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KR20150069340A - L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신을 생산하는 방법 - Google Patents

L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신을 생산하는 방법 Download PDF

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KR20150069340A
KR20150069340A KR1020130155634A KR20130155634A KR20150069340A KR 20150069340 A KR20150069340 A KR 20150069340A KR 1020130155634 A KR1020130155634 A KR 1020130155634A KR 20130155634 A KR20130155634 A KR 20130155634A KR 20150069340 A KR20150069340 A KR 20150069340A
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KR
South Korea
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ftsb
lysine
gene
microorganism
glu
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KR1020130155634A
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KR101565770B1 (ko
Inventor
문준옥
박상희
허란
이광호
Original Assignee
씨제이제일제당 (주)
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Abstract

격막 형성 개시 인자 단백질이 불활성화된 라이신 생산능이 향상된 코리네형 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-라이신을 생산하는 방법{A corynebacterium microorganism having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same}
L-라이신의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-라이신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 미생물은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. L-아미노산, 특히 L-라이신은 동물사료, 사람의 의약품 및 화장품 산업에 사용되고 있으며 코리네박테리움 균주를 이용한 발효에 의해 생성되고 있다.
코리네박테리움 균주를 이용한 L-아미노산의 제조방법을 개선하기 위하여 많은 시도가 행해지고 있다. 그 중에서 재조합 DNA 기술을 이용하여 특정유전자를 파괴시키거나 감쇠 발현시킴으로써 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 있었다. 또한, 각각의 L-아미노산 생합성에 관련된 유전자를 증폭시켜 L-아미노산 생성에 미치는 효과를 연구하고 L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 많이 있어 왔다. 또한, 다른 박테리아 유래의 외래 유전자를 도입하는 경우도 있다.　
그러나, 상기한 종래 방법에 의하더라도 여전히 L-라이신의 생산능이 향상된 균주는 여전히 요구되고 있다.
일 양상은 L-라이신 생산능이 향상된 코리네형 미생물을 제공한다.
다른 양상은 상기 미생물을 이용한 L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.
일 양상은 격막 형성 개시 인자 (septum formation initiator) 단백질이 불활성화된, L-라이신 생산능이 향상된 코리네형 미생물을 제공한다.
본 명세서에 있어서, 용어 "격막 형성 개시 인자 (septum formation initiator)"는 코리네형 미생물의 세포 분열 과정에 있어서 형성되는 세포 내부를 구분하는 막상 구조물, 즉 격막의 형성을 개시하는데 필요한 인자를 지칭한다. 따라서 세포분열은 상기 격막 형성 개시 인자의 존재하에서 일어날 수 있다. 격막 형성 개시 인자의 존재 하에, 격막은 세포 중앙 부근의 주변부에서 함입되어 세포질을 둘로 나눌 수 있다. 그 후 세포 외막의 합성이 수반되어 세포 분열이 일어날 수 있다. 상기 격막 형성 개시 인자 단백질은 표 1 및 2에 표시된 단백질 중 하나일 수 있다.
Figure pat00001
Figure pat00002
격막 형성 개시인자는 사상 온도 감수성 (Filamentous Temperature Sensitive: Fts) 단백질을 포함할 수 있다. 상기 사상 온도 감수성 단백질은 디비좀(divisiom) 형성에 관여하는 단백질로, 미생물의 세포 분열 과정에 있어서 필요한 것일 수 있다. 사상 온도 감수성 단백질은 FtsB, FtsA, FtsZ, FtsEX, FtsK, FtsQ, FtsW, FtsI 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 FtsB일 수 있다. FtsB는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 70% 상동성, 바람직하게는 80% 상동성, 더욱 바람직하게는 90% 상동성, 가장 바람직하게는 95% 상동성을 가지는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 용어 "상동성"은 두 아미노산 서열 간의 동일성을 나타내는 것으로, 점수(score), 동일성(identity), 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 BLAST 2.0를 이용하는, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.
사상 온도 감수성 단백질을 코딩하는 유전자는 ftsA, ftsB, ftsZ, ftsEX, ftsK, ftsQ, ftsW, ftsI 또는 이들의 조합을 코딩하는 핵산일 수 있다.
