EA028515B1 - Способы и композиции для терапии рака печени - Google Patents

Abstract

Изобретение обеспечивает способы лечения рака печени и предотвращения рецидива рака печени с помощью антипрогастриновых антител, способы мониторинга эффективности лечения рака печени при использовании антипрогастриновой терапии и композиции, которые применяются для этого.

Description

Данная заявка заявляет приоритет в соответствии с 35 И8С §119(е) временной заявки № 61/367851, поданной 26 июля 2010 г., и временной заявки № 61/476204, поданной 15 апреля 2011 г., содержание которых является введенным в данную заявку в качестве ссылки в своей целостности.

2. Ссылка на список последовательностей, таблицы и компьютерные программы

Настоящая заявка содержит список последовательностей, которые были представлены в А8СП формате посредством электронной подачи. Указанная А8СП копия, созданная 14 июля 2011 г., имеет название ВК (005\νϋ)ΤχΙ и размер 79913 байт.

3. Область, к которой относится изобретение

Настоящее описание является направленным, среди прочего, на способы лечения субъектов с раком печени или с риском возникновения рака печени путем введения субъекту композиции, включающей антитело, специфическое для прогастрина.

4. Предпосылки создания изобретения

Рак печени представляет собой пятый по счету вид рака в мире и третью наиболее частую причину смерти от рака; Πονβΐ и др., 2003, Гепатоклеточная карцинома, Ьаисе! 362: 1907-17. Наиболее общая форма рака печени представляет собой гепатоклеточную карциному, которая является также известной как НСС, и часто развивается при других сопутствующих повреждениях печени, типично при гепатите или циррозе; Тйогдейъкои и др., 2002, Молекулярный патогенез человеческой гепатоклеточной карциномы, Ыа1иге СепеОсх. 31: 339-346. Другие, менее типичные, формы рака печени включают гепатобластому и холангиокарциному. Стандартное лечение рака печени представляет собой хирургическую резекцию, если это является возможным, и химиотерапию, химиоэмболизацию или лучевую терапию в случае, если хирургия не является возможной. Хирургическое лечение не всегда является возможным по причине размера опухоли или ее расположения, прогрессирующего цирроза. Даже в случае хирургии рецидив/возврат опухоли насчитывает 70% случае в течение 5 лет после резекции; см. Б1о\'е1 и др., выше. Химиотерапевтические способы лечения также оказались такими, которые имеют сниженную эффективность при раке печени, возможно, по причине повышенной способности клеток рака печени выводить химиотерапевтические агенты. Таким образом, существует значительная и настоятельная потребность в более эффективном лечении рака печени.

5. Краткое изложение сущности изобретения

Гастрит представляет собой пептидный гормон желудка, который функционирует как стимулятор секреции гастриновой кислоты. У взрослых млекопитающих он вырабатывается преимущественно С клетками гастральной полости и в варьирующей степени в верхней части тонкого кишечника и в поджелудочной железе. Со ссылкой на фиг. 1 ген гастрина транслируется в полипептид из 101 аминокислоты, который называется препрогастрином и содержит сигнальную последовательность (подчеркнута), которая отщепляется, образуя прогастрин (РС), полипептид из 80 аминокислот. Гастрин, который в основном обнаруживается в трех формах, С34, С17 и С14 (не иллюстрируется), образуется в результате процессинга прогастрина. Было продемонстрировано наличие не полностью процессированной формы гастрина, включая РС, в некоторых образцах ткани рака печени (см., например, СарБи и др., 1999, Экспрессия и процессинг гастрина при гепатоклеточной карциноме, фиброламеллярной карциноме и холангиокарциноме, 1. Нера!о1., 30: 519-526). Было обнаружено, что подходы на основе антипрогастрина могут использоваться для мониторинга, лечения и предотвращения рака печени и/или его рецидива. Как было продемонстрировано впервые в данной заявке, количество мРНК гастрина является повышенным в стволовых клетках рака печени, а способность клеток рака печени или изолированных стволовых клеток рака печени к образованию раковых сфер или сфероидов при ростовых условиях сниженного прикрепления является значительно уменьшенной с помощью антипрогастриновых антител. Не имея намерения быть связанным с какой-либо теорией операции, можно сказать, что антипрогастриновые антитела со способностью связывать прогастрин (РС) и нейтрализовать биологическую активность РС предполагаются как такие, которые препятствуют росту клеток рака печени, в частности клеток, инициирующих опухоль печени, или раковых стволовых клеток. В соответствии с предположением это уменьшает размер и количество клеток рака печени и предотвращает рецидив рака печени. Эти открытия обеспечивают новые средства для лечения, предотвращения и мониторинга лечения рака печени.

В соответствии с этим в одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы и композиции, полезные для лечения рака печени и предотвращения рецидива рака печени у животных, включая людей. Как описывается более подробно ниже, способы лечения вовлекают введение субъекту, диагностированному с раком печени, количества антитела, которое специфически связывает прогастрин (антиРС антитело), эффективного для обеспечения терапевтического преимущества. Анти-РС антитело может вводиться отдельно, в виде монотерапии, или в сочетании с, или дополнительно к другим приемам, таким как резекция опухоли, лучевая терапия, химиотерапия, терапия при использовании другого антитела и т.д. При использовании в сочетании с или дополнительно к резекции опухоли анти-РС антитело может вводиться перед и/или после удаления опухоли и может продолжаться в течение конкретного периода времени после удаления опухоли до тех пор, пока уровень прогастрина в плазме и/или сыворотке крови не будет нижеуказанного порогового уровня, или до тех пор, пока не будет достигнуто снижение

- 1 028515 уровней прогастрина в плазме и/или сыворотке крови в течение указанного периода времени. При использовании в сочетании с или дополнительно к химиотерапии анти-РС антитело может вводиться перед химиотерапией совместно с химиотерапией или после химиотерапии. Кроме того, анти-РС антитело может вводиться в течение указанного периода времени, до тех пор, пока уровни прогастрина в плазме и/или сыворотке крови не будут ниже указанного порогового уровня, или до тех пор, пока не будет достигнуто снижение уровней прогастрина в плазме и/или сыворотке в течение указанного периода времени.

Композиции в соответствии с настоящим описанием содержат по крайней мере одно анти-РС антитело, которое специфически связывается с РС и нейтрализует его биологическую активность. Любое анти-РС антитело может использоваться в способах в соответствии с настоящей заявкой, включая, но без ограничения таковыми, поликлональные и моноклональные анти-РС антитела. Анти-РС антитела, полезные для применения в способах лечения и предотвращения, которые раскрываются в данной заявке, включают те, что описаны ниже в разделе 7.11. Предпочтительно анти-РС антитело является специфическим для РС видов, которые подвергают лечению. Например, анти-ЬРС антитело вводят субъекту, который представляет собой человека. Анти-РС композиции, приемлемые для применения в способах в соответствии с настоящим описанием, могут включать фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель и/или разбавитель. Могут быть получены композиции различных путей введения, как описывается в данной заявке, и включают носители, наполнители и/или разбавители, приемлемые для выбранного пути введения. Для целей лечения анти-РС антитела могут быть упакованы в виде единичных доз для удобства применения. Единичные дозы могут быть упакованы в наборы, содержащие разбавитель и, необязательно, инструкции для применения.

В другом аспекте настоящая заявка обеспечивает способ мониторинга эффективности анти-РС лечения путем измерения концентрации или уровня, или РС в образце крови (сыворотке, плазме или цельной крови), полученном от индивидуума с раком печени, которого подвергают лечению с помощью анти-РС композиции, и сравнение измеренного уровня РС с базовым уровнем РС. Базовый уровень может представлять собой уровень РС в образце крови, взятом в более ранний момент времени, например в начале лечения. Измерение, которое сравнивают с базовым уровнем, может быть получено от образца, взятого во время или после прохождения курса лечения. Измеренный уровень РС, который является ниже базового уровня, является показательным для эффективности лечения, а измеренный уровень РС, который является равным или выше базового уровня, является показательным для отсутствия эффективности лечения.

6. Краткое описание чертежей

Фиг. 1 дает представление об аминокислотных последовательностях человеческого препрогастрина (БЕф ГО N0:100), где сигнальная пептидная последовательность является подчеркнутой, зрелого человеческого прогастрина (БЕф ГО N0:20) и некоторых продуктов процессинга прогастрина, включая С34 (БЕф ГО N0:102), С34-С1у (БЕф ГО N0:103), С17 (БЕф ГО N0:104), С17-С1у (БЕф ГО N0:105) и СТЕР (БЕф ГО N0:106).

Фиг. 2 дает представление о полинуклеотидных и аминокислотных последовательностях вариабельной области легкой и вариабельной области тяжелой цепей определенных типичных мышиных антиЬРС моноклональных антител. В каждом случае три СОК выделены жирным шрифтом с подчеркиванием. В частности:

фиг. 2А дает представление о полипептидной последовательности ν_Η цепи мышиного анти-ЬРС МАЬ 3 (БЕф ГО N0:12) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (БЕф ГО N0:16);

фиг. 2В дает представление о полипептйдной последовательности ν₂ цепи мышиного анти-ЬРС МАЬ 3 (БЕф ГО N0:13) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (БЕф ГО N0: 17);

фиг. 2С дает представление о полипептидной последовательности ν_Η цепи мышиного анти-ЬРС МАЬ 4 (БЕф ГО N0:14) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (БЕф ГО N0: 18);

фиг. 2Ό дает представление о полипептидной последовательности ν₂ цепи мышиного анти-ЬРС МАЬ 4 (БЕф ГО N0:15) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (БЕф ГО N0:19);

фиг. 2Е дает представление о полипептидной последовательности ν_Η цепи мышиного анти-ЬРС МАЬ 8 (БЕф ГО N0:59) и полинуклеотидную последовательность, которая ее кодирует (БЕф ГО N0:67);

фиг. 2Е дает представление о полипептидной последовательности V цепи мышиного анти-ЬРС МАЬ 8 (БЕф ГО N0:63) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (БЕф ГО N0:71);

фиг. 2С дает представление о полипептидной последовательности ν_Η цепи мышиного анти-ЬРС МАЬ 13 (БЕф ГО N0:60) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (БЕф ГО N0:68);

фиг. 2Η дает представление о полипептидной последовательности V цепи мышиного анти-ЬРС МАЬ 13 (БЕф ГО N0:64) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (БЕф ГО N0:72);

фиг. 21 дает представление о полипептидной последовательности ν_Η цепи мышиного анти-ЬРС МАЬ 16 (БЕф ГО N0:61) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (БЕф ГО N0:69);

фиг. 21 дает представление о полипептидной последовательности ν₂ цепи мышиного анти-ЬРС МАЬ 16 (БЕф ГО N0:65) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (БЕф ГО N0:73);

фиг. 2К дает представление о полипептидной последовательности ν_Η цепи мышиных анти-ЬРС

- 2 028515

МЛЬ 19 (δΕΟ ΙΌ N0:62) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (δΕΟ ΙΌ N0:70); и фиг. 2Ь дает представление о полипептидной последовательности У_ъ цепи мышиного анти-ЬРО МАЬ 19 (δΕΟ ΙΌ N0:66) и полинуклеотидной последовательности, которая ее кодирует (δΕΟ ΙΌ N0:74).

Фиг. 3 дает представление о предсказанных полипептидных последовательностях гуманизированных вариабельных тяжелых и легких цепей выбранных анти-ЬРО моноклональных антител, описанных в данной заявке. В каждом случае три СОК выделены жирным шрифтом с подчеркиванием. В частности:

фиг. ЗА дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности ν_Η цепи гуманизированного МАЬ 3 (δΕΟ ΙΌ N0:21);

фиг. ЗВ дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности V цепи гуманизированного МАЬ 3 (δΕΟ ΙΌ N0:22);

фиг. ЗС дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности ν_Η цепи гуманизированного МАЬ 4 (δΕΟ ΙΌ N0:23);

фиг. 3Ό дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности Ун цепи гуманизированного МАЬ 4 (δΕΟ ΙΌ N0:24);

фиг. 3Ε дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности ν_Η цепи гуманизированного МАЬ 8(а) (δΕΟ ΙΌ N0:75);

фиг. 3Р дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности цепи гуманизированного МАЬ 8(а) (δΕΟ ΙΌ N0:76);

фиг. 3О дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности ν_Η цепи гуманизированного МАЬ 8(Ь) (δΕΟ ΙΌ N0:77);

фиг. 3Η дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности V цепи гуманизированного МАЬ 8(Ь) (δΕΟ ΙΌ N0:78);

фиг. 3Ι дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности ν_Η цепи гуманизированного МАЬ 8(с) (δΕΟ ΙΌ N0:79);

фиг. 31 дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности У_ь цепи гуманизированного МАЬ 8(с) (δΕΟ ΙΌ N0:76);

фиг. 3К дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности ν_Η цепи гуманизированного МАЬ 13(а) (δΕΟ ΙΌ N0:80);

фиг. 3Ь дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности цепи гуманизированного МАЬ 13(а) (δΕΟ ΙΌ N0:81);

фиг. 3М дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности ν_Η цепи гуманизированного МАЬ 13(Ь) (δΕΟ ΙΌ N0:82);

фиг. 3N дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности у!, цепи гуманизированного МАЬ 13(Ь) (δΕΟ ΙΌ N0:83);

фиг. 30 дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности ν_Η цепи гуманизированного МАЬ 16(а) (δΕΟ ΙΌ N0:84);

фиг. 3Р дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности У₂ цепи гуманизированного МАЬ 16(а) (δΕΟ ΙΌ N0:85);

фиг. 30 дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности ν_Η цепи гуманизированного МАЬ 16(Ь) (δΕΟ ΙΌ N0:86);

фиг. 3К дает представление о предсказанной аминокислотной последовательность У_ъ цепи гуманизированного МАЬ 16(Ь) (δΕΟ ΙΌ N0:87);

фиг. 3 δ дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности ν_Η цепи гуманизированного МАЬ 16(с) (δΕΟ ΙΌ N0:88);

фиг. 3Т дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности у цепи гуманизированного МАЬ 16(с) (δΕΟ ΙΌ N0:89);

фиг. 3и дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности ν_Η цепи гуманизированного МАЬ 19(а) (δΕΟ ΙΌ N0:90);

фиг. 3ν дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности У_ъ цепи гуманизированного МАЬ 19(а) (δΕΟ ΙΌ N0:91);

фиг. 3\У дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности ν_Η цепи гуманизированного МАЬ 19(Ь) (δΕΟ ΙΌ N0:92);

фиг. 3Х дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности У_ъ цепи гуманизированного МАЬ 19(Ь) (δΕΟ ΙΌ N0:93);

фиг. 3Υ дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности ν_Η цепи гуманизированного МАЬ 19(с) (δΕΟ ΙΌ N0:94) и фиг. 3Ζ дает представление о предсказанной аминокислотной последовательности у цепи гуманизированного МАЬ 19(с) (δΕΟ ΙΌ N0:95).

Фиг. 4 дает представление о гистограмме уровней мРНК ОАδΤ в опухолях, полученных от 14 индивидуумов с раком печени (ЯСС), по сравнению со средним уровнем, который определяется в здоровой ткани печени.

- 3 028515

Фиг. 5А, В дает представление о гистограмме уровней мРНК ОА8Т в трех линиях клеток рака печени - РЬС/РКР/5 (фиг. 5А), НиЬ-б (фиг. 5В) и НиЬ-7 (фиг. 5В) - по сравнению с уровнями, которые наблюдали в клеточной линии колоректального рака, 8^480, которая является известной как такая, которая имеет повышенную экспрессию ΟΑδΤ.

Фиг. бА, В дает представление о гистограмме уровней мРНК ΟΑδΤ в НиЬ-б (фиг. бА) и НиЬ-7 (фиг. бВ) боковой популяции (8Р) клеток по сравнению с уровнями, которые наблюдали в неотобранном пуле НиЬ-б или НиЬ-7 клеток, выращенных при условиях культивирования сниженного прикрепления.

Фиг. 7 дает представление о количественной диаграмме роста сфероидов на ячейку РЬС/РКЬ/5 клеток, выращенных при условиях культивирования сниженного прикрепления в присутствии типичного анти-РО моноклонального антитела или контрольного антитела.

Фиг. 8 дает представление о количественной диаграмме роста сфероидов на ячейку НиЬ-б боковой популяции (8Р) клеток, выращенных при ростовых условиях сниженного прикрепления в присутствии доксорубицина и диметисульфоксида (ДМСО), ДМСО, взятого отдельно, типичного анти-РО поликлонального антитела или контрольного поликлонального антитела.

Фиг. 9 дает представление о количественной диаграмме роста сфероидов на ячейку НиЬ-7 боковой популяции клеток, выращенных при ростовых условиях сниженного прикрепления в присутствии доксорубицина и ДМСО, ДМСО, взятого отдельно, типичного анти-РО поликлонального антитела или контрольного поликлонального антитела.

Фиг. 10 дает представление о количественной диаграмме роста сфероидов на ячейку НиЬб клеток, выращенных при ростовых условиях сниженного прикрепления в чистой среде (Контроль) или с добавлением анти-ЬРО МАЬ 13 или анти-ЬРО МАЬ 19.

Фиг. 11 дает представление о гистограмме среднего количества роста сфероидов на ячейку НиЬ-б клеток, выращенных при ростовых условиях сниженного прикрепления после роста при постоянных условиях прикрепления в чистой среде (Контроль), или с добавлением анти-ЬРО МАЬ 8 или анти-ЬРО МАЬ 13.

Фиг. 12А, В дает представление о гистограмме среднего количества роста сфероидов на ячейку НиЬ7 клеток, выращенных при ростовых условиях сниженного прикрепления. Фиг. 12А показывает клетки, выращенные в чистой среде (Контроль), против клеток, обработанных с помощью анти-ЬРО МАЬ 13. Фиг. 12В показывает клетки, обработанные с помощью одного из: контрольное моноклональное антитело (Контрольное МАЬ ), анти-ЬРО МАЬ 13 и анти-ЬРО МАЬ 1б.

Фиг. 13А, В дает представление о гистограмме среднего количества роста сфероидов на ячейку НиЬ7 клеток, выращенных при ростовых условиях сниженного прикрепления после роста при постоянных условиях прикрепления при добавлении либо анти-ЬРО МАЬ 8 (фиг. 13А), либо анти-ЬРО МАЬ 1б (фиг. 13В), по сравнению с контрольным моноклональным антителом (Контрольное МАЬ ).

Фиг. 14 дает представление о гистограмме среднего количества роста сфероидов на ячейку НиЬ7 боковой популяции клеток, выращенных при ростовых условиях сниженного прикрепления в чистой среде (Контроль) или с добавлением анти-ЬРО МАЬ 8 или анти-ЬРО МАЬ 13.

Фиг. 15А-С дает представление о гистограмме среднего количества роста сфероидов на ячейку РЬС/РКЬ/5 клеток, обработанных с помощью анти-ЬРО МАЬ 19 (фиг. 15А), анти-ЬРО МАЬ 13 (фиг. 15В) или анти-ЬРО МАЬ 8 и МАЬ 13 (фиг. 15С), по сравнению с контрольным моноклональным антителом (Контрольное МАЬ ). Фиг. 1б дает представление о гистограмме среднего количества роста сфероидов на ячейку РЬС/РКЬ/5 клеток, выращенных при ростовых условиях сниженного прикрепления после роста при постоянных условиях прикрепления при добавлении какого-либо одного из: контрольное моноклональное антитело (СТ МАЬ ), анти-ЬРО МАЬ 8 или анти-ЬРО МАЬ 1б.

Фиг. 17 дает представление о гистограмме среднего количества роста сфероидов на ячейку РЬС/РКТ/5 боковой популяции клеток, выращенных при ростовых условиях сниженного прикрепления в чистой среде (Контроль) или с добавлением анти-ЬРО МАЬ 13 или анти-ЬРО МАЬ 1б.

7. Подробное описание

7.1. Рак печени.

Рак печени включает гепатоклеточную карциному (НСС), холангиокарциному и гепатобластому. Большинство случаев рака печени представляют собой НСС и часто возникают у индивидуумов, страдающих от других лежащих в основе патологий, включая гепатит, цирроз и/или отравление афлатоксином В1, что вызывает воспаление печени и хроническое повреждение и регенерацию печеночных клеток. Диагноз рака печени в настоящее время основывается на комбинации ультразвуковой эхографии, тонкоигольной пункционной биопсии и определения циркулирующих уровней определенных маркерных белков, включая, например, альфа-фетопротеин. НСС может классифицироваться на ранний, средний, прогрессирующий рак и рак последней стадии на основе размера опухоли, количества и морфологии (например, инкапсулированная или инвазивная) и функции печени.

Современные способы лечения рака печени включают трансплантацию печени, хирургическое удаление, чрескожную экстирпацию, химиотерапию, включая химиоэмболизацию, лучевую терапию, лечение с использованием антител. Печеночный трансплантат, хотя и является полностью лечебным, не является доступным для большинства пациентов по причине стадии их заболевания и/или отсутствия дос- 4 028515 тупных органов для трансплантации. Доступность трансплантатов может также ограничиваться для пациентов, инфицированных с помощью вирусов гепатита В или С, а также пациентов, страдающих от алкоголизма. Хирургическая резекция, а также перкутанная и чрескожная экстирпация, процедуры, которые удаляют или уничтожают раковую ткань, могут иметь хорошие результаты, но не являются доступными для всех пациентов. Расположение и размер опухоли могут исключать хирургическую резекцию, как и цирроз или другое повреждение функции печени, по причине риска повреждения органа, присущего этой процедуре. Даже при резекции печение рецидивы опухоли насчитывают 70% случаев в течение 5 лет. Чрескожная экстирпация разрушает неопластические клетки и является приемлемой для индивидуумов с одной опухолью с размерами менее 3 см, которые не являются кандидатами для хирургической резекции. Для индивидуумов, у которых рак находится на более прогрессирующей стадии, или у тех, у которых повреждена функция печени, стандартные способы лечения представляют собой химиотерапию и лучевую терапию, с эмболизацией или при ее отсутствии (окклюзия артерии для того, чтобы перекрыть кровоснабжение и индуцировать гибель опухоли). Современные доступные способы лечения являются неспособными удовлетворить потребность в эффективной терапии, которая может использоваться для лечения большинства индивидуумов, подверженных раку печени.

7.2. Рецидив рака печени.

Рецидив является особенно проблематичным при раке печени. Под рецидивом рака в общем случае понимают возврат рака после лечения и после периода времени, во время которого прежний рак не определяется. Были предложены различные объяснения высокого показателя рецидивов рака печени, включая невозможность удаления всех раковых клеток во время хирургических процедур, распространение раковых клеток инструментами во время чрескожной экстирпации и устойчивость к химиотерапевтическим агентам. Существует необходимость в способах терапии рака печени, которые снижают или устраняют рецидив.

7.3. Раковые стволовые клетки.

Солидные опухоли не обязательно являются гомогенными тканями. Напротив, некоторые опухоли включают множество патологических типов клеток, которые обладают отличными фенотипическими и функциональными свойствами. В соответствии с этим такие опухоли являются аналогичными патологическим органам. Клетки, содержащиеся в солидных опухолях, отличаются в отношении той степени, в которой они являются способными инициировать образование новой опухоли при трансплантации в новый сайт в том же хозяине, или новому хозяину того же вида или отличных видов. Клетки, обладающие этим свойством, являются известными как клетки, инициирующие опухоли или рак, или альтернативно, опухолевые или раковые стволовые клетки; см., например, СЫЬа и др., 2009, Раковые стволовые клетки при гепатоклеточной карциноме: современный прогресс и перспектива, Сапсег Ьейетк, 286: 145-153. Такие клетки образуют опухоли при трансплантации иммунодефицитным мышам в значительно меньшем количестве, чем то количество, которое является необходимым для неотобранного пула клеток рака печени при формировании опухолей у таких мышей (1000 клеток рака печени боковой популяции против 1 млн неотобранных клеток рака печени); см. СЫЬа и др., выше. В общем случае раковые стволовые клетки определяются двумя свойствами: способностью к самовосстановлению и способностью давать начало дочерним клеткам, которые дифференцируются в нестволовые клетки. Самовосстановление представляет собой способность к клеточному делению, посредством чего одна или обе дочерние клетки остаются недифференцированными, сохраняя способность давать начало еще одной раковой стволовой клетке с подобной способностью пролиферировать в качестве родительской клетки. Это свойство позволяет раковым стволовым клеткам давать начало, в конечном счете, большому количеству клеток, которые составляют растущую опухоль. Раковые стволовые клетки также обладают способностью обеспечивать дочерние клетки, которые дифференцируют и дают начало широкому спектру более дифференцированных нестволовых клеток, или клеткам массы, опухолевые клетки обнаруживаются во многих солидных опухолях. Таким образом, при трансплантации в новое животное раковые стволовые клетки могут воссоздавать тип опухоли, от которой они происходят, даже после многократных серийных трансплантаций. Кроме того, предполагается, что раковые стволовые клетки несут генетические мутации и/или эпигенетические изменения, которые могут приводить к измененным моделям пролиферации и/или низким показателям апоптоза.

Раковые стволовые клетки могут быть идентифицированы в соответствии с рядом фенотипических характеристик, которые отличают их от массы опухолевых клеток. Во-первых, как было указано выше, стволовые клетки рака печени имеют способность инициировать образование новой опухоли при трансплантации в нового хозяина. В противовес этому, масса опухолевых клеток является либо неспособной к инициации новой опухоли, либо требует значительно большего количества клеток, чем в случае раковых стволовых клеток, для достижения инициации новой опухоли; см. СЫЬа и др., 2009, Раковые стволовые клетки при гепатоклеточной карциноме: современный прогресс и перспектива, Сапсег Ьейетк, 286: 145153.

Способы, полезные для оценки, содержит ли опухоль или клеточная линия раковые стволовые клетки, являются известными квалифицированному специалисту в данной области техники. В качестве неограничивающего примера, опухоль или ее часть, которые предполагаются как такие, которые содер- 5 028515 жат раковые стволовые клетки, подвергают изоляции, такой как хирургическое удаление. После этого опухолевую ткань измельчают и обрабатывают ферментами или подвергают другой обработке, эффективной для дезинтеграции опухоли, и высвобождают составляющие ее клетки. Альтернативно, когда линия клеток подвергается анализу, может быть необходимым только диссоциировать клетки с помощью ферментативной или химической обработки. Или же может быть отобрана субпопуляция клеток, отобранных на основе одного или более фенотипов, описанных в данной заявке, таких как присутствие или отсутствие маркерных белков или способность исключать некоторые красители или другие вещества. Клеточная популяция, не имеющая маркерного(ых) профиля(ей), исключения красителя или другого свойства, ассоциированного с раковыми стволовыми клетками, может быть получена в качестве контроля. После изоляции соответствующей клеточной популяции предварительно определенное количество таких клеток потом имплантируют в одну или более целевых тканей или органов реципиентного животного. В некоторых воплощениях реципиентное животное представляет собой иммунодефицитную мышь, включая, но без ограничения таковыми, голых мышей, мышей с тяжелым сочетанным иммунодефицитом (§СГО) и диабетических мышей, которые не страдают ожирением §СГО (ΝΟΌ-δΟΙΌ). Могут также использоваться другие виды в соответствии со знаниями квалифицированного специалиста в данной области техники.

Клетки могут быть имплантированы подкожно или в печень. Клетки также могут имплантироваться в другие органы и ткани. В некоторых воплощениях целевая ткань или орган выбирается для воспроизведения ткани или органа происхождения опухоли при анализе. Однако в других воплощениях выбирают отличные ткани или органы, в которые пересаживают имплантированные клетки.

После имплантации, которую осуществляют при использовании методик, известных специалисту, клетки оставляют без вмешательства для определения, будет ли новая опухоль расти в сайте имплантации. Для клеток, имплантированных подкожно, опухолевый рост может определяться с помощью визуальной оценки и пальпации сайта трансплантации. Если опухоль является способной к определению, то ее размер может измеряться в течение времени при использовании штангенциркуля. Для клеток, имплантированных во внутренний орган, животное может умерщвляться в определенный момент времени после имплантации для определения, присутствует ли одна или более опухолей, и если это так, то каков размер такой(таких) опухоли(ей). Альтернативно, в соответствии со знаниями квалифицированного специалиста в данной области техники могут использоваться неинвазивные методики для оценки опухолевого роста.

Во-вторых, раковые стволовые клетки могут также быть идентифицированы в соответствии с их моделями экспрессии или не-экспрессии определенных маркеров, в то время как клетки массы опухоли, полученные из той же опухоли, могут иметь отличные модели экспрессии маркера. В некоторых случаях отсутствие экспрессии маркера является показательным для фенотипа раковой стволовой клетки. Такие маркеры включают белки, которые экспрессируются в клетке или на поверхности клетки и могут определяться при использовании разнообразных методик, включая, но без ограничения таковыми, иммуногистохимию, иммунофлуоресценцию и РАС8 анализ. Стволовые клетки рака печени были идентифицированы с помощью маркеров поверхности клетки. Клетки рака печени, которые несут один или более поверхностных маркера, включая СО133, СИ90 и СИ44, как оказалось, обладают повышенными свойствами инициации опухоли, и были охарактеризованы как стволовые клетки рака печени.

В-третьих, стволовые клетки рака печени были идентифицированы по их способности выводить красители и лекарственные вещества с помощью белков-транспортеров. Инициирующие опухоль клетки рака печени были идентифицированы на основе их способности исключать краситель НоесИН 33342 при использовании АВС транспортера. Такие клетки могут быть идентифицированы путем воздействия на них флуоресцентным красителем и при использовании РАС8 анализа для отделения клеток, которые поглощают такие красители, от тех, которые исключают их. Эти исключающие краситель раковые клетки называются боковой популяцией (δΡ) клеток. δΡ клетки могут инициировать образование опухолей из такого количества клеток, как 1000 клеток (СЫЪа и др., 2006 Боковая популяция, очищенная из клеток гепатоклеточной карциномы, которые имеют свойства, подобные таковым раковых стволовых клеток Нера1о1оду 44: 240-251). Другие методики для определения стволовых клеток рака печени также являются возможными и находятся в пределах знаний среднего специалиста в данной области техники.

В дополнение к способности инициировать опухоли ίη νίνο, где клетки массы опухоли являются либо неспособными инициировать опухоль, либо имеют значительно сниженную способность осуществить это, раковые стволовые клетки также демонстрируют повышенную способность расти в виде сфероидов в среде, свободной от сыворотки, и в условиях культуры низкого прикрепления, по сравнению с клетками опухолевой массы, и могут в зависимости от типа рака образовывать так называемые сфероиды при условиях культуры низкого прикрепления. Сфероиды представляют собой компактные шарики клеток, которые формируются, поскольку некоторые клетки в культуре растут после посева в виде дезагрегированных суспензий. Образование таких сфероидов усиливается тогда, когда клетки выращивают в среде, свободной от сыворотки, обычно в присутствии специфических ростовых факторов (включая, но без ограничения, эпидермальный фактор роста (ЕСР) и основной фактор роста фибробластов (ЪРСР)), и чашки для культуры тканей имеют поверхности, к которым клетки млекопитающих слабо прилипают. Подобно стволовым клеткам из нормальных тканей, было обнаружено, что раковые стволовые клетки

- 6 028515 преимущественно растут в виде сфероидов при приемлемых условиях культивирования; см., например, Карра, О., и др., Ехр. Се11 Кек., 314: 2110 (2008); Бшдй, 8.К., и др., Сапсег Кек., 63: 5821 (2003); Раид, И., и др., Сапсег Кек., 65: 9328 (2005). Анализы роста сфероидов при условиях культуры низкого прикрепления или в условиях роста сфероидов описываются в разделе Примеры, представленном ниже, и также находятся в пределах знаний квалифицированного специалиста в данной области техники.

7.4. Роль раковых стволовых клеток в рецидивах рака печени.

Опухолевые клетки со свойствами раковых стволовых клеток были идентифицированы как такие, которые демонстрируют повышенную устойчивость к облучению и/или химиотерапевтическим агентам; Еу1ег, С.Е. и ΤΝ. КюЬ, 1. Сйп. Опсо1, 26: 2839-2845 (2008). Были предложены различные молекулярные механизмы для объяснения устойчивости к облучению или химиотерапевтическим агентам. Например, сообщалось, что определенные раковые стволовые клетки могут быть способными к более легкому восстановлению своей ДНК после генотоксических инсультов, в то время как другие раковые стволовые клетки экспрессируют высокие уровни анти-апоптических белков или молекулярных насосов, эффективных для устранения химиотерапевтических агентов, поступивших в такие клетки. То, что раковые стволовые клетки пролиферируют более медленно, чем клетки-предшественники, может также объяснить сравнительную способность стволовых клеток выживать при воздействии облучения и токсических химиотерапевтических агентов, которые могли бы уничтожить массу опухолевых клеток; Еу1ег, С.Е., и др., 2008, 1. Сйп. Опсо1, 26:2839-2845. Повышенная устойчивость раковых стволовых клеток к облучению и/или химиотерапевтическим агентам не только снижает эффективность таких способов терапии, но также позволяет таким клеткам персистировать даже после того, как опухоли не являются способными к определению и терапия была успешной. У таких пациентов лечение изначально является эффективным, вызывая сокращение или исчезновение опухолей на диагностических снимках, однако опухоли появляются повторно через некоторое время после окончания лечения. Это, в свою очередь, может объяснить феномен рецидива у индивидуумов, которые ранее подвергались лечению рака печени; см. Еу1ег, выше. Ингибирование роста или уничтожение стволовых клеток рака печени у субъекта, который ранее подвергался лечению от рака печени, где в настоящее время не существует признаков рака печени, может, таким образом, предотвратить рецидив.

