KR20140053848A

KR20140053848A - 지단백질 복합체 및 그의 제조 및 용도

Info

Publication number: KR20140053848A
Application number: KR1020137023430A
Authority: KR
Inventors: 장-루이 다쒜; 다뉠라 까르망 오니슈; 로즈 액커만
Original assignee: 세레니스 쎄라퓨틱스 홀딩 에스에이
Priority date: 2011-02-07
Filing date: 2012-02-06
Publication date: 2014-05-08
Also published as: HUE041797T2; US20150152164A1; WO2012109162A1; US11969456B2; MX2013009083A; US11376309B2; JP2022050603A; LT2673296T; NZ613524A; DK3466969T3; US20230372441A1; US11998587B2; JP2018076286A; ES2717455T3; SG192693A1; HK1198834A1; RS58243B1; CY1121318T1; IN2013DN07828A; EP2767546A1

Abstract

본원은 지단백질 복합체 및 지단백질 집단, 및 이상지질혈증 질환, 장애 및/또는 병태의 치료 및/또는 예방에 있어서 그들의 용도에 관한 것이다. 본원은 추가로 아포지단백질의 재조합 발현, 아포지단백질의 정제, 및 열 사이클링-기반 방법을 이용한 지단백질 복합체의 생산에 관한 것이다.

Description

지단백질 복합체 및 그의 제조 및 용도 {LIPOPROTEIN COMPLEXES AND MANUFACTURING AND USES THEREOF}

1. 관련 출원에 대한 교차 참조

본원은 그 내용이 전부 본원에 참고로 포함된, 2011년 2월 7일 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/440,371, 2011년 3월 14일 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/452,630, 및 2011년 5월 17일 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/487,263의 35 U.S.C. § 119(e) 하의 이익을 주장한다.

2. 기술 분야

본원은 지단백질 복합체, 복합체를 포함하는 제약 조성물, 상기 복합체를 위한 아포지단백질의 생산 및 정제 방법, 복합체의 제조 방법, 및 심혈관 질환, 장애 및/또는 이와 연관된 병태의 치료 또는 예방을 위해 복합체를 사용하는 방법을 제공한다.

3. 배경

3.1. 개요

순환 콜레스테롤은 혈액 내의 지질을 수송하는 혈장 지단백질 (지질 및 단백질 조성물의 복합체 입자)에 의해 운반된다. 다음과 같은 4가지 주요 클래스의 지단백질 입자가 혈장 내에서 순환하고, 지방-수송계에 관여한다: 킬로미크론 (chylomicron), 초저밀도 지단백질 (VLDL), 저밀도 지단백질 (LDL) 및 고밀도 지단백질 (HDL). 킬로미크론은 창자 지방 흡수의 짧게 생존하는 생성물을 구성한다. VLDL 및 특히 LDL은 간 (여기서 콜레스테롤이 합성되거나 식이 공급원으로부터 얻어짐)으로부터 동맥벽을 비롯한 간외 조직으로 콜레스테롤의 전달을 담당한다. 이와 대조적으로, HDL은 특히 간외 조직으로부터 간으로 콜레스테롤 지질을 제거하는 역 콜레스테롤 수송 (RCT)을 매개하고, 간에서 저장, 이화, 제거 또는 재순환된다. HDL은 또한 염증, 산화된 지질 및 인터류킨의 수송에서 유익한 역할을 수행하고, 이것은 다시 혈관벽에서 염증을 감소시킬 수 있다.

지단백질 입자는 콜레스테롤 (보통 콜레스테릴 에스테르의 형태) 및 트리글리세리드로 이루어진 소수성 코어 (core)를 갖는다. 코어는 인지질, 비에스테르화된 콜레스테롤 및 아포지단백질을 포함하는 표면 코트 (coat)로 둘러싸인다. 아포지단백질은 지질 수송을 매개하고, 몇몇은 지질 대사에 관여하는 효소와 상호작용할 수 있다. 다음을 비롯한 적어도 10가지 아포지단백질이 확인되었다: ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoA-V, ApoB, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD, ApoE, ApoJ 및 ApoH. LCAT (레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제), CETP (콜레스테릴 에스테르 수송 단백질), PLTP (인지질 수송 단백질) 및 PON (파라옥소나제)과 같은 다른 단백질도 지단백질과 회합하는 것으로 밝혀졌다.

심혈관 질환, 예컨대 관상동맥성 심장 질환, 관상 동맥 질환, 및 아테롬성동맥경화증은 상승된 혈청 콜레스테롤 수준과 크게 관련된다. 예를 들어, 아테롬성동맥경화증은 동맥벽 내의 콜레스테롤의 축적을 특징으로 하는 느리게 진행하는 질환이다. 아테롬성동맥경화증 병변에 침착된 지질이 주로 혈장 LDL로부터 유래함을 지지하는 강력한 증거가 존재하고; 따라서, LDL은 "나쁜" 콜레스테롤로 대중적으로 알려지게 되었다. 이와 대조적으로, HDL 혈청 수준은 관상동맥성 심장 질환에 대해 반대의 상관성을 갖는다. 실제로, 높은 혈청 수준의 HDL은 음성 (negative) 위험 인자로 간주된다. 높은 수준의 혈장 HDL은 관상 동맥 질환에 대해 보호 작용을 할 뿐만 아니라 아테롬성동맥경화 플라크의 퇴행을 실제로 유도할 수 있다는 가설이 제시되었다 (예를 들어, 문헌 [Badimon et al., 1992, Circulation 86 (Suppl. III):86-94]; [Dansky and Fisher, 1999, Circulation 100:1762-63]; [Tangirala et al., 1999, Circulation 100(17):1816-22]; [Fan et al., 1999, Atherosclerosis 147(1):139-45]; [Deckert et al., 1999, Circulation 100(11):1230-35]; [Boisvert et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19(3):525-30]; [Benoit et al., 1999, Circulation 99(1):105-10]; [Holvoet et al., 1998, J. Clin. Invest. 102(2):379-85]; [Duverger et al., 1996, Circulation 94(4):713-17]; [Miyazaki et al., 1995, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 15(11):1882-88]; [Mezdour et al., 1995, Atherosclerosis 113(2):237-46]; [Liu et al., 1994, J. Lipid Res. 35(12):2263-67]; [Plump et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91(20):9607-11]; [Paszty et al., 1994, J. Clin. Invest. 94(2):899-903]; [She et al., 1992, Chin. Med. J. (Engl). 105(5):369-73]; [Rubin et al., 1991, Nature 353(6341):265-67]; [She et al., 1990, Ann. NY Acad. Sci. 598:339-51]; [Ran, 1989, Chung Hua Ping Li Hsueh Tsa Chih (또한 Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi로서 번역됨) 18(4):257-61]; [Quezado et al., 1995, J. Pharmacol. Exp. Ther. 272(2):604-11]; [Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16(12):1424-29]; [Kopfler et al., 1994, Circulation; 90(3):1319-27]; [Miller et al., 1985, Nature 314(6006):109-11]; [Ha et al., 1992, Biochim. Biophys. Acta 1125(2):223-29]; [Beitz et al., 1992, Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 47(2):149-52] 참조). 따라서, HDL은 대중적으로 "좋은" 콜레스테롤로 알려지게 되었다 (예를 들어, 문헌 [Zhang, et al., 2003 Circulation 108:661-663] 참조).

HDL의 "보호" 역할은 많은 연구에서 확인되었다 (예를 들어, 문헌 [Miller et al., 1977, Lancet 1(8019):965-68]; [Whayne et al., 1981, Atherosclerosis 39:411-19] 참조). 이들 연구에서, 상승된 수준의 LDL은 증가된 심혈관 위험과 연관된 것으로 보이는 반면, 높은 HDL 수준은 심혈관 보호를 부여하는 것으로 보인다. 생체내 연구는 HDL의 보호 역할을 추가로 입증하였고, 이는 토끼에게 HDL 주입이 콜레스테롤 유도된 동맥 병변의 발생을 억제하고/하거나 (문헌 [Badimon et al., 1989, Lab. Invest. 60:455-61] 참조) 그의 퇴행을 유도할 수 있음을 보여준다 (문헌 [Badimon et al., 1990, J. Clin. Invest. 85:1234-41] 참조).

3.2. 역 콜레스테롤 수송, HDL 및 아포지단백질 A-I

역 콜레스테롤 수송 (RCT) 경로는 대부분의 간외 조직으로부터 콜레스테롤을 제거하는 기능을 하고, 신체 내의 대부분의 세포의 구조와 기능 유지에 매우 중요하다. RCT는 주로 3 단계로 이루어진다: (a) 콜레스테롤 유출 (efflux), 즉 말초 세포의 다양한 풀 (pool)로부터 콜레스테롤의 초기 제거; (b) 유출된 콜레스테롤의 세포 내로 재도입을 방지하는, 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 (LCAT)의 작용에 의한 콜레스테롤 에스테르화; 및 (c) 가수분해, 이어서 재순환, 저장, 담즙 내 배출 또는 담즙산으로의 이화작용을 위한 HDL-콜레스테롤 및 콜레스테릴 에스테르의 간 세포로의 흡수.

LCAT (RCT의 핵심 효소)는 간에서 생산되고 HDL 분획과 회합되어 혈장 내에 순환한다. LCAT는 세포-유래 콜레스테롤을 콜레스테릴 에스테르로 전환하고, 이것은 제거될 예정인 HDL에 격리된다 (문헌 [Jonas 2000, Biochim. Biophys. Acta 1529(1-3):245-56] 참조). 콜레스테릴 에스테르 수송 단백질 (CETP) 및 인지질 수송 단백질 (PLTP)은 순환 HDL 집단의 추가의 재형성 (remodeling)에 기여한다. CETP는 LCAT에 의해 만들어진 콜레스테릴 에스테르를 다른 지단백질, 특히 ApoB-포함 지단백질, 예컨대 VLDL 및 LDL로 이동시킨다. PLTP는 레시틴을 HDL에 공급한다. HDL 트리글리세리드는 세포외 간 트리글리세리드 리파제에 의해 이화되고, 지단백질 콜레스테롤은 몇몇 메카니즘을 통해 간에 의해 제거된다.

HDL 입자의 기능적 특징은 그의 주요 아포지단백질 성분, 예컨대 ApoA-I 및 ApoA-II에 의해 주로 결정된다. 소량의 ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoD, ApoA-IV, ApoE 및 ApoJ도 HDL과 연관되어 관찰되었다. HDL은 대사적 RCT 캐스케이드 또는 경로 동안 재형성의 상태에 따라, 상기 언급된 성분들의 매우 다양한 상이한 크기와 상이한 혼합물로 존재한다.

각각의 HDL 입자는 대체로 적어도 1개, 및 대체로 2 내지 4개의 ApoA-I 분자를 포함한다. HDL 입자는 또한 게르드 아스만 (Gerd Assmann) 교수에 의해 설명된 바와 같이 콜레스테롤 유출을 담당하는 것으로도 알려진 ApoE (감마-LpE 입자)만을 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [von Eckardstein et al., 1994, Curr Opin Lipidol. 5(6):404-16] 참조). ApoA-I은 간 및 소장에 의해 프리프로아포지단백질 A-I로서 합성되고, 이것은 프로아포지단백질 A-I (프로ApoA-I)로서 분비되고 신속하게 절단되어 ApoA-I의 혈장 형태 (243개 아미노산의 단일 폴리펩티드 사슬)를 생성한다 (문헌 [Brewer et al., 1978, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:623-30] 참조). 실험에 의해 혈류에 직접 주입된 프리프로ApoA-I도 ApoA-I의 혈장 형태로 절단된다 (문헌 [Klon et al., 2000, Biophys. J. 79(3):1679-85]; [Segrest et al., 2000, Curr. Opin. Lipidol. 11(2):105-15]; [Segrest et al., 1999, J. Biol. Chem. 274 (45):31755-58] 참조).

ApoA-I은 링커 모이어티 (moiety) (종종 프롤린임)에 의해 이격된 6 내지 8개의 상이한 22-아미노산 알파-나선 또는 기능적 반복체를 포함한다. 반복 단위는 양친매성 (amphipathic) 나선 입체형태로 존재하고 (문헌 [Segrest et al., 1974, FEBS Lett. 38:247-53] 참조), ApoA-I의 주요 생물학적 활성, 즉, 지질 결합 및 레시틴 콜레스테롤 아실트랜스퍼라제 (LCAT) 활성화를 부여한다.

ApoA-I은 지질과 함께 다음과 같은 3가지 종류의 안정한 복합체를 형성한다: 프리-베타-1 HDL로 언급되는 작은 지질-부족 복합체; 프리-베타-2 HDL로 언급되는 극성 지질 (인지질 및 콜레스테롤)을 포함하는 편평한 원반상 입자; 및 구형 또는 성숙한 HDL (HDL₃ 및 HDL₂)로 언급되는, 극성 및 비극성 지질을 모두 포함하는 구형 입자. 순환 집단 내의 대부분의 HDL은 ApoA-I 및 ApoA-II를 모두 포함한다 ("AI/AII-HDL 분획"). 그러나, ApoA-I만을 포함하는 HDL의 분획 ("AI-HDL 분획")이 RCT에서 보다 효과적인 것으로 보인다. 특정 역학 연구는 ApoA-I-HDL 분획이 항-아테롬 발생성이라는 가설을 지지한다 (문헌 [Parra et al., 1992, Arterioscler. Thromb. 12:701-07]; [Decossin et al., 1997, Eur. J. Clin. Invest. 27:299-307] 참조).

HDL 입자는 상이한 크기, 지질 조성 및 아포지단백질 조성을 갖는 입자들의 몇몇 집단으로 이루어진다. 이들은 그의 수화된 밀도, 아포지단백질 조성물 및 전하 특징을 비롯한 그의 특성에 따라 분리될 수 있다. 예를 들어, 프리-베타-HDL 분획은 성숙 알파-HDL보다 더 낮은 표면 전하를 특징으로 한다. 상기 전하 차이 때문에, 프리-베타-HDL 및 성숙 알파-HDL은 아가로스 겔에서 상이한 전기영동 이동성을 갖는다 (문헌 [David et al., 1994, J. Biol. Chem. 269(12):8959-8965] 참조).

프리-베타-HDL 및 성숙 알파-HDL의 대사도 또한 상이하다. 프리-베타-HDL은 2가지 대사 운명을 갖는다: 신장에 의한 혈장으로부터 제거 및 이화작용, 또는 간에 의해 우선적으로 분해되는 중간-크기의 HDL로의 재형성 (문헌 [Lee et al., 2004, J. Lipid Res. 45(4):716-728] 참조).

세포 표면으로부터 콜레스테롤 전달 (즉, 콜레스테롤 유출)에 대한 메카니즘은 알려지지 않았지만, 지질-부족 복합체인 프리-베타-1 HDL이 RCT에 관여하는 말초 조직으로부터 전달된 콜레스테롤에 대한 바람직한 수용자 (acceptor)인 것으로 생각된다 (문헌 [Davidson et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:22975-82]; [Bielicki et al., 1992, J. Lipid Res. 33:1699-1709]; [Rothblat et al., 1992, J. Lipid Res. 33:1091-97]; 및 [Kawano et al., 1993, Biochemistry 32:5025-28]; [Kawano et al., 1997, Biochemistry 36:9816-25] 참조). 세포 표면으로부터 상기 콜레스테롤 동원 과정 동안, 프리-베타-1 HDL은 프리-베타-2 HDL로 신속하게 전환된다. PLTP는 프리-베타-2 HDL 원반 형성 속도를 증가시킬 수 있지만, RCT에서 PLTP에 대한 역할을 나타내는 데이터는 결여된 상태이다. LCAT는 원반상의 작은 (프리-베타) 및 구형 (즉, 성숙) HDL과 우선적으로 반응하여, 레시틴 또는 다른 인지질의 2-아실기를 콜레스테롤의 유리 히드록실 잔기에 전달하여 콜레스테릴 에스테르 (HDL 내에 보유됨) 및 리소레시틴을 생성한다. LCAT 반응에서는 활성화제로서 ApoA-I을 필요로 하고; 즉, ApoA-I은 LCAT에 대한 천연 보조인자이다. HDL 내에 격리된 콜레스테롤의 에스테르로의 전환은 세포 내로 콜레스테롤의 재도입을 억제하고, 그의 순 결과는 콜레스테롤이 세포로부터 제거되는 것이다.

ApoAI-HDL 분획 (즉, ApoA-I을 포함하지만 ApoA-II를 포함하지 않음) 내의 성숙 HDL 입자 내의 콜레스테릴 에스테르는 간에 의해 제거되고, ApoA-I 및 ApoA-II를 모두 포함하는 HDL (AI/AII-HDL 분획)로부터 유래하는 것보다 더 효과적으로 담즙으로 처리된다. 이것은 부분적으로는 간세포 막에 대한 ApoAI-HDL의 더 효과적인 결합 때문일 수 있다. HDL 수용체의 존재가 가정되었고, 스캐빈저 (scavenger) 수용체, 클래스 B, 타입 I (SR-BI)이 HDL 수용체로서 확인되었다 (문헌 [Acton et al., 1996, Science 271:518-20]; [Xu et al., 1997, Lipid Res. 38:1289-98] 참조). SR-BI는 스테로이드 생산 조직 (예를 들어, 부신) 및 간에서 가장 풍부하게 발현된다 (문헌 [Landschulz et al., 1996, J. Clin. Invest. 98:984-95]; [Rigotti et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:33545-49] 참조). HDL 수용체의 검토를 위해서는 문헌 [Broutin et al., 1988, Anal. Biol. Chem. 46:16-23]을 참조한다.

ATP-결합 카세트 수송체 AI에 의한 초기 지질화는 혈장 HDL 형성 및 프리-베타-HDL 입자가 콜레스테롤 유출을 수행하는 능력에 매우 중요한 것으로 보인다 (문헌 [Lee and Parks, 2005, Curr. Opin. Lipidol. 16(1):19-25] 참조). 상기 저자들에 따르면, 상기 초기 지질화를 통해 프리-베타-HDL이 콜레스테롤 수용자로서 보다 효율적으로 기능하고, ApoA-I이 기존재하는 혈장 HDL 입자와 신속하게 회합하는 것을 억제할 수 있고, 이것은 콜레스테롤 유출을 위한 프리-베타-HDL 입자의 이용성을 더 크게 만든다.

CETP도 RCT에서 기능할 수 있다. CETP 활성의 변화 또는 그의 수용자, VLDL 및 LDL은 HDL 집단의 "재형성"시에 작용한다. 예를 들어, CETP의 부재시에, HDL은 청소되지 않는 확대된 입자가 된다 (RCT 및 HDL의 검토를 위해서는 문헌 [Fielding and Fielding, 1995, J. Lipid Res. 36:211-28]; [Barrans et al., 1996, Biochem. Biophys. Acta 1300:73-85]; [Hirano et al., 1997, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17(6):1053-59]를 참조한다).

HDL은 또한 다른 지질 및 무극성 분자의 역 수송, 및 해독, 즉, 이화작용 및 배출을 위해 세포, 장기 및 조직으로부터 간으로의 지질의 수송에서 기능한다. 상기 지질은 스핑고미엘린 (SM), 산화된 지질, 및 리소포스파티딜콜린을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Robins and Fasulo (1997, J. Clin. Invest. 99:380-84)]에서는 HDL이 간에 의한 식물 스테롤의 담즙 분비로의 전송을 자극함을 보여주었다.

HDL의 주요 성분인 ApoA-I은 시험관 내에서 SM과 회합할 수 있다. ApoA-I이 시험관 내에서 소 뇌 SM (BBSM)과 재구성할 때, 최대 재구성 속도는 대략 BBSM의 상 전이 온도인 28℃에서 발생한다 (문헌 [Swaney, 1983, J. Biol. Chem. 258(2), 1254-59] 참조). 7.5:1 이하의 BBSM:ApoA-I 비 (wt/wt)에서, 입자당 3개의 ApoA-I 분자를 포함하고 BBSM:ApoA-I 몰비가 360:1인 단일 재구성된 균질한 HDL 입자가 형성된다. 이것은 전자 현미경에서 인지질/단백질의 상승된 비에서 ApoA-I의 포스파티딜콜린과의 재조합에 의해 얻은 것과 유사한 원반상 복합체로서 보인다. 그러나, 15:1의 BBSM:ApoA-I 비 (wt/wt)에서, 더 높은 인지질:단백질 몰비 (535:1)를 갖는 더 큰 직경의 원반상 복합체가 형성된다. 이들 복합체는 포스파티딜콜린과 함께 형성된 ApoA-I 복합체보다 유의하게 더 크고, 더 안정하고, 변성에 대해 더 저항성이다.

스핑고미엘린 (SM)은 초기 콜레스테롤 수용자 (프리-베타-HDL 및 감마-이동성 ApoE-포함 지단백질)에서 상승하고, 이것은 상기 입자가 콜레스테롤 유출을 촉진하는 능력을 SM이 향상시킬 수 있음을 시사한다 (문헌 [Dass and Jessup, 2000, J. Pharm. Pharmacol. 52:731-61]; [Huang et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1834-38]; [Fielding and Fielding 1995, J. Lipid Res. 36:211-28] 참조).

3.3. HDL 및 ApoA -I의 보호 메카니즘

HDL의 보호 메카니즘(들)에 대한 연구는 HDL의 주요 성분인 아포지단백질 A-I (ApoA-I)에 집중하였다. 높은 혈장 수준의 ApoA-I은 관상동맥성 병변의 부재 또는 감소와 연관된다 (문헌 [Maciejko et al., 1983, N. Engl. J. Med. 309:385-89]; [Sedlis et al., 1986, Circulation 73:978-84] 참조).

실험 동물에게 ApoA-I 또는 HDL의 주입은 유의한 생화학적 변화를 유발하고, 또한 아테롬성동맥경화증 병변의 정도 및 중증도를 감소시킨다. 마시에이코 (Maciejko) 및 마오 (Mao)에 의한 초기 보고 (1982, Arteriosclerosis 2:407a) 후에, 바디몬 (Badimon) 등 (문헌 [1989, Lab. Invest. 60:455-61]; [1989, J. Clin. Invest. 85:1234-41] 참조)은 HDL (d=1.063-1.325 g/ml)의 주입에 의해 콜레스테롤-급여 토끼에서 아테롬성동맥경화증 병변의 정도 (45%의 감소) 및 그의 콜레스테롤 에스테르 함량 (58.5%의 감소)을 유의하게 감소시킬 수 있음을 보여주었다. 이들은 또한 HDL 주입이 확립된 병변을 거의 50% 퇴행시킴을 보여주었다. 문헌 [Esper et al., 1987, Arteriosclerosis 7:523a]은 HDL 주입이 조기 동맥 병변이 발생한 유전성 고콜레스테롤혈증이 있는 와따나베 (Watanabe) 토끼의 혈장 지단백질 조성을 뚜렷하게 변화시킬 수 있음을 보여주었다. 이들 토끼에서, HDL 주입은 보호성 HDL 및 아테롬 발생성 LDL 사이의 비를 2배 이상으로 증가시킬 수 있다.

동물 모델에서 HDL이 동맥 질환을 억제하는 능력은 ApoA-I이 시험관 내에서 피브린 용해 활성을 제시할 수 있다는 관찰에 의해 추가로 이해된다 (문헌 [Saku et al., 1985, Thromb. Res. 39:1-8] 참조). 론버거 (Ronneberger) (문헌 [1987, Xth Int. Congr. Pharmacol., Sydney, 990] 참조)는 ApoA-I이 비글 (beagle) 개 및 시노몰로거스 원숭이에서 피브린 용해를 증가시킬 수 있음을 입증하였다. 유사한 활성이 시험관 내에서 인간 혈장에서 관찰되었다. 론버거는 ApoA-I 처리 동물에서 지질 침착 및 동맥 플라크 형성의 감소를 확인할 수 있었다.

시험관 내 연구에서는 ApoA-I 및 레시틴의 복합체가 배양된 동맥 평활근 세포로부터 유리 콜레스테롤의 유출을 촉진할 수 있음을 보여준다 (문헌 [Stein et al., 1975, Biochem. Biophys. Acta, 380:106-18] 참조). 상기 메카니즘에 의해, HDL은 또한 상기 세포의 증식을 감소시킬 수 있다 (문헌 [Yoshida et al., 1984, Exp. Mol Pathol. 41:258-66] 참조).

ApoA-I 또는 ApoA-I 모방 펩티드를 포함하는 HDL을 사용한 주입 요법도 ABC1 수송체에 의해 혈장 HDL 수준을 조절하고, 따라서 심혈관 질환의 치료에서 효능을 갖는 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 문헌 [Brewer et al., 2004, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24:1755-1760] 참조).

ApoA-I의 2개의 천연 생성 인간 다형성이 단리되었고, 여기서 아르기닌 잔기는 시스테인으로 교체된다. 아포지단백질 A-I_밀라노 (ApoA-I_M)에서, 상기 치환은 잔기 173에서 발생하는 반면, 아포지단백질 A-I_파리 (ApoA-I_P)에서, 상기 치환은 잔기 151에서 발생한다 (문헌 [Franceschini et al., 1980, J. Clin. Invest. 66:892-900]; [Weisgraber et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:2508-13]; [Bruckert et al., 1997, Atherosclerosis 128:121-28]; [Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22]; [Klon et al., 2000, Biophys. J. 79(3):1679-85] 참조). ApoA-I의 추가의 천연 생성 인간 다형성이 단리되었고, 여기서 류신은 위치 144에서 아르기닌으로 교체되었다. 상기 다형성은 아포지단백질 A-I 사라고사 (ApoA-I_Z)로 언급되고, 중증 저알파지질단백혈증 및 높은 밀도 지단백질 (HDL) 역 콜레스테롤 수송의 향상된 효과와 연관된다 (문헌 [Recalde et al., 2001, Atherosclerosis 154(3):613-623]; [Fiddyment et al., 2011, Protein Expr. Purif. 80(1):110-116] 참조).

ApoA-I_M 또는 ApoA-I_P의 디술피드-연결된 동종이량체를 포함하는 재구성된 HDL 입자는 디미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC) 에멀젼을 투명하게 만들고 콜레스테롤 유출을 촉진하는 능력에서 야생형 ApoA-I을 포함하는 재구성된 HDL 입자와 유사하다 (문헌 [Calabresi et al., 1997b, Biochemistry 36:12428-33]; [Franceschini et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19:1257-62]; [Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22] 참조). 두 돌연변이에서, 이형접합성 개체는 감소된 수준의 HDL을 갖지만, 역설적으로 아테롬성동맥경화증의 위험이 감소한다 (문헌 [Franceschini et al., 1980, J. Clin. Invest. 66:892-900]; [Weisgraber et al., 1983, J. Biol. Chem. 258:2508-13]; [Bruckert et al., 1997, Atherosclerosis 128:121-28] 참조). 어느 한 변이체를 포함하는 재구성된 HDL 입자는 야생형 ApoA-I을 포함하는 재구성된 HDL 입자에 비해 효율은 감소되지만 LCAT를 활성화시킬 수 있다 (문헌 [Calabresi et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 232:345-49]; [Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22] 참조).

ApoA-I_M 돌연변이는 상염색체 우성 형질로서 전달되고; 패밀리 내의 8 세대의 담체가 확인되었다 (문헌 [Gualandri et al., 1984, Am. J. Hum. Genet. 37:1083-97] 참조). ApoA-I_M 담체 개체의 상태는 HDL-콜레스테롤 수준의 현저한 감소를 특징으로 한다. 이런 특징에도 불구하고, 담체 개체는 동맥 질환의 임의의 증가된 위험을 분명하게 보이지 않는다. 실제로, 계통 (genealogical) 기록의 조사에 의하면, 상기 대상체는 아테롬성동맥경화증으로부터 "보호될" 수 있는 것으로 보인다 (문헌 [Sirtori et al., 2001, Circulation, 103:1949-1954]; [Roma et al., 1993, J. Clin. Invest. 91(4):1445-520] 참조).

돌연변이 담체에서 ApoA-I_M의 가능한 보호 효과의 메카니즘은 하나의 알파-나선의 상실 및 소수성 잔기의 증가된 노출과 함께 돌연변이체 ApoA-I_M의 구조의 변형과 연결된 것으로 보인다 (문헌 [Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:1632-35] 참조). 다중 알파-나선의 긴밀한 구조의 상실은 분자의 가요성 증가를 야기하고, 이것은 정상적인 ApoA-I에 비해 지질과 보다 쉽게 회합한다. 또한, 지단백질 복합체는 변성에 보다 취약하고, 따라서 지질 전달은 또한 돌연변이체의 경우에 개선된다.

문헌 [Bielicki, et al. (1997, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17 (9):1637-43)]은 ApoA-I_M이 야생형 ApoA-I에 비해 막 콜레스테롤을 동원하는 능력이 제한됨을 입증하였다. 또한, ApoA-I_M의 막 지질과의 회합에 의해 형성된 초기의 HDL은 야생형 ApoA-I에 의해 형성된 보다 큰 9- 및 11-nm 복합체보다는 주로 7.4-nm 입자이었다. 이들 관찰은 ApoA-I 1차 서열 내의 Arg₁₇₃→Cys₁₇₃ 치환이 세포 콜레스테롤 동원 및 초기의 HDL 회합의 정상 과정을 방해함을 나타낸다. 돌연변이는 세포로부터 콜레스테롤 제거의 감소된 효율과 분명하게 연관된다. 그의 항아테롬 발생 특성은 따라서 RCT에 관련되지 않을 수 있다.

Arg₁₇₃→Cys₁₇₃ 치환에 의한 가장 놀라운 구조적 변화는 ApoA-I_M의 이량체화이다 (문헌 [Bielicki et al., 1997, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17 (9):1637-43] 참조). ApoA-I_M은 그 자체와 동종이량체를, ApoA-II와 이종이량체를 형성할 수 있다. 아포지단백질의 혼합물을 포함하는 혈액 분획의 연구는 순환계 내의 이량체 및 복합체의 존재가 아포지단백질의 증가된 제거 반감기를 책임질 수 있음을 나타낸다. 상기 증가된 제거 반감기는 돌연변이 담체의 임상 연구에서 관찰되었다 (문헌 [Gregg et al., 1988, NATO ARW on Human Apolipoprotein Mutants: From Gene Structure to Phenotypic Expression, Limone S G] 참조). 다른 연구는 ApoA-I_M 이량체 (ApoA-I_M / ApoA-I_M)가 시험관 내에서 HDL 입자의 상호전환에서 억제 인자로서 작용함을 나타낸다 (문헌 [Franceschini et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:12224-31] 참조).

3.4. 이상지질혈증 및 관련 장애에 대한 현재의 치료

이상지질혈증 장애는 상승된 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세리드 수준, 및 저하된 혈청 HDL:LDL 비와 연관된 질환이고, 고지질혈증, 특히 고콜레스테롤혈증, 관상동맥성 심장 질환, 관상 동맥 질환, 혈관 및 혈관주위 질환, 및 심혈관 질환, 예컨대 아테롬성동맥경화증을 포함한다. 동맥 기능 부전에 의해 야기되는 아테롬성동맥경화증과 연관된 증후군, 예컨대 일과성 허혈 발작 또는 간헐적 파행 (claudication)도 포함된다. 이상지질혈증 장애와 연관된 상승된 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세리드를 저하시키기 위해 많은 치료가 현재 이용가능하다. 그러나, 이들은 각각 그 자체의 단점 및 효능, 부작용 및 환자 집단의 한정이라는 측면에서 제한을 갖는다.

담즙산-결합 수지는 장으로부터 간으로 담즙산의 재순환을 방해하는 약물의 클래스; 예를 들어, 콜레스티라민 (퀘스트란 라이트(Questran Light)®, 브리스톨-마이어스 스퀴브 (Bristol-Myers Squibb)), 콜레스티폴 염산염 (콜레스티드(Colestid)®, 디 업존 컴퍼니 (The Upjohn Company)), 및 콜레세벨람 염산염 (웰콜(Welchol)®, 다이이치-산교 컴퍼니 (Daiichi-Sankyo Company))이다. 경구 복용시에, 상기 양하전된 수지는 장 내의 음하전된 담즙산에 결합한다. 수지는 장으로부터 흡수될 수 없기 때문에, 담즙산을 보유한 상태로 배출된다. 그러나, 상기 수지의 사용은 기껏해야 혈청 콜레스테롤 수준을 단지 약 20% 감소시키고, 변비 및 특정 비타민 결핍증을 비롯한 위장관 부작용과 연관된다. 또한, 수지는 다른 약물에 결합하기 때문에, 다른 경구 의약을 수지 섭취보다 적어도 1시간 전 또는 4 내지 6시간 후에 복용해야 하고; 따라서, 심장병 환자의 약물 요법을 복잡하게 만든다.

스타틴은 HMGCoA 리덕타제 (콜레스테롤 생합성 경로에 관여하는 핵심 효소)를 억제함으로써 콜레스테롤 합성을 차단하는 콜레스테롤 저하제이다. 스타틴, 예를 들어, 로바스타틴 (메바코(Mevacor)®), 심바스타틴 (조코(Zocor)®), 프라바스타틴 (프라바콜(Pravachol)®), 플루바스타틴 (레스콜(Lescol)®) 및 아토르바스타틴 (리피토(Lipitor)®)은 때때로 담즙산-결합 수지와 조합하여 사용된다. 스타틴은 혈청 콜레스테롤 및 LDL-혈청 수준을 유의하게 감소시키고, 관상동맥성 아테롬성동맥경화증의 진행을 지연한다. 그러나, 혈청 HDL 콜레스테롤 수준은 단지 중간 정도로 증가된다. LDL 저하 효과의 메카니즘은 VLDL 농도 감소 및 LDL-수용체의 세포 발현 유도를 모두 수반할 수 있고, 이것은 LDL의 생산 감소 및/또는 이화작용 증가를 유발한다. 간 및 신장 기능이상을 포함한 부작용이 이들 약물 사용과 연관된다 (문헌 [The Physicians Desk Reference, 56^th Ed., 2002, Medical Economics] 참조).

니아신 (니코틴산)은 영양보충제 및 항고지질혈증제로서 사용되는 수용성 비타민 B-복합체이다. 니아신은 VLDL 생산을 감소시키고, LDL 저하에 효과적이다. 몇몇 경우에, 이것은 담즙산 결합 수지와 조합하여 사용된다. 니아신은 적절한 용량으로 사용될 때 HDL을 증가시킬 수 있지만, 그의 유용성은 그러한 높은 용량으로 사용될 때 심각한 부작용에 의해 제한된다. 니아스판(Niaspan)®은 순수한 니아신보다 더 적은 부작용을 일으키는 서방성 니아신 형태이다. 니아신/로바스타틴 (니코스타틴(Nicostatin)®)은 니아신 및 로바스타틴을 모두 함유하는 제제이고, 각각의 약물의 유리한 효과를 조합한다.

피브레이트는 또한 고콜레스테롤혈증과 연관될 수 있는 다양한 형태의 고지질혈증 (즉, 상승된 혈청 트리글리세리드)의 치료에 사용되는 지질-저하 약물의 클래스이다. 피브레이트는 VLDL 분획을 감소시키고 HDL을 완만하게 증가시키지만, 혈청 콜레스테롤에 대한 이들 약물의 효과는 가변적이다. 미국에서, 피브레이트, 예컨대 클로피브레이트 (아트로미드(Atromid)-S®), 페노피브레이트 (트리코(Tricor)®) 및 베자피브레이트 (베자립(Bezalip)®)가 항지질혈증 약물로서 사용이 승인되었지만, 고콜레스테롤혈증제로서는 승인되지 않았다. 예를 들어, 클로피브레이트는 VLDL 분획을 감소시킴으로써 혈청 트리글리세리드를 저하시키는 작용을 하는 (미지의 메카니즘을 통해) 항지질혈증제이다. 혈청 콜레스테롤은 특정 환자 아집단에서 감소할 수 있지만, 약물에 대한 생화학적 반응은 가변적이고, 어느 환자가 유익한 결과를 얻을 것인지 예측하는 것이 항상 가능하지는 않다. 아트로미드-S®는 관상동맥성 심장 질환의 예방에 효과적인 것으로 밝혀지지 않았다. 화학상 및 약물학상 관련된 약물, 겜피브로질 (로피드(Lopid)®)은 혈청 트리글리세리드 및 VLDL 콜레스테롤을 중간 정도로 감소시키고, HDL 콜레스테롤 - HDL₂ 및 HDL₃ 하위분획뿐만 아니라 ApoA-I 및 A-II 모두 (즉, AI/AMT-HDL 분획)를 중간 정도로 증가시키는 지질 조절제이다. 그러나, 지질 반응은 특히 상이한 환자 집단 사이에서 불균일하다. 또한, 관상동맥성 심장 질환의 예방이 기존의 관상동맥성 심장 질환의 병력 또는 증상이 없는 40-55세의 남성 환자에서 관찰되었지만, 이들 소견이 어느 정도로 다른 환자 집단 (예를 들어, 여성, 더 나이 많은 남성 및 더 젊은 남성)에게 외삽될 수 있는지는 분명하지 않다. 실제로, 확립된 관상동맥성 심장 질환이 있는 환자에서 어떠한 효능도 관찰되지 않았다. 독성, 예컨대 악성 종양 (특히 위장관암), 담낭 질환 및 비-관상동맥성 사망률의 발생 증가를 비롯한 심각한 부작용이 피브레이트 사용과 연관된다.

경구 에스트로겐 대체 요법이 폐경기 여성의 중등도 고콜레스테롤혈증에 대해 고려될 수 있다. 그러나, HDL 증가는 트리글리세리드 증가를 수반할 수 있다. 에스트로겐 치료는 물론 특수한 환자 집단 (폐경기 여성)으로 제한되고, 악성 신생물의 유도, 담낭 질환, 혈전색전성 질환, 간 선종, 혈압 상승, 포도당 불내성, 및 고칼슘혈증을 비롯한 심각한 부작용과 연관된다.

고지질혈증 치료에 유용한 다른 작용제는 콜레스테롤 흡수를 차단하거나 억제하는 에제티미브 (제티아(Zetia)®; 머크(Merck))를 포함한다. 그러나, 에제티미브의 억제제는 특정 독성을 보이는 것으로 밝혀졌다.

인지질과 복합체화된 HDL 및 재조합 형태의 ApoA-I은 무극성 또는 양친매성 분자, 예를 들어, 콜레스테롤 및 유도체 (옥시스테롤, 산화된 스테롤, 식물 스테롤 등), 콜레스테롤 에스테르, 인지질 및 유도체 (산화된 인지질), 트리글리세리드, 산화 생성물, 및 지질다당체 (LPS)에 대한 싱크 (sink)/스캐빈저로서 기능을 할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Casas et al., 1995, J. Surg. Res. Nov 59(5):544-52] 참조). HDL은 또한 TNF-알파 및 다른 림포카인에 대한 스캐빈저로서 역할을 할 수 있다. HDL은 또한 인간 혈청 파라옥소나제, 예를 들어, PON-1, -2, -3에 대한 담체로서 역할을 할 수 있다. 파라옥소나제 (HDL과 회합된 에스테라제)는 산화에 대해 세포 성분을 보호하기 위해 중요하다. 산화 스트레스 동안 일어나는 LDL의 산화는 아테롬성동맥경화증의 발생에 직접 연관되는 것으로 보인다 (문헌 [Aviram, 2000, Free Radic. Res. 33 Suppl:S85-97] 참조). 파라옥소나제는 아테롬성동맥경화증 및 심혈관 질환에 대한 감수성에서 역할을 하는 것으로 보인다 (문헌 [Aviram, 1999, Mol. Med. Today 5(9):381-86] 참조). 인간 혈청 파라옥소나제 (PON-1)은 고밀도 지단백질 (HDL)에 결합된다. 그의 활성은 아테롬성동맥경화증에 역으로 관련된다. PON-1은 유기인산염을 가수분해하고, HDL 및 저밀도 지단백질 (LDL)의 산화 억제에 의해 아테롬성동맥경화증에 대해 보호할 수 있다 (문헌 [Aviram, 1999, Mol. Med. Today 5(9):381-86] 참조). 실험 연구에서는 상기 보호가 산화된 지단백질 내의 특이적 지질 과산화물을 가수분해하는 PON-1의 능력과 연관되는 것으로 제안하였다. PON-1 활성을 보존 또는 증진시키는 개입은 아테롬성동맥경화증 및 관상동맥성 심장 질환의 발병을 지연하는 것을 도울 수 있다.

HDL은 추가로 항혈전제 및 피브리노겐 감소제로서 및 출혈성 쇼크에서 약제로서 역할을 한다 (Cockerill et al., WO 01/13939 (2001년 3월 1일 공개)). HDL 및 ApoA-I은 특히 패혈증에 의해 생산된 지질다당체의 ApoA-I을 포함하는 지질 입자로의 교환을 촉진하여, 지질다당체의 기능적 중화를 일으키는 것으로 보였다 (Wright et al., WO9534289 (1995년 12월 21일 공개); Wright et al., 미국 특허 번호 5,928,624 (1999년 7월 27일 허여); Wright et al., 미국 특허 번호 5,932,536 (1999년 8월 3일 허여).

시험관 내에서 단백질 복합체를 제조하기 위한 다양한 방법이 이용가능하다. 미국 특허 번호 6,287,590 및 6,455,088에서는 유기 용매 (또는 용매 혼합물) 내에서 아포지단백질 및 지질 용액의 동시-동결건조 및 동결건조된 분말의 수화 동안 하전된 지단백질 복합체의 형성을 수반하는 방법을 개시하고 있다. 지단백질 복합체는 또한 세제 투석 방법에 의해 형성될 수 있고; 예를 들어, 지질, 지단백질 및 세제, 예컨대 담즙산염의 혼합물을 투석하고 재구성하여 복합체를 형성한다 (예를 들어, 문헌 [Jonas et al., 1986, Methods Enzymol. 128:553-82] 참조). 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0067873의 실시예 1에서는 담즙산염 분산 방법을 개시하고 있고, 여기서 지질 분산액을 미셀 (micelle)을 형성하기 위한 조건 하에 담즙산염과 합하고, 이들을 다시 아포지단백질 용액과 인큐베이팅하여 복합체를 형성한다. 궁극적으로, 독성인 담즙산염은 예를 들어, 투석, 한외여과 또는 친화도 비드 또는 수지 상으로 흡착 흡수에 의해 제거되어야 한다. 미국 특허 번호 6,306,433에서는 단백질 및 지질의 유체 혼합물을 고압 균질화함에 의한 지단백질 복합체 형성을 개시하고 있다. 그러나, 높은 전단에 대해 민감한 단백질은 고압 균질화에 노출될 때 활성을 잃을 수 있다.

따라서, 현재 이용가능한 제조 방법은 출발 물질의 낭비, 예컨대 단백질 분해를 일으키고/일으키거나 생성되는 생성물의 정제, 예컨대 독성 물질의 제거를 필요로 하고, 따라서 비효율적이고 비용이 많이 든다. 추가로, 지단백질 복합체의 제제는 크기 및 조성이 다양한 복합체들의 혼합물을 함유하여, 불균일할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,876,968 참조). 따라서, 효율적이면서 바람직하게는 높은 정도의 순도를 갖는 보다 균질한 복합체를 생성시키는, 지단백질 복합체 생산을 위한 새로운 방법을 개발할 필요가 있다. 그러한 방법은 오염물질로 인한 부작용의 위험이 더 적은 보다 균일한 제약상 허용되는 생성물을 생성하면서 대규모의 보다 경제적인 생산을 허용할 수 있다.

그러나, 추가로, ApoA-I, ApoA-I_M, ApoA-I_P 및 다른 변이체 뿐만 아니라 재구성된 HDL의 치료 용도는 낮은 전체 생산 수율 및 재조합 방식으로 발현된 단백질의 배양액 내에서 단백질 분해 발생을 고려할 때, 치료적 투여를 위해 요구되는 대량의 아포지단백질, 단백질 생산 비용 때문에 현재 제한된다 (예를 들어, 문헌 [Mallory et al., 1987, J. Biol. Chem. 262(9):4241-4247]; [Schmidt et al., 1997, Protein Expression & Purification 10:226-236] 참조). 초기 임상 시험에서는 용량 범위가 심혈관 질환의 치료를 위해 주입 당 1.5-4 g의 단백질인 것이 제안되었다. 충분한 치료를 위해 요구되는 주입의 수는 알려져 있지 않다 (예를 들어, 문헌 [Eriksson et al., 1999, Circulation 100(6):594-98]; [Carlson, 1995, Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. 5:85-91]; [Nanjee et al., 2000, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20(9):2148-55]; [Nanjee et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19(4):979-89]; [Nanjee et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16(9):1203-14] 참조).

재조합 인간 ApoA-I은 이종성 숙주 내에서 발현되었지만, 성숙한 단백질의 수율은 특히 수율을 더욱 감소시키고 불순한 생성물을 생성시키는 정제 방법과 결합될 때 대규모 치료 적용을 위해 불충분하였다.

문헌 [Weinberg et al., 1988, J. Lipid Research 29:819-824]에서는 역상 고압 액체 크로마토그래피에 의해 인간 혈장으로부터 정제된 아포지단백질 A-I, A-II 및 A-IV 및 그들의 이소형의 분리를 설명하고 있다.

WO 2009/025754에서는 인간 혈장으로부터 알파-1-안티트립신 및 ApoA-I의 단백질 분리 및 정제를 설명하고 있다.

문헌 [Hunter et al., 2009, Biotechnol. Prog. 25(2):446-453]에서는 이. 콜라이 내에서 재조합 방식으로 발현된 ApoA-I 밀라노 변이체의 대규모 정제를 설명하고 있다.

문헌 [Caparon et al., 2009, Biotechnol. And Bioeng. 105(2):239-249]에서는 정제된 아포지단백질 생성물 내의 이들 단백질을 수준을 감소시키기 위해 2가지 숙주 세포 단백질을 삭제하도록 유전자 조작된 이. 콜라이 숙주로부터 ApoA-I 밀라노의 발현 및 정제를 설명하고 있다.

미국 특허 번호 6,090,921에서는 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 ApoA-I 및 ApoE를 함유하는 인간 혈장의 분획으로부터 ApoA-I 또는 아포지단백질 E (ApoE)의 정제를 설명하고 있다.

문헌 [Brewer et al., 1986, Meth. Enzymol. 128:223-246]에서는 크로마토그래피 기술을 이용하는 인간 혈액으로부터 아포지단백질의 단리 및 특성결정을 설명하고 있다.

문헌 [Weisweiler et al., 1987, Clinica Chimica Acta 169:249-254]에서는 신속-단백질 액체 크로마토그래피를 이용하는 인간 HDL로부터 ApoA-I 및 ApoA-II의 단리를 설명하고 있다.

문헌 [deSilva et al., 1990, J. Biol. Chem. 265(24):14292-14297]에서는 면역친화도 크로마토그래피 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 아포지단백질 J의 정제를 설명하고 있다.

