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KR20150027761A - 유용미생물 및 목적물질의 제조방법 - Google Patents

유용미생물 및 목적물질의 제조방법 Download PDF

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KR20150027761A
KR20150027761A KR1020147035866A KR20147035866A KR20150027761A KR 20150027761 A KR20150027761 A KR 20150027761A KR 1020147035866 A KR1020147035866 A KR 1020147035866A KR 20147035866 A KR20147035866 A KR 20147035866A KR 20150027761 A KR20150027761 A KR 20150027761A
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가부시키가이샤 지나리스
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Abstract

본 발명의 과제는 중간 대사물인 화합물 P로부터 대사물 M으로의 전환량을 감소시키고, 대사물 M 또는 대사물 M으로부터 생성되는 최종산물을 첨가하지 않는 배지 중에서 화합물 P를 효율적으로 축적할 수 있는 균주를 제공하는 것이다. 본 발명에 따르면, 탄소원으로부터 생육에 필수적인 대사물 M을 생성하는 생합성 경로에서 중간 대사물인 화합물 P를 대사물 M으로 전환시키는 효소 X의 발현량을 조절하여 화합물 P를 축적시키기 위하여, 본 명세서에 기재된 (a) 내지 (d)의 성질을 모두 가지는 원핵생물이 제공된다.

Description

유용미생물 및 목적물질의 제조방법{Useful Microorganism, And Method For Producing Desired Substance}
본 발명은 유기산, 아미노산 등의 유용물질을 효율적으로 제조하기 위한 미생물 및 상기 미생물을 이용한 유용물질의 제조방법에 관한 것이다.
영양요구 변이와 대사조절 돌연변이의 도입 또는 재조합 DNA 기술 등을 이용하여, 유기산, 아미노산, 핵산, 비타민 등 유용 화합물을 효율적으로 제조하는 미생물을 수득하는 방법이 개발되고 있다. 도 1과 같이, 탄소원으로부터 중간 대사물인 화합물 P를 거쳐 생육에 필수적인 대사물 M을 생성하는 생합성 경로 또는 대사경로에 있어서, 화합물 P를 효율적으로 생산시키기 위하여 화합물 P를 대사물 M으로 전환시키는 효소 X의 활성을 결핍한 영양요구 변이주를 수득하는 방법이 자주 이용되어 왔다. 그러나, 상기 변이주를 이용하여 목적하는 화합물 P를 생산할 경우, 대사물 M 또는 대사물 M으로부터 생성되는 최종산물을 배지에 첨가할 필요가 있으며, 제조비용이 높아진다는 문제점이 있었다.
예를 들어, 도 2에 도시한 시킴산 경로의 중간 대사물인 시킴산(shikimic acid)을 시킴산 키나제 활성을 결핍한 에스케리키아·콜리(Escherichia coli)를 이용하여 효율적으로 생산된다는 사실이 보고되었다(특허문헌 1, 비 특허문헌 1). 다만, 상기 미생물을 이용할 경우, 트립토판, 티로신, 페닐알라닌의 요구성에 더해 파라-히드록시벤조산, 파라-아미노벤조산 및 2,3-디히드록시벤조산의 요구성이 생기기 때문에, 이들 6종류의 화합물을 배지에 첨가할 필요가 있다는 문제점이 있었다. 또한, 시킴산 경로의 중간 대사물인 3-데히드로시킴산을 시킴산 탈수소 활성을 결핍한 에스케리키아·콜리를 이용하여 효율적으로 생산된다는 사실이 보고되고 있지만, 상기 미생물도 상기 6개의 화합물의 요구성이 생긴다는 문제점이 있었다(특허문헌 2, 비 특허문헌 2).
N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘이나 에틸메탄술폰산 등의 변이제를 이용한 처리나 UV, 방사선 조사 등에 의해 변형 처리하거나 자연 돌연변이 등에 따라 변이를 도입함으로써 화합물 P로부터 대사물 M으로 전환시키는 효소 X의 양을 감소시키는 변이를 도입하고, 대사물 M의 생성량을 감소시킴으로써 화합물 P의 양을 증가시킬 수 있다. 이 경우, 효소 X의 활성이 잔존함으로써 화합물 P의 일부가 항상 대사물 M으로 전환하기 위하여 화합물 P의 생산량을 최대화하는 조건을 찾기가 용이하지 않다.
본 발명은 효소 X를 암호화하는 유전자 x의 전사를 인위적으로 리프레서의 제어하에 두고 대사물 M의 생성량을 조절함으로써 대사물 M 또는 대사물 M으로부터 생성되는 최종산물을 배지에 첨가하지 않고 화합물 P를 효율적으로 생산하는 방법을 개시하나, 유전자 x 본래의 프로모터가 아니라 리프레서에 의해 전사억제되는 다른 프로모터를 이용하여 유전자 x의 전사량을 제어함으로써 화합물 P의 생산량을 향상시킨 사례는 보고되지 않았다.
미생물을 이용하여 유용한 화합물을 제조할 경우, 탄소원으로부터 중간 대사물인 화합물 P를 거쳐 생육에 필수적인 대사물 M을 생성하는 생합성 경로 또는 대사경로에서, 상기 경로 상의 화합물 P에서 분기하는 경로에 의해 상기 유용한 화합물을 생산시키는 방법이 이용되는 경우도 많다. 이 방법을 이용하는 경우에도, 상기 효소 X의 활성을 결핍한 영양요구 변이주를 수득하는 방법이 자주 이용되어 왔지만, 대사물 M 또는 대사물 M으로부터 생성되는 최종산물을 배지에 첨가할 필요가 있으며, 제조비용이 높아진다는 문제점이 있었다.
다수의 분기 경로를 가진 시킴산 경로(도 2)를 이용하는 목적물질의 생산에 관해서는, 예를 들어, 트립토판 생산균주의 대부분은 중간 대사물인 코리스민산이 티로신, 페닐알라닌의 합성경로에 도입되지 않도록 하기 위하여, 티로신, 페닐알라닌의 요구성을 가지는 것으로 알려져 있다(특허문헌 3, 비 특허문헌 3 및 4). 또한, 페닐알라닌 생산균은 티로신의 요구성을 가지는 것으로 알려져 있다(특허문헌 4 및 5,비 특허문헌 5). 따라서, 목적하는 방향족 아미노산을 제조할 때에는, 다른 방향족 아미노산을 배지에 첨가할 필요가 있다.
3-데히드로시킴산(3-dehydroshikimic acid, 이하에서는, "DHS"로 약함)으로부터 시킴산(대사물 M)으로 전환시키는 효소를 결핍시키고, 시킴산 경로의 출발물질인 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로손산-7-인산(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate, 이하에서는, "DAHP"로 약함)의 생성량을 증가시킨 변이주를 작제함으로써, 약 40 g/L 프로토카테큐산을 생산할 수 있는 것도 보고되었다(비 특허문헌 6). 단, 상기 변이주를 이용할 경우, 트립토판, 티로신, 페닐알라닌의 요구성에 더해 파라-히드록시벤조산, 파라아미노벤조산 및 2,3-디히드록시벤조산의 요구성이 생기기 때문에, 이들 6종류의 화합물을 배지에 첨가할 필요가 있다는 문제점이 있었다. 또한, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 세균(특허문헌 6) 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 세균(특허문헌 7 및 8)에 변이를 도입함으로써, 프로토카테큐산 생산균을 수득하였지만, 이들 변이주는 프로토카테큐산의 생산에 대해서 티로신 등의 영양 공급원이 필요하다. 또한, 이들 변이주의 프로토카테큐산 생산량의 최고치는 약 13g/L이며, 상술한 방향족 아미노산 영양요구 변이주 생산량보다 낮다(특허문헌 8).
[특허문헌 1] United States Patent 6,472,169 [특허문헌 2] United States Patent 5,821,266 [특허문헌 3] 특허 제4,305,184호 공보 [특허문헌 4] 특개평 5-49489호 공보 [특허문헌 5] 특개평 5-304971호 공보 [특허문헌 6] 특공소 45-39036호 공보 [특허문헌 7] 특개소 50-89592호 공보 [특허문헌 8] 특개소 60-98989호 공보
[비 특허문헌 1] Biotechnol. Prog. 19, 808(2003) [비 특허문헌 2] Biotechol. Bioeng. 64, 61(1999) [비 특허문헌 3] Agric. Biol. Chem. 39, 343(1975) [비 특허문헌 4] Appl Environ Microbiol. 65, 2497(1999) [비 특허문헌 5] Agric. Biol. Chem. 37, 2013(1973) [비 특허문헌 6] J. Am. Chem. Soc. 127, 2874(2005)
본 발명의 과제는 탄소원으로부터 중간 대사물인 화합물 P를 통해 생육에 필수적인 대사물 M을 생성하는 생합성 경로 또는 대사경로를 가진 미생물을 이용하여 화합물 P를 생산할 때 화합물 P로부터 대사물 M으로의 전환량을 감소시키고, 대사물 M 또는 대사물 M으로부터 생성되는 최종산물을 첨가하지 않는 배지 중에서 화합물 P를 효율적으로 축적할 수 있는 균주를 수득하는 방법(도 1)을 제공함으로써, 축적된 화합물 P를 가지고 효소 Y에 의해 화합물 Q를 생산하는 방법(도 3)을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032주(이하에서는, "ATCC13032주"라 함)를 이용하여, 목적물질인 DHS를 효율적으로 생산하는 균주를 작제하는 연구에서, 상기 과제를 해결하는 것을 시도하였다. 우선, 포도당으로부터 DHS(화합물 P)에 이르는 생합성 경로에 관련된 여러 효소의 발현을 증강하고, DHS로부터 프로토카테큐산으로의 전환을 촉진하는 DHS 탈수효소(효소 Y)를 암호화하는 유전자인 qsuB(cg0502) 유전자의 전사를 tuf(cg0587) 유전자의 프로모터(이하에서는, "Tu 프로모터"라 약함) 제어하의 NSH주를 가지고, DHS로부터 시킴산(대사물 M)으로의 전환을 촉진하는 시킴산 탈수소효소(효소 X)를 암호화하는 aroE3(cg1835) 유전자에 결실 돌연변이를 도입한 NSHΔaroE3주를 작제한 결과, NSHΔaroE3주의 증식은 3종류의 방향족 아미노산(트립토판, 페닐알라닌 및 티로신)를 첨가하지 않으면 극히 늦어짐을 확인하였다. 이 NSHΔaroE3주는 3종류의 방향족 아미노산과 시킴산을 첨가한 배지 중에서 배양함으로써, 0.5g/L 프로토카테큐산을 생산하는 것을 확인하였다. 다음으로, 이 NSHΔaroE3주를 가지고 활성형 시킴산 탈수소효소 유전자(aroE3 유전자)의 발현을 vanR(cg2615) 유전자가 암호화하는 리프레서(이하에서는, "VanR 리프레서"라 약함)에 의해 제어하기 위하여, aroE3 유전자를 vanA(cg2616) 유전자의 프로모터(이하에서는, "vanA 프로모터"라 약함)에 연결된 DNA를 염색체에 도입한 NSHΔaroE3_vanE3주를 작제하였다. 이 NSHΔaroE3_vanE3주는 3종류의 방향족 아미노산과 시킴산을 첨가하지 않는 합성배지 중에서 성장하며, 16.6 g/L 프로토카테큐산을 생산하는 것을 알아내고, 본 발명의 과제를 해결하기에 이르렀다. 또한, 이 NSHΔaroE3주를 가지고 aroE3 유전자 발현을 rhcR(cg1308) 유전자가 암호화하는 리프레서(이하에서는, "RhcR 리프레서"라 약함)에 의해 제어하는 균주를 작제한 결과, 11.2 g/L 프로토카테큐산의 생산성이 확인되어 VanR 리프레서 이외의 리프레서를 이용하더라도 우수한 프로토카테큐산의 생산성을 얻을 수 있는 것을 확인하였다.
다음으로, NSHΔaroE3주의 aroE3 유전자 결실 돌연변이에 더해 DHS로부터 시킴산(대사물 M)으로의 전환을 촉진하는 시킴산 탈수소효소를 암호화하는 qsuD(cg0504) 유전자와 DHS 탈수효소를 암호화하는 qsuB 유전자에도 결실 돌연변이를 도입한 NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD주를 작제한 결과, NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD주는 3종류의 방향족 아미노산과 비타민 K2와 파라-아미노벤조산을 첨가하지 않으면 증식할 수 없음을 확인하였다. 이 NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD주는 이들 첨가물을 가한 배지 중에서 배양함으로써, 7.7 g/L의 DHS를 생산하는 것을 확인하였다. NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD주의 구축과 같은 순서로, NSHΔaroE3_vanE3주를 가지고 qsuD 유전자와 qsuB 유전자에 결실 돌연변이를 도입한 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuBΔqsuD주를 작제하였다. 이 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuBΔqsuD주를 가지고 benA(cg2637) 유전자의 프로모터와 VanR 리프레서를 암호화하는 vanR 유전자를 연결한 DNA를 염색체에 도입한 Pben-vanR주를 작제한 결과, Pben-vanR주는 이들 첨가물을 포함하지 않는 합성배지 중에서 성장하고, 15.4 g/L의 DHS를 생산할 수 있는 것을 알아내고, 본 발명의 과제를 해결하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 (1)~(24)에 관한 것이다:
(1) 탄소원으로부터 생육에 필수적인 대사물 M을 생성하는 생합성 경로에서 중간 대사물인 화합물 P를 대사물 M으로 전환시키는 효소 X의 발현량을 조절하여 화합물 P를 축적시키기 위하여, 이하의 (a) 내지 (d)에 기재된 성질을 모두 가지는 원핵생물:
(a) 상기 원핵생물이 이용할 수 있는 탄소원으로부터 화합물 P에 이르는 생합성에 관련한 효소군 중 1개 이상의 효소활성이 상기 원핵생물의 야생주에 비해 증대되고,
(b) 효소 X의 단백질을 암호화하는 야생형 유전자 x의 번역영역, 상기 유전자의 번역조절 영역 또는 유전자 x의 전사를 촉진하는 프로모터 영역 내에 1개 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되는 변이를 가짐으로써, 효소 X의 활성이 결손 또는 저하되며,
(c) 상기 유전자 x의 전사를 촉진하는 본래의 프로모터와 다른, 리프레서 R 단백질에 의한 전사가 억제되는 프로모터 A에 의해 활성형 효소 X를 암호화하는 DNA의 전사가 제어되며,
(d) 리프레서 R의 단백질을 암호화하는 유전자 z를 1카피 이상 가지고, 상기 유전자의 전사가 상기 유전자 본래의 프로모터 및/또는 상기 프로모터와 다른 유도 프로모터 B에 의해 제어된다.
(2) 성질 (b)에 기재된 유전자 x의 전사를 촉진하는 프로모터 영역 속의 치환변이가, 상기 프로모터의 전역 또는 일부 영역을 성질 (c)에 기재된 프로모터 A의 DNA로 치환하는 변이인 것을 특징으로 하는, (1)에 기재된 원핵생물.
(3) 상기 원핵생물이 가지는 화합물 P를 대사하는 효소 중, 효소 X 이외의 1개 이상의 대사효소 활성이 결손 또는 저하되는 것을 특징으로 하는, (1) 또는 (2)에 기재된 원핵생물.
(4) 상기 프로모터 B가 훼루린산, 바닐린산, 바닐린, 벤조산, 3-히드록시벤조산, 레조르시놀, 4-히드록시벤조산, 2,4-디히드록시벤조산, 과당 및 자당으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물의 첨가에 의해 유도되는 프로모터인 것을 특징으로 하는, (1) 내지 (3)의 어느 하나에 기재된 원핵생물.
(5) 상기 리프레서 R의 단백질을 암호화하는 유전자 z가 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032주의 vanR(cg2615) 유전자, pcaR(cg2624) 유전자 또는 rhcR(cg1308) 유전자인 것을 특징으로 하는, (1) 내지 (4)의 어느 하나에 기재된 원핵생물.
(6) 상기 프로모터 A가 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032주의 vanA(cg2616) 유전자의 프로모터, pobA(cg1226) 유전자의 프로모터, pcaH(cg2631) 유전자의 프로모터 또는 rhcH(cg1309) 유전자의 프로모터인 것을 특징으로 하는, (1) 내지 (5)의 어느 하나에 기재된 원핵생물.
(7) (1) 내지 (6)의 어느 하나에 기재된 원핵생물을 프로모터 A의 전사를 억제하는 상태에서 탄소원의 존재하에서 배양하는 단계를 포함하는 화합물 P의 제조방법.
(8) (1) 내지 (6)의 어느 하나에 기재된 원핵생물을 프로모터 A의 전사를 억제하는 상태에서 탄소원의 존재하에서 배양하는 단계; 및,
프로모터 B의 전사를 유도함으로써 리프레서 R 단백질의 발현량을 증가시키고 대사물 M의 생성량을 감소시키는 단계를 포함하는 화합물 P의 제조방법.
(9) (1) 내지 (6)의 어느 하나에 기재된 원핵생물을 프로모터 A의 전사억제를 해제한 상태에서 탄소원의 존재하에서 배양하는 단계; 및,
프로모터 B의 전사를 유도함으로써 리프레서 R 단백질의 발현량을 증가시키고 대사물 M의 생성량을 감소시키는 단계를 포함하는 화합물 P의 제조방법.
(10) 상기 화합물 P 및 상기 대사물 M의 조합이 이하에 기재된 (f) 내지 (i)의 하나인 것을 특징으로 하는 화합물 P의 제조방법:
(f) 화합물 P가 3-데히드로시킴산이고 대사물 M이 시킴산이며,
(g) 화합물 P가 글루탐산이고 대사물 M이 N-아세틸글루탐산 또는 γ-글루타밀인산이며,
(h) 화합물 P가 아스파르트산이고 대사물 M이 β-아스파틸인산이며,
(i) 화합물 P가 세린이고 대사물 M이 글리신이다.
(11) 축적하는 화합물 P를 효소 Y의 화합물 Q로 전환하기 위하여 (a) 내지 (d)에 기재된 성질에 더하여 아래의 성질 (e)를 가지는 것을 특징으로 하는 원핵생물:
(e) 효소 Y의 단백질을 암호화하는 유전자 y의 번역영역, 상기 유전자의 번역조절 영역 또는 유전자 y의 전사를 촉진하는 프로모터 영역 내에 1개 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되는 변이를 가짐으로써 화합물 P로부터 화합물 Q로의 전환능력이 증대되거나 유전자 y의 발현이 야생형과는 다른 제어를 받는다.
(12) 상기 원핵생물이 가지는 화합물 Q를 대사하는 효소 중 1개 이상의 대사효소 활성이 결손 또는 저하되는 것을 특징으로 하는, (11)에 기재된 원핵생물.
(13) 성질 (e)에 기재된 유전자 y의 전사를 촉진하는 프로모터 영역 속의 치환변이가 상기 프로모터의 전역 또는 일부 영역을 그 유전자의 전사를 촉진하는 본래의 프로모터 및 프로모터 A와는 다른 프로모터 C의 DNA로 치환하는 변이인 것을 특징으로 하는, (11) 또는 (12)에 기재된 원핵생물.
(14) 상기 프로모터 C가 프로모터 B와 동일하거나 또는 상기 프로모터 C가 프로모터 B의 전사를 제어하는 단백질에 의한 전사제어를 받는 것을 특징으로 하는, (13)에 기재된 원핵생물.
(15) 상기 프로모터 C가 유도 프로모터인 것을 특징으로 하는, (13) 또는 (14)에 기재된 원핵생물.
(16) 상기 프로모터 C가 훼루린산, 바닐린산, 바닐린, 벤조산, 3-히드록시벤조산, 레조르시놀, 4-히드록시벤조산, 2,4-디히드록시벤조산, 과당 및 자당으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물의 첨가에 의해 유도되는 프로모터인 것을 특징으로 하는, (15)에 기재된 원핵생물.
(17) (11) 내지 (16)의 어느 하나에 기재된 원핵생물을 프로모터 A의 전사를 억제하는 상태에서 탄소원의 존재하에서 배양하는 단계를 포함하는 화합물 Q의 제조방법.
(18) (11) 내지 (16)의 어느 하나에 기재된 원핵생물을 프로모터 A의 전사를 억제하는 상태에서 탄소원의 존재하에서 배양하는 단계; 및,
프로모터 B의 전사를 유도함으로써 리프레서 R 단백질의 발현량을 증가시키고 대사물 M의 생성량을 감소시켜 화합물 Q의 생성량을 증가시키는 단계를 포함하는 화합물 Q의 제조방법.
(19) (11) 내지 (16)의 어느 하나에 기재된 원핵생물을 프로모터 A의 전사억제를 해제한 상태에서 탄소원의 존재하에서 배양하는 단계; 및,
프로모터 B의 전사를 유도함으로써 리프레서 R 단백질의 발현량을 증가시키고 대사물 M의 생성량을 감소시켜 화합물 Q의 생성량을 증가시키는 단계를 포함하는 화합물 Q의 제조방법.
(20) (11) 내지 (16)의 어느 하나에 기재된 원핵생물을 탄소원의 존재하에서 배양하는 단계; 및,
상기 프로모터 C의 전사를 유도함으로써 전기 효소 Y의 발현량을 증가시키고 화합물 Q의 생성량을 증가시키는 단계를 포함하는 화합물 Q의 제조방법.
(21) 상기 화합물 P, 전술한 화합물 Q 및 상기 대사물 M의 조합이 이하 (j) 내지 (w)의 하나인 것을 특징으로 하는, (17) 내지 (20)의 어느 하나에 기재된 화합물 Q의 제조방법:
(j) 화합물 P가 3-데히드로시킴산이고 화합물 Q가 프로토카테큐산이며 대사물 M이 시킴산이고,
(k) 화합물 P가 코리스민산이고 화합물 Q가 안트라닐산이며 대사물 M이 프리펜산이고,
(l) 화합물 P가 프리펜산이고 화합물 Q가 4-히드록시페닐피루빈산이며 대사물 M이 페닐피루빈산이고,
(m) 화합물 P가 프리펜산이고 화합물 Q가 아로겐산이며 대사물 M이 페닐피루빈산이고,
(n) 화합물 P가 프리펜산이고 화합물 Q가 페닐피루빈산이며 대사물 M이 4-히드록시페닐피루빈산 또는 아로겐산이고,
(o) 화합물 P가 2-옥소이소발레르산이고 화합물 Q가 2-이소프로필말산이며 대사물 M이 발린이고,
(p) 화합물 P가 2-옥소이소발레르산이고 화합물 Q가 발린이며 대사물 M이 2-이소프로필말산이고,
(q) 화합물 P가 글루탐산이고 화합물 Q가 γ-글루타밀인산이며 대사물 M이 N-아세틸글루탐산이고,
(r) 화합물 P가 글루탐산이고 화합물 Q가 N-아세틸글루탐산이며 대사물 M이 γ-글루타밀인산이고,
(s) 화합물 P가 아스파르트산이고 화합물 Q가 아스파라긴이며 대사물 M이 β-아스파틸인산이고,
(t) 화합물 P가 아스파르트산 β-세미알데히드이고 화합물 Q가 2,3-디히드로디피콜린산이며 대사물 M이 호모세린이고,
(u) 화합물 P가 호모세린이고 화합물 Q가 o-아세틸호모세린이며 대사물 M이 호모세린인산이고,
(v) 화합물 P가 호모세린이고 화합물 Q가 호모세린인산이며 대사물 M이 o-아세틸호모세린이고,
(w) 화합물 P가 세린이고 화합물 Q가 o-아세틸세린이며 대사물 M이 글리신이다.
(22) 효소 X가 시킴산 탈수소효소이고, 효소 Y가 3-데히드로시킴산 탈수효소인 것을 특징으로 하는 (21)의 (j)에 기재된 프로토카테큐산의 제조방법.
(23) 프로토카테큐산 2,3-디옥시게나제를 암호화하는 유전자, 프로토카테큐산 3,4-디옥시게나제를 암호화하는 유전자, 프로토카테큐산 4,5-디옥시게나제를 암호화하는 유전자 및 프로토카테큐산 탈탄산 효소를 암호화하는 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 유전자에 대하여, 상기 유전자의 번역영역 또는 그 전사·번역조절 영역 내에 1개 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되는 변형을 도입함으로써 프로토카테큐산의 대사 활성이 결손 또는 저하되는 성질인 것을 특징으로 하는, (22)에 기재된 프로토카테큐산의 제조방법.