상기 ftsB 유전자는 코리네형 미생물의 세포분열에 관여하는 유전자로, ftsZ, ftsEX, ftsK, FtsQ, ftsW 및 클래스 B HMW-PBPs와 함께 디비좀 (divisome)을 형성할 수 있다. 상기 ftsB 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산일 수 있다. 상기 ftsB 유전자는 예를 들면 NCBI 허가번호 NCg10936 유전자일 수 있다. 용어, "NCBI 허가번호 NCg10936 유전자"란 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 유래의 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것뿐만 아니라, 코리네박테리움 속에 속하는 미생물에 존재하는 유전자로서 상기 NCBI 허가번호 NCg10936 유전자 산물과 실질적으로 동일한 산물을 발현하는 유전자를 말한다. 본 발명에 있어서, "실질적으로 동일한"이란 NCBI 허가번호 NCg10936 유전자 산물과 동일한 종류의 활성 및 조절 기작을 갖는 것을 말한다.
본 명세서에 있어서, 용어 "불활성화 (inactivation)"는 세포 또는 효소가 비교 가능한 동일 종의 세포 또는 그의 본래 효소에서 측정되는 활성 수준을 나타내지 않는 것을 의미할 수 있다. 상기 비교 가능한 동일 종의 세포는 재조합 또는 변형과 같은 조작이 수행되지 않은 세포일 수 있다. 상기 미생물에 있어서, 격막 형성 개시 인자 (septum formation initiator) 단백질의 불활성화는 격막 형성 개시 인자를 코딩하는 폴리펩티드의 활성이 제거된 것을 의미할 수 있다. 또한, 상기 미생물은 L-라이신을 생산하는데 충분한 정도로 격막 형성 개시 인자 단백질의 활성이 불활성화되어 있다.
상기 불활성화는 재조합 방법에 의하여 야기된 것일 수 있다. 상기 재조합 방법은 상동 재조합 (homologous recombination)을 포함할 수 있다. 상기 상동 재조합 방법은 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 상기 미생물에 형질전환하고, 선별 마커 산물의 존재 하에서 배양하는 경우 상기 유전자의 일부 서열과 상기 미생물 내의 내재적 유전자와 상동 재조합을 일으킬 수 있다. 벡터는 서열번호 4의 NCBI 허가번호 NCg10936 유전자 단편을 포함하는 pDZ-ㅿftsB 또는 서열번호 6의 NCBI 허가번호 NCg10936 유전자 단편을 포함하는 pDZ-ftsB W140* 벡터일 수 있다. 상기 상동 재조합에 의하여 상기 미생물 내의 상기 내재적 유전자는 재조합되고, 재조합된 유전자 중에서 상기 마커를 포함하는 재조합체만이 선별 마커에 의하여 선별될 수 있다. 상기 상동 재조합 방법에 의하여, 내재적 NCBI 허가번호 NCg10936 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물을 얻을 수 있다.
상기 미생물에 있어서, 단백질 활성의 불활성화는 유전자의 염기, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합의 결실, 치환, 부가, 역전 또는 이들의 조합에 의하여 야기된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 단백질 활성의 불활성화 방법은 예를 들면, 유전자 넉아웃 접근법, 안티센스 기술, 또는 RNAi 기술을 이용할 수 있다. 또한 각 유전자의 초기 카피를 결실시킬 수 있거나, 돌연변이체로 초기 카피를 치환시키거나, 약한 프로모터로부터 초기 카피를 발현시키는 방법을 포함할 수 있다. 또한 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터를 치환하거나, 무작위 또는 표적 돌연변이 유발법에 의해 돌연변이를 도입하거나, 상기 유전자를 파괴 또는 넉아웃시킬 수 있다. 또한, 불안정화 요소를 mRNA로 도입하거나, 또는 유전자 변형을 도입하여 RNA의 리보솜 결합 부위(RBS)를 변이시키는 방법을 포함할 수 있다.
유전자의 불활성화가 NCBI 허가번호 NCg10936 유전자의 일부분과 선별 마커를 포함하는 벡터를 코리네박테리움 속 미생물에 형질전환시키고, 항생제의 존재하에서 배양하여 선별함으로써 달성될 수 있다.
상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위하여 구현된 것일 수 있다. 상기 선별 마커는 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커일 수 있다.　
