KR20150083991A

KR20150083991A - 멀티―체인 키메라 항원 수용체 및 그것의 용도들

Info

Publication number: KR20150083991A
Application number: KR1020157008739A
Authority: KR
Inventors: 줄리안 스미스; 앤드류 샤렌버그; 세실 마니위; 쥐스탕 이켐
Original assignee: 셀렉티스
Priority date: 2012-09-04
Filing date: 2013-09-04
Publication date: 2015-07-21
Also published as: SG11201501471VA; KR102141259B1; IL237576A0; MX2015002760A; HK1212728A1; ES2714523T3; AU2013312838A1; CA2883502A1; AU2013312838B2; RU2663725C2; CN104769103B; WO2014039523A1; DK2893004T3; MX367730B; CN104769103A; EP2893004A1; IL237576B; BR112015004522A2; RU2015112125A; JP6352920B2

Abstract

본 발명은 멀티-체인 CAR들로 가리켜지는 키메라 항원 수용체들 (CAR)의 새로운 세대에 대한 것이다. 리간드-결합 도메인 물성들을 활용하는 선택된 표적을 향하여 면역(immune) 세포 특이성 및 반응성을 다시 보내는 것을 목표로 하는, 이러한 CAR들은 다른 막횡단 폴리펩타이드들 내 신호전달 도메인들 및 분리된 세포외 리간드 결합(binding)을 포함한다. 신호전달(signalling) 도메인들은 막옆(juxtamembrane) 위치에서 조립되도록 설계되는데, 이는 최적의 신호 전달(signal transduction)을 부여하는 자연적(natural) 수용체에 더 가까운 유연한(flexible) 구조를 형성한다. 본 발명은 그것들의 표면에서 그것들을 발현시키는 분리된 세포들 및 상기 멀티-체인 CAR를 코드하는 벡터들, 폴리뉴클레오타이드들, 특히, 면역요법에의 그것들의 용도를 포함한다. 본 발명은 암 및 바이러스 감염들을 치료하기 위한 효율적인 취해진(adoptive) 면역요법 전략들로의 길을 연다.

Description

멀티―체인 키메라 항원 수용체 및 그것의 용도들{MULTI-CHAIN CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR AND USES THEREOF}

본 발명은 키메라 항원 수용체들(chimeric 항원 receptors) (CAR)에 대한 것이다. CAR들(CARs)은 리간드-결합(ligand-binding) 도메인(domain) 특성들을 활용하는 선택된 표적(target)을 향한 면역 세포 특이성 및 반응성을 다시 보낼 수 있다(redirect). 특히, 본 발명은 세포외(extracellular) 리간드 결합 및 신호전달(signaling) 도메인들이 그것들의 기능들을 개선하기 위하여 다른 막횡단(transmembrane) 폴리펩타이드들에 분리되어 있는 멀티-체인 키메라 항원 수용체에 대한 것이다. 본 발명의 멀티-체인 CAR을 포함하는(composing) 다른 막횡단 폴리펩타이드들은, 일단 서로 조립되면(assembled), 표적에서 하나 또는 몇몇의 리간드(들)에 특이적으로 결합하고, 그것들이 발현되고 면역반응 하는 면역 세포들의 활성화를 유도할 수 있다. 본 발명은 또한 폴리뉴클레오타이드들, 이러한 막횡단 폴리펩타이드들을 코드하는(encoding) 벡터들 및 면역 요법을 위하여 그것들의 표면에서 상기 멀티-체인 CAR을 발현시키는 분리된(isolated) 세포들에 대한 것이다. 본 발명은 또한 그것들의 표면에서 멀티-체인을 발현시키는 면역 세포들을 제작하는(engineering) 방법들에 대한 것이다. 본 발명은 암 및 바이러스 감염들을 치료하기 위한 효율적인 취해진(adoptive) 면역요법(immunotherapy) 전략들로의 길을 연다.

엑스 비보(ex vivo)에서 생기는 자가(autologous) 항원-특이적 T 세포들의 이동을 수반하는, 취해진 면역요법은 바이러스 감염들 및 암을 치료하기 위한 유망한 전략이다. 취해진 면역요법에서 사용되는 T 세포들은 항원-특이적 T 세포들의 발현 또는 유전공학을 통한 T 세포들의 방향수정(redirection)에 의하여 만들어질 수 있다(Park, Rosenberg et al. 2011). 바이러스 항원 특이적 T 세포들의 이동은 이식 관련된 바이러스 감염들과 희귀산 바이러스-관련 악성종양들(malignancies)의 치료에 사용되는 잘-확립된 절차이다. 유사하게 종양(tumor) 특이적 T 세포들의 분리 및 이동(transfer)는 흑색종 치료에 성공적으로 나타났다.

T 세포들의 신규한 특이성들은 유전자도입(transgenic) T 세포 수용체들 또는 키메라 항원 수용체들(CARs)의 유전적 이동을 통하여 성공적으로 만들어져 왔다(Jena, Dotti et al. 2010). CAR들은 단일 융합 분자에서 하나 또는 그 이상의 신호전달 도메인들과 고나련된 표적 모이어티(targeting moiety)로 구성된다. 보통, CAR의 결합 모이어티(moiety)는 플렉서블한(flexible) 링커(linker)에 의하여 연결된 단일클론 항체의 가변운(light) 그리고 가변(variable) 단편들(fragments)를 포함하는, 단일-사슬 항체(scFv)의 항원-결합 도메인으로 구성된다. 수용체 또는 리간드 도메인들에 기초한 결합 모이어티들은 성공적으로 사용되어 왔다. 첫 번째 세대(generation) CAR들(CARs)를 위한 신호전달 도메인들은 CD3제타 또는 Fc 수용체 감마 체인들의 세포질 영역으로부터 유래한다. 첫 번째 세대 CAR들은 T 세포 세포독성을 성공적으로 다시 보내왔으나, 그것들은 인 비보에서 장기적인 확장 및 항-종양 활성을 제공하는데는 실패하였다. CD28, OX-40 (CD134), 및 4-1BB (CD137)를 포함하는 공-자극(co-stimulatory) 분자들로부터의 신호전달 도메인들은 CAR 변형된 T 세포들의 생존을 증강시키고 확산을 증가시키기 위하여 단독으로(두 번째 세대) 또는 복합(in combination)(세 번째 세대)하여 첨가되어 왔다. CAR들은 림프종들 및 고형 암들을 포함하는 다양한 악성종양들로부터 종양 세포들의 표면에 발현되는 항원들에 대하여 T 세포들을 다시 보내게(redirect) 성공적으로 해왔다(Jena, Dotti et al. 2010).

현재의 CAR 구조들(architectures)은 모든 관련 도메인들이 단일 폴리펩타이드 내에 포함되는 디자인 상에 지어진 것이다(US 7,741,465). 이 디자인은 신호전달 도메인들의 연속적인 덧붙이기(serial appending)를 필요하게 하여, 이와 같이, 원형질막(plasma membrane)으로부터 먼 쪽의, 그것들의 원래의 막옆(juxtamembrane) 위치들로부터 일부 도메일들을 움직이는 것을 필요로 하게 한다. 그럼에도 불구하고, 리간드들 및 신호전달 도메인들이 (즉, 그것의 내부 측 상 세포막에 인접한) 그것들의 정상적인 막옆(juxtamembrane) 위치들에 분리되어 있는 구조들은 더 바람직하고, 공자극(costimulatory) 도메인들의 개선된 기능을 허용하는 것으로 간주될 것이다. IgE (FcεRI)에 대한 높은 친밀도(affinity) 수용체는 이러한 구조를 제공할 수 있다. 정말로, 비만 세포들 및 호염기성 세포들(basophils) 상에 존재하는 FcεRI는 리간드 결합 알파 서브유닛, 베타 서브유닛 및 두 개의 신호-전달(signal-transducing) 감마 서브유닛들의 호모다이머(homodimer)로 구성되는 4합체 복합체(complex)이다(Metzger, Alcaraz et al. 1986). FcεRI 알파 도메인은 IgE에 결합하는 두 개의 Ig-유사(like) 도메인들, 막횡단 도메인 및 짧은 세포질 꼬리를 포함하는 세포외 도메인으로 구성된다. 베타 서브유닛은 아미노 및 카르복시 말단 세포질(cytoplasmic) 꼬리들을 분리하는 4개의 막횡단(transmembrane) 부분들(segments)을 포함한다. 감마 체인은 하나의 면역 수용체 티로신-베이스의 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based 활성화 motif) (ITAM) (Cambier 1995)를 포함하는 세포질 꼬리 및 막횡단 영역으로 본질적으로 구성된다(consists essentially of).

취해진(adoptive) 면역요법을 이용한 환자들의 치료를 위한 현재 프로토콜은 자가 세포 이동(autologous cell transfer)에 기초한다. 이 접근에서, T 림프구들이 환자들로부터 회수되고, 유전자 조작되거나 또는 엑스 비보(ex vivo)로 선택되고, 만약 필요하다면 세포들의 수를 증폭시키기 위하여 인 비트로에서 배양되고, 그리고 최종적으로 환자에 주입된다(infuse). 림프구 주입(lymphocyte infusion)에 추가하여, 숙주는 예컨대 (방사선 치료(radiation) 또는 화학요법으로) 프리-컨디셔닝(pre-conditioning)인, T 세포들의 이식(engraftment) 또는 면역 반응에의 그것들의 참여, 및 (IL-2와 같은) 림프구 성장 인자들의 투여를 지지하는 다른 방법으로 처리될 수 있다. 각각의 환자들은 환자들 고유의 림프구들(즉, 자가유래(autologous) 치료)를 이용하여 개인적으로 맞춤된 치료(individually fabricated treatment)를 받는다.

자가유래 요법들(autologous therapies)은 실질적 적용을 위해서는 상당한 기술적 및 실행적(logistic) 장애들에 직면하고 있는데, 그것들의 세대는 비싼 전용 시설들 및 전문 인력들을 요구하고, 그것들은 환자의 진단에 따라 단시간에 만들어져야 하고, 많은 경우들에서 환자의 예비치료(pretreatment)는 저하된 면역 기능을 야기하여, 환자의 림프구들은 기능적으로 좋지 않고, 매우 낮은 수들로 존재할 수 있다. 이러한 장애들때문에, 각각의 환자들의 자가유래 세포 준비는 효과적으로 새로운 산물이며, 효능 및 안전에 상당한 차이를 야기한다. 이상적으로, 동종이계 치료 세포들(allogeneic 치료적(therapeutic) 세포들)이 미리-제조되고(pre-manufactured), 상세하게 특징화되고(characterized in detail), 그리고 환자들에게 즉시 투여에 이용가능한 표준화된 요법을 이용하고 싶어한다. 동종이계(allogeneic)에 의하여, 동일한 종들에 속하나 유전적으로 같지 않은 개인들로부터 수득되는 세포들을 의미한다. 그러나, 동종이계 세포들의 이용은 현재 많은 문제점을 갖는다. 면역적격(immune-competent) 숙주들에서, 동종이계(allogeneic) 세포들은 급히 거부되며, 숙주편대이식(host versus graft) 거부(rejection) (HvG)로 명명된 과정, 이는 이동된(transferred) 세포들의 효능을 상당히 제한한다. 면역부적격(immune-incompetent) 숙주들에서, 동종이계(allogeneic) 세포들은 이식할 수 있으나, 그것들의 내생(endogenous) TCR 특이성들은 숙주 조직을 이물질(foreign)로 인식하여, 이식편대숙주 질환(graft versus host disease) (GvHD)을 야기하는데, 이는 심각한 조직 손상 및 사망으로 이끌 수 있다. 동종이계(allogeneic) 세포들을 효과적으로 이용하기 위하여, 이들 문제들은 모두 극복되어야 한다.

면역적격 숙주들에서, 동종이계 세포들은 숙주 면역 체계에 의하여 신속히 거부된다. 방사능 처리되지 않은(non-irradiated) 혈액 제품들에 존재하는 동종이계 백혈구들이 5 내지 6일 밖에 지속되지 않을 것이라는 것이 입증되어 왔다(Boni, Muranski et al. 2008). 이와 같이, 동종이계 세포들의 거부를 방지하기 위하여, 숙주의 면역 체계는 효과적으로 억제되어야 한다. 글루코코르티코이드스테로이드들(Glucocorticoidsteroids)은 면역억제에 널리 치료적으로 사용된다(Coutinho and Chapman 2011). 이 종류(class)의 스테로이드(steroid) 호르몬들은 T 페포들의 시토졸(cytosol)에 존재하는 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 수용체(receptor) (GR)에 결합하여, 핵으로의 위치변경(translocation) 및 면역(immunologic) 과정에 관여하는 많은 유전자들의 발현을 조절하는 특이적 DNA 모티프들(motifs)의 결합을 야기한다. 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 스테로이드들로 하는 T 세포들의 치료는, T 세포 면역성 결핍(anergy)을 이끌고 T 세포 활성화에 개입하는(interfere) 사이토카인(cytokine) 생산 레벨의 감소를 야기한다. CAMPATH1-H로도 알려진 알렘투주맙(Alemtuzumab)은, 12 아미노산 글리코실포스파티딜-이노시톨-(GPI)-연결된 당단백질(glycosylphosphatidyl-inositol- (GPI) linked glycoprotein)인, CD52를 표적으로 하는 인간화된 단일클론 항체이다(Waldmann and Hale 2005). CD52는 T 및 B 림프구들에서 높은 레벨들로, 그리고 단핵구들(monocytes)에서 낮은 레벨들로 발현되며, 반면, 과립구들(granulocytes) 및 골수 전구체들 상에는 없다. 알렘투주맙(Alemtuzumab)의 치료에서, CD52로 향하는 인간화된 단일클론 항체는 순환하는 림프구들 및 단핵구들(monocytes)의 신속한 소모(depletion)를 유도하는 것을 보여져 왔다. 그것은 T 세포 림프종들의 치료 및 이식(transplantation)을 위한 조절(conditioning) 식이요법(regimen)의 부분으로서 특정 케이스들에서 자주 이용된다. 그러나 취해진(adoptive) 면역요법의 케이스에서, 면역억제제들의 사용은 또한 도입된 치료적 T 세포들에 유해한 효과를 갖는다. 그러므로 이러한 조건들에서, 취해진(adoptive) 면역요법 접근을 효과적으로 이용하기 위하여, 도입된 세포들은 면역억제 치료에 저항력 있을 필요가 있을 것이다.

반면, T 세포 수용체들(TCR)은 항원의 제시에 응한 T 세포들의 활성화에 참여하는 세포 표면 수용체들이다. TCR은 보통 두 개의 체인들(chains)로 만들어지는데, 알파 및 베타이고, 이는 조립되어 헤테로다이머(heterodimer)를 형성하고, CD3-형질도입(transducing) 서브유닛들과 연관되어(associates with), 세포 표면 상에 존재하는 T-세포 수용체(receptor) 복합체를 형성한다. TCR의 각각의 알파 및 베타 체인은 면역글로불린(immunoglobulin)-비슷한 N-말단 가변(variable) (V) 및 불변(constant) (C) 영역, 소수성 막횡단(transmembrane) 도메인, 및 짧은 세포질(cytoplasmic) 영역으로 구성된다. 면역글로불린 분자들을 위하여, 알파 및 베타 체인들의 가변 영역은 V(D)J 재조합(recombination)에 의하여 만들어지고, T 세포들 군(population) 내에 큰 다양성의 항원 특이성들을 만든다. 그러나, 온전한 항원들을 인식하는 면역글로불린들과 대조적으로, T 세포들은 MHC 문자와 관련된 가공된(processed) 펩타이드 단편들에 의하여 활성화되어, 여분 차원(extra dimension)을 T 세포들에 의한 항원 인식에 도입하는데, 이는 MHC 제한(restriction)으로 알려져 있다. T 세포 수용체를 통한 도너(donor) 및 수용자(recipient) 사이의 MHC 차이들의 인식은 T 세포 증식(proliferation) 및 GVHD의 잠재적 발달을 이끈다. TCR의 정상 표면 발현이 조직화된(coordinated) 합성 및 복합체의 7개의 성분들 모두의 조립에 의존한다는 것이 보여져 왔다(Ashwell and Klusner 1990). TCR알파(TCR알파(alpha)) 또는 TCR베타(TCR베타(beta))의 불활성화는 동종항원(alloantigen) 및 이와 같이 GVHD의 인식을 막는 T 세포들의 표면으로부터 TCR의 제거를 야기할 수 있다. 그러나, TCR 파괴(disruption)는 CD3 신호전달(signaling) 성분의 제거를 야기하고, 게다가 T 세포 확장(expansion)의 수단들을 바꾼다.

T-세포 매개된 면역력은 면역력 반응을 미세조정하는 공-자극(co-stimulatory) 및 억제 신호들 사이의 균형에 의하여 조절되는 복수의 순차적인 단계들을 포함한다. 면역 체크포인트들로 언급된 억제 신호들은 자가내성(self-tolerance)의 유지에 결정적이며, 또한 면역-매개된 이차적(collateral) 조직 손상을 제한한다. 면역 체크포인트들 단백질의 발현은 종양들에 의하여 낮게 조절될(deregulate) 수 있다. 이들 억제 경로들을 끌어들이는 종양들의 능력은 면역 내성(immune resistance)의 중요한 메커니즘에 해당하며, 면역요법의 성공을 제한한다. 치료적 T-세포 면역 반응을 활성화시키기 위한 유망한 접근들 중 하나는 이들 면역 체크포인트들의 차단이다(Pardoll 2012). 면역 체크포인트들은 암에서의 기능적 세포 면역력의 활성화에 대한 중대한 장애물들에 해당하며, 그리고 CTLA4 및 예정사(programmed death)-1 (PD-1)을 포함하는 T 세포들 상 억제 리간드들에 특이적인 길항성(antagonistic) 항체들은 임상에서 평가되는 표적화된 제제들의 예들이다.

세포독성-T-림프구-관련 항원 4(cytotoxic-T-lymphocyte-associated 항원 4 (CTLA-4; CD152으로도 알려져 있음)는 T 세포 활성화의 진폭(amplitude)을 낮게 조절하고, 길항제(antagonist) CTLA4 항체들 (이필리무맙(ipilimumab))으로 하는 치료는 흑색종 환자들에 있어, 생존 이익을 보였다(Robert and Mateus 2011). 예정세포사(Programmed 세포 death) 단백질 1(PD1 또는 PDCD1, CD279로도 알려져 있음)은 면역요법의 또다른 매우 유망한 표적에 해당한다(Pardoll and Drake 2012; Pardoll 2012). CTLA-4와 달리, PD1은 감염에 대한 염증 반응의 시기에 주변 조직에서 T 세포 반응기(effector) 기능들을 제한하고, 자가면역력을 제한한다. PD1 항체로 하는 첫 번째 임상 시험은 종양 억제의 일부 경우들을 보인다(Brahmer, Drake et al. 2010). 복수 개의 추가적인 면역 체크포인트 단백질은 최근의 연구들에 기초한 치료적 차단을 위한 유망한 표적들에 해당한다.

정상 T-세포들에서, T 세포 수용체들은 프리(pre)-T 세포 수용체들 (pTCR)에서 나오는데, 이것들은 미성숙 흉선세포들(thymocytes)에 의하여 발현되고, 이중 음성(double negative)(CD4- CD8-)으로부터 이중 양성(double-positive) (CD4+ CD8+) 단계들로의 T 세포 발달에 중요하다. TCR베타 자리(locus)의 생산적 재배열들에 성공하는 프리-T 세포들은 불변(invariant) 프리T알파(preTalpha) 체인과 짝을 이루는 기능적 TCR베타 체인들 및 CD3 신호전달(signaling) 성분들을 발현시켜, 프리-TCR 복합체를 형성한다. 세포 표면에서의 프리TCR(preTCR)의 발현은, T 세포들의 발달의 확장을 유도하고, TCR베타 자리(locus)의 대립 배제(allelic exclusion)를 강요하고, 그리고 TCR알파(TCR알파(alpha)) 자리(locus)에서 재배열의 유도를 야기하는 과정인, 베타-선택을 촉발시키는데(triggering) 필요하다(von Boehmer 2005). 성숙 TCR을 형성하기 위한, 생산적인(productive) TCR알파 재배열들 및 TCR알파에 의한 pT알파(pTalpha)의 치환 후, 흉선세포들(thymocytes)은 선택의 두 번째 단계를 겪는데, 이는 흉선의(thymic) 상피 세포들 상에 발현되는 셀프(self) 펩타이드 MHC 복합체들의 결합에 대한, 양성 또는 TCR알파/베타 선택으로 불린다. 이런 식으로 성숙 T 세포들은 그것들의 TCR을 통하여 항원/MHC 복합체를 인식하고 반응한다. TCR 활성화의 가장 즉각적인 결과는 관련된 CD3 서브유닛들을 통한 신호전달(signaling) 경로들의 시작으로, 이는 T 세포들의 클론 확장(clonal expansion), 세포 표면의 활성화 마커들의 상향조절 및 세포 독성 또는 사이토카인 분비의 유도를 포함하는 복수 개의 일들(events)을 야기한다.

TCR알파가 불활성화되는 T 세포들에서, 흉선의 발달 동안 프리T알파(preTalpha)와의 짝짓기(pairing)를 통한 TCR베타 체인들의 선택의 특성 때문에, pT알파 전이유전자(transgene)의 이종(heterologous) 도입은 프리TCR의 형성을 야기할 수 있다. 이 pTCR은 비-MHC 의존적인 방식으로 T 세포 활성화 또는 자극의 수단으로 작용할 수 있으며, 이와 같이, 예컨대 TCR알파 불활성화 후 알파/베타 T-세포들의 연속된 확장을 가능하게 한다. 중요하게, pTCR 복합체는 관련된 CD3 서브유닛들의 면에서 TCR로서 유사한 생화학적 조성물을 보여준다(Carrasco, Ramiro et al. 2001). 그리고, TCR과 대조적으로 프리-TCR 신호전달(signaling)은 리간드 비의존적 이벤트(event)에 의하여 부분적으로 발생할 수 있다. pTCR 세포외 도메인의 결정 구조는 pTCR 신호전달(signaling)의 가능한 리간드-독립성을 위한 구조적 기초를 제공하였다. pTCR은 2 개의 헤테로다이머들(heterodimers)이 연관된 머리부터 꼬리 다이머(dimer)를 형성하는 것을 보여주었다(Pang, Berry et al. 2010).

악성 또는 감염된 세포들을 표적으로 할 수 있는 치료적 등급 조작된(engineered) 면역 세포들을 발달시키는 맥락에서, 발명자들은 천연의 것들과 더 가깝고, 임의의 세포외 모노 또는 멀티-특이적 리간드 결합 도메인들을 이용하여 그에 맞춰 행동을 할 것 같은 개선된 CAR 구조들(architectures)을 추구하여 왔다.

그 결과, "멀티-체인 CAR들"로 표시된, 본 발명에 따른, 분리된 폴리펩타이드 서브-유닛들을 포함하는 CAR들(CARs)의 새로운 세대를 디자인하였다.

"멀티-체인 CAR들"로 표시된, 본 발명에 따른, 분리된 폴리펩타이드 서브-유닛들을 포함하는 CAR들(CARs)의 새로운 세대를 디자인하였다.

도면들 및 표의 간단한 설명
앞선 특징들에 추가하여, 본 발명은 첨부된 도면들과 더불어, 하기의 설명들로부터 드러나는 다른 특징들을 더 포함한다. 본 발명의 더 완전한 공감 및 그것들의 수반되는 이점들은 쉽게 얻어질 것인데, 하기 자세한 설명과 함께 하기 도면들을 참고로 더 잘 이해되기 때문이다.
도 1: T-세포들 및 항원 제시 세포 사이의 정상적인 관계의 도식적 표시(schematic representation).
도 2: 환자의 종양 세포들 및 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 치료적(therapeutic) T-세포들의 도식적 표시.
도 3: 멀티-체인 CAR의 도식적 표시.
도 4: 멀티-체인 CAR들의 다른 버젼들의 도식. A: FcεRI 수용체의 도식. B-C FcεRI 알파 체인의 막횡단(transmembrane) 도메인에 융합된 CD8 줄기(stalk) 영역 및 scFv를 포함하는 멀티-체인 CAR들 (csm1 내지 csm10) 의 다른 버젼들. 적어도 하나의 41BB, CD28 및/또는 CD3 제타(zeta) 도메인들이 FcεRI 알파, 베타 및/또는 감마 체인에 융합될 수 있다.
도 5: 면역치료를 위하여 인간 동종이계(allogenic) 세포들을 조작하는 방법의 하나의 예의 도식적 표시.
도 6: 대조군들 또는 보체(complement)로 항-CD52 항체 (CAMPATH1-H)로 처리 후 살아있는 CD52-양성 또는 CD52-음성 세포들의 밀리리터(milliliter) 당 세포들의 농도.
도 7: 대조군으로서 비활성화된 세포들 및 CD52-양성 및 CD52-음성 세포들 사이, 또는 TCR-양성 및 TCR-음성 세포들 사이에서, 세포 크기의 지표인, 포워드(forward) 사이드(side) 스캐터(scatter) (FSC) 분포의 비교.
도 8: 표적이 된 CD52 및 TCR알파 불활성화된 T 세포들 상 CD107a 발현(탈과립화(degranulation)의 마커)의 유동세포분석법 분석. CD107 발현은 다우디(Daudi) 세포들과의 배양 전(A) 및 후(B) CD52+TCRαβ+ 세포들 (첫 번째 칼럼), CD52-TCRαβ- 세포들 (두 번째 칼럼), CD52-TCRαβ+ 세포들 (세 번째 칼럼) 및 CD52+TCRαβ- 세포들 (네 번째 칼럼) 상에서 분석된다; c)는 CAR로 더 형질주입되고 다우디(Daudi) 세포들과 배양된 T 세포들의 유동세포 분석법 분석을 나타낸다; D)는 CAR로 형질주입되고 다우디(Daudi) 세포들과 배양되지 않은 T 세포들의 유동세포 분석법 분석을 나타낸다 그리고 E) 는 CAR로 형질주입되고 PMA/이노마이신(ionomycin)으로 처리된 T 세포들의 유동세포 분석법 분석을 나타낸다(양성 대조군).
도 9: 잠재적 부위를 벗어난(off-site) 표적들인 TRAC TALE-뉴클레아제들 및 CD52의 딥(deep) 시퀀싱(sequencing) 분석. 도 9는 나타나는(appearance) 순서대로, 모두 각각, 서열번호들 149-165 로서 "왼쪽(left) 반(half) 표적" 서열들 및 서열번호들 166-182로서 "오른쪽(right) 반(half) 표적"을 개시한다.
도 10: T7-엔도뉴클레아제 어세이에 의한 PDCD1 및 CTLA-4 게놈 자리(locus)의 분석. 화살표들은 소화된 PCR 산물들을 가리킨다.
도 11: 프리T알파 구조체들의 일부 예들의 도해적 표시.
도 12: TCR 알파 불활성화된 주르카트(Jurkat) 세포들에서 FL, △18, △48 pT알파 구조체들의 활성(% CD3 표면 발현) 및 형질도입(transduction) 효율(% BFP+ 세포들)의 유동세포분석법 분석.
도 13: pT알파 단백질을 코드하는 렌티바이러스(lentiviral) 구조체의 도해적 표시(프리TCRα).
도 14: A. 실험적 프로토콜의 도해. B. 정제 전후 대조군 BFP 렌티바이러스 벡터 (KO/BFP) 또는 BFP-2A-pTalpha△48 (KO/△48) 으로 형질도입된(transduced) TCR알파 불활성화된 T 세포들 상 TCR 알파/베타, CD3 발현 및 BFP 발현의 유동세포분석법 분석. C. BFP-2A-pTalpha△48 렌티바이러스 벡터로 형질도입되지 않거나(BFPneg) 또는 형질도입된(BFPpos) 정제된 TCR 알파 불활성화된 세포들 상 TCR 알파/베타 및 CD3 발현의 유동세포분석법 분석. NEP은 TRAC TALE-뉴클레아제들로 전기천공되지 않은 세포들을 나타낸다.

도 15: A-B. 대조군 BFP 벡터 (BFP) 또는 BFP-2A-pTα-△48 렌티바이러스 벡터 (pTα-△48), BFP-2A-pTα-△48.41BB 렌티바이러스 벡터 (pTα-△48.BB)로 형질도입된 TCR알파 불활성화된 세포들 (KO) 및 전기천공되지 않은 세포들 (NEP) 상에 각각 항-CD3/CD28 비드들로 재활성화 24 및 48 시간 후 초기(early) 활성화 마커 CD69 (A), 늦은(late) 활성화 마커 CD25 (B) 발현의 유동세포분석법 분석. pTα-△48 막대그래프들은 pTα-△48을 발현시키는 TCR 불활성화된 세포들 (BFP+ 세포들)에서 검출되는 신호에 해당하는 반면, KO 막대그래프들은 pTα-△48 pTα-△48을 발현시키지 않는 TCR알파 불활성화된 세포들(BFP-세포들)에 해당한다. BB 막대그래프들이 pTα-△48.41BB을 발현시키는 TCR 불활성화된 세포들에서 검출된 신호에 해당하는 반면(BFP+ 세포들), KO 막대그래프들은 pTα-△48.41BB 을 발현시키지 않는 TCR알파 불활성화된 세포들에 해당한다(BFP-세포들). NEP (전기천공되지 않은(non electroporated)) 막대그래프들은 조작되지 않은 세포들에서 검출되는 신호에 해당한다. C. 대조군 BFP 벡터 (BFP) 또는 BFP-2A-pTα-△48 렌티바이러스 벡터 (pTα-△48), BFP-2A-pTα-△48.41BB 렌티바이러스 벡터 (pTα-△48.BB)로 형질도입된 TCR알파 불활성화된 세포들 (KO) 및 전기천공되지 않은 세포들 (NEP) 상 항-CD3/CD28 비드들로 재활성화 72 시간 후 세포들의 크기의 유동세포분석법 분석. 각각의 그래프의 뒷 부분에 표시된 값들은 각 군의 형광의 기하평균에 해당한다.
도 16: 다른 시간 포인트들(x-축)에서 항- CD3/CD28 비드들로 IL2에서, 또는 IL2에서 유지되는 대조군 BFP 벡터 (BFP) 또는 pT알파-△48 (pTa△48)로 형질도입된 TCR 알파 불활성화된 세포들 (KO)의 세포 성장 분석. BFP+ 세포들 수는 각각의 조건에 대하여 다른 시간 포인트들에서 추산되고, 이들 세포들의 배수(fold) 유도(induction) (y-축)은 재활성화 2일 후 수득된 값에 대하여 추산되었다. 결과들은 두 개의 독립적 도너들로부터 얻어진다. 두 번째 도너를 위하여, 세포 성장이 또한 pT알파-△48.41BB (pTa-△48.BB) 및 전장(full-length) pT알파- (pTa-FL)로 형질도입된 세포들에 대하여 결정되었다.
도 17: 5개의 다른 사이토펄스(Cytopulse) 프로그램들로 전기천공된 PBMC들 상 GFP 양성 세포들의 유동세포분석법 분석. A. NEP, EP#1 (GFP) 및 EP#2 (GFP); B. EP#3 (pUC), EP#4 (GFP) 및 EP#5 (GFP). 윗쪽 선은 큐벳 당 6x10⁶ 세포들의 형질주입(transfection)에 해당하고 반면, 더 낮은 선은 큐벳 당 3x10⁶ 세포들의 형질주입(transfection)에 해당한다.
도 18: 대조군 pUC DNA 및 GFP mRNA, GFP DNA로 전기천공 후 살아있는 군 중 GFP 양성 세포들의 그리고 생존능 염료 (eFluor-450)를 이용하여 정제된 T 세포 치사율(mortality)의 유동세포분석법 분석. A. NT 및 NEP; B. EP (DNA 없음(no DNA)) 및 GFP DNA; C. pUC DNA 및 GFP mRNA. NEP는 전기천공 버퍼에서 유지되었으나 전기천공되지 않은 세포들에 해당하고, NT는 배양 배지에서 유지된 전기천공되지 않은 세포들에 해당한다.
도 19: TRAC TALE-뉴클레아제 mRNA 전기천공 (위) 후 인간 초대(primary) T 세포들 상 TCR 알파/베타 및 CD3 발현의 유동세포분석법 분석. TRAC TALE-뉴클레아제 mRNA 전기천공 (bottom) 후 인간 초대(primary) T 세포들로부터 추출된 게놈 DNA의 딥(Deep) 시퀀싱(sequencing) 분석(나타난 순서대로, 각각, 서열번호들 183-192).
도 20: A. 단일 체인 CAR을 코드하는 mRNA 없이 또는 그것으로 T 세포들의 전기천공 후 CAR 발현 (항 F(ab')2)의 유동세포분석법 분석. B. 다우디(daudi) 세포들과 공배양된 전기천공된(electroporated) T 세포들 상 CD107a 발현 (탈과립화의 마커)의 유동세포분석법 분석.