(24) 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 에스케리키아·콜리인 것을 특징으로 하는, (1) 내지 (6)의 어느 하나 또는 (11) 내지 (16)의 어느 하나에 기재된 원핵생물.
본 발명에 따르면, 포도당 등의 탄소원을 가지고 DHS나 프로토카테큐산 등 유용한 유기 화합물을 효율적으로 생산하는 미생물을 수득할 수 있으며, 본 발명의 미생물을 이용하면 방향족 아미노산을 포함하지 않는 배지를 이용하여 DHS나 프로토카테큐산 등을 효율적으로 제조할 수 있다.
[도 1] 유전자 z의 산물인 리프레서 R에 의해 효소 X(화합물 P로부터 대사물 M으로의 전환을 관장하는 효소)의 발현을 제어함으로써, 탄소원으로부터 생육에 필수적인 대사물 M에 이르는 생합성 경로 상의 중간 대사물인 목적하는 화합물 P를 제조하는 방법을 나타내는 그림.
[도 2] 탄소원으로부터 방향족 아미노산의 생합성에 관련된 시킴산 경로를 나타내는 그림.
[도 3] 유전자 z의 산물인 리프레서 R에 의해 효소의 발현을 제어함으로써 탄소원으로부터 생육에 필수적인 대사물 M에 이르는 생합성 경로 상의 목적하는 화합물 P를 제조하고, 화합물 P로부터 화합물 Q로의 전환을 관장하는 효소 Y를 발현시킴으로써 목적하는 화합물 Q를 제조하는 방법을 나타내는 그림.
[도 4] 리프레서 R에 의한 프로모터 A의 전사억제에 의한 효소 X의 발현을 낮게 유지하여 대사물 M의 생산량을 제한함으로써, 화합물 P를 효율적으로 생산할 수 있음을 나타내는 그림.
[도 5] 배양 전기는 리프레서 R에 의한 프로모터 A의 전사억제가 해제되어 효소 X가 정상적으로 생산되지만, 배양 후기는 리프레서 R에 의한 프로모터 A의 전사억제가 회복됨으로써 효소 X의 발현량이 크게 줄고 화합물 P가 축적되는 것을 나타내는 그림.
[도 6] 배양 전기는 리프레서 R의 양이 적기 때문에 프로모터 A의 전사에 의해 효소 X가 정상적으로 생산되지만, 배양 후기는 리프레서 R의 양이 늘어나기 때문에 효소 X의 발현량이 크게 줄어 화합물 P가 축적되는 것을 나타내는 그림.
[도 7] 프로모터 B의 제어하에 있는 유전자 z가 암호화하는 리프레서 R에 의한 프로모터의 전사가 억제되기 때문에 효소 X의 발현량이 크게 줄고 화합물 P가 축적되고, 화합물 P를 유전자 z의 산물인 효소 Y의 작용에 의해 화합물 Q로 전환하는 것을 나타내는 그림.
[도 8] 배양 전기는 리프레서 R에 의한 프로모터 A의 전사억제가 해제되어 효소 X가 정상적으로 생산되지만, 배양 후기는 리프레서 R에 의한 프로모터 A의 전사억제가 회복됨으로써 효소 X의 발현량이 크게 감소하여 축적된 화합물 P가 효소 Y의 작용에 의해 화합물 Q로 전환되는 것을 나타내는 그림.
[도 9] 배양 전기는 리프레서 R의 양이 적기 때문에 프로모터 A의 전사에 의해 효소 X가 정상적으로 생산되지만, 배양 후기는 리프레서 R의 양이 늘어나기 때문에 효소 X의 발현량이 크게 감소하여 축적된 화합물 P가 효소 Y의 작용에 의해 화합물 Q로 전환되는 것을 나타내는 그림.
[도 10] 배양 전기는 리프레서 R에 의한 프로모터 A의 전사억제에 의해 효소 X의 발현이 낮게 유지되어 대사물 M의 생산량을 제한함으로써 미생물을 증식시키면서 소량의 화합물 P를 생산하지만, 배양 후기에는 화합물 P를 화합물 Q로 전환시키는 효소 Y를 유도 발현시켜 효소 Y의 발현량을 증가시킴으로써 화합물 Q의 생산량을 증가시키는 것을 나타내는 그림.
[도 11] 배양 전기는 리프레서 R에 의한 프로모터 A의 전사억제에 의해 효소 X의 발현이 낮게 유지되어 대사물 M의 생산량을 제한함으로써 미생물을 증식시키면서 소량의 화합물 P를 생산하지만, 배양 후기는 리프레서 R을 유도 발현시켜 화합물 P의 축적량을 증가시키는 동시에 축적된 화합물 P를 화합물 Q로 전환시키는 효소 Y를 유도 발현시켜 효소 Y의 발현량을 증가시킴으로써 화합물 Q의 생산량을 증가시키는 것을 나타내는 그림.
이하에서는, 도 1과 도 3을 이용하여 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 미생물은 탄소원으로부터 생육에 필수적인 대사물 M에 이르는 생합성 경로 상의 중간 대사물인 목적하는 화합물 P를 효율적으로 제조하기 위하여 사용하는 미생물이고, 이하에 기재된 4가지 성질 (a)~(d)를 가진다. 상기 미생물은 유전자 발현조절을 위해 리프레서 R에 의한 전사억제계(transcription regulatory system)가 발달된 원핵생물인 것이 바람직하다.
(a) 상기 미생물을 이용할 수 있는 탄소원으로부터 화합물 P에 이르는 생합성에 관련한 효소군 중 1개 이상의 효소활성이 상기 원핵생물의 야생주에 비해 증강된다.
(b) 화합물 P를 대사물 M으로 전환시키는 효소 X의 단백질을 암호화하는 야생형 유전자 x의 번역영역, 상기 유전자의 번역조절 영역 또는 유전자 x의 전사를 촉진하는 프로모터 영역 내에 1개 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되는 변이를 가짐으로써, 효소 X의 활성이 결손 또는 저하된다.
(c) 상기 유전자 x의 전사를 촉진하는 본래의 프로모터와 다른, 리프레서 R 단백질에 의한 전사가 억제되는 프로모터 A에 의해 활성형 효소 X를 암호화하는 DNA의 전사가 제어된다.
(d) 리프레서 R의 단백질을 암호화하는 유전자 z를 1카피 이상 가지고, 상기 유전자의 전사가 상기 유전자 본래의 프로모터 및/또는 상기 프로모터와 다른 유도 프로모터 B에 의해 제어된다.
포도당 등의 탄소원으로부터 화합물 P에 이르는 생합성 경로에 관련한 효소군 중 1개 이상의 효소에 대해 다음과 같이 효소활성의 증강 및/또는 효소 단백질의 양을 증가시킴으로써, 본 발명에서 이용하는 미생물에 성질 (a)를 부여할 수 있다. 즉, 상기 효소 단백질을 암호화하는 유전자의 번역개시 영역으로의 변이도입, 상기 유전자의 프로모터 영역으로의 변이도입, 상기 프로모터의 다른 강한 프로모터로의 치환, 다수 카피 플라스미드로의 복제 등에 의한 상기 유전자의 증폭, 상기 유전자의 전사를 정(正)으로 제어하는 단백질의 발현 증가 및/또는 상기 유전자의 전사를 역(負)으로 제어하는 단백질의 발현 감소 결손 등의 방법으로, 상기 효소활성의 증강 및/또는 상기 효소 단백질의 양을 증가시킴으로써 화합물 P의 생성량을 증가시킬 수 있다. 혹은, 하류의 대사물에 의해 피드백 저해를 받는 효소의 경우, 그 피드백 저해를 해제하는 아미노산의 변이를 효소 단백질에 도입함으로써 화합물 P의 생성량을 증가시킬 수 있다. 이들 DNA 또는 단백질로의 변이도입에 대해서는 변이유발 처리 등에 의해 수행할 수도 있고, 재조합 DNA 기술 및 상동 재조합 기술을 사용할 수 있다.
성질 (b)의 부여에 대해서는, 변이유발 처리나 변형 DNA 기술 등을 이용하여서 효소 X의 활성을 결핍시킬 수 있으나, 바람직하게는 상동 재조합(homologous recombination) 기술을 이용하여 야생형 유전자 x의 번역영역 내에 결실 돌연변이를 도입한다. 이 경우 번역영역을 모두 결실시키면, 극성 효과(polar effect)에 의해 하류의 유전자 발현을 저해되므로, 번역영역의 5'측 부분과 3'측 부분을 남기고 인-프레임(in-frame)으로 번역영역 내에 결실 돌연변이를 도입하는 것이 바람직하다. 또한, 유전자 x의 번역개시 영역 주변 또는 유전자 x의 전사를 촉진하는 프로모터 영역 내에 1개 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되는 변형을 도입함으로써도, 효소 X의 활성을 결핍시킬 수 있다. 또한, 유전자 x의 전사를 촉진하는 본래의 프로모터 영역을 성질 (c)에 기재된 프로모터 A의 DNA로 치환함으로써, 성질 (b)와 성질 (c)를 동시에 부여해도 무방하다.
성질 (c)는, 리프레서 R에 의해 전사가 억제되는 프로모터 A의 제어하에 활성형 효소 X의 단백질을 암호화하는 DNA를 둠으로써 부여할 수 있다. 프로모터 A는, 전술한 유전자 x의 전사를 촉진하는 본래의 프로모터와 다른 프로모터이고 리프레서 R에 의한 전사가 억제된다면 어떤 프로모터도 무방하다. 바람직하게는, 에스케리키아·콜리 K-12주에서 리프레서 R에 의해 억제되는 프로모터 A로서는, λ파지 cI857 유전자 산물에 의해 전사억제를 받는 pL 프로모터 또는 pR 프로모터, lacI 유전자 산물에 의해 전사억제를 받는 lac 프로모터, 혹은 galR 유전자 산물에 의해 전사억제를 받는 gal-오페론의 프로모터를 예로 들 수 있다. 또한, ATCC13032주에서 리프레서 R에 의해 억제되는 프로모터 A로서는, vanR(cg2615) 유전자(이하에서는, "vanR 유전자"라 약함)의 산물(이하에서는, "VanR 리프레서"라 약함)에 의해 전사억제되는 vanA 프로모터, rhcR(cg1308) 유전자(이하에서는, "rhcR 유전자"라 약함)의 산물(이하에서는, "RhcR 리프레서"라 약함)에 의해 전사억제되는 rhcH(cg1309) 유전자(이하에서는, "rhcH 유전자"라 약함)의 프로모터(이하에서는, "rhcH 프로모터"라 약함), 혹은 pcaR(cg2624) 유전자(이하에서는, "pcaR 유전자"라 약함)의 산물(이하에서는, "PcaR 리프레서"라 약함)에 의해 전사억제되는 pcaI(cg2623) 유전자(이하에서는, "pcaI 유전자"라 약함)의 프로모터(이하에서는, "pcaI 프로모터"라 약함)를 예로 들 수 있다. 또한, 유전자 x는 본 발명의 미생물 유래 유전자를 사용해도 무방하고, 본 발명의 미생물과 다른 원핵생물 또는 진핵생물 유래의 유전자를 사용해도 무방하다.
본 발명의 미생물은 성질 (b)와 성질 (c)의 부여에 의해 통상 상태에서는 효소 X의 발현량은 낮다. 그러나, 상기 미생물은 성질 (a)의 부여에 의해 화합물 P의 양을 증가시키는 변이를 가지고 있기 때문에, 생장에 필요한 양의 대사물 M을 생산할 수 있다. 화합물 P의 생성량이 극히 낮고 생육이 나쁜 경우에는, 리프레서 R에 의한 전사억제를 해제하고 효소 X의 발현량을 상승시킴으로써, 상기 미생물의 생육을 좋게 할 수 있다.
성질 (d)는, 리프레서 R의 단백질을 암호화하는 유전자 z의 야생형 발현 유닛(expression unit) 뿐만 아니라, 유전자 z를 상기 유전자의 프로모터와 다른 유도 프로모터 B 제어하의 유전자 z의 발현 유닛을 작제하여서도 부여할 수 있다. 본 발명의 미생물에 대하여, 유전자 z의 야생형 발현 유닛에 더해 유도 프로모터 B 제어하의 유전자 z의 발현 유닛을 포함시켜도 무방하다. 리프레서 R에 대해서는 원핵생물 유래의 리프레서라면 어떤 리프레서도 사용할 수 있으나, 유도물질의 첨가나 온도 변화 등에 의해 억제를 해제할 수 있는 리프레서를 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로, 본 발명의 미생물로 에스케리키아·콜리 K-12주를 이용하는 경우, 예를 들면, 38℃ 이상의 배양에 의해 유도되는 λ파지 cI857 유전자, 락토스의 첨가에 의해 유도되는 lacI 유전자, 갈락토스의 첨가에 의해 유도되는 galR 유전자, 혹은 테트라사이클린의 첨가에 의해 유도되는 tetR 유전자가 암호화하는 리프레서 등을 이용할 수 있다. 본 발명의 미생물로 ATCC13032주를 이용하는 경우에는, 예를 들면, 훼루린산(ferulic acid）, 바닐린산(vanillic acid) 또는 바닐린(vanillin)의 첨가에 의해 억제가 해제되는 VanR 리프레서, 레조르시놀(resorcinol) 또는 2,4-디히드록시벤조산의 첨가에 의해 억제가 해제되는 RhcR 리프레서 또는 4-디히드록시벤조산의 첨가에 의해 억제가 해제되는 PcaR 리프레서를 이용할 수 있다.
프로모터 B는 원핵생물 유래의 유도 프로모터라면, 어떤 프로모터라도 이용할 수 있다. 구체적으로, 에스케리키아·콜리 K-12주에서 유전자 z을 발현시키는 경우, λ파지 pL 프로모터 또는 pR 프로모터, lac 프로모터, gal-오페론의 프로모터, trp 오페론의 프로모터, 혹은 araBAD 프로모터 등을 이용할 수 있으며, ATCC13032주에서 유전자 z를 발현할 때는 훼루린산, 바닐린산 또는 바닐린의 첨가에 의해 유도되는 vanA 프로모터, 레조르시놀 또는 2,4-디히드록시벤조산의 첨가에 의해 유도되는 rhcH 프로모터, 4-히드록시벤조산의 첨가에 의해 유도되는 pcaI 프로모터, 3-히드록시벤조산의 첨가에 의해 유도되는 nagI(cg3351) 유전자(이하에서는, "nadI 유전자"라 약함)의 프로모터(이하에서는, "nagI 프로모터"라 약함), 벤조산의 첨가에 의해 유도되는 benA(cg2637) 유전자(이하에서는, "benA 유전자"라 약함)의 프로모터(이하에서는, "benA 프로모터"라 약함), 혹은 과당(fructose) 또는 자당(sucrose)의 첨가에 의해 유도되는 cg2118 유전자의 프로모터 또는 ptsS(cg2925) 유전자(이하에서는, "ptsS 유전자"라 약함)의 프로모터를 이용할 수 있다.
본 발명의 미생물은 효소 X 이외에 화합물 P를 대사하는 효소활성을 가지고있어, 화합물 P의 제조에 있어서 상기 화합물의 축적량이 감소할 가능성이 있는 경우, 돌연변이 유도처리 또는 재조합 DNA 기술에 의해 상기 미생물이 갖는 화합물 P의 대사효소 중 1개 이상의 대사효소의 활성을 결손 또는 저하시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 미생물은 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 아스로박터(Arthrobacter) 속, 노카디오다세아에(Nocardioidaceae) 속, 마이크로박테리움(Microbacterium) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 아미코라톱시스(Amycolatopsis) 속, 로도코커스(Rhodococcus) 속, 키네오코커스(Kineococcus) 속, 아시네토박터 균(Acinetobactor) 속, 녹농균(Pseudomonas) 속, 판토에아(Pantoea) 속, 클렙시엘라(Klebsiella) 속 및 에스케리키아(Escherichia) 속의 어느 하나에 속하는 원핵생물이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 아미노산 발효 생산에서 자주 이용되는 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 성상이 상세히 알려져 있는 에스케리키아·콜리이다.
본 발명의 미생물을 이용한 화합물 P의 제조방법은, 예컨대 탄소원을 포함하는 배지 중에서 프로모터 A의 전사를 억제하는 상태에서 배양함으로써 목적하는 화합물 P를 제조하는 방법이 있다. 본 발명의 미생물에서 효소 X의 발현을 제어하는 프로모터 A의 전사량이 리프레서 R에 의해 낮게 억제되어 있기 때문에, 대사물 M의 생산량이 제한되어 화합물 P를 효율적으로 생산할 수 있다(도 4).
본 발명의 제조과정에서 효소 X의 발현을 제어하는 프로모터 A의 전사량이 낮기 때문에, 상기 미생물의 생육이 늦어질 경우에는 화합물 P의 제조공정을 배양 전기와 배양 후기의 2기로 나눔으로써 목적하는 화합물 P를 제조할 수도 있다. 즉, 탄소원을 포함하는 배지에 상기 미생물을 접종한 다음, 리프레서 R의 성질에 따라 유도물질의 첨가 또는 배양온도 상승 또는 하락 등으로 인해 전사억제를 해제함으로써, 효소 X의 발현량을 늘려 배양을 계속한다. 그런 다음, 적절한 시기에 리프레서 R에 의한 억제를 회복시키고 효소 X의 발현을 억제함으로써, 화합물 P의 생산량을 증가시킬 수 있다(도 5). 유도물질의 첨가에 의해 유도되는 프로모터 A를 이용하는 경우, 상기 유도물질의 첨가량을 조절하여 배양 후기에 상기 유도물질을 고갈시킴으로써, 리프레서 R에 의한 억제를 회복시킬 수 있다. 배양온도 상승 또는 하락에 따라 유도되는 프로모터 A을 이용한 경우, 리프레서 R에 의해 억제가 일어나는 온도로 배양온도를 되돌림으로써, 리프레서 R에 의한 억제를 회복시킬 수 있다.
바람직하게는, 리프레서 R의 발현을 유도 프로모터 B 제어하의 본 발명의 미생물을 이용하여 화합물 P의 제조공정을 배양 전기와 배양 후기의 2기로 나눔으로써 목적하는 화합물 P를 제조한다. 즉, 탄소원을 포함하는 배지에 상기 미생물을 접종하고 세포를 증식시킨 다음, 유도 프로모터 B의 성질에 따라 유도물질의 첨가 또는 배양온도 상승 또는 하락에 의해 유도 프로모터 B를 활성화하고 리프레서 R의 생성량을 증가시킴으로써, 대사물 M의 생산을 억제하는 화합물 P의 생산량을 증가시킨다(도 6).
이상과 같이 본 발명의 미생물에 의해 제조방법을 사용하면, 상기 미생물의 증식 상태 또는 화합물 P가 상기 미생물에 미치는 영향에 따라 동일한 미생물을 이용하여 배양방법을 바꿈으로써, 용이하게 화합물 P의 생산량을 최대화할 수 있다.
탄소원으로는 본 발명의 미생물이 이용할 수 있는 탄소원이라면 어떠한 탄소원도 사용할 수 있다. 예를 들어, 포도당, 자당, 과당 등의 당류, 에탄올, 메탄올 등의 알코올류, 구연산, 사과산, 호박산 등의 유기산류, 글리세롤, 폐 당밀 등을 사용할 수 있다.
화합물 P는 탄소원으로부터 생육에 필수적인 대사물을 생성하는 생합성 경로 상의 대사물이라면, 어떤 유기 화합물이라도 무방하다. 예를 들어, DHS, 글루탐산, 아스파라긴산 및 세린 등을 들 수 있다.
DHS는, 시킴산(대사물 M)을 생성하는 시킴산 탈수소효소(효소 X)의 발현을 제어함으로써 생산할 수 있다. DHS는 항산화제로서 유용한 외에(United States Patent 5,821,266), 미생물을 이용하여 프로토카테큐산, 시킴산 등의 제조시 원료로 이용할 수 있다.
유용한 아미노산인 글루탐산은 N-아세틸글루탐산(대사물 M)을 생성하는 아미노산-N-아세틸전달효소(효소 X) 또는 γ-글루타밀인산(대사물 M)을 생성하는 γ-글루타밀 인산화효소(효소 X)의 발현을 제어함으로써 생산할 수 있다.
유용한 아미노산인 아스파르트산은 β-아스파틸인산(대사물 M)을 생성하는 아스파르트키나제(효소 X) 또는 아스파라긴(대사물 M)을 생성하는 아스파라긴 합성효소(효소 X)의 발현을 제어함으로써 생산할 수 있다.
유용한 아미노산인 세린은 글리신(대사물 M)을 생성하는 세린 히드록시메틸기 전달효소(효소 X) 또는 o-아세틸세린(대사물 M)을 생성하는 세린 효소(효소 X)의 발현을 제어함으로써 생산할 수 있다.
여기에서 보다 구체적인 예로 DHS를 효율적으로 생산하는 ATCC13032주로부터 유래된 균주에 대해 상세히 설명한다. 또한, ATCC13032주의 게놈서열에 대해서는 내셔널 센터·포·바이오테크놀로지·인포메이션(National Center for Biotechnology Information, 이하에서는, "NCBI"라 함)의 진뱅크(GenBank; 이하, "GB"라 함) 데이터베이스에서 GB 등록번호 BX927147로 입수할 수 있다. 이와 비슷한 게놈서열은 GB 등록번호 NC_003450으로도 입수할 수 있는데, 본 명세서에서는 GB 등록번호 BX927147의 염기번호 및 유전자명에 따라 염기의 위치와 유전자명을 기재한다.
DHS를 생산하는 ATCC13032주로부터 유래된 균주는 아래의 성질 (aa)~(dd)을 가지는 미생물이다:
(aa) 상기 균주가 이용할 수 있는 탄소원으로부터 DHS(화합물 P)에 이르는 생합성에 관련한 효소군 중 1개 이상의 효소활성이 야생주에 비해 증강된다.
(bb) DHS를 시킴산(대사물 M)으로 전환하는 시킴산 탈수소효소(효소 X)의 단백질을 암호화하는 야생형 유전자(유전자 x)의 번역영역 또는 번역조절 영역 또는 상기 유전자의 전사를 촉진하는 프로모터 영역 내에 1개 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되는 변이를 가짐으로써, DHS로부터 시킴산으로의 전환능력이 결손 또는 저하된다. ATCC13032주는 활성형 시킴산 탈수소효소를 암호화하는 유전자로서, aroE3(cg1835) 유전자(상보쇄 염기번호 1,726,078~1,726,908의 DNA 영역), aroE1(cg1283) 유전자(상보쇄 염기번호 1,182,337~1,183,143의 DNA 영역) 및 qsuD(cg0504) 유전자 염기번호 446,537~447,388의 DNA 영역)의 3종류를 가지고 있지만, DHS로부터 시킴산으로의 변환에 주요 역할을 하는 aroE3 유전자에 변이를 도입하여 상기 유전자 활성형 시킴산 탈수소효소 발현을 결손 또는 저하시켜 성질 bb를 부여할 수 있다. 아울러, aroE3 유전자 변이와 함께 qsuD 유전자 및/또는 aroE1 유전자에 대해서도, 상기 유전자 활성형 시킴산 탈수소효소 발현이 결손 또는 저하되는 변이를 도입함으로써 성질 bb를 부여해도 무방하다.
(cc) 상기 유전자 x의 전사를 촉진하는 본래의 프로모터와 다른, 리프레서 R 단백질에 의한 전사가 억제되는 프로모터 A에 의해 활성형 효소 X를 암호화하는 DNA의 전사가 제어된다.
(dd) 리프레서 R의 단백질을 암호화하는 유전자 z를 1카피 이상 가지고, 상기 유전자의 전사가 상기 유전자 본래의 프로모터 및/또는 상기 프로모터와 다른 유도 프로모터 B에 의해 제어된다.
리프레서 R로는 상술한 바와 같이, 훼루린산, 바닐린산 또는 바닐린의 첨가에 의해 억제가 해제되는 VanR 리프레서, 레조르시놀 또는 2,4-디히드록시벤조산의 첨가에 의해 억제가 해제되는 RhcR 리프레서 또는 4-디히드록시벤조산의 첨가에 의해 억제가 해제되는 PcaR 리프레서를 이용할 수 있다.
프로모터 A로서는, ATCC13032주에서 리프레서 R에 의해 억제되는 프로모터 A로서, VanR 리프레서에 의해 전사가 억제되는 vanA 프로모터, RhcR 리프레서에 의해 전사가 억제되는 rhcH 프로모터, 혹은 PcaR 리프레서에 의해 전사가 억제되는 pcaI 유전자의 프로모터를 예로 들 수 있다.
