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KR20130083438A - 간암 요법을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

간암 요법을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20130083438A
KR20130083438A KR1020137004701A KR20137004701A KR20130083438A KR 20130083438 A KR20130083438 A KR 20130083438A KR 1020137004701 A KR1020137004701 A KR 1020137004701A KR 20137004701 A KR20137004701 A KR 20137004701A KR 20130083438 A KR20130083438 A KR 20130083438A
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레일라 호우호우
안네-소피에 둠
도미니크 쥬베르트
프레드릭 홀란드
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르 라보레또레 쎄르비에르
인썸(인스티튜트 내셔날 드 라 싼테 에 드 라 리셰르셰메디칼르)
썽뜨르 나쇼날르 드 라 르쉐르쉐 씨엉띠삐끄
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Publication date
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Abstract

본 발명의 개시는 항-프로가스트린 항체를 이용하여 간암을 치료하고 간암 재발을 예방하는 방법, 간암에 대한 항-프로가스트린 요법의 치료 효능을 모니터하는 방법, 및 상기 방법들에 유용한 조성물을 제공한다.

Description

간암 요법을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR LIVER CANCER THERAPY}
1. 관련 출원의 전후 참조
본 출원은 2010년 7월 26일에 출원된 가출원 번호 61/367,851호 및 2011년 4월 15일에 출원된 가출원 번호 61/476,204호의 35 USC §119(e) 하에서의 이점을 주장하며, 상기 출원 모두의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다.
2. 서열목록, 표 또는 컴퓨터 프로그램에 대한 언급
본 출원은 전자 출원을 통해 ASCII 포맷으로 제공되는 서열목록을 함유한다. 2011년 7월 14일에 생성된 상기 ASCII 카피는 BR (005WO).txt로 명명되며, 이는 79,913 바이트 크기이다.
3. 발명의 분야
본 발명의 개시는 특히 프로가스트린에 특이적인 항체를 포함하는 조성물을 피검체에 투여함으로써 간암에 걸린 피검체 또는 간암 재발의 위험이 있는 피검체를 치료하는 방법에 관한 것이다.
4. 배경
간암은 전세계에서 다섯번째로 가장 흔한 암이며, 암과 관련된 사망의 세번째로 가장 흔한 원인이다(Llovet et al ., 2003, "Hepatocellular carcinoma," Lancet 362: 1907-17). 간암의 가장 흔한 형태는 HCC로도 공지된 간세포암종이며, 이는 다른 기초 간 손상, 통상적으로 간염 또는 경화증과 관련하여 종종 발달한다(Thorgeirsson et al ., 2002, "Molecular pathogenesis of human hepatocellular carcinoma," Nature Genetics 31 :339-346). 간암의 다른 덜 흔한 형태는 간모세포종 및 담관암종을 포함한다.
간암에 대한 표준 치료는 가능한 경우에는 외과적 절제이며, 수술이 선택될 수 없는 경우에는 화학요법, 화학색전술(chemoembolisation), 또는 방사선요법이다. 수술은 종양 크기 또는 위치, 진전된 경화증으로 인해 항상 선택가능한 것은 아니며, 수술을 하는 경우에도, 절제 5년 후에 환자의 70%가 종양 재현/재발된다. 문헌[Llovet et al ., 상기]을 참조하라. 화학요법 치료는 또한 가능하게는 화학요법제를 유출시키는 간암 세포의 능력 증가로 인해 간암에서 감소된 효능을 갖는 것으로 보인다. 따라서, 간암의 더욱 효과적인 치료가 중요하며 시급히 필요하다.
5. 개요
가스트린은 위산의 분비를 촉진하는 장 펩티드 호르몬이다. 성체 포유동물에서, 이는 주로 유문동(gastric antrum), 어느 정도까지는 상부 소장 및 췌장 내의 G 세포에 의해 생성된다. 도 1을 참조하여, 가스트린 유전자는 신호 서열(밑줄)을 함유하는 "프레프로가스트린"으로 언급되는 101개의 아미노산 폴리펩티드로 번역되고, 이는 절단되어 80개의 아미노산 잔기의 폴리펩티드인 프로가스트린("PG")을 발생시킨다. G34, G17 및 G14의 3개의 형태로 주로 발견되는 가스트린(예시되지 않음)은 프로가스트린 처리로부터 발생된다.
일부 간암 조직 샘플에서 PG를 포함하는 가스트린의 불완전하게 처리된 형태의 존재가 보고되었다(예를 들어, Caplin et al ., 1999, "Expression and processing of gastrin in hepatocellular carcinoma, fibrolamellar carcinoma and choangiocarcinoma," J. Hepatol. 30:519-526 참조). 간암 및/또는 이의 재발을 모니터하고, 치료하고, 예방하기 위해 항-프로가스트린 방법이 이용될 수 있는 것이 이제 발견되었다. 본원에서 첫번째로 입증된 바와 같이, 가스트린 mRNA가 간암 줄기세포에서 상승되고, 저 부착 성장 조건하에서 암 구상(sphere) 또는 구상체(spheroid)를 형성하는 간암 세포 또는 분리된 간암 줄기세포의 능력이 항-프로가스트린 항체에 의해 유의하게 감소된다. 임의의 작용 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 프로가스트린("PG")에 결합하고 PG의 생물학적 활성을 중화시키는 능력을 갖는 항-프로가스트린 항체가 간암 세포, 특히 간 종양 개시 또는 암 줄기세포의 성장을 방해하는 것으로 생각된다. 이는 간암 종양 크기 및 수를 감소시키고, 간암의 재발을 예방하는 것으로 생각된다. 이러한 발견은 간암의 치료, 예방, 및 모니터링을 위한 새로운 수단을 제공한다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명의 개시는 인간을 포함하는 동물에서 간암을 치료하고, 간암의 재발을 예방하는데 유용한 방법 및 조성물을 제공한다. 하기에 더욱 상세히 기재되는 바와 같이, 치료 방법은 간암으로 진단된 피검체에 치료적 이익을 제공하는데 효과적인 양의 프로가스트린에 특이적으로 결합하는 항체("항-PG 항체")를 투여하는 것을 포함한다. 항-PG 항체는 단일요법으로서 단독으로 투여될 수 있거나, 종양 절제, 방사선요법, 화학요법, 또 다른 항체를 이용하는 요법 등과 같은 다른 치료 양식과 함께 또는 상기 다른 치료 양식을 보조하여 투여될 수 있다.
종양 절제와 함께 또는 종양 절제에 보조하여 사용되는 경우, 항-PG 항체는 종양의 제거 전 및/또는 후에 투여될 수 있고, 특정 역치 수준 미만의 혈장 및/또는 혈청 프로가스트린 수준이 달성되거나, 특정 기간에 걸친 혈장 및/또는 혈청 프로가스트린 수준에서의 감소가 달성될 때까지 종양 제거 후 특정 기간 동안 지속될 수 있다.
화학요법과 함께 또는 화학요법에 보조하여 사용되는 경우, 항-PG 항체는 화학요법 전, 화학요법과 동시에, 또는 화학요법 후에 투여될 수 있다. 다시, 항-PG 항체는 특정 역치 수준 미만의 혈장 및/또는 혈청 프로가스트린 수준이 달성되거나, 특정 기간에 걸친 혈장 및/또는 혈청 프로가스트린 수준에서의 감소가 달성될 때까지 특정 기간 동안 투여될 수 있다.
본 발명의 개시의 조성물은 PG에 특이적으로 결합하고, 이의 생물학적 활성을 중화시키는 적어도 하나의 항-PG 항체를 함유한다. 폴리클로날 및 모노클로날 항-PG 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 임의의 항-PG 항체가 본 발명의 개시의 방법에서 사용될 수 있다. 본원에 개시된 치료 및 예방의 방법에서 사용하기에 유용한 항-PG 항체는 하기 섹션 7.11에 기재되는 것을 포함한다. 바람직하게는, 항-PG 항체는 치료되는 종의 PG에 특이적이다. 예를 들어, 항-인간 PG 항체는 인간 피검체에 투여된다.
본 발명의 개시의 방법에 사용하기에 적합한 항-PG 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 및/또는 희석제를 포함할 수 있다. 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 다양한 투여 경로를 위해 제형화될 수 있고, 이는 선택 경로에 적합한 담체, 부형제, 및/또는 희석제를 포함한다. 치료 목적상, 항-PG 항체는 용이한 사용을 위한 단위 용량으로 패키징될 수 있다. 단위 용량은 희석제 및, 임의로 사용설명서를 포함하는 키트로 패키징될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 항-PG 조성물로 치료되는 간암에 걸린 개체로부터의 혈액(혈청, 혈장, 또는 전혈) 샘플 중의 PG의 농도 또는 수준을 측정하고, 측정된 PG 수준을 PG의 기준선 수준에 비교함으로써 항-PG 치료의 효능을 모니터하는 방법을 제공한다. 기준선은 보다 초기의 시점, 예를 들어, 치료 시작시의 혈액 샘플 중 PG 수준일 수 있다. 기준선 수준에 비교되는 측정은 치료 과정 동안 또는 치료 과정 후에 수득된 샘플로부터의 측정일 수 있다. 기준선 수준 미만의 측정된 PG 수준은 치료 효능을 나타내고, 기준선 수준 또는 기준선 수준 초과의 측정된 PG 수준은 효능의 결핍을 나타낸다.
6. 도면의 간단한 설명
도 1은 인간 프레프로가스트린(SEQ ID NO:100)(여기서, 신호 펩티드 서열을 밑줄로 표시한다), 성숙 인간 프로가스트린(SEQ ID NO:20), 및 G34(SEQ ID NO:102), G34-Gly(SEQ ID NO:103), G17(SEQ ID NO:104), G17-Gly(SEQ ID NO:105) 및 CTFP(SEQ ID NO:106)을 포함하는 프로가스트린 처리의 특정 생성물의 아미노산 서열을 제공한다.
도 2는 예시적인 특정 뮤린 항-hPG 모노클로날 항체의 가변 경쇄 및 가변 중쇄의 폴리누클레오티드 및 아미노산 서열을 제공한다. 각각의 경우에, 3개의 CDR이 굵은 체로-밑줄친 텍스트로 도시된다. 특히,
도 2a는 뮤린 항-hPG MAb3의 VH 사슬의 폴리펩티드 서열(SEQ ID NO:12) 및 이를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열(SEQ ID NO:16)을 제공한다;
도 2b는 뮤린 항-hPG MAb3의 VL 사슬의 폴리펩티드 서열(SEQ ID NO:13) 및 이를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열(SEQ ID NO:17)을 제공한다;
도 2c는 뮤린 항-hPG MAb4의 VH 사슬의 폴리펩티드 서열(SEQ ID NO:14) 및 이를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열(SEQ ID NO:18)을 제공한다;
도 2d는 뮤린 항-hPG MAb4의 VL 사슬의 폴리펩티드 서열(SEQ ID NO:15) 및 이를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열(SEQ ID NO:19)을 제공한다;
도 2e는 뮤린 항-hPG MAb8의 VH 사슬의 폴리펩티드 서열(SEQ ID NO:59) 및 이를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열(SEQ ID NO:67)을 제공한다;
도 2f는 뮤린 항-hPG MAb8의 VL 사슬의 폴리펩티드 서열(SEQ ID NO:63) 및 이를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열(SEQ ID NO:71)을 제공한다;
도 2g는 뮤린 항-hPG MAb13의 VH 사슬의 폴리펩티드 서열(SEQ ID NO:60) 및 이를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열(SEQ ID NO:68)을 제공한다;
도 2h는 뮤린 항-hPG MAb13의 VL 사슬의 폴리펩티드 서열(SEQ ID NO:64) 및 이를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열(SEQ ID NO:72)을 제공한다;
도 2i는 뮤린 항-hPG MAb16의 VH 사슬의 폴리펩티드 서열(SEQ ID NO:61) 및 이를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열(SEQ ID NO:69)을 제공한다;
도 2j는 뮤린 항-hPG MAb16의 VL 사슬의 폴리펩티드 서열(SEQ ID NO:65) 및 이를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열(SEQ ID NO:73)을 제공한다;
도 2k는 뮤린 항-hPG MAb19의 VH 사슬의 폴리펩티드 서열(SEQ ID NO:62) 및 이를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열(SEQ ID NO:70)을 제공한다; 그리고
도 2l은 뮤린 항-hPG MAb19의 VL 사슬의 폴리펩티드 서열(SEQ ID NO:66) 및 이를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열(SEQ ID NO:74)을 제공한다.
도 3은 본원에 기재된 선별된 항-hPG 모노클로날 항체의 인간화 가변 중쇄 및 경쇄에 대해 계획된 폴리펩티드 서열을 제공한다. 각각의 경우에, 3개의 CDR이 굵은 체로-밑줄친 텍스트로 도시된다. 특히,
도 3a는 인간화 MAb3의 VH 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:21)을 제공한다;
도 3b는 인간화 MAb3의 VL 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:22)을 제공한다;
도 3c는 인간화 MAb4의 VH 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:23)을 제공한다;
도 3d는 인간화 MAb4의 VL 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:24)을 제공한다;
도 3e는 인간화 MAb8(a)의 VH 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:75)을 제공한다;
도 3f는 인간화 MAb8(a)의 VL 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:76)을 제공한다;
도 3g는 인간화 MAb8(b)의 VH 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:77)을 제공한다;
도 3h는 인간화 MAb8(b)의 VL 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:78)을 제공한다;
도 3i는 인간화 MAb8(c)의 VH 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:79)을 제공한다;
도 3j는 인간화 MAb8(c)의 VL 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:76)을 제공한다;
도 3k는 인간화 MAb13(a)의 VH 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:80)을 제공한다;
도 3l은 인간화 MAb13(a)의 VL 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:81)을 제공한다;
도 3m은 인간화 MAb13(b)의 VH 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:82)을 제공한다;
도 3n은 인간화 MAb13(b)의 VL 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:83)을 제공한다;
도 3o는 인간화 MAb16(a)의 VH 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:84)을 제공한다;
도 3p는 인간화 MAb16(a)의 VL 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:85)을 제공한다;
도 3q는 인간화 MAb16(b)의 VH 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:86)을 제공한다;
도 3r은 인간화 MAb16(b)의 VL 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:87)을 제공한다;
도 3s는 인간화 MAb16(c)의 VH 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:88)을 제공한다;
도 3t는 인간화 MAb16(c)의 VL 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:89)을 제공한다;
도 3u는 인간화 MAb19(a)의 VH 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:90)을 제공한다;
도 3v는 인간화 MAb19(a)의 VL 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:91)을 제공한다;
도 3w는 인간화 MAb19(b)의 VH 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:92)을 제공한다;
도 3x는 인간화 MAb19(b)의 VL 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:93)을 제공한다;
도 3y는 인간화 MAb19(c)의 VH 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:94)을 제공한다; 그리고
도 3z는 인간화 MAb19(c)의 VL 사슬의 계획된 아미노산 서열(SEQ ID NO:95)을 제공한다.
도 4는 간암(HCC)에 걸린 14 개체로부터 수거된, 건강한 간 조직에서 검출된 평균 수준에 비한 종양에서의 GAST mRNA 수준의 막대 도표를 제공한다.
도 5a-b는 상승된 GAST 발현을 갖는 것으로 공지된 결장직장암 세포주 SW480에서 관찰된 수준에 비한 3개의 간암 세포주 PLC/PRF/5(도 5a), Huh6(도 5b) 및 Huh7(도 5b)에서의 GAST mRNA 수준의 막대 도표를 제공한다.
도 6a-b는 저 부착 배양 조건하에서 성장한 Huh6 또는 Huh7 세포의 선별되지 않은 푸울(pool)에서 관찰된 수준에 비한 Huh-6(도 6a) 및 Huh7(도 6b) "측면 군락(side population)"(SP) 세포에서의 GAST mRNA 수준의 막대 도표를 제공한다.
도 7은 예시적 항-PG 모노클로날 항체 또는 대조군 항체의 존재하에서 저 부착 배양 조건하에서 성장한 PLC/PRL/5 세포의 웰 당 구상체 성장 수의 그래프를 제공한다.
도 8은 독소루비신 및 디메틸 설폭시드(DMSO), DMSO 단독, 예시적 항-PG 폴리클로날 항체, 또는 대조군 폴리클로날 항체의 존재하에서 저 부착 성장 조건하에서 성장한 Huh6 "측면 군락"(SP) 세포의 웰 당 구상체 성장 수의 그래프를 제공한다.
도 9는 독소루비신 및 DMSO, DMSO 단독, 예시적 항-PG 폴리클로날 항체 또는 대조군 폴리클로날 항체의 존재하에서 저 부착 성장 조건하에서 성장한 Huh7 "측면 군락" 세포의 웰 당 구상체 성장 수의 그래프를 제공한다.
도 10은 배지 단독("대조군"), 또는 항-hPG MAb13, 또는 항-hPG MAb19를 갖는 배지 중에서 저 부착 성장 조건하에서 성장한 Huh6 세포의 웰 당 구상체 성장 수의 그래프를 제공한다.
도 11은 배지 단독("대조군"), 또는 항-hPG MAb8, 또는 항-hPG MAb13을 갖는 배지 중에서 표준 부착 조건하에서의 성장 후에 저 부착 성장 조건하에서 성장한 Huh6 세포의 웰 당 구상체 성장 중간 수(median number)의 막대 도표를 제공한다.
도 12a-b는 저 부착 성장 조건하에서 성장한 Huh7 세포의 웰 당 구상체 성장 수의 그래프를 제공한다. 도 12a는 항-hPG MAb13으로 처리된 세포에 비한 배지 단독("대조군")에서 성장한 세포를 도시한다. 도 12b는 대조군 모노클로날 항체("대조군 MAb"), 항-hPG MAb13, 및 항-hPG MAb16 중 하나로 처리된 세포를 도시한다.
도 13a-b는 대조군 모노클로날 항체("대조군 MAb")에 비한 항-hPG MAb8(도 13a) 또는 항-hPG MAb16(도 13b)을 이용한 표준 부착 조건하에서의 성장 후에 저 부착 성장 조건하에서 성장한 Huh7 세포의 웰 당 구상체 성장 수의 그래프를 제공한다.
도 14는 배지 단독("대조군"), 또는 항-hPG MAb8 또는 항-hPG MAb13을 갖는 배지를 이용한 저 부착 성장 조건하에서 성장한 Huh7 "측면 군락" 세포의 웰 당 구상체 성장 수의 그래프를 제공한다.
도 15a-c는 대조군 모노클로날 항체("대조군 MAb")에 비한 항-hPG MAb19(도 15a), 항-hPG MAb13(도 15b), 또는 항-hPG MAb8 및 MAb13(도 15c)로 처리된 PLC/PRL/5 세포의 웰 당 구상체 성장 수의 그래프를 제공한다.
도 16은 대조군 모노클로날 항체("CT MAb"), 항-hPG MAb8, 또는 항-hPG MAb16 중 하나를 이용한 표준 부착 조건하에서의 성장 후에 저 부착 성장 조건하에서 성장한 PLC/PRL/5 세포의 웰 당 구상체 성장 수의 그래프를 제공한다.
도 17은 배지 단독("대조군"), 또는 항-hPG MAb13 또는 항-hPG MAb16을 갖는 배지에서의 저 부착 성장 조건하에서 성장한 PLC/PRL/5 "측면 군락" 세포의 웰 당 구상체 성장 수의 그래프를 제공한다.
7. 상세한 설명
7.1. 간암
간암은 간세포암종(HCC), 담관암종 및 간모세포종을 포함한다. 대부분의 간암은 HCC이고, 간 염증 및 간세포의 만성 손상 및 재생을 야기시키는 간염, 경화증, 및/또는 아플라톡신 B1(aflatoxin B1) 중독을 포함하는 다른 기초 간 병변에 걸린 개체에서 종종 발생한다. 간암의 진단은 현재 초음파촬영술, 미세-바늘 생검, 및, 예를 들어, 알파-태아단백질을 포함하는 특정 마커 단백질의 순환 수준의 검출의 조합을 기초로 한다. HCC는 종양 크기, 수 및 형태(예를 들어, 피막화 또는 침습성), 및 간 기능을 기초로 하여 초기, 중기, 진전, 및 말기암으로 분류될 수 있다.
간암에 대한 현재 치료는 간 이식, 외과적 절제, 경피 절제, 화학요법, 예를 들어, 화학학색전술, 방사선 치료, 항체 치료를 포함한다. 완전히 치료용인 간 이식은 대부분의 환자에게 적용가능하지 않은데, 이는 환자의 질병의 단계 및/또는 이식에 이용가능한 기관의 부족 때문이다. 이식의 이용가능성은 또한 B형 간염 또는 C형 간염 바이러스에 감염된 환자 뿐만 아니라 알콜 중독에 걸린 환자에 대해 제한될 수 있다. 암 조직을 제거하거나 사멸시키는 절차인 외과적 절제 및 경피 절제는 우수한 결과를 가질 수 있으나, 모든 환자에 이용가능하지 않다. 종양 위치 또는 크기는 외과적 절제 절차에 따르는 기관 기능상실의 위험으로 인해 경화증 또는 다른 간 기능의 손상을 유발할 수 있음에 따라 외과적 절제를 배제시킬 수 있다. 간 절제의 경우에도, 5년 이내에 환자의 70%가 종양 재발된다. 경피 절제는 신생물 세포를 파괴하고, 외과적 절제 후보가 아닌 3 cm보다 작은 하나의 종양을 갖는 개체에 적합하다. 암이 더욱 진전되고, 간 기능이 손상된 개체에서, 표준 치료는 색전술(종양으로의 혈액 공급을 중단시키고, 종양의 사멸을 유도하기 위한 동맥의 폐색)을 이용하거나 이용하지 않는 화학요법 및 방사선요법이다. 현재 이용가능한 치료는 간암에 걸린 개체 대부분을 치료하는데 사용될 수 있는 효과적인 요법의 필요를 충족시키기에는 불충분하다.
