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CN118159298A - 生产抗体-接头偶联物的方法 - Google Patents

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CN118159298A
CN118159298A CN202280071416.5A CN202280071416A CN118159298A CN 118159298 A CN118159298 A CN 118159298A CN 202280071416 A CN202280071416 A CN 202280071416A CN 118159298 A CN118159298 A CN 118159298A
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CN
China
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antibody
linker
payload
amino acid
moiety
Prior art date
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CN202280071416.5A
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I·阿廷格-托勒
R·伯特兰
R·斯塔克
D·格拉布罗夫斯基
P·施皮歇尔
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Alaris Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Alaris Biotechnology Co ltd
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Publication date
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Abstract

本发明涉及一种通过转谷氨酰胺酶生成抗体‑有效载荷偶联物的方法。该方法包括：将包含结构(在N→C方向上示出的)(Sp1)‑K‑(Sp2)‑B‑(Sp3)或(Sp1)‑B‑(Sp2)‑K‑(Sp3)的接头偶联至抗体中包含的Gln残基的步骤，其中，(Sp1)是化学间隔物或不存在；(Sp2)是化学间隔物或不存在；(Sp3)是化学间隔物或不存在；K是赖氨酸或赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物；B是连接部分或有效载荷；其中，接头经由赖氨酸残基、赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物的侧链中包含的伯胺偶联至抗体中包含的Gln残基；并且其中，抗体与小于80摩尔当量的接头接触。进一步，本发明涉及抗体‑接头偶联物、抗体‑药物偶联物以及包含赖氨酸残基的接头构建体。

Description

生产抗体-接头偶联物的方法
本发明涉及通过转谷氨酰胺酶生产抗体-接头偶联物的方法。本发明进一步提供了抗体-接头偶联物、包含本发明的抗体-接头偶联物的药物组合物及其用途。
抗体-药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)通常由抗体和经由化学接头偶联至抗体的小分子药物组成。经过几十年的临床前研究和临床研究后，一系列ADC已被批准用于治疗特定的肿瘤类型，诸如用于复发性霍奇金淋巴瘤和系统性间变性大细胞淋巴瘤的维布妥昔单抗(brentuximab vedotin，)、用于急性骨髓性白血病的吉妥珠单抗(gemtuzumab ozogamicin，)、用于HER2阳性转移性乳腺癌的恩美曲妥珠单抗(ado-trastuzumab emtansine，)、用于B细胞恶性肿瘤的奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin，)和最近的泊洛妥珠单抗韦多汀(polatuzumabvedotin-piiq，)。最近，恩诺单抗韦多汀(enfortumab vedotin，)、德曲妥珠单抗(trastuzumab deruxtecan，)、戈沙妥珠单抗(sacituzumab govitecan，)、以及贝兰他单抗莫福汀(belantamab mafadotin，)已经获准上市。关于ADC的综述参见例如(Zhao P等人，2020，Acta Pharmaceutica Sinica B，10，1589-1600)。虽然许多ADC已经显示出令人印象深刻的抗癌活性，但许多患者对这些治疗没有反应，在疗效迹象之前经历严重副作用或在一定时间段后复发，因此医学上仍然需要具有有利的药物样特性的新型ADC形式，其能以合理的成本以足够的数量和质量生产以支持药物开发，并且适合作为治疗剂。
ADC制备中的关键步骤是有效载荷与抗体的共价偶联步骤。在目前临床开发中的大多数ADC通过偶联至抗体的内源赖氨酸或半胱氨酸残基进行，仔细控制平均修饰程度以产生在3.5-4.0范围内的平均药物抗体比(DAR)。历史上，此比率基于(a)最小化非偶联抗体的量和(b)使用非常高的DAR避免混合物中的种类来选择，由于较高的疏水性和较低的溶解度，这在制造和配制中可能是有问题的(Lambert JM和Berkenbilt A.，2018，Annu.Rev.Med.69，191-207)，并且通常导致较差的药代动力学性质(Lyon RP等人，2015，Nat Biotechnol，33，733-735)。最近，已经开发了多种遗传、化学和酶促的方法进行位点特异性偶联，这可以实现2(或4)的DAR，同时避免抗体的修饰不足或过度修饰。Yamada等人概述了这些方法(综述于Kei Yamada和Yuji Ito，2019，20，ChemBioChem，2729-2739)。
酶偶联已经显示出极大的兴趣，因为这些偶联反应通常是快速的、位点特异性的，并且可以在生理条件下进行。在可用的酶中，来自物种茂原链霉菌(Streptomycesmobaraensis)的微生物转谷氨酰胺酶(MTG)作为功能部分(包括抗体)的常规化学蛋白质偶联的有吸引力的替代方案，越来越受到人们的关注。MTG在生理条件下催化蛋白质或肽的“反应性”谷氨酰胺与蛋白质或肽的“反应性的”赖氨酸残基之间的转酰胺反应，而后者也可以是简单的低分子量伯胺，诸如5-氨基戊基(Jeger S等人，2010，Angew.Chem.Int.Ed.，49，9995-9997)。
Jeger等人描述了使用转谷氨酰胺酶作为酶的抗体的偶联发生在Q295残基处，然而，只有在用PNGase F去除天冬酰胺残基297(N297)处的聚糖部分时才可能偶联，而糖基化抗体不能有效偶联(偶联效率低于20％)(Jeger S等人，2010，Angew.Chem.Int，Ed.，49，9995-9997；Mindt T等人，2008，Bioconj Chem，9，271-278)。
通过MTG生成ADC的其他方法基于非糖基化(aglycosylated)抗体的使用，其中，残基N297被不能进行糖基化的氨基酸残基取代。然而，N297针对另一氨基酸的取代可能导致不想要的效果，因为它可能影响整个Fc结构域的整体稳定性(Subedi GP和Barb AW.，2015，Structure，23，1573-1583)和整个偶联物的功效。其结果是，可能导致抗体聚集增加和溶解度降低，这对于疏水有效载荷尤其变得重要。进一步，存在于N297处的聚糖具有重要的免疫调节作用，因为它触发效应子功能(诸如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)等)。这些免疫调节作用将在去糖基化或上述任何其他方法中丧失以获得非糖基化抗体。进一步，已建立的抗体的任何序列修饰也可能导致调节问题，这是有问题的，因为通常使用已接受的和临床验证的抗体作为ADC偶联的起点。
最近，Spycher等人公开了基于转谷氨酰胺酶的偶联方法，该方法不需要抗体的先前去糖基化以用于有效载荷偶联(Spycher等人，WO 2019/057772)。可以偶联天然的糖基化抗体在生产方面提供显著的优点：在良好的生产工艺(GMP)方面，酶去糖基化步骤是不期望的，因为必须确保去糖基化酶(例如，PNGase F)以及切割的聚糖两者都从反应混合物中去除。此外，不需要用于有效载荷附接的抗体的基因工程，从而可以避免可能增加免疫原性和降低抗体整体稳定性的序列插入。
鉴于上述情况，本领域仍然需要具有高偶联效率的用于生成ADC的改进方法。
发明内容
本发明的特征在于本文提供的实施方式和权利要求。特别地，本发明尤其涉及以下实施方式：
1.一种通过转谷氨酰胺酶生产抗体-接头偶联物的方法，该方法包括将包含(如N→C方向所示的)(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)结构的接头偶联至抗体中包含的Gln残基的步骤，其中，
·(Sp1)是化学间隔物或不存在；
·(Sp2)是化学间隔物或不存在；
·(Sp3)是化学间隔物或不存在；
·K是赖氨酸或赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物；
·B是连接部分或有效载荷；
其中，接头经由赖氨酸残基、赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物的侧链中包含的伯胺偶联至抗体中包含的Gln残基；并且
其中，抗体与小于80摩尔当量的接头接触。
2.根据实施方式1的方法，其中，抗体与20摩尔当量或小于20摩尔当量的接头接触。
3.根据实施方式1或2的方法，其中，抗体与2-20摩尔当量的接头接触。
4.根据实施方式1-3中任一项的方法，其中，将抗体以1-50mg/mL范围内的浓度添加到偶联反应中。
5.根据实施方式1-4中任一项的方法，其中，将转谷氨酰胺酶以1-20U/mg抗体范围内的浓度添加到偶联反应中。
6.根据实施方式1-5中任一项的方法，其中，接头与抗体的偶联在6至8.5范围内的pH处实现。
7.根据实施方式1-6中任一项的方法，其中，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和(Sp3)各自独立地包含0至12个氨基酸残基。
8.根据实施方式1-7中任一项的方法，其中，接头包含不超过25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4个氨基酸残基。
9.根据实施方式1-8中任一项的方法，其中，接头的净电荷是中性或正的。
10.根据实施方式1-9中任一项的方法，其中，接头不包含带负电荷的氨基酸残基。
11.根据实施方式1-10中任一项的方法，其中，B是连接部分。
12.根据实施方式11的方法，其中，连接部分B包含
·生物正交标记基团，或
·用于交联的非生物正交实体。
13.根据实施方式12的方法，其中，生物正交标记基团或用于交联的非生物正交实体由至少一个分子或部分组成或者包含至少一个分子或部分，该分子或部分选自由以下组成的组：
·-N-N≡N或-N3；
·Lys(N3)；
·四嗪；
·炔烃；
·应变环辛炔(strained cyclooctyne)；
·BCN；
·应变烯烃；
·光反应性基团；
·醛；
·酰基三氟硼酸酯；
·蛋白质降解剂(‘PROTAC’)；
·环戊二烯/螺环戊二烯(spirolocyclopentadiene)；
·硫代选择性亲电体；
·-SH；以及
·半胱氨酸。
14.根据实施方式11-13中任一项的方法，该方法包括将一种或多种有效载荷偶联至连接部分B的进一步步骤。
15.根据实施方式14的方法，其中，一种或多种有效载荷经由点击反应偶联至连接部分B。
16.根据实施方式1-10中任一项的方法，其中，B是有效载荷。
17.根据实施方式14至16中任一项的方法，其中，有效载荷包括以下中的至少一种：
·毒素；
·细胞因子；
·生长因子；
·放射性核素；
·激素；
·抗病毒剂；
·抗菌剂；
·荧光染料；
·免疫调节剂/免疫刺激剂；
·半衰期增加部分；
·溶解度增加部分；
·聚合物-毒素偶联物；
·核酸；
·生物素或链霉亲和素部分；
·维生素；
·蛋白质降解剂(‘PROTAC’)；
·靶结合部分；和/或
·抗炎剂。
18.根据实施方式17的方法，其中，毒素是选自由以下组成的组中的至少一种：
·吡咯并苯并二氮杂卓(例如，PBD)；
·奥瑞他汀(auristatin，例如，MMAE、MMAF)；
·类美登素(maytansinoid，例如，美登素、DM1、DM4、DM21)；
·倍癌霉素(duocarmycin)；
·烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)抑制剂；
·微管溶素(tubulysin)；
·烯二炔(例如，卡奇霉素)；
·蒽环类衍生物(PNU)(例如，阿霉素)；
·吡咯基驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)抑制剂；
·念珠藻素(cryptophycin)；
·药物外排泵抑制剂；
·山卓霉素；
·鹅膏蕈碱(例如，α-鹅膏蕈碱)；以及
·喜树碱(例如，依喜替康(exatecans)、德鲁替康(deruxtecans))。
19.根据实施方式1至18中任一项的方法，其中，化学间隔物(Sp2)包括自裂解(self-immolative)部分。
20.根据实施方式19的方法，其中，自裂解部分直接附接至有效载荷B。
21.根据实施方式19或20的方法，其中，自裂解部分包括对氨基苄基氨基甲酰基(PABC)部分或自裂解氨基亚甲基间隔物。
22.根据实施方式1至21中任一项的方法，其中，抗体是IgG抗体，特别是IgG1抗体。
23.根据实施方式22的方法，其中，接头偶联的Gln残基包含在抗体的Fc结构域中，特别是其中，接头偶联的Gln残基是IgG抗体的CH2结构域的Gln残基Q295(EU编号)。
24.根据实施方式22的方法，其中，通过分子工程将接头偶联的Gln残基引入抗体的重链或轻链中。
25.根据实施方式24的方法，其中，通过分子工程引入抗体的重链或轻链的Gln残基是非糖基化(aglycosylated)IgG抗体的CH2结构域的N297Q(EU编号)。
26.根据实施方式24的方法，其中，通过分子工程引入抗体的重链或轻链中的Gln残基包含在肽中，该肽已(a)整合到抗体的重链或轻链中或者(b)融合到抗体的重链或轻链的N-末端或C-末端。
27.根据实施方式26的方法，其中，包含Gln残基的肽已融合到抗体的重链的C-末端。
28.根据实施方式22至24或26至27中任一项的方法，其中，IgG抗体是糖基化IgG抗体，特别是其中，IgG抗体在CH2结构域的残基N297(EU编号)处糖基化。
29.根据实施方式1至28中任一项的方法，其中，抗体选自由以下组成的组：维布妥昔单抗(Brentuximab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、吉妥珠单抗(Gemtuzumab)、奥英妥珠单抗(Inotuzumab)、阿维单抗(Avelumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、利妥昔单抗(Rituximab)、达雷妥尤单抗(Daratumumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、托珠单抗(Tocilizumab)、乌司奴单抗(Ustekinumab)、戈利木单抗(Golimumab)、奥妥珠单抗(Obinutuzumab)、沙西妥珠单抗(Sacituzumab)、贝兰妥单抗(Belantamab)、泊洛妥珠单抗(Polatuzumab)以及恩诺单抗(Enfortumab)。
30.根据实施方式1至29中任一项的方法，其中，接头偶联至抗体中包含的Gln残基的γ-羧酰胺基。
31.根据实施方式1至30中任一项的方法，其中，接头适合于以至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的偶联效率偶联至糖基化抗体。
32.根据实施方式1至31中任一项的方法，其中，转谷氨酰胺酶是微生物转谷氨酰胺酶，该微生物转谷氨酰胺酶衍生自链霉菌属(Streptomyces)物种，特别是茂原链霉菌。
33.一种通过根据实施方式1至32中任一项的方法生产的抗体-接头偶联物。
34.一种药物组合物，其包含根据实施方式33的抗体-接头偶联物。
35.根据实施方式34的药物组合物，包含至少一种额外的治疗活性剂。
36.根据实施方式33的抗体-接头偶联物或根据实施方式34或35的药物组合物，用于治疗和/或诊断，特别是其中抗体-接头偶联物包含至少一种有效载荷。
37.根据实施方式33的抗体-接头偶联物或根据实施方式34或35所述的药物组合物，用于治疗
·患有肿瘤性疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染性疾病的患者，
·处于发展为肿瘤性疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染性疾病的风险的患者，和/或
·被诊断为肿瘤性疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染性疾病的患者，
特别是其中，抗体-接头偶联物包含至少一种毒素。
38.根据实施方式37的使用的抗体-接头偶联物或药物组合物，其中，抗体-接头偶联物包含泊洛妥珠单抗，并且其中，肿瘤性疾病是B细胞相关癌症。
39.根据实施方式38的使用的抗体-接头偶联物或药物组合物，其中，B细胞相关癌症是非霍奇金淋巴瘤，特别是其中，B细胞相关癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤。
40.根据实施方式37的使用的抗体-接头偶联物或药物组合物，其中，抗体-接头偶联物包含曲妥珠单抗，并且其中，肿瘤性疾病是HER2阳性癌症，特别是HER2阳性乳腺癌、胃癌、卵巢癌或肺癌。
41.根据实施方式37的使用的抗体-接头偶联物或药物组合物，其中，抗体-接头偶联物包含恩诺单抗或恩诺单抗变体，并且其中，肿瘤性疾病是结合素(Nectin)-4阳性癌症，特别是结合素-4阳性胰腺癌、肺癌、膀胱癌或乳腺癌。
因而，在一种实施方式中，本发明涉及一种通过转谷氨酰胺酶生产抗体-接头偶联物的方法，该方法包括将包含(如N→C方向所示的)(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)结构的接头偶联至抗体中包含的Gln残基的步骤，其中，
·(Sp1)是化学间隔物或不存在；
·(Sp2)是化学间隔物或不存在；
·(Sp3)是化学间隔物或不存在；
·K是赖氨酸或赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物；
·B是连接部分或有效载荷；
其中，接头经由赖氨酸残基、赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物的侧链中包含的伯胺偶联至抗体中包含的Gln残基；并且
其中，抗体与小于80摩尔当量的接头接触。
也就是说，本发明至少部分基于令人惊讶的发现，即基于赖氨酸的接头能够在优化的反应条件下以极其高的效率偶联至糖基化抗体。特别地，发明人已经显示，优化的接头与抗体的比率导致令人惊讶的高偶联效率。
在WO 2019/057772中，首次证明了基于赖氨酸的肽接头可以偶联至糖基化抗体。为了实现有效的偶联，本领域认为糖基化抗体必须与大量接头接触。因此，糖基化抗体已经与80摩尔当量的基于赖氨酸的接头接触以实现WO 2019/057772中的偶联。与所认为相反，本发明人令人惊讶地发现，降低接头与抗体的比率导致糖基化抗体的显著更有效的偶联。因此，已在单个步骤中实现了包含庞大有效载荷的各种接头的定量偶联。
特别地，已经证明，使抗体与小于80摩尔当量的接头接触导致改善的偶联效率。在优选的实施方式中，抗体与小于70摩尔当量的接头接触。在更优选的实施方式中，抗体与小于60摩尔当量的接头接触。在甚至更优选的实施方式中，抗体与小于50摩尔当量的接头接触。在甚至更优选的实施方式中，抗体与小于40摩尔当量的接头接触。在甚至更优选的实施方式中，抗体与小于30摩尔当量的接头接触。在甚至更优选的实施方式中，抗体与小于20摩尔当量的接头接触。在甚至更优选的实施方式中，抗体与小于15摩尔当量的接头接触。在最优选的实施方式中，抗体与小于10摩尔当量的接头接触。
可替代地，抗体可以与2-80摩尔当量的接头、优选2-70摩尔当量的接头、更优选2-60摩尔当量的接头、甚至更优选2-50摩尔当量的接头、甚至更优选2-40摩尔当量的接头、甚至更优选2-30摩尔当量的接头、甚至更优选2-25摩尔当量的接头、甚至更优选2-20摩尔当量的接头、甚至更优选2-15摩尔当量的接头、甚至更优选2-10摩尔当量的接头、最优选2-8摩尔等量的接头接触。
可替代地，抗体可以与2.5-80摩尔当量的接头、优选2.5-70摩尔当量的接头、更优选2.5-60摩尔当量的接头、甚至更优选2.5-50摩尔当量的接头、甚至更优选2.5-40摩尔当量的接头、甚至更优选2.5-30摩尔当量的接头、甚至更优选2.5-25摩尔当量的接头、甚至更优选2.5-20摩尔当量的接头、甚至更优选2.5-15摩尔当量的接头、甚至更优选2.5-10摩尔当量的接头、最优选2.5-8摩尔等量的接头接触。
抗体可以以任何浓度添加到偶联反应中。然而，优选将抗体以0.1-50mg/ml范围内的浓度添加到偶联反应中。也就是说，在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，抗体以0.1-50mg/mL、优选1-50mg/mL、更优选1-25mg/mL、更优选2.5-20mg/mL、甚至更优选5-20mg/mL、最优选5-17mg/mL范围内的浓度添加到偶联反应中。
根据本发明的方法优选在6至9范围内的pH进行。因此，在优选的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，接头与抗体的偶联在6至8.5范围内的pH、更优选在6.5至8范围内的pH、甚至更优选在7至8范围内的pH实现。在最优选的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，接头与抗体的偶联在pH 7.6实现。
本发明的方法可以在适用于有效载荷与接头偶联的任何缓冲液中进行。适用于本发明方法的缓冲液包括但不限于Tris、MOPS、HEPES、PBS或BisTris缓冲液。缓冲液的浓度尤其取决于抗体和/或接头的浓度，并且可以在10-1000mM、10-500mM、10-400mM、10-250mM、10-150mM或10-100mM范围内变化。进一步，缓冲液可以包括适合于实施本发明方法的任何盐浓度。例如，本发明方法中使用的缓冲液可以具有≤150mM、≤140mM、≤130mM、＜120mM、≤110mM、≤100mM、≤90mM、≤80mM、≤70mM、≤60mM、≤50mM、≤40mM、≤30mM、≤20mM或≤10mM的盐浓度，或者不具有盐。在特定的实施方式中，本发明的方法在50mM Tris(pH 7.6)中进行，优选不含盐。
需要注意，最佳反应条件(例如，pH值、缓冲液、盐浓度)可能因有效载荷而异，并且在一定程度上取决于接头和/或有效载荷的物理化学性质。然而，本领域技术人员不需要过多的实验来确定适合实施本发明的方法的反应条件。
转谷氨酰胺酶可以以允许抗体与接头有效偶联的任何浓度添加到偶联反应中。在某些实施方式中，偶联反应中转谷氨酰胺酶的浓度可以取决于在相同反应中使用的抗体的量。例如，可以将转谷氨酰胺酶以小于100U/mg抗体、90U/mg抗体、80U/mg抗体、70U/mg抗体、60U/mg抗体、50U/mg抗体、40U/mg抗体、30U/mg抗体、20U/mg抗体、10U/mg抗体或6U/mg抗体的浓度添加到偶联反应中。在某些实施方式中，转谷氨酰胺酶可以以1U/mg、3U/mg、5U/mg或6U/mg抗体的浓度添加到偶联反应中。
也就是说，在某些实施方式中，可以将转谷氨酰胺酶以1-20U/mg抗体范围内、优选1-10U/mg抗体范围内、更优选1-7.5U/mg抗体范围内、甚至更优选2-6U/mg抗体范围内、甚至更优选2-4U/mg抗体范围内的浓度，最优选3U/mg抗体的浓度添加到偶联反应中。
根据本发明的方法优选由微生物转谷氨酰胺酶催化。然而，需要注意的是，等效反应可以通过非微生物来源的包含转谷氨酰胺酶活性的酶进行。因而，根据本发明的抗体-接头偶联物可以用非微生物来源的包含转谷氨酰胺酶活性的酶生成。
应当理解，本申请涵盖上述公开的接头、抗体、转谷氨酰胺酶和/或缓冲液浓度的任何组合。
