BR112020006211A2

BR112020006211A2 - preparação de enzima produzida por um método, preparação de enzima, método para produzir um produto de pancreatina, composição farmacêutica e método para tratar insuficiência pancreática exócrina

Info

Publication number: BR112020006211A2
Application number: BR112020006211-1A
Authority: BR
Inventors: Martin Babcock; Cynthia Burnell; Vikram Kalthod; Jörg Breitenbach; Frithjof Sczesny; Frauke-Regina RUEFFER; George Shlieout
Original assignee: Abbott Laboratories Gmbh; Abbott Gmbh & Co. Kg
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2018-09-27
Publication date: 2020-10-13
Also published as: EA202090851A1; WO2019067743A8; WO2019067743A1; EP3688153A1; CN111630164A

Abstract

A presente invenção refere-se a uma preparação de enzima obtida de tecido animal irradiado com feixe de elétrons, tal como pâncreas suíno. A presente invenção refere-se também a métodos para produzir tais preparações de enzimas, a composições farmacêuticas compreendendo tais preparações de enzimas e a métodos para usar tais composições farmacêuticas e preparações de enzimas.

Description

“PREPARAÇÃO DE ENZIMA PRODUZIDA POR UM MÉTODO, PREPARAÇÃO DE ENZIMA, MÉTODO PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE PANCREATINA,

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E MÉTODO PARA TRATAR INSUFICIÊNCIA PANCREÁTICA EXÓCRINA” Campo técnico

[0001] A presente invenção refere-se a preparações de enzimas derivadas de tecido animal, a composições farmacêuticas compreendendo tais preparações de enzimas e a métodos para reduzir o risco de contaminação viral ou microbiana em tais preparações e a composições. Composições de enzimas exemplares incluem extratos pancreáticos apropriados para uso terapêutico, tal como para o tratamento e/ou profilaxia de má digestão, e em particular a má digestão baseada em insuficiência pancreática exócrina, em mamíferos e seres humanos. Histórico

[0002] Produtos derivados de tecido animal podem exibir contaminação viral e/ou microbiana. Determinados contaminantes biológicos tais como bactérias ou protozoários podem ser inativados durante os processos de fabricação. No entanto, outros contaminantes biológicos tais como vírus não revestidos e determinadas bactérias formadoras de esporos (por exemplo, Bacillus cereus) são resistente a métodos estabelecidos para redução ou inativação de contaminantes. Um desafio particular é a inativação ou remoção de vírus e de bactérias formadoras de esporos de composições de enzimas derivadas de tecido animal ser destruir ou mudar a atividade das enzimas no processo.

[0003] Métodos estabelecidos para inativação viral incluem, por exemplo, pasteurização, calor seco, calor de vapor,

tratamento com solvente/detergente e pH baixo. A seleção dos métodos a serem empregados para inativação viral depende da natureza e contaminação do produto, do método de purificação usado, caso exista, e da natureza do contaminante viral. Por exemplo, o tratamento com solvente ou detergente pode romper a membrana lipídica de vírus revestidos e, assim tem sido usado para inativação de vírus revestidos. No entanto, de modo geral, muitos vírus não revestidos não são inativados por tratamento com solvente ou detergente. De modo semelhante, muitas bactérias formadoras de esporos são resistentes tanto ao calor como a solventes orgânicos.

[0004] Calor, em particular calor seco, é outro método estabelecido para inativação viral. Embora o tratamento com calor seco possa inativar até vírus altamente resistentes, tais como vírus não revestidos, o tratamento requer longos períodos de tempo (de várias horas) e monitoramento do teor de umidade. Além disso, o tratamento com calor pode comprometer a atividade biológicas desejada do produto, particularmente onde o produto é uma composição enzimática.

[0005] Produtos de enzimas pancreáticas são utilizados há muito tempo para tratar insuficiência pancreática exócrina, uma condição associada com fibrose cística (CF), pancreatite crônica, obstrução do pâncreas ou duto biliar comum (como uma doença neoplástica), procedimentos cirúrgicos como pancreatectomia ou cirurgia de desvio (by-pass gastrointestinal, além de outras doenças e distúrbios. O pâncreas secreta enzimas digestivas, incluindo lipases, proteases e amilases, no lúmen duodenal proximal, onde facilitan a hidrólise de macronutrientes. As amilases e proteases são secretadas por outros órgãos que não o pâncreas e contribuem para a digestão de carboidratos e proteínas. No entanto, há relativamente pouca lipase de outras fontes além do pâncreas envolvidas na digestão de lipídios. Assim, pacientes com insuficiência pancreática exócrina não tratada têm dificuldade em digerir gordura e podem apresentar sintomas de má digestão ou desnutrição, ou ambos, com deficiências de ácidos graxos essenciais e de vitaminas lipossolúveis, perda de peso, cólicas, flatulência, oleosidade e mau cheiro, quantidades excessivas de gorduras nas fezes (esteatorréia). Para pacientes com CF, o tratamento inadequado pode ter sérias consequências, pois o bom estado nutricional está diretamente relacionado à boa função pulmonar.

[0006] A terapia enzimática pancreática trata e/ou evita a má absorção e facilita o crescimento e desenvolvimento em pacientes com insuficiência pancreática exócrina. Em pacientes com CF, o muco bloqueia o duto pancreático no pâncreas assim como nos pulmões. As enzimas digestivas pancreáticas não são secretadas no intestino e, com isso, a digestão de amido, gordura e proteína é prejudicada. A falta de digestão resulta em esteatorréia, dor abdominal e perda de peso, entre outros.

[0007] A má digestão em mamíferos e seres humanos é geralmente baseada na deficiência de enzimas digestivas, em particular na deficiência de lipase endógena, mas também de protease e/ou amilase. Se a insuficiência pancreática for patológica, ela poderá ser congênita ou adquirida. A insuficiência pancreática crônica adquirida pode, por exemplo, ser atribuída ao alcoolismo. A insuficiência pancreática congênita pode, por exemplo, ser atribuída à fibrose cística da doença congênita. As consequências da deficiência de enzimas digestivas podem ser sintomas graves de subnutrição e desnutrição, que podem ser acompanhadas por maior suscetibilidade a doenças secundárias.

[0008] A substituição por enzimas digestivas exógenas Ou por misturas de enzimas digestivas (isto é, terapia enzimática pancreática) provou ser um tratamento eficaz para uma deficiência de enzimas digestivas endógenas. Mais frequentemente, as preparações farmacêuticas contendo pancreatina suína são usadas para terapia enzimática pancreática (também conhecida como “terapia de substituição enzimática). Para essas preparações farmacêuticas, o ingrediente ativo avaliado em ensaios clínicos é a lipase e as quantidades de dosagem para produtos comerciais são fornecidas em unidades de lipase. No entanto, essas misturas de enzimas digestivas obtidas do pâncreas de porco compreendem lipases, amilases e proteases, e podem ser usadas eficazmente para terapia enzimática pancreática em seres humanos devido à grande semelhança das enzimas e substâncias associadas contidas no conteúdo de sucos pancreáticos humanos. As enzimas pancreáticas são geralmente administradas por via oral na forma de preparações sólidas. Os pâncreas podem ser obtidos de animais, como porcos, criados e abatidos para alimentação. As regulamentações governamentais geralmente exigem que os pâncreas sejam obtidos de um matadouro de uma única espécie (ou seja, nenhuma outra espécie é abatida e processada nessa instalação) e, assim, limitam a disponibilidade do material de partida. A contaminação generalizada das instalações com agentes infecciosos pode levar à paralização da produção e ao déficit de suprimento. Os procedimentos de teste atuais podem identificar lotes contaminados e a eliminação de tais lotes coloca outros encargos em um suprimento já restrito de material de partida.

[0009] Estão disponíveis processos para obter enzimas pancreáticas a partir do pâncreas de mamífero. Por exemplo, processos estão descritos em U.S. 4.623.624 a partir dos quais se obtém pancreatina através de autólise de uma pasta semifluida de tecido contendo isopropanol aquoso.

[0010] Reconhece-se a presença de agentes infecciosos, e em particular vírus e bactérias formadoras de esporos, em pâncreas de suínos usados para fabricar pancreatina. De fato, a maioria dos rebanhos suínos foi infectada com parvovírus suíno (PPV), que apresenta alta resistência à inativação. O PPV foi detectado na pancreatina como um agente infeccioso. Embora não se acredite que o PPV seja patogênico para seres humanos, é desejável obter pancreatina com uma carga reduzida de PPV. Além disso, o PPV é um vírus modelo comum pois é difícil de inativar por métodos padronizados, tal como processamento químico ou térmico. Da mesma forma, foi relatada a contaminação da substância medicamentosa da pancreatina com Bacillus cereus e/ou enterotoxina de Bacillus cereus.

[0011] U.S. 2010/0119654 refere-se à irradiação de um extrato biológico aquoso ou alcoólico que contém sólidos na forma de uma suspensão. A radiação empregada em U.S. 2010/0119654 é radiação ultravioleta (UV), radiação de raios- XxX, radiação À ou radiação 7. A radiação UV de um intermediário de pancreatina dissolvido em isopropanol a 40% produziu uma redução de até 4logiw em fago M2. Irradiação gama de pancreatina (API) produziu uma diminuição de aproximadamente 40% em atividade de lipase a 27 kGy e uma diminuição de 13% em atividade de lipase a 5 kGy. O teor bacteriano foi reduzido em mais que 2,5logio, mas a inativação de vírus não foi relatada. Quando a pancreatina (API) foi tratada com irradiação À, foi relatado que mais que 85% da atividade enzimática foi mantida, mas a “contagem de germes” foi reduzida apenas em aproximadamente 1,5logio.

[0012] WO 2003/020324 refere-se à esterilização de enzimas digestivas, tais como tripsina, o-galactosidase, e iduronato- 2-sulfatase, com irradiação. Enzimas líquidas ou liofilizadas (tripsina, uma glicosidase ou uma sulfatase) foram irradiadas sozinhas ou na presença de um estabilizador. Irradiação / foi realizada usando uma fonte de “'Co. Não foi relatada inativação viral.

[0013] WO 2007/014896 refere-se à redução da concentração de um ou mais contaminantes biológicos, em particular virais de pancreatina aquecendo a pancreatina.

[0014] Em U.S. 2009/0233344, o tratamento térmico de pancreatina a 80ºC por 32 horas proveu uma redução de cerca de 2,5l09gi em título viral de PPV, mas também uma perda de 20% em atividade de lipase. O tratamento térmico de pancreatina a 100ºC por 8 horas proveu uma redução maior que 3logi em título viral de PPV, mas aproximadamente 50% de atividade de lipase foi perdida.

[0015] Assim, etapas de processo que podem ser eficazes contra vírus difíceis de inativar, tal como PPV, têm um elevado potencial para mudar a natureza do produto de pancreatina degradando ou reduzindo as enzimas pancreáticas, particularmente lipase, a níveis inaceitáveis. Tais mudanças em potência podem reduzir ou alterar o perfil de eficácia do produto final. Portanto, é desejável manter a atividade enzimática, particularmente a atividade de lipase, durante o processo de fabricação.

[0016] Como cada um dos processos de depuração viral testados anteriormente, que demonstraram alguma eficácia contra vírus difíceis de inativar (por exemplo, PPV), resultou em perda significativa da atividade enzimática, incluindo lipase, houve ceticismo na indústria quanto a um nível robusto de inativação/depuração viral pode ser alcançada ser comprometer a qualidade do produto. Em particular, houve ceticismo na indústria de que uma etapa de depuração viral ortogonal robusta e adequada poderia ser desenvolvida sem impactar adversamente as propriedades químicas, físicas e farmacêuticas da pancreatina. Vide, por exemplo, a carta de Scientific Protein Laboratories para o FDA de 22 de junho de 2004, no boletim nº 2003D-0206. Sumário da invenção

[0017] A presente invenção refere-se a uma preparação de enzima isolada de uma fonte de tecido animal. A preparação de enzima isolada inclui uma ou mais enzimas, tem uma contaminação viral e/ou microbiana reduzida em relação ao tecido animal da fonte, e mantém pelo menos uma atividade biológica do tecido animal da fonte. Em determinadas incorporações, a preparação de enzima é produzida submetendo o tecido animal da fonte à radiação, preferivelmente radiação de feixe de elétrons, e subsequentemente isolando uma ou mais enzimas do tecido irradiado. Em determinadas incorporações, O tecido animal da fonte é tecido intacto. Em determinadas incorporações, o tecido irradiado exibe uma redução de pelo menos três logiw, preferivelmente de pelo menos quatro logo na carga viral quando se compara com o tecido animal da fonte. Em determinadas incorporações, empregam-se etapas adicionais de redução viral ortogonal (por exemplo, durante a etapa de isolamento uma ou mais enzimas do tecido irradiado). Em determinadas incorporações, a preparação de enzima isolada do tecido irradiado tem uma atividade biológica correspondente a pelo menos 50%, preferivelmente a pelo menos 90% da atividade biológica de uma preparação de enzima de controle, tal como uma preparação de enzima isolada de um tecido animal da fonte não irradiado. Em determinadas incorporações, a atividade biológica é atividade de lipase. Em determinadas incorporações, o tecido irradiado exibe uma redução de pelo menos três logw, preferivelmente de pelo menos quatro logi nos contaminantes virais e/ou microbianos quando se compara a um tecido animal de fonte não irradiado e a preparação de enzima isolada do tecido irradiado tem uma atividade biológica correspondente a pelo menos 50%, preferivelmente a pelo menos 90% da atividade biológica de uma preparação de enzima de controle, tal como uma preparação de enzima isolada de um tecido animal da fonte não irradiado.

