KR20130116641A - 잎새버섯 다당체를 함유하는 피부 외용제 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 잎새버섯 다당체를 함유하는 피부 외용제 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 잎새버섯 균사체 또는 균사체 배양액에서 추출한 다당체를 저분자화하고, 저분자화된 잎새버섯 다당체를 함유하여 피부의 주름 및 탄력을 증진시키고 피부의 면역력을 강화시키며 우수한 보습 효능을 제공할 수 있는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

Description

잎새버섯 다당체를 함유하는 피부 외용제 조성물 및 이의 제조 방법{Composition of skin external application containing polysaccharides, and the method for preparing thereof}

본 발명은 잎새버섯 다당체를 함유하는 피부 외용제 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 잎새버섯 균사체 또는 균사체 배양액에서 추출한 다당체를 저분자화하고, 저분자화된 잎새버섯 다당체를 함유하여 피부의 주름 및 탄력을 증진시키고 피부의 면역력을 강화시키며 우수한 보습 효능을 제공할 수 있는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

인간의 피부는 인체의 일차 방어막으로서 온도 및 습도의 변화, 자외선, 공해물질과 같은 외부 환경의 자극으로부터 체내의 기관을 보호해 주는 기능을 하며, 나이가 들어감에 따라 여러 가지 내적, 외적 요인에 의해 변화를 겪는다. 즉, 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되며, 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양 광선 중 지표에 도달하는 자외선의 함량이 증가하고 환경 오염이 더욱 심화됨에 따라 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써, 피부의 두께가 감소하고, 주름이 증가하며, 탄력이 감소될 뿐 아니라 피부 혈색도 칙칙해지고, 피부 트러블이 자주 발생하며, 기미와 주근깨 및 검버섯 또한 증가하고, 혈색이 나빠지고 피부톤도 어두워지는 등 여러 가지 변화를 일으키게 된다.

이러한 피부 내적 및 외적 요인에 의한 피부 상태의 변화를 방지하고, 건강한 피부 상태를 유지하기 위해서 기존에 알려진 각종 동물, 식물, 미생물 등으로부터 얻은 생리 활성 물질들을 화장품에 부가하여 사용함으로써 피부 상태를 개선시키기 위한 노력이 있어 왔다.

국내 특허출원 제2001-0062648호.

이에 본 발명자들은 잎새버섯 균사체로부터 추출한 다당체 중에서도 특정 분자량을 가지는 다당체가 우수한 피부 주름 및 탄력 증진, 염증 완화 및 피부 보습력 개선 등의 효과를 제공할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 잎새버섯 다당체의 저분자화 공정을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 저분자화된 잎새버섯 다당체를 함유하여 피부의 전반적인 상태를 개선시킬 수 있는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 분자량이 2,000~10,000Da 범위인 잎새버섯 다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 저분자량 잎새버섯 다당체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 조성물은 특정 분자량 범위의 잎새버섯 다당체를 함유함으로써 피부에 대한 투과성이 향상되었으며, 또한 피부 진피층의 콜라겐 합성을 유도하여 피부의 주름 및 탄력을 증진시키고, 피부의 면역력을 강화하여 염증 완화에 도움이 되며, 피부에 도포시 우수한 보습 효능을 제공할 수 있어 피부 건강 개선에 효과적이다.

도 1은 잎새버섯 다당체의 가수분해 용액의 분자량 분획 공정을 개략적으로 나타낸 것이다.

본 발명에 의한 피부 외용제 조성물은 잎새버섯 다당체를 유효성분으로 함유한다.

본 발명에서 사용되는 잎새버섯은 한국, 중국, 일본, 유럽, 미국 전역에서 자생하는 버섯의 일종으로서, 물참나무, 밤나무, 너도밤나무 등의 활엽수의 밑둥 주변에서 늦여름부터 가을까지 발생하고, 자실체(fruit body)의 크기가 0.6~1.5m, 최대 20kg에 이르는 거대한 버섯이다. 효능과 관련하여서는, 아시아에서 전통적으로 강장제, 면역증진, 혈압 조절 기능의 약제로 쓰여왔으며, 면역력 증강에 의한 항암효과를 나타내어 암치료에 있어서 대체 치료요법으로도 쓰이고 있다.

일반적인 버섯 다당체의 구조가 1,3-β-D-글루코스의 주쇄에 1,6-β-D-글루코스의 측쇄 구조인 반면, 잎새버섯의 다당체는 일반적인 구조와 더불어 1,6-β-D-글루코스의 주쇄에 1,3-β-D-글루코스의 측쇄 구조가 혼재되어 있는 형태이며, 잎새 버섯이 나타내는 효능은 이와 같은 잎새버섯 다당체의 특이 구조에 기인하는 것으로 알려져 있다.

원래, 잎새버섯으로부터 추출한 다당체의 분자량은 최대 2.0×10⁶g/mol을 가지는 것으로서, 매우 넓은 분포를 나타낸다. 그러나, 피부의 견고한 구조로 인하여 물질의 분자량이 낮을수록 투과성이 높다는 사실을 고려하면, 잎새버섯 다당체의 우수한 효능에도 불구하고 이를 그대로 사용할 경우 분자의 크기가 지나치게 거대해서 피부로의 투과가 극히 제한적일 수 밖에 없다.

따라서, 피부에 대한 투과성을 높이기 위하여 잎새버섯 유래 다당체를 그대로 사용하기보다는 본래의 성질을 유지하는 한도 내에서 분자량을 적절히 조절하는 것이 필요하다.

이에, 본 발명에서 사용하는 잎새버섯 다당체는 잎새버섯 균사체로부터 추출한 것으로서 분자량이 2,000~10,000Da의 범위에 속하는 것이다. 분자량이 10,000Da을 초과하면 피부 투과율이 떨어져서 충분한 효능을 발휘하지 못하며, 분자량이 2,000Da 미만인 것은 투과되더라도 그 특유의 구조적 특징이 사라져 충분한 효능을 나타내기 어렵다.

본 발명에 의한 조성물은 분자량이 2,000~10,000Da의 범위인 잎새버섯 다당체를 조성물 총 중량에 대하여 0.5~20중량%의 양으로 함유할 수 있다. 상기 잎새버섯 다당체의 함량이 0.5중량% 미만이면 상기 성분에 의한 효능, 효과가 미약하고, 20중량%를 초과하면 공정상 또는 제형상의 문제가 있기 때문이다.

잎새버섯 다당체는 독특한 균사체와 특이한 분자 구조를 가져서 우수한 약리 활성을 가지는 물질이므로, 잎새버섯 다당체를 함유하는 본 발명의 조성물은 피부 진피층의 콜라겐 합성을 유도하여 피부 재생에 도움을 주고, 각질 형성 세포의 분화를 촉진하고 손상된 피부 장벽 기능을 회복 시켜 피부의 주름 및 탄력을 증진시킴으로써, 우수한 항노화 효과를 제공할 수 있다.

