KR20090100407A

KR20090100407A - 비천연 아미노산 및 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 비천연 아미노산 및 폴리펩티드를 포함하는 방법, 및 비천연 아미노산 및 폴리펩티드의 용도

Info

Publication number: KR20090100407A
Application number: KR1020097014780A
Authority: KR
Inventors: 젠웨이 미아오; 준지 리우
Original assignee: 암브룩스, 인코포레이티드
Priority date: 2006-12-18
Filing date: 2007-12-18
Publication date: 2009-09-23
Also published as: WO2011028195A2; JP2010512800A; CA2672205A1; WO2008077079A1; AU2007333737A1; CN101578264A; MX2009006617A; EP2079687A1; WO2011028195A3

Abstract

본원에는 비천연 아미노산 및 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와, 이러한 비천연 아미노산 및 폴리펩티드의 제조 방법이 개시된다. 상기 비천연 아미노산은 그 자체로서 또는 폴리펩티드의 일부로서 다양한 작용기를 포함할 수 있으나, 일반적으로 하나 이상의 인돌, 카보닐 및/또는 하이드라진 기를 포함한다. 본원에는 또한, 추가로 번역 후 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 이러한 변형을 실시하는 방법, 및 이러한 폴리펩티드를 정제하는 방법이 개시된다. 일반적으로, 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 하나 이상의 인돌, 카보닐 및/또는 하이드라진 기를 포함한다. 본원에는 또한 치료 용도, 진단 용도 및 다른 생물공학적 용도를 비롯하여, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 사용 방법도 개시된다.

Description

비천연 아미노산 및 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 비천연 아미노산 및 폴리펩티드를 포함하는 방법, 및 비천연 아미노산 및 폴리펩티드의 용도{COMPOSITIONS CONTAINING, METHODS INVOLVING, AND USES OF NON-NATURAL AMINO ACIDS AND POLYPEPTIDES}

[관련 출원]

본 출원은 2006년 12월 18일에 출원된 미국 정규 특허 출원 제60/870,594호를 기초로 우선권을 주장한다.

[발명의 분야]

본 발명은 비천연 아미노산, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 상기 비천연 아미노산 및 폴리펩티드의 제조 방법과, 진단 용도, 환경 용도, 산업 용도 및 치료 용도에 있어서의 상기 비천연 아미노산 및 폴리펩티드의 사용에 관한 것이다.

유전자에 의해 코딩된 것이 아닌 아미노산(즉, "비천연 아미노산")을 단백질 내로 도입하는 능력은 천연 작용기, 예컨대 라이신의 엡실론 -NH₂, 시스테인의 설프하이드릴 -SH, 히스티딘의 이미노기 등에 대한 가치있는 대용물을 제공할 수 있는 화학적 작용기의 도입을 가능하게 한다. 일부 화학적 작용기는 유전적으로 코딩된 20종의 일반 아미노산에서 발견되는 작용기에 대해 비활성이지만, 비천연 아미노산에 도입될 수 있는 작용기와 명백히 효율적으로 반응하여 안정한 결합을 형성하는 것으로 알려져 있다.

유전적으로 코딩된 20종의 일반 아미노산에서 발견되는 작용기들 모두에 대해 화학적 비활성을 나타내며 특정 작용기를 포함하는 물질과 효율적 및 선택적으로 반응하여 안정한 공유 결합을 형성하는 데 사용될 수 있는, 단백질 내에서 발견되지 않는 화학적 작용기를 선택적으로 도입하는 방법이 현재 이용 가능하다.

[발명의 개요]

비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 특성 분석하고 사용하는 방법, 조성물, 기법 및 수단이 본원에 기재되어 있다. 일 양태에서, 비천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유도체화하기 위한 방법, 조성물, 기법 및 수단이 제공된다. 일 실시형태에서, 이러한 방법, 조성물, 기법 및 수단은 화학적 유도체화를 수반하고, 다른 실시형태에서는, 생물학적 유도체화를 수반하며, 다른 실시형태에서는, 물리적 유도체화를 수반하고, 다른 실시형태에서는, 유도체화의 조합을 수반한다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 이러한 유도체화는 위치 선택적 유도체화이다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 이러한 유도체화는 비천연 아미노산 함유 반응제(reagent)와 유도체화제 둘 다에 있어서 화학량론적이거나 거의 화학량론적이다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 이러한 유도체화는 주위 온도에서 신속히 일어난다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 이러한 유도체화는 수용액 중에서 일어난다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 이러한 유도체화는 pH 약 4∼약 10에서 일어난다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 이러한 유도체화는 비천연 아미노산 함유 반응제와 유도체화제 둘 다에 있어서 화학량론적, 거의 화학량론적 또는 화학량론적 유사 유도체화이다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 원하는 기를 비천연 아미노산 폴리펩티드 상에 화학량론적으로, 거의 화학량론적으로 또는 화학량론적 유사 방식으로 도입할 수 있는 방법이 제공된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 원하는 기를 비천연 아미노산 폴리펩티드 상에 화학량론적으로, 거의 화학량론적으로 또는 화학량론적 유사 방식으로 도입할 수 있는 수단, 반응 혼합물 및 합성 조건이 제공된다.

일 양태에서, 하나 이상의 케톤기 및/또는 하나 이상의 알데히드기를 포함하는 군을 비롯하여 카보닐기 또는 마스킹된 카보닐기의 반응성에 기초한 펩티드 및 단백질의 화학적 유도체화를 위한 비천연 아미노산이 제공된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 하이드라진기 또는 마스킹된 하이드라진기의 반응성에 기초한 펩티드 및 단백질의 화학적 유도체화를 위한 비천연 아미노산이 제공된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 전술한 비천연 아미노산 중 적어도 하나가 폴리펩티드로 도입되며, 즉, 그러한 실시형태는 비천연 아미노산 폴리펩티드이다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 이들 자신과 유도체화 분자의 반응이 인돌 함유 결합을 생성하도록 그 측쇄 상에서 작용기화된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 유도체화 분자와 반응하여 인돌 결합을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생성할 수 있는 비천연 아미노산 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 카보닐 및/또는 하이드라진 측쇄를 갖는 아미노산으로부터 선택된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 마스킹된 하이드라진기 및/또는 마스킹된 카보닐기를 비롯한 마스킹된 측쇄를 포함한다.

또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 카보닐 측쇄를 포함하며, 여기서 카보닐은 케톤 또는 알데히드로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, 적절하게 작용기화된 반응제로 처리할 경우 인돌을 형성할 수 있는 작용기를 포함하는 비천연 아미노산이 제공된다. 일부 실시형태에서, 인돌 부분을 포함하는 비천연 아미노산이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 질환, 병증 또는 질병을 치료하기 위한 인돌 부분을 포함하는 비천연 아미노산이 제공된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 구조 면에서 천연 아미노산과 유사하나 전술한 작용기 중 하나를 포함한다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 페닐알라닌 또는 타이로신(방향족 아미노산)과 유사한 한편, 또 다른 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 알라닌 및 루신(소수성 아미노산)과 유사하다. 일 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 천연 아미노산의 특성과 상이한 특성을 갖는다. 일 실시형태에서, 이러한 상이한 특성은 측쇄의 화학적 반응성이고, 추가 실시형태에서, 이 상이한 화학적 반응성은 상기 비천연 아미노산의 측쇄가 폴리펩티드의 단위인 상태로 반응할 수 있게 하며, 단, 동일한 폴리펩티드 내의 천연 아미노산 단위의 측쇄에서는 상기 반응이 일어나지 않는다. 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산의 측쇄는 천연 아미노산의 측쇄에 대해 오르토고날(orthogonal)인 화학적 성질을 갖는다. 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산의 측쇄는 친전자체 함유 부분을 포함하고, 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산의 측쇄 상의 친전자체 함유 부분에서 질소 함유 복소환 유도체화 단백질(예를 들어, 인돌 부분을 함유함)을 비롯한 복소환 유도체화 단백질을 생성할 수 있는 친핵성 공격 반응이 일어날 수 있다. 이 단락의 전술한 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 비천연 아미노산은 별개의 분자로 존재하거나 임의의 길이의 폴리펩티드로 도입되며; 폴리펩티드로 도입되는 경우, 일부 실시형태에서 상기 폴리펩티드는 천연 또는 비천연 아미노산을 추가로 도입한다.

또 다른 양태에서, 인돌 함유 복소환 결합에 기초한 유도체화된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 제조를 위한 하이드라진 치환 분자가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 인돌 함유 복소환 결합의 형성을 통해 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유도체화하는 데 사용되는 하이드라진 치환 분자가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 상기 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 케톤 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드이다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 카보닐함유 비천연 아미노산은 측쇄를 포함하며, 여기서 카보닐은 케톤 또는 알데히드로부터 선택된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 하이드라진 치환 분자는 원하는 작용기성을 포함한다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 하이드라진 치환 분자는 하이드라진 치환 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산의 측쇄는, 상기 비천연 아미노산이 하이드라진 치환 분자와 선택적으로 반응할 수 있도록 하는, 천연 아미노산의 측쇄에 대해 오르토고날인 화학적 성질을 갖는다. 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산의 측쇄는 하이드라진 함유 분자와 선택적으로 반응하는 친전자체 함유 부분을 포함하고; 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산의 측쇄 상의 친전자체 함유 부분에서 질소 함유 복소환 유도체화 단백질을 비롯한 복소환 유도체화 단백질을 생성할 수 있는 친핵성 공격 반응이 일어날 수 있다. 이 단락에 기재된 실시형태들에 관련된 또 다른 양태에서, 유도체화 분자와 비천연 아미노산 폴리펩티드와의 반응으로부터 생성되는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 실시형태는 이미 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 임의의 추가 변형을 포함한다.

또 다른 양태에서, 질소 함유 복소환(예를 들어, 인돌 또는 인돌 부분을 함유하는 다환 구조)을 비롯한 복소환 결합에 기초한 유도체화된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 제조를 위한 카보닐 치환 분자가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 인돌 함유 복소환 결합의 형성을 통해 하이드라진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유도체화하는 데 사용되는 카보닐 치환 분자가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, pH 범위 약 1∼약 6에서 하이드라진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드와 함께 상기 복소환을 형성할 수 있는 카보닐 치환 분자가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 유도체화 분자와 하이드라진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 사이의 인돌 함유 복소환 결합의 형성을 통해 하이드라진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유도체화하는 데 사용되는 카보닐 치환 분자가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 상기 카보닐 치환 분자는 케톤 치환 분자이고, 다른 양태에서 알데히드 치환 분자이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 카보닐 치환 분자는 원하는 작용기성을 포함한다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 알데히드 치환 분자는 알데히드 치환 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산의 측쇄는, 상기 비천연 아미노산이 카보닐 치환 분자와 선택적으로 반응할 수 있도록 하는, 천연 아미노산의 측쇄에 대해 오르토고날인 화학적 성질을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산의 측쇄는 카보닐 함유 분자와 선택적으로 반응하는 부분(예를 들어, 하이드라진기)을 포함하고; 또 다른 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산의 측쇄 상의 친핵성 부분에서 질소 함유 복소환 유도체화 단백질을 비롯한 복소환 유도체화 단백질을 생성할 수 있는 친전자성 공격 반응이 일어날 수 있다. 이 단락에 기재된 실시형태들에 관련된 또 다른 양태에서, 유도체화 분자와 비천연 아미노산 폴리펩티드와의 반응으로부터 생성되는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 실시형태는 이미 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 임의의 추가 변형을 포함한다.

또 다른 양태에서, 인돌 함유 복소환 결합에 기초한 유도체화된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생성을 위한 일작용성, 이작용기성 및 다작용기성 링커가 제공된다. 일 실시형태에서, 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 다른 분자에 연결하는 데 사용될 수 있는 (이작용기성 및 다작용기성) 분자 링커가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 하이드라진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 다른 분자에 연결하는 데 사용될 수 있는 (이작용기성 및 다작용기성) 분자 링커가 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 상기 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 케톤 또는 알데히드를 포함한다. 하이드라진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 이용하는 일 실시형태에서, 상기 분자 링커는 그 말단 중 하나에 카보닐기를 포함하며; 또 다른 실시형태에서, 상기 카보닐기는 알데히드기 또는 케톤기로부터 선택된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 하이드라진 치환 링커 분자는 하이드라진 치환 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커 분자이다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 카보닐 치환 링커 분자는 카보닐 치환 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커 분자이다. 또 다른 실시형태에서, "다른 분자"라는 어구는, 예를 들어 단백질, 다른 중합체 및 소분자를 포함한다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 하이드라진 함유 분자 링커는 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드와의 반응시 그 생성물이 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동종다량체화 생성물이 되도록 모든 말단 상에 동일한 또는 동등한 기를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 동종다량체화는 동종이량체화이다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 카보닐 함유 분자 링커는 하이드라진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드와의 반응시 그 생성물이 하이드라진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동종다량체화 생성물이 되도록 모든 말단 상에 동일한 또는 동등한 기를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 동종다량체화는 동종이량체화이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산의 측쇄는, 상기 비천연 아미노산이 하이드라진 치환 링커 분자와 선택적으로 반응할 수 있도록 하는, 천연 아미노산의 측쇄에 대해 오르토고날인 화학적 성질을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산의 측쇄는, 상기 비천연 아미노산이 카보닐 치환 링커 분자와 선택적으로 반응할 수 있도록 하는, 천연 아미노산의 측쇄에 대해 오르토고날인 화학적 성질을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산의 측쇄는 하이드라진 함유 링커 분자와 선택적으로 반응하는 친전자체 함유 부분을 포함하고; 또 다른 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산의 측쇄 상의 친전자체 함유 부분에서 질소 함유 복소환 유도체화 단백질을 비롯한 복소환 유도체화 단백질을 생성할 수 있는 하이드라진 함유 링커 분자에 의한 친핵성 공격 반응이 일어날 수 있다. 이 단락에 기재된 실시형태들에 관련된 또 다른 양태에서, 링커 분자와 비천연 아미노산 폴리펩티드와의 반응으로부터 생성되는 결합된(변형된) 비천연 아미노산 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 실시형태는 이미 결합된(변형된) 비천연 아미노산 폴리펩티드의 임의의 추가 변형을 포함한다.

일 양태에서, 질소 함유 복소환 유도체화 단백질을 비롯한 복소환 유도체화 단백질을 생성하기 위한, 카보닐 반응물과 하이드라진 반응물의 반응을 통해 단백질을 유도체화하는 방법이 제공된다. 이 양태에는, 질소 함유 복소환 유도체화 단백질 부가 생성물을 비롯한 복소환 유도체화 단백질 부가 생성물을 생성하기 위한, 카보닐 함유 반응제와 하이드라진 함유 반응제의 축합 반응에 기초한 단백질의 유도체화 방법이 포함된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 하이드라진 작용기화 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자로 케톤 함유 단백질 또는 알데히드 함유 단백질을 유도체화하는 방법이 제공된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 하이드라진 치환 분자는 단백질, 다른 중합체 및 소분자를 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서, 카보닐 치환 단백질의 유도체화를 위한 하이드라진 치환 분자의 화학적 합성을 위한 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 상기 하이드라진 치환 분자는 펩티드, 다른 중합체(비분지형 및 분지형) 및 소분자를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 예를 들어 케톤 또는 알데히드 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 비롯한 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 유도체화에 적합한 하이드라진 치환 분자의 제조 방법이 제공된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 단백질의 생체내 번역 과정에서 부위 특이적으로 도입된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 하이드라진 치환 분자는 각각의 카보닐기의 친핵성 공격 반응을 통해 카보닐 함유 비천연 아미노산의 부위 특이적 유도체화를 가능하게 하여, 질소 함유 복소환 유도체화 폴리펩티드를 비롯한 복소환 유도체화 폴리펩티드를 부위 특이적인 방식으로 형성할 수 있다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 하이드라진 치환 분자의 제조 방법은 다종 다양한 부위 특이적으로 유도체화된 폴리펩티드를 입수할 수 있게 한다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 하이드라진 작용기화 폴리에틸렌(PEG) 분자의 합성 방법이 제공된다.

또 다른 양태에서, 하이드라진 치환 비천연 아미노산 폴리펩티드의 유도체화를 위한 카보닐 치환 분자의 화학적 합성 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 상기 카보닐 치환 분자는 케톤 및/또는 알데히드 치환 분자이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 카보닐 치환 분자는 단백질, 중합체(비분지형 및 분지형) 및 소분자를 포함한다. 도 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 방법은 단백질의 생체내 번역 과정에서 비천연 아미노산의 부위 특이적 도입을 가능하게 하는 기술을 보완한다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 부위 특이적으로 유도체화된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제공하도록 하이드라진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드와 반응하기에 적합한 카보닐 치환 분자의 제조를 위한 일반적 방법이 제공된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 카보닐 치환 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자의 합성 방법이 제공된다.

또 다른 양태에서, 하이드라진 함유 이작용기성 링커를 사용한 카보닐 치환 비천연 아미노산 폴리펩티드의 화학적 유도체화 방법이 제공된다. 일 실시형태에서, 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 결합을 생성하기 위한 축합 반응을 통해 카보닐 치환 단백질에 하이드라진 치환 링커를 부착시키는 방법이 제공된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 카보닐 치환 비천연 아미노산은 케톤 및/또는 알데히드 치환 비천연 아미노산이다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 하이드라진 함유 이작용기성 링커를 사용하여 부위 특이적으로 및/또는 3차원 구조의 정확한 제어를 이용하여 유도체화한다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 카보닐 함유(예를 들어, 케톤 및/또는 알데히드 함유) 비천연 아미노산 폴리펩티드에 분자 링커(일작용기성, 이작용기성 및 다작용기성)를 부착시키는 데 이용되며, 여기서 상기 링커 말단 중 적어도 하나는 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 결합을 통해 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드에 연결될 수 있는 하이드라진기를 함유한다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 이러한 링커는, 예를 들어 단백질, 다른 중합체(분지형 및 비분지형) 및 소분자를 비롯한 다른 분자에 상기 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 연결하는 데 사용된다.

일부 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 수용성 중합체에 연결된다. 일부 실시형태에서, 상기 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리에틸렌 글리콜 분자는 이작용기성 중합체이다. 일부 실시형태에서, 상기 이작용기성 중합체는 제2 폴리펩티드에 연결된다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드와 동일하고, 다른 실시형태에서, 상기 제2 폴리펩티드는 상이한 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 수용성 중합체에 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함한다.

일부 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 수용체에 대한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 친화성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 수용해도를 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 숙주 세포 내에서 생성된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 용해도를 증가시키는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 치환, 부가 또는 결실을 갖지 않는 아미노산 폴리펩티드에 비해 프로테아제 내성, 혈청 반감기, 면역원성 및/또는 발현을 조절하는 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.

일부 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 효현제(agonist), 부분 효현제, 길항제, 부분 길항제, 또는 역 효현제(inverse agonist)이다. 일부 실시형태에서, 상기 효현제, 부분 효현제, 길항제, 부분 길항제 또는 역 효현제는 수용성 중합체에 연결된 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용성 중합체에 연결된 비천연 아미노산을 포함하는 상기 폴리펩티드는 상응하는 수용체의 이량체화를 방지한다. 일부 실시형태에서, 수용성 중합체에 연결된 비천연 아미노산을 포함하는 상기 폴리펩티드는 결합 파트너, 리간드 또는 수용체와 폴리펩티드의 결합을 조절한다. 일부 실시형태에서, 수용성 중합체에 연결된 비천연 아미노산을 포함하는 상기 폴리펩티드는 이 폴리펩티드의 하나 이상의 특성 또는 활성을 조절한다.

일부 실시형태에서, 상기 셀렉터 코돈은 앰버(amber) 코돈, 오커(ochre) 코돈, 오팔(opal) 코돈, 독특한(unique) 코돈, 희귀(rare) 코돈, 비천연 코돈, 5 염기 코돈 및 4 염기 코돈으로 구성된 군에서 선택된다.

본원에는 수용성 중합체에 연결된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하는 방법도 기재된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 비천연 아미노산을 포함하는 단리된 폴리펩티드를, 상기 비천연 아미노산과 반응하는 부분을 포함하는 수용성 중합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 도입되는 비천연 아미노산은 20종의 일반 아미노산 중 임의의 아미노산에 대해 달리 반응성을 나타내지 않는 수용성 중합체에 대해 반응성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 상기 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 부분을 포함한다. 상기 중합체의 분자량은 경우에 따라 원하는 중합체 분자량 범위 내이다.

본원에는 본원에 기재된 비천연 아미노산 중 적어도 하나를 포함하는 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물도 기재된다. 일부 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 수용성 중합체에 연결된다. 약학적으로 허용되는 담체 및 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물도 본원에 기재된다. 일부 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 사카라이드 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 수용성 중합체는 사카라이드 부분을 통해 폴리펩티드에 연결된다. 본원에는 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 전구약물도 기재되며; 또한, 본원에는 상기 전구약물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 기재된다. 본원에는 또한 상기 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 대사물질이 기재되며; 일부 실시형태에서, 상기 대사물질은 상기 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성을 보완하거나 상승시키는 소정의 활성을 갖는다. 또한 본원에는, 상기 대사물질을 필요로 하는 환자를 비롯한 유기체에 소정의 대사물질을 제공하도록 본원에 기재된 상기 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 사용하는 용도가 기재된다.

셀렉터 코돈을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포도 본원에 기재된다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 비천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 치환시키기 위한 오르토고날 RNA 합성효소 및/또는 오르토고날 tRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 세포 배양물 중의 세포인 반면, 다른 실시형태에서는, 양서류, 파충류, 조류 및 포유동물을 비롯한 다세포 유기체의 일부의 세포이다. 임의의 세포 실시형태에서, 추가 실시형태는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생성하기 위해 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 비롯한 비천연 아미노산 폴리펩티드를 생성하기 위해 본원에 기재된 비천연 아미노산을 이용할 수 있는 유기체가 제공된다. 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및/또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 유기체가 제공된다. 그러한 유기체는 양서류, 파충류, 조류 및 포유동물을 비롯한 단세포 및 다세포 유기체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 시험관내에서 생성된다. 일부 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 세포 용해물 중에서 생성된다. 일부 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 리보솜에 의한 번역에 의해 생성된다.

비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법도 본원에 기재된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들, 오르토고날 RNA 합성효소 및/또는 오르토고날 tRNA를 포함하는 세포를, 폴리펩티드가 발현될 수 있는 조건하에 배양하는 단계; 및 상기 세포 및/또는 배양 배지로부터 상기 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함한다.

본원에 기재된 비천연 아미노산의 라이브러리 또는 본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 라이브러리 또는 본원에 기재된 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 라이브러리, 또는 이들의 조합 라이브러리도 본원에 기재된다. 하나 이상의 비천연 아미노산, 하나 이상의 비천연 아미노산 폴리펩티드 및/또는 하나 이상의 변형된 비천연 아미노산을 함유하는 어레이(array)도 본원에 기재된다. 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 어레이도 본원에 기재된다. 본원에 기재된 어레이는, 예를 들어 (폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 검출하거나 폴리펩티드의 번역을 검출함으로써) 유기체 내에서의 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생성을 스크리닝하는 데 사용된다.

원하는 활성에 대해 본원에 기재된 라이브러리를 스크리닝하는 방법, 또는 본원에 기재된 라이브러리를 스크리닝하기 위해 본원에 기재된 어레이를 사용하는 방법, 또는 원하는 활성에 대해 화합물 및/또는 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 다른 라이브러리를 스크리닝하는 방법도 본원에 기재된다. 또한, 라이브러리 스크리닝으로부터 얻은 활성 데이터를 새로운 치료제를 개발하고 탐색하는 데 사용하는 용도와 치료제 그 자체도 기재된다.

본원에는 폴리펩티드의 치료 반감기, 혈청 반감기 또는 순환 시간을 증가시키는 방법도 기재된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 천연 폴리펩티드 중의 임의의 하나 이상의 아미노산을 하나 이상의 비천연 아미노산으로 치환하는 단계, 및/또는 상기 폴리펩티드를 수용성 중합체에 커플링하는 단계를 포함한다.

비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 유효량의 약학 조성물을 사용하여 치료가 필요한 환자를 치료하는 방법 또한 본원에 기재된다. 일부 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 수용성 중합체에 커플링된다.

또 다른 또는 대안의 실시형태에서, 인돌 함유 비천연 아미노산, 카보닐 함유 비천연 아미노산 및 하이드라진 함유 비천연 아미노산으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 다른 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 본원에 기재된 폴리펩티드로 합성에 의해 도입되었다. 또 다른 또는 대안의 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 화학식 I∼XV의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 화합물 1∼4의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 천연 아미노산을 포함한다.

또 다른 또는 대안의 실시형태에서, 하기 구조식으로 표시되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드, 또는 이의 활성 대사물질, 염, 또는 약학적으로 허용되는 전구약물 또는 용매화물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다:

상기 식에서,

A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 치환된 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이고;

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 한쪽 말단이 인돌 함유 부분에 연결된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')C(NCN)N(R')-, -N(R')C(NNO₂)N(R')-, -N(R')C(NCOOR')N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이며;

n은 0, 1, 2 또는 3이고, m은 0, 1, 2 또는 3이며, 단, n 또는 m 중 적어도 하나는 0이 아니고;

여기서, 구조식 1, 2, 3 및 4에 있어서 결합된 R_a 기를 갖는 각각의 고리는 0개, 1개 또는 2개의 R_a 기를 포함할 수 있고, 각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택되거나; 또는 1개보다 많은 R_a 기가 존재할 경우, 2개의 R_a가 임의로 아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R₃과 R₄, 또는 2개의 R₃ 기가 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;

각각의 R₅는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")₂, OH, NH₂, CN, NO₂, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)₂R", 또는 -C(O)N(R")₂(여기서, 각각의 R"은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이거나, 또는 1개보다 많은 R" 기가 존재할 경우, 2개의 R"이 임의로 헤테로시클로알킬을 형성함)이거나; 또는

R₅는 L-X이고, 여기서 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 세포 독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트제; 보조 인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물학적 물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속 함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선에 의해 여기 가능한 부분; 리간드; 광이성질체화 가능한 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적으로 절단 가능한 기; 광절단 가능한 기; 연장된 측쇄; 탄소 결합된 당; 산화환원 활성 물질; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지 부분; 생물물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기(intercalating group); 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성 물질; 검출 가능한 표지; 소분자; 억제성 리보핵산; 방사성 뉴클레오티드; 중성자 포획제; 바이오틴의 유도체; 양자점(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체 효소(abzyme); 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제(adjuvant); 아글리칸; 알레르기원; 안지오스타틴; 안티호르몬; 항산화제; 압타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 벡터; 거대분자; 미모토프(mimotope); 수용체; 역 미셀; 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되고; L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)_k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

1개보다 많은 R₅ 기가 존재할 경우, 2개의 오르토 R₅ 기가 임의로 헤테로시클로알킬 또는 방향족 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있거나; 또는

-B-인돌 함유 부분이 함께 하나 이상의 인돌 부분을 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성한다.

일 실시형태에서, X는 수용성 중합체; 폴리알킬렌 옥시드; 폴리에틸렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 하나 이상의 아미노산; 하나 이상의 당기(sugar group); 하나 이상의 뉴클레오티드; 하나 이상의 뉴클레오시드; 리간드; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 검출 가능한 표지; 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.

일 실시형태에서, A와 B 둘 다 결합이고, 각각의 R₃은 H이고, R₄는 H이다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂는 각각 하나 이상의 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂는 각각 2개 이상의 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂는 각각 3개 이상의 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂는 각각 4개 이상의 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂는 각각 5개 이상의 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂는 각각 6개 이상의 아미노산이다.

또 다른 실시형태에서, 약학적으로 허용되는 담체와 함께 치료적 유효량의 비천연 아미노산 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, X가 수용성 중합체인 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, X가 폴리에틸렌 글리콜의 유도체인 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, X가 세포 독성 화합물인 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, X가 약물인 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다.

일부 실시형태에서, X가 제2 폴리펩티드인 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 제2 폴리펩티드가 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 펩티드인 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 제2 폴리펩티드가 구조식 1∼4로 표시되는 비천연 아미노산 폴리펩티드와 동일한 아미노산 구조를 갖는 것인 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 화합물 1∼4의 하나 이상의 비천연 아미노산이 폴리펩티드 내의 특정 부위에 도입된 것인 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 화합물 1∼4의 비천연 아미노산이 번역 시스템을 통해 도입된 것인 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 하기 구조식의 화합물로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 또는 이의 활성 대사물질, 염, 또는 약학적으로 허용되는 전구약물 또는 용매화물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다:

상기 식에서,

R₅는 L-X이고, 여기서 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 세포 독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트제; 보조 인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물학적 물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속 함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선에 의해 여기 가능한 부분; 리간드; 광이성질체화 가능한 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적으로 절단 가능한 기; 광절단 가능한 기; 연장된 측쇄; 탄소 결합된 당; 산화환원 활성 물질; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지 부분; 생물물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성 물질; 검출 가능한 표지; 소분자; 억제성 리보핵산; 방사성 뉴클레오티드; 중성자 포획제; 바이오틴의 유도체; 양자점(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체 효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르기원; 안지오스타틴; 안티호르몬; 항산화제; 압타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 벡터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 역 미셀; 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되고; L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)_k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;

일 실시형태에서, X는 수용성 중합체; 폴리알킬렌 옥시드; 폴리에틸렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 하나 이상의 아미노산; 하나 이상의 당기; 하나 이상의 뉴클레오티드; 하나 이상의 뉴클레오시드; 리간드; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 검출 가능한 표지; 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.

또 다른 실시형태에서, 구조식 5∼8의 화합물을 갖는 치료적 유효량의 폴리펩티드와 함께 약학적으로 허용되는 담체를 투여하는 것을 더 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂가 둘 다 폴리펩티드인 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, X가 수용성 중합체인 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, X가 폴리에틸렌 글리콜인 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, X가 세포 독성 화합물인 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, X가 약물인 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, X가 제2 폴리펩티드인 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 제2 폴리펩티드가 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 펩티드인 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다.

또 다른 또는 대안의 실시형태에서, 화합물 1∼4의 구조를 갖는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공되며, 여기서 상기 폴리펩티드는 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨 이뇨 인자, 심방 나트륨 이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인 단백질-1, 단핵구 화학유인 단백질-2, 단핵구 화학유인 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, I309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피세포 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피세포 성장 인자(EGF), 상피세포 호중구 활성화 펩티드, 에리스로포이에틴(EPO), 박리 독소(exfoliating toxin), 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4 나선 번들 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그(hedgehog) 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질 세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴투린, 호중구 억제 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 암유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴렉신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 슈퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화 인자, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), 우로텐신, VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론 수용체로 구성된 군에서 선택되는 치료용 단백질과 상동성인 단백질이다.

또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 비천연 아미노산이 폴리펩티드의 특정 부위에 도입되는 것인 구조식 5∼8의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산이 번역 시스템에 의해 도입되는 것인 구조식 5∼8의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산이 번역 시스템 및 변역 후 변형 시스템에 의해 폴리펩티드로 도입되는 것인 구조식 5∼8의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 적어도 1개월 동안 안정한 것인 구조식 5∼8의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 적어도 2주 동안 안정한 것인 구조식 5∼8의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법이 제공된다.

또 다른 또는 대안의 실시형태에서, 하나 이상의 인돌 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법으로서, 생성된 인돌 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드가 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 이 폴리펩티드의 생체이용률을 증가시키는 것인 치료 방법이 제공된다.

또 다른 또는 대안의 실시형태에서, 하나 이상의 인돌 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법으로서, 생성된 인돌 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드가 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 이 폴리펩티드의 안전성 프로필을 향상시키는 것인 치료 방법이 제공된다.

또 다른 또는 대안의 실시형태에서, 하나 이상의 인돌 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법으로서, 생성된 인돌 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드가 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 이 폴리펩티드의 수용해도를 증가시키는 것인 치료 방법이 제공된다.

또 다른 또는 대안의 실시형태에서, 하나 이상의 인돌 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법으로서, 생성된 인돌 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드가 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 이 폴리펩티드의 치료 반감기를 증가시키는 것인 치료 방법이 제공된다.

또 다른 또는 대안의 실시형태에서, 하나 이상의 인돌 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법으로서, 생성된 인돌 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드가 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 이 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 것인 치료 방법이 제공된다.

또 다른 또는 대안의 실시형태에서, 하나 이상의 인돌 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법으로서, 생성된 인돌 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드가 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 이 폴리펩티드의 순환 시간을 연장시키는 것인 치료 방법이 제공된다.

또 다른 또는 대안의 실시형태에서, 하나 이상의 인돌 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법으로서, 생성된 인돌 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드가 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 이 폴리펩티드의 생물학적 활성을 조절하는 것인 치료 방법이 제공된다.

또 다른 또는 대안의 실시형태에서, 하나 이상의 인돌 함유 비천연 아미노산을 포함하는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법으로서, 생성된 인돌 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드가 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 이 폴리펩티드의 면역원성을 조절하는 것인 치료 방법이 제공된다.

본원에 기재된 방법 및 조성물은 본원에 기재된 특정한 방법, 프로토콜, 세포주, 구성체 및 시약에 한정되지 않고 그 자체가 임의로 변화되는 것으로 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어는 특정 실시형태만을 기술하기 위한 것이지 본원에 기재된 방법 및 조성물의 범위를 한정하려는 것은 아니며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구의 범위에 의해서만 한정되어야 하는 것으로 이해해야 한다.

본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용될 때, 단수 형태의 표현은, 그 문맥이 명백히 달리 명시하지 않는다면, 복수 형태의 표현도 포함한다.

달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 갖는 자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 어떠한 방법, 장치 및 재료도 본원에 기재된 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료를 이하에 기재하였다.

본원에서 언급된 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 그 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시내용을 예상할 자격이 없음을 인정한 것으로 해석되어서는 안 된다.

본원에서 사용되는 "친화성 표지"란 용어는 다른 분자에 가역적 또는 비가역적으로 결합하여, 상기 다른 분자를 변형하거나, 파괴하거나, 상기 다른 분자와 함께 화합물을 형성하는 표지를 말한다. 예를 들어, 친화성 표지는 효소 및 이의 기질, 또는 항체 또는 이의 항원을 포함한다.

"알콕시", "알킬아미노" 및 "알킬티오(또는 티오알콕시)"란 용어는 각각 산소 원자, 아미노기 또는 황 원자를 통해 분자에 결합된 알킬기를 말한다.

그 자체로서 또는 다른 분자의 일부로서 사용되는 "알킬"이란 용어는, 달리 명시하지 않는 한, 경우에 따라 완전 포화, 단일 불포화 또는 다중 불포화 직쇄, 분지쇄 또는 환형 탄화수소 라디칼 또는 이들의 조합을 의미하며, 표시된 수의 탄소 원자를 갖는(즉, C₁-C₁₀은 1∼10개의 탄소를 의미함) 2가 또는 다가 라디칼을 포함할 수 있다. 포화 탄화수소 라디칼의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 시클로헥실, (시클로헥실)메틸, 시클로프로필메틸, 이들의 동족체 및 이성질체, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등과 같은 기를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 불포화 알킬기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖는 알킬기이다. 불포화 알킬기의 예로는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1-프로피닐 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고급 동족체 및 이성질체를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 또한, "알킬"이란 용어는, 달리 명시하지 않는 한, 본원에서 보다 상세히 정의하는 알킬의 유도체, 예컨대 "헤테로알킬", "할로칼킬" 및 "호모알킬"을 포함한다.

그 자체로서 또는 다른 분자의 일부로서 사용되는 "알킬렌"이란 용어는, (-CH₂-)_n(여기서, n은 1∼약 24임)으로 예시되는, 알칸으로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 예를 들어, 이러한 기로는 10개 이하의 탄소 원자를 갖는 기, 예컨대 구조식 -CH₂CH₂- 및 -CH₂CH₂CH₂CH₂-의 기를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 8개 이하의 탄소 원자를 갖는 보다 짧은 쇄의 알킬 또는 알킬렌 기이다. "알킬렌"이란 용어는, 달리 명시하지 않는다면, "헤테로알킬렌"으로서 본원에 기재된 기들도 포함한다.

"아미노산"이란 용어는 천연 및 비천연 아미노산뿐만 아니라, 천연 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 말한다. 천연적으로 코딩된 아미노산은 20종의 일반 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린), 파이로라이신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 천연 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 예를 들어, 수소에 결합된 α-탄소, 카복실기, 아미노기 및 R 기를 갖는 화합물을 말한다. 그러한 유사체는 임의로 변형된 R 기(예를 들어, 노르루신) 또는 임의로 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 천연 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 유사체의 비한정적인 예로는 호모세린, 노르루신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 들 수 있다.

본원에서 아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권장되는 명칭, 3 문자 기호 또는 1 문자 기호로 지칭될 수 있다. 또한, 뉴클레오티드도 통상적으로 인정되는 1 문자 코드로 지칭될 수 있다.

"항체 단편"이란 전체 길이 형태 이외의 임의의 항체 형태를 의미한다. 본원에서 항체 단편은 전체 길이 항체 내에 존재하는 보다 작은 구성요소인 항체 및 조작된 항체를 포함한다. 항체 단편으로는 Fv, Fc, Fab 및 (Fab')₂, 단일쇄 Fv(scFv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중 기능성 하이브리드 항체, CDR1, CDR2, CDR3, CDR의 조합, 가변 영역, 골격구조 영역, 불변 영역, 중쇄, 경쇄 및 가변 영역, 및 대안적 골격(scaffold) 비항체 분자, 이중 특이적 항체 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다[Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402]. 또 다른 기능성 하위구조(substructure)는 펩티드 링커에 의해 공유 결합되는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄로 이루어진 가변 영역으로 구성된 단일쇄 Fv(scFv)이다[S-z Hu et al., 1996, Cancer Research, 56, 3055-3061]. 이러한 작은(Mr 25,000) 단백질은 일반적으로 단일 폴리펩티드 내에 항원에 대한 특이성 및 친화성을 보유하며, 보다 큰 항원 특이적 분자에 대한 편리한 빌딩 블록을 제공할 수 있다. 달리 구체적으로 명시하지 않은 한, "항체" 또는 "항체들"이란 용어를 사용하는 문장 및 청구범위는 구체적으로 "항체 단편" 및 "항체 단편들"을 포함한다.

본원에서 사용되는 "방향족" 또는 "아릴"이란 용어는 공액 파이(pi) 전자 시스템을 갖는 하나 이상의 고리를 갖는 폐환 구조를 지칭하며, 탄소환 아릴 및 복소환 아릴(또는 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족") 기를 둘 다 포함한다. 상기 탄소환 또는 복소환 방향족 기는 임의로 5∼20개의 고리 원자를 포함한다. 상기 용어는 공유 결합된 단환 고리 또는 접합 고리 다환(즉, 인접한 탄소 원자 쌍을 공유하는 고리) 기를 포함한다. 방향족 기는 비치환되거나 치환될 수 있다. "방향족" 또는 "아릴" 기의 비한정적인 예로는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 안트라세닐 및 페난트라세닐을 들 수 있다. 상기 아릴 및 헤테로아릴 고리계 각각에 대한 치환기는 본 명세서에 기재된 허용 가능한 치환기의 군에서 선택된다.

간결함을 위해, (아릴옥시, 아릴티옥시, 아랄킬을 포함하나, 이들에 한정되지 않는) 다른 용어들과 함께 사용될 때 "방향족" 또는 "아릴"이란 용어는 상기에 정의한 바와 같은 아릴 고리 및 헤테로아릴 고리를 둘 다 포함한다. 따라서, "아랄킬" 또는 "알카릴"이란 용어는 탄소 원자(메틸렌기를 포함하나, 이에 한정되지 않음)가 헤테로원자, 예를 들어 산소 원자로 치환된 알킬기를 포함하는 알킬기에 아릴기가 부착된 라디칼(벤질, 펜에틸, 피리딜메틸 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않음)을 의미한다. 이러한 아릴기의 예로는 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 "아릴렌"이란 용어는 2가 아릴 라디칼을 말한다. "아릴렌"의 비한정적인 예로는 페닐렌, 피리디닐렌, 피리미디닐렌 및 티오페닐렌을 들 수 있다. 아릴렌기의 치환기는 본원에 기재된 허용 가능한 치환기의 군에서 선택된다.

"하나 이상의 아미노산"이란 표현은 단일 아미노산, 복수의 아미노산, 올리고펩티드, 아미노산 이량체, 아미노산 삼량체, 아미노산 사량체, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 임의의 다른 연결된 아미노산 사슬을 말한다.

"이작용기성 링커"로도 지칭되는 "이작용기성 중합체"는 다른 부분과 특이적으로 반응하여 공유 결합 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 2개의 작용기를 포함하는 중합체를 말한다. 이러한 부분으로는 천연 또는 비천연 아미노산, 또는 이러한 천연 또는 비천연 아미노산을 포함하는 펩티드 상의 측쇄를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 예를 들어, 이작용기성 링커는 제1 펩티드 상의 기와 반응하는 작용기, 및 제2 펩티드 상의 기와 반응하는 또 다른 작용기를 가짐으로써, 제1 펩티드, 이작용기성 링커 및 제2 펩티드를 포함하는 접합체를 형성한다. 각종 화합물을 펩티드에 부착시키기 위한 방법 및 링커 분자에 대해서는, 예를 들어 유럽 특허 출원 제188,256호; 미국 특허 제4,671,958호; 미국 특허 제4,659,839호; 미국 특허 제4,414,148호; 미국 특허 제4,699,784호; 미국 특허 제4,680,338호; 및 미국 특허 제4,569,789호를 참조할 수 있다. "다작용성 링커"로도 지칭되는 "다작용성 중합체"는 다른 부분과 반응할 수 있는 2개 이상의 작용기를 포함하는 중합체를 말한다. 이러한 부분으로는 공유 결합 또는 비공유 결합을 형성하는, 천연 또는 비천연 아미노산 상의 측기 또는 이러한 천연 또는 비천연 아미노산을 포함하는 펩티드 상의 측기(아미노산 측기를 포함하나, 이에 한정되지 않음)를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이작용기성 중합체 또는 다작용기성 중합체는 임의의 원하는 길이 또는 분자량을 가질 수 있고 화합물에 결합된 하나 이상의 분자와 이 화합물이 결합하는 분자 또는 상기 화합물 사이에 특정한 소정의 공간 또는 입체구조를 제공하도록 임의로 선택된다.

본원에서 사용되는 "생체이용률"이란 용어는 물질 또는 그 활성 부분이 약학적 제형으로부터 전달되어 작용 부위 또는 전신 순환에서 이용 가능하게 되는 속도 및 정도를 말한다. 생체이용률의 증가란 물질 또는 그 활성 부분이 약학적 제형으로부터 전달되어 작용 부위 또는 전신 순환에서 이용 가능하게 되는 속도 및 정도가 증가하는 것을 말한다. 예를 들어, 생체이용률의 증가는 다른 물질 또는 활성 부분과 비교할 때 혈액 중에 해당 물질 또는 그 활성 부분의 농도가 증가하는 것으로 나타난다. 이러한 방법은 경우에 따라 임의의 폴리펩티드의 생체이용률을 평가하는 데 이용된다.

본원에서 사용될 때 "생물학적 활성 분자", "생물학적 활성 부분" 또는 "생물학적 활성제"란 용어는 바이러스, 박테리아, 박테리오파지, 트랜스포존(transposon), 프리온, 곤충, 진균, 식물, 동물 및 인간을 포함하나 이들에 한정되지 않는 유기체에 관한 생물학적 시스템, 경로, 분자 또는 상호작용의 임의의 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 줄 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 본원에서 사용되는 바와 같이, 생물학적 활성 분자는 인간 또는 다른 동물에서 질환을 진단하거나, 치유하거나, 완화하거나, 치료하거나, 예방하기 위한, 또는 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 복지를 향상시키기 위한 임의의 물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 생물학적 활성 분자의 예로는 펩티드, 단백질, 효소, 소분자 약물, 경질 약물, 연질 약물, 탄수화물, 무기 원자 또는 분자, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 방사성 핵종(radionuclide), 올리고뉴클레오티드, 독소, 세포, 바이러스, 리포솜, 마이크로입자 및 미셀을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용하기에 적합한 생물학적 활성제의 부류에는 약물, 전구약물, 방사성 핵종, 조영제(imaging agent), 중합체, 항생제, 살진균제, 항바이러스제, 항염증제, 항종양제, 심혈관제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드제, 미생물 유래 독소 등이 포함되나, 이들에 한정되지 않는다.

"생물학적 활성을 조절하는"이란 폴리펩티드의 반응성을 증가 또는 감소시키거나 폴리펩티드의 선택성을 변경하거나 폴리펩티드의 기질 선택성을 증가 또는 감소시키는 것을 의미한다. 변경된 생물학적 활성의 분석은 비천연 폴리펩티드의 생물학적 활성을 천연 폴리펩티드의 생물학적 활성과 비교하여 수행할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "생물학적 물질"은 생물 반응기 및/또는 재조합 방법 및 기법으로부터 수득된 물질을 포함하나 이에 한정되지 않는 생물학적으로 유래된 물질을 말한다.

본원에서 사용되는 "생물물리적 프로브"란 용어는 분자의 구조적 변화를 검출하거나 모니터링할 수 있는 프로브를 말한다. 이러한 분자로는 단백질을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않고, "생물물리적 프로브"는 경우에 따라 단백질과 다른 거대분자의 상호작용을 검출하거나 모니터링하는 데 사용된다. 생물물리적 프로브의 예로는 스핀 표지, 형광단 및 광활성화 가능한 기를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 "생합성에 의해"라는 표현은 하기 구성요소, 즉, 폴리뉴클레오티드, 코돈, tRNA 및 리보솜 중 하나 이상을 사용하는 것을 포함하여, 번역 시스템(세포 또는 비세포 번역 시스템)을 이용하는 임의의 방법을 말한다. 예를 들어, 비천연 아미노산은 섹션 VIII["비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생체내 제조]에 기재된 방법 및 기법을 이용하여 비천연 아미노산 폴리펩티드로 "생합성에 의해 도입된다".

본원에서 사용되는 바와 같이, "바이오틴 모방체"로도 지칭되는 "바이오틴 유사체"란 용어는 아비딘 및/또는 스트렙타비딘에 대해 고친화성으로 결합하는, 바이오틴 이외의 임의의 분자를 말한다.

본원에서 사용되는 "카보닐"이란 용어는, 하나 이상의 케톤기, 및/또는 하나 이상의 알데히드기, 및/또는 하나 이상의 에스테르기, 및/또는 하나 이상의 카복실산기, 및/또는 하나 이상의 티오에스테르기를 포함하는 군을 포함하나 이에 한정되지 않는, -C(O)-, -S(O)-, -S(O)₂- 및 -C(S)-로 구성된 군에서 선택되는 부분을 포함하는 기를 말한다. 이러한 카보닐기로는 케톤, 알데히드, 카복실산, 에스테르 및 티오에스테르를 들 수 있다. 또한, 이러한 기는 임의로 직쇄, 분지쇄 또는 환형 분자의 일부이다.

본원에서 사용되는, "화학적으로 불안정한 기"로도 지칭되는 "화학적으로 절단 가능한 기"란 표현은 산, 염기, 산화제, 환원제, 화학적 개시제 또는 라디칼 개시제에 노출될 때 파괴 또는 절단되는 기를 말한다.

본원에서 사용되는 "화학발광성 기"란 용어는 열을 가하지 않아도 화학 반응으로 인하여 빛을 발하는 기를 말한다. 예를 들어, 루미놀(5-아미노-2,3-디하이드로-1,4-프탈라진디온)은 염기 및 금속 촉매의 존재하에 과산화수소(H₂O₂)와 같은 산화제와 반응하여 여기 상태의 생성물(3-아미노프탈레이트, 3-APA)을 생성한다.

본원에서 사용되는 "발색단"이란 용어는 가시광 파장, UV 파장 또는 IR 파장의 빛을 흡수하는 분자를 말한다.

본원에서 사용되는 용어 "보조 인자"는 대형 분자의 작용에 필수적인 원자 또는 분자를 말한다. 보조 인자로는 무기 이온, 조효소(coenzyme), 또는 효소의 활성에 필요한 몇몇 다른 인자들을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 그 예로는 헤모글로빈에 있어서의 헴(heme), 클로로필에 있어서의 마그네슘 및 단백질에 대한 금속 이온을 들 수 있다.

본원에서 사용되는 "비교 윈도우"는 두 서열을 최적으로 정렬한 후 동일한 수의 연속된 위치들을 갖는 기준 서열에 서열을 비교하기 위해 이용되는 연속된 위치들 중 어느 하나의 분절을 말한다. 이러한 연속된 위치들로는 약 50개∼약 200개의 연속된 단위 및 약 100개∼약 150개의 연속된 단위를 비롯하여 약 20개∼약 600개의 연속된 단위로 구성된 군을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 그러한 서열에는 폴리펩티드 및 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 포함되며, 상기 연속된 단위는 천연 아미노산 및 비천연 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 예를 들어, 그러한 서열은 뉴클레오티드가 상응하는 연속된 단위인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 비교를 위한 서열 정렬 방법으로는 문헌[Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482c]의 국부적 상동성 알고리즘, 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. 85; 2444]의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 전산화된 실행(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 Genetics Computer Group의 Wisconsin Genetics Software Package의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 수동 정렬 및 시각적 조사(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)] 참조)를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.

예를 들어, 서열 동일성(%) 및 서열 유사성을 측정하기 위해 이용되는 알고리즘으로는 각각 문헌[Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402] 및 문헌[Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410]에 기재되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있다. BLAST 분석 수행용 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 입수가 가능하다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 워드 길이(wordlength; W) 11, 기대값(E) 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드 길이 3 및 기대값(E) 10, 및 BLOSUM62 점수 행렬(문헌[Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10915] 참조), 정렬(B) 50, 기대값(E) 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. BLAST 알고리즘은 일반적으로 턴 오프된(turned off) "낮은 복잡도(low complexity)" 필터를 사용하여 수행한다.

또한, BLAST 알고리즘은 두 서열 사이의 유사성을 통계적으로 분석한다(예를 들어, 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치(match)가 우연히 발생할 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들어, 기준 핵산에 대해 테스트 핵산을 비교할 때 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 또는 약 0.01 미만, 또는 약 0.001 미만일 경우, 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.

"보존적 변형 변이체"란 표현은 천연 아미노산 및 비천연 아미노산, 천연 핵산 서열 및 비천연 핵산 서열 및 이들의 조합에 적용된다. 특정한 핵산 서열에 있어서, "보존적 변형 변이체"란 동일하거나 실질적으로 동일한 천연 아미노산 서열 및 비천연 아미노산 서열을 코딩하는 천연 핵산 및 비천연 핵산을 말하거나, 천연 및 비천연 핵산이 천연 및 비천연 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우 실질적으로 동일한 서열을 말한다. 예를 들어, 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여, 기능상 동일한 다수의 핵산이 임의의 소정의 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 지정된 모든 위치에서, 그 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변경하지 않으면서 전술한 임의의 해당 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이가 보존적 변형 변이의 한 종류인 "침묵 변이(silent variation)"이다. 따라서, 본원에서 천연 또는 비천연 폴리펩티드를 코딩하는 모든 천연 또는 비천연 핵산 서열은 또한 천연 또는 비천연 핵산의 가능한 모든 침묵 변이를 포함한다. 천연 또는 비천연 핵산 내의 각각의 코돈(통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG와, 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG는 제외)은 변형되어 기능상 동일한 분자를 생성할 수 있다. 따라서, 천연 및 비천연 폴리펩티드를 코딩하는 천연 및 비천연 핵산의 각각의 침묵 변이는 기재된 각각의 서열에 내포되어 있다.

아미노산 서열의 경우, 코딩된 서열에 대해 단일 천연 및 비천연 아미노산 또는 작은 비율(%)의 천연 및 비천연 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 부가는, 그 변경이 아미노산의 결실, 아미노산의 부가 또는 화학적으로 유사한 아미노산으로의 천연 및 비천연 아미노산의 치환으로 귀결될 경우, "보존적 변형 변이"이다. 과학 문헌으로부터 입수 가능한 보존적 치환 표는 기능상 유사한 천연 아미노산을 제공한다. 이러한 보존적 변형 변이체는 본원에 기재된 방법 및 조성물의 다형성 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자 변이체에 추가적인 것으로서 이들을 배제하지 않는다.

하기 8개 군은 각각 서로 간에 보존적 치환인 아미노산들을 포함한다:

1) 알라닌(A), 글리신(G);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 라이신(K);

5) 이소루신(I), 루신(L), 메티오닌(M), 발린(V);

6) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W);

7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

8) 시스테인(C), 메티오닌(M)

(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd Edition (December 1993)] 참조)

그 자체로서 또는 다른 용어와 함께 사용되는 "시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"이란 용어는, 달리 명시하지 않는다면, 각각 알킬" 및 "헤테로알킬"의 환형 버전을 나타낸다. 따라서, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬은 포화, 부분 불포화 및 완전 불포화 고리 결합을 포함한다. 또한, 헤테로시클로알킬의 경우, 헤테로원자가, 복소환이 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치를 차지할 수 있다. 헤테로원자로는 산소, 질소 또는 황을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 시클로알킬의 예로는 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥세닐, 3-시클로헥세닐, 시클로헵틸 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 헤테로시클로알킬의 예로는 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라하이드로푸란-2-일, 테트라하이드로푸란-3-일, 테트라하이드로티엔-2-일, 테트라하이드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 상기 용어는 2환 및 3환 고리 구조를 포함하나 이들에 한정되지 않는 다환 구조를 포함한다. 유사하게, 그 자체로서 또는 다른 분자의 일부로서 사용되는 "헤테로시클로알킬렌"이란 용어는 헤테로시클로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하고, 그 자체로서 또는 다른 분자의 일부로서 사용되는 "시클로알킬렌"이란 용어는 시클로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다.

본원에서 사용되는 "시클로덱스트린"이란 용어는 고리 형성에 있어서 적어도 6∼8개의 글루코스 분자로 구성된 환형 탄수화물을 말한다. 고리의 외부 부분은 수용성 기를 포함하고, 고리의 중심에는 소분자를 수용할 수 있는, 비교적 비극성의 공동(cavity)이 있다.

본원에서 사용되는 "세포 독성"이란 용어는 세포에 유해한 화합물을 말한다.

본원에서 사용되는 "원하는(소정의) 작용기성"이란 표현은 하기 군 중 어느 하나를 말한다: 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 세포 독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트제; 보조 인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물학적 물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속 함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선에 의해 여기 가능한 부분; 리간드; 광이성질체화 가능한 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적으로 절단 가능한 기; 광절단 가능한 기; 연장된 측쇄; 탄소 결합된 당; 산화환원 활성 물질; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지 부분; 생물물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성 물질(이 경우, 생물학적 활성 물질은 치료 활성을 갖는 물질을 포함할 수 있고, 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산은 부착된 치료제와 함께 보조 치료제로서 또는 치료제를 유기체 내의 원하는 부위로 전달하기 위한 수단으로서 사용될 수 있음); 검출 가능한 표지; 소분자; 억제성 리보핵산; 방사성 뉴클레오티드; 중성자 포획제; 바이오틴의 유도체; 양자점(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체 효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르기원; 안지오스타틴; 안티호르몬; 항산화제; 압타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 벡터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 역 미셀; 및 이들의 임의의 조합.

본원에서 사용되는 "하이드라진"이란 용어는 하나 이상의 하이드라진 작용기를 포함하는 기/분자를 말한다.

