KR20090123857A

KR20090123857A - 특이성이 개선된 트랜스글루타미나아제 변이체

Info

Publication number: KR20090123857A
Application number: KR1020097016491A
Authority: KR
Inventors: 션 후; 신 자오; 왕 지안후아; 치추안 챙; 레이프 노르스코브-라우릿센; 징 수
Original assignee: 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2007-02-22
Filing date: 2008-02-22
Publication date: 2009-12-02
Also published as: US20100099610A1; WO2008102007A1; US20100087371A1; JP2010518843A; WO2008102008A1; BRPI0808014A2; MX2009008877A; CA2678669A1; JP2010518842A; AU2008219238A1; CN101679503A; EP2118132A1; EP2121744A1; RU2009134725A

Abstract

사람 성장 호르몬의 Gln-141에 대하여 개선된 선택성을 갖는 스트렙토베르티실리움 라다카눔으로부터의 트랜스글루타미나아제의 변이체를 제공한다.

트랜스글루타미나아제

Description

특이성이 개선된 트랜스글루타미나아제 변이체{TRANSGLUTAMINASE VARIANTS WITH IMPROVED SPECIFICITY}

본 발명은 스트렙토베르티실리움 라다카눔(Streptoverticillium ladakanum)으로부터의 트랜스글루타미나아제의 신규한 변이체에 관한 것이다. 변이체는 개선된 선택성으로 지정된 글루타민 잔기에서 펩티드의 부위-특이적 변형에 사용될 수 있다.

단백질에 특성을 알맞게 변화시키는 기를 접합시킴으로써 펩티드의 특성 및 특징을 변형시키는 것이 널리 알려져 있다. 특히 치료용 펩티드를 위해서 상기 펩티드에 펩티드의 반감기를 연장시키는 기를 접합하는 것이 요망되거나 또는 필요할 수 있다. 통상적으로 이러한 접합 기는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 덱스트란 또는 지방산이다 - J.Biol.Chem. 271, 21969-21977 (1996) 참조.

트랜스글루타미나아제 (TGase)는 이전부터 펩티드의 특성을 변화시키는데 사용되어 왔다. 식품 산업 및 특히 낙농 산업에서 TGase를 사용하여 예컨대 펩티드를 가교-결합시키는데 많은 기술이 이용될 수 있다. 다른 문헌들은 생리적 활성 펩티드의 특성을 변화시키기 위한 TGase의 사용을 개시한다. EP 950665, EP 785276 및 Sato, Adv. Drug Delivery Rev. 54, 487-504 (2002)는 TGase의 존재하에서 하나 이 상의 Gln 및 아민-관능화된 PEG 또는 유사한 리간드를 포함하는 펩티드 사이의 직접 반응을 개시하고, Wada in Biotech. Lett. 23, 1367-1372 (2001)는 TGase를 사용하는 β-락토글로불린과 지방산의 직접 접합을 개시하고, 그리고 Valdivia in J. Biotechnol. 122, 326-333 (2006)는 카탈라아제의 TGase 촉매된 부위-특이적 글리코시드화를 보고한다. WO2005070468는 TGase를 사용하여 글루타민 함유 펩티드에 관능기를 조합시켜서 관능화된 펩티드를 형성할 수 있는 것과, 이 관능화된 펩티드를 다음 단계에서 예컨대 상기 관능화된 단백질과 반응할 수 있는 PEG와 반응시켜서 PEG화된 펩티드를 형성할 수 있는 것을 개시한다.

트랜스글루타미나아제 (E.C.2.3.2.13)는 또한 단백질-글루타민-γ-글루타밀트랜스페라아제로서 알려져 있으며 일반적인 반응

을 촉매하고, 여기서 Q-C(O)-NH₂는 글루타민 함유 펩티드를 나타내고, Q'-NH₂는 상기 논의된 반응에서 펩티드에 포함되는 관능기를 제공하는 아민 공여체를 나타낼 수 있다.

생체내 통상의 아민 공여체는 펩티드 결합된 리신이고, 상기 반응은 펩티드의 가교-결합을 제공한다. 응고 인자 Factor XIII는 트랜스글루타미나아제이며 상처에서 혈액을 응고시키는 작용을 한다. 상이한 TGase는, 예컨대 Gln 주변의 어떤 아미노산 잔기가 기질이 되는 단백질에 필요한지의 점에서 서로 상이하며, 즉 상이 한 TGase는 어떤 아미노산 잔기가 Gln 잔기에 이웃하는지에 따라 기질로서 상이한 Gln-함유 펩티드를 가질 것이다. 변형되는 펩티드가 하나 이상의 Gln 잔기를 함유한다면 이 관점을 이용할 수 있다. 존재하는 Gln 잔기의 일부에만 선택적으로 펩티드를 접합시키는 것이 필요하다면 이 선택성은 기질로서 관련 Gln 잔기(들)만을 수용하는 TGase의 선택으로 얻을 수 있다.

사람 성장 호르몬(hGH)은 13개 글루타민 잔기를 포함하고, 따라서 hGH의 TGase 매개된 접합은 낮은 선택성에 의해 잠재적으로 방해된다. hGH 상의 13개 글루타민(Gln) 중에서 두개의(Q141 및 Q40) 글루타민은 TGase의 촉매작용하에서 반응성이라는 것이 이전부터 설명되어 왔다(WO2006/134148). hGH의 더욱 더 특이적인 관능화를 매개하는 TGase를 확인할 필요성이 있다.

발명의 요약

스트렙토베르티실리움 라다카눔으로부터의 mTGase(용어 mTGase는 이것이 분리되는 미생물에 의해 발현되는 TGase를 표시하기 위해 사용됨)(S. 라다카눔으로부터의 mTGase는 mTGase-SL으로 약기될 수 있음)은 스트렙토마이세스 모바라엔시스(Streptomyces mobaraensis)의 mTGase의 두배인 더욱 높은 부위-특이성(선택성이라고도 함)을 갖는다는 것으로 판단되었다.

한 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID No. 1 내의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열은 SEQ ID No. 1의 아미노산 잔기 Tyr62, Tyr75 및 Ser250에 대한 위치 중 하나 이상에서 변형된, 분리된 펩티드에 관한 것이다.

한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드를 암호화하는 핵산 구조체에 관한다.

한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터에 관한다.

한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주에 관한다.

한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드를 포함하는 조성물에 관한다.

한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드의 존재하에서 hGH와 아민 공여체의 반응을 포함하는, hGH 접합 방법에 관한다.

도 1은 스트렙토마이세스 모바라엔시스로부터의 mTGase 및 스트렙토베르티실리움 라다카눔으로부터의 mTGase의 서열의 서열 배열을 나타낸다.

도 2A 반응을 위한 블랭크: 야생형 hGH와 1,3-디아미노 프로판올. mTGase을 첨가하지 않았다.

도 2B. S. 모바라엔시스로부터의 AlaPro-mTGase. 반응 시간=30분; 선택성=5.7; 전환율=32%

도 2C. GlyPro-mTGase-SL; 반응 시간=15분; 선택성=10.31; hGH 전환율=55%.

도 2D. GlyPro-mTGase_Y75A-SL; 반응 시간=300분; 선택성=17.33; hGH 전환율=40%.

도 2E. GlyPro-mTGase_Y75F-SL; 반응 시간=75분; 선택성=20.94; hGH 전환율=33%.

도 2F. GlyPro-mTGase_Y75N-SL; 반응 시간=90분; 선택성=15.66; hGH 전환율=50%.

도 2G. GlyPro-mTGase_Y62H_Y75N-SL; 반응 시간=75분; 선택성=26.33; hGH 전환율=38%.

도 2H. GlyPro-mTGase_Y62H_Y75F-SL; 반응 시간=120분; 선택성=36.21; hGH 전환율=49.4%

도 3. HPLC에 의한 S. 라다카눔 TGase으로 촉매된 hGH 돌연변이의 반응 혼합물의 분석. 상단: hGH-Q40N. 제1 피크(26.5 min, 면적 1238)는 생성물-Q141이고 제2 피크(29.7 min, 면적 375)는 남아있는 hGH-Q40N이다. 하단: hGH-Q141N. 제1 피크(19.2 min, 면적 127)는 생성물-Q40이고 제2 피크(30.3 min, 면적 1158)은 남아있는 hGH-Q141N이다.

도 4. HPLC에 의한 S. 모바렌스 TGase로 촉매된 hGH 돌연변이의 반응 혼합물의 분석. 상단: hGH-Q40N. 제1 피크(26.9 min, 면적 1283)은 생성물-Q141이고 제2 피크(30.1 min, 면적 519)는 남아있는 hGH-Q40N이다. 하단: hGH-Q141N. 제1 피크(19.5 min, 면적 296)는 생성물-Q40이고 제2 피크(30.6 min, 면적 1291)는 남아있는 hGH-Q141N이다.

도 5: 표 5로부터 트랜스아미네이션 혼합물 3과 4의 CIE HPLC. 피크 1 = hGH, 피크 2 = 위치 40에서 트랜스아미네이션, 피크 3 = 위치 141에서 트랜스아미 네이션 및 피크 4 = 위치 40/141에서 트랜스아미네이션.

본 발명은 TGase 활성을 갖는 펩티드를 제공하며, 펩티드는 hGH 내의 Gln40에 비하여 hGH 내의 Gln 141에 대하여 개선된 선택성을 갖고, 보다 구체적으로, 본 발명은 hGH의 Gln-40에 비하여 hGH의 Gln-141에 대한 특이성을 갖는 트랜스글루타미나아제 펩티드에 관하며, 이는 SEQ ID No. 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 hGH의 Gln-40에 비한 hGH의 Gln-141에 대한 특이성 보다 높다.

용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 본원에서 교대로 사용되며 펩티드 결합에 의해 연결된 5개 이상 구성 아미노산으로 구성된 화합물을 의미하는 것으로 받아들어져야 한다. 구성 아미노산은 유전 코드로 암호화되는 아미노산의 군에서 유래할 수 있고, 이들은 유전 코드에 의해 암호화되지 않는 천연 아미노산 및 합성 아미노산일 수 있다. 유전 코드에 의해 암호화되지 않는 천연 아미노산은, 예컨대 히드록시프롤린, y-카르복시글루타메이트, 오르니틴, 포스포세린, D-알라닌 및 D-글루타민이 있다. 합성 아미노산은 화학 합성에 의해 제조된 아미노산, 즉 D-알라닌 및 D-류신과 같은 유전 코드로 암호화된 아미노산의 D-이성질체, Aib (a-아미노이소부티르산), Abu (a-아미노부티르산), Tle(tert-부틸글리신), β-알라닌, 3-아미노메틸 벤조산 및 안트라닐산을 포함한다. 명사로서 용어 "접합"은 변형된 펩티드, 즉 펩티드의 특성을 변형시키기 위해 이것에 결합된 모이어티가 있는 펩티드를 나타내도록 의도된다. 동사로서, 이 용어는 펩티드에 모이어티를 결합시켜서 상기 펩티드의 특성을 변형시키는 과정을 나타내도록 의도된다.

본문에서 "TGase 활성이 있는 펩티드" 또는 "트랜스글루타미나아제" 또는 유사한 용어는 글루타민 잔기의 γ-카르복시아미드기와 아민 공여체로서 기능하는 여러 1차 아민 사이의 아실 전이 반응을 촉매하는 능력을 갖는 펩티드를 의미하도록 의도된다.

본문에서 "트랜스아미네이션", "트랜스글루타미네이션", "트랜스글루타미나아제 반응" 또는 유사 용어는 단백질/펩티드로부터의 글루타민 잔기의 γ-글루타미닐이 1차 아민 또는 리신의 ε-아미노기 또는 물로 전이될 때의 반응을 나타내도록 의도되며 이때 암모니아 분자가 방출된다.

본문에서, 용어 "특이성" 및 "선택성"은 hGH 내의 다른 특정 글루타민 잔기에 비하여 hGH 내의 하나 이상의 특정 글루타민 잔기와의 반응에 대한 TGase의 선호도를 설명하기 위해 교대로 사용된다. 본 명세서를 위해서, hGH 내의 Gln141에 비하여 Gln-40에 대한 본 발명의 펩티드의 특이성은 실시예에서 설명하는 펩티드 테스트 결과에 따라 결정된다.

본 발명의 펩티드는 펩티드, 예컨대 hGH를 트랜스글루타미네이션하기 위한 트랜스글루타미나아제로서 유용하다. 펩티드의 트랜스글루타미네이션은 WO2005/070468 및 WO2006/134148에 설명된 바와 같이 예컨대 상기 펩티드의 접합체 제조에 유용하다.

예로서 hGH를 사용하여 접합된 펩티드를 제조하는 한 방법은 관능화된 hGH를 산출하기 위한, hGH과 관능기를 포함하는 아민 공여체 사이의 제1 반응을 포함하며, 상기 제1 반응은 TGase에 의해 매개된다(즉 촉매됨). 제2 반응 단계에서, 상기 관능화된 hGH는 예컨대 가능한 또는 상기 조합된 관능기와 반응하여 접합된 hGH를 제공하는 PEG 또는 지방산과 더 반응한다. 제1 반응을 하기에 나타낸다.

X는 관능기 또는 잠재적 관능기, 즉 다른 반응, 예컨대 산화 또는 가수분해시 관능기로 변형되는 기를 나타낸다.

또한 미생물 S. 모바라엔시스는 스트렙토베르티실리움 모바라엔스(Streptoverticillium mobaraense)로 분류된다. TGase는 유기체로부터 분리될 수 있고, 이 TGase는 비교적 낮은 분자량(~38 kDa) 및 칼슘-독립성을 특징으로 한다. S. 모바라엔시스로부터의 TGase는 비교적 잘 설명되어 있으며; 예컨대 용해되는 결정 구조를 갖는다(US 156956; Appl. Microbiol. Biotech. 64, 447-454 (2004)).

