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 12의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 13의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 21의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 22의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 23의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, LOX-1에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 서열 31의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 32의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 33의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 41의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 42의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 43의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, LOX-1에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 서열 51의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 52의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 53의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 61의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 62의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 63의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, LOX-1에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 서열 71의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 72의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 73의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 81의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 82의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 83의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는, LOX-1에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
또 다른 구체적 실시양태에서, 본 발명은 서열 91의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 92의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 93의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 101의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 102의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 103의 경쇄 가변 영역 CDR3 을 포함하는, LOX-1에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 표 1에 기재된 바와 같은, LOX-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, LOX-1에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 Fab FF1, FF3, FF4, FF5 및 FF6이다.
본원에 사용된 인간 항체는 항체의 가변 영역 또는 전장 쇄가 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자를 사용한 시스템으로부터 수득된 경우에 특정한 배선 서열"의 산물"이거나 "그로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 이러한 시스템은 인간 이뮤노글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 관심 항원으로 면역화하거나, 또는 파지 상에 디스플레이된 인간 이뮤노글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원으로 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 산물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 이뮤노글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 인간 항체의 서열에 가장 밀접한 서열 (즉, % 동일성이 가장 큰 것)인 인간 배선 이뮤노글로불린 서열을 선택함으로써 확인할 수 있다.
특정한 인간 배선 이뮤노글로불린 서열"의 산물"이거나 "그로부터 유래된" 인간 항체는 배선 서열과 비교 시에, 예를 들어 자연 발생 체세포 돌연변이, 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적인 도입으로 인한 아미노산 차이를 함유할 수 있다. 그러나, VH 또는 VL 프레임워크 영역에서, 선택된 인간 항체는 전형적으로 아미노산 서열이 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 동일하고, 다른 종의 배선 이뮤노글로불린 아미노산 서열 (예를 들어, 뮤린 배선 서열)과 비교 시에 인간 항체를 인간의 것으로 확인시켜 주는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정 경우에, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열이 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
전형적으로, 재조합 인간 항체는 VH 또는 VL 프레임워크 영역에서 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정 경우에, 인간 항체는 배선 이뮤노글로불린 유전자에 의해 코딩된 아미노산 서열과 5개 이하 또는 심지어 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 디스플레이할 수 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자의 예는 하기 기재된 가변 도메인 배선 단편 뿐만 아니라 DP47 및 DPK9를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
상동 항체
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 표 1에 기재된 서열에 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하고, 항체는 LOX-1 단백질 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 LOX-1)에 결합하며, 표 1에 기재된 그러한 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하며, 여기서 중쇄 가변 도메인은 서열 14, 34, 54, 74 또는 94로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 도메인은 서열 24, 44, 64, 84 또는 104로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; LOX-1 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 LOX-1)에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 기능적 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명의 특정 측면에서, 중쇄 및 경쇄 서열은 카바트에 의해 정의된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열, 예를 들어 각각 서열 8, 9, 10, 18, 19 및 20을 추가로 포함한다. 본 발명의 특정 다른 측면에서, 중쇄 및 경쇄 서열은 코티아에 의해 정의된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 서열, 예를 들어 각각 서열 11, 12, 13, 21, 22 및 23을 추가로 포함한다.
다른 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 표 1에 제시된 서열에 대해 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 다른 실시양태에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 아미노산 위치에서의 아미노산 치환을 제외하고는 동일할 수 있다. 표 1에 기재된 것의 VH 및 VL 영역에 대해 높은 (즉, 80% 또는 그 초과의) 동일성을 갖는 VH 및 VL 영역을 갖는 항체는 각각 서열 15, 35, 55, 75 또는 95 및 서열 25, 45, 65, 85 또는 105를 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 이어서 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 코딩된 변경된 항체를 보유 기능에 대해 시험하는 것에 의해 수득될 수 있다.
다른 실시양태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 아미노산 서열은 표 1에 기재된 서열에 대해 50% 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 서열 16, 36, 56, 76 또는 96 중 임의의 것의 전장 중쇄, 및 서열 26, 46, 66, 86 또는 106 중 임의의 것의 전장 경쇄에 대해 높은 (즉, 80% 또는 그 초과의) 동일성을 갖는 전장 중쇄 및 전장 경쇄를 갖는 항체는 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 돌연변이유발 (예를 들어, 부위-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 이어서 본원에 기재된 기능적 검정을 사용하여 코딩된 변경된 항체를 보유 기능에 대해 시험하는 것에 의해 수득될 수 있다.
다른 실시양태에서, 전장 중쇄 및/또는 전장 경쇄 뉴클레오티드 서열은 표 1에 제시된 서열에 대해 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
다른 실시양태에서, 중쇄 뉴클레오티드 서열의 가변 영역 및/또는 경쇄 뉴클레오티드 서열의 가변 영역은 표 1에 제시된 서열에 대해 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 2개의 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 2개 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100). 2개의 서열 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 하기 비제한적 예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열은, 예를 들어 관련 서열을 확인하기 위해 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열"로서 추가로 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 검색은 [Altschul, et al., 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10]의 BLAST 프로그램 (버전 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다.
보존적 변형을 갖는 항체
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 가지며, 여기서 이들 CDR 서열 중 하나 이상은 본원에 기재된 항체를 기초로 하여 특정된 아미노산 서열 또는 그의 보존적 변형을 갖고, 항체는 본 발명의 LOX-1-결합 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다.
따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어지며, 여기서 중쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열은 서열 8, 28, 48, 68 및 88 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 중쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열은 서열 9, 29, 49, 69 및 89 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 중쇄 가변 영역 CDR3 아미노산 서열은 서열 10, 30, 50, 70 및 90 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR1 아미노산 서열은 서열 18, 38, 58, 78 및 98 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 경쇄 가변 영역 CDR2 아미노산 서열은 서열 19, 39, 59, 79 및 99 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; CDR3 아미노산 서열의 경쇄 가변 영역은 서열 20, 40, 60, 80 및 100 및 그의 보존적 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되고; LOX-1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화되고, 전장 중쇄 서열 및 전장 경쇄 서열을 가지며, 여기서 이들 서열 중 하나 이상은 본원에 기재된 항체 또는 그의 보존적 변형을 기초로 하여 특정된 아미노산 서열을 갖고, 항체는 본 발명의 LOX-1 결합 항체의 목적하는 기능적 특성을 보유한다. 따라서, 본 발명은 전장 중쇄 및 전장 경쇄로 이루어지며, 여기서 전장 중쇄는 서열 16, 36, 56, 76 또는 96 및 그의 보존적 변형의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; 전장 경쇄는 서열 26, 46, 66, 86 또는 106 및 그의 보존적 변형의 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고; LOX-1 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 LOX-1)에 특이적으로 결합하는, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된 단리된 항체를 제공한다.
동일한 에피토프에 결합하는 항체
본 발명은 표 1에 기재된 LOX-1 결합 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 추가의 항체는 따라서 LOX-1 결합 검정 (예컨대 실시예에 기재된 것)에서 본 발명의 다른 항체와 경쟁하는 (예를 들어, 통계적으로 유의한 방식으로 결합을 경쟁적으로 억제하는) 그의 능력에 기초하여 확인될 수 있다. LOX-1 단백질에 대한 본 발명의 항체의 결합을 억제하는 시험 항체의 능력은 시험 항체가 LOX-1에 대한 결합에 대해 상기 항체와 경쟁할 수 있다는 것을 입증하고; 이러한 항체는 비-제한적 이론에 따라 그것이 경쟁하는 항체와 LOX-1 단백질 상의 동일하거나 관련된 (예를 들어, 구조적으로 유사하거나 공간적으로 근접한) 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체와 LOX-1 상의 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 모노클로날 항체이다. 이러한 인간 모노클로날 항체는 본원에 기재된 바와 같이 제조 및 단리될 수 있다. 본원에 사용된 항체는, 경쟁 항체가 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편의 LOX-1 결합을 등몰 농도의 경쟁 항체의 존재 하에 50% 초과 (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%)만큼 억제하는 경우에 결합에 대해 "경쟁한다".
다른 실시양태에서 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 LOX-1 C 말단 렉틴-유사 도메인 (oxLDL 결합 도메인), 보다 구체적으로 인간 LOX-1로부터의 아미노산 잔기 228-246 (FRVRGAVSQTYPSGTCAYI; 서열 3)을 포함하는 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 LOX-1 (서열 1)의 아미노산 잔기 Arg229 및 Arg231을 포함하는 인간 LOX-1 상의 에피토프에 결합한다.
조작 및 변형된 항체
본 발명의 항체는 추가로 변형된 항체를 조작하기 위해 출발 물질로서 본원에 제시된 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상을 갖는 항체를 사용하여 제조될 수 있고, 변형된 항체는 출발 항체로부터 변경된 특성을 가질 수 있다. 항체는 하나 또는 둘 다의 가변 영역 (즉, VH 및/또는 VL) 내, 예를 들어 하나 이상의 CDR 영역 내 및/또는 하나 이상의 프레임워크 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 항체는 예를 들어 항체의 이펙터 기능(들)을 변경시키기 위해 불변 영역(들) 내의 잔기를 변형시킴으로써 조작될 수 있다.
수행될 수 있는 가변 영역 조작의 한 유형은 CDR 그라프팅이다. 항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내의 아미노산 서열은 개별 항체 사이에서 CDR 외부의 서열보다 더 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터의 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 특정한 자연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 특정한 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어, 문헌 [Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033]; 미국 특허 번호 5,225,539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조).
따라서, 본 발명의 또 다른 실시양태는 각각 서열 8, 28, 48, 68 및 88로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 서열 9, 29, 49, 69 및 89로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 서열 10, 30, 50, 70 및 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 각각 서열 18, 38, 58, 78 및 98로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR1 서열; 서열 19, 39, 59, 79 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 CDR2 서열; 및 서열 20, 40, 60, 80 및 100으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 따라서, 이러한 항체는 모노클로날 항체의 VH 및 VL CDR 서열을 함유하지만, 이들 항체로부터의 다양한 프레임워크 서열을 함유할 수 있다.
이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 "VBase" 인간 배선 서열 데이터베이스 (월드 와이드 웹 상의 mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용가능함), 뿐만 아니라 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836] (이들 문헌 각각의 내용은 본원에 명백하게 참조로 포함됨)에서 찾을 수 있다.
본 발명의 항체에 사용하기 위한 프레임워크 서열의 예는 본 발명의 선택된 항체에 의해 사용되는 프레임워크 서열, 예를 들어 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 사용되는 컨센서스 서열 및/또는 프레임워크 서열과 구조적으로 유사한 것이다. VH CDR1, 2 및 3 서열, 및 VL CDR1, 2 및 3 서열은 프레임워크 서열이 유래되는 배선 이뮤노글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 갖는 프레임워크 영역에 그라프팅될 수 있거나, 또는 CDR 서열은 배선 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 프레임워크 영역에 그라프팅될 수 있다. 예를 들어, 특정 경우에 프레임워크 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합 능력을 유지 또는 증진시키는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 (Queen et al.) 참조). 본원에 기재된 항체 및 항원 결합 단편을 구축하기 위한 스캐폴드로 사용될 수 있는 프레임워크는 VH1A, VH1B, VH3, Vk1, Vl2 및 Vk2를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 추가의 프레임워크는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 월드 와이드 웹 상의 vBase 데이터 베이스에서 vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?&MMN_position=1:1에서 찾을 수 있다.
따라서, 본 발명의 실시양태는 서열 14, 34, 54, 74 또는 94로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이러한 서열의 프레임워크 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 추가로 서열 24, 44, 64, 84 또는 104로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이러한 서열의 프레임워크 영역에서 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 LOX-1 결합 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
또 다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VL CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 관심 항체의 하나 이상의 결합 특성 (예를 들어, 친화도)을 개선하는 것으로, "친화도 성숙"으로 공지되어 있다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발은 돌연변이(들)를 도입하기 위해 수행될 수 있고, 항체 결합에 대한 효과 또는 다른 관심 기능적 특성은 본원에 기재되고 실시예에 제공되는 것과 같은 시험관내 또는 생체내 검정에서 평가될 수 있다. 보존적 변형 (상기 논의된 바와 같음)이 도입될 수 있다. 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있다. 또한, 전형적으로 CDR 영역 내에서 1, 2, 3, 4 또는 5개 이하의 잔기가 변경된다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 8, 28, 48, 68 및 88을 갖는 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 8, 28, 48, 68 및 88과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 VH CDR1 영역; 서열 9, 29, 49, 69 및 89로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 9, 29, 49, 69 및 89와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 영역; 서열 10, 30, 50, 70 및 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 10, 30, 50, 70 및 90과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역; 서열 18, 38, 58, 78 및 98로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 18, 38, 58, 78 및 98과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1 영역; 서열 19, 39, 59, 79 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 19, 39, 59, 79 및 99와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 영역; 및 서열 20, 40, 60, 80 및 100으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 20, 40, 60, 80 및 100과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3 영역으로 이루어진 단리된 LOX-1-결합 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 11, 31, 51, 71 및 91을 갖는 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 11, 31, 51, 71 및 91과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열로 이루어진 VH CDR1 영역; 서열 12, 32, 52, 72 및 92로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 12, 32, 52, 72 및 92와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR2 영역; 서열 13, 33, 53, 73 및 93으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 13, 33, 53, 73 및 93과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VH CDR3 영역을 갖는 중쇄 가변 영역; 서열 21, 41, 61, 81 및 101로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 21, 41, 61, 81 및 101과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1 영역; 서열 22, 42, 62, 82 및 102로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 22, 42, 62, 82 및 102와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR2 영역; 및 서열 23, 43, 63, 83 및 103으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 서열 23, 43, 63, 83 및 103과 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 갖는 아미노산 서열을 갖는 VL CDR3 영역으로 이루어진 단리된 LOX-1-결합 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
대안적 프레임워크 또는 스캐폴드 내로의 항원-결합 도메인 그라프팅
생성되는 폴리펩티드가 LOX-1에 특이적으로 결합하는 적어도 1개의 결합 영역을 포함하는 한, 매우 다양한 항체/이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드가 사용될 수 있다. 이러한 프레임워크 또는 스캐폴드는 인간 이뮤노글로불린의 다섯가지 주요 이디오타입 또는 그의 단편을 포함하고, 바람직하게는 인간화 측면을 갖는 다른 동물 종의 이뮤노글로불린을 포함한다. 이와 관련하여, 낙타류에서 확인된 것과 같은 단일 중쇄 항체가 특히 관심대상이다. 신규 프레임워크, 스캐폴드 및 단편이 통상의 기술자에 의해 계속해서 발견되고 개발되고 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 CDR이 그라프팅될 수 있는 비-이뮤노글로불린 스캐폴드를 사용하여 비-이뮤노글로불린 기반 항체를 생성하는 것에 관한 것이다. 공지된 또는 향후 비-이뮤노글로불린 프레임워크 및 스캐폴드는 그들이 표적 LOX-1 단백질에 특이적인 결합 영역을 포함하는 한 사용될 수 있다. 공지된 비-이뮤노글로불린 프레임워크 또는 스캐폴드는 피브로넥틴 (컴파운드 테라퓨틱스, 인크.(Compound Therapeutics, Inc.), 매사추세츠주 월섬), 안키린 (몰레큘라 파트너스 아게(Molecular Partners AG), 스위스 취리히), 도메인 항체 (도만티스, 리미티드(Domantis, Ltd.), 매사추세츠주 캠브리지 및 아블링스 엔브이(Ablynx nv), 벨기에 츠뷔나아르드), 리포칼린 (피에리스 프로테오랩 아게(Pieris Proteolab AG), 독일 프라이징), 소형 모듈 면역약제 (트루비온 파마슈티칼스 인크.(Trubion Pharmaceuticals Inc.), 워싱턴주 시애틀), 맥시바디 (아비디아, 인크.(Avidia, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰), 단백질 A (아피바디 아게(Affibody AG), 스웨덴) 및 아필린 (감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴) (실 프로테인스 게엠베하(Scil Proteins GmbH), 독일 할레)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
피브로넥틴 스캐폴드는 피브로넥틴 유형 III 도메인 (예를 들어, 피브로넥틴 유형 III의 제10 모듈 (10 Fn3 도메인))을 기반으로 한다. 피브로넥틴 유형 III 도메인은 단백질의 코어를 형성하도록 그 자체가 서로에 대해 패킹된 2개의 베타 시트 사이에 분포된 7 또는 8개의 베타 가닥을 갖고, 베타 가닥을 서로 연결하고 용매 노출되는 루프 (CDR과 유사)를 추가로 함유한다. 베타 시트 샌드위치의 각 가장자리에는 적어도 3개의 이러한 루프가 존재하며, 여기서 가장자리는 베타 가닥의 방향에 수직인 단백질의 경계이다 (US 6,818,418 참조). 이들 피브로넥틴-기반 스캐폴드는 이뮤노글로불린이 아니지만, 전반적인 폴드는 낙타 및 라마 IgG 내의 전체 항원 인식 단위를 포함하는 중쇄의 가변 영역인 최소의 기능적 항체 단편의 그것과 밀접한 관련이 있다. 이러한 구조로 인해, 비-이뮤노글로불린 항체는 속성 및 친화도가 항체의 그것과 유사한 항원 결합 특성을 모방한다. 이들 스캐폴드는 생체내 항체의 친화도 성숙 과정과 유사한 시험관내 루프 무작위화 및 셔플링 전략에 사용될 수 있다. 이들 피브로넥틴-기반 분자는 표준 클로닝 기술을 사용하여 분자의 루프 영역이 본 발명의 CDR로 대체될 수 있는 스캐폴드로서 사용될 수 있다.