7.5. Анти-РО антитела и их влияние на стволовые клетки рака печени.

Как представлено в примерах, приведенных ниже, опухоли рака печени и НСС линии клеток проявляют повышенную экспрессию гена гастрина (ОЛБТ), который кодирует прогастрин. Эта экспрессия является даже еще более высокой в боковой популяции клеток - которая несет характеристики стволовых клеток рака печени - в двух различных линиях рака печени. Не имея намерения быть связанным с определенной теорией операции, предполагается, что один путь лечения рака печени, начального или рецидивирующего, заключается во введении агента, который ингибирует рост стволовых клеток рака печени, и предпочтительно ингибирует способность инициирующих образование опухоли клеток образовывать опухоли. Заявители неожиданно обнаружили, что антипрогастриновые антитела являются такими агентами. Как раскрывается в данной заявке, было неожиданно обнаружено, что рост стволовых клеток рака печени может ингибироваться путем лечения с использованием антител, которые специфически узнают человеческий прогастрин (ПРО). На основе этих неожиданных результатов, предполагается, что введение терапевтически эффективного количества анти-ПРО антител пациенту, который имеет рак, содержащий стволовые клетки рака печени, будет предоставлять терапевтическое преимущество путем, например, но не в качестве ограничения, снижения способности таких клеток осуществлять свой вклад в рак печени или его рецидив. Предполагается, что анти-РО антитела в соответствии с настоящим описанием являются эффективными для ингибирования роста стволовых клеток рака печени путем связывания с прогастрином, предотвращая, таким образом, связывание с его путативным рецептором или рецепторами, даже если они не известны, на раковых стволовых клетках. Прогастрин, который продуцируется либо самими раковыми стволовыми клетками, либо здоровыми тканями, является, таким образом, устраненным от опосредования их биологических эффектов, связанных с усилением роста таких клеток. Как следствие, предполагается, что нейтрализация РО анти-РО антителами в соответствии с настоящим описанием блокирует взаимодействие РО с его рецептором или рецепторами на таких клетках и может вызвать гибель таких клеток, возможно, в результате апоптоза, и/или остановить или замедлить деление клеток. Другие механизмы, с помощью которых анти-РО антитела препятствуют выживанию и/или росту раковых стволовых клеток, являются также возможными и не предназначены для ограничения объема изобретений, раскрытых в данной заявке. Способность анти-РО антитела нейтрализовать активность РО может быть определена при использовании анализов, которые являются известными специалисту в данной области техники, включая анализы ингибирования роста клеток ш νίίτο, такие как те, что описываются в разделе Примеры, приведенном ниже.

7.6. Способы лечения рака печени.

Настоящая заявка обеспечивает способы лечения рака печени у субъекта путем введения эффективного количества антипрогастринового (анти-РО) антитела, которое обладает терапевтическим преимуществом. Способы лечения рака печени в соответствии с настоящей заявкой осуществляются путем введения одного или более анти-РО антитела, способного нейтрализовать РО, описанного подробно в разде- 7 028515 ле 7.11, индивидуумам с раком печени. Любое антитело, которое нейтрализует РС, может использоваться в способах в соответствии с настоящей заявкой, включая, но без ограничения таковыми, поликлональные и моноклональные (например, химерные, гуманизированные, полностью человеческие, полноразмерные, РаЬ, одноцепочечные) анти-РС антитела. Приемлемые анти-РС антитела являются способными ингибировать рост клеток рака печени ίη νίίτο. В некоторых воплощениях анти-РС антитела являются способными к ингибированию роста сфероидов при условиях культивирования с помощью клеток рака печени со свойства инициирования опухолей, включая стволовые клетки рака печени, клетки рака печени, которые несут один или более маркеров поверхности клеток, выбранных из группы, которая состоит из ί'.Ό133. СЭ44 и СЭ90. и клеток рака печени, которые являются способными экспортировать краситель НоесЫ 33342.

Субъекты, которые нуждаются в лечении рака печени, представляют собой индивидуумов, диагностированных с раком печени. Рак печени может быть впервые возникшим или представлять собой рецидив. Приемлемые субъекты включают индивидуумов с повышенной концентрацией РС в крови, индивидуумов, рак печени которых не способен к лечению другими способами, например у индивидуумов с неоперабельными опухолями или у индивидуумов, у которых другие типы терапии были неуспешными, и у индивидуумов, получающих другое лечение от рака печени, включая хирургическую резекцию, химиотерапию, химиоэмболизацию, лучевую терапию или терапию на основе антител при использовании антитела, отличного от анти-РС антитела в соответствии с настоящей заявкой. Приемлемые субъекты также включают индивидуумов, которые прежде подвергались лечению от рака печени и которые после периода ремиссии имеют рецидивирующий рак печени. Рак печени может быть на любой стадии развития. Субъект может представлять собой человека или животное, отличное от человека, включая одомашненное и неодомашненное животное.

Анти-РС лечение может назначаться в виде монотерапии или в комбинации с или дополнительно к одному или более другим способам лечения рака печени. Другие способы лечения включают, без ограничения, хирургическую резекцию и лечение с помощью второго терапевтического агента, такого, как химиотерапевтический агент, агент для облучения или антитело, как описывается в данной заявке. Комбинационное лечение, как обеспечивается в данной заявке, вовлекает введение по крайней мере двух способов лечения пациенту, один из которых представляет собой анти-РС лечение с помощью по крайней мере одного анти-РС антитела, и второй из которых представляет собой лечения при использовании терапевтического агента или процедуры.

Анти-РС лечение может сочетаться с хирургическими процедурами, такими как хирургическое удаление или чрескожная экстирпация. Анти-РС антитела могут вводиться субъектам с первичным или рецидивирующим раком печени в комбинации с хирургическим удалением или чрескожной экстирпацией поврежденной(ых) части(ей) печени. Анти-РС лечение может инициироваться перед, одновременно с, или после хирургического удаления.

Анти-РС лечение может также сочетаться с лучевой терапией. Лучевая терапия представляет собой применение излучения высоких энергий от рентгеновских лучей, гамма лучей, нейтронов, протонов и других источников для уничтожения раковых клеток и уменьшения размера опухолей. Излучение может исходить от устройства за пределами организма (дистанционная лучевая терапия), или оно может исходить от радиоактивного материала, помещенного в организм рядом с раковыми клетками (внутренняя лучевая терапия, или брахитерапия). Системная лучевая терапия использует радиоактивное вещество, такое, как радиоактивно меченное моноклональное антитело, которое мигрирует через кровь к тканям в организме. Лучевая терапия может также именоваться облучением и радиотерапией. Другие способы радиационной терапии также включают пространственную конформную лучевую терапию (3И-СКТ) и лучевую терапию с модулируемой интенсивностью (1МК.Т). Другие способы лучевой терапии также являются возможными. Лечение на основе анти-РС антитела может также сочетаться с химиотерапетвическим агентом. Химиотерапия представляет собой применение лекарственных средств на основе малых молекул, которые уничтожают (цитотоксические или цитоцидные) или предотвращают рост (цитостатические) раковые клетки. Для рака печени химиотерапевтические агенты часто сочетают с эмболизационным лечением, как, например, сочетание желатина для эмболизации и доксорубицина, митомицина или цисплатина в качестве химиотерапевтических агентов. Химиотерапевтические агенты включают, но без ограничения таковыми, токсины, которые также называются как цитотоксины или цитотоксические агенты, которые включают любой агент, который является разрушительным для жизнеспособности клеток, и липосомы или другие носители, содержащие химиотерапевтические соединения. Примеры приемлемых химиотерапевтических агентов включают, но без ограничения таковыми, токсины, которые также называются цитотоксинами или цитотоксическими агентами, которые включают любой агент, который является разрушительным для жизнеспособности клеток, липосомы или другие носители, содержащие химиотерапевтические соединения. Примеры приемлемых химиотерапевтических агентов включают, но без ограничения таковыми, 1-дегидротестостерон, 5-фторурацил декарбазин, 6-меркаптопурин, 6тиогуанин, актиномицин Ό, адриамицин, альдеслейкин, алкилирующие агенты, аллопуринол натрия, альтретамин, амифостин, анастразол, антрамицин (АМС), анти-митотические агенты, цис-дихлор диамин платина (II) (ИИР) цисплатин), диаминодихлор платина, антрациклины, антибиотики, антиметаболиты,

- 8 028515 аспарагиназу, ВСО живую (интравезикальную), бетаметазон фосфат натрия и бетаметазон ацетат, бикалутамид, блеомицин сульфат, бусульфан, лейковорин кальция, калихеамицин, капецитабин, карбоплатин, ломустин (ССЫИ), кармустин (ΒδΝυ), хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, колхицин, конъюгированные эстрогены, циклофосфамид, циклотосфамид, цитарабин, цитарабин, цитохалазин В, цитоксан, дакарбазин, дактиномицин, дактиноцин (бывший актиномицин), даунорубицин НСЬ, даунорубицин цитрат, денилейкин дифтитокс, дексразоксан, дибромоманнитол, дигидрокси антрацин дион, доцетаксел, доластерон мезилат, доксорубицин НСЬ, дронабинол, Ь-аспарагиназу Е. сой, эметин, эпоэтин-α, Ьаспарагиназу Εηνίηία. эстерифицированные эстрогены, эстрадиол, эстрамустин фосфат натрия, бромид этидия, этинил эстрадиол, этидронат, этопозид цитророрум фактор, этопозид фосфат, филграстим, флоксуридин, флуконазол, флударабин фосфат, фторурацил, флутамид, фолиновую кислоту, гемцитабин НСЬ, глюкокортикоиды, гозерелин ацетат, грамицидин Ό, гранисетрон НСЬ, гидроксимочевину, идарубицин НСЬ, ифосфамид, интерферон а-2Ь, иринотекан НСЬ, летрозол, лейковорин кальция, лейпролид ацетат, левамизол НСЬ, лидокаин, ломустин, майтансиноид, мехлорэтамин НСЬ, медроксипрогестерон ацетат, мегестрол ацетат, мелфалан НСЬ, меркаптипурин, месна, метотрексат, метилтестостерон, митрамицин, митомицин С, митотан, митоксантрон, нилутамид, октреотид ацетат, ондансетрон НСЬ, оксалиплатин, паклитаксел, памидронат динатрия, пентостатин, пилокарпин НСЬ, плимицин, полифепросан 20 с имплантатом кармустина, порфимер натрия, прокаин, прокарбазин НСЬ, пропранолол, ритуксимаб, сарграмостин, стрептозотоцин, тамоксифен, таксол, тегафур, тенипозид, тенопозид, тестолактон, тетракаин, тиотепа хлорамбуцил, тиогуанин, тиотепа, топотекан НСЬ, торемифен цитрат, трастузумаб, третиноин, валрубицин, винбластин сульфат, винкристин сульфат и винорелбин тартрат.

Анти-РО антитела могут также вводиться с комбинацией химиотерапевтических агентов. Типичные комбинации химиотерапевтических агентов включают 5-фторурацил (5Ρυ) в сочетании с лейковорином (фолиновая кислота или ЬУ); капецитабин в сочетании с урацилом (ЦЕТ) и лейковорином; тегафур в сочетании с урацилом (ЦЕТ) и лейковорином; оксалиплатин в сочетании с 5ЕЦ или в сочетании с капецитабином; иринотекан в сочетании с капецитабином, митомицин С в сочетании с 5ЕЦ, иринотеканом или капецитабином. Другие комбинации химиотерапевтических агентов и других терапевтических агентов также являются возможными. Стандартные режимы дозирования для химиотерапевтических агентов, используемые для пациентов, которые имеют рак печени, могут использоваться в способах настоящей заявки. Как является известным в соответствующей области техники, химиотерапевтические режимы для рака печени, использующие комбинации различных химиотерапевтических агентов, были стандартизованы в клинических исследованиях; см. Ь1оус1 и др., выше, для обзора клинических исследований при использовании химиотерапевтических агентов.

Анти-РО антитела могут также использоваться в комбинации с другими антителами, включая, но без ограничения таковыми, моноклональные антитела, которые непосредственно или опосредованно уничтожают, замедляют или останавливают рост раковых клеток. Такие антитела могут функционировать с помощью множества различных механизмов. Например, некоторые антитела могут маркировать раковые клетки для атаки иммунной системой пациента посредством антителозависимой опосредованной клетками цитотоксичности (АЭСС) или других механизмов. Предполагается, что ритуксимаб (Ритуксан®), который связывает СЭ20 антиген, находится на В клетках, и эдреколомаб, который связывает 17-1А антиген, функционирует этим путем. Другие антитела связывают и изменяют или ингибируют функцию антигенов, которые являются необходимыми раковым клеткам для выживания и/или роста. Ряд антител, как предполагается, функционирует таким образом, включая, например, цетуксимаб (Эрбитукс®) и панитумумаб (Вектибикс®), каждый из которых связывает ЕОЕ рецептор (БОЕК); и бевацизумаб (ΑνακΙίη®), который связывается с ростовым фактором УЕОЕ. Другие механизмы также являются возможными, а определенные антитела могут быть способными работать с помощью одного или более механизмов действия. Другие антитела могут быть конъюгированными с радиоактивными или хемотоксическими остатками и нацеливать их на раковые клетки, которые предпочтительно экспрессируют антигены, которые специфически узнаются антителами.

Анти-РО антитело и второй агент могут вводиться одновременно, последовательно или раздельно. Как используется в данной заявке, говорят, что анти-РО антитело и второй агент вводятся последовательно, если они вводятся пациенту в тот же день, например, во время того же визита пациента. Последовательное введение может осуществляться спустя 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 ч. В противовес этому, говорят, что анти-РО антитело и второй агент вводятся раздельно, если они вводятся пациенту в различные дни, например анти-РО антитело и второй терапевтический агент могут вводиться с интервалами в 1, 2 или 3 дня, 1, 2 недели или с месячными интервалами. В способах настоящей заявки введение анти-РО антитела в соответствии с настоящей заявкой может предшествовать введению второго агента или следовать за ним. В качестве неограничивающего примера, анти-РО антитело и второй агент могут вводиться одновременно в течение определенного периода времени, после этого на протяжении второго периода времени введение анти-РО антитела и второго агента чередуют.

7.7. Способы предотвращения рецидивов рака печени.

В другом аспекте настоящая заявка обеспечивает способ предотвращения рецидива рак печени,

- 9 028515 включающий введение эффективного количества анти-РО антитела субъекту, который нуждается в предотвращении. Способы предотвращения рецидива рака печени в соответствии с настоящей заявка осуществляются путем введения одного или более анти-РО антитела, способного нейтрализовать РО, описанного подробно в разделе 7.11, индивидуумам с риском рецидива рака печени.

Субъекты, которые нуждаются в предотвращении рецидива рака печени, представляют собой индивидуумов, которые ранее подвергались лечению от рака печени, которые имеют риск развития рака печени, но при этом не были вновь диагностированы с раком печени. Приемлемые субъекты включают индивидуумов, которые ранее подвергались лечению от рака печени с помощью каких либо способов, включая хирургическую резекцию, химиотерапию или любой иной способ терапии.

Эффективное предотвращение рецидива рака печени включает, но без ограничения, полное и длительное отсутствие рецидива рака печени. В некоторых воплощениях эффективное предотвращение измеряется с помощью отсутствия опухолей рака печени или стволовых клеток рака печени в образцах, полученных от субъекта, который имеет риск рецидива рака печени. В некоторых воплощениях эффективное предотвращение определяется с помощью отсутствия повышения концентрации РО в крови у субъекта, имеющего риск возникновения рецидива рака печени.

Анти-РО лечение может вводиться в виде монотерапии или в комбинации с или дополнительно к одному или более другим способам лечения рака печени. Другие способы лечения включают, без ограничения, хирургическую резекцию и лечение с помощью второго терапевтического агента, такого, как химиотерапевтический агент, агент для облучения или антитело, как описывается в данной заявке. Комбинационное лечение, как обеспечивается в данной заявке, вовлекает введение по крайней мере двух способов лечения пациенту, один из которых представляет собой анти-РО лечение с помощью по крайней мере одного анти-РО антитела, а второй представляет собой лечения при использовании терапевтического агента или процедуры. Анти-РО антитело и второй агент могут вводиться одновременно, последовательно или раздельно. Как используется в данной заявке, говорят, что анти-РО антитело и второй агент вводятся последовательно, если они вводятся пациенту в тот же день, например, во время того же визита пациента. Последовательное введение может осуществляется спустя 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 ч. В противовес этому, говорят, что анти-РО антитело и второй агент вводятся раздельно, если они вводятся пациенту в различные дни, например анти-РО антитело и второй терапевтический агент могут вводиться с интервалами в 1, 2 или 3 дня, 1, 2 недели или с месячными интервалами. В способах настоящей заявки введение анти-РО антитела в соответствии с настоящей заявкой может предшествовать введению второго агента или следовать за ним. В качестве неограничивающего примера, анти-РО антитело и второй агент могут вводиться одновременно в течение определенного периода времени, после этого на протяжении второго периода времени введение анти-РО антитела и второго агента чередуют.

7.8. Фармацевтические композиции.

Анти-РО антитела, полезные в способах в соответствии с настоящей заявкой, могут быть включены в композицию. Необязательно, композиции могут включать один или более дополнительный(ых) терапевтический(их) агент(ов), таких как второй агент, описанный выше. Композиции обычно будут поставляться как часть стерильной фармацевтической композиции, которая в норме будет включать фармацевтически приемлемый носитель. Такая композиция может находиться в любой приемлемой форме (в зависимости от желаемого способа введения ее пациенту). Анти-РО антитела могут вводиться индивидууму разнообразными путями, такими как пероральный, трансдермальный, подкожный, внутривенный, внутримышечный, интраокулярный, местный, интратекальный и интрацеребровентрикулярный. Наиболее приемлемый путь введения в любом конкретном случае будет зависеть от частного антитела, субъекта, а также природы и тяжести заболевания и физического состояния субъекта. Антитела могут быть включены в водный раствор, который вводятся путем подкожной инъекции. Фармацевтически приемлемые носители для применения в заявке могут приобретать разнообразные формы в зависимости, например, от состояния, которое подвергается лечению, и пути введения. Фармацевтические композиции могут традиционно быть представлены в виде единичных дозированных форм, содержащих предварительно определенное количество анти-РО антитела на дозу. Такая единица может содержать, например, но без ограничения, от 5 мг до 5 г, например от 10 мг до 1 г, или от 20 до 50 мг анти-РО антитела на единичную дозу. Фармацевтические композиции могут включать анти-РО антитела, способные к связыванию более одного РО эпитопа. Альтернативно, фармацевтические композиции могут включать комбинацию антиРО антител, каждое из которых является способным к связыванию отличного РО эпитопа. Фармацевтические композиции в соответствии с данной заявкой могут быть получены для хранения в виде лиофилизированных композиций или в виде водных растворов путем смешивания антитела, обладающего достаточной степенью чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами, которые типично используются в области техники (они все обозначаются в данной заявке как носители), то есть буферными агентами, стабилизирующими агентами, консервантами, изотоническими агентами, неионными детергентами, антиоксидантами и другими вспомогательными добавками; см. Кешшд1оп'8 РЬатшасеийса1 8аспсс5. 16-е изд. (Οδοί, ред. 1980). Такие добавки должны быть нетоксическими для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях.

Буферные агенты помогают поддерживать рН в интервале, который приближен к физиологическим

- 10 028515 условиям. Они могут присутствовать при концентрации, которая колеблется в интервале от приблизительно 2 до приблизительно 50 мМ. Приемлемые буферные агенты для применения в настоящей заявке включают как органические, так и неорганические кислоты и их соли, такие как цитратные буферы (например, смесь цитрат мононатрия - цитрат динатрия, смесь лимонная кислота -цитрат тринатрия, смесь лимонная кислота - цитрат мононатрия и т.д.), сукцинатные буферы (например, смесь янтарная кислота сукцинат мононатрия, смесь янтарная кислота - гидроокись натрия, смесь янтарная кислота - сукцинат динатрия и т.д.), тартратные буферы (например, смесь винная кислота - тартрат натрия, смесь винная кислота - тартрат калия, смесь винная кислота - гидроокись натрия и т.д.), фумаратные буферы (например, смесь фумаровая кислота - фумарат мононатрия, смесь фумаровая кислота - фумарат динатрия, смесь фумарат мононатрия - фумарат динатрия и т.д.), глюконатные буферы (например, смесь глюконовая кислота - глюконат натрия, смесь глюконовая кислота - гидроокись натрия, смесь глюконовая кислота - глюконат калия и т.д.), оксалатный буфер (например, смесь щавелевая кислота - оксалат натрия, смесь щавелевая кислота - гидроокись натрия, смесь щавелевая кислота - оксалат калия и т.д.), лактатные буферы (например, смесь молочная кислота - лактат натрия, смесь молочная кислота - гидроокись натрия, смесь молочная кислота - лактат калия и т.д.) и ацетатные буферы (например, смесь уксусная кислота - ацетат натрия, смесь уксусная кислота - гидроокись натрия и т.д.). Дополнительно могут использоваться фосфатные буферы, гистидиновые буферы и соли триметиламина, такие как Трис. Консерванты могут прибавляться для задержки микробного роста, при этом они могут прибавляться в количествах, которые колеблются в интервале от 0,2 до 1% (вес./об.). Приемлемые консерванты для применения в настоящей заявке включают фенол, бензиловый спирт, мета-крезол, метил парабен, пропил парабен, октадецилдиметилбензил аммоний хлорид, галиды бензалкония (например, хлорид, бромид и иодид), хлорид гексаметония и алкил парабены, такие как метил или пропил парабен, катехол, резорцинол, циклогексанол и 3-пентанол. Изотонические агенты, которые иногда являются известными как стабилизаторы, могут прибавляться для обеспечения изотоничности жидких композиций в соответствии с настоящей заявкой и включают многоатомные сахарные спирты, например трехатомные или более высокие сахарные спирты, такие как глицерин, эритритол, арабитол, ксилитол, сорбитол и маннитол. Стабилизаторы относятся к широкой категории наполнителей, которые могут варьировать по своей функции от объемообразующего агента до добавки, которая солюбилизирует терапевтический агент или помогает предотвратить денатурацию или приклеивание к стенке контейнера. Типичные стабилизаторы могут представлять собой многоатомные сахарные спирты (перечислены выше); аминокислоты, такие как аргинин, лизин, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аланин, орнитин, Ь-лейцин, 2-фенилаланин, глутаминовая кислота, треонин, и т.д., органические сахара или сахарные спирты, такие как лактоза, трегалоза, стахилоза, маннитол, сорбитол, ксилитол, рибитол, миоинозитол, галактитол, глицерол и тому подобное, включая циклитолы, такие как инозитол; полиэтиленгликоль; аминокислотные полимеры; содержащие серу восстанавливающие агенты, такие как мочевина, глутатион, липоевая кислота, тиогликолат натрия, тиоглицерол, α-монотиоглицерол и тиосульфат натрия; полипептиды с низким молекулярным весом (например, пептиды из 10 остатков или меньше); белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, бычий сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; моносахариды, такие как ксилоза, манноза, фруктоза, глюкоза; дисахариды, такие как лактоза, мальтоза, сахароза и трисахариды, такие как раффиноза; и полисахариды, такие как декстран. Стабилизаторы могут присутствовать в интервале от 0,1 до 10000 вес.ч. на весовую часть активного белка.

Неионные поверхностно-активные вещества или детергенты (также известные как смачивающие агенты) могут прибавляться для того, чтобы помочь солюбилизировать терапевтический агент, а также для того, чтобы защитить терапевтический белок от индуцированной перемешиванием агрегации, что также помогает композиции подвергаться сдвигу поверхности без денатурации белка. Приемлемые неионные поверхностно-активные вещества включают полисорбаты (20, 80 и т.д.), полиоксамеры (184, 188 и т.д.), полиолы Плюроника, моноэтеры полиоксиэтилен сорбитана (ТВИН®-20, ТВИН®-80 и т.д.). Неионные поверхностно-активные вещества могут присутствовать в интервале от приблизительно 0,05 до приблизительно 1,0 мг/мл, например от приблизительно 0,07 до приблизительно 0,2 мг/мл. Дополнительные разнообразные наполнители могут включать объемообразующие агенты (например, крахмал), хелатирующие агенты (например, ЭДТА), антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, метионин, витамин Е) и сорастворители.

Анти-РО антитела могут вводиться отдельно или в виде смесей одного или более отдельных антиРО антител, в смеси или комбинации с другими агентами, полезными для лечения рака печени. Примеры приемлемой комбинации и дополнительных способов терапии обеспечиваются выше.

7.9. Эффективные дозировки.

Анти-РО антитела в соответствии с настоящей заявкой или их композиции будут в общем случае использоваться в количестве, эффективном для достижения предполагаемого результата, например в количестве, эффективном для лечения рака печени у субъекта с раком печени, или в количестве, эффективном для предотвращения рецидива у субъекта, имеющего риск рецидива рака печени. Эффективное

- 11 028515 количество представляет собой количество, которое обеспечивает терапевтическое преимущество. В контексте способов лечения рака печени терапевтическое преимущество означает любую тенденцию к частичному или полному лечению рака печени. Терапевтическое преимущество может быть подтверждено с помощью любого из следующих показателей, взятых отдельно или в комбинации: уменьшение размера, количества или морфологии (например, инкапсулированная против инвазивной) печеночных опухолей; устранение опухолей печени; уменьшение тяжести рака печени; индукция ремиссии рака печени; остановка или задержка обострения симптомов или признаков, ассоциированных с раком печени; повышение комфортности для пациента, уменьшение боли пациента; уменьшение и устранение количества клеток боковой популяции, клеток рака печени, которые несут один или более маркеров поверхности клеток СЭ133, СЭ44 или СЭ90, или стволовых клеток рака печени; снижение концентрации РС в крови у субъекта с раком печени. Размер опухоли, количество и метаболизм опухолей могут измеряться при использовании различных методик сканирования, таких как, но без ограничения таковыми, КТ, ЯМР, функциональную ЯМР, ОФЭКТ и ПЭТ, а также других способов, известных среднему специалисту в данной области техники. Полное излечение, хотя и является желательным, не требуется для существования терапевтического преимущества.

В контексте предотвращения рецидива рака печени терапевтическое преимущество означает любую тенденцию к частичному или полному повторному возникновению или повторному росту рака у субъекта в течение некоторого времени после того, как рак был определен. Терапевтическое преимущество может быть подтверждено с помощью любого из следующих методов, взятых отдельно или в комбинации: поддержание ремиссии рака печени; повышение прогнозируемой длительности жизни субъекта; отсрочка роста опухолей печени; ингибирование роста стволовых клеток рака печени, клеток боковой популяции или клеток рака печени, которые несут один или более маркеров поверхности клеток С.П133. С.П44 или С.П90; снижение количества или устранение боковой популяции клеток, клеток рака печени, которые несут один или более маркеров поверхности клеток СЭ133, С.П44 или СЭ90, или стволовых клеток рака печени.

В некоторых случаях терапевтическое преимущество может коррелировать с одной или более идентифицирующих конечных точек в соответствии со знаниями среднего специалиста в данной области техники. В качестве примера, но не в качестве ограничения, концентрации РС в плазме и/или сыворотке могут измеряться у субъекта в течение периода времени, при этом снижение уровней РС или уровня, ниже порогового значения, например ниже приблизительно 50, 40, 30, 20, 10 или 5 пМ, что является показательным для терапевтического преимущества. В других воплощениях терапевтическое преимущество композиции анти-РС антитела может определяться с помощью его способности уничтожать раковые стволовые клетки, ингибировать рост или пролиферацию стволовых раковых клеток, или повышать апоптоз стволовых раковых клеток. Как обсуждается в где-либо в данной заявке, стволовые клетки рака печени могут быть идентифицированы как такие, которые имеют одну или более фенотипические характеристики, которые ассоциируются с раковыми стволовыми клетками, включая, но без ограничения таковыми, экспрессию некоторых клеточных маркеров, способность к росту в виде сфероидов в условиях культивирования при низком прикреплении, и способность инициировать рост новой опухоли после трансплантации.

Связывание всего свободного РС не требуется для достижения терапевтической эффективности. Свободный РС означает РС, который является доступным для связывания с помощью анти-РС антитела. Более того, снижение концентрации свободного РС в опухоли системно, в частности, в жидкостях организма или где-либо в другом месте, до более ограниченной степени, может также быть эффективным. Типичные ткани и жидкости организма, в которых концентрация свободного РС может снижаться путем введения композиции анти-РС антитела, описанного в данной заявке, включают, но без ограничения таковыми, образцы биопсии, удаленные у пациента, асцитную жидкость, жидкость из плевральных выпотов, цереброспинальную жидкость, лимфу, кровь, плазму, сыворотку и другие. Концентрация РС в одной или более этих тканях или жидкостях организма может количественно оцениваться при использовании методики ЕЬТЗЛ или других методик, известных среднему специалисту в данной области техники.

В соответствии со знанием среднего специалиста в данной области техники доза анти-РС антитела может быть оттитрована у пациента для того, чтобы снижать концентрацию свободного РС в ткани или жидкости организма, которые представляют интерес, в определенное время после введения по крайней мере приблизительно на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100%, или приблизительно на 5-10%, приблизительно 10-15%, приблизительно 15-20%, приблизительно 20-25%, приблизительно 25-30%, приблизительно 30-35%, приблизительно 35-40%, приблизительно 40-45%, приблизительно 45-50%, приблизительно 50-55%, приблизительно 55-60%, приблизительно 60-65%, приблизительно 65-70%, приблизительно 70-75%, приблизительно 75-80%, приблизительно 80-85%, приблизительно 85-90% или приблизительно 90-95%, или процентное снижение свободного РС колеблется между любыми из указанных выше значений. Композиции, включающие анти-РС антитела, могут вводиться индивидуумам (например, субъектам, которые представляют собой людей) в эффективных дозировках. Количество вводимого анти-РС антитела будет зависеть от разнообразных факторов, включая размер и вес пациентов, которые подвергаются лечению, форму, путь и сайт введения, режим лечения (например, используется ли второй

- 12 028515 терапевтический агент), возраст и состояние конкретного субъекта, которого подвергают лечению, чувствительность индивидуума к анти-РО антителам. Приемлемая дозировка может быть легко определена квалифицированным специалистом в данной области техники. В конечном итоге, лечащий врач будет определять приемлемые дозировки, которые используются. Эта дозировка может быть повторяемой так часто, как это является приемлемым. Если развиваются побочные эффекты, то количество и/или частота введения дозировки может изменяться или снижаться в соответствии с нормальной клинической практикой. Надлежащая дозировка и режим лечения могут устанавливаться путем мониторинга развития лечения при использовании традиционных методик, известных среднему специалисту в данной области техники. Эффективные дозировки могут оцениваться изначально из анализов ίη νίίτο. Например, начальная доза для применения у животных должна обеспечивать достижение такой концентрации анти-РО антитела в циркулирующей крови или сыворотке, которая находится на уровне или выше связывающей аффинности антитела для прогастрина, как измеряется ίη νίίτο. Расчет дозировок для достижения таких концентраций в циркулирующей крови или сыворотке с учетом биодоступности конкретного антитела находится в пределах способностей средних специалистов в области техники. Для руководства можно отослать читателя к части 1: Оепега1 Ргтар1е8 в Оообтан апб Ойшап'к ТНе РНагшасо1одюа1 Ва818 о£ ТНегареийс8, 11-е изд., Нагбшап, ЕО., и др., ред. МсОга\\-НП1 Рго£е88юиа1, и ссылкам, которые там приводятся. Начальные дозировки могут также оцениваться из данных ίη νίνΌ, например из животных моделей. Животные модели, полезные для исследования эффективности соединений для лечения рака печени, являются хорошо известными в области техники и включают, но без ограничения таковыми ксенотрансплантаты клеток гепатоклеточной карцины у мышей или других животных. Средний специалист в области техники может обычным образом адаптировать эту информацию для определения дозировок, приемлемых для введения человеку.

В специфических воплощениях внутривенная доза может быть определена для индивидуального субъекта путем измерения концентрации РО в сыворотке или плазме индивидуума несколько раз на протяжении периода времени от нескольких дней до нескольких недель перед лечением и подсчета количества анти-РО антитела, которое будет насыщающим, то есть количества, которое будет достаточным для связывания всего РО. Как будет оценено квалифицированными специалистами, количество какого-либо специфического антитела, необходимое для достижения насыщения для данной концентрации РО в плазме или сыворотке крови, будет зависеть, отчасти, от константы аффинности конкретного антитела. Способы подсчета насыщающих количеств для специфических анти-РО антител, которые представляют интерес, являются хорошо известными.