도 21: A. 멀티-체인 CAR를 코드하는 mRNA의 도해. B. 멀티-체인 CAR를 코드하는 폴리시스트론인 mRNA 없이 또는 그것으로 전기천공된 독자 생존가능한(viable) T 세포들 상 CAR 발현 (항 F(ab')2)의 유동세포분석법 분석. C. 다우디 세포들과 공배양된 전기천공된 T 세포들 상 CD107a 발현(탈과립화의 마커)의 유동세포분석법 분석.
도 22: 폴리시스트론인 mRNA들의 전기천공 후 인간 T 세포들에서 멀티-체인 CAR들 발현.
도 23: 멀티-서브유닛 CAR들의 발현은 3개 체인들α, β 및 γ의 발현에 의하여 좌우된다(condition).
도 24: 표적 세포들과 공배양 후 멀티-체인 CAR들을 일시적으로 발현시키는 인간 T 세포들은 탈과립시킨다.
도 25: 표적 세포들과 공배양 후 멀티-체인 CAR들을 일시적으로 발현시키는 인간 T 세포들은 사이토카인들을 분비한다.
도 26: 멀티-체인 CAR들을 일시적으로 발현시키는 인간 T 세포들은 표적 세포들을 용해시킨다(lyse).
표 1: 인간 GR 유전자 내 TALE-뉴클레아제들 표적 부위들의 서열들 및 GR TALE-뉴클레아제들의 설명.
표 2; 효모 내 GR TALE-뉴클레아제들의 절단 활성. 값들은 0 및 1 사이에 포함된다. 최대값은 1이다.
표 3: 293 세포들 내 내생(endogenous) TALE-뉴클레아제 표적 부위들에서 표적이 된 돌연변이 유발의 퍼센트.
표 4: 초대(primary) T 림프구들 내 내생(endogenous) TALE-뉴클레아제 표적 부위들에서 표적이 된 돌연변이 유발의 퍼센트.
표 5: 인간 해당하는 유전자들에서 TALE-뉴클레아제들 표적 부위들의 서열 및 TRBC TALE-뉴클레아제들 및 TRAC, CD52의 설명.
표 6: TRAC 및 CD52 TALE-뉴클레아제들을 위한 추가적인 표적 서열들.
표 7: CD52_T02, TRAC_T01, TRBC_T01 및 TRBC_T02 표적들을 표적으로 하는 TALE-뉴클레아제을 위한 삽입-결실들의 퍼센트.
표 8: 대응하는 TALE-뉴클레아제-expressing 폴리뉴클레오타이드들의 형질주입(transfection) 후 CD52- 음성(negative), TCR-음성 및 CD52/TCR-이중(double) 음성(negative) T 림프구들의 퍼센트들.
표 9: TRBC TALE-뉴클레아제-발현 폴리뉴클레오타이드들의 형질주입(transfection) 후 TCR-음성 T 림프구들의 퍼센트들.
표 10: 인간 해당하는 유전자들 내 TALE-뉴클레아제들 표적 부위들의 서열 및 PDCD1 TALE-뉴클레아제들 및 CTLA4의 설명.
표 11: pT알파 구조체들의 부분집단(subset)의 설명.
표 12: 주르카트(Jurkat) TCR 알파 불활성화된 세포 내 다른 pT알파 구조체들의 활성. 활성은 다른 프리T알파 구조체들로 형질주입된 주르카트(jurkat) TCR 알파 불활성화된 세포 상 CD3 발현의 유동세포 분석법 분석에 의하여 측정되었다.
표 13: PBMC 유래된 T-세포들 내 전기천공에 요구되는 최소 전압을 결정하기 위하여 사용되는 다른 사이토펄스 프로그램들.
표 14: 정제된 T-세포들을 전기천공하기 위하여 사용되는 사이토펄스(Cytopulse) 프로그램.
표 15: 멀티-체인 CAR들 버젼들의 FcR 체인들 조성물들의 설명.

본 발명의 개요

선행 기술의 키메라 항원 수용체들(Chimeric Antigen Receptors) (CAR)은 신호전달(signaling) 도메인들의 연속적인 덧붙이기(serial appending)를 필요로 하게 하는 단일 융합(fusion) 분자들로서 존재한다. 그러나 이들 천연 옆(juxtamembrane) 위치로부터 신호전달 도메인들을 제거하는 것은 그것들의 기능에 개입하는 것이다(interfere). 그러므로, 이 문제점을 극복하기 위하여, 발명자들은 모든 관련된 신호전달(signaling) 도메인들의 막옆(juxtamembrane) 위치를 허용하는 소위 멀티-체인 CAR들을 디자인하는데 성공하였다. 멀티-체인 CAR들에서, 신호전달 도메인들은 그것들이 막옆(juxtamembrane) 위치들을 차지하는 다른 폴리펩타이드 체인들 상에 위치한다. 예컨대, 멀티-체인 CAR는 scFv와 같은 세포외 리간드-결합 도메인에 의하여 FcεRI 알파 체인의 고친화성(high affinity) IgE 결합 도메일을 대체함으로써, FcεRI로부터 유래될 수 있는 반면, FcεRI 베타 및/또는 감마 체인의 N 및/또는 C-말단들 꼬리들은 정상 막옆(juxtamembrane) 위치들의 신호 전달(signal transducing) 도메인을 위치시키는데 사용된다. 세포외 리간드 결합 도메인은 세포 표적들을 향한 T-세포 특이성을 다시 보내는(redirecting) 역할을 맡은 반면, 막옆(juxtamembrane) 위치들의 옆, 신호 전달(signal transducing) 도메인들은 면역 세포 반응을 활성화시킨다.

막옆(juxtamembrane) 위치의 신호전달 도메인들이 세포외 리간드 결합 도메인을 갖는 것과는 별개의 폴리펩타이드(들) 상에 존재한다는 사실은 CAR들을 위한 더 유연한(flexible) 구조를 제공한다. 따라서, 추가적인 신호전달 도메인들 또는 공-자극 도메인들은 CAR의 리간드 결합 도메인 및 그것의 수용체 사이를 추구하는 상호작용의 강도에 의존적인 CAR로부터 제거되거나 추가될 수 있다. CAR의 구조 내 이 유연성(flexibility)은 또한 추가적인 세포외 리간드 결합 도메인(들)을 도입하는 것을 허용한다. 이는 첫 번째 리간드 결합 도메인을 갖는 폴리펩타이드에 두 번째 리간드 결합 도메인의 융합에 의하여, 또는 추가적인 세포외 리간드 결합 도메인들을 도입함으로써 될 수 있다. 만약 이 두 번째 리간드 결합 도메인이 다른 특이성을 갖는다면, 이는 이중특이(bi-specific) 멀티-체인 CAR를 형성하고, 만약 추가적인 것들이 있다면, 멀티-특이적인 멀티-체인 CAR이다. 그것들의 표면에 둘 또는 그 이상의 다른 수용체들을 갖는 정해진 세포 또는 바이러스를 표적(target)으로 하는 것을 고려하여, 이것들은 특히 이익이 된다. 이것은 상기 세포 또는 바이러스를 향한 이러한 멀티-체인 CAR의 특이성을 증가시킨다. 다른 한 편으로는 신호전달 도메인들의 수는 다른 결합 도메인들로 각각 신호의 조정을 허용할 수 있다. 그리고, CAR를 형성하는 각각의 재조합(recombinant) 폴리펩타이드는 CAR의 활성을 더 조절하기 위하여 다른 발현 레벨들에서 독립적으로 발현될 수 있다.

본 발명은 이 새로운 CAR 구조(architecture), 그것을 코드하는 재조합 폴리뉴클레오타이드들, 그리고 면역 세포들의 어떠한 목적 및 특성일지라도, 특이적 세포 인식을 위한 면역 세포들을 조작하는 방법들에 대한 것이다.

본 발명은 추가적으로 면역요법 목적들에 더욱 적합한 이러한 면역(immune) 세포들을 만드는 방법들을 제공한다.

예를 들어, 면역(immune) 세포들은, 특히 초대(primary) 세포들 내 TCR 알파 또는 베타 유전자들을 불활성화시켜, 및/또는, 특히 CD52 및 GR (글루코코르티코이드(Gluococorticoid) 수용체들(Receptors))인, 다른 면역억제제들을 위한 표적들을 코드하는 유전자들의 불활성화를 커플링함으로써, 그리고, 상기 면역억제제들에 저항력있는 세포들을 선택함으로써, 비-동종반응성(non-alloreactive) 및/또는 면역억제제들에 저항성 있게 더 조작될 수 있다.

유전적으로 변형된 면역 세포들의 상기 개념들에 더하여, 본 발명은 또한, 예컨대 세포에서 일시적으로 프리T알파를 발현시킴으로써, TCR알파가 불활성화될 때, 면역(immune) 세포들이 증식을 허용하여, 이로써 기능적 알파/베타 TCR이 없을 때에 기능적 CD3 복합체를 회복시키도록, 조작되는 예(embodiment)들에 대한 것이다.

유전적으로 높게 활성으로 변형된 면역 세포들을 조작하기 위하여, 본 발명은 또한 면역 체크포인트들이 PD1 및 CTLA-4와 같은 유전자들의 발현의 부족에 의하여 차단된 방법들을 제공한다.

본 출원은 더욱 특히, 살아 있는 생물에 이러한 면역(immune) 세포들을 투여함으로써 암을 치료 또는 예방하기 위한, 약제에 사용되는 조작된 면역(immune) 세포들 특히 T 세포들을 공개한다.

본 발명의 자세한 설명

여기에 특별히 정의되지 않는다면, 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 유전자 요법, 생화학, 유전자공학 및 분자생물학의 영역의 당업자에 의하여 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

여기에 기재된 것들과 유사하거나 또는 동등한 모든 방법들 및 물질들은 여기에 기재된 적절한 방법들 및 물질들을 갖고, 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있다. 여기에 언급된 모든 출판물들, 특허 출원들, 특허들, 및 다른 참고문헌들은 그 전체가 참고문헌으로서 포함된다. 상충되는 경우, 정의들을 포함하는 본 명세서가 이길 것이다. 게다가, 물질들, 방법들, 및 실시예들은 분명히 보여주기 위한 것일 뿐이며, 다르게 특정하지 않는한, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

본 발명의 실시는, 다르게 표시하지 않는 한, 업계의 기술 내인 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자전달(transgenic) 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 종래 기술들을 이용할 것이다. 이러한 기술들은 본 문헌에서 완전히 설명된다. 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the series, Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), specifically, Vols.154 and 155 (Wu et al. eds.) and Vol. 185, "Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); and Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986) 참조.

멀티-체인 키메라 항원 수용체( CAR )

본 발명은, 특히 면역요법에서 이용되는 면역(immune) 세포들에 적합한, 멀티-체인 키메라 항원 수용체 (CAR)에 대한 것이다.

본 발명에 따른 멀티-체인 CAR는 보통 적어도 하기를 포함하여:

- 적어도 하나의 세포외 리간드-결합 도메인을 포함하는 하나의 막횡단 폴리펩타이드 및;

- 적어도 하나의 신호-전달(signal-transducing) 도메인을 포함하는 하나의 막횡단 폴리펩타이드;

상기 폴리펩타이드들은 서로 조립되어 멀티-체인 키메라 항원 수용체를 형성한다.

여기에서 사용된 "세포외(extracellular) 리간드-결합 도메인"은 리간드에 결합할 수 있는 올리고- 또는 폴리펩타이드로 정의된다. 바람직하게는, 도메인은 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 세포외 리간드-결합 도메인은 특정 질병 상태와 관련된 표적 세포들 상에서 세포 표면 마커(marker)로서 작용하는 리간드(ligand)를 인식하기 위하여 선택될 수 있다. 이런 식으로, 리간드들로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커들의 예들은 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염들, 자가면역 질환 및 암 세포들과 관련된 것들을 포함한다. 특히, 세포외 리간드-결합 도메인은 표적의 항원에 대한 항체로부터 유래한 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 제한되지 않는 예들로서, 표적의 항원들은 ErbB2 (HER2/neu), 암배아 항원 (CEA), 상피 세포 부착 분자 (EpCAM), 상피의 성장인자 수용체 (EGFR), EGFR 변형(variant) III (EGFRvIII), CD19, CD20, CD30, CD40, 디스일라오강글리오사이드(disialoganglioside) GD2, 관상(ductal)-상피의 뮤신(mucine), gp36, TAG-72, 글리코스핑고리피드들(glycosphingolipids), 신경교종(glioma)-관련 항원, β-인간 융모성(chorionic) 고나도트로핀(gonadotropin), 알파펙토프로틴(alphafetoprotein) (AFP), 렉틴(lectin)-반응성(reactive) AFP, 다이로글로불린(thyroglobulin), RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로메라제(telomerase) 역전사효소, RU1, RU2 (AS), 창자의 카르복실 에스테라제(carboxyl esterase), mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제(prostase), 프로스타제 특이적 항원 (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGA-1a, p53, 프로스타인(prostein), PSMA, 잔존한(surviving) 그리고 텔로메라제(telomerase), 전립선(prostate)-암종(carcinoma) 종양(tumor) 항원(antigen)-1 (PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구(neutrophil) 엘라스타제(elastase), 에프린(ephrin) B2, CD22, 인슐린(insulin) 성장인자 (IGF1)-I, IGF-II, IGFI 수용체, 메소텔린(mesothelin), 종양-특이적 펩타이드 에피토프(epitope)를 보이는 주요 조직 적합 유전자 복합체(major histocompatibility complex)(MHC) 분자, 5T4, ROR1, Nkp30, NKG2D, 종양 기질의(stromal) 항원들, 파이브로넥틴(fibronectin)의 여분(extra) 도메인 A (EDA) 및 여분(extra) 도메인 B (EDB) 및 테나신(tenascin)-C (TnC A1)의 A1 도메인 및 섬유아세포(fibroblast) 관련(associated) 단백질(protein) (fap); 하기와 같은 계통(lineage)-특이적 또는 조직 특이적 항원, CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD33, CD34, CD133, CD138, CTLA-4, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), 엔도글린(endoglin), 주요 조직 적합 유전자 복합체(major histocompatibility complex) (MHC) 분자, BCMA (CD269, TNFRSF 17), 또는 하기와 같은 바이러스-특이적 표면 항원 HIV-특이적 항원 (HIV gp120와 같은); EBV-특이적 항원, CMV-특이적 항원, HPV-특이적 항원, 라쎄(Lasse) 바이러스(Virus)-특이적 항원, 인플루엔자(Influenza) 바이러스-특이적 항원 아울러 이들 표면 마커들의 임의의 유도체 또는 변형과 같은 종양-관련 표면 항원일 수 있다.

세포외 리간드-결합 도메인은 또한 표적의 항원에 결합하는 펩타이드, 표적의 항원에 결합하는 항체에 결합하는 펩타이드 또는 단백질, 성장인자와 같은 펩타이드 또는 단백질 리간드, 표적 상의 수용체에 결합하는 제한되지 않는 예들로서의 사이토카인 또는 호르몬, 또는 성장인자 수용체와 같은 수용체로부터 유래한 도메인, 표적 상의 펩타이드 또는 단백질 리간드에 결합하는, 제한되지 않는 예들로서 사이토카인 수용체 또는 호르몬 수용체를 포함할 수 있다. 바람직하게는 표적은 세포 또는 바이러스이다.

바람직한 예에서, 상기 세포외 리간드-결합 도메인은 유연성있는(flexible) 링커에 의하여 연결된 표적 항원 특이적 단일클론 항체의 가벼운(VL) 그리고 무거운 (VH) 가변(variable) 단편(fragment)를 포함하는 단일 체인 항체 단편(single 체인 antibody fragment)(scFv)이다. 바람직한 예에서, 상기 scFv는 항(anti)-CD19 scFV이고, 바람직하게는 scFV-4G7이다 (Peipp et al., J Immunol Methods. 2004 Feb 15;285(2):265-80) (VH: 서열번호: 193 and VL: 서열번호: 194, scFV: 서열번호: 195).

scFv 외 다른 결합 도메인은 또한 제한되지 않은 예들로서, 낙타과(camelid) 단일-도메인 항체 단편들 또는 혈관(vascular) 내피의(endothelial) 성장인자 폴리펩타이드, 인테그린(integrin)-결합 펩타이드, 헤레굴린(heregulin) 또는 IL-13 돌연변이단백질(mutein)와 같은 수용체 리간드들, 항체 결합 도메인들, 항체 고변이(hypervariable) 루프들(loops) 또는 CDR들과 같은 림프구들의 미리 정의된 표적화(targeting)에 사용될 수 있다.

바람직한 예에서 상기 막횡단 폴리펩타이드는 상기 세포외 리간드-결합 도메인 및 상기 막횡단(transmembrane) 도메인 사이의 줄기(stalk) 영역을 더 포함한다. 여기에서 사용된 용어 "줄기(stalk) (region)"는 보통 막횡단(transmembrane) 도메인을 세포외 리간드-결합 도메인에 연결하는 작용을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 특히, 줄기(stalk) 영역은 세포외 리간드-결합 도메인를 위한 유연성(flexibility) 및 접근성(accessibility)을 제공하는데 사용된다. 줄기(stalk) 영역은 300 아미노산들을, 바람직하게는 10 내지 100 아미노산들을 그리고 가장 바람직하게는 25 내지 50 아미노산들을 포함할 수 있다. 줄기 영역은 CD8, CD4 또는 CD28의 세포외 영역의 모두 또는 부분으로부터, 또는 항체 불변 영역의 모두 또는 부분으로부터와 같은, 자연 발생하는 분자들의 모두 또는 부분으로부터 유래할 수 있다. 대체하여 줄기(stalk) 영역은 자연적으로 발생하는 줄기 서열에 대응하는 합성 서열일 수 있고 또는 완전히 합성인 줄기 서열일 수도 있다. 바람직한 예에서, 상기 줄기(stalk) 영역은 인간 CD8 알파 체인(chain)의 부분이다 (예를 들어 NP_001139345.1) (서열번호: 196). 그러므로 면역(immune) 세포들의 멀티-체인 CAR의 발현은, 각각의 종양-관련 표면 항원을 갖는 악성 세포들 또는 바이러스-특이적 표면 항원을 갖는 바이러스 감염된 세포들, 또는 계통(lineage)-특이적 또는 조직-특이적 표면 항원을 갖는 표적 세포들을 포함하나 이에 제한되지 않는, 선택적으로 그리고 정의된 표적들을 제거하는, 변형된 세포들을 야기한다.

표적 항원들의 돌연변이 또는 하향조절은 보통 항원-상실(antigen-loss) 도피(escape) 변형을 만들어내는 암 세포들에서 관찰된다. 그러므로, 종양 도피(escape)를 상쇄하고 면역 세포를 표적에 더욱 특이적으로 만들기 위하여, 멀티-체인 CAR는 몇몇의 세포외 리간드-결합 도메인들을 포함할 수 있어, 표적의 다른 성분들에 동시에 결합시키고 이로써 면역 세포 활성화 및 작용을 증가시킨다. 한 예에서, 세포외 리간드-결합 도메인들은 동일한 막횡단 폴리펩타이드 상에 나란히 위치할 수 있고, 선택적으로 링커에 의하여 분리될 수 있다. 한 예에서, 상기 다른 세포외 리간드-결합 도메인들은 멀티-체인 CAR을 포함하는(composing) 다른 막횡단 폴리펩타이드들 상에 위치할 수 있다. 한 예에서, 본 발명은 각각(each one) 다른 세포외 리간드 결합 도메인들을 포함하는 멀티-체인 CAR들의 군(population)에 대한 것이다. 특히, 본 발명은 면역(immune) 세포를 제공하는 단계 및 상기 세포의 표면에서 각각(each one) 다른 세포외 리간드 결합 도메인들을 포함하는 멀티-체인 CAR의 군을 발현시키는 단계를 포함하는 면역(immune) 세포들의 조작(engineering) 방법에 대한 것이다. 또다른 특정 예에서, 본 발명은 면역 세포를 제공하는 단계 및 상기 세포 내로 각각(each one) 다른 세포외 리간드 결합 도메일들을 포함하는 멀티-체인 CAR의 군을 포함하는(composing) 폴리펩타이드들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들을 도입하는 단계를 포함하는 면역 세포의 조작 방법에 대한 것이다. 특정 예에서, 면역 세포의 조작 방법은 세포 표면에서 적어도 신호-전달(signal-transducing) 도메인에 융합된(fused) FcεRI 베타 및/또는 감마 체인의 일부분 및 다른 세포외 리간드 결합 도메인들에 융합된 FcεRI 알파 체인들의 몇몇 부분을 발현시키는 단계를 포함한다. 더 특정한 예에서, 상기 방법은 상기 세포 내로 다른 세포외 리간드 결합 도메인들에 융합된 몇몇 FcεRI 알파 체인들 및 신호-전달(signal-transducing) 도메인에 융합된 FcεRI 베타 및/또는 감마 체인의 일부분을 코드하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함한다. 멀티-체인 CAR들 군(population)으로, 이것은 각각(each one) 다른 세포외 리간드 결합 도메인들을 포함하는, 적어도 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 그보다 많은 멀티-체인 CAR들을 의미한다. 본 발명에 따른 다른 세포외 리간드 결합 도메인들은 표적의 다른 성분들에 바람직하게는 동시에 결합하여, 면역 세포 활성화 및 기능을 증대시킬 수 있다.

본 발명은 또한 각각 다른 세포외 리간드 결합 도메인들을 포함하는 멀티-체인 CAR들의 군을 포함하는 분리된 면역 세포에 대한 것이다.

본 발명의 멀티-체인 CAR의 신호 전달(signal transducing) 도메인 또는 세포내 신호전달(signaling) 도메인은 면역 세포의 활성화 및 면역 반응을 야기하는, 세포외 리간드 결합 도메인의 표적에의 결합 후 세포내 신호전달(signaling)에 책임이 있다. 다시 말해서, 신호 전달(signal transducing) 도메인은 멀티-체인 CAR가 발현되는 면역 세포의 정상적인 반응기(effector) 기능들 중 적어도 하나의 활성화에 책임이 있다. 예를 들어, T 세포의 반응기(effector) 기능은 사이토카인들의 분비를 포함하는 헬퍼(helper) 활성 또는 세포용해(cytolytic) 활성일 수 있다. 그러므로, 용어 "신호 전달(signal tansducing) 도메인"은 반응기(effector) 신호 기능 신호를 전달하고(transduce), 세포를 전문화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 가리킨다.

멀티-체인 CAR에의 사용을 위한 신호 전달(signal transducing) 도메인의 바람직한 예들은 항원 수용체 참여(engagement) 후 신호 전달(signal transduction)을 시작하기 위하여 협력하여 작용하는 공-수용체들(co-receptors) 및 Fc 수용체 또는 T 세포 수용체의 세포질 서열들과 더불어 이들 서열들의 임의의 유도체 또는 변형 및 동일한 기능적 능력으로서 임의의 합성 서열일 수 있다. 신호 전달(signal transduction) 도메인은 세포질(cytoplasmic) 신호전달(signaling) 서열의 두 개의 별개의 종류들을 포함하는데, 이것들은 항원-의존적 1차(primary) 활성화를 시작하고, 그리고 이것들은 2차 또는 공-자극 신호를 제공하는 항원-비의존적 방식으로 작용한다. 1차(primary) 세포질 신호전달(signaling) 서열은 ITAM(ITAMs)들의 면역수용체(immunoreceptor) 티로신(tyrosine)-베이스의 활성화 모티프들(motifs)로 알려진 신호전달(signaling) 모티프들을 포함할 수 있다. ITAM들은, syk/zap70 종류(class) 티로신 키나제들을 위한 결합 부위들(sites)로서 작용하는 여러가지 수용체들의 세포질내(intracytoplasmic) 꼬리에서 발견되는, 잘 정의된 신호전달(signaling) 모티프들이다. 본 발명에서 이용되는 ITAM의 예들은 제한되지 않는 예들로서, TCRzeta, FcRgamma, FcRbeta, FcRepsilon, CD3gamma, CD3delta, CD3epsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함할 수 있다. 바람직한 예에서, 멀티-체인 CAR의 신호전달(signaling) 전달(transducing) 도메인은 CD3제타(zeta) 신호전달(signaling) 도메인, 또는 FcεRI 베타 또는 감마 체인들의 세포질내 도메인을 포함할 수 있다.

특정 예에서, 본 발명의 멀티-체인 CAR의 신호 전달(signal transduction) 도메인은 공-자극 신호 분자를 포함한다. 공-자극 분자는 효율적인 면역 반응에 요구되는 항원 수용체 또는 그것들의 리간드들이 아닌 세포 표면 분자이다. "공-자극(co-stimulatory) 리간드"는 T-세포 상 관련이 있는(cognate) 공-자극 분자에 특이적으로 결합하여, 이로써 예를 들어 펩타이드를 로딩하는(load) MHC 분자로 TCR/CD3 복합체에 결합함으로써, 제공되는 1차 신호에 더하여, 증식(proliferation) 활성화, 분화 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, T 세포 반응들을 매개하는 신호를 제공하는, 항원 제시 세포 상 분자를 가리킨다. 공-자극 리간드는 CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도할 수 있는(inducible) 공자극(costimulatory) 리간드(igand) (ICOS-L), 세포간(intercellular) 부착(adhesion) 분자 (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, 림포톡신(lymphotoxin) 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, 톨(Toll) 리간드 수용체에 결합하는 항체 또는 작용제(agonist) 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 공-자극 리간드는 또한 그 중에서도, CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능(function)-관련된 항원(antigen)-1 (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, CD83로 특이적으로 결합하는 리간드와 같은, 그러나 이에 재한되지 않는, T 세포 상에 존재하는 공-자극 분자로 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.

"공-자극(co-stimulatory) 분자"는 공-자극 리간드로 특이적으로 결합하여, 증식과 같으나 이에 제한되지 않는, 세포에 의한 공-자극 반응을 매개하는, T-세포 상 관련이 있는(cognate) 결합 파트너(partner)를 가리킨다. 공-자극 분자들은 MHC 클래스(class) I 분자, BTLA 및 톨(Toll) 리간드 수용체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 공자극 분자들의 예들은 CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능(function)-관련(associated) 항원(antigen)-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83으로 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다.

또다른 특정 예에서, 상기 신호 전달(signal transducing) 도메인은 TNFR-관련(associated) 인자(Factor) 2 (TRAF2) 결합 모티프들, 공자극 TNFR 멤버 패밀리의 세포질내 꼬리(tail)이다. 공자극 TNFR 패밀리 멤버의 세포질 꼬리는 주요(major) 보존된 모티프 (P/S/A)X(Q/E)E) 또는 작은(minor) 모티프 (PXQXXD)로, 이때 X는 임의의 아미노산인 것으로 구성되는, TRAF2 결합 모티프들을 포함한다. TRAF 단백질들은 수용체 삼합체화(trimerization)에 대한 반응으로 많은 TNFR들의 세포내 꼬리들로 모집된다(recruit).

바람직한 예에서, 본 발명의 멀티-체인 CAR의 신호 전달(signal transduction) 도메인은 4-1BB (GenBank: AAA53133.) 및 CD28 (NP_006130.1)로 구성되는 군으로부터 선택되는 공-자극 신호 분자의 일부분을 포함한다. 특히, 본 발명의 멀티-체인 CAR의 신호 전달(signal transduction) 도메인은 서열번호: 200 및 서열번호: 201로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.

적절한 막횡단 폴리펩타이드들의 구별되는 특징들은, 특히 림프구 세포들 또는 내추럴(Natural) 킬러(killer) (NK) 세포들인, 면역 세포의 표면에서 발현되고, 미리 정해진 표적 세포에 대항하여 면역 세포의 세포 반응을 지시하기 위하여 서로 상호작용하는 능력을 포함한다. 세포외 리간드-결합 도메인 및/또는 a 신호 전달(signal transducing) 도메인을 포함하는, 본 발명의 멀티-체인 CAR의 다른 막횡단 폴리펩타이드들은 표적 리간드와의 결합 후 신호 전달(signal transduction)에 참여하기 위하여 서로 상호작용하고 면역 반응을 유도한다. 막횡단(transmembrane) 도메인은 자연적으로 또는 합성 소스(source)로부터 유도될 수 있다. 막횡단(transmembrane) 도메인은 임의의 막-결합된 또는 막횡단(transmembrane) 단백질들로부터 유래될 수 있다. 제한되지 않는 예들로서, 막횡단 폴리펩타이드는 α, β, γ 또는 δ와 같은 T 세포 수용체의 서브유닛, CD3 복합체, IL2 수용체 p55 (α 체인), p75 (β 체인) 또는 γ 체인을 이루는 폴리펩타이드, Fc 수용체들, 특히 Fcγ 수용체 III 의 서브유닛 체인 또는 CD 단백질들일 수 있다. 대체하여, 막횡단(transmembrane) 도메인은 합성일 수 있고, 대부분 류신(leucine) 및 발린(valine)과 같은 소수성 잔기들을 포함할 수 있다. 바람직한 예에서, Fcε 수용체 체인들 또는 그것의 변형(variant)으로부터 유도된 막횡단 폴리펩타이드는, 특히 FcεRI α (서열번호: 202), β (서열번호: 203) 및/또는 γ 체인들 (서열번호: 204) 또는 그것의 변형(variant)의 일부분을 포함한다.

용어 "으로부터 유도되는"은 Fcε 수용체의 서열의 하나 또는 그보다 많은 아미노산 변형(modification)(들)을 포함하는 Fcε 수용체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 아미노산 변형(modification)(들)은 아미노산 치환(들), 결실(들), 첨가(들) 또는 이들 변형들 중 임의의 것의 조합을 포함할 수 있고, 그리고 Fc 수용체의 그것에 대한 Fc 결합 영역의 생물학적 활성을 바꿀 수 있다. 반면, 특정 Fc 수용체로부터 유래된 Fc 결합 영역들은 Fc 수용체에 대한 Fc 결합 영역의 생물학적 활성을 상당히 바꾸지 않는, 하나 또는 그보다 많은 아미노산 변형(들)을 포함할 수 있다. 이 종류의 아미노산 변형(들)은 보통 보존적 아미노산 치환(들)을 포함할 것이다.

특정 예에서, 멀티-체인 CAR는 FcεRI 체인으로부터 유래되는 막횡단 폴리펩타이드를 포함한다. 더 특정한 예에서, FcεRI 체인은 세포외 도메인이 세포외 리간드-결합 도메인에 의하여, 바람직하게는 scFV, 더욱 바람직하게는 scFv-4G7 (서열번호: 195)에 의하여 대체된, FcεRI α 체인이다.

더 특정한 예에서, 상기 멀티-체인 CAR는 FcεRI 알파 체인의 일부분 및 FcεRI 베타 체인의 일부분 또는 그것의 변형(variant)을 포함할 수 있어, 상기 FcεRI 체인들이 자발적으로 서로 이합체화되어(dimerize) 이합체인(dimeric) 키메라 항원 수용체를 형성한다. 또다른 예에서, 멀티-체인 키메라 항원은 FcεRI 알파 체인의 일부분 및 FcεRI 감마 체인의 일부분 또는 그것의 변형(variant)을 포함할 수 있어, 상기 FcεRI 체인들이 자발적으로 서로 삼합체화하여 삼합체인 키레마 항원 수용체를 형성하고, 또다른 예에서, 멀티-체인 키메라 항원 수용체는 FcεRI 알파 체인의 일부분, FcεRI 베타 체인의 일부분 및 FcεRI 감마 체인의 일부분 또는 그것들의 변형을 포함할 수 있어, 상기 FcεRI 체인들 자발적으로 서로 사합체화하여 사합체인 키레마 항원 수용체를 형성한다.

다시 말해서, 하기 성분들 중 적어도 둘을 포함하는 멀티-체인 CAR:

a) FcεRI 알파 체인의 일부분 및 세포외 리간드-결합 도메인을 포함하는 하나의 폴리펩타이드,

b) FcεRI 베타 체인의 일부분을 포함하는 하나의 폴리펩타이드 및/또는

c) FcεRI 감마 체인의 일부분을 포함하고, 이로써 다른 폴리펩타이드들이 서로 자발적으로 다합체화하여(multimerize), 이합체, 삼합체 또는 사합체인 CAR을 형성하는 하나의 폴리펩타이드.

바람직한 예에서, 본 발명의 멀티-체인 CAR는 서열번호: 202 내지 서열번호: 204로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드의 일부분을 포함한다.

여기에서 사용된 용어 "의 일부분"은 더 짧은 펩타이드인 분자의 임의의 부분집단(subset)을 가리킨다. 대체하여, 폴리펩타이드의 아미노산 서열 기능적 변형들(variants)은 폴리펩타이드를 코드하는 DNA의 돌연변이에 의하여 제조될 수 있다. 이러한 변형들 또는 기능적 변형들은 예를 들어, 아미노산 서열 내 잔기들의 치환들 또는 삽입(insertions)들 또는 이로부터의 결실들을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 또한, 특히 특이적 항-표적 세포 면역 활성을 보여주는, 최종 구조체가 바랐던 활성을 갖고 있다면, 최종 구조체(construct)에 도달하도록 만들어질 수 있다. 숙주 세포 내 본 발명의 멀티-체인 CAR의 기능성은 특정 표적의 결합에의 상기 멀티-체인 CAR의 신호전달(signaling) 잠재성을 입증하기에 적합한 분석에서 탐지될 수 있다. 이러한 분석들은 당업자에게 이용가능하다. 예를 들어, 이 분석은 세포내 티로신 인산화, 이노시톨(inositol) 포스페이트(phosphate) 전환(turnover), 또는 이와 같이 영향을 받는 인터루킨(IL) 2, 인터페론 γ, GM-CSF, IL-3, IL-4 생산, 칼슘 이온 방출의 증가의 측정을 포함하는 분석과 같은, 표적의 결합으로 촉발되는 신호전달(signaling) 경로의 탐지를 허용한다.

제한되지 않는 예로서, 멀티-체인 CAR의 다른 버젼들은 도 4에 나타나 있다.더욱 선호되는 예에서, 본 발명의 멀티-체인 CAR는 서열번호: 206 내지 서열번호: 213로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 선호되는 예에서, 멀티-체인 CAR는 서열번호: 206 내지 서열번호: 213로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과, 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %, 95 % 97 % 또는 99 % 서열 일치성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.

폴리뉴클레오타이드들 , 벡터들:

본 발명은 또한 본 발명에 따른 앞서 설명한 멀티-체인 CAR를 코드하는 벡터들, 폴리뉴클레오타이드들에 대한 것이다. 본 발명은 멀티-체인 CAR에 포함될 수 있는, 여기에 기재된 막횡단 폴리펩타이드들을 코드(encode)하는 DNA 및 RNA 분자들을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드들을 제공한다. 특히, 본 발명은 앞서 설명한 멀티-체인 CAR를 포함하는(composing) 적어도 하나의 막횡단 폴리펩타이드을 코드하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 대한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 앞서 설명한 멀티-체인 CAR를 포함하는(composing) 막횡단 폴리펩타이드들을 코드하는 둘 또는 그보다 많은 핵산 서열들을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 대한 것이다. 선호되는 예에서, 본 발명은 서열번호: 214 내지 서열번호: 223:로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드에 대한 것이다. 선호되는 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 214 내지 서열번호: 223으로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %, 95 % 97 % 또는 99 % 서열 일치성(identity)을 갖는다.