또한, 잎새버섯 다당체는 피부의 면역력을 강화시키고 염증을 완화시키는데 도움을 주므로, 잎새버섯 다당체를 함유하는 본 발명의 조성물은 아토피, 여드름의 증상을 개선시키는데 효과적이며, 우수한 항염 효과를 제공한다.

또한, 잎새버섯 다당체는 분자 구조의 특성상 강한 친수성을 나타내므로, 잎새버섯 다당체를 함유하는 본 발명의 조성물은 피부에 도포 시 우수한 보습 효능을 나타낸다.

본 발명에서 사용되는 분자량이 2,000~10,000Da의 범위인 잎새버섯 다당체는 하기 방법으로 제조할 수 있으며, 이는 도 1에 개략적으로 도시되어 있다.

1. 잎새버섯 다당체의 추출

잎새버섯 균사체 또는 균사체 배양액으로부터 다당체를 추출하며, 추출하는 방법은 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있고, 특히 국내 특허출원 제2001-0062648호에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 잎새버섯 다당체는 예를 들어 건조한 잎새버섯 자실체를 분쇄하여 분말 상태로 제조한 후 80℃의 증류수에 침지하여 다당체 성분을 용해한 다음, 여과용 부직포를 이용하여 용해되지 않은 부분과 불순물을 제거하고, 제조된 용액을 자연건조하거나 동결건조하여 파우더 또는 스펀지 상의 다당체 고형분을 얻는 방법으로 제조할 수 있다.

2. 다당체의 가수분해 실시

상기한 바와 같이 추출한 잎새버섯 다당체를 증류수, 아세트산나트륨 완충용액 등과 같은 적절한 용매에 용해하여 용액을 제조한 후 산 또는 효소에 의한 가수분해를 실시한다.

산에 의한 가수분해의 경우는 HCl 등을 사용할 수 있으며, 구체적으로 1N HCl에 10%(w/v)의 농도로 잎새버섯 다당체를 용해한 후 100℃에서 3시간 동안 가수분해를 실시하고, 가수분해 종료를 위해 0.2N의 NaOH 또는 KOH 수용액을 이용하여 pH 7으로 중화 반응을 하여 잎새버섯 다당체의 가수분해를 실시할 수 있다.

또한, 효소에 의한 가수분해는 셀룰라아제 계열의 효소를 사용할 수 있으나 이상적으로는 베타-글루카나제를 사용하는 것이 효과적이다. 구체적으로는 잎새버섯 다당체를 1%(w/v)의 농도로 0.2M의 아세트산나트륨 완충용액(pH 5.0)에 용해한 후, 효소를 20U/ml의 농도로 투입하고 50℃에서 2시간 동안 반응하여 가수분해를 실시할 수 있다.

가수분해는 pH를 조절하거나 온도를 낮춤으로써 종료시킬 수 있다.

3. 다당체의 여과

상기 방법으로 가수분해된 잎새버섯 다당체를 한외여과막을 이용함으로써 분자량을 조절한다. 한외여과막(ultrafiltration membrane)을 이용한 여과 방식은 데드엔드 플로우(Dead-end flow), 크로스플로우(Cross flow), 중공사막 여과 방식의 세 가지를 모두 사용할 수 있으며, 도 1에는 그 중에서도 크로스플로우 방식을 사용한 것을 나타내었다.

상기 단계에서 잎새버섯 다당체의 가수분해물 용액에 압력을 가하여 분획분자량(MWCO) 10,000의 한외여과막을 통과시켜 여과된 용액을 회수한다. 그 다음, 회수된 여과액(분자량 10,000 이하)을 동일한 장치와 방법으로 분획분자량 2,000의 한외여과막을 이용하여 통과시켜서 막을 통과한 여과액은 폐기하고 여과되지 않은 액은 다시 회수함으로써 분자량의 범위가 2,000 내지 10,000인 잎새버섯 다당체만 선별한다. 이 때, 장치의 운전시간은 용액의 양에 따라 1~12시간 범위로 조절할 수 있다.

이와 같이 분자량을 선별하여 제조한 잎새버섯 다당체 용액은 이에 증류수를 추가하거나 증류하여 농도를 조절할 수 있으며, 바람직하게는 용액에서 잎새버섯 다당체의 최종 농도를 0.1~2.0%(w/w)로 조절할 수 있다. 또한, 화장료 조성물을 제조하기 위해서는 상기 잎새버섯 다당체 용액에 페녹시에탄올 및 1,3-부틸렌글리콜 등을 혼합하여 사용할 수 있다.

상기한 본 발명의 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물로서 제형화될 수 있으며, 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유하여 제형화될 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로서, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 폼(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

특히, 본 발명의 피부 외용제 조성물이 비듬 방지, 육모 또는 백모 방지용으로서 사용될 경우에는 두피 및 모발용 조성물로서 제형화될 수 있으며, 제형이 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 헤어토닉, 모발 영양화장수, 스칼프트리트먼트, 헤어트리트먼트, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어로션 또는 두피 모발 겸용 트리트먼트 등으로 제형화될 수 있다.

또한 본 발명에 의한 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

또한, 본 발명의 조성물은 피부 개선 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.

이하, 시험예 및 제형예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 시험예 및 제형예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[참고예 1] 저분자량 잎새버섯 다당체의 제조

건조한 잎새버섯 자실체를 분쇄하여 분말 상태로 제조한 후 80℃의 증류수에 침지하여 다당체 성분을 용해하고, 여과용 부직포를 이용하여 용해되지 않은 부분과 불순물을 제거하였다. 제조된 용액을 자연건조하거나 동결건조하여 파우더 상의 다당체 고형분을 얻었다.

얻은 다당체 고형분을 1%(w/v)의 농도로 0.2M의 아세트산나트륨 완충용액(pH 5.0)에 용해하였다. 이후 베타-글루카나제를 20U/ml의 농도로 투입하고 50℃에서 2시간 동안 반응하여 가수분해를 실시하였다. 가수분해는 온도를 낮춤으로써 종료시켰다.

가수분해된 용액을 도 1과 같이 크로스플로우 방식으로 한외여과막을 단계별로 통과시켜 2,000~10,000Da 범위의 분자량을 가지는 다당체를 수득하였다. 우선 분획분자량 10,000Da의 한외여과막을 통과시켜 분자량 10,000Da 이하의 다당체 용액을 얻은 후 이를 다시 분획분자량 2,000Da의 한외여과막을 이용하여 반복하여 투과시켰다. 이때 투과된 용액은 2,000Da 이하의 분자량을 지니는 다당체를 포함하는 것이므로 투과되지 않고 남은 부분을 수득하여 2,000~10,000Da 분자량을 지니는 다당체를 함유한 용액을 얻었다.

