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KR20130062905A - 췌장 효소 약학 제제에서 바이러스를 불활성화하는 베타-프로피오락톤 - Google Patents

췌장 효소 약학 제제에서 바이러스를 불활성화하는 베타-프로피오락톤 Download PDF

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KR20130062905A
KR20130062905A KR1020127027016A KR20127027016A KR20130062905A KR 20130062905 A KR20130062905 A KR 20130062905A KR 1020127027016 A KR1020127027016 A KR 1020127027016A KR 20127027016 A KR20127027016 A KR 20127027016A KR 20130062905 A KR20130062905 A KR 20130062905A
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KR
South Korea
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bpl
pep
pancreatic enzyme
pancreatic
preparation
Prior art date
Application number
KR1020127027016A
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Inventor
피터 티쎈
조세프 첼레이
Original Assignee
앱탈리스 파마 캐나다 아이엔씨.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

본 발명은 바이러스 감염가가 상당한 수준 아래로 감소되고 높은 효소 활성을 나타내는 췌장 효소 제제(PEP)를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. PEP는 리파아제, 프로테아제, 아밀라아제, 외피 비보유 바이러스(예를 들어, 돼지 파보바이러스(PPV), 돼지 써코바이러스 2형(PCV-2), 돼지 뇌심근염바이러스(EMCV)) 및 외피 보유 바이러스(예를 들어, 수포성 구내염 바이러스(VSV)와 인플루엔자 A(IFA))를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 제약 조성물을 투여함으로써 췌장 분비 부전증을 치료하는 방법과 바이러스 감염가를 감소시키기 위해 PEP를 베타-프로피오락톤(BPL)으로 처리하여 상기 제약 조성물을 제조하는 방법도 제공한다.

Description

췌장 효소 약학 제제에서 바이러스를 불활성화하는 베타-프로피오락톤{BETA-PROPIOLACTONE FOR INACTIVATION OF VIRUSES IN PHARMACEUTICAL PANCREATIC ENZYME PREPARATIONS}
본 발명은 2010년 3월 19일 출원된 미국 가출원 제61/315,813호의 이익을 주장하며, 이는 여기서 참조로서 포함된다.
본 발명은 바이러스 감염가를 감소시킨 췌장 효소 제제에 관한 것으로, 특히 베타-프로피오락톤(BPL)으로 처리한 제제, 이를 포함하는 제약 조성물 및 이들을 제조하는 방법에 관한 것이다.
췌장 외분비 기능 부전증은 췌장 질환(예를 들어, 만성 췌장염, 낭포성 섬유증, 중증 급성 괴사성 췌장염 및 췌장암), 셀리악병과 크론병과 같은 췌장외 질병, 그리고 위장관 및 췌장의 외과 절제술의 주된 결과이다. 췌장 외분비 기능 대체는 영양 불량과 관련된 병적인 상태와 사망을 방지하기 위해 중요하다. 췌장 외분비 기능 부전증의 한 가지 치료법은 영양분이 위를 비우는 시점에 십이지장 관강에 활성 리파아제를 충분히 공급하고자 췌장 효소를 경구 투여하는 것이다.
동물 공급원에서 얻은 췌장 효소 제제(PEP)는 다양한 췌장 효소 결핍증 및 소화장애를 겪는 환자들의 효소 결핍증을 부분적으로 개선하기 위해 지난 70년에 걸쳐 다양한 형태로 사용되었다. 췌장 효소 제제는 일반적으로 지방, 단백질, 그리고 당질의 소화에 중요한 리파아제, 프로테아제 및 아밀라아제를 포함하는, 적어도 세 범주의 효소 조합을 함유한다. 췌장 리파아제로 알려진 한 췌장 효소 제제는 췌장 리파아제를 캡슐당 35,000 USP 단위까지 함유한 캡슐제에 장용성 코팅된 입자들이 혼입된 형태로 상용화되어 있다(예를 들어, 판크레카브®(Digestive Care, Inc.), 울트라제®(Axcan Scandipharm Inc.), 판크레아제®(McNeil Pharmaceutical), 코타자임®(Organon USA, Inc.), 젠펩®(Eurand Pharmaceuticals) 및 크레온®(Solvay Pharmaceuticals, Inc.)). 이러한 효소들은 동물 공급원으로부터 분리되므로, 돼지에서 유래한 재료에 외피 비보유 바이러스(예를 들어, 돼지 파보바이러스(PPV), 돼지 써코바이러스 2형(PCV-2), 돼지 뇌심근염바이러스(EMCV)) 및 외피 보유 바이러스(예를 들어, 수포성 구내염 바이러스(VSV)와 인플루엔자 A(IFA))와 같은 바이러스가 오염되기 쉽다. 월드와이드웹상의 fda.gov/ohrms/dockets/ac/cder08.html#AntiviralDrugs에서 이용할 수 있는 2008년 12월에 개최된 미국 식품의약국 항바이러스제 자문위원회의 정보 참조.
특정 바이러스는 화학물질 또는 기타 기술을 이용하여 불활화할 수 있음이 보고된 바 있다. 예를 들어, Mayr, Development of non-immunizing, paraspecific vaccine from attenuated pox viruses: a new type of vaccine, Berl Munch Tierarztl Wochenschr. 2001, 114:184-7; Arguello Villares, Viral haemorrhagic disease of rabbits: vaccination and immune response, Rev Sci Tech. 1991, 10:459-80; Horowitz, Inactivation of viruses found with plasma proteins, Biotechnology 1991, 19:417-30; Epstein and Fricke, Current safety of clotting factor concentrates, Arch Pathol Lab Med. 1990, 114:335-40; Stephan, Inactivation of hepatitis viruses and HIV in plasma and plasma derivatives by treatment with beta-propiolactone/UV irradiation, Curr Stud Hematol Blood Transfus. 1989, 56:122-7; Stephan, Virus safety of labile plasma products from the German viewpoint, Beitr Infusionsther. 1989, 24:40-5; Anderson et al., The role of specific IgE and beta-propiolactone in reactions resulting from booster doses of human diploid cell rabies vaccine, J Allergy Clin Immunol. 1987, 80:861-8; Prince et al ., Beta-propiolactone/ultraviolet irradiation: a review of its effectiveness for inactivation of viruses in blood derivatives, Rev Infect Dis. 1983, 5:92-107; U.S. Publication Number 2006/0115376 참조.
현재는 바이러스가 없거나 바이러스 감염가를 줄인, 활성 효소 보조제 함유 경구용 췌장 효소 제제가 필요하다.
본 발명자들은 췌장 효소 제제를 화학 시약인 베타-프로피오락톤(BPL)으로 처리하여 췌장 효소 제제의 효소 활성을 제거하지 않고도 췌장 효소 제제(PEP)의 바이러스를 효과적으로 불활화할 수 있음을 발견했다. 임의의 이론에 구속되지 않은 상태에서, BPL에 의한 바이러스의 불활화는 바이러스 게놈의 알킬화에 기초를 두고 있다. 본 발명자들은 또한 BPL의 알킬화 활성을 잠재적으로 줄일 수 있는 췌장 효소 또는 핵산과 같은, 상기 바이러스 외의 췌장 효소 제제 구성성분들이 췌장 효소 재재 내 바이러스 불활화를 저해하지 않는다는 점도 발견했다.
본 발명의 일실시예는 바이러스 감염가가 감소된 췌장 효소 제제이다. 상기 췌장 효소 제제는 (i) BPL로 처리된 하나 이상의 췌장 효소와 (ii) 3-하이드록시프로피온산(즉, BPL의 가수분해 생성물), BPL, 또는 이의 혼합물을 포함한다. 바람직하게, 상기 췌장 효소 제제는 여기서 참조로서 포함되는 미국 특허공개번호 제2009/0226414호에 기술된 PPV FFID-감염 분석법으로 측정한 바와 같이, 약 103 FFID50/g PEP 미만의 PPV 바이러스 감염가를 나타낸다. 바람직하게, 상기 췌장 효소 제제는 BPL로 처리하지 않은 비슷한 제제의 바이러스 감염가보다 최소한 1로그 적은 바이러스 감염가를 나타내며, 상기 바이러스 감염가는 외피 비보유 바이러스, 외피 보유 바이러스, PPV, EMCV, 또는 이들의 조합의 바이러스 감염가이다.
