KR20120100982A

KR20120100982A - 시그너처 펩티드 및 질량 분광법에 의해 혼합물에서 개별적인 재조합 단백질의 다중 정량

Info

Publication number: KR20120100982A
Application number: KR1020127011934A
Authority: KR
Inventors: 토르벤 프란드센; 헨리크 나에스테드; 제테 바그트베르그 젠; 페르닐레 포게드 옌센
Original assignee: 심포젠 에이/에스
Priority date: 2009-10-09
Filing date: 2010-10-07
Publication date: 2012-09-12
Also published as: ZA201202431B; AU2010305150A1; US20120264155A1; RU2012118620A; WO2011042027A3; CN102687020A; BR112012007815A2; EP2486411A2; WO2011042027A2; CA2776508A1; JP2013507603A; MX2012003538A; IN2012DN03911A; IL218821A0

Abstract

본 발명은 혈청 중의 재조합 폴리클로날 항체 또는 배양 상청액에서 발현된 재조합 폴리클로날 항체와 같은 복잡한 매트릭스에서 선택된 다수의 재조합 단백질을 정량하기 위한 분석적 방법에 관한 것이다.

Description

시그너처 펩티드 및 질량 분광법에 의해 혼합물에서 개별적인 재조합 단백질의 다중 정량{MULTIPLEX QUANTITATION OF INDIVIDUAL RECOMBINANT PROTEINS IN A MIXTURE BY SIGNATURE PEPTIDES AND MASS SPECTROMETRY}

본 출원에 인용된 모든 특허 및 비특허 참조문헌은 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.

본 발명은 혈청 중의 재조합 폴리클로날 항체 또는 배양 상청액에서 발현된 재조합 폴리클로날 항체와 같은 복잡한 샘플에서 선택된 다수의 재조합 단백질을 정량하는 분석적 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 질량 분광법에 의한 펩티드의 고감도 정량을 포함한다.

인간 혈청 또는 혈장에서와 같이 다양한 복잡한 단백질 샘플에서 재조합 단백질에 대한 정량적 검정에 대한 요구가 존재한다. 통상적으로 이러한 검정은 특이성과 같이 표적 단백질에 대해 특이적인 항체 및 검출 시약을 이용하는, 예컨대 ELISA와 같은 면역검정으로서 실행되었다.

특히 동위원소로 표지된 펩티드 또는 단백질의 내부 표준을 포함하는 신규한 방법은 질량 분광법이 그러한 정량적인 펩티드 및 단백질 검정을 제공할 수 있도록 한다. 내부 참조 펩티드를 이용한 질량 분광법에 의한 정량은 당 분야에 잘 기재되어 있다. 그러나, 여기에는 전체 혈장 단백질을 펩티드로 분해함에 의해 생성된 것들과 같은, 매우 복잡한 혼합물에 적용되는 경우 MS 검정의 감도 및 역동 범위(dynamic range)의 문제가 남아 있다. 역동 범위 및 감도와 관련된 문제는 내인성 바이오마커의 정량적 분석을 위해 MS와 함께 설비된 면역친화성의 발생에 의해 이전에 다루어진 적이 있다 [1-5].

본 발명은, 혈청 또는 혈장과 같은 복잡한 샘플 또는 배양 상청액으로부터 재조합 폴리클로날 항체와 같은 재조합 폴리클로날 단백질의 친화성 정제를 내부 참조 펩티드를 이용한 질량 분광법에 의한 정량과 조합시킨다. 본 발명은 친화성 정제 단계의 실행에 의해 감도의 개선을 제공한다.

본 발명에서 다루어진 또 다른 문제는 분석물의 통합성이다. 통상적으로, 펩티드에 기반하여 단백질을 정량하는 것은 완전한 단백질 외에 부분적으로 분해된 단백질이 정량될 가능성을 남긴다. 이것은 특히, 예컨대 약동학 프로필의 생성을 위해 생물학적 약제를 정량할 때 문제가 된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 초기 단백질 A 정제 단계는 항체 혼합물의 정량을 위해 실행된다. 단백질 A가 면역글로불린의 Fc 부분에 결합하고 그 뒤에 오는 정량이 CDR 영역으로부터 유래된 특이적 마커 펩티드에 기반하기 때문에, 실제로 완전한 항체가 정량되게 할 것이다.

본 발명에 따른 방법은 예컨대 ELISA에서와 같이 특이적인 항-이디오타입 항체를 필요로 하지 않으며 혈청에서 항체가 검출 및 정량되게 한다. 더욱이, 본 발명에 기재된 방법은 포괄적이다. 단지 적합한 시그너처 펩티드(signature peptide)만이 동정되고 MS에 의한 정량을 위해 확인되어야 한다. 심지어 더욱 큰 감도를 위해, 시그너처 펩티드에 대해 생성된 항체로 면역친화성 단계를 실행할 수 있다. 본 발명의 방법이 질량 분광법에 의한 독특한 펩티드의 검출을 포함하기 때문에, 항-시그너처 펩티드 항체의 고 특이성, 유일한 고 친화성의 요구가 없다.

ELISA에 비해 본 발명에 따른 방법의 또 다른 이점은 질량 분광 분석이 개선된 역동 범위를 생성한다는 것이다.

발명의 개요

본 발명은 약동학 연구에서 폴리클론성 및 고 처리량 분석을 특성화하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 샘플 중 하나 이상의 재조합 단백질을 정량하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은,

i) 친화성 정제에 의해 상기 하나 이상의 재조합 단백질을 농도-상승(up-concentration)시켜 제 1 분획을 수득하는 단계

ii) 상기 제 1 분획을 분해시켜 상기 재조합 단백질 각각에 대한 하나 이상의 특이적인 시그너처 펩티드를 제 2 분획내로 방출시키는 단계

iii) 상기 시그처너 펩티드 각각에 대한 하나 이상의 내부 참조 펩티드를 상기 제 1 분획 및/또는 상기 제 2 분획에 첨가시키는 단계

iv) 상기 시그너처 펩티드 및 상기 내부 참조 펩티드를 항-시그너처 펩티드 항체에 커플링된 수지를 이용하여 임의로 농도-상승시킨 후 상기 시그너처 펩티드 및 상기 내부 참조 펩티드를 방출시켜 제 3 분획을 수득하고/거나 상기 시그너처 펩티드 및 상기 내부 참조 펩티드를 샘플을 분획화할 수 있는 화학물질을 지니는 수지를 이용하여 임의로 농도-상승시킴으로써 대상 펩티드를 농도-상승시키는 단계

v) 상기 시그너처 펩티드를 질량 분광 분석에 의해 정량하는 단계를 포함한다.

상기 방법은 샘플 중 하나 이상의 단백질을 정량하는데 이용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 샘플 중 재조합 폴리클로날 항체와 같은 두 개 이상의 단백질을 정량하기 위해 이용된다. 샘플은 혈청 또는 혈장 샘플, 세포 배양액 또는 생물반응기 상청액 또는 처리 중에 있는 재조합 폴리클로날 항체 샘플일 수 있다. 상기 방법은 약동학 연구 동안 개별적인 항체의 생체내 청소를 측정하는데 이용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 재조합 폴리클로날 항체 샘플의 약물에서 폴리클론성을 특성화하는데 이용된다.

여전히 또 다른 구체예에서, 본 발명은 재조합 폴리클로날 항체의 제조와 관련하여 본 발명에 따른 하나 이상의 재조합 단백질을 정량하는 방법의 이용에 관한 것이다. 정량은 약제 및/또는 약물에 대한 업스트림 및/또는 다운스트림 가공 중에 수행될 수 있다.

본 발명의 중요한 특징은, 이것이 하나 이상의 샘플 중의 공지되지 않은 성분들 모두를 서로 비교하는 문제에 있다기보다, 선험적으로 선택된 특이적인 재조합 단백질에 대한 정량적 검정을 확립하는데 있다는 점이다. 본 발명에 따른 방법은 혈청 샘플 중 하나 이상의 동종 재조합 단백질을 분석하는데 이용될 수 있고, 이 때 상기 혈청 샘플은 다른 동종 단백질의 배경(background)을 포함한다.

본 발명의 방법은, 예컨대 ELISA 기반 기술에서와 같이 항-이디오타입 항체를 필요로 하지 않으면서, 예컨대 약동학 연구를 위해 혈청에서 폴리클로날 항체 조성물의 개별적인 항체의 분석을 촉진할 수 있다. 따라서, 재조합 폴리클로날 항체의 농도는 약동학에서와 같이 예컨대 투여 후 경과 시간에 따라 이를 필요로 하는 개체에서 측정되고/모니터링될 수 있다. 정제는 일 구체예에서 단백질 A 또는 유사한 Fc 결합 분자에 의해 수행되고 후속하는 정량은 바람직하게는 항체의 가변 도메인들 중 하나에서 펩티드의 측정에 의해 수행된다. 이것은 측정된 분석물이 분해 생성물이 아님을 보장하는데, 왜냐하면 분해 생성물은 Fc 및 Fab 둘 모두의 존재에 의존적이기 때문이다.

정의 및 약어

용어 '시그너처 펩티드(들)'는 샘플에서 주어진 단백질의 모니터(monitor) 단편/펩티드로서 선택된 하나 이상의 상이한 펩티드(들)를 의미한다.

용어 '내부 참조 펩티드'는 시그너처 펩티드와 동일한 아미노산 서열을 지니는 동위원소 표지된 펩티드를 의미한다. '내부 참조 펩티드'는 1) 적합한 결합제에 의해 시그너처 펩티드와 동등한 것으로 인지되거나 생물리적 성질에 의해 화학적으로 동등한 것으로 인지되고 2) 분자 질량의 직접 측정을 통해서나 단편의 질량 측정을 통해 (예컨대, MS/MS 분석을 통해) 또는 또 다른 동등한 수단에 의해, 질량 분광계에 위해 구별될 수 있는 방식으로 시그너처 펩티드와 상이해진 각각의 시그너처 펩티드의 어떠한 변경된 버젼일 수 있다.

용어 '항체'는 임의의 종의 면역글로불린 분자, 또는 그로부터 유래된 임의의 분자, 또는 분석물에 특이적으로 결합하도록 또는 재조합 단백질 및/또는 시그너처 펩티드와 같은 단편을 모니터링하도록 보존된 분자 스캐폴드의 변형에 의해 작제된 임의의 다른 특이적인 결합제의 부류 중 어느 것을 지칭한다.

용어 '항-펩티드 항체'는 '항-시그너처 펩티드 항체'와 동의어로 사용되며 이것은 샘플 또는 가공된 샘플로부터 풍부하게(enrichment) 할 목적으로 시그너처 펩티드 및 내부 참조 펩티드와 같은 펩티드에 결합하는 어떠한 유형의 항체 (전술한 일반적인 의미에서)일 수 있다. 일반적으로, 본원에서 항체로 수행된 임의의 이용은 애피바디(affibody) 또는 항체 모방체와 같은 또 다른 결합제에 의해서도 충족될 수 있었던 용도인 것으로 이해된다. 일 구체예에서, 펩티드에 대한 항-펩티드 항체의 결합은 그다지 특이적이지 않고 - 즉, 고 친화성 및/또는 결합성(avidity)은 일 구체예에서 더욱 중요하다.

용어 '결합제'는 다수의 상이한 분자, 생물학적 세포 또는 응집물 중 어느 것일 수 있다. 이와 관련하여, 결합제는 검출에 앞서 분석물을 풍부하게 하기 위해 검출하려는 분석물에 결합하고, 특수한 방식으로 분석물에 결합하는데, 이로 인해 하나 이상의 분석물이 결합되어 풍부하게 된다. 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산 (올리고누클레오티드 및 폴리누클레오티드), 항체, 리간드, 다당류, 미생물, 수용체, 항생제, 시험 화합물 (특히 조합 화학에 의해 생산된 것들)이 각각 결합제일 수 있다.

용어 '결합'은 영구적이거나 일시적일 수 있는 어떠한 물리적 부착 또는 근접 회합(close association)을 포함한다. 일반적으로 가역적인 결합은 대상 분자와 측정하려는 분석물간 물리적 부착을 촉진시키는 전하 상호작용, 수소 결합, 소수성 결합, 반 데르 발스 힘 등의 양태를 포함한다.

용어 "단백질"은 길이 또는 번역후 변형과 무관하게 아미노산의 임의의 사슬을 지칭한다. 단백질은 둘 이상의 어셈블링된 폴리펩티드 사슬, 단백질의 단편, 폴리펩티드, 올리고펩티드 또는 펩티드를 포함하는 단합체 또는 다합체로서 존재할 수 있다.

용어 "재조합 폴리클로날 항체"는 재조합 기술을 이용하여 제조된 재조합 항체 분자의 신중하게 선택된 조성물을 지칭한다. 본 발명은 특히 재조합 폴리클로날 항체 조성물의 특성화에 관한 것인데, 여기서 항체는 재조합 항체의 상업적인 생산에 일반적으로 사용되는 세포주, 예를 들어 상기 언급된 인간 또는 그 밖의 포유동물 세포주 중 하나를 이용하여 발현된다. 본 발명에 관해, 항체는, 그 코딩 서열이 공지되어 있는 경우, 즉 이것이 또한 하이브리도마 또는 무한증식 B-세포로부터 발현되는 경우 재조합으로 간주된다. 본 발명에 관해, 용어 "재조합 단백질"은 "재조합 폴리클로날 항체"를 포함한다.

재조합 폴리클로날 항체는 동일하거나 상이한 항원 상의 여러 상이한 특이적 항원성 결정인자에 결합하거나 이와 반응할 수 있는 상이한 항체 분자의 조성물을 의미한다. 폴리클로날 항체는 또한 "모노클로날 항체들의 칵테일"로서 고려될 수 있다. 폴리클로날 항체의 가변성은 폴리클로날 항체를 구성하는 개별적인 항체의 소위 가변 영역, 특히 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3에 있다. 본 발명의 방법에 의해 특성화될 수 있는 폴리클로날 항체는 키메라, 인간화 또는 완전히 인간인 임의의 기원의 것일 수 있다. 본 발명에 따른 재조합 폴리클로날 항체는 두 개 이상의 상이한 항체의 집단을 포함하는 것이 바람직하다.