코리네형 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (C. glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (C. ammoniagenes), 코리네박테리움 슈도투베르쿨로시스 (C.pseudotuberculosis), 코리네박테리움 에피시엔스 (C. efficiens), 코리네박테리움 슈도제니탈리움 (C. pseudogenitalium), 코리네박테리움 제니탈리움 (C.genitalium), 코리네박테리움 아코렌스 (C. accolens), 코리네박테리움 아미콜라툼 (C. amycolatum), 코리네박테리움 마트루초티 (C. matruchotii), 코리네박테리움 카세이 (C.casei), 코리네박테리움 리보필로플라봄 (C. lipophiloflavum), 코리네박테리움 투버쿨로스테아리쿰 (C. tuberculostearicum), 코리네박테리움 제이케이움 (C.jeikeium), 코리네박테리움 파우로메타볼룸 (C. paurometabolum) 및 이들의 야생형으로부터 제조된 L-라이신 생산 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다. 상기 코리네박테리움 글루타미쿰은 수탁번호 KCCM11016P, KCCM10770P, KCCM11347P 또는 CJ3P일 수 있다.
본 명세서에 있어서, 용어 "코리네형 미생물"은 L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속의 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 예를 들면, L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물에서 격막 형성 개시 인자 단백질을 코딩하는 유전자를 불활성화 시키도록 돌연변이를 도입하여 L-라이신 생산능이 향상된 것일 수 있다. 상기 "L-라이신 생산능을 갖는"은 상기 미생물이 배지에서 배양되는 경우, 배지 내에 L-라이신을 생산하고 분비하는 능력을 갖는 것을 의미한다. 상기 미생물은 야생형 또는 모균주보다 대량으로 배양 배지에 L-라이신을 생산하고 축적시킬 수 있는 미생물일 수 있다.
일 구체예에 따른 격막 형성 개시 인자 단백질을 코딩하는 유전자가 불활성화된 코리네형 미생물은 사상 온도 감수성 단백질 중 하나인 FtsB의 활성이 불활성되어, 상기 코리네형 미생물의 세포분열이 저해되는 반면 상대적으로 L-라이신 생산능이 향상될 수 있다.
다른 양상은 본 발명의 미생물을 배양하여 배양물 중에 L-라이신을 생산하는 단계; 및 배양물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 미생물의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양의 방법은 회분식, 연속식, 및 유가식 배양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 배양을 포함할 수 있다.
상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 미생물의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 미량원소 성분, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.
상기 탄소원은 탄수화물, 지방, 지방산, 알코올, 유기산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소원일 수 있다. 상기 탄수화물은 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스, 및 이들의 조합일 수 있다. 상기 지방은 대두유, 해바라기유, 파자마유, 코코넛유, 및 이들의 조합일 수 있다. 상기 지방산은 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 알코올은 글리셀로 또는 에탄올일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산을 포함할 수 있다.
상기 질소원은 유기 질소원, 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 유기 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 대두밀, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 무기 질소원은 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 배지는 인, 금속염, 아미노산, 비타민, 전구체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다. 상기 인의 공급원은 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 또는 이들에 상응하는 소듐-함유염을 포함할 수 있다. 상기 금속염은 황산마그네슘 또는 황산철일 수 있다.
상기 배지 또는 이를 이루는 개별 성분은 회분식, 연속식, 또는 유가식 배양으로 첨가될 수 있다.
상기 배양 방법에 있어서, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 상기 pH의 조정은 상기 배양물에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 또는 황산을 첨가하여 이루어질 수 있다. 또한, 상기 배양 방법은 기포 생성 억제를 포함할 수 있다. 상기 기포 생성 억제는 소포제의 사용을 통하여 이루어질 수 있다. 상기 소포제는 지방산 폴리글리콜 에스테르를 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양 방법은 배양물 내로 기체의 주입을 포함할 수 있다. 상기 기체는 배양물의 호기 상태를 유지하기 위한 어떤 기체도 포함할 수 있다. 상기 기체는 산소 또는 산소 함유 기체일 수 있다. 상기 산소 함유 기체는 공기를 포함한다. 상기 배양에 있어서, 배양물의 온도는 20 내지 45℃, 예를 들면, 22 내지 42℃, 또는 25 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 원하는 L-라이신의 생성량을 획득할 때까지 지속될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 배양은 배치 공정, 주입 배치 및 반복 주입 배치 공정과 같은 연속식 또는 회분식으로 이루어질 수 있다. 이러한 배양은 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 임의의 방법이 사용될 수 있다. L-아미노산은 음이온 교환 크로마토그래피 및 후속으로 닌히드린 유도체화에 의하여 분리되고 분석될 수 있다.