[0018] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para produzir uma preparação de enzima derivada de um tecido animal, sendo que a preparação de enzima tem uma contaminação viral e/ou microbiana reduzida em relação ao tecido animal da fonte. O método inclui um tratamento suficiente para produzir uma redução de pelo menos três logo, preferivelmente de pelo menos quatro logo, em contaminantes virais e/ou microbianos quando se compara com o tecido animal da fonte. Em determinadas incorporações, O tratamento compreende submeter um tecido animal da fonte intacto à radiação, preferivelmente radiação de feixe de elétrons, para produzir tecido animal irradiado. Em determinadas incorporações, o tratamento com radiação de feixe de elétrons é suficiente para reduzir a contaminação viral e/ou microbiana do tecido animal da fonte, mantendo, simultaneamente, pelo menos uma atividade biológica do tecido animal da fonte. Em determinadas incorporações, a atividade biológica é atividade de lipase. Em determinadas incorporações, uma ou mais enzimas e/ou proenzimas são extraídas do tecido animal irradiado. Em determinadas incorporações, uma ou mais enzimas são isoladas do tecido animal irradiado. Em determinadas incorporações, o método reduz o risco de contaminação infecciosa da preparação de enzima derivada de animal ou de uma composição farmacêutica compreendendo a preparação de enzima derivada de animal em relação a um controle não tratado.

[0019] Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo as preparações de enzimas aqui descritas. A composição farmacêutica pode estar numa forma de dosagem farmacêutica oral. Em determinadas incorporações, a composição farmacêutica é usada para tratar ou prevenir uma doença responsiva à terapia de reposição enzimática pancreática, como a insuficiência pancreática exócrina. Assim, outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para tratar ou prevenir insuficiência pancreática exócrina compreendendo administrar a um indivíduo que necessita da mesma uma dose de uma preparação de enzima ou composição farmacêutica aqui descrita.

[0020] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um kit que compreende as preparações de enzimas ou composições farmacêuticas aqui descritas.

[0021] Estes e outros objetivos estão descritos nos parágrafos seguintes. Esses objetivos não devem ser considerados como limitativos da abrangência da invenção. Descrição detalhada da invenção

[0022] Esta descrição detalhada destina-se apenas a familiarizar os outros especialistas na técnica com a presente invenção, seus princípios e sua aplicação prática, para que outros especialistas na técnica possam adaptar e aplicar a invenção em suas inúmeras formas, pois podem ser mais adequadas para os requisitos de um uso específico. Esta descrição e seus exemplos específicos destinam-se apenas a fins ilustrativos. Portanto, esta invenção não se limita às incorporações descritas neste pedido de patente e pode ser modificada de várias maneiras. A. Definições

[0023] Conforme usados no relatório descritivo e nas reivindicações anexas, a menos que sejam especificados o contrário, os termos seguintes têm o significado indicado:

[0024] Quando aqui usado, o termo “API” significa “ingrediente farmacêutico ativo”. O API preferido aqui divulgado é pancreatina, em particular pancreatina suína quando geralmente usada para fins terapêuticos, isto é, pancreatina de acordo com as exigências de farmacopeias padrão, por exemplo, Ph. Eur. e/ou USP e apropriada para administração oral no tratamento e profilaxia de má digestão em mamíferos, em particular em seres humanos, e em particular de má digestão devida a insuficiência pancreática exócrina crônica tal como em pacientes que sofrem de fibrose cística,

pancreatite crônica ou pacientes que sofreram cirurgia gastrointestinal superior.

[0025] Quando aqui usado, o termo “bruta” refere-se a uma preparação não purificada ou mistura contendo enzimas e/ou proenzimas bem como componentes adicionais derivados do tecido da fonte. Uma preparação ou mistura bruta inclui, mas não se limita ao próprio tecido animal.

[0026] O termo “preparação de enzima” refere-se a qualquer composição de matéria contendo uma ou mais enzimas, quer na forma ativa ou na forma inativa (isto é, proenzimas ou zimogênios). O termo inclui extratos celulares ou de tecidos bem como preparações brutas derivadas de tecido animal ou de outro material celular. Um exemplo de uma preparação de enzima é pancreatina, pancrelipase, um extrato derivado de mamífero, preferivelmente pâncreas de suínos.

[0027] O termo “extrato”, no que se refere às presentes preparações enzimáticas, refere-se a uma ou mais enzimas e/ou proenzimas que foram separadas de pelo menos um componente do tecido do qual elas derivaram. Os componentes extraídos podem estar na forma de uma enzima ativa ou de uma proenzima (zimogênio) que requer conversão subsequente para a forma ativa.

[0028] O termo “isolada”, no que se refere Às presentes preparações enzimáticas, refere-se a uma ou mais enzimas ativas que foram separadas de pelo menos um componente do tecido do qual elas derivaram. Assim, em determinadas incorporações, uma “enzima isolada” ou uma “preparação de enzima isolada” inclui uma ou mais enzimas ativas que foram convertidas da forma de proenzima correspondente via hidrólise e/ou autólise. A hidrólise e/ou autólise para converter a proenzima numa enzima ativa pode ocorrer antes, durante ou após a extração.

[0029] Quando aqui usados, os termos “enzimas pancreáticas”, “pancreatina” e “pancrelipase” referem-se a misturas enzimáticas derivadas dos pâncreas de mamíferos compreendendo enzimas digestivas tais como lipase, protease e amilase como componentes principais. Em particular, os termos “enzimas pancreáticas”, “pancreatina” e “pancrelipase” podem ser usados aqui como sinônimos e se referem a extratos pancreáticos apropriados para uso terapêutico, de acordo com farmacopeias padrão, que contêm várias enzimas digestivas cujas propriedades são definidas por monografias padrão explicadas acima. Devido aos processos de fabricação padronizados, “enzimas pancreáticas”, “pancreatina” e “pancrelipase” são usualmente fornecidas em forma de pó como “pancreatina em pó”, algumas vezes também referida como “pó de pâncreas”. Enzimas pancreáticas, pancreatina e pancrelipase também podem ser, e preferivelmente são APIS. A pancreatina para uso farmacêutico é tipicamente de origem bovina ou suína. Prefere-se a pancreatina suína. A pancrelipase foi descrita em algumas referências como uma preparação enzimática com atividade (de lipase) aumentada em relação à pancreatina.

[0030] Quando aqui usado, o termo “composição farmacêutica” significa uma composição compreendendo uma preparação de enzima tal como aqui descrita e opcionalmente um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[0031] Usa-se de modo adjetivo o termo “farmaceuticamente aceitável” para significar que o substantivo modificado é apropriado para uso como um produto farmacêutico ou como uma parte de um produto farmacêutico.

[0032] Uma etapa de redução microbiana e/ou viral “ortogonal” refere-se a um método distinto para a redução de micróbios e/ou vírus que podem estar presentes numa amostra. Uma etapa de redução microbiana e/ou viral pode ser ortogonal contanto que haja uma ou mais etapas adicionais de redução microbiana e/ou viral no processo. Em determinadas incorporações, uma etapa de redução microbiana e/ou viral “ortogonal” tem um mecanismo suficientemente distinto de todas as outras etapas de redução microbiana e/ou viral usadas no processo tal que o logiww de mortalidade alcançado pela etapa “ortogonal” se torne aditivo com o logiw de mortalidade cumulativo obtido a partir de todas as outras etapas de redução microbiana e/ou viral que são usadas para obter a preparação de enzima.

[0033] Os termos “prevenir”, “prevenindo” e “prevenção” referem-se a um método para prevenir o aparecimento de uma condição, distúrbio ou doença e/ou os sintomas associados e impedir um indivíduo de adquirir uma condição, distúrbio ou doença. Quando aqui usados, os termos “prevenir”, “prevenindo” e “prevenção” incluem também retardar o início de uma condição, distúrbio ou doença e/ou os sintomas associados e reduzir o risco de um indivíduo de adquirir uma condição, distúrbio ou doença.

[0034] O termo “indivíduo” inclui seres humanos e outros primatas bem como animais domésticos e semidomésticos incluindo, mas não se limitando a aves domésticas, abelhas, vacas, ovelhas, cabras, porcos, cavalos, cães, gatos, coelhos, ratos, camundongos e similares. O termo “aves domésticas” abrange todos os tipos de aves domésticas,

incluindo, mas não se limitando a galinhas, perus, patos, gansos, emas, avestruzes e aves de caça. Em determinadas incorporações, o indivíduo é um ser humano.

[0035] o termo “quantidade terapeuticamente eficaz” significa uma quantidade suficiente da preparação de enzima ou da composição farmacêutica para tratar uma condição, distúrbio ou doença, numa razão benefício/risco razoável aplicável a qualquer tratamento médico. Quando usada num tratamento médico, pode-se empregar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma das preparações de enzimas como um extrato ou numa forma bruta. Alternativamente, a composição enzimática pode ser administrada como uma composição farmacêutica contendo a composição de enzima de interesse em combinação com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[0036] os termos “tratar”, “tratando” e “tratamento” referem-se a um método para aliviar ou anular uma condição, distúrbio ou doença e/ou os sintomas associados. B. Preparações de enzimas e métodos de fabricação

[0037] Em um aspecto, a presente invenção inclui uma preparação de enzima compreendendo uma ou mais enzimas e/ou proenzimas derivadas de tecido animal, preferivelmente mamífero. Em determinadas incorporações, a preparação de enzima compreende uma mistura de enzimas digestivas e/ou proenzimas. Em determinadas incorporações, a preparação de enzima compreende uma lipase. Em determinadas incorporações, a preparação de enzima compreende uma amilase. Em determinadas incorporações, a preparação de enzima compreende pancreatina. Em determinadas incorporações, a preparação de enzima compreende uma proenzima, tal como uma prolipase ou um tripsinogênio. Em determinadas incorporações, a preparação de enzima está numa forma bruta. Em determinadas incorporações a preparação de enzima compreende uma ou mais enzimas e/ou proenzimas que foram extraídas de um tecido animal. Em determinadas incorporações, a preparação de enzima compreende uma ou mais enzimas que foram isoladas de um tecido animal.

[0038] Em determinados aspectos, uma preparação enzimática isolada tem a mesma ou substancialmente a mesma atividade biológica, mas menos infectuosidade, do tecido do qual foi isolada. Em determinadas incorporações, a preparação enzimática isolada tem a mesma ou substancialmente a mesma atividade biológica de uma preparação enzimática de controle. Em determinadas incorporações, a infectuosidade da preparação enzimática isolada é reduzida em pelo menos três logio, preferivelmente em pelo menos quatro logiw, em relação à infectuosidade do tecido do qual ela foi isolada. Em determinadas incorporações, a infectuosidade que é reduzida é infectuosidade viral, particularmente, infectuosidade viral não revestida e/ou infectuosidade viral revestida. Em determinadas incorporações, a atividade biológica da preparação enzimática isolada é pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou preferivelmente pelo menos 90% da atividade biológica de uma preparação enzimática de controle. Em determinadas incorporações, a atividade biológica é atividade enzimática, tal como atividade de protease, atividade de amilase ou, preferivelmente, atividade de lipase.

[0039] Em outro aspecto, a preparação enzimática é isolada de uma fonte de tecido pré-tratada e tem a mesma ou substancialmente a mesma atividade biológica, mas menos infectuosidade, que uma preparação de controle isolada de uma fonte de tecida não tratada. Em determinadas incorporações, a infectuosidade da preparação enzimática é reduzida em pelo menos três logi, preferivelmente em pelo menos quatro logo em relação à preparação de controle. Em determinadas incorporações, a infectuosidade da fonte de tecido pré- tratada é reduzida em pelo menos três logih, preferivelmente em pelo menos quatro logiw em relação à fonte de tecido não tratada. Em determinadas incorporações, a infectuosidade que é reduzida é infectuosidade viral, particularmente, infectuosidade viral não revestida. Em determinadas incorporações, uma atividade biológica da preparação enzimática é pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou, preferivelmente, pelo menos 90% da atividade biológica de uma preparação de controle isolada de uma fonte de tecido não tratada. Em determinadas incorporações, a atividade biológica é atividade enzimática tal como atividade de protease, atividade de amilase ou, preferivelmente, atividade de lipase.

[0040] Em outro aspecto, a preparação de enzima deriva de um tecido irradiado com feixe de elétrons. Em determinadas incorporações, o tecido irradiado com feixe de elétrons é, preferivelmente um tecido de mamífero, preferivelmente um tecido de suíno. Em determinadas incorporações, a preparação enzimática derivada de tecido irradiado com feixe de elétrons compreende pancreatina. Em determinadas incorporações, a preparação enzimática derivada de tecido irradiado com feixe de elétrons compreende uma proenzima, tal como prolipase ou tripsinogênio. Em determinadas incorporações, a preparação enzimática derivada de tecido irradiado com feixe de elétrons está numa forma bruta. Em determinadas incorporações, a preparação enzimática derivada de tecido irradiado com feixe de elétrons compreende uma ou mais enzimas e/ou proenzimas que foram extraídas do tecido irradiado. Em determinadas incorporações, a preparação enzimática derivada de tecido irradiado com feixe de elétrons compreende uma ou mais enzimas que foram isoladas do tecido irradiado.

[0041] Em outro aspecto, a preparação enzimática é isolada de um tecido irradiado com feixe de elétrons e tem a mesma ou substancialmente a mesma atividade biológica, mas menos infectuosidade, que uma preparação de controle isolada de uma fonte de tecido não irradiada. Em determinadas incorporações, o tecido irradiado é tecido pancreático. Em determinadas incorporações, o tecido irradiado é um tecido pancreático laminado, um pâncreas inteiro ou uma porção de um pâncreas inteiro. Em determinadas incorporações, a fonte de tecido não irradiada é tecido pancreático. Em determinadas incorporações, a infectuosidade da preparação de enzima é reduzida em pelo menos três logiw, preferivelmente em pelo menos quatro logiw em relação à preparação de controle. Em determinadas incorporações, a infectuosidade que é reduzida é infectuosidade viral, particularmente infectuosidade viral revestida ou não revestida. Em determinadas incorporações, a infectuosidade que é reduzida é infectuosidade de PPV. Em determinadas incorporações, a atividade biológica da preparação enzimática isolada é pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou, preferivelmente, pelo menos 90% da atividade biológica da preparação de controle. Em determinadas incorporações, a atividade biológica é atividade enzimática, tal como atividade de protease,

atividade de amilase ou, preferivelmente, atividade de lipase.

