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KR20090038478A - 세포 성장 자극, 시냅스 리모델링 및 장기간 기억 강화 방법 - Google Patents

세포 성장 자극, 시냅스 리모델링 및 장기간 기억 강화 방법 Download PDF

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KR20090038478A
KR20090038478A KR1020097004146A KR20097004146A KR20090038478A KR 20090038478 A KR20090038478 A KR 20090038478A KR 1020097004146 A KR1020097004146 A KR 1020097004146A KR 20097004146 A KR20097004146 A KR 20097004146A KR 20090038478 A KR20090038478 A KR 20090038478A
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Ceased
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KR1020097004146A
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English (en)
Inventor
다니엘 엘. 알콘
짜린 흥파이산
Original Assignee
블랜체트 록펠러 뉴로사이언시즈 인스티튜트
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Publication date
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Abstract

본 발명은 유효량의 단백질 키나제 C(PKC) 활성화제를 기억 상실로 확인된 피검체의 PKC와 접촉시켜 기억 상실을 지연시키거나 역행시키는 단계를 포함하는, 기억 및 학습 상실을 지연 또는 역행시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 세포 성장, 뉴우런 성장, 수상돌기 성장, 수상돌기 가시 형성, 수상돌기 가시 밀도, 및 ELAV의 근위 수상돌기로의 전위, 및 시냅스 리모델링을 자극하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 장기간 기억을 강화시키기에 충분하게 단백질 합성을 자극하기에 충분하도록 단백질 키나제 C 활성화제를 PKC와 접촉시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 PKC를 하향조절하기에 충분하도록 단백질 키나제 C 활성화제를 PKC와 접촉시키는 방법을 제공한다.
단백질 키나제 C(PKC), PKC 활성화제, 수상돌기, 뉴우런, 기억 상실

Description

세포 성장 자극, 시냅스 리모델링 및 장기간 기억 강화 방법{Methods of stimulating cellular growth, synaptic remodeling and consolidation of long-term memory}
본 발명은 세포 성장 자극, 시냅스 리모델링 및 기억 향상에 유용한 단백질 키나제 C(protein kinase C: PKC)를 상향조절 및 하향조절하는 방법 및 세포 증식 장애의 치료에 관한 것이다.
인지에 영향을 끼치는 다양한 장애 및 질환이 존재한다. 일반적으로 인지는 적어도 3개의 상이한 구성요소: 주의력, 학습 및 기억을 포함하는 것으로 기술될 수 있다. 이들 구성요소 각각 및 이들 각각의 수준은 피검체의 인지 능력에 대한 전체적인 수준에 영향을 끼친다. 예를 들어, 알츠하이머 환자는 전체적인 인지의 상실 및 따라서 각각의 이들 특징들의 악화를 겪는 한편, 이 질환과 매우 흔히 연관되는 것이 기억 상실이다. 다른 질환에서, 환자들은 인지의 다른 특징들과 보다 우세하게 연관된 인지 손상을 겪는다. 예를 들어, 주의력 결핍 과다활동 장애(ADHD)는 집중 상태를 유지하는 개체의 능력에 초점을 맞춘다. 기타 상태는 다 른 신경학적 질환, 노화, 및 정신 능력에 대해 해로운 영향을 끼칠 수 있는 상태의 치료, 예를 들어 암 치료와 연관된 일반적인 치매, 뇌졸증/허혈, 및 정신 지체를 포함한다.
장기간 기억을 위한 단백질 합성에 대한 필요성은 다양한 기억 패러다임에 대해 수십 년에 걸쳐 입증되어왔다[참조: Agranoff et al. (1967) Science 158: 1600-1601; Bergold et al. (1990) Proc. Nail. Acad. Sci. 87:3788-3791; Cavallaro et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99: 13279-16284; Crow et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 4490-4494; Crow et al. (1999) J. Neurophysiol. 82: 495-500; Epstein et al. (2003) Neurobiol. Learn. Mem. 79: 127-131; Ezzeddine et al. (2003) J. Neurosci. 23: 9585-9594; Farley et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 2016-2020; Flexner et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 55: 369-374; Hyden et al. (1970) Proc. Natl. Acad. Sci. 65: 898-904; Nelson et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 269-273; Quattrone et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. 98: 11668-11673; Zhao et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 34893-34902; Zhao et al. (2000) FASEB J. 14: 290-300]. 플렉스너(Flexner)는, (예를 들어 5-프로필우라실 또는 아니소마이신을 사용하는) 단백질 합성에 대한 약물-유도된 억제가 트레이닝 패러다임 후 임계적 시간 간격 동안 발생하는 경우, 상기한 억제가 장기간 기억을 차단한다는 것을 최초로 밝혀내었다[참조: Flexner et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 55: 369-374]. 단백질 합성이 이러한 임계적 시간 윈도우 전 또는 이러한 윈도우 후의 임의 시간에 억제되 는 경우, 장기간 기억에 대해 영향을 끼치지 않았다. 기억 강화에 필수적인 단백질의 확인, 이들의 조절에 대한 메카니즘 및 장기간 기억의 강화에서의 이들의 역할은 알려지지 않았다.
많은 종에서, 장기간의 연상 기억의 형성은 또한 단백질 키나제 C(protein kinase C: PKC) 이소자임의 뉴우런 막으로의 전위(translocation) 및 따라서 활성화에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 먼저, 이들 PKC 이소자임은, 칼슘과 보조인자, 예를 들어 디아실글리세롤의 배합물에 의해 활성화되는 경우, 외부 뉴우런 막 및 내부 소기관, 예를 들어 세포질세망의 막의 보다 긴밀한 양상과 함께 안정한 연합을 달성한다. PKC 활성화는, 연체동물 헤르미센다(Hermissenda)에 대한 단일 확인된 타입 B 세포[참조: McPhie et al. (1993) J. Neurochem. 60: 646-651], 래비트 순막(nictitating membrane) 컨디셔닝(conditioning)[참조: Bank et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 1988-1992; Olds et al. (1989) Science 245: 866-869], 래트 공간 미로 학습[참조: Olds et al. (1990) J. Neurosci. 10: 3707-3713], 및 파블로비안 컨디셔닝 시, 래트 후각 식별 학습을 포함한 다양한 포유동물 연상 학습 프로토콜에서 일어나는 것으로 밝혀졌다. 또한, PKC의 알파 이소자임에 대한 고친화성 기질인 칼렉스시틴(calexcitin)[참조: Nelson et al. (1990) Science 247: 1479-1483]은 파블로비안(Pavlovian)-컨디셔닝-의존적 방식으로 단일 확인된 타입 B 세포에서 양 및 인산화[참조: Kuzirian et al. (2001) J. Neurocytol. 30: 993-1008]가 증가하였다.
개개의 PKC 이소자임이 생물학적 과정에서 상이한 (때때로 상반됨) 역할을 하여 약리학적 개발에 있어 2가지 방향을 제공한다는 증거가 늘고 있다. 이 중 하나는 PKC에 대한 특이적 (바람직하게는, 이소자임 특이적) 억제제를 고안하는 것이다. 이러한 시도는 촉매 도메인이 PKC의 이소타입 특이성에 대해 우선적으로 중요한 도메인이 아니라는 사실에 의해 복잡해진다. 다른 시도는 이소자임-선택적이고 조절 부위-지시된 PKC 활성화제를 개발하는 것이다. 이들은 상반되는 생물학적 효과를 갖는 다른 시그널 전달 경로의 효과에 우선하는 길을 제시할 수 있다. 달리, PKC의 급격한 활성화 후 하향-조절을 유도함으로써, PKC 활성화제를 장기간 길항작용하게 할 수 있다.
연상 기억 프로토콜 수행 후, 특정 뇌 영역의 막 분획과 PKC의 증가된 연합이 여러일 동안 지속될 수 있다[참조: Olds et al. (1989) Science 245: 866-869]. 이러한 발견과 일치하는 것으로서, 강력한 PKC 활성화제인 브리오스타틴의 투여가 래트의 공간 미로 학습을 향상시켰다[참조: Sun et al. (2005) Eur. J. Pharmacol. 512: 45-51]. 또한, PKC 활성화제인 브리오스타틴을 사용한 임상 시도에서[참조: Marshall et al. (2002) Cancer Biology & Therapy 1: 409-416], PKC 활성화 효과가 약물 전달의 간헐적 스케쥴에 의해 증진될 수 있다는 것을 제시하였다. 하나의 PKC 활성화제인 브리오스타틴(마크롤라이드 락톤)은 서브-나노몰 농도에서 PKC를 활성화시킨다[참조: Talk et al. (1999) Neurobiol. Learn. Mem. 72: 95-117]. 포르볼 에스테르 및 내인성 활성화제 DAG와 같이, 브리오스타틴은 PKC 내의 C1 도메인에 결합하고 이를 막으로 전위시키며, 이어서 하향조절이 뒤따른다.
비-종양원성 PKC 활성화제인 브리오스타틴은 초기 PKC 활성화 후 장기간 하 향조절을 일으키는 것으로 공지된 용량(25 μg/m2-120 μg/m2)으로 암을 치료하기 위해 사람에서 광범위한 시험을 수행하였다[참조: Prevostel et al. (2000) Journal of Cell Science 113: 2575-2584; Lu et al. (1998) Mol. Biol. Cell 18: 839-845; Leontieva et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:5788-5801]. 또한, 최근들어 PKC의 브리오스타틴 활성화가, 사람 섬유아세포로부터의 무독성 단편인 가용성 전구체 단백질(sAPP)를 생성하도록 아밀로이드 전구체 단백질(APP)를 절단하는 알파-세크레타제를 활성화시킨다는 것이 밝혀졌다[참조: Etcheberrigaray et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 11141-11146]. 또한, 브리오스타틴은 래트 공간 미로 작업에 대한 학습 및 기억 보유[참조: Sun et al. (2005) Eur. J. Pharmacol. 512: 45-51], 래비트 순막 패러다임의 학습[참조: Schreurs and Alkon, 비공개됨], 및, 예비적 리포트에서, 헤르미센다 컨디셔닝[참조: Scioletti et al. (2004) Biol. Bull. 207: 159]을 향상시킨다. 따라서, PKC의 최적 활성화는 정상 상태 및 질환 상태에서의 인지에 영향을 끼치는 많은 분자적 메카니즘에 중요하다.
PKC의 상향조절을 하향조절 없이는 달성하기 어렵기 때문에(반대도 마찬가지), PKC 활성화와 연관되어 관측되는 인지적 이점을 향상시키기 위해서는 하향조절을 최소화하면서 PKC을 상향조절하는 방법이 필요하다. 본 발명의 방법 및 조성물은 이들 요구를 충족시키며, 알츠하이머 질환 및 기타 신경퇴행성 질환에 대한 임상 치료를 상당히 개선시킬 것이며, 또한 예방학적으로 인지 향상을 증진시킬 것이다. 또한, 본 발명의 방법 및 조성물은 α-세크라타제의 조절을 통해 인지 상태 의 치료 및/또는 향상을 제공한다.
발명의 요지
본 발명은 장기간 기억을 강화시키기에 충분하게 단백질의 합성을 자극하기에 충분하도록 단백질 키나제 C(PKC) 활성화제를 PKC와 접촉시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 PKC 활성화제와 PKC를 접촉시켜 세포 성장을 자극하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 PKC 활성화제와 PKC를 접촉시켜 뉴우런 성장을 자극하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 PKC 활성화제와 PKC를 접촉시켜 수상돌기 성장을 자극하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 PKC 활성화제와 PKC를 접촉시켜 수상돌기 가시(dendritic spine) 형성을 자극하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 PKC 활성화제와 PKC를 접촉시켜 수상돌기 가시 밀도를 자극하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 PKC 활성화제와 PKC를 접촉시켜 ELAV의 근위 수상돌기로의 전위를 자극하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 기억력 상실을 갖는 것으로 확인된 피검체에서 유효량의 PKC 활성화제를 PKC와 접촉시켜 기억력 상실을 지연시키거나 복귀시키는 단계를 포함하는, 기억 및 학습의 상실을 지연 또는 복귀시키는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 유효량의 PKC 활성화제와 PKC와의 접촉은 세포 또는 뉴우런 성장을 자극한다. 또 다른 양태에서, 유효량의 PKC 활성화제와 PKC와의 접촉은 수상돌기 성장을 자극한다. 또 다른 양태에서, 유효량의 PKC 활성화제와 PKC와의 접촉은 수상돌기 가시 형성을 자극한다. 또 다른 양태에서, 유효량의 PKC 활성화제와 PKC와의 접촉은 수상돌기 가시 밀도를 자극한다.
또한, 본 발명은 피검체에서 유효량의 PKC 활성화제를 PKC와 접촉시켜 세포 또는 뉴우런 성장을 자극하는 단계를 포함하는, 세포 또는 뉴우런 성장을 자극하는 방법을 제공한다. 하나의 양태에서, 피검체는 손상된 학습 또는 기억을 갖는 것으로 확인된 피검체이다. 또 다른 양태에서, 유효량의 PKC 활성화제와 PKC와의 접촉은 수상돌기 성장을 자극한다. 또 다른 양태에서, 유효량의 PKC 활성화제와 PKC와의 접촉은 수상돌기 가시 형성을 자극한다. 또 다른 양태에서, 유효량의 PKC 활성화제와 PKC와의 접촉은 수상돌기 가시 밀도를 자극한다.
하나의 양태에서, PKC 활성화제는 마크로사이클릭 락톤이다. 하나의 양태에서, PKC 활성화제는 벤조락탐이다. 하나의 양태에서, PKC 활성화제는 피롤리디논이다. 바람직한 양태에서, 마크로사이클릭 락톤은 브리오스타틴이다. 보다 바람직한 양태에서, 브리오스타틴은 브리오스타틴-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, 또는 -18이다. 가장 바람직한 양태에서, 브리오스타틴은 브리오스타틴-1이다.
하나의 양태에서, 마크로사이클릭 락톤은 네리스타틴이다. 바람직한 양태에 서, 네리스타틴은 네리스타틴-1이다.
하나의 양태에서, 상기 접촉은 PKC를 활성화시킨다. 하나의 양태에서, 상기 접촉은 PKC의 양을 증가시킨다. 하나의 양태에서, 상기 접촉은 PKC의 합성을 증가시킨다. 하나의 양태에서, 상기 접촉은 칼렉스시틴의 양을 증가시킨다. 하나의 양태에서, 상기 접촉은 PKC에 대한 실질적인 후속적 하향 조절을 나타내지 않는다.
하나의 양태에서, 상기 접촉은 반복된다. 또 다른 양태에서, 상기 접촉은 일정한 간격으로 반복된다. 또 다른 양태에서, 간격은 1주 내지 1개월, 1일 내지 1주, 또는 1시간 미만 내지 24시간이다. 또 다른 양태에서, 간격은 1주 내지 1개월이다. 또 다른 양태에서, 간격은 1일 내지 1주이다. 또 다른 양태에서, 간격은 1시간 미만 내지 24시간이다.