용어 "폴리클론성"은 재조합 폴리클로날 단백질이 소정의 수의 단백질을 함유함으로써 통상적인 재조합 단백질 또는 모노클로날 항체와 달리 폴리클로날인 사실을 지칭한다. 상기 용어는 유전자 및 단백질 수준 둘 모두에서 폴리클론성을 기재하기 위해 사용될 수 있다. 재조합 폴리클로날 단백질의 가변성은 재조합 폴리클로날 단백질의 개별적인 구성원의 아미노산 서열에서의 차이를 특징으로 한다.

용어 "조성 가변성"은 최종 배치들의 실제량에 관해 측정된 개별적인 재조합 단백질 또는 항체의 가변성을 지칭한다.

용어 "면역글로불린"은 일반적으로 혈액 또는 혈청에서 발견된 항체 혼합물의 집합적 의미로서 사용된다. 따라서 혈청-유래 폴리클로날 항체는 종종 면역글로불린 또는 감마 글로불린이라고 불린다. 그러나, "면역글로불린"은 또한 기타 공급원으로부터 유래된 항체의 혼합물, 예컨대 재조합 면역글로불린을 가리키는데 사용될 수 있다. 특이성에 관계없이 모든 면역글로불린은 네 개의 폴리펩티드 사슬을 갖는 공통의 구조를 지닌다: 두 개의 동일한 중쇄로서, 각각이 발현 조건에 따라 공유적으로 부착된 올리고사카라이드 기를 잠재적으로 지니는 두 개의 동일한 중쇄; 및 두 개의 동일한 전형적으로 글리코실화되지 않은 경쇄. 디설파이드 결합은 중쇄와 경쇄를 함께 연결시킨다. 중쇄는 또한 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된다. 네 개 모두의 폴리펩티드 사슬은 각각 카르복실 및 아미노 말단에서 발견된 불변 영역 및 가변 영역을 함유한다.

면역글로불린은 이들의 중쇄 성분인 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE에 따라 5개의 주요 부류로 나뉜다. 두 유형의 경쇄인 κ(카파) 및 λ(람다)가 있다. 개별적인 분자는 카파 또는 람다를 함유할 수 있으나 둘 모두를 함유하지 않을 수 있다. IgG 및 IgA는 추가로 각 부류 내에서 아미노산 서열의 근소한 차이에서 비롯된 서브부류로 나뉜다. 인간에서 네 개의 IgG 서브부류인 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 발견된다. 마우스에서도 네 개의 IgG 서브부류가 발견된다: IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3. 세 개의 IgA 서브부류인 IgA1, IgA2 및 IgA3가 인간에 존재한다.

애피바디: 애피바디 분자는 다수의 표적 단백질에 특이적으로 결합하도록 공학처리될 수 있는 소형이며 강건한(robust) 고 친화성 단백질 분자이다.

MS는 질량 분광법이다.

MS/MS는 직렬 질량 분광법이다.

MRM은 다중 반응 모니터링, 또는 예컨대 SRM (단일/선택된 반응 모니터링)과 같은 이와 동등한 기술이다.

B-세포 수용체는 B-세포의 외부 표면 상에 위치한 막횡단 수용체 단백질이다. 수용체의 결합 모이어티(moiety)는, 모든 항체와 같이, 독특하고 랜덤하게 결정된 항원-결합 부위를 지니는 막-결합 항체를 포함한다.

T-세포 수용체 또는 TCR은, 일반적으로 주조직적합복합체 (MHC) 분자에 결합된 항원을 인지하도록 하는 T 림프구 (또는 T 세포)의 표면상에서 발견되는 분자이다. 이것은 T 세포의 95%에서 알파 및 베타 사슬로 구성된 헤테로이합체인 한편, T 세포의 5%는 감마 및 델타 사슬로 구성된 TCR을 지닌다.

도 1: A992 시그너처 펩티드 대 AQUA 펩티드의 피크 면적의 비를 블랭크 시노몰구스(Cynomolgus) 원숭이 혈장의 푸울에 스파이킹된(spiked) A992의 농도와 상호관련시킨 표준 곡선. 각각의 샘플에 대해 1 pmol의 A992 AQUA 펩티드를 첨가하였다. 각각의 농도에서의 비를 세 번 측정하였다. 데이터를 선형 회귀로 핏팅시켰고 점선은 최적-핏 선형 회귀에 대한 95% 신뢰 밴드를 나타낸다.
도 2: A1024 시그너처 펩티드 대 AQUA 펩티드의 피크 면적의 비를 블랭크 시노몰구스 원숭이 혈장의 푸울에 스파이킹된 A1024의 농도와 상호관련시킨 표준 곡선. 각각의 샘플에 대해 1 pmol의 A1024 AQUA 펩티드를 첨가하였다. 각각의 농도에서의 비를 세 번 측정하였다. 데이터를 선형 회귀로 핏팅시켰고 점선은 최적-핏 선형 회귀에 대한 95% 신뢰 밴드를 나타낸다.
도 3: 8mg/kg의 리드(lead) 약물을 투약한 시노몰구스 원숭이에서 A992 및 A1024의 혈장 농도-시간 곡선. A992 및 A1024의 농도를 리드 약물을 투여한 지 0.5 내지 48시간 후에 측정하였다.
도 4: 세 번 실시한, 0.2 ㎍/ml-100 ㎍/ml 범위의 표준 곡선 (하나의 가외치). 선형성 곡선은 스파이킹된 혈청 샘플에서의 항체 농도와 시그너처 펩티드/참조 펩티드의 상대 반응 사이의 관련성을 도시한다. 두 개의 항체가 동시에 측정된다. 상부 패널은 A992에 대한 표준 곡선이고 하부 패널은 A1024에 대한 표준 곡선이다.

본 발명은 혈청 중의 재조합 폴리클로날 항체 또는 세포 또는 조직 배양 상청액에서 발현된 재조합 폴리클로날 항체와 같은 복잡한 샘플에서 선택된 다수의 재조합 단백질을 정량하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 질량 분광법에 의한 펩티드의 고감도 정량을 포함한다.

ii) 상기 제 1 분획을 분해시켜 상기 재조합 단백질 각각에 대한 하나 이상의 특이적인 시그너처 펩티드를 제 2 분획내로 방출시키는 단계로서, 상기 제 1 분획의 환원 및/또는 알킬화가 분해에 앞서 임의로 수행될 수 있는 단계

iii) 상기 시그너처 펩티드 각각에 대한 하나 이상의 내부 참조 펩티드를 상기 제 1 분획 및/또는 상기 제 2 분획에 첨가시키는 단계

v) 상기 시그너처 펩티드를 질량 분광 분석에 의해 정량하는 단계

vi) 샘플 내로 스파이킹된 공지된 농도의 상응하는 단백질 제조물로 상기 단계 i) 내지 v)를 임의로 반복시켜 단백질 표준 곡선을 수득하는 단계

vii) 상기 단계 v)에서 수득된 상기 시그너처 펩티드의 양(quantitation)을 상기 단계 vi)에서 수득한 단백질 표준 곡선과 비교하고 상기 샘플 중 상기 하나 이상의 재조합 단백질의 정량을 달성하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 상기 샘플 중 상기 하나 이상의 재조합 단백질의 절대 정량을 초래한다.

바람직한 구체예에서, 본 발명은 상기 정의된 것과 동일한 단계 i) 내지 vi)를 포함하는, 샘플 중 두 개 이상의 재조합 단백질을 정량하는 방법에 관한 것이다.

단계 ii) 및 iii)은 특수한 적용에 유리할 경우 반대로 될 수 있다.

재조합 단백질의 농도-상승에 관한 단계 i)

상기 단계 i)은 하나 이상의 재조합 단백질의 농도-상승/풍부화(enrichment)를 위해 당 분야에 기재된 어떠한 방법을 포함할 수 있다 - 풍부해진 분획은 제 1 분획이라 불린다. 일 구체예에서, 농도-상승/풍부화는 완전한 단백질, 예컨대 완전한 재조합 폴리클로날 항체와 같은 완전한 재조합 단백질을 포획한다.

친화성 크로마토그래피에 의한 분리는 특이적인 결합 분자를 향한 친화성의 차이에 기반한다. 결합 분자 및 다수의 이러한 것들을 (이러한 상이한 옵션은 아래에서 단지 결합 분자로 명명된다) 크로마토그래피 매질에 고정하고, 재조합 단백질을 함유하는 샘플을 개별적인 구성원과 고정된 결합 분자간 상호작용을 촉진하는 조건하에 친화성 컬럼에 적용시킨다. 고정된 결합 분자에 대해 친화성을 보이지 않는 단백질을 컬럼 플로우-쓰루(flow-through)에서 수집하고, 고정된 결합 분자에 대해 친화성을 보이는 단백질을 후속하여 결합을 방해하는 조건하에 (예컨대, 낮은 pH, 높은 염 농도 또는 높은 리간드 농도) 컬럼으로부터 용리시킨다.

농도-상승/풍부화는 단백질 A에 의해 수행될 수 있다. 단백질 A를 지지체 상에 고정시키고 혈청과 같은 미정제 단백질 혼합물로부터 전체 IgG의 정제에 이용할 수 있다. 단백질 A는 높은 친화성으로 인간 IgG1 및 IgG2 뿐만 아니라 마우스 IgG2a 및 IgG2b에 결합한다. 단백질 A는 중간 친화성으로 인간 IgM, IgA 및 IgE 뿐만 아니라 마우스 IgG3 및 IgG1에 결합한다. 단백질 A는 또한 원숭이를 포함하는 다른 동물로부터 항체를 정제하는데 이용될 수 있다. 단백질 A의 하나의 재조합 형태를 MabSelect SuRe라고 부른다. 일 구체예에서, 아가로스 비드에 고정된 스타필로코커스(Staphylococcal) 단백질 A로 구성된 매트릭스 상에서의 친화성 크로마토그래피를 단계 i)에 이용한다. 대안으로는 단백질 A-SEPHAROSE, 아가로스에 고정된 단백질 A, 활성화 아르기닌-아가로스에 커플링된 단백질 A, 및 자석, 라텍스 및 아가로스 비드, 폴리머 비드, 폴리스티렌 비드 및 PEG 비드에 커플링된 단백질 A가 있다.

단백질 A 외에, 예컨대 단백질 G, 단백질 A/G 및 단백질 L과 같이 면역글로불린 결합성 박테리아 단백질과 같은 그 밖의 면역글로불린 결합성 단백질을 상기 단계 i)에 이용할 수 있다. 이러한 면역글로불린 결합성 단백질 각각은 인지되는 항체의 부분 및 이것이 결합될 항체의 종 및 유형에 관해 상이한 항체 결합 프로필을 지닌다. 본 발명은 또한 다른 종에서 생성된 그러한 스트렙토코커스 단백질 G, 토끼 항-마우스 IgG 면역글로불린, 항-인간 IgG 면역글로불린 및 항-원숭이 IgG 면역글로불린과 같은, 다른 면역글로불린-결합 단백질의 이용에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 단계 i)에서 그 밖의 친화성 기반 정제 방법의 이용에 관한 것이다. 이들은 항체용 임의의 표적, Fc 수용체, Con A (예컨대, 카나발리아 엔시포르미스(Canavalia ensiformis)로부터의 콘카나발린(Concanavalin) A (Jack bean); 당단백질 인지), 다른 유형의 렉틴 친화성 크로마토그래피, 항체의 가변 부분에 대한 항체 또는 FC 부분과 같은 항체의 불변 부분에 대한 항체를 포함한다. 자석 비드 상의 항체를 또한 상기 단계 i)에 이용할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 재생 면역친화성을 상기 단계 i)에 이용한다.

또 다른 구체예에서, 단계 i)는 하나 이상의 펩티드와 커플링된 수지 및/또는 컬럼 또는 하나 이상의 재조합 폴리클로날 항체와 같은 재조합 단백질 중 하나 이상에 의해 인지된 표적 항원을 이용하여 하나 이상의 항체를 정제하는 것을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 하나 이상의 단백질의 정제는 결합된 표적 항원과의 상호작용을 통해서일 수 있다.

단계 i)에서 단백질 A에 의한 풍부화와 같은 초기 농도-상승 단계는 96웰 포맷과 같은 배치 포맷 또는 다차원 LC-MS 시스템의 일부로서 수행될 수 있다. 대안적으로, 이것은 오프 라인 배치식(off line batch wise)으로 수행될 수 있다.

환원, 알킬화 및 분해에 관한 단계 ii )

단계 i)에서의 초기 농도-상승 이후에, 제 1 분획을 선택된 프로테아제로 분해시켜 정량되는 각각의 단백질로부터의 하나 이상의 특이적인 시그너처 펩티드를 제 2 분획내로 방출시킨다. 일 구체예에서, 제 1 분획을 분해에 앞서 환원시키고 알킬화한다. 제 2 분획은 시그너처 펩티드 및 프로테아제에 의해 방출된 그 밖의 펩티드를 포함한다. 상기 제 1 및/또는 제 2 분획의 환원, 알킬화 및 분해는 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 펩티드는 예컨대 디티오트레이톨 (DTT)을 이용하여 환원될 수 있고, 후속하여, 예컨대 4-비닐피리딘, 요오도 아세트아미드 또는 요오도아세트산으로 알킬화될 수 있다.

당업자가 하나 이상의 선택된 재조합 단백질(들)을 측정하길 원하는 제 1 분획은, 재현가능한 방식으로 수행될 수 있는 경우, 트립신과 같은 적합한 프로테아제로 바람직하게는 본질적으로 완전히 분해되거나 부분적으로 분해되어 펩티드를 생성한다 (선택된 시그너처 펩티드(들) 포함). 서열이 재조합 단백질 서열에 한 차례 나타나는 시그너처 펩티드의 경우, 제 1 분획에 재조합 단백질 분자가 존재하였기 때문에, 이러한 분해는 이론적으로는 동일한 수의 시그너처 펩티드 분자를 생성하여야 한다.

