KR20110010758A

KR20110010758A - 생물학적 활성제의 캡슐화

Info

Publication number: KR20110010758A
Application number: KR1020107027240A
Authority: KR
Inventors: 메멧 피드언보이루; 아르네 파파니콜라우
Original assignee: 글락소 그룹 리미티드
Priority date: 2008-05-06
Filing date: 2009-05-05
Publication date: 2011-02-07
Also published as: US20110064821A1; PE20091965A1; TW201012489A; UY31808A; UY31810A; AR072668A1; EP2441447A1; AR072359A1; TW201012488A; AR071633A1; KR20110015604A; KR20110010760A; CA2721241A1; PE20091882A1; CL2009001076A1; TW201012490A; UY31809A; JP2011522792A; CL2009001080A1; EP2271323A2

Abstract

본 발명은 미립자 담체, 예컨대, 나노입자 내에 생물학적 활성제, 예컨대, 단백질을 캡슐화하는 방법을 제공한다. 또한, 이러한 방법에 의해 획득가능한 미립자 담체를 포함하는 조성물 및 이러한 조성물의 치료 목적으로의 용도를 제공한다.

Description

생물학적 활성제의 캡슐화{ENCAPSULATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE AGENTS}

수많은 약물은 뇌 또는 눈 내의 표적에서 활성을 갖는데, 이 약물은 이들의 타겟에 이르기 위해서, 생물학적 장벽, 예컨대, 혈액 뇌 장벽을 통과해야한다. 일부 분자는 생물학적 장벽을 통과할 수 있는 반면, 이러한 장벽을 효과적으로 또는 전혀 통과하지 못하는 기타 분자가 존재한다. 많은 약물 또한 직접적으로 표적 조직내로 주어진 경우에만 효과적이며, 이러한 표적 조직에 도달되지 못한 경우, 약물은 단순히 작용할 수 없다. 따라서, 잠재적으로 효능 있는 많은 약물이 이러한 생물학적 장벽의 통과에 무능하기 때문에 임상적으로 유용하지 않다.

이러한 생물학적 장벽을 통한 약물 침투를 증가시키기 위한, 수많은 접근법이 당업계에 기술되어 왔다.

한가지 접근법은 장벽 자체의 기능을 변형시키는 것이다. 예를 들어, 삼투성 시약(osmotic agents) 또는 콜린자극성 아레콜린(cholinomimetic arecolines)은 혈액 뇌 장벽의 개방 또는 침투성의 변화를 유발한다(Saija A et al, J Pharm. Pha. 42:135-138 (1990)).

또 다른 접근법은 약물 분자 자체의 개질에 관한 것이다. 예를 들어, 혈액 뇌 장벽을 통해 통과를 시도하도록 한 단백질의 개질은 이러한 단백질을 글리케이팅(glycating)하거나 대안적으로는, 전구약물을 형성시킴에 의한 것을 포함한다(WO/2006/029845).

또 다른 접근법은 활성 성분을 매트릭스 시스템으로부터 신경 조직으로 직접적으로 방출시키는 방출 조절 폴리머의 부착(implantation)이다. 그러나, 이러한 접근법은 침습적이며, 직접적으로 뇌 또는 척수에 부착될 경우 수술적 개입을 필요로 하는데(sable et al. US patent no. 4,833,666), 환자의 수용상태에 관한 문제가 존재하고 종종 보통 매우 빠르게 빠지는 약물을 투여함으로서 뇌 안으로 집중된 전달만을 가능케한다(WO/2006/029845).

이러한 제한을 극복하기 위해서, 약물 단체 시스템이 사용되고 있으나, 표적화된 약물 전달의 중요 문제는 빠른 옵소닌화(opsonisation) 및 세망내피계(RES), 특히 간 및 비장 내의 대식 세포에 의한 주입된 담체의 섭취이다.

따라서, 거대분자, 예컨대 단백질을 뇌 및 눈으로 전달하는 효과적이고 효율적인 방법의 필요성이 여전히 존재한다. 특히, 뇌 안으로 진입시에 활성을 유지하며, 또한 요망되는 방출 동역학을 제공할 수 있으며, 단백질 안정성 및 활성을 유지하고, 제거 메카니즘(clearance mechanisms)을 회피하는 능력을 갖는, 혈액 뇌 장벽을 통한 거대분자의 전달 방법을 발견하는 것이 요망될 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 동적 광 산란(DLS)을 이용해 나노입자 제형에 대해 획득한 크기순 데이타를 나타내며 이는 현탁액 중 중공(hollow) 방법에 의해 제조된 나노입자의 존재를 나타낸다.

도 1(a)는 동적 광 산란에 의한 나노 입자 현탁액의 분석 후 획득된 코렐로그램(Correlogram)을 나타낸다.

도 1(b)는 크기 범위에 걸쳐 입자 집단(개수)의 분포를 도시하도록 플로팅화된(plotted) 나노입자의 다모드 크기 분포(파생 데이타)를 나타낸다.

도 1(c)는 크기 범위에 걸쳐 입자 집단(개수)의 분포를 도시하도록 플로팅화된(plotted) 나노입자의 다모드 크기 분포(파생 데이타)를 나타낸다.

도 1(d)는 크기 범위에 걸쳐 입자 집단(개수)의 분포를 도시하도록 플로팅화된(plotted) 나노입자의 다모드 크기 분포(파생 데이타)를 나타낸다.

도 2 - SEM에 의해 분석된 나노입자.

도 3 - 비교를 위해 고체 PBCA 나노입자의 이미지를 중첩한, TEM에 의한 중공 나노입자의 영상.

도 4 - 모노클로날 IgGI(항-CD23)의 캡슐화 효율 측정.

도 5 - 입자의 효소성 분해 후 측정된 방출 프로파일 및 ELISA에 의한 방출된 효소의 분석.

도 6 - 중공 PBCA 나노입자에서 바이신코니닉산(bicinchoninic acid) 분석(BCA 분석)에 의한 도메인 항체(헨 에그 리소자임(hen-egg lysozyme) dAb)의 캡슐화 효율 측정.

도 7 - 모노클로날 IgGI(항-CD23)의 캡슐화 효율 측정.

발명의 요약

본 발명의 일 양태에서, 미립자 담체 내 생물학적 활성제를 캡슐화하는 방법, 예컨대, 나노입자 내, 또는 내 및 위에서, 또는 나노입자와 함께 단백질 및/또는 펩티드를 캡슐화하는 방법, 및 나노입자 내, 또는 내 및 위에서, 또는 나노입자와 함께 캡슐화하여 단백질 및/또는 펩티드를 혈액 뇌 장벽을 통해 전달하는 방법 및 미립자 담체 내, 또는 내 및 위에서, 또는 미립자 담체와 함께 캡슐화하여 눈으로 단백질 및/또는 펩티드를 전달하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 단백질 및/또는 펩티드를 혈액 뇌 장벽을 통해 혈액에서 뇌까지 전달하기 위한, 또는 눈으로 전달하기 위한, 입자 형성 물질 및 생물학적 활성제, 예컨대, 단백질 및/또는 펩티드를 포함하는 미립자 담체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 중추 신경계 및/또는 눈의 장애 또는 질병을 치료하기 위한, 나노입자의 조성물 및 이들의 용도를 제공한다.

본 발명은 입자 형성 물질 및 생물학적 활성제를 포함하는 미립자 담체 및 상기 미립자 담체를 제조하는 방법을 제공한다.

일 구체예에서, 중공 루멘 내 수성 상 중에 생물학적 활성제를 포함하는 폴리머 미립자 담체가 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 안구 전달을 위해 미립자 담체 내 생물학적 활성제를 캡슐화하는 방법이 제공되며, 이 방법은 하기 단계를 포함한다:

a) 유기 용매 중에 폴리머를 용해시켜 폴리머 용액을 형성시키는 단계;

b) 생물학적 활성제를 포함하는 수성 용액을 상기 폴리머 용액에 첨가하여 연속 유기상 내에 수성상 액적의 1차 에멀젼을 형성시키는 단계;

c) 상기 1차 에멀젼과 수성 매질을 혼합하여 W/O/W 에멀젼을 형성시키는 단계; 및

d) 상기 유기상을 증발시킴으로서 수성 상 내 상기 생물학적 활성제를 함유하는 중공 루멘(hollow lumen)을 포함하는 미립자 담체를 획득하는 단계.

추가 구체예에서, 안구 전달은 안구 주위, 예를 들어, 경공막(trans-scleral), 결막하(subconjunctival), 테논하(sub-tenon), 눈둘레(peribulbar), 국부, 구후(retrobulbar)이거나, 위, 아래 또는 외직근(lateral rectus muscle)로 전달된다. 일 구체예에서, 안구 전달은 경공막이다.

유기상을 증발시키는 것은 수동적이거나 활성일 수 있다. 예를 들어, 활발한 증발은 열을 이용함으로써 이뤄질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 단백질을 혈액 뇌 장벽으로 전달하기 위한 나노입자를 생성하는 방법이 제공되며, 이 방법은 하기 단계를 포함한다:

b) 단백질을 포함하는 수성 용액을 상기 폴리머 용액에 첨가하여 연속 유기상 내에 수성상 액적의 1차 에멀젼을 형성시키는 단계;

d) 상기 유기상을 증발시킴으로서 수성 상 내 상기 단백질을 함유하는 중공 루멘을 포함하는 나노입자를 획득하는 단계.

