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JP2017522884A - がん免疫療法のためのEGFRvIII特異的キメラ抗原受容体 - Google Patents

がん免疫療法のためのEGFRvIII特異的キメラ抗原受容体 Download PDF

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Abstract

本発明は、免疫細胞の特異性および反応性を選択された膜抗原に対して再指向化することができる組換えキメラタンパク質である、およびより特定すれば、細胞外リガンド結合が、EGFRvIIIモノクローナル抗体に由来するscFVであり、EGFRvIII陽性細胞に対して特異免疫を付与するキメラ抗原受容体(CAR)に関する。このようなCARを備えたTCR KO操作された免疫細胞は、肺がん、肛門がん、および多形性神経膠芽腫を処置するのに特に適している。【図1】

Description

本発明は、免疫細胞の特異性および反応性を、神経膠芽腫、神経膠腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、および前立腺癌を含めたヒト腫瘍に見つかる細胞表面糖タンパク質であるEGFRvIIIに対して再指向化(redirect)することができる組換えキメラタンパク質であるキメラ抗原受容体(CAR)に関する。本発明によるCARは、T細胞またはNK細胞内で発現されるとき、EGFRvIII抗原を持つ悪性細胞を処置するのに特に有用である。得られる操作された免疫細胞は、悪性細胞に対して高レベルの特異性を示し、免疫療法に安全性および有効性を付与する。
養子免疫療法は、ex vivoで生成される自己抗原特異的T細胞の移植を伴い、ウイルス感染症およびがんを処置するための有望な戦略である。養子免疫療法に使用されるT細胞は、抗原特異的T細胞の拡大増殖または遺伝子操作によるT細胞の再指向化によって生成することができる(Park、Rosenbergら、2011)。ウイルス抗原特異的T細胞の移植は、ウイルス感染症および稀有なウイルス関連悪性腫瘍に関連した移植片の処置に使用される十分に確立された手順である。同様に、腫瘍特異的T細胞の単離および移植は、黒色腫の処置に成功したことが示された。
T細胞における新規の特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体の遺伝的伝達によって成功裏に生成された(CAR)(Jena、Dottiら、2010)。CARは、単一融合分子中の1つまたは複数のシグナリングドメインと結合しているターゲティング部分からなる合成受容体である。一般に、CARの結合部分は、可動性リンカーによって接合されたモノクローナル抗体の軽鎖可変断片(light and variable fragment)を含む単鎖抗体(scFv)の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドドメインに基づく結合部分も成功裏に使用されている。第1の世代のCARのシグナリングドメインは、CD3ゼータまたはFc受容体ガンマ鎖の細胞質領域に由来する。第1の世代のCARは、T細胞細胞毒性を成功裏に再指向化することが示されている。しかし、これらは、in vivoの長期的な拡大増殖および抗腫瘍活性をもたらすことに失敗した。共刺激分子に由来するシグナリングドメイン、ならびに膜貫通ドメインおよびヒンジドメインが付加されて第2および第3の世代のCARが形成され、ヒトにおけるいくつかの治験の成功をもたらし、この場合、T細胞を、CD19を発現する悪性細胞に対して再指向化することができた(Juneら、2011)。しかし、CD19 ScFvに関して使用されるシグナリングドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインの特定の組合せは、幾分抗原特異的であったので、いずれの抗原マーカーにも展開できるわけではない。
悪性神経膠腫は、最も一般的で致命的な脳腫瘍である。それでもやはり、最も攻撃的な神経膠腫である神経膠芽腫を有する患者の生存期間は、個々に多様であるが、スタンダードオブケアの改善に起因して過去5年において診断後に10カ月の平均から14カ月に改善された。放射線療法は、数十年にわたって、これらの病変部の処置にとって極めて重要であり続けており、強度変調または画像ガイド技法を用いてビームの焦点を合わせ、それを脳腫瘍の不規則な輪郭に適応させ、近傍の極めて重要な構造への線量を最小限にする能力は、大いに改善されている。テモゾロミド、単純な経口投与および好都合な毒性プロファイルを有するアルキル化剤が、放射線療法と併せて、かつその後に使用される。より新しい外科的技法、例えば、蛍光誘導切除および神経内視鏡手法などが、悪性神経膠腫の管理において重要となっている(Van Meirら、2010)。
これらの進歩にもかかわらず、神経膠芽腫の非侵襲的療法の大きな必要性が依然として存在する。特に、EGFRvIII媒介病態の処置、特に、肺がん、肛門がん、残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、および多形性神経膠芽腫(GBM)、好ましくは残留性もしくは再発性EGFRvIII+神経膠腫、またはGBMの処置にこれらを使用するための「オフザシェルブ(off the shelve)CAR T細胞」の必要性が存在する。ここで、本発明者らは、神経膠芽腫においてユニークに発現されるが、正常な脳組織内で発現されない糖タンパク質である、UniprotデータベースにおいてP00533と呼ばれる、抗原として上皮成長因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)(NCBIリファレンスNM−00522を有する遺伝子によってコードされる)を標的とする有効なキメラ抗原受容体を開発した。本発明は、特に、著しい臨床的利点を有するCAR発現T細胞を使用して、免疫療法によって神経膠芽腫などのヒト腫瘍を処置するための道を開く。
本発明は、本明細書で同定した課題を解決する以下の物を提供する。
1.図2に例示したV1〜V6から選択されるポリペプチド構造の1つを有するEGFRvIII特異的キメラ抗原受容体(EGFRvIII CAR)であって、前記構造は、
− モノクローナル抗EGFRvIII抗体に由来するVHおよびVL、任意選択でリンカー、特に、式(G4S)n(式中、nは、1〜3、好ましくはn=3である)の(配列番号10の)リンカーを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
− ヒンジ、
− 膜貫通ドメイン、ならびに
− CD3ゼータシグナリングドメインおよび4−1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン
を含む、EGFRvIII特異的キメラ抗原受容体。
2.本発明は、
モノクローナル抗EGFRvIII抗体に由来するVHおよびVL、式(G4S)3の(配列番号10の)リンカーを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
− ヒンジ、
− CD8アルファに由来する膜貫通ドメイン、ならびに
− CD3ゼータシグナリングドメインおよび4−1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン
を含む、1に記載のEGFRvIII特異的CARを提供する。
3.本発明は、ヒトCD28に由来するドメイン、特に、ヒトCD28に由来する共刺激ドメインを含まない1または2に記載のEGFRvIII特異的CARを提供する。
4.本発明は、前記VHおよびVLが、配列番号11〜14から選択されるポリペプチド配列と少なくとも80%の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、1から3のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CARを提供する。
5.本発明は、4−1BBに由来する前記共刺激ドメインが、配列番号8と少なくとも80%の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、1から4のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CARを提供する。
6.本発明は、前記CD3ゼータシグナリングドメインが、配列番号9と少なくとも80%の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、1から5のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CARを提供する。
7.本発明は、前記CD8α膜貫通ドメインが、配列番号6と少なくとも80%の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、1から6のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CARを提供する。
8.本発明は、EGFRvIIIに特異的でない別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、1から7のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CARを提供する。
9.本発明は、シグナルペプチドをさらに含む、1から8のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CARを提供する。
10.本発明は、前記シグナルペプチドが、配列番号1または配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する、ヒト化されていてもよい、9に記載のEGFRvIII特異的CARを提供する。
11.本発明は、前記構造V1が、FcγRIIIαヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、1から10のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CARを提供する。
12.本発明は、前記FcγRIIIαヒンジが、配列番号3と少なくとも80%の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、11に記載のEGFRvIII特異的CARを提供する。
13.本発明は、前記構造V3が、CD8αヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、1から10のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CARを提供する。
14.本発明は、前記CD8αヒンジが、配列番号4と少なくとも80%の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、13に記載のEGFRvIII特異的CARを提供する。
15.本発明は、前記構造V5が、IgG1ヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、1から10のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CARを提供する。
16.本発明は、前記IgG1ヒンジが、配列番号5と少なくとも80%の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、15に記載のEGFRvIII特異的CARを提供する。
17.本発明は、配列番号15または配列番号17と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチド配列を含む、1から10または11から12のいずれか1つに記載の構造V1のEGFRvIII特異的CARを提供する。
18.本発明は、有利には、配列番号24および配列番号26から選択される配列と少なくとも80%の同一性を有する、1から10または13から14のいずれか1つに記載の構造V3のEGFRvIII特異的CARを提供する。
19.本発明は、配列番号25および配列番号27から選択される配列と少なくとも80%の同一性を有する、1から10または15から16のいずれか1つに記載の構造V5のEGFRvIII特異的CARを提供する。
20.本発明は、CD8αに由来するシグナルペプチド、ヒンジ、およびTMドメインを有する、1から10または13から14または18のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CARを提供する。
一実施形態では、上記1から20までに記載した本発明の前記EGFRvIII CARは、EGFRvIIIへの、好ましくはEGFRvIII発現細胞への、より好ましくはEGFRvIII発現がん細胞への前記EGFRvIII CARを発現するT細胞の結合、好ましくは前記EGFRvIII CARを発現する以下のような操作されたT細胞の結合を可能にする。
別の実施形態では、上記1から20までに記載した本発明の前記EGFRvIII CARは、EGFRvIIIへの、好ましくはEGFRvIII発現細胞への、より好ましくはEGFRvIII発現がん細胞への前記EGFRvIII CARを発現するT細胞の結合、好ましくは前記EGFRvIII CARを発現する以下のような操作されたT細胞の結合を可能にし、前記EGFRvIII発現細胞、より好ましくはEGFRvIII発現がん細胞を破壊する。
21.本発明は、1から20のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CARをコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明は、ポリペプチド配列が、ヒトCD28に由来する配列を含有しない、1から20のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CARを提供する。
特定の実施形態では、1から20の本発明のEGFRVIII CARは、ヒトCD28と少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10のアミノ酸同一性を有する配列を含まない。
特定の実施形態では、1から20の本発明のEGFRVIII CARの細胞質内ドメインおよび/または膜貫通ドメインは、ヒトCD28由来配列を含まず、特に、ヒトCD28と少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10のアミノ酸同一性を有する配列を有さない。
22.本発明は、21に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
23.本発明は、レンチウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターpCLD27600である、22に記載の発現ベクターを提供する。
特定の実施形態では、前記発現ベクターは、上記1から20に記載の本発明のEGFRvIII CARの安定発現を可能にする。
24.本発明は、細胞表面膜において、1から20のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CARを発現する操作された免疫細胞を提供する。
25.本発明は、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球から選択される免疫細胞、好ましくは細胞傷害性Tリンパ球に由来する、24に記載の操作された免疫細胞を提供する。
本発明は、細胞傷害性Tリンパ球に由来する、24に記載の操作された免疫細胞を提供する。
26.本発明は、NK細胞に由来する、24に記載の操作された免疫細胞を提供する。
27.本発明は、TCRの発現が抑制されている、24から26のいずれか1つに記載の操作された細胞を提供する。
28.本発明は、少なくとも1種のMHCタンパク質、好ましくはβ2mまたはHLAの発現が抑制されている、24から27のいずれか1つに記載の操作された細胞を提供する。
29.本発明は、少なくとも1種の免疫抑制薬または化学療法薬に耐性である、24から28のいずれか1つに記載の操作された細胞を提供する。
30.本発明は、患者における状態を防止または処置する療法において使用するための、24から29のいずれか1つに記載の操作された細胞を提供する。
31.本発明は、EGFRvIII発現がん細胞によって特徴付けられる前悪性がん状態または悪性がん状態を処置するための、30に記載の療法において使用するための操作された細胞を提供する。
32.本発明は、過剰のEGFRvIII発現がん細胞によって特徴付けられる状態を処置するための、30から31のいずれか1つに記載の療法において使用するための操作された細胞を提供する。
33.本発明は、状態が、肺がん、肛門がん、残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、および多形性神経膠芽腫(GBM)、好ましくは残留性もしくは再発性EGFRvIII+神経膠腫、またはGBMから選択されるがんである、30から32のいずれか1つに記載の療法において使用するための操作された細胞を提供する。
本発明は、状態がGBMである、30から32のいずれか1つに記載の療法において使用するための操作された細胞を提供する。
本発明は、状態が再発性EGFRvIII+神経膠腫である、30から32のいずれか1つに記載の療法において使用するための操作された細胞を提供する。
本発明の前記EGFRvIII CARが、EGFRvIII、好ましくはEGFRvIII発現細胞、より好ましくはEGFRvIII発現がん細胞に結合する、24から32の本発明の操作された細胞も本明細書に開示されている。
好ましくは、実施形態24から32のいずれかに記載の開示した本発明の操作された細胞は、EGFRvIII発現がん細胞に結合し、EGFRvIII発現がん細胞の前記生存期間に影響し、より好ましくは、以下の実施形態のいずれかに記載のここで開示した本発明の操作された細胞は、神経膠腫、特に、GBMに罹患している患者の生存期間を改善する。
34.がん細胞に障害を与える方法であって、前記がん細胞を、前記がん細胞の障害を引き起こすのに有効な量で24から29のいずれか1つに記載の操作された細胞と接触させることを含む方法を提供する。
35.本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、
(a)免疫細胞を準備すること、
(b)前記細胞の表面において、1から20のいずれか1つに記載の少なくとも1種のEGFRvIII特異的CARを発現させること
を含む方法を提供する。
36.本発明は、35に記載の免疫細胞を操作する方法であって、
(a)免疫細胞を準備すること、
(b)前記細胞内に、21に記載の、前記EGFRvIII特異的CARをコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを導入すること、
(c)前記細胞内に前記ポリヌクレオチドを発現させること
を含む方法を提供する。
37.本発明は、35から36のいずれか1つに記載の免疫細胞を操作する方法であって、
(a)免疫細胞を準備すること、
(b)前記細胞内に、前記EGFRvIII特異的CARをコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを導入すること、
(c)EGFRvIIIに特異的でない少なくとも1種の他のCARを導入すること
を含む方法を提供する。
38.本発明は、それを必要とする対象を処置する方法であって、
(a)表面においてEGFRvIII特異的CARを発現する24から29のいずれか1つに記載の操作された細胞を準備すること、
(b)前記操作された細胞を前記患者に投与すること
を含む方法を提供する。
39.本発明は、前記操作された細胞が、ドナーによって提供された免疫細胞を使用して調製される、38に記載の方法を提供する。
40.本発明は、前記ドナーが患者であり、好ましくは前記患者が、35から37のいずれか1つに従って操作された患者自体の免疫細胞を使用して処置されることになる、39に記載の方法を提供する。
本発明は、以下のものも提供する:
1.EGFRVIIIに特異的な抗体の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)、(EGFRVIII CAR)であって、EGFRVIIIに特異的な抗体の抗原結合ドメイン、リーダー配列、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内T細胞シグナリングドメインを含むEGFRVIII CAR。
抗原結合ドメインが、配列番号11または13を含む軽鎖可変領域を含む、1に記載のEGFRVIII CAR。
抗原結合ドメインが、配列番号12または14を含む重鎖可変領域を含む、1または2に記載のEGFRVIII CAR。
4.抗原結合ドメインが、配列番号10を含むリンカーペプチドを含む、1から3のいずれか1つに記載のEGFRVIII CAR。
5.抗原結合ドメインが、配列番号1または2を含むリーダー配列を含む、1から4のいずれか1つに記載のEGFRVIII CAR。
6.抗原結合ドメインが、配列番号1のリーダー配列を含む、1から5のいずれか1つに記載のEGFRVIII CAR。
7.細胞外ヒンジドメインをさらに含む、1から6のいずれか1つに記載のEGFRVIII CAR。
8.リーダー配列、細胞外ヒンジドメイン、および膜貫通ドメインが、CD8アルファ鎖に由来する配列(配列番号6)を含む、1から7のいずれか1つに記載のEGFRVIII CAR。
9.細胞内T細胞シグナリングドメインが、4−1BB 配列番号8、およびCD3ζ(配列番号9)を含み、好ましくはCD28配列を含まない、1から8のいずれかに記載のEGFRVIII CAR。
10.1から9のいずれに記載のEGFRVIII CARをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
11.10に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
12.11に記載の組換え発現ベクターを含む単離初代細胞。
13.11に記載の組換え発現ベクターを含むTCR−KO単離初代細胞。
14.1から9に記載のEGFRVIII CARを含むTCR−KO単離初代細胞。
15.12、13、または14に記載の少なくとも1種の単離初代細胞を含む初代細胞の集団。
16.1から9に記載のEGFRVIII CAR、10に記載の核酸、11に記載の組換え発現ベクター、12、13、または14に記載の単離初代細胞、15に記載の初代細胞の集団、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
17.好ましくは神経膠腫、より好ましくは神経膠芽腫に罹患している宿主におけるがんの処置または防止において使用するための、1から9に記載のEGFRVIII CAR、10に記載の核酸、11に記載の組換え発現ベクター、12、13、もしくは14に記載の単離初代細胞、15に記載の単離初代細胞の集団、または16に記載の医薬組成物。
1.本発明は最後に、図2に例示したV1〜V4から選択されるポリペプチド構造の1つを有するEGFRvIII特異的キメラ抗原受容体(CAR)であって、前記構造は、モノクローナル抗EGFRvIII抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、ならびにCD3ゼータシグナリングドメインおよび4−1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む、EGFRvIII特異的キメラ抗原受容体を提供する。
2.前記構造V1が、FcγRIIIαヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、1に記載のEGFRvIII特異的CAR。
3.前記構造V2が、FcγRIIIαヒンジおよび4−1BB膜貫通ドメインを含む、1に記載のEGFRvIII特異的CAR。
4.前記構造V3が、CD8αヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、1に記載のEGFRvIII特異的CAR。
5.前記構造V4が、CD8αヒンジおよび4−1BB膜貫通ドメインを含む、1に記載のEGFRvIII特異的CAR。
6.前記VHおよびVLが、配列番号11〜14から選択されるポリペプチド配列と少なくとも80%の同一性を有する、1から5のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CAR。
7.4−1BBに由来する共刺激ドメインが、配列番号8と少なくとも80%の同一性を有する、1から6のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CAR。
8.前記CD3ゼータシグナリングドメインが、配列番号9と少なくとも80%の同一性を有する、1から6のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CAR。
9.前記FcγRIIIαヒンジが、配列番号3と少なくとも80%の同一性を有する、1または2のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CAR。
10.前記CD8αヒンジが、配列番号4と少なくとも80%の同一性を有する、3または4のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CAR。
11.前記IgG1ヒンジが、配列番号5と少なくとも80%の同一性を有する、5に記載のEGFRvIII特異的CAR。
12.前記CD8α膜貫通ドメインが、配列番号6と少なくとも80%の同一性を有する、2または4のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CAR。
13.前記4−1BB膜貫通ドメインが、配列番号7と少なくとも80%の同一性を有する、1、3または5のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CAR。
14.EGFRvIIIに特異的でない別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、1から13のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CAR。