프로모터 B로서는, 훼루린산, 바닐린산 또는 바닐린의 첨가에 의해 유도되는 vanA 프로모터, 레조르시놀 또는 2,4-디히드록시벤조산의 첨가에 의해 유도되는 rhcH 프로모터, 4-히드록시벤조산의 첨가에 의해 유도되는 pcaI 프로모터, 3-히드록시벤조산의 첨가에 의해 유도되는 nagI 프로모터, 벤조산의 첨가에 의해 유도되는 benA 프로모터, 혹은 과당 또는 자당의 하나의 첨가에 의해 유도되는 cg2118 유전자의 프로모터 또는 ptsS 프로모터를 이용할 수 있다.
시킴산 탈수소효소(효소 X)의 단백질을 암호화하는 aroE3 유전자(유전자 x)의 전사를 촉진하는 본래의 프로모터 영역을 성질 (cc)에 기재된 프로모터 A의 DNA로 치환함으로써, 성질 (bb)와 성질 (cc)을 동시에 부여해도 무방하다.
상기 성질 (aa)의 부여에 대해서는, 공지된 지식에 근거하여 DAHP로부터 DHS를 생성하는 경로를 강화시키는 변이, 또는 DAHP의 생성량을 증가시키는 변이를 도입하면 된다.
DAHP는 3-데히드로키나산(3-dehydroquinic acid) 합성효소에 의해 3-데히드로키나산(이하에서는, "DHQ"라 함)으로 전환되고, DHQ는 DHQ 탈수효소에 의해 DHS로 전환된다. 따라서, DHQ 합성효소를 암호화하는 유전자 aroB(cg1827) 유전자(이하에서는, "aroB 유전자"라 약함) 및/또는 DHQ 탈수효소를 암호화하는 aroD(cg0503) 유전자(이하에서는, "aroD 유전자"라 약함)의 전사·번역조절 영역에 변이를 도입함으로써, DHQ 합성효소 및/또는 DHQ 탈수효소 발현량을 증강시키고 DHS량을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, aroB 유전자 및/또는 aroD 유전자의 전사를 촉진하는 본래의 프로모터를 프로모터 활성이 강한 Tu 프로모터로 치환함으로써 DHS량을 증가시킬 수 있다.
또한, DAHP량을 증가시켜서도 DHS량을 증가시킬 수 있다. DAHP량을 증가시키는 방법으로는, DAHP 합성효소에 대한 방향족 아미노산에 의한 피드백 저해 해제, DAHP 합성효소 발현량의 증강, 혹은 DAHP 합성효소의 기질인 에리트로스 4-인산(erythrose 4-phosphate, 이하에서는, "E4P"라 함) 또는 포스포에놀피루빈산(phosphoenolpyruvic acid, 이하에서는, "PEP"라 함)의 양을 증가시키는 방법을 예로 들 수 있다.
DAHP 합성효소는 트립토판, 티로신, 페닐알라닌에 의해 피드백 저해를 받는 경우가 많다. DAHP 합성효소에 아미노산 치환변이 등을 도입함으로써 피드백 저해를 해제할 수 있는 것으로 알려져 있으므로, aroF(cg1129) 유전자(이하에서는, "aroF 유전자"라 약함) 및 aroG(cg2391) 유전자(이하에서는, "aroG 유전자"라 약함) 등의 DAHP 합성효소 유전자에 변이를 도입하여 DAHP량을 증가시킬 수 있다.
DAHP 합성효소의 발현량은 DAHP 합성효소를 암호화하는 유전자의 전사·번역조절 영역에 변이를 도입하여 증대될 수 있다. 예를 들어, DAHP 합성효소를 암호화하는 유전자의 전사를 촉진하는 본래의 프로모터를 Tu 프로모터로 치환함으로써 DAHP량을 증가시킬 수 있다.
DAHP 합성효소의 기질인 E4P의 양을 증가시키는 방법으로는, 트랜스케톨라제를 암호화하는 tkt(cg1774) 유전자(이하에서는, "tkt 유전자"라 약함), 알돌 전이 효소(transaldolase)를 암호화하는 tal(cg1776) 유전자(이하에서는, "cg1776 유전자"라 약함) 또는 포도당-6-인산 1-탈수소효소를 암호화하는 zwf(cg1778) 유전자 등 펜토스 인산경로에 관련된 효소 유전자의 전사·번역조절 영역에 변이를 도입하여 상기 유전자 발현을 증강하는 방법을 예로 들 수 있다.
또한, DAHP 합성효소의 기질인 PEP의 양을 증가시키는 방법으로는, PEP 합성효소를 암호화하는 pps(cg0644) 유전자 또는 PEP 카복시키나제를 암호화하는 pck(cg3169) 유전자의 전사·번역조절 영역에 변이를 도입하고, 상기 유전자 발현을 증강하는 방법을 예로 들 수 있다.
또한, 피루빈산키나제를 암호화하는 pyk(cg2291) 유전자, PEP 카르복실라제를 암호화하는 ppc(cg1787) 유전자, 또는 포도당 등 당의 흡수에 관여하는 인산전달효소(phosphotransferase)를 암호화하는 유전자 군(cg2117 유전자 등) 중 하나의 유전자 번역영역 또는 상기 유전자의 전사·번역조절 영역에 변이를 도입하여 PEP의 변환을 억제함으로써, PEP의 양을 증가시킬 수 있다.
상기 성질 (aa)를 부여하기 위하여는, 단독의 유전자에 변이를 도입해도 좋지만, DHS의 생성량을 더욱 향상시키기 위하여, 상기 유전자 중 복수의 유전자에 변이를 도입하는 쪽이 바람직하다.
상술한 성질 (aa)~(dd)을 가지는 ATCC13032주로부터 유래된 균주는 포도당 등의 탄소원을 가지고 DHS를 생산할 수 있다. DHQ 탈수효소를 암호화하는 aroD 유전자가 DHS를 프로토카테큐산으로 전환하는 DHS 탈수효소(DHS dehydratase)를 암호화하는 qsuB(cg0502) 유전자(이하에서는, qsuB 유전자"라 약함)와 오페론을 형성하고 있으므로, 성질 (aa)를 부여하기 위하여서는 프로모터 치환에 의해 aroD 유전자 발현을 증가시키면 qsuB 유전자의 발현도 증가함으로써, 축적된 DHS의 일부가 프로토카테큐산으로 전환된다. 프로토카테큐산으로의 전환을 억제하려면, qsuB 유전자의 번역영역 또는 상기 유전자의 전사·번역조절 영역에 변이를 도입하는 것이 바람직하다.
본 발명의 미생물이 상기 4가지 성질 (a)~(d) 이외에 이하의 성질 (e)를 가지면, 상기 미생물을 이용함으로써 탄소원으로부터 생육에 필수적인 대사물 M에 이르는 생합성 경로 상의 화합물 P를 화합물 Q로 전환함으로써, 목적하는 화합물 Q를 효율적으로 제조할 수 있다.
(e) 화합물 P로부터 화합물 Q로 전환시키는 효소 Y의 단백질을 암호화하는 유전자 y의 번역영역, 상기 유전자의 번역조절 영역 또는 유전자 y의 전사를 촉진하는 프로모터 영역 내에 1개 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되는 변이를 가짐으로써, 화합물 P로부터 화합물 Q로의 전환능력이 증강되거나 유전자 y의 발현이 야생형과 다른 제어를 받는다.
성질 (e)에 대해서는, 효소 Y의 발현량이 야생형 상태에서는 충분하지 않은 경우가 많으므로, 상기 유전자 y의 번역조절 영역 또는 유전자 y의 전사를 촉진하는 프로모터 영역 내에 1개 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되는 변형을 도입함으로써 효소 Y의 발현량을 증강시키거나, 유전자 y의 전사를 야생형 프로모터의 제어와 다른 제어하에 둠으로써 성질 (e)를 부여할 수 있으며, 분기 경로의 최초 효소는 최종산물에 의한 피드백 저해를 받는 경우도 많아 유전자 y의 번역영역 내에 변이를 도입함으로써 상기 피드백 저해를 해제하여, 효소 Y의 활성을 증강함으로써도 성질 (e)를 부여할 수 있다.
바람직하게는, 유전자 y의 전사를 촉진하는 프로모터의 전역 또는 일부 영역을 그 유전자의 전사를 촉진하는 본래의 프로모터 및 프로모터 A와 다른 프로모터 C의 DNA로 치환함으로써 성질 (e)를 부여할 수 있다.
프로모터 C로서는, 유전자 y 본래의 프로모터와 다른, 프로모터 A와 다른 프로모터를 이용할 수 있다. 프로모터 C로서는 구성적 발현 프로모터(constitutive expression promotor)를 이용할 수 있지만, 유도 프로모터(inducible promotor)를 이용하는 것이 바람직하다. 유도 프로모터는 상술한 성질 (d)의 부여에 이용되는 프로모터 B의 예로 든 프로모터의 하나를 사용할 수 있다.
즉, 프로모터 C로서는, λ파지의 pL 프로모터 또는 pR 프로모터, lac 프로모터, gal-오페론의 프로모터, trp 오페론의 프로모터, 혹은 araBAD 프로모터 등 혹은 훼루린산, 바닐린산 또는 바닐린의 첨가에 의해 유도되는 vanA 프로모터, 레조르시놀 또는 2,4-디히드록시벤조산의 첨가에 의해 유도되는 rhcH 프로모터, 4-히드록시벤조산의 첨가에 의해 유도되는 pcaI 프로모터, 3-히드록시벤조산의 첨가에 의해 유도되는 nagI 프로모터, 벤조산의 첨가에 의해 유도되는 benA 프로모터, 혹은 과당 또는 자당의 하나의 첨가에 의해 유도되는 cg2118 유전자의 프로모터 또는 ptsS 프로모터를 이용할 수 있다.
성질 (e)의 부여에 이용되는 프로모터 C는 성질 (d)의 부여에 이용되는 프로모터 B와 동일하다. 또한, 상기 프로모터 C는 상기 프로모터 B의 전사를 제어하는 단백질에 의한 전사제어를 받는 프로모터라도 무방하다.
본 발명의 미생물은 화합물 Q를 대사한다. 효소활성을 가지기 때문에, 화합물 P의 제조에 있어서 상기 화합물의 축적량이 감소하는 경우에는, 돌연변이 유도처리 또는 재조합 DNA 기술에 의해 상기 미생물이 갖는 화합물 P의 대사효소 중 1개 이상의 대사효소 활성을 결손 또는 저하시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 미생물을 이용한 화합물 Q의 제조방법은, 예컨대 탄소원을 포함하는 배지 중에서 프로모터 A의 전사를 억제하는 상태에서 배양함으로써 화합물 Q를 제조하는 방법이 있다. 본 발명의 미생물에서 효소 X의 발현을 제어하는 프로모터 A의 전사량이 리프레서 R에 의해 낮게 억제되기 때문에, 대사물 M의 생산량이 제한되어 화합물 P로부터 화합물 Q를 효율적으로 생산할 수 있다(도 7).
본 발명의 제조과정에서 효소 X의 발현을 제어하는 프로모터 A의 전사량이 낮기 때문에, 상기 미생물의 생육이 늦어질 경우에는 화합물 Q의 제조공정을 배양 전기와 배양 후기의 2기로 나눠 화합물 Q를 제조하는 것이 좋다. 즉, 상기 미생물을 탄소원을 포함하는 배지에 접종한 다음, 리프레서 R의 성질에 따라 유도물질의 첨가 또는 배양온도 상승 또는 하락 등으로 인해 전사억제를 해제함으로써, 효소 X의 발현량을 늘려 배양을 계속한다. 그런 다음, 적절한 시기에 리프레서 R에 의한 억제를 회복하고, 효소 X의 발현을 억제함으로써 화합물 P로부터 화합물 Q의 생성량을 증가시킬 수 있다(도 8). 유도물질의 첨가에 의해 유도되는 프로모터 A를 이용한 경우에는, 상기 유도물질의 첨가량을 조절해 배양 후기에 상기 유도물질을 고갈시킴으로써, 리프레서 R에 의한 억제를 회복시킬 수 있다. 배양온도 상승 또는 하락에 따라 유도되는 프로모터 A를 이용한 경우에는, 리프레서 R에 의한 억제가 일어나는 온도로 배양온도를 되돌림으로써, 리프레서 R에 의한 억제를 회복시킬 수 있다.
바람직하게는, 리프레서 R의 발현을 유도 프로모터 B 제어하의 본 발명의 미생물을 이용하여, 화합물 Q의 제조공정을 배양 전기와 배양 후기의 2기로 나눔으로써 화합물 Q를 제조한다. 즉, 상기 미생물을 탄소원을 포함하는 배지에 접종하고 세포를 증식시킨 다음, 유도 프로모터 B의 성질에 따라 유도물질의 첨가 또는 배양온도 상승 또는 하락에 따른 유도 프로모터 B를 활성화하고 리프레서 R의 생성량을 증가시킴으로써, 대사물 M의 생산을 억제하는 화합물 P로부터 화합물 Q의 생성량을 증가시킬 수 있다(도 9).
본 발명의 제조과정에서, 화합물 Q가 본 발명의 미생물의 증식에 영향을 줄 경우에는, 효소 Y의 발현을 유도 프로모터 C 제어하의 미생물을 이용하여 화합물 Q의 제조공정을 배양 전기와 배양 후기의 2기로 나눔으로써, 화합물 Q를 제조하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 미생물을 탄소원을 포함하는 배지에 접종하고 세포를 증식시킨 다음, 유도 프로모터 C의 성질에 따라 유도물질의 첨가 또는 배양온도 상승 또는 하락에 의해 유도 프로모터 C의 전사를 활성화하고 효소 Y의 생성량을 증가시킴으로써, 화합물 P로부터 화합물 Q로의 생성량을 증가시킬 수 있다(도 10). 또한, 배양 후기에 유도 프로모터 C의 전사를 활성화하고 효소 Y의 생성량을 증가시키는 동시에, 유도 프로모터 B를 활성화하고 리프레서 R의 생성량을 증가시킴으로써, 대사물 M의 생산을 억제하는 화합물 P로부터 화합물 Q로의 생성량을 증가시켜도 무방하다(도 11).
이 경우, 프로모터 C와 프로모터 B를 동일한 프로모터로 함으로써, 프로모터 C의 유도를 프로모터 B의 유도와 같은 시기에 할 수 있으며, 프로모터 C와 프로모터 B를 동일한 제어 단백질에 의한 전사제어를 받는 프로모터 군 중에서 택할 경우엔 각각이 다른 프로모터이더라도, 프로모터 C의 유도를 프로모터 B의 유도와 같은 시기에 행할 수 있다.
이상과 같이, 본 발명의 미생물에 의한 제조방법을 이용하면, 상기 미생물의 증식 상태 또는 화합물 Q가 상기 미생물에 미치는 영향에 따라 동일한 미생물을 이용하여 배양방법을 바꿈으로써, 용이하게 화합물 Q의 생산량을 최대화할 수 있다.
본 발명의 미생물을 이용하여 제조하는 화합물 Q에 관해서는, 탄소원으로부터 화합물 P를 거쳐 생육에 필수적인 대사물 M을 생성하는 생합성 경로 또는 대사경로에서 화합물 P에서 분기한 경로에 의해 화합물 Q를 생성하면, 어떠한 화합물도 제조할 수 있다.
화합물 P는 탄소원으로부터 생육에 필수적인 대사물을 생성하는 생합성 경로상의 대사물이라면, 어떠한 유기 화합물이라도 무방하다. DHS, 코리스민산, 프리펜산, 2-옥소이소발레르산, 글루탐산, 아스파라긴산, 아스파르트산 β-세미알데히드, 호모세린 및 세린 등을 예로 들 수 있다. 화합물 Q는 화합물 P를 효소 Y로 전환함으로써 얻는 물질이라면, 어떠한 유기 화합물이라도 무방하다. 프로토카테큐산, 안트라닐산, 4-히드록시페닐피루빈산, 아로겐산, 페닐피루빈산, 2-이소프로필말산, 발린, γ-글루타밀인산, N-아세틸글루탐산, 아스파라긴, 2,3-디히드로디피콜린산 및 o-아세틸호모세린 등을 예로 들 수 있다.
화합물 P가 DHS인 경우, 시킴산 탈수소효소(효소 X)에 의해 시킴산(대사물 M)이 생성되고, DHS 탈수효소(효소 Y)에 의해 프로토카테큐산(화합물 P)을 생산할 수 있다. 프로토카테큐산은 의약, 농약, 향료 등의 원료가 되며, 새로운 플라스틱 원료로 기대되는 2-피론-4,6-디카복실산(2-pyrone-4,6-dicarboxylic acid)을 미생물을 이용하여 제조할 경우 원료로 이용할 수 있다.
화합물 P가 코리스민산인 경우, 코리스민산 뮤타제(효소 X)에 의해 프리펜산(대사물 M)이 생성되고, 안트라닐산 합성효소(효소 Y)에 의해 안트라닐산(화합물 P)을 생산할 수 있다. 안트라닐산은 방향족 아미노산인 트립토판 등의 합성원료가 되는데, 상기 미생물이 트립토판의 생합성 경로를 갖고 있으면, 트립토판을 직접 생산할 수도 있다.
화합물 P가 프리펜산인 경우, 프리펜산 무수화 효소(효소 X)에 의해 페닐피루빈산(대사물 M)이 생성되고, 본 발명의 미생물이 에스케리키아·콜리 K-12주 등인 경우 프리펜산 탈수소효소(효소 Y)의 4-히드록시페닐피루빈산(화합물 Q)을 생산할 수 있다. 4-히드록시페닐피루빈산은 방향족 아미노산인 티로신의 합성원료가 되는데, 상기 미생물이 4-히드록시페닐피루빈산으로부터 티로신의 생합성 경로를 갖고 있으면, 티로신을 직접 생산할 수도 있다.
화합물 P가 프리펜산인 경우, 프리펜산 무수화 효소(효소 X)에 의해 페닐피루빈산(대사물 M)이 생성되고, 본 발명의 미생물이 코리네박테리움·글타미쿰 등인 경우 프리펜산 아미노트랜스퍼라제(효소 Y)에 의해 아로겐산(화합물 Q)을 생산할 수 있다. 아로겐산은 방향족 아미노산인 티로신의 합성원료가 되는데, 상기 미생물이 아로겐산에서 티로신의 생합성 경로를 갖고 있으면, 티로신을 직접 생산할 수도 있다.
화합물 P가 프리펜산인 경우, 본 발명의 미생물이 에스케리키아·콜리 K-12주 등에서는 프리펜산 탈수소효소(효소 X)에 의해 4-히드록시페닐피루빈산(대사물 M)이 생성되고, 본 발명의 미생물이 코리네박테리움·글타미쿰인 경우 프리펜산 탈수소효소(효소 X)에 의해 아로겐산(대사물 M)이 생성되고, 프리펜산 무수화 효소(효소 Y)에 의해 페닐피루빈산(화합물 Q)을 생산할 수 있다. 페닐 피루빈산은 방향족 아미노산인 페닐알라닌의 합성원료가 되는데, 상기 미생물이 페닐알라닌의 생합성 경로를 갖고 있으면, 페닐알라닌을 직접 생산할 수도 있다.
화합물 P가 2-옥소이소발레르산인 경우, 분기 사슬 아미노산 아미노 전달효소(효소 X)에 의해 발린(대사물 M)이 생성되고, 2-이소프로필말산 합성효소(효소 Y)에 의해 2-이소프로필말산(화합물 Q)을 생산할 수 있다. 2-이소프로필말산은 루신의 합성원료가 되는데, 상기 미생물이 류신 생합성 경로를 갖고 있으면, 류신을 직접 생산할 수도 있다.
화합물 P가 2-옥소이소발레르산인 경우, 2-이소프로필말산 합성효소(효소 X)에 의해 2-이소프로필말산(대사물 M)이 생성되고, 분기 사슬 아미노산 아미노 전달효소(효소 Y)에 의해 발린(화합물 Q)을 생산할 수 있다.
화합물 P가 글루탐산인 경우, 아미노산-N-아세틸전달효소(효소 X)에 의해 N-아세틸글루탐산(대사물 M)이 생성되고, γ-글루타밀 인산화효소(효소 Y)에 의해 γ-글루타밀인산(화합물 Q)을 생산할 수 있다. γ-글루타밀인산은 프롤린의 합성원료가 되는데, 상기 미생물이 프롤린 생합성 경로를 갖고 있으면, 프롤린을 직접 생산할 수도 있다.
화합물 P가 글루탐산인 경우, γ-글루타밀 인산화 효소(효소 X)에 의해 γ-글루타밀인산(대사물 M)이 생성되고, 아미노산-N-아세틸전달효소(효소 Y)에 의한 N-아세틸글루탐산(화합물 Q)을 생산할 수 있다. N-아세틸글루탐산은 아르기닌의 합성원료가 되는데, 상기 미생물이 아르기닌 생합성 경로를 갖고 있으면, 아르기닌을 직접 생산할 수도 있다.
화합물 P가 아스파르트산인 경우, 아스파르트키나제(효소 X)에 의해 β-아스파틸인산(대사물 M)이 생성되고, 아스파라긴 합성효소(효소 Y)에 의해 아스파라긴(화합물 Q)을 생산할 수 있다.
화합물 P가 아스파르트산 β-세미알데히드인 경우, 호모세린 탈수소효소(효소 X)에 의해 호모세린(대사물 M)이 생성되고, 디히드록시피로포스페이트 합성효소(효소 Y)에 의해 2,3-디히드로디피콜린산(화합물 Q)을 생산할 수 있다. 2,3-디히드로디피콜린산은 리신의 합성원료가 되는데, 상기 미생물이 2,3-디히드로디피콜린산에서 리신을 합성하는 생합성 경로를 갖고 있으면, 리신을 직접 생산할 수도 있다.
화합물 P가 호모세린인 경우, 호모세린 키나제(효소 X)에 의해 호모세린인산(대사물 M)이 생성되고, 호모세린 아세틸전달효소(효소 Y)에 의해 o-아세틸호모세린(화합물 Q)을 생산할 수 있다. o-아세틸호모세린은 메티오닌의 합성원료가 되는데, 상기 미생물이 메티오닌의 생합성 경로를 갖고 있으면, 메티오닌을 직접 생산할 수도 있다.
화합물 P가 호모세린인 경우, 호모세린 아세틸전달효소(효소 X)에 의해 o-아세틸호모세린(대사물 M)이 생성되고, 호모세린 키나제(효소 X)에 의해 호모세린인산(화합물 Q)을 생산할 수 있다. 호모세린인산은 L-트레오닌이나 이소루신의 합성원료가 되는데, 상기 미생물이 이소류신의 생합성 경로를 가지고 있으면 트레오닌이나 이소루신을 직접 생산할 수도 있다.
화합물 P가 세린인 경우, 세린 히드록시메틸기 전달효소(효소 X)에 의해 o-아세틸세린(화합물 Q)을 생산할 수 있다. o-아세틸세린은 시스테인의 합성원료가 되는데, 상기 미생물이 시스테인의 생합성 경로를 갖고 있으면, 시스테인을 직접 생산할 수도 있다.
상기 화합물 Q의 생산에 관련한 효소 Y를 암호화하는 유전자는 본 발명의 미생물 유래의 유전자를 사용해도 좋고, 본 발명의 미생물과 다른 원핵생물 또는 진핵생물 유래의 유전자를 사용해도 무방하다. 예를 들어, 본 발명의 미생물을 이용하여 프로토카테큐산을 제조할 때에는 ATCC13032주는 DHS 탈수효소 유전자를 가지고 있으므로, 그 유전자 산물을 프로토카테큐산의 생산에 이용하면 좋지만, 에스케리키아·콜리 K-12주는 DHS 탈수효소 유전자를 갖고 있지 않으므로, 다른 미생물 유래의 DHS 탈수효소 유전자를 사용해야 한다.
이하에서는 보다 구체적인 예로서, 상술한 ATCC13032주에서 유래한 DHS 생산균주에 성질 (ee)를 부여함으로써 작제할 수 있는 프로토카테큐산을 효율적으로 생산하는 균주에 대해 자세히 논의한다.
프로토카테큐산을 생산하는 ATCC13032주로부터 유래된 균주는 상술한 성질 (aa)~(dd)외에 아래의 성질 (ee)를 가지는 미생물이다.