안키린 기술은 다양한 표적에 대한 결합에 사용될 수 있는 가변 영역을 보유하도록 안키린 유래의 반복 모듈을 갖는 단백질을 스캐폴드로서 사용하는 것에 기초한다. 안키린 반복 모듈은 2개의 역평행 α-헬릭스 및 β-턴으로 이루어진 33개 아미노산의 폴리펩티드이다. 가변 영역의 결합은 리보솜 디스플레이를 사용함으로써 대부분 최적화된다.
아비머는 천연 A-도메인 함유 단백질, 예컨대 LRP-1로부터 유래된다. 이들 도메인은 원래 단백질-단백질 상호작용을 위해 사용되고, 인간에서는 250종 초과의 단백질이 구조적으로 A-도메인을 기반으로 한다. 아비머는 아미노산 링커를 통해 연결된 다수의 상이한 "A-도메인" 단량체 (2-10개)로 이루어진다. 예를 들어 미국 특허 출원 공개 번호 20040175756; 20050053973; 20050048512; 및 20060008844에 기재된 방법론을 사용하여 표적 항원에 결합할 수 있는 아비머를 생성할 수 있다.
아피바디 친화성 리간드는 단백질 A의 IgG-결합 도메인 중 하나의 스캐폴드를 기준으로 하는 3개의 헬릭스 다발로 구성된 소형의 단순 단백질이다. 단백질 A는 박테리아 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터의 표면 단백질이다. 이 스캐폴드 도메인은 58개의 아미노산으로 이루어지며, 이 중 13개는 무작위화되어 다수의 리간드 변이체를 갖는 아피바디 라이브러리를 생성한다 (예를 들어, US 5,831,012 참조). 아피바디 분자는 항체를 모방하고, 항체의 분자량이 150 kDa인데 비해 이는 6 kDa의 분자량을 갖는다. 아피바디 분자는 작은 크기에도 불구하고 그의 결합 부위가 항체의 결합 부위와 유사하다.
안티칼린은 피에리스 프로테오랩 아게에 의해 개발된 제품이다. 이는 화학적으로 감수성 또는 불용성 화합물의 생리학적 수송 또는 저장에 통상적으로 수반되는 소형의 강건한 단백질의 광범위한 집단인 리포칼린으로부터 유래된다. 몇몇 천연 리포칼린이 인간 조직 또는 체액에서 생성된다. 단백질 아키텍처는 초가변 루프가 경질 프레임워크의 상부에 존재하는 이뮤노글로불린을 연상시킨다. 그러나, 항체 또는 그의 재조합 단편과 대조적으로, 리포칼린은 160 내지 180개 아미노산 잔기를 갖는 단일 폴리펩티드 쇄로 구성되어, 단일 이뮤노글로불린 도메인보다 단지 약간 더 크다. 결합 포켓을 구성하는 4개의 루프 세트는 현저한 구조적 가소성을 나타내고 다양한 측쇄를 허용한다. 따라서, 상이한 형상의 규정된 표적 분자를 높은 친화도 및 특이성으로 인식하도록 하기 위해 결합 부위를 독점적 방법으로 재성형할 수 있다. 리포칼린 패밀리의 한 단백질인 피에리스 브라시카에(Pieris Brassicae)의 빌린-결합 단백질 (BBP)이, 4개 루프 세트를 돌연변이유발하는 것에 의해 안티칼린을 개발하는데 사용되어 왔다. 안티칼린을 기재하는 특허 출원의 한 예는 PCT 공개 번호 WO 199916873이다.
아필린 분자는 단백질 및 소분자에 대한 특이적 친화도를 위해 설계된 소형의 비-이뮤노글로불린 단백질이다. 신규 아필린 분자는 각각 상이한 인간 유래의 스캐폴드 단백질을 기준으로 하여 2개의 라이브러리로부터 매우 신속하게 선택될 수 있다. 아필린 분자는 이뮤노글로불린 단백질과 어떠한 구조적 상동성도 나타내지 않는다. 현재, 2종의 아필린 스캐폴드가 사용되며, 이 중 하나는 감마 결정질의 인간 구조적 눈 수정체 단백질이고, 다른 것은 "유비퀴틴" 슈퍼패밀리 단백질이다. 인간 스캐폴드는 둘 다 매우 소형이고, 고온 안정성을 나타내고, pH 변화 및 변성제에 거의 내성이다. 이러한 높은 안정성은 주로 단백질의 확장된 베타 시트 구조로 인한 것이다. 감마 결정질 유래의 단백질의 예는 WO200104144에 기재되어 있고, "유비퀴틴-유사" 단백질의 예는 WO2004106368에 기재되어 있다.
단백질 에피토프 모방체 (PEM)는 단백질-단백질 상호작용에 수반되는 주요 2차 구조인 단백질의 베타-헤어핀 2차 구조를 모방하는 중간 크기의 시클릭 펩티드-유사 분자 (MW 1-2kDa)이다.
본 발명은 LOX-1 단백질에 특이적으로 결합하는 완전 인간 항체를 제공한다. 키메라 또는 인간화 항체와 비교하여, 본 발명의 인간 LOX-1-결합 항체는 인간 대상체에게 투여될 때 더욱 감소된 항원성을 갖는다.
낙타류 항체
신세계 구성원, 예컨대 라마 종 (라마 파코스(Lama paccos), 라마 글라마(Lama glama) 및 라마 비쿠그나(Lama vicugna))을 비롯한 낙타 및 단봉낙타 (카멜루스 박트리아누스(Camelus bactrianus) 및 카멜루스 드로메다리우스(Camelus dromedarius)) 패밀리의 구성원으로부터 수득된 항체 단백질은 인간 대상체를 위해 크기, 구조적 복잡성 및 항원성에 관하여 특성화되었다. 자연에서 발견된 이 포유동물 패밀리로부터의 특정 IgG 항체는 경쇄가 결핍되어 있으며 따라서 다른 동물로부터의 항체에 대해 전형적인 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 갖는 4개 쇄 4차 구조와는 구조적으로 상이하다. PCT/EP93/02214 (1994년 3월 3일 공개된 WO 94/04678)를 참조한다.
VHH로 확인된 소형 단일 가변 도메인인 낙타류 항체 영역은 "낙타류 나노바디"로 공지된 저분자량 항체-유래 단백질을 생성하는, 표적에 대해 높은 친화도를 갖는 소형 단백질을 생성하기 위한 유전자 조작에 의해 수득될 수 있다. 1998년 6월 2일에 등록된 미국 특허 번호 5,759,808을 참조하고; 또한 문헌 [Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; 및 Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520]을 참조한다. 낙타류 항체 및 항체 단편의 조작된 라이브러리는, 예를 들어 아블링스 (벨기에 겐트)로부터 상업적으로 입수가능하다. 비-인간 기원의 다른 항체와 마찬가지로, 낙타류 항체의 아미노산 서열은 인간 서열과 보다 밀접하게 유사한 서열을 수득하기 위해 재조합적으로 변경될 수 있으며, 즉 나노바디는 "인간화"될 수 있다. 따라서, 인간에 대한 낙타류 항체의 자연적으로 낮은 항원성을 추가로 감소시킬 수 있다.
낙타류 나노바디는 분자량이 인간 IgG 분자의 대략 1/10이고, 상기 단백질은 단지 수 나노미터의 물리적 직경을 갖는다. 작은 크기로 인한 한가지 중요성은 보다 큰 항체 단백질의 경우에는 기능적으로 보이지 않는 항원 부위에 결합하는 낙타류 나노바디의 능력으로, 즉 낙타류 나노바디는 전형적인 면역학적 기술을 사용하여 달리 알 수 없는 항원을 검출하는 시약으로서 및 가능한 치료제로서 유용하다. 따라서, 작은 크기로 인한 또 다른 중요성은, 낙타류 나노바디는 표적 단백질의 홈 또는 좁은 틈새 내의 특이적 부위에 결합한 결과로서 억제할 수 있기 때문에, 전형적인 항체의 기능보다 전형적인 저분자량 약물의 기능과 보다 밀접하게 유사한 능력을 제공할 수 있다는 것이다.
저분자량 및 조밀한 크기는 추가로, 낙타류 나노바디가 극도로 열안정성이고, 극한 pH 및 단백질분해적 소화에 대해 안정하고, 낮은 항원성이도록 한다. 또 다른 중요성은 낙타류 나노바디가 순환계로부터 조직 내로 용이하게 이동하고, 심지어는 혈액-뇌 장벽을 횡단하며, 신경 조직에 영향을 미치는 장애를 치료할 수 있다는 것이다. 나노바디는 또한 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 약물 수송을 용이하게 할 수 있다. 2004년 8월 19일에 공개된 미국 특허 출원 20040161738을 참조한다. 인간에 대한 낮은 항원성과 조합된 이들 특징은 높은 치료 잠재력을 나타낸다. 추가로, 이들 분자는 원핵 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 내에서 완전하게 발현될 수 있고, 박테리오파지와의 융합 단백질로서 발현되며, 기능적이다.
따라서, 본 발명의 특징은 LOX-1에 대해 고친화도를 갖는 낙타류 항체 또는 나노바디이다. 본원의 특정 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 낙타류 동물에서 자연적으로 생산되는데, 즉 다른 항체에 대해 본원에 기재된 기술을 사용하여 LOX-1 또는 그의 펩티드 단편으로 면역화시킨 후의 낙타류에 의해 생산된다. 대안적으로, LOX-1-결합 낙타류 나노바디는 조작되며, 즉 예를 들어 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 표적으로서 LOX-1를 사용하는 패닝 절차를 사용하여 적절하게 돌연변이시킨 낙타류 나노바디 단백질을 디스플레이하는 파지의 라이브러리로부터 선택함으로써 생산된다. 조작된 나노바디는 수여 대상체 내에서의 반감기가 45분 내지 2주가 되도록 유전자 조작함으로써 추가로 적합화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 낙타류 항체 또는 나노바디는 예를 들어 PCT/EP93/02214에 기재된 바와 같이 본 발명의 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR 서열을 나노바디 또는 단일 도메인 항체 프레임워크 서열로 이식하여 수득된다.
이중특이적 분자 및 다가 항체
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 LOX-1-결합 항체 또는 그의 단편을 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 영역은 유도체화되거나 또 다른 기능적 분자, 예를 들어 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예를 들어, 또 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)에 연결되어 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 실제로 유도체화되거나 1개 초과의 다른 기능적 분자에 연결되어 2개 초과의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성할 수 있고; 이러한 다중특이적 분자도 또한 본원에 사용된 용어 "이중특이적 분자"에 포괄된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 발명의 항체는 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 등에 의함)될 수 있어서 이중특이적 분자가 생성된다.
따라서, 본 발명은 LOX-1에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 예를 들어, 제2 표적 에피토프는 제1 표적 에피토프와 상이한 LOX-1의 또 다른 에피토프이다.
추가로, 이중특이적 분자가 다중특이적인 본 발명의 경우에, 상기 분자는 제1 및 제2 표적 에피토프에 더하여 제3 결합 특이성을 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 결합 특이체로서 적어도 하나의 항체 또는 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일 쇄 Fv를 비롯한 그의 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한 미국 특허 번호 4,946,778 (Ladner et al.)에 기재된 바와 같은 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 그의 임의의 최소 단편, 예컨대 Fv 또는 단일 쇄 구축물일 수 있다.
디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현되고, 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 가능하게 하기에는 너무 짧은 링커로 연결된 2가, 이중특이적 분자이다. VH 및 VL 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성함으로써, 2개의 항원 결합 부위를 생성한다 (예를 들어, 문헌 [Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123] 참조). 디아바디는 동일한 세포 내에 구조 VHA-VLB 및 VHB-VLA (VH-VL 구성) 또는 VLA-VHB 및 VLB-VHA (VL-VH 구성)를 갖는 2개의 폴리펩티드 쇄를 발현시킴으로써 생산될 수 있다. 그들 중 대부분은 박테리아에서 가용성 형태로 발현될 수 있다. 단일 쇄 디아바디 (scDb)는 대략 15개의 아미노산 잔기의 링커로 2개의 디아바디-형성 폴리펩티드 쇄를 연결하여 생산된다 (문헌 [Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36] 참조). scDb는 박테리아 내에서 가용성 활성 단량체 형태로 발현될 수 있다 (문헌 [Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun and Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21] 참조). 디아바디는 Fc와 융합되어 "디-디아바디"를 생성할 수 있다 (문헌 [Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65] 참조).
본 발명의 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.
이중특이적 분자는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 구성성분 결합 특이체를 접합시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각 결합 특이체를 개별적으로 생성한 다음 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이체가 단백질 또는 펩티드인 경우에, 공유 접합을 위해 다양한 커플링제 또는 가교제가 사용될 수 있다. 가교제의 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법은 문헌 [Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), 및 Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기재된 것을 포함한다. 접합제는 둘 다 피어스 케미칼 캄파니(Pierce Chemical Co.) (일리노이주 록포드)에서 입수가능한 SATA 및 술포-SMCC이다.
결합 특이체가 항체인 경우에, 이는 2개 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합에 의해 접합될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 힌지 영역은 접합 전에 홀수의 술프히드릴 잔기, 예를 들어 1개의 술프히드릴 잔기를 함유하도록 변형된다.
대안적으로, 결합 특이체가 둘 다 동일한 벡터 내에 코딩되어 동일한 숙주 세포에서 발현 및 조립될 수 있다. 이러한 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일 쇄 항체 및 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단일 쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단일 쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,260,203; 미국 특허 번호 5,455,030; 미국 특허 번호 4,881,175; 미국 특허 번호 5,132,405; 미국 특허 번호 5,091,513; 미국 특허 번호 5,476,786; 미국 특허 번호 5,013,653; 미국 특허 번호 5,258,498; 및 미국 특허 번호 5,482,858에 기재되어 있다.
이중특이적 분자의 그의 특이적 표적에 대한 결합은, 예를 들어 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA), 방사성면역검정 (REA), FACS 분석, 생물검정 (예를 들어, 성장 억제) 또는 웨스턴 블롯 검정에 의해 확인될 수 있다. 각각의 이들 검정은 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)을 사용하여 특정한 관심 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 LOX-1에 결합하는 본 발명의 항체의 적어도 2개의 동일하거나 상이한 항원-결합 부분을 포함하는 다가 화합물을 제공한다. 항원-결합 부분은 단백질 융합 또는 공유 또는 비 공유 연결을 통해 함께 연결될 수 있다. 대안적으로, 연결 방법은 이중특이적 분자에 대해 기재된 바 있다. 4가 화합물은 예를 들어 본 발명의 항체를 본 발명의 항체의 불변 영역, 예를 들어 Fc 또는 힌지 영역에 결합하는 항체와 가교시켜 수득할 수 있다.
삼량체화 도메인은, 예를 들어 특허 EP 1 012 280B1 (Borean)에 기재되어 있다. 오량체화 모듈은, 예를 들어 PCT/EP97/05897에 기재되어 있다.
연장된 반감기를 갖는 항체
본 발명은 연장된 생체내 반감기를 갖는, LOX-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
많은 인자가 단백질의 생체내 반감기에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 신장 여과, 간에서의 대사, 단백질분해 효소 (프로테아제)에 의한 분해 및 면역원성 반응 (예를 들어, 항체에 의한 단백질 중화 및 대식세포 및 수지상 세포에 의한 흡수). 다양한 전략이 본 발명의 항체의 반감기를 연장시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 (PEG), reCODE PEG, 항체 스캐폴드, 폴리시알산 (PSA), 히드록시에틸 전분 (HES), 알부민-결합 리간드 및 탄수화물 쉴드에의 화학적 연결에 의해; 혈청 단백질, 예컨대 알부민, IgG, FcRn 및 트랜스페린에 결합하는 단백질에 대한 유전적 융합에 의해; 혈청 단백질, 예컨대 나노바디, Fab, DARPin, 아비머, 아피바디 및 안티칼린에 결합하는 다른 결합 모이어티에 (유전학적으로 또는 화학적으로) 커플링됨으로써; rPEG, 알부민, 알부민의 도메인, 알부민-결합 단백질 및 Fc에 대한 유전적 융합 의해; 또는 나노담체, 느린 방출 제제 또는 의료 장치 내로의 혼입에 의해.