지단백질 및 지단백질 복합체는 현재, 지단백질 요법의 실행가능성을 확립하는 상이한 지단백질-기반 물질을 사용하는 임상 연구를 이용하여 임상 사용을 위해 개발되고 있다 (문헌 [Tardif, 2010, Journal of Clinical Lipidology 4:399-404] 참조). 한 연구에서는 자가 탈지질화 HDL을 평가하였다 (문헌 [Waksman et al., 2010, J Am. Coll. Cardiol. 55:2727-2735] 참조). 또 다른 연구에서는 ETC-216 (재조합 ApoA-I_M 및 팔미토일-올레오일-PC (POPC)의 복합체)을 평가하였다 (문헌 [Nissen et al., 2003, JAMA 290:2292-2300] 참조). CSL-111은 대두 포스파티딜콜린 (SBPC)과 복합체화된, 혈장으로부터 정제된 재구성된 인간 ApoA-I이다 (문헌 [Tardif et al., 2007, JAMA 297:1675-1682] 참조). 현재의 탐구 약물은 아테롬성동맥경화 플라크를 감소시키는데 효능을 보였지만, 효과는 2차 효과, 예컨대 트랜스아미나제 증가 또는 ApoA-I 항체 형성을 동반하였다 (문헌 [Nanjee et al., 1999, Arterioscler. Vasc. Throm. Biol. 19:979-89]; [Nissen et al., 2003, JAMA 290:2292-2300]; [Spieker et al., 2002, Circulation 105:1399-1402]; [Nieuwdorp et al., 2004, Diabetologia 51:1081-4]; [Drew et al., 2009, Circulation 119, 2103-11]; [Shaw et al., 2008, Circ. Res. 103:1084-91]; [Tardiff et al., 2007, JAMA 297:1675-1682]; [Waksman, 2008, Circulation 118:S371]; 미국 특허 번호 7,273,849 B2 (Cho) (2007년 9월 25일 허여됨)). 예를 들어, ERASE 임상 시험 (문헌 [Tardiff et al., 2007, JAMA 297:1675-1682] 참조)에서는 2가지 용량의 CSL-111: 즉, 40 mg/kg 및 80 mg/kg의 ApoA-I을 사용하였다. 80 mg/kg 용량군은 간 독성으로 인해 (심각한 트랜스아미나제 상승에 의해 보이는 바와 같이) 중단해야 했다. 심지어 40 mg/kg 용량군에서, 몇몇 환자는 트랜스아미나제 상승을 경험하였다.

따라서, 혈청 콜레스테롤을 저하시키고, HDL 혈청 수준을 증가시키고, 이상지질혈증 및/또는 이상지질혈증과 연관된 질환, 병태 및/또는 장애를 예방 및/또는 치료하는데 보다 효과적인 보다 안전한 약물이 필요하다. 간 독성과 연관되지 않고 바람직하게는 트리글리세리드, LDL-트리글리세리드, 또는 VLDL-트리글리세리드의 증가를 최소로 유도하는 (또는 전혀 유도하지 않는) 지단백질 제제, 및 이들 지단백질 제제를 상업적인 규모로 신뢰가능하게 제조하기 위해 사용할 수 있는 강건한 생산 방법이 당업계에서 필요하다.

4. 개요

본 개시내용은 특히 이상지질혈증 및 이상지질혈증과 연관된 질환, 장애 및/또는 병태의 치료 및/또는 예방에 적합한, 단백질 분획 (예를 들어, 아포지단백질 분획) 및 지질 분획을 포함하는 지단백질 복합체, 및 그의 집단을 제공한다. 보다 큰 순도 및/또는 균질성을 갖고/갖거나 본원에서 설명되는 특정 비의 지질 및 단백질을 포함하는 복합체의 집단이 부작용 위험은 감소하면서 콜레스테롤을 이동시키는 능력은 증가함이 밝혀졌다.

지단백질 복합체는 단백질 분획 (예를 들어, 아포지단백질 분획) 및 지질 분획 (예를 들어, 인지질 분획)을 포함한다. 단백질 분획은 지단백질 복합체에 존재할 때 콜레스테롤을 이동시킬 수 있는 하나 이상의 지질-결합 단백질, 예컨대 아포지단백질, 펩티드, 또는 아포지단백질 펩티드 유사체 또는 모방체 (mimetic)를 포함한다. 상기 아포지단백질 및 아포지단백질 펩티드의 비-제한적인 예는 프리프로아포지단백질, 프리프로ApoA I, 프로ApoA-I, ApoA-I, 프리프로ApoA-II, 프로ApoA-II, ApoA-II, 프리프로ApoA-IV, 프로ApoA-IV, ApoA-IV, ApoA-V, 프리프로ApoE, 프로ApoE, ApoE, 프리프로ApoA-I_M, 프로ApoA-I_M, ApoA-I_M, 프리프로ApoA-I_P, 프로ApoA-I_P, ApoA-I_P, 프리프로ApoA-I_Z, 프로ApoA-I_Z, 및 ApoA-I_Z를 포함한다. 아포지단백질(들)은 단량체, 이량체, 또는 삼량체, 또는 이들의 혼합물의 형태일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 아포지단백질 분획은 본질적으로 ApoA-I으로, 가장 바람직하게는 단일 이소형으로 이루어진다. 지단백질 복합체 내의 ApoA-I은 서열 1의 아미노산 25 내지 267에 대응하는 단백질에 대해 적어도 90% 또는 적어도 95%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 임의로, ApoA-I은 추가로 서열 1의 전장 ApoA-I 아미노산 25에 대응하는 위치 (및 성숙한 단백질의 위치 1)에 아스파르트산을 포함한다. 바람직하게는, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 ApoA-I은 정확하게 프로세싱 (processing)된 성숙 단백질 (즉, 신호 및 프로펩티드 서열이 결여됨)이고, 산화, 탈아미드화 및/또는 말단절단되지 않은 것이다.

본 개시내용은 또한 ApoA-I을 발현하도록 조작된 포유동물 숙주 세포, ApoA-I을 포함하는 세포 배양액, 및 성숙한 생물학상 활성 ApoA-I의 생산 방법을 제공한다. 미성숙 ApoA-I (프로ApoA-I) 및 프로테아제 분해에 의해 생성된 말단절단된 형태의 ApoA-I 둘 모두가 실질적으로 존재하지 않는 대량의 성숙 ApoA-I을 발현하도록 포유동물 숙주 세포를 조작하는 것이 가능함이 밝혀졌다. 이들 결과는 놀라운 것이다. 먼저, 단백질 프로세싱을 위한 숙주 세포 기구 (machinery)는 비프로세싱된 미성숙 단백질의 생산을 유도하는, 이종성 단백질, 예컨대 ApoA-I의 과다발현에 의해 압도될 것으로 예상될 수 있다. 두 번째로, 배양 배지 내로 분비된 ApoA-I은 프로테아제에 의한 분해를 겪지만, 단지 낮은 수준의 말단절단된 ApoA-I만이 배양 배지에서 관찰된다. 포유동물 숙주 세포, 세포 배양액 및 ApoA-I의 생산 방법은 특히 치료 용도에 유용한 성숙 단백질을 상업적인 양으로 생산하는데 적합하다.

본원에서 제시되는 바와 같이, 포유동물 숙주 세포는 바람직하게는 서열 1의 위치 25 내지 267에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (또는 이로 이루어지는) 단백질을 발현하도록 조작된다. 단백질은 바람직하게는 서열 1의 위치 25에 대응하는 위치에 아스파르트산 잔기를 갖는다. 포유동물 숙주 세포는 임의로 상기 단백질을 추가로 분비할 수 있다. 몇몇 경우에, 포유동물 숙주 세포에 의해 발현 및/또는 분비된 단백질은 18-아미노산 신호 서열 (MKAAVLTLAVLFLTGSQA, 서열 2) 및/또는 6-아미노산 프로펩티드 서열 (RHFWQQ, 서열 3)을 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 숙주 세포는 서열 1에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 발현하도록 조작된다.

숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (예를 들어, CHO-K1 또는 CHO-S), VERO, BHK, BHK 570, HeLa, COS-1, COS-7, MDCK, 293, 3T3, PC12 및 W138을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 포유동물 세포주, 또는 골수종 세포 또는 세포주 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포 또는 세포주)로부터 유래될 수 있다.

포유동물 숙주 세포는 ApoA-I 단백질, 예를 들어 서열 1의 위치 25 내지 267을 포함하거나 이로 이루어지는 단백질을 코딩하는 다중 카피의 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 포유동물 숙주 세포는 적어도 약 5, 6, 7, 8개, 또는 그 초과의 카피, 및 약 10, 11, 12, 13, 또는 14개 카피까지의 핵산을 포함할 수 있다. 핵산은 추가로 포유동물 숙주 세포에서 단백질을 높은 수준으로 발현할 수 있는 프로모터, 예컨대, 예를 들어, 원숭이 사이토메갈로바이러스 프로모터 또는 보다 구체적으로는, 최조기 (immediate early) 원숭이 사이토메갈로바이러스 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.

포유동물 숙주 세포는 바람직하게는 배양액에서 적어도 약 0.5, 1, 2, 또는 3 g/L ApoA-I 및/또는 배양액에서 약 20 g/L 이하의 ApoA-I, 예를 들어, 배양액에서 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 또는 15 g/L 이하의 ApoA-I을 생산할 수 있다. 배양액은 약 150 mL 내지 약 500 L, 1000 L, 2000 L, 5000 L, 10,000 L, 25,000 L, 또는 50,000 L 또는 그 초과의 임의의 규모일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 배양 부피는 10 L 내지 50 L, 50 L 내지 100 L, 100 L 내지 150 L, 150 L 내지 200 L, 200 L 내지 300 L, 300 L 내지 500 L, 500 L 내지 1000 L, 1000 L 내지 1500 L, 1500 L 내지 2000 L, 2000 L 내지 3000 L, 3000 L 내지 5000 L, 5000 L 내지 7500 L, 7500 L 내지 10,000 L, 10,000 L 내지 20,000 L, 20,000 L 내지 40,000 L, 30,000 L 내지 50,000 L일 수 있다. 몇몇 경우에, 배양은 대규모 배양, 예컨대 15 L, 20 L, 25 L, 30 L, 50 L, 100 L, 200 L, 300 L, 500 L, 1000 L, 5000 L, 10,000 L, 15,000 L, 20,000 L, 25,000 L, 50,000 L 이하 또는 그 초과일 수 있다.

본 개시내용의 포유동물 숙주 세포는 배양액에서 성장할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 추가로 상기에서 또는 하기 섹션 6.1.2에서 설명되는 다수의 포유동물 숙주 세포를 포함하는 포유동물 세포 배양액을 제공한다. 세포 배양액은 다음 특징 중의 하나 이상을 포함할 수 있다: (a) 배양액 (임의로 적어도 10 리터, 적어도 20 리터, 적어도 30 리터, 적어도 50 리터, 적어도 100 리터, 300 L, 500 L, 1000 L, 5000 L, 10,000 L, 15,000 L, 20,000 L, 25,000 L, 50,000 L 이하의 대규모 배치식 배양 또는 적어도 10 리터, 적어도 20 리터, 적어도 30 리터, 적어도 50 리터, 적어도 100 리터, 300 L, 500 L, 1000 L, 5000 L, 또는 10,000 L 이하의 연속식 배양임)은 서열 1의 아미노산 25 내지 267에 대응하는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 적어도 약 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0 g/L 또는 그 초과의 성숙 ApoA-I 단백질을 포함한다; (b) 배양 배지 내의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 단백질은 신호 서열이 결여된 ApoA-I 단백질이다; (c) 배양 배지 내의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 단백질은 신호 서열 및 프로펩티드 서열이 결여된 성숙 ApoA-I 단백질이다; 및 (d) 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%의 성숙 ApoA-I은 말단절단, 산화, 또는 탈아미드화되지 않은 것이다.

본 개시내용은 또한 성숙한 생물학상 활성 ApoA-I의 생산 방법을 제공한다. 일반적으로, 이 방법은 상기에서 또는 하기 섹션 6.1.2에서 설명되는 임의의 포유동물 숙주 세포를 ApoA-I이 발현 및 분비되는 조건 하에 배양하는 것을 포함한다. 이 방법은 배양된 포유동물 숙주 세포의 상청액으로부터 성숙한 생물학상 활성 ApoA-I을 회수하고, 임의로 이를 정제하는 단계 (예컨대 하기 섹션 6.1.3 및 6.1.4에 개시된 방법에 의해)를 추가로 포함한다.

상기 방법에 의해 얻거나 얻을 수 있는 ApoA-I은 추가로 지질과 복합체화되어 본원에서 설명되는 지단백질 복합체를 형성하고/하거나 제약 조성물에 치료 유효량으로 혼입될 수 있다. 제약 조성물은 바람직하게는 또한 부형제로서 수크로스 및/또는 만니톨을 함유하는 인산염 완충 용액이다.

크로마토그래피 및 여과 단계의 새로운 조합을 사용하여 ApoA-I을 정제함으로써, 단백질을 치료 용도에 특히 적합하게 만드는, 부작용 위험 감소 및 낮거나 또는 전혀 없는 독성을 포함하는 하나 이상의 특징을 부여하기에 충분히 낮은 수준의 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 DNA, 내독소 및 말단절단된 형태의 단백질을 함유하는 대량의 순수한 ApoA-I이 생산될 수 있음이 추가로 밝혀졌다. 바람직하게는, 본원에서 설명되는 방법에 의해 정제된 ApoA-I은 포유동물 세포에서 재조합 방식으로 생산되고, 성장 배지 내로 분비된다. 따라서, 본 개시내용은 (a) ApoA-I 함유 용액을 음이온 교환 매트릭스와, ApoA-I이 매트릭스에 결합하지 않도록 하는 조건 하에 접촉시키고; (b) 단계 (a)에서 얻은 ApoA-I 함유 용액을 바이러스 또는 바이러스 입자를 제거하기 위해 충분한 세공 크기를 갖는 막을 통해 여과하고; (c) 단계 (b)에서 얻은 여액을 ApoA-I이 매트릭스에 결합하도록 하는 조건 하에 제1 역상 크로마토그래피 컬럼에 통과시키고; (d) 증가하는 농도의 유기 용매의 구배를 사용하여 제1 ApoA-I 함유 역상 용리액을 제1 역상 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리하고; (e) 단계 (d)의 제1 ApoA-I 역상 용리액을 ApoA-I이 매트릭스에 결합하도록 하는 조건 하에 제2 역상 크로마토그래피 컬럼에 통과시키고; (f) 증가하는 농도의 유기 용매의 구배를 사용하여 제2 ApoA-I 함유 역상 용리액을 제2 역상 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리하는 단계를 포함하는 ApoA-I의 정제 방법에 관한 것이다. 단계를 수행하는 순서는 중요하지 않고, 예를 들어, 예시적인 실시양태에서 바이러스 또는 바이러스 입자를 제거하기 위한 막을 통한 여과 단계는 단계 (a) 다음보다는 상기 단계 (f) 이후에 수행된다.

ApoA-I의 농도가 적어도 10 g/L인, 본원에서 설명되는 정제 방법에 의해 얻거나 얻을 수 있는 실질적으로 순수한 ApoA-I 생성물이 본원에서 제공된다. 본원에서 설명되는 정제 방법에 의해 생산된 실질적으로 순수한 ApoA-I 생성물은 바람직하게는 ApoA-I 1 mg당 약 10 pg 미만의 숙주 세포 DNA, ApoA-I 1 mg당 약 100 ng 미만의 숙주 세포 단백질, 및/또는 ApoA-I 1 mg당 0.1 EU 미만의 내독소를 포함한다. ApoA-I 생성물은 적어도 95% 순수, 적어도 96% 순수, 적어도 97% 순수, 적어도 98% 순수 또는 적어도 99% 순수할 수 있다.

또한, 실질적으로 순수한 ApoA-I 생성물은 임의의 본원에서 설명되는 제약 조성물 및/또는 ApoA-I을 포함하는 지단백질 복합체에 혼입될 수 있다.

지질 분획은 일반적으로 중성, 음하전된 된, 양하전된 것, 또는 이들의 조합물일 수 있는 하나 이상의 인지질을 포함한다. 인지질 상의 지방산 사슬은 바람직하게는 12 내지 26개 또는 16 내지 26개 탄소의 길이이고, 포화로부터 일-불포화까지 포화도가 상이할 수 있다. 예시적인 인지질은 작은 알킬 사슬 인지질, 에그 (egg) 포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린, 1-스테아로일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린 디올레오포스파티딜에탄올아민, 디라우로일포스파티딜글리세롤 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 디포스파티딜글리세롤, 예컨대 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디올레오일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티드산, 디팔미토일포스파티드산, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린, 뇌 포스파티딜세린, 뇌 스핑고미엘린, 에그 스핑고미엘린, 우유 스핑고미엘린, 팔미토일 스핑고미엘린, 피토스핑고미엘린, 디팔미토일스핑고미엘린, 디스테아로일스핑고미엘린, 디팔미토일포스파티딜글리세롤 염, 포스파티드산, 갈락토세레브로시드, 강글리오시드, 세레브로시드, 디라우릴포스파티딜콜린, (1,3)-D-만노실-(1,3)디글리세리드, 아미노페닐글리코시드, 3-콜레스테릴-6'-(글리코실티오)헥실 에테르 당지질, 및 콜레스테롤 및 그의 유도체를 포함한다. SM 및 팔미토일스핑고미엘린을 포함하는 인지질 분획은 리소인지질, 팔미토일스핑고미엘린 이외의 다른 스핑고미엘린, 갈락토세레브로시드, 강글리오시드, 세레브로시드, 글리세리드, 트리글리세리드, 및 콜레스테롤 및 그의 유도체를 포함하고 이로 제한되지 않는 소량의 임의의 종류의 지질을 임의로 포함할 수 있다.

가장 바람직하게는, 지질 분획은 적어도 하나의 중성 인지질, 및 임의로 하나 이상의 음하전된 인지질을 함유한다. 중성 및 음하전된 인지질 둘 모두를 포함하는 지단백질 복합체에서, 중성 및 음하전된 인지질은 동일한 또는 상이한 수의 탄소 및 동일한 또는 상이한 포화도를 갖는 지방산 사슬을 가질 수 있다. 몇몇 경우에, 중성 및 음하전된 인지질은 동일한 아실 테일 (tail), 예를 들어 C16:0, 또는 팔미토일, 아실 사슬을 가질 것이다.

복합체의 지질 성분이 중성 및 음하전된 인지질을 포함하거나 이로 이루어질 때, 중성 대 음하전된 인지질(들)의 중량 대 중량 (wt:wt) 비는 바람직하게는 약 99:1 내지 약 90:10, 보다 바람직하게는 약 99:1 내지 약 95:5, 가장 바람직하게는 약 98:2 내지 약 96:4의 wt:wt 비이다. 한 실시양태에서, 중성 인지질(들) 및 음하전된 인지질(들)은 약 97:3의 중성 인지질(들) 대 음하전된 인지질(들)의 중량 대 중량 (wt:wt) 비로 존재한다.

중성 인지질은 천연 또는 합성일 수 있다. 바람직하게는, 인지질은 임의로 사슬 길이가 16 내지 26개의 탄소 원자인 포화 또는 일-불포화 지방산을 갖는 스핑고미엘린 ("SM"), 예컨대 팔미토일 스핑고미엘린, 피토스핑고미엘린, 디피토스핑고미엘린, 포스포스핑고지질, 또는 글리코스핑고지질이다. SM은 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, SM은 우유, 에그, 뇌로부터 얻거나, 또는 합성에 의해 제조할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, SM은 에그 ("에그 SM")로부터 얻는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, SM은 팔미토일스핑고미엘린이다.

생리학적 pH에서 적어도 부분적인 음전하를 갖는 임의의 인지질은 음하전된 인지질로서 사용될 수 있다. 비-제한적인 예는 음하전된 형태, 예를 들어, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤 및 포스파티드산의 염을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 음하전된 인지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)], 또는 DPPG, 포스파티딜글리세롤이다. 바람직한 염은 칼륨 및 나트륨염을 포함한다.

본 개시내용의 복합체를 제조하기 위해 사용된 인지질은 바람직하게는 적어도 95% 순수하고, 보다 바람직하게는 적어도 99% 순수하고/하거나 4 meq O/kg 미만, 보다 바람직하게는 3 meq O/kg 미만 (예를 들어, 2 meq O/kg 미만)의 산화 수준을 갖는다. 산소 및 지방산의 주요 초기 반응 생성물은 히드로과산화물이다. 아이오딘 적정 방법을 사용하여, 샘플 내의 과산화물의 존재를 검정함으로써 산화 수준을 측정할 수 있다.

본 개시내용의 지단백질 복합체는 바람직하게는 아래 실시예에서 제시되는 바와 같이 보다 완전하고 균질한 복합체 형성을 유도하는 아포지단백질 대 지질의 비를 갖는다. 지단백질 복합체는 1:80 내지 1:120, 1:100 내지 1:115, 또는 1:105 내지 1:110의 아포지단백질 분획:지질 분획 몰비를 특징으로 하고, 여기서 아포지단백질은 ApoA-I 동등물로 표현된다. 구체적인 실시양태에서, 아포지단백질 분획:지질 분획의 몰비는 1:80 내지 1:90 (예를 들어, 1:82, 1:85 또는 1:87), 1:90 내지 1:100 (예를 들어, 1:95 또는 1:98), 1:100 내지 1:110 (예를 들어, 1:105 또는 1:108)이다.

구체적인 실시양태, 특히 에그 SM이 중성 지질로서 사용되는 실시양태에서, 아포지단백질 분획:지질 분획의 중량비는 약 1:2.7 내지 약 1:3 (예를 들어, 1:2.7)이다

본 개시내용의 지단백질 복합체는 또한 소수성, 지질친화성 또는 무극성 활성제를 전달하기 위한 담체로서 사용될 수 있다. 상기 용도를 위해, 지질 분획은 지방산, 약물, 핵산, 비타민, 및/또는 영양분을 포함하고 이로 제한되지 않는 하나 이상의 소수성, 지질친화성 또는 무극성 활성제를 추가로 포함할 수 있거나, 또는 지단백질 복합체는 이들 활성제로 로딩될 수 있다. 활성제의 구체적인 예는 섹션 6.2에서 설명된다.

본 개시내용은 또한 지단백질 복합체의 집단을 제공한다.

일반적으로:

- 집단은 각각 단백질 분획 및 지질 분획을 포함하는 다수의 지단백질 복합체를 포함한다;

- 단백질 분획은 상기 설명되고 및 섹션 6.1 또는 섹션 6.5.3에서 설명되는 지단백질 또는 지단백질 유사체를 포함하고; 가장 바람직하게는 단백질 분획은 섹션 6.1.2에서 설명되는 방법에 의해 얻거나 얻을 수 있고/또는 섹션 6.1.4에서 설명되는 방법에 의해 정제된 지단백질 (예를 들어, ApoA-I 단백질)을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지고;

- 지질 분획은 상기 설명되고 섹션 6.2 또는 섹션 6.5.2에서 설명되는 지질을 포함하고;

- 지단백질 복합체는 바람직하게는 섹션 6.5.4에서 설명되는 열 사이클링 (thermal cycling) 방법에 의해 생산된다.

본 발명자들은 지단백질 복합체 집단의 효능 및 안전성 프로파일에 개별적으로 또는 조합하여 기여하는 것으로 생각되는 몇몇의 특징을 밝혀내었다. 이들 특징을 다음을 포함한다:

- 대부분 4 nm 내지 15 nm (예를 들어, 5 nm 내지 12 nm, 6 nm 내지 15 nm, 또는 8 nm 내지 10 nm)인 집단 내의 복합체의 크기의 균질성;

- 복합체 제조에 사용되는 아포지단백질의 순도 (예를 들어, 산화, 탈아미드화, 말단절단된, 및/또는 미성숙 형태의 아포지단백질의 결여 및/또는 내독소의 결여, 및/또는 아포지단백질(들) 이외의 다른 단백질 (예컨대 숙주 세포 단백질), 및/또는 재조합 생산시에 종종 존재하는 숙주 세포 DNA의 결여);

- 집단 내의 복합체 자체의 순도 (복합체 제조에 사용되는 오염물질, 예컨대 용매 또는 세제의 결여; 산화된 지질의 결여; 탈아미드화, 산화 또는 말단절단된 단백질의 결여; 및/또는 비복합체화된 아포지단백질 및/또는 지질의 감소된 양 또는 결여를 특징으로 함).

이들 특징 중에서, 복합체의 균질성 및 복합체 내의 성숙한, 비변형된 아포지단백질의 우세함이 효능을 증가시키는 것으로 생각된다. 아포지단백질, 지질, 및 복합체의 순도는 부작용의 위헌, 예컨대 간 효소 (예를 들어, 트랜스아미나제)의 증가에 의해 반영되는 간 손상을 감소시킨다. 추가로, 본 발명자들은 대부분의 아포지단백질을 복합체 내로 혼입시키는 방법에 의해 지단백질 복합체의 집단의 제조를 실행가능하도록 만들었고, 비복합체화된 아포지단백질의 양의 감소는 또한 이종성 단백질의 투여에 의해 야기될 수 있는 대상체 내의 면역원 반응의 위험을 감소시키기 때문에 유익하다.

따라서, 본 개시내용은 다음 특징 중의 하나 이상, 또는 심지어 전부를 특징으로 하는 지단백질 복합체의 집단을 제공한다:

(a) 상기 집단 내의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% (중량 기준)의 지단백질, 일반적으로 ApoA-I은 성숙한 형태이고;

(b) 상기 집단 내의 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하 (중량 기준)의 지단백질, 일반적으로 ApoA-I은 미성숙한 형태이고;

(c) 집단은 지단백질, 일반적으로 ApoA-I 1 mg당 100 pg 이하, 50 pg 이하, 25 pg 이하, 10 pg 이하 또는 5 pg 이하의 숙주 세포 DNA를 포함하고;

(d) 집단은 지단백질, 일반적으로 ApoA-I 1 mg당 500 ng 이하, 200 ng 이하, 100 ng 이하, 50 ng 이하, 또는 20 ng 이하의 숙주 세포 단백질을 포함하고;

(e) 집단 내의 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하 (중량 기준)의 지단백질, 일반적으로 ApoA-I은 말단절단된 형태이고;

(f) 지단백질 성분은 성숙 ApoA-I을 포함하거나 이로 이루어지고, 상기 집단 내의 상기 ApoA-I 중 각각의 메티오닌 112 및 메티오닌 148의 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 3% 이하, 2% 이하 또는 1% 이하가 산화되고;

(g) 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 지단백질 복합체는 겔 투과 크로마토그래피 ("GPC") 또는 동적 광 산란 ("DLS")에 의해 측정하였을 때 크기가 4 nm 내지 15 nm, 예를 들어, 6 nm 내지 15 nm, 또는 8 내지 12 nm, 보다 바람직하게는 5 nm 내지 12 nm인 입자 형태로 존재하고;

(i) 집단은 지단백질, 일반적으로 ApoA-I 1 mg당 1 EU 이하, 0.5 EU 이하, 0.3 EU 이하 또는 0.1 EU 이하의 내독소를 포함하고;

(j) 상기 집단 내의 지단백질, 일반적으로 ApoA-I 내의 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하 또는 1% 이하의 아미노산은 탈아미드화되고;

(k) 상기 복합체 내의 지질 분획 중 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 2% 이하 또는 0% (중량 기준)의 지질은 콜레스테롤이고;

(l) 집단은 200 ppm, 100 ppm, 50 ppm 이하의 비수성 용매를 포함하고;

(m) 집단은 임의의 세제 (예를 들어, 담즙산염)를 포함하지 않고;

(n) 집단은 겔 투과 크로마토그래피에서 단일 피크 내의 집단의 비율에 의해 측정하였을 때 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 균질할 수 있고;

(o) 집단은 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 97%의 단백질이 복합체화된 형태인 조성물에 존재하고;

(p) 상기 집단 내의 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하 또는 1% 이하의 지질은 산화되고;

(q) 상기 집단 내의 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하 또는 1% 이하의 메티오닌 및/또는 트립토판 잔기는 산화된다.

구체적인 실시양태에서, 집단은 다음 군 중에서 선택된 특징을 갖는다:

군 I: 상기 특징 (a), (b) 및 (e);

군 II: 상기 특징 (c), (d) 및 (i);

군 III: 상기 특징 (f), (j), (e), (p) 및 (q);

군 IV: 상기 특징 (g), (n) 및 (o);

군 V: 상기 특징 (l) 및 (m); 및

군 VI: 상기 특징 (k).

특정 측면에서, 집단은 각각의 군 I 및 군 IV로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 특징을 특징으로 하고; 임의로, 집단은 각각의 군 I 및 군 IV로부터 독립적으로 선택된 3개의 특징을 특징으로 한다. 집단은 추가로 각각의 군 II 및/또는 군 III으로부터 독립적으로 선택된 1, 2 또는 3개의 특징을 특징으로 할 수 있다. 집단은 추가로 군 V로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 특징 및/또는 군 VI으로부터 독립적으로 선택된 1개의 특징을 특징으로 할 수 있다.

특정 지질 및 단백질 성분은 다수의 상이하지만 균질한 지단백질 복합체를 형성할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 또한 상이한 양의 아포지단백질 분자 (예를 들어, 2, 3 또는 4개의 ApoA-I 분자 또는 ApoA-I 동등물)를 포함하는 지단백질 복합체의 2, 3 또는 4개의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 예시적인 실시양태에서, 조성물은 2개의 지단백질 복합체 집단을 포함하고, 여기서 제1 집단은 지단백질 복합체당 2개의 ApoA-I 분자 또는 ApoA-I 동등물을 갖는 지단백질 복합체를 포함하고, 제2 집단은 지단백질 복합체당 3 또는 4개의 ApoA-I 분자 또는 ApoA-I 동등물을 갖는 지단백질 복합체를 포함하고, 임의로 제3 집단은 각각 지단백질 복합체당 4 또는 3개의 ApoA-I 분자 또는 ApoA-I 동등물을 갖는 지단백질 복합체를 포함한다.

지단백질 복합체의 2개 이상의 집단을 포함하는 조성물은 바람직하게는 낮은 수준의 비복합체화된 지단백질 및/또는 지질을 갖는다. 따라서, 바람직하게는 조성물 내의 15% 이하, 12% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 지질은 비복합체화된 형태이고/이거나 조성물 내의 15% 이하, 12% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 지단백질은 비복합체화된 형태이다.

본 개시내용은 지단백질 복합체를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 특히 비복합체화된 지질 및 지질-결합 단백질 또는 펩티드를 함유하는 현탁액을 열 사이클링 조건에 적용하면 지단백질 복합체가 성분들을 고정된 온도에서 인큐베이팅함으로써 생산되는 다른 방법에 비해 유리한 결과를 갖는 지단백질 복합체가 형성된다는 발견을 기초로 한 것이다.

본 개시내용은 섹션 6.5.1 내지 6.5.4에서 설명되는 것과 같은, 지단백질 복합체의 제조를 위한 열 사이클링 방법을 제공한다. 이 방법은 일반적으로 지질 입자 ("지질 성분") 및 지질-결합 단백질 또는 펩티드 ("단백질 성분")를 포함하는 현탁액을 대부분의 단백질 성분이 지단백질 복합체 내로 혼입될 때까지 다수의 열 사이클에 적용하는 것을 포함한다. 이 방법은 일반적으로 지단백질 복합체가 형성될 때까지 보다 높은 제1 온도 범위의 온도와 보다 낮은 제2 온도 범위의 온도 사이에서 현탁액을 사이클링하는 것을 수반한다. 열 사이클링 공정의 고온 및 저온 범위는 지단백질 복합체의 지질 및 단백질 성분의 상 전이 온도를 기초로 한다. 별법으로, 불포화 지방산 사슬을 갖는 인지질 또는 인지질의 혼합물을 사용할 때 발생할 수 있는 규정된 또는 별개의 상 전이를 지질 성분이 보이지 않는 경우에, 열 사이클링의 고온 및 저온 범위는 적어도 약 20℃, 약 40℃ 이하 또는 심지어 그보다 더 높은 온도만큼 상이하다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 저온 및 고온 범위는 20℃-30℃, 20℃-40℃, 20℃-50℃, 30℃-40℃, 30℃-50℃, 25℃-45℃, 35℃-55℃만큼 상이하다.

지질에 대해, 상 전이는 겔 상태로 알려진, 긴밀하게 충전되고 규칙적인 구조로부터 유체 상태로 알려진, 느슨하게 충전되고 덜-규칙적인 구조로의 변화를 수반한다. 지단백질 복합체는 일반적으로 지질 입자 및 아포지단백질을 사용되는 특정 지질 또는 지질의 혼합물의 전이 온도 근처의 온도에서 인큐베이팅함으로써 당업계에서 형성된다. 지질 성분의 상 전이 온도 (열량 측정에 의해 결정될 수 있음) +/-12℃, 보다 바람직하게는 +/- 10℃는 본 개시내용의 방법에서 "낮은" 온도 범위를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 저온 범위는 지질 성분의 상 전이 온도의 +/-3℃, +/-5℃, 또는 +/-8℃이다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 저온 범위는 지질 성분의 상 전이 온도보다 5℃ 이상 또는 10℃ 이상 더 낮은 온도 내지 5℃ 더 높은 온도까지이다.

단백질에 대해, 상 전이 온도는 3차 구조로부터 2차 구조로의 변화를 수반한다. 단백질 성분의 상 전이 온도 +/-12℃, 보다 바람직하게는 +/-10℃는 본 개시내용의 방법에서 "높은" 온도 범위를 나타낸다. 구체적인 실시양태에서, 고온 범위는 단백질 성분의 상 전이 온도의 +/-3℃, +/-5℃, 또는 +/-8℃이다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 저온 범위는 단백질 성분의 상 전이 온도보다 10℃ 미만 내지 상 전이 온도보다 5℃ 이하, 10℃ 이하, 또는 15℃ 이하로 더 높은 온도이다.

출발 현탁액, 즉, 열 사이클링에 아직 적용되지 않은 현탁액의 지질 성분은 바람직하게는 지질 입자를 포함하고, 예를 들어 지질-결합 단백질에 복합체화되지 않은 지질로 우세하게 이루어진다. 지질 성분의 조성은 일반적으로 아래 섹션 6.5.2에 설명된 바와 같다.

출발 현탁액의 단백질 성분은 바람직하게는 지질에 비복합체화되거나, 또는 요구되는 복합체 내의 단백질/펩티드 대 지질 비보다 적어도 5배 더 큰 (예를 들어, 적어도 5배, 적어도 10배 또는 적어도 20배 더 큰) 단백질/펩티드 대 지질 비로 지질과 조합되는 지질-결합 펩티드 및/또는 단백질을 포함한다. 단백질 성분의 조성은 일반적으로 아래 섹션 6.1 및 섹션 6.5.3에 설명된 바와 같다. 단백질 성분은 바람직하게는 섹션 6.1.2에 설명된 방법에 따라 제조되고/되거나 섹션 6.1.3 또는 6.1.4에 설명된 방법에 따라 정제된다.

본 개시내용의 방법에서, 단백질 성분 및 지질 성분을 함유하는 현탁액은 일반적으로 고온 범위와 저온 범위 사이에서, 바람직하게는 고온 범위의 온도에서 출발하여 지단백질 복합체가 형성될 때까지 열 사이클링된다. 적합한 양의 지질 및 단백질 성분 (예를 들어, 그 내용 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 공개 번호 2006-0217312 A1에 설명된 바와 같이)을 사용하여, 지질 및 단백질 성분의 실질적으로 완전한 복합체화는 몇몇 사이클 후에 달성될 수 있다. 열 사이클링 방법에 적합한 단백질 및 지질 화학양론에 대한 추가의 상세한 설명은 섹션 6.5.4에서 설명된다.

상기 방법에 의해 생산된 복합체는 일반적으로 단백질 성분이 특정 화학양론적 범위에서 균질한 크기 분포로 지질 성분에 물리적으로 결합된 미셀, 소포, 구형 또는 원반상 입자로서 형성된 초거대분자 회합체이다. 본 방법은 출발 현탁액 내의 지질 및/또는 단백질의 실질적으로 완전한 복합체화를 유리하게 유도하여, 크로마토그래피와 같은 분리 방법에서 관찰되는 바와 같이 유리 지질 및/또는 유리 단백질이 실질적으로 없는 조성물을 생성한다. 따라서, 본 개시내용의 방법은 정제 단계의 부재 하에 수행할 수 있다.

출발 현탁액 내의 지질 성분은 일반적으로 입자 형태로 존재한다. 입자는 우세하게 적어도 45 nm, 적어도 50 nm, 적어도 55 nm 또는 적어도 60 nm의 크기 내지 65 nm 이하, 70 nm 이하, 75 nm 이하, 80 nm 이하, 100 nm 이하, 120 nm 이하, 150 nm 이하, 200 nm 이하, 250 nm 이하, 300 nm 이하, 500 nm 이하, 예를 들어, 45 nm 내지 100 nm 또는 45 내지 250 nm 크기 범위, 보다 바람직하게는 50 nm 내지 90 nm 크기 범위, 및 가장 바람직하게는 55 nm 내지 75 nm 크기 범위인 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 지질 입자는 에그-스핑고미엘린으로 우세하게 이루어지고, 55 내지 75 nm의 크기이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 지질 입자는 우세하게 하나 이상의 합성 스핑고미엘린 (예를 들어, 팔미토일스핑고미엘린 또는 피토스핑고미엘린)으로 이루어지고, 175 nm 내지 250 nm의 크기이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 지질 입자는 우세하게 하나 이상의 합성 지질 (예를 들어, 팔미토일 스핑고미엘린 또는 피토스핑고미엘린)로 이루어지고, 250 nm 내지 1000 nm의 크기이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 지질 입자는 우세하게 하나 이상의 합성 지질 (예를 들어, 팔미토일 스핑고미엘린 또는 피토스핑고미엘린)로 이루어지고, 1000 nm 내지 4000 nm의 크기이다. 본원에서 언급되는 크기는 동적 광 산란에 의해 결정되는 제타 (Z) 평균 크기이다. 고압 균질화, 예를 들어 미세유동화는 적합한 크기의 지질 입자를 유리하게 생산한다. 다른 입자 형성 방법은 하기 섹션 6.5.2에서 개시되고, 균질화에 대한 대안으로서 사용될 수 있다. 상기 방법이 바람직한 크기 범위 외의 입자를 생성할 경우, 입자는 적합한 크기의 입자를 얻기 위해 크기 여과에 적용될 수 있다.

본원에서 설명되는 지단백질 복합체를 제조하는 방법은 그 크기 분포가 균질하여 크기 분획화가 필요없는 복합체를 유리하게 생산한다. 또한, 본 개시내용의 방법은 출발 단백질의 지단백질 입자 내로의 실질적으로 완전한 혼입 (예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%)을 달성한다. 따라서, 본 개시내용은 지단백질 복합체를 포함하고 예를 들어 겔 투과 크로마토그래피를 사용하여 결정할 때 조성물 내의 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 지질-결합 단백질이 지질에 복합체화된 조성물을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 본 개시내용은 4 nm 내지 20 nm 제타 평균 크기, 예를 들어, 4 nm 내지 20 nm 제타 평균 크기, 4 nm 내지 15 nm 제타 평균 크기, 4 nm 내지 12 nm 제타 평균 크기, 5 nm 내지 15 nm 제타 평균 크기, 5 nm 내지 12 nm 제타 평균 크기, 5 nm 내지 10 nm 제타 평균 크기, 5 nm 내지 20 nm 제타 평균 크기, 6 nm 내지 15 nm 제타 평균 크기, 또는 8 nm 내지 12 nm 제타 평균 크기를 갖고 예를 들어 겔 투과 크로마토그래피를 사용하여 결정할 때 조성물 내의 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 지질-결합 단백질이 지질에 복합체화된 지단백질 복합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본원에서 설명되는 방법에 따라 지질 입자를 지단백질과 함께 열 사이클링에 적용하면 일반적으로 4 nm 내지 15 nm 크기의 지단백질 입자의 집단, 예를 들어 6 nm 내지 15 nm 크기, 5 nm 내지 12 nm 크기, 또는 8 nm 내지 12 nm 크기의 지단백질 입자의 집단이 생성된다. 열 사이클링에 적용되는 지질 입자의 크기는 50 nm 내지 250 nm일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 지질 입자는 우세하게 에그-스핑고미엘린으로 이루어지고, 55 내지 75 nm의 크기이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 지질 입자는 우세하게 하나 이상의 합성 스핑고미엘린 (예를 들어, 피토스핑고미엘린)으로 이루어지고, 175 nm 내지 250 nm 크기이다.

지단백질 복합체의 제조 방법에서 하나 이상의 단계는 불활성 기체 하에 수행될 수 있다. 이것은 아포지단백질 및/또는 지질의 산화를 감소시키거나 억제하여, 부작용, 예컨대 간 손상의 위험을 감소시킬 수 있다. 적합한 불활성 기체는 질소, 헬륨, 및 아르곤을 포함한다.

상기 설명한 방법에 의해 얻거나 얻을 수 있는 지단백질 복합체는 복합체가 형성된 후에 추가의 정제 단계가 불필요하기 때문에 특히 치료 용도에 적합하다.

본 개시내용은 또한 본원에서 설명되는 바와 같은 지단백질 복합체의 집단, 및 지단백질 복합체 또는 그의 집단을 포함하는 제약 조성물을 제공하고, 이것은 임의로 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 제약 조성물은 투여에 적합한 단위 투여량으로 포장된다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 조성물은 밀봉된 바이알에 포장된 단위 투여량의 건조된 (예를 들어 동결건조된) 지단백질 복합체를 포함한다. 상기 조성물은 물, 생리학적 용액 (예컨대 염수) 또는 완충제를 사용한 재구성, 및 주사를 통한 투여에 적합하다. 상기 조성물은 임의로 하전된 복합체의 재구성을 용이하게 하는 하나 이상의 항-케이킹 (caking) 및/또는 항-응집제, 또는 재구성된 현탁액의 pH, 삼투질 농도 및/또는 염도를 조정하도록 설계된 하나 이상의 완충제, 등장화제 (예를 들어, 수크로스 및/또는 만니톨), 당 또는 염 (예를 들어, 염화나트륨)을 포함할 수 있다. 상기한 지단백질 복합체의 집단 및/또는 제약 조성물은 산화를 최소화하여 산화된 생성물에 의해 야기되는 부작용, 예컨대 간 손상의 위험을 감소시키는 조건 하에 제조될 수 있다. 예를 들어, 제약 조성물은 불활성 기체, 예컨대 질소, 헬륨, 또는 아르곤 하에 제조될 수 있다.

상업적인 적용을 위해, 지단백질 복합체 및 제약 조성물의 대규모 제제를 제조하는 것이 유용하다. 따라서, 본 개시내용은 또한 적어도 약 3 mg/mL, 적어도 약 4 mg/mL, 또는 적어도 약 5 mg/mL, 및 약 10 mg/mL, 약 15 mg/mL, 또는 약 20 mg/mL 이하, 바람직하게는 약 8 mg/mL 내지 약 12 mg/mL, 가장 바람직하게는 약 8 mg/mL의 지질-결합 단백질의 농도를 달성하기 위해 충분한 양의 지단백질 복합체를 포함하는 적어도 1 L, 2 L, 5 L 또는 10 L 및 15 L, 20 L, 30 L, 50 L 이하, 또는 그 초과의 제제 (예를 들어, 5 L 내지 30 L, 10 L 내지 15 L, 또는 30 L 내지 50 L의 제제)를 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 제제는 15 L 내지 25 L의 부피를 갖고, 약 100 g 내지 약 250 g의 ApoA-I을 함유한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 제제는 30 L 내지 50 L의 부피를 갖고, 약 240 g 내지 약 780 g의 ApoA-I을 함유한다.

본원에서 설명되는 지단백질 복합체는 동물, 가장 바람직하게는 인간에서 이상지질혈증 장애의 치료에 유용하다. 그러한 병태는 고지질혈증, 및 특히 고콜레스테롤혈증 (이형접합성 및 동형접합성 가족성 고콜레스테롤혈증 포함), 및 심혈관 질환, 예컨대 아테롬성동맥경화증 (아테롬성동맥경화증의 치료 및 예방 포함) 및 아테롬성동맥경화증의 많은 임상 징후, 예컨대, 예를 들어, 뇌졸중, 허혈성 뇌졸중, 일과성 허혈 발작, 심근경색, 급성 관상동맥 증후군, 협심증, 간헐적 파행, 중증 하지 허혈, 판막 협착증, 및 심방 판막 경화증; 재협착증 (예를 들어, 의료 시술, 예컨대 풍선 혈관성형술의 결과로서 발생하는 아테롬성동맥경화 플라크의 예방 또는 치료); 및 다른 장애, 예컨대 종종 패혈성 쇼크를 야기하는 내독소혈증을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

본원에서 설명되는 지단백질 복합체 및 조성물은 현재까지의 연구에서 다른 지단백질 복합체에 대해 사용되는 것보다 더 낮은 용량으로 투여될 때 콜레스테롤 유출을 유도하고/하거나 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 15 mg/kg 내지 80 mg/kg의 용량을 사용하는 문헌 [Spieker et al., 2002, Circulation 105:1399-1402 (80 mg/kg의 용량 사용)]; [Nissen et al., 2003, JAMA 290:2292-2300 (15 mg/kg 또는 40 mg/kg의 용량 사용)]; [Tardif et al., 2007 JAMA 297:1675-1682 (40 mg/kg 내지 80 mg/kg의 용량 사용] 참조)을 참조한다. 추가로, 본원에서 설명되는 지단백질 복합체는 부작용을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 아래 실시예에 제시한 바와 같이, 본 개시내용의 지단백질 복합체는 2 mg/kg의 낮은 용량에서 콜레스테롤을 효과적으로 이동시키고, 인간 환자에게 이전에 투여된 지단백질 복합체와 대조적으로 트리글리세리드, VLDL, 및 간 효소, 예컨대 트랜스아미나제의 수준을 유의하게 상승시키지 않음이 밝혀졌다 (문헌 [Nanjee et al., 1999, Arterioscler. Vasc. Throm. Biol. 19:979-89] 참조). 또한, 부작용 감소는 정상적인 간 및/또는 신장 기능을 갖는 정상적인 대상체에서 용량이 약 15 mg/kg 이하로 증가된 경우에도 (트리글리세리드 상승의 결여) 또는 45 mg/kg의 높은 경우에도 (트랜스아미나제 증가의 결여) 관찰된다. 따라서, 부작용 없이 투여되는 본 개시내용의 복합체의 능력은 바람직하게는 정상적인 간 기능, 정상적인 신장 기능, 또는 둘 모두를 갖는 개체에서 평가된다.