본원에서 사용되는 "검출 가능한 표지"란 용어는 형광법, 화학발광법, 전자 스핀 공명법, 자외선/가시광선 흡수 분광분석법, 질량 분광분석법, 핵 자기 공명법, 자기 공명법 및 전기화학적 방법을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 분석 기법을 이용하여 관찰할 수 있는 표지를 말한다.

본원에서 사용되는 "카보닐"이란 용어는 하나 이상의 알데히드 또는 하나의 케톤을 포함하는 기/분자를 말한다.

본원에서 사용되는 "약물"이란 용어는 질병 또는 병증의 예방, 진단, 경감, 치료 또는 치유에 사용되는 임의의 물질을 말한다.

본원에서 사용되는 "염료"란 용어는 발색단을 함유하는 가용성 착색 물질을 말한다.

본원에 사용되는 "유효량"이란 용어는, 치료 대상 질병 또는 병증의 증상 중 하나 이상을 어느 정도까지 경감하는, 투여되는 물질 또는 화합물의 충분한 양을 말한다. 결과는 질병의 징후, 증상 또는 원인의 경감 및/또는 완화, 또는 생물학적 시스템의 임의의 다른 원하는 변경일 수 있다. 예를 들어, 투여되는 물질 또는 화합물로는 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 예방, 증강 및/또는 치료적 처치를 위해 투여될 수 있다. 임의의 개별 사례에 있어서 적절한 "유효량"은 용량 증가 연구와 같은 기법을 이용하여 임의로 결정된다.

본원에서 사용되는 "전자 밀집 기"란 용어는 전자 빔을 조사할 경우 전자를 산란시키는 기를 말한다. 이러한 기로는 암모늄 몰리브데이트, 비스무트 서브니트레이트 카드뮴 요오다이드, 99% 카보하이드라지드, 염화철(II) 헥사하이드레이트, 헥사메틸렌 테트라민, 98.5% 인듐 트리클로라이드 무수물, 란탄 니트레이트, 납 아세테이트 트리하이드레이트, 납 시트레이트 트리하이드레이트, 납 니트레이트, 과요오드산, 포스포몰리브덴산, 포스포텅스텐산, 포타슘 페리시아나이드, 포타슘 페로시아나이드, 루테늄 레드, 실버 니트레이트, 실버 프로테이네이트(Ag 분석치: 8.0∼8.5%) "Strong", 실버 테트라페닐포핀(S-TPPS), 소듐 클로로아우레이트, 소듐 텅스테이트, 탈륨 니트레이트, 티오세미카바자이드(TSC), 우라닐 아세테이트, 우라닐 니트레이트 및 바나딜 설페이트를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 "에너지 전달제"란 용어는 다른 분자에 에너지를 주거나 다른 분자로부터 에너지를 받을 수 있는 분자를 말한다. 예를 들어, 형광 공명 에너지 전달(FRET)은 형광 공여 분자의 여기 상태 에너지가 비여기 수용 분자에 비방사적으로 전달되고, 이 수용 분자가 더 긴 파장에서 공여된 에너지를 형광적으로 방사하는 쌍극자-쌍극자 커플링 과정이다.

"증강(향상)시키다" 또는 "증강(향상)시키는"이란 표현은 원하는 효과를 효능 또는 지속 기간의 측면에서 증가시키거나 연장시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 치료제의 효과를 "증강(향상)시키는" 것은 질병, 질환 또는 병증의 치료 과정 중에 치료제의 효과를 효능 또는 지속 기간의 측면에서 증가시키거나 연장시키는 능력을 말한다. 본원에 사용되는 "증강(향상)시키는 유효량"이란 표현은 질병, 질환 또는 병증의 치료에 있어서 치료제의 효과를 증강(향상)시키는 데 적절한 양을 말한다. 환자에게 사용될 경우, 이러한 용도에 유효한 양은 질병, 질환 또는 병증의 중증도 및 경과, 선행 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 치료 의사의 판단에 따라 달라진다.

본원에서 사용되는 "진핵생물"이란 용어는 동물(포유동물, 곤충, 파충류, 조류 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않음), 섬모충, 식물(외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물 및 조류(藻類) 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않음), 진균류, 효모, 편모충, 미포자충 및 원생생물을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 계통발생적 진핵생물(Eucarya) 영역에 속하는 유기체를 말한다.

본원에서 사용되는 "지방산"이란 용어는 약 C₆ 또는 더 긴 탄화수소 측쇄를 갖는 카복실산을 말한다.

본원에서 사용되는 "형광단"이란 용어는 여기될 때 광자를 방사함으로써 형광을 발하는 분자를 말한다.

본원에서 사용되는 "작용기", "활성 부분", "활성화 기", "이탈기", "반응성 부위", "화학적 반응기" 및 "화학적 반응성 부분"이란 용어들은 화학 반응이 일어나는 분자의 부분 또는 단위를 말한다. 상기 용어들은 화학 분야에서 어느 정도 동의어로 사용되며, 몇 가지 기능 또는 활성을 수행하고 다른 분자와 반응하는 분자의 일부분을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.

"할로겐"이란 용어는 불소, 염소, 요오드 및 브롬을 포함한다.

본원에서 사용되는 "할로아실"이란 용어는 할로겐 부분을 포함하는 아실기를 말하며, -C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 "할로알킬"이란 용어는 할로겐 부분을 포함하는 알킬기를 말하며, -CF₃ 및 -CH₂CF₃ 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 "헤테로알킬"이란 용어는 O, N, Si 및 S로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 헤테로원자 및 알킬기로 이루어진 직쇄, 분지쇄 또는 환형 탄화수소 라디칼 또는 이들의 조합을 지칭하며, 여기서 상기 질소 및 황 원자는 경우에 따라 산화되고 질소 헤테로원자는 경우에 따라 4차화된다. 헤테로원자(들) O, N, S 및 Si는 헤테로알킬기의 임의의 내부 위치, 또는 알킬기가 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치에 임의로 위치한다. 예로는 -CH₂-CH₂-O-CH₃, -CH₂-CH₂-NH-CH₃, -CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃, -CH₂-S-CH₂-CH₃, -CH₂-CH₂-S(O)-CH₃, -CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃, -CH=CH-O-CH₃, -Si(CH₃)₃, -CH₂-CH=N-OCH₃ 및 -CH=CH-N(CH₃)-CH₃를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 예를 들어, -CH₂-NH-OCH₃ 및 -CH₂-O-Si(CH₃)₃와 같이 최대 2개의 헤테로원자가 임의로 연속된다.

"복소환에 기초한 결합" 또는 "복소환 결합"이란 용어는 카보닐기와 하이드라진기의 반응으로부터 형성된 부분을 말한다. 생성된 반응 생성물은 헤테로아릴기 또는 헤테로시클로알킬기를 포함하는 복소환이다. 생성된 복소환 기는 비천연 아미노산 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드와 다른 작용기 사이의 화학 결합으로서 작용한다. 일 실시형태에서, 상기 복소환 결합은, 예를 들어 피롤 결합, 인돌 결합, 벤조디아제핀 결합 및 피라잘론 결합을 비롯한 질소 함유 복소환 결합을 포함한다.

마찬가지로, "헤테로알킬렌"이란 용어는 -CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂- 및 -CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-에 의해 예시된 바와 같은(단, 이들에 한정되지 않음) 헤테로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬렌기의 경우, 동일하거나 상이한 헤테로원자가 쇄의 말단 중 한쪽 또는 양쪽에 존재할 수도 있다(알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노, 아미노옥시알킬렌 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않음). 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 결합기의 경우, 결합기의 배향은 결합기의 화학식이 기재된 방향에 내포되어 있지 않다. 예를 들어, 화학식 -C(O)₂R'-은 -C(O)₂R'-과 -R'C(O)₂-를 둘 다 나타낸다.

본원에서 사용되는 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족"이란 용어는 N, O 및 S로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 아릴기를 지칭하며, 여기서 상기 질소 및 황 원자는 경우에 따라 산화되고, 상기 질소 원자(들)은 경우에 따라 4차화된다. 헤테로아릴기는 경우에 따라 치환되거나 비치환된다. 헤테로아릴기는 경우에 따라 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착된다. 헤테로아릴기의 비한정적인 예로는 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 퓨리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴 및 6-퀴놀릴을 들 수 있다.

본원에서 사용되는 "호모알킬"이란 용어는 탄화수소기인 알킬기를 말한다.

본원에서 사용되는 "동일한"이란 표현은 동일한 2개 이상의 서열 또는 부분 서열(subsequence)을 말한다. 또한, 본원에서 사용되는 "실질적으로 동일한"이란 표현은, 비교 알고리즘을 이용하거나 수동 정렬 및 시각적 조사로 측정할 경우, 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 대하여 최대 상응도로 비교 및 정렬할 때 일정 비율(%)의 동일한 연속 단위를 갖는 2개 이상의 서열을 말한다. 예를 들어, 2개 이상의 서열은 연속 단위가 특정한 영역에 대하여 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일할 때 "실질적으로 동일하다". 이러한 비율(%)은 2개 이상의 서열의 "동일성(%)"을 나타내기 위한 것이다. 서열의 동일성은 적어도 약 75∼100개의 연속 단위 길이를 갖는 영역, 약 50개의 연속 단위 길이를 갖는 영역, 또는 특정되지 않은 경우 전체 서열에 걸쳐 나타날 수 있다. 또한, 이 정의는 테스트 서열의 상보체를 말하기도 한다. 예를 들어, 2개 이상의 폴리펩티드 서열은 아미노산 잔기들이 동일할 때 동일한 반면, 2개 이상의 폴리펩티드 서열은 아미노산 잔기들이 특정한 영역에 대하여 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일할 때 "실질적으로 동일하다". 동일성은 적어도 약 75∼100개의 아미노산 길이를 갖는 영역, 약 50개의 아미노산 길이를 갖는 영역, 또는 특정되지 않은 경우 폴리펩티드 서열의 전체 서열에 걸쳐 나타날 수 있다. 또한, 예를 들어, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열은 핵산 잔기들이 동일할 때 동일한 반면, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열은 핵산 잔기들이 특정한 영역에 대하여 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90% 또는 약 95% 동일할 때 "실질적으로 동일하다". 동일성은 적어도 약 75∼100개의 핵산 길이를 갖는 영역, 약 50개의 핵산 길이를 갖는 영역, 또는 특정되지 않은 경우 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 서열에 걸쳐 나타날 수 있다.

서열 비교를 위해, 일반적으로 한 서열이 기준 서열로서 사용되고, 이 기준 서열에 대해 테스트 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 경우, 테스트 서열 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 부분 서열 좌표가 지정되며, 필요에 따라, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터를 사용하거나, 대안의 파라미터를 지정할 수 있다. 그 후, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터를 기초로 기준 서열에 대한 테스트 서열의 서열 동일성(%)을 계산한다.

본원에서 사용되는 "면역원성"이란 용어는 치료 약물의 투여에 대한 항체 반응을 의미한다. 치료용 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 면역원성은 생물학적 유체 중의 항 비천연 아미노산 폴리펩티드 항체의 검출을 위한 정량적 및 정성적 분석법을 이용하여 얻을 수 있다. 이러한 분석법으로는 방사능 면역분석법(RIA), 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 발광 면역분석법(LIA) 및 형광 면역분석법(FIA)을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 치료용 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 면역원성의 분석은 치료용 비천연 아미노산 폴리펩티드를 투여했을 때의 항체 반응을 치료용 천연 아미노산 폴리펩티드를 투여했을 때의 항체 반응과 비교하는 것을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "인터칼레이팅 기"로 지칭되기도 하는 "인터칼레이팅제"란 용어는 한 분자의 분자내 공간 또는 분자들 사이의 분자간 공간으로 삽입될 수 있는 화학 물질을 말한다. 예를 들어, 인터칼레이팅제 또는 인터칼레이팅 기는 DNA 이중 나선의 적층된 염기 내로 삽입되는 분자이다.

본원에서 사용되는 "단리된"이란 표현은 원하는 성분을 원하지 않는 성분들로부터 분리하고 제거하는 것을 말한다. 단리된 물질은 건조 또는 반건조 상태이거나, 또는 수용액을 포함하나 이에 한정되지 않는 용액 중에 존재할 수 있다. 단리된 성분은 균질한 상태일 수 있거나, 단리된 성분은 추가의 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물의 일부일 수 있다. 순도 및 균질도는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 포함하나 이에 한정되지 않는 분석 화학 기법을 이용하여 측정한다. 또한, 원하는 성분이 단리되어 제제 중에 주된 종으로서 존재할 경우, 이 성분은 본원에서 실질적으로 정제되었다고 한다. 본원에서 사용되는 "정제된"이란 표현은 순도가 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상인 원하는 성분을 지칭한다. 예를 들어, 핵산 또는 단백질은, 이러한 핵산 또는 단백질이 천연 상태에서 서로 회합되어 있는 세포내 성분들 중 적어도 일부를 포함하지 않거나, 핵산 또는 단백질이 그의 생체내 또는 시험관내 제조시의 농도보다 더 높은 농도로 농축된 경우 "단리되어 있다"고 한다. 또한, 예를 들어, 유전자는, 이 유전자의 측면에 위치하고 원하는 유전자 이외의 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로부터 분리되어 있을 때 단리되어 있다고 한다.

본원에서 사용되는 "표지"라는 용어는 화합물 내로 도입되고 용이하게 검출됨으로써 그 물리적 분포가 임의로 검출 및/또는 모니터링될 수 있는 물질을 말한다.

본원에서 사용되는 "결합(linkage)"이란 용어는 링커의 작용기와 다른 분자 사이의 화학 반응으로부터 형성된 결합(bond) 또는 화학적 부분을 말한다. 상기 결합으로는 공유 결합 및 비공유 결합을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않으며, 상기 화학적 부분으로는 에스테르, 카보네이트, 이민 포스페이트 에스테르, 하이드라존, 아세탈, 오르토에스테르, 펩티드 결합 및 올리고뉴클레오티드 결합을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 가수분해에 안정한 결합은, 결합이 수중에서 실질적으로 안정하고 유용한 pH 값에서(생리학적 조건을 포함하나 이에 한정되지 않음) 장기간 동안, 가능한 경우 심지어 무기한 동안 물과 반응하지 않는다는 것을 의미한다. 가수분해에 불안정한 또는 가수분해에 의해 분해 가능한 결합은, 결합이 수중에서 또는 수용액 중에서(예를 들어, 혈액을 포함함) 분해될 수 있다는 것을 의미한다. 효소에 불안정한 또는 효소에 의해 분해 가능한 결합은, 결합이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, PEG 및 관련 중합체는 중합체 골격 내에, 또는 중합체 골격과 중합체 분자의 말단 작용기들 중 하나 이상의 말단 작용기 사이의 링커기 내에 분해 가능한 결합을 포함한다. 이러한 분해 가능한 결합으로는, 생물학적 활성제 상의 알코올기와 PEG 카복실산 또는 활성화된 PEG 카복실산의 반응에 의해 형성된 에스테르 결합을 들 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 여기서 이러한 에스테르기는 생리학적 조건하에서 일반적으로 가수분해되어 생물학적 활성 물질을 방출한다. 가수분해에 의해 분해 가능한 다른 결합으로는 카보네이트 결합; 아민과 알데히드의 반응으로부터 생성된 이민 결합; 알코올과 포스페이트기의 반응에 의해 형성된 포스페이트 에스테르 결합; 하이드라지드와 알데히드의 반응 생성물인 하이드라존 결합; 알데히드와 알코올의 반응 생성물인 아세탈 결합; 포르메이트와 알코올의 반응 생성물인 오르토에스테르 결합; 아민기(PEG와 같은 중합체의 말단에 존재하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않음)와 펩티드의 카복실기에 의해 형성된 펩티드 결합; 및 포스포아미다이트기(중합체의 말단에 존재하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않음)와 올리고뉴클레오티드의 5' 하이드록실기에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드 결합을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 "배지"란 용어는 세포, 및/또는 이러한 세포에 의해 발현 및/또는 분비되는 생성물을 배양하고 회수하는 데 사용되는 임의의 배양 배지를 말한다. 이러한 "배지"는, 예를 들어 박테리아 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진핵생물 숙주 세포, 포유동물 숙주 세포, CHO 세포, 원핵생물 숙주 세포, 이. 콜라이 또는 슈도모나스 숙주 세포를 포함하는 임의의 숙주 세포 및 세포 내용물을 유지하거나 함유할 수 있는 용액, 고체, 반고체 또는 경질의 지지체를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 "배지"는 증식 단계 전 또는 후의 배지를 비롯하여, 폴리펩티드가 분비된 숙주 세포가 배양된 배지를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 "배지"는, 예를 들어 세포 내에서 폴리펩티드가 생성되고 숙주 세포가 용해 또는 파괴되어 상기 폴리펩티드를 방출하는 경우, 숙주 세포 용해물을 함유하는 완충액 또는 시약을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 "대사물질"이란 용어는 화합물, 예를 들어 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드가 대사될 때 형성되는 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 유도체를 말한다. "약학적 활성 대사물질" 또는 "활성 대사물질"이란 용어는 화합물, 예를 들어 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드가 대사될 때 형성되는 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생물학적 활성 유도체를 말한다.

본원에서 사용되는 "대사되는"이란 표현은 특정 물질이 유기체에 의해 변화되는 총체적인 과정을 말한다. 이러한 과정으로는 가수분해 반응 및 효소에 의해 촉진되는 반응을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 대사에 대한 추가 정보는 문헌[The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Edition, McGraw-Hill (1996)]으로부터 입수할 수 있다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 대사물질은 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 숙주에게 투여하고 숙주로부터 얻은 조직 시료를 분석함으로써 확인하거나, 천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 시험관내에서 간 세포와 함께 항온처리하고 생성된 화합물들을 분석함으로써 확인한다.

본원에서 사용되는 "금속 킬레이트제"란 용어는 금속 이온과의 금속 착물을 형성하는 분자를 말한다. 예를 들어, 이러한 분자는 중심 금속 이온과 2개 이상의 배위 결합을 형성하여 고리 구조를 형성한다.

본원에서 사용되는 "금속 함유 부분"이란 용어는 금속 이온, 원자 또는 입자를 함유하는 기를 말한다. 이러한 부분으로는 시스플라틴, 킬레이트된 금속 이온(예컨대, 니켈, 철 및 백금), 및 금속 나노입자(예컨대, 니켈, 철 및 백금)을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 "중원자를 도입하는 부분"이란 표현은 일반적으로 탄소보다 더 무거운 원자의 이온을 도입하는 기를 말한다. 이러한 이온 또는 원자로는 규소, 텅스턴, 금, 납 및 우라늄을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 "변형된"이란 표현은 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드에 변화가 가해졌음을 의미한다. 이러한 변화 또는 변형은 경우에 따라 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 합성 후 변형, 또는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 번역 동시 변형 또는 번역 후 변형에 의해 얻어진다. "변형된 또는 비변형된"이란 표현은 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드가 경우에 따라 변형되는 것, 즉 언급되는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드가 변형되거나 또는 변형되지 않을 수 있다는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 "조절된 혈청 반감기"란 표현은 비변형 형태와 비교할 때 변형된 생물학적 활성 분자의 순환 반감기에 양의(positive) 또는 음의(negative) 변화가 있음을 의미한다. 예를 들어, 변형된 생물학적 활성 분자로는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 예를 들어, 혈청 반감기는 생물학적 활성 분자 또는 변형된 생물학적 활성 분자를 투여한 후 다양한 시점에서 혈액 시료를 채취하여 각 시료 중의 해당 분자의 농도를 측정함으로써 측정한다. 혈청 농도와 시간의 상관관계를 통해 혈청 반감기를 계산할 수 있다. 예를 들어, 조절된 혈청 반감기는 투여 계획을 개선시킬 수 있거나 독성 효과를 피할 수 있는 혈청 반감기의 증가일 수 있다. 혈청에 있어서의 이러한 증가는 약 2배 이상, 약 3배 이상, 약 5배 이상, 또는 약 10배 이상이다. 이 방법은 경우에 따라 임의의 폴리펩티드의 혈청 반감기를 평가하는 데 이용된다.

본원에서 사용되는 "조절된 치료 반감기"란 표현은 비변형 형태와 비교할 때 치료적 유효량의 변형된 생물학적 활성 분자의 반감기에 양의 또는 음의 변화가 있음을 의미한다. 예를 들어, 변형된 생물학적 활성 분자로는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 예를 들어, 치료 반감기는 투여 후 다양한 시점에 분자의 약동학적 및/또는 약력학적 특성을 측정함으로써 측정한다. 증가된 치료 반감기는 유리한 특정 투여 계획 또는 유리한 특정 총 투여량을 이용할 수 있게 하거나, 원치않는 효과를 피할 수 있게 한다. 예를 들어, 증가된 치료 반감기는 증가된 효능, 변형된 분자와 그 표적의 증가된 또는 감소된 결합, 비변형 분자의 또 다른 파라미터 또는 작용 메커니즘의 증가 또는 감소, 또는 예를 들어, 프로테아제와 같은 효소에 의한 분자의 증가된 또는 감소된 분해로부터 비롯된다. 이 방법은 임의의 폴리펩티드의 치료 반감기를 평가하는 데 이용된다.

본원에서 사용되는 "나노입자"란 용어는 입자 크기가 약 500 nm∼약 1 nm인 입자를 말한다.

본원에서 사용되는 "거의 화학량론적인"이란 표현은 화학 반응에 참여하는 화합물의 몰비가 약 0.75∼약 1.5인 것을 말한다.

본원에서 사용되는 "비진핵생물"이란 용어는 비진핵 유기체를 말한다. 예를 들어, 비진핵생물 유기체는 진정세균(Eubacteria)[에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus), 또는 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)를 포함하나, 이에 한정되지 않음] 계통발생적 영역, 또는 고세균(Archaea)[메타노코커스 잔나스키(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모오토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum), 아키오글로버스 풀기더스(Archaeoglobus fulgidus), 파이로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus), 파이로코커스 호리코쉬이(Pyrococcus horikoshii), 애우로피룸 페르닉스(Aeuropyrum pernix) 또는 할로박테리움(Halobacterium), 예를 들어 할로페락스 볼카니이(Haloferax volcanii) 및 할로박테리움 종 NRC-1을 포함하나, 이에 한정되지 않음] 계통발생적 영역에 속한다.

"비천연 아미노산"은 20종의 일반 아미노산 중 하나, 파이로라이신(pyrolysine) 또는 셀레노시스테인(selenocysteine)이 아닌 아미노산을 말한다. 다른 동의어로는 "비천연적으로 코딩된 아미노산", "비천연 아미노산", "비자연 발생 아미노산" 등이 있다. "비천연 아미노산"이란 용어는 천연적으로 코딩된 아미노산(20종의 일반 아미노산 또는 파이로라이신 및 셀레노시스테인을 포함하나, 이들에 한정되지 않음)의 변형에 의해 자연적으로 발생되지만 그 자체가 번역 복합체(translation complex)에 의해 성장하는 폴리펩티드 쇄 내로 도입되는 것은 아닌 아미노산을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 천연적으로 코딩되지 않는 천연 아미노산의 예로는 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌 및 O-포스포타이로신이 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, "비천연 아미노산"이란 용어는 자연적으로 발생되지 않고 합성에 의해 수득되거나 비천연 아미노산의 변형에 의해 수득되는 아미노산을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 "핵산"이란 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 중합체를 말한다. 예를 들어, 이러한 핵산 및 핵산 중합체로는 (i) 기준 핵산과 유사한 결합 특정을 가지며 천연 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 유사체; (ii) PNA(펩티도핵산), 안티센스 기법에 사용되는 DNA의 유사체(포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 등)를 포함하나 이에 한정되지 않는 올리고뉴클레오티드 유사체; (iii) 이들의 보존적 변형 변이체(축퇴성 코돈 치환을 포함하나 이에 한정되지 않음) 및 상보적 서열, 및 명시적으로 표시된 서열을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 예를 들어, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 발생시킴으로써 이루어진다[Batzer et al., Nucleic Acids Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); and Cassol et al., (1992); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)].

본원에서 사용되는 "산화제"란 용어는 산화되는 화합물로부터 전자를 제거하는 화합물 또는 물질을 말한다. 예를 들어, 산화제로는 산화된 글루타티온, 시스틴, 시스타민, 산화된 디티오트레이톨, 산화된 에리트레이톨 및 산소를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 다종 다양한 산화제가 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기에 적합하다.

본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는"이란 표현은 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 파괴하지 않고 비교적 비독성인 염, 담체 또는 희석제(이에 한정되지 않음)를 비롯한 물질로서, 즉, 이 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하거나 이것이 포함된 조성물 중의 임의의 성분들과 유해하게 상호작용하지 않고서 개체에 투여될 수 있다.

본원에서 사용되는 "광친화성 표지"란 용어는 빛에 노출될 때 표지가 친화성을 나타내는 분자와 결합을 형성하는 기를 갖는 표지를 말한다. 예를 들어, 이러한 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합이다.

본원에서 사용되는 "광케이징된 부분"이란 용어는 특정 파장에서 조사할 때 다른 이온 또는 분자와 공유 결합하거나 비공유 결합하는 기를 말한다.

본원에서 사용되는 "광절단 가능한 기"란 용어는 빛에 노출될 때 파괴되는 기를 말한다.

본원에서 사용되는 "광가교결합제"란 용어는 빛에 노출될 때 반응성을 나타내어 2개 이상의 단량체 또는 중합체 분자와 공유 결합 또는 비공유 결합을 형성하는 2개 이상의 작용기를 포함하는 화합물을 말한다.

본원에서 사용되는 "광이성질체화 가능한 부분"이란 용어는 빛을 조사할 때 한 이성질체 형태로부터 다른 이성질체 형태로 변화하는 기를 말한다.

본원에서 사용되는 "폴리알킬렌 글리콜"이란 용어는 선형 또는 분지형 중합체 폴리에테르 폴리올을 말한다. 이러한 폴리알킬렌 글리콜로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜 및 이들의 유도체를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 다른 예시적 실시형태는, 예를 들어 Shearwater Corporation의 카탈로그["Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001)]와 같은 상업적 공급업체의 카탈로그에 기재되어 있다. 예를 들어, 이러한 중합체 폴리에테르 폴리올은 원하는 중합체 분자량 범위 내의 평균 분자량을 갖는다.

본원에서 사용되는 "원하는 중합체 분자량 범위 내의"란 표현은 약 0.1 kDa∼약 100 kDa을 의미한다. 예를 들어, 약 100 Da∼약 100,000 Da 또는 그 이상이다. 상기 중합체의 분자량은, 예를 들어 약 100 Da∼약 100,000 Da으로서, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da 및 100 Da을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100 Da∼약 50,000 Da이다. 일부 실시형태에서, 상기 중합체의 분자량은 약 100 Da∼약 40,000 Da이다. 일부 실시형태에서, 상기 중합체의 분자량은 약 1,000 Da∼약 40,000 Da이다. 일부 실시형태에서, 상기 중합체의 분자량은 약 5,000 Da∼약 40,000 Da이다. 일부 실시형태에서, 상기 중합체의 분자량은 약 10,000 Da∼약 40,000 Da이다. 일부 실시형태에서, 상기 중합체 분자는 분지쇄 중합체이다. 상기 분지쇄 중합체의 분자량은, 예를 들어 약 1,000 Da∼약 100,000 Da으로서, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da 및 1,000 Da을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 상기 분지쇄 중합체의 분자량은 약 1,000 Da∼약 50,000 Da이다. 일부 실시형태에서, 상기 분지쇄 중합체의 분자량은 약 1,000 Da∼약 40,000 Da이다. 일부 실시형태에서, 상기 분지쇄 중합체의 분자량은 약 5,000 Da∼약 40,000 Da이다. 일부 실시형태에서, 상기 분지쇄 중합체의 분자량은 약 5,000 Da∼약 20,000 Da이다.

본원에서 사용되는 "중합체"란 용어는 반복된 서브유닛(subunit)으로 이루어진 분자를 말한다. 이러한 분자로는 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리사카라이드, 또는 폴리알킬렌 글리콜을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

"폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"이란 용어들은 아미노산 잔기들로 이루어진 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 즉, 폴리펩티드에 대한 설명은 펩티드의 설명에 동일하게 적용되고, 펩티드에 대한 설명은 폴리펩티드의 설명에도 동일하게 적용된다. 상기 용어들은 천연 아미노산 중합체뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산인 아미노산 중합체에도 적용된다. 또한, 이러한 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 전체 길이 단백질을 비롯한 임의의 길이의 아미노산 쇄를 포함하며, 여기서 아미노산 잔기들은 공유 펩티드 결합에 의해 연결되어 있다.

"번역 후 변형"이란 표현은 천연 또는 비천연 아미노산이 폴리펩티드 쇄에 번역에 의해 도입된 후 일어나는 천연 또는 비천연 아미노산의 임의의 변형을 말한다. 이러한 변형으로는 생체내에서 번역과 동시에 일어나는 변형, 시험관내에서 번역과 동시에 일어나는 변형(예컨대, 세포 비함유 번역 시스템 내에서의 변형), 생체내에서의 번역 후 변형 및 시험관내에서의 번역 후 변형을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 "전구약물" 또는 "약학적으로 허용되는 전구약물"이란 표현들은 생체내 또는 시험관내에서 모 약물로 전환되는 물질로서 약물의 생물학적 활성 또는 특성을 파괴하지 않고 비교적 비독성이며, 즉, 이 물질은 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하거나 이것이 포함된 조성물 중의 임의의 성분들과 유해하게 상호작용하지 않고서 개체에 투여된다. 전구약물은 일반적으로, 피험체에 투여되어 흡수된 후 대사 경로에 의한 전환과 같이 몇 가지 과정을 통해 활성 또는 보다 고활성의 종으로 전환되는 약물 전구체이다. 몇몇 전구약물은 이 전구약물의 활성을 감소시키고/감소시키거나 약물에 용해도 또는 다른 몇 가지 특성을 부여하는 전구약물 상에 존재하는 화학 기를 갖는다. 전구약물로부터 화학 기가 절단 및/또는 변형되면, 활성 약물이 생성된다. 전구약물은 체내에서 효소 또는 비효소 반응을 통해 활성 약물로 전환된다. 전구약물은, 예를 들어 개선된 물리화학적 특성, 예컨대 우수한 용해도, 향상된 전달 특성, 예컨대 특정한 세포, 조직, 기관 또는 리간드를 특이적으로 표적화하는 특성, 및 약물의 개선된 치료 효과를 제공한다. 이러한 전구약물의 이점으로는 (i) 모 약물에 비해 투여가 용이하다는 점; (ii) 모 약물은 그렇지 않으나 전구약물은 경구 투여를 통해 생체내 이용이 가능하다는 점; 및 (iii) 전구약물이 모 약물에 비해 약학 조성물에서 개선된 용해도를 나타낸다는 점을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 전구약물은 약리학적으로 비활성이거나 감소된 활성을 갖는 활성 약물의 유도체를 포함한다. 전구약물은, 약물의 특성, 예컨대 물리화학적 특성, 생물의약적 특성 또는 약동학적 특성의 조작을 통해 원하는 작용 부위에 도달하는 약물 또는 생물학적 활성 분자의 양을 조절하도록 디자인된다. 전구약물의 비한정적인 예로, 전달 물질의 세포막 관통(세포막 관통에 있어서는 수용성이 이동성에 불리하게 작용함)을 촉진하기 위해 에스테르("전구약물")로서 투여되지만, 그 후 수용성이 유리하게 작용하는 세포 내에 진입되면, 대사에 의해 활성 물질인 카복실산으로 가수분해되는 비천연 아미노산 폴리펩티드를 들 수 있다. 전구약물은 또한, 예를 들어 부위 특이적 조직으로의 약물 전달을 향상시키기 위해 개질제로서 사용하기 위한 가역적 약물 유도체로서 디자인된다.

본원에서 사용되는 "예방적 유효량"이란 표현은 하나 이상의 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 하나 이상의 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물이 환자에게 예방 목적으로 투여될 경우 치료 대상 질병, 병증 또는 질환 중 하나 이상의 증상을 어느 정도까지 경감시킬 수 있는 상기 조성물의 양을 의미한다. 이러한 예방 용도에 있어서, 상기 유효량은, 예를 들어 환자의 건강 상태, 체중 등에 따라 달라진다.

본원에서 사용되는 "보호된"이란 표현은 특정한 반응 조건하에 화학적 반응성 작용기의 반응을 방지하는 "보호기" 또는 부분이 존재함을 의미한다. 보호기는 보호되는 화학적 반응기의 종류에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, (i) 화학적 반응기가 아민 또는 하이드라지드인 경우, 보호기는 tert-부틸옥시카보닐(t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc)로부터 선택되고; (ii) 화학적 반응기가 티올인 경우, 보호기는 오르토피리딜디설파이드이며; (iii) 화학적 반응기가 카복실산, 예를 들어 부탄산 또는 프로피온산, 또는 하이드록실기인 경우, 보호기는 벤질 또는 알킬 기, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 tert-부틸이다.

예를 들어, 차단기/보호기는 하기 기들로부터 선택된다:

또한, 보호기는 Nvoc 및 MeNvoc과 같은 광불안정 기 및 다른 보호기, 예컨대 문헌[Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999]에 기재된 것을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 "방사성 부분"이란 용어는 핵이 핵 방사선, 예컨대, 알파, 베타 또는 감마 입자를 자발적으로 방출하는 기를 지칭하는데, 여기서 알파 입자는 헬륨 핵이고, 베타 입자는 전자이며, 감마 입자는 고에너지 광자이다.

본원에서 사용되는 "반응성 화합물"이란 용어는 적절한 조건하에 다른 원자, 분자 또는 화합물에 대해 반응성을 나타내는 화합물을 말한다.

"숙주 세포"로도 지칭되는 "재조합 숙주 세포"란 용어는 외인성(exogenous) 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 말하며, 여기서 외인성 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 삽입하는 데 이용되는 방법으로는 재조합 숙주 세포를 생성하기 위한 직접 흡수법, 형질도입, 또는 f-교배(mating)를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 예를 들어, 상기 외인성 폴리뉴클레오티드는 플라스미드를 포함하나 이에 한정되지 않는 비통합(nonintegrated) 벡터이거나 숙주 게놈 내로 통합된다.

본원에서 사용되는 "산화환원 활성제"란 용어는 다른 분자를 산화시키거나 환원시키는 분자를 말하며, 이로써 산화환원 활성제는 환원되거나 산화된다. 산화환원 활성제의 예로는 페로센, 퀴논, Ru^2+/3+ 착물, Co^2+/3+ 착물 및 Os^2+/3+ 착물을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 "환원제"란 용어는 환원되는 화합물에 전자를 부가할 수 있는 화합물 또는 물질을 말한다. 예를 들어, 환원제로는 디티오트레이톨(DTT), 2-머캅토에탄올, 디티오에리트리톨, 시스테인, 시스테아민(2-아미노에탄티올) 및 환원된 글루타티온을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 환원제는, 예를 들어 설프하이드릴기를 환원된 상태로 유지하고 분자내 또는 분자간 디설파이드 결합을 환원시키는 데 사용된다.

본원에서 사용되는 "수지"란 용어는 고분자량의 불용성 중합체 비드를 말한다. 예를 들어, 이러한 비드는 고체상 펩티드 합성을 위한 지지체로서 사용되거나, 정제 전 분자의 부착을 위한 부위로서 사용된다.

본원에서 사용되는 "사카라이드(saccharide)"란 용어는 당(sugar), 모노사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드를 포함하나 이들에 한정되지 않는 일련의 탄수화물을 말한다.

본원에서 사용되는 "안전성" 또는 "안전성 프로필"이란 용어는 약물의 투여 횟수에 대한 약물의 투여와 관련된 부작용을 말한다. 예를 들어, 여러 차례 투여되었고 단지 경미한 부작용을 유발하거나 부작용을 유발하지 않는 약물은 우수한 안전성 프로필을 갖는다고 말한다. 이 방법은, 예를 들어 임의의 폴리펩티드의 안전성 프로필을 평가하는 데 이용된다.

본원에서 사용되는 "스핀 표지"란 용어는 전자 스핀 공명 분광분석법에 의해 검출될 수 있고 다른 분자에 부착될 수 있는 홀전자 스핀을 나타내는 원자 또는 원자단(즉, 안정한 상자성 기)을 함유하는 분자를 말한다. 이러한 스핀 표지 분자로는 니트릴 라디칼 및 니트록시드를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않고, 단일 스핀 표지 또는 이중 스핀 표지가 있다.

본원에서 사용되는 "화학량론적"이란 표현은 화학 반응에 참여하는 화합물의 몰비가 약 0.9∼약 1.1인 것을 말한다.

본원에서 사용되는 "화학량론적 유사"란 표현은 반응 조건의 변화시 또는 첨가제 존재하에 화학량론적이 되거나 거의 화학량론적인 상태가 되는 화학 반응을 말한다. 반응 조건에서의 이러한 변화로는 온도의 증가 또는 pH의 변화를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 상기 첨가제로는 촉진제를 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 "피험체"란 용어는 처치, 관찰 또는 실험의 대상인 동물을 말한다. 예를 들어, 피험체는 인간을 포함하나 이에 한정되지 않는 포유동물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 "실질적으로 정제된"이란 표현은 정제하기 전에는 일반적으로 원하는 성분에 동반되거나 원하는 성분과 상호작용하는 다른 성분들을 실질적으로 또는 본질적으로 포함하지 않는 원하는 성분을 말한다. 예를 들어, 원하는 성분은 원하는 성분의 제제가 (건조 중량을 기준으로) 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만의 오염 성분들을 함유할 경우 "실질적으로 정제된 것"이다. 따라서, "실질적으로 정제된" 원하는 성분의 순도는 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상이다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 천연 세포로부터 정제되거나, 재조합에 의해 제조된 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 경우 숙주 세포로부터 정제된다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 제제는 이 제제가 (건조 중량을 기준으로) 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만의 오염 물질을 함유할 경우 "실질적으로 정제된 것"이다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드가 숙주 세포에 의해 재조합적으로 제조되는 경우, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 세포의 건조 중량의 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만으로 존재한다. 예를 들어, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드가 숙주 세포에 의해 재조합적으로 제조되는 경우, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 세포의 건조 중량의 약 5 g/L, 약 4 g/L, 약 3 g/L, 약 2 g/L, 약 1 g/L, 약 750 mg/L, 약 500 mg/L, 약 250 mg/L, 약 100 mg/L, 약 50 mg/L, 약 10 mg/L 또는 약 1 mg/L 또는 그 미만으로 배양 배지 중에 존재한다. 예를 들어, "실질적으로 정제된" 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 순도는, SDS-PAGE 분석, RP-HPLC, SEC 및 모세관 전기영동을 포함하나 이들에 한정되지 않는 적절한 방법에 의해 측정시 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99% 또는 이보다 높다.

"비간섭 치환기"로도 지칭되는 "치환기"란 용어는 분자 상의 다른 기를 치환하는 데 사용되는 기를 말한다. 이러한 기로는 할로, C₁-C₁₀ 알킬, C₂-C₁₀ 알케닐, C₂-C₁₀ 알키닐, C₁-C₁₀ 알콕시, C₅-C₁₂ 아랄킬, C₃-C₁₂ 시클로알킬, C₄-C₁₂ 시클로알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 톨루오일, 크실레닐, 비페닐, C₂-C₁₂ 알콕시알킬, C₅-C₁₂ 알콕시아릴, C₅-C₁₂ 아릴옥시알킬, C₇-C₁₂ 옥시아릴, C₁-C₆ 알킬설피닐, C₁-C₁₀ 알킬설포닐, -(CH₂)_m-O-(C₁-C₁₀ 알킬)(여기서, m은 1∼8임), 아릴, 치환된 아릴, 치환된 알콕시, 플루오로알킬, 복소환 라디칼, 치환된 복소환 라디칼, 니트로알킬, -NO₂, -CN, -NRC(O)-(C₁-C₁₀ 알킬), -C(O)-(C₁-C₁₀ 알킬), C₂-C₁₀ 알킬 티오알킬, -C(O)O-(C₁-C₁₀ 알킬), -OH, -SO₂, =S, -COOH, -NR₂, 카보닐, -C(O)-(C₁-C₁₀ 알킬)-CF₃, -C(O)-CF₃, -C(O)NR₂, -(C₁-C₁₀ 아릴)-S-(C₆-C₁₀ 아릴), -C(O)-(C₆-C₁₀ 아릴), -(CH₂)_m-O-(CH₂)_m-O-(C₁-C₁₀ 알킬)(여기서, m은 각각 1∼8임), -C(O)NR₂, -C(S)NR₂, -SO₂NR₂, -NRC(O)NR₂, -NRC(S)NR₂, 이들의 염 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 상기 목록에서 각각의 R 기는 H, 알킬 또는 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴, 또는 알카릴을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 치환기가 좌측부터 우측으로 기재되는 관용 화학식으로 특정되는 경우, 이들은 구조를 우측부터 좌측으로 기재함으로써 비롯되는 화학적으로 동일한 치환기도 포함하는데, 예를 들어, -CH₂O-는 -OCH₂-와 동등하다.

예를 들어, 알킬 및 헤테로알킬 라디칼(알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 시클로알키닐, 헤테로시클로알킬, 시클로알케닐 및 헤테로시클로알케닐로 지칭되는 기들을 포함함)에 대한 치환기로는 -OR, =0, =NR, =N-OR, -NR₂, -SR, -할로겐, -SiR₃, -OC(O)R, -C(O)R, -CO₂R, -CONR₂, -OC(O)NR₂, -NRC(O)R, -NRC(O)NR₂, -NR(O)₂R, -NR-C(NR₂)=NR, -S(O)R, -S(O)₂R, -S(O)₂NR₂, -NRSO₂R, -CN 및 -NO₂가 있으나 이들에 한정되지 않는다. 이 목록에서 각각의 R 기로는 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴(1개 또는 2개의 할로겐으로 치환된 아릴을 포함하나 이에 한정되지 않음), 치환된 또는 비치환된 알킬, 알콕시, 티오알콕시 기, 또는 아랄킬기를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 2개의 R 기가 동일한 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 질소 원자와 조합되어 5원, 6원 또는 7원 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR₂는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.

예를 들어, 아릴 및 헤테로아릴 기에 대한 치환기로는 0 내지 방향족 고리계 상의 개방 원자가의 총수 범위 내의 수의 -OR, =NR, =N-OR, -NR₂, -SR, -할로겐, -SiR₃, -OC(O)R, -C(O)R, -CO₂R, -CONR₂, -OC(O)NR₂, -NRC(O)R, -NRC(O)NR₂, -NR(O)₂R, -NR-C(NR₂)=NR, -S(O)R, -S(O)₂R, -S(O)₂NR₂, -NRSO₂R, -CN, -NO₂, -R, -N₃, -CH(Ph)₂, 플루오로(C₁-C₄)알콕시 및 플루오로(C₁-C₄)알킬을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않으며; 이 목록에서 각각의 R 기로는 수소, 알킬, 헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 "치료용 단백질"이란 용어는 하기 폴리펩티드/단백질 중 어느 하나 또는 전부를 의미한다: 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨 이뇨 인자, 심방 나트륨 이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인 단백질-1, 단핵구 화학유인 단백질-2, 단핵구 화학유인 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, I309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피세포 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피세포 성장 인자(EGF), 상피세포 호중구 활성화 펩티드, 에리스로포이에틴(EPO), 박리 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4 나선 번들 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, IFN 패밀리의 임의의 인터페론 유사 분자 또는 구성원, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질 세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴투린, 호중구 억제 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 암유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴렉신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 슈퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화 인자, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론.

본원에서 사용되는 "치료적 유효량"이란 표현은 하나 이상의 비천연 아미노산 폴리펩티드 및/또는 하나 이상의 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물이 질병, 병증 또는 질환을 이미 앓고 있는 환자에게 투여된 경우 치료 대상 질병, 병증 또는 질환의 증상 중 하나 이상을 어느 정도까지 치유하거나 적어도 부분적으로 저지하거나 경감시키기에 충분한 상기 조성물의 양을 말한다. 이러한 조성물의 유효성은 질병, 병증 또는 질환의 중증도 및 경과, 선행 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 치료 의사의 판단을 포함하나 이들에 한정되지 않는 조건에 달려 있다. 예를 들어, 치료적 유효량은 용량 증가 임상 시험을 포함하나 이에 한정되지 않는 방법에 의해 결정된다.

본원에서 사용되는 "티오알콕시"란 용어는 산소 원자를 통해 분자에 연결된 황 함유 알킬기를 말한다.

"열 융점" 또는 T_m이란 용어는 표적에 상보적인 프로브의 50%가 (지정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도하에) 평형 상태에서 표적 서열에 하이브리드화하는 온도이다.

본원에서 사용되는 "독성 부분"이란 용어는 유해할 수 있거나 사망(사멸)을 초래할 수 있는 화합물을 말한다.

본원에서 사용되는 "치료한다", "치료하는" 또는 "치료"란 표현은 질병 또는 병증의 증상을 완화하거나 경감하거나 개선하는 것, 추가 증상을 예방하는 것, 증상의 대사적 기초 원인을 개선하거나 예방하는 것, 질병 또는 병증을 억제하는 것, 예를 들어, 질병 또는 병증의 진행을 저지하는 것, 질병 또는 병증을 경감하는 것, 질병 또는 병증의 역행을 유발하는 것, 질병 또는 병증에 의해 유발되는 증상을 경감하는 것, 또는 질병 또는 병증의 증상을 정지시키는 것을 포함한다. "치료한다", "치료하는" 또는 "치료"란 표현은 예방적 및/또는 치료적 처치를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 "수용성 중합체"란 용어는 수성 용매 중에서 용해될 수 있는 임의의 중합체를 말한다. 이러한 수용성 중합체로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 모노 C₁-C₁₀ 알콕시 또는 이의 아릴옥시 유도체(그러한 수용성 중합체의 개시내용에 대해서는 본원에서 참고로 인용되는 미국 특허 제5,252,714호에 기재되어 있음), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 폴릴비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리아미노산, 디비닐에테르 말레산 무수물, N-(2-하이드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 덱스트란 유도체(덱스트란 설페이트를 포함함), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 폴리사카라이드, 올리고사카라이드, 글리칸, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체(메틸셀룰로스 및 카복시메틸 셀룰로스를 포함하나, 이들에 한정되지 않음), 혈청 알부민, 전분 및 전분 유도체, 폴리펩티드, 폴리알킬렌 글리콜 및 이의 유도체, 폴리알킬렌 글리콜의 공중합체 및 이의 유도체, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 알파-베타-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파르트아미드 등, 또는 이들의 혼합물을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 예를 들어, 이러한 수용성 중합체를 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 폴리펩티드에 커플링하면, 비변형 형태에 비해 수용해도 증가, 혈청 반감기의 증가 또는 조절, 치료 반감기의 증가 또는 조절, 생체이용률의 증가, 생물학적 활성의 조절, 순환 시간의 증가, 면역원성의 조절, 물리적 회합 특성의 조절(응집 및 다량체 형성을 포함하나 이에 한정되지 않음), 수용체 결합 변경, 하나 이상의 결합 파트너에 대한 결합 변경 및 수용체 이량체화 또는 다량체화의 변경을 포함하나 이들에 한정되지 않는 변화가 초래된다. 또한, 이러한 수용성 중합체는 경우에 따라 그 자신의 생물학적 활성을 갖는다.

달리 명시하지 않는다면, 질량 분광분석법, NMR, HPLC, 단백질 화학법, 생화학법, 재조합 DNA 기법 및 약리학적 기법과 같은 통상적인 방법이 사용된다.

본원에 제시된 화합물(비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물을 제조하기 위한 반응제를 포함하나, 이들에 한정되지 않음)은 하나 이상의 원자가 천연 상태에서 통상적으로 발견되는 원자량 또는 질량수와 상이한 원자량 또는 질량수를 갖는 원자로 치환된다는 점을 제외하고 본원에 제시된 다양한 화학식 및 구조식으로 표시된 화합물들과 동일한 동위원소 표지 화합물을 포함한다. 본 발명의 화합물 내로 도입될 수 있는 동위원소의 예는 각각 ²H, ³H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸O, ¹⁷0, ³⁵S, ¹⁸F, ³⁶Cl과 같은 수소, 탄소, 질소, 산소, 불소 및 염소의 동위원소를 포함한다. 본원에 기재된 몇몇 동위원소 표지 화합물, 예컨대, ³H 및 ¹⁴C와 같은 방사성 동위원소가 도입된 화합물은 약물 및/또는 기질 조직 분포 분석에 유용하다. 또한, 중수소, 즉 ²H와 같은 동위원소로의 치환은 보다 큰 대사 안정성, 예를 들어 생체내 반감기 증가 또는 투여량 요구 감소로부터 비롯된 치료적 이점을 제공할 수 있다.

본원의 화합물들 중 일부(비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물을 제조하기 위한 반응제를 포함하나, 이들에 한정되지 않음)는 비대칭 탄소 원자를 가지므로 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체로서 존재할 수 있다. 부분입체이성질체 혼합물은 공지된 방법, 예를 들어, 크로마토그래피 및/또는 분별 결정에 의해 그 물리화학적 차이점에 기초하여 이들의 개별 부분입체이성질체로 분리될 수 있다. 거울상이성질체는, 적절한 광학적 활성 화합물(예를 들어, 알코올)과의 반응으로 거울상이성질체 혼합물을 부분입체이성질체 혼합물로 전환하고, 부분입체이성질체를 분리하고, 개개의 부분입체이성질체를 상응하는 순수한 거울상이성질체로 전환(예를 들어, 가수분해)함으로써 분리할 수 있다. 부분입체이성질체, 거울상이성질체 및 이들의 혼합물을 포함하는 이러한 모든 이성질체는 본원에 기재된 조성물의 일부로서 간주된다.

추가의 또는 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 화합물(비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물들을 제조하기 위한 반응제를 포함하나, 이들에 한정되지 않음)은 전구약물의 형태로 사용된다. 추가의 또는 또 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 화합물(비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물들을 제조하기 위한 반응제를 포함하나, 이들에 한정되지 않음)은 이를 필요로 하는 유기체에게 투여될 때 대사되어 대사물질을 생성하고, 이 대사물질은 원하는 치료 효과를 비롯한 원하는 효과를 얻는 데 사용된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 비천연 아미노산, 및 "변형 또는 비변형된" 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성 대사물질이 제공된다.

본원에 기재된 방법 및 제제는 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 N-옥시드, 결정질 형태(다형체로도 알려져 있음) 또는 약학적으로 허용되는 염의 사용을 포함한다. 또한, 본원에 기재된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 비용매화 형태뿐만 아니라, 물, 에탄올 등과 같은 약학적으로 허용되는 용매와의 용매화 형태로 존재할 수 있다. 본원에 제시된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 용매화 형태도 본원에 개시된 것으로 간주된다.

본원에 기재된 화합물들 중 일부(비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물들을 제조하기 위한 반응제를 포함하나, 이들에 한정되지 않음)는 여러 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다. 이러한 모든 호변이성질체 형태는 본원에 기재된 조성물의 일부로서 간주된다. 또한, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 화합물들(비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물들을 제조하기 위한 반응제를 포함하나, 이들에 한정되지 않음)의 모든 에놀-케토 형태도 본원에 기재된 조성물의 일부로서 간주된다.

본원에 기재된 화합물들 중 일부(비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물들을 제조하기 위한 반응제를 포함하나, 이들에 한정되지 않음)는 산성이며, 약학적으로 허용되는 양이온과의 염을 형성한다. 본원에 기재된 화합물들 중 일부(비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드, 및 전술한 화합물들을 제조하기 위한 반응제를 포함하나, 이들에 한정되지 않음)는 염기성이며 따라서 약학적으로 허용되는 음이온과의 염을 형성한다. 이염(di-salt)을 비롯한 모든 이러한 염들이 본원에 기재된 조성물의 범위 내에 있고, 이들은 공지된 방법에 의해 제조된다. 예를 들어, 염은 경우에 따라 수성, 비수성 또는 부분 수성 매질 중에서 산성 물질과 염기성 물질을 접촉시킴으로써 제조한다. 염은 여과, 비용매를 사용한 침전 후 여과, 용매의 증발, 또는 수용액의 경우 동결건조 중 하나 이상의 기법을 이용하여 회수한다.

본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 약학적으로 허용되는 염은 경우에 따라, 모 비천연 아미노산 폴리펩티드 내에 존재하는 산성 프로톤이 금속 이온, 예를 들어 알칼리 금속 이온, 알칼리 토금속 이온, 알루미늄 이온에 의해 치환되거나 유기 염기와 배위결합할 때 형성된다. 또한, 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 염 형태는 경우에 따라 출발 물질 또는 중간체의 염을 사용하여 제조한다. 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라, 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 유리 염기 형태와 약학적으로 허용되는 무기 또는 유기 산을 반응시킴으로써 약학적으로 허용되는 산 부가염(이는 약학적으로 허용되는 염의 한 종류임)으로서 제조된다. 대안으로, 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 본원에 개시된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 유리 산 형태와 약학적으로 허용되는 무기 또는 유기 염기를 반응시킴으로써 약학적으로 허용되는 염기 부가염(이는 약학적으로 허용되는 염의 한 종류임)으로서 제조된다.

약학적으로 허용되는 염의 종류로는, (1) 염산, 수소화브롬산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산을 사용하여 형성하거나, 아세트산, 프로피온산, 헥산산, 시클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄디설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-메틸비시클로-[2.2.2]옥트-2-엔-1-카복실산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-(3-하이드록시-2-엔-1-카복실산), 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 3차 부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산 등을 사용하여 형성한 산 부가 염; (2) 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 금속 이온, 예를 들어, 알칼리 금속 이온, 알칼리 토금속 이온 또는 알루미늄 이온으로 치환되거나 유기 염기와 배위 결합을 형성할 때 형성되는 염을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 허용되는 유기 염기로는 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등이 있다. 허용되는 무기 염기로는 수산화알루미늄, 수산화칼슘, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 수산화나트륨 등이 있다.

비천연 아미노산 폴리펩티드의 약학적으로 허용되는 염의 상응하는 반대 이온은 이온 교환 크로마토그래피, 이온 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 유도 결합 플라즈마, 원자 흡수 분광분석법, 질량 분광분석법, 또는 이들의 임의의 조합을 비롯한 다양한 방법을 이용하여 분석하고 확인한다. 또한, 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 약학적으로 허용되는 염의 치료 활성은 실시예 9∼17에 기재된 기법 및 방법을 이용하여 테스트한다.

염이라고 말한 것은 그 용매 부가 형태 또는 결정 형태, 특히 용매화물 또는 다형체를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 용매화물은 화학량론적 또는 비화학량론적 양의 용매를 함유하며, 종종 물, 에탄올 등의 약학적으로 허용되는 용매에 의한 결정화 과정 중에 형성된다. 수화물은 용매가 물일 때 형성되고, 알코올레이트는 용매가 알코올일 때 형성된다. 다형체는 동일한 원소 조성을 갖는 화합물의 상이한 결정 패킹 배열을 포함한다. 다형체는 통상적으로 다양한 X선 회절 패턴, 적외선 스펙트럼, 융점, 밀도, 경도, 결정 형상, 광학적 및 전기적 특성, 안정성 및 용해도를 갖는다. 재결정화 용매, 결정화 속도 및 저장 온도와 같은 다양한 요인이 단일 결정 형태가 우세해지도록 하는 것으로 예상된다.