[0042] Em outro aspecto, a preparação de enzima compreende proenzimas irradiadas com feixe de elétrons. Em determinadas incorporações, a preparação enzimática é ainda processada, tal como convertendo as proenzimas irradiadas em sua forma ativa (por exemplo, por autólise e/ou hidrólise).

[0043] As presentes preparações enzimáticas podem ser melhores entendidas juntamente com os métodos seguintes que ilustram técnicas exemplares através dos quais se pode obter as preparações enzimáticas.

[0044] Em um aspecto, a presente invenção inclui um método para fabricar uma composição enzimática compreendendo submeter uma fonte de proenzima à radiação, preferivelmente, radiação de feixe de elétrons. Em determinadas incorporações, a fonte de proenzima é uma população de células. Em determinadas incorporações, a população de células é um tecido intacto obtido de uma glândula de mamífero ou de uma porção da mesma. Em determinadas incorporações, a população de células é uma glândula inteira obtida de um mamífero. Em determinadas incorporações, a população de células é uma porção de uma glândula obtida de um mamífero. Em determinadas incorporações, a população de células é um bloco de tecido congelado. Em determinadas incorporações, a população de células é de tecido animal laminado ou picado.

[0045] Em outro aspecto, a presente invenção inclui um método para fabricar uma preparação de enzima. O método compreende submeter um tecido animal à radiação, preferivelmente radiação de feixe de elétrons. Em determinadas incorporações, o tecido animal é um tecido intacto. Em determinadas incorporações, o tecido animal intacto é um bloco de tecido congelado. Em determinadas incorporações, o tecido animal intacto é um tecido animal laminado ou picado.

[0046] Em determinadas incorporações, o método começa com tecido animal, preferivelmente tecido animal intacto. Em determinadas incorporações, o tecido animal é de pâncreas de mamífero, preferivelmente, de porco. Em determinadas incorporações, procura-se pâncreas suíno de um matadouro aprovado, preferivelmente de um abatedouro de uma única espécie.

[0047] Em determinadas incorporações, o tecido animal intacto inclui tecido pancreático intacto. Em determinadas incorporações, o tecido pancreático intacto inclui um pâncreas inteiro ou uma porção do mesmo, tal como um ou mais lóbulos. Em determinadas incorporações, o tecido pancreático inclui tecido congelado laminado. Em determinadas incorporações, o tecido pancreático intacto inclui um bloco de tecido congelado, que pode ter sido mecanicamente processado. Em determinadas incorporações, o tecido pancreático intacto inclui tecido pancreático que foi minimamente manipulado ou alterado, ou preferivelmente não manipulado ou alterado, de modo a, por exemplo, destruir enzimas ativas e/ou converter proenzimas no tecido para sua forma ativa. Por exemplo, um tecido homogeneizado que passou por um processamento químico ou enzimático significativo para converter proenzimas em sua forma ativa não é “tecido intacto”, como o termo é aqui usado.

[0048] O picar envolve tipicamente processar o tecido da fonte em um moedor em pedaços menores ou iguais a 0,5 em,

menores ou iguais a 0,4 cm, menores ou iguais a 0,3 cm, menores ou iguais a 0,2 cm” ou menores ou iguais a 0,1 cm. A homogeneização envolve, tipicamente, misturar o material picado com água para formar uma suspensão ou pasta semifluida tal como se conhece na técnica. O tecido também pode ser misturado com outras soluções e/ou estabilizantes para permitir ou facilitar o processamento mecânico, contanto que a misturação com outras soluções e/ou estabilizantes não destrua enzimas ativas e/ou converta proenzimas no tecido para sua forma ativa, por exemplo, mantendo a temperatura do homogeneizado, suspensão ou pasta semifluida a 10ºC + 5ºC, preferivelmente abaixo de 10ºC.

[0049] Assim, o processamento mecânico de tecido abrange, explicitamente, a adição de ou misturação com água e/ou álcool inferior (por exemplo, álcool isopropílico) em quantidade suficiente para permitir ou facilitar processamento mecânico tal como picar ou homogeneizar contanto que a misturação/combinação não venha acompanhada por autólise ou hidrólise concomitante. Assim, o processamento mecânico de acordo com os métodos da invenção pode ser executado para manter o tecido a 10ºC + 5ºC, preferivelmente abaixo de 10ºC (incluindo congelamento), durante o processamento para minimizar ou parar a autólise ou hidrólise. Consequentemente, por exemplo, um tecido homogeneizado pode ser uma mistura de tecido e água, que foi mantida a 10ºC + 5ºC, preferivelmente abaixo de 10ºC durante o processamento de modo a impedir que o tecido sofra hidrólise e/ou autólise.

[0050] Por outro lado, “intermediário em processo” (e termos análogos) faz referência a tecidos que, além da alteração mecânica opcional a partir do tecido fonte, também foram sujeitos a uma ou mais etapas do processamento químico e/ou enzimático, incluindo hidrólise e autólise. Em particular, a uma ou mais etapas do processamento químico e/ou enzimático alteram a população biomolecular e/ou o perfil biomolecular, por exemplo, destruindo enzimas ativas e/ou convertendo proenzimas no tecido para sua forma ativa. Assim, um intermediário em processo também pode ter uma razão alterada de proenzimas para enzimas ativas.

[0051] Em determinadas incorporações, o tecido animal, preferivelmente tecido animal congelado está triturado. Em determinadas incorporações, a trituração pode ser atingida usando um triturador de bloco fundido, tal como um Hydrauflake Chunker fornecido por General Machinery Corporation (Sheboygan, WI), que é projetado para cortar pedaços grossos de tecido congelado em preparação para processamento adicional.

[0052] Em determinadas incorporações, o tecido animal é irradiado. Em determinadas incorporações, o tecido animal é exposto a um feixe esterilizante de elétrons acelerados, isto é um feixe de elétrons ou radiação de feixe de elétrons. Em determinadas incorporações, o tecido animal intacto é exposto a irradiação de feixe de elétrons. Em determinadas incorporações, um pâncreas inteiro ou uma porção intacta do mesmo é exposta a irradiação de feixe de elétrons. Em determinadas incorporações, tecido pancreático suíno laminado é exposto a irradiação de feixe de elétrons.

[0053] Radiação de feixe de elétrons é uma forma de energia ionizante que, de modo geral, caracteriza-se por sua baixa penetração e altas taxas de dosagem. O feixe, uma corrente muito carregada e concentrada de elétrons, é gerado pela aceleração e conversão de eletricidade. Os elétrons são gerados por equipamentos referidos como aceleradores, que são capazes de produzir feixes que são ou pulsados ou contínuos. Quando ao material que está sendo irradiado passa sob ou em frente o feixe de elétrons, a energia dos elétrons é absorvida. Esta absorção de energia altera várias ligações químicas e propriedades biológicas dentro do produto/material. A energia que é absorvida é referida como a “dose absorvida”. É essa absorção de energia que destrói vírus e microrganismos, por exemplo, destruindo suas cadeias de DNA ou RNA.

[0054] A irradiação pode ser executada de maneira convencional, tal como colocando o tecido num recipiente apropriado e expondo o tecido a um feixe de elétrons. Em determinadas incorporações, o recipiente prendendo o tecido é colocado num transportador que depois passa através do feixe de elétrons. Em determinadas incorporações, o recipiente prendendo o tecido não contém qualquer solvente. Em determinadas incorporações, o recipiente prendendo o tecido está substancialmente livre de solvente. Em determinadas incorporações, o recipiente prendendo o tecido não contém nenhum solvente inflamável. Em determinadas incorporações, O recipiente prendendo o tecido está substancialmente livre de um solvente inflamável, tal como álcool. Por exemplo, oO recipiente pode conter tecido intacto congelado tal como uma glândula inteira, uma porção de uma glândula inteira ou um tecido em lâminas.

[0055] Em determinadas incorporações, a radiação é fornecida numa dose suficiente para inativar substancialmente vírus e/ou micróbios resistentes no tecido. Em determinadas incorporações, a radiação está numa dose que impede perda de atividade biológica, preferivelmente uma atividade enzimática, em relação a uma preparação enzimática de controle isolada de tecido não irradiado.

[0056] O feixe de elétrons acelerados pode ser fornecido por um acelerador de elétrons, tal como um acelerador de elétrons provido por Iotron Industries USA, Inc. (Columbia City, IN). Em determinadas incorporações, o acelerador de elétrons opera em potências de 20 a 250 kW e energias de feixe de 5 a 18 mega elétron-volts (MeV). Em determinadas incorporações, o acelerador de elétrons opera em 60 kW e 10 MeV. Em determinadas incorporações, o acelerador de elétrons provê uma energia de feixe maior ou igual a 10 MeVv.

[0057] Um tecido exposto a irradiação de feixe de elétrons durante um intervalo de tempo e numa quantidade suficiente para atingir inativação viral ou microbiana sem comprometer uma atividade biológica de uma ou mais enzimas subsequentemente extraídas ou isoladas do tecido irradiado. A dosagem de irradiação de feixe de elétrons requerida para esterilizar um tecido pode variar baseada, por exemplo, no tamanho do tecido, no tipo do tecido e no tipo e quantidade de contaminante viral ou microbiano na, ou suspeito de estar presente na amostra de tecido. Um especialista na técnica reconhecerá e será capaz de determinar uma dose apropriada e um intervalo de tempo apropriado para um tecido particular e baseados nas características do tecido e no acelerador sendo usado. A dose de feixe de elétrons selecionada é eficaz para inativação de agentes infeciosos que são difíceis de destruir por processos convencionais causando, simultaneamente, perda mínima em atividade enzimática.

[0058] Uma “dose absorvida” de radiação é expressa em termos de quilograys (kGy) sendo que um quilogray é igual a mil Joules de energia depositada por quilograma de material. Em determinadas incorporações, o tecido é exposto ao feixe de elétrons até uma quantidade inativadora de agente infeccioso ser absorvida. Por exemplo, o tecido pode ser exposto ao feixe de elétrons até se atingir uma dose de cerca de 10, de cerca de 15, de cerca de 20, de cerca de 25, de cerca de 30, de cerca de 35, de cerca de 40, de cerca de 45 ou de cerca de 50 kGy ou mais. Como outro exemplo, o tecido pode ser exposto ao feixe de elétrons até se atingir uma dose de cerca de 5 a cerca de 50, de cerca de 10 a cerca de 40, de cerca de 15 a cerca de 35 kGy. Em determinadas incorporações, o tecido é exposto ao feixe de elétrons até absorver uma dose de cerca de 30 kGy. Em determinadas incorporações, pâncreas suíno é irradiado com uma dose de feixe de elétrons suficiente para prover uma mortalidade de alto logo para agentes infecciosos, preferivelmente agentes infecciosos que sejam difíceis de inativar tais como vírus não revestidos, causando, ao mesmo tempo, perda mínima em atividade enzimática.

[0059] Em determinadas incorporações, a dosagem pode ser determinada com o uso de películas de corantes radiocrômicos. Tais películas podem ser calibradas por referência a um padrão nacional.

[0060] Em determinadas incorporações, o tecido é exposto à radiação de feixe de elétrons por um tempo e numa quantidade suficiente para produzir redução de pelo menos três logo, preferivelmente de pelo menos quatro logi em carga viral de um vírus modelo quando se compara com uma amostra de controle. Em algumas tais incorporações, o tecido é exposto à radiação de feixe de elétrons por um tempo e numa quantidade suficiente para produzir redução entre cerca de três logw e cerca de cinco logi em carga viral de um vírus modelo quando se compara com uma amostra de controle. Em algumas tais incorporações, o tecido é exposto à radiação de feixe de elétrons por um tempo e numa quantidade suficiente para produzir redução de cerca de quatro logiw em carga viral de um vírus modelo quando se compara com uma amostra de controle. Em determinadas incorporações, o vírus modelo é PPV. Em determinadas incorporações, o tecido é tecido intacto. Em algumas tais incorporações, o tecido intacto é uma glândula, tal como um pâncreas inteiro ou uma porção do mesmo, tal como um ou mais lóbulos de um pâncreas. Em outras tais incorporações, o tecido intacto é tecido laminado congelado.

[0061] Em determinadas incorporações, a exposição a feixe de elétrons inclui exposição em um único lado ou exposição em múltiplos lados. Em determinadas incorporações, o tecido é submetido a uma exposição em um só lado ao feixe de elétrons. Em determinadas incorporações, o tecido é submetido a uma exposição em múltiplos lados, por exemplo, uma exposição em dois lados ao feixe de elétrons. Assim uma dose de cerca de kGy pode compreender uma exposição em dois lados em cerca de 10 kGy/lado; uma dose de cerca de 30 kGy pode compreender uma exposição em dois lados em cerca de 15 kGy/lado; uma dose de cerca de 40 kGy pode compreender uma exposição em dois lados em cerca de 20 kGy/lado; e uma dose de cerca de 50 kGy pode compreender uma exposição em dois lados em cerca de 25 kGy/lado.

[0062] Em determinadas incorporações, os métodos para fabricar a preparação de enzima reduzem o risco de infectuosidade viral ou microbiana de uma composição farmacêutica compreendendo a preparação enzimática.

[0063] Em determinadas incorporações, a infectuosidade de um pâncreas irradiado é reduzida em pelo menos três logio, preferivelmente em pelo menos quatro logiw em relação à infectuosidade da glândula antes do tratamento com radiação. Em determinadas incorporações, a infectuosidade de uma preparação de enzima derivada ou isolada de um pâncreas irradiado é reduzida em pelo menos três logo, preferivelmente em pelo menos quatro logiw em relação à infectuosidade da glândula antes do tratamento com radiação. Alternativamente, a infectuosidade da preparação enzimática é determinada em relação a uma preparação enzimática de controle derivada ou isolada de um pâncreas não irradiado.