이론에 매이지는 않지만, 본 발명자들은 본 개시내용의 지단백질 복합체의 잇점이 선행 치료제에 비해 복합체의 보다 균질한 크기 분포 및 감소된 양의 손상된 단백질 및/또는 지질 (예를 들어, 산화된 단백질, 탈아미드화된 단백질, 및 산화된 지질)에 의한 것으로 생각한다. 추가로, 지질 분획을 포함하는 음하전된 인지질은 통상적인 지단백질 복합체에 비해 개선된 치료 특성을 본원에서 설명되는 복합체 및 조성물에 부여할 것으로 생각된다. 신장에서 분해되는 작은 원반상 프리-베타 HDL 입자와, 콜레스테롤이 저장되고 재순환되고 대사되고 (담즙산으로서) 또는 제거되는 (담즙에서) 간에 의해 인식되는 큰 원반상 및/또는 구형 HDL 사이의 핵심 차이 중의 하나는 입자의 전하이다. 작은 원반상 프리-베타 HDL 입자는 음하전된 큰 원반상 및/또는 구형 HDL 입자보다 더 낮은 표면 음전하를 갖는다. 보다 높은 음전하는 간에 의한 입자의 인식을 촉발하고 따라서 신장에 의한 입자의 이화작용을 방지하는 인자 중의 하나로 생각된다. 또한, 신장은 하전된 입자를 쉽게 흡수하지 않음이 밝혀졌다 (문헌 [Hacker et al., 2009, Pharmacology: Principles and Practice, 183] 참조). 따라서, 부분적으로 하전된 인지질(들)의 존재 때문에, 본원에서 설명되는 음하전된 지단백질 복합체 및 조성물은 통상적인 지단백질 복합체보다 오래 순환계에 존재하거나, 또는 전하가 지단백질의 반감기에 전하-의존 방식으로 영향을 줄 것으로 생각된다. 복합체가 응집하고 음전하의 결과로서 존재하는 HDL와 융합하는 비율 및/또는 정도의 감소와 조합되어 그의 보다 긴 순환 (체류) 시간은 콜레스테롤 이동 (복합체에게 콜레스테롤을 축적하기 위한 보다 긴 시간을 제공함으로써) 및 에스테르화 (LCAT가 에스테르화 반응을 촉매하기 위한 보다 긴 시간을 제공함으로써)를 용이하게 할 것으로 예상된다. 전하는 또한 콜레스테롤 포획 및/또는 제거 속도를 증가시켜, 콜레스테롤을 보다 대량으로 제거하는 것을 촉진할 수 있다. 그 결과, 본원에서 설명되는 음하전된 지단백질 복합체 및 조성물은, 보다 적은 복합체 및/또는 조성물이 보다 적은 횟수로 투여되고 부작용이 감소되기 때문에 통상적인 지단백질 요법에 비해 치료 이익을 제공할 것으로 예상된다.

따라서, 본원에 제공되는 방법은 일반적으로 이상지질혈증 장애의 치료 또는 예방을 위해 본원에서 설명되는 치료 유효량의 지단백질 복합체, 지단백질 복합체의 집단, 또는 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 수반한다. 지단백질 복합체는 주사당 약 0.25 mg/kg ApoA-I 동등물 내지 약 45 mg/kg의 용량, 예를 들어, 약 0.5 mg/kg 내지 약 30 mg/kg 또는 약 1 mg/kg ApoA-I 동등물 내지 약 15 mg/kg ApoA-I 동등물의 용량으로 투여될 수 있다. 용량은 추가로 트리글리세리드, VLDL-콜레스테롤 및/또는 VLDL-트리글리세리드의 수준 증가를 최소화하는 용량을 선택함으로써 개체에 따라 조정될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 용량은 약 3 mg/kg, 약 6 mg/kg, 또는 약 12 mg/kg이다.

방법은 추가로 5 내지 14일 또는 6 내지 12일 간격, 예컨대 1 또는 2주 간격으로 지단백질 복합체를 투여하는 것을 포함한다. 방법은 추가로 지단백질 복합체를 상기한 임의의 간격으로, 바람직하게는 1주 간격으로 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 52회 이하로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 지단백질 복합체는 각각의 투여 사이에 1주 간격을 두고 6회 투여된다. 만성 병태에 대해, 52회 초과의 투여가 실시될 수 있다. 임의로, 방법에는 지단백질 복합체가 보다 빈번하게 투여되는 초기 유도 상이 선행될 수 있다.

복합체 및/또는 그의 제약 조성물은 비경구로, 예를 들어, 정맥 내로 투여할 수 있다. 정맥내 투여는 약 1 내지 약 24시간, 또는 약 1 내지 4시간, 약 0.5 내지 2시간, 또는 약 1시간에 걸친 주입으로서 수행될 수 있다.

아래 실시예는 용량 30 mg/kg 및 45 mg/kg의 투여 후의 트리글리세리드 수준의 작은 증가를 보여주고, 이것은 고도의 콜레스테롤 이동에 의한 VLDL 및 LDL의 증가에 의해 설명된다. 이들 파라미터는 표준 지질 패널을 사용하여 병원 실험실에서 일상적으로 측정되기 때문에 치료 동안 제어될 수 있다. 아래 실시예를 기초로 하여, 용량 선택은 개인의 필요에 맞춘 의약이 가능하도록, 의약에 대한 환자 반응에 따라 트리글리세리드 및 VLDL-콜레스테롤 및 VLDL-트리글리세리드의 수준 증가를 최소화하기 위해 달성될 수 있다.

복합체 및/또는 조성물은 단독으로 (단독요법으로서) 투여될 수 있거나, 또는 별법으로, 이상지질혈증 및/또는 그의 연관 병태, 질환 및/또는 장애의 치료 및/또는 예방에 유용한 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 본원에서 설명되는 음하전된 지단백질 복합체 및 조성물이 함께 투여될 수 있는 치료제의 비-제한적인 예는 담즙산-결합 수지, HMG CoA-리덕타제 억제제 (스타틴), 니아신, 수지, 콜레스테롤 흡수 억제제, 혈소판 응집 억제제, 피브레이트, 항응고제, CETP 억제제 (예를 들어, 아나세트라피브 및 달세트라피브), 및/또는 PCSKG 항체 또는 리간드를 포함한다.

5. 도면의 간단한 설명
도 1: 인간 프리프로-아포지단백질 A-I의 아미노산 서열 (서열 1; 진뱅크 (GenBank) 기탁 번호 AAB59514.1). 굵은 글씨체의 아미노산 1-18은 ApoA-I의 신호 서열에 대응하고, 밑줄친 아미노산 19-24는 프로펩티드 서열에 대응한다. 신호 서열 및 프로펩티드 둘 모두는 세포에서 절단되어 성숙한 전장 인간 ApoA-I (아미노산 25-267)을 생산한다.
도 2: ApoA-I을 발현하는 재조합 S-CHO 세포에서 12-일 유가식 (fed batch) 배양시의 ApoA-I 역가. 세포를 세대 0으로부터 세대 43까지 연속 계대배양에 의해 연속 배양하였다. ApoA-I 생산은 세대 4, 8, 14, 19, 25, 21, 36 및 43에서 역상 HPLC에 의해 모니터링하였다. 배양 배지 내의 ApoA-I의 양은 1259 mg/L 내지 1400 mg/L로 상이하였다.
도 3a-3b: 도 3a는 ApoA-I을 발현하는 재조합 S-CHO 세포의 200 L 13-일 배양에서 생육성 세포 밀도를 보여준다. 생육성 세포 밀도는 제9일에 33.20 x 10⁵ 세포/mL로 최고였고, 생육성은 92.5%이었다. 도 3b는 13-일 배양의 배양 배지의 ApoA-I의 농도를 보여준다. 배양 배지의 ApoA-I의 농도는 제12일에 약 2 mg/mL로 최고였다.
도 4: 본원에 설명된 방법에 의해 정제된 ApoA-I의 SDS 폴리아크릴아미드 겔. 좌측 레인은 분자량 마커를 보여준다. 우측 레인은 분자량이 대략 28 kD인 정제된 ApoA-I을 보여준다.
도 5a-5d: 1:2.5 (조성 A; 도 5a), 1:2.7 (조성 B; 도 5b), 1:3.1 (조성 C; 도 5c)의 단백질:지질 중량비의 프로ApoA-I/SM 복합체, 및 1:2.7의 단백질:지질 중량비 (조성 D; 도 5d)의 프로ApoA-I/SM/DPPC 복합체의 HPLC 크로마토그래피.
도 6a-6d: 각각 10, 20, 30, 및 60분에 조성 D의 지단백질 복합체의 HPLC 크로마토그램.
도 7a-7d: 각각 10, 20, 30, 및 50분에서 조성 B의 지단백질 복합체의 HPLC 크로마토그램.
도 8a-8d: 각각 20, 40, 60, 및 120분에서 조성 F의 지단백질 복합체의 HPLC 크로마토그램.
도 9: 프로ApoA-I 및 SM을 포함하는 1:2.7 지단백질:총 인지질 wt:wt 비 (조성 B)의 지단백질 복합체, 프로ApoA-I, SM, DPPC 및 DPPG (SM:DPPC:DPPG wt:wt 비 48:48:4) (조성 F), 및 프로ApoA-I, SM, DPPC 및 DPPG (SM:DPPC:DPPG wt:wt 비 73:23:4) (조성 G)의 형성을 보여주는 시간 경과에 따른 프리-베타 HDL 복합체 형성의 차트.
도 10a-10d: 각각 조성 E, H, I, 및 J에 대한 HPLC 크로마토그램.
도 11: 지단백질 복합체의 예시적인 제조 공정의 개략도.
도 12: 비-상업적인 규모 열 사이클링 운전을 위해 사용되는 예시적인 열 사이클링 장치.
도 13a-13e: 증가하는 열 사이클 횟수에서 SM/DPPG/ApoA-I 단백질 복합체의 겔 투과 크로마토그램. 성분을 각각의 온도에서 5분 동안, 총 30분 (도 13a), 60분 (도 13b), 120분 (도 13c), 180분 (도 13d) 또는 210분 (도 13e) 동안 57℃ 내지 37℃에서 열 사이클링에 적용하였다.
도 14: SM/ApoA-I 복합체의 겔 투과 크로마토그램.
도 15: N-팔미토일-4-히드록시스핑가닌-1-포스포콜린 (식물 SM 또는 피토스핑고미엘린의 형태)/DPPG/ApoA-I 복합체의 겔 투과 크로마토그램.
도 16: 합성 팔미토일 SM/DPPG/ApoA-I 복합체의 겔 투과 크로마토그램.
도 17: 피토스핑고미엘린/DPPG/ApoA-I 복합체의 겔 투과 크로마토그램.
도 18: SM/DPPC/DPPG/ApoA-I 펩티드 복합체의 겔 투과 크로마토그램.
도 19a-19d: 맬버른 인스트루먼츠 제타사이저 (Malvern Instruments Zetasizer, 맬버른 인스트루먼츠 인크 (Malvern Instruments Inc.))를 사용한 동적 광 산란 시스템에 의한 지질 입자의 특성결정. 도 19a에서, Z 평균은 84.49 nm ("84 nm 입자")이고; 도 19b에서, Z 평균은 76.76 nm ("77 nm 입자")이고; 도 19c에서, Z 평균은 66.21 nm ("66 nm 입자")이고; 도 19d에서, Z 평균은 59.50 nm ("60 nm 입자")이다.
도 20a-20d: 84 nm (도 20a), 77 nm (도 20b), 66 nm (도 20c) 및 60 nm (도 20d) 지질 입자를 사용한 5회의 열 사이클 후의 복합체의 겔 투과 크로마토그램.
도 21a-21b: 450 nm (도 21a) 및 40 nm (도 21b) 지질 입자로 출발한 6회의 열 사이클 후의 복합체의 겔 투과 크로마토그램.
도 22: 제1 사이클이 37℃의 "저온"에서 개시된, 65 nm 지질 입자로 출발한 6회의 열 사이클 후의 복합체의 겔 투과 크로마토그램.
도 23: 본 개시내용의 방법에 의해 생산된 지단백질 복합체를 상업상 유용한 제약 조성물로 제제화하는 것을 포함하는, 지단백질 복합체를 포함하는 제약 조성물을 제조하는 예시적인 실시양태의 개략도.
도 24: 조성 B 및 조성 H에 따른 지단백질 복합체의 주입 후의 혈장 VLDL-총 콜레스테롤 수준의 증가. 조성 H (■) 및 조성 B (▼)에 따른 지단백질 복합체를 5 mg/kg의 용량으로 금식 토끼에 주입하였다. 3개의 군에 대한 0.03 내지 0.3 g/L의 기준선 값을 혈장 VLDL-총 콜레스테롤 수준의 증가를 결정하기 위해 차감하였다.
도 25: 조성 B 및 조성 H에 따른 지단백질 복합체의 주입 후의 혈장 트리글리세리드 수준의 증가. 조성 H (■) 및 조성 B (▲)에 따른 지단백질 복합체를 5 mg/kg의 용량으로 금식 토끼에 주입하였다. 3개의 군에 대한 0.31 내지 0.71 g/L의 기준선 값을 혈장 트리글리세리드 수준의 증가를 결정하기 위해 차감하였다.
도 26a-26d: 희석제 (■)에 비해 토끼에서 ApoA-I/에그SM 복합체 (●, ▲) 또는 ApoA-I/합성 SM 복합체 (◆,▼)의 5 mg/kg 또는 20 mg/kg의 주입 후의 혈장 총 콜레스테롤 (도 26a), 트리글리세리드 (도 26b), 인지질 (도 26c), 및 ApoA-I (도 26d)의 증가. 기준선 값은 측정된 상이한 혈장 지질에 대해 다음과 같았다: 혈장 콜레스테롤에 대해 0.28 내지 0.4 g/L, 혈장 트리글리세리드에 대해 0.23 내지 0.29 g/L, 및 혈장 인지질에 대해 0.45 내지 0.61 g/L.
도 27a-27c: 희석제 (■)에 비해 토끼에서 5 mg/kg의 ApoA-I/에그SM 복합체 (●) 및 ApoA-I/합성 SM 복합체 (◆)의 주입 후의 혈장 HDL-총 콜레스테롤 (도 27a), LDL-총 콜레스테롤 (도 27b), 및 VLDL-총 콜레스테롤 (도 27c)의 증가. 기준선 값은 다음과 같았다: 혈장 HDL-총 콜레스테롤에 대해 0.20 내지 0.31 g/L, 혈장 LDL-총 콜레스테롤에 대해 0.06 내지 0.09 g/L, 및 혈장 VLDL-총 콜레스테롤에 대해 0.007 내지 0.011 g/L.

6. 상세한 설명

본 개시내용은 지단백질 복합체, 그의 집단을 지단백질 복합체의 제조 방법과 함께 제공한다. 복합체, 및 그의 집단 및 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)은 특히 이상지질혈증 및/또는 이상지질혈증과 연관된 질환, 장애 및/또는 병태의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 개요 섹션에 논의된 바와 같이, 지단백질 복합체는 2개의 주요 분획, 즉 아포지단백질 분획 및 인지질 분획을, 바람직하게는 규정된 중량 또는 몰비로 포함하고, 바람직하게는 특정된 양의 중성 인지질 및 임의로 하나 이상의 음하전된 인지질을 포함한다.

6.1. 단백질 분획

본 개시내용은 단백질 분획을 포함하는 지단백질 복합체를 제공한다. 본 개시내용은 지단백질 복합체의 제조 방법을 추가로 제공한다. 지단백질 복합체의 단백질 성분은 본 방법의 성공에 중요하지 않다. 치료 및/또는 예방적 이익을 제공하는 실질적으로 임의의 지질-결합 단백질, 예컨대 아포지단백질 및/또는 그의 유도체 또는 유사체가 복합체 내에 포함될 수 있다. 또한, 임의의 알파-나선 펩티드 또는 펩티드 유사체, 또는 지질과 회합할 때 LCAT를 활성화하거나 원반상 입자를 형성할 수 있다는 점에서 아포지단백질 (예컨대, 예를 들어 ApoA-I)의 활성을 "모방하는" 임의의 다른 종류의 분자가 지단백질 복합체에 포함될 수 있고, 용어 "지질-결합 단백질"에 포함된다.

6.1.1. 지질 결합 단백질

본 개시내용은 예를 들어 지단백질 복합체를 제조하는데 사용하기 위해 재조합 방식으로 생산된 단백질의 정제 방법을 추가로 제공한다. 재조합 방식으로 생산된 단백질은 가장 적합하게는 아포지단백질이다. 적합한 단백질은 아포지단백질 ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoA-V 및 ApoE를, 바람직하게는 성숙한 형태로 포함한다. 지질-결합 단백질은 또한 상기한 아포지단백질의 활성 다형성 형태, 이소형, 변이체 및 돌연변이체 및 말단절단된 형태를 포함하고, 그의 가장 통상적인 것은 아포지단백질 A-I_밀라노 (ApoA-I_M), 아포지단백질 A-I_파리 (ApoA-I_P), 및 아포지단백질 A-I_사 _라고 _사 (ApoA-I_Z)이다. 시스테인 잔기를 함유하는 아포지단백질 돌연변이체가 또한 알려져 있고, 또한 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0181372 참조). 아포지단백질은 단량체 또는 동종이량체 또는 이종이량체일 수 있는 이량체의 형태일 수 있다. 예를 들어, ApoA-I (문헌 [Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16(12):1424-29] 참조), ApoA-I_M (문헌 [Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem. 260:1632-35] 참조), ApoA-I_P (문헌 [Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22] 참조), ApoA-II (문헌 [Shelness et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(14):8637-46]; [Shelness et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(15):9929-35] 참조), ApoA-IV (문헌 [Duverger et al., 1991, Euro. J. Biochem. 201(2):373-83] 참조), ApoE (문헌 [McLean et al., 1983, J. Biol. Chem. 258(14):8993-9000] 참조), ApoJ 및 ApoH의 동종- 및 이종이량체 (실시가능한 경우)가 사용될 수 있다. 아포지단백질이 복합체에 포함될 때 몇몇 생물학적 활성을 보유한다면, 아포지단백질은 그의 단리를 용이하게 하는 요소, 예컨대 His 태그, 또는 다른 목적을 위해 설계된 다른 요소에 대응하는 잔기를 포함할 수 있다.

그러한 아포지단백질은 동물 공급원으로부터 (특히 인간 공급원으로부터) 정제할 수 있거나 또는 당업계에 잘 공지된 바와 같이 재조합 방식으로 생산된다. 예를 들어, 문헌 [Chung et al., 1980, J. Lipid Res. 21(3):284-91]; [Cheung et al., 1987, J. Lipid Res. 28(8):913-29]을 참조한다. 또한, 미국 특허 번호 5,059,528, 5,128,318, 6,617,134; 미국 특허 출원 공개 번호 20002/0156007, 2004/0067873, 2004/0077541, 및 2004/0266660; 및 PCT 공개 번호 WO/2008/104890 및 WO/2007/023476을 참조한다. 예를 들어, 아래 섹션 6.1.3 및 6.1.4에 설명된 바와 같은 다른 정제 방법도 가능하다.

본원에서 설명되는 복합체 및 조성물에 아포지단백질로서 사용하기 위해 적합한, 아포지단백질에 대응하는 펩티드 및 펩티드 유사체, 및 ApoA-I, ApoA-I_M, ApoA-II, ApoA-IV, 및 ApoE의 활성을 모방하는 효능제의 비-제한적인 예는 미국 특허 번호 6,004,925, 6,037,323 및 6,046,166 (Dasseux et al.), 미국 특허 번호 5,840,688 (Tso), 미국 특허 출원 공개 번호 2004/0266671, 2004/0254120, 2003/0171277 및 2003/0045460 (Fogelman), 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0087819 (Bielicki) 및 PCT 공개 WO/2010/093918 (Dasseux et al.)에 개시되어 있고, 이들은 그 개시내용 전체가 본원에 참고로 포함된다. 상기 펩티드 및 펩티드 유사체는 L-아미노산 또는 D-아미노산 또는 L- 및 D-아미노산의 혼합물로 이루어질 수 있다. 이들은 또한 하나 이상의 비-펩티드 또는 아미드 연결, 예컨대 하나 이상의 공지의 펩티드/아미드 동배체를 포함할 수 있다. 상기 "펩티드 및/또는 펩티드 모방체" 아포지단백질은 예를 들어 미국 특허 번호 6,004,925, 6,037,323 및 6,046,166에 기재된 기술을 포함하여 당업계에 공지된 임의의 펩티드 합성 기술을 사용하여 합성되거나 제조될 수 있다.

복합체는 단일 종류의 지질-결합 단백질, 또는 동일한 또는 상이한 종으로부터 유래될 수 있는 2개 이상의 상이한 지질-결합 단백질의 혼합물을 포함할 수 있다. 요구되지는 않지만, 지단백질 복합체는 바람직하게는 요법에 대한 면역 반응의 유발을 방지하기 위해서 치료되는 동물 종으로부터 유래되거나 아미노산 서열이 상기 동물 종에 대응하는 지질-결합 단백질을 포함할 것이다. 따라서, 인간 환자의 치료를 위해, 인간 기원의 지질-결합 단백질이 바람직하게는 본 개시내용의 복합체에 사용된다. 펩티드 모방체 아포지단백질의 사용은 또한 면역 반응을 감소시키거나 방지할 수 있다.

특정 바람직한 실시양태에서, 지질-결합 단백질은 성숙 인간 ApoA-I 단백질, 예를 들어, 서열 1의 위치 25 내지 267에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질이다. 특정 실시양태에서, 성숙 인간 ApoA-I 단백질은 서열 1의 위치 25 내지 267에 대해 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 성숙한 인간 ApoA-I 단백질은 위치 1 (즉, 서열 1의 위치 25에 대응하는 위치)에 아스파르트산을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 구체적인 실시양태에서, 성숙한 인간 ApoA-I 단백질은 서열 1의 위치 25 내지 267에 대응하는 아미노산 서열을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, ApoA-I 단백질은 다음 하위섹션에서 설명되는 바와 같이 포유동물 숙주 세포, 가장 바람직하게는 차이니즈 햄스터 난소 ("CHO") 세포에서 재조합 방식으로 생산된다.

6.1.2. 아포지단백질의 재조합 발현

본 개시내용은 지질 결합 단백질, 예컨대 ApoA-I의 생산을 위한 재조합 발현 방법, 및 관련 핵산, 포유동물 숙주 세포, 세포 배양액을 제공한다. 생성되는 재조합 지질 결합 단백질은 정제되고/되거나 본원에 설명된 바와 같은 지단백질 복합체 내로 혼입될 수 있다.

일반적으로, 재조합 생산을 위해, 지질-결합 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 적절한 발현 비히클, 즉, 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 요소, 또는 RNA 바이러스 벡터의 경우에 복제 및 번역에 필요한 요소를 함유하는 벡터 내로 삽입된다. 발현 벡터는 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 포진바이러스, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다. 이어서, 발현 비히클은 단백질 또는 펩티드를 발현할 적합한 표적 세포 내로 형질감염된다. 적합한 숙주 세포는 세균 종, 바큘로바이러스 시스템을 포함하는 포유동물 또는 곤충 숙주 세포 시스템 (예를 들어, 문헌 [Luckow et al., Bio/Technology, 6, 47 (1988)] 참조), 및 확립된 세포주, 예컨대 293, COS-7, C127, 3T3, CHO, HeLa, BHK 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 사용된 발현 시스템에 따라, 발현된 펩티드는 이어서 당업계에 잘 확립된 절차에 의해 단리된다. 재조합 단백질 및 펩티드의 생산 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 각각 그 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.]; 및 [Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.] 참조)

ApoA-I이 지질 결합 단백질인 경우에, ApoA-I 단백질은 ApoA-I을 코딩하는 재조합 뉴클레오티드 서열로부터 발현된다. 몇몇 실시양태에서, ApoA-I을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인간의 서열이다. 인간 ApoA-I 뉴클레오티드 서열의 비-제한적인 예는 그 개시내용 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 번호 5,876,968; 5,643,757; 및 5,990,081, 및 WO 96/37608에 개시되어 있다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 숙주 세포로부터 ApoA-I의 분비를 위한 신호 서열 (예를 들어, 서열 1의 아미노산 1-18) 및/또는 프로단백질 서열 (예를 들어, 서열 1의 아미노산 19-25)에 작동가능하게 연결된 성숙 ApoA-I 단백질의 아미노산 서열을 코딩한다. ApoA-I의 유도된 분비에 적합한 다른 신호 서열은 ApoA-I에 이종성, 예를 들어, 인간 알부민 신호 펩티드 또는 인간 IL-2 신호 펩티드이거나, 또는 ApoA-I에 상동성일 수 있다.

바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 성숙한 인간 ApoA-I 폴리펩티드, 예를 들어 서열 1의 위치 25 내지 267에 대응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하고 임의로 위치 25에 아스파르트산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직한 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 뉴클레오티드 서열은 또한 진뱅크 기탁 번호 NP_000030, AAB59514, P02647, CAA30377, AAA51746 또는 AAH05380.1 중의 하나에 제시된 인간 ApoA-I 단백질의 아미노산 서열에 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하고 임의로 성숙한 인간 ApoA-I 단백질의 제1 아미노산에 대응하는 위치에 아스파르트산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.

ApoA-I 코딩 폴리뉴클레오티드는 재조합 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있다. 바람직한 숙주 세포는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는 포유동물 숙주 세포이다: 차이니즈 햄스터 난소 세포 (예를 들어 CHO-K1; ATCC No. CCL 61; CHO-S (깁코 라이프 테크놀로지스 인크. (GIBCO Life Technologies Inc., 미국 메릴랜드주 록빌), 카탈로그 #11619012)), VERO 세포, BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), HeLa 세포, COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), MDCK 세포, 293 세포 (ATCC No. CRL 1573; 문헌 [Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977] 참조), 3T3 세포, 골수종 세포 (특히 뮤린), PC12 세포 및 W138 세포. 특정 실시양태에서, 포유동물 세포, 예컨대 CHO-S 세포 (인비트로겐(Invitrogen)™, 미국 캘리포니아주 칼스바드)는 혈청-미함유 배지에서 성장을 위해 조정된다. 추가의 적합한 세포주는 당업계에 공지되어 있고, 공공 기탁기관, 예컨대 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 매나서스)으로부터 이용가능하다.

ApoA-I의 재조합 발현을 위해, ApoA-I을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관심있는 숙주 세포에서 ApoA-I의 발현을 조절하는 하나 이상의 제어 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 종결 부위에 작동가능하게 연결된다. 제어 서열(들)은 ApoA-I-코딩 서열에 대해 천연 또는 외래 물질이고, 또한 ApoA-I이 발현되는 숙주 세포에 대해 천연 또는 외래 물질이다. 제어 서열은 프로모터, 리보좀 결합 부위, 리더 (leader), 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 신호 펩티드 서열, 및 전사 종결 부위를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 제어 서열은 프로모터, 리보좀 결합 부위, 및 전사 및 번역 중지 신호를 포함한다. 제어 서열은 또한 ApoA-I을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역과 제어 서열의 라이게이션을 용이하게 하는 특이적 제한 부위의 도입을 위한 하나 이상의 링커를 포함한다.

ApoA-I의 재조합 발현을 유도하는 프로모터는 구성적 프로모터, 조절된 프로모터, 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 적절한 프로모터 서열은 숙주 세포에 대해 내인성 또는 이종성인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 얻을 수 있다. 상이한 강도의 프로모터의 단리, 확인 및 조작 방법은 당업계에서 이용가능하거나 당업계로부터 쉽게 변경된다. 예를 들어, 그 개시내용 전부가 본원에 참고로 포함된 문헌 [Nevoigt et al. (2006) Appl. Environ. Microbiol. 72:5266-5273]을 참조한다.

하나 이상의 제어 서열은 바이러스 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 특정 측면에서, 프로모터는 폴리오마 또는 아데노바이러스 주요 후기 프로모터로부터 유래된다. 다른 측면에서, 프로모터는 원숭이 바이러스 40 (SV40)로부터 유래되고, SV40 바이러스 복제 기점을 또한 함유하는 단편으로서 얻을 수 있거나 (문헌 [Fiers et al., 1978, Nature, 273:113-120] 참조), 또는 사이토메갈로바이러스, 예를 들어, 원숭이 사이토메갈로바이러스 최조기 프로모터로부터 유래된다 (미국 특허 번호 4,956,288 참조). 다른 적합한 프로모터는 메탈로티오네인 유전자의 것을 포함한다 (미국 특허 번호 4,579,821 및 4,601,978 참조).

재조합 ApoA-I 발현 벡터가 또한 본원에서 제공된다. 재조합 발현 벡터는 재조합 숙주 세포에서 이종성 ApoA-I의 발현을 용이하게 하기 위해 재조합 DNA 기술에 의해 조작될 수 있는 임의의 벡터, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스일 수 있다. 발현 벡터는 재조합 숙주 세포의 염색체 내로 통합될 수 있고, ApoA-I의 생산에 유용한 하나 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 이종성 유전자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 낮은 카피수 (예를 들어, 게놈 동등물당 약 1 내지 약 10 카피) 또는 높은 카피수 (예를 들어, 게놈 동등물당 약 10 초과의 카피)로 발견되는 염색체외 복제 DNA 분자, 예를 들어, 선형 또는 폐환 플라스미드이다. 다양한 실시양태에서, 발현 벡터는 선택가능한 마커, 예컨대 벡터를 포함하는 재조합 숙주 유기체에 항생제 내성 (예를 들어, 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린 내성)을 부여하는 유전자를 포함한다. 특정 측면에서, DNA 구축물, 벡터 및 폴리뉴클레오티드는 포유동물 세포에서 ApoA-I의 발현에 적합하다. 포유동물 세포에서 ApoA-I의 발현을 위한 벡터는 숙주 세포 시스템에 상용성인 복제 기점, 프로모터 및 임의의 필요한 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 부위 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 측면에서, 복제 기점은 숙주 세포에 대해 이종성이고, 예를 들어 바이러스 기원 (예를 들어, SV40, 폴리오마, 아데노, VSV, BPV)의 것이다. 다른 측면에서, 복제 기점은 숙주 세포 염색체 복제 메카니즘에 의해 제공된다.

외래 DNA를 포유동물 숙주 세포 내로 도입하기 위한 방법, 시약 및 도구는 당업계에 공지되어 있고, 인산칼슘-매개 형질감염 (문헌 [Wigler et al., 1978, Cell 14:725]; [Corsaro et al., 1981, Somatic Cell Genetics 7:603]; [Graham et al., 1973, Virology 52:456] 참조), 전기천공 (문헌 [Neumann et al., 1982, EMBO J. 1:841-5] 참조), DEAE-덱스트란 매개 형질감염 (문헌 [Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (John Wiley & Sons 1995)] 참조), 및 리포좀-매개 형질감염 (문헌 [Hawley-Nelson et al., 1993, Focus 15:73]; [Ciccarone et al., 1993, Focus 15:80] 참조)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

고수율 생산을 위해, ApoA-I의 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 숙주 세포 내로 외래 DNA의 도입 후에, 숙주 세포는 농축 배지에서 1-2일 동안 성장시킬 수 있고, 이어서 선택 배지로 전환한다. 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소 및 선택가능한 마커에 의해 제어되는 ApoA-I-코딩 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환될 수 있다. 벡터 내의 선택가능 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고, 세포가 그의 염색체 내로 벡터를 안정하게 통합하고 성장하여 클로닝되고 세포주로 증식할 수 있는 증식소 (foci)의 형성을 허용한다. 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (문헌 [Wigler et al., 1977, Cell 11:223] 참조), 히포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (문헌 [Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026] 참조), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (문헌 [Lowy et al., 1980, Cell 22:817] 참조)를 포함하고 이로 제한되지 않는 많은 선택 시스템이 사용될 수 있고, 상기 유전자는 각각 tk^-, hgprt^- 또는 aprt^- 세포에서 이용될 수 있다. 또한, 항대사물질 내성은 예를 들어 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr (문헌 [Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567]; [O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527] 참조); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo (Colberre- Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); 및/또는 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hyg (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147)를 사용하는 선택의 기초로 사용될 수 있다.

안정한 고수율 발현은 또한 숙주 세포 게놈 내로 통합되는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 달성될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2008/0286779 및 2004/0235173 참조). 별법으로, ApoA-I의 안정한 고수율 발현은 예를 들어 WO 1994/012650에 설명된 바와 같이 선택된 포유동물 세포의 게놈 DNA 내에서 내인성 ApoA-I 유전자의 발현을 활성화하고 증폭하는 것을 수반하는, 유전자 활성화 방법에 의해 달성될 수 있다. 증가하는 카피수의 ApoA-I 유전자 (ApoA-I 코딩 서열 및 하나 이상의 제어 요소를 함유)는 ApoA-I의 고수율 발현을 촉진할 수 있다. 바람직하게는, ApoA-I이 발현되는 포유동물 숙주 세포는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 또는 적어도 5의 ApoA-I 유전자 카피 지수를 갖는다. 구체적인 실시양태에서, ApoA-I이 발현되는 포유동물 숙주 세포는 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 또는 적어도 10의 ApoA-I 유전자 카피 지수를 갖는다.

특정 실시양태에서, 포유동물 세포는 ApoA-I을 적어도 0.5 g/L, 적어도 1 g/L, 적어도 1.5 g/L, 적어도 2 g/L, 적어도 2.5 g/L, 적어도 3 g/L, 적어도 3.5 g/L, 및 임의로 4 g/L 이하, 4.5 g/L 이하, 5 g/L 이하, 5.5 g/L 이하, 또는 6 g/L 이하의 양으로 생산하도록 변형된다. 포유동물 숙주 세포는 바람직하게는 배양액에서 적어도 약 0.5, 1, 2, 또는 3 g/L의 ApoA-I 및/또는 배양액에서 약 20 g/L 이하의 ApoA-I, 예를 들어, 배양액에서 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 또는 15 g/L 이하의 ApoA-I을 생산할 수 있다.

특정 실시양태에서, 포유동물 세포는 혈청-미함유 배지에서 성장하도록 변형된다. 이들 실시양태에서, ApoA-I은 세포로부터 분비된다. 다른 실시양태에서, ApoA-I은 세포로부터 분비되지 않는다.

본원에서 제공되는 포유동물 숙주 세포가 ApoA-I을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 방법은 본원에서 설명되는 포유동물 숙주 세포를 ApoA-I이 발현되는 조건 하에 배양하는 것을 포함한다. 또한, 방법은 포유동물 세포 배양액의 상청액으로부터 성숙 ApoA-I을 회수하고, 임의로, 정제하는 것을 포함할 수 있다.

배양 배지, 온도, pH를 비롯한 배양 조건은 배양되는 포유동물 숙주 세포 및 선택된 배양 방식 (진탕 플라스크, 생물반응기, 롤러 병 등)에 적합할 수 있다. 포유동물 세포는 대규모 배치식 배양, 연속식 또는 반-연속식 배양으로 성장할 수 있다.

본원에 설명되는 다수의 ApoA-I-생산 포유동물 숙주 세포를 포함하는 포유동물 세포 배양액을 또한 본원에서 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물 세포 배양액은 적어도 0.5 g/L, 적어도 1 g/L, 적어도 1.5 g/L, 적어도 2 g/L, 적어도 2.5 g/L, 적어도 3 g/L, 적어도 3.5 g/L, 및 임의로 4 g/L 이하, 4.5 g/L 이하, 5 g/L 이하, 5.5 g/L 이하, 또는 6 g/L 이하의 ApoA-I을 함유한다. 배양은 약 150 mL 내지 약 500 mL, 1 L, 10 L, 15 L, 50 L, 100 L, 200 L, 250 L, 300 L, 350 L, 400 L, 500 L, 750 L, 1000 L, 1500 L, 2000 L, 2500 L, 3000 L, 5000 L, 7500 L, 10000 L, 15000 L, 20000 L, 25000 L, 50000 L 또는 그 초과의 임의의 규모일 수 있다. 몇몇 경우에, 배양은 대규모 배양, 예컨대 15 L, 20 L, 25 L, 30 L, 50 L, 100 L, 200 L, 300 L, 500 L, 1000 L, 5000 L, 10000 L, 15000 L, 20000 L, 25000 L, 50000 L 이하 또는 그 초과이다.

6.1.3. 아포지단백질의 정제

본 개시내용은 본원에 설명된 바와 같은 지단백질 복합체 및 그의 조성물의 제조에 유용한 고도로 정제된 아포지단백질을 얻는 방법에 관한 것이다. 방법은 ApoA-I, -II, -III 또는 -IV; ApoB48 및 ApoB100; ApoC-I, -II, -III 또는 -IV; ApoD; ApoE, ApoH; ApoJ를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 아포지단백질에 적용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 고도로 정제된 ApoA-I을 얻는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시양태에서, ApoA-I은 진뱅크 기탁 번호 NP_000030, AAB59514, P02647, CAA30377, AAA51746 및 AAH05380.1에 제시된 서열로부터 선택되고 이로 제한되지 않는 서열을 갖는 인간 단백질이다. 특정 실시양태에서, ApoA-I은 상기 섹션 6.1.2에 설명된 바와 같은 인간 단백질이다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 비-인간 동물 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2004/0077541 참조), 예를 들어, 소, 말, 양, 원숭이, 개코원숭이, 염소, 토끼, 개, 고슴도치, 오소리, 마우스, 래트, 고양이, 기니 피그, 햄스터, 오리, 닭, 연어 및 뱀장어로부터 얻은 ApoA-I을 정제하기 위해 사용될 수 있다 (문헌 [Brouillette et al., 2001, Biochim. Biophys. Acta. 1531:4-46]; [Yu et al., 1991, Cell Struct. Funct. 16(4):347-55]; [Chen and Albers, 1983, Biochim Biophys Acta. 753(1):40-6]; [Luo et al., 1989, J Lipid Res. 30(11):1735-46]; [Blaton et al., 1977, Biochemistry 16:2157-63]; [Sparrow et al., 1995, J Lipid Res. 36(3):485-95]; [Beaubatie et al., 1986, J. Lipid Res. 27:140-49]; [Januzzi et al., 1992, Genomics 14(4):1081-8]; [Goulinet and Chapman, 1993, J. Lipid Res. 34(6):943-59]; [Collet et al., 1997, J Lipid Res. 38(4):634-44]; 및 [Frank and Marcel, 2000, J. Lipid Res. 41(6):853-72] 참조).

본원에 개시된 방법에 의해 정제될 수 있는 ApoA-I 단백질의 예는 프리프로아포지단백질 형태의 ApoA-I, 프로- 및 성숙한 형태의 ApoA-I, 및 활성 다형성 형태, 이소형, 변이체 및 돌연변이체 및 말단절단된 형태, 예를 들어, ApoA-I_M, ApoA-I_Z, 및 ApoA-I_P를 포함하고 이로 제한되지 않는다. ApoA-I_M은 ApoA-I의 R173C 분자 변이체이다 (예를 들어, 문헌 [Parolini et al., 2003, J Biol Chem. 278(7):4740-6]; [Calabresi et al., 1999, Biochemistry 38:16307-14]; 및 [Calabresi et al., 1997, Biochemistry 36:12428-33] 참조). ApoA-I_P는 ApoA-I의 R151C 분자 변이체이다 (예를 들어, 문헌 [Daum et al., 1999, J Mol Med. 77(8):614-22] 참조). ApoA-I_Z는 ApoA-I의 L144R 분자 변이체이다 (문헌 [Recalde et al., 2001, Atherosclerosis 154(3):613-623]; [Fiddyment et al., 2011, Protein Expr. Purif. 80(1):110-116] 참조). 시스테인 잔기를 함유하는 아포지단백질 A-I 돌연변이체도 알려져 있고, 또한 본원에서 설명되는 방법에 의해 정제할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2003/0181372 참조). 본원에서 설명되는 방법에 사용하기 위한 ApoA-I은 단량체, 동종이량체, 또는 이종이량체의 형태일 수 있다. 예를 들어, 제조될 수 있는 프로- 및 성숙 ApoA-I의 동종- 및 이종이량체는 특히 ApoA-I (문헌 [Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16(12):1424-29] 참조), ApoA-I_M (문헌 [Franceschini et al., 1985, J Biol Chem. 260:1632-35] 참조), 및 ApoA-I_P (문헌 [Daum et al., 1999, J Mol Med. 77:614-22] 참조)를 포함한다.

본원에서 설명되는 정제 방법은 숙련된 당업자에게 편리한 임의의 규모로 수행할 수 있다.

몇몇 측면에서, 본원에서 설명되는 방법에 의해 정제할 수 있는 ApoA-I 단백질은 서열 1의 아미노산 25-267에 대해 적어도 75% 동일한, 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 91% 동일한, 적어도 92% 동일한, 적어도 93% 동일한, 적어도 94% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 적어도 99% 동일한 또는 적어도 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는다.

아포지단백질은 혈장 또는 원핵 또는 진핵 세포에서 재조합 발현을 포함하는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, 아포지단백질은 ApoA-I, 예를 들어, 인간 ApoA-I이다. 몇몇 측면에서, ApoA-I은 원핵 또는 진핵 숙주 세포의 세포질 또는 주변세포질에서 발현된다. 이들 실시양태에서, 세포는 ApoA-I을 정제하기 전에 ApoA-I을 상청액 내로 방출하도록 파괴된다. 세포 파괴 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예시적인 세포 파괴 방법은 효소에 의한 방법, 초음파 처리, 세제 방법, 및 기계적 방법을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 바람직한 측면에서, ApoA-I은 포유동물 세포, 바람직하게는 CHO 세포 내에서 발현되고, 성장 배지 내로 분비된다. 이들 실시양태에서, ApoA-I은 맑아진 세포-미함유 배지로부터 정제된다. 정제 방법이 인간 ApoA-I과 연관하여 본원에서 상세히 설명되지만, 당업자가 쉽게 확인할 수 있는 특정 단백질 특성 (예를 들어, 분자량, 등전점, 스토크스 (Stokes) 반경, 소수성, 다량체 상태 등)에 따라 정제 조건을 다른 아포지단백질, 및 비-인간 ApoA-I, ApoA-I 또는 다른 아포지단백질의 다형성 형태, 이소형, 변이체, 돌연변이체 및 말단절단된 형태에 대해 조정하는 것은 당업계에서 용이한 기술임이 이해될 것이다.

ApoA-I이 혈장으로부터 제조되는 경우에, 이것은 냉 (cold) 분획화 공정, 예컨대 문헌 [Cohn et al., 1946, J. Am. Chem. Soc. 68:459-475] ("콘 (Cohn) 공정") 또는 [Oncley et al., 1949, J. Am. Chem. Soc. 71:541-550] ("콘-온클레이 (Cohn-Oncley) 공정")에 기재된 공정을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 공지의 방법에 의해 혈장으로부터 분리될 수 있다. 혈장으로부터 아포지단백질을 단리하기 위한 다른 방법은 콘 및 콘-온클레이 공정의 변형, 예컨대 키슬러-니취먼 (Kistler-Nitschmann) 공정을 포함한다 (문헌 [Nitschmann et al., 1954, Helv. Chim. Acta 37:866-873]; [Kistler et al., 1962, Vox Sang. 7:414-424] 참조).

이들 실시양태에서, 아포지단백질은 차가운 알콜, 예를 들어, 에탄올로 혈장을 침전시켜 얻는다. 혈장의 냉 분획화에 사용하기 위한 다른 알콜은 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알콜, 예컨대 메탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, sec-부탄올, 이소부탄올 및 tert-부탄올을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 단백질 용해도를 감소시키는 알콜 이외의 다른 물질이 아포지단백질을 혈장으로부터 침전시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 물질은 에테르, 황산암모늄, 7-에톡시아크리딘-3,9-디아민 (리바놀) 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 침전된 단백질은 침강, 원심분리 및 여과를 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 상청액으로부터 분리될 수 있다.

ApoA-I은 단백질을 함유하는 혈장의 임의의 분획으로부터 회수될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, ApoA-I은 피브리노겐의 양이 약 8% (w/w) 에탄올을 사용한 침전에 의해 감소된 인간 혈장의 혈청 분획으로부터 회수된다. 다른 실시양태에서, 아포지단백질은 다른 혈청 단백질 (예를 들어, β-글로불린 및 γ-감마 글로불린)의 농도가 약 25% (w/w) 에탄올을 사용한 침전에 의해 감소된 인간 혈장의 혈청 분획으로부터 회수된다. 또 다른 실시양태에서, 아포지단백질은 에탄올 농도를 약 38% 내지 약 42% (w/w)로 증가시킴으로써 얻어진 인간 혈청으로부터의 침전물로서 회수된다. 특정 실시양태에서, 아포지단백질은 에탄올 농도를 약 40% (w/w)로 증가시킴으로써 얻어진 인간 혈청 (콘 분획 IV)으로부터의 침전물로서 회수된다. 침전된 ApoA-I은 원심분리 및 여과를 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 혈청 분획으로부터 회수될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 아포지단백질이 회수되는 혈장 분획의 온도는 단백질의 변성을 방지하기 위해 충분히 낮다. 이들 실시양태에서, ApoA-I 분획의 온도는 약 -10℃ 내지 약 0℃, 예컨대 약 -8℃ 내지 약 -2℃이다. 다양한 실시양태에서, ApoA-I이 회수되는 혈장 분획의 pH는 단백질의 변성을 방지하는 범위이다. 이들 실시양태에서, ApoA-I을 함유하는 분획의 pH는 약 5 내지 약 7, 예컨대 약 5.5 내지 약 6.5이다.

6.1.4. 개선된 지단백질 정제 공정

본 발명자들은 성숙하고 무손상이며 실질적으로 오염물질이 없는 지단백질을 생산하는, 아래에서 설명되고 실시예에서 예시되는 개선된 정제 방법을 추가로 밝혀내었다. 본원에서 설명되는 정제 방법은 숙련된 당업자에 대해 편리한 임의의 규모로 수행할 수 있다.

이 방법은 ApoA-I, -II, -III 또는 -IV; ApoB48 및 ApoB100; ApoC-I, -II, -III 또는 -IV; ApoD; ApoE, ApoH; ApoJ를 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 아포지단백질에 적용될 수 있다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 고도로 정제된 ApoA-I을 얻는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시양태에서, ApoA-I은 진뱅크 기탁 번호 NP_000030, AAB59514, P02647, CAA30377, AAA51746 및 AAH05380.1에 제시된 서열로부터 선택되고 이로 제한되지 않는 서열을 갖는 인간 단백질이다. 특정 실시양태에서, ApoA-I은 상기 섹션 6.1.2에 설명된 바와 같은 인간 단백질이다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 비-인간 동물 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2004/0077541 참조), 예를 들어, 소, 말, 양, 원숭이, 개코원숭이, 염소, 토끼, 개, 고슴도치, 오소리, 마우스, 래트, 고양이, 기니 피그, 햄스터, 오리, 닭, 연어 및 뱀장어로부터 얻은 ApoA-I을 정제하기 위해 사용될 수 있다 (문헌 [Brouillette et al., 2001, Biochim Biophys Acta. 1531:4-46]; [Yu et al., 1991, Cell Struct Funct. 16(4):347-55]; [Chen and Albers, 1983, Biochim Biophys Acta. 753(1):40-6]; [Luo et al., 1989, J Lipid Res. 30(11):1735-46]; [Blaton et al., 1977, Biochemistry 16:2157-63]; [Sparrow et al., 1995, J Lipid Res. 36(3):485-95]; [Beaubatie et al., 1986, J Lipid Res. 27:140-49]; [Januzzi et al., 1992, Genomics 14(4):1081-8]; [Goulinet and Chapman, 1993, J Lipid Res. 34(6):943-59]; [Collet et al., 1997, J Lipid Res. 38(4):634-44]; 및 [Frank and Marcel, 2000, J Lipid Res. 41(6):853-72] 참조).

본원에 개시된 방법에 의해 정제될 수 있는 ApoA-I 단백질의 예는 프리프로아포지단백질 형태의 ApoA-I, 프로- 및 성숙한 형태의 ApoA-I, 및 활성 다형성 형태, 이소형, 변이체 및 돌연변이체 및 말단절단된 형태, 예를 들어, ApoA-I_M, ApoA-I_Z, 및 ApoA-I_P를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 시스테인 잔기를 함유하는 아포지단백질 A-I 돌연변이체도 알려져 있고, 또한 본원에서 설명되는 방법에 의해 정제할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2003/0181372 참조). 본원에서 설명되는 방법에 사용하기 위한 ApoA-I은 단량체, 동종이량체, 또는 이종이량체의 형태일 수 있다. 예를 들어, 제조될 수 있는 프로- 및 성숙 ApoA-I의 동종- 및 이종이량체는 특히 ApoA-I (문헌 [Duverger et al., 1996, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 16(12):1424-29] 참조), ApoA-I_M (문헌 [Franceschini et al., 1985, J Biol Chem. 260:1632-35] 참조), 및 ApoA-I_P (문헌 [Daum et al., 1999, J Mol Med. 77:614-22] 참조)를 포함한다.

