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KR20100124787A - 바이오매스의 가수분해를 향상시키기 위한 헤미셀룰라아제 강화 조성물 - Google Patents

바이오매스의 가수분해를 향상시키기 위한 헤미셀룰라아제 강화 조성물 Download PDF

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Publication number
KR20100124787A
KR20100124787A KR1020107021210A KR20107021210A KR20100124787A KR 20100124787 A KR20100124787 A KR 20100124787A KR 1020107021210 A KR1020107021210 A KR 1020107021210A KR 20107021210 A KR20107021210 A KR 20107021210A KR 20100124787 A KR20100124787 A KR 20100124787A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
hemicellulase
seq
composition
enzyme
xylanase
Prior art date
Application number
KR1020107021210A
Other languages
English (en)
Inventor
스콧 디 파워
로버트 엠 콜드웰
수잔 이 란츠
에드먼드 에이 레어너스
Original Assignee
다니스코 유에스 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40810747&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20100124787(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 다니스코 유에스 인크. filed Critical 다니스코 유에스 인크.
Publication of KR20100124787A publication Critical patent/KR20100124787A/ko

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Abstract

본 발명은, 바이오매스에서 흔히 발견되는 셀룰로오스성 및 헤미셀룰로오스성 물질들의 효소적 가수분해를 개선하기 위한, 셀룰라아제/헤미셀룰라아제 효소 블렌드들에 관한 조성물들 및 방법들을 개시한다.

Description

바이오매스의 가수분해를 향상시키기 위한 헤미셀룰라아제 강화 조성물 {HEMICELLULASE ENRICHED COMPOSITIONS FOR ENHANCING HYDROLYSIS OF BIOMASS}
우선권
본 특허출원은, 2008년 3월 21일 출원된 미국 가출원 일련번호 제 61/038,520호를 우선권으로 주장하며, 상기 가출원은 그 전체 내용이 본 명세서에 참고문헌으로서 통합된다.
기술분야
본 발명의 조성물들 및 방법들은 셀룰로오스성 물질들의 효소적 가수분해의 개선을 위한 셀룰라아제/헤미셀룰라아제 효소 블렌드들에 관한 것이다.
바이오매스(biomass)의 주 성분들은 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스이다. 셀룰로오스는 보다 높은 차수의 섬유상 구조로 조직화되는 β-1,4-결합된 글루코오스 잔기들의 중합체들로 이루어진다. 헤미셀룰로오스들은 글루코시드성 결합 뿐 아니라 에스테르 결합들에 의해서도 서로 연결된 D-자일로오스, L-아라비노오스, D-만노오스, D-글루코오스, D-갈락토오스 및 4-O-메틸-D-글루쿠론산과 같은, 글루코오스 외의 단당류를 포함하는 이종성다당류(heteropolysaccharides)이다. 헤미셀룰로오스의 조성 및 구조는 셀룰로오스보다 더욱 복잡하고, 각종 목질 식물종들, 풀 및 곡물들에 따라 정량적 및 정성적으로 다양할 수 있다.
셀룰로오스는 글루코오스와 같은 당으로 전환될 수 있으며, 산업적 목적을 위해 세균, 효모 및 진균을 포함하는 수많은 미생물들에 의해 에너지 공급원으로서 사용될 수 있다. 셀룰로오스성 물질들은 상업적으로 구매가능한 효소들에 의해 당으로 전환될 수도 있으며, 결과의 당들은 플라스틱 및 에탄올과 같은 생성물들을 생산하기 위하여 산업 미생물용 공급물로서 사용될 수 있다. 그러나, 현재 셀룰라아제 제품들은 일반적으로 헤미셀룰로오스성 물질들을 가수분해하는 능력이 없어서, 상기 헤미셀룰로오스성 물질들이 바이오매스 조성물 중에 소비되지 않고 남아서 바이오매스의 취급 및 처리를 방해할 수 있다.
따라서, 헤미셀룰로오스성 올리고머들 및 중합체들을 발효를 위해 유리 펜토오스로 전환시키기 위한 효소들의 최적화된 세트의 공동생산 또는 블렌딩을 포함하는, 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 모두를 가수분해하는데 효과적인 효소계들을 개발할 필요가 남아있다. 그러한 최적화된 효소계들은 바이오매스의 효율 및 경제성을 개선시키는데 바람직하다.
개요
본 발명의 개시내용은 최적화된 생물학적 전환 효소 블렌드들, 그의 제조방법들 및 상기 최적화된 생물학적 전환 효소 블렌드를 사용하여 바이오매스를 당으로 전환하는 방법을 제공한다. 상기 생물학적 전환 효소 블렌드는 전체(whole) 셀룰라아제 및 하나 이상의 헤미셀룰라아제들의 혼합물을 포함하며, 그의 선택은 의도된 바이오매스 기질 및 가공 조건들에 따라 달라진다.
한 측면에서, 셀룰로오스성 및 헤미셀룰로오스성 물질들의 혼합물을 가수분해하기 위한 효소 블렌드 조성물이 제공되며, 이는
(a) 셀룰라아제를 포함하는 제 1 효소 조성물,
(b) GH10 또는 GH11 자일라나아제로부터 선택되는 하나 이상의 자일라나아제를 포함하는 제 2 효소 조성물, 및
(c) GH10 또는 GH11 자일라나아제가 아니거나 또는 (b)에서와 동일한 GH10 또는 GH11 자일라나아제가 아닌 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제를 포함하는 제 3 효소 조성물을 포함하고,
상기 효소 블렌드는, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제가 결여된 균등한 효소 블렌드 조성물에 비해 (i) 향상된 글루칸 전환 또는 (ii) 향상된 자일란 전환 중 하나 이상을 제공한다.
일부 구체예들에서, 상기 제 1 효소 조성물은 섬유성 진균류로부터의 전체 셀룰라아제 블렌드이다. 일부 구체예들에서, 상기 제 1 효소 조성물은 추가량의 β-글루코시다아제로 보충된 섬유성 진균류로부터의 전체 셀룰라아제 블렌드이다.
일부 구체예들에서, 상기 제 2 효소 조성물은 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)로부터의 자일라나아제 XYN2를 포함한다. 일부 구체예들에서, 제 2 효소는 트리코더마 리세이로부터의 자일라나아제 XYN3을 포함한다.
일부 구체예들에서, 하나 이상의 자일라나아제는 서열번호 1 또는 서열번호 2로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 하나 이상의 자일라나아제는 서열번호 1 또는 서열번호 2로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 심지어 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 특정 구체예들에서, 상기 하나 이상의 자일라나아제는 서열번호 1 또는 서열번호 2로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는 GH54 헤미셀룰라아제, GH62 헤미셀룰라아제, GH27 헤미셀룰라아제, GH36 헤미셀룰라아제, GH5 헤미셀룰라아제, GH74 헤미셀룰라아제, GH67 헤미셀룰라아제, GH28 헤미셀룰라아제, GH11 헤미셀룰라아제, GH10 헤미셀룰라아제, GH3 헤미셀룰라아제 및 CE5 헤미셀룰라아제로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구체예들에서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는 β-자일로시다아제 또는 아라비노푸라노시다아제이다. 특정 구체예들에서, 상기 β-자일로시다아제는 트리코더마 리세이로부터의 BXL1이고, 상기 아라비노푸라노시다아제는 트리코더마 리세이로부터의 ABF1, ABF2 또는 ABF3이다. 일부 구체예들에서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는 β-자일로시다아제와 아라비노푸라노시다아제의 조합이다.
일부 구체예들에서, 상기 제 1 효소 조성물은 추가량의 β-글루코시다아제로 보충된 섬유성 진균류로부터의 전체 셀룰라아제 블렌드이고, 상기 제 2 효소 조성물은 자일라나아제를 포함하고, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는 β-자일로시다아제와 아라비노푸라노시다아제의 조합이다.
일부 구체예들에서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는, α-아라비노푸라노시다아제 I (ABF1), α-아라비노푸라노시다아제 II (ABF2), α-아라비노푸라노시다아제 III (ABF3), α-갈락토시다아제 I (AGL1), α-갈락토시다아제 II (AGL2), α-갈락토시다아제 III (AGL3), 아세틸 자일란 에스테라아제 I (AXE1), 아세틸 자일란 에스테라아제 III (AXE3), 엔도글루카나아제 VI (EG6), 엔도글루카나아제 VIII (EG8), α-글루쿠로니다아제 I (GLR1), β-만나아제 (MAN1), 폴리갈락투로나아제 (PEC2), 자일라나아제 I (XYN1), 자일라나아제 II (XYN2), 자일라나아제 III (XYN3) 및 β-자일로시다아제 (BXL1)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 트리코더마 리세이 헤미셀룰라아제이다.