비천연 아미노산 폴리펩티드의 약학적으로 허용되는 염의 다형체 및/또는 용매화물의 스크리닝 및 특성 분석은 열 분석법, X선 회절법, 분광분석법, 증기 흡착법 및 현미경법을 포함하나 이들에 한정되지 않는 다양한 기법을 이용하여 수행한다. 열 분석법은 다형 전이를 포함하나 이에 한정되지 않는 열화학적 분해 또는 열물리적 방법을 다루며, 이 방법들은 다형체 형태 간의 관계를 분석하거나 중량 손실을 측정하거나 유리 전이 온도를 측정하거나 부형체 상용성 연구를 위해 사용된다. 이러한 방법으로는 시차 주사 열량분석법(DSC), 변조 시차 주사 열량분석법(MDSC), 열중량 측정 분석법(TGA) 및 열중량 측정 및 적외선 분석법(TG/IR)을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. X선 회절법으로는 단결정 및 분말 회절계 및 싱크로트론 소스를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 이용되는 다양한 분광분석 기법으로는 라만, FTIR, UVIS 및 NMR(액상 및 고상)을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 다양한 현미경 기법으로는 편광 현미경법, 에너지 분산 X선 분석(EDX)을 이용한 주사 전자 현미경법(SEM), EDX를 이용한 환경 주사 전자 현미경법(기체 또는 수증기 분위기에서), IR 현미경법 및 라만 현미경법을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

[도면의 간단한 설명]

본 발명의 방법 및 조성물의 특징 및 장점은 본 방법, 조성물, 디바이스 및 장치의 원리가 이용되는 예시적 실시형태를 설명하는 후술하는 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조하면 더 잘 이해할 수 있다.

도 1은 본원에 기재된 방법, 조성물, 수단 및 기법의 특정한 측면들의 관계를 보여주는 비한정적인 개략도를 도시한다.

도 2는 피셔(Fischer) 인돌 합성 메커니즘을 보여주는 비한정적인 개략도를 도시한다.

도 3은 본원에 기재된 비천연 아미노산을 제조하는 데 이용되는 합성 방법의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 4는 본원에 기재된 비천연 아미노산을 제조하는 데 이용되는 합성 방법의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 5는 본원에 기재된 비천연 아미노산을 제조하는 데 이용되는 합성 방법의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 6은 본원에 기재된 비천연 아미노산을 제조하는 데 이용되는 합성 방법의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 7은 본원에 기재된 비천연 아미노산을 제조하는 데 이용되는 합성 방법의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 8은 본원에 기재된 비천연 아미노산을 제조하는 데 이용되는 합성 방법의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 9는 본원에 기재된 비천연 아미노산을 제조하는 데 이용되는 합성 방법의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 10은 본원에 기재된 비천연 아미노산을 제조하는 데 이용되는 합성 방법의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 11은 본원에 기재된 비천연 아미노산을 제조하는 데 이용되는 합성 방법의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 12는 피셔 인돌 합성법에 대한 금속 이온의 효과를 보여주는 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 13은 본원에 기재된 비천연 아미노산을 제조하는 데 이용되는 합성 방법에 대한 니켈 금속 이온의 촉진 효과를 보여주는 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 14는 본원에 기재된 비천연 아미노산을 제조하는 데 이용되는 합성 방법에 대한 용매의 효과를 보여주는 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 15는 본원에 기재된 인돌 함유 비천연 아미노산을 합성하는 데 사용되는 하이드라진 함유 비천연 아미노산 반응제의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 16은 본원에 기재된 인돌 함유 비천연 아미노산을 합성하는 데 사용되는 카보닐 함유 비천연 아미노산 반응제 및 마스킹된 카보닐 함유 비천연 아미노산 반응제의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 17은 본원에 기재된 인돌 함유 비천연 아미노산을 합성하는 데 사용되는 카보닐 함유 비천연 아미노산 반응제 및 마스킹된 카보닐 함유 비천연 아미노산 반응제의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 18은 본원에 기재된 인돌 함유 비천연 아미노산을 합성하는 데 사용되는 카보닐 함유 비천연 아미노산 반응제의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 19는 변형된 인돌 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하기 위한 하이드라진 함유 반응제에 의한 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 번역 후 변형의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 20은 변형된 인돌 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하기 위한 카보닐 함유 반응제에 의한 하이드라진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 번역 후 변형의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 21은 인돌 함유 비천연 아미노산 단백질을 형성하기 위한 하이드라진 함유 반응제에 의한 카보닐 함유 단백질 및 마스킹된 카보닐 함유 단백질 표지 또는 변형의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 22는 인돌 함유 비천연 아미노산 단백질을 형성하기 위한 카보닐 함유 반응제에 의한 하이드라진 함유 단백질 표지 또는 변형의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 23은 (A) 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드로의 화학적 전환에 의한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 변형; 및 (B) 하이드라진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드로의 화학적 전환에 의한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 변형의 예시적인 비한정적 예를 도시한다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 본원에 기재된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 특성 분석하고 사용하기 위한 방법, 조성물, 기법 및 수단 중 어느 하나에 사용되거나 통합된다.

도 24A는 원하는 작용기성을 도입하기 위한 하이드라진 및 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 단백질의 예시적인 비한정적 예를 도시한다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 본원에 기재된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 특성 분석하고 사용하기 위한 방법, 조성물, 기법 및 수단 중 어느 하나에 사용되거나 통합된다.

도 24B는 작용기 함유 폴리펩티드 또는 단백질과 PEG 유도체와의 반응의 예시적인 비한정적 예를 도시한다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 본원에 기재된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 특성 분석하고 사용하기 위한 방법, 조성물, 기법 및 수단 중 어느 하나에 사용되거나 통합된다.

도 25는 인돌의 형성을 통해 비천연 아미노산 함유 단백질 또는 폴리펩티드와 PEG 유도체를 연결하기 위해 이작용기성 링커기를 사용하는 것의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 26은 양쪽 말단에 하이드라진을 함유하는 이작용기성 링커기 합성의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 27은 2개의 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동종이량체를 형성하기 위해 이작용기성 링커를 사용하는 것의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

도 28은 인돌을 함유하는 변형된 폴리펩티드를 형성하기 위한 분지형 PEG 함유 반응제와 카보닐 함유 비천연 아미노산 함유 폴리펩티드와의 반응의 예시적인 비한정적 예를 도시한다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 본원에 기재된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 특성 분석하고 사용하기 위한 방법, 조성물, 기법 및 수단 중 어느 하나에 사용되거나 통합된다.

도 29는 인돌을 함유하는 변형된 폴리펩티드를 형성하기 위한 분지형 PEG 함유 반응제와 하이드라진 함유 비천연 아미노산 함유 폴리펩티드와의 반응의 예시적인 비한정적 예를 도시한다. 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 본원에 기재된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 특성 분석하고 사용하기 위한 방법, 조성물, 기법 및 수단 중 어느 하나에 사용되거나 통합된다.

도 30은 하이드라진기 및 카보닐기를 함유하는 PEG 유도체의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

[상세한 설명]

I. 서론

최근, 단백질 과학에서 단백질의 부위 특이적 변형과 관련된 한계를 상당수 극복한 전혀 새로운 기술이 보고되었다. 구체적으로, 원핵생물 에스케리치아 콜라이(E. coli)(예를 들어, 문헌[L. Wang, et al., (2001), Science 292: 498-500] 참조) 및 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아(S. cerevisiae)(예를 들어, 문헌[J. Chin et al., Science 301: 964-7 (2003)] 참조)의 단백질 생합성 기구에 생체내에서 비천연 아미노산을 단백질로 도입할 수 있게 하는 새로운 구성요소들이 첨가되었다. 광친화성 표지 및 광이성질체화 가능한 아미노산, 케토 아미노산 및 글리코실화된 아미노산을 비롯하여 신규한 화학적, 물리적 또는 생물학적 특성을 갖는 다수의 신규 아미노산이 이 방법에 의해 앰버(amber) 코돈인 TAG에 반응하여 이. 콜라이 및 효모에서 높은 충실도로 효율적으로 단백질 내로 도입되었다. 예를 들어, 문헌[J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124: 9026-9027](본원에 그 전체가 참고로 포함됨); 문헌[J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11): 1135-1137](본원에 그 전체가 참고로 포함됨); 문헌[J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99: 11020-11024](본원에 그 전체가 참고로 포함됨); 및 문헌[L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1: 1-11](본원에 그 전체가 참고로 포함됨)을 참조할 수 있다. 이 연구들은, 단백질에서 발견되지 않으며, 유전적으로 코딩된 20종의 일반 아미노산에서 발견되는 모든 작용기에 대해 화학적으로 비활성이고, 효율적 및 선택적으로 반응하여 안정한 공유 결합을 형성하는 데 사용될 수 있는 화학적 작용기를 선택적으로 도입할 수 있음을 입증하였다.

II. 개요

도 1은 본원에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 수단의 비한정적인 예이다. 일 양태에서, 카보닐, 하이드라진 또는 복소환(질소 함유 복소환 기를 포함함)을 갖는 하나 이상의 비천연 아미노산 또는 변형된 비천연 아미노산을 제조하고 사용하는 수단(방법, 조성물, 기법)이 본원에 기재된다. 카보닐기로는 케톤 또는 알데히드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 추가 작용기(원하는 작용기를 포함하나 이에 한정되지 않음)를 포함한다. 전술한 다양한 작용기들은, 한 작용기의 구성원이 다른 작용기의 구성원으로서 분류될 수 없음을 의미하는 것은 아님에 주목해야 한다. 실제로, 특정한 상황에 따라 중복되기도 한다. 예를 들어, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜의 유도체와 그 범위가 중복되지만, 그 중복은 완전한 중복은 아니며 따라서 양쪽 작용기가 상기에 인용된다.

도 1에 도시된 바와 같이, 일 양태에서 본원에 기재된 방법, 조성물 및 기법을 이용하여 변형시키고자 하는 폴리펩티드를 선택하고 디자인하기 위한 방법이 제공된다. 신규 폴리펩티드는, 예를 들어 (다수의 폴리펩티드가 디자인, 합성, 특성 분석 및/또는 테스트되는) 고처리량 스크리닝 방법의 일부로서 또는 연구자들의 관심 여부에 따라 임의로 새롭게 디자인된다. 대안으로, 신규 폴리펩티드는 공지된 또는 부분적으로 특성 분석된 폴리펩티드의 구조에 기초하여 임의로 디자인된다. 예를 들어, 성장 호르몬 유전자 수퍼패밀리(하기 참조)는 과학계에 의한 집중 연구 대상이었고; 일 실시형태에서, 이 유전자 수퍼패밀리의 한 구성원 또는 구성원들의 구조에 기초하여 신규 폴리펩티드가 디자인된다. 치환 및/또는 변형시킬 아미노산(들)을 선택하는 원리는 본원에 별도로 기재하였다. 이용할 변형의 선택도 본원에 기재되어 있고, 실험자 또는 최종 사용자의 요구를 충족시키는 데 사용된다. 이러한 요구는 폴리펩티드의 치료 효과의 조정, 폴리펩티드의 안전성 프로필의 개선, 폴리펩티드의 약동학적, 약리학적 및/또는 약력학적 특성의 조절, 예컨대, 수용해도 및 생체이용률의 증가, 혈청 반감기의 증가, 치료 반감기의 증가, 면역원성의 조절, 생물학적 활성의 조절, 또는 순환 시간의 연장을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 이러한 변형은, 예를 들어 추가 작용기를 폴리펩티드에 제공하는 것, 태그, 표지 또는 검출 가능한 신호를 폴리펩티드로 도입하는 것, 폴리펩티드의 단리 특성을 개선하는 것, 및 전술한 변형의 임의의 조합을 포함한다.

하이드라진, 카보닐 또는 복소환(질소 함유 복소환 기를 포함함)을 포함하도록 변형되었거나 경우에 따라 변형되는 비천연 아미노산도 본원에 기재된다. 카보닐기로는 케톤 또는 알데히드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이 양태에는 이러한 비천연 아미노산을 제조하고 정제하고 특성 분석하고 사용하는 방법이 포함된다. 또 다른 양태에서, 하나 이상의 이러한 비천연 아미노산을 폴리펩티드로 도입하기 위한 방법, 수단 및 기법이 본원에 기재된다. 또한, 이 양태에는 하나 이상의 이러한 비천연 아미노산을 함유하는 이러한 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 특성 분석하고 사용하는 방법도 포함된다. 또한, 이 양태는, 적어도 부분적으로, 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제조하는 데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드(DNA 및 RNA를 포함함)를 제조하고 정제하고 특성 분석하고 사용하기 위한 조성물 및 방법이 포함된다. 또한, 이 양태에는, 적어도 부분적으로, 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제조하는 데 사용될 수 있는 그러한 올리고뉴클레오티드를 발현할 수 있는 세포를 제조하고 정제하고 특성 분석하고 사용하기 위한 조성물 및 방법이 포함된다.

따라서, 하이드라진, 카보닐 또는 복소환(질소 함유 복소환 기를 포함함)을 갖는 하나 이상의 비천연 아미노산 또는 변형된 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드가 본원에 제공되고 기재된다. 카보닐 변형 비천연 아미노산으로는 케톤 및 알데히드를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 하이드라진, 카보닐 또는 복소환(질소 함유 복소환 기를 포함함)을 갖는 하나 이상의 비천연 아미노산 또는 변형된 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 그 폴리펩티드 상의 일부 위치에서의 하나 이상의 번역 동시 변형 또는 번역 후 변형을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 카보닐 변형된 비천연 아미노산은 또한 케톤 및 알데히드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 번역 동시 변형 또는 번역 후 변형은 많은 경우 세포내 기관을 통해 일어나고(예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미테이트 부가, 인산화, 당지질 결합 변형 등), 이러한 세포내 기관에 기초한 번역 동시 변형 또는 번역 후 변형은 폴리펩티드 상의 천연 아미노산 부위에서 일어나지만, 일부 실시형태에서는, 세포내 기관에 기초한 번역 동시 변형 또는 번역 후 변형이 폴리펩티드 상의 비천연 아미노산 부위(들)에서 일어난다.

다른 실시형태에서, 번역 후 변형은 세포내 기관을 이용하지 않는 대신에, 본원에 기재된 화학적 방법 또는 특정 반응기에 적합한 다른 방법을 이용하여 제1 반응기[케톤, 알데히드, 하이드라진, 또는 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 작용기를 포함하나 이들에 한정되지 않음]를 포함하는 하나 이상의 비천연 아미노산에 제2 반응기를 포함하는 분자(원하는 작용기를 포함하나 이에 한정되지 않음)를 부착시키는 것에 의해 제공된다. 특정 실시형태에서, 번역 동시 변형 또는 번역 후 변형은 진핵 세포 또는 비진핵 세포 내에서 생체내에서 만들어진다. 특정 실시형태에서, 번역 동시 변형 또는 번역 후 변형은 세포내 기관을 이용하지 않고 시험관내에서 만들어진다. 이 양태에는 하나 이상의 이러한 번역 후 변형 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 특성 분석하고 사용하는 방법도 포함된다.

폴리펩티드의 일부인 비천연 아미노산(카보닐기, 케톤, 케토알데히드, 하이드라진 또는 이들의 보호된 형태를 포함함)과 반응하여 전술한 번역 후 변형 중 임의의 변형을 형성할 수 있는 반응제도 본원에 기재된 방법, 조성물, 수단 및 기법의 범위 내에 포함된다. 일반적으로, 생성된 번역 후 변형 비천연 아미노산은 하나 이상의 인돌 유도체를 생성한다. 일부 실시형태에서, 생성된 인돌에 기초한 변형된 비천연 아미노산은 후속 변형 반응을 거치게 된다. 이 양태에는 이러한 비천연 아미노산(들)의 임의의 그같은 번역 후 변형을 생성할 수 있는 반응제들을 제조하고 정제하고 특성 분석하고 사용하는 방법도 포함된다.

특정 실시형태에서, 상기 폴리펩티드는 한 숙주 세포에 의해 생체내에서 만들어지는 하나 이상의 번역 동시 변형 또는 번역 후 변형을 포함하는데, 여기서 상기 번역 후 변형은 다른 종류의 숙주 세포에 의해서는 정상적으로 만들어지지 않는다. 특정 실시형태에서, 상기 폴리펩티드는 진핵 세포에 의해 생체내에서 만들어지는 하나 이상의 번역 동시 변형 또는 번역 후 변형을 포함하는데, 여기서 상기 번역 동시 변형 또는 번역 후 변형은 비진핵 세포에 의해서는 정상적으로 만들어지지 않는다. 이러한 번역 동시 변형 또는 번역 후 변형의 예로는 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미테이트 부가, 인산화, 당지질 결합 변형 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 일 실시형태에서, 번역 동시 변형 또는 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라긴 결합에 의해 올리고사카라이드를 아스파라긴에 부착시키는 것을 포함한다(올리고사카라이드가 (GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc 등을 포함하는 경우를 포함하나, 이에 한정되지 않음). 또 다른 실시형태에서, 번역 동시 변형 또는 번역 후 변형은 GalNAc-세린, GalNAc-트레오닌, GlcNAc-세린, 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 세린 또는 트레오닌에 올리고사카라이드(Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함하나 이에 한정되지 않음)를 부착시키는 것을 포함한다. 분비 신호 서열의 예로는 원핵 분비 신호 서열, 진핵 분비 신호 서열, 박테리아 발현을 위해 5' 최적화된 진핵 분비 신호 서열, 새로운 분비 신호 서열, 펙테이트 리아제(pectate lyase) 분비 신호 서열, Omp A 분비 신호 서열, 및 파지 분비 신호 서열을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 분비 신호 서열의 예로는 STII(원핵), Fd GIII 및 M13(파지), Bgl2(효모), 및 트랜스포존으로부터 유도된 신호 서열 bla를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 특정 실시형태에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 분비 또는 위치 지정 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합 등을 포함할 수 있다. 이 양태에는 하나 이상의 이러한 번역 동시 변형 또는 번역 후 변형을 포함하는 폴리펩티드를 제조하고 정제하고 특성 분석하고 사용하는 방법도 포함된다. 다른 실시형태에서, 글리코실화된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 비글리코실화된 형태로 제조된다. 이러한 글리코실화된 비천연 아미노산의 비글리코실화된 형태는 경우에 따라, 단리된 또는 실질적으로 정제된 또는 정제되지 않은 글리코실화된 비천연 아미노산 폴리펩티드로부터 올리고사카라이드기를 화학적 또는 효소적으로 제거하는 방법; 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드를 글리코실화하지 못하는 숙주(상기 폴리펩티드를 글리코실화하지 못하도록 조작 또는 돌연변이된 원핵생물 또는 진핵생물을 비롯한 숙주)에서 비천연 아미노산을 제조하는 방법; 글리코실화 억제제를 세포 배양 배지 내로 도입하는 방법(여기서, 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 이 폴리펩티드를 정상적으로 글리코실화할 수 있는 진핵생물에 의해 제조됨); 또는 임의의 이러한 방법들의 조합을 포함하는 방법에 의해 제조된다. 또한, 정상적으로 글리코실화된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 이러한 비글리코실화된 형태도 본원에 기재된다("정상적으로 글리코실화된"이라 함은 천연 폴리펩티드가 글리코실화되는 조건하에 제조될 때 폴리펩티드가 글리코실화될 것임을 의미함). 물론, 정상적으로 글리코실화된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 이러한 비글리코실화된 형태는 경우에 따라 비정제된 형태, 실질적으로 정제된 형태 또는 단리된 형태이다.

대안의 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 카보닐기, 케톤, 알데히드, 하이드라진, 복소환(질소 함유 복소환 기를 포함함) 또는 이들의 보호된 형태를 포함하는 비천연 아미노산을 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상 포함한다. 상기 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있으며, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 이상의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 내에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 이상의 상이한 부위가 존재할 수 있다. 특정 실시형태에서, 단백질의 천연 형태에 존재하는 1개 이상의 (단, 전체 아미노산보다 적은 수의) 특정 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된다.

본원에 제공되고 기재된 방법 및 조성물은 카보닐기, 케톤, 알데히드, 하이드라진, 복소환(질소 함유 복소환 기를 포함함), 또는 이들의 보호된 또는 마스킹된 형태를 포함하는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 하나 이상의 비천연 아미노산이 폴리펩티드로 도입됨으로써, 20종의 일반 천연 아미노산과 반응하지 않으면서 하나 이상의 비천연 아미노산(이에 한정되지 않음)과의 특이적 화학 반응을 수반하는 접합 화학의 적용이 가능하다. 비천연 아미노산 측쇄가 도입되면, 이 측쇄는 본원에 기재되어 있는 화학 방법 또는 천연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 특정 작용기 또는 치환기에 적합한 화학 방법을 이용하여 변형시킬 수도 있다.

본원에 기재된 비천연 아미노산 방법 및 조성물은 다종 다양한 작용기, 치환기 또는 부분을 갖는 물질과 원하는 작용기성(이에 한정되지 않음)을 갖는 다른 물질과의 접합체를 제공한다.

특정 실시형태에서, 화학식 I∼XV의 화합물 및 화합물 1∼4를 비롯하여 본원에 기재된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 링커 및 반응제는 약산성 조건하의(pH 약 1∼약 6을 포함하나 이에 한정되지 않음) 수용액 중에서 안정하다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 화합물들은 약산성 조건하에서 적어도 1개월 동안 안정하다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 화합물들은 약산성 조건하에서 적어도 2주 동안 안정하다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 화합물들은 약산성 조건하에서 적어도 5일 동안 안정하다.

본원에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 수단의 또 다른 양태에서, 전술한 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드 중 임의의 폴리펩티드를 연구하거나 사용하는 방법이 제공된다. 이 양태에는, 예를 들어 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하는 폴리펩티드로부터 이익을 얻을 수 있는 치료 용도, 진단 용도, 분석에 기초한 용도, 산업적 용도, 화장품 용도, 식물 생물학적 용도, 환경적 용도, 에너지 생산 용도, 소비재 용도 및/또는 군사적 용도가 포함된다.

III. 폴리펩티드 내의 비천연 아미노산의 위치

본원에 기재된 방법 및 조성물은 하나 이상의 비천연 아미노산을 폴리펩티드로 도입하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 비천연 아미노산은 폴리펩티드의 활성을 파괴하지 않는 하나 이상의 특정 위치에 도입된다. 이것은 경우에 따라 소수성 아미노산을 비천연 또는 천연 소수성 아미노산으로, 부피가 큰(bulky) 아미노산을 부피가 큰 비천연 또는 천연 아미노산으로, 친수성 아미노산을 비천연 또는 천연 친수성 아미노산으로 치환하는 것을 포함하나 이들에 한정되지 않는 "보존적" 치환을 수행하고/하거나 비천연 아미노산을 활성에 필요하지 않은 위치에 삽입함으로써 수행한다. 이러한 치환이 본원에 기재된 비천연 아미노산에 대해서는 알려져 있지 않지만, 천연 아미노산 군에 있어서의 보존적 치환의 생성 방법은 알려져 있다. 유사한 방법을 본원에 기재된 비천연 아미노산에 임의로 이용한다.

다양한 생화학적 및 구조적 방법을 이용하여, 비천연 아미노산으로 치환시키고자 하는 폴리펩티드 내의 원하는 부위를 선별할 수 있다. 폴리펩티드 쇄의 어떠한 위치도 비천연 아미노산을 도입하기 위한 선별에 적합하고, 선별은 경우에 따라 합리적 디자인에 기초하거나 또는 임의의 또는 불특정한 소정의 목적을 위한 무작위 선별로 행해진다. 원하는 부위의 선별은 경우에 따라 효현제, 수퍼 효현제(super-agonist), 부분 효현제, 역 효현제, 길항제, 수용체 결합 조절제, 수용체 활성 조절제, 결합 파트너와의 결합 조절제, 결합 파트너 활성 조절제, 결합 파트너 입체구조 조절제, 이량체 또는 다량체 형성을 포함하나 이들에 한정되지 않는 임의의 원하는 특성 또는 활성을 갖는 비천연 아미노산 폴리펩티드(임의로 추가로 변형되거나 비변형된 상태로 남아 있는)를 생성하는 것, 천연 분자와 비교해서 활성 또는 특성을 변화시키지 않는 것, 또는 폴리펩티드의 임의의 물리적 또는 화학적 특성, 예를 들어 용해도, 응집도, 또는 안정성을 조작하는 것에 기초한다. 예를 들어, 폴리펩티드의 생물학적 활성에 요구되는 폴리펩티드 내의 위치는 포인트 돌연변이 분석, 알라닌 스캐닝 또는 동족체 스캐닝 방법을 포함하나 이들에 한정되지 않는 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 알라닌 또는 동족체 스캐닝 돌연변이 유발을 포함하나 이에 한정되지 않는 방법에 의해 생물학적 활성에 중요한 것으로 확인된 잔기들 이외의 잔기는, 폴리펩티드로부터 얻고자 하는 원하는 활성에 따라, 비천연 아미노산에 의한 치환에 우수한 후보가 된다. 대안으로, 생물학적 활성에 중요한 것으로 확인된 부위도, 역시 폴리펩티드로부터 얻고자 하는 원하는 활성에 따라 비천연 아미노산으로의 치환을 위한 우수한 후보이다. 또 다른 대안은 폴리펩티드 쇄 상의 각각의 위치에서 비천연 아미노산으로 단순히 연속적으로 치환시키고, 폴리펩티드의 활성에 대한 영향을 관찰하는 것이다. 비천연 아미노산을 임의의 폴리펩티드 내로 치환시키기 위한 위치를 선별하기 위한 임의의 수단, 기법 또는 방법이 본원에 기재된 방법, 기법 및 조성물에 사용하기에 적합하다.

또한, 결실을 포함하는 폴리펩티드의 천연 돌연변이체의 구조 및 활성을 조사하여 비천연 아미노산으로의 치환을 허용하기 쉬운 단백질의 영역을 결정할 수 있다. 비천연 아미노산으로의 치환을 허용하지 않을 것 같은 잔기가 일단 제거되면, 각각의 나머지 위치에서 제안된 치환의 영향을, 관련 폴리펩티드, 및 임의의 회합 리간드 또는 결합 단백질의 3차 구조를 포함하나 이에 한정되지 않는 방법을 이용하여 조사할 수 있다. 많은 폴리펩티드의 X선 결정학적 구조 및 NMR 구조는 큰 단백질 및 핵산 분자의 3차원 구조 데이터를 포함하는 중앙 집중형 데이터베이스(centralized database)인 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank)(PDB, www.rcsb.org)에서 이용 가능하다. 또한, 3차원 구조 데이터를 이용할 수 없는 경우, 폴리펩티드의 2차 및 3차 구조를 조사하기 위한 모델을 임의로 만들 수 있다. 따라서, 당업자는 비천연 아미노산으로 치환시킬 수 있는 아미노산 위치의 본질을 용이하게 확인할 수 있다.

비천연 아미노산의 도입을 위한 예시적인 부위는, 잠재적 수용체 결합 영역 또는 결합 단백질 또는 리간드와의 결합을 위한 영역으로부터 배제된 부위, 완전히 또는 부분적으로 용매에 노출되는 부위, 인접 잔기와의 최소한의 수소 결합 상호작용을 하거나 수소 결합 상호작용을 전혀 하지 않는 부위, 인접 반응성 잔기에 최소한으로 노출되는 부위, 및/또는 특정 폴리펩티드와 이의 회합 수용체, 리간드 또는 결합 단백질의 3차원 결정 구조에 의해 예측할 때 높은 유연성을 갖는 영역에 존재할 수 있는 부위를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.

다종 다양한 비천연 아미노산이 폴리펩티드 내의 소정의 위치에서 임의로 치환되거나 소정의 위치 내로 도입된다. 예를 들어, 폴리펩티드와 이의 회합 리간드, 수용체 및/또는 결합 단백질의 3차원 결정 구조의 조사, 보존적 치환에 대한 선호성에 기초하여 도입을 위한 특정 비천연 아미노산을 선택한다.

일 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 제1 반응기를 포함하는 비천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 도입하는 단계; 및 상기 폴리펩티드를, 제2 반응기를 포함하는 분자(원하는 작용기를 포함하나 이에 한정되지 않음)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 반응기는 카보닐 부분이고, 상기 제2 반응기는 하이드라진 부분이며, 이로써 인돌 결합이 형성된다. 특정 실시형태에서, 상기 제1 반응기는 하이드라진 부분이고, 상기 제2 반응기는 카보닐 부분이며, 이로써 인돌 결합이 형성된다.

일부 경우, 비천연 아미노산 치환(들) 또는 도입(들)은 폴리펩티드 내의 다른 부가, 치환 또는 결실과 조합되어 다른 화학적, 물리적, 약리학적 및/또는 생물학적 특징에 영향을 줄 것이다. 일부 경우, 상기 다른 부가, 치환 또는 결실은 폴리펩티드의 안정성(단백질 분해에 대한 내성을 포함하나, 이에 한정되지 않음)을 증가시키거나 그의 적절한 수용체, 리간드 및/또는 결합 단백질에 대한 폴리펩티드의 친화성을 증가시킨다. 일부 경우, 상기 다른 부가, 치환 또는 결실은 폴리펩티드의 용해도(이. 콜라이 또는 다른 숙주 세포에서 발현되는 경우를 포함하나, 이에 한정되지 않음)를 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 이. 콜라이 또는 다른 재조합 숙주 세포에서 발현된 후 폴리펩티드의 용해도를 증가시킬 목적으로 비천연 아미노산을 도입하기 위한 또 다른 부위 이외에 천연적으로 코딩된 또는 비천연 아미노산으로의 치환을 위한 부위를 선택한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 회합된 리간드, 결합 단백질 및/또는 수용체에 대한 친화성을 조절하거나, 수용체 이량체화를 조절하거나(증가시키거나 감소시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않음), 수용체 이량체를 안정화하거나, 순환 반감기를 조절하거나, 방출 또는 생체이용률을 조절하거나, 정제를 용이하게 하거나, 또는 특정한 투여 경로를 개선하거나 변경하는 또 다른 부가, 치환 또는 결실을 포함한다. 유사하게, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 검출(GFP를 포함하나, 이에 한정되지 않음), 조직 또는 세포 막을 통한 수송, 전구약물 방출 또는 활성화, 크기 축소, 정제 또는 폴리펩티드의 다른 특징을 개선하는 화학적 또는 효소 절단 서열, 프로테아제 절단 서열, 반응기, 항체 결합 도메인(FLAG 또는 폴리-His를 포함하나, 이에 한정되지 않음), 또는 친화성에 기초한 다른 서열(FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하나, 이에 한정되지 않음) 또는 연결된 분자(바이오틴을 포함하나, 이에 한정되지 않음)를 포함할 수 있다.

IV. 예로서의 성장 호르몬 수퍼유전자 패밀리

본원에 기재된 방법, 조성물, 수단 및 기법은 폴리펩티드 또는 단백질의 특정한 종류, 부류 또는 패밀리로 한정되지 않는다. 실제로, 사실상 임의의 폴리펩티드가 본원에 기재된 하나 이상의 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산을 포함하도록 임의로 디자인되거나 변형된다. 예를 들어, 폴리펩티드는 치료용 단백질과 상동성이다.

따라서, 성장 호르몬(GH) 수퍼유전자 패밀리의 하기 설명은 설명 및 예시를 위한 목적으로 제시된 것으로서 본원에 기재된 방법, 조성물, 수단 및 기법의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 또한, 본원에서 GH 폴리펩티드라고 하는 것은 GH 수퍼유전자 패밀리의 임의의 구성원의 예로서 일반 용어를 사용하기 위한 것이다. 따라서, GH 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여 본원에 기재된 변형 및 화학적 기법은 본원에 구체적으로 기재된 것들을 비롯한 GH 수퍼유전자 패밀리의 임의의 구성원에 동일하게 적용될 수 있음을 이해해야 한다.

하기 단백질들은 성장 호르몬(GH) 수퍼유전자 패밀리의 유전자에 의해 코딩되는 단백질들을 포함한다(문헌[Bazan, F., Immunology Today 11: 350-354 (1991)]; 문헌[Bazan, J. F. Science 257: 410-411 (1992)]; 문헌[Mott, H. R. and Campbell, I. D., Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)]; 문헌[Silvennoinen, O. and Ihle, J. N., SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS (1996)] 참조): 성장 호르몬, 프로락틴, 태반 락토겐, 에리스로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 인터루킨-2(IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12(p35 서브유닛), IL-13, IL-15, 온코스타틴 M, 섬모 신경영양 인자, 백혈병 억제 인자, 알파 인터페론, 베타 인터페론, 엡실론 인터페론, 감마 인터페론, 오메가 인터페론, 타우 인터페론, 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 및 카디오트로핀-1(CT-1)("GH 수퍼유전자 패밀리"). 향후, 유전자 클로닝 및 서열 분석을 통해 이 유전자 패밀리의 추가 구성원이 확인될 것으로 기대된다. GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원은, 일반적으로 제한된 아미노산 또는 DNA 서열 동일성을 갖는다는 사실에도 불구하고, 유사한 2차 및 3차 구조를 갖는다. 공유되는 구조적 특징은, 유전자 패밀리의 새로운 구성원을 용이하게 확인할 수 있게 하고, 본원에 기재된 비천연 아미노산 방법 및 조성물에 유사하게 적용된다.

G-CSF(문헌[Zink et al., FEBS Lett. 314: 435 (1992)]; 문헌[Zink et al., Biochemistry 33: 8453 (1994)]; 문헌[Hill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5167 (1993)] 참조), GM-CSF(문헌[Diederichs, K., et al. Science 154: 1779-1782 (1991)]; 문헌[Walter et al., J. Mol. Biol. 224: 1075-1085 (1992)] 참조), IL-2(문헌[Bazan, J. F. and McKay D. B., Science 257: 410-411 (1992)] 참조), IL-4(문헌[Redfield et al., Biochemistry 30: 11029-11035(1991); Powers et al., Science 256: 1673-1677 (1992)] 참조), 및 IL-5(문헌[Milburn et al., Nature 363: 172-176 (1993)] 참조)를 비롯한 다수의 사이토카인의 구조가 X선 회절 및 NMR 연구에 의해 결정되었으며, 유의적인 1차 서열 상동성이 없음에도 불구하고 GH 구조에 있어서 현저한 보존성을 보인다. IFN은 모델링 및 다른 연구에 기초할 때 이 패밀리의 구성원인 것으로 간주되고 있다(문헌[Lee et al., J. Interferon Cytokine Res. 15: 341 (1995)]; 문헌[Murgolo et al., Proteins 17: 62 (1993)]; 문헌[Radhakrishnan et al., Structure 4: 1453 (1996)]; 문헌[Klaus et al., J. Mol. Biol. 274: 661 (1997)] 참조). 섬모 신경영양 인자(CNTF), 백혈병 저해 인자(LIF), 트롬보포이에틴(TPO), 온코스타틴 M, 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF), IL-3, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-13, IL-15 및 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF)뿐만 아니라 알파, 베타, 오메가, 타우, 엡실론 및 감마 인터페론과 같은 IFN을 포함하는 상당수의 추가 사이토카인 및 성장 인자들이 이 패밀리에 속한다(문헌[Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)]; 문헌[Silvennoinen and Ihle (1996) SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS]에서 재검토됨). 현재 상기 사이토카인 및 성장 인자들 모두가 하나의 대형 유전자 패밀리를 구성하는 것으로 간주된다.

이 패밀리의 구성원은, 유사한 2차 및 3차 구조를 공유하는 것 외에도, 세포 표면 수용체를 반드시 올리고머화여 세포 내 신호 전달 경로를 활성화하는 특성을 공유한다. GH 및 EPO를 포함하나 이들에 한정되지 않는 일부 GH 패밀리 구성원은 단일 유형의 수용체에 결합하여 상기 수용체가 동종이량체를 형성하게 한다. IL-2, IL-4 및 IL-6을 포함하나 이들에 한정되지 않는 다른 패밀리 구성원은 1종 이상의 수용체에 결합하여 상기 수용체가 이종이량체 또는 보다 높은 차수의 응집체를 형성하게 한다(문헌[Davis et al., (1993), Science 260: 1805-1808]; 문헌[Paonessa et al., (1995), EMBO J. 14: 1942-1951]; 문헌[Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)] 참조). 돌연변이 유발 연구는 GH와 마찬가지로 이러한 다른 사이토카인 및 성장 인자들도 다수의 수용체 결합 부위, 전형적으로 2개의 수용체 결합 부위를 포함하고, 그들의 동족(cognate) 수용체에 순차적으로 결합한다는 것을 밝혀내었다(문헌[Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)]; 문헌[Matthews et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9471-9476] 참조). GH와 마찬가지로, 이러한 다른 패밀리 구성원에 대한 1차 수용체 결합 부위는 주로 4개의 알파 나선 및 A-B 루프에서 나타난다. 수용체 결합에 관여하는 나선 다발 내의 특정 아미노산은 상기 패밀리 구성원 사이에 서로 상이하다. GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원과 상호작용하는 세포 표면 수용체의 대부분은 구조적으로 관련되어 있고, 제2의 대형 다중 유전자 패밀리를 포함한다. 예를 들어, GH 수퍼유전자 패밀리의 설명에 관해서는 본원에서 참고로 인용하는 미국 특허 제6,608,183호를 참조할 수 있다.

GH 수퍼유전자 패밀리의 다양한 구성원의 돌연변이 연구로부터 얻은 일반적인 결론은, 알파 나선을 연결하는 루프는 일반적으로 수용체 결합에 관여하지 않는 경향이 있다는 점이다. 특히, 짧은 B-C 루프는 전부는 아니더라도 대부분의 패밀리 구성원에서 수용체 결합에 대해 필수적이지 않은 것으로 보인다. 이러한 이유로, B-C 루프는 GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원에서 본원에 기재된 비천연 아미노산으로 임의로 치환된다. 또한, A-B 루프, C-D 루프(및 GH 수퍼패밀리의 인터페론/IL-10 유사 구성원의 D-E 루프)도 비천연 아미노산으로 임의로 치환된다. 또한, 나선 A에 근접해 있으며 최종 나선에 멀리 떨어져 있는 아미노산도 수용체 결합에 관여하지 않는 경향이 있고, 또한 비천연 아미노산을 도입하기 위한 선택적 부위이기도 하다. 일부 실시형태에서, 비천연 아미노산은 A-B, B-C, C-D 또는 D-E 루프의 처음 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 그 이상의 아미노산을 포함하나 이들에 한정되지 않는 루프 구조 내의 임의의 위치에서 치환된다. 일부 실시형태에서, 비천연 아미노산은 A-B, B-C, C-D 또는 D-E 루프의 마지막 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 그 이상의 아미노산 내에서 치환된다.

EPO, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IFN, GM-CSF, TPO, IL-10, IL-12, p35, IL-13, IL-15 및 베타 인터페론을 포함하나 이들에 한정되지 않는 GH 패밀리의 특정 구성원은 N 결합 및/또는 O 결합 당을 함유한다. 단백질 내의 글리코실화 부위는 거의 루프 영역에서만 나타나고 알파 나선 다발에는 나타나지 않는다. 루프 영역은 일반적으로 수용체 결합에 관여하지 않고, 당기의 공유 결합을 위한 부위이기 때문에, 이들은 비천연 아미노산 치환을 단백질 내로 도입하기에 유용한 부위이다. 단백질에서 N 결합 글리코실화 부위 및 O 결합 글리코실화 부위를 구성하는 아미노산은 표면에 노출되기 때문에 비천연 아미노산 치환을 위한 부위이다. 따라서, 천연 단백질은 이들 부위에서 단백질에 부착되는 부피가 큰(bulky) 당기를 허용하고, 글리코실화 부위는 수용체 결합 부위로부터 떨어져 위치하는 경향이 있다.

향후, GH 유전자 패밀리의 추가 구성원이 발견될 가능성이 있다. 예측 단백질 서열의 컴퓨터 보조 2차 및 3차 구조 분석 및 특정 표적에 결합하는 분자를 확인하도록 디자인된 선별 기법에 의해 GH 수퍼유전자 패밀리의 새로운 구성원을 확인할 수 있다. GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원은 전형적으로 비나선 아미노산(루프 영역)에 의해 연결된 4개 또는 5개의 양친매성 나선을 갖는다. 일부 실시형태에서, 단백질은 이들의 N-말단에 세포로부터의 분비를 촉진하기 위한 소수성 신호 서열을 포함한다. 또한, 이러한 추후 발견될 GH 수퍼유전자 패밀리의 구성원도 본원에 기재된 방법 및 조성물 내에 포함된다.

V. 비천연 아미노산

본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용되는 비천연 아미노산은 하기 4 가지 특성 중 하나 이상의 특성을 갖는다: (1) 비천연 아미노산의 측쇄 상의 하나 이상의 작용기가 유전적으로 코딩되는 20종의 일반 아미노산(즉, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린)의 화학적 반응성에 대해 오르토고날이거나 또는 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 존재하는 천연 아미노산의 화학적 반응성에 적어도 오르토고날인 1종 이상의 특성 및/또는 활성 및/또는 반응성을 가짐; (2) 도입된 비천연 아미노산이 유전적으로 코딩된 20종의 일반 아미노산에 대해 실질적으로 화학적 비활성을 나타냄; (3) 바람직하게는 천연 아미노산과 같은 정도로 안정적으로 또는 전형적인 생리학적 조건하에서 비천연 아미노산을 폴리펩티드로 안정하게 도입할 수 있고, 더 바람직하게는 이러한 도입은 생체내 시스템을 통해 일어날 수 있음; 및 (4) 비천연 아미노산이 바람직하게는, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생물학적 특성을 파괴하지 않는 조건하에서(물론 이러한 생물학적 특성의 파괴가 변형/전환을 목적으로 한 것이 아닌 경우) 반응제와의 반응에 의해 카보닐기, 케톤기, 알데히드기, 하이드라진기, 복소환(질소 함유 복소환 기를 포함함)(인돌기를 포함함), 또는 카보닐기, 케톤기, 알데히드기, 하이드라진기, 복소환(질소 함유 복소환 기를 포함함)(인돌기를 포함함)으로 전환될 수 있는 작용기를 포함하거나, 또는 바람직하게는 이때 상기 전환은 pH 약 4∼약 6의 수성 조건하에 일어날 수 있거나, 또는 바람직하게는 비천연 아미노산 상의 반응성 부위가 친핵성 부위임. 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 비천연 아미노산에 대한 이들 4 가지 특성들을 만족시키는 아미노산의 비한정적인 예시적 예는 도 15∼18에 도시되어 있다. 임의의 수의 비천연 아미노산이 폴리펩티드로 도입될 수 있다.

도 15, 16 및 18이 치환된 탄소환 아릴 측쇄를 갖는 아미노산을 도시하고 있긴 하지만, 이러한 도면은 또한 치환된 헤테로아릴 측쇄를 개시하는 것으로 이해해야 한다. 예를 들어, 도 15의 화합물 각각은 치환된 페닐 측쇄를 가지지만, 일부 실시형태에서, 페닐기는 피리디닐기, 피리미딜기, 피라지닐기, 티오푸라닐기 또는 푸라닐기로 치환된다. 따라서, 탄소환 아릴 측쇄는 단지 본 발명의 개시내용에 포함되는 다양한 방향족 기의 예시적 예이다.

비천연 아미노산은 또한 임의로 카보닐기 또는 카보닐기로 전환될 수 있는 보호된 또는 마스킹된 기, 보호된 기의 탈보호 또는 마스킹된 기의 탈마스킹 후의 카보닐기, 하이드라진 또는 하이드라진기로 전환될 수 있는 보호된 또는 마스킹된 기를 포함한다.

본원에 기재된 방법 및 조성물에서 임의로 사용되는 비천연 아미노산으로는 광활성화 가능한 가교결합제를 포함하는 아미노산, 스핀 표지 아미노산, 형광 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속 함유 아미노산, 방사능 아미노산, 새로운 작용기를 갖는 아미노산, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 광케이징된 및/또는 광이성질체화 가능한 아미노산, 바이오틴 또는 바이오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화된 아미노산, 예컨대 당 치환된 세린, 탄수화물에 의해 변형된 다른 아미노산, 케토 함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중원자로 치환된 아미노산, 화학적으로 절단 가능한 및/또는 광절단 가능한 아미노산, 천연 아미노산에 비해 연장된 측쇄(약 5개 이상 또는 약 10개 이상의 탄소를 포함하나 이에 한정되지 않는 폴리에테르 또는 장쇄 탄화수소)를 갖는 아미노산, 탄소 결합 당 함유 아미노산, 산화환원 활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산 및 하나 이상의 독성 부분을 포함하는 아미노산을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

일부 실시형태에서, 비천연 아미노산은 사카라이드 부분을 포함한다. 이러한 아미노산의 예로는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노사미닐-L-세린이 있다. 또한, 이러한 아미노산의 예로는, 아미노산과 사카라이드 사이의 천연 N 결합 또는 0 결합이 알켄, 옥심, 티오에테르, 아미드, 복소환(질소 함유 복소환을 포함함), 카보닐 등을 포함하나 이들에 한정되지 않는, 자연에서 통상적으로 발견되지 않는 공유 결합에 의해 치환되는 예들을 포함한다. 이러한 아미노산의 예는 또한 천연 단백질에서는 통상적으로 발견되지 않는 사카라이드, 예컨대 2-데옥시-글루코스, 2-데옥시갈락토스 등이 있다.

비천연 아미노산을 폴리펩티드로 도입하는 것을 통해 폴리펩티드로 도입되는 화학적 부분은 폴리펩티드의 다양한 이점 및 조작을 제공한다. 예를 들어, 독특한 비천연 아미노산[벤조페논 및 아릴아지드(페닐아지드 측쇄를 포함하나 이에 한정되지 않음)를 포함하나 이에 한정되지 않음]은, 예를 들어 단백질의 효율적인 생체내 및 시험관내 광가교결합을 가능하게 한다. 광반응성 비천연 아미노산의 예로는 p-아지도-페닐알라닌 및 p-벤조일-페닐알라닌을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 광반응성 비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드는 광반응성 기를 제공하는 일시적 제어의 여기에 의해 임의로 광가교결합된다. 비한정적인 예로서, 비천연 아미노의 메틸기는, 핵 자기 공명 및 진동 분광분석법의 이용을 포함하나 이들에 한정되지 않는 방법에 의해 국소 구조 및 역학의 프로브로서, 동위원소로 표지된 메틸기를 포함하나 이에 한정되지 않는 기로 치환된다.

A. 비천연 아미노산의 구조 및 합성: 하이드라진기, 하이드라진 유사 기, 마스킹된 하이드라진기 및 보호된 하이드라진기

하이드라진기를 포함하는 비천연 아미노산은 다양한 카보닐기 및 카보닐기와 동등한 기와 반응하여 인돌 결합을 통해 접합체를 형성한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 하이드라진기, 하이드라진 유사 기(이것은 하이드라진기와 유사한 반응성을 지니고 하이드라진기와 구조적으로 유사함), 마스킹된 하이드라진기(이것은 하이드라진기로 쉽게 전환될 수 있음), 또는 보호된 하이드라진기(이것은 탈보호시 하이드라진기와 유사한 반응성을 지님)를 포함하는 측쇄를 갖는 비천연 아미노산이 본원에 개시된다. 이러한 아미노산으로는 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 아미노산을 들 수 있다:

상기 식에서,

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')C(NCN)N(R')-, -N(R')C(NNO₂)N(R')-, -N(R')C(NCOOR')N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

J는

이고;

R은 H, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 치환된 알키닐렌, 카보닐, 또는 치환된 카보닐이며;

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R₃과 R₄가 함께 또는 2개의 R₃ 기가 함께 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는

-A-B-J-R 기가 함께 하이드라진기, 보호된 하이드라진기 또는 마스킹된 하이드라진기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;

구조식 J에

이 존재할 경우, 이것은 J가 B 또는 R의 임의의 위치에 부착될 수 있음을 의미하는 것이다. 비한정적인 예로서, J가 하이드라진페닐 유도체인 경우, B 및 J는 이하에 예시된 것과 같이 임의로 고리 주위에 위치한다:

또한, 상기 고리는 경우에 따라 추가로 임의 치환된다는 점에 주목해야 한다. 또한, 하이드라진기에 인접한 치환기 중 적어도 하나가 수소임에 주목해야 한다. 이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태로 존재하거나, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드로 도입되고, 경우에 따라 번역 후 변형된다.

일 실시형태에서, A와 B 둘 다 결합이고, 각각의 R₃은 H이며, R₄는 H이다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂는 각각 하나 이상의 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂는 2개 이상의 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂는 각각 3개 이상의 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂는 각각 4개 이상의 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂는 각각 5개 이상의 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂는 각각 6개 이상의 아미노산이다.

특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 약산성 조건하에 수용액 중에서 적어도 1개월 동안 안정하다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 약산성 조건하에 수용액 중에서 적어도 2주 동안 안정하다. 특정 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 약산성 조건하에 수용액 중에서 적어도 5일 동안 안정하다. 특정 실시형태에서, 이러한 산성 조건은 pH가 약 2∼약 8이다.

또한, 하기 화학식 (II)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:

상기 식에서,

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, =N-O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

R₃ 및 R₄는 독립적으로 수소로 구성된 군에서, 또는 하기 화학식:

으로 표시되는 아민 보호기를 포함하나 이에 한정되지 않는 아민 보호기로부터 선택되고;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, CN, NO₂, -N(R')₂, -C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택된다.

이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태로 존재하거나, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드로 도입되고, 경우에 따라 번역 후 변형된다.

일 실시형태에서, A와 B 둘 다 결합이다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂는 각각 하나 이상의 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂는 각각 2개 이상의 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂는 각각 3개 이상의 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂는 각각 4개 이상의 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂는 각각 5개 이상의 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, R₁ 및 R₂는 각각 6개 이상의 아미노산이다.

또한, 하기 화학식 (III)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:

상기 식에서,

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-, -N(R')-, -S-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

으로 표시되는 아민 보호기를 포함하나 이에 한정되지 않는 아민 보호기로부터 선택되며;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택되고;

n은 0∼8이다.

이러한 비천연 아미노산은 염의 형태로 존재할 수 있거나, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드로 도입될 수 있으며, 경우에 따라 번역 후 변형될 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 하기 구조를 갖는 화학식 (II)의 화합물이 제공된다:

상기 식에서, n은 0, 1, 2, 3, 또는 4이고; m은 0, 1, 2, 3 또는 4이고; 단, n+m은 1, 2, 3, 4 또는 5이며; X₁ 및 X₂는 독립적으로 결합, O, 또는 NH이고; y는 0 또는 1이다.

또한, 하기 아미노산이 포함된다:

여기서, 이러한 화합물은 경우에 따라 아미노 보호된 형태 및 카복실 보호된 형태, 또는 이의 염이거나, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드로 도입될 수 있으며, 경우에 따라 번역 후 변형될 수 있다.

또한, 하기 화학식 (IV)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:

상기 식에서,

또한, 하기 아미노산이 포함된다:

여기서, 이러한 화합물은 경우에 따라 아미노 보호된 형태, 경우에 따라 카복실 보호된 형태, 경우에 따라 아미노 보호 및 카복실 보호된 형태, 또는 이의 염이거나, 경우에 따라 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드로 도입되며, 경우에 따라 번역 후 변형된다.

B. 비천연 아미노산의 구조 및 합성: 카보닐기, 카보닐 유사 기, 마스킹된 카보닐기 및 보호된 카보닐기

친전자성 반응기를 갖는 아미노산은 친핵성 첨가 반응을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 화학 반응을 통해 분자를 결합시키는 다양한 반응을 가능하게 한다. 이러한 친전자성 반응기로는 카보닐기(케토기 또는 알데히드기를 포함함), 카보닐 유사 기(이것은 카보닐기와 유사한 반응성을 지니고 카보닐기와 구조적으로 유사함), 마스킹된 카보닐기(이것은 카보닐기로 쉽게 전환될 수 있음), 또는 보호된 카보닐기(이것은 탈보호시 카보닐기와 유사한 반응성을 지님)를 들 수 있다. 이러한 아미노산은 하기 화학식 (V)의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:

상기 식에서,

A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이고;

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

J는

이고;

R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이고;

각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 또는 보호기이거나, 또는 1개보다 많은 R" 기가 존재할 경우, 2개의 R"이 임의로 헤테로시클로알킬을 형성하며;

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R₃과 R₄, 또는 2개의 R₃ 기가 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는

-A-B-J-R 기가 함께 디카보닐기, 보호된 디카보닐기를 비롯한 보호된 카보닐기, 또는 마스킹된 디카보닐기를 비롯한 마스킹된 카보닐기를 비롯한 하나 이상의 카보닐기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는

-J-R 기가 함께 디카보닐기, 보호된 디카보닐기를 비롯한 보호된 카보닐기, 또는 마스킹된 디카보닐기를 비롯한 마스킹된 카보닐기를 비롯한 하나 이상의 카보닐기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;

단, A는 페닐렌이고 각각의 R₃이 H인 경우, B는 존재하고; A가 -(CH₂)₄이고 각각의 R₃이 H인 경우, B는 -NHC(O)(CH₂CH₂)-가 아니며; A와 B가 존재하지 않고 각각의 R₃이 H인 경우, R은 메틸이 아니다.

이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태로 존재하거나, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드로 도입되며, 경우에 따라 번역 후 변형된다.

특정 실시형태에서, 화학식 (V)의 화합물은 약산성 조건하에 수용액 중에서 적어도 1개월 동안 안정하다. 특정 실시형태에서, 화학식 (V)의 화합물은 약산성 조건하에 수용액 중에서 적어도 2주 동안 안정하다. 특정 실시형태에서, 화학식 (V)의 화합물은 약산성 조건하에 수용액 중에서 적어도 5일 동안 안정하다. 특정 실시형태에서, 이러한 산성 조건은 pH가 약 2∼약 8이다.

화학식 (V)의 화합물의 특정 실시형태에서, B는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 또는 -S(O)₂(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-이다. 화학식 (I)의 화합물의 특정 실시형태에서, B는 -O(CH₂)-, -CH=N-, -CH=N-NH-, -NHCH₂-, -NHCO-, -C(O)-, -C(O)-(CH₂)-, -CONH-(CH₂)-, -SCH₂-, -S(=O)CH₂-, 또는 -S(O)₂CH₂-이다. 화학식 (V)의 화합물의 특정 실시형태에서, R은 C_1-6 알킬 또는 시클로알킬이다. 화학식 (V)의 화합물의 특정 실시형태에서, R은 -CH₃, -CH(CH₃)₂, 또는 시클로프로필이다. 화학식 (V)의 화합물의 특정 실시형태에서, R₁은 H, tert-부틸옥시카보닐(Boc), 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), N-아세틸, 테트라플루오로아세틸(TFA), 또는 벤조일옥시카보닐(Cbz)이다. 화학식 (V)의 화합물의 특정 실시형태에서, R₁은 수지, 하나 이상의 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 (V)의 화합물의 특정 실시형태에서, R₂는 OH, O-메틸, O-에틸, 또는 O-t-부틸이다. 화학식 (V)의 화합물의 특정 실시형태에서, R₂는 수지, 하나 이상의 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 (V)의 화합물의 특정 실시형태에서, R₂는 폴리뉴클레오티드이다. 화학식 (V)의 화합물의 특정 실시형태에서, R₂는 리보핵산(RNA)이다. 화학식 (V)의 화합물의 특정 실시형태에서, R₂는 tRNA이다. 화학식 (V)의 화합물의 특정 실시형태에서, 상기 tRNA는 셀렉터 코돈을 특이적으로 인식한다. 화학식 (V)의 화합물의 특정 실시형태에서, 상기 셀렉터 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 독특한 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5 염기 코돈 및 4 염기 코돈으로 구성된 군에서 선택된다. 화학식 (V)의 화합물의 특정 실시형태에서, R₂는 서프레서 tRNA이다.