항체의 생체내 혈청 순환을 연장시키기 위해, 불활성 중합체 분자, 예컨대 고분자량 PEG는 다관능성 링커를 사용하거나 사용하지 않고 항체 또는 그의 단편에, 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 PEG의 부위 특이적 접합을 통해 또는 리신 잔기 상에 존재하는 엡실론-아미노 기를 통해 부착될 수 있다. 항체를 PEG화하기 위해, 항체 또는 그의 단편을 전형적으로 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질을 유도체화하기 위해 사용되는 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포괄하는 것으로 의도된다. 특정 실시양태에서, PEG화되는 항체는 비-글리코실화된 항체이다. 최소한의 생물학적 활성의 손실을 일으키는 선형 또는 분지형 중합체 유도체화가 사용될 것이다. 항체에 대한 PEG 분자의 적절한 접합을 보장하기 위해 접합 정도를 SDS-PAGE 및 질량 분광측정법에 의해 면밀히 모니터링할 수 있다. 미반응 PEG는 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 접합체로부터 분리될 수 있다. PEG-유도체화된 항체는 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 본원에 기재된 면역검정에 의해 결합 활성 뿐만 아니라 생체내 효능에 대해 시험될 수 있다. 단백질을 PEG화하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 (Nishimura et al.) 및 EP 0 401 384 (Ishikawa et al.)를 참조한다.
다른 변형된 PEG화 기술은, tRNA 신테타제 및 tRNA를 포함하는 재구축 시스템을 통해 화학적으로 특정된 측쇄를 생합성 단백질에 혼입하는, 화학적으로 직교 지시된 조작 기술의 재구축 (ReCODE PEG)을 포함한다. 상기 기술은 이. 콜라이, 효모 및 포유동물 세포에서 30개 초과의 새로운 아미노산을 생합성 단백질에 혼입할 수 있게 한다. tRNA는 앰버 코돈이 위치한 임의의 부위에 비천연 아미노산을 혼입시켜, 정지 코돈으로부터의 앰버가 화학적으로 특정된 아미노산의 혼입을 신호하는 것으로 전환되게 한다.
또한, 재조합 PEG화 기술 (rPEG)이 혈청 반감기 연장을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술은 300-600개 아미노산의 비구조화 단백질 꼬리를 기존의 제약 단백질에 유전적으로 융합시키는 것을 수반한다. 이러한 비구조화 단백질 쇄의 겉보기 분자량은 그의 실제 분자량보다 약 15배 더 높기 때문에, 상기 단백질의 혈청 반감기는 크게 증가된다. 화학적 접합 및 재정제를 필요로 하는 통상적인 PEG화와 대조적으로, 제조 방법은 크게 간소화되고 산물은 균질하다.
폴리시알화는 활동 수명을 지속시키고 치료 펩티드 및 단백질의 안정성을 개선하기 위해 천연 중합체 폴리시알산 (PSA)을 사용하는 또 다른 기술이다. PSA는 시알산의 중합체 (당)이다. 단백질 및 치료 펩티드 약물 전달을 위해 사용되는 경우에, 폴리시알산은 접합체에 보호 미세환경을 제공한다. 이는 순환 중인 치료 단백질의 활동 수명을 증가시키고, 면역계에 의해 인식되는 것을 방지한다. PSA 중합체는 인간 신체에서 자연적으로 발견된다. 특정 박테리아는 수백만년에 걸쳐 그의 벽을 이것으로 코팅하도록 진화하여왔다. 이어서, 이들 천연 폴리시알릴화 박테리아는 분자 모방에 의해 신체의 방어 시스템을 이겨낼 수 있었다. 자연계의 궁극적인 은폐 기술인 PSA는 이러한 박테리아로부터 대량으로, 미리 결정된 물리적 특성을 갖는 것으로서 용이하게 생산될 수 있다. 박테리아 PSA는 인간 신체 내의 PSA와 화학적으로 동일하기 때문에 단백질에 커플링될 때에도 완전하게 비-면역원성이다.
또 다른 기술은 항체에 연결된 히드록시에틸 전분 ("HES") 유도체의 사용을 포함한다. HES는 찰옥수수 전분에서 유래된 변형된 천연 중합체이고, 신체의 효소에 의해 대사될 수 있다. HES 용액은 통상적으로 부족한 혈액량을 대체하고 혈액의 레올로지 특성을 개선하기 위해 투여된다. 항체의 HES화는 분자의 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라 신장 클리어런스를 감소시킴으로써 순환 반감기의 지속을 가능하게 하여 생물학적 활성을 증가시킨다. 다양한 파리미터, 예컨대 HES의 분자량을 변경시킴으로써, 광범위한 HES 항체 접합체가 맞춤화할 수 있다.
증가된 생체내 반감기를 갖는 항체는 또한 1개 이상의 아미노산 변형 (즉, 치환, 삽입 또는 결실)을 IgG 불변 도메인, 또는 그의 FcRn 결합 단편 (바람직하게는 Fc 또는 힌지 Fc 도메인 단편)에 도입하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 국제 공개 번호 WO 98/23289; 국제 공개 번호 WO 97/34631; 및 미국 특허 번호 6,277,375를 참조한다.
추가로, 항체는 항체 또는 항체 단편을 생체내에서 보다 안정하게 하고 보다 긴 생체내 반감기를 갖게 하도록 알부민 (예를 들어, 인간 혈청 알부민; HSA)에 접합될 수 있다. 상기 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 국제 공개 번호 WO 93/15199, WO 93/15200 및 WO 01/77137; 및 유럽 특허 번호 EP 413,622를 참조한다. 또한, 상기 기재된 바와 같은 이중특이적 항체와 관련하여, 항체의 특이성은 항체의 제2 결합 도메인이 혈청 알부민, 바람직하게는 HSA에 결합하는 동안 항체의 한 결합 도메인이 LOX-1에 결합하도록 설계될 수 있다.
반감기를 증가시키는 전략은 나노바디, 피브로넥틴-기반 결합제, 및 생체내 반감기를 증가시키고자 하는 다른 항체 또는 단백질에 특히 유용하다.
항체 접합체
본 발명은 이종 단백질 또는 폴리펩티드 (또는 그의 단편, 바람직하게는 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개 또는 적어도 100개의 아미노산의 폴리펩티드)에 재조합적으로 융합되거나 화학적으로 접합된 (공유 및 비-공유 접합 둘 다를 포함) LOX-1 단백질에 특이적으로 결합하여 융합 단백질을 생성하는 항체 또는 그의 단편을 제공한다. 특히, 본 발명은 본원에 기재된 항체의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, F(ab)2 단편, VH 도메인, VH CDR, VL 도메인 또는 VL CDR) 및 이종 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 항체 또는 항체 단편에 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 융합 또는 접합시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851 및 5,112,946; 유럽 특허 번호 EP 307,434 및 EP 367,166; 국제 공개 번호 WO 96/04388 및 WO 91/06570; 문헌 [Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; 및 Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341]을 참조한다.
추가의 융합 단백질은 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링 ("DNA 셔플링"으로 총칭됨)의 기술을 통해 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 활성을 변경시키기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 보다 높은 친화도 및 보다 낮은 해리율을 갖는 항체 또는 그의 단편). 일반적으로, 미국 특허 번호 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252 및 5,837,458; 문헌 [Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; 및 Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313]을 참조한다 (이들 특허 및 간행물은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 항체 또는 그의 단편, 또는 코딩된 항체 또는 그의 단편은 재조합 전에 오류-유발 PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 다른 방법에 의한 무작위 돌연변이유발에 의해 변경될 수 있다. LOX-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 이종 분자의 하나 이상의 성분, 모티프, 절편, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.
더욱이, 항체 또는 그의 단편은 마커 서열, 예컨대 정제를 용이하게 하는 펩티드에 융합될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 마커 아미노산 서열은 특히 헥사-히스티딘 펩티드, 예컨대 pQE 벡터 (퀴아젠, 인크.(QIAGEN, Inc.), 91311 캘리포니아주 채츠워스 에톤 애비뉴 9259)에서 제공되는 태그이고, 이의 다수가 상업적으로 입수가능하다. 문헌 [Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824]에 기재된 바와 같이, 예를 들어 헥사-히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 다른 펩티드 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응하는 헤마글루티닌 ("HA") 태그 (Wilson et al., 1984, Cell 37:767) 및 "플래그" 태그를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 진단제 또는 검출가능한 작용제에 접합된다. 이러한 항체는 특정한 요법의 효능을 결정하는 것과 같은 임상 시험 절차의 일부로서 질환 또는 장애의 발병, 발생, 진행 및/또는 중증도를 모니터링하거나 예측하는데 유용할 수 있다. 이러한 진단 및 검출은 항체를 검출가능한 물질, 예를 들어 비제한적으로 다양한 효소, 예컨대 비제한적으로 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제; 보결분자단, 예컨대 비제한적으로 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴; 형광 물질, 예컨대 비제한적으로 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린; 형광 물질, 예컨대 비제한적으로 루미놀; 생물발광 물질, 예컨대 비제한적으로 루시페라제, 루시페린 및 에쿼린; 방사성 물질, 예컨대 비제한적으로 아이오딘 (131I, 125I, 123I 및 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중수소 (3H), 인듐 (115In, 113In, 112In 및 111In), 테크네튬 (99Tc), 탈륨 (201Ti), 갈륨 (68Ga, 67Ga), 팔라듐 (103Pd), 몰리브데넘 (99Mo), 크세논 (133Xe), 플루오린 (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re,142 Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn 및 117Tin; 및 양전자 방출 금속 (다양한 양전자 방출 단층촬영을 사용함), 및 비-방사성 상자성 금속 이온에 커플링시켜 달성될 수 있다.
본 발명은 추가로, 치료 모이어티에 접합된 항체 또는 그의 단편의 사용을 포괄한다. 항체 또는 그의 단편은 치료 모이어티, 예컨대 세포독소, 예를 들어 세포증식억제제 또는 세포파괴제, 치료제 또는 방사성 금속 이온, 예를 들어 알파-방출체에 접합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해로운 임의의 작용제를 포함한다.
추가로, 항체 또는 그의 단편은 주어진 생물학적 반응을 변형시키는 치료 모이어티 또는 약물 모이어티에 접합될 수 있다. 치료 모이어티 또는 약물 모이어티는 전형적인 화학적 치료제로 제한되는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 약물 모이어티는 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어 독소, 예컨대 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 아폽토시스제, 항혈관신생제; 또는 생물학적 반응 조절제, 예컨대 예를 들어 림포카인을 포함할 수 있다.
더욱이, 항체는 치료 모이어티, 예컨대 방사성 금속 이온, 예컨대 알파-방출자, 예컨대 213Bi, 또는 방사선금속 이온, 예컨대 비제한적으로 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm을 폴리펩티드에 접합시키는데 유용한 마크로시클릭 킬레이트화제에 접합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 마크로시클릭 킬레이트화제는 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산 (DOTA)이다. 이러한 링커 분자는 관련 기술분야에 통상적으로 공지되어 있고, 문헌 [Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; 및 Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 참조로 포함된다.
항체에 치료 모이어티를 접합시키는 기술은 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58]을 참조한다.
항체는 또한 면역검정 또는 표적 항원의 정제에 특히 유용한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 이러한 고체 지지체는 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 항체를 생산하는 방법
항체를 코딩하는 핵산
본 발명은 상기 기재된 LOX-1-결합 항체 쇄의 절편 또는 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는, 실질적으로 정제된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산 중 일부는 서열 15, 35, 55, 75 또는 95에 제시된 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및/또는 서열 25, 45, 65, 85 또는 105에 제시된 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 구체적 실시양태에서, 핵산 분자는 표 1에서 확인되는 것이다. 본 발명의 일부 다른 핵산 분자는 표 1에서 확인되는 것의 뉴클레오티드 서열에 대해 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 65, 80%, 95% 또는 99%) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 적절한 발현 벡터로부터 발현될 때, 이들 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 LOX-1 항원 결합 능력을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 기재된 LOX-1-결합 항체의 중쇄 또는 경쇄로부터의 적어도 1개의 CDR 영역 및 통상적으로 모든 3개의 CDR 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 다른 폴리뉴클레오티드는 상기 기재된 LOX-1-결합 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역 서열의 모두 또는 실질적으로 모두를 코딩한다. 코드의 축중성으로 인해, 다양한 핵산 서열이 각각의 이뮤노글로불린 아미노산 서열을 코딩할 것이다.
본 발명의 핵산 분자는 항체의 가변 영역 및 불변 영역을 둘 다 코딩할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열의 일부는 서열 16, 36, 56, 76 또는 96에 기재된 중쇄 서열에 대해 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80%, 90% 또는 99%) 중쇄 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 다른 핵산 서열은 서열 26, 46, 66, 86 또는 106에 기재된 경쇄 서열에 대해 실질적으로 동일한 (예를 들어, 적어도 80%, 90%, 또는 99%) 경쇄 서열을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함한다.
폴리뉴클레오티드 서열은 LOX-1-결합 항체 또는 그의 결합 단편을 코딩하는 기존의 서열 (예를 들어, 하기 실시예에 기재된 바와 같은 서열)의 신생 고체-상 DNA 합성 또는 PCR 돌연변이유발에 의해 생산될 수 있다. 핵산의 직접적인 화학적 합성은 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90]의 포스포트리에스테르 방법; 문헌 [Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979]의 포스포디에스테르 방법; 문헌 [Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981]의 디에틸포스포르아미다이트 방법; 및 미국 특허 번호 4,458,066의 고체 지지체 방법에 의해 달성될 수 있다. PCR에 의해 폴리뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입하는 것은, 예를 들어 문헌 [PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; 및 Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 기재된 LOX-1-결합 항체를 생산하기 위한 발현 벡터 및 숙주 세포가 제공된다. LOX-1-결합 항체 쇄 또는 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서 항체를 생산하기 위해 바이러스-기반 및 비-바이러스 발현 벡터 둘 다가 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 및 시스템은 플라스미드, 에피솜 벡터 (전형적으로, 단백질 또는 RNA 발현을 위한 발현 카세트를 가짐), 및 인간 인공 염색체 (예를 들어, 문헌 [Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997] 참조)를 포함한다. 예를 들어, 포유동물 (예를 들어, 인간) 세포에서 LOX-1-결합 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 발현시키는데 유용한 비-바이러스 벡터는 pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 샌디에고), MPSV 벡터, 및 다른 단백질 발현과 관련하여 관련 기술분야에 공지된 다수의 다른 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노연관 바이러스, 헤르페스 바이러스를 기반으로 하는 벡터, SV40, 유두종 바이러스, HBP 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스를 기반으로 하는 벡터, 백시니아 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스 (SFV)를 포함한다. 문헌 [Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; 및 Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992]을 참조한다.
발현 벡터의 선택은 벡터를 발현시키고자 의도되는 숙주 세포에 의존한다. 전형적으로, 발현 벡터는 LOX-1-결합 항체 쇄 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 및 다른 조절 서열 (예를 들어, 인핸서)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 유도 조건 하인 경우를 제외하고 삽입된 서열의 발현을 방지하기 위해 사용된다. 유도성 프로모터는 예를 들어 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 프로모터 또는 열 쇼크 프로모터를 포함한다. 형질전환된 유기체의 배양물은, 발현 산물이 숙주 세포에 의해 보다 우수하게 허용되는 서열을 코딩하는 집단으로 편향되지 않으면서 비유도 조건 하에서 증식될 수 있다. 프로모터에 더하여, LOX-1-결합 항체 쇄 또는 단편의 효율적인 발현을 위해 다른 조절 요소가 또한 요구되거나 바람직할 수 있다. 이들 요소는 전형적으로 ATG 개시 코돈 및 인접한 리보솜 결합 부위 또는 다른 서열을 포함한다. 또한, 발현 효율은 사용하는 세포 시스템에 적절한 인핸서를 포함시키는 것에 의해 증진될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; 및 Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987] 참조). 예를 들어, SV40 인핸서 또는 CMV 인핸서가 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
발현 벡터는 또한 삽입된 LOX-1-결합 항체 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 융합 단백질을 형성하는 분비 신호 서열 위치를 제공할 수 있다. 보다 흔히, 삽입된 LOX-1-결합 항체 서열은 신호 서열에 연결된 후 벡터에 포함된다. LOX-1-결합 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 서열을 수용하는데 사용되는 벡터는 때때로 또한 불변 영역 또는 그의 일부를 코딩한다. 이러한 벡터는 불변 영역과의 융합 단백질로서 가변 영역의 발현을 허용함으로써 무손상 항체 또는 그의 단편이 생산되게 한다. 전형적으로, 이러한 불변 영역은 인간의 것이다.