在优选的实施方式中，本发明涉及一种用于通过转谷氨酰胺酶生产抗体-接头偶联物的方法，该方法包括将包含(如N→C方向所示的)(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)结构的接头偶联至抗体中包含的Gln残基的步骤，其中，
·(Sp1)是化学间隔物或不存在；
·(Sp2)是化学间隔物或不存在；
·(Sp3)是化学间隔物或不存在；
·K是赖氨酸或赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物；
·B是连接部分或有效载荷；
其中，接头经由赖氨酸残基、赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物的侧链中包含的伯胺偶联至抗体中包含的Gln残基；并且
其中，抗体与2-70摩尔当量的接头接触；和/或其中，抗体以0.1-50mg/mL范围内的浓度添加到偶联反应中；并且任选地，其中，转谷氨酰胺酶以1-20U/mg抗体范围内的浓度添加到偶联反应中。
在更优选的实施方式中，本发明涉及一种通过转谷氨酰胺酶生产抗体-接头偶联物的方法，该方法包括将包含(如N→C方向所示的)(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)结构的接头偶联至抗体中包含的Gln残基的步骤，其中，
·(Sp1)是化学间隔物或不存在；
·(Sp2)是化学间隔物或不存在；
·(Sp3)是化学间隔物或不存在；
·K是赖氨酸或赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物；
·B是连接部分或有效载荷；
其中，接头经由赖氨酸残基、赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物的侧链中包含的伯胺偶联至抗体中包含的Gln残基；并且
其中，抗体与2-50摩尔当量的接头接触；和/或其中，抗体以1-50mg/mL范围内的浓度添加到偶联反应中；并且任选地，其中，转谷氨酰胺酶以1-20U/mg抗体范围内的浓度添加到偶联反应中。
在甚至更优选的实施方式中，本发明涉及一种通过转谷氨酰胺酶生产抗体-接头偶联物的方法，该方法包括将包含(如N→C方向所示的)(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)结构的接头偶联至抗体中包含的Gln残基的步骤，其中，
·(Sp1)是化学间隔物或不存在；
·(Sp2)是化学间隔物或不存在；
·(Sp3)是化学间隔物或不存在；
·K是赖氨酸或赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物；
·B是连接部分或有效载荷；
其中，接头经由赖氨酸残基、赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物的侧链中包含的伯胺偶联至抗体中包含的Gln残基；并且
其中，抗体与2-25摩尔当量的接头接触；和/或其中，抗体以2.5-25mg/mL范围内的浓度添加到偶联反应中；并且任选地，其中，转谷氨酰胺酶以1-15U/mg抗体范围内的浓度添加到偶联反应中。
在甚至更优选的实施方式中，本发明涉及一种通过转谷氨酰胺酶生产抗体-接头偶联物的方法，该方法包括将包含(如N→C方向所示的)(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)结构的接头偶联至抗体中包含的Gln残基的步骤，其中，
·(Sp1)是化学间隔物或不存在；
·(Sp2)是化学间隔物或不存在；
·(Sp3)是化学间隔物或不存在；
·K是赖氨酸或赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物；
·B是连接部分或有效载荷；
其中，接头经由赖氨酸残基、赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物的侧链中包含的伯胺偶联至抗体中包含的Gln残基；并且
其中，抗体与2-20摩尔当量的接头接触；和/或其中，抗体以2.5-20mg/mL范围内的浓度添加到偶联反应中；并且任选地，其中，转谷氨酰胺酶以1-15U/mg抗体范围内的浓度添加到偶联反应中。
在甚至更优选的实施方式中，本发明涉及一种通过转谷氨酰胺酶生产抗体-接头偶联物的方法，该方法包括将包含(如N→C方向所示的)(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)结构的接头偶联至抗体中包含的Gln残基的步骤，其中，
·(Sp1)是化学间隔物或不存在；
·(Sp2)是化学间隔物或不存在；
·(Sp3)是化学间隔物或不存在；
·K是赖氨酸或赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物；
·B是连接部分或有效载荷；
其中，接头经由赖氨酸残基、赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物的侧链中包含的伯胺偶联至抗体中包含的Gln残基；并且
其中，抗体与2.5-15摩尔当量的接头接触；和/或其中，抗体以2.5-20mg/mL范围内的浓度添加到偶联反应中；并且任选地，其中，转谷氨酰胺酶以1-10U/mg抗体范围内的浓度添加到偶联反应中。
在甚至更优选的实施方式中，本发明涉及一种通过转谷氨酰胺酶生产抗体-接头偶联物的方法，该方法包括将包含(如N→C方向所示的)(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)结构的接头偶联至抗体中包含的Gln残基的步骤，其中，
·(Sp1)是化学间隔物或不存在；
·(Sp2)是化学间隔物或不存在；
·(Sp3)是化学间隔物或不存在；
·K是赖氨酸或赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物；
·B是连接部分或有效载荷；
其中，接头经由赖氨酸残基、赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物的侧链中包含的伯胺偶联至抗体中包含的Gln残基；并且
其中，抗体与2.5-10摩尔当量的接头接触；和/或其中，抗体以5-20mg/mL范围内的浓度添加到偶联反应中；并且任选地，其中，转谷氨酰胺酶以2-10U/mg抗体范围内的浓度添加到偶联反应中。
在最优选的实施方式中，本发明涉及一种通过转谷氨酰胺酶生产抗体-接头偶联物的方法，该方法包括将包含(如N→C方向所示的)(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)结构的接头偶联至抗体中包含的Gln残基的步骤，其中，
·(Sp1)是化学间隔物或不存在；
·(Sp2)是化学间隔物或不存在；
·(Sp3)是化学间隔物或不存在；
·K是赖氨酸或赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物；
·B是连接部分或有效载荷；
其中，接头经由赖氨酸残基、赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物的侧链中包含的伯胺偶联至抗体中包含的Gln残基；并且
其中，抗体与2.5-8摩尔当量的接头接触；和/或其中，抗体以5-17mg/mL范围内的浓度添加到偶联反应中；并且任选地，其中，转谷氨酰胺酶以2-10U/mg抗体范围内的浓度添加到偶联反应中。
在另一实施方式中，本发明涉及一种通过转谷氨酰胺酶生产抗体-接头偶联物的方法，该方法包括将包含(如N→C方向所示的)(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)结构的接头偶联至抗体中包含的Gln残基的步骤，其中，
·(Sp1)是化学间隔物或不存在；
·(Sp2)是化学间隔物或不存在；
·(Sp3)是化学间隔物或不存在；
·K是赖氨酸或赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物；
·B是连接部分或有效载荷；
其中，接头经由赖氨酸残基、赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物的侧链中包含的伯胺偶联至抗体中包含的Gln残基；并且
其中，抗体与5-40摩尔当量的接头接触；和/或其中，抗体以5-17mg/mL范围内的浓度添加到偶联反应中；并且任选地，其中，转谷氨酰胺酶以2-10U/mg抗体范围内的浓度添加到偶联反应中。
在另一实施方式中，本发明涉及一种通过转谷氨酰胺酶生产抗体-接头偶联物的方法，该方法包括将包含(如N→C方向所示的)(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)结构的接头偶联至抗体中包含的Gln残基的步骤，其中，
·(Sp1)是化学间隔物或不存在；
·(Sp2)是化学间隔物或不存在；
·(Sp3)是化学间隔物或不存在；
·K是赖氨酸或赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物；
·B是连接部分或有效载荷；
其中，接头经由赖氨酸残基、赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物的侧链中包含的伯胺偶联至抗体中包含的Gln残基；并且
其中，抗体与5-20摩尔当量的接头接触；和/或其中，抗体以5-17mg/mL范围内的浓度添加到偶联反应中；并且任选地，其中，转谷氨酰胺酶以2-10U/mg抗体范围内的浓度添加到偶联反应中。
在本发明中优选的是，接头包括结构(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)，其中，接头经由接头的残基K中包含的伯胺偶联至抗体中的谷氨酰胺残基。在某些实施方式中，残基K是赖氨酸残基。然而，在某些实施方式中，残基K还可以是赖氨酸模拟物或赖氨酸衍生物，其条件是赖氨酸模拟物或赖氨酸衍生物在其氨基酸侧链中包括伯胺。
因此，在某些实施方式中，残基K可以是赖氨酸模拟物。如本文所使用的，术语“赖氨酸模拟物”是指具有不同于赖氨酸的结构，但具有与赖氨酸相似的特征的化合物，并且因此可以在不会显著改变肽或蛋白质的功能和/或结构的情况下用于替换肽或蛋白质中的赖氨酸。在某些实施方式中，赖氨酸模拟物可以在连接伯胺和α-碳原子的脂族链的长度或组成上与赖氨酸不同。因此，在某些实施方式中，赖氨酸模拟物可以是鸟氨酸、2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、2,5-二氨基戊酸、2,6-二氨基己酸或2,7-二氨基庚酸。在某些实施方式中，赖氨酸模拟物可以是β-氨基酸，诸如β-高赖氨酸。
在某些实施方式中，残基K可以是赖氨酸衍生物。如本文所使用的，术语“赖氨酸衍生物”是指赖氨酸或赖氨酸模拟物，其中，赖氨酸或赖氨酸模拟物中包含的一个或多个官能团被修饰或取代。在本发明中，优选的是赖氨酸衍生物的侧链中的氨基是未修饰的，从而可用于与蛋白质中的谷氨酰胺残基偶联。在残基K位于接头的C-末端位置的实施方式中，K可以是赖氨酸衍生物，其中，α-羧基被修饰或取代。在某些实施方式中，赖氨酸模拟物的α-羧基可以被酰胺化。
在本发明的范围内，基于赖氨酸的接头可以具有结构(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)。也就是说，接头可以包括一个或多个化学间隔物(Sp)。本文所使用的术语“化学间隔物”描述了共价附接到接头的化学残基和/或介于接头的两个化学残基之间的化学部分。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和(Sp3)各自独立地包含0至12个氨基酸残基。
也就是说，在某些实施方式中，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)可以存在或不存在。在存在(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)的实施方式中，(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)可以包含一个或多个氨基酸残基。在这样的实施方式中，(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)中的每一个可以包含0至12个氨基酸残基。必须注意的是，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)也可以包括非氨基酸残基，这将在下面更详细地公开。
化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)中包含的“氨基酸残基”可以是氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物。应当理解，术语氨基酸不仅包括α-氨基酸，还包括其他氨基酸，诸如β-氨基酸、γ-氨基酸或δ-氨基酸。α-氨基酸残基可以以其L-形式或D-形式存在于化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)中。在(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)包含手性β-氨基酸、γ-氨基酸或δ-氨基酸的实施方式中，手性β-氨基酸、γ-氨基酸或δ-氨基酸可以其S-形式或R-形式存在。由此，在最广义上，本文所使用的术语“氨基酸残基”可以指含有氨基(-NH2)和羧基(-COOH)的任何有机化合物。因此，无论何时在本公开中提及“氨基酸”或“氨基酸残基”，应当理解，术语氨基酸残基也可以包括氨基酸模拟物或衍生物。
进一步，应当理解，术语氨基酸残基不限于已知的蛋白原氨基酸组，即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、以及缬氨酸，而且还涵盖非经典氨基酸和非天然氨基酸。如在本文所使用的“非经典氨基酸(non-canonical amino acid)”可以是不是该蛋白原氨基酸组的一部分，但可以从天然来源获得的任何氨基酸。然而，必须注意的是，在天然存在的肽和/或蛋白质中也可能发现一些非经典氨基酸。
如在本文所使用的，“非天然氨基酸”或“合成氨基酸”可以是属于氨基酸的一般定义(即包括氨基和羧基)但在自然界中未发现的任何分子。因此，非天然氨基酸优选通过化学合成获得。应当理解，在某些情况下，非经典氨基酸和非天然氨基酸之间的区别可能是不确定的。例如，被定义为非天然氨基酸的氨基酸可以在稍后的时间点在自然界中被鉴定，从而被重新分类为非经典氨基酸。
非经典氨基酸或非天然氨基酸的实例可以是但不限于D-氨基酸(诸如，D-丙氨酸、D-精氨酸、D-甲硫氨酸)、高氨基酸(诸如，高丝氨酸、高精氨酸、高半胱氨酸、α-氨基己二酸)、N-甲基化氨基酸(诸如，肌氨酸、N-Me-亮氨酸)、α-甲基氨基酸(诸如，α-甲基-组氨酸、α-氨基异丁酸)、β-氨基酸(诸如，β-丙氨酸、D-3-氨基异丁酸、L-β-高丙氨酸)、γ-氨基酸(诸如，γ-氨基丁酸)、丙氨酸模拟物或衍生物(诸如，β-环丙基丙氨酸、苯基甘氨酸、脱氢丙氨酸、β-氰基丙氨酸、β-(3-吡啶基)-丙氨酸、β-(1,2,4-三唑-1-基)-丙氨酸、β-(1-哌嗪基)-丙氨酸)、苯丙氨酸模拟物或衍生物(诸如，4-碘苯丙氨酸、五氟-苯丙氨酸、萘基-丙氨酸、4-氨基苯丙氨酸)、精氨酸模拟物或衍生物(诸如，β-脲基丙氨酸、ω-甲基精氨酸)、赖氨酸模拟物或衍生物(诸如,(3-(3-甲基-3H-二氮杂环丙烷-3-基)丙氨基)羰基-l-赖氨酸、Nε,Nε,Nε-三甲基赖氨酸)、组氨酸模拟物或衍生物(诸如，2,5-二碘组氨酸、1-甲基组氨酸)、酪氨酸模拟物或衍生物(诸如，3-氨基酪氨酸、甲状腺原氨酸、3,5-二硝基酪氨酸、3-羟基-甲基-酪氨酸、O-磷酸-L-酪氨酸)、色氨酸模拟物或衍生物(诸如，5-羟基-色氨酸、1-甲基色氨酸)、丝氨酸模拟物或衍生物(诸如，β-(2-噻吩基)-丝氨酸、β-(3,4-二羟基苯基)-丝氨酸、O-磷酸丝氨酸)、苏氨酸模拟物或衍生物(诸如，异苏氨酸、O-磷酸苏氨酸)、脯氨酸模拟物或衍生物(诸如，羟脯氨酸、3,4-脱氢-脯氨酸、焦谷氨酸、硫杂脯氨酸、顺式-八氢吲哚-2-羧酸)、亮氨酸和异亮氨酸模拟物或衍生物(诸如，异亮氨酸、正亮氨酸、4,5-脱氢亮氨酸、(4S)-4-羟基-L-异亮氨酸)、缬氨酸模拟物或衍生物(诸如，正缬氨酸、γ-羟基缬氨酸)、瓜氨酸模拟物或衍生物(诸如，硫瓜氨酸、高瓜氨酸)、半胱氨酸模拟物或衍生物(诸如，青霉胺、硒代半胱氨酸、丁硫氨酸-磺基肟)、甲硫氨酸模拟物或衍生物(诸如，S-甲基甲硫氨酸、L-甲硫氨酸砜、L-甲硫氨酸亚砜、L-甲硫氨酸磺基肟、硒代甲硫氨酸)、天冬氨酸模拟物或衍生物(诸如，DL-苏-β-羟基天冬氨酸、L-天冬氨酸β-甲酯)、谷氨酸模拟物或衍生物(诸如，γ-亚甲基谷氨酸、γ-羧基谷氨酸、γ-羟基谷氨酸、L-谷氨酸5-甲酯、L-2-氨基庚二酸)、天冬酰胺模拟物或衍生物(诸如，L-苏-3-羟基天冬酰胺、N,N-二甲基-L-天冬酰胺、L-2-氨基-2-羧基乙磺酰胺、5-重氮-4-氧代-L-正缬氨酸)、谷氨酰胺模拟物或衍生物(诸如，4-F-(2S,4R)-氟谷氨酰胺、γ-谷氨酰基甲酰胺、茶氨酸、L-谷氨酸γ-单草酸盐)、包含环状部分的氨基酸(诸如，4-氨基哌啶-4-羧酸、氮杂环丁烷-2-羧酸、哌啶酸、1-氨基环戊羧酸、刺氨酸(spinacine))、或包含生物正交部分的氨基酸(诸如，炔丙基甘氨酸、α-烯丙基甘氨酸、L-叠氮基-高丙氨酸、对-苯甲酰基-1-苯丙氨酸、对-2-氟乙酰基-1-苯丙氨酸、(S)-2-氨基-3-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)丙酸)。
除上述α-氨基酸外，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)可以包含一种或多种β-氨基酸、γ-氨基酸、δ-氨基酸或ε-氨基酸。因此，在某些实施方式中，接头可以是肽模拟物。肽模拟物可以非排他地包含在两个α-氨基酸之间形成的经典肽键，而是可以另外或替代地包含一个或多个酰胺键，该酰胺键分别在α氨基酸与β-氨基酸、γ-氨基酸、δ-氨基酸或ε-氨基酸之间，或者在两个β-氨基酸、γ-氨基酸、δ-氨基酸、δ-氨基酸或ε-氨基酸之间形成。因此，在接头被描述为肽的本发明的任何实例中，应当理解，接头也可以是肽模拟物，并且由此非排他地由α-氨基酸组成，而是可以包含一个或多个β-氨基酸、γ-氨基酸、δ-氨基酸或ε-氨基酸或未被归类为氨基酸的分子。可以包含在本发明的接头中的β-氨基酸、γ-氨基酸、δ-氨基酸或ε-氨基酸的实例包括但不限于β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、6-氨基己酸和他汀类。
而且，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)可以包括氨基酸衍生物和/或氨基酸模拟物。在(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)包含一种或多种氨基酸衍生物的实施方式中，优选氨基酸衍生物具有游离氨基和羧基，使得它们可以形成肽或异肽键。在(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)包含一种或多种氨基酸衍生物的实施方式中，氨基酸模拟物可以具有游离的氨基和羧基，使得它们可以形成肽或异肽键。然而，在某些实施方式中，氨基酸模拟物或衍生物可以具有不阻止肽键形成的取代氨基。这种氨基酸模拟物或衍生物的实例可以是N-甲基化氨基酸，诸如，肌氨酸或N-甲基亮氨酸(N-Me-leucine)。
在包含在(Sp1)或(Sp3)中的氨基酸残基是末端氨基酸残基的实施方式中，末端氨基酸残基可以包含修饰的、受保护的或取代的N-末端氨基或C-末端羧基。
进一步，氨基酸模拟物或衍生物可以是包含衍生氨基的氨基酸，诸如，脯氨酸或其他环状氨基酸(诸如，氮杂环丁烷-2-羧酸、哌啶酸或刺氨酸)的模拟物或衍生物。进一步，氨基酸模拟物还可以包括取代标准氨基酸的氨基和/或羧基的其他官能团，这允许氨基酸模拟物与相邻的氨基酸、氨基酸衍生物和/或氨基酸模拟物形成替代键，并且形成肽模拟物。
如本文中所使用的术语“氨基酸模拟物”是指具有不同于特定氨基酸的结构，但以类似于特定氨基酸的方式起作用的化合物，并因此可以用于取代特定的氨基酸。如果氨基酸模拟物至少在某种程度上满足与其模拟的氨基酸相似的结构和/或功能特征，则称其以与特定氨基酸相似的方式起作用。术语“氨基酸衍生物”是指本文定义的氨基酸，其中，氨基酸中包含的一个或多个官能团被修饰或取代。氨基酸衍生物可以优选是蛋白质原性氨基酸或非经典氨基酸的衍生物。氨基酸衍生物的任何官能团都可以被取代或修饰。
在接头包含一个或多个末端氨基酸残基的实施方式中，末端氨基酸残基可以被保护。例如，在(Sp1)包含N-末端氨基酸残基的实施方式中，N-末端氨基可以被保护。例如，在某些实施方式中，包括在间隔物(Sp1)中的N-末端氨基酸残基可以被乙酰化。在其他实施方式中，赖氨酸残基K可以是接头的N-末端氨基酸。在这样的实施方式中，赖氨酸、赖氨酸模拟物或赖氨酸衍生物的N-末端氨基可以例如通过乙酰化被保护。在某些实施方式中，连接部分B或有效载荷B可以是氨基酸或基于氨基酸。在这样的实施方式中，基于氨基酸的有效载荷或连接部分B的N-末端氨基可以例如通过乙酰化被保护。
同样，在(Sp3)包含C末端氨基酸残基的实施方式中，C末端羧基可以被保护。例如，在某些实施方式中，间隔物(Sp3)中的C-末端氨基酸残基可以被酰胺化。在其他实施方式中，K残基可以是接头的C-末端氨基酸。在这样的实施方式中，赖氨酸、赖氨酸模拟物或赖氨酸衍生物的C-末端羧基可以例如通过酰胺化被保护。在某些实施方式中，连接部分B或有效载荷B可以是氨基酸或基于氨基酸。在这样的实施方式中，基于氨基酸的有效载荷或连接部分B的C-末端羧基可以例如通过酰胺化被保护。
在某些实施方式中，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)中的每一个可以包含0至12个氨基酸残基，包括氨基酸衍生物和氨基酸模拟物。也就是说，在某些实施方式中，(Sp1)可以包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基，(Sp2)可以包括0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基，并且(Sp3)可以包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸残基。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，接头包含不超过25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4个氨基酸残基。
也就是说，在某些实施方式中，接头可以包含25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸残基，包括氨基酸模拟物和氨基酸衍生物。应当理解，当B是基于氨基酸的连接部分或有效载荷时，在接头中包含的氨基酸残基(包括氨基酸模拟物和氨基酸衍生物)优选地是在K残基、化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)中、以及在某些实施方式中也在B中包含的氨基酸残基。
在某些实施方式中，接头可以包含2至25个氨基酸残基，包括氨基酸模拟物和氨基酸衍生物。在其他实施方式中，接头可以包含2至20个氨基酸残基，包括氨基酸模拟物和氨基酸衍生物。在其他实施方式中，接头可以包含2至15个氨基酸残基，包括氨基酸模拟物和氨基酸衍生物。在其他实施方式中，接头可以包含2至10个氨基酸残基，包括氨基酸模拟物和氨基酸衍生物。在其他实施方式中，接头可以包含3至10个氨基酸残基，包括氨基酸模拟物和氨基酸衍生物。在其他实施方式中，接头可以包含3至8个氨基酸残基，包括氨基酸模拟物和氨基酸衍生物。在其他实施方式中，接头可以包含3至6个氨基酸残基，包括氨基酸模拟物和氨基酸衍生物。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，接头的净电荷是中性或正的。
在某些实施方式中，接头是肽接头(或本文所公开的肽模拟物)。也就是说，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)(如果存在)仅由氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物组成。肽的净电荷通常在中性pH(7.0)计算。在最简单的方法中，净电荷是通过添加带正电荷的氨基酸残基(Arg和Lys以及任选的His)的数量和带负电荷的氨基酸残基(Asp和Glu)的数量相加并且计算这两组之差来确定。在接头包括非经典氨基酸或其中带电官能团被修饰或取代的氨基酸衍生物的情况下，本领域技术人员知道在中性pH下测定非经典氨基酸或者氨基酸衍生物的电荷的方法。