분해는, 먼저 단백질 샘플을 변성시키고 (예컨대, 우레아 또는 구아니딘 HCl 이용), 단백질에서 디설파이드 결합을 환원시키고 (예컨대, 디티오트레이톨 또는 메르캅토에탄올 이용), 시스테인을 알킬화하고 (예컨대, 요오도아세트아미드의 첨가에 의해), 마지막으로 (변성제의 제거 또는 희석 후에) 트립신과 같은 선택된 단백질분해 효소를 첨가시킨 후 분해가 가능하도록 인큐베이션함에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 변성은 단백질의 화학적 변형을 일으키지 않는다. 변성은 MS 상용가능한 하나 이상의 세척제를 이용하여 수행될 수 있다. 일 구체예에서, RapiGest™ SF 계면활성제 (Waters)를 이용하여 단백질의 효소적 분해를 향상시키고 환원 및 알킬화 동안 변성제로서의 우레아 또는 구아니딘 HCl을 대신한다.

인큐베이션 후에, 화학적 억제제 (예컨대, DFP 또는 PMSF)의 첨가에 의해서나 변성에 의해 (열 또는 변성제의 첨가, 또는 둘 모두에 의해), 산성화, 또는 트립신과 같은 프로테아제의 제거에 의해 (트립신과 같은 프로테아제가 솔리드 지지체 상에 있는 경우), 프로테아제 (예컨대, 트립신)의 작용이 종료된다. 프로테아제 활성의 파괴는, 샘플 중 잔류하는 단백질분해 활성에 의한 추후 항체 손상을 피하기 위해 중요하다.

분해는 트립신, 키모트립신, Asp-N, Glu-C, Lys-C, lys-N 및 Arg-C (참고, 하기 본원의 표에 기재된 프로테아제의 특이성)을 포함하는 임의의 프로테아제에 의해 수행될 수 있다. 하나를 초과하는 프로테아제, 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 초과의 프로테아제를 이용할 수 있다.

일 구체예에서, 분해는 화학적 분해(degradation)에 의해 수행될 수 있다.

내부 참조 펩티드에 관한 단계 iii )

안정한 동위원소(들)로 표지된 선택된 시그너처 펩티드(들)의 버젼을 합성하는데, 여기서 화학적 구조는 유지되지만 하나 이상의 원자를 동위원소로 치환시켜 MS 분석이 표지된 펩티드를 보통의 펩티드 (천연적으로 풍부한 각각의 원소 동위원소 함유)로부터 구별할 수 있게 한다. 이렇게 동위원소로 표지된 펩티드를 내부 참조 펩티드라고 부른다.

환원, 알킬화 및 분해 이전 및/또는 이후에, 안정한 동위원소로 표지된 시그너처 펩티드 각각에 대한 내부 참조 펩티드를 정량을 위해 상기 제 1 및/또는 제 2 분획에 첨가시켜 이후의 절대 정량을 가능하게 한다. 표지된 펩티드를 공지된 농도로 첨가하기 때문에, 최종 MS 분석에 의해 검출된 표지된 내부 참조 펩티드와 천연 시그너처 펩티드의 양 사이의 비율로부터 샘플 혼합물 중 시그너처 펩티드의 농도를 계산할 수 있다.

적어도 세 개의 적합한 동위원소 (¹³C, ^l5N, ¹⁸O)가 고도로 풍부해진 (> 98원자%) 적합한 형태로 시판된다. ¹³C-표지된, ^l5N-표지된, 또는 ¹⁸O-표지된 내부 참조 펩티드의 생성을 위해 이들을 이용할 수 있다.

안정한 동위원소 표지는 '회수-후(post-harvest)'와 같은 당 분야에 기재된 어떠한 방법에 의해, 화학적 접근법에 의해 또는 살아 있는 세포에서 대사성 혼입을 통해 혼입될 수 있다. 이러한 동위원소 조작은 질량 스펙트럼으로부터 [6] 또는 MRM에 의한 직접 정량을 촉진시킨다. 바람직하게는, 안정한 동위원소 표지화는 화학적 합성에 의해 수행되어 하나의 거대 아미노산을 포함하는 내부 참조 펩티드를 생성시킨다.

바람직한 구체예에서, 내부 참조 펩티드 중 하나의 아미노산이 표지된다. 바람직하게는, 하나의 표지된 아미노산 리신 또는 아르기닌이고, 표지되는 아미노산은 MRM정량을 위한 적합한 전이 단편에서 나타나야 한다. 내부 참조 펩티드는 바람직하게는 펩티드의 잘 특성화된 동종 제조물이다.

동위원소에 의해 표지된 내부 참조 펩티드의 측정된 분취량은 그 후 일 구체예에서 고정된 양의 분해된 샘플 펩티드 혼합물의 측정된 분취량에 첨가된다. 이러한 첨가 이후에, 선택된 펩티드(들)가 샘플에 두 형태로 존재할 것이다 (천연 시그너처 펩티드 및 동위원소에 의해 표지된 내부 참조 펩티드). 동위원소에 의해 표지된 버젼의 농도는 첨가된 양 및 공지된 분취량 용적에 기반하여 정확하게 알려진다. 동위원소에 의해 표지된 내부 참조 펩티드의 분취량은 대안적으로 샘플의 분해 이전에 첨가될 수 있다.

일 구체예에서, 동위원소에 의해 표지된 내부 참조 펩티드(들)의 하나의 농도를 선택하고 상이한 양의 시그너처 펩티드(들)의 분석에 의해 표준 곡선을 생성한다 - 즉, 동위원소에 의해 표지된 내부 참조 펩티드의 농도는 모든 샘플에서 동일한 반면, 시그너처 펩티드(들)의 농도는 표준 곡선에서 변화되는데, 그 이유는 시그너처 펩티드의 농도가 분석되는 샘플에서 변화될 것으로 예상되기 때문이다. 동윈원소에 의해 표지된 내부 참조 펩티드(들)의 농도는 바람직하게는 예상되는 측정 영역의 중간에 있다 - 즉, 동위원소에 의해 표지된 내부 참조 펩티드(들)의 농도는 바람직하게는 상이한 샘플에서 시그너처 펩티드의 측정된 가장 낮은 농도와 가장 높은 농도의 대략 평균이다.

시그너처 및 내부 참조 펩티드의 농도-상승에 관한 단계 iv )

시그너처 펩티드 및 내부 참조 펩티드의 푸울(pool)을 후속하여, 예컨대 토끼에서 생성된 항-시그너처 펩티드 항체와 커플링된 수지를 이용하여 농도-상승시킬 수 있다. 이어서 시그너처 펩티드의 푸울을 방출시킨다 (이러한 분획을 제 3 분획이라고 부른다). 대안적으로, 시그너처 및 참조 펩티드를 음이온 교환, 양이온 교환, 소수성 상호작용, 역상, 친수성 상호작용, 크기 배제 및 그 밖의 분리 원리와 같은 공지된 분리 기술의 임의의 광범한 선택을 이용한 미정제 분획화에 의해 농도상승시킬 수 있다. 단게 iv)는 임의적이다.

항-시그너처 펩티드 항체를 이용하기 위해, 항-시그너처 펩티드 항체의 제조물 (폴리클로날 또는 모로클로날이든지, 또는 임의의 동등한 특이적인 결합제이든지 간에)을 포획을 위해 이용함으로써 특이적인 시그너처 펩티드 (복잡한 단백질 샘플의 단백질분해물에서 정량하려는 단백질의 특이적인 펩티드 단편) 및 내부 참조 펩티드 (안정한 동위원소 표지를 포함하지만 동일한 화학적 구조)를 풍부하게 한다.

상기 단계 iv)의 농도상승 단계는 96웰 포맷 또는 다차원 LC-MS 시스템의 일부로서 수행될 수 있다. 펩티드의 농도-상승은 오프라인으로 수행될 수 있고, 용리액을 농축시킨 다음, C18 모세관 컬럼에 적용시키는데, 용리액은 상기 컬럼으로부터 ESI 공급원으로 용리된다. 대안적으로, 펩티드의 농도-상승으로부터의 용리액은 ESI 공급원으로 직접 용리될 수 있다.

농도상승은 선택된 분리 특이성에 상응하는 화학물질을 지니거나, 항-시그너처 펩티드 항체에 커플링된 자석 비드에 의해 수행될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 면역친화성을 재생시키는 것 - 즉, 항-시그너처 펩티드 항체 수지의 재생을 이용할 수 있다.

본 발명은 또한 시그너처 펩티드의 풍부화를 위한 RNA 앱타머, 펩티드 앱타머, 애피바디 등과 같은 항체 이외의 펩티드-결합제의 이용에 관한 것이다.

펩티드 혼합물은 시그너처 펩티드(들)의 생물리적 성질에 적합한 분리 기술을 이용하여 대충 분획화된다. 분리는 동일한 화학물질을 공유하는 시그너처 펩티드 및 참조 펩티드를 함유하는 분획의 결합을 포함하거나, 대안적으로 플로우-쓰루가 시그너처 펩티드 및 참조 펩티드를 함유할 것이다. 수지 상에 유지된 시그너처 및 참조 펩티드의 경우, 이들은 선택된 매트릭스 및 펩티드의 화학물질에 적합한 용리액에 의해 용리될 것이다.

대안적으로 펩티드 혼합물을 펩티드-특이적인 친화성 포획제에 노출시키며, 상기 포획제는 선택된 펩티드에 우선적으로 결합하지만 표지된 형태와 표지되지 않은 형태를 구별하지 않는다 (동위원소 치환이 항체 결합 친화성에 아무런 영향을 주지 않을 것으로 예상되므로). 펩티드-특이적인 친화성 포획은 다음과 같이 수행될 수 있다. 세척 단계 (예컨대, 포스페이트-완충된 염수 이용) 이후에, 결합된 펩티드를 MS 분석을 위해 용리시킨다 (예컨대, 10% 아세트산, 또는 물과 아세토니트릴의 혼합물 이용). 친화성 지지체는, 요망되는 경우, 또 다른 샘플을 위한 제조에서 재순환될 수 있다. 구상된 고-처리량 검정 적용에서, 고정된 항체 결합물은 수 천번은 아니더라도 수 백번 재순환되는 것이 바람직할 것이다.

풍부화 단계는 샘플 중 예컨대 풍부도(abundance)가 낮은 단백질로부터 유래된, 예컨대 풍부도가 낮은 펩티드의 풍부화 및 농축을 가능하게 한다. 일 구체예에서, 이러한 풍부화 공정은 단지 모니터 펩티드 (즉, 시그너처 펩티드 및 내부 참조 펩티드)를 MS로 전달하며, 이의 검출을 전체 샘플 분해물에 존재하는 잠재적으로 훨씬 더 많이 풍부한 펩티드인 그 밖의 다수의 배경에 대해 모니터 단백질을 검출하는 문제가 아니라, 절대 MS 감도의 문제로 만든다. 이러한 접근법은 샘플 및 이의 분해물 중 풍부도가 높은 다른 단백질 및 펩티드의 존재하에 MS 검출기의 검출 감도 및 역동 범위를 효과적으로 연장시킨다. 바람직한 구체예에서 - 예컨대, MS 방법이 MRM 또는 추출된 이온 크로마토그램을 포함할 때 - 풍부화 공정은 반드시 모니터 펩티드만이 MS로 전달되도록 하는 것이 아니라 오히려 펩티드의 혼합물이 전달되게 한다 (여기서 모니터 펩티드의 농도는 풍부화 공정 이전의 모니터 펩티드의 농도에 비해 증가되었다). 일 구체예에서, 풍부화 공정은 5배 내지 100배, 예컨대 5-10배, 예를 들어 10-15배, 예컨대 15-20배, 예를 들어 20-25배, 예컨대 25-30배, 예를 들어 30-35배, 예컨대 35-40배, 예를 들어 40-45배, 예컨대 45-50배, 예를 들어 50-55배, 예컨대 55-60배, 예를 들어 60-65배, 예컨대 65-70배, 예를 들어 70-75배, 예컨대 75-80배, 예를 들어 80-85배, 예컨대 85-90배, 예를 들어 90-95배, 예컨대 95-100배로 모니터 펩티드 농도를 증가시킨다.

정량적 질량 분광법에 관한 단계 v)

질량 분광 (MS) 분석은 단백질의 구조적 특성화를 위한 필수적인 도구이다. 질량 분광 측정은 이온화된 분석물 상에서 가스상으로 수행된다. 자명하게는, 질량 분광계는 이온원, 이온화된 분석물의 질량-대-전하 비(m/z)를 측정하는 질량 분석기, 및 각각의 m/z 값에서 이온의 수를 기록하는 검출기로 구성된다. 전자분무 이온화 (ESI) 및 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 (MALDI)는 MS 분석을 위해 단백질 또는 펩티드를 기화시키고 이온화하는데 가장 일반적으로 이용되는 두 개의 기술이다. ESI는 용액 중의 분석물을 이온화시키므로 액체-기반 (예를 들어, 크로마토그래피 및 전기영동) 분리 도구에 용이하게 커플링된다. MALDI는 레이저 펄스를 통해 건조 결정질 매트릭스 밖으로 샘플을 승화시키고 이온화한다. MALDI-MS는 일반적으로 비교적 단순한 펩티드 혼합물을 분석하는데 이용되는데 반해, 통합된 액체-크로마토그래피 ESI-MS 시스템 (LC-MS)은 복잡한 샘플을 분석하기에 바람직하다. 질량 분석기는 이 기술의 중심이며 이의 중요한 파라메터는 감도, 해상도, 질량 정확도 및 펩티드 단편으로부터 정보가 많은 이온 질량 스펙트럼 (MS/MS 스펙트럼)을 생성하는 능력이다. 적어도 네 개의 기본적인 유형의 질량 분석기가 존재한다. 이에는 이온-트랩, 타임-오브-플라이트(TOF), 4중극 및 푸리에(Fourier) 트랜스폼 이온 시클로트론(FT-MS) 분석기가 있다. 이들은 설계 및 성능에 있어서 매우 상이하며, 각각은 고유의 장점 및 단점을 지닌다. 이러한 분석기들은 단독으로 유효할 수 있으나, 일부 경우에 각 장점에 편승하기 위해 직렬로 구성된다 (보다 상세하게는, [8-9] 참조).