폴리뉴클레오타이드는 (예를 들어 박테리아 숙주 세포로 도입(introduction)을 위한 플라스미드, 또는 곤충(insect) 숙주 세포의 형질주입(transfection)을 위한 바쿨로바이러스(baculovirus) 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 포유동물 숙주 세포의 형질주입(transfection)을 위한 렌티바이러스(lentivirus)와 같은 바이러스 벡터 또는 플라스미드) 발현 벡터 또는 발현 카세트(cassette)로 구성될 수 있다.

특정 예에서, 다른 핵산 서열들은 2A 펩타이드를 코드하는 서열과 같은 라이보좀의(ribosomal) 스킵(skip) 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함하는 하나의 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드에 포함될 수 있다. 피코르나바이러스들(picornaviruses)의 압토바이러스(Aphthovirus) 하위집단(subgroup)에서 확인되었던, 2A 펩타이드들은 코돈(codon)들에 의하여 코드되는 2개의 아미노산들 사이의 펩타이드 결합의 형성 없이 하나의 코돈으로부터 옆으로 라이보좀의(ribosomal) "스킵(skip)"을 야기한다(Donnelly et al., J. of General Virology 82: 1013-1025 (2001); Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227-4239 (2008); Atkins et al., RNA 13: 803-810 (2007) 참조). "코돈"에 의하여, 라이보좀에 의하여 하나의 아미노산 잔기로 번역되는 mRNA (또는 DNA 분자의 센스(sense) 가닥 상의) 상의 3개의 뉴클레오타이드들을 의미한다. 그러므로, 2 개의 폴리펩타이드들이 폴리펩타이드들이 프레임 내인(in frame) 2A 올리고펩타이드 서열에 의하여 분리될 때, mRNA 내 단일, 연속된 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로부터 합성될 수 있다. 이러한 라이보좀 스킵(ribosomal skip) 메커니즘은 당업계에 잘 알려져 있으며, 단일 메신저(messenger) RNA에 의하여 코드되는 몇몇 단백질들의 발현을 위ㅎ나 몇몇 벡터들에 의하여 사용되는 것으로 알려져 있다. 제한되지 않는 예로서, 본 발명에서는 2A 펩타이드들이 멀티-체인 CAR의 다른 폴리펩타이드들을 세포 내로 발현시키는데 이용되어 왔다. 더욱 선호되는 예에서, 본 발명은 서열번호: 224 내지 서열번호: 232 : 로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드들에 대한 것이다.

숙주 세포의 분비 경로로 FcεR 와 같은 막횡단 폴리펩타이드를 지시하기 위하여, 분비 신호 서열(리더(leader) 서열, 프리프로(prepro) 서열 또는 프리(pre) 서열로도 알려져 있음)가 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 벡터 서열에 제공된다. 분비 신호 서열은 FcεR의 것일 수 있고, 다른 분비된 단백질들 (예컨대, t-PA)로부터 유래하거나 또는 처음부터(de novo) 합성될 수 있다. 분비 신호 서열은 막횡단(transmembrane) 핵산 서열에 사용 가능하게 연결되는데, 즉, the two 서열들은 올바른(correct) 리딩 프레임으로 연결되고(join) ?고 숙주 세포의 분비 경로 내로 새롭게 합성된 폴리펩타이드를 지시할 수 있게 위치된다. 비록 특정 분비 신호 서열들 이 관심있는 핵산 서열의 다른 곳에 위치할 수 있을지라도, 분비 신호 서열들은 보통 관심있는 폴리펩타이드를 코드하는 핵산 서열에 대하여 5'에 위치한다(예컨대, Welch et al., U.S. Patent No. 5,037,743; Holland et al., U.S. Patent No. 5,143,830 참조). 선호되는 예에서, 신호 펩타이드는 FcεRI 알파 체인 (NP_001992.1)의 1 내지 25의 잔기들을 포함하고, 아미노산 서열 서열번호: 205를 갖는다.

당업자는 유전자 코드의 축퇴(degeneracy)의 관점에서, 이들 폴리뉴클레오타이드 분자들 내에 상당한 서열 변이가 가능하다는 것을 인식할 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산 서열들은 포유류 세포들내 발현을 위하여, 인간 세포들 내 발현을 위하여, 코돈-최적화되어 있다. 코돈-최적화는, 교환되는 코돈들로서 아미노산들을 코드하는 이러한 코돈들, 이러한 종들의 고발현된 유전자들에서 보통 빈번한 코돈들에 의한 정해진 종들의 고발현된 유전자들에서 보통 희귀한 코돈들의 관심있는 서열 내 교환(exchange)을 가리킨다.

선호되는 예에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 214 내지 서열번호: 223 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명은 서열번호: 214 내지 서열번호: 222로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %, 95 % 97 % 또는 99 % 서열 일치성(identity)을 갖는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드들에 대한 것이다.

면역 세포를 조작하는 방법들:

포함되는 특정 예에서, 본 발명은 상기 멀티-체인 CAR를 포함하는(composing) 폴리펩타이드들을 상기 면역(immune) 세포들 내로 도입하는 단계 및 상기 세포들을 확장하는(expanding) 단계를 포함하는, 면역요법을 위한 면역(immune) 세포들을 제조하는 방법에 대한 것이다. 특정 예에서, 본 발명은 세포를 제공하는 단계 및 전술한 바와 같은 적어도 하나의 멀티-체인 CAR를 상기 세포의 표면에서 발현시키는 단계를 포함하는 면역 세포를 조작하는 방법에 대한 것이다. 특정 예에서, 그 방법은 세포를 전술한 적어도 하나의 멀티-체인 CAR를 포함하는(composing) 폴리펩타이드들을 코드하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드로 형질전환하는(transforming) 단계, 및 상기 세포 내로 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 단계를 포함한다.

또다른 예에서, 본 발명은 상기 멀티-체인 CAR를 포함하는(composing) 다른 폴리펩타이드들을 상기 세포들 내로 도입하는 단계 및 상기 세포들을 확장하는(expand) 단계를 포함하는, 면역요법을 위한 세포들의 제조 방법에 대한 것이다. 선호되는 예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드들은 세포들에서 안정적으로 발현되는 관점에서 렌티바이러스(lentiviral) 벡터들에 포함된다.

또다른 예에서, 상기 방법은 TCR의 한 성분을 발현하는 적어도 하나의 유전자, 면역억제제에 대한 표적, HLA 유전자 및/또는 PDCD1 또는 CTLA-4와 같은 면역 체크포인트 유전자를 불활성화시킴으로써, 상기 세포를 유전적으로 변형하는 단계를 더 포함한다. 선호되는 예에서, 상기 유전자는 TCR알파(alpha), TCR베타(beta), CD52, GR, PD1 및 CTLA-4로 구성되는 군으로부터 선택된다. 선호되는 예에서, 상기 방법은 상기 유전자들의 DNA 절단에 의하여 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 상기 T 세포들 내로 도입하는 단계를 더 포함한다. 더 선호되는 예에서, 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제(nuclease)이다. 본 발명에 따른 선호되는 TALE-뉴클레아제들은 서열번호: 1 내지 6 (GR), 서열번호: 37, 57 내지 60 (TCR알파(alpha)), 서열번호: 38 또는 39 (TCR베타(beta)), 및 서열번호: 40, 서열번호: 61 내지 서열번호: 65 (CD52), 서열번호: 74 내지 서열번호: 78 (PD1 및 CTLA-4) : 로 구성되는 군으로부터 선택되는 표적 서열을 인식하고 절단하는 것들이다.

유전자를 불활성화시킴으로써, 관심있는 유전자가 기능적 단백질 형태로 발현되지 않는다는 것이 의도된다. 특정 예에서, 본 방법의 유전적 변형은 하나의 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제의, 조작할 제공된 세포들 내에서의, 발현에 의존하여, 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제가 하나의 표적된 유전자에서 절단을 특이적으로 촉매화하고, 이로써 상기 표적된 유전자를 불활성화시킨다. 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제에 의하여 야기되는 핵산 가닥 깨어짐들(breaks)은 보통 상동 재조합(homologous recombination) 또는 비상동 말단 결합(non-homologous end joining) (NHEJ)을 통하여 수선(repair)된다. 그러나, NHEJ는 절단 부위에서 DNA 서열에 변화를 자주 야기하는 불완전한 수선 공정이다. 메커니즘들은 직접적인 재-연결(re-ligation)(Critchlow and Jackson 1998) 또는 소위 미세상동성-매개된 말단 연결(microhomology-매개된 end joining) (Ma, Kim et al. 2003)을 통한 두 개의 DNA 말단들의 남아 있는 것들의 재연결(rejoining)을 포함한다. 비상동 말단 결합 (NHEJ)을 통한 수선은 가끔 작은 삽입들 또는 결실들을 야기하고, 특정 유전자 넉아웃들(knockouts)의 창출에 이용될 수 있다. 상기 변형은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 치환, 결실, 또는 첨가일 수 있다. 절단-유도된 돌연변이 유발 이벤트(event), 즉 NHEJ 이벤트에 연이은 돌연변이 유발 이벤트가 발생한 세포들은 당업계에 잘 알려진 방법에 의하여 확인되고 그리고/또는 선택될 수 있다.

또다른 예에서, 추가적인 촉매적 도메인은 세포 내로 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제가 더 도입되어, 본 명세서에 기재된 표적된 유전자들을 불활성화시키는 그것들의 능력을 증강시키기 위하여 돌연변이 유발을 증가시킬 수 있다. 특히, 상기 추가적인 촉매적 도메인은 DNA 말단 가공(processing) 효소이다. DNA 말단-가공 효소들의 제한되지 않는 예들은, 5-3' 엑소뉴클레아제들(exonucleases), 3-5’ 엑소뉴클레아제들, 5-3' 알칼라인(alkaline) 엑소뉴클레아제들, 5' 플랩(flap) 엔도뉴클레아제들(endonucleases), 헬리카제들(helicases), 호스파타제(hosphatase), 하이드롤라제들(hydrolases) 및 주형-비의존적 DNA 폴리머라제들(polymerases)를 포함한다. 이러한 촉매적 도메인의 제한되지 않는 예들은 hExoI (EXO1_HUMAN), 효모 ExoI (EXO1_YEAST), 대장균 ExoI, Human TREX2, 마우스 TREX1, 인간 TREX1, 소(Bovine) TREX1, 래트 TREX1, TdT (말단(terminal) 디옥시뉴클레오티딜(deoxynucleotidyl) 트랜스페라제(transferase) 인간 DNA2, 효모 DNA2 (DNA2_YEAST)로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질 도메인의 촉매적으로 활성인 유도체 또는 단백질 도메인을 포함한다. 선호되는 예에서, 상기 추가적인 촉매적 도메인은 3'-5'-엑소뉴클레아제 활성을 갖고, 더 선호되는 예에서, 상기 추가적인 촉매적 도메인은 TREX이고, 더욱 바람직하게는 TREX2 촉매적 도메인이다 (WO2012/058458). 또다른 선호되는 예에서, 상기 촉매적 도메인은 단일 체인 TREX 폴리펩타이드에 의하여 코드된다. 상기 추가적인 촉매적 도메인은 펩타이드 링커에 의하여 선택적으로 본 발명에 따른 키메라 단백질 또는 뉴클레아제(nuclease) 융합(fusion) 단백질에 융합될 수 있다.

에도뉴클레오리틱(Endonucleolytic) 깨어짐(breaks)들은 상동 재조합의 비율(rate)을 자극하는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 또다른 예에서, 본 발명의 유전적 변형 단계는 세포들 내로 적어도 표적 핵산 서열의 부분(portion)에 상동인 서열을 포함하는 외인성(exogeneous) 핵산을 도입하여, 상동 재조합이 표적 핵산 서열 및 외인성 핵산 사이에서 발생하는 단계를 더 포함한다. 특정 예들에서, 상기 외인성 핵산은 각각 표적 핵산 서열의 영역 5' 및 3'에 상동(homologous)인 첫 번째 및 두 번째 부분들을 포함한다. 이들 예들에서 상기 외인성 핵산은 또한 표적 핵산 서열 영역들 5' 및 3'과 상동성이 없는 첫 번째 및 두 번째 부분 사이에 위치한 세 번째 부분(portion)을 포함한다. 표적 핵산 서열의 절단 후, 상동 재조합 이벤트는 표적 핵산 서열 및 외인성 핵산 사이에서 자극된다. 바람직하게는 적어도 50 bp, 바람직하게는 100 bp보다 많은, 그리고 더욱 바람직하게는 200 bp보다 많은 상동인 서열들이 상기 도너 매트릭스(matrix) 내에 사용된다. 그러므로, 외인성 핵산은 바람직하게는 200 bp 부터 6000 bp 까지, 더욱 바람직하게는 1000 bp 부터 2000 bp 까지이다. 정말로, 공유된(shared) 핵산 상동성들이 깨어짐(break) 위치 업스트림(upstream) 및 다운스트림(downstream) 측면의 영역들에 위치되며, 도입될 핵산 서열은 두 팔들(arms) 사이에 위치되어야 한다.

특히, 상기 외인성 핵산은 잇따라서 상기 절단의 업스트림 서열들에 대한 상동성의 첫 번째 영역, 절단의 다운스트림 서열들에 대한 상동성의 두 번째 영역 및 TCR 알파, TCR 베타, CD52, GR, 면역 체크포인트 유전자들로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 표적된 유전자를 불활성화시키기 위한 서열을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드 도입(introduction) 단계는 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제의 도입 또는 발현과 동시, 그 전 또는 이후일 수 있다. 깨어짐 이벤트가 발생하는 표적 핵산 서열의 위치에 의존하여, 이러한 외인성 핵산은, 예컨대 외인성 핵산이 상기 유전자의 오픈 리딩 프레임 내에 위치할 때, 유전자를 넉-아웃(knock-out)하는데 또는 관심있는 새로운 서열들 또는 유전자들을 도입하는데 사용될 수 있다. 이러한 외인성 핵산을 이용함으로써 서열 삽입들은 상기 유전자의 대체 또는 수정(correction)에 의하여(제한되지 않는 예로서, 대립 유전자(allele) 맞바꾸기(swap)) 표적인 존재하는 유전자를 변형시키는데, 또는 표적인 유전자의 발현을 상향 또는 하향-조절하는데(제한되지 않는 예로서 프로모터 맞바꾸기), 상기 표적인 유전자 수정 또는 대체,로 이용될 수 있다. 선호되는 예에서, TCR 알파, TCR 베타, CD52, GR, 면역 체크포인트 유전자들로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자들의 불활성화는 특정 TALE-뉴클레아제에 의하여 표적이된 정확한 유전적 위치에서 일어날 수 있고, 이때, 상기 특정 TALE-뉴클레아제는 절단을 촉매화하고, 이때 상기 외인성 핵산은 상동 재조합에 의하여 통합되는 TCR 알파, TCR 베타, CD52, GR, 면역 체크포인트 유전자들로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 표적인 유전자를 불활성화시키기 위하여, 적어도 상동성 영역 및 서열을 잇따라서 포함한다. 또다른 예에서, 몇몇 유전자들은, 잇따라서 또는 동시에, 각각 몇몇 TALE-뉴클레아제들을 이용하여, 그리고 특정 유전자 불활성화를 위하여 하나의 정의된 유전자 및 몇몇 특정 폴리뉴클레오타이드들을 특이적으로 표적화하여 불활성화될 수 있다.

추가적인 유전적 변형 단계에 의하여, TCR 알파, TCR 베타, CD52, GR, 면역 체크포인트 유전자들로 구성되는 군으로부터 선택되는 또다른 유전자의 불활성화가 또한 의도될 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 추가적인 유전적 변형 단계는 하기를 포함하는 불활성화 단계일 수 있다:

(a) 상기 세포들 내로 적어도 하나의 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제를 도입하여, 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제가 상기 세포의 게놈의 하나의 표적인 서열에서의 절단을 특이적으로 촉매화하는 단계.

(b) 상기 세포들 내로 상기 절단의 업스트림 서열들에 상동성인 첫 번째 영역, 상기 세포의 게놈 내로 삽입되는 서열 및 상기 절단의 다운스트림 서열들에 상동성인 두 번째 영역을 연속적으로 포함하는 외인성 핵산을 선택적으로 도입하는 단계.

이때, 상기 도입되는 외인성 핵산은 유전자를 불활성화시키고, 적어도 하나의 관심있는 재조합 단백질을 코드하는 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 통합시킨다. 또다른 예에서, 상기 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열은 TCR 알파, TCR 베타, CD52, GR, 면역 체크포인트 유전자들로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자 내로 통합된다.

- 면역억제제 T 세포들:

특정 관점에서, 세포들을 유전적으로 변형시키는 단계들 중 하나는 하기를 포함하는 방법일 수 있다:

(a) 면역억제를 위한 표적을 발현하는 적어도 하나의 유전자를 불활성화시킴으로써 T-세포들를 변형시키는 단계,및

(b) 상기 면역억제제의 존재 하 선택적으로 상기 세포들을 확장(expand)시키는 단계.

면역억제제는 작용의 몇몇 메커니즘들 중 하나에 의하여 면역 기능을 억제하는 제제이다. 다시 말해서, 면역억제제는 면역 반응의 정도 및/또는 탐욕(voracity)을 약화시키는 능력에 의하여 보여지는 화합물에 의하여 역할이 되는 기능이다. 제한되지 않는 예로서, 면역억제제는 칼시뉴린(calcineurin) 억제제, 라파마이신(rapamycin)의 표적, 인터루킨-2 α-체인 차단제, 이노신(inosine) 모노파스페이트(monophosphate) 디하이드로게나제의 억제제, 디하이드로엽산(dihydrofolic acid) 리덕타제(reductase)의 억제제, 코르티코스테로이드(corticosteroid) 또는 면역억제적 대사길항물질(antimetabolite)일 수 있다. 전통적인 세포독성의 면역억제제들은 DNA 합성을 억제함으로써 작용한다. 다른 것들은 T-세포들의 활성화를 통하여 또는 헬퍼 세포들의 활성화를 억제함으로써 작용할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 T 세포들에서 면역억제제의 표적을 불활성화함으로써 면역요법을 위한 T 세포들에 면역억제제 저항성(resistance)을 부여하는 것을 허용한다. 제한되지 않는 예들로서, 면역억제제에 대한 표적들은 CD52, 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 수용체 (GR), FKBP 패밀리 유전자 멤버 및 사이클로필린(cyclophilin) 패밀리 유전자 멤버: 와 같은 면역억제제를 위한 수용체일 수 있다.

유전자를 불활성화시킴으로써, 그것은 관심있는 유전자가 기능적인 단백질 형태로 발현되지 않는 것으로 의도된다. 특정 예에서, 본 방법의 유전적 변형은 조작하기 위하여, 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제가 특이적으로 하나의 표적인 유전자에서 절단을 촉매화하고, 이로써 상기 표적인 유전자를 불활성화시키는, 하나의 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제의, 제공된 세포들에서의 발현에 의존한다. 특정 예에서, 세포들을 조작하기 위한 상기 방법은 하기 단계들 중 적어도 하나를 포함한다:

(a) 바람직하게는 세포 배양(culture)으로부터 또는 혈액 샘플로부터의 T-세포를 제공하는 단계;

(b) 면역억제제를 위한 표적을 발현시키는 상기 T-세포에서 유전자를 선택하는 단계;

(c) DNA 절단에 의하여, 바람직하게는 상기 면역억제제를 위한 표적을 코드하는 상기 유전자를 이중-가닥 깨뜨림(break)에 의하여, 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제를 상기 T-세포에 도입시키는 단계, 및

(d) 상기 면역억제제의 존재 하 선택적으로 상기 세포들을 확장시키는 단계.

더 선호되는 예에서, 상기 방법은 하기를 포함한다.

(a) 바람직하게는 세포 배양물(culture)로부터 또는 혈액 샘플로부터의 T-세포를 제공하는 단계;

(c) DNA 절단에 의하여, 바람직하게는 상기 면역억제제를 위한 표적을 코드하는 상기 유전자를 이중-가닥 깨어짐(break)에 의하여 선택적으로 불활성화시킬 수 있는, 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제를 코드하는 핵산으로 상기 T 세포를 형질전환(Transform)시키는 단계, 및

(d) 상기 T-세포들 내로 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제들을 발현시키는 단계;

(e) 상기 면역억제제의 존재 하 선택적으로 상기 세포들을 확장시키는 단계.

특정 예에서, 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제는 CD52, GR로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 유전자를 표적으로 한다. 또다른 예에서, 면역억제 치료에 특이적인 단계 (b)의 상기 유전자는 CD52이고, 단계 (d) 또는 (e)의 면역억제 치료는 CD52 항원을 표적으로 하는 인간화된 항체를 포함한다.

또다른 예에서, 면역억제 치료에 특이적인 단계 (b)의 상기 유전자는 글루코코르티코이드 수용체 (GR)이고 단계 d) 또는 (e)의 면역억제 치료는 덱사메타손(dexamethasone)과 같은 코르티코스테로이드(corticosteroid)를 포함한다.

또다른 예에서, 면역억제 치료에 특이적인 단계 (b)의 상기 표적 유전자는 FKBP 패밀리 유전자 멤버 또는 그것의 변형(variant)이고, 단계 (d) 또는 (e)의 면역억제 치료는 탈크롤리무스(Tacrolimus) 또는 푸지마신(fujimycin)으로도 알려진 FK506를 포함한다. 또다른 예에서, 상기 FKBP 패밀리 유전자 멤버는 FKBP12 또는 그것의 변형(variant)이다.

또다른 예에서, 면역억제 치료에 특이적인 단계 (b)의 상기 유전자는 사이클로필린(cyclophilin) 패밀리 유전자 멤버 또는 그것의 변형(variant)이고 단계 (d) 또는 (e)의 면역억제 치료는 사이클로스포린(cyclosporine)을 포함한다.

또다른 예에서, 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제(meganuclease), 징크(Zinc) 핑거(finger) 뉴클레아제 또는 TALE-뉴클레아제일 수 있다. 선호되는 예에서, 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다. 본 발명에 따른 선호되는 TALE-뉴클레아제들은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 표적 서열을 인식하고 절단하는 것들이다:

- 서열번호: 1 내지 6 (GR), 및

- 서열번호: 40, 61 내지 65 (CD52)

상기 TALE-뉴클레아제들은 바람직하게는 각각의(respective) 표적 서열들 서열번호: 1 내지 6 및 서열번호: 40 을 절단하기 위하여, 서열번호: 7 로부터 서열번호: 18까지 그리고 서열번호: 47 내지 서열번호: 48 로부터 선택되는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.

- 면역요법을 위한 고 활성( highly active )인 T 세포들

특정 관점에서, 세포를 유전적으로 변형시키는 하나의 특정 단계는 하기 방법을 포함할 수 있다:

(a) 적어도 하나의 면역 체크포인트 유전자를 불활성화시킴으로써 T-세포들을 변형시키는 단계;및

(b) 상기 세포들을 확장시키는 단계.

T 세포-매개된 면역력(immunity)은 항원 특이적 세포들의 클론적(clonal) 선택, 그것들의 활성화 및 2차(secondary) 림프 조직에서의 증식, 항원의 위치로의 그것들의 거래(trafficking) 및 염증, 직접적인 반응기(effector) 기능의 수행(execution) 및 반응기(effector) 면역 세포들의 다수(multitude)를 위한 (사이토카인들 및 막 리간드들을 통한) 도움의 제공을 포함하는 복수 개의 순차적인 단계들을 포함한다. 이들 단계들 각각은 반응을 미세조절하는 자극적 및 억제적 신호를 균형시킴으로써 조절된다. 용어 "면역(immune) 체크포인트들(checkpoints)"이 T 세포에 의하여 발현되는 한 무리의 분자들을 의미한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 이들 분자들은 면역 반응을 하향-조절하거나 또는 억제하기 위하여 "브레이크들(brakes)"로서 효과적으로 작용한다. 면역 체크포인트 분자들은 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 예정사(Programmed Death) 1 (PD-1, PDCD1 또는 CD279로도 알려짐, accession number: NM_005018), 세포독성(Cytotoxic) T-림프구(Lymphocyte) 항원(Antigen) 4 (CTLA-4, CD152로도 알려짐, GenBank accession number AF414120.1), LAG3 (CD223로도 알려짐, accession number: NM_002286.5), Tim3 (HAVCR2로도 알려짐, GenBank accession number: JX049979.1), BTLA (CD272로도 알려짐, accession number: NM_181780.3), BY55 (CD160로도 알려짐, GenBank accession number: CR541888.1), TIGIT (VSTM3로도 알려짐, accession number: NM_173799), B7H5 (C10orf54로도 알려짐, 마우스 비스타(vista) 유전자의 상동체(homolog), accession number: NM_022153.1), LAIR1 (CD305로도 알려짐, GenBank accession number: CR542051.1), SIGLEC10 (GeneBank accession number: AY358337.1), 2B4 (CD244로도 알려짐, accession number: NM_001166664.1)로, 이는 면역 세포들을 직접적으로 억제한다. 예를 들어, CTLA-4는 특정 CD4 및 CD8 T 세포들 상에 발현되는 세포-표면 단백질이다: 항원 제시 세포들 상 그것의 리간드들 (B7-1 및 B7-2)에 의하여 관여될 때(engage), T-세포 활성화 및 반응기(effector) 기능이 억제된다. 이런 식으로, 본 발명은 특히 면역요법을 위한, 특히 PD1 및/또는 CTLA-4인, 면역 체크-포인트에서 수반되는 적어도 하나의 단백질을 불활성화시킴으로써, T-세포들을 유전적으로 변형시키는 단계를 포함하는, T-세포의 조작 방법에 대한 것이다.

특정 예에서, 세포들을 조작하는 상기 방법은 하기 단계들 중 적어도 하나를 포함한다:

(a) 바람직하게는 세포 배양물로부터 또는 혈액 샘플로부터 T-세포를 제공하는 단계;

(b) DNA 절단에 의하여, 바람직하게는 면역 체크포인트 단백질을 코드하는 하나의 유전자를 이중-가닥 깨뜨림(break)에 의하여 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제를 상기 T-세포 내로 도입하는 단계,

(c) 상기 세포들을 확장시키는 단계.

더 바람직한 예에서, 상기 방법은 하기를 포함한다:

(a) 바람직하게는 세포 배양물(culture)로부터 또는 혈액 샘플로부터 T-세포를 제공하는 단계;

(b) 상기 T 세포를 DNA 절단에 의하여, 바람직하게는 면역 체크포인트 단백질를 코드하는 유전자를 이중-가닥 깨뜨림(break)에 의하여 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제를 코드하는 핵산으로 형질전환(transforming)시키는 단계;

(c) 상기 T-세포들 내로 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제들을 발현시키는 단계;

(d) 상기 세포들을 확장시키는 단계.

특정 예에서, 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 유전자를 특이적으로 표적으로 한다: PD1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, TCR 알파 및 TCR 베타. 또다른 예에서, 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제, 징크(Zinc) 핑거 뉴클레아제 또는 TALE-뉴클레아제일 수 있다. 선호되는 예에서, 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다. TALE-뉴클레아제에 의하여 전사(Transcription) 활성제(Activator) 유사(Like) 반응기(Effector) (TALE)로부터 유도되는 DNA-결합 도메인 및 핵산 표적 서열을 절단하기 위한 하나의 뉴클레아제 촉매적 도메인으로 구성되는 융합(fusion) 단백질이 의도된다(Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Cermak, Doyle et al. 2011; Geissler, Scholze et al. 2011; Huang, Xiao et al. 2011; Li, Huang et al. 2011; Mahfouz, Li et al. 2011; Miller, Tan et al. 2011; Morbitzer, Romer et al. 2011; Mussolino, Morbitzer et al. 2011; Sander, Cade et al. 2011; Tesson, Usal et al. 2011; Weber, Gruetzner et al. 2011; Zhang, Cong et al. 2011; Deng, Yan et al. 2012; Li, Piatek et al. 2012; Mahfouz, Li et al. 2012; Mak, Bradley et al. 2012).

본 발명에서, 새로운 TALE-뉴클레아제들은 취해진(adoptive) 면역요법 전략들을 위한 관련 유전자들을 정확하게 표적화하기 위하여 설계되었다. 본 발명에 따라 선호되는 TALE-뉴클레아제들은 서열번호: 77 및 서열번호: 78 (PD1), 서열번호: 74 내지 서열번호: 76 (CTLA-4):으로 구성되는 군으로부터 선택되는 표적 서열을 인식하고 절단하는 것들이다. 본 발명은 또한 서열번호: 79 내지 서열번호: 88 로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 TALE-뉴클레아제 폴리펩타이드들에 대한 것이다.

본 발명은 또한 서열번호: 79 내지 서열번호: 88 로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %, 95 % 97 % 또는 99 % 서열 일치성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드들에 대한 것이다. 본 발명의 범위에는, 본 발명에 따른, 앞서 설명한 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들, 벡터들 또한 포함된다. 이 방법은 본 명세서에 기재된 다른 방법들 중 임의의 하나와 관련될 수 있다.

- 비 동종반응성 T 세포들:

또다른 예에서, 본 발명은 특히 동종이계(allogeneic) 면역요법에 적합할 수 있다. 이 경우, 세포들을 유전적으로 변형시키는 단계들 중 하나는 하기를 포함하는 방법일 수 있다:

(a) T-세포 수용체 (TCR)의 성분을 코드하는 적어도 하나의 유전자를 불활성시킴으로써 T-세포들을 변형시키는 단계

(b) 상기 세포들을 확장시키는 단계.

특정 예에서, 그 방법의 유전적 변형은, 조작할 제공된 세포들 내에서, 하나의 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제의 발현에 의존하여, 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제가 하나의 표적이 된 유전자에서 절단을 특이적으로 촉매화하여, 이로써 상기 표적이 된 유전자를 활성화시킨다. 특정 예에서, 세포들을 조작하는 상기 방법은 하기 단계들 중 적어도 하나를 포함한다:

상기 T-세포 내로 DNA 절단에 의하여, 바람직하게는 T-세포 수용체 (TCR)의 성분을 코드하는 적어도 하나의 유전자를 이중-가닥 깨어짐(break)에 의하여 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제를 도입하는 단계.

(b) 상기 세포들을 확장시키는 단계.

더욱 바람직한 예에서, 상기 방법은 하기를 포함한다:

(b) 상기 T 세포 내로 DNA 절단에 의하여, 바람직하게는 T-세포 수용체 (TCR)의 성분을 코드하는 적어도 하나의 유전자를 이중-가닥 깨어짐(break)에 의하여 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제를 코드하는 핵산으로 형질전환(Transforming)시키는 단계;

(d) 그것들의 세포 표면 상에 TCR을 발현시키지 않는 형질전환된(transformed) T-세포들을 분류하는(sort) 단계;

(e) 상기 세포들을 확장시키는 단계.

또다른 예에서, 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제, 징크(Zinc) 핑거 뉴클레아제 또는 TALE-뉴클레아제일 수 있다. 선호되는 예에서, 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다. 본 발명에 따른 선호되는 TALE-뉴클레아제들은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 표적 서열을 인식하고 절단하는 것들이다:

-서열번호: 37, 57 내지 60 (TCR알파(alpha)),

-서열번호: 38 또는 39 (TCR베타(beta)),

상기 TALE-뉴클레아제들은 바람직하게는 각각의(respective) 표적 서열들 서열번호: 37 내지 39 를 절단하기 위하여, 서열번호: 41로부터 서열번호: 48까지 선택되는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.

-프리 T알파( PreTalpha )

또다른 관점에서, 세포를 유전적으로 변형시키는 또다른 단계는 CD3 복합체의 자극을 통하여 선택적으로 상기 T-세포 pT알파(프리TCRα(preTCRα)로도 명칭됨) 또는 그것의 기능적 변형(variant) 내로 도입하고 상기 세포들을 확장시키는 단계를 포함하는 TCR 알파 결핍(deficient) T-세포를 확장시키는 방법일 수 있다.선호되는 예에서, 그 방법은 하기를 포함한다:

a) CD3 표면 발현을 지지하기 위하여 적어도 pT알파의 단편을 코드하는 핵산으로 상기 세포들을 형질전환하는(Transforming) 단계

b) 상기 세포들 내로 상기 pT알파를 발현시키는 단계

c) CD3 복합체의 자극을 통하여 선택적으로 상기 세포들을 확장시키는 단계.

본 발명은 또한 T-세포의 확장을 위한 방법의 단계들을 포함하는 면역요법을 위한 T-세포들의 제조 방법에 대한 것이다.

특정 예에서, pT알파 폴리뉴클레오타이드 서열은 무작위로 또는 상동 재조합, 특히, TCR알파 유전자의 불활성화와 관련될 수 있는 삽입을 통하여 도입될 수 있다.