다른 실시예는 (i) BPL로 처리된 하나 이상의 췌장 효소(또는 췌장 효소 제제)와 (ii) 3-하이드록시프로피온산, BPL, 또는 이의 혼합물을 포함하는 바이러스 감염가가 감소된 제약 조성물이다. 또 다른 실시예는 환자에게 치료적으로 유효한 양의 본 발명의 췌장 효소 제제 또는 제약 조성물을 투여하여 췌장 분비 부전증을 치료해야 하는 환자의 췌장 분비 부전증을 치료하는 방법이다.
또 다른 실시예는 (a) BPL을 하나 이상의 췌장 효소를 함유하는 제제와 충분한 시간 동안 반응시켜 상기 제제의 바이러스 감염가를 감소시키는 단계를 포함하는 췌장 효소 제제의 제조방법이다. 일실시예에서, (a) 단계의 반응은 (i) 하나 이상의 췌장 효소를 함유하는 제제를 함유하는 용액 또는 현탁액에 BPL을 첨가하고, (ii) 용액의 바이러스 감염가를 감소시키기 충분한 시간동안 (a) 단계의 상기 용액에 BPL을 배양하여 수행된다. 상기 방법은 (a) 단계의 반응 후에 (b) BPL을 불활화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. BPL은 수성 용액에 배양하거나, (소디움 티오설페이트와 같은) 불활화제를 첨가하여, 또는 (a) 단계에서 형성된 용액을 냉동시킨 후 동결 건조하여 불활화시킬 수 있다.
본 발명의 임의의 실시예에서 췌장 효소는 재조합으로 형성되거나 동물 공급원(돼지, 양, 소)에서 유래할 수 있다. 적합한 췌장 효소로는 리파아제, 프로테아제, 아밀라아제, 그리고 전술한 효소들 중 임의의 조합을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 췌장 효소 혼합물은 돼지에서 유래한 췌장 리파아제이다.
정의
본 발명에 따르면, 당해 분야의 기술 내에는 분자면역학, 세포면역학, 약학 및 미생물학에서 흔히 사용되는 도구와 기술과 같이 수많은 도구와 기술이 있을 수 있다. 예를 들어, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York; Ausubel et al. eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Bonifacino et al. eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coico et al. eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc. : Hoboken, NJ; and Enna et al. eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ., 및 Animal Cell Culture (Freshney, ed.:1986) 참조.
"환자"는 인간 또는 다른 동물을 나타낸다.
일반적인 약어는 다음과 같은 측정단위, 기술, 특성 또는 화합물에 해당한다. "min"은 분(시간 단위)을 나타내고, "h" 또는 "hr"은 시간(시간 단위)을 나타내고, "μL" 또는 "μl"은 마이크로리터를 나타내고, "mL" 또는 "ml"은 밀리리터를 나타내고, "mM"은 밀리몰(몰농도)을 나타내고, "M"은 몰(몰농도)을 나타내고, "mmole"은 밀리몰(몰수)을 나타낸다.
"USP 단위"는 비타민 또는 약물의 효력, 즉 기대되는 생물학적 효과를 측정하는 데 사용하는 단위를 나타낸다. 이러한 단위가 적용되는 각 물질에 대해서는 미국 식품의약국이 1USP 단위의 용량과 관련된 생물학적 효과를 밝혀냈다. 그렇다면 상기 물질의 다른 양은 이러한 표준단위로 나타낼 수 있다. 대부분의 경우, USP 단위는 국제 단위(IU)와 동일하다.
아밀라아제 활성 1 USP 단위는 여기서 참조로 포함시킨 췌장 리파아제에 대한 공정서(2009년 미국약전 32/ 국가의약품집 27)의 아밀라아제 활성 분석법 조건 하에서 분당 0.16μEq의 글리코시드 결합을 가수분해하는 정도의 초기 속도로 전분을 분해하는 췌장 리파아제의 양에 해당한다.
리파아제 활성 1USP 단위는 여기서 참조로 포함시킨 췌장 리파아제에 대한 공정서(2009년 미국약전 32/ 국가의약품집 27)의 리파아제 활성 분석법 조건 하의 pH 9.0 및 37℃에서 분당 1.0μEq의 산을 유리시키는 췌장 리파아제의 양에 해당한다.
프로테아제 활성 1USP 단위는 여기서 참조로 포함시킨 췌장 리파아제에 대한 공정서(2009년 미국약전 32/ 국가의약품집 27)의 프로테아제 활성 분석법 조건 하에서 트리클로로아세트산에 의해 침전되지 않는 펩티드가 280nm에서 티로신 15nmol과 같은 흡광도를 나타내는 양으로 유리되는 정도의 초기 속도로 카제인을 가수분해하는 췌장 리파아제의 양에 해당한다.
췌장 효소 제제( PEP )
적합한 췌장 효소 제제(PEPs)는 리파아제, 프로테아제 및 아밀라아제와 같은 소화효소의 혼합물을 함유할 수 있다. 췌장 효소 제제는 동물 공급원으로부터 유래할 수 있다. 동물에서 유래한 췌장 효소 제제는 PPV, PCV-2, EMCV, VSV 및 인플루엔자 A와 같은 적어도 하나 이상의 바이러스와 핵산으로 오염될 수 있다. 췌장 효소 제제는 또한 이소프로파놀(IPA)을 나머지로 함유할 수 있다.
췌장 효소 제제에 존재할 수 있는 활성 효소는 췌장 리파아제(리파아제, 프로테아제 및 아밀라아제의 혼합물) 또는 판크레아틴과 같은 췌장 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 췌장 효소 제제에 존재할 수 있는 기타 활성 효소로는 (i) 트립신 E.C. (효소위원회 번호) 3.4.4.4, 키모트립신 E.C. 3,4,4,5, 키모트립신 B E.C. 3,4,5,6, 판크레아토펩티다아제 E E.C. 3.4.4.7, 카르복시펩티다아제 A E.C. 3.4.2.1 및 카르복시펩티다아제 B E.C. 3.4.2.2를 포함하나, 이에 한정되지 않는 활성 프로테아제, (ii) 글리세롤 에스테르 가수분해효소(리파아제) E.C. 3.1.1.3, 포스포리파아제 A2 E.C. 3.1.1.4 및 스테롤 에스테르 가수분해효소 E.C. 3.1.1.13을 포함하나, 이에 한정되지 않는 활성 리파아제, (iii) 리보뉴클레아제 E.C. 2.7.7.16와 데옥시리보뉴클레아제 E.C. 3.1.4.5와 같으나, 이에 한정되지 않는 뉴클레아제 및 (iv) 알파-아밀라아제 E.C. 3.2.1.1과 같은 활성 아밀라아제를 포함한다.
바람직한 일실시예에서, 상기 췌장 효소 제제는 프로테아제, 아밀라아제 및 리파아제를 포함하는 췌장 효소의 혼합물과, 선택적으로 리보뉴클레아제와 같은 뉴클레아제를 포함한다. 상기 효소는 돼지, 양, 소와 같은 동물 공급원으로부터 유래할 수 있다. 코리파아제 또한 상기 췌장 효소 제제에 포함될 수 있다. 여기서 사용된 바와 같이, "효소"라는 용어는 이미 활성화된 형태뿐만 아니라, 포유류의 장액에서 활성형으로 전환될 수 있는 지모겐 전구체도 포함한다는 점을 이해하여야 한다.
일실시예에서, 상기 췌장 효소 제제는 약 69 내지 약 120 U USP/mg의 리파아제 활성, 약 216 U USP/mg 이상의 아밀라아제 활성, 약 264 U USP/mg 이상의 프로테아제 활성 및 약 264 U USP/mg 이상의 총 프로테아제 활성을 나타내는 췌장 리파아제이다.
(BPL 처리 전 또는 처리 후) 췌장 효소 제제의 리파아제 활성은 약 1,000 내지 약 150,000 국제 단위(U)의 범위일 수 있다. (BPL 처리 전 또는 처리 후) 췌장 효소 제제의 아밀라아제 활성은 약 3,000 내지 약 500,000U일 수 있다. (BPL 처리 전 또는 처리 후) 췌장 효소 제제의 프로테아제 활성은 약 3,000 내지 약 500,000U일 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 췌장 효소 제제는 약 2,000 내지 약 75,000 USP 단위의 리파아제, 약 8,000 내지 약 250,000U의 프로테아제 및 약 8,000 내지 약 250,000U의 아밀라아제를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 췌장 효소 제제는 약 2,000 내지 약 40,000 USP 단위의 리파아제, 약 8,000 내지 약 160,000U의 프로테아제 및 약 8,000 내지 약 160,000U의 아밀라아제를 포함한다.