상기 반응이 스트렙토마이세스 모바라엔시스로부터의 TGase에 의해 매개되는 경우, hGH와 H₂N-X(아민 공여체) 사이의 반응은 Gln-40 및 Gln-141에서 우세하게 일어난다. 상기 반응을 예컨대 hGH PEG화를 사용하여 반감기가 연장된 치료용 성장 호르몬 생성물을 얻을 수 있다. 일반적으로 치료용 조성물은 단일-화합물 조성물인 것이 요망되므로, 상기 논의된 특이성의 부족은 또 다른 정제 단계를 필요로 하며, 여기서 Gln-40 관능화된 hGH, Gln-141 관능화된 hGH 및/또는 Gln-40/Gln-141 이중-관능화된 hGH이 서로 분리된다.

이러한 사람 성장 호르몬의 접합을 위한 트랜스글루타미나아제의 사용은 WO2005/070468, WO2006/134148, WO2007/020291 및 WO2007/020290에 광범위하게 설명되어 있다.

S. 라다카눔으로부터 분리된 TGase의 서열은 S. 모바라엔시스로부터의 서열과 두서열 사이의 총 22개 아미노산 상이를 제외하고 동일한 아미노산 서열을 갖는다(Yi-Sin Lin et al., Process Biochemistry 39(5), 591-598 (2004).

S. 라다카눔으로부터의 mTGase의 서열이 SEQ ID No. 1에 주어지고 S. 모바라엔시스로부터의 mTGase의 서열이 SEQ ID No. 2에 주어진다.

본 발명의 펩티드는 hGH의 Gln-40에 비하여 Gln-141에 대한 특이성을 가지며, 이는 SEQ ID No. 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 hGH의 Gln-40에 비한 Gln-141에 대한 특이성 보다 현저히 높고, 여기서 특이성은 실시예에 설명된 바와 같이 측정된다. 따라서 본 발명의 펩티드는 SEQ ID No.2의 아미노산 서열을 갖는 TGase를 사용하는 반응에 비해서, Gln-40 관능화된 hGH 또는 Gln-141 관능화된 hGH의 생성을 증가시키기 위해 hGH를 트랜스글루타미네이션하는 방법에 사용된다.

따라서, 한 실시형태에서, 본 발명의 트랜스글루타미나아제 펩티드는 hGH의 Gln-40에 비하여 hGH의 Gln-141에 대한 특이성을 가지며, 이는 SEQ ID No. 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 hGH의 Gln-40에 비한 hGH의 Gln-141에 대한 특이성 보다 높다. 한 실시형태에서, Gln-40에 비한 Gln-141에 대한 본 발명의 펩티드의 특이성은, SEQ ID No. 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 Gln-40에 비한 Gln-141에 대한 특이성 보다 1.25배 이상, 예컨대 1.50배 이상, 예를 들면 1.75배 이상, 예컨대 2.0배 이상, 예를 들면 2.5배 이상, 예컨대 3.0배 이상, 예를 들면 3.5배 이상, 예컨대 4.0배 이상, 예를 들면 4.5배 이상, 예컨대 5.0배 이상, 예를 들면 5.5배 이상, 예컨대 6.0배 이상, 예를 들면 6.5배 이상, 예컨대 7.0배 이상, 예를 들면 7.5배 이상, 예컨대 8.0배 이상, 예를 들면 8.5배 이상, 예컨대 9.0배 이상, 예를 들면 9.5배 이상, 예컨대 10.0배 이상 높다.

한 실시형태에서, 본 발명의 트랜스글루타미나아제 펩티드는 SEQ ID No. 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 Ala-Pro의 N-말단 부가된 SEQ ID No. 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 hGH의 Gln-40에 비한 hGH의 Gln-141에 대한 특이성 보다 높은 hGH의 Gln-40에 비한 hGH의 Gln-141에 대한 특이성을 갖는데, 이는 Ala-Pro의 N-말단 부가된 SEQ ID No. 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 SEQ ID No. 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 동일한 특이성을 가지기 때문이다 (실시예 참조). 한 실시형태에서, Gln-40에 비한 Gln-141에 대한 본 발명의 펩티드에 대한 특이성은 SEQ ID No. 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 Gln-40에 비한 Gln-141에 대한 특이성 보다 1.25배 이상, 예컨대 1.50배 이상, 예를 들면 1.75배 이상, 예컨대 2.0배 이상, 예를 들면 2.5배 이상, 예컨대 3.0배 이상, 예를 들면 3.5배 이상, 예컨대 4.0배 이상, 예를 들면 4.5배 이상, 예컨대 5.0배 이상, 예를 들면 5.5배 이상, 예컨대 6.0배 이상, 예를 들면 6.5배 이상, 예컨대 7.0배 이상, 예를 들면 7.5배 이상, 예컨대 8.0배 이상, 예를 들면 8.5배 이상, 예컨대 9.0배 이상, 예를 들면 9.5배 이상, 예컨대 10.0배 이상 높다.

한 실시형태에서, 본 발명에 따른 펩티드는 특정 아미노산 잔기에 돌연변이를 보유하고 및/또는 추가로 N-말단 부가된 아미노산 잔기를 갖는 S. 라다카눔으로부터의 mTGase의 서열에 기초한 서열을 포함한다. 한 실시형태에서, 본 발명에 따른 펩티드는 추가로 N-말단 부가된 아미노산 잔기를 갖는 S. 모바라엔시스로부터 mTGase의 서열에 기초한 서열을 포함한다.

특히 본 발명은 스트렙토베르티실리움 라다카눔으로부터의 트랜스글루타미나아제의 신규한 변이체에 관한다. 변이체는 개선된 선택성으로 지정된 글루타민 잔기에서 펩티드의 부위-특이적 변형에 사용될 수 있다.

본 발명에서, 용어 "변이체"는 해당 폴리펩티드의 자연 발생 변이체 또는, 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 치환, 부가, 결실, 삽입 또는 반전에 의해 변형된, 해당 펩티드 또는 단백질의 재조합 제조된 또는 달리 변형된 변이체 중 어느 하나를 의미하도록 의도된다.

한 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID No. 1 내의 아미노산 서열과 80% 이상, 예컨대 85% 이상, 예를 들면 90% 이상, 예컨대 95% 이상, 예를 들면 100% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 펩티드를 제공하며, 여기서 상기 서열은 SEQ ID No. 1의 아미노산 잔기 Tyr62, Tyr75 및 Ser250에 대한 위치 중 하나 이상에서 변형된다.

용어 "동일성"은 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 서열을 비교함으로써 측정되는, 두개 이상의 펩티드의 서열 간의 관계를 의미한다. 당업계에서, "동일성"은 또한 두개 이상의 아미노산 잔기의 가닥 간에 일치하는 수에 의해 결정되는, 단백질 간의 서열 연관성의 정도를 말하는 것이기도 하다. "동일성"은 특정한 통계학적 모델이나 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")을 통해 어드레싱되는 갭 정렬(존재하는 경우)을 사용하여 두개 이상의 서열의 가장 짧은 것 간의 일치의 퍼센트를 측정한다. 관련 단백질의 동일성은 공지된 방법을 통해 쉽게 계산할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면 Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; 및 Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)에 기술된 것들이지만 이에 제한되는 것은 아니다.

동일성을 측정하기 위한 바람직한 방법은 테스트된 서열 간에 가장 긴 일치 서열을 만들도록 디자인하는 것이다. 동일성을 측정하기 위한 방법은 공용 컴퓨터 프로그램에 설명되어 있다. 두 서열 간의 동일성을 측정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GAP(Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA(Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990))를 포함하는 GCG 프로그램 패키지를 포함한다. BLASTX 프로그램은 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 및 기타 공급처(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., 상기의 문헌)에서 공개적으로 구할 수 있다. 익히 공지되어 있는 Smith Waterman 알고리즘도 동일성을 측정하는데 사용될 수 있다.

예를 들면, 컴퓨터 알고리즘 GAP(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)를 사용하여, 서열 동일성 %를 측정할 두개의 펩티드를 그들 각 아미노산의 최적의 일치에 대해 정렬한다(알고리즘에 의해 측정되는 "일치되는 스팬"). 갭 열림 벌점(이는 3회 측정된 것으로서, 평균 항(項): "평균 항"은 사용되는 대조 행렬의 항의 평균이고; "항"은 특정 대조 행렬에 의한 각각의 완전해 아미노산 일치에 할당받은 점수 또는 숫자이다), 및 갭 연장 벌점(이는 보통 {분수(1/10)} 곱하기 갭 열림 벌점이다), 뿐만 아니라, PAM 250 또는 BLOSUM 62와 같은 대조 행렬을 알고리즘과 함께 사용한다. 또한 표준 대조 행렬(PAM 250 대조 행렬에 대해서는 Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978); BLOSUM 62 대조 행렬에 대해서는 Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992) 참조)를 알고리즘에 사용한다.

펩티드 서열 비교를 위한 바람직한 매개변수는 하기를 포함한다:

알고리즘: Needleman et al., J. Mol. Biol, 48:443-453 (1970); 대조 행렬: Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919 (1992)의 BLOSUM 62 ; 갭 벌점: 12, 갭 길이 벌점: 4, 유사도의 역치: 0.

GAP 프로그램은 상기 매개변수를 사용하여 유용하다. 상기 언급한 매개변수는 GAP 알고리즘을 사용한 펩티드 비교에 대해 디폴트 매개변수(말단 갭에 대해 페널티가 없는 것과 함께)이다.

한 실시형태에서, 본 발명은 상술한 바와 같은 분리된 펩티드를 제공하며, 여기서 상기 아미노산 서열은 Tyr62에 해당하는 위치에서 변형되고, 변형은 Tyr와 상이한 아미노산 잔기로 원 티로신 잔기의 치환으로 구성된다. 한 실시형태에서, Tyr62에 해당하는 위치에서 아미노산 잔기의 변형은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, 및 Val에서 선택된 아미노산 잔기로 원 티로신 잔기의 치환으로 구성된다. 한 실시형태에서, Tyr62에 해당하는 위치에서 Tyr는 His, Met, Asn, Val, Thr, 및 Leu에서 선택된 아미노산 잔기로 치환된다.

한 실시형태에서, 본 발명은 상술한 바와 같은 분리된 펩티드를 제공하며, 여기서 상기 아미노산 서열은 Tyr75에 해당하는 위치에서 변형되며, 변형은 Tyr와 상이한 아미노산 잔기로 원 티로신 잔기의 치환으로 구성된다. 한 실시형태에서, Tyr75에 해당하는 위치에서 아미노산 잔기의 변형은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, 및 Val에서 선택된 아미노산 잔기로 원 티로신 잔기의 치환으로 구성된다. 한 실시형태에서, Tyr75에 해당하는 위치에서 Tyr은 Ala, Phe, Asn, Met, 또는 Cys로 치환된다.

한 실시형태에서, 본 발명은 상술한 분리된 펩티드를 제공하며, 여기서 상기 아미노산 서열은 Ser250에 해당하는 위치에서 변형되며, 변형은 Ser와 상이한 아미노산 잔기로 원 세린 잔기의 치환으로 구성된다. 한 실시형태에서, Ser250에 해당하는 위치에서 아미노산 잔기의 변형은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr, 및 Val에서 선택된 아미노산 잔기로 원 티로신 잔기의 치환으로 구성된다.

한 실시형태에서, 본 발명에 따른 펩티드는 N-말단에서 1개 이상, 예컨대 1개 내지 9개, 예를 들면 1개 내지 8개, 예컨대 1개 내지 7개, 예를 들면 1개 내지 6개, 예컨대 1개 내지 5개, 예를 들면 1개 내지 4개, 예컨대 1개 내지 3개, 예를 들면 1개 내지 2개, 예컨대 1개의 아미노산의 부가에 의해 변형된다. 한 실시형태에서, 상기 서열은 N-말단에서 Met의 부가에 의해 변형된다.

한 실시형태에서, 본 발명에 따른 펩티드는 N-말단에서 1개 이상, 예컨대 2개 내지 9개, 예를 들면 2개 내지 8개, 예컨대 2개 내지 7개, 예를 들면 2개 내지 6개, 예컨대 2개 내지 5개, 예를 들면 2개 내지 4개, 예컨대 2개 내지 3개, 예를 들면 2개의 아미노산의 부가에 의해 변형된다. 한 실시형태에서, 부가되는 아미노산 잔기는 디펩티드 라디칼 Gly-Pro-이다. 한 실시형태에서, 부가되는 아미노산 잔기는 디펩티드 라디칼 Ala-Pro-이다.

본 발명의 펩티드는 US 5,156,956에 설명된 분석법에서 결정되는 바와 같이 TGase 활성을 나타낸다. 간단히 설명하면, 해당 펩티드의 활성 측정은 Ca²⁺의 존재하에서 기질로서 벤질옥시카르보닐-L-글루타미닐 글리신과 히드록시아민을 사용하여 반응을 행하고, 트리클로로아세트산의 존재하에서 얻어진 히드록삼산으로 철 착체를 형성하고, 525 nm에서의 흡광도를 측정하고, 그리고 교정 곡선에 의해 히드록삼산의 양을 결정함으로써 행하여 활성을 산출한다. 본 명세서를 위해서, 상기 분석에서 트랜스글루타미나아제 활성을 나타내는 펩티드는 트랜스글루타미나아제 활성을 갖는 것으로 생각된다. 특히, 본 발명의 펩티드는 SEQ ID No. 2의 아미노산 서열을 갖는 S. 라다카눔으로부터의 TGase의 30% 이상, 예컨대 50% 이상, 예컨대 70% 이상, 예컨대 90% 이상인 활성을 나타낸다.

한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드를 암호화하는 핵산 구조체를 제공한다.

본원에 사용된 용어 "핵산 구조체"는 cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 RNA 기원의 핵산 분자를 나타내도록 의도된다. 용어 "구조체"는 단일- 또는 이중-가닥일 수 있는 핵산 세그먼트를 나타내도록 의도되며, 해당 단백질을 암호화하는 완전 또는 부분 자연 발생 뉴클레오티드 서열에 기초할 수 있다. 구조체는 다른 핵산 세그먼트를 선택적으로 함유할 수 있다.