본 발명에 따라, pT알파의 다른 기능적 변형들이 사용된다. 펩타이드의 "기능적(functional) 변형(variant)"은 전체 펩타이드 또는 그것의 단편과 상당히 유사한 분자를 가리킨다. 본 발명의 pT알파 또는 그것의 기능적 변형의 "단편(fragment)"은 분자의 임의의 부분집단(subset), 즉, 더 짧은 펩타이드를 가리킨다. 선호되는 pT알파 또는 그것의 기능적 변형은 전장(full length) pT알파 또는 C-말단들 짧아진(truncated) pT알파 버젼일 수 있다. C-말단들 짧아진(truncated) pT알파는 C-말단 끝(end)에 하나 또는 그보다 많은 잔기들(residues)이 부족하다. 제한되지 않는 예들로서, C-말단들 짧아진(truncated) pT알파 버젼은 단백질의 C-말단으로부터 18 , 48, 62, 78, 92, 110 또는 114 잔기들이 부족하다(서열번호: 107 내지 서열번호: 114). 게다가, 펩타이드의 아미노산 서열 변형들은 펩타이드를 코드하는 DNA 내 돌연변이들에 의하여 제조될 수 있다. 이러한 기능적 변형들(variant)은 예컨대, 아미노산 서열 내 잔기들의 삽입들 또는 치환들 또는 이로부터의 결실들을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합은 최종 구조체가 바랐던 활성, 특히, 기능적 CD3 복합체의 복구(restoration)를 갖고 있다면, 최종 구조체(construct)에 도달하도록 만들어질 수 있다. 선호되는 예에서, 적어도 하나의 돌연변이가 이합체화에 영향을 미치기 위하여 전술한 바와 같이 다른 pT알파 버젼들 내에 도입될 수 있다. 제한되지 않는 예로서, 돌연변이된 잔기(residue)는 적어도 인간 pT알파 단백질의 W46R, D22A, K24A, R102A 또는 R117A 또는 pT알파 패밀리 또는 상동인(homologue) 멤버 상 CLUSTALW 방법을 이용한 정렬된(aligned) 위치들(positions)이다. 바람직하게는 전술한 대로 pT알파 또는 그것의 변형(variant)은 돌연변이된 잔기 W46R (서열번호:123) 또는 돌연변이된 잔기들 D22A, K24A, R102A 및 R117A (서열번호: 124 )을 포함한다. 특정 예에서, 상기 pT알파 또는 변형들은 또한 제한되지 않는 예들로서 CD28, OX40, ICOS, CD27, CD137 (4-1BB) 및 CD8과 같은 신호-전달(signal-transducing) 도메인에 융합된다(서열번호: 115 내지 서열번호: 120). 전술한 바와 같은 pT알파 또는 변형들의 세포외 도메인은 TCR알파 단백질의 단편, 특히 TCR알파의 막횡단(transmembrane) 및 세포내 도메인과 융합될 수 있다(서열번호: 122). pT알파 변형들은 또한 TCR알파의 세포내 도메인에 융합될 수 있다(서열번호:121 ).

또다른 예에서, 상기 pT알파 버젼들은 세포외 리간드-결합 도메인에 융합되고, 더욱 바람직하게는 pT알파 또는 그것의 기능적 변형(variant)이 유연한(flexible) 링커에 의하여 연결된 표적 항원 특이적 단일클론 항체의 가볍고(light) (VL) 그리고 무거운(heavy) (VH) 가변 단편을 포함하는 단일 체인 항체 단편 (scFV)에 융합된다. 제한되지 않는 예로서, 아미노산 서열 of pT알파 또는 그것의 기능적 변형(variant)은 서열번호: 107 내지 서열번호: 124 로 구성되는 군으로부터 선택된다.

일부 가변성(variability)은 이들 폴리펩타이드들이 유래하는 유전적 데이터로부터 일어나기 때문에, 또한 중대한 기능 상실 (기능적 변형들) 없이, 이들 폴리펩타이드들에 존재하는 일부 아미노산들을 치환할 가능성을 고려하여, 본 발명은 본 출원에서 제공된 서열들과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80 %, 더욱 바람직하게는 적어도 90 % 그리고 더욱더 바람직하게는 적어도 95 % 일치성(identity)을 공유하는 상기 폴리펩타이드들의 폴리펩타이드들 변형들을 포함한다.

본 발명은 이와 같이 서열번호:107 내지 서열번호: 124 로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90 %, 95 % 97 % 또는 99 % 서열 일치성(identity)을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함하는 폴리펩타이드들에 대한 것이다.

TCR 알파 결핍 T 세포에 의하여 기능적 TCR 알파 체인의 발현이 부족한 분리된 T 세포가 의도된다. 이는 다른 수단들에 의하여 달성될 수 있으며, 제한되지 않는 예들로서, T 세포를 조작하여, 그것의 세포 표면 상에 임의의 기능적 TCR 알파를 발현시키지 않거나, 또는 T 세포를 조작하여, 그것의 표면 상에 기능이 거의 없는 TCR 알파 체인을 생산하거나 또는 T 세포를 조작함으로써 TCR 알파 체인의 돌연변이 또는 짧아진(truncated) 형태를 발현시킨다.

TCR 알파 결핍 세포들은 CD3 복합체를 통하여 더 이상 확장될 수 없다. 그러므로, 이 문제를 극복하고 TCR 알파 결핍 세포들의 증식을 허용하기 위하여 pT알파 또는 그것의 기능적 변형(variant)이 상기 세포들 내로 도입되어, 이와같이 기능적 CD3 복합체를 회복시킨다. 선호되는 예에서, 그 방법은 T-세포 수용체 (TCR)의 하나의 성분을 코드하는 하나의 유전자를 DNA 절단에 의하여 선택적으로 불활성화시킬 수 있는 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제들을 상기 T 세포들 내로 도입하는 단계를 더 포함한다. 특정 예에서, 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제들이다. 제한되지 않는 예들로서, TALE-뉴클레아제는 서열번호: 37 및 서열번호: 57 내지 60으로 구성되는 군으로부터 선택되는 TCR알파의 유전자 표적 서열들 중 하나로 향한다(direct). 바람직하게는 TALE-뉴클레아제들은 서열번호: 41 및 서열번호: 42 로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본 발명에는 pT알파(pTalpha), 특히 전술한 기능적 변형들을 코드하는 폴리펩타이드들 또한 포함된다. 선호되는 예에서, 본 발명은 CD28, OX40, ICOS, CD137 및 CD8와 같은 신호 전달(signal transducing) 도메인에 융합되는 pT알파 또는 그것의 기능적 변형(variant)에 대한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 서열번호: 107 내지 서열번호: 124 로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 pT알파 기능적 변형(variant)에 대한 것이다. 본 발명에는 pT알파 또는 전술한 그것의 기능적 변형들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들, 벡터들 또한 포함된다.

본 발명의 범위에, 상기 방법에 의하여 수득되는것이 허용되는(susceptible) 분리된 세포 또는 세포주들(cell lines) 또한 포함된다. 특히 상기 분리된 세포들 또는 세포주들은 CD3 표면 발현을 위하여 상기 세포들 pT알파 또는 그 기능적 변형(variant) 내로 도입함으로써 수득된다. 선호되는 예에서, 상기 분리된 세포 또는 세포주는 TCR알파 유전자를 불활성화시킴으로써 더 유전적으로 변형된다. 이 유전자는 바람직하게는 적어도 하나의 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제에 의하여 불활성화시킨다. 선호되는 예에서, 상기 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제는 TALE-뉴클레아제이다.

본 발명의 범위에, TCR 알파, TCR 베타, CD52, GR, 면역 체크포인트 유전자들로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자가 불활성화된, 세포들, 특히 T 세포들을 조작하기 위하여 상기 방법으로 수득되는 것이 허용되는(susceptible) 분리된 세포들 또는 세포주들 또한 포함된다.

- 이중특이성 항체들

추가의 예에 따라, 전술한 다른 방법들에 의하여 수득되는 조작된 T 세포들은 이중특이성(bispecific) 항체들에 의하여 더 노출될 수 있다. 상기 T-세포들은 환자에의 투여 전 엑스 비보(ex vivo)로 또는 환자에의 투여 후 인 비보(in vivo)로 이중특이적 항체들에 노출될 수 있다. 상기 이중특이적 항체들은 표적 항원에 근접하게 조작된 세포들을 가져가는 것을 허용하는 별개의(distinct) 항원 특성들(properties)로 두 개의 가변(variable) 영역들을 포함한다. 제한되지 않는 예로서, 상기 이중특이적 항체는 종양 마커 및 CD3와 같은 림프구 항원으로 향하며, 종양들에 대하여 임의의 순환하는 T 세포들을 활성화시키고 다시 보내는(redirect) 잠재력을 갖다.

전달( Delivery ) 방법들

전술한 다른 방법들은 멀티-체인 CAR, pT알파 또는 그것의 기능적 변형들, 희귀 절단 엔도뉴클레아제, TALE-뉴클레아제, 선택적으로 DNA-말단(end) 가공(processing) 효소를 갖는 CAR, 또는 외인성 핵산을 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.

제한되지 않는 예로, 상기 멀티-체인 CAR, pT알파 또는 그것의 기능적 변형(variant), 희귀 절단 엔도뉴클레아제들, TALE-뉴클레아제들 또는 선택적으로 DNA-말단(end) 가공 효소를 갖는 CAR 또는 외인성 핵산은 하나에 의하여 코드되는 전이유전자들(transgenes) 또는 다른 플라스미드 벡터들로서 도입될 수 있다. 다른 전이유전자들(transgenes)은 2A 펩타이드를 코드하는 서열과 같은 라이보좀 스킵 서열을 코드하는 핵산 서열을 포함하는 하나의 벡터 내로 포함될 수 있다. 피코르나바이러스들(picornaviruses)의 압토바이러스(Aphthovirus) 하위집단 내로 확인된, 2A 펩타이드들은 코돈들에 의하여 코드되는 두 개의 아미노산들 사이에 펩타이드 결합의 형성 없이 하나의 코돈으로부터 옆의 것으로 라이보좀 "스킵(skip)"을 야기한다(Donnelly et al., J. of General Virology 82: 1013-1025 (2001); Donnelly et al., J. of Gen. Virology 78: 13-21 (1997); Doronina et al., Mol. And. Cell. Biology 28(13): 4227-4239 (2008); Atkins et al., RNA 13: 803-810 (2007) 참조). "코돈(codon)"에 의하여 하나의 아미노산 잔기 내로 라이보좀에 의하여 번역되는 mRNA 상에(또는 DNA 분자의 센스 가닥 상에) 세 개의 뉴클레오타이드들을 의미한다. 그러므로, 두 개의 폴리펩타이드들이 프레임 내(in frame)인 2A 올리고펩타이드 서열에 의하여 폴리펩타이드들이 분리될 때 mRNA 내에서 단일의 근접한(contiguous) 오픈 리딩 프레임으로부터 합성될 수 있다. 이러한 라이보좀의 스킵 메커니즘들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 단일 메신저(messenger) RNA에 의하여 코드되는 몇몇 단백질들의 발현을 위한 몇몇 벡터들에 의하여 사용되는 것으로 알려져 있다. 제한되지 않는 예로서, 본 발명에서, 2A 펩타이드들은 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제 및 DNA 말단(end)-가공(processing) 효소 또는 멀티-체인 CAR의 다른 폴리펩타이드들을 세포 내로 발현시키기 위하여 사용되어 왔다.

상기 플라스미드 벡터는 또한 상기 벡터를 받는 세포들의 확인 및/또는 선택을 위하여 제공되는 선택 마커를 포함할 수 있다.

폴리펩타이드들은 세포 내로 상기 폴리펩타이드들를 코드하는 폴리뉴클레오타이드들의 도입의 경과, 세포 내에서 인 시츄(in situ)로 합성될 수 있다. 대체하여, 상기 폴리펩타이드들은 세포 밖에서 생산되어 그 다음에 거기로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 구조체(construct)를 동물 세포들 내로 도입하는 방법들은 당업계에 알려져 있으며, 제한되지 않는 예들로서 폴리뉴클레오타이드 구조체(construct)가 세포의 게놈에 통합되는, 안정적인 형질전환(transformation) 방법들, 폴리뉴클레오타이드 구조체(construct)가 세포의 게놈 내로 통합되지 않는 일시적(transient) 형질전환(transformation) 방법들 및 바이러스 매개된 방법들을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드들은 예컨대, 재조합 바이러스 벡터들(예를 들어 레트로바이러스들(retroviruses), 아데노바이러스들(adenoviruses)), 리포좀(liposome) 등에 의하여 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 일시적 형질전환(transformation) 방법들은 예를 들어 미세주입(microinjection), 전기천공(electroporation) 또는 유전자총(particle bombardment)을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드들은 세포들에서 발현되는 관점에서, 벡터들, 더욱 특히 플라스미드들 또는 바이러스에 포함될 수 있다.

- 전기천공(Electroporation )

본 발명의 특정 예에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들은 세포들로 직접, 예를 들어 전기천공에 의하여 도입되는 mRNA일 수 있다. 본 발명자들은 T-세포에서 mRNA 전기천공을 위한 최적의 조건을 결정하였다.

본 발명자들은 펄스된 전기장들(pulsed electric field)에서의 사용에 의하여, 세포들 내로 물질의 전달(delivery)을 위한 살아 있는 세포들을 일시적으로 투과가능하게(permeabilize) 하는 것을 허용하는, 사이토펄스(cytoPulse) 기술을 이용하였다. 펄스아질(PulseAgile) (Cellectis property) 전기천공 파형들(waveforms)에 기초한 기술은 펄스(pulse) 나비(duration), 강도와 더불어 펄스들 간의 간격(interval)을 정확하게 통제하는 것을 허용한다(미국 특허 6,010,613 및 국제 PCT 출원 WO2004083379). 이들 파라미터들은 모두 최소의 치사율(mortality)을 갖고 높은 형질주입(transfection) 효율을 위한 최고의 조건들에 도달하기 위하여 변형될 수 있다. 기본적으로, 첫 번째 높은 전장(electric field) 펄스들은 구멍(pore) 형성을 허용하는데, 반면 그 다음 더 낮은 전장 펄스들은 폴리뉴클레오타이드를 세포로 이동시키는 것을 허용한다. 본 발명의 하나의 관점에서, 본 발명자들은 T 세포들 내 mRNA의 >95% 형질주입(transfection) 효율의 달성을 이끄는 단계, 및 T 세포들에서 다른 종류의 단백질들을 발현시키는 전기천공 프로토콜의 이용을 기재한다. 특히, 본 발명은 T 세포를 형질전환시키는(transforming) 방법에 대한 것으로, 이는 상기 T 세포를 RNA와 접촉시키는 단계 및 T 세포에 하기로 구성되는 빠른(agile) 펄스(pulse)를 적용하는 단계를 포함한다:

(a) 단계 (a) 및 (b)의 전기적 펄스들 사이의 0.2 내지 10 ms의 펄스 간격, 0.1 ms 의 펄스 폭(pulse width), 센티미터 당 2250 부터 3000 V까지의 전압 범위로 하나의 전기적 펄스;

(b) 단계 (b)의 전기적 펄스 및 단계 (c)의 첫 번째 전기적 펄스 사이의 100 ms 의 펄스 간격 및 100 ms 의 펄스 폭(pulse width)를 갖고 2250 부터 3000 V 까지의 전압 범위를 갖는 하나의 전기적 펄스; 및

(c) 4 개의 전기적 펄스들 각각 사이의 2 ms의 펄스 간격 및 0.2 ms 의 펄스 폭을 갖고 325 V 의 전압으로 4개의 전기적 펄스들.

특정 예에서, T 세포를 형질전환시키는 방법으로, 상기 T 세포를 RNA와 접촉시키는 단계 및 T 세포에 하기로 구성되는 짧은(agile) 펄스들을 적용하는 단계를 포함하는 방법:

(a) 단계 (a) 및 (b) 사이의 전기적 펄스들 사이의 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 ms의 펄스 간격 및 0.1 ms의 펄스 폭(pulse width), 센티미터 당 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 또는 3000V의 전압으로 하나의 전기적 펄스;

(b) 단계 (b)의 전기적 펄스 및 단계 (c)의 첫 번째 전기적 펄스 사이의 100 ms의 펄스 간격 및 100 ms의 펄스 폭(pulse width)으로, 2250 부터의, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2400, 2450, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 또는 3000V의, 전압 범위로 하나의 전기적 펄스;및

(c) 4 개의 전기적 펄스들 각각 사이의 2 ms의 펄스 간격 및 0.2 ms 의 펄스 폭(pulse width)으로 325 V의 전압으로 4개의 전기적 펄스들.

전술한 값(value) 범위 내 포함되는 임의의 값들은 본 출원에 공개된다. 전기천공 배지(medium)는 당업계에 알려진 임의의 적절한 배지일 수 있다. 바람직하게는, 전기천공 배지는 0.01 내지 1.0 밀리지멘스(milliSiemens)에 걸치는 범위에서 전도성(conductivity)을 갖는다.

특정 예에서, 제한되지 않는 예들로서, 상기 RNA는 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제, Half-TALE-뉴클레아제와 같은 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제의 하나의 모노머, 키메라 항원 수용체, 멀티-체인 키메라 항원 수용체의 적어도 하나의 성분, pT알파 또는 그것의 기능적 변형(variant), 외인성 핵산, 하나의 추가적인 촉매적 도메인을 코드한다.

변형된 T-세포들

본 발명은 또한 세포들을 조작하기(engineer) 위하여 상기 방법으로 수득되는 것이 허용되는(susceptible) 분리된 세포들 또는 세포주들에 대한 것이다. 특히 상기 분리된 세포는 전술한 바와 같이 적어도 하나의 멀티-체인 CAR를 포함한다. 또다른 예에서, 상기 분리된 세포는 각각 다른 세포외 리간드 결합(binding) 도메인들을 포함하는 멀티-체인 CAR들의 군을 포함한다. 특히, 상기 분리된 세포는 적어도 하나의 멀티-체인 CAR를 포함하는 폴리펩타이드들을 코드하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열들을 포함한다. 상기 세포들은 CD52, GR, TCR 알파, TCR 베타, HLA 유전자, CTLA-4 및 PD1 과 같은 면역 체크 포인트 유전자들로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 불활성화된 유전자를 포함하며, pT알파 전이유전자를 발현시킬 수 있다.

본 발명의 범위에, 분리된 면역 세포, 바람직하게는 전술한 방법들 중 임의의 하나에 따라 수득되는 T-세포 또한 포함된다. 상기 면역(immune) 세포는 선천적인(innate) 및/또는 적응성(adaptative) 면역 반응의 시작 및/또는 수행(execution)에 기능적으로 포함되는 조혈(hematopoietic) 기원(origin)의 세포를 가리킨다. 본 발명에 따른 상기 면역(immune) 세포는 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 줄기 세포들은 성체 줄기 세포들, 배아 줄기 세포들, 더욱 특히 비-인간 줄기 세포들, 제대혈 줄기 세포들, 간(progenitor)세포들, 골수 줄기 세포들, 유도(induced) 만능(pluripotent) 줄기 세포들, 전능성(totipotent) 줄기 세포들 또는 조혈(hematopoietic) 줄기 세포들일 수 있다. 대표적인 인간 세포들은 CD34+ 세포들이다. 상기 분리된 세포는 또한 수지상 세포, 킬러(killer) 수지상 세포, 비만(mast) 세포, NK-세포, B-세포 또는, 염증성 T-림프구들, 세포독성의 T-림프구들, 조절성(regulatory) T-림프구들 또는 헬퍼 T-림프구들로 구성되는 군으로부터 선택되는 T-세포일 수 있다. 또다른 예에서, 상기 세포는 CD4+ T-림프구들 및 CD8+ T-림프구들로 구성되는 군으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 세포들의 유전적 변형 및 확장 전에, 세포들의 소스는 여러가지 제한되지 않는 방법들을 통하여 대상(subject)로부터 수득될 수 있다. 세포들은 말초 혈액 단핵(mononuclear) 세포들, 골수, 림프절(lymph node) 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염의 위치로부터의 조직, 복수(ascites), 흉수(pleural effusion), 비장 조직, 및 종양들을 포함하는 제한되지 않는 많은 소스들로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 특정 예에서, 이용가능하고 당업자에게 알려진 많은 T 세포주들이 사용될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 세포는 건강한 도너(donor), 암으로 진단된 환자로부터 또는 감염으로 진단된 환자로부터 유래될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 세포는 다른 표현형 특성들을 보이는 세포들의 혼합된 군의 부분이다. 본 발명의 범위에, 전술한 방법에 따라 형질전환된(transform) T-세포로부터 수득되는 세포주가 포함된다. 면역억제 치료에 저항력이 있고, 전의 방법에 의하여 수득되는 것이 허용되는 변형된 세포들은 본 발명의 범위에 포함된다.

또다른 예에서, 본 발명에 따른 상기 분리된 세포는 CD52, GR, PD1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, B7H5, LAIR1, SIGLEC10, 2B4, HLA, TCR 알파 및 TCR 베타로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 불활성화 유전자를 포함하고, 그리고/또는 CAR, 멀티-체인 CAR 및/또는 pT알파 전이유전자를 발현시킨다. 또다른 특정 예에서, 상기 분리된 세포는 멀티-체인 CAR를 포함하는 상기 폴리펩타이드들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들을 포함한다.

또다른 예에서, 본 발명에 따른 상기 분리된 세포는 CD52 및 GR, CD52 및 TCR 알파, CDR52 및 TCR 베타, GR 및 TCR 알파, GR 및 TCR 베타, TCR 알파 및 TCR 베타, PD1 및 TCR 알파, PD1 및 TCR 베타, CTLA-4 및 TCR 알파, CTLA-4 및 TCR 베타, LAG3 및 TCR 알파, LAG3 및 TCR 베타, Tim3 및 TCR 알파, Tim3 및 TCR 베타, BTLA 및 TCR 알파, BTLA 및 TCR 베타, BY55 및 TCR 알파, BY55 및 TCR 베타, TIGIT 및 TCR 알파, TIGIT 및 TCR 베타, B7H5 및 TCR 알파, B7H5 및 TCR 베타, LAIR1 및 TCR 알파, LAIR1 및 TCR 베타, SIGLEC10 및 TCR 알파, SIGLEC10 및 TCR 베타, 2B4 및 TCR 알파, 2B4 및 TCR 베타로 구성된 군으로부터 선택되는 두 개의 불활성화된 유전자들을 포함하고, 그리고/또는 CAR, 멀티-체인 CAR 및/또는 pT알파 전이유전자를 발현시킨다.

또다른 예에서, TCR은 TCR 알파 유전자 및/또는 TCR 베타 유전자(들)을 불활성화시킴으로써 본 발명에 따른 세포들에서 비 기능적으로 만들어진다. 상기 전략들은 더욱 특히 GvHD을 피하기 위하여 사용된다. 본 발명의 특정 측면에서, 개인으로부터 유래하는 변형된 세포들을 수득하기 위한 방법, 이 때 상기 세포들이 주요 조직 적합 유전자 복합체(Major Histocompatibility Complex) 신호전달(signaling) 경로와 관계없이 증식할 수 있다. 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:

(a) 상기 개인(individual)로부터 세포를 회수하는(Recovering) 단계;

(b) TCR 알파 또는 TCR 베타 유전자들을 불활성화시킴으로써, 엑스-비보(ex-vivo)에서 상기 세포들을 유전적으로 변형시키는 단계;

(c) 상기 세포들을 증폭(amplify)시키기 위하여 적절한 조건들에서 인 비트로(in vitro)로 유전적으로 변형된 T-세포들을 배양하는 단계.

이 방법에 의하여 수득되는 것이 허용되는, 주요 조직 적합 유전자 복합체(Major Histocompatibility Complex) 신호전달(signaling) 경로와 관계없이 증식할 수 있는 변형된 세포들은 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 변형된 세포들은 숙주편대이식(Host versus Graft) (HvG) 거부(rejection) 및 이식편대숙주병(Graft versus Host Disease)에 대항하여 그것을 필요로 하는 환자를 치료하기 위하여 사용될 수 있다; 그러므로 본 발명의 범위에 불활성화된 TCR 알파 및/또는 TCR 베타 유전자들을 포함하는, 유효량의 변형된 세포들을 상기 환자에 투여함으로써 상기 환자를 치료하는 것을 포함하는, 숙주편대이식(Host versus Graft) (HvG) 거부(rejection) 및 이식편대숙주병(Graft versus Host Disease) (GvHD)에 대항하여, 그것을 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이 포함된다.

T 세포들의 활성화 및 확장

T 세포들의 유전적 변형 전 또는 후에, T 세포들은, 예컨대, U.S. 특허들 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 U.S. 특허출원공개 No. 20060121005에, 기재된 방법들을 이용하여 활성화되고 유전적으로 확장(expand)될 수 있다. T 세포들은 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)로 확장될 수 있다.

유전적으로, 본 발명의 T 세포들은 T-세포를 위한 활성화 신호를 만들기 위하여 T 세포들의 표면 상에 공-자극 분자 및 CD3 TCR 복합체를 자극하는 제제와의 접촉에 의하여 확장된다.

예를 들어, 칼슘 이노포레(calcium ionophore) A23187, 포볼(phorbol) 12-미리스테이트(myristate) 13-아세테이트(acetate) (PMA), 또는 파이토헤마글루티닌(phytohemagglutinin)(PHA)과 같은 미토겐성(mitogenic) 렉틴(lectin)과 같은 화학물질들이 T-세포를 위한 활성화 신호를 만들기 위하여 사용될 수 있다.

제한되지 않는 예로서, T 세포 군들은 항-CD3 항체, 또는 그것의 항원-결합 단편, 또는 표면 상에 고정화된 항-CD2 항체와의 접촉에 의한 것 또는 칼슘 이노포레(calcium ionophore)와 함께 단백질 키나제 C 활성화제(activator) (예컨대, 브리오스타틴(bryostatin))와의 접촉에 의한 것과 같이 인 비트로(in vitro)로 자극될 수 있다. T 세포들의 표면 상 보조(accessory) 분자의 공-자극(co-stimulation)을 위하여, 보조(accessory) 분자에 결합하는 리간드가 이용된다. 예를 들어, T 세포들의 군은 T 세포들의 증식을 자극하기에 적절한 조건들 하, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포들 또는 CD8+ T 세포들의 증식을 자극하기 위하여, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 제제들이 용액 내에 또는 표면에 연결되어(coupled) 있을 수 있다. 당업자는 입자들의 세포들에 대한 비율이 표적 세포에 비례한(relative to) 입자 크기에 의존할 수 있다는 것을 쉽게 인식할 수 있다. 본 발명의 더한 예에서, T 세포들과 같은 세포들은 제제(agent)-코팅된 비드들(beads)과 결합하고, 비드들 및 세포들은 나중에 분리되고, 그 다음에 세포들은 배양된다. 대체되는 예에서, 배양 전, 제제-코팅된 비드들 및 세포들은 분리되지 않고 함께 배양된다. T 세포 배양에 적합한 조건들은 혈청 (예컨대, 소 태아 또는 인간 혈청), 인터루킨-2 (IL-2), 인슐린, IFN-g , 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, - 2, 1L-15, TGFp, 및 TNF- 또는 당업자에게 알려진 세포들의 성장을 위한 다른 첨가제들을 포함하는, 증식(proliferation) 및 생존능(viability)에 필요한 인자들을 포함할 수 있는 적절한 배지((예컨대, Minimal Essential Media 또는 RPMI Media 1640 또는, X-vivo 5, (Lonza))를 포함할 수 있다. 세포들의 성장을 위한 다른 첨가제들은 계면활성제, 플라즈마네이트(plasmanate), 및 2-메르캅토에탄올(mercaptoethanoi) 및 N-아세틸-시스테인(N-acetyl-cysteine)과 같은 환원제들을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배지는 첨가된 아미노산, 소듐(sodium) 피루베이트(pyruvate), 및 비타민들(vitamins)과, 호르몬들의 정의된 세트 및/또는 T 세포들의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인(들), 또는 적절한 양의 혈청 (or plasma)으로 보충되어 또는 무-혈청으로, RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1, 및 X-Vivo 20, Optimizer을 포함할 수 있다. 항체들, 예컨대 페니실린 및 스트렙토마이신,은 실험적 배양에서만 포함되며, 대상에 융합되는 세포들의 배양에서는 아니다. 표적 세포들은 예를 들어, 적절한 온도 (예컨대, 37 ℃) 및 공기 (예컨대, a공기 플러스 5% C0₂)인, 성장을 지지하기에 필요한 조건들 하 유지된다. 다른 자극 시간들에 노출된 T 세포들은 다른 특성들을 보일 수 있다.

또다른 특정 예에서, 상기 세포들은 조직 또는 세포들과 공-배양(co-culturing)함으로써 확장될 수 있다. 상기 세포들은 또한 인 비보(in vivo)에서, 예를 들어 대상 내로 상기 세포를 투여한 후 대상의 혈액에서, 확장될 수 있다.

치료적 적용들

또다른 예에서, 다른 방법들에 의하여 수득된 분리된 세포 또는 전술한 상기 분리된 세포로부터 유래된 세포주는 의약(medicament)으로서 이용될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 의약은 이를 필요로 하는 환자에서 암 또는 감염들을 치료하기 위하여 이용될 수 있다. 또다른 예에서, 본 발명에 따른 상기 분리된 세포 또는 상기 분리된 세포로부터 유래된 세포주는 이를 필요로 하는 환자에서 암, 바이러스 감염 또는 자가면역질환의 치료를 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다.

또다른 관점에서, 본 발명은 그것을 필요로 하는 환자들을 치료하는 방법들에 의존하며, 상기 방법은 하기 단계들 중 적어도 하나를 포함한다:

(a) 전술한 방법들 중 임의의 하나에 의하여 수득되는 면역-세포를 제공하는 단계;

(b) 상기 형질전환된(transformed) 면역(immune) 세포들을 상기 환자에 투여하는 단계,

하나의 예에서, 본 발명의 상기 T 세포들은 양호한(robust) 인 비보(in vivo) T 세포 확장을 겪을 수 있고, 연장된 시간 동안 지속될 수 있다.

상기 치료는 개선적, 치유적 또는 예방적일 수 있다. 그것은 자가유래(autologous) 면역요법의 일부 또는 동종이계(allogenic) 면역요법 치료의 일부일 수 있다. 자가유래(autologous)에 의하여, 환자들을 치료하는데 사용되는 세포들, 세포주 또는 세포들의 군이 상기 환자로부터 또는 인간 백혈구 항원(Human Leucocyte Antigen) (HLA) 호환성(compatible) 도너로부터 유래한다는 것이 의미된다. 동종이계(allogeneic)에 의하여 환자들을 치료하는데 사용되는 세포들 또는 세포들의 군이 상기 환자로부터가 아니라 도너로부터 유래된다는 것이 의미된다.

본 발명은 특히 그것이, 보통 도너들로부터 수득되는, T-세포들의, 비-동종반응성(non-alloreactive) 세포들로의, 형질전환(transformation)을 가능하게 하는 한, 동종이계(allogenic) 면역요법에 적합하다. 이는 표준 프로토콜들 하 되고, 필요한 만큼 많이 재생산될 수 있다. 결과인 변형된 T 세포들은 풀(pool)이 될 수 있으며, "규격품인(off the shelf)" 치료제로서, 이용가능하게 만들어져, 하나의 또는 몇몇 환자들에 투여될 수 있다.

공개된 방법들로 이용될 수 있는 세포들은 앞 섹션에서 설명되었다. 상기 치료는 암, 바이러스 감염, 자가면역 질환들(disorders) 또는 이식편대숙주병(Graft versus Host Disease) (GvHD)으로 진단된 환자들을 치료하는데 이용될 수 있다. 치료될 수 있는 암들은 혈관화되지 않은 또는 아직 상당히 혈관화되지 않은, 그리고 혈관화된(vascularized) 종양인 종양들을 포함한다. 암들은 (혈액의(hematological) 종양들, 예를 들어, 백혈병 및 림프종과 같은) 비고형(nonsolid) 종양들을 포함할 수 있고 또는 고형 종양들을 포함할 수 있다. 본 발명의 멀티-체인 CAR들로 치료되는 암들의 타입들은, 상피성암(carcinoma), 아세포종(blastoma), 및 육종(sarcoma), 및 특정 백혈병(leukemia) 또는 림프의 악성종양들(malignancies), 양성 및 악성 종양들, 및 예컨대, 육종들(sarcomas), 상피성암들(carcinomas), 및 흑색종들(melanomas)인 악성종양들을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 성인 종양들/암들 및 소아 성인 종양들/암들 또한 포함된다.

그것은 항체들 치료(therapy), 화학요법, 사이토카인들 치료(therapy), 수지상 세포 치료(therapy), 유전자 치료(therapy), 호르몬 치료(therapy), 레이저광(laser light) 치료 및 방사선 치료로 구성되는 군으로부터 선택되는 암에 대한 하나 또는 그보다 많은 치료들(therapies)과 결합한 치료일 수 있다.

본 발명의 선호되는 예에 따라, 상기 치료는 면역억제 치료를 겪는 환자들 내로 투여될 수 있다. 정말로, 본 발명은 바람직하게는 이러한 면역억제제를 위한 수용체를 코드하는 유전자의 불활성화 때문에 적어도 하나의 면역억제제에 저항성을 갖도록 만들어진, 세포들 또는 세포들 군에 의존한다. 이 관점에서, 면역억제 치료는 환자들 내의 본 발명에 따른 T-세포들의 선택 및 확장을 도와야 한다.

본 발명에 따른 세포들 또는 세포들 군의 투여는 에어로졸(aerosol) 흡입(inhalation), 주입(injection), 섭취(ingestion), 투입(transfusion), 피하주입(implantation) 또는 이식(transplantation)에 의한 것을 포함하는, 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 여기에서 기재된 조성물들은 피하로(subcutaneously), 피내로(intradermaliy), 종양내로(intratumorally), 절내로(intranodally), 골수내로(intramedullary), 근육내로(intramuscularly), 정맥(intravenous) 또는 림프내(intralymphatic) 주입(injection)에 의하여, 또는 복강내로(intraperitoneally) 환자에 투여될 수 있다. 하나의 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 바람직하게는 정맥 주입에 의하여 투여된다.

세포들 또는 세포들 군의 투여는, 이들 범위들 내 세포 수들의 모든 정수값들을 포함하는, kg 체중 당 10⁴- 10⁹ 세포들, 바람직하게는 10⁵ 내지 10⁶ 세포들/kg 체중의 투여로 구성될 수 있다(consist of). 세포들 또는 세포들의 군은 하나 또는 그보다 많은 용량들로 투여될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 유효한 양의 세포들은 일회량(single dose)으로 투여된다. 또다른 예에서, 상기 유효한 양의 세포들은 기간 시간 동안 하나의 용량보다 많은 것으로 투여된다. 투여 타이밍은 담당 의사의 판단으로, 환자의 임상적 상태에 의존한다. 세포들 또는 세포들의 군은 혈액 은행 또는 도너와 같은 임의의 소스로부터 수득될 수 있다. 개인 필요가 다른 반면, 당업계에서 특정 질병들 또는 질환들을 위한 정해진 세포 타입의 유효한 양들의 최적 범위들의 결정. 유효한 양은 치료적(therapeutic) 또는 예방적(prophylactic) 이점을 제공하는 양을 의미한다. 투여되는 용량은 수용자(recipient)의 체중, 연령, 건강, 동시에 하는 치료의 종류, 만약 있다면 치료의 빈도 및 원하는 효과의 특성에 의존할 것이다.