추가 구체예에서, 본원에 기술된 방법 중 어느 하나에서 이용된 폴리머는 하기로부터 선택되나 이에 제한되지 않는다: 폴리-L-락티드(PLA), 폴리(락토-코-글리콜리드)(PLG), 폴리(락티드), 폴리(카프로락톤), 폴리(히드록시부틸레이트) 및/또는 이들의 코폴리머. 적합한 입자-형성 물질은, 폴리(디엔), 예컨대, 폴리(부타디엔) 등; 폴리(알켄), 예컨대, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등; 폴리(아크릴릭), 예컨대, 폴리(아크릴산) 등; 폴리(메타크릴릭), 예컨대, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(히드록시에틸 메타크릴레이트) 등; 폴리(비닐에테르); 폴리(비닐 알코올); 폴리(비닐 케톤); 폴리(비닐할라이드), 예컨대, 폴리(비닐 클로라이드) 등; 폴리(비닐 니트릴), 폴리(비닐 에스테르), 예컨대, 폴리(비닐 아세테이트) 등; 폴리(비닐 피리딘), 예컨대, 폴리(2-비닐 피리딘), 폴리(5-메틸-2-비닐 피리딘) 등; 폴리(스티렌); 폴리(카보네이트); 폴리(에스테르); 폴리(올쏘에스테르); 폴리(에스테스아미드); 폴리(무수물); 폴리(우레탄); 폴리(아미드); 셀룰로오스 에테르, 예컨대, 메틸 셀룰로오스, 히드록시에틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 등; 셀룰로오스 에스테르, 예컨대, 셀룰로오스 아세테이스, 셀룰로오스 아세테이스 프탈레이트, 셀룰로오스 아세테이스 부틸레이트 등; 다당류, 단백질, 젤라틴, 녹말, 검, 수지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 물질들은 물리적 혼합물(혼합액)으로서, 또는 코폴리머로서, 단독으로 사용될 수 있다. 또한, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리부틸시아노아크릴레이트, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리아릴아미드, 폴리무수물, 폴리올쏘에스테르, N,N-L-리신디일텔레프탈레이트, 폴리무수물, 탈용매화된 생물학적 활성제 또는 탄수화물, 다당류, 폴리아크롤레인, 폴리글루타르알데히드 및 유도체, 코폴리머 및 폴리머 혼합액.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 하기 단계를 포함하는 미립자 담체 생성에 의한 생물학적 활성제 캡슐화 방법이 제공된다:

a) 유기 용매 중에 폴리부틸시아노아크릴레이트(PBCA)를 용해시켜 폴리머 용액을 형성시키는 단계;

d) 상기 유기상을 증발시킴으로서 수성 상 내 상기 생물학적 활성제를 함유하는 중공 루멘을 포함하는 미립자 담체를 획득하는 단계.

본원에 기술된 방법의 추가적 구체예에서, 단계(d)는 겔 형성 폴리머를 첨가하는 단계를 추가적으로 포함한다. 추가 구체예에서, 상기 겔 형성 폴리머는 아가로스이다.

일 구체예에서, 본 발명의 미립자 담체는 생물학적 활성제, 예컨대, 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 이러한 단백질은 본원에서 사용된 바와 같이, 표적에 결합할 수 있는, 항체, 항체 단편 및 기타 단백질 작제물로 지칭되는, 항원 결합 분자일 수 있다. 항원 결합 분자는 도메인을 포함할 수 있다. "도메인"은 나머지 단백질과는 관계없이 3차 구조를 갖는, 접힌 단백질 구조이다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 분리된 기능적 특성을 담당하며, 많은 경우에, 나머지 단백질 및/또는 나머지 도메인의 기능 손실 없이, 다른 단백질에 첨가되거나, 제거되거나 또는 전달될 수 있다. "단일 항체 가변 도메인"은 항체 가변 도메인의 서열 특성을 포함하는, 접힌 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인 및 예를 들어 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특성이 아닌 서열에 의해 대체된, 개질된 가변 도메인 또는 N- 또는 C- 말단 연장부를 포함하거나 트렁케이팅된(truncated) 된 항체 가변 도메인을 비롯하여 적어도 결합 활성 및 전장 도메인의 특이성을 유지하는 가변 도메인의 접힌 단편을 포함한다.

항원 결합 분자는 한개 이상의 면역글로불린 가변 도메인을 포함할 수 있는데, 예를 들어, 이러한 분자는 항체, 도메인 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ScFv, 디아바디, 헤테로콘쥬게이트 항체를 포함할 수 있다. 이러한 항원 결합 분자는 단일 표적에 결합할 수 있거나, 다특이적일 수 있는데(즉, 다수의 표적에 결합), 예를 들어, 이것은 이중특이적 또는 삼중특이적일 수 있다. 일 구체예에서, 항원 결합 분자는 항체이다. 또 다른 구체예에서, 항원 결합 분자는 도메인 항체(dAb)이다. 또 다른 구체예에서, 항원 결합 분자는 항체 및 항원 결합 단편의 조합, 예컨대, 예를 들어, 하나 이상의 dAbs 및/또는 모노클로날 항체에 부착된 하나 이상의 ScFvs일 수 있다. 추가 구체예에서, 항원 결합 분자는 항체 및 펩티드의 조합일 수 있다. 항원 결합 분자는 하나 이상의 비-Ig 결합 도메인, 예컨대, 상이한 V 영역 또는 도메인에 관계없이 특이적으로 항원 또는 에피토프에 결합하는 도메인을 포함할 수 있으며, 이는 dAb, 예를 들어, 인간, 카멜리드 또는 상어 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있거나, 천연 리간드 이외의 리간드에 결합을 수득하기 위해 단백질 공학처리(engineering)된, CTLA-4(에비바디(Evibody)); 리포칼린; 단백질 A 유래 분자, 예컨대, 단백질 A의 Z-도메인(에피바디(Affibody), SpA), A-도메인(Avimer/Maxibody); 열 충격 단백질, 예컨대, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(트랜스-바디); 안키린 반복 단백질(DARPin); 펩티드 압타머; C-형 렉틴 도메인(테트라넥틴(Tetranectin)); 인간-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(affilins); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 억제제의 스콜피온 독소쿠니츠(toxinkunitz)형 도메인; 및 피브로넥틴(애드넥틴(adnectin))으로 이루어진 군에서 선택된 지지체(scaffold)의 유도체인 도메인일 수 있다.

CTLA-4(세포독성 T 림프구 관련 항원 4)는 주로 CD4+ T-세포에서 발현된 CD28-패밀리 수용체이다. 이의 세포외 도메인은 가변 도메인-유사 Ig 폴드(fold)를 갖는다. 항체의 CDRs에 상응하는 루프는 이종 서열로 대체되어 상이한 결합 특성을 부여할 수 있다. 상이한 결합 특이성을 갖도록 공학처리된 CTLA-4 분자는 애비바디(Evibodies)로도 공지되어 있다. 추가 상세한 설명은 문헌[Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)]을 참조하라.

리포칼린은 작은 소수성 분자, 예컨대, 스테로이드, 빌린, 레티노이드 및 지질을 운반하는 세포외 단백질의 패밀리이다. 리포칼린은 원뿔형 구조의 개구부 끝에 다수의 루프를 지닌 단단한-시트 구조를 가졌는데, 이는 상이한 표적 항원에 결합하도록 공학처리될 수 있다. 안티칼린은 크기상 160-180개의 아미노산이며, 리포칼린으로부터 유래된다. 추가 상세한 설명은 문헌[Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)], US7250297B1 및 US20070224633를 참조하라.

에피바디는 스타필로코쿠스 아우레우스의 단백질 A로부터 유래된 골격으로, 항원에 결합하도록 공학처리될 수 있다. 도메인은 대략 58개의 아미노산의 세개의 나선형 묶음으로 구성된다. 표면 잔기의 랜덤화에 의해 라이브러리가 생성되었다. 추가 상세한 설명은 문헌[Protein Eng. Des. SeI. 17, 455-462 (2004)] 및 EP1641818A1를 참조하라.

아비머는 A-도메인 골격 패밀리에서 유래된 멀티도메인 단백질이다. 대략 35개의 아미노산의 천연 도메인은 정의된 이황화 결합된 구조를 채택하였다. A-도메인의 패밀리에 의해 나타낸 자연적 변이체의 뒤섞임에 의해 다양성이 생성된다. 추가 상세한 설명은 문헌[Nature Biotechnology 23(12), 1556 -1561 (2005) 및Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)]을 참조하라.

트랜스페린은 모노머 혈청 운반 당단백질이다. 트랜스페린은 허용적(permissive) 표면 루프 내에서 펩티드 서열의 삽입에 의해 상이한 표적 항원에 결합하도록 공학처리될 수 있다. 공학처리된 트랜스페린 골격의 예는 트랜스-바디를 포함한다. 추가 상세한 설명은 문헌[J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)]을 참조하라.

계획된 안키린 반복 단백질(Designed Ankyrin Repeat Proteins, DARPins)은 세포 골격에 내재성 막 단백질의 부착을 매개하는 단백질의 한 페밀리인 안키린에서 유래된다. 단일 안키린 반복은 두 개의 α-나선 및 β-턴으로 이루어진 33개의 잔기 모티프(residue motif)이다. 이것은 각각의 반복의 제 1 α-나선 및 β-턴 중 잔기를 랜덤화함에 의해 상이한 표적 항원에 결합하도록 공학처리될 수 있다. 이들의 결합 인터페이스는 모듈의 수를 증가시킴에 의해 증가될 수 있다(친화도 성숙(affinity maturation)법). 추가 상세한 설명은 문헌[J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) 및 J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) 및 US20040132028A1]을 참조하라.

피브로넥틴은 항원에 결합하도록 공학처리될 수 있는 골격이다. 애드넥틴은 인간 피브로넥틴 유형 Ⅲ(FN3)의 15 반복 단위의 10번째 도메인의 천연 아미노산 서열의 백본으로 이루어져 있다. 샌드위치의 한 말단에서 세 개의 루프는 애드넥틴이 흥미로운 치료적 표적을 특이적으로 인식할 수 있도록 공학처리될 수 있다. 추가 상세한 설명은 문헌[Protein Eng. Des. SeI. 18, 435-444(2005), US20080139791, WO2005056764 및 US6818418B1]을 참조하라.

펩티드 압타머는 불변 골격 단백질, 활성 부위에 삽입된 제약적 가변 펩티드 루프를 포함하는 전형적인 티오레독신(TrxA)으로 이루어진 조합적 인식 분자이다. 추가 상세한 설명은 문헌[Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)]을 참조하라.