7.2. 간암 재발
재발은 간암에서 특히 문제가 된다. 암 재발은 일반적으로 치료 후, 및 보다 초기의 암이 검출될 수 없는 기간 후의 암의 복귀로 이해된다. 외과적 절차 동안 모든 암 세포 제거의 실패, 경피 절제 동안 기구에 의한 암 세포의 스프레딩, 및 화학요법제에 대한 내성을 포함하는 다양한 설명이 높은 비율의 간암 재발에 대해 제공되었다. 재발을 감소시키거나 배제시키는 간암 요법이 필요하다.
7.3. 암 줄기세포
고형 종양은 반드시 균일한 조직은 아니다. 오히려, 일부 종양은 별개의 표현형 및 기능적 특성을 갖는 다수의 이상 세포 유형을 포함한다. 이 점에서, 상기 종양은 이상 기관과 유사하다. 고형 종양을 포함하는 세포는 이들이 동일 숙주 내의 새로운 부위 또는 동일하거나 상이한 종의 새로운 숙주에 이식되는 경우에 새로운 종양의 형성을 개시할 수 있는 정도와 관련하여 상이하다. 상기 특성을 갖는 세포는 종양 또는 암 개시 세포, 또는 대안적으로 종양 또는 암 줄기세포로 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Chiba et al ., 2009, "Cancer stem cells in hepatocellular carcinoma: Recent progress and perspective," Cancer Letters 286:145-153]을 참조하라. 이러한 세포는 면역결핍 마우스에서 종양을 형성시키는 간암 세포의 선별되지 않은 푸울(pool)에 필요한 수보다 훨씬 적은 수로 면역결핍 마우스에 이식되는 경우에 종양을 형성시킨다(1000개의 "측면 군락" 간암 세포 대 100만개의 분류되지 않은 간암 세포). 예를 들어, 문헌[Chiba et al ., 상기]을 참조하라.
일반적으로, 암 줄기세포는 자가-재생하는 능력 및 비-줄기세포로 분화하는 딸세포를 발생시키는 능력의 두 능력에 의해 규정된다. 자가-재생은 하나 또는 둘 모두의 딸세포가 미분화된 채로 유지되고 세포 분열을 겪음으로써 모(parental) 세포와 유사한 증식 능력을 갖는 또 다른 암 줄기세포를 발생시키는 능력을 보존하는 능력이다. 이러한 특성은 암 줄기세포가 궁극적으로 성장하는 종양을 포함하는 매우 많은 수의 세포를 발생시키도록 한다. 암 줄기세포는 또한 분화하여 많은 고형 종양에서 발견되는 더욱 분화된 비-줄기, 또는 벌크, 종양 세포의 스펙트럼을 발생시키는 딸세포를 생성시키는 능력을 갖는다. 따라서, 이식되는 경우, 암 줄기세포는 다수의 연속적 이식 후에도 이들이 유래되는 종양의 유형을 재구성시킬 수 있다. 더욱이, 암 줄기세포가 변경된 증식 패턴 및/또는 낮은 비율의 아폽토시스를 발생시키는 유전적 돌연변이 및/또는 후성적 변화를 갖는 것으로 생각된다.
암 줄기세포는 벌크 종양 세포로부터 암 줄기세포를 구별하는 다수의 표현형 특징에 따라 확인될 수 있다. 첫째로, 상기 기재된 바와 같이, 간암 줄기세포는 새로운 숙주에 이식되는 경우 새로운 종양을 개시시키는 능력을 갖는다. 대조적으로, 벌크 종양 세포는 새로운 종양을 개시시킬 수 없거나, 새로운 종양을 형성하기 위해 암 줄기세포보다 많은 세포를 필요로 한다. 문헌[Chiba et al ., 2009, "Cancer stem cells in hepatocellular carcinoma: Recent progress and perspective," Cancer Letters 286: 145-153]을 참조하라.
종양 또는 세포주가 암 줄기세포를 함유하는지 평가하는데 유용한 방법은 당업자에게 친숙하다. 비제한적인 예로서, 암 줄기세포를 함유하는 것으로 여겨지는 종양 또는 이의 일부는 외과적 절제에 의해 분리된다. 이후, 종양 조직은 잘게 썰리고, 종양을 분해하고 종양의 구성 세포를 방출시키는데 효과적인 효소 또는 일부 다른 처리로 처리된다. 대안적으로, 세포주가 분석중인 경우, 세포주는 효소 또는 화학적 처리를 이용하여 세포를 해리시키는 것만을 필요로 할 수 있다. 또는, 본원에 기재된 표현형, 예를 들어, 마커 단백질의 존재 또는 부재 또는 염료 또는 다른 물질을 배제시키는 능력 중 하나 이상을 기초로 하여 선택된 세포의 하위집단이 제조될 수 있다. 마커 프로파일(들), 염료 배제, 또는 암 줄기세포와 관련된 다른 특성이 결핍된 세포 집단이 대조군으로 제조될 수 있다.
관련 세포 하위집단을 분리시킨 후, 미리 결정된 수의 상기 세포가 수용 동물 내의 하나 이상의 표적 조직 또는 기관으로 이식된다. 일부 구체예에서, 수용 동물은 누드 마우스, 중증 복합 면역결핍(SCID)을 갖는 마우스, 및 비만이 없는 당뇨 SCID(NOD-SCID) 마우스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 면역결핍 마우스이다. 당업자의 지식에 따라 다른 종이 또한 사용될 수 있다.
세포는 피하 이식되거나 간으로 이식될 수 있다. 세포는 또한 다른 조직 및 기관으로 이식될 수 있다. 일부 구체예에서, 분석 중인 종양의 기원 조직 또는 기관을 복제시키기 위해 표적 조직 또는 기관이 선택된다. 그러나, 다른 구체예에서, 숙주에 이식되는 세포와 별개의 조직 또는 기관이 선택된다.
당업자에게 친숙한 기술을 이용하여 세포가 이식되고, 일정 기간 동안 방해받지 않고 방치된 후, 동물은 이식 부위에 새로운 종양이 성장하였는지 결정하기 위해 평가될 수 있다. 피하 이식되는 세포에 대해, 종양 성장은 시각적 검사 및 이식 부위의 촉지(palpation)에 의해 평가될 수 있다. 종양이 검출가능한 경우, 이의 크기는 캘리퍼스를 이용하여 기간 전체에 걸쳐 측정될 수 있다. 내부 기관으로 이식되는 세포에 대해, 동물은 하나 이상의 종양이 존재하는지 여부, 만약 존재한다면 그러한 종양(들)의 수 및 크기를 결정하기 위해 이식 후 미리 결정된 시간에서 희생될 수 있다. 대안적으로, 당업자의 지식에 따라, 종양 성장을 평가하기 위해 비-침습성 기술이 이용될 수 있다.
둘째로, 암 줄기세포는 또한 이의 특정 마커의 발현 또는 비-발현에 의해 확인될 수 있는 반면, 동일 종양으로부터의 벌크 종양 세포는 상이한 패턴의 마커 발현을 갖는다. 일부 구체예에서, 마커의 발현의 부재는 암 줄기세포 표현형을 나타낸다. 이러한 마커는 세포 내 또는 세포 표면 상에서 발현되는 단백질을 포함하며, 이는 면역조직화학, 면역형광, 및 FACS 분석을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술을 이용하여 검출될 수 있다. 간암 줄기세포는 세포 표면 마커에 의해 확인되어 왔다. CD133, CD90, 및 CD44를 포함하는 하나 이상의 세포 표면 마커를 갖는 간암 세포는 증가된 종양 개시 특성을 갖는 것으로 보이며, 간암 줄기세포로 특성규명되어 왔다.
셋째로, 간암 줄기세포는 또한 단백질 전달체를 통해 염료 및 약물을 유출시키는 능력에 의해 확인되어 왔다. 종양-개시 간암 세포는 ABC 전달체를 통해 Hoechst 33342 염료를 유출시키는 능력을 기초로 하여 확인되어 왔다. 이러한 세포는 이들을 형광 염료에 노출시키고, 상기 염료를 배제하는 세포로부터 상기 염료를 흡수하는 세포를 분리시키는 FACS 분석을 이용함으로써 확인될 수 있다. 이러한 염료-배제 암 세포는 측면 군락(SP) 세포로 언급된다. SP 세포는 1000개의 세포만큼 소수의 세포로부터 종양을 개시시킬 수 있다(Chiba et al ., 2006 "Side-population purified from hepatocellular carcinoma cells harbors cancer stem cell-like properties" Hepatology 44: 240-251). 당업자의 지식에 따라 간암 줄기세포를 검출하기 위한 다른 기술이 또한 가능하다.
생체내에서 종양을 개시시키는 능력에 더하여, 벌크 종양 세포가 종양을 개시시킬 수 없거나, 종양을 개시시킬 능력히 현저히 덜한 경우, 암 줄기세포는 벌크 종양 세포에 비해 혈청 비함유의 저-부착 배양 조건하에서 성장하는 능력의 증가를 또한 나타내고, 암의 유형에 따라 저-부착 배양 조건하에서 소위 구상체를 형성할 수 있다. 구상체는 분리된 현탁액으로 시딩된 후에 특정 세포가 배양 중에 성장함에 따라 형성되는 세포의 밀집된 구이다. 이러한 구상체의 형성은 세포가 일반적으로 특정 성장인자(표피성장인자(EGF) 및 기본 섬유모세포 성장인자(bFGF)를 포함하나, 이에 제한되지는 않음)의 존재하에서 포유동물 세포가 불량하게 부착되는 표면을 갖는 조직 배양 접시 중의 혈청 비함유 배지 중에서 성장되는 경우에 촉진된다. 정상 조직으로부터의 줄기세포와 유사하게, 암 줄기세포는 적절한 배양 조건하에서 우선적으로 구상체로 성장하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌[Rappa, G., et al ., Exp. Cell Res., 314:2110 (2008); Singh, S.K., et al ., Cancer Res., 63:5821 (2003); Fang, D., et al ., Cancer Res., 65:9328 (2005)]을 참조하라. 저 부착 배양 조건, 또는 구상체 성장 조건하에서의 구상체 성장에 대한 검정은 하기 실시예에 기재되며, 이는 또한 당업자의 지식 범위 내이다.
7.4. 간암 재발에서의 암 줄기세포의 역할
방사선 및/또는 화학요법제에 대해 향상된 내성을 나타내는 암 줄기세포의 특성을 갖는 종양 세포가 확인되었다(Eyler, C.E., et al ., 2008, J. Clin . Oncol, 26:2839-2845). 방사선 및 화학요법에 대한 암 줄기세포의 증가된 내성은 상기 요법의 효능을 감소시킬 뿐만 아니라 상기 세포가 종양이 더 이상 검출가능하지 않고 요법이 성공한 후에도 존속되도록 할 수 있다. 이러한 환자에서, 치료는 처음에 효과적이어서 진단 스캔에서 종양이 수축되거나 소실되도록 하지만, 종양은 치료 중지 후에 종종 재발한다. 이는 차례로 간암에 대해 이전에 치료된 개체에서의 재발 현상을 설명할 수 있다(Eyler, 상기). 따라서, 간암의 현재 징후가 없는, 간암에 대해 이전에 치료된 피검체에서의 간암 줄기세포의 성장을 억제하거나 줄기세포를 사멸시키는 것이 재발을 예방할 수 있다.
7.5. 간암 줄기세포에 대한 항- PG 항체 및 이의 효과
하기 실시예에 제시되는 바와 같이, 간암 종양 및 HCC 세포주는 프로가스트린을 엔코딩하는 가스트린 유전자(GAST)의 증가된 발현을 나타낸다. 이러한 발현은 2개의 상이한 간암 세포주에서 간암 줄기세포의 특징을 갖는 "측면 군락" 세포에서 추가로 상승된다. 임의의 작용 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 최초이거나 재발인 간암을 치료하는 한 방식이 간암 줄기세포의 성장을 억제하고, 바람직하게는 종양을 형성시키는 종양 개시 세포의 능력을 억제하는 작용제를 투여하는 것으로 생각된다.
출원인은 항-프로가스트린 항체가 상기 작용제인 것을 발견하였다. 본원에 개시된 바와 같이, 놀랍게도 간암 줄기세포의 성장이 인간 프로가스트린("hPG")을 특이적으로 인지하는 항체를 이용한 치료에 의해 억제될 수 있는 것을 발견하였다. 이러한 놀라운 결과를 기초로 하여, 간암 줄기세포를 포함하는 암을 갖는 환자에게 치료적 유효량의 항-hPG 항체를 투여하는 것이, 비제한적인 예로, 간암 또는 이의 재발에 기여하는 상기 세포의 능력을 감소시킴에 의해 치료 이익을 갖는 것으로 예상된다.
본 발명의 개시의 항-PG 항체는 프로가스트린에 결합함으로써 프로가스트린이 공지되어 있지 않더라도 암 줄기세포 상의 추정 수용체 또는 수용체들과 상호작용하는 것을 방지함으로써 간암 줄기세포의 성장을 억제하는데 효과적인 것으로 생각된다. 따라서, 암 줄기세포 자신에 의해 생성되거나 건강한 조직에 의해 생성되건 간에 프로가스트린은 상기 세포에 대한 성장을 촉진하는 생물학적 효과를 매개하는 것이 금지된다. 결과로서, 본 발명의 개시의 항-PG 항체가 작용하는 바와 같이 PG를 중화시키는 것이 상기 세포 상의 PG의 수용체 또는 수용체들과 PG의 상호작용을 차단하고, 가능하게는 아폽토시스의 결과로서 및/또는 세포 분열을 중지시키거나 늦춤으로써 세포를 사멸시킬 수 있는 것으로 생각된다. 항-PG 항체가 암 줄기세포의 생존 및/또는 성장을 방해하는 다른 메커니즘이 또한 가능하고, 이는 본원에 개시된 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. PG의 활성을 중화시키는 항-PG 항체의 능력은 하기 실시예에 기재되는 것과 같은 시험관내 세포 성장 억제 검정을 포함하는 당업자에게 공지된 검정을 이용하여 결정될 수 있다.
7.6. 간암을 치료하는 방법
본 발명의 개시는 치료 이익을 갖는 유효량의 항-프로가스트린("항-PG") 항체를 투여함으로써 피검체의 간암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 개시에 따라 간암을 치료하는 방법은 하기 섹션 7.11에 상세히 기재되는 PG를 중화시킬 수 있는 하나 이상의 항-PG 항체를 간암을 갖는 개체에 투여함으로써 달성된다. 폴리클로날 및 모노클로날(예를 들어, 키메라, 인간화, 전체 인간, 전장, Fab, 단쇄) 항-PG 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 PG를 중화시키는 임의의 항체가 본 발명의 개시의 방법에서 사용될 수 있다. 적합한 항-PG 항체는 시험관내에서 간암 세포의 성장을 억제할 수 있다. 일부 구체예에서, 항-PG 항체는 간암 줄기세포, CD133, CD44, 및 CD90으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포 표면 마커를 갖는 간암 세포, 및 Hoechst 33342 염료를 유출시킬 수 있는 간암 세포를 포함하는 종양-개시 특성을 갖는 간암 세포에 의한 저 부착 배양 조건하에서 구상체의 성장을 억제할 수 있다.
간암에 대한 치료를 필요로 하는 피검체는 간암으로 진단된 개체이다. 간암은 첫번째 발생 또는 재발일 수 있다. 적합한 피검체는 PG의 상승된 혈중 농도를 갖는 개체, 간암이 다른 수단에 의해 치료될 수 없는 개체, 예를 들어, 수술불가능한 종양을 갖는 개체 또는 다른 유형의 요법이 실패한 개체, 및 외과적 절제, 화학요법, 화학색전술, 방사선요법, 또는 본 발명의 개시의 항-PG 항체가 아닌 항체를 이용한 항체 요법을 포함하는 간암에 대한 다른 치료를 받는 개체를 포함한다. 적합한 피검체는 또한 완화 기간 후에 재발된 간암을 갖는, 간암에 대해 이전에 치료된 개체를 포함한다. 간암은 임의의 진행 단계일 수 있다. 피검체는 인간, 또는 가축 또는 비-가축 동물을 포함하는 비-인간일 수 있다.
항-PG 치료는 단일요법으로서 단독으로 적용될 수 있거나, 간암에 대한 하나 이상의 다른 치료와 함께 또는 상기 다른 치료에 보조하여 적용될 수 있다. 다른 치료는 외과적 절제, 및 제 2 치료제, 예를 들어, 화학요법제, 방사선조사제, 또는 본원에 기재된 바와 같은 항체를 이용한 치료를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 제공되는 바와 같은 조합 치료는 환자로의 적어도 2개의 치료의 적용을 포함하며, 치료 중 하나는 적어도 하나의 항-PG 항체를 이용한 항-PG 치료이고, 치료의 나머지는 치료제 또는 절차를 이용한 치료이다.
항-PG 치료는 외과적 절차, 예를 들어, 외과적 절제 또는 경피 절제와 조합될 수 있다. 항-PG 항체는 간의 병에 걸린 부분(들)의 외과적 절제 또는 경피 절제와 조합되어 원발성 또는 재발성 간암을 갖는 피검체에 투여될 수 있다. 항-PG 치료는 외과적 절제 전, 외과적 절제와 동시에, 또는 외과적 절제 후에 개시될 수 있다.
항-PG 치료는 방사선요법과 조합될 수 있다. 방사선요법은 x-선, 감마선, 중성자, 양성자, 및 암세포를 사멸시키고 종양을 수축시키는 다른 소스로부터의 고에너지 방사선의 사용이다. 방사선은 신체 외부의 기계(외부-빔 방사선 요법)로부터 유래될 수 있거나, 이는 암세포 근처의 체내에 위치(내부 방사선 요법, 또는 근접치료)된 방사성 물질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 간암은 131I를 이용한 내부 방사선에 의해 치료되어 왔다. 전신 방사선요법은 신체 전체에 걸쳐 혈액내에서 조직으로 이동하는 방사선 표지된 모노클로날 항체와 같은 방사성 물질을 이용한다. 방사선요법은 또한 방사선조사 및 방사선치료로 언급될 수 있다. 다른 방사선 요법은 3차원 입체조형 방사선요법(three-dimensional conformal radiation therapy, 3D-CRT) 및 강도 변조 방사선요법(intensity modulated radiation therapy, IMRT)을 포함한다. 다른 방사선요법이 또한 가능하다.
항-PC 항체 치료는 또한 화학치료제와 조합될 수 있다. 화학요법은 암세포를 사멸(세포독성 또는 세포파괴성)시키거나 성장을 막는(세포정지) 소분자 약물을 이용한다. 간암에 대해, 화학치료제는 종종 색전술 치료와 조합되며, 예를 들어, 색전술에 대한 젤라틴 및 화학치료제로서 독소루비신, 미토마이신, 또는 시스플라틴이 조합된다. 화학치료제는 세포의 생존력에 유해한 임의의 작용제를 포함하는, 세포독소 또는 세포독성제로도 불리는 독소, 작용제, 및 화학치료제 화합물을 함유하는 리포좀 및 그 밖의 소포를 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 적합한 화학치료제의 예는 1-데히드로테스토스테론, 5-플루오로우라실 데카르바진, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 액티노마이신 D, 아드리아마이신, 알데스류킨, 알킬화제, 알로푸리놀 소듐, 알트레타민, 아미포스틴, 아나스트로졸, 안트라마이신(AMC), 항-유사분열제, 시스-디클로로디아민 플라티눔(II)(DDP) 시스플라틴), 디아미노 디클로로 플라티눔, 안트라시클린, 항생제, 항대사물질, 아스파라기나제, 생 BCG(방광내), 베타메타손 소듐 포스페이트 및 베타메타손 아세테이트, 비칼루타미드, 블레오마이신 설페이트, 부술판, 칼슘 류코우오린, 칼리케아미신, 카페시타빈, 카르보플라틴, 로무스틴(CCNU), 카르무스틴(BSNU), 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 콜히친, 컨쥬게이션된 에스트로겐, 시클로포스파미드, 시클로토스파미드, 시타라빈, 시타라빈, 시토칼라신 B, 시톡산, 다카르바진, 닥티노마이신, 닥티노마이신(이전에는 액티노마이신), 다우니루비신 HCL, 다우노루비신 시트레이트, 데니류킨 디프티톡스(denileukin diftitox), 덱스라족산(Dexrazoxane), 디브로모만니톨, 디히드록시 안트라신 디온, 도세탁셀, 돌라세트론 메실레이트, 독소루비신 HCL, 드로나비놀, 이. 콜라이(E. coli) L-아스파라기나제, 에메틴, 에포에틴-α, 에르위니아 L-아스파라기나제, 에스테르화된 에스트로겐, 에스트라디올, 에스트라무스틴 포스페이트 소듐, 에티듐 브로마이드, 에티닐 에스트라디올, 에티드로네이트, 에토포시드 시트로로룸 인자, 에토포시드 포스페이트, 필그라스팀, 플록수리딘, 플루코나졸, 플루다라빈 포스페이트, 플루오로우라실, 플루타미드, 폴린산, 젬시타빈 HCL, 글루코코르티코이드, 고세렐린 아세테이트, 그라미시딘 D, 그라니세트론 HCL, 히드록시우레아, 이다루비신 HCL, 이포스파미드, 인터페론 α-2b, 이리노테칸 HCL, 레트로졸, 류코보린 칼슘, 류프롤리드 아세테이트, 레바미솔 HCL, 리도카인, 로무스틴, 메이탄시노이드, 메클로르에타민 HCL, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 멜팔란 HCL, 머캅티퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 메틸테스토스테론, 미트라마이신, 미토마이신 C, 미토탄, 미톡산트론, 닐루타미드, 옥트레오티드 아세테이트, 온단세트론 HCL, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파미드로네이트 디소듐, 펜토스타틴, 필로카르핀 HCL, 플리마이신, 카르무스틴 임플란트를 갖는 폴리페프로산 20, 포르피머 소듐, 프로카인, 프로카르바진 HCL, 프로파놀롤, 리툽시맙, 사르그라모스팀, 소라페니브, 스트렙토조토신, 타목시펜, 탁솔, 테가푸르, 테니포시드, 테노포시드, 테스톨락톤, 테트라카인, 티오에파 클로람부실, 티오구아닌, 티오테파, 토포테칸 HCL, 토레미펜 시트레이트, 트라스투주맙, 트레티노인, 발루비신, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트 및 비노르엘빈 타르트레이트를 포함하나 이로 제한되지 않는다.