본 발명의 펩티드를 암호화하는 본 발명의 핵산 구조체는, 예컨대 표준 기술에 따라 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 제조하고 합성 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 혼성화에 의해 단백질의 전부 또는 일부를 암호화하는 DNA 서열을 스크리닝하고(J. Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York 참조) 기술 분야에 공지된 바와 같이 돌연변이를 도입함으로써 얻어지는 적절한 게놈 또는 cDNA 기원일 수 있다.

단백질을 암호화하는 본 발명의 핵산 구조체는 또한 정립된 표준 방법, 예컨대 Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1859-1869 (1981)에 기재된포스포아미디트법, 또는 Matthes et al., EMBO Journal 3, 801-805 (1984)에 설명된 방법에 의해 합성에 의해 제조할 수 있다. 포스포아미디트법에 따르면, 올리고뉴클레오티드는 예컨대 자동 DNA 합성기에서 합성, 정제, 아닐링, 라이게이션 및 적절한 벡터로 복제된다.

또한, 핵산 구조체는 표준 기술에 따라 합성, 게놈 또는 cDNA 기원의 단편을 (적절하게) 결찰함으로써 제조된 혼합 합성 및 게놈, 혼합 합성 및 cDNA 또는 혼합 게놈 및 cDNA 기원일 수 있으며, 단편은 전체 핵산 구조체의 여러 부분에 해당한다.

핵산 구조체는, 예컨대 US 4,683,202 또는 Saiki et al., Science 239, 487-491 (1988)에 설명된 바와 같이 특정 프라이머를 사용하여 폴리머라아제 연쇄반응에 의해 제조될 수 있다.

한 실시형태에서, 핵산 구조체는 DNA 구조체이다.

한 실시형태에서, 본 발명의 핵산 구조체는 핵산 서열을 포함하며, 핵산 서열은 프로테아제 기질 아미노산 서열을 암호화하고, 프로테아제 기질 아미노산 서열은 핵산 구조체에 의해 암호화된 펩티드의 N-말단부로서 발현된다. 한 실시형태에서, 본 발명의 핵산 구조체는 핵산 서열을 포함하고, 핵산 서열은 프로테아제 기질 아미노산 서열을 암호화하고, 프로테아제 기질 아미노산 서열은 핵산 구조체에 의해 암호화된 펩티드의 C-말단부로서 발현된다.

이러한 프로테아제 및 프로테아제 기질 아미노산 서열은 기술 분야에 잘 알려져 있다. 이러한 서열을 보유하는 펩티드를 적합한 환경(프로테아제의 선택에 따름)하에서 적절한 프로테아제로 처리하면, 프로테아제는 프로테아제 및 프로테아제 기질 아미노산 서열에 따른 위치에서 펩티드를 절단할 것이다. 따라서 상기 프로테아제 기질 아미노산 서열의 실제 아미노산 서열은 제조 방침 및 프로테아제의 선택에 따라 다를 것이다.

일부 경우, 프로테아제 처리는 후에 일부 아미노산을 남기고, 이는 원 펩티드에 N- 또는 C-말단 부가로서 생각될 수 있으며, 원 펩티드는 프로테아제 기질 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 부가 전에 핵산에 의해 암호화된 것이다.

한 실시형태에서, 상기 프로테아제는 3C 프로테아제이다. 한 실시형태에서, 상기 프로테아제는 3C 프로테아제이며 적합한 환경하에서 프로테아제 기질 아미노산 서열은 3C 프로테아제로 절단될 수 있다. 한 실시형태에서, 상기 3C 프로테아제 기질 아미노산 서열은 LEVLFQGP이다. 다른 실시형태에서, 3C 프로테아제 기질 아미노산 서열 LEVLFQGP은 원 펩티드의 N-말단에 부착되고, 3C 프로테아제로의 처리는 원 펩티드의 N-말단에 부착된 후 Gly-Pro 디펩티드를 남긴다.

한 실시형태에서, 상기 프로테아제는 엔테로키나아제이다. 한 실시형태에서, 상기 프로테아제는 엔테로키나아제이고 적절한 환경하의 프로테아제 기질 아미노산 서열은 엔테로키나아제로 절단될 수 있다. 다른 실시형태에서, 엔테로키나아제 기질 아미노산 서열은 원 펩티드의 N-말단에 부착되고, 엔테로키나아제로의 처리는 원 펩티드의 N-말단에 부착된 후 Ala-Pro 디펩티드를 남긴다.

예컨대 이것은 mTGase-SL 변이체의 제조에 사용되며, 이때 특정 아미노산이 N-말단에 부가되어 있다.

한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 구조체를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 숙주를 제공한다.

본 발명의 DNA 구조체가 삽입된 재조합 벡터는 재조합 DNA 과정을 용이하게 실시할 수 있는 어떤 벡터가 될 수 있으며, 벡터의 선택은 종종 이것이 도입되는 숙주 세포에 따를 것이다. 따라서, 벡터는 자율 복제 벡터, 즉 복제가 염색체 복제와 독립적인 염색체외 실체로서 존재하는 벡터, 예컨대 플라스미드일 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주 세포 게놈으로 통합되어 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 벡터는 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA 서열이 DNA의 전사에 필요한 추가의 세그먼트에 작동가능하게 연결된 발현 벡터이다. 용어, "작동가능하게 연결된"은 세그먼트가 그들의 의도된 목적과 일치하여 기능하도록, 예컨대 전사가 프로모터에서 시작되고 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 통해 진행하도록 배열된 것을 의미한다. 프로모터는 선택의 숙주 세포에서 전사적 활성을 나타내는 어떤 DNA 서열일 수 있고 숙주 세포와 동종의 또는 이종의 단백질을 암호화하는 유전자로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 또한 필요에 따라 사람 성장 호르몬 종결자(Palmiter et al., op. cit.) 또는 (진균 숙주를 위해) TPI1 (Alber and Kawasaki, op. cit.) 또는 ADH3 (McKnight et al., op. cit.) 종결자와 같은 적절한 종결자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 벡터는 폴리아데닐화 신호(예컨대 SV40 또는 아데노바이러스 5 Elb 영역으로부터), 전사 인핸서 서열(예컨대 SV40 인핸서) 및 전사 인핸서 서열(예컨대 아데노바이러스 VA RNA를 암호화 하는 것)과 같은 요소를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 벡터를 해당 숙주 세포에서 복제할 수 있는 DNA 서열을 더 포함할 수 있다.

벡터는 또한 선택가능한 마커, 예컨대 디히드로폴레이트 리덕타아제(DHFR)를 암호화하는 유전자와 같은 숙주 세포에서 결함을 보완하는 생성물인 유전자, 또는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) TPI 유전자(P. R. Russell, Gene 40, 125-130 (1985)에 설명됨), 또는 약물, 예컨대 암피실린, 카나마이신, 테트라시클린, 클로르암페니콜, 네오마이신, 하이그로마이신 또는 메토트렉사트에 저항성을 부여하는 것을 포함할 수 있다. 사상 진균에 대하여, 선택가능한 마커는 amdS, pyrG, argB, niaD 및 sC를 포함한다.

본 발명의 단백질을 숙주 세포의 분비 경로로 유도하기 위해서, 분비 신호 서열(리더 서열, 프리프로 서열 또는 프리 서열로서 알려짐)이 재조합 벡터에 제공될 수 있다. 분비 신호 서열은 정확한 리딩 프레임에서 단백질은 암호화하는 DNA 서열에 조합된다. 분비 신호 서열은 통상적으로 단백질을 암호화하는 DNA 서열에 대하여 5'에 위치한다. 분비 신호 서열은 일반적으로 단백질과 연관되는 것일 수 있고 또는 또 다른 분비된 단백질을 암호화하는 유전자로부터 유래할 수 있다.

본 단백질, 프로모터 및 선택적으로 종결자 및/또는 분비 신호 서열을 각각 암호화하는 DNA 서열을 결찰하고 이들을 복제에 필요한 정보를 갖는 적절한 벡터로 삽입하는데 사용되는 과정은 당업자에게 잘 알려져 있다(예컨대 Sambrook et al., op.cit. 참조).

본 발명의 DNA 구조체 또는 재조합 벡터가 도입되는 숙주 세포는 본 단백질을 생성할 수 있는 어떤 세포일 수 있으며 세균, 효모, 진균 및 고등 진핵 세포를 포함한다. 그 다음 상술한 변형 또는 트랜스펙션된 숙주 세포를 본 펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 적절한 영양 배지에서 배양하며, 그 후 얻어진 단백질을 배양액으로부터 회수한다.

세포를 배양하는데 사용되는 배지는 미네랄 또는 적절한 첨가물을 함유하는 복합 배지와 같은 숙주 세포를 성장시키는데 적합한 종래의 배지일 수 있다. 적합한 배지는 시판의 공급체로부터 입수가능하거나 공개된 방법에 따라 제조할 수 있다(예컨대 American Type Culture Collection의 카탈로그). 그 다음 세포에 의해 생성된 단백질은 해당 단백질의 종류에 따라 원심분리 또는 여과에 의한 배지로부터 숙주 세포의 분리, 황산암모늄과 같은 염을 사용한 상청액 또는 여과액 내의 단백질성 성분의 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 겔여과 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등과 같은 다양한 크로마토그래피 과정에 의한 정제를 포함하는 종래의 과정에 의해 배양 배지로부터 회수될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 상이한 방식으로 제조될 수 있다. 펩티드는 기술 분야에 알려진 단백질 합성 방법에 의해 제조될 수 있다. 펩티드가 다소 크다면, 이는 조합되는 펩티드의 여러 단편을 합성함으로써 보다 용이하게 행하여 본 발명의 펩티드를 제공할 수 있다. 특정 실시형태에서, 그러나 본 발명의 펩티드는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 핵산 구조체 또는 본 발명의 펩티드로 변형될 수 있는 펩티드를 암호화하는 핵산 구조체를 포함하는 적절한 숙주의 발효에 의해 제조된다.

한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드의 제조방법을 제공하며, 여기서

i) 펩티드의 재조합 발현이 가능한 숙주 세포를 펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 발효하고, 그리고

ii) 단계 i)에서 발현된 펩티드를 포함하는 조성물을 제1 이온 교환 크로마토그래피 단계로서 양이온 교환 크로마토그래피한다.

양이온 교환 크로마토그래피의 사용은 발효 후 제1 크로마토그래피 단계로서 유사한 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 비하여 큰 선택성 및 수율을 제공한다.

선택적으로, ii)로부터의 펩티드를 포함하는 조성물은 각 단계 전후에 또 다른 정제 단계를 실시할 수 있으며, 다만 단계 ii)의 양이온 크로마토그래피는 제1 크로마토그래피 단계이다. 이것이 유일한 크로마토그래피 단계일 수도 있다.

예를 들어, 단계 i)의 배양으로부터의 상청액을 양이온 교환하기 전에 희석 및 pH 조정과 같은 일부 변형을 행할 수 있다. 상청액을 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 배 이상 희석할 수 있고, 양이온 교환 물질의 선택에 따라 또는 당업자에 의해 달리 생각되는 적절한 수단에 의해 pH를 조정할 수 있다.

한 실시형태에서, 단계 ii)에서 설명되는 양이온 교환은 SP Big Beads(GE Healthcare)와 같은 아가로스계 수지 또는 Toyopearl Megacap 2(TosoBioscience)와 같은 폴리머계 수지에서 행한다. 두 예시적인 수지는 강한 양이온 교환 수지이다. 다른 실시형태에서, ii)에서의 양이온 교환 단계를 실시하는 조성물은 pH가 5.2이다.

한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 펩티드의 제조방법을 제공하고, 여기서

a) 펩티드의 재조합 발현이 가능한 숙주 세포를 펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 발효하고, 여기서 상기 숙주 세포는 본 발명의 펩티드를 암호화하는 핵산 구조체를 포함하는 벡터를 포함하고, 상기 핵산 구조체는 또한 핵산 서열을 포함하며, 핵산 서열은 프로테아제 기질 아미노산 서열을 암호화하고, 프로테아제 기질 아미노산 서열은 핵산 구조체에 의해 암호화된 원 펩티드의 N- 또는 C-말단부로서 발현되고, 그리고

b) a)하에서 배양으로부터의 재조합 펩티드를 포함하는 조성물을 프로테아제 기질 아미노산 서열을 절단할 수 있는 프로테아제로 처리한다.

프로테아제 기질 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 이러한 핵산 구조체는 본원에서 설명된다.

한 실시형태에서, 상술한 바와 같이 a)하에서 배양으로부터의 재조합 펩티드를 프로테아제로 처리하기 전에 제1 크로마토그래피 단계로서 양이온 교환 크로마토그래피한다.

한 실시형태에서, 단계 b)에서 프로테아제 처리한 펩티드를 포함하는 조성물을 단계 b) 이후에 제2 양이온 교환 크로마토그래피한다.

한 실시형태에서, 본 발명의 펩티드를 포함하는 얻어진 조성물에 20%의 최종 농도로 에틸렌 글리콜을 첨가한다.

한 실시형태에서, 본 발명은 펩티드를 접합하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 상기 펩티드를 본 발명에 따른 펩티드의 존재하에서 아민 공여체와 반응시키는 것을 포함한다. 한 실시형태에서, 접합되는 펩티드는 성장 호르몬이다. 한 실시형태에서, 펩티드는 hGH 또는 그것의 변이체 또는 유도체이다.

본문에서, 용어 "유도체"는 폴리펩티드, 또는 즉 모체 폴리펩티드에 바람직하게는 생체활성을 갖는 어떤 종류의 분자의 공유 결합에 의해 변형된 그것의 변이체 또는 단편을 의미하도록 의도된다. 대표적인 변형은 아미드, 카르보히드레이트, 알킬기, 아실기, 에스테르, PEG화 등이 있다.