미소체는 3-4개의 시스테인 브릿지를 포함하는, 길이상 25-50개의 아미노산의 자연적으로 발생한 마이크로단백질에서 유래된다 - 마이크로단백질의 예는 카라타B1(KalataB1) 및 코노독소(conotoxin) 및 노틴(knottins)을 포함한다. 상기 마이크로단백질은 상기 마이크로단백질의 전반적인 접힘에 영향을 미치지 않고, 최대 25개의 아미노산을 포함하도록 공학처리될 수 있는 루프를 갖는다. 공학처리된 노틴 도메인의 추가 상세한 설명은 WO2008098796을 참조하라.

다른 비 Ig 결합 도메인은 상이한 표적 항원 결합 특성을 공학처리하기 위하여 골격으로서 사용된 단백질을 포함하고, 이 단백질에는 인간-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아플린), 인간 프로테아제 저해제의 쿠니츠형 도메인, 라스(Ras)-결합 단백질 AF-6의 PDZ-도메인, 스콜피온 독소(카리브도독소(charybdotoxin)), C-형 렉틴 도메인(테트라넥틴)이 포함된다 - [Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies(2007, Stefan Dubel 출판)의 제 7장 및 Protein Science 15:14-27 (2006)에 개관되어 있음]. 본 발명의 비 Ig 결합 도메인은 상기 임의의 대체 단백질 도메인에서 유래될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 항원 결합 분자는 중추 신경계, 예컨대, 뇌 또는 척수에서, 또는 예를 들어, 신경 조직에서 발견되는 표적에 결합한다.

본원에 상술된 발명의 추가 구체예에서, 항원 결합 분자는 신경학적 질병 또는 장애, 예컨대, MAG(미엘린 관련 당단백질), NOGO(신경돌기 성장 억제 단백질) 또는 β-아밀로이드와 관련된 것으로 공지된 표적에 특이적으로 결합한다.

이러한 항원 결합 분자는 NOGO, 예를 들어 항-NOGO 항체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자를 포함한다. 본 발명에서 이용하기 위한 항-NOGO 항체의 한 예는 SEQ ID NO 1의 중쇄 및 SEQ ID NO 2의 경쇄에서 정의된 항체이거나, SEQ ID NO 1 및 2에 제시된 항체의 CDRs를 포함하는 항-NOGO 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 이러한 항체(H28 L16)의 추가 상세한 설명은 본원에 참조로서 통합된, PCT 출원 WO2007068750에서 설명될 수 있다.

이러한 항원 결합 분자는 MAG, 예를 들어 항-MAG 항체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자를 포함한다. 본 발명에서 이용하기 위한 항-MAG 항체의 한 예는 SEQ ID NO 11의 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO 12의 경쇄 가변 영역에서 정의된 항체이거나, SEQ ID NO 1 및 2에 제시된 항체의 CDRs를 포함하는 항-MAG 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 이러한 항체(BvH1 CvL1)의 추가 상세한 설명은 본원에 참조로서 통합된, PCT 출원 WO2004014953에서 설명될 수 있다.

이러한 항원 결합 분자는 β-아밀로이드, 예를 들어 항-β-아밀로이드 항체에 결합할 수 있는 항원 결합 분자를 포함한다. 본 발명에서 이용하기 위한 항-β-아밀로이드 항체의 한 예는 SEQ ID NO 5의 중쇄 또는 SEQ ID NO 6의 경쇄에서 정의된 항체이거나, SEQ ID NO 5 및 7에 제시된 항체의 CDRs를 포함하는 항-β-아밀로이드 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 이러한 항체(H2L1)의 추가 상세한 설명은 본원에 참조로서 통합된, PCT 출원 WO2007113172에서 설명될 수 있다. 본 발명에서 이용하기 위한 대안적인 항-β-아밀로이드 항체는 SEQ ID NO 7의 중쇄 및/또는 SEQ ID NO 8의 경쇄에서 정의된 항체이거나, SEQ ID NO 7 및 8에 제시된 항체의 CDRs를 포함하는 항-β-아밀로이드 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.

이러한 항체의 CDR 서열은 카벳 계수 시스템(Kabat numbering system)(Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987), 초티아 계수 시스템(Chothia numbering system)(Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948), 접촉 정의 방법(the contact definition method)(MacCallum R.M., and Martin A.C.R. and Thornton J. M, (1996), Journal of Molecular Biology, 262 (5), 732-745), 또는 당업자에게 공지된 CDR 측정 및 항체에 잔여물 계수에 대한 임의의 다른 확립된 방법으로 측정될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 항원 결합 단백질은 눈에서 발견되는 표적, 예컨대, TNF, TNFr-1, TNFr-2, TGF베타 수용체-2, VEGF, NOGO, MAG, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-17, CD20, 베타 아밀로이드, FGF-2, IGF-1, PEDF, PDGF 또는 보체인자, 예를 들어, C3, C5, C5aR, CFD, CFH, CFB, CFI, sCR1 또는 C3에 결합한다.

본 발명의 일 구체예에서, 항원 결합 단백질은 VEGF에 결합한다. 본 발명의 대안적 구체예에서, 항원 결합 단백질은 β-아밀로이드에 결합한다.

본 발명의 일 구체예에서, 미립자 담체는 미소구체(microspheres) 또는 나노입자일 수 있다. 이러한 한가지 구체예에서, 미립자 담체는 나노입자이며, 생물학적 활성제는 단백질이다. 또 다른 구체예에서, 미립자 담체는 나노입자이며 생물학적 활성제는 펩티드이다. 추가 구체예에서, 미립자 담체는 나노입자이며 생물학적 활성제는 항원 결합 분자, 예를 들어, 도메인 항체 또는 항체를 포함한다. 추가 구체예에서, 미립자 담체는 나노입자이며 생물학적 활성제는 도메인을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 미립자 담체는 미소구체이며 생물학적 활성제는 단백질이다. 추가 구체예에서, 미립자 담체는 미소구체이며 생물학적 활성제는 펩티드이다. 추가 구체예에서, 미립자 담체는 미소구체이며 생물학적 활성제는 항원 결합 분자, 예를 들어, 도메인 항체 또는 항체를 포함한다. 추가 구체예에서, 미립자 담체는 미소구체이며 생물학적 활성제는 도메인을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 본원에 제시된 발명의 임의의 방법에 따른 나노입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 추가 구체예에서, 개수로(by number) 약 90% 이상의 나노입자가 동적 광 산란 기법(dynamic light scattering techniques)을 이용하여 측정시, 약 1 nm 내지 약 1OOO nm의 범위 이내이다. 추가 구체예에서, 개수로(by number) 약 90% 이상의 나노입자가 동적 광 산란 기법을 이용하여 측정시, 약 1 nm 내지 약 400 nm, 또는 약 1 nm 내지 약 250 nm, 또는 약 1 nm 내지 약 150 nm, 또는 약 40 nm 내지 약 250 nm, 또는 약 40 nm 내지 약 150 nm, 또는 약 40 nm 내지 약 100 nm의 범위 이내이다.

본 발명의 추가 구체예에서, 개수로 약 90% 이상의 나노입자가 동적 광 산란 기법을 이용하여 측정시, 약 40 nm 내지 약 250 nm의 범위 이내이다.

본 발명의 추가 구체예에서, 개수로 약 90% 이상의 나노입자가 동적 광 산란 기법을 이용하여 측정시, 약 40 nm 내지 약 150 nm의 범위 이내이다.

추가 구체예에서, 본 발명의 나노입자를 포함하는 조성물이 제공되는데, 상기 조성물 내 나노입자의 중간 크기는 동적 광 산란 기법을 이용하여 측정시, 직경상 약 1OOO nm 미만, 예를 들어, 직경상 약 4OO nm 미만, 예를 들어, 직경상 약 250 nm 미만, 예를 들어, 직경상 약 150 nm 미만이다.

추가 구체예에서, 상기 조성물 내 나노입자의 중간 크기는 약 40 nm 내지 약 250 nm이다.

추가 구체예에서, 상기 조성물 내 나노입자의 중간 크기는 약 40 nm 내지 약 150 nm이다.

본 발명의 일 구체예에서, 본원에 제시된 발명의 임의의 방법에 따른 미소구체를 포함하는 조성물을 제공한다. 추가 구체예에서, 개수로 약 90% 이상의 미소구체가 저각도 레이저 광 산란 기법(Low angle laser light scattering techniques)을 이용하여 측정시, 약 1μm 내지 약 100μm의 범위 이내의 직경을 갖는다. 추가 구체예에서, 개수로(by number) 약 90% 이상의 입자가 저각도 레이저 광 산란 기법을 이용하여 측정시, 약 1μm 내지 약 80μm, 또는 약 1 μm 내지 약 60μm, 또는 약 1μm 내지 약 40μm, 또는 약 1μm 내지 약 30μm, 또는 약 1μm 내지 약 10μm의 범위 이내이다.

본 발명의 추가 구체예에서, 개수로 약 90% 이상의 미소구체가 저각도 레이저 광 산란 기법을 이용하여 측정시, 약 1μm 내지 약 60μm의 범위 이내이다.

본 발명의 추가 구체예에서, 개수로 약 90% 이상의 미소구체가 저각도 레이저 광 산란 기법을 이용하여 측정시, 약 1μm 내지 약 30μm의 범위 이내이다.

추가 구체예에서, 본 발명의 미소구체를 포함하는 조성물이 제공되는데, 상기 조성물 내 미소구체의 중간 크기는 상기 조성물 내 나노입자의 중간 크기는 저각도 레이저 광 산란 기법을 이용하여 측정시, 직경상 약 100μm 미만, 예를 들어, 직경상 약 80μm 미만, 예를 들어, 직경상 약 60μm 미만, 예를 들어, 직경상 약 40μm 미만이다.

추가 구체예에서, 상기 조성물 내 미소구체의 중간 크기는 약 1 μm 내지 약 6μm, 또는 1 μm 내지 약 30μm이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 미립자 담체는 치료적 양의 활성 생물학적 분자를 약 3달 또는 그 이상, 또는 최대 6개월 또는 그 이상, 또는 최대 12개월 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 계속적으로 방출한다.