[참고예 2] 잎새버섯 다당체 용액의 제조

하기 표 1의 조성과 같이 잎새버섯 다당체 용액을 제조하였다. 실시예 1~3의 경우는 상기 참고예 1에서 제조한 분자량이 2,000~10,000Da의 범위에 속하는 잎새버섯 다당체를 포함하는 것이고, 비교예 1은 잎새버섯 다당체를 포함하지 않는 것이며, 비교예 2~3은 상기 범위를 벗어나는 분자량의 잎새버섯 다당체를 포함하는 용액이다.

(함량: 중량%)

성분(INCI 명칭)	실시예 1	실시예 2	실시예 3	비교예 1	비교예 2	비교예 3
물	78.0	78.0	78.0	79.0	78.0	78.0
1,3 부틸렌글리콜	20.9	20.9	20.9	20.9	20.9	20.9
잎새버섯 다당체(MW 1,000)	-	-	-	-	1.0	-
잎새버섯 다당체(MW 2,000)	1.0	-	-	-	-	-
잎새버섯 다당체(MW 5,000)	-	1.0	-	-	-	-
잎새버섯 다당체(MW 10,000)	-	-	1.0	-	-	-
잎새버섯 다당체(MW 12,000)	-	-	-	-	-	1.0
페녹시에탄올	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
합계	100	100	100	100	100	100

[시험예 1] 엘라스타아제 활성 억제 효능 측정

분자량에 따른 잎새버섯 다당체의 엘라스타아제 활성 저해능을 EGCG와 비교하여 측정하였다. 사용된 엘라스타아제와 기질은 미국 시그마알드리치 사로부터 상업적으로 구매하였다(Cat.No. E0127).

하기의 시험방법으로 엘라스타아제 활성 저해작용을 시험하였다.

96웰 플레이트에서 10mg/L Tris-HCL 완충액(pH 8.0)으로 조제한 것에 상기 실시예 1~3 및 비교예 1~3의 잎새버섯 다당체 용액 200μL 및 20㎍/mL 엘라스타아제·타입 III 용액 50μL를 혼합하였다. EGCG 250μM은 양성 대조군으로 사용하였으며 음성 대조군인 비처리군은 증류수를 사용하였다. 그 후, 상기 완충액으로 조제한 0.4514㎎/mL N-SUCCINYL-ALA-ALA-ALA-p-NITROANILIDE 100μL를 첨가하고, 25℃에서 15분 반응시켰다. 반응종료 후, 파장 415㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 동일한 방법으로 공시험을 행하여 보정하였다.

엘라스타아제 활성 저해작용의 계산방법은 하기 수학식 1과 같으며, 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

A: 시험물질 무첨가, 효소 첨가에서의 파장 415 ㎚에 있어서의 흡광도

B: 시험물질 무첨가, 효소 무첨가에서의 파장 415 ㎚에 있어서의 흡광도

C: 시험물질 첨가, 효소 첨가에서의 파장 415 ㎚에 있어서의 흡광도

D: 시험물질 첨가, 효소 무첨가에서의 파장 415 ㎚에 있어서의 흡광도

화합물	억제정도(%)
비처리군	0
EGCG	65
실시예 1	37
실시예 2	44
실시예 3	53
비교예 1	6
비교예 2	13
비교예 3	57

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 잎새버섯 다당체의 엘라스타아제 활성 억제 정도는 분자량에 따라 다르게 나타났다. 잎새버섯 다당체의 분자량이 12,000Da인 비교예 3의 경우, 엘라스타아제 활성 억제제로 알려져 있는 EGCG와 비교하여서 유사한 정도(약 88%)의 저해 효능을 나타내었다.

또한, 잎새버섯 다당체의 분자량이 2,000~10,000Da에 해당하는 실시예 1~3을 처리한 경우가 분자량이 큰 경우와 동등한 저해 효능을 나타내지는 못하지만 분자량이 상기 범위보다 낮은 비교예 2와 비교하여서는 상당할만한 수준의 저해 효능을 나타내는 것을 알 수 있다. 상기 분자량 범위의 잎새버섯 다당체는 대조군으로 사용된 EGCG 대비 57~82%의 효능을 나타내었다.

[시험예 2] 콜라게나아제(MMP-1) 저해능

본 발명의 잎새버섯 다당체의 콜라게나아제 생성 저해능을 레티노익산과 비교하여 측정하였다.

2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 들어있는 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/공(well)이 되도록 넣고, 70~80% 정도 자랄 때까지 CO₂ 5%, 37℃ 배양기(incubator)에서 배양하였다. 상기 실시예 1~3 및 비교예 1~3의 잎새버섯 다당체 용액 또는 레티노익산을 10㎍/ml 농도로 24시간 동안 처리한 다음, 세포배양액을 채취하였다.

상업적으로 이용가능한 콜라게나아제 측정기구(미국 아머샴파마샤 사, Catalog #: RPN 2610)를 이용하여 채취한 세포배양액의 콜라게나아제 생성 정도를 측정하였다. 먼저 1차 콜라게나아제 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)에 채취한 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96-공 평판(96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, sigma)을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 발색반응을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띠게 되며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타났다.

노란색을 띠는 96-공 평판(96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하고, 하기 수학식 2에 의해 콜라게나아제의 합성 정도를 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 이때 조성물을 처리하지 않은 군에서 채취한 세포 배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다.

화합물	발현정도(%)
비처리군	100
레티노익산	75
실시예 1	74
실시예 2	77
실시예 3	76
비교예 1	97
비교예 2	89
비교예 3	74

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 잎새버섯 다당체의 콜라게나아제 발현 정도가 콜라게나아제 발현 저해제로 알려져 있는 레티노익산과 비교하여서도 콜라게나아제 발현 저해 효과가 비슷한 수준임을 알 수 있다.

또한, 잎새버섯 다당체의 분자량이 2,000~10,000Da에 해당하는 실시예 1~3을 처리한 경우가 잎새버섯 다당체의 분자량이 상기 범위를 벗어나는 비교예 2보다 우수한 콜라게나아제 발현 저해 효과를 나타내며 비교예 3과 비교하여서는 거의 유사한 효과를 보임을 확인할 수 있다.

이와 같은 결과를 통하여, 본 발명의 잎새버섯 다당체는 기질 메탈로 프로테아제(MMP-1)를 저해시키는 효과를 가짐을 확인할 수 있다.

