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KR20150036788A - 바이러스 백신의 제조를 위한 오리 배아 유래 줄기 세포주 - Google Patents

바이러스 백신의 제조를 위한 오리 배아 유래 줄기 세포주 Download PDF

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KR20150036788A
KR20150036788A KR1020157005296A KR20157005296A KR20150036788A KR 20150036788 A KR20150036788 A KR 20150036788A KR 1020157005296 A KR1020157005296 A KR 1020157005296A KR 20157005296 A KR20157005296 A KR 20157005296A KR 20150036788 A KR20150036788 A KR 20150036788A
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KR
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cell
duck
virus
medium
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파비엔느 구에노
까린느 모호
마가일 에휴뉠뜨
마지 메딸리
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발네바
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Abstract

본 발명은 바이러스 백신의 개발 및 제조에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 바이러스 벡터와 백신의 산업적 생산 분야에 관한 것으로, 더 구체적으로는 바이러스 벡터 및 바이러스의 생산을 위하여 조류 배아 줄기 세포, 좋기로는 오리 배아 줄기 세포 유래의 EBx® 세포주의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간 및 동물의 바이러스 감염을 예방하기 위한 바이러스 백신의 산업적 생산에 유용하다.

Description

바이러스 백신의 제조를 위한 오리 배아 유래 줄기 세포주 {DUCK EMBRYONIC DERIVED STEM CELL LINES FOR THE PRODUCTION OF VIRAL VACCINES}
본 발명은 바이러스 백신의 개발 및 제조에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 바이러스 벡터 및 백신의 산업적 생산 분야에 관한 것이며, 더 구체적으로는 바이러스 벡터 및 바이러스를 생산하기 위하여 조류 내인성 레트로바이러스를 제외한 배아 줄기 세포로부터 유래된 오리 세포주의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간 및 동물의 바이러스 감염을 예방하기 위한 바이러스 백신의 산업적 생산에 유용하다.
백신은 감기, 홍역, 이하선염, 천연두, 황열 등과 같은 다양한 바이러스성 감염에 의한 사망과 질병을 효과적으로 감소하고 예방한다.
다양한 바이러스성 백신은 현재, 달걀 또는 닭 배아에서 추출한 배의 닭 달걀 또는 1차 닭 배아 섬유아세포에 생산되고 있다. 그러나, 때때로 백신 생산은 백신주를 증식하기 위하여 사용되는 조류 세포 기질에서 유래한 외래 인자에 의한 우연한 오염에 의하여 복잡해진다. 실제로 역전사 효소(RT) 활성, 레트로바이러스의 존재의 징후는 황열, 홍역과 이하선염에 대한 유럽과 미국 제조업자에 의하여 생산된 닭에서 유래된 살아있는 세포인 순화 백신에서 검출되었다 [문헌,(Hussain et al., 2003, J. Virol 77:1105-1111; Johnson et Heneine, 2001, J. Virol., 75:36305-3612 참조]. 그러한 백신 내의 RT 활성의 기원에 대한 조사로, 내인성 조류 백혈병 바이러스(ALV-E)와 내인성 조류 바이러스(EVA) 유래 RNA를 함유하는 입자에서 증거를 발견하였다(Johnson et Heneine, 2001, J. Virol 75:3605-3612; Tsang et al., 1999, J. Virol 73:5843-5851; Weissmahr et al., 1997, J. Virol 71:3005-3012).
ALV-E와 EAV 둘다는 닭 생식 계열 내에 존재하는 내인성 레트로바이러스계의 일원이다. ALV-E는 유전하는 유전 요소인 ev 유전자좌에서 발현된다. envelope sequence에 기반한 ALV-E는 외래에서 수득한 감염인 하위군 A 내지 D 및 J와는 구별된다. 외래 ALVs가 감염된 닭에서 심근염, 골화석증 등의 몇몇 종양 질병을 일으키는 반면, ALV-E는 닭의 병원균으로 알려지지 않았다. ALV-E 감염에 수반되는 종양유발 가능성의 감소는 내인성 장형 반복 말단(LTR) 내의 바이러스 종양 유전자와 인헨서 활성 모두의 결핍에 의한 것일 수 있다. 20개 이상의 서로 다른 ev 유전자좌가 화이트 레그혼 닭 내에서 동정되었다(ev 1 내지 ev 22). 발견된 순으로 지정된 Ev 유전자좌 호칭은, 그들이 나타내는 유전자 산물과 감염 입자를 생산하는 능력을 고려하여 표현형적으로 분류된 것이다. ev 유전자좌에 의하여 주어진 ALV-E 표현형의 범위는 구조적이고 효소에 의하여 완성된 감염 입자에서 바이러스 단백질 발현이 검출되지 않도록 구조적으로 또는 효소학적으로(RT-) 불완전한 것에 이른다. 대부분의 ev 유전자좌는 구조적으로 불완전하고 따라서 감염 바이러스 입자의 생산에 필요한 모든 서열을 암호화하지 못한다. ev-0이라고 명명되는 닭 계통은 ALV-E 에 저항성이 있도록 번식되어 수득할 수 있다. Line-0 닭은 ev 유전자좌(즉, ev-0)이 결손되어있으나, EAV 프로바이러스 서열이 유전자 계열 0 닭 내에 존재한다(Dunwiddieand Faras, 1985 Proc Natl. Acad. Sci USA, 83: 5097-5011).
ALV 계와는 다르지만 관련이 있는, EAV 계열에 대해서는 거의 알려진 바 없다. EAV 요소는 닭 게놈 당 최소 50 복사가 존재한다. 그러나, EAV 서열이 완전한 길이와 무손상의 레트로바이러스 게놈을 나타내는 것으로 알려져있지 않고, 전염성의 EAV 격리는 아직 동정되지 않았다. 그러나, EAV는 조류 속, gallus에서 유래된 배아 세포로 고도로 발현된다. Weissmahr 등(1997, J. Virol 71:3005-3012)은 EAV 내인성 레트로바이러스 계열의 입자가 대부분 배양된 닭 배아 섬유아세포의 상청액에서 발견된 입자 관련 RT 활성의 큰 부분에 대하여 책임이 있는 것을 나타내고 있다.
비활성 공정에 수행할 수 없고, 그것 중 대부분을 인간에 주입하여, 비특이적 면역 보호 메커니즘을 회피하기 때문에 우연한 전달의 위험은 살아있는 독성이 약화된 바이러스 백신에 대하여 특히 높다. 따라서, 동물과 인간에 대한 백신 사용의 안전성을 보장하기 위하여, 현재 백신 생산을 위한 세포 기질이, 면역화 동안에 동물 또는 인간 숙주로 통과할 수 있는 복제 가능 레트로바이러스의 존재를 시험해보고 있다(WHO technical reports Series, 1994 참조).
다른 한편으로는, 닭 배아 달걀과 1차 닭 배아 섬유아세포 생산 시스템은 다음을 포함하는 몇 가지 심각한 한계가 있다:
- 각 개별적인 생산 작업을 위해 많은 양의 달걀 또는 CEFs를 질적으로 조달하고 컨트롤하는 것을 필요로 하는, 시간이 많이 걸리고, 성가시며 자원-소비적인 제조 과정;
- 많은 경우, 값비싼 특정 무병원체(SPF, specific pathogen free) 닭 배를 사용해야 하는 필요성;
- 공여자 닭 무리에서의 유행성 감염의 경우 달걀을 공급하기에 충분하지 않은 위험성을 갖고 있는 것;
- BSE-면제국으로부터 생겨난 소 혈청의 사용과 관련된 인플레이션 비용;
- 닭에게 매우 전염성이 강하고 죽일 수 있는 바이러스를 전파시키기 위한 달걀 사용의 불가능.
따라서, 달걀 또는 닭 배아 섬유 아세포에 기반한 현재의 바이러스 백신 제조 기술을 향상시키기 위한 필요가 긴급하다. 바이러스 백신의 제조를 위한 CEF 생산 시스템과 달걀을 대체하기 위한 세포 배양 플랫폼의 개발이 현재 백신 생산의 정체와 시간의 제약을 극복할 수 있는 가장 빠르고 전도유망한 해결법이다. 또한, 달걀 또는 CEF 플랫폼 대신, 바이러스 백신의 제조를 위한 세포주의 용도는 백신의 안전성과 관련된 하기의 추가적인 장점을 가진다: 백신 제제 중에 항생 물질 첨가물이 존재하지 않음; 독성 있는 방부제(티오메르살 등)가 필요 없음; 내독소 수준이 감소되고 달걀 알레르기 문제가 없음; 단백질과 무혈청 배지 내에서의 세포 배양에 의한 외래성 제제(adventitious agent)/BSE의 위험이 없음; 바이러스 백신 제조의 높은 순도.
바이러스 백신의 생산을 위한 세포주의 예로는, MDCK(Madin-Darby 개 신장에서 유래된 세포), CRUCELL(네델란드)에서 개발된 PerC6(인간 아데노바이러스 종류 5의 E1 유전자에 삽입하여 유전적으로 변이된 인간 배아 망막 세포에서 유래된 세포), VERO(일본, Chiba 내의 Chiba 대학에서 분리한 아프리카 녹색 원숭이(Cercopithecus aethiops)의 신장 상피 세포에서 유래된 세포), BHK21(아기 햄스터 신장 세포에서 불멸화시킨 세포)가 있다. 의학적, 조절적, 산업적 요구를 모두 만족시키는 세포주는 없다. 예를 들면, 이러한 세포주의 대부분은 발암성이고, 인간 백신의 생산을 위한 발암성 세포의 용도와 관련한 중요한 조절 중요성이 있다. 따라서, 오늘날 조절 당국은 대량의 백신을 생산하는 발암성 세포 기질을 승인하는 것을 달갑게 여기지 않는다. 또한, 이러한 세포주의 몇몇은 부착 의존성이어서, 백신 생산의 산업적 확대를 위한 심각한 장애물이 된다.
따라서, 레트로바이러스의 복제 가능 요소가 제거된 부착 비의존성 세포주로, 비발암성이고 산업적으로 유순하여 바이러스의 광범위한 감염에 민감한 세포주의 개발이 요구된다. 이것이 본 발명의 목적이다.
따라서, 본 발명자들은 조류 생물학과 조류 배아 줄기 세포(ES)의 전문기술에서의 이점을 이용해, 인간 및 수의사 백신 및 백신 후보자의 큰 그룹의 효율적인 복제를 가능하게 하고, 신규하고 안정한 오리 세포주를 개발하였다. 특허된 방법(참고 WO 03/076601 및 WO 05/007840)을 이용해, 본 발명자들은 특성이 규명되고 증명된 세포주(dEBx 세포) 세트를 생산하였으며, 이는 유전적, 화학적 또는 바이러스 불멸화(immortalization)의 단계를 거치지 않은 오리 ES 세포로부터 유발되고 배양에서 복제 가능 레트로바이러스를 생산하지 않는 것이다.
본 발명은 조류 배아 줄기 세포(ES)에서 유래된, EBx라고 불리는 연속적 이배체 조류 세포주를 얻기 위한 방법을 제공하는데, 상기 조류 세포주는 복제 가능 내인성 레트로바이러스 입자를 생산하지 않는다.
본 발명의 세포주는 "연속적"인데, 왜냐하면 그들은 시험관 내에서 연장된 기간을 넘어서도 배양되는 것이 특징이기 때문이다. 유리하게는, 본 발명의 세포주는 최소 50 계대, 최소 75 계대, 최소 100 계대, 최소 125 계대, 최소 150 계대, 최소 175 계대, 최소 200 계대, 최소 250 계대로 증식할 수 있다. 250 계대는 시간 제한이 없는데, 이는 상기 수득한 세포주는 여전히 생존하고 추가적인 계대 배양을 위하여 여전히 계대 접종될 수 있기 때문이다. 특정 이론에 구애되는 것은 아니나, 본 발명의 세포는 세포가 텔로머라아제를 발현하는 한 "연속적으로" 배양될 수 있을 것이다. 정말로, 본 발명의 조류 세포의 텔로머라아제의 고농도의 발현은 유전적 안정성(즉, 본 발명의 조류 세포는 이배체이다)과 연속적인 세포 성장을 초래하는 것이라 생각된다.
"계대(passage)"는 희석하거나 하지 않고, 또는 희석함 없이, 하나의 배양 용기로부터 다른 용기로 세포를 전달하는 것을 의미한다. 세포가 한 용기에서 다른 용기로 이송될 때마다, 세포의 특정 부분이 결손될 수 있으므로, 의도 되었건 또는 의도되지 않았건 간에 세포의 희석이 일어날 수 있다. 이 용어는 용어 "2차 배양(subculture)"과 같은 의미이다. 계대 배양의 수는 세포가 배양되는 횟수로서, 새로운 용기 내로 2차 배양되거나 이송되어 현탁액 또는 부착 상태로 성장한다. 이 용어는 세포 개체군이 한 번 복제하는데 필요한 시간, 즉 세포 집락 중 개개의 세포가 복제하는데 대체로 걸리는 시간인 개체군 배가 또는 세대와 동의어가 아니다. 예를 들면, 본 발명의 단계 a)의 조류 ES 세포의 개체군 배가 시간(PDT)은 대략 40 시간을 초과한다. 본 발명의 상기 조류 EBx 세포의 PDT는 약 30 시간 미만이며, EBx® 세포의 경우, 대개, 3세대마다 1번 계대 배양한다.
"이배체"는 본 발명의 세포가 보통 하나는 모계, 하나는 부계에서 유래된 각 염색체의 2개의 복제본을 가지는 것을 의미한다.
본 발명의 조류 EBx® 세포주가 연속적이고 이배체(즉, 유전학적으로 안정적)라는 사실은, 그 자체로 뚜렷하고 독특한 특징인데, 이는 이 용어가 보통 길항적이기 때문이다. 따라서, 화학적, 물리적(U.V 조사, X-ray 또는 g-irradiation 등) 또는 유전적 변이(바이러스 변형, 종양 유전자 과발현)에 의한 암 세포 및/또는 불멸화된 세포는 무기한으로 배양되어 복제될 수 있기 때문에 연속적인 세포이지만, 그들은 다배체 핵형을 나타내기 때문에 유전적으로는 안정적이지 않다. 다른 한편, 닭 배아 섬유아세포 등의 1차 세포, MRC5, WI38는 전환되지 않은 세포로 몇 세대 이후 제한된 수명을 가지기 때문에 연속적이지 않지만, 그들은 유전적으로는 안정적인 세포이다(즉, 이배체).
본 발명에서, 상기 용어 "세포주"와 "세포"는 혼용하여 사용한다.
본원에 사용된 용어 "조류(avian)", "새", "조류(aves)", 또는 "ava"는 모두 같은 의미를 갖는 것으로 간주되며 구분되지 않고 사용될 것이다. "조류"는 분류 집단 <<ava>>에 속하는 모든 종, 아종 또는 품종을 일컫는 것으로 간주된다. 바람직한 구현예에서, "새"는 분류학적 기준의 모든 동물을 일컫는다:
- "안세리폼(Anseriformes)"(즉, 오리, 거위, 백조 및 동류). 안세리폼은 3개 과의 약 150 종의 새를 포함한다: 안히미대(Anhimidae, 명매기 일종), 안세라나티대(Anseranatidae, 까치-거위) 및 오리, 거위 및 백조 중에서 140 종 이상의 물새를 포함하는 아나티대(Anatidae). 이들 모든 종은 물 표면에서 수중 생활을 하기에 매우 적합하다. 모두는 수영을 할 수 있게 물갈퀴를 가진다(비록 일부는 불완전하여 주로 육상 생활을 한다).
- "갈리폼(Galliformes)"(즉, 닭, 메추라기, 칠면조, 꿩 및 동류). 갈리폼은 닭, 칠면조, 메추라기 및 꿩을 포함하는 새이다. 약 256종이 전세계에서 발견되었다.
- "콜럼비폼(Columbiformes)"(즉, 비둘기 및 동류). 이 새는 매우 널리 분포하는 비둘기(dove and pigeon)를 포함한다.
본 발명에서, 용어 "내인성 레트로바이러스성 입자" 또는 "내인성 레트로바이러스 입자"는 혼용하여 사용되는데, 이는 레트로바이러스성 입자 또는 몇몇 조류 세포 게놈 내에 존재하는 ALV-E 또는 EAV 프로바이러스성 서열에서 발현되고 코딩되는, 또는 발현되거나 코팅되는 레트로바이러스를 의미한다. 새에서, ALV-E 프로바이러스성 서열은 집 닭(Line-0 닭을 제외하고), 적색야계(red jungle fowl)와 꿩(Ringneck pheasant) 내에 존재하는 것으로 알려져 있다. 새 중에서, EAV 프로바이러스성 서열이 모든 속(genus), 집 닭, Line-0 닭, 적색야계, 녹색야계, 회색야계, ceyloness jungle fowl과 그 동종을 포함한 gallus 내에 존재한다는 것이 알려져 있다(Resnick et al., 1990, J. Virol, 64:4640-4653 참조).
양호한 실시예에 따르면, 본 발명의 새는 게놈 내에 ALV-E와 EAV 프로바이러스성 서열을 포함하지 않는 새 중에서 선택한다. 본 발명의 숙련된 기술자는 ALV-E 와 EAV 서열이 새 게놈 내에 존재하는지 아닌지를 알 수 있다(Johnson and Heneine, 2001; Weissmahr et al., 1996 참조). 좋기로는 상기 새는 Anseriformes(즉, 오리, 거위, 백조), 칠면조, 메추라기, 메추라기(Japanese quail), 호로새(guinea fowl), 공작 중에서 선택된다. 따라서, 그러한 새에서 유래된 세포는 복제가능 내인성 ALV-E 및/또는 EAV 입자를 생산하지 않는다. 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 새는 오리, 거위, 백조, 칠면조, 메추라기, 메추라기(Japanese quail), 호로새(guinea fowl), 공작 중에서 선택된다. 더 양호한 실시 상태에 의하면, 상기 새는 오리, 더 좋기로는 페킨(Pekin) 오리 또는 무스코비(Muscovy) 오리이다. 더 양호한 실시 상태에 따르면, 상기 새는 페킨 오리이다. 따라서, 본 발명은 배아 줄기 세포(ES)에서 유래된 연속적 이배체 오리 세포주를 얻는 방법을 제공하되, 상기 오리 세포주는 복제 가능 내인성 레트로바이러스 입자를 생산하지 않는다.
두 번째 양호한 실시 상태에 따르면, 본 발명의 새는 게놈 내에 EAV 프로바이러스성 서열이지만, 완전한 ALV-E 프로바이러스성 서열을 포함하지는 않는다. 본 기술 분야의 숙련된 자는 부분적 또는 완전한 ALV-E와 EAV 서열이 새 게놈 내에 존재하는지 아닌지를 측정할 수 있다(Johnson and Heneine, 2001). 몇몇 닭 계통은 완전한 ALV-E 프로바이러스성 서열(즉, ev-0 계통)을 포함하지 않아서, 하기와 같은 감염 ALV-E 레트로입자를 생산하지 않는 혈통 중에서 선택된다;
- 이스트 랜싱 미국 농무부(USDA) 포울트리 스톡(poultry stock)의 Lin 0 집 닭(ELL-0 계통). 이스트 랜싱 Line-0 닭은 ALV와 관련된 어떠한 내인성 바이러스(ev) 유전자좌를 함유하지 않는다(Dunwiddie and Faras, 1985).
-프랑스 국립 농업연구소(INRA; Institut National de la Recherche Agronomique)의 DE와 PE11 계통(Domaine de Magner명 Surgeres, France).
따라서, ev-0 새에서 유래된 세포는 복제 가능 내인성 ALV-E 입자를 생산하지 않는다. 양호한 실시 상태에 따르면, 상기 새는 ev-0 집 닭(Gallus Gallus subspecies domesticus), 좋기로는 ELL-0, DE 및 PE11 중에서 선택된다.
보통, ev-0 닭은 여전히 EAV 프로바이러스성 서열(proviral sequence)를 함유하지만, 지금까지 전염성의 분리된 EAV는 동정되지 않았다. 따라서, 본 발명은 ev-0 닭 계통의 배아 줄기 세포(ES)에서 유래한 연속적 이배체 닭 세포주를 수득하기 위한 방법을 제공하되, 상기 ev-0 닭 세포주는 복제 가능 내인성 레트로바이러스 입자를 생산하지 않는다.
3번째 실시 상태에 따르면, 본 발명의 새는 게놈 내에 완전한 및/또는 불완전한 ALV-E와 EAV 프로바이러스성 서열을 포함하지만, 복제 가능 ALV-E와 EAV 레트로입자를 생산할 수 없는 새 중에서 선택된다. 본 기술 분야의 숙련된 자들은 ALV-E 및/또는 EAV 전염성 및/또는 비전염성 레트로입자가 새 세포로부터 생산되는지 아닌지를 측정할 수 있다(Johnson and Heneine, 2001; Weissmahr et al., 1996). 좋기로는 상기 새는 특정 무병원체(SPF; specific pathogen free) 닭을 포함하는 군에서 선택되는 것이 좋으며, 좋기로는 Valo 계통(Lohman) 또는 Line 22(SPAFAS)인 것이 좋다.
"복제 가능"은, 내인성 레트로바이러스성 입자가 전염성이 있으며, 그러한 레트로바이러스성 입자가 본 발명의 조류 세포 내로 감염될 수 있고 복제될 수 있음을 의미한다.
본 발명의 EBx®라고 명명된 연속적 이배체 조류 세포주의 확립 방법은 하기의 두 단계를 포함한다.
a) 복제 가능 내인성 레트로바이러스성 입자, 더 구체적으로는 EAV 및/또는 ALV-E 프로바이러스성 서열 또는 그의 단편을 생산할 여지가 있는 완전한 내인성 프로바이러스성 서열 또는 그의 단편을 함유하지 않는 조류 배아 줄기 세포를, 성장에 필요한 모든 인자를 포함하고, 영양 세포층이 존재하며, 동물 혈청이 첨가된 완전한 배지 내에서 분리, 배양 및 증식시키는 단계; 선택적으로, 상기 완전한 배양 배지는 추가적으로 아미노산(즉, 글루타민, 비필수 아미노산 등), 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), 베타-머캅토에탄올, 비타민, 비-동물 기원의 단백질 가수분해물(즉, 이스톨레이트, 식물 hydrolyzate(콩, 밀,...)) 등과 같은 첨가물을 더 포함할 수 있음.
b) 상기 인자, 상기 영양 세포층과 상기 혈청, 그리고 선택적으로 상기 첨가물을 회수하고, 추가로 복제 가능 내인성 레트로 바이러스 입자를 생산하지 않으나, 외래 성장 인자, 영양 세포층 및 동물 혈청을 포함하지 않는 기본 배지 내에서 장기간 동안 증식할 수 있는 EBx®라고 명명된 부착성 또는 현탁 조류 세포 세포주를 얻기 위하여 배양 배지를 변형시킴으로써 계대 배양하는 단계.
성장 인자, 혈청, 영양 세포층을 점진적으로 또는 전체적으로 제거하기 위해, EBx® 세포주를 확립하는 단계 b)의 배양 배지를 변형시키는 것은 동시에, 연속적으로 또는 독립적으로 이루어질 수 있다. 배양 배지를 버리는 순서는 다음으로부터 선택될 수 있다:
- 영양 세포층/혈청/성장인자;
- 영양 세포층/성장인자/혈청;
- 혈청/성장인자/영양 세포층;
- 혈청/영양 세포층/성장인자;
- 성장인자/혈청/영양 세포층;
- 성장인자/영양 세포층/혈청.
양호한 실시 상태에 따르면, 회수 순서는 성장 인자/영양 세포층/혈청이다. 양호한 실시 상태에 따르면, 소듐 피루베이트, 비필수 아미노산(NNEA), 비타민, 이스톨레이트 등과 같은 첨가제의 회수는 영양 세포층의 회수 후에, 그리고 혈청의 회수 전에 수행한다. 좋기로는, 이스톨레이트의 회수는 소듐 피루베이트, NNEA 및 비타민의 회수 후에 수행한다.
양호한 실시 상태에 따르면, 본 발명의 a) 단계에 따른 조류 배아 줄기 세포는 산란시, 즉 알을 낳았을 때의 조류 배아에서 수집한다. Sellier 등에 따르면(2006, J. Appl. Poult. Res., 15:219-228), 착란은 Eyal-Giladi의 분류에 따른 하기의 발생 단계에 대응된다(EYAL-GILADI의 분류: EYAL-GILADI 및 KOCHAV, 1976, <<From cleavage to primitive streack formation : a complementary normal table and a new look at the first stages of the development in the chick>>, "General Morphology" Dev. Biol. 49:321-337 참조).
- 무스코비 오리(바바리 오리라고도 부름) : 단계 VII
- 기니 닭(Guinea fowl) : 단계 VII - VIII
- 칠면조 : 단계 VII - VIII
- 페킨 오리 : 단계 VIII
- 닭 : 단계 X
- 일본 메추라기 : 단계 XI
- 거위 : 단계 XI.
좋기로는, 단계 a)의 오리 배아 줄기(ES) 세포는 Eyal-Giladi의 분류의 단계 VIII(착란)에 있는 페킨 오리의 배아(들)를 분해시킴으로써 얻어진다. 만약 착란시 수집한 산란된 알이 배아 줄기 세포를 수집할 정도로 충분히 발생하지 않았다면, 상기 산란된 알은 배아가 발달할 수 있도록 몇 시간(밤새) 내지 1 내지 2일 동안 추가로 인큐베이션 시킬 수 있다. 두 번째 실시 상태에 따르면, 단계 a)의 오리 배아 줄기(ES) 세포는 무스코비 오리에서 얻어진다. 착란 시, 무스코비 오리는 단계 VII에 있기 때문에 충분히 성숙하지 않는데, 따라서 상기 알은 Eyal-Giladi의 분류의 단계 VIII 내지 단계 X에 도달하도록 밤새 발달하도록 인큐베이션된다.
좋기로는 단계 a)의 닭 배아 줄기(ES) 세포, 좋기로는 ev-0 닭 계통에서 유래한 것인 배아 줄기 세포는 Eyal-Giladi의 분류의 단계 X(착란)에 있는 배아를 분해시킴으로써 얻어진다.
별법으로, 본 발명의 단계 a)의 상기 조류 배아 줄기 세포는 착란 전의 배아로부터 수집된다. 착란 전의 경우 부딪히는 주된 제한은, 알이 암탉으로부터 수술에 의하여 제거된다는 것이고 배아 당 ES 세포의 양이 현저히 낮다는 것이다. 더욱이, 조류 배아 발생의 매우 이른 단계에서는 ES 세포의 시험관 밖에서의 배양은 잘 특성화되지 않는다. 본 기술분야의 숙련된 자는 조류 ES 세포를 수집하기 위하여 허락된 알을 산란하기 전에 시간 프레임(timeframe)을 정의할 수 있을 것이다.
별법으로, 본 발명의 단계 a)의 조류 배아 줄기 세포는 착란 후 부화되기까지의 조류 배아로부터 수집할 수 있다. 그러나, 조류 배아 줄기 세포는 분화 조직으로 발생하기 위한 분화 단계로 점진적으로 도입된다. 따라서, 조류 ES를 수집하기 위하여서는 산란 후 오랜 시간이 지나지 않도록 하는 것이 좋다. 본 기술 분야의 숙련자들은 조류 배아 줄기 세포를 수집하기 위하여 허락된 알이 산란된 후, 시간 프레임을 정의할 수 있을 것이다.
다른 실시 상태에 따르면, 단계 a)의 세포는 원시 생식 세포(PGC)에 많이 존재하는 배아 줄기 세포 집단이다. 더 좋기로는, 단계 a)의 조류 ES 세포는 정제된 PGC이다. 조류 종에서, 원시 생식 세포는 배아원기의 중심 부위로부터 발생한다(Ginsburg and Eyal-Giladi, 1987 Development 101(2):209-19; Karagenc et al, 1996 Dev Genet 19(4):290-301; Petitte et al, 1997 Poult Sci. 76(8):1084-92). 그리고 나서, 이들은 배아 발생의 2.5 내지 5일 사이에 맥관계(vasculature)에 의해 수득될 때까지 전방, 배체외영역(extra-embryonic site)인 생식 반월(germinal crescent)로 이동하여, 생식 융기에 이르른다. 이들은 생식 융기를 군집화시키는데, 이 생식 융기에서 이들은 실질적으로 난모세포 또는 정모세포로 분화된다(Nieuwkoop and Sutasurya, 1979. The Migration of the primordial germ cells. In: Primordial germ cell in Chordates. London: Cambridge University Press p113-127). 공여자 조류 배아로부터 PGC를 분리하는 방법은 문헌에 보고되었으며 당업자에 의해 손쉽게 수행될 수 있다(참고예. 1993년 9월 7일에 공개된 공개번호 05-227947의 JP924997; Chang et al. 1992. Cell Biol. Int. 19(2):143-149; Naito et al. 1994 Mol. Reprod. Dev. 39:153-161; Yasuda et al. 1992. J. Reprod. Fert. 96:521-528; Chang et al. 1992 Cell Biol. Int.Reporter 16(9): 853-857). 일 실시상태에서는, PGC는 Hamburger & Hamilton의 분류상 단계 12-14의 닭 배아의 등쪽 대동맥으로부터 수득한 배아 혈액으로부터 수득된다(Hamburger & Hamilton 1951 A series of normal stages in the development of chick embryo. J. Morphol. 88:49-92). 다른 양호한 실시상태에서는, 닭 배아를 기계적으로 절제하여 PGC를 생식 능선으로부터 수득하거나 또는 생식샘으로부터 수득하였다. 그러나, 상기에 언급한 바와 같이, PGC를 분리하는 다른 방법도 공지되어 있으며 선택적으로 사용될 수 있다.
이러한 조류 배아 줄기 세포는 39℃의 배양액 내에서 48 내지 72 시간의 느린 배가 시간을 가진다.