일 구체예에서, 단백질 대 폴리머의 w/w 비는 0.5% 내지 50%, 예를 들어 약 0.5% 이상 또는 약 1% 이상 또는 약 2% 이상 또는 약 5% 이상 또는 약 7% 이상 또는 약 10% 이상 또는 약 11% 이상 또는 약 14% 이상 또는 약 20% 이상 또는 약 40% 이상 또는 약 50% 이상 일 수 있다. 예를 들어, 단백질이 폴리펩티드인 경우, 상기 펩티드 대 폴리머의 비는 약 11% 이상일 수 있거나, 단백질이 항체인 경우, 상기 항체 대 폴리머의 비는 약 14% 이상일 수 있거나, 단백질이 도메인 항체인 경우, 도메인 항체 대 폴리머의 비는 약 11% 이상일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 입자의 캡슐화 효율은 약 1% 이상 또는 약 2% 이상 또는 약 10% 이상 또는 약 20% 이상 또는 약 40% 이상 또는 약 50% 이상 또는 약 60% 이상 또는 약 70% 이상 또는 약 80% 이상 또는 약 90% 이상 또는 약 95% 이상 또는 약 97% 이상 또는 약 99% 이상이다. 예를 들어, 단백질이 펩티드인 경우, 캡슐화 효율은 약 60% 이상일 수 있으며, 단백질이 항체인 경우, 캡슐화 효율은 약 90% 이상일 수 있거나, 단백질이 도메인 항체인 경우, 캡슐화 효율은 약 60% 이상일 수 있다.

본 발명의 방법에 이용하기 적합한 유기 용매의 예는 물과 섞이지 않는(water-immiscible) 에스테르, 예컨대, 에틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, n-프로필 아세테이트, 이소부틸 아세테이트, n-부틸 아세테이트, 이소부틸 이소부틸레이트, 2-에틸헥실 아세테이트, 에틸렌 글리콜 디아세테이트; 물과 섞이지 않는 케톤, 예컨대, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸케톤, 메틸 이소아밀 케톤, 메틸 n-아밀 케톤, 디이소부틸케톤; 물과 섞이지 않는 알데히드, 예컨대, 아세트알데히드, n-부틸알데히드, 크로톤알데히드, 2-에틸헥사알데히드, 이소부틸알데히드 및 프로피온알데히드; 물과 섞이지 않는 에테르 에스테르, 예컨대, 에틸 3-에톡시프로피오네이트; 물과 섞이지 않는 방향족 탄화수소, 예컨대, 톨루엔 크실렌 및 벤젠; 물과 섞이지 않는 할로탄화수소, 예컨대 1,1,1 트리클로로에탄; 물과 섞이지 않는 글리콜 에테르 에스테르, 예컨대, 프로필렌 글리콜 모노메틸 에테르 아세테이트, 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 아세테이트, 에틸렌 글리콜 모노부틸 에테르 아세테이트, 디에틸렌 글리콜 모노부틸 에테르 아세테이트; 물과 섞이지 않는 프탈레이트 가소제(plasticisers), 예컨대, 디부틸 프탈레이트, 디에틸 프탈레이트, 디메틸 프탈레이트, 디옥틸 프탈레이트, 디옥틸 테레프탈레이트, 부틸 옥틸 프탈레이트, 부틸 벤질 프탈레이트, 알킬 벤질 프탈레이트; 물과 섞이지 않는 가소제, 예컨대, 디옥틸 아디페이트(adipate), 트리에틸렌 글리콜 디-2-에틸헥사노에이트, 트리옥틸 트리멜리테이트(trimellitate), 글리세릴 트리아세테이트, 글리세릴/트리프로피오닌, 2,2,4-트리메틸-1,3-펜탄디올 디이소부틸레이트, 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 또는 디메틸설폭사이드, 사염화탄소, 클로로포름, 사이클로헥산, 1,2-디클로로에탄, 디클로로메탄, 디에틸 에테르, 디메틸 포름아미드, 헵탄, 헥산 및 기타 탄화수소, 메틸-tert-부틸 에테르, 펜탄, 톨루엔, 2,2,4-트리메틸펜탄, 1-옥타놀 및 이의 이성질체 또는 벤질 알코올을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용된 용매는 메틸렌 클로라이드, 에틸아세테이트 또는 디메틸설폭사이드, 카본 테트라클로라이드, 클로로포름, 사이클로헥산, 1,2-디클로로에탄, 디클로로메탄, 디에틸 에테르, 디메틸 포름아미드, 헵탄, 헥산 및 기타 탄화수소, 메틸-tert-부틸 에테르, 펜탄, 톨루엔, 2,2,4-트리메틸펜탄, 1-옥탄올 및 이의 이성질체 또는 벤질 알코올에서 선택될 것이다.

본원에 기술된 본 발명의 모든 양태에서, 미립자 담체, 이들의 제작 방법 또는 이들을 포함하는 조성물은 계면활성제, 예컨대, 하기에 제한되지는 않는 계면활성제의 첨가를 추가적으로 포함할 수 있다: 소듐 클로레이트(소듐 클로레이트), 폴록사머 188(pluronic F68™, 또는 F127), 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리솔베이트 80, 덱스트란, 폴록사머, 폴록사민, 다기능 알코올의 카복실산 에스테르, 알콕시화된 에테르, 알콕시화된 에스테르, 알콕시화된 모노, 디 및 트리글리세리드, 알콕시화된 페놀 및 디페놀, 에톡시화된 에테르, 에톡시화된 에스테르, 에톡시화된 트리글리세리드, GenapolR™ 및 BaukiR™ 시리즈 물질, 지방산의 금속염, 카복실산의 금속염, 알코올 설페이트의 금속염, 및 지방산 알코올 설페이트의 금속염 및 설포숙시네이트의 금속염 및 상기 물질의 두개 이상의 혼합물.

추가 구체예에서, 상기 계면활성제는, 소듐 클로레이트, 폴록사머 188(플루로닉(pluronic) F68™), 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리솔베이트 80, 덱스트란에서 선택된다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 기술된 발명의 방법 중 어느 하나에 의해 획득가능한 생물학적 활성제를 포함하는 미립자 담체가 제공된다.

본 발명의 조성물 및/또는 미립자 담체가 캡슐화된 생물학적 활성제는 미립자 담체로부터의 방출에 대한 적어도 일부 생물학적 활성을 보유하는데, 예를 들어, 상기 활성제가 결합제(binding agent)일 경우, 조성물 내 분자의 일부는 적어도 이들의 표적에 결합하는 일부 능력을 보유할 수 있고, 입자로부터 생물학적 활성제의 방출에 대한 생물학적 반응을 유도할 수 있다. 이러한 결합은 적합한 생물학적 결합 분석으로 측정될 수 있는데, 적합한 분석의 예는 ELISA 또는 Biacore™를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 추가 구체예에서, 조성물은 입자로부터의 방출에 대해 생물학적 결합 분석에 의해 측정시(예를 들어, 일 구체예에서는 ELISA, Biacore로 측정된 경우), 타겟에 대해 50% 이상의 친화력, 또는 70% 이상 또는 90% 이상의 친화력(Kd)을 보유한다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 피검체에 투여된 경우 치료적 효과를 유도할 수 있을 것이다. 본 발명의 조성물의 생물학적 활성은 캡슐화된 생물학적 활성 분자의 활성을 측정하는 임의의 적합한 분석에 의해 측정될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 나노입자 내 단백질의 캡슐화에 의해 생물학적 장벽, 예컨대, 혈액 뇌 장벽을 통해 환자에게 단백질을 전달하는 방법이 제공된다. 추가 구체예에서, 환자는 인간이다.

본 발명의 일 구체예에서, 미립자 담체, 예컨대 미소구체내 캡슐화된 단백질을 표유류, 예를 들어 인간의 눈으로, 전달하는 방법이 제공된다.

또 다른 구체예에서, 상기 기술된 본 발명의 미립자 담체 내 캡슐화된 생물학적 활성제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.

추가 구체예에서, 상기 기술된 본 발명의 나노입자 내 캡슐화된 단백질을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 추가 구체예에서, 눈의 질병을 치료 및/또는 예방하기 위해 본원에 기술된 바와 같은 안구 전달을 위한 미소구체 내 캡슐화된 단백질을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.

추가 구체예에서, 본 발명의 조성물은 혈액 뇌 장벽을 통과하는 미립자 담체와 관련이 있는 장애 또는 질병을 치료 및/또는 예방하는데 이용될 수 있다.

추가 구체예에서, 본원에 기술된 본 발명의 조성물은 중추 신경계의 장애 또는 질명을 치료 및/또는 예방하는데 이용될 수 있는데, 예를 들어, 조성물은 알츠하이머병, 헌팅턴병, 광우병, 웨스트 나일 바이러스 뇌염(West Nile virus encephalitis), 신경-AIDS, 뇌손상, 척수 손상, 뇌의 전이성 암, 또는 다중 경화증, 뇌졸중을 치료 및/또는 예방하는데 이용될 수 있다.

추가 구체예에서, 조성물은 뇌졸중 또는 신경성 손상의 치료 및/또는 예방을 위해 항-MAG 항체를 포함할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 조성물은 뇌졸중 또는 신경성 손상의 치료 및/또는 예방을 위해, 또는 예를 들어, 신경퇴행성 질병, 예컨대 알츠하이머병의 치료 또는 예방을 위해, 항-NOGO 항체를 포함할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 조성물은 뇌졸중 또는 신경성 손상의 치료 및/또는 예방을 위해, 또는 예를 들어, 신경퇴행성 질병, 예컨대 알츠하이머병의 치료 또는 예방을 위해, 항-β 아밀로이드 항체를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 본원에 기술된 바와 같이, 미립자 담체는 비경구 주사 또는 주입, 정맥 주사 또는 동맥내 투여에 의해 환자에게 투여될 수 있다.

추가 구체예에서, 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 조성물은 눈의 장애 또는 질병을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 추가 구체예에서, 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 조성물은 장애, 예컨대, 노화 연관 황반 변성(신생혈관/습성), 당뇨 망막 병증, 망막 정맥 폐쇄성 질환, 포도막염, 각막 신혈관형성(corneal neovascularisation) 또는 녹내장(이에 제한되지는 않음)을 치료 및/또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.