15.配列番号15および配列番号17と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチド配列を含む、2に記載の構造V1のEGFRvIII特異的CAR。
16.配列番号16および配列番号18と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチド配列を含む、3に記載の構造V2のEGFRvIII特異的CAR。
17.シグナルペプチドをさらに含む、1から16のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的CAR。
18.前記シグナルペプチドが、配列番号1または配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する、17に記載のEGFRvIII特異的CAR。
19.1から18のいずれか1つに記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
20.6または7に記載の核酸を含む発現ベクター。
21.細胞表面膜において、1から18のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的キメラ抗原受容体を発現する操作された免疫細胞。
22.炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球に由来する、21に記載の操作された免疫細胞。
23.NK細胞に由来する、21に記載の操作された免疫細胞。
24.療法において使用するための21から23のいずれか1つに記載の操作された細胞。
25.ヒトの療法において使用するための21から23のいずれか1つに記載の操作された細胞。
26.状態が、EGFRvIII発現細胞によって特徴付けられる前悪性がん状態または悪性がん状態である、療法において使用するための21から25のいずれか1つに記載の操作された細胞。
27.状態が、過剰のEGFRvIII発現細胞によって特徴付けられる状態である、療法において使用するための21から26のいずれか1つに記載の操作された細胞。
28.状態ががん状態である、療法において使用するための21から27のいずれか1つに記載の操作された細胞。
29.がん状態が、肺がん、肛門がん、または多形性神経膠芽腫である、療法において使用するための21から28のいずれか1つに記載の操作された細胞。
30.TCRの発現が、前記免疫細胞内で抑制されている、21から29のいずれか1つに記載の操作された細胞。
31.少なくとも1種のMHCタンパク質、好ましくはβ2mまたはHLAの発現が、前記免疫細胞内で抑制されている、21から30のいずれか1つに記載の操作された細胞。
32.突然変異されて少なくとも1種の免疫抑制薬または化学療法薬に対する耐性が付与されている、21から31のいずれか1つに記載の操作された細胞。
33.がん細胞に障害を与える方法であって、前記細胞を、前記がん細胞の障害を引き起こすのに有効な量で21から32のいずれか1つに記載の操作された細胞と接触させることを含む方法
34.免疫細胞を操作する方法であって、
(a)免疫細胞を準備すること、
(b)前記細胞の表面において、1から19のいずれか1つに記載の少なくとも1種のEGFRvIII特異的キメラ抗原受容体を発現させること
を含む方法。
35.34に記載の免疫細胞を操作する方法であって、
(a)免疫細胞を準備すること、
(b)前記細胞内に、前記EGFRvIII特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを導入すること、
(c)前記細胞内に前記ポリヌクレオチドを発現させること
を含む方法。
36.34に記載の免疫細胞を操作する方法であって、
(a)免疫細胞を準備すること、
(b)前記細胞内に、前記EGFRvIII特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを導入すること、
(c)EGFRvIIIに特異的でない少なくとも1種の他のキメラ抗原受容体を導入すること
を含む方法。
37.それを必要とする対象を処置する方法であって、
(a)表面において1から19のいずれか1つに記載のEGFRvIII特異的キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞を準備すること、
(b)前記免疫細胞を前記患者に投与すること
を含む方法。
38.前記免疫細胞が、ドナーから提供される、37に記載の方法。
39.前記免疫細胞が、患者自体から提供される、37に記載の方法。
本発明者らは、異なる構造を有し、異なるEGFRvIII特異的抗体に由来する異なるscFVを含むEGFRvIII特異的CARを生成した。本発明の好適なCARポリペプチドは、配列番号15〜19から選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明のより好適なCARは、V3またはV5構成(表AおよびB)を有するEGFRvIII特異的CARであり、V3構成(表A)がさらにより好適であり、さらにより好ましくは、本発明のCARは、配列番号24および配列番号26から選択されるアミノ酸配列を有する、ヒト化されていてもよいEGFRvIII特異的CARである。
本発明のさらにより好適なCARは、配列番号24、配列番号25、配列番号26、および配列番号27から選択されるヒト化CARであり、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも5、少なくとも8、少なくとも10のアミノ酸が、非ヒト化EGFRvIII CARのものと同様の、またはそれより良好なヒトEGFRvIIIに対する選択性および親和性を保持しながらHAMA応答を低減するために変更されている。
用語「同様の」は、0.05〜0.5の標準偏差(n=2)で非ヒト化CARの親和性を有することを意味する。用語「改善された」は、少なくとも1.2倍増大した非ヒト化EGFRvIII CARの親和性を有することを意味する。
本発明によれば、ヒト化は、wt EGFRvIII CAR配列または元のEGFRvIII CAR配列と少なくとも80%の同一性を有するEGFRvIII CARも意味する。
in vitroでの非特異的活性化の後(例えば、抗CD3/CD28コートビーズおよび組換えIL2を用いて)、ドナーに由来するT細胞を、ウイルストランスダクションを使用してこれらのCARを発現するポリヌクレオチドで形質転換した。ある特定の場合では、T細胞を、より特に、移植片対宿主反応を防止するためにTCR(αβ−T細胞受容体)の成分を破壊することによって、さらに操作して非アロ反応性T細胞を創製した。
得られた操作されたT細胞は、EGFRvIII陽性細胞に対して様々な程度にin−vitroで反応性を示し、本発明のCARが、T細胞の抗原依存性活性化およびまた増殖に寄与し、これらを免疫療法にとって有用にすることを示した。
得られた操作されたT細胞は、EGFRvIII陽性細胞に対してin−vivoで反応性を示し、本発明のCARが、in−vivoでT細胞の抗原依存性活性化およびまた増殖に寄与し、これらを免疫療法にとって有用にすることを示した。
本発明のCARをコードするポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列を、本明細書で詳述する。
本発明の操作された免疫細胞は、多発性骨髄腫を処置するためなどの治療用途に特に有用である。
本発明の操作された免疫細胞は、多形性神経膠芽腫(GBM)(神経膠芽腫、星細胞腫グレードIV、およびグレードIV星細胞腫としても公知)を処置するためなどの治療用途に特に有用である。好ましくは、がんは、EGFRvIIIを発現する細胞によって特徴付けられる。
また、本発明のEGFRvIII CARコンストラクト、好ましくはV3構成を有するEGFRvIII CARを備えた操作された免疫細胞であって、ヒンジドメインは、CD8アルファに由来するヒンジドメインである、操作された免疫細胞が本明細書に開示されている。
本発明の操作された免疫細胞は、CD8に由来するヒンジをシグナルペプチドおよび/またはやはりCD8アルファに由来する膜貫通領域と組み合わせたEGFRvIII CARコンストラクトを備えることができる。
本発明による操作された免疫細胞の略図である。この図に提示した操作された免疫細胞は、CARをコードするレトロウイルスポリペプチドで形質導入されたT細胞である。このT細胞は、患者へのより良好でより安全な生着を可能にするようにさらに操作され、それは、本発明の枠組み内で任意選択である。X遺伝子は、例えば、TCRの成分(TCRアルファまたはTCRベータ)を発現する遺伝子であり得、Yは、CD52(Campathに関して)またはHPRT(6−チオグアニンに関して)のような、免疫抑制薬へのT細胞の感受性に関与する遺伝子であり得る。 異なるCAR構成(V1〜V4)およびV5〜V6の略図である。 EGFRvIII CARコンストラクトの略図である。 CAR mRNA生成のための骨格を示す図である。 CARレンチウイルスベクター生成のための骨格を示す図である。 FACSによって分析された初代T細胞内のEGFRvIII CAR発現を示す図である。 EGFRVIタンパク質またはEGFRVIIIタンパク質を過剰発現するU87神経膠腫細胞のウエスタンブロットによる特徴付けを示す図である。 標的細胞との共培養後にFACS分析によって評価したEGFRvIII CAR T脱顆粒能力を示す図である。 本発明のEGFRvIII CART細胞の細胞傷害性アッセイを示す図である。
Figure 2017522884
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本明細書で具体的に定義されていない限り、使用されるすべての技術用語および科学用語は、遺伝子療法、生化学、遺伝学、および分子生物学の分野における当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。
本明細書に記載したものと同様のまたは等価なすべての方法および材料を、本明細書を実践または試験するのに使用することができ、適当な方法および材料が本明細書に記載されている。本明細書に述べられるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれている。矛盾する場合、本明細書が、定義を含めて、支配することになる。さらに、材料、方法、および実施例は、別段に指定されていない限り、例示的なだけであり、限定的であるように意図されていない。
本発明の実践では、別段に示されていない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の慣例的な技法が用いられることになり、これらは、当技術分野の技術の範囲内である。このような技法は、文献において完全に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL、2000、Wiley and son Inc、Library of Congress、USA);Molecular Cloning:A Laboratory Manual、3版、(Sambrookら、2001、Cold Spring Harbor、New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984);Mullisら、米国特許第4,683,195号;Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries&S.J.Higgins編、1984);Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins編、1984);Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney、Alan R.Liss,Inc.、1987);Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press、1986);B.Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);シリーズ、Methods In ENZYMOLOGY(J.AbelsonおよびM.Simon編集長、Academic Press,Inc.、New York)、具体的には、154巻および155巻(Wuら編)ならびに185巻、「Gene Expression Technology」(D.Goeddel編);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.MillerおよびM.P.Calos編、1987、Cold Spring Harbor Laboratory);Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(MayerおよびWalker編、Academic Press、London、1987);Handbook Of Experimental Immunology、I〜IV巻(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編、1986);ならびにManipulating the Mouse Embryo、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1986)を参照。
Figure 2017522884
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EGFRvIII特異的キメラ抗原受容体
本発明は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナリング形質導入ドメインを含む抗EGFRvIIIキメラ抗原受容体(CARまたはEGFRvIII CARもしくは抗EGFRvIII CAR)の新しい設計に関する。
一般に、用語「含む」は、「で構成される」を含み、好適な実施形態では、「含む」は、「で構成される」を意味する。
本発明の実施形態のそれぞれにおいて、用語「含む」は、「で構成される」を意味することができる。
用語「細胞外リガンド結合ドメイン」は、本明細書では、リガンドを結合させることができるオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができることになる。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。好適な実施形態では、前記細胞外リガンド結合ドメインは、可動性リンカーによって接合された標的抗原特異的モノクローナル抗EGFRvIII抗体の軽(V)可変断片および重(V)可変断片を含む単鎖抗体断片(scFv)を含む。前記VおよびVは、好ましくは表2に示した139およびMR1と呼ばれる抗体から選択される。これらは、好ましくは、例えば、配列の配列番号10を含む可動性リンカーによって一緒に連結されている。言い換えれば、前記CARは、配列番号11〜配列番号14からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、97%、または99%の同一性を示すポリペプチド配列を含む細胞外リガンド結合ドメインを優先的に含む。
本発明によるCARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合の後の細胞内シグナリングを担い、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす。言い換えれば、シグナル伝達ドメインは、CARが発現される免疫細胞の通常のエフェクター機能の少なくとも1つの活性化を担う。例えば、T細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含めた細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、用語「シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊機能を実施するように指示するタンパク質の部分を指す。
CAR中で使用するためのシグナル伝達ドメインの好適な例は、抗原受容体エンゲージメント後にシグナル伝達を開始するように協力して作用するT細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアント、ならびに同じ機能的能力を有する任意の合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインは、2つの別個のクラスの細胞質シグナリング配列、すなわち、抗原依存性一次活性化を開始するもの、および二次シグナルまたは共刺激シグナルをもたらすように抗原非依存性様式で作用するものを含む。一次細胞質シグナリング配列は、ITAMの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフとして公知であるシグナリングモチーフを含むことができる。ITAMは、syk/zap70クラスチロシンキナーゼの結合部位として機能を果たす様々な受容体の細胞質内尾部中に見つかる詳細がはっきりしているシグナリングモチーフである。本発明で使用されるITAMの例は、非限定的な例として、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、FcRイプシロン、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものを含み得る。好適な実施形態では、CARのシグナリング伝達ドメインは、(配列番号9)からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ゼータシグナリングドメインを含むことができる。
より好適な実施形態では、本発明のEGFRvIII CARの細胞質内ドメインは、ヒトCD28に由来するいずれの配列も除外し、ヒトCD28に由来する配列を含まない。
さらにより好適な実施形態では、EGFRvIII CARのシグナリングドメインは、配列番号9と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有し、CD28シグナリングドメインに由来するいずれの配列も除外するCD3ゼータシグナリングドメインを含む。特定の実施形態では、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子は、効率的な免疫応答に要求される抗原受容体またはこれらのリガンド以外の細胞表面分子である。「共刺激リガンド」は、T細胞上の同族共刺激分子を特異的に結合させ、それによって、例えば、TCR/CD3複合体のペプチドがロードされたMHC分子との結合によってもたらされる一次シグナルに加えて、それだけに限らないが、増殖活性化、分化などを含めたT細胞応答を媒介するシグナルをもたらす抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドとして、それだけに限らないが、CD7、B7−1(CD80)、B7−2(CD86)、PD−L1、PD−L2、4−1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド(ICOS−L)、細胞間接着分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA−G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンベータ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7−H3と特異的に結合するリガンドを挙げることができる。共刺激リガンドは、とりわけ、T細胞上に存在する共刺激分子、例えば、それだけに限らないが、CD27、CD28、4−1BB、OX40、CD30、CD40、PD−1、ICOS、リンパ球機能関連抗原−1(LFA−1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7−H3、CD83と特異的に結合するリガンドなどと特異的に結合する抗体も包含する。
「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、それだけに限らないが、増殖などの細胞による共刺激応答を媒介するT細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子としては、それだけに限らないが、MHCクラスI分子、BTLA、およびトールリガンド受容体が挙げられる。共刺激分子の例としては、CD27、CD28、CD8、4−1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD−1、ICOS、リンパ球機能関連抗原−1(LFA−1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7−H3、およびCD83と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。
好適な実施形態では、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、4−1BB(GenBank:AAA53133.)およびCD28(NP_006130.1)の断片からなる群から選択される共刺激シグナル分子の一部を含む。特に、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、配列番号8からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、または99%の配列同一性を構成するアミノ酸配列を含む。
好適な実施形態では、本発明のEGFRvIII CARのシグナル伝達ドメインは、4−1BBに由来する共刺激シグナル分子を含み、ヒトCD28に由来する任意の共刺激シグナル分子を除外する。
本発明によるCARは、細胞の表面膜上で発現される。したがって、このようなCARは、膜貫通ドメインをさらに含む。適切な膜貫通ドメインの際立った特徴は、細胞、好ましくは本発明において、免疫細胞、特に、リンパ球細胞またはナチュラルキラー(NK)細胞の表面で発現され、免疫細胞の細胞応答を既定の標的細胞に対して向けるために一緒に相互作用する能力を含む。膜貫通ドメインは、天然源または合成源から得ることができる。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、T細胞受容体のサブユニット、例えば、α、β、γ、またはδなど、CD3複合体を構成するポリペプチド、IL2受容体p55(α鎖)、p75(β鎖)またはγ鎖、Fc受容体、特に、Fcγ受容体IIIまたはCDタンパク質のサブユニット鎖であり得る。代わりに、膜貫通ドメインは、合成であり得、主に疎水性残基、例えば、ロイシンおよびバリンなどを含み得る。好適な実施形態では、前記膜貫通ドメインは、ヒトCD8アルファ鎖(例えば、NP_001139345.1)に由来する。
好適な実施形態では、本発明のEGFRvIII CARのTMドメインは、CD8アルファ鎖(例えば、NP_001139345.1)に由来する。
膜貫通ドメインは、前記細胞外リガンド結合ドメインと前記膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域をさらに含むことができる。本明細書で使用される用語「ヒンジ領域」は、一般に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。特に、ヒンジ領域は、細胞外リガンド結合ドメインにとってさらにフレキシビリティおよびアクセシビリティをもたらすために使用される。ヒンジ領域は、最大で300アミノ酸、好ましくは10〜100アミノ酸、最も好ましくは25〜50アミノ酸を含み得る。ヒンジ領域は、天然に存在する分子のすべてまたは一部、例えば、CD8、CD4、もしくはCD28の細胞外領域のすべてもしくは一部、または抗体定常領域のすべてもしくは一部などに由来し得る。代わりに、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に対応する合成配列であってもよく、または完全に合成のヒンジ配列であってもよい。好適な実施形態では、前記ヒンジドメインは、配列番号3、配列番号4、および配列番号5と本明細書でそれぞれ呼ばれるヒトCD8アルファ鎖、FcγRIIIα受容体、もしくはIgG1の一部、またはこれらのポリペプチドと好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、もしくは99%の配列同一性を示すヒンジポリペプチドを含む。
好適な実施形態では、本発明のEGFRvIII CARは、配列番号4のCD8αに由来するヒンジ、CD8αに由来するTMドメイン、およびCD8αに由来するペプチドシグナルを含む。
より好適な実施形態では、本発明のEGFRvIII CARは、配列番号4と好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、または99%の配列同一性を示すCD8αヒンジ、CD8αに由来するTMドメイン、およびCD8αに由来するペプチドシグナルを含む。
本発明によるcarは、一般に、配列番号6または7のポリペプチドと同一性を示す、CD8αおよび4−1BBからより特に選択される膜貫通ドメイン(TM)をさらに含む。
好ましくは、本発明によるEGFRvIII CARは、配列番号6のポリペプチドと少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を示すTMを含む。
ヒンジ領域が、CD8αに由来するヒンジ領域である本発明のEGFRvIII CARコンストラクトも本明細書に開示されている。例えば、本発明のCARコンストラクトは、CD8αに由来するヒンジ領域を、CD8αに由来するシグナルペプチドおよび/またはやはりCD8αに由来する膜貫通領域と組み合わせることができる。
好適な実施形態では、本発明のEGFRvIII CARコンストラクトは、CD8αに由来するヒンジ領域を、CD8αに由来するシグナルペプチドおよびやはりCD8αに由来する膜貫通領域と組み合わせることができる。
さらにより好適な実施形態では、本発明のCARコンストラクトは、CD8αに由来するヒンジ領域を、CD8αに由来するシグナルペプチドおよびやはりCD8αに由来する膜貫通領域と組み合わせることができ、CD28シグナリングドメインに由来するいずれの配列も除外する。
