EA047087B1 - Мультиплексное количественное определение посттрансляционных модификаций белков с использованием тандемных массовых меток - Google Patents
Мультиплексное количественное определение посттрансляционных модификаций белков с использованием тандемных массовых меток Download PDFInfo
- Publication number
- EA047087B1 EA047087B1 EA202292177 EA047087B1 EA 047087 B1 EA047087 B1 EA 047087B1 EA 202292177 EA202292177 EA 202292177 EA 047087 B1 EA047087 B1 EA 047087B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- samples
- tmt
- sample
- ptm
- digested
- Prior art date
Links
- 238000012986 modification Methods 0.000 title claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 23
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 title description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 claims description 123
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 89
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 87
- 238000013459 approach Methods 0.000 claims description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 56
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 49
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 46
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 42
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 38
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 35
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 33
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 32
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 31
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 31
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims description 30
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims description 29
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 claims description 24
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 22
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 claims description 20
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 19
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 19
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 claims description 18
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 18
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 claims description 18
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 17
- IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N mandelic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 15
- 230000036252 glycation Effects 0.000 claims description 15
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 14
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 claims description 14
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 14
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 14
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 claims description 13
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 claims description 13
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 claims description 13
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N p-cresol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1 IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 claims description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 12
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 11
- 229940043131 pyroglutamate Drugs 0.000 claims description 11
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 11
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 11
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 10
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 10
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 9
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 9
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 6
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 5
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 claims description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 claims description 4
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 claims description 4
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000009509 drug development Methods 0.000 claims description 4
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims description 3
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 claims description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 claims 1
- XQXPVVBIMDBYFF-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxyphenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XQXPVVBIMDBYFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 13
- 229940090248 4-hydroxybenzoic acid Drugs 0.000 description 12
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 12
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 11
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 4
- 125000003338 L-glutaminyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 4
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000013442 quality metrics Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000012034 trail making test Methods 0.000 description 3
- CNBUSIJNWNXLQQ-NSHDSACASA-N (2s)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 CNBUSIJNWNXLQQ-NSHDSACASA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 2
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 2
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 2
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- -1 Asp-N Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710115821 Flavin reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 101000935587 Homo sapiens Flavin reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 1
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 1
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 101800000597 N-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000108 N-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010001441 Phosphopeptides Proteins 0.000 description 1
- 241001208007 Procas Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000944 Soxhlet extraction Methods 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000011190 asparagine deamidation Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940126587 biotherapeutics Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000002045 capillary electrochromatography Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000001360 collision-induced dissociation Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000002013 hydrophilic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000000050 ionisation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012006 liquid chromatography with tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000409 membrane extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000874 microwave-assisted extraction Methods 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940045641 monobasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006303 photolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- REQCZEXYDRLIBE-UHFFFAOYSA-N procainamide Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 REQCZEXYDRLIBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000244 procainamide Drugs 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000000581 reactive spray deposition Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 101150041393 rsd gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000002470 solid-phase micro-extraction Methods 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013097 stability assessment Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 238000000194 supercritical-fluid extraction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011191 terminal modification Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000013385 tryptic peptide mapping Methods 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
Description
Ссылка на перечень последовательностей
В настоящую заявку посредством ссылки включен перечень последовательностей, поданный в машиночитаемой форме в виде файла 10693WO01-Sequence.txt, созданного 26 января 2021 г., размером 1462 байта.
Область техники
Настоящее изобретение относится к биофармацевтическим препаратам и относится к мультиплексному количественному определению посттрансляционных модификаций белков, таких как терапевтические моноклональные антитела, с использованием тандемных массовых меток (ТМТ).
Уровень техники
С момента первого одобрения Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в 1986 г. рекомбинантные моноклональные антитела (mAb) стали одним из наиболее быстро растущих классов биотерапевтических препаратов для лечения различных заболеваний человека в портфеле разрабатываемых лекарственных средств и на рынке биофармацевтических препаратов благодаря их высокой специфичности, длительному периоду полужизни в кровотоке, возможности вызывать эффекторный ответ иммунных клеток и меньшему количеству побочных действий по сравнению с низкомолекулярными препаратами. На сегодняшний день около 80 лекарственных препаратов на основе mAb IgG были одобрены FDA и Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA), и более 70 находятся на поздней стадии разработки.
mAb IgG представляют собой ковалентные гетеротетрамерные белки с молекулярной массой приблизительно 150 кДа, состоящие из двух идентичных тяжелых и легких цепей, которые ковалентно связаны несколькими дисульфидными связями с образованием Y-образной структуры. Из-за своего большого размера и структурной сложности mAb подвержены широкому спектру посттрансляционных модификаций (ПТМ), таких как гликозилирование Fc, окисление метионина (Met), дезамидирование аспарагина (Asn), циклизация/изомеризация аспарагиновой кислоты (Asp), циклизация N-концевого глутамина (Gln) или глутамата (Glu), клиппирование C-концевого лизина (Lys), неферментативное гликозилирование Lys и трисульфидная связь, во время культивирования клеток, очистки, приготовления лекарственного препарата и хранения. ПТМ могут быть основным источником структурной неоднородности и играть важную роль в модулировании физико-химических свойств mAb. Некоторые ПТМ, такие как гликозилирование, дезамидирование и окисление, в зависимости от расположения затронутых остатков (например, в областях, определяющих комплементарность (CDR)), могут даже оказывать пагубное влияние на стабильность, функцию, иммуногенность и фармакокинетику/фармакодинамику, которые обычно считаются критическими показателями качества (CQA) антител, подлежащими тщательному мониторингу во время разработки лекарственных средств (Wang et al., J. Pharm. Sci., 2007, 96, 1-26; Manning et al., Pharm Res. 2010, 27, 544-557). Окисление двух консервативных остатков Met, расположенных на границе константных доменов тяжелой цепи 2 (CH2) и 3 (CH3) в большинстве антител IgG, может снижать термостабильность (Houde et al., Mol. Cell. Proteomics., 2010, 9, 1716-1728), связывание белка А (Bertolotti-Ciarlet et al., Mol. Immunol., 2009, 46, 1878-1882), связывание FcRn (Zhang et al., Anal. Chem., 2014, 86, 3468-3475) и период полужизни антител IgG из кровотока (Wang et al., Mol. Immunol., 2011, 48, 860866), тогда как окисление Met или триптофана (Trp) и дезамидирование Asn в подверженных действию растворителя CDR потенциально могут влиять на связывание антигена и активность (Wei et al., J. Pharm. Sci., 2009, 98, 3509-3521; Yan et al., J. Pharm. Sci., 2009, 98, 3509-3521). N-связанное гликозилирование по консервативному Asn тяжелой цепи CH2 в Fc-области антител также важно для поддержания структуры и стабильности mAb и в некоторых случаях может регулировать последующие эффекторные функции, такие как комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC) и антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) посредством модулирования связывания с FCY-рецепторами (Jennewein, M.F., Alter, G., Trends in Immunology., 2017, 38, 358-372). Следовательно, важно охарактеризовать и контролировать уровни ПТМ, особенно тех, которые считаются CQA, во время разработки, производства и хранения терапевтических антител, чтобы обеспечить качество продукта и определить любое потенциальное влияние на конечную безопасность и эффективность.
Пептидное картирование методом жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ-МС) используется в биофармацевтической промышленности для получения характеристики терапевтических антител на молекулярном уровне (Beck et al., Anal. Chem., 2013, 85, 715-736; Sandra, K. et al., J. Chromatogr. A., 2014, 1335, 81-103). В этом методе используется восходящая методика, включающая ферментативное (т.е. обычно трипсиновое) расщепление белков в невосстанавливающих (пептидное картирование в невосстанавливающих условиях) или восстанавливающих (пептидное картирование в восстанавливающих условиях) условиях с последующим разделением полученных пептидов и анализом с использованием ультрафиолетового (УФ) детектирования и/или масс-спектрометрии (МС), что обеспечивает преимущества оценки структурной целостности, поддерживаемой межцепочечными и внутрицепочечными дисульфидными связями, подтверждения аминокислотной последовательности белка и обеспечения сайт-специфического количественного анализа при посттрансляционных и химических модификациях, которые могут возникнуть во время производства, обработки или хранения (Mouchahoir, T., Schiel, J.E., Anal. Bioanal. Chem., 2018, 410, 2111-2126).
- 1 047087
В методе пептидного картирования на основе ЖХ-МС для анализа ПТМ количественное определение сайт-специфических ПТМ осуществляют по спектрам МС1 ферментативных гидролизатов путем расчета отношения площади пика хроматограммы выбранного иона (EIC) модифицированного пептида, содержащего ПТМ, к сумме площади пиков EIC соответствующего нативного пептида и модифицированного пептида. Несмотря на то, что оптимизированный рабочий процесс пептидного картирования может обеспечить высокий охват последовательностей и позволить эффективно охарактеризовать множество показателей (например, различные сайт-специфические ПТМ) образца антитела в одном цикле ЖХ-МС благодаря быстрому развитию инструментов ЖХ-МС и программного обеспечения для биоинформатики, это традиционный подход без использования меток для относительного количественного определения сайт-специфических ПТМ требует подготовки образцов и сбора массспектрометрических данных для отдельных образцов, что может занимать значительное время, затрудняя удовлетворение постоянно растущих потребностей в получении характеристики моноклональных антител в процессе разработки лекарственных средств. Недавние достижения в области технологии пептидного картирования были в основном сосредоточены на повышении эффективности подготовки образцов, например, разработке автоматизированной системы для увеличения пропускной способности или встроенной в поток системы расщепления для сокращения времени подготовки образцов (Richardson et al., Anal. Biochem., 2011, 411, 284-291; Cao et al., J. Pharm. Sci., 2019, 108, 3540-3549; и Mao et al., mAbs. 2019, 11, 767-778), однако, когда размер образца увеличивается, время работы прибора, необходимое для сбора данных ЖХ-МС образцов, также увеличивается линейным образом, что не только ограничивает общую эффективность технологического процесса пептидного картирования для получения характеристики белков, но также может привести к большой изменчивости количественного определения ПТМ в результате колебаний работы прибора, связанных со временем и температурой, аппаратных и программных сбоев прибора или нарушения стабильности при хранения образца в автоматическом пробоотборнике во время ЖХ-МС анализа гидролизатов при пептидном картировании.
Краткое описание изобретения
В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ количественного определения множества показателей качества множества образцов в одном цикле масс-спектрометрии (МС), включающий приведение двух или более образцов в контакт с расщепляющим раствором в условиях, достаточных для расщепления двух или более образцов, где каждый образец расщепляется отдельно, и расщепляющий раствор представляет собой буферный раствор, не содержащий трис-буфера; приведение каждого из двух или более расщепленных образцов в контакт со специфическим реагентом для мечения тандемной массовой меткой (TMT) в условиях, достаточных для мечения пептидов в каждом из двух или более расщепленных образцов с использованием специфического реагента для мечения TMT; гашение мечения пептидов в каждом из двух или более расщепленных образцов; объединение равных объемов двух или более меченых расщепленных образцов в раствор одного объединенного образца; и анализ раствора одного объединенного образца с использованием нацеленного масс-спектрального анализа, с обеспечением таким образом возможности количественного определения множества показателей качества двух или более образцов в одном цикле масс-спектрометрии (МС).