[0064] Em determinadas incorporações, a infectuosidade que é reduzida é infectuosidade viral, particularmente a infectuosidade de um vírus não revestido tal como PPV. Por exemplo, a infectuosidade de PPV de um produto de pancreatina isolado de um pâncreas irradiado é reduzida em pelo menos três logiw, preferivelmente em pelo menos quatro logw em relação a uma preparação enzimática de controle isolada de um pâncreas não irradiado. Como outro exemplo, a infectuosidade de PPV de um pâncreas irradiado é reduzida em pelo menos três login, preferivelmente em pelo menos quatro logiw em relação a um pâncreas não irradiado. Em algumas tais incorporações, a infectuosidade de PPV de uma preparação enzimática é ainda reduzida por etapas subsequentes de inativação viral ortogonal executadas após a irradiação.

[0065] Em determinadas incorporações, os métodos também podem incluir a etapa de, após a etapa de irradiação, testar a presença ou quantidade de um ou mais microrganismos (por exemplo, vírus, bactérias ou protozoários) no tecido ou na preparação enzimática derivada do tecido. Métodos para determinar se uma amostra contém um microrganismo são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ensaios de placa ou teste de formação de colônias. A esterilização eficaz também pode ser determinada usando técnicas microbiológicas convencionais, tal como, por exemplo, a inclusão de indicadores biológicos apropriados num lote de radiação ou contatar o tecido com um meio de cultura e incubar o meio para determinar a esterilidade do tecido.

[0066] Em determinadas incorporações, a infectuosidade viral pode ser calculada titulação de ponto final e cálculo subsequente da metade da dose infecciosa de cultura do tecido (TCIDso). Os títulos de vírus calculados desta maneira podem ser dados como logi6 TCIDso por mL com intervalos de confiança de 95%.

[0067] Em determinadas incorporações, uma redução na contaminação viral é dada de acordo com capítulo geral 1050 de USP-NF, como um fator de redução logarítmico que é a diferença em título de vírus entre uma amostra de controle e a amostra derivado de um tecido irradiado com feixe de elétrons após isolamento. Por exemplo, uma redução de 3logio pode indicar uma redução em carga viral por um fator de 1.000 e uma redução de 4l0giw pode indicar uma redução em carga viral por um fator de 10.000.

[0068] Em determinadas incorporações, os métodos para fabricar a preparação de enzima permitem a redução de contaminação viral e/ou microbiana da preparação enzimática sem uma redução substancial em sua atividade enzimática.

[0069] Em determinadas incorporações, a atividade enzimática de uma preparação de enzima isolada de um pâncreas irradiado é mantida. Por exemplo, em determinadas incorporações, a atividade biológica da preparação enzimática é pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou, preferivelmente, pelo menos 90% da atividade biológica de uma preparação de controle isolada de um pâncreas não irradiado. Em determinadas incorporações, a atividade biológica é atividade enzimática, tal como atividade de protease, atividade de amilase ou, preferivelmente, atividade de lipase.

[0070] Após a irradiação, o tecido pode ser ainda processado para prover a composição de enzima. Por exemplo, em determinadas incorporações, uma ou mais enzimas e/ou proenzimas são extraídas do tecido irradiado. Em determinadas incorporações, uma ou mais enzimas são isoladas do tecido irradiado. São conhecidos vários métodos para isolar enzimas de amostras de tecidos. Por exemplo, U.S. 4.623.624 provê métodos para isolar pancreatina por autólise de uma pasta semifluida aquosa de tecido contendo isopropanol.

[0071] Em determinadas incorporações, o tecido irradiado pode ser submetido a autólise e/ou hidrólise para converter proenzimas para sua forma ativa. Por exemplo, o tecido irradiado pode ser combinado com um iniciante de hidrólise para iniciar autólise. Em determinadas incorporações, a autólise e/ou hidrólise é executada em temperatura ambiente. Em determinadas incorporações, a mistura reagente é filtrada após o término da reação; o filtrado é coletado; as enzimas presentes no filtrado são precipitadas (por exemplo, com isopropanol); e o precipitado é filtrado, lavado com isopropanol e secado a vácuo.

[0072] Pode-se considerar que os métodos descritos acima e ilustrados na seção de Exemplos, são ilustrativos e não devem ser lidos como limitativos da abrangência da invenção, conforme definido nas reivindicações anexas. Todas as alternativas, modificações e equivalentes dos métodos e exemplos específicos estão incluídos dentro dos limites da abrangência das reivindicações. C. Composições

[0073] Em pelo menos um aspecto, a presente invenção inclui composições compreendendo uma composição de enzima aqui descrita. Em determinadas incorporações, a composição compreende uma ou mais enzimas e/ou proenzimas extraídas de um tecido animal irradiado. Em determinadas incorporações, a composição compreende uma ou mais enzimas isoladas de um tecido animal irradiado. Em determinadas incorporações, a composição é uma mistura bruta contendo uma ou mais enzimas derivadas de tecido animal.

[0074] Num outro aspecto, provê-se uma composição farmacêutica compreendendo uma preparação de enzima aqui descrita, compreendendo “opcionalmente ainda um ou mais excipientes convencionais farmaceuticamente aceitáveis, tais como aqueles encontrados em compêndios tais como Remington's Pharmaceutical Sciences, 18º Ed. (Alfonso R. Gennaro, ed.; Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990); Remington: the Science and Practice of Pharmacy 19º Ed. (Lippincott, Williams & Wilkins, 1995); Handbook of Pharmaceutical

Excipients, 3º Ed. (Arthur H. Kibbe, ed.; Amer. Pharmaceutical AsSSOC., 1999); Pharmaceutical Codex: Principles and Practice of Pharmaceutics 12º Ed. (Walter Lund ed.; Pharmaceutical Press, London, 1994); The United States Pharmacopeia: The National Formulary (United States Pharmacopeial Convention); e Goodman and Gilman's: the Pharmacological Basis of Therapeutics (Louis S. Goodman and Lee E. Limbird, eds.; McGraw Hill, 1992), cujas divulgações aqui se incorporam por referência.

[0075] Composições farmacêuticas compreendendo uma preparação de enzima aqui descrita podem ser usadas para suplementar enzimas digestivas no tratamento e/ou na profilaxia de má digestão em mamíferos, em particular de má digestão devida a insuficiência pancreática exócrina crônica tal como em pacientes sofrendo de fibrose cística, pancreatite crônica ou pacientes que sofreram cirurgia gastrointestinal superior. As composições farmacêuticas Ou formas de dosagem aqui descritas podem, preferivelmente, ser formas de dosagem oral que podem, em particular, ser administradas em seres humanos.

[0076] Uma forma de dosagem oral contendo uma preparação de enzima pode estar, por exemplo, na forma de cápsulas, grânulos, granulados, micropelotas, microesferas, microcomprimidos, pelotas, pílulas, pós e/ou comprimidos. Para os propósitos desta descrição, o prefixo “micro” é usado para descrever uma forma de dosagem oral se o diâmetro da forma de dosagem oral ou todas as suas dimensões (comprimento, altura, largura) for menor ou igual a cerca de mm.

[0077] Em determinadas incorporações, a forma de dosagem oral é uma cápsula. A cápsula pode compreender entre cerca de

2.000 e cerca de 40.000 unidades de lipase por cápsula. Em determinadas incorporações, a forma de dosagem é uma cápsula compreendendo 3.000, 6.000, 12.000, 24.000 ou 36.000 unidades de lipase por cápsula. Em determinadas incorporações, a forma de dosagem oral é uma cápsula compreendendo 3.000, 5.000,

10.000, 15.000, 20.000, 25.000 ou 40.000 unidades de lipase por cápsula. Em determinadas incorporações, a forma de dosagem oral é uma cápsula compreendendo 2.600, 4.200,

10.500, 16.800 ou 21.000 unidades de lipase por cápsula. Em determinadas incorporações, a forma de dosagem oral é uma cápsula compreendendo 4.000, 13.800, 20.700 ou 23.000 unidades de lipase por cápsula. Em determinadas incorporações, a forma de dosagem oral é uma cápsula compreendendo 4.000, 8.000 ou 16.000 unidades de lipase por cápsula. Em outras incorporações, a forma de dosagem oral é uma cápsula compreendendo 3.000, 4,000, 6.000 ou 8.000 unidades de lipase por cápsula. A força de dosagem pode ser expressa de vários modos, incluindo unidades USP, unidades Ph.Eur ou unidades BP.

[0078] Em determinadas incorporações, a forma de dosagem oral é um comprimido compreendendo 10.440 ou 20.880 unidades de lipase por comprimido.

[0079] São conhecidas várias composições farmacêuticas e formas de dosagem contendo pancreatina, tais como composições de liberação imediata e de liberação retardada. Por exemplo, U.S. 9.198.871 provê composições de pancreatina de liberação retardada.

[0080] Em determinadas incorporações, a forma de dosagem oral é uma micropelota de pancreatina ou uma microesfera de pancreatina.

Em determinadas incorporações, a micropelota de pancreatina ou a microesfera de pancreatina é revestida, por exemplo, com um revestimento entérico.

Em determinadas incorporações, a micropelota de pancreatina ou a microesfera de pancreatina - independentemente de qualquer tal revestimento - compreende entre cerca de 10% e cerca de 95% em peso de pancreatina, entre cerca de 5% e cerca de 90% em peso de pelo menos um agente ligante farmaceuticamente aceitável e entre cerca de 0% e cerca de 10% em peso de pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Mais especificamente, a micropelota de pancreatina ou a microesfera de pancreatina compreende entre cerca de 70% e cerca de 90% em peso de pancreatina, entre cerca de 10% e cerca de 30% em peso de pelo menos um agente ligante farmaceuticamente aceitável e entre cerca de 0% e cerca de 5% em peso de pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em determinadas incorporações, a micropelota de pancreatina ou a microesfera de pancreatina compreende entre cerca de 70% e cerca de 90% em peso de pancreatina e entre cerca de 10% e cerca de 30% em peso de pelo menos um agente ligante farmaceuticamente aceitável.

Em determinadas incorporações, micropelota de pancreatina ou a microesfera de pancreatina é aproximadamente esférica e tem um diâmetro entre cerca de 0,5 mm e cerca de 2,0 mm.

Em determinadas incorporações, micropelota de pancreatina ou a microesfera de pancreatina tem uma primeira dimensão entre cerca de 0,5 mm e cerca de 2,0 mm e uma segunda dimensão entre cerca de 0,5 mm e cerca 2,0 mm.

Em determinadas incorporações, micropelota de pancreatina ou a microesfera de pancreatina tem uma primeira dimensão entre cerca de 0,8 mm e cerca de 1,0 mm e uma segunda dimensão entre cerca de 0,5 mm e cerca 2,0 mm.

[0081] Exemplos de agentes ligantes farmaceuticamente aceitáveis incluem poli(glicol etilênico) 1500, poli(glicol etilênico) 2000, poli(glicol etilênico) 3000, poli(glicol etilênico) 4000, poli(glicol etilênico) 6000, polií(íglicol etilênico) 8000, poli(glicol etilênico) 10000, hidroxipropil metil celulose, polioxietileno, copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno e misturas dos ditos polímeros orgânicos. A lista anterior de agentes ligantes farmaceuticamente aceitáveis não significa estar completa, mas meramente ilustrativa pois um especialista na técnica entenderá que muitos outros agentes ligantes farmaceuticamente aceitáveis também podem ser usados. O poli (glicol etilênico) 4000 é um agente ligante farmaceuticamente aceitável preferido.

[0082] Exemplos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis apropriados incluem agentes de deslizamento como estearato de magnésio ou estearato de cálcio, ácido esteárico, talco e/ou amido; cargas como fosfato de cálcio, amido de milho, dextranas, dextrina, dióxido de silício hidratado, celulose microcristalina, caulim, lactose, manitol, polivinilpirrolidona, carbonato de cálcio precipitado, sorbitol e/ou talco; agentes desintegrantes como AEROSIL (ácido silícico), ácido algínico, amilose, alginato de cálcio, carbonato de cálcio, gelatina de formaldeído, carbonato péctico, amido de sagu, bicarbonato de sódio e/ou amido; e/ou hidratantes como glicerol e/ou amido. A lista anterior de excipientes farmaceuticamente aceitáveis não significa estar completa, mas meramente ilustrativa pois um especialista na técnica entenderá que muitos outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis ou combinação de excipientes também podem ser usados. Para os propósitos da presente divulgação, óleos sintéticos e ésteres de ácido ftálico monoméricos não devem ser considerados como excipientes farmaceuticamente aceitáveis apropriados. Em determinadas incorporações, micropelotas de pancreatina ou microesferas de pancreatina não contêm quaisquer excipientes farmaceuticamente aceitáveis, mas podem conter, opcionalmente, uma quantidade maior de pancreatina.

[0083] Em outra incorporação, provê-se uma forma de dosagem oral, tal como uma forma de dosagem oral revestida entérica, de pancreatina para a fabricação de um medicamento para o tratamento de condições médicas tais como distúrbios digestivos, insuficiência pancreática exócrina, pancreatite, fibrose cística, diabetes tipo I e/ou diabetes tipo II.

[0084] Em determinadas incorporações, a composição farmacêutica é uma composição farmacêutica de liberação controlada. Por exemplo, uma composição farmacêutica de liberação controlada pode ser obtida aplicando um revestimento entérico numa forma de dosagem oral. Em determinadas incorporações, o revestimento entérico compreende um agente formador de película, um plastificante e, opcionalmente, um agente antiaderente.