LOX-1-결합 항체 쇄를 보유하고 발현하는 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 이. 콜라이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현시키는데 유용한 하나의 원핵 숙주이다. 사용하기에 적합한 다른 미생물 숙주는 바실루스, 예컨대 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 다른 엔테로박테리아세아에, 예컨대 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함한다. 이들 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 상용성인 발현 제어 서열 (예를 들어, 복제 기점)을 함유하는 발현 벡터를 또한 제조할 수 있다. 또한, 임의의 수의 다양한 널리 공지된 프로모터, 예컨대 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템, 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템이 존재할 것이다. 프로모터는 임의로 오퍼레이터 서열과 함께 전형적으로 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시 및 완료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다. 본 발명의 LOX-1-결합 폴리펩티드를 발현시키기 위해 다른 미생물, 예컨대 효모가 또한 사용될 수 있다. 바큘로바이러스 벡터와 조합되어 곤충 세포가 또한 사용될 수 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포가 본 발명의 LOX-1-결합 폴리펩티드를 발현시키고 제조하는데 사용된다. 예를 들어, 이는 내인성 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포주 (예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은 1D6.C9 골수종 하이브리도마 클론) 또는 외인성 발현 벡터를 보유하는 포유동물 세포주 (예를 들어, 하기 예시된 SP2/0 골수종 세포)일 수 있다. 이들은 임의의 정상적인 사멸, 또는 정상적이거나 비정상적인 불멸 동물 또는 인간 세포를 포함한다. 예를 들어, CHO 세포주, 다양한 Cos 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마를 비롯한, 무손상 이뮤노글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 개발되었다. 폴리펩티드를 발현시키기 위한 포유동물 조직 세포 배양의 사용은 예를 들어 문헌 [Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987]에서 일반적으로 논의된다. 포유동물 숙주 세포를 위한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예컨대 복제 기점, 프로모터 및 인핸서 (예를 들어, 문헌 [Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986] 참조), 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 이들 발현 벡터는 통상적으로 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 구성적, 세포 유형-특이적, 단계-특이적 및/또는 조정가능하거나 조절가능한 것일 수 있다. 유용한 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 구성적 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 덱사메타손-유도성 MMTV 프로모터, SV40 프로모터, MRP polIII 프로모터, 구성적 MPSV 프로모터, 테트라시클린-유도성 CMV 프로모터 (예컨대, 인간 극초기 CMV 프로모터), 구성적 CMV 프로모터, 및 관련 기술분야에 공지된 프로모터-인핸서 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
관심 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터를 도입하는 방법은 세포 숙주의 유형에 따라 달라진다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염은 원핵 세포에 통상적으로 이용되고, 반면에 인산칼슘 처리 또는 전기천공은 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다. (일반적으로 상기 문헌 [Sambrook, et al.] 참조). 다른 방법, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포솜-매개 형질전환, 주사 및 미세주사, 탄도적 방법, 비로솜, 이뮤노리포솜, 다가양이온:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 포진 바이러스 구조 단백질 VP22에 대한 융합 (Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997), DNA의 작용제-증진 흡수 및 생체외 형질도입을 포함한다. 재조합 단백질의 장기, 고수율 생산을 위해, 안정한 발현이 종종 요구될 것이다. 예를 들어, LOX-1-결합 항체 쇄 또는 결합 단편을 안정하게 발현하는 세포주는 바이러스 복제 기점 또는 내인성 발현 요소 및 선택 마커 유전자를 함유하는 본 발명의 발현 벡터를 사용하여 제조될 수 있다. 벡터의 도입 후에, 세포를 선택 배지로 교체시키기 전에 풍부화 배지 중에서 1-2일 동안 성장하도록 할 수 있다. 선택 마커의 목적은 선택에 대한 내성을 부여하는 것이고, 그의 존재는 선택 배지에서 도입 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장을 가능하게 한다. 내성이 있는, 안정하게 형질감염된 세포는 세포 유형에 적절한 조직 배양 기술을 사용하여 증식될 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체의 생성
모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어 [Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 비롯한 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위한 많은 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성 형질전환이 사용될 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 동물 시스템은 뮤린, 래트 및 토끼 시스템을 포함한다. 마우스에서 하이브리도마를 생산하는 것은 널리 확립된 절차이다. 면역화 프로토콜, 및 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리를 위한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차가 또한 공지되어 있다.
본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기 기재된 바와 같이 제조된 뮤린 모노클로날 항체의 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린을 코딩하는 DNA는 관심 뮤린 하이브리도마로부터 수득되고 비-뮤린 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 뮤린 가변 영역은 인간 불변 영역에 연결될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly et al.) 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해, 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여, 뮤린 CDR 영역은 인간 프레임워크 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5225539 (Winter), 및 미국 특허 번호 5530101; 5585089; 5693762 및 6180370 (Queen et al.)을 참조한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 모노클로날 항체이다. LOX-1에 대해 지시된 이러한 인간 모노클로날 항체는 마우스 면역계보다는 인간 면역계의 일부를 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소믹 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이들 트랜스제닉 및 트랜스크로모소믹 마우스는 본원에서 각각 HuMAb 마우스 및 KM 마우스로 지칭되는 마우스를 포함하며, 본원에서 "인간 Ig 마우스"로 총칭된다.
HuMAb 마우스® (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.))는 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자좌를 불활성화하는 표적화 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니유전자좌를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859] 참조). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 대한 반응으로 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에서 부류 전환 및 체세포 돌연변이가 일어나 고친화도의 인간 IgGκ 모노클로날을 생성한다 (Lonberg, N. et al., 1994 supra; reviewed in Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, 및 Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). HuMAb 마우스의 제조 및 사용, 및 이러한 마우스에 의해 보유되는 게놈 변형은 하기 문헌에 추가로 기재되어 있다: [Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; 및 Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851] (상기 모든 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 구체적으로 참조로 포함됨). 추가로, 미국 특허 번호 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429 (모두 Lonberg and Kay); 미국 특허 번호 5,545,807 (Surani et al.); PCT 공개 번호 WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 및 WO 99/45962 (모두 Lonberg and Kay); 및 PCT 공개 번호 WO 01/14424 (Korman et al.)를 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 트랜스진 및 트랜스크로모솜 상에 인간 이뮤노글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예를 들어 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스"로 지칭되며, PCT 공개 WO 02/43478 (Ishida et al.)에 상세하게 기재되어 있다.
또한 추가로, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스제닉 동물 시스템이 관련 기술분야에서 이용가능하고, 본 발명의 LOX-1-결합 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스 (아브게닉스, 인크.(Abgenix, Inc.))로 지칭되는 대안적 트랜스제닉 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 및 6,162,963 (Kucherlapati et al.)에 기재되어 있다.
또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스크로모소믹 동물 시스템이 관련 기술분야에서 이용가능하고, 본 발명의 LOX-1-결합 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, "TC 마우스"로 지칭되는, 인간 중쇄 트랜스크로모솜 및 인간 경쇄 트랜스크로모솜 둘 다를 보유하는 마우스가 사용될 수 있고; 이러한 마우스는 문헌 [Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기재되어 있다. 또한, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스크로모솜을 보유하는 소가 관련 기술분야에 기재되어 있으며 (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894), 이는 본 발명의 LOX-1-결합 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 인간 이뮤노글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 관련 기술분야에 확립되어 있거나 또는 하기 실시예에 기재되어 있다. 예를 들어 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 및 5,571,698 (Ladner et al.); 미국 특허 번호 5,427,908 및 5,580,717 (Dower et al.); 미국 특허 번호 5,969,108 및 6,172,197 (McCafferty et al.); 및 미국 특허 번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 (Griffiths et al.)을 참조한다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 면역화시 인간 항체 반응이 생성될 수 있도록 인간 면역 세포를 재구성한 SCID 마우스를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767 (Wilson et al.)에 기재되어 있다.
프레임워크 또는 Fc 조작
본 발명의 조작된 항체는, 예를 들어 항체의 특성을 개선하기 위해 VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 변형을 가한 것을 포함한다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한가지 접근법은 하나 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "복귀돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이가 일어난 항체는 항체가 유래된 배선 서열과는 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그의 배선 배위로 되돌리기 위해, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발에 의해 체세포 돌연변이를 배선 서열로 "복귀돌연변이"시킬 수 있다. 이러한 "복귀돌연변이" 항체도 또한 본 발명에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 T 세포-에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키기 위해 프레임워크 영역 내 또는 심지어는 하나 이상의 CDR 영역 내의 하나 이상의 잔기를 돌연변이시키는 것을 수반한다. 이 접근법은 또한 "탈면역화"로도 지칭되고, 미국 특허 공개 번호 20030153043 (Carr et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형에 추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 항체는 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포성 세포독성을 변경시키기 위하여 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 다시 변경시키기 위해 화학적으로 변형될 수 있거나 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음), 또는 그의 글리코실화가 변경되도록 변형될 수 있다. 각각의 이들 실시양태가 하기에 추가로 상세하게 기재되어 있다. Fc 영역에서 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 인덱스의 것이다.
한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역이 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경, 예를 들어 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다.
또 다른 실시양태에서, 항체의 생물학적 반감기를 감소시키기 위해 항체의 Fc 힌지 영역이 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역에 도입되어, 항체는 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 단백질 A (SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖게 된다. 이 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745 (Ward et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 하기 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다: 미국 특허 번호 6,277,375 (Ward)에 기재된 바와 같은 T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022 (Presta et al.)에 기재된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취해진 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경되어 항체의 이펙터 기능을 변경한다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체되어, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모 항체의 항원-결합 능력은 보유하도록 할 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는, 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260 (둘 다 Winter et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이 다양한 아미노산 잔기로 치환되어, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소 또는 폐지된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖도록 할 수 있다. 이 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551 (Idusogie et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경되어 보체를 고정하는 항체의 능력을 변경한다. 이 접근법은 PCT 공개 WO 94/29351 (Bodmer et al.)에 추가로 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키고/거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형된다. 이 접근법은 PCT 공개 WO 00/42072 (Presta)에 추가로 기재되어 있다. 추가로, 인간 IgG1 상의 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 결합 부위가 맵핑되었고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되어 있다 (문헌 [Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604] 참조).
또 다른 실시양태에서, 항체의 글리코실화는 변형된다. 예를 들어, 비-글리코실화 항체가 제조될 수 있다 (즉, 항체는 글리코실화가 결핍됨). 글리코실화는, 예를 들어 "항원"에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 항체 서열 내에서의 글리코실화 중 하나 이상의 부위를 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위의 제거를 유발하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어져, 그에 의해 그 부위에서 글리코실화를 제거할 수 있다. 이러한 비-글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861 (Co et al.)에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
추가로 또는 대안적으로, 변경된 글리코실화 유형을 갖는 항체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 저푸코실화 항체 또는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 갖는 항체가 제조될 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포 내에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 관련 기술분야에 기재되어 있고, 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, EP 1,176,195 (Hang et al.)는 푸코실 트랜스퍼라제를 코딩하는, 기능적으로 파괴된 FUT8 유전자를 갖는 세포주를 기재하며, 이러한 세포주에서 발현된 항체는 저푸코실화를 나타낸다. PCT 공개 WO 03/035835 (Presta)는 Asn(297)-연결된 탄수화물에 푸코스를 부착시키는 능력이 감소된 변이체 CHO 세포주, Lecl3 세포를 기재하며, 이러한 숙주 세포에서 발현된 항체의 저푸코실화를 또한 유발된다 (또한, 문헌 [Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). PCT 공개 WO 99/54342 (Umana et al.)는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제 (예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하며, 이러한 조작된 세포주에서 발현된 항체는 증가된 양분성 GlcNac 구조를 나타내어 항체의 증가된 ADCC 활성을 유발한다 (또한 문헌 [Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조).
변경된 항체를 조작하는 방법
상기 논의된 바와 같이, 본원에 제시된 VH 및 VL 서열 또는 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 LOX-1-결합 항체를 사용하여, 전장 중쇄 및/또는 경쇄 서열, VH 및/또는 VL 서열, 또는 그에 부착된 불변 영역(들)을 변형시킴으로써 새로운 LOX-1-결합 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 LOX-1-결합 항체의 구조적 특징은 인간 LOX-1에 대한 결합 및 LOX-1의 하나 이상의 기능적 특성의 억제 (예를 들어, LOX-1 수용체에 대한 LOX-1 결합의 억제, LOX-1 의존성 세포 증식의 억제)와 같은 본 발명의 항체의 적어도 하나의 기능적 특성을 보유하는 구조적으로 관련된 LOX-1 항체를 생성하기 위해 사용된다.
예를 들어, 본 발명의 항체의 하나 이상의 CDR 영역 또는 그의 돌연변이는 공지된 프레임워크 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합적으로 조합되어, 상기 논의된 바와 같은 본 발명의 추가의 재조합-조작된 LOX-1-결합 항체를 생성할 수 있다. 다른 유형의 변형은 이전 섹션에 기재된 것을 포함한다. 조작 방법을 위한 출발 물질은 본원에 제공되는 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 생성하기 위해, 본원에 제공되는 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상 또는 그의 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조할 (즉, 단백질로서 발현시킬) 필요는 없다. 오히려, 서열(들) 내에 함유된 정보를 출발 물질로서 사용하여 원래의 서열(들)로부터 유래된 "제2 세대" 서열(들)을 생성한 다음, "제2 세대" 서열(들)을 단백질로서 제조 및 발현시킨다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 8, 28, 48, 68 및 88로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 9, 29, 49, 69 및 89로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열 10, 30, 50, 70 및 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및 서열 18, 38, 58, 78 및 98로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 19, 39, 59, 79 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열 20, 40, 60, 80 및 100으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 항체 서열로 이루어진 LOX-1-결합 항체를 제조하고; 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경시켜 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 생성하고; 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 방법을 제공한다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 11, 31, 51, 71 및 91로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 12, 32, 52, 72 및 92로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열 13, 33, 53, 73 및 93으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및 서열 21, 41, 61, 81 및 101로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR1 서열, 서열 22, 42, 62, 82 및 102로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열 23, 43, 63, 83 및 103으로 이루어진 군으로부터 선택된 CDR3 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 항체 서열로 이루어진 LOX-1-결합 항체를 제조하고; 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경시켜 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 생성하고; 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 방법을 제공한다.
따라서, 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 16, 36, 56, 76 또는 96의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 전장 중쇄 항체 서열; 및 서열 26, 46, 66, 86 또는 106의 군으로부터 선택된 서열을 갖는 전장 경쇄 항체 서열로 이루어진, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된 LOX-1-결합 항체를 제조하고; 전장 중쇄 항체 서열 및/또는 전장 경쇄 항체 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경시켜 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 생성하고; 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 중쇄 또는 경쇄의 변경은 중쇄 또는 경쇄의 프레임워크 영역에 있다.
변경된 항체 서열은 또한 US2005/0255552에 기재된 바와 같은 고정된 CDR3 서열 또는 최소 필수 결합 결정기 및 CDR1 및 CDR2 서열에 대한 다양성을 갖는 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 제조될 수 있다. 스크리닝은 항체 라이브러리로부터 항체를 스크리닝하는데 적절한 임의의 스크리닝 기술, 예컨대 파지 디스플레이 기술에 따라 수행될 수 있다.
표준 분자 생물학 기술을 사용하여 변경된 항체 서열을 제조하고 발현시킬 수 있다. 변경된 항체 서열(들)에 의해 코딩되는 항체는 본원에 기재된 LOX-1-결합 항체의 기능적 특성 중 하나, 일부 또는 모두를 보유하는 것이며, 기능적 특성은 인간, 시노몰구스, 래트 및/또는 마우스 LOX-1에 대한 특이적 결합을 포함하나 이에 제한되지는 않고; 항체는 F36E 및/또는 Ba/F3-LOX-1R 세포 증식 검정에서 LOX-1-의존성 세포 증식을 억제한다.
본 발명의 항체를 조작하는 방법의 특정 실시양태에서, 돌연변이는 LOX-1-결합 항체 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위적으로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 생성되는 변형된 LOX-1-결합 항체는 결합 활성 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 관련 기술분야에 기재되어 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 02/092780 (Short)은 포화 돌연변이유발, 합성 라이게이션 조립 또는 그의 조합을 사용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하는 방법을 기재하고 있다. 대안적으로, PCT 공개 WO 03/074679 (Lazar et al.)는 항체의 생리화학적 특성을 최적화하기 위해 컴퓨터 스크리닝 방법의 사용 방법을 기재하고 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 항체는 탈아미드화 부위를 제거하도록 조작된다. 탈아미드화는 펩티드 또는 단백질에서 구조적 및 기능적 변화를 야기하는 것으로 공지되어 있다. 탈아미드화는 감소된 생물활성, 뿐만 아니라 단백질 약제의 약동학 및 항원성의 변경을 유발할 수 있다. (Anal Chem. 2005 Mar 1;77(5):1432-9).
본 발명의 특정 실시양태에서, 항체는 pI를 증가시키고 그의 약물-유사 특성을 개선하도록 조작된다. 단백질의 pI는 분자의 전반적인 생물물리학적 특성의 주요 결정인자이다. 낮은 pI를 갖는 항체는 덜 가용성이고, 덜 안정적이고, 응집되기 쉬운 것으로 공지되어 있다. 추가로, 낮은 pI를 갖는 항체의 정제는 도전과제이고, 특히 임상 용도를 위한 규모-확대 동안 문제가 될 수 있다. 본 발명의 항-LOX-1 항체 또는 Fab의 pI를 증가시키는 것은 그의 용해도를 개선하여 항체가 보다 높은 농도 (>100 mg/ml)로 제제화될 수 있게 하였다. 고농도 (예를 들어 >100mg/ml)의 항체 제제는 환자의 눈에 유리체내 주사를 통한 항체의 보다 많은 용량의 투여를 가능하게 하는 이점을 제공하고, 이는 투여 빈도를 감소시켜, 심혈관 장애를 비롯한 만성 질환의 치료를 위한 유의한 이점을 제공할 수 있다. 보다 높은 pI는 또한 항체의 IgG 버전의 FcRn-매개된 재순환을 증가시켜, 약물이 체내에서 보다 오랜 기간 동안 지속되게 함으로써, 보다 적은 횟수의 주사를 필요로 할 수 있다. 마지막으로, 항체의 전반적인 안정성은 보다 높은 pI로 인해 유의하게 개선되어, 보다 긴 저장 수명 및 생체내 생물활성을 유발한다. 바람직하게는, pI는 8.2 이상이다.