(ee) DHS로부터 프로토카테큐산으로 전환하는 DHS 탈수효소(효소 Y)의 단백질을 암호화하는 qsuB 유전자(유전자 y; 염기번호 444,184~446,040)의 전사를 촉진하는 본래의 프로모터와 다르고, 프로모터 A와도 다른 프로모터 C에 의한 qsuB 유전자의 전사가 제어된다.
상술한 성질 (aa)~(ee)를 가지는 ATCC13032주로부터 유래된 균주는 포도당 등의 탄소원을 가지고 프로토카테큐산을 생산할 수 있지만, 상기 균주는 프로토카테큐산 디옥시게나제를 가지고 있어 생성된 프로토카테큐산을 분해하여 프로토카테큐산의 양이 감소할 가능성이 있다. 따라서, 프로토카테큐산 4,5-디옥시게나제·알파 서브유닛·단백질을 암호화하는 pcaG(cg2630) 유전자(상보쇄 염기번호 2,511,382~2,511,996) 및/또는 프로토카테큐산 4,5-디옥시게나제·베타 서브유닛·단백질을 암호화하는 pcaH(cg2631) 유전자(상보쇄 염기번호 2,512,008~2,512,700)번역영역 또는 상기 유전자의 전사·번역조절 영역 내에 1개 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되는 변형을 도입함으로써, 그 효소가 가진 분해활성을 결손 또는 저하시키는 것이 바람직하다.
또한, 상기 균주는 프로토카테큐산의 5번 위치를 수산화하고 갈릭산(gallic acid)에 대한 변환을 촉매하는 파라-히드록시벤조산 수산화효소를 가지고 있어, 생성된 프로토카테큐산의 일부를 갈릭산으로 전환할 가능성이 있다. 따라서, 파라-히드록시 벤조산 수산화효소, 단백질을 암호화하는 pobB(cg1226) 유전자(상보쇄 염기번호 1,126,301~1,127,488)의 번역영역 또는 상기 유전자의 전사·번역조절 영역 내에 1개 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되는 변형을 도입함으로써, 상기 파라-히드록시벤조산 수산화효소가 가지는 수산화 활성을 결손 또는 저하시키는 것이 바람직하다.
이하에서는, 본 발명의 미생물의 작제에 있어서, DNA 복제와 변이도입주 작제방법에 대해 설명한다. 상술한 바와 같이 본 발명의 미생물은 코리네박테리움 속, 브레비박테리움 속, 아스로박터 속, 노카디오다세아에 속, 마이크로박테리움, 스트렙토마이세스 속, 아미코라톱시스 속, 로도코커스 속, 키네오코커스 속, 아시네토박터 속, 녹농균 속, 판토에아 속, 클렙시엘라 및 에스케리키아에 속하는 미생물이라면 어느 미생물도 사용할 수 있지만, ATCC13032주에 대해 변이도입방법에 대해서만 자세히 설명한다. 또한, DNA 복제와 변이를 도입하기 위하여 이용 숙주으로는 주로 에스케리키아·콜리 K-12주를 이용한다.
상기 에스케리키아·콜리 K-12주와 ATCC13032주는 각각 에스케리키아·콜리와 코리네박테리움 속 세균의 배양에 통상 사용되는 공지된 방법으로 배양한다. 배양 후 공지된 방법(예를 들면, Current Protocols in Molecular Bilogy에 기재된 방법)에 따라 상기 미생물의 염색체 DNA를 분리 정제한다. 제한효소 절단, 중합효소연쇄반응(PCR) 또는 합성 DNA를 이용한 혼성화 등에 의해, 상기 염색체 DNA로부터 상기 프로모터 또는 대사효소 등을 암호화하는 DNA를 포함하는 절편을 수득할 수 있다.
DNA 복제와 변이도입을 위해 DNA 연결을 위한 에스케리키아·콜리용 벡터로는 에스케리키아·콜리 K-12주 등에서 자가복제 가능한 벡터라면 플라스미드 벡터, 파지 벡터 등을 모두 사용할 수 있으며, 구체적으로는 pUC19(Gene, 33, 103(1985)]pUC18, pBR322 등을 사용할 수 있다.
상기 벡터의 숙주로서 이용 에스케리키아·콜리는 에스케리키아·콜리에 속하는 미생물이라면 어느 것도 이용할 수 있으며, 구체적으로는 에스케리키아·콜리(Escherichia coli) XL1-Blue MRF'[Stratagene사제, Strategies, 5, 81(1992)], 에스케리키아·콜리 JM109, 에스케리키아·콜리 BL21 등을 예로 들 수 있다.
코리네박테리움 속, 브레비박테리움 속, 아스로박터 속, 노카디오다세아에 속, 마이크로박테리움, 스트렙토마이세스 속, 아미코라톱시스 속, 로도코커스 속, 키네오코커스 속, 아시네토박터 속, 녹농균 속, 판토에아 속, 클렙시엘라 및 에스케리키아 속에 속하는 미생물 속에 상기 DNA를 도입하는 경우에는, 이들 미생물에서 자가복제 가능한 벡터를 이용한다. 바람직하게는, 상기 미생물의 어느 하나와 에스케리키아·콜리 K-12주의 양쪽의 미생물에서 자가복제 가능한 셔틀 벡터를 이용하여 재조합 DNA를 숙주가 된 상기 미생물에 도입할 수 있다.
코리네박테리움 속 세균으로 자가복제 가능한 셔틀 벡터로는, pAM330(특개 소 58-67699호 공보 참조), pHM1519(특개소 58-77895호 공보 참조) 등을 예로 들 수 있다. 또한, 이들 벡터에서 코리네박테리움 내에서 플라스미드를 자가복제 가능한 능력을 가지는 DNA 절편을 꺼내 에스케리키아·콜리-코리네박테리움용 셔틀 벡터에 삽입하면, 에스케리키아·콜리 및 코리네박테리움 양쪽에서 자가복제 가능한 벡터로 사용할 수 있다. 예를 들면, 에스케리키아·콜리용 벡터인 pHSG298(다카라 바이오)에 코리네박테리움 속주에서 플라스미드를 복제시키기 위한 복제영역으로서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13058주가 가진 플라스미드 pHM1519의 복제영역을 삽입함으로써, 상기 셔틀 벡터를 구축할 수 있다. 상기 셔틀 벡터를 유지할 수 있다. ATCC13032주와 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13058주는 독립행정법인·제품평가기술기반기구·생물유전자자원부문(Biological Resource Center, the National Institute of Technology and Evaluation, 이하에서는, "NITE"라 함)으로부터 입수할 수 있다.
DNA의 도입방법으로는 상기 숙주세포에 DNA를 도입하는 방법이라면 모두 이용할 수 있는데, 칼슘이온을 이용하는 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972)), 전기천공법(Nucleic Acids Res., 16, 6127(1988)) 등을 예로 들 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰에 대한 DNA의 도입은 van der Rest 등의 방법(Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541(1999))에 의해서도 수행할 수 있다.
상술한 바와 같이 수득한 형질전환체에서 DNA를 추출하여, 상기 DNA에 포함된 본 발명의 DNA 염기서열을 결정할 수 있다. 염기서열의 결정은 통상 사용되는 염기서열 해석방법, 예를 들면 디옥시 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977)) 또는 3730xl형 DNA 분석기(Applied Biosystems) 등의 염기서열 분석장치를 사용할 수 있다.
또한, 상기에서 결정된 DNA의 염기서열에 따라, PerSeptive Biosystems, Inc.산 8905형 DNA 합성기 등을 이용하여 화학합성함으로써, 표적 DNA를 제조할 수도 있다.
목적하는 표현형을 가지는 균주는, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘이나 에틸메탄슬폰산 등의 변이제를 이용한 처리나 UV, 방사선 조사 등에 의해 변형 처리하거나 자연 돌연변이 등에 따라 변이를 도입함으로써 수득할 수 있다. 또는, 상기 균주는 변이를 도입하는 영역의 DNA를 복제하여 실험실 조건에서(in vitro) DNA에 변이를 도입한다. 큰 치환변이를 도입하는 경우에는, 상기 균주에서 복제 가능한 벡터에 치환할 DNA를 포함하는 플라스미드를 구축한 다음, 상기 플라스미드를 상기 균주에 도입 또는 상기 플라스미드로 염색체 DNA 사이의 상동 재조합에 의해 치환변이를 도입할 수도 있다. 도입하는 변이의 종류에 대해서는 목적하는 표현형이 나타난다면 염기 치환변이, 결실 돌연변이, 삽입 돌연변이 또는 큰 DNA 절편과 치환변이의 어느 것도 좋고, 변이의 크기에 대해서도 1염기 이상이면 어떤 크기의 이변이라도 무방하다. 이하, 변이의 도입방법은 특기하지 않는 한 상기 방법을 이용한다.
본 발명의 미생물에서 프로모터나 전사제어 단백질 이외에서 유전자의 발현량을 조절할 필요가 있을 경우에는, 리보솜 결합서열과 번역개시 코돈 사이의 거리 조정, 번역개시 코돈의 주위의 배열의 변화, 또는 번역영역 내의 염기서열의 개편 등에 의한 상기 유전자의 번역개시 효율을 조절할 수 있다.
이렇게 얻을 수 있는 변이를 도입하기 위한 DNA는 통상 에스케리키아·콜리에서 복제 가능한 플라스미드에 삽입한 다음, 전술한 DNA의 도입법을 이용하여 숙주인 코리네박테리움 글루타미쿰에 도입한다. 그 플라스미드에 온도 감수성 벡터인 경우에는 고온배양(high-temperature culture) 선택에 의해, 숙주 내에서 발현할 수 있는 카나마이신 내성 등 항생물질 내성 마커를 가진 경우에는 그 항생제 내성 선택에 의해 1회 교차형 상동 재조합(single-crossover homologous recombination)을 선별한다. 상기 DNA 절편과 상동 염색체의 영역에서 2회 교차형 상동 재조합(double-crossover homologous recombination)에 의해 상기 DNA가 치환된 변이주를 얻기 위해서는, 통상 W. Jager 등[J. Bacteriol. 174, 5462(1992)]이 개발한 바실러스·섭틸리스(Bacillus subtilis) 168주의 레반스쿠라제 유전자(sacB 유전자)를 이용하는 방법을 사용할 수 있다. 자당 내성(sucrose resistance) 선택을 이용한다. 본 방법을 사용하면, 바실러스·섭틸리스 168주의 sacB 유전자를 발현하는 코리네박테리움 글루타미쿰은 자당을 포함하는 배지에서는 치사적으로 되므로, 2회 교차형 상동 재조합에 의해 레반스쿠라제 유전자를 상실한 변이주를 자당 내성 선택에 의해 얻을 수 있다.
본 발명의 미생물 배양은 탄소원, 질소원, 무기염류, 각종 비타민 등을 포함하는 통상의 배양기에서 할 수 있는데, 탄소원으로는 예를 들면, 포도당, 자당, 과당 등의 당류, 에탄올, 메탄올 등의 알코올류, 구연산, 사과산, 호박산 등의 유기산류, 글리세롤, 폐 당밀 등이 이용된다. 질소원으로는 예를 들면, 암모니아, 황산 암모늄, 염화 암모늄, 질산 암모늄, 요소 등이 각각 단독 또는 혼합하여 이용된다. 또한, 무기염류로는 제일 인산 수소 칼륨, 인산 2수소 칼륨, 황산 마그네슘 등이 이용된다. 이 밖에 펩톤, 육즙, 효모 추출물, 콘 스팁 리커(corn steep liquor), 카자미노산(casamino acid), 비오틴 등의 각종 비타민 등의 영양소를 배지에 첨가할 수 있다.
배양은 통상 통기교반, 진탕 등의 호기성 조건하에서 실시한다. 배양온도는 본 발명의 미생물이 생육할 수 있는 온도이면 특별히 제한은 없으며, 배양 중의 pH도 본 발명의 미생물이 생육할 수 있는 pH 범위에 있으면 특별히 제한은 없다. 배양 중인 pH 조정은 산 또는 알칼리를 첨가할 수 있다.
배양 종료 후 배양액 중 목적하는 유기 화합물은 필요에 따라 원심분리 등에 의해 그 배양액으로부터 세포 등의 불용성분을 제거한 다음, 예를 들면 초산 에틸 등의 유기용매에 의한 추출법, 활성탄을 이용하는 방법, 이온교환 수지를 이용하는 방법, 결정법, 염석 등의 침전법, 증류법 등의 방법을 단독으로 또는 조합함으로써, 목적하는 유기 화합물을 채취할 수 있다.
실시예
이하에서는, 본 발명의 미생물로서 화합물 P로서 DHS를 효율적으로 생산하는 ATCC13032주의 균주의 작제와 상기 미생물에 의한 DHS의 제조방법에 대하여 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 또한, 본 발명의 미생물로서 화합물 Q로서 프로토카테큐산을 효율적으로 생산하는 ATCC13032주의 균주의 작제와 상기 미생물에 의한 프로토카테큐산의 제조방법에 대하여 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 본 발명은 이들의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Pben-vanR주와 NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD주의 DHS 생산성 비교
다음과 같이, qsuB 유전자 인-프레임 결실(in-frame deletion) 돌연변이에 의한 DHS로부터 프로토카테큐산(protocatechuic acid)으로의 전환능력을 잃고 benA 프로모터의 제어하에 있는 vanR 유전자가 암호화하는 VanR 리프레서에 의해 aroE3 유전자의 발현이 억제되는 Pben-vanR주(참고예 11), 및 qsuB 유전자와 qsuD 유전자와 aroE3 유전자의 인-프레임 결실 돌연변이에 의해 DHS으로부터 시킴산(shikimic acid)으로의 전환능력과 DHS로부터 프로토카테큐산으로의 전환능력을 상실한 NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD주(참고예 10)를 3 L 자 발효기(Jar fermentor)에서 배양하여 DHS의 생산성을 시험하였다. 이들 균주는 DAHP로부터의 DHS 합성에 관여하는 4종류의 유전자(aroF, aroG, aroB 및 aroD 유전자)의 전사가 Tu 프로모터에 의해 제어되기 때문에, 야생주에 비해 DHS 생성량이 향상되었다.
이들 균주의 전전 배양(preliminary preculture) 및 전 배양(preculture) 배지는 CGXII 배지(황산 암모늄 20 g/L, 요소 5 g/L, 인산 2수소 칼륨 1 g/L, 인산 수소 2칼륨 1 g/L, 황산 마그네슘·7수화물 0.25 g/L, 염화 칼슘 10 mg/L, 황산 제1철·7수화물 10 mg/L, 황산 망간·5수화물 10 mg/L, 황산 아연·7수화물 1 mg/L, 황산 구리 0.2 mg/L, 염화 니켈·6수화물 0.02 mg/L, 비오틴 0.2 mg/L, 포도당 20 g/L, 프로토카테큐산 30 mg/L, pH 7.0)를 이용하였다. 이들 균주의 전전 배양액 1%를 전 배양액에 접종한 다음, 30℃에서 24시간 배양하였다. 전 배양액을 흡광도 600nm이 3.0이 되도록 CGXII 배지로 희석한 다음, 3L 자 발효기(ABLE Corporation, BMS-03NP2) 내의 본 배양용 배지(0.9 L)에 1%만 접종하였다. 본 배양용 배지는 2.1 g/L 무수 시트르산과 1.0 g/L 황산철·7H2O을 포함하는 CGXII 배지인 CGCF 배지를 이용하였다. 이하에서, DHS 및 프로토카테큐산의 생산 실험은 특기하지 않는 한, 이 방법을 이용하였다.
또한, NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD주는 CGXII 배지와 CGCF 배지에서는 극히 생육이 나쁘기 때문에, 0.5 g/L 트립토판, 0.4 g/L 페닐알라닌, 0.45 g/L 티로신, 17 mg/L 시킴산, 45 mg/L 비타민 K2 및 14 mg/L 파라-아미노벤조산을 이들의 배지에 첨가하여 배양하였다. 본 배양 개시 후에 적시 배양액을 채취하여 5% 아세토니트릴 수용액에서 1000배로 희석하고, 고속액체 크로마토그래피(Waters, LCT Premier XE)를 이용하여 표 1의 분리조건으로 분석한 다음, 농도를 알고 있는 DHS 수용액(DHS는 Sigma사에서 구입)에 대한 DHS 피크의 면적 비율을 산출하였다. 이하에서, DHS의 정량은 이 방법을 사용하여 측정하였다.
Pben-vanR주에 대해서는 본 배양 개시시에 최종농도 5 mM의 벤조산을 첨가하고 38시간 후에 포도당을 4.0 g/시간 비율로 첨가한 다음, 다시 48시간 배양하였다. 한편, NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD주는 본 배양 개시 후 45.5시간의 시점에서 포도당을 6.0 g/시간의 비율로 첨가하고, 16.5시간 배양하였다. Pben-vanR주와 NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD주의 DHS의 생산량은 각각 배양 개시 후 86시간과 62시간째에 최대화되었고, 이들 균주의 DHS의 최대 생산량은 각각 15.4g/L과 7.7 g/L이었다. 이 결과로부터, aroE 유전자 발현을 VanR 리프레서에서 인위적으로 제어할 수 있는 Pben-vanR주는 방향족 아미노산 등을 포함하는 배지 중에서 배양한 NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD주와 비교하여, 방향족 아미노산 등을 포함하지 않는 배지 중에서 배양해도 DHS의 생산성이 우수한 것으로 확인되었다.
Figure pct00001
NSHΔaroE3주 및 NSHΔaroE3_vanE3주를 이용한 프로토카테큐산의 생산
다음과 같이, aroE3 유전자에 인-프레임 결실 돌연변이를 가지는 NSHΔaroE3주(참고예 7) 및 상기 균주를 가지고 VanR 리프레서의 제어하에서 aroE3 유전자를 발현하도록 개변된 NSHΔaroE3_vanE3주(참고예 8)를 3L 자 발효기에서 배양하고, 프로토카테큐산의 생산량을 비교하였다.
이들 균주를 CGXII 배지에 배양한 배양액을 흡광도 600nm이 3.0이 되도록 CGXII 배지로 희석한 다음, 3L 자 발효기 내 CGCF 배지(0.9 L)에 1%만 접종하였다. 또한, NSHΔaroE3주는 aroE3 유전자 결실 돌연변이에 의한 CGXII 배지와 CGCF 배지에서는 극히 생육이 나쁘기 때문에, 50 mg/L 트립토판, 50 mg/L 페닐알라닌, 50 mg/L 티로신 및 17 mg/L 시킴산을 이들 배지에 첨가해 배양하였다. 본 배양 개시 후 24시간의 시점에서 포도당을 2.0 g/시간 비율로 첨가하고, 다시 62.5시간 배양하였다. 본 배양 개시 후에 적시 배양액을 채취해 배양액을 5% 아세토니트릴 수용액으로 1000배 희석하고 고속액체 크로마토그래피(Water사, LCT Premier Xe)를 이용하여 표 1의 분리조건으로 분석한 다음, 농도를 알고 있는 프로토카테큐산 수용액(프로토카테큐산은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.로부터 구입)에 대한 프로토카테큐산 피크의 면적 비율을 산출하였다. 이하에서, 프로카테큐산의 정량은 이 방법을 사용하여 측정하였다. 그 결과, NSHΔaroE3주와 NSHΔaroE3_vanE3주의 프로토카테큐산의 생산량은 각각 배양 개시 후 48시간째와 62.5시간째에 최대화하고, 이들 균주의 프로토카테큐산의 최대 생산량은 각각 0.5 g/L와 16.6 g/L이었다. 이 결과로부터, aroE 유전자 발현을 VanR 리프레서로 제어하는 균주를 방향족 아미노산과 시킴산을 포함하지 않은 배지 중에서 배양하면, 방향족 아미노산과 시킴산을 포함하는 배지 중에서 배양한 NSHΔaroE3주의 프로토카테큐산의 생산량과 비교해 약 33배의 프로토카테큐산을 생산하는 것을 확인할 수 있었다.
NSHΔaroE3_vanE3주와 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB주 및 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB-vanR주를 이용한 프로토카테큐산의 생산
다음과 같이, 상기 NSHΔaroE3_vanE3주(참고예 8), qsuB 유전자 발현을 벤조산의 첨가에 의한 유도할 수 있도록 조작한 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB주(참고예 12) 및 qsuB 유전자 및 vanR 유전자 발현을 벤조산의 첨가에 의한 유도할 수 있도록 조작한 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB-vanR주(참고예 13)를 각각 3L 자 발효기을 이용하여 배양함으로써, 프로토카테큐산의 생산량을 비교하였다. NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB주에 대해서는, 본 배양 개시 후 14.5시간의 시점에서 벤조산을 최종농도 5 mM가 되도록 첨가함으로써 qsuB 유전자를 유도하고, NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB-vanR주에 대해서는, 본 배양 개시 후 15.5시간의 시점에서 벤조산을 최종농도 5 mM가 되도록 첨가함으로써 qsuB 유전자와 vanR 유전자를 유도하였다. NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB주, NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB-vanR주 및 NSHΔaroE3_vanE3주에 있어서는, 각각 본 배양 개시 후 14.5시간, 15.5시간 및 18.5시간의 시점에서 포도당을 3.5 g/시간 비율로 첨가하고, 본 배양 개시로부터 62시간 후에 배양을 종료하였다. 그 결과, NSHΔaroE3_vanE3주, NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB주 및 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB-vanR주의 프로토카테큐산 생산량은 각각 배양 개시 후 43.8시간째와 43.8시간째 38.5시간째에 최대가 되었고, 이들 균주의 프로토카테큐산 최대 생산량은 각각 8.5 g/L, 8.6 g/L, 15.2 g/L이었다. 이 결과로부터, VanR 리프레서의 제어하에서 aroE3 유전자를 발현하는 균주는 유의미한 양의 프로토카테큐산을 축적할 수 있으며, VanR 리프레서량을 증가시켜 aroE3 유전자 발현억제를 강화하는 쪽이 프로토카테큐산의 생산성이 높은 것으로 나타났다.
NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB-vanR주와 tkt주를 이용한 프로토카테큐산의 생산
다음과 같이, 상기 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB-vanR주(참고예 13) 및 상기 균주의 트랜스케톨라제 발현을 강화한 tkt주(참고예 14)를 각각 3L 자 발효기을 이용하여 배양함으로써 프로토카테큐산의 생산량을 비교하였다. 각각의 균주와 함께 본 배양 개시 후 17시간의 시점에서 벤조산을 최종농도 5 mM가 되도록 첨가하고, 본 배양 개시 후 24시간의 시점에서 포도당을 4.5 g/시간 비율로 첨가하여 배양을 시작한 지 64시간 후에 배양을 종료하였다. 그 결과, NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB-vanR주와 tkt주 프로토카테큐산의 생산량은 각각 배양 개시 후 40시간째와 45시간째에 최대화하였고, 이들 균주의 프로토카테큐산의 최대 생산량은 각각 14.8 g/L, 20.0 g/L이었다. 이 결과로부터, VanR 리프레서에 의한 aroE 유전자 발현조절에 더해, 트랜스케톨라제 발현을 증강하면 프로토카테큐산의 생산성이 향상되는 것으로 밝혀졌다.
RhcR 리프레서에 의한 제어계를 이용한 프로토카테큐산의 생산
상술한 실시예는 모두 VanR 리프레서에 의한 aroE3 유전자 발현을 제어한 생산실험이었지만, VanR 리프레서 대신 RhcR 리프레서에 의한 aroE3 유전자 발현을 제어하고 nagI 프로모터의 제어하에서 qsuB 유전자와 rhcR 유전자를 발현하는 Pnag-qsuB-rhcR주(참고예 17)를 이용하여, nagI 프로모터의 전사유도의 유무에 의한 프로토카테큐산의 생산성 차이를 다음과 같이 조사하였다. Pnag-qsuB-rhcR주 nagI 프로모터의 전사를 유도하는 경우, 본 배양 개시 후 16.5시간의 시점에서 3-히드록시벤조산을 5 mM이 되도록 첨가하고 20.5시간의 시점에서 포도당을 4.9 g/시간 비율로 첨가하여 배양을 시작한 지 62.5시간 후에 배양을 종료하였다. Pnag-qsuB-rhcR주 nagI 프로모터의 전사를 유도하지 않을 경우에는, 3-히드록시벤조산을 첨가하지 않고 배양 개시부터 62.5시간 후에 배양을 종료하였다. 그 결과, nagI 프로모터의 전사유도한 Pnag-qsuB-rhcR주의 nagI 프로모터의 전사유도를 하지 않는 Pnag-qsuB-rhcR주의 프로토카테큐산 생산량은 각각 배양 개시 후 47.5시간째와 43.5시간째에 최대화되었고, 각각의 프로토카테큐산 최대 생산량은 11.2 g/L, 8.4 g/L이었다. 이 결과로부터, RhcR 리프레서에 의해 aroE3 유전자와 qsuB 유전자 발현을 제어한 경우에도 유의미한 양의 프로토카테큐산이 생산할 수 있으며, 배양 후기에 RhcR 리프레서의 양을 증강하는 쪽이 프로토카테큐산의 생산성이 높아지는 것을 확인할 수 있었다.