아포지단백질은 혈장 또는 원핵 또는 진핵 세포에서 재조합 발현을 포함하는 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시양태에서, 아포지단백질은 ApoA-I, 예를 들어, 인간 ApoA-I이다. 몇몇 측면에서, ApoA-I은 원핵 또는 진핵 숙주 세포의 세포질 또는 주변세포질에서 발현된다. 이들 실시양태에서, 세포는 ApoA-I을 정제하기 전에 ApoA-I을 상청액 내로 방출하도록 파괴된다. 세포 파괴 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예시적인 세포 파괴 방법은 효소에 의한 방법, 초음파 처리, 세제 방법, 및 기계적 방법을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 바람직한 측면에서, ApoA-I은 포유동물 세포, 바람직하게는 CHO 세포 내에서 발현되고, 성장 배지 내로 분비된다. 이들 실시양태에서, ApoA-I은 맑아진 세포-미함유 배지로부터 정제된다. 정제 방법이 인간 ApoA-I과 연관하여 본원에서 상세히 설명되지만, 당업자가 쉽게 확인할 수 있는 특정 단백질 특성 (예를 들어, 분자량, 등전점, 스토크스 반경, 소수성, 다량체 상태 등)에 따라 정제 조건을 다른 아포지단백질, 및 비-인간 ApoA-I, ApoA-I 또는 다른 아포지단백질의 다형성 형태, 이소형, 변이체, 돌연변이체 및 말단절단된 형태에 대해 조정하는 것은 당업계에서 용이한 기술임이 이해될 것이다.

일반적으로, 정제 방법은 (a) ApoA-I 함유 용액을 음이온 교환 매트릭스와, ApoA-I이 매트릭스에 결합하지 않도록 하는 조건 하에 접촉시키고; (b) 단계 (a)에서 얻은 ApoA-I 함유 용액을 바이러스 또는 바이러스 입자를 제거하기 위해 충분한 세공 크기를 갖는 막을 통해 여과하고; (c) 단계 (b)에서 얻은 여액을 ApoA-I이 매트릭스에 결합하도록 하는 조건 하에 제1 역상 크로마토그래피 컬럼에 통과시키고; (d) 증가하는 농도의 유기 용매의 구배를 사용하여 제1 ApoA-I 함유 역상 용리액을 제1 역상 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리하고; (e) 단계 (d)의 제1 ApoA-I 역상 용리액을 ApoA-I이 매트릭스에 결합하도록 하는 조건 하에 제2 역상 크로마토그래피 컬럼에 통과시키고; (f) 증가하는 농도의 유기 용매의 구배를 사용하여 제2 ApoA-I 함유 역상 용리액을 제2 역상 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리하는 단계를 포함한다. 단계를 수행하는 순서는 중요하지 않다. 당업자에게 분명해지는 바와 같이, 단계의 순서에 대한 다양한 순열이 가능하고, 그 중 몇몇이 아래에서 설명된다.

특정 측면에서, ApoA-I 함유 용액은 단계 (a)에서 음이온 교환 매트릭스와 접촉하기 전에 컨디셔닝된다. 컨디셔닝은 ApoA-I이 단계 (a)에서 음이온 교환 매트릭스에 결합하지 않는 범위가 되도록 단백질 용액의 pH를 조정하기 위해 수행된다 (즉, 단백질은 순 음전하를 갖지 않고 단계 (a)는 음성 방식으로 실시됨). 이들 측면에서, ApoA-I 함유 용액의 pH는 약 5 내지 약 7, 바람직하게는 약 5.0 내지 약 5.6이다. 특정 측면에서, pH는 약 5.1 내지 약 5.5이다. 또 다른 측면에서, pH는 약 5.3이다. pH의 조정은 요구되는 범위 내의 pH가 얻어질 때까지 적절한 산 (예를 들어, 염산) 또는 염기 (예를 들어, 수산화나트륨)를 첨가함으로써 수행할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, ApoA-I 함유 용액은 세포 및 세포 파편을 제거하기 위해 컨디셔닝 단계 전에 여과된다. 다른 실시양태에서, 컨디셔닝 단계가 부재할 때, ApoA-I 함유 용액은 임의로 세포 및 세포 파편을 제거하기 위해 단계 (a) 전에 여과된다.

몇몇 실시양태에서, ApoA-I 함유 용액을 음이온 교환 매트릭스와 접촉시키는 단계 (a)는 단백질 용액을 크로마토그래피 컬럼을 통과시킴으로써 수행한다. 이들 실시양태에서, 컬럼은 약 10 cm 내지 약 50 cm의 베드 높이, 바람직하게는 약 10 cm 내지 약 30 cm, 보다 바람직하게는 약 20 cm의 베드 높이로 충전한다. 특정 측면에서, 컬럼에 리터당 약 10 g 내지 약 50 g, 예컨대 약 10 g 내지 약 30 g, 예컨대 약 25 g 내지 약 35 g의 ApoA-I을 포함하는 단백질 용액을 로딩한다. 특정 실시양태에서, 컬럼에 리터당 약 32 g 이하의 ApoA-I을 포함하는 단백질 용액을 로딩한다. 다른 실시양태에서, 단계 (a)는 배치식 방식으로, 즉, 음이온 교환 매트릭스를 플라스크 내의 단백질 용액에 첨가하고, 오염물질을 매트릭스에 결합시키기 충분한 기간 동안 혼합한 후, 예를 들어 여과 또는 원심분리에 의해 매트릭스 물질을 단백질 용액으로부터 분리함으로써 수행한다. 특정 실시양태에서, 단백질 용액은 이를 음이온 교환 매트릭스와 접촉시키기 전에 용액 내의 미립자를 제거하기 위해 여과된다.

본원에서 설명되는 방법의 단계 (a)에서 사용하기 위한 음이온 교환 매트릭스는 당업계에 공지된 임의의 음이온 교환 매트릭스일 수 있다. 적합한 음이온 교환 매트릭스는 Q-세파로스 FF, Q-스페로실, DEAE-세파로스 FF, Q-셀룰로스, DEAE-셀룰로스 및 Q-스페로덱스를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 음이온 교환 매트릭스는 Q-세파로스 FF (지이 헬쓰케어 (GE Healthcare))이다. 특정 측면에서, 단백질 용액을 단계 (a)에서 음이온 교환 매트릭스와 접촉시키기 전에, 매트릭스는 ApoA-I이 매트릭스에 결합하지 않도록 상기 논의한 바람직한 범위 내의 pH를 갖는 완충제 내에서 평형화된다. 단계 (a) 전에 음이온 교환 매트릭스를 평형화하고 단계 (a)를 수행하기 위해 유용한 완충제는 당업자에게 알려져 있다. 특정 실시양태에서, 완충제는 TAMP A (20 mM 인산나트륨, pH 5.3)이다.

다양한 실시양태에서, 단계 (a)는 음이온 교환 매트릭스에 결합하여, 상기한 pH 및 염 조건 하에서 매트릭스에 결합하지 않는 ApoA-I으로부터 분리되는 ApoA-I 이외의 다른 단백질 (예를 들어, 숙주 세포 단백질), 숙주 세포 DNA 및 내독소에 대해 ApoA-I을 정제하기 위해 사용된다. 몇몇 측면에서, 출발 용액 내의 ApoA-I의 양의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90% 또는 그 초과가 음이온 교환 단계로부터 회수된다.

다양한 실시양태에서, 정제 방법은 단계 (a)로부터의 ApoA-I 용액이 바이러스 및 바이러스 입자를 포획하기에 충분한 세공 크기를 갖는 필터를 사용하여 여과되는 단계 (b)를 포함한다. 임의로, 바이러스 또는 바이러스 입자를 제거하기 위해 막을 통해 여과하는 단계 (b)는 단계 (a) 후보다는 상기 단계 (f) 후에 수행한다. 특정 측면에서, 음이온 교환 매트릭스로부터의 용리액의 pH는 수산화나트륨 또는 다른 적합한 염기의 첨가에 의해 바이러스 여과 단계 (b) 전에 조정된다. 단계 (a)로부터의 ApoA-I 함유 용액은 약 7.8 내지 약 8.2의 pH로 조정한다. 특정 측면에서, ApoA-I 함유 용액은 약 8.0의 pH로 조정된다. 단계 (b)에서 사용되는 필터는 바이러스 포획에 적절한 세공 크기, 예를 들어, 약 15 nm 내지 약 75 nm의 세공 크기를 갖는 임의의 필터일 수 있다. 특정 실시양태에서, 필터의 세공 크기는 약 20 nm이다 (예를 들어, 플라노바 (Planova) 20N, 아사히 가세이 메디칼 (Asahi Kasei Medical)). 당업자는 바이러스 필터를 통한 단백질 용액의 유동 속도가 용액의 특성 (예를 들어, 그의 점도, 미립자의 농도 등)에 의해 결정됨을 이해할 것이다. 바이러스 여과를 위한 일반적인 유동 속도는 약 12.5 L/h/m²이지만, 유동 속도는 1 bar 이하의 필터 압력을 유지하기 위해 더 높거나 더 낮게 조정될 수 있다. 단계 (b)로부터의 여액은 ApoA-I을 함유한다. 특정 측면에서, 바이러스 여과 단계로부터의 ApoA-I은 단계 (a)로부터의 음이온 교환 용리액 내의 ApoA-I의 양의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 또는 그 초과이다.

특정 실시양태에서, 본원에서 설명되는 정제 방법은 단계 (b) 후에 단계 (c)를 포함하고, 여기서 단계 (b)로부터의 여액은 아포지단백질 A-I이 매트릭스에 결합하도록 허용하는 완충제 및 염 조건 하에 제1 역상 크로마토그래피 컬럼을 통과한다. 이들 실시양태에서, ApoA-I은 증가하는 농도의 유기 용매의 구배를 사용하여 숙주 세포 DNA, 숙주 세포 단백질, 내독소 및 말단절단된 형태에 대해 정제된다. 역상 크로마토그래피는 C4 내지 C18 소수성 리간드가 접합된 실리카, 폴리스티렌, 또는 가교결합된 아가로스 기반 매질을 포함하고 이로 제한되지 않는 매트릭스의 당업계에 공지된 매우 다양한 변형체를 사용하여 수행할 수 있다. 본원에서 설명되는 방법에 유용한 상업적으로 이용가능한 소수성 매트릭스는 부틸 세파로스-FF, 옥틸 세파로스-FF, 디아논 (Dianon) HP20ss, C18 하이퍼실 (Hypersil) 및 소스 (Source) 30 RPC를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 단계 (c)에서 사용되는 매트릭스는 소스 30 RPC (지이 헬쓰케어)이다. 특정 측면에서, 역상 크로마토그래피 컬럼의 베드 높이는 약 10 cm 내지 약 50 cm, 예컨대 약 10 cm 내지 약 30 cm이다. 특정 측면에서, 역상 크로마토그래피 컬럼의 베드 높이는 약 25 cm이다.

몇몇 실시양태에서, 바이러스 여과 단계 (b)로부터의 ApoA-I 여액을 리터당 약 1 내지 약 20 g의 ApoA-I, 예컨대 약 1.5 g 내지 약 5 g의 ApoA-I의 농도, 보다 바람직하게는 약 2.5 g 내지 약 3.5 g의 ApoA-I의 농도로 역상 컬럼에 로딩한다. 특정 측면에서, 단계 (b)로부터의 ApoA-I 여액은 리터당 약 3.4 g의 ApoA-I의 농도로 역상 컬럼 상에 로딩된다. ApoA-I 로딩 전에 역상 컬럼을 평형화하고 로딩시에 단백질이 컬럼에 결합하는 것을 보장하기 위해 사용될 수 있는 완충제 조건은 당업자에 의해 쉽게 확인가능할 것이다. 바람직하게는, 컬럼 평형화 완충제는 컬럼 pH를 약 9.5로 감소시킬 수 있는 강한 완충제이다. 특정 실시양태에서, 평형화 완충제는 TAMP D (20 mM 탄산암모늄)이다. 바람직하게는, 평형화 후에, 단계 (b)로부터의 ApoA-I 함유 여액 (약 8.0의 pH에서)을 약 0.5 cm 내지 약 5.0 cm/분, 예컨대 약 2.0 cm 내지 약 4.0 cm/분의 유동 속도로 컬럼 상에 로딩한다. 특정 실시양태에서, ApoA-I 함유 여액은 약 2.8 cm/분의 유동 속도로 컬럼 상에 로딩된다.

ApoA-I이 단계 (c)에서 역상 매트릭스에 결합된 후, 단백질은 완충제 내의 증가하는 농도의 유기 용매의 구배, 예컨대 TAMP D 완충제 내의 약 35% 내지 약 50% 아세토니트릴에 대한 노출에 의해 단계 (d)에서 용리된다. 몇몇 측면에서, 약 60 내지 약 90분의 기간, 예컨대 약 70분 또는 보다 바람직하게는 약 80분에 걸친 약 35% 내지 약 50% 아세토니트릴의 선형 구배를 사용하여 ApoA-I을 컬럼으로부터 용리할 수 있다. 특정 측면에서, 선형 구배 다음에 50% 아세토니트릴을 사용한 약 10분의 동용매 용리가 이어진다. 역상 컬럼으로부터 ApoA-I을 용리하기 위한 정확한 조건은 당업자가 쉽게 확인할 수 있을 것이다. 다양한 실시양태에서, 컬럼 로드 내의 약 60%, 예컨대 약 65%, 약 70%, 약 75% 또는 약 80% 또는 그 초과의 ApoA-I이 단계 (d)에서의 컬럼 용리액에 존재한다.

특정 측면에서, 본원에서 설명되는 정제 방법은 전장 단백질로부터 DNA, 숙주 세포 단백질 및 말단절단된 형태의 ApoA-I을 추가로 제거하기 위해 단계 (d)로부터의 아포지단백질 A-I 역상 용리액을 제2 역상 크로마토그래피 컬럼을 통과시키는 단계 (e)를 단계 (d) 다음에 추가로 포함한다. 바람직하게는, 단계 (d)로부터의 역상 용리액은 아포지단백질 A-I이 매트릭스에 결합하도록 허용하는 조건 하에서 제2 역상 컬럼 상에 로딩된다. 단계 (e)에서 사용하기 위한 역상 매트릭스는 단계 (d)에서 사용되는 것과 동일한 종류의 매트릭스 또는 상이한 종류의 매트릭스일 수 있다. 특정 실시양태에서, 단계 (e)에서 사용되는 역상 매트릭스는 C18 실리카 매트릭스, 예컨대 다이소겔 (Daisogel) SP-300-BIO C18 매트릭스 (300 Å, 10 ㎛; 다이소 컴퍼니 (Daiso Co., Ltd.))이다. ApoA-I 로딩 전에 C18 컬럼을 평형화하고 로딩시에 단백질이 컬럼에 결합하는 것을 보장하기 위해 사용될 수 있는 완충제 조건은 당업자에 의해 쉽게 확인가능할 것이다. 바람직하게는, 컬럼 평형화 완충제는 컬럼 pH를 약 9.5로 감소시킬 수 있는 강한 완충제이다. 특정 실시양태에서, 평형화 완충제는 TAMP E (100 mM 탄산암모늄)이다. 다양한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 정제 방법의 단계 (e)에서 사용되는 역상 컬럼의 베드 높이는 약 10 cm 내지 약 50 cm, 예컨대 약 10 cm 내지 약 30 cm이다. 특정 실시양태에서, 단계 (e)에서 사용되는 역상 컬럼의 베드 높이는 약 25 cm이다.

다양한 실시양태에서, 단계 (d)로부터의 ApoA-I 용리액을 리터당 약 0.5 g 내지 약 30 g의 ApoA-I의 농도, 예컨대 약 1 g 내지 약 10 g의 ApoA-I의 농도, 보다 바람직하게는 약 4 g 내지 약 5 g의 ApoA-I의 농도로 C18 역상 컬럼에 로딩한다. 특정 실시양태에서, 단계 (d)로부터의 ApoA-I 용리액은 리터당 약 4.7 g의 ApoA-I의 농도로 C18 역상 컬럼 상에 로딩된다. 바람직하게는, 평형화 후에, 단계 (d)로부터의 ApoA-I 함유 용리액을 약 0.5 cm 내지 약 5.0 cm/분, 예컨대 약 1.0 cm 내지 약 3.0 cm/분의 유동 속도로 컬럼 상에 로딩한다. 특정 실시양태에서, ApoA-I 함유 여액은 약 2.1 cm/분의 유동 속도로 컬럼 상에 로딩된다.

ApoA-I이 단계 (e)에서 역상 매트릭스에 결합된 후에, 단백질은 완충제 내의 증가하는 농도의 유기 용매, 예컨대 TAMP E 완충제 내의 약 40% 내지 약 50% 아세토니트릴의 구배를 사용하여 단계 (f)에서 용리된다. 몇몇 측면에서, 약 40% 내지 약 50% 아세토니트릴의 선형 구배는 약 40 내지 약 80분의 기간, 예컨대 약 50분, 약 60분 또는 약 70분에 걸쳐 ApoA-I을 컬럼으로부터 용리하기 위해 사용된다. 특정 실시양태에서, 약 60분의 기간에 걸친 TAMP E 완충제 내의 약 40% 내지 약 50% 아세토니트릴의 선형 구배가 ApoA-I을 역상 매트릭스로부터 용리하기 위해 사용된다. 특정 측면에서, 선형 구배 다음에 50% 아세토니트릴을 사용한 약 15분의 동용매 용리가 이어진다. 역상 컬럼으로부터 ApoA-I을 용리하기 위한 정확한 조건은 당업자가 쉽게 확인할 수 있을 것이다. 다양한 실시양태에서, 컬럼 로드 내의 약 60%, 예컨대 약 65%, 약 70%, 약 75% 또는 약 80% 또는 그 초과의 ApoA-I이 단계 (f)에서의 컬럼 용리액에서 회수된다.

특정 실시양태에서, 유기 용매는 본원에 설명된 방법의 단계 (f)에서 얻은 ApoA-I 함유 용리액으로부터 제거된다. 용매 제거는 단계 (f)에서 얻은 ApoA-I 함유 용리액을 농축하고 농축물을 수성 완충제 내로 정용여과하는 것을 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 단계 (f)로부터의 용리액은 단계 (f)에서의 역상 컬럼으로부터의 용리액의 부피에 비해 약 2배, 약 2.5배, 약 3배, 약 3.5배, 약 4배, 약 4.5배 또는 약 5배 농축된다. 특정 실시양태에서, 용리액은 약 2.5배 농축된 후, 대략 10, 15, 또는 20, 바람직하게는 15 부피의 적합한 수성 완충제에 대해 정용여과된다. 적합한 수성 완충제는 당업계에 공지되어 있다. 특히 바람직한 완충제는 TAMP C (3 mM 인산나트륨, pH 8.0)이다.

몇몇 실시양태에서, 크로마토그래피 컬럼들의 순서가 역전된다.

임의로, 농축 및 완충제 교환 후에, 수성 ApoA-I 용액은 잔류 DNA 및 다른 음하전된 오염물질, 예컨대 숙주 세포 단백질을 제거하기 위해 음성 방식으로 (즉, ApoA-I이 음이온 교환 매트릭스에 결합하지 않는 조건 하에) 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제된다 (단계 (g)). 몇몇 실시양태에서, 음이온 교환 단계는 배치식 방식으로 수행된다. 다른 실시양태에서, 음이온 교환 단계는 컬럼 크로마토그래피에 의해 수행된다. 배치식 방식에서 또는 컬럼 크로마토그래피에서 사용하기 적합한 음이온 교환 매트릭스는 Q 세파로스-FF 또는 단계 (a)에서 사용하기 위해 상기 논의된 임의의 음이온 교환 매트릭스를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 특정 측면에서, 음이온 교환 단계는 ApoA-I 용액을 음이온 교환 막, 예컨대 큰 표면적 및 강한 양이온 전하를 갖는 막, 예를 들어, 사르토빈드 (Sartobind) Q 또는 무스탕 (Mustang) Q에 통과시킴으로써 수행된다. 바람직하게는, 음이온 교환 단계는 무스탕 Q 음이온 교환 막 (폴 라이프 사이언시스 (Pall Life Sciences))을 사용하여 수행된다. 특정 측면에서, 수성 ApoA-I 용액의 pH는 임의의 적합한 산을 사용하여 상기 음이온 교환 단계 전에 약 5.5, 약 6.0 또는 약 6.5로 감소된다. 특정 측면에서, 수성 ApoA-I 용액의 pH는 묽은 인산을 사용하여 약 6.0으로 감소된다. 바람직한 실시양태에서, ApoA-I 용액은 대략 12.5 L/m2/h로 무스탕 Q 카트리지를 통과한다.

몇몇 실시양태에서, 음이온 교환 막 여액은 농축되고, 임의로 ApoA-I의 저장 또는 추가의 프로세싱, 예컨대 아래 섹션 6.5.1에 설명된 바와 같은 지질과의 복합체화 및/또는 아래 섹션 6.6에 설명된 바와 같은 제약 조성물 내의 제제화에 적합한 것으로 용매를 교환하기 위해 정용여과된다. ApoA-I의 저장 또는 추가의 프로세싱에 적합한 완충제는 당업자에 의해 쉽게 확인가능할 것이다. 특정 실시양태에서, 정제된 ApoA-I은 TAMP C 완충제로 교환된다. 막이 단백질이 아니라 완충제의 통과를 허용하도록 전장 성숙 ApoA-I의 분자량 미만의 분자량 컷오프 (cutoff)를 갖는다면 임의의 한외여과 막을 본 단계에서 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 10,000의 명목상 분자량 컷오프의 폴리에테르술폰 막 (예를 들어, 필트론 오메가 (Filtron Omega) 시리즈)이 사용된다. 바람직하게는, 한외여과 후에 용액 내의 ApoA-I 농도는 적어도 10 g/L, 적어도 12 g/L, 적어도 15 g/L, 적어도 20 g/L, 적어도 25 g/L, 적어도 30 g/L, 적어도 35 g/L, 적어도 40 g/L, 적어도 45 g/L 또는 적어도 50 g/L이다.

6.1.5. 아포지단백질 생성물

본 개시내용은 또한 실질적으로 순수한 성숙한 전장 아포지단백질을 제공한다. 본원에서 사용될 때, 용어 "실질적으로 순수한"은 적어도 95% 순수한 단백질을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 실질적으로 순수한 단백질은 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9% 또는 100% 순수한 것이다. 특정 측면에서, 본원에서 설명되는 정제 방법에 의해 생산된 실질적으로 순수한 아포지단백질 생성물은 백색 배경에 대해 광원을 사용하여 시각적으로 조사할 때 투명하거나 가시적인 입자가 없는 약간 유백색의 무색 용액이다. 다양한 실시양태에서, 상기 섹션 6.1.4에 설명된 방법에 의해 얻거나 얻을 수 있는 실질적으로 순수한 아포지단백질은 낮은 또는 비검출가능한 양의 하나 이상의 숙주 세포 DNA, 아포지단백질 이외의 다른 단백질 (예를 들어, 숙주 세포 단백질), 내독소, 잔류 용매, 및 아래 추가로 상세히 설명된 바와 같이 낮은 생물부하 (bioburden) (즉, 샘플 상 또는 내의 낮은 수의 미생물)를 포함한다. 아포지단백질 생성물의 순도는 N-말단 에드만 (Edman) 서열결정, MALDI-MS, 겔 전기영동, HPLC, 및/또는 면역검정을 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정할 수 있다.

다양한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법에 의해 얻은 실질적으로 순수한 아포지단백질 생성물은 질량이 약 28.1 kD인 전장 성숙한 인간 ApoA-I이다. 생성물 내의 ApoA-I의 질량은 MALDI-MS를 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 생성물 내의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 ApoA-I 단백질은 성숙 전장 ApoA-I (예를 들어, 서열 1의 아미노산 25 내지 267을 포함하는 ApoA-I)이다. 특정 측면에서, 실질적으로 순수한 ApoA-I 생성물은 약 15% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하 또는 약 1% 이하 (중량 기준)의 N-말단 연장된 ApoA-I 이소형 (예를 들어, 프로ApoA-I)을 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 생성물 내의 임의의 N-말단 연장된 ApoA-I은 투여시에 혈액 내에서 신속하게 성숙 ApoA-I으로 전환될 것이다. 다양한 실시양태에서, ApoA-I 생성물은 약 25% 이하, 약 20% 이하, 약 15% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하, 약 0.75% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.25% 이하, 또는 약 0.1% 이하 (중량 기준)의 말단절단된 형태의 ApoA-I을 포함한다. 말단절단된 또는 연장된 ApoA-I의 양은 예를 들어 N-말단 에드만 서열결정 및/또는 MALDI-MS 및/또는 존재할 경우, 정제된 ApoA-I 밴드 면적의 강도 대 모든 밴드의 총 강도의 비를 결정하기 위한 SDS-PAGE 겔 이동 및 스캐닝에 의해 결정될 수 있다. 다양한 실시양태에서, ApoA-I 생성물은 약 20% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하, 약 0.75% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.25% 이하, 또는 약 0.1% 이하 (중량 기준)의 산화된 형태의 ApoA-I, 특히 위치 Met₁₁₂ 및/또는 Met₁₄₈에서 산화된 ApoA-I을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법에 의해 생산된 실질적으로 순수한 아포지단백질은 숙주 세포 단백질을 약 100 ppm 미만 (예를 들어, ng/mg), 예컨대 약 75 ppm 미만, 약 50 ppm 미만, 약 40 ppm 미만, 약 30 ppm 미만, 약 20 ppm 미만, 또는 약 10 ppm 미만의 양으로 포함한다. 특정 실시양태에서, 실질적으로 순수한 아포지단백질 생성물은 약 20 ppm의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 보다 바람직하게는, 아포지단백질 생성물은 약 10 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 아포지단백질 샘플 내의 숙주 세포 단백질의 존재 및 양은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 결정할 수 있다. 아포지단백질이 예를 들어, 포유동물 세포에서 재조합 방식으로 생산될 때, 상업적으로 이용가능한 ELISA 키트 (예를 들어, 시그너스 테크놀로지스 (Cygnus Technologies)의 Kit F015)가 숙주 세포 단백질을 검출하고 그의 수준을 정량하기 위해 사용될 수 있다.

몇몇 측면에서, 본원에서 설명되는 바와 같이 정제된 실질적으로 순수한 아포지단백질 생성물은 숙주 세포 DNA를 아포지단백질 1 mg당 약 50 pg 미만, 예컨대 약 40 pg 미만, 약 30 pg 미만, 약 20 pg 미만, 약 10 pg 미만, 또는 약 5 pg 미만의 양으로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 실질적으로 순수한 아포지단백질 생성물은 아포지단백질 1 mg당 약 10 pg 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다. 아포지단백질 샘플 내의 숙주 세포 DNA의 존재 및 양은 실시간-PCR 또는 항-SSB 항체 (글리코타입 바이오테크놀로지 (Glycotype Biotechnology))를 사용한 단일 가닥 결합 단백질과의 복합체의 검출을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 바람직하게는 정량적 PCR에 의해 결정할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법에 의해 생산된 실질적으로 순수한 아포지단백질 생성물은 내독소를 아포지단백질 1 mg당 약 0.5 EU 미만, 예컨대 약 0.4 EU 미만, 약 0.3 EU 미만, 약 0.2 EU 미만 또는 약 0.1 EU 미만의 양으로 포함한다. 바람직하게는, 본원에서 설명되는 실질적으로 순수한 아포지단백질 생성물은 아포지단백질 1 mg당 약 0.1 EU 미만의 내독소를 포함한다. 내독소의 검출 및 정량은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 그람-음성 세균 내독소에 대한 리물루스 아메보사이트 용해물 (Limulus Amebocyte Lysate) (LAL) 정성 시험을 이용하여 달성할 수 있다 (캄브렉스 (Cambrex); 감도 0.125 EU/mL).

본원에서 설명되는 실질적으로 순수한 아포지단백질 생성물은 낮은 생물부하를 갖는다. 용어 "생물부하"는 생성물 내의 호기성 세균, 혐기성 세균, 효모 및 곰팡이의 수준을 의미한다. 다양한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 바와 같이 정제된 실질적으로 순수한 아포지단백질 생성물의 생물부하는 약 1 CFU/mL 미만이다. 생물부하 시험은 임의의 공지의 방법에 따라, 예를 들어 유럽 약전 (European Pharmacopoeia) 챕터 (Chapter) 2.6.12.B, 2.6.1 및 USB 챕터 61 통일된 (harmonized) 방법에 따라 수행할 수 있다.

본원에서 설명되는 실질적으로 순수한 아포지단백질 생성물은 소량의 잔류 용매를 포함한다. 특정 실시양태에서, 잔류 용매는 10 mg/L의 아포지단백질에 대해 약 50 ppm 미만, 약 45 ppm 미만, 약 40 ppm 미만, 약 35 ppm 미만, 약 30 ppm 미만, 약 25 ppm 미만, 약 20 ppm 미만, 약 15 ppm 미만 또는 약 10 ppm 미만의 양으로 존재한다. 바람직하게는, 잔류 용매는 10 mg/L의 아포지단백질에 대해 약 41 ppm 미만의 양으로 존재한다. 잔류 용매의 양은 GC-MS 및 HPLC를 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 검정할 수 있다.

바람직하게는, 아포지단백질은 ApoA-I (예를 들어, 서열 1의 아미노산 25-267을 포함하는 ApoA-I)이다. 몇몇 실시양태에서, 성숙 인간 ApoA-I 단백질은 위치 1 (즉, 서열 1의 위치 25에 대응하는 위치)에 아스파르트산을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

6.2. 지질 분획

본 개시내용의 지단백질 복합체 및 조성물은 지질 분획을 포함한다. 지질 분획은 하나 이상의 지질을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 하나 이상의 지질은 포화 및/또는 불포화, 및 천연 또는 합성 지질일 수 있다. 지질 분획은 바람직하게는 적어도 하나의 인지질을 포함한다.

지질 분획에 존재할 수 있는 적합한 지질은 작은 알킬 사슬 인지질, 에그 포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린, 1-스테아로일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린 디올레오포스파티딜에탄올아민, 디라우로일포스파티딜글리세롤 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 디포스파티딜글리세롤, 예컨대 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디올레오일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티드산, 디팔미토일포스파티드산, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린, 뇌 포스파티딜세린, 뇌 스핑고미엘린, 팔미토일스핑고미엘린, 디팔미토일스핑고미엘린, 에그 스핑고미엘린, 우유 스핑고미엘린, 피토스핑고미엘린, 디스테아로일스핑고미엘린, 디팔미토일포스파티딜글리세롤 염, 포스파티드산, 갈락토세레브로시드, 강글리오시드, 세레브로시드, 디라우릴포스파티딜콜린, (1,3)-D-만노실-(1,3)디글리세리드, 아미노페닐글리코시드, 3-콜레스테릴-6'-(글리코실티오)헥실 에테르 당지질, 및 콜레스테롤 및 그의 유도체를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 합성 지질, 예컨대 합성 팔미토일스핑고미엘린 또는 N-팔미토일-4-히드록시스핑가닌-1-포스포콜린 (피토스핑고미엘린의 형태)이 지질 산화를 최소화하기 위해 사용될 수 있다. 팔미토일스핑고미엘린을 포함하는 인지질 분획은 리소포스포 지질, 팔미토일스핑고미엘린 이외의 다른 스핑고미엘린, 갈락토세레브로시드, 강글리오시드, 세레브로시드, 글리세리드, 트리글리세리드, 및 콜레스테롤 및 그의 유도체를 포함하고 이로 제한되지 않는 소량의 임의의 종류의 지질을 임의로 포함할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 지질 분획은 다음과 같은 2 종류의 인지질을 포함한다: 스핑고미엘린 (SM) 및 음하전된 인지질. SM은 생리학적 pH에서 약 0의 순수 전하를 갖기 때문에 "중성" 인지질이다. 사용되는 SM의 종류는 성공에 중요하지 않다. 따라서, 본원에서 사용될 때, 표현 "SM"은 천연 공급원으로부터 유래되거나 얻은 스핑고미엘린, 및 천연 생성 SM처럼 LCAT에 의한 가수분해에 견디는 천연 생성 SM의 유사체 및 유도체를 포함한다. SM은 구조가 레시틴과 매우 유사한 인지질이지만, 레시틴과 달리 글리세롤 골격 (backbone)을 갖지 않고, 따라서 아실 사슬을 부착시키는 에스테르 연결을 갖지 않는다. 오히려, SM은 아미드 연결이 아실 사슬을 연결하는 세라미드 골격을 갖는다. SM은 LCAT의 기질이 아니고, 일반적으로 이에 의해 가수분해될 수 없다. 그러나, 이것은 LCAT의 억제제로서 작용할 수 있거나 또는 기질 인지질의 농도를 희석함으로써 LCAT 활성을 감소시킬 수 있다. SM은 가수분해되지 않기 때문에, 보다 오래 순환계에 유지된다. 상기 특징은 본원에서 설명되는 음하전된 지단백질 복합체가 약물학적 효과 (콜레스테롤의 이동)의 보다 긴 지속기간을 갖고 SM을 포함하지 않은 아포지단백질 복합체보다 더 많은 지질, 특히 콜레스테롤을 포착하도록 할 것으로 예상된다. 상기 효과는 치료를 위해 SM을 포함하지 않는 지단백질 복합체에 대해 필요한 것보다 덜 빈번하거나 보다 적은 용량이 필요하도록 만들 수 있다.

SM은 실질적으로 임의의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, SM은 우유, 에그 또는 뇌로부터 얻을 수 있다. SM 유사체 또는 유도체도 사용될 수 있다. 유용한 SM 유사체 및 유도체의 비제한적인 예는 팔미토일스핑고미엘린, N-팔미토일-4-히드록시스핑가닌-1-포스포콜린 (피토스핑고미엘린의 형태), 팔미토일스핑고미엘린, 스테아로일스핑고미엘린, D-에리트로-N-16:0-스핑고미엘린 및 그의 디히드로 이성질체, D-에리트로-N-16:0-디히드로-스핑고미엘린을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 합성 SM, 예컨대 합성 팔미토일스핑고미엘린 또는 N-팔미토일-4-히드록시스핑가닌-1-포스포콜린 (피토스핑고미엘린)은 동물 기원의 스핑고지질보다 오염물질 및/또는 산화 생성물이 보다 적고 더 균질한 복합체를 생산하기 위해 사용될 수 있다.

예시적인 스핑고미엘린 팔미토일스핑고미엘린 및 피토스핑고미엘린이 아래에 제시된다.

팔미토일 SM

피토-SM

천연 공급원으로부터 단리된 스핑고미엘린은 하나의 특정 포화 또는 불포화 아실 사슬에서 인공적으로 농축된다. 예를 들어, 우유 스핑고미엘린 (아반티 포스포리피드 (Avanti Phospholipid, 미국 알라바마주 알라바스터))은 긴 포화 아실 사슬 (즉, 20개 이상의 탄소 원자를 갖는 아실 사슬)을 특징으로 한다. 이와 대조적으로, 에그 스핑고미엘린은 짧은 포화 아실 사슬 (즉, 20개 미만의 탄소 원자를 갖는 아실 사슬)을 특징으로 한다. 예를 들어, 단지 약 20%의 우유 스핑고미엘린만이 C16:0 (16 탄소, 포화) 아실 사슬을 포함하는 반면, 약 80%의 에그 스핑고미엘린은 C16:0 아실 사슬을 포함한다. 용매 추출을 사용하여, 우유 스핑고미엘린의 조성은 에그 스핑고미엘린의 것과 동등한 아실 사슬 조성을 갖도록 농축될 수 있거나, 그 반대도 가능하다.

SM은 특정 아실 사슬을 갖도록 반-합성될 수 있다. 예를 들어, 우유 스핑고미엘린은 먼저 우유로부터 정제된 후, 하나의 특정 아실 사슬, 예를 들어, C16:0 아실 사슬이 절단되고 또 다른 아실 사슬로 교체될 수 있다. 또한, SM은 예를 들어 대규모 합성에 의해 완전히 합성될 수 있다. 예를 들어, 1993년 6월 15일 등록된 동 (Dong) 등의 미국 특허 번호 5,220,043 (발명의 명칭: Synthesis of D-erythro-sphingomyelins); 문헌 [Weis, 1999, Chem. Phys. Lipids 102 (1-2):3-12]을 참조한다.

반-합성 또는 합성 SM을 포함하는 아실 사슬의 길이 및 포화 수준은 선택적으로 변할 수 있다. 아실 사슬은 포화 또는 불포화될 수 있고, 약 6 내지 약 24개의 탄소 원자를 함유할 수 있다. 각각의 사슬은 동일한 수의 탄소 원자를 함유할 수 있거나, 별법으로 각각의 사슬은 상이한 수의 탄소 원자를 함유할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 반-합성 또는 합성 SM은 하나의 사슬은 포화되고 하나의 사슬은 불포화되도록 혼합된 아실 사슬을 포함한다. 상기 혼합된 아실 사슬 SM에서, 사슬 길이는 동일하거나 상이할 수 있다. 다른 실시양태에서, 반-합성 또는 합성 SM의 아실 사슬은 포화 또는 불포화 상태이다. 다시, 사슬들은 동일한 또는 상이한 수의 탄소 원자를 함유할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 반-합성 또는 합성 SM을 함유하는 아실 사슬은 동일하다. 구체적인 실시양태에서, 사슬은 천연 발생 지방산, 예컨대 예를 들어 올레산, 팔미트산 또는 스테아르산의 아실 사슬에 대응한다. 또 다른 실시양태에서, 포화 또는 불포화 관능화된 사슬을 갖는 SM이 사용된다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 두 아실 사슬은 포화되고, 6 내지 24개의 탄소 원자를 함유한다. 반-합성 및 합성 SM에 포함될 수 있는 통상적으로 발생하는 지방산에 존재하는 아실 사슬의 비제한적인 예는 아래 표 1에 제시한다:

바람직한 실시양태에서, SM은 팔미토일 SM, 예컨대 C16:0 아실 사슬을 갖는 합성 팔미토일 SM이거나, 또는 주성분으로서 팔미토일 SM을 포함하는 에그 SM이다.

구체적인 실시양태에서, 관능화된 SM, 예컨대 피토스핑고미엘린이 사용된다.

지질 분획은 바람직하게는 음하전된 인지질을 포함한다. 본원에서 사용될 때, "음하전된 인지질"은 생리학적 pH에서 순수 음전하를 갖는 인지질이다. 음하전된 인지질은 단일 종류의 음하전된 인지질, 또는 2가지 이상의 상이한 음하전된 인지질의 혼합물을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 하전된 인지질은 음하전된 글리세로인지질이다. 하전된 인지질(들)의 종류(들)은 성공에 중요하지 않다. 적합한 음하전된 인지질의 구체적인 예는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)], 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 및 포스파티드산을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 음하전된 인지질은 하나 이상의 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤 및/또는 포스파티드산을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 음하전된 인지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)], 또는 DPPG로 이루어진다.

SM과 마찬가지로, 음하전된 인지질은 천연 공급원으로부터 얻거나 화학적 합성에 의해 제조할 수 있다. 합성 음하전된 인지질을 사용하는 실시양태에서, 아실 사슬의 종류는 SM과 관련하여 상기 논의한 바와 같이 선택적으로 상이할 수 있다. 본원에 설명되는 음하전된 지단백질 복합체의 몇몇 실시양태에서, 음하전된 인지질 상의 아실 사슬은 동일하다. 몇몇 실시양태에서, SM 및 음하전된 인지질 상의 아실 사슬은 모두 동일하다. 구체적인 실시양태에서, 음하전된 인지질(들), 및/또는 SM은 모두 C16:0 또는 C16:1 아실 사슬을 갖는다. 구체적인 실시양태에서, SM의 지방산 모이어티는 우세하게 C16:1 팔미토일이다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 하전된 인지질(들) 및/또는 SM의 아실 사슬은 팔미트산의 아실 사슬에 대응한다.

사용되는 인지질은 바람직하게는 적어도 95% 순수하고/하거나 감소된 수준의 산화제를 갖는다. 천연 공급원으로부터 얻은 지질은 바람직하게는 산화에 취약하지 않은 더 적은 다가불포화 지방산 모이어티 및/또는 지방산 모이어티를 갖는다. 샘플 내의 산화의 수준은 샘플 1 kg당 단리된 아이오딘의 밀리-당량 (meq O/kg로 약칭함)으로 표현되는 과산화물 값을 제공하는 아이오딘 적정 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Gray, J.I., Measurement of Lipid Oxidation: A Review, Journal of the American Oil Chemists Society, Vol. 55, p. 539-545 (1978)]; [Heaton, F.W. 및 Uri N., Improved Iodometric Methods for the Determination of Lipid Peroxides, Journal of the Science of food and Agriculture, vol 9. P, 781-786 (1958)]을 참조한다. 바람직하게는, 산화 수준, 또는 과산화물 수준은 낮고, 예를 들어 5 meq O/kg 미만, 4 meq O/kg 미만, 3 meq O/kg 미만, 또는 2 meq O/kg 미만이다.

SM 및 팔미토일스핑고미엘린을 포함하는 지질 분획은 임의로 소량의 추가의 지질을 포함할 수 있다. 리소인지질, 갈락토세레브로시드, 강글리오시드, 세레브로시드, 글리세리드, 트리글리세리드, 및 콜레스테롤 및 그의 유도체를 포함하고 이로 제한되지 않는, 실질적으로 임의의 종류의 지질이 사용될 수 있다.

포함될 경우 상기 선택적인 지질은 일반적으로 약 15 wt% 미만의 지질 분획을 이룰 것이지만, 몇몇 경우에 보다 많은 선택적인 지질이 포함될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 선택적인 지질은 약 10 wt% 미만, 약 5 wt% 미만, 또는 약 2 wt% 미만을 구성한다. 몇몇 실시양태에서, 지질 분획은 선택적인 지질을 포함하지 않는다.

구체적인 실시양태에서, 인지질 분획은 에그 SM 또는 팔미토일 SM 또는 피토스핑고미엘린 및 DPPG를 90:10 내지 99:1, 보다 바람직하게는 95:5 내지 98:2의 중량비 (SM:음하전된 인지질)로 함유한다. 한 실시양태에서, 중량비는 97:3이다.

본 개시내용의 지단백질 복합체는 또한 다양한 치료 또는 진단 용도를 위해 소수성, 지질친화성 또는 무극성 활성제를 전달하기 위해 담체로서 사용될 수 있다. 상기 용도를 위해, 지질 분획은 지방산, 약물, 핵산, 비타민, 및/또는 영양분을 포함하고 이로 제한되지 않는 하나 이상의 소수성, 지질친화성 또는 무극성 활성제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 소수성, 지질친화성 또는 무극성 활성제는 치료 범주에 의해 제한되지 않고, 예를 들어, 진통제, 소염제, 구충제, 부정맥치료제, 항균제, 항바이러스제, 항응혈제, 항우울제, 당뇨병 치료제, 간질 치료제, 항진균제, 통풍 치료제, 항고혈압제, 항말라리아제, 편두통 치료제, 항무스카린제, 항신생물제, 발기 부전 개선제, 면역억제제, 항원충제, 항갑상선제, 항불안제, 진정제, 최면제, 신경이완제, β-차단제, 심장 수축 촉진제, 코르티코스테로이드, 이뇨제, 파킨슨 치료제, 위장약, 히스타민 수용체 길항제, 각질용해제, 지질 조절제, 협심증 치료제, cox-2 억제제, 류코트리엔 억제제, 마크로라이드, 근이완제, 영양제, 핵산 (예를 들어, 작은 간섭 RNA), 오피오이드 진통제, 프로테아제 억제제, 성 호르몬, 자극제, 근이완제, 골다공증 치료제, 비만 치료제, 인지 증진제, 요실금 치료제, 영양 오일, 양성 전립선 비대증 치료제, 필수 지방산, 비-필수 지방산, 및 그의 혼합물일 수 있다.

적합한 소수성, 지질친화성, 또는 무극성 활성제의 구체적인 비제한적인 예는 다음과 같다: 아세트레틴, 알벤다졸, 알부테롤, 아미노글루테티미드, 아미오다론, 암로디핀, 암페타민, 암포테리신 B, 아토르바스타틴, 아토바쿠온, 아지트로마이신, 바클로펜, 베클로메타손, 베네제프릴, 벤조나테이트, 베타메타손, 비칼루타니드, 부데소니드, 부프로피온, 부술판, 부테나핀, 칼시페디올, 칼시포트리엔, 칼시트리올, 캄토테신, 칸데살탄, 카프사이신, 카르바메제핀, 카로테네스, 셀레콕시브, 세리바스타틴, 세티리진, 클로르페니라민, 콜레칼시페롤, 실로스타졸, 시메티딘, 신나리진, 시프로플록사신, 시사프리드, 클라리트로마이신, 클레마스틴, 클로미펜, 클로미프라민, 클로피도그렐, 코데인, 조효소 Q10, 시클로벤자프린, 시클로스포린, 다나졸, 단트롤렌, 덱스클로르페니라민, 디클로페낙, 디코우마롤, 디고신, 데히드로에피안드로스테론, 디히드로에르고타민, 디히드로타키스테롤, 디리트로마이신, 도네제필, 에파비렌즈, 에포살탄, 에르고칼시페롤, 에르고타민, 필수 지방산 공급원, 에토돌락, 에토포시드, 파모티딘, 페노피브레이트, 펜타닐, 펙소페나딘, 피나스테리드, 플루코나졸, 플루르비프로펜, 플루바스타틴, 포스페니토인, 프로바트립탄, 푸라졸리돈, 가바펜틴, 겜피브로질, 글리벤클라미드, 글리피지드, 글리부리드, 글리메피리드, 그리세오풀빈, 할로판트린, 이부프로펜, 이르베살탄, 이리노테칸, 이소소르비드 디니트레이트, 이소트레티노인, 이트라코나졸, 이베르멕틴, 케노코나졸, 케토롤락, 라모트리긴, 란소프라졸, 레플루노미드, 리시노프릴, 로페라미드, 로라타딘, 로바스타틴, L-트리록신, 루테인, 리코펜, 메드록시프로게스테론, 미페프리스톤, 메플로퀸, 메게스트롤 아세테이트, 메타돈, 메톡살렌, 메트로니다졸, 미코나졸, 미다졸람, 미글리톨, 미녹시딜, 미톡산트론, 몬텔루카스트, 나부메톤, 날부핀, 나라트립탄, 넬프마비르, 디페디핀, 닐솔리디핀, 닐루타니드, 니트로푸란토인, 니자티딘, 오메프라졸, 오프레빌킨, 오에스트라디올, 옥사프로진, 파클리탁셀, 파라칼시톨, 파록세틴, 펜타조신, 피오글리타존, 피조페틴, 프라바스타틴, 프레드니솔론, 프로부콜, 프로게스테론, 슈도에페드린, 피리도스티그민, 라베프라졸, 랄록시펜, 로페콕시브, 레파글리니드, 리파부틴, 리파펜틴, 리멕솔론, 리타노비르, 리자트립탄, 로시글리타존, 사퀴나비드, 설트랄린, 시부트라민, 실데나필 시트레이트, 심바스타틴, 실로리무스, 스피로노락톤, 수마트립탄, 타크린, 타크로리무스, 타목시펜, 탐술로신, 타르그레틴, 타자로텐, 텔미살탄, 테니포시드, 테르비나핀, 테라조신, 테트라히드로칸나비놀, 티아가빈, 티클로피딘, 티로피브란, 티자니딘, 토피라메이트, 토포테칸, 토레미펜, 트라마돌, 트레티노인, 트로글리타존, 트로바플록사신, 우비데카레논, 발살탄, 벤라팍신, 베르테포르핀, 비가바트린, 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 자피르루카스트, 질레우톤, 졸미트립탄, 졸피뎀, 및 조피클론. 상기 나열된 작용제의 염, 이성질체 및 유도체, 및 혼합물도 사용될 수 있다.