변경된 항체의 기능적 특성은 관련 기술분야에서 이용가능하고/하거나 본원에 기재된 표준 검정, 예컨대 실시예에 기재된 것 (예를 들어, ELISA)을 사용하여 평가될 수 있다.
예방 및 치료 용도
본원에 기재된 바와 같은 LOX-1에 결합하는 항체는, 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 투여하는 것에 의한 증가된 LOX-1 수준 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 치료를 위해 치료상 유용한 농도로 사용될 수 있다. 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하는 것에 의한 LOX-1-연관 심혈관 장애의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체를 투여하는 것에 의한 LOX-1-연관 심혈관 장애의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 항체는, 특히 심혈관 장애, 내피 세포 기능장애, 내피 세포 장애, 아테롬성동맥경화증, 동맥경화증, 고혈압, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 당뇨병, 산화질소 결핍, 심근경색, 혈관 산화성 스트레스, 심근 허혈, 허혈-재관류, 패혈증, 당뇨병성 신병증, 신질환, 심근병증, 심부전, 말초 동맥 질환, 관상동맥 심장 질환, 파행 (예를 들어, 간헐성 파행, 러더포드 부류 II/III 파행), 말초 동맥 질환 (PAD), 협심증 (예를 들어, 불응성 협심증), 관상 동맥 질환 (CAD) (예를 들어, 심장에 공급되는 동맥의 아테롬성동맥경화증으로 인함), 졸중 및 비정상적 내피-의존성 혈관확장을 포함하나 이에 제한되지는 않는 LOX-1 연관 상태 또는 장애를 예방, 치료, 예방 및 개선하는데 사용될 수 있다.
심혈관 장애, 예를 들어, LOX-1-연관 심혈관 장애의 치료 및/또는 예방은 혈관 기능의 임상 관련 측정을 사용하여 건강 관리 전문가에 의해 결정될 수 있다. LOX-1-연관 심혈관 장애의 치료는 혈관 기능, 혈관 해부학 및/또는 혈류역학 파라미터의 개선 또는 보존을 유발하거나 또는 유발하는 것으로 고려되는 임의의 작용 (예를 들어, 본원에 기재된 항-LOX-1 항체의 투여)을 의미한다. 또한, 예방은 그것이 심혈관 장애와 연관된 상태 또는 장애에 관한 것일 때, 본원에 정의된 바와 같은 혈관 기능 및/또는 심혈관 장애 파라미터의 악화에 대한 위험이 있는 환자에서 상기 악화를 예방하거나 또는 둔화시키는 임의의 작용 (예를 들어, 본원에 기재된 항-LOX-1 항체의 투여)을 의미한다.
oxLDL 및 가용성 LOX-1 수준이 안정형 협심증 및 급성 허혈성 증후군에서 둘 다 증가되어 있기 때문에, 본 발명의 항-LOX-1 항체는 혈관 산화성 스트레스를 억제하고, 심근 허혈을 감소시키고, 협심증 및 운동 내성을 개선할 것으로 예상되고; 상기 항체는 제1 질환-변형 항-협심증 치료가 이용가능해지도록 하는 잠재력을 갖는다.
상기 치료적 투여의 효능은 일과성 허혈 사건 (보행 ECG 모니터링) 및 협심증 (시애틀 협심증 설문지)의 빈도 및 지속기간에 대한 일련의 평가 및 관류 영상화 옵션을 사용한 일련의 운동 내성 시험에 의해 측정될 수 있다. 효능은 또한 바이오마커, 예컨대 혈장 oxLDL, 가용성 LOX-1 및 산화성 스트레스 바이오마커 (F2-이소프로스탄, 말론디알데히드, 미엘로퍼옥시다제)를 사용하여 측정될 수 있다.
본원에 사용된 "파행"은 중증 파행 및 다른 유사 용어를 포함하며, 이동 장애 및 높은 미충족 의료 필요성을 기재한다. 파행은 하지 허혈, 근육 피로 야기, 휴식에 의해 완화되는 분투 시의 통증, 제한된 이동 및 감소된 삶의 질을 특징으로 하는 상태이며, 아테롬성동맥경화증 및 비정상적 (예를 들어, 손상된) 내피-의존성 혈관확장에 의해 야기된다. 미국에서 그의 유병률은 8-12백만명 환자이다. 간헐성 파행을 가진 환자 중에서, 7%는 하지 우회로 수술을 겪을 것이고, 4%는 대절단을 요구할 것이고, 16%는 파행 악화를 발달시킬 것이다. 심혈관 사건, 예컨대 심근경색 및 졸중은 5년에 걸쳐 중증 파행 환자의 20%에서 발생한다. 현행 요법은 수술이고, 덜 침습적인 수단을 통한 치료, 예컨대 본 발명의 항-LOX-1 항체의 투여는 엄청난 치료 돌파구를 나타낼 것이다.
상기 치료적 투여의 효능은 통증 개시까지의 시간, 운동 지속기간 및 보행 거리에 대한 종점과 함께 운동-유도 파행의 일련의 평가 (족저 굴곡 및 트레드밀)에 의해 측정될 수 있다. 효능은 또한 기계론적 바이오마커, 예컨대 혈장 oxLDL 및 가용성 LOX-1; 산화성 스트레스 바이오마커 (F2-이소프로스탄, 말론디알데히드, 미엘로퍼옥시다제); 하지 흐름 및 근육 O2 포화에 있어서 운동-유도 변화를 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명의 항-LOX-1 항체가 치료상 유용할 또 다른 높은 미충족 의료 필요성은 불응성 협심증이다. 협심증은 재혈관화에 대한 옵션 없이 최적 의료 요법 (예를 들어, 장기 작용 베타-차단제 니트레이트 및 칼슘 채널 차단제의 투여)에도 불구하고 이환 대상체에서 재발한다. 불응성 협심증은 심근의 허혈로 인한, 일반적으로는 관상 동맥의 폐쇄 또는 연축 (예를 들어, 관상 동맥 질환으로부터)으로 인한 흉통에 의해 표시되며 쇠약 증상, 매우 제한된 신체 활동 및 열악한 삶의 질을 갖는 상태이다. 미국에서 1-1.8백만명의 환자인 불응성 협심증 환자는 1년에 10% 비율의 증가된 심혈관성 사망률을 경험하며; 1년에 적어도 100,000건의 새로운 불응성 협심증 사례가 발생한다.
본 발명의 항체는 또한 LOX-1 연관된 장애의 예방, 치료 또는 개선을 위한 다른 작용제와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 스타틴 요법이 심혈관 장애를 가진 환자의 치료를 위해 본 발명의 LOX-1 항체 및 항원 결합 단편과 조합되어 사용될 수 있다.
제약 조성물
본 발명은 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된 LOX-1-결합 항체 (무손상 또는 결합 단편)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 조성물은 예를 들어, 심혈관 질환과 연관된 상태 또는 장애의 치료 또는 예방에 적합한 하나 이상의 다른 치료제를 추가로 함유할 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 조성물을 증진 또는 안정화시키거나, 또는 조성물의 제조를 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 제약상 허용되는 담체는 생리학상 상용성인 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라진다. 투여가 유리체내, 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하이거나, 표적 부위에 근접하게 투여되는 것이 바람직하다. 제약상 허용되는 담체는 유리체내, 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합해야 한다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 산의 작용 및 화합물을 불활성화할 수 있는 다른 천연 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
조성물은 멸균되고 유동성이어야 한다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨 및 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것은 바람직하다. 주사가능한 조성물의 장기 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 관련 기술분야에 널리 공지되고 통상적으로 실시되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; 및 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다. 제약 조성물은 바람직하게는 GMP 조건 하에 제조된다. 전형적으로, LOX-1-결합 항체의 치료 유효 용량 또는 효과적인 용량이 본 발명의 제약 조성물에 사용된다. LOX-1-결합 항체는 통상의 기술자에게 공지된 통상의 방법에 의해 제약상 허용되는 투여 형태로 제제화된다. 투여 요법은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정된다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 또는 치료 상황의 위급성에 의해 지시되는 바와 같이 용량이 비례적으로 감소되거나 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 바와 같은 투여 단위 형태는 치료할 대상체에 대한 단위 투여량으로서 적합화된 물리적 이산 단위를 지칭하고; 각각의 단위는 필요한 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 특정한 환자에게 독성이 아니면서 상기 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하기에 유효한 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정한 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정한 화합물의 배출 속도, 치료 지속기간, 사용된 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료할 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 이전 병력을 비롯한 다양한 약동학적 인자 및 기타 인자에 의존한다.
의사 또는 수의사는 제약 조성물 중에 사용되는 본 발명의 항체의 용량을 목적하는 치료 효과 달성에 필요한 것보다 더 낮은 수준에서 시작하여, 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 심혈관 장애의 치료를 위한 본 발명의 조성물의 유효 용량은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리적 상태, 환자가 인간인지 동물인지의 여부, 투여되는 다른 의약, 및 치료가 예방적인지 또는 치료적인지의 여부를 비롯한 많은 상이한 인자에 따라 달라진다. 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화하도록 적정될 필요가 있다. 항체를 전신 투여하는 경우에, 투여량은 숙주 체중의 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 및 보다 통상적으로 0.01 내지 15 mg/kg의 범위이다. 항체를 유리체내 투여하는 경우에, 투여량은 0.1 mg/눈 내지 5mg/눈의 범위일 수 있다. 예를 들어, 0.1 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.7 mg/ml, 0.8 mg/ml, 0.9 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.1 mg/ml, 1.2 mg/ml, 1.3 mg/ml, 1.4 mg/ml, 1.5 mg/ml, 1.6 mg/ml, 1.7 mg/ml, 1.8 mg/ml, 1.9 mg/ml, 2.0 mg/ml, 2.1 mg/ml, 2.2 mg/ml, 2.3 mg/ml, 2.4 mg/ml, 2.5 mg/ml, 2.6 mg/ml, 2.7 mg/ml, 2.8 mg/ml, 2.9 mg/ml, 3.0 mg/ml, 3.1 mg/ml, 3.2 mg/ml, 3.3 mg/ml, 3.4 mg/ml, 3.5 mg/ml, 3.6 mg/ml, 3.7 mg/ml, 3.8 mg/ml, 3.9 mg/ml, 4.0 mg/ml, 4.1 mg/ml, 4.2 mg/ml, 4.3 mg/ml, 4.4 mg/ml, 4.5 mg/ml, 4.6 mg/ml, 4.7 mg/ml, 4.8 mg/ml, 4.9 mg/ml, 또는 5.0 mg/ml. 예시적인 치료 요법은 2주마다 1회 또는 1개월 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회의 전신 투여를 수반한다. 예시적인 치료 요법은 2주마다 1회 또는 1개월 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회, 또는 필요한 만큼 (PRN) 전신 투여를 수반한다.
항체는 통상적으로 다수회 투여된다. 단일 투여량 사이의 간격은 매주, 매월 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자에서 LOX-1-결합 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 나타나는 바에 따라 불규칙적일 수 있다. 또한, 대안적 투여 간격은 의사에 의해 결정될 수 있고, 매월 또는 효과상 필요에 따라 투여될 수 있다. 전신 투여의 일부 방법에서, 투여량은 1-1000 μg/ml, 및 일부 방법에서는 25-500 μg/ml의 혈장 항체 농도가 달성되도록 조정된다. 대안적으로, 항체는 지속 방출 제제로서 투여될 수 있고, 이 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간화 항체는 키메라 항체 및 비인간 항체보다 더 긴 반감기를 나타낸다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 달라질 수 있다. 예방 용도에서, 상대적으로 낮은 투여량이 상대적으로 덜 빈번한 간격으로 장기간에 걸쳐 투여된다. 일부 환자는 그의 여생 동안 계속 치료를 받는다. 치료 용도에서, 질환의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 개선을 나타낼 때까지 상대적으로 짧은 간격의 상대적으로 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 환자에게 예방 요법을 투여할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 발명의 다른 변형은 통상의 기술자에게 자명할 것이고, 첨부된 청구범위에 포괄된다.
실시예 1: 항원으로서 사용하기 위한 정제된 재조합 인간 가용성 LOX-1의 제조
인간 CD33으로부터의 N-말단 신호 펩티드, 정제 태그 (EFHR) 및 BirA 비오티닐화 서열 (GLNDIFEAQKIEWHE) (서열 144)을 갖는 인간 LOX-1 폴리펩티드의 세포외 도메인 (아미노산 잔기 61-273)을 코딩하는 핵산 서열을 포유동물 세포 발현 벡터 pRS5a 내로 서브클로닝하였다. 생성된 플라스미드, pRS5a_APP-Avi-인간-sLOX-1(61-273)을 표준 폴리에틸렌이민 (PEI) 형질감염 방법을 사용하여 HEK293T 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포를 노파르티스(Novartis) 배지 M11V3 (바이오콘셉트(Bioconcept))에서 현탁액 배양물 중에 증식시키고, 형질감염은 웨이브 바이오리액터(Wave Bioreactor)를 사용하여 5 리터 배지에서 1.4 x 106개 세포/ml의 최종 세포 농도로 수행하였다.
형질감염 5시간 후에, 5 리터의 엑스셀(ExCell) VPRO 혈청-무함유 배지 (시그마(Sigma))를 첨가하였다. 세포를 10일 동안 37℃ 및 5% CO2에서 성장시켰다. 이어서, 세포를 원심분리에 의해 수거한 다음, 0.22 마이크로미터 멸균 필터에 의해 여과하였다. 청정화 상청액을 PBS로 평형화된 20 mL 항-APP 친화도 수지 (노파르티스 소유)에 통과시켰다. 칼럼을 280 nm에서의 기준선 흡광도에 도달할 때까지 PBS로 세척하였다. 이어서, 칼럼을 1% 트리톤 X-100 및 0.3% 트리-n-부틸포스페이트를 함유하는 10 칼럼 부피의 PBS, 이어서 25 칼럼 부피의 PBS로 세척하였다. 이어서, sLOX-1 단백질을 50 mM 시트르산나트륨, pH 3.0으로 용리시키고, 분획을 1/10 부피의 1M 트리스, pH 9.0으로 중화시켰다. 적절한 분획을 풀링하고, PBS에 대해 남김없이 투석한 다음, 분취하고, 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 분석적 크기결정 분석은 정제된 가용성 LOX-1 단백질 물질이 >95% 이량체 형태인 것으로 제시하였으며, 이는 이러한 단백질의 예상된 형태이다.
실시예 2: 인간 LOX-1 형질감염된 HEK293 세포의 제조
항-LOX1 특이적 항체의 결합 특이성 및 기능적 활성을 시험하기 위해, 인간 LOX-1을 안정하게 과다발현하는 HEK293 세포를 생성하였다. 표준 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 형질감염 방법을 사용하여, HEK293-6E 세포를 전장 인간 LOX-1 cDNA 및 히그로마이신 내성을 코딩하는 포유동물 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염된 배양물을 형질감염 후 제3일에 유동 세포측정법에 의해 LOX-1의 표면 발현에 대해 평가한 다음, 히그로마이신 선택 (200 μg/ml)에 적용하여 안정하게 발현하는 세포를 풍부화하였다. 클론 집단을 한계 희석의 순차적 2 라운드에 의해 수득하고, 발현을 유동 세포측정법에 의해 확인하였다. 배양물 중 4주 초과 동안 안정한 LOX-1 발현을 유지하는 클론만을 선택하여 후속 항체 특성화 검정에 사용하였다.
실시예 3: 모노클로날 항체의 제조
재조합 인간 LOX-1 단백질을 실시예 1에 기재된 바와 같이 사내 제조하고, 항-LOX-1 하이브리도마 클론의 생성을 위한 면역원으로서 사용하였다. PBS 중 LOX-1 항원을 Balb/c 마우스에서 면역 반응을 증진시키기 위한 동등 부피의 프로인트 아주반트와 혼합하였다. 완전 프로인트 아주반트 (시그마 F5881)를 제1 주사에 사용하고, 불완전 프로인트 아주반트 (시그마 F5506)를 후속 면역화에 사용하였다.
동물 면역화 및 샘플 수집을 IACUC-승인 표준 동물 사용 프로토콜에 따라 수행하였다. 간략하게, 5-6주령의 암컷 Balb/c VAF 마우스 (찰스 리버 래보러토리즈(Charles River Laboratories))를 인간 LOX-1 단백질 및 아주반트의 항원 에멀젼에 의해 면역화하였다. 마우스를 동물당 100 μL의 항원-아주반트 혼합물 중 대략 20 μg의 단백질로 4회 동안 피하 면역화하였다. 주사를 2-3주마다 수행하여 동물에서 면역 반응을 발생시켰다. 하이브리도마 생성을 위한 세포 융합 3일 전에, 마우스를 불완전 프로인트 아주반트와 혼합된 LOX-1 항원의 동일한 용량으로 1회 초과로 복강내 부스팅시키고, 세포 융합 당일에 멸균된 수술 조건 하에서 비장 수집을 위해 희생시켰다.