추가 구체예에서, 조성물은 AMD(노화 연관 시력 감퇴), 예를 들어, 습성 AMD, 또는 건성 AMD를 치료 및/또는 예방하기 위해 사용된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 바와 같은, 의약으로 사용하기 위한, 나노입자 및/또는 미소구체 내 캡슐화된 생물학적 활성제가 제공된다.

본 발명의 일 구체예에서, 중추신경계의 질병을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제(medicament)의 제조에서의 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 조성물의 용도가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 알츠하이머병을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 조성물의 용도가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 뇌졸중 또는 신경 손상을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 조성물의 용도가 제공된다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 안구 질환의 치료 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조, 예컨대, AMD의 치료 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 조성물의 용도가 제공된다.

본 발명은 본 발명의 조성물을 이용하여 중추신경계의 질병을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 추가 구체예에서, 본 발명의 조성물을 이용하여 알츠하이머병을 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물을 이용하여 뇌졸중 또는 신경 손상을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다.

또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 이용하여 안구 질병을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 추가 구체예에서, 본 발명의 조성물을 이용하여 AMD을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다.

정의

본원에서 사용된, 용어 "입자 형성 물질"은 폴리머화할 수 있는 모노머 및/또는 올리고머 또는 수성 환경, 예를 들어, PBCA, PLGA에서 불용성 입자를 형성할 수 있는 폴리머를 상술하기 위해 사용된다. 상기 입자 형성 물질은 폴리머화되지 않을 경우, 유기 용매에 용해될 것이다.

본 명세서를 통해, 본원에서 사용된, 용어 "미립자 담체"는 나노입자와 미소구체 둘 모두를 포함하도록 사용된다. "미소구체"는 1μm보다 큰 직경을 갖는, 다양한 천연 및 합성 물질로 구성되는 입자인 반면, 본원에서 사용된 "나노입자"는 예컨대, 1-1000 nm의 서브마이크론(submicro)의 크기의 입자이다.

일 구체예에서, 본원에서 사용된 용어 미립자 담체, 나노입자 및 미소구체는 투여 후에 충분한 양의 입자가 인간 또는 동물의 체내로 들어간 후, 및 원하는 표적 기관 또는 조직, 예를 들어, 뇌 또는 눈에 도달할 수 있도록 충분한 시간 동안, 실질적으로 무손상을 유지하도록, 생체적합적이며, 사용 환경에 의한 화학적 및/또는 물리적 파괴에 충분히 견딜 수 있는 담체 구조를 나타낸다.

본원에서 사용된 용어 "생물학적 활성제"는 분자가 이들의 원하는 표적에 도달한 경우, 적어도 일부 생물학적 활성을 가질 수 있어야 하는 분자를 나타낸다. 의심의 소지를 없애기 위해, 본 명세서를 통해 이용된, 용어 "생물학적 활성제" 및 "생물학적 활성 분자"는 동일한 의미를 갖도록 의도되었고 상호교환적으로 사용될 수 있다.

용어 "가용화"는 용매 중 개별 분자 형태로 용액의 형성 또는 액체 내 현탁된 분자의 미세한 고체 응집 형태로 액체 현탁액 중 고체의 형성으로 정의된다. 가용화 과정은 또한 충분히 용해된 분자 및 현탁된 고체 응집의 혼합물을 형성할 수 있다.

미립자 담체 내 캡슐화에 대해 본 명세서를 통해 사용된 용어 "단백질"은 11kDa 이상, 또는 12kDa 이상, 또는 50kDa 이상, 또는 100kDa 이상, 또는 150kDa 이상, 또는 200kDa 이상의 분자량을 갖는 단백질을 포함한다. 캡슐화를 위한 단백질은 또한 상당한 길이, 예컨대, 길이상 70개 이상의 아미노산 또는 길이상 100개 이상의 아미노산 또는 길이상 150개 이상의 아미노산 또는 길이상 200개 이상의 아미노산일 수 있다.

미립자 담체 내 캡슐화에 대해 본 명세서를 통해 사용된 용어 "펩티드"는 약 10 kDa 이하, 또는 약 8 kDa 이하, 또는 약 5 kDa 이하, 또는 약 2 kDa 이하, 또는 약 1 kDa 이하, 또는 약 1 kDa 미만의 분자량을 가지는 아미노산의 짧은 서열을 포함한다. 캡슐화를 위한 펩티드는 길이상 70개 이하의 아미노산 또는 길이상 50개 이하의 아미노산 또는 길이상 40개 이하의 아미노산 또는 길이상 20개 이하의 아미노산 또는 길이상 10개 미만의 아미노산이다.

용어 "안구-주위(Peri-ocular)"는 눈의 외부 주위를 둘러싸는 위치에의 국부 투여를 지칭하며, 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는다: "결막하" - 결막의 아래 - 공막을 걸쳐 안구를 덮는 맑은 점액 막; "테논 하" - 공막 외부이나 눈을 감싸는 테논 막의 아래; "눈둘레" - 안구 구멍(eye socket) 내 적합한 안구의 구체 아래 공간; "구후(retrobulbar)" - 안구의 구체의 매우 뒤쪽 공간, 시신경에 근접함; "맥락막 위(supra-choroidal)" - 공막 아래이나 맥락막 위 공간에 대해 맥락막의 외부; "트랜스-공막(trans-scleral)" - 이 용어는 또한 즉, 공막의 외부로부터가로지르는 전달을 의미하는데 이용될 수 있다.

"면역글로불린 단일 가변 도메인"이란 어구는 상이한 V 영역 또는 도메인과 무관하게 항원 또는 에피토프와 특이적으로 결합하는 항체 가변 도메인(V_H, V_HH, V_L)을 지칭한다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은, 다른 영역 또는 도메인이 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합을 위해 필요하지 않는 경우(즉, 면역글로불린 단일 가변 도메인이 추가의 가변 도메인들과 무관하게 항원과 결합하는 경우), 상기 다른, 상이한 가변 영역들 또는 가변 도메인들과 형태(format)(예를 들어, 동종다합체(homo-multimer) 또는 이종다합체(hetero-multimer)) 형태로 존재할 수 있다. "도메인 항체" 또는 "dAb"는 이러한 용어가 본원에서 사용되는 경우 항원에 결합할 수 있는 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 인간 항체 가변 도메인일 수 있지만, 또한 설치류와 같은 다른 종으로부터의 단일 항체 가변 도메인을 포함한다(예를 들어, WO 00/29004에 기재된 바와 같은, 널스 상어(nurse shark) 및 카멜리드(Camelid) V_HH dAb). 카멜리드 V_HH는, 본래 경쇄가 없는 중쇄 항체를 생성시키는, 낙타, 라마(llama), 알파카(alpaca), 단봉낙타(dromedary) 및 과나코(guanaco)를 포함하는 종으로부터 유래된 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. 이러한 V_HH 도메인은 당 분야에서 이용가능한 표준 기술에 따라 인간화(humanised)될 수 있고, 이러한 도메인은 여전히 본 발명에 따른 "도메인 항체"로 간주된다. 본원에서 사용되는 경우, V_H는 카멜리드 V_HH 도메인을 포함한다.

본원에서 사용된, 용어 "항원 결합 분자"는 항체, 항체 단편 및 표적에 결합할 수 있는 다른 단백질 작제물을 지칭한다.

"도메인"은 접힌 단백질 구조를 지칭하는데, 이러한 구조는 단백질의 나머지 부분과 무관한 3차 구조를 지닌다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 구별된 기능적 특성을 담당하고, 많은 경우에 그러한 단백질 및/또는 도메인의 잔여 부분의 기능 상실없이 다른 단백질로 첨가되거나 이동되거나 전달될 수 있다. "단일 가변 도메인"은 항체 가변 도메인의 특징이 되는 서열을 포함하는 접힌 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인 및 변형된 가변 도메인, 예를 들어 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특징이 아닌 서열에 의해 대체된 가변 도메인, 또는 트렁케이션되거나 N- 또는 C-말단 연장부를 포함하는 항체 가변 도메인 뿐만 아니라 적어도 전장 도메인의 결합 활성 및 특이성을 보유하는 가변 도메인의 접힌 단편을 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "광 산란 기법"은 용액 내 작은 입자의 크기 분포 프로파일을 측정하는데 사용된 수단이다 - 광 산란 기법 중 한가지 예는 나노입자를 측정하기 위해 사용될 수 있는 동적 광 산란 기법이며, 광 산란의 또 다른 예는 미소구체를 측정하기 위해 사용될 수 있는 정적 광 산란 또는 저 각도 광 산란이다. 본원에서 사용된 용어 "동적 광 산란"(DLS)은 입자의 크기에 대한 정보를 유추하기 위해 입자 분산에 의해 산란된 광을 이용하는 방법이다. 동적 광 산란은 액체 현탁액에서 사용되는 경우, 입자의 브라운 운동이 입자 크기에 의존하며, 입자의 브라운 운동은 입자 샘플로부터 산란된 빛의 강도의 변동을 발생시킨다는 사실에 의존한다. 입자의 직경은 상관 함수에 의한 이러한 변동을 분석함으로서 유추된다. 그 다음 스톡스-아인슈타인(Stokes Einstein) 방정식이 적용되어 입자의 평균 유체 역학적 직경이 산출된다.

다-지수(multi-exponential) 분석은 입자 분포를 생성할 수 있고, 이는 샘플 내부에 상이한 종류의 존재에 대한 통찰을 제공한다. DLS은 일반적으로 나노입자의 분석을 용인한다.

본 명세서를 통해 상호교환적으로 사용된 "정적 광 산란" 또는 "저각도 레이저 광 산란"은 때때로 레이저 회절로 지칭된다. 레이저 회절은 회절 각도가 입자의 크기에 반비례한다는 사실에 의존한다. 이 방법은 빛과 물질의 상호작용에 대한 방정식을 완벽히 해결하는 풀 미 이론(full Mie theory)을 이용한다. 레이저 회절은 나노입자 및 미세입자(직경 상 0.02 내지 2000 마이크로미터)의 분석에 이용될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "혈액 뇌 장벽"(BBB)은 주로 필수 대사 작용을 허용하면서, 혈액 중 화학물질로부터 뇌를 보호하는 역할을 하는 막구조이다. 이것은 뇌 모세혈관 내에서 타이트하게 패킹된, 대뇌 미세혈관 상피 세포로 구성된다. 이러한 높은 밀도는 신체 내 다른 모세혈관 내 상피세포보다 훨씬 더 혈액흐름으로부터 물질의 통과를 제한한다.