[시험예 3] 콜라겐 합성 촉진 효과

인체 섬유아세포를 24 웰(well) 평판배양기에 배양한 후, 상기 실시예 1~3 및 비교예 1~3이 각각 포함된 배지로 교체하였다. 대조군으로는 비처리군을 사용하였다. 배양 3일째에 10%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배지를 각 웰 당 0.5㎖씩 첨가한 후, L[2,3,4,5-³H]-프롤린 10μCi를 첨가하였다. 24 시간 경과 후, 각 웰에 들어있는 배지와 세포들을 긁어 모아 5% 트리클로로아세트산(TCA; Trichloroacetic acid) 용액에 넣어 수세한 후, 2개의 시험관에 분주하고 1개의 시험관에는 타입 I 콜라게나제(type I collagenase) 1unit/㎕를 넣고, 37℃에서 90분간 배양하였으며, 다른 시험관은 4℃에서 보관하였다. 그 후, 모든 시험관에 50% 트리클로로아세트산을 0.05㎖씩 첨가하고 4℃에서 20분간 방치한 다음, 각각 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여, 각각의 상등액과 침전물을 액체 신틸레이션 계수기(LSC; Liquid Scintillation Counter)로 씨피엠(CPM; Count Per Minute) 값을 얻어, 하기 수학식 3에 의거하여 대조군과 실험군에 대해 콜라겐 생합성 값(RCB; Relative Collagen Biosynthesis)을 측정하고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

화합물	발현정도(%)
비처리군	100
실시예 1	127
실시예 2	151
실시예 3	169
비교예 1	89
비교예 2	103
비교예 3	174

상기 표 4에서 나타낸 바와 같이, 잎새버섯 다당체가 섬유아세포의 콜라겐 생합성을 증가시킴을 알 수 있으며, 잎새버섯 다당체의 분자량이 2,000~10,000Da에 해당하는 실시예 1~3을 처리한 경우가 분자량이 작은 비교예 2에 비해서 효과가 우수하고 분자량이 더 큰 비교예 3과는 유사함을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 잎새버섯 다당체는 콜라겐의 생합성을 촉진하여 진피층의 탄력을 증가시킴으로써 피부의 주름을 예방하고 피부 활력을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.

[참고예 3] 제형예 1~3 및 비교제형예 1~3의 제조

하기 표 5의 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양크림을 제조하였다(단위: 중량%).

배합성분	제형예 1	제형예 2	제형예 3	비교제형예 1	비교제형예 2	비교제형예 3
정제수	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100
실시예 1	5.00	-	-	-	-	-
실시예 2	-	5.00	-	-	-	-
실시예 3	-	-	5.00	-	-	-
비교예 1	-	-	-	5.00	-	-
비교예 2	-	-	-	-	5.00	-
비교예 3	-	-	-	-	-	5.00
식물성 경화유	1.50	1.50	1.50	1.50	1.50	1.50
스테아린산	0.60	0.60	0.60	0.60	0.60	0.60
글리세롤 스테아레이트	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
스테아릴 알코올	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00
폴리글리세릴-10 펜타스테아레이트 & 베헤닐 알코올 &소디움 스테아로일 락틸에이트	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
아라키딜 베헤닐 알코올 &아라키딜글루코사이드	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
세틸아릴 알코올 & 세테아릴글루코사이드	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00	2.00
PEG-100 스테아레이트 & 글리세롤올레이트 & 프로필렌글리콜	1.50	1.50	1.50	1.50	1.50	1.50
카프릴릭/카르릭 트리 글리세라이드	11.00	11.00	11.00	11.00	11.00	11.00
사이클로메디콘	6.00	6.00	6.00	6.00	6.00	6.00
방부제, 향	적량	적량	적량	적량	적량	적량
트리에탄올 아민	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1

[시험예 4] 피부 탄력 향상 효능 확인

사람에서의 피부 탄력 향상 효과를 확인하기 위하여 상기 제형예 1~3과 비교제형예 1~3의 제형으로 다음과 같이 평가하였다.

30~40대의 건강한 여성 60명을 각각 제형예 1~3과 비교제형예 1~3의 6개 군에 대해 10명씩 6조로 나누어 영양크림을 매일 1회씩 12주간 안면에 도포하게 한 후, 피부탄력측정기(Cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 피부탄력을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다. 표 6의 결과값은 Cutometer SEM 575의 ΔR8 값으로 기재하였는데, R8 값은 피부 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.

실험제품	피부탄력효과
제형예 1	0.21
제형예 2	0.32
제형예 3	0.37
비교제형예 1	0.08
비교제형예 2	0.13
비교제형예 3	0.15

상기 표 6에 나타난 바와 같이, 잎새버섯 다당체가 함유된 제형예 1~3 및 비교제형예 2~3은 잎새버섯 다당체가 함유되지 않은 비교제형예 1을 도포한 군에 비하여 피부 탄력성이 더 증가되었다. 또한, 제형예 1~3을 도포한 군은 앞선 결과와 유사하게 비교제형예 2와 비교하여 더 우수한 효과를 나타내었다.

또한, 상기한 시험예 1~3의 결과에서 효능이 우수한 것으로 나타난 분자량이 12,000Da인 잎새버섯 다당체는 사람 피부에 적용시 피부 투과율이 떨어져서 충분한 효능을 발휘하지 못하는 반면, 본 발명에서 사용되는 분자량을 조정한 잎새버섯 다당체는 성분 자체는 분자량이 큰 경우보다 효능이 떨어지더라도 피부 투과율이 높아 사람 피부에 제형을 적용시 결과적으로 보다 높은 효능을 제공할 수 있음을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 잎새버섯 다당체는 피부 탄력 향상에 매우 효과적임을 확인할 수 있다.

[시험예 4] 피부 주름 개선 효능 확인

본 발명의 조성물에 의한 사람에서의 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 상기 제형예 1~3과 비교제형예 1~3을 이용하였다.

상기 제형예 1~3과 비교제형예 1~3의 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 평가하였다. 40대의 건강한 여성 60명을 각각 제형예 1~3과 비교제형예 1~3의 6개 군에 대해 10명씩 6조로 나누어 영양크림을 매일 1회씩 12주간 안면에 도포하게 한 후, 실리콘을 이용하여 레플리카를 떠서 주름의 상태를 피부측정기(visiometer, SV600, Courage+Khazaka electronic GmbH, Germany)로 측정하여 화상분석하였다. 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다. 하기 표 7의 값은, 도포 12주 후의 각각의 변수(parameter)값에서 도포 전 변수값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다.

사용 8주 후 임상 결과	R1	R2	R3	R4	R5
제형예 1	0.17	0.16	0.12	0.02	0.02
제형예 2	0.15	0.14	0.09	0.01	0.01
제형예 3	0.14	0.13	0.08	0.01	0.01
비교제형예 1	0.28	0.27	0.23	0.04	0.03
비교제형예 2	0.21	0.19	0.16	0.03	0.02
비교제형예 3	0.18	0.15	0.10	0.02	0.02

R1 : 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이값

R2 : 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균

R3 : 5개씩 나눈 R1값 중 최고 값

R4 : 주름 등고선의 베이스라인(baseline)에서 각 각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값

R5 : 주름 등고선의 베이스라인(baseline)에서 각 각의 주름 윤곽을 뺀 값의 차이 값

상기 표 7에서 나타낸 바와 같이, 제형예 1~3의 외용제 조성물이 비교제형예 1~2의 외용제 조성물을 사용한 경우보다 피부 주름 개선 효과가 더 우수하였다.