일부 구체예들에서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는 상기 언급된 아미노산 서열들 중 하나에 대해 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 심지어 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 특정 구체예들에서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는 상기 언급된 아미노산 서열들 중 하나에 대응하는 아미노산 서열을 갖는다.
또다른 측면에서, 셀룰로오스성 및 헤미셀룰로오스성 물질들의 혼합물을 하기 (a) 내지 (c) 와 접촉시켜 상기 셀룰로오스성 및 헤미셀룰로오스성 물질들의 혼합물을 가수분해시키는 것을 포함하는, 셀룰로오스성 및 헤미셀룰로오스성 물질들의 혼합물을 가수분해하기 위한 방법이 제공된다:
(a) 셀룰라아제를 포함하는 제 1 효소 조성물,
(b) GH10 또는 GH11 자일라나아제로부터 선택되는 하나 이상의 자일라나아제를 포함하는 제 2 효소 조성물, 및
(c) GH10 또는 GH11 자일라나아제가 아니거나 또는 (b)에서와 동일한 GH10 또는 GH11 자일라나아제가 아닌 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제를 포함하는 제 3 효소 조성물,
상기 접촉은, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제의 부재하에서의 균등한 접촉에 비해 (i) 향상된 글루칸 전환 또는 (ii) 향상된 자일란 전환 중 하나 이상을 초래한다.
일부 구체예들에서, 상기 제 1 효소 조성물은 섬유성 진균류로부터의 전체 셀룰라아제 블렌드이다. 일부 구체예들에서, 제 1 효소 조성물은 추가량의 β-글루코시다아제로 보충된 섬유성 진균류로부터의 전체 셀룰라아제 블렌드이다.
일부 구체예들에서, 상기 제 2 효소 조성물은 트리코더마 리세이로부터의 자일라나아제 XYN2를 포함한다. 일부 구체예들에서, 제 2 효소 조성물은 트리코더마 리세이로부터의 자일라나아제 XYN3를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 하나 이상의 자일라나아제는 서열번호 1 또는 서열번호 2로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 하나 이상의 자일라나아제는 서열번호 1 또는 서열번호 2로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 심지어 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 특정 구체예들에서, 상기 하나 이상의 자일라나아제는 서열번호 1 또는 서열번호 2로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는 GH54 헤미셀룰라아제, GH62 헤미셀룰라아제, GH27 헤미셀룰라아제, GH36 헤미셀룰라아제, GH5 헤미셀룰라아제, GH74 헤미셀룰라아제, GH67 헤미셀룰라아제, GH28 헤미셀룰라아제, GH11 헤미셀룰라아제, GH10 헤미셀룰라아제, GH3 헤미셀룰라아제 및 CE5 헤미셀룰라아제로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구체예들에서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는 β-자일로시다아제 또는 아라비노푸라노시다아제이다. 특정 구체예들에서, 상기 β-자일로시다아제는 트리코더마 리세이로부터의 BXL1이고, 상기 아라비노푸라노시다아제는 트리코더마 리세이로부터의 ABF1, ABF2 또는 ABF3이다. 일부 구체예들에서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는 β-자일로시다아제와 아라비노푸라노시다아제의 조합이다.
일부 구체예들에서, 상기 제 1 효소 조성물은 추가량의 β-글루코시다아제로 보충된 섬유성 진균류로부터의 전체 셀룰라아제 블렌드이고, 상기 제 2 효소 조성물은 자일라나아제를 포함하고, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는 β-자일로시다아제와 아라비노푸라노시다아제의 조합이다.
일부 구체예들에서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는 α-아라비노푸라노시다아제 I (ABF1), α-아라비노푸라노시다아제 II (ABF2), α-아라비노푸라노시다아제 III (ABF3), α-갈락토시다아제 I (AGL1), α-갈락토시다아제 II (AGL2), α-갈락토시다아제 III (AGL3), 아세틸 자일란 에스테라아제 I (AXE1), 아세틸 자일란 에스테라아제 III (AXE3), 엔도글루카나아제 VI (EG6), 엔도글루카나아제 VIII (EG8), α-글루쿠로니다아제 I (GLR1), β-만나아제 (MAN1), 폴리갈락투로나아제 (PEC2), 자일라나아제 I (XYN1), 자일라나아제 II (XYN2), 자일라나아제 III (XYN3) 및 β-자일로시다아제 (BXL1)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 트리코더마 리세이 헤미셀룰라아제이다.
일부 구체예들에서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는, 상기 언급된 아미노산 서열들 중 하나에 대해 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 심지어 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 특정 구체예들에서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는 상기 언급된 아미노산 서열들 중 하나에 대응하는 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 상기 셀룰로오스성 및 헤미셀룰로오스성 물질들의 혼합물과 제 1 효소 조성물, 제 2 효소 조성물 및 제 3 효소 조성물과의 접촉은 동시에 수행된다.
일부 구체예들에서, 제 1 효소 조성물, 제 2 효소 조성물 및 제 3 효소 조성물은 효소 블렌드의 단일 조성물로 제공된다.
본 발명의 조성물들 및 방법들의 이러한 측면들 및 기타 측면들 및 구체예들은 하기 설명으로부터 명백할 것이다.
발명의 상세한 설명
I. 정의
여기에서 달리 정의되지 않는 경우, 여기 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 여기 제공된 제목들은, 하나의 제목 하에 설명된 발명의 각종 측면 또는 구체예들을 한정하는 것은 아니며, 전체로서 조성물들 및 방법들에 적용될 수 있다. 상기의 일반적인 설명 및 하기의 상세한 설명은 모두 예시적이며 설명을 위한 것이지, 본 명세서에 기재된 조성물들 및 방법들을 제한하고자 하는 것은 아니다. 단수형태의 사용은 특별히 달리 언급되지 않는 한 복수형태를 포함하는 것이고, 달리 언급되지 않는 한 "또는"의 사용은 "및/또는"을 의미하는 것이다. "포함한다(comprise(s), include(s))", "포함하는(comprising, including)"은 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에서 언급된 모든 특허들 및 간행물들은, 그러한 특허들 및 간행물들 내에 개시된 모든 아미노산 및 뉴클레오티드 서열들을 포함하여, 본 명세서에서 참고문헌으로서 명시적으로 포함된다. 명확성을 위해 하기 용어들을 정의하였다:
여기 사용된 것과 같은, "셀룰로오스"라는 용어는: 일반식 (C6H10O5)n을 갖는 β(1→4) 결합된 D-글루코오스 단위들로 이루어지는 다당류를 의미한다. 셀룰로오스는 녹색 식물, 많은 형태의 조류 및 난균류(oomycetes)의 일차 세포벽의 구조 성분이다.
여기 사용된 것과 같은, "셀룰라아제"라는 용어는, 셀룰로오스 중합체를 보다 짧은 올리고머들 및/또는 글루코오스로 가수분해할 수 있는 효소를 의미한다.
여기 사용된 것과 같은, "전체 셀룰라아제 조성물/제제/혼합물" 등의 표현은, 생물체, 예로서 섬유성 진균류에 의해 생산된 복수의 셀룰라아제들을 포함하는, 자연에 존재하는 조성물들 및 자연에 존재하지 않는 조성물들 모두를 의미한다. 전체 셀룰라아제 조성물의 한 예는 섬유성 진균류들이 배양된 매질로, 이 매질은 분비된 셀룰라아제들, 예컨대 하나 이상의 셀로비오하이드롤라아제들, 하나 이상의 엔도글루카나아제들, 및 하나 이상의 β-글루코시다아제들을 소정의 비율로 포함한다.
여기 사용된 것과 같은, "헤미셀룰로오스"라는 용어는, 글루코오스만을 함유하고 있는 셀룰로오스와 달리, 글루코오스 외의 당 단량체들을 함유하는 식물성 물질들의 중합체 성분이다. 글루코오스에 추가하여, 헤미셀룰로오스는 자일로오스, 만노오스, 갈락토오스, 람노오스 및 아라비노오스를 포함할 수 있고, 자일로오스가 가장 흔한 당 단량체이다. 헤미셀룰로오스들은 주로 D-펜토오스 당류를 포함하며, 때때로 소량의 L-당류를 포함한다. 헤미셀룰로오스 중의 당류는 에스테르 결합 및 글리코시드 결합에 의해 결합될 수 있다. 예시적인 형태들의 헤미셀룰로오스는 이에 제한되지는 않지만 갈락탄, 만난, 자일란, 아라바난, 아라비노자일란, 글루코만난, 갈락토만난 등을 포함한다.
여기 사용된 것과 같은, "헤미셀룰라아제"라는 용어는, 헤미셀룰로오스를 그의 구성성분 당들 또는 더욱 짧은 중합체들로 분해시킬 수 있는 부류의 효소들을 의미하며, 이는 엔도-작용(endo-acting) 하이드롤라아제, 엑소-작용 하이드롤라아제, 및 각종 에스테라아제들을 포함한다.