MALDI- 및 EIS-MS 둘 모두에서, 존재하는 분석물의 양과 측정된 신호 세기 사이의 관련성은 복잡하며 완전히 이해되지 않는다. 질량 분광계는 따라서 본래 불충분한 정량적 장치이다. 프로테오믹 분야에서 정량적 MS 데이터를 얻기 위해 안정한 동위원소 단백질 표지화 방법이 개발되어 왔다. 이러한 방법들은 다양한 안정한 동위원소 조성물의 화학적으로 동일한 펩티드 쌍이 이들의 질량 차이로 인해 질량 분광계에서 구별될 수 있고 이러한 펩티드 쌍에 대한 신호 세기들의 비가 정확하게 두 펩티드에 대한 풍부도(abundance) 비를 나타낸다는 사실을 이용한다. ESI-MS 동안, 펩티드는 LC-MS 진행 동안 공-용리되는 다른 분석물에 의해 이온-억제된다. 따라서 참조 펩티드가 시그너처 펩티드/분석물과 공-용리되는 경우 정량되는 것은 단지 고체이므로 동일한 정도의 이온 억제가 가해진다. 동일한 화학적 조성을 지니며 단지 질량만이 동위원소의 혼입으로 인해 상이해진 참조 펩티드의 경우, 참조 및 시그너처 펩티드의 공-용리가 보장된다. 따라서, 원래 샘플 중 상응하는 단백질의 상대적인 풍부도가, 시그너처 펩티드 대 내부 참조 비를 시그너처 펩티드의 절대 농도와 관련시킨 표준 곡선을 이용하여 결정될 수 있다. 안정한 동위원소 태그가 i) 대사성 표지화, ii) 효소적으로, 또는 iii) 화학적 반응을 통해 단백질에 도입될 수 있다. 현재, 단백질 또는 펩티드의 화학적 동위원소-태깅이 가장 많이 사용되는 방법이다 (보다 상세하게는, [8] 참조). 일 구체예에서, 예컨대 Sigma Aldrich로부터의 AQUA 펩티드와 같은 하나의 잘-정의된 순수한 거대 아미노산을 포함하는 펩티드가 사용될 수 있다.

본 발명에 기재된 방법에 따른 상기 제 2 또는 제 3 분획의 시그너처 펩티드가 정량적 질량 분광법에 의해 정량된다. 적합한 질량 분광계내로 용리시에, 시그너처 펩티드 (유래 샘플) 및 참조 (표지된 동위원소) 펩티드가 정량되고, 이들의 측정된 풍부도 비가 초기 샘플에서 시그너처 펩티드 및 이의 부모 단백질의 풍부도를 계산하는데 사용된다. 실질적인 정량을 수행하는 한 가지 방법은 전체 스펙트럼을 얻은 다음 참조 펩티드를 포함하는 측정하려는 펩티드로부터의 이온 전류를 추출하는 것이고, 유래된 추출된 이온 전류를 피크의 적분에 의해 정량적 측정치로서 이용한다. 이러한 기술에서, 펩티드를 분석할 수 있는 임의의 전자분무 질량 분광계를 이용할 수 있다. 대안적으로 그리고 바람직하게는, 다중 반응 모니터링(MRM)을 이용할 수 있다. 비록 다른 기계도 MRM-유사 성질을 갖는 실험을 수행할 수 있지만 이러한 기술은 전형적으로 삼중 4중극 또는 동등한 기계를 필요로 한다.

삼중 4중극 (/선형 이온 트랩) 기계를 이용한 다중 반응 모니터링 (MRM)에서, 4중극 1 (Q1)은 충돌 챔버로 들어가는 별개의 전구체 질량을 위해 배치된다. 모든 단편이 제 3의 4중극 (Q3)을 통해 스캐닝되는 생성물 이온 스캐닝과 대조적으로, Q3은 하나 이상의 별개의 단편 질량에 대해 일정하게 배치된다. 이러한 방식으로 전이 Q1 내지 Q3을 모니터링한다. 신호는 고도로 특이적이므로 매우 복잡한 혼합물에서 별개의 단백질/펩티드를 검출하는데 이용된다. 더욱이, 이의 세기는 전형적으로 5배를 넘는 크기로 샘플 양에 비례한다. 따라서 이러한 기술은 광범한 역동 범위에 걸쳐 매우 특이적이고 민감한 다중 정량적 방법을 가능하게 한다. 본 발명은 일 구체예에서 삼중 4중극 기계 등을 이용한 MRM에 기반한 MS 방법의 이용에 관한 것이다.

일반적인 접근법은 서열-기반 동정을 실시하기 위해 질량 분광계에서 추가로 단편화될 수 있는 (MS/MS) 펩티드로 단백질을 분해시키는 것 (예컨대, 트립신 이용)을 포함한다. 상기 접근법은, 예컨대 전자분무 이온화 (ESI)로 이용될 수 있고, 질량 분광계에 도입된 펩티드의 복잡성을 감소시키기 위해 하나 이상의 차원의 크로마토그래피 분획화 후에 적용될 수 있다. 설정된 질량 분광법은 질량 분광법과 조합된 단일 차원 LC 분리, 예컨대 극도로 높은 해상도의 푸리에-트랜스폼 이온 시클로트론 공명 (FTICR) MS와 조합된 LC 분리일 수 있다. 설정된 대안적인 MS는 ESI-MS/MS 또는 MALDI-MS/MS를 능가하는 단일 LC 분리이다. ESI-MS/MS 또는 MALDI-MS/MS와 같이 두 개의 크로마토그래피 분리를 또한 MS와 조합시킬 수 있다. 제 2 또는 제 3 분획이 또한 역상 기반 LC-MS에 의해 분리될 수 있고 예컨대 추출된 이온 크로마토그램 또는 다중 반응 모니터링(MRM)과 같은 적합한 MS 기술을 이용하여 정량될 수 있다. 그 밖의 MS 기반 방법을 또한 절대 정량, 예컨대 MALDI-PSD 또는 이온 트랩 기반 방법을 위해 이용할 수 있다.

일 구체예에서, 전술한 단계에서 풍부해진 선택된 펩티드(들) (시그너처 펩티드(들) 및 동위원소에 의해 표지된 내부 참조 펩티드(들) 포함)를 바람직하게는 전자분무 이온화에 의해 질량 분광계의 입구로 전달한다. 구체예에서, 펩티드(들)는 용리 완충제 (예컨대, 10% 아세트산)에서 질량 분광계로 직접 도입된다. 바람직하게는 펩티드(들)를 역상 (예컨대, C-18 또는 등가물) 컬럼에 적용하고 (예컨대 물 중 아세토니트릴/트리플루오로아세트산의) 구배에 의해 질량 분광계의 전자분무원(즉, LC/MS)으로 용리시킨다.

질량 분광계는 이온 트랩, 삼중 4중극, ESI-TOF, TOF, Q-TOF, Orbitrap 타입 기계, 또는 적합한 질량 분석과 감도의 어떠한 다른 기계일 수 있다. 바람직하게는, 삼중 4중극 기반 기계를 이용한다.

표지되고 표지되지 않은 펩티드의 양 사이의 비율을 계산하고, 즉 시그너처 펩티드를 내부 참조 펩티드와 비교한다. 첨가된 표지된 펩티드의 양이 알려져 있기 때문에, 샘플 분해물로부터 유래된 시그너처 펩티드의 양이 그 후 표준 곡선으로부터 계산될 수 있다.

단백질 표준 곡선의 생성 및 단백질의 정량에 관한 단계 vi )

항체 표준 곡선 (예컨대, 재조합 폴리클로날 항체 표준 곡선)과 같은 단백질 표준 곡선을 혈청 샘플과 같은 블랭크 샘플 내로 스파이킹된 공지된 농도의 상응하는 단백질 (항체/재조합 폴리클로날 항체) 제조물로부터 획득할 수 있다. 상기 단백질 (항체/재조합 폴리클로날 항체)을 스파이킹된 샘플로부터 정제하고 실제 샘플과 동일한 절차를 이용하여 분석한다 - 즉, 모든 샘플에 첨가된 고정량의 참조 펩티드를 포함시킨 상기 본원의 단계 i) 내지 v) 이용. 따라서 표준 곡선은 시그너처 펩티드의 농도에 대한 상대 신호 (참조 펩티드에 대한 시그너처 펩티드)에 관한 것이다.

시그너처 펩티드의 선택

본 발명의 중요한 특징은, 이것이 두 개 이상의 샘플 중의 공지되지 않은 성분들 모두를 서로 비교하는 문제에 있다기보다, 선험적으로 선택된 특이적인 재조합 단백질에 대한 정량적 검정을 확립하는데 있다는 점이다.

재조합 단백질의 공지된 서열을 이용하여, 그 안에서 하나 이상의 펩티드 세그먼트를 '시그너처 펩티드'로서 선택한다. 양호한 시그너처 펩티드는, 비록 요망되는 효소를 이용한 절단에서 비롯된 어떠한 펩티드도 가능한 선택이긴 하지만, 바람직하게는 고수율로 화학적으로 합성될 수 있고, 적절한 질량 분광계에서 정량적으로 검출될 수 있으며, 항원으로서 이용시에 항체를 유도하는 펩티드를 선택하도록 설계된 한 세트의 기준에 의해 정의될 수 있다. 일 구체예에서, 시그너처 펩티드를 선택하기 위해 하기 기준 중 하나 이상을 이용할 수 있다:

a) 펩티드는 요망되는 단백질분해 효소 (예컨대, 트립신)를 이용한 단백질의 절단에서 비롯된 서열을 지닌다. 모든 후보 트립신분해(tryptic) 펩티드는 일반적으로 이용가능한 소프트웨어를 적용시켜 단백질 서열로부터 용이하게 계산될 수 있다.

b) 펩티드는 바람직하게는 중간 소수성이고, 효소적 분해 및 친화성 크로마토그래피에 이용된 통상적인 용매에서 가용성이어야 하나, 탈염을 위한 C-18 또는 동등한 컬럼 상에 유지될 정도로 충분히 소수성이어야 한다.

c) 펩티드는 바람직하게는 전자분무 (ESI) 또는 또 다른 유형의 이온화에 의해 잘 이온화되어야 한다. 이러한 특징은 소프트웨어 프로그램에 의해 추정되거나 펩티드가 가장 높은 상대 풍부도로 검출될지를 알기 위한 대상 단백질 분해물의 MS 분석에 의해 실험적으로 결정될 수 있다.

d) 항-시그너처 펩티드 항체를 이용하는 경우, 펩티드는 바람직하게는 항-시그너처 펩티드 항체가 생성될 종에서 면역원성이어야 한다. 면역원성은 친수성이고; 이차 구조 예측 소프트웨어에 의해 예측된 굴곡(bend)을 포함하며; 글리코실화 부위를 포함하지 않고; 길이가 10-20개 아미노산, 예컨대 바람직하게는 10-15개 아미노산인 펩티드의 경우에 일반적으로 양호하다.

e) 검정이 PK에 대해 개발된 경우, 펩티드는 바람직하게는 인간 표적 유기체와 같은 표적 유기체의 임의의 다른 단백질과 뚜렷한 상동성을 공유하지 않아야 한다 (예를 들어 BLAST 서열 비교 프로그램에 의해 측정하는 경우). 이러한 특징으로부터 표적 이외의 단백질에서 생긴 펩티드로부터의 어떠한 방해를 항체 포획 단계에서 감소시키기 쉬울 것이다. 방해하는 펩티드의 존재는 또한 실험적으로 검사되어야 한다.

f) 펩티드는 바람직하게는 화학적 반응 잔기 (트립토판, 메티오닌, 시스테인), 또는 화학적 불안정 서열 (Asp-Gly, N-term Gln, N-term Asn)을 함유하지 않는다.

g) 펩티드는 바람직하게는 화학적으로 안정하다.

h) 펩티드는 바람직하게는 실험 동안 응집되지 않고/거나 바람직하게는 하나 이상의 요망되지 않는 표면에 부착하지 않는다.

표적 단백질로부터 유래된 모든 가능한 펩티드를 이러한 기준에 따라 용이하게 평가할 수 있고 방법의 요건에 가장 일치하는 하나 이상의 펩티드를 선택할 수 있다.

바람직하게는, 펩티드는 실험 데이터에 기반하여 - 예컨대, 펩티드 맵의 분석으로부터 선택된다.

항-펩티드 항체의 생성

항-펩티드 항체의 생산을 위해 동물을 면역시키기 위해, 펩티드를 담체 단백질 (예컨대, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH); 인간 단백질과 동일하지 않음)에 커플링하고 항-펩티드 항체를 효과적으로 생성하는 공지된 프로토콜 중 하나에 의해 동물 (예컨대, 토끼, 닭, 염소 또는 양)을 면역시키는데 이용한다. 편의상, 면역화 및 항체 정제에 사용된 펩티드는 바람직하게는 시그너처 펩티드 서열 (본원에서 생략하여 시그너처)에 첨가된 추가의 c-말단 잔기, 예컨대 n-term-시그너처-lys-gly-ser-gly-cys-c-term을 함유한다. 생성된 연장된 시그너처 펩티드는 다수의 SH-반응기가 담체에 부착하도록 헤테로이작용성 시약과 사전에 반응된 담체 KLH에 편리하게 커플링될 수 있다. 펩티드를 이용한 전통적인 면역화에서 (이제는 담체 단백질 상의 합텐으로서), 펩티드, 담체 및 그 밖의 비특이적 에피토프에 대한 항체를 함유하는 폴리클로날 항혈청이 생산될 것이다. 대안적으로, 항체 생산을 위해 펩티드를 임의의 연장이나 변형을 가하여 또는 연장이나 변형 없이 담체에 커플링시키는 많은 방법이 당 분야에 공지되어 있고, 이들 중 어떠한 것도 이용할 수 있다.

유사하게, 동물을 담체 상의 펩티드로 면역시키는 것 이외의 수단에 의해 항-펩티드 항체를 생산하는 공지된 방법이 존재한다. 시그너처 펩티드에 대한 적합한 특이적 가역 결합제가 생산된다면, 대안들 중 어떠한 것도 이용될 수 있다.