또한, 분자량이 12,000Da인 잎새버섯 다당체를 함유하는 비교제형예 3을 사용한 경우와 비교하여서도 본 발명에 따른 제형예 1~3이 이와 유사하거나 보다 높은 주름 개선 효능을 제공함을 알 수 있다. 이는 작은 분자량의 잎새버섯 다당체에 비하여 12,000Da인 잎새버섯 다당체의 피부 투과율이 떨어지기 때문인 것으로 판단할 수 있다.

[시험예 5] 피부 보습력 증가 효과 측정

분자량에 따른 잎새버섯 다당체가 피부 보습력 증가에 미치는 효과를 측정하기 위하여, 상기 제형예 1~3 및 비교제형예 1~3을 이용하였고, 하기와 같이 평가하였다.

건조 피부로 분류된 40~50대 성인 남녀 60명을 각각 제형예 1~3 및 비교제형예 1~3의 6개 군에 대해 10명씩 6조로 나누어 영양크림을 매일 2회씩 4주간 안면에 도포하게 하였다. 도포 개시 전과, 도포 후 1주, 2주, 4주 경과한 시점, 그리고 도포를 중지한 2주 경과(총 6주 경과) 후에 항온, 항습 조건(24℃, 상대습도 40%)에서 피부수분량측정기(Corneometer CM825, C+K Electronic Co., 독일)로 피부수분량을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 8에 나타내었다. 표 9의 결과는 시험개시 직전에 측정한 피부 수분량 측정기 값을 기준으로 하여 일정기간 처치한 후의 측정값의 증가분을 백분율로 표시한 것이다.

시험군	수분 증가율 (%)
	1주 경과	2주 경과	4주 경과	6주 경과
제형예 1	31	33	35	27
제형예 2	31	34	33	28
제형예 3	32	34	35	30
비교제형예 1	30	29	30	17
비교제형예 2	31	33	32	20
비교제형예 3	32	34	33	23

상기 표 8의 결과를 보면, 제형예 1~3 및 비교제형예 2~3을 도포한 경우 비교제형예 1을 도포한 경우에 비하여 피부수분 증가율이 보다 높음을 확인할 수 있다. 분자량이 작은 비교제형예 2및 분자량이 높은 비교제형예3과 비교하여 도포 중에는 비슷하였지만 도포 중단 후 2주가 경과한 6주째에는 본 발명에 따른 제형예 1~3의 경우가 더 우수한 피부 보습력 효과를 제공함을 알 수 있다.

[시험예 6] 각질형성세포 분화 촉진 효과 측정

분자량에 따른 잎새버섯 다당체의 각질형성세포의 분화 촉진 효과를 알아보기 위해, 하기와 같이 각질형성세포의 분화시 생성되는 CE(Cornified Envelop)양을 흡광도를 이용하여 측정하였다.

먼저, 신생아의 표피로부터 분리해 일차 배양한 사람의 각질형성세포를 배양용 플라스크에 넣어 바닥에 부착시킨 뒤 상기 실시예 1~3 및 비교예 1~3을 배양액에 5ppm 농도로 처리한 후 세포가 바닥 면적의 70~80% 정도 자랄 때까지 5일간 배양하였다. 이때, 저칼슘(0.03mM) 처리군과 고칼슘(1.2mM) 처리군을 각각 음성 대조군, 양성 대조군으로 하였다. 그 다음 상기 배양한 세포를 수확하여 PBS(Phosphate buffered saline)로 세척한 뒤 2% SDS(sodium dodecyl sulfate)와 20mM 농도의 DTT(Dithiothreitol)를 함유한 10mM 농도의 트리스-염산 완충액(Tris-HCl, pH 7.4) 1ml를 가하여 소니케이션(sonication), 보일링(boiling), 원심분리를 하고, 침전물을 다시 PBS 1ml에 현탁시켜 340nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이와 별도로 상기 소니케이션 후의 용액을 일부 취하여 단백질 함량을 측정하고, 세포 분화정도 평가시 기준으로 삼았다. 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

시험물질	각질형성세포에서의 분화능(%)
저칼슘(0.03mM) 용액 (음성 대조군)	100
고칼슘(1.2mM) 용액 (양성 대조군)	210
실시예 1	257
실시예 2	265
실시예 3	279
비교예 1	104
비교예 2	205
비교예 3	273

상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 실시예 1~3 및 비교예 2~3을 도포한 경우 각질 형성 세포의 분화 촉진 효과가 우수한 것을 알 수 있다. 본 발명에 따른 실시예 1~3을 처리한 경우 각질 형성 세포의 분화 촉진 효과가 우수한 것으로 나타났으며 특히 실시예 3의 경우 분자량이 높은 비교예 3을 처리한 경우와 유사함을 확인할 수 있다.

[시험예 7] 피부 장벽기능 회복 효과 측정

분자량에 따른 잎새버섯 다당체가 피부 손상으로 인해 손상된 피부 장벽기능의 회복에 미치는 효과를 측정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 성인 남녀 10명의 상박을 테이프 스트립핑(Tape Stripping) 방법을 이용하여 피부 장벽에 손상을 주고 각각 하기 표 10의 조성으로 제조한 제형예 4~6 및 비교제형예 4~7의 7개 군을 도포하면서 7일 동안 하루에 한번씩 경피수분손실량(TWEL)의 회복 정도를 Vapometer(Delfin, 핀란드)로 측정 비교하였다. 여기에서 비교제형예 7은 음성대조군으로서 비히클(vehicle)이다. 실험 결과는 하기 표 11에 나타내었다. 표 11의 결과는 장벽 손상 전과 장벽 손상 후의 처리전 차이를 100% 기준으로 하여 비교하였다.