В некоторых вариантах осуществления множество показателей качества включают посттрансляционную модификацию (ПТМ).
В некоторых вариантах осуществления ПТМ включает одно или более из дезамидирования, окисления, гликирования, образования дисульфидных связей, образования N-концевого пироглутамата, удаления C-концевого лизина и гликозилирования.
В некоторых вариантах осуществления ПТМ включает гликозилирование.
В некоторых вариантах осуществления количественное определение множества показателей качества в одном цикле МС включает количественное определение ПТМ путем количественного определения относительного содержания ПТМ из площадей выбранных пиков полученного репортерного иона, генерированного в целевых масс-спектрах.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает приведение каждого из двух или более расщепленных образцов в контакт с низкомолекулярной добавкой перед приведением каждого из двух или более расщепленных образцов в контакт со специфическим реагентом для мечения TMT.
В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярная добавка выбрана из группы, состоящей из BOC-Y -OH, п-крезола, гидроксифенилуксусной кислоты (HPAA), гидроксибензойной кислоты (HBA), ацетаминофена и п-аминобензойной кислоты (PABA).
В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярная добавка представляет собой PABA.
В некоторых вариантах осуществления пептиды представляют собой гликопептиды.
В некоторых вариантах осуществления гликопептиды получены из моноклонального антитела.
В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело относится к изотипу IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или смешанному изотипу.
В некоторых вариантах осуществления два или более образцов представляют собой от 2 до 16 образцов.
- 2 047087
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает получение двух или более образцов для анализа.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает подготовку двух или более образцов для расщепления перед приведением двух или более образцов в контакт с расщепляющим раствором в условиях, достаточных для расщепления двух или более образцов.
В некоторых вариантах осуществления подготовка двух или более образцов перед расщеплением включает приведение каждого из двух или более образцов в контакт с денатурирующим и восстанавливающим раствором в условиях, которые обеспечивают денатурацию и восстановление образца; и приведение каждого из двух или более денатурированных и восстановленных образцов в контакт с алкилирующим раствором в условиях, которые обеспечивают алкилирование образца.
В некоторых вариантах осуществления анализ раствора одного объединенного образца с использованием нацеленного масс-спектрального анализа включает нанесение одного объединенного образца на разделительную колонку и проведение направленного масс-спектрального анализа элюированных компонентов образца.
В некоторых вариантах осуществления разделительная колонка представляет собой колонку для жидкостной хроматографии.
В некоторых вариантах осуществления проведение нацеленного масс-спектрального анализа элюированных компонентов образца включает применение ионизации электрораспылением для генерирования заряженных ионов из элюированных компонентов образца и измерение генерированных заряженных ионов.
В одном аспекте изобретения способ количественного определения посттрансляционных модификаций (ПТМ) множества образцов в одном цикле масс-спектрометрии (МС) включает приведение двух или более образцов в контакт с расщепляющим раствором в условиях, достаточных для расщепления двух или более образцов, где каждый образец расщепляется отдельно, и расщепляющий раствор представляет собой буферный раствор, не содержащий трис-буфера; приведение каждого из двух или более расщепленных образцов в контакт с низкомолекулярной добавкой; приведение каждого из двух или более расщепленных образцов в контакт со специфическим реагентом для мечения тандемной массовой меткой (TMT) в условиях, достаточных для мечения пептидов в каждом из двух или более расщепленных образцов с использованием специфического реагента для мечения TMT; гашение мечения пептидов в каждом из двух или более расщепленных образцов; объединение равных объемов двух или более меченых расщепленных образцов в раствор одного объединенного образца; и анализ раствора одного объединенного образца с использованием нацеленного масс-спектрального анализа, с обеспечением таким образом возможности количественного определения ПТМ двух или более образцов в одном цикле МС.
В некоторых вариантах осуществления ПТМ включает одно или более из дезамидирования, окисления, гликирования, образования дисульфидных связей, образования N-концевого пироглутамата, удаления C-концевого лизина и гликозилирования.
В некоторых вариантах осуществления ПТМ включают гликозилирование.
В некоторых вариантах осуществления количественное определение ПТМ включает количественное определение относительного содержания ПТМ из площадей выбранных пиков полученного репортерного иона, генерированного в целевых масс-спектрах.
В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярная добавка выбрана из группы, состоящей из BOC-Y -OH, п-крезола, гидроксифенилуксусной кислоты (HPAA), гидроксибензойной кислоты (HBA), ацетаминофена и п-аминобензойной кислоты (PABA).
В некоторых вариантах осуществления низкомолекулярная добавка представляет собой PABA.
В некоторых вариантах осуществления пептиды представляют собой гликопептиды.
В некоторых вариантах осуществления гликопептиды получены из моноклонального антитела.
В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело относится к изотипу IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или смешанному изотипу.
В некоторых вариантах осуществления два или более образцов представляют собой от 2 до 16 образцов.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает получение двух или более образцов для анализа.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает подготовку двух или более образцов для расщепления перед приведением двух или более образцов в контакт с расщепляющим раствором в условиях, достаточных для расщепления двух или более образцов.
В некоторых вариантах осуществления подготовка двух или более образцов перед расщеплением включают приведение каждого из двух или более образцов в контакт с денатурирующим и восстанавливающим раствором в условиях, которые обеспечивают денатурацию и восстановление образца; и приведение каждого из двух или более денатурированных и восстановленных образцов в контакт с алкилирующим раствором в условиях, которые обеспечивают алкилирование образца.
В некоторых вариантах осуществления анализ раствора одного объединенного образца с
- 3 047087 использованием нацеленного масс-спектрального анализа включает нанесение одного объединенного образца на разделительную колонку и проведение направленного масс-спектрального анализа элюированных компонентов образца.
В некоторых вариантах осуществления разделительная колонка представляет собой колонку для жидкостной хроматографии.
В некоторых вариантах осуществления проведение нацеленного масс-спектрального анализа элюированных компонентов образца включает применение ионизации электрораспылением для генерирования заряженных ионов из элюированных компонентов образца и измерение генерированных заряженных ионов.
В различных вариантах реализации любые из признаков или компонентов вариантов осуществления, обсуждаемых выше или далее в настоящем изобретении, можно комбинировать, и такие комбинации входят в объем настоящего изобретения. Любое конкретное значение, обсуждаемое выше или далее в настоящем изобретении, может быть комбинировано с другим взаимосвязанным значением, обсуждаемым выше или далее в настоящем изобретении, для определения диапазона, в котором указанные значения представляют собой верхний и нижний пределы диапазона, и такие диапазоны и все значения, входящие в такие диапазоны, входят в объем настоящего изобретения. Каждое из значений, обсуждаемых выше или далее в настоящем изобретении, может быть указано с отклонением в 1, 5, 10 или 20%. Например, концентрация 10 мМ может быть указана как 10±0,1 мМ (отклонение в 1%), 10±0,5 мМ (отклонение в 5%), 10±1 мМ (отклонение в 10%) или 10±2 мМ (отклонение в 20%). Другие варианты осуществления будут очевидны после прочтения следующего подробного описания изобретения.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1A и 1B показано влияние NCE (35-70) на содержание репортерного иона двух репрезентативных меченых ТМТ пептидов в mAb-A (фиг. 1A) и на относительное количественное определение различных типов ПТМ в mAb-A наряду с количественными результатами по ПТМ, полученными с использованием традиционного подхода (фиг. 1B). На фиг. 1B порядок столбцов слева направо для каждой сайт-специфической ПТМ представляет собой следующий: контроль (без TMT), NCE 35, NCE 40, NCE 50, NCE 55, NCE 60, NCE 70.
На фиг. 2A и 2B показано влияние NCE (35-100) на количественное определение гликозилирования Lys в mAb-B (фиг. 2A) и влияние NCE (27-100) на количественное определение пироглутамата при Nконцевом Glu в mAb-B (фиг. 2B). Черные планки погрешностей: среднеквадратическое отклонение процентов ПТМ в двух параллельных анализах. Порядок столбцов на фиг. 2A (слева направо): контроль (без TMT), NCE 35, NCE 40, NCE 50, NCE 55, NCE 60, NCE 70, NCE 80, NCE 90 и NCE 100. Порядок столбцов на фиг. 2B (слева направо): контроль (без TMT), NCE 27, NCE 30, NCE 35, NCE 40, NCE 50, NCE 55, NCE 60, NCE 70, NCE 80, NCE 90 и NCE 100.
На фиг. 3A и 3B показано влияние NCE (35-80) на количественную оценку трисульфидных связей в IgG1 mAb-C (фиг. 3A) и IgG4 mAb-D (фиг. 3B) наряду с количественными результатами, полученными с использованием традиционного подхода.
На фиг. 4A показана оценка относительного количественного определения четырех ПТМ в mAb-E в шести каналах ТМТ при соотношении 1:1:1:1:1:1. Объединенные образцы, меченые ТМТ, были получены из трех определений и проанализированы с использованием ЖХ-МС/МС в двух параллельных анализах. Ящичковые диаграммы показывают среднее значение (более крупная точка), процентиль от 25- до 75-го (ящик) и процентиль от 5- до 95-го (усы). Проценты ПТМ, рассчитанные с использованием традиционного подхода, обозначены пунктирными линиями.
На фиг. 4B показана оценка воспроизводимости относительного количественного определения четырех ПТМ в mAb-E в шести каналах ТМТ при соотношении 1:1:1:1:1:1. Объединенные образцы, меченые ТМТ, были получены из трех определений и проанализированы с использованием ЖХ-МС/МС в двух параллельных анализах. Ящичковые диаграммы показывают среднее значение (точка), 25- и 75-й процентиль (ящик) и 5- и 95-й процентиль (усы). Проценты ПТМ, рассчитанные с использованием традиционного подхода, обозначены пунктирными линиями.
На фиг. 5 показана оценка чувствительности относительного количественного определения четырех ПТМ в mAb-A в шести каналах ТМТ при соотношении 1:2:4:8:16:32. Объединенные образцы, меченые ТМТ, были получены из трех определений и проанализированы с использованием ЖХ-МС/МС в двух параллельных анализах. Ящичковые диаграммы показывают среднее значение (точка), 25- и 75-й процентиль (ящик) и 5- и 95-й процентиль (усы). Проценты ПТМ, рассчитанные с использованием традиционного подхода, обозначены пунктирными линиями.
На фиг. 6 показано количественное определение ПТМ в образцах mAb-A, подвергнутых принудительной деградации, с использованием подхода на основе целевой МС/МС (сплошные столбцы) и традиционного подхода (полосатые столбцы). Черные планки погрешностей: среднеквадратическое отклонение процентов ПТМ в двух параллельных анализах. Порядок столбцов слева направо для каждой сайт-специфической ПТМ представляет собой: mAb-A-S0 (без TMT), mAb-A-S0 (TMT-126), mAb-A-S1 (без TMT), mAb-A-S1 (TMT-127), mAb-A-S2 (без TMT), mAb-A-S2 (TMT-128), mAb-A-S3 (без TMT),
- 4 047087 mAb-A-S3 (TMT-129), mAb-A-S4 (без TMT), mAb-A-S4 (TMT-130), mAb-A-S5 (без TMT), mAb-A-S5 (TMT-131).