일 양상에 따른 격막 형성 개시 인자 단백질을 코딩하는 유전자가 불활성화된 미생물에 의하면, 상기 미생물의 L-라이신 생산 능력을 향상시킬 수 있다.
일 양상에 따른 L-라이신을 생산하는 방법에 의하면, L-라이신을 높은 생산성으로 생산할 수 있다.
이하 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 결손에 의한 ftsB 유전자 불활성화 재조합 벡터 제작
미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)에 보고된 염기서열에 근거하여 ftsB 유전자의 뉴클레오티드의 서열을 확보하였다(서열번호 2). ftsB의 개방해독틀(open reading frame)이 내부적으로 소실된 유전자 단편을 만들기 위하여, 상기 서열번호 2를 바탕으로 각각 프라이머 0936F1, 09369R1, 0936F2, 및 0936R2를 제작하였고, 각각을 서열번호 7 내지 10으로 나타내었다.　
ftsB 유전자 결손에 의한 불활성화 재조합 벡터를 제작하기 위하여 pDZ 벡터(한국 등록특허 0924065호 참고)를 사용하였으며 이후, 상기에서 기술한 바와 같이 불활성화되도록 제작된, ftsB 유전자의 변형된 서열을 가지는 핵산 분자를 상기 pDZ 벡터의 멀티클로닝 사이트 부위에 삽입시켜, 서열번호 4의 핵산 서열을 포함하는 벡터 pDZ-ΔftsB 벡터를 제조하였다. 상기 서열번호 4의 핵산 서열은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 아미노산을 코딩한다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 하여 프라이머 0936F1-0936R1과 0936F2-0936R2을 사용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 53℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다.
그 결과, 74bp와 95bp 의 ftsB 유전자 부위를 포함한 유전자 두 쌍인, ftsB-A 및 ftsB-B를 얻었다. 증폭된 산물은 Infusion cloning kit (Invitrogen)을 사용하여 pDZ벡터에 접합하였고 pDZ-ΔftsB 벡터를 제작하였다. pDZ-ΔftsB는 135bp ftsB의 XbaI 양쪽 말단을 포함하는 것으로, ftsB의 내부적 유전자 408bp가 소실된 단편을 포함한다.
실시예 2: 종결코돈 변이 도입에 의한 ftsB 유전자 불활성화 재조합 벡터 제작
종결코돈 변이 도입에 의한 ftsB 유전자 불활성화 재조합 벡터를 제작하기 위하여 상기 pDZ 벡터를 사용하였으며, ftsB 유전자 개방해독틀에서 140번째의 아미노산인 트립토판 대응코돈을 종결코돈으로 치환시키기 위한 프라이머를 제작하였다. 0936 F1 과 0936 R3을 쌍으로 하는 프라이머와 0936 F3과 0936 R2을 쌍으로 하는 프라이머를 사용하여 실시예 1과 동일한 방법의 PCR로 증폭하고 pDZ 벡터에 접합하여 벡터 pDZ-ftsB W140*를 제작하였다. 상기 0936F3 및 0936R3 프라이머의 서열은 서열번호 11 및 12으로 각각 나타내었다. 상기 제작 벡터에 접합된 fts 유전자의의 아미노산은 서열번호 5의 서열을 갖고, 핵산은 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
실시예 3: ftsB 유전자 불활성화 변이주 제작
상기 실시예 1과 2에서 제작한 재조합 벡터를 각각 전기펄스법을 이용하여 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P (구 기탁번호 KFCC10881, 한국 등록특허 0159812호, 한국 등록특허 0397322호 참고)에 형질전환시켰다(Appl. Microbiol.Biotechnol.(1999) 52:541-545에 의한 형질전환법 이용). 카나마이신 (kanamycin) 25 mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상의 동 유전자와 상동성에 의해 삽입된 균주를 선별하였다. 벡터의 성공적인 염색체 삽입은 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함한 고체 배지에서 푸른색을 나타내는가 여부를 확인함으로써 가능하였다. 1차 염색체 삽입된 균주를 영양 배지에서 진탕 배양 (30℃, 8시간)한 후, 각각 10-4으로부터 10-10까지 희석하여, X-gal을 포함하고 있는 고체 배지에 도말하였다. 대부분의 콜로니가 푸른색을 나타내는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차 (crossover)에 의해 ftsB 유전자가 불활성화된 균주를 각각 선별하였다.