Для достижения насыщения может вводиться количество, которое является большим, чем подсчитанное насыщающее количество, например по крайней мере в 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- или даже 10 раз более высокое, чем подсчитанное насыщающее количество. Для способов введения, отличных от внутривенного, количество может доводиться на основе фармакокинетики и биодоступности, что является хорошо известным в данной области техники.

Эффективная доза анти-РО антитела в соответствии с заявкой может колебаться от приблизительно 0,001 до приблизительно 75 мг/кг на единичное (например, болюсное) введение, множественное введение или беспрерывное (например, инфузия) введение, или для достижения концентрации в сыворотке 0,01-5000 мкг/мл на одно введение, множественное введения или непрерывное введение, или может представлять любой эффективный интервал или значение в этих пределах в зависимости от состояния, которое подвергается лечению, способа введения и возраста, веса и состояния субъекта. В некоторых воплощениях каждая доза будет колебаться от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мг/кг; от приблизительно 0,25 до приблизительно 0,75 мг/кг; от приблизительно 0,5 до приблизительно 1 мг/кг; от приблизительно 1 до приблизительно 2 мг/кг; от приблизительно 1,5 до приблизительно 2,5 мг/кг; от приблизительно 2 до приблизительно 3 мг/кг; от приблизительно 2,5 до приблизительно 3,5 мг/кг; от приблизительно 3 до приблизительно 4 мг/кг; от приблизительно 3,5 до приблизительно 4,5 мг/кг; от приблизительно 4 до приблизительно 5 мг/кг; от приблизительно 5 до приблизительно 7 мг/кг; от приблизительно 6 до приблизительно 8 мг/кг; от приблизительно 7 до приблизительно 9 мг/кг; от приблизительно 8 до приблизительно 10 мг/кг; от приблизительно 10 до приблизительно 15 мг/кг; от приблизительно 12,5 до приблизительно 17,5 мг/кг; от приблизительно 15 до приблизительно 20 мг/кг; от приблизительно 17,5 до приблизительно 22,5 мг/кг; от приблизительно 20 до приблизительно 25 мг/кг; от приблизительно 22,5 до приблизительно 27,5 мг/кг; от приблизительно 25 до приблизительно 30 мг/кг; от приблизительно 30 до приблизительно 40 мг/кг; от приблизительно 35 до приблизительно 45 мг/кг; от приблизительно 40 до приблизительно 50 мг/кг; от приблизительно 45 до приблизительно 55 мг/кг; от приблизительно 50 до приблизительно 60 мг/кг; от приблизительно 55 до приблизительно 65 мг/кг; от приблизительно 60 до приблизительно 70 мг/кг; от приблизительно 65 до приблизительно 75 мг/кг. Другие интервалы дозировок также являются возможными.

Количество, частота и длительность введений будут зависеть от разнообразных факторов, таких как возраст, вес и состояние заболевания пациента. Анти-РО лечение является показанным у субъектов с раком печени, включая НСС и гепатобластому, либо первичную, либо рецидивирующую. Лечение назначается на любой стадии рака печени и, в частности, у индивидуумов, для которых трансплантация или

- 13 028515 хирургическое удаление не является доступным или является противопоказанным. Режим лечения для введения может продолжаться в течение 1 дня или более, 2 дней или более, 3 дней или более, 4 дней или более, 5 дней или более, 6 дней или более, 1 недели или более, от 2 недель до неопределенного времени, в течение от 2 недель до 6 месяцев, от 3 месяцев до 5 лет, от 6 месяцев до 1 года или 2 лет, от 8 месяцев до 18 месяцев, или подобных периодов времени. Необязательно режим лечения обеспечивается для повторяемого введения, например, один раз в день, два раза в день, через день, один раз в три дня, один раз в пять дней, один раз в неделю, один раз в две недели или один раз в месяц. Повторяемое введение может осуществлять при той же дозе или при отличной дозе. Введение может повторяться один раз, два раза, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз, семь раз, восемь раз, девять раз, десять раз или более. Терапевтически эффективное количество анти-РО антитела может вводиться в виде единичной дозы или на протяжении курса терапевтического режима, например в течение курса длительностью 1, 2, 3 недели, 1, 3, 6 месяцев, 1 год или дольше.

7.10. Способы мониторинга эффективности лечения.

Настоящая заявка также обеспечивает способы мониторинга субъекта, которого подвергают лечению с помощью анти-РО антитела, для определения, является лечение эффективным. Уровень РО может измеряться у пациента, который получает анти-РО лечение, и использоваться в качестве показателя, является ли лечение эффективным на основе того, что измеренный уровень является выше или ниже базового уровня РО; см., например, временную заявку США под номером 61/293557, которая называется Прогастрин и патологии печени, поданную 8 января 2010 г., и патентную заявку США под номером 12/984507 под названием Прогастрин и патологии печени, поданную 4 января 2011 г., содержание каждой из них является введенной в данную заявку в качестве ссылки. Эта информация может использоваться медицинским персоналом для решения вопроса о том, стоит ли продолжать введение анти-РО антитела или следует модифицировать лечение. Эти способы могут использоваться для мониторинга анти-РО лечения, отдельно или в комбинации с другими способами лечения, как описано выше.

Для целей мониторинга эффективности лечения уровни РО в крови, плазме или сыворотке могут измеряться в указанные моменты времени. Снижение концентрации в течение времени и/или в том случае, когда измеренный уровень ниже порогового значения в определенный момент времени, является показательным для эффективности. Пороговое значение может быть таким, как обсуждалось выше, или может представлять собой специфическое для субъекта значение, полученное от субъекта, который подвергается лечению, перед началом терапии, или в ранний момент времени во время проведения цикла терапии.

Не имея намерения быть связанным с определенной теорией операции, предполагается, что количество и/или размер опухолей у пациента снижаются в результате осуществления цикла терапии, когда общее количество РО, который вырабатывается опухолями, также снижается. В противовес этому, отсутствие существенного изменения или повышение уровней РО после завершения цикла терапии, могут свидетельствовать о том, что терапия не является эффективной. Эта информация может использоваться медицинским персоналом для решения, необходимо ли начинать новый цикл терапии.

Уровни РО могут измеряться при использовании методик, известных среднему специалисту в данной области техники, таких как, но без ограничения таковыми, К1А и ΕυδΛ. Анти-ЬРО антитела, полезные для измерения уровней РО человеческих субъектов, описываются в следующем разделе. Примеры анализов для измерения уровней РО описываются во временной патентной заявке США под номером N0. 61/293557, см. выше, примеры 1, 2.

В специфическом воплощении уровни РО могут измеряться при использовании сэндвич Ε^IδА с одним анти-РО антителом, нацеленным на ^терминальный конец прогастрина, и вторым анти-РО антителом, нацеленным на С-терминальный конец прогастрина. Типичные N и С-терминальные анти-РО антитела, полезные для такого сэндвич-анализа, описываются в разделе, приведенном ниже. В таком анализе готовят поверхность, такую, как ячейки в планшете на 96 ячеек, с которой связывается известное количество первого, иммобилизованного ^терминального или С-терминального анти-РО антитела. Исследуемый образец потом применяют к поверхности и выдерживают в течение периода инкубации. Поверхность потом промывают для удаления несвязанного антигена и применяют раствор, содержащий второе идентифицирующее анти-РО антитело, где идентифицирующее антитело связывает отличный эпитоп РО (например, иммобилизованное антитело представляет собой С-терминальное анти-РО антитело, а ^терминальное анти-РО антитело используют как идентифицирующее антитело, и наоборот). Уровни РО потом измеряют либо непосредственно (если, например, идентифицирующее антитело является конъюгированным со способной к определению меткой) или опосредованно (с помощью меченного вторичного антитела, которое связывает идентифицирующее анти-РО антитело). Для этого анализа антитела могут использоваться в избытке, так, что весь РО связывается и количественно оценивается. Специфический сэндвич-анализ для измерения уровней РО в плазме и/или сыворотке крови обеспечивается в примере 1.

Могут быть проведены многочисленные измерения при различных интервалах, после чего строится график для определения, существует ли определенная тенденция. В некоторых воплощениях зависимое от времени снижение концентрации РО крови свидетельствует о том, что лечение рака печени является

- 14 028515 эффективным. В неограничивающем примере уровни РО могут определяться при еженедельных, месячных или ежегодных интервалах тогда, когда пациент получает анти-РО антитела. Другие интервалы также являются возможными.

В воплощении, вовлекающем цикл терапии при использовании анти-РО антитела, одно или более измерений могут также осуществляться в процессе курса терапии так, что может оцениваться влияние антител на уровни РО. В других таких воплощениях, где у пациента присутствуют остаточные анти-РО антитела во время взятия образцов, данные могут демонстрировать снижение уровней РО благодаря секвестрации РО антителом, за которым следует повышение, поскольку этот эффект снижается, после этого происходит последующее снижение, если лечение было эффективным. В других воплощениях измерения после осуществления терапии могут осуществляться после того, как произведена оценка того, что антиРО антитела были выведены у пациента, так, что связывание РО таким антителом не оказывает влияния на точность определения концентрации РО.

В некоторых воплощениях способов уровень РО в одной или более жидкостях организма, таких как цельная кровь, плазма, сыворотка пациента, получающего лечение на основе анти-РО антитела, может измеряться и потом сравниваться с базовым уровнем. Типично, уровень РО представляет собой концентрацию РО в образце, выраженную в молярных количествах (М) или в молях/литр (моль/л). Уровень РО выше базового уровня является показательным для отсутствия эффективности лечения. В противовес этому, уровень РО, который равен или ниже базового уровня является показательным для эффективности лечения.

Могут использоваться различные базовые уровни, против которых сравниваются уровни РО, которые определяются у пациента. Базовый уровень может представлять собой одно значение или интервал значений. Базовый уровень может основываться на одном или более измерений, полученных от пациента, или основываться на измерениях РО в образцах от популяции индивидуумов. В некоторых воплощениях способов базовая линия представляет собой уровень РО одного и того же пациента, взятый при одном или более интервалах, например, перед началом анти-РО лечения, во время курса лечения или после того, как лечение закончено. В некоторых воплощениях базовая линия может представлять собой средний уровень РО в популяции индивидуумов с характеристиками, подобными тем, которые существуют у индивидуума, подвергающегося мониторингу. Такие характеристики могут включать, но не обязательно ограничены таковыми, как пол, возраст, тип и стадия рака печени, историю хирургических вмешательств, анти-РО лечение или другие способы лечения. В некоторых воплощениях базовая линия представляет собой специфический уровень РО, такой как приблизительно 50, приблизительно 40, приблизительно 30, приблизительно 20, приблизительно 10, приблизительно 5, приблизительно 2, приблизительно 1 пМ или даже ниже. В некоторых воплощениях базовая линия представляет собой интервал.

В других воплощениях базовая линия может быть получена средних уровней РО в популяции пациентов с характеристиками, подобными тем, которые существуют у пациента, подвергающегося мониторингу. Такие характеристики могут включать, но не обязательно ограничены таковыми, как пол, возраст, первичный тип рака, применение определенных способов лечения, любую комбинацию перечисленных выше и другие лечения. В других воплощениях при мониторинге определенного пациента может использоваться более одной базовой линии. Например, могут использоваться как присущая пациенту базовая линия, так и базовая линия, полученная из популяции. В некоторых воплощениях, в которых средняя концентрация РО у пациента с раком, который ранее подвергался лечению, находиться в пределах нормального интервала для релевантной популяции, с которой сравнивается пациент и остается стабильной, пациент будет оцениваться как такой, который не имеет рецидива и, таким образом, не требует нового лечения. В противовес этому, если концентрация РО повышается в течение периода у пациента, который ранее подвергался лечению, и в некоторых воплощениях превышает пороговое значение, полученное из данных популяции, может считаться как такой, который, возможно, имеет рецидив, и, таким образом является кандидатом для нового лечения от рецидива рака.

Поскольку потребление пищи обычно повышает синтез и секрецию гастрина, оно может также вызвать краткосрочное повышение уровней РО в крови, что может препятствовать точному измерению уровней РО у пациентов, которые подвергаются мониторингу. Для того чтобы избежать этого эффекта, в частности, тогда, когда определяют концентрацию РО в образцах крови, образцы могут быть взяты от пациента натощак или по прошествии достаточного времени после приема для того, чтобы временные влияния на концентрацию РО исчезли.

7.11. Анти-РО антитела.

Антитела, полезные в способах, раскрытых в данной заявке, являются такими, которые специфически связывают прогастрин по сравнению с другими продуктами прогастринового гена. Ссылаясь на фиг. 1, ген гастрина транслируется с образованием полипептида из 101 аминокислоты, который называется пре-прогастрином, содержащий сигнальную последовательность (подчеркнута), которая отщепляется с образованием прогастрина, полипептида из 80 аминокислот. Прогастрин, в свою очередь, расщепляется с образованием продукта из 34 аминокислот, соответствующей последовательности остатков 38-71 прогастрина, который потом удлиняется на своем карбокситерминальном конце с помощью остатка глицина, образуя удлиненный глицином О34 (О34-О1у) продукт. Побочный продукт этого расщепления пред- 15 028515 ставляет собой пептид, состоящий из б аминокислот, называемый С-терминальным фланкирующим пептидом, или СТРР, который соответствует последовательности остатков 75-80 прогастрина. О34-О1у потом дополнительно расщепляется с образованием полипептида из 17 остатков, соответствующего последовательности остатков 55-71 прогастрина и обозначается как О17-О1у. Удаление С-терминальных глицинов О34-О1у и О17-О1у, после чего осуществляется С-терминальное амидирование, обеспечивает О34 и О17 соответственно, которые оба являются С-терминально амидированными.

Как используется в данной заявке, антитело является высоко специфическим для ЬРО или высоко специфически связывает ЬРО, если оно связывается с полноразмерным прогастрином, но не связывается вообще с СТРР, амидированным гастрином или с удлиненным глицином гастрином, и является специфическим для ЬРО или специфически связывает ЬРО, если оно демонстрирует, по крайней мере, приблизительно в 5 раз большее связывание ЬРО, чем СТРР и других продуктов гастринового гена, как измеряется в стандартных анализах связывания. Специфический анализ ЕЫ8А, который может использоваться для оценки специфичности конкретного анти-ЬРО антитела, обеспечивается в примере 2.

Такие высоко специфические и/или специфические анти-ЬРО антитела (в данной заявке называются как анти-ЬРО антитела) могут быть поликлональными (анти-ЬРО РАЬ) или моноклональными (антиЬРО МАЬ ), хотя для терапевтических применений и, в некоторых случаях, диагностических или других ίη νίίΓΟ применений, моноклональные антитела являются предпочтительными.

Эпитоп, который связывается анти-ЬРО антителом, не является критическим. Полезные анти-ЬРО антитела могут связывать Ν-терминальный участок ЬРО, С-терминальный участок ЬРО или другой участок ЬРО. Недавно было продемонстрировано, что, по крайней мере, для моноклональных анти-ЬРО антител, выбор антигена, который используется для того, чтобы вызвать образование анти-ЬРО антител, может быть важным (см. международную заявку РСТ/ЕР2010/00б329, поданную 15 октября 2010 г., и заявку США № 12/90б041, поданную 15 октября 2010 г., раскрытие которых и, в частности, раскрытые анти-ЬРО антитела являются введенными в данную заявку в качестве ссылки; далее упоминаются как '329 и '041 заявки соответственно). Как раскрывается в заявках '329 и '041, не все антигены, которые имеют происхождение от ЬРО, стимулируют образование моноклональных антител, которые, в частности, связывают ЬРО при физиологических условиях. Действительно, некоторые антигены, которые успешно использовались для получения поликлональных анти-ЬРО антител, таких как полноразмерный рекомбинантный ЬРО (см., например, νΟ 08/07б454, которая относится к δίη§1ι) и пептид, соответствующий последним десяти аминокислотам на С-терминальном конце ЬРО (см. νΟ 07/135542, которая относится к Но11апбе и др.), были неуспешными для получения моноклональных антителах. Как указывается в '329 и '041 заявках, антигенные Ν-терминальные и С-терминальные последовательности в пределах ЬРО последовательности были идентифицированы как такие, которые могут использоваться для получения моноклональных антител, которые, в частности, связывают ЬРО. Интересно отметить, что необходимая антигенная последовательность не является ограниченной участками ЬРО последовательности, которые являются уникальными для нее. Пептидные антигены, имеющие участки последовательности наряду с другими продуктами гастринового гена, например О17, О34 и СТРР, обеспечивают получение моноклональных антител, которые не только связывают ЬРО, но связывают его специфически.

Анти-ЬРО антитела, получаемые при использовании пептидного антигена, имеющего последовательность, соответствующую Ν-терминальному участку ЬРО, и/или такие, которые связывают Νтерминальный участок ЬРО, называются в данной заявке Ν-терминальными анти-РО антителами. Специфический типичный антигенный участок ЬРО, который может использоваться для конструирования иммуногена, приемлемого для получения как поликлональных, так и моноклональных антител, специфических для ЬРО, соответствует остаткам 1-14 ЬРО: δVΚРКδ^^Р^ΑР^Ο (8ЕЦ ГО ΝΟ:25). Типичные иммуногены, полезные для получения Ν-терминальных анти-ЬРО антител, а также последовательности СГОК и У_Н и Уь Ν-терминальных анти-ЬРО моноклональных антител, полученные при использовании этих типичных иммуногенов, обеспечиваются в табл. 1А, приведенной ниже, и в разделе Примеры.

- 1б 028515

Таблица 1А

Ν-Терминальные анти-НРС моноклональные антитела

Иммуноген	Гибридома (депозит. №)	МАЬ	Последовательности мышиных СОК	Последовательности мышиных Ун и Уь	Гуманизированные последовательности Ун и V,, (прогнозируемые)
N1	43В9О11	МАЫ
N1	ΨΕ5Η2Ο7	МАЬ2
N2	6В5В11С10	МАЬЗ	Ун СБК1.3	ΟΥΙΡΤδΥΨ	(δΕΟ ίο N0:1)	тУн.З	(δΕΟ ГО N0.12)	ЬУн.З	(δΕΟ ГО N0:21)
			νΗ СОК 2.3	ΡΥΡΟΝδϋδ	(δΕΟ Ю N0:2)
			Ун СОК 3.3	τκκοδΡΟΥ	(δΕΟ ΙΟ N0:3)
			Уь СБК 1.3	ΟδίνΗδΝΟΝΤΥ	(δΕΟ ΙΟ N0:4)	тУь.З	(δΕΟ ГО N0:13)	ЬУь.З	(δΕΟ ГО N0:22)
			Уь СБК2.3	κνδ	(δΕΟ ΙΟ N0:5)
			Уь СБКЗ.З	ΡΟΟδΗΥΡΡΤ	(δΕΟ ΙΟ N0:6)
N2	20Б2СЗС2	МАЬ4	Ун СБК 1.4 ΟΥΤΡδδδΨ	(δΕΟ Ю N0:7)	тУн.4	(δΕΟ ГО N0:14)	ЬУН.4	(δΕΟ ГО N0:23)
			Ун СОК 2.4	ΡΕΡΟδΟδΤ	(δΕΟ ГО N0:8)
			Ун СОК 3.4	ΑΤϋΟΝΥΟΨΡΑΥ	(δΕΟ ΙΟ N0:9)
			Уь СОК 1.4	ΟδΕνΗδδΟνΤΥ	(δΕΟ ΙΟ N0:10)	тУь.4	(δΕΟ ГО N0:15)	ЬУь.4	(δΕΟ Ιθ N0:24)
			Уь СОК 2.4	κνδ	(δΕΟ ΙΟ N0:5)
			Уь СБК3.4	δ()δΤΗνΡΡΤ	(δΕΟ Ю N0:11)
N2	1Е9А4А4 (1-4376)	МАЫ 5
N2	1Ε9Ω9Β6	МАЫ 6	νΗ СОК 1.16	ΟΥΤΡΤδΥΥ	(δΕΟ ГО N0:39)	тУн. 16	(δΕΟ Ιθ N0:61)	ЬУн.16а	(δΕΟ ГО N0:84)
			νΗ СОК 2.16	ΙΝΡδΝΟΟΤ	(δΕΟ ГО N0:43)			ЬУН.16Ь	(δΕΟ Ιθ N0:86)
			νΗ СОК 3.16	ΤΚΟΟΥΥΡΡϋΥ	(δΕΟ Ю N0:47)			ЬУн.16с	(δΕΟ Ιθ N0:88)
			Уь СОК 1.16	Οδίτοδοοκτγ	(δΕΟ ГО N0:50)	тУь.16	(δΕΟ Ιθ N0:65)	ЬУь.16а	(δΕΟ ΙΟΝΟ:85)
			Уь СОК 2.16	ΙΨδ	(δΕΟ ГО N0:53)			ЬУь.16Ь	(δΕΟ ГО N0:87)
			Уь СОК3.16	ΨΟΟΤΗδΡΥΤ	(δΕΟ ГО N0:57)			НУь.16с	(δΕΟ Ιθ N0:89)
N2	1С8Б10Р5	МАЫ 7
N2	1А7СЗР11	МАЫ 8
N2	1ВЗВ4Р11	МАЫ 9	Ун СОК 1.19	ΟΥδΙΤδϋΥΑ	(δΕΟ ГО N0:40)	тУн.19	(δΕΟ Ιθ N0:62)	ЬУн.19а	(δΕΟ Ιθ N0:90)
			Ун СОК 2.19	ΙδΡδΟΥΤ	(δΕΟ ГО N0:44)			ЬУН.19Ь	(δΕΟ Ιθ N0:92)
			Ун СОК 3.19	ΑΚΕνΝΥΟϋδΥΗΡΟΥ	(δΕΟ ГО N0:48)			ЬУн.19с	(δΕΟ Ιθ N0:94)
			Уь СОК 1.19	δφΗΚΤΥΤ	(δΕΟ ГО N0:51)	тУь.19	(δΕΟ 1ϋΝΟ:66)	ЬУь.19а	(δΕΟ 1ϋΝ0:91)
			Уь СОК 2.19	νΚΚϋΟδΗ	(δΕΟ ГО N0:54)			ЬУь.19Ь	(δΕΟ Ιθ N0:93)
			Уь СОК 3.19	ΟνΟϋΑΙΚΟφδνΡν	(δΕΟ ГО N0:58)			ЬУь.19с	(δΕΟ Ιθ N0:95)
N2	1С11Р5Е8	МАЬ20

Иммуноген N1 = 8^КРК8^^Р^АР^С-АНx-Суδ-Β8А, также представленный как (8Ε^ ГО ΝΘ:25)-ΆΗχ^γδ-ΒδΆ.

Иммуноген N2 = 8^КРК8^^Р^АР^С-АНx-Суδ-К^Н, также представленный как (8Ε^ ГО N0:25)-АНx-Суδ-К^Н.

В табл. 1А все аминокислотные последовательности являются представленными при использовании традиционной Ν^ί' ориентации. Для каждого иммуногена прогастриновый пептид синтезировали при использовании С-терминального линкера одного остатка аминогексаноевой кислоты (АНх), после которого следует остаток цистеина (Сух), который потом конъюгируют с носителем, представленным либо бычьим сывороточным альбумином (В8А), либо гемоцианином лимфы улитки (КЬН), через линкерный остаток Сух.

Анти-НРС антитела, получаемые при использовании пептидного антигена, имеющего последовательность, соответствующую С-терминальному участку НРС, и/или такие, которые связывают Стерминальный участок НРС, называются в данной заявке С-терминальными анти-РС антителами. Специфический типичный антигенный участок НРС, который может использоваться для конструирования иммуногена, полезного для получения как поликлональных, так и моноклональных С-терминальных анти-НРС антител, соответствует остаткам 55-80 НРС: ^СР^^ΕΕΕΕΕАΥС^Μ^ΡСККδАΕ^ΕN (8Ер ГО N0:27). Типичные иммуногены, включая этот антиген, полезные для получения С-терминальных антиНРС антител, а также последовательностей СОК и У_Н и У_Е С-терминальных анти-НРС моноклональных антител, полученные при использовании этих типичных иммуногенов, обеспечиваются в табл. 1В, приведенной ниже, и в разделе Примеры.

- 17 028515

Таблица 1В

С-Терминальные анти-ЬРС моноклональные антитела

Иммуноген	Гибридома (депозит. №)	МАЬ	Последовательности мышиных СОК	Последовательности мышиных Ун и Уь	Г уманизированные последовательности Ун и УЕ (прогнозируемые)
С1	1В4А1ГО11 (1-4371)	МАВ5
С1	1В6А11Р2 (1-4372)	МАЬб
С1	1В11Е4В11 (1-4373)	МАЬ7
С1	1СЮОЗВ9	МАВ8	νΗ СОК. 1.8	ΟΡΤΡΤΤΥΑ	(δΕζ) ГО N0:37)	шУн.8	(8Еф ГО N0:59)	ЬУн.8а	(δΕφ ГО N0:75)
			νΗ СОК 2.8	ΙδδΟΟΤΥΤ	(5Εφ ТО N0:41)			ЬУН.8В	(δΕςΐΟΝΟ:77)
			Ун СОК 3.8	ΑΤφΟΝΥδΙΠΡ	(δΕφ Ю N0:45)			ЬУн.8с	(δΕφΙϋΝΟ:79)
			УЬСОК 1.8	ΚδΕΚΗΤΚΟΙΤΡ	(δΕφ ГО N0:49)	шУь.8	(δΕφ ТО N0:63)	НУь.8а	(δΕφ ГО N0:76)
			Уь СОК 2.8	φΜδ	(δΕφ Ю N0:52)			ΙϊΆ.δΒ	(δΕ(3ΙϋΝΟ:78)
			Уь СОК 3.8	А(ЖЕЬРЬТ	(δΕφ ГО N0:55)			ЬУь.8с	(ЗЕф ГО N0:76)
С1	ГО8Р5ВЗ	МАВ9
С1	1Е1С7В4	МАЫО
С1	2В4С8С8 (1-4374)	МАЫ 1
С1	2В11Е6О4 (1-4375)	МАЫ 2
С1	2С6СЗС7	МАЫЗ	νΗ СОК 1.13	ΟΡΙΡδδΥΟ	(8Εφ Ю N0:38)	шУн.13	(8Еф ГО N0:60)	ЬУн.13а	(ЗЕф ГО N0:80)
			νΗ СОК 2.13	ΙΝΤΡΟϋΚΤ	(3Εζ> ГО N0:42)			НУн.13Ь	(5Еф ГО N0:82)
			νΗ СОК 3.13	ακοτοτυ	(δΕφ Ю N0:46)
			VI. СОК 1.13	φδΕΕΟδΟΟΚΤΥ	(δΕφ ГО N0:50)	тУь.13	(δΕφ ГО N0:64)	ЬУЕ.13а	(ЗЕ<3 ГО N0:81)
			Уь СОК 2.13	ЬУ8	(δΕφ Ю N0:53)			ЬУь. 13В	(δΕφΙΟΝΟ:83)
			V,. СОК 3.13	ΨφΟΤΗΡΡφΤ	(δΕφ ГО N0:56)
С1	2Н9Р4В7	МАЫ 4
С2	1Р11Р5Е10	МАВ21
С2	1Р11Р5О9	МАВ22
С2	1А11Р2С9	МАВ23

Иммуноген С1 = КШ-Суз-АЬх-АЬх-рСР¹№ЕВВВВВА¥САМПЕСИИБЛЕПЕХ. также представленный как Κ^Η-Суδ-ЛЬx-ЛЬx-(8В^ ГО N0:27).

Иммуноген С2 = ПТ-Суз-АЬх-АЬх-рСР^ВВВВВВАУС^МПЕСНКЗАВОВЧ также представленный как ПТ-Суз-АЬх-АЬх-(8Вр ГО N0:27).

В табл. 1В все аминокислотные последовательности являются представленными при использовании традиционной N^0 ориентации. Для каждого иммуногена прогастриновый пептид синтезировали при использовании ^терминального линкера АЬх-АЬх-Суз, который потом конъюгируют с носителем, представленным либо гемоцианином лимфы улитки (ΚΤΗ), либо токсином дифтерии, через линкерный остаток Суз.

Специфические эпитопы, связанные с типичными анти-ЬРС моноклональными антителами МАЬ 1МАЬ 23, которые обеспечиваются в табл. 1А и 1В, картировали при использовании БР0Т методики и аланинового сканирования, как описывается у Тайпе и др., 2002, I. 1ттипо1. Ме1ЬоТз, 267: 53-70 и Тайпе, 1997, I. Вю1. СЬет., 272: 30937-30944 соответственно (см. также пример 6 заявки '329). В методике БР0Т пептидные последовательности из 15 аминокислот, охватывающие путативный эпитоп, получали и переносили на нитроцеллюлозные фильтры, которые потом подвергали зондированию с исследуемым антителом для определения минимальной последовательности эпитопа, которая узнается этим антителом. Аланиновое сканирование использовали для определения остатков в пределах эпитопа, которые являются критическими для связывания антитела. Каждый остаток в пределах путативного эпитопа подвергали мутации, один за другим, до аланина, и содержащие аланин пептиды потом зондировали с исследуемым антителом. Для ^терминальных анти-ЬРС моноклональных антител МАЬ 1-4 и 15-20, эпитопы включали, по крайней мере, следующие последовательности: ЭАРЬС (БВр ГО N0:28), РЭАРЬС (БВр ГО N0:29), РКБРРРО (БВр ГО N0:30), \\'КРРБО(44) (БВр ГО N0:31) или УКРРБО(44 )·\Ι4 Λ ι (БВр ГО N0:32), как показано в табл. 2А, приведенной ниже.

Таблица 2А

РС пептидны й антиген: 3ΝΚΡΗ3β ΟΡϋΑΡΣα	РС пептидный антиген: ЗИКРКЗОСРПАРЬб	8Е<2 ГО ΝΟ
МАЬ2	ИКРКЗОаРОАРЬС	32
МАЬ4	икррзоороарьс	32
МАЫ	РЭАРЬС	29
МАЬЗ	РАРЬС	28
МАЫ 7	икркзсоро	31
МАЫ 8	ΜΚΡΡ5ζ)<2Ρ0	31
МАЫ 9	ИКРР300РО	31
МАЬ20	ν?ΚΡΡ5£)ζ)Ρ0	31
МАЫ 5	ΡΚ3ζ)ζ)Ρ0	30
МАЫ 6	ΡΡ3ζ)ζ)Ρ0	30

- 18 028515

Для С-терминальных анти-ПРО моноклональных антител МЛЬ 5-7, 9-12, 14 и 21-23 эпитопы включали, по крайней мере, следующие последовательности: РОКК (8Е^ ΙΌ N0:33), МОРОК (8Е^ ΙΌ N0:34), АЕ^ЕN (8Е^ ΙΌ N0:35), и О^МОРОКК (8Е^ ΙΌ N0:36), как показано в табл. 2В, приведенной ниже.

Таблица 2В

МАЬ#	РС пептидный антиген: ОСР\УЬЕЕЕЕЕАУС\УМОРСКК8АЕ ϋΕΝ	8Е<2 ГО ΝΟ
МАЫ4	симэгскк	36
МАЫ1	МБЕСК	34
МАЬ5	ЕСКЕ	33
МАЬб	ЕСКК	33
МАЬ7	ЕСКК	33
МАЬ9	ЕСКК	33
МАЫО	ЕСКК.. Е	33
МАЫ2	ЕСКК	33
МАЬ23	ΑΕϋΕΝ	35

Эксперименты по картированию эпитопов выявили, что анти-ПРО МАЬ 2 и МАЬ 4 связывают тот же эпитоп; анти-ПРО МАЬ 1 и МАЬ 3 связывают приблизительно тот же эпитоп; МАЬ 17, МАЬ 18, МАЬ 19 и МАЬ 20 связывают приблизительно тот же эпитоп; МАЬ 15 и МАЬ 16 связывают приблизительно тот же эпитоп; анти-ПРО МАЬ 5, МАЬ 6, МАЬ 7, МАЬ 9 и МАЬ 12 связывают тот же эпитоп и связывают приблизительно тот же эпитоп, что и анти-ПРО МАЬ 10; и анти-ПРО МАЬ 11 и МАЬ 14 связывают приблизительно тот же эпитоп.

Специфические воплощения ^терминальных анти-РО антител, полезных в способах и наборах, описанных в данной заявке, включают антитела, которые связывают эпитоп, включающий остатки 10-14 ПРО (8Е^ ΙΌ N0:28), остатки 9-14 ПРО (8Ер ΙΌ N0:29), остатки 4-10 ПРО (8Ер ΙΌ N0:30), остатки 2-10 ПРО (ЗЕ^ ΙΌ N0:31) или остатки 2-14 ПРО (8Е^ ΙΌ N0:32).

Специфические воплощения С-терминальных анти-РО антител, полезных в способах и наборах, описанных в данной заявке, включают антитела, которые связывают эпитоп, включающий остатки 71-74 ПРО (8Е^ ΙΌ N0:33), остатки 69-73 ПРО (8Е^ ΙΌ N0:34), остатки 76-80 ПРО (8Е^ ΙΌ N0:35), или остатки 67-74 ПРО (8Е^ ΙΌ N0:36). ^терминальные и С-терминальные анти-ПРО антитела, полезные в способах и наборах, описанных в данной заявке, в дополнение к тем, которые обеспечиваются в табл. 1А и 1В, могут быть идентифицированы в конкурентных анализах связывания с типичными МАЬ 1-23, или с другими эталонными антителами, которые связывают N или С-терминальные эпитопы, как будет описано более подробно в разделе, приведенном ниже.