標的抗原のダウンレギュレーションまたは突然変異が一般に、がん細胞内で観察され、抗原喪失エスケープバリアントを創製する。したがって、腫瘍エスケープを相殺し、免疫細胞を標的に対してより特異的にするために、本発明によるEGFRvIII特異的CARは、標的中の異なるエレメントを同時に結合させ、それによって免疫細胞の活性化および機能を増強するための別の細胞外リガンド結合ドメインを含むことができる。一実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、同じ膜貫通ポリペプチド上に相前後して配置することができ、リンカーによって分離されていてもよい。
別の実施形態では、前記異なる細胞外リガンド結合ドメインは、CARを構成している異なる膜貫通ポリペプチド上に配置することができる。
別の実施形態では、本発明は、各1つが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団に関する。特に、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を準備することと、前記細胞の表面において、各1つが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を発現させることとを含む方法に関する。別の特定の実施形態では、本発明は、免疫細胞を操作する方法であって、免疫細胞を準備することと、前記細胞内に、各1つが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することとを含む方法に関する。CARの集団とは、各1つが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む少なくとも2、3、4、5、6以上のCARを意味する。本発明による異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは標的中の異なるエレメントを同時に結合させ、それによって免疫細胞の活性化および機能を増強することができる。本発明はまた、各1つが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を含む単離免疫細胞に関する。
本発明は、
− EGFRVIIIに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的な結合ドメインであって、より好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的な前記結合ドメインは、単鎖可変断片(scFv)である、結合ドメイン、
− ヒンジ、
− 膜貫通ドメイン、
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、および
ヒトCD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRvIII特異的キメラ抗原受容体(EGFRVIII CAR)を提供する。
一実施形態では、本発明のEGFRVIII CARは、ヒトCD28に由来する配列を有さない。
好適な実施形態では、本発明のEGFRVIII CARは、CD28由来配列を含まず、特に、ヒトCD28と少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10のアミノ酸同一性を有する配列を有さない。
より好適な実施形態では、本発明のEGFRVIII CARの細胞質内ドメインおよび/または膜貫通ドメインは、ヒトCD28由来配列を含まず、特に、ヒトCD28と少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10のアミノ酸同一性を有する配列を有さない。
本発明のEGFRVIII CARは、
− EGFRVIIIに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的な結合ドメインであって、より好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的な前記結合ドメインは、単鎖可変断片(scFv)である、結合ドメイン、
− ヒンジ、
− 膜貫通ドメイン、
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− ヒトCD3ゼータシグナリングドメインで構成され、ヒトCD28シグナリングドメインで構成されない細胞内シグナリングドメイン
を含む。
好適な実施形態では、本発明のEGFRVIII CARは、CD28に由来するいずれの配列も含有せず、CD8αに由来するシグナルペプチド(またはリーダー配列)、TMドメイン、およびヒンジを含む。
一実施形態では、本発明のEGFRVIII CARは、ヒトCD8α(配列番号1)に由来するリーダー配列、または配列番号1と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくは100%の同一性を有する、好ましくは配列番号1と100%の同一性を有するリーダー配列を含む。
別の実施形態では、本発明のEGFRVIII CARは、配列番号2のリーダー配列、または配列番号2と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、もしくは100%の同一性を有する、好ましくは配列番号2と100%の同一性を有するリーダー配列を含む。
一実施形態では、本発明は、
− EGFRVIIIに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的なドメインであって、より好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的な前記ドメインは、単鎖可変断片(scFv)である、結合ドメイン、
− ヒトCD8アルファ鎖に由来する(CD8αに由来する)ヒンジ、
− ヒトCD8アルファ(α)に由来する膜貫通ドメイン、
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− ヒトCD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRvIII特異的キメラ抗原受容体(EGFRVIII CAR)を提供する。
本発明は、
− EGFRVIIIに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的なドメインであって、より好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的な前記ドメインは、単鎖可変断片(scFv)である、結合ドメイン、
− ヒトIgG1に由来するヒンジ、
− ヒトCD8アルファ(α)に由来する膜貫通ドメイン、
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− ヒトCD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRvIII特異的キメラ抗原受容体(EGFRVIII CAR)を提供する。
本発明は、配列番号1または配列番号2のシグナルペプチドを有する本発明のEGFRVIII CARを包含する。
本発明では、scfvは、好ましくは4〜25アミノ酸の短いリンカーペプチドで接続されたEGFRVIIIに特異的な免疫グロブリンの、より好ましくは配列番号10の重鎖(VH domain)および軽鎖(VL domain)(またはVH domainを伴ったVL domain)の可変領域の融合タンパク質である。
本発明のscfvは、EGFRVIIIに特異的な抗体に由来し、これは、リンカーによってVLドメインと分離されたVHドメインを含み、前記VHドメインおよび/またはVLドメインは、EGFRVIIIへの結合に一緒に寄与する。
一実施形態では、本発明の前記scfvは、リーダー配列(またはシグナルペプチド)をさらに含み、好ましくは、前記リーダー配列は、VHドメインに連結されている。
前記リーダー配列がVLドメインに連結されている実施形態は、本発明の一部である。
好ましくは、前記リーダー配列は、配列番号1または2の、より好ましくは配列番号1のアミノ酸配列を有している。
一実施形態では、VHドメインがヒンジに連結されており、別の実施形態では、VLドメインが前記ヒンジに連結されている。
本発明は、異なる長さを有するヒンジ、好ましくはCD8α、IgG1、またはFCRIIIに由来するヒンジ(図2を参照)、より好ましくはCD8αに由来するヒンジ、さらにより好ましくは配列番号4を有するヒンジに連結された抗EGFRVII scfvを提供する。
好ましくは、本発明は、
− シグナルペプチド、好ましくはCD8アルファに由来するシグナルペプチド、より好ましくは配列番号1または配列番号2のCD8アルファに由来するシグナルペプチド、
− リンカーによってVLドメインと分離されたVHドメインを含む(scFv)であって、前記VHおよびVLは、EGFRVIIIへの結合に寄与する、(scFv)、
− ヒトCD8アルファ鎖に由来するヒンジ、またはヒトIgG1に由来するヒンジ、
− CD8アルファ(α)に由来する膜貫通ドメイン(TM)、
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− CD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを提供する。
より好ましくは、本発明は、
− ヒトCD8アルファに由来するシグナルペプチド、
− リンカーによってVLドメインと分離されたVHドメインを含む(scFv)であって、前記VHおよびVLは、EGFRVIIIへの結合に寄与する、(scFv)、
− ヒトCD8アルファ鎖に由来するヒンジ、またはヒトIgG1に由来するヒンジ、
− CD8アルファ(α)に由来する膜貫通ドメイン(TM)、
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− CD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを提供する。
さらにより好ましくは、本発明は、
− ヒトCD8アルファに由来するシグナルペプチド、
− リンカーによってVLドメインと分離されたVHドメインを含む(scFv)であって、前記VHおよびVLは、EGFRVIIIへの結合に寄与し、前記VHドメインおよびVLドメインは、ヒト化されている、(scFv)、
− ヒトCD8アルファ鎖に由来するヒンジ、またはヒトIgG1に由来するヒンジ、
− ヒトCD8アルファ(α)に由来する膜貫通ドメイン(TM)、
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− ヒトCD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを提供する。
そしてさらにより好ましくは、本発明のEGFRVIII CARは、
− リーダー配列(例えば、CD8αリーダー配列またはCD8αシグナルペプチド)、
− VH、リンカー、およびVLを含む抗EGFRVIII scfv、
− CD8αヒンジ、
− CD8α TM、
− 4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− 細胞内CD3ゼータシグナリングドメイン
を含む。
そしてさらにより好ましくは、本発明のEGFRVIII CARは、
− リーダー配列(例えば、CD8αリーダー配列またはCD8αシグナルペプチド)、
− VL、リンカー、およびVHを含む抗EGFRVIII scfv、
− CD8αヒンジ、
− CD8α TM
− 4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− 細胞内CD3ゼータシグナリングドメイン
を含む。
そしてさらにより好ましくは、本発明のEGFRVIII CARは、
− リーダー配列(例えば、CD8αリーダー配列またはCD8αシグナルペプチド)、
− VH、リンカー、およびVLを含む抗EGFRVIII scfv、
− CD8αヒンジ、
− CD8α TM、
− 4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− 細胞内CD3ゼータシグナリングドメイン
で構成される。
一実施形態では、前記リンカーは、式(G4S)nのリンカーであり、式中、nは、1〜3であり、好ましくはn=3であり、前記配列は、(G4S)3であり、より好ましくは配列番号10のものである。
本発明の1種のEGFRVIII CARは、
− ヒトCD8αリーダー配列(CD8αリーダーまたはCD8αシグナルペプチド)
− VH、リンカー、およびVLを含む抗EGFRVIII scfvであって、有利には、scfvは、ヒト化されている、抗EGFRVIII scfv、
− ヒトCD8αヒンジ、
− ヒトCD8α TM、
− 4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− 細胞内CD3ゼータシグナリングドメイン
で構成される。
一実施形態では、本発明は、
− 配列番号1のヒトCD8αリーダー配列(CD8αリーダーまたはCD8αシグナルペプチド)、
− 配列番号11のVH、配列番号10のリンカー、および配列番号12のVL、または配列番号13のVH、配列番号10のリンカー、および配列番号14のVLを含む抗EGFRVIII scfvであって、有利には、scfvは、ヒト化されている、抗EGFRVIII scfv、
− 配列番号4のヒトCD8αヒンジ、
− 配列番号6のヒトCD8α TM、
− 配列番号8の4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− 配列番号9の細胞内CD3ゼータシグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを提供する。
一実施形態では、本発明は、
− 配列番号1のヒトCD8αリーダー配列(CD8αリーダーまたはCD8αシグナルペプチド)、
− 配列番号12のVL、配列番号10のリンカー、および配列番号11のVH、配列番号14のVL、配列番号10のリンカー、および配列番号13のVHを含む抗EGFRVIII scfvであって、有利には、scfvは、ヒト化されている、抗EGFRVIII scfv、
− 配列番号4のヒトCD8αヒンジ、
− 配列番号6のヒトCD8α TM、
− 配列番号8の4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− 配列番号9の細胞内CD3ゼータシグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを提供する。
一実施形態では、本発明は、
− 配列番号1または2のポリペプチドと少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するシグナルペプチドであって、好ましくは配列番号1のポリペプチドと少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、シグナルペプチド、
− リンカーによってVLと分離されたVHドメインであって、前記VHおよびVLは、EGFRVIIIへの結合に寄与し、前記リンカーは、配列番号10のポリペプチドと少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有し、
前記VHドメインは、配列番号11または配列番号13のポリペプチドと少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有し、
前記VLドメインは、配列番号12または配列番号14のポリペプチドと少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有する、リンカーによってVLドメインと分離されたVHドメイン、
− − 配列番号4のポリペプチドと少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒトCD8アルファ鎖に由来するヒンジ、
− 配列番号6のポリペプチドと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有するCD8アルファ(α)に由来する膜貫通ドメイン、
− 配列番号8からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒト4−1BB(または4−1BB細胞内ドメイン)に由来する共刺激シグナル分子、
− 配列番号9からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRvIII特異的キメラ抗原受容体(EGFRVIII CAR)を提供する。
好適な実施形態では、本発明のEGFRvIII特異的キメラ抗原受容体(EGFRVIII CAR)は、CD28、またはヒトCD28、特に、ヒトCD28イントラシグナリングドメイン(intra signaling domain)に由来するいずれの配列も含まない。より好適な実施形態では、本発明のEGFRvIII特異的キメラ抗原受容体(EGFRVIII CAR)は、ヒトCD28、特に、ヒトCD28イントラシグナリングドメインに由来するいずれの配列も含まず、EGFRVIIIに特異的なscfvのVHドメインに好ましくは融合されたCD8αに由来するシグナルペプチドをさらに含有する。
一実施形態では、本発明は、配列番号24のEGFRVIII CARを提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号25のEGFRVIII CARを提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号26のEGFRVIII CARを提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号27のEGFRVIII CARを提供する。
好適な実施形態では、本発明は、配列番号24または配列番号25の、より好ましくは配列番号24のEGFRVIII CARを提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号24のポリペプチドと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号25のポリペプチドと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号26のポリペプチドと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号27のポリペプチドと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを提供する。
一態様では、本発明のEGFRVIII CARの抗EGFRvIII結合ドメインは、ヒト化抗EGFRvIII結合ドメインである。
本発明の抗EGFRvIII CARのいずれも、CARの結合特性に著しく影響せず、もしくはそれを変更しない、かつ/または修飾アミノ酸配列を含有するCAR T細胞の活性に著しく影響せず、ヒト抗マウス抗体(HAMA)応答を低減し、もしくは無効にするアミノ酸修飾を有するヒト化抗EGFRvIII結合ドメインであり得る。
「ヒト化」は、CARの結合特性に著しく影響せず、もしくはそれを変更しない、かつ/または修飾アミノ酸配列を含有するCAR T細胞の活性に著しく影響せず、ヒト抗マウス抗体(HAMA)応答を低減し、もしくは無効にするアミノ酸修飾を指すように意図されている。
「ヒト化」は、CARの結合特性(親和性結合活性)を有意に改善することができ、かつ/または修飾アミノ酸配列を含有するCAR T細胞の活性に著しく影響せず、ヒト抗マウス抗体(HAMA)応答を低減し、もしくは無効にするアミノ酸修飾を指すように意図されている。
このような保存的修飾としては、前記CARの前記抗体断片中の、および/または前記CAR分子の他の部分のいずれかの中のアミノ酸置換、付加、および欠失が挙げられる。修飾は、抗体中、抗体断片中、または本発明のCAR分子の他の部分のいずれかの中に、当技術分野で公知の標準技法、例えば、部位特異的突然変異誘発、PCR媒介突然変異誘発などによって、または最適化された生殖系列配列を用いることによって導入することができる。
用語「保存的配列修飾」または「アミノ酸変化」は、アミノ酸配列を含有する抗体または抗体断片の結合特性に著しく影響しない、またはそれを変更しないアミノ酸修飾を指すように意図されている。このような保存的修飾としては、アミノ酸置換、付加、および欠失が挙げられる。修飾は、本発明の抗体または抗体断片中に、当技術分野で公知の標準技法、例えば、部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介突然変異誘発などによって導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられているものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分枝状側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、本発明のCAR内の1つまたは複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置き換えることができ、変更されたCARを、本明細書に記載の機能アッセイを使用して試験することができる。
好適な実施形態では、本発明は、配列番号24のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して保存的配列修飾(またはアミノ酸配列変化)を有するEGFRVIII CARを提供する。
好適な実施形態では、本発明は、配列番号24のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して2つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを提供する。
好適な実施形態では、本発明は、配列番号24のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して3つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを提供する。
好適な実施形態では、本発明は、配列番号24のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して4つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを提供する。
好適な実施形態では、本発明は、配列番号24のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して5つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを提供する。
より好適な実施形態では、本発明は、配列番号24のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して5つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを提供し、配列番号24中のすべてのCDRは、保存されている。
より好適な実施形態では、本発明は、配列番号24のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して1〜15のアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを提供し、配列番号24中のすべてのCDRは、保存されている。
好適な実施形態では、本発明のEGFRVIII CARの配列は、前記CARのその標的(EGFRVIII)への結合能力を改変することなく、HAMA(ヒト抗マウス応答)を低減するために、配列番号24と比較して少なくとも1つのアミノ酸、2〜15のアミノ酸を変更することによって修飾されている。一実施形態では、前記結合は、改善され得る。
好適な実施形態では、本発明は、配列番号24のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して少なくとも1つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを提供し、前記少なくとも1つのアミノ酸変化は、初代T細胞内の前記EGFRVIII CARの結合および/または活性にインパクトを有さず、またはこれらを改善する。
本発明は、本発明のEGFRVIII CARに関連する、関連した核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、および医薬組成物も提供する。
ヒンジが、CD8αのTMドメインおよびシグナルペプチドと組み合わせたとき、これらの構造エレメントおよび技術的特徴を組み合わせていない以前のCARコンストラクトと比較して、前記EGFRVIII CARのEGFRVIII発現細胞へのより良好な親和性および選択性を付与している(図9に見られるように)、本発明のEGFRVIII CARコンストラクトも本明細書に開示されている。好ましくは、EGFRVIII発現細胞に対してより良好な親和性および選択性を有する本発明のEGFRVIII CARコンストラクトは、V3構成の技術的特徴を組み合わせ、より好ましくは、EGFRVIII発現細胞に対してより良好な親和性および選択性を有する本発明のEGFRVIII CARコンストラクトは、配列番号24と少なくとも80%の同一性を有する配列を有し、ヒト化されている。
構造が、これらの構造エレメントおよび技術的特徴を組み合わせていない以前のCARコンストラクトと比較して、前記EGFRVIII CARのEGFRVIII発現細胞へのより良好な親和性および選択性を付与している(図9に見られるように)、本発明のEGFRVIII CARコンストラクトも本明細書に開示されている。
好ましくは、EGFRVIII発現細胞に対してより良好な親和性および選択性を有する本発明のEGFRVIII CARコンストラクトは、V3構成の技術的特徴を組み合わせ、より好ましくは、EGFRVIII発現細胞に対してより良好な親和性および選択性を有する本発明のEGFRVIII CARコンストラクトは、配列番号24と少なくとも80%の同一性を有する配列を有し、ヒト化されている。
ポリヌクレオチド、ベクター:
本発明はまた、本発明による上述したCARをコードするポリヌクレオチド、ベクターに関する。
ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター(例えば、細菌宿主細胞内への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルスなどのプラスミドもしくはウイルスベクター)で構成され得る。