여기 사용된 것과 같은, "자일라나아제"라는 용어는, 분지된 자일란들 및 자일로올리고다당류들을 포함하는 자일란의 탄수화물 주쇄(backbone)의 여러 위치들 중 하나 이상에서의 분열(cleavage)을 촉매하는 능력을 갖고, 미생물들, 예로서 진균, 세균으로부터, 또는 식물 또는 동물로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩티드의 단백질 또는 폴리펩티드 영역(domain)을 의미한다. 자일라나아제는 헤미셀룰라아제의 한 유형이라는 점에 주목하여야 한다.
여기 사용된 것과 같은, "바이오매스 기질"이라는 용어는 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스를 모두 함유하는 물질이다.
여기 사용된 것과 같은, "자연에 존재하는" 조성물은 자연적으로 생산되거나 또는 자연적으로 존재하는 생물에 의해 생산된 것을 의미한다.
여기 사용된 것과 같은, "변종" 단백질은, 적은 수의 아미노산 잔기들, 예로서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상의 아미노산 잔기들의 치환, 결실 또는 첨가에 의해, 그가 유래된 "부모" 단백질과 상이하다. 일부 경우들에서, 부모 단백질은 "야생형", "천연" 또는 "자연에 존재하는" 폴리펩티드들이다. 각종 단백질들은 부모 단백질과 소정의 % 서열 동일성, 예로서 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 심지어 99% 이상의 동일성을 갖는 것으로서 기재될 수 있으며, 이는 당 기술분야에서 알려진 임의의 적당한 소프트웨어 프로그램, 예로서 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel 등 (eds) 1987, Supplement 30, section 7.7.18)에 기재된 것들을 사용하여 결정될 수 있다.
바람직한 프로그램들은 Vector NTI Advance™ 9.0(Invitrogen Corp. Carlsbad, CA), GCG Pileup 프로그램, FASTA (Pearson 등 (1988) Proc . Natl , Acad. Sci USA 85:2444-2448), 및 BLAST (BLAST Manual, Altschul 등, Natl Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, Md., 및 Altschul 등 (1997) NAR 25:3389-3402)을 포함한다. 또다른 바람직한 설정 프로그램은, 바람직하게는 기본(default) 파라미터들을 사용하는, ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA)이다. 사용할 수 있는 또다른 서열 소프트웨어 프로그램은 Sequence Software Package Version 6.0 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)에서 구매가능한 TFASTA Data Searching Program이다.
II . 생물학적 전환 효소 블렌드 조성물들 및 그들의 사용 방법들
셀룰로오스는 무수셀로비오스(anhydrocellobiose)의 동종중합체로, 따라서 선형 β-(1-4)-D-글루칸이다. 대조적으로, 헤미셀룰로오스들은 자일란, 자일로글루칸, 아라비노자일란 및 만난과 같은 각종 화합물들을 복합 분지 구조들로 포함하며, 광범위한 치환기들을 갖는다. 헤미셀룰로오스들, 특히 아라비노자일란의 복합 분지 및 이종성 조성의 결과로, 식물성 물질의 효소적 분해는 일련의 탈분지화 및 탈중합체화 활성 작용을 필요로 한다. 추가적으로, 식물 물질들의 분해는 자일로스 및 아라비노오스와 같은 5탄당(펜토오스) 및 만노오스 및 글루코오스와 같은 6탄당(헥소오스)을 모두 함유하는 헤미셀룰로오스들 상에 작용하는 효소들을 필요로 한다.
헤미셀룰로오스의 그의 단량체들로의 효소 가수분해는 상이한 기능들을 갖는 몇몇 헤미셀룰라아제 효소들의 참여를 필요로 한다. 헤미셀룰라아제들은 3 개의 일반 카테고리들로 분류될 수 있다: 다당류 내의 내부 결합들을 공격하는 엔도-작용 효소들, 다당류 사슬의 환원 또는 비환원 말단으로부터 차례로 작용하는 엑소-작용 효소들, 및 보조 효소들인 아세틸에스테라아제들 및 리그닌 글리코시드 결합들을 가수분해하는 에스테라아제들, 예컨대 쿠마르산 에스테라아제 및 페룰산 에스테라아제.
어떤 진균류는 엑소-셀로비오하이드롤라아제(또는 CBH-형 셀룰라아제들), 엔도글루카나아제들 (또는 EG-형 셀룰라아제들) 및 β-글루코시다아제들 (또는 BG-형 셀룰라아제들)을 포함하는 완전한 셀룰라아제 계들을 생산하는 한편, 알려진 셀룰라아제 효소들 및 이들의 혼합물들은 전형적으로 헤미셀룰로오스에 대해 제한된 활성 및 식물성 물질들의 가수분해에 있어 제한된 값을 갖는다. 본 발명의 생물학적 전환 효소 블렌드 조성물들 및 방법들은, 부분적으로는 셀룰라아제들 및 헤미셀룰라아제들의 특정 조합들이, 우선적으로 글루칸 및 자일란의 전환을 모니터링함에 의해 결정되는 바와 같은, 식물성 물질 가수분해 효율을 현저히 증가시킨다는 관찰에 기초한 것이다.
글루칸 및/또는 자일란의 가수분해를 증가시키는 셀룰라아제/헤미셀룰라아제 조성물들을 확인하기 위하여 사용된 상기 예시적인 셀룰라아제 조성물은 섬유성 진균류 (즉, 트리코더마 리세이)에 의해 생산된 전체 셀룰라아제 조성물이다. 상기 조성물은 몇몇 엑소-셀로비오하이드롤라아제 및 엔도글루카나아제를 포함하며, 추가의 β-글루코시다아제로 보충되어 글루코오스의 유리를 증가시킨다. 이 조성물은 ACCELLERASE 1000™ (Danisco A/S, Genencor Division, Palo Alto, CA)로서 상업적으로 이용가능하다. ACCELLERASE 1000™은 엑소-셀로비오하이드롤라아제(즉, 약 50% (중량/중량)의 CBHI (CEL7A) 및 약 14%의 CBHII (CEL6A)), 엔도글루카나아제(즉, 약 12%의 EGI (CEL7B) 및 약 10% EGII (CEL5A)), 및 β-글루코시다아제(즉, 약 5%의 BGLI (CEL3A))를 포함한다. 소량의 XYN2(즉, 약 1% 미만)도 존재할 수 있다. 확인되지 않은 기타 성분들도 약 1% 미만의 양으로 존재한다.
기타 전체 셀룰라아제 혼합물들 및 다수의 개별적으로 분리된 셀룰라아제들로부터 집합된 셀룰라아제 혼합물들을 포함하는, 기타 셀룰라아제 조성물들이 사용될 수 있다. 바람직한 셀룰라아제 조성물들은 각각의 엑소-셀로비오하이드롤라아제, 엔도글루카나아제 및 β-글루코시다아제 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예들에서, 다수의 셀룰라아제들을 포함하는 전체 배양액(broth)은 아크레모니움( Acremonium ), 아스퍼질러스 ( Aspergillus ), 에메리셀라 ( Emericella ), 푸사리움( Fusarium ), 후미콜라( Humicola ), 무코르 ( Mucor ), 마이셀리오프토라( Myceliophthora ), 뉴로스포라 ( Neurospora ), 사이탈리디움 ( Scytalidium ), 티엘라비아( Thielavia ), 톨리포클라디움 ( Tolypocladium ), 페니실리움 ( Penicillium ) 또는 트리코더마( Trichoderma ) 종 또는 이들로부터 유도된 종들과 같은 생물체로부터 제조된다.