6.3. 지단백질 복합체

본 개시내용은 단백질 분획 및 지질 분획을 포함하는 지단백질 복합체를 제공하고, 그 각각의 조성은 각각 섹션 6.1 및 6.2에서 설명되었다.

일반적으로, 단백질 분획은 치료 및/또는 예방적 이익을 제공하는 하나 이상의 지질-결합 단백질, 예컨대 아포지단백질 및/또는 그의 유도체 또는 유사체를 포함한다. 복합체는 단일 종류의 지질-결합 단백질, 또는 동일한 또는 상이한 종으로부터 유래될 수 있는 2개 이상의 상이한 지질-결합 단백질의 혼합물을 포함할 수 있다. 적합한 지질-결합 단백질은 상기 섹션 6.1에 설명되어 있다. 요구되지는 않지만, 지단백질 복합체는 바람직하게는 요법에 대한 면역 반응의 유발을 방지하기 위해서 치료되는 동물 종으로부터 유래되거나 아미노산 서열이 상기 동물 종에 대응하는 지질-결합 단백질을 포함할 것이다. 따라서, 인간 환자의 치료를 위해, 인간 기원의 지질-결합 단백질이 바람직하게는 본 개시내용의 복합체에 사용된다. 펩티드 모방체 아포지단백질의 사용은 또한 면역 반응을 감소시키거나 방지할 수 있다.

높은 정도의 순도 (예를 들어, 성숙하고, 말단절단, 산화, 탈아미드화, 내독소로 오염된 및/또는 다른 단백질 또는 핵산으로 오염되지 않은)를 갖는 아포지단백질의 사용은 지단백질 복합체의 치료 효능 및/또는 안전성을 향상시킬 것으로 생각된다. 따라서, 단백질 분획은 임의로 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 약 0%의 산화된 메티오닌-112 또는 메티오닌-148, 및/또는 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 약 0%의 탈아미노화된 아미노산을 갖는, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 성숙한 전장 ApoA-I을 포함할 수 있다. 아포지단백질은 본원에 설명되는 임의의 방법에 따라 정제할 수 있다. 바람직하게는, 아포지단백질은 섹션 6.1.4에 설명된 바와 같이 제조할 수 있다.

구체적인 실시양태에서, 단백질 분획은 ApoA-I, 예를 들어, 상기 섹션 6.1.5에 설명된 바와 같이 실질적으로 순수한 성숙한 전장 ApoA-I을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다.

지질 분획은 하나 이상의 지질을 포함하고, 이것은 포화, 불포화, 천연 및 합성 지질 및/또는 인지질일 수 있다. 적합한 지질은 작은 알킬 사슬 인지질, 에그 포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린, 1-스테아로일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린 디올레오포스파티딜에탄올아민, 디라우로일포스파티딜글리세롤 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 디포스파티딜글리세롤, 예컨대 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디올레오일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티드산, 디팔미토일포스파티드산, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린, 뇌 포스파티딜세린, 뇌 스핑고미엘린, 에그 스핑고미엘린, 우유 스핑고미엘린, 피토스핑고미엘린, 팔미토일스핑고미엘린, 디팔미토일스핑고미엘린, 디스테아로일스핑고미엘린, 디팔미토일포스파티딜글리세롤 염, 포스파티드산, 갈락토세레브로시드, 강글리오시드, 세레브로시드, 디라우릴포스파티딜콜린, (1,3)-D-만노실-(1,3)디글리세리드, 아미노페닐글리코시드, 3-콜레스테릴-6'-(글리코실티오)헥실 에테르 당지질, 및 콜레스테롤 및 그의 유도체를 포함하고 이로 제한되지 않는다. SM 및 팔미토일스핑고미엘린을 포함하는 인지질 분획은 리소인지질, 팔미토일스핑고미엘린 이외의 다른 스핑고미엘린, 갈락토세레브로시드, 강글리오시드, 세레브로시드, 글리세리드, 트리글리세리드, 및 콜레스테롤 및 그의 유도체를 포함하고 이로 제한되지 않는 소량의 임의의 종류의 지질을 임의로 포함한다. 합성 지질, 예컨대 합성 팔미토일 스핑고미엘린 또는 N-팔미토일-4-히드록시스핑가닌-1-포스포콜린 (피토스핑고미엘린)이 바람직하다. 추가로 지질은 상기 섹션 6.2에 설명되어 있다. 바람직하게는, 지단백질 복합체는 스핑고미엘린을 포함한다.

임의로, 본 개시내용의 지단백질 복합체는 다양한 치료 또는 진단 용도를 위해 지방산, 약물, 핵산, 비타민, 및/또는 영양분을 포함하고 이로 제한되지 않는 소수성, 지질친화성 또는 무극성 활성제로 로딩될 수 있다. 적합한 활성제는 섹션 6.2에 설명되어 있다.

지단백질 복합체는 본원에 설명된 임의의 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 바람직하게는, 복합체는 섹션 6.5.1 내지 6.5.4에 설명된 바와 같이 제조한다.

본원에서 설명되는 음하전된 지단백질 복합체의 지질 분획 대 단백질 분획의 몰비는 상이할 수 있고, 다른 인자 중에서 단백질 분획을 포함하는 아포지단백질의 종류(들), 지질 분획을 포함하는 하전된 인지질의 종류 및 양, 및 하전된 지단백질 복합체의 요구되는 크기에 따라 결정될 것이다. 아포지단백질, 예컨대 ApoA-I의 생물학적 활성은 아포지단백질을 포함하는 양친매성 나선에 의해 매개된다고 생각되기 때문에, 지질:아포지단백질 몰비의 아포지단백질 분획을 ApoA-I 단백질 동등물을 사용하여 표현하는 것이 편리하다. 나선을 계산하기 위해 사용된 방법에 따라 ApoA-I이 6-10개의 양친매성 나선을 함유함이 일반적으로 승인된다. 다른 아포지단백질은 이들이 함유하는 양친매성 나선의 수를 기초로 하여 ApoA-I 동등물의 측면에서 표현될 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 디술피드-가교된 이량체로서 존재하는 ApoA-I_M은 2개의 ApoA-I 동등물로 표현될 수 있고, 이것은 ApoA-I_M의 각각의 분자가 ApoA-I 분자보다 2배 많은 양친매성 나선을 함유하기 때문이다. 이와 반대로, 단일 양친매성 나선을 함유하는 펩티드 아포지단백질은 1/10-1/6 ApoA-I 동등물로서 표현될 수 있고, 그 이유는 각각의 분자가 ApoA-I 분자보다 1/10-1/6배의 양친매성 나선을 함유하기 때문이다. 일반적으로, 지단백질 복합체의 지질:ApoA-I 동등물 몰비 (본원에서 "Ri"로서 정의됨)는 약 105:1 내지 110:1 범위일 것이다. 몇몇 실시양태에서, Ri는 약 108:1이다. 중량비는 인지질에 대해 대략 650-800의 MW를 사용하여 얻어질 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 지질:ApoA-I 동등물 ("RSM")의 몰비는 약 80:1 내지 약 110:1, 예를 들어, 약 80:1 내지 약 100:1 범위이다. 구체적인 예에서, 지단백질 복합체에 대한 RSM은 약 82:1일 수 있다.

다양한 아포지단백질 및/또는 인지질 분자를 포함하는 음하전된 지단백질 복합체는 안정한 동위원소 (예를 들어, ¹³C, ¹⁵N, ²H 등); 방사성 동위원소 (예를 들어, ¹⁴C, ³H, ¹²⁵I 등); 형광단; 화학발광물질; 또는 효소 마커를 포함하는 임의의 당업계에 공지된 검출가능한 마커로 표지될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 지단백질 복합체는 바람직하게는 성숙한 전장 ApoA-I인 단백질 분획, 및 중성 인지질, 스핑고미엘린 (SM), 및 음하전된 인지질을 포함하는 지질 분획을 포함하는 음하전된 지단백질 복합체이다.

지단백질 복합체의 지질 분획을 이루는 SM 및 음하전된 인지질의 조성 및 상대적인 양이 복합체를 포함하는 조성물의 균질성 및 안정성에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. 실시예 섹션에서 예시되는 바와 같이, 지질 분획이 SM 및 음하전된 인지질으로 이루어진 복합체를 포함하는 조성물은 지질 분획이 SM 이외에 DPPC를 포함하는 유사한 조성물보다 더 균질하고 더 안정하다.

따라서, SM 및 음하전된 지질을 함유하는 본 개시내용의 복합체는 바람직하게는 그의 균질성 및 안정성을 개선하기 위해 레시틴의 부재 하에 형성된다. SM 및 음하전된 지질을 함유하는 균질한 복합체가 형성된 후에, 추가의 지질, 예컨대 레시틴이 혼입될 수 있다.

포함될 경우, 선택적인 지질은 일반적으로 약 15% 미만의 지질 분획을 이루지만, 몇몇 경우에 보다 많은 선택적인 지질이 포함될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 선택적인 지질은 약 10% 미만, 약 5% 미만, 또는 약 2% wt% 미만을 구성한다. 몇몇 실시양태에서, 음하전된 지단백질 복합체의 지질 분획은 선택적인 지질을 포함하지 않는다.

구체적인 실시양태에서, 인지질 분획은 에그 SM 또는 팔미토일 SM 또는 피토SM 및 DPPG를 90:10 내지 99:1, 보다 바람직하게는 95:5 내지 98:2, 예를 들어, 97:3의 중량비 (SM:음하전된 인지질)로 함유한다.

몇몇의 아포지단백질은 생체 내에서 한 지단백질 복합체로부터 또 다른 지단백질 복합체로 교환된다 (이것은 아포지단백질 ApoA-I에 대해 적용된다). 상기 교환 과정 동안, 아포지단백질은 일반적으로 그와 함께 하나 이상의 인지질 분자를 보유한다. 상기 특성 때문에, 본원에서 설명되는 음하전된 지단백질 복합체는 음하전된 인지질을 내인성 HDL에 "파종"하여 이를 신장에 의한 제거에 대해 보다 저항성인 알파 입자로 전환할 것으로 예상된다. 따라서, 본원에서 설명되는 음하전된 지단백질 복합체 및 조성물의 투여는 HDL의 혈청 수준을 증가시키고/시키거나 내인성 HDL 반감기 및 내인성 HDL 대사를 변경할 것으로 예상된다. 이것은 콜레스테롤 대사 및 역 지질 수송의 변경을 야기할 것으로 예상된다.

실시예 섹션에서 예시되는 바와 같이, ApoA-I:SM 및 DPPG 인지질의 중량비가 약 1:2.7인 복합체를 포함하는 조성물은 다른 중량:중량비를 갖는 유사한 조성물보다 더 균질하고 더 안정하였다. 따라서, 본 개시내용은 단백질:지질 중량비가 복합체의 균질한 집단의 형성에 최적화된 지단백질 조성물을 제공한다. 상기 중량:중량비는 ApoA-I, SM, 및 DPPG의 복합체에 대해, 및 유사한 분자 질량의 성분의 복합체에 대해 1:2.6 내지 1:3이고, 가장 적합하게는 1:2.7이다. 구체적인 실시양태에서, ApoA-I 단백질 분획 대 지질 분획의 비는 일반적으로 약 1:2.7 내지 약 1:3이고, 1:2.7이 바람직하다. 이것은 대략 1:90 내지 1:140의 ApoA-I 단백질 대 인지질의 몰비에 대응한다. 따라서, 본 개시내용은 단백질 대 지질의 몰비가 약 1:90 내지 약 1:120, 약 1:100 내지 약 1:140, 또는 약 1:95 내지 약 1:125인 복합체를 제공한다. 구체적으로 상기 최적화된 비에서, ApoA-I 단백질 분획 및 SM 및 DPPG 지질 분획은 각각 컬럼 크로마토그래피 및 겔 전기영동에 의해 검정될 때 천연 HDL과 동일한 크기 및 전하 특성을 갖는 실질적으로 균질한 복합체를 형성한다.

음하전된 지단백질 복합체의 크기는 Ri를 변경함으로써 제어될 수 있다. 즉, Ri가 작을수록, 디스크가 더 작다. 예를 들어, 큰 원반상 디스크는 일반적으로 약 200:1 내지 100:1의 Ri를 갖는 반면에, 작은 원반상 디스크는 일반적으로 약 100:1 내지 30:1 범위의 Ri를 가질 것이다.

몇몇 구체적인 실시양태에서, 음하전된 지단백질 복합체는 2-4개의 ApoA-I 동등물 (예를 들어, 2-4개 분자의 ApoA-I, 1-2개 분자의 ApoA-I_M 이량체 또는 12-40개의 단일 나선 펩티드 분자), 1개 분자의 음하전된 인지질 및 400개 분자의 SM을 함유하는 큰 원반상 디스크이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 음하전된 지단백질 복합체는 2-4개의 ApoA-I 동등물; 1-10개, 보다 바람직하게는 3-6개 분자의 음하전된 인지질; 및 90-225개 분자, 보다 바람직하게는 100-210개 분자의 SM을 함유하는 작은 원반상 디스크이다.

6.3.1. 복합체 및 입자 크기 의 측정

지단백질 복합체의 조성, 및 그의 크기 및 지단백질 복합체의 제조에 사용된 지질 입자의 크기는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 결정될 수 있다.

용액 내의 지단백질 복합체의 단백질 및 지질 농도는 단백질 및 인지질 검정, 크로마토그래피 방법, 예컨대 HPLC, 겔 여과, 질량분광법, UV 또는 다이오드-어레이, 형광, 탄성 광 산란 등을 포함하는 다양한 검출기와 연결된 GC를 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 지질 및 단백질의 통합성은 또한 동일한 크로마토그래피 기술에 의해 및 펩티드 매핑 (mapping), SDS-page 겔 전기영동, ApoA-I의 N- 및 C-말단 서열결정, 및 지질 산화를 결정하기 위한 표준 검정에 의해 결정할 수 있다.

지단백질 복합체 및 지단백질 복합체의 제조에 사용된 지질 입자의 크기는 본원에 설명된 바와 같은 범위일 수 있다. 지질 입자 크기 및/또는 지질 및 단백질 복합체 크기는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예시적인 방법은 동적 광 산란 및 겔 투과 크로마토그래피를 포함한다.

광자 상관 분광법으로도 알려진 동적 광 산란 (DLS)은 브라운 운동에 의해 용액에서 이동하는 입자를 때리는 광 빔의 파장의 변화를 측정한다. 구체적으로, 이동하는 입자는 레이저에 의해 조사될 때 광을 산란하고, 산란된 광의 생성되는 강도 변동은 용액 내의 구체의 크기 분포를 계산하기 위해 사용될 수 있다. 문헌 [Zetasizer Nano Series User Manual, MAN0317 Issue 2.1 (July 2004)]을 참조한다. DLS는 용액 내의 입자의 강도 분포 및 평균을 결정하고, 이를 기초로 하여 입자 부피 및 수 분포 및 평균을 계산할 수 있다. DLS 기술은 지단백질 복합체 제조에 사용된 지질 입자의 크기, 및 지단백질 복합체 자체의 크기를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 적합한 DLS 기기는 맬버른 인스트루먼츠의 제타사이저 나노 (Zetasizer Nano)이다.

겔 투과 크로마토그래피 (GPC)는 또한 단백질-함유 복합체의 크기를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 겔 투과 크로마토그래피는 혼합물 내의 성분을 분자 크기를 기초로 하여 분리한다. 지질-단백질 복합체의 크기는 복합체의 용리 프로파일을 공지의 표준물 또는 참조 샘플의 것과 비교함으로써, 일반적으로 보정 (calibration) 곡선과 비교함으로써 결정할 수 있다. 참조 샘플은 상업적으로 이용가능하고, 단백질 및 비-단백질 표준물, 예컨대 알부민, 페리틴, 및 비타민 B₁₂를 모두 포함할 수 있다 (문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (1998), Section IV, 10.9.1-10.9.2] 참조).

본 개시내용의 지단백질 복합체의 제조에 유용한 지질 입자의 크기는 DLS (예를 들어, 측정된 강도를 사용하여)에 의해 측정시에 적어도 45 nm, 적어도 50 nm, 적어도 55 nm, 적어도 60 nm일 수 있다. 또한, 지질 입자의 크기는 DLS에 의해 측정시에 65 nm 이하, 70 nm 이하, 80 nm 이하, 90 nm 이하, 100 nm 이하, 120 nm 이하, 150 nm 이하, 200 nm 이하, 250 nm 이하, 300 nm 이하, 또는 500 nm 이하일 수 있다.

본 개시내용의 지단백질 복합체의 크기는 본원에서 설명되는 기술에 의해 측정하였을 때 4 nm 내지 15 nm, 6 nm 내지 15 nm, 4 nm 내지 12 nm, 5 내지 12 nm, 6 nm 내지 12 nm, 8 nm 내지 12 nm, 또는 8 nm 내지 10 nm일 수 있다.

6.4. 지단백질 복합체의 집단

본 개시내용은 본원에 설명되는 지단백질 복합체의 집단을 추가로 제공한다. 집단은 예를 들어 상기 섹션 6.3에 설명된 바와 같이 각각 단백질 분획 및 지질 분획을 포함하는 본원에 설명된 바와 같은 다수의 지단백질 복합체를 포함한다. 본 발명자들은 개별적으로 또는 조합하여 지단백질 복합체의 집단의 효능 및 안전성 프로파일에 기여하는 것으로 생각되는 몇몇의 특징을 밝혀내었다. 지단백질 복합체의 집단은 본원에서 설명되는 임의의 수의 특징을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다.

먼저, 집단 내의 지단백질 복합체의 균질성, 즉, 집단 내의 지단백질 복합체의 하나 이상의 별개의 피크에 의해 표시되는 집단 내의 하나 이상의 별개의 지단백질 복합체(들)의 우세함, 및 성숙한 비변형된 아포지단백질의 지단백질 복합체 내의 우세함은 효능을 증가시키는 것으로 생각된다. 따라서, 지단백질 복합체의 집단은 아포지단백질, 예를 들어, ApoA-I을 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어지는 단백질 분획, 및 지질 분획을 포함할 수 있고, 여기서 집단은 겔 투과 크로마토그래피에서 단일 피크 내의 집단의 퍼센트에 의해 측정시에 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 균질하다.

몇몇 실시양태에서, 집단 내의 지단백질 복합체 크기는 4 nm 내지 15 nm, 예를 들어, 5 nm 내지 12 nm, 6 nm 내지 15 nm, 또는 8 nm 내지 10 nm일 수 있다.

집단 내의 아포지단백질, 예를 들어, ApoA-I은 성숙한, 바람직하게는 전장 (비말단절단된) ApoA-I일 수 있고, 집단은 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% (중량 기준)의 성숙한, 바람직하게는 전장 (비말단절단된) ApoA-I을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 집단은 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하 (중량 기준)의 미성숙한 또는 불완전하게 프로세싱된 ApoA-I 및/또는 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하 (중량 기준)의 말단절단된 ApoA-I을 포함한다.

두 번째로, 복합체 내의 아포지단백질 및 지질의 순도 및 지단백질 복합체 내의 오염물질의 상대적인 부재 (지단백질 복합체의 순도로도 언급됨)는 간 효소 (예를 들어, 트랜스아미나제)의 증가에 의해 반영되는 부작용, 예컨대 간 손상의 위험을 감소시키는 것으로 생각된다. 아포지단백질의 순도는 산화 및/또는 탈아미드화의 상대적인 결여에 의해 측정할 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서, 지단백질 복합체의 집단은 감소된 양의 산화된 아포지단백질, 예컨대 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 산화된 메티오닌, 특히 메티오닌-112 또는 메티오닌-148, 또는 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 산화된 트립토판을 가질 수 있다. 또한, 지단백질 복합체의 집단은 감소된 비율의 탈아미드화된 아미노산, 예를 들어 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 탈아미노화된 아미노산을 가질 수 있다.

지단백질 복합체 내의 지질의 순도를 제어하는 것이 또한 바람직하다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 상기 집단 내의 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하 또는 1% 이하의 지질이 산화된다.

복합체 및 그의 집단의 순도의 또 다른 척도는 아포지단백질의 생산 또는 정제 방법 또는 지단백질 복합체 자체의 제조 방법에 의한 오염물질의 감소 또는 부재이다. 따라서, 아포지단백질이 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 숙주 세포로부터 정제되는 경우에, 지단백질 복합체의 집단에는 바람직하게는 숙주 세포 DNA 또는 단백질이 없다. 구체적인 실시양태에서, 집단은 지단백질 1 mg당 500 ng 이하, 200 ng 이하, 100 ng 이하, 50 ng 이하, 또는 20 ng 이하의 숙주 세포 단백질, 및/또는 지단백질, 일반적으로 ApoA-I 1 mg당 100 pg 이하, 50 pg 이하, 25 pg 이하, 10 pg 이하 또는 5 pg 이하의 숙주 세포 DNA를 포함한다.

발생할 수 있고 방지되어야 하는 다른 오염물질은 내독소이고, 이것은 세포 배양액 및 혈장 샘플, 및 특히 지단백질 복합체를 제조하고/하거나 정제하기 위해 사용되는 방법에 따라 존재할 수 있는 용매 및 세제에 존재할 수 있다. 지단백질 복합체의 집단은 지단백질, 예를 들어 ApoA-I 1 mg 당 최대 약 1 EU, 약 0.5 EU, 약 0.3 EU, 또는 약 0.1 EU의 내독소를 포함할 수 있다. 지단백질 복합체의 집단은 또한 200 ppm, 250 ppm, 100 ppm 이하의 비-수성 용매를 함유하도록 제한될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 집단은 임의의 세제, 예를 들어, 담즙산염을 함유하지 않는다.

추가로, 본원에 개시된 방법을 이용하여, 집단 내에 존재하는 비복합체화된 아포지단백질의 양을 제한하면서 대부분의 아포지단백질 출발 물질을 복합체 내에 혼입하는 것이 가능하다. 비복합체화된 아포지단백질의 양의 감소는 이종성 단백질에 대한 노출에 의한 면역원성 반응의 위험을 감소시키기 때문에 유익하다. 지단백질 복합체의 집단은 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 단백질이 지단백질 복합체, 즉, 복합체화된 형태로 존재하는 조성물에 존재할 수 있다. 임의로, 지단백질 복합체의 집단은 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 지질이 지단백질 복합체에 존재하는 조성물에 존재할 수 있다.

임의로, 집단은 지질 분획이 지질의 중량 기준으로 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 또는 0%의 콜레스테롤을 포함하는 복합체를 포함할 수 있다.

특정 지질 및 단백질 성분은 다수의 상이하지만 균질한 지단백질 복합체를 형성할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 또한 상이한 양의 아포지단백질 분자 (예를 들어, 2, 3 또는 4개의 ApoA-I 분자 또는 ApoA-I 동등물)을 포함하는 지단백질 복합체의 2, 3 또는 4개의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 예시적인 실시양태에서, 조성물은 2개의 지단백질 복합체 집단을 포함하는데, 제1 집단은 지단백질 복합체당 2개의 ApoA-I 분자 또는 ApoA-I 동등물을 갖는 지단백질 복합체를 포함하고, 제2 집단은 지단백질 복합체당 3 또는 4개의 ApoA-I 분자 또는 ApoA-I 동등물을 갖는 지단백질 복합체를 포함하고, 임의로 제3 집단은 각각 지단백질 복합체당 4 또는 3개의 ApoA-I 분자 또는 ApoA-I 동등물을 갖는 지단백질 복합체를 포함한다.

지단백질 복합체의 2개 이상의 집단을 포함하는 조성물은 바람직하게는 낮은 수준의 비복합체화된 지단백질 및/또는 지질을 포함한다. 따라서, 바람직하게는 조성물 내의 15% 이하, 12% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 지질은 비복합체화된 형태이고/이거나, 조성물 내의 15% 이하, 12% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 지단백질은 비복합체화된 형태이다.

상업적인 용도, 예컨대 치료 목적를 위한 지단백질 복합체의 대규모 제조를 위해 특히 유용한 지단백질 복합체, 또는 그의 집단의 대규모 제제를 또한 본원에서 제공한다. 본원에서 고려되는 제제는 본원에 설명된 바와 같은 지단백질 복합체, 예를 들어, 음하전된 지단백질 복합체의 집단을 포함한다.

제제는 상업적인 규모로 조성물, 예를 들어, 제약 조성물 및 투여 형태의 제조에 적합한 지단백질 복합체의 부피, 양 및 생성되는 농도로 제공된다. 전형적인 제제 부피는 약 5 L 내지 약 50 L, 또는 그 초과, 예를 들어, 약 10 L 내지 약 40 L, 약 15 L 내지 약 35 L, 약 15 L 내지 약 30 L, 약 20 L 내지 약 40 L, 약 20 L 내지 약 30 L, 약 25 L 내지 약 45 L, 약 25 L 내지 약 35 L 범위이다. 제제는 약 5 L, 약 6L, 약 7L, 약 8L, 약 9L, 약 10 L, 약 11 L, 약 12L, 약 13L, 약 14L, 약 15 L, 약 16L, 약 17L, 약 18L, 약 19L, 약 20 L, 약 25 L, 약 30 L, 약 35 L, 약 40 L, 약 45 L, 또는 약 50 L의 부피를 가질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 제제는 약 20 L의 부피를 갖는다.

제제는 추가로 약 5 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 5 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 또는 약 8 mg/mL 내지 약 12 mg/mL의 아포지단백질의 농도를 달성하기 위해 충분한 양으로 지단백질 복합체, 또는 그의 집단을 함유한다. 제제의 부피에 따라, 양은 제제 내의 아포지단백질, 예를 들어, ApoA-I의 양으로 표현될 때 약 25 g 내지 약 350 g의 범위일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 제제는 약 8 mg/mL의 ApoA-I을 함유한다.

구체적인 실시양태에서, 제제는 15 L 내지 25 L의 부피를 갖고, 약 100 g 내지 약 250 g의 ApoA-I을 함유한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 제제는 30 L 내지 50 L의 부피를 갖고, 약 240 g 내지 약 780 g의 ApoA-I을 함유한다.

6.5. 지단백질 복합체의 제조 방법

6.5.1. 지단백질 복합체의 열 사이클링 기반 제조 방법

본원에서 설명되는 단백질 및 지질 성분의 열 사이클링을 사용한 방법은 다른 방법에 비해 잇점을 갖는 지단백질 복합체를 생성하기 위해 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 본원에서 제공되는 열 사이클링 방법에서, 단백질 성분 및 지질 성분은 대부분의 단백질 성분 (예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%)이 지질 성분과 복합체화되어 지단백질 복합체를 형성할 때까지 열 사이클링에 적용된다. 숙련된 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 지단백질 복합체의 생산을 위한 다른 방법에 비해 본 방법의 이점은 생성되는 생성물에 존재하는 부산물 (예를 들어, 비복합체화된 단백질) 또는 제조 불순물 (예를 들어, 세제 또는 계면활성제, 분해된 단백질, 산화된 성분)이 거의 내지 전혀 없으면서 실질적으로 균질한 및 순수한 최종 생성물을 생산함으로써 비용이 많이 들고 낭비가 많은 정제 단계를 필요로 하지 않는 높은 복합체화 효율성을 포함한다. 따라서, 방법은 효율적이고 출발 물질의 거의 내지 전혀 낭비하지 않는다. 또한, 방법은 규모 확대가 용이하고 낮은 설비 비용을 필요로 한다. 산업 용매를 사용하지 않으면서 상기 방법을 수행하는 능력은 또한 방법을 환경 친화적으로 만든다.

바람직하게는, 단백질 및 지질 성분의 산화를 최소화하기 위해, 복합체 형성 (지질 성분의 균질화 포함)의 하나, 하나 초과 또는 모든 단계는 불활성 기체 (예를 들어, 질소, 아르곤 또는 헬륨) 블랭킷 하에 수행된다.

6.5.2. 지질 성분

본 개시내용의 열 사이클링 방법은 상기 섹션 6.2에 설명된 바와 같이 포화, 불포화, 천연 및 합성 지질 및/또는 인지질을 포함하는 다양한 지질을 단독으로 또는 조합하여 이용할 수 있다.

지질은 지질 입자, 예컨대 다층 소포 ("MLV"), 작은 단층 소포 ("SUV"), 큰 단층 소포 ("LUV"), 미셀, 분산액 등을 생성하는 임의의 방법을 사용하여 단백질 성분과 함께 열 사이클링하기 위해 제조될 수 있다.

지질 입자의 생산을 위한 다양한 기술이 알려져 있다. 지질 입자는 상이한 종류의 소포를 형성하는 다양한 프로토콜을 사용하여 생산되었다. 본 개시내용의 열 사이클링 방법에 사용되는 입자는 주로 45-80 nm 크기 범위, 가장 바람직하게는 55 nm 내지 75 nm 크기 범위를 갖는 것이 바람직하다.

고압 균질화, 예를 들어 미세유동화는 적합한 크기의 입자를 유리하게 생산한다. 균질화 압력은 바람직하게는 적어도 1,000 바, 적어도 1,200 바, 적어도 1,400 바, 적어도 1,600 바, 적어도 1,800 바이고, 가장 바람직하게는 적어도 2,000 바, 예를 들어 적어도 2,200 바, 적어도 2,400 바, 적어도 2,600 바, 적어도 2,800 바, 적어도 3,000 바, 적어도 3,200 바, 적어도 3,400 바, 적어도 3,600 바, 적어도 3,800 바, 또는 적어도 4,000 바이다. 구체적인 실시양태에서, 균질화 압력은 상기한 값의 임의의 범위, 예를 들어, 1,600 내지 3,200 바; 1,800 내지 2,800 바; 1,900 내지 2,500 바; 2,000 내지 2,500 바; 2,000 내지 3,000 바; 2,400 내지 3,800 바; 2,800 내지 3,400 바 등이다. 1 바는 100 kPa, 1,000,000 다인/제곱센티미터 (바리 (barye)), 0.987 atm (기압), 14.5038 psi, 29.53 inHg 및 750.06 토르와 같다.

한 적합한 균질화 방법에서, 지질의 에멀젼은 마이크로플루이다이저 모델 (Microfluidizer Model) 110Y (마이크로플루이딕스 인크 (Microfluidics Inc, 미국 매사추세츠주 뉴튼))의 공급 용기로 전송된다. 균질화 동안 공정 온도 (예를 들어, 55℃, 58℃, 62℃ 등)를 유지하기 위해 장치를 조에 침지하고, 사용 전에 불활성 기체, 예컨대 아르곤으로 씻어낸다. 프라이밍 (priming) 후에, 에멀젼은 상호작용 헤드를 가로지르는 압력 구배에서 5-20분 동안 연속적인 재순환시에 균질화기 (homogenizer)를 통과한다. 단백질 성분의 부재 하의 지질 성분의 균질화는 균질화 기술에 사용된 높은 전단력에 의한 단백질 성분의 파괴를 방지한다.

적합한 크기의 입자를 얻을 수 있는 다른 방법이 적합하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 수성 용액에 의한 지질의 수화는 지질의 분산 및 다층 소포 ("MLV")의 자발적 형성을 유발할 수 있다. MLV는 중심 수성 코어를 둘러싸는 다수의 지질 이중층을 갖는 입자이다. 이들 종류의 입자는 작은 단층 소포 (SUV)보다 크고, 직경이 350-400 nm일 수 있다. MLV은 지질이 플라스크의 벽 상에 얇은 층을 형성할 때까지 지질을 환저 플라스크 내에서 클로로포름 내에 가용화시키고 클로로포름을 증발시킴으로써 제조할 수 있다. 수성 용액을 첨가하고, 지질 층을 재수화시킨다. 플라스크를 빙빙 돌리거나 또는 볼텍싱 (vortexing)할 때 소포가 형성된다 (문헌 [Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (citing Bangham et al., 1965, J. Mol. Biol. 13:238)] 참조). 상기 방법은 또한 단층 소포를 생성하기 위해서도 사용될 수 있다 (문헌 [Johnson et al., 1971, Biochim. Biophys. Acta 233:820] 참조).

작은 단층 소포 (SUV)는 수성 코어를 감싸는 단일 지질 이중층을 갖는 입자이다. SUV를 생성하기 위해 사용된 방법에 따라, 이들은 직경 25-110 nm의 크기 범위일 수 있다. 제1 SUV는 클로로포름 내의 인지질 제제를 질소 하에 건조하고, 수성 층을 첨가하여 밀리몰 범위의 지질 농도를 생성하고, 용액을 투명하게 45℃에서 초음파처리하여 제조하였다 (문헌 [Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York] 참조). 상기 방식으로 제조된 SUV는 직경이 25-50 nm 범위인 입자를 생성한다.

SUV의 또 다른 제조 방법은 에탄올/지질 용액을 캡슐화할 수성 용액 내로 신속하게 주사하는 것이다 (문헌 [Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (citing Batzri et al., 1973, Biochim. Biophys. Acta 298: 1015)] 참조). 상기 방법에 의해 생산된 SUV는 직경 30-110 nm의 크기 범위이다.

SUV는 또한 다층 소포를 20,000 psi에서 프렌치 프레스 (French Press)에 4회 통과시킴으로써 생산될 수 있다. 생산된 SUV는 직경 30-50 nm의 크기 범위일 것이다 (문헌 [Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (citing Barenholz et al., 1979, FEBS Letters 99:210)] 참조).

다층 및 단층 인지질 소포는 또한 인지질의 수성 제제를 작은 세공 막을 통해 고압으로 압출함으로써 형성될 수 있다 (문헌 [Hope et al., 1996, Chemistry and Physics of Lipids, 40:89-107] 참조)

큰 단층 소포는 중심 수성 코어를 둘러싸는 단일 지질 이중층이라는 점에서 SUV와 유사하지만, LUV는 SUV보다 훨씬 더 크다. 그의 구성하는 부분 및 그 제조에 사용되는 방법에 따라, LUV는 직경 50-1000 nm의 크기 범위일 수 있다 (문헌 [Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York] 참조). LUV는 대체로 다음 3가지 방법 중의 하나를 사용하여 제조된다: 세제 희석, 역상 증발, 및 주입.

세제 희석 기술에서, 세제 용액, 예컨대 담즙산염, 데옥시콜레이트, 옥틸 글루코시드, 헵틸 글루코시드 및 트리톤 (Triton) X-100이 지질 제제로부터 미셀을 형성하기 위해 사용된다. 이어서, 용액을 투석하여 세제를 제거한다 (문헌 [Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York] 참조).

역상 증발 기술은 지질을 수성-비극성 용액에 용해시켜 뒤집힌 (inverted) 미셀을 형성한다. 비극성 용매는 증발되고, 미셀은 응집하여 LUV를 형성한다. 상기 방법은 일반적으로 다량의 지질을 필요로 한다.

주입 방법은 비-극성 용액 내에 가용화된 지질을 캡슐화할 수성 용액 내로 주사한다. 비극성 용액이 증발함에 따라, 지질은 기체/수성 계면 상에 수집된다. 지질 시트는 기체가 수성 용액을 통해 거품을 내면서 LUV 및 올리고층 (oligolamellar) 입자를 형성한다. 입자는 여과에 의해 크기별로 분류된다 (문헌 [Deamer et al., 1983, in Liposomes (Ostro, Ed.), Marcel Dekker, Inc. New York (citing Deamer et al., 1976, Biochim. Biophys. Acta 443:629 and Schieren et al., 1978, Biochim. Biophys. Acta 542:137)] 참조).

지질 입자가 본원에 개시된 열 사이클링 방법에서 지질 성분으로서 사용하기 적합함을 확인하기 위해, 생성되는 지질 제제의 분취액의 특성을 결정할 수 있다. 지질 제제의 특성결정은 크기 배제 여과, 겔 여과, 컬럼 여과, 겔 투과 크로마토그래피, 및 비-변성 겔 전기영동을 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

6.5.3. 단백질 성분

지단백질 복합체의 단백질 성분은 본 열 사이클링 방법의 성공에 중요하지 않다. 치료 및/또는 예방적 이익을 제공하는 실질적으로 임의의 지질-결합 단백질, 예컨대 아포지단백질 및/또는 그의 유도체 또는 유사체가 복합체 내에 포함될 수 있다. 또한, 임의의 알파-나선 펩티드 또는 펩티드 유사체, 또는 지질과 회합할 때 LCAT를 활성화하거나 원반상 입자를 형성할 수 있다는 점에서 아포지단백질 (예컨대, 예를 들어 ApoA-I)의 활성을 "모방하는" 임의의 다른 종류의 분자가 지단백질 복합체에 포함될 수 있고, 따라서 용어 "지질-결합 단백질"의 정의에 포함된다. 열 사이클링 방법에 사용될 수 있는 지질-결합 단백질은 상기 섹션 6.1에 설명된 것을 포함한다. 지질-결합 단백질은 상기 섹션 6.1.2에 설명된 바와 같이 재조합 방식으로 생산할 수 있다. 지질-결합 단백질은 상기 섹션 6.1.3 또는 섹션 6.1.4에 설명된 것을 비롯하여 본원에 설명되는 임의의 방법에 의해 정제할 수 있다.

단백질 성분은 당업계에 잘 공지된 바와 같이 동물 공급원으로부터 (및 특히 인간 공급원으로부터) 정제되거나, 화학적으로 합성되거나 또는 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chung et al., 1980, J. Lipid Res. 21(3):284-91]; [Cheung et al., 1987, J. Lipid Res. 28(8):913-29]을 참조한다. 또한, 미국 특허 번호 5,059,528, 5,128,318, 6,617,134; 미국 특허 공개 번호 20002/0156007, 2004/0067873, 2004/0077541, 및 2004/0266660; 및 PCT 공개 번호 WO/2008/104890 및 WO/2007/023476을 참조한다.

단백질 성분은 요구되는 복합체 내의 단백질/펩티드 대 지질 비보다 적어도 5배 더 큰 (예를 들어, 적어도 5배, 적어도 10배 또는 적어도 20배 더 큰) 단백질/펩티드 대 지질 비로 지질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 요구되는 단백질 대 지질 비가 몰 기준으로 1:200인 지단백질 복합체를 생산하기 위해, 단백질 성분 내의 단백질은 지질, 일반적으로 최종 복합체 내에 단지 작은 분획의 지질을 제시하는 것과, 예를 들어 1:10 내지 1:20의 비로 조합될 수 있다. 임의의 메카니즘을 제시하지는 않지만, 상기 단백질의 소량의 지질에 대한 "예비-" 복합체화는 요구되는 복합체가 하나 초과의 종류의 지질을 갖고, 따라서 열 사이클링에 의해 생산된 지단백질 복합체 내에 소량 (예를 들어, 요구되는 지단백질 복합체 내의 총 지질의 10 중량% 이하, 5 중량% 이하, 3 중량% 이하, 2 중량% 이하, 또는 1 중량% 이하)으로 존재하는 지질의 보다 균질한 분포를 허용할 때 유용하다.

6.5.4. 열 사이클링에 의한 지단백질 복합체의 생성

방법은 일반적으로 지단백질 복합체가 형성될 때까지 지질 입자 및 지질 결합 단백질을 포함하는 현탁액을 "높은" 온도 범위와 "낮은" 온도 범위 사이에서 열 사이클링하는 것을 수반한다.

열 사이클링되는 현탁액은 열 사이클링에 적용되는 "출발" 현탁액을 형성하기 위해서, 바람직하게는 고온 범위의 온도에서 함께 존재하는 지질 성분 및 단백질 성분을 함유한다.

출발 현탁액 내의 지질 및 단백질의 최적 비는 생산되는 궁극적인 지단백질 복합체 내의 성분의 요구되는 화학양론에 의해 결정된다. 숙련된 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 지질 분획 대 단백질 분획의 몰비는 다른 인자 중에서 단백질 성분 내의 단백질 및/또는 펩티드의 종류(들), 지질 분획 내의 지질의 종류 및 양, 및 지단백질 복합체의 요구되는 크기에 따라 결정될 것이다. 지단백질 복합체 내의 적합한 지질 대 단백질 비는 겔 전기영동 이동성 검정, 크기 배제 크로마토그래피, HDL 수용체와의 상호작용, ATP-결합 카세트 수송체 (ABCAl)에 의한 인식, 간에 의한 흡수, 및 약동학/약력학을 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 많은 기능적 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 겔 전기영동 이동성 검정은 복합체 내의 지질 성분 대 단백질 성분의 최적 비를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해 생산된 복합체가 지질 성분 내에 인지질을 포함시킨 결과로서 하전될 경우, 복합체는 천연 프리-베타-HDL 또는 알파-HDL 입자와 유사한 전기영동 이동성일 보이도록 설계될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 천연 프리-베타-HDL 또는 알파-HDL 입자는 복합체의 이동성을 결정하기 위한 표준물로서 사용될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 궁극적인 복합체는 그 내용이 본원에 참고로 포함된 PCT WO2006/100567에 기재된 것과 같은, 적어도 하나의 아포지단백질 또는 아포지단백질 모방체 (가장 바람직하게는 각각 성숙한 인간 ApoA-I 또는 ApoA-I 펩티드), 적어도 하나의 중성 지질, 및 적어도 하나의 음하전된 지질을 갖는다.

아포지단백질, 예컨대 ApoA-I의 생물학적 활성은 아포지단백질을 포함하는 양친매성 나선에 의해 매개된다고 생각되기 때문에, 지질:아포지단백질 몰비의 아포지단백질 분획을 ApoA-I 단백질 동등물을 사용하여 표현하는 것이 편리하다. 나선을 계산하기 위해 사용된 방법에 따라 ApoA-I이 6-10개의 양친매성 나선을 함유함이 일반적으로 승인된다. 다른 아포지단백질은 이들이 함유하는 양친매성 나선의 수를 기초로 하여 ApoA-I 동등물의 측면에서 표현될 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 디술피드-가교된 이량체로서 존재하는 ApoA-I_M은 2개의 ApoA-I 동등물로 표현될 수 있고, 이것은 ApoA-I_M의 각각의 분자가 ApoA-I 분자보다 2배 많은 양친매성 나선을 함유하기 때문이다. 이와 반대로, 단일 양친매성 나선을 함유하는 펩티드 아포지단백질은 1/10-1/6 ApoA-I 동등물로서 표현될 수 있고, 그 이유는 각각의 분자가 ApoA-I 분자보다 1/10-1/6배의 양친매성 나선을 함유하기 때문이다.

일반적으로, 지단백질 복합체의 지질:ApoA-I 동등물 몰비 (본원에서 "Ri"로서 정의됨)는 약 2:1 내지 200:1 범위일 것이다. 몇몇 실시양태에서, Ri는 약 50:1 내지 150:1, 또는 75:1 내지 125:1, 10:1 내지 175:1이다. 중량비는 인지질에 대해 대략 650-800의 MW를 사용하여 얻어질 수 있다.

특정 실시양태에서, 성분의 몰비는 2-6 (음하전된 지질, 예를 들어, DPPG):90-120 (중성 지질, 예를 들어, SM):1 (ApoA-I 동등물)이다. 실시예 1에서 설명되는 구체적인 실시양태에서, 복합체는 DPPG, SM 및 ApoA-I을 대략 108:1의 지질 대 단백질 몰비로 포함하고, DPPG는 총 지질의 3 중량% (+/-1%)를 나타내고, SM은 지질의 97 중량% (+/-5%)를 나타낸다.

열 사이클링의 개시 전에 출발 현탁액 내의 지질 및 단백질 성분의 농도는 1 내지 30 mg/ml 농도의 ApoA-I 동등물 및 1 내지 100 mg/ml 농도의 지질일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 단백질 성분의 농도는 1 내지 30 mg/ml, 2 내지 20 mg/ml, 5 내지 20 mg/ml, 2 내지 10 mg/ml, 5 내지 15 mg/ml, 5 내지 20 mg/ml, 및 10 내지 20 mg/ml로부터 선택되고, 지질 성분의 농도는 10 내지 100 mg/ml, 10 내지 75 mg/ml, 25 내지 50 mg/ml, 10 내지 75 mg/ml, 25 내지 100 mg/ml, 25 내지 75 mg/ml, 및 1 내지 75 mg/ml로부터 독립적으로 선택된다.

열 사이클링 공정의 고온 및 저온 범위는 지단백질 복합체의 지질 및 단백질 성분의 상 전이 온도를 기초로 한다. 별법으로, 불포화 지방산 사슬을 갖는 인지질 또는 인지질의 혼합물을 사용할 때 발생할 수 있는 규정된 또는 별개의 상 전이를 지질 성분이 보이지 않는 경우에, 열 사이클링의 고온 및 저온 범위는 적어도 약 20℃, 약 40℃ 이하 또는 심지어 그보다 더 높은 온도만큼 상이하다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 저온 및 고온 범위는 20℃-30℃, 20℃-40℃, 20℃-50℃, 30℃-40℃, 30℃-50℃, 25℃-45℃, 35℃-55℃만큼 상이하다.

지질에 대해, 상 전이는 겔 상태로 알려진, 긴밀하게 충전되고 규칙적인 구조로부터 유체 상태로 알려진, 느슨하게 충전되고 덜-규칙적인 구조로의 변화를 수반한다. 지단백질 복합체는 일반적으로 지질 입자 및 아포지단백질을 사용되는 특정 지질 또는 지질의 혼합물의 전이 온도 근처의 온도에서 인큐베이팅함으로써 당업계에서 형성된다. 지질 성분의 상 전이 온도 (열량 측정에 의해 결정될 수 있음) +/- 5℃-10℃는 본 개시내용의 방법에서 "낮은" 온도 범위를 나타낸다.

단백질에 대해, 상 전이 온도는 폴딩된 3차원 구조로부터 2차원 구조로의 변화를 수반한다. 지질에 대해, 상 전이는 겔 상태로 알려진, 긴밀하게 충전되고 규칙적인 구조로부터 유체 상태로 알려진, 느슨하게 충전되고 덜-규칙적인 구조로의 변화를 수반한다. 지단백질 복합체는 일반적으로 당업계에서 지질 입자 및 아포지단백질을 사용되는 특정 지질 또는 지질의 혼합물의 전이 온도 근처의 온도에서 인큐베이팅함으로써 형성된다.

지질 성분의 상 전이 온도 (열량 측정에 의해 결정될 수 있음) +/-12℃, 보다 바람직하게는 +/-10℃는 본 개시내용의 방법에서 "낮은" 온도 범위를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 저온 범위는 지질 성분의 상 전이 온도의 +/-3℃, +/-5℃, 또는 +/-8℃이다. 하나의 구체적인 실시양태에서, 저온 범위는 지질 성분의 상 전이 온도보다 5℃ 이상 또는 10℃ 이상 더 낮은 온도 내지 5℃ 더 높은 온도까지이다.