항-PG 항체는 또한 화학치료제와 함께 투여될 수 있다. 화학치료제의 예시적인 조합물은 류코보린(폴린산 또는 LV)과 함께 5-플루오로우라실(5FU); 우라실(UFT) 및 류코보린과 함께 카페시타빈; 우라실(UFT) 및 류코보린과 함께 테가푸르(tegafur); 5FU 또는 카페시타빈과 함께 옥살리플라틴; 카페시타빈과 함께 이리노테칸, 및 5FU, 이리노테칸 또는 카페시타빈과 함께 미토마이신 C를 포함한다. 본원에 개시된 화학치료제의 다른 조합의 이용이 또한 가능하다.
간암에 걸린 환자에게 사용되는 화학치료제에 대한 표준 투여 계획이 본 발명의 개시된 방법에 이용될 수 있다. 관련 분야에서 공지된 대로, 상이한 화학요법제의 조합물을 이용한 간암을 위한 화학요법 계획이 임상 시험에서 표준화되었다. 화학요법제를 이용한 임상 시험의 요약에 대해서는 상기 문헌[Llovet et al.,]을 참조하라.
항-PG 항체는 또한 암세포를 직접 또는 간접적으로 사멸시키거나 성장을 늦추거나 정지시키는 모노클로날 항체를 포함하나 이로 제한되지 않는 그 밖의 항체와 함께 이용될 수 있다. 그러한 항체는 다양한 별개의 메카니즘을 통해 기능할 수 있다. 예를 들어, 특정 항체는 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 또는 그 밖의 메카니즘을 통해 환자의 면역계에 의한 공격에 대해 암세포를 마크할 수 있다. B 세포 상에서 발견되는 CD20 항원에 결합하는 리툭시맙(Rituxan®) 및 17-1A 항원에 결합하는 에드레콜로맙이 상기 방식으로 기능할 수 있는 것으로 생각된다. 그 밖의 항체는 암세포가 생존 및/또는 성장을 위해 필요로 하는 항원에 결합하여 이의 기능을 변경시키거나 억제시킨다. 다수의 항체가 이러한 방식으로 기능하는 것으로 여겨지며, 예를 들어 각각이 EGF 수용체(EGFR)에 결합하는 세툭시맙(Erbitux®) 및 파니투무맙(Vectibix®); 및 성장 인자 VEGF에 결합하는 베바시주맙(Avastin®)을 포함한다. 다른 메카니즘이 또한 가능하며, 특정 항체가 하나 이상의 작용 메카니즘을 통해 기능할 수 있다. 또한 다른 항체가 방사성 또는 화학독성 부분에 컨쥬게이션되어 항체에 의해 특이적으로 인지되는 항원을 우선적으로 발현시키는 암세포에 이들을 표적화할 수 있다.
항-PG 항체 및 제 2 작용제는 동시에, 연속적으로, 또는 별개로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은, 항-PG 항체 및 제 2 작용제는 이들이 동일한 날에, 예를 들어, 동일한 환자 방문 동안에 환자에게 투여되는 경우에 연속적으로 투여되는 것으로 언급된다. 연속적 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8시간 떨어져 발생할 수 있다. 대조적으로, 항-PG 항체 및 제 2 작용제는 상이한 날에 환자에게 투여되는 경우에 개별적으로 투여되는 것으로 언급되며, 예를 들어, 항-PG 항체 및 제 2 치료제는 1일, 2일 또는 3일, 1주, 2주 또는 월 1회 간격으로 투여될 수 있다. 본 발명의 개시의 방법에서, 본 발명의 개시의 항-PG 항체의 투여는 제 2 작용제의 투여에 선행하거나 후속될 수 있다. 비제한적인 예로서, 항-PG 항체 및 제 2 작용제가 일정 기간 동안 동시될 수 있고, 이후, 두번째 기간 동안 항-PG 항체 및 제 2 작용제의 투여가 교대될 수 있다.
7.7. 간암 재발을 예방하는 방법
또 다른 양태에서, 본 발명의 개시는 유효량의 항-PG 항체를 예방을 필요로 하는 피검체에 투여하는 것을 포함하는 간암 재발을 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 개시에 따른 간암 재발을 예방하는 방법은 하기 섹션 7.11에 상세히 기재되는 PG를 중화시킬 수 있는 하나 이상의 항-PG 항체를 간암 재발의 위험이 있는 개체에 투여함으로써 달성된다.
간암 재발의 예방을 필요로 하는 피검체는 간암의 위험이 있으나, 다시 간암으로 진단되지 않은 간암에 대해 이전에 치료된 개체이다. 적합한 피검체는 외과적 절제, 화학요법, 또는 임의의 다른 요법을 포함하는 임의의 수단에 의해 간암에 대해 이전에 치료된 개체를 포함한다.
간암 재발의 효과적인 예방은 간암 재발의 완전한 부재 및 진행중인 부재를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 효과적인 예방은 간암 재발의 위험이 있는 피검체로부터 수득된 간암 종양 또는 간암 줄기세포의 부재에 의해 측정된다. 일부 구체예에서, 효과적인 예방은 간암 재발의 위험이 있는 피검체에서의 PG의 혈중 농도의 증가 결핍에 의해 결정된다.
항-PG 치료는 단일요법으로서 단독으로 적용될 수 있거나, 하나 이상의 다른 치료와 함께 또는 상기 다른 치료에 보조하여 적용될 수 있다. 다른 치료는 외과적 절제, 및 제 2 치료제, 예를 들어, 화학요법제, 방사선조사제, 또는 본원에 기재된 바와 같은 항체를 이용한 치료를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 제공되는 바와 같은 조합 치료는 환자로의 적어도 2개의 치료의 적용을 포함하며, 치료 중 하나는 적어도 하나의 항-PG 항체를 이용한 항-PG 치료이고, 치료의 나머지는 치료제 또는 절차를 이용한 치료이다.
항-PG 항체 및 제 2 작용제는 동시에, 연속하여, 또는 별개로 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 대로, 항-PG 항체 및 제 2 작용제는 같은 날에, 예를 들어 동일한 환자 방문 동안에 환자에게 투여되는 경우, 연속하여 투여된 것으로 일컬어진다. 연속 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8시간 간격으로 일어날 수 있다. 대조적으로, 항-PG 항체 및 제 2 작용제는 다른 날에 환자에게 투여된 경우에 별개로 투여된 것으로 일컬어지며, 예를 들어 항-PG 항체 및 제 2 치료제는 1일, 2일 또는 3일, 1주일, 2주일 또는 매월 간격으로 투여될 수 있다. 본 발명에 개시된 방법에서, 본 발명에 개시된 항-PG 항체의 투여는 제 2 작용제의 투여에 선행하거나 후속될 수 있다. 비제한적인 예로서, 항-PG 항체 및 제 2 작용제는 일정한 기간 동안 동시에 투여될 수 있고, 이후, 두번째 기간 동안, 항-PG 항체 및 제 2 작용제의 투여가 교대될 수 있다.
7.8 약학적 조성물
본 발명에 개시된 방법에 유용한 항-PG 항체는 조성물로 제형화될 수 있다. 임의로, 조성물은 하나 이상의 추가 작용제(들), 예를 들어, 상기 기재된 제 2 작용제를 포함할 수 있다. 조성물은 일반적으로 살균되고 약학적으로 허용되는 담체를 보통 포함할 약학적 조성물의 일부로서 제공될 것이다. 이러한 약학적 조성물은(이것을 개체에게 투여하는 요망되는 방법에 따라) 임의의 적합한 형태일 수 있다.
항-PG 항체는 경구, 경피, 피하, 비내, 정맥내, 동맥내, 근내, 안내, 국소, 수막내 및 뇌심실내와 같은 다양한 경로에 의해 개체에게 투여될 수 있다. 어떠한 주어진 경우에 투여에 가장 적합한 경로는 특정 항체, 피검체, 및 질환의 특성과 중증도 및 환자의 건강 상태에 의존적일 것이다. 항체는 수용액으로서 제형화되고 피하 주입에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 개시에 사용되는 약학적으로 허용되는 담체는, 예를 들어, 치료하려는 질환 또는 투여 경로에 따라 광범한 다양한 형태를 취할 수 있다.
약학적 조성물은 용량 당 미리 결정된 양의 항-PG 항체를 함유하는 단위 용량 형태로 편리하게 제공될 수 있다. 그러한 단위는 단위 용량 당, 예를 들어 5 mg 내지 5 g, 예를 들어 10 mg 내지 1 g, 또는 20 내지 50 mg의 항-PG 항체를 함유할 수 있다. 약학적 조성물은 하나를 초과하는 PG 에피토프에 결합할 수 있는 항-PG 항체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 약학적 조성물은 각각이 상이한 PG 에피토프에 결합할 수 있는 항-PG 항체들의 조합물을 포함할 수 있다.
본 발명에 개시된 약학적 조성물은 요망되는 정도의 순도를 지니는 항체를 당 분야에서 통상적으로 이용되는 임의의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제(이들 모두는 본원에서 "담체"로서 언급된다), 즉 완충제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 비이온성 세제, 항산화제, 및 그 밖의 다양한 첨가제와 혼합시킴에 의해 동결건조된 제형 또는 수용액으로서 저장을 위해 제조될 수 있다. 참조: 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980)]. 그러한 첨가제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용체에게 무독성이어야 한다.
완충제는 생리적 조건에 가까운 범위로 pH를 유지하는 것을 돕는다. 이들은 약 2 mM 내지 약 50 mM의 범위의 농도로 존재할 수 있다. 본 발명의 개시에 사용하기 적합한 완충제는 유기산 및 무기산 둘 모두와 이들의 염, 예를 들어, 시트레이트 완충제(예를 들어, 모노소듐 시트레이트-디소듐 시트레이트 혼합물, 시트르산-트리소듐 시트레이트 혼합물, 시트르산-모노소듐 시트레이트 혼합물 등), 숙시네이트 완충제(예를 들어, 숙신산-모노소듐 숙시네이트 혼합물, 숙신산-소듐 히드록사이드 혼합물, 숙신산-디소듐 숙시네이트 혼합물 등), 타르트레이트 완충제(예를 들어, 타르타르산-소듐 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-포타슘 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-소듐 히드록사이드 혼합물 등), 푸마레이트 완충제(예를 들어, 푸마르산-모노소듐 푸마레이트 혼합물, 푸마르산-디소듐 푸마레이트 혼합물, 모노소듐 푸마레이트-디소듐 푸마레이트 혼합물 등), 글루코네이트 완충제(예를 들어, 글루콘산-소듐 글리코네이트 혼합물, 글루콘산-소듐 히드록사이드 혼합물, 글루콘산-포타슘 글리코네이트 혼합물 등), 옥살레이트 완충제(예를 들어, 옥살산-소듐 옥살레이트 혼합물, 옥살산-소듐 히드록사이드 혼합물, 옥살산-포타슘 옥살레이트 혼합물 등), 락테이트 완충제(예를 들어, 락트산-소듐 락테이트 혼합물, 락트산-소듐 히드록사이드 혼합물, 락트산-포타슘 락테이트 혼합물 등) 및 아세테이트 완충제(예를 들어, 아세트산-소듐 아세테이트 혼합물, 아세트산-소듐 히드록사이드 혼합물 등)를 포함한다. 추가로, 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제 및 트리메틸아민 염, 예를 들어, Tris를 이용할 수 있다.
미생물 성장을 저지하기 위해, 보존제가 첨가될 수 있고, 0.2%-1% (w/v) 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 본 발명의 개시에 사용하기 적합한 보존제는 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레솔, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤즈알코늄 할라이드(예를 들어, 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드), 헥사메토늄 클로라이드, 및 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥사놀, 및 3-펜탄올을 포함한다. 때로 "안정화제"로서 공지된 등장화제(isotonicifier)를 첨가하여 본 발명에 개시된 액체 조성물의 등장성을 확보할 수 있고, 다가 당 알코올, 예를 들어 삼가 또는 고가 당 알코올, 예를 들어, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다. 안정화제는 벌크제(bulking agent)로부터 치료제를 용해시키거나 변성 또는 용기 벽으로의 부착을 방지하는데 도움이 되는 첨가제까지 기능에 있어서 다양할 수 있는 광범한 범주의 부형제를 지칭한다. 통상적인 안정화제는 다가 당 알코올(상기 열거됨); 아미노산, 예를 들어, 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌, 등, 유기 당 또는 당 알코올, 예를 들어, 락토스, 트레할로스, 스타치오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 리비톨, 마이오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등, 시클리톨, 예를 들어, 이노시톨 포함; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 폴리머; 황 함유 환원제, 예를 들어, 우레아, 글루타치온, 티옥산, 소듐 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 소듐 티오 설페이트; 저 분자량 폴리펩티드(예를 들어, 10개 또는 그 미만 잔기의 펩티드); 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈 단당류, 예를 들어, 자일로스, 만노스, 프룩토스, 글루코스; 이당류, 예를 들어, 락토스, 말토스, 수크로스 및 삼당류, 예를 들어, 라피노스; 및 다당류, 예를 들어, 덱스트란일 수 있다. 안정화제는 활성 단백질의 중량 부 당 0.1 내지 10,000 중량의 범위로 존재할 수 있다.
비이온성 계면활성제 또는 세제("습윤제"로도 알려짐)는 교반-유도 응집에 대해 치료 단백질을 보호할 뿐만 아니라 치료제를 용해시키는 것을 돕기 위해 첨가될 수 있고, 이것은 또한 제형이 단백질 변성을 야기하지 않으면서 응력이 가해진 전단 표면에 노출되게 한다. 적합한 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트(20, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), 플루로닉 폴리올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르(TWEEN®-20, TWEEN®-80 등)를 포함한다. 비이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 예를 들어 약 0.07 mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 범위로 존재할 수 있다.
추가의 여러 부형제는 벌크제(예를 들어, 전분), 킬레이팅제(예를 들어, EDTA), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E), 및 공용매를 포함한다.
항-PG 항체는 단독으로, 하나 이상의 항-PG 항체의 혼합물로서, 간암을 치료하는데 유용한 다른 작용제와 혼합하거나 조합하여 투여될 수 있다. 적합한 조합 및 보조 요법의 예가 상기에 제공되어 있다.
7.9. 효과적인 투여량
본 발명의 개시의 항-PG 항체 또는 이의 조성물은 일반적으로 의도된 결과를 달성하기에 효과적인 양, 예를 들어, 간암에 걸린 피검체서 간암을 치료하는데 효과적인 양, 또는 간암 재발의 위험이 있는 피검체에서 재발을 예방하는데 효과적인 양으로 사용될 것이다. 효과적인 양은 치료 이익을 제공하는 양이다.
간암을 치료하는 방법의 상황에서, 치료적 이익은 간암을 부분적 또는 완전히 치료하는 임의의 경향을 의미한다. 치료적 이익은 간 종양의 크기, 수, 또는 형태(예를 들어, 피막화 대 침습성)를 감소시키고; 간 종양을 제거하고; 간암의 중증도를 감소시키고; 간암의 완화를 유도하고; 간암과 관련된 증상 또는 징후의 악화를 정지시키거나 지연시키고; 환자 동통을 감소시켜 환자 편의를 증가시키고; 측면 군락 세포, 하나 이상의 세포 표면 마커 CD133, CD44, 또는 CD90을 갖는 간암 세포, 또는 간암 줄기세포의 수를 감소시키거나 제거하고; 간암에 걸린 피검체에서의 PG의 혈중 농도를 감소시키는 것 중 임의의 것의 단독 또는 조합에 의해 확인될 수 있다. 종양 크기, 수 및 대사는, 비제한적인 예로, CT, MRI, 기능적 MRI, SPECT 및 PET, 뿐만 아니라 당업자에게 공지된 다른 방법과 같은 다양한 스캐닝 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 요망되지만, 완전한 치료가 치료적 이익에 존재하는 것이 요구되지는 않는다.
간암 재발을 예방하는 상황에서, 치료적 이익은 암이 검출 불가능하게 된 후에 피검체에서의 종종 발생하는 암의 재발 또는 재성장을 부분적 내지 완전히 예방하는 임의의 경향을 의미한다. 치료적 이익은 간암으로부터의 완화 유지; 피검체의 기대 여명 증가; 간 종양의 성장의 지연; 간암 줄기세포, 측면 군락 세포, 또는 하나 이상의 세포 표면 마커 CD133, CD44, 또는 CD90을 갖는 간암 세포의 성장 억제; 측면 군락 세포, 하나 이상의 세포 표면 마커 CD133, CD44, 또는 CD90을 갖는 간암 세포, 또는 간암 줄기세포의 수의 감소 또는 제거 중 임의의 것의 단독 또는 조합에 의해 확인될 수 있다.
일부 문맥에서, 치료적 이익은 당업자의 지식에 따라 하나 이상의 대용 종점(surrogate end point)과 관련될 수 있다. 비제한적인 예로서, 혈장 및/또는 혈청 PG 농도를 시간 경과에 따라 피검체에서 측정할 수 있고, PG 수준에서의 감소, 또는 역치 수준 미만의 수준, 예를 들어 약 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 또는 5 pM 미만의 수준은 치료적 이익을 나타낸다.
다른 구체예에서, 항-PG 항체 조성물의 치료적 이익은 암 줄기세포를 사멸시키거나, 암 줄기세포 성장 또는 증식을 억제하거나, 암 줄기세포 아폽토시스를 증가시키는 능력에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 개시의 다른 곳에 논의된 바와 같이, 간암 줄기세포는 특정 세포 마커의 발현, 저 부착 배양 조건하에서 구상체로 성장하는 능력, 및 이식 후에 새로운 종양 성장을 개시시키는 능력을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 암 줄기세포와 관련된 하나 이상의 표현형 특징을 갖는 것으로 확인될 수 있다.
치료 효능을 달성하기 위해 모든 자유 PG와의 결합이 요구되는 것은 아니다. 자유 PG는 항-PG 항체에 의해 결합하는데 이용될 수 있는 PG를 의미한다. 오히려, 종양 내, 전신적으로, 특히 체액에서, 또는 다른 곳에서 자유 PG의 농도를 더욱 제한된 한도로 감소시키는 것이 또한 효과적일 수 있다. 자유 PG 농도가 본원에 기재된 항-PG 항체 조성물의 투여에 의해 감소될 수 있는 예시적인 조직 및 체액은 환자로부터 제거된 암 생검물, 복수, 흉막 삼출로부터의 유체, 뇌척수액, 림프액, 혈액, 혈장, 혈청 등을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 이러한 조직 또는 체액 중 하나 이상에서 PG의 농도를 ELISA 기법 또는 당업자에게 잘 알려진 그 밖의 기법을 이용하여 정량할 수 있다.
당업자의 지식에 따라, 항-PG 항체의 용량이 환자에서 적정될 수 있는데, 이러한 용량은 투여 후 미리 정해진 시간에서 관심있는 조직 또는 체액 중 자유 PG의 농도를 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90, 또는 100%, 또는 약 5%-10%, 약 10%-15%, 약 15%-20%, 약 20%-25%, 약 25%-30%, 약 30%-35%, 약 35%-40%, 약 40%-45%, 약 45%-50%, 약 50%-55%, 약 55%-60%, 약 60%-65%, 약 65%-70%, 약 70%-75%, 약 75%-80%, 약 80%-85%, 약 85%-90%, 또는 약 90%-95%만큼 감소시키거나, 자유 PG의 농도의 비율을 상기 어떠한 값들 사이의 범위로 감소시킨다.
항-PG 항체를 포함하는 조성물은 효과적인 투여량으로 개체(예를 들어, 인간 피검체)에 투여될 수 있다. 투여되는 항-PG 항체의 양은 치료되는 환자의 크기 및 체중, 투여 형태, 경로 및 부위, 치료 계획(예를 들어, 제 2 치료제가 이용되는지 여부), 치료하려는 특정 피검체의 연령 및 상태, 항-PG 항체에 대한 환자의 민감성을 포함하는, 다양한 요인에 의존적일 것이다. 적합한 투여량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 궁극적으로, 의사가 사용되는 적절한 투여량을 결정할 것이다. 이러한 투여량은 적절하다면 종종 반복될 수 있다. 부작용이 발생하면, 투여량 및/또는 투여 빈도를 통상적인 임상적 관례에 따라 변경하거나 감소시킬 수 있다. 적절한 투여량 및 치료 계획은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 치료의 경과를 모니터링함에 의해 확립될 수 있다.
유효한 투여량은 시험관내 검정으로부터 초기에 산정될 수 있다. 예를 들어, 동물에 사용되는 초기 용량은 시험관내에서 측정된 대로 프로가스트린에 대한 항체의 결합 친화성에서의 또는 그 초과의 항-PG 항체의 순환 혈중 또는 혈청 농도를 달성하도록 제형화될 수 있다. 특정 항체의 생체이용율을 고려하여 그러한 순환 혈중 또는 혈청 농도를 달성하는 순환 투여량을 계산하는 것은 충분히 당업자의 역량 내에 있다. 지침용으로, 독자는 문헌[Fingl & Woodbury, "General Principles" in Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Chapter 1, latest edition, Pagamonon Press], 및 본원에 인용된 참조문헌을 참조한다.
초기 투여량은 동물 모델과 같은 생체내 데이터로부터 평가될 수 있다. 간암을 치료하기 위한 화합물의 효능 및 안전성을 검사하는데 유용한 동물 모델은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 비제한적인 예로, 마우스 또는 다른 동물에서의 인간 간세포암종의 이종이식이 있다. 당업자는 이러한 정보를 관례대로 적용시켜 인간 투여에 적합한 투여량을 결정할 수 있다.