Как также описано в заявках '329 и '041, не все анти-ПРО антитела, даже те, которые демонстрируют высокую степень специфичности и аффинности для ПРО, нейтрализуют биологическую активность ПРО. Например, несмотря на то, что анти-ПРО МАЬ 14 связывает ПРО со значением К_о приблизительно 6 пМ, оно не ингибировало, по крайней мере, при исследуемых концентрациях, рост клеток колоректального рака в анализе го νίίτο, в то время как другие анти-ПРО моноклональные антитела демонстрировали значительную ингибиторную активность (см., например, пример 7 заявки '329). В то время как оба как ненейтрализующее, так и нейтрализующее антитело, которые, в частности, связывают ПРО, являются полезными для диагностических способов и способов мониторинга, описанных в данной заявке, анти-ПРО антитела, полезные для терапевтических способов, будут демонстрировать нейтрализующую активность.

Как используется в данной заявке, нейтрализующее анти-ПРО антитело представляет собой антиПРО антитело, которое обеспечивает статистически значимое снижение количества живых НиП7 клеток в исследуемом образце, обработанном с помощью анти-ПРО антитела, по сравнению с контрольным образцом, обработанным с помощью неспецифического антитела. Специфический анализ для оценки способности какого-либо конкретного анти-ПРО антитела нейтрализовать ПРО описывается в примере 3. Те анти-ПРО антитела, которые демонстрируют, по крайней мере, приблизительно 50% снижение количества живых клеток в этом анализе, предполагаются как особенно полезные в лечении рака печени, несмотря на то, что анти-ПРО антитела, демонстрирующие более низкие уровни нейтрализующей активности, например статистически значимое снижение 40, 30, 20, 15 или даже 10% количества живых клеток в этом анализе, предполагаются как такие, которые обеспечивают терапевтические преимущества.

В соответствии с этим в некоторых воплощениях, например терапевтических воплощениях, полезные анти-ПРО антитела являются нейтрализующими. Как раскрыто в заявках '329' и '041', способность анти-ПРО моноклонального антитела быть нейтрализующим не является зависимой от эпитопа, как N терминальные, так и С-терминальные анти-ПРО моноклональные антитела демонстрируют нейтрализующую активность в анализа с клетками колоректального рака, несущими мутацию в гене АРС. Таким образом, в некоторых специфических воплощениях нейтрализующие анти-ПРО антитела представляют собой ^терминальные нейтрализующие анти-ПРО антитела. В других воплощениях нейтрализующие анти-ПРО антитела представляют собой С-терминальные нейтрализующие анти-ПРО антитела.

Аффинность какого-либо специфического анти-ПРО антитела не является критической. Однако при некоторых применениях антитела, демонстрирующие аффинности, по крайней мере, приблизительно 1 мкМ, могут быть предпочтительными. Для терапевтических применений аффинность по крайней мере

- 19 028515 приблизительно 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,1, 0,01, 0,001 нМ или даже больше, может быть желательной. Измеренные аффинности анти-ИРС моноклональных антител, идентифицированных в табл. 1А и 1В, колеблются в интервале от 10^-6 до 10^-12 М, как показано в табл. 3, приведенной ниже.

Таблица 3

Моноклональное антитело	Аффинность (измеренное значение Ко)
МАЫ	2,5 мкМ (2,5 х 10'бМ)
МАЬ2	185 нМ (1,85 х 107 М)
МАЬЗ	6,4 нМ (6,4 х 10’9М)
МАЬ4	3,5 нМ (3,5 х 10'9М)
МАЬ5	13 пМ (1,30 х 10'“ М)
МАЬб	0,6 нМ (6,38 х 10'1иМ)
МАЬ7	58 пМ (5,84 х 10'11 М)
МАЬ8	0,1 нМ (1,08 х 10'ιυΜ)
МАЫ0	3,6 нМ (3,62 х 10'9 М)
МАЫ1	0,3 нМ (3,12 х 10’1θΜ)
МАЫ 2	0,4 нМ (4,43 х 10’1иМ)
МАЫЗ	0,6 нМ (6,12 х 10'1иМ)
МАЫ 4	6,8 пМ (6,86 х 10‘12М)
МАЫ 5	0,2 нМ(2,11 х 10’шМ)
МАЫ 6	0,2 нМ (2,78 х 10'*9 М)
МАЫ 7	8,3 нМ (8,29 х 10'9 М)
МАЫ 8	1,2 нМ (1,24 х ΙΟ’9 М)
МАЫ 9	0,7 нМ (7,79 х 10'шМ)
МАЬ20	0,2 нМ (2,47 х 10'1θΜ)
МАН21	3,9 нМ (3,90 х 10'9 М)
МАЬ22	5 нМ (4,94 х 10’9 М)
МАЬ23	0,4 мкМ (3,99 х 107 М)

Анти-РС моноклональное антитело, обладающее аффинностью, особенно приемлемой для конкретного желаемого применения, может быть легко выбрано из них, или получено, или сконструировано при использовании различных иммуногенов, последовательностей участка, определяющего комплементарность (СОК), последовательностей вариабельной тяжелой (У_Н) и вариабельной легкой (У_ь) цепи антиИРС антител, описанных в данной заявке. Аффинность какого-либо конкретного анти-РС моноклонального антитела может быть определена при использовании методик, хорошо известных в данной области техники или описанных в данной заявке, таких как, например, анализы ЕЫЗЛ, изотермальная титрационная калориметрия (1ТС), В1Асог, или анализы флуоресцентной поляризации. Специфический анализ обеспечивается в примере 4.

Как указано в табл. 1А и 1В, были идентифицированы некоторые Ν-терминальные и Стерминальные моноклональные анти-ИРС антитела. Все эти антитела являются специфическими для ИРС, как измеряется с помощью анализа, описанного в примере 2, и все они, за исключением МАЬ 14, демонстрируют нейтрализующую активность в анализах с клетками колоректального рака. Все эти антитела при проведении исследований с клетками рака печени (МАЬз 3, 8, 13, 16 и 19) демонстрировали нейтрализующую активность. Несколько гибридом, полезных для получения антител, были задепонированы 6 октября 2010 г. в Национальной коллекции культур микроорганизмов (СNСМ) (СNСМ, ΙικΙϊΐιιΙ РаЫенг, 25 гае ди 1)ос1еиг Коих, Р-75724 Рапз Седех 15, Ргапсе) в соответствии с Будапештским договором. Наименования гибридом, которые продуцируют анти-ИРС МАЬ 1-23, и регистрационные номера этих задепонированных гибридом, присвоенные коллекцией, обеспечиваются в табл. 1А и 1В. Кроме того, для некоторых из этих антител были определены их вариабельные тяжелые цепи (У_Н), участки, определяющие комплементарность вариабельных легких цепей (У_ь) и У_Н СОК. Эти аминокислотные последовательности и сокращенное наименование, которое используется для ссылки на них в заявке, также обеспечиваются в табл. 1А и 1В. Кратко, мышиные вариабельные домены тяжелой и легкой цепей обозначаются в данной заявке как тУ_Н и шУ_ь после чего приводится номер соответствующего моноклонального антитела, например шУ_Н-3 и шУ_ь-3 для вариабельной легкой и вариабельной тяжелой цепей анти-ИРС МАЬ 3 соответственно. Подобно этому, человеческие вариабельные домены тяжелой и легкой цепей обозначаются в данной заявке как ИУ_Н и ИУ_Ь после чего приводится номер соответствующего моноклонального антитела. Три СОК вариабельной тяжелой цепи и три СОК вариабельной легкой цепи обозначаются как У_Н СОК 1, 2 или 3 и У_ь СОК 1, 2 или 3 соответственно, после чего следует номер специфического анти-ИРС моноклонального антитела. Например, У_Н СОК 1 МАЬ 3 обозначается как У_Н СОК 1.3 и У_ь СОК 1 МАЬ 3 обозначается как У_ь СОК 1.3. У_Н СОК 2 МАЬ 3 обозначается как У_Н СОК 2.3, и У_ь СОК 2 МАЬ 3 обозначается как У_ь СОК 2.3.

Предполагается, что соответствующие СОК и/или У_Н и У_ь цепи анти-ИРС моноклональных антител, которые связывают приблизительно одинаковые эпитопы, могут быть взаимно заменены с получе- 20 028515 нием анти-ИРС моноклональных антител, полезных в способах и наборах, описанных в данной заявке. Например, как указано выше, типичные анти-ИРС моноклональные антитела МАЪ 5 и МАЪ 6 связывают один и тот же эпитоп. Анти-ИРС моноклональное антитело может быть сконструировано так, что включает в своей У[, цепи различные комбинации У_ъ СОК этих двух антител, и/или в своей У_Н цепи включает различные комбинации У_Н СОК этих двух антител. В качестве специфического неограничивающего примера для иллюстрации различных возможных комбинаций, такое антитело может включать в своей У_ъ цепи СОК 1 и 2 МАЪ 5 (У_ъ СОК 1.5 и У_ЪСОК 2.5 соответственно) и СОК 3 МАЪ 6 (У_ъ СОК 3.6), и в своей У_Н цепи, СОК 1 МАЪ 6 (У_Н СОК 1.6) и СОК 2 и 3 МАЪ 5 (У_Н СОК 2.5 и У_Н СОК 3.5 соответственно). Аминокислотные последовательности СОК антител (которые являются также известными как гипервариабельные участки), вырабатываемых гибридомами, которые были задепонированы, могут быть получены при использовании традиционных средств.

Как является известным в области техники, аминокислотное положение/очерченный границами гипервариабельный участок антитела может варьировать в зависимости от контекста и различных определений, известных в уровне техники. Некоторые положения в рамках вариабельного домена могут рассматриваться как гибрид гипервариабельных положений в том, что эти положения могут подразумеваться как такие, которые находятся в рамках гипервариабельного участка в соответствии с одним набором критериев, в то время как подразумеваются как такие, которые находятся за пределами гипервариабельного участка в соответствии с другим набором критериев. Одно или более из этих положений может также обнаруживаться в удлиненных гипервариабельных участках. Анти-РС антитела, описанные в данной заявке, могут содержать модификации в этих гибридных гипервариабельных положениях. Вариабельные домены нативных тяжелой и легкой цепей каждый включает четыре РК участка, главным образом, путем приобретения β-складчатой конфигурации, связанной тремя СОК, которые образуют петлю, соединяющую, а, в некоторых случаях, формирующую, часть β-складчатой структуры. СОК в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости с СОК из других цепей с помощью РК участков в таком порядке РК1-СОК1-РК2-СОК2-РК3-СОК3-РК4, и с СОК и осуществляют свой вклад в образование сайта целевого связывания антитела (см. КаЬа1 и др., δе^иеηсе5 о£ Рто1еш5 о£ 1штипо1одюа1 1п1еге51„ Ναΐίοηαΐ 1п5Ши1е о£ НеаИй, ВеШе5ба, Мб. 1987). Как используется в данной заявке, нумерация аминокислотных остатков иммуноглобулина осуществляется в соответствии с системой нумерации аминокислотных остатков иммуноглобулина КаЬа1 и др., если не указано другое. Со ссылкой на табл. 1 А, специфические воплощения Ν-терминальных анти-ИРС антител, полезных в способах и наборах, описанных в данной заявке, включают, но без ограничения таковыми, следующие:

(a) антитела, имеющие У_ъ СЭК5, которые соответствуют по последовательности У_ъ СЭК5 МАЪ 1, МАЪ 2, МАЪ 3, МАЪ 4, МАЪ 15, МАЪ 16, МАЪ 17, МАЪ 18, МАЪ 19 или МАЪ 20, и У_Н СШК которые соответствуют по последовательности У_Н СЭК5 МАЪ 1, МАЪ 2, МАЪ 3, МАЪ 4, МАЪ 15, МАЪ 16, МАЪ 17, МАЪ 18, МАЪ 19 или МАЪ 20;

(b) антитела, имеющие У_ъ СЭК5 и У_Н СЭК5, которые соответствуют по последовательности У_ъ и У_Н СОК5 МАЪ 1, МАЪ 2, МАЪ 3, МАЪ 4, МАЪ 15, МАЪ 16, МАЪ 17, МАЪ 18, МАЪ 19 или МАЪ 20;

(c) антитела, в которых:

(ί) У_ъ СОК 1 является выбранным из ΟδΙ\ΊΙδ\Ο\ΤΥ (У_ъ СОК 1.3; δΕΟ ΙΌ N0:4), ^δ^УНδδСУΤΥ (У_ъ СОК 1.4; δΕΟ ГО N0:10), ΟδΙ.Ι.Ι)δΐκ..ΚΤΥ (У_ъ СОК 1.16; δΕΟ ГО N0:50) и 80НКТУТ (У_ъ СОК 1.19; δΕΟ ГО N0:51);

(ίί) У_ъ СОК 2 является выбранным из Κ\δ (У_ъ СОК 2.3 или У_ъ СОК 2.4; δΕΟ ГО N0:5), Ε\δ (У_ъ СОК 2.16; δΕΟ ГО N0:53) и \ΊΜΜκ..δΙ I (У_ъ СОК 2.19; δΕΟ ГО N0:54);

(ίίί) У_ъ СОК 3 является выбранным из Р^СδНУΡРΤ (У_ъ СОК 3.3; δΕΟ ГО N0:6), δΟδΤΗ’^Τ (У_ъ СОК 3.4; δΕΟ ГО N0:11), \\'0С.Т1^1УТ (У_ъ СОК 3.16; δΕΟ ГО N0:57) и С.УС.1)Л1КСУ«\УУ (У_ъ СОК 3.19; δΕΟ ГО N0:58);

(ίν) У_Н СОК 1 является выбранным из ΟΥΙΡΥδΥΥ (У_Н СОК 1.3; δΕΟ ГО N0:1), ΟΥΤΡδδδΑ' (У_Н СОК 1.4; δΕΟ ГО N0:7), СΥТРТδΥΥ (У_Н СОК 1.16; δΕΟ ГО N0:39) и (..ΥδΙΤδΙίΥΆ (У_Н СОК 1.19; δΕΟ ГО N0:40);

(ν) У_Н СОК 2 является выбранным из РΥΡСNδ^δ (У_Н СОК 2.3; δΕΟ ГО N0:2), Р^ΡСδСδΤ (У_Н СОК 2.4; δΕΟ ГО N0:8), Е^^СТ (У_Н СОК 2.16; δΕΟ ГО N0:43) и IδРδСΥТ (У_Н СОК 2.19; δΕΟ ГО N0:44); и (νί) У_Н СОК 3 является выбранным из ΤКК^δΡ^Υ (У_Н СОК 3.3; δΕΟ ГО N0:3), ЛТОС.\У1ЖРЛУ (У_Н СОК 3.4 δΕΟ ГО N0:9), ТКССУУРРОУ (У_Н СОК 3.16; δΕΟ ГО N0:47) и КΕУNΥС^δΥНР^Υ (У_Н СОК 3.19; δΕΟ ГО N0:48);

(б) антитела, имеющие У_ъ, который соответствует по последовательности У_ъ МАЪ 1, МАЪ 2, МАЪ 3, МАЪ 4, МАЪ 15, МАЪ 16, МАЪ 17, МАЪ 18, МАЪ 19 или МАЪ 20, и У_Н, который соответствует по последовательности У_Н МАЪ 1, МАЪ 2, МАЪ 3, МАЪ 4, МАЪ 15, МАЪ 16, МАЪ 17, МАЪ 18, МАЪ 19 или МАЪ 20; и (е) антитела, имеющие У_ъ и У_Н, которые соответствуют по последовательности У_ъ и У_Н МАЪ 1, МАЪ 2, МАЪ 3, МАЪ 4, МАЪ 15, МАЪ 16, МАЪ 17, МАЪ 18, МАЪ 19 или МАЪ 20.

- 21 028515

Со ссылкой на табл. 2В специфические воплощения С-терминальных анти-ЬРО антител, полезных в способах и наборах, описанных в данной заявке, включают, но без ограничения таковыми, следующие:

(a) антитела, имеющие УЬ СГОНз, которые соответствуют по последовательности У_ъ СЭНз МЛЬ 5, МЛЬ 6, МАЬ 7, МАЬ 8, МАЬ 9, МАЬ 10, МАЬ 11, МАЬ 12, МАЬ 13, МАЬ 14, МАЬ 21, МАЬ 22 или МАЬ 23, и У_Н СГОНз, которые соответствуют по последовательности У_Н СЭНз МАЬ 5, МАЬ 6, МАЬ 7, МАЬ 8, МАЬ 9, МАЬ 10, МАЬ 11, МАЬ 12, МАЬ 13, МАЬ 14, МАЬ 21, МАЬ 22 или МАЬ 23;

(b) антитела, имеющие У_ъ СЭНз и У_Н СЭНз, которые соответствуют по последовательности У_ъ и У_Н СОНз МАЬ 5, МАЬ 6, МАЬ 7, МАЬ 8, МАЬ 9, МАЬ 10, МАЬ 11, МАЬ 12, МАЬ 13, МАЬ 14, МАЬ 21, МАЬ 22 или МАЬ 23;

(c) антитела, в которых:

(ί) У_ъ СОК 1 является выбранным из К8ЬННТКО1ТР (У СОК 1.8; 81®) ГО N0:49) и (')8РРО8ОС.КТ¥ (У СОН 1.13; 81®) ГО N0:50);

(ίί) У_ъ СОН 2 является выбранным из 0М8 (У СОН 2.8; 81®) ГО N0:52) и ЬУ8 (У СОН 2.13; 81®) ГО N0:53);

(ίίί) У_ъ СОН 3 является выбранным из ЛОМ.Н1.Р1.Т (У_ъ СОН 3.8; 81®) ГО N0:55) и \¥(')С.Т11РР(')Т (У СОН 3.13; 81®) ГО N0:56);

(ίν) У_Н СОН 1 является выбранным из ОРТРТТУА (У_Н СОН 1.8; 81®) ГО N0:37) и ОР1Р88УО (У_Н СОН 1.13; 81®) ГО N0:38);

(ν) У_Н СОН 2 является выбранным из 188ООТУТ (У_Н СОН 2.8; 81®) ГО N0:41) и 1\ТР®,0НТ (У_Н СОН 2.13; 81®) ГО N0:42); и (νί) У_Н СОН 3 является выбранным из АТ(')С,\¥81.0Р (У_Н СОН 3.8; 81®) ГО N0:45) и НОТОТУ (У_Н СОН 3.13; 81®) ГО N0:46);

(ά) антитела, имеющие У_ь, который соответствует по последовательности У МАЬ 5, МАЬ 6, МАЬ 7, МАЬ 8, МАЬ 9, МАЬ 10, МАЬ 11, МАЬ 12, МАЬ 13, МАЬ 14, МАЬ 21, МАЬ 22 или МАЬ 23, и У_Н, который соответствует по последовательности У_Н МАЬ 5, МАЬ 6, МАЬ 7, МАЬ 8, МАЬ 9, МАЬ 10, МАЬ 11, МАЬ 12, МАЬ 13, МАЬ 14, МАЬ 21, МАЬ 22 или МАЬ 23; и (е) антитела, имеющие У и У_Н, которые соответствуют по последовательности У и У_Н, которые соответствуют по последовательности У и У_Н МАЬ 5, МАЬ 6, МАЬ 7, МАЬ 8, МАЬ 9, МАЬ 10, МАЬ 11, МАЬ 12, МАЬ 13, МАЬ 14, МАЬ 21, МАЬ 22 или МАЬ 23.

Как будет оценено квалифицированными специалистами в данной области техники, анти-ЬРО антитела, полезные в диагностических способах, могут иметь любое происхождение, включая, например, от млекопитающего (например, человека, примата, грызуна, козы или кролика), от животного, отличного от млекопитающего, или могут быть химерными по своей природе (иметь происхождение от более чем одного вида). Антитела, приемлемые для терапевтических применений у животных, включая людей, предпочтительно имеют происхождение от тех же видов, для лечения которых они предназначаются, или были модифицированы или сконструированы для того, чтобы быть неиммуногенными или иметь сниженную иммуногенность у животного, которого подвергают лечению. Специфический класс анти-ЬРО антител, полезных для терапевтических применений у людей, представляет собой класс гуманизированных антител, которые обсуждаются более подробно ниже. Анти-ЬРО антитела, полезные в способах и наборах, описанных в данной заявке, могут также быть или иметь происхождение от любого изотипа, включая, например, 1дА (например, 1дА1 или 1дА2), ί§ϋ, 1дЕ, 1дО (например, 1дО1, 1дО2, 1дО3 или 1дО4) или 1дМ. Анти-ЬРО антитела, предназначенные для терапевтических применений, предпочтительно являются такими 1дО изотипа.

В некоторых воплощениях анти-ЬРО антитела, полезные для терапевтических способов, описанных в данной заявке, являются гуманизированными. В общем случае, гуманизированные антитела включают существенно все или по крайней мере один и типично два вариабельных домена, в которых все или существенно все СОН участки соответствуют таковым не-человеческого иммуноглобулина, и все или существенно все каркасные участки являются таковыми с консенсусными последовательностями человеческого иммуноглобулина, и могут обозначаться как СГОН-привитые. Гуманизированное антитело может также включать по крайней мере часть константного участка иммуноглобулина (Рс), типично такие с консенсусной последовательностью человеческого иммуноглобулина. Способы гуманизации антител, включая способы конструирования гуманизированных антител, являются хорошо известными в области техники; см., например, ЬеРгапс и др., 2003, Эем. Сотр. 1ттипо1., 27: 55-77; ЬеРгапс и др., 2009, №с1. Ас1Й8 Нез., 37: Ό1006-1012; ЬеРгапс, 2008, Мо1. Вю1есЬпо1., 40: 101-111; ЮесЬтапп и др., 1988, №1иге 332:323-7; патенты США №№ 5530101, 5585089, 5693761, 5693762 и 6180370, которые относятся к Оиееп и др., ЕР239400; РСТ публикация \0 91/09967; патент США № 5225539; ЕР592106; ЕР519596; РаЫап, 1991, Мо1. 1ттипо1., 28:489-498; 8т®тска и др., 1994, Ргок Епд., 7:805-814; Нодизка и др., 1994, Ргос. №ιΐΡ Аса® 8ск, 91:969-973 и патент США № 5565332, раскрытие которых является введенным в данную заявку в своей целостности.

Гуманизированные варианты антител, имеющих СОН последовательности, соответствующую СОН анти-ЬРО антител, не принадлежащих человеку, включая в качестве примера и без ограничения, различные ^терминальные анти-ЬРО моноклональные антитела, которые обеспечиваются в табл. 1А, и раз- 22 028515 личные С-терминальные анти-НРС моноклональные антитела, которые обеспечиваются в табл. 1В, могут быть получены при использовании этих хорошо известных способов. Прогнозируемые последовательности для гуманизированных и ν_Η цепей выбранных анти-НРС антител обеспечиваются в табл. 1А и 1В. Специфические примеры гуманизированных антител включают антитела, включающие:

(а) какие-либо три ν₂ ΟΌΚβ и какие-либо три ν_Η ΟΌΚβ, раскрытые в данной заявке;

(Н) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую §ЕЦ ГО N0:21, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую 8ЕЦ ГО N0:22;

(с) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую 8ЕЦ ГО N0:23, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, соответствующую 8ЕЦ ГО N0:24;

(Д) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8ЕЦ ГО N0:75, 77 и 79, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8ЕЦ ГО N0:76 и 78;

(е) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8ЕЦ ГО N0:80 и 82 и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8ЕЦ ГО N0:81 и 83;

(ί) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8ЕЦ ГО N0:84, 86 и 88 и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8ЕЦ ГО N0:85, 86 и 89; и (д) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8ЕЦ ГО N0:90, 92 и 94, и вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из 8ЕЦ ГО N0:91, 93 и 95. Как будет признано квалифицированными специалистами, анти-НРС антитела, обладающие свойствами специфического связывания, такими как способность к связыванию специфического эпитопа, представляющего интерес, могут быть легко получены при использовании различных антигенов и иммуногенов, описанных в данной заявке, и будут подвергаться анализу на их способность конкурировать за связывание НРС с эталонным антителом, которое представляет интерес. Любое из анти-НРС антител, описанных в данной заявке, может использоваться как эталонное антитело в таком конкурентном анализе. Специфический анализ, полезный для оценки способности антитела конкурировать за связывание НРС с биотинилированным эталонным анти-НРС антителом, которое представляет интерес, обеспечивается в примере 5.

При проведении исследования конкуренции антитела между эталонным анти-НРС антителом и любым исследуемым антителом (вне зависимости от видов или изотипа), следует сначала пометить эталонное антитело с помощью метки, которая определяется либо непосредственно, например, с помощью радиоизотопа или флуорофора, или опосредованно, например, с помощью биотина (является способной к определению посредством связывания с флуоресцентно-меченным стрептавидином) или фермента (ферментативной реакции), для того, чтобы позволить осуществить последующую идентификацию. В этом случае меченное эталонное анти-НРС антитело (в фиксированных или повышающихся концентрациях) инкубируют с помощью известного количества НРС, образующего комплекс НРС: меченное анти-НРС антитело. Немеченное исследуемое антитело потом присоединяют к комплексу. Измеряют интенсивность комплексной метки. Если исследуемое антитело конкурирует с меченным эталонным анти-НРС антителом за НРС путем связывания с перекрывающимся эпитопом, то интенсивность комплексной метки будет снижаться по сравнению с контрольным экспериментом, который осуществляют при отсутствии исследуемого антитела.

Многочисленные способы для осуществления анализов конкурентного связывания являются известными и могут быть адаптированы для получения результатов, сравнимых с такими для анализа, описанного выше и в примере 5. Считается, что антитело конкурирует за связывание НРС с этапонным антиНРС антителом, и таким образом считается таким, которое связывает приблизительно тот же или перекрывающийся эпитоп НРС, что и эталонное анти-НРС антитело, если оно снижает связывание эталонного анти-НРС антитела с НРС в конкурентном анализе связывания, и, в частности, конкурентном анализе связывания примера 5 по крайней мере на 50%, при концентрации исследуемого антитела в интервале 0,01100 мкг/мл (например, 0,01, 0,08, 0,4, 2, 10, 50 или 100 мкг/мл или другая концентрация в пределах указанного интервала), несмотря на то, что более высокие уровни снижения, например 60, 70, 80, 90 или даже 100%, могут быть желательными.

Средние специалисты в данной области техники смогут оценить, что в некоторых случаях, например, в диагностических случаях и в случае мониторинга, может быть желательным метить анти-РС антитела. Такие метки являются полезными для определения и количественной оценки. Приемлемые метки являются хорошо известными в области техники, и могут быть непосредственными в том, что они не- 23 028515 посредственно наблюдаются или определяются (например, флуорофоры или радиоизотопы) или опосредованными в том, что они взаимодействуют с чем-либо еще, что обеспечивает получение наблюдаемого или определяемого сигнала (например, фермент, который воздействует на субстрат с образованием определяемого сигнала, или связывающая молекула, такая, как биотин, который связывает меченную стрептавидином молекулу). Многочисленные системы для мечения, а также средства для мечения антител с помощью них, которые являются известными в области техники, предполагаются для применения в данной заявке.

Несмотря на то что различные анти-ЬРО антитела, полезные в способах, описанных в данной заявке, были представлены с помощью антитела полной длины, квалифицированные специалисты смогут оценить, что связывающие фрагменты, или суррогатные сконструированные антитела или такие, которые имеют происхождение от антитела полной длины или связывающих фрагментов, могут также использоваться. Приемлемые фрагменты, суррогаты и тому подобное включают, но без ограничения таковыми, РаЬ', Р(аЬ')₂, РаЬ, Ρν, νΙβΟ, ксРу фрагменты и сурротела. Если не указано другое, то термин антитело, как используется в данной заявке, является предназначенным для включения всех форм молекул антитела и антителоподобных суррогатных молекул, включая одноцепочечные антитела, сурротела и связывающие фрагменты. Антитела, имеющие структуры, типичные для существующих в природе антител, обозначаются в данной заявке как нативные антитела.

Способы получения анти-РО антител.

Анти-РО антитела, полезные в способах, описанных в данной заявке, могут быть получены при использовании стандартных, хорошо известных способов. Для экспрессии анти-РО антител, полезных в способах, описанных в данной заявке, ДНК, которые кодируют частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, встраивают в экспрессионные векторы так, что гены являются оперативно связанными с последовательностями контроля транскрипции и трансляции. В этом контексте термин оперативно связанный является предназначенным для понимания того, что ген антитела является лигированным в вектор, так, что последовательности контроля транскрипции и трансляции в пределах вектора служат для его предписанной функции регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессионный вектор и последовательности контроля экспрессии выбирают так, чтобы они были совместимыми с используемой для экспрессии хозяйской клеткой. Г ен легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть встроены в отдельные векторы или, более типично, оба гена встраивают в один и тот же экспрессионный вектор. Гены антитела встраивают в экспрессионный вектор с помощью стандартных способов (например, путем лигирования комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и вектора или лигирования тупых концов в случае, если отсутствуют сайты рестрикции). Перед встраиванием последовательностей легкой или тяжелой цепей анти-РО антитела экспрессионный вектор может уже нести последовательности константного участка антитела. Например, один подход для превращения последовательностей У_н и У_ъ анти-РО антитела в полноразмерные гены антитела заключается во встраивании их в экспрессионные векторы, которые уже кодируют константные участки тяжелых цепей и константные участки легких цепей соответственно так, что У_н сегмент является оперативно связанным с С_н сегментом(ами) в пределах вектора, а У_ъ сегмент является оперативно связанным с С_ъ сегментом в пределах вектора. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный экспрессионный вектор может кодировать сигнальный пептид, который способствует секреции цепи антитела из хозяйской клетки. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор, так, что сигнальный пептид является связанным в рамке с аминотерминальным концом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный пептид (то есть сигнальный пептид из белка, отличного от иммуноглобулина).

В дополнение к генам цепей антитела рекомбинантные экспрессионные векторы в соответствии с описанием несут последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепей антитела в хозяйской клетке. Термин регуляторная последовательность является предназначенным для включения промоторов, энхансеров и других элементов контроля экспрессии (например, сигналов полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антитела. Такие регуляторные последовательности являются описанными, например, у ОоеЬЬек Оепе Ехргеккюи ТесЬио1о§у: МеЬюЬк ίη Εηζνιηοίοβγ 185 (ЛсаЬешю Ргекк, 8аи П1едо, СА, 1990). Квалифицированные специалисты в данной области техники смогут оценить то, что конструирование экспрессионного вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор хозяйской клетки, которую подвергают трансформации, уровень экспрессии желаемого белка, и т.д. Приемлемые регуляторные последовательности для экспрессии в хозяйской клетке млекопитающего включают вирусные элементы, которые направляют высокие уровни белковой экспрессии в хозяйских клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (СМУ) (такие как промотор/энхансер СМУ), обезьяньего вируса 40 (8У40) (такие как промотор/энхансер 8У40), аденовирусов, (например, основной поздний промотор аденовируса (АЬМЬР)) и полиомы. Для дополнительного описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей, см., например, патент США № 5168062, который относится к 8Ьпккк патент США № 4510245, который относится к Ве11 и др., и патент США № 4968615, который относится к 8сЬайиег и др.

- 24 028515

Дополнительно к генам цепей антитела и регуляторным последовательностям рекомбинантные экспрессионные векторы могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в хозяйских клетках (например, источники репликации) и гены селективного маркерного гена. Ген селективного маркерного гена способствует селекции хозяйских клеток, в которые этот вектор был введен (см., например, патент США №№ 4399216, 4634665 и 5179017, которые все относятся к Ахе1 и др.). Например, типично ген селективного маркера придает устойчивость к лекарственным средствам, таким, как О418, пуромицин, бластицидин, гигромицин или метотрексат, хозяйской клетке, в которую был введен вектор. Приемлемые гены селективного маркера включают ген дигидрофолатредуктазы (ЭНЕК) (для применения в ЭНЕК хозяйских клетках с селекции/амплификацией при использовании метотрексата) и ген пео (для О418 селекции). Для экспрессии тяжелых и легких цепей экспрессионный(ые) вектор(ы), кодирующие тяжелые и легкие цепи, трансфицировали в хозяйскую клетку с помощью стандартных методик. Различные формы термина трансфекция является предназначенным для того, чтобы охватывать широкое разнообразие методик, которые обычно используются для введения экзогенной ДНК в прокариотические или эукариотические хозяйские клетки, например электропорация, липофекция, преципитация, опосредованная фосфатом кальция, ΌΕАЕ-декстраном и тому подобное. Является возможным экспрессировать антитела, описанные в данной заявке, либо в прокариотических, либо в эукариотических хозяйских клетках. В некоторых воплощениях экспрессию антитела осуществляют в эукариотических клетках, например хозяйских клетках млекопитающего, для оптимальной секреции правильно собранного и иммунологически активного антитела. Типичные хозяйские клетки млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител в соответствии с описанием включают клетки яичника китайского хомячка (СНО клетки) (включая ОНЕК^-СНО клетки, описанные у Цг1аиЬ и СЬа81п, 1980, Ргос. Ναΐΐ. Асай. 8сЕ Ц8А, 77: 4216-4220, которые используются с ЭНЕК селективным маркером, например, так как описано у КаиГтап и 8Ьагр, 1982, Мо1. Вю1., 159: 601621), миеломные N80 клетки, СО8 клетки, 293 клетки и 8Р2/0 клетки. Когда рекомбинантные экспрессионные векторы, содержащие гены антитела, вводят в хозяйские клетки млекопитающих, антитела получают путем культивирования хозяйских клеток в течение периода времени, достаточного для того, чтобы позволить осуществить экспрессию антитела в хозяйских клетках или секрецию антитела в культуральную среду, в которой выращивают хозяйские клетки. Антитела могут быть извлечены из культуральной среды при использовании стандартных способов очистки белка. Хозяйские клетки могут также использоваться для получения частей интактного антитела, таких как Е_аЬ фрагменты или 8сЕ_ν молекулы. Является понятным, что вариации указанной выше процедуры находятся в пределах настоящей заявки. Например, является желательным трансфицировать хозяйскую клетку с помощью ДНК, кодирующей либо тяжелую цепь, либо легкую цепь (или обе) анти-РО антитела, описанного в данной заявке. Методика рекомбинантной ДНК может также использоваться для удаления некоторой части или всей ДНК, кодирующей какую-либо одну из них, либо обе легкую и тяжелую цепи, которые не являются необходимыми для связывания с РО. Молекулы, которые экспрессируются из таких укороченных молекул ДНК, также являются полезными в способах, описанных в данной заявке.