출발 현탁액은 출발 현탁액 내의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 단백질이 지단백질 복합체 내에 혼입될 때까지, 바람직하게는 고온에서 출발하는, 고온 내지 저온 사이의 열 사이클링에 적용된다. 적합한 화학양론적 양의 지질 및 단백질 성분을 사용하여, 지질 및 단백질 성분의 실질적으로 완전한 복합체화는 몇회의 사이클 후에 도달할 수 있다. 사이클의 수는 단백질 및 지질 성분, 사이클 지속 시간에 따라 결정될 것이지만, 일반적으로 5회 이상의 사이클, 10회 이상의 사이클, 또는 15회 이상의 사이클 (고온 및 저온 둘 모두에서의)이 실질적으로 완전한 복합체화를 위해 필요할 것이다. 사이클은 일반적으로 2분 내지 60분의 범위이다. 구체적인 실시양태에서, 사이클은 각각의 온도에서 5 내지 30분, 10 내지 20분, 5 내지 20분, 2 내지 45분, 또는 5 내지 45분의 범위이다.

상기 방법에 의해 생산된 복합체는 일반적으로 단백질 성분이 인지질과 단백질 사이의 특정 화학양론적 범위에서 균질한 크기 분포로 인지질 성분에 물리적으로 결합된 미셀, 소포, 구형 또는 원반상 입자로서 형성된 초거대분자 회합체이다. 본 방법은 출발 현탁액 내의 지질 및/또는 단백질의 실질적으로 완전한 복합체화를 유리하게 유도하여, 크로마토그래피와 같은 분리 방법에서 관찰되는 바와 같이 유리 지질 및/또는 유리 단백질이 실질적으로 없는 조성물을 생성한다. 따라서, 본 개시내용의 방법은 정제 단계의 부재 하에 수행할 수 있다.

본 개시내용의 방법은 그의 크기 분포가 균질하여 크기 분획화의 필요성이 없는 복합체를 유리하게 생산한다.

본 개시내용의 몇몇 실시양태에서, 지단백질 복합체는 하나 이상의 지질을 포함하는 하나 초과의 종류의 지질을 비교적 소량 (예를 들어, 10% 미만, 5% 미만, 3% 미만 또는 1% 미만의 지질 성분)으로 함유할 것이다. 분산을 최적화하기 위해, 소량으로 사용되는 지질은 지질 성분 내의 지질 입자에 혼입되기보다는 단백질 성분과 예비 블렌딩될 수 있다.

복합체가 요구되는 특성을 갖는 것을, 예를 들어, 지질 성분 내로 단백질 성분의 실질적으로 완전한 (예를 들어, >90%, >95%, >97% 또는 >98%) 혼입을 갖는 것을 확인하기 위해, 생성되는 지단백질 복합체의 분취액의 특성을 결정할 수 있다. 복합체의 특성결정은 크기 배제 여과, 겔 여과, 컬럼 여과, 겔 투과 크로마토그래피, 및 비-변성 겔 전기영동을 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

본원에서 설명되는 지단백질 복합체 또는 조성물의 균질성 및/또는 안정성은 크로마토그래피 방법, 예컨대 겔 여과 크로마토그래피를 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 단일 피크 또는 제한된 수의 피크는 안정한 복합체와 연관될 수 있다. 복합체의 안전성은 시간 경과에 따른 새로운 피크의 출현에 의해 결정할 수 있다. 새로운 피크의 출현은 입자의 불안정성 때문에 복합체 사이의 재구성의 징후이다.

바람직하게는, 단백질 및 지질 성분의 산화를 최소화하기 위해, 열 사이클링은 불활성 기체 (예를 들어, 질소, 아르곤 또는 헬륨) 블랭킷 하에 수행된다.

6.5.5. 지단백질 복합체의 다른 제조 방법

음하전된 지단백질 복합체를 비롯하여 본원에 설명되는 지단백질 복합체는 소포, 리포좀, 프로테오리포좀 (proteoliposome), 미셀, 및 원반상 입자를 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 형태로 제조될 수 있다. 상기 설명된 열 사이클링 방법에 추가로, 당업자에게 공지된 다양한 방법이 지단백질 복합체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 리포좀 또는 프로테오리포좀을 제조하기 위한 다양한 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 아포지단백질은 복합체를 형성하기 위해서 적절한 인지질과 함께 동시에 초음파 처리될 수 있다 (초음파 조 또는 초음파 프로브 사용). 별법으로, 아포지단백질, 예를 들어, ApoA-I은 예비형성된 지질 소포와 조합되어 지단백질 복합체의 자발적 형성을 유도할 수 있다. 지단백질 복합체는 또한 세제 투석 방법에 의해 형성될 수 있고; 예를 들어, 아포지단백질, 하전된 인지질(들), 및 SM 및 세제, 예컨대 담즙산염의 혼합물을 투석하여 세제를 제거하고, 재구성하여 음하전된 지단백질 복합체를 형성하거나 (예를 들어, 문헌 [Jonas et al., 1986, Methods in Enzymol. 128:553-82] 참조), 또는 압출기 장치를 사용하거나 또는 균질화에 의해 형성될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 복합체는 약 40, 약 50, 또는 약 60분 동안 고압 (예를 들어, 약 32000 p.s.i.)을 사용한 균질화에 의해 제조한다. 구체적인 실시양태에서, ApoA-I, SN, 및 DPPG를 포함하는 복합체는 다음과 같이 제조된다. ApoA-I을 인산염 완충제에 용해하고, 높은 전단 혼합기를 사용하여 제조된 인산염 완충제 내의 DPPG의 분산액과 함께 50℃에서 인큐베이팅한다. ApoA-I/DPPG 혼합물을 이어서 SM의 분산액과 조합하고, 동적 광 산란 또는 겔 투과 크로마토그래피에 의해 모니터링할 때 복합체 형성이 실질적으로 완전할 때까지 30-50℃에서 30,000 p.s.i.를 초과하는 압력에서 균질화한다.

몇몇 실시양태에서, 지단백질 복합체는 그 개시내용 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 공개 번호 2004/0067873의 실시예 1에 기재된 담즙산염 분산 방법에 의해 제조할 수 있다. 간단히 설명하면, 건조 지질을 NaHCO₃ 완충제에서 수화한 후, 볼텍싱하고, 모든 지질이 분산될 때까지 초음파 처리한다. 담즙산염 용액을 첨가하고, 혼합물이 투명해질 때까지 (지질 담즙산염 미셀이 형성됨을 나타냄) 주기적으로 볼텍싱하고 초음파 처리하면서 30분 동안 인큐베이팅한다. NaHCO₃ 완충제 내의 프로ApoA-I을 첨가하고, 용액을 1시간 동안 대략 37℃-50℃에서 인큐베이팅한다.

담즙산염은 당업계에 잘 공지된 방법에 의해 제거될 수 있다. 예를 들어 담즙산염은 투석, 한외여과에 의해 또는 친화도 비드 또는 수지 상에 대한 흡착 흡수에 의한 담즙산염 분자의 제거에 의해 제거될 수 있다. 한 실시양태에서, 친화도 비드, 예를 들어, 바이오-비즈(BIO-BEADS)® (바이오-라드 래보러토리즈 (Bio-Rad Laboratories))는 담즙산염을 흡착하기 위해 음하전된 지단백질 복합체 및 담즙산염의 제제에 첨가한다. 또 다른 실시양태에서, 지단백질 복합체 및 담즙산염의 제제, 예를 들어, 미셀 제제는 친화도 비드로 충전된 컬럼을 통과한다.

구체적인 실시양태에서, 담즙산염은 제제를 주사기 내의 바이오-비즈® 상에 로딩함으로써 지단백질 복합체의 제제로부터 제거된다. 이어서, 주사기를 장벽 필름으로 밀봉하고, 4℃에서 흔들면서 밤새 인큐베이팅한다. 사용 전에, 담즙산염은 용액을 바이오-비즈®를 통해 주사함으로써 제거되고, 여기서 담즙산염은은 비드에 의해 흡착된다.

본원에 설명되는 지단백질 복합체, 예컨대 음하전된 지단백질 복합체는 복합체가 HDL, 특히 프리-베타-1 또는 프리-베타-2 HDL 집단 내의 HDL과 유사한 크기 및 밀도를 가질 때 순환시에 증가된 반감기를 가질 것으로 예상된다. 긴 저장 수명을 갖는 안정한 제제는 동결건조에 의해 제조될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 당업계에 통상적으로 알려진 동시-동결건조 방법이 ApoA-I-지질 복합체의 제조를 위해 사용된다. 간단히 설명하면, 동시-동결건조 단계는 ApoA-I 및 지질의 혼합물을 유기 용매 또는 용매 혼합물에 용해시키거나, 또는 ApoA-I 및 지질을 별개로 용해시키고 이들을 함께 혼합하는 것을 포함한다. 동시-동결건조를 위한 용매 또는 용매 혼합물의 바람직한 특성은 다음을 포함한다: (i) 소수성 지질 및 양친매성 단백질을 용해시킬 수 있는 중간 상대 극성, (ii) 잔류 유기 용매와 연관된 잠재적인 독성을 방지하기 위한 FDA 용매 가이드라인 (Federal Register, volume 62, No. 247)에 따른 클래스 2 또는 클래스 3 용매, (iii) 동결건조 동안 용이한 용매 제거를 보장하기 위한 낮은 비점, (iv) 보다 신속한 동결을 제공하기 위한 높은 융점, 보다 높은 응축 온도 및 동결-건조기에 대한 보다 작은 마모 및 손상. 몇몇 실시양태에서, 빙초산이 사용된다. 메탄올, 빙초산, 자일렌, 또는 시클로헥산의 조합물도 사용될 수 있다.

이어서, ApoA-I-지질 용액을 균질한 분말을 얻기 위해 동결건조한다. 동결건조 조건은 동결건조된 아포지단백질-지질 분말에 최소량의 잔류 용매를 남기면서 용매의 신속한 증발을 얻기 위해 최적화될 수 있다. 동결-건조 조건의 선택은 용매의 특성, 용기의 종류 및 치수, 유지 용액, 충전 부피, 및 사용된 동결-건조기의 특성에 따라 당업자가 결정할 수 있다.

동결건조된 지단백질 복합체는 제약 재제제화를 위한 벌크 공급물을 제조하거나 지단백질 복합체의 용액 또는 현탁액을 얻기 위해 재구성될 수 있는 개별적인 분취액 또는 투여량 단위를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 재구성을 위해, 동결건조된 분말은 수성 용액을 사용하여 적합한 부피 (예를 들어, 정맥내 주사에 편리한 5 mg 폴리펩티드/ml)로 재수화된다. 몇몇 실시양태에서, 동결건조된 분말은 인산염 완충 염수 또는 생리학적 염수 용액으로 재수화된다. 혼합물은 재수화를 촉진하기 위해 교반되거나 볼텍싱될 수 있다. 재구성 단계는 복합체의 지질 성분의 상 전이 온도와 같거나 더 높은 온도에서 수행할 수 있다.

ApoA-I-지질 복합체는 적절한 pH 및 삼투질 농도의 수성 배지로 동결건조된 아포지단백질-지질 분말을 수화시킨 후에 자발적으로 형성될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 수화 배지는 수크로스, 트레할로스 및 글리세린을 포함하고 이로 제한되지 않는 안정화제를 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 용액은 복합체가 형성되도록 지질의 전이 온도 초과로 수회 가열된다. 지질 대 단백질의 비는 1:1 내지 200:1 (몰/몰)일 수 있고, 바람직하게는 3:1 내지 2:1의 지질:단백질 (w/w), 보다 바람직하게는 2.7:1 내지 2.1:1의 지질:단백질 (w/w), 예를 들어, 2.7:1의 지질:단백질 (w/w)일 수 있다. 분말은 단백질 동등물로 표현된 5-30 mg/ml의 최종 복합체 농도를 얻기 위해 수화된다.

다양한 실시양태에서, ApoA-I 분말은 NH₄HCO₃ 수용액 내의 폴리펩티드 용액을 동결-건조함으로써 얻을 수 있다. 이어서, ApoA-I 및 지질 (예를 들어, 스핑고미엘린)의 균질한 용액을 지질 분말 및 ApoA-I 분말을 빙초산에 용해시킴으로써 형성한다. 이어서, 용액을 동결건조하고, 수성 배지 내에서 생성되는 분말의 수화에 의해 HDL-유사 아포지단백질-지질 복합체가 형성된다.

몇몇 실시양태에서, ApoA-I-지질 복합체는 인지질 및 단백질 용액 또는 현탁액의 동시-동결건조에 의해 형성된다. 유기 용매 또는 유기 용매 혼합물 내의 ApoA-I 및 지질 (예를 들어, 인지질)의 균질한 용액을 동결건조하고, 이어서 수성 완충제 내에서 동결건조된 분말의 수화에 의해 ApoA-I-지질 복합체가 자발적으로 형성된다. 상기 방법에 사용하기 위한 유기 용매 및 용매 혼합물의 예는 초산, 초산/자일렌 혼합물, 초산/시클로헥산 혼합물, 및 메탄올/자일렌 혼합물을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

복합체가 요구되는 크기 분포; 예를 들어, HDL의 크기 분포를 갖는지 확인하기 위해, 생성되는 재구성된 제제의 분취액의 특성을 결정할 수 있다. 크기 특성을 결정하기 위한 예시적인 방법은 겔 여과 크로마토그래피이다. 공지의 분자량 및 스토크스 직경의 일련의 단백질, 및 인간 HDL이 컬럼을 보정하기 위한 표준물로서 사용될 수 있다.

다른 실시양태에서, 재조합 ApoA-I-지질 복합체는 그 개시내용 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 공개 번호 2006/0217312 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2006/100567 (PCT/IB2006/000635)에 개시된 지질로 ApoA-I을 복합체화함으로써 제조된다.

미국 특허 번호 6,004,925, 6,037,323, 6,046,166 및 6,287,590 (그 전체가 본원에 참고로 포함된)은 HDL과 유사한 특성을 갖는 음하전된 지단백질 복합체를 제조하는 간단한 방법을 개시하고 있다. 유기 용매 (또는 용매 혼합물) 내에서의 아포지단백질 및 지질 용액의 동시-동결건조 및 동결건조된 분말의 수화 동안 음하전된 지단백질 복합체의 형성을 수반하는 상기 방법은 다음과 같은 이점을 갖는다: (1) 방법은 매우 적은 단계를 필요로 하고; (2) 방법은 저렴한 용매(들)을 사용하고; (3) 대부분의 또는 모든 포함된 성분은 설계된 복합체를 형성하기 위해 사용되고, 따라서 다른 방법에 공통적인 출발 물질의 낭비를 방지하고; (4) 생성되는 복합체가 사용 직전에 재구성될 수 있도록 저장 동안 매우 안정한 동결건조된 복합체가 형성되고; (5) 생성되는 복합체는 대체로 형성 후 및 사용 전에 추가로 정제될 필요가 없고; (6) 세제, 예컨대 담즙산염을 포함하는 독성 화합물이 방지되고; (7) 생산 방법은 쉽게 규모 확장될 수 있고 GMP 제조에 (즉, 내독소-미함유 환경에서) 적합하다.

다른 적합한 방법은 각각의 개시내용 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0217312 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2006/100567 (PCT/IB 2006/000635)에 기재되어 있다.

바람직하게는, 단백질 및 지질 성분의 산화를 최소화하기 위해, 복합체 형성의 하나, 하나 초과 또는 모든 단계는 불활성 기체 (예를 들어, 질소, 아르곤 또는 헬륨) 블랭킷 하에 수행된다.

용액 내의 아포지단백질-지질 입자의 단백질 및 지질 농도는 단백질 및 인지질 검정, 크로마토그래피 방법, 예컨대 HPLC, 겔 여과, 질량분광법, UV 또는 다이오드-어레이, 형광, 탄성 광 산란 등을 포함하는 다양한 검출기와 연결된 GC를 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 지질 및 단백질의 통합성은 또한 동일한 크로마토그래피 기술에 의해 및 펩티드 매핑, SDS-page 겔 전기영동, ApoA-I의 N- 및 C-말단 서열결정, 및 지질 산화를 결정하기 위한 표준 검정에 의해 결정할 수 있다.

6.6. 제약 조성물

본 개시내용에 의해 고려되는 제약 조성물은 생체 내에서의 투여 및 전달에 적합한 제약상 허용되는 담체 내의 활성 성분으로서 음하전된 지단백질 복합체를 포함한다. 펩티드는 산성 및/또는 염기성 말단 및/또는 측쇄를 포함할 수 있기 때문에, 펩티드 모방체 아포지단백질은 유리 산 또는 염기의 형태, 또는 제약상 허용되는 염의 형태로 조성물에 포함될 수 있다. 변형된 단백질, 예컨대 아미드화, 아실화, 아세틸화 또는 페길화 (pegylated) 단백질도 사용될 수 있다. 임의로, 제약 조성물은 상기 섹션 6.2 및 6.3에 설명된 바와 같이 하나 이상의 소수성, 지질친화성, 또는 무극성 활성제로 로딩된 지단백질 복합체를 포함할 수 있다.

주사가능 조성물은 수성 또는 오일상 비히클 내의 활성 성분의 멸균 현탁액, 용액 또는 에멀젼을 포함한다. 또한, 조성물은 제제화제, 예컨대 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 주사가능 조성물은 인산염 완충 염수 (10 mM 인산나트륨, 80 mg/mL 수크로스, pH 8.2) 내의 음하전된 지단백질 복합체를 포함한다. 주사용 조성물은 단위 투여 형태로, 예를 들어 앰퓰 또는 다중 투여 용기에 제시될 수 있고, 첨가된 보존제를 포함할 수 있다. 주입에 대해, 조성물은 음하전된 지단백질 복합체와 상용성인 물질, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 상용성 물질로 제조된 주입 백에 제공될 수 있다.

적합한 투여 형태는 약 5 mg/mL 내지 약 15 mg/mL의 지단백질의 최종 농도에서 음하전된 지단백질 복합체를 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 투여 형태는 약 8 mg/mL 내지 약 10 mg/mL의 아포지단백질 A-I, 바람직하게는 약 8 mg/mL의 최종 농도에서 음하전된 지단백질 복합체를 포함한다.

바람직하게는, 단백질 및 지질 성분의 산화를 최소화하기 위해, 제약 조성물은 불활성 기체 (예를 들어, 질소, 아르곤 또는 헬륨) 블랭킷 하에서 제제화 및/또는 충전된다.

6.7. 치료 방법

본원에서 설명되는 지단백질 복합체, 예를 들어, 음하전된 지단백질 복합체, 및 조성물은 지단백질 복합체가 유용한 것으로 밝혀진 실질적으로 모든 목적을 위해 사용될 수 있다. 지단백질 복합체, 예컨대 음하전된 지단백질 복합체는 현재 이용가능한 치료 요법에서 요구되는 아포지단백질의 양 (2 내지 5일마다 투여당 20 mg/kg 내지 100 mg/kg, 평균 체구의 인간당 1.4 g 내지 8 g)보다 유의하게 더 낮은 용량으로 투여될 때에도 콜레스테롤 이동에 효과적이다.

따라서, 본 개시내용의 복합체 및 조성물은 심혈관 질환, 장애, 및/또는 연관된 병태의 치료 또는 예방 특히 유용하다. 대상체에서 심혈관 질환, 장애, 및/또는 연관된 병태의 치료 또는 예방 방법은 일반적으로 대상체에게 낮은 (<15 mg/ kg) 용량 또는 특정 적응증의 치료 또는 예방에 효과적인 요법에 따른 본원에서 설명되는 지단백질 복합체 또는 제약 조성물의 양을 투여하는 것을 포함한다.

지단백질 복합체는 치료 이익을 제공하기 위해 충분한 또는 효과적인 양으로 투여된다. 심혈관 질환, 장애, 및/또는 연관된 병태의 치료의 측면에서, 치료 이익은 다음 중 하나 이상이 발생하면 예상될 수 있다: 기준선에 비해 콜레스테롤 이동의 증가, 아테롬성동맥경화 플라크 부피의 감소, 평균 혈장 트리글리세리드 농도의 증가 또는 간 트랜스아미나제 (또는 알라닌 아미노트랜스퍼라제) 수준의 정상 범위를 초과한 증가 없이 기준선 수준에 비해 유리 콜레스테롤의 고밀도 지단백질 (HDL) 분획의 증가. 완전한 치유가 바람직하지만, 치료 이익을 위해 요구되지는 않는다.

몇몇 실시양태에서, 지단백질 복합체는 주사당 약 2 mg/kg ApoA-I 동등물 내지 약 12 mg/kg ApoA-I 동등물의 용량으로 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질 복합체는 약 3 mg/kg ApoA-I 동등물의 용량으로 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질 복합체는 약 6 mg/kg ApoA-I 동등물의 용량으로 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질 복합체는 약 12 mg/kg ApoA-I 동등물의 용량으로 투여된다.

치료되는 대상체는 심혈관 질환, 장애, 및/또는 연관된 병태로 고통받는 개체이다. 본원에서 설명되는 지단백질 복합체 및 조성물로 치료 또는 예방될 수 있는 상기 심혈관 질환, 장애 및/또는 연관된 병태의 비제한적인 예는 말초 혈관 질환, 재협착증, 아테롬성동맥경화증, 및 아테롬성동맥경화증의 다양한 임상 징후, 예컨대, 예를 들어, 뇌졸중, 허혈성 뇌졸중, 일과성 허혈 발작, 심근 경색, 급성 관상동맥 증후군, 협심증, 간헐적 파행, 중증 하지 허혈, 판막 협착증, 및 심방 판막 경화증을 포함한다. 대상체는 급성 관상동맥 증후군, 예컨대 심근 경색 (ST 상승이 있거나 없는) 또는 불안정성 협심증이 이전에 발생한 개체일 수 있다. 치료받는 대상체는 임의의 동물, 예를 들어, 포유동물, 특히 인간일 수 있다.

한 실시양태에서, 방법은 대상체에게 본원에서 설명되는 하전된 지단백질 복합체 또는 조성물을 투여 후에 환자의 기준선 ApoA-I을 변경하지 않는 양으로 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환의 치료 또는 예방 방법을 포함한다.

다른 실시양태에서, 방법은 대상체에게 투여 전의 기준선 (초기) 수준보다 대략 투여 2시간 후에 약 5 mg/dL 내지 100 mg/dL 및/또는 대략 투여 24시간 후에 약 5 mg/dL 내지 20 mg/dL 더 높은 유리 또는 복합체화된 아포지단백질의 혈청 수준을 달성하기 위해 효과적인 양으로 본원에서 설명되는 지단백질 복합체 (예를 들어, 하전된 복합체) 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환의 치료 또는 예방 방법을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 방법은 대상체에게 투여 전의 초기 HDL-콜레스테롤 분획보다 적어도 약 10% 더 높은 HDL-콜레스테롤 분획의 순환 혈장 농도를 투여 후에 적어도 1일 동안 달성하기 위해 효과적인 양으로 본원에서 설명되는 지단백질 복합체 (예를 들어, 하전된 복합체) 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환의 치료 또는 예방 방법을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 방법은 대상체에게 투여 5분 내지 1일 후에 30 내지 300 mg/dL의 HDL-콜레스테롤 분획의 순환 혈장 농도를 달성하기 위해 효과적인 양으로 본원에서 설명되는 지단백질 복합체 (예를 들어, 하전된 복합체) 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환의 치료 또는 예방 방법을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 방법은 대상체에게 투여 5분 내지 1일 후에 30 내지 300 mg/dL의 콜레스테릴 에스테르의 순환 혈장 농도를 달성하기 위해 효과적인 양으로 본원에서 설명되는 지단백질 복합체 (예를 들어, 하전된 복합체) 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환의 치료 또는 예방 방법을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 방법은 대상체에게 투여 전의 기준선 (초기) 수준보다 적어도 약 10% 높은 대변 콜레스테롤 배출의 증가를 투여 후에 적어도 1일 동안 달성하기 위해 효과적인 양으로 본원에서 설명되는 지단백질 복합체 (예를 들어, 하전된 복합체) 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환의 치료 또는 예방 방법을 포함한다.

본원에서 설명되는 음하전된 지단백질 복합체, 또는 조성물을 포함하는 지단백질 복합체는 단독으로 상기 병태의 치료 또는 예방을 위해 사용되는 다른 약물과 함께 조합 요법으로 사용될 수 있다. 상기 요법은 관련 약물의 동시 또는 순차적인 투여를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 예를 들어, 고콜레스테롤혈증, 예컨대 가족성 고콜레스테롤혈증 (동형접합성 또는 이형접합성) 또는 아테롬성동맥경화증의 치료에서, 하전된 지단백질 제제는 현재 사용되는 임의의 하나 이상의 콜레스테롤 저하 요법제; 예를 들어, 담즙산 수지, 니아신, 스타틴, 콜레스테롤 흡수 억제제 및/또는 피브레이트와 함께 투여될 수 있다. 상기 조합 요법은 각각의 약물이 콜레스테롤 합성 및 수송에서 상이한 표적에 대해 작용하기 때문에 특히 유익한 치료 효과를 생성할 수 있고; 즉, 담즙산 수지는 콜레스테롤 재순환, 킬로미크론 및 LDL 집단에 영향을 주고; 니아신은 VLDL 및 LDL 집단에 1차적으로 영향을 주고; 스타틴은 콜레스테롤 합성을 억제하고, LDL 집단을 감소시키고 (및 아마도 LDL 수용체 발현을 증가시키고); 본원에서 설명되는 음하전된 지단백질 복합체를 포함하는 지단백질 복합체는 RCT에 영향을 미치고, HDL을 증가시키고, 콜레스테롤 유출을 촉진한다.

또 다른 실시양태에서, 본원에서 설명되는 음하전된 지단백질 복합체를 포함하는 지단백질 복합체, 또는 조성물은 관상동맥성 심장 질환; 관상 동맥 질환; 심혈관 질환, 재협착증, 혈관 또는 혈관주위 질환; 아테롬성동맥경화증 (아테롬성동맥경화증의 치료 및 예방 포함)의 치료 또는 예방을 위해 피브레이트와 함께 사용될 수 있고; 예시적인 제제 및 치료 요법은 아래에서 설명된다.

본원에서 설명되는 음하전된 지단백질 복합체를 포함하는 지단백질 복합체, 또는 조성물은 작은 HDL 분획, 예를 들어, 프리-베타, 프리-감마 및 프리-베타-유사 HDL 분획, 알파 HDL 분획, HDL3 및/또는 HDL2 분획을 증가시키는 투여량으로 투여될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 투여량은 예를 들어, 영상화 기술, 예컨대 자기 공명 영상화 (MRI) 또는 혈관내 초음파 (IVUS)에 의해 측정하였을 때 아테롬성동맥경화 플라크 감소를 달성하기 위해 효과적이다. IVUS의 파라미터는 기준선으로부터 영상화 부피의 변화 % 및 총 영상화 부피의 변화를 포함하고 이로 제한되지 않는다. MRI의 파라미터는IVUS에 대한 것 및 플라크의 지질 조성 및 석회화를 포함하고 이로 제한되지 않는다.

플라크 퇴행은 그 자신의 대조군 (시간 0)으로서의 환자 대 마지막 주입 종료시의 시간 t, 또는 마지막 주입 후 수주 내, 또는 요법의 개시 후 3개월, 6개월, 또는 1년 내에 측정될 수 있다.

투여는 정맥내 (IV), 근육내 (IM), 피내, 피하 (SC), 및 복강내 (IP) 주사를 포함하는 비경구 투여 경로에 의해 최상으로 달성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여는 관류기 (perfusor), 침투기 (infiltrator) 또는 카테터 (catheter)에 의해 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질 복합체, 예를 들어, 음하전된 지단백질 복합체는 주사, 피하 이식가능 펌프 또는 데포 (depot) 제제에 의해, 비경구 투여를 통해 얻어진 것과 동등한 순환 혈청 농도를 달성하는 양으로 투여된다. 또한, 복합체는 예를 들어 스텐트 (stent) 또는 다른 장치에서 흡수될 수 있다.

투여는 다양한 상이한 치료 요법을 통해 달성할 수 있다. 예를 들어, 몇몇의 정맥내 주사는 1일 동안 주기적으로 투여될 수 있고, 누적 총 주사 부피는 1일 독성 용량에 도달하지 않는다. 방법은 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12일 간격으로 지단백질 복합체를 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 지단백질 복합체는 1주 간격으로 투여된다.

방법은 지단백질 복합체를 상기한 임의의 간격으로 지단백질 복합체 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12회 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 지단백질 복합체는 각각의 투여 사이에 1주 간격으로 6회 투여된다. 몇몇 실시양태에서, 투여는 일련의 주사로서 수행한 후, 6개월 내지 1년 동안 중지될 수 있고, 이어서 또 다른 일련의 주사를 시작할 수 있다. 이어서, 일련의 유지 주사가 매년 또는 3 내지 5년마다 투여될 수 있다. 일련의 주사는 1일 (복합체의 특정 혈장 수준의 유지를 위한 관류), 수일 (예를 들어, 8일에 걸친 4회의 주사) 또는 수주 (예를 들어, 4주에 걸친 4회의 주사)에 걸쳐 수행되고, 이어서 6개월 내지 1년 후에 재시작할 수 있다. 만성 병태에 대해, 투여는 계속 진행하는 방식으로 수행될 수 있다. 임의로, 방법에는 지단백질 복합체가 보다 빈번하게 투여되는 유도 상이 선행될 수 있다.

또 다른 실시태양에서, 증가하는 용량이 투여될 수 있고, 여기서 투여당 50-200 mg의 용량으로 약 1 내지 5회 투여한 후, 투여당 200 mg 내지 1 g을 반복 투여한다. 환자의 필요에 따라, 투여는 1시간 초과로 지속되는 느린 주입, 1시간 이하의 신속한 주입, 또는 단일 볼러스 (bolus) 주사에 의해 실시될 수 있다.

다양한 지단백질 복합체의 독성 및 치료 효능은 LD50 (50%의 집단에 치사적인 용량) 및 ED50 (50%의 집단에 치료상 효과적인 용량)을 결정하기 위한 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차를 사용하여 결정될 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이고, 비 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 보이는 지단백질 복합체, 예컨대 음하전된 지단백질 복합체가 바람직하다. 따를 수 있는 파라미터의 비제한적인 예는 간 기능 트랜스아미나제 (정상적인 기준선 수준의 2X 초과)를 포함한다. 이것은 너무 많은 콜레스테롤이 간으로 이동하고 그 양을 소화할 수 없음을 나타낸다. 적혈구로부터 콜레스테롤의 이동은 적혈구를 약하게 만들거나, 또는 그의 형태에 영향을 주기 때문에, 적혈구에 대한 효과를 또한 모니터링할 수 있다.

환자는 의료 처치 (예를 들어, 예방적 처치) 수일 내지 수주 전에, 또는 의료 처치 동안 또는 후에 치료될 수 있다. 투여는 또 다른 침습성 요법, 예컨대, 혈관성형술, 경동맥 절제, 로토블레이더 (rotoblader) 또는 장기 이식 (예를 들어, 심장, 신장, 간 등)과 병용하여 또는 동시에 실시될 수 있다.

특정 실시양태에서, 음하전된 지단백질 복합체는 그의 콜레스테롤 합성이 스타틴 또는 콜레스테롤 합성 억제제에 의해 제어되는 환자에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 음하전된 지단백질 복합체는 담즙산 염 및 콜레스테롤을 포획하고, 담즙산 배출을 증가시키고 혈액 콜레스테롤 농도를 저하시키기 위해 결합 수지, 예를 들어, 반-합성 수지, 예컨대 콜레스티라민, 또는 섬유, 예를 들어, 식물 섬유를 사용한 치료를 받고 있는 환자에게 투여된다.

6.8. 다른 용도

본원에서 설명되는 지단백질 복합체, 예를 들어, 음하전된 지단백질 복합체, 및 조성물은 예를 들어 진단 목적을 위해 혈청 HDL을 측정하기 위한 시험관 내 검정에서 사용될 수 있다. ApoA-I, ApoA-II 및 Apo 펩티드는 혈청의 HDL 성분과 회합하기 때문에, 음하전된 지단백질 복합체는 HDL 집단, 및 프리-베타1 및 프리-베타2 HDL 집단에 대한 "마커"로서 사용될 수 있다. 또한, 음하전된 지단백질 복합체는 RCT에 효과적인 HDL의 아집단에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 이를 위해, 음하전된 지단백질 복합체는 환자 혈청 샘플에 첨가되거나 이와 혼합될 수 있고; 적절한 인큐베이션 시간 후에, HDL 성분은 혼입된 음하전된 지단백질 복합체를 검출함으로써 검정될 수 있다. 이것은 표지된 음하전된 지단백질 복합체 (예를 들어, 방사성 표지, 형광 표지, 효소 표지, 염료 등)를 사용하거나, 또는 음하전된 지단백질 복합체에 특이적인 항체 (또는 항체 단편)을 사용한 면역검정에 의해 달성할 수 있다.

별법으로, 표지된 음하전된 지단백질 복합체는 HDL이 콜레스테롤 유출시에 활성을 가져야 하는 지방 선조, 아테롬성동맥경화증 병변 등에서 순환계를 가시화하기 위해, 또는 RCT를 모니터링하기 위해, 또는 HDL의 축적을 가시화하기 위해 영상화 절차 (예를 들어, CAT 스캔, MRI 스캔)에서 사용될 수 있다.

특정 프로ApoA-I-지질 복합체의 제조 및 특성결정과 연관된 실시예 및 데이터는 그 개시내용 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 공개 번호 2004/0067873에 기재되어 있다.

특정 프로ApoA-I-지질 복합체를 사용한 동물 모델 시스템에서 얻은 데이터는 그 개시내용 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 공개 번호 2004/0067873에 기재되어 있다.

7. 실시예 1: APOA -I 발현 시스템의 개발

7.1. 차이니즈 햄스터 난소 ( CHO ) 세포에서 인간 ApoA -I의 클로닝 및 발현

7.1.1. ApoA -I 발현 벡터의 제조

프리프로ApoA-I 유전자 서열은 NCBI (P02647)로부터 얻었고, 인접 서열을 용이한 클로닝 및 개선된 발현을 위해 부가하였다. 프리프로ApoA-I 코딩 DNA를 인접 서열과 함께 합성하고, 블루스크립트 (Bluescript) KS+ 벡터 내로 클로닝하였다. 5' 인접 서열은 최적화된 코작 (Kozak) 번역 서열을 함유하였다. 프리프로ApoA-I 삽입체를 Hind III 및 Bgl II 제한 효소로 블루스크립트 KS+ 벡터로부터 절제하였다. 상기 단편을 겔-정제하고, 다음 유전 요소를 보유하는 레트로바이러스 발현 벡터에 라이게이션하였다: 몰로니 뮤린 육종 바이러스 5' LTR에 융합된 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터, MoMuLV/SV 패키징 (packaging) 영역, 최조기 원숭이 사이토메갈로바이러스 프로모터, 다중 클로닝 부위, MoMuLV로부터의 3' LTR, 및 세균 복제 기점 및 베타-락타마제 유전자. 생성되는 구축물의 클론을 유전자 및 인접 영역을 통해 서열결정하였다. 최종 클론 (클론 #17)은 예측된 DNA 서열에 대한 일치를 기초로 하여 선택하였다. 이어서, 수포성 구내염 바이러스 외피 당단백질의 발현 플라스미드로 동시 형질감염된 293GP 세포를 사용한 형질도입을 위한 레트로벡터를 제조하였다. 상청액을 동시 형질감염된 세포로부터 회수하여 농축하고, 아래 섹션 7.1.2에 설명된 CHO-S 형질도입 단계를 위해 사용하였다.

7.1.2. ApoA -I의 발현을 위한 포유동물 세포주의 생산

혈청-미함유 배지에서 성장하기에 적합한 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO-S)를 섹션 7.1.1.에서 설명한 레트로바이러스 벡터를 사용하여 3 라운드의 형질도입 (1X, 2X, 및 3X)에 적용하였다. 집단을 모으고, 각각의 형질도입 후에 냉동보존을 위해 팽창시킨 후, 세포의 샘플을 유전자 카피 분석을 위해 제출하였다. 유전자 카피 지수를 아래 표 2에 제시한다. 3X 형질도입된 세포주를 2개의 125 mL 플라스크에서 16일의 유가식 시험으로 생산성에 대해 분석하였다. 그 결과를 표 3에 제시한다.

7.1.3. ApoA -I을 발현하는 세포주의 안정성

장기간 배양 동안 그의 생육성의 안정성, 성장 속도, 유전자 삽입체의 보존, 및 지속적인 생성물 분비를 평가하기 위해 ApoA-I을 생산하는 마스터 세포 은행인 CHO-S-ApoA-I-R (3X) 클론, 17에 대한 비-GMP 특성 결정 연구를 수행하였다.

세포주를 마스터 세포 은행으로부터 해동하고, PF CHO LS 배지 (하이클론 (HyClone), 미국 유타주 로간)를 사용하여 125 mL 진탕 플라스크에서 배양하였다. 세포를 세대 0 내지 세대 43까지 연속 계대배양에 의해 연속적으로 배양하였다. 세대 4, 8, 14, 19, 25, 31, 36 및 43에서, 세포의 샘플을 동결하였다. 배양 종료시에, 모든 세대로부터의 세포 샘플을 해동하고, 동일한 실험에서 상이한 세대의 세포주의 ApoA-I 단백질 생산과 비교하기 위한 최종 배양을 수행하기 위해 사용하였다. 각각의 샘플로부터의 상청액을 ApoA-I 생산 수준을 결정하기 위해 역상 HPLC 분석을 사용하여 제12일에 시험하였다. ApoA-I 농도는 다양한 샘플에 대해 1259 mg/L로부터 1400 mg/L까지 상이한 것으로 밝혀졌다 (도 2).

유전자 삽입체의 안정성을 비교하기 위해서, 세대 0, 4, 14, 25, 36 및 43의 CHO 세포의 샘플을 DNA 단리를 위해 사용하였다. 각각의 샘플에 대한 유전자 삽입체의 수는 게놈 DNA에 대한 실시간 PCR을 사용하여 결정하였다. 표 3에 제시된 바와 같이, 카피수의 PCR-기반 지수는 세대 0과 세대 43 사이에 중복되는 표준 편차를 기초로 할 때 유의하게 상이하지 않았다. 마스터 세포 은행 세포주로부터의 ApoA-I의 생산 및 유전자 카피 지수값은 시험된 43 세대에 걸쳐 안정한 것으로 밝혀졌다.

7.2. 세포 성장 및 ApoA -I의 수거

7.2.1. 접종 및 200 L 생물반응기 생산까지의 규모 확대

마스터 세포 은행으로부터의 인간 ApoA-I 유전자로 안정하게 형질감염된 CHO-S 세포의 바이알을 37℃ 수조에서 해동하고, 35 mL의 HyQ PF-CHO LS 세포 배양 배지가 담긴 단일 진탕 플라스크 (250 mL) (써모 피셔 사이언티픽 (Thermo Fisher Scientific))에 첨가하였다. 혈구계를 사용하여 결정한 초기 세포 계수는 2.48 x 10⁵ 세포/mL 및 93.8% 생육성이었다. 이어서, 배양액을 가습, 5% CO₂ 환경에서 37℃에서 유지되는 인큐베이터 내의 오빗 (Orbit) 진탕기 (90 rpm)에 두었다. 계대배양 단계는 대략 1.6 x 10⁵ 세포/mL의 접종 밀도를 표적으로 하였다. 플라스크 내의 제4일 세포 계수 및 % 생육성은 15.01 x 10⁵ 세포/mL 및 93.9%이었다. 250 mL 플라스크를 1 L 플라스크로 계대배양하였다. 1 L 플라스크 내의 제3일 평균 생육성 세포 계수는 13.56 x 10⁵ 세포/mL 및 95.3% 생육성이었다. 1 L 플라스크를 각각 1000 mL 및 1.75 x 10⁵ 세포/mL의 초기 배양 부피 및 초기 표적 세포 밀도에서 10 L 일회용 웨이브 (Wave) 백 (지이 헬쓰케어 바이오사이언스 바이오프로세스 코프 (GE Healthcare Bioscience Bioprocess Corp), 미국 뉴저지주 소머세트)을 사용하여 웨이브 바이오리액터 시스템 (Wave Bioreactor System) 20EH으로 계대배양하였다. 웨이브 바이오리액터 운전 설정은 37℃ 인큐베이션 온도, 15.0 cpm 로커 (rocker) 속도, 10.9°흔들림 각, 및 기체 유동 속도가 0.25 L/분인 폭기 기체 내의 5.0% CO₂ 농도. 배양 3일 후에, 웨이브 백 내의 생육성 세포 밀도는 10.73 x 10⁵ 세포/mL이었고, 새로운 HyQ PF-CHO LS를 첨가하여 배양 부피를 5000 mL로 만들었다. 추가의 3일 후에, 생육성 세포 밀도는 13.25 x 10⁵ 세포/mL이었고, 웨이브 백 내의 부피를 30 L 생물반응기로 옮겼다. 온도, pH, 용존 산소, 압력, 및 교반 속도에 대한 30 L 생물반응기의 운전 설정점은 각각 37℃, pH 7.0, 40% 공기 포화, 1 psig 압력, 및 50 rpm 교반 속도이었다.

30 L 생물반응기 내의 생육성 세포 밀도는 배양 제3일에 10.80 x 10⁵ 세포/mL이었고, 이것은 2.40 x 10⁵ 세포/mL의 초기 표적 밀도로 200 L 생물반응기를 접종하기에 충분하였다. 30 L의 전체 내용물을 옮기고, 접종 후 중량, 세포 밀도 및 생육성은 각각 134.5 Kg, 2.37 x 10⁵ 세포/mL 및 90.9%이었다. 온도, pH, 용존 산소, 압력, 및 교반 속도에 대한 200 L 생물반응기 내의 운전 설정점은 각각 37℃, pH 7.0, 40% 공기 포화, 1 psig 압력, 및 35 rpm 교반 속도이었다. 제3일에, 세포 밀도는 15.71 x 10⁵ 세포/mL이었고, 이것은 60 L (v/v)의 완전 배지 (AGT CD CHO 5X, 인비트로겐) 및 200 mM L-글루타민 (최종 농도 10 mM) 용액을 생물반응기에 첨가하기에 충분하였다. 제8 및 12일에, 포도당 수준은 5 g/L 미만으로 떨어졌고, 이것은 3 g/L의 포도당 (20%) 용액의 첨가를 촉발하였다. 생육성 세포 밀도는 92.5%의 생육성에서 33.20 x 10⁵ 세포/mL로 제9일에 피크를 이루었다. 생물반응기는 제13일에 78.5%의 세포 생육성으로 수거하였다. 배양 기간에 걸친 배양액의 세포 계수 및 생육성을 도 3a에 제시하고, 배양 기간에 걸친 배양 배지 내의 ApoA-I 농도는 도 3b에 제시한다.

7.2.2. 세포의 수거, 세포 분리 및 저장

생물반응기로부터의 배지는 생물반응기 내용물을 이중 쿠노 (Cuno) (미국 뉴저지주 러더포드) 60M02 맥시마이저 (Maximizer) 필터, 이어서 밀리포어 (Millipore) 0.22 ㎛ 옵티캡 (Opticap) (미국 매사추세츠주 빌레리카)을 통해 200 L 백 내로 통과시킴으로써 수거하였다. 이어서, 맑아진 배지를 분배 운전시까지 2-8℃에서 보관하였다. 맑아진 배지를 밀리포어 0.22 ㎛ 필터 (미국 매사추세츠주 빌레리카)을 통해 여과하고, 2 L 멸균 PETG 병 (써모피셔 (ThermoFisher, 미국 오하이오주 마리에타))에 분배한 후, 수송을 꺼낼 때까지 -20℃에서 동결하였다.

8. 실시예 2: APOA -I 정제 시스템의 개발

8.1. 물질 및 방법

발현, 1차 분리 및 컨디셔닝. 실시예 1에 설명된 바와 같이 얻은 ApoA-I 맑아진 세포 성장 배지 (대략 1.8 L)를 실온에서 보관하여 해동하였다. 해동된 배지를 1M HCl을 사용하여 pH를 5.3±0.2로 감소시켜 음이온 교환 크로마토그래피를 위해 컨디셔닝하였다.

Apo A-I의 정제. 20 cm의 베드 높이에서 충전된 Q-세파로스 FF (지이 헬쓰케어) 음이온 교환 컬럼을 TAMP A 완충제 (20 mM 인산나트륨, pH 5.3)로 평형화하였다. 평형화는 컬럼 유출물의 pH가 대략 5.5일 때 완전한 것으로 판단하였다. 컨디셔닝된 여액을 3.7 cm/min의 유동 속도에서 25-35 g ApoA-I/L (음이온 교환 수지)로 컬럼에 로딩하였다. ApoA-I을 TAMP A 관류액 내에서 컬럼을 통해 세척하고, 수집하였다.

음이온-교환 컬럼으로부터의 ApoA-I 함유 관류액의 pH를 1M NaOH를 사용하여 8.0±0.2로 조정하였다. 이어서, 용액을 바이러스 및 바이러스 입자를 제거하기 위해 약 12.5 L/h/m²의 유동 속도로 0.2 ㎛ 플라노바 20N 필터 (아사히 가세이 메디칼)를 통해 여과하였다.

베드 높이가 25 cm인 소스 30 역상 크로마토그래피 컬럼을 컬럼 유출물이 pH 9.5에 도달하여 평형화될 때까지 TAMP D 완충제 (20 mM 탄산암모늄, pH 9.5)로 세척하였다. 바이러스 여과 단계로부터의 ApoA-I 함유 여액을 2.8 cm/min의 유동 속도로 컬럼에 로딩하였다. 샘플 내의 ApoA-I은 매트릭스에 흡착되고, TAMP D 완충제 내의 35-50% 아세토니트릴의 구배로 용리하였다.

25 cm의 베드 높이에서 충전된 역상 실리카 C18 컬럼 (300Å 10 ㎛)을 컬럼 유출물이 pH 9.5에 도달하여 평형화될 때까지 TAMP E 완충제 (100 mM 탄산암모늄, pH 9.5) 내에서 세척하였다. 이어서, C18 컬럼을 4.7 g ApoA-I/L (매트릭스)로 로딩하였다. 컬럼 매트릭스에 흡착된 ApoA-I은 TAMP E 완충제 내의 40-50% 아세토니트릴의 구배로 용리하였다.

분획을 모으고 대략 2.5배 농축한 후, 농축물을 15 부피의 TAMP C 완충제 (3 mM 인산나트륨, pH 8)에 대해 정용여과함으로써 C18 컬럼으로부터 용리된 ApoA-I 함유 분획으로부터 아세토니트릴을 제거하였다. 정용여과된 ApoA-I 용액의 pH를 묽은 인산을 사용하여 약 6.0으로 감소시킨 후, DNA 및 숙주 세포 단백질을 제거하기 위해 무스탕 Q 음이온 교환 막 (폴 라이프 사이언시스)에 통과시켰다. 무스탕 Q 여액을 5 부피의 TAMP C 완충제에 대해 정용여과하였다.

이어서, 정용여과된 여액을 막이 28,000 달톤의 ApoA-I을 보유하도록 10,000 달톤 분자량 컷오프를 갖는 폴리에테르술폰 막 (필트론 오메가 시리즈)을 사용하여 최종 한외여과에 적용하였다. 단백질 용액은 SDS-PAGE 겔을 스캐닝하고 정제된 ApoA-I 밴드 면적의 강도 및 모든 밴드의 총 강도의 비를 측정함으로써 결정된 7.8-17 g/L 순수한 ApoA-I을 함유하였다.

8.2. 결과

ApoA -I의 특성결정. ApoA-I 생성물의 순도는 SDS-PAGE에 의해 99% 초과로 순수한 것으로 검정되었고, DNA 및 숙주 세포 단백질은 낮은 수준이었고, 검출가능한 양의 말단절단된 ApoA-I은 존재하지 않았다. 도 4 참조.