(BPL 처리 전 또는 처리 후) 췌장 효소 제제의 리파아제 활성은 약 3,000 내지 약 25,000IU, 약 4,500 내지 약 25,000IU, 예를 들어 약 4,500 내지 약 5,500IU, 약 9,000 내지 약 11,000IU, 약 13,500 내지 약 16,500IU, 및 약 18,000 내지 약 22,000IU의 범위일 수 있다. (BPL 처리 전 또는 처리 후) 췌장 효소 제제의 아밀라아제 활성은 약 8,100 내지 약 180,000IU, 예를 들어 약 8,000 내지 약 45,000IU, 약 17,000 내지 약 90,000IU, 약 26,000 내지 약 135,000IU, 약 35,000 내지 약 180,000IU일 수 있다. (BPL 처리 전 또는 처리 후) 췌장 효소 제제의 프로테아제 활성은 약 8,000 내지 약 134,000IU, 예를 들어 약 8,000 내지 약 34,000IU, 약 17,000 내지 약 67,000IU, 약 26,000 내지 약 100,000IU, 약 35,000 내지 약 134,000IU일 수 있다. 일실시예에서, 상기 리파아제 활성은 약 4,500 내지 약 5,500IU이고, 상기 아밀라아제 활성은 약 8,000 내지 약 45,000IU이고, 상기 프로테아제 활성은 약 8,000 내지 약 34,000IU이다. 다른 실시예에서, 상기 리파아제 활성은 약 9,000 내지 약 11,000IU이고, 상기 아밀라아제 활성은 약 17,000 내지 약 90,000IU이고, 상기 프로테아제 활성은 약 17,000 내지 약 67,000IU이다. 또 다른 실시예에서, 상기 리파아제 활성은 약 13,500 내지 약 16,500IU이고, 상기 아밀라아제 활성은 약 26,000 내지 약 135,000IU이고, 상기 프로테아제 활성은 약 26,000 내지 약 100,000IU이다. 또 다른 실시예에서, 상기 리파아제 활성은 약 18,000 내지 약 22,000IU이고, 상기 아밀라아제 활성은 약 35,000 내지 약 180,000IU이고, 상기 프로테아제 활성은 약 35,000 내지 약 134,000IU이다. 또 다른 실시예에서, 상기 리파아제 활성은 약 5,000 또는 약 30,000 리파아제 PhEur일 수 있다.
(BPL 처리 전 또는 처리 후) 췌장 효소 제제의 아밀라아제와 리파아제 (USP 단위) 비율은 약 1.8 내지 약 8.2, 예를 들어, 약 1.9 내지 약 8.2, 그리고 약 2.0 내지 약 8.2일 수 있다. (BPL 처리 전 또는 처리 후) 췌장 효소 제제의 프로테아제와 리파아제 비율은 약 1.8 내지 약 6.2, 예를 들어, 약 1.9 내지 약 6.1, 그리고 약 2.0 내지 약 6.1일 수 있다.
일실시예에서, (BPL 처리 전 또는 처리 후) 췌장 효소 제제의 아밀라아제:리파아제 비율은 약 1 내지 약 10, 예를 들어, 약 2.38 내지 약 8.75 (USP에 따라 효소적 분석법을 행할 경우)일 수 있다. (BPL 처리 전 또는 처리 후) 췌장 효소 제제의 프로테아제:리파아제 비율은 약 1.00 내지 약 8.00, 예를 들어, 약 1.86 내지 약 5.13 (USP에 따라 효소적 측정법을 행할 경우)일 수 있다.
일실시예에서, 췌장 효소 제제는 리파아제, 프로테아제 및 아밀라아제를 포함하며, (i) 췌장 효소 제제 내 아밀라아제 대 리파아제 비율은 약 3:1 내지 약 6:1이고, (ii) 프로테아제 대 리파아제 비율은 약 3:1 내지 약 6:1이다(USP 단위로 측정한 바와 같이).
아래 표는 적합한 췌장 효소 혼합물을 추가로 제공하며, 여기서 리파아제, 프로테아제 및 아밀라아제의 양은 USP 단위로 제공된다.
Figure pct00001
또 다른 실시예에서, 리파아제, 프로테아제 및 아밀라아제의 활성은 아래 표 A와 표 B에 기재한 바와 같다.
표 A
Figure pct00002
표 B
Figure pct00003
아래는 아밀라아제, 리파아제 및 프로테아제의 단위 변환 표이다.
Figure pct00004

상기 효소는 농축된 형태일 수 있다. 상기 효소는 무정형 분말 또는 결정형일 수 있다. 췌장 효소 제제 용액은 제조하는 동안 여과될 수 있다. BPL 처리 후 췌장 효소 제제 내 리파아제 활성은 일반적으로 약 24 USP 단위/mg PEP 이상, 그리고 더욱 바람직하게는 약 39 단위/mg PEP 이상 또는 약 75 USP 단위/mg PEP이다. 일실시예에서, BPL 처리 후 췌장 효소 제제 내 리파아제 활성은 약 86 내지 약 120 USP 단위/mg PEP이다. BPL 처리 후 췌장 효소 제제 내 프로테아제 활성은 일반적으로 약 100 USP 단위/mg PEP 이상이며, 바람직하게는 약 200 단위/mg PEP 이상 또는 약 240 USP 단위/mg PEP이다. 일실시예에서, BPL 처리 후 췌장 효소 제제 내 프로테아제 활성은 약 280 내지 약 440 USP 단위/mg PEP이다. BPL 처리 후 췌장 효소 제제 내 아밀라아제 활성은 일반적으로 약 100 USP 단위/mg PEP 이상이며, 바람직하게는 약 200 단위/mg PEP 이상이다. 일실시예에서, BPL 처리 후 췌장 효소 제제 내 아밀라아제 활성은 약 210 내지 약 570 USP 단위/mg PEP이다.
췌장 효소 제제에서 발견되는 감염성 바이러스 입자 또는 감염성 바이러스는 PPV와 같은, 돼지에서 발견되는 바이러스 입자 또는 바이러스를 포함하는 임의의 형태일 수 있다. PPV는 외피를 보유하지 않은, 작은 DNA 바이러스로(Bergeron et al., Virology, 1993, 197(1):86-98; and J. Virol. 1996 April; 70(4): 2508 2515; Simpson et al., J. Mol . Biol ., 2002 315(5):1189-98; Szelei et al., 2006. Porcine parvovirus pp. 434-445, in: Parvoviruses (Kerr et al., eds), Hodder Arnold Publ., London, UK), 췌장 효소 제제에서 발견되는 바이러스 중에서 가장 눈에 잘 띈다. PPV는 환경에서 우수한 안정성을 나타내며, 제조하는 동안 가수분해 효소와 상대적으로 높은 온도에 내성을 나타내고, 광범위한 pH 범위에 걸쳐 감염성을 유지한다. PPV는 내성이 강하므로, 췌장 효소 제제에서 발견될 수 있는 기타 바이러스에 대한 모델 바이러스가 될 수 있다.
췌장 효소 제제에서 발견될 수 있는 기타 외피 비보유 바이러스는 EMCV(돼지 뇌척수심근염 바이러스, MEV로도 알려져 있음), 돼지 간염 바이러스(HEV(돼지 E형 간염 바이러스) 포함), SVDV(돼지 수포병 바이러스, PEV9으로도 알려져 있음), 수포성 발진 바이러스, 돼지 써코바이러스 (PCV1(돼지 써코바이러스 1형)과 PCV2(돼지 써코바이러스 2형)을 포함), 돼지 로타바이러스(Rota A), 레오바이러스(Reo3로 알려진 레오바이러스 3형을 포함), 구제역 바이러스, 돼지 텟소바이러스 1형(PTV1, PEV1으로도 알려져 있음), 돼지 아데노바이러스 및 돼지 호흡기 코로나바이러스를 포함한다. 슈도레이비스바이러스, VSV(수포성 구내염 바이러스), IFA(인플루엔자 A), 레이비스 바이러스, 아프리카 돼지열 바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 돼지 열병 바이러스, 웨스트나일 바이러스, 돼지두창바이러스, 한타바이러스, 돼지 거대세포 바이러스, 돼지 림프친화성 허피스바이러스, 돼지 내인성 레트로 바이러스, 돼지 호흡기 생식기 증후군 바이러스, 파라믹소바이러스 및 뇌척수염 바이러스와 같은 외피 보유 바이러스도 췌장 효소 제제에서 발견될 수 있다. 월드와이드웹 상의 fda.gov/ohrms/dockets/ac /cder08.html#AntiviralDrugs에서 이용할 수 있는 2008년 12월에 개최된 미국 식품의약국 항바이러스제 자문위원회의 정보 참조. 췌장 효소 제제는 또한 신생 외피 보유 또는 외피 비보유 부정성 물질(예를 들어, 에볼라 바이러스) 또는 돌연변이 바이러스와 같은 신생 바이러스를 잠재적으로 함유할 수 있다. 췌장 효소 제제에서 발견될 수 있는 기타 바이러스는 슈도레이비스 바이러스, 소 바이러스성 설사병 바이러스, 피코르나바이러스(돼지 피코르나바이러스 포함), 레오바이러스(돼지 레오바이러스 포함), 아스트로바이러스(돼지 아스트로바이러스 포함), 아데노바이러스(돼지 아데노바이러스 포함) 및 E형 간염 바이러스(돼지 E형 간염 바이러스 포함)를 포함한다.