На фиг. 7A и 7B показано количественное определение ПТМ образцов для оценки сопоставимости mAb-F, изготовленных на различных технологических площадках, с использованием подхода на основе целевой МС/МС (сплошные столбцы) и традиционного подхода (полосатые столбцы). На фиг. 7A показаны ПТМ с уровнями >2,5%, а на фиг. 7B показаны ПТМ с уровнями <2,5%. Черные планки погрешностей: среднеквадратическое отклонение процентов ПТМ в двух параллельных анализах. Порядок столбцов слева направо для каждой сайт-специфической ПТМ для обеих фиг. 7A и 7B представляет собой следующий: mAb-F-P1 (без TMT), mAb-F-P1 (TMT-128), mAb-F-P2 (без TMT), mAbF-P2 (TMT-129), mAb-F-P3 (без TMT), mAb-F-P3 (TMT-130), mAb-F-P4 (без TMT), mAb-F-P4(TMT-131).
На фиг. 8 показано количественное определение трисульфидных связей в стандартных образцах для оценки трисульфидных связей mAb-E с использованием подхода на основе целевой МС/МС (сплошные столбцы) и традиционного подхода (полосатые столбцы). Трисульфидные стандарты mAb-E с различными уровнями трисульфидных связей были получены путем смешивания образца, подвергнутого воздействию H2S, и эталонного стандартного образца в различных соотношениях. mAb-E-TS0 (100:0), mAb-E-TS1 (75:25), mAb-E-TS2 (50:50), mAb-E-TS3 (25:75) и mAb-E-TS4 (0:100).
На фиг. 9 показано влияние различных низкомолекулярных добавок во время мечения ТМТ на относительное содержание меченых ТМТ фрагментов с разными метками ТМТ и разными изоформами для пептида WQQG (остатки 1-4 SEQ ID NO: 3) и пептида TTPP (остатки 1-4 SEQ ID NO: 4). Сайты мечения ТМТ у каждого фрагменты были выделены (выделение жирным шрифтом). Boc-Y: Н-(третбутоксикарбонил)-тирозин; HPAA: 4-гидроксифенилуксусная кислота; HBA: 4-гидроксибензойная кислота; PABA: 4-аминобензойная кислота.
На фиг. 10 показана структура иллюстративной тандемной массовой метки и иллюстративных реагентов тандемной массовой метки.
На фиг. 11 показано химические структуры иллюстративных реагентов, предотвращающих избыточное мечение - BOC-Y-OH, п-крезола, гидроксифенилуксусной кислоты (HPAA), гидроксибензойной кислоты (HBA), ацетаминофена и/или п-аминобензойной кислоты (PABA).
Подробное описание изобретения
Обращаясь к описанию настоящего изобретения, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными описанными способами и условиями экспериментов, так как указанные способы и условия могут варьироваться. Также следует исходить из того, что используемая в настоящем изобретении терминология предназначена только для описания частных вариантов осуществления и не подразумевает ограничительного характера, так как объем настоящего изобретения ограничен только прилагаемой формулой изобретения. Любые варианты осуществления или признаки вариантов осуществления могут быть комбинированы друг с другом, и такие комбинации явным образом входят в объем настоящего изобретения.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют значение, обычно понимаемое специалистом в области техники, к которой относится данное изобретение. В контексте настоящего изобретения термин приблизительно при использовании в отношении конкретного приведенного числового значения означает, что это значение может отличаться от приведенного значения не более чем на 1%. Например, в контексте настоящего изобретения выражение приблизительно 100 включает 99 и 101, и все значения между ними (например, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 и т.д.).
Хотя любые методы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем изобретении, могут использоваться при практическом осуществлении или испытании настоящего изобретения, предпочтительные методы и материалы описаны далее. Содержание всех патентов, заявок и непатентных публикаций, упомянутых в настоящем описании, включено в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме.
Сокращения, используемые в настоящем изобретении.
ACN: ацетонитрил;
ADCC: антителозависимая клеточная цитотоксичность;
Asn: аспарагин;
AUC: площадь под кривой;
Boc-Y: №(трет-бутоксикарбонил)-тирозин;
CDC: комплемент-зависимая цитотоксичность;
CDR: область, определяющая комплементарность;
CQA: критические показатели качества;
CV: коэффициент вариации;
EIC: хроматограмма выбранного иона;
ELISA: твердофазный иммуноферментный анализ;
ESI-МС: масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением;
FA: муравьиная кислота;
FDA: управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов;
- 5 047087
FLR: флуоресцентное детектирование;
HBA: 4-гидроксибензойная кислота;
HC: тяжелая цепь;
HILIC: жидкостная хроматография гидрофильного взаимодействия;
HPAA: 4-гидроксифенилуксусная кислота;
IgG: иммуноглобулин G;
LC: легкая цепь;
ЖХ-МС: жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией;
mAb: моноклональное антитело;
Met: метионин;
МС: масс-спектрометрия;
MW: молекулярная масса;
NCE: нормированная энергия столкновения;
PABA: 4-аминобензойная кислота;
ФК: фармакокинетика;
PROCA: прокаинамид;
PQA: показатель качества продукта;
ПТМ: посттрансляционная модификация;
ОФ-ЖХ-МС/МС: обращенно-фазовая жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией;
ТФЭ: твердофазная экстракция;
TCEP-HCl: трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид ;
TFA: трифторуксусная кислота;
TMT: тандемная массовая метка;
УФ: ультрафиолет.
Определения.
Термин антитело в контексте настоящего изобретения относится к молекулам иммуноглобулина, состоящим из четырех полипептидных цепей: двух тяжелых (H) цепей и двух легких (L) цепей, связанных между собой дисульфидными связями (т.е. молекулам полноразмерного антитела), а также их мультимерам (например, IgM) или их антигенсвязывающим фрагментам. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи (состоящей из доменов CH1, CH2 и CH3). В различных вариантах осуществления тяжелая цепь может относиться к изотипу IgG. В некоторых случаях тяжелая цепь выбрана из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь относится к изотипу IgG1 или IgG4, необязательно включая химерную шарнирную область изотипа IgG1/IgG2 или IgG4/IgG2. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (LCVR или VL) и константной области легкой цепи (CL). В областях VH и VL можно дополнительно выделить области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), которые перемежаются с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Термин антитело включает ссылку как на гликозилированные, так и на негликозилированные иммуноглобулины любого изотипа или подкласса. Термин антитело включает молекулы антител, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные рекомбинантными методами, такие как антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансфицированной для экспрессии антитела. Обзор структуры антител см. в источниках Lefranc et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains, 27(1) Dev., Comp. Immunol., 55-77 (2003); и M. Potter, Structural correlates of immunoglobulin diversity, 2(1), Surv. Immunol. Res., 27-42 (1983).
Термин антитело также охватывает биспецифичное антитело, которое включает гетеротетрамерный иммуноглобулин, который может связываться с несколькими разными эпитопами. Одна половина биспецифичного антитела, которая включает одну тяжелую цепь и одну легкую цепь и шесть CDR, связывается с одним антигеном или эпитопом, а другая половина антитела связывается с другим антигеном или эпитопом. В некоторых случаях биспецифичное антитело может связывать один и тот же антиген, но разные эпитопы или неперекрывающиеся эпитопы. В некоторых случаях обе половины биспецифичного антитела имеют идентичные легкие цепи, сохраняя при этом двойную специфичность. Биспецифичные антитела в общих чертах описаны в публикации патентной заявки США № 2010/0331527 (30 декабря 2010 г.).
Термин антигенсвязывающая часть антитела (или фрагмент антитела) относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином антигенсвязывающая часть антитела, включают (i) Fab-фрагмент - одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')2-фрαгмент - двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; (v) фрагмент dAb (Ward et al.
- 6 047087 (1989), Nature, 241:544-546), состоящий из домена VH; (vi) выделенную CDR; и (vii) scFv, состоящий из двух доменов Fv-фрагмента, VL и VH, соединенных синтетическим линкером с образованием единой белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются, образуя одновалентные молекулы. Другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела, также охватываются термином антитело (см., например, источники Holliger et al. (1993), 90, PNAS U.S.A., 6444-6448; и Poljak et al. (1994), 2, Structure, 1121-1123).
Кроме того, антитела и их антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с использованием стандартных технологий рекомбинантной ДНК, широко известных в данной области техники (см. источник Sambrook et al., 1989). В данной области техники также известны способы получения человеческих антител у трансгенных мышей. С использованием технологии VELOCIMMUNE® (см., например, патент США № 6596541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) или любого другого известного способа получения моноклональных антител, сначала выделяют высокоаффинные химерные антитела к желаемому антигену, имеющие человеческую вариабельную область и мышиную константную область. Технология VELOCIMMUNE® включает создание трансгенной мыши, геном которой содержит человеческие вариабельные области тяжелой и легкой цепи, функционально связанные с эндогенными локусами мышиной константной области, так что мышь продуцирует антитело, содержащее человеческую вариабельную область и мышиную константную область, в ответ на антигенную стимуляцию. ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела, выделяют и функционально связывают с ДНК, кодирующей человеческие константные области тяжелой и легкой цепи. Затем ДНК экспрессируют в клетке, способной экспрессировать полностью человеческое антитело.
Подразумевается, что термин человеческое антитело включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, происходящие из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Человеческие mAb согласно изобретению могут содержать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные путем случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или соматической мутации in vivo), например, в CDR и, в частности, в CDR3. В то же время термин человеческое антитело в контексте настоящего изобретения не предполагает включение mAb, в которых последовательности CDR, происходящие из зародышевой линии других видов млекопитающих (например, мыши), были привиты на человеческие последовательности FR. Указанный термин включает антитела, рекомбинантно продуцированные в организме млекопитающего, не являющегося человеком, или в клетках млекопитающего, не являющегося человеком. Указанный термин не предполагает включение антител, выделенных из или полученных в организме субъекта-человека.
В контексте настоящего изобретения термин субъект относится к животному, предпочтительно млекопитающему, более предпочтительно человеку, нуждающемуся, например, в облегчении, предупреждении и/или лечении заболевания или расстройства.
Посттрансляционная модификация (ПТМ) относится к ковалентной модификации белков после биосинтеза белка. Посттрансляционные модификации могут иметь место на боковых цепях аминокислот или на С- или N-концах белка. Примеры посттрансляционных модификаций антител включают дезамидирование, окисление, гликирование, образование дисульфидных связей, образование N-концевого пироглутамата, удаление C-концевого лизина и гликозилирование.