참고예 1: 대장균-코리네박테리움 속 세균용 셔틀 벡터 pHCG298의 구축
플라스미드 pHM1519를 보유하는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13058주를 NITE로부터 입수하여, 플라스미드 pHM1519를 통상의 방법에 따라 분리하였다. 이어, ATCC13032주 중에서 기능하는 카나마이신 내성 유전자를 유지하는 대장균용 벡터 pHSG298(Takara Bio Inc.)로 제한효소 BglII 부위와 NcoI 부위를 부가하기 위하여, 2종류의 DNA(서열번호 1 및 2)를 합성하였다. 이들 DNA를 pHSG298의 KpnI 부위와 PstI 부위 사이에 삽입하여, 플라스미드 pHSG298BN을 구축하였다. 그런 다음, 플라스미드 pHM1519로부터 플라스미드 복제영역을 포함하는 약 3.1 kb의 BglII 절편을 BglII에 의해 절단하여 pHSG298BN의 BglII 부위에 삽입함으로써, 플라스미드 pHCG100을 구축하였다. 이 pHCG100을 제한효소 BglII와 NcoI에 의해 절단한 다음, Blunting High 키트(Toyobo Co., Ltd.)를 이용하여 제한효소 절단 말단 쪽을 평활 말단으로 바꿨다. pHCG100로부터 유래한 약 1.9 kb의 BglII(평활 말단)-NcoI(평활 말단) 절편을 정제한 다음, pHSG298의 StuI 부위에 삽입함으로써, 대장균-코리네박테리움용 셔틀 벡터 pHCG298을 구축하였다.
참고예 2: 레반스쿠라제 구성적 발현 플라스미드 pHKPsacB1의 구축
코리네박테리움 속 세균에 있어서 2회 교차형 상동 재조합에 의해 표적 DNA 영역을 염색체의 특정영역에 도입할 때에 이용하는 레반스쿠라제(levansucrase) 유전자를 구성적으로 발현하는 플라스미드 pHKPsacB1을 다음과 같이 구축하였다.
1. 레반스쿠라제 유전자의 복제
2회 교차형 상동 재조합에 따른 표적 DNA 영역이 염색체의 특정영역에 도입된 주를 선별하기 위하여, 숙주세포에 대해 치사적으로 기능하는 레반스쿠라제를 암호화하는 바실러스·섭틸리스 168주의 sacB 유전자를 선별 마커로 이용하였다. 바실러스·섭틸리스 168주는 이화학연구소 미생물계통보존시설로부터 IAM2118주로 입수하였다. 또한, 바실러스·섭틸리스 168주의 게놈서열 정보(GB 등록번호:NC_000964)를 NCBI로부터 인터넷 경유로 입수하였다. 바실러스·섭틸리스 168주의 염색체 DNA를 염색체 DNA 추출키트(RBC Bioscience)를 이용하여 정제하였다. 이 염색체 DNA(100 ng)을 주형으로 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 3 및 4)를 이용하여 PCR 반응을 실시함으로써, sacB 유전자를 포함하는 증폭 DNA 절편을 수득하였다. 이어, Taq DNA 중합효소를 이용하여 증폭 DNA 절편의 3'말단에 A 잔기를 부가하였다. 증폭 DNA 절편을 겔 전기영동 후에 회수하고 정제한 다음, pT7Blue-T 벡터에 장착함으로써, sacB 유전자를 유지하는 플라스미드 pTBSACB1을 구축하였다.
2. 플라스미드 pHKPsacB1의 구축
서열번호 5~12로 나타내는 8개의 합성 DNA를 합성한 다음, 이들 합성 DNA를 pT7Blue-T 벡터에 장착함으로써, sacB 유전자를 구성적으로 발현하는 플라스미드 pTRKD2를 구축하였다. 이어서, 상기 1에서 수득한 플라스미드 pTBSACB1 상의 sacB 유전자 영역을 제한효소 HindIII과 KpnI 및 제한효소 KpnI과 XbaI을 이용하여 절단함으로써, sacB 유전자 영역에서 유래하는 1.0 kb의 HindIII-KpnI 절편과 0.4 kb의 KpnI-XbaI 절편을 수득하였다. 이들 2개의 DNA 절편을 상기에서 수득한 pTRKD2에서 유래한 0.2 kb의 HindIII-SphI 절편과 함께 대장균용 클론벡터 pHSG298(Takara Bio Co., Ltd.)의 SphI 부위와 XbaI 부위 사이에 삽입함으로써, sacB 유전자 구성적 발현 플라스미드 pHKPsacB1을 구축하였다. 플라스미드 pHKPsacB1은 코리네박테리움 속 세균의 염색체 DNA와 상동성이 높은 DNA를 운반할 때에는, 염색체 DNA와 플라스미드 사이에서 상동 재조합이 일어나 플라스미드 전체가 염색체에 도입된다. 이렇게 하여 수득된 균주는 카나마이신 내성, 자당 감수성의 표현형을 나타내었다. 그런 다음, 2회 교차형 상동 재조합이 일어나면, 플라스미드 유래 DNA 영역이 염색체 상에서 제거된다. 그 결과, 상기 세균은 카나마이신 감수성, 자당 내성의 표현형을 나타내었다.
참고예 3: ATCC13032주의 수식·제한효소 유전자를 파괴한 HT23주의 작제
1. DNA 수식·제한효소 유전자 파괴용 플라스미드의 구축
다음과 같이, ATCC13032주를 가지고 DNA를 수식·제한효소 유전자를 파괴한 HT23주를 작제하였다. ATCC13032주는 NITE보다 NBRC12168주로 입수하였다. 또한, 다음의 실례로 나타내는 염기번호는 ATCC13032주의 게놈서열의 염기번호이며, 그 게놈서열 정보에 대해서는 NCBI의 GB 데이터베이스에서 등록번호 NC_006958로 인터넷 경유로 입수하였다. 또한, ATCC13032주를 포함하는 코리네박테리움 속 세균의 배양은 특기하지 않는 한 CGYE 배지(황산 암모늄 20 g/L, 요소 5 g/L, KH2PO4 1 g/L, K2HPO4 1 g/L, MgSO4.7H20 0.25 g/L, 효모 추출물 1 g/L, CaCl2 10 mg/L, FeSO4.7H2O 10 mg/L, MnSO4.5H2O 10 mg/L, ZnSO4.7H2O 1 mg/L, CuSO4 0.2 mg/L, NiCl2.6H2O 0.02 mg/L, 비오틴 0.2 mg/L, 포도당 20 g/L, pH 7)를 이용하여 행하였다.
ATCC13032주가 보유하는 DNA 수식효소를 암호화하는 cglIM(cg1996) 유전자(염기번호 1,879,784~1,880,875) 및 2개의 제한효소를 암호화하는 cglIR(cg1997) 유전자(염기번호 1,880,884~1,881,960) 및 cglIIR(cg1998) 유전자(염기번호 1,881,962~1,883,860)는 유전체 상에 연속된다. 이들 3개의 유전자 발현을 결손시키기 위하여, 상기 균주의 염색체 DNA의 일부(염기번호 1,879,784~1,883,860)를 이하의 순서로 결실시켰다.
DNA 수식·제한효소 유전자의 5' 인접부위(5' flanking region, 염기번호 1,878,625~1,879,745)를 증폭시키기 위하여, 2종류의 프라이머(서열번호 13 및 14)를 합성하였다. ATCC13032주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 상기 5' 인접부위를 증폭시켰다. Taq DNA 중합효소에 의해 증폭 DNA 절편의 3'말단에 A 잔기를 부가한 후, 증폭 DNA 절편을 겔 전기영동법에 의해 정제하고 pT7Blue-T 벡터에 장착함으로써, 상기 5' 인접부위를 유지하는 플라스미드 pTUSR1F를 구축하였다. 그런 다음, DNA 수식·제한효소 유전자 영역의 3' 인접부위(3' flanking region, 염기번호 1,883,891~1,885,298)를 증폭시키기 위하여, 2종류의 프라이머(서열번호 15 및 16)를 합성하였다. ATCC13032주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 상기 3' 인접부위를 증폭시켰다. Taq DNA 중합효소에 의해 증폭 DNA 절편의 3'말단에 A 잔기를 부가한 후, 증폭 DNA 절편을 겔 전기영동법에 의해 정제하고 pT7Blue-T 벡터에 장착함으로써, 상기 3' 인접부위를 유지하는 플라스미드 pTDSR1R을 구축하였다. 이어, 플라스미드 pTUSR1F에서 상기 5' 인접부위를 포함하는 약 1.1 kb의 BamHI-XhoI 절편을 제조하였다. 또한, 플라스미드 pTUSR1R에서 상기 3' 인접부위를 포함하는 약 1.4 kb의 XbaI-XhoI 절편을 제조하였다. 아울러, 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2의 2)으로부터 sacB 유전자 구성적 발현영역을 포함하는 약 1.6 kb의 BamHI-SphI 절편을 제조하였다. 이들 3절편을 대장균용 클론벡터 pHSG298의 BamHI 부위와 XbaI 부위 사이에 삽입하여, DNA 수식·제한효소 유전자 파괴용 플라스미드 pHKSD0977-9를 구축하였다.
2. DNA 수식·제한효소 유전자 파괴주의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여, 상기 플라스미드 pHKSD0977-9를 ATCC13032주에 도입하고, 카나마이신 내성을 선택함으로써 SCR주를 수득하였다. 서열번호 13과 16의 프라이머 및 sacB 유전자 확인용 프라이머(서열번호 3 및 4)를 이용하는 PCR법에 의해 SCR주를 해석한 결과, 예상하는 결과를 얻었으므로 SCR주는 플라스미드 pHKSD0977-9가 DNA 수식·제한효소 유전자 영역에 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
SCR주를 1 mL의 LB 액체배지(10 g/l 트립톤, 5 g/l 효모 추출물, 10 g/l 염화 나트륨)에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 HT23주를 수득하였다. 서열번호 13과 14의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 HT23주가 예상대로 DNA 수식·제한효소 유전자가 결손된 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
참고예 4: pcaH·pcaG 유전자 파괴주의 작제
다음과 같이 참고예 3에서 작제한 HT23주를 가지고 프로토카테큐산 4,5-디옥시게나제를 암호화하는 pcaH·pcaG 유전자를 결손시키기 위하여, ATCC13032주의 염색체 DNA의 일부(상보쇄 염기번호 2,511,382~2,512,700)를 결실시킨 DRHG 주를 작제하였다.
1. pcaH·pcaG 유전자 파괴용 플라스미드의 구축
HT23주의 pcaH·pcaG 유전자 5' 인접부위(염기번호 2,512,743~2,513,990)를 증폭시키기 위한 2종류의 프라이머(서열번호 17과 18)를 합성하였다. HT23주의 염색체 DNA(100 ng)를 주형으로 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 상기 5' 인접부위를 증폭시켰다. 이어, Taq DNA 중합효소에 의해 증폭 DNA 절편의 3'말단에 A 잔기를 부가한 후, 증폭 DNA 절편을 겔 전기영동법에 의해 정제하고 pT7Blue-T 벡터(Novagen)에 장착함으로써, 상기 5' 인접부위를 갖는 플라스미드 pTPCAUSR1F를 구축하였다. 마찬가지로, HT23주의 3' 인접부위(상보쇄(complementary strand) 염기번호 2,510,015~2,511,377)을 증폭하기 위한 2종류의 프라이머(서열번호 19 및 20)를 합성하고, HT23주의 정제된 염색체 DNA를 주형으로 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 상기 3' 인접부위를 증폭시켰다. Taq DNA 중합효소에 의해 증폭 DNA 절편의 3'말단에 A 잔기를 부가한 후, 증폭 DNA 절편을 겔 전기영동법에 의해 정제하고 pT7Blue-T 벡터에 장착함으로써, 상기 3' 인접부위를 갖는 플라스미드 pTPCADSR1R을 구축하였다. 제한효소 절단에 의해 pTPCAUSR1F으로부터 상기 5' 인접부위를 포함하는 약 1.3 kb의 EcoRI-MluI 절편을 제조하였다. 또한, 제한효소 절단에 의해 pTPCADSR1R에서 상기 3' 인접부위를 포함하는 약 1.4 kb의 MluI-BamHI 절편을 제조하였다. 또한, 제한효소 절단에 의해 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)으로부터 sacB 유전자 영역을 포함하는 약 1.6 kb의 BamHI-SphI 절편을 제조한 다음, 이들 3개의 절편을 대장균용 클론벡터 pHSG298의 EcoRI 부위와 SphI 부위 사이에 삽입하여, 유전자 파괴용 플라스미드 pHKSDPHG1을 구축하였다.
2. DRHG주의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여, 상기 플라스미드 pHKSDPHG1을 HT23주에 도입하고, 카나마이신 내성을 선택함으로써 SCRHG 주를 수득하였다. 서열번호 21과 22의 프라이머 및 sacB 유전자 확인용 프라이머(서열번호 3 및 4)를 이용하는 PCR법에 의해 SCRHG 주를 해석한 결과, 예상하는 결과를 얻었으므로 SCRHG주는 플라스미드 pHKSDPHG1이 pcaH·pcaG 유전자 영역에 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
SCRHG주를 1 mL의 LB 액체배지 중에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 DRHG주를 수득하였다. 서열번호 23과 24의 프라이머 세트를 이용하는 PCR법에 의해 DRHG주는 예상대로 pcaH·pcaG 유전자가 결손된 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다. 또한, 서열번호 25와 26의 프라이머를 이용하여 PCR 반응한 결과, 증폭 DNA 절편을 수득하지 못하였으므로 DRHG주가 sacB 유전자가 결손된 것을 확인하였다.
참고예 5: pobB 유전자 파괴주의 작제
파라-히드록시벤조산 수산화효소를 암호화하는 pobB 유전자를 파괴하고 프로토카테큐산으로부터 갈릭산(gallic acid)의 생성을 억제하기 위하여, 참고예 4에서 작제한 DRHG주를 가지고 염색체 DNA의 일부(상보쇄 염기번호 1,126,301~1,127,488b)를 결실시킨 DRHG145주를 다음과 같이 작제하였다.
1. pobB 유전자 파괴용 플라스미드의 구축
pobB 유전자의 3' 인접부위(염기번호 1,125,101~1,126,300)을 증폭하는 동시에 증폭 절편의 양 말단에 제한효소 SphI 부위와 XbaI 부위를 부가하기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 27 및 28)를 합성하였다. DRHG주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 pobB 유전자의 3' 인접부위를 증폭시켰다. 그런 다음, pobB 유전자의 5' 인접부위(염기번호 1,127,505~1,128,687)을 증폭하는 동시에 증폭 절편의 양 말단에 제한효소 XbaI 부위와 SalI 부위를 부가하기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 29와 30)를 합성하였다. DRHG주의 염색체 DNA를 주형으로, 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 pobB 유전자의 5' 인접부위를 증폭시켰다. 3' 인접부위의 증폭 DNA 절편을 제한효소 SphI와 XbaI으로 절단하고, 5' 인접부위의 증폭 DNA 절편을 제한효소 XbaI와 SalI으로 절단한 다음, 이들 DNA 절편을 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)의 다클론부위 내에 있는 SphI 부위와 SalI 부위 사이에 도입하여 플라스미드 pHKPsacBΔpobB을 수득하였다.
2. pobB 유전자 파괴주의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여 상기 플라스미드 pHKPsacBΔpobB를 DRHG주에 도입하고, 카나마이신 내성을 선택함으로써 DRHG_Km주를 수득하였다. 서열번호 27과 30의 프라이머 및 sacB 유전자 확인용 프라이머(서열번호 3 및 4)를 이용하는 PCR법에 의해 DRHG_Km주를 해석한 결과, 예상하는 결과를 얻었으므로 이들 균주는 플라스미드 pHKPsacBΔpobB가 pobB 유전자 영역에 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
DRHG_Km주를 1 mL의 LB 액체배지 중에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 DRHG145주를 수득하였다. 서열번호 27과 30의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 DRHG145주가 예상대로 pobB 유전자가 결손된 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
참고예 6: Tu 프로모터가 aroF 유전자, aroG 유전자, aroB 유전자 및 aroD 유전자의 전사를 제어하는 NSH주의 작제
이하의 4단계에서 DAHP로부터의 DHS 합성과 관련된 4종류의 유전자(aroF, aroG, aroB 및 aroD 유전자)의 전사를 ATCC13032주의 Tu 프로모터(염기번호 526,013~526,374)의 제어하에 둠으로써, DHS 생성량을 증강시킨 NSH주를 작제하였다.
1. qsuB 유전자, aroD 유전자 및 qsuD 유전자의 프로모터를 Tu 프로모터로 치환한 NUA주의 작제
ATCC13032주의 qsuB 유전자, aroD 유전자, qsuD 유전자는 오페론 구조를 형성하고(이하에서는, "aro 오페론"이라 함), 동일한 제어인자(cg0500 유전자 산물)에 의해 발현량이 조절된다. 참고예 5에서 작제한 DRHG145주를 가지고, 상기 aro 오페론의 프로모터 영역(염기번호 441,597~442,756)을 전사활성이 강한 Tu 프로모터로 치환한 NUA주를 아래와 같이 작제하였다.
(1) cg0500 유전자와 aro프로모터의 영역을 Tu 프로모터로 치환하기 위한 플라스미드의 구축
cg0500 유전자의 5' 인접부위(염기번호 440,437~441,596)를 증폭함과 동시에 증폭 절편의 양 말단에 제한효소 SphI 부위와 RsrII 부위를 부가하기 위하여, 2종류의 프라이머(서열번호 31 및 32)를 합성하였다. aro프로모터 3' 인접부위(염기번호 442,757~443,916)를 증폭함과 동시에 증폭 절편의 양 말단에 제한효소 PfoI 부위와 SbfI 부위를 부가하기 위하여, 2종류의 프라이머(서열번호 33 및 34)를 합성하였다. 또한, Tu 프로모터 영역을 증폭함과 동시에 증폭 절편의 양 말단에 제한효소 RsrII 부위와 PfoI 부위를 부가하기 위하여, 2종류의 프라이머(서열번호 35 및 36)를 합성하였다. DRHG주의 염색체 DNA를 주형으로, 이들 3쌍의 프라이머 세트를 이용하는 PCR법에 의해 cg0500 유전자의 5' 인접부위, aro 오페론의 프로모터 영역의 3' 인접부위 및 Tu 프로모터를 증폭하였다.
cg0500 유전자의 5' 인접부위의 증폭 DNA 절편을 제한효소 SphI와 RsrII로 절단하고, aro 오페론의 프로모터 영역의 3' 인접부위의 증폭 DNA 절편을 제한효소 PfoI와 SbfI으로 절단하며, Tu 프로모터의 증폭 DNA 절편을 제한효소 RsrII와 PfoI으로 절단한 다음, 이들 제한효소에 의해 얻어진 3종류의 DNA 절편을 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)의 다클론부위 내에 있는 SbfI 부위와 SphI 부위 사이에 도입하여 플라스미드 pHKPsacB_aro-Ntu를 수득하였다.
(2) 플라스미드 pHKPsacB_aro-Ntu를 이용한 상동 재조합의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여 pHKPsacB_Ntu-aro를 DRHG145주에 도입하고, 카나마이신 내성을 선택함으로써 DRHG145_Km주를 수득하였다. 서열번호 31과 34의 프라이머 및 sacB 유전자 확인용 프라이머(서열번호 3 및 4)를 이용하는 PCR법에 의해 DRHG145_Km주를 해석한 결과, 예상하는 결과를 얻었으므로 DRHG145_Km주는 플라스미드 pHKPsacB_Ntu-aro이 cg0500 유전자 영역에 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
DRHG145_Km주를 1 mL의 LB 액체배지 중에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 NUA주를 수득하였다. 서열번호 37의 프라이머를 합성하고, 이와 서열번호 36의 프라이머와 서열번호 31과 34의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 DRHG145주가 예상대로 cg0500 유전자와 aro프로모터가 Tu 프로모터로 치환된 주 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
2. aroG 유전자의 프로모터가 Tu 프로모터로 치환된 NDSGU주의 작제
DAHP 합성효소를 암호화하는 aroG 유전자의 프로모터 영역이 Tu 프로모터 영역으로 치환된 NDSGU주를 다음과 같이 NUA주를 가지고 작제하였다.
(1) aroG 프로모터 치환용 플라스미드의 구축
aroG 유전자의 프로모터 5' 인접부위(상보쇄 염기번호 2,280,842~2,282,206)를 증폭하는 동시에 증폭 절편의 양 말단에 제한효소 SphI 부위와 RsrII 부위를 부가하기 위하여, 2종류의 프라이머(서열번호 38 및 39)를 합성하였다. aroG 유전자의 프로모터 3' 인접부위(상보쇄 염기번호 2,279,366~2,280,754)를 증폭하는 동시에 증폭 절편의 양 말단에 제한효소 PfoI 부위와 SbfI 부위를 부가하기 위하여, 2종류의 프라이머(서열번호 40 및 41)를 합성하였다. 또한, DRHG주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 aroG 유전자의 프로모터 5' 인접부위와 3' 인접부위를 각각 증폭하였다. 이와 별도로 DRHG주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 35와 36의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 Tu 프로모터를 증폭하였다.
aroG 유전자의 프로모터 5' 인접부위의 증폭 DNA 절편을 제한효소 SphI와 RsrII으로 절단하고, aroG 유전자의 프로모터 3' 인접부위의 증폭 DNA 절편을 제한효소 PfoI와 SbfI으로 절단하고, Tu 프로모터의 증폭 DNA 절편을 제한효소 RsrII와 PfoI으로 절단한 다음, 이들 제한효소에 의해 얻어진 3종류의 DNA 절편을 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)의 다클론부위 내에 있는 SbfI 부위와 SphI 부위 사이에 도입하여 플라스미드 pHKPsacB_aroG-Ntu를 수득하였다.
(2) 플라스미드 pHKPsacB_aroG-Ntu를 이용한 상동 재조합의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여 플라스미드 pHKPsacB_aroG-Ntu를 NUA주에 도입하고, 카나마이신 내성을 선택함으로써 NUA_Km주를 수득하였다. 서열번호 38과 41의 프라이머 및 sacB 유전자 확인용 프라이머(서열번호 3 및 4)를 이용하는 PCR법에 의해 NUA_Km주를 해석한 결과, 예상하는 결과를 얻었으므로 NUA_Km주는 플라스미드 pHKPsacB_aroG-Ntu가 aroG 유전자 영역에 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
NUA_Km주를 1 mL의 LB 액체배지 중에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 NDSGU주를 수득하였다. 서열번호 38과 41의 프라이머 및 서열번호 35와 36의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 NDSGU주가 예상대로 aroG 프로모터 영역이 Tu 프로모터에 치환된 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다. 아울러, aroG 유전자의 5' 인접부위의 바깥쪽 DNA 프라이머(서열번호 42) 및 3' 인접부위의 바깥쪽 DNA 프라이머(서열번호 43)를 합성하고, 이들 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해서도 aroG 프로모터 영역이 Tu 프로모터로 치환된 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
3. aroB 유전자의 프로모터를 Tu 프로모터로 치환된 NSU주의 작제
DHQ 합성효소를 암호화하는 aroB 유전자의 프로모터 영역을 Tu 프로모터 영역으로 치환된 NSU주를 다음과 같이 NDSGU주를 가지고 작제하였다.