하나의 양태에서, 상기 접촉은 고정된 지속기간 동안 유지된다. 또 다른 양태에서, 고정된 지속기간은 24시간 미만이다. 또 다른 양태에서, 고정된 지속기간은 12시간 미만이다. 또 다른 양태에서, 고정된 지속기간은 6시간 미만이다. 또 다른 양태에서, 고정된 지속기간은 4시간 미만이다. 또 다른 양태에서, 고정된 지속기간은 2시간 미만이다. 바람직한 양태에서, 고정된 지속기간은 약 1시간 내지 12시간이다. 보다 바람직한 양태에서, 고정된 지속기간은 약 2시간 내지 6시간이다. 가장 바람직한 양태에서, 고정된 지속기간은 약 4시간이다.
하나의 양태에서, 상기 접촉은 1일 초과의 가간 동안 반복된다. 또 다른 양태에서, 상기 접촉은 1일 내지 1개월의 기간 동안 반복된다. 또 다른 양태에서, 상기 접촉은 1일 내지 1주의 기간 동안 반복된다. 또 다른 양태에서, 상기 접촉은 1주 내지 1개월의 기간 동안 반복된다. 또 다른 양태에서, 상기 접촉은 1개월 내지 6개월의 기간 동안 반복된다. 또 다른 양태에서, 상기 접촉은 1개월의 기간 동안 반복된다. 또 다른 양태에서, 상기 접촉은 1개월 초과의 기간 동안 반복된다.
하나의 양태에서, PKC 활성화제는 뇌 또는 중추신경계에의 전달을 증진시키고 말초 조직으로의 전달은 최소화시키는 방식으로 투여된다. 또 다른 양태에서, PKC 활성화제는 혈뇌장벽(BBB)을 가로지른 PKC 활성화제의 이송을 증진시키는 방식으로 투여된다. 하나의 양태에서, PKC 활성화제는 뇌 또는 중추신경계로의 전달은 증진시키지만 말초 조직으로의 전달은 최소화하는 약제학적 조성물로 제형화된다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 PKC 활성화제는 미국 공보 제20040204354호(본원에 전부 참조로 삽입됨)에 기술되어 있는 바와 같이 인위적 LDL 입자로 투여된다. 또 다른 양태에서, PKC 활성화제는 인위적 LDL 입자로 제형화된다. 또 다른 양태에서, PKC 활성화제는 콜레스테롤에 결합되고 인위적 LDL 입자로 제형화된다.
본 발명은 PKC를 하향조절하기에 충분하도록 PKC 활성화제를 PKC와 접촉시키는 방법에 관한 것이다.
하나의 양태에서, PKC 활성화제는 마크로사이클릭 락톤이다. 하나의 양태에서, PKC 활성화제는 벤조락탐이다. 하나의 양태에서, PKC 활성화제는 피롤리디논이다. 바람직한 양태에서, 마크로사이클릭 락톤은 브리오스타틴이다. 보다 바람직한 양태에서, 브리오스타틴은 브리오스타틴-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, 또는 -18이다. 가장 바람직한 양태에서, 브리오스타틴은 브리오스타틴-1이다.
하나의 양태에서, 마크로사이클릭 락톤은 네리스타틴이다. 바람직한 양태에서, 네리스타틴은 네리스티틴-1이다.
하나의 양태에서, 상기 접촉은 PKC의 합성을 자극하지 않는다. 또 다른 양태에서, 상기 접촉은 PKC의 합성을 실질적으로 자극하지 않는다. 또 다른 양태에서, 상기 접촉은 PKC의 양을 감소시키지 않는다. 또 다른 양태에서, 상기 접촉은 PKC의 양을 실질적으로 감소시키지 않는다. 또 다른 양태에서, 상기 접촉은 칼렉스시틴의 합성을 자극하지 않는다.
하나의 양태에서, 상기 접촉은 지속된 기간(sustained period) 동안 수행된다. 하나의 양태에서, 지속된 기간은 1시간 미만 내지 24시간이다. 또 다른 양태에서, 지속된 기간은 1일 내지 1주이다. 또 다른 양태에서, 지속된 기간은 1주 내지 1개월이다. 또 다른 양태에서, 지속된 기간은 1시간 미만 내지 12시간이다. 또 다른 양태에서, 지속된 기간은 1시간 내지 8시간이다. 또 다른 양태에서, 지속된 기간은 1시간 내지 4시간이다. 또 다른 양태에서, 지속된 기간은 약 4시간이다.
하나의 양태에서, 상기 접촉은 PKC의 지속된 하향조절(sustained downregulation)을 일으킨다. 하나의 양태에서, 지속된 기간은 1시간 미만 내지 24시간이다. 또 다른 양태에서, 지속된 기간은 1일 내지 1주이다. 또 다른 양태에서, 지속된 기간은 1주 내지 1개월이다. 또 다른 양태에서, 지속된 기간은 1시간 미만 내지 12시간이다. 또 다른 양태에서, 지속된 기간은 1시간 내지 8시간이다. 또 다른 양태에서, 지속된 기간은 1시간 내지 4시간이다. 바람직한 양태에 서, 지속된 기간은 약 4시간이다.
본 발명은 장기간 기억을 강화시키기에 충분하게 단백질의 합성을 자극하기에 충분하도록 단백질 키나제 C(PKC) 활성화제를 PKC와 접촉시키는 방법에 관한 것으로서, PKC의 분해를 억제하는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 분해는 유비퀴틴화를 통해 수행된다. 또 다른 양태에서, 분해는 락타시스테인에 의해 억제된다. 또 다른 양태에서, PKC는 사람으로부터의것이다.
본 발명은 장기간 기억을 강화시키기에 충분하게 단백질의 합성을 자극하기에 충분하도록 단백질 키나제 C(PKC) 활성화제를 PKC와 접촉시키는 방법에 관한 것으로서, PKC 활성화제는 PKC 활성화제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 제공된다.
하나의 양태에서, 약제학적 조성물은 추가로 PKC 억제제를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, PKC 억제제는 말초 조직에서 PKC를 억제하는 화합물이다. 본원에서 사용되는 용어 "말초 조직"은 뇌 이외의 조직을 의미한다. 또 다른 양태에서, PKC 억제제는 말초 조직에서 PKC를 우선적으로 억제하는 화합물이다. 또 다른 양태에서, PKC 억제제는 피검체에게 PKC 활성화제를 투여하는 것과 연관된 근육통을 감소시키는 화합물이다. 또 다른 양태에서, PKC 억제제는 PKC 활성화제로 처리되는 피검체에서 발생하는 근육통을 감소시키는 화합물이다. 또 다른 양태에서, PKC 억제제는 PKC 활성화제의 내약 용량을 증가시키는 화합물이다. 구체적으로, PKC 억제제는, 예를 들어, 이로 제한됨이 없이, 비타민 E, 비타민 E 동족체, 및 이 의 염; 칼포스틴 C; 티아졸리딘디온; 루복시스타우린, 및 이의 배합물을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "비타민 E"는 α-토코페롤(5, 7, 8-트리메틸토콜); β-토코페롤(5,8-디메틸토콜; δ-토코페롤(8-메틸토콜); 및 γ-토코페롤(7,8-디메틸토콜), 이의 염 및 동족체를 의미한다.
도 1은 장기간 기억 습득에 대한 브리오스타틴의 효과를 나타내며, 준최적으로 트레이닝되나 브리오스타틴 처리된 동물들은 모두 장기간 기억을 습득한다는 것을 나타낸다.
도 2는 장기간 기억 습득에 대한 브리오스타틴의 효과를 나타내며, 브리오스타틴의 존재 또는 부재 하에 광 및 회전의 임의적(random) 제시가 조건화된(conditioned) 반응을 나타내지 않는다는 것을 나타낸다.
도 3은 장기간 기억 습득에 대한 브리오스타틴의 효과를 나타내며, 2일 연속해서 4시간의 브리오스타틴 노출 후 3일째에 2회의 트레이닝 이벤트(training event: TE)를 수행한 동물은 적어도 6일의 장기간 기억을 습득한다는 것을 나타낸다.
도 4는 장기간 기억 습득에 대한 브리오스타틴의 효과를 나타내며, 3일 연속해서 4시간 브리오스타틴 노출 후 4일째에 2 TE를 수행한 동물은 적어도 96시간의 장기간 기억을 습득한다는 것을 나타낸다.
도 5는 장기간 기억 습득에 대한 브리오스타틴의 효과를 나타내며, 8 내지 20시간 동안 브리오스타틴 노출 후 2 TE를 수행한 동물은 브리오스타틴에의 4시간 노출 후 달성되는 기억과 동등한 기억을 습득하는데 충분하지 않다는 것을 나타낸다.
도 6은 장기간 기억 습득에 대한 브리오스타틴의 효과를 나타내며, 1.0 ng/ml 초과의 브리오스타틴에의 노출은 장기간 기억 습득을 억제한다는 것을 나타낸다.
도 7은 장기간 기억 습득에 대한 브리오스타틴 및 아니소마이신의 효과를 나타내며, 2 TE와 함께 브리오스타틴에의 단일 4시간 노출이 수시간 지속되는 장기간 기억을 나타내었고, 아니소마이신이 브리오스타틴 노출 동안 존재하는 경우에는 완전히 제거되었다는 것을 나타낸다.
도 8은 브리오스타틴 및 락타시스테인의 효과를 나타내며, 락타시스테인이 단일의 브리오스타틴 노출(이어서 2 TE)에 의해 야기되는 단기간 기억을 수일간 지속되는 장기간 기억으로 전환한다는 것을 나타낸다.
도 9는 칼렉스시틴에 대한 PKC 활성화의 효과를 나타낸다.
도 10a는 칼렉스시틴 면역염색에 대한 브리오스타틴 및 트레이닝 이벤트의 효과를 나타낸다. 본 도면은 트레이닝 이벤트의 수에 따른 타입 B 세포 내의 증가된 칼렉스시틴을 나타낸다.
도 10b는, 면역염색에 의해 나타나는 바와 같이, 칼렉스시틴에 대한 브리오스타틴 단독의 효과를 나타낸다.
도 11a는, 칼렉스시틴 세기(intensity)에 대한, 2일 연속해서 4시간 브리오 스타틴 노출에 이어 24시간 후 2 TE를 수행한 효과를 나타낸다. 본 도면은 2일 연속해서 브리오스타틴에의 4시간 노출에 이어 24시간 후 2 TE의 수행이 칼렉스시틴의 수준을 강화된 장기간 기억과 연관된 양으로 증가시키는데 필요하다는 것을 나타낸다.
도 11b는 칼렉스시틴에 대한 브리오스타틴 노출 후 아니소마이신 첨가의 효과를 나타낸다. 본 도면은, 2 TE + 3일의 4시간 브리오스타틴 노출 후, 아니소마이신이 칼렉스시틴 면역염색을 감소시키지 않았다는 것을 나타낸다.
도 12는, 세포질 분획에서 히스톤 인산화로 측정되는, PKC 활성에 대한 반복된 4-시간 브리오스타틴 노출의 효과를 나타낸다. 본 도면은 2일 연속한 브리오스타틴에의 노출이 PKC 활성을 대조군 또는 기저선 수준을 상당히 초과하게 한다는 것을 나타낸다.
도 13은, 막 분획에서 히스톤 인산화로 측정되는, PKC 활성에 대한 반복된 4-시간 브리오스타틴 노출의 효과를 나타낸다. 본 도면은 2일 연속한 브리오스타틴에의 노출이 PKC 활성을 대조군 또는 기저선 수준을 상당히 초과하게 한다는 것을 나타낸다.
도 14는 PKC 활성에 대한 아니소마이신의 효과를 나타낸다. 본 도면은 연속 3일 연속해서 매일 브리오스타틴에 노출시키는 동안의 아니소마이신의 존재가 세포질 및 막 분획 모두에서 PKC 활성을 감소시켰다는 것을 나타낸다.
도 15는 해마 뉴우런의 막-결합된 PKC에 대한 브리오스타틴의 효과를 나타낸다. 본 도면은, 배양된 해마 뉴우런의 30분 동안의 단일 활성화 용량의 브리오스 타틴(0.28 nM)에의 노출이 PKC를 세포질로부터 특정 분획으로 단시간 전위(약 60%)시키고 이어서 장기간의 하향조절을 일으켰다는 것을 나타낸다. 제1 노출 후 4시간 이하의 제2 노출이 단일의 브리오스타틴 노출 4시간 후 나타나는 하향조절을 상당히 약화시킨다.
도 16은 PKC 활성에 대한 반복된 브리오스타틴 노출의 효과를 나타낸다. 본 도면은, 2- 내지 4-시간 지연 후 제2 노출이 단일의 30분 브리오스타틴 노출이 야기시키는 상당한 하향조절을 제거하며, 제2 노출이 제1 노출 후 4시간까지 지연되는 경우, 활성은 기저선을 초과하여, 2시간 이내 전달된 제2 노출과 비교하여 상당히 큰 정도로 증가하였다는 것을 나타낸다.
도 17은 단백질 합성에 대한 브리오스타틴의 효과를 나타낸다. 래트 IGF-IR 세포를 1 내지 79시간의 인큐베이션 시간 동안 0.28 nM 브리오스타틴과 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서,[35S]메티오닌(9.1 μCi)을 배지에 가한 후 방사선라벨을 분석하였다. 0.28 nM 브리오스타틴에의 단일 30분 노출은, 뉴우런을 수집하기 마지막 30분 전에[35S]메티오닌을 삽입함으로써 측정시, 총체적인 단백질 합성을 24시간 내에 20% 증가시켰으며, 브리오스타틴 노출 후 79시간에는 60%까지 증가시켰으나, PKC 억제제 Ro-32-0432의 존재 하에서는 상당히 덜 증가시켰다.
도 18은 PKCα의 뉴우런 세포의 혈장 막으로의 전위 유도를 나타낸다.
도 19는 CA1 뉴우런에서 PKCα의 용량 및 시간 의존성을 나타낸다.
도 20은 ELAV의 수상돌기 새프트(shaft)로의 브리오스타틴-매개된 핵 전달을 나타낸다.
도 21은 ELAV의 수상돌기 새프트로의 브리오스타틴-매개된 핵 전달의 용량 및 시간 의존성을 나타낸다.
도 22는, 가시-특이적 단백질인 스피노필린의 라벨링으로 측정되는, 수상돌기 가시 밀도의 브리오스타틴-매개된 증가를 나타낸다.
도 23은, CA1 및 CA3 뉴우런의 브리오스타틴에의 30분 노출 후, 근위 수상돌기 새프트에서 수상돌기 가시 밀도의 브리오스타틴-매개된 증가를 나타낸다.