Термин тандемная массовая метка (TMT) представляет собой химическую метку, используемую для количественного определения и идентификации биологических макромолекул, таких как белки, пептиды и нуклеиновые кислоты, на основе масс-спектрометрии (МС). ТМТ принадлежит к семейству реагентов, называемых изобарическими массовыми метками. Они представляют собой альтернативу количественному определению на основе геля или антител, но также могут применяться в сочетании с этими и другими методами. Помимо помощи в количественном определении белка, метки TMT также могут повысить чувствительность обнаружения некоторых высокогидрофильных аналитов, таких как фосфопептиды, в анализах ОФ-ВЭЖХ-МС. В настоящее время коммерчески доступны шесть разновидностей ТМТ (Thermo Fisher Scientific, Алтам, Массачусетс, США): TMTzero - коровая структура без изотопного замещения; TMTduplex - изобарическая пара массовых меток с одним изотопным замещением; TMTsixplex - изобарический набор из шести массовых меток с пятью изотопными замещениями; TMT 10-plex - набор из 10 изотопных массовых меток, в которых используется репортерная область TMTsixplex, но изотоп другого элемента для создания разницы масс в 0,0063 Да, TMTpro - версия 16 plex с репортером и нормализатором массы, отличным от исходной TMT, и TMTpro Zero. Метки содержат четыре области, а именно область репортера массы (M), область расщепляемого линкера (F), область нормирования массы (N) и группу, реагирующую с белком (R). Химические структуры всех меток идентичны, но каждая из них содержит изотопы, замещающие в различных положениях, так что области репортера массы и нормирования массы имеют разные молекулярные массы в каждой метке. В совокупности области M-F-N-R меток имеют одинаковую общую молекулярную массу и структуру, поэтому при хроматографическом или электрофоретическом
- 7 047087 разделении и в режиме одноступенчатой МС молекулы, меченые разными метками, неразличимы. При фрагментации в режиме МС/МС информацию о последовательности получают из фрагментации пептидного остова, и одновременно получают данные количественного определения из фрагментации меток, дающей масс-репортерные ионы.
В контексте настоящего изобретения термин гликопептид/гликопротеин представляет собой модифицированный пептид/белок во время или после их синтеза с ковалентно связанными углеводами или гликаном. В отдельных вариантах осуществления гликопептид получают из моноклонального антитела, например, из протеазного гидролизата моноклонального антитела.
В контексте настоящего изобретения термин гликан представляет собой соединение, содержащее одно или более сахарных звеньев, которые обычно включают глюкозу (Glc), галактозу (Gal), маннозу (Man), фукозу (Fuc), N-ацетилгалактозамин (GalNAc), N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) и N-ацетилнейраминовую кислоту (NeuNAc) (Frank Kjeldsen et al., Anal. Chem., 2003, 75, 2355-2361). Гликановый фрагмент в гликопротеине, таком как моноклональное антитело, является важной особенностью для определения его функции или клеточной локализации. Например, определенное моноклональное антитело модифицировано определенным гликановым фрагментом.
В контексте настоящего изобретения термин образец относится к смеси молекул, которая содержит по меньшей мере молекулу анализируемого вещества, например, гликопептид, например, полученный из моноклонального антитела, который подвергается манипуляции в соответствии со способами согласно изобретению, включая, например, разделение, анализ, экстракцию, концентрирование или профилирование.
В контексте настоящего изобретения термины анализ или проведение анализа используются взаимозаменяемо и относятся к любому из различных методов разделения, обнаружения, выделения, очистки, солюбилизации, обнаружения и/или получения характеристики представляющих интерес молекул (например, пептидов). Примеры включают, не ограничиваясь перечисленным, твердофазную экстракцию, твердофазную микроэкстракцию, электрофорез, масс-спектрометрию, например, ESI-МС (масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением), SPE HILIC (жидкостная хроматография гидрофильного взаимодействия с твердофазной экстракцией) или MALDI-MS (масс- спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией), жидкостную хроматографию, например, высокоэффективную, например, обращенно-фазовую, нормально-фазовую или эксклюзионную, ионпарную жидкостную хроматографию, жидкостно-жидкостную экстракцию, например, ускоренную жидкостную экстракцию, сверхкритическую флюидную экстракцию, микроволновую экстракцию, мембранную экстракцию, экстракцию в аппарате Сокслета, осаждение, осветление, электрохимическое обнаружение, окрашивание, элементный анализ, деградацию по Эдмунду, ядерный магнитный резонанс, инфракрасный спектральный анализ, проточно-инжекционный анализ, капиллярную электрохроматографию, УФ-детектирование и их комбинации.
Термин профилирование в контексте настоящего изобретения относится к любому из различных методов анализа, которые используются в комбинации для определения содержания, состава или характеристического соотношения белков, таких как пептид, в образце.
Приведение в контакт в контексте настоящего изобретения включает соединение по меньшей мере двух веществ в растворе или твердой фазе.
Целевая масс-спектрометрия в контексте настоящего изобретения представляет собой метод массспектрометрии, в котором используется множество стадий тандемной масс-спектрометрии (MCn с n=2 или 3) для ионов определенной массы (m/z) в определенное время. Значения m/z и времени определены в списке включения, полученном на основе предыдущего анализа.
Тандемная масс-спектрометрия, также известная как МС/МС или МС2, представляет собой метод инструментального анализа, при котором два или более масс-спектрометров соединяют друг с другом с использованием дополнительной стадии реакции для увеличения их способности анализировать химические образцы. Обычно тандемную МС применяют для анализа биомолекул, таких как белки и пептиды. Молекулы отдельно взятого образца ионизируются, и первый спектрометр (обозначаемый МС1) разделяет эти ионы по их отношению массы к заряду (часто обозначаемому как m/z или m/Q). Ионы с определенным отношением m/z, поступающие из МС1, отбираются, а затем расщепляются на более мелкие фрагментные ионы, например, путем диссоциации, вызванной столкновением, ионмолекулярной реакции или фотодиссоциации. Эти фрагменты затем вводятся во второй массспектрометр (МС2), который, в свою очередь, разделяет фрагменты по их отношению m/z и осуществляет их детекцию. Стадия фрагментации позволяет идентифицировать и разделять ионы, которые имеют очень близкие отношения m/z, в обычных масс-спектрометрах.
Общее описание.
Пептидное картирование в сочетании с жидкостной хроматографией с тандемной массспектрометрией (ЖХ-МС) стало ключевым аналитическим методом для количественного определения показателей качества (например, посттрансляционных модификаций (ПТМ)) моноклональных антител во время разработки лекарственных средств. Тем не менее традиционный безметочный подход к относительному количественному определению ПТМ требует большого количества времени работы
- 8 047087 прибора для сбора данных ЖХ-МС отдельных расщепленных образцов, что ограничивает эффективность метода пептидного картирования, особенно с учетом постоянно растущей потребности в получении характеристики белков.
Таким образом, существует потребность в способах получения характеристики белков с повышенной эффективностью. Раскрытое изобретение удовлетворяет эту потребность.
В настоящем изобретении раскрыт новый подход, основанный на тандемной массовой метке (ТМТ), в сочетании с целевой масс-спектрометрией для мультиплексного сайт-специфического количественного определения ПТМ белков, включая моноклональные антитела. Этот новый способ основан на исследованиях, о которых сообщается в настоящем изобретении, в которых авторы изобретения неожиданно обнаружили, что этот подход позволяет проводить одновременное количественное определение показателей качества (например, ПТМ) для множества образцов в одном цикле ЖХ-МС. В частности, с использованием этого способа множество образцов расщепленных антител химически метят вариантами тандемных массовых меток, объединяют в равном объеме, а затем анализируют с использованием целевой масс-спектрометрии. Дифференцированно меченые пептиды неразличимы в полном МС спектре интактных пептидов из-за одинаковой молекулярной структуры и массы каждого варианта, но каждый меченый вариант пептида дает уникальный репортерный ион в спектре МС/МС при фрагментации внутри масс-спектрометра, таким образом, позволяя различать пептид в разных образцах и отображая содержание пептида в соответствующем образце. Относительное содержание ПТМ в каждом образце количественно определяют по площадям выбранных пиков полученного репортерного иона, генерированного из соответствующих дифференцированно меченых нативных и модифицированных пептидов в спектрах целевой МС/МС, что позволяет одновременно количественно определять множество показателей качества (например, ПТМ) для множества образцов, например, до 16-плексного определения, что обусловлено текущей способностью мультиплексирования коммерчески доступного реагента ТМТ, в одном цикле ЖХ-МС, что обеспечивает значительное сокращение времени сбора данных и варьирования результатов количественного определения ПТМ от цикла к циклу.
В некоторых вариантах осуществления способ включает получение ТМТ-пептидов. В некоторых вариантах осуществления подготовка образца включает приведение образца в контакт с денатурирующим и восстанавливающим раствором в условиях, которые обеспечивают денатурацию и восстановление образца; приведение денатурированного и восстановленного образца в контакт с алкилирующим раствором в условиях, которые обеспечивают алкилирование образца; приведение алкилированного образца в контакт с расщепляющим раствором в условиях, которые обеспечивают расщепление образца и мечение ТМТ; и приведение расщепленного образца в контакт с гасящим раствором в условиях, которые останавливают расщепление образца. Полученные ТМТ-пептиды затем могут быть проанализированы, например, с использованием ЖХ-МС.
В некоторых вариантах осуществления приведение образца в контакт с расщепляющим раствором в условиях, которые обеспечивают расщепление, включает следование стандартному протоколу расщепления, за исключением того, что его проводят в буфере, не содержащем трис-буфера, например, в натрий-фосфатном буфере (PBS), pH от 7,5 до 8. В некоторых вариантах осуществления рН раствора PBS регулируют перед добавлением реагента ТМТ в расщепляющий раствор. Наборы тандемных массовых меток (TMT) представляют собой реагенты, которые легко реагируют с пептидами (N-концом и лизином, любым основным NH2); имеют эквивалентную молекулярную массу (одинаковую массу МС1); и генерируют разные репортерные фрагментные ионы МС2 из-за распределения тяжелых атомов вокруг каждой метки. Иллюстративные ТМТ представлены на фиг. 10 и коммерчески доступны от Thermo Fisher Scientific (Уолтем, Массачусетс, США). Хотя известно, что коммерчески доступные ТМТ реагируют только с NH2-группами (N-конец, лизин), авторы настоящего изобретения обнаружили, что ТМТ также могут в значительной степени реагировать с ОН-группами (тирозин, треонин, серин). Эта реакционная способность вызывала сложности, поскольку усложняла интегрирование, расщепляя каждый пептид на множество форм, уменьшая сигнал каждого пика и приводя к избыточному мечению ТМТ. Раскрытый в настоящем изобретении способ устраняет эти ограничения путем добавления низкомолекулярной добавки в высокой концентрации (например, 100 моль низкомолекулярной добавки/моль пептида), что позволяет ТМТ по-прежнему быстро реагировать с КИ2-группами пептидов, но перенаправляет избыток ТМТ от пептидов, что позволяет большинству ТМТ-пептидов существовать в одной форме и легче интегрироваться. В некоторых примерах эта низкомолекулярная добавка представляет собой BOC-Y -OH, п-крезол, гидроксифенилуксусную кислоту (HPAA), гидроксибензойную кислоту (HBA), ацетаминофен и/или п-аминобензойную кислоту (PABA). Химические структуры этих реагентов представлены на фиг. 11. В некоторых вариантах осуществления способ включает добавление низкомолекулярной добавки к образцу гидролизата перед добавлением каждого реагента ТМТ. Каждый реагент ТМТ, такой как коммерчески доступные реагенты ТМТ от Thermo Fisher Scientific, растворяют в ACN, добавляют к каждому образцу белка и оставляют для инкубации, например, при комнатной температуре в течение 1 ч. Все реакции гасят, например гасят до рН менее 4 перед объединением в один образец, и затем оценивают с использованием ЖХ-МС. В некоторых вариантах осуществления способ включает подготовку образца
- 9 047087 для ввода пробы для ЖХ и его оценку путем проведения целевой МС2.