배합성분	제형예 4	제형예 5	제형예 6	비교제형예 4	비교제형예 5	비교제형예 6	비교제형예 7
정제수	65	65	65	65	65	65	70
프로필렌글리콜	30	30	30	30	30	30	30
실시예 1	5	-	-	-	-	-	-
실시예 2	-	5	-	-	-	-	-
실시예 3	-	-	5	-	-	-	-
비교예 1	-	-	-	5	-	-	-
비교예 2	-	-	-	-	5	-	-
비교예 3	-	-	-	-	-	5	-

시험군	TWEL 변화 (%)
	처리전	1일	2일	3일	4일	5일	6일
제형예 4	100	117	119	108	107	104	105
제형예 5	100	119	122	117	112	109	106
제형예 6	100	115	109	117	110	108	107
비교제형예 4	100	112	113	97	73	57	46
비교제형예 5	100	111	108	109	102	104	99
비교제형예 6	100	120	123	117	109	110	103
비교제형예 7	100	108	101	96	69	53	37

상기 표 11에서 알 수 있는 바와 같이, 잎새버섯 다당체를 함유하지 않은 비교제형예 4 및 비교제형예 7을 처리한 경우에는 시간이 지남에 따라 경피 수분 손실량이 점점 많아지는 반면, 잎새버섯 다당체를 함유한 제형예 4~6 및 비교제형예 5~6을 처리한 경우에는 경피 수분 손실량이 정상으로 돌아오며, 특히 본 발명에 따른 잎새버섯 다당체를 함유한 제형예 4~6을 처리한 경우에는 빠른 속도로 경피 수분 손실량이 정상으로 돌아오면서 장벽 손상이 회복됨을 확인할 수 있다.

[참고예 4] 제형예 7~9 및 비교제형예 8~12의 제조

하기 표 12에 나타낸 성분 및 함량(중량%)에 따라 제형예 7~9 및 비교제형예 8~12를 제조하였다. 구체적으로 설명하면, 제형예 7~9는 본 발명에 따른 분자량 범위를 가지는 잎새버섯 다당체인 실시예 1~3을 배합시킨 것이고, 비교제형예 8~10은 비교예 1~3을 배합시킨 것이며, 비교제형예 11은 여드름 피부 개선의 유효성분을 전혀 포함시키지 않은 것이고, 비교제형예 12는 항균력에 대한 기준으로 삼을 표준물질로서 여드름 치료제로 많이 사용하는 에리스롬마이신(erythromycin)을 함유시킨 것이다.

제형예 7~9 및 비교제형예 8~12의 제조 방법은 다음과 같다. 하기 표 12의 A상의 성분들을 완전 용해시키고 별도의 용해조에서 B상의 성분들을 완전 용해시킨 다음, B상을 A상에 첨가하여 혼합가용화 시켰다. 여기에 C상의 성분들을 표 12에 기재된 배합비율에 따라 첨가하여 혼합 균일화시킨 다음 여과시켜 본 조성물들을 제조하였다.

구분		제형예 7	제형예 8	제형예 9	비교제형예 8	비교제형예 9	비교제형예 10	비교제형예 11	비교제형예 12
A	탈이온수(Deionized Water)	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100	To 100
	EDTA-2Na	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
	글리세린	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
B	에탄올	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
	PEG-60 경화 피마자유 (hydrogenated castor oil)	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4	0.4
	향료(perfume)	0.04	0.04	0.04	0.04	0.04	0.04	0.04	0.04
C	실시예 1	5.0	-	-	-	-	-	-	-
	실시예 2	-	5.0	-	-	-	-	-	-
	실시예 3	-	-	5.0	-	-	-	-	-
	비교예 1	-	-	-	5.0	-	-	-	-
	비교예 2	-	-	-	-	5.0	-	-	-
	비교예 3	-	-	-	-	-	5.0	-	-
	에리스롬마이신	-	-	-	-	-	-	-	5.0

[시험예 8] 여드름균에 대한 항균력 시험

제형예 7~9 및 비교제형예 8~12의 조성으로 제조된 각각의 화장료 조성물을 가지고 여드름 원인 균주인 프로피오니박테리움 아크네스(ATCC 6919: 배지-BHI 브로쓰(broth))에 대하여 항균력을 시험하였다.

여드름균에 대한 항균력 시험 방법은 다음과 같았다.

(1) 시험 균액 준비

프로피오니박테리움 아크네스는 BHI 브로쓰에 접종하여 혐기 배양한 배양액을 사용하였다.

(2) 희석 용액 준비

BHI 브로쓰(pH 6.8) 또는 LB 브로쓰(pH 4.5) 15ml에 상기 시험 균액을 0.15ml 첨가하여 잘 혼합한 것을 희석용액으로 사용하였다.

(3) 시료 준비

제형예 7~9 및 비교제형예 8~12로부터 제조된 화장료 조성물 원액 그대로를 시료로 사용하였다.

(4) 항균력 시험

1) 96웰의 세포배양관(96 well plate) 1번 행에 출발 농도에 맞도록 시료를 넣고 희석용액으로 총량을 200μl씩을 넣는다.

2) 1번 행의 혼합액을 잘 섞어준 다음 100μl를 취하여 2번 행에 넣고 잘 섞어준 다음, 다시 100μl를 취하여 3번 행에 넣는 방식으로 이중 희석(double dilution)을 행한다.

3) 32℃에서 24시간 및 48시간 정치 배양한 후 현탁된 정도로 균의 증식 유무를 판단하여 균의 증식이 없는 최소농도를 MIC(최소저지농도; Minimum Inhibitory Concentration) 값으로 결정한다. 만약 혼합액이 불투명하여 균의 증식 유무를 판단하기 어려우면 현미경 관찰을 통하여 확인한다.

여드름균에 대한 항균력 시험 결과를 하기 표 13에 나타내었다. MIC는 제형에 함유된 유효성분의 농도로 환산하여 표기하였다.

항목	pH	프로피오니박테리움 아크네스
제형예 7	5.7	> 50 ppm
제형예 8	5.7	> 50 ppm
제형예 9	5.7	> 50 ppm
비교제형예 8	5.7	최고 농도(항균력 없음)
비교제형예 9	5.7	> 50 ppm
비교제형예 10	5.7	> 50 ppm
비교제형예 11	5.7	최고 농도(항균력 없음)
비교제형예 12	5.7	> 100ppm

MIC에서 ppm 농도가 작을수록 여드름균에 대한 항균력에 대하여 유효한 물질이라고 할 수 있는데, 제형예 7~9 및 비교제형예 9~10의 경우 ppm농도가 작게 나왔으며, 특히 제형예 7~9의 경우 공지의 여드름 치료제인 에리스롬마이신을 사용한 비교제형예 12보다 ppm 농도가 현저하게 작게 나와 본 발명에 따른 잎새버섯 다당체를 함유하는 조성물은 시험균에 대하여 훨씬 우수한 항균력을 가짐을 확인할 수 있다.