特定の実施形態では、異なる核酸配列を、2Aペプチドをコードする配列などのリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含む1つのポリヌクレオチドまたはベクター中に含めることができる。ピコルナウイルスのアフタウイルス(Aphthovirus)亜群中に同定された2Aペプチドは、コドンによってコードされる2つのアミノ酸間にペプチド結合を形成することなく、1つのコドンから次のコドンへのリボソームの「スキップ」を引き起こす((DonnellyおよびElliott、2001;Atkins,Willsら、2007;Doronina,Wuら、2008)を参照)。「コドン」とは、リボソームによって1つのアミノ酸残基に翻訳されるmRNA上(またはDNA分子のセンス鎖上)の3つのヌクレオチドを意味する。したがって、2つのポリペプチドを、ポリペプチドがインフレームにある2Aオリゴペプチド配列によって分離されているとき、mRNA内で単一の連続したオープンリーディングフレームから合成することができる。このようなリボソームスキップ機構は、当技術分野で周知であり、単一のメッセンジャーRNAによってコードされるいくつかのタンパク質の発現のためにいくつかのベクターによって使用されることが公知である。
本発明のEGFRVIII CARが細胞内で発現されることを可能にするベクターは、本発明の別の目的である。好適な実施形態では、前記ベクターは、本発明のEGFRVIII CARの一過性発現を可能にする。より好適な実施形態では、前記ベクターは、細胞のゲノム中に配列を挿入することによって本発明のEGFRVIII CARの構成的で安定な発現を可能にする。本発明のEGFRVIII CARの発現および/または本発明のEGFRVIII CARを発現する細胞の生存期間は、制御することができる。
一実施形態では、本発明は、本発明のEGFRVIII CARをコードする配列を含むベクターを提供する。
好適な実施形態では、本発明は、配列番号24、配列番号25、配列番号26、および配列番号27から選択される本発明のEGFRVIII CARをコードする配列を含むベクターを提供する。
より好適な実施形態では、本発明は、本発明のCARをコードする配列を含むpCLS 9632ベクター(図4にあるような)を提供する。
より好適な実施形態では、本発明は、配列番号24、配列番号25、配列番号26、および配列番号27から選択されるCARをコードする配列を含むpCLS 9632ベクター(図4にあるような)を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号25のCARをコードする配列を含むpCLS 9632ベクター(図4にあるような)を提供する。
より好適な実施形態では、本発明は、配列番号27のCARをコードする配列を含むpCLS 9632ベクター(図4にあるような)を提供する。
より好適な実施形態では、本発明は、配列番号26のCARをコードする配列を含むpCLS 9632ベクター(図4にあるような)を提供する。
さらにより好適な実施形態では、本発明は、配列番号24のCARをコードする配列を含むpCLS 9632ベクター(図4にあるような)を提供する。
別の実施形態では、本発明は、本発明のCARを含むpCLS 26700ベクター(図5にあるような)を提供する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号24、配列番号25、配列番号26、および配列番号27から選択されるCARをコードするCAR配列を含むpCLS 26700ベクター(図5に例示したような)であって、前記CARは、ヒト化されていてもよい、ベクターを提供する。
別のより好適な実施形態では、本発明は、配列番号24のCARをコードする配列を含むpCLS 26700ベクター(図5にあるような)を提供する。別のより好適な実施形態では、本発明は、配列番号25のCARをコードする配列を含むpCLS 26700ベクター(図5にあるような)を提供する。
別のより好適な実施形態では、本発明は、配列番号26のCARをコードする配列を含むpCLS 26700ベクター(図5にあるような)を提供する。
別のより好適な実施形態では、本発明は、配列番号27のCARをコードする配列を含むpCLS 26700ベクター(図5にあるような)を提供する。
膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路内に導くために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても公知)がポリヌクレオチド配列またはベクター配列中に提供される。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に作動可能に連結されており、すなわち、2つの配列は、正しい読み枠内で接合され、新しく合成されるポリペプチドを宿主細胞の分泌経路内に導くように配置されている。分泌シグナル配列は、一般に、目的のポリペプチドをコードする核酸配列の5’に配置されるが、ある特定の分泌シグナル配列は、目的の核酸配列中の他の場所に配置されてもよい(例えば、Welchら、米国特許第5,037,743号;Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照)。好適な実施形態では、シグナルペプチドは、アミノ酸配列、配列番号1および2を含む。
より好適な実施形態では、本発明のCARのシグナルペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を含む。
当業者は、遺伝コードの縮重を考慮して、かなりの配列バリエーションがこれらのポリヌクレオチド分子の中で可能であることを認識することになる。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞内の発現について、好ましくはヒト細胞内の発現についてコドン最適化されている。コドン最適化は、所与の種の高度に発現される遺伝子中で一般に稀有であるコドンの、このような種の高度に発現される遺伝子中で一般に頻繁であるコドンによる目的の配列中の交換を指し、このようなコドンは、交換されているコドンのようにアミノ酸をコードする。
CARを備えた免疫細胞を操作する方法:
本発明は、免疫療法のための免疫細胞を調製する方法であって、以前に記載したEGFRvIII CARの1つをコードするポリヌクレオチドまたはベクターを前記免疫細胞内にex−vivoで導入することを含む方法を包含する。
本発明は、好ましくは免疫療法のための、より好ましくはがんのさらなる療法のための本発明のEGFRVIII CARの1つをコードするポリヌクレオチドまたはレンチウイルスベクターを備えた免疫細胞を含む初代免疫細胞も包含する。
本発明の初代免疫細胞は、EGFRVIII発現がん細胞に対するより良好な親和性および選択性を有する本発明のEGFRVIII CARコンストラクトを含む。
好適な実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、免疫細胞内で安定に発現されることを考慮してレンチウイルスベクター(好ましくは図5にあるような)中に含められる。
さらなる実施形態によれば、前記方法は、前記細胞を遺伝的に修飾してこれらを同種移植により適したものにするステップをさらに含む。
第1の態様によれば、免疫細胞は、例えば、WO2013/176915に記載されたようにT細胞受容体(TCR)の1種または複数の成分を発現する少なくとも1種の遺伝子を不活化することによって、同種とすることができ、この不活化は、HLAまたはβ2mタンパク質発現をコードまたは調節する遺伝子の不活化と組み合わせることができる。したがって、移植片対宿主症候群および移植片拒絶のリスクは、著しく低減される。
別の態様によれば、免疫細胞をさらに遺伝子操作して、EGFRvIII陽性悪性細胞を処置するための標準的なケアとして使用される免疫抑制薬または化学療法処置に対するこれらの耐性を改善することができる。例えば、Campath(アレムツズマブ)処置およびグルココルチコイド処置の薬物標的であるCD52およびグルココルチコイド受容体(GR)を不活化して、細胞をこれらの処置に対して耐性にし、特異的なEGFRvIII CARを備えていない患者自体のT細胞に優る競合上の利点を細胞に与えることができる。CD3遺伝子の発現を抑制または低減して、別の免疫抑制薬であるテプリズマブに対する耐性を付与することもできる。HPRTの発現は、本発明によって抑制または低減して、特に、急性リンパ芽球性白血病を処置するために化学療法で一般に使用される細胞増殖抑制剤である6−チオグアニンに対する耐性を付与することができる。
本発明のさらなる態様によれば、免疫細胞を、PDCD1またはCTLA−4などのT細胞活性化の調節因子として作用する「免疫チェックポイント」として作用するタンパク質をコードする遺伝子を不活化することによって、さらにマニピュレートして細胞をより活性にし、または消耗を制限することができる。その発現が低減または抑制され得る遺伝子の例を、表9に示す。
Figure 2017522884
好適な実施形態では、免疫細胞をさらに操作する前記方法は、DNA切断によって上述したもののような遺伝子を選択的に不活化するための特異的レアカッティングエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、特にmRNAを前記T細胞内に導入することを伴う。より好適な実施形態では、前記レアカッティングエンドヌクレアーゼは、TALE−ヌクレアーゼまたはCas9エンドヌクレアーゼである。TALE−ヌクレアーゼは、他のタイプのレアカッティングエンドヌクレアーゼに対してより高い特異性および切断効率をこれまで証明しており、これらを一定のターンオーバーで大規模に操作された免疫細胞を生成するための最適なエンドヌクレアーゼにする。
送達方法
上述した異なる方法は、細胞内にCARを導入することを伴う。非限定的な例として、前記CARを、1つのプラスミドベクターによってコードされる導入遺伝子として導入することができる。前記プラスミドベクターは、前記ベクターを受け取った細胞を同定および/または選択できるようにする選択マーカーも含有することができる。
ポリペプチドは、細胞内に前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する結果として、細胞内でin situで合成され得る。代わりに、前記ポリペプチドを細胞の外で生成し、次いで細胞に導入することができる。細胞内にポリヌクレオチドコンストラクトを導入するための方法は、当技術分野で公知であり、非限定的な例として、ポリヌクレオチドコンストラクトが細胞のゲノム内に組み込まれる安定形質転換法、ポリヌクレオチドコンストラクトが細胞のゲノム内に組み込まれない一過性形質転換法、およびウイルス媒介方法を含む。前記ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス)、リポソームなどによって細胞内に導入され得る。例えば、一過性形質転換法としては、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、または粒子ボンバードメントがある。前記ポリヌクレオチドは、細胞内で発現されることを考慮して、ベクター、より特定すれば、プラスミドまたはウイルス中に含めることができる。
操作された免疫細胞
本発明のEGFRVIII CARを備えた初代免疫細胞(または操作された免疫細胞)は、本発明の別の目的である。好ましくは、前記細胞は、初代T細胞、より好ましくは、EGFRVIII発現細胞の破壊をもたらす EGFRVIII発現細胞に対してCTL活性を有する初代T細胞である。
好ましくは、前記初代T細胞は、配列番号24のEGFRVIII CARを備えている。
好ましくは、前記初代T細胞は、配列番号25のEGFRVIII CARを備えている。
好ましくは、前記初代T細胞は、配列番号26のEGFRVIII CARを備えている。
好ましくは、前記初代T細胞は、配列番号27のEGFRVIII CARを備え、より好ましくは、前記初代T細胞は、ヒト化されていてもよい、配列番号24のEGFRVIII CARを備える。
本発明は、本発明のEGFRVIII CARを発現し、EGFRVIII発現細胞に対して、好ましくはEGFRVIII発現がん細胞に対してCTLおよび/または脱顆粒活性を呈する初代T細胞を提供し、好ましくは、EGFRVIII発現細胞に対して、好ましくはEGFRVIII発現がん細胞に対してCTLおよび/または脱顆粒活性を呈する前記初代T細胞は、配列番号27のEGFRVIII CARを備え、より好ましくは、前記初代T細胞は、ヒト化されていてもよい、配列番号24のEGFRVIII CARを備える。
本発明は、EGFRVIII発現細胞、特に、EGFRVIII発現腫瘍細胞を溶解するための本発明のEGFRVIII CARを発現する初代T細胞も提供する。
本発明のEGFRVIII CARを発現し、EGFRVIII発現細胞に対して、好ましくはEGFRVIII発現がん細胞に対してCTLおよび/または脱顆粒活性を呈する初代T細胞も、本明細書に開示されている。
本発明のEGFRVIII CARを発現し、EGFRVIII発現細胞に対して、好ましくはEGFRVIII発現がん細胞に対してCTLおよび/または脱顆粒活性を呈する初代T細胞も、本明細書に開示されている。
以下の追加のかつ具体的な主題も提供されている。
− EGFRVIIIに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的な結合ドメイン、より好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的な前記結合ドメインは、単鎖可変断片(scFv)である、結合ドメイン、
− ヒンジ、
− 膜貫通ドメイン、
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、および
ヒトCD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを発現する本発明の初代免疫T細胞。
一実施形態では、本発明の初代免疫T細胞内で発現されるEGFRVIII CARは、ヒトCD28に由来する配列を有さない。
好適な実施形態では、本発明の初代免疫T細胞は、CD28由来配列を含まない、特に、ヒトCD28と少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10のアミノ酸同一性を有する配列を有さないEGFRVIII CARを発現する。
より好適な実施形態では、本発明の初代免疫T細胞内の本発明のEGFRVIII CARの細胞質内および/または膜貫通ドメインは、ヒトCD28由来配列を含まず、特に、ヒトCD28と少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10のアミノ酸同一性を有する配列を有さない。
本発明の初代免疫T細胞は、
− EGFRVIIIに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的な結合ドメインであって、より好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的な前記結合ドメインは、単鎖可変断片(scFv)である、結合ドメイン、
− ヒンジ、
− 膜貫通ドメイン、
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− ヒトCD3ゼータシグナリングドメインで構成され、ヒトCD28シグナリングドメインで構成されない細胞内シグナリグンドメイン
を含むEGFRVIII CARを発現する。
好適な実施形態では、本発明の初代免疫T細胞は、CD28に由来する配列を含まず、CD8αに由来するシグナルペプチド(リーダー配列)、TMドメイン、およびヒンジを含むEGFRVIII CARを発現する。
一実施形態では、本発明の初代免疫T細胞は、ヒトCD8α(配列番号1)に由来するリーダー配列、または配列番号1と少なくとも95%の同一性を有する、好ましくは配列番号1のリーダー配列を含むEGFRVIII CARを発現する。
別の実施形態では、本発明の初代免疫T細胞は、配列番号2のリーダー配列、または配列番号2と少なくとも95%の同一性を有するリーダー配列を含むEGFRVIII CARを発現する。
一実施形態では、本発明の初代免疫T細胞は、
− EGFRVIIIに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的なドメインであって、より好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的な前記ドメインは、単鎖可変断片(scFv)である、結合ドメイン、
− ヒトCD8アルファ鎖に由来する(CD8αに由来する)ヒンジ、
− ヒトCD8アルファ(α)に由来する膜貫通ドメイン、
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− ヒトCD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを発現する。
一実施形態では、本発明の初代免疫T細胞は、
− EGFRVIIIに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的なドメインであって、より好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的な前記ドメインは、単鎖可変断片(scFv)である、結合ドメイン、
− ヒトIgG1に由来するヒンジ、
− ヒトCD8アルファ(α)に由来する膜貫通ドメイン、
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− ヒトCD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを発現する。
本発明は、配列番号1または配列番号2のシグナルペプチドを含むEGFRVIII CARを発現する本発明の初代免疫T細胞を包含する。
本発明は、ヒンジ、好ましくはCD8α、IgG1、またはFCRIIIに由来するヒンジ(図2を参照)、より好ましくはCD8αに由来するヒンジ、さらにより好ましくは配列番号4を有するヒンジに連結された抗EGFRVIII scfvを含むEGFRVIII CARを発現する本発明の初代免疫T細胞を提供する。
好ましくは、本発明は、
− シグナルペプチド、好ましくはCD8アルファに由来するシグナルペプチド、より好ましくは配列番号1または配列番号2のCD8アルファに由来するシグナルペプチド、
− リンカーによってVLドメインと分離されたVHドメインを含む(scFv)であって、前記VHおよびVLは、EGFRVIIIへの結合に寄与する、(scFv)、
− ヒトCD8アルファ鎖に由来するヒンジ、またはヒトIgG1に由来するヒンジ、
− CD8アルファ(α)に由来する膜貫通ドメイン(TM)
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− CD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
より好ましくは、本発明は、
− ヒトCD8アルファに由来するシグナルペプチド、
− リンカーによってVLドメインと分離されたVHドメインを含む(scFv)であって、前記VHおよびVLは、EGFRVIIIへの結合に寄与する、(scFv)、
− ヒトCD8アルファ鎖に由来するヒンジ、またはヒトIgG1に由来するヒンジ、
− CD8アルファ(α)に由来する膜貫通ドメイン(TM)、
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− CD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
さらにより好ましくは、本発明は、
− ヒトCD8アルファに由来するシグナルペプチド、
− リンカーによってVLドメインと分離されたVHドメインを含む(scFv)であって、前記VHおよびVLは、EGFRVIIIへの結合に寄与し、前記VHドメインおよびVLドメインは、ヒト化されている、(scFv)、
− ヒトCD8アルファ鎖に由来するヒンジ、またはヒトIgG1に由来するヒンジ、
− ヒトCD8アルファ(α)に由来する膜貫通ドメイン(TM)、
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− ヒトCD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
本発明のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞は、
− リーダー配列(例えば、CD8αリーダー配列またはCD8αシグナルペプチド)、
− VH、リンカー、およびVLを含む抗EGFRVIII scfv、
− CD8αヒンジ、
− CD8α TM、
− 4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− 細胞内CD3ゼータシグナリングドメイン
を含む。
本発明のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞は、
− リーダー配列(例えば、CD8αリーダー配列またはCD8αシグナルペプチド)、
− VL、リンカー、およびVHを含む抗EGFRVIII scfv、
− CD8αヒンジ、
− CD8α TM、
− 4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− 細胞内CD3ゼータシグナリングドメイン
を含む。
本発明のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞は、
− リーダー配列(例えば、CD8αリーダー配列またはCD8αシグナルペプチド)、
− VH、リンカー、およびVLを含む抗EGFRVIII scfv、
− CD8αヒンジ、
− CD8α TM、
− 4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− 細胞内CD3ゼータシグナリングドメイン
で構成される。
一実施形態では、前記リンカーは、式(G4S)nのリンカーであり、式中、nは、1〜3であり、好ましくはn=3であり、前記配列は、(G4S)3であり、より好ましくは配列番号10のものである。
本発明のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞は、
− ヒトCD8αリーダー配列(例えば、CD8αリーダーまたはCD8αシグナルペプチド)、
− VH、リンカー、およびVLを含む抗EGFRVIII scfvであって、有利には、scfvは、ヒト化されている、抗EGFRVIII scfv、
− ヒトCD8αヒンジ、
− ヒトCD8α TM、
− 4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− 細胞内CD3ゼータシグナリングドメイン
を含む。
一実施形態では、本発明は、
− 配列番号1のヒトCD8αリーダー配列(例えば、CD8αリーダーまたはCD8αシグナルペプチド)、
− 配列番号11のVH、配列番号10のリンカー、および配列番号12のVL、または配列番号13のVH、配列番号10のリンカー、および配列番号14のVLを含む抗EGFRVIII scfvであって、有利には、scfvは、ヒト化されている、抗EGFRVIII scfv、
− 配列番号4のヒトCD8αヒンジ、
− 配列番号6のヒトCD8α TM、
− 配列番号8の4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− 配列番号9の細胞内CD3ゼータシグナリングドメイン
を含む本発明のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、
− 配列番号1のヒトCD8αリーダー配列(例えば、CD8αリーダーまたはCD8αシグナルペプチド)、
− 配列番号12のVL、配列番号10のリンカー、および配列番号11のVH、配列番号14のVL、配列番号10のリンカー、および配列番号13のVHを含む抗EGFRVIII scfvであって、有利には、scfvは、ヒト化されている、抗EGFRVIII scfv、
− 配列番号4のヒトCD8αヒンジ、
− 配列番号6のヒトCD8α TM、
− 配列番号8の4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− 配列番号9の細胞内CD3ゼータシグナリングドメイン
を含む本発明のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、
− 配列番号1または2のポリペプチドと少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するシグナルペプチドであって、好ましくは、配列番号1のポリペプチドと少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、シグナルペプチド、
− リンカーによってVLドメインと分離されたVHドメインであって、前記VHおよびVLは、EGFRVIIIへの結合に寄与し、前記リンカーは、配列番号10のポリペプチドと少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有し、
前記VHドメインは、配列番号11または配列番号13のポリペプチドと少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有し、
前記VLドメインは、配列番号12または配列番号14のポリペプチドと少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有する、リンカーによってVLドメインと分離されたVHドメイン、
− − 配列番号4のポリペプチドと少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒトCD8アルファ鎖に由来するヒンジ、
− 配列番号6のポリペプチドと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有するCD8アルファ(α)に由来する膜貫通ドメイン、
− 配列番号8からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒト4−1BB(または4−1BB細胞内ドメイン)に由来する共刺激シグナル分子、