도 24는 CA1 뉴우런에서 가시 수의 브리오스타틴-매개된 증가에 대한 용량 및 시간 의존성을 나타낸다.
도 25는 생체 내 CA1 및 CA3 해마 뉴우런에서 가시 수의 브리오스타틴-매개된 증가를 나타낸다.
도 26은 학습 및 기억 보유에 대한 브리오스타틴의 효과를 나타낸다. 별표는 수영 대조군과 상당히 다르다는 것을 나타낸다(**, p<0.01; **, p<0.001). 프로브 시험에서, 미로(Mazo) + 브리오(Bryo)는 미로 및 미로 + 브리오 + RO와 상당히 다르다(p<0.05).
도 27은 공간 미로 작업으로 트레이닝된(trained) 래트의 수상돌기 가시에 대한 브리오스타틴의 효과를 나타낸다. 별표는 비투약(naive) 대조군과 상당한 차이가 있음을 나타낸다(*, p<0.05; **, p<0.001).
도 28은 버섯모양의 가시에 대한 브리오스타틴의 효과를 나타낸다. 별표는 비투약 대조군과 상당한 차이가 있음을 나타낸다(*, p<0.05; **, p<0.001).
도 29는 전시냅스(presynaptic) 및 후시냅스(postsynatic) 구조물에 대한 브리오스타틴의 효과를 나타낸다. 별표는 비투약 대조군과 상당한 차이가 있음을 나타낸다(*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001).
도 30은 PKC 활성화에 의한 증가된 가시 밀도의 메카니즘을 나타낸다. 황색 화살표는 혈장 막을 나타낸다. 백색 화살표는 CA1 뉴우런을 나타낸다.
도 31은 PKC 활성화에 의한 증가된 가시 밀도의 메카니즘을 나타낸다. 별표는 비투약 대조군과 상당한 차이가 있음을 나타낸다(*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001).
1. 정의
본원에서 사용되는 용어 "상향조절"은, 작용제, 예를 들어 PKC 단백질 또는 전사물의 양 또는 활성을, 전사물 또는 단백질 생성물의 증가된 전사, 해독 및/또는 증가된 안정성(이로 제한되지 않음)을 포함한 임의의 메카니즘을 통해, 기저 상태와 비교하여, 증가시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "하향조절"은, 작용제, 예를 들어 PKC 단백질 또는 전사물의 양 또는 활성을, 전사물 또는 단백질 생성물의 증가된 전사, 해독 및/또는 감소된 안정성(이로 제한되지 않음)을 포함한 임의의 메카니즘을 통해, 기저 상태와 비교하여, 감소시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분이 배합될 수 있고 배합 후에는 피검체에 활성 성분을 투여하는데 사용될 수 있는 화학적 조성물, 화합물, 또는 용매를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 담체는, 이로 제한됨이 없이, 다음 중 하나 이상을 포함한다: 부형제; 계면활성제; 분산제; 불활성 희석제; 과립화제 및 붕해제; 결합제; 윤활제; 보존제; 생리학적으로 분해가능한 조성물, 예를 들어 젤라틴; 수성 비히클 및 용매; 유성 비히클 및 용매; 현탁제; 분산제 또는 습윤제; 유화제, 점활제; 완충제; 염; 농조화제; 충전제; 항산화제; 및 약제학적으로 허용되는 중합체성 또는 소수성 물질 및 당업계에 공지되고 기술된 기타 성분[참조: Genaro, ed. (1985) Remington's Pharmaceutical Sciences Mack Publishing Co., Easton, Pa., 본원에 참조로 삽입됨].
본원에 기술된 약제학적 조성물의 제형은 약리학의 기술 분야에서 공지되거나 후에 개발되는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 활성 성분을 담채 또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 함께 배합한 후, 필요하거나 바람직한 경우, 생성물을 목적하는 단일- 또는 다수-용량 단위로 형성 또는 포장하는 단계를 포함한다.
본원에서 제공되는 약제학적 조성물의 기술이 원칙적으로는 사람에의 전문의약품 투여에 적합한 약제학적 조성물에 대한 것이지만, 당업자라면 이러한 조성물이 일반적으로 모든 종류의 동물에의 투여에도 적합하다는 것을 알 수 있을 것이다. 사람에의 투여에 적합한 약제학적 조성물을 다양한 동물에의 투여에 적합하도록 하기 위한 변형이 널리 알려져 있으며, 통상의 지식을 가진 수의학적 약리학자는 단지 통상적인 실험으로 이러한 변형을 고안 및 수행할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물이 투여되는 피검체는, 이로 제한됨이 없이, 사람 및 기타 영장류, 및 기타 포유동물을 포함한다.
2. 알츠하이머 질환
알츠하이머 질환은 뇌에서의 특정 뉴우런 서브군의 광범위한 상실과 연관되며 기억 상실이 가장 일반적인 증후군이다[참조: Katzman (1986) New England Journal of Medicine 314: 964]. 알츠하이머 질환은 신경병리학적 변화에 대해 잘 특징분석되어 있다. 그러나, 이상이 말초 조직에서 보고되었으며, 이는 알츠하이머 질환이 전신적 장애라는 가능성을 지지하며, 중추신경계 병리가 가장 두드러진다[참조: Connolly (1998) Review., TiPS Col. 19: 171-77]. 유전적 기원 및 염색체 1, 14 및 21에 대한 알츠하이머 질환의 연관에 대해, 문헌[참조: St. George-Hyslop et al. (1987) Science 235: 885; Tanzi et al. Review, Neurobiology of Disease 3:159-168; Hardy (1996) Acta Neurol Scand: Supplement 165: 13-17]을 참조한다.
알츠하이머 질환을 앓는 개체는 진행적인 기억 손상, 언어 및 공간 시각 기술의 상실 및 행동 결핍에 의해 특징지어진다[참조: McKhann et al. (1986) Neurology 34: 939-944]. 알츠하이머 질환을 앓는 개체의 인지 손상은 대뇌피질, 해마, 기저 전뇌 및 기타 뇌 영역에 위치된 뉴우런 세포의 퇴화의 결과이다. 부검에서 얻어진 알츠하이머 질환을 갖는 뇌의 조직학적 분석 결과, 퇴화 뉴우런의 세포체(perikarya) 및 엑손에서의 신경섬유매듭(NFT), 세포외 신경반(neutritic plaque)(노인반: senile plaque), 및 병에 걸린 뇌 영역의 일부 혈관 내 및 주위의 아밀로이드판의 존재를 나타내었다. 신경섬유매듭은 나선형으로 짝지은 섬유(직경 약 10 nm)(따라서, 짝지은 나선형 섬유라고도 불린다)를 포함하는 비정상적 섬유성 구조물이다. 신경반은 퇴화하는 신경 말단(엑손 및 수상돌기 모두)에 위치되며, 아밀로이드 단백질 섬유의 코어 화합물을 포함한다. 요약하면, 알츠하이머 질환은, 주로 세포골격 단백질로 구성된 세포내 신경섬유매듭, 및 세포외 실질(parenchymal) 및 뇌혈관 아밀로이드를 포함하는 특정한 신경병리학적 양상으로 특징지어진다. 또한, 오늘날 알츠하이머 환자, 정상적인 노인, 및 다른 신경퇴행성 질환, 예를 들어 파킨슨 질환, 헌팅톤무도병, 베르니케-코르사코프(Wernicke-Korsakolf) 또는 정신분열병을 구분하는 방법이 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제5,580,748호 및 제6,080,582호에서 더욱 기술되어 있다.
뉴우런 상실을 이끄는 세포 변화 및 질환의 근본적인 병인은 조사 중이지만, APP 대사의 중요성을 잘 확립되어 있다. 알츠하이머 질환을 앓는 환자의 뇌에서 매우 일관되게 확인되는 것으로서 뇌의 생리학 또는 병태생리학에서 역할을 하는 2개의 단백질은 β-아밀로이드 및 tau이다[참조: Selkoe (2001) Physiological Reviews. 81:2]. β-아밀로이드 단백질 대사에서의 결함 및 비정상적 칼슘 항상성 및/또는 칼슘 활성화된 키나제에 대해 문헌[참조: Etcheberrigaray et al. Alzheimer's Reports Vol. Nos. 3, 5 & 6 pp 305-312; Webb et al. (2000) British Journal of Pharmacology 130: 1433-52]을 참조한다.
알츠하이머 질환(AD)은 변형된 단백질 이화작용으로 특징지어지는 뇌 장애이다. 변형된 단백질 인산화가 알츠하이머 질환에서 발견되는 세포내 신경섬유매듭의 형성에 연루되어 있다. 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 프로세싱은, 후에 응집하여 AD의 특징적인 아밀로이드 침착물(노인반 또는 AD 플라크로도 공지됨)을 형성하는, 단편들의 생성을 결정한다. 알츠하이머 질환의 병리에 대한 주요 양상은 플라크 내 아밀로이드 단백질의 침착이다. 따라서, APP 프로세싱이 AD에 있어 초기의 주요한 병태생리학적 사건이다.
3가지의 택일적 APP 프로세싱 경로가 확인되었다. 이전에 명명된 "정상적" 프로세싱은 Aβ 서열 내의 잔기 Lys16에서(또는 Lys16과 Leu17 사이; APP770) APP를 절단하는 효소의 참여를 수반하며, 이로써 비-아밀로이드형성(non-amyloidogenic) 단편: 큰 N-말단 외부도메인(ectodomain) 및 작은 9 kDa 막 결합 단편을 생성한다. 이러한 효소는 아직 완전히 확인되지는 않았지만 α-세크레타제로 공지되어 있다. 2개의 부가적 세크레타제가 APP 프로세싱에 참여한다. 하나의 택일적 경로는 Aβ 도메인 밖의 Met671과 Asp672 사이에서(β-세크라타제에 의함) APP의 절단 및 엔도솜-리포솜 시스템의 참여를 수반한다. 추가의 절단 부위는, Aβ 펩타이드의 아미노산 39 이후의 혈장 막 내에 있는, Aβ 부분의 카복실-말단 끝에서 발생한다. 세크레타제(γ) 작용은 전체 Aβ 서열 및 약 6 kDa의 세포-결합된 단편을 포함하는 세포외 아미노산 말단을 생성한다. 따라서, β 및 γ 세크레타제에 의한 프로세싱은, 이들이 완전한 Aβ 서열을 포함하므로, 잠재적인 아밀로이드형성 단편을 생성한다. 택일적 경로가 지정된 시스템에서 나타나며 가용성 Aβ가 "정상적 생성물"일 수 있다는 수개의 증거가 있다. 그러나, 또한 CSF 및 혈장 중의 순환성 Aβ의 양이 "스웨덴식(Swedish)" 돌연변이를 수반하는 환자에서 상승된다는 증거도 있다. 또한, 이러한 돌연변이 또는 APP717 돌연변이로 트랜스펙션된(transfected) 배양 세포는 다량의 Aβ를 분비한다. 보다 최근에는, 다른 Aβ 돌연변이 및 PS1 및 PS2 돌연변이의 캐리어가 상승량의 특정 형태인 긴(42 내지 43개 아미노산) Aβ를 분비한다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 모든 택일적 경로가 정상적으로 일어날 수 있다고 하더라도, 아밀로이드형성 프로세싱을 유리하게 하는 불균형이 가족력 및 아마도 돌발적 AD에서 발생한다. 이러한 증진된 아밀로이드형성 경로는 결국에는 AD 환자의 뇌에서 원섬유(fibril) 및 플라크 형성을 이끈다. 따라서, 비-아밀로이드형성의 α-세크레타제 경로를 유리하게 하는 중재는, APP 프로세싱이 잠재적으로 독성인 Aβ 펩타이드와 비교하여 상대적 양의 sAPP를 증가시키는 아마도 비-병원성 프로세싱을 지향하도록 균형을 이동시킨다.
PKC 이소자임은 중요한, 특이적, 속도 제한적인 분자적 표적물(이러한 표적물을 통해 생화학적, 생물리학적 및 거동적 효능에 대한 특별한 연관성이 입증되며 인지능을 향상시키기 위해 환자에게 적용될 수 있다)을 제공한다.
또한, 정상적 및 비정상적 기억과 관련하여, K+ 및 Ca2 + 채널이 기억 저장 및 회상에 중요한 역할을 한다는 것이 입증되었다. 예를 들어, 칼륨 채널은 기억 저장 동안 변화하는 것으로 밝혀졌다[참조: Etcheberrigaray et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 7184; Sanchez-Andres et al. (1991) Journal of Neurobiology 65: 796; Collin et al. (1988) Biophysics Journal 55: 955; Alkon et al. (1985) Behavioral and Neural Biology 44: 278; Alkon (1984) Science 226: 1037]. 알츠하이머 환자에서의 기억 상실에 대한 거의 일반적인 증후군과 연관되는 이러한 관측은 알츠하이머 질환 병리에 대한 가능한 부위로서의 칼륨 채널 작용 및 인지에 대한 PKC 조절의 효과를 조사하게 한다.
3. 단백질 키나제 C 및 알츠하이머 질환
PKC는 가장 큰 유전자 패밀리의 비-수용체 세린-트레오닌 단백질 키나제 중의 하나로 확인되었다. 니시즈카(Nishizuka) 및 공동연구자에 의한 80년대 초기의 PKC의 발견[참조: Kikkawa et al. (1982) J. Biol. Chem. 257: 13341] 및 포르볼 에스테르의 주요 수용체로서의 이의 확인[참조: Ashendel et al. (1983) Cancer Res., 43: 4333] 이래로, 많은 생리학적 시스널화 메카니즘을 이러한 효소의 탓으로 돌려졌다. PKC에 대한 강한 관심은 칼슘 및 디아실글리세롤(및 이의 포르볼 에스테르 유사체(mimetics))(이의 형성이 성장 및 분화 인자의 작용에 의해 인지질 전환과 커플링되는 이펙터)에 의해 시험관 내에서 활성화되는 특별한 능력으로부터 유래한다.
PKC 유전자 패밀리는 현재 4개의 아그룹으로 구분되는 11개의 유전자로 이루어진다: 1) 전형의 PKCα, β1, β2(β1 및 β2는 동일한 유전자에 대해 택일적으로 스플라이싱된 형태이다) 및 γ, 2) 신규한 PKCδ, ε, η 및 θ, 3) 비정형의 PKCξ, λ, η 및 ι 및 4) PKCμ. PKCμ는 신규한 PKC 이소형태를 닮기는 하지만, 추정의 트랜스막 도메인을 갖는다는 것이 다르다[참조: Blohe et al. (1994) Cancer Metast. Rev. 13: 411; Ilug et al. (1993) Biochem J 291: 329; Kikkawa et al. (1989) Ann. Rev. Biochem. 58: 31]. α, β1, β2, 및 γ 이소형태는 Ca2, 인지질 및 디아실글리세롤-의존적이며 전형적인 이소형태의 PKC를 나타내는 한편, 다른 이소형태는 인지질 및 디아실글리세롤에 의해 활성화되기는 하나 CA2 +에 의존적인 것은 아니다. 모든 이소형태는 5개의 가변(V1-V5) 영역을 포함하며, α, β, γ 이소형태는 고도로 보존된 4개의(C1-C4) 구조적 도메인을 포함한다. PKCα, β 및 γ를 제외한 모든 이소형태는 C2 도메인이 결여되고, λ, η 및 이소형태도 디아실글리세롤이 결합하는 C1 내의 2개의 시스테인-농축 아연 핑거 도메인 중 9개가 결여된다. C1 도메인은 또한 모든 이소형태 사이에서 고도로 보존되며, 불활성 구조의 효소를 생성하도록 기질-결합 부위를 차단함으로써 자가-조절 작용을 돕는 슈도-기질 서열을 포함한다[참조: House et al., (1987) Science 238: 1726].