화학식 (V)의 화합물의 특정 실시형태에서,

은 하기 (i)∼(iv)로 구성된 군에서 선택된다:

(i) A는 치환된 저급 알킬렌, C₄-아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이고;

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)₂N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)₂N(R')-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N-, -N(R')C(NCN)N(R')-, -N(R')C(NN0₂)N(R')-, -N(R')C(NCOOR')N(R')- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 2가 링커임;

(ii) A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 치환된 저급 알킬렌, C₄-아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이고;

B는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -N(R')-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(S)-, -S(O)N(R'), -S(O)₂N(R'), -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)N(R')-, -N(R')S(O)₂N(R')-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N-, -N(R')C(NCN)N(R')-, -N(R')C(NN0₂)N(R')-, -N(R')C(NCOOR')N(R')- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 2가 링커임;

(iii) A는 저급 알킬렌이고;

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 구성된 군에서 선택되는 2가 링커임, 및

(iv) A는 페닐렌이고;

B는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 구성된 군에서 선택되는 2가 링커이며;

J는

이고;

각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;

R₁은 임의적인 것으로서, 존재할 경우, H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;

R₂는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이며;

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이고;

R'은 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이거나; 또는

-A-B-J-R 기가 함께 하나 이상의 카보닐을 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성함.

또한, 화학식 (VI)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:

상기 식에서,

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(S)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')S(O)_kNR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N-, -N(R')C(NCN)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(NNO₂)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(NCOOR')NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌) 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

단, A가 페닐렌인 경우, B는 존재하고; A가 -(CH₂)₄-인 경우, B는 -NHC(O)(CH₂CH₂)-가 아니며; A와 B가 존재하지 않는 경우, R은 메틸이 아니다. 이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태로 존재하거나, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드로 도입되고, 경우에 따라 번역 후 변형된다.

또한, 화학식 (VII)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:

상기 식에서,

B는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_kN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(S)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')S(O)_kNR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N-, -N(R')C(NCN)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(NNO₂)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(NCOOR')NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌) 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이며;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, NO₂, CN, -N(R')₂, -C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택되거나; 2개 이상의 R_a가 함께 복소환, 헤테로아릴 또는 아릴을 형성한다. 이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태로 존재하거나, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드로 도입되고, 경우에 따라 번역 후 변형된다.

또한, 하기 아미노산이 포함된다:

또한, 하기 화학식 (VIII)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:

상기 식에서,

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(S)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')S(O)_kNR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N-, -N(R')C(NCN)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(NNO₂)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(NCOOR')NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌) 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

R₂은 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이며;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, CN, NO₂, -N(R')₂, -C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며; n은 O∼8이고;

단, A가 -(CH₂)₄-인 경우, B는 -NHC(O)(CH₂CH₂)-가 아니다. 이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 염의 형태로 존재하거나, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드로 도입되고, 경우에 따라 번역 후 변형된다.

또한, 하기 아미노산이 포함된다:

여기서, 이러한 화합물들은 경우에 따라 아미노 보호된 형태, 경우에 따라 카복실 보호된 형태, 경우에 따라 아미노 보호 및 카보닐 보호된 형태, 또는 이의 염이거나, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드로 도입되며, 경우에 따라 번역 후 변형된다.

또한, 하기 화학식 (IX)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:

상기 식에서,

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(S)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')S(O)_kNR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N-, -N(R')C(NCN)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(NN0₂)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(NCOOR')NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌) 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

Y 및 Z는 독립적으로 -OH, 알킬 치환된 산소, -SH 또는 알킬 치환된 황으로 구성된 군에서 선택되고, Y 및 Z는 함께 시클로알킬 고리를 형성할 수 있다.

또한, 하기 화학식 (X)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:

상기 식에서,

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(S)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')S(O)_kNR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N-, -N(R')C(NCN)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(NNO₂)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(NCOOR')NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌) 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, CN, NO₂, -N(R')₂, -C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택되거나; 또는 2개 이상의 R_a가 함께 복소환, 헤테로아릴 또는 아릴을 형성하고;

Y 및 Z는 독립적으로 -OH, 알킬 치환된 산소, -SH 또는 알킬 치환된 황으로 구성된 군에서 선택되고, Y와 Z는 함께 시클로알킬 고리를 형성할 수 있다.

또한, 하기 아미노산이 포함된다:

여기서, 이러한 화합물들은 경우에 따라 아미노 보호된 형태, 경우에 따라 카복실 보호된 형태, 경우에 따라 아미노 보호 및 카복실 보호된 형태, 또는 이의 염이거나, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드로 도입되며, 경우에 따라 번역 후 변형된다.

또한, 하기 화학식 (XI)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:

상기 식에서,

Y는 독립적으로 OR", NR"R", NC(O)R"(여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택된다.

또한, 하기 아미노산이 포함된다:

또한, 하기 화학식 (XII)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:

상기 식에서,

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, CN, NO₂, -N(R')₂, -C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택되거나; 또는 2개 이상의 R_a가 함께 복소환, 헤테로아릴 또는 아릴을 형성하며;

R₃ 및 R₄는 독립적으로 H, 할로겐, CN, NO₂, 알킬, 치환된 알킬, N(R')₂, C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택되고;

X는 C, N, O, S이고; 단, X가 O 또는 S인 경우, R₄는 H, 할로겐, CN, NO₂, 알킬, 치환된 알킬, N(R')₂, C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임)일 수 없으며, n은 0, 1 또는 2이다.

또한, 하기 아미노산이 포함된다:

또한, 하기 화학식 (XIII)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:

상기 식에서, B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(S)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')S(O)_kNR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N-, -N(R')C(NCN)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(NNO₂)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(NCOOR')NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌) 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며; n은 O∼8이고,

Y 및 Z는 독립적으로 -OH, 알킬 치환된 산소, -SH 또는 알킬 치환된 황으로 구성된 군에서 선택되고, Y와 Z가 함께 시클로알킬 고리를 형성할 수 있다.

또한, 하기 아미노산이 포함된다:

또한, 하기 화학식 (XIV)의 구조를 갖는 아미노산이 포함된다:

상기 식에서,

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(S)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')S(O)_kNR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N-, -N(R')C(NCN)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(NNO₂)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(NCOOR')NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌) 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며; n은 0∼8이고;

Y는 독립적으로 OR", NR"R", NC(O)R"으로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬이다.

또한, 하기 아미노산이 포함된다:

C. 인돌릴 작용기를 포함하는 비천연 아미노산

인돌기를 포함하는 비천연 아미노산은, 하이드라진을 포함하는 비천연 아미노산과 카보닐기를 포함하는 반응제를 반응시키거나 카보닐기를 포함하는 비천연 아미노산과 하이드라진기를 포함하는 반응제를 반응시킴으로써 제조한다. 이 반응을 피셔 인돌 합성(Fisher indole synthesis)이라 부른다. 이 반응은 통상적으로 강산 및/또는 금속 이온 촉진제 존재하에 매우 혹독한 조건에서 또는 유기 용매 중에서 환류하에 수행된다. 도 2는 아릴하이드라진과 카보닐화합물 사이의 아릴하이드라존 중간체를 형성하는 단계, 그 후 [3,3] 시그마 결합 자리옮김 반응을 수행하고 암모니아를 제거한 후 인돌 생성물을 형성하는 단계를 포함하는 상기 반응의 메커니즘을 도시한다.

일 실시형태에서, 카보닐과 아릴하이드라진 사이의 반응은 실온에서 수성 완충액 중에서 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 카보닐과 아릴하이드라진 사이의 반응은 pH 약 1∼약 6 및 약 2∼약 4에서 수행된다. 또한, 예를 들어 상이한 pH에서 하이드라존 중간체 형성 및 자리옮김 단계를 수행하여 인돌을 형성함으로써 상기 반응을 촉진시킨다. 일 실시형태에서, 하이드라존 중간체는 pH 5에서 형성된다. 또 다른 실시형태에서, 상기 자리옮김 반응은 pH 1에서 수행된다. 도 3∼6과 8∼11은 pH가 피셔 인돌 합성에 미치는 영향을 예시한다.

특정 실시형태에서, 인돌 생성물의 형성 속도를 촉진하기 위해 금속 이온이 사용된다. 도 12는 인돌 생성물의 형성 속도에 촉진 효과를 나타내는 금속 이온의 비한정적인 예를 도시한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 반응계 중의 유기 용매의 양은 인돌 생성물의 형성 속도에 영향을 미친다. 도 14는 용매가 인돌 생성물의 형성 속도에 미치는 영향을 도시한다.

이 반응에 사용되는 반응제는 임의로 원하는 작용기에 추가로 연결된다. 일부 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 폴리펩티드로 도입되며, 적절한 반응제와 반응할 경우 상기 폴리펩티드와 소정의 분자 사이에 접합체가 형성된다.

그러한 아미노산은 하기 화학식 (XV)의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:

상기 식에서,

J는

이고;

R₃ 및 R₄은 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R₃과 R₄, 또는 2개의 R₃ 기가 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하고;

각각의 R₅는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")₂, CN, NO₂, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)₂R", 또는 -C(O)N(R")₂이고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, L-Y이거나, 또는 1개보다 많은 R" 기가 존재할 경우, 2개의 R"이 임의로 헤테로시클로알킬을 형성하며;

1개보다 많은 R₅ 기가 존재할 경우, 2개의 R₅가 임의로 헤테로시클로알킬 또는 방향족 헤테로시클로알킬을 형성하고;

여기서, 구조식 1, 2, 3 및 4에 있어서 결합된 R_a 기를 갖는 각각의 고리는 0개, 1개 또는 2개의 R_a 기를 포함할 수 있고, 각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택되거나; 또는 1개보다 많은 R_a 기가 존재할 경우, 2개의 R_a가 임의로 아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;

Y는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 세포 독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트제; 보조 인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물학적 물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속 함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선에 의해 여기 가능한 부분; 리간드; 광이성질체화 가능한 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적으로 절단 가능한 기; 광절단 가능한 기; 연장된 측쇄; 탄소 결합된 당; 산화환원 활성 물질; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지 부분; 생물물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성 물질(이 경우, 생물학적 활성 물질은 치료 활성을 갖는 물질을 포함할 수 있고, 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 변형된 비천연 아미노산은 치료제가 결합되어 있는 보조 치료제로서 또는 치료제를 유기체 내의 원하는 부위로 전달하기 위한 수단으로서 사용될 수 있음); 검출 가능한 표지; 소분자; 억제성 리보핵산; 방사성 뉴클레오티드; 중성자 포획제; 바이오틴의 유도체; 양자점(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체 효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르기원; 안지오스타틴; 안티호르몬; 항산화제; 압타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 벡터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 역 미셀; 및 이들의 임의의 조합 중에서 선택되고;

L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)_k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택되는 링커이거나; 또는

-A-B-J- 기가 함께 인돌 부분을 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성한다

일 실시형태에서, Y는 수용성 중합체; 폴리알킬렌 옥시드; 폴리에틸렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 하나 이상의 아미노산; 하나 이상의 당기; 하나 이상의 뉴클레오티드; 하나 이상의 뉴클레오시드; 리간드; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 검출 가능한 표지; 및 이들의 임의의 조합 중에서 선택된다.

또 다른 실시형태에서, 하기 구조식 1∼4로 표시되는 화합물, 또는 이의 활성 대사물질, 염, 또는 약학적으로 허용되는 전구약물 또는 용매화물이 제공된다:

상기 식에서,

또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, A가 결합, 치환된 또는 비치환된 저급 알킬렌, 또는 페닐렌, 피리디닐렌, 피리미디닐렌 또는 티오페닐렌으로 구성된 군에서 선택되는 비치환된 또는 치환된 아릴렌인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, A가 결합인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, A가 치환된 또는 비치환된 저급 헤테로알킬렌인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, A가 페닐렌인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, A가 치환된 저급 헤테로알킬렌이고, 이때 치환기가 단일 =0 기인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, A가 치환된 저급 알킬렌이고, 이때 치환기가 단일 =0 기인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, B가 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R")CO-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 또는 -S(O)₂(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, B가 결합인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, B가 -O(CH₂)-, -NHCH₂-, -NHCO-, -C(O)-, -C(O)-(CH₂)-, -CONH-(CH₂)-, -SCH₂-, -S(=O)CH₂-, 또는 -S(O)₂CH₂-인 화합물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, R₅가 -OH, -NH₂, 또는 NO₂인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, R₁이 H, tert-부틸옥시카보닐(Boc), 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), N-아세틸, 테트라플루오로아세틸(TFA), 또는 벤질옥시카보닐(Cbz)인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, R₁이 수지, 하나 이상의 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, R₂가 OH, O-메틸, O-에틸, 또는 O-t-부틸인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, R₂가 수지, 하나 이상의 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, R₂가 폴리뉴클레오티드인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, R₂가 리보핵산(RNA)인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, R₂가 tRNA인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, 상기 tRNA가 셀렉터 코돈을 특이적으로 인식하는 것인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, 상기 셀렉터 코돈이 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 독특한 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5 염기 코돈 및 4 염기 코돈으로 구성된 군에서 선택되는 것인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, R₂가 서프레서 tRNA인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, X가 펩티드, 단백질, 효소, 항체, 약물, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 세포, 바이러스, 리포솜, 마이크로입자 및 미셀로 구성된 군에서 선택되는 생물학적 활성 물질인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, X가 항생제, 살진균제, 항바이러스제, 항염증제, 항종양제, 심혈관제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자 및 스테로이드제로 구성된 군에서 선택되는 약물인 화합물이 포함된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, X가 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제 및 글루코스 옥시다제로 구성된 군에서 선택되는 효소인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, X가 형광성 부분, 인광성 부분, 화학발광성 부분, 킬레이팅 부분, 전자 밀집 부분, 자성 부분, 인터칼레이팅 부분, 방사능 부분, 발색 부분 및 에너지 전달 부분으로 구성된 군에서 선택되는 검출 가능한 표지인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, X가 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 또는 치환된 아랄킬인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, 상기 중합체가 폴리알킬렌 옥시드 또는 치환된 폴리알킬렌 옥시드인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, 상기 중합체가 -[(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-(수소, 알킬, 또는 치환된 알킬)]_x(여기서, x는 20∼10,000임)를 포함하는 것인 화합물이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 화합물로서, 상기 중합체가 분자량 약 2 kDa∼약 40 kDa의 m-PEG인 화합물이 제공된다. 특정 실시형태에서, 화학식 (XV)의 화합물은 약산성 조건하에 수용액 중에서 적어도 1개월 동안 안정하다. 특정 실시형태에서, 화학식 (XV)의 화합물은 약산성 조건하에 수용액 중에서 적어도 2주 동안 안정하다. 특정 실시형태에서, 화학식 (XV)의 화합물은 약산성 조건하에 수용액 중에서 적어도 5일 동안 안정하다. 특정 실시형태에서, 이러한 산성 조건은 pH가 약 2∼약 8이다.

이러한 아미노산의 비한정적인 예로는 하기 구조를 갖는 아미노산, 또는 이의 염, 이 화합물이 임의의 위치에 도입된 폴리펩티드를 포함한다:

일부 실시형태에서, 하기 구조식 5∼8의 화합물이 추가로 제공된다:

상기 식에서,

여기서, 구조식 5, 6, 7 및 8에 있어서 결합된 R_a 기를 갖는 각각의 고리는 0개, 1개 또는 2개의 R_a 기를 포함할 수 있고, 각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택되거나, 1개보다 많은 R_a 기가 존재할 경우, 2개의 R_a 기가 임의로 아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성한다.

또 다른 실시형태에서, 하기 구조식 9∼12의 화합물이 제공된다:

상기 식에서,

n은 0, 1, 2, 3 또는 4이고; m은 0, 1, 2, 3 또는 4이고; 단, n+m은 1, 2, 3, 4 또는 5이며; X₁ 및 X₂는 독립적으로 결합, O, 또는 NH이고; y는 0 또는 1이다.

또 다른 실시형태에서, 하기 화합물, 또는 이의 염, 또는 이 화합물 중 임의의 것이 임의의 위치에 도입된 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 화합물이 제공된다:

C. 비천연 아미노산의 세포내 흡수

진핵 세포에 의한 비천연 아미노산 흡수는 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위한 목적을 포함하나 이에 한정되지 않는 목적을 위해 비천연 아미노산을 디자인하고 선별할 때 일반적으로 고려되는 문제 중 하나이다. 예를 들어, α-아미노산의 높은 전하 밀도는 이러한 화합물들이 세포를 잘 투과하지 못할 수 있음을 시사한다. 천연 아미노산은 단백질에 기초한 수송 시스템의 집합체를 통해 진핵 세포 내로 흡수된다. 비천연 아미노산이 존재할 경우, 어떤 비천연 아미노산이 세포에 의해 흡수되는지 평가하는 신속한 스크리닝을 수행할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 그 전체를 참고 문헌으로 포함하는 미국 특허 공보 제2004/198637호(발명의 명칭: "Protein Arrays"); 및 문헌[Liu, D. R. & Schultz, P. G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96: 4780-4785]에서의 독성 분석을 참조할 수 있다. 흡수는 다양한 분석법을 이용하여 용이하게 분석할 수 있지만, 세포내 흡수 경로에 알맞도록 비천연 아미노산을 디자인하는 것에 대한 대안은 생체내에서 아미노산을 생성하는 생합성 경로를 제공하는 것이다.

일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이 세포내 흡수를 통해 제조된 비천연 아미노산은, 효율적인 단백질 생합성에 충분하지만, 다른 아미노산의 농도에 영향을 주거나 세포내 자원을 고갈시키는 정도까지는 아닌 농도(천연 세포내 함량을 포함하나 이에 한정되지 않음)로 제조된다. 이러한 방식으로 제조되는 전형적인 농도는 약 10 mM∼약 0.05 mM이다.

D. 비천연 아미노산의 생합성

세포 내에는, 아미노산 및 다른 화합물을 제조하는 많은 생합성 경로들이 이미 존재한다. 특정 비천연 아미노산에 대한 생합성 방법이 자연계(세포를 포함하나 이에 한정되지 않음)에 존재하지 않을 수도 있지만, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 이러한 방법을 제공한다. 예를 들어, 비천연 아미노산의 생합성 경로는 숙주 세포 내에서 임의로 새로운 효소의 첨가 또는 기존의 숙주 세포 경로의 변경에 의해 형성된다. 추가적인 새로운 효소로는 천연 효소 또는 인위적 조작 효소를 들 수 있다. 예를 들어, p-아미노페닐알라닌의 생합성[WO 2002/085923호(발명의 명칭: "In vivo incorporation of unnatural amino acids")에서 예로서 제시됨]은 다른 유기체 유래의 공지된 효소의 조합물을 첨가하는 것에 의존한다. 이들 효소에 대한 유전자는 이 유전자를 포함하는 플라스미드로 세포를 형질전환시킴으로써 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 유전자가 세포 내에서 발현될 경우, 이것은 목적 화합물을 합성할 수 있는 효소 경로를 제공한다. 임의로 첨가되는 효소 종류의 예는 본원에 제공된다. 추가적인 효소 서열은, 예를 들어, 진뱅크(GenBank)에서 찾을 수 있다. 인위적 조작 효소도 동일한 방식으로 세포 내로 첨가될 수 있다. 이러한 방식으로, 세포내 기관 및 세포내 자원을 조작하여 비천연 아미노산을 생산한다.

생합성 경로에서의 사용 또는 기존 경로의 진화를 위해 새로운 효소를 제조하기 위한 다양한 방법들이 이용 가능하다. 예를 들어, Maxygen, Inc.(www.maxygen.com에서 입수 가능함)에 의해 개발된 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 반복적 재조합법을 이용하여 새로운 효소 및 경로를 개발할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370 (4): 389-391]; 및 문헌[Stemmer (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91: 10747-10751]을 참조할 수 있다. 유사하게, Genencor(www.genencor.com에서 입수 가능함)에 의해 개발된 DesignPath^TM는 경우에 따라 세포 내에서 비천연 아미노산을 생성하기 위한 경로를 조작하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 대사 경로 조작에 사용된다. 이러한 기법은 기능 유전체학 및 분자의 진화 및 디자인을 통해 확인된 것을 포함하나 이들에 한정되지 않는 신규 유전자의 조합을 사용하여 숙주 유기체 내에서 기존 경로를 재구성한다. 또한, Diversa Corporation(www.diversa.com에서 입수 가능함)도 유전자 및 유전자 경로의 라이브러리의 신속한 스크리닝을 위한 기법(비천연 아미노산을 생합성에 의해 제조하기 위한 새로운 경로를 찾는 것을 포함하나 이에 한정되지 않음)을 제공한다.

일반적으로, 본원에 기재된 조작된 생합성 경로를 통해 제조된 비천연 아미노산은, 효율적인 단백질 생합성에 충분하지만, 다른 아미노산의 농도에 영향을 주거나 세포내 자원을 고갈시키는 정도까지는 아닌 농도(천연 세포내 함량을 포함하나 이에 한정되지 않음)로 제조된다. 이러한 방식으로 제조되는 전형적인 농도는 약 10 mM∼약 0.05 mM이다. 특정 경로에 필요한 효소를 생성하는 데 이용되는 유전자를 포함하는 플라스미드로 세포를 형질전환시키고, 비천연 아미노산이 생성되면, 경우에 따라, 리보솜의 단백질 합성 및 세포 성장 양쪽에 대해 비천연 아미노산의 생산이 더 최적화되도록 생체내 선별을 이용한다.

E. 추가 합성 방법

본원에 기재된 비천연 아미노산은 경우에 따라 공지된 방법을 이용하거나, 본원에 기재된 기법을 이용하거나, 이들을 병용함으로써 합성한다. 보조적으로, 하기 표는 원하는 작용기를 생성하도록 임의로 조합된 다양한 출발 친전자체 및 친핵체를 제공한다. 제공된 정보는 설명을 위한 것으로서 본원에 기재된 합성 기법을 한정하고자 하는 것이 아니다.

[표 1] 공유 결합 및 이의 전구체의 예

공유 결합 생성물	친전자체	친핵체
카복스아미드	활성화된 에스테르	아민/아닐린
카복스아미드	아실 아지드	아민/아닐린
카복스아미드	아실 할라이드	아민/아닐린
에스테르	아실 할라이드	알코올/페놀
에스테르	아실 니트릴	알코올/페놀
카복스아미드	아실 니트릴	아민/아닐린
이민	알데히드	아민/아닐린
하이드라존	알데히드 또는 케톤	하이드라진
옥심	알데히드 또는 케톤	하이드록실아민
알킬 아민	알킬 할라이드	아민/아닐린
에스테르	알킬 할라이드	카복실산
티오에테르	알킬 할라이드	티올
에테르	알킬 할라이드	알코올/페놀
티오에테르	알킬 설포네이트	티올
에스테르	알킬 설포네이트	카복실산
에테르	알킬 설포네이트	알코올/페놀
에스테르	무수물	알코올/페놀
카복스아미드	무수물	아민/아닐린
티오페놀	아릴 할라이드	티올
아릴 아민	아릴 할라이드	아민
티오에테르	아진딘	티올
보로네이트 에스테르	보로네이트	글리콜
카복스아미드	카복실산	아민/아닐린
에스테르	카복실산	알코올
하이드라진	하이드라지드	카복실산
N-아실우레아 또는 무수물	카보디이미드	카복실산
에스테르	디아조알칸	카복실산
티오에테르	에폭시드	티올
티오에테르	할로아세트아미드	티올
암모트리아진	할로트리아진	아민/아닐린
트리아지닐 에테르	할로트리아진	알코올/페놀
아미딘	이미도 에스테르	아민/아닐린
우레아	이소시아네이트	아민/아닐린
우레탄	이소시아네이트	알코올/페놀
티오우레아	이소티오시아네이트	아민/아닐린
티오에테르	말레이미드	티올
포스파이트 에스테르	포스포아미다이트	알코올
실릴 에테르	실릴 할라이드	알코올
알킬 아민	설포네이트 에스테르	아민/아닐린
티오에테르	설포네이트 에스테르	티올
에스테르	설포네이트 에스테르	카복실산
에테르	설포네이트 에스테르	알코올
설폰아미드	설포닐 할라이드	아민/아닐린
설포네이트 에스테르	설포닐 할라이드	페놀/알코올

일반적으로, 탄소 친전자체는 탄소 친핵체를 비롯한 상보적 친핵체에 의해 공격받기 쉬운데, 이때 공격 친핵체는 친핵체와 탄소 친전자체 사이에 새로운 결합을 형성하도록 탄소 친전자체에 전자쌍을 제공한다.

탄소 친핵체의 비한정적인 예로는 알킬, 알케닐, 아릴 및 알키닐 그리냐르, 유기 리튬, 유기 아연, 알킬-, 알케닐-, 아릴- 및 알키닐-주석 시약(유기 스타난), 알킬-, 알케닐-, 아릴- 및 알키닐-보란 시약(유기 보란 및 유기 보로네이트)을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않으며; 이러한 탄소 친핵체들은 물 또는 극성 유기 용매 중에서 역학적으로 안정하다는 장점을 갖는다. 다른 탄소 친핵체의 비한정적인 예로는 인 일리드, 에놀 및 에놀레이트 시약을 들 수 있고; 이러한 탄소 친핵체들은 전구체들로부터 비교적 용이하게 생성된다는 장점을 갖는다. 탄소 친핵체는 탄소 친전자체와 함께 사용될 경우 탄소 친핵체와 탄소 친전자체 사이에 새로운 탄소-탄소 결합을 생성한다.

탄소 친전자체에의 커플링에 적합한 비탄소 친핵체로의 비한정적인 예로는 1차 및 2차 아민, 티올, 티올레이트 및 티오에테르, 알코올, 알콕시드, 아지드, 세미카바자이드 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 비탄소 친핵체들은 탄소 친전자체들과 함께 사용될 경우 일반적으로 헤테로원자 결합(C-X-C)을 생성하며, 이때 X는 산소, 황 또는 질소를 포함하나 이에 한정되지 않는 헤테로원자이다.

일 실시형태에서, 하기 화학식 (II)의 화합물과 카보닐 함유 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

상기 식에서,

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 한쪽 말단이 인돌 함유 부분에 연결된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, =N-O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, CN, NO₂, -N(R')₂, -C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택되고;

R₃ 및 R₄는 독립적으로 수소 또는 아민 보호기(하기 화학식의 기를 포함하나 이에 한정되지 않음)이다:

또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, A가 치환된 또는 비치환된 저급 알킬렌, 또는 페닐렌, 피리디닐렌, 피리미디닐렌 또는 티오페닐렌으로 구성된 군에서 선택되는 비치환된 또는 치환된 아릴렌인 제조 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, A가 치환된 또는 비치환된 저급 헤테로알킬렌인 제조 방법이 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, A가 치환된 저급 헤테로알킬렌이고, 이때 치환기가 단일 =0 기인 제조 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, A가 치환된 저급 알킬렌이고, 이때 치환기가 단일 =O 기인 제조 방법이 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, B가 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R")CO-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 또는 -S(O)₂(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-이고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬인 제조 방법이 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, B가 -O(CH₂)-, -NHCH₂-, -NHCO-, -C(O)-, -C(O)-(CH₂)-, -CONH-(CH₂)-, -SCH₂-, -S(=O)CH₂-, 또는 -S(O)₂CH₂-인 제조 방법이 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, R₁이 H, tert-부틸옥시카보닐(Boc), 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc), N-아세틸, 테트라플루오로아세틸(TFA), 또는 벤질옥시카보닐(Cbz)인 제조 방법이 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, R₃ 및 R₄가 수소,

인 제조 방법이 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, R₁이 수지, 하나 이상의 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드인 제조 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, R₂가 OH, O-메틸, O-에틸, 또는 O-t-부틸인 제조 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, R₂가 수지, 하나 이상의 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드인 제조 방법이 제공된다.

일부 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, 화학식 (II)의 화합물이 하기 구조를 갖는 것인 제조 방법이 제공된다:

상기 식에서, n은 0, 1, 2, 3 또는 4이고; m은 0, 1, 2, 3 또는 4이고; 단, n+m은 1, 2, 3, 4 또는 5이며; X₁ 및 X₂는 독립적으로 결합, O, 또는 NH이고; y는 0 또는 1이다.

또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, R₂가 폴리뉴클레오티드인 제조 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, R₂가 리보핵산(RNA)인 제조 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, R₂가 tRNA인 제조 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, 상기 tRNA가 셀렉터 코돈을 특이적으로 인식하는 것인 제조 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, 상기 셀렉터 코돈이 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 독특한 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5 염기 코돈 및 4 염기 코돈으로 구성된 군에서 선택되는 것인 제조 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, R₂가 서프레서 tRNA인 제조 방법이 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 하기 화합물로 구성된 군에서 선택되는 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

일부 실시형태에서, 하기 화학식 (IV)에 해당하는 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

상기 식에서, 각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, CN, NO₂, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다.

또 다른 실시형태에서, 하기 화학식 (V)의 화합물과 하이드라진 함유 물질을 반응시키는 단계를 더 포함하는 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

상기 식에서,

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

J는

이고;

R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이며;

-A-B-J-R 기가 함께 카보닐기, 보호된 카보닐기를 비롯한 보호된 카보닐기, 또는 마스킹된 카보닐기를 비롯한 마스킹된 카보닐기를 비롯한 하나 이상의 카보닐기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는

-J-R 기가 함께 카보닐기, 보호된 카보닐기를 비롯한 보호된 카보닐기, 또는 마스킹된 카보닐기를 비롯한 마스킹된 카보닐기를 비롯한 하나 이상의 카보닐기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;

단, A가 페닐렌이고 각각의 R₃이 H인 경우, B가 존재하고; A가 -(CH₂)₄-이고 각각의 R₃이 H인 경우, B는 -NHC(O)(CH₂CH₂)-가 아니며; A와 B가 존재하지 않고 각각의 R₃이 H인 경우, R은 메틸이 아니다.

또 다른 실시형태에서, 하기 화학식 (VI)에 해당하는 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, A가 페닐렌, 피리디닐렌, 피리미디닐렌으로 구성된 군에서 선택되는 비치환된 또는 치환된 아릴렌, 또는 치환된 또는 비치환된 저급 알킬렌인 제조 방법이 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, B가 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-, -NR"-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R")CO-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 또는 -S(O)₂(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-인 제조 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, B가 -O(CH₂)-, -NHCH₂-, -NHCO-, -C(O)-, -C(O)-(CH₂)-, -CONH-(CH₂)-, -SCH₂-, -S(=O)CH₂-, 또는 -S(O)₂CH₂-인 제조 방법이 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 하기 화합물로 구성되는 군에서 선택되는 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

또 다른 실시형태에서, 하기 화학식 (VII)에 해당하는 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

상기 식에서, 각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다.

또 다른 실시형태에서, 하기 화학식 (VIII)에 해당하는 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

(VIII)

상기 식에서, R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂-, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

또 다른 실시형태에서, 하기 화학식 (IX)에 해당하는 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

상기 식에서, 각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

Y는 독립적으로 OR", NR"R", NC(O)R"으로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다.

또 다른 실시형태에서, 하기 화학식 (X)에 해당하는 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

상기 식에서,

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택되거나; 또는 1개보다 많은 R_a 기가 존재할 경우, 2개의 R_a가 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;

R₃ 및 R₄는 독립적으로 H, 할로겐, CN, NO₂, 알킬, 치환된 알킬, N(R')₂, C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

X는 C, N, 또는 S이고, 단, X가 O 또는 S인 경우, R₄는 H, 할로겐, CN, NO₂, 알킬, 치환된 알킬, N(R')₂, C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임)일 수 없으며, n은 0, 1 또는 2이다.

또 다른 실시형태에서, 화학식 (XI)에 해당하는 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

상기 식에서,

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬로 구성된 군에서 선택되고;

Y 및 Z는 독립적으로 -OH, 알킬 치환된 산소, -SH 또는 알킬 치환된 황으로 구성된 군에서 선택되며, Y와 Z가 함께 시클로알킬 고리를 형성할 수 있다.

또 다른 실시형태에서, 하기 화합물로 구성된 군에서 선택되는 구조식 1 또는 2의 제조 방법이 제공된다:

또 다른 실시형태에서, 화학식 (XII)에 해당하는 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

상기 식에서,

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(RO")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

B는 -CH=N-O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-을 더 포함하고;

n은 1, 2 또는 3이며;

Y는 독립적으로 OR", NR"R", NC(O)R"으로 구성된 군에서 선택되고, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬이다.

또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, 상기 화합물이 온화한 조건하에 수용액 중에서 카보닐 함유 물질에 대해 반응성을 나타내는 것인 제조 방법이 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, 상기 화합물과 상기 카보닐 함유 또는 보호된 카보닐 함유 물질의 반응이 하기 특징, 즉, (i) pH 범위 약 1∼약 6에서 수행되는 것; (ii) 생물학적 조건하에 안정한 인돌 결합을 생성하는 것; (iii) 부위 특이적인 것; (iv) 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않는 것; (v) 실온에서 발생하는 것; (vi) 수성 조건하에 용이하게 발생하는 것; 또는 (vii) 위치 선택적 및/또는 위치 특이적인 것 중 적어도 하나를 갖는 것인 제조 방법이 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, 상기 온화한 조건이 pH 약 1∼약 6인 제조 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, 상기 온화한 조건이 pH 약 3∼약 6인 제조 방법이 제공된다. 또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, 상기 반응이 온화한 조건하에 수용액 중에서 일어나는 것인 제조 방법이 제공된다.

또 다른 실시형태에서, 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법으로서, 화학식 (V)의 화합물과 하이드라진 함유 물질의 반응이 하기 특징, 즉, (i) pH 범위 약 1∼약 6에서 수행되는 것; (ii) 생물학적 조건하에 안정한 인돌 결합을 생성하는 것; (iii) 부위 특이적인 것; (iv) 폴리펩티드의 3차 구조를 비가역적으로 파괴하지 않는 것; (v) 실온에서 신속하게 발생하는 것; (vi) 수성 조건하에 용이하게 발생하는 것; 또는 (vii) 위치 선택적 및/또는 위치 특이적인 것 중 적어도 하나를 갖는 것인 제조 방법이 제공된다.

VI. 비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드

편의상, 본 섹션에 기재된 화합물의 형태, 특성 및 다른 특징은 개괄적으로 및/또는 구체적인 예를 들어 설명하였다. 그러나, 본 섹션에 기재된 형태, 특성 및 다른 특징은 본 섹션에 제공된 일반적인 설명 또는 구체적인 예에만 한정되는 것이 아니며, 본 섹션에 기재된 형태, 특성 및 다른 특징은 화학식 I∼XV의 범위 내에 속하는 모든 화합물과 구조식 1∼4로 표시되는 화합물(본원의 명세서, 청구의 범위 및 도면에 기재된 화학식 I∼XV 및 구조식 1∼4의 범위 내에 속하는 임의의 하위 화학식의 화합물 또는 특정 화합물을 포함함)에 동일하게 적용된다.

본원에 기재된 조성물 및 방법은 하나 이상의 비천연 아미노산을 폴리펩티드로 도입시킨다. 상기 비천연 아미노산은 경우에 따라 폴리펩티드의 임의의 말단 위치 또는 임의의 내부 위치를 비롯한 폴리펩티드 상의 임의의 위치에 존재한다. 바람직하게는, 상기 비천연 아미노산은 폴리펩티드의 활성 및/또는 3차 구조의 파괴가 비천연 아미노산을 폴리펩티드로 도입하는 목적 중 하나인 경우가 아니라면 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 활성 및/또는 3차 구조를 파괴하지 않는다. 또한, 비천연 아미노산을 폴리펩티드로 도입하는 것은, 경우에 따라, 폴리펩티드의 활성[예를 들어, 폴리펩티드의 치료 효과의 변경, 폴리펩티드의 안전성 프로필의 개선, 폴리펩티드의 약동학적, 약리학적 및/또는 약력학적 특성의 조절(예를 들어, 수용해도, 생체이용률의 증가, 혈청 반감기의 증가, 치료 반감기의 증가, 면역원성의 조절, 생물학적 활성의 조절, 또는 순환 시간의 연장), 폴리펩티드에의 추가 작용기의 제공, 태그, 표지 또는 검출 가능한 신호의 폴리펩티드 내로의 도입, 폴리펩티드의 단리 특성의 개선, 및 전술한 변형의 임의의 조합] 및/또는 3차 구조를 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 어느 정도까지 변경하지만, 상기 활성 및/또는 3차 구조를 완전히 파괴하지는 않는다. 활성 및/또는 3차 구조의 이러한 변경은 종종 이러한 도입을 수행하는 목적 중 하나이지만, 비천연 아미노산을 폴리펩티드로 도입하는 것이 경우에 따라 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 활성 및/또는 3차 구조에 거의 영향을 미치지 않기도 한다. 따라서, 비천연 아미노산 폴리펩티드, 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 이러한 폴리펩티드 및 폴리펩티드 조성물의 제조 방법, 이러한 폴리펩티드 및 폴리펩티드 조성물의 정제, 단리 및 특성 분석 방법, 및 이러한 폴리펩티드 및 폴리펩티드 조성물을 사용하는 방법은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 또한, 본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 또 다른 폴리펩티드(예를 들어, 비천연 아미노산 폴리펩티드 또는 천연 아미노산 폴리펩티드를 포함함)에 연결되기도 한다.

상기 폴리펩티드는, 예를 들어, 질병, 질환 또는 병증을 앓고 있는 사람에게 치료 효과를 제공하는 것으로 알려진 단백질인 임의의 공지된 치료용 단백질로부터 선택된다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨 이뇨 인자, 심방 나트륨 이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인 단백질-1, 단핵구 화학유인 단백질-2, 단핵구 화학유인 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, I309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피세포 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피세포 성장 인자(EGF), 상피세포 호중구 활성화 펩티드, 에리스로포이에틴(EPO), 박리 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4 나선 번들 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질 세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴투린, 호중구 억제 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 암유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴렉신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 슈퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화 인자, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), 우로텐신, VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론 수용체로부터 선택된다.

본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 생합성에 의해 또는 생합성에 의하지 않고서 제조된다. "생합성에 의해"란, 폴리뉴클레오티드, 코돈, tRNA 및 리보솜 중 적어도 하나를 이용하는 것을 포함하는, 번역 시스템(세포 또는 비세포 번역 시스템)을 이용하는 임의의 방법을 의미한다. "생합성에 의하지 않고서"란 번역 시스템을 이용하지 않는 임의의 방법을 의미하는데, 이 방법은 고체 상태(solid state) 펩티드 합성법, 고상(solid phase) 펩티드 합성법, 1종 이상의 효소를 이용하는 방법 및 1종 이상의 효소를 이용하지 않는 방법으로 더 분류될 수 있으며, 또한, 이러한 세부 분류 중 어느 하나는 다른 세부 분류와 중복될 수 있고 다수의 방법이 경우에 따라 이러한 세부 분류의 조합을 이용할 수 있다.

본원에 기재된 방법, 조성물, 수단 및 기법은 특정 종류, 부류 또는 패밀리의 폴리펩티드 또는 단백질에 한정되지 않는다. 실제로, 본원에 기재된 조성물의 범위는 본원에 기재된 1종 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 사실상 어떠한 폴리펩티드도 허용한다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 치료용 단백질과 상동성이다. 관련된 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 성장 호르몬 수퍼유전자 패밀리의 임의의 폴리펩티드 구성원과 상동성이다.

상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이 추가로 변형되거나, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 추가 변형없이 사용된다. 폴리펩티드 내로의 비천연 아미노산의 도입은 단백질 구조 및/또는 기능 변화의 조정(tailoring), 크기, 산도, 친핵성, 수소 결합, 소수성, 프로테아제 표적 부위의 접근 용이성의 변화, 일정 부분에 대한 표적화(폴리펩티드 어레이의 경우를 포함하나 이에 한정되지 않음)의 변화 등을 포함하나 이들에 한정되지 않는 다양한 목적을 위해 수행된다. 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 향상된 또는 심지어 완전히 새로운 촉매 특성 또는 생물물리적 특성을 지닐 수 있다. 예를 들면, 비천연 아미노산을 폴리펩티드 내로 포함시킴으로써 하기 특성들을 변경할 수 있다: 독성, 생체내 분포, 구조적 특성, 분광학적 특성, 화학적 및/또는 광화학적 특성, 촉매 능력, 반감기(혈청 반감기를 포함하나 이에 한정되지 않음), 공유결합 또는 비공유결합을 포함하나 이들에 한정되지 않는 다른 분자와 반응할 수 있는 능력 등. 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 신규한 치료제, 진단제, 촉매 효소, 산업용 효소, 결합 단백질(항체를 포함하나 이에 한정되지 않음), 및 단백질 구조 및 기능의 연구를 포함하나 이에 한정되지 않는 연구에 유용하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 문헌[Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4: 645-652]을 참조할 수 있다.

또한, 폴리펩티드의 상기 비천연 아미노산 성분(들)의 측쇄는 이 폴리펩티드에 광범위한 추가적인 작용기성을 제공한다. 비한정적인 예를 들면, 폴리펩티드의 비천연 아미노산 부분의 측쇄는 임의의 원하는 작용기성을 포함한다.

일 양태에서, 조성물은 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개 또는 적어도 10개, 또는 그 이상의 비천연 아미노산을 포함하나 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 비천연 아미노산은 경우에 따라 동일하거나 상이하다. 또한, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 그 이상의 상이한 또는 동일한 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 내에 경우에 따라 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 이상의 상이한 부위가 존재한다. 또 다른 양태에서, 조성물은 폴리펩티드 내에 존재하는 1개 이상(그러나, 전체 아미노산보다 적은 수)의 특정 아미노산이 비천연 아미노산(들)으로 치환된 폴리펩티드를 포함한다. 1개보다 많은 비천연 아미노산을 갖는 소정의 폴리펩티드의 경우, 상기 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다(예를 들어, 상기 폴리펩티드는 2개 이상의 상이한 종류의 비천연 아미노산을 포함할 수 있거나, 동일한 2개의 비천연 아미노산을 포함할 수 있음). 2개보다 많은 비천연 아미노산을 갖는 소정의 단백질의 경우, 상기 비천연 아미노산은 동일하거나 상이하거나 동일한 종류의 비천연 아미노산 복수개와 1종 이상의 상이한 비천연 아미노산의 조합일 수 있다.

본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 실시형태는 경우에 따라 고체상(예를 들어, 고체 수지) 펩티드 합성법, 용액상 펩티드 합성법을 통해 및/또는 효소를 사용하지 않고서 화학적으로 합성되지만, 본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 다른 실시형태는 세포막, 세포 추출물 또는 용해물 시스템을 통한 합성 또는 생체내 시스템을 통한 합성, 예컨대 원핵 세포 또는 진핵 세포의 세포내 기관을 이용한 합성을 가능하게 한다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 핵심 특징들 중 하나는 리보솜을 이용하여 이들을 합성할 수 있다는 점이다. 본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 고체 수지, 효소의 비사용, 리보솜의 이용 및/또는 생체내 시스템의 사용의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 방법들의 조합에 의해 합성된다.

리보솜 및/또는 생체내 시스템을 통한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 합성은 고체 수지 상에서 또는 효소를 사용하지 않고 합성한 비천연 아미노산 폴리펩티드로부터 기인한 분명한 장점과 특징을 갖는다. 이러한 장점 또는 특징은 상이한 불순물 프로필을 포함하는데, 즉, 리보솜을 이용하는 시스템 및/또는 생체내 시스템은 숙주 세포 단백질, 막 부분 및 지질을 비롯하여 사용된 생물학적 시스템으로부터 유래된 불순물을 함유하는 반면, 고체 수지를 이용하는 시스템 및/또는 효소를 이용하지 않는 시스템으로부터의 불순물 프로필은 유기 용매, 보호기, 수지 재료, 커플링제 및 합성 과정에서 사용된 다른 화학물질을 포함할 수 있다. 또한, 리보솜의 이용 및/또는 생체내 시스템을 통해 합성된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동위원소 패턴은 세포에서 이용되는 공급원료의 동위원소 패턴과 유사할 수 있는 반면, 고체 수지 상에서 합성한 비천연 아미노산 폴리펩티드 및/또는 효소를 사용하지 않고 합성한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동위원소 패턴은 합성에 이용된 아미노산의 동위원소 패턴과 유사할 수 있다. 또한, 리보솜의 이용 및/또는 생체내 시스템을 통해 합성된 비천연 아미노산은 아미노산의 D-이성질체를 실질적으로 함유하지 않을 수 있고/있거나, 내부 시스테인 아미노산을 폴리펩티드의 구조 내로 용이하게 도입할 수 있고/있거나, 내부 아미노산 결실 폴리펩티드를 거의 제공하지 않을 수 있다. 다른 한편으로, 고체 수지 상에서 합성한 비천연 아미노산 폴리펩티드 및/또는 효소를 사용하지 않고 합성한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 보다 높은 함량의 아미노산의 D-이성질체 및/또는 보다 적은 함량의 내부 시스테인 아미노산 및/또는 보다 높은 비율의 내부 아미노산 결실 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 게다가, 당업자는 리보솜의 이용 및/또는 생체내 시스템의 이용에 의해 합성한 비천연 아미노산 폴리펩티드를 고체 수지의 사용 및/또는 효소의 비사용을 통해 합성한 비천연 아미노산 폴리펩티드로부터 구별할 수 있을 것이다.

VII. 핵산 및 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 방법

A. 본원에서 사용되는 일반적인 재조합 핵산 방법

본원에 기재된 방법 및 조성물의 많은 실시형태에서, 원하는 폴리펩티드(예를 들어, GH 폴리펩티드를 포함함)를 코딩하는 핵산을 단리하고 클로닝하고 종종 재조합 방법을 이용하여 변형시킨다. 이러한 실시형태는 단백질 발현을 위해, 또는 변이체, 유도체, 발현 카세트, 또는 폴리펩티드로부터 유도된 다른 서열을 제조하는 과정에서 이용되나 이들에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 이종(heterologous) 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.

비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조할 수 있는 세포도 본원에 기재되어 있으며, 이때 상기 폴리펩티드 상의 하나 이상의 비천연 아미노산은 카보닐, 하이드라진, 인돌 결합을 갖는 측쇄를 포함한다. 이러한 세포는 본원에 기재된 방법 또는 이의 변형법을 이용하여 그러한 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하지만, 하나 이상의 비천연 아미노산을 생합성에 의해 제조한다. 하나 이상의 비천연 아미노산을 생합성하는 세포는 본원에 기재된 기법, 방법, 조성물 및 수단 또는 이들의 변형예를 이용하여 제작할 수 있다.

비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은, 모 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 합성되고, 그 후 관련 아미노산 잔기(들)의 도입(즉, 삽입 또는 치환) 또는 제거(즉, 결실 또는 치환)가 이루어지도록 뉴클레오티드 서열을 변화시키는 것에 의해 생성된다. 뉴클레오티드 서열은 공지된 방법에 따라 위치 지정 돌연변이 유발법에 의해 편리하게 변형될 수 있다. 대안으로, 뉴클레오티드 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기의 사용을 포함하나 이에 한정되지 않는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여, 바람직하게는, 재조합 폴리펩티드가 제조되는 숙주 세포에서 선호되는 코돈을 선택하여 디자인한다. 예를 들어, 원하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 몇몇 작은 올리고뉴클레오티드는 PCR, 결찰 또는 결찰 연쇄 반응에 의해 합성하고 조립할 수 있다. 예를 들어, 전술한 내용과 관련하여 본원에서 참고로 인용되는 문헌[Barany, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 189-193(1991)], 및 미국 특허 제6,521,427호를 참조할 수 있다.

본원에 기재된 비천연 아미노산 방법 및 조성물은 재조합 유전학 분야의 기법을 이용한다. 본원에 기재된 비천연 아미노산 방법 및 조성물에 이용되는 일반적 방법을 개시하는 기본 문헌으로는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)]; 문헌[Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)]; 및 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)]을 포함한다.

분자생물학적 기법을 설명하는 일반 문헌으로는 문헌[Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger)]; 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1 or 2, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook")]; 및 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) ("Ausubel")]을 들 수 있다. 이러한 문헌들은 비천연 아미노산을 포함하는 단백질의 제조를 위한 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 오르토고날 tRNA, 오르토고날 합성효소 및 이들의 쌍을 제조하는 것(이러한 것들을 포함하나 이에 한정되지 않음)에 관련된 돌연변이 유발법, 벡터의 사용, 프로모터 및 많은 다른 관련 주제를 기술하고 있다.

신규 합성효소 또는 tRNA의 제조, tRNA 분자의 돌연변이 유발, 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 돌연변이 유발, tRNA 라이브러리의 제조, 합성효소 라이브러리의 제조, 셀렉터 코돈의 제조, 원하는 단백질 또는 폴리펩티드에서 비천연 아미노산을 코딩하는 셀렉터 코돈을 삽입하는 것을 포함하나 이들에 한정되지 않는 다양한 목적을 위해 다양한 종류의 돌연변이 유발 기법이 본원에 기재된 비천연 아미노산 방법 및 조성물에서 사용된다. 이는 위치 지정 돌연변이 유발법, 무작위 포인트 돌연변이 유발법, 상동성 재조합법, DNA 셔플링법 또는 다른 반복적 돌연변이 유발법, 키메라 구축법, 우라실 함유 주형을 사용한 돌연변이 유발법, 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이 유발법, 포스포로티오에이트 변형 DNA 돌연변이 유발법, 갭을 갖는 이중체 DNA를 사용한 돌연변이 유발법 등 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 다른 적절한 방법은 포인트 미스매치 수복법, 수복 결함 숙주 균주를 사용한 돌연변이 유발법, 제한 선택 및 제한 정제법, 결실 돌연변이 유발법, 전체 유전자 합성에 의한 돌연변이 유발법, 이중 가닥 파괴 수복법 등을 포함한다. 키메라 구성체를 사용하는 돌연변이 유발법을 포함하나 이에 한정되지 않는 돌연변이 유발법도 본원에 기재된 비천연 아미노산 방법 및 조성물에 포함된다. 일 실시형태에서, 돌연변이 유발법은 서열 비교, 물성, 결정 구조 등을 포함하나 이들에 한정되지 않는, 천연 분자, 또는 변경된 또는 돌연변이된 천연 분자의 공지된 정보를 지침으로 할 수 있다.

본원에 기재된 문헌 및 예는 이와 같은 관련 절차를 개시하고 있다. 하기 간행물 및 이 간행물에 인용된 참고 문헌에서 추가 정보를 얻을 수 있다: 문헌[Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254 (2): 157-178 (1997)]; 문헌[Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57: 369-374 (1996)]; 문헌[Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19: 423-462 (1985)]; 문헌[Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229: 1193-1201 (1985)]; 문헌[Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237: 1-7 (1986)]; 문헌[Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987)]; 문헌[Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492 (1985)]; 문헌[Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987)]; 문헌[Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242: 240-245 (1988)]; 문헌[Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983)]; 문헌[Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987)]; 문헌[Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500 (1982)]; 문헌[Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983)]; 문헌[Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987)]; 문헌[Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985)]; 문헌[Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985)]; 문헌[Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease NciI cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986)]; 문헌[Sayers et al., 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16: 791-802 (1988)]; 문헌[Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814]; 문헌[Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984)]; 문헌[Kramer & Fritz, Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154: 350-367 (1987)]; 문헌[Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988)]; 문헌[Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988)]; 문헌[Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38: 879-887 (1984)]; 문헌[Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985)]; 문헌[Carter, Improved oligotiucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987)]; 문헌[Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986)]; 문헌[Wells et al., Importance of Hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986)]; 문헌[Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984)]; 문헌[Sakamar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988)]; 문헌[Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34: 315-323 (1985)]; 문헌[Grundstroem et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by 'shot-gun' gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985)]; 문헌[Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7177-7181 (1986)]; 문헌[Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4: 450-455 (1993)]; 문헌[Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19: 456-460 (2001)]; 문헌[W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994)]; 및 문헌[I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995)]. 이같은 방법 중 다수에 대한 추가적인 설명은 문헌[Methods in Enzymology Volume 154]에서 찾아볼 수 있는데, 이 문헌은 또한, 각종 돌연변이 유발법과 관련된 문제 해결을 위한 유용한 관리법을 기술하고 있다.

본원에 기재된 방법 및 조성물은 또한 오르토고날 tRNA/RS 쌍을 통한 비천연 아미노산의 생체내 도입을 위한 진핵 숙주 세포, 비진핵 숙주 세포 및 유기체의 사용을 포함한다. 숙주 세포는, 본원에 기재된 폴리펩티드에 상응하는 폴리뉴클레오티드, 또는 본원에 기재된 폴리펩티드에 상응하는 벡터(예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있음)를 포함하나 이에 한정되지 않는, 본원에 기재된 폴리펩티드에 상응하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구성체에 의해 유전공학적으로 조작된다(형질전환, 형질도입 또는 형질감염을 포함하나, 이들에 한정되지 않음). 예를 들어, 오르토고날 tRNA, 오르토고날 tRNA 합성효소 및 유도체화하고자 하는 단백질에 대한 코딩 영역들을 원하는 숙주 세포에서 기능성인 유전자 발현 조절 요소에 작동 가능하게 연결한다. 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지, 박테리아, 바이러스, 네이키드(naked) 폴리뉴클레오티드 또는 접합된 폴리뉴클레오티드의 형태일 수 있다. 벡터는 전기천공법(문헌[Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5824 (1985)] 참조), 바이러스 벡터에 의한 감염, 소형 비드 또는 입자로 된 매트릭스 내에 또는 표면 상에 핵산을 갖는 소립자에 의한 고속 탄도 침투(ballistic penetration)(문헌[Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)] 참조)를 비롯한 방법에 의해 세포 및/또는 미생물 내로 도입된다.

조작된 숙주 세포는, 예를 들어 스크리닝 단계, 프로모터의 활성화 또는 형질전환체의 선별과 같이, 그 활성에 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 이러한 세포들은 경우에 따라 형질전환 유기체 내에서 배양될 수 있다. 세포 단리 및 배양(예를 들어, 후속 핵산 단리)을 포함하나 이들에 한정되지 않는 것에 대한 다른 유용한 참고 문헌으로는 문헌[Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third Edition, Wiley-Liss, New York] 및 이 문헌에 인용된 참고 문헌[Payne et al., (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY]; 문헌[Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)] 및 문헌[Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL]을 포함한다.