일실시예에서, 감염성 PPV 바이러스의 허용 가능한 수준은 미국 특허공개번호 제2009/0226414호에 기술된 PPV FFID-감염가 분석법으로 측정하였을 때, 약 105 FFID50/g PEP (약 104.5 TCID50에 해당) 미만, 바람직하게는 약 103 FFID50/g PEP 미만, 그리고 가장 바람직하게는 약 102 FFID50/g PEP 미만이다. 다른 실시예에서, EMCV, HEV, SVDV, PCV1, PCV2, VSV 및 IFA와 같은 다른 감염성 바이러스의 허용 가능한 수준은 공중이 이용할 수 있는 분석 기법의 검출 한도 미만(예를 들어, 약 102 감염성 바이러스 입자/g PEP 미만)이고, 바람직하게는 약 0 감염성 바이러스 입자/g PEP. 바이러스 입자의 수준은 아래에서 논한 바와 같이 BPL을 이용하여 췌장 효소 제제를 처리하기 전, 처리한 후, 또는 처리하기 전과 후에 측정할 수 있다.
또한, BPL은 항미생물제로서(예를 들어, 항세균제로서) 작용할 수 있다.
췌장 효소 제제는 제약 조성물 내에 포함되거나 제약 조성물로 예를 들어, 의도하는 투여 경로와 표준 제약 관행에 대하여 선택된 적합한 제약 부형제, 희석제 및/또는 담체와의 혼합물로 형성될 수 있다. 본 발명의 조성물은 인간에 사용하기에 편리한 임의의 방식으로 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 췌장 효소 제제는 경구용 제형으로서 복용될 수 있다. 경구용 제형은 산제, 정제, 미니 정제, 마이크로 정제, 비코팅 제형, 코팅 제형, 마이크로스피어, 프릴, 캐플릿(caplets), 젤라틴 캡슐, 캡슐제 및 의료용 식품을 포함한다. 예를 들어, 정제는 당해 분야에 알려진 압축 기법으로 만들 수 있다. 일반적으로, 이러한 효소들은 산을 매개로 한 리파아제 불활화를 피하기 위해, 그리고 영양분과 병행하여 효소의 위 배출을 확실히 하기 위해 장용성 코팅된 미니 마이크로스피어 형태로 경구 복용된다.
적합한, 약학적으로 허용 가능한 부형제는 희석제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제 및 착색제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보존제, 안정제, 염료 및 착향료와 같은 다른 성분들은 상기 제형에 포함될 수 있다. 보존제의 예로 소디움벤조에이트, 아스코르브산 및 파라-하이드록시벤조산의 에스테르를 들 수 있다. 항산화제와 현탁화제 또한 포함될 수 있다. 치료적 용도를 위한, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 및 담체는 제약 분야에서 알려져 있으며, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins (A.R. Gennaro edit. 2005)에 기술되어 있다.
베타-프로피오락톤( BPL )
베타-프로피오락톤(BPL, 2-옥세타논)은 4원자 고리를 가진 락톤 계열의 작은 유기 화합물이다. 베타-프로피오락톤은 약간 달콤한 냄새가 나는 맑고 무색의 액체로, 물에 매우 잘 녹는다. 높은 수용성과 작은 크기 덕분에 BPL은 단백질 함량이 높은 용액과 같은 점도가 높고 다입자성 물질이 있는 용액에 쉽게 분산된다. 베타-프로피오락톤은 물과 천천히 반응하여 가수분해되어 무독성 화합물인 3-하이드록시프로피온산(하이드라아크릴산)을 생성한다. 따라서, BPL 활성은 자기 제한적이며, 잔류 독성 오염물질이 없다.
일실시예에 따르면, BPL은 췌장 효소 제제를 환자에 투여할 수 있는 수준으로 바이러스 감염가를 낮추는 데 효과적인 양의 췌장 효소 제제를 함유하는 수성 또는 유기 용액 또는 현탁액에 첨가된다. 예를 들어, 일실시예에서, 약 100 내지 약 200 mg PEP/ml을 함유하는 용액에 약 0.004% 내지 약 1.0% (v/v)의 BPL이 첨가된다. 바람직한 실시예에서, 약 0.1 내지 약 0.8% (v/v) BPL이 약 100 내지 약 200 mg PEP/ml을 함유하는 용액에 첨가되거나, 약 0.2 내지 약 0.4% (v/v) BPL이 약 100 내지 약 200 mg PEP/ml을 함유하는 용액에 첨가된다. 임의의 이론에 구속되지 않고, 본 발명자들은 BPL이 바이러스를 알킬화하여 그들을 불활화한다고 이론화하였다. 따라서, BPL 처리 후 바이러스 감염가가 감소된 췌장 효소 제제는 불활화된 바이러스를 함유할 수 있다.
BPL 함유 췌장 효소 제제는 약 30분 내지 약 48시간 또는 약 72시간 (또는 그 이상) 동안 배양될 수 있다. 일실시예를 따르면, BPL 함유 췌장 효소 제제는 약 24시간 내지 약 72시간 동안, 또는 약 48시간 동안, 예를 들어 약 5℃ 내지 약 50℃, 약 15℃ 내지 약 40℃, 또는 실온 또는 약 25℃에서 배양된다. 다른 실시예에서, BPL 함유 췌장 효소 제제는 약 15분 내지 약 2시간 동안 (예를 들어, 약 30분 동안) 예를 들어 약 15℃ 내지 약 40℃ 또는 실온 또는 약 25℃에서 배양된다. 다른 실시예에서, BPL 함유 췌장 효소 제제는 약 15분 내지 약 12시간 동안 (예를 들어, 약 4시간 동안) 약 4℃에서 배양된다.
배양 후, BPL은 불활화 및/또는 상기 췌장 효소 제제로부터 제거될 수 있다. BPL은 수성 매체에서 배양하여 불활화되어 무독성의 3-하이드록시프로피온산을 형성할 수 있다. 물에서 BPL의 최대 반감기는 25℃에서 대략 210분 이하이다(Hoffman and Warshowsky, Beta-Propiolactone Vapor as a Disinfectant, Appl Microbiol 1958, 6:358-362). BPL 불활화 속도는 pH, 온도, 완충액의 이온강도와 같은 환경적 요인에 의존한다(Budowsky and Zalesskaya, Principles of selective inactivation of viral genome (V) Rational selection of conditions for inactivation of the viral suspension infectivity to a given extent by the action of beta-propiolactone, Vaccine 1991, 9:319-325). BPL은 가수분해에 의해, 그리고 불활화시키고자 하는 분자를 목표로 하는 알킬화 반응에 의해 소비된다. 따라서, 20℃에서 8시간 배양 후 BPL 수준은 최소한 8배로 감소될 수 있다.
BPL로 처리한 후 바이러스 감염가가 감소되고, (i) 하나 이상의 췌장 효소와 (ii) 3-하이드록시프로피온산, BPL, 또는 이의 혼합물을 함유하는 췌장 효소 제제는 미국 특허공개번호 제2009/0226414호에 기재된 PPV FFID-감염가 분석법과 같이 아래에서 논한 바이러스 감염 활성을 측정하는 방법 중 하나에 의해 측정한 바와 같이 BPL로 처리하지 않은 제제의 바이러스 감염가보다 적어도 약 1로그 적은, 적어도 약 2로그 적은, 적어도 약 3로그 적은, 약 1로그 적은, 약 2로그 적은, 또는 약 3로그 적은 바이러스 감염가를 나타낼 수 있다. 상기 췌장 효소 제제의 상대적인 바이러스 감염가는 외피 비보유 바이러스, 외피 보유 바이러스, 모든 바이러스, 또는 상기 췌장 효소 제제 내의 임의의 바이러스(예를 들어, PPV 또는 EMCV)의 바이러스 감염가일 수 있다.