한 실시형태에서, 본 발명은 상술한 바와 같이 성장 호르몬을 접합하는 방법을 제공하며, 여기서 hGH의 위치 Gln-40에 해당하는 위치에서 접합된 hGH의 양에 비한 hGH의 위치 Gln-141에 해당하는 위치에서 접합된 성장 호르몬의 양은, SEQ ID No.2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 본 발명에 따른 펩티드 대신 상기 방법에 사용했을 때 위치 Gln-40에 해당하는 위치에서 접합된 hGH의 양에 비한 hGH의 위치 Gln-141에 해당하는 위치에서 접합된 hGH의 양과 비교하여 현저히 증가한다.

한 실시형태에서, 본 발명은 hGH를 접합하는 방법을 제공하며, 여기서 hGH의 위치 Gln-40에 해당하는 위치에서 접합된 hGH의 양에 비한 hGH의 위치 Gln-141에 해당하는 위치에서 접합된 성장 호르몬의 양은, SEQ ID No.1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 본 발명에 따른 펩티드 대신 상기 방법에 사용했을 때 위치 Gln-40에 해당하는 위치에 접합된 hGH의 양에 비하여 hGH의 위치 Gln-141에 해당하는 위치에서 접합된 hGH의 양과 비교하여 현저히 증가한다.

한 실시형태에서, 본 발명은 위치 141에 해당하는 위치에서 접합된 hGH의 제조방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 본 발명에 따른 펩티드의 존재하에서 아민 공여체와 상기 hGH의 반응을 포함한다.

본 발명에 따른 방법의 한 실시형태에서 접합된 hGH은 페길화된 hGH의 제조에 사용되고, 여기서 상기 페길화는 접합된 위치에서 일어난다.

한 실시형태에서, 본 발명은 상기 hGH 또는 그것의 변이체 또는 유도체를 본 발명에 따른 펩티드의 존재하에서 아민 공여체와 반응시키는 단계를 포함하는, 접합된 성장 호르몬의 약학적 제조 방법을 제공한다. 한 실시형태에서, 성장 호르몬은 hGH 또는 그것의 변이체 또는 유도체이다.

한 실시형태에서, 본 발명은 상기 hGH 또는 그것의 변이체 또는 유도체를 본 발명에 따른 펩티드의 존재하에서 아민 공여체와 반응시키고, 얻어진 접합된 성장 호르몬 펩티드를 페길화된 성장 호르몬의 제조에 사용하는 단계를 포함하는, 페길화된 성장 호르몬의 약학적 제조방법을 제공하며, 여기서 상기 페길화는 접합된 위치에서 일어난다. 한 실시형태에서, 성장 호르몬은 hGH 또는 그것의 변이체 또는 유도체이다. 한 실시형태에서, 페길화된 성장 호르몬은 위치 Gln141에서 페길화된 hGH이다. 한 실시형태에서, 페길화된 성장 호르몬은 WO2006/134148에 설명된 페길화된 성장 호르몬이다.

한 실시형태에서, 본 발명은 접합된 성장 호르몬의 제조에서 본 발명에 따른 펩티드의 사용을 제공한다. 한 실시형태에서, 성장 호르몬은 hGH 또는 그것의 변이체 또는 유도체이다. 한 실시형태에서, 성장 호르몬은 hGH 내의 위치 Gln141에 해당하는 위치에 접합된다.

한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 방법의 사용에 의해 제조된 약학적 조제품을 그것을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 성장 호르몬의 부족과 관련된 질환 또는 장애의 치료방법을 제공하며, 여기서 접합되는 펩티드는 성장 호르몬이다. 한 실시형태에서, 환자에서 성장 호르몬의 부족과 관련된 질환 또는 장애는 성장 호르몬 결핍증 (GHD); 터너 증후군; 프래더-윌리 증후군(PWS); 누난 증후군; 다운 증후군; 만성 신장 질환, 소아 류마티스 관절염; 낭포성 섬유증, HAART 치료를 받은 소아에서 HIV-감염(소아 HIV/HALS); 부당 경량아(SGA); 극저출생시 저체중아(VLBW)로서 SGA가 아닌 것; 골격 형성장애; 연골형성저하증; 연골무형성증; 특발성 저신장(ISS); 성인에서의 GHD; 긴뼈, 예컨대 경골, 비골, 대퇴골, 상박골, 요골, 척골, 쇄골, 마타카피아(matacarpea), 마타타시아(matatarsea) 및 손가락뼈 내부 또는 이러한 뼈의 골절; 스폰지성 뼈, 예컨대 두개골, 손바닥뼈, 발바닥뼈 내부 또는 이러한 뼈의 골절; 예를 들면, 손, 무릎, 또는 어깨의 힘줄이나 인대 수술 후의 환자; 정신착란 골형성을 앓거나 진행중인 환자; 골반 또는 디스크 교체, 관절반달 교체, 척수 융합 또는 인공삽입물 고정, 예컨대 무릎, 골반, 어깨, 팔꿈치, 허리 또는 턱과 같은 곳에서의 고정 후의 환자; 조골 물질, 예컨대 못, 나사 및 판이 고정된 환자; 골절 후 교합이 되지 않았거나 잘못 교합된 환자; 골종, 예컨대 경골이나 첫번째 발가락 뼈의 골종 후의 환자; 그래프트 이식 후의 환자; 외상이나 관절염 유발성 무릎내 관절 연골의 퇴화; 터너증후군을 가진 환자에서 골다공증; 남성 골다공증; 성인 만성 투석 환자(APCD); APCD에서 영양결핍성 혈관 질병; APCD에서 카켁시아의 반복; APCD에서 암; APCD에서 만성 폐질환; APCD에서 HIV; APCD를 앓는 노인; APCD에서 만성 간 질환, APCD에서 피로 증후군; 크론병; 간기능손상; HIV 감염된 남성; 작은창자 증후군; 중추 비만; HIV-관련 지방이상 증후군(HALS); 남성 불임; 주요 예정 수술 후의 환자, 알콜/약물 탈독소 또는 신경 외상; 노화; 허약한 노인; 뼈관절염; 외상으로 손상입은 연골; 발기부전; 섬유근육통; 기억 이상; 우울증; 뇌 외상; 척수 외상; 거미막하부 출혈; 매우 낮은 출생시 체중; 대사증후군; 글루코르티코이드 근육병증; 또는 소아에서 글루코코르티코이드 치료로 인한 저신장증에서 선택된다.

하기는 본 발명의 실시형태의 목록이며, 이 목록이 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않는다:

실시형태 1 : SEQ ID No. 1 내의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열은 SEQ ID No. 1의 아미노산 잔기 Tyr62, Tyr75 및 Ser250에 대한 위치 중 하나 이상에서 변형된 분리된 펩티드.

실시형태 2: SEQ ID No. 1 내의 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열은 SEQ ID No. 1의 아미노산 잔기 Tyr62, Tyr75 및 Ser250에 해당하는 위치 중 하나 이상에서 변형된 실시형태 1에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 3: SEQ ID No. 1 내의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열은 SEQ ID No. 1의 아미노산 잔기 Tyr62, Tyr75 및 Ser250에 해당하는 위치 중 하나 이상에서 변형된 실시형태 2에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 4: SEQ ID No. 1 내의 아미노산 서열과 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열은 SEQ ID No. 1의 아미노산 잔기 Tyr62, Tyr75 및 Ser250에 해당하는 위치 중 하나 이상에서 변형된 실시형태 3에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 5: SEQ ID No. 1에 정의된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열은 SEQ ID No. 1의 아미노산 잔기 Tyr62, Tyr75 및 Ser250에 해당하는 위치 중 하나 이상에서 변형된 실시형태 4에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 6: 상기 아미노산 서열이 Tyr62에 해당하는 위치에서 변형되고, 변형은 Tyr과 상이한 아미노산 잔기로 원 티로신 잔기의 치환으로 구성된, 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 7: Tyr62에 해당하는 위치에서 아미노산 잔기의 변형은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, 및 Val에서 선택된 아미노산 잔기로 원 티로신 잔기의 치환으로 구성된, 실시형태 6에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 8: Tyr62에 해당하는 위치에서 Tyr는 His, Met, Asn, Val, Thr, 및 Leu에서 선택된 아미노산 잔기로 치환된, 실시형태 7에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 9: Tyr62에 해당하는 위치에서 Tyr가 His로 치환된, 실시형태 8에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 10: Tyr62에 해당하는 위치에서 Tyr가 Val로 치환된, 실시형태 8에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 11 : Tyr62에 해당하는 위치에서 Tyr가 Met, Asn, Thr, 및 Leu에서 선택된 아미노산 잔기로 치환된, 실시형태 8에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 12: Tyr62에 해당하는 위치에서 Tyr가 Met로 치환된, 실시형태 8에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 13: Tyr62에 해당하는 위치에서 Tyr가 Asn로 치환된, 실시형태 8에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 14: Tyr62에 해당하는 위치에서 Tyr가 Thr로 치환된, 실시형태 8에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 15: Tyr62에 해당하는 위치에서 Tyr가 Leu로 치환된, 실시형태 8에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 16: 상기 아미노산 서열은 Tyr75에 해당하는 위치에서 변형되고, 변형은 Tyr과 상이한 아미노산 잔기로 원 티로신 잔기의 치환으로 구성된 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 17: Tyr75에 해당하는 위치에서 아미노산 잔기의 변형은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, 및 Val에서 선택된 아미노산 잔기로 원 티로신 잔기의 치환으로 구성된, 실시형태 16에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 18: Tyr75에 해당하는 위치에서 Tyr은 Ala, Phe, Asn, Met, Leu, 또는 Cys로 치환된, 실시형태 17에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 19: Tyr75에 해당하는 위치에서 Tyr은 Phe로 치환된, 실시형태 18에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 20: Tyr75에 해당하는 위치에서 Tyr은 Asn로 치환된, 실시형태 18에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 21 : Tyr75에 해당하는 위치에서 Tyr은 Ala, Met, Leu, 또는 Cys로 치환된, 실시형태 18에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 22: Tyr75에 해당하는 위치에서 Tyr은 Ala로 치환된, 실시형태 21에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 23: Tyr75에 해당하는 위치에서 Tyr은 Met로 치환된, 실시형태 21에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 24: Tyr75에 해당하는 위치에서 Tyr은 Leu로 치환된, 실시형태 21에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 25: Tyr75에 해당하는 위치에서 Tyr은 Cys로 치환된, 실시형태 21에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 26: 상기 아미노산 서열은 Ser250에 해당하는 위치에서 변형되고, 변형은 Ser와 상이한 아미노산 잔기로 원 세린 잔기의 치환으로 구성된, 실시형태 1 내지 25 중 어느 하나에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 27: Ser250에 해당하는 위치에서 아미노산 잔기의 변형은 Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr, 및 Val에서 선택된 아미노산 잔기로 원 세린 잔기의 치환으로 구성된, 실시형태 26에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 28: Ser250에 해당하는 위치에서 아미노산 잔기의 변형은 Ala, Arg, Asp, Cys, Gln, Gly, His, Leu, Met, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr, 및 Val에서 선택된 아미노산 잔기로 원 세린 잔기의 치환으로 구성된, 실시형태 27에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 29: Ser250에 해당하는 위치에서 아미노산 잔기의 변형은 Gly로 원 세린 잔기의 치환으로 구성된, 실시형태 27에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 30: Ser250에 해당하는 위치에서 아미노산 잔기의 변형은 Cys, Leu, Pro, Trp, Tyr, 및 Val에서 선택된 아미노산 잔기로 원 세린 잔기의 치환으로 구성된, 실시형태 27에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 31 : 상기 Ser250은 Cys로 치환된, 실시형태 30에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 32: 상기 Ser250은 Leu로 치환된, 실시형태 30에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 33: 상기 Ser250은 Pro로 치환된, 실시형태 30에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 34: 상기 Ser250은 Trp로 치환된, 실시형태 30에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 35: 상기 Ser250은 Tyr로 치환된, 실시형태 30에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 36: 상기 Ser250은 Val로 치환된, 실시형태 30에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 37: 상기 아미노산 서열은 N-말단에서 1개 내지 10개의 아미노산 잔기의 부가에 의해 변형된, 실시형태 1 내지 36 중 어느 하나에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 38: 상기 아미노산 서열은 N-말단에서 1개 내지 9개 아미노산의 부가에 의해 변형된, 실시형태 37에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 39: 상기 서열은 N-말단에서 1개 내지 8개 아미노산의 부가에 의해 변형된, 실시형태 38에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 40: 상기 서열은 N-말단에서 1개 내지 7개 아미노산의 부가에 의해 변형된, 실시형태 39에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 41: 상기 서열은 N-말단에서 1개 내지 6개 아미노산의 부가에 의해 변형된, 실시형태 40에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 42: 상기 서열은 N-말단에서 1개 내지 5개 아미노산의 부가에 의해 변형된, 실시형태 41에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 43: 상기 서열은 N-말단에서 1개 내지 4개 아미노산의 부가에 의해 변형된, 실시형태 42에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 44: 상기 서열은 N-말단에서 1개 내지 3개 아미노산의 부가에 의해 변형된, 실시형태 43에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 45: 상기 서열은 N-말단에서 1개 내지 2개 아미노산의 부가에 의해 변형된, 실시형태 44에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 46: 상기 서열은 N-말단에서 1개 아미노산의 부가에 의해 변형된, 실시형태 45에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 47: 상기 서열은 N-말단에서 Met의 부가에 의해 변형된, 실시형태 46에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 48: 상기 서열은 N-말단에서 2개 내지 9개 아미노산의 부가에 의해 변형된, 실시형태 37에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 49: 상기 서열은 N-말단에서 2개 내지 8개 아미노산의 부가에 의해 변형된, 실시형태 48에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 50: 상기 서열은 N-말단에서 2개 내지 7개 아미노산의 부가에 의해 변형된, 실시형태 49에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 51 : 상기 서열은 N-말단에서 2개 내지 6개 아미노산의 부가에 의해 변형된, 실시형태 50에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 52: 상기 서열은 N-말단에서 2개 내지 5개 아미노산의 부가에 의해 변형된, 실시형태 51에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 53: 상기 서열은 N-말단에서 2개 내지 4개 아미노산의 부가에 의해 변형된, 실시형태 52에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 54: 상기 서열은 N-말단에서 2개 내지 3개 아미노산의 부가에 의해 변형된, 실시형태 53에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 55: 상기 서열은 N-말단에서 2개 아미노산의 부가에 의해 변형된, 실시형태 54에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 56: 부가된 디펩티드 라디칼은 Gly-Pro-인, 실시형태 55에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 57: 부가된 디펩티드 라디칼은 Ala-Pro-인, 실시형태 55에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 58: 펩티드가 트랜스글루타미나아제 활성을 갖는, 실시형태 1 내지 55 중 어느 하나에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 59: 펩티드가 hGH의 Gln-40에 비하여 hGH의 Gln-141에 대한 특이성을 갖고, 이는 SEQ ID No. 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 hGH의 Gln-40에 비하여 hGH의 Gln-141에 대한 특이성 보다 큰, 실시형태 58에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 60: 펩티드가 hGH의 Gln-40에 비하여 hGH의 Gln-141에 대한 특이성을 갖고, 이는 SEQ ID No. 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 hGH의 Gln-40에 비하여 hGH의 Gln-141에 대한 특이성 보다 큰, 실시형태 58에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 61: 펩티드가 트랜스글루타미나아제 활성을 갖는, 실시형태 56 또는 실시형태 57에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 62: 펩티드가 hGH의 Gln-40에 비하여 hGH의 Gln-141에 대한 특이성을 갖고, 이는 SEQ ID No. 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 hGH의 Gln-40에 비하여 hGH의 Gln-141에 대한 특이성 보다 큰, 실시형태 61에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 63: 펩티드가 hGH의 Gln-40에 비하여 hGH의 Gln-141에 대한 특이성을 갖고, 이는 SEQ ID No. 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 hGH의 Gln-40에 비하여 hGH의 Gln-141에 대한 특이성 보다 큰, 실시형태 61에 따른 분리된 펩티드.