그 후 특이적 항-펩티드 항체를 단단히(tightly)-결합된 펩티드를 함유하는 컬럼 상에서 친화성 정제에 의해 이러한 항혈청으로부터 제조한다. 그러한 컬럼은, 연장된 시그너처 펩티드의 분취량을 시판되는 티오프로필 세파로스와 같은 티올-반응성 솔리드 지지체와 반응시킴에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 미정제 항혈청을 이러한 컬럼에 적용시킬 수 있고, 그 후 세척하고, 최종적으로 10% 아세트산 (또는 낮은 pH, 높은 pH, 또는 높은 카오트로프 농도의 그 밖의 용리 완충제)에 노출시켜 항펩티드 항체를 특수하게 용리시킨다. 이러한 항체는 (변성을 막기 위해) 중화되거나 용리 완충제로부터 분리되고, 컬럼은 필요한 경우 더 많은 항혈청의 적용을 위해 생리적 조건으로 재순환된다.

펩티드-특이적 항체는 펩티드-특이적인 친화성 포획제로서의 사용을 위해 컬럼, 비드 또는 다른 표면 상에 최종적으로 고정된다. 바람직한 구체예에서, 항-펩티드 항체는 시판되는 단백질 A-유도된 POROS 크로마토그래피 매질 (Applied Biosystems) 상에 고정되거나 디메틸 피멜이미데이트와의 공유 가교에 의해 이러한 지지체 상에 제조자의 지시에 따라 공유적으로 고정된다. 생성된 고형상 매질은 특히 펩티드 혼합물로부터의 시그너처 펩티드에 결합할 수 있고, 세척 단계 후에, 모니터 펩티드를 부드러운 용리 조건 (예컨대, 10% 아세트산) 하에 방출시킨다. 그 후 컬럼을 중성 pH로 회복시켜 또 다른 샘플에 다시 사용하기 위해 컬럼을 재생시키는데, 이러한 공정은 수 백번 반복될 수 있는 것으로 당 분야에 널리 공지되어 있다.

본 발명은 추가로 하나를 초과하는 상이한 항-시그너처 펩티드 항체, 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 20개 초과의 상이한 항-시그너처 펩티드 항체에 커플링된 수지 또는 컬럼에 관한 것이다.

분석되는 재조합 단백질

본 발명은 샘플에서 선택된 재조합 단백질을 정량하는 분석적 방법에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 샘플 - 즉 복잡한 매트릭스에서 선택된 다수의 재조합 단백질을 정량하기 위한 분석적 방법에 관한 것이다. 선택된 다수의 재조합 단백질은 일 구체예에서, 2개 이상의 선택된 재조합 단백질, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 또는 100개 초과의 선택된 재조합 단백질을 지칭한다.

선택된 다수의 재조합 단백질은 폴리클로날 재조합 항체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.

본 발명의 재조합 폴리클로날 단백질은 일 구체예에서 상이하지만 유사한 단백질 분자를 포함하는 단백질 조성물을 포함하는데, 이러한 분자들은 천연적으로 가변성이며, 바람직한 구체예에서, 천연적으로 가변성이라 함은 변이체 핵산의 라이브러리가 천연 발생 다양성을 포함함을 의미한다. 따라서, 각각의 단백질 분자는 조성물의 다른 분자와 유사하지만, 또한 폴리클로날 단백질의 개별적인 구성원들간 아미노산 서열의 차이를 특징으로 하는, 가변 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 스트레치(stretch)를 함유한다. 가변 폴리펩티드 서열을 구성하는 아미노산 서열(들)에서의 차이는 하나의 아미노산만큼 근소할 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 서열에서의 차이는 하나를 초과하는 아미노산으로 구성된다.

일반적으로, 폴리클로날 항체 또는 TcR의 천연 가변성은 폴리펩티드 사슬의 소위 가변 영역 또는 V-영역에 있는 것으로 고려된다.

본 발명의 일 양태에서, 폴리클로날 단백질의 개별적인 구성원은 대략 길이가 80 내지 120개 아미노산인 가변 영역을 포함한다. 가변 영역은 과가변 도메인, 예컨대 상보성 결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다.

천연 발생 TcR에서, 각각의 가변 영역에는 네 개의 CDR이 존재한다. 천연 발생 항체에서는, 중쇄에 세 개의 CDR과 경쇄에 세 개의 CDR이 존재한다.

본 발명의 추가의 양태에서, 폴리클로날 단백질의 개별적인 구성원의 가변 영역은 길이가 1 내지 26개 아미노산, 바람직하게는 길이가 4 내지 16개 아미노산인 하나 이상의 과가변 도메인을 포함한다. 이러한 과가변 도메인은 CDR3 영역과 일치할 수 있다. 항체의 경우, 각각의 가변 영역은 바람직하게는 세 개의 과가변 도메인을 구성한다. 이들은 CDR1, CDR2 및 CDR3에 일치할 수 있다. TcR의 경우, 각각의 가변 영역은 바람직하게는 네 개의 과가변 도메인을 구성한다. 이들은 CDR1, CDR2, CDR3 및 CDR4에 일치할 수 있다. 과가변 도메인은 본 발명의 재조합 폴리클로날 단백질의 가변 영역 내에서 단독으로 가변 서열을 구성할 수 있다.

본 발명에 관해, 폴리펩티드 서열의 가변성 (폴리클론성)은 또한, 예컨대, 두 개 이상의 상이한 항체 아이소형(isotype), 예컨대 인간 아이소형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD, 및 IgE, 또는 뮤린 아이소형 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, 및 IgA를 함유하는 항체 혼합물의 경우에서와 같이, 항체 폴리펩티드 사슬의 소위 불변 영역 또는 C 영역에 존재하는 개별적인 항체 분자들 사이의 차이를 나타내는 것으로 이해될 수 있다. 따라서, 재조합 폴리클로날 항체는 가변 영역 (V 영역) 또는 불변 영역 (C 영역) 또는 두 영역 모두에서 개별적인 항체 분자들 사이의 서열 차이를 특징으로 하는 항체 분자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 동일한 아이소형을 지니는데, 그 이유는 이것이 후속적인 정제를 상당히 용이하게 하기 때문이다. 또한, 예컨대 아이소형 IgG1, IgG2, 및 IgG4의 항체를 조합시키는 것을 생각해 볼 수 있는데, 이러한 조합이 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 모두 함께 정제될 수 있기 때문이다. 바람직한 구체예에서, 폴리클로날 항체를 구성하는 모든 항체는 추가로 정제를 촉진시키기 위해 동일한 불변 영역을 지닌다. 보다 바람직하게는, 항체는 중쇄의 동일한 불변 영역을 지닌다. 경쇄의 불변 영역이 또한 별개의 항체에서 동일할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 불변 영역에 가변성이 존재할 수 있다.

대상 재조합 폴리클로날 단백질의 조성물은 소정의 서브세트의 단백질을 포함하는데, 이러한 단백질은, 요망되는 표적 항원에 대한 폴리클로날 항체의 경우에, 요망되는 표적으로의 공유된 결합 활성과 같은 공통의 특징에 의해 정의되었다. 전형적으로, 폴리클로날 단백질 조성물은 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 또는 100개의 별개의 변이체 구성원, 예컨대 2 내지 5, 2 내지 8 또는 2 내지 10개의 별개의 구성원을 지닌다. 재조합 폴리클로날 단백질 조성물에 요구되는 별개의 구성원의 수는 표적의 복잡성에 의존적일 수 있다. 항체의 경우, 표적화된 항원(들)의 복잡성은 재조합 폴리클로날 항체 조성물에 필요한 변이체 구성원의 수에 영향을 줄 것이다. 소형이거나 그다지 복잡하지 않은 표적의 경우, 예를 들어 소형 단백질의 경우, 2 또는 3 내지 100개의 별개의 변이체 구성원을 포함하는 폴리클로날 항체 조성물이 충분할 수 있고, 변이체의 수가 90개를 초과하지 않거나, 심지어 80 또는 70개를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 많은 경우에, 별개의 변이체의 수는 60 또는 50개를 초과하지 않을 것이고, 변이체의 수는 2 내지 40개, 예컨대 2 내지 30개의 범위인 것이 바람직하다.

포유동물에서, 항체 또는 면역글로불린 분자와 같이 혈액에서 자유롭게 순환하거나 T 세포 수용체 및 B 세포 수용체와 같이 세포 표면 상에 존재하는 천연 발생 폴리클로날 단백질의 여러 공지된 예가 존재한다. 이러한 천연 발생 폴리클로날 단백질의 다양성은, 일부 포유동물에서, 이러한 단백질의 가변 영역을 엔코딩하는 유전자의 유전적 재조합에 의해 달성된다. 항체는 체세포 돌연변이에 의해 이들의 다양성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 두 개의 독립적인 유전자 세그먼트, 예컨대 항체 가변 중쇄와 가변 경쇄, TcRa 사슬과 β 사슬 또는 TcRδ 사슬과 y 사슬로부터 엔코딩된 단백질의 경우, 라이브러리에 있는 각각의 벡터는 이러한 가변 영역 엔코딩 서열의 쌍을 구성할 것이다.

단백질의 다양성은, 예를 들어 합성 또는 돌연변이에 의한 인공적인 방식으로 또한 형성될 수 있다. 돌연변이는 단일 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열의 랜덤 또는 점 돌연변이일 수 있으며, 이로 인해 단일 단백질의 폴리클로날 집단을 생성한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 재조합 폴리클로날 단백질은 재조합 폴리클로날 항체 또는 항체 단편이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 재조합 폴리클로날 단백질은 재조합 폴리클로날 TcR 또는 TcR 단편이다.

따라서 본 발명의 재조합 폴리클로날 단백질은 상이한 아이소형 또는 보다 바람직하게는 상이한 서브부류로 구성될 수 있다. 면역글로불린의 폴리클론성은 면역글로불린 분자의 가변 도메인에서 또는 불변 부분에서 발생하거나 불변 부분과 가변 도메인 둘 모두에서 발생할 수 있다.

소위 불변 영역, 특히 항체의 중쇄에서의 폴리클론성이 항체의 치료적 용도와 관련하여 흥미롭다. 다양한 면역글로불린 아이소형은 상이한 생물학적 기능을 지니고, 이러한 기능은 치료용 항체로 활용될 때 조합시키는 것이 바람직할 수 있는데, 그 이유는 면역글로불린의 상이한 아이소형이 천연 면역 반응의 상이한 양태에서 관련될 수 있기 때문이다.

상기 단계 iii)에서 사용된 하나 이상의 내부 참조 펩티드는 재조합 폴리클로날 항체 및/또는 TcR과 같은 재조합 단백질 내에 있는 서열과 동일한 서열을 지니는 임의의 펩티드일 수 있다. 내부 참조 펩티드는 상기 재조합 폴리클로날 항체의 임의의 영역, 예컨대 불변 영역, 가변 영역, 경쇄, 중쇄, 프레임워크, 과가변 도메인, 상보성 결정 영역 (CDR), 예컨대 CDR1, CDR2 및 CDR3 내에 있는 서열과 동일한 서열을 지닐 수 있다. 내부 참조 펩티드는 이러한 상이한 영역으로부터의 내부 참조 펩티드의 어떠한 조합물일 수 있다.

상기 단계 iii)에서 사용된 하나 이상의 내부 참조 펩티드는 인간 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 재조합 폴리클로날 항체와 같은 재조합 단백질 내에 있는 서열과 동일한 서열을 지니는 어떠한 펩티드일 수 있다. 재조합 폴리클로날 항체는 여러 치료적 용도 - 즉, 혈장-유래 면역글로불린의 대체와 관련된, 감염성 질환의 예방 또는 치료, 및 암의 치료의 가능성이 있다.

일 구체예에서, 분석되는 재조합 단백질은 하기 중 하나 이상일 수 있다.:

a) 하나 이상의 감염성 질환(들)의 치료 및/또는 예방에 사용되는 재조합 폴리클로날 항체

b) 하나 이상의 박테리아 감염(들)의 치료 및/또는 예방에 사용되는 재조합 폴리클로날 항체

c) 하나 이상의 바이러스 감염(들)의 치료 및/또는 예방에 사용되는 재조합 폴리클로날 항체

d) 하나 이상의 암 형태(들)의 치료 및/또는 예방에 사용되는 재조합 폴리클로날 항체

e) 알츠하이머병과 같은 하나 이상의 아밀로이드 관련 질환의 치료 및/또는 예방에 사용되는 재조합 폴리클로날 항체

f) Sym001 - 25개의 상이한 재조합 폴리클로날 항-레수스(Rhesus) D (RhD) 항체로 구성된 재조합 폴리클로날 항체 (WO 2006/007850).

g) 현존하는 항-백시니아 과면역 면역글로불린 (VIG)을 대체하는 재조합 폴리클로날 항-백시니아 바이러스 항체를 포함하는 Sym002 (WO 2007/065433).

h) Sym003 - 항-호흡기세포 융합 바이러스 (RSV)를 표적화하는 재조합 폴리클로날 생성물 후보 (WO 2008/106980, 및 WO 2007/101441).

i) Sym004는 표피 성장 인자 수용체, 인간 암 항원을 표적화하는 재조합 폴리클로날 항체 생성물 후보이다 (WO 2008/104183).

j) 인간 암 항원을 표적화하는 재조합 폴리클로날 항체 생성물 후보.

j) 박테리아 병원체에 대해 생성된 재조합 폴리클로날 항체.

k) 감염성 질환 표적을 표적화하는 재조합 폴리클로날 항체.

본 발명에 따른 방법은 추가로 뱀 독소에 대한 항체와 같은 하나 이상의 상이한 항체를 포함하는 샘플 중 하나 이상의 재조합 단백질의 정량에 관한 것이다.