BPL을 빠르게 불활화하는 하나의 방법은 소디움 티오설페이트와 같은 BPL 불활화제를 첨가하는 방법이다. 아래 실시예에서 최종 농도 100mM의 소디움 티오설페이트는 4℃에서 몇 분 이내에 불활화를 완성하는 것 이상으로 BPL을 비활성화시켰다. 일실시예에서, BPL 중화를 위해 이용하는 소디움 티오설페이트의 최저 농도는 BPL 몰 농도의 약 1.7배를 초과한다(예를 들어, 0.4% BPL (v/v) (63.61 mM) 용액은 1.08 M 소디움 티오설페이트 용액 부피의 적어도 10분의 1과 혼합될 것이다).
BPL 함유 췌장 효소 제제는 또한 냉동되고 동결 건조되어 BPL을 불활화할 수 있다. PPV와 BPL의 불활화 반응을 정지시키기 위해 검체를 빠르게 냉동시킬 수 있다. 냉동된 물질을 보관하는 동안, BPL은 얼음 존재 하에서 서서히 분해되어 부분적으로 증발할 수 있다. 추가적인 PPV 불활화도 이러한 조건 하에서 서서히 일어날 수 있다. 예를 들면, 빠르게 냉동시키기 위해 상기 제제를 아세톤과 건조 얼음의 혼합물 내에 위치시킨 다음 -80℃에서 저장한 후, -45℃에서 약 2일간 동결 건조시킬 수 있다. 실험에서 동결 건조 기간은 검체의 부피에 달려있다. 일반적으로, 부피가 적을수록 적은 시간이 필요하다.
바이러스 감염 활성 측정
초기 췌장 효소 제제 및 처리된 췌장 효소 제제의 바이러스 활성은 당해 분야에서 알려진 임의의 방법으로 측정할 수 있다. 바람직하게, 하나 이상의 바이러스의 바이러스 감염가는 처리된 췌장 효소 제제에서 측정된다. 일실시예에서, PPV, EMCV, PCV-2 및/또는 기타 바이러스의 바이러스 감염가가 측정된다.
일실시예에서, 감염가 분석법은 조직 배양 웰에서 자라는 세포 배양물을 이용하며, 조직 배양 웰에 검체를 적용하여 세포의 감염을 관찰한다.
예를 들어, 하나의 96-웰 플레이트 상에 PPV 또는 다른 바이러스를 대상으로 두 제제를 시험할 수 있으며 이때, 양성 대조군을 다른 병행 플레이트 상에 배양시킨다. PPV의 경우, 검체 적용에 앞서 검체를 세포 배양 배지에 단계별로 희석하여(예를 들어, 각 단계에서 1:4로 희석하여 총 8회 희석) 세포 배양물과 함께 5% CO2에서 적어도 5일을 37℃에서 배양한다. 검체 제거 및 파라포름알데하이드를 이용한 세포 고정 후, 표준 면역형광 분석법을 이용하여 항-PPV 항체로 각 웰에서 PPV (또는 기타) 바이러스 감염 여부를 추적 관찰한다. 양성으로 염색된 세포를 함유하는 웰의 수를 표에 기록한다. 카버(Karber) 식에 따라 형광 병소 감염량(Fluorescence Focus Infectious Doses, FFID50)을 계산하였다:
FFID50 = 10(D-0.5d+d (S));
여기서 D = 주어진 희석물의 모든 레플리카가 담긴 모든 웰에 적어도 하나의 감염성 형광 병소가 존재함을 기초로 하여 100% 감염을 나타내는 최고 농도의 희석배수 log10, d = 희석률의 log10, S = 희석배수당 웰 수에 대해 감염을 나타내는 전체 웰 수의 비율. 모든 결과는 처리한 검체 부피와 희석배수를 고려한 후의 검체인 1-그램 건조 췌장 효소 제제, 예를 들어, 췌장 리파아제에 대해 다시 계산한다. 특정 실시예에서, 감염성 바이러스의 수준을 정량하기 위하여 6개의 병렬 웰을 이용하여 상기 분석법을 수차례 반복한다.
바이러스 감염성을 측정하는 다른 분석법으로는 Hierholzer, J.C., Killington, R.A., 1996. Virus isolation and quantitation. In: Mahy, B.W.J., Kangro, H.O. (Eds.), Virology methods manual. Academic Press, London, pp.25 46에서 논한 바와 같은 TCID50 분석법을 들 수 있다.
췌장 효소 제제의 효소 활성은 바이러스 감염가를 검측하는 데 사용하는 세포에 독성을 나타낼 수 있고, 상기 효소는 또한 다른 방식으로 시험용 세포주의 바이러스 감염을 저해할 수 있다. 상기 제제 내에 존재하는 다른 화합물 또한 바이러스, 예를 들어 PPV의 감염을 방해할 수 있다. PPV 복제를 위해서는 세포 증식이 필요하므로, 이러한 세포분열을 억제하거나 독성이 있는 임의의 효소의 존재는 추가적으로 바이러스 감염의 효율성을 줄이고, 췌장 효소 제제 검체 내의 바이러스 감염가의 정확한 측정을 저해할 수 있다. 따라서, PPV 활성을 측정하기 전에 췌장 효소 제제 검체를 처리하는 편이 유용할 수 있다. 예를 들어, 아래에서 기술한 바와 같이 처리한 후, 검체를 본래의 검체 부피와 같거나 그보다 적은 양의 세포 배양액에 용해시켜 감염가 분석법의 감도를 유지할 수 있다.
여기서 참조로서 포함된 미국 특허공개번호 제2009/0226414호는 효소 제제(예를 들어 췌장 효소 제제)의 바이러스 감염가를 결정하기 전에 상기 제제를 처리하여 효소 제제 내의 PPV와 같은 감염성 외피 비보유 바이러스를 검출하는, 재현성 있고 효율적인 방법을 제공한다. 이 방법은 상기 췌장 효소 제제 검체로부터 독성이 있는 효소 물질을 상당히 제거하면서 감염성 있는 외피 비보유 바이러스를 보존한다.
이 방법은 다음 단계들을 포함한다:
(a) 상기 제제의 검체를 클로로포름으로 적어도 2회 추출하여 상층과 하층이 있는 정제 검체를 생산하는 단계;
(b) (a) 단계의 상층 중 적정량을 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 침전시키는 단계;
(c) (b) 단계의 생성물을 완충액에 현탁시키는 단계;
(d) (c) 단계의 생성물을 PEG로 침전시키는 단계;
(e) (d) 단계의 생성물을 용액에 현탁시키는 단계;
(f) 클로로포름으로 (e) 단계의 생성물로부터 과량의 PEG와 미세 입자들을 제거하는 단계로, 이는 (i) (e) 단계의 현탁이 10배 더 적은 부피에서 가능하게 하여 전체 감도를 10배 증가시킬 수 있고; (ii) 가장 독성이 있는 검체가 가장 덜 희석된 단계에서 남아있는 방해 물질을 제거할 수 있게 하는 단계; 및
(g) 상기 용액 내 감염성 바이러스의 존재를 검측하거나 그 양을 측정하는 단계.
열 불활화, 장기적인 보관, 초원심분리 및 기타 추출방법도 특정 환경 하에서 감염성 바이러스 측정에 앞서 검체를 처리하는 데 유용할 수 있다.
PCV-2와 EMCV와 같은 기타 바이러스의 불활화 수준은 TCID50 분석법(Hierholzer, J.C., Killington, R.A., 1996. Virus isolation and quantitation. In: Mahy, B.W.J., Kangro, H.O. (Eds.), Virology methods manual. Academic Press, London, pp.25-46)을 이용하여 측정할 수 있다.
효소 활성 측정
췌장 효소 제제의 효소(예를 들어, 프로테아제, 리파아제 및 아밀라아제)의 효소 활성은 예를 들어 미국약전(USP)에서 상술한 방법(The United States Pharmacopeia and the National Formulary (USP 31/NF 26). 2008. Rockville (MD): United States Pharmacopeial Convention, Inc.)을 이용하여 측정할 수 있다.