특정 이론에 구애되는 것은 아니나, 성장 인자, 영양 세포층, 첨가제 및 혈청의 단계적인 제거를 수반하는 조류 ES 세포의 소정의 세포 배양 조건에 의하면, ES 세포의 바람직한 특징(핵형의 안정화, 일정치 않은 증식, ES 마커의 발현)을 대부분 유지하는 것뿐만 아니라, 무혈청 배지에서 현탁 상태로 고농도 성장 등 산업 친화적인 성과를 나타내는 세포를 개조하고 선택할 수 있다. 텔로머라아제 는 가장 중요한 ES 마커 중 하나를 구성한다. 세포 계대에 따라 지속되고 유지되는 텔로머라아제 발현 때문에, EBx® 세포는 연속적이면서도(즉, 불멸) 또한 유전적으로 안정적이다(즉, 이배체).
더 구체적으로, 본 발명은 ES 세포로부터 유래된 연속적 이배체 조류 세포 세포주를 수득하는 방법을 제공하는데, 상기 조류 세포주는 복제 가능 내인성 레트로바이러스성 입자를 생산하지 않고, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) Eyal-Giladi의 분류((EYAL-GILADI의 분류: EYAL-GILADI 및 KOCHAV, 1976, <<From cleavage to primitive streack formation : a complementary normal table and a new look at the first stages of the development in the chick>>, "General Morphology" Dev. Biol. 49:321-337 참조)의 단계 Ⅵ를 포함하는 발생 단계에 있고 부화 전이며, 좋기로는 착란 단계에 있고, 게놈은 복제 가능 내인성 레트로바이러스성 입자를 생산할 수 있는 내인성 프로바이러스성 서열을 포함하지 않는 것인 조류 배아, 좋기로는 오리 또는 ev-0 닭의 조류 배아를 분리하는 단계;
b) 하기 물질이 포함된 기본 배지에서 단계 a)의 배아를 분리하여 수득된 조류 배아 줄기(ES) 세포를 현탁하는 단계;
- 인슐린 성장 인자 1(IGF-1)와 섬모 신경영양 인자(CNTF);
- 동물 혈청; 및
- 선택적으로, 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 줄기세포 인자(SCF), 섬유아세포 성장 인자(FGF)
c) 단계 b)에서 수득한 ES 세포의 현탁액을 영양 세포층에 접종한 뒤 상기 ES 세포를 최소 1 계대하는 동안 배양하는 단계;
d) 1 내지 15 계대 동안, 좋기로는 3 내지 15 계대의 몇몇 계대 배양의 범위에 걸친 배양 배지로부터 IL-6, IL-6R, SCF, FGF를 포함하는 군에서 선택된 성장 인자 모두를 제거하고, 최소 1 계대 동안 조류 ES 세포를 배양하는 단계; 좋기로는 배양 배지로부터 IL-6, IL-6R, SCF, FGF를 포함하는 군에서 선택된 성장 인자 모두의 제거는 1 계대 동안 동시에 수행하는 것이 좋다. 보통 IL-6, IL-6R, SCF, FGF의 제거는 10 내지 15 계대 동안 수행된다.
e) 배양 배지로부터의 IGF-1과 CNTF를 제거하는 단계와 추가로 최소 1 계대 동안 조류 ES 세포를 배양하는 단계. 좋기로는, 배양 배지로부터 IGF-1과 CNTF를 포함하는 군에서 선택된 성장 인자의 제거는 1 계대 동안 동시에 수행되는 것이 좋다. 보통, IGF-1과 CNTF의 제거는 계대 N˚15 내지 N˚25 정도에서 수행한다. 별법으로, IGF-1과 CNTF의 제거는 몇몇 계대 동안에 걸쳐 점진적으로 감소하면서 수행한다(최소 2 계대 그리고 대략 15 계대까지);
f) 수회의 계대 후 영양층 전체가 제거되도록 배양 배지 내의 영양 세포 농도를 점진적으로 감소하고, 추가로 상기 세포를 배양하는 단계;
g) 선택적으로, 적어도 1 계대 이후에 첨가제를 모두 회수하기 위하여, 배양 배지 내의 첨가제의 농도를 점진적으로 감소시키는 단계; 및
h) 선택적으로, 몇몇 계대 배양 후에 동물 혈청을 모두 회수하기 위하여 배양 배지 내의 동물 혈청의 농도를 점진적으로 감소시키는 단계; 및
i) 성장 인자, 영양층이 결손되고, 선택적으로 동물 혈청과 첨가제가 없는 기본 배지 내에서 증식 가능한 ES 세포로부터 유래되는, EBx®로 불리는 부착 조류 세포주를 수득하는 단계로, 상기 연속적 이배체 조류 세포주는 복제 가능 내인성 레트로 바이러스 입자를 생산하지 않는 것,
j) 선택적으로, 상기 부착 조류 EBx® 세포주를 현탁 배양 조건에 적응시키는 단계. 현탁액에 세포 배양을 적응시키는 단계는 EBx® 세포의 확립 방법 전체에 걸쳐 수행될 수 있다. 예를 들면, 무스코비 배아 줄기 세포에서 유래된 오리 EBx® 세포에서, 상기 세포는 영양 세포층의 제거 전에 현탁액 내에서의 성장에 적응된다. 페킨 오리에서 유래된 오리 EB® 세포(EB24, EB26, EB66)에서, 상기 세포는 동물 혈청 제거 전에 현탁액 내에서의 성장에 적응된다.
k) 선택적으로, 상기 조류 EBx®세포를 서브 클로닝(subcloning)하는 단계.
양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명은 복제 가능 내인성 레트로바이러스 입자를 생산하지 않는 조류 배아 줄기 세포(ES)에서 유래된 EBx®라 불리는 연속적 이배체 조류 세포주를 수득하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하위 단계를 포함한다:
a) 상기 조류의 대략 착란 시기의 발생 단계에 있는 조류 배아를 분리하는 단계로, 상기 조류의 게놈은 복제 가능 내인성 레트로 바이러스 입자를 생산하는 내인성 프로바이러스성 서열을 함유하지 않는 것,
b) 최소한 하기 물질이 첨가된 기본 배지에서 단계 a)의 배아를 분리하여 수득된 조류 배아 줄기(ES) 세포를 현탁하는 단계;
-인슐린 성장 인자 1(IGF-1)와 섬모 신경영양 인자(CNTF); 및
-우태 혈청 등의 포유류 혈청.
c) 단계 b)에서 수득한 ES 세포의 현탁액을 영양 세포층에 접종한 뒤 상기 ES 세포를 최소 1 계대 하는 동안 배양하는 단계;
e) 배양 배지로부터의 IGF-1과 CNTF를 제거하는 단계와 추가로 최소 1 계대 동안 조류 ES 세포를 배양하는 단계.
f) 몇몇 개대 후의 영양층 전체가 제거되도록 배양 배지 내의 영양 세포 농도를 점진적으로 감소하고, 추가로 상기 세포를 배양하는 단계;
g) 몇몇 계대 배양 후에 포유동물 혈청을 모두 회수하기 위하여 배양 배지로부터 상기 포유동물 혈청의 농도를 점진적으로 감소시키는 단계;
h) 성장 인자, 영양층 및 포유동물 혈청이 결손된 기본 배지 내에서 증식 가능한 ES 세포로부터 부착 조류 EBx® 세포주를 수득하는 단계로, 상기 연속적 이배체 조류 세포주는 복제 가능 내인성 레트로바이러스 입자를 생산하지 않는 것,
i) 선택적으로, 부착 조류 EBx® 세포를 추가로 현택 배양 조건에, 좋기로는 현탁액으로서 성장을 촉진시킴으로써 적응시키는 단계로, 더 좋기로는 초기 support(즉, Ultra Low attachment support) 보다 부착 특성이 낮은 다른 support 내에서 단계 h)에서 수득한 부착 조류 EBx® 세포주를 이동시켜서 적응시키는 단계.
부착 조류 EBx® 세포주를 현탁 배양 조건에 적응시키는 단계 j)는, 다른 양호한 실시 상태에 있어서, 배양 배지 내의 포유동물 혈청의 농도를 점진적으로 감소시키는 단계 g)를 수행하기 전에 수행하는 경우 효과적일 수 있다.
다른 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명에 따라 연속적 이배체 조류 세포주를 수득하기 위한 방법의 단게 b)에서의 기본 배양 배지에는, 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 줄기세포 인자(SCF) 및 섬모 신경영양 인자(FGF)을 포함하는 군에서 선택된 성장 인자가 추가적으로 첨가되고, 상기 방법은 하기의 단계 d)를 추가로 포함한다:
d) 선택적으로, 배양 배지에서 IL-6, IL-6R, SCF, FGF를 포함하는 군에서 선택되는 성장 인자 모두를 회수하고, 최소 1 계대 배양 후 ES 세포를 추가로 배양하는 단계.
더 양호한 실시 상태에 있어서, 단계 d)를 수행할 때, 배양 배지에서 IGF-1과 CNTF를 제거하는 단계 e)를, 배양 배지에서 IL-6, IL-6R, SCF, FGF를 포함하는 군에서 선택되는 성장 인자 모두를 회수하는 단계 d) 이후에 수행하는 것이 효과적이다.
본 발명에서, "기본 배양 배지"는 그 자체로써 최소한 세포가 생존하고, 더 좋기로는 세포가 성장할 수 있게 하는 기본적인 배지 조성을 가진 배지를 의미한다. 기본 배지의 예로는 BME(basal Eagle Medium), MEM(minimum Eagle Medium), 배지 199, DMEM(Dulbecco's modified Eagle Medium), GMEM(Glasgow modified Eagle medium), DMEM-HamF12, Ham-F12 및 Ham-F10, Iscove's Modified Dulbecco's 배지, MacCoy's 5A 배지, RPMI 1640, GTM3이다. 기본 배지는 무기염(예: CaCl2, KCl, NaCl, NaHCO3, NaH2PO4, MgSO4,...), 아미노산, 비타민(티아민, 리보플라빈, 폴릭산, D-Ca 판토테네이트, ...) 및 글루코스, 베타-메캅토-에탄올, 소듐 피루베이트와 같은 다른 성분을 포함한다. 좋기로는 기본 배지는 합성 배지이다. 표 1은 DMEM-HamF12 조성을 제공한다.
[표 1]
DMEM - HAM F12 조성(㎎/l)
무기염
무수 염화칼슘 116.60
질산 철(Ⅲ)·9H2O 0.05
황산 철(Ⅱ)·7H2O 0.417
염화칼륨 311.80
황산 구리(Ⅱ)·5H2O 0.0013
염화 마그네슘·6H2O 61.20
무수 황산 마그네슘 48.84
염화 나트륨 6996.00
인산 이수소 나트륨·H2O 62.50
Di-무수 인산 이수소 나트륨 71.02
황산 아연·7H2O 0.432
탄산수소 나트륨 1200.00
아미노산
L-알라닌 4.45
*L-아르기닌·HCl 147.50
L-아스파라긴·H2O 7.50
L-아스파르산 6.65
L-시스틴·HCl·H2O 31.29
L-시스테인·2HCl 17.56
L-글루탐산 7.35
E15-813 내의 L-글루타민 365.00
글리신 18.75
L-히스티딘·HCl·H2O 31.48
L-이소루신 54.47
L-류신 59.05
L-리신·HCl 91.25
L-메티오닌 17.24
L-페닐알라닌 35.48
L-프롤린 17.25
L-세린 26.25
L-트레오닌 53.45
L-트립토판 9.02
L-티로신 38.70
L-발린 52.85
비타민
D(+)-비오틴 0.0035
D-판토텐산칼슘 2.24
염화콜린 8.98
폴산 2.65
이노시톨(myo-inositol) 12.60
니코틴산아미드 2.02
피리독살(pyridoxal)·HCl 2.00
피리독신(pyridoxine)·HCl 0.031
리보플라빈 0.219
티아민·HCl 2.17
티아미딘 0.365
비타민 B12 0.68
다른 성분
D-무수 글루코오스 3151.00
히포크산틴 2.10
DL-68-리포산 0.105
리놀렌산 0.042
페놀레드 8.10
퓨트레신·2HCl 0.081
소듐 피루베이트 55.00
또한, 본 발명의 기본 배지에는 하위 군에서 선택된 첨가제가 보충될 수 있다.
- 0.1 내지 5 mML-글루타민, 좋기로는 2 내지 3 mML-글루타민;
-0.05 내지 2 mM 소듐 피루베이트, 좋기로는 0.1 mM 내지 1 mM 소듐 피루베이트;
-0.1 내지 2.5% 비필수 아미노산, 좋기로는 약 1% 비필수 아미노산;
-0.1 내지 2.5% 비타민, 좋기로는 약 1% 비타민;
-0.05 내지 5 mM 베타-머캅토-에탄올, 좋기로는 약 0.16 mM 베타-머캅토-에탄올;
-비-동물 기원의 단백질 가수분해물.
본 발명의 오리 EBx® 세포의 확립을 위하여, 좋기로는 기본 배지에 비-동물 기원의 단백질 가수분해물이 첨가된다. 비-동물 기원의 단백질 가수분해물은 박테리아 트립톤, 효모 트립톤, 콩 가수분해물과 같은 식물 가수분해물, 또는 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 양호한 실시 상태에 있어서, 비-동물 기원의 단백질 가수분해물은 효모 가수분해물이다. 용어 "가수분해물(hydrolysate)"은 콩 펩톤 또는 효모 추출물의 효소적 분해물을 포함한다. 가수분해물은 대다수의 콩 펩톤 또는 효모 추출 조제품으로부터 얻어지며, 이 각각은 추가적으로 효소적 분해되거나(예를 들어, 파파인에 의해), 및/또는 자가용해(autolysis), 열분해(thermolysis) 및/또는 원형질분해(plasmolysis)에 의해 형성된다. 또한, 가수분해물은 Yeastolate, Hy-Soy, Hy-Yeast 412 및 Hi-Yeast 444 등, 그리고 JRH BioSciences(Lenaxa, KA), Quest International(Norwich, N.Y), OrganoTechnie S.A(France) 또는 Deutsche Hefewerke GmbH(Germany) 등의 수득처로부터 상업적으로 얻어질 수 있다. 또한, 효모 추출물의 수득처는 WO 98/15614에 기술되어 있다. 효모 추출물과 콩 가수분해물의 수득처는 WO 00/03000에 기술되어 있다. 본 발명의 배지에 사용된 가수분해물은 조추출물 분획으로부터 정제하는 것이 바람직한데, 그 이유는 효율적인 배양을 방해할 수 있는 불순물이 이러한 정제 과정 동안 바람직하게 제거되고, 이로 인해 가수분해물의 농도를 향상시키기 때문이다. 정제는 한외여과 또는 세파덱스 크로마토그래피(예를 들어, 세파덱스 G25 또는 세파덱스 G10 또는 동등한 물질을 이용해), 이온-교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피, 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피 또는 "역상(reversed-phase)" 크로마토그래피에 의해 수행된다. 좋기로는, 정제는 10 kDa 컷-오프 필터를 이용한 한외여과에 의해 수행된다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법을 사용하면, 기재된 분자량의 콩 또는 효모 가수분해물을 포함하는 분획을 선별할 수 있다. 좋기로는, 콩 및 효모 가수분해물의 평균 분자량은 약 220 내지 375 달톤이다. 좋기로는,효모 가수분해물이 세포 배양 배지에 존재한다. SAFC-BIOSCIENCES(Ref 58902)로부터 얻어진 효모 가수분해물 50×(약 200 g/ℓ)는 배양 배지에 최종 농도 약 0.1× 내지 2×, 좋기로는, 약 0.5× 내지 1×로 포함된다. 또한, 콩 가수분해물이 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. SAFC-BIOSCIENCES(Ref 58903C)로부터 얻어진 콩 가수분해물 50×는 배양 배지에 최종 농도 약 0.1× 내지 2×, 좋기로는 약 1×로 첨가된다. 별법으로, 콩 가수분해물 및 효모 가수분해물의 혼합물은 US2004/0077086에 기술된 바와 같은 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다.
본 발명의 양호한 기본 배지는, 2 mM L-글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트, 1% 비-필수 아미노산, 비타민 1%, 0.16 mM 베타-머캅토-에탄올, 및 선택적으로 1×효모 가수분해물이 첨가된 DMEM-HamF12이다.
"완전 배양 배지"는 1종 이상의 성장 인자 및 동물 혈청이 첨가된, 보완되거나 보완되지 않은 기본 배지, 좋기로는 기본 합성 배지를 의미한다. 완전 배양 배지의 예는, WO 03/076601, WO 05/007840, EP 787,180, US 6,114,168, US 5,340,740, US 6,656,479, US 5,830,510 및 문헌 Pain et al.(1996, Development 122:2339-2348)에 기술되어 있다. 별법으로, 완전 배양 배지는 조건화된 배지 좋기로는 BRL 조건화된 배지일 수 있다. 예를 들면, 문헌 Smith and Hooper(1987, Dev. Bio. 121:1-9)에 개시된 바와 같이, 기술분야에 알려진 기술에 따라 제조된 BRL 조건화된 배지를 제조하였다. BRL 세포의 ATCC accession number CRL-14442로부터 입수 가능하다. 조건화된 배지는 하기에 기술한 바와 같은 외부 성장 인자와 동물 혈청이 첨가될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "성장 인자"는 배양하는 동안 미분화된 조류 ES 세포의 생존 및 성장에 필수적인 기본 배양 배지에 첨가되는 성장 인자를 의미한다. 성장 인자를 두 가지 종으로 개략적으로 구분하는 것이 가능하다: 사이토카인 및 영양 인자. 사이토카인은 gp130 단백질과 결합되어 있는 수용체를 통해 작용을 하는 사이토카인이다. 따라서, 백혈병 억제 인자(LIF), 인터루킨 11, 인터루킨 6, 인터루킨 6 수용체, 섬모 신경영양 인자(CNTF), 온코스타틴 및 카디오트로핀은 특정 사슬의 수용체 레벨에서 모이는 유사한 작용을 하며, 모노머 또는 헤테로-다이머 형태로 gp130 단백질과 함께 모인다. 영양 인자는 주로 줄기세포 인자(SCF), 인슐린 성장 인자 1(IGF-1) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)이며, 좋기로는 염기성 FGF(bFGF) 또는 인간 FGF(hFGF)이다.
본 발명에 따른 완전 배양 배지는 기본 배지, 좋기로는 기본 합성 배지 및 gp130 단백질과 결합하는 수용체를 통해 작용을 하는 최소한 하나의 사이토카인 및/또는 최소한 하나의 영양 인자를 포함한다. 좋기로는, 본 발명에 따른 완전 배양 배지는 기본 배지 및 백혈병 억제 인자(LIF), 온코스타틴, 카디오트로핀, 인슐린 성장 인자 1(IGF-1), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 줄기세포 인자(SCF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 인터루킨 11(IL-11)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소한 하나의 성장 인자를 포함하는 것이 좋다. 본 발명의 첫 번째 양호한 실시 상태에 따르면, 완전 배양 배지는 동물 혈청과 함께 IGF-1과 CNTF 중 최소한 하나가 첨가된 기본 배지이다. 본 발명의 두 번째 양호한 실시 상태에 따르면, 완전 배양 배지는 동물 혈청과 함께 IGF-1, CNTF, IL-6 및 IL-6R 중 최소한 하나가 첨가된 기본 배지이다. 본 발명의 세 번째 양호한 실시 상태에 따르면, 완전 배양 배지는 동물 혈청과 함께 IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF 및 FGF 중 최소한 하나가 첨가된 기본 배지이다. 다른 실시 상태에 따르면, 완전 배양 배지는 성장 인자(즉 예를 들면 BRL 또는 STO 세포에 의해 발현되는 것) 및 선택적으로는 백혈병 억제 인자(LIF), 인슐린 성장 인자 1(IGF-1), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 줄기세포 인자(SCF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 인터루킨 11(IL-11)을 포함하는 군으로부터 선택되는 최소한 하나의 외인성 성장 인자가 첨가된 조건 배양 배지이다. 기본 배지 또는 조건 배양 배지에 들어 있는 성장 인자 IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF, IL-11의 농도는 약 0.01 내지 10 ng/㎖, 좋기로는 0.1 내지 5 ng/㎖, 더욱 좋기로는 약 1 ng/ml이다.
본 발명의 배양 배지는 또한, 미생물에 의한 오염을 막기 위하여 예를 들면, 겐타마이신, 페니실린 및 스트렙토마이신 등과 같은 항생제를 더 포함할 수 있다. 항생제는 ES 세포 배양의 초기 계대 배양에서 배양 배지에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 최종 농도가 10 ng/㎖인 겐타마이신, 최종 농도가 100 U/㎖인 페니실린과 최종 농도가 100 ㎍/㎖인 스트렙토마이신이 배양 배지에 첨가될 수 있다. 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 연속적 이배체 조류 세포주의 확립 방법의 후기 단계 동안에 배양 배지에 항생제가 첨가되지 않는다.
본 발명의 조류 배아 줄기 세포주의 확립 방법 중 세포는 영양 세포층 상에서 배양된다. 더 좋기로는, 영양 세포는 조류 ES 세포 배양을 목적으로 배양되는 동물 세포 또는 세포주가 될 수 있다. 별법으로, 영양 세포는 세포외 매트릭스와 결합한 성장 인자로 구성된다. 영양 매트릭스는 영양 세포 또는 세포외 매트릭스로도 불린다. 본원에 사용된 영양 매트릭스는 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기에서 언급한 바와 같이, 영양 매트릭스는 좋기로는 필수조건이다. 용어 "필수조건"은 영양 매트릭스와 접촉한 수정된 조류의 알의 배아원기 디스크로부터 유도된 세포를 저장하기 전 시간 동안 예를 들면, 영양 매트릭스에 의해 성장 인자 또는 다른 인자를 생산하기 시작하고 확립하기에 충분한 시간 동안 배지의 존재하에서 영양 매트릭스가 배양되는 것을 의미하며; 일반적으로 영양 매트릭스가 영양 매트릭스와 접촉한 수정된 조류알의 배아원기 디스크로부터 유도된 세포를 저장하기전 하루 또는 2일 동안 그 자체로도 영양 매트릭스를 배양할 수 있는 것이 필수조건이다. 영양세포는 좋기로는 생쥐 섬유아세포를 포함한다. STO 섬유아세포가 바람직하지만 일차 섬유아세포도 적합하다. 또한, 본 발명이 생쥐 세포 영양 매트릭스의 이용에 대해 기술하였지만, 다른 생쥐 종(예, 쥐); 다른 포유동물 종(예; 유제동물, 소, 돼지 종); 또는 조류 종(예, 순계루 새, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 꿩)의 세포를 포함하는 영양 매트릭스도 사용될 수 있다. 다른 실시 상태에 있어서, 본 발명의 영양 세포는 STO 세포에 들어있는 조류 SCF와 같은 성장 인자의 구성적인 발현을 가능하게 하는 발현 벡터(들)에 의해 형질전환될 수 있다. 따라서, 이 "영양" 세포는 세포의 혈장 막에 부착 및/또는 용해된 형태의 인자를 생산한다. 따라서, 본 발명의 배양 방법은 선택적으로 단일층의 영양 세포층을 확립하는 단계를 포함할 수 있다. 영양 세포는 표준 기술을 이용하여 유사분열을 불활성화되게 할 수 있다. 예를 들어, 영양 세포는 X선 또는 감마선 조사(예, 4000 라드의 감마선 조사)에 노출되거나 마이토마이신 C(예, 2-3시간 동안 10 ㎍/ml)로 처리될 수 있다. 세포의 유사분열을 불활성화시키는 방법은 미국 유전자 은행(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209의 세포(예, STO 영양 세포는 ATCC 참조번호 1503으로 이용가능하다)에 관한 일반적인 정보에 자세히 나와있다. 단일층은 선택적으로는 약 80%의 밀집도로 배양되며, 바람직하게는 약 90%의 밀집도로, 더욱 바람직하게는 약 100%의 밀집도로 배양될 수 있다. 단일층으로서 영양 세포의 형상은 배양을 하기에 바람직한 형상이지만, 모든 가능한 형상이 본 발명의 범위에 속한다. 따라서, 예를 들어, 영양 세포의 층, 단일층, 클러스터, 응괴 또는 다른 응집체 또는 그룹이 본 발명의 범위에 속하며, 특히 용어 "매트릭스"라는 의미에 속할 수 있다.
본 발명의 배양 배지는 동물 혈청이 포함된다. 사용되는 동물 혈청은 바람직하게는 동물 태아 혈청이다. 우태아 혈청이 바람직하다. 또한, 본 발명은 우태아 혈청을 사용하는 것으로 기재되어 있지만 다른 동물 종(예, 닭, 말, 돼지, 유제동물 등)으로부터의 혈청을 포함하는 동물 혈청도 사용될 수 있다. 배양 배지에 들어있는 동물 혈처의 최종 농도는 약 1 내지 25%, 좋기로는 5% 내지 20%, 더 좋기로는 8% 내지 12% 범위를 포함한다. 양호한 실시 상태에 있어서, 배양 배지에 들어있는 동물 혈청의 최종 농도는 약 10%이다. 양호한 실시 상태에 따르면, 배양 배지는 약 10%의 우태아 혈청을 포함한다.
*첫 번째 양호한 실시 상태에 따르면, 본 발명의 조류는 Anseriformes 종, 좋기로는 오리, 더 좋기로는 페킨 오리, 그리고 더 좋기로는 페킨 오리 M14 또는 GL30 종에서 선택하는 것이 좋다. 두 번째 양호한 실시 상태에 따르면, 본 발명의 조류는 무스코비 오리인 것이 좋다. 따라서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 배아 줄기 세포로부터 유래된 연속 이배체 오리 세포주를 얻는 제1공정을 제공하는데, 으로, 상기 오리 세포주는 복제 가능 내인성 레트로 바이러스 입자를 생산하지 않는 것인 제1공정을 제공한다:
a) 착란시(즉, 알을 낳을 때) 또는 착란 조금 전 또는 착란 조금 후, 오리 배아를 분리하는 단계. 선택적으로, 상기 알은 성숙될 때까지(즉, 무스코비 오리) 보통 밤새 인큐베이션할 수 있다.
b) 인슐린 성장 인자 1(IGF-1), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 6 수용체(IL-6R), 줄기세포 인자(SCF), 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및 동물 혈청이 첨가된 기본 배양 배지에서 단계 a)의 배아를 분리하여 수득한 오리 배아 줄기(ES) 세포를 현탁하는 단계;
c) 단계 b)에서 수득한 ES 세포의 현탁액을 영양 세포층에 접종하고, 최소 1 계대 배양 동안 오리 ES 세포를 추가로 배양하는 단계;
d) 약 1 내지 15 계대 배양 동안, 좋기로는 동시에 1 계대 배양에서 동시에, 배양 배지에서 IFG-1, CHTF, IG-6, IL-6R, SCF, FGF를 포함하는 군에서 선택된 성장인자를 모두 회수하고, 추가로 최소 1 계대 배양 동안 오리 ES 세포를 배양하는 단계;
f) 몇몇 계대 배양 후, 좋기로는 약 5 내지 25 계대 배양 후, 영양층 전체를 회수하기 위하여 하나의 계대에서 다른 계대로, 배양 배지 내의 영양 세포 농도를 점진적으로 감소시키고, 추가로 상기 세포를 배양하는 단계;
g) 선택적으로, 몇몇 계대 배양 후 동물 혈청을 모두 회수하기 위하여 배양 배지 내의 동물 혈청의 농도를 점진적으로 감소시키는 단계; 및
h) 성장 인자, 영양층이 결손되고, 선택적으로 동물 혈청이 결손된 기본 배지 내에서 성장할 수 있는 오리 EBx®로 불리는 ES 세포로부터 유래된 고착 오리 세포주를 수득하는 단계로, 상기 연속 이배체 오리 세포주는 복제 가능 내인성 레트로 바이러스 입자를 생산하지 않는 것.
i) 선택적으로, 현탁 배양 조건에 고착 오리 세포주를 추가로 적응시키는 단계.
기본 배지의 첨가제는 공정 동안 회수되는데, 좋기로는 단계 f)와 g) 사이 또는 단계 g)와 h)사이 동안 회수된다.
상기 단계 b)의 동물 혈청 농도는 좋기로는 5 내지 10%이다. IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF의 농도는 1 ng/㎖인 것이 좋다.
본 발명은 또한, 배아 줄기 세포(ES)에서 유래된 연속 이배체 오리 세포주를 수득하는 제2 공정을 제공하는데, 상기 오리 세포주는 복제 가능 내인성 레트로바이러스 입자를 생산하지 않으며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다.
a) 착란시(즉, 알을 낳을 때) 또는 착란 조금 전 또는 착란 조금 후, 오리 배아를 분리하는 단계. 선택적으로, 상기 알은 성숙될 때까지(즉, 무스코비 오리) 보통 밤새 인큐베이션할 수 있다.
b) IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF 및 동물 혈청이 첨가된 기본 배양 배지에서 단계 a)의 배아를 분리하여 수득한 오리 배아 줄기(ES) 세포를 현탁하는 단계;
c) 단계 b)에서 수득한 ES 세포의 현탁액을 영양 세포층에 접종하고, 최소 1 계대 배양 동안 오리 ES 세포를 추가로 배양하는 단계;
d) 약 1 내지 15 계대 배양 후, 좋기로는 동시에 1 계대 배양에서 동시에, 배양 배지에서 IL-6, IL-6R, SCF, FGF를 포함하는 군에서 선택된 성장인자를 모두 회수하고, 추가로 최소 1 계대 배양 동안 오리 ES 세포를 배양하는 단계;
e) 약 1 내지 15 계대 배양 동안, 좋기로는 1 계대 배양에서 동시에, 배양 배지에서 성장 인자 IGF-1, CNTF를 회수하고, 최소 1 계대 배양 동안 오리 ES 세포를 추가로 배양하는 단계;
f) 몇몇 계대 배양 후, 좋기로는 약 5 내지 25 계대 배양 후 영양층 모두를 회수하기 위하여 배양 배지 내의 영양 세포 농도를 점진적으로 감소시키고, 추가로 상기 세포를 배양하는 단계;
g) 선택적으로, 몇몇 계대 배양 후 동물 혈청을 모두 회수하기 위하여 배양 배지 내의 동물 혈청의 농도를 점진적으로 감소시키는 단계; 및
h) 성장 인자, 영양층이 결손되고, 선택적으로 동물 혈청이 결손된 기본 배지 내에서 성장할 수 있는 오리 EBx®로 불리는 ES 세포로부터 유래된 고착 오리 세포주를 수득하는 단계로, 상기 연속 이배체 오리 세포주는 복제 가능 내인성 레트로 바이러스 입자를 생산하지 않는 것.
i) 선택적으로, 현탁 배양 조건에 고착 오리 세포주를 추가로 적응시키는 단계.