상기 조성물은, 하나 이상, 그리고 일부 경우들에서는, 2 또는 3 이상의 헤미셀룰라아제들을 더 포함한다. 적당한 추가의 헤미셀룰라아제들의 예들은 자일라나아제, 아라비노푸라노시다아제, 아세틸 자일란 에스테라아제, 글루쿠로니다아제, 엔도-갈락타나아제, 만나아제, 엔도 또는 엑소-아라비나아제, 엑소-갈락타나아제 및 그의 혼합물들을 포함한다. 적당한 엔도-작용 헤미셀룰라아제들의 예들은 엔도-아라비나아제, 엔도-아라비노갈락타나아제, 엔도글루카나아제, 엔도-만나아제, 엔도-자일라나아제 및 페락산 엔도자일라나아제를 포함한다. 적당한 엑소-작용 헤미셀룰라아제들의 예들은 α-L-아라비노시다아제, β-L-아라비노시다아제, α-1,2-L-푸코시다아제, α-D-갈락토시다아제, β-D-갈락토시다아제, β-D-글루코시다아제, β-D-글루쿠로니다아제, β-D-만노시다아제, β-D-자일로시다아제, 엑소-글루코시다아제, 엑소-셀로비오하이드롤라아제, 엑소-만노비오하이드롤라아제, 엑소-만나아제, 엑소-자일라나아제, 자일란 α-글루쿠로니다아제 및 코니페린 β-글루코시다아제를 포함한다. 적당한 에스테라아제들의 예들은 아세틸 에스테라아제들(아세틸 자일란 에스테라아제, 아세틸갈락탄 에스테라아제, 아세틸만난 에스테라아제 및 아세틸자일란 에스테라아제) 및 아릴 에스테라아제들(쿠마르산 에스테라아제 및 페룰산 에스테라아제)를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물들 및 방법들은, 헤미셀룰로오스의 자일란 주쇄를 분열시키는 한 특정 유형의 헤미셀룰라아제인, 하나 이상의 자일라나아제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 자일라나아제는 엔도-1,4-β-자일라나아제 (E.C. 3.2.1.8)이다. 진균 및 세균 미생물들로부터 수많은 자일라나아제들이 동정 및 특징화되었다(예로서, 미국특허 제 5,437,992호; Coughlin, M. P. 상기 참조; Biely, P. 등 (1993) Proceedings of the second TRICEL symposium on Trichoderma reesei cellulases and Other Hydrolases, Espoo 1993; Souminen, P. and Reinikainen, T. (eds)., Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8:125-135 참조). 3개의 특정 자일라나아제들(XYN1, XYN2 및 XYN3)이 T. 리세이에서 동정되었다(Tenkanen, 등 (1992) Enzyme Microb . Technol. 14:566; Torronen, 등 (1992) Bio / Technology 10:1461; 및 Xu, 등 (1998) Appl. Microbiol . Biotechnol . 49:718). T. 리세이로부터 분리된 제 4의 자일라나아제(XYN4)가 Saloheimo 등의 Xylanase from Trichoderma reesei, method for production thereof and methods emplying this enzyme이라는 명칭의 미국특허 제 6,555,335호 및 6,768,001호에 기재되었으며, 이는 그 전체로서 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
본 조성물들 및 방법들에서 이용되는 예시적인 자일라나아제들은 XYN2 및 XYN3이다. XYN2 및 XYN3의 적당한 변종들 및 기타 생물들로부터의 적당한 관련 효소들은, XYN2 또는 XYN3(즉, 각각 서열번호 1 및 2)에 대해 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 심지어 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
셀룰라아제 조성물 및 자일라나아제에 추가하여, 상기 조성물들 및 방법들은 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제들, 예컨대 엔도-작용 헤미셀룰라아제, 엑소-작용 헤미셀룰라아제 및/또는 에스테라아제들을 포함할 수 있다.
적당한 엔도-작용 헤미셀룰라아제들은 이에 제한되지는 않지만, 하기를 포함한다: 만난, 갈락토만난, 글루코만난에서의 1,4-β-D-만노실릭 결합들의 랜덤 엔도가수분해(endohydrolysis)를 촉매하는, 만난 엔도-1,4-β-만노시다아제(E.C. 3.2.1.78, β-만나아제 및 β-만난아제로도 알려짐); 3 이상의 1,4-α-결합된 D-글루코오스 단위들을 포함하는 다당류에서 1,4-α-D-글루코시드성 결합들의 엔도가수분해를 촉매하는, α-아밀라아제(E.C. 3.2.1.1); 경목재(hardwood) 자일란들의 주쇄에서 α-D-1,2-(4-O-메틸)글루쿠로노실 결합들의 가수분해를 촉매하는, 자일란 α-1,2-글루쿠로노시다아제(E.C. 3.2.1.131,α-글루쿠로노시다아제로도 알려짐); 및 셀룰라아제, 리체닌(lichenin) 및 곡물 β-D-글루칸에서 1,4-β-D-글루코시드성 결합들의 엔도가수분해를 촉매하는 엔도글루카나아제 (E.C. 3.2.1.4). 엔도글루카나아제의 다수의 하위유형들이 동정되어 왔으며, 이들은 본 조성물들 및 방법들에서의 사용에 적합하고, 예로서 엔도글루카나아제 I, 엔도글루카나아제 II, 엔도글루카나아제 III, 엔도글루카나아제 V 및 엔도글루카나아제 VI가 있다.
적당한 엑소-작용 헤미셀룰라아제들은 이에 제한되지는 않지만, α-아라비노푸라노시다아제, α-갈락토시다아제 및 β-자일로시다아제를 포함한다. α-아라비노푸라노시다아제는 α-N-아라비노푸라노시다아제 (E.C. 3.2.1.55)로도 알려져 있으며, α-L-아라비노시드들에서 말단의 비환원성 α-L-아라비노푸라노시드 잔기들의 가수분해를 촉매한다. 3 개 이상의 알려진 아라비노푸라노시다아제 (즉, abf1, abf2 및 abf3)의 하위유형들 중 어느 것이 사용될 수 있다. α-갈락토시다아제 (E.C. 3.2.1.22)는, 갈락토오스 올리고다당류 및 갈락토만난류를 포함하는 α-D-갈락토시드들에서 말단의 비환원성 α-D-갈락토오스 잔기들의 가수분해를 촉매한다. 3 개의 알려진 하위유형들, 즉 α-갈락토시다아제 I (agl1), α-갈락토시다아제 II (agl2) 및 α-갈락토시다아제 III (agl3) 중 어느 것이 사용될 수 있다. 글루코아밀라아제는 글루칸 1,4-α-글루코시다아제(E.C. 3.2.1.3)로도 알려져 있으며, 사슬들의 비환원성 말단들로부터 말단 1,4-결합된 α-D-글루코오스 잔기들의 가수분해를 연속적으로 촉매하여 β-D-글루코오스를 유리시킨다. β-글루코시다아제(E.C. 3.2.1.21)는 말단의 비환원성 β-D-글루코오스 잔기들의 가수분해를 촉매하여 β-D-글루코오스를 유리시킨다. β-자일로시다아제는 자일란 1,4-β-자일로시다아제(E.C. 3.2.1.37)로도 알려져 있으며, 1,4-β-D-자일란의 가수분해를 촉매하여, 상기 비환원성 말단들로부터의 연속적인 D-자일로오스 잔기들을 제거한다. 자일라나아제 및 α-아라비노푸라노시다아제 또는 β-자일로시다아제 중 하나와 더불어 전체 셀룰라아제 혼합물을 포함하는 조성물들은 글루칸 및/또는 자일란 전환에 특히 효과적이다.
적당한 에스테라아제들은 이에 제한되지는 않지만, 페룰산 에스테라아제 및 아세틸 자일란 에스테라아제를 포함한다. 페룰산 에스테라아제는 페룰레이트 에스테라아제(E.C. 3.1.1.73)로도 알려져 있으며, "천연" 기질들 중에서 일반적으로 아라비노오스인, 에스테르화 당으로부터 4-히드록시-3-메톡시신나모일(페룰로일)기의 가수분해를 촉매한다. 알려진 미생물성 페룰산 에스테라아제들은 배지 내로 분비된다. 페룰산 에스테라아제의 알려진 3개의 하위유형들(fae1, fae2, 및 fae3) 중 임의의 것이 본 발명의 조성물들 및 방법들에 사용될 수 있다. 아세틸 자일란 에스테라아제 I (E.C. 3.1.1.72)은 자일란 및 자일로-올리고당의 디아세틸화를 촉매하며, 본 발명의 조성물들 및 방법들에 사용될 수도 있다. De Graaff 등의 미국특허 제 5,426,043호 및 5,681,732호는 진균류 기원으로부터의 아세틸 자일란 에스테라아제들의 클로닝 및 발현을 설명한다. EP 507 369호는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)로부터 분리된 아세틸 자일란 에스테라아제를 암호화하는 DNA 서열을 개시한다. Enzyme with acetyl esterase activity라는 명칭의 Christgau 등의 미국특허 제 5,830,734호는 식품산업에서의 이용을 위한 각종 에스테라아제들의 분리를 설명하고 있다.