이러한 구조적 특징 때문에, 다양한 PKC 이소형태가 생리학적 자극에 반응한 시그널 변환[참조: Nishizuka (1989) Cancer 10: 1892] 및 신생물성 전환 및 분화[참조: Glazer (1994) Protein Kinase C. J. F. Kuo, ed., Oxford U. Press (1994) at pages 171-198]에서 고도로 특수화된 역할을 한다고 생각된다. 공지된 PKC 조절제에 대한 검토를 위해 국제출원 제PCT/US97/08141호, 미국 특허 제5,652,232호; 제6,043,270호; 제6,080,784호; 제5,891,906호; 제5,962,498호; 제5,955,501호; 제5,891,870호 및 제5,962,504호를 참조한다.
PKC가 시그널 변환에 관여한다는 주요한 역할에 비추어서, PKC가 APP 프로세싱을 조절하기 위한 흥미로운 표적물이라는 것이 입증되었다. PKC가 APP 프로세싱에 역할을 한다는 것이 잘 확립되어 있다. 예를 들어, 포르볼 에스테르는 PKC 활성화를 통해 분비되는 비-아밀로이드형성 가용성 APP(sAPP)의 상대적 양을 상당히 증가시키는 것으로 나타났다. 그러나, 포르볼 에스테르에 의한 PKC의 활성화가 APP 분자를 직접적으로 인산화시키는 것으로는 보이지 않는다. 작용의 정확한 부위와 무관하게, 포르볼-유도된 PKC 활성화로 α-세크레타제의 비-아밀로이드형성 경로가 활성화되거나 유리해진다. 따라서, PKC 활성화는 유해하지 않은 sAPP이 생성에 영향을 끼치고 심지어는 유리한 sAPP을 생성하며 동시에 상대적인 양의 Aβ 펩타이드를 감소시키는 관심을 끄는 접근법이다. 그러나, 포르볼 에스테르는 종양 촉진 활성 때문에 궁극적인 약물 개발에 적합한 화합물은 아니다[참조: Ibarreta et al. (1999) NeuroReport Vol. 10, No. 5&6, pp 1034-40].
또한, 본 발명자는 PKC의 활성화가 알츠하이머 질환(AD) 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 α-세크레타제 프로세싱에 유리하여 비-아밀로이드형성의 가용성 APP(sAPP)를 생성한다는 것을 관측하였다. 그 결과, 아밀로이드형성 A1-40 및 A1-42(3)의 상대적 분비가 감소된다. APP 및 프레세닐린 AD 돌연변이를 발현하는 섬유아세포 및 기타 세포들이 증가량의 총 Aβ 및/또는 증가율의 A1-42(3)/A1-40를 분비하므로, 이는 특히 중요하다. 흥미롭게도, PKC 결함이 AD 뇌(α 및 β 이소형태) 및 AD 환자로부터의 섬유아세포(α-이소형태)에서 발견되었다.
α, β 및 γ 이소형태에 대해 증진된 선택성을 갖는 기타 PKC 활성화제(즉, 벤조락탐)가 기저 수준 이상으로 sAPP 분비를 향상시키는 것으로 나타났다. 또한, 벤조락탐-처리된 AD 세포에서의 sAPP 분비는 대조군의 벤조락탐-처리된 섬유아세포와 비교하여 약간 높았으며, 대조군은 단지 10 μM BL으로 처리한 후 sAPP 분비에 있어 상당한 증가를 나타내었다. 또한, 관련된 화합물들도 PC12 세포에서 약 3배의 sAPP 분비를 일으키는 한편, 스타우로스포린(PKC 억제제)은 대조군 및 AD 섬유아세포 모두에서 벤조락탐의 효과를 제거한다고 보고되었다. 본 발명자는 비-아밀로이드형성 APP 프로세싱에 유리한 PKC 활성화제로서의 브리오스타틴이 비-종양 촉진제이고 제II 단계 임상 시도에서 이미 비-종양 촉진제였으므로, 브리오스타틴의 사용이 특별한 치료학적 가치를 갖는다는 것을 밝혀내었다.
알츠하이머 질환(AD) 환자의 섬유아세포에서의 변경에는, 칼슘 조절 및 칼륨(K+) 채널에서의 변경뿐만 아니라 PKC에서의 변경이 포함된다. PKC 활성화는, TEA-유도된[Ca2 +] 상승에 의해 측정되는 바와 같이, 정상적인 K+ 채널 기능을 회복시키는 것으로 나타났다. 또한, 패치-클램프(patch-clamp) 자료는 113 psK+ 채널 활성의 회복에 대한 PKC 활성화제의 효과를 입증한다. 따라서, K+ 채널의 PKC 활성화제-기초한 회복은 AD 병태생리학의 조사에 대한 접근법으로서 확립되었으며, AD 치료를 위한 유용한 모델을 제공한다[참조: 계류중인 미국 특허원 제09/652,656호, 본원에 전부 참조로 삽입됨]
PKC를 자극하도록 작용하는 마크로사이클릭 락톤(즉, 브리오스타틴 부류 및 네리스타틴 부류)가 특히 중요하다. 브리오스타틴 부류 화합물 중, 브리오스타틴-1은 PKC를 활성화시키는 것으로 나타났으며 종양 촉진 활성이 없는 것으로 입증되었다. 또한, PKC 활성화제로서의 브리오스타틴-1은 이의 용량 반응 곡선이 이상성(biphasic)이기 때문에 특히 유용하다. 추가적으로, 브리오스타틴-1은 PKCα, PKCδ, 및 PKCε을 포함한 PKC 이소형태에 대해 차등적 조절을 나타낸다. 브리오스타틴-1을 동물 및 사람에서 독성 및 안전성 연구에 사용하였으며, 항암제로서 활발히 연구되고 있다. 상기 연구에서 브리오스타틴-1의 사용에 의해 사람에서의 주요 유해 반응이 근육통이라는 것이 확인되었으며, 이는 최대 용량을 40 mg/m2으로 제한한다. 본 발명은 sAPP 분비를 극적으로 증가시키도록 0.1 nM의 브리오스타틴-1을 사용하였다. 브리오스타틴-1은 비히클 단독 및 또 다른 PKC 활성화제인 벤조락탐(BL)(10,000배 높은 농도로 사용됨)과 비교되었다. 브리오스타틴은 현재 항암제로서 임상 시도 중에 있다. 브리오스타틴은 PKC의 조절 도메인에 결합하고 이 효소를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 브리오스타틴은 PKC의 이소자임-선택적 활성화제의 예이다. 브리오스타틴 이외의 화합물도 PKC를 조절하는 것으로 밝혀졌다[참조: 예를 들어, WO 97/43268; 본원에 전부 참조로 삽입됨].
마크로사이클릭 락톤 및 특히 브리오스타틴-1은 미국 특허 제4,560,774호(본원에 전부 참조로 삽입됨)에 기술되어 있다. 마크로사이클릭 락톤 및 이들의 유도체는 또한 예를 들어 미국 특허 제6,187,568호, 제6,043,270호, 제5,393,897호, 제5,072,004호, 제5,196,447호, 제4,833,257호, 제4,611,066호(이들 각각이 전부 본원에 참조로 삽입됨)에 기술되어 있다. 상기 특허문헌들은 다양한 화합물 및 소염제 또는 항종양제로서의 이들의 사용을 포함한 마크로사이클릭 락톤의 다양한 이용을 기술한다. 브리오스타틴 부류에 대한 기타 논의는 문헌[참조: Szallasi et al. (1994) Differential Regulation of Protein Kinase C Isozymes by Bryostatin 1 and Phorbol 12-Myristate 13-Acetate in NIH 3T3 Fibroblasts, Journal of Biological Chemistry 269(3): 2118-24; Zhang et al. (1996) Preclinical Pharmacology of the Natural Product Anticancer Agent Bryostatin 1, an Activator of Protein Kinase C, Cancer Research 56: 802-808; Hennings et al. (1987) Bryostatin 1, an activator of protein kinase C, inhibits tumor promotion by phorbol esters in SENCAR mouse skin, Carcinogenesis 8(9): 1343-46; Varterasian et al. (2000) Phase II Trial of Bryostatin 1 in Patients with Relapse Low-Grade Non-Hodgkin's Lymphoma and Chronic Lymphocytic Leukemia, Clinical Cancer Research 6: 825-28; 및 Mutter et al. (2000) Review Article: Chemistry and Clinical Biology of the Bryostatins, Bioorganic & Medicinal Chemistry 8: 1841-1860, 이들 각각이 전부 본원에 참조로 삽입됨]에서 찾을 수 있다.
근육통은 PKC 활성화제의 내용량을 제한하는 주요한 부작용이다. 예를 들어, 브리오스타틴-1을 사용하는 제II상 임상 시도에서, 근육통이 모든 처리된 환자 중 10 내지 87%에서 보고되었다[참조: Clamp et al. (2002) Anti-Cancer Drugs 13: 673-683]. 3주 동안 주당 1회의 20 μg/m2 용량이 잘 허용되었으며, 근육통 또는 기타 부작용과 관련되지 않았다[참조: Weitman et al. (1999) Clinical Cancer Research 5: 2344-2348]. 또 다른 임상 연구에서, 8주 동안 주당 1회 투여된 25 μg/m2의 브리오스타틴-1은 최대 허용 용량이었다[참조: Jayson et al. (1995) British J of Cancer 72(2): 461-468]. 또 다른 연구에서는 50 μg/m2(6주 동안 격주로 1회씩 1시간 정맥 내 주입 투여됨)가 최대 허용 용량이었다[참조: Prendville et al. (1993) British J. of Cancer 68(2): 418-424]. 보고된 근육통은 브리오스타틴-1의 반복 치료와 함께 누적적이었으며, 초기 주입 수일 후 발병하였다. 환자의 삶의 질에 대한 근육통의 유해한 영향은 브리오스타틴-1 처리의 불편에 기여하는 원인이다. 브리오스타틴-유도된 근육통의 병인은 불확실하다.
국립암연구소(The National Cancer Institute)는 근육통을 등급화하기 위한 공통의 독성 표준을 확립하였다. 구체적으로, 표준은 5개의 카테고리 또는 등급으로 나뉜다. 등급 0은 근육통이 없다는 것이다. 등급 1의 근육통은 진통약이 필요없는 경미한 단시간의 통증으로 특징지어진다. 등급 1의 근육통에서, 환자는 충분히 보행가능하다. 등급 2의 근육통은 중간 통증으로 특징지어지며, 통증 또는 요구되는 진통제가 일부 기능을 방해하나 나날의 활동을 방해하지는 않는다. 등급 3의 근육통은 심각한 통증과 연관되며, 통증 또는 필요한 진통제가 나날의 활동을 심각하게 방해한다. 등급 4의 근육통은 불구가 되는 것이다.
본 발명의 조성물은 환자에게 투여되는 PKC 활성화제의 내성 용량을 증가시키고/시키거나 말초 조직에서 PKC의 활성화를 약화시킴으로써 PKC 활성화와 연관된 부작용을 개선한다. 구체적으로, PKC 억제제는 말초 조직에서 PKC를 억제하거나 말초조직에서 PKC를 우선적으로 억제한다. 예를 들어, 비타민 E가 당뇨병 래트의 대동맥 및 상승된 글루코스 수준에 노출된 배양된 래트 평활근 세포에서 디아실글리세롤-단백질 키나제 C를 정상화시키는 것으로 나타났다[참조: Kunisaki et al. (1994) Diabetes 43(11): 1372-1377]. 적당히 진행된 알츠하이머 질환을 앓는 환자에서 비타민 E(2000 IU/day) 처리의 이중-맹검 시도에서, 비타민 E 처리는 사망률 및 이환률을 감소시키나, 인지 능력을 향상시키지는 않는 것으로 밝혀졌다[참조: Burke et al. (1999) Post Graduate Medicine 106(5): 85-96].
브리오스타틴 부류를 포함한 마크로사이클릭 락톤은 비굴라 네리티나 엘(Bigula neritina L)로부터 최초 유래되었다. 마크로사이클릭 락톤, 특히 브리오스타틴 부류에 대한 다수의 용도가 공지되었으나, 마크로사이클릭 락톤과 인지 향상과의 관계는 이전에는 알려진 바 없었다.
본 발명에 사용될 수 있는 화합물의 예는 마크로사이클릭 락톤(즉, 브리오스타틴 부류 및 네리스타틴 부류 화합물)을 포함한다. 이들 화합물의 구체적 양태가 실시예 및 상세한 설명에 기술되며, 참조문에 기술된 화합물 및 이의 유도체도 본 조성물 및 방법에 사용될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 마크로사이클릭 락톤 화합물 및 이들의 유도체, 특히 브리오스타틴 부류는 조합적 합성 기술로 다루기 쉬우므로, 이로 제한되지 않으나, 조성물의 효능 및 안전성을 포함한 약리학적 변수를 최적화시키도록 화합물의 라이브러리가 형성될 수 있다. 추가로, 이러한 라이브러리는 바람직하게는 α-세크레타제 및/또는 PKC를 조절하는 구성원을 결정하기 위해 검정될 수 있다.
브리오스타틴의 합성 동족체도 본 발명에 의해 고려된다. 구체적으로, 이들 동족체는, 브리오스타틴과의 NMR 분광 비교 및 다양한 정도의 PKC-결합 친화성에 의해 측정되는 바와 같이, C1-, C19-, C26-산소 인식 도메인에 대한 오리엔테이션(orientation)을 보유한다. 미국 특허 제6,624,189호(본원에 전부 참조로 삽입됨)에 기술된 브리오스타틴 동족체도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, 미국 특허 제6,624,189호(컬럼 3, 35행 내지 66행)의 화학식 I의 부류(genus) 및 미국 특허 제6,624,189호의 화학식 II-VII의 종류(species) 및 1998a 및 1990b(컬럼 8, 28행 내지 60행)로 기술되는 브리오스타틴 동족체가 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 PKC 활성화제이다.