또다른 예에서, 이들 세포들을 포함하는 조성물 또는 세포들의 상기 유효한 양은 비경구적으로(parenterally) 투여된다. 상기 투여는 정맥(intravenous) 투여일 수 있다. 상기 투여는 종양 내로 주입에 의하여 직접 이루어질 수 있다.

본 발명의 특정 예들에서, 세포들은 항바이러스 치료(therapy), 시도포비어(cidofovir) 및 인터루킨-2, 시트라빈(Cytarabine) (ARA-C로도 알려짐) 와 같은 제제들로 치료, 또는 MS 환자들을 위한 나탈리지맙(nataliziimab) 치료 또는 건선(psoriasis) 환자들을 위한 에팔리크티맙(efaliztimab) 치료 또는 PML 환자들을 위한 다른 치료들을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌, 많은 관련 치료 양식들과 함께 (예컨대, 그 전에, 동시에 또는 그 후에) 환자에 투여된다. 추가의 예들에서, 본 발명의 T 세포들은 화학요법, 방사선(radiation), 사이클로스포린(cyclosporin), 아자티오프린(azathioprine), 메토트렉세이트(methotrexate), 미코페놀레이트(mycophenolate), 및 FK506와 같은 면역억제제들, 항체들, 또는 CAM PATH, 항-CD3 항체들과 같은 다른 면역을 없애는(immunoablative) 제제들(agents) 또는 다른 항체 치료들, 사이톡신(cytoxin), 플루다리빈(fludaribine), 사이클로스포린(cyclosporin), FK506, 라파마이신, 미코플리에놀산(mycoplienolic acid), 스테로이드들(steroids), FR901228, 사이토카인들, 및 조사(irradiation)와 결합하여 이용될 수 있다. 이들 약물들은 칼슘 의존적 포스파타제(phosphatase) 칼시뉴린(사이클로스포린(cyclosporine) 및 FK506)를 억제하거나 또는 성장인자 유도된 신호전달(signaling)에 중요한 p70S6 키나제를 억제한다(라파마이신(rapamycin))(Liu et al., Cell 66:807-815, 1 1; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Citrr. Opin. mm n. 5:763-773, 93). 추가의 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 골수 이식(transplantation), 플루다라빈(fludarabine)과 같은 화학요법 제제들을 이용한 T 세포 면역 없애는(ablative) 치료, 외부-빔(external-beam) 방사선 치료 (XRT), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 또는 OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체들과 함께 (예컨대, 그 전에, 동시에 또는 그 후에) 환자에 투여된다. 또다른 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 예컨대 리툭산(Rituxan)인, CD20과 반응하는 제제들과 같은 B-세포 면역 없애는(ablative) 치료 후 투여된다. 예를 들어, 하나의 예에서, 대상(subjects)들은 고용량 화학요법으로 표준 치료를 수행한 후, 말초 혈액 줄기 세포 이식(transplantation)이 이어질 수 있다. 특정 예들에서, 이식 후에, 대상들은 본 발명의 확장된 면역(immune) 세포들의 융합을 받는다. 추가적인 예에서, 확장된 세포들은 수술(surgeiy) 전 또는 후에 투여된다. 여기에 기재된 방법들 중 임의의 하나에 의하여 수득되는 상기 변형된 세포들은 숙주편대이식(Host versus Graft) (HvG) 거부 및 이식편대숙주병(Graft versus Host Disease) (GvHD)에 대항하여, 이를 필요로 하는 환자들의 치료를 위하여, 본 발명의 특정 관점에서 사용될 수 있다; 그러므로 본 발명의 관점에서 불활성화된 TCR 알파 및/또는 TCR 베타 유전자들을 포함하는 유효한 양의 변형된 세포들을 상기 환자에 투여함으로써 상기 환자를 치료하는 것을 포함하는, 숙주편대이식(Host versus Graft) (HvG) 거부 및 이식편대숙주병(Graft versus Host Disease) (GvHD) 에 대항하여 이를 필요로 하는 환자들을 치료하는 방법이다.

면역치료를 위하여 인간 동종이계 ( allogeneic ) 세포들을 조작하는 방법의 예

본 발명을 더 잘 이해하기 위하여, 면역요법을 위하여 인간 동종이계(allogenic) 세포들을 조작하는(engineer) 방법의 하나의 예가 도 5에 나타나 있다. 하기 단계들 중 하나 또는 몇몇의 조합을 포함하는 방법:

1. 세포 배양물로부터 또는 혈액 샘플로부터 하나의 개인 환자로부터 또는 혈액 은행으로부터 T-세포들를 제공하여, 항-CD3/C28 활성화제(activator) 비드들(beads)을 이용하여 상기 T 세포들을 활성화시키는 것. 비드들은 T 세포들의 활성화 및 확장에 요구되는 일차(primary) 및 공-자극 신호들 모두를 제공한다.

2. a) 상기 세포들을 pT알파 또는 그것의 기능적 변형(variant) 전이유전자(transgene)로 형질도입(transducing)하여, CD3 표면 발현을 지지하고, CD3 복합체의 자극을 통하여 세포 확장을 허용하는 것. TCR 파괴(disruption)는 TCR 복합체의 제거가 예상되고, 그리고 알로반응성(alloreactivity)을 제거하지만, CD3 신호전달(signaling) 성분의 상실(loss) 때문에 동종이계(allogenic) 세포들 확장을 바꿀 수 있다. 형질도입된(transduced) 세포들은 pT알파 체인 또는 그것의 기능적 변형(variant)을 발현시킬 것으로 예상된다. 이 pT알파 체인은 TCR베타 체인 및 CD3 신호전달(signaling) 성분들과 짝지어, 프리TCR 복합체를 형성하고, 그리고 이와 같이 기능적 CD3 복합체를 회복시키고, 불활성화된 TCR알파 세포들의 자극 또는 활성화를 지지한다. pT알파 렌티바이러스(lentiviral) 벡터로의 T-세포들의 형질도입(tansduction)은 TCR알파 불활성화 전 또는 후에 실현될 수 있다.

b) 상기 세포들을 멀티-체인 CAR들로 형질도입하여(transducing) 림프종들 및 고형 종양을 포함하는 여러가지 악성종양들로부터 표적 세포들의 표면에서 발현되는 항원들에 대항하여 T 세포들을 다시 보내는(redirecting) 것을 허용하는 것. 공-자극 도메인의 기능을 개선하기 위하여, 본 발명자들은 전술한 FcεRI 유래의 멀티-체인 CAR를 설계하였다. 형질도입(transduction)은 CD52 유전자들와 같은 다른 유전자들 및 TCR알파의 불활성화 전 또는 후에 실행될 수 있다.

3. 비 동종반응성(alloreactive) 및 면역억제약(immunosuppressive) 저항성 T 세포들의 조작:

a) 상기 세포들에서 TCR 알파를 불활성화시켜, 세포 표면으로부터 TCR을 제거하고, 동종이계(allogenic)의 TCR에 의하여 이물질(foreign)로서 숙주 조직의 인식을 방지하여, 이와 같이 GvHD를 피하는 것이 가능하다.

b) 면역억제제에 대한 표적을 코드하는 하나의 유전자를 불활성화시켜, 상기 세포들을 면역억제 치료에 저항성이 있게 만들어, 이식된 T 세포들에 영향을 미치지 않고 이식편 거부를 방지하는 것 또한 가능하다. 이 예에서, 면역억제제들의 표적은 CD52이고, 면역억제제는 인간화된 단일클론 항-CD52 항체이다.

T-세포들 내 DSB 이벤트들의 더 높은 비율(rates)을 허용함으로써, TALE-뉴클레아제의 이용이 T-세포들에서 상기 이중(double) 불활성화를 달성하는데 특히 이익이라는 것을 본 발명자들이 보였다. 바람직하게는, TCR알파 및 CD52 유전자들은 상기 유전자을 표적으로 하는 TALE-뉴클레아제를 코드하는 mRNA로 전기천공함으로써(electoporating) 불활성화된다. 높은 형질전환(transformation) 비율을 야기하는 mRNA를 이용하는 것이 T-세포들에 덜 해롭고, 그래서 T-세포들을 조작하는 공정에서 매우 중요하다는 것을 본 발명자들이 보였다. 그 다음에, 불활성화된 T 세포들은 자성 비드들을 이용하여 분류된다. 예를 들어, CD52를 발현시키는 T 세포들은 고체 표면으로부터 고정(fixation)에 의하여 제거되고, 불활성화된 세포들은 칼롬을 통해 통과함으로써 스트레스(stress)에 노출되지 않는다. 이 온건한 방법은 적절히 조작된 T-세포들의 농도를 증가시킨다.

4. CD3 복합체의 자극을 통한 환자에의 투여 후 인 비보(in vivo)로 또는 환자에의 투여 전에 조작된 환자에의 투여 전에 조작된 T-세포들의 인 비트로(in vitro) 확장. 투여 단계 전, 환자들은 CAMPATH1-H, 인간화된 단일클론 항체 항-CD52와 같은 면역억제 치료를 받게 될 수 있다.

5. 표적 항원에 인접하게 조작된 세포들을 가져가기 위하여. 환자에 투여 후 인 비보(in vivo)로 또는 환자에의 투여 전 엑스 비보(ex vivo)에서 이중특이적 항체들에 선택적으로 노출된 상기 세포들.

다른 정의들

- 다르게 특정되지 않는 한, "하나", "하나", "그" 및 "적어도 하나"는 교환될 수 있게 사용되며, 하나 또는 하나보다 많은 것을 의미한다. 폴리펩타이드 서열 내 아미노산 잔기들은 예를 들어, Q 는 Gln 또는 글루타민(Glutamine) 잔기를 의미하고, R은 Arg 또는 알지닌(Arginine) 잔기를 의미하고 그리고 D 는 Asp 또는 아스파르트산(Aspartic acid) 잔기를 의미하는, 일-문자 코드에 따라 여기에 표시된다.

- 아미노산 치환은 하나의 아미노산 잔기의 또다른 잔기로의 교체를 의미하며, 예컨대, 알지닌(Arginine) 잔기의 펩타이드 서열 내 글루타민(Glutamine)으로의 치환은 아미노산 치환이다.

- 뉴클레오타이드들은 하기와 같이 표시된다: 일-문자 코드는 뉴클레오사이드(nucleoside)의 염기를 가리키는 것으로 이용된다: a는 아데닌(adenine)이고, t는 티민(thymine)이고, c는 사이토신(cytosine)이고, 그리고 g는 구아닌(guanine)이다. 축퇴된(degenerate) 뉴클레오타이드들에 대하여, r 은 g 또는 a (purine 뉴클레오타이드들)에 해당하고, k 는 g 또는 t에 해당하고, s 는 g 또는 c에 해당하고, w 는 a 또는 t에 해당하고, m 은 a 또는 c에 해당하고, y 는 t 또는 c (pyrimidine 뉴클레오타이드들)에 해당하고, d 는 g, a 또는 t에 해당하고, v 는 g, a 또는 c에 해당하고, b 는 g, t 또는 c에 해당하고, h 는 a, t 또는 c에 해당하고, 그리고 n g, a, t 또는 c에 해당한다.

- 여기에 사용된 대로, "핵산(nucleic acid)" 또는 "폴리뉴클레오타이드들(polynucleotides)"은 디옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid) (DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid) (RNA), 올리고뉴클레오타이드들(oligonucleotides), 중합효소(polymerase) 연쇄(chain) 반응(reaction) (PCR)에 의하여 생기는 단편들 및 임의의 연결(ligation), 절단(scission), 엔도뉴클레아제 작용, 및 엑소뉴클레아제에 의하여 생기는 단편들과 같은, 뉴클레오타이드들 및/또는 폴리뉴클레오타이드들을 가리킨다. 핵산 분자들은 (DNA 및 RNA와 같은) 자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드들, 또는 자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드들의 유사체들(analogs)(예컨대, 자연적으로 발생하는 뉴클레오타이드들의 거울상이성질체(enantiomeric) 형태들) 또는 그 둘의 조합인 모노머들로 이루어져(composed) 있을 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드들은 당(sugar) 및/또는 피리미딘(pyrimidine) 모어티들의 변경들(alterations) 또는 퓨린(purine) 베이스 모이어티를 가질 수 있다. 당(sugar) 변형들은, 예를 들어, 하나 또는 그보다 많은, 할로겐들을 갖는 하이드록실(hydroxyl) 기들, 알킬기들, 아민들, 및 아지도(azido) 기들의 대체를 포함하며, 또는 당들(sugars)은 에터들(ethers) 또는 에스터들로서 기능적으로 될 수도 있다. 게다가 전체 당(sugar) 모이어티(moiety)는 아자(aza)-당들 및 카르보사이클릭(carbocyclic) 당(sugar) 유사체들과 같은, 입체적으로 그리고 전자적으로 유사한 구조들로 대체될 수 있다. 염기 모이어티의 변형들의 예들은 알킬화된 퓨린들 및 피리미딘들, 아실화된(acylated) 퓨린들 또는 피리미딘들, 또는 다른 잘 알려진 헤테로사이클릭(heterocyclic) 대체제들(substitutes)이다. 핵산 모노머들은 포스포다이에스터(phosphodiester) 결합들에 의하여 연결되거나 또는 이러한 결합들의 유사체들일 수 있다. 핵산들은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.

- "상기 이중 결합 깨어짐(break)의 업스트림 서열들에 대한 상동성(homology)의 첫 번째 영역, 상기 세포의 게놈으로 삽입되는 서열, 상기 이중 결합 깨어짐(break)의 다운스트림 서열들에 대한 상동성(homology)의 두 번째 영역"에 의하여, 인 시츄(in situ)에서 DNA 표적의 5' 및 3' 영역들에 상동인(homologous) 첫 번째 및 두 번째 부분을 포함하는 매트릭스 또는 DNA 구조체(construct)를 의미하는 것으로 의도된다. DNA 구조체(construct)는 또한 인 시츄(in situ)에서 해당하는 DNA 서열에 일부 상동성(homology)을 포함하거나, 또는 대체하여, 인 시츄(in situ)에서 DNA 표적의 5' 및 3' 영역들과 상동성(homology)이 없는 것을 포함하는 첫 번째 및 두 번째 부분 사이에 위치하는 세 번째 부분을 포함할 수 있다. DNA 표적의 절단 후, 상동 재조합 이벤트(event)가 관심있는 자리(locus)에 포함되는 표적인 유전자를 포함하는 게놈 및 이 매트릭스 사이에서 자극되고, 이때 DNA 표적을 포함하는 게놈 서열은 매트릭스의 세 번째 부분 및 상기 매트릭스의 첫 번째 및 두 번째 부분(portions)들의 다른 부분(part)에 의하여 대체된다.

- "DNA 표적" "DNA 표적 서열", "표적 DNA 서열", "핵산 표적 서열", "표적 서열" 또는 "가공(processing) 자리(site)"에 의하여, 본 발명에 따른 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제에 의하여 표적화되고 가공될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열이 의도된다. 이들 용어들은 특이적 DNA 위치(location), 바람직하게는 세포 내 게놈의(genomic) 위치를 가리키나, 또한 플라스미드들, 에피솜들(episomes), 바이러스, 트랜스포존들(transposons)과 같은 유전적 물질들의 본체에 독립적으로, 또는 제한되지 않는 예로서, 미토콘드리아와 같은 세포 기관 내에 존재할 수 있는 유전적 물질의 부분이기도 하다. TALE-뉴클레아제 표적들의 제한되지 않는 예들로서, 표적이된 게놈 서열들은 보통 15-bp 스페이서(spacer)에 의하여 (반(half) 표적들로 불리는) 2 개의 17-bp 길이(long) 서열들로 구성된다. 각각의 반-표적은 EF1-알파 프로모터 또는 T7 프로모터의 통제 하, 플라스미드들에서 코드되는, 제한되지 않는 예들로서, 표들 1, 5, 6 및 10에 리스트된 TALE-뉴클레아제들의 반복들에 의하여 인식된다. 핵산 표적 서열은 표들 1, 5, 6 및 10에 표시된 바와 같이 상기 표적의 하나의 가닥의 5' 내지 3' 서열에 의하여 정의된다.

- 키메라 항원 수용체 (CAR)에 의하여, 표적 세포 상에 존재하는 성분에 대항한 결합 도메인을 결합(combine)하는 분자들이 의도되는데, 예를 들어, 특이적 항-표적 세포 면역 활성을 보이는 키메라 단백질을 만드는 T 세포 수용체-활성 세포내 도메인을 갖는, 원하는 항원 (예컨대, 종양 항원)에 대한 항체-베이스의 특이성이다. 보통, CAR는 T 세포 항원 수용체 복합체 제타(zeta) 체인 (scFvFc:ζ)의 세포내 신호전달(signaling) 도메인에 융합된 세포외 단일 체인 항체 (scFvFc)로 구성되고, T 세포들에서 발현될 때, 단일클론 항체의 특이성에 기초한 항원 인식을 다시 보낸다(redirect). 본 발명에서 사용한 CAR의 한 예는 CD19 항원에 대항하여 향해진(directing) CAR 이고, 제한되지 않는 예로서 아미노산 서열 : 서열번호: 73 을 포함할 수 있다.

- "전달(delivery) 벡터" 또는 "전달(delivery) 벡터들"에 의하여, 본 발명에서 필요로 하는 분자들(단백질들 또는 핵산들) 및 제제들/화학물질들(chemicals)을 세포 접촉(즉 "접촉하는")으로 들어가기 위하여 또는 세포이하(subcellular) 구획들(compartments)(즉, "도입하는") 또는 세포들 내로 전달하기 위하여 본 발명에서 사용될 수 있는 임의의 전달 벡터가 의도된다. 그것은 리포솜의(liposomal) 전달(delivery) 벡터들, 바이러스(viral) 전달(delivery) 벡터들, 약물 전달(delivery) 벡터들, 화학적 담체들, 폴리머 담체들, 리포플렉스들(lipoplexes), 폴리플렉스들(polyplexes), 덴드리머들(dendrimers), 마이크로버블들(microbubbles) (초음파 조영제들(ultrasound contrast agents)), 나노입자들(nanoparticles), 유화액들(emulsions) 또는 다른 적절한 이동(transfer) 벡터들을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 전달(delivery) 벡터들은 분자들, 화학물질들, 거대분자들(유전자들, 단백질들) 또는 Diatos에 의하여 개발된 펩타이드들, 플라스미드들과 같은 다른 벡터들의 전달을 허용한다. 이들 케이스들에서, 전달(delivery) 벡터들은 분자 담체들이다. "전달 벡터" 또는 "전달 벡터들"에 의하여 "형질주입(transfection)"을 수행하기 위하여 전달 방법들이 또한 의도된다.

- 용어 "벡터" 또는 "벡터들"은 그것이 연결된 것에 또다른 핵산을 이동시킬 수 있는 핵산 분자를 가리킨다. 본 발명에서 "벡터"는 염색체의, 비 염색체의, 반-합성 또는 합성 핵산들로 구성될 수 있는 벡터, 플라스미드, RNA 벡터 또는 선형 또는 환형(circular) DNA 또는 RNA 분자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 선호되는 벡터들은 그것들이 연결되는 것에 (발현 벡터들) 핵산들의 발현 및/또는 자율적인(autonomous) 복제(에피솜의(episomal) 벡터)가 가능한 것들이다. 상당수의 적절한 벡터들이 당업자들에게 알려져 있고 상업적으로 이용가능하다.

바이러스 벡터들은 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 파보바이러스(parvovirus) (예를 들어 아데노(adeno) 관련(associated) 바이러스들), 코로나바이러스(coronavirus), 오쏘믹소바이러스(orthomyxovirus)와 같은 음성(negative) 가닥 RNA 바이러스들 (예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 랍도바이러스(rhabdovirus) (예를 들어, 광견병(rabies) 및 수포성 구내염(vesicular stomatitis) 바이러스), 파라믹소바이러스(paramyxovirus) (예를 들어 홍역(measles) 및 센다이(Sendai)), 피코나바이러스(picornavirus) 및 알파바이러스(alphavirus)와 같은 양성(positive) 가닥 RNA 바이러스들, 및 헤르페스바이러스(herpesvirus) (예를 들어, 헤르페스(Herpes) 심플렉스(Simplex) 바이러스 타입들 1 및 2, 엡스타인(Epstein)-바(Barr) 바이러스, 사이토메가바이러스(cytomegalovirus)), 폭스바이러스(poxvirus) (예를 들어, 우두(vaccinia), 계두(fowlpox) 및 카나리아두창(canarypox)) 및 아데노바이러스(adenovirus)를 포함하는 이중 가닥 DNA 바이러스들을 포함한다. 다른 바이러스들은, 예를 들어, 노르워크(Norwalk) 바이러스, 토가바이러스(togavirus), 플라비바이러스(flavivirus), 레오바이러스들(reoviruses), 파포바이러스(papovavirus), 헤파드나바이러스(hepadnavirus), 및 간염(hepatitis) 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스들의 예들은 하기를 포함한다: 조류(avian) 백혈병(leukosis)-육종, 포유류(mammalian) C-타입, B-타입 바이러스들, D 타입 바이러스들, HTLV-BLV 군, 렌티바이러스(lentivirus), 스푸마바이러스(spumavirus)(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).

- "렌티바이러스(lentiviral) 벡터"에 의하여, 그것들의 상대적으로 큰 포장(packaging) 수용력, 감소된 면역원성 및 큰 범위의 다른 세포 타입들로 높은 효율로 형질도입(transduce)될 수 있는 그것들의 능력 때문에, 유전자 전달에 매우 유망한 HIV-베이스의 렌티바이러스(lentiviral) 벡터들을 의미한다. 렌티바이러스(lentiviral) 벡터들은 생산자(producer) 세포들 내로 3개(포장(packaging), 외피(envelope) 및 이동(transfer) 또는 그보다 많은 플라스미드들의 일시적인 형질주입(transfection) 후 보통 생긴다. HIV처럼, 렌티바이러스 벡터들은 세포 표면 상의 수용체들로 바이러스 표면 당단백질들의 상호작용을 통하여 표적 세포에 들어간다. 들어가면, 바이러스 RNA는 바이러스 역전사효소 복합체에 의하여 매게되는 역전사를 겪는다. 역전사의 산물은 이중-가닥의 선형 바이러스 DNA로, 이는 감염된 세포들의 DNA에서 바이러스 통합을 위한 기질이다. "통합하는(integrative) 렌티바이러스 벡터들 (또는 LV)"에 의하여, 표적 세포의 게놈에 통합될 수 있는, 제한되지 않는 예로서, 이러한 벡터들이 의미된다. "비-통합성(non-integrative) 렌티바이러스 벡터들 (또는 NILV)"에 의하여 대조적으로, 바이러스 인테그라제(integrase)의 작용을 통하여 표적 세포의 게놈으로 통합되지 않는 효율적인 유전자 전달(delivery) 벡터들이 의미된다.

- 전달 벡터들 및 벡터들은 초음파천공법(sonoporation) 또는 전기천공 또는 이들 기술들의 유도체들과 같은 임의의 세포 투과화(permeabilization) 기술들과 통합되거나 관련될 수 있다.

- 세포 또는 세포들에 의하여 인 비트로(in vitro) 배양들을 위한 이들 생물들로부터 유래한 임의의 진핵 생(living) 세포들, 초대(primary) 세포들 및 세포주들이 의도된다.

- "초대(primary) 세포" 또는 "초대 세포들"에 의하여, 집단 배가(population doublings)들이 거의 없게 겪어지고, 그러므로 연속적인 종양형성의 또는 인공적으로 불사화된(immortalized) 세포주들과 비교하여, 그것들이 유래된 조직들의 특성들 및 주된 기능적 성분들의 더욱 대표적인, 살아 있는 조직(즉, 조직검사 물질)로부터 직접 취해지고 인 비트로에서 성장을 위하여 확립된 세포들이 의도된다.

제한되지 않는 예들로서, 세포주들은 CHO-K1 세포들; HEK293 세포들; Caco2 세포들; U2-OS 세포들; NIH 3T3 세포들; NSO 세포들; SP2 세포들; CHO-S 세포들; DG44 세포들; K-562 세포들, U-937 세포들; MRC5 세포들; IMR90 세포들; Jurkat 세포들; HepG2 세포들; HeLa 세포들; HT-1080 세포들; HCT-116 세포들; Hu-h7 세포들; Huvec 세포들; Molt 4 세포들로 구성된 군드로부터 선택될 수 있다.

이들 모든 세포주들은 관심있는 유전자 또는 단백질을 생산하고, 발현시키고, 정량화하고, 검출하고, 연구사기 위하여 세포주를 제공하기 위하여 본 발명의 방법에 의하여 변형될 수 있다: 이들 모델들은 제한되지 않는 예들로서, 화학물질들(chemical), 바이오연료들, 치료법들 및 농경학(agronomy)과 같은 다양한 분야들 및 생산 및 연구에서 관심있는 생물학적으로 활성인 분자들은 스크리닝하는데도 또한 사용될 수 있다.

- "돌연변이"에 의하여 폴리뉴클레오타이드 (cDNA, gene) 또는 a 폴리펩타이드 서열에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 그보다 많은 뉴클레오타이드들/아미노산들까지의 치환, 결실, 삽입이 의도된다. 돌연변이는 유전자의 코딩 서열 또는 그것의 조절(regulatory) 서열에 영향을 미칠 수 있다. 그것은 코드된 mRNA의 구조/안정성 또는 게놈 서열의 구조에 영향을 미칠 수 있다.

- "변형(variant)(들)"에 의하여, 반복 변형, 변형, DNA 결합 변형, TALE-뉴클레아제 변형, 모(parent) 분자의 아미노산 서열의 적어도 하나의 잔기의 돌연변이 또는 대체에 의하여 수득되는 폴리펩타이드 변형이 의도된다.

- "기능적 변형"에 의하여 단백질 또는 a 단백질 도메인의 촉매적으로 활성인 돌연변이가 의도된다; 이러한 돌연변이는 그것의 모 단백질 또는 단백질 도메인에 비교하여 동일한 활성 또는 추가적인 특성들 또는 더 높거나 또는 더 낮은 활성을 가질 수 있다.

- "유전자"에 의하여, 특이적 단백질 또는 단백질의 부분(segment)을 코드하는, 염색체를 따라 선형 방식으로 배열된 DNA의 부분(segment)으로 구성되는 유전의 기본 단위가 의미된다. 유전자는 보통 프로모터, 5' 번역되지 않는 영역, 하나 또는 그보다 많은 코딩 서열들 (exons), 선택적으로 인트론들, 3' 번역되지 않는 영역을 포함한다. 유전자는 터미네이터(terminator), 인헨서(enhancers) 및/또는 사일런서(silencers)를 더 포함할 수 있다.

- 여기에 사용되었듯이, 용어 "자리(locus)"는 염색체 상 DNA 서열 (예를 들어 유전자의)의 특이적 물리적 위치이다. 용어 "자리(locus)"는 염색체 상 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제 표적 서열의 특이적 물리적 위치를 가리킬 수 있다. 이러한 자리(locus)는 본 발명에 따른 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제에 의하여 인식 및/또는 절단되는 표적 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 관심있는 자리(locus)가 세포의 유전적 물질의 본체 내(즉, 염색체 내)에 존재하는 핵산 서열에 자격을 줄(qualify) 뿐 아니라, 플라스미드들, 에피좀들(episomes), 바이러스, 트랜스포존들과 같은 유전적 물질의 상기 본체에 독립적으로 또는 제한되지 않는 예들로서 미토콘드리아와 같은 기관들 내 존재할 수 있는 유전적 물질의 부분일 수 있다는 것이 이해될 것이다.

- 용어 "엔도뉴클레아제(endonuclease)"는 DNA 또는 RNA 분자, 바람직하게는 a DNA 분자 내 핵산들 사이의 결합들의 가수분해(절단)을 촉매화할 수 있는 임의의 야생형 또는 변형 효소를 가리킨다. 엔도뉴클레아제들은 DNA 또는 RNA 분자를 그것의 서열에 개의치 않고 절단하지 않고, 특이적 폴리뉴클레오타이드 서열들에서 DNA 또는 RNA 분자를 인식하고 절단하며, "표적 서열들" 또는 "표적 부위들(sites)"로 표시된다. 엔도뉴클레아제들은 보통 12 염기쌍들(bp) 길이보다 큰, 더욱 바람직하게는 14-55 bp의, 폴리뉴클레오타이드 인식 부위를 가질 때, 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제들이라고 분류될 수 있다. 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제들은 정의된 자리(locus)에서 DNA 이중-가닥 깨어짐(double-strand breaks) (DSBs)을 유도함으로써 HR을 상당히 증가시킨다(Rouet, Smih et al. 1994; Choulika, Perrin et al. 1995; Pingoud and Silva 2007). 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제들은 예를 들어 호밍(homing) 엔도뉴클레아제 (Paques and Duchateau 2007), FokI와 같은 제한 효소의 촉매적 도메인을 갖는 조작된 징크-핑거 도메인들의 융합으로부터 야기된 키메라 징크(Zinc)-핑거(Finger) 뉴클레아제 (ZFN) (Porteus and Carroll 2005) 또는 화학적(chemical) 엔도뉴클레아제일 수 있다. 화학적 엔도뉴클레아제들에서 화학적 또는 펩타이드적(peptidic) 절단자는 핵산들의 폴리머 또는 특이적 표적 서열을 인식하는 또다른 DNA와 콘쥬게이트되어(conjugate), 이로써 특이적 서열에 대한 절단 활성을 표적화한다. 화학적 엔도뉴클레아제들은 또한 특이적 DNA 서열들에 결합한다고 알려진 트리플렉스(triplex)--형성(forming) 올리고뉴클레오타이드들(oligonucleotides) (TFOs), DNA 절단(cleaving) 분자 및 오소페난트롤린(orthophenanthroline)의 콘쥬게이트들과 같은 화학적 뉴클레아제들을 포함한다. 이러한 화학적 엔도뉴클레아제들은 본 발명에 따른 "엔도뉴클레아제" 용어 내에 포함된다.

희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제들은 잔토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원체들(pathogen)에 의한 감염 공정에 사용되는 단백질들의 패밀리인, 전사(Transcription) 활성제(Activator) 유사(Like) 반응기(Effector) (TALE)로부터 유래하는 DNA 결합 도메인 및 FokI 촉매적 도메인을 이용한, 새로운 종류의 키메라 뉴클레아제들인, 예를 들어 TALE-뉴클레아제들일 수 있다(Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al.). FokI-베이스의 TALE-뉴클레아제 (TALE-nuclease)의 기능적인 레이아웃(layout)은 기본적으로 TALE 도메인에 의하여 대체된 징크(Zinc)-핑거 DNA 결합 도메인을 갖고, ZFN의 그것이다. 보통 말하는 TALE-뉴클레아제에 의한 DNA 절단은 비특이적 중앙 영역의 측면에 배치되는(flanking) 2개의 DNA 인식 영역들을 요구한다. 본 발명에 포함되는 희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제들은 또한 TALE-뉴클레아제들로부터 유래할 수 있다.

희귀-절단(rare-cutting) 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제라는 명칭으로도 달려져 있는, 호밍(homing) 엔도뉴클레아제일 수 있다. 이러한 호밍(homing) 엔도뉴클레아제들은 당업계에 잘 알려져 있다(Stoddard 2005). 호밍(homing) 엔도뉴클레아제들은 DNA 표적 서열을 인식하고 단일- 또는 이중-가닥 깨어짐(break)을 만들어낸다. 호밍(homing) 엔도뉴클레아제들은 매우 특이적이며, 12 부터 45 까지의 염기쌍들 (bp) 길이의 범위의, 보통 14 부터 40 bp까지의 길이의 범위의 DNA 표적 부위들을 인식한다. 본 발명에 따른 호밍(homing) 엔도뉴클레아제들은 예를 들어 LAGLIDADG 엔도뉴클레아제 (서열번호: 127로 공개된 "LAGLIDADF")에, HNH 엔도뉴클레아제에, 또는 GIY-YIG 엔도뉴클레아제에 부합할 수 있다. 본 발명에 따른 선호되는 호밍(homing) 엔도뉴클레아제는 I-CreI 변형일 수 있다.