실시형태 64: 실시형태 1 내지 63 중 어느 하나에 따른 펩티드를 암호화하는 핵산 구조체.

실시형태 65: 상기 핵산 구조체가 핵산 서열을 포함하며, 핵산 서열은 프로테아제 기질 아미노산 서열을 암호화하고, 프로테아제 기질 아미노산 서열은 핵산 구조체에 의해 암호화된 실시형태 1 내지 63 중 어느 하나에 따른 펩티드의 N-말단부로서 발현된, 실시형태 64에 따른 핵산 구조체.

실시형태 66: 상기 핵산 구조체가 핵산 서열을 포함하며, 핵산 서열은 프로테아제 기질 아미노산 서열을 암호화하고, 프로테아제 기질 아미노산 서열은 핵산 구조체에 의해 암호화된 실시형태 1 내지 63 중 어느 하나에 따른 펩티드의 C-말단부로서 발현되는, 실시형태 64에 따른 핵산 구조체.

실시형태 67: 적합한 조건 하의 상기 프로테아제 기질 아미노산 서열은 3C 프로테아제에 의해 분리될 수 있는, 실시형태 65 또는 실시형태 66에 따른 핵산 구조체.

실시형태 68: 상기 프로테아제 기질 아미노산 서열은 LEVLFQGP인, 실시형태 67에 따른 핵산 구조체.

실시형태 69: 적합한 조건 하의 상기 프로테아제 기질 아미노산 서열은 엔테로키나아제에 의해 절단될 수 있는, 실시형태 65에 따른 핵산 구조체.

실시형태 70: 실시형태 64에 따른 핵산을 포함하는 벡터.

실시형태 71: 실시형태 65 내지 69 중 어느 하나에 따른 핵산을 포함하는 벡터.

실시형태 72: 실시형태 70의 벡터를 포함하는 숙주 세포.

실시형태 73: 실시형태 1 내지 63 중 어느 하나에 따른 펩티드를 포함하는 조성물.

실시형태 74: i) 팹티드의 재조합 발현이 가능한 숙주 세포를 펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하고, 그리고

ii) 단계 i)하에서 배양으로부터의 재조합 펩티드를 포함하는 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피한 후 어떤 또 다른 이온 교환 크로마토그래피하는, 실시형태 1 내지 63 중 어느 하나에 따른 펩티드의 제조방법.

실시형태 75: 단계 ii)에서 양이온 교환 크로마토그래피는 SP Big Beads 또는 Toyopearl Megacap 2에서 선택된 수지에서 행하는, 실시형태 74에 따른 방법.

실시형태 76: a) 펩티드의 재조합 발현이 가능한 숙주 세포를 펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하고, 상기 숙주 세포는 실시형태 71에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포이고, 그리고

b) a)하에서 발현으로부터의 재조합 펩티드를 포함하는 조성물을 프로테아제 기질 아미노산 서열을 절단할 수 있는 프로테아제로 처리하는, 실시형태 1 내지 63 중 어느 하나에 따른 펩티드의 제조방법.

실시형태 77: a)하에서 배양으로부터의 재조합 펩티드를 단계 b)에 설명한 바와 같이 프로테아제로의 처리 이전에 양이온 교환 크로마토그래피하는, 실시형태 76에 따른 방법.

실시형태 78: 단계 ii)에서 양이온 교환 크로마토그래피는 SP Big Beads 또는 Toyopearl Megacap 2에서 선택된 수지에서 행하는, 실시형태 77에 따른 방법.

실시형태 79: 단계 b)에서 프로테아제 처리된 펩티드를 포함하는 조성물을 단계 b) 후 제2 양이온 교환 크로마토그래피하는, 실시형태 76 또는 실시형태 78에 따른 방법.

실시형태 80: 펩티드를 포함하는 얻어진 조성물에 에틸렌 글리콜을 20%의 총량으로 첨가하는, 실시형태 74 내지 79 중 어느 하나에 따른 방법.

실시형태 81 : 상기 방법은 상기 펩티드를 실시형태 1 내지 63 중 어느 하나에 따른 펩티드의 존재하에서 아민 공여체와 반응시키는 것을 포함하는, 펩티드의 접합방법.

실시형태 82: 상기 접합되는 펩티드는 성장 호르몬인, 실시형태 81에 따른 펩티드의 접합방법.

실시형태 83: 상기 성장 호르몬은 hGH 또는 그것의 변이체 또는 유도체인, 실시형태 82에 따른 방법.

실시형태 84: hGH의 위치 Gln-40에 해당하는 위치에 접합된 hGH의 양에 비하여 hGH의 위치 Gln-141에 해당하는 위치에서 접합된 성장 호르몬의 양이, SEQ ID No.2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 실시형태 1 내지 63 중 어느 하나에 따른 펩티드 대신 상기 방법에 사용했을 때 위치 Gln-40에 해당하는 위치에서 접합된 hGH의 양에 비하여 hGH의 위치 Gln-141에 해당하는 위치에서 접합된 hGH의 양과 비교하여 현저히 증가된, 실시형태 83에 따른 성장 호르몬을 접합하는 방법.

실시형태 85: hGH의 위치 Gln-40에 해당하는 위치에 접합된 hGH의 양에 비하여 hGH의 위치 Gln-141에 해당하는 위치에서 접합된 성장 호르몬의 양이, SEQ ID No.1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 실시형태 1 내지 63 중 어느 하나에 따른 펩티드 대신 상기 방법에 사용했을 때 위치 Gln-40에 해당하는 위치에서 접합된 hGH의 양에 비하여 hGH의 위치 Gln-141에 해당하는 위치에서 접합된 hGH의 양과 비교하여 현저히 증가된, 실시형태 81에 따른 성장 호르몬을 접합하는 방법.

실시형태 86: 상기 방법은 상기 hGH를 실시형태 1 내지 63 중 어느 하나에 따른 펩티드의 존재하에서 아민 공여체와 반응시키는 것을 포함하는, 위치 141에 해당하는 위치에서 접합된 hGH의 제조방법.

실시형태 87: 접합된 hGH를 페길화된 hGH의 제조에 사용하고, 상기 페길화는 접합된 위치에서 발생하는, 실시형태 81 내지 86 중 어느 하나에 따른 방법.

실시형태 88: 상기 hGH 또는 그것의 변이체 또는 유도체를 실시형태 1 내지 63 중 어느 하나에 따른 펩티드의 존재하에서 아민 공여체와 반응시키는 단계를 포함하는, 접합된 성장 호르몬의 약학적 제조방법.

실시형태 89: 상기 성장 호르몬은 hGH 또는 그것의 변이체 또는 유도체인, 실시형태 88에 따른 방법.

실시형태 90: 상기 hGH 또는 그것의 변이체 또는 유도체를 실시형태 1 내지 63 중 어느 하나에 따른 펩티드의 존재하에서 아민 공여체와 반응시키고, 페길화된 성장 호르몬의 제조에 접합된 성장 호르몬 펩티드를 사용하는 단계를 포함하고, 상기 페길화는 접합된 위치에서 일어나는, 페길화된 성장 호르몬의 약학적 제조방법.

실시형태 91 : 상기 성장 호르몬은 hGH 또는 그것의 변이체 또는 유도체인 실시형태 90에 따른 방법.

실시형태 92: 페길화된 성장 호르몬은 위치 Gln141에서 페길화된 hGH인, 실시형태 91에 따른 방법.

실시형태 93: 접합된 성장 호르몬의 제조에서 실시형태 1 내지 63 중 어느 하나에 따른 펩티드의 사용.

실시형태 94: 성장 호르몬은 hGH 또는 그것의 변이체 또는 유도체인 실시형태 93에 따른 사용.

실시형태 95: 성장 호르몬이 hGH에서 위치 Gln141에 해당하는 위치에서 접합된, 실시형태 93 또는 실시형태 94에 따른 사용.

실시형태 96: 실시형태 88 내지 92 중 어느 하나에 따른 방법의 사용에 의해 제조된 약학적 조제품을 그것을 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 성장 호르몬의 부족과 관련된 질환 또는 장애의 치료방법.

실시형태 97: 환자에서 성장 호르몬의 부족과 관련된 질환 또는 장애는 성장 호르몬 결핍증 (GHD); 터너 증후군; 프래더-윌리 증후군(PWS); 누난 증후군; 다운 증후군; 만성 신장 질환, 소아 류마티스 관절염; 낭포성 섬유증, HAART 치료를 받은 소아에서 HIV-감염(소아 HIV/HALS); 부당 경량아(SGA); 극저출생시 저체중아(VLBW)로서 SGA가 아닌 것; 골격 형성장애; 연골형성저하증; 연골무형성증; 특발성 저신장(ISS); 성인에서의 GHD; 긴뼈, 예컨대 경골, 비골, 대퇴골, 상박골, 요골, 척골, 쇄골, 마타카피아(matacarpea), 마타타시아(matatarsea) 및 손가락뼈 내부 또는 이러한 뼈의 골절; 스폰지성 뼈, 예컨대 두개골, 손바닥뼈, 발바닥뼈 내부 또는 이러한 뼈의 골절; 예를 들면, 손, 무릎, 또는 어깨의 힘줄이나 인대 수술 후의 환자; 정신착란 골형성을 앓거나 진행중인 환자; 골반 또는 디스크 교체, 관절반달 교체, 척수 융합 또는 인공삽입물 고정, 예컨대 무릎, 골반, 어깨, 팔꿈치, 허리 또는 턱과 같은 곳에서의 고정 후의 환자; 조골 물질, 예컨대 못, 나사 및 판이 고정된 환자; 골절 후 교합이 되지 않았거나 잘못 교합된 환자; 골종, 예컨대 경골이나 첫번째 발가락 뼈의 골종 후의 환자; 그래프트 이식 후의 환자; 외상이나 관절염 유발성 무릎내 관절 연골의 퇴화; 터너증후군을 가진 환자에서 골다공증; 남성 골다공증; 성인 만성 투석 환자(APCD); APCD에서 영양결핍성 혈관 질병; APCD에서 카켁시아의 반복; APCD에서 암; APCD에서 만성 폐질환; APCD에서 HIV; APCD를 앓는 노인; APCD에서 만성 간 질환, APCD에서 피로 증후군; 크론병; 간기능손상; HIV 감염된 남성; 작은창자 증후군; 중추 비만; HIV-관련 지방이상 증후군(HALS); 남성 불임; 주요 예정 수술 후의 환자, 알콜/약물 탈독소 또는 신경 외상; 노화; 허약한 노인; 뼈관절염; 외상으로 손상입은 연골; 발기부전; 섬유근육통; 기억 이상; 우울증; 뇌 외상; 척수 외상; 거미막하부 출혈; 매우 낮은 출생시 체중; 대사증후군; 글루코르티코이드 근육병증; 또는 소아에서 글루코코르티코이드 치료로 인한 저신장증에서 선택된, 실시형태 96에 따른 방법.

본원에 인용된 공개문헌, 특허출원, 및 등록특허를 포함하는 모든 참조문헌은 본원에 전원이 참조로서 포함되는 것이고, 본원에서 달리 이루어진 특정 문서의 별도로 제공되는 조합인지에 관계없이, 그 전체로서 본원에(법에 의해 최대한 허용되는 바에 따라), 개별적으로 그리고 구체적으로 지시된 바와 같은 동일한 정도로 포함된다.

본 발명을 설명하는 내용에서 용어 "하나" 및 "하나의" 및 "그" 및 유사한 표현의 사용은, 본 명세서에서 달리 지적하거나 명백하게 반대되는 언급을 하지 않은 한, 단수 및 복수 형태 모두를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 예를 들어, "화합물"은 달리 지적하지 않은 한, 기술하는 특정 구체예, 또는 본 발명의 각종 "화합물들"을 언급하는 것으로 이해되어야 한다.