기본 배지의 첨가제는 공정 동안 회수되는데, 좋기로는 단계 f)와 g) 사이 또는 단계 g)와 h)사이 동안 회수된다.
상기 단계 b)의 동물 혈청 농도는 좋기로는 5 내지 10%이다. IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF의 농도는 1 ng/㎖인 것이 좋다.
본 발명은 또한, 배아 줄기 세포(ES)에서 유래된 연속 이배체 오리 세포주를 수득하는 제3 공정을 제공하는데, 상기 오리 세포주는 복제 가능 내인성 레트로바이러스 입자를 생산하지 않으며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다.
a) 착란시(즉, 알을 낳을 때) 또는 착란 조금 전 또는 착란 조금 후, 오리 배아를 분리하는 단계. 선택적으로, 상기 알은 성숙될 때까지(즉, 무스코비 오리) 보통 밤새 인큐베이션할 수 있다.
b) 인슐린 성장 인자 1(IGF-1), 섬모 신경영양 인자(CNTF) 및 동물 혈청이 첨가된 기본 배양 배지에서 단계 a)의 배아를 분리하여 수득한 오리 배아 줄기(ES) 세포를 현탁하는 단계;
c) 단계 b)에서 수득한 ES 세포의 현탁액을 영양 세포층에 접종하고, 최소 1 계대 배양 동안 오리 ES 세포를 추가로 배양하는 단계;
d) 약 1 내지 15 계대 배양 동안, 좋기로는 1 계대 배양에서 동시에, 배양 배지에서 성장 인자 IGF-1과 CNTF를 회수하고, 추가로 최소 1 계대 배양 동안 오리 ES 세포를 배양하는 단계;
f) 몇몇 계대 배양 후, 좋기로는 약 5 내지 25 계대 배양 후 영양층 모두를 회수하기 위하여 배양 배지 내의 영양 세포 농도를 점진적으로 감소시키고, 추가로 상기 세포를 배양하는 단계; 첨가제의 제거.
g) 선택적으로, 몇몇 계대 배양 후 동물 혈청을 모두 회수하기 위하여 배양 배지 내의 동물 혈청의 농도를 점진적으로 감소시키는 단계; 및
h) 성장 인자, 영양층이 결손되고, 선택적으로 동물 혈청이 결손된 기본 배지 내에서 성장할 수 있는 오리 EBx®로 불리는 ES 세포로부터 유래된 고착 오리 세포주를 수득하는 단계로, 상기 연속 이배체 오리 세포주는 복제 가능 내인성 레트로 바이러스 입자를 생산하지 않는 것.
i) 선택적으로, 현탁 배양 조건에 고착 오리 EBx® 세포주를 추가로 적응시키는 단계.
기본 배지의 첨가제는 공정 동안 회수되는데, 좋기로는 단계 f)와 g) 사이 또는 단계 g)와 h)사이 동안 회수된다.
상기 단계 b)의 동물 혈청 농도는 좋기로는 5 내지 10%이다. IGF-1과 CNTF의 농도는 좋기로는 약 1 ng/㎖이다.
한번 부착 또는 현탁액 오리 세포주를 수득하면, 본 발명의 방법은 또한, 효모 가수분해물 등의 비-동물 기원의 단백질 가수분해물이 없는 세포 배양 배지 내에서 성장하는 오리 EBx® 세포를 적응시키는 추가 단계를 포함할 수 있다.
좋기로는, 본 발명의 오리 EBx® 세포주는 Q-PERT 분석에 의한 역전사 효소(reverse transcriptase) 활성을 나타내지 않는다. 또한, 복제 가능 내인성 레트로바이러스 입자가 quail QT6 세포 또는 닭 DF1 세포 등과 같은 ALV 복제 가능 세포와 본 발명의 오리 EBx® 세포의 공동 배양 실험에 의해서, 오리 EBx® 세포가 복제 가능 내인성 레트로바이러스 입자를 생산하지 않는다는 것이 입증되었다. 게다가, 투과전자 현미경(TEM) 분석 또한, 오리 EBx® 세포 내의 복제 가능 내인성 레트로바이러스 입자의 결손을 증명한다. 본 발명의 오리 EBx® 세포주는 좋기로는, 이하에서 기재한 바와 같이, 오리 EB24, 오리 EB26 및 오리 EB66 중에서 선택된다.
다른 양호한 실시 상태에서, 본 발명의 조류는 갈리포머(Galliformer)목에서 선택되고, 더 좋기로는 닭, 좋기로는 ev-0 집 닭(Gallus Gallus subspeceis domesticus)이다. 따라서, 본 발명은 배아 줄기 세포(ES) 에서 유래된 연속 이배체 ev-0 집 닭 세포주를 수득하는 방법을 제공하되, 상기 ev-0 집 닭 세포주는 복제 가능 내인성 ALV-E 레트로바이러스 입자를 생성하지 않으며, 상기 방법은 하위 단계를 포함한다.
a) 착란시(즉, 알을 놓을 때) 또는 착란 조금 전 또는 후의 ev-0 집 닭 배아(들)를 추출하는 단계;
b) IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF 및 동물 혈청이 첨가된 기본 배양 배지에서 단계 a)의 배아를 분리하여 ev-0 집 닭 배아 줄기(ES) 세포를 현탁하는 단계;
c) 단계 b)에서 수득한 ES 세포의 현탁액을 영양 세포층에 접종하고, 최소 1 계대 배양 동안 ev-0 집 닭 ES 세포를 추가로 배양하는 단계;
d) 약 1 내지 15 계대 배양 동안, 좋기로는 1 계대 배양에서 동시에, 배양 배지에서 IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF를 포함하는 군에서 선택된 성장 인자를 모두 회수하고, 최소 1 계대 배양 동안 닭 ES 세포를 추가로 배양하는 단계;
f) 몇몇 계대 배양 후, 좋기로는 약 5 내지 25 계대 배양 후, 영양층 모두를 회수하기 위하여 배양 배지 내의 영양 세포 농도를 점진적으로 감소시키고, 추가로 상기 세포를 배양하는 단계;
g) 선택적으로, 몇몇 계대 배양 후, 동물 혈청을 모두 회수하기 위하여 배양 배지 내의 동물 혈청의 농도를 점진적으로 감소시키는 단계; 및
h) 성장 인자, 영양층이 결손되고, 선택적으로 동물 혈청이 결손된 기본 배지 내에서 성장할 수 있는 EBx ev-0이라 불리는 ES 세포로부터 유래된 고착 ev-0 집 닭 세포주를 수득하는 단계로, 상기 연속 이배체 조류 세포주는 복제 가능 내인성 ALV-E 레트로 바이러스 입자를 생산하지 않는 것.
i) 선택적으로, 현탁 배양 조건에 고착 조류 세포주 EBx ev-0을 추가로 적응시키는 단계.
기본 배지의 첨가제는 공정 동안 회수되는데, 좋기로는 단계 f)와 g) 사이 또는 단계 g)와 h)사이 동안 회수된다.
상기 단계 b)의 동물 혈청 농도는 좋기로는 5 내지 10%이다. IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF의 농도는 약 1 ng/㎖인 것이 좋다.
또한, 본 발명은 배아 줄기 세포(ES)에서 유래된 연속 이배체 ev-0 집 닭 세포주를 수득하는 제2 공정을 제공하는데, 상기 ev-0 집 닭 세포주는 복제 가능 내인성 ALV-E 레트로바이러스 입자를 생성하지 않으며, 상기 방법은 하위 단계를 포함한다.
a) 착란시(즉, 알을 놓을 때) 또는 착란 조금 전 또는 후의 ev-0 집 닭 배아(들)를 추출하는 단계;
b) IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF 및 동물 혈청이 첨가된 기본 배양 배지에서 단계 a)의 배아를 분리하여 ev-0 집 닭 배아 줄기(ES) 세포를 현탁하는 단계;
c) 단계 b)에서 수득한 ES 세포의 현탁액을 영양 세포층에 접종하고, 최소 1 계대 배양 동안 ev-0 집 닭 ES 세포를 추가로 배양하는 단계;
d) 약 1 내지 15 계대 배양 동안, 좋기로는 동시에 1 계대 배양에서 동시에, 배양 배지에서 IL-6, IL-6R, SCF, FGF를 포함하는 군에서 선택된 성장인자를 모두 회수하고, 추가로 최소 1 계대 배양 동안 닭 ES 세포를 배양하는 단계;
e) 약 1 내지 15 계대 배양 동안, 좋기로는 1 계대 배양에서 동시에, 배양 배지에서 성장 인자 IGF-1와 CNTF를 회수하고, 최소 1 계대 배양 동안 ev-0 집 닭 ES 세포를 추가로 배양하는 단계;
f) 몇몇 계대 배양 후, 좋기로는 약 5 내지 45 계대 배양 후, 영양층 모두를 회수하기 위하여 배양 배지 내의 영양 세포 농도를 점진적으로 감소시키고, 추가로 상기 세포를 배양하는 단계;
g) 선택적으로, 몇몇 계대 배양 후, 동물 혈청을 모두 회수하기 위하여 배양 배지 내의 동물 혈청의 농도를 점진적으로 감소시키는 단계; 및
h) 성장 인자, 영양층이 결손되고, 선택적으로 동물 혈청이 결손된 기본 배지 내에서 성장할 수 있는 닭 EBx®로 불리는 ES 세포로부터 유래된 고착 ev-0 집 닭 세포주를 수득하는 단계로, 상기 연속 이배체 ev-0 집 닭 세포주는 복제 가능 내인성 레트로 바이러스 입자를 생산하지 않는 것.
i) 선택적으로, 현탁 배양 조건에 고착 ev-0 집 닭 세포주를 추가로 적응시키는 단계.
기본 배지의 첨가제는 공정 동안 회수되는데, 좋기로는 단계 f)와 g) 사이 또는 단계 g)와 h)사이 동안 회수된다.
상기 단계 b)의 동물 혈청 농도는 좋기로는 5 내지 10%이다. IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF의 농도는 약 1 ng/㎖인 것이 좋다.
또한, 본 발명은 배아 줄기 세포(ES)에서 유래된 연속 이배체 ev-0 집 닭 세포주를 수득하는 제3 공정을 제공하는데, 상기 ev-0 집 닭 세포주는 복제 가능 내인성 ALV-E 레트로바이러스 입자를 생성하지 않으며, 상기 방법은 하위 단계를 포함한다.
a) 착란시(즉, 알을 놓을 때) 또는 착란 조금 전 또는 후의 ev-0 집 닭 배아(들)를 추출하는 단계;
b) IGF-1, CNTF 및 동물 혈청이 첨가된 기본 배양 배지에서 단계 a)의 배아를 분리하여 ev-0 집 닭 배아 줄기(ES) 세포를 현탁하는 단계;
c) 단계 b)에서 수득한 ES 세포의 현탁액을 영양 세포층에 접종하고, 최소 1 계대 배양 동안 ev-0 집 닭 ES 세포를 추가로 배양하는 단계;
d) 약 1 내지 15 계대 배양 동안, 좋기로는 동시에 1 계대 배양에서 동시에, 배양 배지에서 성장 인자 IGF-1과 CNTF를 회수하고, 추가로 최소 1 계대 배양 동안 ev-0 집 닭 ES 세포를 배양하는 단계;
f) 몇몇 계대 배양 후, 좋기로는 약 5 내지 45 계대 배양 후, 영양층 모두를 회수하기 위하여 배양 배지 내의 영양 세포 농도를 점진적으로 감소시키고, 추가로 상기 세포를 배양하는 단계;
g) 선택적으로, 몇몇 계대 배양 후, 동물 혈청을 모두 회수하기 위하여 배양 배지 내의 동물 혈청의 농도를 점진적으로 감소시키는 단계; 및
h) 성장 인자, 영양층이 결손되고, 선택적으로 동물 혈청이 결손된 기본 배지 내에서 성장할 수 있는, 닭 EBx® ev-0라고 불리는 ES 세포로부터 유래된 고착 ev-0 집 닭 세포주를 수득하는 단계로, 상기 연속 이배체 집 닭 세포주는 복제 가능 내인성 레트로 바이러스 입자를 생산하지 않는 것.
i) 선택적으로, 현탁 배양 조건에 고착 ev-0 집 닭 세포주를 추가로 적응시키는 단계.
기본 배지의 첨가제는 공정 동안 회수되는데, 좋기로는 단계 f)와 g) 사이 또는 단계 g)와 h)사이 동안 회수된다.
상기 단계 b)의 동물 혈청 농도는 좋기로는 5 내지 10%이다. IGF-1 및 CNTF의 농도는 약 1 ng/㎖ml인 것이 좋다.
다른 양호한 실시 상태에 있어서, 본 발명의 조류는 특정 무병원체(SPF) 무리로부터 수득한 집 닭(Gallus Gallus subspecies domesticus)이다. 더 좋기로는, 상기 닭 계통은 화이트 레그혼이다. SPF 닭 알은 세망내피증 바이러스(reticuloendotheliosis virus; REV)와 조류 외인성 백혈병 바이러스(ALV-A, AVV-B, ALV-C, ALV-D, AVL-J)를 포함하는 닭 미생물 병원균과 바이러스로 알려진 것이 결손된 것으로 선별된다. 본 발명의 SPF 알은 LOHMANN(Cuxhaven, Germany)의 VALO 달걀 또는 CHARLES RIVER(Spafas)의 L22 달걀일 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, ev-0 닭알과 같은 SPF 닭의 알에서 수득한 배아 줄기 세포(ES)에서 유래된 연속 이배체 닭 세포주를 수득하는 방법을 제공한다. 좋기로는, SPF 달걀에서 수득한 닭 EBx® 세포주는 EBv13이다.
본 발명의 닭 EBx® 세포주는 Q-PERT 분석에 의한 역전사 효소(reverse transcriptase) 활성을 나타낼 수 있지만, 복제 가능 내인성 레트로바이러스 입자를 생산하지는 않는다. 본 발명의 닭 EBx® ev-0 세포와 quail QT6 세포 또는 닭 DF1 세포 등과 같은 ALV 복제 가능 세포를 공동 배양하는 실험을 통하여, 복제 가능 내인성 레트로바이러스 입자의 결손이 증명되었다. 또한, 투과전자 현미경(TEM)에 의하여, 닭 EBx® ev-0 세포 내의 내인성 레트로바이러스 입자의 결손이 증명될 수 있다.
조류의 체온은 보통 39℃이다. 따라서, 본 발명의 방법은 본 발명의 조류 세포주가 37℃에서 성장하도록, 37℃까지 세포 배양 온도를 감소시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 좋기로는, 온도 적응은 영양 고갈 후, 그리고 혈청 고갈 전 수행된다. 별법으로, 상기 온도 적응은 혈청 고갈 단계 후, 또는 세포주의 현탁 배양 적응 후에 수행할 수 있다.
본 발명의 확립된 EBx® 세포주는 외인성 성장 인자와 동물 혈청이 없고, 영양 세포가 없는 배양 배지 내에서 부착 세포 또는 현탁 세포(suspension cells)로서 성장된다는 특징을 가진다. 하기의 여러 기술들을 단독으로 또는 조합하여 이용함으로써, 세포를 현탁 배양시킬 수 있다:
- 부착 세포를 고농도로 접종하되, 세포가 현탁 상태가 되도록 하는 세포 포화도를 약간 상회하도록 접종하는 것;
- 부착 세포를 저농도의 동물 혈청이 포함된 세포 배양 배지 내에 접종하는 것;
- Corning(tissue culture dishes & plates Ref. 3262, 3473, 3471, 3473l Flasks Ref. 3814) 또는 Sarstedt(Flask ref 831810502...)와 같은 회사에서 개발된 초저부착성 플레이트 또는 박테리아 디쉬와 플레이트 등과 같이, 세포 부착 또는 약한 세포 부착을 허용하지 않는 플라스틱으로 제조된 세포 배양 용기에 부착 세포를 접종하는 것;
-부착 세포를 용기에 접종하고 교반(약 50 rpm) 하에서 배양하는 것.
EBx® 세포, 좋기로는 오리 EBx®와 닭 EBx® ev-0은 시험관 내에서 상당한 시간 동안 배양될 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 방법에서 얻은 부착 의존성 또는 부착 비의존성(즉, "현탁) EBx® 세포는 적어도 50 계대, 적어도 75 계대, 적어도 100 계대, 적어도 125 계대, 적어도 150 계대, 적어도 175 계대, 적어도 200 계대, 적어도 250 계대 동안 증식할 수 있다. "세포주(line)"라는 표현은 동일한 형태적, 표현형적 특징을 더 많거나 더 낮은 수준으로 유지시키는 동안, 시험관 내 배양에서 무제한적으로 증식가능한 모든 세포 군집을 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명의 EBx® 세포로부터 예컨대, 제한적으로 희석에 의하여 클론을 얻을 수 있다. 이러한 클론은 분열에 의해 유도된 세포와 유전적으로 동일한 세포들이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의하여 수득될 수 있는, EBx®라고 불리는 연속 이배체 조류 세포주에 관한 것으로, 상기 EBx®는 작고 둥근 모양이며(즉, 직경이 약 10 um), 각각은 37℃ 또는 39℃에서 약 30 시간 이하의 배가 시간을 가진다. 상기 조류 EBx® 세포는, 좋기로는 오리 EBx® 또는 닭 EBx® ev-0이며, 배아 줄기 세포 표현형은 다음의 특징을 나타낸다:
- 높은 핵-세포질 비,
- 내인성 텔로머라아제 활성,
- 선택적으로, 세포들은 알칼리 포스파타아제, SSEA-1, EMA-1, ENS1 마커 등의 하나 이상의 추가적 ES 마커를 나타낼 수 있음.
- 본 발명의 방법에서, 단계 a)의 조류 ES 세포의 배가 시간(39℃에서 48 내지 72 시간)보다 짧은 배가 시간인, 37℃에서 약 30 시간 이하(좋기로는 24 시간).
상기 세포들은 복제 가능 내인성 레트로바이러스 입자를 생산하지 않는다.
본 발명의 조류 EBx® 세포주는 기본 배지, 구체적으로 SAFC Excell 배지, DMEM, GMEM, DMEM-HamF12 또는 McCoy와 같은 외래 성장 인자, 혈청 및/또는 비활성 영양층, 선택적으로는 당해 기술 분야의 숙련된 자가 일반적으로 사용하는 다양한 첨가제가 결손된 배지에서 무제한적으로 증식될 수 있다. 상기 첨가제의 예로는, 비-필수 아미노산, 비타민 및 소듐 피루베이트, 항생제가 있다. 본 발명의 오리 EBx® 세포는 글루타민이 첨가되지 않은 기본 배양 배지 내에서 성장할 수 있는 뚜렷한 특징을 가진다.
또한, 본 발명은 다수 또는 다분화성 조류 배아 줄기 세포, 좋기로는 다수 또는 다분화성 오리 배아 줄기(ES) 세포를 비분화된 상태에서 배양하는 세포 배양 배지에 관한 것이다. 양호한 실시 상태에 따르면, 본 발명은 동물 혈청과 최소 IGF-1과 CNTF가 첨가된 기본 배양 배지를 포함하는 오리 배아 줄기 세포에 대한 세포 배양 배지에 관한 것이다. 제 2의 양호한 실시 상태에 따르면, 본 발명은 동물 혈청과 최소 IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R이 첨가된 기본 배양 배지를 포함하는 오리 배양 줄기 세포에 대한 세포 배양 배지에 관한 것이다. 제3의 양호한 실시 상태에 따르면, 본 발명은 동물 혈청과 최소 IGF-1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF 및 FGF가 첨가된 기본 배양 배지를 포함하는 오리 배양 줄기 세포에 대한 세포 배양 배지에 관한 것이다. 상기 배지는 상기 오리 ES 세포를, 미분화된 상태에서 최소 7일, 좋기로는 최소 20일, 좋기로는 최소 100일 동안 배양하는데 충분하다. 본 발명의 상기 배양 배지는, 인터루킨-11, 카디오트로핀, 온코스타틴 및 백혈병 저해 인자(leukaemia inhibitory factor; LIF)를 포함하는 군에서 선택된 최소 하나의 화합물을 선택적으로 추가로 포함할 수 있다. 좋기로는, 상기 배양 배지는 전술한 바와 같이, 비-동물 기원의 단백질 가수분해물을 추가로 포함는데, 더 좋기로는 1×농도의 효모 가수분해물을 포함한다. 본 발명의 조류(좋기로는 오리) ES 세포의 배양 배지는 추가로 영양 세포층을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 특징을 가지는 줄기 세포 표현형을 발현하는 미분화된 오리 ES 세포로 본질적으로 구성되는 지속형 오리 ES 세포 배양체를 제공한다.
- 높은 핵-세포질 비,
- 내인성 텔로머라아제 활성,
- 선택적으로, 오리 ES 세포는 알카리 포스파타아제, SSEA-1, EMA-1, ENS1 마커 등의 하나 이상의 추가적 ES 마커를 나타낼 수 있음.
- 37℃ 또는 39℃에서, 약 40 시간의 배가 시간.
본 발명에 따른 상기 미분화된 오리 세포들은 전술한 바와 같이, 오리 배아 줄기 세포에 대한 세포 배양 배지 내에서 영양 세포 상에서 성장할 때, 상기 줄기 세포 표현형을 유지할 수 있다. 상기 미분화된 오리 세포들은 키메릭 또는 형질전환된 오리를 생산하는데 유용하다.
따라서, 본 발명은 또한, 키메릭 오리를 수득하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 전술한 배양된(sustained) 오리 ES 세포 배양을 수여자 오리 배아의 반-배아 강(subgerminal cavity)에 도입하는 단계, 및
b) 상기 단계 a)에서 얻은 배아를 배양하여 새끼 오리로 부화시키는 단계,
c) 상기 새끼 오리에 집락을 형성한 이형 세포를 포함하는 키메라 새끼 오리를 선별하는 단계.
또한, 본 발명은 유전적으로 변형된 키메라 오리를 수득하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 전술한 유전적으로 변형된 오리 ES 세포를 수여자 오리 배아의 반-배아 강에 도입하는 단계, 및
b) 단계 a)에서 얻은 배아를 배양하여 새끼 오리로 부화시키는 단계,
c) 상기 새끼 오리에 집락을 형성한 유전적으로 변형된 이형 세포를 포함하는 키메라 새끼 오리를 선별하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 키메라 새끼 오리의 자손을 얻는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 단계 c)로 얻은 선별된 키메라 새끼 오리를 성인 오리로 성숙하도록 놓아두는 단계,
b) 본 발명의, 이형 세포를 갖는 성인 새를 교배시켜 자손 새를 만드는 단계,
c) 자손 중에서 관심 새를 선별하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 유전적으로 변형된 오리 ES 세포에 포함된 발현 벡터에 의하여 코딩되는 이형 폴리펩타이드를 발현하는 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 좋기로는, 상기 이형 폴리펩타이드는 혈액, 정액, 소변 등의 생체액으로 전달되거나 유전적으로 변형된 오리의 암컷에 의하여 생산되는 발생하는 조류 알의 흰자 위로 전달된다.
본 발명의 EBx® 세포는 상기 언급한 특징을 모두 가지고, 바이러스 백신과 재조합 펩타이드 및 단백질 등의 생물제제의 생산에 유용하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 연속 이배체 조류 EBx® 세포주 내에서 바이러스를 복제하는 방법을 제공한다. 더 좋기로는, 본 발명은 본 발명의 연속 이배체 조류 EBx® 세포주, 좋기로는 오리 또는 닭 EBx® 세포주 내에서 바이러스를 복제하는 방법을 제공하는 것으로, 하기 단계를 포함한다.
- 조류 EBx® 세포 배양물을 대상 바이러스와 감염시키는 단계, 상기 조류 EBx® 세포는 동물 혈청이 결손된 배지에서 배양됨.
- 상기 바이러스를 복제하기 위하여 감염된 조류 EBx® 세포를 배양하는 단계,
- 세포 배양 상청액 및/또는 상기 세포 내에서 바이러스를 수득하는 단계.
양호한 실시 상태에 따르면, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 상기 조류 EBx®를 무혈청 배지 N°1가 들어있는 배양 용기에서, 현탁 상태로 증식시키는 단계,
b) 세포 농도가 최소 1.5 백만 세포/㎖이 될 때 상기 세포를 선별된 바이러스로 감염시키는 단계;
c) 선택적으로, 감염 바로 직전, 감염과 동시에, 또는 감염 직후에 상기 감염물을 세포 배양 무혈청 배지 N°2에 첨가시키는 단계, 및
d) 바이러스를 복제시키기 위해 상기 감염된 세포를 추가로 배양하는 단계, 및
e) 선택적으로, 상기 바이러스를 회수하는 단계.
본 발명의 상기 방법은 바이러스 증식이 가능한 조건 하에서, 배양 배지 내에 단백질 가수분해 효소를 배양 배지에 첨가하는 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 상기 단백질 가수분해 효소는 트립신, 키모트립신, 서몰리신, 펩신, 펜크레아틴, 파파인, 프로나아제, 서브틸리신 A, 엘라스타아제, 퓨린 및 카르복시펩티다아제로 구성된 군에서 선택된다. 양호한 실시 상태에 따르면, 상기 효소는 트립신이다. 좋기로는, 단백질 가수분해 효소는 원핵 숙주 또는 식물에서 생성된 재조합 단백질이다(즉, trypzean). 단백질 가수분해 효소는 바이러스 감염 전, 감염 중 및/또는 감염 후에 첨가될 수 있다. 좋기로는, 단백질 가수분해 효소는 바이러스 감염 후에 첨가될 수 있다. 단백질 가수분해 효소의 배양 배지로의 첨가는 바이러스가 회수될 때까지, 하루에 1회 수행될 수 있고, 하루에 1회 이상, 또는 하루에 1회 이전 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "바이러스"는 자연적으로 발생하는 바이러스뿐만 아니라 독성이 약화된 바이러스, 재조합된(reassortant) 바이러스, 백신 균주, 및 이에서 유래된 재조합 바이러스, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 본 발명의 바이러스는 좋기로는, 폭스 바이러스, 오쏘믹 소바이러스(orthomyxoviruses), 파라믹소 바이러스, 헤르페스 바이러스, 헤파드나 바이러스(hepadnaviruses), 아데노 바이러스, 파보 바이러스, 레오 바이러스, 서코 바이러스, 코로나 바이러스, 플라비 바이러스(flaviviruses), 토가 바이러스, 비르나 바이러스(birnavirus) 및 레트로 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된다.
양호한 실시 상태에 있어서, 바이러스, 관련 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 바이러스 백신은 폭스바이러스 과(family), 더 좋기로는 코도폭스비리대(chordopoxviridae)에 속한다. 일 실시 상태에 있어서, 바이러스 또는 관련 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 바이러스 백신은 폭스 바이러스, 좋기로는 계두 바이러스(즉, TROVAC), 카나리아 폭스 바이러스(즉 ALVAC), 준코폭스 바이러스, 마이나폭스(mynahpox) 바이러스, 비둘기폭스 바이러스, 싸이타신폭스(psittacinepox) 바이러스, 메추리폭스바이러스, 참새폭스바이러스, 찌르레기폭스바이러스, 칠면조 폭스바이러스로부터 선택되는 조류폭스 바이러스이다. 다른 양호한 실시 상태에 따르면, 상기 바이러스는 Lister-Elstree 백시니아 바이러스 균주, ATCC로부터 얻을 수 있는 변형된 백시니아 안카라 바이러스(MVA, ATCC Number VR-1508), NYVAC(Tartaglia et al., 1992 Virology 188: 217-232), LC16m8(Sugimoto et Yamanouchi 1994 Vaccine 12:675-681), CVI78(Kempe et al.,1968 Pediatrics 42:980-985) 및 다른 재조합 또는 비-재조합 백시니아 바이러스와 같은 변형된 백시니아 바이러스로부터 선택된 백시니아 바이러스이다.
다른 양호한 실시 상태에 있어서, 바이러스, 관련 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 백신은 오쏘믹소바이러스 과(family), 구체적으로는 인플루엔자 바이러스에 속한다. 상기 인플루엔자 바이러스는 인간 인플루엔자 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, 말 이플루엔자 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 고양이 인플루엔자 바이러스로 구성된 군에서 선택된다. 인플루엔자 바이러스는 좋기로는 균주(strain) A, B 및 C에서 선택되는 것이 좋다. 균주 A 중에서는, H1N1, H2N2, H3N2, H4N2, H4N6, H5N1, H5N2, H7N7 또는 H9N2에만 국한되는 것은 아니지만 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제(neuraminidase)의 다른 서브타입을 가진 바이러스를 열거할 수 있다. H1N1 균주 중에서는, A/Porto Rico8/34, A/New Caledonia/20/99, A/Beijing/262/95, A/Johannesburg/282/96, A/Texas/36/91, A/Singapore, A/Solomon Islands/03/2006를 열거할 수 있다. 균주 H3N2 중에서는, A/Panama/2007/99, A/Moscow/10/99, A/Johannesburg/33/94, A/Wisconsin/10/04를 열거할 수 있다. B 균주 중에서는, 이에 국한되는 것은 아니지만 B/Porto Rico8/34, B/Johannesburg/5/99, B/Vienna/1/99, B/Ann Arbor/1/86, B/Memphis/1/93, B/Harbin/7/94, N/Shandong/7/97, B/Hong Kong/330/01, B/Yamanashi/166/98, B/Jiangsu/10/03, B/Malaysia를 열거할 수 있다. 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 야생형 바이러스, 감염된 환자로부터 수득된 일차 바이러스 분리물, 재조합 바이러스, 독성이 약화된 바이러스, 온도 민감성 바이러스, 저온 순화된 바이러스, 재편성된(reassortant) 바이러스, 역 유전자 변형된 바이러스로부터 선택된다. 본 발명의 바이러스가 인플루엔자 바이러스인 경우, 본 발명의 방법은 바이러스 증식을 가능하게 하는 조건에서 배양 배지에 단백질분해 효소를 첨가하는 단계를 포함한다. 양호한 실시 상태에 따르면, 상기 효소는 트립신이다. 세포 배양 배지 내의 트립신 최종 농도는 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖이다. 더 좋기로는, 세포 배양 배지 내의 트립신 최종 농도는 0.01 내지 10 usp/㎖(usp: US pharmacopea unit)이고, 좋기로는 0.05 내지 2 usp/㎖이고, 더욱 좋기로는 0.3 내지 1 usp/㎖이며, 더욱 좋기로는 약 0.75 usp/㎖이다.