결손에 의한 ftsB 유전자 불활성화 변이주를 선별하기 위하여 유전자 특이적 프라이머 쌍인 서열번호 7 및 서열번호 10의 0936F1-0936R2 를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다. 목적 부위에 대한 염기서열 분석을 통하여 최종 확인하여 결손에 의한 ftsB 유전자 결손에 의한 불활성화 변이주 KCCM11016P-ΔftsB를 제작하였다. 종결코돈 변이 도입에 의한 ftsB 유전자 불활성화 변이주를 선별하기 위하여 서열번호 7 및 서열번호 10의 0936F1-0936R2 을 쌍으로 하는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 목적 부위에 대한 염기서열 분석을 통하여 최종 확인하여 종결코돈 변이 도입에 의한 ftsB 유전자 불활성화 변이주 KCCM11016P-ftsB W140*를 제작하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 다른 균주들에서의 효과도 확인하기 위하여 역시 상기와 같은 방법으로 KCCM10770P(한국 등록특허 0924065호 참고), KCCM11347P(한국 등록특허 1994-0001307 참고) 및 CJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)를 모균주로 하여 각각 ftsB 유전자가 결손된 균주와 종결코돈이 도입된 균주 KCCM10770P-ΔftsB, KCCM11016P-ftsB W140*, KCCM11347P-ΔftsB, KCCM11347P-ftsB W140*, CJ3P-ΔftsB, CJ3P-ftsB W140* 를 제작하였다.
실시예 4: ftsB 유전자 불활성화 균주에서의 라이신 생산
실시예 3에서 제작된 L-라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P-ㅿftsB, KCCM11016P-ftsB W140*, KCCM10770P-ㅿftsB, KCCM10770P-ftsB W140*, KCCM11347P-ㅿftsB, KCCM11347P-ftsB W140, CJ3P-ㅿftsB, 및 CJ3P-ftsB W140*를 L-라이신 생산을 위하여 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기의 종 배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 및 KCCM11016P-ㅿftsB, KCCM11016P-ftsB W140*, KCCM10770P-ㅿftsB, KCCM10770P-ftsB W140*, KCCM11347P-ㅿftsB, KCCM11347P-ftsB W140*, CJ3P-ㅿftsB, 및 CJ3P-ftsB W140*를 각각 접종하고 30 ℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕배양하였다. 그 후 하기의 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 상기 배양된 1 ml의 종 배양액을 각각 접종하고 30℃에서 120 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
종배지 (pH 7.0)
원당 20 g, 펩톤 10 g, 효모 추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
생산배지 (pH 7.0)
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 및 KCCM11016P-ㅿftsB, KCCM11016P-ftsB W140*, KCCM10770P-ㅿftsB, KCCM10770P-ftsB W140*, KCCM11347P-ㅿftsB, KCCM11347P-ftsB W140, CJ3P-ㅿftsB, 및 CJ3P-ftsB W140*에 대한 배양액 중의 L-라이신 농도는 표 3과 같다. 표 3의 결과는 반복실험한 평균치이다.