특정 구체예에서, 정맥내 용량이 개개의 피검체에 대해 결정될 수 있는데, 이러한 용량은 치료하기 수 일 내지 수 주 전에 개체의 혈청 또는 혈장 PG 농도를 몇 번 측정하고 포화될 항-PG 항체의 양, 즉 모든 PG에 결합하기에 충분할 양을 계산함에 의해 결정될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 주어진 PG의 혈청 또는 혈장 농도에 대해 포화를 달성하는데 필요한 어떠한 특정 항체의 양은 부분적으로 특정 항체의 친화성 상수에 의존적일 것이다. 관심있는 특정 항-PG 항체에 대해 포화량을 계산하는 방법은 널리 공지되어 있다.
포화를 보장하기 위해, 계산되는 포화량에 비해 더 많은 양을 투여할 수 있고, 예를 들어, 계산되는 포화량보다 적어도 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- 또는 심지어 10-배 더 많은 양을 투여할 수 있다. i.v. 이외의 투여 방식의 경우, 그 양은 당 분야에 널리 공지된 대로 약동학 및 생체이용율에 기반하여 조정될 수 있다.
본 발명에 개시된 항-PG 항체의 유효량은 치료되는 질환, 투여 경로 및 피검체의 연령, 체중 및 상태에 따라 단일(예를 들어, 볼루스(bolus)) 투여, 다중투여 또는 연속(예를 들어, 주입) 투여 당 약 0.001 내지 약 250 mg/kg 범위이거나, 단일 투여, 다중투여 또는 연속 투여 당 0.01-5000 ㎍/ml의 혈청 농도를 달성하는 범위, 또는 그 안에 있는 임의의 유효한 범위 또는 값일 수 있다. 특정 구체예에서, 각각의 용량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 0.5 mg/kg; 약 0.25 mg/kg 내지 약 0.75 mg/kg; 약 0.5 mg/kg 내지 약 1 mg/kg; 약 1 mg/kg 내지 약 2 mg/kg; 약 1.5 mg/kg 내지 약 2.5 mg/kg; 약 2 mg/kg 내지 약 3 mg/kg; 약 2.5 mg/kg 내지 약 3.5 mg/kg; 약 3 mg/kg 내지 약 4 mg/kg; 약 3.5 mg/kg 내지 약 4.5 mg/kg; 약 4 mg/kg 내지 약 5 mg/kg; 약 5 mg/kg 내지 약 7 mg/kg; 약 6 mg/kg 내지 약 8 mg/kg; 약 7 mg/kg 내지 약 9 mg/kg; 약 8 mg/kg 내지 약 10 mg/kg; 약 10 mg/kg 내지 약 15 mg/kg; 약 12.5 mg/kg 내지 약 17.5 mg/kg; 약 15 mg/kg 내지 약 20 mg/kg; 약 17.5 mg/kg 내지 약 22.5 mg/kg; 약 20 mg/kg 내지 약 25 mg/kg; 약 22.5 mg/kg 내지 약 27.5 mg/kg; 약 25 mg/kg 내지 약 30 mg/kg; 약 30 mg/kg 내지 약 40 mg/kg; 약 35 mg/kg 내지 약 45 mg/kg; 약 40 mg/kg 내지 약 50 mg/kg; 약 45 mg/kg 내지 약 55 mg/kg; 약 50 mg/kg 내지 약 60 mg/kg; 약 55 mg/kg 내지 약 65 mg/kg; 약 60 mg/kg 내지 약 70 mg/kg; 약 65 mg/kg 내지 약 75 mg/kg의 범위일 수 있다. 그 밖의 투여량 범위도 가능하다.
투여량, 빈도 및 지속기간은 개체의 연령, 체중 및 질환 상태와 같은 다양한 요인에 의존적일 것이다. 항-PG 치료는 원발성 또는 재발성의 HCC 및 간모세포종을 포함하는 간암에 걸린 환자에 필요하다. 치료는 특히 이식 또는 외과적 절제가 이용가능하지 않거나 금기되는 개체에서 간암의 임의의 단계에 필요하다.
투여를 위한 치료 요법은 1일 또는 그 초과, 2일 또는 그 초과, 3일 또는 그 초과, 4일 또는 그 초과, 5일 또는 그 초과, 6일 또는 그 초과, 1주 또는 그 초과, 2주 내지 무기한, 2주 내지 6개월, 3개월 내지 5년, 6개월 내지 1 또는 2년, 8개월 내지 18개월 등의 기간 동안 지속될 수 있다. 임의로, 치료 요법은 반복된 투여, 예를 들어, 하루에 1회, 하루에 2회, 2일에 1회, 3일에 1회, 5일에 1회, 1주일에 1회, 2주일에 1회, 또는 1개월에 1회 투여를 제공한다. 반복된 투여는 동일 용량이거나 상이한 용량일 수 있다. 투여는 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 그 초과로 반복될 수 있다. 치료적 유효량의 항-PG 항체는 단일 용량으로 투여되거나, 치료 요법의 과정에 걸쳐, 예를 들어, 1주, 2주, 3주, 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 또는 그 초과의 과정에 걸쳐 투여될 수 있다.
7.10. 치료 효능을 모니터하는 방법
본 발명의 개시는 또한 치료가 효과적인지 결정하기 위해 항-PG 항체로 치료되는 피검체를 모니터하는 방법을 제공한다. PG의 수준은 항-PG 치료를 받는 환자에서 측정될 수 있고, 이는 측정된 수준이 기준선 PG 수준을 초과하거나 이 수준 미만인지의 여부를 기초로 하여 치료가 효과적인지의 지표로 사용될 수 있다. 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 각각 포함되는, "PROGASTRIN AND LIVER PATHOLOGIES"를 표제로 하는, 2010년 1월 8일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/293,557호, 및 "PROGASTRIN AND LIVER PATHOLOGIES"를 표제로 하는, 2011년 1월 4일에 출원된 미국 특허 출원 번호 12/984,507호를 참조하라. 이러한 정보는 항-PG 항체를 투여하는 것을 지속시키거나 치료를 변경시키는 것의 여부를 결정하기 위해 관리 제공자에 의해 이용될 수 있다. 이러한 방법은 항-PG 치료를 모니터하기 위해 단독으로 사용되거나, 상기 기재된 바와 같은 다른 치료와 조합되어 사용될 수 있다.
요법의 효능을 모니터하기 위한 목적상, 혈액, 혈장 또는 혈청 PG 수준이 특정 시점에 측정될 수 있다. 시간 경과에 따른 농도의 감소, 및/또는 특정 시점에서 역치 값 미만의 측정된 수준이 효능을 나타낸다. 역치 값은 상기 논의된 값일 수 있거나, 요법 개시 전, 또는 라운드 요법 동안 초기의 어느 시점에 치료되는 피검체로부터 수득된 피검체-특이적 값일 수 있다.
임의의 특정 작용 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 환자에서의 종양의 수 및/또는 크기가 요법의 라운드의 결과로서 감소됨에 따라, 종양에 의해 생성되는 PG의 전체량이 또한 감소되는 것으로 생각된다. 대조적으로, 실질적 변화가 없거나, 요법의 라운드가 완료된 후에 PG 수준에서의 상승은 요법이 효과적이지 않은 것을 나타낼 수 있다. 이러한 정보는 새로운 라운드의 요법이 시작되어야 하는지의 여부를 결정하기 위해 관리 제공자에 의해 이용될 수 있다.
PG 수준은, 비제한적인 예로, RIA 및 ELISA와 같은 당업자에게 친숙한 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 인간 피검체의 PG 수준을 측정하는데 유용한 항-hPG 항체는 이후의 섹션에 기재된다. PG 수준을 측정하기 위한 검정의 예는 미국 가특허 출원 번호 61/293,557호(상기)의 실시예 1-2에 기재되어 있다.
특정 구체예에서, PG 수준은 프로가스트린의 N-말단을 표적화하는 하나의 항-PG 항체 및 프로가스트린의 C-말단을 표적화하는 제 2 항-PG 항체를 이용한 샌드위치 ELISA를 이용하여 측정될 수 있다. 그러한 샌드위치 검정에 유용한 예시적인 N- 및 C-말단 항-PG 항체가 이후의 섹션에 기재되어 있다. 그러한 검정에서, 96-웰 플레이트의 웰과 같은 표면을 제조하는데, 여기에는 공지된 양의 제 1 "포획" N-말단 또는 C-말단 항-PG 항체가 결합되어 있다. 이후, 시험 샘플을 표면에 적용한 다음 인큐베이션 기간을 거친다. 이어서, 표면을 세척하고 제 2 "검출" 항-PG 항체를 함유하는 용액을 적용하시키는데, 여기서 검출 항체는 PG의 상이한 에피토프에 결합한다(예를 들어, 포획 항체가 C-말단 항-PG 항체인 경우, N-말단 항-PG 항체를 검출 항체로서 이용하며, 그 역으로도 가능하다). 이후, PG 수준을 직접(예를 들어, 검출 항체가 검출가능한 표지에 컨쥬게이션된 경우) 또는 간접적으로(검출 항-PG 항체에 결합하는 표지된 이차 항체를 통해) 측정할 수 있다. 이러한 검정을 위해, 항체는 모든 PG가 결합하고 정량되도록 과량으로 이용되어야 한다. 혈장 및/또는 혈청 PG 수준을 측정하기 위한 특정 샌드위치 검정이 실시예 1에 제공되어 있다.
상이한 간격을 두고 다수의 측정치를 얻은 다음, 어떠한 추세가 존재하는 지를 결정하기 위해 그래프로 나타낼 수 있다. 일부 구체예에서, PG의 혈중 농도에서의 시간 의존적 감소는 간암에 대한 치료가 효과적인 것을 나타낸다. 비제한적인 예에서, 환자가 항-PG 항체를 투여받는 동안 PG 수준을 매주, 매월, 또는 일년 간격으로 측정할 수 있다. 다른 간격이 또한 가능하다.
항-PG 항체를 이용한 일 라운드의 요법을 포함하는 구체예에서, PG 수준에 대한 항체의 효과를 판단할 수 있도록 치료를 진행하는 동안 하나 이상의 측정치를 또한 수득할 수 있다. 그러한 다른 구체예에서, 잔여 항-PG 항체가 샘플링 동안 환자에 존재하는 경우, 데이터는 항체에 의한 PG의 격리로 인해 PG 수준에서의 감소를 나타낼 수 있고, 이어서 이러한 효과가 약해짐에 따라 수준이 증가하며, 치료가 효과적인 경우 후속하여 PG 수준이 떨어진다. 또 다른 구체예에서, 항-PG 항체가 환자로부터 제거되어 그러한 항체에 의한 PG의 결합이 PG 농도의 측정치의 정확도에 영향을 미치지 않는다고 판단한 이후에, 치료후 측정치를 수득할 수 있다.
상기 방법의 일부 구체예에서, 항-PG 항체 치료를 받는 피검체의 하나 이상의 체액, 예를 들어, 전혈, 혈장, 혈청에서의 PG 수준이 측정된 후, 기준선 수준과 비교될 수 있다. 통상적으로, PG 수준은 몰(M) 양 또는 몰/리터(mol/liter)로 표현되는 샘플 내의 PG의 농도이다. 기준선을 초과하는 PG 수준은 치료 효능의 결핍을 나타낸다. 대조적으로, 기준선 수준과 동등하거나 낮은 PG 수준은 치료 효능을 나타낸다.
환자에서 검출된 PG 수준을 비교하기 위해 다양한 기준선이 이용될 수 있다. 기준선 수준은 단일한 수이거나 일정 범위의 수일 수 있다. 기준선은 환자로부터 수득된 하나 이상의 측정치 또는 개체의 집단으로부터의 샘플 중의 PG의 측정치를 기초로 할 수 있다. 상기 방법의 일부 구체예에서, 기준선은, 예를 들어, 항-PG 치료 개시 전, 치료 과정 동안, 또는 치료가 중단된 후에 하나 이상의 간격에서 수득된 동일 환자로부터의 PG 수준이다. 일부 구체예에서, 기준선은 모니터링이 진행중인 개체의 특징과 유사한 특징을 갖는 개체의 집단에서의 평균 PG 수준일 수 있다. 이러한 특징은 성별, 연령, 간암의 유형 및 단계, 수술 이력, 항-PG 치료, 또는 다른 치료를 포함할 수 있으나, 반드시 이로 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 기준선은 특정 PG 수준, 예를 들어, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM, 약 20 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 약 2 pM, 약 1 pM, 또는 이보다 낮은 수준이다. 일부 구체예에서, 기준선은 일정 범위이다.
다른 구체예에서, 기준선은 모니터링이 진행중인 환자의 특징과 유사한 특징을 갖는 환자의 집단에서의 평균 PG 수준으로부터 확립될 수 있다. 이러한 특징은 성별, 연령, 일차 암 유형, 특정 유형의 치료에 대한 노출, 이들의 임의의 조합 등을 포함할 수 있으나, 반드시 이로 제한되지는 않는다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 기준선이 특정 환자의 모니터링에 이용될 수 있다. 예를 들어, 환자 특이적 기준선 뿐만 아니라 집단 유래 기준선 둘 모두가 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 이전에 치료된 암 환자에서의 평균 PG 농도가 환자가 비교되는 관련 집단에 대해 정상 범위 내이고, 항정으로 유지되는 경우, 환자는 재발되지 않는 것으로 기록될 것이고, 따라서 새로운 치료를 필요로 하지 않는다. 대조적으로, PG 농도가 이전에 치료된 암 환자에서 일정 기간에 걸쳐 상승하는 것이 관찰되고, 특정 구체예에서, 집단 데이터로부터 유래된 역치를 초과하는 경우, 환자는 재발이 가능한 것으로 기록될 수 있고, 따라서 암 재발에 대한 새로운 치료를 위한 후보일 수 있다.
일반적으로 섭식이 가스트린 합성 및 분비를 증가시키기 때문에, 또한 혈중 PG 수준에서의 일시적인 증가를 초래할 수 있고, 이것은 모니터되는 환자에서 PG 수준의 정확한 측정을 방해할 수 있다. 이러한 효과를 피하기 위해, 특히 혈중 샘플 중 PG 농도가 측정되어야 하는 경우, 금식후 또는 PG 농도에 대한 임의의 일시적 효과가 없어지는 충분한 기간의 식사 후에 환자로부터 샘플을 수득할 수 있다.
7.11 항- PG 항체
본원에 개시된 방법에 유용한 항체는 가스트린 유전자의 다른 생성물에 비해 인간 프로가스트린에 특이적으로 결합하는 항체이다. 도 1을 참조하면, 가스트린 유전자는 프레-프로가스트린이라 불리는 101개-아미노산 폴리펩티드로 번역되는데, 프레-프로가스트린은 절단되어 80개-아미노산 폴리펩티드인 프로가스트린을 생성하는 신호 서열(밑줄침)을 함유한다. 프로가스트린은, 다시, 절단되어 서열에 있어서 프로가스트린의 잔기 38 내지 71에 상응하는 34개-아미노산 생성물을 발생시키며, 이것은 이후에 글리신 잔기를 지니는 이의 카르복시 말단에서 연장되어 글리신-연장 G34("G34-Gly")를 발생시킨다. 이러한 절단의 부산물은 서열에 있어서 프로가스트린의 잔기 75 내지 80에 상응하는, C-말단 플랭킹 펩티드, 또는 CTFP라 불리는 6개-아미노산 펩티드이다. G34-Gly은 이후 추가로 절단되어 서열에 있어서 프로가스트린의 잔기 55 내지 71에 상응하고 G17-Gly라고 불리는 17개 잔기의 폴리펩티드를 생성한다. G34-Gly 및 G17-Gly의 C-말단 글리신의 제거에 이은 C-말단 아미드화에 의해 G34 및 G17을 각각 생성하는데, 둘 모두는 C-말단 아미드화된다.
본원에서 사용된 대로, 표준 결합 검정으로 측정시, 항체가 전장 프로가스트린에 결합하나, CTFP, 아미드화된 가스트린, 또는 글리신-연장된 가스트린에 전혀 결합하지 않는 경우, 항체는 hPG에 대해 "고도로 특이적"이거나 hPG에 "고도로 특이적으로 결합"하는 것이고, CTFP 및 가스트린 유전자의 다른 생성물보다 hPG에 적어도 약 5배 더 크게 결합하는 것을 나타내는 경우, 항체는 hPG에 대해 "특이적"이거나 hPG에 "특이적으로 결합"하는 것이다. 특정 항-hPG 항체의 특이성을 평가하기 위해 사용될 수 있는 특정 ELISA 검정이 실시예 2에 제공되어 있다.
이렇게 고도로 특이적이고/거나 특이적인 항-hPG 항체(본원에서 "항-hPG 항체"로서 지칭됨)는 폴리클로날("항-hPG PAb") 또는 모노클로날("항-hPG MAb")일 수 있으나, 치료적 이용 그리고, 일부 경우에, 진단적 또는 그 밖의 시험관내 이용을 위해, 모노클로날 항체가 바람직하다.
항-hPG 항체에 의해 결합되는 에피토프는 중요하지 않다. 유용한 항-hPG 항체는 hPG의 N-말단 영역, hPG의 C-말단 영역, 또는 hPG의 상이한 영역에 결합할 수 있다. 최근에, 적어도 모노클로날 항-hPG 항체의 경우, 항-hPG 항체를 생성하는데 이용된 항원의 선택이 중요할 수 있음이 발견되었다(참조: 2010년 10월 15일 출원된 국제 출원 번호 PCT/EP2010/006329호 및 2010년 10월 15일 출원된 미국출원 번호 12/906,041호, 이들의 개시내용 및 특히 개시된 항-hPG 항체는 본원에 참조로서 포함된다; 이하에서 각각 '329 및 '041 출원으로서 언급된다). '329 및 '041 출원에 개시된 바와 같이, hPG로부터 유래된 모든 항원이 생리적 조건하에 hPG에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 생성을 자극하는 것은 아니다. 실제로, 폴리클로날 항-hPG 항체를 생성하는데 성공적으로 이용되었던 특정 항원, 예를 들어, 전장 재조합 hPG(참조: 예를 들어, WO 08/076454 to Singh) 및 hPG의 C-말단 끝에서 마지막 10개의 아미노산에 상응하는 펩티드(참조: WO 07/135542 to Hollande et al.)는 모노클로날 항체를 생성하지 못하였다. '329 및 '041 출원에 언급된 대로, hPG에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생성하는데 사용될 수 있는 hPG 서열 내 항원성 N-말단 및 C-말단 서열이 확인되었다. 흥미롭게도, 항원성 서열은 이것에 독특한 hPG 서열의 영역으로 한정될 필요가 없다. 가스트린 유전자의 다른 생성물과 공통인 서열의 영역을 지니는 펩티드 항원, 예를 들어 G17, G34, 및 CTFP는 hPG에 결합할 뿐만 아니라 여기에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생성하였다.
hPG의 N-말단 영역에 상응하는 서열을 지니는 펩티드 항원을 이용하여 수득될 수 있고/거나 hPG의 N-말단 영역에 결합하는 항-hPG 항체를 본원에서 "N-말단 항-PG 항체"라고 지칭한다. hPG에 특이적인 폴리클로날 및 모노클로날 항체 둘 모두를 수득하는데 적합한 면역원을 작제하기 위해 이용될 수 있는 hPG의 특정 예시적인 항원성 영역은 hPG의 잔기 1 내지 14에 상응한다: SWKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO:25). N-말단 항-hPG 항체를 수득하는데 유용한 예시적인 면역원뿐 아니라 이러한 예시적인 면역원으로 수득된 N-말단 항-hPG 모노클로날 항체의 CDR 및 VH 및 VL 서열이 하기 표 1A 및 실시예 섹션에 제공되어 있다:
Figure pct00001
Figure pct00002
hPG의 C-말단 영역에 상응하는 서열을 지니는 펩티드 항원을 이용하여 수득될 수 있고/거나 hPG의 C-말단 영역에 결합하는 항-hPG 항체를 본원에서 "C-말단 항-hPG 항체"라고 지칭한다. 폴리클로날 및 모노클로날 C-말단 항-hPG 항체 둘 모두를 수득하는데 유용한 면역원을 작제하기 위해 이용될 수 있는 특정 예시적인 항원성 영역은 hPG의 잔기 55 내지 80에 상응한다: QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN(SEQ ID NO:27). C-말단 항-hPG 항체를 수득하는데 유용한 이러한 항원을 포함하는 예시적인 면역원뿐 아니라 이러한 예시적인 면역원으로 수득된 C-말단 항-hPG 모노클로날 항체의 CDR 및 VH 및 VL 서열이 하기 표 1B 및 실시예 섹션에 제공되어 있다:
Figure pct00003
Figure pct00004
표 1A 및 1B에 제공된 예시적인 항-hPG 모노클로날 항체 MAb1-MAb23에 의해 결합된 특이적 에피토프를 문헌[Laune, et al ., 2002, J. Immunol . Methods 267:53-70 and Laune, 1997, J. Biol. Chem. 272:30937-30944]에 각각 기재된 대로 SPOT 기술 및 알라닌 스캐닝을 이용하여 맵핑하였다(참조: 또한 '329 출원의 실시예 6).
SPOT 기술에서, 추정상의 에피토프에 걸쳐 있는 15개 아미노산 펩티드 서열을 생성하고 니트로셀룰로스 막 상에 스폿팅한 다음 항체에 의해 인지되는 최소 에피토프 서열을 결정하기 위해 시험 항체로 프로빙하였다(probed). 알라닌 스캐닝을 이용하여 항체 결합에 결정적인 에피토프 내의 잔기를 결정하였다. 추정상의 에피토프 내에 있는 각각의 잔기는 하나씩 알라닌으로 돌연변이되고, 이후 알라닌-함유 펩티드를 시험 항체로 프로빙하였다.
N-말단 항-hPG 모노클로날 항체 MAb1-4 및 15-20의 경우, 하기 표 2A에 제시된 바와 같이 에피토프는 적어도 하기 서열을 포함한다: DAPLG(SEQ ID NO:28), PDAPLG(SEQ ID NO:29), PRSQQPD(SEQ ID NO:30), WKPRSQQPD(SEQ ID NO:31), 또는 WKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO:32).