在某些实施方式中，在(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)中包含的有效载荷、连接部分B或任何非氨基酸部分也可以有助于接头的净电荷。然而，本领域技术人员知道优选在中性pH(7.0)计算整个接头(包括任何非氨基酸部分)的净电荷的方法。
在某些实施方式中，接头的净电荷仅基于接头中包含的氨基酸残基(包括氨基酸模拟物和氨基酸衍生物)来计算。由此，在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，在接头中包含的氨基酸残基的净电荷是中性或正的。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，接头不包含带负电荷的氨基酸残基。
也就是说，接头可以不含带负电荷的氨基酸残基(包括氨基酸模拟物和氨基酸衍生物)。带负电荷的氨基酸残基是在中性pH(7.0)下携带负电荷的氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物。带负电荷的典型氨基酸是谷氨酸和天冬氨酸。然而，本领域已知带负电荷的非经典氨基酸、氨基酸模拟物和氨基酸衍生物。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，接头包括除残基K之外的至少一个带正电荷的氨基酸残基。即，(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)可以包括至少一个带正电荷的氨基酸。在某些实施方式中，(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)包含至少一个组氨酸残基或精氨酸残基。然而，在本文优选的是，接头不包括序列基序RK，其中，R是精氨酸、精氨酸模拟物或精氨酸衍生物，并且其中，K是赖氨酸、赖氨酸模拟物或赖氨酸衍生物。也就是说，在特别优选的实施方式中，本发明涉及一种通过转谷氨酰胺酶生产抗体-接头偶联物的方法，该方法包括将包含(如N→C方向所示的)(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)结构的接头偶联至抗体中包含的Gln残基的步骤，其中，
·(Sp1)是化学间隔物或不存在；
·(Sp2)是化学间隔物或不存在；
·(Sp3)是化学间隔物或不存在；
·K是赖氨酸或赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物；
·B是连接部分或有效载荷；
其中，接头经由赖氨酸残基、赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物的侧链中包含的伯胺偶联至抗体中包含的Gln残基；
其中，抗体与小于80摩尔当量的接头接触；并且
其中，残基K不直接偶联至N-末端精氨酸、精氨酸模拟物或精氨酸衍生物。
在某些实施方式中，(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)包含至少一个组氨酸残基。在某些实施方式中，组氨酸残基直接连接至赖氨酸残基、赖氨酸模拟物或赖氨酸衍生物。也就是说，在某些实施方式中，根据本发明的接头包括基序HK。
在具体实施方式中，本发明涉及一种通过转谷氨酰胺酶生产抗体-接头偶联物的方法，该方法包括将包含(如N→C方向所示的)(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)结构的接头或由(如N→C方向所示的)(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)结构组成的接头偶联至抗体中包含的Gln残基的步骤，其中，
·(Sp1)是化学间隔物或不存在；
·(Sp2)是化学间隔物或不存在；
·(Sp3)是化学间隔物或不存在；
·K是赖氨酸或赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物；
·B是连接部分或有效载荷；
其中，接头经由赖氨酸残基、赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物的侧链中包含的伯胺偶联至抗体中包含的Gln残基；
其中，抗体与小于80摩尔当量的接头接触；并且
其中，接头包含至少一个组氨酸残基，特别是其中，至少一个组氨酸残基直接连接至残基K，特别是其中，接头包含序列基序HK。
在具体实施方式中，本发明涉及一种抗体-接头偶联物，其包括包含(如N→C方向所示的)(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)结构的接头或由(如N→C方向所示的)(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)结构组成的接头，
其中，
·(Sp1)是化学间隔物或不存在；
·(Sp2)是化学间隔物或不存在；
·(Sp3)是化学间隔物或不存在；
·K是赖氨酸或赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物；
·B是连接部分或有效载荷；
其中，接头经由赖氨酸残基、赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物的侧链中包含的伯胺偶联至抗体中包含的Gln残基；并且
其中，接头包含至少一个组氨酸残基，特别是其中，至少一个组氨酸残基直接连接至残基K，特别是其中，接头包含序列基序HK。
除了或代替氨基酸残基(包括氨基酸模拟物和衍生物)，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)可以包括非氨基酸部分或由非氨基酸部分组成。
也就是说，在某些实施方式中，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)可以不完全由氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物组成。也就是说，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)可以包括非氨基酸组分，或者可以仅由非氨基酸组分组成。在某些实施方式中，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)可以包括氨基酸和非氨基酸组分。
例如但不限于，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)中的每一个可以包括1至200个原子的含碳骨架，任选地在一个或多个原子处被取代的至少10个原子(例如10至100个原子或20至100个原子)的含碳骨架，任选地其中，含碳骨架是线性烃或包含环状基团、对称或不对称支链烃、单糖、二糖、线性或支链(不对称支化或对称支化)的寡糖、其他天然线性或支链(不对称支化或对称支化)的低聚物、或者更一般地由任何链增长或逐步增长聚合过程产生的任何二聚体、三聚体或更高的低聚物(线性的、不对称支化或对称支化)。
(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)可以是任何线性的、支链的和/或环状的C2-30烷基、C2-30烯基、C2-30炔基、C2-30杂烷基、C2-30-杂烯基、C2-30杂炔基，任选地其中，可以插入一个或多个同环芳族化合物基团或杂环化合物基团；特别是任何直链或支链的C2-5烷基、C5-10烷基、C11-20烷基、-O-C1-5烷基、-O-C5-10烷基、-O-C11-20烷基、或(CH2-CH2-O-)1-24或(CH2)x1-(CH2-O-CH2)1-24-(CH2)x2-基(其中，x1和x2独立地是选自0至20的整数)、氨基酸、寡肽、聚糖、硫酸盐、磷酸盐或羧酸盐。在一些实施方式中，(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)可以包括C2-6烷基。
在某些实施方式中，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)可以包括一个或多个聚乙二醇(PEG)部分或类似的缩聚物，诸如，聚(甲基丙烯酸羧甜菜碱)(pCBMA)、聚恶唑啉、聚甘油、聚乙烯吡咯烷酮、或聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(pHEMA)。聚乙二醇(PEG)是具有从工业制造到医学的许多应用的聚醚化合物。PEG也被称为聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯(POE)，这取决于其分子量。PEG的结构通常表示为H-(O-CH2-CH2)n-OH。本领域技术人员知晓官能化缩聚物的方法，使得它们可以偶联至氨基酸残基或有效载荷。
因此，在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，接头包括一个或多个PEG部分。在某些实施方式中，PEG部分可以包含在化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)中。在某些实施方式中，在接头中包含的每个PEG部分可以包含2至20个乙二醇单体、2至15个乙二醇单体、2至10个乙二醇单体、或2至5个乙二醇单体。在某些实施方式中，将PEG部分包含在(Sp2)中以将连接部分或有效载荷直接连接至K残基。在某些实施方式中，将PEG部分包含在(Sp2)中以将连接部分或有效载荷连接至在(Sp2)中包含的氨基酸残基。在某些实施方式中，将PEG部分包含在(Sp2)中以将K残基连接到自裂解部分，该自裂解部分又连接至有效载荷。在某些实施方式中，将PEG部分包含在(Sp2)中以将在(Sp2)中包含的氨基酸残基连接至自裂解部分，该自裂解部分又连接至有效载荷。
在某些实施方式中，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)可以包括葡聚糖。本文所使用的术语“葡聚糖”是指由不同长度的链组成的复杂支链葡聚糖，其可以具有范围从3kDa至2000kDa的重量。直链通常由葡萄糖分子之间的α-1,6糖苷键组成，而支链则从α-1,3键开始。葡聚糖可以由蔗糖合成，例如由乳酸菌合成。在本发明的上下文中，用作载体的葡聚糖可以优选具有约15kDa至1500kDa的分子量。
在某些实施方式中，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)可以包括寡核苷酸。本文所使用的术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的低聚物或聚合物、以及非天然存在的寡核苷酸。由于更高的稳定性，寡核苷酸优选为DNA的聚合物。
在某些实施方式中，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)(如果存在)仅由氨基酸残基(包括氨基酸模拟物和衍生物)和PEG部分组成。在某些实施方式中，如果存在的话，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)仅由氨基酸残基(包括氨基酸模拟物和衍生物)组成。在某些实施方式中，包含在化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)中的所有氨基酸残基都是α-L-氨基酸。也就是说，在某些实施方式中，不包括有效载荷或连接部分B的接头仅由氨基酸残基组成。在某些实施方式中，不包括有效载荷或连接部分B的接头仅由α-L-氨基酸残基组成。这样的基于肽的接头可以在N-末端和/或C-末端包含保护基团。也就是说，N-末端氨基可以被乙酰化和/或C-末端羧基可以被酰胺化。
必须注意，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)可以具有相同的结构。然而，优选的是，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)中的每一个具有不同的结构，和/或并非所有的化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)都同时存在。也就是说，在某些实施方式中，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)中只有一个或两个可以存在于接头中。
在某些实施方式中，K残基可以直接连接至一个或多个小的疏水性氨基酸残基。例如，在某些实施方式中，K残基可以直接连接至一个或多个丙氨酸残基。
在本发明中，优选的是，接头经由残基K的侧链中包含的伯胺偶联至抗体。由此，优选的是，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和/或(Sp3)不包括额外的赖氨酸残基、赖氨酸模拟物或赖氨酸衍生物，它们可以在基于转谷氨酰胺酶的偶联反应中用作额外的胺供体。在其他实施方式中，在接头中包含的任何游离N-末端氨基可以被取代(例如乙酰化)，使得它不能充当转谷氨酰胺酶的底物。
本发明的接头还包括至少一个连接部分或有效载荷B。本发明的接头可以用于在一步偶联过程中将有效载荷直接偶联至抗体。在其他实施方式中，在第一步骤中包含一个或多个连接部分的接头可以偶联至抗体，然后在第二步骤中一个或更多个有效载荷可以连接到抗体-接头偶联物。下表1阐明了本文中所使用的两个术语：
表1:一步偶联和两步偶联
在某些实施方式中，接头可以包括一个或多个连接部分B。由此，在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，B是连接部分。
本文所使用的“连接部分”通常指至少双功能的分子。在本发明中，连接部分包括允许连接部分与本发明的接头偶联的第一官能团和可以用于在接头与抗体偶联之前或之后将额外分子偶联至接头的第二官能团。在某些实施方式中，本发明的连接部分是氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物。在这样的实施方式中，连接部分优选经由其氨基连接到接头，而氨基酸侧链中包含的官能团可以用于将额外的分子偶联至接头。可替代地，连接部分可以通过其羧基连接到接头，而氨基酸侧链中包含的官能团可以用于将额外的分子偶联至接头。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中连接部分B包括
·生物正交标记基团、或
·用于交联的非生物正交实体。
术语“生物正交标记基团”已经由Sletten和伯Bertozzi建立(“A BioorthogonalQuadricyclane Ligation(生物正交双环连接)”，J Am Chem Soc，2011，133(44)，17570-17573)用于指定可以导致化学反应在活体系统内发生而不干扰天然生物化学过程的反应性基团。“用于交联的非生物正交实体”可以是包括第一官能团或由第一官能团组成的任何分子，其中，第一官能团可以化学或酶促交联到包括兼容的第二官能团的有效载荷。即使在交联反应是非生物正交反应的情况下，优选的是，除了有效载荷与接头的交联之外，该反应不会对抗体引入额外的修饰。鉴于上述情况，连接部分B可以由“生物正交标记基团”或“非生物正交实体”组成，或者可以包括“生物正交标记基团”和“非生物正交实体”。例如，在连接部分Lys(N3)的情况下，在本发明中，整个Lys(N3)和叠氮基两者都可以被视为生物正交标记基团。Lys(N3)是指6-叠氮基-L-赖氨酸，也可以缩写为K(N3)。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，生物正交标记基团或用于交联的非生物正交实体由至少一个分子或部分组成或者包含至少一个分子或部分，该分子或部分选自由以下组成的组：
·-N-N≡N或-N3；
·Lys(N3)；
·四嗪；
·炔烃；
·应变环辛炔；
·BCN；
·应变烯烃；
·光反应性基团；
·醛；
·酰基三氟硼酸酯；
·蛋白质降解剂(‘PROTAC’)；
·环戊二烯/螺环戊二烯；
·硫代选择性亲电体；
·-SH；以及
·半胱氨酸。
在接头中包含的用于交联的生物正交标记基团或非生物正交实体可以例如参与表2中所示的任何结合反应：
表2
连接部分B可以是或包含表2中所谓的“结合配偶体1”或“结合配偶体2”。
在某些实施方式中，连接部分B可以是半胱氨酸、半胱氨酸模拟物或具有游离巯基的半胱氨酸衍生物。
此类Cys残基(或模拟物或衍生物)的游离巯基可以偶联至包含硫代选择性亲电体(诸如马来酰亚胺)的有效载荷构建体。包含马来酰亚胺部分的毒素构建体已被频繁使用，并且还被医学当局批准，如Adcetris。因此，可以将包括MMAE毒素的毒素构建体偶联至本发明的接头中的Cys残基的游离巯基。
必须注意的是，在本发明的方法中，还可以使用其他硫代选择性亲电子试剂(诸如3-芳基丙腈(APN)或磷酸酰胺化物(phosphonamidate))来代替马来酰亚胺。
因此，在根据本发明的接头中提供Cys残基具有允许使用现成的毒素-马来酰亚胺构建体来产生抗体-有效载荷偶联物的优点，或更一般地，能够完全利用Cys-马来酰亚胺结合化学的优点。同时，可以使用现成的抗体，其不必去糖基化。在具体的实施方式中，Cys残基可以是基于氨基酸的接头中的C-末端或链内的。
在另一实施方式中，连接部分B可以包含叠氮基团。本领域技术人员知晓包含可以并入根据本发明的接头的叠氮基团的分子，诸如6-叠氮基-赖氨酸(Lys(N3))或4-叠氮基-高丙氨酸(Xaa(N3))。包含叠氮基团的连接部分可以用作不同生物正交反应中的底物，诸如应变促进的叠氮-炔环加成反应(SPAAC)、铜催化的叠氮化物-炔环加成反应(CuAAC)或施陶丁格(Staudinger)连接。例如，在某些实施方式中，包括环辛炔衍生物(诸如，DBCO、DIBO、BCN或BARAC)的有效载荷可以通过SPAAC偶联至包括叠氮化物基团的接头。
在另一实施方式中，连接部分B可以包括四嗪基团。本领域技术人员知晓可以并入根据本发明的接头中的含四嗪的分子，优选包含四嗪基团的氨基酸衍生物。包含四嗪的连接部分可以在生物正交四嗪连接中用作底物。例如，在某些实施方式中，包含环丙烯、降冰片烯、降冰片烯衍生物或环辛炔基团(诸如二环[6.1.0]壬炔(BCN))的有效载荷可以偶联至包含四嗪基团的接头。
某些实施方式中，连接部分B可以包括环状二烯，诸如环戊二烯衍生物。Amant等人“Tuning the Diels-Alder Reaction for Bioconjugation to Maleimide Drug-Linkers(调节生物偶联至马来酰亚胺药物接头的Diels-Alder反应)”，Bioconjugate Chem.2018,29,7,2406-2414；和Amant等人“A Reactive Antibody Platform for One-StepProduction of Antibody–Drug Conjugates through a Diels-Alder Reaction withMaleimide(通过与马来酰亚胺的Diels-Alder反应一步生产抗体-药物偶联物的反应性抗体平台)”，Bioconjugate Chem.2019,30,9,2340-2348已经描述了可以连接到包含马来酰亚胺的有效载荷分子的潜在环戊二烯衍生物。
在某些实施方式中，连接部分B可以包括光反应性基团。本文中所使用的术语“光反应性基团”是指对施加的外部能源做出反应以产生活性物质，从而与相邻化学结构(例如，可提取的氢)共价键合的化学基团。光反应性基团的实例是但不限于芳基叠氮化物，诸如苯基叠氮化物、邻-羟基苯基叠氮化物、间-羟基苯基叠氮化物、四氟苯基叠氮化物、邻-硝基苯基叠氮化物、间-硝基苯基叠氮化物、或叠氮基-甲基香豆素、双吖丙啶、补骨脂素或苯酮。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，该方法包括将一个或多个有效载荷偶联至连接部分B的进一步步骤。
代替在一步过程中将包含一个或多个有效载荷的接头直接偶联至抗体，在某些实施方式中，本发明涉及两步过程，其中，包含至少一个连接部分B的接头在第一步中与抗体偶联，并且一个或多个有效载荷可以随后在第二步中与连接部分B偶联。
本文中使用的术语“有效载荷”表示任何天然存在或合成生成的分子，包括小分子量分子或化学合成的化学实体以及需要通过宿主细胞发酵产生或也可以化学合成并赋予抗体新功能的大分子或生物实体。应当理解，有效载荷可以包括进一步的结构或官能团，该结构或官能团允许有效载荷与包含在接头中的连接部分或接头的其他部分(诸如，化学间隔物(Sp1)和/或(Sp3)或K残基)偶联。
在两步偶联方法中，有效载荷可以通过本领域已知的任何合适的方法连接至连接部分。优选地，有效载荷可以连接到本文所公开的生物正交标记基团或用于交联的非生物正交实体中的任一者。也就是说，有效载荷优选包括与在至少一个连接部分B中包含的生物正交标记基团或用于交联的非生物正交实体兼容的官能团。
可以用于将有效载荷连接到包括在连接部分B中的生物正交标记基团的几种生物正交反应是本领域已知的。例如，已经开发了许多满足生物正交性的要求的化学连接策略，包括叠氮化物与环辛炔之间(也称为无铜点击化学，Baskin等人(“Copper-free clickchemistry for dynamic in vivo imaging(用于动态体内成像的无铜点击化学)”，Proceedings of the National Academy of Sciences.104(43)：16793-7))、在硝酮与环辛炔之间(Ning等人(“Protein Modification by Strain-Promoted Alkyne-NitroneCycloaddition(应变促进的炔烃-硝酮环加成修饰蛋白质)”，Angewandte ChemieInternational Edition.49(17)：3065))的1,3-偶极环加成；醛和酮形成肟/腙(Yarema等人(“Metabolic Delivery of Ketone Groups to Sialic Acid Residues.ApplicationTo Cell Surface Glycoform Engineering(酮基向唾液酸残基的代谢传递，应用于细胞表面糖型工程)”，生物化学杂志，273(47)：31168-79))；四嗪连接(Blackman等人(“TheTetrazine Ligation:Fast Bioconjugation based on Inverse-electron-demandDiels-Alder Reactivity(四嗪连接：基于反电子需求Diels-Alder反应性的快速生物偶联)”，Journal of the American Chemical，130(41)：13518-9))；基于异腈的点击反应(等人(“Exploring isonitrile-based click chemistry for ligation withbiomolecules(探索用于生物分子连接的基于异腈的点击化学)”，Organic&BiomolecularChemistry，9(21)：7303))；以及最近的四环烷连接(Sletten和Bertozzi(JACS，“ABioorthogonal Quadricyclane Ligation(生物正交四环烷连接)”，J Am Chem Soc，2011，133(44)，17570-17573))；铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC，Kolb&Sharpless(“The growing impact of click chemistry on drug discovery(点击化学对药物发现的日益增长的影响)”，Drug Discov Today.8(24)：1128-1137))、应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(SPAAC，Agard等人(“A Comparative Study of Bioorthogonal Reactions withAzides(与叠氮化物的生物正交反应的比较研究)”，ACS Chem.Biol.1:644-648))，或应变促进的炔-硝基酮环加成(SPANC，MacKenzie等人(“Strain-promoted cycloadditionsinvolving nitrones and alkynes-rapid tunable reactions for bioorthogonallabeling(应变促进的环加成涉及用于生物正交标记的硝基酮和炔烃快速可调反应)”，Curr Opin Chem Biol.21:81-8))。所有这些文件通过引用合并于此，以提供充分的公开披露，并避免冗长的重复。