9. 실시예 3: 지단백질 복합체 성분의 최적화

9.1. 아 포지단백질 및 인지질 성분의 제조

프로 ApoA -I: 단백질 프로ApoA-I은 유나이테 데 바아오테크놀로지, 인스티투트 뫼리스 (Unite de Biotechnologie, Institut Meurice, 벨기에 비-1070 애비뉴 에밀 그리존 1 호이테 에콜 루시아 데 브로우케레)에 의해 대략 90 mg의 단백질을 함유하는 동결건조된 개별적인 100 mL 플라스크로 공급되었다. 배치 번호는 20060202이었다. 단백질을 사용시까지 약 4℃에서 보관하였다. 동결건조 전에, 프로ApoA-I의 함량은 3.225 mg/mL이며, 요소 함량은 약 0.011 mg/mL이었다. 약 630 mg의 프로ApoA-I를 25.6 mL의 초산/물 5%로 용해하여 프로ApoA-I의 용액을 제조하였다. 용액의 최종 농도는 25 mg/mL이었다.

ApoA -I: ApoA-I은 상기 실시예 1에 설명된 바와 같이 제조하였다.

스핑고미엘린: 에그 유래의 스핑고미엘린 (코트섬(Coatsome)® NM-10)은 엔오에프 코퍼레이션 (NOF Corporation, 일본 660-0095 아마가사끼시 오오하마쪼 1-56)에 의해 공급되었다. 배치 번호는 0502ES1이었다. 스핑고미엘린을 사용시까지 약 -20℃에서 보관하였다. 스핑고미엘린의 순도는 99.1%이었다. 스핑고미엘린의 용액은 50 mg/mL의 최종 농도를 생성하도록 799.4 mg의 정제된 스핑고미엘린을 16 mL의 초산/물 5%에 용해하여 제조하였다.

포스파티딜글리세롤: 나트륨염으로서의 1,2-디팔미토일-SN-글리세로-3-포스파티딜 글리세롤 (DPPG-Na, 코트섬® MG-6060 LS)은 엔오에프 코퍼레이션 (일본 660-0095 아마가사끼시 오오하마쪼 1-56)에 의해 공급되었다. 배치 번호는 0309651L이었다. DPPG-Na를 사용시까지 약 -20℃에서 보관하였다. DPPG-Na의 순도는 99.2%이었다. DPPG-Na의 용액은 50 mg/mL의 최종 농도를 생성하도록 49.1 mg의 DPPG-Na를 1 mL의 초산/물 5%에 용해하여 제조하였다.

포스파티딜콜린: 디-팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC)은 상업적인 공급원으로부터 입수하였다.

9.2. 지단백질 복합체의 제조

다음 지단백질 복합체를 제조하였다:

(a) 중성 지단백질 복합체:

a. 조성 A: 1:2.5의 단백질:인지질 중량비의 프로ApoA-I 및 SM;

b. 조성 B: 1:2.7의 단백질:인지질 중량비의 프로ApoA-I 및 SM;

c. 조성 C: 1:3.1의 단백질:인지질 중량비의 프로ApoA-I 및 SM;

d. 조성 D: 1:2.7의 지단백질 wt: 총 인지질 wt 비의 프로ApoA-I, SM, 및 DPPC (SM:DPPC wt 비 = 50:50);

e. 조성 E: 1:2.7의 단백질:인지질 중량비의 ApoA-I 및 SM.

(b) 음하전된 지단백질 복합체:

a. 조성 F: 1:2.7의 지단백질 wt:총 인지질 wt 비의 프로ApoA-I, SM, DPPC 및 DPPG (SM:DPPC:DPPG wt:wt 비 = 48:48:4);

b. 조성 G: 1:2.7의 지단백질 wt:총 인지질 wt 비의 프로ApoA-I, SM, DPPC 및 DPPG (SM:DPPC:DPPG wt:wt 비 = 73:23:4);

c. 조성 H: 1:2.7의 지단백질 wt:총 인지질 wt 비의 ApoAI, SM, 및 DPPG (SM:DPPG wt:wt 비 = 97:3);

d. 조성 I: 1:3.0 지단백질 wt:총 인지질 wt 비의 ApoAI, SM, 및 DPPG (SM:DPPG wt:wt 비 = 97:3);

e. 조성 J: 1:3.3 지단백질 wt:총 인지질 wt 비의 ApoAI, SM, 및 DPPG (SM:DPPG wt:wt 비 = 97:3);

9.3. 지단백질 복합체의 형성 속도 및 균질성

조성 A 내지 J의 지단백질 복합체의 형성은 지단백질 복합체의 크기 및 분포를 조사하기 위해 샘플을 HPLC 시스템 내에 주입함으로써 시험하였다. 복합체를 공동-균질화에 의해 생산하고, 지시된 시간에 샘플을 채취하였다.

도 5는 상이한 지단백질:SM wt:wt 비를 포함하는 조성 A 내지 C, 및 1:2.7의 비로 지단백질 및 중성 인지질을 포함하는 조성 D (여기서, 중성 인지질은 50:50 SM:DPPC임)에 따른 중성 지단백질 복합체에 대한 예시적인 HPLC 크로마토그램을 보여준다. 1:2.7의 지단백질:SM wt:wt 비가 최적이었다. SM 및 DPPC의 혼합물을 함유하는 조성 D는 불량한 복합체 형성을 보였다.

제2 중성 인지질로서 포스파티딜 콜린의 첨가는 느리고 불완전한 복합체 형성을 야기하였다. 도 6은 10, 20, 30, 및 60분에 조성 D의 지단백질 복합체의 HPLC 크로마토그램을 보여준다. 이와 대조적으로, 도 7에 제시된 바와 같이, 조성 B는 신속하게 복합체를 형성하였다.

음하전된 인지질 DPPG를 SM 및 DPPC에 첨가하면, 20, 40, 60, 및 120분에 조성 F의 지단백질 복합체의 HPLC 크로마토그램을 보여주는 도 8에 제시된 바와 같이 훨씬 더 적은 복합체가 형성되었다.

도 9에 도시된 바와 같이, 1:2.7의 단백질 대 지질 중량비로, 인지질로서 SM만을 함유하는 지단백질 복합체는 보다 많은 프리-B HDL 복합체를 형성하고, 동일한 단백질 대 지질 중량비를 갖지만 DPPC 및/또는 DPPG를 함유하는 지단백질 복합체보다 더 신속하게 형성하였다. 따라서, 중성 지질로서 SM만을 함유하는 지단백질 복합체는 DPPG를 첨가하거나 첨가하지 않으면서 SM 이외에 DPPC를 포함하는 복합체보다 더 신속한 속도로 보다 균질한 지단백질 복합체를 형성한다.

마지막으로, 인지질 분획이 SM 및 DPPG를 97 내지 3 중량비로 함유하는, 1:2.7 내지 1:3의 아포지단백질:인지질 중량비를 포함하는 음하전된 지단백질 복합체는 1:3.3의 아포지단백질:인지질 중량비를 포함하는 복합체 및 하전되지 않은 지단백질 복합체에 비해 최적 균질성을 보이고 유리 지질 피크는 보이지 않았다. 조성 E, H, I, 및 J에 대한 HPLC 크로마토그램을 제시하는 도 10을 참조한다. 조성 B 및 H에 따른 지단백질 복합체를 동물에서 추가 연구를 위해 선택하였고 (실시예 6), 동물 연구의 결과를 기초로 하여 조성 H의 지단백질 복합체를 인간 환자에서의 임상 평가를 위해 선택하였다 (실시예 6 및 8).

10. 실시예 4: 열 사이클링-기반 방법을 이용한 지단백질 복합체의 형성

10.1. ApoA -I/ DPPG / 스핑고미엘린 복합체의 제조 절차의 개요

1 내지 30 mg/ml, 일반적으로 5 내지 20 mg/ml의 단백질 농도의 인산염 완충제 (pH 7-9) 내의 동결된 ApoA-I 용액은 대략 24-96 hr 동안 2-8℃에서 해동함으로써 제조하고, 칭량한다. pH 7.4 완충제 내의 10 mM의 최종 펩티드 농도를 얻기 위해 제일인산나트륨 및 제이인산나트륨을 ApoA-I 용액에 첨가한다.

DPPG 용액은 인산염 완충제 (10 mM 인산나트륨, pH 8.0)를 50℃의 표적까지 가온함으로써 제조한다. DPPG 분말 (엔오에프 코퍼레이션)은 적어도 1.5 hr 동안 실온에서 해동된 후, 칭량하고, 완충제 용기에 첨가한다. 이어서, DPPG를 울트라-투락스(ULTRA-TURRAX)® 고성능 분산기 (이카(IKA)® 웍스, 인크. (Works, Inc.))를 사용하여 50℃의 온도에서 분산시킨다. 분산 후에, DPPG 현탁액 및 ApoA-I 용액을 57℃로 가열한다. 이들을 합하여 질소 하에서 30분 동안 57℃에서 가열하였다. 상기 예비-복합체 용액을 실온으로 냉각한다.

스핑고미엘린 (SM) 분말 (엔오에프 코퍼레이션)을 실온에서 해동한 후, 칭량하여 유리 탱크 내로 넣느다. 인산염 인산염 완충제 (10 mM 인산나트륨, pH 8.0)를 220 mg/ml의 SM 농도를 위해 SM 분말과 합하여 50℃로 가열한다. SM 분말을 울트라-투락스®를 사용하여 현탁액에 분산하고, 분산액을 4℃로 냉각한 후, 균질화기를 통과시킨다. SM 입자는 55 내지 70 nm 제타 (Z) 평균 크기 (강도 측정 사용)까지 동적 광 산란 (DLS)에 의해 모니터링한다. 이것은 예를 들어 32000 +/- 3000 바에서, 10-18℃의 유입구 온도 및 바람직하게는 30-40℃의 유입구 온도 (59℃를 초과하지 않음)에서 나노 데비 (Nano DeBee) 균질화기를 사용하여 달성될 수 있고, Z-평균 크기가 58 nm인 입자를 생성한다.

복합체화를 위해, ApoA-I/DPPG 혼합물 및 SM 분산액을 별개로 57℃까지 가온한다. 가온된 SM 분산액을 57℃의 초기 온도 설정점에서 ApoA-I/DPPG 혼합물에 첨가한다. 교반하여 조합한 후, 용액을 37℃로 냉각하고, 이어서 ApoA-I/DPPG/SM 복합체를 형성하기 위해 일련의 열 사이클 (57℃ 내지 37℃)을 실시한다. 상기 가열-냉각 공정은 5분 내지 30분의 온도 사이의 접촉 시간에서 지속된다. 가열-냉각 사이클은 대부분의 단백질 성분이 지단백질 복합체 내로 혼입될 때까지 반복한다. 열 사이클링 동안 복합체의 크기 및 분포는 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)에 의해 모니터링된다.

ApoA-I/DPPG/SM 복합체를 상기 설명한 (및 도 11에 예시된) 절차에 따라 제조하였다. ApoA-I 단백질은 도 1에 제시된 서열의 위치 25 내지 267에 대응하는 아미노산 서열을 가졌다. 복합체는 스핑고미엘린 (SM), 및 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) (디팔미토일포스파티딜글리세롤 또는 DPPG)을 97:3의 중량비로 함유한다. ApoA-I 단백질 대 총 지질의 비는 1:2.7 중량/중량 (w/w)이고, 이것은 1:108의 몰비에 동등한 것이다. 지질 및 단백질 성분을 합하고, 연동 (peristaltic) 펌프에 의해 연결된, 좌측에 라우다 에콜린 스타 에디션 타입 (Lauda Ecoline Star edition Type) 26LE 수조 (여기서 샘플이 열 사이클링됨) 및 우측에 쉘 (shell) & 튜브 열 교환기 (모델 EF-C50-HE)를 포함하고 18-ml 보유 부피를 갖는 도 5에 도시된 바와 같이 배열된 열 교환기를 사용하여 각각의 온도에서 5분 동안 57℃ 내지 37℃에서 사이클링하였다.

180 mg의 DPPG를 2.82 g의 10 mM 인산염 완충제 (pH 8.0)에 첨가하였다. 현탁액을 10분 동안 50℃에서 울트라-투락스® 분산기에서 분산시켰다. 22 g의 SM 분말을 78 g의 10 mM 인산염 완충제 (pH 8.0)와 합하였다. 현탁액을 20 내지 40분 동안 50℃에서 울트라-투락스® 분산기에서 분산시켰다. SM을 60 nm의 평균 입자 크기로 설정된 나노비 (NanoBEE)를 사용하여 균질화하였다. DPPG, SM 및 단백질을 57℃로 만들었다. 18 mg (0.3 ml)의 DPPG를 57℃의 10 mM 인산염 완충제 (pH 7.4) 내의 214 mg의 ApoA-I 단백질에 첨가하였다. 57℃에서 30분 후에, 559 mg의 SM 입자 (2.54 ml)를 첨가하였다. 이어서, 상기 용액을 복합체를 형성하기 위해 열 사이클링시켰다.

30분, 60분, 120분, 180분 및 210분 동안 열 사이클링 후에 ApoA-I/DPPG/SM 복합체 형성을 보여주는 겔 투과 크로마토그래피를 도 13a-13e에 각각 제시한다. 주요 GPC 피크의 급한 증가에 의해 제시되는 바와 같이 사이클 시간이 증가함에 따라 보다 조밀한 복합체가 생산된다. 또한, 비복합체화된 단백질에 대응하는 피크는 시간 경과에 따라 사라진다.

10.2. ApoA -I/ 스핑고미엘린 복합체의 형성

ApoA-I/SM 복합체는 상기한 절차를 따르되, ApoA-I을 DPPG와 예비-복합체화하지 않으면서 제조하였다. 단백질 성분은 8.9 mg/ml 농도의 5 ml의 ApoA-I이었고, 지질 성분은 10 mM 인산염 완충제 (pH 8.0)에 현탁되고 60 nm의 지질 입자를 형성하기 위해 균질화된 0.5 ml 에그 스핑고미엘린 (220 mg/ml)이었다. 단백질 및 지질 성분은 50℃에서 1:2.5의 wt:wt로 혼합하였다. 생성되는 현탁액을 도 5에 도시된 열 사이클링 장치를 사용하여 18시간 (108회 사이클 및 사이클링 시간 10분) 동안 열 사이클링에 적용하였다. 겔 투과 크로마토그래피는 형성된 단백질/지질 복합체가 본질적으로 균질함을 보여준다 (도 14의 GPC 크로마토그램 참조).

10.3. ApoA -I/ DPPG /N- 팔미토일 -4- 히드록시스핑가닌 -1- 포스포콜린 (피토스핑고미엘린) 복합체의 형성

ApoA-I/DPPG/피토스핑고미엘린 복합체는 상기한 절차에 따라 제조하였다. 피토스핑고미엘린 입자를 약 183 nm의 크기 (DLS에 의해 측정됨)로 균질화하고, 1:2.7의 최종 단백질 대 지질 (SM 및 DPPG) 비를 달성하기 위해 7.8 g/L 단백질:DPPG 혼합물에 첨가하였다. N-팔미토일-4-히드록시스핑가닌-1-포스포콜린 (피토-스핑고미엘린) 및 단백질:DPPG 성분을 함유하는 현탁액을 총 2시간에 걸쳐 37℃에서 10분 및 57℃에서 10분의 6회 사이클 동안 열 사이클링시켰다. 겔 투과 크로마토그래피는 형성된 단백질/지질 복합체가 본질적으로 균질함을 보여준다 (도 15의 GPC 크로마토그램 참조).

10.4. ApoA -I/ DPPG /합성 팔미토일 스핑고미엘린의 형성

ApoA-I/DPPG/합성 팔미토일 스핑고미엘린 복합체를 다음과 같이 제조하였다. 10 mM 인산염 완충제 (pH 7.4) 내의 합성 팔미토일 스핑고미엘린 (220 mg/ml)의 8.8 mL 용액을 3300 nm의 입자 크기에 도달할 때까지 혼합하였다. ApoA-I (14 mg/ml의 945 mg)을 0.03 중량% DPPG (60 mg/ml)와 합하고, 50℃에서 30분 동안 가열하였다. 합성 팔미토일 스핑고미엘린 미셀을 단백질/DPPG 복합체와 1:2.7의 아포지단백질:인지질 중량비로 합하였다. 단백질 및 지질의 현탁액을 총 240분 동안 또는 적절한 입자 크기 분포가 얻어질 때까지 10분마다 37℃ 및 57℃에서의 가열-냉각 사이클로 열 사이클링시켰다. 열 사이클링 동안 복합체의 크기 및 분포는 GPC에 의해 모니터링하였다. 복합체화 후에, 농도는 8.0 mg ApoA-I/ml이었고, 이어서 수크로스 (40 mg/ml) 및 만니톨 (20 mg/ml)을 등장성을 위해 복합체에 첨가하였다. 지단백질 복합체를 GPC에 의해 검정하였고, 본질적으로 균질한 것으로 밝혀졌다 (도 16의 GPC 크로마토그램 참조).

10.5. ApoA -I/ DPPG /피토 스핑고미엘린의 형성

ApoA-I/DPPG/피토스핑고미엘린 복합체를 다음과 같이 제조하였다. 10 mM 인산염 완충제 (pH 7.4) 내의 피토스핑고미엘린 (220 mg/ml)의 2.0 mL 용액을 990 nm의 입자 크기에 도달할 때까지 40분 동안 50℃에서 울트라-투락스®에서 분산시켰다. ApoA-I (7.8 mg/ml 농도의 15.6 mg)을 0.03 중량% DPPG (60 mg/ml)와 합하고, 57℃에서 30분 동안 가열하였다. 피토스핑고미엘린 용액을 단백질/DPPG 혼합물과 1:2.7의 아포지단백질:인지질 중량비로 합하였다. 단백질 및 지질의 현탁액을 총 240분 동안 또는 적절한 입자 크기 분포가 얻어질 때까지 10분마다 37℃ 및 57℃에서의 가열-냉각 사이클로 열 사이클링시켰다. 지단백질 복합체의 집단을 GPC에 의해 측정하였고, 약 92.6% 균질한 것으로 밝혀졌다 (도 17의 GPC 크로마토그램 참조).

10.6. ApoA -I 펩티드와의 복합체 형성

ApoA-I 펩티드, DPPG 및 스핑고미엘린의 복합체를 ApoA-I 펩티드 (H-Lys-Leu-Lys-Gln-Lys⁵-Leu-Ala-Glu-Leu-Leu¹⁰-Glu-Asn-Leu-Leu-Glu¹⁵-Arg-Phe-Leu-Asp-Leu²⁰-Val-Inp²²-OH; 서열 4) 용액을 사용하여 상기 설명된 바와 같이 생성하였다 (섹션 10.1 참조). 인지질 성분은 48.5:48.5:3 중량비의 에그 스핑고미엘린 (SM), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (디팔미토일포스파티딜콜린, DPPC) 및 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)] (디팔미토일포스파티딜-글리세롤, DPPG)로 이루어진다. 펩티드 대 총 인지질 복합체의 비는 1:2.5 (w/w)이다. 약물 복합체는 인산염 완충 염수 (12 mM 인산나트륨, 130 mM 염화나트륨, pH 8.2) 내의 CER-522 복합체의 용액이다. 복합체는 50℃ 내지 37℃에서 2시간 동안 1 ml/min의 유동 속도로 열 사이클링에 적용함으로써 형성되었다.

겔 투과 크로마토그래피는 형성된 단백질/지질 복합체가 본질적으로 균질함을 보여주고, 여기서 대부분의 단백질이 지단백질 복합체 내로 혼입되었다 (도 18의 GPC 크로마토그램 참조).

10.7. 복합체 형성에 대한 지질 입자 크기 및 열 사이클의 수의 효과

입자 크기에 대한 지질 입자 크기 및 열 사이클의 수의 효과를 연구하였다. SM 용액을 나노비에 한번 통과시킴으로써 4가지의 상이한 출발 지질 입자 크기 (제타 평균 85 nm, 77 nm, 66 nm, 및 60 nm) (각각 도 19a 내지 19d)의 제제를 생성하였다. 각각의 통과물을 그의 제타 평균에 대해 분석하였다. 지질 입자 크기는 각각의 통과와 함께 감소하였고, 요구되는 크기가 달성될 때 지질 입자를 수거하였다. 4개의 상이한 지질 입자 크기는 37℃에서 3분 및 57℃에서 10분의 5 또는 7 사이클 동안 섹션 10.1의 복합체 형성 방법에서 시험하였다.

지질 성분이 단백질 성분과 혼합될 때, 생성되는 현탁액은 혼탁하다. 복합체가 형성되면서 혼탁도는 감소하고, 용액은 보다 투명해진다.

5회 사이클 후에, 60 nm 지질 입자로부터 생성된 복합체의 현탁액이 가장 투명하였다. GPC 크로마토그램 (도 20a 내지 20d)은 주요 피크의 균질성에 의해 입증되는 바와 같이 모든 샘플에서 완전한 또는 거의 완전한 복합체화를 보여준다. 66 nm 지질 입자를 사용하여 출발할 때, 지단백질 복합체의 생성되는 현탁액 내의 GPC에 의한 검출가능한 비복합체화된 단백질은 존재하지 않았고, 이것은 모든 단백질이 5회 사이클 후에 지질과 복합체화됨을 나타내고, 생성되는 복합체는 98% 순수하였다. 7회 사이클 후에, 모든 4개의 현탁액은 보다 투명해졌고, 이것은 보다 큰 복합체화 정도를 보여준다. 60 nm 지질 입자를 사용하여 제조된 현탁액이 가장 맑은 것으로 보였다.

별개의 연구에서, 450 nm 및 40 nm의 SM 입자는 섹션 10.1에 설명된 방법을 이용하여 ApoA-I 및 DPPG와 복합체화되었다. 전부는 아니지만 대부분의 ApoA-I은 도 21a의 GPC 크로마토그램에 제시된 바와 같이 (9.8분 피크) 지질 성분으로서 450 nm SM 입자를 사용하여 지단백질 복합체 내로 혼입되었다. ApoA-I의 훨씬 더 작은 분획은 도 21b의 GPC 크로마토그램에 제시된 바와 같이 (9.551분 피크) 지질 성분으로서 40 nm SM 입자를 사용하여 지단백질 복합체 내로 혼입되었다.

10.8. 복합체 형성에 대한 출발 온도의 효과

복합체 형성에 대한 초기 열 사이클링 온도의 효과를 연구하였다. ApoA-I/DPPG/SM 복합체는 지질 성분 및 단백질 성분을 57℃ 대신에 37℃로 가온하여 합한 것을 제외하고는 섹션 10.1에서 설명된 바와 같이 생성하였다. 생성되는 복합체의 GPC 크로마토그램은 도 22에 제시되어 있다. 비교적 큰 단백질 피크 (도 22의 9.455분에 용리되는)에 의해 입증되는 바와 같이 열 사이클링이 57℃에서 개시될 때보다 실질적으로 더 적은 단백질 성분이 지단백질 복합체 내로 혼입되었다.

10.9. 열 사이클링 방법을 이용하는 지단백질 복합체의 상업적 생산

대규모의 상업적 제조를 위해, 본 개시내용의 방법은 규모가 확대되고, 임의로 제제화 단계와 조합될 수 있다. 상업적인 실시양태는 도 23에 도시된다. 상기 실시양태에서, 열 사이클링 단계 이후, 지단백질 복합체를 희석하고, 하나 이상의 등장화제 (예를 들어, 수크로스 및/또는 만니톨)와 혼합하고, 여과하고, 바이알 내로 분취한다. 바이알의 내용물은 생성되는 제제의 저장 수명을 연장하기 위해 동결-건조될 수 있다.

섹션 10.1에서 설명된 ApoA-I/DPPG/SM 복합체는 DaBEE2000을 사용하여 20-리터 규모로 생산하였다. 상기 복합체를 인산염 완충제 (pH 7-8)로 희석하고, 수크로스 및 만니톨과 혼합하여 인산염 완충제 10 mM (pH 7.4), 8 mg/ml ApoA-I, 4% (w/w) 수크로스 및 2% (w/w) 만니톨을 함유하는 최종 제제를 제조하였다.

10.10. 열 사이클링 대 동시- 균질화에 의해 제조된 지단백질 복합체의 비교

본원에 개시된 열 사이클링 방법에 의해 제조된 ApoA-I/DPPG/SM 복합체를 지질 및 단백질 성분의 동시-균질화에 의해 제조된 복합체와 비교하였다. 열 사이클링에 의해 제조된 복합체의 순도는 겔 투과 크로마토그래피에 측정시에 동시-균질화에 비해 97% 개선되었다. SDS-PAGE를 사용하여, 열 사이클링에 의해 제조된 복합체는 동시-균질화된 복합체에 비해 98%의 증가된 주요 밴드 순도를 보였고, 더 적은 말단절단된 단백질 밴드가 존재하였다.

ApoA-I의 산화는 또한 동시-균질화에 비해 열 사이클링 공정에 의해 감소된다. RP-HPLC (C18)은 동시-균질화된 복합체에서 RT 0.93 및 0.99에서 2개의 산화 피크를 보이고, 이것은 열 사이클링 공정에는 존재하지 않는다. 펩티드 지도는 또한 동시-균질화에 의해 생산된 복합체에 비해 열 사이클링에 의해 생산된 복합체에서 Met 112 및 Met 148에서 ApoA-I의 메티오닌의 산화의 감소를 보여준다.

데이터의 요약을 아래 표 5에 제시한다.

10.11. 제조 방법에서 불활성 기체의 사용

ApoA-I은 화학적 불안정성 (예를 들어, 산화)에 취약한 민감한 단백질이다. ApoA-I/SM/DPPC-함유 제약 조성물에서 ApoA-I의 안정성을 향상시키기 위해서, 제약 조성물을 불활성 기체인 질소 분위기 하에서 제조하였다 (열 사이클링, 충전 및 마무리 처리 단계 포함). 동시-균질화에 의해 제조된 ApoA-I/SM/DPPC 복합체 및 질소 하에서 열 사이클링에 의해 제조된 ApoA-I/SM/DPPC 복합체를 비교한 연구의 결과를 아래에 제시한다.

11. 실시예 5: 시험관내 콜레스테롤 유출 연구

ApoA-I-지질 복합체의 생물학적 활성을 Fu5AH 래트 간암 세포에서 연구하고, ABCA1-매개 콜레스테롤 유출을 측정하였다.

Fu5AH 래트 간암 세포는 세포와 성숙한 HDL 사이의 콜레스테롤의 양방향 유동을 촉진하는 스캐빈저 수용체 클래스 B 타입 I (SRB1)의 높은 발현을 갖는다. 상기 모델은 HDL-매개 콜레스테롤 유출 활성에 대한 특이적 검정을 제공한다. 검정은 문헌 [Mweva et al., 2006, "Comparison of different cellular models measuring in vitro the whole human serum cholesterol efflux capacity," Eur. J. Clin. Invest. 36, 552-559]에 기재된 방법을 사용하여 수행하였다. Fu5AH 세포는 ³H-콜레스테롤로 24시간 동안 표지하였다. 유출을 위한 수용자 배지를 각각의 시험 샘플 (25 mM HEPES로 완충된 MEM으로 희석한, 30, 20 및 10 ㎍/ml의 ApoA-I/DPPG/팔미토일 SM, ApoA-I/DPPG/에그 SM, 또는 ApoA-I/DPPG/피토SM) 및 대조 샘플 (인간 혈장 (20 ㎍/mL), HDL₃, 2% 인간 혈청, 배지 단독으로부터 정제된 ApoA-I)에 대해 제조하였다. 시험 또는 대조 샘플을 함유하는 수용자 배지를 세포에 4시간 동안 첨가하고, Fu5AH 세포로부터 방출된 콜레스테롤의 %를 결정하기 위해 콜레스테롤을 유출 배지 및 세포 단일층에서 측정하였다. 시험 샘플의 생물학적 활성을 계산하고, 양성 실험 대조군으로서 기능하는 시험 샘플 내의 지단백질 복합체와 동일한 농도의 상기한 조성 H의 참조 표준물과 비교한 콜레스테롤 유출의 %로서 표현된다. 결과는 아래 표 7에 제시되고, 시험된 지단백질 복합체가 콜레스테롤 유출 검정으로 측정시에 유의한 생물학적 활성을 가짐을 입증한다.

12. 실시예 6: 토끼에서 조성 B 및 조성 H 복합체의 단일, 저용량 투여의 약력학 연구

정상 토끼에게 다음과 같은 단일 주사를 실시하였다: (a) 5 mg/kg 용량의 조성 B (ApoA-I 및 SM을 1:2.7 아포지단백질:인지질의 중량비로 함유하는 중성 지단백질 복합체)의 제제; (b) 5 mg/kg 용량의 조성 H (ApoA-I, SM, 및 DPPG를 1:2.7의 아포지단백질:인지질 중량비 및 97:3의 SM:DPPG 중량비로 함유하는 음하전된 지단백질 복합체)의 제제; 또는 (c) 지단백질 복합체 제제에 대한 희석제를 함유하는 대조 제제. 4마리의 토끼를 각각의 조성 B, 조성 H 및 대조군으로 시험하였다.

시간 경과에 따른 VLDL 총 콜레스테롤 및 트리글리세리드의 혈장 수준을 도 24 및 25에 제시한다. 조성 B (ApoA-I 및 SM의 지단백질 복합체)로 처리된 동물의 수준보다 조성 H (ApoA-I/DPPG/SM 복합체) (b)로 처리된 동물에서 혈장 VLDL 총 콜레스테롤 수준은 덜 증가하였고, 보다 신속하게 기준선으로 되돌아갔다. 유사한 효과가 트리글리세리드 수준에 대해 관찰되었다. 상기 연구는 이들 수준의 일시적인 상승이 중성 지단백질 복합체 사용시보다 ApoA-I/DPPG/SM 복합체 사용시에 더 짧은 시간 동안 지속됨을 보여주었다. 상기 결과는 인간 대상체에서 조성 H의 지단백질 복합체의 I상 연구의 결과 (아래 실시예 8에서 설명됨)와 일치한다.

13. 실시예 7: 에그 SM 및 합성 팔미토일 SM 의 비교 약력학 연구

토끼에게 정맥 내로 주사된 아포지단백질 A-I (ApoA-I)/에그 SM 및 ApoA-I/합성 팔미토일SM 지단백질 복합체의 약력학적 효과를 연구하였다. 지단백질 복합체의 주사 이후, 혈장 지질 및 지단백질 수준의 변화를 측정하였다.

ApoA-I/에그 SM 또는 ApoA-I/합성 SM의 지단백질 복합체를 1 mL/min의 속도로 귀 정맥 내로의 정맥내 주입에 의해 5 mg/kg 또는 20 mg/kg의 용량으로 토끼에게 투여하였다. 군당 4마리의 동물을 연구하였다. 혈장 샘플을 투여 전에, 주입 종료 직후에, 및 주입 개시 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h 및 30 h 후에 채취하였다. 이어서, 혈장 샘플을 총 콜레스테롤, 비에스테르화된 콜레스테롤, 인지질 및 총 트리글리세리드에 대해 상업적인 효소 키트를 사용하여 분석하였다. 상업적인 ELISA 키트를 사용하여 ApoA1을 혈장 샘플 내에서 검정하였다. 총 및 비에스테르화된 콜레스테롤 프로파일을 결정하기 위해 혈장 샘플을 GPC에 의해 분석하였다. 5 mg/kg의 용량 처리에 대해, 결과를 크로마토그램 트레이스의 총 곡선하 면적의 %를 기초로 하여 정량하였다.

도 26a-26d는 5 mg/kg 및 20 mg/kg의 ApoA-I/에그 SM 또는 ApoA-I/합성 SM을 주입한 토끼에서 시간 경과에 따른 콜레스테롤, 트리글리세리드, 인지질 및 ApoA-I의 혈장 수준을 보여준다. 신속한 및 유의한 콜레스테롤 이동은 투여된 두 용량 모두에서 주입 개시 후 30분 내에 관찰되었고: 콜레스테롤 이동은 5 mg/kg 용량의 경우 투여 30분 후에 피크를 보이고, 콜레스테롤 이동의 큰 증가는 20 mg/kg 용량에서 관찰되었다. 시험된 각각의 용량에서, 두 제제는 혈장 트리글리세리드, 혈장 인지질 및 혈장 재조합 인간 ApoA-I에 대해 유사한 프로파일을 가졌다.

도 27a-27c는 혈장 HDL-총 콜레스테롤 수준, 혈장 LDL-총 콜레스테롤 수준, 및 혈장 VLDL-총 콜레스테롤 수준을 보여준다. ApoA-I/에그 SM 및 ApoA-I/합성 SM에 대한 HDL-총 콜레스테롤의 증가는 유사하였다 (도 27a). 혈장 LDL-C 및 VLDL-C 수준은 거의 변하지 않았고, 수준은 두 제제의 지단백질 복합체의 주사에 의해 실질적으로 변경되지 않았다 (도 27b-27c).

본 연구의 결과는 ApoA-I/에그 SM 및 ApoA-I/합성 SM 지단백질 복합체가 생체 내에서 유사한 반응을 유도함을 보여준다.

14. 실시예 8: 건강한 이상지질혈증 대상체에서 APOA -I/ DPPG / SM 복합체의 I상 연구

14.1. 물질 및 방법

I상 임상 시험은 LDL/HDL 비가 3.0 초과인 건강한 지원자에서 무작위 배정된, 이중-맹검, 위약 대조, 교차, 단일 용량 증가 연구로서 조성 H의 지단백질 복합체를 사용하여 수행하였다. 상기 I상 연구의 목적은 단일 용량으로서 투여될 때 음하전된 지단백질 복합체의 안전성, 내성, 약동학 및 약력학을 평가하기 위한 것이었다. 0.25, 0.75, 2.0, 5.0, 10.0, 15.0, 30.0 및 45.0 mg/kg의 상승하는 용량을 연구하였다. 대상체에게 단백질 및 지질 성분의 동시-균질화에 의해 제조된 ApoA-I (실시예 1에 설명된 바와 같이 제조됨), SM 및 DPPG (1:2.7의 단백질:지질 중량비 및 97% SM/3% DPPG (w/w)의 지질 조성)의 지단백질 복합체를 함유하는 멸균 용액을 주입하였다. 멸균 용액은 지단백질 복합체 이외에 만니톨 및 수크로스 (4% (w/w) 수크로스, 2% (w/w) 만니톨)을 함유하는 pH 8.0의 10 mM 인산염 완충 용액이었다.

14.2. 결과

상기 I상 연구로부터의 임상 소견을 아래에 요약한다.

총 콜레스테롤: 각각의 시점에서 평균 혈장 총 콜레스테롤 농도를 아래 표 8에 제시한다:

총 콜레스테롤 내의 VLDL , LDL 및 HDL: 총 콜레스테롤 내의 VLDL, LDL 및 HDL에 대한 평균 값을 아래 표 9-11에서 시점 및 용량에 따라 요약한다:

비에스테르화된 (유리) 콜레스테롤: 각각의 시점에서 평균 혈장 유리 (비에스테르화된) 콜레스테롤 농도를 아래 표 12에 제시한다:

유리 콜레스테롤 내의 VLDL , LDL 및 HDL: 유리 콜레스테롤 내의 VLDL, LDL 및 HDL에 대한 평균 값을 아래 표 13-15에서 시점 및 용량에 따라 요약한다:

트리글리세리드: 각각의 시점에서 평균 혈장 트리글리세리드 농도를 아래 표 16에 제시한다:

ApoA -I: 시간 경과에 따른 대상체의 기준선 ApoA-I의 변화 (mg/dL 단위)를 아래 표 17에 제시한다. 혈장 ApoA-I의 최대 변화를 각각의 용량에 대해 굵은 글씨체로 표시한다.

트랜스아미나제: 독성과 연관된 간 알라닌 아미노트랜스퍼라제, 또는 트랜스아미나제 수준에 대한 평균 값을 아래 표 18에 제시한다. 알라닌 아미노트랜스퍼라제의 정상 범위는 9 내지 60 IU/L이다.

유해 사례: 총 7명 (22%)의 대상체가 유해 사례를 겪었다. 어느 대상체도 적어도 연구 약물에 관련될 가능성이 있는 것으로 조사자에 의해 간주될 유해 사례를 보이지 않았다. 유해 사례의 발생시에 임의의 용량-관련 경향은 나타나지 않는다. 어느 대상체도 심각한 유해 사례를 겪지 않았고, 어느 대상체도 유해 사례 때문에 연구로부터 배제되지 않았다. 아래 표 19는 신체 시스템에 의한 유해 사례의 요약을 제공한다:

14.3. 결론

조성 H의 음하전된 지단백질 복합체를 0.25, 0.75 2.0, 5.0, 10.0, 15.0, 30.0 및 45.0 mg/kg의 단일 IV 용량으로 포함하는 멸균 용액의 제제를 투여한 상기 I상 연구에서는 다음 결론을 도출하였다.

제제는 위약을 사용하여 관찰된 것과 유사한 유해 사례 프로파일을 갖는 모든 대상체에서 모든 용량에서 잘 인용되었다. 복합체는 임상 화학, 혈액학 또는 응고 파라미터에 위약과 상이하게 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다. ECG에 대한 유해 효과는 관찰되지 않았다. ApoA-I에 대한 항체는 단일 용량 투여 이후 검출되지 않았다.

ApoA-I 및 스핑고미엘린의 혈장 농도는 용량에 따라 증가하였다: ApoA-I 수준은 10 mg/kg 이하의 용량에 대해 투여 24시간 후에, 10 mg/kg를 초과하는 용량에 대해 투여 72시간 후에 기준선으로 되돌아갔다. 스핑고미엘린 수준은 5 mg/kg 이하의 용량에 대해 투여 24시간 후에, 10 내지 30 mg/kg의 용량에 대해 투여 72시간 후에, 및 45 mg/kg을 투여한 대상체에 대해 투여 7일 후에 기준선으로 되돌아갔다.

콜레스테롤 이동은 용량 증가에 따라 증가하였다: 유리 콜레스테롤의 HDL 분획의 이동은 2.0 mg/kg정도로 낮은 용량에서 보였고 (기준선으로부터 평균 23% 증가), 용량에 따라 증가하였다. 트리글리세리드 수준은 15 mg/kg 이상의 용량에서 위약을 사용할 때 나타난 수준을 초과하여 일시적으로 증가하였다.

또한, 복합체의 투여는 간 트랜스아미나제 수준을 유의하게 상승시키지 않았고, 모든 경우에, 그 수준은 정상 범위 내에 잘 유지되었다. 이것은 80 mg/kg (환자 체중)의 용량으로 투여될 때 몇몇 환자에서 알라닌 아미노트랜스퍼라제 수준을 정상 상한의 100배 초과까지 상승시키는 것으로 나타난 CSL-111 (대두 포스파티딜콜린과 복합체화된 혈장으로부터의 재구성된 정제된 인간 ApoA-I)과 대조적이다 (문헌 [Tardif et al., 2007, JAMA 297:1675-1682] 참조).

따라서, 본 개시내용의 복합체는 HDL을 모방하는 다른 제제에 대해 보고된 것보다 더 낮은 용량으로 투여될 수 있고, 유해한 부작용없이 지질 파라미터에서 여전히 임상학상 유의한 개선을 달성할 수 있다.

15. 실시예 9: 급성 관상동맥 증후군의 대상체의 치료에서 APOA -I/SM/DPPG 복합체의 II 상 임상 연구

심혈관 질환의 치료에서 조성 H (ApoA-I, 에그-스핑고미엘린 (에그-SM), 및 DPPG를 1:2.7의 아포지단백질:인지질 중량비에서, 이때 에그-SM 대 DPPG 중량비는 97:3임)의 음하전된 지단백질 복합체의 저용량의 치료 이익을 추가로 확인하기 위해 임상 시험을 수행한다. ApoA-I은 상기 실시예 1에 설명된 바와 같이 CHO 세포 내에서 발현에 의해 제조하고, 복합체는 실시예 4의 열 사이클링 방법에 의해 생성한다.

ACS의 증상을 보이는 대상체가 상기 연구를 위해 스크리닝하기에 적격이다. 기준선 카테터 삽입 시간에, 대상체는 이전의 또는 현재의 PCI에 의해 영향을 받지 않는 IVUS를 위한 1개의 "표적" 동맥의 적당한 혈관내 초음파 (IVUS) 평가를 받을 필요가 있고, 표적 동맥의 근위 4 cm는 시각적 혈관조영 평가에 의해 0 내지 50%의 협착 직경, 참조 직경 ≥2.5 mm을 갖고, 혈전을 시사하는 충만 결손 (filling defect)이 없어야 한다. 일단 기준선 IVUS가 전반적 품질, 적합한 표적 혈관의 존재, 및 IVUS 영상의 정확한 판독을 불가능하게 할 수 있는 기술적 요인의 부재에 대해 IVUS 코어 래보러토리 (Core Laboratory)에 의해 평가되면, 대상체는 위약 또는 3가지 용량의 복합체 (3, 6, 또는 12 mg/kg) 중 하나의 1시간에 걸쳐 제공되는 정맥내 주입을 투여받도록 무작위 배정된다. 무작위 배정된 대상체를 5회의 추가 주입을 위해 매주 간격 (즉, 7 내지 11일 마다)으로 복귀시킨다. 치료 종료 (End-of-treatment) 실험을 마지막 주입 1주 (5 내지 9일) 후에 얻었다. 추적조사 (follow-up) IVUS는 마지막 주입 약 3주 (14 내지 35일) 후에 수행한다. 추적조사 방문은 항-ApoA1 항체 시험을 위한 샘플을 수집하기 위해 및 주요 유해 심장 사건 (MACE) 종점에 대해 모니터링하기 위해 마지막 주입 약 6개월 (+/-2주) 후에 발생한다.

1차 종점은 3차원 IVUS에 의해 평가된 표적 관상 동맥의 30 mm 분절 (segment)에서 총 플라크 부피의 명목상 변화이다. 다른 효능 측정은 표적 30 mm 분절에서 플라크 부피의 변화 % 및 죽종 부피의 변화 %, 표적 30 mm 분절에서 총 혈관 부피의 변화뿐만 아니라, 기준선에서 최소 플라크 부하 (burden)를 갖는 부위 상에 중심을 둔 해부학상 비견되는 5 mm 분절, 및 3차원 IVUS 상에서 기준선에서 최대 플라크 부하를 추적조사하기 위해 기준선으로부터 플라크, 내강 (lumen) 및 총 혈관 부피의 변화를 포함한다. 플라크 부피의 변화 %는 명목상 변화를 기준선 값으로 나누고 100을 곱하여 계산한다. % 죽종 (obstructive) 부피는 플라크 부피를 외탄력막 (EEM) 부피로 나눈 후 100을 곱하여 산출한다.

16. 구체적인 실시양태, 참고문헌의 인용

본 개시내용의 다양한 측면을 숫자로 표시한 문단에 제시된 실시양태에서 설명한다.

1. 아포지단백질 분획 및 지질 분획을 포함하고, 상기 지질 분획이 본질적으로 95 내지 99 중량% 중성 인지질 및 1 내지 5 중량% 음하전된 인지질로 이루어지고, 아포지단백질 분획 대 인지질 분획의 중량비가 약 1:2.7 내지 약 1:3 범위인 지단백질 복합체.

2. 실시양태 1에 있어서, 아포지단백질이 프리프로아포지단백질, 프리프로ApoA-I, 프로ApoA I, ApoA-I, 프리프로ApoA-II, 프로ApoA II, ApoA II, 프리프로ApoA-IV, 프로ApoA-IV, ApoA-IV, ApoA-V, 프리프로ApoE, 프로ApoE, ApoE, 프리프로ApoA-I_밀라노, 프로ApoA-I_밀라노, ApoA-I_밀라노, 프리프로ApoA-I_파리, 프로ApoA-I_파리, 및 ApoA-I_파리 및 그의 혼합물로부터 선택되는 것인 지단백질 복합체.

3. 실시양태 2에 있어서, 아포지단백질이 본질적으로 서열 1의 아미노산 25 내지 267에 대응하는 단백질에 적어도 90% 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 ApoA I로 이루어지는 것인 지단백질 복합체.

4. 실시양태 3에 있어서, 아포지단백질이 단량체, 이량체 및/또는 사량체를 포함하는 것인 지단백질 복합체.

5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 아포지단백질이 ApoA-I 펩티드 모방체를 포함하는 것인 지단백질 복합체.

6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 아포지단백질 분획 대 인지질 분획의 중량비가 1:2.7인 지단백질 복합체.

7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 지질:아포지단백질 몰비가 약 1:105 내지 약 110 범위이고, 여기서 아포지단백질 값이 ApoA-I 동등물로 표현되는 것인 지단백질 복합체.

8. 실시양태 7에 있어서, 지질:아포지단백질 몰비가 1:108인 지단백질 복합체.

9. 실시양태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 중성 지질이 천연 스핑고미엘린 또는 합성 스핑고미엘린인 지단백질 복합체.

10. 실시양태 9에 있어서, 스핑고미엘린이 에그-스핑고미엘린인 지단백질 복합체.

11. 실시양태 9에 있어서, 적어도 95% 순수한 스핑고미엘린으로부터 제조되는 지단백질 복합체.

12. 실시양태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 분획이 본질적으로 96 내지 98 중량% 중성 인지질 및 2 내지 4 중량% 음하전된 인지질로 이루어지는 것인 지단백질 복합체.

13. 실시양태 12에 있어서, 상기 지질 분획이 본질적으로 97 중량% 중성 인지질 및 3 중량% 음하전된 인지질로 이루어지는 것인 지단백질 복합체.

14. 실시양태 13에 있어서, 음하전된 인지질이 포스파티딜글리세롤을 포함하는 것인 지단백질 복합체.

15. 실시양태 14에 있어서, 음하전된 인지질이 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)] (DPPG)의 염을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 지단백질 복합체.

16. 실시양태 15에 있어서, 염이 나트륨염 또는 칼륨염인 지단백질 복합체.

17. 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 중성 및/또는 음하전된 인지질의 아실 사슬이 각각 서로 독립적으로, 12 내지 26, 14 내지 26, 또는 16 내지 26개의 탄소 원자를 함유하는 포화 또는 일-불포화 탄화수소로부터 선택되는 것인 지단백질 복합체.

18. 실시양태 17에 있어서, 중성 및/또는 음하전된 인지질의 각각의 아실 사슬이 동일한 것인 지단백질 복합체.

19. 실시양태 17에 있어서, 중성 및/또는 음하전된 인지질의 각각의 아실 사슬이 상이한 것인 지단백질 복합체.

20. 실시양태 17에 있어서, 중성 및 음하전된 인지질의 아실 사슬이 동일한 수의 탄소 원자를 함유하는 것인 지단백질 복합체.

21. 실시양태 17에 있어서, 중성 및 음하전된 인지질의 아실 사슬이 상이한 정도의 포화도를 갖는 것인 지단백질 복합체.

22. 실시양태 17에 있어서, 중성 및 음하전된 인지질의 아실 사슬이 16개의 탄소 원자를 함유하는 것인 지단백질 복합체.

23. 실시양태 1 내지 22 중 어느 하나에 따른 지단백질 복합체의 집단.