[0085] Agentes formadores de películas apropriados incluem ágar, homopolímeros e copolímeros de carbômero (isto é, polímeros baseados em ácido acrílico, reticulados de alto peso molecular), carboxi metil celulose, carboxi metil etil celulose, carragenana, ftalato acetato de celulose, succinato acetato de celulose, trimelitato acetato de celulose, quitina, extrato de proteína de milho, etil celulose, goma arábica, hidroxipropil celulose, succinato acetato de hidroxipropil metila, succinato acetato de hidroxipropil metil celulose, ftalato de hidroxipropil metil celulose, copolímero de ácido metacrílico-metacrilato de etila, metil celulose, pectina, poli (ftalato acetato de vinila), poli (álcool vinílico), goma-laca, alginato de sódio, ftalato acetato d amido e/ou copolímero de estireno/ácido maleico ou misturas dos ditos polímeros formadores de películas. Ftalato acetato de celulose, succinato acetato de hidroxipropil metil celulose e/ou copolímero de ácido metacrílico-metacrilato de metila são os agentes formadores de películas preferidos. Ftalato de hidroxipropil metil celulose é muito preferido, tal como HP 55 ou HPMCP HP-50. Óleos sintéticos não são considerados como agentes formadores de películas preferidos. A lista anterior de agentes formadores de películas não significa estar completa, mas meramente ilustrativa pois um especialista na técnica entenderá que muitos outros agentes formadores de películas ou combinação de agentes formadores de películas também podem ser usados.

[0086] De modo geral, os plastificantes podem estar presentes numa quantidade maior que cerca de 1,5% e, tipicamente, numa quantidade entre cerca de 2% e cerca de 20% em peso, em relação ao agente formador de película. O plastificante pode conter álcoois monoídricos lineares saturados tendo de 12 a 30 átomos de carbono. Mais especificamente, plastificantes aceitáveis incluem álcool laurílico, álcool tridecílico, álcool miristílico, álcool pentadecílico, álcool cetílico, álcool heptadecílico, álcool estearílico, álcool nonadecílico, álcool aráquico, álcool beenílico, álcool carnaubílico, álcool cerílico, álcool corianílico, álcool melissílico, citrato de tributil acetila, sebaçato de dibutila, ésteres de ácidos graxos de glicerol, glicerol, poli(glicol etilênico), ácidos graxos de sorbitano, triacetila, citrato de trietila e misturas dos ditos plastificantes. Os plastificantes preferidos são: álcool cetílico, álcool estearílico, citrato de trietila e misturas dos mesmos. Quando se usa o álcool cetílico como o único plastificante, ele pode estar presente numa quantidade maior que cerca de 1,5%, tipicamente numa quantidade de cerca de 2% a cerca de 15%, preferivelmente de cerca de 2% a cerca de 10% em peso em relação ao agente formador de películas. Quando se usa o citrato de trietila como o único plastificante, ele pode estar presente numa quantidade entre cerca de 5% e cerca de 20%, preferivelmente entre cerca de 12% e cerca de 15% em peso em relação ao agente formador de películas. Óleos sintéticos e ésteres de ácido ftálico monoméricos não são considerados como plastificantes apropriados. A lista anterior de plastificantes não significa estar completa, mas meramente ilustrativa pois um especialista na técnica entenderá que muitos outros plastificantes ou combinação de plastificantes também podem ser usados contanto que eles estejam substancialmente livres de óleos sintéticos e de ésteres de ácido ftálico monoméricos.

[0087] Em determinadas incorporações, o plastificante compreende álcool cetílico e citrato de trietila que estão coletivamente presentes numa quantidade maior que cerca de 3%, tipicamente, numa quantidade de cerca de 4% a cerca de 20%, em particular entre cerca de 6% e cerca de 15%, mais particularmente entre cerca de 7% e cerca de 10% em peso em relação ao agente formador de película. A razão ponderal de álcool cetílico para citrato de trietila quando ambos estão presentes pode ser de cerca de 0,05:1 a cerca de 1:1, por exemplo, 0,1:1, 0,2:1, 0,3:1, 0,4:1, 0,5:1, 0,6:1, 0,7:1, 0,8:1 ou 0,9:1. Em particular, a razão de álcool cetílico para citrato de trietila pode ser de cerca de 0,25:1 a cerca de 0,5:1, preferivelmente de cerca de 0,3:1 a cerca de 0,45:1, mais preferivelmente de cerca de 0,35:1 a cerca de 0,4:1 e ainda mais preferivelmente de cerca de 0,38:1 a cerca de 0,4:1 (peso/peso).

[0088] Opcionalmente, o revestimento entérico compreende um agente antiaderente. Agentes antiaderentes apropriados incluem dimeticona e óleo de rícino. Dimeticona, em particular dimeticona 1000, é o agente antiaderente preferido. A quantidade de agente antiaderente (se presente) no revestimento entérico está entre cerca de 1,5% e cerca de 3% em peso em relação ao agente formador de película. Óleos sintéticos não são considerados agentes antiaderentes preferidos. A lista anterior de agentes antiaderentes não significa estar completa, mas meramente ilustrativa pois um especialista na técnica entenderá que muitos outros agentes antiaderentes ou combinação de agentes antiaderentes também podem ser usados.

[0089] Em determinadas incorporações, o revestimento entérico compreende entre cerca de 5% e cerca de 30% em peso, mais preferivelmente entre cerca de 7% e cerca de 20% em peso, ainda mais preferivelmente entre cerca de 10% e cerca de 15% em peso da composição total da forma de dosagem oral revestida entérica ou da composição farmacêutica de liberação controlada. Em determinadas incorporações, o revestimento entérico compreende entre cerca de 20% e cerca de 30% em peso, mais preferivelmente entre cerca de 22% e cerca de 26% em peso, ainda mais preferivelmente entre cerca de 22,5% e cerca de 25% em peso da composição total da forma de dosagem oral revestida entérica ou da composição farmacêutica de liberação controlada.

[0090] Em determinadas incorporações, a composição farmacêutica é uma cápsula de liberação controlada para administração oral. A cápsula pode conter pelotas revestidas entéricas compreendendo lipase, protease e amilase. As pelotas revestidas entéricas podem ter uma primeira dimensão entre cerca de 0,5 mm e cerca de 2,0 mm e, opcionalmente, uma segunda dimensão entre cerca de 0,5 mm e cerca de 2,0 mm. Por exemplo, as pelotas revestidas entéricas podem ser como fiada e ter um diâmetro entre cerca de 0,5 mm e cerca de 2,0 mm e um comprimento entre cerca de 0,5 mm e cerca de 2,0 mm. A composição pode incluir ainda ingredientes inativos aqui descritos, tais como álcool cetílico, dimeticona, ftalato de hipromelose, poli(glicol etilênico) e citrato de trietila.

[0091] Em determinadas incorporações, a composição farmacêutica é uma composição farmacêutica de liberação imediata. Por exemplo, a composição farmacêutica de liberação imediata pode não ter um revestimento entérico. D. Métodos de uso

[0092] Em pelo menos um aspecto, a presente invenção inclui um método para tratar insuficiência pancreática exócrina num indivíduo, em particular um indivíduo humano necessitando de tal tratamento. o método compreende administrar uma preparação de enzima ou uma composição farmacêutica contendo uma preparação de enzima ao indivíduo. Em determinadas incorporações, a insuficiência pancreática exócrina é devida a fibrose cística, pancreatite crônica, pancreatectomia Ou outras condições.

[0093] Em outro aspecto, a presente invenção inclui um método para tratar ou evitar má digestão num indivíduo, em particular um indivíduo humano, necessitando de tal tratamento ou prevenção. Em determinadas incorporações, a má digestão é devida a insuficiência pancreática exócrina, tal como em indivíduos sofrendo de fibrose cística, pancreatite crônica ou pacientes submetidos a cirurgia gastrointestinal superior.

[0094] Em outro aspecto, a presente invenção inclui o uso de uma preparação de enzima ou de uma composição farmacêutica contendo uma preparação de enzima para tratar insuficiência pancreática exócrina num indivíduo necessitando de tal tratamento.

[0095] Em outro aspecto, a presente invenção inclui o uso de uma preparação de enzima ou de uma composição farmacêutica contendo uma preparação de enzima para o tratamento ou para a profilaxia de má digestão num indivíduo necessitando de tal tratamento ou profilaxia.

[0096] Em determinadas incorporações relacionadas aos métodos e usos acima mencionados, a preparação de enzima compreende pancreatina. Em determinadas incorporações, uma dosagem apropriada de pancreatina pode basear-se em unidades de lipase, A Cystic Fibrosis Foundation (Fundação de Fibrose Cística) (CFF) publicou diretrizes de consenso que contêm doses diárias totais recomendadas de unidades de lipase.

[0097] Em determinadas incorporações, administra-se de

2.000 a 4.000 unidades de lipase, preferivelmente 3.000 unidades de lipase, por 120 mL de fórmula ou por amamentação a uma criança de até 12 meses de idade.

[0098] Em determinadas incorporações, administra-se de

1.000 a 2.500 unidade por kg de peso corporal por refeição a um indivíduo de um (1) a quatro (4) anos de idade. Em determinadas incorporações, administra-se de 500 a 2.500 unidade por kg de peso corporal por refeição a um indivíduo de pelo menos quatro (4) anos de idade.

[0099] Em determinadas incorporações, a dosagem diária máxima não ultrapassa 10.000 unidades de lipase por kg de peso corporal. Em determinadas incorporações, a dosagem diária máxima não ultrapassa 4.000 unidades de lipase por g de gordura ingerida.

[0100] Em determinadas incorporações, a preparação de enzima ou a composição farmacêutica contendo a preparação de enzima é administrada imediatamente antes de uma refeição. Em determinadas incorporações, a preparação de enzima ou a composição farmacêutica contendo a preparação de enzima durante uma refeição ou um lanche.

[0101] Em outra incorporação ainda, provê-se um método para o tratamento de uma condição médica tal como distúrbios digestivos, insuficiência pancreática exócrina, pancreatite, fibrose cística, diabetes do tipo I e/ou diabetes do tipo II administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma preparação de enzima ou de uma composição farmacêutica contendo a preparação de enzima a uma pessoa necessitando de tal tratamento.

[0102] Em pelo menos um aspecto, a presente invenção inclui um método de digerir uma proteína. O método compreende contatar a proteína a ser digerida com uma preparação de enzima em condições suficientes para digerir a proteína.

[0103] Em determinadas incorporações, a preparação de enzima compreende uma ou mais enzimas e/ou proenzimas extraídas do tecido animal irradiado com feixe de elétrons. Em determinadas incorporações, a preparação enzimática compreende uma ou mais enzimas isoladas de um tecido animal irradiado com feixe de elétrons. Em determinadas incorporações, a preparação enzimática está numa forma bruta.

[0104] Em determinadas incorporações, a etapa de contato ocorre in vivo. Em determinadas incorporações, a etapa de contato ocorre in vitro.

[0105] Em determinadas incorporações, usa-se a proteína digerida para preparar um hidrolisado de proteína.

[0106] As preparações enzimáticas, composições, métodos e usos aqui descritos serão melhores entendidos por referência às seguintes incorporações exemplares e exemplos, que estão incluídos como uma ilustração e não para limitar a abrangência da invenção. E. Incorporações exemplares

[0107] Um aspecto da presente invenção inclui uma preparação de enzima produzida por um método compreendendo as etapas de: (a) prover tecido pancreático de mamífero; (b) submeter o tecido pancreático a uma radiação de feixe de elétrons para produzir tecido pancreático irradiado, sendo que a radiação de feixe de elétrons é suficiente para produzir uma redução na carga microbiana e/ou viral; e (c) isolar a pancreatina do tecido pancreático irradiado. Em determinadas incorporações, a etapa de isolamento compreende misturar o tecido pancreático irradiado com água. Em determinadas incorporações, a etapa (c) compreende ativar uma proenzima do tecido pancreático irradiado. Em determinadas incorporações, a redução na carga microbiana e/ou viral é de pelo menos três logi, preferivelmente uma redução de pelo menos quatro logi em relação a uma amostra de controle obtida de tecido não irradiado. Por exemplo, a redução na carga microbiana e/ou viral é uma redução de pelo menos três login, preferivelmente uma redução de pelo menos quatro logo em carga viral de PPV em relação a uma amostra de controle obtida de tecido não irradiado. Em determinadas incorporações, uma atividade biológica da preparação de enzima obtida na etapa (c) corresponde a pelo menos 50%, preferivelmente a pelo menos 90% da atividade biológica de uma preparação enzimática de controle obtida de tecido pancreático não irradiado. Em determinadas incorporações, a atividade biológica é atividade de lipase. Em determinadas incorporações, a atividade biológica é atividade de protease ou atividade de amilase. Em determinadas incorporações, oO método compreende ainda uma ou mais etapas adicionais que provêm uma redução adicional na carga microbiana e/ou viral.

[0108] Outro aspecto da presente invenção inclui uma preparação enzimática compreendendo uma ou mais enzimas isoladas de um tecido de mamífero submetida a um tratamento suficiente para produzir uma redução de pelo menos três logio, preferivelmente uma redução de pelo menos quatro lo na carga viral. Por exemplo, o tratamento é suficiente para produzir uma redução de pelo menos três logo, preferivelmente uma redução de pelo menos quatro low na carga viral de PPV em relação a uma amostra de controle não irradiada.