− 配列番号9からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含む本発明のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
好適な実施形態では、本発明の初代免疫T細胞内で発現される本発明のEGFRVIII CARは、CD28由来、またはヒトCD28由来、特に、ヒトCD28イントラシグナリングドメインに由来するいずれの配列も含まない。より好適な実施形態では、本発明の初代免疫T細胞内で発現される本発明のEGFRVIII CARは、ヒトCD28由来、特に、ヒトCD28イントラシグナリングドメインに由来するいずれの配列も含まず、EGFRVIIIに特異的なscfvのVHドメインに好ましくは融合されたCD8αに由来するシグナルペプチドをさらに含有する。
一実施形態では、本発明は、配列番号24のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号25のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号26のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号27のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
好適な実施形態では、本発明は、配列番号24または配列番号25、より好ましくは配列番号24のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
より好適な実施形態では、本発明は、EGFRVIII発現細胞に対して、好ましくはEGFRVIII発現がん細胞に対してCTLおよび/または脱顆粒活性を呈する配列番号24または配列番号25、より好ましくは配列番号24のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号24のポリペプチドと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号25のポリペプチドと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号26のポリペプチドと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号27のポリペプチドと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
本発明はまた、細胞を操作する前記方法によって得られやすい単離された細胞または細胞株に関する。特に、前記単離細胞は、上述した本発明の少なくとも1種のCARを含む。別の実施形態では、前記単離細胞は、各1つが異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を含む。特に、前記単離細胞は、CARをコードする外因性ポリヌクレオチド配列を含む。本発明の遺伝的に修飾された免疫細胞は、活性化されており、抗原結合機構とは独立に増殖する。
本発明の範囲内において、以前に記載した方法のいずれか1つに従って得られる単離免疫細胞、好ましくはT細胞も包含される。前記免疫細胞は、先天的および/または適応的免疫応答の開始および/または実行に機能的に関与される造血起源の細胞を指す。本発明による前記免疫細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より特定すれば、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞は、CD34+細胞である。前記単離細胞はまた、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球からなる群から選択される樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、NK細胞、B細胞、またはT細胞であり得る。別の実施形態では、前記細胞は、CD4+Tリンパ球およびCD8+Tリンパ球からなる群に由来し得る。本発明の細胞の拡大増殖および遺伝的修飾の前に、細胞源を、様々な限定されない方法によって対象から得ることができる。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含めたいくつかの限定されない源から得ることができる。本発明のある特定の実施形態では、当業者に利用可能で公知の任意の数のT細胞株が使用され得る。別の実施形態では、前記細胞は、健康なドナー、がんと診断された患者、または感染症と診断された患者に由来し得る。別の実施形態では、前記細胞は、異なる表現型特性を提示する細胞の混合集団の一部である。本発明の範囲において、以前に記載した方法による形質転換T細胞から得られる細胞株も包含する。免疫抑制処置に耐性であり、以前の方法によって得られやすい修飾細胞は、本発明の範囲内に包含される。
好適な実施形態として、本発明は、機能的TCRを発現せず、EGFRvIII陽性細胞に対して反応性である、上述したEGFRvIII CARを備えたT細胞またはT細胞の集団を、患者へのその同種移植のために提供する。
T細胞の活性化および拡大増殖
T細胞の遺伝的修飾の前であっても後であっても、本発明の遺伝的に修飾された免疫細胞が活性化されており抗原結合機構とは独立に増殖する場合でも免疫細胞、特に本発明のT細胞は、例えば、米国特許6,352,694号;同第6,534,055号;同第6,905,680号;同第6,692,964号;同第5,858,358号;同第6,887,466号;同第6,905,681号;同第7,144,575号;同第7,067,318号;同第7,172,869号;同第7,232,566号;同第7,175,843号;同第5,883,223号;同第6,905,874号;同第6,797,514号;同第6,867,041号;および米国特許出願公開第20060121005号に記載された方法を一般に使用してさらに活性化および拡大増殖され得る。T細胞は、in vitroまたはin vivoで拡大増殖され得る。
一般に、本発明のT細胞は、T細胞の表面でCD3 TCR複合体および共刺激分子を刺激してT細胞に対して活性化シグナルを創製する作用物質との接触によって拡大増殖される。例えば、化学物質、例えば、カルシウムイオノフォアA23187、ホルボール12−ミリステート13−アセテート(PMA)、または分裂促進レクチン様フィトヘマグルチニン(PHA)などを、T細胞に対する活性化シグナルを創製するのに使用することができる。
非限定的な例として、T細胞集団を、抗CD3抗体もしくはその抗原結合性断片、または表面に固定化された抗CD2抗体との接触、またはカルシウムイオノフォアと併せたプロテインキナーゼC活性化因子(例えば、ブリオスタチン)との接触などによってin vitroで刺激することができる。T細胞の表面上のアクセサリー分子の同時刺激について、アクセサリー分子を結合させるリガンドが使用される。例えば、T細胞の集団を、T細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。T細胞培養に適切な条件は、血清(例えば、胎児ウシ血清もしくはヒト血清)、インターロイキン−2(IL−2)、インスリン、IFN−g、1L−4、1L−7、GM−CSF、−10、−2、1L−15、TGFp、およびTNF−、または当業者に公知の細胞の増殖(growth)のための任意の他の添加剤を含めた増殖(proliferation)および生存能に必要な因子を含有し得る適切な培地(例えば、最小必須培地、またはRPMI培地1640、またはX−vivo 5(Lonza))を含む。細胞の増殖のための他の添加剤としては、それだけに限らないが、界面活性剤、プラズマネート、ならびに還元剤、例えば、N−アセチル−システインおよび2−メルカプトエタノールなどが挙げられる。培地として、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを添加された、無血清の、または適切な量の血清(もしくは血漿)、または規定されたセットのホルモン、ならびに/またはT細胞の増殖および拡大増殖に十分な量のサイトカインを補充された、RPMI 1640、A1M−V、DMEM、MEM、a−MEM、F−12、X−Vivo 1、ならびにX−Vivo 20、Optimizerを挙げることができる。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的な培養液中にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養液中に含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度(例えば、37℃)および雰囲気(例えば、空気+5% CO)下で維持される。様々な刺激時間に曝露されたT細胞は、異なる特性を呈し得る。
別の特定の実施形態では、前記細胞は、組織または細胞と共培養することによって拡大増殖され得る。前記細胞はまた、in vivoで、例えば、前記細胞を対象内に投与した後の対象の血液中で拡大増殖され得る。
治療用途
本発明は、本発明の別の目的である本発明のEGFRVIII CARを発現する初代T細胞および薬学的に許容できるビヒクルを含む組成物を提供する。
特に免疫療法のための医薬としての本発明のEGFRVIII CARを発現する初代T細胞も本明細書に開示されている。
がんの処置において使用するための、または炎症を減弱するための本発明のEGFRVIII CARを発現する初代T細胞も本明細書に開示されている。
別の実施形態では、異なる方法によって得られる単離細胞または以前に記載した前記単離細胞に由来する細胞株を、医薬として使用することができる。別の実施形態では、前記医薬は、がんを処置するのに、特に、その必要のある患者におけるB細胞リンパ腫および白血病を処置するのに使用することができる。別の実施形態では、本発明による前記単離細胞または前記単離細胞に由来する細胞株は、その必要のある患者におけるがんの処置のための医薬の製造において使用することができる。
用語「がん」は、1つまたはいくつかのタイプの細胞の急速で制御されない増殖によって特徴付けられる疾患を指す。がんの例は、本明細書に記載されており、それだけに限らないが、神経膠芽腫、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵がん、結腸直腸がん、腎がん、肝がん、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺がんが挙げられる。好ましくは、本発明のEGFRvIII CARで防止または処置されるがんは、神経膠腫、好ましくは神経膠芽腫、より好ましくは多発性神経膠芽腫である。
用語「EGFRvIIIの発現に関連した疾患」は、本明細書では、それだけに限らないが、EGFRvIIIの発現に関連した疾患、または様々ながん、例えば、神経膠芽腫(神経膠芽腫幹細胞を含む);乳癌、卵巣癌、および非小細胞肺癌;頭頸部扁平上皮癌;髄芽腫、結腸直腸がん、前立腺がん、および膀胱癌などの腫瘍細胞を含めたEGFRvIIIを発現する細胞の活性に関連した状態を含む。溶解(lyse)は、それにより本発明のEGFRvIII CAR T細胞が、EGFRvIII発現細胞に対して作用し、腫瘍を低減または排除し、宿主の免疫細胞の腫瘍部位への浸潤を促進し、抗腫瘍応答を増強/拡張する機構の1つである。
別の態様では、本発明は、その必要のある患者を処置するための方法であって、以下のステップの少なくとも1つを含む方法を利用する。
(a)以前に記載した方法のいずれか1つによって入手可能な免疫細胞を準備するステップ、
(b)前記患者に前記形質転換免疫細胞を投与するステップ。
一実施形態で、本発明の前記T細胞は、ロバストなin vivo T細胞拡大増殖を起こすことができ、長い量の時間にわたって持続することができる。
前記処置は、回復的、治癒的、または予防的であり得る。それは、自己免疫療法の一部または同種免疫療法処置の一部であり得る。自己とは、患者を処置するのに使用される細胞、細胞株、または細胞の集団が、前記患者またはヒト白血球抗原(HLA)互換性ドナーに起源を持つことを意味する。同種とは、患者を処置するのに使用される細胞、または細胞の集団が、前記患者に起源を持たず、ドナーに起源を持つことを意味する。
開示した方法とともに使用され得る細胞は、以前のセクションに記載されている。前記処置は、EGFRvIII発現細胞、特に、過剰のEGFRvIII発現細胞によって特徴付けられる前悪性がん状態または悪性がん状態と診断された患者を処置するのに使用することができる。このような状態は、肺がん、肛門がん、および多形性神経膠芽腫などのがんにおいて見つかる。
本発明のCARを用いて処置されるがんのタイプとしては、それだけに限らないが、肺がん、肛門がん、および多形性神経膠芽腫が挙げられる。成人腫瘍/がんおよび小児腫瘍/がんも含まれる。
本発明は、EGFRvIIIに関連した疾患および障害を処置するための組成物および方法を提供する。EGFRvIIIに関連した疾患または障害の一例は、神経膠腫である。
神経膠腫は、グリア細胞(例えば、神経細胞を囲繞および支持し、乏突起膠細胞、星状細胞、ミクログリア、および上衣細胞を含む細胞)内で始まる中枢神経系のがんを指す。神経膠腫は、これらの詳細な病理組織型に従って7つを超えるタイプ、例えば、神経膠芽腫および未分化星細胞腫などに分類される。
病期(腫瘍サイズ、遠位転移の存在)および組織学的悪性度が、原発性脳腫瘍の悪性度の程度を判定するとき使用される。組織学的悪性度は、the Guidelines for the Treatment of Brain Tumors((2002)Kanehara&Co.,Ltd.)に従って4つのレベル、すなわちG1〜G4に分類され、これらは、それぞれWH01〜WH04に対応する。数値が大きいほど、悪性度の程度が高い。例えば、神経膠芽腫の悪性度は、G4(WH04)であり、一方、未分化星細胞腫の悪性度はG3(WH03)であり、G3およびG4はともに悪性と分類される。
したがって、特定の実施形態によれば、本発明の方法は、悪性神経膠腫を標的とする。他の態様では、本発明は、多形性神経膠芽腫(GBM)または多発性神経膠芽腫を標的とする。
さらなる実施形態では、本発明の組成物および方法は、それだけに限らないが、未分化星細胞腫、巨細胞神経膠芽腫、膠肉腫、未分化乏突起膠腫、未分化上衣細胞腫、脈絡叢癌、未分化神経節膠腫、松果体芽腫、髄上皮腫、上衣芽細胞腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、および非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍を含めた他の神経膠腫の処置において使用される場合がある。
神経膠芽腫は、成人における最も一般的な原発性脳腫瘍である。毎年悪性原発性脳腫瘍と診断される患者の半分超が、多形性神経膠芽腫を有する。多形性神経膠芽腫は、高い増殖指数、微小血管増殖、および局所的なネクローシスを伴った未分化の、高度に細胞性の腫瘍である。
これらの病変部の高度に増殖性の特質は、複数の分裂促進効果から生じる可能性が高い。GBMのホールマークの1つは、内皮増殖である。多数の血管新生増殖因子およびこれらの受容体の宿主が、GBMにおいて見つかる。
多形性神経膠芽腫の予後は、悲惨なままである。生存時間は、患者の大部分について2年未満である。
原発性多形性神経膠芽腫は、グリア細胞から新規に発症し、典型的には6カ月未満の病歴を有し、高齢患者においてより一般的であり、小細胞組織構造(small−cell histology)を提示する。続発性の多形性神経膠芽腫は、既存の低グレード神経膠星状細胞腫から数カ月または数年にわたって発症し、主に若者に影響し、巨細胞組織構造(giant−cell histology)を提示する。
悪性神経膠腫は、高グレードの神経膠腫としても公知である。これらは、脳および脊髄に影響し得る。一部の態様では、本発明の組成物および方法は、脳悪性神経膠腫、例えば、未分化星細胞腫(AA)、多形神経膠芽腫(GBM)、未分化乏突起膠腫(AO)、および未分化乏突起星細胞腫(AOA)の中で選択されるものを担持する対象を処置するのに使用することができる。
本発明の組成物および方法は、EGFRvIIIを発現する細胞もしくは組織を有するとして特徴付けられている、またはEGFRvIIIを発現する細胞もしくは組織を有すると疑われる対象を処置するのに使用することができる。例えば、本発明による処置から恩恵を受ける対象としては、例えば、頭蓋内圧の増大の結果として頭痛、吐き気および嘔吐、発作、視覚の喪失、疼痛、脱力感、四肢のしびれ、ならびに/または脳神経障害の1つまたは複数の存在によって立証されるような、神経膠腫を有する対象、または神経膠腫を有すると疑われる対象が挙げられる。特定の実施形態では、処置される神経膠腫は、多形性神経膠芽腫である。本実施形態によれば、多形性神経膠芽腫は、脳または脊髄内に存在し得る。
本発明では、免疫細胞は、プリンヌクレオチド類似体、プラチン(シスプラチンまたはカルボプラチン)、抗トポイソメラーゼI(イリノテカン)、抗トポイソメラーゼII(エトポシド)、メトトレキセート(葉酸類似体)から選択される薬物に対してなどの化学療法に対して耐性である初代免疫細胞、単離初代免疫細胞、単離初代免疫T細胞、単離初代免疫NK細胞、単離初代免疫TCR−KO T細胞、好ましくは単離初代免疫TCR−KO T細胞を意味する。
好ましくは、本発明は、神経膠芽腫、より特定すれば、多発性神経膠芽腫の処置で使用するための本発明の効率的なEGFRVIII CARを発現する初代T細胞を提供する。より好ましくは、本発明は、神経膠芽腫、より特定すれば、多発性神経膠芽腫の処置で使用するための、ヒト化されていてもよい、配列番号24の本発明の効率的なEGFRVIII CARを発現する初代T細胞を提供する。
一実施形態では、患者は、残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、残留性または再発性EGFRvIII+神経膠芽腫を有する患者である。
別の実施形態では、本発明は、神経膠芽腫、より特定すれば、多発性神経膠芽腫の処置で使用するための本発明の効率的なEGFRVIII CARを発現する初代T細胞を提供する。より好ましくは、本発明は、未分化星細胞腫、神経膠芽腫、神経膠腫、膠肉腫、または神経上皮腫を有する患者の処置で使用するための、ヒト化されていてもよい、配列番号24の本発明の効率的なEGFRVIII CARを発現する初代T細胞を提供する。
がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するためのEGFRVIII発現細胞に対して、好ましくはEGFRVIII発現がん細胞に対してCTLおよび/または脱顆粒活性を呈する本発明のEGFRVIII CARを発現する初代T細胞も本明細書に開示されている。
がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、
− EGFRVIIIに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的な結合ドメインであって、より好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的な前記結合ドメインは、単鎖可変断片(scFv)である、結合ドメイン、
− ヒンジ、
− 膜貫通ドメイン、
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、および
− ヒトCD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞が本明細書に提供されている。
好適な実施形態では、本発明の初代免疫T細胞は、CD28由来配列を含まず、特に、ヒトCD28と少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10のアミノ酸同一性を有する配列を有さないEGFRVIII CARを発現し、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するために提供される。
より好適な実施形態では、本発明の初代免疫T細胞内の本発明のEGFRVIII CARの細胞質内および/または膜貫通ドメインは、ヒトCD28由来配列を含まず、特に、ヒトCD28と少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10のアミノ酸同一性を有する配列を有さず、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するために提供される。
がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、
− EGFRVIIIに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的な結合ドメインであって、より好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的な前記結合ドメインは、単鎖可変断片(scFv)である、結合ドメイン、
− ヒンジ、
− 膜貫通ドメイン、
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− ヒトCD3ゼータシグナリングドメインで構成され、ヒトCD28シグナリングドメインで構成されない細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを発現する本発明の初代免疫T細胞が提供されている。
好適な実施形態では、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、CD28に由来する配列を含まず、CD8αに由来するシグナルペプチド(リーダー配列)、TMドメイン、およびヒンジを含むEGFRVIII CARを発現する本発明の初代免疫T細胞が提供されている。
一実施形態では、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、ヒトCD8αに由来するリーダー配列、または配列番号1と少なくとも95%の同一性を有する、好ましくは配列番号1のリーダー配列を含むEGFRVIII CARを発現する本発明の初代免疫T細胞が提供されている。
別の実施形態では、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、配列番号2のリーダー配列、または配列番号2と少なくとも95%の同一性を有するリーダー配列を含むEGFRVIII CARを発現する本発明の初代免疫T細胞が提供されている。
一実施形態では、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、
− EGFRVIIIに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的なドメインであって、より好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的な前記ドメインは、単鎖可変断片(scFv)である、結合ドメイン、
− ヒトCD8アルファ鎖に由来する(CD8αに由来する)ヒンジ
− ヒトCD8アルファ(α)に由来する膜貫通ドメイン
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子
− ヒトCD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを発現する本発明の初代免疫T細胞が提供されている。
がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、
− EGFRVIIIに特異的な結合ドメイン、好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的なドメインであって、より好ましくはヒトEGFRVIIIに特異的な前記ドメインは、単鎖可変断片(scFv)である、結合ドメイン、
− ヒトIgG1に由来するヒンジ
− ヒトCD8アルファ(α)に由来する膜貫通ドメイン
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子
− ヒトCD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを発現する本発明の初代免疫T細胞が提供されている。
本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、配列番号1または配列番号2のシグナルペプチドを含むGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を包含する。
本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、ヒンジ、好ましくはCD8α、IgG1、またはFCRIIIに由来するヒンジ(図2を参照)、より好ましくはCD8αに由来するヒンジ、さらにより好ましくは配列番号4を有するヒンジに連結された抗EGFRVIII scfvを含むEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、ヒンジ、好ましくはCD8αに由来するヒンジ、CD8αに由来するTM、およびCD8αに由来するシグナルペプチド、さらにより好ましくは配列番号4を有するヒンジ、CD8αに由来するTM、およびCD8αに由来するシグナルペプチドに連結された抗EGFRVIII scfvを含むEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
好ましくは、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫の処置で使用するための、
− シグナルペプチド、好ましくはCD8アルファに由来するシグナルペプチド、より好ましくは配列番号1のCD8アルファに由来するシグナルペプチド、
− リンカーによってVLドメインと分離されたVHドメインを含む(scFv)であって、前記VHおよびVLは、EGFRVIIIへの結合に寄与する、(scFv)、
− ヒトCD8アルファ鎖に由来するヒンジ、またはヒトIgG1に由来するヒンジ、
− CD8アルファ(α)に由来する膜貫通ドメイン(TM)、
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− CD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