달리 지적하지 않은 한, 본원에 제공된 모든 정확한 수치는 대략적인 수치에 해당하는 값의 대표값이다(예를 들면, 특정한 인자 또는 측정에 대해 제공된 모든 정확한 실험적 수치는, 적당한 경우 "약"이 붙여진, 해당하는 대략적인 측정값으로 간주될 수도 있다).

본 발명의 어떤 양태 또는 양태들의 본원에서의 설명은, 성분이나 성분들과 관련하여 "포함하는", "갖는", "포함하는", 또는 "함유하는"과 같은 용어를 사용하는데, 이것은 달리 언급하지 않거나 명백히 반대되는 언급을 하지 않은 한, 특정 성분 또는 성분들로 "구성되고", "필수적으로 구성되고", 또는 "실질적으로 포함하는" 본 발명의 유사한 양태를 뒷받침하기 위해 제공되는 것이다(예를 들면, 특정 성분을 포함하는 것으로 본원에 기술된 조성물은, 달리 언급하지 않거나 명백히 반대되는 언급을 하지 않는 한, 그 성분으로 구성되는 조성물을 기술하는 것으로서 이해되어야 한다).

실시예 1

GlyPro-TGase 형태의 프로펩티드-mTGase의 클로닝 및 돌연변이 발생

스트렙토베르티실리움 라다카눔 ATCC27441로부터의 TGase

S. 라다카눔으로부터의 프로펩티드-mTGase의 서열(프로펩티드-mTGase는 펩티드이며, E. coli과 같은 또 다른 유기체에서 S. 라다카눔으로부터의 TGase를 암호화하는 DNA의 발현의 결과임)을 SEQ ID No.3에 나타낸다. 프로펩티드-부분은 SEQ ID No. 3의 aa 1-49이며 서열의 나머지는 SEQ ID No. 1에 나타낸 성숙한 mTGase이다. 성숙한 mTGase 부분(SEQ ID No. 1)은 도 1에 나타낸 S. 모바라엔시스 (SEQ ID No. 2)로부터의 mTGase의 것에 대하여 93.4% 동일성을 갖는다.

3C-프로테아제 서열 LEVLFQGP (3C)을 프로펩티드-도메인 (SEQ ID No. 3의 aa 1-49)과 S. 라다카눔의 프로펩티드-TGase의 성숙한 mTGase 도메인 사이에 클로닝하였다. 3C-프로테아제는 LEVLFQGP 부위의 Q와 G 사이를 특이적으로 절단하고, 성숙한 mTGase(SEQ ID No. 1에 나타냄)의 N-말단에 부가되는 2개의 추가적 아미노산 잔 기, Gly-Pro가 얻어진다. E. coli에서 발현을 위해서, Met-프로펩티드-(3C)-mTGase를 암호화하는 DNA를 pET39b (Novagen) 발현 벡터의 Ndel과 BamHI 부위 사이에 복제하고 발현을 위해 E. coli BL21 (DE3)로 전달하였다. S. 라다카눔으로부터 프로펩티드-(3C)-mTGase의 서열은 SEQ ID No. 6에서 볼 수 있다.

QuikChange 부위-지정 돌연변이 생성 키트(Stratagene)를 사용하여 부위-지정 돌연변이 생성을 행하였다. 예컨대, PCR에서 주형으로서 프로펩티드-(3C)-mTGase 서열을 암호화하는 DNA를 사용하여 Y75A, Y75F, Y62H_Y75N 및 Y62H_Y75F의 돌연변이(SEQ ID No.1의 넘버링을 사용)가 발생되었다.

실시예 2

음이온 크로마토그래피를 사용한 N-말단 아미노산 잔기 부가된 TGase 돌연변이의 제조

GlyPro-mTGase의 제조

pET39b_Met-프로펩티드-(3C)-mTGase-SL/E. coli BL21 (DE3) 세포를 30℃에서 30 ㎍/ml 카나마이신 보충된 LB 배지에서 광학 밀도 0.4로 배양하고, 세포를 0.1 mM IPTG로 또 다른 4h 시간 동안 유도하였다. 원심분리에 의해 세포 펠릿을 수확하였다.

세포 펠릿으로부터의 가용성 분획을 추출하고 음이온 교환, Q-세파로스 HP, 컬럼으로 정제하여 순수한 프로펩티드-(3C)-mTGase 단백질을 얻었다. 그 다음 이 단백질을 프로펩티드-(3C)-mTGase 단백질에 대하여 1:100 (w/w) 비율로 3C-프로테아제(폴리오바이러스로부터)를 사용하여 20℃에서 밤새 분해시켰다. 분해 혼합물을 양이온-교환 컬럼, SP 세파로스 HP/Source 3OS으로 활성 mTGase을 위해 더 정제하였고, 이는 TGase 활성 분석에 의해 확인된다.

AlaPro-mTGase의 제조

프로펩티드의 소화를 3C 프로테아제 대신 엔테로키나아제(EK)로 행하는 것을 제외하고, GlyPro-mTGase와 유사한 방식으로 AlaPro-mTGase를 생성하였다. 간단히 말하면, 스트렙토마이세스 모바라엔시스로부터의 프로펩티드-mTGase를 E. coli에서 발현하고, 가용성 분획에서 확인하였다. 프로펩티드-mTGase를 Q 세파로스 HP 이온 교환 크로마토그래피에서 정제하고, EK로 소화시켜서 AlaPro-mTGase를 제공하였다. 그 다음, AlaPro-mTGase를 SP 세파로스 HP 이온 교환 컬럼에서 더 정제하였다.

S. 라다카눔으로부터의 mTGase의 선택성에 대한 상이한 N-말단의 엑스트라 서열의 효과를 비교하기 위해서, S. 라다카눔으로부터의 Met-mTGase 형태의 mTGase, AlaPro-mTGase 및 야생형 mTGase을 분리하여 복제하고, 발현하고, 정제하였다.

상술한 EK로부터 발생한 S. 모바라엔시스로부터의 AlaPro-mTGase와 비교하여, GlyPro-mTGase-SL의 발생은 프로펩티드-3C-mTGase-SL로부터 3C-프로테아제(폴리오바이러스로부터) 분해에 의해 진행되었으며, 이는 EK 분해를 사용한 것 보다 개선된 회수율로 보다 특이적이다.

실시예 3

양이온 크로마토그래피를 사용한 N-말단 아미노산 잔기 부가된 TGase 돌연변이의 정제

GE Healthcare로부터의 AKTA 기술을 사용하여, GlyPro-mTGase (Tyr62His,Tyr75Phe)의 제조품을 양이온 교환 컬럼에서 정제하였다.

사용된 컬럼은 ToyoPearl MegaCap2 및 SP Sepharose BB, 실온에서 직경 11 mm, 높이 200 mm, 체적 19,0 ml이었다.

단계/흐름	버퍼
평형 흐름: 6 cv/h~2 ml/분	A:25 mM NaAcetat, pH 5,2 5 SV
적용 ____ ml 6x 희석	Konc: 280 mg/L 첨가된 H₂O: 4부 첨가된 평형 버퍼: 1부 pH 5,2까지 0,1 M HCl로 천천히 pH 조정 최종 농도: 0,03 mg/ml.
린스	A:25 mM NaAcetat, pH 5,2 6 SV
용리	A:25 mM NaAcetat, pH 5,2 B:25 mM NaAcetat, 0,5 M NaCl, pH 5,2 0-100% B 20 SV 이상
풀 체적:	8 ml 분획
Reg1	1 N NaOH 5 SV
재평형	A:25 mM NaAcetat, pH 5,2 >5 SV

컬럼 물질	샘플	Antal ml	강도 mg/ml	순도 %	총 mg	수율 %
Toyopearl MegaCap II	어플리케이션	1500	0,008 (0,03)	26,24	12,0 (45)
Toyopearl MegaCap II	런-스루 어플리케이션	1500	0,001	12,45	1,5
Toyopearl MegaCap II	풀 1	80	0,417	85,97	33,36	(74%)
SP Sepharose BB	어플리케이션	1500	0,08 (0,03)	35,04	12,0 (45)
SP Sepharose BB	gennemlØb appl	1500	0,001	7,14	1,5
SP Sepharose BB	p1 F6-F9	32	0,038	20,52	1,2
SP Sepharose BB	p1 F10-F18	72	0,587	73,01	42,26	(94%)

실시예 4

양이온 크로마토그래피를 사용한 N-말단 아미노산 잔기 부가된 TGase 돌연변이의 제조

GlyPro-mTGase(Tyr62His, Tyr75Phe)의 제조

pET39b_Met-프로펩티드-(3C)-mTGase-SL Tyr62His,Tyr75Phe/E. coli BL21 (DE3) 세포를 30℃에서 30 ㎍/ml 카나마이신 보충된 LB 배지에서 광학 밀도 0.4로 배양하고, 세포를 0.1 mM IPTG로 또 다른 4h 시간 동안 유도하였다. 원심분리에 의해 세포 펠릿을 수확하였다.

세포 펠릿으로부터의 가용성 분획을 추출하고 실시예에 설명한 바와 같이 양이온 교환으로 정제하여 순수한 프로펩티드-(3C)-mTGase 단백질을 얻었다. 그 다음 이 단백질을 프로펩티드-(3C)-mTGase 단백질에 대하여 1:100 (w/w) 비율로 3C-프로테아제(폴리오바이러스로부터)를 사용하여 20℃에서 밤새 분해시켰다. 분해 혼합물을 양이온-교환 컬럼, SP 세파로스 HP/Source 3OS으로 활성 mTGase을 위해 더 정제하고, 정제된 mTGase에 20% 농도로 에틸렌 글리콜을 첨가하였다.

실시예 5

고선택성 변이체에 대한 스크리닝 분석 - S. 라다카눔으로부터 mTGase의 선택성에 대한 N-말단 엑스트라 서열의 효과를 평가하는데 사용되는 속도론 방법

hGHQ40N 및 hGHQ141N의 제조

부위-지정 돌연변이 생성에 의해 hGH 돌연변이 hGHQ40N 및 hGHQ141N를 구성하였다. 이들을 N-말단의 4개 추가의 아미노산 잔기와 함께 E. coli에서 MEAE-hGHQ40N 및 MEAE-hGHQ141N로서 발현하고, 야생형 재조합 hGH과 동일한 방식으로 정 제하였다. 간단히 말해서, 가용성 MEAE-hGH 돌연변이를 Q Sepharose XL 크로마토그래피로 조 E. coli 용해물로부터 회수한 다음, 페닐 세파로스 FF로 더 정제하였다. 부분 정제된 MEAE-hGH 돌연변이를 DAP-1 효소로 42℃에서 1시간 동안 소화시켜서 N-말단에서 MEAE를 제거하였다. 마지막으로, hGH 돌연변이를 38% 냉각 에탄올로 석출한 다음, 7M 우레아에 용해하고, Source 30 Q 컬럼으로 정제하였다

속도론적 반응

200 mM NaCl, 50 uM hGHQ141N 또는 hGHQ40N, 100 uM 단실-카다베린 (DNC, Fluka)을 함유하는 200 μl Tris-HCl 버퍼, 20 mM, pH 7.4에서 속도론적 반응을 행하였다. 2 ㎍ mTGase를 첨가함으로써 반응을 시작하고 26℃에서 실행하였다. 1시간 동안 20초 마다 Ex/Em: 340/520 nm에서 형광을 모니터하였다. 0-2000초 사이에서 수집한 데이터를 사용하여 진행 곡선을 2차 다항식으로 피팅하여 기울기를 얻었다. 피팅 계산은 초기 시간 범위(0-2000초)에서 얻어진 데이터에 기초하며, 이때 진행 곡선의 기울기는 선형이고 역반응은 비교적 미세하다.

실시예 6

TGase 돌연변이의 고선택성을 확인하기 위한 모세관 전기영동:

hGH의 트랜스글루타미네이션 반응

아민 공여체로서 1,3-디아미노-프로판올을 사용하여 트랜스글루타미네이션 반응을 행하였다. TGase 단백질의 첨가에 의해 반응을 시작하고 실온에서 2h 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 시간 간격(15-30분)으로 취하고, 액체 질소로 냉각하고 CE에 의한 전환율 및 선택성의 분석을 위해 -20℃에서 저장하였다. 반응 혼합물은 표 1과 같이 제조하였다.

야생형 hGH 및 1,3-디아미노 프로판올을 사용한 트랜스글루타미네이션을 위한 반응 혼합물의 제조. hGH 사용 용액을 먼저 TrisHCl, 5 mM, pH 7.0 중의 그것의 스톡 용액으로부터 제조한 다음 반응에 사용하였다.

	야생형 hGH 사용 용액		1,3-dap	mTGase	H ₂ O	TrisHCl pH 8.0	총 vol.
스톡 용액	4.0 mg/ml	H₂O	1 M	다양함		1 M
반응	320㎖μl	280μl	90μl	10 μl	290 μl	10 μl	1 ml
최종 농도	≒60μM (1.28mg/ml)		90 mM	0.2-0.3 μM (10-15 μg/ml)		10 mM

*1,3-dap: 1,3-디아미노-프로판올

CE 분석

트랜스글루타미네이션 반응으로부터의 냉동 샘플을 우선 H₂O으로 1:10로 희석하고 Beckman Coulter으로부터의 P/ACE MDQ를 사용하여 30.5 cm x 50 um i.d.의 모세관으로 CE를 행하고, 214 nm에서 20℃에서 UV 검출을 행하였다. 트랜스아민화된 hGH의 pI은 약 5.80-6.20이었고, CE 분석은 TrisHCl, 5OmM, pH 8.0에서 행하였다.

모세관을 우선 0.1 M HCl으로 0.5분 동안 컨디셔닝하고, 증류수로 1.5분 동안 린스하고, 샘플을 0.5분 동안 주입하고, 마지막으로 +15 kV에서 25분 동안 샘플 분리를 위해 실행하였다.

CE 프로파일로부터, 야생형 hGH, Q141에서 단일치환된 hGH 및 Q40에서 단일치환된 hGH의 지연 시간은 각각 6.5, 7.9 및 10분이었다.