본 명세서를 통해, 퍼센트 약물 로딩(percentage drug loading)은 입자 제형에서 사용된 물질의 중량 당 약물의 중량 퍼센트로 정의된다(폴리머 중량) w/w.

% 약물 로딩 = (약물의 중량/ 입자 제형에서 사용된 물질의 중량) x 100%.

본 명세서 중에서, 본 발명은 명확하고 간결하게 본 명세서가 작성될 수 있도록 하는 방법으로, 구체예를 참조하여 기술되었다. 구체예는 본 발명을 벗어나지 않고, 다양하게 결합 또는 분리될 수 있음을 인식해야 하며, 그렇게 의도된다.

실시예

실시예 1 - BCA ( 부틸시아노아크릴레이트 ) 모노머의 폴리머화 :

유기 용매 중 빠른 폴리머화 반응이 폴리머를 형성하기 위해 사용되었다:

BCA 모노머(200 μl, Vetbond, 3M)를 25 ml 비커에서 천천히 돌리면서 1 ml의 무수 에탄올에 첨가하였다. 생성된 용액을 폴리머화 반응이 시작될 때까지 서서히 혼합하였다. 폴리머화 반응은 흰색 고체 분산물(dispersion)을 형성시켰다. 분산물의 혼합을 중단하자마자, 반응 혼합물은 너무 점성이 강해 휘저을 수 없게 되었다.

그 다음 반응 혼합액 중의 에탄올을 적어도 1시간 동안 흄-후드(fume-hood)에서 증발시켰다. 에탄올을 증발시킨 후, 갈라진 흰색 고체 케이크를 획득하였다. 상기 고체를 수집하였고, 나노 입자 제조 과정에 사용하였다.

실시예 2 - 이중 에멀젼 방법에 의한 중공 나노입자의 제조:

PBCA 폴리머를 1% w/v의 농도로 디클로로메탄에 용해시키고, 하기와 같이, 이중 에멀젼(수 중 유 중 수 w/o/w) 내로 유화시켜 중공 PBCA 나노입자를 제조하는데 이용하였다:

(i) 1차 에멀젼(w/o)

내부상(w): 물 또는 완충용액 중 5% 소듐 클로레이트(SIGMA), 혼합하여 제조됨:

500 μl의 물 또는 완충용액; 및

500 μl의 소듐 클로레이트(10% w/v 저장용액(stock solution)).

상기 내부 수성상의 총 부피는 1 ml이었다. 상기 용액을 사용할 때까지 얼음상태로 보관하였다. 각 용액을 사용 이전에 1ml의 인슐린 주사기(테르모(Terumo) 1 ml, BD 마이크로란스 바늘(microlance needle) 19G 1.5")로 끌어들였다.

외부 (유기) 상(o): 디클로로메탄("DCM, Fischer) 중 PBCA 폴리머(1 % w/v).

유기상(DCM 중 PBCA 폴리머, 6 ml)를 10ml 비커(차가운 상태를 유지하기 위해 얼음에 둠)에 붓고, 균질기의 프로브를 삽입하였다(Ultra-Turrax, T25, 50ml 프로브). 상기 용액을 파라필름으로 덮고(비커 및 프로브에 부착) 로터 고정자 균질기(rotor stator homogeniser)(Ulltra-Turrax T25 basic)를 이용하여 24,000 rpm의 속도로 균질화시켰다.

1차 에멀젼의 형성:

균질기가 필요한 속도에 다다른 즉시, 내부 상을 프로브에 근접한 용액 내로 주입함으로서 첨가하였다. 생성된 에멀젼을 2분 동안(얼음 상태) 균질화시킨 후, 유리 주사기(SGE, 25 ml, 가스 기밀, 유기 용매에 적합함, P/N 009462 25MDR-LL-GT, Batch # F06-A2190, 굵은 바늘인 5 cm 2R2 바늘, 0.7 mm ID에 맞음)로 옮겼다.

( ii ) 2차 에멀젼 (w/o/w)

내부상(w/o): 상기 기술된 균질화 단계로부터의 1차 에멀젼

외부상(w): 물 중 소듐 클로레이트(1.25% w/v).

2차 에멀젼의 형성:

균질화하면서 2차 수성 상(1.25% w/v 소듐 클로레이트)에 첨가함으로서 이중 에멀젼(w/o/w)을 형성하는데 1차 단일 에멀젼(w/o)을 이용하였다. 소듐 클로레이트 용액(1.25 % w/v, 30 ml)을 긴 50 ml 비커(에멀젼을 차갑게 유지하기 위해 얼음위에 둠)에 옮겨 담고, 실벌슨(Silverson) L4RT 균질기의 프로브(3/4 인치 프로브, 고 에멀설 스크린(high emulsor screen))를 삽입하였다. 상기 용액을 파라필름으로 덮고(비커 및 프로브에 부착) 8,000 rpm의 속도로 균질화시켰다. 8,000 rpm 속도에 도달한 즉시, 1차 에멀젼을 프로브에 근접한 용액 내로 주입하였다. 생성된 에멀젼을 6분 동안 균질화시켰다.

형성된 이중 에멀젼을 짧은 50 ml 비커로 옮기고, 유기상을 3시간 동안 일정하게 저으면서(IKA 마그네틱 교반기, 세팅 4) 흄 후드에서 증발시켰다.

원심분리에 의한 나노입자 세척:

유기 용매의 제거 후, 형성된 나노입자를 한차례 16,200 rcf에서 원심분리하여 세척하였고, 물(10 ml)에서 재-현탁시켰다.

실시예 3 - 동적 광 산란에 의한 나노입자 형성 확인

나노입자의 형성을 준-탄성 광 산란(uasi-elastic light scattering, QELS)(동적 광 산란(DLS)으로도 알려짐)을 이용하여 크기화함으로써 확인하였다. 이 입자를 제조업자에 의해 제공된 표준 절차에 따라 브룩헤븐 인스트루먼트 코퍼레이션(Brookhaven Instruments corporation) 입자 크기 분석기(BIC 90 플러스)를 이용해 분석하였다. 상기 입자 현탁액을 물에서 200x로 희석하고, 표준 크기 파라미터(25°C의 온도, 90°의 레이저 빔 각도, 658 nm의 레이저 파장)를 이용하여 크기화하였다. 상기 입자를 각 기간마다 1분의 10 사이징 실행(sizing runs)을 수행하여 분석하였다.

상기 기계는 표준 형태의 코렐로그램으로 미가공 데이타를 제공하였다. 이는 상이한 시간 간격으로 입자로부터의 분산된 빛 강도의 자기상관함수 C(τ) 및 자기상관(autocorrelation)이 붕괴 시간 τ에 따라 어떻게 붕괴(decay)하는지를 나타낸다. 산란된 빛의 자기상관에서의 붕괴는 입자 직경에 의존하며, 작은 입자에서 더 빠르다. 상기 기계는 스톡스-아인슈타인 방정식을 적용함으로써, 입자 크기에 대한 정보를 유추한다. 이는 샘플 내 입자의 평균 유체 역학적 직경 및 추가로 입자 집단에 대해 유추된 데이타를 산출한다.

동적 광 산란은 거대 입자의 존재에 매우 민감하며, 심지어 샘플의 1% 미만이 존재하는 경우에도 측정에 상당한 영향을 미친다. 그 결과, 샘플 중 거대 입자에 상당히 영향을 받는 기계가 제시하는 평균 유체 역학적 직경은 실질적으로 다를 수 있다. 그 결과, 배치 사이의 수십 나노미터의 차이가 관찰될 수 있으며, 이러한 이유로, 가장 중요한 코렐로그램과 함께 기계가 제공하는 완벽한 데이타 세트를 살피는 것이 중요하다. 완벽한 데이타 세트를 살핌으로서, 샘플을 정확히 특징화하는 것이 가능한데, 이는 상기 기계가 거대 입자가 거의 존재하지 않음에도 불구하고, 샘플 내 존재하는 작은 입자 대부분을 쉽게 감지할 수 있기 때문이다. 코렐로그램 그 자체의 형상은 상기 입자가 작은지 여부 및 상기 샘플이 다분산성인지 여부의 매우 명확히 표시를 제공한다. 기준 지표(baseline index) 또한 데이타의 질의 정확한 표시를 제공한다. 본원 내 모든 데이타는 5 이하에 포함되지 않는 기준 지표를 나타내며, 10은 판독의 가능한 가장 높은 품질에 대한 최대값이다.

도 1a는 QELS에 의해 입자 현탁물질의 크기에 따라 획득된 코렐로그램(미가공 데이타)을 나타낸다. 상기 코렐로그램은 입자의 존재는 임의의 빛 분산을 생성하지 않을 것이기 때문에, 입자 제조 과정에 의해 나노입자 현탁물질이 생성되었음을 명확히 나타내었다. 코렐로그램의 형상은 입자가 작고, 거대 응집체가 존재하지 않기 때문에, 상기 현탁물질이 우수한 약학적 품질임을 나타내었다. 나노입자 현탁물질의 QELS에 의한 크기화는, 262.6 nm의 나노입자의 평균 유체역학적 직경이 형성되었음을 나타내었다(도 1a). 상기 입자 집단은 또한 샘플 내 얼마나 넓은 범위의 입자 크기임을 측정하는 다분산도 지표를 이용해 0.262에서, 상대적으로 단분산성(monodisperse)으로 관찰되었다(도 1a). 이것은 입자 제형에 대해 최대 허용가능한 값 0.300 이하이다. 일반적으로, 상기 코렐로그램은 이중 에멀젼 과정이 우수한 품질의 PBCA 나노입자 현탁물질을 성공적으로 생성했음을 확인시켰다.