より好ましくは、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、
− ヒトCD8アルファに由来するシグナルペプチド、
− リンカーによってVLドメインと分離されたVHドメインを含む(scFv)であって、前記VHおよびVLは、EGFRVIIIへの結合に寄与する、(scFv)、
− ヒトCD8アルファ鎖に由来するヒンジ、またはヒトIgG1に由来するヒンジ
− CD8アルファ(α)に由来する膜貫通ドメイン(TM)
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子
− CD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
さらにより好ましくは、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、
− ヒトCD8アルファに由来するシグナルペプチド、
− リンカーによってVLドメインと分離されたVHドメインを含む(scFv)であって、前記VHおよびVLは、EGFRVIIIへの結合に寄与し、前記VHドメインおよびVLドメインは、ヒト化されている、(scFv)
− ヒトCD8アルファ鎖に由来するヒンジ、またはヒトIgG1に由来するヒンジ
− CD8アルファ(α)に由来する膜貫通ドメイン(TM)
− ヒト4−1BBに由来する共刺激シグナル分子
− CD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、
− リーダー配列(例えば、CD8αリーダー配列またはCD8αシグナルペプチド)
− VH、リンカー、およびVLを含む抗EGFRVIII scfv、
− CD8αヒンジ
− CD8α TM
− 4−1BBに由来する共刺激シグナル分子
− 細胞内CD3ゼータシグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞が提供されている。
がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、
− リーダー配列(例えば、CD8αリーダー配列またはCD8αシグナルペプチド)
− VL,リンカー、およびVHを含む抗EGFRVIII scfv、
− CD8αヒンジ
− CD8α TM
− 4−1BBに由来する共刺激シグナル分子
− 細胞内CD3ゼータシグナリングドメイン
を含むEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞が提供されている。
がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、
− リーダー配列(例えば、CD8αリーダー配列またはCD8αシグナルペプチド)
− VH、リンカー、およびVLを含む抗EGFRVIII scfv、
− CD8αヒンジ
− CD8α TM
− 4−1BBに由来する共刺激シグナル分子
− 細胞内CD3ゼータシグナリングドメイン
で構成される本発明のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞が提供されている。
一実施形態では、前記リンカーは、式(G4S)nのリンカーであり、式中、nは、1〜3であり、好ましくはn=3であり、前記配列は、(G4S)3であり、より好ましくは配列番号10のものである。
がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、
− ヒトCD8αリーダー配列(CD8αリーダーまたはCD8αシグナルペプチド)、
− VH、リンカー、およびVLを含む抗EGFRVIII scfvであって、有利には、scfvは、ヒト化されている、抗EGFRVIII scfv、
− ヒトCD8αヒンジ
− ヒトCD8α TM
− 4−1BBに由来する共刺激シグナル分子
− 細胞内CD3ゼータシグナリングドメイン
を含む本発明のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞が提供されている。
一実施形態では、本発明は、
がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、
− 配列番号1のヒトCD8αリーダー配列(CD8αリーダーまたはCD8αシグナルペプチド)
配列番号11のVH、配列番号10のリンカー、および配列番号12のVL、または配列番号13のVH、配列番号10のリンカー、および配列番号14のVLを含む抗EGFRVIII scfvであって、有利には、scfvは、ヒト化されている、抗EGFRVIII scfv、
− 配列番号4のヒトCD8αヒンジ、
− 配列番号6のヒトCD8α TM
− 配列番号8の4−1BBに由来する共刺激シグナル分子
− 配列番号9の細胞内CD3ゼータシグナリングドメイン
を含む本発明のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、
がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、
− 配列番号1のヒトCD8αリーダー配列(CD8αリーダーまたはCD8αシグナルペプチド)
配列番号12のVL、配列番号10のリンカー、配列番号11のVH、配列番号14のVL、配列番号10のリンカー、および配列番号13のVHを含む抗EGFRVIII scfvであって、有利には、scfvは、ヒト化されている、抗EGFRVIII scfv、
− 配列番号4のヒトCD8αヒンジ、
− 配列番号6のヒトCD8α TM
− 配列番号8の4−1BBに由来する共刺激シグナル分子、
− 配列番号9の細胞内CD3ゼータシグナリングドメイン
を含む本発明のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための、
− 配列番号1または2のポリペプチドと少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するシグナルペプチドであって、好ましくは、配列番号1のポリペプチドと少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、シグナルペプチド、
− リンカーによってVLと分離されたVHドメインであって、前記VHおよびVLは、EGFRVIIIへの結合に寄与し、前記リンカーは、配列番号10のポリペプチドと少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有し、
前記VHドメインは、配列番号11または配列番号13のポリペプチドと少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有し、
前記VLドメインは、配列番号12または配列番号14のポリペプチドと少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有する、リンカーによってVLドメインと分離されたVHドメイン、
− − 配列番号4のポリペプチドと少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒトCD8アルファ鎖に由来するヒンジ、
− 配列番号6のポリペプチドと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有するCD8アルファ(α)に由来する膜貫通ドメイン、
− 配列番号8からなるアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒト4−1BB(または4−1BB細胞内ドメイン)に由来する共刺激シグナル分子、
− 配列番号9からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、95%、97%、99%、または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ゼータシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含む本発明のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
好適な実施形態では、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための初代免疫T細胞内で発現される本発明のEGFRVIII CARは、CD28、またはヒトCD28、特に、ヒトCD28イントラシグナリングドメインに由来するいずれの配列も含まない。
より好適な実施形態では、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための本発明の初代免疫T細胞内で発現される本発明のEGFRVIII CARは、ヒトCD28、特に、ヒトCD28イントラシグナリングドメインに由来するいずれの配列も含まず、EGFRVIIIに特異的なscfvのVHドメインに好ましくは融合されたCD8に由来するシグナルペプチドをさらに含有する。
一実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための配列番号24のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための配列番号25のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための配列番号26のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための配列番号27のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
好適な実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための配列番号24または配列番号25の、より好ましくはがん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための配列番号24のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
より好適な実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための配列番号24または配列番号25の、より好ましくは、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するためのEGFRVIII発現細胞に対して、好ましくはEGFRVIII発現がん細胞に対してCTLおよび/または脱顆粒活性を呈する配列番号24のEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための配列番号24のポリペプチドと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための配列番号25のポリペプチドと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための配列番号26のポリペプチドと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを発現する初代T免疫細胞を提供する。
一実施形態では、本発明は、がん、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、より好ましくは多形性神経膠芽腫(GBM)の処置で使用するための配列番号27のポリペプチドと少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を有するEGFRVIII CARを発現する初代免疫T細胞を提供する。
本発明による操作された免疫細胞を用いた処置は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法、および放射線療法の群から選択されるがんに対する1つまたは複数の療法と組み合わせたものであり得る。
本発明の好適な実施形態によれば、前記処置は、免疫抑制処置を受けている患者に投与することができる。実際に、本発明は、好ましくは、少なくとも1種の免疫抑制剤に対して、このような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活化に起因して耐性にされた細胞または細胞の集団を利用する。この態様では、免疫抑制処置は、患者内の本発明によるT細胞の選択および拡大増殖を助けるはずである。
本発明による細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸血、インプランテーション、または移植によるものを含めた任意の好都合な様式で実施され得る。本明細書に記載の組成物は、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内もしくはリンパ管内注射によって、または腹腔内に、患者に投与することができる。一実施形態では、本発明の細胞組成物は、静脈内注射によって好ましくは投与される。
細胞または細胞の集団の投与は、体重1kg当たり10〜10細胞、好ましくは、これらの範囲内のすべての整数値の細胞数を含めて10〜10細胞/体重1kgの投与からなり得る。細胞または細胞の集団は、1回または複数回の用量で投与することができる。別の実施形態では、細胞の前記有効量は、単回用量として投与される。別の実施形態では、細胞の前記有効量は、ある時間にわたって1回を超える用量で投与される。投与のタイミングは、管理医師の判断内であり、患者の臨床状態に依存する。細胞または細胞の集団は、任意の供給源、例えば、血液銀行またはドナーなどから得ることができる。個々の必要性は変動するが、特定の疾患または状態の所与の細胞型の有効量の最適な範囲の判定は、当技術分野の技術の範囲内である。有効量は、治療的または予防的な利益をもたらす量を意味する。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、もしあれば同時処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の特質に依存することになる。
別の実施形態では、細胞またはこれらの細胞を含む組成物の前記有効量は、非経口的に投与される。前記投与は、静脈内投与であり得る。前記投与は、腫瘍内に注射によって直接行うことができる。
本発明のある特定の実施形態では、細胞は、それだけに限らないが、作用物質を用いた処置、例えば、MS患者のための抗ウイルス療法、シドフォビルおよびンターロイキン−2、シタラビン(ARA−Cとしても公知)、もしくはナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ(efaliztimab)処置、またはPML患者のための他の処置などを含めた任意の数の妥当な処置モダリティーと併せて(例えば、前に、同時に、または後に)患者に投与される。さらなる実施形態では、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノレート、およびFK506、抗体または他の免疫除去剤、例えば、CAMPATH、抗CD3抗体、または他の抗体療法など、細胞毒(cytoxin)、フルダラビン(fludaribine)、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸(mycoplienolic acid)、ステロイド、FR901228、サイトカイン、および照射と組み合わせて使用され得る。これらの薬物は、カルシウム依存ホスファターゼカルシニュリンを阻害し(シクロスポリンおよびFK506)、または増殖因子誘導シグナリングにとって重要であるp70S6キナーゼを阻害する(ラパマイシン)(Henderson、Nayaら、1991;Liu、Albersら、1992 Bierer、Hollanderら、1993)。
さらなる実施形態では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム照射療法(XRT)、シクロホスファミド、またはOKT3もしくはCAMPATHなどの抗体を使用するT細胞除去療法と併せて(例えば、前に、同時に、または後に)患者に投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、B細胞除去療法、例えば、CD20と反応する作用物質、例えば、リツキサンなどの後に投与される。例えば、一実施形態では、対象は、高用量化学療法を用いた標準的な処置を受け、その後に末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある特定の実施形態では、移植の後に、対象は、本発明の拡大増殖された免疫細胞の注入を受ける。追加の実施形態では、拡大増殖された細胞は、手術前または後に投与される。
他の定義
− ポリペプチド配列中のアミノ酸残基は、1文字コードに従って本明細書で指定され、この中で例えば、Qは、Glnまたはグルタミン残基を意味し、Rは、Argまたはアルギニン残基を意味し、Dは、Aspまたはアスパラギン酸残基を意味する。
− アミノ酸置換は、1つのアミノ酸残基の別のアミノ酸残基との置き換えを意味し、例えば、ペプチド配列中のアルギニン残基のグルタミン残基との置き換えは、アミノ酸置換である。
− ヌクレオチドは、以下の通り指定される。1文字コードが、ヌクレオシドの塩基を指定するのに使用される。aは、アデニンであり、tは、チミンであり、cは、シトシンであり、gは、グアニンである。縮重ヌクレオチドについて、rは、gまたはa(プリンヌクレオチド)を表し、kは、gまたはtを表し、sは、gまたはcを表し、wは、aまたはtを表し、mは、aまたはcを表し、yは、tまたはc(ピリミジンヌクレオチド)を表し、dは、g、a、またはtを表し、vは、g、a、またはcを表し、bは、g、t、またはcを表し、hは、a、t、またはcを表し、nは、g、a、t、またはcを表す。
− 本明細書では、「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生成される断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成される断片などのヌクレオチドならびに/またはポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド(DNAおよびRNAなど)、もしくは天然に存在するヌクレオチドの類似体(例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性形態)、または両方の組合せであるモノマーから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分および/またはピリミジンもしくはプリン塩基部分において変化を有し得る。糖修飾としては、例えば、1つまたは複数の水酸基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基との置き換えを含み、または糖をエーテルもしくはエステルとして官能化することができる。さらに、糖部分全体を、立体的および電子的に同様の構造体、例えば、アザ糖および炭素環糖類似体などと置き換えることができる。塩基部分における修飾の例としては、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジン、または他の周知の複素環式置換体がある。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこのような連結部の類似体によって連結することができる。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。
− キメラ抗原受容体(CAR)とは、特異的抗標的細胞免疫活性を呈するキメラタンパク質を生成するために、標的細胞に存在する成分に対する結合ドメイン、例えば、所望の抗原(例えば、腫瘍抗原)に対する抗体ベース特異性を、T細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせる分子を意図している。一般に、CARは、T細胞抗原受容体複合体ゼータ鎖(scFvFc:ζ)の細胞内シグナリングドメインに融合された細胞外単鎖抗体(scFvFc)からなり、T細胞内で発現されるとき、モノクローナル抗体の特異性に基づいて抗原認識を再指向化する能力を有する。本発明で使用されるCARの一例は、EGFRvIII抗原に対してCARであり、非限定的な例として、アミノ酸配列:配列番号15〜18、好ましくは配列番号24〜27、より好ましくは配列番号24;より好ましくはヒト化された配列番号24〜27、より好ましくはヒト化された配列番号24を含み得る。
本発明のCARを発現する初代T細胞とは、特異的抗標的細胞免疫活性(CTL活性)を呈するキメラタンパク質を生成するために、EGFRvIIIに対する少なくとも1つの結合ドメイン、例えば、所望の腫瘍抗原(EGFRvIII)に対する抗体ベース特異性を、T細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせる分子を発現する初代T細胞を意図している。
一般に、本発明のEGFRvIII CARを発現するT細胞は、モノクローナル抗体の特異性に基づいて抗原認識を再指向化し、標的細胞の破壊を誘導する。− 用語「エンドヌクレアーゼ」は、DNA分子またはRNA分子、好ましくはDNA分子内の核酸間の結合の加水分解(切断)を触媒することができる任意の野生型またはバリアント酵素を指す。エンドヌクレアーゼは、その配列に関係なくDNA分子またはRNA分子を切断しないが、「標的配列」または「標的部位」とさらに呼ばれる特異的ポリヌクレオチド配列でDNA分子またはRNA分子を認識および切断する。エンドヌクレアーゼは、典型的には、長さが12塩基対(bp)超、より好ましくは14〜55bpのポリヌクレオチド認識部位を有するとき、レアカッティングエンドヌクレアーゼに分類することができる。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、規定される遺伝子座でDNA二本鎖切断(DSB)を誘導することによってHRを著しく増大させる(Perrin、Buckleら、1993;Rouet、Smihら、1994;Choulika、Perrinら、1995;PingoudおよびSilva、2007)。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ(PaquesおよびDuchateau、2007)、操作されたジンクフィンガードメインのFok Iなどの制限酵素の触媒ドメインとの融合から生じるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)(PorteusおよびCarroll、2005)、CRISPRシステムに由来するCas9エンドヌクレアーゼ(Gasiunas、Barrangouら、2012;Jinek、Chylinskiら 2012;Cong、Ranら、2013;Mali、Yangら、2013)、または化学的エンドヌクレアーゼ(Eisenschmidt、Lanioら、2005;Arimondo、Thomasら 2006)であり得る。化学的エンドヌクレアーゼでは、化学的切断因子またはペプチド性切断因子が、特定の標的配列を認識する核酸または別のDNAのポリマーにコンジュゲートされており、それによって切断活性を特定の配列に標的化する。化学的エンドヌクレアーゼは、特定のDNA配列を結合させることが公知のオルトフェナントロリン、DNA切断分子、および三重鎖形成性オリゴヌクレオチド(TFO)の合成ヌクレアーゼ様コンジュゲートも包含する(KalishおよびGlazer、2005)。このような化学的エンドヌクレアーゼは、本発明による用語「エンドヌクレアーゼ」に含まれる。
− 「TALE−ヌクレアーゼ」(TALEN)とは、典型的には転写アクチベーター様エフェクター(TALE)に由来する核酸結合ドメイン、および核酸標的配列を切断するための1つのヌクレアーゼ触媒ドメインからなる融合タンパク質を意図している。触媒ドメインは、好ましくは、ヌクレアーゼドメイン、より好ましくは、例えば、I−TevI、ColE7、NucA、およびFok−Iのようなエンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。特定の実施形態では、TALEドメインは、例えば、I−CreIおよびI−OnuIのようなメガヌクレアーゼ、またはその機能性バリアントに融合させることができる。より好適な実施形態では、前記ヌクレアーゼは、モノマーTALE−ヌクレアーゼである。モノマーTALE−ヌクレアーゼは、特異的な認識および切断のために二量体化を必要としないTALE−ヌクレアーゼ、例えば、WO2012138927に記載された操作されたTALリピートのI−TevIの触媒ドメインとの融合物などである。転写アクチベーター様エフェクター(TALE)は、細菌種ザントモナス(Xanthomonas)に由来するタンパク質であり、複数のリピート配列を含み、各リピートは、12位および13位に2つの残基を含み(RVD)、これらは、核酸標的配列の各ヌクレオチド塩基に特異的である。同様のモジュラー塩基対塩基核酸結合性質(MBBBD)を有する結合ドメインも、異なる細菌種において出願人が最近発見した新しいモジュラータンパク質に由来し得る。新しいモジュラータンパク質は、TALリピートより多くの配列変異性を示すという利点を有する。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識と関連したRVDは、Cを認識するためのHD、Tを認識するためのNG、Aを認識するためのNI、GまたはAを認識するためのNN、A、C、G、またはTを認識するためのNS、Tを認識するためのHG、Tを認識するためのIG、Gを認識するためのNK、Cを認識するためのHA、Cを認識するためのND、Cを認識するためのHI、Gを認識するためのHN、Gを認識するためのNA、GまたはAを認識するためのSN、およびTを認識するためのYG、Aを認識するためのTL、AまたはGを認識するためのVT、およびAを認識するためのSWである。別の実施形態では、極めて重要なアミノ酸12および13は、ヌクレオチドA、T、C、およびGに対するこれらの特異性をモジュレートするために、特に、この特異性を増強するために、他のアミノ酸残基へと突然変異させることができる。TALE−ヌクレアーゼは、既に記載されており、遺伝子ターゲティングおよび遺伝子修飾を刺激するのに使用されている(Boch、Scholzeら、2009;MoscouおよびBogdanove、2009;Christian、Cermakら、2010;Li、Huangら、2011)。カスタムメイドTALE−ヌクレアーゼは、商標名TALEN(商標)(Cellectis、8 rue de la Croix Jarry、75013 Paris、フランス)の下で市販されている。