실시예 7

고선택성 mTGase 돌연변이의 평가

돌연변이의 선택성의 개선을 S. 모바라엔시스로부터의 야생형 mTGase (AlaPro-mTGase 형태)과 비교하였다. N-말단 변이체의 선택성을 스크리닝 분석에 의해 평가하였다. 모든 돌연변이의 선택성을, 기질로서 야생형 hGH 및 아민 공여체로서 1,3-디아미노 프로판올을 사용하여 트랜스글루타민반응에 대한 CE 분석에 의해 평가하였다.

실시예 8

S. 라다카눔으로부터의 mTGase의 선택성에 대한 상이한 N-말단 서열의 효과

실시예 5에 설명한 분석법을 사용하여 상이한 N-말단 엑스트라 서열이 있는 S. 라다카눔으로부터의 mTGase의 변이체를 hGHQ40 (기질로서 hGHQ141을 사용)에 비하여 hGHQ141 (기질로서 hGHQ40N을 사용)에서의 선택성을 비교하였다.

표 2에 나타낸 결과는 S. 라다카눔으로부터의 mTGase의 전체적인 선택성이 S. 모바라엔시스로부터의 AlaPro-mTGase보다 높다는 것을 나타내었다.

상이한 N-말단 서열을 갖는 4개 상이한 버전의 S. 라다카눔으로부터의 mTGase중에서, GlyPro-mTGase이 RS 2.7로 가장 높은 선택성을 갖는 것이 두드러진다. S. 라다카눔으로부터의 mTGase의 결정 구조가 이용불가능하지만, 표 2에 나타낸 결과는 mTGase의 N-말단이 그것의 기질, 예컨대 hGH에 대한 mTGase의 결합 포켓의 입체구조 변화에 포함될 수 있다는 것을 나타낸다. 개선된 선택성은 mTGase의 결합 포켓의 스퀴징 다운에 기인할 수 있으며, 이것은 기질의 특정 부위, 예컨대 hGH의 Q141에서의 Gln 잔기를 mTGase 촉매된 트랜스클루타미네이션에 대해 보다 바람직하게 만든다. S. 라다카눔으로부터의 야생형 GlyPro-mTGase의 선택성은 CE에 의해 측정된 글루타미네이션 반응에 의해 더 확인된다. 상기 결과에 기초하여, S. 라다카눔의 GlyPro-mTGase에서 또 다른 돌연변이가 발생하였다.

S. 모바라엔시스로부터의 mTGase의 상이한 N-말단 버전에 대한 선택성의 상이함이 발견되지 않았으므로, S. 모바라엔시스로부터의 AlaPro-mTGase을 기준으로서 사용하고, 실시예 5에 설명된 스크리닝 분석으로부터 산출된 RS(상대 선택성)에 의해 선택성의 개선을 평가하였다.

상이한 N-말단 서열을 갖는 S. 라다카눔으로부터의 mTGase의 변이체의 선택성의 비교. S. 모바라엔시스로부터의 AlaPro-mTGase를 기준으로 사용하였다. 계산된 선택성은 hGH40 (기질로서 hGHQ141 사용)에 비한 hGHQ141 (기질로서 hGHQ40N 사용)에 대한 활성이었다.

mTGase의 공급원	mTGase 변이체	hGHQ40N에 대한 활성 (RFU/sec/㎍)	hGHQ40N에 대한 활성 (RFU/sec/㎍)	선택성 (Q141/Q40)	RS¹
S. 모바라엔시스²	mTGase	3.35	0.98	3.4	1.0
	Met-mTGase	5.44	1.24	4.4	1.3
	AlaPro-mTGase	5.05	1.56	3.2	1.0
	GlyPro-mTGase	4.28	1.13	3.8	1.2
S. 라다카눔	Mature mTGase	3.55	0.63	5.6	1.7
	Met-mTGase	4.74	0.80	6.0	1.8
	AlaPro-mTGase	6.91	1.02	6.8	2.1
	GlyPro-mTGase	4.25	0.48	8.8	2.7

¹ RS: 상대 선택성, 돌연변이의 선택성 대 S. 모바라엔시스로부터의 야생형 mTGase의 선택성의 비율

실시예 9

S. 라다카눔으로부터의 GlyPro-mTGase에 기초한 부위-지정 돌연변이에 의해 발생된 mTGase 돌연변이

기질로서 야생형 hGH 및 아민 공여체로서 1.3-디아미노 프로판올과 함께 GlyPro-mTGase를 사용하여 트랜스글루타미네이션 반응을 행하였다. Q40에 비하여 hGH의 Q141에서 트랜스글루타미네이션에 대한 선택성을 CE로 평가하였다. 기준으로서 S. 모바라엔시스로부터의 AlaPro-mTGase 및 벤치마크로서 S. 라다카눔으로부터의 GlyPro-mTGase를 사용하여 선택성의 개선을 평가하였다. 결과를 표 3에 나타낸다. 각 돌연변이 CE에 대한 CE 그래프를 도 2B 내지 도 2H에 나타낸다.

표 3에 열거한 결과는 Y75A, Y75F, Y75N, Y62H_Y75N 및 Y62H_Y75F을 포함하는 모든 돌연변이가 GlyPro-mTGase-SL 보다 개선된 선택성을 갖는다는 것을 나타낸다. 가장 높은 선택성의 돌연변이는 hGH 전환율이 49.2%일 때 선택성이 36.2인 GlyPro-mTGase_Y62H_Y75F이며, 이는 S. 모바라엔시스로부터의 AlaPro-mTGase 보다 6.4배 높다. 38.1%의 낮은 hGH 전환율하에서 선택성의 7.6배 개선으로 또 다른 측정을 행하였다. GlyPro-mTGase_Y62H_Y75F 변이체를 사용하는 반복된 글루타미네이션 반응은 돌연변이 및 기준 mTGase 모두에 대한 hGH 전환율이 약 40%이었을 때 S. 모바라엔시스로부터의 AlaPro-mTGase의 것보다 7.6배 높은 선택성 개선을 제공하였다.

mTGase 변이체의 선택성의 비교

mTGase 변이체	선택성 (Q141/Q40)	hGH 전환율 (%)	반응 시간 (m)	사용된 효소 농도(㎍/ml)	RS ¹	CE 도면 ¹
S. 모바라엔시스 ²
AlaPro-mTGase	5.7	33	30	9.6	1.0	도 2B
S. 라다카눔
GlyPro-mTGase	10.3	55	15	16	1.8	도 2C
GlyPro-mTGase_Y75A	17.3	40	300	17.7	3.0	도 2D
GlyPro-mTGase_Y75F	29.1	41	60	12.9	5.1	도 2E
GlyPro-mTGase_Y75N	19.3	44	120	6.5	3.4	도 2F
GlyPro-mTGase_Y62H_Y75N	26.3	38	75	34.5	4.6	도 2G
GlyPro-mTGase_Y62H_Y75F	36.2	49.4	120	7	6.4	도 2H
	76.5² (Ref.=10.1)	38.1	60	8.8	7.6	(별도의 실험²)
	Ref. 10.1	39	45	4.6	1

¹ CE 프로파일로부터, 야생형 hGH, Q141에서 단일치환된 hGH 및 Q40에서 단일치환된 hGH에 대한 지연 시간은 각각 6.5, 7.9 및 10분이었다.

²기준, AlaPro-mTGase이 10.1의 선택성을 갖고, hGH 전환율이 38.1이었을 때 별도로 이 실험을 행하였다.

S. 라다카눔으로부터 GlyPro-mTGase_Y62H_Y75F의 서열은 SEQ ID No. 4로서 주어진다.

S. 라다카눔으로부터의 펩티드 프로펩티드-(3C)-mTGase은 SEQ ID No. 5에 주어진다.

실시예 10

S. 라다카눔 및 S. 모바렌스로부터의 mTGase의 hGH 내의 Gln-141 대 Gln-40에 대한 이들의 선택성에 대한 테스트

본 분석은 위치 Gln-40 및 Gln-141 중 하나에서 글루타민 대신 아스파라긴 잔기를 각각 갖는 두개의 hGH 돌연변이를 사용하며, 달리 하나의 글루타민을 반응하기 위해 남긴다. 상기 돌연변이의 제조는 Kunkel TA et al., Methods in Enzymology 154, 367-382 (1987), 및 Chung Nan Chang et al., Cell 55, 189-196 (1987)에 설명되어 있다. hGH 돌연변이 Q40N는 hGH 내의 Gln-141을 위한 모델 기질이며, Q141N는 Gln-40을 위한 모델 기질이다.

225 mM 1,3-디아미노-2-프로판올 및 35 mM Tris(pH가 농축된 HCl의 첨가에 의해 8.0로 조정됨)가 있는 400 μl 버퍼 용액에, 600 μl 돌연변이 hGH (1.5 mg/ml) 및 5 μl TGase(1.6 mg/ml)를 첨가한다. 반응 혼합물을 25℃에서 30분 동안 인큐베이션한다.

Mono Q 5/5 GL 1ml(GE Health) 컬럼 및 280 nm에서 UV 검출을 사용하여 FPLC에 의해 다음 분석을 행한다. 버퍼 A: 20 mM 트리에탄올아민 pH 8.5; 버퍼 B: 20 mM 트리에탄올아민 0.2M NaCl pH 8.5; 유속: 0.8 ml/min. 용리 구배는 하기와 같이 정의된다:

단계	시간/분	%A	%B
1	2.00	100.0	0.0
2	4.00	70.0	30.0
3	5.00	70.0	30.0
4	35.00	50.0	50.0

다음에, 두 생성물, Q141 및 Q40에 기인하는 곡선(도 3 및 4에 나타냄)하의 두 면적(임의 단위)의 비로부터 선택성 비를 산출하였다. S. 라다카눔 (SEQ ID No. 1 ) 및 S. 모바렌스 (SEQ ID No. 2)로부터의 TGase를 사용했을 때 얻어진 결과를 도 4에 나타낸다. Q40N + 그것의 생성물-Q141 = Q141N + 그것의 생성물-Q40이고, 그리고 100으로 표준화한다.

효소	Q40N	생성물- Q141	Q141N	생성물- Q40	트랜스아미네이션 Gln 40 대 Gln 141	Gln 40 대 Gln 141 (표준화됨)
S. 모바렌스로부터의 mTGase	29	71	81	19	19:71	21:79
S. 라다카눔으로부터의 mTGase	23	77	90	10	10:77	11:89

실시예 11

hGH의 PEG화

a) hGH를 포스페이트 버퍼(50 mM, pH 8.0)에 용해한다. 이 용액을 포스페이트 버퍼(50 mM, 1ml, pH 8.0, 아민 공여체의 용해 후 희석된 염산으로 8.0으로 pH 조정됨)에 용해된 아민 공여체, 예컨대 1,3-디아미노-프로판-2-올의 용액과 혼합한다.

마지막으로 포스페이트 버퍼(50 mM, pH 8.0, 1 ml)에 용해된 TGase (~ 40 U)의 용액을 첨가하고 포스페이트 버퍼(50 mM, pH 8)의 첨가에 의해 체적을 10 ml로 조정한다. 조합된 혼합물을 대략 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 온도를 실온으로 낮추고 N-에틸-말레이미드(TGase 억제제)를 최종 농도 1mM로 첨가한다. 1시간 후 혼합물을 tris 버퍼(50 mM, pH 8.5)의 10배 체적으로 희석한다.

b) 그 다음 a)로부터 얻어진 트랜스아민화된 hGH를 선택적으로 더 반응시켜서 잠재적 관능기가 아민 공여체에 존재한다면 이것을 더 활성화시킬 수 있다.

c) 그 다음 a) 또는 b)로부터 얻어진 관능화된 hGH를 hGH로 유도된 관능기와 반응할 수 있는 적절하게 관능화된 PEG와 반응시킨다. 예로서, 카르보닐 모이어티(알데히드 또는 케톤)을 알콕시아민과 반응시킴으로써 옥심 결합을 형성할 수 있다.

실시예 12

hGH의 PEG화

단계 a

hGH를 트리에탄올 아민 버퍼(20 mM, pH 8.5, 40% v/v 에틸렌 글리콜)에 용해한다. 이 용액을 트리에탄올 아민 버퍼(20 mM, pH 8.5, 40% v/v 에틸렌 글리콜, 아민 공여체의 용해 후 희석된 염산으로 8.6까지 pH 조정됨)에 용해된 아민 공여체, 예컨대 1,3-디아미노-프로판-2-올의 용액과 혼합한다.

마지막으로 20 mM PB, pH 6.0에 용해된 S. 모바렌스로부터의 AlaPro-mTGase(AlaPro-mTGase-SM) 또는 S. 라다카눔으로부터의 GlyPro-mTGase Y62H_Y75F(GlyPro-mTGase Y62H_Y75F-SL) (~ 0.5-7 mg/g hGH)를 첨가하고 체적을 5-15 mg/ml hGH (20 mM, pH 8.5)에 도달하도록 조정한다. 조합된 혼합물을 실온에서 1-25시간 동안 인큐베이션한다. 반응 혼합물을 표 5 및 도 5에 나타낸 바와 같이 CIE HPLC에 의해 분석한다. TA 40는 위치 40에서의 트랜스아민화를 의미하고, TA 141는 위치 141에서의 트랜스아민화를 의미하고, TA 40/141는 위치 40 및 141에서의 트랜스아민화를 의미한다.

.반응시간(시간)/효소	hGH 좌측 (면적 %)	TA 40 (면적 %)	TA 141 (면적 %)	TA 40/141 (면적 %)
1/AlaPro-mTGase-SM	63.6	4.4	27.5	1.3
1/GlyPro-mTGase Y62H_Y75F-SL	63.0	1.7	32.0	0.3
22/AlaPro-mTGase-SM	38.4	6.2	40.5	3.6
22/GlyPro-mTGase Y62H_Y75F-SL	48.3	3.5	37.5	0.6
25/GlyPro-mTGase Y62H_Y75F-SL*	9.9*	2.5	65	3.7

*출발 물질 내의 75% hGH

단계 b

그 다음 아민 공여체가 존재한다면 단계 a)에서 얻어진 트랜스아민화된 hGH를 선택적으로 더 반응시켜서 잠재적 관능기를 활성화시킨다.