구체적인 특징의 인지 능력 또는 일반적 인지를 통해 전체적인 인지를 개선하기 위한 치료 방법의 개발이 여전히 필요하다. 또한, 구체적인 질환 상태 또는 인지 장애와 관련되든 아니든 인지적 향상을 개선하기 위한 방법의 개발이 여전히 필요하다. 본 발명의 방법 및 조성물은 이러한 요구를 충족시키며 알츠하이머 질환 및 기타 신경퇴행성 질환에 대한 임상적 치료를 크게 개선할 것이며, 또한 개선된 인지 향상을 제공할 것이다. 또한, 본 발명의 방법 및 조성물은 α-세크레타제의 조절을 통해 인지 상태의 치료 및/또는 향상을 제공한다.
4. 단백질 키나제 C 활성화 및 시냅스 가소성
단백질 키나제 C의 활성화는 시냅스 가소성을 자극한다. 시냅스 가소성은 2개의 뉴우런 사이의 연결물 또는 시냅스의 길이 변화에 대한 능력을 기술하기 위해 사용되는 용어이다. 시냅스로 방출되는 신경전달자의 양에 있어서의 변화 및 이러한 신경전달자에 세포가 효과적으로 반응하는 방식에 있어서의 변화를 포함하여, 수개의 메카니즘이 시냅스 가소성을 달성하기 위해 협조한다.[참조: Gaiarsa et al., 2002]. 기억은 뇌에 있는 시냅스의 상호연결된 네트워크에 의해 생성되기 때문에, 시냅스 가소성이 학습 및 기억에 대한 중요한 신경화학적 토대 중의 하나이다.
수상돌기 가시 밀도에 있어서의 변화가 시냅스 가소성의 기초를 형성한다. 수상돌기 가시 밀도에 있어서의 변화가 학습 및 기억을 포함한 많은 뇌 기능에 역할을 한다. 예를 들어, 장기간 기억은 특정 신경 경로를 보강하도록 새로운 수상돌기 가시의 성장에 의해 부분적으로 중재된다. 2개의 뉴우런 사이의 연결을 강화시킴으로써, 전시냅스 세포가 후시냅스 세포를 활성화시키는 능력이 향상된다.
수상돌기 가시는 수상돌기로부터 돌출하여 시냅스의 절반을 형성하는 작은(서브-마이크로미터) 막성 돌출물이다. 전형적으로, 가시는 얇은 가시 목(neck)을 통해 모체의 수상돌기에 연결되는 구상의 헤드(가시 헤드)를 갖는다. 수상돌기 가시는 뇌에 있는 대부분의 주요한 뉴우런의 수상돌기에서 발견된다. 가시는, 예를 들어 버섯 가시, 얇은 가시 및 뭉뚝한 가시와 같은 모양에 따라 구분된다. 전자 현미경 검사에서는 이들 카테고리 간의 모양의 연속성을 나타낸다. 상이하게 모양을 취하는 가시는 상이한 발달 단계 및 시냅스의 세기를 반영한다는 증거가 일부 있다. 레이저 스캐닝 및 공초점 현미경 검사를 이용하여, 가시 크기 및 밀도를 포함한 수상돌기 가시의 특성 변화를 나타내었다. 동일한 기술을 이용한 살아있는 동물의 뇌에서의 시간-경과 조사에서, 가시는 내왕하며 보다 커다란 버섯모양의 가시가 시간이 흐르면서 가장 안정한 것으로 나타났다.
수개의 단백질이 수상돌기 가시 형성에 대한 마커이다. 예를 들어, 스피노필린은 수상돌기 가시에 고도로 농축되며 수상돌기 가시의 형성 및 기능을 조절하는 것으로 나타났다. ELAV 단백질은 뉴우런 분화에 대한 최초의 마커 중의 하나이다. ELAV 단백질은 일반적으로 유전자 발현의 전사후 조절에 수반된다.
실시예 1: 행동 약리학
헤르미센다 크라시코르니스(Hermissenda Crassicornis)의 시료를, 실험 개시 전, 구멍이 뚫린 50 ml 원추형 원심분리 튜브에서 3일 동안 15°에서 인공 해양수(ASW)에 보관하였다. 바다의 이끼벌레류(bryozoan) 부굴라 네리티나(Bugula neritina)로부터 정제된 브리오스타틴을 EtOH에 용해시키고, ASW에 이의 최종 농도로 희석시켰다. 동물들을 4시간 동안 ASW 중에서 브리오스타틴과 함께 인큐베이션한 후, 전형의 ASW로 세정하였다. 선별된 실험을 위해, 락타시스테인(10 μM) 또 는 아니소마이신을 ASW에 가하였다.
각각의 동물을 가두는 길이 8 cm, 직경 1 cm의 시험관 내 수영 매질에 약물을 가함으로써, 헤르미센다의 행동 및 생화학에 대한 브리오스타틴의 효과를 야기시켰다.
실시예 2: 면역염색법
실험적 처치 및 시험 후, 동물들은 신속히 절두하고, 중추신경계(CNS)를 떼어내고, 20 mM 트리스-완충된(pH 8) 천연 해수(NSW; 0.2 μm 마이크로포어-여과됨) 중의 4% 파라-포름알데히드에 고정시켰다. 이어서, CNS를 폴리에스테르 왁스(20)에 함몰시키고, 절단하며(6 μm), 아비딘-결합된 마이크로퍼옥시다제에 커플링된 바이오티닐화된 2차 항체를 사용하여 면역염색하였다(ABC 방법, Vector). 아미노에틸카바졸(AEC)를 색원체로 사용하였다. 1차 폴리클로날 항체(25U2로 명명)는 오징어 시엽(squid optic lobe)으로부터 추출된 전체 길이의 칼렉스시틴 단백질로부터 래비트에서 생성하였다. B-광수용체의 국한 세포질 면적 - 동일한 배경 면적(비-염색 신경망)에 대한 디지탈 현미경사진으로부터 그레이-스케일(gray-scale) 세기를 측정하였다.
실시예 3: 단백질 키나제 C 검정
세포를 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 및 50 mM NaF를 포함하는 100 μl의 10 mM Tris-HCL pH 7.4 완충액에서 초음파처리(5초, 25 W)하여 분쇄시켰다. 분쇄물을 폴 리알로머 원심분리 튜브에 옮기고, 4°에서 10분 동안 100,000 xg로 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 즉시 드라이아이스에서 냉동시켰다. 미립자 분획을 100 μl의 동일한 완충액에서 초음파처리하여 재현탁시키고, -80°에서 저장하였다. PKC를 측정하기 위해서, 10 μl의 세포질 또는 미립자 분획을 10 μM 히스톤, 4.89 mM CaCl2, 1.2 μg/μl 포스파티딜-L-세린, 0.18 μg/μl 1.2-디옥타노일-sn-글리세롤, 10 mM MgCl2, 20 mM HEPES(pH 7.4), 0-8 mM EDTA, 4 mM EGTA, 4% 글리세롤, 8 μg/ml 아프로티닌, 8 μg/ml 류펩틴, 및 2 mM 벤즈아미딘의 존재 하, 37°에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 0.5 μCi[γ32-P]ATP를 가하고, 32P 인단백질 형성을 전술된 바와 같이 포스포셀룰로스에 대한 흡착으로 측정하였다(25). 이러한 검정은 헤르미센다 신경 시스템 분쇄물 또는 배양된 포유동물 뉴우런 분쇄물에 적용하기 위해 약간의 조절과 함께 이용하였다.
실시예 4: 세포 배양
래트 해마 H19-7/IGF-IR 세포(ATCC)를 폴리-L-리신 코팅된 플레이트에 도말하고, 약 50%가 커버될 때까지 수일 동안 DMEM/10% FCS 중 35°에서 성장시켰다. 이어서, 배지를 10 ng/ml 염기성 섬유아세포 성장 인자를 포함하는 5 ml N2 배지로 교체함으로써 상기 세포를 뉴우런 표현형으로 분화를 유도하고, 39℃의 T-25 플라스크에서 성장시켰다(26). 이어서, 다양한 농도의 브리오스타틴(0.01-1.0 nM)을 10 μl 수용액에 가하였다. 특정 기간 후, 배지를 제거하고, 세포를 PBS를 세척한 후, 적당한 스크래핑으로 떼어내고, 5분 동안 1000 rpm에서 원심분리하여 수집하였다.
실시예 5: 행동 컨디셔닝
헤르미센다의 파블로비안 컨디셔닝은, 비-조건화된(unconditioned) 자극인 오비탈 진동과 함께 중립적 자극인 광의 반복적 페어링(paring)을 수반한다[참조: Lederhendler et al. (24) and Epstein et al. (6)]. 회전/진동 자극은 평형포 털 세포를 자극시켜 비-조건화된 반응(발을 지탱하는 표면에 대한 부착 또는 "밀착"이 동반되는, 발이라 불리는 근육 밑면의 활발한 수축)을 유도한다. 컨디셔닝 전, 광은 발의 신장을 수반하는 약한 포지티브 주광성을 유도한다. 충분한 광-회전 페어링 후, 광은 더 이상 주광성을 유도하지 않으나, 대신에 새로운 반응(24)(단지 비-조건화된 자극에 의해서만 사전 유도되는 "밀착" 및 발의 단축)을 유도한다(도 1). 따라서, 비-조건화된 자극인 회전 또는 오비탈 진동의 효력(meaning)은 조건화된(conditioned) 자극으로 옮겨졌으며, 광-유도된 발 수축(발 길이의 네가티브 변화)에 의해 표시된다. 광에 대한 이러한 조건화된 반응은 수주 동안 지속될 수 있으며, 임의적 광 및 회전에 의해서는 생성되지 않고, 자극-특이적이며, 포유동물의 파블로비안 컨디셔닝에 대한 다른 정의된 특징을 공유한다.
실시예 6: 연상 기억의 브리오스타틴 -유도된 연장
헤르미센다의 파블로비안 컨디셔닝은, 학습된 조건화된 반응을 점진적으로 길게 연장되게 보유하게 하는 명확한 트레이닝 파라미터를 갖는다. 예를 들어, 페어드 광 및 오비탈 진동("Methods" 참조)의 2회의 트레이닝 이벤트(2 TE)는 약 7분 동안 약물 처리 없이 지속되는 학습된 조건화된 반응(광-유도된 발 수축 및 단축)을 유도한다. 4 내지 6회의 트레이닝 이벤트(4-6 TE)는 수시간 동안 지속되는 조건화된 반응을 유도하나, 트레이닝한 지 약 1일 후에 사라진다. 9회의 TE는 수일, 종종 2주까지 지속되는 장기간 연상 기억을 일으킨다.
트레이닝 전 암 적응(10분) 동안 가해지고 4시간 동안 지속되는 브리오스타틴(0.25 ng/ml)을 사용하거나, 브리오 없이(NSW 대조군), 동물들을 4- 및 6-페어드(paired) CS/US 트레이닝 이벤트(TE)의 준최적 치료법으로 트레이닝하였다; 9-페어드 TE 및 NSW는 포지티브 대조군으로 사용되었다. 모든 동물들은 4시간, 이어서 24시간 간격을 두고 CS 단독으로 시험되었다. 준최적으로 트레이닝되었으나 브리오스타틴으로 처리된 동물들 모두 장기간 보유를 나타내었다(n = 8-16 동물/조건/실험; ANOVA, p<0.01).
2 TE + 브리오스타틴은 수시간 지속되는 기억 보유를 나타내었으며(브리오스타틴 없는 경우의 수분과 대조됨), 4 TE + 브리오스타틴은 24시간을 초과하게 기억 보유가 연장되었으며(도 1), 6 TE + 브리오스타틴은 1주 이상 보유가 지속되었다.
브리오스타틴 없이는(NSW), 무작위(random) 및 페어드 CS/US 트레이닝 이벤트(TE)가 LTM을 생성하지 못하였으며, 4시간 간격으로 시험되는 경우 CR을 유도하지 못했다. 6-TE 컨디셔닝 전(10분 암 적응 동안) 적용되고 그 후 4시간 동안 적용된 브리오스타틴(0.25 ng/ml, NSW 중)은 포지티브 CR(발 수축; 길이의 네가티브 변화)을 나타내었으며, 이는 LTM이 확립되었다는 것을 나타낸다. 길항제인 Ro-32를 사전 트레이닝(pre-training)으로(암 적응 동안) 적용하는 경우, 6 TE + 브리오스타틴의 효과를 차단하였다. 즉, 동물들은 정상적인 주광성으로 신장되었다(포지티브 길이 변화)(n = 4-8 동물/조건/실험; ANOVA 차이, p<0.01). 브리오스타틴의 존재 또는 부재 하에서, 광 및 회전의 무작위 제시는 조건화된 반응(도 2), 즉 광-유도된 발-수축을 나타내지 않았다. 따라서, 트레이닝 동안 및 트레이닝 직후의 브리오스타틴은 준최적의 트레이닝 시도로 기억 보유를 연장시켰다.
실시예 7: 트레이닝 전 수일에 걸친 브리오스타틴에의 사전-노출(pre-exposure)은 기억 습득을 향상시킨다
이전의 측정(15, 17)은 뉴우런 막과의 학습-유도된 PKC 연합(즉, 전위)이 지속될 수 있음을 나타내었다. 래비트의 순막 컨디셔닝, 래트의 공간 미로 학습, 미로 학습, 및 래트의 후각 판별 학습 모두, 트레이닝 후 수일 동안 지속되는 PKC 전위를 동반하는 것으로 밝혀졌다. 헤르미센다 컨디셔닝은 트레이닝 후 적어도 1일 동안 단일의 확인가능한 타입 B 세포에 국지화될 수 있는 PKC 전위로 이어졌다(15).
이미 기술된 바와 같이, 트레이닝 동안 및 트레이닝 후 4시간 동안 브리오스타틴에의 노출은 6-8분부터 수시간까지 2 TE에 의해 생성되는 기억 보유를 향상시킨다. 그러나, 트레이닝 이전의 날(day) 및 2 TE의 날에 브리오스타틴에의 4시간 노출은 트레이닝 후 1일 초과 동안 기억 보유를 연장시켰다. 2-페어드 CS/US 트레 이닝 이벤트와 커플링된 2일 연속의 4시간 브리오스타틴 노출(0.25 ng/ml)은, CS 단독으로 시험되는 경우 CR(신체 길이 수축)에 의해 입증되는, 적어도 6일의 장기간 보유를 나타내었다(n = 16 동물/조건; ANOVA, p<0.01)(도 3).