다른 양호한 실시 상태에 있어서, 바이러스, 관련 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 백신은 파라믹소 바이러스의 과(family of paramyxoviridae)이다. 바이러스는 좋기로는 자연적으로 발생한 파라믹소바이러스 또는 재조합 파라믹소바이러스이며, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 풍진 바이러스, 센다이 바이러스(Sendai virus), 호흡기 바이러스(Respiratory Syncythial Virus;RSV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 1 과 유형 3, 우역 바이러스(Rinderpest virus), 강아지 홍역 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스 및 오리 파라인플루엔자 바이러스를 포함하는 군에서 선택된다. 양호한 실시 상태에 따르면, 상기 바이러스는 홍역 바이러스 또는 재조합 홍역 바이러스이다. 다른 양호한 실시 상태에 따르면, 상기 바이러스는 뉴캐슬병 바이러스(NDV) 또는 재조합 NDV이다. NDV 균주의 예로는 Lasota 균주가 있다. 본 발명의 바이러스가 NDV인 경우, 본 발명의 방법은 좋기로는, 바이러스 증식을 가능하게 하는 조건에서 배양 배지에 단백질분해 효소를 첨가하는 단계를 포함한다. 양호한 실시 상태에 따르면, 상기 효소는 트립신이다. 세포 배양 배지 내의 트립신 최종 농도는 약 0.01 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖이다. 더 좋기로는, 세포 배양 배지 내의 트립신 최종 농도는 0.01 내지 10 usp/㎖(usp: US pharmacopea unit)이고, 더욱 좋기로는 0.3 내지 1 usp/㎖이며, 더욱 좋기로는 0.4 내지 0.75 usp/㎖이다. 흥미롭게도, 고착하여 성장할 수 있는 본 발명의 EBx® 세포주는 프라크 시험법(plaque assay)에서 바이러스 적정(titration), 좋기로는 NDV 적정을 수행하는데 유용하다. 정말로, 어떠한 세포 변성 효과가 관찰되지 않았던 CEFs와 닭 DF1 섬유아세포와는 다르게, EBx® 세포 내에서의 바이러스 성장은 거대한 세포 특성 형성을 초래한다. 또한, NDV 바이러스 입자는 적혈구 응집반응(haemagglutination assay)에 의하여 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 NDV 바이러스 등의 바이러스 적정을 위한 본 발명의 EBx® 세포의 용도와 관련된다.
다른 양호한 실시 상태에 있어서, 바이러스, 관련 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 백신은 토가비리다애(togaviridae)의 과(family)이다. 상기 바이러스는 좋기로는, 자연적으로 발생된 알파바이러스이거나 재조합 알파바이러스이며, 신비스(Sinbis) 바이러스, 세밀키 포레스트 바이러스(semliki forest virus), 오뇽뇽 바이러스(O'nyong'nyong virus), 치쿤구냐 바이러스(chikungunya virus), 마야로 바이러스(Mayaro virus), 로스 리버 바이러스(Ross river virus), 동부 말뇌염(Eastern equine encephalitis virus), 서부 말뇌염(Western equine encephalitis virus) 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스(Venezuelan Equine encephalitis virus)를 포함하는 군에서 선택되는 것이 좋다.
다른 양호한 실시 상태에 있어서, 바이러스, 관련 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 백신은 헤르페스바이러스 과(family)이다. 상기 바이러스는 좋기로는, 자연적으로 발생된 마렉병(Marek Disease) 바이러스이거나 재조합 마렉병 바이러스이다. 마렉병 바이러스(MDV)는 좋기로는, FC126(HTV), SB-1, 301B/1, CV1988 Clone C, CV1988/C/R6, CV1988/Rispens, R2/23(Md11/75) 등의 MDV의 허가 백신 균주 중에서 선택된다.
다른 양호한 실시 상태에 있어서, 바이러스, 관련 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 백신은 헤파드나바이러스(hepadnaviridae) 과(family)에 속하는 것이다. 상기 바이러스는 좋기로는, 자연적으로 발생된 헤파드나바이러스과거나 재조합 헤파드나바이러스이며, 좋기로는 조류 헤파드바이러스나 인간 헤파드나바이러스 중에서 선택된 것이 좋다. 상기 조류 헤파드나바이러스는 좋기로는, 오리 B형 간염 바이러스(duck hepatitis B virus; DHBV)와 헤론 B형 간염 바이러스(heron hepatitis B virus; HHBV)와 흰 기러기 B형 간염 바이러스(snow goose hepatitis B virus)로 구성되는 군 중에서 선택되는 것이 좋다.
다른 양호한 실시 상태에 있어서, 바이러스, 관련 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 백신은 버나비리대(birnaviridae) 과(family), 구체적으로 전염성 F낭병바이러스(Infectious Bursal Disease virus)에 속하는 것이다.
다른 양호한 실시 상태에 있어서, 바이러스, 관련 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 백신은 플라비비리대(flaviviridae) 과(family), 구체적으로 뎅기 바이러스(Dengue virus), 일본 뇌염 바이러스 및 웨스트 나일 바이러스에 속하는 것이다.
다른 양호한 실시 상태에 있어서, 바이러스, 관련 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 백신은 코로나비리다에(coronaviridae) 과(family), 구체적으로는 전염성 기관지병 바이러스(Infectious Bronchitis virus)에 속하는 것이다.
다른 양호한 실시 상태에 있어서, 바이러스, 관련 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 백신은 써코비리대(circoviridae) 과(family), 구체적으로 닭 빈혈 바이러스(Chicken Anemia Virus)에 속하는 것이다.
다른 양호한 실시 상태에 있어서, 바이러스, 관련 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 백신은 레트로비리다에(retroviridae) 과(family)에 속하는 것이다. 상기 바이러스는 좋기로는, 세망내피증(Reticulo-endotheliosis), 오리 전염성 빈혈 바이러스(duck infectious anemia virus), 오리 비장 괴사 바이러스(duck spleen necrosis virus) 중에서 선택되는 자연 발생 레트로바이러스 또는 이들의 재조합 레트로바이러스인 것이 좋다.
다른 양호한 실시 상태에 있어서, 바이러스, 관련 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 백신은 파르보비리다에(parvoviridae) 과(family)에 속한다. 좋기로는, 상기 바이러스는 오리 파르보바이러스 등과 같이 자연적으로 발생된 것 또는 이들의 재조합 파르보바이러스인 것이 좋다.
*다른 양호한 실시 상태에 있어서, 바이러스, 관련 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및 백신은 아데노비리다에(adenoviridae) 과(family)에 속한다. 좋기로는, 상기 바이러스는 계두 아데노바이러스(fowl adenovirus), 거위 아데노바이러스, 오리 아데노바이러스, 비둘기 아데노바이러스에서 선택된 자연적으로 발생된 아데노바이러스이거나 이들의 재조합 아데노바이러스인 것이 좋다. 계두 아데노바이러스의 예로는, 계두 아데노바이러스 1(Fowl adenovirus 1; CELO), 계두 아데노바이러스 5(340), 계두 아데노바이러스 4(KR95), 계두 아데노바이러스 10(CFA20), 계두 아데노바이러스 2(P7-A), 계두 아데노바이러스 3(75), 계두 아데노바이러스 9(A2-A), 계두 아데노바이러스 11(380), 계두 아데노바이러스 6(CR119), 계두 아데노바이러스 7(YR36), 계두 아데노바이러스 8a(TR59), 계두 아데노바이러스 8b(764) 및 산란 저하 증후군 바이러스(Egg Drop syndrome virus)가 있다. 거위 아데노바이러스의 예로는, 거위 아데노바이러스 1, 거위 아데노바이러스 2, 거위 아데노바이러스 3가 있다. 오리 아데노바이러스의 예로는 오리 아데노바이러스 2가 있다. 비둘기 아데노바이러스의 예로는 비둘기 아데노바이러스 1가 있다.
재조합 바이러스는 비상동 유전자(heterologous gene)를 함유하는 바이러스 벡터를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 몇몇 실시 상태에 있어서, 바이러스의 복제에 대한 헬퍼 함수(helper function)는 숙주 세포 EBx®, 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드에 의하여 제공된다. 대표 벡터는 조류 세포 또는 포유동물 세포를 감염시키는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 클라미디아(Chlamydia), 리케차(Rickettsia), 콕시엘라(Coxiella) 등과 같은 세포 내 세균(intracellular bacteria)을 복제하는 본 발명의 EBx® 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 EBx® 세포는 또한, 재조합 단백질과 펩타이드를 생산하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 재조합 단백질과 펩타이드의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:(ⅰ) 본 발명의 EBx® 세포를 발현 벡터로 일시적 또는 안정적으로 형질 감염(transfection)시켜서 유전적으로 변형시키는 단계,(ⅱ) 선택적으로, 상기 재조합 단백질 또는 펩타이드를 발현하는 EBx® 세포를 선별하는 단계,(ⅲ) 그리고 상기 펩타이드 또는 단백질을 정제하는 단계. EBx® 세포에서 생산되는 펩타이드와 단백질도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 배양 용기는, 좋기로는 연속적으로 교반되는 탱크 생물반응기, WaveTM 생물반응기, BelloTM 반응기, 스피너 플라스크, 플라스크 및 세포 팩토리로부터 선택된다. 전형적으로, 세포는 마스터 또는 작동 세포 뱅크 바이알로부터 다양한 크기의 T-플라스크, 롤러 병 또는 WaveTM 생물반응기를 통해 스케일 증가되며, 좋기로는 생물 반응기로 최종적으로 스케일 증가된다. 그리고 난 후, 제조된 세포 현탁물은 추가적인 배양을 위해 씨드(seed) 생산 생물반응기(일반적으로 20-30 L 부피)로 공급되며, 몇몇 실시 상태에서는 대량 생산 생물반응기(일반적으로 150-180 L 부피 및 그 이상)로 공급된다. 씨드 생물반응기에 대한 이차(더 큰) 생물반응기의 부피비는 일차 생물반응기에서 증식된 세포주의 정도에 의존하지만, 일반적으로는 3:1 내지 10:1, 예컨대(6-8):1의 범위이다. 양호한 실시 상태에 따르면, 배양 용기는 온도, 공기순환, pH 및 다른 조절 조건이 조절되는 연속 교반 탱크 생물반응기이며, 세포, 멸균 산소, 배양을 위한 다양한 배지 등을 주입하기 위한 적당한 입구(inlet), 세포 및 배지를 제거하기 위한 출구(outlet) 및 생물반응기에 있는 배양 배지를 혼합하기 위한 수단과 같은 장치가 장착되어 있다.
본 발명에 따르면, "무혈청 배지(serum-free medium)"(SFM)는 사용하기 위해 준비된 세포 배양 배지를 의미하며, 즉, 세포 생존과 세포 성장을 가능하게 하는 동물 혈청의 첨가를 필요로 하지 않는 것을 의미한다. 이 배지는 화학적으로 정제될 필요는 없으며, 다양한 기원, 이를테면 식물 또는 효모로부터의 가수분해물을 포함할 수도 있다. 좋기로는, 상기 SFM은 "비 동물 기원"으로 한정되며, 즉, 동물 또는 인간 기원의 성분을 포함하지 않는다(FAO status: "동물 기원이 없음"). SFM에는, 천연 혈청 단백질이 재조합 단백질로 대체된다. 대신, 본 발명에 따른 SFM 배지는 단백질을 포함하지 않고(PF 배지: "무-단백질 배지") 및/또는 화학적으로 정의된다(CDM 배지: "화학적으로 정의된 배지"). SFM 배지는 여러 가지 이점이 있다:(i) 이중에 첫 번째는 이러한 배지의 조절 순응도(regulatory compliance)(실제로, BSE, 바이러스와 같은 우발적 제제에 의한 오염의 위험이 없다),(ii) 정제 공정의 최적화(iii) 훨씬 더 정제된 배지로 인해 공정에서의 훨씬 더 높은 재생산율. 상업적으로 이용 가능한 SFM 배지의 예는 다음과 같다: VP SFM(InVitrogen Ref 11681-020, 카탈로그 2003), Opti Pro(InVitrogen Ref 12309-019, 카탈로그 2003), Episerf(InVitrogen Ref 10732-022, 카탈로그 2003), Pro 293 S-CDM(Cambrexref 12765Q, 카탈로그 2003), LC17(Cambrex Ref BESP302Q), Pro CHO 5-CDM(Cambrex ref 12-766Q, 카탈로그 2003), HyQ SFM4CHO(Hyclone Ref SH30515-02), HyQ SFM4CHO-Utility(Hyclone Ref SH30516.02), HyQ PF293(Hyclone ref SH30356.02), HyQ PF Vero(Hyclone Ref SH30352.02), Excell 293 배지(JRH Biosciences ref 14570-1000M), Excell 325 PF CHO Protein free medium(SAFC Biosciences ref 14335-1000M), Excell VPRO 배지(JRH Biosciences ref 14560-1000M), Excell 302 무혈청 배지(JRH Biosciences ref 14312-1000M), Excell 65319, Excell 65421, Excell 65625, Excell 65626, Excell 65627, Excell 65628, Excell 65629(JRH Bioscience), Excell MDCK SFM(SAFC-Biosciences Ref. 14581C), Excell MDCK Prod(Ref. M3678), 유전자 치료 배지 3(무-동물성분)(SIGMA-Aldrich, ref G-9916 또는 Excell GTM-3)(이하, G9916 배지라 일컬음), HYQ CDM4 HEK-293(Hyclone Ref. SH30859), HYQ SFM4 HEK-293(HYCLONE Ref. SH30521), AEM(inVitrogen). 양호한 제1 실시 상태에 따르면, 무혈청 배지 N˚1 및 무혈청 배지 N˚2는 동일한 배지이다. 양호한 제2 실시 상태에 따르면, 무혈청 배지 N˚1 및 무혈청 배지 N˚2는 서로 다른 성분을 포함한다.
본 발명의 방법은 무혈청 배지 1 전체 또는 일부를 제거한 뒤, 무혈청 배지 N˚2로 대체하는 단계를 포함한다. 그러나, 무혈청 배지 1의 실질적인 부분(즉, 약 50% 까지)을 제거한 뒤, 배지 1을 제거, 예컨대 스핀필터(spinfilter)를 통해 제거하는 동안 무혈청 배지 N˚2로 대체하는 것이 더 편리하다. 양호한 실시 상태에 따르면, 무혈청 배지 N˚1의 일부를 제거하지 않고 무혈청 배지 N˚1에 직접 무혈청 배지 N˚2가 첨가된다. 무혈청 배지 N˚2의 0.25 내지 10 부피가 무혈청 배지 N˚1의 1 부피에 첨가된다. 양호한 실시 상태에 있어서, 무혈청 배지 N˚2의 0.5 내지 8 부피가 무혈청 배지 N˚1의 1 부피에 첨가된다. 더 양호한 실시 상태에 있어서, 무혈청 배지 N˚2의 3 내지 6 부피가 무혈청 배지 N˚1의 1 부피에 첨가된다.
무혈청 배지 N˚1 및/또는 무혈청 배지 N˚2는 아미노산, 지질, 지방산, 콜레스테롤, 비타민, 탄수화물, 비-동물 기원의 단백질 가수분해물 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 최소 하나의 성분이 첨가될 수 있다.
별법으로, 본 발명의 방법은 아미노산, 지질, 비타민, 탄수화물, 비-동물 기원의 단백질 가수분해물, 계면활성제 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 성분을 세포에 공급하는 추가적인 단계를 포함하는 페드-배치(fed-batch) 방법이다. 제1 양호한 실시 상태에 따르면, 상기 공급 단계는 바이러스를 복제하는 본 발명의 방법에서 단계 a) 내지 d) 동안, 선택적으로는 오직 단계 b) 내지 d) 동안, 또는 오직 단계 d) 동안 발생한다. 상기 공급은 매일 또는 계속적으로 발생할 수 있다. 상기 공급이 연속적이지 않을 때, 상기 공급은 1일 1회, 1일 1회 이상 또는 1일 1회 미만 발생할 수 있다.
본 발명의 SFM 배지는 아미노산, 비타민, 유기염 및 무기염, 탄수화물의 근원, 시험관 내에서 세포 배양을 도와주는 양으로 존재하는 각 성분을 포함하는 다수의 성분을 포함한다. 그러나, 세포 성장 또는 바이러스 생산도를 향상시키기 위해, 추가 성분이 SFM 배지에 첨가된다.
세포 배양에 첨가되는 아미노산의 선택은 배양되고 있는 세포에 의한 아미노산 소비를 분석하여 결정될 수 있다: 세포 종에 따른 다양한 소비가 있다. 양호한 실시 상태에 따르면, 배지에 첨가되는 아미노산은 아스파라긴 및 글루타민 또는 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 더 양호한 실시 상태에 따르면, 글루타민이 닭 EBx 세포 배양에 첨가되며, 글루타민의 공급은 배지 내의 글루타민 농도를 약 0.5 mM 내지 약 5 mM, 좋기로는 약 1 mM 내지 약 3 mM, 가장 좋기로는 약 2 mM을 유지하기 위하여, 단계 a) 내지 d) 동안에 수행된다. 양호한 실시 상태에 있어서, 글루타민의 공급은 연속적으로 이루어진다. 흥미롭게도, 오리 EBx® 세포는 많은 양의 글루타민을 소비하지 않는데, 이는 오리 세포가 글루타민을 합성할 수 있기 때문이다. 따라서, 글루타민은 오리 EBx 세포 배양에 첨가되거나 첨가되지 않을 수 있다.
양호한 실시 상태에 따르면, 배지에 첨가되는 탄수화물은 D-글루코스, D-수크로스 및 D-갈락토스 또는 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 더 양호한 실시 상태에 따르면, 첨가되는 탄수화물은 D-글루코스이다. D-글루코스의 공급은 배지 내의 D-글루코스 농도를 약 0.5 g/ℓ 내지 25 g/ℓ, 좋기로는 약 1 g/ℓ 내지 10 g/ℓ, 더욱 좋기로는 약 2 g/ℓ 내지 3 g/ℓ를 유지하도록, 단계 a) 내지 d) 동안, 더욱 바람직하게는 b) 내지 d) 동안 수행된다. 양호한 실시 상태에 있어서, D-글루코스의 공급은 연속적으로 이루어진다.
양호한 실시 상태에 따르면, 지질은 콜레스테롤, 스테로이드 및 팔미틱산, 팔미토레익산, 스테아릭산, 올레익산, 리놀레익산, 리놀레닉산 등의 지방산과 이의 유도체 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 더 좋기로는, 지방산은 SIGMA-ALDRICH(Ref. F7050)의 것이며, 약 0.35 ㎕/㎖의 지방산 용액이 배양 배지에 첨가된다.
배지는 소듐 바이카보네이트와 같은 완충 물질, 산화 안정제, 물리적 스트레스를 중화하는 안정제, 또는 프로테아제 저해제와 같은 보조 성분을 포함할 수 있다. 필요한 경우, 폴리프로필렌 글리콜(PLURONIC F-61, PLURONICF-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 또는 PLURONIC F-108)과 같은 비이온성 계면활성제가 거품형성억제제로서 배지에 첨가될 수 있다. 이들 제제는 계면활성제를 첨가하지 않는 경우, 공기 거품을 위로 상승시켜 터지게 함으로써 공기 거품("sparging")의 표면에 존재하는 세포의 손상을 유도할 수 있으므로 공기순환의 부작용으로부터 세포를 보호하는데 일반적으로 사용된다. 비이온성 계면활성제의 양은 좋기로는 약 0.05 내지 약 10 g/L, 일반적으로는 약 0.1 내지 약 5 g/L이다. 본 발명의 다른 실시 상태에 따르면, 세포 배양 배지 내의 계면활성제의 농도는 세포 클럼프의 크기에 따라(즉, 증가 또는 감소) 변형시킬 수 있다.
본 발명의 바이러스를 복제하는 방법의 한 실시 상태에 따르면, 세포 배양에 무혈청 배지 N˚2의 첨가는 감염 단계 b) 이후에 수행되며, 좋기로는 단계 b) 수행 후 약 0.5 내지 4시간 뒤, 더 좋기로는 단계 b) 후 약 1시간 뒤에 수행하는 것이 좋다. 본 발명의 또 다른 실시 상태에 따르면, 세포 배양에 무혈청 배지 N˚2의 첨가는 감염 단계 b) 이전에 수행되며, 좋기로는 단계 b) 수행 전 약 0.5 내지 4시간 전 더 좋기로는 단계 b) 후 약 1시간 뒤에 수행하는 것이 좋다. 본 발명의 다른 실시 상태에 따르면, 무혈청 배지 N˚2의 첨가는 감염 단계 b와 동시에 수행된다. 바이러스 감염 단계 b)는 약 10 내지 10-8로, 좋기로는 약 10-1 내지 10-6, 더 좋기로는 약 10-2 내지 10-5, 더욱 좋기로는 약 10-4 m.o.i(multiplicity of infection)에서 수행된다. 당업자라면 바이러스 종류에 따른 적절한 m.o.i를 결정할 수 있을 것이다. 단계 c)에서, 감염된 세포는 좋기로는, 최소 24시간, 최소 48시간, 최소 72시간, 최소 96시간, 최소 120시간, 최소 144시간 동안 배양되는 것이 좋다. 바이러스가 폭스 바이러스일 때, 상기 감염된 세포는 최소 144시간 배양된다.
본 발명의 방법에서, 세포 배양 단계 a)는 배치(batch) 배양, 반복 배치 배양, 페드-배치(fed-batch) 배양 또는 관류(perfusion) 배양에 의해 수행된다. 더 좋기로는, 세포 배양 단계 a)는 페드-배치 배양에 의해 수행된다. 단계 b)에서의 감염은 세포 농도가 최소 약 4백만, 좋기로는 6백만 세포/㎖, 더욱 좋기로는 8백만 세포/㎖일 때, 배치 또는 페드-배치 배양에서 수행된다. 관류 방법이 사용되는 경우, 단계 b)에서의 감염은 세포 농도가 최소 8백만 세포/㎖, 좋기로는 약 9 내지 10 백만 세포/㎖, 또는 그 이상일 때 수행된다.
단계 a), b), c) 및 d)에 있는 무혈청 배양 배지의 pH는 생물반응기에 의해 모니터링되는 것이 좋다. 상기 pH는 6.5 내지 7.8, 좋기로는 약 6.8 내지 7.5, 더 좋기로는 약 7.2의 범위인 것이 좋다.
본 발명의 방법에서, 단계 d)는 수득하기 전, 1 내지 10일 동안 유지된다. 양호한 실시 상태에 따르면, 단계 d)는 수득하기 2 내지 5일 동안 유지된다. 수득(단계 e)의 시간은 배양 용기 내의 세포 농도에 따라 결정된다. 본 발명은 바이러스 수득을 위한 적정 시간은, 살아있는 세포의 농도가 적정 수준에 도달한 후 2일 째인데, 이는 바이러스 감염이 감소되기 시작하기 때문임을 발견하였다.
세포 배양은 바이러스 종류에 따라 32℃ 내지 39℃의 온도에서 수행된다. 인플루엔자 바이러스와 폭스바이러스를 생산하기 위해, 세포 배양 감염은 좋기로는 33℃에서 수행한다.
EBx® 세포는 소량의 세포, 100개 이상까지 세포가 약하게 응집되어 있는 상태로 현탁 배양에서 자랄 수 있다. 특정 이론에 구애되는 것은 아니나, 클럼프의 크기는 세포 배양 배지의 조성에 따라 다양할 것이다. 예를 들어, 폴리프로필렌 글리콜(PLURONIC F-61, FPURONIC F-68, SYNPERONIC F-68, PLURONIC F-71 또는 PLURONIC F-108)과 같은 계면활성제의 존재 및 교반(stirring), Mg2+와 Ca2+와 같은 2가 이온의 농도는 클럼프 사이즈에 영향을 줄 것이다. 본 발명자는 최소한 본 발명의 방법의 단계 a) 동안, 본 발명의 EBx® 세포가 서로 응집되게 하여 클럼프를 형성함으로써 바이러스 수율이 증가할 수 있다는 발견하였다. 다양한 사이즈의 T-플라스크 또는 롤러-바틀을 통해, 마스터 및 작동 세포 뱅크 바이알로부터 생물반응기로 용량-증가시키는 동안, 현탁 세포는 새로운 배지로 희석시키거나 또는 원심분리 후 세포 펠렛을 새로운 배지로 재현탁시킴으로써, 일반적으로 더 큰 용기로 계대된다(passaged). 본 발명자는 세포 계대 동안, 배양에서 큰 세포 클럼프를 유지시키는 것이 요구됨을 발견하였다. 이를 위해, EBx® 세포에서의 바이러스 복제를 향상시키기 위해 세포 클럼프를 파괴하지 않는 것이 더 낫다. 예를 들어, T-플라스크 또는 롤러-바틀에서의 배양 단계 a)의 최초 기(phase) 동안은, 세포를 계대시키기 위해 세포 배양을 더 큰 용기로 희석시킬 필요가 있으며, 원심분리하거나, 피펫팅 또는 교반에 의해 세포 클럼프를 파괴시키지 않을 필요가 있다. 그러나, 너무 많은 클럼프는 높은 바이러스 생산율을 위한 차선책이 될 수 있다. 결론적으로, 당업자라면 단계 a)의 최초 세포 계대 동안 피펫팅 또는 교반을 함으로써 클럼프의 일부를 파괴하는 것이 바이러스 수율을 향상시킬 수 있는지 여부를 정의내릴 수 있을 것이다. 양호한 실시 상태에 따르면, 폭스바이러스, 좋기로는 MVA, ALVAC 및 Fowlpox 바이러스는 미약하게 응집되어 있는 소량의 세포에서 클럼프된 EBx® 세포를 증식시켜, 최소 100개의 세포, 최소 200개의 세포, 최소 500개의 세포, 최소 1000개의 세포로 세포수를 증가시키는 단계 a)를 포함하는 본 발명의 방법에 의해 얻어진다.
본 발명은 EBx® 세포 클럽프의 크기, 좋기로는 오리 EBx® 세포 클럼프의 크기는 부착 비의존성 세포 배양 배지 내의 Ma2+ 및/또는 Ca2+이온 농도에 따라 다를 수 있다. 너무 큰 클럽프는 높은 바이러스 생산율을 위한 차선책이 될 수 있으므로, 클럼프의 크기는 배양 배지 내의 Ma2+ 및/또는 Ca2+이온 농도를 적정함으로써 모니터링할 수 있다. 오리 EBx® 세포에서, 배양 배지는 Ma2+을 좋기로는 0.5 mM 내지 2.5 mM, 좋기로는 약 1.6 mM의 농도로 함유하고, Ca2+를 0.01 mM 내지 0.5 mM, 좋기로는 약 0.1 mM의 농도로 함유한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의하여 얻을 수 있는 바이러스에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 바이러스를 함유하는 백신에 관한 것이다. 바이러스 백신의 제조 방법은 본 발명에 따른 바이러스를 복제하는 방법을 포함하며, 여기서 바이러스를 수득하는 단계 e)는 여과, 농축, 냉동 및 안정화제의 첨가에 의한 안정화 중에서 선택되는 최소한 한 가지 단계를 포함한다. 바이러스 수득은 당업자에게 공지된 기술에 따라 수행된다. 양호한 실시 상태에 따르면, 상기 바이러스를 수득하는 단계는, 세포 배양 농축물의 원심분리로부터 얻어지는 세포 배양 상청액을 수집한 뒤, 여과하고, 농축하고, 냉동하고, 안정화제를 첨가하여 바이러스 제조물을 안정화시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스에 대해서는 문헌(Furminger,In Nicholson, Webster and Hay(Eds) Textbook of influenza, chapter 24 pp324-332)을 참조한다.
또한, 본 발명에 따른 바이러스 백신 제조 방법은 수득된 바이러스를 불활성화시키는 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 불활성화 단계는 포름알데하이드, 베타-프로피오락톤, 에테르, 에테르와 계면활성제(즉, Tween 80TM과 같은 것), 세틸-트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB) 및 트리톤 N102, 소듐 데옥시콜레이트 및 트리(N-부틸)포스페이트를 이용한 처리에 의해 수행되는 것이 좋다.
또한, 다른 실시 상태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득 가능한 바이러스로부터 바이러스 항원 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기의 추가적인 단계를 포함한다:
a) 선택적으로, 바이러스 전체를 포함하는 세포 배양 상청액을 데옥시리보뉴클레익산 제한효소, 좋기로는 DNAses(참조, EC3.1.21 및 EC3.1.22 분류) 및 뉴클레아제(참조, EC3.1.30 및 EC3.1.31 분류)와 배양하는 단계; 좋기로는 DNA 소화 효소는 벤조나아제(Benzon nuclease) 또는 DNaseⅠ;
b) 양이온성 계면활성제의 첨가 단계. 양이온성 계면활성제의 예는 다음과 같다; 이에 한정되지는 않음: CTAB와 같은 세틸-트리메틸 암모늄 염, 미리스틸-트리메틸 암모늄 염, 리포펙틴, DOTMA 및 TweenTM;
c) 항원 단백질의 분리 단계. 상기 이후 단계는 원심분리 또는 한외여과에 의해 달성된다.