- "TALE-뉴클레아제(nuclease)" (TALEN)에 의하여 전사(Transcription) 활성제(Activator) 유사(Like) 반응기(Effector) (TALE)로부터 보통 유래하는 핵산-결합 도메인 및 핵산 표적 서열을 절단하기 위한 하나의 뉴클레아제 촉매적 도메인으로 구성되는 융합 단백질이 유도된다. 촉매적 도메인은 바람직하게는 뉴클레아제 도메인이고, 더욱 바람직하게는 예를 들어 I-TevI, ColE7, NucA 및 Fok-I과 같은 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 도메인이다. 특정 예에서, TALE 도메인은 예를 들어 I-CreI 및 I-OnuI 또는 그것의 기능적 변형(variant)과 같은 메가뉴클레아제에 융합될 수 있다. 더욱 선호되는 예에서, 상기 뉴클레아제는 모노머인 TALE-뉴클레아제(Nuclease)이다. 모노머인 TALE-뉴클레아제(Nuclease)는 WO2012138927에 기재된 I-TevI의 촉매적 도메인을 갖는 가공된 TAL 반복들의 융합들과 같은, 특이적 인식 및 절단을 위한 이합체화를 요구하지 않는 TALE-뉴클레아제(Nuclease)이다. 전사(Transcription) 활성제(Activator) 유사(Like) 반응기(Effector) (TALE)는 박테리아 종 잔타모나스(Xanthomonas)로부터의 단백질들로, 핵산 표적화된 서열의 각각의 뉴클레오타이드 염기에 특이적인 12 및 13 위치들 (RVD)의 두(di)-잔기들을 포함하는 각각의 반복인, 수많은 반복된 서열들을 포함한다. 유사한 모듈식(modular) 염기-당-염기(base-per-base) 핵산 결합 물성들(MBBBD)을 갖는 결합 도메인들은 또한 다른 박테리아 종들에서 출원인에 의하여 최근에 공개된 새로운 모듈식 단백질들로부터 유래될 수 있다. 새로운 모듈형 단백질들은 TAL 반복들(repeats)보다 더 서열 가변성(variability)을 보이는 이점을 갖는다. 바람직하게는 다른 뉴클레오타이드들의 인식과 관련된 RVD들(RVDs)은 C의 인식을 위한 HD, T의 인식을 위한 NG, A의 인식을 위한 NI, G 또는 A의 인식을 위한 NN, A, C, G 또는 T의 인식을 위한 NS, T의 인식을 위한 HG, T의 인식을 위한 IG, G의 인식을 위한 NK, C의 인식을 위한 HA, C의 인식을 위한 ND, C의 인식을 위한 HI, G의 인식을 위한 HN, G의 인식을 위한 NA, G 또는 A의 인식을 위한 SN 및 T의 인식을 위한 YG, A의 인식을 위한 TL, A 또는 G의 인식을 위한 VT 및 A의 인식을 위한 SW이다. 또다른 예에서, 중요한 아미노산들 12 및 13 은 뉴클레오타이드들 A, T, C 및 G에의 그것들의 특이성을 조절하기 위하여 그리고 특히 이 특이성을 증강시키기 위하여 다른 아미노산 잔기들로 돌연변이될 수 있다. TALE-뉴클레아제는 이미 기재되어 있으며, 유전자 표적화 및 유전자 변형들을 자극하기 위하여 사용된다(Boch, Scholze et al. 2009; Moscou and Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al. 2010; Li, Huang et al.). 조작된 TAL-뉴클레아제들은 TALENTM라는 상표 하 상업적으로 이용가능하다(Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 Paris, France).

- 용어 "절단(cleavage)"는 폴리뉴클레오타이드의 공유적(covalent) 백본(backbone)의 깨어짐을 가리킨다. 절단은 포스포다이에스터 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하는 여러가지 방법들에 의하여 시작될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 단일-가닥의 절담 및 이중-가닥의 절단 모두가 가능하며, 이중-가닥의 절단은 두 개의 구분되는 단일-가닥의 절단 이벤트들의 결과로서 발생할 수 있다. 이중 가닥의 DNA, RNA, 또는 DNA/RNA 혼성(hybrid) 절단은 뭉툭한(blunt) 말단들(ends) 또는 엇먹은(staggered) 말단들(ends)의 생산을 야기할 수 있다.

- "융합 단백질"에 의하여 원래 단백질들 각각으로부터 유래하는 기능적 물성들을 갖는 단일 폴리펩타이드를 야기하는 상기 "융합 유전자"의 번역, 분리된 단백질들 또는 그것들의 부분을 원래 코드하는 둘 또는 그 이상의 유전자들의 연결(joining)으로 구성되는 당업계에 잘 알려진 공정의 결과가 의미된다.

- "일치성(identity)"는 두 개의 핵산 분자들 또는 폴리펩타이드들 사이의 서열 일치성(identity)을 가리킨다. 일치성(identity)은 비교 목적을 위하여 정렬될 수 있는 각각의 서열 내 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열 내 위치가 동일한 염기에 의하여 차지될 때, 그 때 분자들은 그 위치에서 일치한다. 핵산 또는 아미노산 서열들 사이의 유사도(similarity) 또는 일치성(identity) 정도는 핵산 서열들에 의하여 공유되는 위치들에서 일치하거나 매칭되는 뉴클레오타이드들의 수의 기능이다. GCG 서열 분석 패키지의 일부로서 이용가능한 BLAST 또는 FASTA를 포함하여, 다양한 정렬(alignment) 알고리즘들 및/또는 프로그램들이 두 서열들 사이의 일치성(identity)을 계산하기 위하여 이용될 수 있고(University of Wisconsin, Madison, Wis.), 예컨대 디폴트(default) 세팅(setting)으로 이용될 수 있다. 예를 들어 여기에 기재된 특이적 폴리펩타이드들에 적어도 70%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 일치성(identity)을 갖고, 이러한 폴리펩타이드들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드에 더하여, 바람직하게는 동일한 기능들을 상당히 보이는 폴리펩타이드들이 고려된다.

- "유사도(similarity)"는 둘 또는 그보다 많은 폴리펩타이드들의 아미노산 서열들 사이의 관계를 말한다. BLASTP는 BLOSUM45, BLOSUM62 또는 BLOSUM80와 같은 유사도(similarity) 매트릭스를 이용하여 참고 아미노산 서열와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 99% 서열 유사도(similarity)를 갖는 아미노산 서열를 확인하는데 사용될 수 있다. 다르게 표시되지 않는 한, 유사도(similarity) 지수(score)는 BLOSUM62의 사용에 기초할 것이다. BLASTP가 이용될 때, 퍼센트 유사도(similarity)는 BLASTP 양성들(positives) 지수에 기초하고, 퍼센트 서열 일치성(identity) BLASTP 일치성들(identities) 지수에 기초한다. BLASTP "일치성들(Identities)"은 일치하는 높은 지수의 서열 쌍들 내 총 잔기들의 부분(fraction) 및 수를 보여주고; 그리고 BLASTP '양성(Positives)"은 서로 유사한, 양성 값들을 갖는 정렬 지수를 위한 잔기들의 부분 및 수를 보여준다. 여기에 기재된 아미노산 서열들에 대하여 유사도(similarity)의 일치성(identity)의 임의의 중간(intermediate) 정도 또는 일치성(identity) 또는 유사도(similarity)의 이들 정도를 갖는 아미노산 서열들은 이 문헌에 의하여 포함되며, 고려된다. 유사한 폴리펩타이드들의 폴리뉴클레오타이드 서열들은 유전부호(genetic code)를 이용하여 추정되며(deduce), 현행 수단들에 의하여 수득될 수 있다. 예를 들어, pT알파의 기능적 변형(variant)은 서열번호 : 107의 아미노산 서열에 대하여 70%, 75%, 80%, 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 97.5%, 98%, 99% 서열 유사도(similarity)를 가질 수 있다. 이러한 기능적 변형(variant)을 코드하는 폴리뉴클레오타이드는 유전 부호를 이용하여 그것의 아미노산 서열을 역번역함으로써(역(reverse) translating) 생산될 것이다.

- "신호-전달(signal-transducing) 도메인" 또는 "공-자극(co-stimulatory)" 리간드"는 T-세포 상의 관련이 있는(cognate) 공-자극 분자에 특이적으로 결합하는 항원 제시 세포 상 분자를 가리키며, 이로써, 예를 들어, 펩타이드가 로드된 MHC 분자로의 TCR/CD3 복합체의 결합에 의하여 제공되는 일차(primary) 신호에 더하여, 증식(proliferation) 활성화, 분화 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 T 세포 반응을 중개하는 신호를 제공하게 된다. 공-자극 리간드는 CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, inducible 공자극 igand (ICOS-L), 세포간 부착 분자 (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, 톨(Toll) 리간드 수용체에 결합하는 항체 또는 작용제(agonist) 및 B7-H3에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 공-자극 리간드는 또한 그 중에서도 CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능(function)-관련된(associated) 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, CD83에 특이적으로 결합하는 리간드와 같은, 그러나 이에 제한되는 것은 아닌, T 세포 상에 존재하는 공-자극 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.

"공-자극 분자"는 공-자극 리간드에 특이적으로 결합하는 T세포 상 관련이 있는(cognate) 결합 파트너를 가리키며, 이로써, 증식과 같은, 그러나 이에 제한되는 것은 아닌, 세포에 의한 공-자극 반응을 매개한다. 공-자극 분자들은 MHC 클래스(class) I 분자, BTLA 및 톨(Toll) 리간드 수용체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

여기에서 사용한 "공-자극 신호"는 TCR/CD3 연결(ligation)과 같은 일차(primary) 신호와 결합하여, 주요(key) 분자들의 상향조절 또는 하향조절 및/또는 T 세포 증식(proliferation)을 이끄는 신호를 가리킨다.

- "이중특이성(bispecific) 항체"는 단일 항체 분자 내 두 개의 다른 항원들을 위한 결합 부위들을 갖는 항체를 가리킨다. 기본형(canonical) 항체 구조에 더하여, 다른 분자들이 두 개의 결합 특이성들을 갖고 건설될 수 있다는 것은 당업자에게 쉽게 인식될 것이다. 이중특이적 항체에 의한 항원 결합이 동시 또는 순차적일 수 있다는 것도 ㅇ나아가 인식될 것이다. 이중특이적 항체들은 화학적 기술들에 의하여 (예컨대 Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 5807 참조), "폴리도마(polydoma)" 기술들에 의하여(U.S. Pat. No. 4,474,893 참조) 또는 그 자체가 잘 알려진 재조합 DNA 기술들에 의하여 생산될 수 있다. 제한되지 않는 예로서, 각각의 결합 도메인은 항체 중쇄(heavy chain)("VH 또는 H 영역")로부터의 적어도 하나의 가변(variable) 영역(region)을 포함하며, 이때 첫 번째 결합 도메인의 VH 영역(region)은 특이적으로 CD3와 같은 림프구 마커에 결합하고, 두 번째 결합 도메인의 VH 영역(region)은 종양 항원에 특이적으로 결합한다.

- 여기에서 사용된 용어 "세포외(extracellular) 리간드-결합 도메인"는 리간드에 결합할 수 있는 올리고- 또는 폴리펩타이드로 정의된다. 바람직하게는, 도메인은 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 세포외 리간드-결합 도메인은 특정 질병 상태와 관련된 표적 세포들 상의 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하기 위하여 선택될 수 있다. 이와 같이 리간드들로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커들의 예들은 바이러스, 박테리아, 및 기생충 자가면역질환 및 암 세포들과 관련된 것들을 포함한다.

여기에서 사용된 용어 "대상(subject)" 또는 "환자"는 비-인간 영장류들 및 인간들을 포함하는 동물 계(kingdom)의 모든 멤버들을 포함한다.

본 발명의 상기 기재한 설명은 그것을 이용하고 만드는 공정 및 방식을 제공하여, 당업자는 동일한 것을 만들고 이용할 수 있고, 특히 덧붙여진 청구항들의 주제를 위해 제공되는 실시가능성은 원래 명세서의 부분을 채운다.

수치 한정 또는 범위가 여기에 언급될 때, 종말점들(endpoints)이 포함된다. 또한 수치 한정 또는 범위 내 모든 값들 및 부분범위들(subranges)은 명쾌하게 쓴 것처럼 특이적으로 포함된다.

상기 명세서는 당업자가 본 발명을 만들고 이용하는 것을 가능하게 하기 위하여 주어지며, 그것의 요구 및 특정 적용의 문맥 상에서 제공된다. 바람직한 예들의 여러가지 변형들은 당업자에게 쉽게 분명할 것이며, 여기에서 정의된 포괄적인 원칙들은 본 발명의 범위 및 정신으로부터 벗어나지 않고 다른 예들 및 적용들에도 적용될 것이다. 그러므로 이 발명은 보여진 예들에 한정되는 것으로 의도되지 않고, 여기에 공개된 원칙들 및 특징들과 일치하는 가장 넓은 범위에 따른다.

이 발명을 일반적으로 기재하는 것, 더 나아간 이해는 다르게 특정되지 않는 한, 제한되는 것으로 의도되지 않고 오직 설명의 목적으로만 여기에 제공된, 특정 특이적 예들에 대한 참고로서 얻어질 수 있다.

실시예들

실시예 ( Example ) 1: 인간 GR 유전자를 절단하는 TALE -뉴클레아제들

인간 GR 유전자의 엑손들(exons)을 표적으로 하는 6개의 헤테로다이머인 TALE-뉴클레아제들이 설계되고 생산되었다. 하기 표 1은 각각의 TALE-뉴클레아제에 의하여 절단되는 표적 서열들을 나타낸다. GR TALE-뉴클레아제는 각각, 15-bp 스페이서(spacer)에 의하여 분리되는 (반(half) 표적들로 불리는) 두 개의 17-bp 길이 서열들로 구성되는 GR 표적 서열들을 절단하고 결합하도록 조작된 반복 서열을 포함하는, (반(half) TALE-뉴클레아제들이라 불리는) 2 개의 독립적 독립체들(entities)을 포함한다(compose).

표 1: 인간 GR 유전자 내 TALE-뉴클레아제들 표적 부위들의 서열들 및 GR TALE-뉴클레아제들의 설명.

N-말단(termianl), C-말단 도메인들 및 반복의 아미노산 서열들은 AvrBs3 TALE에 기초한다(참고: GenBank: X16130.1). 그 C-말단 및 N-말단(termianl) 도메인들 두 개의 BsmBI 제한 부위들에 의하여 분리된다. 원하는 서열들 (서열번호: 1 내지 6)을 표적으로 하는 반복(repeat) 어레이들(arrays)(서열번호: 7 내지 18)은 연이은 제한/연결(ligation)/세척 단계들 (국제 PCT 출원 WO2013/017950)을 포함하는(compose) 고형체(solid) 지지체(support) 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 간단히 말해서, (둘(di)-반복을 코드하는) 첫 번째 블럭(block)은 비오틴/스트렙타비딘(streptavidin) 상호작용을 통해 고형체 지지체 상에 고정화되었고, 두 번째 블럭(block) (삼(tri)-반복)은 그 다음에 첫 번째에 연결(ligate)되고, SfaNI 소화(digestion) 후 세 번째 블럭(bloc) (tri-repeat)이 커플링된다. 공정은 원하는 반복 어레이를 얻자마자 곧 삼- 또는 이- 반복 블럭들을 이용하여 반복되었다. 산물은 그 다음에 대장균 내 증폭을 위하여 전통적인 pAPG10 클로닝 플라스미드에서 클로닝되고, 시퀀싱되었다. 이와 같이 수득된 반복 어레이 서열들은 삽입된 반복 서열을 위한 SfaNI 및 BbvI 및 플라스미드를 받기 위하여 타입 IIS 제한 효소들 BsmBI를 이용하여 효모 발현 TALE 벡터에서 서브클로닝(subcloned)되었다. FokI 제한 효소의 촉매적 도메인에 융합되는 DNA 결합 도메인으로부터 유래하는 TALE를 포함하는, 반(half) TALE-뉴클레아제를 코드하는 DNA는 대장균에서 증폭되고, 표준 미니프렙(miniprep) 기술들에 의하여 회수되고, 삽입물(insert)의 온전성(integrity)을 평가하기 위하여 시퀀싱되었다.

효모 내 GR TALE -뉴클레아제들의 활성:

6 개의 GR-TALE-뉴클레아제들의 뉴클레아제 활성이 및 서열번호: 1 내지 6을 야기하는 15 bp들의 스페이서에 의하여 분리된 DNA 가닥 상 서로 마주 보는 두 개의 TALE 표적 서열들을 포함하는 표적들 상 (Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006)에서 그리고 전술한 우리의 효모 SSA 어세이(국제 PCT 출원들 WO 2004/067736에서 37 ℃ 및 30 ℃에서 테스트되었다. TALE-뉴클레아제 DNA 표적 서열들을 포함하는 모든 효모 표적 리포터(reporter) 플라스미드들은 (국제 PCT 출원들 WO 2004/067736 및 (Epinat, Arnould et al. 2003; Chames, Epinat et al. 2005; Arnould, Chames et al. 2006; Smith, Grizot et al. 2006에서) 전술한 바와 같이 건설되었다. 표적들 상 개개의 클론들의, 효모에서의, TALE-뉴클레아제 절단 활성 레벨들은 표 2에 나타나 있다.

표 2: 효모 내 GR TALE-뉴클레아제들의 절단 활성.

값들은 0 및 1 사이로 포함된다. 최대값은 1이다.

HEK293 세포들에서의 GR TALE -뉴클레아제들의 활성:

각각의 TALE-뉴클레아제 구조체(construct)는 pEF1알파(alpha) 긴(long) 프로모터의 통제 하 포유류(mammalian) 발현 벡터에서 제한 효소 소화(digestion)를 이용하여 서브클로닝되었다.

백만 HEK293세포들이 형질주입(transfection) 하루 전 접종되었다. 세포들은 제조업자의 지시에 따라 25μL의 리포펙타민(lipofectamine) (Invitrogen)을 이용하여 EF1알파(EF1alpha) 프로모터의 통제 하 GR 유전자 내 관심있는 두 반(half) 표적들 게놈 서열들을 인식하는, GRex2, GRex3T2, GRex3T4, GRex5T1, GRex5T2 또는 GRex5T3 TALE-뉴클레아제의 왼쪽 및 오른쪽 반(half)을 코드하는 두 개의 플라스미드들 각각의 2.5 μg과 공-형질주입되었다. 대조군으로서, 세포들은 EF1알파 프로모터의 통제 하 T-세포 수용체 알파 불변(constant) 체인 영역(region) (TRAC_T01) 표적 부위 ((TRAC_T01-L 및 -R TALE-뉴클레아제 (서열번호: 41 및 서열번호: 42, TRAC_T01 표적 부위 (서열번호: 37))를 표적으로 하는 TALE-뉴클레아제들의 왼쪽 및 오른쪽 반(half)을 코드하는 두 개의 플라스미드들 각각의 2.5 μg과 공-형질주입되었다. 서열을 코드하는 GR에서의 TALE-뉴클레아제들에 의하여 생기는 이중 가닥 깨어짐(break)은 비상동 말단 결합(non homologous end joining) (NHEJ)을 유도하는데, 이는 오류발생이 쉬운(error-prone) 메커니즘이다. TALE-뉴클레아제들의 활성은 표적이 된 게놈 자리(locus)에서 삽입들 또는 결실들의 빈도에 의하여 측정된다.

형질주입(transfection) 2 또는 7 일 후, 세포들이 수확되었으며, 하기 합성(composite) 프라이머들을 이용하여 추출된 게놈 DNA에 대하여 자리(locus) 특이적 PCR들이 수행되었다: 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-3' (포워드(forward) 어댑터(adaptator) 서열, 서열번호: 126)- 10N (TAG)- 자리(locus) 특이적 포워드(forward) 서열로 GR 2를 위한 것: 5'-GGTTCATTTAACAAGCTGCC-3' (서열번호: 127; 합성 프라이머로 서열번호: 31에서 공개된 것), GR 엑손 3를 위한 것: 5'-GCATTCTGACTATGAAGTGA-3' (서열번호: 128; 합성 프라이머로 서열번호: 32로 공개됨) 및 GR 엑손 5을 위한 것: 5'-TCAGCAGGCCACTACAGGAGTCTCACAAG-3' (서열번호: 129; 합성 프라이머로 서열번호: 33로 공개됨) 및 역(reverse) 합성 프라이머 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-3' (역(reverse) 어댑터(adaptor) 서열, SEQ ID No: 130))- 자리(locus) 특이적 역(reverse) 서열로 GR 엑손 2를 위한 것임 : 5'-AGCCAGTGAGGGTGAAGACG-3' (서열번호: 131; 합성 프라이머로 서열번호: 34로 공새됨), GR 엑손 3를 위한 것임 : 5'-GGGCTTTGCATATAATGGAA-3' (서열번호: 132; 합성 프라이머로 서열번호: 35로 공개됨) 그리고 GR 엑손 5를 위한 것임 : 5'-CTGACTCTCCCCTTCATAGTCCCCAGAAC-3' (서열번호: 133; 합성 프라이머로 서열번호: 36로 공개됨).

PCR 산물들 454 시퀀싱 시스템에 의하여 세퀀싱되었다(454 Life Sciences). 거의 10,000 개 서열들이 PCR 산물 당 수득되었고, 그리고나서 부위(site)-특이적 삽입 또는 결실 이벤트들의 존재가 분석되었다. 표 3은 샘플 내 서열들의 총 수 중 TALE-뉴클레아제 표적 부위에서 삽입들 또는 결실들을 보이는 서열들의 퍼센트를 표시한다. 표 3 에서, GRex2, GRex3T2 및 GRex3T4에 대한 리스트된 것은 대표 실시예의 결과들이다.

테스트된 모든 경우들에서, 돌연변이 유발의 %는 7일에서, 형질주입(transfection) 2일 째의 샘플 중 하나에 비교하여 유사하였다. 돌연변이 이벤트들의 성격들이 분석되었고, 삽입들에 비교하여 모든 경우들에서 다수의 결실들이 밝혀졌다.

표 3: 내생(endogenous) TALE-뉴클레아제에서 표적화된 돌연변이 유발의 퍼센트

HEK293 세포들 내 표적 부위들.

초대( primary ) T 림프구들 내 GR TALE -뉴클레아제들의 활성:

각각의 TALE-뉴클레아제 구조체(construct)는 T7 프로모터의 통제 하 발현 벡터에서 제한 효소 소화를 이용하여 서브클로닝되었다.

GR 게놈 서열들을 절단하는 TALE-뉴클레아제들을 코딩하는 mRNA는 T7 프로모터로부터 다운스트림 코딩 서열들을 갖는 플라스미드 각각으로부터 합성되었다. 말초 혈액으로부터 분리된 T 림프구들은 항-CD3/CD28 활성화제(activator) 비드들 (Life technologies)을 이용하여 5 일 동안 활성화되었고, 5백만 개의 세포들은 CytoLVT-P 기구(instrument) (BTX-Harvard apparatus)을 이용하여 반(half) TALE-뉴클레아제들 둘 다를 코딩하는 2 mRNA들 각각 10 μg으로 전기천공에 의하여 형질주입(transfect)되었다. CD52 유전자 (CD52_T02-L 및 -R TALEN (서열번호: 55 및 56), 표적 서열 CD52_T02 서열번호: 40)을 표적으로 하는 반(half) TALE-뉴클레아제들 둘 다를 코드하는 2 mRNA들 각각의 10 μg으로 형질주입된 T 세포들이 대조군으로 이용된다.

형질주입 후 3 및 7일에, 게놈 DNA가 형질주입된 세포들로부터 분리되었고, 전술한 프라이머들을 이용하여 자리(locus) 특이적 PCR들이 수행되었다. PCR 산물들이 454 시퀀싱 시스템 (454 Life Sciences)에 의하여 시퀀싱되었다. 10,000 개에 가까운 서열들이 PCR 산물 당 수득되었고, 그 다음에 부위-특이적 삽입 또는 결실 이벤트들의 존재가 분석되었다;결과들은 표 4에 있다.

표 4; 초대(primary) T 림프구들 내 내생(endogenous) TALE-뉴클레아제 표적 부위들에서 표적화된 돌연변이 유발의 퍼센트.

실시예 2: 인간 CD52 유전자, 인간 T-세포 수용체 알파 불변( constant ) 체인 (TRAC) 및 인간 T-세포 수용체 베타 불변( constant ) 체인들 1 및 2 ( TRBC )을 절단하는 TALE -뉴클레아제들

실시예 1에서 기재한 바와 같이, 각각 CD52, TRAC 및 TRBC 유전자들을 표적으로 하는 헤테로다이머인 TALE-뉴클레아제들이 설계되고 생산되었다. 표적이 된 게놈 서열들은 11 또는 15-bp 스페이서에 의하여 분리된 (반(half) 표적들이라고 불리는) 2 개의 17-bp 길이(long) 서열들로 구성된다. 각각의 반(half)-표적은 표 5에 리스트된 반(half) TALE-뉴클레아제들의 반복들에 의하여 인식된다. 인간 게놈은 두 개의 기능적인 T-세포 수용체 베타 체인들 (TRBC1 및 TRBC2)을 포함한다. 알파/베타 T 림프구들의 발달 동안, 이들 두 개의 불변(constant) 체인들 중 하나는 각각의 세포에서 선택되어, TCR-베타의 여러가지(variable) 영역으로 잇게 되고(splice), 기능적인 전장(full length) 베타 체인을 형성한다. 2 개의 TRBC 표적들이 TRBC1 및 TRBC2 사이의 보존된 서열들에서 선택되었고, 해당하는 TALE-뉴클레아제가 동시에 TRBC1 및 TRBC2 둘 다를 절단할 것이다.

표 5: 인간 해당하는 유전자들에서 TALE-뉴클레아제들 표적 부위들의 CD52, TRAC 및 TRBC TALE-뉴클레아제들 및 서열들의 설명.

TRAC 및 CD52 유전자들의 다른 표적 서열들이 설계되었으며, 이는 표 6에 나타나 있다.

표 6: TRAC 및 CD52 TALE-뉴클레아제들을 위한 추가적인 표적 서열들.

HEK293 세포들에서 CD52 - TALE -뉴클레아제, TRAC - TALE -뉴클레아제 및 TRBC -TALE-뉴클레아제의 활성

각각의 TALE-뉴클레아제 구조체(construct)는 pEF1알파 긴(long) 프로모터의 통제 하 포유류(mammalian) 발현 벡터에서 제한 효소 소화를 이용하여 서브클로닝되었다. 백만 개의 HEK293 세포들이 형질주입(transfection) 하루 전 접종되었다. 세포들은 제조업자의 지시에 따라 25 μl of 리포펙타민(lipofectamine) (Invitrogen)을 이용하여 5 μg의 대조군 pUC 벡터 또는 EF1-알파 프로모터의 통제 하 CD52 유전자, T-세포 수용체 알파 불변(constant) 체인 영역(region) (TRAC) 또는 T-세포 수용체 베타 불변(constant) 체인 영역(region) (TRBC)에서 관심있는 게놈 서열에서 2 개의 반(half) 표적들을 인식하는 TALE-뉴클레아제들을 코드하는 두 개의 플라스미드들 각각의 2.5 μg으로 공-형질주입되었다. CD52 또는 TRAC 코딩 서열들에서 TALE-뉴클레아제들에 의하여 생기는 이중 가닥의(stranded) 절단은 비상동 말단 결합(non homologous end joining)(NHEJ)에 의하여 살아 있는(live) 세포들에서 수선되는데, 이는 오류 발생이 쉬운(error-prone) 메커니즘이다. 살아있는 세포들에서 TALE-뉴클레아제들의 활성은 표적인 게놈 자리(locus)에서 삽입들 또는 결실들의 빈도에 의하여 측정된다. 형질주입(transfection) 48 시간 후, 게놈 DNA가 형질주입된 세포들로부터 분리되었고, 자리(locus) 특이적 PCR들이 하기 합성 프라이머들을 이용하여 수행되었다: 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG (포워드(forward) 어댑터(adaptor) 서열, 서열번호: 126)- 10N (TAG)- 자리(locus) 특이적 포워드(forward) 서열로 CD52를 위한 것임: 5'-CAGATCTGCAGAAAGGAAGC-3' (서열번호: 134; 합성 프라이머로, 서열번호: 66로서 공개됨), TRAC를 위한 것임: 5'-ATCACTGGCATCTGGACTCCA-3' (서열번호: 135; 합성 프라이머로, 서열번호: 67로 공개됨), TRBC1를 위한 것임: 5'-AGAGCCCCTACCAGAACCAGAC-3' (서열번호: 136; 합성 프라이머로서 서열번호: 68로 공개됨), 또는 TRBC2를 위한 것임: 5'- GGACCTAGTAACATAATTGTGC-3' (서열번호: 137; 합성 프라이머로서 서열번호: 69로 공개됨), 및 역(reverse) 합성 프라이머 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG (역(reverse) 어댑터(adaptor) 서열, 서열번호: 130)- 내생(endogenous) 자리(locus) 특이적 역(reverse) 서열로 CD52를 위한 것임: 5'-CCTGTTGGAGTCCATCTGCTG-3' (서열번호: 138; 합성 프라이머로서 서열번호: 70으로 공개됨), TRAC를 위한 것임: 5'-CCTCATGTCTAGCACAGTTT-3' (서열번호: 139; 합성 프라이머로서 서열번호: 71로 공개됨), TRBC1 및 TRBC2을 위한 것임: 5'- ACCAGCTCAGCTCCACGTGGT-3' (서열번호: 140; 합성 프라이머로서 서열번호: 72로 공개됨). PCR 산물들은 454 시퀀싱 시스템에 의하여 시퀀싱되었다 (454 Life Sciences). 10,000 개에 가까운 서열들이 PCR 산물 당 수득되었고 그 다음에 부위-특이적 삽입 또는 결실 이벤트들의 존재가 분석되었다;결과들은 표 7에 있다.

표 7: CD52_T02, TRAC_T01, TRBC_T01 및 TRBC_T02 표적들을 표적화하는 TALE-뉴클레아제에 대한 삽입-결실들(indels)의 퍼센트들.

초대( primary ) T 림프구들 내 CD52 - TALE -뉴클레아제, TRBC - TALE -뉴클레아제 및 TRAC - TALE -뉴클레아제의 활성

각각의 TALE-뉴클레아제 구조체(construct)가 T7 프로모터의 통제 하 포유류(mammalian) 발현 벡터 내 제한 효소 소화를 이용하여 서브클로닝되었다.

CD52 TRAC 및 TRBC 게놈 서열을 절단하는 TALE-뉴클레아제를 코드하는 mRNA가 T7 프로모터로부터 다운스트림 코딩 서열들을 갖는 플라스미드로부터 합성되었다. 말초 혈액로부터 분리되는 T 림프구들은 항-CD3/CD28 활성화제(activator) 비드들 (Life technologies)를 이용하여 5일 동안 활성화되었고, 그리고 5백만 개의 세포들이 그 다음에 CytoLVT-P 기구를 이용하여 반(half) TALE-뉴클레아제 둘 다를 코드하는 2개의 mRNA들 (또는 대조군들로서 코딩하지 않는(non coding) RNA) 각각 10 μg 으로 전기천공에 의하여 형질주입되었다. NHEJ에 의하여 유도되는 삽입들 및 결실들의 결과로서, CD52 및/또는 TRAC를 위한 코딩 서열은 비-기능적 유전자들을 야기하는 세포들의 부분에서 프레임을 벗어날 것이다(out of frame). 전기천공 5일 후, 세포들은, 그것들의 세포 표면에서 TCR 또는 CD52의 존재에 대한 유동세포 분석법(flow cytometry)에 의하여 플루오로크롬(fluorochrome)-콘쥬게이트된 항-CD52 또는 항-TCR 항체로 표지되었다. 말초 혈액으로부터 확장된 모든 T 림프구들이 보통 CD52 및 TCR를 발현시키기 때문에, CD52-음성(negative) 또는 TCR-음성(negative) 세포들의 비율은 TALE-뉴클레아제 활성의 직접적인 측정이다. 표 8에 대표 실시예의 결과들이 리스트되어 있다. 표 9는 TRBC TALE-뉴클레아제들의 효율을 테스트한 대표적 실시예의 결과들을 보여준다.

표 8: 대응하는 TALE-뉴클레아제-발현 폴리뉴클레오타이드들의 형질주입(transfection) 후 CD52- 음성, TCR-음성 및 CD52/TCR-이중 음성 T 림프구들의 퍼센트들.

표 9: TRBC TALE-뉴클레아제-발현 폴리뉴클레오타이드들의 형질주입(transfection) 후 TCR-음성 T 림프구들의 퍼센트들.

표적이 된 CD52 유전자로 T 세포들의 기능적 분석

CD52 유전자 불활성화의 목적은 T 림프구들을 항-CD52 항체 매개된 면역억제에 저항성으로 만드는 것이다. 앞의 절에서 기재한 바와 같이, T 림프구들은 CD52를 절단하는 TALE-뉴클레아제를 코드하는 mRNA로 형질주입(transfect)되었다. 형질주입(transfection) 7일 후, 세포들은 30% 토끼 보체(complement) (Cedarlane)와 함께 또는 없이, 50μg/ml 항-CD52 단일클론 항체 (또는 대조군으로서 래트 IgG)로 처리되었다. 37 ℃에서 배양 2 시간 후, 세포들은 형광성(fluorescent) 생존능(viability) 염료(dye)(eBioscience)를 포함하여 플루오로크롬-콘쥬게이트된 항-CD52 항체로 표지되었고, 살아있는 세포들 중 CD52-양성 및 CD52-음성 세포들의 빈도를 측정하기 위하여, 유동세포 분석법에 의하여 분석되었다. 도 6은 CD52-음성 세포들이 보체-매개된 항-CD52 항체 독성에 완전히 저항성이라는 것을 입증하는, 대표 실시예의 결과를 보여준다.

표적화된 TRAC 유전자로 T 세포들의 기능적 분석

TRAC 유전자 불활성화의 목적은 T 림프구들을 T-세포 수용체 자극에 반응하지 않게 만드는 것이다. 전의 절에서 기재한 바와 같이, T 림프구들은 TRAC 또는 CD52를 절단하는 TALE-뉴클레아제를 코드하는 mRNA로 형질주입되었다. 형질주입(transfection) 16 일 후, 세포들은 T 세포 수용체를 통하여 작용하는 T-세포 미토겐(mitogen)인, 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin) (PHA, Sigma-Aldrich) 5μg/ml까지로 처리되었다. 기능적인 T-세포 수용체를 갖는 세포들은 PHA 처리 후 크기가 증가하여야 한다. 배양 3일 후, 세포들은 플루오로크롬-콘쥬게이트된 항-CD52 또는 항-TCR 항체로 표지되었고, TCR-양성 및 TCR-음성 세포들 사이에서, 또는 CD52-양성 및 CD52-음성 세포들 사이에서 세포 크기 분포를 비교하기 위하여 유동세포 분석법에 의하여 분석되었다. 도 7은 TCR-양성 세포들이 PHA 처리 후 크기가 상당히 증가한 반면, TCR-음성 세포들은 처리되지 않은 세포들과 동일한 크기를 갖고 있다는 것을 보여주는데, 이는 TRAC 불활성화가 그것들을 TCR-신호전달(signaling)에 반응하지 않게 만들었다는 것을 가리킨다. 그에 반하여, CD52-양성 및 CD52-음성은 같은 정도로 크기가 증가한다.