Figure pct00005
C-말단 항-hPG 모노클로날 항체 MAb5-7, 9-12, 14 및 21-23의 경우, 하기 표 2B에 제시된 바와 같이 에피토프는 적어도 하기 서열을 포함한다: FGRR(SEQ ID NO:33), MDFGR(SEQ ID NO:34), AEDEN(SEQ ID NO:35), 및 GWMDFGRR(SEQ ID NO:36).
Figure pct00006
에피토프 맵핑 실험은, 항-hPG MAb2 및 MAb4가 동일한 에피토프에 결합하고; 항-hPG MAb1 및 MAb3이 대략 동일한 에피토프에 결합하며; MAb17, MAb18, MAb19, 및 MAb20이 대략 동일한 에피토프에 결합하고; MAb15 및 MAb16이 대략 동일한 에피토프에 결합하며; 항-hPG MAb5, MAb6, MAb7, MAb9, 및 MAb12가 동일한 에피토프에 결합하고 항-hPG MAb10과 대략 동일한 에피토프에 결합하며; 항-hPG MAb11 및 MAb14가 대략 동일한 에피토프에 결합함을 나타낸다.
본원에 기재된 방법 및 키트에 유용한 N-말단 항-PG 항체의 특정 구체예는 hPG의 잔기 10 내지 14(SEQ ID NO:28), hPG의 잔기 9 내지 14(SEQ ID NO:29), hPG의 잔기 4 내지 10(SEQ ID NO:30), hPG의 잔기 2 내지 10(SEQ ID NO:31), 또는 hPG의 잔기 2 내지 14(SEQ ID NO:32)를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 키트에 유용한 C-말단 항-PG 항체의 특정 구체예는 hPG의 잔기 71 내지 74(SEQ ID NO:33), hPG의 잔기 69 내지 73(SEQ ID NO:34), hPG의 잔기 76 내지 80(SEQ ID NO:35), 또는 hPG의 잔기 67 내지 74(SEQ ID NO:36)를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
표 1A 및 1B에 제공된 것들 외에 본원에 개시된 방법 및 키트에 유용한 N-말단 및 C-말단 항-hPG 항체는, 하기 섹션에서 더욱 상세하게 기재되는 바와 같이, 예시적인 MAb1-23, 또는 N- 또는 C-말단 에피토프에 결합하는 그 밖의 참조 항체를 이용한 경쟁적 결합 검정에서 확인될 수 있다.
또한 '329 및 '041 출원에서 보고된 바와 같이, 항-hPG 항체, hPG에 대해 높은 특이성과 친화성 정도를 나타내는 항체들조차도 모두 hPG의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 것은 아니다. 예를 들어, 항-hPG MAb14는 hPG에 약 6 pM의 KD로 결합하지만 시험관내 검정에서 결장직장암 세포의 성장을 억제하지 않은 반면, 다른 항-hPG 모노클로날 항체는 현저한 억제 활성을 나타내었다(참조: 예를 들어, '329 출원의 실시예 7). hPG에 특이적으로 결합하는 비-중화성 및 중화성 항체 둘 모두가 본원에 기재된 다양한 진단 및 모니터링 방법에 유용하지만, 치료 방법에 유용한 항-hPG 항체는 중화 활성을 나타내어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "중화성 항-hPG 항체"는 비특이적 항체로 처리한 대조군 샘플에 비해 항-hPG 항체로 처리한 시험 샘플에서 살아 있는 Huh7 세포의 수를 통계적으로 유의하게 감소시키는 항-hPG 항체이다. hPG를 중화시키는 임의의 특정 항-hPG 항체의 능력을 평가하는 특정 검정은 실시예 3에 기재되어 있다. 상기 검정에서 살아 있는 세포의 수에 있어서 적어도 약 50%의 감소를 나타내는 그러한 항-hPG 항체가 간암을 치료하는데 특히 유용한 것으로 여겨지나, 더 낮은 수준의 중화 활성, 예를 들어 상기 검정에서 살아 있는 세포의 수에 있어서 40%, 30%, 20%, 15%, 또는 심지어 10%의 통계적으로 유의한 감소를 나타내는 항-hPG 항체도 치료적 이익을 제공할 것으로 예상된다.
따라서, 일부 구체예, 예를 들어 치료적 구체예에서, 유용한 항-PG 항체는 중화성이다. '329 및 '041 출원에 개시된 바와 같이, 항-hPG 모노클로날 항체의 능력은 에피토프 의존적이지 않은데, 그 이유는 N-말단 및 C-말단 항-hPG 모노클로날 항체 둘 모두가 간암 세포를 이용한 검정에서 중화성 활성을 나타내었기 때문이다. 따라서, 일부 특정 구체예에서, 중화성 항-hPG 항체는 N-말단 중화성 항-hPG 항체이다. 다른 구체예에서, 중화성 항-hPG 항체는 C-말단 중화성 항-hPG 항체이다.
어떠한 특이적 항-hPG 항체의 친화성은 중요하지 않다. 그러나, 일부 사용을 위해, 적어도 약 1 μM의 친화성을 나타내는 항체가 바람직할 수 있다. 치료적 이용을 위해, 적어도 약 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.1　nM, 0.01　nM, 또는 심지어 더 높은 친화성이 바람직할 수 있다. 표 1A 및 1B에서 확인되는 기재된 항-hPG 모노클로날 항체의 측정된 친화성은 하기 표 3에 기재된 대로 10-6 내지 10-12 M의 범위이다:
Figure pct00007
특히 요망되는 적용에 특히 적합한 친화성을 갖는 항-PG 모노클로날 항체를 이들 중에서 용이하게 선택할 수 있거나, 본원에 기재된 항-hPG 항체의 다양한 면역원, 상보성 결정 영역(CDR) 서열, 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 서열을 이용하여 생성하거나 고안할 수 있다. 임의의 특정 항-PG 모노클로날 항체의 친화성은, 예를 들어 ELISA, 등온 적정 열량측정법(ITC), BIAcore, 또는 형광 분극 검정과 같은 당 분야에 널리 공지되거나 본원에 기재된 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 특정 검정이 실시예 4에 제공되어 있다.
표 1A 및 1B에 언급된 대로, 여러 N-말단 및 C-말단 모노클로날 항-hPG 항체가 동정되었다. 이러한 항체들 모두는 실시예 2에 기재된 검정에 의해 측정된 바와 같이 hPG에 특이적이며, MAb14를 제외하고는, 모두 결장직장암 세포를 이용한 시험에서 중화성 활성을 나타내었다. 간암 세포를 이용하여 시험된 항체 모두(MAb3, 8, 13, 16 및 19)는 중화성 활성을 나타내었다. 항체를 수득하는데 유용한 하이브리도마 중 여러 개가 2010년 10월 6일 부다페트스 조약에 따라 Collection Nationale de Cultures de Microorganisms(CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, France)에 기탁되었다. 항-hPG MAb1-23을 생성하는 하이브리도마의 지정 명칭 및 기탁된 그러한 하이브리도마의 수탁 등록 번호가 표 1A 및 1B에 제공되어 있다. 또한, 항체들 중 여러 개에 대해, 이들의 가변 중쇄(VH), 가변 경쇄(VL), VL 상보성 결정 영역(CDR) 및 VH CDR의 아미노산 서열이 결정되었다. 이러한 아미노산 서열, 및 본 발명의 개시 전체에 걸쳐 이들을 언급하는데 사용된 속기 명명법이 또한 표 1A 및 1B에 제공되어 있다. 간략하게, 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 본원에서 mVH 및 mVL로서 언급하며, 이어서 상응하는 모노클로날 항체의 번호가 기재되는데, 예를 들어 항-hPG MAb3의 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 경우 각각 mVH.3 및 mVL.3이다. 유사하게, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 본원에서 hVH 및 hVL로서 언급하며, 이어서 상응하는 모노클로날 항체의 번호가 기재된다. 3개의 가변 중쇄 CDR 및 세 개의 가변 경쇄 CDR은 각각 VH CDR 1, 2, 또는 3, 및 VL CDR 1, 2, 또는 3으로 각각 지칭되며, 이어서 특정 항-hPG 모노클로날 항체의 번호가 기재된다. 예를 들어, MAb3의 VH CDR 1은 VH CDR 1.3으로 기재되고, MAb3의 VL CDR 1은 VL CDR 1.3으로 기재된다. MAb3의 VH CDR 2는 VH CDR 2.3으로 기재되고, MAb3의 VL CDR 2는 VL CDR 2.3으로 기재된다.
대략 동일한 에피토프에 결합하는 항-hPG 모노클로날 항체의 상응하는 CDR 및/또는 VH 및 VL 사슬은 상호교환되어 본원에 기재된 방법 및 키트에서 유용한 새로운 항-hPG 모노클로날 항체를 생성할 수 있을 것으로 예상된다. 예를 들어, 상기 언급된 대로, 예시적인 항-hPG 모노클로날 항체 MAb5 및 MAb6은 동일한 에피토프에 결합한다. 항-hPG 모노클로날 항체는 그 VL 사슬에 이러한 2개 항체의 VL CDR들의 다양한 조합, 및/또는 그 VH 사슬에 이러한 2개 항체의 VH CDR들의 다양한 조합을 포함하도록 고안될 수 있다. 특정한 비제한적인 예로서, 가능한 다양한 조합을 설명하기 위해, 그러한 항체는 그 VL 사슬에, MAb5의 CDR 1 및 2(각각 VL CDR1.5 및 VL CDR2.5)과 MAb6의 CDR3(VL CDR3.6), 및 그 VH 사슬에, MAb6의 CDR1(VH CDR1.6) 및 MAb5의 CDR 2 및 3(각각 VH CDR2.5 및 VH CDR3.5)을 포함할 수 있다. 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 항체들의 CDR의 아미노산 서열(과변이 영역으로도 알려짐)을 통상적인 수단을 이용하여 수득할 수 있다.
당 분야에 공지된 대로, 항체의 과변이 영역을 묘사하는 아미노산 위치/경계는 당 분야에 공지된 다양한 정의 및 정황에 따라 다양할 수 있다. 가변 도메인 내 일부 위치는, 이러한 위치가 한 세트의 기준하에 과변이 영역 내에 있는 것으로 여겨질 수 있으면서 다른 세트의 기준하에 과변이 영역의 외부에 있는 것으로 여겨질 수 있다는 점에서 하이브리드 과변이 위치로서 간주될 수 있다. 이러한 위치들 중 하나 이상은 또한 연장된 과변이 영역에서 발견될 수 있다. 본원에 기재된 항-PG 항체는 이러한 하이브리드 과변이 위치에 변형을 함유할 수 있다. 자연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 주로 β-시트 배치를 채용함에 의해 3개의 CDR에 연결되는 4개의 FR 영역을 각각 포함하는데, 이러한 영역은 루프 연결을 형성하며, 몇몇 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성한다. 각각의 사슬의 CDR은 FR 영역에 근접하여 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 함께 유지되며, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께, 항체의 표적 결합 부위를 형성하는데 기여한다(참조: Kabat et al., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, Md.). 본원에서 사용된 대로, 면역글로불린 아미노산 잔기의 넘버링은 달리 지시되지 않는 한, 케이뱃(Kabat) 등의 면역글로불린 아미노산 잔기 넘버링 시스템에 따라 수행된다.
표 1A와 관련하여, 본원에 기재된 방법 및 키트에 유용한 N-말단 항-hPG 항체의 특정 구체예는 하기를 포함하나 이로 제한되지 않는다:
(a) 서열에 있어서 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb16, MAb17, MAb18, MAb19 또는 MAb20의 VL CDR에 상응하는 VL CDR, 및 서열에 있어서 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb16, MAb17, MAb18, MAb19 또는 MAb20의 VH CDR에 상응하는 VH CDR을 갖는 항체;
(b) 서열에 있어서 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb16, MAb17, MAb18, MAb19 또는 MAb20의 VL 및 VH CDR에 상응하는 VL CDR 및 VH CDR을 갖는 항체;
(c) (ⅰ) VL CDR　1이 QSIVHSNGNTY("VL　CDR　1.3"; SEQ ID NO:4), QSLVHSSGVTY("VL　CDR　1.4"; SEQ ID NO:10), QSLLDSDGKTY("VL　CDR　1.16"; SEQ ID NO:50), 및 SQHRTYT("VL　CDR　1.19"; SEQ ID NO:51)로부터 선택되고;
(ⅱ) VL CDR　2가 KVS("VL　CDR　2.3" 또는 "VL　CDR　2.4"; SEQ ID NO:5), LVS("VL　CDR　2.16"; SEQ ID NO:53), 및 VKKDGSH("VL　CDR　2.19"; SEQ ID NO:54)로부터 선택되고;
(ⅲ) VL CDR　3이 FQGSHVPFT("VL　CDR　3.3"; SEQ ID NO:6), SQSTHVPPT("VL　CDR　3.4"; SEQ ID NO:11), WQGTHSPYT("VL　CDR　3.16"; SEQ ID NO:57), 및 GVGDAIKGQSVFV("VL　CDR　3.19"; SEQ ID NO:58)로부터 선택되고;
(ⅳ) VH CDR　1이 GYIFTSYW("VH　CDR　1.3"; SEQ ID NO:1), GYTFSSSW("VH　CDR　1.4"; SEQ ID NO:7), GYTFTSYY("VH　CDR　1.16"; SEQ ID NO:39), 및 GYSITSDYA("VH　CDR　1.19"; SEQ ID NO:40)로부터 선택되고;
(ⅴ) VH CDR　2가 FYPGNSDS("VH　CDR　2.3"; SEQ ID NO:2), FLPGSGST("VH　CDR　2.4"; SEQ ID NO:8), INPSNGGT("VH　CDR　2.16"; SEQ ID NO:43), 및 ISFSGYT("VH　CDR　2.19"; SEQ ID NO:44)로부터 선택되고; 그리고
(ⅵ) VH CDR　3이 TRRDSPQY("VH　CDR　3.3"; SEQ ID NO:3), ATDGNYDWFAY("VH　CDR　3.4"; SEQ ID NO:9), TRGGYYPFDY("VH　CDR　3.16"; SEQ ID NO:47), 및 AREVNYGDSYHFDY("VH　CDR　3.19"; SEQ ID NO:48)로부터 선택되는 항체;
(d) 서열에 있어서 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb16, MAb17, MAb18, MAb19 또는 MAb20의 VL 에 상응하는 VL 및 서열에 있어서 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb16, MAb17, MAb18, MAb19 또는 MAb20의 VH에 상응하는 VH를 갖는 항체; 및
(e) 서열에 있어서 MAb1, MAb2, MAb3, MAb4, MAb15, MAb16, MAb17, MAb18, MAb19 또는 MAb20의 VL 및 VH 에 상응하는 VL 및 VH 를 갖는 항체.
표 1B와 관련하여, 본원에 기재된 방법 및 키트에서 유용한 C-말단 항-hPG 항체의 특정 구체예는 하기를 포함하나 이로 제한되지 않는다:
(a) 서열에 있어서 MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAb10, MAb11, MAb12, MAb13, MAb14, MAb21, MAb22 또는 MAb23의 VL CDR에 상응하는 VL CDR 및 서열에 있어서 MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAb10, MAb11, MAb12, MAb13, MAb14, MAb21, MAb22 또는 MAb23의 VH CDR에 상응하는 VH CDR을 갖는 항체;
(b) 서열에 있어서 MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAb10, MAb11, MAb12, MAb13, MAb14, MAb21, MAb22 또는 MAb23의 VL 및 VH CDR에 상응하는 VL CDR 및 VH CDR을 갖는 항체;
(c) (ⅰ) VL CDR　1이 KSLRHTKGITF("VL　CDR　1.8"; SEQ ID NO:49) 및 QSLLDSDGKTY("VL　CDR　1.13"; SEQ ID NO:50)로부터 선택되고;
(ⅱ) VL CDR　2가 QMS("VL 　CDR　2.8"; SEQ ID NO:52) 및 LVS("VL　CDR　2.13"; SEQ ID NO:53)로부터 선택되고;
(ⅲ) VL CDR　3이 AQNLELPLT("VL　CDR　3.8"; SEQ ID NO:55) 및 WQGTHFPQT("VL　CDR　3.13"; SEQ ID NO:56)로부터 선택되고;
(ⅳ) VH CDR　1이 GFTFTTYA("VH　CDR　1.8"; SEQ ID NO:37) 및 GFIFSSYG("VH　CDR　1.13"; SEQ ID NO:38)로부터 선택되고;
(ⅴ) VH CDR　2가 ISSGGTYT("VH　CDR　2.8"; SEQ ID NO:41) 및 INTFGDRT("VH　CDR　2.13"; SEQ ID NO:42)로부터 선택되고; 그리고
(ⅵ) VH CDR　3이 ATQGNYSLDF("VH　CDR　3.8"; SEQ ID NO:45) 및 ARGTGTY("VH　CDR　3.13"; SEQ ID NO:46)로부터 선택된 항체;
(d) 서열에 있어서 MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAb10, MAb11, MAb12, MAb13, MAb14, MAb21, MAb22 또는 MAb23의 VL에 상응하는 VL 및 서열에 있어서 MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAb10, MAb11, MAb12, MAb13, MAb14, MAb21, MAb22 또는 MAb23의 VH에 상응하는 VH를 갖는 항체; 및
(e) 서열에 있어서 MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb9, MAb10, MAb11, MAb12, MAb13, MAb14, MAb21, MAb22 또는 MAb23의 VL 및 VH에 상응하는 VL 및 VH를 갖는 항체.
당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 진단 방법에 유용한 항-hPG 항체는, 예를 들어 포유동물(예를 들어, 인간, 영장류, 설치류, 염소 또는 토끼), 비-포유동물, 또는 자연 키메라(하나를 초과하는 종의 기원으로부터 유래됨)을 포함하는 임의의 기원의 것일 수 있다. 인간을 포함하는 동물에서의 치료적 이용에 적합한 항체는 바람직하게는 치료하려고 하는 동일한 종으로부터 유래되거나, 치료하려는 동물에서 비면역원성이도록 변형 또는 설계되거나 감소된 면역원성을 갖는다. 인간에서의 치료적 이용에 유용한 항-hPG 항체의 특정 부류는 하기에 보다 상세하게 논의되는 인간화 항체의 부류이다. 본원에 기재된 방법 및 키트에 유용한 항-hPG 항체는 또한, 예를 들어, IgA(예를 들어, IgA1 또는 IgA2), IgD, IgE, IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4) 또는 IgM을 포함하는 임의의 이소형의 것이거나 이로부터 유래될 수 있다. 치료적 이용을 위해 설계된 항-hPG 항체는 IgG 이소형인 것이 바람직하다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 치료 방법에 유용한 항-hPG 항체는 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 및 통상적으로 두 개의 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함하는데, 여기서 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린에 일치하고, 프레임워크 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 컨센서스(consensus) 서열의 것들이며, 상기 인간화 항체는 "CDR-그래프트된(grafted)" 것으로 지칭될 수 있다. 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 통상적으로 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 일부를 포함할 수 있다. 인간화 항체를 설계하는 방법을 포함하는 항체 인간화 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Lefranc et al ., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27:55-77; Lefranc et al ., 2009, Nucl. Acids Res. 37:D1006-1012; Lefranc, 2008, Mol. Biotechnol. 40: 101-111; Riechmann et al ., 1988, Nature 332:323-7; U.S. Patent Nos. 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762 and 6,180,370 to Queen et al .; EP239400; PCT publication WO 91/09967; U.S. Patent No. 5,225,539; EP592106; EP519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol. 28:489-498; Studnicka et al ., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973; and U.S. Patent No. 5,565,332, 이들의 개시내용 전체는 본원에 참조로서 포함됨]을 참조하라.
비제한적인 예로서, 표 1A에 제공된 다양한 N-말단 항-hPG 모노클로날 항체 및 표 1B에 제공된 다양한 C-말단 항-hPG 모노클로날 항체를 포함하는, 비-인간 항-hPG 항체의 CDR에 상응하는 CDR 서열들을 갖는 항체의 인간화 버젼이 이러한 널리 공지된 방법을 이용하여 수득될 수 있다. 선택된 항-hPG 항체의 인간화 VL 및 VH 사슬에 대한 계획된 서열이 표 1A 및 1B에 제공된다. 인간화 항체의 특정 예는 하기를 포함하는 항체를 포함한다:
(a) 본원에 개시된 임의의 3개의 VL CDR 및 임의의 3개의 VH CDR;
(b) SEQ ID NO:21에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:22에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(c) SEQ ID NO:23에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:24에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(d) SEQ ID NO:75, 77, 및 79로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:76 및 78로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(e) SEQ ID NO:80 및 82로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:81 및 83으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(f) SEQ ID NO:84, 86, 및 88로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:85, 87, 및 89로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(g) SEQ ID NO:90, 92, 및 94로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:91, 93, 및 95로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 관심있는 특정 에피토프에 결합하는 능력과 같은 특이적 결합 특성을 갖는 항-hPG 항체를 본원에 기재된 다양한 항원 및 면역원을 이용하여 hPG와의 결합에 대해 관심있는 참조 항체와 경쟁하는 이들의 능력을 평가함에 의해 용이하게 수득할 수 있다. 본원에 기재된 어떠한 항-hPG 항체도 이러한 경쟁 검정에서 참조 항체로서 이용될 수 있다. hPG와의 결합에 대해 관심있는 비오티닐화된 참조 항-hPG 항체와 경쟁하는 항체의 능력을 평가하는데 유용한 특정 검정이 실시예 5에서 제공된다.