Для рекомбинантной экспрессии анти-РО антитела хозяйская клетка может быть совместно транфицирована с помощью двух экспрессионных векторов, где первый вектор кодирует полипептид, имеющий происхождение тяжелой цепи, а второй вектор кодирует полипептид, имеющий происхождение легкой цепи. Типично, каждый из этих двух векторов содержит отдельный селективный маркер. Альтернативно, может использоваться один вектор, который кодирует полипептиды как тяжелой, так и легкой цепи.

Анти-РО антитела могут также быть получены с помощью химического синтеза (например, при использовании способов, описанных в 8оЬй РЬазе РерЬйе 8уп!Ье818, 2-е изд., 1984 ТЬе Р1егсе СЬетюа1 Со., КоскГогй, 111.). Вариантные антитела также могут быть получены при использовании бесклеточных методик (см., например, СЬи и др., 2001, ВюсЬениа №. 2 (КосЬе Мо1еси1аг Вю1одюа18)).

После того как анти-РО антитело получено с помощью рекомбинантной экспрессии или при использовании методов синтеза, оно может быть очищено с помощью любого способа, известного в области техники для очистки молекулы иммуноглобулина, например с помощью хроматографии (например, ионообменной хроматографии, аффинной, в частности, при использовании аффинности для РО после селекции с использованием белка А или белка О, и эксклюзионной колоночной хроматографии), центрифугирования, дифференциальной растворимости, или с помощью стандартной методики для очистки белка. Кроме того, анти-РО антитела или их связывающие фрагменты могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями, описанными в данной заявке или иным образом известными в области техники для того, чтобы способствовать очистке.

Приведенные ниже примеры являются иллюстративными и не предназначены для ограничения изобретения.

- 25 028515

Примеры

Пример 1. Количественная оценка уровней РС в плазме или сыворотке крови.

Уровни РС в плазме или сыворотке крови могут быть традиционно определены при использовании следующего анализа. Планшеты на 96 ячеек покрывали с помощью 0,5-10 мкг/мл С-терминального антиЬРС антитела, например кроличьего С-терминального анти-ЬРС поликлонального антитела или Стерминального анти-ЬРС антитела, описанного в данной заявке, и потом инкубировали в течение ночи. Планшеты трижды промывали в смеси РВ§-Твин (0,05%) и блокировали при использовании 2% (вес./об.) обезжиренного сухого молока в РВ§-Твин (0,05%). Отдельно готовили исследуемые образцы, контрольные образцы (чистый образец или негативный по РС образец крови или сыворотки), и от приблизительно 5 пМ (0,5х 10^-11 М) до приблизительно 0,1 нМ (1х10^-10М) эталонного стандартного ЬРС (лиофилизированный ЬРС, разведенный в негативной по РС плазме или сыворотке) в приемлемом разбавителе (например, РВ§-Твин 0,05%). Образцы инкубировали на покрытых планшетах в течение 2-4 ч при 37°С или, альтернативно, от 12 до 16 ч при 21°С. После инкубации планшеты трижды промывали с помощью РВ§Твин (0,05%) и инкубировали с 0,001-0,1 мкг/мл Ν-терминального анти-ЬРС антитела или Νтерминального анти-ЬРС моноклонального антитела, описанного в данной заявке, слитого с пероксидазой хрена (ИКР) (см. ΝαΓαηο и др., 1974, 1. НЩосЬет. Су1осЬет. 22(12): 1084-1091) в течение 30 мин при 21°С. Планшеты трижды промывали в РВ§-Твин (0,05%) и прибавляли субстрат НКР в течение 15 мин при 21°С. Реакцию останавливали путем прибавления 100 мкл 0,5 М серной кислоты и осуществляли измерения оптической плотности при 405 нМ. Уровни ЬРС исследуемого образца определяли путем сравнения со стандартной кривой, построенной из измерений, полученных с эталонным стандартом ЬРС.

Пример 2. Анализ ЕЫ§Л для оценки специфичности анти-ЬРС антитела.

Специфичность анти-ЬРС антител может быть традиционно определена при использовании ЕЫ§Л анализов, как описано ниже. Планшеты на 96 ячеек инкубировали в течение ночи при 4°С с приемлемой(ыми) концентрацией(ями) исследуемого полипептида (например, 25 и 50 нг рекомбинантного человеческого РС и 50 и 250 нг СТРР или других продуктов, имеющих происхождение от гена гастрина) в забуференном фосфатом физиологическом растворе (РВ§), после чего ячейки трижды промывали промывочным раствором (РВ§ и 0,1% Твин-20) и потом инкубировали в течение 2 ч при 22°С с 100 мкл блокирующего раствора (РВ§, 0,1% Твин-20, 0,1% бычьего сывороточного альбумина или гидролизата казеина) на ячейку. После блокирования ячейки трижды промывали и прибавляли антитело, которое подвергается анализу (исследуемое антитело). 100 мкл исследуемого антитела (при концентрации от 0,3 до 1 нг/мл) в РВ§ и 0,1% Твин-20 прибавляли к каждой ячейке. Потом планшеты инкубировали в течение 2 ч при 22°С, после чего раствор исследуемого антитела отбрасывали и заменяли, после этапа промывания (3х 100 мкл промывочного раствора, как указано выше) с помощью блокирующего раствора, содержащего вторичное антитело, прибавляли козье анти-мышиное 1дС (Рс) антитело, слитое с пероксидазой хрена. Через 1 ч инкубации со вторичным антителом 100 мкл раствора субстрата (например, РаЦ ОРЭ или Офенилендиамин дигидрохлорид, доступный от Зщта-АИпсЬ Со., приготовленный в соответствии с инструкциями производителя) прибавляли к каждой ячейке и инкубировали в темноте в течение 20 мин при 22°С. Реакцию останавливали путем прибавления 50 мкл 4Ν серной кислоты и определяли количество катализированного субстрата путем измерения оптической плотности при (ОГО.) 492 нм. Превращение субстрата является пропорциональным количеству первичного (исследуемого) антитела, связанного с антигеном. Эксперименты проводили в двукратной повторности, и измерения ОИ выстраивали как функцию концентрации антигена. Исследованные антитела считали высоко специфическими для РС, если измеренное значение ОГО. составляло от 0,2 до 1,5 для ЬРС и не существовало статистически значимого сигнала, выше фона с СТРР или каким-либо другим пептидом, имеющим происхождение от гена гастрина, где фон представлял собой среднее значение сигнала от контрольных ячеек, содержащих только РВ§

Пример 3. Анализ для оценки нейтрализующей активности анти-ЬРС антитела.

Специфический тест для оценки, является ли специфическое анти-ЬРС антитело нейтрализующим, может быть осуществлен так, как описано ниже. НиЬ7 клетки гепатоклеточной карциномы высевали в планшеты на 24 ячейки с ультранизким прикреплением (500 клеток/ячейка) в свободную от сыворотки среду М11. Клетки выращивали при 37°С и ежедневно два раза в день в течение 7 дней обрабатывали исследуемым анти-ЬРС антителом или контрольным, неспецифическим моноклональным антителом, при концентрациях антитела приблизительно 5 мкг/мл. В конце эксперимента делают микрофотографии, подсчитывают количество сфер на ячейку и определяют среднее и процентильное распределение. Исследуемое антитело определяют как нейтрализующее в этом анализе, если количество сфероидов, образовавшихся НиЬ7 клетками в условиях культуры низкого прикрепления, демонстрирует статистически значимое снижение по крайней мере 20% по сравнению с клетками, обработанными с помощью контрольного антитела, при использовании критерия Стьюдента для одной выборки при анализе одного анти-ЬРС антитела или однофакторного ΑΝΟνΑ с апостериорным критерием Бонферрони, когда подвергаются анализу многочисленные антитела (с отличием, которое считается значимым тогда, когда р<0,05).

- 26 028515

Пример 4. Анализ для оценки аффинности анти-НРС антитела.

Константы аффинности анти-НРС антител могут измеряться при использовании методики РгоЮоп (ВюКай) в соответствии с ΝαΗδΗοΙ и др. (2008) Лиа1уйса1 ВюсНстМгу 383: 52-60, которая является введенной в данную заявку в качестве ссылки в своей целостности. Кратко, для мышиных анти-РС антител анти-мышиное 1дС антитело (50 мкг/мл) сначала наносили на сенсорный чип, убеждаясь, что определяемый чипом сигнал после введения антитела находится в интервале от 10000 до 11500 единиц ответа (КИ). Потом вводили мышиное анти-НРС антитело, которое представляет интерес (исследуемое антитело) (при типичной концентрации 30 мкг/мл). Если исследуемое антитело связывается достаточно, то будет наблюдаться дополнительный сигнал по крайней мере 500 Ки. Процесс связывания между исследуемым антителом и НРС потом осуществляли путем введения варьирующих концентраций НРС, например, 200, 100, 50, 25 и 12,5 нМ, и определения уровня ассоциации. Типично, несколько каналов были доступными для исследуемого множества антител параллельно в одном эксперименте, делая возможным анализ связывания единственного исследуемого антитела при различных концентрациях НРС параллельно. Один канал будет заполняться мышиным моноклональным антителом, которое не является специфическим для НРС, в качестве контрольного для неспецифического связывания, а другие каналы будет заполняться буфером для разведения, взятым отдельно в качестве базовой линии для фонового сигнала. В общем случае никакого связывания не определяют в канале, в который вводится неспецифическое мышиное антитело. Антитела, которые демонстрируют высокий уровень ассоциации в анализе, что может приводить к насыщению захваченного моноклонального антитела НРС, могут анализироваться против более низких концентраций НРС (50, 25, 12,5, 6,25 и 3,125 нМ), позволяя осуществлять более точное измерение. Константы аффинности (К_с) подсчитывают как соотношение между константой диссоциации (к,|) и константой ассоциации (к_а). Экспериментальные значения могут быть подтверждены путем анализа статистически релевантного подобия между экспериментальными кривыми на основе измерений связывания и теоретических профилей.

Константы аффинности не-мышиных анти-НРС антител могут быть оценены в подобном формате при использовании 1дС, специфических для видов происхождения анти-НРС исследуемого антитела.

Пример 5. Анализ для оценки конкурентного связывания с эталонным анти-НРС антителом.

Специфический анализ для оценки, конкурирует ли антитело, которое представляет интерес (исследуемое антитело), за связывание НРС с биотинилированным эталонным анти-НРС антителом, может осуществляться так, как описано ниже. Планшеты на 96 ячеек покрывали с помощью иммобилизованного анти-НРС антитела (поликлональное или моноклональное антитело, узнающее Ν- или Стерминальный участок НРС, который отличается от эпитопа, который узнается биотинилированным эталонным анти-НРС антителом), при концентрации, которая является выбранной в пределах интервала 1-10 мкг/мл, в течение ночи при 4°С (от 0,1 до 1 мкг/ячейка). После блокирования с помощью блокирующего буфера (0,1% Твин-20, 0,1% В8Л в РВ§) в течение 2 ч при 22°С, прибавляли рекомбинантный НРС при концентрации, которая колеблется от 10 пМ до 1 нМ (от 10 до 1000 пг/ячейка), и инкубировали в течение 2 ч при 22°С. После этого прибавляли биотинилированное эталонное анти-НРС антитело (или смесь, содержащую биотинилированное эталонное анти-НРС антитело), вместе с повышающимися концентрациями немеченного исследуемого антитела и инкубировали в течение 1 ч при 22°С. После промывания для удаления несвязанного антитела определение связанного меченного эталонного анти-НРС антитела осуществляли путем инкубации смеси с 50 нг/мл страптавидин-НКР в течение 1 ч при 22°С, после чего проводили инкубацию с хемилюминисцентным субстратом для пероксидазы хрена в течение 5 мин при 22°С и потом осуществляли количественную оценку относительных световых единиц (КЕИ) в люминометре. Анализы осуществляли в двукратной повторности.

Антитела, которые конкурируют с эталонным анти-НРС антителом, ингибируют связывание эталонного антитела с НРС. Антитело, которое связывается существенно с тем же эпитопом или с перекрывающимся эпитопом, что и эталонное антитело, существенно снижает (например, по крайней мере на 50%) количество связанного эталонного анти-НРС антитела, как становится очевидным с помощью снижения наблюдаемых КЕИ.

Высокое контрольное значение получают из контрольного эксперимента, который осуществляется путем инкубации меченного эталонного антитела с рекомбинантным НРС без исследуемого антитела. Низкое контрольное значение получают из контрольного эксперимента, который осуществляется путем инкубации меченного эталонного антитела с рекомбинантным НРС в присутствии избыточных концентраций немеченного эталонного антитела (немеченное эталонное антитело, таким образом, конкурирует с меченым антителом за связывание с НРС). Способность исследуемого антитела конкурировать с эталонным анти-НРС антителом потом определяют путем инкубации меченного эталонного антитела с рекомбинантным НРС в присутствии повышающихся концентраций немеченого исследуемого антитела. В тестовом анализе значительное снижение наблюдаемых уровней КЬи в присутствии исследуемого антитела свидетельствует о том, что исследуемое антитело узнает существенно тот же эпитоп, что и эталонное анти-НРС антитело. Ингибирование связывания может выражаться как ингибирование константы, или К₁, которая подсчитывается в соответствии со следующей формулой:

К₁ = 1С₅₀/[1 + (концентрация эталонного анти-НРС ЛЬ/К_С ^{эталонного [|}'^|[|-|||'^{С аь})],

- 27 028515 где1С₅₀ представляет собой концентрацию исследуемого антитела, которая обеспечивает 50% снижение связывания эталонного антитела, а К_с ^{эталонного анти-НРО} аь представляет собой константу диссоциации эталонного анти-НРО антитела, меру его аффинности для НРО. Полезные исследуемые антитела, которые конкурируют с эталонным анти-НРО антителом (например, одним из анти-НРО антител, описанных в данной заявке), будут типично иметь значения К₁, которые колеблются от 10 пМ до 100 нМ при условиях проведения анализа, описанных в данной заявке.

Пример 6. Гепатоклеточные карциномы из опухолей рака печени демонстрируют повышенные уровни экспрессии гена ОАЗТ.

Этот пример описывает наблюдения того, что образцы опухоли печени, полученные от пациентов с гепатоклеточной карциномой (НСС), экспрессируют повышенные уровни гена ОАЗТ по сравнению с нормальной тканью.

A. Способы.

Первичные опухоли печени и нормальные ткани контроля хирургически удаляли у 14 пациентов. РНК получали как из образцов опухоли, так и здоровой ткани печени, и целостность мРНК контролировали с помощью устройства АдПей: В1оаиа1у8ег. Экспрессию мРНК ОАЗТ измеряли с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и нормализовали при использовании экспрессии НРКТ мРНК. Для ОТ-ПЦР общую РНК из НСС образцов экстрагировали при использовании набора ΡΗ81Ρ.ΝΑ Рго Огсси (МР ВюМеб) в соответствии с прописью производителя. РНК подвергали обратной транскрипции при использовании Зирег8спр1 II КТ (1иу11го§си) в присутствии рандомного праймера (Κ&Ό Зу8ίет8). ОТ-ПЦР в реальном времени осуществляли при использовании набора ΟικιηΙίΠΐ8ΐ ЗУВК Огсси РСК ^адеН) и ЕррепбогГ Ма81егсус1ег ер геа1р1ех (ЕррепбогГ). Праймеры для амплификации генов ОАЗТ и НРКТ получали от З1дта ЫГе Заспсе. Каждую ПЦР амплификацию осуществляли в трех ячейках при использовании следующих условий: 5 мин при 95°С, после чего проводили 45 двухтемпературных циклов (10 с при 95°С и 30 с при 60°С).

B. Результаты.

Как показано на фиг. 4, экспрессия мРНК ОАЗТ повышалась в образцах НСС опухолей по сравнению с нормальной тканью печени у 10 из 14 субъектов с раком печени. В образцах, где экспрессия мРНК ОАЗТ повышалась, экспрессия колебалась от 2 до 2800-кратной по сравнению с нормальной тканью.

Пример 7. Линии клеток рака печени, выращенные при условиях культивирования сниженного прикрепления, демонстрируют повышенные уровни экспрессии гена ОАЗТ.

Этот пример описывает наблюдение, что линии клеток рака печени, выращенные при условиях культивирования сниженного прикрепления, экспрессируют повышенные уровни гена ОАЗТ по сравнению с линией клеток колоректального рака.

A. Способы.

Две клеточные линии гепатоклеточной карциномы, НиН7 и РЬС/РКР/5, линию клеток гепатобластомы, НиН6, и линию клеток колоректального рака, ЗА480, каждую высевали во флаконы для выращивания при условиях низкого прикрепления в М11 среду, и выращивали до достижения образования сфер. Сферы потом подвергали обработке для экстракции РНК. ОТ-ПЦР осуществляли так, как описано в примере 1, за исключением того, что общую РНК экстрагировали при использовании набора ^IАОЕN Киса8у Μίηί в соответствии с прописью производителя. Уровни экспрессии мРНК ОАЗТ из линий клеток рака печени потом нормализовали по отношению к экспрессии в ЗА480 клетках, что служило в качестве позитивного контроля.

B. Результаты.

Как показано на фиг. 5А, 5В, все исследуемые линии клеток печени, НиН6, НиН7 и РЬС/РКР/5, экспрессировали повышенные уровни мРНК ОАЗТ по сравнению с линией клеток ЗА480 колоректальной опухоли при выращивании в условиях культивирования сниженного прикрепления. Результаты выражали по отношению к уровням экспрессии гена гастрина в ЗА480 клетках.

Пример 8. Клетки боковой популяции, изолированные из линий клеток рака печени и выращенные при условиях культивирования сниженного прикрепления, демонстрируют повышенные уровни экспрессии гена ОАЗТ.

Этот пример описывает наблюдение, что исключающие краситель клетки боковой популяции из двух линий клеток рака печени, НиН6 и НиН7, экспрессируют повышенные уровни мРНК ОАЗТ по сравнению с общей популяцией таких клеток (то есть боковая популяция и не-боковая популяция), выращенных при условиях культивирования сниженного прикрепления.

А. Способы.

Исключающие краситель клетки боковой популяции из линий клеток рака печени НиН6 и НиН7 изолировали из общей популяции таких клеток при использовании РАСЗ. В частности, клетки разобщали с помощью обработки трипсином и ЭДТА. Потом клетки инкубировали в 1 мл окрашивающей среды (ΌΜΕΜ, 2% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ ЭДТА) в течение 10 мин при 37°С. К негативному контрольному образцу прибавляли 1 мкл 50 мМ раствора верапамила (заключительная концентрация 50 мкМ). Контрольный и исследуемый образцы потом инкубировали в течение 10 мин при 37°С. Потом прибавляли раствор красителя к исследуемым образцам (2,5 мкл 2 мг/мл НοесНδί 33342; заключительная

- 28 028515 концентрация красителя 5 мкг/мл), после чего осуществляли осторожное перемешивание. Потом все образцы инкубировали в течение 50 мин при 37°С при регулярном осторожном перемешивании. После инкубации на льду в течение 5-10 мин образцы инкубировали в течение 5 мин при 1000 об./мин. Потом ресуспендировали осадки клеток в 1 мл разведения 1:40 раствора иодида пропидия с концентрацией 25 мкг/мл в М11 среде. Агрегированные клетки удаляли путем фильтрования через сито в пробирку на 5 мл. Потом образцы помещали на лед для осуществления цитометрии при использовании РАСδА^^а цитометра с сигнальной детекцией при 450 и 488 нм. Потом РНК очищали, и уровни экспрессии мРНК ОАδΤ количественно оценивали так, как описано в примерах 6 и 7, потом их сравнивали с уровнями экспрессии гена ОАδΤ из Η11Ι16 и Ηιι1ι7 клеток, выращенный в виде сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления, и из δ\ν480 клеток колоректального рака. Уровни экспрессии мРНК ОАδΤ из линии клеток рака печени потом нормализовали по отношению к экспрессии в δν480 клетках, которые служили в качестве позитивного контроля.

В. Результаты.

Как показано на фиг. 6, исключающая краситель боковая популяция Η11Ι16 и Ηιι1ι7 клеток экспрессирует повышенные уровни мРНК ОАδΤ по сравнению с общей популяцией таких клеток, выращенных в виде сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления (фиг. 6А и 6В соответственно). Боковая популяция Ηιι1ι7 клеток экспрессировала больше мРНК гастрина по сравнению с боковой популяцией Η11Ι16 клеток. Результаты выражали по отношению к уровням экспрессии гена гастрина в δν480 клетках.

Пример 9. РЬС/РКЬ/5 клетки гепатоклеточной карциномы, выращенные в условиях роста сфероидов, образуют меньшее количество сфероидов при обработке с помощью анти-РО антитела.

Этот пример демонстрирует влияние на рост в виде сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления РЬС/РКЬ/5 клеток рака печени, обработанных с помощью анти-ЬРО моноклональных антител.

A. Способы.

РЬС/РКЬ/5 клетки гепатоклеточной карциномы высевали в планшеты на 24 ячейки для ультранизкого прикрепления (220 клеток/ячейка) в свободной от сыворотки среде М11 (ОМНМ/Р12 с 20 нг/мл ΕОΡ, 10 нг/мл РОР, 20 мкг/мл инсулина, N2 добавка, 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы). Клетки выращивали в течение 10 дней при 37°С с ежедневным прибавлением контрольного или анти-ЬРО МАЬ 3 моноклонального антитела (1 мкг/мл). В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.

B. Результаты.

Как показано на фиг. 7, обработка с помощью анти-ЬРО моноклональных антител РЬС/РКР/5 клеток существенно снижала количество сфероидов, которые сформировались во время роста при условиях культивирования низкого прикрепления по сравнению с контрольным моноклональным антителом.

Пример 10. Клетки боковой популяции клеток, очищенные из Η11Ι16 линии клеток гепатобластомы, выращенной при условиях роста сфероидов, формировали меньшее количество сфероидов при обработке с помощью анти-РО антитела.

Этот пример демонстрирует влияние на рост в виде сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления исключающей краситель боковой популяции Η11Ι16 клеток рака печени, обработанных с помощью анти-ЬРО поликлоналных антител.

A. Способы.

Исключающую краситель боковую популяцию клеток Η11Ι16 изолировали так, как описано выше. Потом боковую популяцию клеток высевали в планшеты на 96 ячеек низкого прикрепления (200 клеток/ячейка) в среде М11 и выращивали в течение 13 дней при температуре 37°С в присутствии контрольных или антипрогастриновых поликлональных антител (1 мкг/мл), 5 нМ доксорубицина (химиотерапевтический агент, который используется при некоторых способах терапии рака печени), или ДМСО (носитель для доксорубицина) (15 ячеек на вариант). Состав среды М11 был следующим: ПМЬМ/Р12глутамакс (каталожный номер 31331, ЬлЬгодсп); 20 нг/мл ΕОР (Κ&Ό 5У51ст5); 10 нг/мл РОР (Κ&Ό 5у51С1П5); 20 мкг/мл инсулина (δίβΐηα); 1/100 разведение N2 добавки (каталожный номер Р1510, ОЛсо); 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы. В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.

B. Результаты.

Как показано на фиг. 8, обработка с помощью анти-ЬРО поликлональных антител боковой популяции клеток, очищенных из Η11Ι16 линии клеток, существенно снижала количество сфероидов, которые формируются во время роста при культивировании в условиях низкого прикрепления, по сравнению с контрольными антителами, доксорубицином и ДМСО контролем.

- 29 028515

Пример 11. Боковая популяция клеток, очищенных из НиЫ7 гепатоклеточной линии клеток, выращенных при условиях роста сфероидов, формирует меньшее количество сфероидов при обработке с помощью анти-ЫРО антитела.

Этот пример демонстрирует влияние обработки с помощью анти-ЫРО поликлональных антител на рост в виде сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления исключающей краситель боковой популяции НиЫ7 клеток рака печени.

A. Способы.

Исключающую краситель боковую популяцию клеток НиЫ7 изолировали так, как описано в примере 8. Потом боковую популяцию клеток высевали в планшеты на 96 ячеек низкого прикрепления (200 клеток/ячейка) в среде М11 и выращивали в течение 9 дней при 37°С в присутствии контрольных или антипрогастриновых поликлональных антител (1 мкг/мл), 5 нМ доксорубицина (химиотерапевтический агент, который используется при некоторых способах терапии рака печени), или ДМСО (носитель для доксорубицина) (15 ячеек на вариант). Состав среды М11 был следующим: ИМЕМ/Р12-глутамакс (каталожный номер 31331, 1пуйтодеп); 20 нг/мл ЕОР (Κ&Ό 5ук1етк); 10 нг/мл РОР (Κ&Ό 5ук1етк); 20 мкг/мл инсулина (Зфта); 1/100 разведение N2 добавки (каталожный номер Р1510, О1Ьсо); 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы. В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.

B. Результаты.

Как показано на фиг. 9, обработка с помощью анти-ЫРО поликлональных антител боковой популяции клеток, очищенных из НиЫ7 линии клеток, существенно снижала количество сфероидов, которые формируются во время роста при культивировании в условиях низкого прикрепления, по сравнению с контрольными антителами и ДМСО контролем. Наблюдали, что доксорубицин также снижал количество сфероидов, которые формируются в культуре.

Пример 12. НиЫ6 клетки гепатобластомы формируют меньшее количество сфероидов при ростовых условиях сниженного прикрепления при обработке с помощью анти-ЫРО моноклональных антитела.

Этот пример показывает влияние обработки с помощью анти-ЫРО моноклональных антител на рост НиЫ6 сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления.

A. Способы.

Клетки НиЫ-6 гепатобластомы высевали в планшеты на 96 ячеек для ультранизкого прикрепления (85 клеток/ячейка) в свободной от сыворотки среде М11 (ИМЕМ/Р12 с 20 нг/мл ЕОР, 10 нг/мл РОР, 20 мкг/мл инсулина, N2 добавка, 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы). Клетки обрабатывали два раза в день в течение 7 дней при 37°С с помощью носителя (РВ8, контроль) или с помощью анти-ЫРО МАЬ 13 или МАЬ 19 моноклональных антител (3 мкг/мл). В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфероидов на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.

B. Результаты.

Как показано на фиг. 10, обработка НиЫ6 клеток с помощью анти-ЫРО моноклональных антител существенно снижает количество сфероидов, которые формируются во время роста при культивировании в условиях низкого прикрепления, по сравнению с необработанными контрольными клетками.

Пример 13. НиЫ6 клетки, предварительно обработанные с помощью анти-ЫРО моноклональных антител, формируют меньшее количество сфероидов при выращивании при условиях культивирования низкого прикрепления.

Этот пример демонстрирует ингибиторный эффект предварительной обработки с помощью антиЫРО моноклональных антител на последующую способность НиЫ6 клеток гепатобластомы расти в виде сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления.

A. Способы.

100000 НиЫ6 клеток гепатобластомы/ячейка сначала высевали в планшеты на 6 ячеек в ИМЕМ с 10% РС8, истощали сыворотку в течение ночи и выращивали в течение 48 ч в ИМЕМ в присутствии 10 мкг/мл антипрогастринового моноклонального антитела МАЬ 8 или МАЬ 13 или контрольного моноклонального антитела (РСХ63Ад8, АТСС, Ке£ Т1В-9). В конце эксперимента для каждой группы обработки 500 клеток/ячейка высаживали в шесть ячеек планшетов ультранизкого прикрепления на 24 ячейки в 500 мкл свободной от сыворотки М11 среды, содержащей ЬРОР и ЕОР, и выращивали в течение последующих 5 дней при отсутствии обработки. По окончании этого периода делали фотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также измеряли поверхность сфер. Фотографии делали в конце 5-дневного периода вымывания, во время которого клетки НиЫ-6 для всех исходных условий обработки выращивали в той же среде М11. После этого оператор, который не имел информации в отношении идентификации всех ячеек, подсчитывал количество сфер.

B. Результаты.

Как показано на фиг. 11, способность клеток НиЫ6 гепатобластомы расти в виде сфероидов в планшетах низкого прикрепления была значительным образом сниженной с помощью предшествующей 48часовой обработки с помощью моноклонального антитела против прогастрина.

- 30 028515

Пример 14. НиЬ7 клетки гепатоклеточной карциномы, выращенные при условиях роста сфероидов, формируют меньшее количество сфероидов при обработке с помощью анти-РО моноклонального антитела.

Этот пример показывает влияние анти-ЬРО моноклональных антител на формирование сфероидов НиЬ7 клеток при культивировании их в условиях низкого прикрепления.

A. Способы.

В первом эксперименте НиЬ7 клетки гепатоклеточной карциномы высевали в планшеты на 24 ячейки для ультранизкого прикрепления (500 клеток/ячейка) в свободной от сыворотки среде М11 (ИМЕМ/Р12 с 20 нг/мл ЕОР, 10 нг/мл РОР, 20 мкг/мл инсулина, Ν2 добавка, 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы). Клетки обрабатывали два раза в день в течение 7 дней выращивания при 37°С с помощью носителя (РВ8, контроль) или с помощью 3 мкг/мл анти-ЬРО МАЬ 13 моноклонального антитела (анти-ЬРО МАЬ 13). В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.

Во втором эксперименте НиЬ7 клетки гепатоклеточной карциномы высевали в планшеты на 24 ячейки для ультранизкого прикрепления (500 клеток/ячейка) в свободной от сыворотки среде М11 (ИМЕМ/Р12 с 20 нг/мл ЕОР, 10 нг/мл РОР, 20 мкг/мл инсулина, Ν2 добавка, 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы). Клетки обрабатывали два раза в день в течение 7 дней выращивания при 37°С с помощью б мкг/мл одного из следующих: контрольное моноклональное антитело (контроль МАЬ, (Р3Хб3А§8, АТСС, КеГ Т1В-9), анти-ЬРО МАЬ 13, или анти-ЬРО МАЬ 1б моноклональных антител. В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.

B. Результаты.

В первом эксперименте, показанном на фиг. 12А, обработка НиЬ7 клеток с помощью анти-ЬРО моноклонального антитела МАЬ 13 существенно снижала количество сфероидов, которые формируются во время роста при культивировании в условиях низкого прикрепления по сравнению с необработанными контрольными клетками. В втором эксперименте, показанном на фиг. 12В, обработка НиЬ7 клеток с помощью анти-ЬРО моноклонального антитела МАЬ 13 или антитела МАЬ 1б существенно снижала количество сфероидов, которые формируются во время роста при культивировании в условиях низкого прикрепления по сравнению с клетками, обработанными с помощью контрольного моноклонального антитела.

Пример 15. НиЬ7 клетки, предварительно обработанные с помощью анти-ЬРО моноклональных антител, формируют меньшее количество сфероидов при выращивании при условиях культивирования низкого прикрепления.

Этот пример демонстрирует ингибиторный эффект предварительной обработки с помощью антипрогастринового моноклонального антитеал на способность НиЬ7 клеток гепатоклеточной карциномы формировать сфероиды при условиях культивирования низкого прикрепления.

А. Способы.

В одном эксперименте 75000 НиЬ7 клеток гепатоклеточной карциномы/ячейка сначала высевали в планшеты на б ячеек в среде МЕМа с 10% РС8, истощали сыворотку в течение ночи и выращивали в течение б0 ч в МЕМа + 0,5% паннексина Н в присутствии 10 мкг/мл антипрогастринового моноклонального антитела МАЬ 8 или контрольного моноклонального антитела (Р3Хб3А§8, АТСС, КеГ Т1В-9). В конце эксперимента для каждой группы обработки 500 клеток/ячейка высаживали в восемь ячеек планшетов ультранизкого прикрепления на 24 ячейки в 500 мкл свободной от сыворотки М11 среды, содержащей ЬРОР и ЕОР, и выращивали в течение последующих 5 дней при отсутствии обработки. По окончании этого периода делали фотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также измеряли поверхность сфер. Фотографии делали в конце 5-дневного периода вымывания, во время которого клетки НиЬ-7 для всех исходных условий обработки выращивали в той же среде М11. После этого оператор, который не имел информации в отношении идентификации всех ячеек, подсчитывал количество сфероидов.