[0109] Outro aspecto da presente invenção inclui uma preparação enzimática compreendendo uma ou mais enzimas isoladas de um tecido de mamífero, sendo que, antes de se isolar a enzima, o tecido de mamífero foi submetido a um tratamento suficiente para produzir uma redução de pelo menos três logi, preferivelmente uma redução de pelo menos quatro low na carga viral. Por exemplo, o tratamento é suficiente para produzir uma redução de pelo menos três logo, preferivelmente uma redução de pelo menos quatro low na carga viral de PPV em relação a uma amostra de controle não tratada. Em determinadas incorporações, o tecido de mamífero é uma glândula pancreática suína. Em determinadas incorporações, a glândula pancreática suína está laminada. Em determinadas incorporações, a glândula pancreática suína está num bloco congelado. Em determinadas incorporações, a glândula pancreática suína é uma glândula inteira ou porção da mesma, tal como um ou mais lóbulos. Em determinadas incorporações, a uma ou mais enzimas compreendem pancreatina. Em determinadas incorporações, o tratamento compreende radiação de feixe de elétrons. Em determinadas incorporações a radiação de feixe de elétrons tem uma dose de cerca de 5 a cerca de 50 kGy, preferivelmente de cerca de 10 a cerca de 40 kGy. Em determinadas incorporações, uma atividade biológica da preparação de enzima corresponde a pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 90% da atividade biológica de uma preparação enzimática de controle obtida de um tecido de mamífero não tratado. Em determinadas incorporações, a atividade biológica é atividade de lipase. Em determinadas incorporações, a atividade biológica é atividade de protease ou atividade de amilase. Em determinadas incorporações, a redução na carga viral é uma redução ortogonal.

[0110] Outro aspecto da presente invenção inclui um método para reduzir o risco de contaminação de um produto de pancreatina por um agente infeccioso compreendendo as etapas de: (a) prover tecido pancreático de mamífero; (b) submeter o tecido pancreático a uma radiação de feixe de elétrons para produzir tecido pancreático irradiado, sendo que a radiação de feixe de elétrons é suficiente para reduzir o risco de contaminação por um agente infeccioso; e (c) isolar a pancreatina do tecido pancreático irradiado, obtendo-se assim um produto de pancreatina com um risco reduzido de contaminação pelo agente infeccioso em relação ao tecido pancreático de mamífero provido na etapa (a) ou uma amostra de pancreatina derivada de tecido pancreático não irradiado. Em determinadas incorporações, o agente infeccioso é parvovírus suíno (PPV). Em determinadas incorporações, O método provê uma redução de pelo menos três logo, preferivelmente uma redução de pelo menos quatro low numa medida indicativa de um nível ou atividade de um vírus não revestido, tal como parvovírus suíno (PPV). Em determinadas incorporações, a medida indicativa do nível ou atividade do vírus não revestido é a carga viral.

[0111] Outro aspecto da presente invenção inclui uma preparação enzimática compreendendo uma ou mais enzimas isoladas de um tecido de mamífero e um vírus não revestido substancialmente inativado, sendo que a preparação tem uma atividade biológica que corresponde a pelo menos 50%, preferivelmente a pelo menos 90% da atividade biológica de uma preparação de controle. Em determinadas incorporações, a preparação de controle não foi submetida a um tratamento suficiente para inativar o vírus não revestido. Em determinadas incorporações, o vírus não revestido substancialmente inativado é parvovírus suíno (PPV). Em determinadas incorporações, a uma ou mais enzimas compreendem pancreatina. Em determinadas incorporações, a uma ou mais enzimas são isoladas do tecido de mamífero. Em determinadas incorporações, o tecido de mamífero é um tecido de mamífero irradiado com feixe de elétrons.

[0112] Outro aspecto da presente invenção inclui uma composição farmacêutica compreendendo uma ou mais enzimas isoladas de um tecido de mamífero que foi submetido a um tratamento para reduzir o risco de infecção viral e microbiana, sendo que a composição tem uma atividade biológica que corresponde a pelo menos 50%m preferivelmente a pelo menos 90% da atividade biológica de uma composição de controle. Em determinadas incorporações, a uma ou mais enzimas compreendem lipase. Em determinadas incorporações, a composição de controle compreende uma amostra não tratada de um tecido de mamífero correspondente ao tecido de mamífero que foi submetido a um tratamento para reduzir o risco de infecção viral e microbiana. Em determinadas incorporações, O tratamento compreende radiação de feixe de elétrons. Em determinadas incorporações, a radiação de feixe de elétrons tem uma dose de cerca de 5 a cerca de 50 kGy, preferivelmente de cerca de 10 a cerca de 40 kGy.

[0113] Outro aspecto da presente invenção inclui um método para produzir um produto de pancreatina compreendendo as etapas de: (a) prover um tecido pancreático de mamífero; (b) submeter o tecido pancreático a radiação de feixe de elétrons para produzir tecido pancreático irradiado; e (c) isolar pancreatina do tecido pancreático irradiado para obter o produto de pancreatina. Em determinadas incorporações, a atividade biológica do produto de pancreatina obtido na etapa (c) corresponde a pelo menos 50%, preferivelmente a pelo menos 90% da atividade biológica de um produto de pancreatina de controle. Em determinadas incorporações, o produto de pancreatina de controle é obtido de tecido pancreático não irradiado. Em determinadas incorporações, a radiação de feixe de elétrons é suficiente para produzir uma redução de pelo menos três logiw, preferivelmente uma redução de pelo menos quatro low na carga viral de PPV em relação a uma amostra de controle não irradiada. Em determinadas incorporações, a radiação de feixe de elétrons tem uma dosagem de cerca de 5 a cerca de 50 kGy, preferivelmente de cerca de 10 a cerca de 40 kGy. Em determinadas incorporações, a atividade biológica é atividade de lipase. Em determinadas incorporações, a atividade biológica é atividade de protease ou atividade de amilase.

[0114] Outro aspecto da presente invenção inclui um método para digerir uma proteína compreendendo as etapas de: (a) prover uma preparação de enzima ou de proenzima isolada de um tecido animal irradiado com feixe de elétrons; e (b) contatar a proteína com a preparação de enzima ou de proenzima em condições suficientes para digerir a proteína. Em determinadas incorporações, a etapa de contato ocorre in vivo. Em determinadas incorporações, a etapa de contato ocorre in vitro. Em determinadas incorporações, o tecido animal é pâncreas suíno. Em determinadas incorporações, a preparação de enzima ou de proenzima derivada de um tecido animal irradiado com feixe de elétrons exibe pelo menos uma redução de pelo menos três logih, preferivelmente uma redução de pelo menos quatro low na carga viral quando se compara com uma preparação de enzima ou de proenzima derivada de tecido animal não irradiado. Em determinadas incorporações, a preparação de enzima ou de proenzima exibe uma atividade biológica correspondente a pelo menos 50%, preferivelmente a pelo menos 90% da atividade biológica de uma preparação de enzima ou de proenzima derivada de tecido animal não irradiado.

[0115] Outro aspecto da presente invenção inclui uma preparação de enzima compreendendo uma ou mais enzimas isoladas de tecido pancreático irradiado com feixe de elétrons. Em determinadas incorporações, o tecido pancreático compreende uma glândula pancreática suína. Em determinadas incorporações, a glândula pancreática suína é congelada e processada mecanicamente em flocos ou blocos antes da irradiação. Assim, em algumas tais incorporações, o tecido pancreático submetido à irradiação de feixe de elétrons é tecido pancreático congelado em flocos ou um bloco congelado de tecido pancreático. Em determinadas incorporações, a glândula pancreática suína é uma glândula inteira ou porção da mesma, tal como um ou mais lóbulos. Em determinadas incorporações, a uma ou mais enzimas compreendem pancreatina. Em determinadas incorporações, a preparação de enzima exibe uma redução de pelo menos três logi, preferivelmente uma redução de pelo menos quatro low na carga viral quando se compara com uma preparação de enzima de controle. Por exemplo, a preparação de enzima exibe uma redução de pelo menos três logih, preferivelmente uma redução de pelo menos quatro low na carga viral de PPV em relação a uma preparação enzimática de controle. Em determinadas incorporações, uma atividade biológica da preparação enzimática corresponde a pelo menos 50%, preferivelmente a pelo menos 90% da atividade biológica de uma preparação enzimática de controle. Em determinadas incorporações, a atividade biológica é atividade de lipase. Em determinadas incorporações, a atividade biológica é atividade de protease ou atividade de amilase. Em determinadas incorporações, a preparação enzimática de controle é obtida de tecido não irradiado. Em determinadas incorporações, a redução na carga viral é uma redução ortogonal.

[0116] Outro aspecto da presente invenção inclui um método para tratar insuficiência pancreática exócrina compreendendo: administrar uma dose das preparações enzimáticas e/ou composições farmacêuticas anteriores a um indivíduo necessitando das mesmas. Em determinadas incorporações, a insuficiência pancreática exócrina é devida a fibrose cística ou pancreatite crônica. F. Exemplos Exemplo 1. Irradiação de feixe de elétrons de parvovírus supino (PPV), API de pancreatina e pâncreas suíno Materiais e métodos

[0117] Parvovírus suíno em frasco para injetáveis em fluido de cultura celular. Como o próprio tecido da glândula suína pode ter alguns efeitos inativadores sobre os vírus, inicialmente, as amostras de vírus usadas para estes estudos foram preparadas a partir de culturas celulares infectadas. Células de parvovírus (PPV), de linhagem NADL-2 (ATCCº VR- 742m) e de testículos de porcos (ST) (ATCCº CRL-1746") foram adquiridas de American Type Culture Collection (ATCC). PPV foi propagado, cultivado e mantido de acordo com as recomendações de ATCC. PPV foi propagado para um título aproximado de 10º unidades infecciosas (UI) de vírus/mL. O vírus foi colhido das células lisadas no meio de cultura celular consistindo de meio essencial mínimo (MEM), soro bovino fetal (FBS) a 10%, glutamina 2 mM, 100 unidades/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina.

[0118] O PPV foi embalado em frascos e depois ensacado duas vezes antes do envio. Os frascos foram frascos criogênicos Nalgene (isto é, polipropileno com tampa rosqueada de polietileno de alta densidade (HDPE) com um anel de vedação à prova de vazamentos tendo um comprimento de 1,87 polegadas; diâmetro de 0,5 polegadas; uma capacidade de 2,0 mL; e volume útil de 1,0 mL). Cada frasco foi colocado em um saco Food Saver (polietileno com uma camada externa de náilon) e vedado a vácuo. Os sacos foram cortados para caber exatamente o frasco. Quatro frascos vedados individualmente foram então colocados dentro de outro saco Food Saver (de aproximadamente 11 x 14") e vedados a vácuo.

[0119] Flocos congelados de pâncreas suíno. Os pâncreas obtidos de porco de açougueiro (Animal Technologies, Tyler, TX) foram mantidos em gelo seco.

[0120] Flocos congelados de pâncreas suíno foram colocados num recipiente (de polipropileno transparente) de 12” x 12" x 1%", que foi vedado a vácuo dentro de um saco de poli/náilon transparente de 3 milipolegadas. O saco foi então vedado termicamente. Os pâncreas foram mantidos em gelo seco para garantir temperaturas abaixo de -20ºC. O peso da amostra de flocos congelados de pâncreas suíno foi de 1,05 kg mais o peso da embalagem de 270 gramas (0,27 kg). A tampa pesou 100 g. A densidade superficial foi de 1,3 g/cmº. Foram feitas duas embalagens para cada dose de radiação, incluindo o controle sem radiação; uma embalagem intacta foi usada para o isolamento da preparação enzimática após o trânsito de volta ao local onde o isolamento foi conduzido, sendo a outra embalagem uma reserva.

[0121] Pancreatina (API). Foram usados dois tipos de pancreatina API: pancreatina N e pancreatina S. Ambas as API foram mantidas em condições ambiente. A pancreatina N (Material %*+1030828, Abbott Laboratories) é um pó amarelo claro/cinza a cor de marfim. A pancreatina S (Material $1030829, Abbott Laboratories) é um pó amarelo claro/cinza a cor de marfim. A pancreatina S é originária do pâncreas de porcas.

[0122] A pancreatina API foi colocada num recipiente (de polipropileno transparente) de 2 4" x 3 4" x 1 5/8", que foi vedado a vácuo dentro de um saco de poli/náilon transparente de 3 milipolegadas. O saco foi selado termicamente. O peso da amostra de pancreatina API foi de 80 gramas mais um peso de embalagem de 26 gramas. A densidade superficial foi de 1,4 g/cm. As amostras de pancreatina N foram expostas a radiação de feixe de elétrons na dose indicada. O controle não foi exposto a radiação de feixe de elétrons. A pancreatina N foi testada quanto à atividade após o trânsito de volta ao local experimental. A pancreatina N derivou de porco de açougueiro. Todos os pacotes de pancreatina N chegaram intactos do local de irradiação. Irradiação de feixe de elétrons

[0123] A fonte do feixe de elétrons foi um acelerador linear de elétrons de processamento de materiais industriais (IMPELAGO; Iontron Industries, Inc., Columbia City, IN), 10 MeV, amplitude de varredura de 80 cm.

[0124] As amostras de parvovírus suíno e flocos de pâncreas supino congelados embalados foram mantidos abaixo de -20ºC colocando em gelo seco contido numa bandeja de alumínio. Os dosímetros foram colocados na superfície superior de cada amostra. As amostras de pancreatina API embaladas mantidas em temperatura ambiente foram colocadas numa folha de espuma de poliestireno expandido e os dosímetros foram colocados na superfície superior. Os pacotes foram enviados em uma correia transportadora sob a trompa de varredura do feixe de elétrons. Após um passe de radiação, os dosímetros foram recuperados. Os pacotes foram enviados sob a trompa de radiação para um segundo passe após inverter o pacote (o lado superior agora está voltado para baixo) e um novo dosímetro foi colocado na superfície superior. Após o segundo ciclo de radiação, os pacotes e dosímetros foram recuperados. Os pacotes de parvovírus suíno e flocos de pâncreas supino congelados foram recuperados e colocados em gelo seco para envio. Os pacotes de pancreatina API foram recuperados e mantidos em temperatura ambiente para envio. Os pacotes de controle de parvovírus suíno e flocos de pâncreas supino congelados colocados em gelo seco foram preparados para reenvio em gelo seco sem sofrer radiação. Os pacotes de controle de pancreatina API mantidos em temperatura ambiente foram preparados para reenvio em ambiente sem sofrer radiação. Calculou-se a dosagem de feixe de elétrons a partir da exposição ao dosímetro usando uma curva de calibração. Teste de infecciosidade viral

[0125] A infecciosidade viral foi determinada por titulação de dez vezes em microplacas de 96 cavidades usando controles apropriados para amostras em triplicata a cada dose de energia. Os títulos de vírus foram calculados usando o método de Reed e Muench descrito em Reed, L.J.; Muench, H. (1938), "A simple method of estimating fifty percent endpoints”, The American Journal of Hygiene 27: 493-497 e expressos como 50% de TCID;s, por mL.