분석되는 샘플

본 발명에 따른 방법에 의해 분석되는 샘플은 하나 이상의 재조합 단백질을 포함하는 임의의 샘플일 수 있다. 일 구체예에서, 샘플은 하나 이상의 재조합 폴리클로날 항체와 같은 하나 이상의 재조합 단백질을 포함하는 혈청 또는 혈장 - 예컨대 인간 혈청 또는 혈장이다. 본 발명은 단 하나의 개별적인 공급원으로부터 샘플을 분석하기 위해 이용될 수 있거나, 집단에서 특정 단백질의 수준을 평가할 목적으로, 표적 집단으로부터 푸울링된 샘플을 분석하기 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 세포 배양 상청액 또는 생물반응기에서 발현된 하나 이상의 참조 재조합 단백질의 정량적 분석이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 세포 배양 상청액 또는 세포 생물반응기에서 발현된 하나 이상의 재조합 항체, 예컨대 하나 이상의 재조합 폴리클로날 항체의 정량에 관한 것이다.

폴리클로날 단백질은 예를 들어 폴리클로날 세포 배양 상청액으로부터 수득된 세포 배양 상청액으로부터 유래될 수 있다. 폴리클로날 단백질은, 예컨대 단백질 A 친화성 정제, 면역침전 또는 겔 여과에 의해 상청액으로부터 정제되거나 풍부화될 수 있다. 이러한 정제전 단계는, 그러나, 재조합 폴리클로날 단백질의 특성화의 일부가 아닌데, 그 이유는 이들이 조성물 중 상이한 동종 단백질의 어떠한 분리를 반드시 제공하는 것은 아니기 때문이다. 바람직하게는, 본 발명의 특성화 공정으로 처리된 샘플은 적어도 한 번의 정제 단계로 처리되었다.

폴리클로날 단백질을 구성하는 상이한 동종 단백질은 배양 동안의 상이한 시점에 단일 폴리클로날 세포 배양액으로부터 수득된 샘플 상에서 정량될 수 있고, 이에 따라 생산의 진행 내내 개별적인 폴리클로날 단백질 구성원의 상대 비율을 모니터링하여, 배양 동안 이의 조성의 가변성을 평가할 수 있다. 대안적으로, 폴리클로날 단백질을 구성하는 상이한 동종 단백질은 상이한 제조 진행으로부터 수득된 샘플 상에서 정량될 수 있고, 이에 따라 상이한 배치에서 조성의 가변성을 모니터링하여 배치-대-배치 일관성을 평가할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 특성화되는 샘플은 일 구체예에서 상이한 가변 영역 단백질, 특히 상이한 재조합 단백질을 지니는 상이한 동종 단백질의 소정의 서브세트를 포함한다. 전형적으로, 폴리클로날 단백질의 개별적인 구성원은, 예컨대 항체의 경우에, 요망되는 표적으로의 공유된 결합 활성과 같은 공통의 특징에 의해 정의되었다. 전형적으로, 본 발명의 특성화 플랫폼에 의해 분석되는 폴리클로날 단백질 조성물은 2, 3, 4, 5, 10 또는 20개 이상의 별개의 변이체 구성원 (상이한 동종 단백질)을 포함할 것이다. 따라서, 폴리클로날 단백질 조성물은 전형적으로 (적어도) 2개의 상이한 동종 단백질, 예컨대 (적어도) 3, (적어도) 4, (적어도) 5, (적어도) 6, (적어도) 7, (적어도) 8, (적어도) 9, (적어도) 10, (적어도) 11, (적어도) 12, (적어도) 13, (적어도) 14, (적어도) 15, (적어도) 16, (적어도) 17, (적어도) 18, (적어도) 19, (적어도) 20, (적어도) 21, (적어도) 22, (적어도) 23, (적어도) 24 또는 (적어도) 25개의 상이한 동종 단백질, 예컨대 2 내지 30개의 상이한 동종 단백질, 예를 들어 2 내지 5개, 6 내지 10개, 11개 내지 15개, 16개 내지 20개, 21개 내지 25개 또는 26개 내지 30개의 상이한 동종 단백질을 포함할 것이다. 일부 경우에, 폴리클로날 단백질 조성물은 다수의 별개의 변이체 구성원, 예컨대 적어도 50 또는 100개의 상이한 동종 단백질을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 단일 변이체 구성원은 폴리클로날 단백질 조성물 중 개별적인 구성원의 총 수의 75% 이하를 차지하고, 최종 폴리클로날 조성물 중 개별적인 구성원의 총 수의 예컨대 50% 이하 또는 예를 들어 25% 이하 또는 예컨대 10% 이하, 또는 예를 들어 1% 이하를 차지한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상이한 가변 영역을 지니는 상이한 동종 단백질을 포함하는 샘플은 폴리클로날 항체이다. 폴리클로날 항체는 하나 이상의 상이한 항체 서브부류 또는 아이소형, 예컨대 인간 아이소형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2, 또는 뮤린 아이소형 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 및 IgA를 포함할 수 있다.

본 발명은 추가로 재조합 폴리클로날 항체 조성물 중 상이한 항체 종의 집단을 특성화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 정량적 분석에 유용하고, 예를 들어 배치-대-배치 일관성을 분석할 뿐만 아니라 제조 진행 동안 조성의 안정성을 평가하고 주어진 배치가 소정의 특정 방출 명세에 적합한지를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 폴리클로날 세포 뱅크용 클론의 선택 - 즉, 생산 동안 요망되는 항체 조성물을 생성시키는 클론의 선택을 위해 이용될 수 있다.

본 발명은 또한 재조합 폴리클로날 항체 조성물 중 한 집단의 항체들간 변동을 검출하는 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 재조합 폴리클로날 항체 조성물은 배양 동안 상이한 시점에서 단일 폴리클로날 세포 배양액으로부터 수득된다. 두 번째 구체예에서, 재조합 폴리클로날 항체 조성물은 특정 시점에 상이한 폴리클로날 세포 배양액으로부터 수득된다. 세 번째 구체예에서, 변동은, 재조합 폴리클로날 항체 조성물에 존재하는 적어도 3개, 예컨대 적어도 5개 또는 적어도 10개의 항체들의 상대 비율을 비교함에 의해 검출된다.

또한 본 발명에 따른 방법은 예컨대 약동학 연구를 위해 인간과 같은 개체로부터의 혈청 중 재조합 폴리클로날 항체 조성물/생성물을 구성하는 개별적인 항체의 생체내 청소의 동시 분석을 위해 수행될 수 있다. 일 구체예에서, 두 개 이상의 재조합 단백질, 예컨대 두 개 이상의 재조합 폴리클로날 항체를 상기 개체에게 투여하였다.

본 발명은 또한 약물/약제에서 폴리클론성을 특성화하는 것에 관한 것이다. 공정 개발 및 약물 특성화에서의 이용을 위해, 본 발명에 따른 방법은 고 처리량과 같은 합당한 처리량으로 수행될 수 있는 항체의 상대 및 절대 농도의 측정을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 처리 중에 있는 샘플에서의 하나 이상의 재조합 항체를 정량하는 것에 관한 것이다.

재조합 폴리클로날 조성물/생성물의 개별적인 항체를 동정하고 정량하기 위해서, 동일한 프로테아제 또는 프로테아제의 조합물에 의해 방출될 모든 항체의 가변 영역으로부터 유일한 시그너처 펩티드가 존재하여야 한다.

일 구체예에서, 분석되는 재조합 단백질은 하나 이상의 재조합 B-세포 수용체를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 분석되는 재조합 단백질은 하나 이상의 재조합 T-세포 수용체를 포함한다.

본 발명에 기재된 방법에 의해 분석되는 샘플은 개체로부터 유래된 혈청 또는 혈장과 같은 샘플일 수 있다. 상기 개체는 인간 또는 실험실/시험 동물을 포함하는 동물일 수 있다. 동물은 토끼, 햄스터, 마우스, 설치류, 래트, 원숭이, 소, 돼지, 말, 당나귀, 닭, 어류 또는 실험적 검사에 사용되는 임의의 다른 동물일 수 있다.

분석되는 샘플은 인간, 남성, 여성, 폐경후 여성, 임신 여성, 수유 여성, 유아, 아동, 또는 성인으로 구성된 군으로부터 선택된 개체들 중 한 명 이상으로부터 수득될 수 있다. 인간과 같은 개체는 신생아에서 120세까지, 예를 들어 0 내지 6개월, 예컨대 6 내지 12개월, 예를 들어 1 내지 5세, 예컨대 5 내지 10세, 예를 들어 10 내지 15세, 예컨대 15 내지 20세, 예를 들어 20 내지 25세, 예컨대 25 내지 30세, 예를 들어 30 내지 35세, 예컨대 35 내지 40세, 예를 들어 40 내지 45세, 예컨대 45 내지 50세, 예를 들어 50 내지 60세, 예컨대 60 내지 70세, 예를 들어 70 내지 80세, 예컨대 80 내지 90세, 예를 들어 90 내지 100세, 예컨대 100 내지 110세, 예를 들어 110 내지 120세와 같은 임의의 연령일 수 있다. 개체는 백인, 흑인, 동양인, 몽골 인종의 사람, 에티오피아 인종의 사람, 흑색 인종의 사람, 아메리칸 인디언 인종의 사람 또는 말레이 인종의 사람과 같은 임의의 인종일 수 있다.

상기 인간 또는 동물은 건강하거나 하나 이상의 질환을 지닐 수 있다. 상기 인간 또는 동물은 하나 이상의 질환에 대해 진단되고/거나 치료될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 개체는 하나 이상의 질환에 대해 유전적으로 처리된다.

재조합 폴리클로날 항체를 제조하는 방법

본 발명은 추가로 재조합 폴리클로날 항체를 제조하는 방법에 관한 것인데, 상기 방법은 샘플 중 재조합 단백질을 정량하기 위해 본 발명의 방법을 이용하는 단계를 포함한다. 따라서, 상기 방법에 의해 정량할 수 있는 폴리클로날 항체를 폴리클로날 항체의 푸울로부터 선택할 수 있다.

실시예

실시예 1

본 실시예는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 대한 두 개의 항체 A992 및 A1024의 1:1 혼합물로 구성된 재조합 폴리클로날 항체 조성물의 다중 정량을 기재한다 (WO 2008/104183). 시노몰구스 원숭이에서 임상전 약동학 (PK) 측정법이 제시되었고, 개별적인 항체 A992 및 A1024는 리드(lead) 약물의 투여 후에 혈장에서 측정되었다.

PK 프로필은 리드 약물 (18 mg), 즉 9 mg의 A992 및 9 mg의 A1024를 단일 시노몰구스 원숭이에게 1회 용량으로 투여한 후에 수집된 샘플 상의 혈장에서 측정되었다. 이러한 PK 샘플을 상이한 농도의 리드 약물로 스파이킹된 세 마리의 피검체로부터의 블랭크 시노몰구스 원숭이 혈장의 푸울을 함유하는 샘플과 함께 분석하였다. 분석은 두 개 파트로 구성된다:

· 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의한 A992 및 A1024의 온도-상승.

· AQUA 펩티드(Sigma)를 이용한 액체 크로마토그래피-질량 분광법 (LC-MS).

단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 온도-상승

세 마리의 피검체로부터의 25㎕의 푸울링된 블랭크 시노몰구스 원숭이 혈장을 함유하는 샘플을 하기 농도의 리드 약물로 스파이킹하였다: 0, 5, 10, 20, 50, 100, 150 및 200㎍/ml. PBS pH 7.2 (Gibco)를 100㎕의 총 부피로 첨가하였다. 100㎕의 총 부피를 위해 25㎕의 혈장을 PBS pH 7.2 (Gibco)에 첨가시킴에 의해 PK 샘플을 제조하였다. 샘플을 96웰 단백질 A HP MultiTrap 플레이트 (GE Healthcare) 상에 로딩하였다. 모든 단계에서, 웰의 액체를 Univac 매니폴드 (Whatman)를 이용한 배출에 의해 제거하였는데, Eppendorf 원심분리 모델 번호 5804R을 이용한 단계 6은 예외였다. 하기 절차를 적용하였다:

시트레이트 포스페이트 완충제의 제조:

시트르산 0.1M:

1L 부피측정 플라스크에서 제조된, 1000 ml로 만드는 물에 용해된 19.21g의 시트르산(Sigma)

Na₂HPO₄ _,200 mM:

1L 부피측정 플라스크에서 제조된, 1000 ml로 만드는 물에 용해된 53.61g의 Na₂HPO₄·7^*H2O(Merck)

시트레이트 포스페이트 pH 6.5 (원액 A):

136 ml의 0.1M 시트르산 및 364 ml의 0.2 M Na₂HPO₄(Merck) 900 ml로 만드는 물 추가. 1000 ml까지 물을 가한다.

시트레이트 포스페이트 pH 3.5 (원액 B):

359 ml의 0.1M 시트르산 + 141 ml 0.2 M Na₂HPO₄ 900 ml로 만드는 물 추가. 1000 ml까지 물을 채운다.

시트레이트 포스페이트 pH 5,25:

567 ml의 시트레이트 포스페이트 원액 A + 433 ml의 시트레이트 포스페이트 원액 B.

단백질 A 친화성 정제 절차:

단계 1: 단백질 A HP MultiTrap 플레이트의 제조

플레이트를 위아래로 흔들어 저장 용액을 현탁시키고, 마개를 제거하고, 제조자의 지시에 따라 저장 용액을 배출시킨다.

단계 2: 평형화

300㎕ PBS pH 7.2를 각 웰에 첨가한다.

단계 3: 리드 약물의 결합

100㎕의 스파이킹된 샘플 또는 PK 샘플을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 4분간 800rpm으로 Eppendorf 써모믹서 컴포트(thermomixer comfort)에서 인큐베이션한다.

단계 4: 세척 1

a) 250㎕ PBS pH 7.2를 각 웰에 첨가하고 배출시킨다.

b) 250㎕ PBS pH 7.2를 각 웰에 첨가하고 배출시킨다.

단계 5: 세척 2

a) 250㎕ 시트레이트 포스페이트 세척 완충제 pH 5.25를 각 웰에 첨가하고 배출시킨다.

b) 250㎕ 시트레이트 포스페이트 세척 완충제 pH 5.25를 각 웰에 첨가하고 배출시킨다.