3일 연속된 4시간의 브리오스타틴 노출(0.25 ng/ml)에 이어 1일 후 2-TE를 받은 동물들은 트레이닝 후 96시간에 걸쳐 측정되는 장기간 보유(LTR)을 나타내었다. 비-노출된 동물들(도 3에서와 동일)은 어떠한 행동 변형도 나타내지 않았다(CS 시험에 대해 CR 없음). 3일 브리오스타틴 처리를 받은 동물들에게 즉시 투여되고 및 트레이닝 후 4시간 동안 지속되는 아니소마이신(ANI)(1 μg/ml)은 장기간 보유를 방해하지 않았다. 따라서, 트레이닝 후 첨가되는 경우 ANI에 의해 통상 차단되는 LTR을 생성하는데 필요한 단백질 합성에 대한 요구가 3일 브리오스타틴 처리에 의해 사라졌다(n = 16 동물/조건; ANOVA, p<0.01). 4시간 간격의 브리오스타틴에의 제3 노출은 파블로비안 조건화된 반응에 대해 유사하게 향상된 보유를 야기하였다(도 4). 이전의 결과들은, 2회 연속 간격의 브리오스타틴에 대한 노출이, 최소한의 동시적 및 후속적 PKC 하향조절과 함께, PKC 활성화를 일으키고 가능하게는 장기간 기억에 중요한 단백질 합성을 일으킨다는 것을 지지한다. 이러한 고찰은, 2 TE로 이어지는 보다 연장된 간격(즉, 8 내지 20시간)의 브리오스타틴 노출(도 5)이, 연속한 이전일(preceding days)에 2번의 4시간 노출을 수반하는 것과 동등한 기억 보유를 생성하는데 있어, 그 자체로서는 충분하지 않았다는 관측에 의해 추가로 지지된다. 이들 실험에서, 트레이닝에 대한 20시간 브리오스타틴(0.25 ng/ml) 노출 효과가 관측되었다. 준최적의 2-페어드 TE 컨디셔닝 요법에서, 보유 는 48시간 내에 사라졌다. 브리오스타틴에의 20시간 사전-노출을 수반하는 4-페어드 TE 컨디셔닝의 보유는 지속적이었다(n = 8 동물/조건; 48시간에서의 ANOVA, p<0.01). 충분히 연장된 브리오스타틴 노출(즉 8 내지 12시간)은 다른 세포 시스템에서 PKC 활성화를 상쇄하고 PKC 합성을 증가시킬 수 있는 연장된 PKC 하향조절을 일으키는 것으로 알려져 있다.
유사하게, 충분히 증가된 농도의 브리오스타틴은, 아마도 또한 PKC 하향조절 때문에, 종국적으로는 기억 보유를 차단하였다(도 6). 0.50 ng/ml 미만의 브리오스타틴 농도는 준최적(4 TE) 트레이닝 조건으로 습득 및 기억 보유를 증대시킨다. 이들 농도가 9-페어드 TE로의 보유 수행에 대해서는 입증가능한 효과가 없었다. 그러나, 시험된 모든 트레이닝 조건에서, 1.0 ng/ml 이상의 농도는, 아마도 PKC 하향조절을 통해, 습득 및 행동 보유를 억제하였다(n = 16 동물/조건).
실시예 8: 브리오스타틴에의 사전-노출은 트레이닝 동안 단백질 합성 요구를 없앤다
동물들은 2-페어드 트레이닝 이벤트(TE)를 받았으며 4시간 후 보유에 대해 시험되었다. 10분의 트레이닝 전 암 적응 기간 및 그 후 4시간 동안 동물에 대해 적용된 NSW 중의 브리오스타틴(0.25 ng/ml)은 행동 컨디셔닝(발 수축(CR) 및 신체 길이의 단축)에 대한 보유를 나타내었다. NSW 대조군 동물 및 트레이닝 전 브리오스타틴 처리에 이어 트레이닝 직후 아니소마이신(1.0 μg/ml) 처리된 동물은, 정상적인 포지티브 주광성으로 발 신장과 더불어 CR을 나타내지 않았다(n = 12 동물/조 건/실험, 2-웨이 ANOVA 통계, p<0.01). 2 TE와 함께 브리오스타틴에의 단일 4시간 노출은, 아니소마이신이 브리오스타틴과 함께 존재하는 경우 완전히 제거되는, 수시간 지속되는 장기간 기억 보유를 나타냈다(도 7). 또한, 아니소마이신의 유사한 차단 효과가 6 TE + 브리오스타틴으로 관측되었다. 그러나, 브리오스타틴에의 반복된 짧은 노출은 PKC, 칼렉스시틴 및 기타 기억 단백질의 네트 합성을 증가시키므로, PKC 하향조절이 충분히 최소화되는 경우, 파블로비안 컨디셔닝 동안 및 후에 새로운 합성에 대한 요구를 없앤다. 3일간 매일 브리오스타틴에 4시간 노출되었된 동물을 2 TE 직후 아니소마이신으로 4시간 동안 처리하여 단백질 합성을 차단하였다. 이 경우, 단백질 합성에 대한 아니소마이신-유도된 차단은 수일 지속되는 기억 보유를 방해하지 못했다(도 4). 대조적으로, 동일한 4시간 아니소마이신 처리는 9 TE(통상 1 내지 2주의 기억 보유가 이어지는 트레이닝 요법)에 의해 생성된 모든 기억 보유를 제거하였다(27). 마지막으로, 매번 아니소마이신을 수반하는 브리오스타틴에의 4시간 노출을 3일 연속한지 1일 후에 2 TE가 주어지는 경우, 장기간 기억이 제거되었다.
실시예 9: 프로테아좀에의 사전-노출은 기억에 대한 브리오스타틴 효과를 증진시킨다
PKC 및 다른 기억-관련 단백질들의 드 노보(de novo) 합성을 향상 및 연장시키는 또 다른 수단이 단백질 분해에 수반되는 경로를 차단함으로써 제공된다. 이중 하나인 유비퀴틴-프로테아좀 경로(28-30)는 PKC의 α-이소자임의 분해를 위한 주요 루트인 것으로 알려져 있다. PKC-α의 분해는 20 μM 내지 50 μM의 프로테아좀 억제제인 락타시스테인에 의해 크게 억제되는 것으로 이미 밝혀졌다.
동물들을 브리오스타틴(0.25 ng/ml) 및 락타시스테인(10 μM)을 사용하여 4시간 동안 동시에 인큐베이션한 후, 24시간 후 2-페어드 CS/US 트레이닝 이벤트(TE)로 조건화하였다. 이어서, 트레이닝 후 4시간 및 이어서 24시간의 간격을 두고 CS 단독으로 동물들을 시험하였다. 조건화된 행동의 보유는 배합된 브리오스타틴/락타시스테인 처리로 지속되었다; 브리오스타틴-단독 처리된 동물에 의해서는 행동 보유가 24시간 후 상실되었다. 락타시스테인-단독 처리된 동물은 행동 트레이닝의 습득 또는 보유를 나타내지 않았다(자료가 그래프화되지 않음). (n = 28 동물, 배합된 브리오스타틴/락타시스테인; n = 20, 브리오스타틴 단독; n = 16, 락타시스테인 단독). 이 경우, 락타시스테인은 단일한 브리오스타틴 노출(이어서 2 TE 수행)에 의해 생성되는 단기간 기억을 여러일 지속하는 장기간 기억으로 전환시켰다(도 8).
실시예 10: PKC 활성화에 기인한 칼렉스시틴 -면역염색
최근에, 본 발명자는 칼렉스시틴의 면역염색 라벨이 헤르미센다 컨디셔닝의 습득 및 보유 동안 단일 확인된 타입 B 세포에서 증가되었다는 것을 밝혔다(20). 많은 이전의 발견들은 헤르미센다 컨디셔닝 동안 PKC 이소자임의 기질로서 저분자량의 칼슘 및 GTP-결합 단백질인 칼렉스시틴을 밀접하게 연관시켰다(19). 일부 동물 종에서는 현재 완전히 서열분석되었고 다른 종에서의 유사 단백질과 상당한 상 동성을 갖는 것으로 밝혀진 칼렉스시틴(31)은 헤르미센다 파블로비안 컨디셔닝 동안 및 후에 인산화 변화를 겪는다. 또한, 이는 PKC의 알파-이소자임에 대한 고친화성 기질이며 β및 감마에 대한 저친화성 기질이다(19).
확대도(A, B)는, 칼렉스시틴 폴리클로날 항체인 25U2로 면역표지된, 헤르미센다 눈으로부터의 대표적인 조직 절편을 도시한다. 브리오스타틴의 사전 투여와 함께 또는 투여 없이 페어드 CS/UCS 조합 컨디셔닝을 경험한 동물의 B-세포 광수용체(*B-세포)에서 포지티브 면역염색이 나타났다(B). 2회의 자극(트레이닝 이벤트, TE)의 무작위 제시는 행동 변화를 일으키지 않았으며 칼렉스시틴을 정상적인 배경 수준 이상으로 증가시키지도 않았다(A); 최하부 막 및 렌즈 염색물은 척추동물의 폴리클로날 항체를 사용하는 것과 관련된 인공물이다. 염색 세기의 차이는 그레이-스케일 세기(0-256; B-세포 세포질 - 조직 배경)로 측정 및 기록되었다. 그래프(C)는 9-무작위 TE로 조건화된 헤르미센다에 대한 세기 측정(좌측 막대) 및 PKC 효능제인 브리오스타틴(0.25 ng/ml)에의 2일간 2회 노출 후 2-페어드 TE로 연합적으로 조건화된 동물에 대한 세기 측정을 나타낸다. 2 TE와 커플링된 브리오스타틴의 2회 노출로부터 PKC의 활성화는 칼렉스시틴을 9-페어드 TE와 연관된 수준으로 상당히 증가시켰으며(장기간) 기억을 강화하였다(n = 4-8 동물/조건/반복; t-시험 비교, p<0.01).
칼렉스시틴 면역염색은 광-전정 신경돌기(photic-vestibular neurite)의 시냅스 필드 내의 부톤(bouton)을 해상하기에 충분히 민감하다(D). 화살표는 인터뉴우런(a), 반대측 뉴우런으로부터의 액손(b), 및 추정 광수용체로부터의 신경돌기의 말단 부톤(c) 사이의 수지상부 필드(arborization field)를 나타낸다. 스케일 바 = 10 μm; CPG, 뇌체측의 결절종(도 9, 10).
이러한 컨디셔닝-유도된 칼렉스시틴 라벨 증가는, 면역염색 항체가 인산화된 단백질 형태 및 비인산화된 단백질 형태 모두와 반응하기 때문에, 단백질 양의 실질적 증가를 나타낸다. 동일 개체의 타입 B 세포 내에서 전위하는 것으로 앞서 밝혀진 PKC는, 특정 PKC-차단제인 Ro-32가 타입 B 세포에서 학습과 학습-특이적 칼렉스시틴의 증가를 모두 억제하였으므로(상기 참조), 명백히 칼렉스시틴 라벨에 있어 컨디셔닝-유도된 증가를 일으켰다. 비투약(naive) 및/또는 무작위 대조군 트레이닝 프로토콜은 미소한 트레이닝-유도된 칼렉스시틴(CE) 면역염색을 나타내었다(도 9).
브리오스타틴 부재 하의 무작위 트레이닝(4-TE)는 배경보다 약간 높은 세기의 값을 나타내었다. 브리오스타틴 투여는 트레이닝 패러다임 모두에 대해 칼렉스시틴 수준을 증가시켰다. 무작위 트레이닝 하에서, 본원에서의 경우와 같이 CS 및 US에 대한 우발적 겹침(페어링)이 있는 경우, CE에 다소의 증가(2.0의 증가)가 일어날 수 있다는 것은 예기치 못한 바가 아니다. 그러나, 칼렉스시틴 수준은 패어드 트레이닝으로 4.3배를 초과하게 증가하였다(평균 ±SE, N = 5 동물/처리. 4RTE = 무작위 대조군, 무작위 광 및 회전으로 4차례 시도; 6 PTE = 페어드 시도, 페어드 광 및 회전으로 6차례 시도. 6PTE-0Bry 대 6PTE-0.25Bry; p<0.001; 4PTE-0.25Bry 대 6PTE-0.25Bry; p<0.001(t-시험). 준최적 트레이닝 이벤트(4-6 TE)가 이용되는 경우, CE 면역염색(도 10a)은 중간 수준의 상승에 도달하였다. 이러한 준최적 요법은 24시간 보다 길게 지속되는 기억 보유를 나타내는데는 불충분하였다. 전술된 바와 같이, 6 TE로의 트레이닝 동안 투여된 브리오스타틴은 장기간 기억 보유(1주 초과)를 유도하였다. 또한, 브리오스타틴 + 6 TE는 9 TE 후에 관측되는 것에 상응하는 CE 면역염색을 유도하였다.
저용량(0.1 내지 0.25 ng/ml)의 브리오스타틴은 2, 4 또는 6회의 트레이닝 시도 후 기억을 현저하게 향상시켰다. 6 TE로의 파블로비안 컨디셔닝은 브리오스타틴으로 수일 지속되는 기억을 야기시켰다. 이러한 기억 향상은 아니소마이신 또는 PKC 억제제인 Ro-32에 의해 차단되었다. 9 TE를 수행한지 24시간 후, 비록 기억은 1주 초과하게 지속되었지만, 면역염색은 크게 감소되었다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 그러나, 보다 지속적인 CE 면역염색이 최소의 트레이닝(2 TE) 전일에 반복적인 브리오스타틴 노출에 의해 나타났다.
1, 2 및 3일 각각에 걸쳐 4시간 동안 투여된 브리오스타틴 단독(연합적인 컨디셔닝 부재)은, 각각의 브리오스타틴 노출 24시간 후 측정시, 헤르미센다의 B-광수용체에서 칼렉스시틴의 수준을 점진적으로 증가시켰다. 4시간 동안 단일의 브리오스타틴 노출 24시간 후, CE 면역염색은 증가하지 않았다(도 10b). 2일간 연속해서 각각의 일에 1회씩 2회의 브리오스타틴 노출 24시간 후, 보다 큰 잔류 CE 면역염색을 나타내었다. 3회의 브리오스타틴 노출에 이은 2-페어드 트레이닝 이벤트(페어드 광 및 오비탈 진동) 후 칼렉스시틴 수준은 그 수준을, 연합하는 컨디셔닝-유도된 행동 수정을 위한 보유일수의 상당한 부수적 길이와 함께, 더욱 더 높은 수준으로 증가시켰다(n = 16 동물/조건; ANOVA, p<0.01). 이러한 3회의 노출 후 다 음날 2 TE를 수행하고, 24시간 후 CE 면역염색한 결과, 9 TE 직후 앞서 관측된 수준에 근접하였다(도 10b). 따라서, 3일간의 4시간 브리오스타틴 노출에 이은 최소 트레이닝(2 TE) 후의 CE 면역염색은 트레이닝 시도 단독이 보였던 것 보다 큰 지속성을 나타냈다. 새로이 합성된 칼렉스시틴의 지속성은 생화학적 관측과 일치하며 브리오스타틴에 의해 유도되는 향상된 단백질 합성을 나타낸다.