일부 구체예들에서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는 GH54 헤미셀룰라아제, GH62 헤미셀룰라아제, GH27 헤미셀룰라아제, GH36 헤미셀룰라아제, GH5 헤미셀룰라아제, GH74 헤미셀룰라아제, GH67 헤미셀룰라아제, GH28 헤미셀룰라아제, GH11 헤미셀룰라아제, GH10 헤미셀룰라아제, GH3 헤미셀룰라아제 및 CE5 헤미셀룰라아제로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예들에서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는 α-아라비노푸라노시다아제 I (ABF1 ), α-아라비노푸라노시다아제 II (ABF2), α-아라비노푸라노시다아제 III (ABF3), α-갈락토시다아제 I (AGL1), α-갈락토시다아제 II (AGL2), α-갈락토시다아제 III (AG L3), 아세틸 자일란 에스테라아제 I (AXE 1), 아세틸 자일란 에스테라아제 III (AXE3), 엔도글루카나아제 VI (EG6), 엔도글루카나아제 VIII (EG8), α-글루쿠로니다아제 I (GLR1), β-만나아제 (MAN1), 폴리갈락투로나아제 (PEC2), 자일라나아제 I (XYN1), 자일라나아제 II (XYN2), 자일라나아제 III (XYN3) 및 β-자일로시다아제 (BXL1)로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 이는 T. 리세이와 같은 섬유성 진균류로부터 유래할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제는, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 , 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대하여, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 심지어 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
헤미셀룰라아제들의 변종들(자일라나아제들 포함)은, 그 효소에 대해 실질적으로 기능에 영향을 미치지 않거나 또는 유리한 특징들을 부가하는, 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 치환, 삽입 또는 결실은 보존된 서열 모티브들(motifs)에 존재하는 것이 아니라, 그 대신 보존된 모티브들 외의 아미노산 서열들에 제한된다. 예시적인 치환들은, 부모 아미노산 서열에 대해 하전, 소수성 또는 측쇄기(side group) 크기를 보존하는, 보존성 치환들이다. 보존성 치환들의 예들을 하기 표에 제공하였다:
Figure pct00001
자연에 존재하는 아미노산들은, 한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 코딩 서열을 변경함에 의해 그 폴리펩티드 내로 도입될 수 있는 한편, 자연에 존재하지 않는 아미노산들은 발현된 폴리펩티드를 화학적으로 변경시킴으로써 전형적으로 생산된다는 것은 명백할 것이다.
추가의 보조 효소들, 예컨대 방향족 화합물들의 산화 및 그 결과 산소의 물로의 환원을 촉매하는 라카아제(laccase)(E.C. 1.10.3.2)가, 본 발명의 조성물들 및 방법들의 생물학적 전환 효소 블렌드들 중에 포함될 수도 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 생물학적 전환 효소 블렌드들에서의 이용되는 효소들은 섬유성 진균류의 하나 이상의 균주들로부터 제조될 수 있다. 적당한 섬유성 진균류는 진균문 및 난균강의 하위구분의 원들을 포함하며, 이에 제한되지는 않지만 하기 속(genera)을 포함한다: 아스퍼질러스 , 아크레모니움 , 아우레오바시디움( Aureobasidium ), 베아우베리아 ( Beauveria ), 세팔로스포리움 ( Cephalosporium ), 세리포리옵시스( Ceriporiopsis ), 카에토미움 ( Chaetomium ), 크리소스포리움( Chrysosporium ), 클라비셉스 ( Claviceps ), 코치오볼러스 ( Cochiobolus ), 크립토코커스( Cryptococcus ), 시아터스 ( Cyathus ), 엔도티아 ( Endothia ), 엔도티아 무코르( Endothia mucor ), 푸사리움 , 길로클라디움 ( Gilocladium ), 후미콜라, 마그나포르테( Magnaporthe ), 마이셀리오프토라 , 마이로테슘 ( Myrothecium ), 무코르 , 뉴로스포라 , 파네로카에테 ( Phanerochaete ), 포도스포라 ( Podospora ), 파에실로마이세스( Paecilomyces ), 파이리쿨라리아 ( Pyricularia ), 라이조무코르 ( Rhizomucor ), 라이조푸스( Rhizopus ), 스키조파일럼 ( Schizophylum ), 스타고노스포라(Stagonospora ), 탈라로마이세스( Talaromyces ), 트리코더마 , 터모마이세스 ( Thermomyces ), 터모아스커 스( Thermoascus ), 티엘라비아 , 톨리포클라디움 , 트리코파이톤 ( Trichophyton ) 및 트라메테스( Trametes ). 일부 구체예들에서, 섬유성 진균류들은 이에 제한되지는 않지만, 하기를 포함한다: A. 니둘란스(A. nidulans ), A. 나이거 (A. niger ), A. 아오마리(A. awomari ), A. 아쿨레아투스 (A. aculeatus ), A. 카와치 (A. kawachi ), 예로서 NRRL 3112, ATCC 22342 (NRRL 3112), ATCC 44733, ATCC 14331 및 균주 UVK 143f, A. 오리재(A. oryzae ), 예로서 ATCC 11490, N. 크라사 (N. crassa ), 트리코더마 리세이, 예로서 NRRL 15709, ATCC 13631, 56764, 56765, 56466, 56767 및 트리코더마 비리데(Trichoderma viride), 예로서 ATCC 32098 및 32086. 바람직한 실시에서, 상기 섬유성 진균은 트리코더마 종들이다. 본 발명에서의 사용에 특히 바람직한 종들 및 균주는 T. 리세이 RL-P37이다.
특정 구체예에서, 단일한 공학적처리된(engineered) 균주는 추가의 정제 또는 보충이 필요하지 않도록, 원하는 비율로 효소 성분을 과잉발현한다. 선택적인 구체예에서, 상기 생물학적 전환 효소 블렌드는 섬유성 진균의 2 이상의 자연적으로 존재하거나 또는 공학적처리된 균주들로부터 수득된다. 효소 성분의 바람직한 비율은 최종 블렌드에서 효소의 상대적인 양을 변경시키므로써 달성될 수 있다. 2 이상의 생산 균주들이 사용된 경우에도, 효소 성분의 바람직한 비율은 정제 또는 부분적으로 정제된 효소로 보충하므로써 달성될 수 있다.
특정 구체예들에서, 헤미셀룰라아제는 아스퍼질러스 아쿨레아투스 , 아스퍼질러스 아와모리 , 아스퍼질러스 포에티두스 ( Aspergillus foetidus ), 아스퍼질러스 자포니쿠스( Aspergillus japonicus ), 아스퍼질러스 니둘란스 , 아스퍼질러스 나이거 또는 아스퍼질러스 오리재로부터 제조된다. 다른 측면에서, 전체 배양액은 푸사리움 박트리디오이데스 ( Fusarium bactridioides ), 푸사리움 시리알리스( Fusarium cerealis), 푸사리움 크룩웰렌스 ( Fusarium crookwellense ), 푸사리움 쿨모룸( Fusarium culmorum ), 푸사리움 그라미네아룸 ( Fusarium graminearum ), 푸사리움 그라미눔( Fusarium graminum ), 푸사리움 헤테로스포룸 ( Fusarium heterosporum ), 푸사리움 네군디 ( Fusarium negundi ), 푸사리움 옥시스포룸 ( Fusarium oxysporum ), 푸사리움 레티쿨라툼 ( Fusarium reticulatum ), 푸사리움 로세움 ( Fusarium roseum ), 푸사리움 삼부시눔 ( Fusarium sambucinum ), 푸사리움 사르코크로움( Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리키오이데스 ( Fusarium sporotrichioides ), 푸사리움 술푸레움 ( Fusarium sulphureum ), 푸사리움 토룰로숨 ( Fusarium torulosum ), 푸사리움 트리코테키오이데스 ( Fusarium trichothecioides ), 푸사리움 베네나툼( Fusarium venenatum ) 또는 푸사리움 베르티실로이데스( Fusarium verticilloides)로부터 제조된다. 또다른 측면에서, 상기 헤미셀룰라아제 복합체는 후미콜라 인솔렌스( Humicola insolens ), 후미콜라 라누기노사( Humicola lanuginosa), 무코르 미에헤이 ( Mucor miehei ), 마이셀리오프토라 써모필라( Myceliophthora thermophila ), 뉴로스포라 크라사 ( Neurospora crassa ), 사이탈리디움 써모필룸 ( Scytalidium thermophilum ) 또는 티엘라비아 테레스트리스( Thielavia terrestris)로부터 제조된다. 다른 구체예들에서, 헤미셀룰라아제는 트리코더마 하르지아눔 ( Trichoderma harzianum ), 트리코더마 코닌기( Trichoderma koningii), 트리코더마 론지브라키아툼 ( Trichoderma longibrachiatum ), 트리코더마 리세이, 예로서 RL-P37 [Sheir-Neiss 등 (1984) Appl . Microbiol . Biotechnology 20:46-53; 미국특허 제4,797,361호; Peoria, III., U.S.A. 소재의, 미국 농림부, Northern Regional Research Laboratory의 영구 배양물 보존으로부터 생물학적 순수 배양물로서 입수가능 (NRRL 15709); ATCC 13631, 56764, 56466, 56767] 또는 트 리코더마 비리데, 예로서 ATCC 32098 및 32086으로부터 제조된다.