[시험예 9] 지질합성(Lipogenesis) 억제 시험

생쥐의 섬유아세포주(fibroblast cell line)인 3T3-L1 세포를 10%의 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM(Dulbecos modified eagles medium, GIBCO BRL, Life Technologes 社) 배지가 담긴 6웰 배양 플레이트(culture plate)에 1×10⁵ 세포/웰로 부착시켰다. 2일이 지난 후 다시 새로운 DMEM(10% FBS 함유) 배지로 교환하고 2일 동안 배양하였다. 그 다음, 상기 배양한 세포를 다시 1㎍/㎖ 인슐린(insulin), 0.5mM IBMX 및 0.25μM 덱사메타손(dexamethasone)을 함유한 DMEM(10% FBS 함유)로 분화 유도를 하고 실시예 1~3, 비교예 1~3 및 카페인을 50μM을 처리한 다음 처리 2일이 경과한 후 다시 인슐린이 포함된 DMEM으로 교환하여 5일 동안 배양하였다. 5일 후 다시 정상 배지(DMEM, 10% FBS 함유)로 교환하고 상기 세포가 형태적으로 지방세포로 변화할 때까지 관찰하면서 배양하였다.

분자량에 따른 잎새버섯 다당체의 지방세포 내 지방 축적 억제 효능을 평가하기 위하여 상기에서 분화가 완료된 3T3-L1 지방세포를 이용하여 수단 III 염색(S4136, sigma-aldrich)을 실시하였다. 지방 세포를 인산염 버퍼 내에서 4% 파라포름알데하이드(pH 7.2)로 상온에서 고정한 후에 PBS(phosphate buffered saline)로 수세해 준 다음, 수단 III으로 염색한 후에 사진을 찍어서 육안 비교하였다. 대조군은 시험물질이나 비교물질을 첨가하지 않은 배지만을 사용한 것이고, 다른 비교군으로 카페인 50μM을 처리하였다. 지방 축적 억제 정도는 염색된 정도를 +++, ++, +, -로 나누어 등급을 부여하였으며, 이때 +++로 갈수록 염색 정도가 크다는 것을 의미한다. 그 결과를 하기 표 14에 나타내었다.

시료	저해율%
대조군	+++
비교군	+
실시예 1	-
실시예 2	-
실시예 3	-
비교예 1	++
비교예 2	+
비교예 3	-

상기 표 14에 나타낸 바와 같이, 잎새버섯 다당체는 지방세포 내 축적된 지방의 양이 적어 지질합성 저해 효과가 있으며, 특히 본 발명에 따른 잎새버섯 다당체인 실시예 1~3의 경우에는 공지된 지질합성 저해 물질인 카페인 보다도 우수한 지질합성 저해 효과가 있음을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 잎새버섯 다당체는 지질합성을 억제함으로써 피지를 감소시켜 여드름 발생을 효과적으로 억제할 수 있다.

[시험예 10] 여드름 개선과 피지분비 감소 및 자극 유무의 시험

여드름을 보유하고 있는 80명을 10명씩 8개 군으로 나누고 각각의 군에 해당하는 피험자에게 상기 제형예 7~9 및 비교제형예 8~12로 제조된 화장료 조성물을 한 달간 사용하게 하였다. 여드름 개선 척도는 1점에서 5점까지로 하고, 1점은 ‘아니다’, 3점은 ‘보통이다’, 5점은 ‘매우 그렇다’로 표기하도록 하였다. 실험 결과는 하기의 표 15에 10명의 평균점수로 표기하였다.

여드름 소멸 시기는 소멸이 판독된 일수를 기준으로 하였으며, 여드름 재발은 유무로 1개월 뒤의 결과를 기준으로 하였다. 피지 분비감소는 1점에서 5점까지로 하고, 1점은 ‘아니다’, 3점은 ‘보통이다’, 5점은 ‘매우 그렇다’로 표기하도록 하였다. 실험 결과는 하기 표 15에 10명의 평균점수로 표기하였다. 피부자극의 유무는 (자극반응을 보인 명수)/(총 시험자수)로 보았다.

	염증성 여드름 개선	면포성 여드름 소멸시기	여드름 재발	피지분비 감소	자극 유무
제형예 7	2.8	4일	무	2.3	0/10
제형예 8	3.8	3일	무	2.4	0/10
제형예 9	3.7	3일	무	2.2	0/10
비교제형예 8	1.7	11일	유	1.7	0/10
비교제형예 9	2.5	5일	유	2.7	1/10
비교제형예 10	3.7	3일	무	2.3	0/10
비교제형예 11	1.5	13일	유	2.0	0/10
비교제형예 12	4.2	2일	무	4.1	9/10

상기 표 15에 나타내 바와 같이, 잎새버섯 다당체를 함유한 제형예 7~9 및 비교제형예 9~10을 사용한 경우에는 비교제형예 8 및 비교제형예 11을 사용한 경우에 비하여 여드름이 재발되지 않았고, 전반적으로 여드름 개선에 대해 우수한 효과가 있으며, 특히 제형예 7~9의 경우에는 매우 뛰어난 여드름 개선 효과를 보임을 알 수 있다.

한편, 항균력 표준물질을 함유한 비교제형예 12의 경우에는 여드름 개선 효과를 나타내고 있지만, 사용함에 있어 피부자극이 강하여 장기적으로 사용하기에는 적당하지 않은 것으로 보이나, 본 발명에 따른 조성물은 자극이 없어 장기간의 사용에도 적당한 것으로 나타났다.

[시험예 11] 염증 개선 효과

1. 프로스타글란딘의 생성 억제 효과

항염증 효과를 프로스타글란딘의 생성 억제 효과로 평가하였다. 잎새버섯 다당체를 이용하여 대식세포를 대상으로 효과를 측정하였다. 우선, 마우스의 복강에서 채취한 대식세포에 최종농도가 500M이 되도록 아스피린을 첨가해 세포에 잔존하는 시클로옥시제나제(cyclooxygenase, COX) 활성을 비가역적으로 억제하였다. 그런 다음 상기 현탁액을 96 웰의 세포배양관의 각 웰에 100μl를 넣어 5% CO₂와 37℃ 조건의 배양기에서 2시간 동안 배양하여 대식 세포를 용기 표면에 부착시켰다. 이어, 부착된 대식 세포를 PBS로 3회 세척한 후 이를 염증 개선 효과 시험에 사용하였다. 상기 배양된 대식세포 5x10⁴ 세포/ml에 LPS를 1%(w/v)로 함유하는 RPMI 배지를 첨가하여 12시간 동안 배양한 후 프로스타글란딘의 생성을 유발하고 실시예 1~3 및 비교예 1~3을 100μl 처리하여 유리된 프로스타글란딘을 효소면역 분석법(ELISA)을 이용하여 정량하였다.

이때, 잎새버섯 다당체의 프로스타글란딘의 생성억제 활성은 LPS를 처리한 군과 처리하지 않은 군에서 각각 생성된 프로스타글란딘의 차이를 100%로 설정하고, LPS와 시료를 함께 처리하여 감소된 프로스타글란딘의 백분율을 통하여 대조군과 비교, 판정하였으며, 그 결과(프로스타글란딘의 생성억제 효과)를 하기 표 16에 나타내었다.