本発明によるレアカッティングエンドヌクレアーゼはまた、Cas9エンドヌクレアーゼであり得る。最近、新しいゲノム操作ツールが、II型原核生物CRISPR(群生性等間隔短回文反復配列)適応免疫系に由来するRNAガイドCas9ヌクレアーゼ(Gasiunas、Barrangouら 2012;Jinek、Chylinskiら、2012;Cong、Ranら、2013;Mali、Yangら、2013)に基づいて開発された(総説(Sorek、Lawrenceら、2013)を参照)。CRISPR関連(Cas)システムは、細菌内で最初に発見され、ウイルスまたはプラスミドの外来DNAに対する防御として機能する。CRISPR媒介ゲノム操作は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)と呼ばれる短い配列モチーフに多くの場合隣接した標的配列の選択によって最初に進行する。標的配列選択の後、この標的配列に相補的な特定のcrRNAが操作される。CRISPR II型システムに要求されるトランス活性化crRNA(tracrRNA)がcrRNAと対形成され、準備されたCas9タンパク質に結合される。Cas9は、tracRNAのcRNAとの塩基対合を促進する分子アンカーとして作用する(Deltcheva、Chylinskiら、2011)。この三元複合体では、デュアルtracrRNA:crRNA構造体は、エンドヌクレアーゼCas9を同族標的配列へと導くガイドRNAとして作用する。Cas9−tracrRNA:crRNA複合体による標的認識は、標的配列とcrRNAとの間の相同性について標的配列をスキャンすることによって開始される。標的配列−crRNA相補性に加えて、DNAターゲティングは、プロトスペーサーに隣接する短いモチーフ(プロトスペーサー隣接モチーフ − PAM)の存在を必要とする。デュアルRNAと標的配列との間の対形成の後、Cas9は、PAMモチーフの3塩基上流に平滑二本鎖切断を引き続いて導入する(Garneau、Dupuisら、2010)。
レアカッティングエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名称の下でも公知であるホーミングエンドヌクレアーゼであり得る。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは、当技術分野で周知である(Stoddard、2005)。ホーミングエンドヌクレアーゼは、DNA標的配列を認識し、一本鎖−または二本鎖切断を生じさせる。ホーミングエンドヌクレアーゼは、高度に特異的であり、長さが12〜45塩基対(bp)、通常長さが14〜40bpの範囲のDNA標的部位を認識する。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、HNHエンドヌクレアーゼ、またはGIY−YIGエンドヌクレアーゼに対応し得る。本発明による好適なホーミングエンドヌクレアーゼは、I−CreIバリアントであり得る。
− 「送達ベクター(delivery vector)」または「送達ベクター(delivery vectors)」は、本発明で必要とされる作用物質/化学物質、および分子(タンパク質または核酸)を細胞接触の状態にする(すなわち「接触させる」)、または細胞もしくは細胞内コンパートメント内部に送達する(すなわち、「導入する」)のに本発明で使用することができる任意の送達ベクターを意図している。これには、それだけに限らないが、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学キャリア、ポリマーキャリア、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、マイクロバブル(超音波造影剤)、ナノ粒子、エマルジョン、または他の適切なトランスファーベクターが含まれる。これらの送達ベクターは、分子、化学物質、巨大分子(遺伝子、タンパク質)、または他のベクター、例えば、Diatosによって開発されたプラスミド、ペプチドなどの送達を可能にする。これらの場合では、送達ベクターは、分子キャリアである。「送達ベクター(delivery vector)」または「送達ベクター(delivery vectors)」とは、トランスフェクションを実施する送達方法も意図している。
− 用語「ベクター(vector)」または「ベクター(vectors)」は、核酸分子であって、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。本発明における「ベクター」としては、それだけに限らないが、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体、非染色体、半合成もしくは合成核酸からなり得る線状もしくは環状DNAもしくはRNA分子が挙げられる。好適なベクターは、自律複製(エピソームベクター)することができ、および/またはこれらが連結されている核酸の発現(発現ベクター)することができるベクターである。多数の適当なベクターが、当業者に公知であり、市販されており、例は、図4および図5にある。
ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス(例えば、アデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えば、オルソミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば、狂犬病および水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、麻疹およびセンダイ)など、プラス鎖RNAウイルス、例えば、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスなど、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルスタイプ1および2、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス)、ならびにポックスウイルス(例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリポックス)を含めた二本鎖DNAウイルスが挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血症−肉腫、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV−BLV群、レンチウイルス、スプマウイルスが挙げられる(Coffin,J.M.、Retroviridae:The viruses and their replication、In Fundamental Virology、第3版、B.N.Fieldsら編、Lippincott−Raven Publishers、Philadelphia、1996)。
− 「レンチウイルスベクター」とは、これらの相対的に大きいパッケージング能力、低減された免疫原性、および大きい範囲の異なる細胞型を高効率で安定に形質導入するこれらの能力のために遺伝子送達に非常に有望であるHIVベースレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは通常、3種(パッケージング、エンベロープ、およびトランスファー)またはそれ超のプラスミドを産生細胞内に一過性にトランスフェクトした後に生成される。HIVと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質の細胞表面上の受容体との相互作用によって標的細胞に侵入する。侵入の際、ウイルスRNAは、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は、二本鎖線状ウイルスDNAであり、それは、感染細胞のDNA内にウイルスを組み込むための基質である。「組込みレンチウイルスベクター(またはLV)」とは、非限定例として、標的細胞のゲノムを組み込むことができるベクターを意味する。反対に、「非組込みレンチウイルスベクター(またはNILV)」とは、ウイルスインテグラーゼの作用によって標的細胞のゲノムを組み込まない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。
− 送達ベクターおよびベクターは、任意の細胞透過化技法、例えば、ソノポレーション、もしくは電気穿孔、またはこれらの技法の派生法などと共に用い、または組み合わせることができる。
− 細胞(cell)または細胞(cells)とは、in vitro培養のためのこれらの生物に由来する任意の真核生物生細胞、初代細胞、および細胞株を意図している。
− 「初代細胞(primary cell)」または「初代細胞(primary cells)」とは、非常に少ない集団倍加を受けており、したがって、連続的な腫瘍形成性のまたは人工的に不死化された細胞株と比較して、これらが由来する組織の主要な機能的成分および特性をより代表する、生きている組織(すなわち、生検材料)から直接採取され、in vitro増殖のために確立された細胞を意図している。
非限定的な例として、細胞株は、CHO−K1細胞;HEK293細胞;Caco2細胞;U2−OS細胞;NIH3T3細胞;NSO細胞;SP2細胞;CHO−S細胞;DG44細胞;K−562細胞、U−937細胞;MRC5細胞;IMR90細胞;ジャーカット細胞;HepG2細胞;HeLa細胞;HT−1080細胞;HCT−116細胞;Hu−h7細胞;Huvec細胞;Molt4細胞からなる群から選択することができる。
すべてのこれらの細胞株は、本発明の方法によって改変して、目的の遺伝子またはタンパク質を生成し、発現させ、定量化し、検出し、試験するための細胞株モデルをもたらすことができる。これらのモデルは、研究および生産および様々な分野、例えば、非限定的な例として、化学物質、生物燃料、治療剤、および農学などにおいて目的の生物活性分子をスクリーニングするのにも使用することができる。
− 「突然変異」とは、ポリヌクレオチド(cDNA、遺伝子)またはポリペプチド配列中の、最大で1、2、3、4、5、6、7、8、8、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、またはそれ超のヌクレオチド/アミノ酸の置換、欠失、挿入を意図している。突然変異は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響し得る。これは、ゲノム配列の構造、またはコードされたmRNAの構造/安定性にも影響し得る。
− 「バリアント」とは、親分子のアミノ酸配列中の少なくとも1つの残基の突然変異または置き換えによって得られるリピートバリアント、バリアント、DNA結合バリアント、TALE−ヌクレアーゼバリアント、ポリペプチドバリアントを意図している。
− 「機能性バリアント」とは、タンパク質またはタンパク質ドメインの触媒活性突然変異体を意図している。このような突然変異体は、その親タンパク質もしくはタンパク質ドメインと比較して同じ活性もしくは追加の性質、またはより高いもしくはより低い活性を有し得る。
− 「同一性」は、2つの核酸分子間またはポリペプチド間の配列同一性を指す。同一性は、比較の目的のために整列され得る各配列中の位置を比較することによって判定することができる。比較される配列中の位置が同じ塩基によって占有されているとき、分子は、その位置で同一である。核酸配列間またはアミノ酸配列間の類似性または同一性の程度は、核酸配列によって共有されている位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。FASTA、またはGCG配列分析パッケージ(ウィスコンシン大学、Madison、Wis.)の一部として利用可能であるBLASTを含めた、様々な整列アルゴリズムおよび/またはプログラムを2つの配列間の同一性を計算するのに使用することができ、例えば、デフォルトの設定を用いて使用することができる。例えば、本明細書に記載の特定のポリペプチドと少なくとも70%、85%、90%、95%、98%、または99%の同一性を有し、好ましくは実質的に同じ機能を呈するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが企図されている。別段に示されていない限り、類似性スコアは、BLOSUM62の使用に基づくことになる。BLASTPが使用されるとき、パーセント類似性は、BLASTP陽性スコアに基づき、パーセント配列同一性は、BLASTP同一性スコアに基づく。BLASTP「同一性」は、同一である高スコア配列対中の全残基の数および画分を示し、BLASTP「陽性」は、整列スコアが正の値を有し、互いに同様である残基の数および画分を示す。本明細書に開示のアミノ酸配列とこれらの程度の同一性もしくは類似性、または任意の中間の程度の同一性もしくは類似性を有するアミノ酸配列が、企図されており、本開示によって包含されている。同様のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝子コードを使用して推定され、慣例的な手段によって、特に、遺伝子コードを使用してそのアミノ酸配列を逆翻訳することによって得ることができる。
− 「シグナル−形質導入ドメイン」または「共刺激リガンド」は、T細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、TCR/CD3複合体のペプチドのロードされたMHC分子との結合によってもたらされる一次シグナルに加えて、それだけに限らないが、増殖活性化、分化などを含めたT細胞応答を媒介するシグナルをもたらす抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドとして、それだけに限らないが、CD7、B7−1(CD80)、B7−2(CD86)、PD−L1、PD−L2、4−1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド(ICOS−L)、細胞間接着分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA−G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンベータ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体を結合させるアゴニストまたは抗体、およびB7−H3と特異的に結合するリガンドを挙げることができる。共刺激リガンドは、とりわけ、T細胞上に存在する共刺激分子、例えば、それだけに限らないが、CD27、CD28、4−1BB、OX40、CD30、CD40、PD−1、ICOS、リンパ球機能関連抗原−1(LFA−1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7−H3、CD83と特異的に結合するリガンドなどと特異的に結合する抗体も包含する。
「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、それだけに限らないが、増殖などの細胞による共刺激応答を媒介するT細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子としては、それだけに限らないが、MHCクラスI分子、BTLA、およびトールリガンド受容体が挙げられる。
「共刺激シグナル」は、本明細書では、TCR/CD3ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、T細胞増殖および/または主要な分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションに導くシグナルを指す。
用語「細胞外リガンド結合ドメイン」は、本明細書では、リガンドに結合することができるオリゴ−またはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができることになる。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。したがって、リガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌、および寄生虫の感染症、自己免疫疾患、ならびにがん細胞と関連したものが挙げられる。
用語「対象」または「患者」は、本明細書では、非ヒト霊長類およびヒトを含めた動物界のすべてのメンバーを含む。一実施形態では、患者は、神経膠腫、好ましくは残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫を有するヒトである。患者は、本発明による処置から恩恵を受けることができる。
本発明の上記書面による記載は、本発明を作製および使用する様式およびプロセスを、当業者がそれを作製および使用することが可能になるように提供し、この可能化は、特に添付の特許請求の範囲の主題についてもたらされ、それは、元の記載の一部を構成する。
数値的な制限または範囲が本明細書で述べられている場合、終点は、含まれている。また、数値的な制限または範囲内のすべての値およびサブ範囲は、明示的に書かれているように具体的に含まれている。
上記記載は、当業者が本発明を作製および使用することが可能になるように提示されており、特定の用途およびその要件との関連で提供されている。好適な実施形態の様々な改変は、当業者に容易に明らかとなり、本明細書に規定される一般的な原理は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく他の実施形態および用途に適用することができる。したがって、本発明は、示した実施形態に限定されるように意図されておらず、本明細書に開示の原理および特徴と一致する最も広い範囲が与えられるように意図されている。
一般的な方法
EGFRvIII CAR
EGFRvIII CARは、全体が参照により本明細書に組み込まれている文書US2010/0105136およびUS2010/0105136A1で以前に記載された方法に従って異なるscfvを使用して調製した。
CARのスクリーニングおよび選択
− 初代T細胞培養
T細胞を、フィコール勾配密集培地(Ficoll gradient density medium)を使用してEFS(Etablissement Francais du Sang、Paris、フランス)によって提供されたバフィーコート試料から精製した。PBMC層を回収し、T細胞を、市販のT細胞濃縮キットを使用して精製した。精製したT細胞を、20ng/mLヒトIL−2、5%ヒト、および1:1のビーズ:細胞比のDynabeadsヒトT活性化因子CD3/CD28(Life Technologies)を補充したX−Vivo(商標)−15培地(Lonza)中で活性化した。
− CAR mRNAトランスフェクション
異なるCARコンストラクトをコードするCAR mRNAのトランスフェクションを、T細胞を精製および活性化した後の4日目または11日目に行った。細胞を、X−Vivo(商標)−15培地中で直ちに希釈し、5% COで37℃でインキュベートした。IL−2を、20ng/mLで電気穿孔して2時間後に添加した。
− CARの発現を可能にする組換えレンチウイルスベクターを用いたT細胞形質導入
T細胞の、CARを発現する組換えレンチウイルスベクターによる形質導入を、T細胞を精製/活性化して3日後に実施した。HEK−293細胞内のゲノムプラスミドおよびヘルパープラスミドのトランスフェクションによってVectalys SA(Toulouse、フランス)によって生成されたレンチウイルスベクターを使用することができる。形質導入を5の感染の多重度で実施した。T細胞の表面のCAR検出を、マウスIgG1 Fc断片と一緒に融合したヒトEGFRVIIIタンパク質の細胞外ドメインからなる組換えタンパク質(LakePharmaによって生成された)を使用して実施する。このタンパク質のCAR分子への結合を、タンパク質のマウスFc部分を標的とするPE−コンジュゲート二次抗体(Jackson Immunoresearch)を用いて検出し、フローサイトメトリーによって分析する。
初代T細胞内の特定の遺伝子の不活化
初代T細胞内の特定の遺伝子の不活化は、T細胞内にCARを導入する前または後に実施することができる。
少なくとも1種の遺伝子を不活化し、1、2、または3種の遺伝子を1ステップで不活化することができる。好適な実施形態では、2種の遺伝子、好ましくはTCRアルファ遺伝子、およびプリンヌクレオチド類似体、プラチン(シスプラチンまたはカルボプラチン)、抗トポイソメラーゼI(イリノテカン)、抗トポイソメラーゼII(エトポシド)、メトトレキセート(葉酸類似体)から選択される薬物に対する耐性を付与する遺伝子を不活化する。
一般に、ヘテロ二量体ヌクレアーゼ、特に、標的遺伝子内でスペーサーによって分離された2つの長い配列(ハーフ標的と呼ばれる)を標的とするTALE−ヌクレアーゼを設計および生成する。
各TALE−ヌクレアーゼコンストラクトを、適切な哺乳動物発現ベクター内でクローニングすることができる。標的ゲノム配列を切断するTALE−ヌクレアーゼをコードするmRNAは、プロモーターの下流にコード配列を担持するプラスミドから合成することができる。抗CD3/CD28コートビーズで予め活性化された精製したT細胞を使用し、半分のTALE−ヌクレアーゼの両方をコードする2つのmRNAのそれぞれをトランスフェクトする。細胞を、可溶性抗CD28で再活性化して様々な時間について細胞増殖を測定し、活性化マーカーCD25を検出して細胞の活性化状態を評価することができる。
− 脱顆粒アッセイ(CD107a動員)
T細胞を、様々なレベルの標的タンパク質(EGFRVIII)を発現する等量の細胞と一緒に、96ウェルプレート中でインキュベートした。共培養を、5% COとともに37℃で6時間維持した。CD107a染色を、対照として抗CD49d、抗CD28、および1×モネンシン溶液と一緒に、共培養の開始時に蛍光性抗CD107a抗体を添加することによって、細胞刺激中に行った。6時間のインキュベーション期間の後、細胞を、固定可能な生存能力色素(fixable viability dye)および蛍光色素コンジュゲート抗CD8を用いて染色し、フローサイトメトリーによって分析した。脱顆粒活性を、CD8+/CD107a+細胞の%として、CD8+細胞の中のCD107a染色の平均蛍光強度信号(MFI)を判定することによって判定した。脱顆粒アッセイを、mRNAをトランスフェクトして24時間後に実施した。
− IFNガンマ放出アッセイ
mRNAをトランスフェクトして24時間後に、CAR発現T細胞を、様々なレベルの標的タンパク質を発現する細胞株と一緒に37℃で24時間インキュベートした。上清を回収し、細胞培養液上清中のIFNガンマ検出をELISAアッセイによって行った。
− 細胞傷害性アッセイ
T細胞を、同じウェル中で10,000の標的細胞(様々なレベルの標的タンパク質を発現する)または(陰性対照)細胞と一緒にインキュベートした。標的および対照細胞を、蛍光細胞内色素(CFSEまたはCell Trace Violet)で標識した後、CAR+ T細胞とともに共培養した。共培養物を37℃で4時間インキュベートした。このインキュベーション期間の後、細胞を、固定可能な生存能力色素で標識し、フローサイトメトリーによって分析した。各細胞集団(標的細胞または陰性対照細胞)の生存能を判定し、特異的細胞溶解の%を計算した。細胞傷害性アッセイを、mRNAをトランスフェクトして48時間後に実施した。
− 抗腫瘍マウスモデル
免疫不全マウスの側腹部に腫瘍細胞(神経膠芽腫)または標的タンパク質発現ルシフェラーゼ細胞をインプラントする。引き続いて、細胞をマウスの脳内にインプラントした。マウスのさらなる世代への連続移植は、in vivoゼノグラフト細胞株の維持を継続する。マウスは、CAR+ T細胞を注射する前に、またはそれと一緒に抗がん処置を任意選択で受けた。次いでマウスに、異なる用量の試験されるCAR+ T細胞、またはCARレンチウイルスベクターで形質導入されなかったT細胞をiv注射する(腫瘍細胞株を注射して2日後または7日後)。生物発光信号を、異なる動物における腫瘍進行を追跡するために、T細胞注射の日(D0)、T細胞注射後のD7、14、21、28、および40に判定する。
Chen、Jianら、Any other model of glioma such as those described in Malignant Glioma: Lessons from Genomics、Mouse Models、and Stem Cells. Cell:149巻、1、36〜47は、本試験に適している。
臨床試験
主目的
脳腫瘍、神経膠芽腫、または膠肉腫、特に、神経膠芽腫、より特定すれば、多発性神経膠芽腫を有する患者中の、抗EGFRvIII CARを発現するTCR KO初代T細胞(抗EGFRvIII CAR操作されたTリンパ球)の投与の安全性および有効性を評価するため。
骨髄非破壊的であるがリンパ枯渇性の準備レジメン後に抗EGFRvIII CAR操作されたTリンパ球およびアルデスロイキンを任意選択で受けている患者の6カ月の無増悪生存期間を判定するため。
二次的目的
・抗EGFRvIII CAR操作されたTリンパ球のin vivo生存期間を判定する
・処置後の放射線透過写真術による変化を評価する
適格性:
・IHCまたはRT−PCRによって判定されたEGFRvIIIを発現する組織学的に証明された神経膠芽腫または膠肉腫
・化学療法の有無にかかわらず放射線療法を用いた先の標準的な処置に失敗
・60%超またはそれに等しいカルノフスキースコア
許容できる制限内の心臓、肺、および実験室パラメータ
設計:
・試験は、第I/II相設計を使用して行った。
・患者は、シクロホスファミドおよびフルダラビンからなる骨髄非破壊的であるがリンパ球枯渇性の準備レジメン、その後ex vivo腫瘍反応性、抗EGFRvIII CAR操作されたTリンパ球、任意選択でそれに加えてIVアルデスロイキンの静脈内注入を受けた。
・MTDを判定した後、試験を第II相部分に進めた。
・治験の2相部分では、患者を2つの群にした。
〇処置の開始時にステロイド使用を必要とする再発性悪性神経膠腫を有する患者
〇処置の開始時にステロイドを必要としない再発性悪性神経膠腫を有する患者
試験タイプ 介入性
試験相 1相〜2相
試験設計
割り当て:ランダム化されていない
エンドポイント分類:安全性/効力試験
介入モデル:単一群割り当て
マスキング:オープンラベル
主目的:処置
条件
神経膠腫(悪性)