면역화된 마우스로부터의 비장은 RPMI-1640 배지에서 단세포 현탁액을 제조하기 위해 2개의 멸균 및 냉동 현미경 슬라이드 사이에서 분쇄하였다. 비장 세포를 펠릿화하고, RPMI-1640 배지로 2회 세척하였다. 하이브리도마 클론을 생성하기 위한 세포 융합을 위해, 비장세포를 혼합하고, 표준 융합 프로토콜 (Zhang C. 2012. Methods Mol. Biol. 901:117-135)에 따라 융합원으로서의 폴리에틸렌 글리콜-1500을 사용하여 뮤린 골수종 P3X63Ag8.653 세포 (Kearney J.F. et al., 1979. J. Immunol., 123:1548-1550)와 융합시켰다. 세포 융합 및 원심분리 후, 세포를 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 (HAT) 보충물 (시그마 H-0262)을 함유하는 완전 RPMI-1640 배지 (200mL/비장)에 현탁시키고, 96-웰 편평-바닥 플레이트 (코닝(Corning)-코스타(Costar) 3596) 내로 웰 당 200μL의 세포 현탁액으로 플레이팅하였다.
37℃, 5% CO2에서 3-4일 동안 인큐베이션한 후, 100 μL의 배양물 상청액을 플레이트의 각 웰로부터 제거하고, 하이포크산틴-티미딘 (HT) 보충물 (시그마 H-0137)을 함유하는 완전 RPMI-1640 배지의 동등 부피로 대체하였다. 플레이트는 하이브리도마 클론이 항체 스크리닝을 가능하게 하기에 충분히 큰 콜로니로 성장할 때까지 37℃에서 5% CO2의 분위기 하에 계속 인큐베이션하였다.
실시예 4: 하이브리도마 스크리닝, 서브클로닝 및 선택
융합 후 제2주에, 하이브리도마 세포가 플레이트 웰 중 전면생장의 절반으로 성장하고 상청액이 오렌지색으로 변할 때까지, 하이브리도마 상청액을 면역검정, 예컨대 세포-기반 LOX-1 항원에 대한 면역형광 유동 세포측정법 또는 LOX-1 단백질 항원에 대한 ELISA에 의해 항체 스크리닝하기 위해 플레이트로부터 샘플링하였다. 1차 스크리닝을 위해, 하이브리도마 상청액을 비-형질감염 세포에 대한 LOX-1-형질감염 293-6E 세포를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 시험하였다. 간략하게, 인간 LOX-1-형질감염 293-6E 세포 또는 비-형질감염 세포를 각각 50 μL의 하이브리도마 상청액과 함께 인큐베이션하고, 이어서 플루오레세인-아피니퓨어(AffiniPure) Fab 단편 염소 항-마우스 IgG (H+L) 접합체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈(Jackson ImmunoResearch Laboratories))로 표지하고, 자동 모드로 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) FACS칼리버(FACSCalibur)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
유동 세포측정 분석에 의해, LOX-1-형질감염 293-6E 세포와 반응하지만 비-형질감염 세포와는 반응하지 않는 하이브리도마 클론을 확인하고, 융합 플레이트로부터 선택하였다. 목적하는 하이브리도마 클론을 추가의 특성화를 위해 T12 플레이트에서 증대시켰다. 관심 하이브리도마 클론을 한계 희석에 의해 서브클로닝하고, LOX-1-특이적 모노클로날 항체를 생산하는 모노클로날 집단을 이룬 단일 콜로니를 현미경 채집하였다. 선택된 하이브리도마 서브클론을 T12 플레이트에서 증대시키고, 동결보존을 위해 동결시키거나 또는 모노클로날 항체 생산에 사용하였다. 하이브리도마 클론으로부터 유래된 특정한 모노클로날 항체의 이소형을 상업적으로 이용가능한 이소형결정 시약을 사용하여 결정하였다.
스크리닝 결과를 기초로 하여, 24개의 인간 LOX-1-특이적 하이브리도마 클론의 패널을 확인하고, 인간 LOX-1 항원에 의한 마우스의 면역화로부터 선택하였다. 이들 하이브리도마 클론 중 하나인 클론 39.1E2E10 (E2E10으로서 약칭되며, 본원에서 E2E10 또는 뮤린 모로서 지칭됨)은 카파 경쇄를 갖는 IgG1의 모노클로날 항체를 생산하였으며, 그의 LOX-1 결합 특성을 기초로 하여 항체 서열분석 및 인간화를 위한 선도 후보 중 하나로서 선택되었다.
실시예 5: LOX-1에 대한 OxLDL 결합의 억제를 위한 모노클로날 항체의 스크리닝
LOX-1 항체를 표준 방법 (예를 들어, 단백질 A 친화성 크로마토그래피)을 사용하여 하이브리도마 상청액으로부터 정제하였다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 정제된 APP-Avi-가용성 인간 가용성 LOX-1(61-273) 단백질을 하기와 같이 비오티닐화하였다: 50 mM 비신 pH 8.3 완충제 중 정제된 가용성 LOX-1 단백질 (8-10 mg)을 대략 1 mg/mL의 최종 농도로 10 mM ATP, 10 mM 마그네슘 아세테이트, 0.1 mM 비오틴 및 BirA 비오틴 리가제 (아비더티(Avidity))의 존재 하에 30℃에서 1 hr 동안 인큐베이션한 다음, 4℃에서 밤새 두었다. 이어서, 단백질을 PBS로 평형화된 S200 슈퍼덱스(Superdex) 16/60 칼럼을 사용하여 정제하였다. 적절한 분획을 풀링하고, 단백질을 대략 1 mg/ml 농도로 농축시키고, 분취하고, 액체 질소에서 급속 동결시켰다. 퍼센트 비오티닐화를 비-비오티닐화 및 비오티닐화 샘플의 질량 분광측정법 펩티드 맵핑에 의해 평가하였다. 전형적으로, 비오티닐화 수율은 >95%였고, 비-비오티닐화 물질은 검출되지 않았다. 분석적 크기결정 분석은 비오티닐화 물질이 100% 이량체 형태인 것으로 제시하였으며, 이는 이러한 단백질의 예상된 형태이다.
이어서, 비오티닐화 가용성 LOX-1 단백질을 PBS 중 2.5 μg/mL 농도로 희석하고, 이 용액 0.1 mL를 뉴트라비딘(NeutrAvidin) 96-웰 플레이트 (피어스 카탈로그 번호 15128)의 웰에 첨가한 다음, 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 3회 세척한 다음, 25% 블록 에이스(Block Ace) (AbD 세로텍(AbD Serotec) 카탈로그 번호 BUF029)의 웰당 0.3 mL를 첨가하여 차단하고, 실온에서 2시간 동안 서서히 진탕시키면서 플레이트를 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 PBS로 1회 세척하였다. 1%BSA/PBS 중에 희석된 LOX-1 항체의 연속 희석물을 제조하고, 0.1 mL의 희석된 항체를 플레이트를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, PBS로 3회 세척하였다. 다음에, 0.1 mL의 oxLDL (고 결합 OxLDL, 칼렌 바이오메이칼(Kalen Biomedical) 카탈로그 번호 770212-7)을 1%BSA/PBS 중에 희석하여 2 ug/mL의 최종 농도가 되게 하였다.
oxLDL 표준 곡선을 생성하기 위해, 다양한 농도의 oxLDL을 20 ug/ml oxLDL의 최상위 농도를 사용하여 LOX-1 항체의 부재 하에 시험하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 플레이트를 PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 1% BSA/PBS 중에 1:1000으로 희석된 0.1 mL/웰의 HRP-접합된 항-ApoB100 항체 (더 바인딩 사이트, 인크.(The Binding Site, Inc.), 카탈로그 번호 PP086)를 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 6회 세척하였다. 이어서, 0.1 mL/웰 TMB 기질을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 정지 용액 (2N 황산, 50μL/웰)을 각 웰에 첨가하고, 450 nm에서의 광학 흡광도를 적절한 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다.
실시예 6: 모노클로날 항체의 인간화
마우스 모노클로날 항체 E2E10을, 그의 단백질 서열을 인간 배선 서열에 보다 가깝게 만들고 그의 면역원성을 감소시키기 위해 인간공학™ 처리하였다. 인간공학™ 기술은 사우스 샌프란시스코의 칼로바이오스(KaloBios)를 통해 입수가능하다. 항체 인간공학™은 모 또는 참조 항체의 특이성 및 친화도를 여전히 보유하면서 인간 배선 서열에 대해 높은 상동성을 갖는 V-영역 서열을 갖는 조작된 인간 항체를 생성한다 (미국 특허 공개 2005/0255552 및 2006/0134098). 과정은 먼저 참조 Fab의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 최소 항원 결합 특이성 결정기 (BSD) (전형적으로 중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR3 내의 서열)를 확인한다. 이들 중쇄 및 경쇄 BSD는 인간공학™ 과정 동안 구축된 모든 라이브러리에서 유지되므로, 각각의 라이브러리는 에피토프-집중되며, 최종의 완전 인간공학™ 항체는 본래의 마우스 항체의 에피토프 특이성을 보유한다.
다음에, 카세트 라이브러리 (마우스 Fab의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 일부분이 인간 서열의 라이브러리로 대체됨)를 생성한다. 박테리아 분비 시스템을 사용하여 항체 Fab 단편으로서의 라이브러리의 구성원을 발현시키고, 라이브러리를 콜로니-리프트 결합 검정 (CLBA)을 사용하여 항원에 결합하는 Fab에 대해 스크리닝한다. 양성 클론을 추가로 특성화하여 최고의 친화도를 갖는 것을 확인한다. 이어서, 잔류 뮤린 서열과 관련하여 결합을 지지하는 확인된 인간 카세트를 최종 라이브러리 스크린에서 합하여 인간 V-영역을 완전히 생성한다.
생성된 인간공학™ Fab는 인간 라이브러리로부터 유래된 V-절편 서열을 갖고, CDR3 영역 내에 확인된 짧은 BSD 서열을 보유하며, 인간 배선 프레임워크 4개 영역을 갖는다. 이들 Fab를, IgG 발현 벡터 내로 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 클로닝함으로써 완전 IgG로 전환시켰다. 이 과정에서 생성된 완전 인간공학™ 항체는 모 뮤린 항체의 결합 특이성을 보유하고, 전형적으로는 모 항체와 동등하거나 또는 모 항체보다 높은 항원 친화도를 가지며, 단백질 수준에서의 인간 배선 항체 유전자와 비교하여 고도의 서열 동일성을 갖는 V-영역을 갖는다.
인간공학™ LOX-1 항체 FF1, FF3, FF4, FF5 및 FF6의 중쇄 및 경쇄 조성물, 및 가장 밀접한 인간 배선 서열에 대한 그의 퍼센트 유사성은 표 2에 제시된다.
<표 2> LOX-1 항체의 중쇄 및 경쇄 조성물 및 가장 밀접한 인간 배선 서열에 대한 퍼센트 유사성 (HC = 중쇄, LC = 경쇄)
Figure pct00013
실시예 7: LOX-1 단백질에 대한 OxLDL 결합의 LOX-1 항체 억제
LOX-1 단백질에 대한 oxLDL 결합을 억제하는 LOX-1 항체의 능력을 실시예 4에 기재된 방법을 사용하여 결정하였다. LDL의 황산구리 매개된 산화에 의해 생성되는 칼렌 바이오메디칼로부터의 "고 결합 OxLDL" (카탈로그 번호 770212-7)에 추가하여, 변형된 LDL의 두가지 다른 형태를 본 검정에서 시험하였다: 말론디알데히드 변형된 LDL (아카데미 바이오-메디칼 캄파니(Academy Bio-Medical Co.) 카탈로그 번호 20P-MD-L105) 및 하이포클로라이트 변형된 LDL. 하이포클로라이트는 변형된 LDL을 하기 절차에 따라 제조하였다. 인간 LDL (칼렌 바이오메디칼 카탈로그 번호 770200-4)을 PBS로 희석하여 0.25 mg/mL의 최종 농도가 되게 하였다. 이어서, 차아염소산나트륨 (NaOCl, JT 베이커(JT Baker) 카탈로그 번호 9416-01)을 첨가하여 0.1 mM 최종 농도가 되게 하였다. 용액을 실온에서 4시간 동안 인큐베이션한 다음, 200 μl 총 부피당 5 μl의 100 mM 메티오닌을 첨가하는 것에 의해 L-메티오닌을 최종 농도의 반응물에 첨가하여 켄칭시켰다. LOX-1에 대한 변형된 LDL 결합의 LOX-1 항체에 의한 억제를 제시하는 대표적인 데이터는 도 1a-1c에 나타내고 표 3에 기재된다.
<표 3> LOX-1 단백질에 대한 OxLDL 결합의 LOX-1 항체 억제 (IC50 값을 갖는 표).
Figure pct00014
실시예 8: LOX-1/HEK293 세포에 대한 OxLDL 결합의 LOX-1 항체 억제
huLOX-1/HEK293 세포를 75 cm2 표면적당 20ml 배양 배지를 함유하는 T 플라스크 내 부착 단층으로서 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 유지하였다. 세포를 가습 인큐베이터 내 5% CO2 및 37℃에서 인큐베이션하고, 2-3일마다 계대배양하였다. 세포를 계대시키기 위해, 배양 배지를 제거하고, 단층을 10-20 ml의 예비-가온된 PBS로 1회 세척하였다. 세척 후에, 1 ml의 예비-가온된 트리플 익스프레스(TrypLE Express)를 첨가하고, 세포를 37℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 예비-가온된 신선한 배양 배지를 첨가하였다.
huLOX-1/HEK293 세포를 1x106개 세포/mL로 재현탁시키고, 96-웰 V-바닥 플레이트 내에 웰당 50 μL (웰당 5x104개 세포)로 시딩하였다. 이어서, 검정 배지 (DMEM + 10% FBS) 내의 LOX-1 또는 비관련 대조군 항체를 세포에 첨가하였다. 전형적인 최종 항체 농도는 0.006 μg/mL 내지 20 μg/mL 범위였다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 온 HBSS로 2회 세척하였다. 이어서, 50ul 검정 배지 내 DiI-oxLDL (인간 diI-표지된 "고 산화" LDL, 칼렌 바이오메디칼, 카탈로그 번호 770262-9; DiI는 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트임)을 첨가하여 최종 농도 30 내지 100 μg/mL가 되게 하였다. 이어서, 세포를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, FACS 완충제 (PBS 중 2%FBS)로 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 도 2 및 표 3에 도시된 바와 같이, 유동 세포측정법에 의해 Di-I 형광 강도에 대해 분석하였다.
실시예 9: OxLDL 유도된 반응성 산소 종 (ROS) 생산 검정
LOX-1 항체 또는 비관련 대조군 항체를 0.05 mL 검정 배지 (DMEM + 10% FBS)에서 단독으로 또는 (Fab)2 가교제 (폴리클로날 염소 항-인간 IgG Fc (Fab)2, 압캠(Abcam) 카탈로그 번호 ab98526)의 존재 하에 2x 최종 농도로 인큐베이션하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. (Fab)2 가교제 대 LOX-1 항체 비를 변경시켰으며, 1:1 및 1:2 비를 포함하였다. LOX-1 또는 대조군 항체 단독 (가교제 없이)을 사용한 용량 반응 실험에서, 0.005 μg/mL 내지 20 μg/mL 범위의 항체 농도를 사용하였다. 단독의 항체를 가교제와의 항체와 비교하는 실험에서, 0.03 μg/mL 내지 20 μg/mL 범위의 항체 농도를 사용하였다.
인간 LOX-1를 발현하는 세포 (huLOX1/HEK293)를 트리플 익스프레스 (인비트로젠 카탈로그 번호 12605-010)를 사용하여 해리하고, PBS로 1회 세척하였다. 이어서, 세포를 검정 배지 (DMEM + 10% FBS)에 2 x 106개 세포/mL로 재현탁시키고, 96-웰 V-바닥 플레이트 (코스타 카탈로그 번호 3894) 내에 50 μl/웰 (1 x 105개 세포/웰)로 시딩하였다. 가교 Fab를 갖는 또는 갖지 않는 50 μl/웰의 LOX-1 (또는 대조군) 항체 용액 (상기 기재된 바와 같이 제조됨)을 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. OxLDL (검정 완충제 중 0.1 mL/웰, 칼렌으부터의 "고 oxLDL", 카탈로그 번호 770252-7)을 첨가하여 25 μg/mL의 최종 농도가 되게 하고, 생성된 혼합물을 37℃에서 100분 동안 인큐베이션하였다. H2DCFDA를 검정 배지 중에 희석하고, 0.1 mL/웰을 첨가하여 5-10 μM의 최종 농도가 되게 하고, 혼합물을 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 칼슘 및 마그네슘을 함유하는 HBSS 200 μl/웰로 1회, 냉 FACS 완충제 (PBS 중 2% FBS) 200 μl/웰로 1회 세척하고, 세포를 냉 FACS 완충제 50-100 μL/웰 중에 재현탁시켰다. H2DCFDA 산화의 결과로 생성된 형광을 유동 세포측정기를 사용하여 측정하였다 (여기: 488 nm, 방출: 500/530 nm). 예시적인 결과는 도 3 및 4 및 표 4에 제시된다.
<표 4> LOX-1 항체는 인간 LOX-1 형질감염된 HEK293 세포에서 oxLDL 유도된 반응성 산소 종 (ROS) 생산을 억제하며 (IC50 값을 갖는 표), LOX-1 효능제 활성 (항체 단독 또는 항체 + 가교 Fab2)에 대한 증거는 없다.