(1) aroB 프로모터 치환용 플라스미드의 구축
aroB 유전자의 프로모터 5' 인접부위(상보쇄 염기번호 1,720,573~1,721,670)를 증폭하는 동시에 증폭 절편의 양 말단에 제한효소 SphI 부위와 RsrII 부위를 부가하기 위하여, 2종류의 프라이머(서열번호 44와 45)를 합성하였다. aroB 유전자의 프로모터 3' 인접부위(상보쇄 염기번호 1,719,404~1,720,501)를 증폭하는 동시에 증폭 절편의 양 말단에 제한효소 PfoI 부위와 SbfI 부위를 부가하기 위하여, 2종류의 프라이머(서열번호 46과 47)를 합성하였다. 또한, DRHG주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이러한 프라이머를 이용하여 PCR법에 의해 aroB 유전자의 프로모터 5' 인접부위와 3' 인접부위를 각각 증폭시켰다. 이와 별도로 DRHG주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 35와 16의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 Tu 프로모터를 증폭하였다.
aroB 유전자의 프로모터 5' 인접부위의 증폭 DNA 절편을 제한효소 SphI와 RsrII으로 절단하고, aroB 유전자의 프로모터 3' 인접부위의 증폭 DNA 절편을 제한효소 PfoI와 SbfI으로 절단하고, Tu 프로모터의 증폭 DNA 절편을 제한효소 RsrII와 PfoI으로 절단한 다음, 이들 제한효소에 의해 얻어진 3종류의 DNA 절편을 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)의 다클론부위 내에 있는 SbfI 부위와 SphI 부위 사이에 도입하여, 플라스미드 pHKPsacB_aroB-Ntu를 수득하였다.
(2) 플라스미드 pHKPsacB_aroB-Ntu를 이용한 상동 재조합의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여, 상기 플라스미드 pHKPsacB_aroB-Ntu를 NDSGU주에 도입하고, 카나마이신 내성을 선택함으로써 NDSGU_Km주를 수득하였다. 수득한 NDSGU_Km주가 목적하는 1번 교차형 상동 재조합체임을 확인하기 위하여, aroB 유전자의 프로모터 5' 인접부위의 상류 일부와 3' 인접부위의 하류 일부에 근거한 2종류의 프라이머(서열번호 48 및 49)를 합성하였다. NDSGU_Km주의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 48과 49의 프라이머, 서열번호 35와 36의 프라이머 및 sacB 유전자 확인용 프라이머(서열번호 3 및 4)를 이용하는 PCR법에 의해 NDSGU_Km주를 해석한 결과, 예상하는 결과를 얻었으므로 NDSGU_Km주는 플라스미드 pHKPsacB_aroB-Ntu가 aroB 유전자 영역에 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
NDSGU_Km주를 1 mL의 LB 액체배지 중에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 NSU주를 수득하였다. 서열번호 44와 47의 프라이머, 서열번호 48과 49의 프라이머, 및 서열번호 35와 36의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 NSU주가 예상대로 aroB 프로모터 영역이 Tu 프로모터에 치환된 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
4. aroF 유전자의 프로모터를 Tu 프로모터로 치환된 NSH주의 작제
DHQ 탈수효소를 암호화하는 aroF 유전자의 프로모터 영역을 Tu 프로모터 영역으로 치환된 NSH주를 다음과 같이 NSU주를 가지고 작제하였다.
(1) aroF 프로모터 치환용 플라스미드의 구축
aroF 유전자의 프로모터 5' 인접부위(상보쇄 염기번호 1,046,619~1,047,863)를 증폭하는 동시에 증폭 절편의 양 말단에 제한효소 SphI 부위와 RsrII 부위를 부가하기 위하여, 2종류의 프라이머(서열번호 50 및 51)를 합성하였다. aroB 유전자의 프로모터 3' 인접부위(상보쇄 염기번호 1,046,619~1,047,863)를 증폭하는 동시에 증폭 절편의 양 말단에 제한효소 PfoI 부위와 SbfI 부위를 부가하기 위하여, 2종류의 프라이머(서열번호 52 및 53)를 합성하였다. 또한, DRHG주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 aroF 유전자의 프로모터 5' 인접부위와 3' 인접부위를 각각 증폭시켰다. 이와 별도로 DRHG주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 35와 36의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 Tu 프로모터를 증폭하였다.
aroF 유전자의 프로모터 5' 인접부위의 증폭 DNA 절편을 제한효소 SphI와 RsrII으로 절단하고, aroF 유전자의 프로모터 3' 인접부위의 증폭 DNA 절편을 제한효소 PfoI와 SbfI으로 절단하고, Tu 프로모터의 증폭 DNA 절편을 제한효소 RsrII와 PfoI으로 절단한 다음, 이들 제한효소에 의해 얻어진 3종류의 DNA 절편을 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)의 다클론부위 내에 있는 SbfI 부위와 SphI 부위 사이에 도입하여, 플라스미드 pHKPsacB_aroF-Ntu를 수득하였다.
(2) 플라스미드 pHKPsacB_aroF-Ntu를 이용한 상동 재조합의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여, 상기 플라스미드 pHKPsacB_aroF-Ntu를 NSU주에 도입하고, 카나마이신 내성을 선택함으로써 NSU_Km주를 수득하였다. 수득한 NSU_Km주가 목적하는 1번 교차형 상동 재조합체임을 확인하기 위하여, aroF 유전자의 프로모터 5' 인접부위의 상류 일부와 3' 인접부위의 하류 일부에 근거한 2종류의 프라이머(서열번호 54 및 55)를 합성하였다. NSU_Km주의 염색체 DNA를 주형으로 서열번호 54와 55의 프라이머, 서열번호 35와 36의 프라이머 및 sacB 유전자 확인용 프라이머(서열번호 3 및 4)를 이용하는 PCR법에 의해 NSU_Km주를 해석한 결과, 예상하는 결과를 얻었으므로 NSU_Km주는 플라스미드 pHKPsacB_aroF-Ntu가 aroF 유전자 영역에 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
NSU_Km주를 1 mL의 LB 액체배지 중에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 NSH주를 수득하였다. 서열번호 50과 53의 프라이머, 서열번호 54와 55의 프라이머, 및 서열번호 35와 36의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해, NSU주가 예상대로 aroB 프로모터 영역이 Tu 프로모터로 치환된 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
참고예 7: 시킴산 탈수소효소를 암호화하는 aroE1 유전자 및 aroE3 유전자 인-프레임 파괴주의 작제
ATCC13032주가 보유하는 3종류의 시킴산 탈수소효소 중, 생육에 영향을 주는 aroE1 유전자와 aroE3 유전자에 인-프레임 결실 돌연변이를 도입한 균주(인-프레임 결실 돌연변이를 도입한 균주(이하에서는, 경우에 따라 "인-프레임 파괴주(strain with in-frame disruption)"라고도 함)을 다음과 같이 작제하였다, 프레임 결실 돌연변이, 즉 인-프레임 파괴는 번역영역 내에 3염기의 배수 길이의 결실을 도입한 변이를 의미한다.
1. aroE1 유전자 인-프레임 파괴용 플라스미드의 구축
aroE1 유전자의 5' 인접부위(염기번호 1,183,128~1,184,160)를 증폭시키기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 56 및 57)를 합성하였다. 또한, 서열번호 56의 프라이머에는 제한효소 SphI 부위를 도입하였다. DRHG주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 aroE1 유전자의 5' 인접부위를 증폭시켰다. 그런 다음, aroE1 유전자의 3' 인접부위(염기번호 1,181,390~1,182,365)를 증폭시키기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 58 및 59)를 합성하였다. 또한, 서열번호 59의 프라이머에는 제한효소 SbfI 부위를 도입하였다.
이렇게 하여 수득한 aroE1 유전자의 5' 인접부위의 증폭 DNA와 3' 인접부위의 증폭 DNA의 혼합물을 주형으로 DNA 프라이머(서열번호 56 및 59)를 이용하여 오버랩 PCR법(overlap PCR)으로 증폭시킨 다음, 제한효소 SphI와 SbfI으로 절단하였다. 수득한 DNA 절편을 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)의 다클론부위 내의 제한효소 부위 SbfI-SphI 사이에 도입하여, 플라스미드 pHKPsacBΔaroE1을 수득하였다. 플라스미드 pHKPsacBΔaroE1은 aroE1 유전자 영역 중 상보쇄 염기번호 1,181,390~1,184,160의 영역이 결실된 구조를 가진다.
2. aroE1 유전자 인-프레임 파괴주의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여, 상기 플라스미드 pHKPsacBΔaroE1을 NSH주에 도입하고, 카나마이신 내성을 선택함으로써 NSH_Km주를 수득하였다. 수득한 NSH_Km주가 목적하는 1번 교차형 상동 재조합체임을 확인하기 위하여, aroE1 유전자 5' 인접부위의 상류 일부와 3' 인접부위의 하류 일부에 근거한 2종류의 프라이머(서열번호 60 및 61)를 합성하였다. 서열번호 56과 59의 프라이머 및 sacB 유전자 확인용 프라이머(서열번호 3 및 4)를 이용하는 PCR법에 의해 NSH_Km주를 해석한 결과, 예상하는 결과를 얻었으므로 NSH_Km주는 플라스미드 pHKPsacBΔaroE1이 aroE1 유전자 영역에 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
NSH_Km주를 1 mL의 LB 액체배지 중에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 NSHΔaroE1주를 수득하였다. 서열번호 60과 61의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해, NSHΔaroE1주가 예상대로 aroE1 유전자가 결손된 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
3. aroE3 유전자 인-프레임 파괴용 플라스미드의 구축
aroE3 유전자의 5' 인접부위를(염기번호 1,726,887~1,727,845)를 증폭시키기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 62 및 63)를 합성하였다. 또한, 서열번호 62의 프라이머에는 제한효소 SphI 부위를 도입하였다. DRHG주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 aroE3 유전자의 5' 인접부위를 증폭시켰다. 그런 다음, aroE3 유전자의 3' 인접부위(염기번호 1,725,101~1,726,094)를 증폭시키기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 64 및 65)를 합성하였다. 또한, 서열번호 65의 프라이머에는 제한효소 SbfI 부위를 도입하였다. 이렇게 하여 수득한 aroE3 유전자의 5' 인접부위의 증폭 DNA와 3' 인접부위의 증폭 DNA의 혼합물을 주형으로 서열번호 62와 65의 프라이머를 이용하는 오버래핑 PCR로 증폭시킨 다음, 제한효소 SphI와 SbfI에 의한 절단하였다. 수득한 DNA 절편을 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)의 다클론부위 내의 제한효소 SbfI 부위와 SphI 부위 사이에 도입하여 플라스미드 pHKPsacBΔaroE3를 수득하였다. 플라스미드 pHKPsacBΔaroE3는 aroE3 유전자 영역 중 상보쇄 염기번호 1,726,095~1,726,886의 영역이 결실된 구조를 가진다.
4. aroE3 유전자 인-프레임 파괴주의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여, 상기 플라스미드 pHKPsacBΔaroE3를 NSH주에 도입하고, 카나마이신 내성을 선택함으로써 NSH_Km2주를 수득하였다. 수득한 NSH_Km2주가 목적하는 1번 교차형 상동 재조합체임을 확인하기 위하여, aroE3 유전자 5' 인접부위의 상류 일부와 3' 인접부위의 하류 일부에 근거한 2종류의 프라이머(서열번호 66 및 67)를 합성하였다. 서열번호 62와 65의 프라이머, 서열번호 66과 67의 프라이머 및 sacB 유전자 확인용 프라이머(서열번호 3 및 4)를 이용하는 PCR법에 의해 NSH_Km주를 해석한 결과, 예상하는 결과를 얻었으므로 NSH_Km2주는 플라스미드 pHKPsacBΔaroE3이 aroE3 유전자 영역에 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
NSH_Km2주를 1 mL의 LB 액체배지 중에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 NSHΔaroE3주를 수득하였다. 서열번호 66과 67의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해, NSHΔaroE3주가 예상대로 aroE3 유전자가 결손된 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
5. aroE1 유전자와 aroE3 유전자의 2겹 파괴주의 작제
NSHΔaroE1균을 가지고 상술한 "aroE3 유전자 인-프레임 파괴주의 작제"와 동일한 방법으로 aroE3 유전자도 인-프레임으로 파괴한 2겹 파괴(double disruption) 주("NSHΔaroE1ΔaroE3주")를 작제하였다.
6. NSHΔaroE1주, NSHΔaroE3주 및에 NSHΔaroE1ΔaroE3주의 방향족 아미노산 요구성 시험
상술한 바와 같이 작제한 NSH주, NSHΔaroE1주, NSHΔaroE3주 및 NSHΔaroE1ΔaroE3주의 4주에 대해 다음과 같이 방향족 아미노산 요구성 시험을 하였다.
각 균주를 전 배양 배지인 LB 배지에 식균하고 30℃에서 밤새도록 배양한 다음, CGXII 배지에 2%를 옮겼다. 또한, CGXII 배지에 시킴산, 트립토판, 페닐알라닌, 티로신을 각각 최종농도 50 mg/L씩 첨가한 배양실험도 병행하였다. 그 결과, NSH주, NSHΔaroE1주는 CGXII 배지에서 정상적으로 생육하지만, NSHΔaroE3주와 NSHΔaroE1ΔaroE3주는 생육하지 않음을 확인하였다. 또한, NSHΔaroE3주와 NSHΔaroE1ΔaroE3주는 CGXII 배지에 시킴산, 트립토판, 페닐알라닌 및 티로신을 첨가하면 생육이 회복하는 것을 발견하고, 시킴산 탈수소효소를 암호화하는 주된 유전자가 aroE3 유전자임을 알아내었다.
참고예 8: vanA 프로모터의 제어하에서 aroE3 유전자를 발현하는 프로토카테큐산 생산균주 NSHΔaroE3_vanE3의 작제
ATCC13032주의 바닐린산 탈 메틸화효소를 암호화하는 유전자는 cg2616(이하에서는, "vanA 유전자"라 약함, 염기번호 2,496,775~2,497,905 bp: 크기 1,131 bp)과 cg2617(이하에서는, "vanB 유전자"라 약함, 염기번호 2,497,909~2,498,886 bp: 크기 978 bp)이다. 또한, 2,496,775~2,498,886 bp를 "vanAB 유전자 영역"이라 약한다. 또한, vanA 유전자와 vanB 유전자를 제어하고 있는 리프레서는 cg2615(이하에서는, "vanR 유전자"라 약함, 상보쇄 염기번호 2,496,013~2,496,591 bp: 크기 579 bp)이 공지되어 있다. vanR 유전자에 의해 aroE3 유전자를 vanA 유전자와 vanB 유전자 영역에 도입하고, aroE3 유전자를 vanR 유전자 제어하로 치환하였다. 친주(parent strain)로서는 상기 참고예 7에 나타내는 NSHΔaroE3주를 이용하였다.
1. vanAB 유전자 영역과 aroE3 유전자 치환용 벡터의 구축
ATCC13032주의 vanAB 유전자 영역을 aroE3 유전자로 치환하기 위하여, 이하의 순서로 치환용 벡터를 구축하였다. 우선, ATCC13032주의 게놈서열을 가지고 vanAB 유전자 영역의 5' 인접부위(염기번호 2,495,799~2,496,774 bp: 크기 976kp)를 증폭시키기 위하여 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 68 및 서열번호 69)를 합성하고, vanAB 유전자 영역의 3' 인접부위(염기번호 2,498,887~2,499,870 bp: 크기 984kp)를 증폭시키기 위하여 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 70 및 서열번호 71)를 합성하였다. 이러한 프라이머를 이용하고 균주 NSH의 염색체 DNA를 주형으로 하여, PCR법에 의해 vanAB 유전자의 5' 인접부위, vanAB 유전자의 3' 인접부위를 증폭시켰다. vanAB 유전자의 5' 인접부위를 증폭하는 동시에 서열번호 68의 DNA 프라이머에 제한효소 부위 SphI을 도입하고, vanAB 유전자의 3' 인접부위를 증폭하는 동시에 서열번호 71의 DNA 프라이머에 제한효소 부위 SbfI을 도입하였다. 또한, aroE3 유전자를 증폭하기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 72 및 서열번호 73)를 합성하였다. aroE3 유전자를 증폭하는 동시에 서열번호 72의 DNA 프라이머에 vanAB 유전자 영역의 5' 인접부위의 3'말단의 15 bp를 부가하고, 서열번호 73의 DNA 프라이머에 vanAB 유전자 영역의 3' 인접부위의 5'말단의 15 bp를 부가하고 증폭시켰다. 증폭된 5' 인접부위, aroE3 유전자를 혼합한 DNA 절편을 주형으로 DNA 프라이머(서열번호 68 및 서열번호 73)를 이용하거나, 증폭된 3' 인접부위, aroE3 유전자를 혼합한 DNA 절편을 주형으로 DNA 프라이머(서열번호 72 및 서열번호 71)를 이용하여 오버랩 PCR법으로 증폭시켰다. 각각 증폭된 DNA 절편을 제한효소 SphI와 aroE3 유전자 내부 제한효소 부위 AscI 및 SbfI와 aroE3 유전자 내부 제한효소 부위 AscI으로 절단하고, 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)의 다클론부위 내의 제한효소 부위 SbfI-SphI 사이에 도입하여, 플라스미드 pHKPsacB_vanR_Pvan-aroE3를 수득하였다.
2. vanAB 유전자 영역과 aroE3 유전자 치환주의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여, 상기 플라스미드 pHKPsacB_vanR_Pvan-aroE3를 균주 NSHΔaroE3에 도입하고, 카나마이신 내성주 NSHΔaroE3를 수득하였다. 수득된 카나마이신 내성주의 염색체 DNA(염기번호 2,495,799~2,499,870 bp: 크기 4,071 bp) 영역 중 염기번호 2,496,775~2,498,886 bp이 aroE3 유전자로 치환하는 것을 확인하기 위하여, 이하의 실험을 하였다. vanAB 유전자의 5' 인접부위의 112 bp밖과 3' 인접부위의 106 bp밖에 DNA 프라이머(서열번호 74 및 서열번호 75)를 작제하고, vanAB 유전자의 5' 인접부위와 3' 인접부위를 증폭할 때 사용한 DNA 프라이머(서열번호 68 및 서열번호 71)를 이용하여 균주 NSHΔaroE3의 카나마이신 내성주의 콜로니를 직접 주형으로 한 PCR을 행하였다. 균주 NSHΔaroE3의 카나마이신 내성주의 염색체 DNA를 주형으로, 서열번호 74와 서열번호 71의 DNA 프라이머를 이용하여 증폭된 PCR에 의해 수득되는 증폭 DNA 절편이 4,194 bp, 서열번호 68과 서열번호 75의 DNA 프라이머로 증폭된 PCR에 의해 수득되는 증폭 DNA 절편은 2,905 bp이었다. 아울러, 서열번호 74와 서열번호 71의 DNA 프라이머를 이용하여 증폭된 PCR에 의해 수득되는 증폭 DNA 절편은 2,913bp, 서열번호 68과 서열번호 75의 DNA 프라이머로 증폭된 PCR에 의해 수득되는 증폭 DNA 절편은 4,186 bp이었다. sacB 유전자 영역이 PCR법에 의한 해석 등을 통해 확인되면서, 균주 NSHΔaroE3는 1회 교차형 상동 재조합으로 나타났다.
균주 NSHΔaroE3의 1번 교차형 상동 재조합체를 LB 액체배지 1 mL에서 24시간 배양한 후, 소량을 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양하였다. 증식한 균주 NSHΔaroE3이 보유하는 염색체 DNA는 sacB 유전자, 카나마이신 내성 유전자, vanAB 유전자 영역이 aroE3 유전자로 치환하고 있다고 예상되어, NSHΔaroE3_vanE3주로 명명하였다. 이 균주 NSHΔaroE3_vanE3에 대해 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 74 및 서열번호 75)를 이용한 PCR법에 의해, vanAB 유전자 영역이 aroE3 유전자로 치환되어 있으며 예상대로 2회 교차형 상동 재조합체임을 알 수 있었다.
3. 균주 NSHΔaroE3_vanE3의 생육 확인
17.5 mg/L 시킴산, 50 mg/L 트립토판, 50 mg/L 페닐알라닌, 50 mg/L 티로신, 10 mg/L 파라-히드록시벤조산 및 10 mg/L 파라-아미노벤조산(이하에서는, "6종류의 첨가물"이라 함)을 첨가한 CGXII 배지 및 6종류의 첨가물을 가하지 않은 CGXII 배지를 이용하여, 균주 NSHΔaroE3_vanE3과 NSHΔaroE3의 생육성(growth condition) 시험을 하였다. 그 결과, 균주 NSHΔaroE3_vanE3은 전자의 배지에서는 정상적으로 증식했으나, 후자의 배지에서는 배양 중기까지 생육 속도가 느렸다. 한편, 균주 NSHΔaroE3은 전자의 배지에서는 증식했으나, 후자의 배지에서는 증식하지 않았다. 또한, 6종류의 첨가물을 가하지 않는 CGXII 배지에 훼루린산 또는 바닐린산 또는 바닐린을 50μ M이상 첨가하고 균주 NSHΔaroE3_vanE3를 배양한 경우, 정상적으로 증식하는 것으로 나타났다.
참고예 9: DHS 탈수효소 유전자 인-프레임 파괴주의 작제
참고예 6, 7 및 8에서 기술한 NSH주, NSHΔaroE3주 및 NSHΔaroE3_vanE3주를 친주로 qsuB 유전자에 인-프레임 결실 돌연변이를 도입함으로써, DHS로부터 프로토카테큐산으로의 전환을 차단한 균주를 다음과 같이 작제하였다.
1. qsuB 유전자 파괴용 플라스미드의 구축
qsuB 유전자의 5' 인접부위(염기번호 443,184~444,207)를 증폭하는 동시에 증폭 절편의 양 말단에 제한효소 SbfI 부위와 XbaI 부위를 부가하기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 76 및 77)를 합성하였다. 또한, qsuB 유전자의 3' 인접부위(염기번호 446,032~447,053)를 증폭함과 동시에 증폭 절편의 양 말단에 제한효소 XbaI 부위와 SalI 부위를 부가하기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 78및 79)를 합성하였다. NSH주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 qsuB 유전자의 5' 인접부위와 3' 인접부위를 증폭시켰다. 5' 인접부위 증폭물을 제한효소 SbfI 및 XbaI으로 절단하고, 3' 인접부위 증폭물을 제한효소 XbaI 및 SalI으로 절단한 다음, 이들의 DNA 절편을 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)의 다클론부위 내에 있는 SbfI 부위와 SalI 부위 사이에 도입하여, qsuB 유전자 파괴용 플라스미드인 pHKPsacBΔqsuB을 수득하였다.
2. qsuB 유전자 파괴주의 작제
상기 플라스미드 pHKPsacBΔqsuB를 NSH주, NSHΔaroE3주 및 NSHΔaroE3_vanE3주에 도입하고, 카나마이신 내성을 선택함으로써 각 균주에서 NSH_qsuB_Km주, NSHΔaroE3_qsuB_Km주 및 NSHΔaroE3_vanE3_qsuB_Km주를 수득하였다. 수득한 균주를 PCR법에 의해 해석하기 위하여, qsuB 유전자의 5' 인접부위 상류 배열과 일치하는 DNA 프라이머(서열번호 80)와 3' 인접부위의 하류 배열과 일치하는 DNA 프라이머(서열번호 81)를 합성하고, 서열번호 79과 80의 프라이머, 서열번호 76과 81의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 해석하였다. 어떤 프라이머 세트를 이용한 PCR법에 의한 해석에서도 예상하는 결과를 얻었으므로, 이들 균주는 플라스미드 pHKPsacBΔqsuB가 qsuB 유전자 영역에 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
NSHΔqsuB_Km주 NSHΔaroE3ΔqsuB_Km주 및 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Km주를 각각 1 mL의 LB 액체배지 중에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 각 균주로부터 NSHΔqsuB주, NSHΔaroE3ΔqsuB주 및 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB주를 수득하였다. 서열번호 80과 81의 프라이머 및 sacB 유전자 확인용 프라이머(서열번호 3 및 4)를 이용하는 PCR법에 의해 이들 균주가 qsuB 유전자 내의 영역(염기번호 444,208~446,031)이 결실된 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
참고예 10: 시킴산 탈수효소 유전자 인-프레임 파괴주의 작제
NSHΔaroE3ΔqsuB주 및 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB주를 가지고 잔존하는 시킴산 무수화효소의 활성을 저감시키기 위하여, 시킴산 무수화 효소를 암호화하는 qsuD 유전자에 인-프레임 결실 돌연변이를 도입한 균주를 다음과 같이 작제하였다.