神経膠芽腫、多発性神経膠芽腫
脳腫瘍
介入
・生物製剤:抗EGFRvIII CAR操作されたTリンパ球
0日目に(フルダラビンを最後に投薬して1〜4日後)、細胞を患者ケアユニットで20〜30分にわたって静脈内に(i.v.)注入した。
・薬物:ビヒクルなし(none of vehicle)
・薬物:アルデスロイキン
およそ8時間毎(+/−1時間)に15分にわたるアルデスロイキン(全体重に対して)72,000IU/kg IV(細胞注入の24時間に開始して最大で5日わたって最大で15用量継続する)。
・薬物:フルダラビン
5日間30分にわたって毎日フルダラビン25mg/m2/日のIVPB。
・薬物:シクロホスファミド
1時間にわたってD5W 250ml中シクロホスファミド60mg/kg/日×2日のIV。
試験群
実験:単一群−
患者は、シクロホスファミドおよびフルダラビンからなる骨髄非破壊的であるがリンパ球枯渇性の準備レジメン、その後抗EGFRvIII CAR操作されたTリンパ球の静脈内注入を受けた。
介入:
・ 生物製剤:抗EGFRvIII CAR操作されたTリンパ球
・ 薬物:なし
・ 薬物:上記の通りのアルデスロイキン
・ 薬物:上記の通りのフルダラビン
・ 薬物:上記の通りのシクロホスファミド
本発明を一般に記載してきたが、さらなる理解を、ある特定の具体的な実施例を参照することによって得ることができる。これらは、例示のみの目的で提供されており、別段の指定のない限り限定的であるように意図されていない。
(実施例1)
EGFRvIII−CARを発現するTCRアルファ不活化細胞の増殖。
T細胞受容体アルファ定常鎖領域(TRAC)遺伝子内で15bpのスペーサーによって分離された2つの長さ17bpの配列(ハーフ標的と呼ぶ)を標的とするヘテロ二量体TALE−ヌクレアーゼを設計および生成した。各ハーフ標的は、表10に列挙したハーフTALE−ヌクレアーゼのリピートによって認識される。
Figure 2017522884
各TALE−ヌクレアーゼコンストラクトを、T7プロモーターの制御下で哺乳動物発現ベクター中に制限酵素消化を使用してサブクローニングした。TRACゲノム配列を切断するTALE−ヌクレアーゼをコードするmRNAを、T7プロモーターから下流にコード配列を担持するプラスミドから合成した。
抗CD3/CD28コートビーズで72時間の間に予め活性化された精製したT細胞に、両方のハーフTRAC_T01 TALEヌクレアーゼをコードする2つのmRNAのそれぞれをトランスフェクトした。トランスフェクトして48時間後に、同じドナーに由来する異なる群のT細胞を、以前に記載したEGFRvIII CAR(配列番号15〜18)の1つをコードするレンチウイルスベクターでそれぞれ形質導入した。形質導入後2日に、CD3NEG細胞を、抗CD3磁気ビーズを使用して精製し、形質導入して5日後に、細胞を可溶性抗CD28(5μg/ml)で再活性化した。
細胞増殖を、1週間に2回細胞をカウントすることによって再活性化後最大で30日にわたって追跡した。EGFRvIII CARを発現するTCRアルファ不活化細胞の増殖の増大が、特に抗CD28で再活性化したとき、形質導入されていない細胞と比較して観察された。
EGFRvIII CARを発現するヒトT細胞が活性化状態を示すか否かを調査するために、活性化マーカーCD25の発現を、形質導入して7日後にFACSによって分析する。EGFRvIII CARをコードするレンチウイルスベクターで形質導入された精製した細胞を、形質導入されていない細胞と比較してこれらの活性化を評価するために、これらの表面におけるCD25発現についてアッセイする。CD25発現の増大が、CD28再活性化条件または無再活性化条件の両方において予期される。
本発明は、神経膠芽腫を処置するための上皮成長因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)を標的とする操作されたEGFRvIII CAR TCR KO T細胞を提供する。
本発明は、多発性神経膠芽腫を処置するための上皮成長因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)を標的とする操作されたEGFRvIII CAR TCR KO T細胞を提供する。
(実施例2)
EGFRvIII CAR−T
神経膠芽腫を処置するための上皮成長因子受容体バリアントIII(EGFRvIII)を標的とする操作されたCAR T細胞の開発。
EGFRvIIIは、最も一般的なEGFR突然変異体であり、エクソン2〜7のインフレーム欠失からなる。この欠失は、トランケートされた細胞外リガンド結合ドメインをもたらし、タンパク質をリガンド非依存性様式で構成的に活性にする。EGFRvIII発現は、腫瘍形成能を増強し、細胞運動性を促進し、放射線および化学療法に対する耐性を付与することが示されている。EGFRvIII発現は、神経膠芽腫の24〜67%において報告されているが、いずれの正常組織においても報告されていないため、CAR T細胞を用いた免疫療法の魅力的な標的である(図1)。
1.EGFRvIII CAR:
1.1.コンストラクト
4種のEGFRvIII CARを設計し(図2および図3)、全体が参照により本明細書に組み込まれている文書US2010/0105136およびUS2010/0105136A1で以前に記載されたように異なるscfvを使用して調製した。特許PCT/US2012/029861でRosenbergによって記載された139抗体に由来する139scfv、または特許US2010/0105136A1でCarterによって記載されたMR1抗体に由来するMR1 scfvを使用した。2つの異なるCAR構成(図2および図3)を設計し、41BB共刺激ドメイン、CD3ζ活性化ドメイン、CD8α膜貫通ドメイン、および2つの異なるヒンジ、CD8αヒンジ(V3構成)またはIgG1ヒンジ(V5構成)を用いて調製した(配列番号24〜配列番号27)。
本発明者らは、Rosenbergによって記載されたCARも、その活性を検証するために生成した(図3)。
コンストラクトを、設計したCARの一過性発現およびスクリーニングのためにpCLS9632(図4)中に挿入した。CARコンストラクトを、AscIおよびHindIII制限部位を使用することによってこの骨格中に導入した。
同じコンストラクトを、初代T細胞内のさらなる形質導入のためにXmaIとSpeI制限部位との間のpCL26700 psew EF1a BFPベクター(pCL26700ベクター)(図5)内に挿入した。
EGFRvIII CARは、139−V3 CAR(配列番号24)および139−V5(配列番号25)CAR、MR1−V3(配列番号26)およびMR1−V5 CAR(配列番号27)であった。
したがって、本発明は、本発明のEGFRvIII CARをコードする配列を含むpCL26700 psew EF1a BFPベクター、例えば、配列番号24をコードする配列を含むpCL26700 psew EF1a BFPベクター、
配列番号25をコードする配列を含むpCL26700 psew EF1a BFPベクター、
配列番号26をコードする配列を含むpCL26700 psew EF1a BFPベクター、
配列番号27をコードする配列を含むpCL26700 psew EF1a BFPベクターなど、好ましくは、配列番号24をコードする配列を含むpCL26700 psew EF1a BFPベクターを提供する。
1.2.CAR発現(図6)
CAR mRNAを、抗CD3CD28コートビーズおよびIL−2によって活性化して5日後に初代TCR KO TまたはT細胞内にトランスフェクトした。CAR発現をフローサイトメトリーによって評価した。139−V3 CARおよび139−V5 CARが検出された。他のCAR発現は、使用した構成(V3またはV5)にかかわらず、この手法を使用することによって低く(MR1)、または検出不可能であった(Rosenbergによって設計されたCAR)(図6)。
2.EGFRvIII細胞株の生成(図7)
抗EGFRvIII CARの機能性を試験するために、EGFRvIIIを過剰発現するU87細胞株を生成した。
2.1.U87細胞内のEGFRおよびEGFRvIIIの過剰発現
2.1.1.細胞株開発
EGFR(EGFRVI)またはEGFRvIIIを過剰発現するU87細胞を生成し、FACSおよびウエスタンブロットによって特徴付けた(図7)。図7は、EGFRVI(170Kda)またはEGFRVIII(155Kda/140Kda)タンパク質を過剰発現するU87神経膠腫細胞を示す。
FACS分析によって得た結果は、細胞の56.6%が検出可能レベルのEGRFVIを発現し、細胞の57.3%が検出可能レベルのEGRFVIIIを発現することを示した。これらのEGFRVI発現細胞およびEGFRVIII発現細胞を最終的に選別し、単離した。
2.1.2.EGFRvIII CAR T細胞の標的細胞としての新しい細胞株の検証
2.1.2.1.脱顆粒アッセイ
細胞株およびCARコンストラクトを検証するために、脱顆粒アッセイを、EGFRvIII CARを発現するT細胞とともにこれらの新しい標的細胞に対して実施した(図3)。CART脱顆粒をフローサイトメトリーによって評価した。読み取りは、標的細胞とともに5時間インキュベートした後のT細胞形質膜におけるCD107a発現である。意外にも、CAR 139−V3、CAR 139−V5、MR1−V3、およびMR1−V5は、これらの発現が低かったときでも脱顆粒することができた。対照的に、Rosenberg CARは、これらの実験条件において活性を示さないことを示した。
図8は、標的細胞とともに共培養した後のFACS分析によって評価したEGFRvIII CART脱顆粒能力を示す。Rosenberg CARは、検出不可能であり、脱顆粒せず、したがってさらに試験しなかった。
2.1.2.2.細胞傷害性アッセイ
細胞傷害性アッセイを、4種のEGFRvIII CARを発現するT細胞とともにこれらの新しい標的細胞に対して実施した。本発明のEGFRvIII CAR、結果は、EGFRvIII細胞(U87−EGFRvIII)の特異的溶解を示したが(図9)、EGFRvI(U87−EGFR)細胞もU87 wt細胞についても特異的溶解を示さなかった。図9は、EGFRvIII CART細胞の細胞傷害性アッセイを示す。
得られたデータは、本発明のEGFRvIII CAR T細胞、特にV3構造のものは、コロニー化した脊髄および脳内でin vitroおよびin vivoで神経膠腫細胞を著しく低減することができたことを示す。
CARポリペプチド配列の例:
枠に入った配列は、好適なVHおよびVL配列に対応する。VHおよびVLは、CAR有効性を改善するために交換してもよい。
139−v1(配列番号1+配列番号15)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQVLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSSGWSEYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNNLAWYQQKPGKAPKRLIYAASNLQSGVPSRFTGSGSGTEFTLIVSSLQPEDFATYYCLQHHSYPLTSGGGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
139−v2(配列番号1+配列番号16)
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MR1−v1(配列番号1+配列番号17)
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MR1−v2(配列番号1+配列番号18)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLEWVASISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSSTSYAMDYWGQGTTVTVGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRPGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDYYCLQSFNVPLTFGDGTKLEKALEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列
配列番号28:Rosenberg CAR
MVLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNNLAWYQQKPGKAPKRLIYAASNLQSGVPSRFTGSGSGTEFTLIVSSLQPEDFATYYCLQHHSYPLTSGGGTKVEIKRTGSTSGSGKPGSGEGSEVQVLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSSGWSEYWGQGTLVTVSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号24:139−v3
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNNLAWYQQKPGKAPKRLIYAASNLQSGVPSRFTGSGSGTEFTLIVSSLQPEDFATYYCLQHHSYPLTSGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQVLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSSGWSEYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号25:139−v5
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNNLAWYQQKPGKAPKRLIYAASNLQSGVPSRFTGSGSGTEFTLIVSSLQPEDFATYYCLQHHSYPLTSGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQVLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGSSGWSEYWGQGTLVTVSSEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号26:MR1−v3
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLEWVASISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSSTSYAMDYWGQGTTVTVGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRPGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDYYCLQSFNVPLTFGDGTKLEKALTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号27:MR1−v5
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGGGLVKPGASLKLSCVTSGFTFRKFGMSWVRQTSDKRLEWVASISTGGYNTYYSDNVKGRFTISRENAKNTLYLQMSSLKSEDTALYYCTRGYSSTSYAMDYWGQGTTVTVGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPASLSVATGEKVTIRCMTSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKFLISEGNTLRPGVPSRFSSSGTGTDFVFTIENTLSEDVGDYYCLQSFNVPLTFGDGTKLEKALEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
参考文献

Claims (40)

  1. 図2に例示したV1〜V6から選択されるポリペプチド構造の1つを有するEGFRvIII特異的キメラ抗原受容体(EGFRvIII CAR)であって、前記構造は、
    − モノクローナル抗EGFRvIII抗体に由来するVHおよびVL、任意選択でリンカー、特に、式(G4S)nの(式中、nは、1〜3であり、好ましくはn=3である)(配列番号10の)リンカーを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
    − ヒンジ、
    − 膜貫通ドメイン、ならびに
    − CD3ゼータシグナリングドメインおよび4−1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン
    を含む、EGFRvIII特異的キメラ抗原受容体(EGFRvIII CAR)。
  2. モノクローナル抗EGFRvIII抗体に由来するVHおよびVL、式(G4S)3の(配列番号10の)リンカーを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
    − ヒンジ、
    − CD8アルファに由来する膜貫通ドメイン、ならびに
    − CD3ゼータシグナリングドメインおよび4−1BBに由来する共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン
    を含む、請求項1に記載のEGFRvIII特異的CAR。
  3. ヒトCD28に由来するドメイン、特に、ヒトCD28に由来する共刺激ドメインを含まない、請求項1または2に記載のEGFRvIII特異的CAR。
  4. 前記VHおよびVLが、配列番号11〜14から選択されるポリペプチド配列と少なくとも80%の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、請求項1から3のいずれか一項に記載のEGFRvIII特異的CAR。
  5. 4−1BBに由来する前記共刺激ドメインが、配列番号8と少なくとも80%の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、請求項1から4のいずれか一項に記載のEGFRvIII特異的CAR。
  6. 前記CD3ゼータシグナリングドメインが、配列番号9と少なくとも80%の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、請求項1から5のいずれか一項に記載のEGFRvIII特異的CAR。
  7. 前記CD8α膜貫通ドメインが、配列番号6と少なくとも80%の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、請求項1から6のいずれか一項に記載のEGFRvIII特異的CAR。
  8. EGFRvIIIに特異的でない別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、請求項1から7のいずれか一項に記載のEGFRvIII特異的CAR。
  9. シグナルペプチドをさらに含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のEGFRvIII特異的CAR。
  10. 前記シグナルペプチドが、配列番号1または配列番号2と少なくとも80%の配列同一性を有する、ヒト化されていてもよい、請求項9に記載のEGFRvIII特異的CAR。
  11. 前記構造V1が、FcγRIIIαヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載のEGFRvIII特異的CAR。
  12. 前記FcγRIIIαヒンジが、配列番号3と少なくとも80%の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、請求項11に記載のEGFRvIII特異的CAR。
  13. 前記構造V3が、CD8αヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載のEGFRvIII特異的CAR。
  14. 前記CD8αヒンジが、配列番号4と少なくとも80%の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、請求項13に記載のEGFRvIII特異的CAR。
  15. 前記構造V5が、IgG1ヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、請求項1から10のいずれか一項に記載のEGFRvIII特異的CAR。
  16. 前記IgG1ヒンジが、配列番号5と少なくとも80%の同一性を有する、ヒト化されていてもよい、請求項15に記載のEGFRvIII特異的CAR。
  17. 配列番号15または配列番号17と少なくとも80%の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項1から10または11から12のいずれか一項に記載の構造V1のEGFRvIII特異的CAR。
  18. 配列番号24および配列番号26から選択される配列と少なくとも80%の同一性を有する、請求項1から10または13から14のいずれか一項に記載の構造V3のEGFRvIII特異的CAR。
  19. 配列番号25および配列番号27から選択される配列と少なくとも80%の同一性を有する、請求項1から10または15から16のいずれか一項に記載の構造V5のEGFRvIII特異的CAR。
  20. CD8αに由来するシグナルペプチド、ヒンジ、およびTMドメインを有する、請求項1から10または13から14または18のいずれか一項に記載のEGFRvIII特異的CAR。
  21. 請求項1から20のいずれか一項に記載のEGFRvIII特異的CARをコードするポリヌクレオチド。
  22. 請求項21に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  23. レンチウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターpCLD27600である、請求項22に記載の発現ベクター。
  24. 細胞表面膜において、請求項1から20のいずれか一項に記載のEGFRvIII特異的CARを発現する操作された免疫細胞。
  25. 炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、調節性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球から選択される免疫細胞、好ましくは細胞傷害性Tリンパ球に由来する、請求項24に記載の操作された免疫細胞。
  26. NK細胞に由来する、請求項24に記載の操作された免疫細胞。
  27. TCRの発現が抑制されている、請求項24から26のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  28. 少なくとも1種のMHCタンパク質、好ましくはβ2mまたはHLAの発現が抑制されている、請求項24から27のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  29. 少なくとも1種の免疫抑制薬または化学療法薬に耐性である、請求項24から28のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  30. 患者における状態を防止または処置する療法において使用するための、請求項24から29のいずれか一項に記載の操作された細胞。
  31. EGFRvIII発現がん細胞によって特徴付けられる前悪性または悪性がん状態を処置するための、請求項30に記載の療法において使用するための操作された細胞
  32. 過剰のEGFRvIII発現がん細胞によって特徴付けられる状態を処置するための、請求項30から31のいずれか一項に記載の療法において使用するための操作された細胞
  33. 状態が、肺がん、肛門がん、残留性または再発性EGFRvIII+神経膠腫、および多形性神経膠芽腫(GBM)、好ましくは残留性もしくは再発性EGFRvIII+神経膠腫、またはGBMから選択されるがんである、請求項30から32のいずれか一項に記載の療法において使用するための操作された細胞
  34. がん細胞に障害を与える方法であって、前記がん細胞を、前記がん細胞の障害を引き起こすのに有効な量で請求項24から29のいずれか一項に記載の操作された細胞と接触させることを含む方法。
  35. 免疫細胞を操作する方法であって、
    (c)免疫細胞を準備すること、
    (d)前記細胞の表面において、請求項1から20のいずれか一項に記載の少なくとも1種のEGFRvIII特異的CARを発現させること
    を含む方法。
  36. 請求項35に記載の免疫細胞を操作する方法であって、
    (d)免疫細胞を準備すること、
    (e)前記細胞内に、請求項21に記載の、前記EGFRvIII特異的CARをコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを導入すること、
    (f)前記細胞内に前記ポリヌクレオチドを発現させること
    を含む方法。
  37. 請求項35から36のいずれか一項に記載の免疫細胞を操作する方法であって、
    (d)免疫細胞を準備すること、
    (e)前記細胞内に、前記EGFRvIII特異的CARをコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを導入すること、
    (f)GFRvIIIに特異的でない少なくとも1種の他のCARを導入すること
    を含む方法。
  38. それを必要とする対象を処置する方法であって、
    (c)表面においてEGFRvIII特異的CARを発現する請求項24から29のいずれか一項に記載の操作された細胞を準備すること、
    (d)前記操作された細胞を前記患者に投与すること
    を含む方法。
  39. 前記操作された細胞が、ドナーによって提供された免疫細胞を使用して調製される、請求項38に記載の方法
  40. 前記ドナーが患者であり、好ましくは前記患者が、請求項35から37のいずれか一項に従って操作された患者自体の免疫細胞を使用して処置されることになる、請求項39に記載の方法
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