백신 내에 바이러스는 활성화 바이러스 입자, 또는 분해된 바이러스 입자로서 존재할 수 있다. 실시 상태에 따르면, 백신은 사멸 또는 불활성화된 백신이다. 다른 실시 상태에 따르면, 상기 백신은 살아있는 독성이 약화된 백신이며, 상기 백신은 본 발명의 방법에 의해 수득 가능한 EBx 세포 배양 상청액을 주로 포함하며, 좋기로는 혈청이 없고, 선택적으로는 여과 및/또는 농축되고 상기 바이러스를 포함한다. 세 번째 실시 상태에 따르면, 백신은 본 발명의 방법에 의해 제조된 바이러스로부터 수득 가능한 바이러스 항원 단백질을 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 감염된 세포주 EBx®, 좋기로는 오리 또는 ev-0 닭 EBx®를 포함하는 백신을 제공하는 것에 관한 것이며, 여기서 감염된 세포주 EBx®, 좋기로는 오리 또는 ev-0 닭 EBx®는 단계 d)에서 수득된다.
본 발명의 백신은 본 발명의 바이러스와 면역 반응을 증가시키는 약제학적으로 허용가능한 성분을 혼합하여 포함할 수 있다. 면역 반응을 증가시키는 성분의 비제한적인 예로는, 불완전한 프룬드(Freund) 애주번트(adjuvant), 사포닌, 알로미늄 하이드록사이드 염, 라이소레시틴, 플루토닉 폴리올, 폴리아나이온(polyanions), 펩타이드, BCG(bacilli Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파븀(corynebacterium parvum)을 포함한다. 합성 어쥬번트의 예는 QS-21가 있다. 추가로, 면역-촉진 단백질(인터루킨 IL1, IL2, IL3, IL4, IL12, IL13, 과립구 집락 자극 인자, ...)이 백신 면역 반응을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
*본 발명의 백신은 좋기로는 액상의 제형, 동결 제제, 탈수 및 동결 제제이며, 선택적으로는 코-내 경로로 투여하도록 적용된다.
본 발명의 백신은 전술한 바이러스에 의해 감염된 인간 또는 동물의 예방 및/또는 치료학적 처치를 위하여 사용된다. 좋기로는, 본 발명의 바이러스 백신은 천연두 및 인플루엔자, 홍역, 볼거리, 루펠라 바이러스, RSV 중에서 선택되는 바이러스에 의해 감염된 인간의 예방 및/또는 치료학적 처치를 위해 사용된다. 별법으로, 본 발명의 백신은 좋기로는, 인플루엔자, 뉴캐슬병 바이러스, 산란 저하 증후군, 전염성 점액 낭병(Infectious Bursal Disease), 전염성 기관지염 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스, 닭 빈혈 바이러스 중에서 선태된 바이러스에 의해 감염된 동물의 예방 및/또는 치료학적 처치를 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 바이러스 백신은 암과 같은 만성 질환 또는 AIDS와 같은 감염성 질환의 예방 및/또는 치료학적 처치를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 EBx® 세포주는 재조합된(re-assorted) 바이러스를 생성시키고 제조하는데 유용하다. 인플루엔자 바이러스와 같이 절단된 게놈을 갖는 바이러스가 재조합될 수 있다. 본 발명의 EBx® 세포를 최소 2개의 다른 인플루엔자 바이러스 균주로 동시에 감염시킬 때, 두 개의 서로 다른 균주로부터의 절단된 게놈의 혼합이 동일한 숙주세포에 존재한다. 바이러스 조립 동안, 게놈 단편의 모든 조합이 이론적으로 생성될 수 있다. 따라서, 특정 재조합 바이러스는 항체, 예를 들어 요구되는 처치를 한 바이러스(참조, Kilnourne E.D in Poltkin SA and Mortimer E.A. Eds. Vaccines 1994)를 이용한 선별 또는 제거를 통해 분리될 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 EBx® 세포주는 역(reverse) 유전학(참조, Enami, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3802-3805(1990); Enami et Palease, J. Virol. 65:2511-2513(1991); Luytjes, Cell 59:1107-1113(1989))에 의해 인플루엔자 바이러스를 생성하고 생산하는데 유용하다.
또한, 본 발명은 바이러스 적정을 수행하기 위한 세포 기질로서의 본 발명의 EBx® 세포주의 용도에 관한 것이다. 바이러스 용액의 적정을 측정하는데 사용되는 발육란(embryonated egg), CEFs, DF1 세포 등의 현재의 세포 시스템을 대체하는데 있어서, EBx® 세포는는 효과적이다. 좋기로는, 바이러스 적정은 TCID50 방법(Reed L, Muench H, 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am . J. Hyg .27, 493-97)에 의하여 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 무균 테스트(sanitary testing)를 수행하기 위한 세포 기질로서의 본 발명의 EBx® 세포주의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 바이러스 또는 이의 성분을 포함하는 진단 조성물에 관한 것이다.
하기 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 하기 제조예 및 실시예는 당업자들이 본 발명을 훨씬 더 명확하게 이해하고, 실시할 수 있도록 기재되어 있다. 그러나, 본 발명은 실시예의 범위에 의해 제한되지는 않으며, 단지 본 발명의 일부분을 예시할 뿐이며, 기능적으로 동일한 범위의 방법도 본 발명의 범위에 속한다. 하기에 기재된 것에 추가로 이후의 설명 및 이에 따르는 도면으로부터 본 발명을 다양하게 변형하는 것도 당업자에게는 용이하다. 이러한 변형은 첨부되는 청구항의 범위 내의 것으로 간주된다. 명세서의 나머지를 설명하기 위해, 하기에 도면의 범례에 대한 설명이 첨부된다.
도 1: 부착 비의존성 닭 EBx 세포
도 1a: 무혈청 배지 내에서의 부착 비의존성 닭 Valo Ebv 13 세포
EBv13 세포를 37℃에서 현탁 상태로 무혈청 배지 Excell 65319(SAFC)에서 배양하였다. EBv13 세포는 균질한 크기를 가지며 느슨하게 응집하면서 성장한다. 집단 배가 시간은 약 16 내지 18 시간이고, 교반 플라스크(agitated flask) 용기 내의 세포 밀도는 약 4-5 백만 세포/㎖이다.
도 1b: 무혈청 배지 내에서의 부착 비의존성 닭 EB Line 0 세포
EB Line 0 세포를 무혈청 배지 Excell 66444(SAFC) 부유물 내에서, 39℃에서 배양하였다. EB Line 0 세포는 균질한 크기를 가지며 배양액 내에서 약하게 응집하면서 성장한다.
도 2: 닭 Valo EBv13 세포가 나타내는 높은 레벨의 텔로머라아제 발현
계대 193에서 나타나는 EBv13 세포는 계대 164(Master cell Bank:MCB), 또는 계대 184(WOrkin Cell bank:WCB)에서의 닭 EB14-O74 세포(WO03/076601 참조)에서와 같은 정도로 텔로머라아제가 높게 발현된다. 쥣과 배아 줄기 세포(Murine embryonic stem cells; mES)는 양성 대조군으로, 쥐 섬유아세포(FED)는 음성 대조군으로 사용되었다.
도 3a 및 3b: 폭스 바이러스에 대한 닭 Valo EBv13 의 민감성( susceptibility )
EBv13(계대 188)를 SFM Excell 배지 65319 또는 4 mM 글루타민이 첨가된 G9916 SFM 배지(SAFC) 중 어느 하나의 40 ㎖를 부피 100mL의 F175 플라스크에 0.4x106 세포/㎖를 접종하였다. 세포 성장과 MVA-GFP(MOI 10-2 TCID 50/세포)로의 감염은 37℃에서 수행하였다. 감염 후 1시간 뒤, 신선한 배지 60 ㎖를 첨가하였다.
도 3a: SFM Excell 배지 65319 또는 G9916 SFM 배지(SAFC)에서의 세포 밀도 역동학.
도 3b: SFM Excell 배지 65319 또는 G9916 SFM 배지(SAFC)에서의 TCID50/㎖ 내에서 발현된 MVA 생산성.
도 4: 오리 EBx 세포의 투과전자현미경 분석
Dr.A Rivoire(Lyon, 프랑스)가 dEBx 세포의 투과전자현미경 분석을 수행하였다. 오리 EBx 세포는, WO 2006/108846에 개시되어 있는 VIVALIS EB14 세포와 쥐과 배아 줄기 세포의 표현형과 닮은 전형적인 배아 줄기 세포 형태(즉, 높은 핵-세포질 비율)를 보인다. 오리 EBx 세포는 큰 핵과 핵소체를 갖고, 세포질 막으로부터 뻗어가는 짧은 위족을 갖는 작고 둥근 세포이다. 이들은 리보좀과 미토콘드리아가 풍부한 세포질을 가져서 대사활성이 높다.
도 5a와 5b: 오리 EBx 세포주 내에서의 텔로머라아제 발현
오리 EBx 세포의 여러 가지 수립 단계 동안의 텔로머라아제 발현은 로슈사의 텔로머라제 검출 킷트(Telomerase OCR ELISA)를 사용하여 확인하였다.
도 5a: 텔로머라아제는 닭 EBv13 세포의 경우와 마찬가지로 서로 다른 여러 가지 부착성 오리 EBx 세포주에서 높은 발현율을 나타내었다. 텔로머라아제를 발현하지 않는 오리 상피 세포가 음성 대조군으로 사용되었다.
도 5b: 현탁 오리 EBx 세포의 수립 과정 동안, 높은 레벨의 텔로머라아제 발현이 유지되었다. 영양 고갈(영양 세포와 함께 또는 영양 세포 없이) 동안, 오리 EB26 세포를 현탁 상태로 하는 공정 동안, 그리고 dEB24 및 dEB26의 혈청 고갈 후, 오리 EBx 세포에서 텔로머라아제가 높은 수준으로(대량) 조사되었다.
EB24와 EB26 등의 오리 EBx 세포는 닭 EB14 세포와 같이 높은 레벨의 텔로머라아제를 발현한다. 또한, 오리 EB66은 높은 레벨의 텔로머라아제를 발현한다(데이터는 미제시).
도 6a 및 6b: 오리 EBx ®세포는 내인성 역전사효소 활성을 나타내지 않는다.
도 6a: 내인성 역전사 효소 발현은 Clean Cells(FRANCE) 내의 direct FPERT 분석법(Lovatt et al., 1999, J. Virol. Methods, 82:185-200)에 의하여 조사되었다. 오리 EBx® 세포주, EB26과 EB5-1은 내인성 역전사 효소(RT) 활성을 나타내지 않는다. 특정 무병원체(SPF) 닭 계통에서 유래된 닭 배아 섬유아세포(CEF)내에서의 적은 연장뿐만 아니라, 닭 EB14와 EBv13 세포 배양액(서로 다른 계대 배양에서)에서도 높은 레벨의 RT 활성이 검출되었다. RTase 음성인 CEM 세포는 분석의 검출 제한에 대한 음성 대조군으로 사용되었다.
도 6b: 오리와 닭 EBx 세포의 배양 배지 상청액 내의 증식(즉, 복제 가능)하거나 증식하지 않는 내인성 레트로바이러스 입자의 존재는 조류 백혈증 주요 캡시드 항원 P27을 검출하는 ELISA 분석법에 의하여 조사되었다. 닭 EBv13 뿐 아니라, 오리 EBx 세포주, EB26과 EB5-1는 ALV p27 항원을 분비하지 않는다. 반대로, 닭 EB14 세포는 ALV P27 항원을 발현한다.
도 7a 및 도 7b: 오리 EBx 세포는 복제하는 조류 백혈병 바이러스( ALV )를 분비하지 않는다.
내인성 그리고 외인성 ALVs에 민감한 것으로 알려진 quail QT6 세포주와 오리 EBx 세포의 공동 배양 분석은, 내인성 복제 오리 바이러스의 존재를 검출하기 위하여 Bioreliance(UK)에서 수행되었다.
도 7a: QT6의 공동배양 원리를 기술.
도 7b: 복제되는 바이러스의 존재를, 조류 백혈증 주요 캡시드 항원 P27을 측정하는 ELISA 분석법에 의하여 측정.
분석법은 테스트된 오리 EBx® 세포(dEB26과 dEB51)가 복제하는 ALV를 분비하지 않는다는 것을 증명한다. QT6 내에서 복제하는 것으로 알려진 RAV-1 바이러스는 양성 대조군으로 사용되었다.
도 8: 오리 EBx 와 닭 EB14 세포주 내에서의 수용체 SA α2-3과 SA α2-6의 세포 표면 발현
세포는 디그옥시게닌(digoxygenin) 표지된 렉틴과 배양된다: 삼부카 니그라(Sambuca nigra) 어글루티닌 렉틴은 Siα2-6Gal에 특이적으로 결합하지만, 마키아 아뮤렌시스(Maackia amurensis) 어글루티닌 렉틴은 Sia2-3Gal에 특이적으로 결합한다. 세포에 결합한 렉틴은 당업자에게 널리 알려진 기술에 따라 항-디그옥시게닌 항체 FITC-표지에 의해 확인된다. FITC-표지된 세포는 형광표지세포분리기(FACS)를 이용해 갯수를 셀 수 있다. SAα2-3 및 SAα2-6 분자는 조류 및 인간 인플루엔자 바이러스 각각에 대한 수용체로 기술되었다. 대부분 모든 오리 EBx 세포가 세포 표면에 수용체 SAα2-3 및 SAα2-6 분자를 고도로 발현한다.
도 9a 및 9b: 감염된 오리 EBx 세포 내의 MVA - GFP 바이러스 증식
도 9a: 세포 배양 SFM 배지에서 세포를 증식시키는 동안, T175 교반 탱크 플라스크에서 오리 EBx®가 작은 클럼프를 형성하도록 유지시켰다. 그리고 난 후, MVAGFP 바이러스의 10-2 TCID50/세포를 클럼프에 감염시켰으며, 상기 혼합물을 생산 SFM 배지로 희석시켰다. 37℃에서 6일 동안의 바이러스 증식 기간 동안, UV-노출 감염 세포 사진을 매일 찍었다. MVA 감염은, 감염 후 4일에서 최대량에 도달하였다. 감염 후 6일, 감염된 세포가 사멸하기 시작한다.
도 9b: 3L 페드-배치 생물반응 장치 내의 오리 EBx® 세포 내에서 증식된 MVA-GFP 바이러스 역가 분석.(왼쪽 패널) 오리 EBx 유래 바이오매스는 세포 성장 배지(SAFC)에서 세포 증식기 동안 축적되도록 하였다. 4일째, 세포 밀도가 4 백만 세포/㎖에 도달하였다. 그리고 난 후, 10-1 TCID50/MVA-GFP의 세포로 세포를 감염시키고 상기 혼합물을 1.5L Excell 배지 내에서 희석시켰다.
37℃에서 6일 동안의 바이러스 증식 기간 동안, 샘플을 매일 수득하였으며, TCID50 역가 분석(오른쪽 패널)은 매일 역동학 마지막에 수행하였다. 205 TCID50/세포의 산출물에 대응하는 8.5 log TCID50/㎖가 감염 후 4일째에 도달하였다.
도 10: EBx ® 세포 클럼프의 크기에 대한 SFM 배지에서의 칼슘과 마그네슘 농도의 영향
도 10a: 닭 EBv13 세포는 고농도의 칼슘(Ca2+)(대략, 0.79 mM)와 마그네슘 이온(Mg2+)을 포함하는 SAFC Bioscience의 SFM 배지 내에서 처음 배양하였다: 이 배지 내에서, 세포는 배양액 내에 큰 응집체를 생산한다.
저농도의 Ca2+(최종 0.03 mM)와 Mg2+(최종 1.6mM)를 함유하는 동일한 SFM 배지로 세포 배양 배지를 변경하고 3일 후, 세포는 작은 응집체를 형성한다.
도 10b: 오리 EB24, EB26 및 EB66 세포를 고농도의 칼슘(Ca2+)(대략 0.79 mM)과 마그네슘(Ma2+) 이온을 포함하는 SAFC Biosciences의 SFM 배지 내에서 처음 배양하였다: 이 배지에서, 세포는 배양액 내에서 큰 응집체를 생산한다.
*저농도의 Ca2+(최종 0.03 mM)와 Mg2+(최종 1.6mM)를 함유하는 동일한 SFM 배지로 세포 배양 배지를 변경하고 3일 후, 세포는 작은 응집체를 형성한다.
도 11a 및 11b: 3L 생물반응기에서 오리 EBx 세포에서의 인플루엔자 바이러스 균주 A의 생산
오리 EBx® 바이오매스가 37℃에서 세포 성장 배지에서 세포 증식기 동안 축적되도록 유지시켰다. 그리고 난 후, 10-4TCID50/A/H1N1/Beijing/262/95 또는 A/H3N2/New York/55/2004 인플루엔자 바이러스의 세포로 상기 세포를 감염시켰으며, 이 혼합물을 0.75 USP/mL 의 트립신이 첨가된 1.5 L Excell 생산 배지(배지 E)로 희석시켰으며, 온도를 33℃로 낮추었다. 14일의 바이러스 증식 기간 동안, 샘플을 매일 수득하였으며, -80℃에 보관하였다.
도 11a: A/H1N1/Beijing/262/95 인플루엔자 바이러스 균주로 감염된 오리 EBx 세포의 성장 역동학
왼쪽 패널: 세포 농도(마름모, x106세포.㎖-1)와 log TCID50/㎖ 에서의 바이러스 역동학.
오른쪽 패널: 총 세포 수(사각형), 생존도(검은색 원, %) 및 헤마글루티닌 농도 ㎍/㎖(빨간 원, %).
배양 상청액의 ㎖당 헤마글루틴의 바이러스 산출물은 20 ㎍에 도달하였다.
도 11b: A/H3N2/New York/55/2004 인플루엔자 바이러스 균주로 감염된 오리 EBx 세포의 성장 역동학
왼쪽 패널: 세포 농도(마름모, x106세포.㎖-1)
오른쪽 패널: 총 세포 수(사각형), 생존도(검은색 원, %) 및 헤마글루티닌 농도 ㎍/㎖(빨간 원, %).
배양 상청액의 ㎖당 헤마글루틴의 바이러스 산출물은 30 ㎍에 도달하였다.
도 12: 오리 EBx ® 세포 내의 인플루엔자 바이러스 균주 B의 생산
오리 EBx® 바이오매스가 37℃에서 세포 성장 배지에서 세포 증식기 동안 축적되도록 유지시켰다. 그리고 난 후, 10-3TCID50/B/Jiangsu/10/2003 인플루엔자 바이러스로 상기 세포를 감염시켰으며, 이 혼합물을 0.75 USP/mL 의 트립신이 첨가된 1.5 L Excell 생산 배지(배지 E)로 희석시켰으며, 온도를 33℃로 낮추었다. 14일의 바이러스 증식 기간 동안, 샘플을 매일 수득하였으며, -80℃에 보관하였다.
왼쪽 패널: 세포 농도(마름모, x106세포.㎖-1)
오른쪽 패널: 총 세포 수(사각형), 생존도(검은색 원, %) 및 헤마글루티닌 농도 ㎍/㎖(빨간 원, %).
배양 상청액의 ㎖당 헤마글루틴의 바이러스 산출물은 25 ㎍에 도달하였다.
도 13: 오리 EB66 세포 현탁액 내의 NDV 생산성과 바이러스 단백질 발현의 분석(MOI 10-3, 0.75 USP/mL 트립신)
오리와 닭 EBx 세포는 NDV La Sota 균주에 대해 민감하고 이를 복제한다. 오리 EB66 세포 내에서 생성된 NDV의 역가(TCID50/㎖)는 감염 후 제0일에서 제2일까지, 평균 106.83TCID50/mL에 달할 정도로 증가한다(도 13 왼쪽 패널).
웨스턴 블랏 분석(도 13 오른쪽 패널)은 NDV 바이러스성 단백질(HN, Fo.F, NP & M) 발현을 보여준다. 오리 EB66 세포들 내에서 생성된 NDV 바이러스의 바이러스 단백질 조성은 닭 EB14 세포 내에서 생성된 NDV 바이러스를 수득한 것과 유사하다. 따라서, 닭과 오리 EBx 세포들에서 생성된 바이러스에 대한 방출 역가 분석은 유사하다.
도 14: 무혈청 배지에서의 조직-배양 플라스크 내의 오리 EB66 세포( MOI 10 - 1 또는 10 -2 ) 현탁액 내의 재조합 홍역 바이러스 복제의 분석
오리 EB66 세포는 최소한 홍역 바이러스에 의하여 감염되는 VERO 세포만큼 민감하다. 오리 EB66 세포주 내에서 생성된 초록 형광 단백질(GFP)을 발현하는 재조합 홍역 바이러스의 역가 분석(TCID50/㎖에서)은 감염 후 6 일째에 107 TCID50/㎖에 도달한다.
도 15a 및 도 15b: 오리 EB66 세포 내의 SSEA -1, EMA -1 & 텔로머라아제 발현
롤러 용기(roller bottle) 내에서 배양된 오리 EB66의 서로 다른 계대에서의 텔로머라아제 발현을 로슈사의 텔로머라제 검출 킷트(Telomerase OCR ELISA)를 사용하여 확인하였다. 롤러 용기 내에서 배양된 오리 EB66의 서로 다른 계대에서의 SSEA-1와 EMA-1가 FACS 분석법에 의하여 조사되었다.
도 15a: 서로 다른 계대(138, 144, 147, 150, 154)에서의 오리 EB66 세포주 현탁액에서 고도로 발현되는 텔로머라아제가 확인됨.
도 15b: 서로 다른 계대(138, 144, 147, 150, 154)에서의 오리 EB66 세포주 현탁액에서 고도로 발현되는 SSEA-1와 EMA-1 세포 표면 마커가 확인됨.
도 16: 오리 EB66 세포의 핵형 분석
오리 EB66 세포 핵형은 Pr.Franck,ENVL, Lyon에 의하여 수행되었다. EB66 세포는 이배체 세포이다.
실시예 1: SPF 닭 계통 VALO 로부터 유래된 닭의 EBv13 세포주
1.1 재료
알
특정 무병원체(SPF) 균주를 발로(Valo)라고 칭하였다. 상기 발로 균주는 독일의 로만사에 의하여 생산되고 전달된 화이트 레그혼 균주이다. 그러한 SPF 닭의 달걀을 다음에 대하여 시험하였으며, 분석 증명서를 첨부하였다: CAV, 조류 아데노바이러스(군 1, 항원형 1-12 그리고 군 3), EDS, 조류 뇌척수염 바이러스, 조류 백혈구 감소증 바이러스/RSV(항원형 ALV-J 포함), 조류 신장염 바이러스, 조류 레오바이러스, 계두 바이러스, 전염성 기관지염 바이러스, 전염성 활액낭염 바이러스(IBDV), 전염성 후두기관염 바이러스, 인플루엔자 바이러스 종류 A, 마렉병 바이러스, 마이코플라즈마병(Mg+Ms), 마이코박테리움 에이비움(Mycobacterium avium), 뉴캐슬병 바이러스, 세망내피증 바이러스(Reticuloendotheliosis Virus), 살모넬라 폴로롬(Salmonella pullorum), 다른 살모넬라 감염, 조류 비기관염 바이러스(Avian Rhinotracheitis virus), 헤모필러스 파라갈리나룸. 발로(Valo) 닭 달걀은 수송 동안의 오염의 모든 위험을 피하기 위하여 정화제로 소독하였다.
영양 세포
EBv13의 확립 방법의 제 1단계에서, 닭 줄기 세포의 다능성을 유지하기 위해 생쥐 기원의 세포(STO 세포)를 영양 세포층으로 사용하였다. 이 영양 세포는 플라스틱에 접종하기 전에 감마선 조사(45 내지 55 Gray)하여 유사분열을 불활성화시켰다. 조사량은 세포 주기를 명확하게 정지시키도록 유도하지만 미분화된 세포의 세포 성장을 촉진하는데 필수적인 성장 인자 및 세포외 매트릭스의 생산은 여전히 허용하는 아-치사량이다.
STO 세포주는 캐나다 토론토의 온타리오 암 연구소의 A. Bernstein에 의하여 SIM(Sandos Inbred Mice) 생쥐 배아 섬유아세포의 계속주로부터 유도된 것이며, 이는 미국 세포주 은행(ATCC, STO 제품 번호: CRL-1503, 배치 번호 1198713)에서 공급받았다. 새로운 영양 세포층은 1주에 2회, 일반적으로 월요일과 목요일에 준비하였다. 대수증식 세포를 분리하고 계수하였다. 세포의 일부는 생존 세포를 유지하기 위해 접종하였고, 나머지 부분은 조사하였다. 조사하기 위해, 튜브 당 10x106 세포/ml 농도로 세포 현탁액을 준비하였다. 세포에는 45 내지 55 그레이 용량으로 노출시키고 플라스틱에 접종하였다. 접종하고 난 뒤, 비활성화된 영양 세포로 코팅한 디쉬 또는 플레이트는 최대 5일 동안 사용하였다.
배지
DMEM-HamF12(Cambrex, 카탈로그 번호 BE04-687)
Optipro 배지(Invitrogen, 카탈로그 번호 12309)
EX-CELLTM 65195, 60947 및 65319(SAFC, 주문 배지)
첨가제
글루타민(Cambrex, 카탈로그 번호 BE17-605E)
페니실린/스트렙토마이신(Cambrex, 카탈로그 번호 BE17-602F)
비필수 아미노산(Cambrex, 카탈로그 번호 BE13-114E)
소듐 피루베이트(Cambrex, 카탈로그 번호 BE13-115)
비타민(Cambrex, 카탈로그 번호 13-607C)
베타 머캅토 에탄올(Sigma, 카탈로그 번호 M7522)
버퍼 및 고정인자
PBS 1×(Cambrex, 카탈로그 번호 BE17-516E)
파라포름알데하이드 4%(Sigma, 카탈로그 번호 P6148)
KCl 5,6%(Sigma, 카탈로그 번호 P9333)
메탄올/아세트산(3/1): 메탄올(Merck, 카탈로그 번호 K34497209; Acetic acid Sigma Cat 카달로그 번호 A6238)
콜세미드(colcemid), 카리오맥스(Karyomax)(Gibco, 카탈로그 번호 15212-046)
동결 억제제
디메틸 설폭사이드(Dimethyl Sulfoxydel; DMSO)(Sigma, 카달로그 번호 D2650)
인자
2개의 다른 재조합 인자가 사용되었다:
□ 재조합 인간 섬모 신경영양 인자(CNTF)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 450-13)
□ 재조합 인간 인슐린 유사 인자 I(IGF I)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 100-11)
두 개의 인자가 대장균 박테리아에서 생산되었다.
우태아 혈청
비조사된 우태아 혈청( FBS )( JRH , 카탈로그 번호 12103)
프로그램에 사용된 비 조사된 혈청은 미국에서 수득하고 생산하였다. 수득에 사용한 동물은 USDA 검사하였으며 도살하기에 적합하다. 이 혈청은 조류 줄기 세포 배양 동안 배지에 첨가하였다. 이 배지는 배양동안 줄기 세포의 유지에 필수적일 수 있는 필수적인 단백질 또는 성분이 파괴되는 것을 막기 위해 조사를 하지 않았다.
조사된 혈청( JRH , 카탈로그 번호 12107)
이 프로그램에 사용한 조사된 배치는 미국에서 수득하였다. 이 조사된 배치는 STO 세포 또는 FED 세포(영양 세포) 배양에 사용되는 DMEM 배지에 첨가물로서 첨가되었다. 이 세포들은 줄기 세포로서 배양 동안 성장과 유지를 하기 위한 특정v품질의 혈청을 필요로 하지 않는다. 배지에 있는 고농도의 혈청을 최소화하기 위해 STO 세포의 성장에는 오직 4%의 FBS 만을 사용하였다.
해리제
프로나아제 ( Roche , 카달로그 번호 165 921)
프로나아제는 고착 조류 줄기 세포의 해리에 사용하기 위하여, 독일의 Roche Diagnostics에 의하여 제조된 재조합 프로테아제이다.
트립신 EDTA ( Cambrex , 카달로그번호 BE17 -161E)
트립신은 STO 또는 FED 세포의 해리를 위하여 및 늦은 계대 배양시 무혈청 배지에 적응된 조류 세포의 해리를 위하여 사용할 수 있다. 돼지 기원의 이 효소는 허가 멸균 여과 방법에 의하여 cGMP 참조 조건에 따라 무균으로 제조되어 현재 E.P.에 따라 시험되었다. 상기 조성 전에 조사된 실험 재료는 엄격히 9/CFR 113.53에 따라 돼지 파보바이러스에 대하여 시험되었다.
비효소적 세포 해리 용액( Sigma , 카달로그번호 C5914 )
이 해리제는 배양 용기의 성장 표면으로부터 천천히 세포를 떼어내는데 사용되는 즉시 사용 가능한 제형이다. 상기 방식은 단백질을 함유하지 않고, 효소를 사용하지 않고 세포를 제거하도록 해준다. 세포 단백질은 보존되어 세포 표면 단백질 인식에 따라 가능한 면역화학적 연구를 가능하게 한다. 이 효소는 EMA-1(상피막 항원 1)과 SSEA1(발생 단계 특이적 태아성 항원-1) 등의 생물학적 마커의 FACS 분석 전에 세포를 떼어내는데 사용하였다.