단계 6: 리드 약물의 용리

단백질 A HP MultiTrap 플레이트를 96웰 콜렉션 플레이트 (GE Healthcare) 상에 놓는다.

a) 200㎕ 시트레이트 포스페이트 용리 완충제 pH 3.5를 각 웰에 첨가하고 70xg에서 원심분리한다.

b) 200㎕ 시트레이트 포스페이트 용리 완충제 pH 3.5를 각 웰에 첨가하고 70xg에서 원심분리한다.

LC - MS 용 샘플의 제조

단백질 A 친화성 크로마토그래피의 농도-상승 이후에, 내인성 Ig 및 리드 약물을 함유하는 샘플을 LC-MS 분석을 위해 제조하였다. 이러한 단계 동안에, AQUA 펩티드를 샘플에 첨가하였다. AQUA 펩티드는 A992 및 A1024로부터의 유일한 시그너처 펩티드와 동일하지만, 이러한 펩티드가 시그너처 펩티드로부터 MS 분석을 이용하여 구별될 수 있게 하는 하나의 안정한 동위원소 표지된 아미노산을 함유하는 합성 펩티드이다. 표지된 아미노산은 98 원자%의 ¹³C 및 ¹⁵N을 함유하므로 질량은 A992 및 A1024의 천연 시그너처 펩티드에 비해 증가되었다. 절대 정량을 위해 선택된 AQUA 펩티드가 하기 표 1에 보고되어 있다.

표 1: 절대 정량에 이용된 시그너처 펩티드. 전자분무 이온화(ESI) 동안 펩티드가 이온화되는 경우, 질량 대 전하 (m/z) 값을 형성된 단일 (MH⁺), 이중 (MH² ⁺) 및 삼중 (MH³ ⁺) 하전된 펩티드에 대해 제시하였다.

표 2: 절대 정량에 이용된 AQUA? 펩티드. ESI 동안 펩티드가 이온화되는 경우, 질량 대 전하 (m/z) 값을 형성된 단일 (MH⁺), 이중 (MH² ⁺) 및 삼중 (MH³ ⁺) 하전된 펩티드에 대해 제시하였다. 굵은 체로 밑줄을 그은 리신 (K) 및 아르기닌 (R)은 AQUA 펩티드에서 표지된 아미노산이었다.

하기 절차를 LC-MS용 샘플의 제조에 이용하였다:

단백질 A HP MultiTrap 플레이트로부터 용리된 면역글로불린(Ig)을 800㎕의 빙냉 아세톤(Merck)을 이용하여 침전시켰다. 후속하여 샘플을 9㎕의 1% Rapigest SF 계면활성제 (Waters)에 용해시키고 Eppendorf 써모믹서 컴포트에서 800rpm으로 혼합시키면서 100℃에서 5분간 가열하였다. 샘플에 90㎕의 최종 부피로 50mM NH₄HCO₃, 1mM CaCl₂를 첨가하고, 샘플을 Eppendorf 써모믹서 컴포트에서 800rpm으로 혼합시키면서 100℃에서 5분간 가열하였다. 후속하여, 샘플을 0.1M 디티오트레이톨(DTT)(Sigma)을 이용하여 환원시키고, 0.25M 요오도아세트아미드(Sigma)를 이용하여 알킬화하고, 트립신 (Worthington)으로 37℃에서 16시간 동안 1:20 (w/w)의 효소 대 Ig 비를 이용하여 분해시켰다. 1% (v/v)의 최종 농도로 트리플루오로아세트산(TFA)(Fluka)을 첨가시킴에 의해 분해물을 켄칭시키고 샘플을 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 2 pmol의 총 AQUA/㎕의 농도를 갖는 0.1% (v/v) 포름산 (FA)(Fluka) 중 10 ㎕의 A992 및 A1024 AQUA (Sigma) 펩티드의 1:1 혼합물을 첨가하였고, 즉 샘플 중 각각의 AQUA 펩티드의 전체 양은 10 pmol이었다. 샘플을 Eppendorf 미니스핀(minispin) 및 원심분리기에서 14100rcf로 10분간 원심분리하였고 HPLC 바이알(Dionex)로 옮겼다.

LC - MS 에 의한 정량

펩티드를 Zorbax 300SB-C18 컬럼 (2.1 x 150mm; Agilent) 및 RSLC 시스템 Ultimate 3000 (Dionex)을 이용하여 역상 LC에 의해 분리시켰다. 용매는 용매 A: 0.1% (v/v) FA (Fluka)를 지니는 물, 용매 B: 0.1% (v/v) FA (Fluka)를 지니는 아세토니트릴 및 200㎕/분의 유량이었다. 샘플을 5% 용매 B에서 로딩시키고, 15% 내지 40% 용매 B의 구배를 이용하여 30분간 용리시켰다. 컬럼을 80% 용매 B에서 20분간 세척하고 컬럼을 5% 용매 B에서 14.7분 동안 재-평형화시켰다.

질량 분광법

펩티드를 microQTOF 기계 (Bruker) 상에서 분석하였다. 샘플의 분석을 위해, 표 3의 파라메터를 가지고 400 내지 3000의 m/z 범위에서 획득을 수행하였다.

표 3: microQTOF 기계 상에서 MS 방법을 위한 파라메터

각각의 진행을 시작할 때, 교정 세그먼트를 포함시켰는데, 20㎕의 ESI 튜닝 믹스 (Agilent)가 전환 밸브를 통해 주입되었다. 시그너처 및 AQUA 펩티드의 MH³ ⁺ 및 MH² ⁺ 전하 상태에 대한 m/z 값의 추출된 이온 크로마토그램 (EIC)을 생성하였고, 추출된 m/z 폭을 0.02로 설정하였다. 시그너처 펩티드와 AQUA 펩티드 사이의 비를 EIC에서 검출된 특이적인 시그너처 및 AQUA 펩티드 화합물의 면적으로부터 결정하였다 (표 4).

표 4: 시그너처 및 AQUA 펩티드의 피크 면적의 결정에 사용된 EIC. A992에 대한 m/z 값은 MH³ ⁺ 하전된 이온이었다. A1024의 경우, MH³ ⁺ 및 MH² ⁺ 하전된 이온 둘 모두의 처음 두 개의 동위원소를 이용하였다.

결과

EIC에서 A992 및 A1024에 대한 시그너처 펩티드 대 AQUA 펩티드의 피크 면적 사이의 비는 표준 곡선에 의해 리드 약물의 농도와 관련될 수 있다. 이러한 실험에서, A1024 및 A992 둘 모두로 구성된 리드 약물을 표준 곡선의 생성을 위해 8개 농도: 0, 5, 10, 20, 50, 100, 150 및 200㎍/ml로 세 마리의 시노몰구스 원숭이로부터의 혈장 푸울에서 스파이킹하였다. 각각의 항체에서, 이러한 농도는 0, 2.5, 5, 10, 25, 50, 75 및 100㎍/ml (도 1 및 도 2)에 상응한다.

표준 곡선은, A992 및 A1024 시그너처 펩티드 대 AQUA 펩티드의 비를 시노몰구스 원숭이 혈장에서 스파이킹된 리드 약물의 농도와 관련시키는 것이 가능하였음을 나타내었다. 더욱이 결과로부터, A992 및 A1024에 대한 시그너처 대 AQUA의 비가 개별적인 항체의 10 내지 100㎍/ml 범위에서 결정될 수 있음이 입증된다. A992 또는 A1024의 시그너처 펩티드에 대한 어떠한 피크도 10㎍/ml 미만의 A992 또는 A1024로 스파이킹된 샘플의 경우에 검출되지 않았다.

도 1 및 도 2를 이용하여 시노몰구스 원숭이에서 리드 약물의 임상전 PK 연구로부터의 샘플 중 A992 및 A1024의 농도를 측정하였다. A992 및 A1024 시그너처의 피크 면적 및 AQUA 펩티드의 피크 면적 사이의 비를 0, 0.5, 1, 4, 8, 24, 48시간의 샘플링 포인트 및 8 mg/kg의 리드 약물을 투여한 지 9, 16, 23, 30, 37 및 44일 후에 측정하였다. A992 및 A1024에 대한 약동학 곡선을 도 3에 도시한다.

A992 및 A1024의 농도를 8mg/kg의 단일 용량의 리드 약물을 투여한 지 0.5 내지 48시간 후의 시점으로부터의 샘플에서 측정하였다. 두 개의 항체가 동일한 분해 패턴을 따르고 있음이 관찰될 수 있다.

실시예 2

본 실시예는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)에 대한 두 개의 항체 A992 및 A1024의 1:1 혼합물로 구성된 재조합 항체 조성물의 다중 정량을 기재한다 (WO 2008/104183). 항체를 공여체 혈청 푸울에서 스파이킹하였고 동시에 측정하였다. 각각의 항체에 대해 하나씩 두 개의 표준 곡선을 생성하였다.

샘플

두 개의 항체를 각각의 항체에 대해 100㎍/ml으로 혈청으로 스파이킹하였다. 그 후, 샘플을 혈청에서 희석시켜 표준 곡선용 샘플을 생성하였다. 사용된 혈청은 10개의 건강한 공여체의 푸울이었다. 표 5는 표준 곡선의 생성에 사용된 농도를 나타낸다.

표 5: 표준 곡선의 생성에 사용된 샘플, 농도는 하나의 샘플/한 개의 웰에서 각각의 항체의 농도를 나타낸다.

샘플 제조

총 IgG를 실시예 1에 기재된 대로 96웰 단백질 A 플레이트 상에서 정제하였으나, 플레이트를 200 ㎕의 0.5M GndHCl/0.1M 글리신 pH 3.0에서 용리시켰다. 33 ml의 세 개의 분취량을 각각의 표준 곡선 포인트에서 분석하였다. 용리액을 증발시키고, 웰 당 50 ㎕의 50 mM 암모늄 바이카르보네이트를 첨가시킴에 의해 재구성하였다. 단백질을 DTT (56℃, 1h)에 의해 환원시키고 IAA에 의해 실온에서 1시간 동안 알킬화하였다.

샘플을 깊은 웰 플레이트로 옮기고 15 pmol의 각각의 AQUA 펩티드를 웰 당 첨가하고, 샘플을 50 mM의 암모늄 바이카르보네이트로 희석시켰다.

샘플을 4% 인산에서 1:1로 희석시키고 Waters Oasis MCX 이온 교환 플레이트 상에서 정제하였다.

플레이트를 ACN/MeOH/ 웰에서 30 ㎕의 30% NH₄OH를 이용하여 용리시켰다.

플레이트를 증발시키고 30 ㎕의 0.1% 포름산을 첨가하였다.

LC - MS 설정

샘플 중 항체 농도를 두 개 항체의 CDR 영역으로부터 선택된 펩티드의 LC-MS 및 다중 반응 모니터링을 이용하여 정량하였다.

샘플을 하기를 이용하여 분석하였다:

질량 분광계: Agilent 6400 삼중 Quad LC/MS (QQQ)

HPLC: Agilent 1200 시리즈

컬럼: Waters Acquity UPLC BEH300 C18 1.7 ㎛, 2.1 x 50 mm 컬럼

유량: 300 ㎕/분

용매 A: 0.1% 포름산

용매 B: 99.9% ACN, 0.1% 포름산

주입 부피: 30 ㎕

MS1: 유닛(Unit)

MS2: 가장 넓음(Widest)

각각의 샘플에 대해 30 ㎕를 LC-MS 시스템에 주입하고 표 6에 제시된 구배를 이용하였다.

표 6: MS로 펩티드를 용리하는데 사용된 구배:

정량을 위해, 두 개의 펩티드를 선택하였고, AQUA™ 펩티드, 즉 동위원소 표지된 거대 아미노산을 함유하는 펩티드로서 주문하였다. 이러한 실험을 위해 두 개의 펩티드를 선택하였다.

결과

도 4에 도시된, 각각의 항체에 대해 하나씩 두 개의 표준 곡선을 생성하였다. 측정은 세 번 이루어지며, 이러한 측정은 양호한 재현성과 비-선형 핏으로 핏팅된 표준 곡선을 입증한다. 두 곡선 모두의 범위는 각각의 항체에 대해 0.2 ㎍/ml-100 ㎍/ml이다. 두 개의 항체가 동시에 측정된다.