Figure pct00015
도 4a-4f에 보이는 바와 같이, LOX-1 항체는 인간 LOX-1 형질감염된 HEK293 세포에서 oxLDL 유도된 반응성 산소 종 (ROS) 생산을 억제하였다. oxLDL의 부재 하에, LOX-1 항체 (단독의 항체 또는 가교 Fab2의 존재 하의 항체)는 ROS 생산을 유도하지 않았다. 이소형 대조군 항체는 인간 LOX-1 형질감염된 HEK293 세포에서 oxLDL 유도된 ROS 생산에 대해 효과를 나타내지 않았다.
실시예 10: LOX-1 항체는 천연 LOX-1 1차 인간 호중구에 결합함
LOX-1 항체를 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)으로부터의 키트 (EZ-링크 마이크로 NHS-PEO4-비오티닐화 키트; 써모 사이언티픽 카탈로그 번호 21955)를 사용하여 비오티닐화하였다. 0.5-1.0 mg/mL 농도의 PBS 완충제 중 항체를 실온에서 60분 동안 50-배 몰 과량의 NHS-비오틴 시약과 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 비오티닐화 항체를 PBS 중에 평형화된 탈염 스핀 칼럼을 사용하여 과량의 비오티닐화 시약으로부터 분리하고, 제조업체의 지침서 (제바 디솔트 스핀 칼럼(Zeba Desalt Spin Column) 7K MWCO, 써모 사이언티픽 카탈로그 번호 89882)에 따라 사용하였다. 비오티닐화 항체의 농도를 280nm에서의 흡광도 측정을 기초로 하여 결정하였다.
표준 방법을 사용하여 호중구를 건강한 공여자로부터 수득된 혈액 샘플로부터 단리하였다. 간략하게, EDTA를 함유하는 바이알에 인간 전혈을 수집하였다. 10 mL의 혈액 샘플에, 10 mL의 침강 완충제 (3% 덱스트란, 0.9% 염화나트륨)를 첨가하고, 생성된 용액을 서서히 혼합하고, 실온에서 20분 동안 방치하였다. 백혈구-풍부 혈장을 포함하는 상부 층을 4℃에서 10분 동안 1200 rpm (250-500 x g)으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 세포 펠릿을 즉시 실온에서 10 mL의 0.9% 염화나트륨 중에 재현탁시켰다. 생성된 세포 현탁액을 10 mL 피콜-파크(Ficoll-Paque)를 함유하는 50 mL 원추형 튜브로 조심스럽게 옮기고, 피콜-파크의 상부에 세포 현탁액을 층형성한 다음, 튜브를 실온에서 30분 동안 1400 rpm (400 x g)으로 원심분리하였다. 상부 층을 폐기하였다. 생성된 세포 펠릿에, 10 mL 0.2% 빙냉 염화나트륨을 첨가하고, 혼합물을 정확하게 30초 동안 인큐베이션하여 적혈구를 용해시키고; 10 mL의 빙냉 1.6% 염화나트륨을 첨가하여 등장성을 회복시켰다. 이어서, 세포 현탁액을 5분 동안 1200 rpm (250-500 rpm)으로 원심분리하였다. 이어서, 상청액을 폐기하고, 적혈구 용해 절차를 1회 초과로 반복하였다. 생성된 세포 펠릿을 FACS 완충제 (PBS 중 2 mM EDTA, 1% BSA 및 0.2% 아지드화나트륨) 중에 2 x 106개 세포/mL의 세포 밀도로 재현탁시켰다.
새로이 단리된 인간 호중구를 함유하는 세포 현탁액을 96-웰 V-바닥 플레이트 (코스타, 카탈로그 번호 3894)의 웰로 옮겼다 (50ul/웰) (1 x 105개 세포/웰). 차단 완충제 (FACS 완충제 (PBS 중 2 mM EDTA, 1% BSA 및 0.2% 아지드화나트륨)에 희석된 4% 정상 토끼 혈청) (50 ul/웰)를 첨가하고, 플레이트를 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, FACS 완충제 중 비오티닐화 LOX-1 항체 (10 ul)를 1ng/ml 내지 5 ug/mL 범위의 최종 농도로 웰에 첨가하고, 플레이트를 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 3분 동안 1200 rpm (250-300 x g)으로 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 0.2 mL FACS 완충제로 2회 세척한 다음, FACS 완충제 중에 1:250으로 희석된 PE-스트렙타비딘 (BD 파밍겐(BD Pharmingen) 카탈로그 번호 554061) 0.1 mL를 첨가하고, 플레이트를 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 다시 원심분리하고, 상청액을 폐기하고, 세포를 0.2 mL FACS 완충제로 2회 세척하였다. 이어서, 세포를 0.1 mL의 고정 완충제 (2% 파라포름알데히드를 갖는 FACS 완충제) 중에 재현탁시키고, FACS 기기를 사용하여 분석하였다. LOX-1 항체에 의한 호중구 결합에 대한 EC50 값을 결정하기 위해, FACS에 의해 결정된 LOX-1 염색 강도를 도 5 및 표 3에 제시된 바와 같이 항체의 농도에 대해 플롯팅하였다.
실시예 11: 수소/중수소 교환 질량 분광측정법에 의한 에피토프 맵핑
질량 분광측정법 (MS)과 조합된 수소-중수소 교환 (HDx) (Woods, 2001)을 사용하여 LOX-1 상의 항체 E2E10의 결합 부위를 맵핑하였다. HDx에서, 단백질의 교환가능한 아미드 수소를 중수소에 의해 대체하였다. 이러한 과정은 단백질 구조/역학 및 용매 접근성에 감수성이므로, 리간드 결합에 대해 보고할 수 있다. HDxMS의 비-침습적 성질, 높은 감수성, 거대 단백질을 사용한 작업 능력 및 결합 부위를 맵핑할 수 있는 고해상도는 그것을 다른 방법과 구별시켜 준다. 이들 실험의 목적은 LOX1 상의 E2E10의 에피토프의 확인이었다.
자동화 HDx/MS 실험을 문헌 (Chalmers, 2006)에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 수행하였다. 립 테크놀로지스(LEAP Technologies) Pal HTS 액체-취급기 (립 테크놀로지스, 노스캐롤라이나주 카버러)를 모든 액체 취급 작업에 사용하였다. 액체-취급기를 립 쉘(LEAP Shell)에 기록되어 있는 자동화 스크립트에 따라 제어하고, 2℃에서 유지된 냉장 외함에 보관하였다. 6-포트 주사 밸브 및 세척 스테이션을 액체-취급기 레일 상에 탑재하고, 크로마토그래피 시스템 내로의 샘플 주사 및 시린지 세척을 용이하게 하였다. 온라인 소화를 위해, 효소 칼럼 (포로스자임(Poroszyme) 고정화 펩신, 20 x 2.1 x 30mm, ABI, 캘리포니아주 포스터 시티)을 주사 밸브와 트랩핑 카트리지 사이에 일렬로 위치시켰다. 2개의 추가 밸브 (15kPSI 발코(Valco), 텍사스주 휴스톤), 4μL EXP 할로(Halo) C18 역상 트랩 카트리지 (옵티마이즈 테크롤로지스 인크.(Optimize Technologies Inc.), 오레곤주 오레곤 시티) 및 분석 칼럼 (300μm ID, 할로 2.7μm C18, 마이크롬 바이오리소시스 인크.(Michrom Bioresources Inc.))으로 이루어진 크로마토그래피 시스템을 LTQ-오비트랩(Orbitrap) 질량 분광계 (써모 사이언티픽, 캘리포니아주 산호세)의 공급원 전면에 탑재된 별개의 냉각 외함에 보관하였다. 크로마토그래피 시스템을 보관하는 외함의 온도를 펠티에 냉각기에 의해 0℃로 유지하였다.
비-중수소화 및 중수소화 대조군을 위해, 10 μL의 인간 가용성 LOX-1 용액 (0.73mg/mL)을 15 μL의 50 mM 트리에탄올아민 완충제 (pH 7.8)로 희석하였다. 복합체를 총 부피가 25 μL이도록 10 μL의 LOX-1 용액 (0.73mg/mL)을 등몰량의 E2E10 및 적절한 양의 50mM 트리에탄올아민 완충제 (pH 7.8)와 혼합함으로써 제조하였다. 복합체를 형성한 후, 용액을 30분 동안 인큐베이션하였다. 교환 반응을 개시하기 위해, 75 μL의 D2O 완충제 (150 mM NaCl 중 D2O, 캠브리지 이소토프스 래보러토리즈(Cambridge Isotopes Laboratories))를 첨가하고, 10분 동안 교환시켰다. 이어서, 혼합물의 pH를 0.25 mL의 환원 완충제 (8 M 우레아, 2 M 티오우레아, 0.25 M TCEP, pH 2.5)의 첨가에 의해 낮추어 디술피드 결합을 환원시키고, 교환 속도를 늦추어 샘플의 교환 상태를 효과적으로 동결시켰다. 환원 10분 후에, 혼합물을 0.5 mL의 켄칭 완충제 (50mM 글리신, pH 2.5)로 희석하였다. 다음에, 0.5 mL의 샘플을 트랩 상에 인라인 소화 칼럼을 통해 주사하고, 하기 기재된 바와 같이 LC-MS에 의해 분석하였다.
크로마토그래피 시스템은 2개의 별개의 HPLC 펌프를 사용하여 인라인 소화를 수행하고, C18 트랩 칼럼 상에 소화된 펩티드를 트랩핑하고, 트랩핑된 펩티드를 분석 칼럼을 통해 질량 분광계 내로 용리시켰다. 125 μL/분 (0.05% TFA)의 유량으로 작동하는 "로딩" 펌프 (서베이어(Surveyor) MS 펌프, 써모 사이언티픽, 캘리포니아주 산호세)에 의해 PAL 주사 밸브 샘플 루프로부터의 샘플 (500 μL)을 펩신 칼럼을 통해 역상 트랩 카트리지 내로 옮겼다. 6분 로딩 단계 후에, "로드" 밸브를 스위칭하여 "구배" 펌프 (나노 액퀴티(Nano Acquity), 워터스 코포레이션(Waters Corp.), 매사추세츠주 밀포드)로부터의 완충제 (0.25% 포름산)를 3분 탈염 기간 동안 20 μL/분의 유량으로 트랩을 통해 유동시켰다. 탈염 단계 후에, "탈염" 밸브를 스위칭하여 트랩으로부터 분석 칼럼 상으로 및 질량 분광계의 이온 공급원 내로 펩티드의 용리를 용이하게 하였다. 구배 펌프는 20분에 걸쳐 0 내지 40% B, 이어서 5분에 걸쳐 40% 내지 75% B의 구배로 전달하였다. 구배를 위한 총 시간은 30분이었다. 구배 펌프 완충제 조성은 A: 99.75:0.25 %v/v (H2O:포름산) 및 B: 99.75:0.25 %v/v (아세토니트릴:포름산)이었다.
단백질분해 펩티드를 탠덤 질량 분광측정법 (MS/MS)에 의해 서열분석하였다. 비록 비-중수소화 LOX-1로부터의 MS2 데이터만이 펩티드 확인에 사용되었지만, 비-중수소화 LOX-1, 중수소화 LOX-1 및 모든 중수소화 복합체 샘플의 획득에 대해 동일한 방법을 사용하였다. 이들 획득에 대해, MS/MS를 LTQ에서 획득하고, MS 스캔을 오비트랩에서 획득하였다. 오비트랩에서의 획득은 400-2000의 m/z 범위에 걸쳐 60,000의 해상도로 획득하였다. 모든 실험에 사용된 기기 파라미터는 스프레이 전압 3.5kV, 최대 주사 시간 1000 ms, MS를 위한 LTQ AGC 표적 50,000개 이온 및 MS를 위한 FTMS AGC 표적 1,000,000개 이온을 포함하였다. 데이터 처리를 개시하기 위해, 사내 프로그램 (RawXtract)을 사용하여 오비트랩 .RAW 파일을 .mzXML 파일로 전환시켰다 (Pedrioli 2004). 이후, .mzXML 파일을 .mzBIN 파일로 전환시키고, 탠덤 MS 획득을 SEQUEST (써모일렉트론(ThermoElectron))를 사용하여 검색하였다. SEQUEST 결과를 DTASelect를 사용하여 여과하였다 (Tabb 2002). 펩티드 서열 확인을 사용하여, 사내 기록 프로그램 (듀토로노미(Deutoronomy))을 사용하여 각각의 확인된 서열 이온에 대한 크로마토그램을 자동으로 추출하고, 명시된 m/z 범위 및 체류 시간 윈도우에 걸쳐 평균 스펙트럼을 생성하였다. 이어서, 평균 스펙트럼을 평활화하였으며, 이는 평균 중수소 혼입을 결정하는데 중심이 되었다. 초기 자동화 처리 후에, 각 평균 스펙트럼의 품질 및 중심은 듀토로노미에 내장된 대화식 데이터 뷰어를 사용하여 수동으로 유효화되거나 보정되었다.
HDxMS 맵핑 실험은 유의하게 보호된 LOX1의 3개 영역을 확인시켜 주었다. 주요 보호는 펩티드 F228RVRGAVSQTYPSGTCAYI246 (서열 3)에 대해 관찰되었다. 펩티드 N100ELKEMIETL109 및 S207RRNPSYPWLWE218에 대한 소수 보호가 또한 관찰되었다 (각각 서열 4 및 5). 보호된 영역을 단백질 데이터 은행 (1YPQ)으로부터 수득된 인간 가용성 LOX-1 C-말단 렉틴-유사 도메인 (CTLD)의 결정 구조 상에 맵핑하였다. 보호된 영역 중 하나인 N100ELKEMIETL109 (서열 4)는 LOX-1 CTLD 결정 구조에 존재하지 않는다. 펩티드 F228RVRGAVSQTYPSGTCAYI246 (서열 3)은 공개된 부위 지정 돌연변이유발 연구에 의해 리간드 결합에 관련된 LOX-1 분자의 면에 대해 맵핑한다 (Ohki et al. (2005) Structure, 13: 905-917). 결과는 E2E10이 LOX-1에 대한 LOX-1 리간드 결합의 경쟁적 억제제로서 작용할 가능성이 있다는 것을 나타낸다. E2E10을 인간화 변이체 FF1, FF3, FF4, FF5 및 FF6으로 전환시키는데 사용된 인간공학 과정은 항체의 에피토프 특이성을 변화시킬 가능성이 거의 없기 때문에 (실시예 6 참조), 이들 결과는 또한 LOX-1 상의 FF1, FF3, FF4, FF5 및 FF6의 주요 결합 부위를 확인시켜 준다.
LOX-1에의 E2E10 결합으로 인한 LOX-1 유래 펩티드의 중수소 혼입의 변화는 표 5에 제시된다.
<표 5>
Figure pct00016
Figure pct00017
실시예 12: LOX-1 항체 결합 검정에 사용하기 위한 정제된 재조합 시노몰구스 원숭이 가용성 LOX-1의 제조
시노몰구스 원숭이 LOX-1의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 결정하기 위해, 총 RNA를 3마리의 개별 원숭이로부터 수득된 기관으로부터 추출하였다: 지아젠(Zyagen)/GW로부터의 1마리 개체로부터의 3종의 기관 및 코반스, 인크.(Covance, Inc.)로부터의 2마리 개체로부터의 12종의 기관. 이어서, 총 RNA를 공개 데이터베이스 (유니프롯(Uniprot), NCBI)에 따라 설계된 비번역 영역으로부터의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 사용하였다. 표준 서열분석 방법을 사용하여, 증폭된 LOX-1 mRNA의 핵산 서열을 결정하였다. 시노몰구스 원숭이 LOX-1의 세포외 도메인 (아미노산 61-273에 상응함) 내에서, 3마리의 개별 원숭이로부터 유래된 시노몰구스 LOX-1 아미노산 서열은 동일하였다.
인간 CD33으로부터의 N-말단 신호 펩티드, 정제 태그 (EFHR) 및 BirA 비오티닐화 서열 (GLNDIFEAQKIEWHE) (서열 144)을 갖는 시노몰구스 원숭이 LOX-1 폴리펩티드의 세포외 도메인 (아미노산 잔기 61-273)을 코딩하는 핵산 서열을 포유동물 세포 발현 벡터 pRS5a 내로 서브클로닝하였다. 시노몰구스 원숭이 가용성 LOX-1의 발현 및 정제는 실시예 1에서 인간 가용성 LOX-1에 대해 기재된 동일한 방법을 사용하여 수행하였다. 성숙 APP-Avi-가용성 시노몰구스 원숭이 LOX-1(61-273)의 아미노산 서열은 표 6에 제시된다. 일부 실험을 위해, 시노몰구스 원숭이 가용성 LOX-1 단백질을 실시예 5에서 인간 가용성 LOX-1에 대해 기재된 동일한 방법을 사용하여 비오티닐화하였다.