24. 다음 특징 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 10개 전부를 특징으로 하는, 지질 분획 및 본질적으로 아포지단백질 A-I ("ApoA-I")로 이루어지는 아포지단백질 분획을 각각 포함하는 지단백질 복합체의 집단:

(a) 상기 집단 내의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% (중량 기준)의 ApoA-I은 성숙한 형태이고;

(b) 상기 집단 내의 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하 (중량 기준)의 ApoA-I은 미성숙한 형태이고;

(c) 집단은 ApoA-I 1 mg당 100 pg 이하, 50 pg 이하, 25 pg 이하, 10 pg 이하 또는 5 pg 이하의 숙주 세포 DNA를 포함하고;

(d) 집단은 ApoA-I 1 mg당 500 ng 이하, 200 ng 이하, 100 ng 이하, 50 ng 이하, 또는 20 ng 이하의 숙주 세포 단백질을 포함하고;

(e) 집단 내의 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하 (중량 기준)의 ApoA-I은 말단절단된 형태이고;

(f) 상기 집단 내의 상기 ApoA-I 중 각각의 메티오닌 112 및 메티오닌 148의 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 3% 이하, 2% 이하 또는 1% 이하가 산화되고;

(g) 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 지단백질 복합체는 겔 투과 크로마토그래피 ("GPC") 또는 동적 광 산란 ("DLS")에 의해 측정하였을 때 크기가 4 nm 내지 15 nm 또는 6 nm 내지 15 nm인 입자 형태로 존재하고;

(h) 집단은 ApoA-I 1 mg당 1 EU 이하, 0.5 EU 이하, 0.3 EU 이하 또는 0.1 EU 이하의 내독소를 포함하고;

(i) 상기 집단 내의 ApoA-I 내의 10% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하 또는 1% 이하의 아미노산은 탈아미드화된다.

25. 실시양태 24에 있어서, 상기 복합체 내의 지질 분획 중 15% 이하, 또는 10% 이하, 5% 이하 또는 2% 이하 (중량 기준)의 지질이 콜레스테롤인 집단.

26. 실시양태 25에 있어서, 콜레스테롤을 함유하지 않는 집단.

27. 실시양태 24 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 단백질이 성숙 ApoA-I 단백질인 집단.

28. 실시양태 27에 있어서, 15% 미만, 10% 미만, 또는 10% 미만의 단백질이 산화된 및/또는 탈아미드화된 및/또는 말단절단된 종인 집단.

29. 실시양태 24 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 지단백질 복합체가 적어도 90%, 적어도 92.5%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 또는 적어도 98% 순수한 것인 집단.

30. 실시양태 24 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 지단백질 복합체가 겔 투과 크로마토그래피에서의 단일 피크에 의해 반영되는 바와 같이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 균질한 것인 집단.

31. 실시양태 30에 있어서, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 지단백질 복합체의 크기가 GPC 또는 DLS에 의해 측정하였을 때 4 nm 내지 12 nm, 6 nm 내지 12 nm, 또는 8 nm 내지 12 nm 범위인 집단.

32. 실시양태 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 단백질이 복합체로 존재하는 것인 집단.

33. 실시양태 24 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 담즙산염을 함유하지 않는 집단.

34. 실시양태 24 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 임의의 세제를 함유하지 않는 집단.

35. 실시양태 24 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 200 ppm 미만, 100 ppm 미만 또는 50 ppm 미만의 비-수성 용매를 함유하는 집단.

36. 실시양태 24 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 ApoA-I이 인간 ApoA-I 단백질인 집단.

37. 실시양태 24 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 ApoA-I이 재조합 ApoA-I인 집단.

38. 실시양태 24 내지 37 중 어느 하나에 있어서, ApoA-I이 서열 1의 아미노산 25 내지 267에 대응하는 단백질에 적어도 90% 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인 집단.

39. 실시양태 24 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 분획이 본질적으로 95 내지 99 중량% 중성 인지질 및 1 내지 5 중량% 음하전된 인지질로 이루어지는 것인 집단.

40. 실시양태 39에 있어서, 상기 지질 분획이 본질적으로 96 내지 98 중량% 중성 인지질 및 2 내지 4 중량% 음하전된 인지질로 이루어지는 것인 집단.

41. 실시양태 24 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 분획이 본질적으로 97 중량% 중성 인지질 및 3 중량% 음하전된 인지질로 이루어지는 것인 집단.

42. 실시양태 41에 있어서, 중성 지질이 천연 스핑고미엘린 또는 합성 스핑고미엘린이고, 여기서 임의로 지질의 과산화물 값은 5 meq O/kg 미만, 4 meq O/kg 미만, 3 meq O/kg 미만 또는 2 meq O/kg 미만인 집단.

43. 실시양태 42에 있어서, 스핑고미엘린이 에그-스핑고미엘린인 집단.

44. 실시양태 42에 있어서, 적어도 95% 순수한 스핑고미엘린으로부터 제조되는 집단.

45. 실시양태 41 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 음하전된 인지질이 포스파티딜글리세롤을 포함하는 것인 집단.

46. 실시양태 45에 있어서, 음하전된 인지질이 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)] (DPPG)의 염을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 집단.

47. 실시양태 46에 있어서, 염이 나트륨염 또는 칼륨염인 집단.

48. 실시양태 24 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 중성 및/또는 음하전된 인지질의 아실 사슬이 각각 서로 독립적으로, 12 내지 26, 14 내지 26, 또는 16 내지 26개의 탄소 원자를 함유하는 포화 또는 일-불포화 탄화수소로부터 선택되는 것인 집단.

49. 실시양태 48에 있어서, 중성 및/또는 음하전된 인지질의 각각의 아실 사슬이 동일한 것인 집단.

50. 실시양태 48에 있어서, 중성 및/또는 음하전된 인지질의 각각의 아실 사슬이 상이한 것인 집단.

51. 실시양태 48에 있어서, 중성 및 음하전된 인지질의 아실 사슬이 동일한 수의 탄소 원자를 함유하는 것인 집단.

52. 실시양태 48에 있어서, 중성 및 음하전된 인지질의 아실 사슬이 상이한 정도의 포화도를 갖는 것인 집단.

53. 실시양태 48에 있어서, 중성 및 음하전된 인지질의 아실 사슬이 16개의 탄소 원자를 함유하는 것인 집단.

54. 실시양태 24 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 1:80 내지 120, 1:85 내지 1:110, 또는 1:100 내지 1:115 범위의 아포지단백질 분획:지질 분획 몰비를 갖고, 여기서 아포지단백질 값이 ApoA-I 동등물로 표현되는 것인 집단.

55. 실시양태 54에 있어서, 1:80 내지 1:90, 1:90 내지 1:100, 1:100 내지 1:110 또는 1:105 내지 1:110 범위의 아포지단백질 분획:지질 분획 몰비를 갖고, 여기서 아포지단백질 값이 ApoA-I 동등물로 표현되는 것인 집단.

56. 실시양태 24 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 아포지단백질 분획 대 인지질 분획의 중량비가 1:2 내지 약 1:3 범위인 집단.

57. 실시양태 24 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 아포지단백질 분획 대 인지질 분획의 중량비가 1:2.1 내지 1:2.7 범위인 집단.

58. 실시양태 57에 있어서, 아포지단백질 분획 대 인지질 분획의 중량비가 1:2.7인 집단.

59. 실시양태 1 내지 22 중 어느 하나에 따른 지단백질 복합체 또는 실시양태 23 내지 58 중 어느 하나에 따른 지단백질 복합체의 집단, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어지는 제약 조성물.

60. 서열 1의 위치 25 내지 267에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 ApoA-I 단백질을 발현하도록 조작된 포유동물 숙주 세포.

61. 실시양태 60에 있어서, 숙주 세포가 배양될 때 단백질이 배지 내로 분비되는 것인 포유동물 숙주 세포.

62. 실시양태 60 또는 실시양태 61에 있어서, 단백질이 신호 서열 MKAAVLTLAVLFLTGSQA을 추가로 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포.

63. 실시양태 60 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 단백질이 프로펩티드 서열 RHFWQQ를 추가로 포함하는 것인 포유동물 숙주 세포.

64. 실시양태 60 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO), CHO-S, CHO-K1, VERO, BHK, BHK 570, HeLa, COS-1, COS-7, MDCK 세포, 293, 3T3, 골수종, PC12 및 W138인 포유동물 숙주 세포.

65. 실시양태 64에 있어서, CHO 세포인 포유동물 숙주 세포.

66. 실시양태 65에 있어서, CHO-S 세포 또는 CHO-K1 세포인 포유동물 숙주 세포.

67. 실시양태 60 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 배양액에서 적어도 0.5, 1, 2, 3, 또는 4 g/L의 상기 ApoA-I 단백질을 생산할 수 있는 포유동물 숙주 세포.

68. 실시양태 67에 있어서, 배양액에서 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15 또는 20 g/L 이하의 상기 ApoA-I 단백질을 생산할 수 있는 포유동물 숙주 세포.

69. 실시양태 67 또는 실시양태 68에 있어서, 배양이 대규모 배양인 포유동물 숙주 세포.

70. 실시양태 69에 있어서, 상기 대규모 배양이 적어도 15 리터, 적어도 20 리터, 적어도 25 리터, 또는 적어도 30 리터인 포유동물 숙주 세포.

71. 실시양태 70에 있어서, 상기 대규모 배양이 약 50 리터, 약 100 리터, 약 200 리터 또는 약 300 리터인 포유동물 숙주 세포.

72. 실시양태 60 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 적어도 약 5 카피의, 상기 ApoA-I 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 포유동물 숙주 세포.

73. 실시양태 72에 있어서, 각각의 뉴클레오티드 서열이 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 포유동물 숙주 세포.

74. 실시양태 73에 있어서, 프로모터가 사이토메갈로바이러스 프로모터인 포유동물 숙주 세포.

75. 실시양태 74에 있어서, 프로모터가 최조기 원숭이 사이토메갈로바이러스 프로모터인 포유동물 숙주 세포.

76. 실시양태 60 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 서열 1의 아미노산 25 내지 267에 대응하는 아미노 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 성숙 ApoA-I 단백질을 분비하는 포유동물 숙주 세포.

77. 실시양태 60 내지 76 중 어느 하나에 따른 다수의 포유동물 숙주 세포를 포함하는 포유동물 세포 배양액.

78. 실시양태 77에 있어서, 적어도 약 0.5 g/L의, 서열 1의 아미노산 25 내지 267에 대응하는 아미노 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 성숙 ApoA-I 단백질을 포함하는 포유동물 세포 배양액.

79. 실시양태 78에 있어서, 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90%의 상기 성숙 ApoA-I 단백질이, 신호 서열이 결여되는 것인 포유동물 세포 배양액.

80. 실시양태 78에 있어서, 적어도 80%, 적어도 85%, 또는 적어도 90%의 상기 성숙 ApoA-I 단백질이, 신호 서열 및 프로펩티드 서열이 결여되는 것인 포유동물 세포 배양액.

81. 실시양태 78 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 적어도 80%, 적어도 85% 또는 적어도 90%의 상기 성숙 ApoA-I 단백질이 말단절단되거나, 산화되거나 또는 탈아미드화되지 않는 것인 포유동물 세포 배양액.

82. 실시양태 60 내지 76 중 어느 하나에 따른 포유동물 숙주 세포를 ApoA-I 단백질이 발현되고 분비되는 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 성숙한 생물학적 활성 ApoA-1 단백질의 생산 방법.

83. 실시양태 82에 있어서, 상기 배양된 포유동물 숙주 세포의 상청액으로부터 상기 성숙한 생물학적 활성 ApoA-1 단백질을 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.

84. 실시양태 82 또는 실시양태 83에 있어서, ApoA-I 단백질을 정제하는 것을 추가로 포함하는 방법.

85. 실시양태 84의 방법에 의해 얻거나 얻을 수 있는 치료 유효량의 ApoA-I 단백질을 포함하는 제약 조성물.

86. 실시양태 85에 있어서, ApoA-I 단백질이 지질과 복합체화된 것인 제약 조성물.

87. 제약 조성물을 불활성 기체 하에 제조하는 것을 포함하는, ApoA-I을 포함하는 제약 조성물 내에 산화 생성물을 최소화하는 방법.

88. 실시양태 87에 있어서, 불활성 기체가 질소, 헬륨 또는 아르곤인 방법.

89. 실시양태 87 또는 실시양태 88에 있어서, 제약 조성물이 ApoA-I을 포함하는 지단백질 복합체의 제약 조성물인 방법.

90. (a) 지질 성분 및 단백질 성분을 포함하는 출발 현탁액을 제1 온도 범위 내의 온도로부터 제2 온도 범위 내의 온도로 냉각하고,

여기서 상기 지질 성분은 본질적으로 지질의 입자로 이루어진 것이고, 상기 단백질 성분은 본질적으로 지질-결합 펩티드 및/또는 지질-결합 단백질로 이루어진 것이고;

(b) 상기 (a)의 냉각된 현탁액을 상기 제2 온도 범위 내의 온도로부터 상기 제1 온도 범위 내의 온도로 가열하고;

(c) 상기 (b)의 가열된 현탁액을 상기 제1 온도 범위 내의 온도로부터 상기 제2 온도 범위 내의 온도로 냉각하고;

(d) 단계 (b) 및 (c)를 적어도 1회 반복하여 지단백질 복합체를 형성하는 것

을 포함하는, 지단백질 복합체의 제조 방법.

91. 실시양태 90에 있어서, 단계 (c)가 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 상기 지질 성분 및/또는 상기 단백질 성분이 복합체화된 형태로 존재할 때까지 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 것을 포함하는 것인 방법.

92. 실시양태 90 또는 실시양태 91에 있어서, 단계 (c)가 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 균질성의 지단백질 복합체가 얻어질 때까지 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 것을 포함하는 방법.

93. 실시양태 90 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 단계 (d)가 단계 (b) 및 (c)를 적어도 3, 적어도 4, 또는 적어도 5회 반복하는 것을 포함하는 것인 방법.

94. 실시양태 90 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 단계 (c)가 단계 (b) 및 (c)를 6회 이하, 8회 이하 또는 10회 이하 반복하는 것을 포함하는 것인 방법.

95. 실시양태 90 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a) 후에, 현탁액을 상기 가열 단계 (b)에 앞서 적어도 1분, 적어도 2분, 적어도 3분, 적어도 4분 또는 적어도 5분 동안 제2 온도 범위 내에 유지하는 것인 방법.

96. 실시양태 90 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 단계 (a) 후에, 현탁액을 상기 가열 단계 (b)에 앞서 6분 이하, 8분 이하, 10분 이하, 20분 이하, 30분 이하 또는 1시간 이하 동안 제2 온도 범위 내에 유지하는 것인 방법.

97. 실시양태 90 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 단계 (b) 후에, 현탁액을 상기 냉각 단계 (c)에 앞서 적어도 1분, 적어도 2분, 적어도 3분, 적어도 4분 또는 적어도 5분 동안 제1 온도 범위 내에 유지하는 것인 방법.

98. 실시양태 90 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 단계 (b) 후에, 현탁액을 상기 냉각 단계 (c)에 앞서 6분 이하, 8분 이하, 10분 이하, 20분 이하, 30분 이하 또는 1시간 이하 동안 제1 온도 범위 내에 유지하는 것인 방법.

99. 실시양태 90 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 생성되는 지단백질 복합체를 원심분리하지 않는 것인 방법.

100. 실시양태 90 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 지질 성분 및 단백질 성분이 단계 (a)의 상기 출발 현탁액 내에서 각각 대다수의 지질 및 단백질 및 펩티드에 해당하는 것인 방법.

101. 실시양태 90 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 지질 성분이 단계 (a)의 상기 출발 현탁액 내에서 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%의 지질에 해당하는 것인 방법.

102. 실시양태 90 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 단백질 성분이 단계 (a)의 상기 출발 현탁액 내에서 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%의 단백질 및 펩티드에 해당하는 것인 방법.

103. 실시양태 90 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 상기 현탁액 내의 5% 이하, 10% 이하, 15% 이하 또는 20% 이하의 지질이 단계 (a)의 출발 현탁액 내의 단백질 성분에 예비-복합체화된 것인 방법.

104. 실시양태 90 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 온도 범위가 상기 단백질 성분의 전이 온도 아래 10℃ 이상, 및 상기 단백질 성분의 전이 온도 위 15℃ 이하, 10℃ 이하, 또는 5℃ 이하의 온도를 포함하는 것인 방법.

105. 실시양태 90 내지 104 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 온도 범위가 상기 지질 성분의 전이 온도 아래 5℃ 이상 또는 10℃ 이상, 및 상기 지질 성분의 전이 온도 위 5℃ 이하의 온도를 포함하는 것인 방법.

106. 실시양태 90 내지 105 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 온도 범위가 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 7℃ 또는 10℃ 이하에 걸치는 것인 방법.

107. 실시양태 90 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 온도 범위가 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 7℃ 또는 10℃ 이하에 걸치는 것인 방법.

108. 실시양태 90 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 상기 출발 현탁액을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

109. 실시양태 108에 있어서, 상기 현탁액 형성이 각각 상기 제1 범위 내의 온도로 예열된 지질 입자의 현탁액, 및 상기 지질-결합 펩티드 및/또는 지질-결합 단백질의 용액을 합하는 단계를 포함하는 것인 방법.

110. 실시양태 108에 있어서, 상기 현탁액 형성이 각각 상기 제1 범위 내의 온도로 예열된 지질 입자의 집단, 및 지질과 예비-복합체화된 상기 지질-결합 펩티드 및/또는 지질-결합 단백질을 혼합하는 단계를 포함하는 것인 방법.

111. 실시양태 110에 있어서, 지질-결합 펩티드 및/또는 지질-결합 단백질과 예비-복합체화된 지질이 상기 출발 현탁액 내의 총 지질의 5% 이하, 10% 이하, 15% 이하, 또는 20% 이하인 방법.

112. 실시양태 109 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 지질의 용액이 균질화된 지질의 용액인 방법.

113. 실시양태 112에 있어서, 상기 합하는 단계에 앞서 고압 균질화를 이용하여 균질화된 지질의 용액을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

114. 실시양태 113에 있어서, 상기 고압 균질화가 1500 바 초과, 1800 바 초과, 또는 2000 바 초과의 압력에서 일어나는 것인 방법.

115. 실시양태 114에 있어서, 상기 고압 균질화가 1900 내지 2500 바의 압력에서 수행되는 것인 방법.

116. 실시양태 90 내지 115 중 어느 하나에 있어서, 지질 성분이 본질적으로 지질 입자로 이루어지고, 상기 지질 입자가

(i) DLS에 의해 측정하였을 때 크기가 적어도 45 nm, 적어도 50 nm, 적어도 55 nm 또는 적어도 60 nm이고;

(ii) DLS에 의해 측정하였을 때 크기가 65 nm 이하, 70 nm 이하, 75 nm 이하, 80 nm 이하, 100 nm 이하, 120 nm 이하, 150 nm 이하, 200 nm 이하, 250 nm 이하, 300 nm 이하, 500 nm 이하인 방법.

117. 실시양태 116에 있어서, 상기 지질 입자가 DLS에 의해 측정하였을 때 크기가 65 nm 이하, 70 nm 이하, 75 nm 이하, 또는 80 nm 이하인 방법.

118. 실시양태 116에 있어서, 상기 지질 입자가 DLS에 의해 측정하였을 때 크기가 100 nm 이하, 120 nm 이하, 150 nm 이하, 200 nm 이하, 250 nm 이하, 300 nm 이하, 500 nm 이하인 방법.

119. 실시양태 90 내지 116 중 어느 하나에 있어서, 단계 (b) 및 (c)가 4 nm 내지 15 nm, 5 nm 내지 15 nm, 6 nm 내지 15 nm, 또는 8 nm 내지 15 nm의 지단백질 복합체가 얻어질 때까지 반복되는 것인 방법.

120. 실시양태 90 내지 116 중 어느 하나에 있어서, 단계 (b) 및 (c)가 5 nm 내지 12 nm, 6 nm 내지 12 nm, 또는 8 nm 내지 12 nm의 지단백질 복합체가 얻어질 때까지 반복되는 것인 방법.

121. 실시양태 90 내지 120 중 어느 하나에 있어서, 1, 1 초과 또는 모든 단계가 불활성 기체 하에 수행되는 것인 방법.

122. 실시양태 121에 있어서, 불활성 기체가 질소인 방법.

123. 실시양태 90 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질 성분이 지질-결합 단백질을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 방법.

124. 실시양태 123에 있어서, 상기 지질-결합 단백질이 ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoE 또는 그의 혼합물인 방법.

125. 실시양태 90 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 상기 단백질 성분이 지질-결합 펩티드를 포함하거나 이로 이루어지는 것인 방법.

126. 실시양태 125에 있어서, 상기 지질 결합 펩티드가 ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoC-I, ApoC-II, ApoC-III, ApoE의 유사체 또는 그의 혼합물인 방법.

127. 실시양태 90 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 성분이 천연 지질, 합성 지질, 또는 그의 혼합물을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 방법.

128. 실시양태 127에 있어서, 상기 지질 성분이 에테르 인지질, 단쇄 인지질, 콜레스테롤, 콜레스테롤 유도체, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고지질, 포스파티딜글리세롤, 강글리오시드, 및/또는 세레브로시드를 포함하거나 이로 이루어지는 것인 방법.

129. 실시양태 128에 있어서, 상기 지질 성분이 에그 포스파티딜콜린, 대두 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린, 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린, 1-스테아로일-2-팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디올레오포스파티딜에탄올아민, 디라우로일포스파티딜글리세롤, 디포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디올레오일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티드산, 디팔미토일포스파티드산, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린, 스핑고미엘린, 디팔미토일스핑고미엘린, 디스테아로일스핑고미엘린, 디팔미토일포스파티딜글리세롤 염, 포스파티드산, 갈락토세레브로시드, 디라우릴포스파티딜콜린, (1,3)-D-만노실(1,3)디글리세리드, 아미노페닐글리코시드, 및/또는 3-콜레스테릴-6'-(글리코실티오)헥실 에테르 당지질을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 방법.

130. 실시양태 90 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 성분이 중성 지질을 포함하는 것인 방법.

131. 실시양태 130에 있어서, 상기 지질 성분이 우세하게 중성 지질인 방법.

132. 실시양태 130 또는 실시양태 131에 있어서, 상기 중성 지질이 스핑고미엘린을 포함하는 것인 방법.

133. 실시양태 132에 있어서, 상기 중성 지질이 우세하게 스핑고미엘린인 방법.

134. 실시양태 132 또는 실시양태 133에 있어서, 스핑고미엘린이 D-에리트로스-스핑고미엘린 및/또는 D-에리트로스 디히드로스핑고미엘린을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 방법.

135. 실시양태 130 내지 135 중 어느 하나에 있어서, 상기 출발 현탁액이 음하전된 인지질을 추가로 포함하는 것인 방법.

136. 실시양태 135에 있어서, 상기 음하전된 인지질이 포스파티딜글리세롤을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 방법.

137. 실시양태 136에 있어서, 상기 포스파티딜글리세롤이 C16:0 아실 사슬을 갖는 것인 방법.

138. 실시양태 136 또는 실시양태 137에 있어서, 상기 포스파티딜글리세롤이 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)의 염을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 방법.

139. 실시양태 138에 있어서, 염이 나트륨염인 방법.

140. 실시양태 90 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 상기 출발 현탁액 내의 지질:단백질 몰비가 약 2:1 내지 약 200:1인 방법.

141. 실시양태 140에 있어서, 상기 출발 현탁액 내의 지질:단백질 몰비가 약 10:1 내지 약 125:1인 방법.

142. 실시양태 140에 있어서, 상기 출발 현탁액 내의 지질:단백질 몰비가 약 10:1 내지 약 150:1인 방법.

143. 실시양태 140에 있어서, 상기 출발 현탁액 내의 지질:단백질 몰비가 약 75:1 내지 125:1인 방법.

144. 실시양태 90 내지 143 중 어느 하나에 있어서, 출발 현탁액이 음하전된 지질, 중성 지질 및 지질-결합 펩티드를 2-6 (음하전된 지질):90-120 (중성 지질):1 (지질-결합 펩티드, 지질 결합 단백질 또는 그의 혼합물) 범위의 몰비로 함유하는 것인 방법.

145. 실시양태 90 내지 144 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 온도 범위가 55℃ 내지 60℃인 방법.

146. 실시양태 90 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 온도 범위가 35℃ 내지 40℃인 방법.

147. 실시양태 90 내지 146 중 어느 하나에 있어서, 생성되는 지단백질 복합체를 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

148. 실시양태 147에 있어서, 동결건조에 앞서 등장화제의 첨가 단계를 추가로 포함하는 방법.

149. 지단백질 복합체의 집단을 포함하는 제약 조성물로서, 상기 지단백질 복합체가

(a) GPC 또는 DLS에 의해 측정하였을 때 크기가 4 nm 내지 15 nm 또는 6 nm 내지 15 nm, 또는 5 내지 12 nm, 또는 8 내지 10 nm이고;

(b) 겔 투과 크로마토그래피에서의 단일 피크에 의해 반영되는 바와 같이 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 균질한 것인 제약 조성물.

150. (a) 실시양태 90 내지 146 중 어느 하나의 방법에 따라 지단백질 복합체의 집단을 제조하고;

(b) 상기 지단백질 복합체의 집단을 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제와 합하는 것

을 포함하는, 제약 조성물의 제조 방법.

151. 실시양태 150에 있어서, 제약 조성물이 불활성 기체 하에 제조되는 것인 방법.

152. 실시양태 151에 있어서, 불활성 기체가 질소, 헬륨 또는 아르곤인 방법.

153. 실시양태 150 내지 152 중 어느 하나에 있어서, 제약 조성물을 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

154. 실시양태 150 내지 152 중 어느 하나에 있어서, 제약 조성물을 개별적인 단위 용량으로 분취하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

155. 실시양태 154에 있어서, 개별적인 단위 용량을 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

156. 실시양태 147의 방법 또는 실시양태 153 또는 실시양태 155의 방법에 의해 제조된 지단백질 복합체의 동결건조된 제제를 재구성하는 것을 포함하는, 제약 조성물의 제조 방법.

157. 실시양태 156에 있어서, 재구성된 지단백질 복합체를 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제와 합하는 것을 추가로 포함하는 방법.

158. 실시양태 156 또는 실시양태 157에 있어서, 제약 조성물을 개별적인 단위 용량으로 분취하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

159. 실시양태 150 또는 실시양태 156의 방법에 의해 제조된 액체 제약 조성물.

160. 실시양태 153의 방법에 의해 제조된 동결건조된 제약 조성물.

161. 실시양태 158의 방법에 의해 제조된 액체 단위 투여 형태.

162. 치료 유효량의 실시양태 149의 제약 조성물을 포함하는 액체 단위 투여 형태.

163. 실시양태 155의 방법에 의해 제조된 건조 단위 투여 형태.

164. 이상지질혈증 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 다음의 것을 투여하는 것을 포함하는, 이상지질혈증 장애의 치료 방법:

(a) 실시양태 1 내지 22 중 어느 하나에 따른 지단백질 복합체;

(b) 실시양태 23 내지 58 중 어느 하나에 따른 지단백질 복합체의 집단;

(c) 실시양태 59, 149, 및 159 중 어느 하나에 따른 제약 조성물;

(d) 치료 유효량의, 실시양태 90 내지 148 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 지단백질 복합체;

(e) 실시양태 161 또는 실시양태 162에 따른 단위 투여 형태;

(f) 건강한 지원자에게 45 mg/kg 이하의 단일 투여 이후 간 효소 상승을 일으키지 않는 지단백질 복합체;

(g) 인간 대상체에게 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여 이후 간 효소 상승을 일으키지 않는 지단백질 복합체;

(h) 인간 대상체에게 1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 용량으로 단일 투여 이후 간 효소 상승을 일으키지 않는 지단백질 복합체;

(i) 인간 대상체에게 각각 1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 용량으로 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여 이후 간 효소 상승을 일으키지 않는 지단백질 복합체;

(j) 건강한 지원자에게 20 mg/kg 이하의 단일 투여 이후 2배 초과의 트리글리세리드 증가를 일으키지 않는 지단백질 복합체;

(k) 인간 대상체에게 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여 이후 2배 초과의 트리글리세리드 증가를 일으키지 않는 지단백질 복합체;

(l) 인간 대상체에게 1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 용량으로 단일 투여 이후 2배 초과의 트리글리세리드 증가를 일으키지 않는 지단백질 복합체; 또는

(m) 인간 대상체에게 각각 1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 용량으로 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여 이후 2배 초과의 트리글리세리드 증가를 일으키지 않는 지단백질 복합체.

165. 실시양태 164에 있어서, 상기 투여를 반복하는 것을 추가로 포함하는 방법.

166. 실시양태 165에 있어서, 투여를 6일 내지 12일 간격으로 반복하는 것인 방법.

167. 실시양태 166에 있어서, 투여가 매주 투여인 방법.

168. 실시양태 165 내지 167 중 어느 하나에 있어서, 투여가 1개월, 5주, 6주, 2개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 이상의 기간에 걸쳐 일어나는 것인 방법.

169. 실시양태 165 내지 167 중 어느 하나에 있어서, 투여가 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 또는 12회 일어나는 것인 방법.

170. 실시양태 164 내지 169 중 어느 하나에 있어서, 투여가 정맥내 투여인 방법.

171. 실시양태 170에 있어서, 투여가 주입에 의한 것인 방법.

172. 실시양태 171에 있어서, 주입이 1 내지 4시간의 기간에 걸쳐 일어나는 것인 방법.

173. 실시양태 171에 있어서, 주입이 24시간 이하의 기간에 걸쳐 일어나는 것인 방법.

174. 실시양태 170 내지 173 중 어느 하나에 있어서, 지단백질 복합체의 양이 투여당 약 0.25 mg/kg ApoA-I 동등물 내지 약 30 mg/kg ApoA-I 동등물 범위인 방법.

175. 실시양태 174에 있어서, 지단백질 복합체의 양이 투여당 약 1 mg/kg ApoA-I 동등물 내지 약 15 mg/kg ApoA-I 동등물 범위인 방법.

176. 실시양태 175에 있어서, 지단백질 복합체의 양이 투여당 약 2 mg/kg ApoA-I 동등물 내지 약 12 mg/kg ApoA-I 동등물 범위인 방법.

177. 실시양태 176에 있어서, 지단백질 복합체의 양이 투여당 약 3 mg/kg ApoA-I 동등물인 방법.

178. 실시양태 176에 있어서, 지단백질 복합체의 양이 투여당 약 6 mg/kg ApoA-I 동등물인 방법.

179. 실시양태 176에 있어서, 지단백질 복합체의 양이 투여당 약 12 mg/kg ApoA-I 동등물인 방법.

180. (a) 대상체에게 1 mg kg 내지 12 mg/kg의 다음 중의 초기 용량을 투여하고:

(i) 실시양태 1 내지 22 중 어느 하나에 따른 지단백질 복합체;

(ii) 실시양태 23 내지 58 중 어느 하나에 따른 지단백질 복합체의 집단;

(iii) 실시양태 59, 149, 및 159 중 어느 하나에 따른 제약 조성물;

(iv) 치료 유효량의, 실시양태 90 내지 148 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 지단백질 복합체;

(v) 실시양태 161 또는 실시양태 162에 따른 단위 투여 형태;

(vi) 건강한 지원자에게 45 mg/kg 이하의 단일 투여 이후 간 효소 상승을 일으키지 않는 지단백질 복합체;

(vii) 인간 대상체에게 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여 이후 간 효소 상승을 일으키지 않는 지단백질 복합체;

(viii) 인간 대상체에게 1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 용량으로 단일 투여 이후 간 효소 상승을 일으키지 않는 지단백질 복합체;

(ix) 인간 대상체에게 각각 1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 용량으로 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여 이후 간 효소 상승을 일으키지 않는 지단백질 복합체;

(x) 건강한 지원자에게 20 mg/kg 이하의 단일 투여 이후 2배 초과의 트리글리세리드 증가를 일으키지 않는 지단백질 복합체;

(xi) 인간 대상체에게 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여 이후 2배 초과의 트리글리세리드 증가를 일으키지 않는 지단백질 복합체;

(xii) 인간 대상체에게 1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 용량으로 단일 투여 이후 2배 초과의 트리글리세리드 증가를 일으키지 않는 지단백질 복합체; 또는

(xiii) 인간 대상체에게 각각 1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 용량으로 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여 이후 2배 초과의 트리글리세리드 증가를 일으키지 않는 지단백질 복합체;

(b) 대상체의 트리글리세리드, VLDL-콜레스테롤 및/또는 VLDL-트리글리세리드가 상기 투여 4, 8, 12, 24, 48, 72, 168, 336 또는 504시간 후에 2배 초과로 상승하는지 결정하고;

(c) 대상체의 트리글리세리드, VLDL-콜레스테롤 및/또는 VLDL-트리글리세리드가 투여전 수준의 2배 초과로 상승하면, 상기 투여를 보다 저 용량으로 반복하고, 대상체의 트리글리세리드, VLDL-콜레스테롤 및/또는 VLDL-트리글리세리드가 투여전 수준의 2배 초과로 상승되지 않으면, 상기 투여를 동등한 또는 보다 높은 용량으로 반복하는 것을 포함하는, 이상지질혈증 장애의 치료 방법.

181. 실시양태 165 내지 180 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체가 고지질혈증 또는 심혈관 질환이 있거나 그에 감수성이 있는 것인 방법.

182. 실시양태 181에 있어서, 환자가 고지질혈증이 있거나 그에 감수성이 있고, 상기 고지질혈증이 고콜레스테롤혈증인 방법.

183. 실시양태 181에 있어서, 환자가 심혈관 질환이 있거나 그에 감수성이 있고, 심혈관 질환이 아테롬성동맥경화증, 뇌졸중, 심근 경색, 급성 관상동맥 증후군, 협심증, 간헐적 파행, 중증 하지 허혈, 심방 판막 경화증 또는 재협착증인 방법.

184. 실시양태 165 내지 183 중 어느 하나에 있어서, 담즙산 수지, 니아신, 소염제, 스타틴, 피브레이트, CETP 억제제, 혈소판 응집 억제제, 항응고제, PCSK9의 효능제 및/또는 콜레스테롤 흡수의 억제제를 보조적으로 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.

185. 실시양태 181에 있어서, 아토르바스타틴, 로수바스타틴, 프라바스타틴 또는 로바스타틴 중에서 선택된 스타틴을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.

186. 실시양태 181에 있어서, 피브레이트인 페노피브레이트를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.

187. 실시양태 181에 있어서, 콜레스테롤 흡수 억제제인 제티아 (zetia)를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.

188. 실시양태 181에 있어서, 아나세트라피브 및 달세트라피브 중에서 선택된 CETP 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.

189. 실시양태 181에 있어서, PCSK9의 항체 효능제 또는 PCSK9의 리간드 효능제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.

190. 실시양태 181에 있어서, 콜레스테롤 흡수 억제제 클로피도그렐 황산염을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.

191. 실시양태 181에 있어서, 항응고제 와파린을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.

192. 실시양태 181에 있어서, 소염제 아스피린을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.

193. 지단백질 복합체의 1, 2 또는 3개의 균질한 집단을 포함하는 조성물.

194. 실시양태 193에 있어서, 적어도 하나의 균질한 집단 내의 지단백질 복합체가 실시양태 1 내지 22 중 어느 하나에 따른 복합체의 특성을 갖는 것인 조성물.

195. 실시양태 193 또는 실시양태 194에 있어서, 적어도 1, 2 또는 3개의 상기 집단이 실시양태 23 내지 58 중 어느 하나에 따른 집단의 특성을 갖는 것인 조성물.

모든 인용된 참조문헌은 각각의 개별 공개문헌, 특허 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 것으로 구체적 및 개별적으로 지시되는 것처럼 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

당업자에게 자명할 바와 같이, 본 발명의 많은 변형 및 변동이 그의 취지와 범위로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다. 설명된 구체적인 실시양태는 단지 예로서 제공되고, 본 발명은 그러한 청구항이 표제되는 동등물의 전체 범위와 함께 첨부된 특허청구범위의 면에서만 제한되어야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> CERENIS THERAPEUTICS HOLDING S.A. <120> LIPOPROTEIN COMPLEXES AND MANUFACTURING AND USES THEREOF <130> 376201-015WO (114437) <140> <141> <150> 61/487,263 <151> 2011-05-17 <150> 61/452,630 <151> 2011-03-14 <150> 61/440,371 <151> 2011-02-07 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp 20 25 30 Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp 35 40 45 Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys 50 55 60 Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr 65 70 75 80 Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp 85 90 95 Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys 100 105 110 Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe 115 120 125 Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu 130 135 140 Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu 145 150 155 160 Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala 165 170 175 Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp 180 185 190 Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn 195 200 205 Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu 210 215 220 Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln 225 230 235 240 Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala 245 250 255 Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 260 265 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(18) <400> 2 Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PROPEP <222> (1)..(6) <400> 3 Arg His Phe Trp Gln Gln 1 5 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Isonipecotic acid <400> 4 Lys Leu Lys Gln Lys Leu Ala Glu Leu Leu Glu Asn Leu Leu Glu Arg 1 5 10 15 Phe Leu Asp Leu Val Xaa 20

Claims

지질 분획 및 본질적으로 아포지단백질 A-I ("ApoA-I")로 이루어지는 아포지단백질 분획을 각각 포함하는 지단백질 복합체의 집단으로서, 여기서 지단백질 복합체는 겔 투과 크로마토그래피에서의 단일 피크에 의해 반영되는 바와 같이 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 균질한 것인, 지단백질 복합체의 집단.
제1항에 있어서, 다음 특성 중 1, 2, 3 또는 4개의 특성을 추가의 특징으로 하는 조성물:
(a) 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99%의 지단백질 복합체는 겔 투과 크로마토그래피 ("GPC") 또는 동적 광 산란 ("DLS")에 의해 측정하였을 때 크기가 4 nm 내지 15 nm, 6 nm 내지 15 nm, 4 nm 내지 12 nm, 6 nm 내지 12 nm, 또는 8 nm 내지 12 nm인 입자 형태이고;
(b) 상기 집단 내의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% (중량 기준)의 ApoA-I는 성숙한 형태이고;
(c) 상기 집단 내의 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하 (중량 기준)의 ApoA-I는 미성숙한 형태이고;
(d) 집단 내의 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하 또는 5% 이하 (중량 기준)의 ApoA-I는 말단절단된 형태이다.
제1항 또는 제2항에 있어서, 다음 특성 중 1, 2, 3, 4 또는 5개의 특성을 추가의 특징으로 하는 조성물:
(a) 상기 집단 내의 상기 ApoA-I 중 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 3% 이하, 2% 이하 또는 1% 이하의 각각의 메티오닌 112 및 메티오닌 148은 산화되고;
(b) 상기 집단 내의 ApoA-I의 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하 또는 1% 이하의 아미노산은 탈아미드화되고;
(c) 집단은 ApoA-I 1 mg당 1 EU 이하, 0.5 EU 이하, 0.3 EU 이하 또는 0.1 EU 이하의 내독소를 함유하고;
(d) 집단은 ApoA-I 1 mg당 100 pg 이하, 50 pg 이하, 25 pg 이하, 10 pg 이하 또는 5 pg 이하의 숙주 세포 DNA를 함유하고;
(e) 집단은 ApoA-I 1 mg당 500 ng 이하, 200 ng 이하, 100 ng 이하, 50 ng 이하 또는 20 ng 이하의 숙주 세포 단백질을 함유한다.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체 내의 지질 분획 중 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 2% 이하 (중량 기준)의 지질이 콜레스테롤인 집단.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ApoA-I이 인간 ApoA-I 단백질인 집단.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ApoA-I이 재조합 ApoA-I인 집단.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 분획이 본질적으로 95 내지 99 중량%의 중성 인지질 및 1 내지 5 중량%의 음하전된 인지질로 이루어지는 것인 집단.
제7항에 있어서, 상기 지질 분획이 본질적으로 96 내지 98 중량%의 중성 인지질 및 2 내지 4 중량%의 음하전된 인지질로 이루어지는 것인 집단.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 분획이 본질적으로 97 중량%의 중성 인지질 및 3 중량%의 음하전된 인지질로 이루어지는 것인 집단.
제9항에 있어서, 중성 지질이 천연 스핑고미엘린 또는 합성 스핑고미엘린이고, 여기서 임의로 지질의 과산화물 값은 5 meq O/kg 미만, 4 meq O/kg 미만, 3 meq O/kg 미만 또는 2 meq O/kg 미만인 집단.
제10항에 있어서, 스핑고미엘린이 에그-스핑고미엘린인 집단.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 음하전된 인지질이 포스파티딜글리세롤을 포함하는 것인 집단.
제12항에 있어서, 음하전된 인지질이 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-[포스포-rac-(1-글리세롤)] (DPPG)의 염을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 집단.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 아포지단백질 분획 대 인지질 분획의 중량비가 1:2 내지 약 1:3 범위인 집단.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 2, 3 또는 4개의 집단을 포함하는 조성물.
제15항에 있어서, 조성물 내에 15% 이하, 12% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 지단백질을 비복합체화된 형태로 포함하는 조성물.
제15항 또는 제16항에 있어서, 조성물 내에 15% 이하, 12% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 지질을 비복합체화된 형태로 포함하는 조성물.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 지단백질 복합체당 2개의 ApoA-I 분자 또는 ApoA-I 동등물을 갖는 지단백질 복합체를 포함하는 제1 집단을 포함하는 조성물.
제18항에 있어서, 지단백질 복합체당 3 또는 4개의 ApoA-I 분자 또는 ApoA-I 동등물을 갖는 지단백질 복합체를 포함하는 제2 집단, 및 임의로 각각 지단백질 복합체당 4 또는 3개의 ApoA-I 분자 또는 ApoA-I 동등물을 갖는 지단백질 복합체를 포함하는 제3 집단을 포함하는 조성물.
제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 지단백질 복합체의 집단, 및 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하거나 본질적으로 이들로 이루어지는 제약 조성물.
치료 유효량의 제21항에 따른 제약 조성물을 포함하는 단위 투여 형태.
서열 1의 위치 25 내지 267에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 ApoA-I 단백질을 발현하도록 조작된 포유동물 숙주 세포.
제23항에 따른 다수의 포유동물 숙주 세포를 포함하는 포유동물 세포 배양액.
제23항에 따른 포유동물 숙주 세포를 ApoA-I 단백질이 발현되고 분비되는 조건 하에 배양하는 것을 포함하는, 성숙한 생물학상 활성 ApoA-I 단백질의 생산 방법.
(a) 지질 성분 및 단백질 성분을 포함하는 출발 현탁액을 제1 온도 범위 내의 온도로부터 제2 온도 범위 내의 온도로 냉각하고,
여기서 상기 지질 성분은 본질적으로 지질의 입자로 이루어진 것이고, 상기 단백질 성분은 본질적으로 지질-결합 펩티드 및/또는 지질-결합 단백질로 이루어진 것이고;
(b) 상기 (a)의 냉각된 현탁액을 상기 제2 온도 범위 내의 온도로부터 상기 제1 온도 범위 내의 온도로 가열하고;
(c) 상기 (b)의 가열된 현탁액을 상기 제1 온도 범위 내의 온도로부터 상기 제2 온도 범위 내의 온도로 냉각하고;
(d) 단계 (b) 및 (c)를 적어도 1회 반복하여 지단백질 복합체를 형성하는 것
을 포함하는, 지단백질 복합체의 제조 방법.
(a) 제26항의 방법에 따라 지단백질 복합체의 집단을 제조하고;
(b) 상기 지단백질 복합체의 집단을 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제와 합하는 것
을 포함하는, 제약 조성물의 제조 방법.
이상지질혈증 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 다음의 것을 투여하는 것을 포함하는, 이상지질혈증 장애의 치료 방법:
(a) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 지단백질 복합체의 집단;
(b) 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 조성물;
(c) 제21항에 따른 제약 조성물;
(d) 치료 유효량의 제26항에 따른 방법에 의해 제조된 지단백질 복합체;
(e) 제22항에 따른 단위 투여 형태;
(f) 건강한 지원자에게 45 mg/kg 이하의 단일 투여 이후 간 효소 상승을 일으키지 않는 지단백질 복합체;
(g) 인간 대상체에게 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여 이후 간 효소 상승을 일으키지 않는 지단백질 복합체;
(h) 인간 대상체에게 1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 용량으로 단일 투여 이후 간 효소 상승을 일으키지 않는 지단백질 복합체;
(i) 인간 대상체에게 각각 1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 용량으로 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여 이후 간 효소 상승을 일으키지 않는 지단백질 복합체;
(j) 건강한 지원자에게 20 mg/kg 이하의 단일 투여 이후 2배 초과의 트리글리세리드 증가를 일으키지 않는 지단백질 복합체;
(k) 인간 대상체에게 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여 이후 2배 초과의 트리글리세리드 증가를 일으키지 않는 지단백질 복합체;
(l) 인간 대상체에게 1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 용량으로 단일 투여 이후 2배 초과의 트리글리세리드 증가를 일으키지 않는 지단백질 복합체; 또는
(m) 인간 대상체에게 각각 1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 용량으로 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여 이후 2배 초과의 트리글리세리드 증가를 일으키지 않는 지단백질 복합체.
(a) 대상체에게 1 mg/kg 내지 12 mg/kg의 초기 용량의 다음의 것을 투여하고:
(i) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 지단백질 복합체의 집단;
(ii) 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 조성물;
(iii) 제21항에 따른 제약 조성물;
(iv) 치료 유효량의 제26항에 따른 방법에 의해 제조된 지단백질 복합체;
(v) 제22항에 따른 단위 투여 형태;
(vi) 건강한 지원자에게 45 mg/kg 이하의 단일 투여 이후 간 효소 상승을 일으키지 않는 지단백질 복합체;
(vii) 인간 대상체에게 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여 이후 간 효소 상승을 일으키지 않는 지단백질 복합체;
(viii) 인간 대상체에게 1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 용량으로 단일 투여 이후 간 효소 상승을 일으키지 않는 지단백질 복합체;
(ix) 인간 대상체에게 각각 1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 용량으로 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여 이후 간 효소 상승을 일으키지 않는 지단백질 복합체;
(x) 건강한 지원자에게 20 mg/kg 이하의 단일 투여 이후 2배 초과의 트리글리세리드 증가를 일으키지 않는 지단백질 복합체;
(xi) 인간 대상체에게 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여 이후 2배 초과의 트리글리세리드 증가를 일으키지 않는 지단백질 복합체;
(xii) 인간 대상체에게 1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 용량으로 단일 투여 이후 2배 초과의 트리글리세리드 증가를 일으키지 않는 지단백질 복합체; 또는
(xiii) 인간 대상체에게 각각 1 mg/kg 내지 20 mg/kg의 용량으로 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여 이후 2배 초과의 트리글리세리드 증가를 일으키지 않는 지단백질 복합체;
(b) 대상체의 트리글리세리드, VLDL-콜레스테롤 및/또는 VLDL-트리글리세리드가 상기 투여 4, 8, 12, 24, 48, 72, 168, 336 또는 504시간 후에 2배 초과로 상승하는지 결정하고;
(c) 대상체의 트리글리세리드, VLDL-콜레스테롤 및/또는 VLDL-트리글리세리드가 투여전 수준의 2배 초과로 상승하면, 상기 투여를 보다 저 용량으로 반복하고, 대상체의 트리글리세리드, VLDL-콜레스테롤 및/또는 VLDL-트리글리세리드가 투여전 수준의 2배 초과로 상승하지 않으면, 상기 투여를 동등한 또는 보다 높은 용량으로 반복하는 것
을 포함하는, 이상지질혈증 장애의 치료 방법.