일부 구체예들에서, 헤미셀룰라아제 효소 성분은 헤미셀룰라아제 효소를 암호화하는 유전자의 발현에 의해 생산될 수 있다. 예로서, 자일라나아제는, 예로서 바실러스 또는 악티노마이세테스와 같은 그람-양성 생물, 또는 트리코더마, 아스퍼질러스, 사카로마이세스 또는 피키아(Pichia)와 같은 진핵 생물의 세포외(extracellular) 공간 내로 분비될 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 헤미셀룰라아제 효소들이 재조합 미생물 중에서 천연 수준에 비해 과잉발현될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 숙주 세포는 그 세포에 대해 내생인 하나 이상의 단백질들의 발현을 감소시키도록, 유전적으로 변경될 수 있다. 한 구체예에서, 세포는 하나 이상의 천연 유전자들, 특히 결실되거나 불활성화된 분비 단백질들을 암호화하는 유전자들을 포함할 수 있다. 예로서, 하나 이상의 프로테아제-암호화 유전자들(예로서, 아스파르틸 프로테아제-암호화 유전자; Berka 등 참조(1990) Gene 86:153-162 및 미국특허 제6,509,171호) 또는 셀룰라아제-암호화 유전자들이 결실 또는 불활성화될 수 있다. 헤미셀룰라아제를 암호화하는 핵산들은 생물체의 게놈 내에 존재할 수 있거나 또는 플라스미드 중에서 운반되어 생물 내에서 복제될 수 있다. 헤미셀룰라아제가 게놈으로부터 발현된 경우, 그와 연관된 유전자 및 조절자(regulator) 서열들은 랜덤(random) 통합 또는 동종성 통합(integration)에 의해 게놈 내로 도입될 수 있다. 특정 경우들에서, 예로서 특히 높은 수준의 발현이 요구되는 경우, 랜덤 및 동종성 통합이 모두 사용될 수 있다.
본 발명의 효소 조성물들 및 방법들을 사용하는 가수분해에 대한 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스의 공급원으로서의 사용되는 바이오매스 기질은, 예로서 초본성(herbaceous) 물질, 농업 잔사들, 임업 잔사들, 도시의 고형 쓰레기, 폐지 및 펄프와 종이 잔사들 등일 수 있다. 바이오매스 기질의 일반적인 형태들은, 이에 제한되지는 않지만, 나무, 관목 및 풀, 밀, 밀짚, 사탕수수 찌꺼기(bagasse), 옥수수, 옥수수 껍질, 낟알들로부터의 섬유물질을 포함한 옥수수 낟알(corn kernel), 옥수수와 같은 곡식들의 분쇄(습식 분쇄 및 건식 분쇄 포함)로부터의 생산물들 및 부산물들 및 도시의 고형 쓰레기, 폐지 및 정원 쓰레기를 포함한다. 상기 바이오매스 기질은 "버진(virgin) 바이오매스" (예컨대 나무, 부쉬(bushes), 풀, 과일, 꽃, 초본성 작물, 경질 및 연질 나무), "비-버진 바이오매스" (예컨대 농업 부산물, 유기성 상업 폐기물, 건설 및 철거 잔해물, 도시의 고형 쓰레기 및 정원 쓰레기) 또는 버진 및 비-버진 바이오매스의 혼합물인 "혼합 바이오매스,"로부터 수득될 수 있다. 바이오매스 기질은 예로서, 나무, 나무 펄프, 제지 슬러지, 제지 펄프 폐수, 파티클 보드(particle board), 옥수수 속대(stover), 옥수수 섬유, 쌀, 종이 및 펄프 가공 쓰레기, 목질 또는 초본성 식물, 과일 펄프, 채소 펄프, 부석(pumice), 증류가공 부산물(distillers grain), 풀, 쌀겨, 사탕수수 찌꺼기, 면, 황마(jute), 대마, 아마, 대나무, 사이잘(sisal), 마닐라삼(abaca), 짚, 옥수숫대(corn cobs), 증류가공 부산물들, 잎, 밀짚, 코코넛 수염(coconut hair), 조류, 스위치글래스(switchgrass) 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
바이오매스 기질은 직접적으로 사용될 수 있거나, 또는 당 기술분야에서 알려진 통상의 방법들을 사용하여 예비처리될 수 있다. 이러한 예비처리들은 화학적, 물리적 및 생물학적 예비처리들을 포함한다. 예로서, 물리적 예비처리 기술들은 이에 제한되지는 않지만, 각종 유형의 분쇄, 파쇄, 스팀처리/스팀 폭발, 방사선조사 및 수소화열분해(hydrothermolysis)를 포함한다. 화학적 예비처리 기술들은 이에 제한되지는 않지만, 희석 산, 알칼리화제, 유기용매, 암모니아, 이산화황, 이산화탄소 및 pH-제어된 수소화열분해를 포함한다. 생물학적 예비처리 기술들은 이에 제한되지는 않지만, 리그닌-가용화 미생물의 적용을 포함한다.
생물학적 전환 효소 블렌드, 및 그 안의 셀룰라아제들 및 헤미셀룰라아제들의 최적 투여량(dosage) 수준은 그 바이오매스 기질 및 사용된 예비처리 기술들에 따라 변화된다. pH, 온도 및 반응시간과 같은 작동 조건들도 에탄올 생산 속도에 영향을 미칠 수 있다. 바람직하게는, 반응 조성물은 바이오매스 1g 당 0.1~200mg의 생물학적 전환 효소 블렌드, 보다 바람직하게는 바이오매스 1g 당 1~100mg의 생물학적 전환 효소 블렌드, 그리고 가장 바람직하게는 바이오매스 1g 당 10~50mg의 생물학적 전환 효소 블렌드를 포함한다. 예시적인 양으로, 바이오매스 1g 당 0.1~50, 1~40, 20~40, 1~30, 2~40 및 10~20mg의 생물학적 전환 효소 블렌드이다. 다르게는, 상기 효소의 양은 그 계 내의 기질 양에 기초하여 결정될 수 있다. 그러한 경우, 반응 조성물은 바람직하게는 총 당류 1g당 0.1~50mg의 생물학적 전환 효소 블렌드, 보다 바람직하게는 총 당류 1g당 1~30mg의 생물학적 전환 효소 블렌드 및 보다 바람직하게는 총 당류 1g당 10~20mg의 생물학적 전환 효소 블렌드를 포함한다. 선택적으로, 상기 효소량은 그 계 내의 셀룰로오스 기질의 양에 기초하여 결정될 수 있다. 그러한 경우, 반응 조성물은 바람직하게는 총 글루칸 1g당 0.2~100mg의 생물학적 전환 효소 블렌드, 보다 바람직하게는 총 글루칸 1g당 2~60mg의 생물학적 전환 효소 블렌드, 그리고 보다 바람직하게는 총 글루칸 1g당 20~40mg의 생물학적 전환 효소 블렌드를 포함한다. 유사하게, 사용된 생물학적 전환 효소 블렌드의 양은 기질 바이오매스 내의 헤미셀룰로오스의 양에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 반응 조성물은 바람직하게는 헤미셀룰로오스 1g 당 0.2~100mg의 생물학적 전환 효소 블렌드, 보다 바람직하게는 헤미셀룰로오스 1g 당 2~60mg의 생물학적 전환 효소 블렌드 및 보다 바람직하게는 헤미셀룰로오스 1g 당 20~40mg의 생물학적 전환 효소 블렌드를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 조성물은, 전체 셀룰라아제 제제 및 하나 이상의 헤미셀룰라아제를 포함하는 헤미셀룰로오스-향상 전체 셀룰라아제 조성물의 형태로, 여기에서 헤미셀룰라아제의 양은 총 단백질의 1~50%의 범위이며, 전체 셀룰라아제는 총 단백질의 99% 미만 내지 50%의 범위이다. 예로서, 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 1%를 나타낼 수 있으며, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 99%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 2%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 98%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 3%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 97%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 4%를 나타낼 수 있으며, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 96%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 5%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 95%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 6%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 94%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 7%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 93%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 8%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 92%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 9%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 91%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 10%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 90%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 11%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 89%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 12%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 88%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 13%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 87%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 14%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 86%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 15%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 85%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 16%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 84%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 17%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 83%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 18%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 82%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 19%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 81%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 20%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 80%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 21%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 79%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 22%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 78%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 23%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 77%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 24%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 76%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 25%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 75%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 26%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 74%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 27%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 73%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 28%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 72%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 29%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 71%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 30%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 70%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 31%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 69%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 32%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 68%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 33%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 67%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 34%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 66%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 35%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 65%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 36%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 64%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 37%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 63%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 38%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 62%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 39%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 61%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 40%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 60%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 41%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 59%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 42%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 58%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 43%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 57%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 44%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 56%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 45%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 55%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 46%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 54%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 47%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 53%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 48%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 52%를 나타낼 수 있고; 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 49%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 51%를 나타낼 수 있고; 또는 상기 헤미셀룰라아제는 총 단백질의 50%를 나타낼 수 있고, 상기 전체 셀룰라아제 조성물은 총 단백질의 50%를 나타낼 수 있다.