표적 핵산을 세포 내로 도입하는 몇 가지 방법이 이용 가능하며, 이들 중 임의의 방법이 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 이들 방법은 수용 세포와, DNA를 함유하는 박테리아 원형질체의 융합, 전기천공법, 추진체 포격(projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 이용한 감염(본원에서 추가로 설명함) 등을 포함한다. 박테리아 세포는 본원에 기재된 폴리펩티드에 상응하는 DNA 구성체를 함유하는 다수의 플라스미드를 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 박테리아는 대수기(log phase)까지 성장하고, 박테리아 내의 플라스미드는 다양한 방법(예를 들어, Sambrook의 문헌 참조)에 의해 단리될 수 있다. 또한, 박테리아로부터 플라스미드를 정제하기 위한 다수의 키트가 시판되고 있다(예를 들어, Pharmacia Biotech에서 시판하는 EasyPrep^TM및 FlexiPrep^TM; Stratagene에서 시판하는 StrataClean^TM; 및 Qiagen으로부터 시판되는 QIAprep^TM). 그 후, 단리되고 정제된 플라스미드를 추가로 조작하여 다른 플라스미드를 제조하거나, 세포를 형질감염시키는 데 사용하거나, 유기체를 감염시키기 위해 관련 벡터 내로 도입한다. 전형적인 벡터는 전사 및 번역 종결 서열, 전사 및 번역 개시 서열, 및 특정 표적 핵산의 발현 조절에 유용한 프로모터를 포함한다. 벡터는 경우에 따라 하나 이상의 독립된 종결 서열, 진핵생물, 원핵생물 또는 이들 둘 다에서 카세트의 복제를 가능하게 하는 서열(셔틀 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않음), 및 원핵 및 진핵 시스템 둘 다에 대한 선별 마커를 포함하는 범용 발현 카세트를 포함한다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물 또는, 바람직하게는, 이들 둘 다에 있어서 복제 및 도입에 적합하다. 문헌[Giliman & Smith, Gene 8: 81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328: 731 (1987)]; 문헌[Schneider, E., et al., Protein Expr. Purif. 6(1): 10-14 (1995)]; 문헌[Ausubel, Sambrook, Berger (all supra)]을 참조할 수 있다. 클로닝에 유용한 박테리아 및 박테리오파지의 카탈로그는, 예를 들어 ATCC에 의해 제공되며, 그 예로는 ATCC가 발행한 카탈로그[The ATCC Catalogue of bacteria and bacteriophage (1992) Gherna et al., (eds)]가 있다. 또한, 서열 분석, 클로닝 및 분자생물학의 다른 측면에 대한 추가 기본 절차 및 기초적인 이론적 고려사항은 문헌[Watson et al., (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY]에서 찾을 수 있다. 또한, 실질적으로 어떠한 핵산도(또한, 표준 또는 비표준의 사실상 어떠한 표지된 핵산도) 다양한 임의의 상업적 공급업체로부터, 예를 들어 Midland Certified Reagent Company(미국 텍사스주 미들랜드 소재, TX mcrc.com에서 이용 가능함), The Great American Gene Company(미국 캘리포니아주 라모마 소재, www.genco.com에서 이용 가능함), ExpressGen Inc.(미국 일리노이주 시카고 소재, www.expressgen.com에서 이용 가능함), Operon Technologies Inc.(미국 캘리포니아주 알라메다 소재) 및 많은 다른 공급업체로부터 맞춤 주문 또는 일반 주문할 수 있다.

B. 셀렉터 코돈

본원에 기재된 방법 및 조성물에 포함되는 셀렉터 코돈은 단백질 생합성 기구의 유전자 코돈 골격구조를 확장시킨다. 예를 들어, 셀렉터 코돈은 독특한 3 염기 코돈, 넌센스 코돈, 예를 들어 앰버 코돈(UAG) 또는 오팔 코돈(UGA)을 포함하나 이들에 한정되지 않는 정지 코돈, 비천연 코돈, 4 또는 그 이상의 염기 코돈, 희귀 코돈 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 원하는 폴리펩티드의 적어도 일부를 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드에서 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 또는 그 이상을 포함하나 이들에 한정되지 않는 많은 수의 셀렉터 코돈을 원하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입할 수 있다.

일 실시형태에서, 본 방법은 하나 이상의 비천연 아미노산을 생체내로 도입하기 위한 정지 코돈인 셀렉터 코돈의 사용을 포함한다. 예를 들어, UAG를 포함하나 이에 한정되지 않는 정지 코돈을 인식하며 O-RS에 의해 원하는 비천연 아미노산으로 아미노아실화되는 O-tRNA가 생성된다. 이 O-tRNA는 천연 숙주의 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해서는 인식되지 않는다. 위치 지정 돌연변이 유발법을 이용하여 원하는 폴리펩티드 내의 원하는 부위에, UAG를 포함하나 이에 한정되지 않는 정지 코돈을 도입할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sayers, J.R., et al., (1988), 5'-3' Exonuclease if a phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 16:791-802]을 참조할 수 있다. O-RS, O-tRNA, 및 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 생체내에서 조합되는 경우, 비천연 아미노산은 UAG 코돈에 반응하여 도입되어 특정 위치에서 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제공한다.

비천연 아미노산은 희귀 코돈을 갖도록 코딩될 수도 있다. 예를 들어, 시험관내 단백질 합성 반응에 있어서 아르기닌 농도를 감소시킬 경우, 희귀 아르기닌 코돈인 AGG가 알라닌에 의해 아실화된 합성 tRNA에 의한 Ala의 삽입에 효율적인 것으로 입증된 바 있다. 예를 들어, 문헌[Ma et al., Biochemistry. 32:7939 (1993)]을 참조할 수 있다. 이 경우, 합성 tRNA는 에스케리치아 콜라이에서 소수 종으로서 존재하는 천연 tRNAArg과 경쟁한다. 일부 유기체는 모든 3 염기 코돈을 이용하지는 않는다. 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)에 있어서 미지정 코돈인 AGA는 시험관내 전사/번역 추출물 중에서의 아미노산의 삽입에 이용되고 있다. 이에 대해서는, 예를 들어 문헌[Kowal and Oliver, Nucl. Acid. Res.. 25:4685 (1997)]을 참조한다. 일 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법의 구성요소들은 생체내에서 이같은 희귀 코돈을 사용하도록 제조될 수 있다.

비천연 아미노산의 생체내 도입은 진핵 숙주 세포에 유의적인 영향을 주지 않으면서 수행될 수 있다. 예를 들어, UAG 코돈에 대한 억제 효율은 O-tRNA(엠버 서프레서 tRNA를 포함하나 이에 한정되지 않음)와 진핵 방출 인자(eRF를 포함하나 이에 한정되지 않음)(이는 정지 코돈에 결합하여, 리보솜으로부터 성장 펩티드의 방출을 개시함) 사이의 경쟁에 좌우되기 때문에, 이러한 억제 효율은 O-tRNA 및/또는 서프레서 tRNA의 발현 수준을 증가시키는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 방법에 의해 조절할 수 있다.

셀렉터 코돈은 또한 4 또는 그 이상의 염기 코돈, 예를 들어, 4 염기 코돈, 5 염기 코돈 또는 6 염기 또는 그 이상의 염기 코돈을 포함하나 이들에 한정되지 않는 연장된 코돈을 포함한다. 4 염기 코돈의 예로는 AGGA, CUAG, UAGA, CCCU 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 5 염기 코돈의 예로는 AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 본원에 기재된 방법 및 조성물의 한 특징은 프레임시프트 억제를 기초로 하여 연장된 코돈을 이용하는 것을 포함한다. 4 또는 그 이상의 염기 코돈은, 하나 또는 복수개의 비천연 아미노산을 포함하나 이들에 한정되지 않는 아미노산을 동일한 단백질 내로 삽입할 수 있다. 예를 들어, 안티코돈(anticodon) 루프, 예를 들어 8∼10개 이상의 뉴클레오티드로 구성된 안티코돈 루프를 갖는 특수 프레임시프트 서프레서 tRNA를 포함하나 이에 한정되지 않는 돌연변이된 O-tRNA의 존재하에, 4 또는 그 이상의 염기 코돈은 단일 아미노산으로서 판독된다. 다른 실시형태에서, 상기 안티코돈 루프는 4개 이상의 염기로 구성된 코돈, 5개 이상의 염기로 구성된 코돈, 또는 6개 이상의 염기로 구성된 코돈을 포함하나 이들에 한정되지 않는 코돈을 해독(decoding)할 수 있다. 256개의 가능한 4 염기 코돈이 존재하기 때문에, 4개 이상의 염기로 구성된 코돈의 사용에 의해 동일한 세포에서 다수의 비천연 아미노산이 코딩될 수 있다. 이와 관련하여, 문헌[Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9: 237-244]; 문헌[Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769]을 참조할 수 있다.

예를 들어, 4 염기 코돈은 시험관내 생합성 방법을 이용하여 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하는 데 사용되어 왔다. 예를 들어, 문헌[Ma et al., (1993) Biochemistry. 32: 7939]; 및 문헌[Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121: 34]을 참조할 수 있다. CGGG 및 AGGU는 시험관내에서 2개의 화학적으로 아실화된 프레임시프트 서프레서 tRNA를 사용하여 2-나프틸알라닌 및 라이신의 NBD 유도체를 동시에 스트렙타비딘으로 도입하는 데 사용되었다. 예를 들어, 문헌[Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121: 12194-12195]을 참조할 수 있다. 생체내 연구에서, Moore 등은 NCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeu 유도체가 UAGN 코돈(N은 U, A, G 또는 C일 수 있음)을 억제하는 능력을 조사하였고, 4개의 염기로 구성된 UAGA가 0 또는 -1 프레임(frame)에서 거의 해독되지 않은 채 13∼26%의 효율로 UCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeu에 의해 해독될 수 있다는 것을 발견하였다. 이와 관련하여, 문헌[Moore et al., (2000) J. Mol. Biol., 298: 195]을 참조할 수 있다. 일 실시형태에서, 희귀 코돈 또는 넌센스 코돈을 기초로 한 연장된 코돈이 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있으며, 이는 원치않는 다른 부위에서의 미스센스 리드쓰루(missense readthrough) 및 프레임시프트 억제를 감소시킬 수 있다.

또한, 소정의 시스템의 경우, 셀렉터 코돈은 천연 3 염기 코돈 중 하나를 포함할 수 있으며, 이때 내인성 시스템은 천연 염기 코돈을 사용하지 않는다(또는 거의 사용하지 않는다). 예를 들어, 이는 천연 3 염기 코돈을 인식하는 tRNA가 결여된 시스템, 및/또는 3 염기 코돈이 희귀 코돈인 시스템을 포함한다.

셀렉터 코돈은 경우에 따라 비천연 염기쌍을 포함한다. 이러한 비천연 염기쌍은 기존의 유전자 알파벳을 더 확장시킨다. 추가의 1개 염기쌍은 3 염기 코돈의 수를 64개에서 125개로 증가시킨다. 세 번째 염기쌍의 특성은 안정한 선택적 염기쌍 형성, 높은 충실도로 폴리머라제에 의한 DNA 내로의 효율적인 효소적 도입, 및 초기(nascent) 비천연 염기쌍의 합성 후 효율적인 연속 프라이머 연장을 포함한다. 본 방법 및 조성물에서 채용될 수 있는 비천연 염기쌍에 대한 설명은, 예를 들어 문헌[Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology. 20: 177-182] 및 문헌[Wu, Y., et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124: 14626-14630]을 참조할 수 있다. 다른 관련 간행물들도 열거되어 있다.

생체내 사용에 있어서는, 비천연 뉴클레오시드는 막 투과성을 지니고 인산화되어 상응하는 트리포스페이트를 형성한다. 또한, 증가된 유전 정보는 안정성이 있고 세포내 효소에 의해 파괴되지 않는다. Benner 등에 의해 이루어진 종래의 연구는 정규(canonical) 왓슨-크릭(Watson-Crick) 쌍에서의 수소 결합 패턴과 상이한 수소 결합 패턴을 이용하였는데, 이 중 가장 주목할 만한 예는 이소-C:이소-G 쌍이다. 이와 관련해서는, 예를 들어 문헌[Switzer et al., (1989) J. Am. Chem. Soc., 111: 8322-8322]; 문헌[Piccirilli et al., (1990) Nature, 343: 33-37]; 및 문헌[Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 602-608]을 참조할 수 있다. 이 염기들은 일반적으로 어느 정도까지 천연 염기와 잘못 쌍을 이루어 효소적으로 복제될 수 없다. Kool과 그의 동료들은 염기 사이의 소수성 팩킹 상호작용이 수소 결합을 대체하여 염기쌍의 형성을 유도할 수 있다는 것을 입증하였다. 이에 관해서는 문헌[Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4: 602-608]; 및 문헌[Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825-2828]을 참조할 수 있다. 상기 요건을 전부 만족시키는 비천연 염기쌍을 개발하기 위한 노력으로, Schultz, Romesberg 및 그 동료들은 일련의 비천연 소수성 염기들을 체계적으로 합성하여 연구하였다. PICS:PICS 자가 쌍(self-pair)은 천연 염기쌍보다 안정한 것으로 밝혀졌고, 에스케리치아 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편(KF)에 의해 DNA 내로 효율적으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌[McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121: 11585-11586]; 및 문헌[Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122: 3274-3278]을 참조할 수 있다. 3MN:3MN 자가 쌍은 생물학적 기능에 충분한 효율성 및 선택성으로 KF에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc. 122: 8803-8804]을 참조할 수 있다. 그러나, 양쪽 염기 둘 다 추가 복제를 위한 사슬 종결 인자로 작용한다. 최근, PICS 자가 쌍을 복제하는 데 사용될 수 있는 돌연변이 DNA 폴리머라제가 개발되었다. 또한, 7AI 자가 쌍도 복제될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc., 123: 7439-7440]을 참조할 수 있다. 또한, 새로운 메탈로염기쌍인 Dipic:Py도 개발되었는데, 이것은 Cu(II)와 결합할 때 안정한 쌍을 형성한다. 문헌[Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122: 10714-10715]을 참조할 수 있다. 연장된 코돈 및 비천연 코돈은 본질적으로 천연 코돈에 오르토고날하기 때문에, 본원에 기재된 비천연 아미노산 방법은 이 특성을 이용하여 이들에 대한 오르토고날 tRNA를 생성할 수 있다.

또한, 번역 우회(translational bypassing) 시스템을 이용하여 원하는 폴리펩티드 내로 비천연 아미노산을 도입할 수 있다. 번역 우회 시스템에서, 큰 서열이 유전자 내로 도입되긴 하나 단백질로 번역되지 않는다. 이 서열은 리보솜이 서열을 건너 뛰어, 삽입 부위 하류의 번역을 재개하도록 유도하는 신호(cue)로서 작용하는 구조를 포함한다.

특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법 및/또는 조성물에 있어서의 원하는 단백질 또는 폴리펩티드(또는 그 일부분)는 핵산에 의해 코딩된다. 일반적으로, 상기 핵산은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다.

원하는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는, 예를 들어 "돌연변이 유발법 및 기타 분자생물학 기법"이라는 제목하에 본원에 기재된 방법을 이용하여, 예를 들어, 비천연 아미노산의 도입을 위한 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하도록 돌연변이시킬 수 있다. 예를 들어, 원하는 단백질에 대한 핵산을, 하나 이상의 비천연 아미노산을 도입시키는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하도록 돌연변이시킨다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은, 예를 들어 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는, 임의의 단백질의 임의의 그러한 변이체(돌연변이체, 변형체(version)를 포함하나 이에 한정되지 않음)를 포함한다. 유사하게, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 상응하는 핵산, 즉, 하나 이상의 비천연 아미노산을 코딩하거나 생체내 도입을 가능하게 하는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 갖는 임의의 핵산을 포함한다.

예를 들어, GH 폴리펩티드를 포함하는 원하는 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 폴리펩티드의 임의의 원하는 위치에서 시스테인이 도입되도록 용이하게 돌연변이될 수 있다. 시스테인은 반응성 분자, 수용성 중합체, 단백질 또는 다종 다양한 다른 분자를 원하는 단백질 내로 도입하는 데 널리 사용된다. 시스테인을 폴리펩티드의 원하는 위치에 도입하기에 적합한 방법으로는, 전술한 내용과 관련하여 본원에서 참고로 인용되는 미국 특허 제6,608,183호에 기재된 방법 및 표준 돌연변이 유발 기법을 들 수 있다. 이러한 시스테인 도입 및 이용 기법은 본원에 기재된 비천연 아미노산 도입 및 이용 기법과 함께 이용될 수 있다.

VIII. 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생체내 제조

편의상, 본 섹션에 기재된 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생체내 제조는 개괄적으로 및/또는 구체적인 예를 들어 설명하였다. 그러나, 본 섹션에 기재된 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생체내 제조는 본 섹션에 제공된 일반적인 설명 또는 구체적인 예에만 한정되는 것이 아니며, 본 섹션에 기재된 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 생체내 제조는 화학식 I∼XV의 범위 내에 속하는 모든 화합물(본원의 명세서, 청구의 범위 및 도면에 기재된 화학식 I∼XV의 범위 내에 속하는 임의의 하위 화학식의 화합물 또는 특정 화합물을 포함함)에 동일하게 적용된다.

본원에 기재된 폴리펩티드는 천연 시스템에서는 코딩되지 않는 아미노산을 부가하거나 이것으로 치환시키기 위해 변형된 tRNA 및 tRNA 합성효소를 사용하여 생체내에서 제조할 수 있다.

천연 시스템에서 코딩되지 않는 아미노산을 사용하는 tRNA 및 tRNA 합성효소를 제조하는 방법은, 예를 들어 본원에서 참고로 인용되는 미국 특허 제7,045,337호(발명의 명칭: "In vivo incorporation of unnatural amino acids") 및 미국 특허 제7,083,970호(발명의 명칭: "Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyl tRNA synthetase pairs")에 기재되어 있다. 이러한 방법은 번역 시스템에 대해 내인성인 합성효소 및 tRNA에 독립적으로 기능하는(따라서, 때때로 "오르토고날"이라고도 지칭됨) 번역 기구를 제조하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 이 번역 시스템은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이 폴리뉴클레오티드는 상응하는 DNA로부터 전사된 mRNA일 수 있거나, 또는 상기 mRNA는 RNA 바이러스 벡터로부터 유래될 수 있으며, 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 비천연 아미노산의 도입을 위한 소정의 부위에 상응하는 셀렉터 코돈을 포함한다. 상기 번역 시스템은 비천연 아미노산을 포함하며 상기 셀렉터 코돈에 특이적인 tRNA를 추가로 포함하고; 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 아미노아실화된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 번역 시스템은 tRNA에 특이적인 아미노아실 합성효소를 포함하고, 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 번역 시스템은 오르토고날 tRNA 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소를 포함한다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 번역 시스템은 (일반적으로 DNA의 형태로) 전술한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, (일반적으로 DNA의 형태로) 전술한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 DNA, 또는 전술한 폴리뉴클레오티드가 통합되어 있는 (추가 실시형태에서, 이 통합은 안정한 통합임) 게놈 DNA 중 적어도 하나를 포함한다. 번역 시스템의 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 셀렉터 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 독특한 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5 염기 코돈 및 4 염기 코돈으로 구성된 군에서 선택된다. 번역 시스템의 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 tRNA는 서프레서 tRNA이다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 리보솜에 의해 합성된다.

또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 번역 시스템은 오르토고날 tRNA(O-tRNA) 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS)를 포함한다. 일반적으로, 상기 O-RS는 번역 시스템에서 O-tRNA를 하나 이상의 비천연 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화하고, 이 O-tRNA는 이 시스템에서 다른 tRNA에 의해 인식되지 않는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 인식한다. 따라서, 이 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 반응하여 비천연 아미노산을 상기 시스템에서 제조된 폴리펩티드 내에 삽입함으로써, 코딩된 폴리펩티드 내의 특정 위치로 비천연 아미노산을 "치환"시킨다.

특정한 합성 아미노산을 폴리펩티드 내에 삽입하기 위한 다종 다양한 오르토고날 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소가 본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조하기 위해 본원에 기재된 방법에서 사용하기에 일반적으로 적합하다. 예를 들어, 케토 특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소가 문헌[Wang, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100; 56-61 (2003)] 및 문헌[Zhang, Z. et al., Biochem. 42 (22): 6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 예시적 O-RS 또는 이의 일부는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 각각 본원에서 참고로 인용되는 미국 특허 제7,045,337호 및 제7,083,970호에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 또한, O-RS와 함께 사용되는 상응하는 O-tRNA 분자도 본원에 그 전체가 참고로 인용되는 미국 특허 제7,045,337호 및 제7,083,970호에 개시되어 있다. 또한, 본원에서 그 전체가 참고로 인용되는 문헌[Mehl et al., J. Am. Chem. Soc. 2003; 125:935-939] 및 문헌[Santoro et al., Nature Biotechnology, 2002 Oct; 20:1044-1048]에는 스크리닝 방법, 및 p-아미노페닐알라닌을 폴리펩티드로 도입하기 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 및 tRNA 분자에 대해 기재되어 있다.

본원에 기재된 방법에서 사용하기에 적합한 예시적인 O-tRNA 서열은 본원에서 참고로 인용되는 미국 특허 제7,045,337호에 개시된 서열 번호 1 또는 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정한 비천연 아미노산에 특이적인 0-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍의 다른 예는 본원에 그 전체가 참고로 인용되는 미국 특허 제7,083,970호에 기재되어 있다. 에스. 세레비시아에서 케토 함유 아미노산 및 아지드 함유 아미노산 둘 다를 도입하는 O-RS 및 O-tRNA는 문헌[Chin, J. W., et al., Science 301: 964-967 (2003)]에 기재되어 있다.

O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소의 사용은 비천연 아미노산을 코딩하는 특정한 코돈의 선택을 포함한다. 임의의 코돈이 사용될 수 있지만, 일반적으로는 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소가 발현되는 세포에서 거의 또는 전혀 사용되지 않는 코돈을 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 예시적인 코돈은 넌센스 코돈, 예컨대 정지 코돈(엠버, 오커 및 오팔), 4 또는 그 이상의 염기 코돈, 및 거의 또는 전혀 사용되지 않는 다른 천연 3 염기 코돈을 포함한다.

특정한 셀렉터 코돈(들)은 돌연변이 유발법(부위 특이적 돌연변이 유발법, 카세트 돌연변이 유발법, 제한 선택 돌연변이 유발법 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않음)을 이용하여 폴리뉴클레오티드 코딩 서열 내의 적절한 위치에 도입할 수 있다.

비천연 아미노산을 도입하는 데 사용될 수 있는 단백질 생합성 기구의 구성요소, 예를 들어 O-RS, O-tRNA, 및 오르토고날 O-tRNA/O-RS 쌍을 생성하는 방법은 문헌[Wang, L. et al., Science 292: 498-500 (2001)]; 문헌[Chin, J. W. et al., J. Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027 (2002)]; 문헌[Zhang, Z. et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 비천연 아미노산의 생체내 도입을 위한 방법 및 조성물은 본원에서 참고로 인용되는 미국 특허 제7,045,337호에 기재되어 있다. 또한, 유기체의 생체내 번역 시스템에서 사용하기 위한 오르토고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선별하는 방법은 본원에서 참고로 인용되는 미국 특허 제7,045,337호 및 미국 특허 제7,083,970호에 기재되어 있다. 또한, 본원에서 그 전체를 참고로 인용하는 PCT 공개 공보 WO 04/035743(발명의 명칭: "Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into proteins")에는 케토 아미노산의 도입을 위한 오르토고날 RS 및 tRNA 쌍이 기재되어 있다. 본원에 그 전체가 참고로 인용되는 PCT 공개 공보 WO 04/094593(발명의 명칭: "Expanding the Eukaryotic Genetic Code")에는 진핵 숙주 세포에서 비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위한 오르토고날 RS와 tRNA 쌍이 기재되어 있다.

하나 이상의 재조합 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 제조하는 방법은 (a) 원핵생물 유기체, 예를 들어 메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 에스케리치아 콜라이, 에이. 풀기더스, 피. 푸리오서스, 피. 호리코쉬이, 에이. 페르닉스, 티. 써모필러스 등, 또는 진핵생물 유기체를 포함하나 이들에 한정되지 않는 제1 유기체로부터의 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)로부터 유도된 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 라이브러리를 생성하는 단계; (b) 비천연 아미노산 및 천연 아미노산의 존재하에 오르토고날 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화는 구성원에 대해 RS(경우에 따라, 돌연변이체 RS)의 라이브러리를 선별(및/또는 스크리닝)함으로써, 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 제공하는 단계; 및/또는 (c) 비천연 아미노산의 부재하에 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 RS(돌연변이체 RS를 포함하나 이에 한정되지 않음)에 대해 상기 풀을 (경우에 따라, 음성 선별을 통해) 선별함으로써, O-tRNA를 비천연 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화하는 하나 이상의 재조합 O-RS를 제공하는 단계를 포함한다.

일 실시형태에서, 상기 RS는 비활성 RS이다. 이러한 비활성 RS는 활성 RS를 돌연변이시켜 생성할 수 있다. 예를 들어, 상기 비활성 RS는 적어도 약 1개, 적어도 약 2개, 적어도 약 3개, 적어도 약 4개, 적어도 약 5개, 적어도 약 6개, 또는 적어도 약 10개, 또는 그 이상의 아미노산을 상이한 아미노산(알라닌을 포함하나 이에 한정되지 않음)으로 돌연변이시킴으로써 생성할 수 있다.

돌연변이체 RS의 라이브러리는, 단백질의 3차원적 RS 구조에 기초한 합리적(rational) 디자인을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 기법, 또는 무작위적 또는 합리적 디자인 기법을 이용한 RS 뉴클레오티드의 돌연변이 유발을 이용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 RS는 부위 특이적 돌연변이, 무작위 돌연변이, 다양성 발생 재조합 돌연변이, 키메라 구성체, 합리적 디자인, 및 본원에 기재되어 있는 다른 방법에 의해 생성될 수 있다.

일 실시형태에서, 비천연 아미노산 및 천연 아미노산의 존재하에 오르토고날 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는, 활성을 갖는 구성원에 대해 RS(경우에 따라, 돌연변이체 RS)의 라이브러리를 선별(및/또는 스크리닝)하는 과정은, 항생제 내성 유전자 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 양성 선별 또는 스크리닝 마커 및 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 라이브러리를 복수개의 세포 내로 도입하는 단계(여기서, 상기 양성 선별 및/또는 스크리닝 마커는 엠버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 독특한 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5 염기 코돈 및 4 염기 코돈을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함); 선별제의 존재하에 상기 복수개의 세포를 배양하는 단계; 양성 선별 또는 스크리닝 마커의 존재 중의 하나 이상의 셀렉터 코돈을 억제하여 선별제 및/또는 스크리닝제의 존재하에 생존하는 (또는 특이적 반응을 나타내는) 세포를 확인함으로써 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 함유하는 양성적으로 선별된 세포의 부분집합을 제공하는 단계를 포함한다. 경우에 따라, 상기 선별제 및/또는 스크리닝제 농도는 변화시킬 수 있다.

일 양태에서, 상기 양성 선별 마커는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase; CAT) 유전자이고, 상기 셀렉터 코돈은 CAT 유전자 내의 엠버 정지 코돈이다. 그 밖의 선별 마커로는 네오마이신 내성 유전자, 블라스티시딘 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 또는 임의의 다른 이용 가능한 내성 유전자를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 경우에 따라, 상기 양성 선별 마커는 β-락타마제 유전자이고, 상기 셀렉터 코돈은 β-락타마제 유전자 내의 엠버 정지 코돈이다. 또 다른 양태에서, 상기 양성 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성에 기초한 스크리닝 마커(세포 표면 마커를 포함하나, 이에 한정되지 않음)를 포함한다.

일 실시형태에서, 비천연 아미노산의 부재하에 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 RS를 포함하나 이에 한정되지 않는 활성 RS(경우에 따라, 돌연변이체)에 대해 풀을 음성적으로 선별하거나 스크리닝하는 과정은, 양성 선별 또는 스크리닝으로부터의 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀과 함께 음성 선별 또는 스크리닝 마커를 제2 유기체의 복수개의 세포 내로 도입하는 단계[여기서, 상기 음성 선별 또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈(클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자를 포함하나 이에 한정되지 않는 항생제 내성 유전자를 포함하나 이에 한정되지 않음)을 포함함]; 및 비천연 아미노산 및 스크리닝제 또는 선별제가 보충된 제1 배지에서 생존하거나 특이적인 스크리닝 반응을 나타내지만 비천연 아미노산 및 선별제 또는 스크리닝제가 보충되지 않은 제2 배지에서는 생존하지 못하거나 특이적 반응을 나타내지 않는 세포를 확인하여 하나 이상의 재조합 O-RS를 갖는 생존 세포 또는 스크리닝된 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 예를 들어, CAT 확인 프로토콜은 경우에 따라, 적절한 O-RS 재조합체를 확인함에 있어서 양성 선별 및/또는 음성 스크리닝으로서 작용한다. 예를 들어, 클론의 풀은 경우에 따라 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하거나 함유하지 않고 CAT(이는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함)를 함유하는 배양 플레이트 상에서 복제된다. 따라서, 비천연 아미노산을 함유하는 플레이트 상에서만 성장하는 콜로니는 재조합 O-RS를 함유하는 콜로니로 간주된다. 일 양태에서, 선별제(및/또는 스크리닝제)의 농도는 변화시킬 수 있다. 일부 양태에서, 제1 유기체와 제2 유기체는 상이하다. 따라서, 제1 유기체 및/또는 제2 유기체는 경우에 따라 원핵생물, 진핵생물, 포유동물, 에스케리치아 콜라이, 진균류, 효모, 원시세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성에 기초한 스크리닝 마커를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS에 대해 풀을 스크리닝 또는 선별(음성 선별을 포함하나 이에 한정되지 않음)하는 과정은, 양성 선별 단계 (b)로부터 활성 돌연변이체 RS의 풀을 단리하는 단계; 음성 선별 또는 스크리닝 마커를 도입하는 단계[여기서, 상기 음성 선별 또는 스크리닝 마커는 하나 이상의 셀렉터 코돈(하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 리보뉴클레아제 바르나제(ribonuclease barnase) 유전자를 포함하나 이에 한정되지 않는 독성 마커 유전자를 포함하나 이에 한정되지 않음)을 포함함]; 및 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 제2 유기체의 복수개의 세포 내로 도입하는 단계; 및 비천연 코딩된 아미노산이 보충되지 않은 제1 배지에서는 생존하거나 특이적인 스크리닝 반응을 나타내지만, 비천연 아미노산이 보충된 제2 배지에서는 생존하지 못하거나 특이적인 스크리닝 반응을 나타내지 않는 세포를 확인함으로써 비천연 아미노산에 특이적인 하나 이상의 재조합 O-RS를 갖는 생존 세포 또는 스크리닝된 세포에 제공하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 상기 하나 이상의 셀렉터 코돈은 약 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다. 경우에 따라, 이러한 실시형태는 하나 이상의 셀렉터 코돈이 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하고, 제1 유기체와 제2 유기체가 상이한 경우(각각의 유기체는 경우에 따라, 원핵생물, 진핵생물, 포유동물, 에스케리치아 콜라이, 진균류, 효모, 원시세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 것이다)를 포함할 수 있다. 또한, 일부 양태는 음성 선별 마커가 리보뉴클레아제 바르나제 유전자(하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함)를 포함하는 경우를 포함한다. 다른 양태는 스크리닝 마커가 경우에 따라 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성에 기초한 스크리닝 마커를 포함하는 경우를 포함한다. 본원의 실시형태에서, 스크리닝 및/또는 선별은 경우에 따라 스크리닝 및/또는 선별 엄격도의 변경을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 재조합 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 제조하는 방법은 (d) 하나 이상의 재조합 O-RS를 단리하는 단계; (e) 하나 이상의 재조합 O-RS로부터 유도된 O-RS(경우에 따라, 돌연변이됨)의 제2 세트를 생성하는 단계; 및 (f) O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 능력을 포함하는 돌연변이된 O-RS가 얻어질 때까지 단계 (b) 및 단계 (c)를 반복하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 경우에 따라, 단계 (d)∼(f)를 약 2회 이상(이에 한정되지 않음) 반복한다. 일 양태에서, 하나 이상의 재조합 O-RS로부터 유도된 돌연변이된 O-RS의 제2 세트는 무작위 돌연변이 유발법, 부위 특이적 돌연변이 유발법, 재조합법 또는 이들의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않는 돌연변이 유발법에 의해 생성될 수 있다.

전술한 방법들에서 양성 선별/스크리닝 단계(b), 음성 선별/스크리닝 단계(c) 또는 양성 및 음성 선별/스크리닝 단계 (b) 및 (c) 둘 다를 포함하나 이들에 한정되지 않는 선별/스크리닝 단계의 엄격도는, 경우에 따라 선별/스크리닝 엄격도를 변화시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 양성 선별/스크리닝 단계(b), 음성 선별/스크리닝 단계(c) 또는 양성 및 음성 선별/스크리닝 단계 (b) 및 (c) 둘 다는 리포터의 사용을 포함하며, 이때 상기 리포터는 형광 활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting; FACS)에 의해 검출되거나 또는 발광에 의해 검출된다. 경우에 따라, 상기 리포터는 세포 표면 상, 파지 디스플레이 상 등에서 나타나고, 비천연 아미노산 또는 유사체와 관련되는 친화성 또는 촉매 활성에 기초하여 선별된다. 일 실시형태에서, 돌연변이된 합성효소는 세포 표면 상, 파지 디스플레이 상 등에서 나타난다.

재조합 오르토고날 tRNA(O-tRNA)를 제조하는 방법은 (a) 제1 유기체로부터 서프레서 tRNA를 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 tRNA로부터 유도된 돌연변이체 tRNA의 라이브러리를 생성하는 단계; (b) 제1 유기체로부터의 RS의 부재하에 제2 유기체로부터의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)에 의해 아미노아실화되는 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA에 대해 상기 라이브러리를 선별(음성 선별을 포함하나 이에 한정되지 않음) 또는 스크리닝하여 tRNA(경우에 따라, 돌연변이체)의 풀을 제공하는 단계; 및 (c) 도입된 오르토고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화되는 구성원에 대해 상기 tRNA(경우에 따라, 돌연변이체)의 풀을 선별 또는 스크리닝함으로써 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계(여기서, 상기 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하고, 상기 제2 유기체로부터의 RS에 의해 효율적으로 인식되지 않으며, 상기 O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화됨)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 하나 이상의 tRNA는 서프레서 tRNA이고/이거나 천연 및/또는 비천연 염기로 된 독특한 3 염기 코돈을 포함하거나, 넌센스 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 4개 이상의 염기를 포함하는 코돈, 앰버 코돈, 오커 코돈 또는 오팔 정지 코돈이다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 O-tRNA는 개선된 오르토고날성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 경우에 따라 O-tRNA를 변형시킬 필요없이 제2 유기체로부터 제1 유기체 내로 도입할 수 있음을 이해할 것이다. 다양한 실시형태에서, 제1 유기체와 제2 유기체는 동일하거나 상이하고, 경우에 따라 원핵생물(메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 에스케리치아 콜라이, 할로박테리움 등을 포함하나 이들에 한정되지 않음), 진핵생물, 포유동물, 진균류, 효모, 고세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 것들로부터 선택된다. 또한, 재조합 tRNA는 경우에 따라 비천연 아미노산에 의해 아미노아실화되며, 이때 상기 비천연 아미노산은 천연적으로 또는 유전자 조작을 통해 생체내에서 생합성된다. 경우에 따라, 비천연 아미노산을 적어도 제1 유기체 또는 제2 유기체에 대한 배양 배지에 첨가하며, 이때 상기 비천연 아미노산은 이 비천연 아미노산이 비천연 아미노산 폴리펩티드 내로 도입될 수 있도록 적절한 세포내 농도에 도달할 수 있다.

일 양태에서, 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 아미노아실화되는 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA에 대해 라이브러리를 선별(음성 선별을 포함하나 이에 한정되지 않음) 또는 스크리닝하는 단계[단계 (b)]는, 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 독성 마커 유전자(또는 독성 물질 또는 세포 성장 억제 물질을 생성하는 유전자 또는 유기체에 필수적인 유전자로서, 이러한 마커 유전자는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함함) 및 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 라이브러리를 제2 유기체 유래의 복수개의 세포 내로 도입하는 단계; 및 하나 이상의 오르토고날 tRNA 또는 비기능적 tRNA를 포함하는 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 함유하는 생존 세포를 선별하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 생존 세포는 비교 비율 세포 밀도 분석을 이용함으로써 선별할 수 있다.

또 다른 양태에서, 상기 독성 마커 유전자는 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 방법의 또 다른 실시형태에서, 상기 독성 마커 유전자는 리보뉴클레아제 바르나제 유전자이며, 이때 상기 리보뉴클레아제 바르나제 유전자는 하나 이상의 앰버 코돈을 포함한다. 경우에 따라, 상기 리보뉴클레아제 바르나제 유전자는 2개 이상의 앰버 코돈을 포함할 수 있다.

일 실시형태에서, 도입된 오르토고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화되는 구성원에 대해 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 선별 또는 스크리닝하는 단계는, 양성 선별 또는 스크리닝 마커 유전자[여기서, 상기 양성 마커 유전자는 약물 내성 유전자(하나 이상의 앰버 정지 코돈과 같은 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 β-락타마제 유전자를 포함하나 이에 한정되지 않음) 또는 유기체에 필수적인 유전자, 또는 독성 물질을 해독시키는 유전자를 O-RS와 함께 포함함]; 및 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 제2 유기체 유래의 복수개의 세포 내로 도입하는 단계; 및 항생제를 포함하나 이들에 한정되지 않는 선별제 또는 스크리닝제의 존재하에 성장한 생존 세포 또는 스크리닝된 세포를 확인함으로써 하나 이상의 재조합 tRNA를 갖는 세포의 풀을 제공하는 단계(여기서, 상기 하나 이상의 재조합 tRNA는 O-RS에 의해 아미노아실화되고, 하나 이상의 셀렉터 코돈에 반응하여 양성 마커 유전자에 의해 코딩되는 번역 생성물 내에 아미노산을 삽입함)를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 선별제 및/또는 스크리닝제의 농도는 변화된다.

특이적 O-tRNA/O-RS 쌍을 생성하는 방법이 제공된다. 이 방법은 (a) 제1 유기체로부터의 하나 이상의 tRNA로부터 유도된 돌연변이체 tRNA의 라이브러리를 생성하는 단계; (b) 제1 유기체로부터의 RS의 부재하에 제2 유기체로부터의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)에 의해 아미노아실화되는 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA에 대해 상기 라이브러리를 음성적으로 선별 또는 스크리닝함으로써 (경우에 따라, 돌연변이체) tRNA의 풀을 제공하는 단계; (c) 도입된 오르토고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화되는 구성원에 대해 (경우에 따라, 돌연변이체) 상기 tRNA의 풀을 선별 또는 스크리닝함으로써 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계를 포함한다. 하나 이상의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하고, 상기 제2 유기체로부터의 RS에 의해 효율적으로 인식되지 않으며, 상기 O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화된다. 또한, 이 방법은 (d) 제3 유기체로부터의 하나 이상의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)로부터 유도된 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 라이브러리를 생성하는 단계; (e) 비천연 아미노산 및 천연 아미노산의 존재하에 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 구성원에 대해 상기 돌연변이체 RS의 라이브러리를 선별 또는 스크리닝하여 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS의 풀을 제공하는 단계; 및 (f) 비천연 아미노산의 부재하에 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 (경우에 따라, 돌연변이체) RS에 대해 상기 풀을 음성적으로 선별 또는 스크리닝함으로써, 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍을 제공하는 단계(여기서, 상기 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 비천연 아미노산에 특이적인 하나 이상의 재조합 O-RS 및 하나 이상의 재조합 O-tRNA를 포함함)를 포함한다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 특이적인 0-tRNA/O-RS 쌍은 본원에 기재된 범위 및 방법에 포함된다. 예를 들어, 상기 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 mutRNATyr-mutTyrRS 쌍, 예컨대 mutRNATyr-SS12TyrRS 쌍, mutRNALeu-mutLeuRS 쌍, mutRNAThr-mutThrRS 쌍, mutRNAGlu-mutGluRS 쌍 등을 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 이러한 방법은 제1 유기체와 제3 유기체가 동일한(메타노코커스 잔나스키이를 포함하나 이에 한정되지 않음) 경우를 포함한다.

또한, 제2 유기체의 생체내 번역 시스템에 사용하기 위한 오르토고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선별하는 방법도 본원에 기재된 방법에 포함된다. 이 방법은 마커 유전자, tRNA, 및 제1 유기체로부터 단리되거나 유도된 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)를 제2 유기체 유래의 세포로 구성된 제1 세트 내로 도입하는 단계; 상기 마커 유전자 및 상기 tRNA를 제2 유기체 유래의 중복(duplicate) 세포 세트 내로 도입하는 단계; 및 상기 중복 세포 세트에서는 생존하지 못하지만 상기 제1 세트에서는 생존하는 세포를 선별하거나, 상기 중복 세포 세트에서는 제공하지 못하는 특이적인 스크리닝 반응을 나타내는 세포를 스크리닝하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 제1 세트와 상기 중복 세포 세트는 선별제 또는 스크리닝제의 존재하에 배양되고, 상기 생존 세포 또는 스크리닝된 세포는 제2 유기체의 생체내 번역 시스템에서 사용하기 위한 오르토고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 포함한다. 일 실시형태에서, 비교 및 선별 또는 스크리닝은 생체내 상보성 분석을 포함한다. 상기 선별제 또는 스크리닝제의 농도는 변화시킬 수 있다.

본원에 기재된 유기체는 다양한 유기체와 다양한 조합을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 유기체는 경우에 따라 메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 에스케리치아 콜라이, 에이. 풀기더스, 피. 푸리오서스, 피. 호리코쉬이, 에이. 페르닉스, 티. 써모필러스 등을 포함하나 이들에 한정되지 않는 원핵생물 유기체이다. 대안으로, 상기 유기체는 식물(복합 식물, 예컨대 외떡잎 식물 또는 쌍떡잎 식물을 포함하나 이에 한정되지 않음), 조류, 원생생물, 진균류(효모 등을 포함하나 이에 한정되지 않음), 동물(포유동물, 곤충, 절지동물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않음) 등을 포함하나 이들에 한정되지 않는 진핵 유기체이다.

A. 비진핵생물 및 진핵생물에서의 발현

본 섹션에 개시된 기법은 본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 비진핵생물 및 진핵생물에서의 발현에 적용될 수 있다. 이러한 발현 시스템에 대해서는 미국 특허 출원에 기재되어 있다.

본원에 기재된 진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포는 비천연 아미노산을 유용한 다량으로 포함하는 폴리펩티드를 합성할 수 있는 능력을 제공한다. 일 양태에서, 조성물은 경우에 따라 10 ㎍ 이상, 50 ㎍ 이상, 75 ㎍ 이상, 100 ㎍ 이상, 200 ㎍ 이상, 250 ㎍ 이상, 500 ㎍ 이상, 1 mg 이상, 10 mg 이상, 100 mg, 1 g 이상, 또는 그 이상의 비천연 아미노산 함유 폴리펩티드, 또는 생체내 폴리펩티드 제조 방법(재조합 단백질 제조 및 정제에 대한 상세한 설명은 본원에 제공되어 있음)으로 얻어질 수 있는 양의 비천연 아미노산 함유 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 상기 폴리펩티드는 경우에 따라, 세포 용해물, 완충액, 약학적 완충액 또는 다른 액체 현탁액을 포함하나 이들에 한정되지 않는 액체(약 1 nl∼약 100 L 또는 그 이상의 임의의 부피를 포함하나 이에 한정되지 않는 부피를 가짐) 1 L당 10 ㎍ 이상, 50 ㎍ 이상, 75 ㎍ 이상, 100 ㎍ 이상, 200 ㎍ 이상, 250 ㎍ 이상, 500 ㎍ 이상, 1 mg 이상 또는 10 mg 이상, 또는 그 이상의 폴리펩티드 농도(이에 한정되지 않음)로 조성물 중에 존재한다. 진핵 세포에서 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 다량(시험관내 번역을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 방법을 이용하여 얻을 수 있는 전형적인 양보다 많은 양을 포함하나 이에 한정되지 않음) 제조하는 것은 본원에 기재된 방법, 기법 및 조성물의 한 특징이다.

본원에 기재된 진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포는 비천연 아미노산을 포함하는 유용한 다량의 단백질을 생합성하는 능력을 제공한다. 예를 들어, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는, 세포 추출물, 세포 용해물, 배양 배지 및/또는 완충액 등 중 10 ㎍/L 이상, 50 ㎍/L 이상, 75 ㎍/L 이상, 100 ㎍/L 이상, 200 ㎍/L 이상, 250 ㎍/L 이상, 또는 500 ㎍/L 이상, 1 mg/L 이상, 2 mg/L 이상, 3 mg/L 이상, 4 mg/L 이상, 5 mg/L 이상, 6 mg/L 이상, 7 mg/L, 8 mg/L 이상, 9 mg/L 이상, 10 mg/L 이상, 적어도 20 mg/L, 30 mg/L, 40 mg/L, 50 mg/L, 60 mg/L, 70 mg/L, 80 mg/L, 90 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L, 300 mg/L, 400 mg/L, 500 mg/L, 600 mg/L, 700 mg/L, 800 mg/L, 900 mg/L, 1 g/L, 5 g/L, 10 g/L 또는 그 이상의 단백질 농도(이에 한정되지 않음)로 제조될 수 있다.

본 섹션에 개시된 기법은 본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 발현 시스템, 배양 및 단리에 적용될 수 있다. 비천연 아미노산 폴리펩티드는 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포 및 박테리아를 비롯한 임의의 수의 적합한 발현 시스템에서 발현될 수 있다.

일단 재조합 숙주 세포 균주가 확립되면(즉, 발현 구성체가 숙주 세포 내로 도입되었고, 적절한 발현 구성체를 갖는 숙주 세포가 단리되면), 재조합 숙주 세포 균주를 폴리펩티드의 제조에 적합한 조건하에 배양한다. 재조합 숙주 세포 균주의 배양 방법은 사용되는 발현 구성체의 특성 및 숙주 세포의 본질에 따라 달라진다. 재조합 숙주 균주는 공지된 방법을 이용하여 통상적으로 배양한다. 일반적으로, 재조합 숙주 세포는 탄소, 질소 및 무기염의 동화 가능한 공급원과, 경우에 따라, 비타민, 아미노산, 성장 인자 및 다른 단백질성 배양 보충물을 함유하는 액체 배지 중에서 배양된다. 숙주 세포 배양용 액체 배지는 경우에 따라 바람직하지 않은 미생물의 증식을 방지하는 항생제 또는 항진균제, 및/또는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선별을 위한 항생제를 포함하나 이에 한정되지 않는 화합물을 함유할 수 있다.

재조합 숙주 세포는 회분식 또는 연속식으로 세포를 수거하거나(목적 폴리펩티드가 세포 내에 축적되는 경우) 또는 배양 상청액을 수거하면서 회분식 또는 연속식으로 배양할 수 있다. 원핵 숙주 세포에서 제조하는 경우, 회분식 배양 및 세포 수거가 바람직하다. 단백질 발현이 세포 또는 세포주 발현 시스템을 통해 이루어지는 경우, 배양물 전부를 현탁액 중에서 배양하는 고정 수단 비의존적 세포 배양 또는 증식을 위해 고체 지지체에 부착시킬 것이 요구되는 고정 수단 의존적 세포 배양(즉, 단일층 유형의 세포 성장)을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 방법으로 세포를 시험관내에서 증식시킬 수 있다. 연속적인 확립된 세포주로부터의 고정 수단 비의존적 배양 또는 현탁 배양은 세포 및 세포 생성물의 대규모 제조를 위한 가장 널리 이용되는 방법이다. 또한, 세포 종류 및 증식 방식은 전술한 다양한 제조 고려사항에 기초하여 선택할 수 있다.

일 실시형태에서, 본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 재조합 시스템에서 발현시킨 후 정제한다. 상기 폴리펩티드는 공지된 다양한 방법에 의해 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 통상적으로, 박테리아 숙주 세포에서 생성된 많은 폴리펩티드가 난용성 또는 불용성(봉입체 형태)일 수 있다. 일 실시형태에서, 본원에 개시된 방법을 이용하여 재조합적으로 제조된 폴리펩티드의 용해도를 증가시키기 위한 목적으로 선택된 아미노산 치환을 폴리펩티드 내로 용이하게 도입할 수 있다. 불용성 폴리펩티드의 경우, 이 폴리펩티드를 원심분리 또는 여과에 의해 숙주 세포 용해물로부터 수거한 후 추가로 세포의 균질화를 실시할 수 있다. 난용성 폴리펩티드의 경우, 폴리에틸렌 이민(PEI)을 포함하나 이에 한정되지 않는 화합물을 첨가하여 부분 용해성 폴리펩티드의 침전을 유도할 수 있다. 그 후, 침전된 폴리펩티드를 원심분리 또는 여과에 의해 편리하게 수거할 수 있다. 재조합 숙주 세포를 파괴하거나 균질화하여, 공지된 방법을 이용하여 세포 내로부터 봉입체를 방출시킬 수 있다. 숙주 세포 파괴 또는 균질화는 효소에 의한 세포 파괴, 초음파 처리, 다운스(dounce) 균질화 또는 고압 방출 파괴를 포함하나 이들에 한정되지 않는 잘 알려진 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 본원에 기재되고 본원에 포함되는 방법의 일 실시형태에서, 고압 방출 기법을 이용하여 이. 콜라이 숙주 세포를 파괴하여 폴리펩티드의 봉입체를 방출시킬 수 있다. 폴리펩티드의 봉입체를 취급하는 경우, 가용화, 기계적 전단 또는 단백질 분해와 같은 요인으로 인한 손실없이 봉입체의 수율을 최대화하기 위해, 반복 수행시 균질화 시간을 최소화하는 것이 유리하다.

그 후, 공지된 다수의 적절한 가용화제 중 어느 하나를 사용하여 불용성 또는 침전된 폴리펩티드를 가용화할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 우레아 또는 구아니딘 염산염으로 가용화한다. 편리하게 취급할 수 있는 회분 크기를 이용하여 큰 회분을 생산할 수 있도록, 가용화된 폴리펩티드의 부피를 최소화해야 한다. 이 요인은 재조합 숙주가 부피가 수천 리터인 회분으로 배양될 수 있는 대규모 상업적 셋팅에 있어서 중요할 수 있다. 또한, 특히 인간을 대상으로 한 의약 용도에 있어서는, 대규모 상업적 셋팅으로 폴리펩티드를 제조하는 경우, 기계류 및 용기, 또는 폴리펩티드 생성물 자체에 손상을 줄 수 있는 독한 화학물질은 가능한 한 피해야 한다. 보다 독한 변성제인 구아니딘 염산염 대신에 더 순한 변성제인 우레아를 사용하여 폴리펩티드 봉입체를 가용화할 수 있다는 점이 본원에 기재되고 본원에 포함되는 방법에서 밝혀졌다. 우레아의 사용은 폴리펩티드 봉입체를 효율적으로 가용화하면서 폴리펩티드의 제조 및 정제 공정에서 사용되는 스테인레스 스틸 장치에 대한 손상 위험을 현저하게 감소시킨다.

가용성 폴리펩티드의 경우, 펩티드는 주변세포질 공간 또는 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 또한, 가용성 펩티드는 숙주 세포의 세포질 내에 존재할 수 있다. 정제 단계를 수행하기 전에 가용성 펩티드를 농축시킬 수 있다. 본원에 기재된 기법을 포함하나 이에 한정되지 않는 공지된 기법을 이용하여, 예를 들어 세포 용해물 또는 배양 배지로부터 가용성 펩티드를 농축시킬 수 있다. 또한, 본원에 기재된 기법을 포함하나 이에 한정되지 않는 공지된 기법을 이용하여, 숙주 세포를 파괴하고 숙주 세포의 세포질 또는 주변세포질 공간으로부터 가용성 펩티드를 방출시킬 수 있다.

폴리펩티드가 융합 단백질로서 생성되는 경우, 융합 서열을 제거하는 것이 바람직하다. 융합 서열의 제거는 효소적 또는 화학적 절단을 포함하나 이들에 한정되지 않는 다수의 방법에 의해 수행될 수 있으며, 효소적 절단이 바람직하다. 융합 서열의 효소적 제거는 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 융합 서열의 제거를 위한 효소의 선택은 융합의 종류에 의해 결정되게 되며, 반응 조건은 효소의 선택에 의해 구체적으로 결정된다. 화학적 절단은 시아노겐 브로마이드, TEV 프로테아제 및 다른 시약을 포함하나 이들에 한정되지 않는 시약을 사용하여 수행할 수 있다. 절단된 폴리펩티드는 경우에 따라 공지된 방법에 의해 절단된 융합 서열로부터 정제된다. 이러한 방법은 융합 서열 및 폴리펩티드의 본질 및 특성에 의해 결정될 것이다. 정제 방법은 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 투석, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.

또한, 폴리펩티드는 경우에 따라 단백질 용액으로부터 DNA를 제거하기 위해 정제된다. DNA는, 예를 들어 침전 또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하나 이들에 한정되지 않는 공지된 방법에 의해 제거될 수 있다. 일 실시형태에서, DNA는, 예를 들어 프로타민 설페이트와 같은 핵산 침전제를 사용한 침전에 의해 제거된다. 폴리펩티드는 원심분리 또는 여과를 포함하나 이들에 한정되지 않는 공지된 방법을 이용하여 침전된 DNA로부터 분리할 수 있다. 숙주 핵산 분자의 제거는 폴리펩티드가 인간을 치료하는 데 사용되는 셋팅에서 중요한 인자이며, 본원에 기재된 방법은 숙주 세포 DNA를 약학적으로 허용되는 수준으로 감소시킨다.

또한, 발효기, 진탕 플라스크, 유동층 생물반응기(bioreactor), 중공 섬유 생물반응기, 롤러 보틀(roller bottle) 배양 시스템 및 교반 탱크 생물반응기 시스템을 포함하나 이들에 한정되지 않는 소규모 또는 대규모 발효 방법을 단백질 발현에 이용할 수 있다. 이러한 방법들 각각은 회분식, 반회분식 또는 연속식 공정으로 수행될 수 있다.

본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 인간 형태는 일반적으로 당업계의 공지된 방법을 이용하여 회수할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지 또는 세포 용해물을 원심분리하거나 여과하여 세포 잔해물을 제거할 수 있다. 상청액을 원하는 부피로 농축 또는 희석하거나, 추가 정제를 위해 제제를 컨디셔닝하는 데 적합한 완충액으로 투석여과할 수 있다. 본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 추가 정제는 상응하는 온전한 형태로부터 폴리펩티드 변이체의 탈아미드화 형태 및 절단된 형태를 분리하는 단계를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

비천연 아미노산, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대한 항체, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 대한 결합 파트너를 포함하나 이에 한정되지 않는 본원에 기재된 방법 및 조성물에 포함되는 폴리펩티드는, 공지된 방법에 따라 부분적으로 균질하게 또는 실질적으로 균질하게 정제할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 폴리펩티드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 또는 염기 추출, 컬럼 크로마토그래피, 친화성 컬럼 크로마토그래피, 음이온 교환 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피 및 이들의 임의의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않는 공지된 방법에 의해 회수 및 정제될 수 있다. 필요에 따라, 정확히 폴딩된 성숙 단백질을 형성하기 위해 단백질 리폴딩 단계가 이용될 수 있다. 고순도가 요구되는 경우 최종 정제 단계에 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 친화성 크로마토그래피 또는 다른 적절한 방법을 이용할 수 있다. 일 실시형태에서, 비천연 아미노산(또는 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드)에 대한 생성된 항체는 하나 이상의 비천연 아미노산(들)을 포함하는 폴리펩티드의 친화성에 기초한 정제(이에 한정되지 않음)를 위한 정제 시약으로서 사용된다. 일단 폴리펩티드가 필요에 따라 부분적으로 또는 균질한 정도로 정제되면, 이 폴리펩티드는 경우에 따라 분석 성분, 치료제, 예방제, 진단제, 연구 시약 및/또는 항체 제조용 면역원을 포함하나 이들에 한정되지 않는 다종 다양한 용도에 사용된다.