1.2 - EBv13 세포주의 확립 방법
달걀들을 깨고, 깬 상태에서 난황을 난백으로부터 분리한다. 배아들을 난황으로부터 파스퇴르 피펫을 이용하여 직접 또는 천공기를 이용하여 관통된 고리의 형태로 미리 절단한 작은 흡착 여과지(Whatmann 3M paper)를 이용하여 제거한다. 상기 천공의 직경은 약 5 ㎜이다. 이들 작은 고리들은 오븐에서 약 30분간 건조 가열하여 멸균된다. 이 작은 종이 고리를 상기 난황의 표면에 놓는데, 배아가 상기 종이 고리에 의해 둘러싸이도록 배아를 중앙에 놓았다. 그 후에 작은 가위를 이용하여 절단되고 완전히 제거된 배아를 PBS 또는 생리식염수로 채워진 페트리 디쉬에 놓는다. 상기 고리에 의해 그렇게 제거된 배아는 배지 내에서 과량의 난황이 제거되고, 그로 인해 과량의 비텔린이 제거된, 배아 디스크를 파스퇴르 피펫을 이용하여 회수한다.
닭 Valo 배아들을 생리학적 배지(1× PBS, 트리스 글루코스, 배지 및 기타 등등)를 함유하는 튜브 내에 놓는다. 그리고 나서, Valo 배아들을 물리적으로 분해시키고, 완전 배양 배지에 들어 있는 STO 영양 세포층에 접종하여 39℃로 유지시켰다. 영양 세포는 약 2.7 X 104 세포/cm2의 플라스크에 접종하였다. 완전 배양 배지는 10% 우태아 혈청, 최종 농도가 1 ng/㎖인 IGF1와 CNTF, 1%의 비필수 아미노산, 1%의 상업적 기원의 비타민 혼합물, 최종 농도 1 mM의 소듐 피루베이트, 최종 농도 0.2 mM의 베타-머캅토-에탄올, 최종 농도 2.9 mM의 글루타민, 최종 농도 100 U/㎖의 페니실린, 최종 농도 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신이 첨가된 기본 상업적 배지 DMEM-Ham F12로 구성된다. 세포의 제1 계대 후 즉시, 항생제의 혼합물이 배지에 더이상 첨가되지 않는다. 상기 즉시라는 표현은 일반적으로 처음 3 내지 5 계대 배양 후로 이해된다.
닭 Valo 배아의 조류 ES 세포가 배양 디쉬에서 다른 곳으로 계대 배양될 때, 배양 디쉬의 접종은, 완전 배양 배지 내의 조류 ES 세포의 약 7×104/cm2 내지 8×104/cm2로 수행된다. 좋기로는, 상기 접종은 약 7.3×104/cm2(4×106세포/55cm2 또는 4×106세포/100 mm 디쉬)인 것이 좋다. 상기 조류 세포는, 좋기로는 단계 a)의 조류 배아 세포가 완전 배지에서 여러 차례의 계대 동안 배양된다. 15회의 계대 접종에서, 완전 배지는 성장 인자 IGF1 과 CNTF가 결핍된다. 상기 결핍은 한 계대 접종으로부터 다른 계대 접종으로, 한 단계에서 직접적으로 이루어진다. 상기 배아 줄기 세포는, 좋기로는 조류 배아 세포가 IGF1과 CNTF 성장 인자가 없는 완전 배지 내에서 여러 차례 계대 배양 접종 동안에 배양된다.
영양 세포들의 결핍은 성장 인자 IGF1과 CNTF의 결핍 후에, 수 차례 이상의 계대 접종에서 영양 세포 농도가 점진적으로 감소됨으로써 수행되었다. 실제로는, 동일한 농도의 영양세포들이 2 내지 4회 계대 접종 동안에 사용되고, 그 후에 상기 영양세포들의 보다 낮은 농도가 추가적인 2 내지 4회 계대 접종 동안에 사용된다. 플라스크는 처음에는, 약 2.7×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 다음에는 약 2.2×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 다음에는 약 1.8×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 다음에는 약 1.4×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 다음에는 약 1.1×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 다음에는 약 0.9×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 다음에는 약 0.5×104 영양세포들/㎠으로 접종된다. 그리고 나서, 상기 플라스크는 영양세포들 없이 6.5×104 조류 세포들/㎠ 내지 7.5×104 조류 세포들/㎠로 접종된다. 영양 세포의 고갈은 약 계대 접종 21에서 시작하여 약 계대 접종 65에서 끝난다. 영양 세포의 고갈 동안, 닭 Valo ES 세포는 단계 a)에서, 약 4×104 세포/㎠ 내지 5×104 세포/㎠ 의 저농도로 배양 플라스크에 접종된다. 플라스크내의 영양 세포 농도의 감소에 따라 Valo ES 세포의 형태가 불량한 것으로 가정될 경우, 영양 세포를 고갈시키기 전에, 상기 조류 세포를 동일한 영양 세포 농도 하에 추가 계대 배양시킨다.
혈청 고갈은 성장 인자와 영양 세포들 고갈 후에 수행되었다. 혈청 고갈의 시작에 있어서, 배양 배지는 10% 우태아 혈청, 1%의 비필수 아미노산, 1%의 상업적 기원의 비타민 혼합물, 최종 농도 1 mM의 소듐 피루베이트, 최종 농도 0.2 mM의 베타-머캅토-에탄올, 최종 농도 2.9 mM의 글루타민이 첨가된 기본 상업적 배지 DMEM-Ham F12로 구성된다. 닭 Valo 세포는 두 단계 공정 동안에, 무혈청 배지 배양에서 성장하는데 적응시킬 수 있다; 첫 번째, 닭 Valo 세포는10% 우태아 혈청, 1%의 비필수 아미노산, 1%의 상업적 기원의 비타민 혼합물, 최종 농도 1 mM의 소듐 피루베이트, 최종 농도 0.2 mM의 베타-머캅토-에탄올, 최종 농도 2.9 mM의 글루타민이 첨가된 상업적 비혈청 배지(SFM), 좋기로는 Excell 60947(SAFC Biosciences)로 구성된 배양 배지에 재빨리 적응시킨다. 한번 새로운 배지(DMEM-HamF12에서 Excell 60947)로 이러한 빠른 적응을 수행하면, SFM 배지 내의 동물 혈청의 농도를 천천히 감소하는 두 번째 단계를 수행한다. 혈청 고갈은, SFM 세포 배양 배지 내의 혈청 농도 10%, 그리고 나서 7.5%, 그 후 5%, 그 후 2.5%, 그 후 1.25%, 그 후 0.75%에서 최종적으로 SFM 세포 배양 배지 내에 0% 혈청으로 되도록 처음부터 점진적으로 수행하였다. 혈청 고갈은 계대 접종 103에서 시작하여 최종 135 계대 접종에서 끝난다.
SFM 배지 중의 잔존 혈청 농도가 0.75% 또는 0%인 혈청 고갈 단계 말기에, 부착 비의존성 EBv13 세포의 현탁 배양에 대한 적응을 개시하였다. 부착 비의존성 EBv13 단리물을 단리하기 위해 수행된 수 차례 시도 중에서, 상기 시도의 62.5%는 성공적이었고, 현탁 EBv13 세포의 여러 가지 단리 추출물을 얻는 것이 가능했다. 개체 배가 시간(약 18시간), 플라스크 배양시 최적 세포 농도(약 4백만개 세포/㎖), 세포 생존성, 세포 배양 동질성(세포 무리의 존재와 크기) 및 세포 조작의 용이성에 따라 EBv13 세포의 단리물을 선택하였다(도 1).
혈청 고갈의 마지막에, EBv13 라고 불리는부착 비의존성 닭 Valo 세포는 성장 인자가 없어도, 영양 세포가 부재해도, 무혈청 배지에서도 성장할 수 있다. 점진적으로 세포 배양 온도를 0.5℃/1일씩 감소시켜서, EBv13 세포는 37℃에서 성장하도록 적응된다.
실시예 2: SPF 닭 균주 ELL -0의 닭 EB Line 0 세포주
2.1 재료
알
Avian Disease and Oncology Laboratory(USDA-ARS-MWA, USA)에서 ELL-0(East Lansing Lin 0)라고 불리는 특정 무병원체(SPF) 균주를 제공받았다. SPF 닭의 달걀들은, 다양한 가금 병원균에 대하여 철저하게 시험받은 무리에서 생산한다. 시험받은 질환으로는 다음을 포함한다: 살모넬라 폴로롬, 살모넬라 갈리나룸, 마이코플라즈마 갈리셉티쿰, 마이코플라스마 시노비애, 조류 백혈증 바이러스 A-D 및 J, 마렉병 바이러스, 세망내피증 바이러스, 조류 아데노바이러스, 전염성 기관지염, 전염성 훼브리셔스낭병, 조류 인플루엔자, 뉴캐슬병 바이러스, 닭 뇌척수염(Avian encephalomyelitis) 및 조류 레오바이러스. Line 0 닭의 달걀은 수송 동안의 오염의 모든 위험을 피하기 위하여 정화제로 속독하였다.
영양 세포
EB Line 0의 확립 방법의 제 1단계에서, 닭 줄기 세포의 다능성을 유지하기 위해 생쥐 기원의 세포(STO 세포)를 영양 세포층으로 사용하였다. 이 영양 세포는 플라스틱에 접종하기 전에 감마선 조사(45 내지 55 Gray)하여 유사분열을 불활성화시켰다. 조사량은 세포 주기를 명확하게 정지시키도록 유도하지만 미분화된 세포의 세포 성장을 촉진하는데 필수적인 성장 인자 및 세포외 매트릭스의 생산은 여전히 허용하는 아-치사량이다.
STO 세포주는 캐나다 토론토의 온타리오 암 연구소의 A. Bernstein에 의하여 SIM(Sandos Inbred Mice) 생쥐 배아 섬유아세포의 계속주로부터 유도된 것이며, 이는 미국 세포주 은행(ATCC, STO 제품 번호: CRL-1503, 배치 번호 1198713)에서 공급받았다. 새로운 영양 세포층은 1주에 2회 대수증식 세포를 분리하고 계수하였다. 세포의 일부는 생존 세포를 유지하기 위해 접종하였고, 나머지 부분은 조사하였다. 조사하기 위해, 튜브 당 10x106 세포/ml 농도로 세포 현탁액을 준비하였다. 세포에는 45 내지 55 그레이 용량으로 노출시키고 플라스틱에 접종하였다. 접종하고 난 뒤, 비활성화된 영양 세포로 코팅한 디쉬 또는 플레이트는 최대 5일 동안 사용하였다.
배지
DMEM-HamF12(Cambrex, 카탈로그 번호 BE04-687)
배지 GTM-3(Sigma, 카탈로그 번호 G9916)
배지 EX-CELLTM 66522, 65788 및 66444(SAFC, 주문 배지)
첨가제
글루타민(Cambrex, 카탈로그 번호 BE17-605E)
페니실린/스트렙토마이신(Cambrex, 카탈로그 번호 BE17-602E)
비필수 아미노산(Cambrex, 카탈로그 번호 BE13-114E)
소듐 피루베이트(Cambrex, 카탈로그 번호 BE13-115)
비타민(Cambrex, 카탈로그 번호 13-607C)
베타 머캅토 에탄올(Sigma, 카탈로그 번호 M7522)
이스톨레이트(SAFC, 카달로그 번호 58902C)
버퍼 및 고정인자
PBS 1×(Cambrex, 카탈로그 번호 BE17-516F)
동결 억제제
디메틸 설폭사이드(Dimethyl Sulfoxydel; DMSO)(Sigma, 카달로그 번호 D2650)
인자
6개의 다른 재조합 인자가 사용되었다:
□ 재조합 인간 섬모 신경영양 인자(CNTF)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 450-13)
□ 재조합 인간 인슐린 유사 인자 I(IGF I)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 100-11)
□ 재조합 인간 인터루킨 6(IL 6)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 200-6)
□ 재조합 인간 수용성 인터루킨 6 수용체(sIL6r)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 200-06R)
□ 재조합 인간 줄기세포 인자(SCF)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 300-07)
□ 재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 100-18B)
IL6r를 제외한 이들 인자 모두는 대장균 박테리아에서 생산되었다. 수용성 IL6r는 형질전환된 HEK293 세포에서 발현된다.
우태아 혈청
비조사된 우태아 혈청( FBS )( SAFC , 카탈로그 번호 12003)
프로그램에 사용된 비 조사된 혈청은 호주에서 수득하고 생산하였다. 수득에 사용한 동물은 USDA 검사하였으며 도살하기에 적합하다. 이 혈청은 조류 줄기 세포 배양 동안 배지에 첨가하였다. 이 배치는 배양동안 줄기 세포의 유지에 필수적일 수 있는 필수적인 단백질 또는 성분이 파괴되는 것을 막기 위해 조사를 하지 않았다.
조사된 혈청( JRH , 카탈로그 번호 12007)
이 프로그램에 사용한 조사된 배치는 호주에서 수득하였다. 이 조사된 배치는 STO 세포 또는 FED 세포(영양 세포) 배양에 사용되는 DMEM 배지에 첨가물로서 첨가되었다. 이 세포들은 줄기 세포로서 배양 동안 성장과 유지를 하기 위한 특정v품질의 혈청을 필요로 하지 않는다. 배지에 있는 고농도의 혈청을 최소화하기 위해 STO 세포의 성장에는 오직 4%의 FBS 만을 사용하였다.
해리제
트립진( Sigma , 카달로그 번호 T3449 )
실시예 2-2 LINE 0 세포주의 확립 방법
Line 0 닭의 13개의 달걀에서 배아들을, 실시예 1.2에서 기술한 방법에 따라 수집하였다. 그 후, Line 0 배아들을 1× PBS를 함유하는 튜브 내에 놓는다. 그리고 나서, 배아를 물리적으로 분해시키고, 완전 배양 배지에 들어 있는 STO 영양 세포층에 접종하여 39℃로 유지시켰다. 영양 세포는 약 2.7 X 104 세포/cm2의 디쉬에 접종하였다. 완전 배양 배지는 10% 우태아 혈청, 최종 농도가 1 ng/㎖인 IGF1, CNTF, bFGF, IL6, IL6r 및 SCF 1%의 비필수 아미노산, 1%의 상업적 기원의 비타민 혼합물, 최종 농도 1 mM의 소듐 피루베이트, 최종 농도 0.2 mM의 베타-머캅토-에탄올, 최종 농도 2.9 mM의 글루타민, 1 X 이스톨레이트, 최종 농도 100 U/㎖의 페니실린, 최종 농도 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신을 포함하는 항생제의 초기 혼합물이 첨가된 기본 상업적 배지 DMEM-Ham F12로 구성된다. 세포의 제7 계대 후, 항생제의 혼합물이 배지에 더이상 첨가되지 않는다.
닭 Line 0 배아의 조류 ES 세포가 배양 디쉬에서 다른 곳으로 계대 배양될 때, 배양 디쉬의 접종은, 완전 배양 배지 내의 조류 ES 세포의 약 7×104/cm2 내지 8×104/cm2로 수행된다. 좋기로는, 상기 접종은 약 7.3×104/cm2(4×106세포/55cm2 또는 4×106세포/100 mm 디쉬)인 것이 좋다. 상기 조류 세포는, 좋기로는 단계 a)의 조류 배아 세포는 10 또는 15%의 FBS가 첨가된 완전 배지 내에서 여러 차례의 계대 동안 배양된다. 7회의 계대 접종에서, 완전 배지는 성장 인자 bFGF, IL6, IL6r 과 SCF가 결핍된다. 상기 결핍은 한 계대 접종으로부터 다른 계대 접종으로, 한 단계에서 직접적으로 이루어진다. 상기 배아 줄기 세포는, 좋기로는 조류 배아 세포가 4개의 성장 인자가 없는 완전 배지 내에서 여러 차례 계대 배양 접종 동안에 배양된다. 12회의 계대 접종에서, 마지막 2개의 인자 IGF1과 CNTF가 배지에서 제거되고 상기 세포는 인자 없이 증폭된다.
세포 성장 촉진을 위하여 3종의 기본 배지를 연속적으로 사용하였다: 1 내지 8 회차 계대 배양에서는 DMEM Ham F12, 18 내지 26 회차 계대 배양시는 Excell GTM-3, 그리고 26 회차 계대 배양 이후에는 Excell 66522와 Excell 66788의 혼합물을 사용하였다.
30 계대 접종 이후, 영양 세포의 고갈은 전술한 방법의 단계 후에 여러 차례의 계대 접종 동안에 영양 세포의 농도를 점진적으로 감소시킴으로써 수행하였다. 영양 손실의 단계 동안, 현탁액에서 성장하는 몇몇 세포들은 Excell 66444를 성장 배지로서 사용하여 추출할 수 있고, 혈청 손실을 시작하였다(도 1b).
실시예 3: 오리 EBx 세포주 EB66
3.1 - 재료
오리 알
페킨(Pekin) 종 GL30의 오리알은 GRIMAUD FRERES SELECTION(La Corbiere, Roussay France)으로부터 얻었다.부모 오리는 다음에 대해 예방접종하였다: 대장균(자가 백신 Coli 01&02), 파스츄렐라 멀토시다(Pasteurella multocida)(Landavax), 오리 바이러스 헤파티티스(Hepatovax), 에리시페로트릭스 류시오패시애(Erysipelothrix rhusiopathiae)(Ruvax), 조류 메타뉴모바이러스(Nemovac), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 과 엔테리디스(Enteridis)(자가 백신), 리메렐라 안티페스티퍼(Riemerella antipestifer)(자가 백신 Riemerella), 조류 메타뉴모바이러스(Nobilis RTV inactive) 및 에리시펠로트릭스 류시오패티에(Erysipelothrix rhusiopathiae)(Ruvax). 수여받고 난 뒤, 수정된 페킨 오리알은 저염소 욕조에서 소독한 뒤 껍질에 묻은 먼지와 함께 오염의 모든 위험을 피하기 위해 퍼마시달(Fermacidal, Thermo)로 오염을 제거하였다.
영양 세포
본 방법의 제1 단계에서, 오리 줄기 세포의 다능성을 유지하기 위해 생쥐 기원의 세포(STO 세포)를 영양 세포층으로 사용하였다. 이 영양 세포는 플라스틱에 접종하기 전에 감마선 조사(45 내지 55 Gray)하여 유사분열을 불활성화시켰다. 조사량은 세포 주기를 명확하게 정지시키도록 유도하지만 미분화된 세포의 세포 성장을 촉진하는데 필수적인 성장 인자 및 세포외 매트릭스의 생산은 여전히 허용하는 아-치사량이다. STO 세포주는 캐나다 토론토의 온타리오 암 연구소의 A. Bernstein에 의하여 SIM(Sandos Inbred Mice) 생쥐 배아 섬유아세포의 계속주로부터 유도된 것이며, 이는 미국 세포주 은행(ATCC, STO 제품 번호: CRL-1503, 배치 번호 1198713)에서 공급받았다. 새로운 영양 세포층은 일주일에 2번 준비하였다. 대수증식 세포를 분리하고 계수할 수 있다. 세포의 일부는 생존 세포를 유지하기 위해 접종하였고, 나머지 부분은 조사하였다. 조사하기 위해, 튜브 당 10x106세포/ml 농도로 세포 현탁액을 준비하였다. 세포에는 45 내지 55 그레이 용량으로 노출시키고 플라스틱에 접종하였다. 접종하고 난 뒤, 비활성화된 영양 세포로 코팅한 디쉬 또는 플레이트는 최대 5일 동안 사용하였다.
배지
배지 EX-CELLTM 65788, 65319, 63066, 66444(SAFC, 주문 배지)
GTM-3 배지(Sigma, 카탈로그 번호 G9916)
DMEM-HamF12(Cambrex, 카달로그 번호 BE04-687)
DMEM(Cambrex, 카달로그 번호 BE12-614F)
첨가제
글루타민(Cambrex, 카탈로그 번호 BE17-605E)
페니실린/스트렙토마이신(Cambrex, 카탈로그 번호 BE17-602E)
비필수 아미노산(Cambrex, 카탈로그 번호 BE13-114E)
소듐 피루베이트(Cambrex, 카탈로그 번호 BE13-115)
비타민(Cambrex, 카탈로그 번호 13-607C)
베타 머캅토 에탄올(Sigma, 카탈로그 번호 M7522)
이스톨레이트(SAFC, 카탈로그 번호 58902C)
버퍼 및 고정인자
PBS 1×(Cambrex, 카탈로그 번호 BE17-516F)
동결 억제제
디메틸 설폭사이드(Dimethyl Sulfoxydel; DMSO)(Sigma, 카달로그 번호 D2650)
인자
2개의 다른 재조합 인자가 사용되었다:
□ 재조합 인간 섬모 신경영양 인자(CNTF)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 450-13)
□ 재조합 인간 인슐린 유사 인자 I(IGF I)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 100-11)
두 개의 인자가 대장균 박테리아에서 생산되었다.
우태아 혈청
비조사된 우태아 혈청( FBS )( JRH , 카탈로그 번호 12003)
프로그램에 사용된 비 조사된 혈청은 호주에서 수득하고 생산하였다. 수득에 사용한 동물은 USDA 검사하였으며 도살하기에 적합하다. 이 혈청은 조류 줄기 세포 배양 동안 배지에 첨가하였다. 이 배지는 배양동안 줄기 세포의 유지에 필수적일 수 있는 필수적인 단백질 또는 성분이 파괴되는 것을 막기 위해 조사를 하지 않았다.
조사된 혈청( JRH , 카탈로그 번호 12107)
이 프로그램에 사용한 조사된 배치는 미국에서 수득하였다. 이 조사된 배치는 STO 세포(영양 세포) 배양에 사용되는 DMEM 배지에 첨가물로서 첨가되었다. 이 세포들은 줄기 세포로서 배양 동안 성장과 유지를 하기 위한 특정 품질의 혈청을 필요로 하지 않는다. 배지에 있는 고농도의 혈청을 최소화하기 위해 STO 세포의 성장에는 오직 4%의 FBS 만을 사용하였다.
해리제
프로나아제 ( Roche , 카달로그 번호 165 921)
프로나아제는 고착 조류 줄기 세포의 해리에 사용하기 위하여, 독일의 Roche Diagnostics에 의하여 제조된재조합 프로테아제이다.
트립신 EDTA ( Cambrex , 카달로그번호 BE17 -161E)
트립신은 늦은 계대 배양에서 STO 세포의 해리를 위하여 및 무혈청 배지에 적응된 조류 세포의 해리를 위하여 사용할 수 있다. 돼지 기원의 이 효소는 허가 멸균 여과 방법에 의하여 cGMP 참조 조건에 따라 무균으로 제조되어 현재 E.P.에 따라 시험되었다. 상기 조성 전에 조사된 실험 재료는 엄격히 9/CFR 113.53에 따라 돼지 파보바이러스에 대하여 시험되었다.
트립진( Sigma , 카달로그번호 T3449 )
트립진 용액은 재조합 bovin 트립신으로 조성되고, 옥수수 내에서 발현되며, ProdiGene 소유의 트랜스제닉 식물 단백질 발현시스템을 사용하여 Sigma Aldrich 에 의하여 제조되었다. 이 산물은 부혈청과 혈청이 첨가된 부착 세포 배양 내에서 세포 해리를 위하여 활용된다.
비효소적 세포 해리 용액( Sigma , 카달로그번호 C5914 )
이 해리제는 배양 용기의 성장 표면으로부터 천천히 세포를 떼어내는데 사용되는 즉시 사용 가능한 제형이다. 상기 방식은 단백질을 함유하지 않고, 효소를 사용하지 않고 세포를 제거하도록 해준다. 세포 단백질은 보존되어 세포 표면 단백질 인식에 따라 가능한 면역화학적 연구를 가능하게 한다. 이 효소는 EMA-1(상피막 항원 1)과 SSEA1(발생 단계 특이적 태아성 항원-1) 등의 생물학적 마커의 FACS 분석 전에 세포를 떼어내는데 사용하였다.
3.2-오리 EBx 세포주 EB66 의 확립 방법
약 360개의 수정된 오리 알을 열었고, 여는 동안 난황을 흰자위로부터 분리하였다. 작은 흡수 필터 페이퍼(Whatmann 3M paper)를 사용하여 난황으로부터 배아를 제거하였으며, 펀치를 사용하여 구멍난 링의 형태 안에 있는 앞을 잘랐다. 구멍의 직경은 약 5mm이다. 이 작은 링은 오븐에서 약 30분 동안 건조 가열하여 멸균시켰다. 실제로, 배아 수득 단계 동안, 작은 페이퍼 링은 난황의 표면 및 배아의 중앙에 위치하게 하여 페이퍼링에 의해 둘러싸이게 하였다. 그리고 난 뒤 작은 수술 가위의 도움으로 잘라나고 제거된 것을 PBS가 채워진 페트리 디쉬에 놓았다. 그리고 난뒤, 링에 의해 옮겨진 배아는 배지 내에서 과다한 난황을 제거하였고, 그로 인해 과량의 비텔린(vitellin)이 존재하지 않게 된 상태로 파스퇴르 피펫으로 수득되었다.
오리 배아는 1X PBS를 포함하는 50 ml 튜브에 놓아두었다. 오리 배아를 물리적으로 분해시키고, PBS로 세척하며, 완전 배양 배지에 들어 있는 비활성화된 STO 영양 세포 층에 접종하여 39℃, 7.5% CO2로 유지시켰다. 영양 세포는 약 2.7 X 104세포/cm2의 6웰 플레이트 또는 디쉬에 접종하였다. 완전 배양 배지는 무혈청 배지 DMEM-Ham F12로 구성되어 있으며, 10% 우태아 혈청, 최종 1 ng/ml 농도의 IGF-1, CNTF, 및 1% 비필수 아미노산, 1%의 상업적 기원의 비타민 혼합물, 최종 농도 0.1 mM의 소듐 피루베이트, 최종 농도 0.5 mM의 베타-머캅토-에탄올, 최종 농도 2.1 mM의 글루타민, 최종 농도 100 U/ml의 페니실린, 최종 농도 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신 및 1X 이스톨레이트가 첨가된다. 계대 4 단계에 즉시, 항체 혼합물은 더 이상 배지에 첨가되지 않는다.
오리 ES 세포는 계대 4단계까지 DMEM-Ham F12 배지에서 배양하였다. 계대 4단계 이후에, 기본 배지를 변경하고 DMEM-Ham F12 완전 배양 배지를 SFM GTM-3 배지로 변형하였는데, 상기 배지는 10% 우태아 혈청, 최종 농도 1ng/ml의 IGF1 및 CNTF, 1% 비필수 아미노산, 1%의 상업적 기원의 비타민 혼합물, 최종 농도 0.1 mM의 소듐 피루베이트, 최종 농도 0.5 mM의 베타-머캅토-에탄올, 최종 농도 2.1 mM의 글루타민, 및 1X 이스톨레이트가 첨가된 것이다. 오리 ES 세포는 계대 14단계까지 상기 새로운 배지 내에서 배양되고, 계대 18 단계에서 성장 인자 고갈이 수행된다. IGF1과 CNTF가 동시에 배지에서 제거되고, 따라서 계대 19 내지 24 단계에서는 10% FBS, 1%의 비필수 아미노산, 1%의 상업적 기원의 비타민 혼합물, 최종 농도가 0.1 mM의 소듐 피루베이트, 최종 농도 0.5 mM의 베타-머캅토-에탄올, 최종 농도 2.1 mM의 글루타민, 및 1X 이스톨레이트가 첨가된 GTM-3 배지를 사용하였다.
페킨 오리 배아 유래의 오리 ES 세포를 하나의 디쉬에서 다른 디쉬로 계대 접종할 때, 배양 디쉬의 접종은 완전 배양 배지 내의 오리 ES 세포가 약 7×104세포/cm2 내지 12×104세포/cm2의 디쉬에서 수행되었다.
그 후, 계대 24 단계 이후, 영양 세포들의 결핍은 수 차례 이상의 계대 접종에서 영양 세포 농도가 점진적으로 감소됨으로써 수행되었다. 디쉬는 처음에는, 약 2.7×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 계대 25 내지 31 단계에서는 약 1.8×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 계대 32 내지 35 단계에서는 약 1.4×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 계대 36 내지 41 단계에서는 약 1×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 계대 42 내지 44 단계에서는 약 0.7×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 계대 45 단계 부터는 영양 세포 없이 조류 세포로만 접종된다. 영양 세포의 고갈 마지막에서는, 상기 디쉬는 9×104 조류 세포들/㎠ 내지 12.7×104 조류 세포들/㎠로 접종된다. 영양 세포의 고갈은 약 계대 접종 25에서 시작하여 약 계대 접종 45에서 끝난다. 영양 세포의 고갈 동안, 오리 ES 세포는 단계 a)보다 높은, 약 9×104 세포/㎠ 내지 12.7×104 세포/㎠ 의 고농도로 배양 디쉬에 접종된다.
영양 세포 없이 수 차례의 계대 접종 이후, 세포 안정성과 건강을 위하여 확립되고 아미노산, 비타민, 베타 머캅토에탄올, 소듐 피루베이트와 이스톨레이트의 고갈을 시작하기 위하여 성장 매개변수(집단 배가 시간(PDT)과 농도)를 관찰하였다. 만약 PDT가 약 40시간 이하이고 세포 밀도가 약 26×104 세포/㎠ 이상이면, 세포는 그러한 고갈에도 충분히 강건한 것으로 여겨진다.