약어

참조문헌

SEQUENCE LISTING <110> Symphogen A/S Naested, Henrik Sen, Jette W. Jensen, Pernille F. Frandsen, Torben <120> Multiplex quantification of individual recombinant proteins in a mixture by signature peptides and mass spectrometry <130> P135PC00 <140> PCT/DK2010/050258 <141> 2010-10-07 <150> PA 2009 01112 <151> 2009-10-09 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signature peptide <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ser Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signal peptide <400> 2 Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser 1 5 10 15 Ser Gly Arg <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Signature peptide <400> 3 Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys 1 5

Claims

i) 친화성 정제에 의해 하나 이상의 재조합 단백질을 농도-상승(up-concentration)시켜 제 1 분획을 수득하는 단계,
ii) 상기 재조합 단백질 각각에 대한 하나 이상의 특이적인 시그너처 펩티드(signature peptide)를 제 2 분획내로 방출시키기 위해 상기 제 1 분획을 분해시키는 단계,
iii) 상기 시그처너 펩티드 각각에 대한 하나 이상의 내부 참조 펩티드(internal reference peptide)를 상기 제 1 분획 및/또는 상기 제 2 분획에 첨가시키는 단계, 및
iv) 상기 시그너처 펩티드를 질량 분광 분석에 의해 정량하는 단계를 포함하는, 샘플 중 하나 이상의 재조합 단백질을 정량하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방법이,
i) 샘플 내로 스파이킹된(spiked) 공지된 농도의 상응하는 단백질 제조물로 제 1항의 단계 i) 내지 iv)를 반복시켜 단백질 표준 곡선을 수득하는 단계, 및
ii) 제 1항의 단계 iv)에서 수득된 상기 시그너처 펩티드의 양(quantitation)을 상기 단계 i)에서 수득한 단백질 표준 곡선과 비교하고 상기 샘플 중 상기 하나 이상의 재조합 단백질의 정량을 달성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방법이 제 1항의 단계 ii)의 분해 이전에 환원 및/또는 알킬화 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방법이, 샘플을 분획화할 수 있는 화학물질을 지니는 수지를 이용하여 상기 시그너처 펩티드 및 상기 내부 참조 펩티드를 농도-상승시킴으로써 대상 펩티드를 농도-상승시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방법이, 항-시그너처 펩티드 항체에 커플링된 수지를 이용하여 상기 시그너처 펩티드 및 상기 내부 참조 펩티드를 농도-상승시킨 후 상기 시그너처 펩티드 및 상기 내부 참조 펩티드를 방출시켜 제 3 분획을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 제 1항의 단계 i)의 친화성 정제가 하나 이상의 면역글로불린-결합 단백질에 대한 결합을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 제 1항의 단계 i)의 친화성 정제가 하나 이상의 박테리아 면역글로불린-결합 단백질에 대한 결합을 포함하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 면역글로불린이 인간 면역글로불린인 방법.
제 8항에 있어서, 상기 인간 면역글로불린이 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgM, 인간 IgA, 또는 인간 IgE인 방법.
제 6항에 있어서, 상기 면역글로불린이 마우스, 토끼, 염소, 돼지, 소, 낙타, 개, 고양이, 닭, 어류 또는 원숭이 면역글로불린인 방법.
제 10항에 있어서, 상기 마우스 면역글로불린이 마우스 IgG2a, 마우스 IgG2b, 마우스 IgG3, 또는 마우스 IgG1인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 친화성 정제가 단백질 A 에 대한 결합을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 친화성 정제가 단백질 G에 대한 결합을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 친화성 정제가 단백질 A/G에 대한 결합을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 친화성 정제가 단백질 L에 대한 결합을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 친화성 정제가 폴리클로날 항체의 불변 부분에 대한 항체로의 결합을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 친화성 정제가 Fc 수용체에 대한 결합을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 친화성 정제가 콘카나발린(Concanavalin) A (Con A)에 대한 결합을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 친화성 정제가 항체에 대한 표적으로의 결합을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 ii)의 분해가 트립신으로 수행되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 ii)의 분해가 키모트립신으로 수행되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 ii)의 분해가 Asp-N으로 수행되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 ii)의 분해가 Glu-C로 수행되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 ii)의 분해가 Lys-C로 수행되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 ii)의 분해가 lys-N으로 수행되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 ii)의 분해가 Arg-C로 수행되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 분해가 본질적으로 완전히 수행되는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 환원이 디티오트레이톨 (DTT)로 수행되는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 환원이 메르캅토에탄올로 수행되는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 알킬화가 4-비닐피리딘으로 수행되는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 알킬화가 요오도아세트아미드로 수행되는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 알킬화가 요오도아세트아미드 및/또는 요오도아세트산으로 수행되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 하나 이상의 내부 참조 펩티드가 ¹³C로 표지된 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 하나 이상의 내부 참조 펩티드가 ¹⁵N으로 표지된 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 하나 이상의 내부 참조 펩티드가 ¹⁸O로 표지된 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 하나 이상의 내부 참조 펩티드가 합성 후 표지화(post-synthetic labelling)에 의해 생성되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 하나 이상의 내부 참조 펩티드가 화학적 합성에 의해 생성되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 하나 이상의 내부 참조 펩티드가 살아 있는 세포에서 대사성 혼입을 통해 생성되는 방법.
제 38항에 있어서, 상기 세포가 미생물의 일부인 방법.
제 38항에 있어서, 상기 세포가 배양 중인 포유동물 세포인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 하나 이상의 내부 참조 펩티드가 시험관내에서 생성되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 하나 이상의 내부 참조 펩티드가, 일차 아미노기를 표지시키기 위해 중수소화된 아세테이트를 포함하는 방법에 의해 생성되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 하나 이상의 내부 참조 펩티드가, n-말단-특이적인 시약을 포함하는 방법에 의해 생성되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 하나 이상의 내부 참조 펩티드가, 펩티드 카르복실기의 퍼메틸 에스테르화를 포함하는 방법에 의해 생성되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 하나 이상의 내부 참조 펩티드가, 절단 동안 트립신분해(tryptic) 펩티드의 c-말단으로 트윈 ¹⁸O 표지의 첨가를 포함하는 방법에 의해 생성되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 하나 이상의 내부 참조 펩티드가, N-말단 펩티드 표지화를 포함하는 방법에 의해 생성되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 하나 이상의 내부 참조 펩티드가, NIT (N-말단 동위원소-엔코딩된 태깅)를 포함하는 방법에 의해 생성되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 하나 이상의 내부 참조 펩티드가, C-말단 펩티드 표지화를 포함하는 방법에 의해 생성되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 하나 이상의 내부 참조 펩티드가, N-말단 및 C-말단 펩티드 표지화와 상이한 표지화를 포함하는 방법에 의해 생성되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 하나 이상의 내부 참조 펩티드가, 아미노산 기반 표지화를 포함하는 방법에 의해 생성되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 하나 이상의 내부 참조 펩티드가, 각각의 펩티드에서 하나의 아미노산의 아미노산 기반 표지화를 포함하는 방법에 의해 생성되는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 항-시그너처 펩티드 항체가 폴리클로날 혈청 유래 항체인 방법.
제 4항에 있어서, 상기 항-시그너처 펩티드 항체가 모노클로날 항체인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 내부 참조 펩티드가 재조합 폴리클로날 항체 및/또는 TcR 내에 있는 서열과 동일한 서열을 지니는 방법.
제 54항에 있어서, 재조합 폴리클로날 항체 내에 있는 서열이 상기 재조합 폴리클로날 항체의 불변 영역 내에 있는 방법.
제 54항에 있어서, 재조합 폴리클로날 항체 내에 있는 서열이 상기 재조합 폴리클로날 항체의 가변 영역 내에 있는 방법.
제 54항에 있어서, 재조합 폴리클로날 항체 내에 있는 서열이 상기 재조합 폴리클로날 항체의 경쇄 내에 있는 방법.
제 54항에 있어서, 재조합 폴리클로날 항체 내에 있는 서열이 상기 재조합 폴리클로날 항체의 중쇄 내에 있는 방법.
제 54항에 있어서, 재조합 폴리클로날 항체 내에 있는 서열이 상기 재조합 폴리클로날 항체의 프레임워크 내에 있는 방법.
제 54항에 있어서, 재조합 폴리클로날 항체 내에 있는 서열이 상기 재조합 폴리클로날 항체의 과가변 도메인 내에 있는 방법.
제 54항에 있어서, 재조합 폴리클로날 항체 내에 있는 서열이 상기 재조합 폴리클로날 항체의 상보성 결정 영역(CDR) 내에 있는 방법.
제 54항에 있어서, 재조합 폴리클로날 항체 내에 있는 서열이 상기 재조합 폴리클로날 항체의 CDR1 내에 있는 방법.
제 54항에 있어서, 재조합 폴리클로날 항체 내에 있는 서열이 상기 재조합 폴리클로날 항체의 CDR2 내에 있는 방법.
제 54항에 있어서, 재조합 폴리클로날 항체 내에 있는 서열이 상기 재조합 폴리클로날 항체의 CDR3 내에 있는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 시그너처 펩티드가 이온 교환 기반 분리를 이용하여 농도상승되는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 시그너처 펩티드가 역상 기반 분리를 이용하여 농도상승되는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 시그너처 펩티드가 친수성 상호작용 기반 분리를 이용하여 농도상승되는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 시그너처 펩티드가 소수성 상호작용 기반 분리를 이용하여 농도상승되는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 시그너처 펩티드가 크기 배제 기반 분리를 이용하여 농도상승되는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 항-시그너처 펩티드 항체가 토끼에서 생성되는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 항-시그너처 펩티드 항체가 닭에서 생성되는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 항-시그너처 펩티드 항체가 염소에서 생성되는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 항-시그너처 펩티드 항체가 양에서 생성되는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 방법이 배치 포맷으로 수행되는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 방법이 96웰 포맷으로 수행되는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 방법이 다차원 LC-MS 시스템의 일부로서 수행되는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 방법이 오프라인(offline)으로 수행되는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 방법이, 상기 시그너처 및 참조 펩티드를 이온 공급원으로 직접 용리시키는 것을 포함하는 방법.
제 5항에 있어서, 상기 방법이, 상기 시그너처 및 참조 펩티드를 전자분무 이온화 (ESI) 공급원으로 직접 용리시키는 것을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 질량 분광법이 ESI에 의한 이온화를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 질량 분광법이 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 (MALDI)에 의한 이온화를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 질량 분광법이 이차원 이상의 크로마토그래피 분획화를 포함하는 LC-MS 분석을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 질량 분광법이 다차원 크로마토그래피를 포함하는 LC-MS 분석을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 질량 분광법이 단일 차원의 LC 분리를 포함하는 LC-MS 분석을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 질량 분광법이 이차원 이상의 LC 분리를 포함하는 LC-MS 분석을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 질량 분광법이 푸리에(fourier)-트랜스폼 이온 시클로트론 공명 (FTICR), Q-타임-오브-플라이트(TOF) 또는 삼중 4중극 기반 방법을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 질량 분광법이 LC-MS/MS를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 질량 분광법이 LC-ESI-MS/MS를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 질량 분광법이 LC-MALDI-MS/MS를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 질량 분광법이 다중 반응 모니터링 (MRM) 기반 방법을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 질량 분광법이 추출된 이온크로마토그램을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 질량 분광법이 이온 트랩(ion trap) 기반 방법을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 질량 분광법이 ESI-삼중 4중극 기반 방법을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 질량 분광법이 오비트랩(Orbitrap) 기반 방법을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 질량 분광법이 ESI-TOF 기반 방법을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 질량 분광법이 ESI-Q-TOF 기반 방법을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 단백질이 두 개 이상의 재조합 폴리클로날 항체를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 단백질이 두 개 이상의 키메라 폴리클로날 항체를 포함하는 방법.
제 98항에 있어서, 상기 두 개 이상의 키메라 폴리클로날 항체가 인간 부분과 마우스 부분을 포함하는 방법.
제 99항에 있어서, 상기 인간 부분이 폴리클로날 항체의 불변 영역인 방법.
제 99항에 있어서, 상기 인간 부분이 폴리클로날 항체의 가변 영역인 방법.
제 99항에 있어서, 상기 마우스 부분이 폴리클로날 항체의 불변 영역인 방법.
제 99항에 있어서, 상기 마우스 부분이 폴리클로날 항체의 가변 영역인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 단백질이 하나 이상의 동종 단백질을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 샘플이 혈청 샘플인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 샘플이 혈장 샘플인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 샘플이 세포 배양 상청액인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 샘플이 생물반응기 상청액인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 단백질이 둘 이상의 감염성 질환(들)의 치료 및/또는 예방에 사용되는 재조합 폴리클로날 항체를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 단백질이 둘 이상의 박테리아 감염(들)의 치료 및/또는 예방에 사용되는 재조합 폴리클로날 항체를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 단백질이 둘 이상의 바이러스 감염(들)의 치료 및/또는 예방에 사용되는 재조합 폴리클로날 항체를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 단백질이 둘 이상의 암 형태(들)의 치료 및/또는 예방에 사용되는 재조합 폴리클로날 항체를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 단백질이 상이한 재조합 폴리클로날 항체들로 구성된 재조합 폴리클로날 항체를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 단백질이 Sym001과 같은 상이한 재조합 폴리클로날 항-레수스(Rhesus) D (RhD) 항체로 구성된 재조합 폴리클로날 항체를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 단백질이 Sym002와 같은 현존하는 항-백시니아 과면역 면역글로불린(VIG)을 대체하기 위한 재조합 폴리클로날 항-백시니아 바이러스 항체를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 단백질이 Sym003과 같은 항-호흡기세포 융합 바이러스 (RSV)를 표적화하는 재조합 폴리클로날 항체를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 단백질이 인간 암 항원을 표적화하는 재조합 폴리클로날 항체를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 단백질이 인간 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)를 표적화하는 재조합 폴리클로날 항체를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 단백질이 박테리아 병원체를 표적화하는 재조합 폴리클로날 항체를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 단백질이 바이러스 병원체를 표적화하는 재조합 폴리클로날 항체를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 단백질이 감염성 질환 표적을 표적화하는 재조합 폴리클로날 항체를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 단백질이 하나 이상의 재조합 B-세포 수용체를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 단백질이 하나 이상의 재조합 T-세포 수용체를 포함하는 방법.
샘플 중 하나 이상의 재조합 단백질을 정량하기 위한 제 1항 내지 제 123항 중 어느 한 항에 따른 방법의 용도.
제 124항에 있어서, 상기 방법이 개체로부터의 혈청에 존재하는 재조합 폴리클로날 항체 조성물을 구성하는 개별적인 항체의 생체내 청소를 측정하는데 사용되는 용도.
제 124항에 있어서, 상기 방법이 개체의 약동학 연구에 사용되는 용도.
제 125항 또는 제 126항에 있어서, 상기 개체가 인간인 용도.
제 125항 또는 제 126항에 있어서, 상기 개체가 설치류인 용도.
제 125항 또는 제 126항에 있어서, 상기 개체가 원숭이인 용도.
제 124항에 있어서, 상기 방법이 약물에서 폴리클론성의 특성화에 사용되는 용도.
제 124항에 있어서, 상기 방법이 약제에서 폴리클론성의 특성화에 사용되는 용도.
제 124항에 있어서, 상기 방법이 처리 중에 있는 샘플에서의 하나 이상의 재조합 항체를 정량하는데 사용되는 방법.
재조합 폴리클로날 항체를 제조하는 것과 관련된 제 1항에 따른 방법의 용도.
약물 생산의 업스트립 또는 다운스트림에 있는 재조합 폴리클로날 항체를 제조하는 것과 관련된 제 1항에 따른 방법의 용도.
약제 생산의 업스트립 또는 다운스트림에 있는 재조합 폴리클로날 항체를 제조하는 것과 관련된 제 1항에 따른 방법의 용도.
폴리클로날 세포 뱅크용 클론을 선택하기 위한 제 1항에 따른 방법의 용도.
제 1항에 있어서, 정량하려는 재조합 단백질의 수가 두 개 또는 그 초과인 방법.