应当理解，在接头已经通过转谷氨酰胺酶与抗体的Gln残基偶联之后，有效载荷优选与本发明的接头中包含的生物正交标记基团或用于交联的非生物正交实体偶联。然而，本发明还包括抗体-接头偶联物，其中，在第一步骤中将一个或多个有效载荷偶联至包含至少一个连接部分B的接头，并且其中在第二步骤中通过转谷氨酰胺酶将所得接头-有效载荷构建体偶联至抗体。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，一个或多个有效载荷经由点击反应偶联至连接部分B。
也就是说，一个或多个有效载荷可以在点击反应，特别是本文公开的任何点击反应中连接至连接部分B。
在特别优选的实施方式中，至少一种有效载荷可以经由硫醇-马来酰亚胺偶联与接头中包含的连接部分B偶联。也就是说，在某些实施方式中，有效载荷可以包括马来酰亚胺基团，并且连接部分B可以是包括硫醇基团的分子，诸如但不限于半胱氨酸残基或半胱氨酸模拟物，诸如同型半胱氨酸。然而，B也可以是包含游离巯基的非氨基酸分子。在另一实施方式中，有效载荷可以包括游离硫醇基团，并且连接部分B可以包括马来酰亚胺基团。
在另一特别优选的实施方式中，至少一种有效载荷可以经由应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(SPAAC)与接头中包含的连接部分B偶联。即，在某些实施方式中，有效载荷可以包含炔基(诸如但不限于环辛炔基(cycloocytne group))，并且该连接部分B可以是包含叠氮基团的分子(诸如但不限于在本文所公开的赖氨酸衍生物Lys(N3)。然而，B还可以是包含游离叠氮基团的非氨基酸分子。在另一实施方式中，有效载荷可以包括炔基(诸如，环辛炔基)，并且连接部分B可以包括叠氮化物基。
除了接头中的连接部分与有效载荷中的官能团之间的点击反应之外，有效载荷可以通过本领域已知的任何酶促或非酶促反应共价结合到连接部分。
优选有效载荷经由共价键连接到连接部分。然而，在某些实施方式中，有效载荷可以经由强非共价键连接到连接部分。即，在某些实施方式中，连接部分B可以包括生物素部分，诸如但不限于赖氨酸衍生物生物胞蛋白。在这样的实施方式中，包含链亲和素部分的有效载荷可以连接到包含生物素部分的接头。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，B是有效载荷。
在某些实施方式中，有效载荷可以已经是接头的一部分，使得有效载荷可以在一步过程中与抗体偶联。在这样的实施方式中，优选通过化学合成将接头偶联至接头。有效载荷优选地偶联至在接头中包含的化学间隔物或直接偶联至K残基。在有效载荷与氨基酸残基(包括氨基酸模拟物和衍生物)偶联的实施方式中，有效载荷可以与氨基酸残基的C-末端羧基或N-末端氨基偶联。可替代地，有效载荷可以与在氨基酸残基的侧链中包含的官能团偶联。本领域技术人员知晓使有效载荷官能化的方法，使得它们可以偶联至羧基、氨基或氨基酸侧链。
进一步，本领域技术人员知晓通过化学合成将有效载荷偶联至基于氨基酸的接头的方法。例如，可以通过化学合成将包含胺的有效载荷、或包含硫醇的有效载荷(例如，美登素类似物)、或包含羟基的有效载荷(例如，SN-38类似物)附接到基于氨基酸的接头的C-末端。然而，本领域技术人员知晓可以用于通过化学合成将有效载荷偶联至氨基酸或氨基酸衍生物的N-末端、C-末端或侧链的进一步反应和反应性基团。可以用于通过化学合成将有效载荷偶联至基于氨基酸的接头的典型反应包括但不限于：肽偶联、活化的酯偶联(NHS酯、PFP酯)、点击反应(CuAAC、SPAAC)、迈克尔加成(硫醇-马来酰亚胺偶联)。有效载荷与肽的偶联在现有技术中已经被广泛描述，例如由Costoplus等人(“Peptide-Cleavable Self-immolative Maytansinoid Antibody-Drug Conjugates Designed To Provide ImprovedBystander Killing(设计用于提供改进的Bystander杀伤的肽-可切割的自裂解类美登素抗体-药物偶联物)”，ACS Med Chem Lett.2019Sep 27；10(10)：1393-1399)；Sonzini等人(“Improved Physical Stability of an Antibody-Drug Conjugate Using Host-GuestChemistry(使用主体-客体化学改善抗体-药物偶联物的物理稳定性)”，BioconjugChem.2020Jan 15；31(1)：123-129)；Bodero等人(“Synthesis and biologicalevaluation of RGD and isoDGR peptidomimetic-α-amanitin conjugates for tumor-targeting(用于肿瘤靶向的RGD和异DGR肽模拟物-α-鹅膏蕈碱偶联物的合成和生物学评价)”，Beilstein J.Org.Chem.2018,14,407–415)；Nunes等人(“Use of a nextgeneration maleimide in combination with THIOMABTMantibody technology deliversa highly stable,potent and near homogeneous THIOMABTMantibody-drug conjugate(TDC)(下一代马来酰亚胺与THIOMABTM抗体技术的联合使用提供了高度稳定、有效且几乎均质的THIOMABTM抗体-药物偶联物(TDC)”，RSC Adv.,2017，7，24828-24832)；Doronina等人(“Enhanced activity of monomethylauristatin F through monoclonal antibodydelivery:effects of linker technology on efficacy and toxicity(通过单克隆抗体递送的单甲基澳瑞他汀F的增强活性：接头技术对功效和毒性的影响)”，BioconjugChem.2006，Jan-Feb；17(1):114-24)；Nakada等人(“Novel antibody drug conjugatescontaining exatecan derivative-based cytotoxic payloads(含有基于依喜替康衍生物的细胞毒性有效载荷的新型抗体药物偶联物)”，Bioorg Med Chem Lett.2016Mar 15；26(6):1542-1545)；以及Dickgiesser等人(“Site-Specific Conjugation of NativeAntibodies Using Engineered Microbial Transglutaminases(利用工程微生物转谷氨酰胺酶进行天然抗体的位点特异性偶联)”，Bioconjug Chem.2020,Mar 12,doi:10.1021/acs.bioconjchem.0c00061)。
应当理解，有效载荷可以偶联至根据本发明的基于肽或包含肽的接头的N-末端或C-末端。在某些实施方式中，有效载荷可以直接偶联至肽或氨基酸残基的N-末端氨基或C-末端羧基。
本领域技术人员知晓适合于将有效载荷偶联至氨基酸残基的反应性基团。例如，包含胺的有效载荷可以经由酰胺键与氨基酸残基的C-末端羧基偶联。可替代地，包含硫醇基或羟基的有效载荷可以分别经由硫酯或酯键与氨基酸的C-末端羧基偶联。包含羧酸基团的有效载荷可以经由酰胺键与氨基酸残基的N-末端氨基偶联。
在某些实施方式中，有效载荷可以间接偶联至根据本发明的接头中包含的肽或氨基酸残基的N-末端或C-末端。本领域技术人员知晓可以用于将有效载荷与根据本发明的接头中包含的氨基酸残基的N-末端氨基或C-末端羧基的接头分子偶联。
在某些实施方式中，包含羟基的有效载荷可以经由接头分子与氨基酸残基的N-末端偶联。例如，包含羟基的有效载荷可以经由氨基甲酸酯接头分子与N-末端氨基偶联。
在某些实施方式中，包含硫醇基的有效载荷可以经由接头分子与氨基酸残基的N-末端偶联。例如，包含硫醇基的有效载荷可以经由硫代氨基甲酸酯接头分子与N-末端氨基偶联。可替代地，包含硫醇基的有效载荷可以经由包含羧基和硫醇基的烷基接头分子与N-末端氨基偶联。在某些实施方式中，烷基接头分子可以是3-巯基丙酸接头分子，其中，有效载荷与3-巯基丙酸接头分子中包含的硫醇基形成二硫键。
在某些实施方式中，包含酰胺基的有效载荷可以经由接头分子与氨基酸残基的N-末端偶联。例如，包含胺基的有效载荷可以经由二羧酸接头分子与N-末端氨基偶联，其中，二羧酸接头与有效载荷和N-末端氨基酸残基的氨基形成酰胺键。在本发明中可以用作接头分子的二羧酸的实例为但不限于琥珀酸或庚二酸。
本领域已经描述了用于将有效载荷间接偶联至根据本发明的接头中包含的氨基酸残基的N-末端的替代接头分子，或者适合于将有效载荷直接偶联至根据本发明的接头中包含的氨基酸残基的C-末端的接头分子，并且其包含在本发明中。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，有效载荷包括以下中的至少一个：
·毒素；
·细胞因子；
·生长因子；
·放射性核素；
·激素；
·抗病毒剂；
·抗菌剂；
·荧光染料；
·免疫调节剂/免疫刺激剂；
·半衰期增加部分；
·溶解度增加部分；
·聚合物-毒素偶联物；
·核酸；
·生物素或链霉亲和素部分；
·维生素；
·蛋白质降解剂(‘PROTAC’)；
·靶结合部分；和/或
·抗炎剂。
本文中所公开的任何一种有效载荷可以直接偶联至用于本文所公开的一步偶联过程的接头，或者可以连接到抗体-接头偶联物中包含的连接部分，该抗体-接头偶联物作为本文公开的两步过程的一部分而产生。
在某些实施方式中，有效载荷可以是细胞因子。本文所使用的术语“细胞因子”是指影响其他细胞功能并在免疫或炎症反应中调节细胞之间相互作用的任何分泌多肽。细胞因子包括但不限于单核因子、淋巴因子和趋化因子，而不管哪种细胞产生它们。例如，单核因子通常被称为由单核细胞产生和分泌，然而，许多其他细胞产生单核因子(诸如，自然杀伤细胞、成纤维细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、内皮细胞、脑星形胶质细胞、骨髓基质细胞、表皮角质形成细胞和B淋巴细胞)。淋巴因子通常被认为由淋巴细胞产生。细胞因子的实例包括但不限于白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和肿瘤坏死因子β(TNFβ)。
在某些实施方式中，有效载荷可以是抗炎剂。如本文中所使用的，术语“抗炎剂”是指其主要作用方式和用途是在治疗炎症领域的那些试剂类，以及来自另一治疗类的具有有用抗炎作用的任何其他试剂。这类抗炎药包括但不限于非甾体抗炎药(NSAID)、改善疾病的抗风湿药(DMARD)、大环内酯类抗生素和他汀类。优选地，NSAID包括但不限于水杨酸盐(例如，阿司匹林)、芳基丙酸(例如，布洛芬)、邻氨基苯甲酸(例如，甲非那米酸(mefenamicacid))、吡唑类(例如，苯基丁氮酮)、环乙酸(吲哚美辛(indomethicin))和奥昔康(oxicam)(例如，吡罗昔康)。优选地，用于本发明的方法中的抗炎剂包括舒林酸、双氯芬酸、泰诺昔康(tenoxicam)、酮咯酸、萘普生、萘丁美酮、地非辛(diflunasal)、酮洛芬、阿利维丙酸(arlypropionic acid)、替尼达普(tenidap)、羟氯喹、柳氮磺吡啶、塞来考昔(celecoxib)、罗非考昔(rofecoxib)、美洛昔康(meloxicam)、艾托考昔(etoricoxib)、伐地考昔(valdecoxib)、甲氨蝶呤、依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗、阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、红霉素、布洛芬、右布洛芬(dexibuprofen)、氟比洛芬、非诺洛芬、芬布芬、苯诺洛芬(benoxaprofen)、右酮洛芬、托芬那酸、尼美舒利和奥沙普秦。
在某些实施方式中，抗炎剂可以是抗炎细胞因子，当其与靶特异性抗体结合时，可以改善例如由自身免疫性疾病引起的炎症。具有抗炎活性的细胞因子可以是但不限于IL-1RA、IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、IL-13或TGF-β。
在某些实施方式中，有效载荷可以是生长因子。本文使用的术语“生长因子”是指能够刺激细胞生长、增殖、细胞分化和/或细胞成熟的天然存在的物质。生长因子以蛋白质或类固醇激素的形式存在。生长因子对于调节各种细胞过程是很重要的。生长因子通常作为细胞之间的信号分子。然而，它们促进细胞生长、增殖、细胞分化和细胞成熟的能力因生长因子而异。生长因子的实例的非限制性列表包括：碱性成纤维细胞生长因子、肾上腺髓质蛋白、血管生成素、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白、脑源性神经营养因子、表皮生长因子、上皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、生长分化因子-9、肝细胞生长因子、肝细胞瘤衍生的生长因子、胰岛素生长因子、胰岛素样生长因子、迁移刺激因子、肌肉抑制素、神经生长因子和其他神经营养因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子α、转化生长因子β、肿瘤坏死因子-α、血管内皮生长因子、胎盘生长因子、胎牛生长素以及细胞因子(例如，IL-3和IL-6的IL-1-辅因子、IL-2-t-细胞生长因子、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6和IL-7)。
在某些实施方式中，有效载荷可以是激素。本文中使用的术语“激素”是指身体某个部位的细胞或腺体释放的化学物质，它发出影响生物体其他部位的细胞的信息。在本发明中有用的激素的实例是但不限于褪黑激素(MT)、五羟色胺(5-HT)、甲状腺素(T4)、三碘甲腺原氨酸(T3)、肾上腺素(epinephrine)或肾上腺素(adrenaline)(EPI)、降肾上腺素(norepinephrine)或去甲肾上腺素(noradrenaline)(NRE)、多巴胺(DPM或DA)、抗穆勒(antimullerian)激素或穆勒氏(mullerian)抑制激素(AMH)、脂联素(Acrp30)、促肾上腺皮质激素或促皮质激素(ACTH)、血管紧张素原和血管紧张素(AGT)、抗利尿激素或血管加压素(ADH)、心房利钠肽或心房肽原(ANP)、降钙素(CT)、胆囊收缩素(CCK)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促红细胞生成素(EPO)、促卵泡激素(FSH)、胃泌素(GRP)、生长激素释放肽(ghrelin)、胰高血糖素(GCG)、促性腺激素释放激素(GnRH)、生长激素释放激素(GHRH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、人胎盘催乳激素(HPL)、生长激素(GH或hGH)、抑制素、胰岛素(INS)、胰岛素样生长因子或生长激素(IGF)、瘦蛋白(LEP)、促黄体激素(LH)、促黑素细胞激素(MSH或α-MSH)、食欲素(orexin)、催产素(OXT)、甲状旁腺激素(PTH)、催乳素(PRL)、松弛素(RLN)、分泌素(SCT)、生长抑素(SRIF)、促血小板生成素(TPO)、促甲状腺激素或甲状腺激素(TSH)、促甲状腺激素释放激素(TRH)、皮质醇、醛固酮、睾酮、脱氢表雄酮(DHEA)、雄甾烯二酮、二氢睾酮(DHT)、雌酮、雌三醇(E3)、孕酮、骨化三醇、骨化二醇、前列腺素(PG)、白三烯(LT)、前列腺环素(PGI2)、血栓烷(TXA2)、促乳素释放激素(PRH)、脂托品(PRH)、脑利尿钠肽(BNP)、神经肽Y(NPY)、组胺、内皮素、胰多肽、肾素和脑啡肽。
在某些实施方式中，有效载荷可以是抗病毒剂。本文所使用的术语“抗病毒剂”是指有效抑制哺乳动物中病毒形成和/或复制的试剂(化合物或生物学的)。这包括干扰哺乳动物中病毒形成和/或复制所需的宿主或病毒机制的试剂。抗病毒剂包括例如利巴韦林、金刚烷胺、VX-497(美泊地布(merimepodib)、Vertex Pharmaceuticals)、VX-498(VertexPharmaceuticals)、左旋韦林(Levovirin)、塔利韦林(Viramidine)、二盐酸组胺(Ceplene)(二盐酸组胺)、XTL-001和XTL-002(XTL Biopharmaceuticals)。
在某些实施方式中，有效载荷可以是抗菌剂。如在本文中所使用的，术语“抗菌剂”是指能够：(i)抑制、降低或防止细菌生长、(ii)抑制或降低细菌在受试者中产生感染的能力、或者(iii)抑制或降低细菌在环境中繁殖或保持感染的能力的任何物质、化合物、物质的组合、或化合物的组合。术语“抗菌剂”也指能够降低细菌传染性或毒力的化合物。
在某些实施方式中，有效载荷可以是免疫调节剂。本文用于联合治疗的术语“免疫调节剂”是指起抑制、掩蔽或增强宿主免疫系统作用的物质。免疫调节剂的实例包括但不限于蛋白质试剂，诸如细胞因子、肽模拟物和抗体(例如，人、人源化、嵌合、单克隆、多克隆、Fv、ScFv、Fab或F(ab)2片段或表位结合片段)、核酸分子(例如，反义核酸分子、iRNA以及三螺旋核酸分子)、小分子、有机化合物以及无机化合物。特别地，免疫调节剂包括但不限于：甲氨蝶呤(methotrexate)、来氟米特(leflunomide)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环磷酰胺(cytoxan)、吡唑酸酐硫脲(Imuran)、环孢素A(cyclosporine A)、米诺环素(minocycline)、硫唑嘌呤(azathioprine)、抗生素(例如FK506(他克莫司))、甲基泼尼龙(methylprednisolone，MP)、皮质类固醇、类固醇、麦考菲诺酯(mycophenolate mofetil)、雷帕霉素(西罗莫司)、溴咪酚(mizoribine)、脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)、布喹那(brequinar)、丙二腈酰胺(malononitriloaminde)(例如，来氟米特(leflunamide))、T细胞受体调节剂和细胞因子受体调节剂。
在某些实施方式中，免疫调节剂可以是免疫刺激剂。本文中使用的术语“免疫刺激剂”优选地是指能够触发免疫反应(例如，针对特定病原体的免疫反应)的任何物质或物质。免疫细胞激活化合物包括Toll样受体(TLR)激动剂。这样的激动剂包括病原体相关分子模式(PAMP)，例如模仿感染的组合物(诸如，细菌衍生的免疫调节剂(又称危险信号))和损伤相关分子模式(例如模仿应激或损伤细胞的组合物)。TLR激动剂包括核酸或脂质组合物(例如单磷酰脂质A(MPLA))。在一个实例中，TLR激动剂包含TLR9激动剂，诸如胞嘧啶鸟苷寡核苷酸(CpG-ODN)、聚(亚乙基亚胺)(PEI)-缩合寡核苷酸(ODN)(诸如，PEI-CpG-ODN-或双链脱氧核糖核酸(DNA))。在另一实例中，TLR激动剂包括TLR3激动剂，诸如聚肌苷-聚胞苷酸(聚(I：C))、PEI-聚(I：C)、聚腺苷酸-聚尿苷酸(聚(A：U))、PEI-聚(A：U)或双链核糖核酸(RNA)。其他示例性疫苗免疫刺激化合物包括脂多糖(LPS)、趋化因子/细胞因子、真菌β-葡聚糖(诸如，香菇多糖)、咪喹莫特、CRX-527和OM-174。
在某些实施方式中，该有效载荷可以是半衰期增加部分或溶解度增加部分。半衰期增加部分是例如PEG-部分(聚乙二醇部分；PEG化)、其他聚合物部分、PAS部分(组成脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的低寡聚肽；PAS酰化)或血清白蛋白结合剂。溶解度增加部分是例如PEG-部分(PEG化)或PAS部分(PAS酰化)。
在某些实施方式中，有效载荷可以是聚合物-毒素偶联物。聚合物-毒素偶联物是能够携带许多有效载荷分子的聚合物。这种偶联物有时也被称为柔性体(fleximer)，例如由Mersana治疗公司销售的。聚合物-毒素偶联物可以包含在本文所公开的毒素中的任一种。
在某些实施方式中，有效载荷可以是核苷酸。核酸有效载荷的一个实例是MCT-485，它是非常小的非编码双链RNA，具有溶瘤和免疫激活特性，由MultiCellTechnologies，Inc.开发。
在某些实施方式中，有效载荷可以是荧光染料。本文使用的术语“荧光染料”是指吸收第一波长的光并以比第一波长更长的第二波长发射的染料。在某些实施方式中，荧光染料是近红外荧光染料，该近红外荧光染料以650nm与900nm之间的波长发射光。在该区域，组织自发荧光较低，并且较少的荧光消光增强了深层组织穿透，背景干扰最小。因而，近红外荧光成像可以用于使本发明的抗体有效载荷偶联物结合的组织在手术期间可见。“近红外荧光染料”是本领域已知的，并且是可商购的。在某些实施方式中，近红外荧光染料可以是IRDye 800CW、Cy7、Cy7.5、NIR CF750/770/790、DyLight 800或Alexa Fluor 750。
在某些实施方式中，有效载荷可以包含放射性核素。本文所使用的术语“放射性核素”涉及医学上有用的放射性核素，包括例如放射性金属的带正电荷的离子，放射性金属诸如Y、In、Tb、Ac、Cu、Lu、Tc、Re、Co、Fe等，诸如90Y、111In、67Cu、77Lu、99Tc、161Tb、225Ac等。放射性核素可以包含在螯合剂(诸如，DOTA或NODA-GA)中。进一步，放射性核素可以是治疗性放射性核素或可以在成像技术中用作造影剂的放射性核素，如下所描述。放射性核素或包含放射性核素的分子是本领域已知的并且可商购。
在某些实施方式中，有效载荷可以是维生素。维生素可以选自由叶酸盐(包括叶酸、叶酸素和维生素B9)组成的组。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，毒素选自由以下组成的组中的至少一个：
·吡咯并苯并二氮杂卓(例如，PBD)；
·奥瑞他汀(例如，MMAE、MMAF)；
·类美登素(例如，美登素、DM1、DM4、DM21)；
·倍癌霉素；
·烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)抑制剂；
·微管溶素；
·烯二炔(例如，卡奇霉素)；
·蒽环类衍生物(PNU)(例如，阿霉素)；
·吡咯基驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)抑制剂；
·念珠藻素；
·药物外排泵抑制剂；
·山卓霉素；
·鹅膏蕈碱(例如，α-鹅膏蕈碱)；以及
·喜树碱(例如，依喜替康、德鲁替康)。
也就是说，用本发明的方法产生的抗体-接头偶联物优选包含毒素有效载荷。如在本文所使用的术语“毒素”涉及由活细胞或生物体产生并且对细胞或生物体有毒的任何化合物。由此，毒素可以是例如小分子、肽或蛋白质。具体实例是神经毒素、坏死毒素、血毒素和细胞毒素。在某些实施方式中，毒素是用于治疗肿瘤性疾病的毒素。也就是说，该毒素可以用本发明的方法与抗体偶联并且由于抗体的靶特异性而被递送至或进入恶性细胞。
在某些实施方式中，毒素可以是奥瑞他汀。如本文所用，术语“奥瑞他汀(auristatin)”是指抗有丝分裂剂家族。奥瑞他汀衍生物也包括在术语“奥瑞他汀”的定义内。奥瑞他汀的实例包括但不限于奥瑞他汀E(AE)、单甲基奥瑞他汀E(MMAE)、单甲基奥瑞他汀F(MMAF)和多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物。