유추된 데이타(스톡스-아인슈타인 방정식을 이용하여 기계에서 생성됨)는 대부분의 입자가 작다고 시사한다(도 1b-d). 상기 결과는 대략 87.5 %의 입자 집단이 138.19 nm 이하의 직경을 갖는다고 시사한다(도 1b). 현탁물질은 대부분의 입자 집단이 상당히 작다는 사실과 함께 거대 응집체가 존재하지 않고 직경상 506.81 nm을 초과하는 어떤 입자도 포함하지 않음이 밝혀졌다(도 1c). 더욱이, 상기 제형은 99.86 nm보다 작은 어떤 입자도 포함하지 않았다(도 1d). 따라서, 대부분의 입자는 정맥내 투여에 이상적인 크기이면서 약물 로딩이 제대로 이뤄지지 않을 정도로 너무 작지는 않은 크기인, 직경 99.86 내지 138.19 nm이다.

도 1 - 현탁액 중에 나노입자의 존재를 나타내는 QELS에 의해 획득한 크기 데이타.

도 1(a) 동적 광 산란에 의한 나노 입자 현탁액의 분석 후 획득된 코렐로그램(Correlogram). 획득된 데이타에 따르면, 입자의 평균 유체 역학적 직경은 262.6 nm이며 다분산도 지표는 0.262였다.

도 1(b) 크기 범위에 걸쳐 입자 집단(개수)의 분포를 도시하도록 플로팅화된(plotted) 나노입자의 다모드 크기 분포(파생 데이타). 다수의 입자 집단(87.5 %)은 138.19 nm 이하의 직경을 갖는것으로 나타났다.

도 1(c) 크기 범위에 걸쳐 입자 집단(개수)의 분포를 도시하도록 플로팅화된 나노입자의 다모드 크기 분포(파생 데이타). 상기 데이타는 87.5%가 138.19 nm 이하의 직경을 가지며, 100%의 입자 샘플이 506.81 nm 이하의 직경을 갖음을 시사한다. 따라서, 상기 현탁물질은 거대 응집체가 존재하지 않으므로, 정맥내 투여에 적합하다고 여겨진다.

도 1(d)는 크기 범위에 걸쳐 입자 집단(개수)의 분포를 도시하도록 플로팅화된 나노입자의 다모드 크기 분포(파생 데이타)를 나타낸다. 상기 데이타는 14.9%의 입자 샘플이 99.86 nm 이하의 직경을 갖음을 시사한다.

상기 과정은, 상이한 나노입자 제형이 제조된 경우, 유사한 나노입자 크기를 산출하는 것으로 밝혀졌다. 표 1은 4개 상이한 제형의 연속적인 실행으로부터 획득한 크기 데이타를 요약한 것이다:

표 1

일반적으로, 중공 PBCA 나노입자 제조 과정은 원하는 직경 및 다분산성인 나노입자 현탁물질을 생성하는 것으로 밝혀졌다.

실시예 4 - 나노입자의 분석 - 전자현미경에 의한 나노입자 제형 및 중공 형태의 확인

입자가 형성되었고, 이 입자가 중공임을 확인하기 위해, 샘플을 전자 현미경으로 시각화하였다. 나노입자 현탁물질을 투과 전자 현미경(TEM)으로 실험하였다. 냉각-건조된 나노입자를 주사 전자 현미경(SEM)으로 분석하였다. 상기 두 현미경 기법에 의한 분석으로 나노입자의 형성이 확인되었다. SEM는 안정한 나노입자가 형성되었음을 나타내었다. TEM는 상기 나노입자가 PBCA 폴리머 벽으로 둘러쌓인 수성 코어를 가지는, 중공임을 확인시켰다.

도 2는 SEM에 의해 분석된 나노입자를 나타낸다.

도 3은 비교를 위해, 고체 PBCA 나노입자의 중첩된 영상과 함께, TEM에 의한 중공 나노입자의 영상을 나타낸다.

실시예 - 5 - 중공 PBCA 나노입자 내 모노클로날 항체(인간 항- CD23 )의 캡슐화

모노클로날 항체(WO99/58679에 기재된 바와 같은, 인간 항-CD23 mAb)를 균질화 과정 중 내부 수성상에 포함시킴으로서, 나노입자의 수성 코어 내에 가두었다. 항체 용액을 1차 에멀젼(w/o) 제조하는데 사용한 다음, 2차 수성상과 함께 균질화하여 하기와 같은 이중 에멀젼(w/o/w)을 형성시켰다:

( iii ) 1차 에멀젼 (w/o)

내부상(w): WO99/58679호에 기재된 바와 같은 항-CD23 mAb(5% 소듐 클로레이트 중 600 μg(SIGMA)), 혼합에 의해 제조됨:

78 μl의 mAb 용액(7.2 mg/ml)

344 μl의 H₂O

500 μl의 소듐 클로레이트 용액(10% w/v 저장 용액).

내부 수성상의 총 부피는 1 ml이었다. 상기 용액을 사용할 때까지 얼음상태로 보관하였다. 각 용액을 사용 이전에 1ml의 인슐린 주사기(테르모 1 ml, BD 마이크로란스 바늘 19G 1.5")로 끌어들였다.

외부상(o): 디클로로메탄(Fischer) 중 PBCA 폴리머(1 % w/v).

유기상(DCM 중 PBCA 폴리머, 6 ml)를 10ml 비커(차가운 상태를 유지하기 위해 얼음에 둠)에 붓고, 균질기의 프로브를 삽입하였다(Ultra-Turrax, T25, 50ml 프로브). 상기 용액을 파라필름으로 덮고(비커 및 프로브에 부착) 24,000 rpm의 속도로 균질화시켰다.

1차 에멀젼의 형성:

균질기가 최고 속도에 다다른 즉시, 내부 수성 상을 프로브에 근접한 용액 내로 주입함으로서 첨가하였다. 생성된 에멀젼을 2분 동안(얼음 상태) 균질화시킨 후, 유리 주사기(SGE, 25 ml, 가스 기밀, 유기 용매에 적합함, P/N 009462 25MDR-LL-GT, Batch # F06-A2190, 굵은 바늘인 5 cm 2R2 바늘, 0.7 mm ID에 맞음)로 옮겼다.

(ⅳ) 2차 에멀젼 (w/o/w)

내부상(w/o): 상기 기술된 균질화 단계로부터의 1차 에멀젼

외부상(w): 물 중 소듐 클로레이트(1.25% w/v).

2차 에멀젼의 형성:

균질화하면서 2차 수성 상(1.25% w/v 소듐 클로레이트)에 첨가함으로서 이중 에멀젼(w/o/w)을 형성하는데 1차, 단일 에멀젼(w/o)을 이용하였다. 소듐 클로레이트 용액(1.25 % w/v, 30 ml)을 긴 50 ml 비커(에멀젼을 차갑게 유지하기 위해 얼음위에 둠)에 옮겨 담고, 실벌슨 L4RT 균질기의 프로브(3/4 인치 프로브, 고 에멀설 스크린)를 삽입하였다. 상기 용액을 파라필름으로 덮고(비커 및 프로브에 부착) 8,000 rpm의 속도로 균질화시켰다. 8,000 rpm 속도에 도달한 즉시, 1차 에멀젼을 프로브에 근접한 용액 내로 주입하였다. 생성된 에멀젼을 6분 동안 균질화시켰다.

원심분리에 의한 나노입자 세척:

생성된 나노입자를 원심분리에 의해 펠렛화시켜 캡슐화된 항체로부터 유리상태를 분리하였다. 캡슐화 효율을 측정하기 위해, 펠렛(갇힌 항체) 및 상청액(유리 항체)를 총 단백질 분석에 의해 분석하였다.

캡슐화 효율은 600 μg 항체 총 양이 사용된 경우, 52%인 것으로 나타났다. 캡슐화의 효율은 PBCA 폴리머의 최대 허용 용량(마우스에서 50 mg/kg)을 초과하지 않고, 항체의 잠재적 치료량의 전달을 허용하도록 충분히 높은 것으로 나타났다. 더욱이, 이것은 후에 상이한 모노클로날 항체, 인간 항-IL13를 포함하는 입자를 제조하는 것이 가능하며, 이것은 상기 방법이 임의의 수용성 생물의약품에 적용가능함을 시사한다.

도 4는 캡슐화 효율 측정에서 획득된 결과를 나타낸다.

실시예 6 - 나노입자로부터 모노클로날 항체의 방출

생물의약품의 효율적 캡슐화를 달성하는 것 이외에도, 투여 후에 물질이 입자로부터 방출할 수 있고, 이의 활성을 유지하는 것이 증명될 필요가 있었다. 입자로부터 활성 항체의 방출은 초기에는 ELISA에 의한 임의의 방출된 항체의 감지 후 입자의 분해에 의해 시험관 내에서 조사되었다. 캡슐화된 항체의 방출을 위해 입자를, PBCA 폴리머의 부틸 에스테르를 절단하는 것으로 보고된, 부틸 에스테라제(돼지간에서 유래됨, SIGMA)로 처리하였다. 반응 중(링거액(Ringers solution), pH 7.0, 37°C) 상이한 시점(0, 1 , 2, 3, 4 및 24시)에 샘플을 채취하였고, 활성 항체의 존재를 ELISA에 의해 분석하였다.

도 5는 입자의 효소적 분해 후 획득된 방출 프로파일 및 방출된 효소의 ELISA에 의한 분석을 나타낸다.

실시예 7 - 중공 PBCA 나노입자 내에 도메인 항체(항-헨 에그 리소자임 dAb )의 캡슐화

하기 실시예에서, 시그마사로부터 획득한 BCA 키트(QPBCA)를 이용하여 BCA 분석을 수행하였고 지시에 따라 수행하였다. 유리 dAb를 분석을 위해 2배 및 10배 희석하였다. 캡슐화된 dAb를 100배 희석하였다.