진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포에서 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 것의 한 가지 장점은, 전형적으로 폴리펩티드가 그의 천연 입체구조로 폴딩된다는 점이다. 그러나, 본원에 기재된 방법 및 조성물의 특정 실시형태에서, 합성, 발현 및/또는 정제 후, 폴리펩티드는 관련 폴리펩티드의 원하는 입체구조와는 상이한 입체구조를 가질 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물의 일 양태에서, 발현된 단백질을 경우에 따라 변성시킨 후 재생시킨다. 이러한 임의의 변성 및 재생은, 샤페로닌(chaperonin)을 원하는 폴리펩티드에 첨가하는 방법, 폴리펩티드를 카오트로픽제(chaotropic agent)(구아니딘 HCl을 포함하나 이에 한정되지 않음) 중에서 가용화하는 방법 및 단백질 디설파이드 이소머라제를 사용하는 방법을 포함하나 이들에 한정되지 않는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행한다.

일반적으로, 발현된 폴리펩티드를 변성시키고 환원시킨 후, 폴리펩티드를 바람직한 입체구조로 리폴딩하는 것이 종종 바람직하다. 예를 들어, 이러한 리폴딩은 구아니딘, 우레아, DTT, DTE 및/또는 샤페로닌을 원하는 번역 생성물에 첨가하여 수행할 수 있다. 단백질의 환원, 변성 및 재생 방법에 대해서는 상기 참고 문헌들과 문헌[Debinski, et al., (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070]; 문헌[Kreitman and Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585]; 및 문헌[Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270]을 참조할 수 있다. 예를 들어, Debinski 등의 문헌은 구아니딘-DTE 중에서의 봉입체 단백질의 변성 및 환원에 관해 개시한다. 이 단백질은 산화된 글루타티온 및 L-아르기닌을 포함하나 이들에 한정되지 않는 산화환원 완충액 중에서 리폴딩될 수 있다. 리폴딩 시약은 유동하거나 다른 방식으로 이동하여 하나 이상의 폴리펩티드 또는 다른 발현 생성물과 접촉할 수 있고, 반대로 하나 이상의 폴리펩티드 또는 다른 발현 생성물이 유동하거나 이동하여 리폴딩 시약과 접촉할 수 있다.

비천연 아미노산 폴리펩티드를 원핵생물에서 제조하는 경우, 그렇게 제조된 폴리펩티드는 미스폴딩되어 생물학적 활성을 갖지 않거나 감소된 생물학적 활성을 가질 수 있다. 이 단백질의 생물학적 활성은 "리폴딩"에 의해 회복될 수 있다. 일 실시형태에서, 미스폴딩된 폴리펩티드는, 예를 들어 하나 이상의 카오트로픽제(우레아 및/또는 구아니딘을 포함하나 이에 한정되지 않음), 및 디설파이드 결합을 환원시킬 수 있는 환원제[디티오트레이톨(DTT) 또는 2-머캅토에탄올(2-ME)을 포함하나 이에 한정되지 않음]를 사용하여 폴리펩티드 쇄를 가용화하고(이때, 폴리펩티드는 또한 불용성임), 언폴딩하고, 환원시킴으로써 리폴딩한다. 그 후, 중간 정도의 무질서 상태에서, 디설파이드 결합을 재형성시키는 산화제(예를 들어, 산소, 시스틴 또는 시스타민)를 첨가한다. 언폴딩된 또는 미스폴딩된 폴리펩티드는 공지된 방법, 예컨대 전술한 내용과 관련하여 본원에서 참고로 인용되는 미국 특허 제4,511,502호, 제4,511,503호 및 제4,512,922호에 기재된 방법을 이용하여 리폴딩할 수 있다. 또한, 폴리펩티드를 다른 단백질과 코폴딩하여 이종이량체 또는 이종다량체를 형성할 수 있다. 리폴딩 또는 코폴딩 후, 폴리펩티드를 추가로 정제할 수 있다.

정제 후, 비천연 아미노산 폴리펩티드를, 상이한 완충액으로 교환하고/하거나, 투석여과 및 투석을 포함하나 이들에 한정되지 않은 공지된 방법으로 농축시킬 수 있다. 단일 정제 단백질로서 제공되는 hGH는 응집시키고 침전시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 정제된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 순도는 [역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 또는 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 측정시] 90% 이상일 수 있다. 다른 특정 실시형태에서, 상기 정제된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 순도는 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 또는 그 이상일 수 있다. 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드의 순도의 정확한 수치값과 관계없이, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드의 순도는 약학 제품으로서 사용하거나 PEG와 같은 수용성 중합체와의 접합을 포함하나 이에 한정되지 않은 추가 공정에 사용하기에 충분하다.

특정 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드 분자는 (부형제, 담체 및 안정화제, 혈청 알부민 등 외에) 다른 활성 성분 또는 단백질의 부재하에서 치료제로서 사용될 수 있고, 특정 실시형태에서 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 또 다른 폴리펩티드 또는 중합체와 착물을 형성할 수 있다.

단백질 염색 방법과 결부된 SDS-PAGE, 면역블롯팅, 질량 분광분석법, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분광분석법(MALDI-MS), 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법, 등전 포커싱, 분석용 음이온 교환, 크로마토포커싱 및 원평광 이색성 분광분석법(circular dichroism)을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 다종 다양한 방법 및 절차를 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 수율 및 순도를 평가하는 데 이용할 수 있다. 예를 들어, 단백질 특성 분석을 위한 그러한 방법 및 절차의 예로는 브래드포드 분석법, SDS-PAGE 및 은 염색 SDS-PAGE, 코마시 염색 SDS-PAGE를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 추가 방법은 내독소를 제거하는 단계를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 내독소는 그램 음성 숙주 세포, 예컨대, 에쉐리키아 콜라이의 외막 상에 위치된 리포폴리사카라이드(LPS)이다. 내독소 수준을 감소시키는 방법은 실리카 지지체, 유리 분말 또는 하이드록시아파타이트를 사용한 정제 기법, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이 방법들의 조합 등을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 원하는 폴리펩티드로부터 오염 물질, 예컨대 동시 이동하는 단백질을 제거하기 위한 변형 방법 또는 추가 방법이 필요할 수 있다. 내독소 수준의 측정 방법으로는 리뮬러스 아메보사이트 용해물(Limulus Amebocyte Lysate; LAL) 분석을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

특정 실시형태에서, 화학식 I∼XV의 범위 내에 속하는 임의의 하위 화학식의 화합물 또는 특정 화합물을 비롯한 화학식 I∼XV의 아미노산을 생합성에 의해 폴리펩티드 내로 도입함으로써 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 다른 실시형태에서, 이러한 아미노산을 폴리펩티드 내의 특정 부위에 도입한다. 다른 실시형태에서, 이러한 아미노산을 번역 시스템을 이용하여 폴리펩티드로 도입한다. 다른 실시형태에서, 이러한 번역 시스템은 (i) 상기 아미노산의 도입을 위한 예정된 부위에 상응하는 셀렉터 코돈을 포함하며 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 상기 아미노산을 포함하며 상기 셀렉터 코돈에 특이적인 tRNA를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시형태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 번역 시스템에서 생성된 mRNA이다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시형태에서, 상기 번역 시스템은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 또는 파지를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시형태에서, 상기 번역 시스템은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 DNA를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시형태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA 내로 안정하게 통합된다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시형태에서, 상기 번역 시스템은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 독특한 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 5 염기 코돈 및 4 염기 코돈으로 구성된 군에서 선택된 셀렉터 코돈에 특이적인 tRNA를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시형태에서, 상기 tRNA는 서프레서 tRNA이다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시형태에서, 상기 번역 시스템은 상기 아미노산으로 아미노아실화되는 tRNA를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시형태에서, 상기 번역 시스템은 상기 tRNA에 특이적인 아미노아실 합성효소를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시형태에서, 상기 번역 시스템은 오르토고날 tRNA 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소를 포함한다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시형태에서, 상기 폴리펩티드는 리보솜에 의해 합성되고, 추가 실시형태에서, 상기 번역 시스템은 박테리아 세포, 고세균 세포 및 진핵 세포로 구성된 군에서 선택된 세포를 포함하는 생체내 번역 시스템이다. 다른 실시형태에서, 상기 세포는 에스케리치아 콜라이 세포, 효모 세포, 슈도모나스 종 유래의 세포, 포유동물 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포이다. 이러한 번역 시스템의 다른 실시형태에서, 상기 번역 시스템은 박테리아 세포, 고세균 세포 또는 진핵 세포로부터의 세포 추출물을 포함하는 시험관내 번역 시스템이다. 다른 실시형태에서, 상기 세포 추출물은 에스케리치아 콜라이 세포, 슈도모나스 종 유래의 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 식물 세포 또는 곤충 세포로부터 유래된 것이다. 다른 실시형태에서, 상기 폴리펩티드의 적어도 일부는 고체상 펩티드 합성 또는 용액상 펩티드 합성 또는 이들의 조합에 의해 합성되는 한편, 다른 실시형태는 상기 폴리펩티드를 또 다른 폴리펩티드에 결찰시키는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 화학식 I∼XV의 범위 내에 속하는 임의의 하위 화학식의 화합물 또는 특정 화합물을 비롯한 화학식 I∼XV의 아미노산은 생합성에 의해 폴리펩티드 내로 도입될 수 있고, 이때 상기 폴리펩티드는 치료용 단백질과 상동성인 단백질이다.

B. 생체내 번역 후 변형

하나 이상의 비천연 아미노산을 갖는 원하는 폴리펩티드를 진핵 세포에서 제조하는 것에 의하면, 이러한 폴리펩티드는 진핵 세포에서의 번역 후 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 비천연 아미노산과, 진핵 세포에 의해 생체내에서 만들어지는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하며, 이때 상기 번역 후 변형은 원핵 세포에 의해서는 만들어지지 않는다. 예를 들어, 번역 후 변형은 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미테이트 부가, 인산화, 당지질 결합 변형, 글리코실화 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 일 양태에서, 상기 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라긴 결합에 의해 올리고사카라이드[(GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc를 포함하나 이에 한정되지 않음]를 아스파라긴에 부착시키는 것을 포함한다. 진핵 세포 단백질의 N 결합 올리고사카라이드의 몇 가지 예를 열거하는 하기 표 1을 참조할 수 있다(기재되지 않은 추가 잔기도 존재할 수 있음). 또 다른 양태에서, 상기 번역 후 변형은 GalNAc-세린 또는 GalNAc-트레오닌 결합, 또는 GlcNAc-세린 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 올리고사카라이드(Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않음)를 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 포함한다.

섹션 1.01

[표 1] GlcNAc 결합에 의한 올리고사카라이드의 예

또 다른 양태에서, 상기 번역 후 변형은 전구체[칼시토닌 전구체, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 전구체, 전전구 부갑상선(preproparathyroid) 호르몬, 전전구 인슐린(preproinsulin), 전구 인슐린(proinsulin), 전전구 오피오멜라노코르틴(prepro-opiomelanocortin), 전구 오피오멜라노코르틴(pro-opiomelanocortin) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않음]의 단백질 분해 처리, 다중 서브유닛(multisubunit) 단백질 또는 거대분자 조립체로의 조립, 세포 내 다른 부위로의 이동(소기관, 예를 들어 소포체, 골지체, 핵, 리소좀, 퍼옥시좀, 미토콘드리아, 엽록체, 액포 등으로의 이동 또는 분비 경로를 통한 이동을 포함하나, 이들에 한정되지 않음)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 단백질은 분비 또는 위치 지정 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합 등을 포함한다.

비천연 아미노산의 한 가지 장점은 이것이 추가 분자를 부가하는 데 사용될 수 있는 추가 화학적 부분을 제공한다는 것이다. 이러한 변형은 진핵 세포 또는 비진핵 세포의 생체내에서 또는 시험관내에서 이루어질 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 번역 후 변형은 비천연 아미노산을 통해 이루어진다. 예를 들어, 상기 번역 후 변형은 친핵성-친전자성 반응을 통해 이루어질 수 있다. 현재, 단백질의 선택적 변형에 사용되는 대부분의 반응은 α-할로케톤과 히스티딘 또는 시스테인 측쇄의 반응을 포함하나 이들에 한정되지 않는 친핵성 반응 파트너와 친전자성 반응 파트너 사이의 공유 결합 형성과 관련되어 있다. 이러한 경우, 선택성은 단백질 내의 친핵성 잔기의 수 및 접근 용이성에 의해 결정된다. 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 본원에 기재된 방법을 이용하여 제조한 폴리펩티드에 있어서, 시험관내 및 생체내에서의 비천연 카보닐 아미노산과 하이드라진의 반응을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 더 선택적인 반응들이 이용될 수 있다. 대표적 예는 문헌[Cornish, et al., (1996) J. Am. Chem. Soc., 118: 8150-8151]; 문헌[Mahal, et al., (1997) Science, 276: 1125-1128]; 문헌[Wang, et al., (2001) Science 292: 498-500]; 문헌[Chin, et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124: 9026-9027]; 문헌[Chin, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., 99: 11020-11024]; 문헌[Wang, et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci., 100: 56-61]; 문헌[Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42: 6735-6746]; 및 문헌[Chin, et al., (2003) Science, 301:964-967]에서 찾아볼 수 있다. 이는 형광단, 가교결합제, 사카라이드 유도체 및 세포 독성 분자를 비롯한 다수의 시약으로 사실상 어떠한 단백질도 선택적으로 표지할 수 있게 한다. 또한, 전술한 내용과 관련하여 본원에서 참고로 인용되는, 2003년 1월 16일 출원된 미국 특허 출원 제10/686,944호(발명의 명칭: "Glycoprotein synthesis")를 참조할 수 있다. 또한, 아지도 아미노산을 통한 번역 후 변형을 포함하나 이에 한정되지 않는 번역 후 변형은 스타우딩어 결찰(Staudinger ligation)(트리아릴포스핀 시약을 이용한 결찰을 포함하나 이에 한정되지 않음)을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 문헌[Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24]을 참조할 수 있다.

IX. 비천연 아미노산 폴리펩티드의 제조를 위한 대체 시스템

비재조합 숙주 세포, 돌연변이된 숙주 세포 또는 무세포 시스템에서 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위해 몇 가지 방법들이 이용되었다. 이와 관련한 추가 정보는 미국 특허 출원 제11/316,534호에서 찾아볼 수 있다.

X. 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분의 번역 후 변형

편의상, 본 섹션(XA∼XJ)에 기재된 화합물의 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분의 번역 후 변형은 개괄적으로 및/또는 구체적인 예를 들어 설명하였다. 그러나, 본 섹션에 기재된 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분의 번역 후 변형은 본 섹션에 제공된 일반적인 설명 또는 구체적인 예에만 한정되는 것이 아니며, 본 섹션에 기재된 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분의 번역 후 변형은 화학식 I∼XV의 범위 내에 속하는 모든 화합물과 구조식 1∼4로 표시되는 화합물(본원의 명세서, 청구의 범위 및 도면에 기재된 화학식 I∼XV 및 구조식 1∼4의 범위 내에 속하는 임의의 하위 화학식의 화합물 또는 특정 화합물을 포함함)에 동일하게 적용된다.

단백질의 생체내 번역 과정에서 비천연 아미노산을 부위 특이적으로 도입하기 위한 방법, 조성물, 기법 및 수단이 개발되었다. 이 기술은, 측쇄의 화학적 성질이, 천연 아미노산의 측쇄의 화학적 성질에 대해 오르토고날인 비천연 아미노산을 도입함으로써, 재조합 단백질의 부위 특이적 유도체화를 가능하게 한다. 그 결과, 본원에 기재된 방법, 조성물, 기법 및 수단의 주요 이점은 유도체화된 단백질이 소정의 균질한 생성물로서 제조될 수 있다는 것이다. 그러나, 본원에 기재된 방법, 조성물, 기법 및 수단은 생체내 단백질 번역 기법에 의해 형성된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 한정되지 않고, 예를 들어, 발현된 단백질 결찰, 화학적 합성, 리보자임에 기초한 기법(예를 들어, 본원의 "대체 시스템에서의 발현" 섹션 참조)을 비롯한 임의의 기법에 의해 형성된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함한다.

비천연 아미노산을 재조합 단백질 내로 도입하는 능력은 번역 후 유도체화를 위해 실시될 수 있는 화학적 기법을 넓게 확장시키는데, 이때 이러한 유도체화는 생체내 또는 시험관내에서 일어난다. 보다 구체적으로, 폴리펩티드의 비천연 아미노산 부분 상의 인돌 결합에 대한 카보닐 및 하이드라진의 반응을 이용하는 폴리펩티드 유도체화는 몇 가지 이점을 제공한다. 첫째, 천연 아미노산은 (a) 하이드라진과 반응하여 인돌 결합을 형성할 수 있는 카보닐기 및 (b) 카보닐기과 반응하여 인돌 결합을 형성할 수 있는 하이드라진기를 포함하지 않으며, 따라서, 이러한 결합을 형성하도록 디자인된 반응제는 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분과 부위 특이적으로 반응함으로써(비천연 아미노산 및 상응하는 반응제가 그러한 결합을 형성하도록 디자인되었다고 가정함), 단백질을 부위 특이적으로 유도체화하는 능력은 공지된 방법을 이용하여 제조한 유도체화된 단백질의 혼합물과는 달리 단일의 균질한 생성물을 제공한다. 둘째, 이러한 인돌 결합은 생물학적 조건하에 안정한데, 이것은 이러한 인돌 결합에 의해 유도체화된 단백질이 치료 용도에 유효한 후보 물질이라는 것을 시사한다. 셋째, 생성된 인돌 결합의 안정성은 인돌 결합이 형성된 비천연 아미노산의 본질(즉, 작용기 및/또는 구조)에 기초하여 조작할 수 있다. 일부 실시형태에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 인돌 결합은 1시간 미만의 분해 반감기, 다른 실시형태에서는 1일 미만의 분해 반감기, 다른 실시형태에서는 2일 미만의 분해 반감기, 다른 실시형태에서는 1주일 미만의 분해 반감기, 다른 실시형태에서는 1주일 초과의 분해 반감기를 갖는다. 다른 실시형태에서, 생성된 인돌 결합은 약산성 조건하에 적어도 2주 동안 안정하며, 다른 실시형태에서, 생성된 인돌 결합은 약산성 조건하에 적어도 5일 동안 안정하다. 다른 실시형태에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 pH 약 2∼약 8에서 적어도 1일 동안 안정하고, 다른 실시형태에서는 pH 약 2∼약 6에서 적어도 1일 동안 안정하며, 다른 실시형태에서 pH 약 2∼약 4에서 적어도 1일 동안 안정하다. 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 수단, 방법, 조성물 및 기법을 이용하여, 용도에 맞게 조정된(예를 들어, 서방형 방출과 같은 치료 용도, 또는 진단 용도, 또는 산업적 용도, 또는 군사적 용도) 분해 반감기를 갖도록 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 인돌 결합을 합성한다.

전술한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 신규 치료제, 진단제, 촉매 효소, 산업용 효소, 결합 단백질(항체 및 항체 단편을 포함하나, 이에 한정되지 않음), 및 단백질 구조 및 기능의 연구(이에 한정되지 않음) 등에 유용하다. 예를 들어, 문헌[Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4: 645-652]을 참조할 수 있다. 전술한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 다른 용도로는, 예를 들어 분석에 기초한 용도, 화장품 용도, 식물 생물학적 용도, 환경적 용도, 에너지 생산 용도 및/또는 군사적 용도를 들 수 있다. 그러나, 전술한 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대해, 폴리펩티드의 치료 유효성의 조절, 폴리펩티드의 안전성 프로필의 개선, 폴리펩티드의 약동학적, 약리학적 및/또는 약력학적 특성의 조절(예를 들어, 수용해도 및 생체이용률의 증가, 혈청 반감기의 증가, 치료 반감기의 증가, 면역원성의 조절, 생물학적 활성의 조절, 또는 순환 시간의 연장), 폴리펩티드에의 추가 작용기의 제공, 폴리펩티드 내로의 태그, 표지 또는 검출 가능한 신호의 도입, 폴리펩티드의 단리 특성의 개선 및 전술한 변형의 임의의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않는 새로운 또는 변형된 기능성을 도입하기 위해 추가 변형을 가할 수 있다.

특정 실시형태에서, 카보닐 함유 비천연 아미노산, 하이드라진 함유 비천연 아미노산으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 이용하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 단리 특성을 개선시키는 방법이 제공된다. 다른 실시형태에서, 이러한 비천연 아미노산은 본원에 기재된 폴리펩티드로 생합성에 의해 도입되었다. 또 다른 또는 대안의 실시형태에서, 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 화학식 I∼XV의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다. 또 다른 또는 대안의 실시형태에서, 이러한 비천연 아미노산 폴리펩티드는 구조식 1∼4로 표시되는 화합물의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다.

본원에 기재된 방법, 조성물, 수단 및 기법은 폴리펩티드의 특정한 종류, 부류 또는 패밀리에 한정되지 않는다. 실질적으로 임의의 폴리펩티드가 본원에 기재된 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 치료용 단백질과 상동성일 수 있다. 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는 또한 성장 호르몬 수퍼유전자 패밀리의 임의의 폴리펩티드 구성원과 상동성일 수 있다.

이러한 변형은, 폴리펩티드의 비천연 아미노산으로, 원하는 작용기를 포함하나 이에 한정되지 않는 추가의 작용기를 도입하는 것을 포함한다.

또한, 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 예를 들어 카보닐 또는 하이드라진과 같은 다른 작용기로 전환될 수 있는 부분을 포함할 수 있다. 도 23은 비천연 아미노산 폴리펩티드를 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 하이드라진 함유 아미노산 폴리펩티드로 화학적으로 전환시키는 것을 예시한다. 형성된 하이드라진 및 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 본원에 기재된 비천연 아미노산, 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특성 분석 및 사용하기 위한 임의의 방법, 조성물, 기법 및 수단에 사용되거나 도입될 수 있다. 화학적 부분의 다른 작용기, 예를 들어 카보닐 또는 하이드라진으로의 화학적 전환은, 예를 들어 문헌[March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 5^th Ed., (Wiley 2001)] 및 문헌[Carey and Sundberg, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4^th, Ed., Vols. A and B (Plenum 2000, 2001)]에 기재된 것과 같은 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

또한, 하이드라진 함유 반응제를 사용한 카보닐 함유 비천연 아미노산의 화학적 변형은, 적절한 여기 상태에서 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 고형광성 인돌 유도체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 도 19 및 21은 하이드라진 함유 반응제를 사용한 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 화학적 변형을 예시한다. 또한, 적절한 여기 상태에서 하이드라진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 카보닐 함유 반응제와 화학적으로 반응시켜 비천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 고형광성 인돌 유도체를 형성할 수 있다. 도 20 및 22는 카보닐 함유 반응제를 사용한 하이드라진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 화학적 변형을 예시한다.

A. 비천연 아미노산 폴리펩티드의 번역 후 변형 방법: 인돌 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 합성

치환된 카보닐 및 치환된 하이드라진 함유 비천연 아미노산의 폴리펩티드로의 도입은 인돌 결합 형성을 통한 부위 특이적 유도체화를 제공한다. 유도체화 및/또는 추가의 변형을 위한 방법은 유도체화 단계 전 또는 유도체화 단계 후에 정제한 폴리펩티드를 사용하여 수행할 수 있다. 또한, 유도체화 및/또는 추가의 변형을 위한 방법은 그러한 변형 전 또는 후에 정제한 합성 중합체, 폴리사카라이드, 또는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 수행할 수 있다. 또한, 유도체화 단계는, 예를 들어 pH 약 1∼약 6을 포함하는 약산성 조건하에 효율적으로 수행할 수 있다.

또한, 특정 인돌 결합은 다양한 검출 방법에서 이용되는 형광성 비천연 아미노산 폴리펩티드의 제조를 가능하게 한다.

도 21은 하이드라진 함유 반응제를 사용한 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 부위 특이적 표지화를 예시한다. 도 22는 카보닐 함유 반응제를 사용한 하이드라진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 부위 특이적 표지화를 예시한다.

또한, 유도체화는 한쪽 말단에는 카보닐기 또는 하이드라진기를, 다른 쪽 말단에는 작용기를 함유하는 반응제를 사용하여 수행할 수 있다. 생성된 인돌 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 추가로 변형시켜, 예를 들어 중합체, 폴리사카라이드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자를 도입할 수 있다. 도 24B는 작용기 함유 폴리펩티드와 PEG 유도체의 반응의 예시적인 비한정적 예를 도시한다.

예를 들어, 화학식 (XVI)의 반응제는 인돌 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하는 데 사용될 수 있으며 다른 분자를 도입하도록 추가로 변형될 수 있는 카보닐 또는 하이드라진 함유 반응제이다. 일 실시형태에서, 화학식 I∼IV의 하이드라진 함유 화합물은 카보닐기를 함유하는 화학식 XVI의 반응제와 반응하여 인돌 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 화학식 V∼XIV의 카보닐 함유 화합물은 하이드라진기를 함유하는 화학식 XVI의 반응제와 반응하여 인돌 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성할 수 있다.

상기 식에서,

각각의 X는 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")₂, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)₂R", 또는 -C(O)N(R")₂(여기서, 각각의 R"은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 또는 치환된 아랄킬임)이거나; 또는

각각의 X는 독립적으로 소정의 작용기이며;

각각의 L은 독립적으로 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)NR'C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되고;

L₁은 임의적인 것으로서, 존재할 경우, -C(R')_p-NR'-C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, p는 0, 1 또는 2임)이고;

각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

W는

및

이고; R은 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다.

화학식 (XVI)의 화합물의 특정 실시형태에서, X는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 또는 치환된 아랄킬을 포함하는 중합체이다. 화학식 (XVI)의 화합물의 특정 실시형태에서, X는 폴리알킬렌 옥시드 또는 치환된 폴리알킬렌 옥시드를 포함하는 중합체이다. 화학식 (XVI)의 화합물의 특정 실시형태에서, X는 -[(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-(수소, 알킬, 또는 치환된 알킬)]_x(여기서, x는 약 20∼약 10,000임)을 포함하는 중합체이다. 화학식 (XVI)의 화합물의 특정 실시형태에서, X는 분자량이 약 2 kDa∼40 kDa인 m-PEG이다. 화학식 (XVI)의 화합물의 특정 실시형태에서, X는 펩티드, 단백질, 효소, 항체, 약물, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 세포, 바이러스, 리포솜, 마이크로입자 및 미셀로 구성된 군에서 선택되는 생물학적 활성 물질이다. 화학식 (XVI)의 화합물의 특정 실시형태에서, X는 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 항염증제, 항종양제, 심혈관제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자 및 스테로이드제로 구성된 군에서 선택되는 약물이다. 화학식 (XVI)의 화합물의 특정 실시형태에서, X는 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제 및 글루코스 옥시다제로 구성된 군에서 선택되는 효소이다. 화학식 (XVI)의 화합물의 일부 실시형태에서, X는 형광성 부분, 인광성 부분, 화학발광성 부분, 킬레이팅 부분, 전자 밀집 부분, 자성 부분, 인터칼레이팅 부분, 방사능 부분, 발색단 부분 및 에너지 전달 부분으로 구성된 군에서 선택되는 검출 가능한 표지이다. 화학식 (XVI)의 화합물의 특정 실시형태에서, X는 카보닐 함유 부분 및 하이드라진 함유 부분으로 구성된 군에서 선택되는 반응기이다. 화학식 (XVI)의 화합물의 특정 실시형태에서, X는 인돌 유도체이다. 화학식 (XVI)의 화합물의 특정 실시형태에서, L은 -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)N(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')- 및 -N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 구성된 군에서 선택된다.

화학식 (XVI)의 화합물의 특정 실시형태에서, 하기 화학식 (XVII)의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:

상기 식에서,

W는

및

이고; R은 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다.

화학식 (XVII)의 화합물의 특정 실시형태에서, 화학식 (XVIII)의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:

여기서, 다른 실시형태에서, 상기 m-PEG 또는 PEG 기는 분자량이 약 5 kDa∼약 30 kDa이다.

화학식 (XVII)의 화합물의 특정 실시형태에서, 하기 화학식 (XIX)의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:

상기 식에서,

W는

및

이고; R은 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;

Y는 존재할 경우 알킬 또는 치환된 알킬이며;

L은 -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-이다. 화학식 (XVII)의 화합물의 특정 실시형태에서, 하기 화학식 (XX)의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:

(XX)

여기서, 화학식 (XX)의 화합물의 다른 실시형태에서, 상기 m-PEG 기는 분자량이 약 5 kDa∼약 30 kDa이다.

화학식 (XVII)의 화합물의 특정 실시형태에서, 하기 화학식 (XXI)의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:

상기 식에서,

W는

및

이고; R은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;

Y는 존재할 경우 알킬 또는 치환된 알킬이고;

L은 -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-이다. 화학식 (XXI)의 화합물의 특정 실시형태에서, 하기 화학식 (XXII)의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:

여기서, 화학식 (XXII)의 화합물의 다른 실시형태에서, 상기 m-PEG 기는 분자량이 약 5 kDa∼약 30 kDa이다.

특정 실시형태에서, 화학식 (XVII)의 링커는 산성 조건하에 수용액 중에서 카보닐 또는 하이드라진 함유 폴리펩티드에 반응성을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 상기 산성 조건은 pH 약 1∼약 6이다.

화학식 (XVII)의 화합물의 특정 실시형태에서, 하기 화학식 (XXIII)의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:

상기 식에서,

Z는 O 또는 NH이고, n은 1, 2, 3 및 4이며;

W는

및

이고; R은 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다. 화학식 (XXIII)의 화합물의 특정 실시형태에서, 하기 화학식 (XXIV)의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:

화학식 (XXIII)의 화합물의 다른 실시형태에서, 하기 화학식 (XXV)의 구조를 갖는 화합물이 제공된다:

특정 실시형태에서, 화학식 I∼XV의 범위에 속하는 임의의 하위 화학식의 화합물 또는 특정 화합물을 비롯한 화학식 I∼XV의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드 및 구조식 1∼4의 화합물을 유도체화하는 방법으로서, 화학식 I∼XV의 하나 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 화학식 (XVI)의 반응제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 폴리펩티드는 화학식 (XVI)의 반응제와 접촉시키기 전 또는 후에 정제한다. 다른 실시형태에서, 생성된 폴리펩티드는 화학식 I∼XV의 하나 이상의 카보닐 또는 하이드라진 함유 아미노산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 생성된 폴리펩티드는 화학식 I∼XV의 화합물과 화학식 (XVI)의 반응제의 커플링 반응으로부터 생성된 하나 이상의 인돌 함유 폴리펩티드를 포함한다.

도 26은 화학식 (XXIV)의 이작용기성 링커의 합성 방법의 예시적 예를 제공한다. 여기서 이 방법은 양쪽 말단에 아민 또는 하이드록실 기를 포함하는 스페이서 반응제를 산 함유 Boc 보호 하이드라진에 커플링하는 단계를 포함한다. Boc 기를 절단하면 화학식 (XXIV)의 링커가 형성된다.

도 27은 화학식 (XXXIV)의 반응제를 사용하여 카보닐 비천연 아미노산 함유 폴리펩티드를 번역 후 변형하여 인돌 함유 폴리펩티드를 형성하는 개략도를 제공한다.

도 28은 화학식 (XX) 및 (XXII)의 반응제를 사용하여 카보닐 비천연 아미노산 함유 폴리펩티드를 번역 후 변형하여 인돌 함유 폴리펩티드를 형성하는 개략도를 제공한다.

도 29는 화학식 (XX) 및 (XXII)의 반응제를 사용하여 하이드라진 비천연 아미노산 함유 폴리펩티드를 번역 후 변형하여 인돌 함유 폴리펩티드를 형성하는 개략도를 제공한다.

도 30은 화학식 (XVIII)의 반응제의 예를 도시한다.

특정 실시형태에서, 인돌 결합을 통해 폴리펩티드 이량체를 제조하는 방법으로서, 화학식 (XXIII)의 링커와 카보닐 또는 하이드라진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 반응으로 이루어지는 방법이 제공된다. 도 27은 화학식 (XXIV)의 링커와 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 축합 반응을 이용한 상기 이량체 형성의 대표적 예를 제공한다.

특정 실시형태에서, 이작용기성 링커를 사용하여 인돌 부분 함유 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서,

(i) 화학식 (I)의 아미노산을 포함하는 제1 폴리펩티드를 이작용기성 링커로 유도체화하는 단계; 및

(ii) 단계 (i)에서 생성된 유도체화 단백질을 PEG와 같은 제2 반응제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 상기 폴리펩티드는 이작용기성 링커와 접촉시키기 전 또는 후에 정제한다.

도 24는 상기 이작용기성 링커의 예시적 예와 PEG 기에 부착된 인돌 함유 폴리펩티드를 제조하기 위한 그 사용을 도시한다.

예를 들어, 이하는 화학식 (XXVI)의 이작용기성 링커의 대표적 예이다.

상기 식에서,

W는

및

이고; R은 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;

L은 -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-N(R')C(O)O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-이다.

일 실시형태에서, 복수의 링커 화학기가 카보닐 또는 하이드라진 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드와 부위 특이적으로 반응할 수 있다. 일 실시형태에서, 본원에 기재된 링커법은 하나 이상의 링커 말단 상에 하이드라진 작용기(일작용기성, 이작용기 또는 다작용기성)를 포함하는 링커를 이용한다. 하이드라진 유도체화 링커와 카보닐 치환 단백질의 반응은 인돌 치환 비천연 단백질을 생성한다. 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 링커법은 하나 이상의 링커 말단 상에 카보닐 작용기(일작용기성, 이작용기성 또는 다작용기성)를 포함하는 링커를 이용한다. 카보닐 유도체화 링커와 하이드라진 치환 단백질의 반응은 인돌 치환 비천연 단백질을 생성한다.

특정 실시형태에서, 카보닐 또는 하이드라진 함유 비천연 폴리펩티드를 포함하는 화학적 합성 폴리펩티드를 카보닐 또는 하이드라진 함유 반응제로 유도체화하여 인돌 유도체를 형성하는 방법이 제공된다.

도 19는 하이드라진 함유 반응제에 의한 카보닐 함유 우로텐신의 유도체화의 예시적 예를 제공한다. 이 예시적 실시형태에서, 하이드라진 함유 반응제가 카보닐 함유 우로텐신 유사체의 완충액(pH 1∼5)에 첨가된다. 반응은 상온에서 수시간 내지 수일 동안 진행된다.

도 20은 카보닐 함유 반응제에 의한 하이드라진 함유 우로텐신의 유도체화의 예시적 예를 제공한다. 이 예시적 실시형태에서, 카보닐 함유 반응제가 하이드라진 함유 우로텐신 유사체의 완충액(pH 1∼5)에 첨가된다. 반응은 상온에서 수시간 내지 수일 동안 진행된다.

다른 실시형태에서, 이러한 유도체화된 폴리펩티드는 약산성 조건하에 수용액 중에서 적어도 1개월 동안 안정하다. 다른 실시형태에서, 이러한 유도체화된 폴리펩티드는 약산성 조건하에 수용액 중에서 적어도 2주 동안 안정하다. 다른 실시형태에서, 이러한 유도체화된 폴리펩티드는 약산성 조건하에 수용액 중에서 적어도 5일 동안 안정하다. 다른 실시형태에서, 이러한 조건은 pH 약 1∼약 6이다. 특정 실시형태에서, 상기 유도체화된 폴리펩티드의 3차 구조는 보존된다. 다른 실시형태에서, 폴리펩티드의 이러한 유도체화는 이 유도체화된 폴리펩티드를 다른 폴리펩티드에 결찰시키는 것을 더 포함한다. 다른 실시형태에서, 유도체화되는 이러한 폴리펩티드는 치료용 단백질과 상동성이다.

B. 작용기 부가의 예: 비천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링된 거대분자 중합체

본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 다양한 변형은 본원에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 수단을 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 변형은, 폴리펩티드의 비천연 아미노산 성분 상에, 원하는 작용기를 포함하나 이에 한정되지 않는 추가 작용기를 도입하는 것을 포함한다. 본원에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 수단의 예시적인 비한정적 예로서, 후술하는 설명은, 본원에 기재된 조성물, 방법, 기법 및 수단이 상기에 열거된 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 작용기를 부가하는 것에도 적용될 수 있다는 조건으로 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드에 거대분자 중합체를 부가하는 것에 초점을 맞출 것이다.

다종 다양한 거대분자 중합체 및 다른 분자를 본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링하여 비천연 아미노산 폴리펩티드(또는 상응하는 천연 아미노산 폴리펩티드)의 생물학적 특성을 조절하고/하거나, 비천연 아미노산 폴리펩티드(또는 상응하는 천연 아미노산 폴리펩티드)에 새로운 생물학적 특성을 제공할 수 있다. 이러한 거대분자 중합체는 비천연 아미노산, 또는 비천연 아미노산의 임의의 작용기 또는 치환기, 또는 비천연 아미노산에 부가된 임의의 치환기 또는 작용기를 통해 비천연 아미노산 폴리펩티드에 커플링될 수 있다.

본원에 기재된 폴리펩티드(천연 또는 합성), 폴리뉴클레오티드, 폴리사카라이드 또는 합성 중합체 내로 도입된 비천연 아미노산에 수용성 중합체가 커플링될 수 있다. 상기 수용성 중합체는 폴리펩티드로 도입된 비천연 아미노산, 또는 비천연 아미노산의 임의의 작용기 또는 치환기, 또는 비천연 아미노산에 부가된 임의의 치환기 또는 작용기를 통해 커플링될 수 있다. 일부 경우, 본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 수용성 중합체에 커플링된 하나 이상의 비천연 아미노산(들), 및 수용성 중합체에 커플링된 하나 이상의 천연 아미노산을 포함한다. 친수성 중합체와 생물학적 활성 분자의 공유 결합은 (예컨대, 생리학적 환경 하에서의) 수용해도를 증가시키거나, 생체이용률을 증가시키거나, 혈청 반감기를 증가시키거나, 치료 반감기를 증가시키거나, 면역원성을 조절하거나, 생물학적 활성을 조절하거나, 단백질, 펩티드 및 특히 소수성 분자를 비롯한 생물학적 활성 분자의 순환 시간을 연장시키는 한 방법이다. 이러한 친수성 중합체의 중요한 추가 특징은 생체적합성, 독성의 부재 및 면역원성의 부재를 포함한다. 바람직하게는, 최종 생성물 제제의 치료적 용도를 위해, 중합체는 약학적으로 허용되는 것이다.

친수성 중합체의 예로는 폴리알킬 에테르 및 이의 알콕시 캡핑된 유사체(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌/프로필렌 글리콜, 및 이의 메톡시 또는 에톡시 캡핑된 유사체, 특히 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG로도 알려진 폴리옥시에틸렌 글리콜); 폴리비닐피롤리돈; 폴리비닐알킬 에테르; 폴리옥사졸린, 폴리알킬 옥사졸린 및 폴리하이드록시알킬 옥사졸린; 폴리아크릴아미드, 폴리알킬 아크릴아미드, 및 폴리하이드록시알킬 아크릴아미드(예를 들어, 폴리하이드록시프로필메타크릴아미드 및 이의 유도체); 폴리하이드록시알킬 아크릴레이트; 폴리시알산 및 이의 유사체; 친수성 펩티드 서열; 폴리사카라이드 및 이의 유도체(덱스트란 및 덱스트란 유도체, 예를 들어 카복시메틸덱스트란, 덱스트란 설페이트, 아미노덱스트란을 포함함); 셀룰로스 및 이의 유도체, 예를 들어, 카복시메틸 셀룰로스, 하이드록시알킬 셀룰로스; 키틴 및 이의 유도체, 예를 들어, 키토산, 숙시닐 키토산, 카복시메틸키틴, 카복시메틸키토산; 히알루론산 및 이의 유도체; 전분; 알기네이트; 콘드로이틴 설페이트; 알부민; 풀루란 및 카복시메틸 풀루란; 폴리아미노산 및 이의 유도체, 예를 들어 폴리글루탐산, 폴리라이신, 폴리아스파르트산, 폴리아스파르트아미드; 말레산 무수물 공중합체, 예컨대 스티렌 말레산 무수물 공중합체, 디비닐에틸 에테르 말레산 무수물 공중합체; 폴리비닐 알코올; 이의 공중합체; 이의 삼원 공중합체; 이의 혼합물; 및 이들의 유도체를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 상기 수용성 중합체는 선형, 갈래형(forked) 또는 분지형을 포함하나 이들에 한정되지 않는 임의의 구조 형태일 수 있다. 일부 실시형태에서, 약 2개∼약 300개의 말단을 갖는 수용성 중합체 골격이 특히 유용하다. 다작용기성 중합체 유도체로는 2개의 말단을 갖는 선형 중합체가 있으나 이에 한정되지 않고, 이때 각각의 말단은 동일하거나 상이할 수 있는 작용기에 결합되어 있다. 일부 실시형태에서, 상기 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 상기 중합체의 분자량은 소정의 중합체 분자량 범위 내에 있을 수 있다. 실질적으로 수용성인 골격에 대해 상기에 열거한 것은 총망라한 것이 아니고 단지 예시적인 것이며, 전술한 특질을 갖는 모든 중합체 물질이 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기에 적합한 것으로 간주된다.

전술한 바와 같이, 친수성 중합체의 일례로는, 약학 분야, 인공 임플란트와, 생체적합성, 독성의 부재 및 면역원성의 부재가 중요한 다른 분야에서 광범위하게 사용되는, PEG로 약칭되는 폴리에틸렌 글리콜이 있다. 본원에 기재된 중합체:폴리펩티드 실시형태는 예시적 친수성 중합체로서 PEG를 사용할 것이지만, 이때 다른 친수성 중합체도 이러한 실시형태에서 유사하게 사용될 수 있다.

PEG는 상업적으로 입수할 수 있거나 공지된 방법에 따라 에틸렌 글리콜의 개환 중합에 의해 제조할 수 있는 수용성 중합체이다(문헌[Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161] 참조). PEG는 일반적으로 투명하고, 무색 무취이며, 수용성이고, 열에 안정하고, 많은 화학 물질에 대해 비활성을 나타내며, 가수분해 또는 열화되지 않고, 일반적으로 비독성이다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 생체적합성 물질로서 간주된다. 즉, PEG는 생조직 또는 생유기체에 손상을 주지 않고 공존할 수 있다. 더욱 구체적으로, PEG는 실질적으로 비면역원성이다. 즉, PEG는 체내에서 면역 반응을 일으키지 않는 경향이 있다. PEG가 체내에서 일정한 바람직한 기능을 갖는 분자, 예컨대 생물학적 활성 물질에 부착될 경우, PEG는 상기 물질을 마스킹하는 경향이 있어서 유기체가 상기 물질의 존재에 대한 내성을 가질 수 있도록 임의의 면역 반응을 저감 또는 제거할 수 있다. PEG 접합체는 실질적인 면역 반응을 유발하거나 응고 또는 다른 바람직하지 않은 효과를 유발하는 경향을 나타내지 않는다.

"PEG"라는 용어는 PEG의 크기 또는 PEG 말단의 변형과 관계없이 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포괄하는 용어로서 널리 사용되며, 하기 화학식으로 표시되는 비천연 아미노산 폴리펩티드에 연결되는 것으로서 나타낼 수 있다:

XO-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-Y

상기 식 중,

n은 2∼10,000이고, X는 H이거나 C_1-4 알킬, 보호기 또는 말단 작용기를 포함하나 이에 한정되지 않는 말단 변형이다. PEG라는 용어는 이작용기성 PEG, 멀티아암형(multiarmed) PEG, 유도체화된 PEG, 갈래형 PEG, 분지형 PEG(각 쇄의 분자량은 약 1 kDa∼약 100 kDa, 약 1 kDa∼약 50 kDa, 또는 약 1 kDa∼약 20 kDa임), 현수형 PEG(즉, 중합체 골격에 현수된 하나 이상의 작용기를 갖는 PEG 또는 관련 중합체), 또는 그 안에 분해 가능한 결합을 갖는 PEG를 비롯한 임의의 형태의 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 일 실시형태에서, n이 약 20∼약 2000인 PEG가 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 상기 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 부분을 포함한다. 상기 PEG 중합체의 분자량은 약 100 Da∼약 100,000 Da 또는 그 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 넓은 범위 내의 분자량일 수 있다. 상기 PEG 중합체의 분자량은 소정의 중합체 분자량 범위 내일 수 있다. 다양한 PEG 분자가 본원에서 참고로 인용되는 Shearwater Polymers, Inc의 카탈로그, Nektar Therapeutics의 카탈로그(이에 한정되지 않음)에 기재되어 있다.

문헌에 기재된 말단 작용기의 구체적인 예로는 N-숙신이미딜 카보네이트(예를 들어, 미국 특허 제5,281,698호 및 제5,468,478호 참조), 아민(예를 들어, 문헌[Buckmann et al. Makromol. Chem. 182: 1379 (1981)] 및 문헌[Zalipsky et al. Eur. Polym. J. 19: 1177 (1983)] 참조), 하이드라지드(예를 들어, 문헌[Andresz et al. Makromol. Chem. 179: 301 (1978)] 참조), 숙신이미딜 프로피오네이트 및 숙신이미딜 부타노에이트(예를 들어, 문헌[Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181], 문헌[Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997]; 및 미국 특허 제5,672,662호 참조), 숙신이미딜 숙시네이트(예를 들어, 문헌[Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7: 175 (1984)] 및 문헌[Joppich et al. Makromol. Chem. 180: 1381 (1979)] 참조), 숙신이미딜 에스테르(예를 들어, 미국 특허 제4,670,417호 참조), 벤조트리아졸 카보네이트(예를 들어, 미국 특허 제5,650,234호 참조), 글리시딜 에테르(예를 들어, 문헌[Pitha et al. Eur. J Biochem. 94: 11 (1979)], 문헌[Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13: 354 (1991)] 참조), 옥시카보닐이미다졸(예를 들어, 문헌[Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131: 25 (1983)], 문헌[Tondelli et al. J. Controlled Release 1: 251 (1985)] 참조), p-니트로페닐 카보네이트(예를 들어, 문헌[Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985)]; 및 문헌[Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27: 45 (1991)] 참조), 알데히드(예를 들어, 문헌[Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22: 341 (1984)], 미국 특허 제5,824,784호 및 미국 특허 제5,252,714호 참조), 말레이미드(예를 들어, 문헌[Goodson et al. Bio/Technology 8: 343 (1990)], 문헌[Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2: 29 (1984)] 및 문헌[Kogan, Synthetic Comm. 22: 2417 (1992)] 참조), 오르토피리딜-디설파이드(예를 들어, 문헌[Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4: 314 (1993)] 참조), 아크릴올(예를 들어, 문헌[Sawhney et al., Macromolecules, 26: 581 (1993)] 참조), 비닐설폰(예를 들어, 미국 특허 제5,900,461호 참조)을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 상기 모든 참고 문헌 및 특허는 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

일부 경우, PEG는 한쪽 말단에 하이드록시 또는 메톡시(즉, X는 H 또는 CH₃임)("메톡시 PEG")를 갖도록 종결된다. 대안으로, PEG는 반응기를 갖도록 종결되어 이작용기성 중합체를 형성할 수 있다. 전형적인 반응기는 20종의 일반 아미노산에서 발견되는 작용기와 반응하는 데 통상적으로 사용되는 반응기[말레이미드기, 활성화된 카보네이트(p-니트로페닐 에스테르를 포함하나 이들에 한정되지 않음), 활성화된 에스테르(N-하이드록시숙신이미드, p-니트로페닐 에스테르 및 알데히드를 포함하나, 이들에 한정되지 않음)를 포함하나 이들에 한정되지 않음]뿐만 아니라, 20종의 일반 아미노산에 대해 비활성이지만 비천연 아미노산에 존재하는 상보적 작용기(페닐 하이드라진 및 카보닐기를 포함하나 이에 한정되지 않음)와 특이적으로 반응하는 작용기를 포함할 수 있다.

상기 화학식에서 Y로 표시되는 PEG의 다른 쪽 말단이 비천연 아미노산을 통해 (합성 또는 천연) 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 폴리사카라이드 또는 합성 중합체에 직접 또는 간접적으로 부착된다는 것을 인식해야 한다. Y가 페닐 하이드라진기인 경우, 페닐 하이드라진 함유 PEG 반응제는 폴리펩티드 내의 카보닐 함유 비천연 아미노산과 반응함으로써 인돌 결합을 통해 폴리펩티드에 연결된 PEG 기를 형성할 수 있다. Y가 카보닐기인 경우, 카보닐 함유 PEG 반응제는 폴리펩티드 내의 페닐 하이드라진 함유 비천연 아미노산과 반응하여 인돌 결합을 통해 폴리펩티드에 연결된 PEG 기를 형성할 수 있다. 도 30은 카보닐 및 하이드라진 함유 PEG 반응제의 비한정적인 예를 도시한다.

일부 실시형태에서, 하이드라진은 비천연 아미노산 내에 존재하는 카보닐기와 반응하여 인돌을 형성할 수 있다. 대안으로, 상기 하이드라진은 비천연 아미노산을 통해 폴리펩티드 내로 도입되어 수용성 중합체 내에 존재하는 카보닐기와 우선적으로 반응하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, PEG 분자의 적어도 한쪽 말단은 비천연 아미노산과의 반응에 이용 가능하다.

따라서, 일부 실시형태에서, 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 비천연 아미노산의 측쇄를 통해 수용성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 연결된다. 본원에 기재된 비천연 아미노산 방법 및 조성물은 20종의 천연적으로 도입된 아미노산에서 발견되지 않는 작용기 또는 치환기를 함유하는 아미노산을 포함하나 이에 한정되지 않는 비천연 아미노산을 셀렉터 코돈에 반응하여 단백질 내로 선택적으로 도입한 후, 이러한 아미노산을 적절한 반응성 PEG 유도체를 사용하여 변형시키는 것을 포함하는, PEG 유도체를 사용한 단백질의 선택적 변형을 위한 매우 효율적인 방법을 제공한다. 수용성 중합체를 단백질 내로 도입하기 위해 다종 다양한 공지된 방법들이 본원에 기재된 비천연 아미노산 방법 및 조성물과 함께 사용하기에 적합하다.

중합체 골격은 선형 또는 분지형일 수 있다. 분지형 중합체 골격은 일반적으로 공지되어 있다. 전형적으로, 분지형 중합체는 중심 분지 코어 부분과 이 중심 분지 코어에 결합된 다수의 선형 중합체 쇄를 갖는다. PEG는 다양한 폴리올, 예를 들어 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리스리톨 및 솔비톨에 에틸렌 옥시드를 첨가함으로써 제조할 수 있는 분지형으로 사용된다. 또한, 상기 중심 분지 부분은 몇몇 아미노산, 예컨대 라이신으로부터 유도될 수 있다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)은 일반적으로 화학식 R(-PEG-OH)_m(여기서, R은 코어 부분, 예컨대 글리세롤, 글리세롤 올리고머 또는 펜타에리스리톨로부터 유도되고, m은 아암의 수를 나타냄)으로 표시될 수 있다. 또한, 멀티아암형 PEG 분자, 예컨대 전술한 내용과 관련하여 본원에서 그 전체가 참고로 인용되는 미국 특허 제5,932,462호, 제5,643,575호, 제5,229,490호 및 제4,289,872호; 미국 특허 출원 제2003/0143596호; WO 96/21469; 및 WO 93/21259에 기재된 것들도 중합체 골격으로서 사용될 수 있다.

또한, 분지형 PEG는 PEG(-YCHZ₂)_n(여기서, Y는 링커기이고, Z는 일정한 길이의 원자로 된 쇄에 의해 CH에 연결된 활성화된 말단 기임)으로 표시되는 갈래형 PEG의 형태로 존재할 수 있다. 또 다른 분지 형태인 현수형 PEG는 PEG 쇄의 말단이 아니라 PEG 골격을 따라 카복실기와 같은 반응기를 갖는다.

또한, 이러한 PEG 형태 이외에도, 골격 내에 약한 또는 분해 가능한 결합을 갖는 중합체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 중합체 골격 내에 가수 분해되기 쉬운 에스테르 결합을 갖는 PEG를 제조할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 이러한 가수분해는 상기 중합체를 저분자량의 단편으로 절단시킨다:

-PEG-CO₂-PEG- + H₂O → PEG-CO₂H + HO-PEG-

폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG라는 용어는 본원에 개시된 것들을 포함하나 이들에 한정되지 않는 공지된 모든 형태를 나타내거나 포함한다. 중합체의 분자량은 약 100 Da∼약 100,000 Da 또는 그 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 넓은 범위의 분자량일 수 있다. 중합체의 분자량은 소정의 중합체 분자량 범위 내에 속할 수 있다.

PEG의 원하는 특성을 최대화하기 위해, 생물학적 활성 분자에 부착된 PEG 중합체 또는 중합체들의 총 분자량 및 수화 상태는 모분자의 생물학적 활성에 악영향을 주지 않으면서 PEG 중합체 부착과 일반적으로 관련되어 있는 유리한 특성, 예컨대 수용해도 증가 및 순환 반감기 증가를 제공할 수 있도록 충분히 높아야 한다.

본원에 기재된 방법 및 조성물은 중합체:단백질 접합체의 실질적으로 균질한 제제를 제조하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 "실질적으로 균질한"이란 중합체:단백질 접합체 분자가 전체 단백질의 절반을 초과하는 정도로 관찰되는 것을 의미한다. 중합체:단백질 접합체는 생물학적 활성을 가지며, 본원에 제공된 본 발명의 "실질적으로 균질한" PEG화된 폴리펩티드 제제는 균질한 제제의 이점, 예를 들어 로트 대 로트(lot to lot) 약동학적 특성을 예측함에 있어서의 임상적 사용의 용이성을 나타내기에 충분한 균질성을 갖는 제제이다.

또한, 당업자는 중합체:단백질 접합체 분자의 혼합물을 제조하는 것을 선택할 수 있으며, 여기에서 제공되는 이점은 혼합물 중에 포함되는 단독중합체:단백질 접합체의 비율을 선택할 수 있다는 것이다. 따라서, 당업자는, 필요에 따라, 다양한 수의 부착된 중합체 부분(즉, 2, 3, 4 등)을 갖는 다양한 단백질의 혼합물을 제조할 수 있고, 본원에 기재된 방법을 이용하여 제조된 단독중합체:단백질 접합체와 상기 접합체를 배합하여, 소정의 비율의 단독중합체:단백질 접합체를 함유한 혼합물을 수득할 수 있다.

단백질 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율은 반응 혼합물 중 그 농도에 따라 달라지게 된다. 일반적으로, (최소한의 과잉 미반응 단백질 또는 중합체가 존재한다는 점에서 반응 효율에 비추어) 최적 비는 선택된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 및 이용 가능한 반응기의 수에 의해 결정될 수 있다. 분자량의 경우, 일반적으로 중합체의 분자량이 클수록, 단백질에 부착될 수 있는 중합체 분자의 수는 적다. 유사하게, 이들 파라미터를 최적화할 때 중합체의 분지화를 고려해야 한다. 일반적으로, 분자량이 클수록 (또는 분지가 많을수록) 중합체:단백질 비가 크다.

본원에서 사용될 때, 친수성 중합체:폴리펩티드/단백질 접합체를 고려할 경우, "치료적 유효량"이란 표현은 또한 환자에게 제공되는 원하는 이익을 증가시키는 양을 말한다. 이 양은 개체마다 다르고, 환자의 전체적인 신체 조건 및 치료하고자 하는 질병, 질환 또는 병증의 기본 원인에 따라 달라진다.

본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합된 수용성 중합체의 수(즉, PEG화 또는 글리코실화 정도)를 조정하여, 변경된 (증가 또는 감소를 포함하나, 이들에 한정되지 않음) 약리학적, 약동학적 또는 약력학적 특성(예컨대, 생체내 반감기)를 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드의 반감기는 비변형 폴리펩티드에 비해 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%, 2배, 5배, 10배, 50배 또는 적어도 약 100배 증가된다.