1. qsuD 유전자 인-프레임 파괴용 플라스미드의 구축
qsuD 유전자의 5' 인접부위(염기번호 443,644~446,553, 단 444,199~446,031의 영역은 qsuB 인-프레임 파괴영역이다)를 증폭시키기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 82 및 83)를 합성하였다. 또한, 서열번호 82의 프라이머에는 제한효소 SbfI 부위를 도입하였다. NSHΔqsuB주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 qsuD 유전자의 5' 인접부위를 증폭시켰다. 그런 다음, qsuD 유전자의 3' 인접부위(염기번호 447,385~448,441)를 증폭시키기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 84 및 85)를 합성하였다. 또한, 서열번호 85의 프라이머에는 제한효소 XhoI 부위를 도입하였다. 이렇게 하여 수득한 aroE 유전자의 5' 인접부위의 증폭 DNA와 3' 인접부위의 증폭 DNA의 혼합물을 주형으로 DNA 프라이머(서열번호 82와 85)를 이용하여 오버랩 PCR법으로 증폭시킨 다음, 제한효소 SbfI와 XhoI으로 절단하였다. 수득한 DNA 절편을 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)의 다클론부위 내의 제한효소 부위 SbfI-SalI 사이에 도입하여 플라스미드 pHKPsacBΔqsuD를 수득하였다. 또한, 플라스미드 pHKPsacBΔqsuD는 qsuD 유전자 영역 중 염기번호 446,554~447,384의 영역이 결실된 구조를 가진다.
2. qsuD 유전자 인-프레임 파괴주의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여 상기 플라스미드 pHKPsacBΔqsuD를 NSHΔaroE3ΔqsuB주 및 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB주에 도입하고, 카나마이신 내성을 선택함으로써 NSHΔaroE3ΔqsuB_Km주 및 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_km주를 수득하였다. 이렇게 하여 수득한 NSHΔaroE3ΔqsuB_Km주 및 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_km주가 목적하는 1번 교차형 상동 재조합체임을 확인하기 위하여, qsuD 유전자 5' 인접부위의 상류 일부와 3' 인접부위의 하류 일부에 근거한 2종류의 프라이머(서열번호 86과 87)를 합성하였다. 서열번호 86과 85의 프라이머, 서열번호 82와 87 및 sacB 유전자 확인용 프라이머(서열번호 3 및 4)를 이용하는 PCR법에 의해 NSHΔaroE3ΔqsuB_Km주 및 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_km주를 해석한 결과, 예상하는 결과를 얻었으므로 NSHΔaroE3ΔqsuB_Km주 및 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_km주는 플라스미드 pHKPsacBΔqsuD가 qsuD 유전자 영역에 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
NSHΔaroE3ΔqsuB_Km주 및 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_km주를 1 mL의 LB 액체배지 중에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD주 및 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuBΔqsuD주를 수득하였다. 서열번호 86과 87의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해, NSHΔaroE3ΔqsuBΔaroE주 및 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuBΔqsuD주가 예상대로 aroE유전자가 결손된 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
3. NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD주의 방향족 아미노산 요구성 시험
상술한 바와 같이 작제한 NSH주, NSHΔaroE3주, NSHΔaroE3ΔqsuB주, NSHΔaroE3ΔqsuBΔaroE1주, NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB주, NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD주의 6주에 대하여, 다음과 같이 방향족 아미노산 요구성 시험을 하였다.
17.5 mg/L 시킴산, 50 mg/L 트립토판, 50 mg/L 페닐알라닌, 50 mg/L 티로신을 첨가한 전 배양 배지인 CGXII 배지에 각 균주를 식균하여 30℃에서 밤새도록 배양한 다음, 2회 세척하고 본 배양 배지인 CGXII 배지에 OD 600이 약 0.05가 되도록 옮겼다. 본 배양 배지인 CGXII 배지에 17.5 mg/L 시킴산, 50 mg/L 트립토판, 50 mg/L 페닐알라닌, 50 mg/L 티로신을 첨가한 배양실험을 병행하였다. 그 결과, NSH주 NSHΔaroE3주, NSHΔaroE3ΔqsuB주, NSHΔaroE3ΔqsuBΔaroE1주, NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB주, NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD주의 6주 중 NSHΔaroE3ΔqsuBΔqsuD주만이 시킴산, 트립토판, 페닐알라닌, 티로신을 첨가할 때만 생육하였으므로, qsuD 유전자 결실에 의해 잔존하는 시킴산 무수화 효소활성이 거의 소실된 것으로 나타났다.
참고예 11: VanR 리프레서 유도 발현에 의해 aroE3 유전자 발현을 제어할 수 있는 DHS 생산균주의 작제
참고예 10에서 작제한 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuBΔqsuD주 benABCD 유전자 영역을 vanR 유전자로 치환함으로써, benA 프로모터의 제어하에서 vanR 유전자를 발현하는 균주를 작제하였다.
1. benABCD 유전자 영역을 vanR 유전자와 치환하기 위한 플라스미드의 구축
benABCD 유전자 영역의 5' 인접부위(염기번호 2,515,963~2,516,969)를 증폭시키기 위하여 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 88 및 89)를 합성하고, benABCD 유전자 영역의 3' 인접부위(염기번호 2,521,372~2,522,498)를 증폭시키기 위하여 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 90 및 91)를 각각 합성하였다. 서열번호 88과 91의 프라이머는 각각 제한효소 SalI 부위와 SbfI 부위를 갖는다. HT23주(참고예 3)의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 benABCD 유전자의 5' 인접부위와 3' 인접부위를 증폭시켰다. 또한, vanR 유전자를 증폭하기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 92 및 93)를 합성하였다. HT23주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 92와 93의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 vanR 유전자 영역을 증폭시켰다. 이렇게 하여 수득한 benABCD 유전자의 5' 인접부위의 증폭 DNA와 qsuB 유전자 영역의 증폭 DNA의 혼합물을 주형으로 서열번호 88과 93의 프라이머를 이용하는 오버래핑 PCR로 증폭시킨 다음, 제한효소 SalI와 NarI에 의한 절단에 의해 서열번호 88의 프라이머 내의 SalI 부위와 vanR 유전자 내부의 NarI 부위가 절단된 DNA 절편을 수득하였다. 또한, vanR 유전자 영역의 증폭 DNA와 benABCD 유전자의 3' 인접부위의 증폭 DNA의 혼합물을 주형으로 서열번호 91과 92의 프라이머를 이용한 오버래핑 PCR로 증폭시킨 다음, 제한효소 NarI와 SbfI에 의한 절단에 의해 vanR 유전자 내부의 NarI 부위와 서열번호 91의 프라이머 내의 SbfI 부위가 절단된 DNA 절편을 수득하였다. 이들 2종류의 DNA 절편을 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)의 다클론부위 내에 있는 SalI 부위와 SbfI 부위 사이에 도입하여, 플라스미드 pHKPsacB_Pben-vanR을 수득하였다.
2. benABCD 유전자 영역을 vanR 유전자로 치환된 균주의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여 상기 플라스미드 pHKPsacB_Pben-vanR을 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuBΔqsuD주에 도입하고, 카나마이신 내성을 가지는 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuBΔqsuD주_Km주를 수득하였다. 이어, NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuBΔqsuD주_Km주를 PCR법에 의해 해석하기 위하여, vanR 유전자의 5' 인접부위의 상류 배열과 일치하는 프라이머(서열번호 94)와 3' 인접부위의 하류 배열과 일치하는 프라이머(서열번호 95)를 합성한 다음, 서열번호 94와 91의 프라이머 및 서열번호 88과 95의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 해석하였다. 어떤 프라이머 세트를 이용한 PCR법에 의한 해석에서도 예상하는 결과를 얻었으므로, NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuBΔqsuD주_Km주는 플라스미드 pHKPsacB_Pben-vanR가 benABCD 유전자 영역에 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuBΔqsuD주_Km주를 1 mL의 LB 액체배지 중에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 Pben-vanR주를 수득하였다. 서열번호 94와 95의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해, Pben-vanR주는 benABCD 유전자 영역이 vanR 유전자로 치환된 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
참고예 12: benA 프로모터의 제어하에서 qsuB 유전자를 발현하는 프로토카테큐산 생산균 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB주의 작제
다음과 같이 참고예 9에서 작제한 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB주 benABCD 유전자 오페론 영역을 qsuB 유전자와 치환함으로써, benA 프로모터의 제어하에서 qsuB 유전자를 발현하는 균주를 작제하였다.
1. benABCD 유전자 영역을 qsuB 유전자와 치환하기 위한 플라스미드의 구축
benABCD 유전자 영역의 5' 인접부위를 증폭시키기 위하여 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 88 및 89)을 이용하고, benABCD 유전자 영역의 3' 인접부위를 증폭하기 위하여 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 90 및 91)을 이용하였다. HT23주(참고예 3)의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 benABCD 유전자의 5' 인접부위와 3' 인접부위를 증폭시켰다. 또한, qsuB 유전자를 증폭하기 위하여 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 96 및 97)를 합성하고, HT23주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 이들 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 qsuB 유전자 영역을 증폭시켰다. 이렇게 하여 수득한 benABCD 유전자의 5' 인접부위의 증폭 DNA와 qsuB 유전자 영역의 증폭 DNA의 혼합물을 주형으로 서열번호 88과 97의 프라이머를 이용하는 오버래핑 PCR로 증폭시킨 다음, 제한효소 SalI와 NarI에 의한 절단에 의해 서열번호 88의 프라이머 내의 SalI 부위와 qsuB 유전자 내부의 NarI 부위가 절단된 DNA 절편을 수득하였다. 또한, qsuB 유전자 영역의 증폭 DNA와 benABCD 유전자의 3' 인접부위의 증폭 DNA의 혼합물을 주형으로 서열번호 91과 96의 프라이머를 이용한 오버래핑 PCR로 증폭시킨 다음, 제한효소 NarI와 SbfI에 의한 절단에 의해 qsuB 유전자 내부의 NarI 부위와 서열번호 91의 프라이머 내의 SbfI 부위가 절단된 DNA 절편을 수득하였다. 이들 2종류의 DNA 절편을 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)의 다클론부위 내에 있는 SalI 부위와 SbfI 부위 사이에 도입하여, 플라스미드 pHKPsacB_Pben-qsuB을 수득하였다.
2. benABCD 유전자 영역을 qsuB 유전자로 치환한 균주의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여, 상기 플라스미드 pHKPsacB_Pben-qsuB를 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB주에 도입하고, 카나마이신 내성을 가지는 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Km주를 수득하였다. 이어, NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Km주를 PCR법에 의해 해석하기 위하여, qsuB 유전자의 5' 인접부위의 상류 배열과 일치하는 프라이머(서열번호 98)와 3' 인접부위의 하류 배열과 일치하는 프라이머(서열번호 99)를 합성한 다음, 서열번호 88과 99의 프라이머 및 서열번호 91과 98의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 해석하였다. 어떤 프라이머 세트를 이용한 PCR법에 의한 해석에서도 예상하는 결과를 얻었으므로, NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Km주는 플라스미드 pHKPsacB_Pben-qsuB가 benABCD 유전자 영역에 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Km주를 1 mL의 LB 액체배지 중에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB주를 수득하였다. 서열번호 88과 99의 프라이머 및 서열번호 91과 98의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 benABCD 유전자 영역이 qsuB 유전자로 치환된 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
참고예 13: benA 프로모터의 제어하에서 qsuB 유전자와 vanR 유전자를 발현하는 프로토카테큐산 생산균 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB-vanR주의 작제
참고예 12에서 작제한 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB주를 가지고, qsuB 유전자와 오페론 구조를 유지하는 형태로 vanR 유전자를 도입하였다. qsuB 유전자와 오페론 구조를 유지함으로써 benA 프로모터의 제어하에서 qsuB 유전자와 vanR 유전자를 발현하는 균주를 다음과 같이 작제하였다.
1. vanR 유전자를 qsuB 유전자 하류에 삽입하기 위한 플라스미드의 구축
vanR 유전자 삽입영역의 5' 인접부위(염기번호 2,520,333~2,521,374)를 증폭시키기 위하여 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 100 및 101)를 합성하고, vanR 유전자 삽입영역의 3' 인접부위(염기번호 2,521,372~2,522,498)를 증폭시키기 위하여 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 102 및 103)를 합성하였다. 서열번호 100과 103의 프라이머는 각각 제한효소 SalI 부위와 SbfI 부위를 갖는다. NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 vanR 유전자 삽입영역의 5' 인접부위와 3' 인접부위를 증폭시켰다. 또한, vanR 유전자를 증폭하기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 104 및 105)를 합성하고, HT23주(참고예 3)의 염색체 DNA를 주형으로 하여 이들 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 vanR 유전자 영역을 증폭시켰다. 이렇게 하여 수득한 vanR 유전자 삽입영역의 5' 인접부위의 증폭 DNA와 vanR 유전자 영역의 증폭 DNA의 혼합물을 주형으로 서열번호 100과 105의 프라이머를 이용하는 오버래핑 PCR로 증폭시킨 다음, 제한효소 SalI와 BamHI에 의한 절단에 의해 서열번호 100의 프라이머 내의 SalI 부위와 vanR 유전자 내부의 BamHI 부위가 절단된 DNA 절편을 수득하였다. 또한, vanR 유전자 영역의 증폭 DNA와 vanR 유전자 삽입영역의 3' 인접부위의 증폭 DNA의 혼합물을 주형으로 서열번호 104와 103의 프라이머를 이용한 오버래핑 PCR로 증폭시킨 다음, 제한효소 BamHI와 SbfI에 의한 절단에 의해 vanR 유전자 내부의 BamHI 부위와 서열번호 103의 프라이머 내의 SbfI 부위가 절단된 DNA 절편을 수득하였다. 이들 2종류의 DNA 절편을 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)의 다클론부위 내에 있는 SalI 부위와 SbfI 부위 사이에 도입하여, 플라스미드 pHKPsacB_Pben-qsuB-vanR을 수득하였다.
2. vanR 유전자를 qsuB 유전자 하류에 삽입한 균주의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여 상기 플라스미드 pHKPsacB_Pben-qsuB-vanR을 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB주에 도입하고, 카나마이신 내성을 가지는 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB주_Km주를 수득하였다. 이어, NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB주_Km주를 PCR법에 의해 해석하기 위하여, vanR 유전자 도입영역의 5' 인접부위의 상류 배열과 일치하는 프라이머(서열번호 106)와 3' 인접부위의 하류 배열과 일치하는 프라이머(서열번호 107)를 합성한 다음, 서열번호 100과 103의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 해석하였다. 어떤 프라이머 세트를 이용한 PCR법에 의한 해석에서도 예상하는 결과를 얻었으므로, NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB주_Km주는 플라스미드 pHKPsacB_Pben-qsuB-vanR이 vanR 유전자 삽입영역에 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB주_Km주를 1 mL의 LB 액체배지 중에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB-vanR주를 수득하였다. 서열번호 106과 107의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의하여 benABCD 유전자 영역의 qsuB 유전자 하류에 vanR 유전자를 삽입된 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
참고예 14: tkt 유전자를 구성적으로 발현하는 프로토카테큐산 생산균 tkt주의 작제
참고예 13에서 작제한 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB-vanR주를 친주로, 에리트로스-4-인산의 합성과 관련된 tkt 유전자를 Tu 프로모터(참고예 6)에 연결된 전사유닛(이하에서는, "Ptu-tkt 전사유닛"이라 약함)을 DNA 수식·제한효소 유전자가 파괴된 부위에 삽입된 tkt주를 다음과 같이 작제하였다.
1. Ptu-tkt 전사유닛을 구축하기 위한 플라스미드의 구축
DNA 수식·제한효소 유전자가 파괴된 5' 인접부위(염기번호 1,885,120~1,883,861)를 증폭시키기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 108 및 109)를 합성하고, DNA 수식·제한효소 유전자가 파괴된 3' 인접부위(염기번호 1,879,744~1,878,664)를 증폭하기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 110 및 111)를 합성하였다. 또한, Tu 프로모터를 증폭시키기 위하여 DNA 프라이머(서열번호 112 및 36)을, tkt 유전자를 증폭시키기 위하여 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 113 및 114)를 각각 합성하였다. 서열번호 108과 111의 프라이머는 각각 제한효소 SbfI 부위와 SalI 부위를 갖는다.
HT23주(참고예 3)의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 DNA 수식·제한효소 유전자가 파괴된 5' 인접부위와 3' 인접부위를 증폭시켰다. 수득한 5' 인접부위의 증폭 DNA와 tkt 유전자 증폭 DNA의 혼합물을 주형으로 서열번호 108과 113의 프라이머를 이용하는 오버래핑 PCR로 증폭시킨 다음, 제한효소 SbfI와 PfoI에 의한 절단에 의해 서열번호 108의 프라이머 내의 SbfI 부위와 서열번호 113의 프라이머 내의 PfoI 부위가 절단된 DNA 절편을 수득하였다. 또한, Tu 프로모터의 증폭 DNA와 3' 인접부위의 증폭 DNA의 혼합물을 주형으로 서열번호 36과 111의 프라이머를 이용한 오버래핑 PCR로 증폭시킨 다음, 제한효소 Pfo와 SalI에 의한 절단에 의해 서열번호 36의 프라이머 내의 PfoI 부위와 서열번호 111의 프라이머 내의 SalI 부위가 절단된 DNA 절편을 수득하였다. 이들 2종류의 DNA 절편을 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)의 다클론부위 내에 있는 SbfI 부위와 SalI 부위 사이에 도입하여, 플라스미드 pHKPsacB_Ptu-tkt을 수득하였다.
2. Ptu-tkt 전사유닛을 도입한 균주의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여 상기 플라스미드 pHKPsacB_Ptu-tkt를 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB-vanR주에 도입하고, 카나마이신 내성을 가지는 NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB-vanR주_Km주를 수득하였다. 이어, NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB-vanR주_Km주를 PCR법에 의해 해석하기 위하여, 5' 인접부위의 상류 배열과 일치하는 프라이머(서열번호 115)와 3' 인접부위의 하류 배열과 일치하는 프라이머(서열번호 116)를 합성한 다음, 서열번호 115와 116의 프라이머 및 서열번호 108과 111의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 해석하였다. 어떤 프라이머 세트를 이용한 PCR법에 의한 해석에서도 예상하는 결과를 얻었으므로, NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB-vanR주_Km주는 플라스미드 pHKPsacB_Ptu-tkt가 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
NSHΔaroE3_vanE3ΔqsuB_Pben-qsuB-vanR주_Km주를 1 mL의 LB 액체배지 중에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 tkt주를 수득하였다. 서열번호 115와 116의 프라이머 및 서열번호 108과 111의 프라이머를 이용하는 PCR법과 증폭 절편의 제한효소 절단에 의해, Ptu-tkt 전사유닛이 DNA 수식·제한효소 유전자 파괴 부위에 삽입된 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
참고예 15: rhcH 프로모터의 제어하에서 aroE3 유전자를 발현하는 균주의 작제
cg1309 유전자로부터 cg1311 유전자까지의 영역(이하에서는, "rhcHMD 유전자 영역"이라 약함)을 aroE3 유전자로 치환한 균주를 다음과 같이 작제하였다.
1. genH 유전자 파괴용 플라스미드의 구축
3-히드록시벤조산 6-수산화효소를 암호화하는 유전자인 cg3354 유전자(이하에서는, "genH 유전자"라 약함)의 5' 인접부위(염기번호 3,201,424~3,202,403)를 증폭하는 동시에 증폭 절편의 양 말단에 제한효소 KpnI 부위와 SbfI 부위를 부가하기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 117 및 118)를 합성하였다. DRHG주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 genH 유전자의 5' 인접부위를 증폭시켰다. 그런 다음, genH 유전자의 3' 인접부위(염기번호 3,203,894~3,204,901)를 증폭하는 동시에 증폭 절편의 양 말단에 제한효소 SbfI 부위와 SalI 부위를 부가하기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 119 및 120)를 합성하였다. DRHG주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 genH 유전자의 3' 인접부위를 증폭시켰다. 5' 인접부위의 증폭 DNA 절편을 제한효소 KpnI와 SbfI으로 절단하고, 3' 인접부위의 증폭 DNA 절편을 제한효소 SbfI와 SalI으로 절단한 다음, 이들의 DNA 절편을 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)의 다클론부위 내에 있는 KpnI 부위와 SalI 부위 사이에 도입하여 플라스미드 pHKPsacBΔgenH를 수득하였다.
2. genH 유전자 파괴주의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여, 상기 플라스미드 pHKPsacBΔgenH를 NSHΔaroE3주에 도입하고, 카나마이신 내성을 선택함으로써 NSHΔaroE3_Km주를 수득하였다. 서열번호 117과 120의 프라이머 및 sacB 유전자 확인용 프라이머(서열번호 3 및 4)를 이용하는 PCR법에 의해 NSHΔaroE3_Km주를 해석한 결과, 예상하는 결과를 얻었으므로 이들 균주는 플라스미드 pHKPsacBΔgenH가 genH 유전자 영역에 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
NSHΔaroE3_Km주를 1 mL의 LB 액체배지 중에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 NSHΔaroE3ΔgenH주를 수득하였다. 서열번호 117과 120의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의하여, NSHΔaroE3ΔgenH주가 예상대로 genH 유전자가 결손된 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
3. rhcHMD 유전자 영역과 aroE3 유전자 치환용 벡터의 구축
rhcHMD 유전자 영역의 5' 인접부위(염기번호 1,213,341~1,214,736)를 증폭시키기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 121 및 서열번호 122)를 합성하였다. 또한, 서열번호 121의 프라이머에는 제한효소 SbfI 부위를 도입하였다. NSH주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 rhcHMD 유전자 영역의 5' 인접부위를 증폭시켰다. 그런 다음, rhcHMD 유전자의 3' 인접부위(염기번호 1,218,296~1,219,545)를 증폭시키기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 123 및 서열번호 124)를 합성하였다. 또한, 서열번호 124의 프라이머에는 제한효소 SalI 부위를 도입하였다.
또한, aroE3 유전자를 증폭하기 위하여, 서열번호 125와 서열번호 126의 DNA 프라이머를 합성하였다. rhcHMD 유전자 영역의 5' 인접부위, aroE3 유전자를 증폭한 DNA 절편을 주형으로 DNA 프라이머(서열번호 121 및 서열번호 126)를 이용한 오버랩 PCR법으로 증폭시켰다. 또한, 3' 인접부위, aroE3 유전자를 증폭한 DNA 절편을 주형으로 DNA 프라이머(서열번호 125 및 서열번호 124)를 이용하여 오버랩 PCR법으로 증폭시켰다. 각각 증폭된 DNA 절편을 SbfI와 AvrII및 AvrII와 SalI으로 절단하고, 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)의 다클론부위 내의 제한효소 부위 SbfI-SalI 사이에 도입하여, 플라스미드 pHKPsacB_rhcR_Prhc-rhcE3를 수득하였다.
4. rhcHMD 유전자 영역과 aroE3 유전자 치환주의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여, 상기 플라스미드 pHKPsacB_rhcR_Prhc-rhcE3를 상기 NSHΔaroE3ΔgenH주에 도입하고, 카나마이신 내성을 선택함으로써 NSHΔaroE3ΔgenH_Km주를 수득하였다.
서열번호 127과 서열번호 128의 DNA 프라이머, 서열번호 121과 서열번호 124의 프라이머 및 sacB 유전자 확인용 프라이머(서열번호 3 및 4)를 이용하는 PCR법에 의해 NSHΔaroE3ΔgenH_Km주를 해석한 결과, 예상하는 결과를 얻었으므로 NSHΔaroE3ΔgenH_Km주는 플라스미드 pHKPsacB_rhcR_Prhc-rhcE3이 rhcHMD 유전자 영역에 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
NSHΔaroE3ΔgenH주의 1번 교차형 상동 재조합을 1 mL의 LB 액체배지 중에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 NSHΔaroE3ΔgenH_rhcE3주를 수득하였다. 서열번호 127과 128의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해, NSHΔaroE3ΔgenH_rhcE3주의 rhcHMD 유전자 영역이 aroE3 유전자로 치환되고, 예상대로 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
5. NSHΔaroE3_vanE3주와 NSHΔaroE3ΔgenH_rhcE3주의 아미노산 요구성 시험
작제한 NSH주 NSHΔaroE3주, NSHΔaroE3_vanE3주, NSHΔaroE3ΔgenH_rhcE3주에 대해 다음과 같이 방향족 아미노산 요구성 시험을 하였다.