참조 항-hPG 항체와 임의의 시험 항체(종 또는 이소형과 무관) 사이의 항체 경쟁 연구를 수행함에 있어서, 당업자는 먼저 참조를 검출가능한 표지, 예를 들어 방사성동위원소 또는 플루오로포어로 직접 표지시키거나, 예를 들어, 비오틴(형광-표지된 스트렙타비딘과의 결합을 통해 검출가능함) 또는 효소(효소 반응을 통해 검출가능함)로 간접 표지시켜 후속하는 확인을 가능하게 할 수 있다. 이러한 경우에, 표지된 참조 항-hPG 항체(고정 농도 또는 증가된 농도)를 공지된 양의 hPG와 함께 인큐베이션시켜 hPG:표지된 항-hPG 항체 복합체를 형성시킨다. 이후, 표지되지 않은 시험 항체를 복합체에 첨가한다. 복합체화된 표지의 세기를 측정한다. 시험 항체가 중복 에피토프로의 결합에 의해 hPG에 대해 표지된 참조 항-hPG 항체와 경쟁하는 경우, 복합체화된 표지의 세기는 시험 항체의 부재하에 수행된 대조군 실험에 비해 감소될 것이다.
결합 경쟁 검정을 수행하기 위한 다수의 방법이 공지되어 있고 상기 및 실시예 5에 기재된 검정에 필적하는 결과를 얻도록 적합화될 수 있다.
항체는 hPG 결합에 대해 참조 항-hPG 항체와 경쟁하는 것으로 고려되며, 따라서 경쟁적 결합 검정, 특히 실시예 5의 경쟁적 결합 검정에서 hPG에 대한 참조 항-hPG 항체의 결합을 0.01-100 ㎍/mL 범위(예를 들어, 0.01 ㎍/mL, 0.08 ㎍/mL, 0.4 ㎍/mL, 2 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 50 ㎍/mL 또는 100 ㎍/mL 또는 언급된 범위 내의 다른 농도)의 시험 항체 농도에서 적어도 50% 만큼 감소시키는 경우, 비록 더 높은 수준의 감소, 예를 들어 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%의 감소가 바람직할 수 있으나, 항체는 참조 항-hPG 항체와 대략 동일한 에피토프 또는 hPG의 중복 에피토프에 결합하는 것으로 고려된다.
당업자는 진단 및 모니터링 환경과 같은 일부 환경에서, 항-PG 항체를 표지시키는 것이 바람직할 수 있음을 인지할 것이다. 이러한 표지는 검출 및 정량에 유용하다. 적합한 표지는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이들이 직접적으로 관찰가능하거나 검출가능하다는 점에서(예를 들어, 플루오로포어 또는 방사성동위원소) "직접적"일 수 있고, 이들이 관찰가능하거나 검출가능한 신호를 생성하는 다른 무엇과 상호작용한다는 점에서(예를 들어, 기질과 작용하여 검출가능한 신호를 생성하는 효소, 또는 표지된 스트렙타비딘 분자와 결합하는 비오틴과 같은 결합 분자) "간접적"일 수 있다. 다수의 표지 시스템, 및 항체를 이들로 표지하기 위한 수단이 당 분야에 공지되어 있고, 본원에서의 사용이 고려된다.
본원에 기재된 방법에 유용한 다양한 항-hPG 항체는 전장 항체로 예시되었으나, 당업자는 결합 단편, 또는 전장 항체 또는 결합 단편으로부터 설계되거나 유래된 대용(surrogate) 항체가 또한 이용될 수 있음을 인지할 것이다. 적합한 단편, 대용물 등은 Fab', (Fab')2, Fab, Fv, vIgG, scFv 단편 및 서로바디(surrobody)를 포함하나 이로 제한되지 않는다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 항체, 및 단일 사슬 항체, 서로바디 및 결합 단편을 포함하는 "항체-유사" 대용 분자의 모든 형태를 포함한다. 자연 발생 항체의 통상적인 구조를 갖는 항체를 본원에서 "자연 항체"로서 지칭한다.
7.12 항- PG 항체를 생성하는 방법
본원에 기재된 방법에 유용한 항-PG 항체를 널리 공지된 표준 방법을 이용하여 수득할 수 있다. 본원에 기재된 방법에 유용한 항-PG 항체를 발현시키기 위해서, 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동적으로 연결되도록 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 엔코딩하는 DNA를 발현 벡터에 삽입한다. 이에 관해, 용어 "작동적으로 연결된"은 벡터 내의 전사 및 번역 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 이들의 의도된 기능을 발휘하도록 항체 유전자가 벡터내로 라이게이션된 것을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 이용된 발현 숙주 세포와 양립되도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 분리된 벡터에 삽입될 수 있거나, 보다 통상적으로, 둘 모두의 유전자가 동일한 발현 벡터에 삽입된다.
항체 유전자는 표준 방법에 의해 발현 벡터에 삽입된다(예를 들어, 항체 유전자 단편 및 벡터 상에서 상보성 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 블런트(blunt) 말단 라이게이션). 항-PG 항체 경쇄 또는 중쇄 서열을 삽입하기 전에, 발현 벡터는 이미 항체 불변 영역 서열을 지닐 수 있다. 예를 들어, 항-PG 항체 VH 및 VL 서열을 전장 항체 유전자로 전환시키는 한 가지 접근법은, 이들을 이미 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 각각 엔코딩하는 발현 벡터에 삽입하여 VH 세그먼트가 벡터 내에서 CH 세그먼트(들)에 작동적으로 결합되게 하고 VL 세그먼트가 벡터 내에서 CL 세그먼트에 작동적으로 결합되게 하는 것이다. 추가로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 엔코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 벡터내로 클로닝될 수 있어서, 신호 펩티드가 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 인-프레임(in-frame)으로 연결된다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드일 수 있다(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드).
항체 사슬 유전자 외에, 본 발명에 개시된 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 지닌다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 조절하는 그 밖의 발현 조절 엘리먼트(예를 들어, 아데닐중합체형성 신호)를 포함한다. 그러한 조절 서열은, 예를 들어 문헌[Goeddel, Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990)]에 기재되어 있다. 당업자는 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 설계가 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 요망되는 단백질의 발현 수준 등과 같은 요인들에 의존적일 수 있음을 인지할 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현에 적합한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 바이러스 엘리먼트, 예를 들어, 시토메갈로바이러스(CMV)(예를 들어, CMV 프로모터/인핸서), 원숭이 바이러스 40(SV40)(예를 들어, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서를 포함한다. 바이러스 조절 엘리먼트 및 이의 서열의 추가의 설명을 위해서는, 예를 들어, 문헌[U.S. Patent No. 5,168,062 by Stinski, U.S. Patent No. 4,510,245 by Bell et al., and U.S. Patent No. 4,968,615 by Schaffner et al.]을 참조하라.
항체 사슬 유전자 및 조절 서열 외에, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 기점) 및 선택가능한 마커 유전자와 같은 추가의 서열을 지닐 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 촉진시킨다(예를 들어, 문헌[U.S. Patents Nos. 4,399,216, 4,634,665 and 5,179,017, all by Axel et al.] 참조). 예를 들어, 통상적으로 선택가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포 상에 G418, 퓨로마이신, 블라스티시딘, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 적합한 선택가능한 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭된 DHFR- 숙주 세포에 이용하기 위함) 및 neo 유전자(G418 선택을 위함)를 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의해 숙주 세포로 트랜스펙션한다. 다양한 형태의 용어 "트랜스펙션"은 외인성 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포로 도입하는데 일반적으로 이용되는 광범위한 기술, 예를 들어, 일렉트로포레이션, 리포펙션, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 등을 포함한다.
원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에서 본원에 기재된 항체를 발현시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 항체의 발현은 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 항체의 최적의 분비를 위해 진핵 세포, 예를 들어, 포유동물 숙주 세포에서 수행된다. 본 발명에 개시된 재조합 항체를 발현시키는 예시적인 포유동물 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)(예를 들어, 문헌[Kaufman and Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 DHFR 선택가능한 마커와 함께 이용되는, 문헌[Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 DHFR- CHO 세포 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포, 293 세포 및 SP2/0 세포를 포함한다. 항체 유전자를 엔코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입되는 경우, 숙주 세포에서 항체의 발현 또는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지로 항체의 분비를 허용하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함에 의해 항체가 생성된다. 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 항체를 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 또한 숙주 세포를 이용하여 무손상 항체의 부분, 예를 들어, Fab 단편 또는 scFv 분자를 생성할 수 있다. 상기 절차에 대한 변형이 본 발명의 개시 범위 내에 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 숙주 세포를 본원에 기재된 항-PG 항체의 경쇄 또는 중쇄 중 어느 쪽(그러나 둘 모두는 아님)을 엔코딩하는 DNA로 트랜스펙션하는 것이 바람직할 수 있다.
재조합 DNA 기술이 또한 PG에 결합하는데 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 어느 쪽 또는 둘 모두를 엔코딩하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거하는데 이용될 수 있다. 그러한 트렁케이션된 DNA 분자로부터 발현된 분자가 또한 본원에 기재된 방법에 유용하다.
항-PG 항체의 재조합 발현을 위해, 숙주 세포는 두 개의 발현 벡터로 공동트랜스펙션될 수 있는데, 첫번째 벡터는 중쇄 유래 폴리펩티드를 엔코딩하고 두번째 벡터는 경쇄 유래 폴리펩티드를 엔코딩한다. 통상적으로, 2개의 벡터는 분리된 선택가능한 마커를 각각 함유할 수 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 모두를 엔코딩하는 단일 벡터를 이용할 수 있다.
항-PG 항체는 또한 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.]에 기재된 방법에 의함). 무-세포 플랫폼(cell-free platform)을 이용하여 변이형 항체가 또한 생성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Chu et al., 2001, Biochemia No. 2 (Roche Molecular Biologicals)] 참조).
일단 항-PG 항체가 재조합 발현 또는 합성 수단에 의해 생성되면, 이는 면역글로불린 분자의 정제를 위해 당 분야에 공지된 어떠한 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 또는 단백질 G 선택 이후에 PG에 대한 친화성에 의해, 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별적 용해성, 또는 단백질의 정제를 위한 어떠한 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 추가로, 항-PG 항체 또는 이의 결합 단편은 정제를 촉진하기 위해 본원에 기재되거나 당 분야에 달리 공지된 이종성 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다.
8. 실시예
하기 실시예는 예시적인 것이며, 이로 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 혈장 또는 혈청 PG 수준의 정량
PG의 혈장 및/또는 혈청 수준은 하기 검정을 이용하여 편리하게 결정될 수 있다. 96-웰 미세역가 플레이트를 0.5 내지 10 ㎍/mL의 C-말단 항-hPG 항체, 예를 들어 토끼 C-말단 항-hPG 폴리클로날 항체, 또는 본원에 기재된 C-말단 항-hPG 항체로 코팅한 후, 밤새 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 PBS-Tween (0.05%)으로 3회 세척하고, PBS-Tween (0.05%) 중 2% (w/v) 탈지분유로 차단시켰다. 별도로, 시험 샘플, 대조군 샘플(블랭크 또는 PG-네거티브 혈장 또는 혈청 샘플), 및 약 5 pM(0.5 x 10-11 M) 내지 약 0.1 nM(1x10-10 M)의 hPG 참조 표준(PG-네거티브 혈장 또는 혈청에서 희석된 동결건조된 hPG)을 적합한 희석제(예를 들어, PBS-Tween 0.05%)에서 제조하였다. 샘플을 2 내지 4시간 동안 37℃에서 코팅된 플레이트 상에서 인큐베이션하거나, 대안적으로 12 내지 16시간 동안 21℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 PBS-Tween(0.05%)으로 3회 세척하고, 호스라디쉬 퍼옥시다제(HRP)(Nakane et al., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22(12): 1084-1091 참조)에 커플링된, 0.001 내지 0.1 ㎍/mL의 N-말단 항-hPG 항체, 예를 들어 본원에 기재된 폴리클로날 N-말단 항-hPG 항체 또는 N-말단 모노클로날 항-hPG 항체와 30분간 21℃에서 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 PBS-Tween(0.05%)에서 3회 세척하고, HRP 기질을 15분간 21℃에서 첨가하였다. 100 ㎕의 0.5M 황산을 첨가함에 의해 반응을 중지시키고, 405 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 시험 샘플 hPG 수준을 hPG 참조 표준으로부터 유래된 측정치로부터 작성한 표준 곡선과의 비교에 의해 결정하였다.
실시예 2: 항- hPG 항체의 특이성을 평가하기 위한 ELISA 검정
항-hPG 항체의 특이성은 하기와 같은 ELISA 검정을 이용하여 편리하게 결정될 수 있다. 96웰 플레이트를 포스페이트-완충된 염수(PBS) 중 적절한 농도(들)의 시험 펩티드(예를 들어, 25 및 50 ng의 재조합 인간 PG, 및 50 및 250 ng의 CTFP 또는 그 밖의 가스트린-유래 유전자 생성물)와 함께 밤새 4℃에서 인큐베이션시킨 후에, 웰을 세척 용액(PBS 및 0.1% Tween-20)으로 3회 세척하고, 웰 당 100 ㎕의 차단 용액(PBS, 0.1% Tween-20, 0.1% 소 혈청 알부민 또는 카세인 가수분해물)과 함께 2시간 동안 22℃에서 인큐베이션하였다. 차단 후에, 웰을 3회 세척하고, 검정하려는 항체(시험 항체)를 첨가하였다. PBS 및 0.1% Tween-20 중 100 ㎕의 시험 항체(0.3 내지 1 ng/mL)를 각각의 웰에 첨가하였다. 이후, 플레이트를 2시간 동안 22℃에서 인큐베이션 한 다음, 시험 항체 용액을 폐기하고, 세척 단계(3X 100 ㎕ 세척 용액, 상기 기재됨) 후에, 호스라디쉬 퍼옥시다제에 커플링된 염소 항-마우스 IgG (Fc) 항체인 이차 항체를 함유하는 차단 용액으로 교체하였다. 이차 항체와 1시간 인큐베이션 후에, 100 ㎕의 기질 용액(예를 들어, 제조자의 지시에 따라 제조된, Sigma-Aldrich Co.로부터 이용가능한 Fast OPD, 또는 O-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드)을 각각의 웰에 첨가하고, 암실에서 20분간 22℃에서 인큐베이션하였다. 50 ㎕의 4N 황산을 첨가시켜 반응을 중지하고 492 nm에서 광학 밀도(O.D.)를 측정함에 의해 촉매화된 기질의 양을 측정하였다. 기질 전환은 항원에 결합된 일차(시험) 항체의 양에 비례한다. 실험은 이중으로 진행되었고, OD 측정치를 항원 농도의 함수로서 플롯팅하였다. 측정된 O.D.가 hPG에 대해 0.2 내지 1.5이고, CTFP 또는 그 밖의 가스트린-유전자 유래 펩티드 중 어떤 것을 갖는 백그라운드 이상의 통계적으로 유의한 신호가 존재하지 않는 경우, 시험 항체는 PG에 특이적인 것으로서 기록되며, 여기서 백그라운드는 PBS만을 함유하는 대조군 웰로부터의 평균 신호이다.
실시예 3: 항- hPG 항체의 중화성 활성을 평가하기 위한 검정
특정 항-hPG 항체가 중화되는지 평가하기 위한 특정 시험은 다음과 같이 수행될 수 있다. Huh7 간세포암종 세포를 혈청 비함유 M11 배지 중에 초 저-부착 24-웰 플레이트(500개 세포/웰)에 시딩하였다. 세포를 37℃에서 성장시키고, 약 5 ㎍/mL의 항체 농도의 시험 항-hPG 항체 또는 대조군, 비특이적 모노클로날 항체로 7일 동안 매일 2회 처리하였다. 실험 종료시, 현미경사진을 찍고, 웰 당 구상의 수를 계수하고, 중간 및 백분위수(percentile) 분포를 계산하였다. 시험 항체는 저 부착 배양 조건하에서 Huh7 세포에 의해 형성된 구상체의 수가 하나의 항-hPG 항체를 시험하는 경우 언페어드 t-검정(unpaired t-test) 또는 다수의 항체를 시험하는 경우 Bonferroni post-hoc 검정을 이용하는 1원 ANOVA(one-way ANOVA)를 이용하여 대조군 항체로 처리된 세포에 비해 적어도 20%의 통계적으로 유의한 감소를 나타내는 경우에 검정에서 중화로 규정하였다(p <0.05인 경우에 유의한 것으로 간주되는 차이를 가짐).
실시예 4: 항- hPG 항체의 친화성을 평가하기 위한 검정
항-hPG 항체의 친화성 상수는 전체내용이 참조로서 포함되는 문헌[Nahshol et al., 2008, Analytical Biochemistry 383:52-60]에 따른 Proteon Technique (BioRad)을 이용하여 측정될 수 있다. 간단히 말해, 뮤린 항-PG 항체의 경우, 항-마우스 IgG 항체(50 ㎍/ml)를 먼저 센서 칩 상에 코팅시켜, 항체 주입 후 칩에 의해 검출된 신호가 10,000 내지 11,500 반응 유닛(RU) 사이에 있음을 확인하였다. 이후, 관심있는 뮤린 항-hPG 항체(시험 항체)를 주입하였다(통상적인 농도: 30 ㎍/ml). 시험 항체가 충분히 결합하면, 적어도 500 RU의 추가 신호가 관찰될 것이다. 이후, 시험 항체와 hPG간 결합의 시간-추이를, 다양한 농도, 예를 들어 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 및 12.5 nM의 hPG를 주입하고, 회합 수준을 검출함에 의해 수득하였다. 통상적으로, 단일 실험에서 다수의 항체를 동시에 시험하기 위한 여러 채널이 이용가능하며, 이러한 채널에 의해 다양한 농도의 hPG에서 단일 시험 항체의 결합을 동시에 검정할 수 있다. 하나의 채널에는 비특이적 결합에 대한 대조군으로서 hPG에 특이적이지 않은 뮤린 모노클로날 항체가 주입되고, 또 다른 채널에는 백그라운드 신호에 대한 기준선으로서 단독의 희석 완충제가 주입되어야 한다. 일반적으로, 비특이적 뮤린 항체가 주입된 채널에서는 어떠한 결합도 검출될 수 없다. 이러한 설정에서 hPG에 의해 트랩핑된 모노클로날 항체의 포화를 초래할 수 있는 높은 수준의 회합을 나타내는 항체를 더욱 정밀한 측정이 가능하도록 더 낮은 hPG 농도(50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM 및 3.125 nM)에 대해 검사할 수 있다.
분리 상수(kd)와 회합 상수(ka) 사이의 비율로서 친화성 상수(KD)를 계산하였다. 결합 측정치에 기반한 실험 곡선과 이론적 프로파일 사이의 통계적으로 관련된 유사성을 분석함에 의해 실험 값을 확인할 수 있다.
비-뮤린 항-hPG 항체의 친화성 상수는 항-hPG 시험 항체의 기원이 되는 종에 특이적인 IgG를 이용하여 유사한 포맷으로 평가될 수 있다.
실시예 5: 참조 항- hPG 항체와의 경쟁적 결합을 평가하기 위한 검정
관심있는 항체(시험 항체)가 hPG와의 결합에 대해 비오티닐화된 참조 항-hPG 항체와 경쟁하는지를 평가하기 위한 특정 검정은 하기와 같이 수행될 수 있다. 96웰 플레이트를 1-10 ㎍/ml의 범위 내에서 선택된 농도의 포획 항-hPG 항체(비오티닐화된 참조 항-hPG 항체에 의해 인지된 에피토프와 상이한 hPG의 N- 또는 C-말단 영역을 인지하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체)로 밤새 4℃(0.1 내지 1㎍/웰)에서 코팅하였다. 차단 완충제(0.1% Tween-20, PBS 중 0.1% BSA)로 2시간 동안 22℃에서 차단시킨 후에, 재조합 hPG를 10pM 내지 1nM(10 내지 1000 pg/웰) 범위의 농도로 첨가하고, 2시간 동안 22℃에서 인큐베이션하였다. 이후, 비오티닐화된 참조 항-hPG 항체(또는 비오티닐화된 참조 항-hPG 항체를 함유하는 혼합물)을 증가하는 농도의 표지되지 않은 시험 항체와 함께 첨가하고, 1시간 동안 22℃에서 인큐베이션하였다. 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거한 후에, 혼합물을 50 ng/ml의 스트렙타비딘-HRP과 함께 1시간 동안 22℃에서 인큐베이션한 다음, 호스라디쉬 퍼옥시다제에 대한 화학발광 기질과 함께 22℃에서 5분간 인큐베이션시킨 후에, 광도계에서 상대 광 유닛(RLU)을 정량함에 의해 결합된 표지된 참조 항-hPG 항체의 검출을 수행하였다. 검정을 이중으로 수행하였다.
참조 항-hPG 항체와 경쟁하는 항체는 hPG에 대한 참조 항체의 결합을 억제한다. 참조 항체와 실질적으로 동일한 에피토프, 또는 중복 에피토프에 결합하는 항체는 관찰된 RLU의 감소에 의해 입증된 바와 같이, 결합된 참조 항-hPG 항체의 양을 현저하게 감소시킨다(예를 들어, 적어도 50% 만큼).
시험 항체 없이 표지된 참조 항체와 재조합 hPG를 인큐베이션시킴에 의해 수행된 대조군 실험으로부터 높은 대조군 값이 수득된다. 낮은 대조군 값은, 표지되지 않은 초과 농도의 참조 항체의 존재(이에 따라 표지되지 않은 참조 항체가 hPG로의 결합에 대해 표지된 항체와 경쟁함)하에 표지된 참조 항체를 재조합 hPG와 인큐베이션시킴에 의해 수행된 대조군 실험으로부터 수득된다. 이후, 증가하는 농도의 표지되지 않은 시험 항체의 존재하에 표지된 참조 항체를 재조합 hPG와 인큐베이션시킴에 의해 참조 항-hPG 항체와 경쟁하는 시험 항체의 능력을 측정한다.
시험 검정에서, 시험 항체의 존재하에 관찰된 RLU에 있어서의 현저한 감소는 시험 항체가 참조 항-hPG 항체와 실질적으로 동일한 에피토프를 인지함을 나타낸다.