단계 c

그 다음 단계 a) 또는 b)에서 얻어진 관능화된 hGH를 hGH로 유도되는 관능기와 반응할 수 있는 적절하게 관능화된 PEG와 반응시킨다. 예로서, 카르보닐 모이어티(알데히드 또는 케톤)를 알콕시아민과 반응시킴으로써 옥심 결합을 형성할 수 있다.

실시예 13

S. 라다카눔으로부터 TGase 돌연변이의 선택성

100μM 모노단실 카다베린(분말을 아세트산으로 용해시키고 1M Tris-HCl, pH 8.5으로 완충시켜서 제조됨) 및 50 μM Q141N 또는 Q40N 사람 성장 호르몬을 함유하는 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 및 200 mM NaCl 버퍼에서 실온에서 각 반응을 행하였다. TGase를 혼합물에 첨가하여 반응을 시작하였다. 30초 마다 ext/em. 340/520 nm에서 형광을 측정하였다. Q40N 및 Q141N에 대한 초기 반응 속도를 추정하고 선택성을 계산하기 위해 사용하였다.

여러 S. 라다카눔 GlyPro-TGase 돌연변이에 대한 이 실험의 결과를 표 6에 나타낸다.

특정 돌연변이	RSA Q141	RSA Q40	RS
GlyPro-S250A	4,23	2,57	1,65
GlyPro-S250C	5,34	3,02	1,77
GlyPro-S250D	1,04	0,76	1,37
GlyPro-S250F	2,63	1,85	1,42
GlyPro-S250G	2,42	1,77	1,37
GlyPro-S250H	2,25	1,40	1,61
GlyPro-S250L	3,59	1,90	1,89
GlyPro-S250M	3,25	2,22	1,46
GlyPro-S250P	3,99	1,86	2,15
GlyPro-S250Q	1,92	1,62	1,18
GlyPro-S250R	0,83	0,59	1,41
GlyPro-S250V	0,96	0,51	1,88
GlyPro-S250W	2,43	1,30	1,87
GlyPro-S250Y	1,71	0,95	1,81
GlyPro-Y62L	0,20	0,07	2,92
GlyPro-Y62M	0,28	0,10	2,79
GlyPro-Y62N	0,18	0,05	3,60
GlyPro-Y62T	0,19	0,10	2,00
GlyPro-Y75C	0,18	0,06	2,77
GlyPro-Y75L	0,18	0,06	2,57
GlyPro-Y75M	0,18	0,10	1,61
GlyPro-Y75A	0,06	0,03	2,45
RSAQ141:	야생형 TGase에 비하여 Q141-hGH 에 대한 특이적 활성
RSAQ40:	야생형 TGase에 비하여 Q40-hGH에 대한 특이적 활성
RS:	상대 선택성, 돌연변이의 선택성 대 야생형 TGase의 선택성의 비율

SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> TRANSGLUTAMINASE VARIANTS WITH IMPROVED SPECIFICITY <130> 7774.504-WO <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 331 <212> PRT <213> Streptoverticillium ladakanum <400> 1 Asp Ser Asp Glu Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met 1 5 10 15 Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Ile Val Asn 20 25 30 Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg 35 40 45 Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys 50 55 60 Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu 65 70 75 80 Ala Phe Ala Phe Phe Asp Glu Asp Lys Tyr Lys Asn Glu Leu Lys Asn 85 90 95 Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val 100 105 110 Ala Lys Asp Ser Phe Asp Glu Ala Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Asp 115 120 125 Val Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Gly 130 135 140 Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala 145 150 155 160 Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn 165 170 175 Thr Pro Ser Phe Lys Asp Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Lys 180 185 190 Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg 195 200 205 Ser Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Glu Ala Phe Arg 210 215 220 Pro Asp Arg Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile 225 230 235 240 Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Ser Phe Val Asn Phe Asp Tyr 245 250 255 Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp 260 265 270 Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met 275 280 285 His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Asp Gly Tyr Ser Asp 290 295 300 Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Val Thr Phe Val Pro Lys Ser Trp Asn 305 310 315 320 Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro 325 330 <210> 2 <211> 331 <212> PRT <213> Streptomyces mobaraensis <400> 2 Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met 1 5 10 15 Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn 20 25 30 Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg 35 40 45 Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys 50 55 60 Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu 65 70 75 80 Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn 85 90 95 Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val 100 105 110 Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu 115 120 125 Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser 130 135 140 Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala 145 150 155 160 Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn 165 170 175 Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg 180 185 190 Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg 195 200 205 Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg 210 215 220 Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile 225 230 235 240 Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr 245 250 255 Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp 260 265 270 Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met 275 280 285 His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp 290 295 300 Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn 305 310 315 320 Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro 325 330 <210> 3 <211> 380 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> TGase from Streptoverticillium ladakanum as expressed in E.coli <400> 3 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Glu Glu Lys Arg Ser Tyr Ala 1 5 10 15 Glu Thr His Arg Leu Thr Ala Asp Asp Val Asp Asp Ile Asn Ala Leu 20 25 30 Asn Glu Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala 35 40 45 Pro Asp Ser Asp Glu Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg 50 55 60 Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Ile Val 65 70 75 80 Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly 85 90 95 Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly 100 105 110 Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg 115 120 125 Leu Ala Phe Ala Phe Phe Asp Glu Asp Lys Tyr Lys Asn Glu Leu Lys 130 135 140 Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg 145 150 155 160 Val Ala Lys Asp Ser Phe Asp Glu Ala Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg 165 170 175 Asp Val Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu 180 185 190 Gly Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp 195 200 205 Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg 210 215 220 Asn Thr Pro Ser Phe Lys Asp Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser 225 230 235 240 Lys Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp 245 250 255 Arg Ser Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Glu Ala Phe 260 265 270 Arg Pro Asp Arg Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn 275 280 285 Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Ser Phe Val Asn Phe Asp 290 295 300 Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val 305 310 315 320 Trp Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala 325 330 335 Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Asp Gly Tyr Ser 340 345 350 Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Val Thr Phe Val Pro Lys Ser Trp 355 360 365 Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Thr Gln Gly Trp Pro 370 375 380 <210> 4 <211> 333 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GlyPro-mTGase_Y62H_Y75F from S. ladakanum <400> 4 Gly Pro Asp Ser Asp Glu Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp 1 5 10 15 Arg Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Ile 20 25 30 Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp 35 40 45 Gly Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser His 50 55 60 Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Phe Pro Thr Asn 65 70 75 80 Arg Leu Ala Phe Ala Phe Phe Asp Glu Asp Lys Tyr Lys Asn Glu Leu 85 90 95 Lys Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly 100 105 110 Arg Val Ala Lys Asp Ser Phe Asp Glu Ala Lys Gly Phe Gln Arg Ala 115 120 125 Arg Asp Val Ala Ser Val Met Asn Lys Ala Leu Glu Asn Ala His Asp 130 135 140 Glu Gly Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn 145 150 155 160 Asp Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu 165 170 175 Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Asp Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro 180 185 190 Ser Lys Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln 195 200 205 Asp Arg Ser Gly Ser Ser Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Glu Ala 210 215 220 Phe Arg Pro Asp Arg Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg 225 230 235 240 Asn Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Ser Phe Val Asn Phe 245 250 255 Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr 260 265 270 Val Trp Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly 275 280 285 Ala Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Asp Gly Tyr 290 295 300 Ser Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Val Thr Phe Val Pro Lys Ser 305 310 315 320 Trp Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Thr Gln Gly Trp Pro 325 330 <210> 5 <211> 388 <212> PRT <213> artificial <220> <223> propeptide-(3C)-MTGase from S. ladakanum <400> 5 Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Glu Glu Lys Arg Ser Tyr Ala 1 5 10 15 Glu Thr His Arg Leu Thr Ala Asp Asp Val Asp Asp Ile Asn Ala Leu 20 25 30 Asn Glu Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ala 35 40 45 Pro Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Asp Ser Asp Glu Arg Val Thr 50 55 60 Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser 65 70 75 80 Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Ile Val Asn Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln 85 90 95 Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu 100 105 110 Gln Arg Glu Trp Leu Ser His Gly Cys Val Gly Val Thr Trp Val Asn 115 120 125 Ser Gly Gln Phe Pro Thr Asn Arg Leu Ala Phe Ala Phe Phe Asp Glu 130 135 140 Asp Lys Tyr Lys Asn Glu Leu Lys Asn Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu 145 150 155 160 Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val Ala Lys Asp Ser Phe Asp Glu 165 170 175 Ala Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Asp Val Ala Ser Val Met Asn Lys 180 185 190 Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Gly Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys 195 200 205 Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg 210 215 220 Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn Thr Pro Ser Phe Lys Asp Arg 225 230 235 240 Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Lys Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser 245 250 255 Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg Ser Gly Ser Ser Asp Lys Arg 260 265 270 Lys Tyr Gly Asp Pro Glu Ala Phe Arg Pro Asp Arg Gly Thr Gly Leu 275 280 285 Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro 290 295 300 Gly Glu Ser Phe Val Asn Phe Asp Tyr Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr 305 310 315 320 Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp Thr His Gly Asn His Tyr His 325 330 335 Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met His Val Tyr Glu Ser Lys Phe 340 345 350 Arg Asn Trp Ser Asp Gly Tyr Ser Asp Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val 355 360 365 Val Thr Phe Val Pro Lys Ser Trp Asn Thr Ala Pro Asp Lys Val Thr 370 375 380 Gln Gly Trp Pro 385

Claims

SEQ ID No. 1 내의 아미노산 서열과 80% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열은 SEQ ID No. 1의 아미노산 잔기 Tyr62, Tyr75 및 Ser250에 대한 위치 중 하나 이상에서 변형된 분리된 펩티드.
제1항에 있어서, SEQ ID No. 1 내의 아미노산 서열과 95% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열은 SEQ ID No. 1의 아미노산 잔기 Tyr62, Tyr75 및 Ser250에 해당하는 위치 중 하나 이상에서 변형된 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제2항에 있어서, SEQ ID No. 1에 정의된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열은 SEQ ID No. 1의 아미노산 잔기 Tyr62, Tyr75 및 Ser250에 해당하는 위치 중 하나 이상에서 변형된 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 N-말단에서 1개 내지 10개 아미노산 잔기의 부가에 의해 변형된 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제4항에 있어서, 부가된 디펩티드 라디칼은 Gly-Pro-인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제4항에 있어서, 부가된 디펩티드 라디칼은 Ala-Pro-인 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드는 트랜스글루타미나아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제5항 또는 제6항에 있어서, 펩티드는 트랜스글루타미나아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제7항 또는 제8항에 있어서, 펩티드는 hGH의 Gln-40에 비하여 hGH의 Gln- 141에 대한 특이성을 가지며, 이는 SEQ ID No. 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 hGH의 Gln-40에 비한 hGH의 Gln-141에 대한 특이성 보다 높은 것을 특징으로 하는 분리된 펩티드.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 암호화하는 핵산 구조체.
제10항에 있어서, 상기 핵산 구조체는 핵산 서열을 포함하며, 핵산 서열은 프로테아제 기질 아미노산 서열을 암호화하고, 프로테아제 기질 아미노산 서열은 핵산 구조체에 의해 암호화된 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 N-말단부 또는 C-말단부로서 발현된 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
제10항 또는 제11항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
제10항 또는 제11항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
제12항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 포함하는 조성물.
i) 펩티드의 재조합 발현을 할 수 있는 숙주 세포를 펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하고, 그리고

ii) 단계 i)하의 배양으로부터의 재조합 펩티드를 포함하는 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피한 후 어떤 또 다른 이온 교환 크로마토그래피하는,

제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 제조방법.
a) 펩티드의 재조합 발현을 할 수 있는 숙주 세포를 펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하고, 상기 숙주 세포는 제13항에 따른 벡터를 포함하고, 그리고

b) 단계 a)하에서 배양으로부터의 재조합 펩티드를 포함하는 조성물을 프로테아제 기질 아미노산 서열을 절단할 수 있는 프로테아제로 처리하는,

제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 제조방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 존재하에서 아민 공여체와 펩티드를 반응시키는 것을 포함하는 펩티드의 접합방법.
제18항에 있어서, 상기 접합되는 펩티드는 성장 호르몬인 것을 특징으로 하는 펩티드의 접합방법.
제19항에 있어서, 상기 성장 호르몬은 hGH 또는 그것의 변이체 또는 유도체이고, hGH의 위치 Gln-40에 해당하는 위치에서 접합된 hGH의 양에 비한 hGH의 위치 Gln-141에 해당하는 위치에서 접합된 성장 호르몬의 양이, SEQ ID No.1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 대신 상기 방법에 사용했을 때, 위치 Gln-40에 해당하는 위치에서 접합된 hGH의 양에 비한 hGH의 위치 Gln-141에 해당하는 위치에서 접합된 hGH의 양과 비교하여 현저히 증가된 성장 호르몬의 접합방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 존재하에서 hGH를 아민 공여체와 반응시키는 것을 포함하는, 위치 141에 해당하는 위치에서 접합된 hGH의 제 조방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 존재하에서 hGH 또는 그것의 변이체 또는 유도체를 아민 공여체와 반응시키는 단계를 포함하는, 접합된 성장 호르몬의 약학적 제조방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 존재하에서 hGH 또는 그것의 변이체 또는 유도체를 아민 공여체와 반응시키고, 얻어진 접합된 성장 호르몬 펩티드를 페길화된 성장 호르몬의 제조에 사용하는 단계를 포함하고, 상기 페길화는 접합된 위치에서 일어나는, 페길화된 성장 호르몬의 약학적 제조방법.
접합된 성장 호르몬의 제조에서 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 사용.
제22항 또는 제23항에 따른 방법의 사용에 의해 제조된 약학적 조제품을 그것을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 성장 호르몬의 부족과 관련된 질환 또는 장애의 치료방법.