췌장 효소 제제의 처리방법
바이러스 감염가가 감소된 췌장 효소 제제 또는 상기 췌장 효소 제제를 함유하는 제약 조성물은 환자의 지방변증을 제어하기 위해 또는 부분적이거나 완전한 췌장 외분비 기능 부전증 환자를 치료하기 위해 유효한 양으로 투여할 수 있다. 상기 췌장 분비 부전증은 낭포성 섬유증(CF), 알코올 이용 또는 기타 원인으로 말미암은 만성 췌장염, 중증 급성 괴사성 췌장염, 췌장암, 수술(주췌관(Wirsung duct) 주사와 함께 또는 이를 생략한 췌십이지장 절제술 또는 위플 수술(Whipple's procedure), 전체 췌장 절제술), 폐색(췌장 및 담즙관 결석증, 췌장 및 십이지장 종양, 관 협착증), 기타 췌장 질병(예를 들어, 유전적인 췌장염, 외상 후 췌장염, 동종이식 췌장염, 혈색소 침착증, 슈와크만 증후군, 지방 침착증 및 부갑상선 기능항진증), 셀리악병과 크론병과 같은 췌장외 질병, 혼합 불량(Billroth II 문합술, 기타 유형의 위 우회술, 가스트린종) 및 당뇨병 제1형 및 제2형에 의한 췌장 분비 부전증일 수 있다.
"치료적으로 유효한 양"은 일반적으로 상태, 장애 또는 질환을 치료하기 위하여 (인간과 같은) 환자에 투여하였을 때 그러한 치료효과를 나타내기에 충분한 화합물 또는 조성물의 양을 나타낸다. "치료적으로 유효한 양"은 상기 화합물 또는 조성물, 질병과 중증도, 연령, 체중, 건강 상태, 치료할 동물의 반응에 따라 달라질 것이다.
실시예
BPL을 이용하여 PPV와 EMCV 불활화를 연구하기 위하여 두 세트의 실험을 했다. 실시예 1 내지 7은 BPL이 췌장 효소 제제 내 PPV와 EMCV를 불활화함을 보여준다. 두 번째 실시예 세트(실시예 8 내지 11)는 췌장 효소 제제를 25℃에서 BPL과 30분간 배양한 다음, 소디움 티오설페이트에 의해, 또는 냉동 후 동결 건조에 의해 나머지 BPL을 불활화한 후, 췌장 효소 제제 내 바이러스 불활화 정도를 확인했다. BPL을 처리한 췌장 효소 제제의 효소 활성 또한 실시예 8 내지 11에서 기술한 검체에 대해 측정하였다.
실시예 1: 0.1 내지 0.8%(v/v) 농도의 BPL 을 이용한 췌장 효소 제제 내 PPV 의 불활화. PPV 는 희석법을 이용하여 적정하였다.
서로 다른 두 로트의 췌장 리파아제 분말을 각각 pH=8.3, 100mg/ml 농도의 100mM Tris에 용해시켰다. (표준 프로토콜(Arella et al., Physicichemical properties, production, and purification of parvoviruses. 1990, In Tijssen, P. (ed.), CRC handbook of parvoviruses. Boca Raton, FL: CRC Press, 11-30))을 이용하여 준비한) 비정제 PPV 바이러스 원액 2ml를 상기 췌장 리파아제 용액 38ml에 첨가하였다. 바이러스를 실온에서 하루 동안 서서히 교반하면서 췌장 효소 제제와 혼합하였다. PPV를 소량 첨가한 췌장 리파아제 원액에서 일정량을 취하여, 각각을 서로 다른 농도의 BPL(Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)로부터 구입 가능)과 실온(20℃)에서 48시간을 (대조군을 제외하고) 배양하였다. 첨가한 바이러스의 역가가 높으므로 1,000배 이상의 계단 희을 이용하여 PPV 감염가 적정에 의해 바이러스 불활화 수준을 측정하였다. FFID50 확인은 미국 특허공개번호 제2009/0226414호의 PPV FFID-감염가 분석법에 기재된 바에 따라 형광분석법을 이용하여 수행하였다.
결과를 표 1에 나타내었다.
Figure pct00005
실시예 2: 0.1 내지 0.8%(v/v) 농도의 BPL 을 이용한 췌장 효소 제제 내 EMCV 의 불활화.
서로 다른 네 로트의 췌장 리파아제 분말을 pH=8.3, 100mg/ml 농도의 100mM Tris에 용해시켰다. EMCV 바이러스 원액(다음 문헌의 방법으로 준비: Meng XJ, Paul PS, Vaughn EM, Zimmerman JJ. Development of a radiolabeled nucleic acid probe for the detection of encephalomyocarditis virus of swine. J Vet Diagn Invest. 1993 5:254-8)를 실온에서 하루 동안 서서히 교반하면서 췌장 리파아제의 최종 농도가 100mg/ml이 되도록 췌장 리파아제와 혼합하였다. EMCV를 소량 첨가한 췌장 리파아제 원액으로부터 일정량을 취하여 각각을 서로 다른 농도의 BPL(Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)로부터 구입 가능)과 실온(20℃)에서 48시간을 (대조군을 제외하고) 배양하였다. 계단 희석을 이용하여 VERO 세포에 대한 EMCV 감염가 적정을 통해 불활화 수준을 측정하였고, TCID50 확인은 Hierholzer, J.C.등(Hierholzer, J.C., Killington, R.A., 1996. Virus isolation and quantitation. In: Mahy, B.W.J., Kangro, H.O. (Eds.), Virology methods manual. Academic Press, London, pp.25-46)에 기재된 바에 따라 수행하였다.
결과를 표 2에 나타내었다.
Figure pct00006
실시예 3: 0.04 내지 0.25%(v/v) 농도의 BPL 을 이용한 췌장 효소 제제 내 PPV 의 불활화. PPV 는 클로로포름/ PEG 법을 이용하여 적정하였다.
미국 특허공개번호 제2009/0226414호에 기재된 바와 같이 PEG로 정제한 PPV를 감염가 분석법에 이용했다는 점을 제외하고는 실시예 1에서 기재한 실험을 반복하였다.
결과를 표 3에 나타내었다. 아마도 실험방법의 민감도가 증가한 덕분에 (실시예 1에서 1,000배 희석 대신 최초 희석을 10배 미만으로 이용하였다) 다소 높은 잔여 감염성이 관찰되었다. 표 3은 0.25% BPL이 상기 바이러스를 초기 감염가의 약 0.02%로 불활화하였음을 나타낸다(약 5,000 내지 50,000배 감소).
Figure pct00007
실시예 4: 0.04 내지 0.25%(v/v) 농도의 BPL 을 이용한 췌장 효소 제제 내 내인성 PPV 의 불활화.
추가로 PPV를 첨가하지 않았다는 점을 제외하고는 실시예 1에 기재된 실험을 반복하였다. 실시예 3과 마찬가지로 PEG/클로로포름 정제 후 감염가를 분석하였다.
결과를 표 4에 나타내었다. 표 4는 BPL이 췌장 효소 제제 내 내인성 PPV를 불활화함을 나타낸다. 실시예 3에서 0.002% 남아 있는 감염가가 측정될 수 있었다(즉, 0.25% BPL에서 약 50,000배 불활화). 그러나 완전한 불활화 규모를 측정하기에 충분한 내인성 바이러스가 없었기 때문에 이는 실시예 4에서는 달성될 수 없었다. 미국 특허공개번호 제2009/0226414호에 기재된 PPV FFID-감염가 분석법을 이용할 경우, 이 실험에서 검출할 수 있었던 최저 수준의 바이러스는 63 FFID50/g PEP였다.
Figure pct00008
실시예 5: 0.004 내지 0.4%(v/v) 농도의 BPL 을 이용한 고농도의 췌장 효소 제제 내 PPV 의 불활화. PPV 는 희석법을 이용하여 적정하였다.
이번 실험의 초점은 췌장 효소 제제의 증가된 농도가 불활화 과정의 효율성에 미치는 영향을 측정하고 BPL의 더 낮은 농도 범위를 평가하는 것이다.
(표준 프로토콜(Arella et al., Physicichemical properties, production, and purification of parvoviruses. 1990, In Tijssen, P. (ed.), CRC handbook of parvoviruses. Boca Raton, FL: CRC Press, 11-30))을 이용하여 준비한) PPV 바이러스 원액을 물로 희석한 다음, (1.42x1010 FFID50 PPV 바이러스를 함유하는) 이 용액을 0.5그램의 췌장 효소 제제 분말 현탁에 사용하여 최종 농도 200mg PEP/ml을 얻었다.