Раскрытый в настоящем изобретении способ может быть использован с пептидным картированием в восстанавливающих (% ПТМ) и невосстанавливающих (% трисульфидных связей) условиях. В различных вариантах осуществления для пептидного картирования в невосстанавливающих условиях ингибитор избыточного мечения, такой как PABA, не требуется, поскольку невосстановленные пептиды не подвержены избыточному мечению.
В некоторых вариантах осуществления образец содержит пептиды. Например, образец включает пептиды с ПТМ. В некоторых вариантах осуществления пептиды представляют собой гликопептиды, такие как гликопептиды, полученные из моноклонального антитела. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело относится к изотипу IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или смешанному изотипу.
В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой моноклональное антитело, а расщепляющий раствор содержит одну или более протеаз, таких как трипсин. В некоторых примерах способ применяют для получения характеристики/анализа гликопептидов, таких как гликопептиды, полученные из моноклонального антитела, такого как антитело, которое было расщеплено одной или более протеазами. Например, способы могут применяться для характеристики гликозилирования белков, например, терапевтических препаратов моноклональных антител (mAb). В отдельных вариантах осуществления образцы на любой промежуточной стадии могут быть концентрированы, разбавлены, обессолены и т.п.
В различных вариантах осуществления разделительная колонка представляет собой разделительную колонку для жидкостной хроматографии (ЖХ). Жидкостная хроматография, включая ВЭЖХ, может применяться для анализа пептидов, включая моноклональные антитела. Для изучения этих структур могут быть использованы различные виды жидкостной хроматографии, включая анионообменную хроматографию, обращенно-фазовую ВЭЖХ, эксклюзионную хроматографию, высокоэффективную анионообменную хроматографию и нормально-фазовую (НФ) хроматографию, включая Нф-ВэЖх (см., например, источник Alpert et al., J. Chromatogr. A, 676:191-202 (1994)). Хроматография гидрофильного взаимодействия (HILIC) представляет собой вариант НФ-ВЭЖХ, который можно проводить на частично водных подвижных фазах, что позволяет разделять пептиды, углеводы, нуклеиновые кислоты и многие белки в нормальной фазе. Порядок элюирования для HILIC представляет собой от наименее полярного до наиболее полярного, в противоположность порядку в обращенно-фазовой ВЭЖХ. ВЭЖХ может быть проведена, например, на системе ВЭЖХ от Waters (например, система ВЭЖХ Waters 2695 Alliance), Agilent, Perkin Elmer, Gilson и т.д.
В некоторых вариантах осуществления анализ ЖХ-МС/МС проводят с использованием колонки ACQUITY UPLC peptide BEH C18. Температуру колонки можно поддерживать на постоянном уровне в течение всего цикла хроматографии, например, с использованием промышленного нагревателя колонки. В некоторых вариантах осуществления колонку поддерживают при температуре от приблизительно 18°C до приблизительно 70°C, например, от приблизительно 30°C до приблизительно 60°C, от приблизительно 40°C до приблизительно 50°C, например, при приблизительно 20°C, приблизительно 25°C, приблизительно 30°C, приблизительно 35°C, приблизительно 40°C, приблизительно 45°C, приблизительно 50°C, приблизительно 55°C, приблизительно 60°C, приблизительно 65°C или приблизительно 70°C. В некоторых вариантах осуществления температура колонки составляет приблизительно 40°C. В некоторых вариантах осуществления время анализа может составлять от приблизительно 15 мин до приблизительно 240 мин, например от приблизительно 20 мин до приблизительно 70 мин, от приблизительно 30 мин до приблизительно 60 мин, от приблизительно 40 мин до приблизительно 90 мин, от приблизительно 50 мин до приблизительно 100 мин, от приблизительно 60 мин до приблизительно 120 мин, от приблизительно 50 мин до приблизительно 80 мин. После ЖХ элюент затем подвергают анализу МС/МС.
В некоторых вариантах осуществления, например, для целевого или нецелевого анализа ЖХ-МС/МС, аликвоту каждого образца, меченого ТМТ, разделяют на колонке ACQUITY UPLC peptide BEH C18. Затем элюент подвергают электрораспылению и анализируют с использованием гибридного масс-спектрометра Q-Exactive Plus с HCD, используемого для фрагментации пептидов в экспериментах МС/МС. Целевой список, содержащий триггерное m/z, z, целевое окно времени удерживания и энергию столкновения меченых ТМТ нативных и модифицированных пептидов, загружают в список включения, чтобы управлять анализом МС/МС предшественников, обнаруженных в обзорных сканированиях МС1. Затем определяют пептид и идентифицируют ПТМ. В некоторых вариантах осуществления процент каждой ПТМ рассчитывают с использованием площади пика на хроматограмме выбранного иона (EIC) модифицированного пептида относительно суммы площадей пиков модифицированного и нативного пептидов.
Примеры
Следующие примеры приведены для того, чтобы предоставить специалистам в данной области техники полное раскрытие и описание того, как получать и применять способы согласно изобретению, и не предназначены для ограничения объема того, что авторы изобретения считают созданным ими
- 10 047087 изобретением. Были предприняты усилия для обеспечения точности в отношении используемых числовых параметров (например, количеств, температуры и т.д.), но следует учитывать возможность некоторых погрешностей эксперимента и отклонений. Если не указано иное, части представляют собой части по массе, молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу, температура приведена в градусах Цельсия, комнатная температура составляет приблизительно 25°C, а давление равно атмосферному или близко к нему.
Пример 1. Материалы и реагенты.
Все человеческие моноклональные антитела IgG1 и IgG4 (mAb-A, mAb-B, mAb-C, mAb-D и mAb-E) в этом исследовании были произведены в Regeneron (Тарритаун, Нью-Йорк). Образцы для оценки стабильности mAb-A были созданы путем инкубации контрольного образца в различных стрессовых условиях и помечены как mAb-A-S0 (контроль), mAb-A-S1 (T=45°C, t=28 дней), mAb-A-S2 (T=25°C, t=6 мес) и mAb-A-S3 (T=5°C, t=24 мес) соответственно. Образцы для оценки сопоставимости mAb-B были изготовлены на четырех различных технологических площадках и обозначены как mAb-B-P1, mAbB-P2, mAb-B-P3 и mAb-B-P4 соответственно. Трисульфидные стандарты mAb-E с различными уровнями трисульфидных связей были получены путем смешивания образца, подвергнутого воздействию H2S, и эталонного стандартного образца в различных соотношениях, и обозначены как mAb-E-TS0 (100:0), mAb-E-TS1 (75:25), mAb-E-TS2 (50:50), mAb-E-TS3 (25:75) и mAb-E-TS4 (0:100) соответственно. Пептид-Н-гликозидаза F Rapid (PNGαза F Rapid) с 5-кратным количеством буфера PNGαза F Rapid была приобретена у New England Biolabs Inc. (Ипсуич, Массачусетс). Ледяная уксусная кислота (чистота >99%), иодацетамид, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, 4-аминобензойная кислота (PABA), 4-гидроксибензойная кислота (HBA), 4-гидроксифенилуксусная кислота (HPAA) и Ы-(трет-бутоксикарбонил)-тирозин (Boc-Y) были приобретены у Sigma (Сент-Луис, Миссури, США). Трипсин и Asp-N, имеющие чистоту для секвенирования, были приобретены у Promega (Мадисон, Висконсин). Изобарические реагенты тандемные массовые метки (TMT), трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид (TCEP-HCl), трифторуксусная кислота (TFA, чистота для секвенирования) и ацетонитрил (Optima, чистота для ЖХ/МС) были приобретены у Thermo Fisher Scientific (Уолтем, Массачусетс). 1,0 М трис-HCl UltraPure (рН 7,5) был приобретен у Invitrogen Life Technologies (Карлсбад, Калифорния), а вода высокой чистоты была приобретена у Milli-Q system (Бедфорд, Массачусетс).
Пептидное картирование mAb в восстанавливающих условиях. Пептидное картирование в восстанавливающих условиях выполняли для количественного определения уровней ПТМ (например, циклизации N-концевого Gln/Glu, окисления Met, дезамидирования Asn, циклизации/изомеризации Asp, клиппирования C-концевого Lys, гликирования Lys и гликозилирования Fc) для образцов для определения стабильности mAb-A и образцов для определения сопоставимости mAb-B. 500 мкг каждого образца подвергали замене буфера на 5 мМ уксусной кислоты для удаления ТМТ-реактивных соединений (например, гистидина, трис-HCl), а затем денатурировали и восстанавливали в 5 мМ уксусной кислоте в присутствии 5 мМ TCEP-HCl при 80°C в течение 10 мин. После денатурации и восстановления каждый образец разводили 100 мМ PBS (pH 8,0), содержащим 8 М мочевину, и алкилировали иодацетамидом в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре. После алкилирования каждый образец дополнительно разводили 50 мМ PBS (pH 8,0) для снижения концентрации мочевины до уровня менее 1 М. Для расщепления трипсином каждый разведенный образец инкубировали с трипсином при отношении фермента к субстрату 1:20 (мас./мас.) при 37°C в течение 4 ч. Для расщепления Asp-N каждый разведенный образец инкубировали с Asp-N при отношении фермента к субстрату 1:50 (мас./мас.) при 37°C в течение 4 ч. Чтобы получить дегликозилированный образец для количественного определения гликозилирования, аликвоту каждого образца, расщепленного трипсином, дополнительно инкубировали с PNGазой F (1 мЕд/мкг белка) в течение еще 1 ч при 37°C для удаления N-связанных гликанов на уровне пептидов. После расщепления трипсином, Asp-N или PNGазой F каждый расщепленный образец делили на две равные аликвоты. Одну аликвоту гасили добавлением 10% TFA, чтобы остановить расщепление трипсином, и подвергали онлайн-анализу методом ЖХ-МС, а другую аликвоту оставляли для последующей процедуры мечения ТМТ.
Триптическое пептидное картирование невосстановленных mAb. Пептидное картирование в невосстанавливающих условиях выполняли для количественного определения уровней трисульфидных связей для трисульфидных стандартов mAb-C, mAb-D и mAb-E. 500 мкг каждого образца подвергали замене буфера на 100 мМ PBS (pH 7,5) для удаления ТМТ-реактивных соединений (например, гистидина, трис-HCl), а затем денатурировали в 8 М мочевине, содержащей 1,0 мМ иодацетамида в 100 мМ PBS, pH 7,5 при 50°C в течение 10 мин в темноте. После денатурации добавляли 100 мМ PBS (рН 7,5) для разбавления концентрации мочевины в 5 раз. Каждый образец затем расщепляли трипсином при соотношении фермента к субстрату 1:20 (мас./мас.) при 37°C в течение 4 ч. После расщепления трипсином каждый расщепленный образец делили на две равные аликвоты. Одну аликвоту гасили добавлением 10% TFA, чтобы остановить расщепление трипсином, и подвергали онлайн-анализу методом ЖХ-МС, а другую аликвоту оставляли для последующей процедуры мечения ТМТ.
Мечение ТМТ восстановленных и невосстановленных гидролизатов mAb. Реагенты TMT6-plex растворяли в 41 мкл ацетонитрила в соответствии с протоколом производителя (Thermo Scientific).