일 실시형태에서, 카보닐 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 PEG 골격에 직접 결합된 말단 아릴하이드라진 부분을 포함하는 PEG 유도체로 변형시킨다.

일 실시형태에서, 카보닐 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 PEG 골격에 직접 결합된 말단 하이드라진 부분을 포함하는 PEG 유도체로 변형시킨다.

또 다른 실시형태에서, 하이드라진 함유 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 PEG 골격에 직접 결합된 말단 카보닐 부분을 포함하는 PEG 유도체로 변형시킨다.

일부 실시형태에서, 상기 카보닐 말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-C(O)-R

상기 식에서,

R은 단순한 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2∼10이며, n은 100∼1,000(즉, 평균 분자량은 5∼40 kDa임)이다. 중합체의 분자량은 약 100 Da∼약 100,000 Da 또는 그 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는 넓은 범위의 분자량일 수 있다. 중합체의 분자량은 소정의 중합체 분자량 범위 내일 수 있다.

PEG의 작용기화 및 접합에 대한 몇 가지 재고찰 문헌 및 논문이 이용 가능하다. 예를 들어, 문헌[Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985)]; 문헌[Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987)]; 문헌[Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992)]; 문헌[Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992)]; 문헌[Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995)]을 참조할 수 있다.

또한, 중합체의 활성화 방법에 대해서는 WO 94/17039, 미국 특허 제5,324,844호, WO 94/18247 및 WO 94/04193, 미국 특허 제5,219,564호, 미국 특허 제5,122,614호, WO 90/13540, 미국 특허 제5,281,698호 및 WO 93/15189호에서 찾아볼 수 있으며, 응고 인자 VIII(WO 94/15625), 헤모글로빈(WO 94/09027), 산소 운반 분자(미국 특허 제4,412,989호), 리보뉴클레아제 및 슈퍼옥시드 디스뮤타제[Veronese et al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985)]를 포함하나 이들에 한정되지 않는 효소와 활성화된 중합체 간의 접합에 대해서는 문헌에 공지되어 있으며, 상기 문헌들의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.

필요에 따라, 소수성 크로마토그래피로부터 얻은 본원에 기재된 PEG화된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 친화성 크로마토그래피; 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피(DEAE 세파로스를 사용하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않음); 실리카 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(세파덱스 G-75를 사용하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않음); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피, 금속 킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/투석여과; 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱; 치환 크로마토그래피; 전기영동법(분취용 등전 포커싱을 포함하나 이에 한정되지 않음), 차등 용해도법(황산암모늄 침전을 포함하나 이에 한정되지 않음), 또는 추출을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 공지된 방법으로 추가 정제할 수 있다. 겉보기 분자량은 구형 단백질 표준 물질과 비교함으로써 GPC에 의해 추정할 수 있다(문헌[Preneta AZ, PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306] 참조). (비천연 아미노산 폴리펩티드):PEG 접합체의 순도는 단백질 분해(트립신 분해를 포함하나 이에 한정되지 않음) 후 질량 분광분석법으로 평가할 수 있다[Pepinsky R. B., et al., J. Pharmacol. & Exp. Ther. 297 (3): 1059-66 (2001)].

본원에 기재된 폴리펩티드의 비천연 아미노산에 결합된 수용성 중합체는 제한없이 추가로 유도체화 또는 치환할 수 있다.

C. 혈청 알부민에 대한 친화성 향상

또한, 다양한 분자를 본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드에 융합시켜 혈청 반감기를 조절할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분자를 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드에 연결 또는 융합시켜 동물의 체내에서의 내인성 혈청 알부민에 대한 친화성을 향상시킨다.

예를 들어, 일부 경우, 폴리펩티드와 알부민 결합성 서열의 재조합 융합체가 제조된다. 예시적인 알부민 결합성 서열은 스트렙토코커스(streptococcal) 단백질 G로부터의 알부민 결합성 도메인(예를 들어, 문헌[Makrides et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277(1): 534-542 (1996)] 및 문헌[Sjolander et al., J. Immunol. Methods 201: 115-123 (1997)] 참조), 또는 알부민 결합성 펩티드, 예를 들어 문헌[Dennis, et al., J. Biol. Chem. 277(38): 35035-35043 (2002)]에 기재된 펩티드를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.

다른 실시형태에서, 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드는 지방산에 의해 아실화된다. 일부 경우, 상기 지방산은 혈청 알부민에 대한 결합을 촉진한다. 예를 들어, 문헌[Kurtzhals, et al., Biochem. J. 312; 725-731 (1995)]을 참조할 수 있다.

다른 실시형태에서, 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드는 혈청 알부민(인간 혈청 알부민을 포함하나 이에 한정되지 않음)에 직접 융합된다. 또한, 다종 다양한 다른 분자들을 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드에 연결하여, 혈청 알부민 또는 다른 혈청 성분에 대한 결합을 조절할 수 있다.

A. 본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 글리코실화

본원에 기재된 방법 및 조성물은 사카라이드 잔기를 보유하는 하나 이상의 비천연 아미노산이 도입된 폴리펩티드를 포함한다. 상기 사카라이드 잔기는 천연 사카라이드 잔기(N-아세틸글루코사민을 포함하나 이에 한정되지 않음) 또는 비천연 사카라이드 잔기(3-플루오로갈락토스를 포함하나 이에 한정되지 않음)일 수 있다. 상기 사카라이드는 N 결합 또는 O 결합 글리코시드 결합(N-아세틸갈락토스-L-세린을 포함하나 이에 한정되지 않음) 또는 비천연 결합(질소 함유 복소환을 비롯한 복소환 결합 또는 상응하는 C 결합 또는 S 결합 글리코시드를 포함하나 이들에 한정되지 않음)에 의해 비천연 아미노산에 결합될 수 있다.

상기 사카라이드(글리코실을 포함하나 이에 한정되지 않음) 부분은 생체내 또는 시험관내에서 비천연 아미노산 폴리펩티드에 부가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 카보닐 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를, 아릴하이드라진기에 의해 유도체화된 사카라이드를 이용하여 변형시켜, 인돌 결합을 통해 연결된 상응하는 글리코실화된 폴리펩티드를 생성한다. 다른 실시형태에서, 아릴하이드라진 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를, 카보닐기에 의해 유도체화된 사카라이드로 변형시켜, 결합을 통해 연결된 상응하는 글리코실화 폴리펩티드를 생성한다. 일단 사카라이드가 비천연 아미노산에 부착되면, 글리코실트랜스퍼라제, 및 비천연 아미노산 폴리펩티드에 결합된 올리고사카라이드를 생성할 수 있는 다른 효소로 처리함으로써 사카라이드를 추가로 조작할 수 있다. 예를 들어, 문헌[H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003)]을 참조할 수 있다.

도 26은 링커가 2개의 동일한 말단, 즉 하이드라진기를 갖는 이작용기성 호모링커의 합성을 보여주는 예시적 예를 도시한다. 이러한 링커는 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 동종이량체를 형성하여 2개의 인돌 결합을 형성하는 데 이용될 수 있다. 대안으로, 이러한 링커 중 한쪽 말단이 보호되면, 이러한 부분적으로 보호된 링커는 인돌 결합을 통해 카보닐 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드의 비보호된 하이드라진 말단에 결합하는 데 이용되어, 탈보호 후 추가 결합 반응에 이용 가능한 보호된 다른 쪽 말단이 남게 된다. 대안으로, 반응제의 화학량론적 양을 신중하게 조작하여, 원하는 이종이량체가 몇몇 동종 이량체로 오염될 가능성이 있다고 하더라도, 유사한 결과(이종이량체)를 얻을 수 있다.

도 27은 이작용기성 호모링커를 통해 2개의 단백질을 커플링하는 것에 의한 단백질 이량체화의 예시적 예를 도시한다.

도 25는, 링커가 2개의 상이한 말단, 예를 들어 카보닐기와 반응기를 갖는, 헤테로이작용기성 링커의 사용에 관한 예시적 예를 도시한다. 또한, 도 25는 다단계 합성으로 비천연 아미노산 폴리펩티드에 PEG 기를 부착시키기 위해 헤테로이작용기성 링커를 사용하는 것에 관한 예시적 예를 도시한다. 제1 단계에서, 이 예시적 도면에 도시된 바와 같이, 하이드라진 함유 비천연 폴리펩티드는 카보닐 함유 이작용기성 링커와 반응하여 인돌 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성한다. 그러나, 상기 이작용기성 링커는 여전히 제2 단계에서 PEG 반응제와 반응하여 복소환 결합을 통해 PEG화 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하는 반응성 작용기를 보유한다.

본원에 기재된 방법 및 조성물은 또한 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체(즉, 삼량체, 사량체 등)와 같은 폴리펩티드 조합을 제공한다. 예를 들어, 하기 설명은 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원에 초점을 맞춘 것이나, 본 섹션에 기재된 방법, 기법 및 조성물은, 예를 들어 치료용 단백질을 비롯한 이량체 및 다량체의 형태로 이익을 제공할 수 있는 실질적으로 임의의 다른 폴리펩티드에 적용될 수 있다.

따라서, 본원에 기재된 방법, 기법 및 조성물은 또 다른 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 또는 이의 변이체, 또는 비GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 또는 이의 변이체인 임의의 다른 폴리펩티드에, 폴리펩티드 골격에 직접 또는 링커를 통해 결합된 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드도 포함한다. GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 이량체 또는 다량체 접합체는 단량체에 비해 증가된 그 분자량으로 인해, 단량체 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원에 비해 상이한 약리학적, 약동학적 또는 약력학적 특성, 조절된 치료적 반감기 또는 조절된 혈장 반감기를 포함하나 이들에 한정되지 않는 새로운 또는 바람직한 특성을 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 이량체는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 수용체의 이량체화를 조절할 것이다. 다른 실시형태에서, 본원에 기재된 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 이량체 또는 다량체는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 수용체 길항제, 효현제 또는 조절제로서 작용할 것이다.

일부 실시형태에서, 상기 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드는 Asn-Lys 아미드 결합 또는 Cys-Cys 디설파이드 결합을 포함하나 이들에 한정되지 않는 결합을 통해 직접 결합된다. 일부 실시형태에서, 연결된 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 및/또는 연결된 비GH 수퍼유전자 패밀리 구성원은, 제1 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 및/또는 연결된 비GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드, 하이드라진 함유 비천연 아미노산을 포함하는 제2 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드에 접합된 카보닐 함유 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 포함하나 이들에 한정되지 않는 이량체화를 촉진하기 위한 상이한 비천연 아미노산을 포함하며, 상기 폴리펩티드는 상응하는 인돌의 형성을 통해 반응한다.

대안으로, 2개의 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 및/또는 연결된 비GH 수퍼유전자 패밀리 구성원은 링커를 통해 연결된다. 임의의 헤테로이작용기성 또는 호모이작용기성 링커가, 동일하거나 상이한 1차 서열을 가질 수 있는 2개의 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 및/또는 연결된 비GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드를 연결하는 데 사용될 수 있다. 일부 경우, GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드 및/또는 연결된 비GH 수퍼유전자 패밀리 구성원 폴리펩티드를 함께 연결하는 데 사용되는 링커가 이작용기성 PEG 반응제일 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 하기와 같은 덤벨 구조를 갖는 수용성 이작용기성 링커를 제공한다: a) 중합체 골격의 적어도 제1 말단 상의 아지드, 알킨, 하이드라진, 디아민, 하이드라지드, 하이드록실아민 또는 카보닐(디카보닐을 포함함) 함유 부분; 및 b) 중합체 골격의 제2 말단 상의 적어도 제2 작용기. 상기 제2 작용기는 제1 작용기와 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 제2 작용기는 상기 제1 작용기와 반응하지 않는다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 분지형 분자 구조로 된 하나 이상의 아암을 포함하는 수용성 화합물을 제공한다. 예를 들어, 상기 분지형 분자 구조는 수지상일 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 하기 구조를 갖는 활성화된 수용성 중합체와의 반응에 의해 형성된 하나 이상의 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원을 포함하는 다량체를 제공한다:

R-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-X

상기 식에서,

n은 약 5∼약 3,000이고, m은 2∼10이며, X는 아지드, 알킨, 하이드라진, 디아민, 하이드라지드, 하이드록실아민, 아세틸, 또는 카보닐(디카보닐을 포함함) 함유 부분이고, R은 X와 동일하거나 상이할 수 있는 캡핑기, 작용기 또는 이탈기이다. R은, 예를 들어 하이드록실, 보호된 하이드록실, 알콕실, N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 1-벤조트리아졸릴 에스테르, N-하이드록시숙신이미딜 카보네이트, 1-벤조트리아졸릴 카보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 하이드라지드, 보호된 하이드라지드, 보호된 티올, 카복실산, 보호된 카복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 알켄, 및 케톤으로 구성된 군에서 선택된 작용기일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 전사 인자를 연결하는 데 링커기를 이용할 수 있다. 유전자는 코딩된 단백질의 발현을 효율적으로 개시시키기 위해 복수의 전사 인자를 필요로 한다. 비천연 아미노산으로 합성된 전사 인자는 전술한 바와 같은 링커에 의해 연결될 수 있고 표적화된 유전자의 인위적 활성화를 향상시키는 데 이용될 수 있다. 연결된 전사 인자는 표적 DNA에 결합하여 정상적인 활성화 신호 캐스케이드 부재하에 RNA 폴리머라제의 동원을 촉진함으로써, 신호를 필요로 하지 않고 유전자를 발현시킨다. 또 다른 실시형태에서, 세포 수용체에 대한 리간드는 수용체의 효율적 활성화를 위해 연결될 수 있다. 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)는 그 수용체에 결합하기 위해 이량체를 형성한다. 비천연 아미노산을 포함하는 PDGF는 연결되어 전술한 바와 같이 링커를 통해 이량체를 형성하며 투여되어 PDGF 수용체의 효율적인 결합을 제공한다. 연결된 단백질의 또 다른 실시형태는 연결된 항체를 포함한다. 각각 동일한 또는 인접한 표적 상의 독특한 에피토프에 특이적인 2종의 상이한 항체가 향상된 자극, 결합 또는 중화를 위해 연결될 수 있다. 예를 들어, HIV의 gp120 및 관련된 gp40 상에서 발견되는 2종의 상이한 에피토프에 특이적인 항체는 연결되어 표적을 더 효과적으로 중화시킬 수 있다. 유사하게, 연결된 항체는 세포 표면 수용체를 자극하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, T 세포 수용체의 CD3에 대한 항체와 CD4에 대한 항체는 연결되어 수용체의 활성화를 위한 필요한 자극을 제공할 수 있다. 또 다른 실시형태는 핵산에 연결된 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 세포 수용체 또는 세포 표면에 결합하는 단백질에 대한 리간드를 치료용 핵산에 연결하여 원하는 표적에 투여할 수 있다. 연결된 리간드는 핵산의 흡수를 촉진하며, 그 후 이 핵산은 세포 내에서 발현되어 치료 효과를 제공한다. 마찬가지로, 펩티드를 핵산에 연결하여 핵산의 패키징 또는 압축을 촉진할 수 있다.

링커 상의 작용기는 동일할 필요도 없고 페닐 하이드라진기일 필요도 없다. 본 명세서 전반에 상세히 설명된 화학 작용을 통해, 하나 이상의 작용기가 비천연 아미노산 폴리펩티드와 함께 인돌기를 형성할 수 있는 링커를 디자인할 수 있으며, 일부 실시형태에서, 링커 상의 다른 작용기는 친핵체/친전자체에 기초한 화학 작용을 비롯한 다른 공지된 방법을 이용한다.

C. 작용기 부가의 예: 폴리펩티드의 단리 특성의 개선

천연 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 폴리펩티드의 용해도 또는 결합 특성을 포함하나 이들에 한정되지 않는 많은 이유로 시료로부터 단리하기 어려울 수 있다. 예를 들어, 치료적 용도로 폴리펩티드를 제조하는 경우, 이러한 폴리펩티드는 이 폴리펩티드를 과다 생산하도록 조작된 재조합 시스템으로부터 단리할 수 있다. 그러나, 폴리펩티드의 용해도 또는 결합 특성으로 인해, 원하는 순도를 달성하는 것이 종종 어려운 것으로 입증되었다. 본원에 기재된 방법, 조성물, 기법 및 수단은 이러한 상황에 대한 해결책을 제공한다.

본원에 기재된 방법, 조성물, 기법 및 수단을 이용하여, 원하는 폴리펩티드와 상동성인 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조할 수 있으며, 여기서 상기 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 개선된 단리 특성을 갖는다. 일 실시형태에서, 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성에 의해 제조된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 본원에 기재된 비천연 아미노산 중 하나를 그 구조 내로 도입하였다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 말단 또는 내부 위치에 도입되고, 또한 부위 특이적으로 도입된다.

일 실시형태에서, 생합성에 의해 제조하여 얻은 비천연 아미노산은 이미 소정의 개선된 단리 특성을 가지고 있다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 개선된 단리 특성을 제공하는 기에 대한 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 결합을 포함한다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산을 추가로 변형시켜, 변형된 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하며, 여기서 상기 변형은 개선된 단리 특성을 제공하는 기와의 복소환(질소 함유 복소환) 결합을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이러한 기는 비천연 아미노산에 직접 연결되고, 다른 실시형태에서, 이러한 기는 링커기를 통해 비천연 아미노산에 연결된다. 특정 실시형태에서, 이러한 기는 단일 화학 반응에 의해 비천연 아미노산에 연결되고, 다른 실시형태에서는, 이러한 기를 비천연 아미노산에 연결하는 데 일련의 화학 반응이 필요하다. 바람직하게는, 개선된 단리 특성을 부여하는 기는 이용된 반응 조건하에서 비천연 아미노산 폴리펩티드 내의 비천연 아미노산에 부위 특이적으로 연결되고 천연 아미노산에는 연결되지 않는다.

또 다른 또는 추가 실시형태에서, 생성된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원과의 상동성을 나타내지만, 본 섹션에 기재된 방법, 기법 및 조성물은, 개선된 단리 특성으로부터 이익을 얻을 수 있는, 예를 들어 치료용 단백질을 비롯한 실질적으로 어떠한 다른 폴리펩티드에도 적용될 수 있다.

다른 또는 추가 실시형태에서, 개선된 단리 특성을 부여하는 기는 폴리펩티드의 수용해도를 개선시키고, 다른 실시형태에서, 상기 기는 폴리펩티드의 결합 특성을 개선시키며, 다른 실시형태에서, 상기 기는 폴리펩티드에 새로운 결합 특성(예를 들어, 바이오틴기 또는 바이오틴 결합 기를 포함함)을 제공한다. 상기 기가 폴리펩티드의 수용해도를 개선시키는 실시형태에서, 상기 기는, 예를 들어 본원에 기재된 PEG 중합체 기 중 임의의 기를 포함하는, 본원에 기재된 수용성 중합체로부터 선택된다.

B. 작용기 부가의 예: 폴리펩티드의 존재 검출

천연 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 이 폴리펩티드에 용이하게 결합할 수 있는 시약 또는 표지의 부재를 포함하나 이에 한정되지 않는 많은 이유로 인하여, 시료(생체내 시료 및 시험관내 시료를 포함함) 중에서 검출되기 어려울 수 있다. 본원에 기재된 방법, 조성물, 기법 및 수단은 이러한 상황에 대한 해결책을 제공한다.

본원에 기재된 방법, 조성물, 기법 및 수단을 이용하여, 원하는 폴리펩티드와 상동성인 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조할 수 있으며, 여기서 상기 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 생체내 시료 및 시험관내 시료 중의 폴리펩티드의 검출을 가능하게 한다. 일 실시형태에서, 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성에 의해 제조된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 본원에 기재된 비천연 아미노산 중 하나를 그 구조 내로 도입하였다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 말단 또는 내부 위치에 도입되고, 또한 부위 특이적으로 도입된다.

일 실시형태에서, 생합성에 의해 제조하여 얻은 비천연 아미노산은 이미 소정의 검출 특성을 가지고 있다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산 폴리펩티드는, 검출 특성을 개선시키기 위해, 인돌 함유 아미노산을 비롯한 카보닐 함유 비천연 아미노산, 하이드라진 함유 비천연 아미노산으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다. 다른 실시형태에서, 이러한 비천연 아미노산은 생합성에 의해 본원에 기재된 폴리펩티드 내로 도입되었다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 화학식 I∼XV의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다. 또 다른 또는 대안의 실시형태에서, 비천연 아미노산 폴리펩티드는 구조식 1∼4의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 검출 특성을 개선시키기 위해 인돌 결합을 포함한다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산을 추가로 변형시켜, 변형된 인돌 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하며, 여기서 상기 변형은 개선된 검출 특성을 제공하는 기에 대한 인돌 함유 결합을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이러한 기를 비천연 아미노산에 직접 연결하고, 다른 실시형태에서, 이러한 기를 링커기를 통해 비천연 아미노산에 연결한다. 특정 실시형태에서, 이러한 기를 단일 화학 반응에 의해 비천연 아미노산에 연결하고, 다른 실시형태에서, 이러한 기를 비천연 아미노산에 연결하는 데 일련의 화학 반응이 필요하다. 바람직하게는, 개선된 검출 특성을 부여하는 기는 이용된 반응 조건하에 비천연 아미노산 폴리펩티드 내의 비천연 아미노산에 부위 특이적으로 연결되고 천연 아미노산에는 연결되지 않는다.

또 다른 또는 추가 실시형태에서, 생성된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원과 상동성이지만, 본 섹션에 기재된 방법, 기법 및 조성물은, 생체내 시료 또는 시험관내 시료 중에서 검출할 필요가 있는, 예를 들어 치료용 단백질을 비롯한 실질적으로 어떠한 다른 폴리펩티드에도 적용될 수 있다.

또 다른 또는 추가 실시형태에서, 개선된 검출 특성을 부여하는 기는 표지; 염료; 친화성 표지; 광친화성 표지; 스핀 표지; 형광단; 방사성 부분; 중원자를 도입하는 부분; 동위원소로 표지된 부분; 생물물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 발색단; 에너지 전달제; 검출 가능한 표지; 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.

일 실시형태에서, 인돌 비천연 아미노산을 포함하도록 항체를 조작하며, 이 항체는 암 세포 상의 독특한 항원을 인식한다. 항체를 본원에 기재된 인돌을 매개로 한 방법으로 표지 및/또는 변형하고 표지된 항체를 정제한 후, 이것을 표지된 항체가 인식할 수 있는 암을 가진 것으로 의심되는 피험체에 투여한다. 표지된 항체를 투여한 후, 환자 체내의 표지된 항체의 존재 및 위치로 암 조직의 존재를 확인할 수 있다. 표지된 항체의 투여는 환자 체내의 암, 피험체 체내의 전이 및/또는 피험체에 있어서의 암 치료 효능의 검출을 가능하게 한다.

또 다른 실시형태에서, 세포 표면 상의 항원에 결합하는 펩티드는 펩티드를 피험체에 투여한 후 펩티드를 추적하는 데 사용될 수 있는 형광 염료를 포함하나 이에 한정되지 않는 염료를 포함하도록 조작한다. 이 염료는 펩티드 내에 위치한 비천연 아미노산을 통해 펩티드에 부착되며, 이 펩티드는 피험체에 투여된다. 이 펩티드의 위치 지정 또는 이 펩티드의 리간드(들)에의 결합은 공지된 영상화 또는 검출 기법을 이용하여 수행한다.

또 다른 실시형태에서, 환자에 있어서 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법으로서, 하기 구조식 1∼4로 표시되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드, 이의 활성 대사물질, 염, 또는 약학적으로 허용되는 전구약물 또는 용매화물를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공된다:

상기 식에서,

여기서, 구조식 1, 2, 3 및 4에 있어서 결합된 R_a 기를 갖는 각각의 고리는 0개, 1개 또는 2개의 R_a 기를 포함할 수 있고, 각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택되거나; 또는 1개보다 많은 R_a 기가 존재할 경우, 2개의 R_a가 임의로 아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있고;

R₅는 L-X이고, 여기서 X는 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 세포 독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트제; 보조 인자; 지방산; 탄수화물; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 사카라이드; 수용성 덴드리머; 시클로덱스트린; 생물학적 물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광단; 금속 함유 부분; 방사성 부분; 신규 작용기; 다른 분자와 공유 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 광케이징된 부분; 화학선에 의해 여기 가능한 부분; 리간드; 광이성질체화 가능한 부분; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 중원자를 도입하는 부분; 화학적으로 절단 가능한 기; 광절단 가능한 기; 연장된 측쇄; 탄소 결합된 당; 산화환원 활성 물질; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위원소 표지 부분; 생물물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성 물질; 검출 가능한 표지; 소분자; 억제성 리보핵산; 방사성 뉴클레오티드; 중성자 포획제; 바이오틴의 유도체; 양자점(들); 나노트랜스미터; 래디오트랜스미터; 항체 효소; 활성화된 착물 활성화제; 바이러스; 보조제; 아글리칸; 알레르기원; 안지오스타틴; 안티호르몬; 항산화제; 압타머; 가이드 RNA; 사포닌; 셔틀 벡터; 거대분자; 미모토프; 수용체; 역 미셀; 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되고; L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)_k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

또 다른 실시형태에서, 환자에 있어서 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법으로서, 구조식 1∼4로 표시되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 하나 이상의 비천연 아미노산은 상기 폴리펩티드 내의 특정 부위로 도입된다. 또 다른 실시형태에서, 환자에 있어서 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법으로서, 구조식 1∼4로 표시되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 비천연 아미노산은 번역 시스템에 의해 도입된다. 또 다른 실시형태에서, 환자에 있어서 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법으로서, 구조식 1∼4로 표시되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 비천연 아미노산은 번역 시스템 및 번역 후 변형 시스템에 의해 폴리펩티드 내로 도입된다. 또 다른 실시형태에서, 환자에 있어서 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법으로서, 구조식 1∼4로 표시되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 하나 이상의 비천연 아미노산은 수용액 중에서 적어도 1개월 동안 안정하다. 또 다른 실시형태에서, 환자에 있어서 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법으로서, 구조식 1∼4로 표시되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 하나 이상의 비천연 아미노산은 적어도 2주 동안 안정하다. 또 다른 실시형태에서, 환자에 있어서 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법으로서, 구조식 1∼4로 표시되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 하나 이상의 비천연 아미노산은 적어도 5일 동안 안정하다.

또 다른 실시형태에서, 구조식 1∼4로 표시되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 폴리펩티드는 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 항체 단편, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨 이뇨 인자, 심방 나트륨 이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인 단백질-1, 단핵구 화학유인 단백질-2, 단핵구 화학유인 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, I309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피세포 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피세포 성장 인자(EGF), 상피세포 호중구 활성화 펩티드, 에리스로포이에틴(EPO), 박리 독소, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4 나선 번들 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질 세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴투린, 호중구 억제 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 암유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴렉신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 슈퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화 인자, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론으로 구성된 군에서 선택되는 치료용 단백질과 상동성인 단백질이다.

또 다른 실시형태에서, 인돌 함유 부분을 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 내에 위치하는 비천연 아미노산을 통해 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 부착시킨다. 적절히 표지된 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 공지된 방법을 통해 검출 및 이미지화를 위해 원하는 피험체에 투여한다. 이러한 표지된 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 통해, 다양한 질병, 대사 경로, 생리학적 구조체 또는 세포내 성분을 이미지화할 수 있다. 예를 들어, 피험체 체내에서 표지된 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 존재를 검출하기 위해 형광 영상 현미경법을 이용할 수 있다.

C. 작용기 부가의 예: 폴리펩티드의 치료적 특성의 개선

천연 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드는 특정 질환, 질병 또는 병증을 앓고 있는 환자에게 특정한 치료적 이익을 제공할 수 있을 것이다. 이러한 치료적 이익은, 예를 들어 폴리펩티드의 안전성 프로필, 및 폴리펩티드의 약동학적, 약리학적 및/또는 약력학적 특성(예를 들어, 수용해도, 생체이용률, 혈청 반감기, 치료 반감기, 면역원성, 생물학적 활성 또는 순환 시간)을 비롯한 다수의 요인에 따라 달라질 것이다. 또한, 폴리펩티드에 추가 작용기, 예컨대, 부착된 세포 독성 화합물 또는 약물을 제공하는 것이 유리하거나, 추가 폴리펩티드를 부착시켜 본원에 기재된 동종다량체 및 이종다량체를 형성하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 변형은 본래의 폴리펩티드의 활성 및/또는 3차 구조를 파괴하지 않는 것이 바람직하다. 본원에 기재된 방법, 조성물, 기법 및 수단은 이 문제에 대한 해결책을 제공한다.

본원에 기재된 방법, 조성물, 기법 및 수단에 의하면, 원하는 폴리펩티드에 대해 상동성인 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 제조할 수 있으며, 여기서 상기 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 개선된 치료적 특성을 갖는다. 일 실시형태에서, 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드는 생합성에 의해 제조된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 본원에 기재된 비천연 아미노산 중 하나를 그 구조 내로 도입하였다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 말단 또는 내부 위치에 도입되고, 또한 부위 특이적으로 도입된다.

일 실시형태에서, 생합성에 의해 제조하여 얻은 비천연 아미노산은 이미 소정의 개선된 치료적 특성을 가지고 있다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산은 개선된 치료적 특성을 제공하는 기에 대한 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 결합을 포함한다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 비천연 아미노산을 추가로 변형시켜, 변형된 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 형성하며, 여기서 상기 변형은 개선된 치료적 특성을 제공하는 기에 대한 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 결합을 제공한다. 일부 실시형태에서, 이러한 기는 비천연 아미노산에 직접 연결되고, 다른 실시형태에서, 이러한 기는 링커기를 통해 비천연 아미노산에 연결된다. 특정 실시형태에서, 이러한 기는 단일 화학 반응에 의해 비천연 아미노산에 연결되고, 다른 실시형태에서, 이러한 기를 비천연 아미노산에 연결하는 데 일련의 화학 반응이 필요하다. 바람직하게는, 개선된 치료적 특성을 부여하는 기는 이용된 반응 조건하에서 비천연 아미노산 폴리펩티드 내의 비천연 아미노산에 부위 특이적으로 연결되고 천연 아미노산에는 연결되지 않는다.

또 다른 또는 추가 실시형태에서, 생성된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 GH 수퍼유전자 패밀리 구성원과 상동성이지만, 본 섹션에 기재된 방법, 기법 및 조성물은 개선된 치료적 특성으로부터 이익을 얻을 수 있는, 예를 들어 치료용 단백질을 비롯한 사실상 어떠한 다른 폴리펩티드에도 적용될 수 있다.

또 다른 또는 추가 실시형태에서, 개선된 치료적 특성을 부여하는 기는 폴리펩티드의 수용해도를 개선시키고; 다른 실시형태에서, 상기 기는 폴리펩티드의 결합 특성을 개선시키며; 다른 실시형태에서, 상기 기는 폴리펩티드에 새로운 결합 특성(예를 들어, 바이오틴기 또는 바이오틴 결합 기를 포함함)을 제공한다. 기가 폴리펩티드의 수용해도를 개선시키는 실시형태에서, 이 기는, 예를 들어 PEG 중합체 기를 비롯한, 본원에 기재된 수용성 중합체로부터 선택된다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 기는 세포 독성 화합물인 반면, 다른 실시형태에서, 상기 기는 약물이다. 또 다른 실시형태에서, 연결된 약물 또는 세포 독성 화합물은 비천연 아미노산 폴리펩티드로부터 절단되어 상기 약물 또는 세포 독성 화합물을 원하는 치료 부위에 전달할 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 기는, 예를 들어 제1 비천연 아미노산 폴리펩티드와 동일한 아미노산 구조를 갖는 폴리펩티드를 비롯한 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 제2 폴리펩티드이다.

또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 변형된 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드이다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 생체이용률을 증가시킨다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 안전성 프로필을 증가시킨다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 수용해도를 증가시킨다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 치료 반감기를 증가시킨다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시킨다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 순환 시간을 연장시킨다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 생물학적 활성을 조절한다. 또 다른 또는 추가 실시형태에서, 상기 복소환(질소 함유 복소환을 포함함) 함유 비천연 아미노산 폴리펩티드는 상동성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 면역원성을 조절한다.

XI. 변형된 폴리펩티드의 치료적 용도

편의상, 본 섹션에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드는 개괄적으로 및/또는 구체적인 예를 들어 설명하였다. 그러나, 본 섹션에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드는 본 섹션에 제공된 일반적인 설명 또는 구체적인 예에만 한정되는 것이 아니며, 본 섹션에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드는 화학식 I∼XV의 범위 내에 속하는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 모든 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드와 구조식 1∼4로 표시되는 화합물(본원의 명세서, 청구의 범위 및 도면에 기재된 화학식 I∼LXV의 범위 내에 속하는 임의의 하위 화학식의 화합물 또는 특정 화합물을 포함함)에 동일하게 적용된다.

동종다량체 및 이종다량체를 비롯한 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드는 치료 용도, 진단 용도, 분석에 기초한 용도, 산업적 용도, 화장품 용도, 식물 생물학적 용도, 환경적 용도, 에너지 생산 용도, 소비재 용도 및/또는 군사적 용도를 포함하나 이들에 한정되지 않는 다수의 용도에 사용될 수 있다. 비한정적인 예로서, 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드의 하기 치료적 용도가 제공된다.

본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드는 다종 다양한 질환, 병증 또는 질병의 치료에 유용하다. 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드 생성물을 투여하면, 인간을 대상으로 한 시판되고 있는 폴리펩티드 제제에 의해 나타나는 활성들 중 임의의 활성이 나타난다. 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드 생성물의 평균 양은 달라질 수 있고, 특히 일정한 자격을 갖춘 의사의 권장 및 처방에 기초해야 한다. 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드의 정확한 양은 치료 대상 병증의 정확한 유형, 치료 대상 환자의 상태, 및 조성물 중의 다른 성분들과 같은 요인들에 달려 있다. 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드를 사용한 치료법에 기초하여 투여량을 결정할 수 있다.

A. 투여 및 약학 조성물

본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드(하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 합성효소, 단백질 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않음)는, 경우에 따라, 적절한 약학적 담체와 함께(이에 한정되지 않음) 치료적 용도로 사용된다. 이러한 조성물은, 예를 들어 치료적 유효량의 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체 또는 부형제로는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및/또는 이들의 조합을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 이 제제는 투여 방식에 적합하도록 제조된다. 일반적으로, 단백질 투여 방법은 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드의 투여에 적용될 수 있다.

효능 및 조직 대사를 확인하고 투여량을 평가하기 위해, 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드를 1종 이상 포함하는 치료용 조성물을, 경우에 따라, 공지된 방법에 준하여 1종 이상의 적절한 시험관내 및/또는 생체내 동물 질환 모델에서 테스트한다. 특히, 투여량은, 즉, 관련 분석에서 측정된, 천연 아미노산 상동체에 대한 비천연 아미노산 상동체의 활성, 안정성 또는 다른 적절한 척도(하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형된 폴리펩티드와 천연 아미노산 폴리펩티드의 비교를 포함하나, 이에 한정되지 않음)에 의해 초기에 결정할 수 있다.

투여는 분자를 최종적으로 혈액 또는 조직 세포와 접촉시키는 데 통상적으로 이용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경우에 따라 1종 이상의 약학적으로 허용되는 담체와 함께 임의의 적절한 방식으로 투여된다. 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드를 환자에게 투여하기에 적합한 방법이 이용 가능하고, 특정 조성물을 투여하는 데 하나 이상의 경로를 이용할 수 있지만, 대개 특정 경로가 또 다른 경로보다 더 빠르고 더 효과적인 작용 또는 반응을 제공할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체는 부분적으로는 투여되는 특정 조성물뿐만 아니라, 조성물을 투여하는 데 이용되는 특정 방법에 의해서도 결정된다. 따라서, 본원에 기재된 약학 조성물로 이루어진 다종 다양한 적절한 제형이 존재한다.

본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 비경구 경로(예를 들어, 피하 또는 정맥 주사 또는 임의의 다른 형태의 주사 또는 주입을 포함하나 이들에 한정되지 않는 주사)를 포함하나 이에 한정되지 않는, 단백질 또는 펩티드에 적합한 임의의 경로를 통해 투여될 수 있다. 폴리펩티드 약학 조성물(본원에 기재된 다양한 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함함)은 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 경피, 피하, 국소, 설하 또는 직장 경로를 포함하나 이들에 한정되지 않는 다수의 경로를 통해 투여될 수 있다. 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 리포솜을 통해 투여될 수도 있다. 본원에 기재된 비천연 아미노산 폴리펩티드는 단독으로, 또는 약학적 담체를 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 적절한 성분들과 함께 사용될 수 있다.

또한, 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드를, 단독으로 또는 다른 적절한 성분들과 함께 흡입 투여를 위한 에어로졸 제제(즉, 이것은 "분무"될 수 있음)로 제조할 수 있다. 에어로졸 제제는 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등과 같은 적절한 압축 추진제 중에 함유될 수 있다.

예를 들어, 관절내(관절 안), 정맥내, 근육내, 피내, 복강내 및 피하 경로에 의한 비경구 투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충액, 정균제와, 제제가 해당 수용자의 혈액과 등장성이 되도록 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성의 등장성 멸균 주사액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 포장된 핵산 제제는 앰플 및 바이알과 같이 단회 투여 또는 다회 투여용 밀봉 용기로 제공될 수 있다.

비경구 투여 및 정맥내 투여가 바람직한 투여 방법이다. 특히, 현재 사용되고 있는 제제와 함께, 천연 아미노산 상동체 치료제에 대해 이미 이용되고 있는 투여 경로(EPO, IFN, GH, G-CSF, GM-CSF, IFN, 인터루킨, 항체 및/또는 임의의 다른 약학적으로 전달되는 단백질에 대해 일반적으로 이용되는 투여 경로를 포함하나, 이에 한정되지 않음)가 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 바람직한 투여 경로 및 제제를 제공한다.

본원에 기재된 조성물 및 방법에 있어서, 환자에게 투여되는 투여량은 시간이 경과함에 따라 환자에게 유익한 치료 반응을 나타내기에 충분하다. 투여량은 특정 제제의 효능과, 사용된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성, 안정성 또는 혈청 반감기 및 환자의 상태뿐만 아니라, 치료 대상 환자의 체중 또는 체표면적에 의해 결정된다. 또한, 투여량의 크기는 특정 환자에 있어서의 특정 제제의 투여에 동반되는 임의의 유해 부작용의 존재, 성질 및 정도 등에 의해 결정된다.

질환(암, 유전 질환, 당뇨병, AIDS 등을 포함하나, 이에 한정되지 않음)의 치료 또는 예방을 위해 투여되는 제제의 유효량을 결정함에 있어서, 의사는 순환 혈장 수치, 제제의 독성, 질환의 진행도, 및/또는 관련이 있는 경우, 항 비천연 아미노산 폴리펩티드 항체의 생성을 평가한다.

예를 들어, 체중 70 kg의 환자에게 투여되는 투여량은, 일반적으로, 해당 조성물의 변경된 활성 또는 혈청 반감기에 맞추어 조정된, 현재 사용되는 치료용 단백질의 투여량과 등가의 범위 내에 있다. 본원에 기재된 약학 제제는 항체 투여, 백신 투여, 세포 독성제의 투여, 천연 아미노산 폴리펩티드의 투여, 핵산의 투여, 뉴클레오티드 유사체의 투여, 생물학적 반응 변경제의 투여 등을 비롯한 다양한 치료법을 보충할 수 있다.

투여에 있어서, 본원에 기재된 약학 제제는 해당 제형의 LD₅₀ 또는 ED₅₀, 및/또는 다양한 농도(예를 들어 환자의 체중 및 환자의 전반적인 건강 상태에 맞게 조정되는 것을 포함하나 이에 한정되지 않음)에서의 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드의 임의의 부작용의 관찰의해 결정된 비율로 투여된다. 투여는 단회 투여 또는 분할 투여를 통해 이루어질 수 있다.

제제를 주입받고 있는 환자가 발열, 오한 또는 근육통을 보일 경우, 적정량의 아스피린, 이부프로펜, 아세트아미노펜 또는 다른 통증/발열 억제 약물을 투여한다. 발열, 근육통 및 오한과 같은 주입에 대한 반응을 보이는 환자에게는, 후속 주입 30분 전에 아스피린, 아세트아미노펜, 또는 디펜하이드라민을 포함하나 이들에 한정되지 않는 약물을 미리 투여한다. 해열제 및 항히스타민제에 빠르게 반응하지 않는 보다 심한 오한 및 근육통에 대해서는 메페리딘을 사용한다. 반응의 중증도에 따라 세포 주입을 늦추거나 중단한다.

본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드는 포유동물 피험체에게 직접 투여할 수 있다. 투여는 폴리펩티드를 피험체에 도입하는 데 통상적으로 이용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드는 경구, 직장, 국소, 흡입(에어로졸을 이용하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않음), 협측(설하를 포함하나 이에 한정되지 않음), 질내, 비경구(피하, 근육내, 피내, 관절내, 흉막강내, 복강내, 뇌내, 동맥내 또는 정맥내 경로를 포함하나 이들에 한정되지 않음), 국소(즉, 피부 및 기도 표면을 비롯한 점막 표면 모두) 및 경피 투여에 적합한 것들을 포함한다. 투여는 국소 또는 전신 투여일 수 있다. 제제는 앰플 및 바이알과 같은 단회 투여 또는 다회 투여용의 밀봉 용기로 제공될 수 있다. 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 단위 제형의 주사제 형태(용액제, 현탁제 또는 에멀션제를 포함하나, 이들에 한정되지 않음)로 혼합물로 제조될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드는 연속 주입(삼투압 펌프와 같은 미니펌프를 포함하나 이에 한정되지 않음), 단일 볼루스 또는 서방형 데포 제제에 의해 투여될 수 있다.

투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충제, 정균제, 및 제제를 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성의 등장성 멸균 용액과, 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 용액 및 현탁액은 이미 알려진 유형의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

동결 건조는, 원하는 단백질 제제로부터 물을 제거하는 역할을 하는, 단백질을 제공하기 위해 통상적으로 이용되는 기법이다. 동결 건조 또는 냉동 건조는 건조시키고자 하는 물질을 먼저 동결시킨 후 진공 환경하에 승화로 얼음 또는 동결된 용매를 제거하는 공정이다. 동결 건조 과정 동안 안정성을 향상시키고 저장시 동결 건조된 생성물의 안정성을 개선시키기 위해 부형제를 동결 건조 전 제제에 포함시킬 수 있다[Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) and Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3): 285-291 (1991)].

약제의 분무 건조는 공지되어 있다. 이에 관해서는, 예를 들어 문헌[Broadhead, J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals," in Drug Dev. Ind. Pharm., 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992)]을 참조할 수 있다. 소분자 약제 이외에도, 다양한 생물학적 물질이 분무 건조되었으며 여기에는 효소, 혈청, 혈장, 미생물 및 효모가 포함된다. 분무 건조는 1 단계 공정으로 액상 약학 제제를 미세한 미분진 또는 과립 분말로 전환할 수 있기 때문에 유용한 기법이다. 기본적인 기법은 하기 4 단계를 포함한다: a) 공급 용액을 분무하여 분무물로 만드는 단계; b) 분무물과 공기를 접촉시키는 단계; c) 분무물을 건조시키는 단계; 및 d) 건조된 생성물을 건조 공기로부터 분리하는 단계. 전술한 내용과 관련하여 본원에서 참고로 인용되는 미국 특허 제6,235,710호 및 제6,001,800호에는 분무 건조에 의한 재조합 에리스로포이에틴의 제조 방법이 기재되어 있다.

본원에 기재된 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 부분적으로는 투여되는 특정 조성물과, 조성물을 투여하는 데 이용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 약학 조성물(임의적인 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함함)로 이루어진 다종 다양한 적절한 제제가 존재한다(예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)]; 문헌[Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975]; 문헌[Liberman, H. A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980]; 및 문헌[Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins, 1999)] 참조). 적절한 담체로는 숙시네이트, 포스페이트, 보레이트, HEPES, 시트레이트, 이미다졸, 아세테이트, 바이카보네이트 및 다른 유기산을 함유하는 완충액; 아스코르브산을 포함하나 이에 한정되지 않는 항산화제; 저분자량의 폴리펩티드(약 10개 미만의 잔기를 갖는 폴리펩티드를 포함하나 이에 한정되지 않음); 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린을 포함하나 이들에 한정되지 않는 단백질; 폴리비닐피롤리돈을 포함하나 이에 한정되지 않는 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 히스티딘 또는 히스티딘 유도체, 메티오닌, 글루타메이트 또는 라이신을 포함하나 이들에 한정되지 않는 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 다른 탄수화물(트레할로스, 수크로스, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하나 이들에 한정되지 않음); EDTA 및 에덴테이트 디소듐을 포함하나 이에 한정되지 않는 킬레이트제; 아연, 코발트 또는 구리를 포함하나 이들에 한정되지 않는 2가 금속 이온; 만니톨 및 솔비톨을 포함하나 이들에 한정되지 않는 당 알코올; 나트륨을 포함하나 이들에 한정되지 않는 염 형성성 반대 이온; 및/또는 Tween^TM[Tween 80(폴리솔베이트 80) 및 Tween 20(폴리솔베이트 20)을 포함하나, 이들에 한정되지 않음], Pluronics^TM 및 다른 플루론산[플루론산 F68(폴록사머 188)을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 플루론산 또는 PEG를 포함하나 이들에 한정되지 않음]을 포함하나 이들에 한정되지 않는 비이온성 계면활성제를 들 수 있다. 적합한 계면활성제로는, 예를 들어 폴리(에틸렌 옥시드)-폴리(프로필렌 옥시드)-폴리(에틸렌 옥시드), 즉 (PEO-PPO-PEO), 또는 폴리(프로필렌 옥시드)-폴리(에틸렌 옥시드)-폴리(프로필렌 옥시드), 즉 (PPO-PEO-PPO)에 기초한 폴리에테르 또는 이들의 조합을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. PEO-PPO-PEO 및 PPO-PEO-PPO는 상표명 Pluronics™, R-Pluronics™, Tetronics™ 및 R-Tetronics™(BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.)로 시판되며, 또한 본원에 그 전체가 참고로 인용되는 미국 특허 제4,820,352호에 기재되어 있다. 다른 에틸렌/폴리프로필렌 블록 중합체도 적절한 계면활성제일 수 있다. 계면활성제 또는 이의 조합을 사용하여, 교반으로 인해 발생하는 스트레스를 포함하나 이에 한정되지 않는 1종 이상의 스트레스로부터 PEG화된 비천연 아미노산 폴리펩티드를 안정화시킬 수 있다. 상기 물질들 중 일부 물질은 증량제(bulking agent)로서 불리기도 한다. 또한, 일부 물질은 "장성 조절제"로서 불리기도 한다. 항균 보존제도 제품 안정성 및 항균 효능을 위해 사용될 수 있고; 적합한 보존제로는 벤질 알코올, 벤즈알코늄 클로라이드, 메타크레솔, 메틸/프로필 파라벤, 크레솔 및 페놀, 및 이들의 조합을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

PEG와 같은 수용성 중합체에 연결된 것들을 비롯한 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드는 서방형 시스템 또는 이의 일부에 의해 투여될 수도 있다. 서방형 조성물은 필름 또는 마이크로캡슐을 포함하나 이들에 한정되지 않는 성형품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 서방형 매트릭스는 생체적합성 물질, 예컨대 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트)(문헌[Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981): Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)] 참조), 에틸렌 비닐 아세테이트(문헌[Langer et al., supra] 참조) 또는 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산(유럽 특허 제133,988호), 폴리락티드(폴리락트산)(미국 특허 제3,773,919호; 유럽 특허 제58,481호), 폴리글리콜리드(글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜리드(락트산과 글리콜산의 공중합체) 폴리무수물(polyanhydride), L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체(문헌[U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983)] 참조), 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 히알루론산, 콜라겐, 콘트로이틴 설페이트, 카복실산, 지방산, 인지질, 폴리사카라이드, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산, 예컨대 페닐알라닌, 타이로신, 이소루신, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘을 포함한다. 또한, 서방형 조성물은 리포솜에 봉입된 화합물을 포함한다. 이 화합물을 함유하는 리포솜은, 독일 특허 제3,218,121호; 문헌[Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)]; 문헌[Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)]; 유럽 특허 제52,322호, 제36,676호 및 제143,949호; 일본 특허 출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호, 제4,619,794호 및 제4,544,545호; 및 유럽 특허 제102,324호 등에 기재된 방법에 의해 제조된다.

리포솜에 봉입된 폴리펩티드는, 예를 들어 독일 특허 제3,218,121호; 문헌[Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82; 3688-3692 (1985)]; 문헌[Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)]; 유럽 특허 제52,322호, 유럽 특허 제36,676호, 유럽 특허 제88,046호 및 유럽 특허 제143,949호; 일본 특허 출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호, 제5,021,234호 및 제4,544,545호; 및 유럽 특허 제102,324호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 리포솜의 조성 및 크기는 공지된 방법에 의해 결정된다. 리포솜의 몇 가지 예가, 예를 들어 문헌[Park JW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1327-1331 (1995)]; 문헌[Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998)]; 문헌[Drummond DC, et al., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002)]; 문헌[Park JW, et al., Clin. Cancer Res. 8: 1172-1181 (2002)]; 문헌[Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta 1591 (1 or 2): 109-118 (2002)]; 문헌[Mamot C, et al., Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003)]에 기재되어 있다.

본원에 기재된 조성물, 제제 및 방법에 있어서, 환자에게 투여되는 투여량은 시간이 경과함에 따라 피험체에서 유익한 반응을 유발하기에 충분해야 한다. 일반적으로, 1회 투여당 비경구로 투여되는 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드의 총 약학적 유효량은 약 0.01 ㎍/kg/일∼약 100 ㎍/kg/일, 또는 환자 체중 기준으로 약 0.05 mg/kg∼약 1 mg/kg이나, 이 양은 치료적 판단에 좌우된다. 또한, 투여 빈도 역시 치료적 판단에 달려 있지만, 인체 사용에 대해 승인된 시판되는 제품보다 투여 빈도보다 더 적거나 더 많을 수 있다. 일반적으로, 예를 들어, 본원에 기재된 PEG화된 폴리펩티드를 비롯한 중합체:폴리펩티드 접합체는 전술한 투여 경로 중 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다.

XII. 변형된 폴리펩티드의 구조와 기능 간의 관계

본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드(하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 합성효소, 단백질 등을 포함하나 이에 한정되지 않음)는 이것이 존재하는 폴리펩티드에 상이한 물리적 특성 및 화학적 특성을 부여할 것이다. 이러한 특성의 유용성은 비천연 아미노산의 구조, 비천연 아미노산 상의 변형의 구조, 또는 양자에 따라 달라지며, 테스트 폴리펩티드의 구조와 기능 간의 관계를 평가하는 실험 모델을 통해 평가할 수 있다.

임의의 주어진 실험 모델에서, 소정의 폴리펩티드 또는 단백질 내의 천연 아미노산을 비천연 아미노산을 치환한다. 비천연 아미노산 함유 펩티드 또는 단백질을 발현시킨 후, 이 단백질을 택일적인 R 기의 라이브러리로 유도체화한다. 이러한 R 기는 폴리펩티드 또는 단백질 내에 포함된 비천연 아미노산과 반응한다. R 기의 라이브러리는 대체된 아미노산의 R 기와의 구조적 또는 화학적 유사성에 의해 선택된다. 새로운 R 기가 단백질 내의 비천연 아미노산에 부가되면, 이 단백질을 적절한 테스트 시스템 내에서 기능 또는 활성에 대해 스크리닝한다. 예를 들어, 단백질 내의 비천연 아미노산이 페닐알라닌으로 대체된다. 그 후, 페닐알라닌의 R 기와 유사한 특성을 갖는 택일적인 R 기의 라이브러리를 비천연 아미노산에 부가한다. 택일적인 하나의 R 기가 비천연 R 기에 부가되며, 그 예로는 고리, 헤테로 고리, 접합 고리 또는 유사한 화학적 특성 및 구조적 특성(이에 한정되지 않음)을 부여하는 다른 화학적 부분을 들 수 있다. 그 후, 적절한 실험 모델에서 테스트함으로써, 새로 치환된 비천연 아미노산의 부가와 관련된 기능 또는 기능들에 대해 유도체화된 단백질을 스크리닝한다. 실험 모델의 예로는 무세포 분석법, 세포를 기반으로 한 분석법, 조직 배양 모델 및 동물 모델을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.

또 다른 실시형태에서, 신약 개발에 있어서 파마코포어(pharmacophore) 활성을 위해 또는 검출에 유용한 형광 코어로서 비천연 아미노산 상에 인돌이 치환된다. 이러한 부가를 용이하게 하기 위해, 최적화된 2 단계 반응을 이용하여 실온에서 수성 완충액 중에서의 인돌 형성을 수행함으로써, 인돌계 R 기 또는 인돌 합성에 적합한 R 기를 비천연 아미노산에 부가한다. 이 반응 후, 유도체화된 단백질을 그 목적 활성에 대해 스크리닝한다.

예를 들어, 산성 알파-글루코시다제 효소(GAA)에 있어서의 비천연 아미노산 치환이 폼페병의 완화에 미치는 효과를 폼페병의 마우스 모델에서 평가할 수 있다. 효소 내의 선택된 부위에 다양한 아미노산 치환을 포함하는 GAA 분자의 라이브러리를 본원에 기재된 방법 및 조성물을 통해 생성하고 발현시킬 수 있다. 그 후, 상기 비천연 아미노산 함유 효소를, 본원에 기재된 것과 같은 비변형 형태 또는 번역 후 변형 형태로, 폼페병의 마우스 모델[GAA에 대해 유전적으로 상이하게(GAA-/-) 태어난 마우스]에서 그 활성에 대해 평가할 수 있다. 상기 비천연 아미노산 함유 효소는 정맥내, 경구, 또는 효율적인 단백질 수송 및 흡수를 가능하게 하는 임의의 다른 투여 경로로 투여될 수 있다. 투여 효율, 효소 반감기 및 폼페병의 완화는, 예를 들어 마우스에서의 글리코겐 분해 및/또는 제거의 측정, GAA의 혈청 수치의 측정, 심장 비대의 변화 또는 감소, 심근증, 근육병증의 평가를 통해 평가할 수 있다.

본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드는 다양한 산업적 용도에 있어서 유용하다. 본원에 기재된 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드 생성물의 사용하면, 산업적 용도에 있어서 시판되는 폴리펩티드 제제에 의해 확인되는 활성 중 임의의 활성을 얻을 수 있다.

예를 들어, 에탄올 생산을 위한 효소를 비천연 아미노산으로 변형시켜 기능의 변화를 분석할 수 있다. 다양한 비천연 아미노산 치환을 포함하는 알코올 데하이드로게나제 II 및 피루베이트 데카복실라제 효소의 라이브러리를 본원에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 생성하여 발현시킬 수 있다. 그 후, 비천연 아미노산 변형 효소를, 비천연 아미노산 치환에 의해 또는 그 결과로서 부여되는 에탄올 생산 효율에 있어서의 변화에 대해 스크리닝할 수 있다. 기질에 대한 친화성 및 전환율에 있어서의 증가(이를 포함하나 이에 한정되지 않음)를 공지된 방법으로 스크리닝하여 에탄올의 산업적 생산에 적용할 수 있다.