　 라이신 g/L OD 560 nm
배치 1 배치 2 배치 3 배치 1 배치 2 배치 3
KCCM11016P 43.3 44.6 43 54.7 57.5 55
KCCM11016P-ㅿftsB 44.9 45 46 53 53.4 52.5
KCCM11016P-ftsB W140* 44.5 45 46.1 51.9 52 52.6
KCCM10770P 46.9 47 47.3 50.5 51 52
KCCM10770P-ㅿftsB 48.9 48.5 48.4 48.6 49 48
KCCM10770P-ftsB W140* 48 48.2 48.9 48.1 48.5 49
KCCM11347P 38 37.7 38.5 79 80 81
KFCC10750-ㅿftsB 39.5 39 39.8 76 75 75
KCCM11347P-ftsB W140* 40 39.5 39.4 74 76 75
CJ3P 8.5 8 8 102 105 103
CJ3P-ㅿftsB 9.1 9.6 9 97 96.5 97.2
CJ3P-ftsB W140* 9.2 9 9.5 98 97.5 97.7
표 3에 나타낸 바와 같이, 모균주 KCCM11016P로부터 ftsB 유전자가 결손되거나 종결코돈이 도입된 경우 모두 라이신 생산이 동일하게 약 4%씩 증가하였다. 이러한 결과는 ftsB 유전자 자체의 구조적 변화에 의해서가 아니라, 격막 형성 개시 인자인 FtsB 단백질의 결손에 의해 라이신 농도가 증가했음을 의미한다. 나아가, 다른 종류의 모균주인 KCCM10770P, KCCM11347P 및 CJ3P에서도 FtsB 가 불화성화된 균주가 야생형 FtsB 활성을 가진 모균주 대비 평균 라이신 농도가 약 4% 증가하였다. 반면 균체량은 FtsB 불활성화된 균주들이 모균주대비 5% 감소함을 보였다. 상기의 결과는 라이신 생산균주의 세포분열을 억제해 균체량을 제어함으로써 라이신 생산능을 향상시킬 수 있음을 의미한다. KCCM11016P-ftsB W140* (CA01-2274) 를 2013년 9월 27일에 한국미생물 보존센터 (대한민국 서울 서대문구 홍제 1동 유림빌딩)에 기탁번호 KCCM11454P로 기탁하였다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11454P 20130927
<110> CJ Corporation <120> A corynebacterium microorganism having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same <130> PN099341 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 180 <212> PRT <213> Coynebacterium <400> 1 Met Ala Lys Gln Lys Lys Thr His Lys Gly Leu Val Pro Val Ser Ser 1 5 10 15 Arg Glu Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ala Thr Arg Ala Pro Phe Arg 20 25 30 Leu Gly Ala Val Gly Ile Gly Ala Ile Ala Leu Val Val Leu Leu Ile 35 40 45 Leu Phe Val Ile Ala Ile Pro Val Arg Asn Tyr Phe Gln Leu Arg Ser 50 55 60 Asp Ile Ala Gln Thr Glu Ala Ser Ile Glu Ala Lys Glu Gln Gln Ile 65 70 75 80 Lys Gln Leu Glu Ser Asp Leu Asn Arg Tyr Gln Ser Glu Ala Tyr Ile 85 90 95 Arg Glu Gln Ala Arg Leu Arg Leu Gly Val Ile Glu Pro Gly Glu Thr 100 105 110 Ala Phe Arg Ile Val Asp Pro Ala Leu Asp Thr Asp Thr Ser Val Thr 115 120 125 Ser Asp Gly Asn Glu Glu Lys Pro Leu Gly Ala Trp Tyr Glu Asn Leu 130 135 140 Trp Asp Ser Val Thr Lys Pro Glu Ala Leu Gly Glu Glu Glu Ile Ala 145 150 155 160 Pro Pro Ala Val Glu Gly Glu Val Pro Thr Leu Ala Pro Thr Glu Glu 165 170 175 Ala Thr Val Gln 180 <210> 2 <211> 543 <212> DNA <213> Corynebacterium <400> 2 atggcaaagc agaagaaaac tcataaaggc cttgttcctg tctcaagcag ggaacgtgct 60 tcagagtcag tttctgctac ccgcgcccca tttagattgg gtgccgtcgg catcggtgca 120 atcgcactcg tagttcttct catcctgttt gtcatcgcga ttcctgtgcg taactatttt 180 cagctgcgct ccgacatcgc ccaaacagag gcttccattg aagccaaaga acaacagatc 240 aaacaactgg aatctgacct caacaggtac caatcagagg cgtacatccg cgaacaagca 300 cgcctgcgcc taggcgtcat tgaacctgga gaaaccgcgt tcagaatcgt ggacccagca 360 ctagataccg acacctcagt cacctctgac ggcaacgaag agaaaccact gggagcttgg 420 tatgaaaacc tctgggactc agtcaccaag ccagaagcac tcggcgaaga ggaaattgcg 480 cctccagcag ttgagggaga agttccaaca cttgcaccaa ctgaggaagc aactgtgcaa 540 tag 543 <210> 3 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant of pdz-ftsB <400> 3 Met Ala Lys Gln Lys Lys Thr His Lys Gly Leu Val Pro Val Ser Ser 1 5 10 15 Arg Glu Arg Glu Glu Glu Ile Ala Pro Pro Ala Val Glu Gly Glu Val 20 25 30 Pro Thr Leu Ala Pro