- 11 047087
Аликвоту каждого расщепленного образца (100 мкг) в экспериментах по пептидному картированию в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях инкубировали с 41 мкл метки ТМТ, растворенной в ацетонитриле, в присутствии контролирующего избыточное мечение реагента (PABA, HBA, HPAA или Boc-Y) (100 моль реагента/моль белка) в течение 1 ч при температуре окружающей среды для мечения. Реакцию мечения останавливали добавлением 10% TFA. Меченые ТМТ гидролизаты образцов для оценки стабильности mAb-A, образцов для оценки сопоставимости mAb-B и трисульфидных стандартов mAb-E объединяли в равных количествах, соответственно, а затем подвергали анализу методом ЖХ-МС/МС.
Анализ ЖХ-МС/МС. Для нецелевого анализа методом ЖХ-МС/МС аликвоту (приблизительно 8 мкг) каждого гидролизата вводили в колонку ACQUITY UPLC peptide BEH C18 (Waters, 2,1x150 мм, размер частиц 1,7 мкм, размер пор 130 А). Пептиды элюировали линейным градиентом, который увеличивался от 0,1% подвижной фазы B до 35% подвижной фазы B в течение 75 мин (подвижная фаза A: 0,05% TFA в воде; подвижная фаза B: 0,045% TFA в ацетонитриле) при скорости потока 0,25 мл/мин при температуре колонки 40°C. Затем элюент подвергали электрораспылению и анализировали с использованием гибридного масс-спектрометра Q-Exactive Plus с высокоэнергетической диссоциацией столкновением (HCD), используемого для фрагментации пептидов в экспериментах МС/МС. Прибор работал в режиме положительных ионов и был настроен на следующие параметры сбора данных: разрешение МС1=70000; цель AGC (автоматической регулировки усиления) МС1=1х106; максимальное время ввода МС1=50 мс; диапазон сканирования МС1=400-2000 m/z; разрешение МС2=17500; цель AGC МС2=1х105; максимальное время ввода=100 мс; TopN=5; окно изоляции=4,0 m/z; нормированная энергия столкновения=27; коэффициент незаполнения=10%; совпадение пептидов=предпочтительно; исключить изотопы=вкл.; динамическое исключение=10 с.
Для анализа методом целевой ЖХ-МС/МС аликвоту каждого образца, меченого ТМТ (приблизительно 8 мкг), разделяли на колонке ACQUITY UPLC peptide BEH C18 (Waters, 2,1x150 мм, размер частиц 1,7 мкм, размер пор 130 А) с более длинным линейным градиентом, который увеличивался от 0,1% подвижной фазы B до 40% подвижной фазы B в течение 150 мин (подвижная фаза A: 0,05% TFA в воде; подвижная фаза B: 0,045% TFA в ацетонитриле) при скорости потока 0,25 мл/мин при температуре колонки 40°C. Затем элюент подвергали электрораспылению и анализировали с использованием гибридного масс-спектрометра Q-Exactive Plus с HCD, используемого для фрагментации пептидов в экспериментах МС/МС. Целевой список, содержащий триггерное m/z, z, целевое окно времени удерживания и энергию столкновения меченых ТМТ нативных и модифицированных пептидов, загружали в список включения, чтобы управлять анализом МС/МС предшественников, обнаруженных в обзорных сканированиях МС1. Прибор работал в режиме положительных ионов и был настроен на следующие параметры сбора данных: разрешение МС1=17500; цель AGC МС1=1х106; максимальное время ввода МС1=50 мс; диапазон сканирования МС1=400-2000 m/z; разрешение МС2=17500; цель AGC МС2=1х105; максимальное время ввода=100 мс; фиксированная первая масса=100; окно изоляции=2,0 m/z; нормированная энергия столкновения=27-100.
Анализ данных. Определение пептидов и идентификацию ПТМ осуществляли с использованием Byonic (Protein Metrics Inc., Сан-Карлос, Калифорния; см. источник Bern et al., Curr. Protoc. Bioinformatics., 2012, 40, 13.30.1-12.20.14) и проверяли вручную. В безметочном подходе для относительного количественного определения сайт-специфических ПТМ были созданы хроматограммы выбранного иона в спектрах МС1 на основе m/z первого изотопного пика как нативного пептида, так и модифицированного пептида, и площади выбранных пиков были интегрированы с использованием skyline-daily (MacCoss Lab, Вашингтонский университет, Вашингтон; см. источник MacLean et al., Bioinformatics., 2010, 26, 966-968).
Процент каждой ПТМ рассчитывали с использованием площади пика на хроматограмме выбранного иона (EIC) модифицированного пептида относительно суммы площадей пиков модифицированного и нативного пептидов. В подходе на основе целевой МС/МС для относительного количественного определения сайт-специфических ПТМ были созданы хроматограммы выбранного иона в спектрах МС/МС на основе m/z репортерного иона как нативного пептида, так и модифицированного пептида, и площади выбранных пиков были интегрированы с использованием skyline-daily (MacCoss Lab, Вашингтонский университет, Вашингтон). Процент каждой ПТМ рассчитывали с использованием площади пика EIC репортерного иона из модифицированного пептида относительно суммы площадей пиков репортерного иона из модифицированного и нативного пептидов.
Пример 2. Оптимизация энергии столкновения HCD для количественного определения ПТМ.
Пептиды ТМТ мечены изобарическими метками, реагирующими с аминами, которые генерируют количественную информацию при активации столкновением. Репортерные ионы ТМТ образуются в результате расщепления амидной связи за счет энергии столкновения с образованием кластера ионов между 126 и 131 m/z в области малой массы тандемных масс-спектров (Thompson et al., Anal. Chem., 2003, 75, 1895-1904). В основанном на TMT подходе для количественного определения ПТМ репортерный ион, генерированный в спектрах целевой МС/МС нативного пептида и модифицированного пептида, используется для расчета процентного содержания ПТМ. Содержание репортерного иона ТМТ,
- 12 047087 генерированного в спектрах МС/МС, коррелирует с нормированной энергией столкновения (NCE) в ячейке HCD, применяемой к меченому ТМТ пептиду. Влияние NCE (35-70) на содержание репортерного иона меченых ТМТ пептидов в mAb-A исследовали, как показано на фиг. 1A. Интенсивности репортерного иона были максимальными, когда NCE увеличивалась до 50 или 55, а затем уменьшались при дальнейшем увеличении NCE до 70. Тем не менее NCE, равная 35, имеет тенденцию давать обширную информацию о фрагментации для идентификации пептидов, а более высокая NCE дает меньше информации о фрагментации по мере увеличения NCE. Например, когда NCE была увеличена до 70, в спектрах МС/МС сохранялось лишь небольшое количество информации о фрагментации.
Количественное определение различных типов ПТМ в mAb-A с использованием репортерного иона, генерированного в спектрах целевой МС/МС нативных и модифицированных пептидов при различных NCE, исследовали в отношении окисления Met, дезамидирования Asn, циклизации/изомеризации Asp, клиппирования C-концевого Lys и гликозилирования Fc, и сравнивали с количественным определением ПТМ с использованием традиционного подхода, основанного на МС1. Отмечено, что не наблюдается существенной разницы в процентах различных ПТМ при NCE 35-70, и проценты ПТМ были сопоставимы с процентами, определенными с использованием традиционного подхода, когда первый изотопный пик нативного и модифицированного пептидов-предшественников в обзорных сканированиях МС1 использовались для расчета процента (см. фиг. 1B), что демонстрирует осуществимость подхода на основе целевой МС/МС для количественного определения ПТМ. Результаты также показывают, что изменяющаяся тенденция содержания репортерного иона при разных NCE одинакова для нативных и модифицированных пептидов. Чтобы максимизировать чувствительность количественного определения редко встречающихся ПТМ при сохранении удовлетворительной информации о фрагментации для подтверждения последовательности пептида была выбрана NCE 55 для количественного определения окисления Met, дезамидирования Asn, циклизации/изомеризации Asp, клиппирования C-концевого Lys и гликозилирования Fc.
Циклизация N-концевого Gln или Glu в легкой или тяжелой цепи с образованием пироглутамата (PyroE или PyroQ) является основным типом N-концевой модификации (Liu et al., mAbs, 2014, 6, 1145-1154). Однако эта модификация ингибирует реакцию реагента для мечения ТМТ с N-концевой аминогруппой путем блокирования N-конца пептида, что ограничивает возможности этого подхода мультиплексирования для количественного определения этой модификации. Чтобы преодолеть это ограничение, исследовали N-концевые пептиды из mAb-A, содержащие Gln или Glu на N-конце, а также остаток лизина на C-конце. В нативном пептиде как N-концевая аминогруппа, так и ε-аминогруппа боковой цепи лизина может быть мечена метками ТМТ, однако в модифицированном пептиде может быть мечена только ε-аминогруппа боковой цепи лизина из-за заблокированной N-концевой аминогруппы. Чтобы оценить возможность использования репортерного иона, генерированного из нативных и модифицированных пептидов, для этого количественного определения ПТМ, рассчитывали процентное содержание пироглутамата при различных NCE (27-100) и сравнивали со значением, полученным при традиционном подходе. Как показано на фиг. 2B, этот подход обеспечил наиболее сопоставимый результат при NCE 35 по сравнению с традиционным подходом (NCE 35 также для PyroQ). Сниженный процент наблюдался при более высокой и более низкой NCE, а при NCE 27 и NCE 55 процентное содержание пироглутамата составляло лишь ~50% от значения, полученного при традиционном подходе. Поэтому для количественного определения пироглутамата была выбрана NCE 35.
Также было исследовано количественное определение гликирования Lys в mAb-B и mAb-C (с разными уровнями) с использованием репортерного иона. Гликирование - это неферментативный процесс, который может привести к модификации первичных аминов путем восстановления сахаров (например, глюкозы, фруктозы). Остатки лизина особенно восприимчивы к гликированию в белке с увеличением массы боковой цепи на 162,05 Да и создают гетерогенность заряда за счет изменения боковой цепи первичного амина с основной на нейтральную (Liu et al., mAbs, 2014, 6, 1145-1154).
Поскольку гликирование Lys ингибирует расщепление пептидной связи трипсином в гликированных сайтах Lys, в результате получается пептид с гликированными остатками Lys, имеющими другую длину по сравнению с пептидом, имеющим нативные остатки Lys. Поэтому для анализа продуктов гликирования в сайте Lys было проведено пептидное картирование с расщеплением Asp-N. Подобно пироглутамату N-концевого Gln/Glu, гликирование может изменять физические свойства остатка лизина, делая остаток лизина нереакционноспособным по отношению к реагенту ТМТ и, следовательно, приводя к разному количеству меток ТМТ на нативном пептиде и гликированном пептиде. Исследование влияния различных NCE (35-100) на количественное определение этой ПТМ показало, что разные проценты также были получены при разных NCE, причем более высокая NCE давала более высокий процент гликирования. Процент, сопоставимый с количественным определением при традиционном подходе, может быть достигнут при увеличении NCE до 90-100 (фиг. 2). Наблюдаемая сильная зависимость от NCE для количественного определения ПТМ пироглутамата и гликирования может быть связана с непоследовательными тенденциями изменения содержания репортерного иона с разными NCE между нативным пептидом и модифицированным пептидом. Например, содержание репортерного иона было максимальным при различных NCE 55 и 70 для
- 13 047087 нативного пептида и гликозилированного пептида соответственно. Таким образом, для достижения сопоставимого с традиционным подходом количественного определения была выбрана NCE 90 для количественного определения гликирования Lys. Следует отметить, что из-за отсутствия достаточной информации о фрагментации можно использовать предварительный анализ с более низким значением NCE (например, 35) для подтверждения последовательности пептида и модификации лизина.