블랭크(Blank)	100%
대조군(아스피린 처리군)	25.0%
실시예 1	23.4%
실시예 2	22.8%
실시예 3	24.1%
비교예 1	0.3%
비교예 2	15.7%
비교예 3	22.1%

상기 표 16에서 보는 바와 같이, 잎새버섯 다당체를 함유한 실시예 1~3 및 비교예 2~3을 처리한 경우 프로스타글란딘의 생성억제효과가 높으며, 특히 실시예 1~3을 처리한 경우 아스피린으로 처리한 대조군과 같이 프로스타글란딘의 생성억제효과가 매우 높음을 알 수 있다.

이를 통해 본 발명의 잎새버섯 다당체는 우수한 염증 개선 효과를 제공할 수 있음을 알 수 있다.

또한 잎새버섯 다당체는 피부 염증 인자인 프로스타글란딘의 발현을 억제하여 피부 트러블을 방지하고 개선시킬 수 있음을 알 수 있다.

2. IL-8 생성 억제 효과

실험 하루 전 피부 각화상피세포(Normal human skin keratinocyte, NHEK, 입수처: Lonza)를 96웰(well) 플레이트에 5x10⁴ 세포/웰이 되도록 분주한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터(incubator)에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, PBS로 세포를 2회 씻어주고 무혈청 KBM(serum free keratinocyte basement media)으로 갈아주었다. 각각의 웰에 실시예 1~3 및 비교예 1~3을 처리하여 30분간 반응시킨 후, PGSA(10㎍/㎖), PGSA(50㎍/㎖), PGSA(50㎍/㎖)+LPS(1㎍/㎖)를 각각 처리하였다. 여기서, PGSA(peptidoglycan from S. aureus )는 포도상구균에서 추출한 펩티도글리칸(peptidoglycan)으로서, 그람 양성(+) 균의 세포벽의 주요 구성 성분이고 박테리아의 세포막 성분들은 염증을 유발시키는 것으로 알려져 있으며, 특히 포도상구균의 경우 아토피 환자의 90% 정도가 이 균에 의한 2차 감염을 일으키는 것으로 보고되어 있다. LPS(lypopolysaccaride)는 그람 음성(-) 박테리아균의 세포막 주요 구성성분이며 염증 유발의 주원인으로 알려져 있다.

24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양한 후 배양액을 취하여 인터류킨-8(Interleukin-8, IL-8)에 대한 ELISA를 진행하였으며, 그 결과를 하기 표 17에 나타내었다. ELISA는 제조회사(BD science)의 실험 방법을 이용하였다.

구분	IL-8 분비(pg/㎖)
무처리 대조군(Control)	935.12
PGSA(10㎍/㎖)	4812.60
PGSA(50㎍/㎖)	5895.08
PGSA(50㎍/㎖)+LPS(1㎍/㎖)	6814.91
실시예 1	1131.23
실시예 2	998.78
실시예 3	1007.44
비교예 1	1454.13
비교예 2	1223.76
비교예 3	1034.29

상기 표 17에서 잎새버섯 다당체가 PGSA와 LPS에 의해 증가한 IL-8의 분비를 감소 및 억제시키며, 특히 본 발명에 따른 잎새버섯 다당체인 실시예 1~3을 처리한 경우 IL-8 분비가 현저하게 억제되는 것을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 PGSA와 LPS에 의해 증가한 IL-8의 분비를 현저히 감소시킴으로써 우수한 항염증 효과를 제공할 수 있음을 알 수 있다.

[시험예 12] 가려움 완화 평가

실험 하루 전 각질형성세포(세포주명: HaCaT 입수처: ATCC)를 96 웰(well) 플레이트에 4x10⁴세포/웰이 되도록 분주한 후 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터(incubator)에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, HBSS(Hanks’Balanced Salt solution) 버퍼로 96 웰 플레이트를 2회 워싱(washing)한 다음, 반응 버퍼(2μM Fluo-4-AM, 20% pluronic acid, 2.5mM probenecid)를 세포에 넣어주었다. 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 30분, 상온에서 30분간 반응시킨 후, HBSS 버퍼로 2회 워싱하고 실시예 1~3 및 비교예 1~3으로 세포를 처리하였다.

10분간 반응시킨 후, 2U/ml 트립신(Trypsin) 또는 5μM PAR-2 활성 펩타이드(SLIGKV)를 처리하고 80초간 세포 내 Ca^{2 +} 농도 변화를 측정하였다. 세포 내 Ca²⁺ 농도 변화 측정은 플렉스테이션3(FlexStation3: Molecular Device, USA)를 이용하였다. 실시예 1~3 및 비교예 1~3과 2U/ml 트립신(Trypsin) 또는 5μM PAR-2 활성 펩타이드(SLIGKV) 처리 후 80초간의 플렉스(flex)를 측정하여 얻어낸 값의 최소값과 최대값의 차를 구한 후, 그 값을 2U/ml 트립신 또는 5μM PAR-2 활성 펩타이드(SLIGKV) 처리 시의 최소값과 최대값의 차와 비교하여 칼슘 이온들의 세포 내 유입에 대한 억제율(%)을 하기 표 18에 나타내었다.

처리물질	칼슘 이온들의 세포 내 유입에 대한 억제율(%)
	트립신(2U/ml)	PAR-2 활성 펩타이드(5μM)
실시예 1	34%	40%
실시예 2	41%	43%
실시예 3	37%	42%
비교예 1	0%	2%
비교예 2	23%	27%
비교예 3	28%	31%

상기 표 18에서 알 수 있듯이, 트립신 또는 PAR-2 활성 펩타이드(SLIGKV)에 의한 세포 내 칼슘 이온들의 유입이 잎새버섯 다당체의 처리에 따라 감소되며, 특히 본 발명에 따른 잎새버섯 다당체인 실시예 1~3을 처리한 경우 세포 내 칼슘 이온들의 유입이 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 잎새버섯 다당체를 함유하는 피부 외용제 조성물은 가려움을 유발시키는 PAR-2 활성을 효과적으로 억제함으로써 우수한 항소양 효과를 제공할 수 있다.

Claims (12)

1. 분자량이 2,000~10,000Da 범위인 잎새버섯 다당체를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 잎새버섯 다당체는 조성물 총 중량에 대하여 (0.5)~(20)중량%의 양으로 함유되는 피부 외용제 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 항노화용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 탄력 향상용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 주름 개선용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 재생 개선용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 면역력 강화용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 항염용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 아토피 개선용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
10. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 여드름 개선용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
11. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 보습용임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
12. (a) 잎새버섯 다당체를 가수분해하는 단계;
    (b) 상기 단계에서 가수분해된 잎새버섯 다당체를 한외여과막을 사용하여 분자량이 2,000~10,000Da인 잎새버섯 다당체를 선별하는 단계;
    를 포함하는 저분자량 잎새버섯 다당체의 제조 방법.

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