Во втором эксперименте 75000 НиЬ7 клеток гепатоклеточной карциномы/ячейка сначала высевали в планшеты на б ячеек в среде МЕМа с 10% РС8, истощали сыворотку в течение ночи и выращивали в течение б0 ч в МЕМа + 0,5% паннексина Н в присутствии 10 мкг/мл антипрогастринового моноклонального антитела МАЬ 1б или контрольного моноклонального антитела (Р3Хб3А§8, АТСС, КеГ Т1В-9). В конце эксперимента для каждой группы обработки 500 клеток/ячейка высаживали в восемь ячеек планшетов ультранизкого прикрепления на 24 ячейки в 500 мкл свободной от сыворотки М11 среды, содержащей ЬРОР и ЕОР, и выращивали в течение последующих 5 дней при отсутствии обработки. По окончании этого периода делали фотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также измеряли поверхность сфер. Фотографии делали в конце 5-дневного периода вымывания, во время которого клетки НиЬ-7 для всех исходных условий обработки выращивали в той же среде М11. После этого оператор, который не имел информации в отношении идентификации всех ячеек, подсчитывал количество сфероидов.

- 31 028515

В. Результаты.

Результаты являются представленными на фиг. 13А, В. Как показано на фиг. 13А, способность НиН7 клеток к выращиванию в виде сфероидов в планшетах низкого прикрепления была значительно снижена с помощью 48-часовой предварительной обработки при использовании анти-НРС МАН 8. Как показано на фиг. 13В, способность НиН7 клеток расти в виде сфероидов в планшетах низкого прикрепления была значительно снижена с помощью 48-часовой предварительной обработки с помощью анти-НРС анти-НРС МАН 16.

Пример 16. Боковая популяция клеток НиН7 гепатоклеточной карциномы формирует меньшее количество сфероидов в условиях культивирования низкого прикрепления при обработке с помощью антиРС антитела.

Этот пример показывает влияние обработки с помощью анти-НРС моноклональных антител на рост сфероидов в условиях культивирования низкого прикрепления исключающих краситель клеток боковой популяции из линии клеток НиН7 рака печени.

A. Способы.

Исключающую краситель боковую популяцию клеток НиН7 изолировали так, как описано в примере 8. Потом клетки боковой популяции высевали в планшеты на 24 ячейки с ультранизким прикреплением (1000 клеток/ячейка) в среде М11 и выращивали в течение 7 дней при 37°С в присутствии контрольной среды или антипрогастриновых моноклональных антител МАН 8 или МАН 13 (6 мкг/мл) (8 ячеек на вариант). Состав среды М11 был следующим: ОМЕМ/Р12-глутамакс (каталожный номер 31331 1пуНтодеп); 20 нг/мл ЕСР (Κ&Ό 5ув1етв); 10 нг/мл РСР (Κ&Ό 5ув1етв); 20 мкг/мл инсулина (81дта); 1/100 разведение N2 добавки (каталожный номер Р1510, СНсо); 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы. В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.

B. Результаты.

Как показано на фиг. 14, обработка с помощью анти-НРС моноклональных антител боковой популяции клеток, очищенных из НиН7 линии клеток, существенно снижала количество сфероидов, которые формируются в процессе культивирования в условиях низкого прикрепления по сравнению с клетками, выращенными в контрольной среде.

Пример 17. РЬС/РКР/5 клетки гепатоклеточной карциномы, обработанные с помощью анти-РС антитела, формируют меньшее количество сфероидов при ростовых условиях сниженного прикрепления.

Этот пример показывает влияние анти-НРС моноклональных антител на образование сфероидов РЬС/РКР/5 клеток при условиях культивирования низкого прикрепления.

A. Способы.

В одном эксперименте РЬС/РРЬ/5 клетки гепатоклеточной карциномы высевали в планшеты на 96 ячеек ультранизкого прикрепления (35 клеток/ячейка) в свободной от сыворотки среде М11 (ОМЕМ/Р12 с 20 нг/мл ЕСР, 10 нг/мл РСР, 20 мкг/мл инсулина, N2 добавка, 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы). Клетки выращивали в течение 8 дней при 37°С при добавлении либо контрольного моноклонального антитела (контроль МАН, Р3Х63Ад8, АТСС, Κ^ί ΤΙΒ-9), либо анти-НРС МАН 19 моноклонального антитела. В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.

В другом эксперименте РЬС/РКР/5 клетки гепатоклеточной карциномы высевали в планшеты на 24 ячейки ультранизкого прикрепления (200 клеток/ячейка) в свободной от сыворотки среде М11 (ЭМЕМ/Е12 с 20 нг/мл ЕСР, 10 нг/мл РСР, 20 мкг/мл инсулина, N2 добавка, 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы). Клетки два раза в день ежедневного в течение 7 при выращивании при температуре 37°С обрабатывали либо контрольным МАН, либо анти-НРС МАН 13 моноклональным антителом. В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.

В дополнительном эксперименте РЬС/РКЬ/5 клетки гепатоклеточной карциномы высевали в планшеты на 24 ячейки ультранизкого прикрепления (200 клеток/ячейка) в свободной от сыворотки среде М11 (ЭМЕМ/Е12 с 20 нг/мл ЕСР, 10 нг/мл РСР, 20 мкг/мл инсулина, N2 добавка, 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы). Клетки два раза в день ежедневного в течение 7 при выращивании при температуре 37°С обрабатывали при использовании 6 мкг/мл одного из следующих: контрольное МАН, анти-НРС МАН 8 или анти-НРС МАН 13 моноклональное антитело. В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.

B. Результаты.

Результаты являются представленными на фиг. 15А-С. Как показано на фиг. 15А, обработка с помощью анти-НРС МАН 19 значительно снижала количество сфероидов, которые образуются РЬС/РКЬ/5 клетками в процессе роста при культивировании в условиях низкого прикрепления по сравнению с клетками, обработанными с помощью контрольного МАН. Как показано на фиг. 15В, обработка с помощью анти-НРС МАН 13 значительно снижала количество сфероидов, которые образуются РЬС/РКЬ/5 клетками в процессе роста в условиях культивирования низкого прикрепления по сравнению с клетками, обрабо- 32 028515 танными с помощью контрольного МАЬ. Как показано на фиг. 15С, обработка с помощью анти-ЬРО МАЬ 8 или МАЬ 13 значительно снижала количество сфероидов, которые образуются РЬС/РКЬ/5 клетками в процессе роста в условиях культивирования низкого прикрепления по сравнению с клетками, обработанными с помощью контрольного МАЬ.

Пример 18. РЬС/РКР/8 клетки, предварительно обработанные с помощью анти-ЬРО моноклональных антител, формируют меньшее количество сфероидов при выращивании в условиях культивирования низкого прикрепления.

Этот пример показывает ингибиторный эффект предварительной обработки с помощью анти-ЬРО моноклональных антител на способность клеток гепатоклеточной карциномы формировать сфероиды в условиях культивирования низкого прикрепления.

A. Способы.

50000 РЬС/РКР/5 клеток гепатоклеточной карциномы/ячейка сначала высевали в планшеты на 6 ячеек в ЕМЕМ с 10% РС8, истощали сыворотку в течение ночи и выращивали в течение 72 ч в ЕМЕМ + 0,5% паннексин Н в присутствии 10 мкг/мл анти-ЬРО МАЬ 8, анти-ЬРО МАЬ 16 или контрольного моноклонального антитела (контроль МАЬ, Р3Х63Ад8, АТСС, КеР Т1В-9). В конце эксперимента для каждой группы обработки 200 клеток/ячейка высаживали в шесть ячеек планшетов ультранизкого прикрепления на 24 ячейки в 500 мкл свободной от сыворотки М11 среды, содержащей ЬРОР и ЕОР, и выращивали в течение последующих 5 дней при отсутствии обработки. По окончании этого периода делали фотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также измеряли поверхность сфер.

Фотографии делали в конце 5-дневного периода вымывания, во время которого клетки РЬС/РКР/5 клеток для всех исходных условий обработки выращивали в той же среде М11. После этого оператор, который не имел информации в отношении идентификации всех ячеек, подсчитывал количество сфероидов.

B. Результаты.

Как показано на фиг. 16, способность РЬС/РКР/5 клеток гепатоклеточной карциномы к формированию сфероидов в планшетах низкого прикрепления значительно снижалась путем предварительной 72часовой обработки при использовании двух различных моноклональных антител против прогастрина по сравнению с контрольным МАЬ.

Пример 19. Боковая популяция клеток РЬС/РКЬ/5 гепатоклеточной карциномы формирует меньшее количество сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления в случае обработки с помощью анти-РО антитела.

Этот пример показывает влияние анти-ЬРО моноклональных антител на образование сфероидов при условиях культивирования низкого прикрепления для исключающей краситель боковой популяции клеток, изолированных из РЬС/РКЬ/5 клеток рака печени.

A. Способы.

Исключающую краситель боковую популяцию клеток РЬС/РКЬ/5 изолировали так, как описано в примере 8. Потом клетки боковой популяции высевали в планшеты на 24 ячейки с ультранизким прикреплением (400 клеток/ячейка) в среде М11 и выращивали в течение 7 дней при 37°С в присутствии контрольной среды или антипрогастриновых моноклональных антител МАЬ 13 (6 мкг/мл) или МАЬ 16 (10 мкг/мл) (6 ячеек на вариант). Состав среды М11 был следующим: ИМЕМ/Р12-глутамакс (каталожный номер 31331 1иуЬтодеи); 20 нг/мл ЕОР (К&И кук!етк); 10 нг/мл РОР (К&И кук!етк); 20 мкг/мл инсулина (81дта); 1/100 разведение N2 добавки (каталожный номер Р1510, ОФсо); 2 мкг/мл ципрофлоксацина, 5 мкг/мл гентамицина и 3 мкг/мл глюкозы. В конце эксперимента делали микрофотографии и подсчитывали количество сфер на ячейку, а также получали среднее значение и стандартное отклонение.

B. Результаты.

Как показано на фиг. 17, обработка боковой популяции клеток, изолированных из РЬС/РКЬ/5 линии клеток, с помощью анти-ЬРО моноклональных антител существенно снижала количество сфероидов, которые образуются при условиях культивирования низкого прикрепления, по сравнению с клетками, выращенными в среде, взятой отдельно.

Все публикации, патенты, патентные заявки и другие документы, приведенные в данной заявке, являются введенными в качестве ссылки в своей целостности для всех целей до такой степени, как если бы каждая индивидуальная публикация, патент, патентная заявка и другой документ были индивидуально указаны для включения в качестве ссылки для всех целей.

Несмотря на то что различные специфические воплощения были проиллюстрированы и описаны, будет понятным, что могут быть внесены различные изменения без отступления от духа и объема данного(ых) изобретения(ий).

- 33 028515

Перечень последовательностей <110> В1ОКЕАЫТЕ5, 5.А.5.

СЕЫТКЕ ЫАТЮЫАЬ БЕ ЬА КЕСНЕКСНЕ 3ΟΙΕΝΤΙΕΙζ)υΕ

ΙΝ3ΤΙΤϋΤ ЫАТЮЫАЬ БЕ ЬА 3ΑΝΤΕ ЕТ БЕ ЬА КЕСНЕЕСНЕ МЕЫСАЬЕ <120> СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ТЕРАПИИ РАКА ПЕЧЕНИ <130> 382657-005ΝΟ <14 0>

<141>

<150> 61/476,204 <151> 2011-04-15 <150> 61/367,851 <151> 2010-07-26 <160> 106 <170> РаЬепЫп версия 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 1

С1у Туг Не РНе ТНг Зег Туг Тгр

5 <210> 2 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 2

РНе Туг Рго С1у Азп Зег Азр Зег

5 <210> 3 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

- 34 028515 <400> 3

ТЬг Агд Агд Азр Зег Рго С1п Туг 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 4

С1п Зег Не Уа1 НЬз Зег Азп С1у Азп ТИг Туг

10 <210> 5 <211> 3 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 5

Ьуз УаЬ Зег <210> 6 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 6

РНе С1п С1у Зег НЬз Уа1 Рго РЬе ТИг

5 <210> 7 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 7

С1у Туг ТЬг РНе Зег Зег Зег Тгр 1 5

- 35 028515 <210> 8 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 8

РЬе Ьеи Рго 61у Зег С1у Зег ТЬг

5 <210> 9 <211> 11 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 9

А1а ТЬг Азр С1у Азп Туг Азр Тгр РЬе А1а Туг

10 <210> 10 <211> 11 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 10

С1п Зег Ьеи Уа1 Низ Зег Зег С1у Уа1 ТЬг Туг 15 10 <210> 11 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 11

Зег 61п Зег ТЬг НЬз Уа1 Рго Рго ТЬг

5 <210> 12 <211> 115 <212> Белок

- 36 028515 <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 12	Рго	С1у 15	А1а
С1и Уа1 1	С1п	Ьеи	С1п С1п Зег С1у ТЬг Уа1	Ьеи А1а	Агд
5	10
Зег Уа1	Ьуз	МеЬ	Зег Суз	Ьуз А1а Зег С1у	Туг 11е	РЬе	ТЬг	Зег	Туг
		20		25			30
Тгр Уа1	Низ	Тгр	Уа1 Ьуз	С1п Агд Рго С1у	С1п С1у	Ьеи	61и	Тгр	11е
	35			40		45
С1у С1у	РЬе	Туг	Рго С1у	Азп Зег Азр Зег	Агд Туг	Азп	С1п	Ьуз	РЬе
50				55	60
Ьуз С1у	Ьуз	А1а	ТЬг Ьеи	ТЬг А1а Уа1 ТЬг	Зег А1а	Зег	ТЬг	А1а	Туг
65			70		75				80
МеЬ Азр	Ьеи	Зег	Зег Ьеи	ТЬг Азп С1и Азр	Зег А1а	Уа1	Туг	РЬе	Суз
			85	90				95
ТЬг Агд	Агд	Азр	Зег Рго	С1п Туг Тгр С1у	С1п С1у	ТЬг	ТЬг	Ьеи	ТЬг
		100		105			110
Уа1 Зег	Зег
	115
<210> 13
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 13

Азр Уа1 Ьеи МеЬ ТЬг С1п ТЬг Рго Ьеи Зег Ьеи Рго Уа1 Зег Ьеи С1у

10 15

Азр С1п А1а Зег Не Зег Суз Агд Зег Зег С1п Зег 11е Уа1 Шз Зег 20 25 30

Азп С1у Азп ТЬг Туг Ьеи С1и Тгр Туг Ьеи С1п Ьуз Рго С1у С1п Зег 35 40 45

Рго Ьуз Ьеи Ьеи Не Туг Ьуз Уа1 Зег Азп Агд РЪе Зег С1у Уа1 Рго 50 55 60

Азр Агд РЪе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЪг Азр РЪе ТЪг Ьеи Ьуз Не 65 70 75 80

Зег Агд Ьеи С1и А1а С1и Азр Ьеи С1у Уа1 Туг Туг Суз РЪе С1п С1у 85 90 95

Зег НЬз Уа1 Рго РЪе ТЪг РЪе С1у С1у С1у ТЪг Ьуз Ьеи 61и Не Ьуз 100 105 110 <210> 14 <211> 118 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 14

С1п Уа1 1	61п Ьеи	С1п 5	61п	Зег	С1у А1а	С1и Ьеи МеЬ 10	Ьуз	Рго	С1у 15	А1а
Зег Уа1	Ьуз Не	Зег	Суз	Ьуз	А1а ТЪг	С1у Туг ТЪг	РЪе	Зег	Зег	Зег
	20				25			30
Тгр Не	С1и Тгр	Ьеи	Ьуз	С1п	Агд Рго	С1у Ηίδ С1у	Ьеи	61и	Тгр	Не
	35				40		45
61у С1и	РЪе Ьеи	Рго	С1у	Зег	С1у Зег	ТЪг Азр Туг	Азп	С1и	Ьуз	РЪе
50				55		60
Ьуз С1у	Ьуз А1а	ТЪг	РЪе	ТЪг	А1а Азр	ТЪг Зег Зег	Азр	ТЪг	А1а	Туг
65			70			75				80
МеЬ Ьеи	Ьеи Зег	Зег	Ьеи	ТЪг	Зег С1и	Азр Зег А1а	Уа1	Туг	Туг	Суз
		85				90			95
А1а ТЪг	Азр С1у	Азп	Туг	Азр	Тгр РЪе	А1а Туг Тгр	С1у	С1п	С1у	ТЪг
	100				105			110
Ьеи Уа1	ТЪг Уа1	Зег	А1а
	115
<210> 15
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная	последовательность

<220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 15

МеЬ

ТЬг 5

С1п

ТЬг

Рго

Ьеи

Зег 10

Ьеи

Рго

Уа1

Зег

Ьеи 15

61у

Азр 1

Ьеи

Уа1

Азр

61п

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

С1п

Зег

Ьеи

Уа1

Ηίδ

Зег

20

25

30

Зег

С1у

Уа1

ТЬг

Туг

Ьеи

НЬз

Тгр

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго

СЯу

С1п

Зег

35

40

45

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Агд

РЬе

Зег

СЯу

Уа1

Рго

50

55

60

Азр

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Зег

Агд

Уа1

СЯи

А1а

СЯи

Азр

Ьеи

С1у

Уа1

Туг

РЬе

Суз

Зег

С1п

Зег

85

90

95

ТЬг

Ηίδ

Уа1

Рго

Рго

ТЬг

РЬе

СЯу

Зег

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

100

105

но

<210> 16

<211> 345

<212> ДНК

<213> Искусственная

последовательность

<220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<220> <221> СЬЗ <222> (1)..

(345)

<400> 16

дад

дЬЬ

сад

сЬс

сад

сад

ЬсЬ

ддд

асЬ

дЬд

сЬд

дса

адд

ссЬ

ддд

дсЬ

48

СЯи

Уа1

С1п

Ьеи

С1п

С1п

Зег

С1у

ТЬг

Уа1

Ьеи

А1а

Агд

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Ьсс

дЬд

аад

аЬд

Ьсс

Ьдс

аад

дсЬ

ЬсЬ

ддс

Ьас

аЬс

ЬЬЬ

асе

аде

Ьас

96

Зег

Уа1

Ьуз

МеЪ

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

11е

РЬе

ТЬг

Зег

Туг

20

25

30

Ьдд

дЬа

сас

Ьдд

дЬЬ

ааа

сад

адд

ссЬ

дда

сад

ддЬ

сЬа

даа

Ьдд

аЬЬ

144

Тгр

Уа1

НЬз

Тгр

Уа1

Ьуз

С1п

Агд

Рго

С1у

С1п

СЯу

Ьеи

С1и

Тгр

11е

35

40

45

дд!

ддЬ

ььь

ΐβΐ

ссЬ

дда

ааЬ

адЬ

даЬ

ЬсЬ

адд

Ьас

аас

сад

ааа

ЬЬс

192

С1у

С1у

РЬе

Туг

Рго

С1у

Азп

Зег

Азр

Зег

Агд

Туг

Азп

С1п

Ьуз

РЬе

55 60

аад ддс

аад Ьуз

дсс А1а

аса ТЬг

сЬд Ьеи 70

асЬ ТЬг

дса А1а

дЬс аса

Ьсс Зег 75

дсс А1а

адЬ Зег

асЬ ТЬг

дсс А1а

Ьас Туг 80

240

Ьуз 65

С1у

Уа1

ТЬг

аЬд

дас

сЬс

аде

аде

сЬд

аса

ааЬ

дад

дас

ЬсЬ

дед

дЬс

ЬаЬ

ЬЬс

ЬдЬ

288

МеЬ

Азр

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Азп

С1и

Азр

Зег

А1а

Уа1

Туг

РЬе

Суз

85

90

95

аса

ада

ада

даЬ

адЬ

ссс

сад

Ьас

Ьдд

ддс

саа

ддс

асе

асЬ

сЬс

аса

336

ТЬг

Агд

Агд

Азр

Зег

Рго

С1п

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

100

105

110

дЬс

Ьсс

Ьса

345

Уа1

Зег

Зег

115

<210> 17

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная

последовательность

<220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(336) <400> 17

да! Азр 1

дЬЪ Уа1

ЬЬд Ьеи

аЬд МеЬ

асе ТЬг 5

саа С1п

асЬ ТЬг

сса Рго

Не Ьеи

Нс Зег 10

Ид Ьеи

сП Рго

дН Уа1

адЬ Зег

сН Ьеи 15

дда С1у

48

даЬ

саа

дсс

Ьсс

аЬс

ЬсЬ

Ьдс

ада

НЬ

адЬ

сад

аде

аН

дЬа

саЬ

адЬ

96

Азр

С1п

А1а

Зег

Не

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

С1п

Зег

11е

Уа1

ΗΪ8

Зег

20

25

30

ааЬ

дда

аас

асе

ЬаЬ

На

даа

Ьдд

Ьас

Ид

сад

ааа

сса

ддс

сад

ЬИ

144

Азп

С1у

Азп

ТЬг

Туг

Ьеи

С1и

Тгр

Туг

Ьеи

С1п

Ьуз

Рго

С1у

С1п

Зег

35

40

45

сса

аад

сЬс

сЬд

аН

Ьас

ааа

дН

Нс

аас

еда

НЬ

НЬ

ддд

дН

сса

192

Рго

Ьуз

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Агд

РЬе

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

дас

адд

ЬЬс

адЬ

ддс

адЬ

дда

Ьса

ддд

аса

даЬ

Нс

аса

Нс

аад

аН

240

Азр

Агд

РЬе

Зег

О1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Не

65

70

75

80

аде

ада

сЬд

дад

дсЬ

дад

даЬ

Ид

дда

дН

ЬаЬ

Ьас

Ьдс

нь

саа

ддЬ

288

Зег

Агд

Ьеи

С1и

А1а

С1и

Азр

Ьеи

С1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

РЬе

С1п

С1у

85

90

95

Ьса

саЬ

дЬЬ

ссд

ЬЬс

асд

Нс

дда

ддд

ддд

асе

аад

Нд

даа

аЬа

ааа

336

Зег

НЬз

Уа1

Рго

РЬе

ТЬг

РЬе

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

01и

Не

Ьуз

100

105

110

<210> 18 <211> 354 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность ' <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(354) <400> 18 сад дРР сад РРд сад сад РсР дда дсР дад сРд аРд аад сса ддд дсс 48

С1п Уа1 С1п Ьеи С1п С1п Зег С1у А1а С1и Ьеи МеР Ьуз Рго 61у А1а

10 15

Рса дрд аад аРа Рсс Ддс аад дсР асР ддс Рас аса РРс адр аде Рсс 96

Зег Х/а1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а ТЬг С1у Туг ТЬг РЬе Зег Зег Зег

25 30

Рдд аРа дад Рдд РРа ааа сад адд ссР дда саР ддс сРР дад Рдд аРР 144

Тгр 11е С1и Тгр Ьеи Ьуз С1п Агд Рго О1у Нтз О1у Ьеи С1и Тгр 11е

40 45 дда дад РРР РРа ссР дда адр ддр адр аса дас Рас аар дад аад РРс 192

С1у С1и РЬе Ьеи Рго С1у Зег С1у Зег ТЬг Азр Туг Азп С1и Ьуз РЬе

55 60 аад ддс аад дсс аса РРс асР дса дас аса Рсс Рсс дас аса дсс Рас 240

Ьуз С1у Ьуз А1а ТЬг РЬе ТЬг А1а Азр ТЬг Зег Зег Азр ТЬг А1а Туг

70 75 80

аРд сРа сРс аде аде

ерд аса РсР

дад дас

РсР дсс дРс РаР

Рас Туг 95

РдР Суз

288

МеР

Ьеи

Ьеи Зег

Зег 85

Ьеи ТЬг

Зег

С1и

Азр 90

Зег

А1а

Уа1

Туг

дса

асР

дар

ддр

ааР

РаР

дас

Рдд

РРР

дсР

Рас

Рдд

ддс

саа

ддд

асР

336

А1а

ТЬг

Азр

С1у

Азп

Туг

Аэр

Тгр

РЬе

А1а

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

100

105

но

сРд дРс асР дРс РсР дса 354

Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1а

115 <210> 19 <211> 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <220>

<221> СЬЗ <222> (1)..(336)

- 41 028515 <400> 19 дар сЬЪ дЬд аЪд асе саа асЪ сса сЬс Нс сЬд ссЬ дЪе адЪ сН дда Азр Ьеи Уа1 МеЪ ТЪг С1п ТЪг Рго Ьеи Зег Ьеи Рго Уа1 Зег Ьеи С1у 15 10 15 даЬ саа дсс Ьсс а+с ЪсЬ Ъдс ада ЬсЪ адЪ сад аде с+Ъ дЬа сас адЬ Азр С1п А1а Зег Не Зег Суз Агд Зег Зег С1п Зег Ьеи Уа1 НЬз Зег

25 30 адЬ дда дЬс асе как На саЬ Ъдд Рас сЪд сад аад сса ддс сад ЬсЬ Зег С1у Уа1 ТЪг Туг Ьеи Н1з Тгр Туг Ьеи Θΐη Ьуз Рго С1у С1п Зег

40 45

144 сса аад с+с с+д а+с Ъас ааа дИ Ьсс аас еда ЪН ЪсЬ ддд дЪс сса Рго Ьуз Ьеи Ьеи 11е Туг Ьуз Уа1 Зег Азп Агд РЪе Зег С1у Уа1 Рго

55 60

192 дас адд Нс адЪ ддс адЪ дда На ддд аса даЬ Нс аса сН аад аН Азр Агд РЪе Зег 61у Зег 01у Зег С1у ТЪг Азр РЪе ТЪг Ьеи Ьуз 11е 65 70 75 80

240

аде

ада

д+д

дад

дИ

дад

даЪ

Ид

дда

дН

РаЬ

Нс

Ьдс

НЪ

саа

адЬ

288

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

С1и

Азр

Ьеи

С1у

Уа1

Туг

РЪе

Суз

Зег

С1п

Зег

85

90

95

аса

саЬ

дН

сП

ссс

асд

Нс

ддс

Нд

ддд

аса

аад

Нд

даа

а+а

ааа

336

ТЪг

НЬз

Уа1

Рго

Рго

ТЪг

РЪе

С1у

Зег

С1у

ТЪг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

100

105

110

<210> 20 <211> 80 <212> Белок <213> Нолю зариепз <400> 20

Зег Тгр Ьуз Рго Агд Зег С1п 61п Рго Азр А1а Рго Ьеи С1у ТЪг С1у 15 10 15

А1а Азп Агд Азр Ьеи С1и Ьеи Рго Тгр Ьеи С1и С1п С1п С1у Рго А1а 20 25 30

Зег Нгз НЬз Агд Агд С1п Ьеи С1у Рго С1п С1у Рго Рго НЬз Ьеи Уа1 35 40 45

А1а Азр Рго Зег Ьуз Ьуз С1п С1у Рго Тгр Ьеи С1и С1и С1и 61и О1и 50 55 60

А1а Туг С1у Тгр Мер Азр РЪе С1у Агд Агд Зег А1а С1и Азр С1и Азп 65 70 75 80 <210> 21 <211> 115 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический

- 42 028515 полипептид

<400> 21

Зег

С1у

А1а

С1и 10

Уа1

Ьуз

Ьуз

Рго

С1у 15

А1а

61п 1

Уа1

С1п

Ьеи

Уа1 5

С1п

Зег

Уа1

Ьуз

Уа1 20

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег 25

С1у

Туг

11е

РЬе

ТЬг 30

Зег

Туг

Тгр

Уа1

Нтз 35

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а 40

Рго

С1у

С1п

Агд

Ьеи 45

С1и

Тгр

МеЬ

С1у

С1у 50

РЬе

Туг

Рго

С1у

Азп 55

Зег

Азр

Зег

Агд

Туг 60

Зег

С1п

Ьуз

РЬе

С1п 65

С1у

Агд

Уа1

ТЬг

Не 70

ТЬг

Агд

Азр

ТЬг

Зег 75

А1а

Зег

ТЬг

А1а

Туг 80

Мер

С1и

Ьеи

Зег

Зег 85

Ьеи

Агд

Зег

С1и

Азр 90

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг 95

Суз

ТЬг

Агд

Агд

Азр 100

Зег

Рго

С1п

Туг

Тгр 105

С1у

61п

С1у

ТЬг

Ьеи 110

УаЬ

ТЬг

Уа1

Зег

Зег 115

<210> 22 <211> 112 <212> Белок <213> Искусственная

последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание=Описание

искусственной последовательности

:: Синтетический О1у

полипептид

Зег

<400> 22

С1п

Рго

Ьеи

Зег 10

Ьеи

Рго Уа1

ТЬг

Ьеи 15

Азр Уа1 1

Уа1

МеЬ

ТЬг 5

С1п Рго

А1а

Зег

11е

Зег

Суз

Агд

Зег

Зег

С1п

Зег 11е

Уа1

ΗΪ3

Зег

20

25

30

Азп С1у

Азп

ТЬг

Туг

Ьеи

С1и

Тгр

РЬе

61п

С1п

Агд Рго

01у

С1п

Зег

35

40

45

Рго Агд

Агд

Ьеи

Не

Туг

Ьуз

Уа1

Зег

Азп

Агд

РЬе Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

Азр Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

Зег Агд Уа1 С1и А1а С1и Азр Уа1 С1у Уа1 Туг Туг Суз РЬе С1п 61у

90 95

Зег ΗΪ3 Уа1 Рго РЬе ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз 100 105 110 <210> 23 <211> 118 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 23	С1у А1а	С1и Уа1 10	Ьуз	Ьуз	Рго	С1у 15	А1а
С1п 1	Уа1	С1п Ьеи	Уа1 61п Зег 5
Зег	Уа1	Ьуз Уа1 20	Зег Суз Ьуз	А1а Зег 25	С1у Туг	ТЬг	РЬе	Зег 30	Зег	Зег
Тгр	МеЬ	НЬз Тгр 35	Уа1 Агд С1п	А1а Рго 40	С1у С1п	С1у	Ьеи 45	С1и	Тгр	МеЬ
С1у	11е 50	РЬе Ьеи	Рго С1у Зег 55	С1у Зег	ТЬг Азр	Туг 60	А1а	С1п	Ьуз	РЬе
О1п 65	С1у	Агд Уа1	ТЬг МеЬ ТЬг 70	Агд Азр	ТЬг Зег 75	ТЬг	Зег	ТЬг	Уа1	Туг 80
МеЬ	61и	Ьеи Зег	Зег Ьеи Агд 85	Зег С1и	Азр ТЬг 90	А1а	Уа1	Туг	Туг 95	Суз
А1а ТЬг Азр С1у Азп Туг Азр Тгр РЬе А1а Туг 100 105 Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210> 24 <211> 112 <212> Белок <213> Искусственная последовательность	Тгр	С1у	С1п 110	С1у	ТЬг

<220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

- 44 028515

<400> 24

Мер

ТНг 5

СЬп ТНг

Рго

Ьеи

Зег 10

Ьеи

Зег

УаЬ

ТНг

Рго 15

СЬу

Азр 1

Не

Уа1

С1п

Рго

А1а

Зег 20

11е

Зег Суз

Ьуз

Зег 25

Зег

С1п

Зег

Ьеи

УаЬ 30

НЬз

Зег

Зег

СЬу

Уа1 35

ТНг

Туг

Ьеи Туг

Тгр 40

Туг

Ьеи

СЬп

Ьуз

Рго 45

СЬу

СЬп

Зег

Рго

С1п 50

Ьеи

Ьеи

11е

Туг Ьуз 55

УаЬ

Зег

Азп

Агд

РНе 60

Зег

СЬу

УаЬ

Рго

Азр 65

Агд

РНе

Зег

СЬу

Зег СЬу 70

Зег

СЬу

ТНг

Азр 75

РНе

ТНг

Ьеи

Ьуз

1Ье 80

Зег

Агд

Уа1

СЬи

А1а 85

С1и Азр

УаЬ

СЬу

Уа1 90

Туг

Туг

Суз

Зег

СЬп 95

Зег

ТНг

НЬз

Уа1

Рго

Рго

ТНг РНе

СЬу

С1п

СЬу

ТНг

Ьуз

Ьеи

СЬи

ТЬе

Ьуз

100 105 110 <210> 25 <211> 14 <212> Белок <213> Нолю зарЬепз <400> 25

Зег Тгр Ьуз Рго Агд Зег С1п С1п Рго Азр А1а Рго Ьеи СЬу 15 10 <210> 26 <211> 16 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <220>

<221> МОБ_КЕЗ <222> (15)..(15) <223> АИх <400> 26

Зег Тгр Ьуз Рго Агд Зег С1п С1п Рго Азр А1а Рго Ьеи СЬу Хаа Суз 15 10 15 <210> 27 <211> 26 <212> Белок