Thr Glu Glu Ala Thr Val Gln 35 40 <210> 4 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> variant of pdz-ftsB <400> 4 atggcaaagc agaagaaaac tcataaaggc cttgttcctg tctcaagcag ggaacgtgaa 60 gaggaaattg cgcctccagc agttgaggga gaagttccaa cacttgcacc aactgaggaa 120 gcaactgtgc aatag 135 <210> 5 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variant of pdz-ftsB <400> 5 Met Ala Lys Gln Lys Lys Thr His Lys Gly Leu Val Pro Val Ser Ser 1 5 10 15 Arg Glu Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ala Thr Arg Ala Pro Phe Arg 20 25 30 Leu Gly Ala Val Gly Ile Gly Ala Ile Ala Leu Val Val Leu Leu Ile 35 40 45 Leu Phe Val Ile Ala Ile Pro Val Arg Asn Tyr Phe Gln Leu Arg Ser 50 55 60 Asp Ile Ala Gln Thr Glu Ala Ser Ile Glu Ala Lys Glu Gln Gln Ile 65 70 75 80 Lys Gln Leu Glu Ser Asp Leu Asn Arg Tyr Gln Ser Glu Ala Tyr Ile 85 90 95 Arg Glu Gln Ala Arg Leu Arg Leu Gly Val Ile Glu Pro Gly Glu Thr 100 105 110 Ala Phe Arg Ile Val Asp Pro Ala Leu Asp Thr Asp Thr Ser Val Thr 115 120 125 Ser Asp Gly Asn Glu Glu Lys Pro Leu Gly Ala 130 135 <210> 6 <211> 543 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> variant of pdz-ftsB <400> 6 atggcaaagc agaagaaaac tcataaaggc cttgttcctg tctcaagcag ggaacgtgct 60 tcagagtcag tttctgctac ccgcgcccca tttagattgg gtgccgtcgg catcggtgca 120 atcgcactcg tagttcttct catcctgttt gtcatcgcga ttcctgtgcg taactatttt 180 cagctgcgct ccgacatcgc ccaaacagag gcttccattg aagccaaaga acaacagatc 240 aaacaactgg aatctgacct caacaggtac caatcagagg cgtacatccg cgaacaagca 300 cgcctgcgcc taggcgtcat tgaacctgga gaaaccgcgt tcagaatcgt ggacccagca 360 ctagataccg acacctcagt cacctctgac ggcaacgaag agaaaccact gggagcttga 420 tatgaaaacc tctgggactc agtcaccaag ccagaagcac tcggcgaaga ggaaattgcg 480 cctccagcag ttgagggaga agttccaaca cttgcaccaa ctgaggaagc aactgtgcaa 540 tag 543 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 0936F1 primer <400> 7 gcaggtcgac tctagaccga ggacaccacc att 33 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 0936R1 primer <400> 8 tctcaagcag ggaacgtgaa gaggaaattg cgcc 34 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 0936F2 primer <400> 9 ggcgcaattt cctcttcacg ttccctgctt gaga 34 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 0936R2 primer <400> 10 ccggggatcc tctagacggt ggaaaggcga tca 33 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 0936F3 primer <400> 11 gggagcttga tatgaaaacc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 0936R3 primer <400> 12 ggttttcata tcaagctccc 20 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 0936F4 primer <400> 13 aaccactggg agcttga 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 0936R4 primer <400> 14 cggtggaaag gcgatca 17

Claims (4)

  1. 격막 형성 개시 인자 (septum formation initiator) 단백질이 불활성화된, L-라이신 생산능이 향상된 코리네형 미생물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 격막 형성 개시 인자 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것인 미생물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 코리네형 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 인 미생물.
  4. 청구항 1 항에 따른 미생물을 배양하여 배양물 중에 L-라이신을 생산하는 단계; 및
    배양물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법.
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