2일 연속된 4시간 브리오스타틴 노출에 이어 24시간 후 2-트레이닝 이벤트(2 TE)가 칼렉스시틴 수준을 강화된 장기간 기억과 연관된 양으로 증가시키는데 필요하다. 전형적으로, 2회의 브리오스타틴 노출과 함께 2-TE가 1주 초과하게 지속되는 보유를 야기시킨다(n = 16 동물/조건; t-시험, p<0.01). 3일 연속된 브리오스타틴에의 4시간 노출에 의한 프라이밍은 강화된 기억에 필요한 칼렉스시틴 수준을 유도할 것이다. 2-페어드 트레이닝 이벤트 직후 첨가된 아니소마이신은 칼렉스시틴 수준을 감소시키지 않았으며, 강화된 기억이 수일 동안 지속된다(n = 8 동물/조건; t-시험, p>0.05, ns). (도 11a, 도 11b).
브리오스타틴 + 트레이닝 직후 PKC의 Ro-32 억제가 장기간 기억 유도를 방해하지 않았고 트레이닝 + 브리오스타틴 동안 이러한 억제가 기억 강화를 방해하지 않았다는 것을 주목할 만하다. 이와는 대조적으로, 브리오스타틴의 존재 및 부재 하의 트레이닝 동안의 아니소마이신은 장기간 기억을 방해하지는 않았으나, 브리오스타틴의 존재 및 부재 하의 트레이닝 후의 아니소마이신은 기억 형성을 완전히 차단했다. 따라서, 트레이닝 동안의 PKC 활성화는 장기간 기억에 필요한 단백질 합성으로 이어진다. 따라서, 일단 PKC 활성화가 충분한 수준으로 유도되면, 필요한 단백질 합성은 피할 수 없는 결과이다. 이와 일치하게, 트레이닝 전일에 브리오스타틴-유도된 PKC 활성화는, 최소한의 트레이닝 시도와 함께, 장기간 기억을 야기시키는데 충분하다. 또한, 이러한 후자의 장기간 기억은 트레이닝(및 그 이전 일들 에서의 PKC 활성화) 후에 일어나는 단백질 합성을 요구하지 않는다. 또한, 사전 PKC 활성화가 후속한 장기간 기억 형성에 필요한 단백질 합성을 일으키기에 충분하였다. 브리오스타틴-유도된 PKC 활성화 및 컨디셔닝 시도에 의해 합성이 유도되는 단백질 중의 하나가, 면역염색 라벨링에 의해 입증되는 바와 같이, 칼렉스시틴이다. 다른 단백질은 PKC 자체이다.
실시예 11: PKC 활성에 대한 브리오스타틴의 효과
브리오스타틴은 세포막 분획과의 PKC 연합을 증가시킴으로써 PKC를 일시적으로 활성화시키는 것으로 공지되어 있다. 또한, 많은 연상 기억 패러다임이 뉴우런 막과의 증가된 PKC 연합을 유발시키는 것으로 입증되었다. 따라서, 본 발명자는 브리오스타틴에의 헤르미센다의 반복적 노출(즉, 4시간 노출, 트레이닝 프로토콜과 정확히 일치)이 또한 장기간의 PKC 활성화를 유도할 수 있는지의 가능성을 시험하였다.
온전한(intact) 헤르미센다를 기술된 조건("행동 약리학") 하에 수일 연속해서 브리오스타틴에 4시간 간격 동안 노출시켰다. 이어서, 분리된 식도주변 신경계에서의 히스톤 인산화("방법" 참조)를 세포질 분획에서 측정하였다 2회의 브리오스타틴 노출의 제2 노출 후 10분 및 24시간에 측정된 PKC 활성은 기저 수준을 초과 하여 상당히 증가하였다. (각각의 측정에 대해 n = 6)(도 12, 13). 따라서, 2개의 분획 모두에서 PKC의 양은 명백히 증가하였으며, 막에서의 PKC 대 세포질 분획에서의 PKC의 비율이 증가한 것은 아니다. 이러한 결과는 브리오스타틴 사전-노출이 PKC에 대해 영향을 끼치며 학습 자체와는 다소 상이하게 하다는 것을 입증한다. 이러한 브리오스타틴의 효과는,(전위를 통한) 초기 활성화 후, 브리오스타틴에 의해 유도되는 칼렉스시틴의 증가된 수준과는 일치하나 반복된 브리오스타틴 노출과 직접적으로 연관되지는 않는, PKC의 증가된 합성에 기인함직하다.
도 12, 13에서 나타난 바와 같이, 단 각각의 브리오스타틴(0.25 ng/ml) 노출과 더불어 아니소마이신(1.0 ng/ml)을 가하였다. 아니소마이신은, 3일 연속해서 브리오스타틴에 노출된 헤르미센다 식도주변 신경계로부터의 세포질 및 막 분획 모두에서, PKC 활성을 현저하게 감소시켰다(각각의 측정에 대해 n = 3, p<0.01)(도 14).
브리오스타틴에의 반복된 노출의 생화학적 결과를 더욱 조사하기 위해서, 래트 해마 뉴우런을 감온성 tsA5CSV40 거대 T 항원의 레트로바이러스 트랜스덕션에 의해 불멸화시킨 후, 상기 래트 해마 뉴우런을 조사하였다(25). 이들은 N2 배지에서 염기성 섬유아세포 성장 인자에 의해 유도되는 경우 뉴우런 표현형을 갖도록 분화하고(26), PKC를 포함한 뉴우런 단백질의 정상적인 보완물을 발현한다.
배양된 해마 뉴우런의 30분 동안의 단일 활성 용량의 브리오스타틴(0.28 nM)에의 노출은, PKC의 세포질로부터 특정 분획으로의 단시간의 전위(약 60%)에 이어 장기간의 하향조절을 야기하였다(도 15). 초기 PKC 활성화 및 후속한 하향조절 모 두 전술된 바 있으며, 막 및 세포질에서의 PKC 활성 측정으로부터 확인되었다. 배양된 해마 뉴우런의 브리오스타틴에의 30분 노출 후 30분 내지 8시간의 간격의 제2의 30분 노출은, 막-결합된 PKC가 보다 신속하게 재결합되도록 하였다. 따라서, 2- 내지 4-시간 지연 후 제2 노출은 단일한 브리오스타틴 노출이 생성하는 상당한 하향조절을 제거시켰다(도 16). 세포질 분획에서, 브리오스타틴에 노출한 후 처음 4시간 내에는 PKC 활성에 대해 어떠한 유의한 변화도 탐지되지 않았다. 이와는 대조적으로, 세포를 2시간 내에 브리오스타틴에 2회 노출시키는 경우, 제2 노출에 반응하여 PKC 활성에 상당한 감소가 있었다. 그러나, 제2 노출이 제1 노출 후 4시간까지 지연되는 경우, 활성은 기저선을 초과하여, 2시간 이내 전달된 제2 노출과 비교하여 상당히 큰 정도로 증가하였다(도 16).
이러한 결과는 PKC의 초기 브리오스타틴 활성화 후 하향조절(28-30)이 PKC 이소자임(및 전술된 바와 같은 칼렉스시틴)의 합성을(드 노보 단백질 합성을 통해) 증가시킨다는 설명과 일치한다. 사실, 본 발명자는 0.28 nM 브리오스타틴에의 단일한 30분 노출이, 뉴우런 수집전 마지막 1/2 시간에 35S-메티오닌의 삽입으로 측정되는, 전체 단백질 합성(도 17)을 24시간 내에는 20% 증가시키고, 브리오스타틴 노출 79시간 후에는 60%로 증가시킨다는 것을 밝혔다. 브리오스타틴에 의해 유도되는 단백질 합성에 대한 이러한 장기간의 충분한 증가는, PKC 억제제인 Ro-32가 또한 존재하는 경우, 부분적으로 차단되었다(도 17).
다수의 관측은 충분한 브리오스타틴-유도된 PKC 활성화가 불가피하게 점진적 인 PKC 불활성화 및 후속한 하향조절을 이끈다는 것을 나타낸다. 충분한 용량의 브리오스타틴(1.0 ng/ml 초과)은 실제로 파블로비안 컨디셔닝을 억제하였다. 이는 고농도 브리오스타틴에 의한 행동 결과를 특징짓는 PK 하향조절에 기인함직 하였다. 브리오스타틴에 의해 유도되는 PKC 활성화는 2개의 상이한 경로에 의해 하향조절되는 것으로 나타났다. 포르볼 에스테르에 의해서도 유도되는 하나의 경로는 유비퀴틴화 및 프로테아좀 경로를 통한 후속한 단백질 분해를 수반한다. 포르볼 에스테르에 의해서는 유도되지 않는, 하향조절의 제2 메카니즘은 포스파타제 PP1 및 PP2A에 의해 매개되는 분해 및 소포 구획을 통한 이동을 수반한다. 충분한 농도 및/또는 기간의 PKC 활성화제를 사용함으로써, PKC 분해 경로는 PKC의 드 노보 합성을 자극하는 PKC의 결핍을 야기시키며, PKC 합성이 불활성화 및 하향조절을 보상할 수 없어 이용가능한 PKC의 95% 이상을 고갈시킨다.
실시예 12: 학습 및 기억 보유에 대한 브리오스타틴의 효과
학습 및 기억에 대한 브리오스타틴의 효과를 래트 공간 미로 모델을 사용하여 검사하였다. 브리오스타틴(NCI, 10 μg/kg 체중)을 1, 3 및 5일에 물 미로 트레이닝 20분 전에 복강내로 주사하였다. RO-31-8220(Sigma, 500 μg/kg 체중)을 브리오스타틴 주사 10분 전에 꼬리 정맥으로 주사하였다. 그 결과가 도 26에 나타나 있다. 별표는 수영 대조군과 상당히 다르다는 것을 나타낸다(**, p<0.01; **, p<0.001). 프로브 시험에서, 미로 + 브리오는 미로 및 미로 + 브리오 + RO와 상당히 다르다(p<0.05).
도 26의 패널 A에서, 래트가 플랫폼에 도달하는 잠재기는 대조군에 비해 브리오스타틴-처리된 동물에서 크게 감소하나(즉, 학습이 용이해졌으나), PKC-α억제제인 RO-31-8220의 존재 하에서는 그렇지 않다. 패널 B에서, 타겟 사분면에 도달하는 시간은, 대조군과 대비하여 브리오스타틴-처리된 동물에 대해, 모든 트레이닝을 수행한 지 24시간 후인 보유 1일에 감소되나, RO-31-8220 존재 하에서는 감소하지 않는다. 패널 C에서, 모든 트레이닝을 수행한 지 1일 후 타겟 교차(target crossing)의 수가 브리오스타틴 처리된 마우스에 대해 보유 1일에 유사하게 향상된다(즉, 기억 보유가 향상된다).
실시예 13: 공간 미로 작업으로 트레이닝된 래트의 수상돌기 가시에 대한 브리오스타틴의 효과
도 27은 물 미로에서 트레이닝된 래트에서 수상돌기 가시 형성에 대한 브리오스타틴의 효과를 나타낸다. 보유 2일에, 공초점 현미경검사 및 Dil 염색을 이용하여 사족(filofodia) 및 수상돌기 가시(버섯모양 가시, 얇은 가시 및 뭉뚝한 가시)를 조사하였다(패널 A). 물 미로 트레이닝은 버섯모양의 가시의 수를 증가시켰다; 이러한 효과는 브리오스타틴에 의해 향상되었다(패널 B). 브리오스타틴 단독(트레이닝 없음)은 뭉뚝한 가시의 수를 증가시켰다(p<0.01)(패널 C). 모든 조건 하에서, 사족 또는 얇은 가시에 어떠한 변화도 관측되지 않았다(나타내지 않음). 단지 브리오스타틴으로 처리된 래트 및 단지 트레이닝만을 받은 래트에서 사족 및(모든 형태의) 가시의 총수는 유사하게 증가하였다(패널 D). 이러한 증가는 물 미 로 래트가 브리오스타틴과 함께 처리되는 경우 향상되었다(p<0.05). 별표는 비투약 대조군과 상당한 차이가 있음을 나타낸다(*, p<0.05; **, p<0.001).
실시예 14: 버섯모양의 가시에 대한 브리오스타틴의 효과
도 28은 버섯모양 가시(M)에서 관측되는 변화 및 후시냅스 밀도(PSD; 황색 화살표); 적색 화살표 = 전시냅스 막; D = 브리오스타틴 처리 및 트레이닝 후의 수상돌기에 대한 전자 현미경사진이다(패널 A). 미로 + 브리오 패널은 천공된 PSD(중심에 구멍을 갖는 큰 PSD)이며, 다른 패널에서의 PSD는 반점 타입(구멍이 없는 작은 PSD)이다. 브리오스타틴의 존재 및 부재 하에서의 물 미로 트레이닝은, 천공된 PSD를 갖는 큰 버섯모양의 가시의 수가 증가하기 때문에(패널 C), PSD의 평균 크기가 커졌다(패널 B). 별표는 비투약 대조군과 상당히 다르다는 것을 나타낸다(*, p<0.05; **, p<0.001).
실시예 15: 전시냅스 및 후시냅스 구조물에 대한 브리오스타틴의 상이한 효과
물 미로 트레이닝은, 정량적인 공초점 면역조직학검사로 측정되는 바와 같이, 수상돌기 가시 마커 스피노필린(도 29; 패널 B), 후시냅스 막 마커 뉴로그라닌(도 29; 패널 A 및 D), 및 전시냅스 마커 GAP-43(패널 A 및 E)의 수는 증가시켰으나, 액손 부톤 마커 시냅토피신(도 29; 패널 A 및 B)의 수는 증가시키지 않았다. 이러한 결과는 새로운 가시가 이미 기존의 가시(들)과 함께 시냅스를 만들었던 기존의 액손 부톤과 함께 시냅스를 형성한다는 것을 나타낸다. 전시냅스 마커의 수 가 브리오스타틴 단독을 수령한 래트에서도 증가되었다. 브리오스타틴 처리의 존재 및 부재 하에서 물 미로 트레이닝은 전시냅스 및 후시냅스 막의 크기를 증가시켰으며, 이는 물 미로 트레이닝이 큰 PSD를 갖는 버섯모양의 가시를 선택적으로 증가시킨다는 것을 입증한다. 별표는 비투약 대조군과 상당히 다르다는 것을 나타낸다(*, p<0.05; **, p<0.001).
실시예 16: PKC 활성화에 의한 증가된 가시 밀도의 메카니즘
PKC 활성화에 의한 증가된 가시 밀도의 메카니즘이 도 30에 나타나 있다. 날카로운 해마 절편을 0.1 nM 브리오스타틴과 연속해서 인큐베이션한 후, 정량적 공초점 면역조직화학검사를 위해 처리하였다. 브리오스타틴은 혈장막으로의 전위(황색 화살표) 및 PKCα의 활성화 및 PKC-의존적 ELAV(mRNA-안정화 단백질)의 세포체의 세포질 및 CA1 뉴우런의 근위 수상돌기로의 핵 전달(백색 화살표)을 자극한다. 또한, 브리오스타틴은, 가시 마커 스피노필린에 의해 측정되는 바와 같이, 수상돌기 가시의 수를 증가시킨다.