각 균주를 전 배양 배지인 CGXII 배지에 식균하여 30℃에서 밤새도록 배양한 다음, 2회 세척하고 본 배양 배지인 CGXII 배지에 흡광도 600nm가 약 0.1이 되도록 옮겼다. 또한, CGXII 배지에 시킴산(17.5 mg/L), 트립토판(50 mg/L), 페닐알라닌(50 mg/L) 및 티로신(50 mg/L)을 첨가한 배양실험을 병행하였다. 그 결과, NSH주는 CGXII 배지에서는 정상적으로 생육했으나, NSHΔaroE3주는 지극히 생육이 늦은 것으로 나타났다. 또한, NSHΔaroE3_vanE3주와 NSHΔaroE3ΔgenH_rhcE3주는 배양 초기에서 중기에 걸쳐 생육이 늦어, 배양 종기에 생육이 회복하는 것을 확인하였다. 또한, NSHΔaroE3_vanE3주 또는 NSHΔaroE3ΔgenH_rhcE3주는 CGXII 배지에 시킴산, 트립토판, 페닐알라닌 및 티로신을 첨가하면, 생육이 회복하는 것을 확인하였다. 이들 결과로부터, VanR 리프레서와 RhcR 리프레서는 함께 aroE3 유전자 발현을 제어하는 것을 확인하였다.
참고예 16: nagI 프로모터의 제어하에서 rhcR 유전자를 발현하는 균주의 작제
rhcR 유전자가 암호화하는 RhcR 리프레서에 의한 aroE3 유전자의 전사를 제어하는 시스템을 구축하기 위하여, nagI 프로모터의 제어하에서 rhcR 유전자를 발현하는 균주를 다음과 같이 작제하였다.
1. nagIKL 유전자 오페론 영역과 rhcR 유전자 치환용 벡터의 구축
다음과 같이, 상기에서 작제한 NSHΔaroE3ΔgenH주 nagIKL 유전자 오페론 영역을 rhcR 유전자와 치환함으로써, nagI 프로모터의 제어하에서 rhcR 유전자를 발현하는 균주를 작제하였다.
nagIKL 유전자 오페론 영역의 5' 인접부위(상보쇄 염기번호 3,199,996~3,200,904)를 증폭시키기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 129와 서열번호 130)를 합성하였다. 또한, 서열번호 129의 프라이머에는 제한효소 SbfI 부위를 도입하였다. NSH주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이러한 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 nagIKL 유전자 오페론 영역의 5' 인접부위를 증폭시켰다. 그런 다음, nagIKL 유전자 오페론 영역의 3' 인접부위(상보쇄 염기번호 3,196,321~3,197,306)를 증폭시키기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 131과 서열번호 132)를 합성하였다. 또한, 서열번호 132의 프라이머에는 제한효소 SalI 부위를 도입하였다.
또한, rhcR 유전자를 증폭하기 위하여, 서열번호 133과 서열번호 134의 DNA 프라이머를 합성하였다. nagIKL 유전자 오페론 영역의 5' 인접부위, rhcR 유전자를 증폭한 DNA 절편을 주형으로 DNA 프라이머(서열번호 133 및 서열번호 134)를 이용한 오버랩 PCR법으로 증폭시켰다. 또한, 3' 인접부위, rhcR 유전자를 증폭한 DNA 절편을 주형으로, DNA 프라이머(서열번호 132 및 서열번호 133)를 이용하여 오버랩 PCR법으로 증폭시켰다. 각각 증폭된 DNA 절편을 SbfI와 AvrII 및 AvrII와 SalI으로 절단하고, 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)의 다클론부위 내의 제한효소 부위 SbfI-SalI 사이에 도입하여, 플라스미드 pHKPsacB_Pnag-rhcR을 수득하였다.
2. nagI 프로모터의 제어하에서 rhcR 유전자를 발현하는 균주의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여 상기 플라스미드 pHKPsacB_Pnag-rhcR을 균주 NSHΔaroE3ΔgenH_rhcE3에 도입하고, 카나마이신 내성을 선택함으로써 NSHΔaroE3ΔgenH_rhcE3_Km주를 수득하였다. 서열번호 135와 서열번호 136의 DNA 프라이머, 서열번호 129와 서열번호 132의 프라이머 및 sacB 유전자 확인용 프라이머(서열번호 3 및 4)를 이용하는 PCR법에 의해 NSHΔaroE3ΔgenH_rhcE3_Km주를 해석한 결과, 예상하는 결과를 얻었으므로 NSHΔaroE3ΔgenH_rhcE3_Km주는 플라스미드 pHKPsacB_Pnag-rhcR이 nagIKL 유전자 오페론 영역에 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
NSHΔaroE3ΔgenH_rhcE3주의 1번 교차형 상동 재조합을 1 mL의 LB 액체배지 중에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 Pnag-rhcR주를 수득하였다. 서열번호 135와 서열번호 136의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해, Pnag-rhcR주 nagIKL 유전자 영역이 rhcR 유전자로 치환되어 있으며, 예상대로 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
참고예 17: nagI 프로모터의 제어하에서 qsuB 유전자와 rhcR 유전자를 발현하는 프로토카테큐산 생산균 Pnag-qsuB-rhcR주의 작제
qsuB 유전자를 Pnag-rhcR주 nagI 프로모터 제어하에 도입한 균주를 다음과 같이 작제하였다.
1. qsuB 유전자를 nagI 프로모터의 하류에 도입하기 위한 플라스미드의 구축
qsuB 유전자 도입영역의 5' 인접부위(염기번호 3,199,996~3,200,904)를 증폭시키기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 137 및 138)를 합성하고, qsuB 유전자 도입영역의 3' 인접부위(염기번호 3,198,925~3,199,995, 이 영역은 rhcR 유전자로 치환됨)를 증폭시키기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 139 및 140)를 합성하였다. 서열번호 137과 140의 프라이머는 각각 제한효소 SbfI 부위와 SphI 부위를 갖는다. Pnag-rhcR주(참고예 16)의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 이들 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 qsuB 유전자 도입영역의 5' 인접부위와 3' 인접부위를 증폭시켰다. 또한, qsuB 유전자를 증폭하기 위하여, 2종류의 DNA 프라이머(서열번호 141 및 142)를 합성하고, HT23주(참고예 3)의 염색체 DNA를 주형으로 하여 이들 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 qsuB 유전자 영역을 증폭시켰다. 이렇게 하여 수득한 qsuB 유전자 도입영역의 5' 인접부위 증폭 DNA와 qsuB 유전자 영역의 증폭 DNA의 혼합물을 주형으로 서열번호 137과 142의 프라이머를 이용하는 오버래핑 PCR로 증폭시킨 다음, 제한효소 SbfI와 XhoI에 의한 절단에 의해 서열번호 137의 프라이머 내의 SbfI 부위와 qsuB 유전자 내부 XhoI 부위가 절단된 DNA 절편을 수득하였다. 또한, qsuB 유전자 영역의 증폭 DNA와 qsuB 유전자 도입영역의 3' 인접부위의 증폭 DNA의 혼합물을 주형으로 서열번호 140과 141의 프라이머를 이용한 오버래핑 PCR로 증폭시킨 다음, 제한효소 XhoI와 SphI에 의한 절단에 의해 qsuB 유전자 내부 XhoI 부위와 서열번호 140의 프라이머 내의 SphI 부위가 절단된 DNA 절편을 수득하였다. 이들 2종류의 DNA 절편을 플라스미드 pHKPsacB1(참고예 2 참조)의 다클론부위 내에 있는 SbfI 부위와 SphI 부위 사이에 도입하여, 플라스미드 pHKPsacB_Pnag-qsuB-rhcR을 수득하였다.
2. nagI 프로모터의 제어하에서 qsuB 유전자와 rhcR 유전자를 발현하는 균주의 작제
전기천공법에 의한 형질전환을 이용하여, 상기 플라스미드 pHKPsacB_Pnag-qsuB-rhcR을 Pnag-rhcR주에 도입하고, 카나마이신 내성을 가지는 Pnag-rhcR주_Km주를 수득하였다. 이어, Pnag-rhcR주_Km주를 PCR법에 의해 해석하기 위하여 qsuB 유전자 도입영역의 5' 인접부위의 상류 배열과 일치하는 프라이머(서열번호 143)와 3' 인접부위의 하류 배열과 일치하는 프라이머(서열번호 144)를 합성한 다음, 서열번호 137과 140의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 해석하였다. 어떤 프라이머 세트를 이용한 PCR법에 의한 해석에서도 예상하는 결과를 얻었으므로, Pnag-rhcR주_Km주는 플라스미드 pHKPsacB_Pnag-qsuB-rhcR이 nagI 프로모터의 하류에 도입된 1회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
Pnag-rhcR주_Km주를 1 mL의 LB 액체배지 중에서 24시간 배양하고, 배양액의 일부를 10% 자당을 함유하는 LB 한천배지 상에서 도말 배양함으로써 Pnag-qsuB-rhcR주를 수득하였다. 서열번호 143과 144의 프라이머를 이용하는 PCR법에 의해 qsuB 유전자가 nagI 프로모터의 하류에 도입된 2회 교차형 상동 재조합체임을 확인하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Genaris <120> Useful microorganism and method for producing a substance of interest <130> 131493A <160> 144 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 catgggatcc tctagatctg acctgca 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 ggtcagatct agaggatccc atggtac 27 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 aagcttaaat gaacatcaaa aagtttgcaa aacaag 36 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 gcgtttttat ttgttaactg ttaattgtcc 30 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 5 ttcgatttat tcaacaaagc cacgttgtgt ctcaaaatct ctgat 45 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 6 gttacattgc acaagataaa aatatatcat catgaacaat aa 42 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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<400> 94 atcatgaggg atctggtaag gc 22 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 95 agtcctaccc aacgcatatc c 21 <210> 96 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 96 ctcttggagg ttcacatgcg tacatccatt gccactg 37 <210> 97 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 97 gattgaccaa gggttagttt gggattcccc gctc 34 <210> 98 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 98 atcatgaggg atctggtaag gc 22 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 99 agtcctaccc aacgcatatc c 21 <210> 100 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 100 ttcctgcagg ttgggtgatc ttgacgatac tgc 33 <210> 101 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 101 ggtgcagttt agctattagt tttcgaacac gtccgtatc 39 <210> 102 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 102 gaagcaggtt taacgatggg ttctcacatc actcacc 37 <210> 103 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 103 ttgcatgctg atatctcgac attgctgtgt c 31 <210> 104 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 104 tagctaaact gcaccactta cc 22 <210> 105 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 105 cgttaaacct gcttccttgt tac 23 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 106 ttggttggaa gatcagacct g 21 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 107 agtcctaccc aacgcatatc c 21 <210> 108 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 108 ttcctgcagg tgctctactg gttcataggt tgc 33 <210> 109 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 109 ggtcttaagc acatctgtgt ctattacaca ggtaccg 37 <210> 110 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 110 cttcggatct aaacgatacc tcgccaccac caaaaaac 38 <210> 111 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 111 ttgtcgactc aggtgagcga catgttgtac 30 <210> 112 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 112 atcgtttaga tccgaaggaa aa 22 <210> 113 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 113 aagtccagga ggacatacaa tgaccacctt gacgctgt 38 <210> 114 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 114 gatgtgctta agaccctttg tac 23 <210> 115 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 115 atcttgtcga aacggtgacg c 21 <210> 116 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 116 acgaggggat aaggtgtttc tgc 23 <210> 117 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 117 aaggatcctg tgcatttgct ccaaacc 27 <210> 118 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 118 aacctgcagg ttgaaaaagg gggttagc 28 <210> 119 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 119 aacctgcagg agcttgaggt attggaacc 29 <210> 120 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 120 aagtcgacaa aaacatgctc cctgc 25 <210> 121 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 121 ttcctgcagg agctcatcaa catagaacgc gac 33 <210> 122 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 122 aaccatggga tctaaccctt cttgaatag 29 <210> 123 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 123 ttccatgggt tctcacatca ctcac 25 <210> 124 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 124 ctacttagac attgccttag tgttcttctg agatgcc 37 <210> 125 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 125 ttccatgggt tctcacatca ctcac 25 <210> 126 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 126 ctacttagac attgccttag tgttcttctg agatgcc 37 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 127 agagcgttct tgacaacctg c 21 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 128 ttggcaacca tcgtgatggt c 21 <210> 129 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 129 aacctgcagg cgtgactctg gaagtttgac c 31 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 130 tgttggagtc ctcctttacg 20 <210> 131 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 131 ctggctgtag tttccacaca ttc 23 <210> 132 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 132 tagtcgacat catcttgccg ctgattgc 28 <210> 133 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 133 ggaggactcc aacaatgccc acgccttcgc ag 32 <210> 134 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 134 ggaaactaca gccagttact gcggtttgac tggg 34 <210> 135 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 135 tgtcgacatt gcattgcagc tc 22 <210> 136 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 136 acacttttga cactgtggtg c 21 <210> 137 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 137 aacctgcagg cgtgactctg gaagtttgac c 31 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 138 tgttggagtc ctcctttacg 20 <210> 139 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 139 aaaaaaagga tttgattcat gcccacgcct tcgcag 36 <210> 140 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 140 aagcatgcac accttggaac acctagtagc 30 <210> 141 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 141 ggaggactcc aacaatgcgt acatccattg ccactg 36 <210> 142 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 142 caaatccttt ttttattagt ttgggattcc ccgct 35 <210> 143 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 143 tgtcgacatt gcattgcagc tc 22 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 144 atgacgcatt gcgtcatacc 20

Claims (24)

  1. 탄소원으로부터 생육에 필수적인 대사물 M을 생성하는 생합성 경로에서 중간 대사물인 화합물 P를 대사물 M으로 전환시키는 효소 X의 발현량을 조절하여 화합물 P를 축적시키기 위하여, 이하의 (a) 내지 (d)에 기재된 성질을 모두 가지는 원핵생물:
    (a) 상기 원핵생물이 이용할 수 있는 탄소원으로부터 화합물 P에 이르는 생합성에 관련한 효소군 중 1개 이상의 효소활성이 상기 원핵생물의 야생주에 비해 증대되고,
    (b) 효소 X의 단백질을 암호화하는 야생형 유전자 x의 번역영역, 상기 유전자의 번역조절 영역 또는 유전자 x의 전사를 촉진하는 프로모터 영역 내에 1개 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되는 변이를 가짐으로써, 효소 X의 활성이 결손 또는 저하되며,
    (c) 상기 유전자 x의 전사를 촉진하는 본래의 프로모터와 다른, 리프레서 R 단백질에 의한 전사가 억제되는 프로모터 A에 의해 활성형 효소 X를 암호화하는 DNA의 전사가 제어되며,
    (d) 리프레서 R의 단백질을 암호화하는 유전자 z를 1카피 이상 가지고, 상기 유전자의 전사가 상기 유전자 본래의 프로모터 및/또는 상기 프로모터와 다른 유도 프로모터 B에 의해 제어된다.
  2. 제1항에 있어서,
    성질 (b)에 기재된 유전자 x의 전사를 촉진하는 프로모터 영역 속의 치환변이가, 상기 프로모터의 전역 또는 일부 영역을 성질 (c)에 기재된 프로모터 A의 DNA로 치환하는 변이인 것을 특징으로 하는
    원핵생물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 원핵생물이 가지는 화합물 P를 대사하는 효소 중, 효소 X 이외의 1개 이상의 대사효소 활성이 결손 또는 저하되는 것을 특징으로 하는
    원핵생물.
  4. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로모터 B가 훼루린산, 바닐린산, 바닐린, 벤조산, 3-히드록시벤조산, 레조르시놀, 4-히드록시벤조산, 2,4-디히드록시벤조산, 과당 및 자당으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물의 첨가에 의해 유도되는 프로모터인 것을 특징으로 하는
    원핵생물.
  5. 제1항 내지 제4항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 리프레서 R의 단백질을 암호화하는 유전자 z가 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032주의 vanR(cg2615) 유전자, pcaR(cg2624) 유전자 또는 rhcR(cg1308) 유전자인 것을 특징으로 하는
    원핵생물.
  6. 제1항 내지 제5항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 프로모터 A가 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032주의 vanA(cg2616) 유전자의 프로모터, pobA(cg1226) 유전자의 프로모터, pcaH(cg2631) 유전자의 프로모터 또는 rhcH(cg1309) 유전자의 프로모터인 것을 특징으로 하는
    원핵생물.
  7. 제1항 내지 제6항의 어느 한 항에 기재된 원핵생물을 프로모터 A의 전사를 억제하는 상태에서 탄소원의 존재하에서 배양하는 단계를 포함하는 화합물 P의 제조방법.
  8. 제1항 내지 제6항의 어느 한 항에 기재된 원핵생물을 프로모터 A의 전사를 억제하는 상태에서 탄소원의 존재하에서 배양하는 단계; 및,
    프로모터 B의 전사를 유도함으로써 리프레서 R 단백질의 발현량을 증가시키고 대사물 M의 생성량을 감소시키는 단계를 포함하는 화합물 P의 제조방법.
  9. 제1항 내지 제6항의 어느 한 항에 기재된 원핵생물을 프로모터 A의 전사억제를 해제한 상태에서 탄소원의 존재하에서 배양하는 단계; 및,
    프로모터 B의 전사를 유도함으로써 리프레서 R 단백질의 발현량을 증가시키고 대사물 M의 생성량을 감소시키는 단계를 포함하는 화합물 P의 제조방법.
  10. 제7항 내지 제9항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물 P 및 상기 대사물 M의 조합이 이하에 기재된 (f) 내지 (i)의 하나인 것을 특징으로 하는 화합물 P의 제조방법:
    (f) 화합물 P가 3-데히드로시킴산이고 대사물 M이 시킴산이며,
    (g) 화합물 P가 글루탐산이고 대사물 M이 N-아세틸글루탐산 또는 γ-글루타밀인산이며,
    (h) 화합물 P가 아스파르트산이고 대사물 M이 β-아스파틸인산이며,
    (i) 화합물 P가 세린이고 대사물 M이 글리신이다.
  11. 제1항 내지 제6항의 어느 한 항에 있어서,
    축적하는 화합물 P를 효소 Y의 화합물 Q로 전환하기 위하여 (a) 내지 (d)에 기재된 성질에 더하여 아래의 성질 (e)를 가지는 것을 특징으로 하는 원핵생물:
    (e) 효소 Y의 단백질을 암호화하는 유전자 y의 번역영역, 상기 유전자의 번역조절 영역 또는 유전자 y의 전사를 촉진하는 프로모터 영역 내에 1개 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되는 변이를 가짐으로써 화합물 P로부터 화합물 Q로의 전환능력이 증대되거나 유전자 y의 발현이 야생형과는 다른 제어를 받는다.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 원핵생물이 가지는 화합물 Q를 대사하는 효소 중 1개 이상의 대사효소 활성이 결손 또는 저하되는 것을 특징으로 하는
    원핵생물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    성질 (e)에 기재된 유전자 y의 전사를 촉진하는 프로모터 영역 속의 치환변이가 상기 프로모터의 전역 또는 일부 영역을 그 유전자의 전사를 촉진하는 본래의 프로모터 및 프로모터 A와는 다른 프로모터 C의 DNA로 치환하는 변이인 것을 특징으로 하는
    원핵생물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 프로모터 C가 프로모터 B와 동일하거나 또는 상기 프로모터 C가 프로모터 B의 전사를 제어하는 단백질에 의한 전사제어를 받는 것을 특징으로 하는
    원핵생물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상기 프로모터 C가 유도 프로모터인 것을 특징으로 하는
    원핵생물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 프로모터 C가 훼루린산, 바닐린산, 바닐린, 벤조산, 3-히드록시벤조산, 레조르시놀, 4-히드록시벤조산, 2,4-디히드록시벤조산, 과당 및 자당으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물의 첨가에 의해 유도되는 프로모터인 것을 특징으로 하는
    원핵생물.
  17. 제11항 내지 제16항의 어느 한 항에 기재된 원핵생물을 프로모터 A의 전사를 억제하는 상태에서 탄소원의 존재하에서 배양하는 단계를 포함하는 화합물 Q의 제조방법.
  18. 제11항 내지 제16항의 어느 한 항에 기재된 원핵생물을 프로모터 A의 전사를 억제하는 상태에서 탄소원의 존재하에서 배양하는 단계; 및,
    프로모터 B의 전사를 유도함으로써 리프레서 R 단백질의 발현량을 증가시키고 대사물 M의 생성량을 감소시켜 화합물 Q의 생성량을 증가시키는 단계를 포함하는 화합물 Q의 제조방법.
  19. 제11항 내지 제16항의 어느 한 항에 기재된 원핵생물을 프로모터 A의 전사억제를 해제한 상태에서 탄소원의 존재하에서 배양하는 단계; 및,
    프로모터 B의 전사를 유도함으로써 리프레서 R 단백질의 발현량을 증가시키고 대사물 M의 생성량을 감소시켜 화합물 Q의 생성량을 증가시키는 단계를 포함하는 화합물 Q의 제조방법.
  20. 제17항 내지 제19항의 어느 한 항에 있어서,
    제11항 내지 제16항의 어느 한 항에 기재된 원핵생물을 탄소원의 존재하에서 배양하는 단계; 및,
    상기 프로모터 C의 전사를 유도함으로써 전기 효소 Y의 발현량을 증가시키고 화합물 Q의 생성량을 증가시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는
    화합물 Q의 제조방법.
  21. 제17항 내지 제20항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 화합물 P, 전술한 화합물 Q 및 상기 대사물 M의 조합이 이하 (j) 내지 (w)의 하나인 것을 특징으로 하는 화합물 Q의 제조방법:
    (j) 화합물 P가 3-데히드로시킴산이고 화합물 Q가 프로토카테큐산이며 대사물 M이 시킴산이고,
    (k) 화합물 P가 코리스민산이고 화합물 Q가 안트라닐산이며 대사물 M이 프리펜산이고,
    (l) 화합물 P가 프리펜산이고 화합물 Q가 4-히드록시페닐피루빈산이며 대사물 M이 페닐피루빈산이고,
    (m) 화합물 P가 프리펜산이고 화합물 Q가 아로겐산이며 대사물 M이 페닐피루빈산이고,
    (n) 화합물 P가 프리펜산이고 화합물 Q가 페닐피루빈산이며 대사물 M이 4-히드록시페닐피루빈산 또는 아로겐산이고,
    (o) 화합물 P가 2-옥소이소발레르산이고 화합물 Q가 2-이소프로필말산이며 대사물 M이 발린이고,
    (p) 화합물 P가 2-옥소이소발레르산이고 화합물 Q가 발린이며 대사물 M이 2-이소프로필말산이고,
    (q) 화합물 P가 글루탐산이고 화합물 Q가 γ-글루타밀인산이며 대사물 M이 N-아세틸글루탐산이고,
    (r) 화합물 P가 글루탐산이고 화합물 Q가 N-아세틸글루탐산이며 대사물 M이 γ-글루타밀인산이고,
    (s) 화합물 P가 아스파르트산이고 화합물 Q가 아스파라긴이며 대사물 M이 β-아스파틸인산이고,
    (t) 화합물 P가 아스파르트산 β-세미알데히드이고 화합물 Q가 2,3-디히드로디피콜린산이며 대사물 M이 호모세린이고,
    (u) 화합물 P가 호모세린이고 화합물 Q가 o-아세틸호모세린이며 대사물 M이 호모세린인산이고,
    (v) 화합물 P가 호모세린이고 화합물 Q가 호모세린인산이며 대사물 M이 o-아세틸호모세린이고,
    (w) 화합물 P가 세린이고 화합물 Q가 o-아세틸세린이며 대사물 M이 글리신이다.
  22. 효소 X가 시킴산 탈수소효소이고, 효소 Y가 3-데히드로시킴산 탈수효소인 것을 특징으로 하는 제21항의 (j)에 기재된 프로토카테큐산의 제조방법.
  23. 제22항에 있어서,
    프로토카테큐산 2,3-디옥시게나제를 암호화하는 유전자, 프로토카테큐산 3,4-디옥시게나제를 암호화하는 유전자, 프로토카테큐산 4,5-디옥시게나제를 암호화하는 유전자 및 프로토카테큐산 탈탄산 효소를 암호화하는 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 1개 이상의 유전자에 대하여, 상기 유전자의 번역영역 또는 그 전사·번역조절 영역 내에 1개 이상의 염기가 치환, 결실 또는 부가되는 변형을 도입함으로써 프로토카테큐산의 대사 활성이 결손 또는 저하되는 성질인 것을 특징으로 하는
    프로토카테큐산의 제조방법.
  24. 제1항 내지 제6항의 어느 한 항 또는 제11항 내지 제16항의 어느 한 항에 있어서,
    코리네박테리움 글루타미쿰 또는 에스케리키아·콜리인 것을 특징으로 하는
    원핵생물.
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