이용시, 상기 생물학적 전환 효소 블렌드 조성물들은 개별적으로, 즉 별도의 효소 조성물들로서, 또는 상기 기질에의 첨가 전에 모든 셀룰라아제들 및 헤미셀룰라아제들이 그 안에 존재하는 단일의 효소 혼합물들로서 적당한 기질 물질에 첨가될 수 있다. 상기 셀룰라아제들 및 헤미셀룰라아제들이 별도의 효소 조성물들인 경우, 이들은 순차적으로 또는 동시에 상기 기질에 첨가될 수 있다. 상기 셀룰라아제들 및 헤미셀룰라아제들이 단일한 혼합물 중에 존재하는 경우, 이들은 동시에 첨가된다.
본 발명의 조성물들 및 방법의 다른 측면들 및 구체예들은 하기 실시예들을 참조시 더욱 이해될 수 있을 것이며, 이들은 제한적인 것으로서 해석되어서는 안된다. 본 기술분야의 당업자에게는, 본 발명의 내용으로부터 벗어나지 않으면서, 재료들 및 방법들 모두에서의 많은 변경이 이루어질 수 있음이 명백할 것이다.
실시예
T. 리세이 BGLU1 β-글루코시다아제가 보충된 T. 리세이 전체 셀룰라아제 혼합물을 포함하는 살균된 세포 물질의 전체 배양액인, ACCELLERASE 1000™ (Danisco A/S, Genencor Division, Palo Alto, CA)을 셀룰라아제 공급원으로서 사용하였다. 고 pI(pi)의 조제 제품, 자일라나아제 II인, MULTIFECT® 자일라나아제 (Danisco A/S, Genencor Division, Palo Alto, CA)를 XYN2 공급원으로서 사용하였다.
결과의 세포 물질(예로서, 컨디셔닝된 매질들 또는 "배양액들") 중에서 이들 셀룰라아제들의 존재를 방지하기 위하여, CBHI, CBHII, EG1 및 EG2를 암호화하는 유전자들이 결실된 T. 리세이의 균주에서 T. 리세이 헤미셀룰라아제들을 개별적으로 과잉발현시켰다. 관심 대상의 헤미셀룰라아제들은 이들 배양액들에서 총 단백질의 10% 초과 내지 85%의 범위였다. 많은 경우들에서, 상기 배양액들은 직접 사용되었다; 그러나, 관찰된 활성들이 상기 배양액 중에 존재하는 다른 단백질로 인한 것이 아님을 증명하기 위하여, 몇몇 헤미셀룰라아제들을 추가로 정제시켰다.
특정 효소들의 약어표기(acronyms), 폴리펩티드 서열번호들 및 탄수화물-활성 효소들(CAZY)의 과(family) 및 클랜(clan)의 명명(알려진 경우)을 표 1에 나타내었다. 상기 언급된 XYN2 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지며, GH11과의 C클랜 효소이다. 미성숙 폴리펩티드의 아미노산 서열들도 하기에 나타내었다.
표 1
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
ABF1, ABF2, ABF3, AGL1, AGL2, AGL3, AXE1, AXE3, EG6, EG8, GLR1, MAN1, PEC2, XYN1, XYN3 및 BXL1을 발현하는 분비된 단백질 배양액을 삼원(ternary) 혼합물들로 시험하였다. 150㎕ AFEX-예비처리된 옥수수 속대(31.7% 글루칸, 19.1% 자일란, 1.83% 갈락탄 및 3.4%의 아라비난, 건조 중량 기준, pH 5의 50mM 나트륨 아세테이트 버퍼 중에서 15.6% 또는 12%의 고체 슬러리로서 제조됨)를 96-웰 마이크로적정 플레이트의 각 웰에 첨가하였다(모든 데이타 값들은 3벌의(triplicate) 웰들에 기초한다). 한 실험(표 9에 나타냄)은 희석 암모니아-예비처리된 13.84% 고형분의 옥수숫대를 기질로서 사용하였다. 20mg/G 셀룰로오스 ACCELLERASE 1000™ (CEL) 단독, 20mg/G ACCELLERASE 1000™ + 5mg/G MULTIFECT® 자일라나아제, 또는 20mg/G ACCELLERASE 1000™ + 5mg/G MULTIFECT® 자일라나아제 + 1 또는 5mg/G의 개별적인 헤미셀룰라아제 배양액들을, 모두 20㎕의 총 효소 부피로, 선택된 웰들에 첨가하였다.
15.6% 또는 12% 고형분의 각 기질 슬러리 중 하나에서 총 셀룰로오스에 대해 효소 도스들(doses)을 조정하였다. 플레이트들을 밀봉하고 50℃에서 72시간 동안 진탕하며 인큐베이션하였다. 반응물들을 그 후 100㎕, pH 10의 100mM 글리신으로 수냉시켰다. 이 혼합물을 여과시키고 추가로 6배(20㎕ + 100㎕ 증류된 H2O) 희석시키고, Agilent Chem Station HPLC 기기의 HPLC-Aminex HPX-87P 컬럼 상에서 당 함량을 분석하였다. 셀로비오스 및 글루코오스에 대한 셀로비오스 표준 곡선 또는 자일로오스에 대한 자일로오스 표준 곡선에 기초하여, HPLC 피크 면적을 당 농도로 전환시켰다. 출발 셀룰로오스 함량에 기초한 전환율(%)은, 3벌의 당 중합체들 각각에 대한 가수분해의 H2O를 포함하도록 계산되었다. 상기 3벌들의 표준편차들도 계산하였다.
표 2 및 3은 상기 프로토콜의 2회의 개별적인 실시에서 결정된 바와 같은 각 효소 혼합물에 대한 글루칸 및 자일란의 평균 전환율(±표준편차)을 제공한다. 이들 개별적인 실행들은 15.6% 고형분(표 2) 및 12% 고형분(표 3)의 두 개의 상이한 AFEX 기질 슬러리들을 이용하여 수행하였으며, 이에 따라 mg/G 셀룰로오스로서의 도스는 동일하지만, 상이한 총 셀룰로오스의 mgs를 포함하였다.
표 2
Figure pct00007
표 3
Figure pct00008
XYN2의 첨가는 자일란 전환을 증가시키는데 효과적이었다. 제 3의 성분(즉, XYN3, AGL2, EG8, BXL1, ABF3 또는 PEC2)을 갖는 6개의 효소 혼합물들은, XYN2를 갖는 셀룰라아제에 비하여 글루칸 및/또는 자일란 전환율에 있어서 더욱 장점을 나타내었다. 4원 효소 혼합물을 상기 설명된 절차에 따라 실험하였다. 표 4는 각 효소 혼합물에 대한 글루칸 및 자일란의 평균 전환율(±표준편차)을 제공한다.
표 4
Figure pct00009
또다른 실험에서, ACCELLERASE 1000™을 정제된 XYN2 및/또는 XYN3과 혼합하고 분석하였다(표 5). XYN2 및 XYN3의 조합은 보다 효율적인 글루칸 및 자일란 전환율을 나타내었다.
표 5
Figure pct00010
추가의 실시예에서, XYN4, XYN5, FAE1 및 약 50%의 관심대상의 단백질을 갖는 새로운 로트(lot)의 ABF3(이전의 로트에 비해 <10%)를 20mg/G ACCELLERASE 1000™ + 5mg/G MULTIFECT® 자일라나아제 XYN2를 포함하는 혼합물들에서 상기와 같이 시험하였다. 결과들을 표 6에 나타내었다. XYN4, XYN5 또는 FAE1의 첨가는 글루칸 및 자일란의 전환을 증가시키는데 효과적이었다.
표 6
Figure pct00011
또다른 실험에서, ACCELLERASE 1000™을 정제된 BxI1 및 XYN2 및/또는 XYN3과 혼합하고 상기와 같이 분석하였다. 결과들을 표 7에 나타내었다. 몇몇 효소 조합들이 글루칸 및/또는 자일란의 전환을 증가시키는데 효과적이었다.
표 7
Figure pct00012
또다른 실시예에서, ABF1, ABF2 및 ABF3(ABF3 샘플 로트는 <10%의 관심대상의 단백질을 가짐)를, 단독, 2원 및 3원 조합으로, 20mg/G ACCELLERASE 1000™ + 5mg/G 정제된 XYN3 + 5mg/G 정제된 BXL1의 기본혼합물(background)에 첨가하였다. 결과들을 표 8에 나타내었다. 몇몇 효소 조합들이 글루칸 및/또는 자일란의 전환을 증가시키는데 효과적이었다.