<표 6>
Figure pct00018
실시예 12
비아코어 결합 검정에 의한 항체 해리 상수 결정
인간 및 시노몰구스 원숭이 LOX-1에 대한 뮤린 LOX-1 항체 E2E10 결합을 위해, 비아코어 T200을 새로운 여과된 구동 완충제 (1x HBS-EP+ (GE 카탈로그 번호 BR-1006-60))로 준비시켰다. CM5 칩 (GE 카탈로그 번호 BR-1005-30)을 마우스 항체 포획 키트 (GE 카탈로그 번호 BR-1008-38) 및 아민 커플링 키트 (GE 카탈로그 번호 BR-1000-50)를 사용하여 제조하였다. 간략하게, 새로운 칩을 420초 동안 10ul/분의 EDC/NHS로 활성화하였다. 항-마우스 IgG 항체를 10mM 아세테이트 pH 5.0 중 30ug/ml로 420초 동안 10ul/분으로 고정화하였다. 칩 표면을 1M 에탄올아민 용액 (420초 동안 10ul/분)으로 탈활성화한 다음, 10mM 글리신-HCl, pH 1.5 (GE 카탈로그 번호 BR-1003-54)로 30초 동안 60ul/분으로 3회 컨디셔닝하였다.
방법 구동을 프로그램화하여 항-LOX-1 항체에 대한 인간 또는 시노몰구스 원숭이 가용성 LOX-1 결합의 동역학을 측정하였다. 5 시동 사이클을 다음과 같이 구동하였다: 1) 30초 동안 60ul/분의 구동 완충제, 2) 350초 동안 60ul/분의 350초 해리로 구동 완충제, 재생 완충제 (글리신-HCl pH 1.5, 0.05% P20 (GE 카탈로그 번호 BR-1000-54))를 사용한 여분의 세척, 3) 60초 동안 60ul/분의 재생 완충제, 4) 35초 동안 60ul/분의 재생 완충제, 구동 완충제를 사용한 여분의 세척 및 캐리-오버 제어 포함.
샘플 사이클 동안, 1) Ms-항-Hu LOX-1 mAb를 10ul/분으로 대략 20RU의 포획을 가능하게 하는 미리 결정된 시간량 동안 유동 셀 2, 3 또는 4 상에서 포획하였다. 유동 셀 1은 참조로서, 2) 30초 동안 60ul/분의 구동 완충제, 3) 다양한 농도로 구동 완충제 중에 희석된 인간 가용성 LOX-1 또는 시노몰구스 원숭이 가용성 LOX-1 (적어도 2개의 이중 샘플 및 350초 동안 60ul/분의 다중 완충제 블랭크, 750초 또는 3000초 해리 시간) 4) 60초 동안 60ul/분의 재생 완충제, 5) 35초 동안 60ul/분의 구동 완충제, 구동 완충제를 사용한 여분의 세척 및 캐리-오버 제어 포함을 사용하였다. 데이터를 완충제 블랭크, 참조 블랭크, 및 곡선 피팅을 위한 1:1 결합 모델을 사용하여 분석함으로써, 회합 및 해리 속도 상수 (ka 및 kd) 및 평형 결합 상수 (KD)를 결정하였다 (표 7-8에서 E2E10에 대한 결과 참조).
인간 또는 시노몰구스 원숭이 LOX-1과 인간화 LOX-1 항체의 상호작용을 정량화하는 표면 플라즈몬 공명 측정을 CM5 칩 상에서 광학 바이오센서 비아코어 T200으로 수행하였다. 염소-항-hIgG (감마) (인비트로젠 H10500)를 아세테이트 완충제, pH 4.0 중에서 CM5 칩 상에 3,000 RU로 코팅하였다. 사용된 구동 완충제는 PBS, pH 7.4 (여과됨, 탈기됨)이었다. 시험 항체를 1 ug/ml의 농도로 10 uL/분의 유량으로 개별 유동 셀 내로 로딩하였다. IgG 포획의 표적 수는 HBS-EP 완충제 (0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.05% P20) 중에서 20-30 RU 사이에 있었다. 인간 또는 시노몰구스 원숭이 가용성 LOX-1을 HBS-EP 완충제 중에 33 nM의 농도로 희석한 다음, 연속적으로 (1:3) 하향 희석하여 0.137 nM의 농도가 되게 하였다. 이것은 인간 또는 시노몰구스 원숭이 LOX-1의 6개의 다양한 농도를 나타낸다. 항원을 30 uL/분의 유량으로 개별 유동 셀 내에 도입하였다. 회합 시간에 대한 파라미터를 700초로 설정하고, 해리 시간을 5,400초로 설정하였다. 데이터를 완충제 블랭크, 참조 블랭크, 및 곡선 피팅을 위한 1:1 결합 모델을 사용하여 분석함으로써, 회합 및 해리 속도 상수 (ka 및 kd) 및 평형 결합 상수 (KD)를 결정하였다 (표 7-8에서 FF1, FF3, FF4, FF5 및 FF6에 대한 결과 참조).
<표 7> 비아코어 동역학적 결합 검정에 의해 결정된 인간 가용성 LOX-1에 대한 LOX-1 항체 결합의 해리 상수 (KD)
Figure pct00019
<표 8> 비아코어 동역학적 결합 검정에 의해 결정된 시노몰구스 원숭이 가용성 LOX-1에 대한 LOX-1 항체의 해리 상수 (KD)
Figure pct00020
실시예 13: 용액 평형 적정 (SET) 검정에 의한 항체 해리 상수 결정
하기 SET 프로토콜을 사용하여 인간 가용성 LOX-1에 대한 비오티닐화 E2E10 결합의 KD 값을 결정하였다. 96-웰 MSD 플레이트 (스탠다드 바인드(Standard Bind) 플레이트, MSD 카탈로그 번호 L15XA-3)를 4℃에서의 밤샘 인큐베이션에 의해 PBS 중 0.25 ug/mL 인간 가용성 LOX-1 50 uL로 코팅하였다. 용액-상 샘플을 폴리프로필렌 V-바닥 96-웰 플레이트에서 SET 희석제 (PBS, 0.5% BSA, 0.1% 트윈-20, 0.1% 트리톤 X-100) 중에 인간 가용성 LOX-1의 적정에 의해 제조하였다. 이 연속 희석물을 SET 희석제 중에 희석된 비오티닐화 E2E10과 1:1로 합하고 (총 100 μL), 샘플을 진탕하면서 실온에서 밤새 인큐베이션하였다.
코팅된 MSD 플레이트를 플레이트 세척기를 사용하여 세척 완충제 (PBS, 0.05% 트윈-20)로 3회 세척한 다음, 역전시키고, 킴와이프(Kimwipe) 상에 블롯팅하여 잔류 액체를 제거하였다. 이어서, 플레이트를 200 uL/웰 SET 차단 완충제 (PBS, 2% BSA, 0.1% 트윈-20, 0.1% 트리톤 X-100)에 의해 차단하고, 서서히 진탕하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 1회 세척하였다. 25 μL/웰의 용액-상 평형 결합 샘플을 플레이트에 이중으로 첨가하고, 진탕하면서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척하였다. SET 희석제 중에 1:500으로 희석된 25 μL/웰 스트렙타비딘 술포-태그(SULFO-TAG) (MSD 카탈로그 번호 R32AD-1)를 플레이트에 첨가하고, 서서히 진탕하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척하였다. 100 μL 판독 완충제 T (MSD 카탈로그 번호 R92TC-1)를 플레이트에 첨가하고, MSD 섹터 이미저(SECTOR Imager) 6000 상에서 판독하였다. KD 값은 하기 방정식에 데이터를 피팅하여 결정하였다:
Figure pct00021
상기 식에서, Bmax는 용액 중에 LOX-1 단백질이 존재하지 않을 때의 신호이고, CAb는 용액 중 LOX-1 항체의 일정한 농도이고, CAg는 용액 중 가용성 LOX-1의 농도이고, KD는 평형 결합 상수이다.
인간화 LOX-1 항체 FF1, FF3, FF4, FF5 및 FF6에 대해, 하기 용액 평형 적정 (SET) 검정 프로토콜을 사용하여 KD 값을 결정하였다. 검정은 하기와 같이 96-웰 폴리프로필렌 플레이트 (써모 사이언티픽, 카탈로그 번호 AB-1127)에서 수행하였다. 일정한 농도의 LOX-1 항체 (1 pM)를 SET 완충제 (PBS, pH 7.4, CaCl2 또는 MgCl2 부재, 깁코(Gibco), 카탈로그 번호 P7949; 0.5% w/v 소 혈청 알부민, 지방산 무함유, 칼바이오켐(Calbiochem), 카탈로그 번호 26575; 및 0.02% v/v 트윈(Tween)-20, 시그마, 카탈로그 번호 P7949) 중 다양한 농도의 비-비오티닐화 인간 또는 시노몰구스 원숭이 LOX-1 단백질 (1 nM 내지 0.017 pM 범위의 3-배 연속 희석물)과 혼합하였다. 최종 반응 부피는 80 μL였다. 플레이트를 접착 필름 (VWR, 카탈로그 번호 60941-062)을 사용하여 밀봉하고, 일정하게 진탕하면서 (300 rpm) 22℃에서 14시간 동안 인큐베이션하였다.
동일한 기간 동안, 384-웰 스트렙타비딘-코팅된 MSD 플레이트 (메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery), 카탈로그 번호 L21SA)를 4℃에서 밤새 웰당 50 μL 차단 완충제 (PBS, pH 7.4, 5% w/v 소 혈청 알부민)와 함께 플레이트를 인큐베이션하여 차단하였다. 이어서, 차단된 MSD 플레이트를 플레이트 세척기 (바이오텍(BioTek))를 사용하여 세척 완충제 (PBS, pH 7.4 및 0.05% v/v 트윈-20)로 3회 세척하였다. 세척 후에, 비오티닐화 인간 또는 시노몰구스 원숭이 가용성 LOX-1 단백질 (25 pM, 웰당 15 μL)을 일정하게 진탕하면서 (600 rpm) 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 표면 상에 고정화하였다. 이어서, 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 3회 세척하였다. 일부 실험에서, 비-비오티닐화 가용성 인간 LOX-1 단백질을 사용하였으며 (알앤디 시스템즈(R&D systems), 카탈로그 번호 1798-LX-050); 이 경우에 LOX-1 단백질을 표준 MSD 플레이트 (MSD, 카탈로그 번호 L21XA)에서 1 nM 농도로 밤새 인큐베이션하여 고정화하였다. 이어서, 평형 결합 반응물 (웰당 15 μL)을 LOX-1이 고정화된 MSD 플레이트에 적용하고, 30분 동안 인큐베이션하였다. 미결합 물질은 플레이트를 세척하여 제거하고, 포획된 항체는 술포-태그부착된 염소 항-인간 IgG (메조 스케일 디스커버리, 카탈로그 번호 R3AJ-1)의 1:500 희석물을 웰당 15 μL로 첨가하여 검출하였다. 이어서, 플레이트를 일정하게 진탕하면서 (600 rpm) 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 3회 세척한 다음, 15 μL/웰의 1X MSD 판독 완충제 T (메조 스케일 디스커버리, 카탈로그 번호 R92TC-2)를 첨가하고, 플레이트를 섹터 이미저 6000 (메조 스케일 디스커버리)을 사용하여 현상하였다. 데이터를 분석을 위해 엑셀로 옮기고, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) v5를 사용하여 플롯팅하였다. KD 값은 하기 방정식에 데이터를 피팅하여 결정하였다:
Figure pct00022
상기 식에서, Bmax는 용액 중에 LOX-1 단백질이 존재하지 않을 때의 신호이고, CAb는 용액 중 LOX-1 항체의 일정한 농도이고, CAg는 용액 중 가용성 LOX-1의 농도이고, KD는 평형 결합 상수이다. FF1, FF3, FF4, FF5, FF6 및 E2E10에 대한 결과는 표 9 및 도 6에 제시된다.
<표 9> 용액 평형 적정 (SET) 검정에 의한 LOX-1 항체 해리 상수 (KD) 결정
Figure pct00023
참조로 포함
특허, 특허 출원, 논문, 교과서 등 및 이들에 인용된 참고문헌을 비롯한 본원에 인용된 모든 참고문헌은 이미 인용되지 않은 정도로 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
등가물
상기 기재된 명세서는 통상의 기술자가 본 발명을 실시할 수 있도록 하는데 충분하다고 여겨진다. 상기 설명 및 실시예는 본 발명의 특정 바람직한 실시양태를 상세하게 기재하는 것이고, 본 발명자들에 의해 고려되는 최적 방식을 기재한다. 그러나, 상기의 것을 문서에서 아무리 상세하게 기재할 수 있을지라도, 본 발명이 다수의 방식으로 실시될 수 있고, 본 발명이 첨부된 청구범위 및 그의 임의의 등가물에 따라 해석되어야 하는 것으로 이해될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG IRM LLC <120> LECTIN-LIKE OXIDIZED LDL RECEPTOR 1 ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> PAT055493-WO-PCT <140> PCT/US2014/043315 <141> 2014-06-20 <150> 61/837,765 <151> 2013-06-21 <160> 147 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 273 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Phe Asp Asp Leu Lys Ile Gln Thr Val Lys Asp Gln Pro Asp 1 5 10 15 Glu Lys Ser Asn Gly Lys Lys Ala Lys Gly Leu Gln Phe Leu Tyr Ser 20 25 30 Pro Trp Trp Cys Leu Ala Ala Ala Thr Leu Gly Val Leu Cys Leu Gly 35 40 45 Leu Val Val Thr Ile Met Val Leu Gly Met Gln Leu Ser Gln Val Ser 50 55 60 Asp Leu Leu Thr Gln Glu Gln Ala Asn Leu Thr His Gln Lys Lys Lys 65 70 75 80 Leu Glu Gly Gln Ile Ser Ala Arg Gln Gln Ala Glu Glu Ala Ser Gln 85 90 95 Glu Ser Glu Asn Glu Leu Lys Glu Met Ile Glu Thr Leu Ala Arg Lys 100 105 110 Leu Asn Glu Lys Ser Lys Glu Gln Met Glu Leu His His Gln Asn Leu 115 120 125 Asn Leu Gln Glu Thr Leu Lys Arg Val Ala Asn Cys Ser Ala Pro Cys 130 135 140 Pro Gln Asp Trp Ile Trp 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 56 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Ala Ala Tyr Val Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Leu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 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Claims (27)

  1. 단리된 항-LOX-1 항체 또는 그의 단편.
  2. LOX-1의 리간드 결합 도메인에 결합하는 단리된 항-LOX-1 항체 또는 그의 단편.
  3. LOX-1의 에피토프에 결합하며, 여기서 에피토프는 LOX-1의 아미노산 잔기 100-109, 207-218 또는 228-246을 포함하는 것인 단리된 항체 또는 그의 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, LOX-1 단백질에 대한 OxLDL 결합을 차단하는 단리된 항체 또는 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, oxLDL 유도된 반응성 산소 종 (ROS) 생산을 억제하는 단리된 항체 또는 단편.
  6. 비아코어(Biacore)에 의해 측정 시에 34 pM 이하의 KD로 또는 용액 평형 적정 검정 (SET)에 의해 측정 시에 4 pM 이하의 KD로 인간 LOX-1 단백질에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1에 언급된 CDR 중 적어도 하나에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 적어도 하나의 상보성 결정 영역을 포함하는 단리된 항체 또는 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1로부터의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1로부터의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며, 여기서 변이체는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 중 하나에서 적어도 1 내지 4개의 아미노산 변화를 갖는 것인 단리된 항체 또는 단편.
  10. 인간 LOX-1에 결합하며, 서열 10, 30, 50, 70 및 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  11. 인간 LOX-1에 결합하며, 서열 14, 34, 54, 74 또는 94로 이루어진 군으로부터 선택된 VH; 및 서열 24, 44, 64, 84 또는 104로 이루어진 군으로부터 선택된 VL 또는 이들에 대해 97-99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  12. 서열 14, 34, 54, 74 또는 94로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  13. 서열 24, 44, 64, 84 또는 104로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  14. 서열 14, 34, 54, 74 또는 94로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄; 및 서열 24, 44, 64, 84 또는 104로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 경쇄 서열을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  15. 서열 8, 28, 48, 68 및 88로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 9, 29, 49, 69 및 89로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 10, 30, 50, 70 및 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 18, 38, 58, 78 및 98로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 19, 39, 59, 79 및 99로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 20, 40, 60, 80 및 100으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  16. 서열 11, 31, 51, 71 및 91로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 12, 32, 52, 72 및 92로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 13, 33, 53, 73 및 93으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 21, 41, 61, 81 및 101로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 22, 42, 62, 82 및 102로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 23, 43, 63, 83 및 103으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  17. 서열 8의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 9의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 10의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 11의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 12의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 13의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  18. 서열 28의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 29의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 30의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 31의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 32의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 33의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  19. 서열 48의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 49의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 50의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 51의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 52의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 53의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  20. 서열 68의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 69의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 70의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 71의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 72의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 73의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  21. 서열 88의 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열 89의 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열 90의 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열 91의 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열 92의 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열 93의 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 단편 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  23. LOX-1-장애를 앓는 대상체에게 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, LOX-1-장애를 치료하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 대상체가 간헐성 파행 및 러더포드(Rutherford) 부류 II/III 파행 중 하나 이상을 앓는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 대상체가 협심증을 앓는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 단편과 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
  27. 인간 LOX-1 단백질에 결합하고, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 단편과 교차 경쟁하는 단리된 항체 또는 그의 단편.
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