Трисульфид также является распространенной модификацией, которая была обнаружена во всех подклассах рекомбинантных IgG. Трисульфидные связи часто присутствуют между пептидами легкой и тяжелой цепей в моноклональных антителах (Gu et al., 2010, 400, 89-98).Эта трисульфидная модификация происходит путем включения атома серы в дисульфидную связь между тяжелой и легкой цепями (Cys-S-S-Cys+H2S+[O]^Cys-S-S-S-Cys+H2O), что приводит к увеличению массы на 31,97 Да. Сообщалось, что присутствие трисульфидных связей не влияет на термическую стабильность, а также на связывание антигена и эффективность. Тем не менее уровни трисульфидных связей могут варьироваться от партии к партии и от процесса к процессу, вероятно, из-за изменений уровней следового H2S в производственных биореакторах, поэтому уровни трисульфидных связей обычно контролируют в образцах моноклональных антител во время разработки процесса культивирования клеток. Для разработки мультиплексного метода количественного определения трисульфидных связей были исследованы количественные результаты при различных NCE для моноклональных антител mAb-C (IgG1) и mAb-D (IgG4) соответственно. Интересно, что процентное содержание трисульфидных связей продемонстрировало четкую линейную зависимость от NCE как для Mab-C, так и для mAb-D, как показано на фиг. 3A и 3B. Когда NCE была увеличена до 55, % трисульфидных связей, определенный с использованием этого подхода, был сопоставим с традиционным подходом как для антител IgG1, так и для антител IgG4, и поэтому она была выбрана в качестве оптимизированной NCE для количественного определения трисульфидных связей.
Пример 3. Низкомолекулярные добавки для предотвращения избыточного мечения реагентом ТМТ.
Сообщалось, что помимо N-концевой аминогруппы и ε-аминогруппы боковой цепи лизина мечение TMT боковой цепи лизина также может происходить по тирозину (Tyr), треонину (Thr) и серину (Ser) в результате нецелевой реакции с гидроксильной группой в этих аминокислотах (Zecha et al., Mol. Cell. Proteomics., 2019, 18, 1468-1478). Это избыточное мечение TMT может снизить чувствительность количественного определения ПТМ в этом подходе за счет разделения ответов нативного пептида и модифицированного пептида на множество фрагментов, меченых разными количествами метки TMT. Например, авторы изобретения наблюдали это при количественном определении ПТМ из триптического пептида (SEQ ID NO: 3, WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK), расположенного в консервативном домене CH3 тяжелой цепи IgG, содержащего остаток метионина, подверженный окислению. После мечения TMT наблюдалась смесь фрагментов с разными метками TMT (до 6), а также наблюдалось множество изоформ для соединений, содержащих 3, 4 и 5 меток TMT. В таблице, представленной на фиг. 9, обобщено относительное содержание фрагментов пептида WQQG (остатки 1-4 SEQ ID NO: 3) с разными метками TMT и с разными изоформами. Высокогетерогенное мечение ТМТ этого пептида распределяет общее содержание в целых 15 различных форм с относительным содержанием в диапазоне от 0,2 до 22,0%, что создает серьезную проблему для количественного определения окисления Met в этом пептиде, особенно когда уровень является низким, с использованием подхода, основанного на целевой МС/МС.
Чтобы ингибировать избыточное мечение ТМТ, первоначально исследовали различные отношения ТМТ к белку (мас./мас.) в диапазоне от 8:1 до 1:1. Уменьшение количества реагента ТМТ может свести к минимуму избыточное мечение, однако может также увеличить недостаточное мечение пептида. Например, эффективность мечения целевых пептидов может быть снижена с более чем 90 до ~35% при изменении отношения от 8:1 до 1:1. В качестве альтернативы оценивали различные гидроксилсодержащие небольшие молекулы (PABA, HBA, HPAA и Boc-Y), введенные в гидролизаты во время мечения ТМТ, в качестве конкурирующих реагентов для этих нецелевых аминокислотных остатков, которые реагируют с избыточным количеством реагента ТМТ и препятствуют избыточному мечению. Как показано на фиг. 9, добавление этих небольших молекул действительно в определенной степени ингибировало избыточное мечение пептидов ТМТ. Для пептида WQQG (остатки 1-4 SEQ ID NO: 3), хотя фрагменты, содержащие 3 метки ТМТ, по-прежнему являются избыточно меченым продуктом, множество изоформ пептида, меченого 3 ТМТ, сводились в единую доминирующую форму, составляющую более 50% общего содержания всех фрагментов, относящихся к этому пептиду. Образование фрагментов, содержащих 5 и 6 меток ТМТ, было значительно подавлено; вместо них имело место увеличение мечения 2 и 3 ТМТ. Подобный ингибирующий эффект можно наблюдать и для другого пептида TTPP: добавление небольших молекул подавляло образование продукта, меченого 3 ТМТ, с 26 до <7%, и увеличивало ожидаемый продукт, меченый 2 ТМТ, до ~94%. Хотя все четыре небольшие молекулы продемонстрировали способность ингибировать избыточное мечение ТМТ, PABA была выбрана в качестве наиболее подходящего конкурирующего реагента, учитывая ее более высокую гидрофильность и более низкую молекулярную массу по сравнению с другими малыми молекулами, которая с меньшей вероятностью будет мешать пептидам-мишеням и вводить фоновый сигнал масс- 14 047087 спектрометрии.
Пример 4. Воспроизводимость и чувствительность мультиплексного количественного определения ПТМ с использованием TMT.
Чтобы оценить воспроизводимость и чувствительность этого подхода, основанного на целевой МС/МС, для количественного определения ПТМ, из каждого триптического гидролизата образца mAb-A из трех препаратов (три определения) брали аликвоты по шесть порций с известным соотношением 1:1:1:1:1:1 и 1:2:4:8:16:32, а затем метили 6-плексными метками TMT. Три объединенных образца каждом соотношении анализировали дважды (два параллельных анализа) с использованием ЖХ-МС/МС. Четыре репрезентативных ПТМ (гликозилирование Lys, дезамидирование Asn, циклизация/изомеризация Asp и окисление Met) с уровнями в диапазоне от 0,6 до 3,3% (проценты рассчитаны на основе традиционного подхода) были выбраны для оценки воспроизводимости количественного определения и чувствительности этого подхода. Интегрированные площади пиков хроматограмм выбранного репортерного иона нативных и модифицированных пептидов использовали для расчета процентного содержания четырех ПТМ в каждом канале TMT. На фиг. 4A показана оценка относительного количественного определения четырех ПТМ в mAb-E в шести каналах ТМТ при соотношении 1:1:1:1:1:1. На фиг. 4B показана оценка воспроизводимости относительного количественного определения четырех ПТМ в mAb-E в шести каналах ТМТ при соотношении 1:1:1:1:1:1.
На фиг. 5 показаны средние проценты и RSD четырех ПТМ, определенных количественно в шести каналах TMT при соотношении 1:2:4: 8:16:32, что соответствует количествам загружаемого образца 0,15, 0,30, 0,60, 1,2, 2,4 и 4,8 мкг соответственно. Средние проценты и относительные среднеквадратические отклонения (RSD) четырех ПТМ, определенных количественно при различных загружаемых количествах, варьировались от 0,6-0,9 до 3,3-29,0% для гликозилирования Lys, от 1,6-1,9 до 3,6-7,2% для дезамидирования Asn, от 2,4-2,6 до 3,4-7,3% для циклизации/изомеризации Asp и от 3,3-3,5 до 3,6-9,4% для окисления Met. В целом средние процентные содержания этих ПТМ, определенные количественно при различных загружаемых количествах, были сопоставимы с процентными содержаниями, рассчитанными с использованием традиционного подхода (загружаемое количество приблизительно 5,0 мкг), даже для редко встречающихся ПТМ, таких как гликозилирование Lys (приблизительно 0,6%), исследованных в этом исследовании. Хотя, когда загружаемое количество составляло 0,15 мкг, наблюдалось большое отклонение с RSD 29,0% (>15%) для количественного определения этого низкого уровня гликирования Lys, что могло быть связано с очень низким содержанием репортерного иона, генерированного из модифицированного пептида при NCE 90; все RSD количественного определения ПТМ с более высокими уровнями или более высокими загружаемыми количествами были в пределах 15%, что демонстрирует высокую чувствительность этого подхода для мультиплексного количественного определения ПТМ при таких низких уровнях, как 1,0%, когда количество загружаемого образца составляет всего приблизительно 0,15 мкг.
Пример 5. Мультиплексное количественное определение ПТМ с использованием TMT для образцов для оценки стабильности mAb-A.
Образцы для оценки стабильности mAb-A анализировали с использованием этого подхода, основанного на целевой МС/МС. В общей сложности четыре образца, включая контрольный образец, расщепляли трипсином в восстанавливающих условиях, а затем метили реагентами 4-plex TMT (каналы 126, 127, 128, 129, 130 и 131). Объединенный образец анализировали с использованием ЖХ-МС/МС для количественного определения ПТМ. Отдельные расщепленные образцы, не меченые ТМТ, также анализировали с использованием традиционного подхода для количественного определения ПТМ. На фиг. 6 обобщены количественные результаты мультиплексного определения ПТМ для шести образцов с использованием этого подхода, а также результаты количественного определения с использованием традиционного подхода для сравнения. При обоих подходах наблюдались сопоставимые результаты количественного определения ПТМ. Наблюдалось влияние температуры на уровни окисления при Met258 и Met434, дезамидирования при Asn390 и циклизации/изомеризации при Asp286, причем образцы, инкубированные при 45 и 25°C, демонстрировали более высокие уровни, чем контрольный образец и образец, инкубированный при 5°C. Кроме того, образец, инкубированный при 45°C в течение 28 дней, демонстрировал несколько более высокие уровни этих ПТМ, чем образец, инкубированный при 25°C в течение 6 месяцев. Не было выявлено существенной разницы в уровнях при сравнении контрольного образца с образцом, инкубированным при 5°C в течение 24 месяцев. Для окисления, дезамидирования и циклизации/изомеризации в других сайтах их уровни были сопоставимы во всех четырех образцах, независимо от условий воздействия, испытанных в этом исследовании. Это исследование конкретного случая демонстрирует возможности данного подхода для количественного определения разницы уровней ПТМ в образцах антител.
Пример 6. Мультиплексное количественное определение ПТМ с использованием TMT для образцов для оценки сопоставимости mAb-B.