BPL 첨가 전에 시험관을 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 PEP 용액에 BPL을 직접 첨가하거나(최종 농도가 0.4부피%가 되도록) 최종 농도 0.04부피% 및 0.004부피%가 되도록 BPL을 먼저 10배 및 100배 희석시켰다. BPL 첨가 후, 상기 용액을 더 혼합하여 일정 기간(1시간, 2시간, 4시간, 6시간 또는 8시간) 25℃에서 배양하였다. 소디움 티오설페이트 용액은 각 불활화 시험일에 새롭게 제조하였다. BPL 불활화 기간 만료 후, 소디움 티오설페이트를 PEP 용액에 첨가하여 철저히 혼합한 후, 4℃에서 최소 6시간을 배양하여 과량의 BPL을 중단시켰다. 이 단계 후, 미국 특허공개번호 제2009/0226414호에 기재된 바대로 감염 역가 실험을 하였다. 각 시간별로 세 개의 병행 검체를 이용하여 모든 실험을 수행하였다.
Figure pct00009
실시예 6: 4℃에서 0.8%(v/v) 농도의 BPL 에 의한 PPV 의 불활화.
실시예 1대로 준비한 검체를 4℃에서 0.8%(v/v) BPL로 4시간을 처리하였다.
Figure pct00010
실시예 7: 4℃에서 0.4% BPL 로 PEP 검체 처리에 의한 PPV 불활화 반응속도론
실시예 1에 기재한 바와 같은 방식으로 준비한 검체를 4℃의 수성 매체(예를 들어, 물과 이소프로필 알코올과의 혼합물)에서 처리하였다. PPV 감염가를 희석법에 의해 결정하였으며, 표 7에 나타난 바와 같이, 45분 처리 후 2로그 감소를 얻을 수 있었다.
Figure pct00011
실시예 8 내지 11
혼화 시를 제외한 대부분의 시간 동안 얼음 위에 두었던 50-ml 플라스틱 튜브를 자주 혼합하여 4.5g의 췌장 리파아제(PEP) 분말을 아주 찬 100mM Tris (pH=8.3) 44ml에 용해시켰다. 용해된 시료에 PPV 원액(표준 프로토콜(Arella et al., Physicichemical properties, production, and purification of parvoviruses. 1990, In Tijssen, P. (ed.), CRC handbook of parvoviruses. Boca Raton, FL: CRC Press, 11-30)을 이용하여 Institut National de la Recherche Scientifique(캐나다, 퀘벡)에서 준비, 107 FFID50/ml; 실시예 8 및 표 8)) 1ml (2 x 0.5 ml)을 소량 첨가한 후, 10분간 혼합하였다.
용해된 췌장 리파아제 중 일정량을 3회 취하여 시험관(A 내지 C)로 옮긴 다음, 얼음에 보관하였다. 이때, (A)에는 BPL을 첨가하지 않았고(대조군), (B)는 0.4부피%의 BPL을, (C)에는 0.8부피% BPL을 첨가하였다. 볼텍스 기계로 간단히 혼합한 후, 상기 튜브를 25℃에서 30분간 배양하였다. 배양 종료 후, 튜브를 얼음 위로 옮긴 다음, 각 실험 조건으로부터 즉시 일정량을 4회씩 취하여 새로운 튜브(a 내지 d)로 옮겼다. 이 튜브들을 급속 냉동을 위해 아세톤/드라이아이스의 혼합물 내로 위치시켰다. 이후, 검체들을 -80℃에 저장하였다.
나머지 용액으로부터, 각 실험당 일정량(3회 반복)을 소디움 티오설페이트를 함유하고 미량의 클로로포름이 추가된 세포배양액에 100배 희석하였다. 검체를 간단히 혼합한 후, FFID50 감염가 결정을 위해 추가로 희석하기 전에 4℃에서 최소 6시간 동안 유지시켰다. 실시예 9 참조.
상기 실험을 2회 더 반복하였다(전부: 실험 1 내지 3).
냉동 검체를 -45℃에서 이틀 동안 동결 건조한 다음, 췌장 리파아제 분말을 4 내지 10℃로 유지시켰다. 모든 실험에서 검체 a와 b를 물에 용해시켰다. 감염가 측정은 희석한 검체로 FFID50 결정을 위해 가장 낮은 희석단계로서 400배 희석한 검체를 이용하였다. 여러 실험의 결과들을 쉽게 비교하기 위해, 얻어진 감염가 실험결과 전부를 특정 감염가(FFID50/gram PEP)로 변환하였다. 실시예 10 및 표 10 참조.
모든 실험에서 검체 c와 d를 USP 31 공정서상의 방법을 이용하여 리파아제, 프로테아제, 아밀라아제 효소 활성을 시험하였다. 실시예 11 및 표 11 참조.
실시예 8의 결과: PPV 원액 제조 및 적정
신선한 바이러스 원액을 제조하여 적정하였다. PEP 검체에 바이러스 소량 첨가 후 바이러스 회수율도 확인하였다. 이들 검체로부터 동등한 PPV 역가를 회수할 수 있었다(표 8).
Figure pct00012
실시예 9의 결과: BPL 에 의한 PPV 불활화 및 이후 소디움 티오설페이트를 이용한 BPL 불활화
표 9는 25℃에서 30분간 BPL에 의한 PPV 불활화 후, 상기 BPL 함유 PEP 용액을 소디움 티오설페이트와 4℃에서 최소 6시간 배양시켜 BPL을 불활화한 결과를 나타낸다. 상술한 바와 같이, PPV 소량 첨가 후 BPL로 불활화하는 독립적인 세 실험 후, 소디움 티오설페이트에 의한 BPL 불활화를 시켰다(각 실험에 대해 3회 병행).
Figure pct00013
실시예 10의 결과: BPL 에 의한 PPV 의 불활화 및 이후 BPL 불활화를 위한 검체의 냉동/동결 건조
냉동 후 동결 건조로 이후에 불활화되는 BPL에 의해 25℃에서 30분간 불활화된 PPV를 함유하는 PEP 검체에 대한 불활화 결과를 표 10에 나타내었다.
Figure pct00014
Figure pct00015
실시예 11의 결과: BPL 처리 및 검체의 냉동/동결 건조 후 효소 활성
표 11은 췌장 리파아제 일정량을 25℃에서 30분간 BPL로 처리한 후, 냉동 및 동결 건조(실시예 10의 검체에 대한 것과 마찬가지의 처리)한 후의 리파아제, 프로테아제 및 아밀라아제 활성을 나타낸다.
Figure pct00016
실시예 8-11에 대한 고찰
BPL을 이용한 PPV 불활화 후 소디움 티오설페이트 처리 직후에 췌장 리파아제 검체를 시험한 결과, 0.4부피% BPL 존재 하에서 실온에서 30분간 배양할 때, 바이러스 감염가가 60배 넘게 감소했다. 나아가, 0.8% BPL은 같은 조건 하에서 PPV를 3배 더 불활화시키는 것으로 나타났다. 표 9 참조.
표 11에 나타난 바와 같이, 0.4% BPL 및 0.8% BPL로 처리한 동결 건조된 검체는 리파아제, 프로테아제 및 아밀라아제 활성의 대부분을 유지했다. 이러한 결과는 췌장 효소 제제가 바이러스 불활화 후 높은 효소 활성을 유지할 수 있음을 증명하는 것이다.
* * *
달리 정의되지 않는 한, 여기서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 흔히 이해하는 바와 같은 의미를 지니고 있다. 여기서 언급한 모든 출판물, 특허출원, 특허 및 기타 참고문헌은 전부 참조로서 포함된다.
전술한 기술내용으로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 용이하게 확인할 수 있으며, 이의 정신과 범위로부터 벗어나지 않은 채 다양한 용도와 조건에 맞도록 본 발명에 다양한 변화와 변경을 가할 수 있다.

Claims (34)

  1. (i) 하나 이상의 췌장 효소 및 (ii) 3-하이드록시프로피온산, 베타-프로피오락톤(BPL), 또는 이의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염가가 감소된 췌장 효소 제제(PEP).
  2. 제1항에 있어서,
    (i) 하나 이상의 췌장 효소 및 (ii) 3-하이드록시프로피온산을 포함하는 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제제는 베타-프로피오락톤(BPL)으로 전처리되었으며, 돼지 파보바이러스(PPV)의 감염가가 BPL로 처리하지 않은 제제보다 적어도 1로그 아래인 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제제는 베타-프로피오락톤(BPL)으로 전처리되었으며, 외피 비보유 바이러스의 감염가가 BPL로 처리하지 않은 제제보다 적어도 1로그 아래인 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제제는 베타-프로피오락톤(BPL)으로 전처리되었으며, 외피 보유 바이러스의 감염가가 BPL로 처리하지 않은 제제보다 적어도 1로그 아래인 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제제는 베타-프로피오락톤(BPL)으로 전처리되었으며, 돼지 뇌척수심근염 바이러스(EMCV)의 감염가가 BPL로 처리하지 않은 제제보다 적어도 1로그 아래인 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제제는 약 103 FFID50/g PEP 미만의 돼지 파보바이러스(PPV) 감염가를 나타내는 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제제의 적어도 하나의 췌장 효소는 동물 공급원에서 유래하는 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 효소는 리파아제, 프로테아제 및 아밀라아제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제제는 췌장 리파아제를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 제제와 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 감염가가 감소된 제약 조성물.