- 45 028515

<210> 33 <211> 4

- 46 028515 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 33

РЪе О1у Агд Агд 1 <210> 34 <211> 5 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 34

МеЪ Азр РЪе С1у Агд 1 5 <210> 35 <211> 5 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 35

А1а С1и Азр С1и Азп 1 5 <210> 36 <211> 8 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 36

С1у Тгр МеЪ Азр РЪе С1у Агд Агд 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 37

С1у РЪе ТЪг РЪе ТЪг ТЪг Туг А1а

5 <210> 38 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 38

- 47 028515

С1у РЬе Не РЬе Зег Зег Туг 61у 1 5 <210> 39 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 39

С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг Туг

5 <210> 40 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 40

С1у Туг Зег 11е ТЬг Зег Азр Туг А1а

5 <210> 41 <211> 8 , <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 41

11е Зег Зег С1у С1у ТЬг Туг ТЬг

5 <210> 42 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 42

Не Азп ТЬг РЬе С1у Азр Агд ТЬг

5

- 48 028515 <210> 43 <211> 8 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 43

Не Азп Рго Зег Азп С1у С1у ТЬг

5 <210> 44 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 44

11е Зег РЬе Зег С1у Туг ТЬг

5 <210> 45 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 45

А1а ТЬг С1п С1у Азп Туг Зег Ьеи Азр РЬе

10 <210> 46 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 46

А1а Агд С1у ТЬг С1у ТЬг Туг

5 <210> 47 <211> 10 <212> Белок <213> Искусственная последовательность

- 49 028515 <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 47

ТЬг Агд С1у С1у Туг Туг Рго РЬе Азр Туг

10 <210> 48 <211> 14 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 48

А1а Агд С1и Уа1 Азп Туг С1у Азр Зег Туг Ηίδ РЬе Азр Туг

10 <210> 49 <211> 11 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 49

Ьуз Зег Ьеи Агд НЬз ТЬг Ьуз С1у Не ТЬг РЬе

10 <210> 50 <211> 11 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 50

С1п Зег Ьеи Ьеи Азр Зег Азр С1у Ьуз ТЬг Туг

10 <210> 51 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник

- 50 028515 <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 51

Зег С1п ΗΪ3 Агд ТНг Туг ТНг

5 <210> 52 <211> 3 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 52

С1п МеТ Зег <210> 53 <211> 3 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 53

Ьеи Уа1 Зег <210> 54 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 54

Уа1 Ьуз Ьуз Азр С1у Зег Н1з

5 <210> 55 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид

- 51 028515 <400> 55

А1а С1п Азп Ьеи О1и Ьеи Рго Ьеи ТЬг 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 56

Тгр С1п С1у ТЬг НЬз РЬе Рго С1п ТЬг

5 <210> 57 <211> 9 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 57

Тгр С1п С1у ТЬг НЬз Зег Рго Туг ТЬг

5 <210> 58 <211> 13 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 58

С1у Уа1 С1у Азр А1а Не Ьуз С1у С1п Зег Уа1 РЬе Уа1

10 <210> 59 <211> 117 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 59

С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго С1у С1у

10 15

- 52 028515

Зег Ьеи Ьуз Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЪе ТЪг РЪе ТЪг ТЪг Туг 20 25 30

А1а Мер Зег Тгр Уа1 Агд С1п ТЪг Рго С1и Ьуз Агд Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45

А1а ТЪг 11е Зег Зег С1у С1у ТЪг Туг ТЪг Туг Туг Рго Азр Зег Уа1 50 55 60

Ьуз 61у Агд РЪе ТЪг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп А1а Ьеи Туг 65 70 75 80

Ьеи С1п Мер Зег Зег Ьеи Агд Зег С1и Азр ТЪг А1а Мер Туг Туг Суз 85 90 95

А1а ТЪг 61п С1у Азп Туг Зег Ьеи Азр РЪе Тгр О1у С1п С1у ТЪг Зег 100 105 110

Ьеи ТЪг Уа1 Зег Зег 115 <210> 60 <211> 114 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 60

С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у

10 15

Зег Ьеи Ьуз Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЪе 11е РЪе Зег Зег Туг 20 25 30

С1у МеР Зег Тгр Уа1 Агд С1п Зег Рго Азр Агд Агд Ьеи С1и Ьеи Уа1 35 40 45

А1а Зег Не Азп ТЪг РЪе С1у Азр Агд ТЪг Туг Туг Рго Азр Зег Уа1 50 55 60

Ьуз С1у Агд РЪе ТЪг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп ТЪг Ьеи Туг 65 70 75 80

Ьеи С1п МеЪ ТЪг Зег Ьеи Ьуз Зег С1и Азр ТЪг А1а 11е Туг Туг Суз 85 90 95

- 53 028515

А1а Агд С1у ТЬг С1у ТЬг Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 100 105 110

Зег Зег <210> 61 <211> 117 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 61

С1п

Зег

С1у А1а

С1и 10

Ьеи Уа1

Ьуз

Рго

С1у 15

А1а

С1п Уа1 1

Θΐη

Ьеи

С1п 5

Зег Уа1

Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

Ьуз

А1а Зег

С1у

Туг ТЬг

РЬе

ТЬг

Зег

Туг

20

25

30

Туг МеЬ

Туг

Тгр

Уа1

Ьуз

С1п

Агд Рго

С1у

С1п С1у

Ьеи

С1и

Тгр

11е

35

40

45

С1у С1и

11е

Азп

Рго

Зег

Азп

С1у С1у

ТЬг

Азп РЬе

Азп

С1и

Ьуз

РЬе

50

55

60

Ьуз Зег

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1 Азр

Ьуз

Зег Зег

Зег

ТЬг

А1а

Туг

65

70

75

80

Мер С1п

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег С1и

Азр

Зег А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

ТЬг Агд

С1у

С1у

Туг

Туг

Рго

РЬе Азр

Туг

Тгр С1у

С1п

С1у

ТЬг

ТЬг

100

105

но

Ьеи ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

<210> 62

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная

последовательность

<220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 62

Азр Уа1 С1п Ьеи С1п С1и Зег С1у Рго С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго Зег С1п

10 15

- 54 028515

Зег	Ьеи	Зег	Ьеи 20	ТЬг	Суз ТЬг УаЬ ТЬг 25	СЬу Туг	Зег	11е	ТЬг 30	Зег Азр
Туг	АЬа	Тгр	Азп	Тгр	Не Агд СЬп РЬе	Рго СЬу	Азп	Ьуз	Ьеи	СЬи Тгр
		35			40			45
МеЪ	СЬу	Туг	Не	Зег	РЬе Зег СЬу Туг	ТЬг Зег	Туг	Азп	Рго	Зег Ьеи
	50				55		60
Ьуз	Зег	Агд	Не	Зег	УаЬ ТЬг Агд Азр	ТЬг Зег	Агд	Азп	СЬп	РЬе РЬе
65					70	75				80
Ьеи	СЬп	Ьеи	ТЬг	Зег	УаЬ ТЬг ТЬг СЬи	Азр ТЬг	АЬа	ТЬг	Туг	Туг Суз
				85		90				95
АЬа	Агд	СЬи	УаЬ	Азп	Туг СЬу Азр Зег	Туг НЬз	РЬе	Азр	Туг	Тгр СЬу
			100		105				110
СЬп	СЬу	ТЬг	ТЬе	УаЬ	ТЬг УаЬ Зег Зег
		115			120
<210> 63
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная	последовательность

<220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 63

Азр Не УаЬ МеЬ ТЬг СЬп АЬа АЬа Зег Зег Азп Рго УаЬ ТЬг Ьеи СЬу

10 15

ТЬг Зег АЬа Зег 11е Зег Суз Агд Зег Зег Ьуз Зег Ьеи Агд НЬз ТЬг 20 25 30

Ьуз СЬу Не ТЬг РЬе Ьеи Туг Тгр Туг Ьеи СЬп Ьуз Рго СЬу СЬп Зег 35 40 45

Рго СЬп Ьеи Ьеи 11е Туг С1п МеЬ Зег Азп Ьеи АЬа Зег С1у УаЬ Рго 50 55 60

Азр Агд РЬе Зег Зег Зег СЬу Зег СЬу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Агд Не 65 70 75 80

Зег Агд УаЬ СЬи АЬа СЬи Азр Ьеи СЬу УаЬ Туг Туг Суз АЬа СЬп Азп 85 90 95

Ьеи С1и Ьеи Рго Ьеи ТЪг РЪе С1у А1а С1у ТЪг Ьуз Ьеи С1и Ьеи Ьуз 100 105 110 <210> 64 <211> 112 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 64

Азр Уа1 Уа1 Ьеи ТЪг С1п ТЪг Рго Ьеи ТЪг Ьеи Зег Уа1 ТЪг Не С1у

10 15

С1п Рго А1а Зег 11е Зег Суз Ьуз Зег Зег С1п Зег Ьеи Ьеи Азр Зег 20 25 30

Азр С1у Ьуз ТЪг Туг Ьеи Азп Тгр Ьеи Ьеи С1п Агд Рго С1у 61п Зег 35 40 45

Рго Ьуз Агд Ьеи 11е Туг Ьеи Уа1 Зег Ьуз Ьеи Азр Зег С1у Уа1 Рго 50 55 60

Азр Агд РЪе ТЪг С1у Зег С1у Зег С1у ТЪг Азр РЪе ТЪг Ьеи Ьуз 11е 65 70 75 80

Зег Агд Уа1 С1и А1а С1и Азр Ьеи С1у Уа1 Туг Туг Суз Тгр С1п С1у 85 90 95

ТЪг НЬз РЪе Рго С1п ТЪг РЪе С1у С1у С1у ТЪг Ьуз Ьеи О1и 11е Ьуз 100 105 110 <210> 65 <211> 112 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 65

Азр Уа1 !7а1 МеЪ ТЪг С1п ТЪг Рго Ьеи ТЪг Ьеи Зег Уа1 ТЪг 11е С1у

10 15

Агд Рго А1а Зег 11е Зег Суз Ьуз Зег Зег С1п Зег Ьеи Ьеи Азр Зег 20 25 30

- 56 028515

Азр СЬу Ьуз ТНг Туг Ьеи Туг Тгр Ьеи Ьеи С1п Агд Рго СЬу СЬп Зег 35 40 45

Рго Ьуз Агд Ьеи 1Ье Туг Ьеи УаЬ Зег СЬи Ьеи Азр Зег СЬу УаЬ Рго 50 55 60

Азр Агд Не ТНг СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТНг Азр РНе ТНг Ьеи Ьуз 11е 65 70 75 80

Зег Агд УаЬ СЬи АЬа СЬи Азр Ьеи СЬу УаЬ Туг Туг Суз Тгр СЬп СЬу 85 90 95

ТНг НЬз Зег Рго Туг ТНг РНе СЬу СЬу СЬу ТНг Ьуз Ьеи СЬи Не Ьуз 100 105 110 <210> 66 <211> 115 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 66

СЬп Ьеи АЬа Ьеи ТНг СЬп Зег Зег Зег АЬа Зег РНе Зег Ьеи СЬу АЬа

10 15

Зег АЬа Ьуз Ьеи ТНг Суз ТНг Ьеи Зег Зег С1п НЬз Агд ТНг Туг ТНг 20 25 30

Не СЬи Тгр Туг СЬп СЬп СЬп Зег Ьеи Ьуз Рго Рго Ьуз Туг УаЬ Мер 35 40 45

СЬи Уа1 Ьуз Ьуз Азр СЬу Зег НЬз Зег ТНг СЬу НЬз СЬу 11е Рго Азр 50 55 60

Агд РНе Зег СЬу Зег Зег Зег СЬу АЬа Азр Агд Туг Ьеи Зег 11е Зег 65 70 75 80

Азп 11е СЬп Рго СЬи Азр СЬи АЬа 11е Туг 11е Суз СЬу УаЬ СЬу Азр 85 90 95

АЬа 11е Ьуз СЬу СЬп Зег УаЬ РНе УаЬ РНе СЬу СЬу СЬу ТНг Ьуз УаЬ 100 105 110

ТНг Уа1 Ьеи 115 <210> 67

- 57 028515 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(351) <400> 67

даа С1и 1

дрд Уа1

сад С1п

сРд Ьеи

дрд Уа1 5

дад С1и

РсР Зег

ддд С1у

дда С1у

ддс С1у 10

РРа Ьеи

дрд Уа1

аад Ьуз

ссР Рго

дда С1у 15

ддд С1у

48

Рсс

сРд

ааа

сРс

Рсс

РдР

дса

дсс

РсР

дда

РРс

асР

РРс

асР

асе

РаР

96

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

РЬе

ТЬг

РЬе

ТЬг

ТЬг

Туг

20

25

30

дсс

аРд

РсР

Рдд

дРР

сдс

сад

асР

ссд

дад

аад

адд

сРд

дад

Рдд

дРс

144

А1а

МеР

Зег

Тгр

Уа1

Агд

С1п

ТЬг

Рго

С1и

Ьуз

Агд

Ьеи

С1и

Тгр

Уа1

35

40

45

дса

асе

аРР

адр

адр

ддр

ддр

асР

Рас

асе

Рас

РаР

сса

дас

адр

дрд

192

А1а

ТЬг

11е

Зег

Зег

С1у

С1у

ТЬг

Туг

ТЬг

Туг

Туг

Рго

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

аад

ддр

еда

РРс

асе

аРс

Рсс

ада

дас

ааР

дсс

аад

аас

дсс

сРа

Рас

240

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

А1а

Ьеи

Туг

65

70

75

80

сРд

саа

аРд

аде

адр

сРд

адд

РсР

дад

дас

асд

дсс

аРд

РаР

Рас

РдР

288

Ьеи

С1п

МеР

Зег

Зег

Ьеи

Агд

Зег

С1и

Азр

ТЬг

А1а

МеР

Туг

Туг

Суз

85

90

95

дса

аса

сад

ддд

ааР

Рас

РсР

РРд

дас

РРс

Рдд

ддс

саа

ддс

асе

РсР

336

А1а

ТЕг

С1п

С1у

Азп

Туг

Зег

Ьеи

Азр

РЬе

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

Зег

100

105

но

сРс аса дРс Рсс Рса 351

Ьеи ТЬг Уа1 Зег Зег

115 <210> 68 <211> 342 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(342) <400> 68

- 58 028515

дад дЬд

сад 61п

сЬд Ьеи

дЬд Уа1 5

дад С1и

Зег

ддд С1у

дда С1у

ддс С1у 10

Нд Ьеи

дЬд Уа1

сад 61п

ссЬ Рго

дда С1у 15

ддд С1у

48

С1и 1

Уа1

Нс

сЬд

ааа

сЬс

Нс

ЬдЬ

дса

дсс

ЬсЬ

дда

Нс

аН

Н:с

адЬ

аде

ЬаЬ

96

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

С1у

РЬе

11е

РЬе

Зег

Зег

Туг

20

25

30

ддс

аЬд

ЬсЬ

Ьдд

дЬЬ

сдс

сад

ЬсЬ

сса

дас

адд

адд

сЬд

дад

ЬЬд

дН

144

61у

МеЬ

Зег

Тгр

Уа1

Агд

С1п

Зег

Рго

Азр

Агд

Агд

Ьеи

С1и

Ьеи

Уа1

35

40

45

дса

адЬ

аН

ааЬ

асЬ

ЬЬЬ

ддЬ

даЬ

ада

асе

ЬаЬ

ЬаЬ

сса

дас

адЬ

дЬд

192

А1а

Зег

11е

Азп

ТЬг

РЬе

С1у

Азр

Агд

ТЬг

Туг

Туг

Рго

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

аад

ддс

еда

ЬЬс

асе

аЬс

Ьсс

ада

дас

ааЬ

дсс

аад

аас

асе

сЬд

Рас

240

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

А1а

Ьуз

Азп

ТЬг

Ьеи

Туг

65

70

75

80

сЬд

саа

аЬд

асе

адЬ

сЬд

аад

НЪ

дад

дас

аса

дсс

аН

ЬаЬ

Рас

ЬдЬ

288

Ьеи

С1п

Мер

ТЬг

Зег

Ьеи

Ьуз

Зег

С1и

Азр

ТЬг

А1а

11е

Туг

Туг

Суз

85

90

95

дса

ада

ддд

асе

дда

асе

Рас

Ьдд

ддс

саа

ддс

асе

асЬ

сЬс

аса

дЬс

336

А1а

Агд

С1у

ТЬг

С1у

ТЬг

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

100

105

110

Ъсс Ьса 342

Зег Зег <210> 69 <211> 351 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<220> <221> СОЗ <222> (1) . .

(351)

<400> 69

сад

дН

саа

сЬд

сад

сад

ЬсЬ

ддд

дсЬ

даа

сЬд

дЬд

аад

ссЬ

ддд

дсЬ

48

61п

Уа1

С1п

Ьеи

С1п

С1п

Зег

С1у

А1а

С1и

Ьеи

Уа1

Ьуз

Рго

С1у

А1а

1

5

10

15

Ьса

дЬд

аад

ЬЬд

Нс

Ьдс

аад

дсЬ

ЬсЬ

ддс

Рас

асе

Нс

асе

аде

Рас

96

Зег

Уа1

Ьуз

Ьеи

Зег

Суз

Ьуз

А1а

Зег

С1у

Туг

ТЬг

РЬе

ТЬг

Зег

Туг

20

25

30

ЬаЬ

аЬд

Ьас

Ьдд

дЬд

аад

сад

адд

сП

дда

саа

ддс

сН

дад

Ьдд

аН

144

Туг

МеЬ

Туг

Тгр

Уа1

Ьуз

С1п

Агд

Рго

С1у

С1п

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

11е

35

40

45

дда

дад

аЬЬ

ааЬ

ссЬ

аде

ааЬ

ддЬ

ддЬ

асЬ

аас

ЬЬс

ааЬ

дад

аад

Нс

192

С1у

С1и

11е

Азп

Рго

Зег

Азп

61у

С1у

ТЬг

Азп

РЬе

Азп

С1и

Ьуз

РЬе

50

55

60

- 59 028515

аад Ьуз 65

аде Зег

аад Ьуз

дсс А1а

аса ТЬг

сРд Ьеи 70

асР ТЬг

дРа Уа1

дас Азр

ааа Ьуз

Рсс Зег 75

Рсс Зег

аде Зег

аса ТЬг

дса А1а

Рас Туг 80

240

аРд

саа

сРс

аде

аде

сРд

аса

РсР

дад

дас

РсР

дед

дРс

РаР

Рас

РдР

288

Мер

61п

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Зег

С1и

Азр

Зег

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

аса

ада

ддс

ддЬ

Рас

Рас

ссс

РРР

дас

Рас

Рдд

ддс

саа

ддс

асе

аср

336

ТЬг

Агд

С1у

С1у

Туг

Туг

Рго

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

ТЬг

100

105

но

сРс аса дРс Рсс Рса 351

Ьеи ТЬг Уа1 Зег Зег

115 <210> 70 <211> 363 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(363) <400> 70

дар Азр 1

дрд Уа1

сад С1п

ерр Ьеи

сад С1п 5

дад С1и

Рсд Зег

дда С1у

ссР Рго

ддс С1у 10

сРд Ьеи

дрд Уа1

ааа Ьуз

ссР Рго

РсР Зег 15

сад С1п

48

РсР

сРд

Рсс

сРс

аса

Рдс

асР

дРс

асР

ддс

Рас

Рса

аРс

асе

адр

дар

96

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Уа1

ТЬг

С1у

Туг

Зег

Не

ТЬг

Зег

Азр

20

25

30

РаР

дсс

Рдд

ааР

Рдд

аРс

едд

сад

РРР

сса

дда

аас

ааа

сРд

дад

Рдд

144

Туг

А1а

Тгр

Азп

Тгр

Не

Агд

С1п

РЬе

Рго

С1у

Азп

Ьуз

Ьеи

С1и

Тгр

35

40

45

аРд

ддс

Рас

аРа

аде

РРс

адр

ддр

Рас

асР

адр

Рас

аас

сса

РсР

сРс

192

Мер

С1у

Туг

Не

Зег

РЬе

Зег

С1у

Туг

ТЬг

Зег

Туг

Азп

Рго

Зег

Ьеи

50

55

60

ааа

адр

еда

аРс

РсР

дРс

асР

едд

дас

аса

Рсс

адд

аас

саа

РРс

РРс

240

Ьуз

Зег

Агд

Не

Зег

Уа1

ТЬг

Агд

Азр

ТЬг

Зег

Агд

Азп

С1п

РЬе

РЬе

65

70

75

80

сРс

сад

РРд

асР

РсР

дрд

асР

асР

дад

дас

аса

дсс

аса

РаР

Рас

РдР

288

Ьеи

С1п

Ьеи

ТЬг

Зег

Уа1

ТЬг

ТЬг

С1и

Азр

ТЬг

А1а

ТЬг

Туг

Туг

Суз

85

90

95

дса

ада

дад

дРс

аас

РаР

ддд

дас

Рсс

Рас

сас

РРР

дас

Рас

Рдд

ддс

336

А1а

Агд

С1и

Уа1

Азп

Туг

С1у

Азр

Зег

Туг

ΗΪ3

РЬе

Азр

Туг

Тгр

С1у

100

105

НО

саа

ддс

асе

аРР

дРс

аса

дРс

Рсс

Рса

363

С1п

С1у

ТЬг

Не

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

- 60 028515

115

120 <210> 71 <211> 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <220>

<221> СОЗ <222> (1)..

336) <400> 71 дас аЕЕ дЕд аЕд асд сад дсЕ дса Есс ЕсЕ ааЕ сса дЕс асЕ сЕЕ дда Азр Не Уа1 МеЕ ТНг С1п А1а А1а Зег Зег Азп Рго Уа1 ТНг Ьеи С1у 15 10 15 аса Есс дсЕ Есс аЕс Есс Еде адд ЕсЕ адЕ аад адЕ сЕс еда саЕ асЕ ТНг Зег А1а Зег 11е Зег Суз Агд Зег Зег Ьуз Зег Ьеи Агд НЬз ТНг

25 30 ааа ддс аЕс асЕ ЕЕЕ ЕЕд ЕаЕ Едд ЕаЕ сЕд сад аад сса ддс сад ЕсЕ Ьуз С1у 11е ТНг РНе Ьеи Туг Тгр Туг Ьеи С1п Ьуз Рго С1у С1п Зег

40 45 ссЕ сад сЕс сЕд аЕЕ ЕаЕ сад аЕд Есс аас сЕЕ дсс Еса дда дЕс сса Рго С1п Ьеи Ьеи 11е Туг С1п МеЕ Зег Азп Ьеи А1а Зег С1у Уа1 Рго

55 60 дас адд ЕЕс адЕ аде адЕ ддд Еса дда асЕ даЕ ЕЕс аса сЕд ада аЕс Азр Агд РНе Зег Зег Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи Агд 11е 65 70 75 80

144

192

240

аде

ада

дкд

дад

дсЕ

дад

даЕ

ЕЕд

ддЕ

дЕЕ

ЕаЕ

Еас

ЕдЕ

дсЕ

саа

ааЕ

288

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

С1и

Азр

Ьеи

С1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

А1а

С1п

Азп

85

90

95

сЕа

даа

сЕЕ

ссд

сЕс

асд

ЕЕс

ддЕ

дсЕ

ддд

асе

аад

сЕд

дад

сЕд

ааа

336

Ьеи

С1и

Ьеи

Рго

Ьеи

ТНг

РНе

С1у

А1а

С1у

ТНг

Ьуз

Ьеи

С1и

Ьеи

Ьуз

100

105

но

<210> 72 <211> 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <220>

<221> СОЗ <222> (1) . .(336) <400> 72

- 61 028515

дай дРР

дрд сРд

асе ТЬг 5

сад асР

сса сРс асР

РРд Рсд дрр асе аРР

дда С1у

48

Азр 1

Уа1

Уа1

Ьеи

С1п

ТЬг

Рго

Ьеи

ТЬг 10

Ьеи

Зег

Уа1

ТЬг

11е 15

саа

сса

дсс

Рсс

аРс

Рсс

Рдс

аад

Рса

адР

сад

аде

сРс

На

дар

адР

96

С1п

Рго

А1а

Зег

11е

Зег

Суз

Ьуз

Зег

Зег

С1п

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Зег

20

25

30

дай

дда

аад

аса

РаР

ЬЬд

ааР

Ьдд

Цд

РРа

сад

адд

сса

ддс

сад

РсР

144

Азр

С1у

Ьуз

ТЬг

Туг

Ьеи

Азп

Тгр

Ьеи

Ьеи

С1п

Агд

Рго

С1у

С1п

Зег

35

40

45

сса

аад

сдс

сРа

аРс

РаР

сРд

дЬд

РсР

ааа

сРд

дас

РсР

дда

дРс

сП

192

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

11е

Туг

Ьеи

Уа1

Зег

Ьуз

Ьеи

Азр

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

дас

адд

РРс

асР

ддс

адР

дда

Рса

ддд

аса

дар

Нс

аса

Ид

ааа

аРс

240

Азр

Агд

РЬе

ТЬг

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

аде

ада

дЬд

дад

дсР

дад

дар

ЬЬд

дда

дЫ

РаР

РаР

Рдс

Ьдд

саа

ддЬ

288

Зег

Агд

Уа1

С1и

А1а

С1и

Азр

Ьеи

С1у

Уа1

Туг

Туг

Суз

Тгр

С1п

С1у

85

90

95

аса

саР

ррр

ссР

сад

асд

РРс

дд!

дда

ддс

асе

аад

сРд

даа

аРс

ааа

336

ТЬг

ΗΪ5

РЬе

Рго

С1п

ТЬг

РЬе

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

100

105

110

<210> 73 <211> 336 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид

<220> <221> СЬЗ <222> (1)..

(336)

<400> 73

дар

дН

дЬд

аРд

асе

сад

асР

сса

сРс

асР

РРд

Рсд

дрр

асе

аРР

ддд

48

Азр

Уа1

Уа1

МеЬ

ТЬг

Θΐη

ТЬг

Рго

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Зег

Уа1

ТЬг

11е

С1у

1

5

10

15

сдс

сса

дсс

Рсс

аРс

РсР

Рдс

аад

Рса

адР

сад

аде

сРс

РРа

дас

адР

96

Агд

Рго

А1а

Зег

11е

Зег

Суз

Ьуз

Зег

Зег

С1п

Зег

Ьеи

Ьеи

Азр

Зег

20

25

30

дар

дда

аад

аса

РаР

РРд

РаР

Рдд

РРд

РРа

сад

адд

сса

ддс

сад

РсР

144

Азр

С1у

Ьуз

ТЬг

Туг

Ьеи

Туг

Тгр

Ьеи

Ьеи

С1п

Агд

Рго

С1у

С1п

Зег

35

40

45

сса

аад

сдс

На

аРс

РаР

сРд

дрд

РсР

дад

сРд

дас

РсР

дда

дРс

ссР

192

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

11е

Туг

Ьеи

Уа1

Зег

С1и

Ьеи

Азр

Зег

С1у

Уа1

Рго

50

55

60

дас

адд

аРс

асР

ддс

адР

ддд

Рсд

ддд

аса

дар

РРс

аса

сРд

аад

аРс

240

Азр

Агд

11е

ТЬг

С1у

Зег

С1у

Зег

С1у

ТЬг

Азр

РЬе

ТЬг

Ьеи

Ьуз

11е

65

70

75

80

аде ада дЕд дад

дсЕ А1а 85

дад даЕ

ЕЕд дда дЕЕ Ьеи С1у Уа1 90

ЕаЕ Туг

ЕаЕ Туг

Еде Суз

Едд Тгр

саа С1п 95

дда С1у

288

Зег

Агд

Уа1

С1и

С1и

Азр

аса

саЕ

ЕсЕ

ссд

Еас

асд

ЕЕс

дда

ддд

ддд

асе

аад

сЕд

даа

аЕа

ааа

336

ТЬг

НЬз

Зег

Рго

Туг

ТЬг

РЬе

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Ьеи

С1и

11е

Ьуз

100

105

но

<210> 74 <211> 345 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полинуклеотид <220>

<221> СОЗ <222> (1)..(345) <400> 74

саа С1п 1

сЕЕ Ьеи

дед А1а

сЕс Ьеи

асЕ ТЬг 5

сад С1п

Еса Зег

ЕсЕ Зег

Еса Зег

дсс А1а 10

ЕсЕ Зег

ЕЕс РЬе

Есс Зег

сЕд Ьеи

дда С1у 15

дсс А1а

48

Еса

дса

ааа

сЕа

асд

Еде

асЕ

ЕЕд

адЕ

адЕ

саа

сас

ада

асд

Еас

асе

96

Зег

А1а

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

С1п

НЬз

Агд

ТЬг

Туг

ТЬг

20

25

30

аЕЕ

даа

Едд

ЕаЕ

сад

саа

сад

Еса

сЕс

аад

ссЕ

ссЕ

аад

ЕаЕ

дЕд

аЕд

144

11е

С1и

Тгр

Туг

С1п

С1п

С1п

Зег

Ьеи

Ьуз

Рго

Рго

Ьуз

Туг

Уа1

МеЕ

35

40

45

дад

дЕЕ

аад

ааа

даЕ

дда

аде

сас

аде

аса

ддЕ

саЕ

ддд

аЕЕ

ссЕ

даЕ

192

С1и

Уа1

Ьуз

Ьуз

Азр

С1у

Зег

НЬз

Зег

ТЬг

С1у

НЬз

С1у

11е

Рго

Азр

50

55

60

сдс

ЕЕс

ЕсЕ

дда

Есс

ад£

ЕсЕ

ддЕ

дсЕ

даЕ

сдс

Еас

сЕс

аде

аЕЕ

Есс

240

Агд

РЬе

Зег

С1у

Зег

Зег

Зег

С1у

А1а

Азр

Агд

Туг

Ьеи

Зег

11е

Зег

65

70

75

80

аас

аЕс

сад

ссЕ

даа

даЕ

даа

дса

аЕа

Еас

аЕс

ЕдЕ

ддЕ

дЕд

ддЕ

даЕ

288

Азп

11е

С1п

Рго

С1и

Азр

С1и

А1а

11е

Туг

11е

Суз

С1у

Уа1

С1у

Азр

85

90

95

дса

аЕЕ

аад

дда

саа

ЕсЕ

дЕд

ЕЕЕ

дЕЕ

ЕЕс

ддс

ддЕ

ддс

асе

аад

дЕс

336

А1а

11е

Ьуз

С1у

С1п

Зег

Уа1

РЬе

Уа1

РЬе

С1у

С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

100

105

110

асЕ дЕс сЕа 345

ТЬг Уа1 Ьеи

115 <210> 75 <211> 117 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 75

Ьеи

Уа1 СЬи Зег С1у С1у СЬу Ьеи УаЬ Ьуз

Рго

СЬу СЬу 15

С1и 1

Уа1

С1п

5

10

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег

СЬу

РЪе

ТЪг

РЪе

ТЪг

ТЪг

Туг

20

25

30

А1а

Мер

Зег

Тгр

УаЬ

Агд

С1п

А1а

Рго

СЬу

Ьуз

СЬу

Ьеи

СЬи

Тгр

УаЬ

35

40

45

Зег

Зег

11е

Зег

Зег

СЬу

СЬу

ТЪг

Туг

ТЪг

Туг

Туг

АЬа

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

С1у

Агд

РЪе

ТЪг

11е

Зег

Агд

Азр

Азп

АЬа

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

С1п

Мер

Азп

Зег

Ьеи

Агд

АЬа

СЬи

Азр

ТЪг

АЬа

УаЬ

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

ТЪг

С1п

61у

Азп

Туг

Зег

Ьеи

Азр

РЪе

Тгр

СЬу

СЬп

СЬу

ТЪг

ТЪг

100

105

110

Уа1 ТЪг Уа1 Зег Зег 115 <210> 76 <211> 112 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник

<223> /примечание=Описание полипептид <400> 76

искусственной последовательности

ι: Синтетический

Азр 1

ЬЬе

УаЬ

МеР

ТЪг 5

СЬп

Зег

Рго

Ьеи

Зег 10

Ьеи

Рго

УаЬ

ТЪг

Рго 15

СЬу

СЬи

Рго

АЬа

Зег 20

ЬЬе

Зег

Суз

Агд

Зег 25

Зег

Ьуз

Зег

Ьеи

Агд 30

Ηί3

ТЪг

Ьуз

СЬу

ЬЬе 35

ТЪг

РЪе

Ьеи

Туг

Тгр 40

Туг

Ьеи

СЬп

Ьуз

Рго 45

СЬу

СЬп

Зег

Рго

СЬп 50

Ьеи

Ьеи

ЬЬе

Туг

СЬп 55

МеР

Зег

Азп

Агд

АЬа 60

Зег

СЬу

УаЬ

Рго

Азр Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег	С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Ьуз Не
65	70	75	80

Зег Агд \/а1 С1и А1а	С1и Азр Уа1 С1у Уа1	Туг Туг Суз А1а С1п Азп
85	90	95

Ьеи С1и Ьеи Рго Ьеи ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Уа1 61и Не Ьуз
	100	105	но
<210> <211> <212> <213>	77 117 Белок Искусственная	последовательность