결합의 억제는 하기 식에 따라 계산된 억제 상수, 또는 Ki로서 표시될 수 있다:
Ki = IC50/ [1 + (참조 항-hPG Ab 농도/KD 참조 항-hPG Ab)]
상기 식에서 "IC50"은 참조 항체 결합의 50% 감소를 야기하는 시험 항체의 농도이고, KD 참조 항- hPG Ab는 hPG에 대한 참조 항체의 친화성의 측정치인, 참조 항-hPG 항체의 분리 상수이다. 참조 항-hPG 항체와 경쟁하는 유용한 시험 항체는(예를 들어, 본원에 기재된 항-hPG 항체들 중 하나) 통상적으로 본원에 기재된 검정 조건하에 10 pM 내지 100 nM 범위의 Ki를 지닐 것이다.
실시예 6: 상승된 수준의 GAST 유전자 발현을 나타내는 간암 종양으로부터의 간세포암종
본 실시예는 간세포암종(HCC)에 걸린 환자로부터의 간 종양 샘플이 정상 조직에 비해 상승된 수준의 GAST 유전자를 발현한다는 관찰을 기재한다.
A. 방법
원발성 간 종양 및 정상 대조군 조직을 14명의 환자로부터 외과적으로 절제하였다. RNA를 종양 및 건강한 간 조직 샘플 둘 모두로부터 제조하고, mRNA 온전성을 Agilent Bioanalyser를 이용하여 조절하였다. GAST mRNA 발현을 정량 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)으로 측정하고, HPRT mRNA 발현으로 표준화시켰다. RT-PCR에 대해, HCC 샘플로부터의 전체 RNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 FastRNA Pro Green Kit(MP BioMed)를 이용하여 추출하였다. RNA를 무작위 프라이머(R&D Systems)의 존재하에서 Superscript II RT(Invitrogen)를 이용하여 역전사시켰다. 실시간 RT-PCR을 Quantifast SYBR Green PCR kit(Qiagen) 및 Eppendorf Mastercycler ep realplex(Eppendorf)를 이용하여 수행하였다. GAST 및 HPRT 유전자 증폭을 위한 프라이머를 Sigma Life Science로부터 구입하였다. 각각의 PCR 증폭을 95℃에서 5분 후, 전체 45회의 2-온도 주기(95℃에서 10초 및 60℃에서 30초)의 조건을 이용하여 삼중 웰로 수행하였다.
B. 결과
도 4에 도시된 바와 같이, GAST mRNA 발현은 간암에 걸린 14명의 피검체 중 10명에서 정상 간 조직에 비해 HCC 종양 샘플에서 상승되었다. GAST mRNA 발현이 상승된 샘플에서, 발현은 정상 조직에 비해 2 내지 2800배 범위로 더 높았다.
실시예 7: 상승된 수준의 GAST 유전자 발현을 나타내는 저 부착 배양 조건하에서 성장한 간암 세포주
본 실시예는 저 부착 배양 조건하에서 성장한 간암 세포주가 결장직장암 세포주에 비해 상승된 수준의 GAST 유전자를 발현한다는 관찰을 기재한다.
A. 방법
2개의 간세포암종 세포주 Huh7 및 PLC/PRF/5, 간모세포종 세포주 Huh6, 및 결장직장암 세포주 SW480 각각을 M11 배지 중에 초 저부착 플라스크에 시딩하고, 구상 형성이 달성될때까지 성장시켰다. 이후, RNA 추출을 위해 구상을 처리하였다. 전체 RNA가 제조업체의 프로토콜에 따라 QIAGEN Rneasy Mini-키트를 이용하여 추출된 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 RT-PCR을 수행하였다. 이후, 간암 세포주로부터의 GAST mRNA 발현 수준을 양성 대조군으로 제공되는 SW480 세포에서의 발현과 관련하여 표준화시켰다.
B. 결과
도 5a-5b에 도시된 바와 같이, 시험된 모든 간 세포주 Huh6, Huh7 및 PLC/PRF/5는 저 부착 배양 조건하에서 성장하는 경우 결장직장 종양 세포주 SW480에 비해 상승된 수준의 GAST mRNA를 발현하였다. 결과는 SW480 세포에서의 가스트린 유전자 발현 수준과 관련하여 표현된다.
실시예 8: 상승된 수준의 GAST 유전자 발현을 나타내는, 간암 세포주로부터 분리되고 저 부착 배양 조건하에서 성장한 측면 군락 세포
본 실시예는 2개의 간암 세포주 Huh6 및 Huh7로부터의 염료-배제 "측면 군락" 세포가 저 부착 배양 조건하에서 성장한 상기 세포의 전체적 군락(즉, 측면 군락 및 비-측면 군락)에 비해 상승된 수준의 GAST mRNA를 발현한다는 관찰을 기재한다.
A. 방법
Huh6 및 Huh7 간암 세포주로부터의 염료-배제 "측면 군락" 세포를 FACS를 이용하여 상기 세포의 전체적 군락으로부터 분리시켰다. 특히, 트립신 및 EDTA를 이용한 처리에 의해 세포를 분리시켰다. 이후, 세포를 37℃에서 10분 동안 1 ml 염색 배지(DMEM, 2% 소 태아 혈청, 2mM EDTA)에서 인큐베이션시켰다. 음성 대조군 샘플에 1 ㎕의 50 mM 베라파밀(verapamil) 용액(최종 농도 50 μM)을 첨가하였다. 이후, 대조군 및 시험 샘플을 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 이후, 염료 용액을 시험 샘플에 첨가(2.5 ㎕의 2 mg/ml Hoechst 33342; 5 ㎍/ml의 최종 염료 농도)한 후, 가볍게 혼합하였다. 이후, 모든 샘플을 규칙적인 가벼운 혼합과 함께 37℃에서 50분 동안 인큐베이션시켰다. 5-10분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시킨 후, 샘플을 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리시켰다. 이후, 세포 펠렛을 1 ml의 M11 배지 중의 25 ㎍/ml 프로피디움 요오드화물 용액의 1:40 희석액에 재현탁시켰다. 5 ml 튜브 내의 체를 통한 여과에 의해 응집된 세포를 분리시켰다. 이후, 세포를 450 nm 및 488 nm에서의 신호 검출과 함께 FACSAria 세포측정기를 이용한 세포측정법을 수행할때까지 얼음 상에 저장하였다. 이후, RNA를 정제하고, GAST mRNA 발현 수준을 실시예 6 및 7에서와 같이 정량한 후, 저 부착 배양 조건하에서 구상체로 성장한 Huh6 및 Huh7 세포, 및 SW480 결장직장암 세포로부터의 GAST 유전자 발현 수준에 대해 비교하였다. 이후, 간암 세포주로부터의 GAST mRNA 발현 수준을 양성 대조군으로 제공되는 SW480 세포에서의 발현과 관련하여 표준화시켰다.
B. 결과
도 6에 도시된 바와 같이, Huh6 및 Huh7 세포의 염료-배제 "측면 군락"은 저 부착 배양 조건하에서 구상체로 성장한 상기 세포의 전체적 군락에 비해 상승된 수준의 GAST mRNA를 발현하였다(도 6a 및 6b 각각). Huh7 세포의 측면 군락은 Huh6 세포의 측면 군락에 비해 많은 가스트린 mRNA를 발현하였다. 결과는 SW480 세포에서의 GAST 유전자 발현 수준과 관련하여 표현된다.
실시예 9: 항- PG 항체로 처리되는 경우 보다 적은 구상체를 형성하는 구상체 성장 조건하에서 성장한 PLC / PRL /5 간세포암종 세포
본 실시예는 항-hPG 모노클로날 항체를 이용한 처리의 PLC/PRL/5 간암 세포의 저 부착 배양 조건하에서의 구상체로서의 성장에 대한 효과를 제시한다.
A. 방법
PLC/PRL/5 간세포암종 세포를 혈청 비함유 M11 배지(20 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF, 20 ㎍/ml 인슐린, N2 보충제, 2 ㎍/ml 시프로플록사신, 5 ㎍/ml 젠타마이신 및 3 ㎍/ml 글루코스를 갖는 DMEM/F12) 중에 초 저-부착 24-웰 플레이트에 시딩(220개 세포/웰)하였다. 세포를 대조군 또는 항-hPG MAb3 모노클로날 항체(1 ㎍/ml)의 매일의 첨가와 함께 37℃에서 10일 동안 성장시켰다. 실험 종료시, 현미경사진을 찍고, 웰 당 구상의 수를 계수하고, 평균 및 표준편차를 계산하였다.
B. 결과
도 7에 도시된 바와 같이, PLC/PRF/5 세포의 항-hPG 모노클로날 항체를 이용한 처리는 대조군 모노클로날 항체에 비해 저 부착 배양 조건하에서의 성장 동안 형성된 구상체의 수를 충분히 감소시켰다.
실시예 10: 항- PG 항체로 처리되는 경우 보다 적은 구상체를 형성하는 구상 체 성장 조건하에서 성장한 Huh6 간모세포종 세포주로부터 정제된 측면 군락 세포
본 실시예는 항-hPG 폴리클로날 항체를 이용한 처리의 Huh6 간암 세포의 염료 배제 측면 군락의 저 부착 배양 조건하에서의 구상체로서의 성장에 대한 효과를 제시한다.
A. 방법
Huh6 세포의 염료 배제 측면 군락 세포를 상기 기재된 바와 같이 분리시켰다. 이후, 측면 군락 세포를 M11 배지 중에 초 저 부착 96-웰 플레이트에 시딩(200개 세포/웰)하고, 대조군 또는 항-프로가스트린 폴리클로날 항체(1 ㎍/ml), 5nM 독소루비신(특정 간암 요법에서 사용되는 화학요법제), 또는 DMSO(독소루비신에 대한 비히클)(조건 당 15웰)의 존재하에서 37℃에서 13일 동안 성장시켰다. M11 배지의 조성은 다음과 같았다: DMEM/F12-Glutamax(Catalog #31331 Invitrogen); 20ng/ml EGF(R&D systems); 10ng/ml FGF(R&D systems); 20 microg/ml 인슐린(Sigma); N2 보충제의 1/100 희석액(Catalog #P1510, Gibco); 2 ㎍/ml 시프로플록사신, 5 ㎍/ml 젠타마이신 및 3 ㎍/ml 글루코스. 실험 종료시, 현미경사진을 찍고, 웰 당 구상의 수를 계수하고, 평균 및 표준편차를 계산하였다.
B. 결과
도 8에 도시된 바와 같이, Huh6 세포주로부터 정제된 측면 군락 세포의 항-hPG 폴리클로날 항체를 이용한 처리는 대조군 항체, 독소루비신 및 DMSO 대조군에 비해 저 부착 배양 조건하에서의 성장 동안 형성된 구상체의 수를 충분히 감소시켰다.
실시예 11: 항- hPG 항체로 처리되는 경우 보다 적은 구상체를 형성하는 구상 체 성장 조건하에서 성장한 Huh7 간세포 세포주로부터 정제된 측면 군락 세포
본 실시예는 Huh7 간암 세포의 염료 배제 측면 군락의 저 부착 배양 조건하에서의 구상체로서의 성장에 대한 항-hPG 폴리클로날 항체를 이용한 처리의 효과를 제시한다.
A. 방법
Huh7 세포의 염료 배제 측면 군락 세포를 실시예 8에 기재된 바와 같이 분리시켰다. 이후, 측면 군락 세포를 M11 배지 중에 초 저 부착 96-웰 플레이트에 시딩(200개 세포/웰)하고, 대조군 또는 항-프로가스트린 폴리클로날 항체(1 ㎍/ml), 5nM 독소루비신(특정 간암 요법에서 사용되는 화학요법제), 또는 DMSO(독소루비신에 대한 비히클)(조건 당 15웰)의 존재하에서 37℃에서 9일 동안 성장시켰다. M11 배지의 조성은 다음과 같았다: DMEM/F12-Glutamax(Catalog #31331 Invitrogen); 20ng/ml EGF(R&D systems); 10ng/ml FGF(R&D systems); 20 microg/ml 인슐린(Sigma); N2 보충제의 1/100 희석액(Catalog #P1510, Gibco); 2 ㎍/ml 시프로플록사신, 5 ㎍/ml 젠타마이신 및 3 ㎍/ml 글루코스. 실험 종료시, 현미경사진을 찍고, 웰 당 구상의 수를 계수하고, 평균 및 표준편차를 계산하였다.
B. 결과
도 9에 도시된 바와 같이, Huh7 세포주로부터 정제된 측면 군락 세포의 항-hPG 폴리클로날 항체를 이용한 처리는 대조군 항체 및 DMSO 대조군에 비해 저 부착 배양 조건하에서의 성장 동안 형성된 구상체의 수를 충분히 감소시켰다. 독소루비신이 또한 배양 중에 형성된 구상체의 수를 감소시키는 것으로 관찰되었다.
실시예 12: 항- hPG 모노클로날 항체로 처리되는 경우 저 부착 성장 조건하에서 보다 적은 구상체를 형성하는 Huh6 간모세포종 세포
본 실시예는 저 부착 성장 조건하에서의 Huh6 구상체의 성장에 대한 항-hPG 모노클로날 항체의 효과를 제시한다.
A. 방법
Huh-6 간모세포종 세포를 혈청 비함유 M11 배지(20 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF, 20 ㎍/ml 인슐린, N2 보충제, 2 ㎍/ml 시프로플록사신, 5 ㎍/ml 젠타마이신 및 3 ㎍/ml 글루코스를 갖는 DMEM/F12) 중에 초 저-부착 96-웰 플레이트에 시딩(85개 세포/웰)하였다. 세포를 비히클(PBS, 대조군) 또는 항-hPG MAb13 또는 MAb19 모노클로날 항체(3 ㎍/ml)를 이용하여 37℃에서 7일 동안 매일 2회 처리하였다. 실험 종료시, 현미경사진을 찍고, 웰 당 구상의 수를 계수하고, 중간 및 백분위수(percentile) 분포를 계산하고, 그래프로 나타내었다.
B. 결과
도 10에 도시된 바와 같이, 항-hPG 모노클로날 항체를 이용한 Huh6 세포의 처리는 처리되지 않은 대조군 세포에 비해 저 부착 배양 조건하에서의 성장 동안 형성된 구상체의 수를 충분히 감소시켰다.
실시예 13: 저 부착 조건하에서 성장하는 경우 보다 적은 구상체를 형성하는 항- hPG 모노클로날 항체로 전처리된 Huh6 세포
본 실시예는 저 부착 배양 조건하에서 구상체로 성장하는 Huh6 간모세포종 세포의 이후의 능력에 대한 항-hPG 모노클로날 항체를 이용한 전처리의 억제 효과를 입증한다.
A. 방법
100,000개 Huh6 간모세포종 세포/웰을 먼저 10% FCS를 갖는 DMEM 중에 6-웰 플레이트에 시딩하고, 밤새 혈청 고갈시키고, 10 ㎍/mL의 항-프로가스트린 모노클로날 항체 MAb8 또는 MAb13 또는 대조군 모노클로날 항체(PCX63Ag8, ATCC, Ref TIB-9)의 존재하에서 DMEM에서 48시간 동안 성장시켰다. 처리 종료시, 각각의 처리 군에 대해, 500개 세포/웰을 bFGF 및 EGF를 함유하는 500 ㎕의 혈청 비함유 M11 배지 중에 초 저-부착 24-웰 플레이트의 8개의 웰에 플레이팅하고, 처리 없이 추가 5일 동안 성장시켰다. 상기 기간 종료시, 사진을 찍고, 웰 당 구상의 수를 계수하고, 구상 표면을 측정하였다. 5일의 "세척" 기간 종료시에 사진을 찍었고, 상기 기간 동안 모든 본래의 처리 조건으로부터의 Huh-6 세포가 동일한 M11 배지에서 성장하였다. 이후, 모든 웰의 정체에 대해 맹검된 작업자가 구상을 계수하였다.
B. 결과
도 11에 도시된 바와 같이, 저-부착 플레이트에서 구상체로 성장하는 Huh6 간모세포종 세포의 능력은 프로가스트린에 대한 모노클로날 항체를 이용한 48시간의 전처리에 의해 현저히 감소되었다.
실시예 14: 항- PG 모노클로날 항체로 처리되는 경우 보다 적은 구상체를 형성하는 구상체 성장 조건하에서 성장한 Huh7 간세포암종 세포
본 실시예는 저 부착 배양 조건에서의 Huh7 세포의 구상체의 형성에 대한 항-hPG 모노클로날 항체의 효과를 제시한다.
A. 방법
첫번째 실험에서, Huh7 간세포암종 세포를 혈청 비함유 M11 배지(20 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF, 20 ㎍/ml 인슐린, N2 보충제, 2 ㎍/ml 시프로플록사신, 5 ㎍/ml 젠타마이신 및 3 ㎍/ml 글루코스를 갖는 DMEM/F12) 중에 초 저-부착 24-웰 플레이트에 시딩(500개 세포/웰)하였다. 세포에 비히클(PBS, 대조군) 또는 3 ㎍/ml 항-hPG MAb13 모노클로날 항체(항-hPG MAb13)를 37℃에서 7일 동안 매일 2회 처리하였다. 실험 종료시, 현미경사진을 찍고, 웰 당 구상의 수를 계수하고, 중간 및 백분위수 분포를 계산하였다.
두번째 실험에서, Huh7 간세포암종 세포를 혈청 비함유 M11 배지(20 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF, 20 ㎍/ml 인슐린, N2 보충제, 2 ㎍/ml 시프로플록사신, 5 ㎍/ml 젠타마이신 및 3 ㎍/ml 글루코스를 갖는 DMEM/F12) 중에 초 저-부착 24-웰 플레이트에 시딩(500개 세포/웰)하였다. 세포에 6 ㎍/ml의 대조군 모노클로날 항체(대조군 MAb, (P3X63Ag8, ATCC, Ref TIB-9), 항-hPG MAb13, 또는 항-hPG MAb16 모노클로날 항체 중 하나를 37℃에서 7일 동안 매일 2회 처리하였다. 실험 종료시, 현미경사진을 찍고, 웰 당 구상의 수를 계수하고, 중간 및 백분위수 분포를 계산하였다.
B. 결과
도 12a에 도시된 첫번째 실험에서, 항-hPG 모노클로날 항체 MAb13을 이용한 Huh7 세포의 처리는 미처리된 대조군 세포에 비해 저 부착 배양 조건하에서의 성장 동안 형성된 구상체의 수를 충분히 감소시켰다.
도 12b에 도시된 두번째 실험에서, 항-hPG 모노클로날 항체 MAb13 또는 항체 MAb16을 이용한 Huh7 세포의 처리는 대조군 모노클로날 항체로 처리된 세포에 비해 저 부착 배양 조건하에서의 성장 동안 형성된 구상체의 수를 충분히 감소시켰다.
실시예 15: 저 부착 조건하에서 성장하는 경우 보다 적은 구상체를 형성하는 항- hPG 모노클로날 항체로 전처리된 Huh7 간세포암종 세포
본 실시예는 저 부착 배양 조건하에서 구상체를 형성하는 Huh7 간세포암종 세포의 능력에 대한 항-프로가스트린 모노클로날 항체를 이용한 전처리의 억제 효과를 제시한다.
A. 방법
한 실험에서, 75,000개 Huh7 간세포암종 세포/웰을 먼저 10% FCS를 갖는 MEMα 중에 6-웰 플레이트에 시딩하고, 밤새 혈청 고갈시키고, 10 ㎍/mL의 항-프로가스트린 모노클로날 항체 MAb8 또는 대조군 모노클로날 항체(P3X63Ag8, ATCC, Ref TIB-9)의 존재하에서 MEMα + 0.5% Pannexin H에서 60시간 동안 성장시켰다. 처리 종료시, 각각의 처리 군에 대해, 500개 세포/웰을 bFGF 및 EGF를 함유하는 500 ㎕의 혈청 비함유 M11 배지 중에 초 저-부착 24-웰 플레이트의 8개의 웰에 플레이팅하고, 처리 없이 추가 5일 동안 성장시켰다. 상기 기간 종료시, 사진을 찍고, 웰 당 구상의 수를 계수하고, 구상 표면을 측정하였다. 5일의 "세척" 기간 종료시에 사진을 찍었고, 상기 기간 동안 모든 본래의 처리 조건으로부터의 Huh-7 세포가 동일한 M11 배지에서 성장하였다. 이후, 모든 웰의 정체에 대해 맹검된 작업자가 구상체를 계수하였다.
두번째 실험에서, 75,000개 Huh7 간세포암종 세포/웰을 먼저 10% FCS를 갖는 MEMα 중에 6-웰 플레이트에 시딩하고, 밤새 혈청 고갈시키고, 10 ㎍/mL의 항-프로가스트린 모노클로날 항체 MAb16 또는 대조군 모노클로날 항체(P3X63Ag8, ATCC, Ref TIB-9)의 존재하에서 MEMα + 0.5% Pannexin H에서 60시간 동안 성장시켰다. 처리 종료시, 각각의 처리 군에 대해, 500개 세포/웰을 bFGF 및 EGF를 함유하는 500 ㎕의 혈청 비함유 M11 배지 중에 초 저-부착 24-웰 플레이트의 8개의 웰에 플레이팅하고, 처리 없이 추가 5일 동안 성장시켰다. 상기 기간 종료시, 사진을 찍고, 웰 당 구상의 수를 계수하고, 구상 표면을 측정하였다. 5일의 "세척" 기간 종료시에 사진을 찍었고, 상기 기간 동안 모든 본래의 처리 조건으로부터의 Huh-7 세포가 동일한 M11 배지에서 성장하였다. 이후, 모든 웰의 정체에 대해 맹검된 작업자가 구상체를 계수하였다.
B. 결과
결과가 도 13a-b에 도시된다. 도 13a에 도시된 바와 같이, 저-부착 플레이트에서 구상체로 성장하는 Huh7 세포의 능력이 항-hPG MAb8을 이용한 48시간의 전처리에 의해 현저히 감소되었다. 도 13b에 도시된 바와 같이, 저-부착 플레이트에서 구상체로 성장하는 Huh7 세포의 능력이 항-hPG MAb16을 이용한 48시간의 전처리에 의해 현저히 감소되었다.