Этот пример иллюстрирует количественную оценку уровней ПТМ в образцах для оценки сопоставимости mAb-F для демонстрации сопоставимого качества моноклональных антител, произведенных на разных технологических площадках. В общей сложности четыре образца для оценки
-
Claims (17)
- сопоставимости расщепляли трипсином в восстанавливающих условиях, а затем метили реагентами 4-plex TMT (каналы 128, 129, 130 и 131). Объединенный образец анализировали с использованием ЖХ-МС/МС для количественного определения ПТМ. Отдельные расщепленные образцы, не меченые ТМТ, также анализировали с использованием традиционного подхода для количественного определения ПТМ. Количественные результаты ПТМ для четырех образцов для оценки сопоставимости, полученные с использованием обоих подходов, обобщенно представлены на фиг. 7A и 7B. Использовали два подхода для количественного определения сопоставимости процентных содержаний ПТМ, и все ПТМ, включая окисление Met, дезамидирование Asn, циклизацию и изомеризацию Asp и С-концевой лизин, продемонстрировали сопоставимые уровни в четырех образцах mAb-B, произведенных на разных технологических площадках. На фиг. 7A показаны ПТМ с уровнями >2,5%, а на фиг. 7B показаны ПТМ с уровнями <2,5%.Пример 7. Мультиплексное количественное определение ПТМ с использованием TMT для стандартных образцов для оценки трисульфидных связей mAb-E.Были получены стандартные образцы для оценки трисульфидных связей для построения калибровочной кривой для мониторинга уровней трисульфидных связей в образцах, взятых в ходе технологического процесса, во время разработки процесса культивирования клеток. В этом примере авторы применили подход, основанный на целевой МС/МС, для количественного определения уровней трисульфидных связей в пяти стандартных образцах для оценки трисульфидных связей mAb-E, полученных путем смешивания образца, подвергнутого воздействию H2S, с эталонным стандартным образцом в различных соотношениях 100:0, 75:25, 50:50, 25:75 и 0:100 соответственно. Пять стандартных образцов для оценки трисульфидных связей расщепляли трипсином в невосстанавливающих условиях, а затем метили реагентами 5-plex TMT (каналы 126, 127, 128, 129 и 130). Объединенный образец анализировали с использованием ЖХ-МС/МС для количественного определения трисульфидных связей. Отдельные расщепленные образцы, не меченые ТМТ, также анализировали с использованием традиционного подхода для сравнения. Как показано на фиг. 8, уровни трисульфидных связей в стандартных образцах, определенные с использованием этого подхода, составили 14,9, 11,1, 7,5, 3,2 и 0,1% соответственно. Эти результаты хорошо согласовывались со значениями, рассчитанными на основе соотношений в смеси подвергнутых воздействию и эталонных стандартных образцов, а также были сопоставимы со значениями, полученными при традиционном подходе, с соответствующими уровнями трисульфидных связей, равными 15,2, 11,7, 7,8, 3,2 и 0,1% соответственно.Раскрытый мультиплексный подход на основе TMT совместим с текущим технологическим процессом пептидного картирования для количественного определения ПТМ с минимальными изменениями в процедуре подготовки образцов, но значительно сокращает время сбора данных в массспектрометрии, особенно при анализе большого набора образцов. В настоящем изобретении показано, что, настраивая NCE от 35 до 90, можно количественно определять различные типы ПТМ с использованием репортерного иона, генерированного из нативных и модифицированных пептидов в спектрах целевой МС/МС, с достижением процентных содержаний, сопоставимых с таковыми в традиционном подходе. Показано, что этот подход обеспечивает превосходную воспроизводимость и чувствительность для количественного определения ПТМ с уровнями всего лишь 1,0% даже при небольшом количестве загружаемого образца. Функция мультиплексирования этого подхода расширяет аналитические возможности получения биофармацевтической характеристики белка на основе ЖХ-МС за счет количественного определения качественных показателей множества образцов в одном цикле ЖХ-МС, а также снижает вариабельность от цикла к циклу при количественном определении ПТМ, с которой можно столкнуться при индивидуальном анализе образцов с использованием ЖХ-МС при традиционном подходе, что повышает качество масс-спектрометрических данных для точного и воспроизводимого количественного определения ПТМ.В целом, как продемонстрировано в настоящем изобретении на примере анализа образцов моноклональных антител в исследованиях различных конкретных случаев, разработанный подход обеспечивает более эффективный способ по сравнению с традиционным подходом для лучшего удовлетворения постоянно растущих потребностей в получении характеристики моноклональных антител на разных этапах разработки лекарственных средств.Объем настоящего изобретения не ограничивается конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем изобретении. Действительно различные модификации данного изобретения в дополнение к описанным в настоящем изобретении будут очевидны специалистам в данной области техники из предшествующего описания и прилагаемых графических материалов. Подразумевается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ количественного определения множества показателей качества множества образцов в одном цикле масс-спектрометрии (МС), включающий приведение двух или более образцов в контакт с расщепляющим раствором в условиях, достаточных для расщепления двух или более образцов, где каждый образец расщепляется отдельно и расщеп- 16 047087 ляющий раствор представляет собой буферный раствор, не содержащий трис-буфера;приведение каждого из двух или более расщепленных образцов в контакт с низкомолекулярной добавкой перед приведением каждого из двух или более расщепленных образцов в контакт со специфическим реагентом для мечения тандемной массовой меткой (ТМТ), где низкомолекулярная добавка выбрана из группы, состоящей из BOC-Y -OH, п-крезола, гидроксифенилуксусной кислоты (НРАА), гидроксибензойной кислоты (НВА), ацетаминофена и п-аминобензойной кислоты (РАВА);приведение каждого из двух или более расщепленных образцов в контакт со специфическим реагентом для мечения ТМТ в условиях, достаточных для мечения пептидов в каждом из двух или более расщепленных образцов с использованием специфического реагента для мечения ТМТ;гашение мечения пептидов в каждом из двух или более расщепленных образцов;объединение равных объемов двух или более меченых расщепленных образцов в раствор одного объединенного образца; и анализ раствора одного объединенного образца с использованием нацеленного масс-спектрального анализа с обеспечением таким образом возможности количественного определения множества показателей качества двух или более образцов в одном цикле МС.
- 2. Способ по п.1, где множество показателей качества включают посттрансляционную модификацию (ПТМ).
- 3. Способ по п.2, где ПТМ включает одно или более из дезамидирования, окисления, гликирования, образования дисульфидных связей, образования N-концевого пироглутамата, удаления С-концевого лизина и гликозилирования.
- 4. Способ по п.3, где ПТМ включает гликозилирование.
- 5. Способ по любому из пп.2-4, где количественное определение множества показателей качества в одном цикле МС включает количественное определение ПТМ путем количественного определения относительного содержания ПТМ по площадям выбранных пиков полученного репортерного иона, генерированного в целевых масс-спектрах.
- 6. Способ по п.1, где низкомолекулярная добавка представляет собой РАВА.
- 7. Способ по любому из пп.1-6, где пептиды представляют собой гликопептиды.
- 8. Способ по п.7, где гликопептиды получены из моноклонального антитела.
- 9. Способ по п.8, где моноклональное антитело относится к изотипу IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или смешанному изотипу.
- 10. Способ по любому из пп. 1-9, где два или более образцов представляют собой от 2 до 11 образцов.
- 11. Способ по любому из пп.1-10, дополнительно включающий получение двух или более образцов для анализа.
- 12. Способ по любому из пп.1-11, дополнительно включающий подготовку двух или более образцов для расщепления перед приведением двух или более образцов в контакт с расщепляющим раствором в условиях, достаточных для расщепления двух или более образцов.
- 13. Способ по п. 12, где подготовка двух или более образцов перед расщеплением включает приведение каждого из двух или более образцов в контакт с денатурирующим и восстанавливающим раствором в условиях, которые обеспечивают денатурацию и восстановление образца; и приведение каждого из двух или более денатурированных и восстановленных образцов в контакт с алкилирующим раствором в условиях, которые обеспечивают алкилирование образца.
- 14. Способ по любому из пп.1-13, где анализ раствора одного объединенного образца с использованием нацеленного масс-спектрального анализа включает нанесение одного объединенного образца на разделительную колонку и проведение направленного масс-спектрального анализа элюированных компонентов образца.
- 15. Способ по п.14, где разделительная колонка представляет собой колонку для жидкостной хроматографии.
- 16. Способ по п.14 или 15, где проведение нацеленного масс-спектрального анализа элюированных компонентов образца включает применение ионизации электрораспылением для генерирования заряженных ионов из элюированных компонентов образца и измерение генерированных заряженных ионов.
- 17. Способ количественного определения посттрансляционных модификаций (ПТМ) множества образцов в одном цикле масс-спектрометрии (МС), включающий приведение двух или более образцов в контакт с расщепляющим раствором в условиях, достаточных для расщепления двух или более образцов, где каждый образец расщепляется отдельно и расщепляющий раствор представляет собой буферный раствор, не содержащий трис-буфера;приведение каждого из двух или более расщепленных образцов в контакт с низкомолекулярной добавкой, где низкомолекулярная добавка выбрана из группы, состоящей из BOC-Y-OH, п-крезола, гидроксифенилуксусной кислоты (НРАА), гидроксибензойной кислоты (НВА), ацетаминофена и п-аминобензойной кислоты (РАВА);приведение каждого из двух или более расщепленных образцов в контакт со специфическим реагентом для мечения тандемной массовой меткой (ТМТ) в условиях, достаточных для мечения пептидов в каждом из двух или более расщепленных образцов с использованием специфического реагента для мече-
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62/966,151 | 2020-01-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA047087B1 true EA047087B1 (ru) | 2024-05-30 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Beck et al. | Biosimilar, biobetter, and next generation antibody characterization by mass spectrometry | |
| US20120264155A1 (en) | Multiplex Quantitation of Individual Recombinant Proteins in a Mixture by Signature Peptides and Mass Spectrometry | |
| US20090186423A1 (en) | Method for Characterization of a Recombinant Polyclonal Protein | |
| M Wooding et al. | Characterization of pharmaceutical IgG and biosimilars using miniaturized platforms and LC-MS/MS | |
| JP2023512521A (ja) | 天然液体クロマトグラフィ質量分析のためのプラットフォーム | |
| US20230417759A1 (en) | Use of Amino Acids to Enhance Signal in Mass Spectral Analyses | |
| KR20220134585A (ko) | 액체 크로마토그래피-질량 분석법에 의한 고 신뢰성 화합물 식별 | |
| US12135328B2 (en) | Tandem mass tag multiplexed quantitation of post-translational modifications of proteins | |
| US12123879B2 (en) | Heavy peptide approach to accurately measure unprocessed C-terminal lysine | |
| Shah et al. | Characterization of charge variants, including post-translational modifications and proteoforms, of bispecific antigen-binding protein by cation-exchange chromatography coupled to native mass spectrometry | |
| EA047087B1 (ru) | Мультиплексное количественное определение посттрансляционных модификаций белков с использованием тандемных массовых меток | |
| US20220177582A1 (en) | Non-consensus glycosylation of bispecific antibodies | |
| Kim et al. | Characterization of biopharmaceuticals focusing on antibody therapeutics | |
| US20240053359A1 (en) | Native microfluidic ce-ms analysis of antibody charge heterogeneity | |
| WO2023043892A9 (en) | Method to prevent sample preparation-induced disulfide scrambling in non-reduced peptide mapping | |
| WO2024020199A1 (en) | Native microfluidic ce-ms analysis of antibody charge heterogeneity | |
| Rosati | Qualitative and Quantitative Characterization of Therapeutic Antibodies by Native Mass Spectrometry |