在某些实施方式中，毒素可以是类美登素。在本发明的上下文中，术语“类美登素(maytansinoid)”是指最初从非洲灌木美登木(Maytenus ovatus)分离的一类高细胞毒性药物以及另外的美登醇(Maytansinol)和天然美登醇的C-3酯(美国专利号4,151,042)；合成美登醇的C-3酯类似物(Kupchan等，J.Med.Chem.21：31-37，1978；Higashide等，Nature270：721-722，1977；Kawai等，Chem.Farm.Bull.32：3441-3451；以及美国专利号5,416,064)；简单羧酸的C-3酯(美国专利号4,248,870；4,265,814；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,317,821；4,322,348；和4,331,598)；以及N-甲基-L-丙氨酸的C-3酯与衍生物(美国专利号4,137,230；4,260,608；和Kawai等人，Chem.Pharm Bull.12：3441,1984)。可以用于本发明的方法或可以包含在本发明的抗体-有效载荷偶联物中的示例性类美登素是美登素、DM1、DM3、DM4和/或DM21。
在某些实施方式中，毒素可以是倍癌霉素(duocarmycin)。合适的倍癌霉素可以是例如倍癌霉素A、倍癌霉素Bl、倍癌霉素B2、倍癌霉素CI、倍癌霉素C2、倍癌霉素D、倍癌霉素SA、倍癌霉素MA和CC-1065。术语“倍癌霉素”应理解为也指倍癌霉素的合成类似物，诸如阿多来新(adozelesin)、比折来新(bizelesin)、卡折来新(carzelesin)、KW-2189和CBI-TMI。
在某些实施方式中，毒素可以是NAMPT抑制剂。如本文所用，术语“NAMPT抑制剂”和“烟酰胺磷酸核糖转移酶抑制剂”是指降低NAMPT活性的抑制剂。术语“NAMPT抑制剂”也可以包括NAMPT抑制剂的前药。NAMPT抑制剂的实例包括但不限于FK866(也称为APO866)、GPP 78盐酸盐、ST 118804、STF31、吡啶基氰基胍(也称为CH-828)、GMX-1778和P7C3。附加的NAMPT抑制剂是本领域已知的，并且可以适用于本文所描述的组合物和方法。参见例如PCT公开WO2015/054060，美国专利号8,211,912和9,676,721，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，NAMPT抑制剂是FK866。在一些实施方式中，NAMPT抑制剂是GMX-1778。
在某些实施方式中，毒素可以是微管溶素。微管溶素是细胞毒性肽，包括9个成员(A-I)。微管溶素A作为抗癌剂具有潜在的应用前景。它在G2/M期阻滞细胞。微管溶素A比长春花碱(vinblastine)更有效地抑制聚合，并诱导分离的微管解聚。微管溶素A对IC50在皮摩尔范围内的各种肿瘤细胞系具有强大的细胞抑制作用。可以用于本发明的方法的其他微管溶素可以是微管溶素E。
在某些实施方式中，毒素可以是烯二炔。本文中使用的术语“烯二炔”是指一类细菌天然产物，其特征是含有两个由双键分隔的三键的九元环和十元环(例如，参见K.C.Nicolaou；A.L.Smith；E.W.Yue(1993)，“Chemistry and biology of natural anddesigned enediynes(天然和设计烯二炔的化学和生物学)”，PNAS 90(13)：5881-5888；其全部内容通过引用并入本文)。一些烯二炔能够进行Bergman环化，并且所得双自由基(1,4-脱氢苯衍生物)能够从DNA的糖骨架中夺取氢原子，这导致DNA链裂解(参见例如S.Walker；R.Landovitz；W.D.Ding；G.A.Ellestad；D.Kahne(1992),“Cleavage behavior ofcalicheamicin gamma 1and calicheamicin T(卡奇霉素γ1和卡奇霉素T的切割行为)，Proc Nat1 Acad Sci U.S.A.89(10)：4608-12；其全部内容通过引用并入本文)。它们与DNA的反应性赋予许多烯二炔抗生素特性，并且一些烯二炔作为抗癌抗生素被临床研究。烯二炔的非限制性实例是达内霉素(dynemicin)、新制癌菌素(neocarziostatin)、卡奇霉素(calicheamicin)、埃斯波霉素(esperramicin)(参见，例如，Adrian L.Smith和K.C.Bicolau，“The Enedizyne Antibiotics(烯二炔抗生素)”，J.Med.Chem.，1996，39(11)，pp 2103-2117；以及Donald Borders，“Enedizyne antibiotics as antitumoragents(烯二炔抗生素作为抗肿瘤药物)”，Informa Healthcare；第1版(Nov.23，1994，ISBN-10：0824789385；其全部内容通过引用并入本文)。在特定的实施方式中，毒素可以是卡奇霉素。
在某些实施方式中，毒素可以是阿霉素。本文所用的“阿霉素”是指来源于链霉菌属(Streptomyces)细菌波塞链霉菌表灰变种(Streptomyces peucetius var.caesius)的蒽环素家族的成员，并且包括阿霉素、柔红霉素、表柔比星和伊达比星。
在某些实施方式中，毒素可以是驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂。术语“驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂”是指抑制驱动蛋白纺锤体蛋白的化合物，该蛋白参与细胞分裂过程中双极纺锤体的组装。正在研究驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂用于治疗癌症。驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂的实例包括伊斯平斯(ispinesib)。进一步，术语“驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂”包括GlaxoSmithKline的SB715992或SB743921和CombinatoRx的戊烷脒/氯丙嗪。
在某些实施方式中，毒素可以是如US20180078656 A1中所描述的念珠藻素，其通过引用并入。
在某些实施方式中，毒素可以是山卓霉素。山卓霉素是酯肽(depsipeptide)，首次从诺卡肽属(Nocardioides sp.)(ATCC 39419)中分离出来，并已被证明具有细胞毒性和抗肿瘤活性。
在某些实施方式中，毒素可以是鹅膏毒素(amatoxin)。鹅膏毒素(包括α-鹅膏蕈碱、β-鹅膏蕈碱和鹅膏蕈碱)是由8个氨基酸组成的环状肽。它们可以从鹅膏菌(Amanitaphalloides)蘑菇中分离出来，或者可以通过合成从构建块中制备。鹅膏毒素特异性抑制哺乳动物细胞的DNA依赖性RNA聚合酶II，并且由此影响细胞的转录和蛋白质生物合成。细胞中转录的抑制导致生长和增殖的停止。虽然不是共价结合的，但鹅膏蕈碱与RNA聚合酶II之间的复合物非常紧密(KD＝3nM)。鹅膏蕈碱从酶中解离是非常缓慢的过程，这使得受影响的细胞不太可能恢复。当细胞中的转录抑制持续时间过长时，细胞会经历程序性细胞死亡(细胞凋亡)。在一个优选实施方式中，本文所使用的术语“鹅膏毒素”是指如例如WO 2010/115630、WO 2010/115629、WO 2012/119787、WO 2012/041504和WO 2014/135282中所描述的α-鹅膏蕈碱或其变体。
在某些实施方式中，毒素可以是喜树碱(camptothecin)。本文中使用的术语“喜树碱”是指具有拓扑异构酶I抑制剂功能的喜树碱或喜树碱衍生物。示例性的喜树碱包括例如，拓扑替康(topotecan)、依喜替康(exatecan)、德鲁替康(deruxtecan)、伊立替康(irinotecan)、DX-8951f、SN38、BN 80915、勒托替康(lurtotecan)、9-硝基喜树碱和氨基喜树碱。已经描述了多种喜树碱，包括用于治疗人类癌症患者的喜树碱。几种喜树碱在例如Kehrer等人，Anticancer Drugs，12(2)：89-105，(2001)或Li等人，ACSMed.Chem.Lett.2019,10,10,1386-1392中描述。
在本发明的意义上，毒素也可以是药物外排转运体的抑制剂。包含毒素和药物外排转运体抑制剂的抗体-有效载荷偶联物可以具有这样的优点，即当内化到细胞中时，药物外排转运体的抑制剂防止毒素流出细胞。在本发明中，药物外排转运体可以是P-糖蛋白。一些常见的P-糖蛋白药物抑制剂包括：胺碘酮、克拉霉素、环孢菌素、秋水仙碱、地尔硫卓、红霉素、非洛地平、酮康唑、兰索拉唑、奥美拉唑和其他质子泵抑制剂、硝苯地平、帕罗西汀、利血平、沙奎那韦、舍曲林、奎尼丁、他莫昔芬、维拉帕米以及度洛西汀。依克立达(elacridar)和CP 100356是其他常见的P-gp抑制剂。唑喹达(zosuquidar)和他立喹达(tariqidar)的开发也考虑到了这一点。最后，伐司扑达(valspodar)和reversan是此类试剂的其他实例。
应当理解，本文所定义的有效载荷B不排他地被理解为实际的有效载荷本身，而是被理解为有效载荷分子。如本文所用的有效载荷分子可以包括额外的结构，例如以促进有效载荷经由化学合成与连接部分B或K残基或化学间隔物偶联。
也就是说，在某些实施方式中，实际有效载荷可以包含在连接到本发明的接头的有效载荷分子中。有效载荷分子可以具有以下结构：
X-(间隔物)-有效载荷，
其中，有效载荷表示实际有效载荷，例如本文所公开的化合物中的一种，X表示适合于将有效载荷分子附接到连接部分(两步过程)或接头的化学间隔物或K残基(一步过程)中的兼容官能团的反应性基团，并且其中，(间隔物)表示在空间上将实际有效载荷与反应性基团X分离的化学间隔物。然而，应当理解，在某些实施方式中，反应性基团X可以是间隔物或实际有效载荷的一部分。例如，间隔物可以包含肽或氨基酸残基，其中，反应性基团X可以是间隔物中包含的N-末端氨基酸残基的氨基。在某些实施方式中，间隔物可以不存在。在不存在间隔物的实施方式中，官能团可以包括在实际有效载荷中。在某些实施方式中，间隔物可以用于将感兴趣的官能团(即与在连接部分中包含的官能团兼容的官能团)附接到实际有效载荷。在某些实施方式中，反应性基团X可以是马来酰亚胺基团或环辛炔基团，诸如但不限于DBCO或BCN基团。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，化学间隔物(Sp2)包括自裂解部分。
也就是说，接头可以包含自裂解部分，以促进有效载荷在靶细胞或组织中的释放。自裂解部分可以包含在接头的任何部分中。然而，自裂解部分优选包含在将有效载荷与K残基分离的化学间隔物(Sp2)中。可替代地，自裂解部分可以包含在(间隔物)中，该间隔物包含在如上定义的有效载荷分子中。
如本文所用，术语“自裂解部分(self-immolative moiety)”是指至少双功能分子，其可以包含在接头中，并且在初始反应发生后自发降解，从而释放有效载荷。初始反应可以是自裂解部分与氨基酸残基之间的共价键的水解。在某些实施方式中，自裂解部分与氨基酸残基之间的共价键可以是在氨基酸的α-羧基和自裂解部分中包含的胺基之间形成的酰胺键，并且初始反应可以由肽酶或蛋白酶催化。然而，本发明包括其他化学物质。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，自裂解部分直接附接到有效载荷B。
更优选地，自裂解部分直接附接至有效载荷B，使得在自裂解部分降解时释放有效载荷。在某些实施方式中，自裂解部分位于有效载荷与接头中包含的K残基之间。也就是说，自裂解部分可以与K残基的N-末端或K残基的C-末端偶联。可替代地，自裂解部分可以位于有效载荷与化学间隔物(Sp2)中包含的氨基酸残基之间，优选位于氨基酸残基的N-末端或C-末端。进一步，通过本领域已知的任何方法，自裂解部分可以位于有效载荷与包含在化学间隔物(Sp2)中的非氨基酸残基之间。
应该理解，自裂解部分的选择尤其取决于有效载荷分子中可用的官能团。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，自裂解部分包括对氨基苄基氨基甲酰基(PABC)部分或氨基亚甲基间隔物。
也就是说，在某些实施方式中，接头可以包含自裂解部分，对氨基苄基氨基甲酰基(PABC)部分。PABC包括适合于偶联至氨基酸残基或肽的C-末端的游离胺基和氨基甲酰基，PABC可以通过氨基甲酰基偶联至有效载荷，特别是包含胺的有效载荷。然而，本领域技术人员知道将有效载荷官能化以使其包含胺基的方法。自裂解部分PABC优选位于有效载荷与接头中包含的氨基酸残基之间。氨基酸残基优选为残基K或化学间隔物(Sp2)包含中的氨基酸。在某些实施方式中，自裂解部分PABC位于有效载荷与在化学间隔物(Sp2)包含中的丙氨酸残基之间。在某些实施方式中，自裂解部分可以位于有效载荷与肽酶切割位点之间。在某些实施方式中，自裂解部分可以位于有效载荷与组织蛋白酶切割位点之间。也就是说，自裂解部分可以位于有效载荷与已知可被组织蛋白酶裂解的基序之间。
本文使用的术语“组织蛋白酶”是指蛋白酶家族。术语组织蛋白酶包括组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶F、组织蛋白酶G、组织蛋白酶H、组织蛋白酶K、组织蛋白酶L1、组织蛋白酶L2、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶W和组织蛋白酶Z。在特定的实施方式中，可切割部分可以是被组织蛋白酶B特异性水解的基序，诸如缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-瓜氨酸或丙氨酸-丙氨酸。Salomon等人“Optimizing Lysosomal Activation of Antibody-Drug Conjugates(ADCs)byIncorporation of Novel Cleavable Dipeptide Linkers(通过掺入新型可切割二肽接头优化抗体-药物偶联物(ADC)的溶酶体激活)”，Mol Pharm，2019，16(12)，第4817-4825页公开了可以被肽酶特异性水解的其他基序。
ADC接头中使用的典型的一个二肽结构是缬氨酸-瓜氨酸基序，例如在Brentuximab Vedotin中提供；并在Dubowchik和Firestone，“Cathepsin B-labiledipeptide linkers for lysosomal release of doxorubicinfrominternalizing immunoconjugates:model studies of enzymatic drug releaseand antigen-specific in vitro anticancer activity(组织蛋白酶B不稳定二肽接头用于阿霉素从内化免疫偶联物中的溶酶体释放：酶促药物释放和抗原特异性体外抗癌活性的模型研究)”；Bioconjug Chem；2002；13(4)；第855-69页中讨论的。这种接头可以被组织蛋白酶B切割，以在疾病部位释放实际的有效载荷。这同样适用于缬氨酸-丙氨酸基序，其例如在SGN-CD33A中提供。
因此，在某些实施方式中，接头可以包括结构(Sp1)-K-(Sp2)-Val-Cit-(自裂解部分)-有效载荷。在某些实施方式中，接头可以包括结构(Sp1)-K-(Sp2)-Val-Cit-有效载荷。在某些实施方式中，接头可以包括结构(Sp1)-K-(Sp2)-Val-Cit-PABC-有效载荷。
在某些实施方式中，接头可以包括结构K-Val-Cit-(自裂解部分)-有效载荷或由其组成。在某些实施方式中，接头可以包括结构K-Val-Cit-PABC-有效载荷或由其组成。在某些实施方式中，接头可以包括结构K-Val-Cit-PABC-MMAE或由其组成。在某些实施方式中，接头可以包括结构K-Val-Cit-PABC-美登素或由其组成。
必须注意，肽切割位点也可以是可被其他肽酶(诸如，半胱天冬酶3、天冬酰胺内切酶(Legumain)或中性粒细胞弹性蛋白酶)切割的基序，或如Dal Corso等人“InnovativeLinker Strategies for Tumor-Targeted Drug Conjugates(肿瘤靶向药物偶联物的创新接头策略)”，Chemistry；25(65)，第14740-14757页中所描述的。
然而，必须注意，细胞包含广泛的细胞肽酶，并且其他不太保守的氨基酸基序也可以被肽酶有效地切割。由此，在某些实施方式中，接头可以包括结构(Sp1)-K-(Sp2)-PABC-有效载荷，其中(Sp2)不存在或由氨基酸残基组成。
在某些实施方式中，接头可以包括结构(Sp1)-K-(Sp2)-PABC-有效载荷，其中，(Sp2)包括PABC部分与(Sp2)或K残基中包含的最C-末端氨基酸残基之间的PEG部分。
在某些实施方式中，将包含自裂解部分PABC的接头偶联至包含胺的有效载荷(特别是包含伯胺或仲胺的有效载荷)。在某些实施方式中，包含胺的有效载荷是奥司他汀，诸如MMAE。在某些实施方式中，包含胺的有效载荷是类美登素，诸如美登素。
必须注意，有效载荷可以经由额外的接头分子与自裂解PABC部分偶联。例如，包含胺的有效载荷可以通过对硝基苯酚(PNP)基团与PABC部分偶联。Su等人，BioconjugateChem.2018，29，4，1155-1167以及Dokter等人，Mol Cancer Ther.2014Nov；13(11)：2618-29已经公开了允许将包含除胺以外的其他反应性基团的有效载荷偶联至PABC部分的其他的接头分子。例如，包含醇或酚基团的有效载荷可以经由乙二胺(EDA)接头偶联至PABC。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，自裂解部分包括甲胺基。先前已经证明，甲胺基可以用作ADC的基于肽的接头中的自裂解部分(Costoplus等人，ACS Med.Chem.Lett.，2019，10，10，1393-1399和Li等人，ACS Med.Chem.Lott.2019，10，10，1386-1392)。
特别地，包含甲胺基的自裂解部分可以通过在氨基酸残基的α-羧基和在甲胺基中包含的胺之间形成的酰胺键偶联至氨基酸残基C-末端。氨基酸残基可以是(Sp2)中包含的氨基酸残基或残基K。甲胺基中包含的甲基可以通过醚或硫醚键与有效载荷偶联。因此，当有效载荷包括羟基或硫醇基时，可以优选使用甲胺基作为自裂解基团。在某些实施方式中，包含羟基的有效载荷可以是喜树碱(诸如，依喜替康衍生物Dxd)或蒽环类药物(诸如，PNU-159682)。在某些实施方式中，包含硫醇的有效载荷可以是类美登素(诸如，DM1、DM4或DM21)。
包含氨基亚甲基间隔物的接头可以包含分子结构C-(NH)-(CH3)-O-C或C-(NH)-(CH3)-S-C。
应当理解，PABC和包含氨基亚甲基间隔物的自裂解部分优选用于将有效载荷偶联至氨基酸残基的C-末端羧基。
可以用于将有效载荷偶联至氨基酸残基的C-末端羧基的其他自裂解部分包括用于将含酚的有效载荷偶联至氨基酸残基的C-末端羧基的对氨基苄乙醇(PABE)接头(Zhang等人，Bioconjugate Chem.2018，29，6，1852-1858)或用于将包含叔胺或杂芳基部分的有效载荷偶联至氨基酸残基的C-末端羧基的对甲基苯胺(PMA)接头(Staben等人，NatureChemistry，第8卷，第1112-1119页(2016))。包含酚基的有效载荷的非限制性实例是倍癌霉素GA或吡咯并苯二氮杂平PBD。包含叔胺的有效载荷的非限制性实例是倍癌霉素GA。
然而，有效载荷也可以经由自裂解部分与N-末端氨基偶联。例如，有效载荷可以经由包含邻羟基保护的芳基硫酸盐的自裂解部分与氨基酸残基的N-末端氨基偶联。例如，邻羟基保护的芳基硫酸盐(OHPAS)可以用于将酚类有效载荷(诸如，PBD)偶联至氨基酸残基的N-末端氨基。OHPAS部分优选包含羧基，该OHPAS部分可以经由羧基直接与氨基酸残基的N-末端氨基偶联。可替代地，OHPAS部分可以通过功能化的PEG接头(例如但不限于功能化的(PEG)2接头)与氨基酸残基的N-末端氨基偶联。优选地，PEG接头的一端用氨基官能化以允许偶联至OHPAS部分中包含的羧基，另一端用羧基官能化以允许偶联至氨基酸残基的N-末端氨基(Park等人，Bioconjugate Chem.2019，30，7，1957-1968)。
可替代地或此外，接头分子可以位于OHPAS的硫酸根基团与有效载荷之间以允许非酚类有效载荷与OHPAS偶联。例如，对羟基苄基(PHB)接头分子可以用于允许包含伯胺或仲胺的有效载荷通过形成氨基甲酸酯与OHPAS部分偶联。包含叔胺的有效载荷可以通过形成四元铵偶联至包含OHPAS的接头。进一步，对羟基苄基乙二胺(PHB-EDA)接头分子可以用于通过形成氨基甲酸酯将含羟基的有效载荷偶联至OHPAS部分(Park等人，BioconjugateChem.2019，30，7，1957-1968)。
在某些实施方式中，有效载荷可以经由可切割部分与在接头中包含的氨基酸残基偶联。本文所用的“可切割部分”是可以通过酶水解或非酶水解从实际有效载荷中分离出来的化学单元。在某些实施方式中，可切割部分可以是可被肽酶或蛋白酶水解的氨基酸基序。
在其他实施方式中，在接头中包含的可切割部分可以是碳水化合物部分。在这样的实施方式中，可切割部分可以是可被葡萄糖苷酶切割的部分。由此，在某些实施方式中，可切割部分可以是可被β-葡萄糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶切割的部分。
在其他实施方式中，在接头中包含的可切割部分可以是磷酸盐部分。在这样的实施方式中，可切割部分可以是可被磷酸酶切割的部分。由此，在某些实施方式中，可切割部分可以是可被β-溶酶体酸性焦磷酸酶或酸性磷酸酶切割的部分。
可以用于从接头分子释放有效载荷的其他可切割部分的实例已由Bargh等人，抗体-药物偶联物中的可切割接头(Cleavable linkers in antibody-drug conjugates)，Chem Soc Rev.2019年8月12日；48(16)：4361-4374描述。在某些实施方式中，接头可以包括结构(可切割部分)-(自裂解部分)-有效载荷。在这样的实施方式中，自裂解部分可以在可切割部分切割时降解并释放有效载荷。
在某些实施方式中，接头可以包括单个连接部分或有效载荷。
在某些实施方式中，接头可以包括两个或更多个连接部分和/或有效载荷B。即，在某些实施例中，接头可以包括以下结构
a)(Sp1)-K-(Sp2)-B1-(Sp3)-B2-(Sp4)、
b)(Sp4)-B2-(Sp1)-K-(Sp2)-B1-(Sp3)、
c)(Sp1)-B1-(Sp2)-K-(Sp3)-B2-(Sp4)、或
d)(Sp4)-B2-(Sp1)-B1-(Sp2)-K-(Sp3)。
在这样的实施方式中，化学间隔物(Sp1)、(Sp2)、(Sp3)和K残基可以具有与上面定义的相同的特性。此外，部分B1和B2可以是上面定义的连接部分和/或有效载荷中的任何一个。进一步，化学间隔物(Sp4)可以具有与化学间隔物(Sp1)、(Sp2)或(Sp3)相同的特性，或者可以不存在。
因此，在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，接头包括第二连接部分或有效载荷B2，特别是其中，B2经由化学间隔物(Sp1)或(Sp3)连接到接头。
也就是说，有效载荷或连接部分B2可以连接到化学间隔物(Sp1)或(Sp3)，或者直接连接到有效载荷或连接部分B1。有效载荷或连接部分B2可以包括适合于将B2偶联至(Sp1)、(Sp3)或B1中包含的官能团的任何官能团。
在某些实施方式中，有效载荷或连接部分B2可以包括氨基，通过该氨基B2连接到(Sp3)或B1。也就是说，B2可以通过所述氨基连接到(Sp3)或B1中包含的羧基。在某些实施方式中，包含在(Sp3)中的羧基可以是在化学间隔物(Sp3)的C-末端氨基酸残基中包含的羧基。在某些实施方式中，B1中包含的羧基可以是基于氨基酸的有效载荷或连接部分的α-羧基。在某些实施方式中，B2可以经由接头分子与在(Sp3)或B1中包含的羧基偶联。在某些实施方式中，接头分子可以包括自裂解部分。
在某些实施方式中，有效载荷或连接部分B2可以包括羧基，通过该羧基B2通过羧基连接到(Sp1)或B1。也就是说，B2可以通过所述羧基连接到(Sp1)或B1中包含的胺基。在某些实施方式中，(Sp1)中包含的胺基可以是化学间隔物(Sp1)的N-末端氨基酸残基中包含的胺基。在某些实施方式中，B1中包含的胺基可以是基于氨基酸的有效载荷或连接部分的α-氨基。在某些实施方式中，B2可以经由接头分子与在(Sp1)或B1中包含的胺基偶联。在某些实施方式中，接头分子可以包括自裂解部分。
然而，必须注意，B2也可以包括除胺或羧基之外的其他官能团。在这样的实施方式中，B2可以通过本领域已知的任何方法直接或经由接头或自裂解基团与(Sp1)、(Sp3)或B1偶联。
在某些实施方式中，有效载荷或连接部分B2可以与在(Sp1)或(Sp3)中包含的氨基酸侧链偶联。也就是说，B2可以经由兼容的官能团连接到在(Sp1)或(Sp3)中包含的氨基酸侧链的官能团。