EB66라고 불리는 현재 오리 EBx® 세포 발달의 경우에 있어서, 비타민, 소듐 피루베이트, 비필수 아미노산 및 베타 머캅토에탄올의 고갈은 계대 52 단계에서 시작된다. 그러한 첨가제 모두는 배지에서 동시에 제거된다. 따라서, 계대 52 내지 59 단계 내에서, 배양 배지는 글루타민, 이스톨레이트 및 FBS가 첨가된 SFM GTM-3이다. 배양의 새로운 조건에의 짧은 기간의 적응 후, 온도 감소를 시작했다. 이러한 감소는 계대 60 내지 67 단계에서 점차적으로 수행하였다. 계대 67 단계에서, 세포는 약 37℃에서 성장할 수 있다. 계대 67 단계 후, 기본 배지 GTM-3은 Excell 65788라고 불리는 새로운 SFM 기본 배지로 대체하였다. 계대 67 단계 후, 배양 배지는, 10% FBS, 2.5 mM 글루타민, 1×이스톨레이트가 첨가된 Excell 65788이다. 계대 80 단계에서, 부착-비의존성 세포 성장을 시작하기 위하여 일정하게 교반하면서 4×106 세포를 Ultra Low Attachment(ULA) 디쉬로 옮겼다. 현탁액으로의 성장을 촉진하기 위하여, 기본 배지를 변경하고 ULA 디쉬에 접종하기 위하여 혈청 농도를 10% 에서 5%로 감소시켰다. 따라서, 계대 80 내지 85 단계에서 배양 배지는, 5% FBS, 2.5 mM 글루타민 및 1×이스톨레이트가 첨가된 SFM GTM03이다. 계대 85 단계 이후, FBS를 천천히 감소시켜 EB66 세포 현탁액에서 시작하였다. 혈청 고갈은 SFM 세포 배양 배지 내의 혈청 농도가 처음에는 2.5%, 그리고 나서 1.5%가 되도록 점진적으로 수행하였고, 최종적으로는 SFM 세포 배양 배지 내의 혈청이 0%이 되도록 하였다. 혈청 고갈은 계대 86 단계에서 시작하여 계대 94 단계에서 마무리된다. 혈청 고갈의 마지막에, 부착 비의존성 dEB66 세포는 성장 인자가 없어도, 영양 세포가 부재해도, 무혈청 배지에서도 37℃에서 성장할 수 있다.
2.5 mM 글루타민이 첨가된 SFM GTM-3 배지 내, 37℃에서 성장할 수 있는 EB66 오리 세포를 수득한 후, 새로운 SFM 조성, 예컨대 Excell 63066, Excell 66444, Excell CHO ACF 등에 점진적으로 적응을 수행하거나 희석하여 제조된 SFM 배지에 추가적인 적응이 이루어진다.
현탁액 오리 EB66 세포의 서브클로닝(subcloning)을 이스톨레이트의 존재 또는 결손 하에서 실현할 수 있다.
실시예 4: 오리 EBx 세포주 EB26
4.1 재료
오리 알, 영양 세포, 첨가제, 버퍼 및 고정인자, 동결 억제제, 소태아 혈청(fetal calf serum)과 해리제(실시예 3 참조)
페킨 계통 GL30 오리 알을 사용하였다.
배지
배지 EX-CELLTM 65319, 63066 및 66444(SAFC, 주문 배지)
배지 GTM-3(Sigma, 카탈로그 번호 G9916)
DMEM(Cambrex, 카탈로그 번호 BE12-614F)
인자
6개의 다른 재조합 인자가 사용되었다:
□ 재조합 인간 섬모 신경영양 인자(CNTF)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 450-13)
□ 재조합 인간 인슐린 유사 인자 I(IGF I)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 100-11)
□ 재조합 인간 인터루킨 6(IL 6)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 200-6)
□ 재조합 인간 수용성 인터루킨 6 수용체(sIL6r)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 200-06R)
□ 재조합 인간 줄기세포 인자(SCF)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 300-07)
□ 재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 100-18B)
IL6r를 제외한 이들 인자 모두는 대장균 박테리아에서 생산되었다. 수용성 IL6r는 형질전환된 HEK293 세포에서 발현된다.
4.2-오리 EBx 세포주 EB26 의 확립 방법
EB66에서 전술한 바와 같이 상기 오리 배아를 수집하였다. 오리 배아를 PBS 1×가 함유된 50 mL 튜브 내에 두었다. 그리고 나서, 물리적으로 분해시키고, PBS로 세척하고, 완전 배양 배지에 들어 있는 비활성화된 STO 영양 세포층에 접종하여 39℃, 7.5% CO2로 유지시켰다. 영양 세포는 약 2.7 X 104 세포/cm2의 디쉬 또는 6 웰 플레이트에 접종하였다. 완전 배양 배지는 5% 우태아 혈청, 최종 농도가 1 ng/㎖인 IGF1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF와 1%의 비필수 아미노산, 1%의 상업적 기원의 비타민 혼합물, 최종 농도 0.1 mM의 소듐 피루베이트, 최종 농도 0.5 mM의 베타-머캅토-에탄올, 최종 농도 2.1 mM의 글루타민, 최종 농도 100 U/㎖의 페니실린, 최종 농도 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신, 1× 이스톨레이트가 첨가된 무혈청 배지 GTM-3으로 구성된다. 세포의 계대 1 단계 후 급속히, 항생제 혼합물이 배지에 더 이상 첨가되지 않는다. 상기 급속히라는 표현은 일반적으로 처음 계대 3 내지 9 단계 후를 의미한다. 오리 EBx 세포를 계대 9 단계까지 완전 배지에서 배양하였다. 계대 9 단계 후, 완전 배지에서 인자들이 부분적으로 고갈된다. 따라서, 계대 10 내지 13 단계에서, SCF, IL6, IL6R 및bFGF가 배지에서 제거되고 단지 재조합 IGF1과 CNTF가 1 ng/mL의 농도로 유지된다. IGF1과 CNTF의 농도의 동시 감소는 계대 13 내지 16 단계에서 수행되어 최종적으로 계대 17 단계에서 재조합 인자 없이도 성장할 수 있는 세포를 얻는다. 상기 인자의 고갈은 점차적으로 저 농도의 인자에 적응하도록 한다. 페킨 오리 배아 유리의 오리 ES세포가 한 배양 디쉬에서 다른 배양 디쉬로 계대 배양 될 때, 완전 배양 배지 내의 오리 ES 세포에서 약 7×104/cm2 내지 12×104/cm2로 배양 디쉬의 접종이 수행된다. 좋기로는, 상기 접종은 약 7.3×104/cm2 로 수행된다(4×106세포/55cm2 또는 4×106세포/100 mm 디쉬).재조합 인자의 고갈 후, 이스톨레이트의 감소는 계대 23 단계에서 수행되어 최종 농도 0.5×에 도달한다. 계대 31 단계 후, 영양 세포들의 결핍은 수 차례 이상의 계대 접종 동안 점진적으로 감소되어 수행된다. 디쉬는 처음에는, 약 2.7×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 계대 32 내지 38 단계에서는 약 1.8×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 계대 39 내지 44 단계에서는 약 1.4×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 계대 45 내지 47 단계에서는 약 1×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 계대 48 내지 50 단계에서는 약 0.7×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 계대 51 단계부터는 영양 세포 없이 조류 세포로만 접종된다. 영양 세포의 고갈 마지막에서는, 상기 디쉬는 9×104 조류 세포들/㎠ 내지 12.7×104 조류 세포들/㎠로 접종된다. 영양 세포의 고갈은 약 계대 접종 32에서 시작하여 약 계대 접종 51에서 끝난다. 영양 세포의 고갈 동안, 오리 ES 세포는 단계 a)보다 높은, 약 9×104 세포/㎠ 내지 12.7×104 세포/㎠ 의 고농도로 배양 디쉬에 접종된다. 영양 세포 없이 수 차례의 계대 접종 이후, 세포 안정성과 건강을 확인하고 현탁액으로서의 세포 성장을 시작하기 위하여 성장 매개변수(집단 배가 시간(PDT)과 농도)를 관찰하였다. 만약 PDT가 약 40시간 이하이고 세포 밀도가 약 26×104 세포/㎠ 이면, 세포가 현탁액에서의 배양에도 충분히 강건한 것으로 여겨진다면, 다. 또한, 세포 형태는 둥글고 굴절을 가지며, 매우 작고 상기 세포는 플라스틱 디쉬에 너무 많이 부착하지 않을 것이다.
EB26 세포 발달의 경우에 있어서, 현탁액에서의 배양은 계대 53 단계에서 시작하였다. 약 50 내지 70 rpm로 일정하게 교반하면서, 7×106 세포를 Ultra Low 부착 디쉬로 옮겼다. 다음 계대를 위하여, T175 플라스크(Sarsted, 831812502 참조)에 0.4 내지 0.5×106 세포/mL를 포함하는 농도로 세포를 접종하였다. 새로운 배양 조건에 짧은 기간의 적응 후, 세포 PDT를 약 160 H 내지 40 시간 동안 감소시켰다. 좋은 용출을 고려하여, 계대 59에서, 새로운 고갈을 수행하였다. 따라서, 비타민, 소듐 피루베이트, 베타-머칸톱에탄올, 그리고 비필수 아미노산을 제거하였다. 따라서, 계대 59 단계 후, 배양 배지에는 5% FBS, 0.5×이스톨레이트, 2.5 mM 글루타민만 첨가하였다. 이미 성장 인자, 영양 세포, 비타민, 비필수 아미노산, 소듐 피루베이트 및 베타-머칸톱에탄올이 결핍된 세포 현탁액에서 혈청 결핍을 수행하였다. 혈청 고갈은 SFM 배양 배지 내의 혈청 농도가 처음에는 5%, 그 후 2.5%, 그리고 나서 1.5%가 되도록 점진적으로 수행하였고, 최종적으로는 SFM 세포 배양 배지 내의 혈청이 0%이 되도록 하였다. 혈청 고갈은 계대 61 단계에서 시작하여 계대 79 단계에서 마무리된다. 혈청 고갈의 마지막에, 부착 비의존성 오리 EB26 세포는 성장 인자가 없어도, 영양 세포가 부재해도, 무혈청 배지에서도 39℃에서 성장할 수 있다. EB26 세포는 계대 80 단계에서 세포 배양 온도가 감소된 37℃의 0.5×이스톨레이트의 결손에서도 성장할 수 있도록 적응시켰다.
2.5 mM 글루타민이 첨가된 SFM GTM-3 배지 내, 37℃에서 성장할 수 있는 EB26 세포의 수득 후, 새로운 SFM 조성, 예컨대 Excell 63066, Excell 66444, Excell CHO ACF 등에 점진적으로 적응을 수행하거나 희석하여 제조된 SFM 배지에 추가적으로 적응시켰다. 현탁액 오리 EB26 세포의 서브클로닝(subcloning)을 이스톨레이트의 존재 또는 결손 하에서 실현할 수 있다.
실시예 5. 오리 EBx 세포주 EB24
5.1 재료
오리 알, 영양 세포, 첨가제, 버퍼 및 고정인자, 동결 억제제, 소태아 혈청(fetal calf serum)과 해리제(실시예 3과 동일)
페킨 계통 GL30 오리 알을 사용하였다.
배지
배지 EX-CELLTM 65319, 63066 및 66444(SAFC, 주문 배지)
배지 GTM-3(Sigma, 카탈로그 번호 G9916)
DMEM F12(Cambrex, 카탈로그 번호 BE04-687)
DMEM(Cambrex, 카탈로그 번호 BE12-614F)
인자
6개의 다른 재조합 인자가 사용되었다:
□ 재조합 인간 섬모 신경영양 인자(CNTF)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 450-13)
□ 재조합 인간 인슐린 유사 인자 I(IGF I)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 100-11)
□ 재조합 인간 인터루킨 6(IL 6)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 200-6)
□ 재조합 인간 수용성 인터루킨 6 수용체(sIL6r)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 200-06R)
□ 재조합 인간 줄기세포 인자(SCF)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 300-07)
□ 재조합 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 100-18B)
IL6r를 제외한 이들 인자 모두는 대장균 박테리아에서 생산되었다. 수용성 IL6r는 형질전환된 HEK293 세포에서 발현된다.
5.2-오리 EBx ® 세포주 EB24 의 확립 방법
EB66에서 전술한 바와 같이 상기 오리 배아를 수집하였다. 오리 배아를 PBS 1×가 함유된 50 mL 튜브 내에 두었다. 그리고 나서, 물리적으로 분해시키고, 완전 배양 배지에 들어 있는 비활성화된 STO 영양 세포층에 접종하여 39℃, 7.5% CO2로 유지시켰다. 영양 세포는 약 2.7 X 104 세포/cm2의 디쉬 또는 6 웰 플레이트에 접종하였다. 완전 배양 배지는 10% 우태아 혈청, 최종 농도가 1 ng/㎖인 IGF1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF와 1%의 비필수 아미노산, 1%의 상업적 기원의 비타민 혼합물, 최종 농도 0.1 mM의 소듐 피루베이트, 최종 농도 0.5 mM의 베타-머캅토-에탄올, 최종 농도 2.1 mM의 글루타민, 최종 농도 100 U/㎖의 페니실린, 최종 농도 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신, 1× 이스톨레이트가 첨가된 무혈청 배지 DMEM-Ham F12로 구성된다. 세포의 계대 1 단계 후 급속히, 항생제 혼합물이 배지에 더 이상 첨가되지 않는다. 상기 급속히라는 표현은 일반적으로 처음 계대 3 내지 9 단계 후를 의미한다.
*상기 오리 ES 세포는 계대 7 단계까지 완전 배지 DMEM-Ham F12 에서 배양한다. 계대 7 단계 후, 기본 배지를 변경하고 DMEM-Ham F12 완전 배지를 10% 우태아 혈청, 최종 농도가 1ng/㎖인 IGF1, CNTF, IL-6, IL-6R, SCF, FGF, 1% 비필수 아미노산, 1%의 상업적 기원의 비타민 혼합물, 최종 농도 0.1mM의 소듐 피루베이트, 최종 농도 0.5mM의 베타 머캅토 에탄올, 최종 농도 2.1mM의 글루타민, 최종 농도 100U/ml의 페니실린, 최종 농도 100㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 이스톨레이트 1×로 구성된, GTM-3 완전 배지로 교체한다. 따라서, 계대 11 단계에서는, 혈청 농도가 5%로 감소되고, SCF, IL6, IL6R 및bFGF는 배지에서 제거된다. 그래서 계대 11 단계부터, 배지는 5% FBS, 최종 농도가 1ng/mL인 IGF1 및CNTF, 1% 비필수 아미노산, 1%의 상업적 기원의 비타민 혼합물, 최종 농도 0.1 mM의 소듐 피루베이트, 최종 농도 0.5 mM의 베타 머캅토-에탄올, 최종 농도 2.1 mM의 글루타민, 최종 농도 100U/㎖의 페니실린, 최종 농도 100㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 이스톨레이트 1×로 구성된다. 계대 22 단계에서, IGF1과 CNTF의 동시 제거를 수행한다. 계대 22 후에는, 재조합 인자가 GTM-3 배양 배지에 존재하지 않는다. 그러한 배지에서 오리 세포는 계대 23 내지 계대 28 단계에서 유지된다. 페킨 오리 배야 유래의 오리 ES 세포가 한 배양 디쉬에서 다른 배양 디쉬로 계대 배양 될 때, 완전 배양 배지 내의 오리 ES 세포에서 약 7×104/cm2 내지 12×104/cm2로 배양 디쉬의 접종이 수행된다. 좋기로는, 상기 접종은 약 7.3×104/cm2 로 수행된다(4×106세포/55cm2 또는 4×106세포/100 mm 디쉬). 그리고 나서, 계대 28 단계 후, 몇몇 계대 동안 영양 세포들의 농도를 점진적으로 감소함으로써 영양 세포의 결핍을 수행한다. 디쉬는 처음에는, 약 2.7×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 계대 29 내지 33 단계에서는 약 1.8×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 계대 34 내지 37 단계에서는 약 1.4×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 계대 38 내지 42 단계에서는 약 1×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 계대 43 내지 46계에서는 약 0.7×104 영양세포들/㎠으로 접종되고, 계대 47 단계부터는 영양 세포 없이 조류 세포로만 접종된다. 영양 세포의 고갈 마지막에서는, 상기 디쉬는 9×104 조류 세포들/㎠ 내지 12.7×104 조류 세포들/㎠로 접종된다. 영양 세포의 고갈은 약 계대 접종 29에서 시작하여 약 계대 접종 47에서 끝난다. 영양 세포의 고갈 동안, 오리 ES 세포는 단계 a)보다 높은, 약 9×104 세포/㎠ 내지 12.7×104 세포/㎠ 의 고농도로 배양 디쉬에 접종된다. 영양 세포 없이 수 차례의 계대 접종 이후, 세포 안정성과 건강을 확인하고 현탁액에서의 세포 성장을 시작하기 위하여 성장 매개변수(집단 배가 시간(PDT)과 농도)를 관찰하였다. 만약 PDT가 약 40시간 이하이고 세포 밀도가 약 26×104 세포/㎠ 이상이면, 세포가 현탁액에서의 배양에도 충분히 강건한 것으로 여겨진다. 또한, 세포 형태는 둥글고 굴절을 가지며, 매우 작고 상기 세포는 플라스틱 디쉬에 너무 많이 부착하지 않을 것이다. EB24 세포 발달의 경우에 있어서, 현탁액에서의 배양은 계대 48 단계에서 시작하였다. 약 50 내지 70 rpm로 일정하게 교반하면서, 8×106 세포를 Ultra Low 부착 디쉬로 옮겼다. 다음 계대를 위하여, T175 플라스크(Sarsted, 831812502 참조)에 0.4 내지 0.5×106 세포/mL를 포함하는 농도로 세포를 접종하였다. 새로운 배양 조건에 짧은 기간의 적응 후, 세포 PDT를 약 248 H 내지 128 시간 동안 감소시키고, 이어서 다음 고갈 단계를 수행하였다. 따라서, 계대 52 단계에서, 비타민, 비필수 아미노산, 소듐 피루베이트 및 베타 머캅토에탄올을 제거하였다. 계대 56에서, PDT가 44시간에 도달하는 좋은 용출을 고려하여, 계대 57 단계에서, 혈청 결핍을 시작하였다. 따라서, 계대 57 단계에서, 배양 배지 GTM-3은 5% FBS, 1×이스톨레이트, 2.5 mM 글루타민만 첨가되었다. 상기 혈청 고갈은 이미 성장 인자, 영양 세포, 비타민, 비필수 아미노산, 소듐 피루베이트 및 베타 머캅토에탄올이 고갈된 세포 현탁액에서 수행하였다. 혈청 고갈은 SFM 세포 배양 배지 내의 혈청 농도가 처음에는 5%, 그 후 2.5%, 그 후 2% 그리고 나서 1.5%가 되도록 점진적으로 감소되도록 수행되었고, 최종적으로는 SFM 세포 배양 배지 내의 혈청이 0%이 되도록 하였다. 혈청 고갈은 계대 57 단계에서 시작하여 계대 77 단계에서 마무리된다. 혈청 고갈 동안, 37℃에서 성장하도록 적응이 또한 수행되었다. 따라서, 계대 65 단계에서, 2.5% FBS가 첨가된 배양 배지 내의 세포 성장은 37℃로 점진적으로 온도가 이동하지 않도록 옮겨졌다. 혈청 고갈의 마지막에, 부착 비의존성 오리 EB24 세포는 성장 인자가 없어도, 영양 세포가 부재해도, 무혈청 배지에서도 37℃에서 성장할 수 있다.
2.5 mM 글루타민이 첨가된 SFM GTM-3의 37℃에서 성장할 수 있는 오리 EB24 세포를 수득한 후, 새로운 SFM 조성, 예컨대 Excell 63066, Excell 66444, Excell CHO ACF 등에 점진적으로 적응을 수행하거나 희석하여 일부 추가적으로 적응시켰다. 현탁액 오리 EB24 세포의 서브클로닝(subcloning)을 수행하고, 오리 EB24-12 서프클론은 효과적인 복제 바이러스 수행 때문에 선택된다.
실시예 6. SPF 오리 무스코비 EBx 세포주
6.1 재료
오리 알
Le Couvoir de Cerveloup(프랑스)에서 무스코비 계통의 오리 SPF 알을 얻었다. 상기 SPF 오리 알은 다양한 가금 병원균에 대하여 집중적으로 시험된 군으로부터 생산된다. 질병 테스트는 다음을 포함한다: 살모넬라 갈라나룸-풀로룸, 마이코플라스마 시노비애, 마이코플라스마 멜레아그리디스(Mycoplasma meleagridis), 마이코플라스마 갈리엡티쿰(Mycoplasma galliepticum), 마렉병 바이러스, 조류 인플루엔자, 타입 2 파라믹소 바이러스, 타입 3 파라믹소 바이러스, 뉴캐슬병, 타입 3 아데노바이러스(EDS), 감보로병, 조류 레오바이러스, 세망내피증 바이러스, 조류 뇌척수염, 전염성 비기관염 바이러스 및 클라미디아증. 무스코비 오리 알은 수송 동안의 오염의 모든 위험을 피하기 위하여 정화제로 속독하였다.
영양 세포(전 실시예 참조)
배지
배지 EX-CELLTM 66444(SAFC, 주문 배지)
GTM-3 배지(Sigma, 카탈로그 번호 G9916)
DMEM-HamF12(Cambrex, 카달로그 번호 BE04-687)
첨가제
글루타민(Cambrex, 카탈로그 번호 BE17-605E)
페니실린/스트렙토마이신(Cambrex, 카탈로그 번호 BE17-602E)
비필수 아미노산(Cambrex, 카탈로그 번호 BE13-114E)
소듐 피루베이트(Cambrex, 카탈로그 번호 BE13-115)
비타민(Cambrex, 카탈로그 번호 13-607C)
베타 머캅토 에탄올(Sigma, 카탈로그 번호 M7522)
이스톨레이트(SAFC, 카탈로그 번호 58902C)
버퍼 및 고정인자
PBS 1×(Cambrex, 카탈로그 번호 BE17-516F)
동결 억제제
디메틸 설폭사이드(Dimethyl Sulfoxydel; DMSO)(Sigma, 카달로그 번호 D2650)
인자
2개의 다른 재조합 인자가 사용되었다:
□ 재조합 인간 섬모 신경영양 인자(CNTF)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 450-13)
□ 재조합 인간 인슐린 유사 인자 I(IGF I)(Peprotech Inc, 카탈로그 번호 100-11)
두 개의 인자가 대장균 박테리아에서 생산되었다.
우태아 혈청
비조사된 우태아 혈청( FBS )( JRH , 카탈로그 번호 12003)
프로그램에 사용된 비 조사된 혈청은 호주에서 수득하고 생산하였다. 수득에 사용한 동물은 USDA 검사하였으며 도살하기에 적합하다. 이 혈청은 조류 줄기 세포 배양 동안 배지에 첨가하였다. 이 배지는 배양동안 줄기 세포의 유지에 필수적일 수 있는 필수적인 단백질 또는 성분이 파괴되는 것을 막기 위해 조사를 하지 않았다.
조사된 혈청( JRH , 카탈로그 번호 12007)
이 프로그램에 사용한 조사된 배치는 호주에서 수득하였다. 이 조사된 배치는 STO 세포(영양 세포) 배양을 위해 사용되는 DMEM 배지에 첨가물로서 첨가되었다. 이 세포들은 줄기 세포로서 배양 동안 성장과 유지를 하기 위한 특정 품질의 혈청을 필요로 하지 않는다. 배지에 있는 고농도의 혈청을 최소화하기 위해 STO 세포의 성장에는 오직 4%의 FBS 만을 사용하였다.
해리제
프로나아제 ( Roche , 카달로그 번호 165 921)
트립진( Sigma , 카달로그 번호 T3449 )
실시예 6.2- 무스코비 오리 EBx 세포주의 확립 방법
전술한 실시예 3의 방법에 따라 수집한 무스코비 오리 수정 SPF 알 20개로부터 배아를 얻었다. 상기 오리 배아를 PBS 1×가 함유된 50 mL 튜브 내에 두었다. 그리고 나서, 물리적으로 분해시키고, PBS로 세척하고, 비활성화된 STO 영양 세포층으로 피복된 12웰 플레이트의 웰에 접종하였다. 오리 배아 세포를 완전 배지 내로 접종하고 39℃, 7,5%5% CO2로 옮겼다. 영양 세포는 약 2.7 X 104 세포/cm2로 접종하였다. 사용한 완전 배양 배지는 10% 우태아 혈청, 최종 농도가 1 ng/㎖인 IGF1, CNTF와 1%의 비필수 아미노산, 1%의 상업적 기원의 비타민 혼합물, 최종 농도 0.1 mM의 소듐 피루베이트, 최종 농도 0.5 mM의 베타-머캅토-에탄올, 최종 농도 2.1 mM의 글루타민, 최종 농도 100 U/㎖의 페니실린, 최종 농도 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신, 1×이스톨레이트가 첨가된 무혈청 배지 DMEM-Ham F12로 구성된다. 세포의 계대 2 단계에서, 상기 DMEM-Ham F12 기본 배지를 GTM-3 기본 배지로 교체하였다. 항생제 혼합물은 계대 4 단계 후에는 배지에 더 이상 첨가하지 않는다.
상기 오리 ES 세포는 계대 8 단계까지 완전 GTM-3 배지에서 배양하였다. 계대 8 단계 후, IFG1과 CNTF의 농도는 0.5 ng/mL로 감소하였다. 오리 ES 세포를 새로운 배양 배지 내에서 추가로 2 계대 동안 배양하고, 성장 인자 고갈을 계대 10 단계에서 수행하였다. IGF1과 CNTF는 동시에 배지에서 제거하였다.
따라서, 계대 10 내지 37 단계까지, 배양 배지는 10% FBS, 1% 비필수 아미노산, 1% 상업적 기원의 비타민 혼합물, 최종 농도가 0.1mM인 소듐 피루베이트, 최종 농도가 0.5mM인 베타-머캅토-에탄올, 최종 농도가 2.1mM인 글루타민 및 이스톨레이트 1×가 첨가된 GTM-3 배지이다.
무스코비 오리 배아로부터 추출된 오리 ES 세포가 한 배양 디쉬에서 다른 배양 디쉬로 계대 배양 될 때, 배양 배지 내의 오리 ES 세포는 약 12×104/cm2 로 수행된다. 몇몇 조건화된 배지를 해리 후 세포 회복을 증진시키기 위하여 세포 접종에 사용할 수 있다. 그리고 나서, 계대 37 단계 후, 전술한 방법에 따라서 몇몇 계대 동안 영양 세포들의 농도를 점진적으로 감소함으로써 영양 세포의 결핍을 수행한다.
영양 결핍 단계 동안, 현탁액 내에서 성장할 수 있는 몇몇 세포들은 추출되고 첨가제와 혈청이 없어도 성장에 적응한다(도 4c). 부착-비의존성 무스코비 오리 EBx 세포는, 텔로머라아제, SSEA-1과 EMEA-1 등의 ES 세포 마커를 발현한다(데이터는 추가하지 않았음).
실시예 7. EBx 세포주 특성화
7.1-닭 VALO EBv13 세포 특성화
7.1.1- 텔로머라아제 활성
텔로머라아제 검출은 공급자 프로토콜에 따라 Roche Applied Science(Telomeric Repeat Amplification Protocol(TRAP)-카달로그 번호 11 854 666 910)의 Telo TAGGG 텔로머라아제 검출 키트(Telomerase PCT ELISA)을 사용하여 수행하였다. Telo TAGGG 텔로머라아제 PCT ELISA는 다음의 ELISA 프로토콜의 비방사성 검출과 결합하여 텔로머라아제 매개 연장 산물의 증폭을 가능하게 한다. 상기 분석은, 1×103 세포 등가물 사용시, 음성 대조군의 흡광도가 0.25 A450nm-A690nm 이하이고, 양성 대조군의 흡광도가 1.5 A450nm-A690nm 이상이면 유효하다. 시료 흡광도의 차이가 0.2 A450nm-A690nm 유닛 보다 높으면 그 시료는 텔로머라아제 양성(telomerase positive)인 것으로 한다. 다음의 두 가지 대조군을 사용하였다: 음성 대조군은 쥐 섬유아세포(FED 세포)이고 양성 대조군으로는 FGB8 세포(129 SV 마우스 배아 유래로 Vivalis에 의해 확립된 배아 줄기 세포), 전술한 WO 03/076601에서 확립된 닭 EB14-O74 세포를 사용하였다.
얻어진 결과는 도 N°2에 요약하였다. EBv13 세포는 높은 수준의 텔로머라아제를 발현한다. 계대 p193 내지195 단계에서, 텔로머라아제 활성은 닭 EB14-O74 세포 중 하나의 동가이다.
7.1.2- ES 세포 생물학적 마커
배아 줄기 세포는 세포 막에 발현되는 생물학적 마커를 발현하는 것이 특징이다. EBv 13 세포의 EMA-1(상피막 항원-1), SSEA-1(발생 단계 특이적 태아성 항원-1)의 발현은 FACS 분석에 의해 측정하였다. PFA 4%(파라-포름알데하이드)로 고정 후 10분 뒤, 세포 시료와 컨트롤을 세척하고, EMA-1 또는 SSEA-1의 단일클론 항체로 선 배양한다. FITC에 혼합된 2차 항체를 선택된 2 생물학적 마커를 발현하는 세포 검출을 위하여 사용한다. 시료는 Coulter의 FACS(Flow Activated Cell Sorter) flow cytometry에 의하여 분석하였다.
마우스 섬유아세포(FED 세포)를 음성 대조군으로 하여 FACS 분석을 수행하고, 뮤린 ES FGB8 세포를 양성 대조군으로, EBx 세포와 EBv13 세포에서의 닭 EB14-O74 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. 예상대로, FED 세포는 생물학적 마커를 발현하지 않는 반면, FGB8과 EB14-O74 세포는 상당량 발현되는데, EMA-1에 대하여서는 60,13%와 78,7, SSEA-1에 대해서는 94,45%와 95%를 나타냈다(데이터는 미제시). 닭 valo EBv13 세포 개체군은 EMA1(2%)에 대하여 착색을 나타내지 않았고, SSEA-1에 대해서는 매우 연하게 나타냈다(22%).