Isolamento de pancreatina e teste

[0126] O método usado para isolamento de pancreatina substancialmente semelhante àquele descrito em U.S. 4.623.624 que compreende hidrólise e/ou autólise, seguido por peneiração de fibras, precipitação de enzimas, separação de precipitado por filtração e/ou centrifugação, lavagem da torta, secagem e redução de tamanho de partícula. A hidrólise foi executada usando um pacote correspondente a cada dosagem de radiação incluindo o controle não irradiado. Um pacote sem danos à embalagem (como grandes fissuras) foi selecionado para cada experimento de isolamento. Devido aos cuidados tomados durante o transporte de volta ao local experimental, todos os pacotes chegaram intactos e um pacote foi selecionado aleatoriamente para cada dosagem de radiação, incluindo o controle para isolamento. Pancreatina de um isolamento anterior foi usada como uma fonte de protease para iniciar a hidrólise. Usou-se hidróxido de cálcio para fornecer íons cálcio necessários para a ativação das proteases. Usa-se bicarbonato de sódio como agente de tamponamento para a hidrólise. Usou-se simeticona como um agente antiespumante. Executou-se a hidrólise do pâncreas próximo da temperatura ambiente. Checou-se o término da hidrólise por centrifugação da mistura hidrolisada após a adição de isopropanol tal como descrito abaixo. Após O término da hidrólise adicionou-se mais isopropanol para reduzir a taxa de hidrólise, a mistura foi resfriada, a mistura foi agitada e as fibras foram separadas usando uma malha de 0,425 polegada. As fibras foram lavadas com isopropanol e comprimidas para expelir o líquido nelas mantido. A lavagem foi combinada com o filtrado obtido anteriormente. Adicionou-se mais isopropanol ao filtrado para causar a precipitação das enzimas. A suspensão foi filtrada através de filtro de pano com aberturas de 15 mícrons e lavada com concentrações crescentes de isopropanol com isopropanol absoluto como a lavagem final. A torta foi secada no filtro de pano sob fluxo de nitrogênio enquanto o vácuo puxava abaixo do filtro de pano até a torta parecer visualmente seca (a cor da torta torna-se mais clara após a remoção de isopropanol e água). A torta foi retirada do filtro de pano e secada a vácuo e fluxo de nitrogênio numa temperatura abaixo de cerca de 50ºC até um teor de água por Karl Fischer menor ou igual a 3,5%. O rendimento de pancreatina seca é de 80 a 100 g de 1 kg de flocos de pâncreas suíno congelados de porco de açougueiro.

[0127] Teste de centrifugação para completar a hidrólise. Três colheres de amostra de 10 mL do recipiente de hidrólise passam por uma peneira de 0,425 mm, coleta-se o filtrado num béquer plástico (raspa-se o filtrado no béquer plástico também), descartam-se as fibras que são retidas na malha. Usando uma pipeta, adicionam-se 10 g de solução de reator ao tubo de 50 mL da centrífuga, adicionam-se 5,5 mL de IPA a 85%, agita-se por 1 minuto com espátula. Adicionam-se 20 mL de IPA a 85% ao filtrado em tubo de 50 mL da centrífuga. Agita-se por um minuto com espátula. Centrifuga-se a suspensão em aproximadamente 90X for dois minutos.

[0128] A primeira amostra pode ser colhida duas horas após o início da hidrólise ou quando a cor estiver mudando de rosa para castanho e a suspensão se tornar mais fina (cerca de 2 horas).

[0129] A amostra seguinte é colhida quando a cor for marrom sem tons de rosa, neste ponto espera-se que o sedimento seja de cerca de 25%, o sedimento será menos firme e os retardadores poderão estar presentes na camada clara acima. Depois disso, a amostragem pode ser feita a cada intervalo possível de meia hora.

[0130] A hidrólise parará se duas medições subsequentes mostrarem menos de 20% de sedimentos. Neste ponto, oO sedimento será firme e sem retardadores na camada clara acima.

[0131] A irradiação do feixe de elétrons em frente e verso do PPV em frasco foi realizada em triplicata. Os dados para redução de carga viral e o log da mortalidade do PPV exposto à radiação de feixe de elétrons são mostrados na Tabela 1:

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[0132] Determinou-se a dosagem de feixe de elétrons estimando a dose absorvida por cada amostra da dose superficial indicada pelo dosímetro fixado ao recipiente da amostra.

[0133] A Tabela 1 mostra que a exposição de PPV para cerca de 40 kGy provê cerca de 6,5 logiw de mortalidade, enquanto que a exposição para cerca de 20 kGy provê cerca de 3 log de mortalidade. Com base nestes dados, espera-se que a exposição para cerca de 30 kGy proverá pelo menos 4 log, de mortalidade.

[0134] Exposição de PPV para cerca de 60 kGy, cerca de 80 kGy ou cerca de 100 kGy resultou em títulos virais abaixo do limite de detecção do ensaio.

[0135] A pancreatina foi testada para atividade de protease, amilase e lipase livres tal como descrito em USP por métodos validados. A pancreatina foi testada para protease total tal como descrito na Farmacopeia Europeia (EP) por métodos validades.

[0136] Foi realizada irradiação bilateral de pancreatina N por feixe de elétrons. Todos os recipientes de pancreatina N foram recebidos intactos no local experimental e foram usados para ensaio. A Tabela 2 mostra os dados para atividade enzimática de pancreatina API exposta a radiação de feixe de elétrons:

Tabela 2 Dose de |Atividade de|Atividade de Atividade dejAtividade de feixe de lipase amilase protease protease elétrons total livre

USP USP USP USP unidades/ unidades/ unidades/ unidades/ kGy grama grama grama grama Controle (0 KkGy) 89106 564390 383192 314093 18,6 kGy 63328 398752 321567 266540 37,45 kGy 58631 386628 302341 244531 56,5 kGy 47755 282378 272499 232087 76,35 kGy 40583 272760 259117 214914 99,4 kGy 37799 286652 247005 196356

[0137] A tabela 2 mostra que a exposição de pancreatina API a cerca de 20 kGy provê cerca de 30% de perda em atividade de lipase, a exposição de pancreatina API a cerca de 40 kGy provê cerca de 35% de perda em atividade de lipase, a exposição de pancreatina API a cerca de 60 kGy provê cerca de 46% de perda em atividade de lipase, a exposição de pancreatina API a cerca de 80 kGy provê cerca de 54% de perda em atividade de lipase, e a exposição de pancreatina API a cerca de 100 kGy provê cerca de 58% de perda em atividade de lipase. Baseado nestes dados, espera-se que a exposição de pancreatina API a cerca de 30 kGy proveja cerca de 30% de perda em atividade de lipase.

[0138] Irradiação bilateral de feixe de elétrons de pâncreas de porco de açougueiro foi executada. A Tabela 3, mostra os dados para atividade enzimática de pancreatina derivada de flocos de pâncreas suíno congelado expostos a radiação de feixe de elétrons:

Tabela 3 Dose de |Atividade de|Atividade de (Atividade dejAtividade de feixe de lipase amilase protease protease elétrons total livre

USP USP USP unidades/ USP unidades/| unidades/ unidades/ kGy grama grama grama grama Controle (0 KkGy) 74986 423487 243421 151365 18,75 kGy 74741 449569 337594 128749 35,5 kGy 65348 349816 360407 128506 56,55 kGy 57976 398281 268297 119727 77,4 kGy 34806 251691 175994 109158 100,4 kGy 36362 276118 206217 100342

[0139] A Tabela 3 mostra que a exposição de flocos de pâncreas suíno congelados para cerca de 20 kGy provê uma perda de cerca de 1% na atividade de lipase; a exposição de flocos de pâncreas suíno congelados para cerca de 40 kGy provê uma perda de cerca de 13% na atividade de lipase; a exposição de flocos de pâncreas suíno congelados para cerca de 60 kGy provê uma perda de cerca de 23% na atividade de lipase; a exposição de flocos de pâncreas suíno congelados para cerca de 80 kGy provê uma perda de cerca de 54% na atividade de lipase; e a exposição de flocos de pâncreas suíno congelados para cerca de 100 kGy provê uma perda de cerca de 52% na atividade de lipase. Baseado nestes dados, espera-se que a exposição de flocos de pâncreas suíno congelados para cerca de 30 kGy proveja uma perda de cerca de 10% na atividade de lipase.

[0140] Como mostrado nas Tabelas 2 e 3, a irradiação com feixe de elétrons da pancreatina API produz mais perda de atividade enzimática quando se compara com a irradiação com feixe de elétrons do tecido pancreático antes do isolamento. Sem querer estar vinculado por teoria, a resistência do tecido intacto a irradiação com feixe de elétrons pode ser devido à conformação da enzima (por exemplo, como uma proenzima) no tecido fonte e/ou cofatores no tecido fonte provendo proteção estrutural. Exemplo 2. Irradiação com feixe de elétrons de pâncreas suínos inteiros

[0141] Um estudo adicional foi executado usando pâncreas suíno inteiro. Aproximadamente 3,6 kg de pâncreas suíno descongelado foram acondicionados em caixas de papelão revestidas com cera com aproximadamente 10 x 15 x 1,5 polegadas de espessura. As caixas foram congeladas a -20ºC e mantidas até usar irradiação com feixe de elétrons. As caixas foram enviadas para irradiação com feixe de elétrons por caminhão frigorífico (-20ºC). As caixas foram removidas do caminhão frigorífico e depois expostas a irradiação bilateral com feixe de elétrons - caixas não irradiadas serviram como controle. Foram usadas cinco (5) caixas para cada dose de radiação nominal: O, 15, 20 e 25 kGy e enviadas de volta pra avaliações por caminhão frigorífico (-20ºC), incluindo as caixas não irradiadas, e depois mantidas a -20ºC.

[0142] Amostras de pâncreas congeladas foram selecionadas de cada caixa em locais aleatórios dentro da caixa para isolamento subsequente de pancreatina. O isolamento foi executado tal como descrito aqui. A pancreatina isolada de pâncreas inteiro irradiado com feixe de elétrons foi então testada para atividade enzimática de acordo com um ensaio colorimétrico.

[0143] Amostras de pancreatina (API) foram testadas usando análise cinética colorimétrica por um leitor de microplaca com o uso de substratos estruturalmente semelhantes àqueles uados em <pancrelipase> 39 de USP. As atividades enzimáticas foram determinadas medindo a taxa de produção do produto em relação ao padrão de referência de pancrelipase. A comparabilidade analítica foi demonstrada entre os métodos monográficos de USP e os métodos alternativos de leitura de microplacas.

[0144] O procedimento de amostragem, isolamento e análise foi repetido quatro vezes para cada dose para obter um total de cinco medições para cada dose. Os valores médios de cinco medições estão apresentados na Tabela 4. Tabela 4: Atividade de enzima API após irradiação de pâncreas inteiro Dose de |Atividade | Atividade | Atividade | Atividade feixe de | média de | média de média de média de elétrons* lipase amilase protease protease livre total Unidades | Unidades Unidades Unidades USP/mg USP/mg USP/mg USP/mg Controle 104 456 197 344 (0 kGy) 13 er Es EE E 19,9 KGy [ 24,9 xGy * (dose mínima + dose máxima) /2

[0145] A Tabela 4 mostra que a pancreatina isolada de um pâncreas inteiro exposto a uma dose de irradiação com feixe de elétrons até cerca de 25 kGy tem a mesma ou substancialmente a mesma atividade de lipase que a pancreatina isolada de um controle não irradiado. Exemplo 3. Baixa dose de irradiação com feixe de elétrons de tecido de pâncreas suíno intacto

[0146] Estudos posteriores foram executados enriquecendo tecido de pâncreas suíno com vírus vivos e, em seguida,

submetendo o tecido enriquecido com vírus à irradiação com feixe de elétrons em dose mais baixa (cerca de 12,3 kGy) para permitir a recuperação e avaliação do vírus. Este trabalho adicional foi realizado para demonstrar a inativação eficaz de vários vírus relacionados a uma dose baixa, o que permitiria a enumeração eficaz do impacto da irradiação com feixe de elétrons.

[0147] Vírus selecionados foram deliberadamente enriquecidos sobre a amostra de tecido e o grau de depuração de vírus foi avaliado por comparação da quantidade de entrada de vírus com a quantidade de vírus restante após o tratamento com feixe de elétrons. Os vírus selecionados para esse estudo estão identificados na Tabela 5. Tabela 5: Vírus selecionados para estudo de depuração viral. Vírus Família Genoma Revestimento Tamanho] Resistência (nm) |físico-química Reovírus tipo Reo RNA Nenhum 60-80 Média 3 (REO3) P ç Arvovirus Parvo DNA Nenhum 18-24 Alta suíno (PPV) Calicivírus felino Calici RNA Nenhum 35-39 Média (FCV)

[0148] REO3 possui um RNA de fita dupla, genoma segmentado e pertence à família de vírus Reoviridae, que também inclui Rotavírus. Assim, o REO3 pode servir como modelo de vírus para a validação de métodos de inativação em produtos sanguíneos e, em particular, como modelo para o vírus da hepatite E (HEV).