在某些实施方式中，(Sp1)、(Sp2)、(Sp3)和K残基仅由氨基酸、氨基酸模拟物和/或氨基酸衍生物组成。在某些实施方式中，B1和/或B2也包含氨基酸骨架。在这样的实施方式中，接头可以是线性肽或肽模拟物。在B1是氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物的实施方式中，接头可以具有结构(Sp1)-K-(Sp2)-B1，其中，(Sp1)-K-(Sp2)-B1是线性肽或肽模拟物。在B1是氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物的实施方式中，接头可以具有结构(Sp1)-K-(Sp2)-B1-(Sp3)，其中，(Sp1)-K-(Sp2)-B1-(Sp3)是线性肽或肽模拟物。在B1是氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物的实施方式中，接头可以具有结构K-(Sp2)-B1-(Sp3)，其中，K-(Sp2)-B1-(Sp3)是线性肽或肽模拟物。在B1是氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物的实施方式中，接头可以具有结构K-(Sp2)-B1，其中，K-(Sp2)-B1是线性肽或肽模拟物。在B1是氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物的实施方式中，接头可以具有结构K-B1-(Sp3)，其中，K-B1-(Sp3)是线性肽或肽模拟物。在B1是氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物的实施方式中，接头可以具有结构K-B1，其中，K-B1是线性肽或肽模拟物。
在B1和B2是氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物的实施方式中，接头可以具有结构(Sp1)-K-(Sp2)-B1-(Sp3)-B2-(Sp4)，其中，(Sp1)-K-(Sp2)-B1-(Sp3)-B2-(Sp4)是线性肽或肽模拟物。在B1和B2是氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物的其他实施方式中，接头可以具有结构(Sp4)-B2-(Sp1)-K-(Sp2)-B1-(Sp3)，其中，(Sp4)-B2-(Sp1)-K-(Sp2)-B1-(Sp3)是线性肽或肽模拟物。在B1和B2是氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物的其他实施方式中，接头可以具有结构(Sp4)-B2-(Sp1)-B1-(Sp2)-K-(Sp3)，其中，(Sp4)-B2-(Sp1)-B1-(Sp2)-K-(Sp3)是线性肽或肽模拟物。
在B1和B2不是氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物的实施方式中，接头可以具有结构(Sp1)-K-(Sp2)-B1-(Sp3)，其中,(Sp1)-K-(Sp2)是线性肽或肽模拟物，并且B1连接到在(Sp2)中包含的C-末端羧基。在B1和B2不是氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物的实施方式中，接头可以具有结构(Sp1)-B1-(Sp2)-K-(Sp3)，其中，(Sp2)-K-(Sp3)是线性肽或肽模拟物，并且B1连接到在(Sp2)中包含的N-末端胺基。然而，必须注意，B1不一定必须直接与肽或肽模拟物偶联。相反，B1可以经由接头分子和/或自裂解部分与肽或肽模拟物偶联。
在B1是氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物并且B2不是氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物的实施方式中，接头可以具有结构(Sp1)-K-(Sp2)-B1-(Sp3)-B2-(Sp4)、(Sp4)-B2-(Sp1)-K-(Sp2)-B1-(Sp3)、(Sp1)-B1-(Sp2)-K-(Sp3)-B2-(Sp4)或(Sp4)-B2-(Sp1)-B1-(Sp2)-K-(Sp3)，其中，(Sp1)-K-(Sp2)-B1-(Sp3)或(Sp1)-B1-(Sp2)-K-(Sp3)是线性肽或肽模拟物并且B2偶联至(Sp3)、B1或K残基中包含的C-末端羧基或偶联至(Sp1)、B1或K残基的N-末端氨基。
在这样的实施方式中，可以生成抗体-有效载荷偶联物，其中例如抗体与有效载荷的比率为2或4，例如一个或两个有效载荷偶联至每个Q295残基。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，B1和B2彼此相同或不同。
也就是说，有效载荷或连接部分B1和B2可以相同(即具有相同的化学结构)或者可以在结构上不同。在某些实施方式中，B1和B2都是有效载荷或都是连接部分。在B1和B2都是有效载荷的实施方式中，有效载荷B1和B2可以是相同或不同的有效载荷。在B1和B2都是连接部分的实施方式中，连接部分B1和B2可以是相同或不同的连接部分。在某些实施方式中，B1可以是连接部分，B2可以是有效载荷，反之亦然。
应当理解，并非所有有效载荷或连接部分都能在位置B1起链内有效载荷或连接部分的作用，例如，因为它们不具有与一侧的(Sp2)或K残基以及另一侧的(Sp3)、(Sp1)或B2形成共价键的官能团。因此，优选地，在B1是链内有效载荷或连接部分的实施方式中，B1是二价或多价分子。例如，B1可以是氨基酸、氨基酸模拟物或氨基酸衍生物。在这样的实施方式中，B1可以经由其氨基与(Sp2)或K的C-末端羧基偶联，并且经由其羧基与(Sp3)或B2的N-末端氨基偶联。可替代地，B1可以经由其羧基与(Sp2)或K的N-末端氨基偶联，并且经由其氨基与(Sp1)或B2的C-末端羧基偶联。
在某些实施方式中，接头可以包括两个连接部分B1和B2。
也就是说，在某些实施方式中，本发明涵盖包含两个生物正交标记基团和/或非生物正交实体的接头。例如，根据本发明的接头可以包含含叠氮化物的连接部分(诸如，Lys(N3)或Xaa(N3))和含巯基的连接部分(诸如，半胱氨酸)。在某些实施方式中，根据本发明的接头可以包含含叠氮化物的连接部分(诸如，Lys(N3)或Xaa(N3))和含四嗪的连接部分(诸如，四嗪修饰的氨基酸)。在某些实施方式中，根据本发明的接头可以包含含巯基的连接部分(诸如，半胱氨酸)和含四嗪的连接部分(诸如，四嗪修饰的氨基酸)。包含两个不同的生物正交标记基团和/或非生物正交实体的接头具有这样的优点，即它们可以接受两种不同的有效载荷，从而产生包含大于一种有效载荷的抗体-有效载荷偶联物。
通过这种方式，可以获得2+2的抗体有效载荷比。使用第二有效载荷可以允许开发一类全新的抗体-有效载荷偶联物，该偶联物在疗效和效力方面超越了当前的治疗方法。
这样的实施方式可以特别允许靶向细胞中的两种不同结构(例如DNA和微管)。由于某些癌症对一种药物(例如微管(microbutule)毒素)具有耐药性，因此DNA毒素仍然可以杀死癌症细胞。
根据另一实施方式，可以使用两种药物，这两种药物只有在同一时间和同一组织中释放时才是完全有效的。在抗体在健康组织中部分降解或一种药物过早损失的情况下，这可能导致脱靶毒性降低。
而且，双标记探针可以用于非侵入性成像和治疗或术中/术后成像/手术。在这样的实施方式中，可以通过非侵入性成像来选择肿瘤患者。然后，可以使用其他成像剂(例如荧光染料)通过手术去除肿瘤，成像剂有助于外科医生或机器人在手术期间识别所有癌组织。
在某些实施方式中，B1和B2中的一个可以是包含巯基的连接部分(诸如，半胱氨酸)，并且B1和B2的另一个可以是包含叠氮化物部分的连接部分(诸如，Lys(N3))。在这样的实施方式中，两个不同的有效载荷可以偶联至接头，一个经由巯基马来酰亚胺偶联，另一个经由SPAAC反应。
在某些实施方式中，接头可以包含两个有效载荷。仅包含有效载荷但不包含连接部分的接头可以在一步过程中与抗体偶联。
应当理解，在B1和B2都是有效载荷的实施方式中，B1和B2在结构上可以是相同或不同的。在某些实施方式中，可以化学合成包括一个或多个有效载荷的接头。可替代地，在接头偶联至抗体之前，可以通过本文公开的任何方法将一个或多个有效载荷偶联至接头中包含的连接部分。
在某些实施方式中，本发明的接头可以允许将两种不同的有效载荷偶联至抗体的CH2结构域的残基Q295。使用第二有效载荷允许开发一类全新的抗体-有效载荷偶联物，该偶联物在疗效和效力方面超越了当前的治疗方法。还设想了新的应用领域，例如用于成像和治疗或手术内/术后手术的双重型成像(参见Azhdarinia A等人“Dual-LabelStrategies for Nuclear and Fluorescence Molecular Imaging:A Review andAnalysis(核与荧光分子成像的双重标记策略：综述与分析)”，Mol ImagingBiol.2012Jun；14(3)：261-276)。例如，包含用于术前正电子发射断层扫描(PET)的分子成像剂和用于引导划定手术边缘的近红外荧光(NIRF)染料的双重标记抗体可以大大增强癌症的诊断、分期和切除(参见Houghton JL.等人“Site-specifically labeled CA19.9-targeted immunoconjugates for the PET,NIRF,and multimodal PET/NIRF imaging ofpancreatic cancer(用于胰腺癌的PET、NIRF和多模式PET/NIRF成像的定点标记CA19.9靶向免疫结合物)”，Proc Natl Acad Sci U S A.2015Dec 29；112(52)：15850-5)。PET和NIRF光学成像提供了互补的临床应用，使非侵入性全身成像能够分别在手术期间定位疾病和识别肿瘤边缘。然而，由于缺乏合适的位点特异性方法，目前这种双重标记的探针的产生是困难的；由于探针的随机偶联，通过化学方法连接两种不同的探针导致几乎不可能的分析和再现性。
而且，在Levengood M等人“(Orthogonal Cysteine Protection EnablesHomogeneous Multi-Drug Antibody-Drug Conjugates(正交半胱氨酸保护使同质多药抗体-药物偶联物成为可能)”，Angewandte Chemie，第56卷，第3期，2017年1月16日)的研究中，双药物标记的抗体具有附接两种不同的奥瑞他汀毒素(具有不同的生理化学性能和发挥互补的抗癌活性)，在对于包含单独的奥瑞他汀组分的ADC是难治的细胞系和异种移植模型中赋予活性。这表明双标记ADC能够比单独地单一传统ADC更有效地解决癌症异质性和耐药性。由于对ADC的一种耐药机制包括从癌症细胞中主动泵出细胞毒性部分，另一种双重药应用可以包括额外和同时递送专门阻断细胞毒性药物的流出机制的药物。因此，与传统ADC相比，这种双标记ADC可以更有效地帮助克服对ADC的癌症耐药性。
本文中使用的术语“抗体”是最广义的，具体涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性。术语“一种抗体(antibody)”和“多种抗体(antibodies)”广泛包括天然存在的抗体形式(例如IgG、IgA、IgM、IgE)。
抗体优选为单克隆抗体。抗体可以来源于人类，但同样来源于小鼠、大鼠、山羊、驴、仓鼠或兔子。在偶联物用于治疗的情况下，鼠或兔抗体可以任选地被嵌合或人源化。
包含CH2结构域的抗体的片段或重组变体可以是例如，
·仅包含重链结构域的抗体形式(鲨鱼抗体/IgNAR(VH-CH1-CH2-CH3-CH4-CH5)2或骆驼抗体/hcIgG(VH-CH2-CH3)2)
·scFv-Fc(VH-VL-CH2-CH3)2
·Fc融合肽，包含Fc结构域和一个或多个受体结构域。
抗体也可以是双特异性的(例如，DVD-IgG、crossMab、附加的IgG-HC融合)或双特异性的。参见Brinkmann和Kontermann；双特异性抗体(Bispecific antibodies)；DrugDiscov Today；2015；20(7)；第838-47页，综述。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，抗体是IgG抗体，特别是IgG1抗体。
本文所用的“IgG”是指属于基本上由公认的免疫球蛋白γ基因编码的抗体类的多肽。在人类中，IgG包括亚类或同种型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中，IgG包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。全长IgG由两对相同的两条免疫球蛋白链组成，每对具有一条轻链和一条重链，每条轻链包含免疫球蛋白结构域VL和CL，并且每条重链包含免疫蛋白结构域VH、Cγ1(也称为CH1)、Cγ2(也称为CH2)和Oγ3(也称为CH3)。在人IgG1的上下文中，根据Kabat中的EU索引，“CH1”指位置118-215，CH2结构域指位置231-340，并且CH3结构域指位置341-447。IgG1还包括铰链结构域，该铰链结构域在IgG1的情况下指位置216-230。
本发明的方法中使用的抗体或本发明的抗体-有效载荷偶联物可以是或包括任何抗体，优选任何IgG型抗体。例如，抗体可以是但不限于维布妥昔单抗(Brentuximab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、吉妥珠单抗(Gemtuzumab)、奥英妥珠单抗(Inotuzumab)、阿维单抗(Avelumab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、利妥昔单抗(Rituximab)、达雷妥尤单抗(Daratumumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、托珠单抗(Tocilizumab)、乌司奴单抗(Ustekinumab)、戈利木单抗(Golimumab)、奥妥珠单抗(Obinutuzumab)、沙西妥珠单抗(Sacituzumab)、贝兰妥单抗(Belantamab)、泊洛妥珠单抗(Polatuzumab)以及恩诺单抗(Enfortumab)。
由此，在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，抗体选自由以下组成的组：维布妥昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗、奥英妥珠单抗、阿维单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、达雷妥尤单抗、帕妥珠单抗、维多珠单抗、奥瑞珠单抗、托珠单抗、乌司奴单抗、戈利木单抗、奥妥珠单抗、沙西妥珠单抗、贝兰妥单抗、泊洛妥珠单抗以及恩诺单抗。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，抗体选自由以下组成的组中：维布妥昔单抗、吉妥珠单抗、曲妥珠单抗、奥英妥珠单抗、泊洛妥珠单抗、恩诺单抗、沙西妥珠单抗以及贝兰妥单抗。
在更优选的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，抗体是泊洛妥珠单抗或曲妥珠单抗或恩诺单抗。
也就是说，在特定的实施方式中，本发明涉及抗体-接头偶联物，其中，抗体是泊洛妥珠单抗，并且其中，接头是在本文所公开的接头中的任一种。
在另一实施方式中，本发明涉及抗体-接头偶联物，其中，抗体是曲妥珠单抗，并且其中，接头是在本文所公开的接头中的任一种。
在另一实施方式中，本发明涉及抗体-接头偶联物，其中，抗体是恩诺单抗，并且其中，接头是在本文所公开的接头中的任一种。
用于根据本发明的方法的抗体可以是糖基化抗体、去糖基化抗体或非糖基化(aglycosylated)抗体。
也就是说，在某些实施方式中，抗体可以是优选在残基N297处糖基化的IgG抗体。由此，在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，IgG抗体是糖基化IgG抗体，特别是其中，IgG抗体在CH2结构域的残基N297(EU编号)处糖基化。
如本文所描述，在残基N297处糖基化的IgG抗体比非糖基化抗体具有几个优点。
然而，抗体也可以是去糖基化抗体，优选其中残基N297处的聚糖已被酶PNGase F切割掉。进一步，抗体可以是非糖基化抗体，优选其中，残基N297已被非天冬酰胺残基替代。使抗体去糖基化和生成非糖基化抗体的方法是本领域已知的。
在某些实施方式中，本发明的接头可以与抗体Fc结构域中的内源性Gln残基偶联，或者与已经通过分子工程引入抗体中的Gln残基偶联。
由此，在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，接头偶联的Gln残基包含在抗体的Fc结构域中，特别是其中，接头偶联的Gln残基是IgG抗体的CH2结构域的Gln残基Q295(EU编号)。
本发明的接头可以与抗体的Fc结构域中的任何Gln残基偶联，该抗体可以用作转谷氨酰胺酶的底物。通常，本文使用的术语Fc结构域是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域(CH2和CH3)以及IgE、IgY和IgM的最后三个恒定区结构域(CH2、CH3和CH4)。也就是说，根据本发明的接头可以与抗体的CH2、CH3和CH4(在适用的情况下)结构域偶联。
在某些实施方式中，内源性Gln残基可以是IgG抗体的CH2结构域的Gln残基Q295(EU编号)。由此，在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，抗体的Fc结构域中的Gln残基是IgG抗体的CH2结构域的Gln残基Q295(EU编号)。在特别优选的实施方式中，抗体的Fc结构域中的Gln残基是糖基化IgG抗体(特别是具有未修饰的恒定区的糖基化IgG抗体)的CH2结构域的Gln残基Q295(EU编号)。
重要的是理解Q295是IgG型抗体中极其保守的氨基酸残基。它在人IgG1、2、3、4以及兔和大鼠抗体中都是保守的。因此，能够使用Q295对于制备治疗性抗体-有效载荷偶联物或诊断性偶联物是相当大的优势，其中抗体通常是非人类来源的。因此，根据本发明的方法确实提供了非常通用和广泛适用的工具。尽管残基Q295在IgG型抗体中极为保守，但一些IgG型抗体(诸如，小鼠和大鼠IgG2a抗体)不具有该残基。由此，应当理解，用于本发明的方法的抗体优选是包含CH2结构域的残基Q295(EU编号)的IgG型抗体。
进一步，已经表明，使用Q295进行有效载荷附接的工程偶联物显示出良好的药代动力学和疗效(Lhospice等人“Site-Specific Conjugation of Monomethyl AuristatinE to Anti-Cd30Antibodies Improves Their Pharmacokinetics and TherapeuticIndex in Rodent Models(单甲基奥瑞他汀E与抗Cd30抗体的位点特异性偶联改善了它们在啮齿动物模型中的药代学和治疗指数)”，Mol Pharm；2015；12(6)，p.1863-1871)，并且能够携带甚至不稳定的易于降解的毒素(Dorywalska等人“Site-Dependent Degradation ofa Non-Cleavable Auristatin-Based Linker-Payload in Rodent Plasma and ItsEffect on ADC Efficacy(啮齿类动物血浆中不可切割的基于奥瑞他汀的接头-有效载荷的位点依赖性降解及其对ADC功效的影响)”，PLoS ONE；2015；10(7)：e0132822)。由此预期的是，用此位点特异性方法将看到类似的效果，因为相同的残基被修饰，而是糖基化抗体。糖基化可以进一步有助于ADC的整体稳定性，与上述方法一样去除聚糖部分已被证明会导致抗体的稳定性降低(Zheng等人；“The impact of glycosylation on monoclonalantibody conformation and stability(糖基化对单克隆抗体构象和稳定性的影响)”，Mabs Austin；2011，3(6)，第568-576页)。
在讨论通过转谷氨酰胺酶将接头偶联至CH2-Gln残基的文献中，重点是小的、低分子量的底物。然而，在现有技术文献中，为了实现这样的偶联，N297位的去糖基化步骤或非糖基化抗体的使用总是被描述为必要的(WO 2015/015448；WO 2017/025179；WO 2013/092998)。
然而，非常令人惊讶的是，与所有预期相反，通过使用上述接头结构，与糖基化抗体的Q295的位点特异性偶联确实是有效的。特别地，包含毒素分子的接头的偶联以大于80％的偶联效率实现。
即使Q295非常接近N297，N297在其天然状态下是糖基化的，根据本发明的方法，使用指定的接头，仍然允许接头或有效载荷与其偶联。
如图所示，根据本发明的方法不需要N297的预先酶促去糖基化，也不需要使用非糖基化抗体，也不要求针对另一氨基酸的N297取代，也不引入T299A突变来防止糖基化。
这两点在制造方面提供了显著的优势。在GMP方面，酶促去糖基化步骤是不期望的，因为它必须确保去糖基化酶(例如PNGase F)和裂解的聚糖都必须从培养基中去除。
此外，不需要用于有效载荷附接的抗体的基因工程，从而可以避免可能增加免疫原性和降低抗体整体稳定性的序列插入。
针对另一氨基酸的N297取代也有不需要的影响，因为它可能影响整个Fc结构域的整体稳定性(Subedi等人“The Structural Role of Antibody N-Glycosylation inReceptor Interactions(抗体N-糖基化在受体相互作用中的结构作用)”，Structure2015，23(9)，1573-1583)，以及整个偶联物的功效，其结果可能导致抗体聚集增加和溶解度降低(Zheng等人“The impact of glycosylation on monoclonal antibodyconformation and stability(糖基化对单克隆抗体构象和稳定性的影响)”，Mabs Austin2011，3(6)，568-576)，这对于疏水性有效载荷(诸如，PBD)特别重要。进一步，存在于N297的聚糖具有重要的免疫调节作用，因为它触发抗体依赖性细胞毒性(ADCC)等。这些免疫调节作用将在去糖基化或以获得非糖基化抗体的上述任何其他方法中丧失。进一步，已建立的抗体的任何序列修饰也可能导致调节问题，这是有问题的，因为通常使用已接受的和临床验证的抗体作为ADC偶联的起点。
因此，根据本发明的方法允许容易地并且没有缺点地制造具有位点特异性有效载荷结合的化学计量良好定义的ADC。
鉴于上述情况，指出本发明的方法优选用于IgG抗体在抗体的CH2结构域的残基Q295(EU编号)处的偶联，其中，抗体在CH2结构域的残基N297(EU编号)处被糖基化。然而，明确指出，本发明的方法还涵盖去糖基化或非糖基化抗体在残基Q295或抗体的任何其他合适的Gln残基处的偶联，其中，Gln残基可以是内源性Gln残基或通过分子工程引入的Gln残基。
由此，在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，与接头偶联的Gln残基已经通过分子工程引入抗体的重链或轻链中。
本文使用的术语“分子工程”是指使用分子生物学方法来操纵核酸序列。在本发明中，分子工程可以用于将Gln残基引入抗体的重链或轻链中。通常，在本发明中设想了将Gln残基引入抗体的重链或轻链的两种不同策略。首先，抗体的重链或轻链的单个残基可以被Gln残基取代。第二，由两个或更多个氨基酸残基组成的含Gln的肽标签可以整合到抗体的重链或轻链中。为此，肽标签可以整合到重链或轻链的内部位置，即在重链或轻链的两个现有氨基酸残基之间或通过替换它们，或者肽标签可以融合(附加)至抗体的重链或轻链的N-末端或C-末端。
例如，抗体的重链或轻链的氨基残基可以被Gln残基取代，条件是所得抗体可以通过转谷氨酰胺酶与本发明的接头偶联。在某些实施方式中，抗体是其中IgG抗体的CH2结构域的氨基酸残基N297(EU编号)被取代的抗体，特别是其中，取代是N297Q取代。包含N297Q突变的抗体可以与抗体的每个重链上的多于一个的接头偶联。例如，包含N297Q突变的抗体可以与四个接头偶联，其中，一个接头与抗体的第一重链的残基Q295偶联，一个接头与抗体的第一重链的残基Q297Q偶联，一个接头与抗体的第二重链的残基Q295偶联，并且一个接头与抗体的第二重链的残基N297Q偶联。本领域技术人员知晓用Gln残基替换IgG抗体的残基N297导致非糖基化抗体。