실시예 16: 항- PG 항체로 처리되는 경우 저-부착 배양 조건하에서 보다 적은 구상체를 형성하는 Huh7 간세포암종 "측면 군락" 세포
본 실시예는 Huh7 간암 세포주로부터의 염료-배제 "측면 군락" 세포의 저 부착 배양 조건하에서의 구상체의 성장에 대한 항-hPG 모노클로날 항체를 이용한 처리의 효과를 제시한다.
A. 방법
Huh7 세포의 염료 배제 측면 군락 세포를 실시예 8에 기재된 바와 같이 분리하였다. 이후, 측면 군락 세포를 M11 배지 중에 초 저 부착 24-웰 플레이트로 시딩(1000개 세포/웰)하고, 대조군 배지 또는 항-프로가스트린 모노클로날 항체 MAb8 또는 MAb13(6 ㎍/ml)(조건 당 8 웰)의 존재하에서 37℃에서 7일 동안 성장시켰다. M11 배지의 조성은 다음과 같았다: DMEM/F12-Glutamax(Catalog #31331 Invitrogen); 20ng/ml EGF(R&D systems); 10ng/ml FGF(R&D systems); 20 microg/ml 인슐린(Sigma); N2 보충제의 1/100 희석액(Catalog #P1510, Gibco); 2 ㎍/ml 시프로플록사신, 5 ㎍/ml 젠타마이신 및 3 ㎍/ml 글루코스. 실험 종료시, 현미경사진을 찍고, 웰 당 구상의 수를 계수하고, 평균 및 표준편차를 계산하였다.
B. 결과
도 14에 도시된 바와 같이, Huh7 세포주로부터 정제된 측면 군락 세포의 항-hPG 모노클로날 항체를 이용한 처리는 대조군 배지에서 성장한 세포에 비해 저 부착 배양 조건하에서의 성장 동안 형성된 구상체의 수를 충분히 감소시켰다.
실시예 17: 저 부착 성장 조건하에서 보다 적은 구상체를 형성하는 항- PG 항체로 처리된 PLC / PRL /5 간세포암종 세포
본 실시예는 저 부착 배양 조건하에서의 PLC/PRL/5 세포의 구상체 형성에 대한 항-hPG 모노클로날 항체의 효과를 제시한다.
A. 방법
한 실험에서, PLC/PRL/5 간세포암종 세포를 혈청 비함유 M11 배지(20 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF, 20 ㎍/ml 인슐린, N2 보충제, 2 ㎍/ml 시프로플록사신, 5 ㎍/ml 젠타마이신 및 3 ㎍/ml 글루코스를 갖는 DMEM/F12) 중에 초 저-부착 96-웰 플레이트에 시딩(35개 세포/웰)하였다. 세포를 3 ㎍/ml의 대조군 모노클로날 항체(대조군 MAb, P3X63 Ag8, ATCC, Ref TIB-9) 또는 항-hPG MAb19 모노클로날 항체로 37℃에서 8일 동안 매일 2회 처리하였다. 실험 종료시, 현미경사진을 찍고, 웰 당 구상의 수를 계수하고, 중간 및 백분위수 분포를 계산하였다.
또 다른 실험에서, PLC/PRL/5 간세포암종 세포를 혈청 비함유 M11 배지(20 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF, 20 ㎍/ml 인슐린, N2 보충제, 2 ㎍/ml 시프로플록사신, 5 ㎍/ml 젠타마이신 및 3 ㎍/ml 글루코스를 갖는 DMEM/F12) 중에 초 저-부착 24-웰 플레이트에 시딩(200개 세포/웰)하였다. 세포를 6 ㎍/ml의 대조군 MAb 또는 항-hPG MAb13 모노클로날 항체로 37℃에서 7일 동안 매일 2회 처리하였다. 실험 종료시, 현미경사진을 찍고, 웰 당 구상의 수를 계수하고, 중간 및 백분위수 분포를 계산하였다.
추가 실험에서, PLC/PRL/5 간세포암종 세포를 혈청 비함유 M11 배지(20 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF, 20 ㎍/ml 인슐린, N2 보충제, 2 ㎍/ml 시프로플록사신, 5 ㎍/ml 젠타마이신 및 3 ㎍/ml 글루코스를 갖는 DMEM/F12) 중에 초 저-부착 24-웰 플레이트에 시딩(200개 세포/웰)하였다. 세포를 6 ㎍/ml의 대조군 MAb, 항-hPG MAb8 또는 항-hPG MAb13 모노클로날 항체 중 하나로 37℃에서 7일 동안 매일 2회 처리하였다. 실험 종료시, 현미경사진을 찍고, 웰 당 구상의 수를 계수하고, 중간 및 백분위수 분포를 계산하였다.
B. 결과
결과가 도 15a-c에 도시된다. 도 15a에 도시된 바와 같이, 항-hPG MAb19를 이용한 처리는 대조군 MAb로 처리된 세포에 비해 저 부착 배양 조건하에서의 성장 동안 PLC/PRL/5 세포에 의해 형성된 구상체의 수를 충분히 감소시켰다. 도 15b에 도시된 바와 같이, 항-hPG MAb13을 이용한 처리는 대조군 MAb로 처리된 세포에 비해 저 부착 배양 조건하에서 PLC/PRL/5 세포에 의해 형성된 구상체의 수를 충분히 감소시켰다. 도 15c에 도시된 바와 같이, 항-hPG MAb8 또는 MAb13을 이용한 처리는 대조군 MAb로 처리된 세포에 비해 저 부착 배양 조건하에서 PLC/PRL/5 세포에 의해 형성된 구상체의 수를 충분히 감소시켰다.
실시예 18: 저 부착 조건하에서 성장하는 경우 보다 적은 구상체를 형성하는 항- hPG 모노클로날 항체로 전처리된 PLC / PRF /5 세포
본 실시예는 저 부착 배양 조건하에서 구상체를 형성하는 간세포암종 세포의 능력에 대한 항-hPG 모노클로날 항체 전처리의 억제 효과를 제시한다.
A. 방법
50,000개 PLC/PRF/5 간세포암종 세포/웰을 먼저 10% FCS를 갖는 EMEM 중에 6-웰 플레이트에 시딩하고, 밤새 혈청 고갈시키고, 10 ㎍/mL의 항-hPG MAb8, 항-hPG MAb16 또는 대조군 모노클로날 항체(대조군 MAb, P3X63Ag8, ATCC, Ref TIB-9)의 존재하에서 EMEM + 0.5% Pannexin H에서 72시간 동안 성장시켰다. 처리 종료시, 각각의 처리 군에 대해, 200개 세포/웰을 bFGF 및 EGF를 함유하는 500 ㎕의 혈청 비함유 M11 배지 중에 초 저-부착 24-웰 플레이트의 8개의 웰에 플레이팅하고, 처리 없이 추가 5일 동안 성장시켰다. 상기 기간 종료시, 사진을 찍고, 웰 당 구상의 수를 계수하고, 구상 표면을 측정하였다. 5일의 "세척" 기간 종료시에 사진을 찍었고, 상기 기간 동안 모든 본래의 처리 조건으로부터의 PLC/PRF/5 세포가 동일한 M11 배지에서 성장하였다. 이후, 모든 웰의 정체에 대해 맹검된 작업자가 구상체를 계수하였다.
B. 결과
도 16에 도시된 바와 같이, 저 부착 플레이트에서 구상체를 형성하는 PLC/PRF/5 간세포암종 세포의 능력은 대조군 MAb에 비해 프로가스트린에 대한 2개의 상이한 모노클로날 항체를 이용한 72시간의 전처리에 의해 현저히 감소되었다.
실시예 19: 항- PG 항체로 처리되는 경우 저-부착 배양 조건하에서 보다 적은 구상체를 형성하는 PLC / PRL /5 간세포암종 "측면 군락" 세포
본 실시예는 PLC/PRL/5 간암 세포로부터 분리된 염료-배제 "측면 군락" 세포에 의한 저 부착 배양 조건하에서의 구상체의 형성에 대한 항-hPG 모노클로날 항체의 효과를 제시한다.
A. 방법
PLC/PRL/5 세포의 염료 배제 측면 군락 세포를 실시예 8에 기재된 바와 같이 분리시켰다. 이후, 측면 군락 세포를 M11 배지 중에 초 저 부착 24-웰 플레이트(400개 세포/웰)로 시딩하고, 대조군 배지 또는 항-프로가스트린 모노클로날 항체 MAb13(6 ㎍/ml) 또는 MAb16(10 ㎍/ml)(조건 당 6 웰)의 존재하에서 37℃에서 7일 동안 성장시켰다. M11 배지의 조성은 다음과 같았다: DMEM/F12-Glutamax(Catalog #31331 Invitrogen); 20ng/ml EGF(R&D systems); 10ng/ml FGF(R&D systems); 20 microg/ml 인슐린(Sigma); N2 보충제의 1/100 희석액(Catalog #P1510, Gibco); 2 ㎍/ml 시프로플록사신, 5 ㎍/ml 젠타마이신 및 3 ㎍/ml 글루코스. 실험 종료시, 현미경사진을 찍고, 웰 당 구상의 수를 계수하고, 평균 및 표준편차를 계산하였다.
B. 결과
도 17에 도시된 바와 같이, 항-hPG 모노클로날 항체를 이용한 PLC/PRL/5 세포주로부터 분리된 "측면 군락" 세포의 처리는 배지 단독에서 성장한 세포에 비해 저 부착 배양 조건하에서 형성된 구상체의 수를 충분히 감소시켰다.
본 출원에 인용된 모든 공개문헌, 특허, 특허 출원 및 그 밖의 문서는, 각각의 개별적인 공개문헌, 특허, 특허 출원 및 그 밖의 문서가 모든 목적을 위해 참조로서 포함된다고 개별적으로 지시된 바와 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
다양한 특정 구체예가 예시되고 기재되었으나, 발명(들)의 사상 및 범위를 벗어나지 않으며 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 인지될 것이다.
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SEQUENCE LISTING <110> BIOREALITES, S.A.S. CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR LIVER CANCER THERAPY <130> 382657-005WO <140> <141> <150> 61/476,204 <151> 2011-04-15 <150> 61/367,851 <151> 2010-07-26 <160> 106 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Phe Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Thr Arg Arg Asp Ser Pro Gln Tyr 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Gln Ser 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gcc atg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aca cag ggg aat tac tct ttg gac ttc tgg ggc caa ggc acc tct 336 Ala Thr Gln Gly Asn Tyr Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 ctc aca gtc tcc tca 351 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 68 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> CDS <222> (1)..(342) <400> 68 gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gtg cag cct gga ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc att ttc agt agc tat 96 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 ggc atg tct tgg gtt cgc cag tct cca gac agg agg ctg gag ttg gtc 144 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Asp Arg Arg Leu Glu Leu Val 35 40 45 gca agt att aat act ttt ggt gat aga acc tat tat cca gac agt gtg 192 Ala Ser Ile Asn Thr Phe Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac acc ctg tac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg acc agt ctg aag tct gag gac aca gcc att tat tac tgt 288 Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ggg acc gga acc tac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc 336 Ala Arg Gly Thr Gly Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 tcc tca 342 Ser Ser <210> 69 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 69 cag gtc caa ctg cag cag tct ggg gct gaa ctg gtg aag cct ggg gct 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag ttg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttc acc agc tac 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 tat atg tac tgg gtg aag cag agg cct gga caa ggc ctt gag tgg att 144 Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga gag att aat cct agc aat ggt ggt act aac ttc aat gag aag ttc 192 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag agc aag gcc aca ctg act gta gac aaa tcc tcc agc aca gca tac 240 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg caa ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 aca aga ggc ggt tac tac ccc ttt gac tac tgg ggc caa ggc acc act 336 Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 ctc aca gtc tcc tca 351 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 70 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 70 gat gtg cag ctt cag gag tcg gga cct ggc ctg gtg aaa cct tct cag 48 Asp Val Gln Leu 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Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 cta gaa ctt ccg ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 336 Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 72 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 72 gat gtt gtg ctg acc cag act cca ctc act ttg tcg gtt acc att gga 48 Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 caa cca gcc tcc atc tcc tgc aag tca agt cag agc ctc tta gat agt 96 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 gat gga aag aca tat ttg aat tgg ttg tta cag agg cca ggc cag tct 144 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aag cgc cta atc tat ctg gtg tct aaa ctg gac tct gga gtc cct 192 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg ttc act ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca ctg aaa atc 240 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ttg gga gtt tat tat tgc tgg caa ggt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 aca cat ttt cct cag acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 336 Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 73 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 73 gat gtt gtg atg acc cag act cca ctc act ttg tcg gtt acc att ggg 48 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 cgc cca gcc tcc atc tct tgc aag tca agt cag agc ctc tta gac agt 96 Arg Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 gat gga aag aca tat ttg tat tgg ttg tta cag agg cca ggc cag tct 144 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cca aag cgc cta atc tat ctg gtg tct gag ctg gac tct gga gtc cct 192 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Glu Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg atc act ggc agt ggg tcg ggg aca gat ttc aca ctg aag atc 240 Asp Arg Ile Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 agc aga gtg gag gct gag gat ttg gga gtt tat tat tgc tgg caa gga 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 aca cat tct ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 336 Thr His Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 74 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400> 74 caa ctt gcg ctc act cag tca tct tca gcc tct ttc tcc ctg gga gcc 48 Gln Leu Ala Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly Ala 1 5 10 15 tca gca aaa cta acg tgc act ttg agt agt caa cac aga acg tac acc 96 Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Arg Thr 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Claims (46)

  1. 치료 이익을 제공하기에 충분한 양의 항-프로가스트린 항체를 간암에 걸린 피검체에 투여하는 단계를 포함하는, 간암을 치료하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 항-프로가스트린 항체가 폴리클로날 항체인 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 피검체가 인간이고, 항-프로가스트린 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 항-프로가스트린 항체가 인간화 모노클로날 항체인 방법.
  5. 제 3항에 있어서, 항-hPG 모노클로날 항체가 N-말단 항-hPG 모노클로날 항체인 방법.
  6. 제 5항에 있어서, N-말단 항-hPG 모노클로날 항체가 DAPLG(SEQ ID NO:28), PDAPLG(SEQ ID NO:29), PRSQQPD(SEQ ID NO:30), WKPRSQQPD(SEQ ID NO:31) 및 WKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO:32)로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 에피토프에 결합하는 방법.
  7. 제 5항에 있어서, N-말단 항-hPG 모노클로날 항체가 서열 SWKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO:25)를 갖는 펩티드를 포함하는 면역원에 대해 발생되는 방법.
  8. 제 5항에 있어서, N-말단 항-hPG 모노클로날 항체가 서열에 있어서 MAb3, MAb4, MAb15, MAb16 또는 MAb19의 VH CDR에 상응하는 3개의 VH CDR 및 서열에 있어서 MAb3, MAb4, MAb15, MAb16 또는 MAb19의 VL CDR에 상응하는 3개의 VL CDR을 포함하는 방법.
  9. 제 5항에 있어서, N-말단 항-hPG 모노클로날 항체가 서열에 있어서 MAb3, MAb4, MAb15, MAb16 또는 MAb19의 CDR에 상응하는 CDR을 포함하는 방법.
  10. 제 5항에 있어서, 항-hPG 모노클로날 항체가 MAb3, MAb4, MAb15, MAb16 및 MAb19로 구성되는 군으로부터 선택된 참조 항체와 hPG 결합에 대해 경쟁하는 방법.
  11. 제 3항에 있어서, 항-hPG 모노클로날 항체가 C-말단 항-hPG 모노클로날 항체인 방법.
  12. 제 11항에 있어서, C-말단 항-hPG 모노클로날 항체가 FGRR(SEQ ID NO:33), MDFGR(SEQ ID NO:34) 및 GWMDFGRR(SEQ ID NO:36)로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 에피토프에 결합하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, C-말단 항-hPG 모노클로날 항체가 서열 QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN(SEQ ID NO:27)을 갖는 펩티드를 포함하는 면역원에 대해 발생되는 방법.
  14. 제 11항에 있어서, C-말단 항-hPG 모노클로날 항체가 서열에 있어서 MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb11, MAb12 또는 MAb13의 CDR에 상응하는 3개의 VH CDR 및 서열에 있어서 MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb11, MAb12 또는 MAb13의 CDR에 상응하는 3개의 VL CDR을 포함하는 방법.
  15. 제 11항에 있어서, C-말단 항-hPG 모노클로날 항체가 서열에 있어서 MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb11, MAb12 또는 MAb13의 CDR에 상응하는 CDR을 포함하는 방법.
  16. 제 11항에 있어서, C-말단 항-hPG 모노클로날 항체가 MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb11, MAb12 및 MAb13으로 구성된 군으로부터 선택된 참조 항체와 hPG 결합에 대해 경쟁하는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 항-프로가스트린 항체가 외과적 절제에 보조하여 투여되는 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 항-프로가스트린 항체가 화학요법에 보조하여 투여되는 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 항-프로가스트린 항체가 방사선요법에 보조하여 투여되는 방법.
  20. 치료 이익을 제공하기에 충분한 양의 항-프로가스트린 항체를 간암에 대해 치료된 적이 있는 피검체에 투여하는 단계를 포함하는, 피검체에서의 간암의 재발을 예방하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 항-프로가스트린 항체가 폴리클로날 항체인 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 피검체가 인간이고, 항-프로가스트린 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  23. 제 21항에 있어서, 항-프로가스트린 항체가 인간화 모노클로날 항체인 방법.
  24. 제 22항에 있어서, 항-hPG 모노클로날 항체가 N-말단 항-hPG 모노클로날 항체인 방법.
  25. 제 24항에 있어서, N-말단 항-hPG 모노클로날 항체가 DAPLG(SEQ ID NO:28), PDAPLG(SEQ ID NO:29), PRSQQPD(SEQ ID NO:30), WKPRSQQPD(SEQ ID NO:31) 및 WKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO:32)으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 에피토프에 결합하는 방법.
  26. 제 24항에 있어서, N-말단 항-hPG 모노클로날 항체가 서열 SWKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO:25)를 갖는 펩티드를 포함하는 면역원에 대해 발생되는 방법.
  27. 제 24항에 있어서, N-말단 항-hPG 모노클로날 항체가 서열에 있어서 MAb3, MAb4, MAb15, MAb16 또는 MAb19의 VH CDR에 상응하는 3개의 VH CDR 및 서열에 있어서 MAb3, Mab4, MAb15, MAb16 또는 MAb19의 VL CDR에 상응하는 3개의 VL CDR을 포함하는 방법.
  28. 제 24항에 있어서, N-말단 항-hPG 모노클로날 항체가 서열에 있어서 MAb3, MAb4, MAb15, MAb16 또는 MAb19의 CDR에 상응하는 CDR을 포함하는 방법.
  29. 제 24항에 있어서, 항-hPG 모노클로날 항체가 MAb3, MAb4, MAb15, MAb16 및 MAb19로 구성된 군으로부터 선택된 참조 항체와 hPG 결합에 대해 경쟁하는 방법.
  30. 제 22항에 있어서, 항-hPG 모노클로날 항체가 C-말단 항-hPG 모노클로날 항체인 방법.
  31. 제 30항에 있어서, C-말단 항-hPG 모노클로날 항체가 FGRR(SEQ ID NO:33), MDFGR(SEQ ID NO:34) 및 GWMDFGRR(SEQ ID NO:36)으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 에피토프에 결합하는 방법.
  32. 제 30항에 있어서, C-말단 항-hPG 모노클로날 항체가 서열 QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN(SEQ ID NO:27)을 갖는 펩티드를 포함하는 면역원에 대해 발생되는 방법.
  33. 제 30항에 있어서, C-말단 항-hPG 모노클로날 항체가 서열에 있어서 MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb11, MAb12 또는 MAb13의 CDR에 상응하는 3개의 VH CDR 및 서열에 있어서 MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb11, MAb12 또는 MAb13의 CDR에 상응하는 3개의 VL CDR을 포함하는 방법.
  34. 제 30항에 있어서, C-말단 항-hPG 모노클로날 항체가 서열에 있어서 MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb11, MAb12 또는 MAb13의 CDR에 상응하는 CDR을 포함하는 방법.
  35. 제 30항에 있어서, C-말단 항-hPG 모노클로날 항체가 MAb5, MAb6, MAb7, MAb8, MAb11, MAb12 및 MAb13으로 구성된 군으로부터 선택된 참조 항체와 hPG 결합에 대해 경쟁하는 방법.
  36. 간 종양 세포 또는 간암 줄기세포의 증식을 억제하기에 충분한 양의 항-프로가스트린 항체에 상기 세포를 노출시키는 단계를 포함하는, 간 종양 세포 또는 간암 줄기세포의 증식을 억제하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 시험관내에서 수행되는 방법.
  38. 제 36항에 있어서, 생체내에서 수행되는 방법.
  39. 피검체의 혈청 프로가스트린(PG) 수준을 약 50 pM 또는 그 미만으로 낮추기에 효과적인 양의 항-프로가스트린을 간암에 대해 치료된 적이 있고, 약 500 pM 또는 그 초과의 혈청 프로가스트린 수준이 측정된 피검체에 투여하는 단계를 포함하는, 피검체에서의 간암의 재발을 예방하는 방법.
  40. 제 39항에 있어서, 항-프로가스트린 항체가 폴리클로날 항체인 방법.
  41. 제 39항에 있어서, 피검체가 인간이고, 항-프로가스트린 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  42. 제 39항에 있어서, 항-프로가스트린 항체가 인간화 모노클로날 항체인 방법.
  43. 시간의 함수에 따라 간암에 대해 치료되는 피검체의 혈중 프로가스트린 수준을 모니터하는 단계로서, 피검체의 혈청 프로가스트린 수준에서의 시간-의존성 감소가 치료가 효과적인 것을 나타내는 단계를 포함하는, 간암 치료의 효과를 모니터하는 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 항-프로가스트린 항체가 폴리클로날 항체인 방법.
  45. 제 43항에 있어서, 항-프로가스트린 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  46. 제 43항에 있어서, 항-프로가스트린 항체가 인간화 모노클로날 항체인 방법.
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