표적이 된 CD52 및 TRAC 유전자들로 T 세포들의 기능적 분석

게놈 조작이 키메라 항원 수용체 (CAR)가 제공되었을 때 항-종양 활성을 보여주는 T 세포들의 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하기 위하여, 우리는 항-CD19 CAR을 코딩하는 RNA 10 μg 으로(서열번호: 73), CD52-TALE-뉴클레아제 및 TRAC-TALE-뉴클레아제로 표적화된 T 세포들을 형질주입하였다. 24 시간 후, T 세포들은 4 시간 동안 CD19 발현 다우디(Daudi) 세포들과 배양되었다. CD107a의 세포 표면 상향조절, T 림프구들에 의한 (탈과립(degranulation)이라 불리는) 세포독성 과립(granule) 방출의 마커가 유동세포 분석법 분석에 의하여 측정되었다(Betts, Brenchley et al. 2003). 결과들은 도 8에 포함되어 있으며, CD52-음성/TCRαβ-음성 세포들 및 CD52-양성/TCRαβ-양성이 PMA /이노마이신(ionomycin) (양성 대조군) 또는 CD19+ 다우디(Daudi) 세포들에 대응하여 탈과립시키는 동일한 능력을 갖는다는 것을 보여준다. CD107 상향조절은 CD19+의 존재에 의존적이다. 이들 데이터들은 통제된 항-종양 반응을 시작하기 위한 T 세포들의 능력에 부정적 영향을 갖지 않는다는 것을 제안한다.

초대 T 림프구들에서 CD52 - TALE -뉴클레아제 및 TRAC - TALE -뉴클레아제의 게놈 안전성

우리의 구조체들이 뉴클레아제 서브유닛들을 포함하기 때문에, 중요한 질문은 복수의 TALE-뉴클레아제 형질주입(transfection)이 '거의 맞먹는(close match)' 표적 서열들에서 또는 반(half)-TALE-뉴클레아제들의 짝짓기 오류에 의하여 표적을 벗어난 절단 및 유전독성을 이끌 수 있는지 여부이다. 세포 게놈들의 온전성에 대한 TRAC-TALE-뉴클레아제 및 CD52-TALE-뉴클레아제의 영향을 추산하기 위하여, 우리는 부위를 벗어난(off-site) 절단 잠재성을 보인 인간 게놈 내 서열들을 리스트화하였다. 이 리스트를 만들기 위하여, 우리는 게놈 내 모든 서열들을 원래의 반(half) 표적들과 비교하여 4 치환들까지 확인하였고, 그 다음에 서로로부터 9 내지 30 bp의 스페이서로 머리를 맞댄 방향으로(head to head orientation) 잠재적 반(half) 표적들의 쌍들을 확인하였다. 이 분석은 하나의 반(half)-TALE-뉴클레아제 분자의 호모다이머들에 의하여 또는 하나의 CD52 반(half) TALE-뉴클레아제 및 하나의 TRAC 반(half)-TALE-뉴클레아제에 의하여 형성된 헤테로다이머들에 의하여 잠재적으로 표적화된 부위들을 포함하였다. 우리는 (미스매치들이 반(half) 표적의 3' 말단에서 염기들에 대하여 더 잘 견디는) 치환들의 위치 및 개개의 치환들의 비용(cost)를 고려하여 특이성 데이터에 기초한 잠재적인, 부위를 벗어난(off-site) 표적들을 수치를 매겼다. 우리는 절단 가능성의 평가를 반영한 점수로 173 개의 고유한 서열들을 얻었다. 우리는 15개의 높은 수치들을 선택하였으며, CD52 및 TRAC TALE-뉴클레아제로 동시에 형질주입된 T 세포들 내 이들 위치들에서 발견된 돌연변이들의 빈도를 딥(deep) 시퀀싱(sequencing)에 의하여 분석하였고, CD52-음성, TCRαβ-음성으로 자성 분리에 의하여 정제하였다. 결과들은 표 9에 있다. 삽입/결실의 가장 높은 빈도는 7x10^-4이다. 이들 결과들은 추정상(putative) 부위외(offsite) 표적을 의도된 표적들보다 적어도 600 배 돌연변이될 가능성을 더 적게 만든다. 이 연구에서 사용된 TALE-뉴클레아제 시약들은 그러므로 극히 특이하게 보인다.

실시예 3: 인간 CTLA4 유전자 및 인간 PDCD1 유전자를 절단하는 TALE-뉴클레아제들.

실시예 1에서 기재한 바와 같이, 각각 PDCD1 및 CTLA4 유전자들을 표적으로 하는 헤테로다이머인 TALE-뉴클레아제들이 설계되고 생산되었다. 표적이 된 게놈 서열들은 11 또는 15-bp 스페이서에 의하여 분리된 (반(half) 표적들로 불리는) 2 개의 17-bp 길이(long) 서열들로 구성된다. 각각의 반(half)-표적은 표 10에 리스트된 반(half) TALE-뉴클레아제들의 반복들에 의하여 인식된다.

표 10: 인간 대응하는 유전자들에서 TALE-뉴클레아제들 표적 부위들의 CTLA4 및 PDCD1 TALE-뉴클레아제들 및 서열들의 설명

HEK293 세포들에서 CTLA4 - TALE -뉴클레아제 및 PDCD1 - TALE -뉴클레아제의 활성

각각의 TALE-뉴클레아제 구조체(construct)는 pEF1알파 긴(long) 프로모터의 통제 하 포유류(mammalian) 발현 벡터에서 제한 효소 소화를 이용하여 서브클로닝되었다. 백만 개의 HEK293 세포들은 형질주입(transfection) 하루 전 접종(seed)되었다. 세포들은 제조업자의 지시에 따라 25 μl의 리포펙타민(lipofectamine) (Invitrogen)을 이용하여 5 μg의 대조군 pUC 벡터 (pCLS0003) 또는 EF1-알파 프로모터의 통제 하 PDCD1 및 CTLA-4 유전자에서 관심있는 게놈 서열 내 2 개의 반(half) 표적들을 인식하는 TALE-뉴클레아제들을 코딩하는 2 개의 플라스미드들 각각 2.5 μg으로 공-형질주입되었다. PDCD1 또는 CTLA-4 코딩 서열들에서 TALE-뉴클레아제들에 의하여 일어나는 이중 가닥의 절단은 비상동 말단 결합(non homologous end joining) (NHEJ)에 의하여 살아있는 세포들에서 수선되며, 이는 오류 발생이 쉬운(error-prone) 메커니즘이다. 살아있는 세포들 내 TALE-뉴클레아제들의 활성은 표적인 게놈 자리(locus)에서 삽입들 또는 결실들의 빈도에 의하여 측정된다. 형질주입(transfection) 48 시간 후, 형질주입된 세포들로부터 게놈 DNA가 분리되었고, 자리(locus) 특이적 PCR들이 하기 합성 프라이머들을 이용하여 수행되었다: 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG (포워드(forward) 어댑터(adaptor) 서열, 서열번호: 126)- 10N (TAG)- 자리(locus) 특이적 포워드(forward) 서열 for CTLA4_T01: 5'-CTCTACTTCCTGAAGACCTG-3' (서열번호: 141; 합성 프라이머로 서열번호: 99로 공개됨), CTLA4_T03/T04를 위한 것임: 5'-ACAGTTGAGAGATGGAGGGG-3' (서열번호: 142; 합성 프라이머로, 서열번호: 100로 공개됨), PDCD1_T01를 위한 것임: 5'-CCACAGAGGTAGGTGCCGC-3' (서열번호: 143; 합성 프라이머로, 서열번호: 101로 공개됨) 또는 PDCD1_T03를 위한 것임: 5'-GACAGAGATGCCGGTCACCA-3' (서열번호: 144; 합성 프라이머로, 서열번호: 102로 공개됨) 및 역(reverse) 합성 프라이머 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG (역(reverse) 어댑터(adaptor) 서열, 서열번호: 130)- 내생(endogenous) 자리(locus) 특이적 역(reverse) 서열로 CTLA4_T01을 위한 것임: 5'-TGGAATACAGAGCCAGCCAA-3' (서열번호: 145; 합성 프라이머로 서열번호: 103로 공개됨), CTLA4_T03/T04를 위한 것임: 5'-GGTGCCCGTGCAGATGGAAT-3' (서열번호: 146; 합성 프라이머로 서열번호: 104로 공개됨), PDCD1_T01을 위한 것임: 5'-GGCTCTGCAGTGGAGGCCAG-3' (서열번호: 147; 합성 프라이머로 서열번호: 105로 공개됨) 또는 PDCD1_T03을 위한 것임: 5'-GGACAACGCCACCTTCACCT-3' (서열번호: 148; 합성 프라이머로 서열번호: 106으로 공개됨).

PCR 산물들은 T7-엔도뉴클레아제 어세이(assay)에 의하여 분석되었다:짧게, PCR 산물의 변성(denaturation) 및 재어닐링(reannealing) 후, T7 엔도뉴클레아제는 야생형 및 돌연변이 가닥들을 포함하는(composed) 미스매치된(mismatched) DNA를 특이적으로 소화시킬 것이다. 소화 산물은 그 다음에 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의하여 분해(resolve)된다. 소화된 산물의 존재는 TALE-뉴클레아제 활성에 의하여 유도된 돌연변이된 서열들을 나타낸다. 결과들은 도 10에 보였으며, 이 때 화살표들은 소화된 PCR 산물들을 가리킨다. 그것들은 PDCD1_T1, PDCD1_T3, CTLA4_T1, CTLA4_T3 및 CTLA4_T4 TALE-뉴클레아제들 모두가 그것들의 표적 부위들에서 돌연변이인 뉴클레아제 활성을 보인다는 것을 입증한다.

실시예 4: pT 알파는 불활성화된 TCR 알파 T 림프구들에서 CD3 표면 발현을 허용한다:

다른 프리 T알파 버젼들의 설명:

인간 pT알파 유전자는 세포외 Ig-유사(like) 도메인, 소수성 막횡단(transmembrane) 도메인 및 큰 C-말단 세포질내 꼬리(tail)를 포함하는 막횡단(transmembrane) 당단백질을 코드한다. 인간 pT알파 당단백질로부터 유래한 다른 버젼들이 설계되었으며 표 11에 기재되어 있고 도 11에 나타내어 있다.

표 11: pT알파 구조체들의 부분집단(subset)의 설명

테스트된 다른 프리T알파 구조체들은 하기를 포함한다:

1) pT알파(pTalpha) 결실 돌연변이체들: 다른 결실들이 (114 아미노산들을 포함하는) 인간 pT알파 단백질(서열번호: 107)의 세포내 세포질(cytoplasmic) 꼬리에서 만들어졌다. 테스트된 구조체들은 18, 48, 62, 78, 92, 110 및 114 아미노산들이 단백질의 C-말단으로부터 결실된 돌연변이체들 및 단백질 (FL)의 전장 버젼을 포함한다(서열번호: 108 내지 서열번호: 114).

2) 세포내 활성화 도메인들을 포함하는 pT알파 돌연변이체들: 그것들의 C-말단에서 CD8, CD28 또는 41BB 세포내 활성화 도메인들에 융합되는 FL 및 △48 변형들(서열번호: 115 내지 서열번호: 120).

3) pT알파/TCRα 키메라 돌연변이체들: 구조체들 중 하나에서, TCRα세포내 도메인 (IC) 이 pT알파의 꼬리-없는 버젼(△114)에 융합되었다(서열번호: 121). 두 번째 구조체(construct)는 또한 pT알파 세포외 도메인이 TCRα로부터 IC 도메인들 및 막횡단(transmembrane) (TM)에 융합된 것에서 만들어졌다(서열번호: 122).

4) pT알파 이합체화 돌연변이체들: 일부 돌연변이들은 올리고머화(oligomerisation)/이합체화(dimerisation)를 변화시킬 수 있는 것으로 문헌에 기재되어 왔다. 이들 돌연변이체들은 (프리TCR 올리고머화에 유도되는 것으로 추정되는) 구성적(constitutive)신호전달(signaling)을 유도하지 않고, 세포 표면에서 프리TCR 발현을 허용하도록 제안된다. 돌연변이체들은 pT알파△48 변형(variant)에 도입되었으며, 하기이다:

- 1xMUT: W46R (서열번호: 123)

- 4x MUT: D22A, K24A, R102A, R117A (서열번호: 124)

TRAC 불활성화된 주르카트 ( Jurkat ) 세포들 내 다른 프리 T알파 구조체들의 활성:

TCR알파 불활성화된 세포들에서 CD3 표면 발현을 회복시키는 그것들의 능력에 대한 다른 pT알파 변형들을 스크리닝하기 위하여, TRAC을 표적으로 하는 TALEN을 이용하여 TCR알파 유전자가 파괴(disrupt)된, 세포주가 만들어졌다. 주르카트(Jurkat) 세포들 (T-세포 백혈병 세포주)은 KO 세포들 (TCR_α/β ^NEG; CD3^NEG) 및 CytoPulse 전기천공을 이용하여 TRAC를 절단하는 TALEN을 코딩하는 플라스미드들로 형질주입되었고, 그 다음 CD3 자성 비드들을 이용하여 음성(negative) 선택에 의하여 정제되었다. KO 군(population) (JKT_KOx3 세포들)은 증폭되었고, 다른 pT알파 변형들의 스크리닝을 위하여 이용되었다. 스크리닝은 EF1α 프로모터의 통제 하 다른 pT알파 변형들을 코딩하는 플라스미드 15 μg 으로 백만개의 JKT_KOx3 세포들의 형질주입(transfection)에 의하여 수행되었다. 도 12는 유동세포 분석법에 의하여 결정된, CD3+ 세포들의 %에 기초한, JKT_KOx3 세포들에서의 FL, △18 및 △48 pT알파 구조체들의 활성 및 형질주입(transfection) 효율들(BFP+ 세포들의 %)의 대표 실시예이다. 다른 구조체들로부터의 결과들은 표 12에 분류되어 있다.

표 12: 주르카트(Jurkat) TCR 알파 불활성화된 세포들 내 다른 pT알파 구조체들의 활성.

활성은 다른 프리T알파 구조체들로 형질주입된 주르카트(jurkat) TCR 알파 불활성화된 세포들에서 CD3 발현의 유동세포 분석법 분석에 의하여 측정되었다.

TCR 알파 불활성화된 초대(primary ) T 림프구들에서 pT 알파- FL 및 pT 알파-△48의 활성:

TCR 알파 불활성화된 T 림프구들에서 CD3 표면 발현을 유도하기 위한 pT알파-FL 및 pT알파-△48 버젼들의 능력을 테스트하기 위하여, pT알파-FL 및 pT알파-△48 코딩 서열들이 SFFV 프로모터 하 푸른(Blue) 형광성(Fluorescent) 단백질 (BFP)를 코드하는 자가-불활성화시키는 pLV-SFFV-BFP-2A-PCTRA 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝되고, 뒤이어 T2A 펩타이드의 자가-절단이 따른다(도 13).

말초 혈액으로부터 분리되는 T 림프구들은 항-CD3/CD28 활성화제(activator) 비드들 (Life technologies)을 이용하여 72 시간 동안 활성화되었고, 4백 50만 개 세포들이 CytoLVT-S 기구 (BTX-Harvard Harbour)를 이용하여 TCR 알파 불변(constant) 체인 영역(region) (TRAC)를 표적으로 하는 TALE-뉴클레아제를 코딩하는 10 μg mRNA로 전기천공에 의하여 형질주입되었다. 전기천공 2일 후, T 세포들은 LV-SFFV-BFP-2A- pT알파-△48 또는 LV-SFFV-BFP-2A-대조군 렌티바이러스 벡터들로 형질도입되었다(transduced). CD3 음성(negative) 및 CD3낮은(low) T 세포들은 항-CD3 자성 비드들 (Miltenyi Biotech)를 이용하여 그 다음에 정제되었다. 이 실험적 프로토콜은 도 14A에 나타나 있다.

도 14B는 CD3 비드들로 정제 전 및 후 대조군 BFP 렌티바이러스 벡터 (KO/BFP) 또는 BFP-2A-pTalpha△48 (KO/△48) 로 형질도입된 TCR알파 불활성화된 T 세포들 (KO) 상 BFP 발현, TCR알파/베타 및 CD3 세포 표면 발현의 유동세포 분석법 분석을 나타낸다. BFP-T2A-pTalpha-△48 벡터 (BFP+ 세포들)로 형질도입된(transduced) TCR알파 불활성화된 세포들은 형질도입되지 않은 세포들 (BFP- 세포들)과 비교하여 CD3의 더 높은 레벨들을 보인다. 대조군 BFP 벡터로 형질도입된(transduced) 세포들 간에 차이가 관찰되지 않는다. 이들 결과들은 pT알파가 TCR알파 불활성화된 세포들의 세포 표면에서 CD3 발현의 회복을 매개한다는 것을 가리킨다. 대조적으로 TCR알파/베타 염색(staining)은, 예상한 바와 같이, pT알파-△48 발현 벡터로 형질도입(transduced)되거나 또는 그렇지 않은 세포들 간에 변화하지 않고 남아 있었다.

pT 알파- 매개된 CD3 발현은 TCR -결핍 T-세포들의 활성화를 지지한다:

세포 활성화 신호들을 전달하는(transduce) pT알파의 수용력(capacity)을 결정하기 위하여, 활성화 마커들의 초기(early) 및 후기(later) 발현이 pT알파-△48 및 pT알파-△48.41BB로 형질도입된, TCR 알파 불활성화된 T 세포들 상에서 분석되었다. pT알파-△48 및 pT알파-△48.41BB로 형질도입된 TCR 알파 불활성화된 T 세포들은 도 14A 및 앞의 섹션에서 기재한 바와 같이 초대(primary) 인간 T-세포들로부터 만들어졌다.

CD3를 통한 신호전달(signaling)을 검출하기 위하여, 세포들은 CD3 비드들로 TCR 알파 불활성화된 T 세포들의 정제 3일 후 항-CD3/CD28-코팅된 비드들을 이용하여 재활성화되었다(도 14A). 세포들은 재활성화 24 및 48 시간 후 각각 플루오로크롬-콘쥬게이트된 항-CD69 (초기(early) 활성화 마커) 및 항-CD25 (늦은(late) 활성화 마커)로 염색되었고, 유동세포 분석법으로 분석되었다(도 15A-B). 도 15A-B에 나타난 바와 같이, pT알파-△48 (KO/pTα-△48) 또는 pT알파-△48.41BB (KO/pTα-△48.BB) 를 발현시키는 TCR 알파 불활성화된 세포들은, TCR알파/베타 발현 세포들에서 관찰되는 것들과 유사한 레벨들로, 활성화 마커들의 상향조절을 보인다(NEP: 전기천공되지 않은(non electroporated) 세포들).

T 세포 활성화의 또다른 지표는 "블라스팅(blasting)"으로 가끔 가리켜진 세포 크기의 증가이다. "블라스팅"을 유도하는 프리TCR 복합체들의 능력이 항-CD3/CD28- 비드들을 이용한 재활성화 72 시간 후 세포 크기의 유동세포 분석법 분석에 의하여 측정되었다(도 15C). 항-CD3/CD28 비드들로 한 자극은 TCR알파/베타 복합체들을 발현시키는 세포들 대(vs.) pT알파-△48 또는 pT알파-△48.41BB를 발현시키는 세포들에서 비슷한 세포 크기 증가를 유도하였다. 이를 종합하면, 이들 결과들은 프리TCR 복합체들이 활성화 마커 상향조절을 매개하는 메커니즘들에 효과적으로 커플링된 신호들을 전달(transduce)하는데 괜찬다(competent)는 것을 제안한다.

pT 알파 매개된 ( mediated ) CD3 발현은 자극성 항- CD3 / CD28 항체들을 이용하여 TCR-결핍 초대( primary ) T-세포들의 확장을 지지한다.

장기 세포 증식을 지지하기 위한 프리TCR 복합체들의 능력을 평가하기 위하여, 전술한 바와 같이 만들어진 세포들의 증식(proliferation)이 측정되었다. 초기(initial) 활성화 10일 후, 세포들은 항-CD3/CD28 비드들로 IL2에서(재-작용(Re-act) 또는 IL2 (비-재-작용(non-Re-act))에서 유지되었다. 각각의 조건들에 대하여, 세포들은 세어지고(counted), BFP+ 세포들의 수를 추산하기 위하여 다른 시간 포인트들에서 유동세포 분석법에 의하여 분석되었다. BFP 또는 BFP-T2A-프리TCRα-△48 벡터들로 형질도입된 TCR알파 불활성화된 세포들 (KO)의 성장이 비교되었고, 이들 세포들의 배수(fold) 유도(induction)이 재활성화 2일 후 얻어직 값에 대하여 추산되었다(estimate). 도 16은 두 개의 독립적 도너들로 얻어진 결과들을 보여준다. 케이스들 둘 다, pT알파-△48 를 발현시키는 TCR알파 불활성화된 세포들은 BFP 대조군(control) 벡터만을 발현시키는 TCR 알파 불활성화된 세포들보다 더 큰 확장을 보였다. 두 번째 도너를 위하여, pT알파-△48.41BB 또는 전장(full-length) pT알파를 발현시키는 TCR알파 불활성화된 세포들 또한 유도되었고, 이 또한 BFP 대조군 벡터만을 발현시키는 TCR알파 불활성화된 세포들보다 더 큰 확장을 보였다.

실시예 5: 사이토펄스 기술을 이용한 T 세포들 내 mRNA 형질주입( transfection )의 최적화

최적화된 사이토펄스 ( cytopulse ) 프로그램의 결정

실시예들의 첫 번째 세트는 세포들이 형질주입될 수 있는 전압 범위를 결정하기 위하여 비 활성화된 PBMC들에서 수행되었다. 5개의 다른 프로그램들이 표 13에 기재된 바와 같이 테스트되었다.

표 13: PBMC 유래된(derived) T-세포들에서 전기천공에 요구되는 최소 전압을 결정하기 위하여 사용된 다른 사이토펄스 프로그램들

3 또는 6 백만개의 세포들이 다른 사이토펄스(Cytopulse) 프로그램들을 이용하여 대조군 플라스미드들 및 GFP를 코딩하는 플라스미드들 20 μg로 0.4 cm 갭(gap) 큐벳(cuvette) (30 또는 15x10⁶ 세포들/ml)에서 전기천공되었다. 전기천공 24 시간 후, 형질주입(transfection)의 효율을 결정하기 위하여 유동세포 분석법에 의하여 전기천공된 세포들에서 GFP 발현이 분석되었다. 도 17에 보인 데이터는 PBMC(derived) 유래된 T 세포들에서 플라스미드 전기천공에 요구되는 최소 전압을 표시한다. 이들 결과들은 사이토펄스 프로그램 3 및 4가 T 세포들의 효율적인 형질전환(transformation)을 허용한다는 것을 입증한다(EP#3 및 #4).

정제된 활성화된 T세포들의 mRNA 의 전기천공

T 세포들의 효율적인 DNA 전기천공을 허용하는 가장 좋은 사이토펄스 프로그램을 결정한 후, 우리는 이 방법이 mRNA 전기천공에 적용가능한지 테스트하였다.

PHA/IL2로 6일 전활성화된(preactivated) 5x10⁶ 의 정제된 T 세포들이 세포천공(cytoporation) 버퍼 T (BTX-Harvard apparatus)에서 재현탁되었고(resupend), 그리고 전의 섹션에서 결정한 대로 바람직한 사이토펄스 프로그램을 이용하여 pUC 또는 GFP를 코드하는 플라스미드들 20μg 또는 GFP를 코드하는 10μg 의 mRNA로 0.4 cm 큐벳들(cuvettes)에서 전기영동되었다.

표 14: 정제된 T-세포들을 전기천공하기 위하여 사용되는 사이토펄스(Cytopulse) 프로그램.

형질주입(transfection) 48 시간 후, 세포들은 생존능(viability) 염료(dye)로 염색되었고(eFluor-450), 그리고 독자생존 가능한(viable) GFP+ 세포들의 % 및 세포(cellular) 생존능(viability)이 세포 분석법 분석에 의하여 결정되었다(도 18).

도 18에 보인 데이터는 여기에서 결정된 최적 조건으로 하는 RNA 전기천공이 독성이 없으며, 독자생존 가능한(viable) 세포들의 95%보다 많은 형질주입(transfection)을 허용한다는 것을 가리킨다.

합성에서, 전체 데이터세트(dataset)는 T-세포들이 DNA 또는 RNA로 효율적으로 형질주입될 수 있다는 것을 보여준다. 특히, RNA 형질주입(transfection)은 세포 생존능에 영향이 없고, 그리고 세포군에서 관심있는 형질주입된 유전자의 균일한(uniform) 발현 레벨들을 허용한다.

효율적인 형질주입(transfection)은 사용된 활성화 방법에 독립적으로, 세포 활성화 후 일찍 달성될 수 있다 (PHA/IL-2 또는 CD3/CD28-코팅된-비드들). 본 발명자들은 >95%의 효율들로 활성화 후 72 시간으로부터 세포들을 형질주입하는데 성공했다. 게다가 해동(thawing) 후 T 세포들의 효율적인 형질주입(transfection) 및 활성화는 또한 동일한 전기천공 프로토콜을 이용하여 얻어질 수 있다.

TALE -뉴클레아제 기능적 발현을 위한 초대( primary ) 인간 T 세포들에서의 mRNA 전기천공

mRNA 전기천공아 초대(primary) 인간 T 세포들에서 효율적인 발현을 허용한다는 것을 입증한 후, 우리는 이 방법이 관심있는 다른 단백질들의 발현에 적용가능한지 테스트하였다. 전사(Transcription) 활성화제(activator)-유사(like) 반응기(effector) 뉴클레아제들 (TALE-nuclease)은 TAL DNA 결합 도메인의 DNA 절단 도메인에의 융합에 의하여 만들어지는 부위-특이적 뉴클레아제들이다. 그것들은 특히 임의의 원하는 DNA 서열에서 그것들이 이중-가닥 깨어짐들(breaks)을 유도하기 때문에 강력한 게놈 편집(editing) 도구(tool)이다. 이들 이중-가닥 깨어짐들(breaks)은 비상동 말단 결합(non-homologous end- joining)을 활성화시키는데, 이는 오류 발생이 쉬운(error-prone) DNA 수선 메커니즘으로, 관심있는 임의의 원하는 유전자의 불활성화를 잠재적으로 이끈다. 대체하여, 만약 적절한 수선 주형이 동시에 세포들에 도입된다면, TALE-뉴클레아제-유도된 DNA 깨어짐들(breaks)이 상동 재조합에 의하여 수선될 수 있고, 그러므로 변형할 가능성을 제공하는 것은 유전자 서열일 것이다.

우리는 T 세포 항원 수용체 (TRAC)의 알파 체인을 코드하는 인간 유전자에서 서열을 특이적으로 절단하도록 설계된 TALE-뉴클레아제를 발현하기 위하여 mRNA 전기천공을 이용하였다. 이 서열에서 유도된 돌연변이들은 세포 표면으로부터 TCRαβ 복합체의 상실 및 유전자 불활성화를 야기할 것으로 기대된다. 대조군으로서 코딩하지 않는(non coding RNA) 또는 TRAC TALE-뉴클레아제 RNA는 사이토펄스(Cytopulse) 기술을 이용하여 활성화된 초대(primary) 인간 T 림프구들 내로 형질주입된다. 전기천공 서열은 1200 V의 2 펄스들로 구성되고, 표 14에서 기재한 바와 같이 130 V 의 네 개의 펄스들이 뒤따른다.

전기천공 7 일 후 TCR 표면 발현의 유동세포 분석법 분석에 의하여(도 19, 위쪽 패널), 우리는 T 세포들의 44%가 TCRαβ의 발현을 상실하였다는 것을 관찰하였다. 우리는 TRAC 자리(locus)의 PCR 증폭 및 뒤이은 454 고성능(high throughput) 시퀀싱(sequencing)에 의하여 형질주입된 세포들의 게놈 DNA를 분석하였다. 시퀀싱된 대립 형질들(alleles)의 33%(2153 중 727)가 TALE-뉴클레아제 절단 부위에서, 삽입 또는 결실을 포함하였다. 도 19(바닥 패널)은 돌연변이된 대립형질들(alleles)의 예들을 보여준다.

이들 데이터들은 사이토펄스 기술을 이용한 mRNA의 전기천공이 TRAC TALE-뉴클레아제의 기능적 발현을 야기한다는 것을 가리킨다.

항- CD19 단일 체인 키메라 항원 수용체 ( CAR )을 코드하는 단일시스트론( monocistronic ) mRNA 로 T 세포들의 전기천공 :

IL2 및 항-CD3/CD28 코팅된 비드들로 며칠 동안(3-5) 전활성화된(preactivated) 5X10⁶ T 세포들이 세포천공(cytoporation) 버퍼 T에서 재현탁되었고, 그리고 표 14에서 기재된 프로그램을 이용하여 단일 체인 CAR (서열번호: 73)을 코드하는 mRNA 10 μg 로, 또는 mRNA 없이, 0.4cm 큐벳들에서 전기천공되었다.

전기천공 24 시간 후, 살아있는(live) 세포들 상에서 CAR의 세포 표면 발현을 평가하는데 특이적인 PE-콘쥬게이트된 염소 항(anti) 마우스(mouse) IgG F(ab')2 및 고정가능한(fixable) 생존능 염료 eFluor-780로 세포들이 염색되었다. 데이터는 도 20에 나타나 있다. 그것은 전술한 단일시스트론인(monocitronic) mRNA로 전기천공된 살아있는 T 세포들의 굉장히 많은 수가 그것들의 표면에서 CAR를 발현시킨다는 것을 가리킨다.

전기천공 24 시간 후, T 세포들은 6 시간 동안 다우디(Daudi) (CD19+) 세포들과 공배양(cocultured)되었고, 그리고 그것들의 표면에서 탈과립(degranulation) 마커 CD107a의 발현을 검출하기 위하여 유동세포 분석법에 의하여 분석되었다(Betts, Brenchley et al. 2003).

도 20에 보여지는 데이터는 전술한 단일시스트론인 mRNA로 전기천공된 세포들의 대부분이 CD19를 발현시키는 표적 세포들의 존재 하 탈과립시킨다는(degranulate) 것을 가리킨다. 이들 결과들은 전기천공된 T 세포들의 표면에서 발현된 CAR가 활성이라는 것을 명백히 입증한다.

항- CD19 멀티서브유닛( multisubunit ) 키메라 항원 수용체 ( CAR )를 코드하는 폴리시스트론인 mRNA 로 T 세포들의 전기천공 :

IL2 및 항(anti) CD3/CD28 코팅된 비드들로 며칠 (3-5) 전활성화된( preactivated) 5X10⁶ 개의 T 세포들이 세포천공(cytoporation) 버퍼 T에서 전기천공되었고, 표 14에 기재된 프로그램을 이용하여, 도 21A 및 도 4B (csm4)), 멀티-체인 CAR (서열번호: 226)를 코드하는 mRNA 45 μg 으로 또는 mRNA 없이 0.4cm 큐벳들에서 전기천공되었다.

전기천공 24 시간 후, 세포들은 살아있는 세포들 상 CAR 의 세포 표면 발현을 평가하는데 특이적인 PE-콘쥬게이트된 염소 항(anti) 마우스 IgG F(ab')2 단편 및 고정가능한 생존능 염료 eFluor-780으로 염색되었다. 도 21에 보여진 데이터는 전술한 폴리시스트론인(polycistronic) mRNA로 전기천공된 살아있는 T 세포들의 굉장히 많은 수가 그것들의 표면에서 CAR를 발현시킨다는 것을 가리킨다.

전기천공 24 시간 후, T 세포들은 6 시간 동안 다우디(Daudi) (CD19+)과 공배양되었고, 그것들의 표면에서 탈과립 마커 CD107a의 발현을 검출하기 위하여 유동세포 분석법을 분석되었다. 도 21에 보여진 데이터는 전술한 폴리시스트론인(polycistronic) mRNA로 전기천공된 세포들의 대다수가 CD19를 발현시키는 표적 세포들의 존재 하 탈과립시킨다(degranulate)는 것을 가리킨다. 이들 결과들은 전기천공된 T 세포들의 표면에서 발현되는 CAR이 활성이라는 것을 명백히 입증한다.

실시예 6: 멀티-체인 CAR 들

A. 멀티-체인 CAR 들의 설계

CD19 항원을 표적으로 하는 9 개의 멀티-체인 CAR들(CARs)이 IgE (FcεRI)를 위한 높은 고친화성(high affinity) 수용체를 기초로 설계되었다. 호염기성세포들(basophiles) 및 비만 세포들(mast 세포들) 상에서 발현된 FcεRI는 알레르기 반응들을 촉발시킨다. 그것은 단일 α 서브유닛 (서열번호: 202), 단일 β 서브유닛 (서열번호: 203) 및 두 개의 다이설파이드(disulfide)-연결된(linked) γ 서브유닛들 (서열번호: 204)를 포함하는(composed) 사량체(tetrameric) 복합체이다. α 서브유닛은 IgE-결합 도메인을 포함한다. β 및 γ 서브유닛들은 신호 전달(signal transduction)을 매개하는 ITAMs (서열번호: 198 및 서열번호: 199)를 포함한다(도 4A). 멀티-체인 CAR들은 도 4B, C 및 표 15에 기재한 바와 같이 설계되었다. 모든 멀티-체인 CAR에서, FcRα 체인의 세포외 도메인이 결실되고(deleted) 4G7scFv 및 CD8α 힌지(hinge) (서열번호: 206)에 의하여 대체되었다. 멀티-체인 CAR들 sm2, csm4, csm5, csm8 및 csm10에서, FcRγ 체인 및/또는 FcRβ 체인의 ITAM 이 결실되었다. 멀티-체인 CAR들 csm2, csm4, csm5, csm6, csm8, csm9 및 csm10에서, CD3

의 3 ITAM들(ITAMs)(서열번호: 197)은 FcRβ 체인 또는 FcRγ 체인에 추가되었다. 멀티-체인 CAR들 csm2, csm4, csm5, csm6, csm7, csm8, csm9 및 csm10에서, 4-1BB 세포내 도메인 (서열번호: 200)이 FcRα 체인, FcRβ 체인 또는 FcRγ 체인에 추가되었다. 멀티-체인 CAR csm10에서, CD28 세포내 도메인이 FcRα 체인 (서열번호: 201)에 추가되었다.