본원에 기재된 방법 및 조성물의 산업적 용도의 그 밖의 예로는 제초제 및 살충제의 환경 정화를 들 수 있다. 널리 사용되는 제초제인 아트라진을 오염된 토양으로부터 제거하는 것은, 아트라진을 대사시켜서 이것을 비독성으로 만드는 효소에 의해 촉진된다. 비천연 아미노산 치환을 포함하는 변형된 아트라진 클로로하이드롤라제 효소의 라이브러리를 본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 생성하고 발현시킬 수 있다. 그 후, 비천연 아미노산 변형 아트라진 클로로하이드롤라제 효소의 라이브러리를, 환경에서 발견되는 아트라진으로부터 염소를 제거하는 능력의 변화 및 비천연 아미노산 치환에 의해 또는 비천연 아미노산 치환의 결과로서 부여되는 임의의 새로운 형태의 아트라진 대사에 대해 스크리닝할 수 있다. 전술한 바와 같이, 효소 효율에 있어서의 변화는 아트라진 또는 중간체의 대사 증가를 포함하나 이에 한정되지 않는 공지된 방법을 통해 평가할 수 있다.

실시예 1

의 합성

이용된 합성은 하기 반응식으로 표시된다:

a)

의 합성

0℃에서, 피리딘(50 mL) 중 1-p-톨릴하이드라진(5.0 g, 31 mmol) 용액에 Ac₂O(30 mL, 318 mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고 MeOH(100 mL)로 켄칭하였다. 진공하에 용매를 제거한 후, 속성 크로마토그래피(실리카, 20∼50% EtOAc/헥산)로 정제하여 무색 오일(6.72 g, 87%)을 수득하였다: ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.28 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 2.47 (s, 6H), 2.40 (s, 3H), 2.14 (s, 3H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 171.8, 169.5, 139.1, 138.8, 130.4, 126.4, 25.4, 22.3, 21.3.

b)

의 합성

CCl₄(300 mL) 중 N',N'-디아세틸-N-p-톨릴아세토하이드라지드(6.4 g, 25.8 mmol) 용액에 N-브로모 숙신이미드(5.1 g, 28.7 mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 환류하에 가열하였다. 2,2'-아조비스이소부티로니트릴(AIBN, 0.2 g, 1.2 mmol)을 첨가하였다. 형성된 혼합물을 환류하에 36시간 동안 교반한 후 실온으로 냉각시켰다. 이 혼합물을 H₂O 및 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 갈색 오일로서 브롬화물(8.62 g)을 수득하였다. 미정제 생성물을 정제하지 않고 다음 단계에 바로 사용하였다.

c)

의 합성

EtOH(80 mL) 중 EtONa(2.3 g, 32.1 mmol) 용액에 디에틸 2-아세트아미도말로네이트(6.3 g, 29.0 mmol)를 첨가하였다. 형성된 혼합물을 0℃에서 20분 동안 교반하였다. N,N'-디아세틸-N-(4-(브로모메틸)페닐)아세토하이드라지드(8.62 g, 26.4 mmol)를 일제히 첨가하였다. 이 혼합물을 80℃에서 밤새 가열하고 실온으로 냉각시켰다. 이 반응 혼합물에 시트르산(10 g, 50 mmol)을 첨가하였다. 대부분의 용매를 제거한 후, 잔류물을 EtOAc(500 mL)로 희석하였다. 이 혼합물을 H₂O 및 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 속성 크로마토그래피(실리카, 15∼80% EtOAc/헥산)로 정제하여 황색 오일로서 디에틸 2-(4-(아세트아미도)벤질)-2-아세트아미도말로네이트(4.17 g, 2 단계에 걸쳐 35%)를 수득하였다: ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.23 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.03 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.57 (s, 1 H), 4.29-4.20 (m, 4H), 3.65 (m, 2H), 2.41 (s, 6H), 2.08 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.27 (t, J = 3.6 Hz, 6H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 171.7, 169.3, 169.2, 167.4, 140.3, 136.4, 131.3, 126.2, 67.2, 63.0, 37.4, 25.3, 23.2, 22.3, 14.2.

d)

의 합성

디옥산(15 mL) 중 디에틸 2-(4-(아세트아미도)벤질)-2-아세트아미도말로네이트(572 mg, 1.24 mmol) 용액에 HCl(12 N, 15 mL)을 첨가하였다. 형성된 혼합물을 환류하에 밤새 가열하고 진공하에 농축시켰다. 잔류물에 MeOH(1 mL)를 첨가하였다. 에테르(200 mL)를 첨가하여 생성물(231 mg, 81%)을 고체로서 침전시켰다: ¹H NMR (500 MHz, D₂O) δ 7.28 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.00 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.21 (dd, J = 7.4, 5.7 Hz, 1H), 3.26 (dd, J = 9.2, 5.7 Hz, 1H), 3.15 (dd, J = 14.7, 7.4 Hz, 1H); ¹³C NMR (125 MHz, D₂O) δ 171.5, 142.9, 130.3, 129.0, 1 15.7, 54.1, 34.7.

실시예 2

이 카보닐 함유 아미노산의 합성은 표준 방법에 따른다.

실시예 3

이 카보닐 함유 아미노산의 합성은 표준 방법에 따른다.

실시예 4: 아릴 하이드라진과 알데히드 간의 반응

인돌을 형성하기 위한 두 분자 간의 모델 반응이 도 3, 4, 5, 6 및 7에 도시되어 있다. 2종의 출발 물질 중 어느 하나는 비천연 아미노산 폴리펩티드 상의 측쇄로서 존재할 수 있고, 나머지 반응제는 상기 측쇄를 유도체화하기 위한 화합물 상의 작용기에 해당한다. 즉, 비천연 아미노산 폴리펩티드 상의 측쇄는 아릴 하이드라진기일 수 있고, 반응성 부분은 수용성 중합체, 하나 이상의 아미노산 또는 검출 가능한 표지에 결합된 알데히드이다. 반대로, 비천연 아미노산 폴리펩티드 상의 측쇄는 알데히드기일 수 있고, 반응성 부분은 수용성 중합체, 하나 이상의 아미노산 또는 검출 가능한 표지에 결합된 아릴 하이드라진이다.

실시예 5: 아릴 하이드라진과 케톤 간의 반응

인돌을 형성하기 위한 두 분자 간의 모델 반응이 도 8, 9, 10, 11, 13 및 14에 도시되어 있다. 2종의 출발 물질 중 어느 하나는 비천연 아미노산 폴리펩티드 상의 측쇄로서 존재할 수 있고, 나머지 반응제는 상기 측쇄를 유도체화하기 위한 화합물 상의 작용기에 해당한다. 즉, 비천연 아미노산 폴리펩티드 상의 측쇄는 아릴 하이드라진기일 수 있고, 반응성 부분은 수용성 중합체, 하나 이상의 아미노산 또는 검출 가능한 표지에 결합된 케톤이다. 반대로, 비천연 아미노산 폴리펩티드 상의 측쇄는 케톤기일 수 있고, 반응성 부분은 수용성 중합체, 하나 이상의 아미노 산 또는 검출 가능한 표지에 결합된 아릴 하이드라진이다.

실시예 6: 아릴 하이드라진 비천연 아미노산을 포함하는 우로텐신 유사체

"X" 위치에 아릴 하이드라진 측쇄를 갖는 비천연 아미노산을 포함하는 우로텐신 유사체가 도 20에 도시되어 있다. 이 화합물은 표준 기법을 이용하여 화학적으로 합성하였다. 측쇄는 케톤, 알데히드 또는 보호된 카보닐 측쇄를 선택적으로 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다(도 21에 개략적으로 도시됨).

실시예 7: 비천연 아미노산의 유도체화를 위한 인돌 형성

아릴 하이드라진과 카보닐기의 반응으로부터의 인돌 부분의 형성이 비천연 아미노산 폴리펩티드를 유도체화하는 데 어떻게 이용될 수 있는지가 도 20, 21, 22, 24, 28 및 29에 도시되어 있다. 이들 도면에 도시된 단백질 '그림'은 우로텐신, 인간 성장 호르몬, 인슐린, 항체, 키나제, 에리스로포이에틴, 또는 본원에 기재되어 있거나 문헌에서 참조할 수 있는 임의의 다른 폴리펩티드 또는 단백질 수 있다.

실시예 8

본 실시예는 이. 콜라이에서 변형된 폴리펩티드를 클로닝하고 발현시키는 것에 관해 상세히 설명한다. 오르토고날 tRNA(O-tRNA) 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS)를 포함하는 도입된 번역 시스템이 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 발현시키는 데 사용된다. 상기 O-RS는 O-tRNA를 비천연 아미노산으로 우선적으로 아미노아실화한다. 또한, 이 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 반응하여 상기 비천연 아미노산을 폴리펩티드에 삽입한다. 비천연 아미노산의 도입 에 유용한 O-tRNA 및 O-RS의 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에서 참고로 인용하는 미국 특허 출원 제10/126,927호(발명의 명칭: "In Vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids") 및 미국 특허 출원 제10/126,931호(발명의 명칭: "Methods and Compositions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs")에 기재되어 있다.

서열 번호 1	엠. 잔나스키이	tRNA
서열 번호 2	HLAD03: 최적화된 앰버 서프레서 tRNA	tRNA
서열 번호 3	HL325A: 최적화된 AGGA 프레임시프트 서프레서 tRNA	tRNA
서열 번호 4	p-아지도-L-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS(6)	RS
서열 번호 5	p-벤조일-L-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-BpaRS(1)	RS
서열 번호 6	프로파길-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 프로파길-PheRS	RS
서열 번호 7	프로파길-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 프로파길-PheRS	RS
서열 번호 8	프로파길-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 프로파길-PheRS	RS
서열 번호 9	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS(1)	RS
서열 번호 10	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS(3)	RS
서열 번호 11	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS(4)	RS
서열 번호 12	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 p-Az-PheRS(2)	RS
서열 번호 13	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 (LW1)	RS
서열 번호 14	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 (LW5)	RS
서열 번호 15	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 (LW6)	RS
서열 번호 16	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 (AzPheRS-5)	RS
서열 번호 17	p-아지도-페닐알라닌의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소 (AzPheRS-6)	RS

변형된 유전자 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소/tRNA 쌍(원하는 비천연 아미노산에 특이적임)을 포함하는 플라스미드로 이. 콜라이를 형질전환시키 면, 비천연 아미노산이 폴리펩티드 내로 부위 특이적으로 도입된다. 37℃에서, 0.01∼100 mM의 특정한 비천연 아미노산을 함유하는 배지 중에서 배양한 형질전환된 이. 콜라이는 높은 충실도 및 효율로 변형된 폴리펩티드를 발현한다. 비천연 아미노산을 함유하는 His 태그 폴리펩티드는 이. 콜라이 숙주 세포에 의해 봉입체 또는 응집물로서 생성된다. 응집물을 가용화하고, 6 M 구아니딘 HCl 중의 변성 조건하에 친화성 정제한다. 4℃에서 50 mM TRIS-HCl(pH 8.0), 40 μM CuSO₄ 및 2%(w/v) 사코실 중에서 밤새 투석하여 리폴딩을 수행한다. 그 후, 이 물질을 20 mM TRIS-HCl(pH 8.0), 100 mM NaCl, 2 mM CaCl₂에 대해 투석한 후, His 태그를 제거한다(문헌[Boissel et al., (1993) 268: 15983-93] 참조). 폴리펩티드의 정제 방법은 공지되어 있으며, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 분석, 또는 전자분무 이온화 이온 트랩 질량 분광분석법 등으로 확인한다.

하기 실시예는, 치료 활성을 갖는 변형된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 시험관내 및 생체내 활성과, 치료 활성을 갖는 천연 아미노산 폴리펩티드의 시험관내 및 생체내 활성을 측정하여 이들을 비교하는 방법에 관해 기술한다.

실시예 9: 세포 결합 분석

0℃에서 90분 동안, 다양한 농도(부피 10 ㎕)의 비표지 GH, hGH 또는 GM-CSF의 부재하 또는 존재하에, 그리고 ¹²⁵I-GH(약 100,000 cpm 또는 1 ng)의 존재하에 PBS/1% BSA(100 ㎕) 중에서 세포(3×10⁶)를 이중으로 항온처리하였다(총 부피: 120 ㎕). 그 후, 세포를 재현탁시켜 350 ㎕ 플라스틱 원심분리 튜브 내의 200 ㎕ 빙냉 FCS 위에 층으로 올려서 원심분리하였다(1,000 g; 1분). 상기 튜브의 끝을 잘라내어 펠릿을 모으고, 펠릿과 상청액을 감마 카운터(Packard)에서 별도로 카운팅하였다.

특이적 결합(cpm)은, 경쟁자 부재시의 총 결합(이중 실험의 평균)으로부터 100배 과잉량의 비표지 GH 존재하에서의 결합(비특이적 결합)을 제하여 결정하였다. 비특이적 결합은 사용된 세포 종류 각각에 대해 측정하였다. 실험은 동일한 ¹²⁵I-GH를 사용하여 서로 다른 날에 수행되며 내적 일관성을 나타내어야 한다. ¹²⁵I-GH는 GH 수용체 생산 세포에 대한 결합을 나타내었다. 이 결합은 비표지 천연 GH 또는 hGH에 의해서는 용량 의존적으로 억제되나 GM-CSF 또는 다른 음성 대조군에 의해서는 그렇지 않다. 천연 GH와 마찬가지로 hGH가 천연 ¹²⁵I-GH의 결합에 대해 경쟁할 수 있음은 이 수용체가 두 가지 형태를 동일하게 잘 인식한다는 것을 시사한다.

실시예 10: 인돌 결합에 의한 hGH PEG화의 생체내 연구

PEG-hGH, 비변형 hGH 및 완충액을 마우스 또는 래트에게 투여하였다. 결과는, 유의적인 체중 증가로 확인되는 바와 같이, 비변형 hGH에 비해 본원에 기재된 PEG화 hGH가 활성이 더 우수하고 반감기가 더 길다는 것을 보여주었다.

실시예 11: 접합 hGH 및 비접합 hGH와 그 변이체의 생체내 반감기의 측정

모든 동물 실험은 AAALAC 인증 시설에서 세인트 루이스 대학(St. Louis University)의 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다. 래트는 실내의 우리 안에 넣어 12시간의 명/암 주기로 개별적으로 사육하였다. 동물에게 품질보증 푸리나(Purina) 설치류 사료 5001과 물을 제공하여 임의로 접근할 수 있게 하였다. 뇌하수체 적출 래트의 경우, 식수에 5% 글루코스를 추가로 포함시켰다.

실시예 12: 약동학적 연구

동물 실험에 들어가기 전에 각각의 PEG화 돌연변이체 hGH의 품질을 3 가지 분석법으로 평가하였다. PEG-hGH(인돌 결합을 통한 PEG화)의 순도는 비환원 조건하에서 MES SDS 전개 완충액을 사용하여 4∼12% 아크릴아미드 NuPAGE Bis-Tris 겔 상에서 전개함으로써 관찰하였다(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재). 겔을 코마시 블루로 염색하였다. 밀도 측정 스캔에 기초할 때 PEG-hGH 밴드의 순도는 95%보다 더 높았다. 각각의 PEG-hGH의 내독소 수치는 Charles River Laboratories(미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재)로부터 구입한 KTA² 키트를 사용한 키네틱 LAL 분석으로 측정하며 투여량당 5 EU 미만이었다. PEG-hGH의 생물학적 활성은 IM-9 pSTAT5 바이오 분석법으로 평가하였으며, EC₅₀ 값이 15 nM 미만인 것으로 확인되었다.

PEG 변형 성장 호르몬 화합물의 약동학적 특성을 Charles River Laboratories로부터 입수한 수컷 스프래그-돌리 래트(261∼425 g)에서 서로 간에, 또한 비PEG화 성장 호르몬과 비교하였다. 채혈을 위해 외과적 시술로 카테터를 경 동맥에 설치하였다. 성공적인 카테터 설치 후, 투약 전에 동물들을 처리군(군당 3∼6 마리)에 할당하였다. 0.41∼0.55 ㎖/kg의 용량으로 화합물 1 mg/kg을 동물에게 피하 투여하였다. 내재된 카테터를 통해 다양한 시점에 혈액 시료를 취하여 EDTA 코팅 마이크로 원심분리 튜브에 넣었다. 원심분리 후 혈장을 모아 분석시까지 -80℃에 저장하였다. BioSource International(미국 캘리포니아주 카마릴로 소재) 또는 Diagnostic Systems Laboratories(미국 텍사스주 웹스터 소재)로부터 입수한 항체 샌드위치 성장 호르몬 ELISA 키트를 사용하여 화합물 농도를 측정하였다. 투여된 유사체에 해당하는 표준 물질을 이용하여 농도를 산출하였다. 모델링 프로그램 WinNonlin(Pharsight, 버전 4.1)을 사용하여 약동학적 파라미터를 추정하였다. 리니어 업/로그 다운 사다리꼴 적분을 이용한 비구획 분석을 이용하였고, 농도 데이타에는 균일하게 가중치를 두었다.

래트에게 1회 피하 투여한 후 일정한 간격으로 혈장 농도를 측정하였다. 래트(군당 3∼6 마리)에게 1 mg/kg의 단백질을 단일 볼루스 투여하였다. hGH 야생형 단백질(WGO hGH), His 태그 hGH 폴리펩티드(his-hGH) 또는 6개의 상이한 위치 각각에서 30 kDa PEG에 공유 결합된 비천연 아미노산 인돌을 포함하는 His 태그 hGH 폴리펩티드를 WHO hGH 및 (his)hGH와 비교하였다. 일정한 시간 간격을 두고 혈장 시료를 취하여 주사된 화합물에 대해 전술한 바와 같이 분석하였다. 비구획 분석으로 농도 대 시간 곡선을 평가하였다(Pharsight, 버전 4.1). 값은 평균(+/- 표준 편차)이다. C_max: 최대 농도; 최종_t1/2: 최종 반감기; AUC_O→inf: 무한대까지 외삽한 농도-시 간 곡선 아래의 면적; MRT: 평균 체류 시간; Cl/f: 겉보기 총 혈장 제거율; 및 Vz/f: 말기 동안의 겉보기 분포 용적.

실시예 13: 약력학적 연구

뇌하수체 적출 수컷 스프래그-돌리 래트를 Charles River Laboratories로부터 입수하였다. 뇌하수체는 3∼4주령 때 외과적으로 적출되었다. 이 동물들을 3주 동안 순응시켰으며, 이 기간 동안 체중을 모니터링하였다. 연구 시작 전 7일 동안 체중이 0∼8 g 증가된 동물들을 처리군에 포함시켜 무작위로 분배하였다. 래트에게 볼루스 주사 또는 매일의 피하 주사로 투여를 실시하였다. 연구 전반에 걸쳐, 매일 순차적으로 래트의 체중 측정, 마취, 채혈 및 투여(해당되는 경우)를 실시하였다. 헤파린 처리 모세관을 사용하여 안구동(orbital sinus)으로부터 채혈하여 EDTA 코팅 마이크로 원심분리 튜브에 넣었다. 원심분리로 혈장을 분리하여 분석시까지 -80℃에 저장하였다. 시간 간격에 대해 평균(+/- S.D.) 혈장 농도의 그래프를 작도하였다.

펩티드 IGF-1은 소마토메딘 또는 인슐린 유사 성장 인자 패밀리의 구성원이다. IGF-1은 성장 호르몬의 성장 촉진 효과 중 다수를 매개한다. IGF-1 농도는 제공된 래트/마우스 IGF-1 표준 물질에 대하여 경쟁적 결합 효소 면역분석 키트를 사용하여 측정하였다(Diagnostic Systems Laboratories). 뇌하수체 적출 래트[군당 5∼7 마리의 래트]에게 1회 투여 또는 매일 투여로 피하 투여를 실시하였다. 매일 순차적으로 동물들의 체중 측정, 마취, 채혈 및 투여(해당되는 경우)를 실시하였다. 위약 처리군, 야생형 hGH(hGH), His 태그 hGH((his)hGH) 및 35번 및 92번 위치 에서 30 kDa PEG에 공유 결합된 인돌을 포함하는 hGH 폴리펩티드 군에 대해 체중 결과를 입수하였다.

실시예 14: 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화(인돌 결합을 통한 PEG화) hGH의 안전성 및/또는 효능에 관한 인간 임상 시험

하기 임상 시험예는 소아 및 성인 성장 호르몬 결핍, 터너 증후군, 만성 신부전증, 프래더-윌리 증후군, 자궁내 발육 지연아, 특발성 저신장증, 만성적인 고용량 글루코코르티코이드 사용에 의한 성장 장애, 이식후 성장 장애, X 연관 저인산염혈증 구루병, 염증성 장 질환, 누난 증후군, 골 이형성증, 셀리악병에 의한 성장 장애, 예를 들어 말기 후천성 면역 결핍증에 의한 근소모증, 화상 치유의 촉진, 비만자의 심각한 다이어트의 부작용, 섬유근육통, 만성 피로 증후군, 노화에 의한 쇠약의 치료 및 인간 성장 호르몬의 다른 용도에 사용된다.

목적

피하 투여된, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 재조합 인간 hGH와 시판되는 1종 이상의 hGH 제품[Humatrope™(Eli Lilly & Co.), Nutropin™(Genentech), Norditropin™(Novo-Nordisk), Genotropin™(Pfizer) 및 Saizen/Serostim™(Serono)을 포함하나 이들에 한정되지 않음]의 안전성 및 약동학적 특성을 비교하는 것이다.

환자

8∼40세이고 체중이 20∼90 kg인 18명의 건강한 지원자들을 이 연구에 등록시킨다(예를 들어, 소아과적 증상이 있는 소아 및 성인적 증상이 있는 성인). 이 피험체들은 혈액 검사 또는 혈청 화학 검사, 및 음성 뇨 독성 스크린, HIV 스크린 및 B형 간염 표면 항원에 대해 임상적으로 유의한 비정상적인 실험값을 나타내지 않는다. 이들은 다음 중 어느 하나에도 해당되지 않아야 한다: 고혈압; 임의의 원발성 혈액 질환의 병력; 심각한 간, 신장, 심혈관, 위장관, 비뇨생식기, 대사, 신경 질환의 병력; 빈혈 또는 발작 장애의 병력; 박테리아 또는 포유동물 유래 생성물, PEG, 또는 인간 혈청 알부민에 대해 알려진 감수성; 카페인 함유 음료의 상습적 다량 소비자; 연구 시작 전 30일 이내에 임의의 다른 임상 시험에 참가했거나 혈액을 수혈받았거나 수혈한 적이 있는 자; 연구 시작 전 3개월 이내에 hGH에 노출된 자; 연구 시작 전 7일 이내에 질환을 앓은 적이 있는 자; 및 연구 시작 전 14일 이내에 연구 전 신체 검사 또는 임상 실험 평가에서 유의한 이상을 나타낸 자. 모든 피험체에 대해 안전성 평가를 수행하고, 계획대로 약동학적 분석을 위한 모든 채혈을 실시한다. 모든 연구는 윤리 위원회의 승인과 환자의 동의하에 수행된다.

연구 디자인

이 연구는 건강한 남성 지원자들을 대상으로 한 I 기, 단일 센터, 공개, 무작위, 두 기간 교차 연구이다. 18명의 피험체를 2개의 치료 순서 군 중 하나(군당 9명의 피험체)에 무작위로 배정하였다. 독립된 두 투여 기간에 걸쳐, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH 및 시판되는 제품 중 선택된 것을 동량으로 사용하여 상대퇴부에 볼루스 피하 주사로서 GH를 투여한다. 시판되는 제품의 투여량 및 투여 빈도는 포장 라벨에 표시된 것과 같다. 추가 군의 피험체를 포함시킴으로써, 시판되는 제품을 사용하여, 추가 투여량, 투여 빈도, 또는 필요에 따라, 다 른 파라미터를 연구에 포함시킬 수 있다. 각각의 투여 기간 사이에 14일간의 워시아웃(washout) 기간을 둔다. 피험체들은 두 투여 기간 각각에 대해 적어도 투여 12시간 전과 투여 72시간 후에만 연구 센터에 있었고 투여 기간 사이에는 그렇지 않았다. 또한 PEG화 hGH에 대해 테스트할 추가 투여량, 투여 빈도 또는 다른 파라미터가 존재할 경우, 추가 군의 피험체를 연구에 포함시킬 수 있다. 인체 사용에 대해 승인된 다수의 GH 제제를 본 연구에 사용할 수 있다. Humatrope™(Eli Lilly & Co.), Nutropin™(Genentech), Norditropin™(Novo-Nordisk), Genotropin™(Pfizer) 및 Saizen/Serostim™ (Serono)가 인체 사용에 대해 승인된 시판되는 GH 제품이다. hGH의 실험 제제는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH이다.

채혈

hGH 투여 전과 투여 후에 직접 정맥 천자를 통해 연속적으로 채혈하였다. 혈청 GH 농도 측정을 위해 정맥혈 시료(5 ㎖)를 투여 전 약 30분, 20분 및 10분째에 입수하고(3개의 기저선 시료), 투여 후 대략 30분, 1시간, 2시간, 5시간, 8시간, 12시간, 15시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 48시간, 60시간 및 72시간째 입수하였다. 각각의 혈청 시료를 2개의 분액으로 나누었다. 모든 혈청 시료를 -20℃에 저장하였다. 혈청 시료는 드라이아이스에 넣어 이송하였다. 금식 임상 실험실 검사(혈액 검사, 혈청 화학 검사 및 뇨 검사)는 제1일에 최초 투여 직전, 제4일 아침, 제16일 투여 직전 및 제19일 아침에 수행하였다.

생체 시료 분석 방법

혈청 GH 농도를 측정하는 데 ELISA 키트법(Diagnostic Systems Laboratory [DSL], 미국 텍사스주 웹스터 소재)을 이용하였다.

안전성 측정

매회 투여 직전(제1일 및 제16일)과, 매회 투여 후 6시간, 24시간, 48시간 및 72시간째 바이탈 사인을 기록하였다. 안전성 판단은 유해 사건의 발생률 및 유형과 임상 실험실 검사에 있어서 기저선으로부터의 변화에 기초한다. 또한, 혈압을 비롯한 바이탈 사인 측정 및 신체 검사 결과에 있어서 연구 전으로부터의 변화를 평가하였다.

데이터 분석

투여 후 혈청 농도값은, 투여 후의 각각의 값으로부터, 투여 전 30분, 20분 및 10분째 수집된 3개 시료의 GH 수치를 평균내어 결정한 평균 기저선 GH 농도를 뺌으로써, 투여 전 기저선 GH 농도에 대해 보정하였다. 투여 전 혈청 GH 농도가 분석의 정량 수치 미만인 경우, 이 농도는 평균값 계산에 포함시키지 않았다. 약동학적 파라미터는 기저선 GH 농도에 대해 보정된 혈청 농도 데이터로부터 결정하였다. 약동학적 파라미터는 최신 버전의 BIOAVL 소프트웨어를 사용하여 Digital Equipment Corporation VAX 8600 컴퓨터 시스템에서 모델 독립적 방법에 의해 산출하였다. 하기 약동학적 파라미터를 결정하였다: 피크 혈청 농도(C_max); 피크 혈청 농도까지 걸리는 시간(t_max); 선형 사다리꼴 법칙을 이용하여 계산한 0 시간 내지 마지막 채혈 시간(AUC_0-72)의 농도-시간 곡선 아래의 면적(AUC); 및 제거율 상수로부 터 산출된 최종 제거 반감기(t_1/2). 제거율 상수는 로그-선형 농도-시간 플롯의 최종 선형 영역에서의 연속적인 데이터 점의 선형 회귀에 의해 추정하였다. 각각의 처리군에 대해 약동학적 파라미터의 평균, 표준 편차(SD) 및 변동 계수(CV)를 산출하였다. 파라미터 평균의 비(보존된 제제/비보존 제제)를 산출하였다.

안전성 결과

유해 사건 발생률은 처리군 전반에 동일하게 분포하였다. 기저선 또는 연구 전 임상 실험실 검사 또는 혈압으로부터 임상적으로 유의한 변화는 없었고, 연구 전 신체 검사 결과 및 바이탈 사인 측정에 있어서도 연구 전으로부터 뚜렷한 변화가 없었다. 두 처리군에 대한 안전성 프로필은 유사한 것으로 보인다.

약동학적 결과

1종 이상의 시판되는 hGH 제품[Humatrope™(Eli Lilly & Co.), Nutropin™(Genentech), Norditropin™(Novo-Nordisk), Genotropin™(Pfizer), Saizen/Serostim™(Serono)을 포함하나 이들에 한정되지 않음]을 1회 용량 투여한 후 18명의 피험체 모두에 대한 평균 혈청 GH 농도-시간 프로필(기저선 GH 수치에 대해 보정하지 않음)을, 측정된 각각의 시점에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH와 비교하였다. 모든 피험체들은 정상적인 생리학적 범위 내의 투여 전 기저선 GH 농도를 나타내야 한다. 약동학적 파라미터는 투여 전 평균 기저선 GH 농도에 대해 보정된 혈청 데이터로부터 결정되고, C_max 및 t_max가 결정된다. 선택된 임상 비교 대상(들)[Humatrope™(Eli Lilly & Co.), Nutropin™(Genentech), Norditropin™(Novo-Nordisk), Genotropin™(Pfizer), Saizen/Serostim™(Serono)]에 대한 평균 t_max는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH에 대한 t_max보다 현저히 더 짧다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH에 대한 최종 반감기와 비교할 때, 테스트된 시판되는 hGH 제품의 최종 반감기가 현저히 더 짧다.

본 연구는 건강한 남성 피험체를 대상으로 수행되었지만, 다른 환자 집단, 예를 들면 암 또는 만성 신부전증을 앓고 있는 남성 또는 여성 환자, 소아 신부전증 환자, 자가조직 예치(autologous predeposit) 프로그램의 환자, 또는 선택 수술이 예정된 환자에 있어서도 유사한 흡수 특징 및 안전성 프로필이 예상된다.

결론적으로, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH의 단회 피하 투여는 건강한 남성 피험체에 있어서 안전하고 이 피험체가 잘 견딜 수 있다. 유해 사건의 상대 발생률, 임상 검사값, 바이탈 사인 및 신체 검사 결과에 기초할 때, 시판되는 형태의 hGH와 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH의 안전성 프로필은 동등하다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화 hGH는 환자와 건강 관리 제공자에게 잠재적으로 큰 임상적 유용성을 제공한다.

실시예 15: PEG화 hGH와 비PEG화 hGH의 수용해도의 비교

hGH 야생형 단백질(WHO hGH), His 태그 hGH 폴리펩티드(his-hGH), 또는 92번 위치에서 30 kDa PEG에 공유 결합된 비천연 아미노산 인돌을 포함하는 His 태그 hGH 폴리펩티드의 수용해도를, 물 100 ㎕에 용해할 수 있는 개개의 폴리펩티드의 양을 측정하여 구하였다. PEG화 hGH의 양이 WHO hGH 및 hGH의 양보다 더 많으며, 이것은 비천연 아미노산 폴리펩티드의 PEG화가 수용해도를 증가시킨다는 것을 보여준다.

실시예 16: 변형된 치료 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드의 생체내 연구

마우스에 전립선 암종 이종이식편을 이식하고 두 개의 군으로 나누었다. 한 군에는 변형된 치료 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드를 매일 투여하고 다른 군에는 치료 활성 천연 아미노산 폴리펩티드를 매일 투여하였다. 종양 크기를 매일 측정하였으며, 변형된 치료 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드로 처리한 군에서 종양 크기가 감소한 것으로 볼 때 변형된 치료 활성 비천연 아미노산 폴리펩티드가 치료 활성 천연 아미노산 폴리펩티드에 비해 개선된 치료적 유효성을 갖는다.

실시예 17: 비천연 아미노산 폴리펩티드 활성 및 친화성의 측정

본 실시예는, 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성과, 수용체, 결합 파트너 또는 리간드에 대한 비천연 아미노산 폴리펩티드의 친화성을 측정하는 것에 관해 상세히 설명한다.

비천연 아미노산 폴리펩티드 수용체, 결합 파트너 또는 리간드에 대한 단백질을 공지된 방법에 따라 발현시켜 단리하였다. 비천연 아미노산 폴리펩티드의 그 수용체에 대한 결합을 분석하는 데 Biacore™ 시스템을 이용하였다. 마찬가지로, 이 분석에 결합 파트너 또는 리간드를 이용할 수 있다.

제조업자가 권장하는 바와 같이, 아민 커플링법을 이용하여, 약 600∼800 RU의 가용성 수용체를 Biacore™ CM5 칩 상에 고정시켰다. HBS-EP 완충액(Biacore™, Pharmacia) 중의 다양한 농도의 야생형 또는 변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드를 40 ㎕/min의 유량으로 표면 위에 4∼5분 동안 주입하고, 주입 후 15분 동안 해리를 모니터링하였다. 상기 표면은 4.5 M MgCl₂의 15초 펄스로 재생시켰다. 적어도 100 사이클의 재생 후, 최소한의 결합 친화성 손실(1∼5%)이 관찰되었다. 수용체가 고정되어 있지 않은 참조 셀을 사용하여, 임의의 완충액 부피(bulk) 효과 및 비특이적 결합을 배제하였다.

변형 또는 비변형의 비천연 아미노산 폴리펩티드 적정 실험으로부터 얻은 역학적 결합 데이터를 BiaEvaluation 4.1 소프트웨어(BIACORE™)로 처리하였다. 평형 해리 상수(K_d)를 개개의 속도 상수의 비(k_off/k_on)로서 산출하였다.

비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 수용체, 결합 파트너 또는 리간드를 발현하는 안정한 세포주를 확립하였다. 수용체, 결합 파트너 또는 리간드 cDNA를 함유하는 구성체를 전기천공으로 세포 내로 도입하였다. 형질감염된 세포를 클로닝 전에 48시간 동안 회복시켰다. 수용체, 결합 파트너 또는 리간드 발현 형질감염체를 수용체에 대한 항체로 표면 염색하여 확인하고, FACS 어레이(BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)에서 분석하였다. 원하는 형질감염체의 반복 서브클로닝을 추가로 실시하자 안정하게 형질감염된 세포 클론이 확립되었다. 이러한 세포를 세포 결합 분석에 사용하였다.

0℃에서 90분 동안, 다양한 농도(부피 10 ㎕)의 비표지 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 음성 대조군 폴리펩티드의 부재하 또는 존재하에, 그리고 ¹²⁵I-(변형) 비천연 아미노산 폴리펩티드(약 100,000 cpm 또는 1 ng)의 존재하에 PBS/1% BSA(100 ㎕) 중에서 세포(3×10⁶)를 이중으로 항온처리하였다(총 부피: 120 ㎕). 그 후, 세포를 재현탁시켜 350 ㎕ 플라스틱 원심분리 튜브 내의 200 ㎕ 빙냉 FCS 위에 층으로 올려서 원심분리하였다(1,000 g; 1분). 상기 튜브의 끝을 잘라내어 펠릿을 모으고, 펠릿과 상청액을 감마 카운터(Packard)에서 별도로 카운팅하였다.

특이적 결합(cpm)은, 경쟁자 부재시의 총 결합(이중 실험의 평균)으로부터 비특이적 결합을 제하여 결정하였다. 비특이적 결합은 사용된 세포 종류 각각에 대해 측정하였다. 실험은 동일한 ¹²⁵I-(변형) 비천연 아미노산 폴리펩티드 제제를 사용하여 서로 다른 날에 수행되며 내적 일관성을 나타내어야 한다. ¹²⁵I-(변형) 비천연 아미노산 폴리펩티드는 수용체, 결합 단백질 또는 리간드 생산 세포에 대한 결합을 나타내었다. 이 결합은 비표지 천연 아미노산 폴리펩티드에 의해서는 용량 의존적으로 억제되나 다른 음성 대조군 폴리펩티드에 의해서는 그렇지 않다.

본원에 기재된 실시예 및 실시형태는 단지 예시를 위해 제공된 것으로서, 이들의 다양한 변형 또는 변경은 본 출원의 기술 사상 및 범위와 첨부된 청구의 범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.

서열 목록

SEQUENCE LISTING <110> AMBRX, INC. <120> COMPOSITIONS CONTAINING, METHODS INVOLVING, AND USES OF NON-NATURAL AMINO ACIDS AND POLYPEPTIDES <130> 31362-724.601 <140> PCT/US07/88011 <141> 2007-12-18 <150> 60/870,594 <151> 2006-12-18 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 77 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 1 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccggcccgc cggacca 77 <210> 2 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 2 cccagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggactctaa atccgttctc gtaggagttc 60 gagggttcga atcccttccc tgggacca 88 <210> 3 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 3 gcgagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggacttcct aatccgttct cgtaggagtt 60 cgagggttcg aatccctccc ctcgcacca 89 <210> 4 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Leu His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 11 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 11 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Val His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 12 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 12 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Ser His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 13 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 13 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Cys His 145 150 155 160 Tyr Arg Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 14 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 14 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Thr His 145 150 155 160 Tyr Arg Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 15 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Gly His 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ile Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 16 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 16 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Arg Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Val Ile His 145 150 155 160 Tyr Asp Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 17 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 17 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Any amino acid as set for in Figure 19 <400> 18 Glu Thr Pro Asp Cys Xaa Trp Lys Tyr Cys Val 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Any amino acid as set for in Figure 20 <400> 19 Glu Thr Pro Asp Cys Xaa Trp Lys Tyr Cys Val 1 5 10

Claims

하기 구조식 1∼4로 표시되는 화합물, 또는 이의 활성 대사물질, 염, 또는 약학적으로 허용되는 전구약물 또는 용매화물:

상기 식에서,

A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 치환된 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이고;

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 한쪽 말단이 인돌 함유 부분에 연결된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')C(NCN)N(R')-, -N(R')C(NNO₂)N(R')-, -N(R')C(NCOOR')N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

R₁은 H, 아미노 보호기, 또는 하나 이상의 아미노산이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 또는 하나 이상의 아미노산이며;

n은 0, 1, 2 또는 3이고, m은 0, 1, 2 또는 3이며, 단, n 또는 m 중 적어도 하나는 0이 아니고;

여기서, 구조식 1, 2, 3 및 4에 있어서 결합된 R_a 기를 갖는 각각의 고리는 0개, 1개 또는 2개의 R_a 기를 포함할 수 있고, 각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택되거나; 또는 1개보다 많은 R_a 기가 존재할 경우, 2개의 R_a가 임의로 아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있고;

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R₃과 R₄, 또는 2개의 R₃ 기가 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;

각각의 R₅는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")₂, OH, NH₂, CN, NO₂, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)₂R", 또는 -C(O)N(R")₂(여기서, 각각의 R"은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이거나, 또는 1개보다 많은 R" 기가 존재할 경우, 2개의 R"이 임의로 헤테로시클로알킬을 형성함)이거나; 또는

R₅는 L-X이고, 여기서 X는 수용성 중합체; 폴리알킬렌 옥시드; 폴리에틸렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 하나 이상의 아미노산; 하나 이상의 당기(sugar group); 하나 이상의 뉴클레오티드; 하나 이상의 뉴클레오시드; 리간드; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 검출 가능한 표지; 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되고; L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)_k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이며, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;

1개보다 많은 R₅ 기가 존재할 경우, 2개의 오르토 R₅ 기가 임의로 헤테로시 클로알킬 또는 방향족 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있거나; 또는

-B-인돌 함유 부분이 함께 하나 이상의 인돌 부분을 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성한다.
제1항에 있어서, A가 결합, 치환된 또는 비치환된 저급 알킬렌, 또는 페닐렌, 피리디닐렌, 피리미디닐렌 또는 티오페닐렌으로 구성된 군에서 선택되는 비치환된 또는 치환된 아릴렌인 화합물.
제2항에 있어서, A가 결합인 화합물.
제1항에 있어서, B가 결합, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R")CO-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R")-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, 또는 -S(O)₂(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-인 화합물.
제5항에 있어서, B가 결합인 화합물.
제1항에 있어서, R₁이 하나 이상의 아미노산인 화합물.
제1항에 있어서, R₂가 하나 이상의 아미노산인 화합물.
제7항에 있어서, R₁이 하나 이상의 아미노산인 화합물.
제1항에 있어서, X가 하나 이상의 아미노산인 화합물.
제1항에 있어서, X가 형광성 부분, 인광성 부분, 화학발광성 부분, 킬레이팅 부분, 전자 밀집 부분, 자성 부분, 인터칼레이팅(intercalating) 부분, 방사능 부분, 발색단 부분 및 에너지 전달 부분으로 구성된 군에서 선택되는 검출 가능한 표지인 화합물.
제1항에 있어서, X가 수용성 중합체인 화합물.
제11항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 폴리알킬렌 옥시드 또는 치환된 폴리알킬렌 옥시드를 포함하는 것인 화합물.
제11항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 -[(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-(수소, 알킬, 또는 치환된 알킬)]_x(여기서, x는 20∼10,000임)을 포함하는 것인 화 합물.
제11항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 약 2 kDa∼약 40 kDa 범위의 분자량을 갖는 m-PEG인 화합물.
하기 화학식 (II)의 화합물과 카보닐 함유 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 구조식 1 또는 2의 화합물의 제조 방법:

상기 식에서,

A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 치환된 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이고;

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 한쪽 말단이 인돌 함유 부분에 연결된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴 렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, =N-O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌), -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

R₁은 H, 아미노 보호기, 또는 하나 이상의 아미노산이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 또는 하나 이상의 아미노산이며;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, CN, NO₂, -N(R')₂, -C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택되고;

R₃ 및 R₄는 독립적으로 수소 또는 하기 화학식의 기를 포함하나 이에 한정되지 않는 아민 보호기이다:

.
제15항에 있어서, A가 결합인 제조 방법.
제16항에 있어서, B가 결합인 제조 방법.
제15항에 있어서, R₁이 하나 이상의 아미노산인 제조 방법.
제15항에 있어서, R₂가 하나 이상의 아미노산인 제조 방법.
제15항에 있어서, 상기 화학식 (II)의 화합물이 하기 화학식 (IV)의 구조를 갖는 것인 제조 방법:

상기 식에서, 각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, CN, NO₂, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3임) 으로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다.
하기 화학식 (V)의 화합물과 하이드라진 함유 물질을 반응시키는 단계를 포함하는 구조식 3 또는 4의 화합물의 제조 방법:

상기 식에서,

A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이고;

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 저급 헤테로알케닐렌, 치환된 저급 헤테로알케닐렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -N(R')CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)- 및 -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

J는
이고;

R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 시클로알킬, 또는 치환된 시클로알킬이며;

각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 또는 보호기이거나, 또는 1개보다 많은 R" 기가 존재할 경우, 2개의 R"이 임의로 헤테로시클로알킬을 형성하며;

R₁은 H, 아미노 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 하나 이상의 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이며;

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬 이거나, 또는 R₃과 R₄, 또는 2개의 R₃ 기가 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는

-A-B-J-R 기가 함께 카보닐기, 보호된 카보닐기를 비롯한 보호된 카보닐기, 또는 마스킹된 카보닐기를 비롯한 마스킹된 카보닐기를 비롯한 하나 이상의 카보닐기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하거나; 또는

-J-R 기가 함께 카보닐기, 보호된 카보닐기를 비롯한 보호된 카보닐기, 또는 마스킹된 카보닐기를 비롯한 마스킹된 카보닐기를 비롯한 하나 이상의 카보닐기를 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성한다.
제21항에 있어서, 하기 화학식 (VI)에 해당하는 것인 제조 방법:

.
제21항에 있어서, 하기 화학식 (VII)에 해당하는 것인 제조 방법:

상기 식에서, 각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다.
제21항에 있어서, 하기 화학식 (X)에 해당하는 것인 제조 방법:

상기 식에서,

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

Y 및 Z는 독립적으로 -OH, 알킬 치환된 산소, -SH 또는 알킬 치환된 황으로 구성된 군에서 선택되고, Y와 Z가 함께 헤테로시클로알킬 고리를 형성할 수 있다.
제21항에 있어서, 하기 화학식 (XI)에 해당하는 것인 제조 방법:

상기 식에서,

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

Y는 독립적으로 OR", NR"R", NC(O)R"으로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다.
제21항에 있어서, 하기 화학식 (XII)에 해당하는 것인 제조 방법:

상기 식에서,

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택되거나; 또는 1개보다 많은 R_a 기가 존재할 경우, 2개의 R_a가 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있고;

R₃ 및 R₄는 독립적으로 H, 할로겐, CN, NO₂, 알킬, 치환된 알킬, N(R')₂, C(O)_kR', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬임)이며;

X는 C, N, 또는 S이고; 단, X가 O 또는 S인 경우, R₄는 H, 할로겐, CN, NO₂, 알킬, 치환된 알킬, N(R')₂, C(O)R', -C(O)N(R')₂, -OR' 및 -S(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3임)일 수 없으며, n은 0, 1 또는 2이다.
제21항에 있어서, 하기 화학식 (XIII)에 해당하는 것인 제조 방법:

상기 식에서,

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬로 구성된 군에서 선택되고;

Y 및 Z는 독립적으로 -OH, 알킬 치환된 산소, -SH 또는 알킬 치환된 황으로 구성된 군에서 선택되며, Y와 Z가 함께 시클로알킬 고리를 형성할 수 있다.
제21항에 있어서, 하기 화학식 (XIV)에 해당하는 것인 제조 방법:

상기 식에서,

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3임)으로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

B는 또한 -CH=N-O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-을 포함하고;

n은 1, 2 또는 3이며;

Y는 독립적으로 OR", NR"R", NC(O)R"으로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬이다.
제15항에 있어서, 상기 화합물이 온화한 조건하에 수용액 중에서 카보닐 함유 물질에 반응성을 나타내는 것인 제조 방법.
제21항에 있어서, 상기 반응이 온화한 조건하에 수용액 중에서 이루어지는 것인 제조 방법.
하기 구조식 1, 2, 3 또는 4로 표시되는 물질, 또는 이의 활성 대사물질, 염, 또는 약학적으로 허용되는 전구약물 또는 용매화물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법:

상기 식에서,

A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 치환된 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이고;

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 한쪽 말단이 인돌 함유 부분에 연결된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')C(NCN)N(R')-, -N(R')C(NNO₂)N(R')-, -N(R')C(NCOOR')N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

R₁은 H, 아미노 보호기, 또는 하나 이상의 아미노산이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 또는 하나 이상의 아미노산이며;

n은 0, 1, 2 또는 3이고, m은 0, 1, 2 또는 3이며, 단, n 또는 m 중 적어도 하나는 0이 아니고;

여기서, 구조식 1, 2, 3 및 4에 있어서 결합된 R_a 기를 갖는 각각의 고리는 0개, 1개 또는 2개의 R_a 기를 포함할 수 있고, 각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)으로 구성 된 군에서 선택되거나; 또는 1개보다 많은 R_a 기가 존재할 경우, 2개의 R_a가 임의로 아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있고;

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R₃과 R₄, 또는 2개의 R₃ 기가 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;

각각의 R₅는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")₂, OH, NH₂, CN, NO₂, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)₂R", 또는 -C(O)N(R")₂(여기서, 각각의 R"은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이거나, 또는 1개보다 많은 R" 기가 존재할 경우, 2개의 R"이 임의로 헤테로시클로알킬을 형성함)이거나; 또는

R₅는 L-X이고, 여기서 X는 수용성 중합체; 폴리알킬렌 옥시드; 폴리에틸렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 하나 이상의 아미노산; 하나 이상의 당기; 하나 이상의 뉴클레오티드; 하나 이상의 뉴클레오시드; 리간드; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 검출 가능한 표지; 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되고; L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)_k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;

1개보다 많은 R₅ 기가 존재할 경우, 2개의 오르토 R₅ 기가 임의로 헤테로시클로알킬 또는 방향족 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있거나; 또는

-B-인돌 함유 부분이 함께 하나 이상의 인돌 부분을 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성한다.
제31항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 투여하는 것을 더 포함하는 치료 방법.
제31항에 있어서, X가 폴리알킬렌 옥시드인 치료 방법.
제31항에 있어서, X가 하나 이상의 아미노산인 치료 방법.
제34항에 있어서, X의 하나 이상의 아미노산이 비천연 아미노산을 포함하는 것인 치료 방법.
제31항에 있어서, X가 검출 가능한 표지인 치료 방법.
하기 구조식 5, 6, 7 또는 8로 표시되는 물질, 또는 이의 활성 대사물질, 염, 또는 약학적으로 허용되는 전구약물 또는 용매화물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 질환, 병증 또는 질병의 치료 방법:

상기 식에서,

A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 치환된 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이고;

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 한쪽 말단이 인돌 함유 부분에 연결된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')C(NCN)N(R')-, -N(R')C(NNO₂)N(R')-, -N(R')C(NCOOR')N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

R₁은 H, 아미노 보호기, 또는 하나 이상의 아미노산이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 또는 하나 이상의 아미노산이며;

n은 0, 1, 2 또는 3이고, m은 0, 1, 2 또는 3이며, 단, n 또는 m 중 적어도 하나는 0이 아니고;

여기서, 구조식 1, 2, 3 및 4에 있어서 결합된 R_a 기를 갖는 각각의 고리는 0개, 1개 또는 2개의 R_a 기를 포함할 수 있고, 각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택되거나; 또는 1개보다 많은 R_a 기가 존재할 경우, 2개의 R_a가 임의로 아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있고;

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R₃과 R₄, 또는 2개의 R₃ 기가 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;

각각의 R₅는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")₂, OH, NH₂, CN, NO₂, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)₂R", 또는 -C(O)N(R")₂(여기서, 각각의 R"은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이거나, 또는 1개보다 많은 R" 기가 존재할 경우, 2개의 R"이 임의로 헤테로시클로알킬을 형성함)이거나; 또는

R₅는 L-X이고, 여기서 X는 수용성 중합체; 폴리알킬렌 옥시드; 폴리에틸렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 하나 이상의 아미노산; 하나 이상의 당기; 하나 이상의 뉴클레오티드; 하나 이상의 뉴클레오시드; 리간드; 바이 오틴; 바이오틴 유사체; 검출 가능한 표지; 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되고; L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)_k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬이며;

1개보다 많은 R₅ 기가 존재할 경우, 2개의 오르토 R₅ 기가 임의로 헤테로시클로알킬 또는 방향족 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있거나; 또는

-B-인돌 함유 부분이 함께 하나 이상의 인돌 부분을 포함하는 이환 또는 삼 환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성한다.
제37항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 투여하는 것을 더 포함하는 치료 방법.
제37항에 있어서, R₁ 및 R₂가 둘 다 하나 이상의 아미노산인 치료 방법.
제37항에 있어서, X가 폴리알킬렌 옥시드인 치료 방법.
제37항에 있어서, X가 하나 이상의 아미노산인 치료 방법.
환자에 있어서 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법으로서, 하기 구조식 1∼4로 표시되는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 상동성 비천연 아미노산 폴리펩티드, 또는 이의 활성 대사물질, 염, 또는 약학적으로 허용되는 전구약물 또는 용매화물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 검출 방법:

상기 식에서,

A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 시클로알킬렌, 치환된 저급 시클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 치환된 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로시클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로시클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아랄킬렌, 또는 치환된 아랄킬렌이고;

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 한쪽 말단이 인돌 함유 부분에 연결된 링커이며, 이 링커는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -NS(O)₂-, -OS(O)₂-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')C(NCN)N(R')-, -N(R')C(NNO₂)N(R')-, -N(R')C(NCOOR')N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되고, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

R₁은 H, 아미노 보호기, 또는 하나 이상의 아미노산이고;

R₂는 OH, 에스테르 보호기, 또는 하나 이상의 아미노산이며;

n은 0, 1, 2 또는 3이고, m은 0, 1, 2 또는 3이며, 단, n 또는 m 중 적어도 하나는 0이 아니고;

여기서, 구조식 1, 2, 3 및 4에 있어서 결합된 R_a 기를 갖는 각각의 고리는 0개, 1개 또는 2개의 R_a 기를 포함할 수 있고, 각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R")₂, -C(O)R", -C(O)N(R")₂, -OR" 및 -S(O)_kR"(여기서, k는 1, 2 또는 3이고, 각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬 또는 치환된 알킬임)으로 구성된 군에서 선택되거나; 또는 1개보다 많은 R_a 기가 존재할 경우, 2개의 R_a가 임의로 아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있고;

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R₃과 R₄, 또는 2개의 R₃ 기가 임의로 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성하며;

각각의 R₅는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알 케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥시드, 치환된 폴리알킬렌 옥시드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")₂, OH, NH₂, CN, NO₂, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)₂R", 또는 -C(O)N(R")₂(여기서, 각각의 R"은 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아랄킬, 치환된 아랄킬이거나, 또는 1개보다 많은 R" 기가 존재할 경우, 2개의 R"이 임의로 헤테로시클로알킬을 형성함)이거나; 또는

R₅는 L-X이고, 여기서 X는 수용성 중합체; 폴리알킬렌 옥시드; 폴리에틸렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 하나 이상의 아미노산; 하나 이상의 당기; 하나 이상의 뉴클레오티드; 하나 이상의 뉴클레오시드; 리간드; 바이오틴; 바이오틴 유사체; 검출 가능한 표지; 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되고; L은 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 알킬렌, 치환된 알킬렌, 알케닐렌, 치환된 알케닐렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3임), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬 렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-O-N=CR'-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S(O)_k-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N- 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-으로 구성된 군에서 선택되는 링커이고, 여기서 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;

1개보다 많은 R₅ 기가 존재할 경우, 2개의 오르토 R₅ 기가 임의로 헤테로시클로알킬 또는 방향족 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있거나; 또는

-B-인돌 함유 부분이 함께 하나 이상의 인돌 부분을 포함하는 이환 또는 삼환 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬을 형성한다.
제42항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 알파-1 안티트립신, 안지오스타틴, 항용혈 인자, 항체, 아포지단백질, 아포단백질, 심방 나트륨 이뇨 인자, 심방 나트륨 이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, 칼시토닌, c-kit 리간드, 사이토카인, CC 케모카인, 단핵구 화학유인 단백질-1, 단핵구 화학유인 단백질-2, 단핵구 화학유인 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, I309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 리간드, c-kit 리간드, 콜라겐, 콜로니 자극 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제제, 보체 수용체 1, 사이토카인, 상피세포 호중구 활성화 펩티드-78, MIP-16, MCP-1, 표피세포 성장 인자(EGF), 상피세포 호중구 활성화 펩티드, 에리스로포이에틴(EPO), 박리 독소(exfoliating toxin), 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, 4 나선 번들 단백질, G-CSF, glp-1, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 성장 인자 수용체, grf, 헤지호그(hedgehog) 단백질, 헤모글로빈, 간세포 성장 인자(hGF), 히루딘, 인간 성장 호르몬(hGH), 인간 혈청 알부민, ICAM-1, ICAM-1 수용체, LFA-1, LFA-1 수용체, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), IGF-I, IGF-II, 인터페론(IFN), IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, 인터루킨(IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, 각질 세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴투린, 호중구 억제 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 암유전자 생성물, 파라시토닌, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬, 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, pth, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, pyy, 릴렉신, 레닌, SCF, 소형 생합성 단백질, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체, 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 슈퍼항원, 스타필로코커스 장독소, SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE, 스테로이드 호르몬 수용체, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 독성 쇼크 증후군 독소, 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성화 인자, 종양 성장 인자(TGF), 종양 괴사 인자, 종양 괴사 인자 알파, 종양 괴사 인자 베타, 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), VLA-4 단백질, VCAM-1 단백질, 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 유로키나제, mos, ras, raf, met, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 테스토스테론 수용체, 알도스테론 수용체, LDL 수용체 및 코르티코스테론으로 구성된 군에서 선택되는 치료용 단백질과 상동성인 단백질인 검출 방법.