<220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 77

Ьеи

Уа1 5

С1и

Зег

С1у

С1у С1у Ьеи 10

Уа1

Ьуз

Рго

С1у 15

С1у

С1и 1

Уа1

С1п

Зег

Ьеи

Агд

Ьеи

Зег

Суз

А1а

А1а

Зег С1у РЬе

ТЬг

РЬе

ТЬг

ТЬг

Туг

20

25

30

А1а

МеЬ

Азп

Тгр

Уа1

Агд

С1п

А1а

Рго С1у Ьуз

С1у

Ьеи

С1и

Тгр

Уа1

35

40

45

Зег

Зег

11е

Зег

Зег

С1у

С1у

ТЬг

Туг ТЬг Туг

Туг

А1а

Азр

Зег

Уа1

50

55

60

Ьуз

С1у

Агд

РЬе

ТЬг

11е

Зег

Агд

Азр Азп А1а

Ьуз

Азп

Зег

Ьеи

Туг

65

70

75

80

Ьеи

С1п

МеЬ

Азп

Зег

Ьеи

Агд

А1а

С1и Азр ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг

Суз

85

90

95

А1а

ТЬг

С1п

С1у

Азп

Туг

Зег

Ьеи

Азр РЬе Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг

ТЬг

100

105

110

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег

Зег

115

<210> 78

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная

последовательность

<220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический

- 65 028515 полипептид <400> 78

Азр Не Уа1 МеЕ ТНг 61п Зег Рго Ьеи Зег Ьеи Рго Уа1 ТНг Рго С1у 15 10 15

С1и Рго А1а Зег 11е Зег Суз Агд Зег Зег Ьуз Зег Ьеи Агд Низ ТНг 20 25 30

Ьуз С1у 11е ТНг РНе Ьеи Азр Тгр Туг Ьеи Θΐη Ьуз Рго С1у С1п Зег 35 40 45

Рго С1п Ьеи Ьеи 11е Туг С1п МеЕ Зег Азп Агд А1а Зег С1у Уа1 Рго 50 55 60

Азр Агд РНе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТНг Азр РНе ТНг Ьеи Ьуз 11е 65 70 75 80

Зег Агд Уа1 С1и А1а С1и Азр Уа1 С1у Уа1 Туг Туг Суз А1а С1п Азп 85 90 95

Ьеи С1и Ьеи Рго Ьеи ТНг РНе С1у С1у С1у ТНг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз 100 105 110 <210> 79 <211> 117 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 79

С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго С1у С1у

10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе ТНг РНе ТНг ТНг Туг 20 25 30

А1а МеЕ Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45

Зег ТНг Не Зег Зег С1у С1у ТНг Туг ТНг Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 50 55 60

Ьуз С1у Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг 65 70 75 80

Ьеи С1п МеЕ Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95

АЬа ТНг СЬп СЬу Азп Туг Зег Ьеи Азр РНе Тгр СЬу СЬп СЬу ТНг ТНг 100 105 110

Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег 115 <210> 80 <211> 114 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 80

С1и Уа1 СЬп Ьеи Уа1 СЬи Зег СЬу СЬу СЬу Ьеи Уа1 С1п Рго СЬу СЬу

10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз АЬа АЬа Зег СЬу РНе Не РНе Зег Зег Туг 20 25 30

СЬу Мер Зег Тгр УаЬ Агд СЬп АЬа Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр Уа1 35 40 45

АЬа Азп 11е Азп ТНг РНе СЬу Азр Агд ТНг Туг Туг Уа1 Азр Зег Уа1 50 55 60

Ьуз СЬу Агд РНе ТНг 11е Зег Агд Азр Азп АЬа Ьуз Азп Зег Ьеи Туг 65 70 75 80

Ьеи СЬп Мер Азп Зег Ьеи Агд АЬа СЬи Азр ТНг АЬа Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95

АЬа Агд СЬу ТНг СЬу ТНг Туг Тгр СЬу СЬп СЬу ТНг Ьеи УаЬ ТНг УаЬ 100 105 110

Зег Зег <210> 81 <211> 112 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 81

- 67 028515

Азр 1	Уа1	Уа1 МеЬ	ТЪг 5	С1п	Зег	Рго Ьеи	Зег 10	Ьеи	Рго Уа1 ТЪг	Ьеи 15	С1у
С1п	Рго	А1а Зег	11е	Зег	Суз	Агд Зег	Зег	С1п	Зег Ьеи Ьеи	Азр	Зег
		20				25			30
Азр	61у	Ьуз ТЪг	Туг	Ьеи	Азп	Тгр РЪе	С1п	С1п	Агд Рго С1у	С1п	Зег
		35				40			45
Рго	Агд	Агд Ьеи	11е	Туг	Ьеи	Уа1 Зег	Азп	Агд	Азр Зег С1у	Уа1	Рго
	50				55				60
Азр	Агд	РЪе Зег	С1у	Зег	С1у	Зег С1у	ТЪг	Азр	РЪе ТЪг Ьеи	Ьуз	11е
65				70				75			80
Зег	Агд	Уа1 С1и	А1а	С1и	Азр	Уа1 С1у	Уа1	Туг	Туг Суз Тгр	С1п	С1у
			85				90			95
ТЪг	Нхз	РЪе Рго	С1п	ТЪг	РЪе	С1у С1у	61у	ТЪг	Ьуз Уа1 С1и	11е	Ьуз
		100				105			110
<210> 82
<211> 114
<212> Белок
<213> Искусственная	последовательность

<220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 82

С1и Уа1 61п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у

10 15

Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РЪе 11е РЪе Зег Зег Туг 20 25 30

С1у МеЪ Зег Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз 61у Ьеи С1и Тгр Уа1 35 40 45

А1а Зег 11е Азп ТЪг РЪе С1у Азр Агд ТЪг Туг Туг Уа1 Азр Зег Уа1 50 55 60

Ьуз С1у Агд РЪе ТЪг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг 65 70 75 80

Ьеи С1п Мер Азп Зег Ьеи Агд А1а С1и Азр ТЪг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95

А1а Агд С1у ТЪг С1у ТЪг Туг Тгр С1у С1п С1у ТЪг Ьеи Уа1 ТЪг Уа1

- 68 028515

100 105 НО

Зег Зег <210> 83 <211> 112 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 83

Азр Уа1 Уа1 МеЬ ТЬг С1п Зег Рго Ьеи Зег Ьеи Рго Уа1 ТЬг Ьеи С1у

10 15

С1п Рго А1а Зег 11е Зег Суз Агд Зег Зег С1п Зег Ьеи Ьеи Азр Зег 20 25 30

Азр С1у Ьуз ТЬг Туг Ьеи Азп Тгр РЬе С1п С1п Агд Рго С1у С1п Зег 35 40 45

Рго Агд Агд Ьеи 11е Туг Ьеи Уа1 Зег Ьуз Агд Азр Зег С1у Уа1 Рго 50 55 60

Азр Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи Ьуз 11е 65 70 75 80

Зег Агд Уа1 С1и А1а С1и Азр Уа1 С1у Уа1 Туг Туг Суз Тгр С1п О1у 85 90 95

ТЬг ΗΪ3 РЬе Рго О1п ТЬг РЬе С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Уа1 О1и 11е Ьуз 100 105 110 <210> 84 <211> 117 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 84

С1п Уа1 О1п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у А1а О1и Уа1 Ьуз Ьуз Рго С1у А1а

10 15

Зег Уа1 Ьуз Уа1 Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг 20 25 30

- 69 028515

Туг МеЪ Туг Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго 61у С1п С1у Ьеи С1и Тгр МеЪ 35 40 45

С1у 11е Не Азп Рго Зег Азп С1у С1у ТЪг Зег Туг А1а 01п Ьуз РЪе 50 55 60

С1п С1у Агд Уа1 ТЪг МеЪ ТЪг Агд Азр ТЪг Зег ТЪг Зег ТЪг Уа1 Туг 65 70 75 80

МеЪ С1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег С1и Азр ТЪг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95

ТЪг Агд С1у О1у Туг Туг Рго РЪе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЪг ТЪг 100 105 110

Уа1 ТЪг Уа1 Зег Зег 115 <210> 85 <211> 112 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 85

Азр Уа1 Уа1 МеЪ ТЪг С1п Зег Рго Ьеи Зег Ьеи Рго Уа1 ТЪг Ьеи С1у

10 15

С1п Рго А1а Зег 11е Зег Суз Агд Зег Зег С1п Зег Ьеи Ьеи Азр Зег 20 25 30

Азр С1у Ьуз ТЪг Туг Ьеи Туг Тгр РЪе С1п 61п Агд Рго С1у С1п Зег 35 40 45

Рго Агд Агд Ьеи 11е Туг Ьеи Уа1 Зег Азп Агд Азр Зег С1у Уа1 Рго 50 55 60

Азр Агд РЪе Зег С1у Зег С1у Зег С1у ТЪг Азр РЪе ТЪг Ьеи Ьуз 11е 65 70 75 80

Зег Агд Уа1 С1и А1а С1и Азр Уа1 С1у Уа1 Туг Туг Суз Тгр С1п С1у 85 90 95

ТЪг Нгз Зег Рго Туг ТЪг РЪе С1у С1п С1у ТЪг Ьуз Ьеи С1и 11е Ьуз 100 105 НО

- 70 028515 <210> 86 <2Ы> 117 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 86
СЬп 1	УаЬ	СЬп Ьеи	УаЬ СЬп Зег СЬу АЬа СЬи	УаЬ	Ьуз	Ьуз	Рго СЬу АЬа 15
5	10
Зег	УаЬ	Ьуз УаЬ 20	Зег Суз	Ьуз АЬа Зег СЬу 25	Туг	ТЬг	РЬе	ТЬг Зег Туг 30
Туг	МеЬ	НЬз Тгр 35	УаЬ Агд	СЬп АЬа Рго СЬу 40	СЬп	СЬу	Ьеи 45	СЬи Тгр МеЬ
СЬу	Не 50	Не Азп	Рго Зег	Азп СЬу СЬу ТЬг 55	Зег	Туг 60	АЬа	СЬп Ьуз РЬе
СЬп 65	СЬу	Агд УаЬ	ТЬг МеЬ 70	ТЬг Агд Азр ТЬг	Зег 75	ТЬг	Зег	ТЬг УаЬ Туг 80
МеЬ	СЬи	Ьеи Зег	Зег Ьеи 85	Агд Зег СЬи Азр 90	ТЬг	АЬа	УаЬ	Туг Туг Суз 95
ТЬг Агд СЬу СЬу Туг Туг Рго РЬе Азр Туг 100 105 УаЬ ТЬг УаЬ Зег Зег 115 <210> 87 <211> 112 <212> Белок <213> Искусственная последовательность	Тгр	СЬу	СЬп	СЬу ТЬг ТЬг 110

<220>

<221> источник

<223> /примечание=Описание полипептид <400> 87

искусственной последовательности: Синтетический

Азр 1

УаЬ

УаЬ

МеЬ

ТЬг 5

СЬп

Зег

Рго

Ьеи

Зег 10

Ьеи

Рго

УаЬ

ТЬг

Ьеи 15

СЬу

СЬп

Рго

АЬа

Зег 20

Ые

Зег

Суз

Агд

Зег 25

Зег

СЬп

Зег

Ьеи

Ьеи 30

Азр

Зег

Азр

СЬу

Ьуз 35

ТЬг

Туг

Ьеи

Азп

Тгр 40

РЬе

СЬп

СЬп

Агд

Рго 45

СЬу

СЬп

Зег

С1у С1и 11е Азп Рго Зег Азп С1у 61у ТЬг Азп Туг А1а С1п Ьуз РЬе 50 55 60

С1п 61у Агд Уа1 ТЬг Мер ТЬг Агд Азр ТЬг Зег ТЬг Зег ТЬг Уа1 Туг 65 70 75 80

Мер С1и Ьеи Зег Зег Ьеи Агд Зег С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95

ТЬг Агд 61у С1у Туг Туг Рго РЬе Азр Туг Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг 100 105 110

Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210> 89 <211> 112

- 72 028515 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 89

Азр Йа1 УаЬ Мер ТНг СЬп Зег Рго Ьеи Зег Ьеи Рго Уа1 ТНг Ьеи СЬу

10 15

СЬп Рго АЬа Зег 11е Зег Суз Агд Зег Зег СЬп Зег Ьеи Ьеи Азр Зег 20 25 30

Азр СЬу Ьуз ТНг Туг Ьеи Туг Тгр РНе СЬп СЬп Агд Рго СЬу СЬп Зег 35 40 45

Рго Агд Агд Ьеи Не Туг Ьеи УаЬ Зег СЬи Агд Азр Зег СЬу Уа1 Рго 50 55 60

Азр Агд РНе Зег СЬу Зег СЬу Зег СЬу ТНг Азр РНе ТНг Ьеи Ьуз 11е 65 70 75 80

Зег Агд УаЬ СЬи АЬа СЬи Азр УаЬ СЬу Уа1 Туг Туг Суз Тгр СЬп СЬу 85 90 95

ТНг НЬз Зег Рго Туг ТНг РНе СЬу СЬп СЬу ТНг Ьуз Ьеи СЬи 11е Ьуз 100 105 110 <210> 90 <211> 121 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 90

С1п УаЬ СЬп Ьеи СЬп СЬи Зег СЬу Рго СЬу Ьеи УаЬ Ьуз Рго Зег СЬп

10 15

ТНг Ьеи Зег Ьеи ТНг Суз ТНг Уа1 Зег СЬу Туг Зег Не ТНг Зег Азр 20 25 30

Туг АЬа Тгр Азп Тгр 11е Агд СЬп НЬз Рго СЬу Ьуз СЬу Ьеи СЬи Тгр 35 40 45

11е СЬу Туг 11е Зег РНе Зег СЬу Туг ТНг Туг Туг Азп Рго Зег Ьеи 50 55 60

Ьуз 65

Зег

Агд

Уа1

ТЬг

11е 70

Зег

Уа1

Азр

ТЬг

Зег 75

Ьуз

Азп

С1п

РЬе

Зег 80

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Зег

Зег 85

Уа1

ТЬг

А1а

А1а

Азр 90

ТЬг

А1а

Уа1

Туг

Туг 95

Суз

А1а

Агд

С1и

Уа1 100

Азп

Туг

С1у

Азр

Зег 105

Туг

НЬз

РЬе

Азр

Туг 110

Тгр

С1у

С1п

С1у

ТЬг 115

Ьеи

Уа1

ТЬг

Уа1

Зег 120

Зег

<210> 91 <211> 115 <212> Белок <213> Искусственная

последовательность

<220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 91

С1п Ьеи Уа1 1

Ьеи

ТЬг 5

С1п

Зег

Рго

Зег

А1а 10

Зег А1а

Зег

Ьеи

С1у 15

А1а

Зег Х/а1 Ьуз

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

С1п НЬз

Агд

ТЬг

Туг

ТЬг

20

25

30

11е С1и Тгр

НЬз

С1п

С1п

С1п

Рго

С1и

Ьуз

С1у Рго

Агд

Туг

Ьеи

МеР

35

40

45

Ьуз Уа1 Ьуз

Ьуз

Азр

С1у

Зег

Низ

Зег

Ьуз

С1у Азр

С1у

11е

Рго

Азр

50

55

60

Агд РЬе Зег

С1у

Зег

Зег

Зег

С1у

А1а

С1и

Агд Туг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

65

70

75

80

Зег Ьеи С1п

Зег

С1и

Азр

С1и

А1а

Азр

Туг

Туг Суз

С1у

Уа1

С1у

Азр

85

90

95

А1а 11е Ьуз

С1у

С1п

Зег

Уа1

РЬе

Уа1

РЬе

С1у С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

100

105

но

С1и 11е Ьуз

115

<210> 92

<211> 121

<212> Белок

<213> Искусственная

последовательность

<220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 92

С1п Уа1 С1п Ьеи С1п С1и Зег С1у Рго С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго Зег С1п

10 15

ТЬг Ьеи Зег Ьеи ТЬг Суз ТЬг Уа1 Зег С1у Туг Зег 11е ТЬг Зег Азр 20 25 30

Туг А1а Тгр Зег Тгр 11е Агд С1п НЬз Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр 35 40 45

11е С1у Туг 11е Зег РЬе Зег С1у Туг ТЬг Туг Туг Азп Рго Зег Ьеи 50 55 60

Ьуз Зег Агд Уа1 ТЬг 11е Зег Уа1 Азр ТЬг Зег Ьуз Азп О1п РЬе Зег 65 70 75 80

Ьеи Ьуз Ьеи Зег Зег Уа1 ТЬг А1а А1а Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 90 95

А1а Агд С1и Уа1 Азп Туг С1у Азр Зег Туг НЬз РЬе Азр Туг Тгр С1у 100 105 110

С1п С1у ТЬг Ьеи Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 120 <210> 93 <211> 115 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 93

Е1п Ьеи Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго Зег А1а Зег А1а Зег Ьеи С1у А1а

10 15

Зег Уа1 Ьуз Ьеи ТЬг Суз ТЬг Ьеи Зег Зег С1п Шз Агд ТЬг Туг ТЬг 20 25 30

11е А1а Тгр Низ С1п О1п С1п Рго 61и Ьуз С1у Рго Агд Туг Ьеи МеЕ 35 40 45

Ьуз Уа1 Ьуз Ьуз Азр С1у Зег Нтз Зег Ьуз С1у Азр С1у 11е Рго Азр 50 55 60

Агд РЬе Зег СЬу Зег Зег Зег СЬу АЬа СЬи Агд Туг Ьеи ТЬг ЬЬе Зег 65 70 75 80

Зег Ьеи СЬп Зег СЬи Азр СЬи АЬа Азр Туг Туг Суз СЬу УаЬ СЬу Азр 85 90 95

АЬа Ые Ьуз СЬу СЬп Зег УаЬ РЬе УаЬ РЬе СЬу СЬу СЬу ТЬг Ьуз УаЬ 100 105 110

СЬи Ые Ьуз 115 <210> 94 <211> 121 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид <400> 94

СЬп 1	УаЬ	СЬп	Ьеи СЬп 5	СЬи	Зег	СЬу Рго СЬу Ьеи УаЬ 10	Ьуз	Рго	Зег 15	СЬп
ТЬг	Ьеи	Зег	Ьеи ТЬг	Суз	ТЬг	УаЬ Зег СЬу Туг Зег	Ые	ТЬг	Зег	Азр
			20			25		30
Туг	АЬа	Тгр	Азп Тгр	Ые	Агд	СЬп НЬз Рго СЬу Ьуз	СЬу	Ьеи	СЬи	Тгр
		35				40	45
Ые	СЬу	Туг	Ые Зег	РЬе	Зег	СЬу Туг ТЬг Зег Туг	Азп	Рго	Зег	Ьеи
	50				55	60
Ьуз	Зег	Агд	УаЬ ТЬг	Ые	Зег	УаЬ Азр ТЬг Зег Ьуз	Азп	СЬп	РЬе	Зег
65				70		75				80
Ьеи	Ьуз	Ьеи	Зег Зег	УаЬ	ТЬг	АЬа АЬа Азр ТЬг АЬа	УаЬ	Туг	Туг	Суз
			85			90			95
АЬа	Агд	СЬи	УаЬ Азп	Туг	СЬу	Азр Зег Туг НЬз РЬе	Азр	Туг	Тгр	СЬу
			100			105		110
СЬп	СЬу	ТЬг	Ьеи УаЬ	ТЬг	УаЬ	Зег Зег
		115				120
<210> 95
<211> 115
<212> Белок
<213> Искусственная	последовательность

<220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид

<400> 95

Зег

А1а 10

Зег А1а

Зег

Ьеи

С1у 15

А1а

С1п 1

Ьеи Уа1

Ьеи

ТЬг 5

С1п

Зег

Рго

Зег

Уа1 Ьуз

Ьеи

ТЬг

Суз

ТЬг

Ьеи

Зег

Зег

61п Низ

Агд

ТЬг

Туг

ТЬг

20

25

30

11е

С1и Тгр

Низ

С1п

С1п

С1п

Рго

С1и

Ьуз

С1у Рго

Агд

Туг

Ьеи

МеЬ

35

40

45

С1и

Уа1 Ьуз

Ьуз

Азр

С1у

Зег

Низ

Зег

Ьуз

61у Азр

С1у

11е

Рго

Азр

50

55

60

Агд

РЬе Зег

С1у

Зег

Зег

Зег

С1у

А1а

С1и

Агд Туг

Ьеи

ТЬг

11е

Зег

65

70

75

80

Зег

Ьеи С1п

Зег

61и

Азр

С1и

А1а

Азр

Туг

Туг Суз

С1у

Уа1

С1у

Азр

85

90

95

А1а

11е Ьуз

С1у

С1п

Зег

Уа1

РЬе

Уа1

РЬе

С1у С1у

С1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

100

105

но

С1и

11е Ьуз

115

<210> 96

<211> 29

<212> Белок

<213> Искусственная

последовательность

<220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <220>

<221> МОЬ_КЕ5 <222> (2)..(3) <223> АЬх <400> 96

Суз Хаа Хаа С1п С1у Рго Тгр Ьеи С1и С1и С1и С1и С1и А1а Туг С1у 15 10 15

Тгр МеЬ Азр РЬе С1у Агд Агд Зег А1а С1и Азр С1и Азп 20 25

- 77 028515 <210> 97 <2Ы> 13 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <220>

<221> ΜΟϋ_ΚΕ3 <222> (2)..(3) <223> АЪх <400> 97

Суз Хаа Хаа РЪе СЬу Агд Агд Зег АЬа СЬи Азр СЬи Азп 15 10 <210> 98 <211> 13 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <220>

<221> МОЬ_КЕ5 <222> (11)..(12) <223> АЪх <400> 98

РЪе СЬу Агд Агд Зег АЬа СЬи Азр СЬи Азп Хаа Хаа Суз 15 10 <210> 99 <211> 15 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид <400> 99

СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег СЬу СЬу СЬу СЬу Зег

10 15 <210> 100 <211> 101 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <400> 100

Мер СЬп Агд Ьеи Суз УаЬ Туг УаЬ Ьеи 11е РЪе А1а Ьеи АЬа Ьеи АЬа

- 78 028515

1

5

10

15

А1а РЬе Зег

С1и

А1а

Зег

Тгр

Ьуз

Рго

Агд

Зег

С1п

61п

Рго

Азр

А1а

20

25

30

Рго Ьеи С1у

ТЬг

С1у

А1а

Азп

Агд

Азр

Ьеи

С1и

Ьеи

Рго

Тгр

Ьеи

С1и

35

40

45

С1п С1п С1у

Рго

А1а

Зег

Низ

Низ

Агд

Агд

С1п

Ьеи

С1у

Рго

С1п

С1у

50

55

60

Рго Рго Низ

Ьеи

Уа1

А1а

Азр

Рго

Зег

Ьуз

Ьуз

С1п

С1у

Рго

Тгр

Ьеи

65

70

75

80

С1и С1и С1и

С1и

С1и

А1а

Туг

С1у

Тгр

Мер

Азр

РЬе

С1у

Агд

Агд

Зег

85

90

95

А1а С1и Азр

С1и

Азп

100

<210> 101 <211> 80 <212> Белок

<213> Ното :

зартепз

<400> 101 Зег Тгр Ьуз

Рго

Агд

Зег

61п

61п

Рго

Азр

А1а

Рго

Ьеи

С1у

ТЬг

С1у

1

5

10

15

А1а Азп Агд

Азр

Ьеи

С1и

Ьеи

Рго

Тгр

Ьеи

С1и

С1п

С1п

С1у

Рго

А1а

20

25

30

Зег Низ Низ

Агд

Агд

С1п

Ьеи

С1у

Рго

С1п

С1у

Рго

Рго

Низ

Ьеи

Уа1

35

40

45

А1а Азр Рго

Зег

Ьуз

Ьуз

С1п

С1у

Рго

Тгр

Ьеи

61и

С1и

С1и

С1и

С1и

50

55

60

А1а Туг С1у

Тгр

Мер

Азр

РЬе

С1у

Агд

Агд

Зег

А1а

С1и

Азр

С1и

Азп

65

70

75

80

<210> 102 <211> 34 <212> Белок

<213> Ното ;

зартепз

<400> 102 С1п Ьеи С1у

Рго

С1п

С1у

Рго

Рго

Низ

Ьеи

Уа1

А1а

Азр

Рго

Зег

Ьуз

1

5

10

15

Ьуз С1п С1у

Рго

Тгр

Ьеи

С1и

С1и

С1и

С1и

С1и

А1а

Туг

С1у

Тгр

Мер

25 30

Азр РНе <210> 103 <211> 35 <212> Белок <213> Ното зарйепз <400> 103

51п Ьеи С1у Рго О1п С1у Рго Рго Нйз Ьеи Уа1 А1а Азр Рго Зег Ьуз 15 10 15

Ьуз С1п С1у Рго Тгр Ьеи С1и С1и С1и С1и С1и А1а Туг С1у Тгр МеЕ 20 25 30

Азр РНе С1у 35 <210> 104 <211> 17 <212> Белок <213> Ното зарйепз <400> 104

С1п С1у Рго Тгр Ьеи С1и С1и С1и С1и С1и А1а Туг 51у Тгр МеЕ Азр 15 10 15

РНе <210> 105 <211> 18 <212> Белок <213> Ното зарйепз <400> 105

С1п С1у Рго Тгр Ьеи С1и О1и С1и С1и С1и А1а Туг О1у Тгр МеЕ Азр 15 10 15

РНе 61у <210> 106 <211> 6 <212> Белок <213> Ното зарйепз <400> 106

Зег А1а С1и Азр С1и Азп

Claims (12)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение моноклонального антитела к человеческому прогастрину (НРС) для получения лекарственного средства для лечения и предотвращения рецидива рака печени.
2. 2. Применение по п.1, где моноклональное антитело к НРС представляет собой гуманизированное моноклональное антитело.
3. 3. Применение по п.1, где моноклональное антитело к НРС представляет собой Ν-терминальное моноклональное антитело.
4. 4. Применение по п.3, где Ν-терминальное моноклональное антитело к НРС связывает эпитоп, включающий последовательность, выбранную из группы, которая состоит из ОАРЬС (8Е0 ГО N0:28), РОАРЕС (8ЕО ГО N0:29), 14380014) (8ЕО ГО N0:30), АКРИЗООРО (8ЕО ГО N0:31) и АРРРЗООРОАРРС. (8ЕО ГО N0:32).
5. 5. Применение по п.3, где ^терминальное моноклональное антитело к НРС вырабатывается против иммуногена, включающего пептид, который имеет последовательность ЗХУКРКЗООРОАРЕС (8Е0 ГО N0:25).
6. 6. Применение по п.3, где ^терминальное моноклональное антитело к НРС включает:

   a) вариабельную область тяжелой цепи, в которой С0К1 включает аминокислотную последовательность У_Н СОК 1.3 (8Е0 ГО N0:1), СГОК2 включает аминокислотную последовательность У_Н СОК 2.3 (8Е0 ГО N0:2) и СЭК3 включает аминокислотную последовательность У_Н СОК 3.3 (8Е0 ГО N0:3), и вариабельную область легкой цепи, в которой СЭК1 включает аминокислотную последовательность У_ъ СОК 1.3 (8Е0 ГО N0:4), СЭК2 включает аминокислотную последовательность У_ь СОК 2.3 (8Е0 ГО N0:5) и СЭК3 включает аминокислотную последовательность У_ь СОК 3.3 (8Е0 ГО N0:6);

   b) вариабельную область тяжелой цепи, в которой СЭК1 включает аминокислотную последовательность У_Н СОК 1.4 (8Е0 ГО N0:7), СЭК2 включает аминокислотную последовательность У_Н СОК 2.4 (8Е0 ГО N0:8) и СЭК3 включает аминокислотную последовательность У_Н СОК 3.4 (8Е0 ГО N0:9), и вариабельную область легкой цепи, в которой СЭК1 включает аминокислотную последовательность У_ъ СОК 1.4 (8Е0 ГО N0:10), СЭК2 включает аминокислотную последовательность У_ъ СОК 2.4 (8Е0 ГО N0:5) и СЭК3 включает аминокислотную последовательность У_ъ СОК 3.4 (8Е0 ГО N0:11);

   c) вариабельную область тяжелой цепи, в которой СЭК1 включает аминокислотную последовательность У_Н СОК 1.16 (8Е0 ГО N0:39), СЭК2 включает аминокислотную последовательность У_Н СОК 2.16 (8Е0 ГО N0:43) и СЭК3 включает аминокислотную последовательность У_Н СОК 3.16 (8Е0 ГО N0:47), и вариабельную область легкой цепи, в которой СЭК1 включает аминокислотную последовательность У_ь СОК 1.16 (8Е0 ГО N0:50), СЭК2 включает аминокислотную последовательность У_ь СОК 2.16 (8Е0 ГО N0:53) и СЭК3 включает аминокислотную последовательность У_ь СОК 3.16 (8Е0 ГО N0:7); или

   й) вариабельную область тяжелой цепи, в которой СЭК1 включает аминокислотную последовательность У_Н СОК 1.19 (8Е0 ГО N0:40), СЭК2 включает аминокислотную последовательность У_Н СОК 2.19 (8Е0 ГО N0:44) и СЭК3 включает аминокислотную последовательность У_Н СОК 3.19 (8Е0 ГО N0:48), и вариабельную область легкой цепи, в которой СЭК1 включает аминокислотную последовательность У_ъ СОК 1.19 (8Е0 ГО N0:51), СЭК2 включает аминокислотную последовательность У_ъ СОК 2.19 (8Е0 ГО N0:54) и СЭК3 включает аминокислотную последовательность У_ь СОК 3.19 (8Е0 ГО N0:58).
7. 7. Применение по п.3, где ^терминальное моноклональное антитело к НРС конкурирует за связывание НРС с эталонным антителом, выбранным из группы:

   (a) моноклональное антитело, включающее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8Е0 ГО N0:12 и последовательность вариабельного домена легкой цепи 8Е0 ГО N0:13;

   (b) моноклональное антитело, включающее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8Е0 ГО N0:14 и последовательность вариабельного домена легкой цепи 8Е0 ГО N0:15;

   (c) моноклональное антитело, включающее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8Е0 ГО N0:61 и последовательность вариабельного домена легкой цепи 8Е0 ГО N0:65;

   (й) моноклональное антитело, включающее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8Е0 ГО N0:62 и последовательность вариабельного домена легкой цепи 8Е0 ГО N0:66.
8. 8. Применение по п.1, где моноклональное антитело к НРС представляет собой С-терминальное моноклональное антитело.
9. 9. Применение по п.8, где С-терминальное моноклональное антитело к НРС связывает эпитоп, включающий последовательность, выбранную из группы, которая состоит из РСКК (8Е0 ГО N0:33), МОРСК (8ЕО ГО N0:34) и САМОРСКК (8ЕО ГО N0:36).
10. 10. Применение по п.8, где С-терминальное моноклональное антитело к НРС вырабатывается против иммуногена, включающего пептид, который имеет последовательность (^1+3444444)^3+0++-11)1+..13138/314)1% (81+) ГО N0:27).
11. 11. Применение по п.8, где С-терминальное моноклональное антитело к НРС включает:

    - 81 028515

    a) вариабельную область тяжелой цепи, в которой СЭК1 включает аминокислотную последовательность У_н СЭК 1.8 (8ЕР ΙΌ N0:37), СЭК2 включает аминокислотную последовательность У_н СЭК 2.8 (8Ер ΙΌ N0:41) и СЭК3 включает аминокислотную последовательность У_н СЭК 3.8 (8Ер ΙΌ N0:45), и вариабельную область легкой цепи, в которой СЭК1 включает аминокислотную последовательность У_ь СЭК 1.8 (8ЕР ΙΌ N0:49), СЭК2 включает аминокислотную последовательность У_ь СЭК 2.8 (8Ер ΙΌ N0:52) и СЭК3 включает аминокислотную последовательность У_ь СЭК 3.8 (8Ер ΙΌ N0:55); или

    b) вариабельную область тяжелой цепи, в которой СЭК1 включает аминокислотную последовательность У_н СЭК 1.13 (8Ер ΙΌ N0:38), СЭК2 включает аминокислотную последовательность У_н СЭК 2.13 (8Ер ΙΌ N0:42) и СЭК3 включает аминокислотную последовательность У_н СЭК 3.13 (8Ер ΙΌ N0:46), и вариабельную область легкой цепи, в которой СЭК1 включает аминокислотную последовательность У_ь СЭК 1.13 (8ЕР ΙΌ N0:50), СЭК2 включает аминокислотную последовательность У_ь СЭК 2.13 (8Ер ΙΌ N0:53) и СЭК3 включает аминокислотную последовательность У_ь СЭК 3.13 (8Ер ΙΌ N0:56).
12. 12. Применение по п.8, где С-терминальное моноклональное антитело к ЬРО конкурирует за связывание ЬРО с эталонным антителом, выбранным из группы, включающей:

    (a) моноклональное антитело, включающее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8Ер ΙΌ N0:59 и последовательность вариабельного домена легкой цепи 8Ер ΙΌ N0:63;

    (b) моноклональное антитело, включающее последовательность вариабельного домена тяжелой цепи 8Ер ΙΌ N0:60 и последовательность вариабельного домена легкой цепи 8Ер ΙΌ N0:64.