표 8
Figure pct00013
또다른 실시예에서, 3.4mg/G 자일란의 정제된 ABF1, ABF2 및/또는 ABF3을 20.7mg/G 글루칸의 ACCELLERASE 1000™ + 5.1mg/G 자일란의 각 정제된 XYN3 및 BXL1에 첨가하였다. 결과들을 표 9에 나타내었다. 몇몇 효소 조합들이 글루칸 및/또는 자일란의 전환을 증가시키는데 효과적이었다.
표 9
Figure pct00014

Claims (30)

  1. 하기 (a) 내지 (c) 를 포함하는 셀룰로오스성 및 헤미셀룰로오스성 물질들의 혼합물을 가수분해하기 위한 효소 블렌드 조성물:
    (a) 셀룰라아제를 포함하는 제 1 효소 조성물,
    (b) GH10 또는 GH11 자일라나아제로부터 선택되는 하나 이상의 자일라나아제를 포함하는 제 2 효소 조성물, 및
    (c) GH10 또는 GH11 자일라나아제가 아니거나 또는 (b)에서와 동일한 GH10 또는 GH11 자일라나아제가 아닌, 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제를 포함하는 제 3 효소 조성물,
    상기 효소 블렌드 조성물이 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제가 결여된 균등한 효소 블렌드 조성물에 비해 (i) 향상된 글루칸 전환 또는 (ii) 향상된 자일란 전환 중 하나 이상을 제공함.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 효소 조성물이 섬유성 진균류로부터의 전체(whole) 셀룰라아제 블렌드인 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 효소 조성물이 추가량의 β-글루코시다아제로 보충된 섬유성 진균류로부터의 전체 셀룰라아제 블렌드인 조성물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 효소 조성물이 트 리코더마 리세이로부터의 자일라나아제 XYN2를 포함하는 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 효소 조성물이 트 리코더마 리세이로부터의 자일라나아제 XYN3을 포함하는 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 자일라나아제가 서열번호 1 또는 서열번호 2로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제가 GH54 헤미셀룰라아제, GH62 헤미셀룰라아제, GH27 헤미셀룰라아제, GH36 헤미셀룰라아제, GH5 헤미셀룰라아제, GH74 헤미셀룰라아제, GH67 헤미셀룰라아제, GH28 헤미셀룰라아제, GH11 헤미셀룰라아제, GH10 헤미셀룰라아제, GH3 헤미셀룰라아제 및 CE5 헤미셀룰라아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제가 β-자일로시다아제 또는 아라비노푸라노시다아제인 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 β-자일로시다아제가 트리코더마 리세이로부터의 BXL1이고 상기 아라비노푸라노시다아제가 트리코더마 리세이로부터의 ABF1, ABF2 또는 ABF3인 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제가 β-자일로시다아제와 아라비노푸라노시다아제의 조합인 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 β-자일로시다아제가 트리코더마 리세이로부터의 BXL1이고, 상기 아라비노푸라노시다아제가 트리코더마 리세이로부터의 ABF1, ABF2 또는 ABF3인 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 효소 조성물이 추가량의 β-글루코시다아제로 보충된 섬유성 진균류로부터의 전체 셀룰라아제 블렌드이고, 상기 제 2 효소 조성물이 자일라나아제를 포함하고, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제가 β-자일로시다아제와 아라비노푸라노시다아제의 조합인 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제가 α-아라비노푸라노시다아제 I (ABF1), α-아라비노푸라노시다아제 II (ABF2), α-아라비노푸라노시다아제 III (ABF3), α-갈락토시다아제 I (AGL1), α-갈락토시다아제 II (AGL2), α-갈락토시다아제 III (AGL3), 아세틸 자일란 에스테라아제 I (AXE1), 아세틸 자일란 에스테라아제 III (AXE3), 엔도글루카나아제 VI (EG6), 엔도글루카나아제 VIII (EG8), α-글루쿠로니다아제 I (GLR1), β-만나아제 (MAN1), 폴리갈락투로나아제 (PEC2), 자일라나아제 I (XYN1), 자일라나아제 II (XYN2), 자일라나아제 III (XYN3) 및 β-자일로시다아제 (BXL1)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 트리코더마 리세이 헤미셀룰라아제인 조성물.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제가 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 조성물.
  15. 셀룰로오스성 및 헤미셀룰로오스성 물질들의 혼합물을 하기 (a) 내지 (c) 와 접촉시켜 셀룰로오스성 및 헤미셀룰로오스성 물질들의 혼합물을 가수분해시키는 것을 포함하는, 셀룰로오스성 및 헤미셀룰로오스성 물질들의 혼합물의 가수분해 방법:
    (a) 셀룰라아제를 포함하는 제 1 효소 조성물,
    (b) GH10 또는 GH11 자일라나아제로부터 선택되는 하나 이상의 자일라나아제를 포함하는 제 2 효소 조성물, 및
    (c) GH10 또는 GH11 자일라나아제가 아니거나 또는 (b)에서와 동일한 GH10 또는 GH11 자일라나아제가 아닌, 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제를 포함하는 제 3 효소 조성물,
    상기 접촉이, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제의 부재 하에서의 균등한 접촉에 비해, (i) 향상된 글루칸 전환 또는 (ii) 향상된 자일란 전환 중 하나 이상의 결과를 초래함.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 제 1 효소 조성물이 섬유성 진균류로부터의 전체 셀룰라아제 블렌드인 방법.
  17. 제 15 항에 있어서, 상기 제 1 효소 조성물이 추가량의 β-글루코시다아제로 보충된 섬유성 진균류로부터의 전체 셀룰라아제 블렌드인 방법.
  18. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 효소 조성물이 트리코더마 리세이로부터의 자일라나아제 XYN2를 포함하는 방법.
  19. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 효소 조성물이 트리코더마 리세이로부터의 자일라나아제 XYN3을 포함하는 방법.
  20. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 자일라나아제가 서열번호 1 또는 서열번호 2로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 방법.
  21. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제가 GH54 헤미셀룰라아제, GH62 헤미셀룰라아제, GH27 헤미셀룰라아제, GH36 헤미셀룰라아제, GH5 헤미셀룰라아제, GH74 헤미셀룰라아제, GH67 헤미셀룰라아제, GH28 헤미셀룰라아제, GH11 헤미셀룰라아제, GH10 헤미셀룰라아제, GH3 헤미셀룰라아제 및 CE5 헤미셀룰라아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  22. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제가 β-자일로시다아제 또는 아라비노푸라노시다아제인 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 β-자일로시다아제가 트리코더마 리세이로부터의 BXL1이고, 상기 아라비노푸라노시다아제가 트리코더마 리세이로부터의 ABF1, ABF2 또는 ABF3인 방법.
  24. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제가 β-자일로시다아제와 아라비노푸라노시다아제의 조합인 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 β-자일로시다아제가 트리코더마 리세이로부터의 BXL1이고, 상기 아라비노푸라노시다아제가 트리코더마 리세이로부터의 ABF1, ABF2, 또는 ABF3인 방법.
  26. 제 15 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 효소 조성물이 추가량의 β-글루코시다아제로 보충된 섬유성 진균류로부터의 전체 셀룰라아제 블렌드이고, 제 2 효소 조성물이 자일라나아제를 포함하고, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제가 β-자일로시다아제와 아라비노푸라노시다아제의 조합인 방법.
  27. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제가 α-아라비노푸라노시다아제 I (ABF1), α-아라비노푸라노시다아제 II (ABF2), α-아라비노푸라노시다아제 III (ABF3), α-갈락토시다아제 I (AGL1), α-갈락토시다아제 II (AGL2), α-갈락토시다아제 III (AGL3), 아세틸 자일란 에스테라아제 I (AXE1), 아세틸 자일란 에스테라아제 III (AXE3), 엔도글루카나아제 VI (EG6), 엔도글루카나아제 VIII (EG8), α-글루쿠로니다아제 I (GLR1), β-만나아제 (MAN1), 폴리갈락투로나아제 (PEC2), 자일라나아제 I (XYN1), 자일라나아제 II (XYN2), 자일라나아제 III (XYN3) 및 β-자일로시다아제 (BXL1)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 트리코더마 리세이 헤미셀룰라아제인 방법.
  28. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 헤미셀룰라아제가 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 방법.
  29. 제 15 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 셀룰로오스성 및 헤미셀룰로오스성 물질들의 혼합물과 상기 제 1 효소 조성물, 제 2 효소 조성물 및 제 3 효소 조성물들과의 접촉이 동시에 수행되는 방법.
  30. 제 15 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 효소 조성물, 제 2 효소 조성물 및 제 3 효소 조성물이 효소 블렌드의 단일 조성물로 제공되는 방법.
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