7.1.3-핵형( karyotype )
핵형 분석은 EBv13 세포의 세포 이배체성과 조류 기원을 확인하기 위하여 수행하였다. 성장 대수기 단계의 세포를 수확하고 2시간 동안 콜세미드(0,02 ㎍/mL)로 처리하였다. 세척과 원심분리 후, 20 분 동안 KCI(0,56%)로 세포에 저장성 초크(hypotonic choc)를 수행하였다. 이어서, EBv13 세포를 메탄올/아세트산(3/1)으로 고정하고 밤새 -20℃에서 저장하였다. 하루 뒤, 세포분열 중기의 표본을 유리 위에 떨어뜨리고, wright/giemsa 용액으로 염색하고, 현미경으로 관찰하였다. 여러 시리즈의 중기를 관찰하여 EBv13 세포의 닭의 기원을 확인하였다. 다수성(polyploidy)의 증거는 전혀 관찰되지 않았다.
7.1.4- EBv13 세포의 클럼프 크기에 대한 세포 배양 조성의 영향
본 발명자는, EBx 세포 배양과 감염에 사용된 무혈청 배지 내의 칼슘과 마그네슘의 농도가 클럼프 크기에 영향을 준다는 것을 발견하였다. 도 10은 EBv13 세포가 배지 내의 Ca2+와 Ma2+ 농도가 고농도에서 저농도로 이동될 경우의 클럼프 크기의 감소를 나타낸다.
7.2-오리 EBx 세포주 특성
7.2.1-오리 EBx 세포 형태
dEBx® 세포의 투과전자 현미경 분석을 Dr. a Rivoire(Lyon, 프랑스)에 의하여 수행하였다. 오리 EBx®세포는 뮤린 배아 줄기 세포와 WO 2006/108846에 기재된 VIVALIS EB14 세포의 표현형과 닮은, 전형적인 배아 줄기 세포 형태(즉, 높은 핵형-세포질 농도)를 나타낸다. 오리 EBx® 세포는 작고 둥근 세포(직경 ~10 ㎛)이며, 큰 핵과 세포체를 가지고, 세포질 막으로부터 뻗어나가는 짧은 위족을 가진다(도 4). 이들은 리보좀과 미토콘드리아가 풍부한 세포질을 가져서, 대사 활성이 높다. 이들은 다수의 세포 내 액포, 매우 발달된 골지계 및 그래뉼화 소포체를 포함한다.
7.2.2- 오리 EBx ® 세포의 텔로머라아제 발현
오리 EBx® 세포의 서로 다른 발생 단계에서의 텔로머라아제 발현은, 로쉐 사의 텔로머라아제 검출 키트(Telomerase OCR ELISA)를 사용하여 확인하였다. 고착 오리 EBx® 세포에서 텔로머라아제는, 영양 결핍 동안, 오리 EBx® 세포가 현탁액에 적응하는 공정 동안, 그리고 영양 고갈 동안과 마찬가지로 높게 발현되는 것을 발견하였다. 도 5는 닭 EB14 세포처럼, 고농도의 텔로머라아제를 발현하는 오리 EB24와 EB26를 나타낸 것이다. 오리 EB66은 또한 모든 세포 계대 접종 동안 고농도의 텔로머라아제를 발현한다. EB66 세포에서 이러한 높은 텔로머라아제 활성은 서로 다른 SFM 내에서 적응 후 안정적이다(도 15).
7.2.3. 오리 EBx ® 세포는 내인성 역전사 효소 활성을 나타내지 않는다
Clean Cell(프랑스) 내에서의 내인성 역전사 효소 발현은 직접 F-PERT 분석(Lovatt et al., 1999, J. Virol. Methods, 82:185-200)에 의하여 조사된다. 오리 EBx® 세포주, EB24(데이터 미제시), EB66(데이터 미제시), EB26과 EB51은 내인성 역전사 효소(RT) 활성을 나타내지 않는다(도 6a). RT 활성은 특정 병균체가 없는(SPF) 닭 계통에서 유래된 닭 배아 섬유아세포 내에서 뿐만 아니라 닭 EB14 세포 배양체에서도 다소 약한 정도나마 검출되었다.
오리와 닭 EBx® 세포의 세포 배양 상청액 내의 복제 또는 비복제하는 내인성 레트로바이러스 입자의 존재가, 조류 백혈증 주요 캡시드 항원 P27(도 6b)를검출하는 ELISA 분석으로 조사되었다. 닭 EBv13 뿐만 아니라 모든 오리 EBx® 세포주(EB26, EB51, EB24, EB66...)가 ALV p27 항원을 분비하지 않는다. 반대로, 닭 EB14 세포는 ALV P27 항원을 발현한다.
7.2.4- 오리 EBx 세포는 복제 조류 백혈증 바이러스( ALV )를 분비하지 않는다
오리 EBx 세포와 내인성 및 외인성 ALVs에 대하여 민감한 것으로 알려진 메추라기 QT6 세포주의 공동 배양 분석을, 내인성 증식하는 오리 바이러스의 존재를 검출하기 위하여 수행하였다. 도 7A는 QT6 공동 배양의 원칙을 기술한다. 증식 바이러스의 존재가 조류 백혈증 주요 캡시드 항원 P27을 검출하는 ELISA 분석에 의하여 검출되었다. 상기 분석은 시험된 오리 EBx 세포가 증식하는(즉, 복제 가능) ALV를 분비하지 않는 것을 증명한다(도 7B).
7.2.5- 오리 EBx 세포는 조류 및 인간 인플루엔자 바이러스 수용체를 발현한다
오리 EBx 세포에서의 조류(Sia 2-3Gal) 및 인간(Sia 2-6Gal) 인플루엔자 바이러스에 대한 수용체의 검출은 하기와 같은 디곡시제닌 표지된 렉틴(Boehringer)를 이용한 형광 세포 계수 분석으로 수행하였다:
▣ Siaα2-6Gal에 특이적으로 결합하는 삼부카 니그라(Sambuca nigra, SNA) 어글루티닌 렉틴;
▣ Siaα2-3Gal에 특이적으로 결합하는 막키아 아뮤렌시스M(aackia amurensis, MAA) 어글루티닌 렉틴.
닭 EB14 세포 및 오리 EBx 세포를 10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 7.5로 세척한 뒤, 최종 농도 5.106으로 동일한 버퍼에 재현탁하였다. 세포를 얼음에서 30분 동안 반응시킨 뒤, SNA 또는 MAA의 존재하에서 추가로 15 내지 30분 동안 반응시켰다. 렉틴 처리된 세포를 FITC-표지된 항-디곡시제닌 항체로 15 내지 30분 동안 얼음에서 반응시키기 전에, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 7.5로 세척하였다. 그리고 난 뒤, 상기 세포를 NaCl 0.9% 로 세척하고 FACS 분석하였다.
닭 EB14 세포와 오리 EBx 세포는 Siaα2-6Gal 및 Siaα2-3Gal 잔기를 가진 올리고사카라이드를 포함하는 세포 표면 수용체를 발현한다(도 8).
7.2.6-핵형
오리 EB24와 EB66 세포의 조류 기원과 세포 이배체를 확인하기 위하여 핵셩 분석을 수행하였다. 급격한 성장 단계의 세포를 수확하고 3 내지 6시간 동안 콜세미드(0,6 mg/mL)으로 처리하였다. 세척과 원심분리 후, 20 분 동안 KCI(0,56%)로 세포에 hypotonic choc 를 수행하였다. 이어서, 오리 EB24와 EB66 세포를 메탄올/아세트산(3/1)으로 고정하고 밤새 -20℃에서 저장하였다. 하루 뒤,메탑시스(metaphasis)를 유리 위에 떨어뜨리고, wright/giemsa 용액으로 염색하고, 현미경으로 관찰하였다. 오리 기원 EBv13 세포를 고정시킨 여러 종류의 메탑시스가 관찰되었다. 다수성(polyploidy)의 증거는 관찰되지 않았다. 도 16은 오리 EBx 세포의 이배체 핵형을 나타낸 것이다(도 16).
실시예 6: 닭 EBv13 세포주의 폭스 바이러스 복제
폭스 바이러스에 대한 EBv13 세포 감염의 민감성은 GFP 유전자(녹색 형광 단백질)를 코딩하는 재조합 Modified Vaccinia Ankara(MVA)를 사용하여 조사하였다.
하기 프로토콜을 사용하였다. 감염 3일 전, 4 mM 글루타민이 포함된 SFM Excell 65319(SAFC) 40 ㎖가 들어 있는 T175 플라스크 내에 EBv13 세포를 0.4x106 세포/㎖ 농도(계대 188)로 접종하였다. 상기 감염은 10-2TCID50/세포(MVA-GFP stock is at 10e9.7 TCID/ml)의 감염 다중도에서 수행하였다. 감염 후 1시간 뒤, 60 ml의 신선한 배지를 플라스크에 첨가하였다. 상기 배양과 감염은 37℃, 7.5% CO2, 교반(60 rpm) 하에서 수행하였다. 감염 후 매일, 세포 현탁액의 일정량을 수집하고 동결하였다. 동역상 마지막에서, 생산성의 평가를 다음의 TCID 50 방법으로 수행하였다. 간단히, 감염 MVA-GFP의 적정은 DF-1 세포에서 수행하였다. 5% 태아 송아지 혈청(FCS)(SAFC) 및 2 mM L-글루타민(Biowhittaker)이 보충된 DMEM 배지(Biowhittaker)에 세포를 15×103 세포/웰 농도로 96 편평-바닥 웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 뒤에, 상기 세포를 DMEM에 10배로 단계적으로 희석하여 감염시키고, 37℃, 5% CO2로 습도 조절되는 환경으로 1주일 동안 배양하였다. 광범위한 세포변병 효과(CPE) 및 UV-노출된 감염 세포를 현미경 관찰함으로써 바이러스 감염도를 측정하였다. 그리고 난 뒤, Reed and Muench 방법(1938, A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97)에 따라 TCID50 역가를 계산하였다. 모든 실험의 세포 증식과 생존 능력을 모니터링하였다. 닭 Valo EBv13 세포는 MVA-GFP 감염에 고도로 민감한 것으로 나타났다(도 3a-3b).
실시예 8: 오리 EBx 세포주 내에서의 폭스바이러스 복제
GFP를 코딩하는 재조합 Modified Vaccinia Ankara를 사용하여 폭스바이러스에 의한 감염에 대한 오리 EBx 세포의 민감성을 조사하였다. 바이러스 적정은 전술한 닭 EBv13 세포에 수행한대로 수행하였다.
8.1-세포 배양 방법
오리 EBx 세포를 -196℃에서 액체 질소 내의 세포 냉동 바이알(Cryovial)에 저장되어 있으며, 각 냉동바이알은 20×106 세포를 포함하고 있다. 상기 냉동바이알을 37℃로 예열된 워터 배쓰에 넣어 냉동된 바이알을 직접 해동시킨다. 세포 현탁액을 30 ㎖ 예열된 배양 배지가 들어 있는 50 ㎖ 멸균 튜브에 넣는다. 상기 세포 현탁액을 실온에서, 300 ± 20g로 5분 동안 원심분리하고, 펠렛을 새로운 배양 배지 15 ㎖에 첨가하여 부드럽게 균질화한다. 상기 시료는 Trypan blue를 사용하여 계수한다. 계수(numeration)는 ≥20×106 세포이고 생존도는 >70%가 좋은 배양을 보장한다.
상기 세포 현탁액을 T75 ㎠ 플라스크에 넣어 7.5% CO2 대기하에서 50 rpm으로 궤도 쉐이킹하면서 37℃의 조건 하에서 배양한다. 새로운 배지를 매일 첨가한다. 상기 세포를 3L-생물반응기에 접종하도록 세포 바이오매스를 증가시키도록 계대 접종한다. 3L-생물반응기에 접종하기 위해서는 320.106 세포가 필요하다. 부드럽게 혼합한 뒤 샘플을 얻어, 트립판 블루를 사용해 계수하여 세포 농도를 측정하였다. 생물반응기 내의 최종 세포 부피 800㎖ 내에서의 세포 농도가 0.4×10 6세포.㎖-1 이 되도록 150 ㎖ 세포 혼합액을 준비하였다. 세포를 접종하기 전에, 용기 내의 pH를 7.2로 세팅하였다(왜냐하면 CO2 표면 주입에 의해 pH가 감소할 것이기 때문이다). pO2는 50% O2 포화로 세팅하였다(매쓰 플로우 조절기를 100%로 맞추며, 이는 최대 스파져(sparger) 플로우 속도가 50 ㎖.min- 1 인 것과 동일하다). 이 과정의 시작에, pH는 CO2 표면 주입에 의해 유지되며, 이후에는, 7.5% NaHCO3의 첨가에 의해 조절된다. 표면 통기(aeration)는 0.3 ㎖.min-1의 플로우 속도의 공기로 시작 한다. 세포 계수는 정기적인 방법으로 수행한다.
배양 3일 후에, 배양 3일 후에, 세포 농도는 4~5×106세포.㎖-1보다 높아야 한다. 예상 세포 농도에 도달하면, 10-4의 MOI로 바이러스 감염을 수행한다. 용기 온도는 33℃에 맞춘다. 바이러스 균주는 얼음에서 해동한다. 감염 혼합물은 10 ㎖의 생산 배지를 준비한다. 감염 믹스를 생물반응기에 접종 후, 바이러스 흡착이 1 시간 동안 이루어진다. 최종 생산 배지를 준비한다: 1.5 L의 생산 배지, 0.3 U.ml-1의 용기 내 최종 농도를 얻기 위하여 트립신을 첨가한다(전체 2.3 L). 그리고 나서, 예열한 최종 생산 배지를 첨가한다. 세포 계수, 세포 형태 분석 및 CPE 관찰을 위하여 대략 15 ml의 샘플을 생물반응기에서 매일채집한다. BioProfile Basic software로 배양 기간에 걸쳐 글루타메이트, 글루타민, 락테이트와 글루코스 등의 대사물을 분석한다. 필요한 경우 대사물의 농도를 적정한다. 예컨대, 글루타민 농도는 필요한 경우, 2 mM로 적정한다. 필요한 경우, 글루코스 농도를 2 g.L-1로 적정한다.
바이러스 적정은 수집한 샘플을 모두 사용하여 실험의 마지막 단계에서 수행하였다.
8.2- 결과
8.2.1 - 3L 페드배치 생물반응기의 오리 EBx ® 세포의 세포 성장 역동학
오리 EBx® 세포는 교반-탱크 생물반응기에서 통상적인 방법으로 배양한다. EBx®-유도된 바이오매스는 세포 농도가 5-6.106 세포/㎖에 도달할때까지 37℃로 세포 성장 배지에서 축적되게 한다. 그리고 난 뒤, 혼합물을 약 3 내지 10배 희석하며, 10일 동안 세포 성장 역동학을 수행한다. 이러한 조건에서, 12 내지 20 백만 세포/㎖ 농도의 세포는 통상적으로 5 내지 8일째에 도달한다. 그러므로 오리 EBx® 세포는최소 10 내지 15 배에 해당하는 광범위한 스플릿팅 비를 보여주는 것이다.
8.2.2 - 오리 EBx 세포에서의 MVA - GFP 바이러스 감염중의 클럼프 사이즈에 미치는 세포 배양 배지 조성의 영향
본 발명자들은 EBx 세포 배양과 감염에 사용되는 무혈청배지의 칼슘과 마그네슘의 농도가 클럼프 크기에 영향을 줄 수 있다는 것을 발견하였다. 오리 EBx 세포의 작은 클럼프의 존재는 바이러스 감염과 증식을 증가시키며, 높은 MVA 바이러스 역가를 초래한다(도 9a).
8.2.3 - 3L 생물반응기에서의 MVA 바이러스 생산
오리 EBx®-유도된 바이오매스는 Excell 66444 성장 배지에서 세포 증식기 동안 축적되도록 놓아두었다. 그리고 난 뒤 10-2 TCID50/세포의 MVA-GFP 바이러스로 상기 세포를 감염시키고, 이 혼합액을 Excell 66444 생산 배지에 희석하였다. 새로운 Excell 배지를 첨가하고 난 뒤, 세포 농도가 2일째에 감소하였으며, 4일째에 감염된 세포의 농도가 증가하여 세포 농도가 12 백만 세포/㎖이 되었다. 이러한 조건에서, MVA-GFP 생산도는 높다. 감염 후 4일째부터, MVA-GFP 역가는 약 108TCID50/㎖(도 9b)이다. 205 TCID50/세포의 MVA-GFP 산출은 오리 EBx® 세포 내에서 얻어진다.
실시예 9: 오리 EBx 세포주에서의 인플루엔자 바이러스의 생산
9.1 - 재료 및 방법
9.1.1 - 인플루엔자 바이러스 감염도 분석( TCID50 )
감염성 인플루엔자 바이러스의 역가 분석은 MDCK 세포에서 수행하였다. 간단하게는, 2.5 mM L-글루타민이 보충된 UltraMDCK 배지에 세포를 3×103 세포/웰 농도로 96 웰 편평-바닥 플레이트에 접종하였다. 24 시간 후에, 6㎍.㎖- 1트립신-EDTA를 포함하는 UltraMDCK에 10배로 연속 희석한 샘플로 상기 세포를 감염시켰으며, 33℃로 5% CO2 습도 유지 대기하에서 1주일 동안 배양하였다. 그리고 난 뒤, 닭 적혈구를 이용하여 HA 분석으로 바이러스 복제를 테스트하고, Reed and Muench 방법(1938)*에 따라 TCID50 역가를 계산하였다. *Reed L & Muench H(1938) A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97.
9.1.2 - 단일 방사선 면역확산 분석( SRID )
인플루엔자 바이러스 감염된 EB14 세포로부터 유도된 샘플에 있는 헤마글루티닌의 농도는 Wood and colleagues*의 방법으로 측정하였다. 간단하게는, 유리 플레이트를 항-인플루엔자 혈청(바람직한 농도는 NIBSC에 의해 제공됨)을 포함하는 아가로즈 젤로 코팅하였다. 젤을 세팅하고 난 뒤, 참고물질 희석액 10㎕과 샘플을 3 mm φ펀치 웰에 로딩하였다. 습윤 챔버에서 실온으로 18-24시간 동안 반응시키고 난 뒤, 상기 플레이트를 0.9% NaCl에 담구고 증류수로 세척하였다. 그리고 난 뒤 젤을 압축 건조시켰다. 상기 플레이트를 코마시 블릴리언트 블루 용액으로 15분 동안 염색한 뒤 명확하게 염색된 부분이 보일때까지 메탄올과 아세트산 혼합액으로 2회 탈염색하였다. 플레이트를 건조시키고 난 뒤, 항원 웰을 둘러싸는 염색 부위의 직경을 직각으로 2회 측정하였다. 표면에 대한 항원 희석의 용량-의존적 커브가 완성되었으며 그 결과를 표준 슬로프-비율 분석 방법에 따라 계산하였다. * Wood JM. Et al. "An improved single-radial-immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: application for potency determinations of inactivated whole virus and subunit vaccines"(J Biol Stand. 1977;5(3):237-24).
9.1.3 - 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질의 웨스턴 블랏 분석
SDS-PAGE는 Laemmli UK(1970, Cleavge of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 259:680-685)의 방법에 따라 10% 폴리아크릴아마이드 젤에서 수행하였다. 변성 단백질(1% SDS, 70 mM β-머캅토에탄올)을 반건조 블라팅 방법(Kyhse-Andersen J(1984) Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocelluse)에 따라 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인(hybond P, Amersham)으로 전달하였다. 1% FCS(SAFC) 첨가된 TBST에 5% 탈지 분유가 혼합된 혼합물에서 상기 블랏을 실온으로 1시간 동안 블라킹시켰다. 그리고 난 뒤, 상기 블랏을 특정 폴리클로날 항-HA 양 혈청이 첨가된(1:5000(NIBSC)) 블라킹 용액에서 밤새 반응시켰다. 상기 블랏을 TBST로 6회 세척하고 hrp-결합된 토끼 항-양 IgG 폴리클로날 항체가 들어있는 블라킹 용액(1:500(Rockland))에서 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBST로 6회 세척하고 난 뒤, 단백질-결합 컴플렉스를 케미루미네센스(ECL kit, Amersham) 및 필름(Hyperfilm, Amersham)을 사용해 최종적으로 확인하였다.
9.2 - 3L 생물 반응기에서의 오리 EBx ® 세포의 인플루엔자 바이러스 감염
9.2.1 - 재료 및 장비
세포 해동 재료
o T75 ㎠ 플라스크(Sarstedt, 카달로그 번호, 831813502)
o 배양 배지(무혈청 배지)
o L-글루타민 200 mM(Biowhittaker, 카달로그 번호, BE17-605E)
o 궤도 혼합기 IKA KS260(Fisher Bioblock, 카달로그 번호, F35044)
세포 증폭 재료
o T75 ㎠ 플라스크(Sarstedt, 카달로그 번호, 831812502)
o 배양 배지(무혈청 배지) : 2.5 mM 글루타민이 첨가된 Excell 65319(JRH, 카달로그 번호, 65319-1000M1687)
o L-글루타민 200 mM(Biowhittaker, 카달로그 번호, BE17-605E)
o D(+) 글루코스(45%)(Sigma, 카달로그 번호, G8769)
생산 재료
o 생산 배지(무혈청배지) : 2.5 mM 글루타민이 첨가된 Excell 65629(JRH, 카달로그 번호, 65629)
o L-글루타민 200 mM(Biowhittaker, 카달로그 번호, BE17-605E)
o D(+) 글루코스(45%)(Sigma, 카달로그 번호, G8769)
o 트립진(Trypzean) 1X,(Sigma, 카달로그 번호, T3449)
o 7.5% 탄산수소 나트륨 용액(Sigma, 카달로그 번호 205-633-8)
o 인플루엔자 바이러스 균주(-80℃에 냉동)
9.2.2 세포 배양 방법
(실시예 7.1의 MVA 복제와 동일)
바이러스 역가 분석, 헤마글루티닌 분석(HAU) 및 HA 항원 정량(웨스턴 블랏, SRID)은 모든 수득된 샘플을 사용하여 실험의 마지막에 수행한다.
9.3 - 결과
본 발명자들은 다양한 인플루엔자 바이러스 균주 A 및 B의 복제를 위해 오리 EBx 세포가 가장 신뢰성이 높고 효과적인 세포 기질임을 확인하였다. 인플루엔자 바이러스 생산은 플라스크 및 스피너(결과 미제시) 및 생물반응기와 같은 다양한 용기에서 수행할 수 있다. 3L 및 30L 교반 탱크 생물반응기에서의 인플루엔자 바이러스 생산의 재생산 가능하고 효과적인 페드배치 공정은 본 발명자에 의해 획득되었다. 15 mg/ℓ에서 50 mg/ℓ 이상의 헤마글루티닌 생산도는 플라스크 및 생물반응기에서 얻어질 수 있으며, 플루엔자 균주 A 및 B를 이용하여 얻어질 수 있다(도 11 및 도 12).
실시예 10: 오리 EBx 세포주 내에서의 뉴캐슬병 바이러스 복제
오리 EBx 세포의 뉴캐슬병 바이러스 감염에 대한 민감성은 NDV La Sota 균주를 사용하여 조사하였다.
10.1. 방법
오리 EBx®세포의 성장을 T175 플라스크 내의 EXcell 배지(SFAC)에서, 37℃, 7.5% CO2, 오비탈 쉐이커(60 rpm)에서 수행하였다. 0일 째, 40 ㎖ 신선한 배지 내에 0.4x106 세포/mL를 접종하였다. 세포 배양액을 37℃, 7.5% CO2, 진탕(60 rpm) 하에서 배양하였다. 세포 성장 역동학은 세포 밀도가 농도 4x106 세포/㎖ 내지 6x106 세포/㎖ 가 될때까지 수행하였다(보통 접종 후 3일). 그 시점에서, 세포에 두 개의 서로 다른 MOI(10-3 와 10-4 TCID50/세포)로 NDV La Sota 균주를 접종하고, 37℃, 7.5% CO2, 진탕(60 rpm) 하에서 추가 1시간 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 신선한 바이러스 생산 배지 60 mL를 첨가하여 희석하고, 37℃, 7.5% CO2, 진탕(60 rpm) 하에서 배양하였다. 세포 성장과 바이러스 생산 역동학은 7일 동안 수행하였다. 프로테아제 공급원으로서, 재조합 트립신(SAFC)를 배양 배지에 매일 첨가하였다; 2개의 트립신 농도(0.4 와 0.75 USP/mL)를시험하였다. 세포 계수, 바이러스 역가와 웨스턴 블러팅 분석에 있어서 일정량을 매일 채집하였다.
샘플을 10% SDS-PAGe를 사용하여 분리하고, 반 건조 기술로 PDVF 막(Amersham)에 블럿팅하였다. 면역 검출을 NDV에 대한 닭 다클론 항혈청(1:2000, CHARLES RIVER 실험실), Alkaline 포스파타아제-결합 토끼 항-닭(1:5000, SIGMA)를 사용하여 수행하였다. 결합된 제2 항체를 ECL-Chemiluminescence 검출 시스템 키트(ROCHE)를 사용하여 검출하였다.
10.2-결과
오리와 닭 EBx 세포는 NDV La Sota 균주에 대해 민감하며, 이를 복제한다. 오리 EBx® 세포 내에서 생산되는 NDV의 역가(TCID50/㎖)는 감염 후 제0일에서 제2일까지, 평균 106.83TCID50/mL에 달할 정도로 증가한다(도 13 왼쪽 패널).
웨스턴 블럿 분석(도 13 오른쪽 패널)은 NDV 바이러스 단백질(HN, Fo/F, NP & M) 발현을 나타낸다. 오리 EBx® 세포 내에서 생산되는 NDV 바이러스의 바이러스 단백질 조성은 닭 EBx® 세포 내에서 생산되는 NDV 바이러스에서 얻은 것과 유사하다. 또한, 닭과 오리 EBx 세포에서 생산된 바이러스에 대한 방출 역동학은 유사하다.
실시예 11: 오리 EB66 세포 내의 홍역 바이러스 복제
오리 EB66 세포의 홍역 바이러스 감염에 대한 민감성은 녹색 형광 단백질을 발현하는 재조합 홍역 바이러스를 사용하여 조사하였다.
11.1. 방법
EB66 세포의 성장을 T175 플라스크 내의 EXcell 배지에서, 37℃, 7.5% CO2, 오비탈 쉐이커(60 rpm)에서 수행하였다. 0일 째, 40 ㎖ 신선한 배지 내에 0.4x106 세포/mL를 접종하였다. 세포 배양액을 37℃, 7.5% CO2, 진탕(60 rpm) 하에서 배양하였다. 세포 성장 역동학은 세포 밀도가 농도 4x106 세포/㎖ 내지 6x106 세포/㎖ 가 될때까지 수행하였다(보통 접종 후 3일). 그 시점에서, 세포에 두 개의 서로 다른 MOI(10-1 와 10-2 TCID50/세포)로 재조합 홍역 바이러스를 접종하고, 37℃, 7.5% CO2, 진탕(60 rpm) 하에서 추가 1시간 배양하였다. 그 후, 세포 배양액을 신선한 바이러스 생산 배지 60 mL를 첨가하여 희석하고, 37℃, 7.5% CO2, 진탕(60 rpm) 하에서 배양하였다. 세포 성장과 바이러스 생산 역동학은 7일 동안 수행하였다. 세포 계수, 바이러스 역가에 있어서 일정량을 매일 채집하였다.
11.2-결과
EB66 세포는 홍역 바이러스에 대하여 민감하고 홍역 바이러스를 복제한다. 최적화되지 않은 조건에서, EB66 세포 내에서 생산된 홍역의 역가(TCID50/㎖)는 평균 107TCID50/mL에 도달한다(도 14).

Claims (7)

  1. 다음 단계들:
    a) 착란 시기의 발생 단계에 있는 조류 배아를 분리하는 단계로서, 상기 조류는 오리 또는 닭인 것이고, 상기 조류의 게놈은 복제 가능 내인성 레트로바이러스 입자를 생산할 수 있는 내인성 프로바이러스성 서열을 함유하지 않는 것인 단계;
    b) 단계 a)의 배아를 단리하여 수득한 조류 배아 줄기(ES) 세포를 하기 물질이 포함된 기본 배지에 현탁하는 단계;
    -인슐린 성장 인자 1(IGF-1)와 섬모 신경영양 인자(CNTF), 및
    -동물 혈청,
    c) 단계 b)에서 수득한 ES 세포의 현탁액을 영양 세포층에 접종한 뒤 상기 ES 세포를 최소 1회 계대 배양하는 단계;
    d) 배양 배지로부터의 IGF-1과 CNTF를 회수하고, 세포를 추가로 최소 1회 계대 배양하는 단계; 및
    e) 배양 배지 내의 영양 세포 농도를 점진적으로 감소시켜, 수회의 계대 배양 후 영양층 전체를 회수하고, 추가로 상기 세포를 배양하는 단계;
    를 포함하는 방법으로 수득가능한, 조류 배아 줄기 세포(ES)로부터 유래된 연속적 이배체 조류 세포주로서, 상기 연속적 이배체 조류 세포주는 성장 인자와 영양층을 포함하지 않는 기본 배지 내에서 증식할 수 있고, 상기 연속적 이배체 조류 세포주는 복제 가능 내인성 레트로바이러스 입자를 생산하지 않는 것인, 연속적 이배체 조류 세포주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포주는 부착 세포주인 것인 연속적 이배체 조류 세포주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포주는 현탁 세포주인 것인 연속적 이배체 조류 세포주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조류는 페킨 오리(Pekin duck)인 것인 연속적 이배체 조류 세포주.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조류는 무스코비 오리(Muscovy duck)인 것인 연속적 이배체 조류 세포주.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조류는 ev-0 집 닭인 것인 연속적 이배체 조류 세포주.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 조류 세포주의 세포들은 하기 특성 중 하나 이상을 갖는 것인 연속적 이배체 조류 세포주:
    - 높은 핵-세포질 비율,
    - 내인성 텔로머라아제 활성,
    - 10 ㎛의 직경,
    - 37℃에서 30 시간 이하의 군집 배가 시간, 및
    - 상기 세포들은 알칼리 포스파타아제, SSEA-1, EMA-1, ENS-1로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현.
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