실시예 17; PKC 활성화에 의한 증가된 가시 밀도의 메카니즘
PKC 활성화에 의한 증가된 가시 밀도의 메카니즘이 도 31에 나타나 있다. 해마 절편에서, 브리오스타틴은 PKCα는 선택적으로 활성화시키나 PKCδ 및 PKCε는 그렇지 않았다(패널 A). ELAV가 브리오스타틴과의 120분 인큐베이션에서 수상돌기로 상당히 수송되는 경우(패널 B), 수상돌기 가시의 수가 증대되었다(패널 C). 이러한 효과는 PKC 차단제인 RO-31-8220 또는 켈레리트린(chelerythrine)에 의해 억제되었다(패널 D). 또한, 증가된 가시 밀도가 단백질 합성 차단제에 의해 억제되었다(나타내지 않음). 대체로, 이들은 브리오스타틴이 PKCα-활성화된 ELAV 단백질을 자극하여 가시 형성에 중요한 단백질 합성을 증진시키고 mRNA 분해를 억제한다는 것을 제시한다. 프로브 시험 및 6-일간의 물 미로 트레이닝한 지 2일 후, ELAV는 수상돌기에서 여전히 증가되었으며(패널 E), 이는 물 미로가 PKC/ELAV/단백질 합성 케스케이드에 의해 버섯모양의 가시 밀도를 증가시킨다는 것을 제시한다. 그러나, 수상돌기에서의 ELAV의 지속된 증가는 브리오스타틴의 존재 및 부재 하에서의 공간 학습 후 상이하지 않으며, 이는 PKC/ELAV/단백질 합성이 버섯모양의 가시 형성에 대한 유일한 경로가 아니라는 것을 제시한다. 별표는 비투약 대조군과 상당히 다르다는 것을 나타낸다(*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001).

Claims (126)

  1. 단백질 키나제 C(PKC) 활성화제를 PKC와 접촉시켜 세포 또는 뉴우런 성장을 자극하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, PKC 활성화제와 PKC와의 접촉이 수상돌기 성장을 자극하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, PKC 활성화제와 PKC와의 접촉이 수상돌기 가시 형성을 자극하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, PKC 활성화제와 PKC와의 접촉이 수상돌기 가시 밀도를 자극하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, PKC 활성화제와 PKC와의 접촉이 ELAV의 근위 수상돌기로의 전위를 자극하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, PKC 활성화제가 마크로사이클릭 락톤인 방법.
  7. 제1항에 있어서, PKC 활성화제가 벤조락탐인 방법.
  8. 제1항에 있어서, PKC 활성화제가 피롤리디논인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 마크로사이클릭 락톤이 브리오스타틴인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 브리오스타틴이 브리오스타틴-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, 또는 -18인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 브리오스타틴이 브리오스타틴-1인 방법.
  12. 제6항에 있어서, 마크로사이클릭 락톤이 네리스타틴인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 네리스타틴이 네리스타틴-1인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 접촉이 PKC를 활성화시키는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 접촉이 PKC의 양을 증가시키는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 접촉이 PKC의 합성을 증가시키는 방법.
  17. 제14항에 있어서, PKC가 PKCα인 방법.
  18. 제15항에 있어서, PKC가 PKCα인 방법.
  19. 제16항에 있어서, PKC가 PKCα인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 접촉이 칼렉스시틴의 양을 증가시키는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 접촉으로 PKC의 실질적인 후속 하향조절이 일어나지 않는 방법.
  22. 제1항에 있어서, PKC 활성화제와 PKC와의 접촉이 반복되는 방법.
  23. 제22항에 있어서, PKC 활성화제와 PKC와의 접촉이 일정한 간격으로 반복되는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 간격이 1주 내지 1개월, 1일 내지 1주, 또는 1시간 미만 내지 24시간인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 간격이 1주 내지 1개월인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 간격이 1일 내지 1주인 방법.
  27. 제24항에 있어서, 간격이 1시간 미만 내지 24시간인 방법.
  28. 제1항에 있어서, PKC 활성화제와 PKC와의 접촉이 고정적 지속기간 동안 유지되는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 고정적 지속기간이 24시간 미만인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 고정적 지속기간이 12시간 미만인 방법.
  31. 제28항에 있어서, 고정적 지속기간이 6시간 미만인 방법.
  32. 제28항에 있어서, 고정적 지속기간이 4시간 미만인 방법.
  33. 제28항에 있어서, 고정적 지속기간이 2시간 미만인 방법.
  34. 제28항에 있어서, 고정적 지속기간이 약 2시간 내지 약 6시간인 방법.
  35. 제28항에 있어서, 고정적 지속기간이 약 4시간인 방법.
  36. 제28항에 있어서, 상기 접촉의 지속기간이 약 1시간 내지 약 12시간인 방법.
  37. 제22항에 있어서, 상기 접촉이 1일 초과의 기간 동안 반복되는 방법.
  38. 제22항에 있어서, 상기 접촉이 1일 내지 1개월의 기간 동안 반복되는 방법.
  39. 제22항에 있어서, 상기 접촉이 1일 내지 1주의 기간 동안 반복되는 방법.
  40. 제22항에 있어서, 상기 접촉이 1주 내지 1개월의 기간 동안 반복되는 방법.
  41. 제22항에 있어서, 상기 접촉이 1개월 내지 6개월의 기간 동안 반복되는 방법.
  42. 제22항에 있어서, 상기 접촉이 1개월의 기간 동안 반복되는 방법.
  43. 제22항에 있어서, 상기 접촉이 1개월 초과의 기간 동안 반복되는 방법.
  44. 단백질 키나제 C(PKC) 활성화제를 PKC와 접촉시켜 장기간 기억을 강화시키기에 충분하게 단백질 합성을 자극하는 단계를 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, PKC 활성화제가 마크로사이클릭 락톤인 방법.
  46. 제44항에 있어서, PKC 활성화제가 벤조락탐인 방법.
  47. 제44항에 있어서, PKC 활성화제가 피롤리디논인 방법.
  48. 제45항에 있어서, 마크로사이클릭 락톤이 브리오스타틴인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 브리오스타틴이 브리오스타틴-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, 또는 -18인 방법.
  50. 제48항에 있어서, 브리오스타틴이 브리오스타틴-1인 방법.
  51. 제45항에 있어서, 마크로사이클릭 락톤이 네리스타틴인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 네리스타틴이 네리스타틴-1인 방법.
  53. 제44항에 있어서, 상기 접촉이 PKC를 활성화시키는 방법.
  54. 제44항에 있어서, 상기 접촉이 PKC의 양을 증가시키는 방법.
  55. 제44항에 있어서, 상기 접촉이 PKC의 합성을 증가시키는 방법.
  56. 제44항에 있어서, 상기 접촉이 칼렉스시틴의 양을 증가시키는 방법.
  57. 제44항에 있어서, 상기 접촉으로 PKC의 실질적인 후속 하향조절이 일어나지 않는 방법.
  58. 제44항에 있어서, PKC 활성화제와 PKC와의 접촉이 반복되는 방법.
  59. 제58항에 있어서, PKC 활성화제와 PKC와의 접촉이 일정한 간격으로 반복되는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 간격이 1주 내지 1개월, 1일 내지 1주, 또는 1시간 미만 내지 24시간인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 간격이 1주 내지 1개월인 방법.
  62. 제60항에 있어서, 간격이 1일 내지 1주인 방법.
  63. 제60항에 있어서, 간격이 1시간 미만 내지 24시간인 방법.
  64. 제44항에 있어서, PKC 활성화제와 PKC와의 접촉이 고정적 지속기간 동안 유지되는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 고정적 지속기간이 24시간 미만인 방법.
  66. 제64항에 있어서, 고정적 지속기간이 12시간 미만인 방법.
  67. 제64항에 있어서, 고정적 지속기간이 6시간 미만인 방법.
  68. 제64항에 있어서, 고정적 지속기간이 4시간 미만인 방법.
  69. 제64항에 있어서, 고정적 지속기간이 2시간 미만인 방법.
  70. 제64항에 있어서, 고정적 지속기간이 약 2시간 내지 약 6시간인 방법.
  71. 제64항에 있어서, 고정적 지속기간이 약 4시간인 방법.
  72. 제64항에 있어서, 상기 접촉의 지속기간이 약 1시간 내지 약 12시간인 방법.
  73. 제58항에 있어서, 상기 접촉이 1일 초과의 기간 동안 반복되는 방법.
  74. 제58항에 있어서, 상기 접촉이 1일 내지 1개월의 기간 동안 반복되는 방법.
  75. 제58항에 있어서, 상기 접촉이 1일 내지 1주의 기간 동안 반복되는 방법.
  76. 제58항에 있어서, 상기 접촉이 1주 내지 1개월의 기간 동안 반복되는 방법.
  77. 제58항에 있어서, 상기 접촉이 1개월 내지 6개월의 기간 동안 반복되는 방법.
  78. 제58항에 있어서, 상기 접촉이 1개월의 기간 동안 반복되는 방법.
  79. 제58항에 있어서, 상기 접촉이 1개월 초과의 기간 동안 반복되는 방법.
  80. 단백질 키나제 C(PKC) 활성화제를 PKC와 접촉시켜 PKC를 하향조절하는 단계 를 포함하는 방법.
  81. 제80항에 있어서, PKC 활성화제가 마크로사이클릭 락톤인 방법.
  82. 제80항에 있어서, PKC 활성화제가 벤조락탐인 방법.
  83. 제80항에 있어서, PKC 활성화제가 피롤리디논인 방법.
  84. 제81항에 있어서, 마크로사이클릭 락톤이 브리오스타틴인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 브리오스타틴이 브리오스타틴-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, -15, -16, -17, 또는 -18인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 브리오스타틴이 브리오스타틴-1인 방법.
  87. 제81항에 있어서, 마크로사이클릭 락톤이 네리스타틴인 방법.
  88. 제81항에 있어서, 네리스타틴이 네리스타틴-1인 방법.
  89. 제80항에 있어서, 상기 접촉이 PKC의 하향조절을 일으키는 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 접촉이 PKC의 실질적인 하향조절을 일으키는 방법.
  91. 제80항에 있어서, 상기 접촉이 PKC의 합성을 자극하지 않는 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 접촉이 PKC의 합성을 실질적으로 자극하지 않는 방법.
  93. 제80항에 있어서, 상기 접촉이 PKC의 양을 감소시키는 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 접촉이 PKC의 양을 실질적으로 감소시키는 방법.
  95. 제80항에 있어서, 상기 접촉이 칼렉스시틴의 합성을 자극하지 않는 방법.
  96. 제93항에 있어서, 상기 자극이 칼렉스시틴의 합성을 자극하지 않는 방법.
  97. 제80항에 있어서, PKC 활성화제와 PKC와의 접촉이 지속된 기간 동안인 방법.
  98. 제97항에 있어서, 지속된 기간이 1시간 미만 내지 24시간인 방법.
  99. 제97항에 있어서, 지속된 기간이 1일 내지 1주인 방법.
  100. 제97항에 있어서, 지속된 기간이 1주 내지 1개월인 방법.
  101. 제97항에 있어서, 지속된 기간이 1시간 미만 내지 12시간인 방법.
  102. 제97항에 있어서, 지속된 기간이 1시간 미만 내지 8시간인 방법.
  103. 제97항에 있어서, 지속된 기간이 1시간 미만 내지 4시간인 방법.
  104. 제97항에 있어서, 지속된 기간이 약 4시간인 방법.
  105. 제80항에 있어서, 상기 접촉이 PKC의 지속된 하향조절을 일으키는 방법.
  106. 제44항에 있어서, PKC의 분해를 억제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  107. 제106항에 있어서, 상기 분해가 유비퀴틴화를 통하는 방법.
  108. 제107항에 있어서, 상기 분해가 락타시스테인에 의해 억제되는 방법.
  109. 제44항에 있어서, PKC가 사람 PKC인 방법.
  110. 제44항에 있어서, PKC 활성화제가 PKC 활성화제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 제공되는 방법.
  111. 제110항에 있어서, 약제학적 조성물이 PKC 억제제를 추가로 포함하는 방법.
  112. 제111항에 있어서, PKC 억제제가 말초 조직의 PKC를 억제하는 방법.
  113. 제111항에 있어서, PKC 억제제가 말초 조직의 PKC를 선택적으로 억제하는 방법.
  114. 제111항에 있어서, PKC 억제제가, PKC를 피검체에 투여하는 것과 연관된 근육통을 감소시키는 화합물인 방법.
  115. 제111항에 있어서, PKC 억제제가 PKC 활성화제의 내용량을 증가시키는 화합물인 방법.
  116. 제111항에 있어서, PKC 억제제가 비타민 E, 비타민 E 동족체, 비타민 E 염, 칼포스틴 C, 티아졸리딘디온, 루복시스타우린 또는 이들의 배합물인 방법.
  117. 유효량의 PKC 활성화제를 기억 상실로 확인된 피검체의 PKC와 접촉시켜 기억 상실을 지연시키거나 역행시키는 단계를 포함하는, 기억 및 학습 상실을 지연 또는 역행시키는 방법.
  118. 제117항에 있어서, 유효량의 PKC 활성화제와 PKC와의 접촉이 세포 또는 뉴우런 성장을 자극하는 방법.
  119. 제117항에 있어서, 유효량의 PKC 활성화제와 PKC와의 접촉이 수상돌기 성장을 자극하는 방법.
  120. 제117항에 있어서, 유효량의 PKC 활성화제와 PKC와의 접촉이 수상돌기 가시 형성을 자극하는 방법.
  121. 제117항에 있어서, 유효량의 PKC 활성화제와 PKC와의 접촉이 수상돌기 가시 밀도를 자극하는 방법.
  122. 유효량의 PKC 활성화제와 피검체의 PKC를 접촉시켜 세포 또는 뉴우런 성장을 자극하는 단계를 포함하는, 세포 또는 뉴우런 성장을 자극하는 방법.
  123. 제122항에 있어서, 피검체가 손상된 학습 또는 기억을 갖는 것으로 확인되는 방법.
  124. 제122항에 있어서, 유효량의 PKC 활성화제와 PKC와의 접촉이 수상돌기 성장을 자극하는 방법.
  125. 제122항에 있어서, 유효량의 PKC 활성화제와 PKC와의 접촉이 수상돌기 가시 형성을 자극하는 방법.
  126. 제122항에 있어서, 유효량의 PKC 활성화제와 PKC와의 접촉이 수상돌기 가시 밀도를 자극하는 방법.
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