표 15: 멀티-체인 CAR들 버젼들의 체인들 조성물들의 설명.

B. 일시적으로 발현된 멀티-체인 CAR들은 T 세포들 활성화를 촉발시킬 수 있다.

멀티-체인 CAR 들은 폴리시스트론인 mRNA 의 전기천공 후 인간 T 세포들에서 발현될 수 있다.

T 세포들은 캡이 있고(capped) 그리고 폴리아데닐화된(polyadenylated) 폴리시스트론인(polycistronic) mRNA (도 21A)로 전기천공되었는데, 이는 mMESSAGE mMACHINE 키트및 주형으로서 선형화된(linearized) 플라스미드들을 이용하여 생산되었다. 주형으로서 이용된 플라스미드들은 T7 RNA 폴리메라제(polymerase) 프로모터에 뒤이은 csm1, csm2, csm4, csm5, csm6, csm7, csm8, csm9 또는 csm10을 코드하는 DNA 서열(서열번호: 224 내지 232)을 포함하였다.

인간 T 세포들 내로 폴리시스트론인 mRNA들의 전기천공은 하기 프로토콜을 따라 CytoLVT-S 장치(Cellectis)를 이용하여 하였다: IL2 및 항(anti) CD3/CD28 코팅된 비드들로 며칠 (3-5) 전처리된 5X10⁶ T 세포들이 세포천공(cytoporation) 버퍼 T에서 재현탁되었고, 그리고 표 14 PBMC3 프로그램을 이용하여 45 μg 의 mRNA 과 0.4cm 큐벳들에서 전기천공되었다.

전기천공 24 시간 후, 멀티-체인 CAR들을 코드하는 폴리시스트론인 mRNA들을 이용하여 조작된 인간 T 세포들은 특이적 PE-콘쥬게이트된 염소 항(anti) 마우스 IgG F(ab')2 단편 및 고정가능한 생존능 염료 eFluor-780로 표지되었고, 유동세포 분석법으로 분석되었다. 도 22에서 보인 데이터는 폴리시스트론인 mRNA들을 이용하여 조작된 살아있는(live) T 세포들이 멀티-체인 CAR들 csm1, csm2, csm4, csm5, csm6, csm7, csm8, csm9 및 csm10를 발현시켰다는 것을 가리킨다.

FcεRI에 대한 문헌들에 기재된 바와 같이, 멀티서브유닛(multi-subunit) CAR들의 발현은 3 체인들의 발현에 의하여 좌우된다(condition). α 체인 단독은 α + γ 체인들 복합체보다 덜 발현되고, 그리고 α + γ 체인들 복합체는 α + β + γ 체인들 복합체보다 덜 발현된다 도 23.

일시적으로 멀티-체인 CAR 들을 발현시키는 인간 T 세포들은 표적 세포들과 공배양후 탈과립시킨다 .

전기천공 24 시간 후, 멀티-체인 CAR들을 코드하는 폴리시스트론인 mRNA들을 이용하여 조작된 인간 T 세포들은 6 시간 동안 대조군 (K562) 세포들 또는 표적 (Daudi)와 공배양되었다. CD8+ T 세포들은 그 다음에 그것들의 표면에서 탈과립 마커 CD107a 의 발현을 검출하기 위하여(detect) 유동세포 분석법으로 분석되었다. 도 24에 보인 데이터는 멀티-체인 CARs csm1, csm2, csm4, csm5, csm6, csm7, csm8, csm9 및 csm10 를 발현시키는 인간 CD8+ T 세포들이 표적 세포들을 발현시키는 CD19 와의 공배양에서 탈과립시키고(degranulate) 그러나 대조군 세포들과의 공배양에서는 그러하지 않다는 것을 가리킨다.

멀티-체인 CAR 들을 일시적으로 발현시키는 인간 T 세포들은 표적 세포들과 공배양 후 사이토카인들을 분비한다.

전기천공 24 시간 후, 멀티-체인 CAR들을 코드하는 폴리시스트론인 mRNA들을 이용하여 조작된 인간 T 세포들은 24 시간 동안 대조군 (K562) 세포들 또는 표적 (Daudi)과 공배양되었다. 상청액들(supernatants)은 그 다음에 수확되었고, T 세포들에 의하여 생산된 사이토카인들을 정량화하기(quantify) 위하여 TH1/TH2 사이토카인(cytokine) 혈구계산(cytometric) 비드 어레이 키트를 이용하여 분석되었다. 도 25A-C에서 보인 데이터는 멀티-체인 CARs csm1, csm2, csm4, csm5, csm6, csm7, csm8, csm9 및 csm10를 발현시키는 인간 T 세포들이 CD19 발현(expressing) 표적 세포들과의 공배양에서, IFNγ, IL8 및 IL5 을 생산하나, 대조군 세포들과의 공배양에서는 그렇지 않다는 것을 가리킨다.

멀티-체인 CAR 들을 일시적으로 발현시키는 인간 T 세포들은 표적 세포들을 용해시킨다

전기천공 24 시간 후, 멀티-체인 CAR들을 코드하는 폴리시스트론인 mRNA들을 이용하여 조작된 인간 T 세포들은 4 시간 동안 대조군 (K562) 세포들 또는 표적 (Daudi)와 공배양되었다. 표적 세포들은 그 다음에 그것들의 생존능(viability)을 분석하기 위하여 유동세포 분석법으로 분석되었다. 도 26에 보인 데이터는 멀티-체인 CARs csm1, csm2, csm4, csm5, csm6, csm7, csm8, csm9 및 csm10을 발현시키는 세포들이 CD19 발현(expressing) 표적 세포들을 용해(lyse)시키나, 대조군 세포들에서는 그렇지 않다는 것을 가리킨다.

본 명세서에서 인용된 참고문헌들의 리스트

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atcgattacc catacgatgt tccagattac 60 gctatcgata tcgccgatct acgcacgctc ggctacagcc agcagcaaca ggagaagatc 120 aaaccgaagg ttcgttcgac agtggcgcag caccacgagg cactggtcgg ccacgggttt 180 acacacgcgc acatcgttgc gttaagccaa cacccggcag cgttagggac cgtcgctgtc 240 aagtatcagg acatgatcgc agcgttgcca gaggcgacac acgaagcgat cgttggcgtc 300 ggcaaacagt ggtccggcgc acgcgctctg gaggccttgc tcacggtggc gggagagttg 360 agaggtccac cgttacagtt ggacacaggc caacttctca agattgcaaa acgtggcggc 420 gtgaccgcag tggaggcagt gcatgcatgg cgcaatgcac tgacgggtgc cccgctcaac 480 ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag 540 acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 600 gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 660 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 720 gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 780 cacggcttga ccccccagca ggtggtggcc atcgccagca atggcggtgg caagcaggcg 840 ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 900 caggtggtgg ccatcgccag ccacgatggc ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 960 ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc 1020 agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1080 caggcccacg gcttgacccc ccagcaggtg gtggccatcg ccagcaatgg cggtggcaag 1140 caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1200 ccggagcagg tggtggccat cgccagcaat attggtggca agcaggcgct ggagacggtg 1260 caggcgctgt tgccggtgct gtgccaggcc cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc 1320 atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg 1380 ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt 1440 ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 1500 ttgaccccgg agcaggtggt ggccatcgcc agccacgatg gcggcaagca ggcgctggag 1560 acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 1620 gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg 1680 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 1740 gatggcggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 1800 cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 1860 ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccggag 1920 caggtggtgg ccatcgccag caatattggt ggcaagcagg cgctggagac ggtgcaggcg 1980 ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccctc agcaggtggt ggccatcgcc 2040 agcaatggcg gcggcaggcc ggcgctggag agcattgttg cccagttatc tcgccctgat 2100 ccggcgttgg ccgcgttgac caacgaccac ctcgtcgcct tggcctgcct cggcgggcgt 2160 cctgcgctgg atgcagtgaa aaagggattg ggggatccta tcagccgttc ccagctggtg 2220 aagtccgagc tggaggagaa gaaatccgag ttgaggcaca agctgaagta cgtgccccac 2280 gagtacatcg agctgatcga gatcgcccgg aacagcaccc aggaccgtat cctggagatg 2340 aaggtgatgg agttcttcat gaaggtgtac ggctacaggg gcaagcacct gggcggctcc 2400 aggaagcccg acggcgccat ctacaccgtg ggctccccca tcgactacgg cgtgatcgtg 2460 gacaccaagg cctactccgg cggctacaac ctgcccatcg gccaggccga cgaaatgcag 2520 aggtacgtgg aggagaacca gaccaggaac aagcacatca accccaacga 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gaccccccag caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt 540 ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc 600 ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc agcaataatg gtggcaagca ggcgctggag 660 acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg 720 gtggccatcg ccagccacga tggcggcaag caggcgctgg agacggtcca gcggctgttg 780 ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc ccccagcagg tggtggccat cgccagcaat 840 ggcggtggca agcaggcgct ggagacggtc cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggcc 900 cacggcttga ccccggagca ggtggtggcc atcgccagcc acgatggcgg caagcaggcg 960 ctggagacgg tccagcggct gttgccggtg ctgtgccagg cccacggctt gaccccccag 1020 caggtggtgg ccatcgccag caatggcggt ggcaagcagg cgctggagac ggtccagcgg 1080 ctgttgccgg tgctgtgcca ggcccacggc ttgacccccc agcaggtggt ggccatcgcc 1140 agcaatggcg gtggcaagca ggcgctggag acggtccagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 1200 caggcccacg gcttgacccc ggagcaggtg gtggccatcg ccagcaatat tggtggcaag 1260 caggcgctgg agacggtgca ggcgctgttg ccggtgctgt gccaggccca cggcttgacc 1320 ccggagcagg tggtggccat cgccagccac 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gcagtgaaaa agggattggg ggatcctatc 2220 agccgttccc agctggtgaa gtccgagctg gaggagaaga aatccgagtt gaggcacaag 2280 ctgaagtacg tgccccacga gtacatcgag ctgatcgaga tcgcccggaa cagcacccag 2340 gaccgtatcc tggagatgaa ggtgatggag ttcttcatga aggtgtacgg ctacaggggc 2400 aagcacctgg gcggctccag gaagcccgac ggcgccatct acaccgtggg ctcccccatc 2460 gactacggcg tgatcgtgga caccaaggcc tactccggcg gctacaacct gcccatcggc 2520 caggccgacg aaatgcagag gtacgtggag gagaaccaga ccaggaacaa gcacatcaac 2580 cccaacgagt ggtggaaggt gtacccctcc agcgtgaccg agttcaagtt cctgttcgtg 2640 tccggccact tcaagggcaa ctacaaggcc cagctgacca ggctgaacca catcaccaac 2700 tgcaacggcg ccgtgctgtc cgtggaggag ctcctgatcg gcggcgagat gatcaaggcc 2760 ggcaccctga ccctggagga ggtgaggagg aagttcaaca acggcgagat caacttcgcg 2820 gccgactgat aa 2832 <210> 57 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAC_T02 : Synthetic oligonucleotide <400> 57 tttagaaagt tcctgtgatg tcaagctggt cgagaaaagc tttgaaaca 49 <210> 58 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 151 ttgctctcac cagtata 17 <210> 152 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 152 tcactcttac ctggacc 17 <210> 153 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 153 tctcagatga tacaccc 17 <210> 154 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 154 tgatcccaca gaaatac 17 <210> 155 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 155 ttcctctaac ctgtatt 17 <210> 156 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 156 tagtccccca gatatga 17 <210> 157 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 157 ttgtcacaca tataccg 17 <210> 158 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 158 taactcttac ctgtagt 17 <210> 159 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 159 ttactccaac taactat 17 <210> 160 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 160 tggctcatac ctgtagt 17 <210> 161 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 161 ttgctcatac atgtgca 17 <210> 162 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 162 ttgtcccaca gacattc 17 <210> 163 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 163 tcacacctgg tacatag 17 <210> 164 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 164 ttgtcccaca gctaccc 17 <210> 165 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 165 tctcaactga aacaagg 17 <210> 166 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 166 ccgtgtacca gctgaga 17 <210> 167 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 167 ggtacaggta agagcaa 17 <210> 168 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 168 ttttcaggta agtgcaa 17 <210> 169 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 169 cctacaggtt aagggcca 18 <210> 170 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 170 agtacaggca tgagcca 17 <210> 171 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 171 gcatttctgt gggatca 17 <210> 172 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 172 gatccaggta aggtcaa 17 <210> 173 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 173 aaggtgtgga tgaggaa 17 <210> 174 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 174 tggtatttgt gtgacaa 17 <210> 175 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 175 agatttctct ggggcaa 17 <210> 176 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540 agcatcagct gccggtccag caagagcctg ctgaacagta acggaaacac atacctctac 600 tggtttctgc agaggcccgg ccagagccct cagctgctga tttaccgcat gtcaaatctt 660 gcctctgggg tgcccgatag atttagtggg agcggatccg gcacagcttt tacattgcgg 720 atctccagag tcgaggccga agacgtgggg gtctattact gtatgcaaca cctggaatac 780 ccctttacct tcggagccgg cacaaagctg gagctgaagc gggctgacac cacaaccccc 840 gctccaaggc cccctacccc cgcaccaact attgcctccc agccactctc actgcggcct 900 gaggcctgtc ggcccgctgc tggaggcgca gtgcatacaa ggggcctcga tttcgcctgc 960 gattttttta tcccattgtt ggtggtgatt ctgtttgctg tggacacagg attatttatc 1020 tcaactcagc agcaggtcac atttctcttg aagattaaga gaaccaggaa aggcttcaga 1080 cttctgaacc cacatcctaa gccaaacccc aaaaacaaca gagccgaggg cagaggcagc 1140 ctgctgacct gcggcgacgt ggaggagaac ccaggcccca tggacacaga aagtaatagg 1200 agagcaaatc ttgctctccc acaggagcct tccagtgtgc ctgcatttga agtcttggaa 1260 atatctcccc aggaagtatc ttcaggcaga ctattgaagt cggcctcatc cccaccactg 1320 catacatggc tgacagtttt gaaaaaagag caggagttcc tgggggtaac acaaattctg 1380 actgctatga tatgcctttg ttttggaaca gttgtctgct ctgtacttga tatttcacac 1440 attgagggag acattttttc atcatttaaa gcaggttatc cattctgggg agccatattt 1500 ttttctattt ctggaatgtt gtcaattata tctgaaagga gaaatgcaac atatctggtg 1560 agaggaagcc tgggagcaaa cactgccagc agcatagctg ggggaacggg aattaccatc 1620 ctgatcatca acctgaagaa gagcttggcc tatatccaca tccacagttg ccagaaattt 1680 tttgagacca agtgctttat ggcttccttt tccactgaaa ttgtagtgat gatgctgttt 1740 ctcaccattc tgggacttgg tagtgctgtg tcactcacaa tctgtggagc tggggaagaa 1800 ctcaaaggaa acaaggttcc agaggatcgt gtttatgaag aattaaacat atattcagct 1860 acttacagtg agttggaaga cccaggggaa atgtctcctc ccattgattt aaaacggggc 1920 cggaagaagc tcctctacat ttttaagcag cctttcatgc ggccagtgca gacaacccaa 1980 gaggaggatg ggtgttcctg cagattccct gaggaagagg aaggcgggtg cgagctgggt 2040 tctggcgtga aacagacttt gaattttgac cttctcaagt tggcgggaga cgtggagtcc 2100 aacccagggc ccatgattcc agcagtggtc ttgctcttac tccttttggt tgaacaagca 2160 gcggccctgg gagagcctca gctctgctat atcctggatg ccatcctgtt tctgtatgga 2220 attgtcctca ccctcctcta ctgtcgactg aagatccaag tgcgaaaggc agctataacc 2280 agctatgaga aatcagatgg tgtttacacg ggcctgagca ccaggaacca ggagacttac 2340 gagactctga agcatgagaa accaccacag agagtgaagt tctccaggag cgcagatgcc 2400 cccgcctatc aacagggcca gaaccagctc tacaacgagc ttaacctcgg gaggcgcgaa 2460 gaatacgacg tgttggataa gagaaggggg cgggaccccg agatgggagg aaagccccgg 2520 aggaagaacc ctcaggaggg cctgtacaac gagctgcaga aggataagat ggccgaggcc 2580 tactcagaga tcgggatgaa gggggagcgg cgccgcggga aggggcacga tgggctctac 2640 caggggctga gcacagccac aaaggacaca tacgacgcct tgcacatgca ggcccttcca 2700 ccccggtga 2709 <210> 229 <211> 2373 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> csm7 : Synthetic polynucleotide <400> 229 atggctcctg ccatggaatc ccctactcta ctgtgtgtag ccttactgtt cttcgctcca 60 gatggcgtgt tagcagaggt gcagttgcag cagtcagggc cagagttgat taagcccgga 120 gcctccgtca agatgtcctg caaggccagc gggtacactt tcaccagcta cgtcatgcat 180 tgggtgaagc agaagccagg ccaggggctt gagtggattg ggtacatcaa cccctacaac 240 gacgggacca aatacaacga gaaattcaag ggcaaagcca cactcacctc cgataagtcc 300 tcctctaccg cctacatgga gctcagctcc ctgacctccg aggatagcgc tgtgtattac 360 tgcgcaaggg gcacatacta ctatggctct agggtgttcg actactgggg gcagggcact 420 actctcacag tgagctcagg cggaggaggc agtggcggag ggggaagtgg gggcggcggc 480 agcgatattg tcatgaccca ggcagcccct agtatccctg tgactccagg cgagagcgtg 540 agcatcagct gccggtccag caagagcctg ctgaacagta acggaaacac atacctctac 600 tggtttctgc agaggcccgg ccagagccct cagctgctga tttaccgcat gtcaaatctt 660 gcctctgggg tgcccgatag atttagtggg agcggatccg gcacagcttt tacattgcgg 720 atctccagag tcgaggccga agacgtgggg gtctattact gtatgcaaca cctggaatac 780 ccctttacct tcggagccgg cacaaagctg gagctgaagc gggctgacac cacaaccccc 840 gctccaaggc cccctacccc cgcaccaact attgcctccc agccactctc actgcggcct 900 gaggcctgtc ggcccgctgc tggaggcgca gtgcatacaa ggggcctcga tttcgcctgc 960 gattttttta tcccattgtt ggtggtgatt ctgtttgctg tggacacagg attatttatc 1020 tcaactcagc agcaggtcac atttctcttg aagattaaga gaaccaggaa aggcttcaga 1080 cttctgaacc cacatcctaa gccaaacccc 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ctgacctccg aggatagcgc tgtgtattac 360 tgcgcaaggg gcacatacta ctatggctct agggtgttcg actactgggg gcagggcact 420 actctcacag tgagctcagg cggaggaggc agtggcggag ggggaagtgg gggcggcggc 480 agcgatattg tcatgaccca ggcagcccct agtatccctg tgactccagg cgagagcgtg 540 agcatcagct gccggtccag caagagcctg ctgaacagta acggaaacac atacctctac 600 tggtttctgc agaggcccgg ccagagccct cagctgctga tttaccgcat gtcaaatctt 660 gcctctgggg tgcccgatag atttagtggg agcggatccg gcacagcttt tacattgcgg 720 atctccagag tcgaggccga agacgtgggg gtctattact gtatgcaaca cctggaatac 780 ccctttacct tcggagccgg cacaaagctg gagctgaagc gggctgacac cacaaccccc 840 gctccaaggc cccctacccc cgcaccaact attgcctccc agccactctc actgcggcct 900 gaggcctgtc ggcccgctgc tggaggcgca gtgcatacaa ggggcctcga tttcgcctgc 960 gattttttta tcccattgtt ggtggtgatt ctgtttgctg tggacacagg attatttatc 1020 tcaactcagc agcaggtcac atttctcttg aagattaaga gaaccaggaa aggcttcaga 1080 cttctgaacc cacatcctaa gccaaacccc aaaaacaaca aacggggccg gaagaagctc 1140 ctctacattt ttaagcagcc tttcatgcgg ccagtgcaga 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gggtacactt tcaccagcta cgtcatgcat 180 tgggtgaagc agaagccagg ccaggggctt gagtggattg ggtacatcaa cccctacaac 240 gacgggacca aatacaacga gaaattcaag ggcaaagcca cactcacctc cgataagtcc 300 tcctctaccg cctacatgga gctcagctcc ctgacctccg aggatagcgc tgtgtattac 360 tgcgcaaggg gcacatacta ctatggctct agggtgttcg actactgggg gcagggcact 420 actctcacag tgagctcagg cggaggaggc agtggcggag ggggaagtgg gggcggcggc 480 agcgatattg tcatgaccca ggcagcccct agtatccctg tgactccagg cgagagcgtg 540 agcatcagct gccggtccag caagagcctg ctgaacagta acggaaacac atacctctac 600 tggtttctgc agaggcccgg ccagagccct cagctgctga tttaccgcat gtcaaatctt 660 gcctctgggg tgcccgatag atttagtggg agcggatccg gcacagcttt tacattgcgg 720 atctccagag tcgaggccga agacgtgggg gtctattact gtatgcaaca cctggaatac 780 ccctttacct tcggagccgg cacaaagctg gagctgaagc gggctgacac cacaaccccc 840 gctccaaggc cccctacccc cgcaccaact attgcctccc agccactctc actgcggcct 900 gaggcctgtc ggcccgctgc tggaggcgca gtgcatacaa ggggcctcga tttcgcctgc 960 gattttttta tcccattgtt ggtggtgatt ctgtttgctg tggacacagg attatttatc 1020 tcaactcagc agcaggtcac atttctcttg aagattaaga gaaccaggaa aggcttcaga 1080 cttctgaacc cacatcctaa gccaaacccc aaaaacaaca aacggggccg gaagaagctc 1140 ctctacattt ttaagcagcc tttcatgcgg ccagtgcaga caacccaaga ggaggatggg 1200 tgttcctgca gattccctga ggaagaggaa ggcgggtgcg agctgagagc cgagggcaga 1260 ggcagcctgc tgacctgcgg cgacgtggag gagaacccag gccccatgga cacagaaagt 1320 aataggagag caaatcttgc tctcccacag gagccttcca gtgtgcctgc atttgaagtc 1380 ttggaaatat ctccccagga agtatcttca ggcagactat tgaagtcggc ctcatcccca 1440 ccactgcata catggctgac agttttgaaa aaagagcagg agttcctggg ggtaacacaa 1500 attctgactg ctatgatatg cctttgtttt ggaacagttg tctgctctgt acttgatatt 1560 tcacacattg agggagacat tttttcatca tttaaagcag gttatccatt ctggggagcc 1620 atattttttt ctatttctgg aatgttgtca attatatctg aaaggagaaa tgcaacatat 1680 ctggtgagag gaagcctggg agcaaacact gccagcagca tagctggggg aacgggaatt 1740 accatcctga tcatcaacct gaagaagagc ttggcctata tccacatcca cagttgccag 1800 aaattttttg agaccaagtg ctttatggct tccttttcca 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tgcacatgca ggcccttcca 2700 ccccggtga 2709 <210> 232 <211> 2670 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> csm10 : Synthetic polynucleotide <400> 232 atggctcctg ccatggaatc ccctactcta ctgtgtgtag ccttactgtt cttcgctcca 60 gatggcgtgt tagcagaggt gcagttgcag cagtcagggc cagagttgat taagcccgga 120 gcctccgtca agatgtcctg caaggccagc gggtacactt tcaccagcta cgtcatgcat 180 tgggtgaagc agaagccagg ccaggggctt gagtggattg ggtacatcaa cccctacaac 240 gacgggacca aatacaacga gaaattcaag ggcaaagcca cactcacctc cgataagtcc 300 tcctctaccg cctacatgga gctcagctcc ctgacctccg aggatagcgc tgtgtattac 360 tgcgcaaggg gcacatacta ctatggctct agggtgttcg actactgggg gcagggcact 420 actctcacag tgagctcagg cggaggaggc agtggcggag ggggaagtgg gggcggcggc 480 agcgatattg tcatgaccca ggcagcccct agtatccctg tgactccagg cgagagcgtg 540 agcatcagct gccggtccag caagagcctg ctgaacagta acggaaacac atacctctac 600 tggtttctgc agaggcccgg ccagagccct cagctgctga tttaccgcat gtcaaatctt 660 gcctctgggg tgcccgatag atttagtggg agcggatccg gcacagcttt tacattgcgg 720 atctccagag tcgaggccga agacgtgggg gtctattact gtatgcaaca cctggaatac 780 ccctttacct tcggagccgg cacaaagctg gagctgaagc gggctgacac cacaaccccc 840 gctccaaggc cccctacccc cgcaccaact attgcctccc agccactctc actgcggcct 900 gaggcctgtc ggcccgctgc tggaggcgca gtgcatacaa ggggcctcga tttcgcctgc 960 gattttttta tcccattgtt ggtggtgatt ctgtttgctg tggacacagg attatttatc 1020 tcaactcagc agcaggtcac atttctcttg aagattaaga gaaccaggaa aggcttcaga 1080 cttctgaacc cacatcctaa gccaaacccc aaaaacaacc ggagcaagcg gagcagaggc 1140 ggccacagcg actacatgaa catgaccccc agacggcctg gccccacccg gaagcactac 1200 cagccctacg ccccacccag ggactttgcc gcctaccggt ccagagccga gggcagaggc 1260 agcctgctga cctgcggcga cgtggaggag aacccaggcc ccatggacac agaaagtaat 1320 aggagagcaa atcttgctct cccacaggag ccttccagtg tgcctgcatt tgaagtcttg 1380 gaaatatctc cccaggaagt atcttcaggc agactattga agtcggcctc atccccacca 1440 ctgcatacat ggctgacagt tttgaaaaaa gagcaggagt tcctgggggt aacacaaatt 1500 ctgactgcta tgatatgcct ttgttttgga acagttgtct gctctgtact tgatatttca 1560 cacattgagg gagacatttt ttcatcattt aaagcaggtt atccattctg gggagccata 1620 tttttttcta tttctggaat gttgtcaatt atatctgaaa ggagaaatgc aacatatctg 1680 gtgagaggaa gcctgggagc aaacactgcc agcagcatag ctgggggaac gggaattacc 1740 atcctgatca tcaacctgaa gaagagcttg gcctatatcc acatccacag ttgccagaaa 1800 ttttttgaga ccaagtgctt tatggcttcc ttttccactg aaattgtagt gatgatgctg 1860 tttctcacca ttctgggact tggtagtgct gtgtcactca caatctgtgg agctggggaa 1920 gaactcaaag gaaacaaggt tccagagaaa cggggccgga agaagctcct ctacattttt 1980 aagcagcctt tcatgcggcc agtgcagaca acccaagagg aggatgggtg ttcctgcaga 2040 ttccctgagg aagaggaagg cgggtgcgag ctgggttctg gcgtgaaaca gactttgaat 2100 tttgaccttc tcaagttggc gggagacgtg gagtccaacc cagggcccat gattccagca 2160 gtggtcttgc tcttactcct tttggttgaa caagcagcgg ccctgggaga gcctcagctc 2220 tgctatatcc tggatgccat cctgtttctg tatggaattg tcctcaccct cctctactgt 2280 cgactgaaga tccaagtgcg aaaggcagct ataaccagct atgagaaatc aagagtgaag 2340 ttctccagga gcgcagatgc ccccgcctat caacagggcc agaaccagct ctacaacgag 2400 cttaacctcg ggaggcgcga agaatacgac gtgttggata agagaagggg gcgggacccc 2460 gagatgggag gaaagccccg gaggaagaac cctcaggagg gcctgtacaa cgagctgcag 2520 aaggataaga tggccgaggc ctactcagag atcgggatga agggggagcg gcgccgcggg 2580 aaggggcacg atgggctcta ccaggggctg agcacagcca caaaggacac atacgacgcc 2640 ttgcacatgc aggcccttcc accccggtga 2670

Claims

적어도 하기를 포함하는 멀티-체인 CAR:
- 적어도 하나의 세포외 리간드-결합 도메인을 포함하는 하나의 막횡단 폴리펩타이드 및;
- 적어도 하나의 신호(signal)-전달(transducing) 도메인을 포함하는 하나의 막횡단 폴리펩타이드;
상기 폴리펩타이드들은 서로 조립하여 멀티-체인 키메라 항원 수용체를 형성한다.
제 1항에 있어서,
적어도 하나의 막횡단 폴리펩타이드가 Fc 수용체 또는 그것의 변형의 부분을 포함하는,
멀티-체인 키메라 항원 수용체.
제 2항에 있어서,
Fc 수용체는 (a) FcεRI 알파 체인. (b) FcεRI 베타 체인 및 (c) FcεRI 감마 체인:으로 구성되는 군으로부터 선택되는,
멀티-체인 키메라 항원 수용체.
제 3항에 있어서,
상기 FcεRI 알파 체인은 적어도 하나의 세포외 리간드-결합 도메인에 융합되는,
멀티-체인 키메라 항원 수용체.
제 3항 또는 제 4항에 있어서,
FcεRI 알파 체인의 부분 및 FcεRI 베타 체인의 부분 또는 그것들의 변형을 포함하여, 상기 FcεRI 체인들이 서로 이합체화되어 다이머인 키메라 항원 수용체를 형성하는,
멀티-체인 키메라 항원 수용체.
제 3항 또는 제 4항에 있어서,
FcεRI 알파 체인의 부분 및 FcεRI 감마 체인의 부분 또는 그것들의 변형을 포함하여, 상기 FcεRI 체인들이 서로 삼합체화되어 트라이머(trimeric)인 키메라 항원 수용체를 형성하는,
멀티-체인 키메라 항원 수용체.
제 3항 또는 제 4항에 있어서,
FcεRI 알파 체인의 부분, FcεRI 베타 체인의 부분 및 FcεRI 감마 체인의 부분 또는 그것의 변형들을 포함하여, 상기 FcεRI 체인들이 서로 사합체화되어 테트라머인(tetrameric) 키메라 항원 수용체를 형성하는,
멀티-체인 키메라 항원 수용체.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포외 리간드-결합 도메인은 단일 체인 항원 단편(single chain antibody fragment) (scFv)인,
멀티-체인 키메라 항원 수용체.
제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 막횡단 폴리펩타이드는 줄기 영역을 더 포함하는,
멀티-체인 키메라 항원 수용체.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 신호(signal) 전달(transducing) 도메인은 TCR 제타 체인, FCεRβ 체인, FcεRIγ 체인, 면역수용체(immunoreceptor) 티로신(tyrosine)-베이스의(based) 활성화(activation) 모티프(motif) (ITAM)로 구성되는 군으로부터 선택되는,
멀티-체인 키메라 항원 수용체.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
CD28, OX40, ICOS, CD137 및 CD8로 구성된 군으로부터 선택되는 공-자극 분자를 더 포함하는,
멀티-체인 키메라 항원 수용체.
제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 202 내지 서열번호: 204 및 서열번호: 206 내지 서열번호: 213 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩타이드들을 포함하는,
멀티-체인 키메라 항원 수용체.
제 1항 내지 제 12항 주 어느 한 항에 따른 멀티-체인 CAR을 포함하는(composing) 적어도 하나의 막횡단 폴리펩타이드를 코드하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 멀티-체인 CAR을 포함하는(composing) 둘 또는 그보다 많은 막횡단 폴리펩타이드들을 코드하는 핵산 서열들을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
제 13항 또는 제 14항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
하기를 포함하는 면역 세포의 조작 방법:
(a) 면역 세포를 제공하는 단계;
(b) 적어도 하나의, 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 멀티-체인 키메라 항원 수용체를 상기 세포들의 표면에서 발현시키는 단계.
하기를 포함하는 제 16항의 면역 세포의 조작 방법:
(a) 면역 세포를 제공하는 단계;
(b) 적어도 하나의, 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 멀티-체인 키미라 항원 수용체를 포함하는(composing) 폴리펩타이드들을 코드하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포 내에 도입하는 단계;
(c) 상기 세포 내로 상기 폴리뉴클레오타이드들을 발현시키는 단계.
하기를 포함하는, 제 16항의 면역 세포의 조작 방법;
(a) 면역 세포를 제공하는 단계;
(b) 각각 다른 세포외 리간드-결합 도메인들을 포함하는, 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 멀티-체인 키메라 항원 수용체들의 군을 상기 세포의 표면에서 발현시키는 단계.
하기를 포함하는, 제 17항의 면역 세포의 조작 방법:
(a) 면역 세포를 제공하는 단계;
(b) 각각 다른 세포외 리간드 결합 도메인들을 포함하는, 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 멀티-체인 키메라 항원 수용체들의 군을 포함하는(composing) 폴리펩타이드들을 코드하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포에 도입하는 단계.
제 16항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 방법으로부터 수득가능한, 분리된 면역 세포.
적어도 하나의, 제 1항 내지 제 12항 주 어느 한 항의 멀티-체인 키메라 항원 수용체를 포함하는, 분리된 면역 세포.
의약으로서 그것의 용도를 위한,
제 20항 또는 제 21항의 분리된 면역 세포.
염증성 T-림프구들, 세포독성 T-림프구들, 조절성 T-림프구들 또는 헬퍼 T-림프구들로부터 유래된,
제 20항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 분리된 세포.
하기를 포함하는 그것을 필요로 하는 환자의 치료 방법:
a) 제 16항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 수득가능한 면역 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 환자에 상기 T-세포들을 투여하는 단계,
제 24항에 있어서,
상기 면역 세포들은 도너들로부터 회수되는,
환자의 치료 방법.
제 24항에 있어서,
상기 면역 세포들은 환자들로부터 회수되는,
환자의 치료 방법.