因此，在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，通过分子工程引入抗体的重链或轻链中的Gln残基是非糖基化IgG抗体的CH2结构域的N297Q(EU编号)。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，通过分子工程引入抗体的重链或轻链中的Gln残基包含在肽中，该肽已(a)整合到抗体的重链或轻链或者(b)融合到抗体的重链或轻链的N-末端或C-末端。
代替取代抗体的单个氨基酸残基，可以将包含转谷氨酰胺酶可接近的Gln残基的肽标签引入抗体的重链或轻链中。这样的肽标签可以与抗体的重链或轻链的N-末端或C-末端融合。可替代地，肽标签可以在合适的位置插入抗体的重链或轻链中。优选地，将包含转谷氨酰胺酶可接近的Gln残基的肽标签融合到抗体的重链的C-末端。甚至更优选地，将包含转谷氨酰胺酶可接近的Gln残基的肽标签融合到IgG抗体的重链的C-末端。WO 2012/059882和WO 2016/144608中描述了几种可以与抗体的重链的C-末端融合并且用作转谷氨酰胺酶的底物的肽标签。
因此，在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，包含Gln残基的肽已经融合到抗体的重链的C-末端。
可以被引入抗体的重链或轻链中，特别是与抗体重链的C末端融合的示例性肽标签是LLQGG(SEQ ID NO:1)、LLQG(SEQ ID NO:2)、LSLSQG(SEQ ID NO:3)、GGGLLQGG(SEQ IDNO:4)、GLLQG(SEQ ID NO:5)、LLQ、GSPLAQSHGG(SEQ ID NO:6)、GLLQGGG(SEQ ID NO:7)、GLLQGG(SEQ ID NO:8)、GLLQ(SEQ ID NO:9)、LLQLLQGA(SEQ ID NO:10)、LLQGA(SEQ ID NO:11)、LLQYQGA(SEQ ID NO:12)、LLQGSG(SEQ ID NO:13)、LLQYQG(SEQ ID NO:14)、LLQLLQG(SEQ ID NO:15)、SLLQG(SEQ ID NO:16)、LLQLQ(SEQ ID NO:17)、LLQLLQ(SEQ ID NO:18)、LLQGR(SEQ ID NO:19)、EEQYASTY(SEQ ID NO:20)、EEQYQSTY(SEQ ID NO:21)、EEQYNSTY(SEQ ID NO:22)、EEQYQS(SEQ ID NO:23)、EEQYQST(SEQ ID NO:24)、EQYQSTY(SEQ ID NO:25)、QYQS(SEQ ID NO:26)、QYQSTY(SEQ ID NO:27)、YRYRQ(SEQ ID NO:28)、DYALQ(SEQ IDNO:29)、FGLQRPY(SEQ ID NO:30)、EQKLISEEDL(SEQ ID NO:31)、LQR以及YQR。
本领域技术人员知晓例如通过Sambrook,Joseph.(2001).分子克隆：实验室手册(Molecular cloning:a laboratory manual)Cold Spring Harbor,N.Y.:Cold SpringHarbor Laboratory Press描述的分子克隆的方法取代抗体的氨基酸残基或将肽标签引入抗体的方法。
通常，本领域技术人员知晓确定接头在抗体的哪个位置偶联的方法。例如，偶联位点可以通过抗体-有效载荷偶联物的蛋白水解消化和所得片段的LC-MS分析来确定。例如，样品可以根据说明书用GlyciNATOR(Genovis)去糖基化，随后分别用胰蛋白酶金(质谱级，Promega)消化。因此，1μg蛋白可以与50ng胰蛋白酶在37℃温育过夜。LC-MS分析可以使用偶联至Synapt-G2质谱仪(Waters)的nanoAcquity HPLC系统进行。为此，可以将100ng肽溶液装载到Acquity UPLC Symmetry C18捕获柱(Waters，part no.186006527)上并用5μL/min流速在1％缓冲液A(水，0.1％甲酸)和99％缓冲液B(乙腈，0.1％甲酸)下捕获3min。然后可以在25min内以从3％至65％缓冲液B的线性梯度洗脱肽。可以在具有正极性的分辨率模式中并且在从50至2000m/z的质量范围内获取数据。其他仪器设置可以是如下：毛细管电压3.2kV，采样锥40V，提取锥4.0V，源温度130℃，锥气体35L/h，毫微级流气体0.1巴，以及吹扫气体150L/h。质谱仪可以用[Glu1]-纤维蛋白肽进行校准。
进一步，本领域技术人员知晓确定抗体-有效载荷构建体的药物与抗体(DAR)比率或有效载荷与抗体比率的方法。例如，DAR可以通过疏水相互作用色谱法(HIC)或LC-MS测定。
对于疏水相互作用色谱法(HIC)，可以将样品调节至0.5M硫酸铵，并且使用从A(1.5M硫酸铵、25mm Tris-HCl、pH 7.5)到B(20％异丙醇、25mm-Tris-HCl，pH 7.5)的全梯度，在1mL/min和30℃的条件下，在20分钟内通过MAB PAK HIC丁基柱(5μM，4.6x 100mm，Thermo Scientific)进行评估。通常，可以使用40μg样品，并且可以在280nm处记录信号。可以通过将ADC DAR2种类的绝对保留时间除以对应的未偶联的mAb的保留时间来计算相对HIC保留时间(HIC-RRT)。
对于LC-MSDAR测定，ADC可以用NH4HCO3稀释至0.025mg/mL的最终浓度。随后，可以在室温下用1μL TCEP(500mM)将40μL溶液还原5min，然后通过添加10μL氯乙酰胺(200mM)进行烷基化，然后在37℃的黑暗中温育过夜。对于反相色谱法，可以使用Dionex U3000系统与Chromeleon软件相结合。该系统可以配备加热至70℃的RP-1000柱(5μm，1.0×100mm，Sepax)和波长设置为214nm的紫外线检测器。溶剂A可以由含有0.1％甲酸的水组成，而溶剂B可以包括含有0.1％甲酸的85％乙腈。可以将还原和烷基化的样品装载到柱上，并且在14分钟内通过从30-55％的溶剂B的梯度进行分离。液相色谱系统可以连接到Synapt-G2质谱仪，用于识别DAR种类。质谱仪的毛细管电压可以设置为3kV，采样锥设置为30V，提取锥加起来可以达到5V的值。源温度可以设置为150℃，去溶剂温度设置为500℃，锥气体设置为20l/h，去溶剂气体设置为600l/h，并且可以在600-5000Da的质量范围内以正模式进行采集，扫描时间为1s。仪器可以用碘化钠校准。可以使用MassLynx的MaxEnt1算法执行光谱的去卷积，直到收敛。在将DAR种类分配给色谱峰之后，可以基于反相色谱的积分峰面积来计算DAR。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，接头与抗体中包含的Gln残基的γ-羧酰胺基偶联。
也就是说，根据本发明的接头优选与抗体中包含的Gln残基的侧链中的酰胺基偶联，优选本文所公开的Gln残基中的任何一个，更优选Gln残基Q295(EU编号)。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，接头适合于以至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的偶联效率偶联至糖基化抗体。
也就是说，在某些实施方式中，接头可以是能够以至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的效率偶联至糖基化抗体的接头。在优选的实施方式中，接头可以是能够以至少70％的效率偶联至糖基化抗体的接头。在另一优选实施方式中，接头可以是能够以至少75％的效率偶联至糖基化抗体的接头。在另一优选实施方式中，接头可以是能够以至少80％的效率偶联至糖基化抗体的接头。在另一优选实施方式中，接头可以是能够以至少85％的效率偶联至糖基化抗体的接头。在另一优选实施方式中，接头可以是能够以至少90％的效率偶联至糖基化抗体的接头。在另一优选实施方式中，接头可以是能够以至少95％的效率偶联至糖基化抗体的接头。优选地，糖基化抗体是糖基化IgG抗体，更优选在残基N297(EU编号)处糖基化的IgG抗体。
本领域技术人员知晓确定抗体与特定接头的偶联效率的方法。例如，偶联效率可以如本文所描述来确定。也就是说，抗体，特别是IgG1抗体，可以在本文定义的条件下温育。在温育期之后，可以通过在还原条件下的LC-MS分析来确定偶联效率。转谷氨酰胺酶可以是来自可从Zedira(德国)获得的茂原链霉菌的微生物转谷氨酰胺酶(MTG)。合适的缓冲液可以是Tris、MOPS、HEPES、PBS或BisTris缓冲液。然而，应该理解，缓冲系统的选择可能会有所不同，并且在很大程度上取决于接头的化学性质。然而，本领域技术人员能够基于本发明的公开来识别最佳缓冲条件。可替代地，偶联效率可以如Spycher等人“Dual,Site-SpecificModification of Antibodies by Using Solid-Phase Immobilized MicrobialTransglutaminase(通过使用固相固定化微生物转谷氨酰胺酶对抗体进行双位点特异性修饰)”，ChemBioChem 2019 18(19)：1923-1927)中所描述进行测定，并如Benjamin等人“Thiolation of Q295:Site-Specific Conjugation of Hydrophobic Payloads withoutthe Need for Genetic Engineering(Q295的硫化：不需要基因工程的疏水有效载荷的位点特异性偶联)”，Mol.Pharmaceutics 2019，16:2795-2807)进行分析。
在某些实施方式中，抗体可以如实施例1中所描述偶联。也就是说，可以在旋转式热混合器中将5mg/ml天然的糖基化单克隆抗体在37℃下在50mM Tris(pH 7.6)中温育24小时，该50mM Tris包括浓度为5U/mg抗体的微生物转谷氨酰胺酶(MTG，Zedira)以及5摩尔当量的所指示的接头-有效载荷。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法，其中，微生物转谷氨酰胺酶衍生自链霉菌属，特别是茂原链霉菌。
也就是说，本发明的方法中使用的微生物转谷氨酰胺酶可以衍生自链霉菌属(特别是衍生自茂原链霉菌)，优选与天然酶具有80％的序列同一性。因此，MTG可以是天然酶，或者可以是天然酶类的工程变体。
这样的微生物转谷氨酰胺酶可从Zedira(德国)商购。它是在大肠杆菌中重组产生的。茂原链霉菌转谷氨酰胺酶具有SEQ ID NO:32中公开的氨基酸序列。已经报道了具有其他氨基酸序列的茂原链霉菌MTG变体，并且也包含在本发明中(SEQ ID NO:33和34)。
在另一实施方式中，可以使用来自达卡链霉菌(Streptomyces ladakanum)(以前称为达卡链轮丝菌(Streptoverticillium ladakanum))的微生物转谷氨酰胺酶。达卡链霉菌转谷氨酰胺酶(美国专利号US 6660510 B2)具有SEQ ID NO:35中公开的氨基酸序列。
上述两种转谷氨酰胺酶都可以进行序列修饰。在若干实施方式中，可以使用与SEQID NO:32-35中的任何一个具有80％、85％、90％或95％或更高序列同一性的转谷氨酰胺酶。
另一种合适的微生物转谷氨酰胺酶是从Ajinomoto商购，称为ACTIVA TG。与Zedira的转谷氨酰胺酶相比，ACTIVA TG缺乏4个N-末端氨基酸，但具有类似的活性。
在Kieliszek和Misiewicz(Folia Microbiol(Praha).2014；59(3)：241–250)、WO2015/191883A1、WO 2008/102007 A1和US2010/0143970)中公开了可用于本发明的其他微生物转谷氨酰胺酶，其内容通过引用完全并入本文。
在某些实施方式中，微生物转谷氨酰胺酶的突变变体可以用于接头与抗体的偶联。也就是说，在本发明的方法中使用的微生物转谷氨酰胺酶可以是如SEQ ID NO:32或33中所列出的茂原链霉菌转谷氨酰胺酶的变体。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:32中所列出的重组茂原链霉菌转谷氨酰胺酶可以包含突变G254D。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:32中所列出的重组茂原链霉菌转谷氨酰胺酶可以包含突变G254D和E304D。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:32中所列出的重组茂原链霉菌转谷氨酰胺酶可以包含突变D8E和G254D。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:32中所列出的重组茂原链霉菌转谷氨酰胺酶可以包含突变E124A和G254D。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:32中所述的重组茂原链霉菌转谷氨酰胺酶可以包含突变A216D和G254D。在某些实施方式中，如SEQ ID NO:32中所列出的重组茂原链霉菌转谷氨酰胺酶可以包含突变G254D和K331T。
在特定的实施方式中，本发明涉及用本发明的方法制备的抗体-接头偶联物。
也就是说，本发明涉及一种通过上述步骤中的任何一种生成的抗体-接头偶联物。
进一步，本发明涉及包含根据本发明的抗体-接头偶联物的药物组合物。
因此，在特定的实施方式中，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含根据本发明的抗体-接头偶联物，特别是其中，抗体-接头偶联物包含至少一种有效载荷和至少一种药学上可接受的成分。
应当理解，药物组合物可以包括已用本文公开的一步或两步方法制备的抗体-有效载荷偶联物。
在药物组合物中包含的抗体-有效载荷构建体中包含的有效载荷的类型取决于药物组合物的用途。在药物组合物用于治疗疾病的实施方式中，有效载荷优选是药物。如果该疾病是肿瘤性疾病，则有效载荷优选是毒素。在药物组合物用于诊断的实施方式中，有效载荷优选是成像剂。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的药物组合物，包含至少一种额外的治疗活性剂。
根据本发明的药物组合物可以包含至少一种药学上可接受的成分。
药学上可接受的成分是指除活性成分外，药物制剂中对受试者无毒的成分。药学上可接受的成分包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
本文所描述的抗体-接头偶联物的药物制剂通过将具有所需纯度的偶联物与一种或多种任选的药学上可接受的成分(Flemington’s Pharmaceutical Sciences 16thedition，Oslo，A.Ed.(1980))混合来制备，以冻干制剂或水溶液的形式。在所使用的剂量和浓度下，药学上可接受的成分通常对受体无毒，并且包括但不限于：缓冲剂(诸如，磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸)；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如，十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵；苯甲氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酯或对羟基苯丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质(诸如，血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；亲水性聚合物，(诸如，聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(诸如，甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸)；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂(诸如，EDTA)；糖(诸如，蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇)；形成盐的反离子(诸如，钠)；金属复合物(诸如，Zn蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂(诸如，聚乙二醇(PEG))。本文示例性药学上可接受的成分还包括体内(insterstitial)药物分散剂，诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人类可溶性PH-20透明质酸糖蛋白，诸如rHuPH20(Baxter International，Inc.)。在美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20。例如，sHASEGP可以与一种或多种额外的糖胺聚糖酶(诸如，软骨素酶)组合。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的抗体-接头偶联物(特别是其中，抗体-接头偶联物包含至少一种有效载荷)或根据本发明的药物组合物用于治疗和/或诊断。
也就是说，根据本发明的抗体-接头偶联物或药物组合物可以用于治疗受试者或诊断受试者的疾病或状况。个体或受试者优选是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如，牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人类和非人类灵长类动物(诸如，猕猴))、兔子和啮齿动物(诸如，小鼠和大鼠)。在某些实施方式中，个体或受试者是人。当根据本发明的抗体-接头偶联物或包含抗体-接头偶联物的药物组合物用于治疗时，优选接头包含药物。当抗体-接头偶联物或包含根据本发明的抗体-接头偶联物的药物组合物用于诊断时，优选接头包含至少一种成像剂。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的抗体-接头偶联物(尤其是其中抗体-接头偶联物包含至少一种有效载荷)，或根据本发明的药物组合物，用于治疗
·患有肿瘤性疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染性疾病的患者，
·处于发展为肿瘤性疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染性疾病的风险的患者，和/或
·被诊断为肿瘤性疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染性疾病的患者。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的抗体-接头偶联物(特别是其中，抗体-接头偶联物包含至少一种有效载荷)或根据本发明的药物组合物，用于治疗患有肿瘤性疾病的患者。
本文使用的术语“肿瘤性疾病”是指以细胞不受控制的异常生长为特征的疾病。肿瘤性疾病包括癌症。癌症的实例包括但不限于恶性上皮肿瘤(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体实例包括乳腺癌症、前列腺癌症、结肠癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌症、宫颈癌、胃肠道癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、肝癌(liver cancer)、膀胱癌症、肝细胞瘤(hepatoma)、结直肠癌、子宫颈癌症、子宫内膜癌、涎腺癌、肾癌、外阴癌、甲状腺癌、原发性肝癌(hepatic carcinoma)、皮肤癌、黑色素瘤、脑癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、骨髓瘤、各种头颈部癌症、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、尤因肉瘤(Ewing sarcoma)以及外周神经上皮瘤。优选癌症包括肝癌、淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、尤因肉瘤以及外周神经上皮瘤。
也就是说，根据本发明的抗体-接头偶联物优选用于治疗癌症。因此，在某些实施方式中，根据本发明的抗体-接头偶联物包含特异性结合存在于肿瘤细胞上的抗原的抗体。在某些实施方式中，抗原可以是肿瘤细胞表面上的抗原。在某些实施方式中，当抗体-接头偶联物与抗原结合时，肿瘤细胞表面上的抗原可以与抗体-接头偶联物一起内化到细胞中。
如果根据本发明的抗体-接头偶联物用于治疗癌症，则优选抗体-接头偶联物包含至少一个有效载荷，该有效载荷具有杀死或抑制抗体-接头偶联物结合的肿瘤细胞增殖的潜力。在某些实施方式中，在抗体-接头偶联物已经内化到肿瘤细胞中之后，至少一种有效载荷表现出其细胞毒性活性。在某些实施方式中，至少一个有效载荷是毒素。
炎症性疾病可以是自身免疫性疾病。传染性疾病可以是细菌感染或病毒感染。
在某些实施方式中，根据本发明的抗体-接头偶联物和/或药物组合物可以用于治疗B细胞相关癌症。
由此，在某些实施方式中，本发明涉及根据本发明的使用的抗体-接头偶联物或药物组合物，其中，药物组合物中包含的抗体-接头偶联物包含泊洛妥珠单抗，并且其中，肿瘤性疾病是B细胞相关癌症。
由此，优选抗体-接头偶联物包括本文所公开的抗-CD79b抗体，优选地其中，抗-CD79b抗体在结合至CD79b时内化到靶细胞中。在某些实施方式中，抗-CD79b抗体是具有如在SEQ ID NO：36中所示的重链和如在SEQ ID NO：37中所示的轻链的泊洛妥珠单抗。进一步，优选的是抗体-接头偶联物包含至少一种毒素。
B细胞相关癌症可以是从由以下组成的组中选择的任何一种：高、中、低度淋巴瘤(包括B细胞淋巴瘤，诸如例如，粘膜相关淋巴组织B细胞淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(NHL)、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、以及霍奇金淋巴瘤和T细胞淋巴瘤)和白血病(包括继发性白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)(诸如，B细胞白血病(CD5+B淋巴细胞)、髓细胞白血病(诸如，急性髓细胞白血病、慢性髓系白血病)、淋巴白血病(诸如，急性淋巴细胞白血病(ALL)和骨髓发育不良)、以及其他血液学和/或B细胞或T细胞相关癌症(包括其他造血细胞的癌症，包括多形核白细胞，诸如嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和单核细胞、树突状细胞、血小板、红细胞和自然杀伤细胞)。还包括选自以下的癌性B细胞增殖性障碍：淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)侵袭性NHL、复发性侵袭性NHL、复发性惰性NHL、难治性NHL、难治性惰性NHL、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)以及套细胞淋巴瘤。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的使用的抗体-接头偶联物或药物组合物，其中，B细胞相关癌症是非霍奇金淋巴瘤，特别是其中，B细胞相关癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤。
进一步，抗CD79b抗体-接头偶联物和/或包含抗-CD79b抗体-接头偶联物的药物组合物可以与适用于治疗B细胞相关癌症的其他疗法结合使用。
因此，在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的使用的抗体-接头偶联物或药物组合物，其中，抗体-接头偶联物或药物组合物与苯达莫司汀和/或利妥昔单抗联合给药。