  12. 바이러스 감염가가 감소된 췌장 효소 제제(PEP)와 선택적으로 하나 이상의약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 고체 경구용 제형으로, (i) 상기 PEP는 약 1,000 내지 약 60,000 USP 단위의 리파아제, 약 3,000 내지 약 360,000 USP 단위의 프로테아제 및 약 3,000 내지 약 360,000 USP 단위의 아밀라아제를 포함하며, (ii) 상기 PEP는 베타-프로피오락톤(BPL)으로 전처리되었으며, 돼지 파보바이러스(PPV) 감염가가 BPL로 처리하지 않은 제제보다 적어도 1로그 아래인 것을 특징으로 하는 고체 경구용 제형.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 제형은 산제, 정제, 미니 정제, 마이크로스피어, 프릴 또는 캡슐제 형태인 것을 특징으로 하는 고체 경구용 제형.
  14. 바이러스 감염가가 감소된 췌장 효소 제제(PEP)와 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 고체 경구용 제형으로, (i) 상기 PEP는 약 1,000 내지 약 60,000 USP 단위의 리파아제, 약 3,000 내지 약 360,000 USP 단위의 프로테아제 및 약 3,000 내지 약 360,000 USP 단위의 아밀라아제를 포함하며, (ii) 상기 PEP는 약 100 FFID50/g PEP 미만의 PPV 감염가를 나타내는 것을 특징으로 하는 고체 경구용 제형.
  15. 바이러스 감소/불화화를 나타내는 췌장 효소 제제(PEP)와 선택적으로 하나 이상의약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 고체 경구용 제형으로, (i) 상기 PEP는 약 2,500 내지 약 45,000 USP 단위의 리파아제, 약 7,500 내지 약 270,000 USP 단위의 프로테아제 및 약 7,500 내지 약 270,000 USP 단위의 아밀라아제를 포함하며, (ii) 상기 PEP는 베타-프로피오락톤(BPL)으로 전처리되었으며, 돼지 파보바이러스(PPV)의 감염가가 BPL로 처리하지 않은 제제보다 적어도 1로그 아래인 것을 특징으로 하는 고체 경구용 제형.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 제형은 산제, 정제, 미니 정제, 마이크로스피어, 프릴 또는 캡슐제 형태인 것을 특징으로 하는 고체 경구용 제형.
  17. 바이러스 감소/불활화를 나타내는 췌장 효소 제제(PEP)와 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 고체 경구용 제형으로, (i) 상기 PEP는 약 2,500 내지 약 45,000 USP 단위의 리파아제, 약 7,500 내지 약 270,000 USP 단위의 프로테아제 및 약 7,500 내지 약 270,000 USP 단위의 아밀라아제를 포함하며, (ii) 상기 PEP는 약 100 FFID50/g PEP 미만의 PPV 감염가를 나타내는 것을 특징으로 하는 고체 경구용 제형.
  18. 바이러스 감염가가 감소된 췌장 효소 제제(PEP); 3-하이드록시프로피온산, 베타-프로피오락톤(BPL), 또는 이의 혼합물; 및 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 고체 경구용 제형으로, 이때 (i) 상기 PEP는 약 1,000 내지 약 60,000 USP 단위의 리파아제, 약 3,000 내지 약 360,000 USP 단위의 프로테아제 및 약 3,000 내지 약 360,000 USP 단위의 아밀라아제를 포함하며, (ii) 상기 PEP는 베타-프로피오락톤(BPL)으로 전처리되었으며, 돼지 파보바이러스(PPV)의 감염가가 BPL로 처리하지 않은 PEP보다 적어도 1로그 아래인 고체 경구용 제형이며, 이때 상기 제형은 산제, 정제, 미니 정제, 마이크로스피어, 프릴 또는 캡슐제인 것을 특징으로 하는 고체 경구용 제형.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 PEP는 약 2,500 내지 약 45,000 USP 단위의 리파아제, 약 7,500 내지 약 270,000 USP 단위의 프로테아제 및 약 7,500 내지 약 270,000 USP 단위의 아밀라아제를 포함하는 것을 특징으로 하는 고체 경구용 제형.
  20. 바이러스 감염가가 감소된 췌장 효소 제제(PEP); 3-하이드록시프로피온산, 베타-프로피오락톤(BPL), 또는 이의 혼합물; 및 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 고체 경구용 제형으로, 이때 (i) 상기 PEP는 약 1,000 내지 약 60,000 USP 단위의 리파아제, 약 3,000 내지 약 360,000 USP 단위의 프로테아제 및 약 3,000 내지 약 360,000 USP 단위의 아밀라아제를 포함하며, (ii) 상기 PEP는 약 100 FFID50/g PEP 미만의 PPV 감염가를 나타내는 고체 경구용 제형이며, 이때 상기 제형은 산제, 정제, 미니 정제, 마이크로스피어, 프릴 또는 캡슐제인 것을 특징으로 하는 고체 경구용 제형.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 PEP는 약 2,500 내지 약 45,000 USP 단위의 리파아제, 약 7,500 내지 약 270,000 USP 단위의 프로테아제 및 약 7,500 내지 약 270,000 USP 단위의 아밀라아제를 포함하는 것을 특징으로 하는 고체 경구용 제형.
  22. 치료적으로 유효한 양의 제11항의 제약 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌장 분비 부전증을 치료해야 하는 환자의 췌장 분비 부전증 치료 방법.
  23. (a) 베타-프로피오락톤(BPL)을 하나 이상의 췌장 효소를 함유하는 제제와 상기 제제 내의 바이러스 감염가를 낮추기에 충분한 시간 동안 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제(PEP)의 제조방법.
  24. 제23항에 있어서,
    BPL과 반응 후 상기 제제 내의 외피 비보유 바이러스의 감염가가 BPL과 반응 전 상기 제제 내의 외비 비보유 바이러스의 감염가와 비교할 때 적어도 1로그 더 낮은 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제의 제조방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    BPL과 반응 후 상기 제제 내의 외피 보유 바이러스의 감염가가 BPL과 반응 전 상기 제제 내의 외비 보유 바이러스의 감염가와 비교할 때 적어도 1로그 더 낮은 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제의 제조방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    BPL과 반응 후 상기 제제 내의 돼지 파보바이러스(PPV) 또는 돼지 뇌척수심근염 바이러스(EMCV)의 감염가가 BPL과 반응 전 상기 제제 내의 PPV 또는 EMCV의 감염가와 비교할 때 각각 적어도 1로그 더 낮은 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제의 제조방법.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 (a)단계는
    (i) BPL을 하나 이상의 췌장 효소 제제를 함유하는 용액 또는 현탁액에 첨가하는 단계와
    (ii) BPL을 (i) 단계의 용액에 상기 용액 내 바이러스 감염가를 감소시키기에 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제의 제조방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 (i) 단계는 약 0.004% 내지 약 1.0% (v/v)의 BPL을 약 100 내지 약 200 mg PEP/ml을 포함하는 용액 또는 현탁액에 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제의 제조방법.
  29. 제23항 내지 제28항에 있어서,
    상기 반응은 약 30분 내지 약 72시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제의 제조방법.
  30. 제23항 내지 제29항에 있어서,
    상기 반응은 약 5 내지 약 50℃의 온도에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제의 제조방법.
  31. 제23항 내지 제30항에 있어서,
    BPL과 상기 췌장 효소를 함유하는 제제의 반응 이후, (b) BPL을 불활화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제의 제조방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 형성된 용액 또는 현탁액에 BPL 불활화제를 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제의 제조방법.
  33. 제31항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 형성된 용액 또는 현탁액을 냉동시킨 다음, 동결 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제의 제조방법.
  34. 제31항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 형성된 용액 또는 현탁액을, BPL을 3-하이드록시프로피온산으로 분해하기에 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하며, 상기 용액은 수성 용액인 것을 특징으로 하는 췌장 효소 제제의 제조방법.
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