[0149] Os pâncreas suínos foram cortados e moídos. O tecido foi então adicionado a uma placa de Petri e pregado com o vírus indicado. Os estoques de vírus padrão possuíam títulos de pelo menos 1 x 10' pfu/ml. A amostra enriquecida foi incubada em temperatura ambiente por um período mínimo de 60 minutos (até o tecido retornar à sua secura original). Após a incubação, adicionou-se mais tecido pancreático suíno na placa de Petri. A placa de Petri foi selada e colocada em gelo seco para envio às instalações de feixe de elétrons. Cada placa de Petri continha aproximadamente 13 gramas de tecido e a densidade do tecido era semelhante à densidade de uma glândula inteira.

[0150] Para cada vírus, foram incluídas amostras de recuperação enriquecidas (não enviadas) e um controle de envio não irradiado (enviado para a instalação de feixe de elétrons, mas não irradiado).

[0151] Executou-se irradiação com feixe de elétrons na instalação de feixe de elétrons. Após completar a exposição à radiação de feixe de elétrons, as amostras irradiadas e os controles de envio não irradiados foram enviados de volta para avaliação de carga viral. Após recebimento, as amostram foram armazenadas numa temperatura menor ou igual a -60ºC até o teste.

[0152] Para cada amostra, adicionaram-se 50 mL de meio de cultura numa garrafa estéril. O tecido foi extraído executando 3 ciclos de imersão por aproximadamente 5-10 minutos em temperatura ambiente seguido por um vórtice de 15- segundos. As amostras foram então centrifugadas em 3.000 rpm por 10 minutos. Usou-se o sobrenadante da extração para teste viral.

[0153] Os títulos de vírus foram determinados por ensaios de placa padrão. O tipo de célula indicadora para REO3, PPV e FCV foram, respectivamente, Vero, PT-1 e CRFK. Os títulos de vírus e os fatores de depuração viral foram calculados de acordo com procedimentos padrão. O fator de depuração de vírus (VCF) foi calculado da seguinte forma: Volume*título antes do processamento VCF = logo Volume*título após o processamento

[0154] A Tabela 6, mostra dados para depuração viral produzida por exposição do tecido enriquecido à radiação de feixe de elétrons. Tabela 6: Depuração viral após irradiação de pâncreas enriquecidos om vírus ; Log de vírus total Limite de Vírus z ; Antes do Após Oo VCF |confiança modelo o processamento | processamento de 95% REOS 65 [rev [Tr as Ee os |

[0155] Estes estudos confirmaram que a inativação suficiente dos vírus, incluindo calicivírus felino (FCV) e reovírus 3 (REO3), pode ser alcançada com radiação de feixe de elétrons de um tecido intacto. Além disso, a irradiação de um pâncreas seguido por isolamento de uma preparação enzimática (por exemplo, pancreatina API) da glândula irradiada mostrou resultados semelhantes com respeito à perda em atividade enzimática em relação a um controle não irradiado para aqueles mostrados na Tabela 3 onde se usou flocos de pâncreas suíno.

Exemplo 4. Irradiação de feixe de elétrons de tecido picado e tecido homogeneizado

[0156] Pâncreas picado: pâncreas suínos congelados foram moídos num picador e subsequentemente congelado para irradiação tal como aqui descrito.

[0157] Pâncreas homogeneizado: pâncreas suínos congelados foram moídos num picador tal como descrito acima e agitados em água numa temperatura de 10ºC + 5ºC até se obter mistura homogênea (cerca de 75 minutos). As amostras foram subsequentemente congeladas para irradiação tal como aqui descrito.

[0158] Como um produto final de controle, usou-se pancreatina como um pó em grau terapêutico para a especificação de Ph. Eur. O pó de pancreatina foi obtido diretamente do fabricante (Abbott Laboratories GmbH, Neustadt, Alemanha) e amostrado da fabricação. A pancreatina para uso terapêutico (de acordo com Ph. Eur.) é também obtenível comercialmente, por exemplo, de Nordmark, Uetersen, Alemanha ou de BIOZYM Gesellschaft fúr Enzymtechnologie mbH, Hamburgo, Alemanha, e/ou pode ser produzida de acordo com métodos conhecidos (vide, por exemplo, EP-A2 115023).

[0159] Para o tratamento com irradiação, as amostras foram removidas do freezer ou refrigerador e colocadas em acumuladores de resfriamento para manter a temperatura tal como descrito abaixo. Como o uso de um termômetro não é possível com amostras congeladas, usou-se, onde necessário, uma câmera de imagem térmica (Testo 880-3, Testo AG Lenzkirch, Alemanha) para determinar temperaturas de superfícies.

[0160] Amostras de tecido pancreático homogeneizado foram descongeladas e irradiadas tem temperatura acima de 0ºC (T > 0ºC), mas abaixo de 20ºC. As amostras de pancreatina foram retiradas do refrigerador e irradiadas em T > 0ºC.

[0161] As amostras foram expostas a radiação de feixe de elétrons usando um acelerador de feixe de elétrons de 10 MeV, kW TT-100 de Rhodotron (IBA Industrial, Louvain-La-Neuve, Bélgica). O processo de irradiação foi executado em etapas.

As caixas de amostras passaram pelo acelerador em etapas de 5 ou 10 kGy até que atingisse a dose requerida. Por exemplo, as amostras planejadas para doses mais baixas foram removidas nas etapas anteriores e as amostras planejadas para doses mais altas foram reexpostas e irradiadas novamente.

[0162] As atividades enzimáticas (isto é, atividade lipolítica, proteolítica, amilolítica) de amostras de teste antes da irradiação (“amostras de pré-tratamento”) foram determinadas de acordo com Ph. Eur., em relação aos padrões de referência relevantes e tomadas como atividades enzimáticas iniciais (lipolítica, proteolítica, amilolítica, quando aplicável) antes do tratamento por irradiação. Subsequentemente, as amostras de teste foram irradiadas tal como aqui descrito. As atividades enzimáticas das amostras de teste após irradiação foram determinadas (“amostras de pós- tratamento”) da mesma maneira que para as amostras de pré- tratamento. As atividades enzimáticas retidas nas amostras de amostras de pós-tratamento foram determinadas e são relatadas como a porcentagem relativa da mesma atividade enzimática determinada na amostra de pré-tratamento.

[0163] A atividade de lipase foi determinada como segue, conforme descrito em Ph. Eur.: a quantidade requerida da amostra de teste (dependendo da atividade esperada, aproximadamente 2,5 g) foi triturada (por exemplo, triturada ou moída dependendo do estado/consistência da amostra de teste) e extraída diretamente com solução tampão. A atividade hidrolítica da lipase é determinada com emulsão em azeite de oliva como substrato. Os ácidos graxos livres clivados dos triglicerídeos do azeite de oliva são titulados com solução de hidróxido de sódio num pH constante de 9,0. A atividade de lipase da amostra é determinada comparando a taxa na qual uma suspensão da amostra hidrolisa um substrato de emulsão em azeite de oliva com a taxa na qual uma suspensão de um pó de referência de pâncreas padrão (padrão de referência de Ph. Eur., descrito na monografia, “pancreas powder (lipase) BRP”) hidrolisa o mesmo substrato nas mesmas condições.

[0164] Os valores de perda de atividade de lipase estão relatados na Tabela 7.

Tabela 7: Atividade enzimática após irradiação de tecido picado e homogenato de tecido. Dose de feixe Perda de atividade de lipase (3%) de elétrons Pancreatina Tecido de Homogenato del (KGy) (produto final)|pâncreas picado) tecido Fo as e as “nt”: não testado

[0165] A irradiação de tecido picado ou de homogenato de tecido (isto é, antes de processamento químico ou enzimático da população de proenzima para forma ativa) resultou consistentemente em retenção de atividade enzimática melhorada em relação à irradiação de produto final. A irradiação entre 20 e 30 kGy resultou em perdas de atividade menores que 20%, inferior àquela atingida por protocolos padrão. Exemplo 5. Irradiação de tecido picado enriquecido com B. cereus

[0166] Pâncreas congelado após picar foi descongelado, embalado em placas de Petri estéreis de poliestireno de 50 x

9 mm (Ted Pella, Inc., Redding, CA, item 14014), enriquecido com aproximadamente 10º cfu de endósporos de B. cereus de uma suspensão pré-titulada comercial (B. cereus ATCC 14579, Mesa Labs, Bozeman, MT), vedada a vácuo num saco (“seal-a-meal”) e depois congelado.

[0167] Uma faixa de níveis de dosagem de feixe de elétrons de O a 20 kGy em incrementos de 5 kGy foi selecionada no presente experimento com pâncreas picado. Os sacos foram enviados para irradiação com feixe de elétrons em gelo seco. Os sacos foram expostos a irradiação de feixe de elétrons - sacos não enviados e sacos não irradiados serviram como controles.

[0168] As amostras retornaram em gelo seco. Todas as amostras foram então diluídas e colocadas em placas de ágar tripticase de soja (Biomerieux item M1040) para enumeração de cfu. As placas foram incubadas a 30-35ºC por 1-2 dias até que as colônias estivessem de tamanho contável. Registraram-se as contagens de CFU.

[0169] A introdução de uma etapa de descontaminação antes de processar o pâncreas suíno provê controle eficaz de agentes infecciosos conhecidos tanto em termos de segurança do operador durante o isolamento de enzimas bem como a segurança do paciente. Assim o uso de um tratamento com feixe de elétrons que é eficaz para inativar um amplo espectro de micróbios e vírus, incluindo os vírus difíceis de inativar (por exemplo, parvovírus suíno) e bactérias formadoras de esporos, com perda mínima em atividade enzimática é vantajoso em relação a outros métodos.

[0170] Quando aqui usada, a etapa de radiação de feixe de elétrons pode ser considerada uma etapa de inativação viral ortogonal. A redução em carga microbiana e/ou viral obtida no tecido pancreático irradiado com feixe de elétrons transfere para a pancreatina que é isolada dele de maneira aditiva com respeito à redução obtida por outras etapas para redução microbiana e/ou viral. O logiw de mortalidade total atingido por todas as etapas, incluindo a radiação de feixe de elétrons, é o login de mortalidade cumulativo atingido por todas as etapas de inativação microbiana e/ou viral executadas no tecido pancreático.

[0171] Entenda-se que a descrição detalhada anterior e os exemplos de acompanhamento são meramente ilustrativos não devem ser considerados como limitativos da abrangência da invenção, que é definida apenas pelas reivindicações anexas e suas equivalentes. Várias “mudanças e modificações das incorporações divulgadas tornar-se-ão evidentes para os especialistas na técnica. Tais mudanças e modificações, incluindo sem limitação aquelas relativas às estruturas químicas, substituintes, derivados, intermediários, sínteses, formulações ou métodos, ou qualquer combinação de tais mudanças e modificações de uso da invenção, podem ser feitas sem se afastar do espírito e da abrangência da invenção.

[0172] Todas as referências (patentes e não patentes) citadas acima são incorporadas por referência neste pedido de patente. A discussão daquelas referências pretende meramente resumir as asserções feitas por seus autores. Não se admite que qualquer referência (ou parte de qualquer referência) seja técnica anterior relevante. O requerente se reserva o direito de contestar a precisão e a pertinência das referências citadas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Preparação de enzima produzida por um método, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) submeter o tecido pancreático de mamífero intacto a uma radiação de feixe de elétrons para produzir tecido pancreático irradiado, sendo que a radiação de feixe de elétrons é suficiente para produzir pelo menos uma redução de três login na carga viral de um vírus modelo em comparação com uma amostra de controle; e (b) isolar a pancreatina do tecido pancreático irradiado.

2. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a radiação de feixe de elétrons ser suficiente para produzir pelo menos uma redução de quatro logio na carga viral de um vírus modelo em comparação com uma amostra de controle.

3. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o vírus modelo ser parvovírus suíno (PPV).

4. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o tecido pancreático de mamífero intacto ser uma lâmina de tecido, uma glândula inteira ou uma porção de uma glândula inteira.

5. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a etapa (b) compreender iniciar hidrólise ou autólise do tecido pancreático irradiado ou ativar uma proenzima do tecido pancreático irradiado.

6. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de uma atividade biológica da preparação de enzima obtida na etapa (b) corresponder a pelo menos 80% da atividade biológica de uma preparação de enzima de controle.

7. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de a atividade biológica ser atividade de lipase.

8. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a radiação de feixe de elétrons ter uma dosagem de cerca de 5 a cerca de 50 kGy.

9. Preparação de enzima, caracterizada pelo fato de compreender uma ou mais enzimas isoladas de um tecido pancreático irradiado com feixe de elétrons.

10. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de o tecido pancreático irradiado com feixe de elétrons ser uma lâmina de tecido pancreático, pâncreas inteiro ou uma porção de pâncreas inteiro.

11. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de a uma ou mais enzimas compreenderem pancreatina.

12. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de uma atividade biológica da preparação de enzima corresponder a pelo menos 80% da atividade biológica de uma preparação de enzima de controle.

13. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de a atividade biológica ser atividade de lipase.

14. Método para produzir um produto de pancreatina, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) submeter o tecido pancreático de mamífero intacto a uma radiação de feixe de elétrons para produzir tecido pancreático irradiado; e (b) isolar a pancreatina do tecido pancreático irradiado.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de uma atividade biológica do produto de pancreatina obtido na etapa (b) corresponder a pelo menos 80% da atividade biológica de uma preparação de enzima de controle.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de a radiação de feixe de elétrons ser suficiente para produzir pelo menos uma redução de três logi na carga viral de um vírus modelo em comparação com uma amostra de controle, sendo que o vírus modelo é parvovírus suíno (PPV).

17. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de a radiação de feixe de elétrons ter uma dosagem de cerca de 5 a cerca de 50 kGy.

18. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de a atividade biológica ser atividade de lipase.

19. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender a preparação de enzima conforme definida pela reivindicação 1.

20. Método para tratar insuficiência pancreática exócrina, caracterizado pelo fato de compreender: administrar uma dose da preparação de enzima, conforme definida pela reivindicação 1, a um indivíduo necessitando da mesma.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de a insuficiência pancreática exócrina dever-se a fibrose cística ou pancreatite crônica.