应当理解接头偶联物或药物组合物不一定必须与额外的治疗剂(诸如，苯达莫司汀和/或利妥昔单抗)同时给药。相反，抗体-接头偶联物或药物组合物可以以不同的给药时间表给药，并且因此在不同的日子作为用于治疗相同疾病的其他治疗剂给药。
在某些实施方式中，根据本发明的抗体-接头偶联物和/或药物组合物可以用于治疗HER2阳性癌症。
由此，在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的使用的抗体-接头偶联物或药物组合物，其中，药物组合物中包含的抗体-接头偶联物包含曲妥珠单抗，并且其中，肿瘤性疾病是HER2阳性癌症，特别是HER2阳性乳腺癌、胃癌、卵巢癌或肺癌。
由此，优选的是抗体-接头偶联物包括本文所公开的抗HER2/neu抗体，优选地其中，抗HER2/neu抗体在结合至HER2/neu时内化到靶细胞。在某些实施方式中，抗HER2/neu抗体是具有SEQ ID NO:38中所示的重链和SEQ ID NO:39中所示的轻链的曲妥珠单抗。进一步，优选的是抗体-接头偶联物包含至少一种毒素。
本文中使用的HER2阳性癌症可以是但不限于HER2阳性的乳腺癌、胃癌、卵巢癌或肺癌。技术人员能够确定癌症是否为HER2阳性癌症。例如，可以在活检中分离肿瘤细胞，并且可以用本领域已知的任何方法确定HER2/neu的存在。
进一步，抗HER2/neu抗体-接头偶联物和/或包含抗-HER2/neu抗体-接头偶联物的药物组合物可以与适用于治疗HER2阳性癌症的其他疗法结合使用。
因此，在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的使用的抗体-接头偶联物或药物组合物，其中，抗体-接头偶联物或药物组合物与拉帕替尼、卡培他滨和/或紫杉烷联合给药。
应当理解抗体-接头偶联物或药物组合物不一定必须与额外的治疗剂(诸如，拉帕替尼、卡培他滨和/或紫杉烷)同时给药。相反，抗体-接头偶联物或药物组合物可以以不同的给药时间表给药，并且因此在不同的日子作为用于治疗相同疾病的其他治疗剂给药。
在某些实施方式中，根据本发明的抗体-接头偶联物和/或药物组合物可以用于治疗结合素-4阳性癌症。
因此，在具体实施方式中，本发明涉及根据本发明的使用的抗体-接头偶联物或药物组合物，其中，药物组合物中包含的抗体-接头偶联物包含恩诺单抗或恩诺单抗变体，并且其中，肿瘤性疾病是结合素-4阳性癌症，特别是结合素-4阳性的胰腺癌、肺癌、膀胱癌或乳腺癌。
由此，优选的是抗体-接头偶联物包括本文所公开的抗结合素-4抗体，优选地其中，抗结合素-4抗体在结合至结合素-4时内化到靶细胞中。在某些实施方式中，抗结合素-4抗体是具有如在SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：42中所示的重链和如在SEQ ID NO：41中所示的轻链的恩诺单抗。进一步，优选的是抗体-接头偶联物包含至少一种毒素。
本文中使用的N结合素-4阳性癌症可以是但不限于结合素-4阳性的胰腺癌、肺癌、膀胱癌或乳腺癌。技术人员能够确定癌症是否为结合素4阳性癌症。例如，可以在活检中分离肿瘤细胞，并且可以用本领域已知的任何方法确定结合素-4的存在。
进一步，抗结合素-4抗体-接头偶联物和/或包含抗结合素-4抗体-接头偶联物的药物组合物可以与适用于治疗结合素-4阳性癌症的其他疗法结合使用。
因此，在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的使用的抗体-接头偶联物或药物组合物，其中，抗体-接头偶联物或药物组合物与基于顺铂的化疗剂和/或帕博利珠单抗(Pemobrolizumab)联合给药。
应当理解，抗体-接头偶联物或药物组合物不一定必须与额外的治疗剂(诸如，基于顺铂的化疗剂和/或帕博利珠单抗)同时给药。相反，抗体-接头偶联物或药物组合物可以以不同的时间表给药，并且因此在不同的日子作为用于治疗相同疾病的其他治疗剂给药。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的抗体-接头偶联物(特别是其中，抗体-接头偶联物包含至少一种有效载荷)或根据本发明的药物组合物，用于制造用于以下治疗的药物的用途，
·患有肿瘤性疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染性疾病的患者，
·处于发展为肿瘤性疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染性疾病的风险的患者，和/或
·被诊断为肿瘤性疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染性疾病的患者。
在特定的实施方式中，本发明涉及一种治疗或预防肿瘤性疾病的方法，该方法包括向需要其的患者给药根据本发明的抗体-接头偶联物(特别是其中，抗体-接头偶联物包含至少一种有效载荷)或根据本发明的药物组合物。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的抗体-接头偶联物(特别是其中，抗体-接头偶联物包含至少一种有效载荷)或根据本发明的药物组合物，用于术前、术中或术后成像。
也就是说，根据本发明的抗体-接头偶联物可以在医学成像中使用。为此，抗体-接头偶联物可以在与特定靶分子、细胞或组织结合时被可视化。本领域已知不同的技术来可视化特定的有效载荷。例如，如果有效载荷是放射性核素，则可以通过PET或SPECT对抗体-接头偶联物结合的分子、细胞或组织进行可视化。如果有效载荷是荧光染料，则可以通过荧光成像来使抗体-接头偶联物结合的分子、细胞或组织可视化。在某些实施方式中，根据本发明的抗体-接头偶联物包括两种不同的有效载荷，例如放射性核素和荧光染料。在这种情况下，可以使用两种不同和/或互补的成像技术(例如PET/SPECT和荧光成像)对抗体-接头偶联物结合的分子、细胞或组织进行可视化。
抗体-接头偶联物可以用于术前、术中和/或术后成像。
术前成像包括可以在手术前进行的所有成像技术，以在诊断某种疾病或状况时使特定的靶分子、细胞或组织可见，并且可选地为手术提供指导。术前成像可以包括通过使用抗体-接头偶联物在进行手术之前通过PET或SPECT使肿瘤可见的步骤，该抗体-接头偶联物包括特异性结合肿瘤上的抗原并偶联至包括放射性核素的有效载荷的抗体。
术中成像包括可以在手术期间进行的所有成像技术，以使特定的靶分子、细胞或组织可见，从而为手术提供指导。在某些实施方式中，包含近红外荧光染料的抗体-接头偶联物可以用于在手术期间通过近红外荧光成像来观察肿瘤。术中成像允许外科医生在手术期间识别特定组织(例如肿瘤组织)，从而可以完全去除肿瘤组织。
术后成像包括手术后可以进行的所有成像技术，以使特定的靶分子、细胞或组织可见并评估手术结果。术后成像可以与术前手术类似地进行。
在某些实施方式中，本发明涉及包含两种或更多种不同有效载荷的抗体-接头偶联物。例如，抗体-接头偶联物可以包括放射性核素和近红外荧光染料。这种抗体-有效载荷偶联物可用于通过PET/SPECT成像和近红外荧光成像。这种抗体的优点在于，它可以用于通过PET或SPECT在手术前后观察靶组织(例如肿瘤)。同时，在手术过程中可以通过近荧光红外成像对肿瘤进行可视化。
在特定的实施方式中，本发明涉及根据本发明的抗体-接头偶联物(特别是其中，抗体-接头偶联物包含至少一种有效载荷)或根据本发明的药物组合物，用于在术中成像指导的癌症手术。
如上所描述，本发明的抗体-接头偶联物可以用于观察靶分子、细胞或组织，并且在手术期间指导外科医生或机器人。也就是说，抗体-接头偶联物可以例如通过近红外成像用于在手术期间使肿瘤组织可视化，并允许完全去除肿瘤组织。
根据本发明的抗体-接头偶联物或药物组合物可以有效治疗疾病或足以用于诊断目的的量或剂量给药于人或动物受试者。
根据本发明的抗体-接头偶联物或药物组合物可以通过任何合适的方式(包括胃肠外、肺内和鼻内给药)给药，并且如果需要局部治疗，可以通过病灶内、宫内或膀胱内给药。肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。给药可以通过任何合适的途径，例如通过注射(诸如，静脉注射或皮下注射)，部分取决于给药是短暂的还是长期的。本文设想了各种给药方案，包括但不限于在各种时间点上的单次或多次给药、推注给药和脉冲输注。
根据本发明的抗体-接头偶联物或药物组合物可以按照与本发明一致的方式配制、给药和施用，将按照与良好医疗实践一致的方式进行配制、给药和施用。在本文中考虑的因素包括正在治疗的特定病症、正在治疗的特殊哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、试剂的递送部位、给药方法、给药时间安排以及医生已知的其他因素。根据本发明的抗体-接头偶联物或药物组合物不需要，而是任选地与一种或多种目前用于预防或治疗有问题病症的试剂进行配制。这种其他试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体-接头偶联物的量、病症或治疗的类型以及上文讨论的其他因素。这些通常以与本文所描述相同的剂量和给药途径使用，或约为本文所描述剂量的1％至99％，或以经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，根据本发明的抗体-接头偶联物或药物组合物的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他额外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、抗体-有效载荷偶联物的类型、疾病的严重程度和病程、是否出于预防或治疗目的给药抗体-接头偶联物、既往治疗、患者的临床病史和对抗体-接头偶联物的反应、以及主治医生的判断。根据本发明的抗体-接头偶联物或药物组合物在一次或一系列治疗中适合地给药于患者。
实施例
常规方法
抗体曲妥珠单抗可商购(Roche，从药店购买)，以及所有肽-接头和接头-有效载荷(分别由LifeTein和Levena Biopharma定制合成)。将具有由SEQ ID NO:36和37的序列组成的重链和轻链的泊洛妥珠单抗瞬时转染到悬浮液适应的CHO-K1细胞中，并在无血清/无动物成分的培养基中表达。通过蛋白质A亲和色谱法(Mab Select Sure柱；GEHealthcare)从上清液中纯化蛋白质。
偶联反应通过将天然糖基化单克隆抗体、微生物转谷氨酰胺酶(MTG，Zedira)、以及指定的肽-接头或接头-有效载荷在缓冲液中在旋转式热混合器中进行混合来进行。偶联效率通过LC-MS在DTT减少的条件下进行评估。通过将样品在37℃在50mM DTT(最终)和50mMTris缓冲液中孵育15min来实现样品的还原。在Xevo G2-XS QTOF(Waters)上分析探针，该QTOF连接到Acquity UPLC H类系统(Waters)和ACQUITY UPLC BEH C18柱。偶联效率(CE)由去卷积光谱计算，并以％表示。根据以下公式，计算时考虑了两种糖型(G1F和G0F)产生的强度：
其中cj＝偶联的，ncj＝非偶联的。
实施例1：优化反应条件的鉴定
方法
使用两组不同的反应条件进行反应：条件1：1mg/ml的天然糖基化曲妥珠单抗抗体、浓度为6U/mg的MTG和80摩尔当量的指定肽-接头或接头-有效载荷，在Tris 50mM(pH7.6)中在37℃在旋转式热混合器中20小时；或条件2：5mg/ml的天然糖基化曲妥珠单抗抗体、浓度为5U/mg的MTG和5摩尔当量的指定肽-接头或接头-有效载荷，在Tris 50mM(pH7.6)中在37℃在旋转式热混合器中24小时。如常规方法中所描述，通过LCMS评估偶联效率。
结果
令人惊讶地，如表3所示，使用显著较少当量的肽-接头和接头-有效载荷(80摩尔当量与5摩尔当量)和较低的MTG(5U/mg与6U/mg)浓度获得了优异的偶联效率。甚至更显著地，使用条件2(即,使用5摩尔当量的肽-接头或接头-有效载荷而不是80摩尔当量)，使用功能化肽的或接头-有效载荷的偶联效率显著提高。这一观察结果适用于不同的接头，但也适用于不同有效载荷类别(三种细胞毒素：MMAE、美登素和依喜替康；以及一种类固醇：皮质醇)，这非常令人惊讶。
表3.使用优化反应条件的偶联效率
CS：皮质醇，May：美登素，Exa：依喜替康，nt：未测试
实施例2：其他反应条件的鉴定
为了证明与赖氨酸-接头-有效载荷的偶联耐受多种反应条件，使用具有不同参数的一系列反应条件进行了接头-有效载荷与泊洛妥珠单抗的偶联。
方法
作为标准条件，使用了以下参数：5mg/ml的天然糖基化泊洛妥珠单抗抗体、浓度为5U/mg的MTG和5摩尔当量的RKAA-PABC-MMAE，在Tris 50mM(pH 7.6)中在37℃在旋转式热混合器中24小时。
可变参数如表4所示。
偶联效率通过LCMS如下评估：偶联效率(CE)由去卷积光谱计算，并以％表示。根据以下公式，计算时考虑了两种糖型(G1F和G0F)产生的强度：
其中cj＝偶联的，ncj＝非偶联的。
结果
RKAA-PABC-MMAE接头-有效载荷在非常宽的反应条件范围内以非常高的偶联效率偶联：使用5至17mg/ml之间的抗体浓度、2至10U/mg之间的相对于抗体浓度的MTG浓度(U/mg)实现了>80％的偶联效率。进一步，用接头相对于抗体的摩尔浓度(2至8当量)以及非常宽范围的pH也获得了高偶联效率(pH 6.0偶联效率为67％，并且pH 8偶联效率为86％)。
令人惊讶的是，与抗体相比，使用较少的接头-有效载荷过量获得了更高的偶联效率，即2-20当量的接头-有效载荷比使用80当量产生了更高的偶联效率，这与预期相反(表4)。
表4.不同反应条件下RK-接头-有效载荷与泊洛妥珠单抗的偶联效率
实施例3：其他反应条件的鉴定
为了证明接头浓度的重要性，将具有不同序列和有效载荷的其他接头以不同浓度偶联至抗体泊洛妥珠单抗和曲妥珠单抗。
方法
作为标准条件，使用了以下参数：3.5mg/ml的天然糖基化的泊洛妥珠单抗或曲妥珠单抗抗体和浓度为5U/mg的MTG，在Tris 50mM(pH 7.6)中在37℃在旋转式热混合器中24小时。将接头RKAA-PABC-MMAE、KAR-PABC-MMAE和AHK-PABC-Exa以不同的浓度添加到反应混合物中。
可变参数如表5所示。
通过RPLC如下评估偶联效率：还原后，使用BioResolve RP mAb聚苯柱在UHPLCDionex UltiMate 3000(Thermo Fisher)上分析样品。偶联效率(CE)根据公式使用从RPLC色谱图中提取的相对峰面积计算并且以％表示：
其中cj＝偶联的，ncj＝非偶联的。
结果
对于所有测试的接头，当将5-20当量的接头有效载荷添加到反应中时获得了异常高的偶联效率。
表5.在不同反应条件下RKAA-PABC-MMAE、KAR-PABC-MMAE或AHK-PABC-Exa与泊洛妥珠单抗或曲妥珠单抗的偶联效率

Claims (37)

1.一种通过转谷氨酰胺酶生产抗体-接头偶联物的方法，所述方法包括将包含(如N→C方向所示的)(Sp1)-K-(Sp2)-B-(Sp3)或(Sp1)-B-(Sp2)-K-(Sp3)结构的接头偶联至抗体中包含的Gln残基的步骤，其中，
·(Sp1)是化学间隔物或不存在；
·(Sp2)是化学间隔物或不存在；
·(Sp3)是化学间隔物或不存在；
·K是赖氨酸或赖氨酸衍生物或赖氨酸模拟物；
·B是连接部分或有效载荷；
其中，所述接头经由赖氨酸残基、所述赖氨酸衍生物或所述赖氨酸模拟物的侧链中包含的伯胺偶联至所述抗体中包含的Gln残基；并且
其中，所述抗体与小于80摩尔当量的所述接头接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述接头偶联的Gln残基是IgG抗体的CH2结构域的Gln残基Q295(EU编号)。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述IgG抗体是糖基化IgG抗体，特别是其中，所述IgG抗体在所述CH2结构域的残基N297(EU编号)处糖基化。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述抗体与20摩尔当量或小于20摩尔当量的所述接头接触。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述抗体与2-20摩尔当量的所述接头接触。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，将所述抗体以1-50mg/mL范围内的浓度添加到偶联反应中。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，将所述转谷氨酰胺酶以1-20U/mg抗体范围内的浓度添加到偶联反应中。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述接头与所述抗体的偶联在6至8.5范围内的pH处实现。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述化学间隔物(Sp1)、(Sp2)和(Sp3)各自独立地包含0至12个氨基酸残基。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述接头包含不超过25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4个氨基酸残基。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述接头的净电荷是中性或正的。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述接头不包含带负电荷的氨基酸残基。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，B是连接部分。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述连接部分B包含
·生物正交标记基团、或
·用于交联的非生物正交实体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述生物正交标记基团或所述用于交联的非生物正交实体由至少一个分子或部分组成或者包含至少一个分子或部分，所述分子或部分选自由以下组成的组：
·-N-N≡N或-N3；
·Lys(N3)；
·四嗪；
·炔烃；
·应变环辛炔；
·BCN；
·应变烯烃；
·光反应性基团；
·醛；
·酰基三氟硼酸酯；
·蛋白质降解剂(‘PROTAC’)；
·环戊二烯/螺环戊二烯；
·硫代选择性亲电体；
·-SH；以及
·半胱氨酸。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，所述方法包括将一种或多种有效载荷偶联至所述连接部分B的进一步步骤。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述一种或多种有效载荷经由点击反应偶联至所述连接部分B。
18.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，B是有效载荷。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中，所述有效载荷包括以下中的至少一种：
·毒素；
·细胞因子；
·生长因子；
·放射性核素；
·激素；
·抗病毒剂；
·抗菌剂；
·荧光染料；
·免疫调节剂/免疫刺激剂；
·半衰期增加部分；
·溶解度增加部分；
·聚合物-毒素偶联物；
·核酸；
·生物素或链霉亲和素部分；
·维生素；
·蛋白质降解剂(‘PROTAC’)；
·靶结合部分；和/或
·抗炎剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述毒素是选自由以下组成的组中的至少一种：
·吡咯并苯并二氮杂卓(例如，PBD)；
·奥瑞他汀(例如，MMAE、MMAF)；
·类美登素(例如，美登素、DM1、DM4、DM21)；
·倍癌霉素；
·烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)抑制剂；
·微管溶素；
·烯二炔(例如，卡奇霉素)；
·蒽环类衍生物(PNU)(例如，阿霉素)；
·吡咯基驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)抑制剂；
·念珠藻素；
·药物外排泵抑制剂；
·山卓霉素；
·鹅膏蕈碱(例如，α-鹅膏蕈碱)；以及
·喜树碱(例如，依喜替康、德鲁替康)。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，所述化学间隔物(Sp2)包括自裂解部分。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述自裂解部分直接附接至所述有效载荷B。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中，所述自裂解部分包括对氨基苄基氨基甲酰基(PABC)部分或自裂解氨基亚甲基间隔物。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中，所述抗体是IgG抗体，特别是IgG1抗体。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中，所述抗体选自由以下组成的组：维布妥昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗、奥英妥珠单抗、阿维单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、达雷妥尤单抗、帕妥珠单抗、维多珠单抗、奥瑞珠单抗、托珠单抗、乌司奴单抗、戈利木单抗、奥妥珠单抗、沙西妥珠单抗、贝兰妥单抗、泊洛妥珠单抗以及恩诺单抗。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中，所述接头偶联至所述抗体中包含的Gln残基的γ-羧酰胺基。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中，所述接头适合于以至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的偶联效率偶联至糖基化抗体。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中，所述转谷氨酰胺酶是微生物转谷氨酰胺酶，所述微生物转谷氨酰胺酶衍生自链霉菌属物种，特别是茂原链霉菌。
29.一种抗体-接头偶联物，其通过根据权利要求1至28中任一项所述的方法生产。
30.一种药物组合物，其包含根据权利要求29所述的抗体-接头偶联物。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，包含至少一种额外的治疗活性剂。
32.根据权利要求29所述的抗体-接头偶联物或根据权利要求30或31所述的药物组合物，用于治疗和/或诊断，特别是其中所述抗体-接头偶联物包含至少一种有效载荷。
33.根据权利要求29所述的抗体-接头偶联物或根据权利要求30或31所述的药物组合物，用于治疗
·患有肿瘤性疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染性疾病的患者，·处于发展为肿瘤性疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染性疾病的风险的患者，和/或
·被诊断为肿瘤性疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染性疾病的患者，
特别是其中，所述抗体-接头偶联物包含至少一种毒素。
34.根据权利要求33所述的使用的抗体-接头偶联物或药物组合物，其中，所述抗体-接头偶联物包含泊洛妥珠单抗，并且其中，所述肿瘤性疾病是B细胞相关癌症。
35.根据权利要求34所述的使用的抗体-接头偶联物或药物组合物，其中，所述B细胞相关癌症是非霍奇金淋巴瘤，特别是其中，所述B细胞相关癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤。
36.根据权利要求33所述的使用的抗体-接头偶联物或药物组合物，其中，所述抗体-接头偶联物包含曲妥珠单抗，并且其中，所述肿瘤性疾病是HER2阳性癌症，特别是HER2阳性乳腺癌、胃癌、卵巢癌或肺癌。
37.根据权利要求33所述的使用的抗体-接头偶联物或药物组合物，其中，所述抗体-接头偶联物包含恩诺单抗或恩诺单抗变体，并且其中，所述肿瘤性疾病是结合素-4阳性癌症，特别是结合素-4阳性胰腺癌、肺癌、膀胱癌或乳腺癌。
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