도메인 항체(항-헨 에그 리소자임 dAb)를 균질화 과정 중 내부 수성상에 포함시킴으로서, 나노입자의 수성 코어 내에 가두었다. 이 과정에서, dAb의 20 mg/ml 용액 0.5 ml(10 mg 단백질)과 0.5 ml의 안정화 용액(소듐 클로레이트, 10% w/v)을 혼합하여 내부 수성상을 제조하였다. 그 다음 실시예 4에 기술된 바와 같이, 이중 에멀젼 과정에 의해 나노입자를 제조하였다. 생성된 나노입자를 원심분리를 이용해 펠렛화하여 캡슐화된 항체로부터 유리형태를 분리하였다. 캡슐화 효율을 측정하기 위해, 펠렛(갇힌 항체) 및 상청액(유리 항체)를 총 단백질 분석(바이신코니닉산(bicinchoninic acid) 분석)에 의해 분석하였다. 분석 결과를 도 6에 나타내었다. 캡슐화된 dAb의 양은 6.66 mg로 나타났다. 유리 dAb의 양은 4.83 mg이었다. 따라서, 로딩 효율 11.1%이며, 캡슐화 효율은 약 66.6%이었다. 따라서, 이중 에멀젼 방법을 이용하여 중공 PBCA 나노입자 내 밀리그램 함량의 단백질을 효과적으로 캡슐화하는 것이 가능하였다.

실시예 8 - 중공 PBCA 나노입자 내 모노클로날 항체(항- IL -13 mAb )의 캡슐화

모노클로날 항체(항-IL-13 mAb)를 균질화 과정 중 내부 수성상에 포함시킴으로서, 나노입자의 수성 코어 내에 가두었다. mAb의 20 mg/ml 용액 0.5 ml(10 mg 단백질)과 0.5 ml의 안정화 용액(소듐 클로레이트, 10% w/v)을 혼합하여 내부 수성상을 제조하였다. 그 다음 실시예 5에 기술된 바와 같이, 이중 에멀젼 과정에 의해 나노입자를 제조하였다. 생성된 나노입자를 원심분리를 이용해 펠렛화하여 캡슐화된 항체로부터 유리형태를 분리하였다. 캡슐화 효율을 측정하기 위해, 펠렛(갇힌 항체) 및 상청액(유리 항체)를 총 단백질 분석(바이신코니닉산 분석)에 의해 분석하였다. 분석 결과를 도 12에 나타내었다. 캡슐화된 mAb의 양은 8.62 mg로 나타났다. 유리 mAb의 양은 1.79 mg이었다. 따라서, 로딩 효율 14.4% w/w이며, 캡슐화 효율은 86.2%이었다.

서열 목록

서열

SEQUENCE LISTING <110> PAPANICOLOAU, Irene FIDANBOYLU, Mehmet <120> Encapsulation of biologically active agents <130> PB63617 <150> US61/050775 <151> 2008-05-06 <150> US61/074171 <151> 2008-06-20 <160> 15 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence of mus musculus and homo sapiens <400> 1 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Glu Leu Met Gln Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 145 150 155 160 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 165 170 175 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 180 185 190 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 195 200 205 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 210 215 220 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 2 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence of mus musculus and homo sapiens <400> 2 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asn Pro Val 20 25 30 Thr Leu Gly Gln Pro Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu 35 40 45 Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln Gln Leu Val Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 3 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence of mus musculus and homo sapiens <400> 3 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtttcc 120 tgcaaggcat ctggatacac cttcaccagc tactggatgc actgggtgcg acaggcccct 180 ggacaagggc ttgagtggat cggaaatatt aatcctagca atggtggtac taactacaat 240 gagaagttca agagcaaggc caccatgacc agggacacgt ccacgagcac agcctacatg 300 gagctgagca gcctgagatc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgaact gatgcagggc 360 tactggggcc agggaacact agtcacagtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc 420 ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg 480 gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc 540 ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 600 gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 660 cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 720 tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcgcg ggggcaccgt cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 960 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 1200 cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg 1380 ggtaaatga 1389 <210> 4 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence of mus musculus and homo sapiens <400> 4 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgat 60 attgtgatga cccagtctcc actctccaac cccgtcaccc ttggacagcc ggtctccatc 120 tcctgcaggt ctagtaagag tctcctatat aaggatggga agacatactt gaattggttt 180 ctccagaggc caggccaatc tccacagctc ctaatttatt tgatgtccac ccgtgcatct 240 ggggtcccag acagattcag cggcggtggg tcaggcactg atttcacact gaaaatcagc 300 agggtggagg ctgaggatgt tggggtttat tactgccaac aacttgtaga gtatccgctc 360 acgtttggcc aggggaccaa gctggagatc aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc 420 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggacaacgc cctccaatcg 540 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 717 <210> 5 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence of mus musculus and homo sapiens <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn 20 25 30 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Phe Ile Ser Asn Leu Ala Tyr Ser Ile Asp Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Gly Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 6 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence of mus musculus and homo sapiens <400> 6 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Val Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Thr 85 90 95 Arg His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 7 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence of mus musculus and homo sapiens <400> 7 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Phe Asn Ile Lys Val Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Leu Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asn Gly Glu Thr Ile Tyr Thr Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Ser Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 155 160 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 180 185 190 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 195 200 205 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Leu Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 340 345 350 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 8 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence of mus musculus and homo sapiens <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asn Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Arg 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence of mus musculus and homo sapiens <400> 9 Tyr Ala Gly Phe Leu Arg 1 5 <210> 10 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence of mus musculus and homo sapiens <400> 10 Glu Val Gln Leu Leu Val Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ala Tyr 20 25 30 Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Ser Pro Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Pro Arg Lys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 115 120 125 Leu Asn 130 <210> 11 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence of mus musculus and homo sapiens <400> 11 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser His Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr Leu Ser Ser Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val 115 <210> 12 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence of mus musculus and homo sapiens <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Pro Ile Asn Tyr Tyr Gly Ile Asn Tyr Glu Gly Tyr Val 100 105 110 Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 13 <211> 1335 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence of mus musculus and homo sapiens <400> 13 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggatt caccttcagt gacaacggaa tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttcattc attagtaatt tggcatatag tatcgactac 180 gcagacactg tgacgggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgt cagcgggacc 300 tggtttgctt actggggcca gggcacacta gtcacagtct cctcagcctc caccaagggc 360 ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540 agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600 aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcgcgg gggcaccgtc agtcttcctc 720 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1080 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320 ctgtctccgg gtaaa 1335 <210> 14 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence of mus musculus and homo sapiens <400> 14 gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga cccctggcga gcccgccagc 60 atcagctgta gagtgagcca gagcctgctg cacagcaacg gctacaccta cctgcactgg 120 tatctgcaga agcctggcca gagccctcag ctgctgatct acaaggtgtc caaccggttc 180 agcggcgtgc ctgatagatt cagcggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 agcagagtgg aggccgagga tgtgggcgtg tactactgct cccagaccag acacgtgcct 300 tacacctttg gcggcggaac aaaggtggag atcaagcgta cggtggccgc ccccagcgtg 360 ttcatcttcc cccccagcga tgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgtctg 420 ctgaacaact tctacccccg ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa tgccctgcag 480 agcggcaaca gccaggagag cgtgaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg 540 agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgtgag 600 gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaaccgggg cgagtgc 657 <210> 15 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanised sequence of mus musculus and homo sapiens <400> 15 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca gagttagtca gagcctttta cacagtaatg gatacaccta tttacattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct ataaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgct ctcaaactag acatgttccg 300 tacacgttcg gcggagggac caaggtggaa atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggacaa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657

Claims

a) 유기 용매 중에 폴리부틸시아노아크릴레이트(PBCA)를 용해시켜 폴리머 용액을 형성시키는 단계;
b) 생물학적 활성제를 포함하는 수성 용액을 상기 폴리머 용액에 첨가하여 연속 유기상 내에 수성상 액적의 1차 에멀젼을 형성시키는 단계;
c) 상기 1차 에멀젼과 수성 매질을 혼합하여 2차 에멀젼을 형성시키는 단계; 및
d) 상기 유기상을 증발시켜서 수성상 내 생물학적 활성제를 함유하는 중공 루멘(hollow lumen)을 포함하는 미립자 담체를 획득하는 단계,
를 포함하는 미립자 담체(particulate carrier) 생산 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 (a)가 겔 형성제(gel forming agent)를 첨가하는 단계를 추가적으로 포함하는, 방법.
제 2항에 있어서, 상기 겔 형성제가 아가로스인, 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리머가 페길화된(pegylated), 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미립자 담체가 미소구체(microsphere)인, 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미립자 담체가 나노입자인, 방법.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 활성제가 단백질 또는 펩티드인, 방법.
제 7항에 있어서, 상기 생물학적 활성제가 항원 결합 분자인, 방법.
제 8항에 있어서, 상기 생물학적 활성제가 도메인을 포함하는, 방법.
제 9항에 있어서, 상기 생물학적 활성제가 항체인, 방법.
제 9항에 있어서, 상기 생물학적 활성제가 도메인 항체인, 방법.
상기 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 방법에 의해 획득가능한 캡슐화된 생물학적 활성제를 포함하는, 미립자 담체.
제 12항에 있어서, 상기 미립자 담체가 나노입자인, 미립자 담체.
제 13항에 있어서, 상기 생물학적 활성제가 단백질인, 미립자 담체.
제 14항에 있어서, 나노입자 내에서 단백질 대 폴리머의 비율이 약 5% w/w 이상, 또는 약 10% w/w 이상, 또는 약 14% w/w 이상인, 미립자 담체.
제 13항에 있어서, 상기 생물학적 활성제가 펩티드인, 미립자 담체.
제 16항에 있어서, 나노입자 내에서 펩티드 대 폴리머의 비율이 약 5% w/w 이상, 또는 약 10% w/w 이상인, 미립자 담체.
제 13항에 있어서, 상기 생물학적 활성제가 항체인, 미립자 담체.
제 18항에 있어서, 나노입자 내에서 항체 대 폴리머의 비율이 약 5% w/w 이상, 또는 약 10% w/w 이상인, 미립자 담체.
제 13항에 있어서, 상기 생물학적 활성제가 dAb인, 미립자 담체.
제 20항에 있어서, 나노입자 내에서 dAb 대 폴리머의 비율이 약 5% w/w 이상, 또는 약 10% w/w 이상, 또는 약 14% w/w 이상인, 미립자 담체.
제 12항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 미립자 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
질병의 치료 또는 예방을 위한, 제 22항의 조성물의 용도.